(57)【要約】  本発明は、広くは胎児における神経管欠損症の検出及び治療のための組成物、試薬及び方法に関する。本発明の一態様は、ノギン又はLDN-193189を含有する組成物を子宮内の胎児に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、母親の血液又は羊水に含まれるBMP4の量が上昇した場合、及び／又はノギンの量が減少した場合に組成物を投与する。本発明の別の態様において、本方法は、GDC-0449を含有する組成物を子宮内の胎児に投与することを含む。特定の実施形態において、母親の血液又は羊水に含まれるソニック・ヘッジホッグの量が上昇した場合にGDC-0449を投与する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノギン（noggin）又はLDN-193189を含有する組成物を子宮内投与することを含む、胎児における神経管欠損症の治療方法。
【請求項２】
胎児の母体から採取したサンプル中における骨形成タンパク質4（BMP4）の量を測定することを更に含み、該サンプルが含むBMP4量が上昇している場合に上記組成物を投与する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記サンプルが血液サンプル又は羊水サンプルである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
神経管欠損症が開放性神経管であり、組成物を神経管に局所的に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
組成物を子宮内注入する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
神経管欠損症が葉酸応答性の神経管欠損症である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
更に
胎児の母体から採取した羊水から胚性幹細胞を単離し；そして
該幹細胞中のH3K4メチル化、H3K27メチル化、H3K9アセチル化、H3K18アセチル化、及びGcn5の少なくとも1つのレベルを測定する
ことを含み、幹細胞がH3K4メチル化及びH3K27メチル化の少なくとも一方のレベルの上昇、又はH3K9アセチル化、H3K18アセチル化、及びGcn5の少なくとも1つのレベルの低下を示した場合に上記組成物を投与する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記幹細胞におけるH3K27メチル化のレベルの測定が、上記幹細胞を、K27におけるジメチル化ヒストンH3及びK27におけるトリメチル化ヒストンH3の少なくとも一方に対する抗体と接触させることを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記幹細胞におけるオクタマー結合転写因子4（Oct4）の存在又は不存在を決定することを更に含み、Oct4の存在又は不存在の決定が上記幹細胞をOct4に対する抗体と接触させることを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
Oct4が幹細胞中に存在し、幹細胞がH3K4メチル化及びH3K27メチル化の少なくとも一方のレベルの上昇、又はH3K9アセチル化、H3K18アセチル化、KDM6B及びGcn5の少なくとも1つのレベルの低下を示した場合に上記組成物を投与する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
GDC-0449を含有する組成物を子宮内投与することを含む、胎児における神経管欠損症の治療方法。
【請求項１２】
胎児の母体から採取したサンプル中のソニック・ヘッジホッグ（Shh）の量を測定することを更に含み、サンプルが含むソニック・ヘッジホッグ（Shh）の量が増大している場合に上記組成物を投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記サンプルが血液サンプル又は羊水サンプルである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
神経管欠損症が開放性神経管であり、組成物を神経管に局所的に投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
神経管欠損症が葉酸非応答性の神経管欠損症である、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
更に
胎児の母体から採取した羊水から胚性幹細胞を単離し；そして
該幹細胞中のH3K9アセチル化、H3K18アセチル化、及びGcn5の少なくとも1つのレベルを測定する
ことを含み、幹細胞がH3K9アセチル化、H3K18アセチル化、及びGcn5の少なくとも1つのレベルの上昇を示した場合に上記組成物を投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
上記幹細胞におけるH3K9アセチル化のレベルの測定が、上記幹細胞をH3K9Acに対する抗体と接触させることを含み、上記幹細胞におけるH3K18アセチル化のレベルの測定が、上記幹細胞をH3K18Acに対する抗体と接触させることを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記幹細胞におけるオクタマー結合転写因子4（Oct4）の存在又は不存在を決定することを更に含み、Oct4の決定が上記幹細胞をOct4に対する抗体と接触させることを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
Oct4が幹細胞中に存在し、幹細胞がH3K9アセチル化、H3K18アセチル化、及びGcn5の少なくとも1つのレベルの上昇を示した場合に上記組成物を投与する、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、2013年7月18日に出願された米国仮特許出願第61/847,662号に基づく優先権を主張するものであり、上記出願の開示全体を参照により本明細書に組み入れる。
技術分野
本発明は、広くは神経管欠損症を検出及び治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄髄膜瘤（MM）、無脳症、全前脳症、及び脳ヘルニア等の神経管欠損症（NTD）は、比較的よく見られ、有病率は合計して妊娠全体の約1/1000である。米国では、二分脊椎で出生する乳児の90％以上が様々なレベルの感覚消失及びまひを有しながら最初の1年を生き延びる。MMで生まれた子供の少なくとも75％は若年成人期に達すると予想できるが、その後悪化することが一般的である。NTDが検出された場合、母親及び子供の双方のために十分な情報を得た上での決断ができるように、できるだけ多くの情報を将来の（両）親に提供することが不可欠である。NTDを予測することは困難であり、出産前スクリーニング及び診断は変動しがちである。妊娠中期のNTDの超音波診断は正確であり、また妊娠11-13週での異数性及びNTDの検出は改善されつつあるが、結果の予測が高い信頼できる早期の検出、及び最終的には子宮内での閉鎖のための革新的な薬理学的治療法の開発に対する需要が依然として存在する。
【０００３】
NTDの重症度の予測を伴う早期の検出によって、NTDについての試験がより普及してきている先進国及び途上国の双方の患者が、胎児及び母親の健康的な結果について情報に基づいた決断をすることができるであろう。早期の検出は、NTDに関連した妊娠の可能性が高い個人にとって特に有益であろう。流産後にNTDが再発するリスクがあり、また以前に流産したことは将来の妊娠における無脳症のリスク指標である。ヒトNTDの病因学における最近の研究、並びにマウスモデルの分析から、感受性の決定にエピジェネティック因子が関与することが示唆されている。
【０００４】
神経管欠損症の既存の治療は、出生直後の外科的介入及び開放神経管の縫合に依存する。死亡率が高く、また生き延びた場合も車椅子に拘束され、更に膀胱制御ができない。受胎前及び神経管発達中に母体に葉酸補給すると神経管欠損症を防止できるが、この処置はヒトの場合約60-70％にのみ有効である。NTDの一部のパーセンテージは葉酸に非応答性である。
【０００５】
葉酸応答性のNTDの場合であっても、葉酸補給の忠告は妊娠する年代の女性に無視されることがある。女性が妊娠に気づく時点までに神経管発達の破壊は既に起こっており、胎児がMMを有することを妊娠女性が知る時点では、子宮内手術を実施する以外の臨床的介入には遅すぎる。しかしながら、子宮内手術はそれ自体欠点があり、母親及び胎児が死亡する可能性がある。生き延びた場合は車椅子生活であり、また膀胱制御ができない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一態様は、胎児におけるNTDの治療方法を提供する。本方法は、ノギン（noggin）又はLDN-193189を含有する組成物を子宮内投与することを含み得る。一実施形態において、母親の血液又は羊水に含まれるノギンの量が減少している場合及び／又はBMP4の量が上昇している場合に本組成物を投与する。別の実施形態において、羊水幹細胞がH3K4メチル化及びH3K27メチル化の少なくとも一方のレベルの上昇、又はH3K9アセチル化、H3K18アセチル化及びGcn5の少なくとも1つのレベルの低下を示す場合に本組成物を投与する。更に別の実施形態において、母親の血液又は羊水に含まれるBMP4の量が上昇し、かつ羊水幹細胞がH3K4メチル化及びH3K27メチル化の少なくとも一方のレベルの上昇、又はH3K9アセチル化、H3K18アセチル化及びGcn5の少なくとも1つのレベルの低下を示す場合に本組成物を投与する。
【０００７】
本発明の別の態様は、GDC-0449を含有する組成物を子宮内投与することを含む、胎児における神経管欠損症の治療方法を提供する。一実施形態において、母親の血液又は羊水に含まれるソニック・ヘッジホッグ（Shh）の量が上昇している場合にGDC-0449を含有する組成物を投与する。別の実施形態において、羊水幹細胞がH3K9アセチル化、H3K18アセチル化及びGcn5の少なくとも1つのレベルの上昇を示す場合にGDC-0449を含有する組成物を投与する。更に別の実施形態において、母親の血液又は羊水に含まれるソニック・ヘッジホッグ（Shh）の量が上昇し、かつ羊水幹細胞がH3K9アセチル化、H3K18アセチル化及びGcn5の少なくとも1つのレベルの上昇を示す場合にGDC-0449を含有する組成物を投与する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本特許又は本出願書類は、カラーで示される少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は本出願公開公報のコピーは、請求により、また必要な費用の支払い後に庁から提供されるであろう。
【図１】羊水幹細胞による幹細胞マーカーの発現を説明する写真を示す。AFSC全体からニューロスフェアが増殖した。母体由来の細胞はニューロスフェア培養培地（Neurobasal＋bFGF及びEGF）中で生存しない。胚性幹細胞はNeurobasal＋bFGF及びEGF中で増殖してニューロスフェアコロニーを形成する。これらの細胞を羊水幹細胞（AFSC）と記載する。コロニーをSox2、Oct4、CD133及びネスチン（nestin）について免疫染色した。核染色のためにDAPIを使用した。Sox2、Oct4、CD133及びネスチンは、正常（A）、MM（B）及び無脳症（C）罹患妊娠からのAFSC中に存在した。各実験は少なくとも4回、トリプリケートで実施した。
【図２】羊水幹細胞が分化した場合に種々の分化マーカーを発現することを説明する写真を示す。増殖因子を含まないNeurobasal培地中でニューロスフェアを7日間増殖させ、続いてアストロサイト（GFAP）、ニューロン（TuJ1）及びオリゴデンドロサイト（O4）マーカーについて免疫染色した。核染色のためにDAPIを使用した。GFAP及びTuJ1は正常（A）、MM（B）及び無脳症（C）罹患妊娠からのAFSC中で同様のレベルであった。O4染色はMM＞無脳症＞正常であった。各実験は少なくとも4回、トリプリケートで実施した。
【図３】正常、MM及び無脳症罹患妊娠からの培養AFSCの免疫染色（H3K4）を説明する写真を示す：（A）H3K4me2及びOct4；（B）H3K4me3及びOct4；全ての細胞はDAPI核染色で対比染色した。幹細胞マーカーであるOct4の存在は、染色された細胞が母親由来ではなく胚性のものであることを示す。H3K4me2及びH3K4me3免疫染色の双方が、MMでは増大しているが、無脳症では増大していない。各実験は少なくとも4回、トリプリケートで実施した。
【図４】正常、MM及び無脳症罹患妊娠からの培養AFSCの免疫染色（H3K27メチル化及びKDM6B）を説明する写真を示す：（A）H3K27me2及びOct4；（B）H3K27me3及びOct4；（C）KDM6B及びOct4；全ての細胞はDAPI核染色で対比染色した。MMではH3K27me2及びH3K4me3免疫染色が増大しているが、無脳症ではH3K27me3のみが増大している。KDM6B免疫染色はMM及び無脳症の双方で低下した。各実験を少なくとも4回、トリプリケートで実施した。
【図５】正常、MM及び無脳症罹患妊娠からのAFSCの免疫染色（H3K9及びH3K18アセチル化及びGcn5）を説明する写真を示す：（A）H3K9Ac及びGcn5；（B）H3K18Ac及びGcn5；全ての細胞はDAPI核染色で対比染色した。H3K4me2及びH3K4me3免疫染色の双方が、MMでは増大しているが、無脳症では増大していない。各実験は少なくとも4回、トリプリケートで実施した。
【図６】エピジェネティックマーカーについての結果を示すグラフである。免疫染色した細胞の最低6箇所の異なる視野をデンシトメトリーを用いて測定し、Oct4＝1とする任意のデンシトメトリー単位で表した総体的な値を示す。正常と比較して、H3K4me2、H3K4me3、H3K27me2及びH3K27me3についての染色強度はMM罹患妊娠からのAFSCで高かった。H3K27me3、H3K9Ac、H3K18Ac及びGcn5についての染色強度は無脳症罹患妊娠からのAFSCで高く、KDM6BレベルはMM及び無脳症サンプルの双方で低かった。
【図７】BMP4及びShhの羊水及び血清レベルを説明する棒グラフを示す。NTD罹患妊娠におけるBMP4及びShhの羊水（A及びC）及び血清（B及びD）レベルを正常と比較した。血清及び羊水間で傾向は同様であった。A）羊水BMP4レベルはMMで高く、無脳症及び脳ヘルニア罹患妊娠で低かった。全前脳症ではBMP4レベルは正常と同様であった。B）羊水Shhは無脳症で有意に高かった。C）血清BMP4はMMでは高く、無脳症では検出不能であった。D）血清Shhレベルは無脳症で最も高く、MMで最も低かった。各実験はトリプリケートで実施した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
神経管欠損症の治療方法
本発明の一態様は、背側及び腹側神経管のシグナル伝達分子の均衡をとり直し、適切な神経管の閉鎖、従って神経堤細胞の適切な分化を生じさせることによって、胎児におけるNTDを治療する方法を提供する。一実施形態において、ノギン又はノギンアゴニストLDN-193189を含有する組成物を子宮内の胎児に投与する。別の実施形態において、ソニック・ヘッジホッグ（Shh）アンタゴニストGDC-0449（ビスモデギブ(Vismodegib)）を含有する組成物を子宮内の胎児に投与する。
【００１０】
現在、発生分子（developmental molecule）である骨形成タンパク質4（BMP4）及びShhのレベルが、胎児における適切な神経管の発達にとって極めて重要であると考えられている。背-腹の適切なシグナル伝達及びパターン形成が適切な神経管閉鎖につながる。BMP4は神経管の背側化において重要である。過剰なBMP4は神経管の過剰な背側化（over dorsalization）、最終的には二分脊椎をもたらす。Shhは神経管の腹側化のために重要であり、適切な神経管閉鎖のために背側神経管では抑制されなければならない。Shhの増大は過剰な腹側化（over ventralization）を引き起こし、従って神経管閉鎖の不足をもたらし得る。Shhの欠如は正中線欠損全前脳症と関連しており、一方Shhの増大は脳脱出及び二分脊椎と関連している。
【００１１】
母親の血液及び羊水中のBMP4及びShhレベルの測定
本発明の一実施形態は、母親の血液又は羊水中のBMP4のレベルが正常レベルを超える場合にノギン又はノギンアゴニストLDN-193189を子宮内投与することを含む、胎児におけるNTDの治療方法を提供する。別の実施形態において、母親の血液又は羊水中のノギンのレベルが正常レベルを下まわる場合にノギン又はノギンアゴニストLDN-193189を投与する。
【００１２】
本発明者等は、ノギンが葉酸応答標的であり、BMP4のアンタゴニストであることを決定した。葉酸応答性NTD罹患妊娠をしている女性の血清及び羊水中ではBMP4レベルが高く、ノギンレベルが低い。BMP4の高発現は神経管の過剰な背側化を引き起こし、従って閉鎖しないことになる。
【００１３】
一実施形態において、ノギンは過剰なBMP4による過剰背側化に対抗するために使用される。こうした状況では、葉酸は、特定の妊娠期間の後は有益ではない。しかしながら、その応答標的であるノギン又はノギンアゴニストLDN-193189を使用して、開口した神経管の子宮内での修復プロセスを活性化することができる。このプロセスは、縫合の代わりに生物学的分子もしくは小分子を用いた「分子的ステッチ」又は開口神経管のステッチと呼ばれる。
【００１４】
本発明の別の態様は、母親の血液又は羊水中のShhのレベルに依存してShhアンタゴニストGDC-0449を子宮内投与することを含む、胎児における神経管欠損症の治療方法を提供する。葉酸非応答性NTDの場合、葉酸の補給はNTDを改善することができない。本出願人は、葉酸非応答性NTD動物モデルで実証されるように、葉酸非応答性NTDが上昇したソニック・ヘッジホッグ（Shh）レベルを有することを決定した。一実施形態において、母親の血液又は羊水のShhレベルが上昇している場合にShhアンタゴニストGDC-0449（ビスモデギブ）を子宮内の胎児に投与する。
【００１５】
羊水幹細胞（AFSC）中のエピジェネティックマーカーの測定
本発明の更に別の実施形態は、羊水幹細胞（AFSC）中の特定のエピジェネティックマーカー又はヒストンモディファイヤーのレベル、またはこれとノギン、BMP4及びShhの少なくとも1つのレベルとの組合せに基づいて、ノギン、ノギンアゴニストLDN-193189又はGDC-0449を子宮内投与することを含む、NTDの治療方法を提供する。特定の実施形態において、マーカーは、ヒストン修飾についてのマーカーである。他の特定の実施形態において、ヒストンモディファイヤーは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼGcn5又はヒストンデメチラーゼKDM6Bである。
【００１６】
ヒストンは、DNAを包む真核細胞の核内に見られる強アルカリ性のタンパク質である。ヒストンは5つの主要なクラス：H1/H5、H2A、H2B、H3、及びH4に分類することができる。これらのクラスは2つのスーパークラス：コアヒストン（H2A、H2B、H3及びH4）及びリンカーヒストン（H1及びH5）にまとめられる。ヒストンは、DNA及び核タンパク質との相互作用を変える翻訳後修飾を受ける。ヒストンは、例えばメチル化、アセチル化及びリン酸化によっていくつかの部位で共有結合によって修飾され得る。ヒストン修飾は、遺伝子調節、DNA修復及び有糸分裂の際の染色体凝縮等の多様な生物学的プロセスで機能する。ヒストン修飾の一般的な命名法は、ヒストンの名前の後にタンパク質中で修飾を受けたアミノ酸の一文字の略号及びアミノ酸位置を記載するものである。最後に修飾の型が示される。例えば、H3K27me2は、H3タンパク質のN-末端から27番目の残基（リシン）のジメチル化を示す。
【００１７】
エピジェネティックマーカーは、ヒストンのメチル化又はアセチル化についてのマーカーであり得る。一実施形態において、幹細胞内のヒストンのメチル化又はアセチル化のレベルは、幹細胞を、ヒストンのメチル化又はアセチル化の少なくとも一方に対して特異的な抗体と接触させることを含む方法によって決定される。更に別の実施形態において、幹細胞内のヒストンアセチルトランスフェラーゼGcn5のレベルは、幹細胞を、Gcn5に対して特異的な抗体と接触させることを含む方法によって決定される。別の実施形態において、幹細胞内のヒストンデメチラーゼKDM6Bのレベルは、幹細胞を、KDM6Bに対して特異的な抗体と接触させることを含む方法によって決定される。例えば、幹細胞内のH3K27メチル化のレベルは、幹細胞を、K27でジメチル化されたヒストンH3及びK27でトリメチル化されたヒストンH3の少なくとも一方に対して特異的な抗体と接触させることを含む方法によって決定される。
【００１８】
抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。特定の実施形態において、抗体は、検出可能なプローブ、例えば放射性プローブ、蛍光プローブ又は化学発光プローブで標識される。別の実施形態において、抗体は、プローブで標識されない。その代わりに、抗体の存在は、該抗体を、そのような検出可能なプローブで標識した二次抗体と接触させることによって検出される。
【００１９】
一実施形態において、AFSCは胚性幹細胞である。母親由来の羊水は、母親の間葉細胞及び成体幹細胞も含み得る。一実施形態において、エピジェネティック又はヒストン修飾マーカーは、羊水から培養した胚性幹細胞で測定される。これらの細胞は、ニューロスフェアに成長させ、採取し、破砕によって単一の細胞を取得し、更に増殖させることができる。ニューロスフェアは、母親からの細胞混入を防ぐために確立される。
【００２０】
母親からの細胞の混入を防ぐために、羊水の細胞をまず、Chang培地中で培養し、次いでbFGF及びEGFを含有するNeurobasal培地に移し、そこでニューロスフェアを形成させる。成体幹細胞は培養中で増殖させることが困難であり、増殖因子を含むNeurobasal培地中でコロニーを形成することができない。胚性幹細胞の存在は、オクタマー結合転写因子4（Oct4）マーカーの存在によって実証することができる。一実施形態において、Oct4の存在は、細胞を、Oct4に対する抗体と接触させることを含む方法によって決定される。
【００２１】
特定の実施形態において、母親の血液又は羊水が、BMP4レベルの上昇及び／又は低いノギンレベルを、AFSC中のH3K4me2、H3K4me3、H3K27me2、HeK27me3、KDM6B、H3K9ac、H3K18ac及びGcn5の少なくとも1、2、3、4、5、6、7又は8種の正常レベルを超える、又は正常レベルを下まわるレベルと併せて示す場合に、ノギン又はノギンアゴニストLDN-193189を子宮内投与する。一実施形態において、AFSCがH3K4メチル化及びH3K27メチル化の少なくとも一方のレベルの上昇、又はH3K9アセチル化、H3K18アセチル化及びGcn5の少なくとも1つのレベルの低下を示す場合に、ノギン又はノギンアゴニストLDN-193189を投与する。
【００２２】
別の実施形態において、母親の血液又は羊水が、Shhレベルの上昇を、AFSC中のH3K4me2、H3K4me3、H3K27me2、HeK27me3、KDM6B、H3K9ac、H3K18ac及びGcn5の少なくとも1、2、3、4、5、6、7又は8種の正常レベルを超える、又は正常レベルを下まわるレベルと併せて示す場合に、ShhアンタゴニストGDC-0449を子宮内の胎児に投与する。一実施形態において、AFSCがH3K9アセチル化、H3K18アセチル化及びGcn5の少なくとも1つのレベルの上昇を示す場合に、GDC-0449を投与する。
【００２３】
神経管欠損症のためのバイオマーカーとしてのノギン、BMP4及びShh
本発明の別の態様は、母親の血液又は羊水中のバイオマーカーのレベルに基づいてNTDの存在を決定する方法を提供する。一実施形態において、葉酸応答性NTDの存在は、母親の血液中のノギンのレベルの低下及び／又はBMP4のレベルの上昇によって示される。別の実施形態において、葉酸非応答性NTDの存在は、母親の血液中のShhのレベルの上昇によって示される。
【００２４】
神経管欠損症のためのバイオマーカーとしてのAFSC中のエピジェネティックマーカー及びヒストンモディファイヤー
本発明の別の態様は、AFSC中のエピジェネティックマーカーもしくはヒストンモディファイヤーのレベル、あるいはこれと母親の血液又は羊水中のノギン、BMP4もしくはShhのレベルとの組合せに基づいて、NTDの存在を決定する方法を提供する。一実施形態において、NTDの存在は、AFSC中のH3K4me2、H3K4me3、H3K27me2、H3K27me3、KDM6B、H3K9ac、H3K18ac及びGcn5の少なくとも1、2、3、4、5、6、7もしくは8種の正常レベルを超えるか又は正常レベルを下まわるレベルによって示される。別の実施形態において、H3K27me2/3レベルの変化（alternation）はMMと関連する。更に別の実施形態において、H3K27me3、H3K9/18ac及びGcn5レベルの変化は無脳症と関連する。別の実施形態において、MMの存在は、H3K4me2、H3K4me3、H3K27me2及びH3K27me3のレベルの上昇、及びKDM6Bのレベルの低下によって示される。
【００２５】
神経管欠損症の検出及び治療のためのキット、試薬及び組成物
本発明はまた、NTDを検出するためのキット及び試薬を提供する。一実施形態において、キットは、少なくともH3K4me2、H3K4me3、H3K27me2、H3K27me3、KDM6B、H3K9ac、H3K18ac及びGcn5の少なくとも1つに対して特異的な抗体を含む試薬を、パッケージ又は容器内のバッファーと組み合わせて含む。別の実施形態において、キットは、少なくともノギン、BMP4及びShhの少なくとも1つに対して特異的な抗体を含む試薬を含む。抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。特定の実施形態において、抗体は、検出可能なプローブ、例えば放射性プローブ、蛍光プローブ又は化学発光プローブで標識される。別の実施形態において、抗体はプローブで標識されない。その代わりに、キットは更に、そのような検出可能なプローブで標識された二次抗体を含む。これらの実施形態、及び下記の実施形態において、バッファーは液状、凍結又は凍結乾燥形態であって良い。
【００２６】
特定の実施形態において、キットはまた、Oct4等の胚性幹細胞マーカーを含む試薬を、パッケージ又は容器内のバッファーと組み合わせて含む。別の実施形態において、キットはまた、DAPI等の核染色剤を含む試薬を、パッケージ又は容器内のバッファーと組み合わせて含む。
【００２７】
別の実施形態において、キットは1種以上の洗浄用バッファー（例えばリン酸緩衝生理食塩水）及び／又はブロッキングバッファー（例えばPBS中の5％正常ロバ血清／0.01％Triton X-100／0.01％アジ化ナトリウム）をパッケージ又は容器内に含む。更に別の実施形態において、キットはシグナル伝達部分からの検出可能なシグナルの発生のためのシグナル生成試薬を含んでいても良い。キットはまた、1種以上のサンプル回収デバイス、例えば腰椎穿刺を実施するのに好適なシリンジ又は針を含んでいても良い。別の実施形態において、キットはまた、陽性及び／又は陰性対照サンプルを適切なパッケージ又は容器内に含む。
【００２８】
キットが供給される場合、異なる成分を別個の容器に包装し、使用直前に混合することができる。このような成分の別個の包装は、活性成分の機能を損なうことなく長期の保存を可能とし得る。キットはまた、使用説明書をつけて供給しても良い。使用説明書は紙又は他の物質に印刷することができ、及び／又は電子的に読むことのできる媒体として供給することができる。
【００２９】
本発明の別の態様は、NTDの治療のための組成物及びキットを提供する。一実施形態は、治療的有効量のノギン、LDN-193189又はGDC-0449及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。「薬学的に許容される」とは、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比につりあって過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題もしくは合併症がなく、ヒトの組織と接触させて使用するのに好適なリガンド、物質、組成物、及び／又は投与形態をいう。NTDの治療における使用に関してノギン、LDN-193189又はGDC-0449の「治療的有効量」とは、所望の投薬の一部として投与された場合に臨床的に許容される基準に従ってNTDの症状を軽減する量をいう。一実施形態において、組成物は、子宮内送達に適した形態で供給され、例えば組成物は、胎児の神経管への送達のための子宮内注入に適した形態で供給される。
【００３０】
本発明の別の態様は、NTDの治療のためのキットを提供する。一実施形態において、キットは治療的有効量のノギン、LDN-193189又はGDC-0449を含む試薬、及び薬学的に許容される担体を含む。キットはまた、胎児の神経管に組成物を送達するのに好適なシリンジ又は他のデバイスを含み得る。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］
ヒト羊水及び血清サンプルの採取
妊娠16〜18週の6名の妊娠女性から、羊水穿刺によって羊水サンプルを採取した。2つのサンプルは正常な妊娠を示す女性からのものであり、そして脊髄髄膜瘤（MM）、無脳症、脳ヘルニア及び全前脳症をそれぞれ示す各1例である。羊水及び血液サンプルを提供した女性は全てインフォームドコンセントフォーム（IRB承認＃STU00012913；Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL）に署名した。
【００３２】
［実施例２］
ヒト羊水細胞の初代培養及び羊水幹細胞（AFSC）の単離
100μmのフィルターを使用して羊水サンプル（5ml）をろ過し、400g（4℃）で10分間遠心分離した。後に使用するために上清を保存し、沈殿物をhAFC培地（15％ESグレードFBS、1％グルタミン及び1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Invitrogen）を含有し、18％Chang B及び2％Chang C（Irvine Scientific）を添加したMEM培地（Gibco, Invitrogen））と共に75mmの組織培養皿にまき、37℃、5％の加湿CO2下でインキュベートした。播種5日後に非接着性細胞を除去した。接着細胞に新しい培地を加え、これを65-70％コンフルエンスになるまで維持した。脳ヘルニア及び全前脳症罹患妊娠と関連した羊水から得られた細胞は、培養中で生存しなかった。これらのサンプルから取得した羊水はわずかに濁り、赤みがかっており、これらのサンプルは長期間室温で放置した結果、細胞溶解が生じた可能性がある。
【００３３】
AFSCを単離するために、初代細胞培養からの細胞を、PolyHEMAで予めコートしたフラスコ内で、bFGF（20ng/ml）及びEGF（20ng/ml）を添加したNeurobasal plus培地中で増殖させた。細胞を7日間増殖させた間に、細胞は浮遊するニューロスフェア（コロニー形成単位）を形成した。分化試験のために、ラミニンでコートした8ウェルのチャンバースライド上、増殖因子のないNeurobasal培地中でニューロスフェアを増殖させ、7日間細胞を分化させた。
【００３４】
［実施例３］
免疫染色
7日目に、＞50μmの個々のコロニーを選択し、ラミニンで予めコートした8ウェルのチャンバースライド（Sigma L2020）に、増殖因子不在下でまいた。接着したニューロスフェアをPBS中4％パラホルムアルデヒドで固定した。CD133（Abcam ab19898-100）、Sox2（Chemicon AB5603）、Oct4（Santa Cruz Biotechnology sc-8629）、アルカリホスファターゼ（Millipore SCR004）、及び神経前駆細胞マーカーネスチン（Nestin、Millipore MAB353）を用いて、幹細胞の性質を確認した。免疫染色はIchi等（Ichi等、J. Biol. Chem 285: 36922-36932 2010）に記載されたように実施した。エピジェネティックマーカーについての抗体は以下を含む：H3K4me2（ab8580）、H3K4me3（ab7766）、H3K27me2（ab24684）及びKDM6B（ウサギポリクローナルab38113）（以上Abcamより）；H3K27me3（ウサギポリクローナル#07-449）（Upstateより）；H3K9ac（ウサギポリ-CS#9671S）及びH3K18ac（ウサギポリ-CS#9675S）（Cell Signalingより）；及びGcn5（ヤギポリクローナル-sc6303）（Santa Cruzより）。一次抗体で処理する前に、PBS中10％正常ロバ血清／0.1％Triton X-100／0.01％アジ化ナトリウムで細胞をブロッキングした。二次抗体は以下を含む：Cy3-コンジュゲートロバ抗ウサギ及び抗マウスIgG（Jackson ImmunoResearch）及びAlexa Fluor 488-標識ロバ抗ウサギ及びヤギIgG（Invitrogen）。核染色はDAPIで行った。デンシトメトリーのために、全ての免疫染色した切片を、ライカ社製の顕微鏡で同一の設定条件（励起／補正等）で検討した。
【００３５】
［実施例４］
BMP4及びShh酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）
羊水及び血清サンプルからのBMP4及びShhレベルを、ELISAキット（Abcam, Cambridge, MA02139）及びヒトBMP4（ab99982）及びヒトShh（ab100639）に対する抗体を用いて希釈し、測定した。
【００３６】
［実施例５］
MM及び無脳症に罹患した妊娠のAFSCにおけるエピジェネティックマーカー
クロマチンの不活化についてのエピジェネティックマーカー（すなわちH3K27me3）、及び活性化についてのエピジェネティックマーカー（すなわちH3K4me2/3）並びにヒストンのアセチル化についてのエピジェネティックマーカーを、重要な発生遺伝子プロモーターと関連付けた。メチル化及びアセチル化のプロファイルがNTDに罹患した妊娠で変化するか否かを確かめるために、AFSCを培養中で増殖させ、H3K4me2、H3K4me3、H3K27me2、H3K27me3、H3K9ac、H3K18ac、KDM6B及びGcn5に対する抗体で免疫染色した。母親の間葉細胞とは対照的に、AFSCは胚起源のものであった。これらの細胞は培養中で生存してニューロスフェアを形成し、一方母親由来の間葉細胞はNeurobasal Plus（増殖因子添加）培地中でニューロスフェアコロニーを形成しない。正常、MM、及び無脳症妊娠から取得した幹細胞は、幹細胞マーカーOct4、CD133及びSox2、及び神経前駆細胞マーカーネスチン（nestin）が陽性であった（図１）。最後に、ニューロスフェアコロニーは、TuJ1、GFAP及びO4染色でそれぞれ証明されるように、様々な系統、すなわちニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトに分化した（図２）。
【００３７】
［実施例６］
H3K4me2/3、H3K27me2/3及びKDM6Bレベルの測定
H3メチル化パターンがNTD罹患妊娠で変化するかどうかを判定するために、正常、MM及び無脳症罹患妊娠からの培養AFSCで、H3K4me2、H3K4me3、H3K27me2、H3K27me3及びKDM6Bについての免疫染色を実施した。H3K4me2及びH3K4me3（図3A及びB）レベルは、正常対照と比較してMM AFSCで上昇していた。これらのマーカーのレベルは無脳症では変化しなかった。H3K27me2及びH3K27me3はMM罹患妊娠からの培養AFSCで高く（図4A及びB）、KDM6Bレベルは低下した。これは、WTと比較してSp-/-胚からの神経堤幹細胞でのH3K27メチル化の増大を示すIchi等（Ichi等、J. Biol. Chem 285: 36922-36932 2010）の動物データを裏付けるものである。無脳症ではH3K27me3レベルが上昇し、KDM6Bレベルが低下した（図4C）。
【００３８】
［実施例７］
H3K9Ac及びH3K18Ac及びGcn5レベルの測定
H3K9ac及びH3K18acは活性クロマチン34-36と関連する。MM関連妊娠から培養したAFSCにおいて、H3K9ac及びH3K18acレベルは正常と同様であった。無脳症関連妊娠から培養したAFSC細胞では、H3K9Ac及びH3K18Acは上昇していた（図５Ｂ）。Gcn5、H3K9及びH3K18アセチルトランスフェラーゼは無脳症と関連して上昇したが、MMでは上昇しなかった。まとめると、無脳症罹患妊娠から培養したAFSCは、MM及び正常妊娠からの細胞と比較して、より高いレベルのH3K9Ac、H3K18Ac及びGcn5を発現する。総体的に、AFSCにおけるエピジェネティックマーカーについてのデータ（図６にまとめたデンシトメトリーのデータ）から、(i)H3K27me2及びH3K27me3の変化はMM罹患妊娠と関連すること、(ii)一方、H3K27me3、H3K9/18ac及びGcn5の変化は無脳症罹患妊娠と関連すること、が示唆される。
【００３９】
［実施例８］
血清及び羊水中のBMP4及びShhレベルの測定
H3K27メチル化の上昇は、BMP4アンタゴニストであるノギンの発現低下と関連し、それによって発達中の脊髄におけるBMP活性が上昇する。本発明者等はAFSCにおけるH3K27メチル化の上昇を観察したため、NTD罹患妊娠からの羊水及び血清中でBMP4レベルが上昇するであろうとの仮説を立てた。BMP4レベルはELISAを用いて調べた。正常と比較して、MMを示す胎児を妊娠している患者から採取した羊水及び血清中ではBMP4レベルが高かった。無脳症及び脳ヘルニア罹患妊娠からの羊水及び血清中ではBMP4レベルは低く、血清BMP4レベルは全前脳症でも低かった（図７Ａ及びＢ）。羊水及び血清中のShhレベルは、胎児が無脳症を示す患者では高く、胎児がMM、脳ヘルニア及び全前脳症を示す患者では低かった（図７Ｃ及びＤ）。
【００４０】
本発明を特定の例示的実施形態を参照して記載し、説明してきたが、本発明がこれらの例示的実施形態に限定されることが意図されるものではない。当業者であれば、以下の請求項によって規定される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく変更及び改変をなし得ることを認識するであろう。従って、そのような変更及び改変の全てが添付した請求項及びその等価物の範囲内にあるものとして、本発明の範囲内に含めることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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