(57)【要約】  本発明は、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化された組換え大腸菌(E. coli)株に関し、前記組換え株において、メチオニン搬入が減衰され、メチオニン流出が強化される。また、本発明は、メチオニン又はその誘導体の発酵的生産を最適化する方法にも関し、前記方法は、a. 組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物において、発酵性の炭素源及び硫黄源を含む適切な培地中で、メチオニン搬入が減衰され、メチオニン流出が強化される工程、及び、b. メチオニン及び/又はその誘導体を培地から回収する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化された組換え大腸菌(E. coli)株であって、前記組換え株において、metN、metI、又はmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子が減衰され、ygaZH遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される、組換え大腸菌株。
【請求項２】
metN、metI、又はmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子が欠失される、請求項１に記載の大腸菌株。
【請求項３】
前記ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択される、請求項１又は２に記載の大腸菌株。
【請求項４】
ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する、請求項３に記載の大腸菌株。
【請求項５】
ygaZH遺伝子又はホモログ遺伝子が誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸菌株。
【請求項６】
さらに、以下の遺伝子：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、fldA、fpr、metA、S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA*アレル、thrA、又はスレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードするthrA*アレルの少なくとも一種の発現が増加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌株。
【請求項７】
前記遺伝子の少なくとも一種が誘導性プロモーターの制御下にある、請求項６に記載の大腸菌株。
【請求項８】
さらに、以下の遺伝子：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA、又はudhAの少なくとも一種の発現が減衰される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の大腸菌株。
【請求項９】
a. metN遺伝子、metI遺伝子、及びmetQ遺伝子が欠失され、ygaZ遺伝子及びygaH遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子が過剰発現され、
b. metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG、及びpycの遺伝子の発現が強化され、及び
c. metJ、pykA、pykF、purU、dgsA、metE、及びyncAの遺伝子の発現が減衰される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の大腸菌株。
【請求項１０】
a. 組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物において、発酵性の炭素源及び硫黄源を含む適切な培地中で、metN、metI、又はmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子が減衰され、ygaZH遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される工程、並びに、
b. 前記培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程
を含む、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産を最適化するための方法。
【請求項１１】
前記組換え微生物が、
a. metN、metI、又はmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子の欠失、及び
b. ygaZH遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え微生物の生育が、培地中で一種以上の無機性基質、特にリン酸塩及び/又はカリウムの制限又は欠乏を受ける、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換え微生物が、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科の中から、好ましくは大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムの中から選択され、最も好ましくは大腸菌である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L-メチオニン及び/又はその誘導体の製造に有用な組換え微生物、並びにL-メチオニンの調製のための方法に関する。本発明の微生物は、L-メチオニン取り込み系の減衰と特定の搬出系の過剰発現とを組み合わせることによりメチオニン/炭素源収率が増加されるような方法で改変されている。特に、組換え微生物中で、metNIQオペロンが欠失され、ygaZ及びygaH遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される。
【背景技術】
【０００２】
システイン、ホモシステイン、メチオニン、又はS-アデノシルメチオニン等の含硫化合物は、細胞代謝に非常に重要である。特に、必須アミノ酸であるL-メチオニンは、動物が合成することができないが、多くの身体機能において重要な役割を果たしている。工業的に生産されるメチオニンの大部分が、動物飼料及び食品添加物として広く用いられている。
【０００３】
BSE及び鳥インフルエンザの結果としての動物由来タンパク質の使用の減少に伴い、純粋なメチオニンの需要が増加してきている。一般的に、D,L-メチオニンは、アクロレイン、メチルメルカプタン、及びシアン化水素から化学的に製造される。しかし、ラセミ混合物は純粋なL-メチオニンのようにはうまく機能しない(Saunderson, 1985)。加えて、純粋なL-メチオニンは、例えばN-アセチル-D,L-メチオニンのアシラーゼ処理によってラセミ体のメチオニンから製造することができるが、製造コストが劇的に増加する。したがって、環境問題と相まって、純粋なL-メチオニンの需要の増加によって、メチオニンの微生物生産は魅力的な展望になる。
【０００４】
他の重要なアミノ酸、例えばリジン、スレオニン、及びトリプトファンは、動物飼料用途で発酵により生産されている。したがって、これらのアミノ酸は、グルコース及び他の再生可能な資源を出発物質として用いて生産することができる。L-メチオニンの発酵による工業的生産は未だ成功していないが、技術の発展は進行中である。
【０００５】
微生物におけるL-メチオニン生産の最適化のための種々のアプローチが以前に記述されている(例えば、US7,790,424、US7,611,873、WO2002/10209、WO2005/059093、及びWO2006/008097の特許又は特許出願を参照)。しかし、微生物からのL-メチオニンの工業的生産には更なる改善が必要である。
【０００６】
L-メチオニンは、ある一定濃度以上合成される場合、フィードバックループを介して自己のさらなる合成を阻害し、細胞の生理機能を妨げる。したがって、これらの改善の一つは、組換えL-メチオニン過剰生産菌において、微生物のL-メチオニン搬入能力を低減させ、一方で同時にL-メチオニン流出を強化することにより、微生物内へのL-メチオニンの蓄積を低減して、効率的な生産を確保することである。
【０００７】
初期の生化学研究及び動態研究により、大腸菌(Escherichia coli)におけるメチオニン取り込みには、少なくとも2つの特異的トランスポーター、高親和性のMetD、及び低親和性のMetP輸送系が関与していることが明らかになった(Jones & George, 1999; Kadner, 1974)。どちらも内部のメチオニンプールのサイズにより制御され、MetDについては、MetJ媒介性の抑制が推測されている(Kadner, 1975; Kadner & Winkler, 1975)。MetDメチオニン取り込み系は、ABCトランスポーターとして特徴付け(キャラクタライズ)される。2002年、Merlinらは、abc、yaeC、及びyaeE遺伝子が、メチオニン取り込み系をコードするローカス(locus)であるmetDを含むことを報告した。彼らは、abc、yaeE、及びyaeCをそれぞれmetN、metI、及びmetQと改名することを提案した。
【０００８】
メチオニン搬出は、大腸菌では複合体YgaZHによって媒介され、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)ではホモログ複合体BrnFEによって媒介される(Trotschel et al., 2005)。YgaZは、L-バリン及びL-メチオニンの搬出を担う分岐鎖アミノ酸エクスポーター(LIV-E)ファミリーのメンバーである。YgaZは、推定内膜タンパク質であるYgaHと複合体を形成し、アミノ酸濃度が細胞にとって毒性を有するような条件下で、アミノ酸を搬出する。
【０００９】
特許出願WO2002/097096及びWO2005/085463は、特にyaeC、abc、及びyaeE遺伝子を一種以上欠失させることにより、MetD2メチオニン取り込み系を減衰させることによる、コリネバクテリウム属におけるL-メチオニン取り込みの低減に関する。コリネバクテリウム属では、MetD2メチオニン取り込み系の減衰により、メチオニン生産の改善がもたらされる。metN、metI、及びmetQ遺伝子によりコードされる、相同性MetDメチオニン取り込み系は、大腸菌においても特徴付けされている(Jones & George, 1999; Kadner 1974, Merlin et al., 2002)。特許出願WO2008/127240は、大腸菌において、コリネバクテリウム属と同様に、MetDメチオニン取り込み系が減衰されるとメチオニン生産が増加することを開示している。
【００１０】
特許出願EP1239041及びWO2008/082211は、大腸菌におけるL-バリン及びL-メチオニンの搬出を担う分岐鎖アミノ酸エクスポーター(YgaZH)の過剰発現を記述している。この過剰発現により、大腸菌においてメチオニンの生産の増加がもたらされる。
【００１１】
Trotschelらは、BrnFEメチオニンエクスポーターをコードするコリネバクテリウム・グルタミクムのbrnF及びbrnE遺伝子を過剰発現させ、同時にmetD系を欠失させた(Trotschel et al., 2005)。それにもかかわらず、これらの改変がメチオニン生産に及ぼす影響についてのエビデンスは、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいても、大腸菌においても、全く発表されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】US7,790,424
【特許文献２】US7,611,873
【特許文献３】WO2002/10209
【特許文献４】WO2005/059093
【特許文献５】WO2006/008097
【特許文献６】WO2002/097096
【特許文献７】WO2005/085463
【特許文献８】EP1239041
【特許文献９】WO2008/082211
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Saunderson C.L., 1985, British Journal of Nutrition, 54:621-633
【非特許文献２】Jones P.M. and George A.M., 1999, FEMS Microbiol. Lett. 179:187-202
【非特許文献３】Kadner R.J., 1974, Journal of Bacteriology. 117(1):232-241
【非特許文献４】Kadner R.J., 1975, Journal of Bacteriology. 122(1):110-119
【非特許文献５】Kadner R.J. and Winkler H.H., 1975, Journal of Bacteriology. 123(3):985-991
【非特許文献６】Trotschel C., Deutenberg D., Bathe B., Burkovski A., Kramer R., 2005, Journal of Bacteriology. 187(11):3786-3794
【非特許文献７】Merlin C., Gardiner G., Durand S., Masters M., 2002, Journal of Bacteriology. 184(19):5513-5517
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
C.グルタミクム及び大腸菌についての先行技術と異なり、本願の発明者らは、大腸菌においてmetDのみを欠失させる(metNIQオペロン由来の遺伝子の一つを欠失させること、又はオペロン全体を欠失させることのいずれかにより達成することができ、このオペロンのどの遺伝子を欠失させても、高親和性メチオニン取り込みの廃止がもたらされる)だけではメチオニン生産能力を改善するために十分ではないことを示した。この改変に、L-メチオニン搬出系の過剰発現を組み合わせなければならない。
【００１５】
したがって、L-メチオニン取り込み系の欠失とL-メチオニン搬出の過剰発現との組み合わせが、メチオニン生産に有益であるとして、本願において初めて示される。
【００１６】
本発明は、メチオニン及び/又はその誘導体の生産を最適化するための組換え大腸菌株及び方法であって、メチオニン搬入が減衰され、メチオニン流出が強化されている、組換え大腸菌株及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
組換え微生物において、メチオニン搬入は、metN、metI、又はmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子の発現の減衰、又は欠失により減衰され、一方メチオニン流出は、ygaZH遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現により強化される。
【００１８】
また、組換え微生物は、他の遺伝子改変、例えば、
・以下の遺伝子：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、fldA、fpr、metA、S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA*アレル、thrA、又はスレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードするthrA*アレルの少なくとも一種の発現の増加、並びに/又は
・以下の遺伝子：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、udhA、dgsA、metE、又はyncAの一種の発現の減衰
を含んでいてもよい。
【００１９】
特定の実施態様において、本発明は、a) metN、metI、及びmetQ遺伝子が欠失され、一方でygaZ及びygaH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、フレキシネル赤痢菌(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター(Enterobacter)属の種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブズス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、若しくはシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)に由来するこれらのホモログ遺伝子が過剰発現され、並びにb) metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、及びpyc遺伝子の発現が強化され、並びにc) metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、dgsA、metE、及びudhA 遺伝子の発現が減衰された、組換え微生物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本願発明を詳細に記述する前に、本発明は具体的に例示された方法に限定されず、当然ながら、変化し得ることが理解されるべきである。また、本願明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためのものであり、限定することを意図せず、限定は添付の特許請求の範囲によってのみされることも、理解されるべきである。
【００２１】
本願明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、上記のものも下記のものも、その全体が参照により本願に組み込まれる。
【００２２】
さらに、本願発明の実施には、別段の指示が無い限り、当該技術分野の範囲内の従来の微生物学的及び分子生物学的技術を用いる。そのような技術は、当業者に周知であり、文献に十分に説明される。
【００２３】
本願明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「一つの」、「ある」、「その」(a、an及びthe)には、文脈において別段の明確な指示がされていない限り、複数への参照が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ある微生物」への参照には、複数のそのような微生物が含まれ、「ある内因性遺伝子」への参照は、一種以上の内因性遺伝子への参照である、などである。別段の規定が無い限り、本願明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本願明細書に記述されるものと類似の又は同等のあらゆる材料及び方法を、本願発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい材料及び方法を以下に記述する。
【００２４】
後に続く特許請求の範囲、及び連続する本願明細書において、表現言語又は必要な含意に起因して文脈により別段要求する場合を除き、語句「含む」、「含有する」、「関わる」若しくは「包含する」、又は「含む」、「含んでいる」、「含有している」、「関わっている」、「包含する」、「包含している」等の変形は、包括的な意味で用いられる、すなわち、記述された特徴を特定するために用いられるが、本発明の様々な実施態様のさらなる特徴の存在又は追加を除外するためには用いられない。
【００２５】
用語「メチオニン」及び「L-メチオニン」は、化学式HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3、及びCAS番号59-51-8、又はその特異的なL-異性体については63-68-3を有する、必須含硫アミノ酸を示す。
【００２６】
「メチオニンの誘導体」は、同一の化学的主鎖を呈するが少なくとも一つの化学基でメチオニンと異なる、メチオニンの分子アナログを指す。本発明において、好ましいメチオニン誘導体は、N-アセチルメチオニン(NAM)、S-アデノシルメチオニン(SAM)、及びヒドロキシ-メチオニン(又はメチオニンヒドロキシアナログ若しくはMHA)である。
【００２７】
本願明細書で用いられる用語「微生物」は、人為的に改変されていない、細菌、酵母、又は真菌を指す。優先的には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトマイセス科(Streptomycetaceae)、及びコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より優先的には、微生物は、エスケリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パントエア属(Pantoea)、サルモネラ属(Salmonella)、又はコリネバクテリウム属の種である。さらにより優先的には、本発明の微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクム種のいずれかである。
【００２８】
本願明細書で用いられる用語「組換え微生物」又は「遺伝子改変された微生物」は、天然には見られず、かつ天然に見られる同等のものと遺伝的に異なっている、細菌、酵母、又は真菌を指す。遺伝的エレメントの導入若しくは欠失又は修飾によって、改変されていることを意味する。また、直接的変異誘発と特定の選択圧下での進化との組み合わせによる新たな代謝経路の発達及び進化を強制することにより、形質転換することもできる(例えば、WO2004/076659又はWO2007/011939を参照)。
【００２９】
微生物は、宿主微生物内でその遺伝子を発現させる全てのエレメントと共に微生物に導入されるならば、外因性遺伝子を発現するように改変されてもよい。外因性DNAを用いた微生物の改変又は「形質転換」は、当業者の日常的業務である。
【００３０】
微生物は、内因性遺伝子の発現レベルを調節するために改変されてもよい。
【００３１】
用語「内因性遺伝子」は、どの遺伝子改変よりも前からその遺伝子が微生物中に存在していたことを意味する。内因性遺伝子は、内因性の調節エレメントに加えて、若しくはその代わりに異種配列を導入することにより、又は遺伝子の一種以上の補足コピーを染色体若しくはプラスミドに導入することにより、過剰発現されてもよい。また、内因性遺伝子は、その発現及び/又は活性を調節するように改変されてもよい。例えば、コード配列に変異を導入して遺伝子産物を改変してもよく、又は内因性の調節エレメントに加えて、若しくはその代わりに異種配列を導入してもよい。内因性遺伝子の調節は、遺伝子産物の活性の上方制御及び/又は強化をもたらしてもよく、又はその代わりに、内因性遺伝子産物の活性の下方制御及び/又は低減をもたらしてもよい。
【００３２】
これらの発現を調節する別の方法は、遺伝子の内因性プロモーター(例えば野生型プロモーター)を、より強い又はより弱いプロモーターと交換して、その内因性遺伝子の発現を上方又は下方制御することである。これらのプロモーターは、相同性であっても非相同性(異種性)であってもよい。適切なプロモーターを選択することは十分当業者の能力の範囲内である。
【００３３】
反対に、「外因性遺伝子」は、当業者に周知の手段により遺伝子が微生物に導入されたことを意味するが、この遺伝子はその微生物内には天然には存在しない。外因性遺伝子は、宿主の染色体に組み込まれてもよく、又はプラスミド若しくはベクターによって染色体外で発現されてもよい。複製起点及び細胞内でのコピー数に関して異なる様々なプラスミドが、当業者に周知である。これらの遺伝子は相同性であってもよい。
【００３４】
本発明との関係において、用語「ホモログ遺伝子」は、理論的共通遺伝子祖先を有する遺伝子を示すことに限定されず、遺伝的には関連が無いかもしれないが、それにも拘わらず、進化して類似の機能を果たす及び/又は類似の構造を有するタンパク質をコードするようになった遺伝子を含む。したがって、本発明の目的における用語「機能的ホモログ」は、ある酵素活性が定義されたアミノ酸配列の特定のタンパク質によってのみならず、他の(非)関連微生物由来の類似配列のタンパク質によっても与えられる可能性があるという事実に関する。
【００３５】
既知の遺伝子に関してGenbankに示される参照を用いて、当業者は他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物等における同等の遺伝子を決定することができる。この日常的業務は、有利には他の微生物に由来する遺伝子との配列アライメントを実行することにより決定されるコンセンサス配列を用いて、及び縮重プローブを設計して別の生物における対応する遺伝子をクローニングすることで、行われる。これらの分子生物学の日常的方法は、当業者に周知である。
【００３６】
本願明細書で用いる用語「改善されたメチオニン生産」、「メチオニン生産を改善する」及びこれらの文法的に同意義のものは、メチオニン/炭素源収率(消費された炭素源のグラム/モルあたりのメチオニンのグラム/モルの比率で、パーセントで表すことができる)の増加を指す。消費された炭素源及び生産されたメチオニンの量を決定する方法は、当業者に周知である。収率は、対応する非改変微生物と比較して組換え微生物において高い。
【００３７】
用語「メチオニンの発酵的生産に最適化された微生物」は、進化及び/又は遺伝子改変されて、対応する野生型微生物の内因性生産と比較して改善されたメチオニン生産を示す微生物を指す。メチオニン生産のために「最適化された」そのような微生物は当業者に周知であり、特に、特許出願WO2005/111202、WO2007/077041、WO2009/043803及びWO2012/098042に開示されている。
【００３８】
本発明によれば、用語「発酵的生産」、「培養」、又は「発酵」は、細菌の生育を示すために用いられる。この生育は、一般的には、使用される微生物に適合し、かつ少なくとも一種の単純炭素源及び必要な場合は補基質を含有する適切な培地を用いた発酵槽中で行われる。
【００３９】
「適切な培地」は、炭素源又は炭素基質、窒素源等、細胞の維持及び/又は生育に必須であるか又は有益である栄養素、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、モルトエキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウム、リン源、例えばリン酸一カリウム若しくはリン酸二カリウム、微量元素(例えば金属塩)、例えばマグネシウム塩、コバルト塩、及び/若しくはマンガン塩、並びにアミノ酸及びビタミン等の成長因子を含む培地(例えば滅菌液体培地)を示す。
【００４０】
本発明による用語「炭素源」又は「炭素基質」又は「炭素の供給源」は、単糖(グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、又はラクトース等)、オリゴ糖、二糖(スクロース、セロビオース、又はマルトース等)、糖蜜、デンプン、又はその誘導体、ヘミセルロース、及びこれらの組み合わせを含む、微生物の通常の生育を補助するために当業者によって用いることができるあらゆる炭素の供給源を示す。特に好ましい単純炭素源は、グルコースである。別の好ましい単純炭素源は、スクロースである。炭素源は、再生可能原料から得ることができる。再生可能原料は、短時間の遅れの範囲内で、かつ所望の製品への変換を可能にするために十分な量で再生される、ある工業的プロセスに必要な原料として定義される。処理されたか又はされていない植物バイオマスは、興味深い再生可能炭素源である。
【００４１】
本発明による用語「硫黄源」は、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィド、及び他のメチルキャッピングされた硫化物又は種々の供給源の組み合わせを指す。より優先的には、培地中の硫黄源は、硫酸塩若しくはチオ硫酸塩、又はこれらの組み合わせである。
【００４２】
用語「窒素源」は、アンモニウム塩又はアンモニアガスのいずれかに相当する。窒素源は、アンモニウム態又はアンモニア態で供給される。
【００４３】
用語「減衰」又は「減衰された発現」は、この関連において、遺伝子の発現又は酵素の生産が非改変微生物と比較して低減されるか又は抑制されることを意味し、これにより非改変微生物と比較したリボ核酸、タンパク質又は酵素の細胞内濃度の減少がもたらされる。当業者は、例えばリボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)の使用、並びに特定のタンパク質の濃度を決定するための特異的抗体の使用を含む、細胞内のリボ核酸濃度又はタンパク質濃度を測定するための種々の手段及び方法を知っている。
【００４４】
酵素生産の減少又は抑制は、該酵素をコードする遺伝子の発現の減衰によって得られる。
【００４５】
遺伝子の減衰は、当業者に周知の手段及び方法によって達成してもよい。一般的に、遺伝子発現の減衰は、
・コーディング領域又はプロモーター領域を変異させる、又は
・遺伝子発現のために必要なプロモーター領域の全て又は一部分を欠失させる、又は
・相同組換えによって遺伝子のコーディング領域の全て又は一部分を欠失させる、又は
・コーディング領域に又はプロモーター領域に外部エレメントを挿入する
・弱いプロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で遺伝子を発現させる
ことによって達成され得る。
【００４６】
当業者は、異なる強度を示す様々なプロモーターを知っており、弱い又は誘導性の遺伝子発現のためにどのプロモーターを使うべきかわかる。
【００４７】
用語、酵素の「活性」は、用語「機能」と互換可能に用いられ、本発明の関連において、酵素によって触媒される反応を示す。当業者は、前記酵素の酵素活性を測定する方法を知っている。
【００４８】
用語、酵素の「活性の減衰」又は「活性の低減」は、アミノ酸配列の変異によって得られるタンパク質の特定の触媒活性の低減、及び/又はヌクレオチド配列の変異によって若しくは遺伝子のコーディング領域の欠失によって得られる細胞内のタンパク質濃度の減少のいずれかを意味する。
【００４９】
用語、酵素の「活性の強化」又は「活性の増加」は、酵素の特定の触媒活性の増加、及び/又は細胞内の酵素の量/アベイラビリティの増加のいずれかを示し、これらは例えば酵素をコードする遺伝子の過剰発現によって得られる。
【００５０】
用語「発現の増加」、「発現の強化」又は「過剰発現」及びこれらの文法的に同意義のものは、文中で互換可能に用いられ、類似の意味を有する。これらの用語は、遺伝子の発現又は酵素の生産が、非改変微生物と比較して増加し、これにより非改変微生物と比較してリボ核酸、タンパク質、又は酵素の細胞内濃度の増加がもたらされることを意味する。当業者は、リボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)の使用、並びに特定のタンパク質の濃度を決定するための特異的抗体の使用を含む、細胞内のリボ核酸濃度又はタンパク質濃度を測定するための種々の手段及び方法を知っている。
【００５１】
酵素生産の増加は、該酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることによって得られる。
【００５２】
遺伝子の発現を増加させるために、当業者は、例えば以下のような種々の技術を知っている。
・微生物内での遺伝子のコピー数を増加させる。遺伝子は染色体上又は染色体外にコードされている。遺伝子が染色体上に位置する場合、(遺伝子置換を含む)当業者に周知の組換え法によって、複数の遺伝子コピーを染色体上に導入することができる。遺伝子が染色体外に位置する場合、遺伝子は、複製起点に関して異なっており、それにより細胞内でのコピー数に関して異なる種々のタイプのプラスミドによって保有されてもよい。これらのプラスミドは、プラスミドの性質によって、すなわちタイトな複製を有する低コピー数のプラスミド(pSC101、RK2)、低コピー数のプラスミド(pACYC、pRSF1010)、又は高コピー数のプラスミド(pSK bluescript II)によって、1〜5コピー、又は約20コピー、又は最大500コピーで、微生物中に存在している。
・高レベルの遺伝子発現をもたらすプロモーターを用いる。当業者は、どのプロモーターが最も使いやすいか知っており、例えばPtrc、Ptac、Placプロモーター、又はcIラムダプロモーターが広く用いられる。これらのプロモーターは、特定の化合物によって、又は温度若しくは光等の特定の外部条件によって「誘導性」になることができる。これらのプロモーターは、相同性であっても非相同性(異種性)であってもよい。
・遺伝子に特異的であるか又は非特異的である転写リプレッサーの活性又は発現を減衰させる。
・対応するメッセンジャーRNAを安定化させるエレメント(Carrier and Keasling, 1999)又はタンパク質を安定化させるエレメント(例えばGSTタグ、GE Healthcare)を用いる。
【００５３】
用語「コードする(encoding、coding)」は、そのプロセスによりポリヌクレオチドが、転写及び翻訳の機構を介して、アミノ酸配列を作り出すようなプロセスを指す。酵素をコードする遺伝子は外因性でも内因性でもよい。
【００５４】
用語「フィードバック感受性」又は「フィードバック阻害」は、細胞内で特定の物質を生産する一種以上の酵素が、その物質があるレベルまで蓄積されると、阻害されるか又は活性がより低くなる、細胞機構制御を指す。したがって、用語「フィードバック感受性の低減」又は「フィードバック阻害の低減」は、そのような機構の活性が非改変微生物と比較して減少するか又は抑制されることを意味する。当業者は、この結果を得るための酵素の改変方法を知っている。そのような改変は、特許出願WO2005/111202又は特許US7,611,873に記述されている。
【００５５】
本発明の第一の態様において、組換え大腸菌株は、該微生物におけるメチオニン取り込みを減衰させることにより、及びメチオニン流出を強化することにより、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化される。
【００５６】
上述のとおり、メチオニン搬入は、以前はabc、yaeE、及びyaeCとそれぞれ名付けられていた、metN、metI、及びmetQ遺伝子によってコードされるMetDメチオニン取り込み系により媒介される。これらの遺伝子は、大腸菌及びC.グルタミクムを含む複数の微生物において同定されている。MetNIQは、有名なABCトランスポーターファミリーに属している。
【００５７】
本発明の一つの実施態様において、metN、metI、及びmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子の発現が、組換え微生物中で減衰される。当業者は、誘導性又は弱いプロモーターの制御下での減衰させる遺伝子のクローニング、減衰させる遺伝子のプロモーター領域若しくはコーディング領域の全部又は一部の欠失のような、遺伝子発現を減衰させるための種々の手段を知っている。好ましくは、metN、metI、及びmetQ遺伝子の少なくとも一種が欠失される。より好ましくは、metN、metI、及びmetQの3つの遺伝子が、本発明の組換え微生物において欠失される。
【００５８】
アミノ酸生産微生物において、メチオニンは特定の流出トランスポーターによって排出される。とりわけ、大腸菌において、このトランスポーターはYgaZHと呼ばれ、ygaZ及びygaH遺伝子にコードされており、一方でC.グルタミクムにおいては、BrnFEと名付けられ、brnF及びbrnE遺伝子にコードされている。このメチオニン流出系の機能的ホモログが、複数の他の微生物において同定されてきた。あるいは、本発明の組換え微生物は、YgaZH又はBrnFE系の機能的ホモログを過剰発現してもよい。YgaZ及びYgaHホモログタンパク質を、表１及び表２にそれぞれ示す。
【００５９】
【表１】
2016529900.tif 000002
2016529900.tif 000003
2016529900.tif 000004
2016529900.tif 000005
2016529900.tif 000006
【００６０】
【表２】
2016529900.tif 000007
2016529900.tif 000008
2016529900.tif 000009
2016529900.tif 000010
2016529900.tif 000011
【００６１】
各ホモログについて表中に開示されたアクセッション番号を用いて、当業者は、例えばNCBIデータベース上で、アミノ酸配列及びそのヌクレオチドコード配列を得ることができる。
【００６２】
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列から、これらのホモログをコードする遺伝子を得ることは、当業者の日常的業務である。アミノ酸配列からの対象のタンパク質をコードする遺伝子の人工合成、又は対応するゲノムDNAからの対象のコーディング領域のPCR増幅のいずれかによって行うことができる。本発明の関連において、これらの遺伝子は、「ygaZ又はygaHのホモログ遺伝子」と呼ばれる。これらのygaZHホモログ遺伝子の配列は、宿主微生物のコドンバイアスに調整してもよい。
【００６３】
本発明の特定の実施態様において、組換え微生物は、配列番号1及び配列番号2にそれぞれ配列が開示されているタンパク質をコードするygaZ及びygaH遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子を過剰発現する。好ましくは、ygaZ及びygaHのホモログ遺伝子は、同一の生物に由来し、ygaZのホモログ遺伝子とygaHのホモログ遺伝子とにより成る遺伝子対により構成される。しかし、第一の生物由来のygaZホモログ遺伝子と、第二の生物由来のygaHホモログ遺伝子とのミスマッチ対を使用することができる。
【００６４】
YgaZH ホモログ遺伝子は、表１及び表２中にそれぞれ開示されるYgaZ及びYgaHホモログをコードする遺伝子の中から選択される。好ましくは、ygaZHホモログ遺伝子は、シトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のYgaZHホモログをコードする遺伝子の中から選択される。より好ましくは、ygaZHホモログ遺伝子は、シトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する。最も好ましくは、ygaZHホモログ遺伝子は、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー、又はエンテロバクター属の種に由来する。
【００６５】
したがって、ygaZHホモログ遺伝子は、好ましくはシトロバクター・コセリ由来の配列番号3及び配列番号4、フレキシネル赤痢菌由来の配列番号及び配列番号6、ラオウルテラ・オルニチノリティカ由来の配列番号7及び配列番号8、エンテロバクター属の種(R4-368)由来の配列番号9及び配列番号10、エルシニア・エンテロコリチカ亜種エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica)由来の配列番号11又は12及び配列番号13又は14、フォトラブズス・ルミネセンス亜種ラウモンディイ(Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii)由来の配列番号15及び配列番号16、シトロバクター・ヤンガエ由来の配列番号17及び配列番号18、シトロバクター・フロインディー由来の配列番号19及び配列番号20によってそれぞれ定義される、YgaZホモログとYgaHホモログとの対をコードする遺伝子の中から選択される。
【００６６】
特定の実施態様において、組換え微生物は、
・metN、metI、又はmetQ遺伝子の少なくとも一種の減衰、及び
・ygaZH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を特徴とする。
【００６７】
別の特定の実施態様において、組換え微生物は、
・metN遺伝子の減衰、及び
・ygaZH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーのこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を特徴とする。
【００６８】
別の特定の実施態様において、組換え微生物は、
・metI遺伝子の減衰、及び
・ygaZH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーのこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を特徴とする。
【００６９】
別の特定の実施態様において、組換え微生物は、
・metQ遺伝子の減衰、及び
・ygaZH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーのこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を特徴とする。
【００７０】
別の特定の実施態様において、組換え微生物は、
・metN、metI、及びmetQ遺伝子の減衰、及び
・ygaZH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーのこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を特徴とする。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、これらの遺伝子は誘導性プロモーターの制御下で過剰発現される。当業者は、そのような誘導性プロモーターを知っている。例えば、λPR又はλPL等のプロモーターを、ygaZH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するygaZHホモログ遺伝子を本発明の組換え微生物中で過剰発現させるために、用いてもよい。
【００７２】
本発明の別の目的は、ygaZHホモログ遺伝子を同定すること、及びアミノ酸生産微生物において前記遺伝子を単独で、又は以下に開示する他の遺伝子改変と組み合わせて、過剰発現させることである。
【００７３】
「メチオニン生合成経路の最適化」
本発明による組換え微生物は、メチオニンの生産を改善するために改変される。メチオニン生産に関与する遺伝子は周知であり、メチオニン特異的生合成経路に関与する遺伝子、並びに前駆体提供経路に関与する遺伝子及びメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含む。
【００７４】
効率的なメチオニン生産には、メチオニン特異的経路及び複数の前駆体提供経路の最適化が必要である。メチオニン生産株は、特に特許出願WO2005/111202、WO2007/077041、及びWO2009/043803に既に記述されている。これらの出願は参照として本願出願に組み込まれる。
【００７５】
別段記述されている場合を除いて、メチオニン生合成経路の最適化に関して下記に言及される全ての遺伝子は、大腸菌由来のものを指す。
【００７６】
本発明の特定の実施態様において、組換え微生物は以下に記述するとおり改変される。ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、fldA、fpr、metA、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA*アレル、thrA、並びにスレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードするthrA*アレルの中から選択される少なくとも一種の発現が増加する。
【００７７】
・ptsGは、特許出願WO2013/001055に記述されるように、PTS酵素IICBGlcをコードし、
・pycは、特許出願WO2013/001055に記述されるように、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする。好ましい実施態様において、pyc遺伝子は非相同性(異種性)であり、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、又はコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種由来のpyc遺伝子から選択される、
・pntABは、特許出願WO2012/055798等に記述されるように、膜結合トランスヒドロゲナーゼをコードし、
・cysPは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、ペリプラズム硫酸塩結合タンパク質をコードし、
・cysUは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、硫酸塩ABCトランスポーターをコードし、
・cysWは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、膜結合硫酸塩輸送タンパク質をコードし、
・cysAは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、硫酸塩パーミアーゼをコードし、
・cysMは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードし、
・cysI及びcysJは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、亜硫酸レダクターゼのα及びβサブユニットをそれぞれコードする。好ましくは、cysI及びcysJは共に過剰発現される、
・cysHは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、 アデニリル硫酸レダクターゼをコードする。
【００７８】
また、C1代謝の向上も、メチオニン生産の改善をもたらす改変である。GcvTHP、Lpd、MetF、又はMetHの中から選択されるC1代謝に関連する少なくとも一種の酵素の活性の増加に関連する。本発明の好ましい実施態様において、以下の少なくとも一つの発現及び/又は活性を強化することにより、一炭素代謝が向上する。
・特許出願WO 2007/077041に記述される、グリシン開裂複合体をコードする、gcvT、gcvH、gcvP、及びlpd。グリシン開裂複合体(GCV)は、グリシンの酸化を触媒して二酸化炭素、アンモニア、メチレン-THF、及び還元ピリジンヌクレオチドを生じる多酵素複合体である。GCV複合体は、Pタンパク質と言われるグリシンデヒドロゲナーゼ(GcvP)、Hタンパク質と言われるリポイル-GcvH-タンパク質(GcvH)、Tタンパク質と言われるアミノメチルトランスフェラーゼ(GcvT)、及びLタンパク質と言われるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ(GcvL又はLpd)の、4つのタンパク質の構成要素から成る。Pタンパク質は、グリシンからのピリドキサールリン酸依存的なCO2の遊離を触媒し、メチルアミン部分を残す。メチルアミン部分はHタンパク質のリポ酸基に移されるが、Hタンパク質はグリシンの脱炭酸前からPタンパク質に結合している。Tタンパク質はメチルアミン基からのNH3の放出を触媒し、残りのC1ユニットをTHFへ移し、メチレン-THFを形成する。その後、Lタンパク質がHタンパク質のリポ酸成分を酸化し、電子をNAD+に移し、NADHを形成する。
・特許出願WO2007/077041に記述される、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードするMetF、
・メチルトランスフェラーゼをコードするMetH(B12依存性ホモシステイン-N5-メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼ)。
【００７９】
また、セリン生合成に関与する以下の遺伝子の少なくとも一種の過剰発現によっても、副産物であるイソロイシンの生産が低減される。
・特許出願WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserA、
・特許出願WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される、ホスホセリンホスファターゼをコードするserB、
・特許出願WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするserC。
【００８０】
以下の遺伝子の過剰発現は、メチオニンの生産を改善することが既に示されている。
・cysEは、セリンアシルトランスフェラーゼをコードする。WO2007/077041に記述されるように、その過剰発現により、メチオニン生産の増加が起こる。
・metAは、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする。アレルのmetA*は、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードする。優先的には、特許出願WO2005/111202に記述されるmetA*アレルが用いられる。
・thrAは、アスパルトキナーゼ/ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする。アレルのthrA*は、WO2005/111202に記述されるように、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードする。
【００８１】
本発明の特定の実施態様において、遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。本発明の好ましい実施態様において、これらの遺伝子の少なくとも一種が、温度誘導性プロモーターの制御下にある。好ましくは、thrA、cysE、metAの遺伝子の少なくとも一種の発現が、直接的に又は間接的に、誘導性プロモーターの制御下にある。より好ましくは、thrA、cysE及びmetAの遺伝子は、直接的に又は間接的に、誘導性プロモーターの制御下にある。本発明の好ましい実施態様において、thrA遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの直接的な制御下にあり、cysE遺伝子の発現は、thrA遺伝子の誘導的発現の極性効果(polar effect)の下にある。本発明の別の好ましい実施態様において、thrA遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの制御下にあり、cysE及びmetA遺伝子の発現は、thrA遺伝子の誘導的発現の極性効果の下にある。
【００８２】
最も好ましい実施態様において、温度誘導性プロモーターは、PRプロモーターのファミリーに属する。誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子を有するメチオニン生産株は、特許出願WO2011/073122に記述される。
【００８３】
本発明の別の特定の実施態様において、微生物はさらに改変されており、metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA、又はudhAの遺伝子の少なくとも一種の発現が減衰される。
・metJ遺伝子は、特許出願JP2000/157267に示唆されたように、メチオニンレギュロンの下方制御を担うリプレッサータンパク質MetJ (GenBank 1790373)をコードする。
・pykA及びpykF遺伝子は、「ピルビン酸キナーゼ」酵素をコードする。ピルビン酸キナーゼの少なくとも一つ又は両方の発現の減衰により、ホスホエノールピルビン酸(PEP)の消費が減少する。PEPのアベイラビリティの増加は、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、ひいてはメチオニンの前駆体となるアスパラギン酸の重要な前駆体である、オキサロ酢酸の生産を増加させる可能性がある。
・purUは、ホルミル-THFデホルミラーゼ反応を触媒する酵素である、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードする。デホルミラーゼ活性の減衰により、ホモシステインのメチル化に必要なメチル-THFの生産が増加する。脱ホルミル化によりC1代謝産物を失うと、メチオニンに変換することができないホモシステインの生産の増加がもたらされる。WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、ホモシステインはその後、ホモランチオニンの生産をもたらすO-スクシニルホモセリンとホモシステインとの間の反応を触媒することができるシスタチオニンガンマシンターゼ(MetB)酵素の基質になることができる。
・ybdLは、特許出願WO2012/090021に記述されるように、アミノトランスフェラーゼをコードする。
・yncAは、特許出願WO2010/020681に記述されるように、N-アセチルトランスフェラーゼをコードする。
・metEは、特許出願PCT/IB2012/001336に記述されるように、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼをコードする。
・dgsAは、Mlcとしての方がよく知られているが、特許発明WO2013/001055に記述されるように、ホスホトランスフェラーゼ(PTS)及びホスホエノールピルビン酸(PEP)系の酵素をコードする遺伝子の発現を調節する転写デュアルレギュレーターをコードする。
・udhAは、特許出願WO2012/055798に記述されるように、可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする。
【００８４】
本発明のより好ましい実施態様において、メチオニンの搬入が減衰され、メチオニンの流出が強化されている組換え微生物による、主要な炭素源としてのグルコースからのメチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産は、前記微生物における上述の改変の組み合わせによって達成してもよく、例えば以下のとおりである。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化される。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化され、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素(thrA*)をコードするthrA*アレルの発現が強化される。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化され、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素(thrA*)をコードするthrA*アレルの発現が強化され、cysE遺伝子の発現が強化される。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化され、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素(thrA*)をコードするthrA*アレルの発現が強化され、cysE遺伝子の発現が強化され、metF及び/又はmetH遺伝子の発現が強化される。
【００８５】
本発明の特定の態様において、組換え微生物は、以下の遺伝子改変を含む。
・metN、metI、metQ遺伝子が欠失され、ygaZ及びygaH遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される、
・metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG及びpyc遺伝子の発現が強化される、及び、
・metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA、及びyncA遺伝子の発現が減衰される。
【００８６】
本発明の特定の実施態様において、微生物は、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科由来である。
【００８７】
優先的には、微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムである。より優先的には、本発明の微生物は大腸菌である。
【００８８】
「培養条件」
本発明の第二の態様において、方法はメチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化される。以下の工程が含まれる。
・組換え微生物を培養する工程であって、発酵性の炭素源及び硫黄源を含む培地中で、メチオニン搬入が、metN、metI、及びmetQの中の少なくとも一種の遺伝子の発現が減衰されることにより減衰され、メチオニン流出が、ygaZH遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現により強化される工程、及び、
・培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程。
【００８９】
当業者は、本発明による微生物のための培養条件を規定することができる。特に、細菌は20℃〜55℃の間、優先的には、25℃〜40℃の間、より特定すればC.グルタミクムについては約30℃、大腸菌については約37℃の温度で発酵される。
【００９０】
大腸菌については、培地は、M9培地(Anderson, 1946)、M63培地(Miller, 1992)、又はSchaeferら(1999)等によって規定される培地と同一であるか又は類似の組成とすることができる。
【００９１】
C.グルタミクムについては、培地は、BMCG培地(Liebl et al., 1989)又はRiedelら(2001)等によって記述される培地と同一であるか又は類似の組成とすることができる。
【００９２】
本発明の方法において、組換え微生物中で過剰発現されるygaZHホモログ遺伝子は、好ましくはシトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択され、より好ましくはシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する。
【００９３】
本発明の特定の態様によれば、方法は、
a. metN、metI、又はmetQの中から選択される少なくとも一種の遺伝子の欠失、及び
b. ygaZH遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現
を含む組換え微生物を用いて行われる。
【００９４】
この本発明の方法の特定の態様において、前記ygaZHホモログ遺伝子は、好ましくはシトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択され、より好ましくはシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディー由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択される。
【００９５】
本発明の方法において、組換え微生物中で過剰発現されるygaZHホモログ遺伝子は、最も好ましくはシトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー、又はエンテロバクター属の種に由来する。
【００９６】
本発明のある実施態様において、組換え微生物の生育は、培地中で一種以上の無機性基質、特にリン酸塩及び/又はカリウムの制限又は飢餓を受ける。これは、微生物の生育が、供給される無機化学物質の量によって管理される条件であって、その量がそれでもなお弱い生育を可能にするものである、条件を指す。そのような微生物生育の制限は、特許出願WO2009/043372に記述されている。本発明の好ましい実施態様において、培養はリン酸塩制限を受ける。本発明の方法の特定の実施態様において、組換え微生物は、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科由来である。優先的には、組換え微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムであり、より優先的には、本発明の組換え微生物は大腸菌である。
【００９７】
「培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する」という作業は、L-メチオニン及び/又はその誘導体、特にN-アセチルメチオニン(NAM)及びS-アデノシルメチオニン(SAM)、並びに有用である可能性がある全ての他の誘導体、例えばヒドロキシ-メチオニン(又はメチオニンヒドロキシアナログ若しくはMHA)を回収する作業を示す。生産した化合物の回収及び精製のための方法は、当業者に周知である(特に、WO2005/007862、WO2005/059155を参照)。好ましくは、メチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程は、発酵液中のメチオニン及び/又はその誘導体を濃縮する工程を含む。
【００９８】
発酵培地中の生産物の量は、周知の多数の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、又はガスクロマトグラフィー(GC)を用いて決定することができる。例えば、培地中に得られたメチオニンの量は、OPA/Fmoc誘導体化の後に、L-メチオニン(Fluka, Ref 64319)を標準として用いるHPLCによって測定される。NAMの量は、NAM (Sigma, Ref 01310)を標準として用いる屈折率測定法HPLCを用いて決定される。
【実施例】
【００９９】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すものであるが、例示の目的でのみ示されるものと理解されるべきである。上記の開示及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な手段を変更することなく、本発明の様々な変更を行って様々な使用及び条件に適合させることができる。
【０１００】
特に、実施例には改変された大腸菌(E. coli)株が示されるが、これらの改変は、同じ科の他の微生物において容易に行うことができる。
【０１０１】
大腸菌は、腸内細菌科に属し、該科には、グラム陰性、桿状、非芽胞形成で、典型的には全長1〜5 μmの菌が含まれる。ほとんどの菌は動き回るための鞭毛を有しているが、数種類の属は非運動性である。この科の多くの菌は、ヒト及び他の動物の腸内に見出される腸管内菌叢の通常の一部であるが、一方で水中若しくは土壌中に見出されたり、様々な種々の動物及び植物の寄生生物であったりするものもいる。大腸菌は、最も重要なモデル生物の一種であるが、他の重要な腸内細菌科の菌には、クレブシエラ属、特にクレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena)、クレブシエラ・プランティコラ(Klebsiella planticola)、又はクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、及びサルモネラ属が含まれる。
【０１０２】
さらに、メチオニン生産の最適化を、過度の試験を行うことなく大腸菌及びコリネバクテリウム・グルタミクムに適用することができることは、複数の特許出願が指摘している。
【０１０３】
「プロトコル」
複数のプロトコルを用いて、以下の実施例に記述するメチオニン生産株を構築した。
【０１０４】
本発明で用いられるプロトコル１(相同組換えによる染色体の改変及び組換え体の選択)及びプロトコル２(P1ファージの形質導入)は、特許出願WO2013/001055に十分に記述されている。
【０１０５】
［プロトコル３：組換えプラスミドの構築］
組換えDNA技術は、詳しく説明されており、当業者に周知である。
【０１０６】
簡潔に言えば、DNA断片を、(当業者であれば規定することができる)オリゴヌクレオチド及びMG1655ゲノムDNAをマトリックスとして用いてPCR増幅した。DNA断片及び選択したプラスミドを、(当業者であれば規定することができる)適合する制限酵素を用いて消化し、ライゲーションしてその後コンピテントセルを形質転換した。形質転換体を分析して、目的の組換えプラスミドをDNAシーケンシングにより確認した。
【０１０７】
【表３】
2016529900.tif 000012
【０１０８】
［プロトコル４：プラスミドキュアリング］
このプラスミドキュアリング法は、通常はDNAの形質転換に用いられる高電圧エレクトロポレーションに基づく。プラスミドキュアリングに関しては、電気ショック前に細胞にDNAを添加しないこと以外は、原理はかなり同一である(Heery et al, 1989)。
【０１０９】
DNA形質転換技術は、十分に記述されており、当業者に周知である。
【０１１０】
簡潔に言えば、プラスミドを除去する必要がある株を、対数増殖期まで培養した。その後、細胞をペレットにし、滅菌脱イオン水で3回洗浄した。細胞を氷上で5〜10分間インキュベートし、その後2.50kV、25μFの電気パルスを1回かけた(時定数約4.5ms)。1 mLのSOC緩衝液をパルス後ただちに加え、細胞を適切な温度で1〜2時間生育させ、その後プラスミドを取り除くための非選択的培地(株内に維持されるべき他のプラスミドに応じて抗生物質を加える)上にプレーティングした。キュアリングされた細胞を単離した後、プラスミドが存在しないことを確認した。
【０１１１】
「実施例１：L-メチオニン過剰生産大腸菌組換え株におけるL-メチオニン分泌系の過剰発現 ― 株１の構築」
特許出願WO2013/001055(参照として本願に組み込まれる)に記述されるメチオニン生産株１６を用いた。この株は、特許出願WO2013/190343に開示される、metE遺伝子に変異を有している。
【０１１２】
コバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードする遺伝子である、metHを、特許出願WO2007/077041に記述されたものと同じプロモーター及びリボソーム結合部位、並びに細菌人工染色体(pCC1BAC, Epicentre)を用いて、過剰生産させた。より正確にいうと、metH遺伝子及び人工プロモーターを、特許出願WO 2013/001055に記述される株１７に含まれるpCC1BAC型のプラスミドにクローニングした。このプラスミドを、pME1109と名付けた。
【０１１３】
同時に、MetHの再活性化系をコードするfldA及びfpr遺伝子を、これらの天然のプロモーターを用いて、中程度のプラスミドコピー数のpCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)より過剰発現させた。このプラスミドを、pME1089と名付けた。
【０１１４】
第三に、メチオニンのエクスポーターをコードするygaZH遺伝子を過剰発現させた。これらを中程度のプラスミドコピー数のpCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)上に、ygaZの天然のプロモーターを用いてクローニングした。より正確にいうと、ygaZHオペロン及びそのプロモーターを上記のpME1089にクローニングした。このプラスミドを、pME1219と名付けた。
【０１１５】
最後に、プラスミドpME1109及びpME1219を用いて、特許出願WO 2013/001055のメチオニン生産株１６を形質転換し、株１を生じた。
【０１１６】
「実施例２：L-メチオニン過剰生産大腸菌株におけるL-メチオニン取り込み系の欠失 ― 株２、株３、株４、及び株５の構築」
特許出願WO2013/001055のメチオニン生産株１６を、(実施例１に記述した)プラスミドpME1109及びpME1089を用いて形質転換し、株２を生じた。
【０１１７】
株２においてmetNIQオペロンによってコードされるメチオニンインポーターを不活性化させるために、Datsenko & Wanner, 2000に記述される(プロトコル１による)相同組換え法を用いた。したがって、オリゴヌクレオチド、Ome0233/Ome0232 (表１に列挙する配列番号21及び22)を用いて、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットをPCR増幅した。次に、得られたPCR産物を、エレクトロポレーションによってMG1655 metA*11 (pKD46)株に導入した。クロラムフェニコール耐性の形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。確保された株を、MG1655 metA*11 ΔmetNIQ::Cmと表記した。最後に、ΔmetNIQ::Cm欠失を、P1ファージ形質導入によって(プロトコル２により)、MG1655 metA*11 ΔmetNIQ::Cm株から株２へと移転させた。クロラムフェニコール耐性の形質導入体を選択し、ΔmetNIQ::Cm染色体欠失の存在を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより確認した。確保された株を、株３と称した。
【０１１８】
同様の方法で、metN、metI、及びmetQの3つの遺伝子を、特許出願WO2013/001055に記述する株１において欠失させた。この特許出願WO2013/001055由来の株１は、本願明細書において株４と改名され、株５の参照となる。
【０１１９】
上述の株４にmetNIQの欠失を行い、株５を生じた。
【０１２０】
「実施例３：L-メチオニン過剰生産大腸菌株における、L-メチオニン分泌系の過剰発現とL-メチオニン取り込み系の欠失との組み合わせ ― 株６の構築」
ygaZHオペロンによりコードされるメチオニンエクスポーターを過剰生産する株において、metNIQオペロンによりコードされるメチオニンインポーターを不活性化させるために、ΔmetNIQ::Cm欠失を、P1ファージ形質導入によって(プロトコル２により)、MG1655 metA*11 ΔmetNIQ::Cm株からメチオニン生産株１へと移転させた。クロラムフェニコール耐性の形質導入体を選択し、ΔmetNIQ::Cm染色体欠失の存在を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより確認した。確保された株を、株６と称した。
【０１２１】
「実施例４：バイオリアクターでの発酵によるL-メチオニンの生産」
L-メチオニンを生産した株を、流加培養(fedbatch)法を用いて、2.5 Lのリアクター(Pierre Guerin)内での生産条件下で試験した。
【０１２２】
簡潔に言えば、2.5 g.L-1グルコースを含む10 mLのLB培地中で生育させた24時間培養液を用いて、24時間の最少培地(B1a)での前培養に植菌した。これらの培養は、ロータリーシェーカー(200 RPM)中の、50 mLの最少培地が入った500 mLバッフル付フラスコ内で行った。第一の前培養は30℃の温度で実行し、第二の前培養は34℃の温度で実行した。
【０１２３】
第三の前培養工程は、5 mLの濃縮した前培養液を用いて1.2 g.L-1のバイオマス濃度に植菌した200 mLの最少培地(B1a)を満たしたバイオリアクター(Sixfors)内で行った。前培養の温度を、34℃で一定に維持し、pHは10 % NH4OH溶液を用いて自動的に6.8の値に調節された。吸気及び/又は攪拌により、溶存酸素濃度を飽和空気分圧30 %の値に継続的に調節した。回分(batch)培地中のグルコースが枯渇した後、0.7 mL.h-1の初期流量で流加培養を開始し、その後26時間、0.13 h-1の増殖率で指数関数的に増加させ、約20 g.L-1の最終細胞濃度が得られるようにした。
【０１２４】
【表４】
2016529900.tif 000013
【０１２５】
【表５】
2016529900.tif 000014
【０１２６】
続いて、2.5 Lリアクター(Pierre Guerin)に600 mL又は620 mLの最少培地(B2)を満たし、80〜100 mLの間で変動する前培養液量を用いて3,2 g.L-1のバイオマス濃度に植菌した。
【０１２７】
細胞の生育はリン酸塩により制御される。そのため、回分培地B2中の最終リン酸塩濃度を、異なる濃度のKH2PO4、K2HPO4、及び(NH4)2HPO4を加えることで0〜20 mMの間に含まれる値に調節した。同様に、F2培地の最終リン酸塩濃度を、異なる濃度のKH2PO4、K2HPO4、及び(NH4)2HPO4を加えることで5〜30 mMの間に含まれる値に調節した。流加培地中のチオ硫酸濃度を、培養中のこの化合物の枯渇を防ぐように調節することができる。
【０１２８】
【表６】
2016529900.tif 000015
【０１２９】
培養温度を、37℃で一定に維持し、pHをNH4OH溶液(10 %及び28 %)の自動添加により作業値(working value) (6.8)に維持した。初期攪拌速度を、回分培養期の間は200 RPMに設定し、流加培養期の間は最大1000 RPMまで上昇させた。初期空気流量を、回分培養期の間は40 NL.h-1に設定し、流加培養期の開始時に100 NL.h-1まで増加させた。溶存酸素濃度を、攪拌を増加させることにより、20〜40%の間、優先的には30%飽和の値に維持した。
【０１３０】
必要な場合、IPTGを終濃度20 μMで回分培地及び流加培地に加えた。必要な場合、抗生物質をスペクチノマイシンについては50 mg.L-1、クロラムフェニコールについては30 mg.L-1、及びアンピシリンについては100 mg.L-1の濃度で加えた。
【０１３１】
細胞質量が5 g.L-1近くの濃度まで達したら、5 mL.h-1の初期流量で流加培養を開始した。流加溶液を、流量の増加を伴うS字形のプロファイル(sigmoid profile)で注入し、25時間後には24 mL.h-1に達した。正確な流加条件は、式：
【０１３２】
【数１】
2016529900.tif 000016
【０１３３】
[式中、Q(t)は流加の流速(mL.h-1)であり、p1 = 1.80、p2 = 22.4、p3 = 0.27、p4 = 6.50である]
によって計算された。この流速を、全培養を通して、10〜50 %、優先的には20〜30 %の間で増加させた。
【０１３４】
25時間の流加培養後、流加溶液ポンプを止め、グルコース枯渇後に培養を終了させた。
【０１３５】
細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連する代謝物を、屈折率検出器を備えたHPLC(有機酸及びグルコース)を用いて、及びシリル化後にGC-MSを用いて分析した。
【０１３６】
metNIQオペロンの欠失及び/又はygaZHオペロンの過剰発現の組み合わせがメチオニン生産に及ぼす影響を試験した。結果を表８及び表９に示す。
【０１３７】
【表７】
2016529900.tif 000017
【０１３８】
表８に提示された結果は、metNIQオペロンの欠失(株３)が、株２の遺伝的背景ではメチオニン生産にとって何の利益にもならないことを示している。したがって、この遺伝子改変を、株２とは異なる遺伝子背景を有する株４において試験した。このアッセイにより、metNIQオペロンの欠失がメチオニン生産に及ぼす負の影響が示される(以下の表９を参照)。株４及び株５を、特許出願WO2013/001055に記述されるように、2Lリアクター中で培養した。
【０１３９】
【表８】
2016529900.tif 000018
【０１４０】
これらの結果は、C.グルタミクムについて記述された先行文献とは異なり、大腸菌におけるmetNIQオペロンのみの欠失は、遺伝的背景が何であれ、メチオニン生産を強化しないことを示している(株３及び株５)。さらに、株５の能力は、その親株(株４)の能力を下回っている。たとえygaZHの過剰発現によって培養の終了時にメチオニンの生産の増加がもたらされたとしても(株１、表８)、驚くべきことに、metNIQオペロンの欠失とygaZHの過剰発現との組み合わせにより、株６からのメチオニン生産の総合的な能力が強化される。親株を含む種々の遺伝的背景において、metNIQオペロンの欠失は、L-メチオニンの生産能力に対して負であるか又は中立的であることが示されていたので、この結果は、予想されていなかった。
【０１４１】
［メチオニン/グルコース収率(Ymet)の決定］
初期液量に、pHを制御するため及び培養に流加するために加えた溶液の量を加えることにより、並びにサンプリングのために使用した液量及び蒸発により失われた液量を減じることにより、リアクター液量を計算した。
【０１４２】
流加培養の液量を、流加ストックを計量することにより継続的に把握した。その後、注入したグルコースを、注入重量、溶液の密度、及びBrix法により決定したグルコース濃度([グルコース])に基づいて計算した。メチオニン収率を以下のとおり表す。
【０１４３】
【数２】
2016529900.tif 000019
【０１４４】
[式中、メチオニン0及びメチオニンtはそれぞれ開始時及び最終のメチオニン濃度であり、V0及びVtは開始時及びt時点の液量である]
【０１４５】
消費されたグルコースは以下のとおり計算される。
【０１４６】
【数３】
2016529900.tif 000020
【０１４７】
注入されたグルコースt = 流加液量t * [グルコース]
消費されたグルコースt = [グルコース]0 * V0 + 注入されたグルコース − [グルコース]残存 * Vt
[式中、[グルコース]0、[グルコース]、[グルコース]残存はそれぞれ開始時、流加された、及び残存するグルコース濃度である]
【０１４８】
「実施例５：L-メチオニン過剰生産菌の大腸菌株における、L-メチオニン取り込み系の欠失と様々な微生物由来の種々のL-メチオニン分泌系の過剰生産との組み合わせ ― 株７〜株１５の構築」
シトロバクター属の種、ラオウルテラ属の種、赤痢菌属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のygaZHホモログ遺伝子を、株３の遺伝的背景において過剰発現した。
【０１４９】
株３を用いる前に、Heery et al, 1989に記述されるように(プロトコル４に従って)、キュアリングプラスミド法を用いて、プラスミドpME1089を除去した。プラスミドpME1089を有さないがプラスミドpME1109を保持していた、キュアリングされた細胞を選択した。得られた株を、株７と命名した。
【０１５０】
［株８〜株１５の構築 ― 相同性L-メチオニン分泌系の過剰生産、表１０に列挙された属及び種由来のygaZHの過剰発現］
表１０に列挙したygaZHホモログ遺伝子を過剰発現させるために、各組の遺伝子を、大腸菌のygaZH遺伝子の場合と同様に、中程度のコピー数のプラスミドpCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)上に、大腸菌のygaZ遺伝子の天然のプロモーター及び天然のリボソーム結合部位を用いて、クローニングした。より正確にいうと、ygaZHホモログ遺伝子を、上述のpME1089プラスミドにクローニングした。表１１に明記するように、ygaZHホモログ遺伝子は、対応する株のゲノムDNAから増幅したか、又は化学合成し、コドン使用頻度を大腸菌に最適化したか、又はしていない(GeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いたGeneArt(登録商標) Gene Synthesisサービス  ― Lifetechnologiesにより提案されたとおり)。ygaZHホモログ遺伝子を含む、増幅されたDNA断片は、表１１に示す配列番号で開示される。生じたプラスミドを、表１１に述べるとおりに命名した。最後に、各プラスミドを用いて株７を形質転換し、表１１中の「株名」として列挙される、株８〜株１５を得た。
【０１５１】
【表９】
2016529900.tif 000021
【０１５２】
【表１０】
2016529900.tif 000022
【０１５３】
「実施例６：フラスコ試験における発酵によるL-メチオニンの生産」
様々な微生物由来の種々のL-メチオニン分泌系(大腸菌由来のYgaZHと相同性である)の過剰発現と組み合わせたmetNIQオペロンの欠失を有する組換えL-メチオニン生産菌を、小三角フラスコ中で評価した。
【０１５４】
5.5 mLの前培養液を、30℃で21時間、混合培地(10 % LB培地(Sigma 25 %)、2.5 g.L-1グルコース含有、及び90 % 最少培地PC1、表１２)中で増殖させた。これを用いて、50 mL培養に、PC1培地中OD600 0.2まで植菌した。必要な場合は、スペクチノマイシン及びカナマイシンを50 mg.L-1、クロラムフェニコールを30 mg.L-1、並びにゲンタマイシンを10 mg.L-1の濃度で加えた。培養の温度は37℃であった。培地がOD600 5〜7に達したら、細胞外アミノ酸をOPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連する代謝物を、屈折率検出器を備えたHPLC(有機酸及びグルコース)を用いて、及びシリル化後にGC-MSを用いて分析した。
【０１５５】
【表１１】
2016529900.tif 000023
【０１５６】
【表１２】
2016529900.tif 000024
【０１５７】
表１３からわかるように、metNIQオペロンの欠失を保有するL-メチオニン生産菌における様々な微生物由来のygaZHホモログ遺伝子の過剰発現は、大腸菌由来のygaZHを過剰発現する株６により得られる成果と同等か、又はそれよりも良い成果をもたらす。大腸菌以外の他の微生物由来の相同性L-メチオニン分泌系は、細菌の内因性タンパク質に置き替わることができる。
【０１５８】
シトロバクター・コセリ(株８、Ymet=19,6g/g)、シトロバクター・ヤンガエ(株１４、Ymet=19,6g/g)、シトロバクター・フロインディー(株１５、Ymet=19,6g/g)、及びエンテロバクター属の種(株１１、Ymet=19,4g/g)由来のホモログタンパク質YgaZHは、株６(Ymet=18.7g/g)と比較して最も良いL-メチオニン生産収率を示した。
【０１５９】
メチオニン収率を以下のとおり表した。
【０１６０】
【数４】
2016529900.tif 000025
【０１６１】
(参考文献)
【０１６２】
【表１３】
2016529900.tif 000026
【配列表】
2016529900000001.app
【国際調査報告】
2016529900.tif 000027
2016529900.tif 000028