(57)【要約】  本発明は、最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造のために従属栄養条件下で、かつ、光の不在下での発酵によって生産される、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類のバイオマスのコンディショニング方法であって、この方法が、発酵の終わりに直ちにバイオマスの収集、およびコンディショニング前に８時間未満の貯蔵と；７０℃よりも下の温度で、３０秒〜１分３０秒間、このように回収され、貯蔵されたバイオマスのＨＴＳＴ処理と；バイオマスの１容積当たり多くとも３容積の水でのバイオマスの洗浄との工程を含むことを特徴とする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造のために従属栄養条件下で、かつ、光の不在下で生産される、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類のバイオマスのコンディショニング方法であって、前記コンディショニング方法が、
−  発酵の終わりに直ちに前記バイオマスの収集、およびそのコンディショニング前に８時間未満の貯蔵と、
−  ６０〜６８℃の温度で、３０秒〜１分３０秒間、前記このように回収され、貯蔵されたバイオマスの高温／短時間（ＨＴＳＴ）熱処理と、
−  バイオマスの１容積当たり多くとも３容積の水での前記ＨＴＳＴ処理されたバイオマスの洗浄と、
の工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
バイオマスがコンディショニングされ、粉砕される前の前記バイオマスのための貯蔵時間が、３時間未満、好ましくは１時間未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＴＳＴ熱処理が、６５℃±２℃の、好ましくは６５℃の温度で１分間実施されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマスが、バイオマスの１容積当たり１容積の水で洗浄されることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＴＳＴ処理が、前記バイオマスの洗浄の工程の前に実施されることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマスが、６．５〜７、好ましくは６．８の初期ｐＨで、そして６．５〜７の値、好ましくは６．８の値で発酵ｐＨを調整しながら、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の発酵により得られたことを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造のための、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類のバイオマスの生産方法であって、
−  従属栄養条件下で、かつ、光の不在下で、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の発酵によるバイオマスの生産であって、前記発酵の初期ｐＨおよび発酵中のｐＨの調整が、６．５〜７の値で、好ましくは６．８の値で固定されている生産と、
−  請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法による前記バイオマスのコンディショニングと、
を含む方法。
【請求項８】
最適化感覚プロフィルを有する、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の粉末の製造方法であって、
−  請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法による前記バイオマスのコンディショニングと；
−  前記コンディショニング済みバイオマスの粉砕と；
−  前記粉砕バイオマスの乾燥と、
を含む方法。
【請求項９】
請求項８に記載の、最適化感覚プロフィルを有する、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の粉末の製造方法であって、前記コンディショニングの前に、従属栄養条件下で、かつ、光の不在下での、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の発酵によるバイオマスの生産であって、前記発酵の初期ｐＨおよび発酵中の前記ｐＨの調整が、６．５〜７の値で、好ましくは６．８の値で固定されている生産もまた含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造を可能にするクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のバイオマスの生産方法に関する。本発明はそれ故、望ましくない風味を生み出すことなく食品調合物へのこの微細藻類粉末の組み込みを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
歴史的に、成長するために「水および日光のみ」を必要とする、藻類は、食物源であると長い間考えられてきた。
【０００３】
食物に使用することができる幾つかの種の藻類があり、最大のものは、昆布、アオサ（アルバ・ラクティューカ（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ））および種類アマノリ属（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）（日本国で栽培されている）または「ダルス」（パルマリア・パルマータ（Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ））の紅藻類などの「大型藻類」である。
【０００４】
しかしながら、これらの大型藻類に加えて、バイオ燃料または食物でのそれらの用途向けに栽培されている、海洋または非海洋起源の、「微細藻類」、すなわち、光合成または非光合成単細胞微細藻類で代表される他の藻類源もある。
【０００５】
例えば、スピルリナ（アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ））は、食品栄養剤としてのまたは菓子類製品もしくは飲料中へ少量（一般に０．５％重量／重量未満）組み込まれる使用のためにオープンの潟湖で（光栄養条件下に）栽培されている。
【０００６】
ある種のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）などの、他の脂質に富む微細藻類はまた、食品栄養剤としてアジア諸国では非常に人気がある（クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）またはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のオメガ−３−生産微細藻類が挙げられる）。
【０００７】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）型の微細藻類の粉末の製造および使用は、例えば、国際公開第２０１０／１２０９２３号および国際公開第２０１０／０４５３６８号に記載されている。
【０００８】
モノ不飽和油から本質的になる可能性がある、微細藻類粉末の油分画は、従来の食品に多くの場合見いだされる飽和の、水素化油およびポリ不飽和油亜と比較して栄養上のおよび健康上の利点を提供し得る。
【０００９】
前記微細藻類のバイオマスから微細藻類粉末粉を工業的に製造することが望まれる場合、技術的観点からのみならず、製造された粉末の感覚プロフィルの観点からも、かなりの難しさが残っている。
【００１０】
実際に、例えば、屋外池においてまたは光バイオ反応器によって光合成的に栽培された藻類を使って製造された藻類粉末が商業的に入手可能であるが、それらは、濃い緑色（クロロフィルに関連した）および強い、不快な味覚を有する。
【００１１】
食品中にまたは栄養補給剤として調合されてさえも、これらの藻類粉末は常に、視覚的に非魅力的な緑色を食品にまたは栄養補給剤に与え、不快な魚に似た味覚または海洋藻類の味を有する。
【００１２】
さらに、ある種の藍藻類は自然に、土のようなまたはカビ臭い匂いを発生する、ゲオスミン（トランス−１，１０−ジメチル−トランス−９−デカロール）またはＭＩＢ（２−メチルイソボルネオール）などの匂いのある化学分子を生産する。
【００１３】
クロレラ科に関しては、この分野で共通して受け入れられている記述子は、粉末の青い大麦または粉末の青い小麦などの他の青い植物粉末にわずかに似た、「緑茶」の味覚であり、この味覚は、その高いクロロフィル含有量のせいである。
【００１４】
それらの味は通常、それらが、強い味の野菜または柑橘果実ジュースと混合された場合にのみマスクされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２０９２３号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４５３６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
それ故、より多数のおよび多様な食品での前記微細藻類から製造された粉末の使用を可能にする好適な官能的品質のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のバイオマスの製造方法を所有するという満たされない必要性が依然として存在する。なおその上、さらに工業的最適化の主旨で、再現可能な官能的品質のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類を再現性よく提供する方法は非常に有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の方法を考案するために、本出願人会社は先ず、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）バイオマス粉末の様々なバッチの知覚特性を評価するために官能パネルを形成することを選んだ。製造バッチの感覚的記載はその結果、期待に沿って、かつ、再現性よく官能的品質の微細藻類バイオマス粉末の製造を可能にするであろう方法の重要段階の特定を可能にする。
【００１８】
本明細書で以下に実証されるように、従属栄養条件下で、かつ、光の不在下での発酵によって微細藻類バイオマスのその生産を実施する際に、本出願人会社はそれ故、これらの様々なバッチを生み出すために様々なバイオマス発酵および処理パラメータを変えた。本出願人会社は最終的に、製造された各バッチに官能パネルによって与えられる感覚ノートと前記バッチの製造方法を実施するための条件の幾つかとの間の相関を実証することに成功した。
【００１９】
この相関はその結果、本出願人会社が、単独でまたは組み合わせて取り込まれて、最適化感覚プロフィルを有するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）バイオマスの生産を保証するバイオマス発酵および処理を実施するためのパラメータを選択することを可能にした。
【００２０】
本出願人会社はその結果、最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造のための、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類のバイオマスをコンディショニングするための生産方法を提案した。
【００２１】
本発明はそれ故、最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造のために従属栄養条件下で、かつ、光の不在下で生産される、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロ
レラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類のバイオマスのコンディショニング方法であって、このコンディショニング方法が、
−  発酵の終わりに直ちにバイオマスの収集、およびそのコンディショニング前に８時間未満の貯蔵と、
−  ７０℃よりも下の温度で、３０秒〜１分３０秒間、このように回収され、貯蔵されたバイオマスの高温／短時間（ＨＴＳＴ）熱処理と、
−  バイオマスの１容積当たり多くとも３容積の水でのバイオマスの洗浄と、
の工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２２】
好ましくは、バイオマスがコンディショニングされ、そして粉砕される前のバイオマスについての貯蔵時間は３時間未満、好ましくは１時間未満である。
【００２３】
好ましくは、ＨＴＳＴ熱処理は、６０〜６８℃、好ましくは６５℃±２℃、特に６５℃の温度で１分間実施される。
【００２４】
好ましくは、バイオマスは、バイオマスの１容積当たり１容積の水で洗浄される。
【００２５】
好ましい一実施形態では、ＨＴＳＴ処理は、バイオマスを洗浄する工程の前に実施される。
【００２６】
好ましい一実施形態では、コンディショニング済みバイオマスは、６．５〜７、好ましくは６．８の初期ｐＨで、そして６．５〜７の値、好ましくは６．８の値で発酵ｐＨを調整しながら、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の発酵によって得られた。
【００２７】
本発明はまた、最適化感覚プロフィルを有する粉末の製造のための、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類のバイオマスの生産方法であって、
−  従属栄養条件下で、かつ、光の不在下で、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の発酵によるバイオマスの生産であって、発酵の初期ｐＨおよび発酵中のｐＨの調整が、６．５〜７の値で、好ましくは６．８の値で固定されている生産と、
−  本明細書に記載されるような方法によるバイオマスのコンディショニングと
を含む方法に関する。
【００２８】
最後に、本発明はまた、最適化感覚プロフィルを有する、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の粉末の製造方法であって、
−  本明細書に記載されるような方法によるバイオマスのコンディショニングと；
−  コンディショニング済みバイオマスの粉砕と；
−  粉砕バイオマスの乾燥と、
を含む方法に関する。
【００２９】
任意選択的に、本方法はまた、コンディショニングの前に、従属栄養条件下で、かつ、光の不在下で、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の発酵によるバイオマスの生産であって、発酵の初期ｐＨおよび発酵中のｐＨの調整が、６．５〜７の値で、好ましくは６．８の値で固定されている生産を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の大群）−発酵ｐＨの影響を示す。
【図２】様々なバッチの感覚プロフィルを表すＰＣＡの相関の円−発酵ｐＨの影響を示す。
【図３】試験されたプレ粉砕組み合わせを示す。
【図４】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の大群）−バイオマスが粉砕される前のバイオマスのコンディショニング工程の影響を示す。
【図５】様々なバッチの感覚プロフィルを表すＰＣＡの相関の円−バイオマスが粉砕される前のバイオマスのコンディショニング工程の影響を示す。
【図６】試験された他のプレ粉砕組み合わせを示す。
【図７】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の大群）−バイオマスが粉砕される前のバイオマスのコンディショニング工程の影響を示す。
【図８】様々なバッチの感覚プロフィルを表すＰＣＡの相関の円−バイオマスが粉砕される前のバイオマスのコンディショニング工程の影響を示す。
【図９】熱処理条件の関数としての１分の熱処理後の残存生存細胞の百分率を示す。
【図１０】（ＨＴＳＴ）熱処理前後のバイオマスから抽出される上澄み分画の組成の比較を示す。
【図１１】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の大群）−熱処理の影響を示す。
【図１２】様々なバッチの感覚プロフィルを表すＰＣＡの相関の円−熱処理の影響を示す。
【図１３】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の大群）−洗浄の影響を示す。
【図１４】様々なバッチの感覚プロフィルを表すＰＣＡの相関の円−洗浄の影響を示す。
【図１５】ＰＣＡの様々なバッチのグラフ表現（点の大群）−バイオマスの収穫中の酸性化の影響を示す。
【図１６】様々なバッチの感覚プロフィルを表すＰＣＡの相関の円−バイオマスの収穫中の酸性化の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の目的のためには、微細藻類粉末は、食品調合物または味見調合物（例えば、本明細書に記載されるようなアイスクリームまたは味見レシピ）での官能パネルによるその評価が、この微細藻類粉末を含有する前記食品調合物の官能的品質を損なうオフノートが不在であると結論する場合には、「最適化感覚プロフィル」を有する。
【００３２】
これらのオフノートは、感覚を喚起するために必要とされる感覚刺激の最小値に相当する知覚閾値によって特徴づけられる望ましくない特有の匂い分子および／または芳香分子の存在に関連することができる。
【００３３】
「最適化感覚プロフィル」はその結果、４つの感覚判定基準（外観、質感、味および風味）の尺度評価に関して最良のスコアを得ることによって官能パネルにより反映される。
【００３４】
本発明の目的のためには、用語「微細藻類粉末」は、その最も幅広い解釈で、そして、例えば、微細藻類バイオマスの複数の粒子を含む組成物を意味すると理解されるべきである。微細藻類バイオマスは微細藻類細胞に由来し、その細胞は、全体細胞であっても溶解細胞であっても、または全体細胞と溶解細胞との混合物であってもよい。
【００３５】
国際公開第２０１０／１２０９２３号などの、ある数の先行技術文献は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）微細藻類バイオマスの生産方法および食品での使用を記載している。
【００３６】
その中で本発明において核心である微細藻類は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、
より特にクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、さらにより特に、当業者にそれ自体公知の任意の方法によって、（培養が、当業者に周知のある種の操作条件下で暗やみの中で実施されるためか、クロロフィル顔料をもはや生産しないように突然変異したためかのいずれかのために）クロロフィル顔料が除かれたクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微細藻類である。
【００３７】
この国際公開第２０１０／１２０９２３号に記載されている発酵法はしたがって、発酵のための条件および生産されたバイオマスの処理が変わる場合に、可変の官能的品質のある数の微細藻類粉末の製造を可能にする。
【００３８】
本出願人会社はしたがって、次のパラメータ：
−  発酵培地の初期ｐＨ、
−  発酵中のｐＨ、
−  発酵必須の収穫中の酸性化、
−  バイオマスの熱処理（ＨＴＳＴと言われる処理）、
−  バイオマスの洗浄、
−  バイオマスの粉砕、
−  ｐＨの調整、
−  低温殺菌、
−  乾燥、および
−  このようにして得られた粉末の貯蔵
の影響を変え、解析することを選んだ。
【００３９】
本明細書で以下に実証されるように、微細藻類粉末の感覚プロフィルを最適化するためにバイオマスのコンディショニング方法の重要な工程は、下記である：
−  発酵の終わりに直ちにバイオマスの収集、およびその粉砕に先行するそのコンディショニングの前に８時間未満の貯蔵、
−  ７０℃よりも下の温度で、３０秒〜１分３０秒間実施される、このようにして回収され、そして貯蔵されたバイオマスのＨＴＳＴ処理、
−  バイオマスの１容積当たり多くとも３容積の水でのＨＴＳＴ処理バイオマスの洗浄。
【００４０】
したがって、バイオマスは、その後の熱処理および／または洗浄工程を受けるためにできるだけ迅速に集められる。貯蔵はできるだけ短くなければならないことが確認された。好ましくは、貯蔵は、８、７、６、５、４、３、２または１時間未満続く。好ましくは、バイオマスがコンディショニングされ、そして粉砕される前のバイオマスのための貯蔵時間は、３時間未満、好ましくは１時間未満である。理想的には、貯蔵工程は存在せず、集められたバイオマスは直ちに、その後の熱処理および／または洗浄工程にかけられる。
【００４１】
ＨＴＳＴ熱処理はまた微細藻類粉末の感覚プロフィル、それ故官能的品質に影響を及ぼすことがまた確認された。したがって、この温度は好ましくは、７０℃以下、そして５０℃よりも上である。それは、５５〜７０℃、好ましくは６０〜６８℃、好ましくは６５℃であり得る。処理時間は好ましくは１分である。
【００４２】
洗浄は、微細藻類粉末の感覚プロフィル、それ故官能的品質を同時に改善しながら最適化され得ることがまた示された。したがって、好ましくは、バイオマスは、バイオマスの１容積に対して３、２．５、２、１．５または１容積の水で洗浄される。一実施形態では、１容積の水が、バイオマスの１容積に対して使用されるであろう。
【００４３】
最後に、コンディショニング工程の順番は微細藻類粉末の感覚プロフィル、それ故官能
的品質に影響を及ぼすことが示された。特に、バイオマスを洗浄する工程の前にＨＴＳＴ熱処理を実施することが好ましい。
【００４４】
コンディショニング済み微細藻類バイオマスは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、好ましくはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の微細藻類の、従属栄養条件下で、かつ、光の不在下での、発酵によって製造されたバイオマスである。
【００４５】
任意選択的に、使用される微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、クロレラ・ソロキニアマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｍａ）、クロレラ・ルテオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・レイシグリイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレア・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ）、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、パラクロレア・ベイゼリンキイ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）およびプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）から、非網羅的に、選ぶことができる。
【００４６】
好ましくは、本発明に従って使用される微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種に属する。この好ましいモードによれば、微細藻類粉末の製造用を意図される藻類は、ＧＲＡＳステータスを有する。食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって１９５８年に生み出された、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）概念は、食品に添加され、そして専門家のパネルによって無害であると見なされる物質またはエキスの規制を可能にする。
【００４７】
発酵条件は、当業者に周知である。用いられるべき適切な培養条件は、Ｉｋｕｒｏ  Ｓｈｉｈｉｒａ−ＩｓｈｉｋａｗａおよびＥｉｊｉ  Ｈａｓｅによる論文、「Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ」，Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５，１９６４に特に記載されている。
【００４８】
この論文は特に、色グレード（無色、黄色、黄色がかった緑色、および緑色）を全て、窒素および炭素源ならびに比率を変えることによりクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）によって生み出し得ることを記載している。特に、「色褪せた」および「無色」細胞は、グルコースに富み、そして窒素に乏しい培地を使用して得られる。
【００４９】
無色細胞と黄色細胞との区別がこの論文で行われている。さらに、過剰のグルコースおよび制限された窒素で培養される色褪せた細胞は、高い増殖速度を有する。さらに、これらの細胞は、高い量の脂質を含有する。
【００５０】
Ｈａｎ  Ｘｕ，Ｘｉａｏｌｉｎｇ  Ｍｉａｏ，Ｑｉｎｇｙｕ  Ｗｕによるもの、「Ｈｉ
ｇｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｉｃｒｏａｌｇａ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２６，（２００６），４９９−５０７などの、他の論文は、すなわち、光の不在下での、従属栄養培養条件が、微細藻類細胞中の脂質の含有量が高いバイオマスの増加を得ることを可能にすることを示している。
【００５１】
固体および液体増殖培地は一般に、文献で入手可能であり、多種多様の微生物菌株向けに好適である特定培地の調製に関する推奨は、例えば、ｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／、その藻類菌株保存のためにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ（ＵＴＥＸ）によって維持されているウェブサイトでオンラインで見いだすことができる。
【００５２】
それらの一般知識および上述の先行技術の観点から、微細藻類細胞の培養に関与する当業者は完全に、好ましくは脂質に富む、好適なバイオマスを得るために培養条件を調整することができるであろう。
【００５３】
特に、発酵プロトコルは、国際公開第２０１０／１２０９２３号に全く大まかに記載されているものに基づいて明確に定めることができる。
【００５４】
本発明によれば、微細藻類は、そのようなものとしてバイオマスを生産するために液体培地で培養される。
【００５５】
バイオマスの生産は、発酵槽（またはバイオリアクター）で実施される。バイオリアクター、培養条件、ならびに従属栄養増殖および増殖方法の具体的な例は、微生物増殖および脂質のおよび／またはタンパク質生産の効率を向上させるために任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【００５６】
特定の一実施形態では、発酵は、グルコース流量が３〜１０ｇ／Ｌの残存グルコース濃度を維持するように調節される状態で、供給回分モードで実施される。
【００５７】
グルコース供給段階中、培地中の窒素含有量は、３０％、４０％、５０％または６０％の量で脂質の蓄積を可能にするように好ましくは制限される。発酵温度は、好適な温度、好ましくは２５〜３５℃、特に２８℃に維持される。溶解酸素は、発酵槽の曝気、逆圧および攪拌を制御することによって最低３０％に好ましくは維持される。
【００５８】
好ましい一実施形態では、発酵中のｐＨは、最終製品の官能的品質に影響を及ぼすことが示された。したがって、発酵の初期ｐＨは、６．５〜７に、好ましくは６．８の値に固定され、それは次に発酵中、６．５〜７の値に、好ましくは６．８の値に調整される。生産発酵時間は、３〜６日、例えば４〜５日である。
【００５９】
好ましくは、得られるバイオマスは、約５０乾燥重量％の脂質含有量、１０乾燥重量％〜５０乾燥重量％の繊維含有量、２乾燥重量％〜１５乾燥重量％のタンパク質含有量、および１０重量％未満の糖含有量で、１３０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌの濃度を有する。
【００６０】
次に、発酵の終わりに得られるバイオマスは、発酵培地から収穫され、上に記載されたようにコンディショニング方法にかけられる。
【００６１】
コンディショニングの後に、バイオマスは微細藻類粉末へ変換される。微細藻類粉末を製造するための主要工程は特に、粉砕、均質化および乾燥を含む。
【００６２】
微細藻類粉末は、機械的に溶解させられ、そして均質化された濃縮微細藻類バイオマスから製造することができ、ホモジネートはそのとき、噴霧乾燥またはフラッシュ乾燥させられる。
【００６３】
微細藻類粉末の製造のために使用されるバイオマス細胞は好ましくは、それらの油または脂質を解放するために溶解させられる。細胞壁および細胞内構成要素は、例えば、ホモジナイザーを用いて、粉砕されるかまたは粉状にされて、非凝集細胞粒子または破片になる。好ましくは、結果として生じる粒子は、５００μｍ未満、１００μｍまたは１０μｍ以下さえの平均サイズを有する。
【００６４】
溶解細胞はまた乾燥させられてもよい。例えば、細胞を溶解させるために圧力破壊器を用いて制限オリフィスを通して細胞含有懸濁液をポンプ送液することができる。高圧（１５００バールまで）、引き続きノズルを通しての即座の膨張が適用される。細胞は、３つの異なるメカニズム：バルブ中への突入、オリフィスでの液体の高い剪断、および細胞を破裂させる、出口での圧力の急降下によって破壊することができる。Ｎｉｒｏホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ）（または任意の他の高圧ホモジナイザー）を、細胞を破壊するために用いることができる。高圧（約１５００バール）下での藻類バイオマスのこの処理は一般に、細胞の９０％超を溶解させ、粒子のサイズを５μ未満まで減らす。好ましくは、かけられる圧力は、９００バール〜１２００バール、特に１１００バールである。
【００６５】
さらに、そして溶解細胞の百分率を上げるために、微細藻類バイオマスは、高圧ダブル処理、またはさらにより多く（トリプル処理など）を受けてもよい。好ましくは、ダブル均質化は、溶解細胞の百分率を５０％超、７５％超または９０％超に上げるために用いられる。約９５％の溶解細胞の百分率がこのダブル処理によって観察されている。
【００６６】
微細藻類細胞の溶解は、任意選択であるが、脂質に富む（特に１０％超の）粉末が望まれる場合には好ましい。したがって、微細藻類粉末は任意選択的に、非溶解細胞の形態にあり得る。
【００６７】
好ましくは、少なくとも部分溶解が望ましい、すなわち、微細藻類粉末は、部分溶解細胞の形態にあり、２５％〜７５％の溶解細胞を含有する。好ましくは、最大のまたさらには全部の溶解が望ましい、すなわち、微細藻類粉末は、強くまたさらには完全に溶解した細胞の形態にあり、８５％以上、好ましくは９０％以上の溶解細胞を含有する。したがって、微細藻類粉末は、９５％超の粉砕度の極粉砕形態までの非粉砕形態にあることができる。具体的な例は、５０％、８５％または９５％、好ましくは８５％または９５％の細胞溶解の粉砕度を有する微細藻類粉末に関する。
【００６８】
あるいは、ボールミルが用いられてもよい。このタイプのミルでは、細胞は、小さい研磨粒子入りの懸濁液中でかき混ぜられる。細胞の破壊は、剪断力、ビーズ間での粉砕、およびビーズとの衝突によって引き起こされる。実際に、これらのビーズは、細胞内容物をそこから解放するように細胞を破壊する。適切なボールミルの記載は、例えば、米国特許第５，３３０，９１３号明細書に与えられている。
【００６９】
任意選択的に起始細胞よりも小さいサイズの、粒子の懸濁液がしたがって、「水中油型」エマルジョンの形態で得られる。
【００７０】
このエマルジョンは次に、噴霧乾燥させることができ、水は排除され、細胞破片および脂質を含有する乾燥粉末を残す。乾燥後に、粉末の含水量または水分含量は、一般に１０
重量％未満、好ましくは５重量％未満、より好ましくは３重量％未満である。
【００７１】
好ましくは、微細藻類粉末は、顆粒の形態で製造される。微細藻類粉末顆粒は、塔の底部に置かれた移動ベルトに粒子を導く平行流れ塔での高圧噴霧ノズルを用いる、特定の噴霧乾燥法によって得ることができる。材料は次に、多孔質層としてポスト乾燥および冷却域を通って運ばれ、それらの域は、ベルトの終わりに壊れる、ケーキのそれのような、クランチー構造をそれに与える。材料は次に、所望の粒度を得るために加工される。この噴霧乾燥原理に従って、藻類粉末の造粒を実施するために、会社ＧＥＡ  Ｎｉｒｏによって販売されるＦｉｌｔｅｒｍａｔＴＭ噴霧乾燥機または会社Ｔｅｔｒａ  Ｐａｋによって販売されるＴｅｔｒａ  Ｍａｇｎａ  Ｐｒｏｌａｃ  ＤｒｙｅｒＴＭ乾燥システムを例えば用いることができる。
【００７２】
好ましい一実施形態では、コンディショニング方法の後で、微細藻類粉末顆粒の製造方法は、次の工程を含んでもよい：
１）１５乾燥重量％〜４０乾燥重量％の固形分の微細藻類粉末のエマルジョンを調製する工程、
２）このエマルジョンを高圧ホモジナイザーへ導入する工程。エマルジョンのこの高圧均質化は、２段階装置、例えば、第１段階で１００〜２５０バール、および第２段階で１０〜６０バールの圧力の、会社ＡＰＶによって販売されるＧａｕｌｉｎホモジナイザーで成し遂げることができる、
３）そのベースに移動ベルトを、そしてその上方部に高圧ノズルを備えた垂直噴霧乾燥機で、同時に、
ａ）噴霧ノズルのレベルでかけられる圧力を、１００バール超、好ましくは１００〜２００バール、より好ましくは１６０〜１７０バールの値に、
ｂ）入口温度を、１５０℃〜２５０℃、好ましくは１８０℃〜２００℃に、そして
ｃ）この噴霧乾燥域の出口温度を、６０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜１１０℃、より好ましくは６０℃〜８０℃に
調整しながら、噴霧する工程、
４）移動ベルト上の乾燥域の入口温度を、４０〜９０℃、好ましくは６０℃〜９０℃に、そして出口温度を、４０℃〜８０℃に調整する工程、および冷却域の入口温度を、１０〜４０℃、好ましくは１０℃〜２５℃の温度に、そして出口温度を、２０℃〜８０℃、好ましくは２０℃〜６０℃に調整する工程、
５）このようにして得られた微細藻類粉末顆粒を集める工程。
【００７３】
本発明によれば、当業者に公知の任意の手段によって発酵培地から抽出されたバイオマスは次に：
−  （例えば遠心分離によって）濃縮される、
−  任意選択的に、標準的な防腐剤（例えば、安息香酸ナトリウムおよびソルビン酸カリウム）を添加することによって保存される、
−  細胞粉砕される。
【００７４】
本発明は、例示的であり、そして非限定的であることを意図する、次の実施例からより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【００７５】
実施例１．クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）バイオマス粉末の様々なバッチの製造
Ａ．標準プロトコルの説明：バイオマス生産から粉末製造まで
【００７６】
１．発酵
発酵プロトコルは、国際公開第２０１０／１２０９２３号に全く大まかに記載されているものから改作される。
【００７７】
生産発酵槽に、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の前培養物を植菌する。植菌後の容積は、９０００Ｌに達する。
【００７８】
使用される炭素源は、３分間１３０℃で滅菌された５５％重量／重量グルコースシロップである。
【００７９】
発酵は、グルコース流量が３〜１０ｇ／Ｌの残存グルコース濃度を維持するように調節される状態で、供給回分モードで実施する。
【００８０】
生産発酵時間は４〜５日である。
【００８１】
発酵の終わりに、細胞濃度は１８５ｇ／Ｌに達する。
【００８２】
グルコース供給段階中に、５０％の量で脂質の蓄積を可能にするように培地中の窒素含有量を制限する。
【００８３】
発酵温度を２８℃に維持する。
【００８４】
植菌前の発酵ｐＨを６．８に調整し、次に発酵中この同じ値に調整する。
【００８５】
溶解酸素は、発酵槽の曝気、逆圧および攪拌を制御することによって最低３０％に維持する。
【００８６】
２．バイオマスコンディショニング
発酵は、７５℃で１分間高温／短時間（「ＨＴＳＴ」）域で熱処理し、６℃に冷却しなければならない。
【００８７】
バイオマスを次に、バイオマスの１容積に対して６容積の水の希釈率で、脱炭酸飲料水で洗浄し、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｆｅｕｘ  ５１０を用いる遠心分離によって濃縮する。
【００８８】
バイオマスを次に、７５％のリン酸でｐＨ４に酸性化し、次に防腐剤（５００ｐｐｍの安息香酸ナトリウム／１０００ｐｐｍのソルビン酸カリウム）を添加する。
【００８９】
３．バイオマス粉砕
バイオマスを次に、直径０．５ｍｍのケイ酸ジルコニウムボールを用いるＮｅｔｚｓｃｈ  ＬＭＥ５００ボールミルで粉砕する。
【００９０】
目標粉砕度は８５％〜９５％である。
【００９１】
生成物は、貯蔵段階中にそして専用の交換器を使ったオンライン冷却によってこのプロセスの全体にわたって冷たく保つ。
【００９２】
酸化防止剤（１５０ｐｐｍ／乾燥のアスコルビン酸および５００ｐｐｍ／乾燥のトコフェロールの混合物）を、酸化による分解の予防法として添加する。
【００９３】
媒体を水酸化カリウムでｐＨ７に調整する。
【００９４】
４．粉末の乾燥
生成物を次に、乾燥操作とともにオンラインで３分間７７℃で低温殺菌する。
【００９５】
乾燥操作は、サイクロン付きＦｉｌｔｅｒｍａｔ  ＦＭＤ１２５で実施する。ノズル圧力は、１６０〜１７０バールである。
【００９６】
Ｂ．官能パネルのおよびバイオマスから得られる微細藻類粉末の官能的品質の評価を可能にする記述子の定義
一連の１４人の個人をこうして、次の記述子を用いて、生産された様々なバイオマスバッチを評価するために集めた：
【００９７】
【表１】
2016526384.tif 000002
【００９８】
本出願人会社は次に、味見マトリックスが次の組成から有利にも構築されることを見いだした：
−  ７％の微細藻類粉末
−  １％の粒状砂糖
−  ０．２５％の家庭用バニラ調味料
−  ９１．７５％のスキムミルク。
【００９９】
この混合物を、均質な混合物が得られるまで（約２０秒）浸漬ミキサーで均質化し、次に水浴中で５分間７５℃で加熱する。
【０１００】
各味見セッションで、４〜５つの生成物が、微細藻類粉末基準バッチ１と比較して各記述子に関して評価される。
【０１０１】
生成物を全て、以下の方法で１から９までの範囲の尺度で、次々に評価する：
１の値：評価される記述子が、生成物中に存在しない；
５の値：評価される記述子が、基準生成物１に関すると全く同じように生成物中に存在する；
９の値：評価される記述子が、生成物中に大いに存在する。
【０１０２】
基準バッチ１は、それが全てのこれらの記述子を「満たす」感覚プロフィルを有するという意味では適合する微細藻類粉末である。
【０１０３】
好ましくは、基準バッチ１は、最適化感覚プロフィルを有する微細藻類粉末と見なされ
るべきではない：それは、特に、試験された記述子全てに関して５のノートを有する、「満足できる」と官能パネルによって認められた微細藻類粉末である。
【０１０４】
微細藻類粉末の他のバッチはそれ故、この基準バッチ１のどちらの側にも官能パネルによって分類されるであろう。
【０１０５】
好ましくは、それが、特に味および風味の、芳香ノートに関連する記述子を満たさないので「大いに許容できない」と見なされる基準バッチ２もまた、含められる。このバッチはそれ故、基準バッチ１からできるだけ離れている。
【０１０６】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、記述子の識別能力を評価するために実施される（その記述子  Ｆｉｓｈｅｒ試験−タイプ−３  ＡＮＯＶＡ−に関連したｐ−値は、モデル記述子における粉末影響について０．２０未満である〜粉末＋判断）。
【０１０７】
粉末影響は、記述子の識別能力として解釈される：影響が全くない場合（臨界確率＞０．２０）、粉末は、この判定基準に従って識別されなかった。この臨界確率が小さければ小さいほど、記述子はより識別力がある。
【０１０８】
主成分分析（ＰＣＡ）を次に、粉末の官能マッピング、そして記述子全てに関する粉末全ての同時表現を得るために実施する。
【０１０９】
データ処理ソフトウェア
分析は、Ｒソフトウェア（自由に売買される）を用いて実施した：
Ｒバージョン  ２．１４．１（２０１１−１２−２２）
版権（Ｃ）２０１１  Ｔｈｅ  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ
ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０
プラットフォーム：ｉ３８６−ｐｃ−ｍｉｎｇｗ３２／ｉ３８６（３２−ビット）
【０１１０】
このソフトウェアは、計算機能を含有するモジュールの装填を必要とする作業環境である。
【０１１１】
この研究に用いられるモジュールは、下記である：
−  ＰＣＡのためには：Ｐａｃｋａｇｅ  ＦａｃｔｏＭｉｎｅＲバージョン  １．１９
−  ＡＮＯＶＡのためには：Ｐａｃｋａｇｅ  ｃａｒバージョン  ２．０−１２
【０１１２】
Ｃ．発酵ｐＨの影響
発酵ｐＨ条件は従来、発酵ｐＨが６．８の値（クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）属の微細藻類について当業者に公知の最適増殖のｐＨ）に固定されるべきであるとの前提からスタートするが、微細藻類粉末の官能的特性へのこのｐＨ値の影響が研究されていないか確立されていないかのいずれかの状態で、標準プロトコルに明確に定められている。
【０１１３】
粉末バッチの２つのシリーズはそれ故、２つの中性（６．８）および酸性（５．２）ｐＨ条件で製造された、バイオマスから製造する。５．２のこの値は、細菌学上の制約を考慮に入れるために選ばれた（酸性ｐＨは、汚染バクテリアの増殖にとって比較的好ましくない）。
【０１１４】
下の表Ｉは、これらの２つのｐＨ値で生産されたバッチの基準を示す。
【０１１５】
【表２】
2016526384.tif 000003
【０１１６】
これらのバッチのそれぞれを次に、上に示された記述子に従って官能パネルによって評価する。
【０１１７】
８つの異なるバッチ（バッチ２１、バッチ２３、バッチ２４、バッチ３１、バッチ５３、バッチ６１、バッチ１１１およびバッチ１３１）を、上記の方法に従って分析した。
【０１１８】
「バター／乳製品」および「野菜の後味」記述子に関する２つの例をここに示す。
【０１１９】
【表３】
2016526384.tif 000004
【０１２０】
研究された２つの記述子についての粉末影響に関連した臨界確率は０．２未満である：２つの記述子はそれ故識別力がある。臨界確率は、「バター／乳製品」記述子に関してよりも、「野菜の後味」記述子に関して小さく、それは、より大きい差が、第２判定基準に関してよりも第１判定基準に関して粉末間で観察されることを意味する。
【０１２１】
下の表ＩＩは、記述子全てに関する粉末および判断影響について得られた臨界確率を合計する。
【０１２２】
【表４】
2016526384.tif 000005
【０１２３】
記述子は全て識別力があり：それらは全て、ＰＣＡを確立するために取っておかれる。
【０１２４】
芳香は粉末の本質的な判定基準であるので、ＰＣＡは、風味のみ（キノコ、穀類、野菜の後味、乳製品、酸敗した）に関連する記述子に関して実施した。このＰＣＡのグラフ表現は図１および図２である。
【０１２５】
ＰＣＡの第１軸は情報の７５％超をまとめているので、それは、我々が「可変の／分類」として用いるこの軸上の生成物の座標である。この分類はそれ故、生成物間の感覚距離について明らかに説明する。
【０１２６】
この方法は、様々な微細藻類粉末の官能的品質の分類を確立することを可能にし、それは、次の通り表すことができる：
一方では、バッチ１１１、３１、２１、２３および１３１と、他方では、バッチ２４、５３および６１との間に明らかな分離ありで、バッチ１１１＞バッチ３１＞バッチ２１＞バッチ２３＞基準バッチ１＞バッチ１３１＞バッチ２４＞バッチ５３＞バッチ６１＞基準バッチ２。
【０１２７】
全体的な観点から、パネルは、バッチ１１１、３１、２１、２３および１３１が許容できる、そしてバッチ２４、５３および６１が許容できないと判断した。
【０１２８】
これらの結果はそれ故、生成物の許容性について全体に許容できない後味の存在への発酵ｐＨの影響を明らかに例示する。
【０１２９】
ｐＨ５．２では、感覚プロフィルは、体系的に野菜の後味を有し、一方、ｐＨ６．８では、感覚プロフィルは、有意な野菜の後味なしに、全体的により中立である。
【０１３０】
初めて読んだとき、それ故、６．８の値に発酵ｐＨを調整することが、好適な、またさらには最適化された、感覚プロフィルを有する微細藻類粉末（バッチ１１１）の製造のための重要な判定基準であるように思われる。
【０１３１】
しかしながら、ｐＨ６．８で生産されたバッチの官能的ばらつきを考えると、ｐＨが観察される影響に関与している唯一のパラメータではないことが指摘されなければならない。
【０１３２】
Ｄ．製造された粉末の官能的品質へのバイオマスの粉砕前のバイオマスのコンディショニングの工程の影響の測定
バイオマスの粉砕前のバイオマスのコンディショニング（プレ粉砕）の２つの主要な工程、ＨＴＳＴ熱処理および洗浄の影響をまた研究する。
【０１３３】
上記の標準方法の工程１に従ってｐＨ６．８で生産された同じバイオマスからスタートして、バイオマスのコンディショニングの工程を、４つの異なる組み合わせに従って実施した（図３）。
【０１３４】
前記工程は、４バッチの製造を可能にした：Ｎｏ．１〜４：
−  組み合わせＮｏ．１は、ＨＴＳＴ処理も洗浄もなしの対照である。
−  組み合わせＮｏ．２：洗浄のみ
−  組み合わせＮｏ．３：ＨＴＳＴのみ
−  組み合わせＮｏ．４：洗浄前のＨＴＳＴ。
【０１３５】
粉末の４つのバッチを、これらの４つの組み合わせに従って製造する。工程の残りは、各シリーズに共通であり、官能分析用の試料をコンディショニングすることを可能にする。下の表ＩＩＩは、このセットの生成物に関して識別力がある（粉末影響に関して０．２未満のｐ−値）記述子のリストを示す。
【０１３６】
【表５】
2016526384.tif 000006
【０１３７】
主成分分析を、製造された様々な粉末間の差を（基準１として選択された粉末、すなわち、上に説明されたように、特に、試験された記述子全てに関して５のノートを有する、「満足できる」と官能パネルによって認められた微細藻類粉末と比較して）示すために実施する。
【０１３８】
結果を図４および図５に示す。
【０１３９】
以下が観察される：
−  基準粉末１は、製造された４つのバッチよりも甘さが少なく、より着色しており、コーティングがより多い；
−  粉末１および粉末３は両方とも最も甘く；洗浄はそれ故、生成物の中立性を確保するための重要な工程であり；
−  粉末１および粉末２は後味を有し、それは、ＨＴＳＴ処理の利点を示す。これらの２つの粉末に関して、パネルは、以前には決して遭遇されなかった、次の通り記載されている、異なる芳香を指摘している：ヨーグルトの酸味、「ハーブの」、苦味、化学薬品の、スパイシー、これは、粉末２に関してよりも粉末１に関してより強く／特徴的である。
【０１４０】
洗浄工程がＨＴＳＴ熱処理操作の後に追加される場合、試料の感覚中立性は向上し、甘さノートが低下する。
【０１４１】
粉砕前にバイオマスのＨＴＳＴの工程と次に洗浄の工程とを統合する組み合わせはしたがって、「粗」バイオマスに特徴的なノートを排除することによって、その中立性を向上させることによって、および甘さノートを低下させることによって最終製品の官能的特性を向上させることを可能にする。
【０１４２】
追加の組み合わせを、「プレ粉砕」法の感覚的影響の特性評価を精緻化するために試験した。図６
【０１４３】
ここで、ＨＴＳＴ操作と洗浄操作とを逆さにする：
組み合わせ４：ＨＴＳＴ、次に洗浄（上の同じ組み合わせ）
組み合わせ５：洗浄後にＨＴＳＴ。
【０１４４】
下の表ＩＶは、このセットの生成物に関して識別力がある（粉末影響に関して０．２未満のｐ−値）記述子のリストを示す。
【０１４５】
【表６】
2016526384.tif 000007
【０１４６】
主成分分析を、製造された２つの異なる粉末間の差を（対照：基準バッチ１とさらに比べて）示すために実施する。
【０１４７】
結果を図７および図８に示す。
【０１４８】
２つの工程が逆さにされる場合、ＨＴＳＴ前の洗浄（組み合わせ５）に相当する微細藻類粉末は、キノコ／穀類および甘さの観点からより強い芳香を有する。
【０１４９】
さらに、パネリストは、生成物が「スパイシー」であるとコメントした。
【０１５０】
組み合わせ４はこの場合には、食品用途においてより有利なそのより中立的な感覚プロフィルのために好ましい。
【０１５１】
Ｅ．バイオマスの品質への熱処理それ自体の影響
熱処理操作は、バイオマスの特性に影響を及ぼす細胞不活性化をもたらす。
【０１５２】
熱処理条件の関数としての百分率細胞不活性化（１分の熱処理後の残存生存細胞の％として表される）を図９に示す。
【０１５３】
１分続く熱処理について、９０％超の百分率不活性化が５０℃からスタートして達成される。
【０１５４】
細胞不活性化には、細胞外培地への細胞内可溶性物質の解放の現象が同伴する。この現象は、恐らく側壁透過性に関係している。
【０１５５】
細胞外培地の固形分の増加に関係した、細胞純度の低下が一般に、バイオマスの熱処理後に観察される（図１０）。解放された可溶性物質は主として、スクロースと、より少ない程度に、塩およびタンパク質とからなる。
【０１５６】
熱処理条件が変えられる実験設計を作成した。
【０１５７】
下の表は、熱処理（ＨＴＳＴ）条件を変えながら製造されたバッチを示す。
【０１５８】
【表７】
2016526384.tif 000008
【０１５９】
下の表Ｖは、このセットのバッチに関して識別力がある（生み出される影響に関して０．２未満のｐ−値）記述子のリストを示す。
【０１６０】
【表８】
2016526384.tif 000009
【０１６１】
ＰＣＡを、様々なバッチ間の差を示すために実施する（図１１および図１２）。
【０１６２】
オフノートがこの評価のもの以外の記述子に関して認められたので、わずかの記述子が、このスペースに関して識別力がある。
【０１６３】
実際に、バッチ４２およびバッチ４５は、より暗い色を有することに加えて、特に苦く、スパイシーで、発酵しており、口中に金属性感覚を残す。
【０１６４】
これらの２つのバッチは、最も少なく熱処理されている（４２は、いかなるＨＴＳＴ処理も受けなかったし、４５：５０℃で１分であった）。
【０１６５】
バッチ４６は、部分的に、野菜の後味を有し；９５℃で３分間の熱処理はそれ故、生成物の感覚的品質にとって不利であろう。
【０１６６】
バッチ２３は中間のプロフィルを有し；１分間／６５℃の熱処理（バッチ４３）が中立的感覚プロフィルを得るために最も有利である。
【０１６７】
Ｆ．洗浄の影響
前と同じように、本出願人会社は、製造される微細藻類粉末の向上した官能的特性を得るために、これらの細胞外可溶性物質を同伴することを可能にする、これらの新たな最適化熱処理条件と最適洗浄工程との結合を検討した。
【０１６８】
様々な洗浄条件を試験した。
【０１６９】
下の表は、（水容積／バイオマス容積比により）洗浄条件を変えることによって製造されるバッチを示す。
【０１７０】
【表９】
2016526384.tif 000010
【０１７１】
この実験設計は、洗浄を（「最も少なく洗浄した」から「最も多く洗浄した」まで、バッチ４７＜バッチ５０＜バッチ５１＜バッチ４９）「増やすこと」によって影響を分析することを可能にすることが指摘されるであろう。
【０１７２】
下の表ＶＩは、このセットのバッチに関して識別力がある（粉末影響に関して０．２未満のｐ−値）記述子のリストを示す。
【０１７３】
【表１０】
2016526384.tif 000011
【０１７４】
ＰＣＡを、様々なバッチ間の差を示すために実施する。結果を図１３および図１４に示す。
【０１７５】
この研究は、洗浄の本質的な性質を明らかに実証する。洗浄されていない、生成物４７は、より甘く、許容できないと判断された。非洗浄生成物（４７）は、それがより甘く、
かつ、異なる、普通ではない味覚を有するので、他のものから区別される。
【０１７６】
この研究の他の生成物は、同様な感覚プロフィルを有する。
【０１７７】
それにもかかわらず、「簡単な」洗浄（バイオマスの１容積当たりちょうど１容積の水）が、完全に好適である製品品質と、同様に、工業的規模でかなりの経済的節約（処理されるバイオマスの１容積当たり６容積の水よりもむしろ１有効容積の水）とをもたらすことが指摘されるであろう。
【０１７８】
Ｇ．バイオマスの収穫中の酸性化の影響
製造される粉末の官能的品質に関与している工程の制御において全く考慮されていないパラメータの１つは、発酵を停止するためのプロトコルの影響である。
【０１７９】
慣例的には、発酵の終わりに、ｐＯ２値が戻るときに（それは、残存グルコースの総消費のサインである）、発酵終了プロトコルは次の工程からなる：
−  ｐＨ調整の停止、
−  Ｔｐ＜２０℃への発酵槽の冷却、
−  攪拌および空気の流量の低減、
−  ドームに関する空気圧の維持。
【０１８０】
４近くのｐＨへの初期発酵ｐＨの漸次降下（それがさらに５．２にまたは６．８に固定されていようと）が起こる。
【０１８１】
この酸性化はＯ２供給の観点から制限される代謝から生じる乳酸の分泌に関連があることが本出願人会社によって実証された。
【０１８２】
この観察をそれ故、バイオマスのコンディショニング前の貯蔵段階の継続時間の影響を測定するために感覚ポイントの観点から評価し、前記貯蔵はこの酸性化をもたらした。
【０１８３】
２つのバッチを生産する：（酸性化に有利に働く）８時間の期間の貯蔵ありおよび貯蔵なしで。
【０１８４】
下の表ＶＩＩは、このセットの生成物に関して識別力がある（粉末影響に関して０．２未満のｐ−値）記述子のリストを示す。
【０１８５】
【表１１】
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【０１８６】
ＰＣＡを、粉末間の差を示すために実施する。結果を図１５および図１６に示す。
【０１８７】
３つの生成物（基準バッチ１を含む）を、バター／乳製品／甘さから穀類／キノコ／野菜の後味／コーティングまでの範囲の軸上で分類する。
【０１８８】
「貯蔵／酸性化なし」バッチは、より顕著なバター／乳製品ありでより甘い。基準１は、穀類／キノコ／野菜の後味が芳香で、より多いコーティングであり；「貯蔵／酸性化あり」試験は、２つの間にある。
【０１８９】
「貯蔵／酸性あり」および「貯蔵／酸性化なし」試験は、比較的匹敵しており、「貯蔵／酸性化なし」試験はしたがって、より「中立的」であり；それは、「貯蔵／酸性化あり」試験よりも少ないオフノートを有する。
【０１９０】
官能分析はそれ故、この酸性化現象に関係がある長い貯蔵段階が、弱い強度の穀類／キノコ／野菜の後味ノートが現れるので最終製品の感覚プロフィルをわずかに悪化させることを明らかに実証する。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図３】
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【図６】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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