(57)【要約】本発明は、生体内での安全性、組織特異性及び抗がん活性が増加された組換えアデノウイルス及びこの用途に関するものであって、詳しくは、肝組織特異的なＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター、前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子、及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスは、生体内での顕著な安全性、標的組織に対する高い特異性及び顕著な抗がん効果を示すので、遺伝子伝達ベクターとして抗がん剤またはがん診断剤として有用に使用できる。
2016505245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝組織特異的なＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター；
前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的な遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；
前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子；及び
血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、
アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１乃至ｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記肝組織特異的なＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーターは、配列番号１で記載される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
前記プロモーターは、配列番号２で記載される塩基配列を有するＡｐｏＡ１のイントロンを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
前記がん特異的な遺伝子は、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、またはＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
前記リボザイムは、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡを特異的に標的するトランススプライシンググループIのリボザイムであることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
前記治療遺伝子は、薬剤感受性遺伝子、細胞死遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子で構成された群から選択される何れか一つであることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子はＬａｃＺ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ:  ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、レニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＳＥＡＰ）またはＨＳＶ−ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
前記組換えアデノウイルスは、配列番号６で記載されるＡｐｏＥ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ）遺伝子のエンハンサー、ＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のエンハンサー、血清アルブミン遺伝子のエンハンサー、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のエンハンサー、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）遺伝子のエンハンサーまたはＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）遺伝子のエンハンサーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
前記トランススプライシングリボザイムは、配列番号３で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記治療遺伝子は、配列番号４で表示される塩基配列を有するＨＳＶ−ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れかによる組換えアデノウイルスを有効成分として含む肝がん治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至１０の何れかによる組換えアデノウイルスを有効成分として含む肝がん診断用組成物。
【請求項１３】
１）請求項１乃至１０の何れかによる組換えアデノウイルスをがん細胞に導入する段階；及び
２）前記段階１）のがん細胞でレポータータンパク質を検出する段階を含む肝がん診断のための情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝組織特異的なＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター；前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子；及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）及びこの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝がんは世界的に最も一般的ながんの一つであって、高い致死率のため、全てのがんのうち三番目に高い死亡率を示す。過去２０年間の疾病の理解及び治療的選択に対する主要な発展にもかかわらず、肝がんは従来の薬物によく反応しないため治療が難しく、侵襲とがん転移の可能性のため、治療後にも再発がよくあることが知られている。
【０００３】
現在まで一般的に施行されている肝がんの治療方法は、大きく部分肝切除術または肝移植術を含む手術的療法と、頸動脈化学塞栓術、経皮的エタノール注入術、高周波熱治療法等を含む非手術的療法に分けられる。しかし、肝がんに伴われる硬変により殆どの肝がん患者の肝機能が広範囲に衰退しているため、このような治療法の適用が容易ではない。肝切除術の場合、全体の肝がん患者の約１０〜２０％のみが対象となり得、再発率も毎年約１０〜３０％程度であることが知られている。肝移植術はドナーの不足により一般的な治療法として使用できておらず、局所治療法の場合は、早期に発見された小さいがんの治療にその対象が限られる。広範囲ながん治療法に知られている全身化学療法または放射線治療等も単に部分的にのみ効果を示している。従って、肝がんに対する新たな治療戦略の開発が必要となり、最近、免疫治療、ホルモン治療、及び遺伝子治療等多様な研究が行われている。
【０００４】
遺伝子治療は、先天的又は後天的な遺伝子欠陥、ウイルス性疾病、がん又は心血管系疾患等のような慢性疾患の治療と予防のために、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の遺伝物質を人体内に投与して治療タンパク質を発現させたり、特定タンパク質の発現を抑制するようにする治療方法であって、疾病の原因を遺伝子次元で解釈して根本的に治療できるため、難病の克服はもちろん、既存の医療方式の代替手段として期待されている方法である。一般的に使用される遺伝子治療用アデノウイルスベクターは複製に必須の一連の遺伝子を削除して、プロモーター活性の水準が高いサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを入れ、治療目的のタンパク質の生体内での高い発現を誘導する。
【０００５】
最近は、遺伝子治療に活用できる標的遺伝子の多数が、細胞分裂を多くする一般細胞にも発現することによって発生する副作用を減らすための努力として、がん細胞の特異的な治療が試みられている。がん又は組織の特異的なプロモーターを使用した転写的標的腫瘍遺伝子の治療は、がん細胞が調節されない増殖及び細胞の生存に重要な多くの遺伝子を過発現または活性化させる性質を用いる。
【０００６】
一方、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からのグループIのイントロンリボザイムが試験管内だけでなく、バクテリア、さらに人体細胞内でトランススプライシング反応を行うことによって、別々に存在する転写体を互いに連結させることができることが報告された（Ｂｅｅｎ,  Ｍ.  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ,  Ｔ.  １９８６,  Ｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｐｒｅ−ｒＲＮＡ  ｓｅｌｆ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ,  ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ,  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ.  Ｃｅｌｌ  ４７:  ２０７−２１６;  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ,  Ｂ.Ａ.  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ,  Ｔ.Ｒ.  １９９４,  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ,  ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ.  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１:  ６１９−６２２;  Ｊｏｎｅｓ,  Ｊ.Ｔ.,  Ｌｅｅ,  Ｓ.Ｗ.,  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ,  Ｂ.Ａ.  １９９６,  Ｔａｇｇｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｔｏ  ｆｏｌｌｏｗ  ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ.  Ｎａｔ  Ｍｅｄ.  ２:  ６４３−６４８）。
【０００７】
従って、グループIのイントロンを基にしたトランストランススプライシングリボザイムにより疾患に関する遺伝子転写体又は正常細胞では発現せず、疾病細胞でのみ特異的に発現する特定のＲＮＡが標的となった後、そのＲＮＡが正常的なＲＮＡに補正されるか、又は新たな治療用遺伝子転写体に置換されるように再プログラムを誘発することによって、非常に疾患特異的であり、安全な遺伝子治療技術になり得る。即ち、単に標的遺伝子転写体が存在する時にのみＲＮＡ置換が生じるため、その結果として、単に適切な時間と空間でのみ我々の所望の遺伝子産物が作られる。
【０００８】
特に、細胞内に発現するＲＮＡを標的とした後、所望の遺伝子産物に代える方法であるため、導入しようとする遺伝子の発現量を調節することができる。また、トランススプライシングリボザイムは、疾患特異のＲＮＡを除去すると同時に我々の所望の治療用遺伝子産物の発現を誘導できるため、治療効果を加えることができる。
【０００９】
さらに、リボザイムに基づいたｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｓｎｃｒｉｐｔａｓｅ）−標的戦略は、テロメラーゼの活性のため、正常の肝組織には認識されず、肝細胞がん腫では８９．５％と認識されることができる新たな肝がんの治療方法として報告された（Ｎａｇａｏ  Ｋ,  Ｔｏｍｉｍａｔｓｕ  Ｍ,  Ｅｎｄｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ:  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｓｎｃｒｉｐｔａｓｅ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｒｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ.  Ｊ  Ｇａｓｔｒｅｎｔｅｒｏｌ  １９９９;  ３４;８３−８７）。ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）は、がん細胞の不滅性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を調節する最も重要な酵素のうちの一つであって、このテロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は無限に複製される生殖細胞、造血細胞及びがん細胞で８０乃至９０％のテロメラーゼの活性を有しているが、がん細胞の周辺の正常細胞はその活性を有していない（Ｂｒｙａｎ,  Ｔ.Ｍ.ａｎｄ  Ｃｅｃｈ,  Ｔ.Ｒ.  １９９９,  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｄｓ.  Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.  １１;  ３１８−３２４）。テロメラーゼのこのような特性を用いて細胞成長に関与するテロメラーゼの抑制子を開発することによって、がん細胞の増殖を抑制しようとする試みが最近活発に行われている（Ｂｒｙａｎ,  Ｔ.Ｍ.,  Ｅｎｇｌｅｚｏｕ,  Ａ.,  Ｇｕｐｔａ,  Ｊ.,  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ,  Ｓ.,  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｅｌ,  Ｒ.Ｒ.  １９９５,  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｏｒｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ.  Ｅｍｂｏ  Ｊ.  １４;  ４２４０−４２４８;  Ａｒｔａｎｄｉ,  Ｓ.Ｅ.  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ,  Ｒ.Ａ.  ２０００,  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ:  ｗｈａｔ  ｃａｎ  ｔｈｅｙ  ｔｅａｃｈ  ｕｓ  ａｂｏｕｔ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｔ.  Ｍｅｄ.  ６;  ８５２−８５５）。
【００１０】
よって、本発明者は肝がん治療のための遺伝子治療方法について研究を続けてきており、組織特異的なプロモーターとがん特異的遺伝子を標的とするトランススプライシングリボザイムを含む組換えアデノウイルスを用いた遺伝子治療方法を開発し、特に肝組織特異的ＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター；前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子；及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）の場合、治療効率及び安定性が顕著に高いことを見出し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、生体内での安全性、組織特異性及び抗がん活性が増加された組換えアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）及びこの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は肝組織特異的なＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター；前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子；及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）Ｅ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスを提供する。
【００１３】
また、本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを有効成分として含む肝がん治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを有効成分として含む肝がん診断用組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、
１）本発明の組換えアデノウイルスをがん細胞に導入する段階；及び
２）前記段階１）のがん細胞でレポータータンパク質を検出する段階を含む肝がん診断のための情報提供方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明による組換えアデノウイルスの模式図を示す図である。
【図２】組織特異的なプロモーターＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）とＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）を含むｐＰＥＰＣＫ−ＨＳＶｔｋ（ｐＰＴ−Ｏ）、並びにＰＥＰＣＫ、ＨＳＶｔｋ及びＡｐｏＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ)  エンハンサーを含むｐＰＥＰＣＫ−  ＨＳＶｔｋ−Ｅｎｈ（ｐＰＴ−Ｅ）組換えアデノウイルスの模式図を示す図である。
【図３】ＡｐｏＥエンハンサーの存在によるＰＥＰＣＫに誘導されたＨＳＶｔｋ活性を確認した図である。
【図４】ＣＭＶプロモーター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含み、Ｅ１及びＥ３遺伝子が欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ５ＣＭＶ.ＧＦＰ）及びＣＭＶプロモーター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＣ）及び血清型３５のファイバーノブと血清型５のシャフトを含み、Ｅ１及びＥ３遺伝子が欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ５／３５ＣＭＶ、ＧＦＰ）の模式図を示す図である。
【図５】Ａｄ５ＣＭＶ.ＧＦＰ及びＡｄ５／３５ＣＭＶ.ＧＦＰをＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株に感染させた後、ＧＦＰ−陽性細胞数を確認した図である。
【図６】Ａｄ５／３５ＣＭＶ.ＧＦＰに感染されたＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株で定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）を用いたアデノウイルスのゲノム数を確認した図である。
【図７】本発明の組換えアデノウイルスの肝がん特異的な効果を確認した図である。
【図８】Ａｄ−ＰＲＴのトランススプライシング作用を確認した図である。
【図９】ＰＥＰＣＫ−陽性及びｈＴＥＲＴ−陽性肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ３９８及びＳＮＵ７３９）、及びＰＥＰＣＫ−陰性並びにｈＴＥＲＴ−陰性の非肝がん細胞株（ヒト上皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ;  ＨＤＦ）、肺がん細胞株（ＳＢＣ−５）及び大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６））で肝がん特異的な効果を確認した図である。
【図１０】正常の肝で組換えアデノウイルスに媒介したＴＫ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子の発現をｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴイメージ及び標準化吸収値（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｖａｌｕｅｓ;  ＳＵＶ）を通じて確認した図である。
【図１１】がん誘発のマウスでＡｄ−ＰＲＴの肝がん−特異的な標的化能力を  ｍｉｃｒｏＰＥＴＭＲ  ｆｕｓｉｏｎイメージを通じて確認した図である。
【図１２】組換えアデノウイルスが感染されたかを確認するために、正常部位（ｎｏｒｍａｌ；Ｎ）及び肝がん部位（ｔｕｍｏｒ;  Ｔ）からそれぞれＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲ分析法を行った図である。
【図１３】Ａｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ＣＲＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＰＲＴで処置されたマウスグループ（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）の生存プロット（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｌｏｔ）をカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）方法を用いて評価した図である。
【図１４】Ａｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ＣＲＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＰＲＴで処置されたマウスグループ（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）の肝機能をＧＣＶ処置した後、３日目及び６日目に肝特異的な酵素であるＡＬＴ及びＡＳＴで測定した結果を示す図である；誤差の棒は平均値±ＳＥＭを示す。
【図１５】肝がん組織でＨ＆Ｅ染色を用いた代表的な組織検査結果及びＴＵＮＥＬ分析法を用いた細胞死の評価を示す図である；ＴＵＮＥＬ分析でこげ茶色の核及び細胞染色は細胞死を意味する。
【図１６】Ａｄ−ＰＲＴによる肝細胞がん腫細胞の侵襲抑制及び新生血管抑制を示す図である；代表的な侵襲細胞を画像化し（上側）、各グループのデータは平均値±ＳＥＭ（＊＊＊ｐ＜０．００１）で表現した（右側）；侵襲細胞数の３番の独立的な実験で、少なくとも５の部位でカウンティングし、統計的有意性はｔ−ｔｅｓｔを用いて評価した。
【図１７】Ａｄ−ＰＲＴによる肝細胞がん腫のマウスでの免疫組織化学的評価を通じた減少したＶＥＧＦ及びＣＤ３４の発現を示した図である。
【図１８】１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴ画像を用いたＡｄ−ＰＲＴの治療的効能を示す図である；各グループの代表的な１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴ画像は、肝でのＳＵＶｍａｘ値と共に示した。
【図１９】Ａｄ−ＰＲＴを投与した肝がん細胞がん腫マウスモデルでのＰＥＴ／ＣＴ画像を５週間観察した結果を示した図である；下記３つの図は、５週間後の剖検の結果であって、左側は外観写真、中間は左側肝葉の組織写真、右側は右側肝葉の組織写真であって、青色の腫瘤が肝細胞がん腫である。
【図２０】Ａｄ−Ｍｏｃｋを投与した肝細胞がん腫マウスモデルでのｍｉｃｒｏＰＥＴ画像を２週間観察した画像を示す図である。
【図２１】Ａｄ−Ｍｏｃｋ（ｎ＝５）、Ａｄ−ＰＲＴ（ｎ＝５）グループでの腫瘍ＳＵＶｍａｘ値を示すグラフである；誤差の棒は平均値±ＳＥＭを示す（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図２２】Ａｄ−ＰＲＴを投与した肝細胞がん腫マウスモデルでのｍｉｃｒｏＰＥＴ画像を２週間観察した画像を示す図である。
【図２３】各グループの代表的な肝組織の顕微鏡写真（Ｈ＆Ｅ染色）を示す図である。
【図２４】腫瘍細胞接種の１４日後に、ＰＲＴ（ｎ＝２０）及びＭｏｃｋ（ｎ＝１０）グループでの腫瘍の重量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の用語を詳しく説明する。
【００１８】
本発明の用語「アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）」とは、アデノウイルスベクターと同一の意味があり、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）属に属するウイルスを意味し、前記アデノウイルス科には、マストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属の動物性アデノウイルスを全て含む。特に、ヒトのアデノウイルスは、Ａ−Ｆ亜属（ｓｕｂｇｅｎｅｒａ）及びその個々の血清型を含み、Ａ−Ｆ亜属は、ヒトのアデノウイルス第１型、第２型、第３型、第４型、第４ａ型、第５型、第６型、第７型、第８型、第９型、第１０型、第１１型（Ａｄ１１Ａ及びＡｄ１１Ｐ）、第１２型、第１３型、第１４型、第１５型、第１６型、第１７型、第１８型、第１９型、第１９ａ型、第２０型、第２１型、第２２型、第２３型、第２４型、第２５型、第２６型、第２７型、第２８型、第２９型、第３０型、第３１型、第３２型、第３３型、第３４型、第３４ａ型、第３５型、第３５ｐ型、第３６型、第３７型、第３８型、第３９型、第４０型、第４１型、第４２型、第４３型、第４４型、第４５型、第４６型、第４７型、第４８型及び第９１型が含まれる。
【００１９】
本発明の用語「プロモーター」とは、特定の宿主細胞で作動可能に連結された他の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味し、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」というのは、一つの核酸断片が他の核酸断片と機能的に結合し、その機能又は発現が他の核酸断片により影響を受けることを言う。
【００２０】
本発明において用語「組織特異的なプロモーター」とは、組織特異的にプロモーターダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始の活性を有する、コード領域のアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）の翻訳されていない核酸配列を言う。
【００２１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２２】
本発明は、肝組織特異的なＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター；前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子；及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１乃至ｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスを提供する。
【００２３】
前記肝組織特異的なＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーターは、配列番号１で記載される塩基配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
前記肝組織特異的なプロモーターによりリボザイムが特定の標的組織でのみ発現し、がん特異的遺伝子に対するＲＮＡ置換の活性を有するトランススプライシングリボザイムの作用を通じて、正常組織ではないがん組織でのみリボザイムのトランススプライシング活性が機能し、これによってがんが発生した組織以外の他の組織でアデノウイルスが作用できず、遺伝子治療による副作用を顕著に減少させることができる。
【００２５】
前記プロモーターは、配列番号２で記載される塩基配列を有するＡｐｏＡ１のイントロンを更に含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
前記がん特異的な遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイムは、組織特異的なプロモーターにより特定組織でのみ発現し、前記特定組織での発現したリボザイムは、細胞内発現する特定のがん特異的な遺伝子を標的としてトランススプラなシング反応を行い、治療遺伝子又はレポーター遺伝子を接合する。
【００２７】
前記がん特異的な遺伝子は、がん細胞で特異的に発現する遺伝子を意味し、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、またはＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）ｍＲＮＡであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
前記リボザイムは、がんに特異的な遺伝子を標的としてトランススプライシング反応を行い、新たな治療遺伝子またはレポーター遺伝子をがん特異的な遺伝子に連結できることが好ましく、がんに特異的なＲＮＡ転写体であるｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを認知してトランススプライシングする能力が検証された配列番号３で表される塩基配列を有するｈＴＥＲＴ標的トランススプライシンググループIのリボザイムであることがより好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
前記血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）は、公知の方法（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏv  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ.  ２０００  Ｎｏｖ；７４（２２）：１０２７４−８６）を用いて血清型５のファイバーノブの部分を血清型３５のファイバーノブの部分で置換して製作することが好ましいが、これに限定されない。
【００３０】
前記組換えアデノウイルスは、ＡｐｏＥ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ）遺伝子のエンハンサー（配列番号：６）、ＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のエンハンサー、血清アルブミン遺伝子のエンハンサー、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のエンハンサー、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）遺伝子のエンハンサーまたはＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）遺伝子のエンハンサーをさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００３１】
前記組換えアデノウイルスは、Ｅ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスであることが好ましいが、これに限定されない。また、Ｅ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスは、公知の方法（Ｙｅｈ  Ｐ,  Ｄｅｄｉｅｕ  ＪＦ,  ｅｔ．  ａｌ.  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９６  Ｊａｎ；７０（１）：５５９−６５）を通じて製作できるが、これに限定されない。
【００３２】
前記Ｅ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４は正常細胞に損傷を与えるため、前記Ｅ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子を欠損させた場合、安定性が有意に増加し、また、前記Ｅ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４の欠損した組換えアデノウイルスは、外因性治療遺伝子を収容する空間が増加するため、約７ｋｂの外因性治療遺伝子を収容できる。
【００３３】
前記治療遺伝子は、薬剤感受性遺伝子、細胞死遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子で構成された群から選択される何れか一つであることが好ましいが、配列番号４で表される塩基配列を有するＨＳＶ−ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子であることがより好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
前記薬剤感受性遺伝子（ｄｒｕｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇｇｅｎｅ）は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に転換させる酵素に対する遺伝子であって、遺伝子が移入された細胞が死滅することになるので、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）とも呼ばれる。即ち、正常細胞には毒性のない前駆体を全身に投与したとき、がん細胞にのみ前駆体が毒性代謝体（ｔｏｘｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）に切り換えられ、薬剤に対する感受性を変化させることによって、がん細胞を破壊させる方法である。代表的なものとして、ＨＳＶ−ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子とガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、大腸菌のシトシン脱アミノ酵素（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＣＤ）遺伝子と５−フルオロシトシン（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ、５−ＦＣ）が可能であるが、これに限定されない。
【００３５】
上記細胞死遺伝子（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）は、発現してプログラムされた細胞の消滅を誘導するヌクレオチド配列をいう。当業者に公知の細胞死遺伝子として、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５に由来）またはアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄに由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００３６】
上記細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現して細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン従属性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９）、成長中止特異性ホメオボックス（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ、ＧＡＸ）遺伝子（国際特許出願公開ＷＯ９７／１６４５９号及びＷＯ９６／３０３８５号）等がある。
【００３７】
上記細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現して毒性効果を示すヌクレオチド配列をいう。一例として、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素等をコードするヌクレオチド配列等がある。
【００３８】
上記腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現して腫瘍表現型を抑制することができるか、細胞死を誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α:  ＴＮＦ−α）、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ．  ａｌ  ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２９，  ６４２，  １９８７）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、腺腫瘍ポリープ症コイルタンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ.  米国特許公報ＵＳ５，７８３，６６６号）、欠損した結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ．  ａｌ.  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９５，  ３０４２−３０４７,  １９９８）、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子及びＶＨＬ遺伝子が含まれる。
【００３９】
前記抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現して免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列をいう。当業者に公知となった抗原性遺伝子の例には、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）及びｐ５３（Ｌｅｖｉｎｅ，  Ａ．，  国際特許出願公開ＷＯ９４／０２１６７号）が含まれる。
【００４０】
前記サイトカイン遺伝子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現してサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロンα、β、γ（インターフェロンα−２ｂ）及びインターフェロンα−２α−１のような融合体等が含まれる。
【００４１】
上記抗新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）は、発現して抗新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列をいう。その例として、アンギオスタチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチン等が含まれる。本発明のＰＥＰＣＫ_ＡＰＯ  ｉｎｔｒｏｎ−ｒｉｂｏｚｙｍｅ_ＨＳＶｔｋ配列は、配列番号２４で記載される塩基配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
また、本発明では、前記リボザイム活性を通じてがん特異遺伝子にレポーター遺伝子を接合することができる。このように特定組織でがん特異遺伝子に接合されたレポーター遺伝子は、プロモーターの転写活性によってレポータータンパク質として発現する。これにより、発現したレポータータンパク質の活性または量を測定することによってがん細胞を診断することができる。この時、レポーター遺伝子は、本発明の属する分野で公知となったものを使用することができ、好ましくは、ＬａｃＺ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ:  ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、レニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＳＥＡＰ）またはＨＳＶ−ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子を使用する。
【００４３】
このようなレポータータンパク質の活性は、下記のように当業者に公知となっている方法を用いて測定できる：ホタルルシフェラーゼ（ｄｅ  Ｗｅｔ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍｏｌ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.,  ７，  ７２５−７３７,  １９８７参照）、レニラルシフェラーゼ（[Ｌｏｒｅｎｚ  Ｗ．Ｗ.  ｅｔ  ａｌ.,  ＰＮＡＳ  ８８,  ４４３８−４２,  １９９１]参照）、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.,  ２,  １０４４−１０５１,  １９８２参照）、ＬａｃＺ（Ｈａｌｌ  Ｃ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ  .,  ２，１０１−１０９，  １９８３参照）、ヒト成長ホルモン（Ｓｅｌｄｅｎ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６，  ３１７３−３１７９，  １９８6参照）、緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６３，  ８０２−８０５，  １９９４参照）、及び分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ.,  Ｇｅｎｅ，  ６６，  １−１０，  １９８８参照）。また、チミジンキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をレポータータンパク質とした場合、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）イメージング法を用いることができる。
【００４４】
本発明の具体的な実施例において、本発明者は、組織特異的なプロモーター、このプロモーターと作動可能に連結されたがん特異的な遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子またはレポーター遺伝子及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１乃至ｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスを製造した（図１参照）。
【００４５】
また、エンハンサーの有無による治療遺伝子の効果を確認するために、エンハンサーを含まないｐＰＴ−Ｏ組換えアデノウイルス及びエンハンサーを含むｐＰＴ−Ｅ組換えアデノウイルスを製作し、Ｈｅｐ３Ｂ肝がん細胞株及びＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株にそれぞれ形質感染させ、ＧＣＶの吸収分析を行った結果、ＡｐｏＥエンハンサーを含まないｐＰＴ−Ｏ組換えアデノウイルスは、肝がん細胞株及び卵巣がん細胞株で有意な変化を示さない反面、ＡｐｏＥエンハンサーを含むｐＰＴ−Ｅ組換えアデノウイルスは、ＰＥＰＣＫ陽性肝がん細胞株で顕著なＨＳＶｔｋ活性を示したが、ＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株では、有意な変化を示さないことを確認した（図３参照）。
【００４６】
また、血清型３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフトを含むアデノウイルスの感染性を確認するために、図４の組換えアデノウイルスを製造し、Ｈｅｐ３Ｂ肝がん細胞株で定量的ＰＣＲを用いてアデノウイルスのゲノム数を測定した結果、本発明の血清型３５のファイバーノブと血清型５のシャフトを含むＡｄ５／３５ＣＭＶ．ＧＦＰは、Ａｄ５ＣＭＶ．ＧＦＰと比較して感染性が顕著に増加したことを確認した（図５及び６参照）。
【００４７】
さらに、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴの肝がん特異的な抗がん効果を確認するために、組換えアデノウイルスをＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株及びＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株に感染させた後、ＧＣＶを処置して細胞生存率を測定した結果、肝がん細胞株では死滅の程度が高かったが、卵巣がん細胞株では有意な細胞死を示さず、本発明の組換えアデノウイルスは肝がん特異的であることを確認した（図７参照）。
【００４８】
また、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴのトランススプライシング作用を確認するために、Ｈｅｐ３Ｂ肝がん細胞株及びＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株に感染させた後、ＲＮＡ分析を行い、その結果、本発明の組換えアデノウイルスは、肝がん細胞株でトランス−接合分子（ＴＳＭ、ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が生成したことを確認した（図８参照）。
【００４９】
さらに、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴの肝がん特異的な毒性効果を確認するために、肝がん細胞株、非-肝がん細胞株、肺がん細胞株及び大腸がん細胞株を用いて細胞死の効果を確認した結果、本発明の組換えアデノウイルスは肝がん細胞株でのみ有意な細胞死の効果を示すことを確認した（図９参照）。
【００５０】
また、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での肝がん特異的な標的化能力を確認するために、マウスに組換えアデノウイルスを投与し、造影剤をｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴを通じて検出した結果、陽性対照群では造影剤が広範囲に検出されたが、本発明の組換えアデノウイルスでは造影剤の吸収信号が肝で示さず、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子標的組織に対する高い特異性を示すことを確認した（図１０参照）。さらに、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴが肝がん−特異的によく感染されたかを確認するために、正常部位及び肝がん部位からそれぞれＲＮＡを分離してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った結果、肝がん組織で本発明の組換えアデノウイルス末端部位（ＩＴＲ）及び治療遺伝子（ＴＫ）が顕著に発現することを確認した（図１２参照）。
【００５１】
また、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安全性を分析するために、組換えアデノウイルスが処置されたマウスの生存プロット（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｌｏｔ）、肝機能評価及びＴＵＮＥＬ分析法を行った結果、本発明の組換えアデノウイルスが投与されたマウスは全て生存し、肝機能の低下が示さず、正常の肝細胞が病理学的に影響を受けないことを確認し、本発明の組換えアデノウイルスが顕著な安全性を示すことを確認した（図１３乃至１５参照）。
【００５２】
さらに、マトリゲル浸襲検定法及び免疫組織化学的分析法を用いて、腫瘍細胞浸襲におけるｈＴＥＲＴ除去の影響を確認した結果、リボザイム媒介のｈＴＥＲＴの除去が、がん転移または新生血管関連の経路の抑制を通じた生体内の抗がん作用を示すことを確認した（図１６及び図１７参照）。
【００５３】
また、本発明の組換えアデノウイルスＡｄ−ＰＲＴ生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗がん効能を分析するために、組換えアデノウイルス処置されたマウスのｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴ画像分析、組織分析及び腫瘍重量の分析を行った結果、本発明の組換えアデノウイルスは、肝がんに対して強い抗がん活性を示すことを確認した（図１８乃至２４参照）。
【００５４】
従って、本発明による組換えアデノウイルスは、生体内での顕著な安全性、標的組織に対する高い特異性及び顕著な抗がん効果を有するため、遺伝子治療療法で抗がん用薬学的組成物として有用に用いることができる。
【００５５】
また、本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを有効成分として含む肝がん治療用薬学的組成物を提供する。
【００５６】
本発明の抗がん用薬学的組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含めて薬剤学的組成物として好ましく製剤化できる。
【００５７】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、液相溶液に製剤化される組成物において許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適するものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤として製剤化でき、標的器官に特異的に作用できるように標的器官特異的な抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。
【００５８】
本発明の組成物に含まれる組換えアデノウイルスは、多様な腫瘍細胞に対して抗腫瘍効能を示すので、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に関する様々な疾病または疾患、例えば、脳がん、胃がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、肝がん、気管支がん、鼻咽喉がん、喉頭がん、食道がん、膵臓がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、結腸がん、骨がん、皮膚がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、尿管がん及び子宮頸部がん等の治療に用いることができる。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮下投与、または局部投与を用いて投与できるが、これに限定されるわけではない。例えば、卵巣がんで腹腔内に投与する場合及び肝がんで門脈に投与する場合には、注入方法で投与することができ、乳がん及び頭頸部がんの場合には腫瘤に直接注射して投与することができ、結腸がんの場合は浣腸に直接注射して投与することができ、膀胱がんの場合はカテーテル内に直接注射して投与することができる。
【００６０】
本発明の抗がん用薬学的組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節することができる。
【００６１】
しかし、好ましい効果のために、本発明の薬学的組成物は、一般的に、１×１０５〜１×１０１５ＰＦＵ／の組換えアデノウイルスを含み、通常、１×１０１０ＰＦＵを２日に一回ずつ５日間注射する。本発明の薬学的組成物は単独で、または外科的手術療法等の補助治療方法と並行して使用することができる。
【００６２】
本発明の組成物と共に使用できる化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）等を含む。発明の組成物と共に用いることができる放射療法は、Ｘ線照射及び線照射等である。好ましくは、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）と併用して使用する。
【００６３】
また、本発明は、組換えアデノウイルスを有効成分として含む肝がん診断用組成物を提供する。
【００６４】
さらに、本発明は、１）前記組換えアデノウイルスでがん細胞に導入する段階；及び２）がん細胞からレポータータンパク質を検出する段階を含む肝がん診断のための情報提供方法を提供する。
【００６５】
本発明の組換えアデノウイルスは、宿主細胞がレポータータンパク質を発現するようにするため、本発明の組換えアデノウイルスが導入されたがん細胞は、レポータータンパク質を示すことができ、このようなレポータータンパク質の検出は、前述した当業者に公知となった方法を使用することができる。
【００６６】
本発明により診断できるがんまたは腫瘍は、特に制限されず、好ましくは、胃がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、肝がん、気管支がん、鼻咽喉がん、喉頭がん、膵臓がん、膀胱がん、大腸がん、結腸がん、子宮頸部がん、脳がん、前立腺がん、骨がん、皮膚がん、甲状腺がん、副甲状腺がんまたは尿管がんがあり、最も好ましくは肝がんである。
【００６７】
以下、本発明を下記実施例及び実験例により詳しく説明する。
【００６８】
但し、下記実施例及び実験例は本発明を例示するだけであり、本発明の内容が下記実施例及び実験例により限定されるわけではない。
【実施例】
【００６９】
<実施例１>
組換えアデノウイルスの構築
本発明の組換えアデノウイルスを製作するために、リボザイムは公知の文献に記載の方法により製作した（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ.  Ｔｈｅｒ.  １２:８２４-８３４,  ２００５）。また、ＰＥＰＣＫ遺伝子のプロモーターは公知の文献に記載の方法により製作した（Ｋｗｏｎ,  Ｂ.Ｓ.  ｅｔ  ａｌ,  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８０，５０３３-５０４３、２００６）。また、ＰＥＰＣＫプロモーター、ＡｐｏＡ１（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ１）イントロン、リボザイム及びＨＳＶｔｋ遺伝子で構成されたＰＥＰＣＫ.Ｒｚ.ＨＳＶｔｋを含むｐｃＤＮＡ  ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター（ｐＰＥＰＣＫ.Ｒｚ.ＨＳＶｔｋ）は公知の文献に記載の方法により製作した（Ｓｏｎｇ  ＭＳ,  ｅｔ.  ａｌ.  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ２００９;１６:１１３-１２５.）。それから、前記ＰＥＰＣＫ.Ｒｚ.ＨＳＶｔｋを含むｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)）ベクター（ｐＰＥＰＣＫ.Ｒｚ.ＨＳＶｔｋ）からＰＥＰＣＫ.ＨＳＶｔｋをＳａｌＩとＳｍａＩ制限酵素で切って、予めＳａｌＩとＥｃｏＲＶ制限酵素で切っておいたｐＺＡＰ１．１ΔＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩベクター（ＯＤ２６０、Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）と連結し、ｐＺＡＰ１．１（ＰＥＰＣＫ.ＴＫ）を製作した。また、ｐＺＡＰ１．１ΔＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩベクターのＢｇｌＩＩとＮｏｔＩは、追ってｒｉｂｏｚｙｍｅを入れるべき制限酵素位の重複を避けようと予め除去した。その後、ｈＴＥＲＴを認知するｒｉｂｏｚｙｍｅ配列を下記プライマーを用いてＣＭＶ−Ｒｉｂｏ−ＴＫ  ｖｅｃｔｏｒ（檀国大学校のイ・ソンウック教授から収得）から増幅した後、前記製作したｐＺＡＰ１．１（ＰＥＰＣＫ−ＴＫ）ｖｅｃｔｏｒ（ＢｇｌＩＩ  ＮｏｔＩ(ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  Ｋｌｅｎｏｗ)）を増幅したｒｉｂｏｚｙｍｅ配列と（ＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ処理）と共に結合してｐＺＡＰ１．１（ＰＥＰＣＫ.Ｒｚ／Ａｓ.ＴＫ）を製作した。
【００７０】
2016505245.tif 000003
【００７１】
その後、前記製作したｐＺＡＰ１．１（ＰＥＰＣＫ.Ｒｚ／Ａｓ.ＴＫ）にｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌ（配列番号：５）とｅｎｈａｎｃｅｒ（配列番号：６）を結合し、ｐＺＡＰ１．１（ＰＥＰＣＫ.Ｒｚ／Ａｓ.ＴＫ）の最終のフォーム（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｏｒｍ）を製作した。また、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４の遺伝子が欠損は公知の方法を用いた（Ｙｅｈ  Ｐ,  Ｄｅｄｉｅｕ  ＪＦ,  ｅｔ.  ａｌ.  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ.  １９９６  Ｊａｎ;７０(１):５５９−６５）。それから、公知の方法（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ  ＤＭ,  ｅｔ.  ａｌ.  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ.  ２０００  Ｎｏｖ;７４(２２):１０２７４−８６）を用いてｐＡｄ３６３（ＯＤ２６０）でファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）部分を血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブで置換してｐＡｄ３６３．３５ｆｋを製作した後、前記製作したｐＺＡＰ１．１（ＰＥＰＣＫ.Ｒｚ／Ａｓ.ＴＫ）の最終のフォームをＳｆｉＩで切断させて連結させ、最終の組換えアデノウイルスベクターを製作した後、ＨＥＫ２９３細胞で増幅した（図１）。
【００７２】
<実施例２>
細胞培養
本発明で使用した全てのヒトがん細胞及びヒト乳腺上皮細胞株（ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；ＨＭＥＣ）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で購入した。
【００７３】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＨＭＥＣｓは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｐ／Ｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、前記細胞株は全て３７℃及び５％の二酸化炭素の条件を有する培養基で培養された後、下記実験に使用した。
【００７４】
<実験例１＞エンハンサーの有無による治療遺伝子の効果確認
ＡｐｏＥエンハンサーの存在によるＰＥＰＣＫに誘導されたＨＳＶｔｋ活性を確認するために、前記<実施例１>と同じ方法で組織特異的なプロモーターＰＥＰＣＫとＨＳＶｔｋを含むｐＰＥＰＣＫ−ＨＳＶｔｋ（ｐＰＴ−Ｏ）、及びＰＥＰＣＫ、ＨＳＶｔｋ並びにＡｐｏＥエンハンサーを含むｐＰＥＰＣＫ−ＨＳＶｔｋ−Ｅｎｈ（ｐＰＴ−Ｅ）組換えアデノウイルスを製作した（図２）。それから、２４ウェルプレートで前記それぞれの組換えアデノウイルス１  ＭＯＩをＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株及びＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株にそれぞれ感染させた後、４８時間後、前記感染された細胞に１．０  ｍＣｉ／ｍｌ[８−３Ｈ]ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＰＣＶ）処理及び非処理した後、３７℃で２時間培養した後、前記細胞を０．１％ＳＤＳ２００ｍｌに溶解させた後、放射能を測定した。
【００７５】
その結果、図３に示すように、ＡｐｏＥエンハンサーを含まないｐＰＴ−Ｏ組換えアデノウイルスは、肝がん細胞株及び卵巣がん細胞株で有意な変化を示さない反面、ＡｐｏＥエンハンサーを含むｐＰＴ−Ｅ組換えアデノウイルスは、ＰＥＰＣＫ陽性肝がん細胞株で顕著なＨＳＶｔｋ活性を示したが、ＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株では有意な変化を示さないことを確認した（図３）。
【００７６】
<実験例２>血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含むアデノウイルスの感染性確認
血清型３５のファイバーノブと血清型５のシャフトを含む組換えアデノウイルスの感染性を確認するために、ＣＭＶプロモーター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＣ）を含み、Ｅ１及びＥ３遺伝子が欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ５ＣＭＢ.ＧＦＰ）を製作した。また、ＣＭＶプロモーター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＣ）及び血清型３５のファイバーノブと血清型５のシャフトを含み、Ｅ１及びＥ３遺伝子が欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ５／３５ＣＭＶ.ＧＦＰ）を製作した（図４）。それから、前記それぞれの組換えアデノウイルスをＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株に感染させた後、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）及び顕微鏡観察を通じてＧＦＰ−陽性の細胞数を確認した。さらに、前記Ａｄ５ＣＭＶ.ＧＦＰ及びＡｄ５／３５ＣＭＶ.ＧＦＰに感染されたＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株で定量的−ＰＣＲを用いたアデノウイルスのゲノムの複製数を測定した。
【００７７】
具体的には、ＤＮＡはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ抽出した後、６０ｕｌｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶かした後、前記ＤＮＡ濃度をｎａｎｏ−ｄｒｏｐを用いて測定した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は１０  ｍｌ  ２  Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ  ＩＮＣ社、日本）、２００  ｎＭ標的プライマーセット（ＡｄＩＴＲ−Ｆ:  ５’−ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＧＴＧ−３'（配列番号：９）、ＡｄＩＴＲ−Ｒ:  ５’−ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  Ａ−３'（配列番号：１０））及び０．４  ｍｌ  ５０  Ｘ  ＲＯＸ  参考染色剤を含む２０  ｍｌの総ボリュームに５０  ｎｇゲノムＤＮＡを使用して行った。ＰＣＲ条件はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を使用して９５℃で３０秒及び６０℃で１分の条件で４０サイクルである。
【００７８】
ベータ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）の増幅は、関心のある遺伝子を持って並行して行い、−[Ｃｔ標的Ｃｔβアクチン]のように定義されたＣｔによる標的タンパク質発現の相対量を分析した。標準曲線はアデノウイルスの粒子１０１から１０９の範囲で決定した。各分析は鋳型を含めていない対照群を含む。全ての測定は３回繰り返して行った。５％以上の多様性の係数を有するサンプルは再試験した。
【００７９】
その結果、図５及び図６に示すように、本発明の血清型３５のファイバーノブと血清型５のシャフトを含むＡｄ５／３５ＣＭＶ.ＧＦＰは、Ａｄ５ＣＭＶ.ＧＦＰと比較し、感染性が顕著に増加したことを確認した（図５及び図６）。
【００８０】
<実験例３>組換えアデノウイルスの肝がん特異的な効果確認
がん組織特異的なＰＥＰＣＫプロモーターとｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｓｎｃｒｉｐｔａｓｅ）を標的するリボザイム及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブと血清型５のシャフトを含む組換えアデノウイルスの肝がん特異的な抗がん効果を確認するために、Ａｄ−ＰＲＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−Ｍｏｃｋを多様な感染多重度（ＭＯＩ:ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）でＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株及びＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株に感染させた後、１００μｍのガンシクロビル（ＧＣＶ）を処置した。それから、前記処置後、５日目に生きている細胞の比率を確認するため、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）分析を実施した。
【００８１】
具体的には、クリスタルバイオレット分析は、細胞株の培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）を除去してＰＢＳで二回洗い、２．３％クリスタルバイオレット溶液を入れて１０分間反応させた後にＰＢＳで洗った後、１００％ＭｅＯＨで細胞を固定した後に行った。
【００８２】
その結果、図７に示すように、肝がん細胞株であるＨｅｐ３ＢではＡｄ−Ｍｏｃｋに比べＡｄ−ＰＲＴ及びＡｄ−Ｔｄに感染させた細胞で死滅の程度が高いことを確認し、卵巣がん細胞株であるＳＫＯＶ３ではＡｄ−ＰＲＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＭＯＣＫの全てで有意な細胞死を示さないので、本発明のＡｄ−ＰＲＴは肝がん特異的であることを確認した（図７)。
【００８３】
<実験例４>Ａｄ−ＰＲＴのトランススプライシング作用の確認
前記<実施例１＞で製作したＡｄ−ＰＲＴのトランススプライシング作用を確認するために、Ａｄ−ＰＲＴ及びＡｄ−Ｍｏｃｋをそれぞれ０、１、５及び１０ＭＯＩでＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞株及びＳＫ−ＯＶ３卵巣がん細胞株に感染させた後、ＲＮＡ分析を行った。
【００８４】
具体的には、組換えアデノウイルスが処理された細胞のリボザイムＲＮＡの水準を分析するために、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）溶液を用いて全体のＲＮＡ５を抽出した後、１０ｍＭ  Ｌ−アルギニンアミドとオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写した。相補的ＤＮＡはＨＳＶｔｋ特異的なプライマー（５’-ＧＣＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡ-３'（配列番号：１１）及び５’-ＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣ-３'（配列番号：１２））を用いて増幅させた。また、検証のためにＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（５’-ＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡ-３'（配列番号：１３）及び５'-ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ-３'（配列番号：１４））を用いて相補的ＤＮＡを増幅させた。細胞内でのトランス−接合ＲＮＡの産出物を確認するために、全体のＲＮＡでＨＳＶｔｋ特異的なプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴ−３'（配列番号：１５））を用いて１０ｍＭ  Ｌ−アルギニンアミドの存在下で逆転写反応を行い、その結果物を鋳型にしてｈＴＥＲＴ  ＲＮＡの５’末端の特異的な５’プライマー（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴ−３'（配列番号：１６））とＨＳＶ−ｔｋの３’末端の塩基配列に特異的な３’プライマー（５’−ＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＡＡ−３'（配列番号：１７））を持って相補的ＤＮＡを増幅させた。この相補的ＤＮＡを鋳型として再度トランス−接合の結合部位の特異的な５’プライマー（５’−ＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＡＡＡＡＣ−３'（配列番号：１８））とＨＳＶｔｋの塩基配列の特異的なネステッド３’プライマー（５’−ＣＡＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴ−３'（配列番号：１９））を用いて、増幅、クローニング及び塩基配列の分析を行った。
【００８５】
その結果、図８に示すように、Ａｄ−ＰＲＴ組換えアデノウイルスに感染されたｈＴＥＲＴ＋Ｈｅｐ３Ｂ細胞では、トランス−接合分子（ＴＳＭ、ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が生成されたが、ｈＴＥＲＴ−ＳＫＯＶ３細胞ではＴＳＭが生成されないことを確認した。従って、Ａｄ−ＰＲＴに感染されたＨｅｐ３Ｂ細胞のトランス−接合分子（ＴＳＭ）は標的ｈＴＥＲＴ  ＲＮＡの肝特異的トランス−接合反応から生成されたことを確認した（図８）。
【００８６】
<実験例５>Ａｄ−ＰＲＴの肝がん特異的な毒性確認
Ａｄ−ＰＲＴの肝がん特異的な毒性の効果を確認するために、前記<実施例２>で培養したＰＥＰＣＫ−陽性及びｈＴＥＲＴ−陽性の肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ３９８及びＳＮＵ７３９）、及びＰＥＰＣＫ−陰性並びにｈＴＥＲＴ−陰性の非肝がん細胞株（ヒト上皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ;  ＨＤＦ）、肺がん細胞株（ＳＢＣ−５）及び大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６））にＡｄ−ＰＲＴ  １０ＭＯＩを処理した後、前記<実験例３>と同じ方法で細胞死の効果を確認した。
【００８７】
その結果、図９に示すように、Ａｄ−ＰＲＴは非肝がん細胞株では有意な反応を示さないが、肝がん細胞株では顕著な細胞死の効果を示すことを確認した。従って、本発明のＡｄ−ＰＲＴは肝がん特異的な毒性の効果を示すことが確認された（図９）。
【００８８】
<実験例６>生体内（In  ｖｉｖｏ）Ａｄ−ＰＲＴの肝がん−特異的な標的化能力の確認
<６−１>実験動物
実験動物として４〜５週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ−ヌードマウス（オリエントバイオ、韓国）を使用した。実験動物は、無病菌の条件で飼育され、使用前に最小１週間実験室環境に馴化し、ＡＡＡＬＡＣの国際動物管理規定（ＡＡＡＬＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｐｏｌｉｃｙ）による国立がんセンターの動物管理センターで飼育された（ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ  ｕｎｉｔＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ:  ｕｎｉｔ  ｎｕｍｂｅｒ−１３９２）。
【００８９】
<６−２>Ａｄ−ＰＲＴの肝がん−特異的な標的化能力の確認
生体内Ａｄ−ＰＲＴの肝がん−特異的な標的化能力を確認するために、本発明の組換えウイルスをがんを有していない前記<６−１>マウスに前記Ａｄ−ＰＲＴを全身に投与し、正常の肝への感染の可否を[１８Ｆ]ＦＨＢＧ（９−（４−[１８Ｆ]ｆｌｕｏｒｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌｇｕａｎｉｎｅ）造影剤を用いてｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴを通じて確認した。
【００９０】
具体的には、本発明の組換えウイルスが感染された肝で組換えアデノウイルスに媒介したＴＫ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子が発現すると、[１８Ｆ]ＦＨＢＧ造影剤が組換えアデノウイルスに感染した細胞に吸収され、ｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴを使用して検出を行った。ここに、前記<実施例１>で製造したＡｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ＣＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＰＲＴをそれぞれ５×１０８ｐｆｕで非がん誘発マウス尾静脈を通じて全身に注入し、注入２日後にｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴを使用して確認した。
【００９１】
また、ＰＥＴを使用してＨＳＶｔｋの発現を検出するために、Ａｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ＣＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＰＲＴが注入されたヌードマウスを１００％酸素中で２％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて麻酔し、少なくとも６時間節食した後、麻酔されている間１８Ｆ-ＦＨＢＧ（１４．８  ＭＢｑ）を尾静脈を通じて注入した。[１８Ｆ]ＦＨＢＧ（９−（４−[１８Ｆ]ｆｌｕｏｒｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌｇｕａｎｉｎｅ）はＰＥＴを使用してＨＳＶｔｋの発現を検出するために用いた。
【００９２】
ＰＥＴ−ＣＴの混合画像は、ＣＴ（６分間３００μ  Ａ及び４０ｋＶ;  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＝２００;  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ＝３６０）のためのＸ線の条件下で、三次元の資料収集モード（ＧＥ社、米国）を行った。画像は[数式１]を用いて標準化吸収値（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｖａｌｕｅｓ;  ＳＵＶ）に平準化した。
【００９３】
ＳＵＶ＝減衰補正平均組織活動濃度（ｄｅｃａｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｍｅａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（Ｂｑ／ｍｌ）／（投与量（Ｂｑ）×  体重（ｇ））
【００９４】
全てのＭＲＩ画像は７Ｔバイオスペック分光計（Ｂｉｏｓｐｅｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（Ｂｒｕｋｅｒ社、ドイツ）を用いて確認した。Ｔ２重量的高速回転共鳴パルス（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｆａｓｔ  ｓｐｉｎ  ｅｃｈｏ  ｐｕｌｓｅ）配列は、下記のような設定で記録した：
【００９５】
繰り返し時間（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ；ＴＲ）＝２，５００ｍｓ；エコー時間（ｅｃｈｏ  ｔｉｍｅ;  ＴＥ）＝３０ｍｓ；２５６＊２５６ｍａｔｒｉｘ；可視領域（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ;  ＦＯＶ）＝３＊３ｃｍ；スライス厚（ｓｌｉｃｅ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）＝０．７ｍｍ；平均数（ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｖｅｒａｇｅ）＝２；ＲＡＲＥ  ｆａｃｔｏｒ＝４
【００９６】
ＰＥＴ／ＭＲの混成実験のために、ＭＲＩ画像処理を一般的な土台（ｂｅｄ）を使用してＰＥＴ−ＣＴスキャン後に行った。ＰＥＴ／ＭＲの画像混成処理は、ＯｓｉｒｉＸの画像ソフトウェアを使用して行った。
【００９７】
その結果、図１０に示すように、ＨＳＶｔｋ遺伝子の発現と連関した[１８Ｆ]ＦＨＢＧの分布は、Ａｄ−ＰＴおよびＡｄ−ＣＴの投与時、肝で広範囲に示された反面、Ａｄ−ＰＲＴの投与群は、Ａｄ−ＰＲＴの肝に対する強い内在性方向性にもかかわらず、[１８Ｆ]ＦＨＢＧの吸収信号が肝で示されないことを確認した（図１０）。従って、本発明のＡｄ−ＰＲＴはリボザイムと組織特異的なプロモーターＰＥＰＣＫの二重調節を通じ、遺伝子標的組織に対する高い特異性を示すことを確認した。
【００９８】
<実験例７>がん誘発のマウスでＡｄ−ＰＲＴの肝がん−特異的な標的化能力の確認
がん誘発のマウスでＡｄ−ＰＲＴの肝がん−特異的な標的化能力を確認するために、Ａｄ−ＰＲＴ及びＡｄ−Ｍｏｃｋのそれぞれをマウスに全身に投与し、がん細胞に感染可否を[１８Ｆ]ＦＨＢＧ造影剤を用いたｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＭＲを通じて確認した。
【００９９】
具体的には、マウスの脾臓（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｅｎ）を通じて肝がん細胞株であるＨｅｐ３Ｂ細胞を注入した後、３週間後にＡｄ−ＰＲＴ及びＡｄ−Ｍｏｃｋをそれぞれ５×１０８ｐｆｕでマウスの尾静脈を通じて全身に注入し、ｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＭＲの混成実験を用いてＨＳＶｔｋの発現を確認した。また、肝がん成長の確認は、１８Ｆ−ＦＤＧ（１４．８  ＭＢｑ）を使用してＰＥＴ画像化を行い、ＭＲＩ画像はＰＥＴ−ＣＴスキャンで行い、ＰＥＴ／ＭＲの画像混成処理は、ＯｓｉｒｉＸの画像ソフトウェアを使用して行った。
【０１００】
さらに、本発明の組換えアデノウイルスが感染されたかを確認するために、前記マウスの正常部位（ｎｏｒｍａｌ；Ｎ）と肝がん部位（ｔｕｍｏｒ；Ｔ）からそれぞれＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲ分析法を行った。
【０１０１】
具体的には、Ａｄ−ＰＲＴによるＴＳＭの生産は、内包的（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴＰＣＲを使用して調査した。第一のＰＣＲは、トランススプライシング反応の結合部位のための特異的な５’プライマー（５’−ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  Ｔ−３’（配列  番号：２０））及びＨＳＶｔｋのための３’プライマー（５’ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＡＡ−３’（配列番号：２１））を使用して行った。第二のＰＣＲは、ＨＳＶｔｋの内部配列のためのプライマー（正方向５‘−ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ−３’（配列番号：２２）及び逆方向５’−ＧＣＡ  ＧＴＴＧＣＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＴＴ−３’（配列番号：２３））を使用して行った。
【０１０２】
その結果、図１１及び図１２に示すように、肝がん細胞株により誘発される腫瘍領域でＡｄ−ＰＲＴによる信号が検出（白色矢印）され、これは、本発明の組換えアデノウイルスが非常に優れた肝がん標的化を形成することができることを確認し（図１１）、また、Ａｄ−ＰＲＴが感染された肝がん組織（Ｔ）でアデノウイルス末端部位（ＩＴＲ）及び治療遺伝子（ＴＫ）が顕著に発現することを確認した（図１２）。
【０１０３】
<実験例８>生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＡｄ−ＰＲＴの安全性の分析
<８−１>生体内実験のためのマウスモデルの製造及びウイルスの投与
ヒト肝細胞がん腫（ＨＣＣ）を模倣した多発性マウス肝がんモデルは、Ｂａｌｂ／ｃ−ヌードマウス（オリエントバイオ社、韓国）にＨｅｐ３Ｂ  ３×１０６の細胞を脾臓内に投与して製造した。前記動物は、ＡＡＡＬＡＣの国際動物管理規定（ＡＡＡＬＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｐｏｌｉｃｙ；公認規格（ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ  ｕｎｉｔ）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ:  ユニットナンバー（ｕｎｉｔ  ｎｕｍｂｅｒ）−１３９２）を遵守する国立がんセンターの動物管理センターで飼育された。殆ど全てのマウスはＨｅｐ３Ｂ細胞投与の１２または１４日後に肝で、特に肝の境界部位で肉眼検査によって容易に検出される多発性小型腫瘍結節を確認した。さらに、マウスの殆どで脾臓腫瘍結節も示されたことを確認した。
【０１０４】
<８−２>生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＡｄ−ＰＲＴの安全性の分析
本発明者は、Ａｄ−ＰＲＴの安全性を評価するために、前記<８−１>で製造した腫瘍が形成されたマウス（ｎ＝１０）に組換えアデノウイルス５×１０８ｐｆｕを静脈内に投与し、ＧＣＶを１４日間処理した。
【０１０５】
具体的には、それぞれＡｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ＣＲＴ、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＰＲＴで処置された群の生存プロット（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｌｏｔｓ）をカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）方法を用いて評価し、マウスの肝機能は、血清ＡＬＴ及びＡＳＴを用いて測定した。
【０１０６】
また、肝特異的な酵素数値（ＡＬＴ及びＡＳＴ）は、ＧＣＶ処置の後、３日及び６日にＵＶ分光計を用いて測定し、代表的に多数のがん組織（ｎ＝６／ｇｒｏｕｐ）でＨ＆Ｅ染色をし、組織学的観察を行い、細胞死の評価をＴＵＮＥＬ法を用いて行った。
【０１０７】
ＴＵＮＥＬ分析法は、Ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ）を用いて製造社の指示に従って行った。
【０１０８】
その結果、図１３に示すように、Ａｄ−ＰＴを投与したマウスは約１０日まで生存した反面、Ａｄ−Ｍｏｃｋ及びＡｄ−ＰＲＴ群では全てのマウスが生存することを確認した（図１３）。また、Ａｄ−ＰＴ群では肝特異的な酵素ＡＬＴおよびＡＳＴの量は非常に高いのに対して、Ａｄ−ＰＲＴ及びＡｄ−Ｍｏｃｋ群では変化せず、特に６日目にも変化しなかった（図１４）。さらに、ＣＭＶプロモーターがＰＥＰＣＫの代わりにＲｚ−ＨＳＶｔｋを調節するＡｄ−ＣＲＴは、Ａｄ−ＰＴと類似に強い毒性を示すことを確認した（図１３）。
【０１０９】
従って、本発明のＡｄ−ＰＲＴは、Ａｄ−ＰＴ及びＡｄ−ＣＲＴに比べ顕著な安全性を示すことを確認した。
【０１１０】
また、図１５に示すように、本発明者は組織学的検査でＡｄ−ＰＲＴ及びＡｄ−Ｍｏｃｋ群で正常の肝細胞が病理学的に影響を受けないことを確認した（図１５）。具体的には、ＴＵＮＥＬ分析を用いて、Ａｄ−ＰＲＴ処理群の腫瘍結節で自己細胞死の特徴（例えば、暗褐色の点）が顕著に示されることを確認した。これと対照的に、Ａｄ−ＰＴ処理群のマウス間では、肝細胞のびまん性浮腫、斑点性壊死（ｓｐｏｔｔｙ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）及び死滅が示され、６日目にはさらに広範囲に拡張した（図１５）。自己細胞死の特徴は、Ａｄ−ＰＴ群で腫瘍性肝細胞および非腫瘍性肝細胞で著しく観察された。Ａｄ−ＰＴ群で腫瘍結節の自己細胞死の頻度は、Ａｄ−ＰＲＴ群よりもさらに少なかった。このような結果は、肝特異的プロモーターＰＥＰＣＫの導入が、Ｒｚ−媒介の標的化において付加的な安全性を提供し、Ａｄ−ＰＲＴが非腫瘍性肝細胞を損傷させず、特異的にＨＣＣを標的化することができることを確認した。
【０１１１】
<実験例９>生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＡｄ−ＰＲＴの治療的効能の分析
<９−１>腫瘍細胞の侵襲におけるｈＴＥＲＴ除去の影響
本発明者は、腫瘍細胞の侵襲において、リボザイムによるｈＴＥＲＴ除去の影響を確認するために、ＧＣＶ処置されないアデノウイルス−処置細胞でマトリゲル侵襲検定法（ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。
【０１１２】
具体的には、ウイルス感染４日後、２４−ウェルプレートでマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国）でコーティングされたポリカーボネートフィルタ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｆｉｌｔｅｒｓ）（６．５−ｍｍ直径、８．０ｍｍ孔サイズ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国）の上層チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒｓ）にＨｅｐ３Ｂ細胞（５×１０５）をプレーティングさせ、２４時間培養した。侵襲細胞はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色キット（Ｓｙｓｍｅｘ社、米国）を使用して固定化及び染色され、位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して画像化して計算した。各膜フィルタに５箇所の無作為に選別した領域を定量した。また、免疫組織化学的分析法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ）は、４−μｍ  から６−μｍ−厚みのパラフィンに浸した肝サンプルを半自動免疫染色システム（Ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ社、スイス）を使用して製造社の指示に従って行った。サンプルは、一次抗体（抗−ＶＥＧＦ−Ｃ；  １：５０、抗−ＣＤ３４；  １：２００、ＡＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で処置され、免疫染色はジアミノベンジジン（３，３‘−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質システムを使用して行った。スライドは青く染色されるヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を持って交差染色を行った。
【０１１３】
その結果、図１６に示したように、肝がん細胞侵襲特性の強い抑制は、非処理群またはＡｄ−ＭＯＣＫ及びＡｄ−ＰＴ感染群と異なり、Ａｄ−ＰＲＴ処理群で観察された（図１６）。
【０１１４】
また、図１７に示すように、Ａｄ−Ｍｏｃｋ感染群で肝がん細胞はＶＥＧＦが強く染色されたが、ＶＥＧＦの発現はＡｄ−ＰＲＴ群で急減に減少したことを確認した。さらに、ＣＤ３４免疫染色法に示されたように、腫瘍部位で血管の形成がＡｄ−Ｍｏｃｋに比べＡｄ−ＰＲＴ群でほぼ完全に抑制されたことを確認した（図１７）。
【０１１５】
従って、リボザイム（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）媒介のｈＴＥＲＴの除去が、がん転移または新生血管関連の経路の抑制を通じた生体内の抗がん作用を示すことが確認された。
【０１１６】
<９−２>肝細胞がん腫マウスモデルでのＡｄ−ＰＲＴの抗−ＨＣＣ効果の分析
本発明者は、肝細胞がん腫マウスモデルでＡｄ−ＰＲＴの抗−ＨＣＣの効果を分析するために、無作為にＡｄ−ＰＲＴ（２０匹）群及びＡｄ−Ｍｏｃｋ（１０匹）群に分けて、３０匹のヌードマウスにＨｅｐ３Ｂ細胞株を投与した。Ａｄ−ＰＲＴの静脈投与後、１４日目に生体内の画像（ｎ＝１０）及び生検（ｎ＝３０）を用いてモニタリングした。
【０１１７】
具体的には、抗−ＨＣＣの効果を測定するために、ＧＣＶ処理した後、１４日目に安楽死させ、全ての肝葉を除去して測定し、写真撮影をし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために順次に切片化した。腫瘍部位（ｔｕｍｏｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、アペリオのイメージスコープ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｉｍａｇｅｓｃｏｐｅ）ｖ１０．２．２．２３１９ソフトウェアを使用して数値化し、腫瘍の重量は腫瘍部位の数値と肝の重量を掛け合わせて計算した。
【０１１８】
腫瘍成長のモニタのために使用したＰＥＴの画像化は、前記実施例<６−２>と同じ方法で行った。
【０１１９】
モニタリングの後、二つの群の動物を全て安楽死させ、該当動物の肝を生体内画像のモニタリングの結果と組織の病理学的所見が一致するかを確認するために検査した。
【０１２０】
本発明者は、全ての動物を１４日目マイクロ−ＰＥＴ／ＣＴを使用して画像化し、二つの互いに異なる処理において、ＦＤＧの脾臓の吸収に基づいて類似する腫瘍開始の段階を有する二つの群にマウスを無作為に分けた（図１８）。
【０１２１】
その結果、図１９及び２０に示すように、Ａｄ−ＰＲＴ処理群（ｎ＝５）のＳＵＶの最大値は２．５１３２±０．１９４であり、Ａｄ−Ｍｏｃｋ処理群は２．６９１６±０．５６１であった。アデノウイルスとＧＣＶ処理後１４日目、Ａｄ−Ｍｏｃｋ処理の動物は処置前よりも２乃至４倍のさらに強い肝での[１８Ｆ]ＦＤＧ  ＰＥＴ信号を示した。これに対して、Ａｄ−ＰＲＴ処理されたマウスは、Ａｄ−Ｍｏｃｋ処理（肝で、２．１９５±０．４５９  ｖｓ．  ３．８５０±０．５６４、ｐ＝０．００５３１）と比較し、有意に弱い信号を示した（図２１）。
【０１２２】
従って、肝と脾臓でＡｄ−ＰＲＴから発現したＨＳＶｔｋがＨｅｐ３Ｂ肝がん細胞死を触発させることを確認した。
【０１２３】
また、肝の状態が生体内画像のモニタリングの結果と組織学的所見が一致するか確認した結果、図２０及び２２（ＰＥＴ画像）及び図２３（組織写真）に示されるように、Ａｄ−ＭＯＣＫ群は注目すべき腹部膨張を示した。対照群の動物の肝は肝細胞がん腫（ＨＣＣ）により殆ど侵襲した反面、Ａｄ−ＰＲＴ群の動物の肝は、ＰＥＴ画像の結果から示されるように、時々分散し、小さくて薄いピンク色の腫瘍結節が示された。さらに、本発明者は、Ａｄ−Ｍｏｃｋ群の動物で急速な腫瘍成長と腫瘍塞栓を起こす均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）好酸性細胞の多発性浸潤（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を観察できたが、Ａｄ−ＰＲＴ群では観察できなかった（図２３）。
【０１２４】
また、腫瘍部位の数値と肝の重量を掛け合わせて計算された腫瘍の重量は対照群では４．６０±１．１１であり、Ａｄ−ＰＲＴ群は０．４９±０．６２で、非常に有意な差を示した（ｐ＝  ０．００２５４）（図２４）。従って、Ａｄ−ＰＲＴは肝がんに対する強い抗がん活性を示すことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の肝組織特異的なＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒ  ｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター；前記プロモーターと作動可能に連結されたがん特異的な遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）；前記リボザイム３’エクソンに連結された治療遺伝子又はレポーター遺伝子、及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）と血清型５のシャフト（ｓｈａｆｔ）を含み、アデノウイルスＥ１、Ｅ３及びＥ４  ｏｒｆ１からｏｒｆ４遺伝子が欠損した組換えアデノウイルスは、生体内での顕著な安全性、標的組織に対する高い特異性及び顕著な抗がん効果を示すので、遺伝子伝達ベクターとして抗がん剤またはがん診断剤として有用に使用されることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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