(57)【要約】レプトスピラ症と関連する新規な免疫優性の抗原性タンパク質および抗原性ペプチドを、レプトスピラゲノムのＯＲＦの発現に基づくプロテオームアレイを使用して同定した。レプトスピラ症感染の診断、およびステージ決定におけるこのような抗原性タンパク質および抗原性ペプチドの組成物、方法および使用、ならびに予防ワクチンおよび治療ワクチンにおける、このような抗原性タンパク質および抗原性ペプチドの組成物、方法、および使用が開示される。
2016503011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原組成物であって、
キャリアと会合した複数の抗体反応性抗原であって、ここで該抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に罹患した集団の血清に関する定量されかつ既知の相対的抗体反応性を有し、該抗原のうちの該少なくとも２種は、疾患パラメーターとの既知の関連性を有する、複数の抗体反応性抗原を含み；
ここで該複数の抗原は、ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１、ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピート  Ａ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔｌ５４−１７３もしくはそれらのフラグメントからなる群より選択される、
抗原組成物。
【請求項２】
前記既知の反応性は、抗体との相互作用の強度によって特徴付けられる、請求項１に記載の抗原組成物。
【請求項３】
前記既知の反応性は、レプトスピラ症の活動状態によって特徴付けられる、請求項１および請求項２に記載の抗原組成物。
【請求項４】
前記疾患パラメーターは、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性のレプトスピラ症感染、潜伏性のレプトスピラ症感染、再発性のレプトスピラ症感染、レプトスピラ症保菌状態、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫からなる群より選択される、請求項１〜３に記載の抗原組成物。
【請求項５】
前記抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に曝露された集団のうちの少なくとも４０％に存在する、請求項１〜４に記載の抗原組成物。
【請求項６】
前記既知の相対的抗体反応性は、レプトスピラ症患者において産生される抗体の結合親和性の上三分位数の中に平均抗体結合親和性を構成する、請求項１〜５に記載の抗原組成物。
【請求項７】
レプトスピラ症患者において産生され、前記少なくとも２種の抗原に対して指向される抗体の平均量は、該レプトスピラ症患者において産生される抗体の上三分位数の中にある、請求項１〜６に記載の抗原組成物。
【請求項８】
前記キャリアは、薬学的に受容可能なキャリアであり、前記抗原組成物は、ワクチンとして製剤化される、請求項１〜７に記載の抗原組成物。
【請求項９】
前記ワクチンは、治療ワクチンである、請求項８に記載の抗原組成物。
【請求項１０】
少なくとも４種の抗原を含む、請求項８または９に記載の抗原組成物。
【請求項１１】
前記キャリアは、不溶性キャリアであり、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種は、該キャリアに配置された場合に識別可能である、請求項１〜７に記載の抗原組成物。
【請求項１２】
前記キャリアは、固体キャリアであり、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第１の抗原は、該固体キャリアの第１の位置に配置され、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第２の抗原は、該固体キャリアの第２の位置に配置され、ここで該第１の位置は、該第２の位置から識別可能である、請求項１１に記載の抗原組成物。
【請求項１３】
前記キャリアは、懸濁可能な粒子を含み、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第１の抗原は、第１の懸濁可能な粒子に配置され、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第２の抗原は、第２の懸濁可能な粒子に配置され、ここで該第１の懸濁可能な粒子は、該第２の懸濁可能な粒子から識別可能である、請求項１１に記載の抗原組成物。
【請求項１４】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、少なくとも部分的に精製されている、請求項１〜１３に記載の抗原組成物。
【請求項１５】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、組換えである、請求項１〜１４に記載の抗原組成物。
【請求項１６】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、６０％より高い純度で存在する、請求項１〜１５に記載の抗原組成物。
【請求項１７】
哺乳動物におけるレプトスピラ症の診断において使用するための抗原組成物であって、該抗原組成物は、
キャリアと会合した複数の抗体反応性抗原であって、ここで該抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に罹患した集団の血清に関して定量されかつ既知の相対的抗体反応性を有し、該抗原のうちの少なくとも２種は、疾患パラメーターと既知の関連を有する、複数の抗体反応性抗原を含み；
ここで該複数の抗原は、ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１，ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピート  Ａ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔ１５４−１７３もしくはそれらのフラグメントからなる群より選択される、
抗原組成物。
【請求項１８】
前記既知の反応性は、抗体との相互作用の強度によって特徴付けられる、請求項１７に記載の抗原組成物。
【請求項１９】
前記既知の反応性は、レプトスピラ症の活動状態によって特徴付けられる、請求項１７および請求項１８に記載の抗原組成物。
【請求項２０】
前記疾患パラメーターは、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性のレプトスピラ症感染、潜伏性のレプトスピラ症感染、再発性のレプトスピラ症感染、レプトスピラ症保菌状態、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫からなる群より選択される、請求項１７〜１９に記載の抗原組成物。
【請求項２１】
前記抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に曝露された集団のうちの少なくとも４０％に存在する、請求項１７〜２０に記載の抗原組成物。
【請求項２２】
前記既知の相対的抗体反応性は、レプトスピラ症患者において産生される抗体の結合親和性の上三分位数の中にある平均抗体結合親和性を構成する、請求項１７〜２１に記載の抗原組成物。
【請求項２３】
レプトスピラ症患者において産生され、前記少なくとも２種の抗原に対して指向される抗体の平均量は、前記レプトスピラ症患者において産生される抗体の上三分位数の中にある、請求項１７〜２２に記載の抗原組成物。
【請求項２４】
前記キャリアは、不溶性キャリアであり、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種は、該キャリアに配置された場合に識別可能である、請求項１７〜２３に記載の抗原組成物。
【請求項２５】
前記キャリアは、固体キャリアであり、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第１の抗原は、該固体キャリアの第１の位置に配置され、該複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第２の抗原は、該固体キャリアの第２の位置に配置され、ここで該第１の位置は、該第２の位置から識別可能である、請求項２４に記載の抗原組成物。
【請求項２６】
前記キャリアは、懸濁可能な粒子を含み、前記複数の抗原のうちの少なくとも２種のうちの第１の抗原は、第１の懸濁可能な粒子に配置され、前記複数の抗原のうちの該少なくとも２種のうちの第２の抗原は、第２の懸濁可能な粒子に配置され、ここで該第１の懸濁可能な粒子は、該第２の懸濁可能な粒子から識別可能である、請求項２４に記載の抗原組成物。
【請求項２７】
前記キャリアは、マトリクスに配置された懸濁可能な粒子を含み、該マトリクスは、該マトリクスを通って流体が流れるのを可能にする複数の開口部を含む、請求項２４に記載の抗原組成物。
【請求項２８】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、少なくとも部分的に精製されている、請求項１７〜２７に記載の抗原組成物。
【請求項２９】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、組換えである、請求項１７〜２８に記載の抗原組成物。
【請求項３０】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、６０％を超える純度で存在する、請求項１７〜２９に記載の抗原組成物。
【請求項３１】
哺乳動物におけるレプトスピラ症ワクチンとしての使用のための抗原組成物であって、該抗原組成物は、
キャリアと会合した複数の抗体反応性抗原であって、ここで該抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に罹患した集団の血清に関して定量されかつ既知の相対的抗体反応性を有し、該抗原のうちの少なくとも２種は、疾患パラメーターとの既知の関連を有する、複数の抗体反応性抗原を含み；
ここで該複数の抗原は、ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１、ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピート  Ａ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔｌ５４−１７３もしくはそれらのフラグメントからなる群より選択される、
抗原組成物。
【請求項３２】
前記既知の反応性は、抗体との相互作用の強度によって特徴付けられる、請求項３１に記載の抗原組成物。
【請求項３３】
前記既知の反応性は、レプトスピラ症の活動状態によって特徴付けられる、請求項３１および請求項３２に記載の抗原組成物。
【請求項３４】
前記疾患パラメーターは、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性のレプトスピラ症感染、潜伏性のレプトスピラ症感染、再発性のレプトスピラ症感染、レプトスピラ症保菌状態、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫からなる群より選択される、請求項３１〜３３に記載の抗原組成物。
【請求項３５】
前記抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に曝露された集団のうちの少なくとも４０％に存在する、請求項３１〜３４に記載の抗原組成物。
【請求項３６】
前記既知の相対的抗体反応性は、レプトスピラ症患者で生じる抗体の結合親和性の上三分位数の中にある平均抗体結合親和性を構成する、請求項３１〜３５に記載の抗原組成物。
【請求項３７】
レプトスピラ症患者で産生され、前記少なくとも２種の抗原に対して指向される抗体の平均量は、該レプトスピラ症患者で産生される抗体の上三分位数の中にある、請求項３１〜３６に記載の抗原組成物。
【請求項３８】
前記キャリアは、薬学的に受容可能なキャリアである、請求項３１〜１７に記載の抗原組成物。
【請求項３９】
アジュバントをさらに含む、請求項３１〜３８に記載の抗原組成物。
【請求項４０】
前記ワクチンは、治療ワクチンである、請求項３１〜３９に記載の抗原組成物。
【請求項４１】
少なくとも４種の抗原を含む、請求項３１〜４０に記載の抗原組成物。
【請求項４２】
前記抗原もしくはそれらのフラグメントのうちの少なくとも１種は、少なくとも部分的に精製されている、請求項３１〜４１に記載の抗原組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年12月１２日に出願された仮出願第６１／７３６３９１号の優先権を主張する。これらおよびすべての他の参照される外部材料は、その全体が、参考として本明細書に援用される。参考として援用される参考文献における用語の定義または使用が、本明細書において提供される用語の定義と一貫してないかまたは反対である場合、本明細書で提供される用語の定義が支配的であると見なされる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、種々の障害および疾患、特に、レプトスピラ症の診断および処置のための組成物および方法である。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
レプトスピラ症は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌による感染によって引き起こされる、重大で広がっている疾患である。上記疾患は、感染した家畜もしくは野性動物との接触から、またはそれらの尿との接触によって、ヒトへと伝播する。広く種々の動物種が、上記細菌の保有宿主として作用し得る。結果として、ヒトレプトスピラ症は、しばしば、最も広がっている人獣共通感染症と考えられている。レプトスピラ症（ｌｅｐｔｏｓｐｒｉｏｓｉｓ）のリスクが慣例的に高い群としては、農家、獣医師、軍人、鉱山労働者、および下水処理場で働く人々が挙げられる。しかし、伝播のもう一つのパターンもまた観察されてきた。レプトスピラ症の大流行は、レクリエーション活動（例えば、アウトドア活動を強調しているエコツーリズムおよびスポーツイベント）と関連してきた。
【０００４】
レプトスピラ症を有する個体は、その病気の初期ステージで広く種々の比較的非特異的な臨床症状（発熱、頭痛、悪寒、およびひどい筋肉痛が挙げられる）を示し、臨床所見に基づく早期診断を困難にしている。不運なことに、感染のうちの５〜１５％は、重篤な多臓器合併症（ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（黄疸、腎不全、および出血が挙げられる）を生じる。重症レプトスピラ症は、死亡率５〜４０％を有する。重度の貧困と関連する状態は、ブラジルおよび他の国々の都市部においてレプトスピラ症の流行と高死亡率とをもたらしてきた。
【０００５】
迅速かつ信頼性の高いポイントオブケア診断検査の欠如は、上記疾患の世界的な負荷を評価することへの大きな障壁であるだけでなく、早期診断を提供することへの大きな障壁でもある。現在の診断検査は、主に、レプトスピラリポポリサッカリド（ＬＰＳ）に結合する抗体の検出に依拠し、初期の病気では、抗生物質治療が最も有効である場合には、感度が低い。
【０００６】
レプトスピラ症の診断は難しく、特に上記疾患の早期の処置可能なステージにおいては難しい。現在、レプトスピラの存在の最も直接的な証拠は、単離と培養もしくはＰＣＲのいずれかによる。不運なことには、細菌学的な単離は、高価なプロセスであり、高度に訓練された専門技術者および特別な施設を要する。レプトスピラ症の場合、これは、レプトスピラの感度の性質（これは、非常に新鮮なサンプルの使用を要する）によってさらに複雑である。さらに、この生物は、培養では比較的ゆっくりと増殖し、結果として、発育するのに数週間を要する。従って、ＰＣＲが、サンプル中のレプトスピラの同定のためのより有用なツールであると判明した。しかし、ＰＣＲ法は、特殊な装置および適切に行うには高レベルの技術をなお必要とし、感度は高いものの、レプトスピラ感染のステージを評価するには十分に定量的では可能性がある。
【０００７】
レプトスピラ症はまた、その生物に対する個体の免疫学的応答を特徴付ける血清学的方法を使用して診断され得る。レプトスピラ症の血清学的診断のための現在の標準法は、微量凝集試験（ｍｉｃｒｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）（ＭＡＴ）であり、ここでは、患者血清が培養されたレプトスピラを凝集させる能力が特徴付けられる。不運なことに、この方法は、このアッセイにおいて使用するためにレプトスピラを培養する必要性があることおよびこの生物の不均一性によって制限されている。
【０００８】
レプトスピラ症の診断のための旧来のイムノアッセイ（例えば、酵素イムノアッセイもしくはラテラルフロー試験）において有用であり得る特定のレプトスピラタンパク質もしくはペプチドを同定および生成する試みが行われてきた。例えば、欧州特許第２２０５６２５Ｂ１（Ｃｈａｎｇ）および米国特許出願第２０１２／０１００１４３（Ｃｈａｎｇ）において、多くのレプトスピラ外膜タンパク質（すなわち、ＬＰ  １４５４、ＬＰ  １１１８、ＬＰ  １９３９、ＭＣＥＩＩ、ＣＡＤＦ−ｌｉｋｅ１、ＣＡＤＦ−ｌｉｋｅ２、ＣＡＤＦ−ｌｉｋｅ３、Ｌｐ００２２、Ｌｐ１４９９、Ｌｐ４３３７、Ｌｐ３２８、Ｌ２１）および表面タンパク質（すなわち、ＬｉｇＡおよびＬｉｇＢ）が、レプトスピラ症の診断および予防における使用のために開示されている。同様に、米国特許第７，５３１，１７７号（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ）は、レプトスピラのワクチン接種種としての、および免疫学的アッセイにおける使用のための抗原として、表面会合タンパク質ＬｐＬ５３、ＯＭＰＬ５５、ＯＭＰＬ１６、ＯＭＰＬ３１、ＯＭＰＬ１５、ＯＭＰＬ２０、ＬｐＬ２３、ＬｐＬ２２、ＯＭＰＬ１７、ＯＭＰＬ３０、ＯＭＰＬ２７、ＯＭＰＬ２１、ＯＭＰＬ２２、ＭＰＬ１７、ＭＰＬ２１、ＯＭＰＡＬ２１、ＯＭＰＬ６３、ＯＭＰＬ１４、ＭＰＬ３６、ＭＰＬ３９、ＭＰＬ４０、およびＭＰＬ２１の使用を記載する。しかし、このようなアプローチにおける潜在的な抗原の予備選択は、それらを、個体の免疫系によってアクセス可能であるものの、有用な標的を含まない可能性があるレプトスピラ表面タンパク質に限定する。
【０００９】
他の研究者らは、より広い種々のタンパク質から潜在的レプトスピラ抗原を同定するために種々の方法を使用した。例えば、米国特許第７，６３５，４８０号（Ａｎｄｒｅ−Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ）は、病原性株および非病原性株の両方に由来するタンパク質を標識するために、レプトスピラの病原性株の全細胞で免疫化することによって生成された血清を使用することを開示する；そのようにして標識されたタンパク質間のその後の区別は、レプトスピラ症の予防および同定において有用なペプチドの同定をもたらした。米国特許第８，４４５，６５８号（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ）に記載される別のアプローチでは、レプトスピラゲノムのファージライブラリーが開発され、回復期のレプトスピラ症患者に由来する免疫血清を使用して、免疫応答を誘発したタンパク質を有するクローンを選択した。以前は未同定だったいくつかのタンパク質抗原（すなわち、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、およびＢｉｇＬ３）を、多くの以前から公知のレプトスピラ抗原とともに同定した。このようなアプローチは、特定のクラスのタンパク質の予備選択によって持ち込まれるバイアスを減らすものの、それらは、抗体が誘発されるタンパク質および／もしくはタンパク質フラグメントを同定するに過ぎない。しかし、このようなアプローチは、診断および予防目的に有用な、特に強いおよび／または広範な抗体応答を生じるレプトスピラ抗原を特異的に同定および提供できない。
【００１０】
本明細書で同定される全ての刊行物は、各個々の刊行物もしくは特許出願が、参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されたかのように、同程度に参考として援用される。援用される参考文献中の用語の定義もしくは使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と一致しないもしくは矛盾する場合には、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。
従って、免疫学的方法によるレプトスピラ症の診断において、ならびに／もしくは予防ワクチンおよび治療ワクチンの生成において有用なレプトスピラ免疫優性抗原がなお必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第２２０５６２５明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０１００１４３明細書
【特許文献３】米国特許第７，５３１，１７７号明細書
【特許文献４】米国特許第７，６３５，４８０号明細書
【特許文献５】米国特許第８，４４５，６５８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の主題は、レプトスピラ症の診断、予防、および処置のための装置、システムおよび方法を提供する。一局面において、レプトスピラインタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ）の天然および組換えのポリペプチドを含む組成物は、患者診断のために使用され得る。別の局面において、レプトスピラインタロガンスの天然および／もしくは組換えのポリペプチドを含む組成物は、予防および／もしくは治療ワクチンとして使用され得る。抗原の選択のため、血清診断抗原もしくはワクチン抗原を同定するため、および上記タンパク質に対する抗体に関する診断アッセイを作り出すための富化分析（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）もまた、企図される。
【００１３】
本発明の主題の一実施形態は、キャリアと会合した２種以上の抗体反応性抗原を含む抗原組成物である。上記抗原は、レプトスピラ症に曝露されたかもしくはそうでなければ罹患した集団に由来する血清から得られる抗体と、既知の、定量された、および／もしくは別の方法で特徴付けられた反応性（例えば、相互作用の強度）を有する。このような実施形態のうちのいくつかにおいて、このような抗原に関する上記既知の抗体反応性は、レプトスピラ症患者によって生じる抗体の結合親和性の上三分位数（ｕｐｐｅｒ  ｔｅｒｔｉｌｅ）の中で平均される。同様に、本発明の概念の他のこのような実施形態において、レプトスピラ症患者で産生され、１種以上のこのような抗原に対して指向される抗体の平均量は、上三分位数の中にある。同様に、他のこのような実施形態において、反応性は、レプトスピラ症感染の活動状態によって特徴付けられる。上記抗原のうちの少なくとも２種は、疾患パラメーターとの既知の関連（例えば、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性のレプトスピラ症感染、潜伏性のレプトスピラ症感染、再発性のレプトスピラ症感染、レプトスピラ症保菌状態、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫）を有する。適切な抗原としては、以下が挙げられる：ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１、ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピート  Ａ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔ１５４−１７３、もしくはそれらのフラグメント。このような抗原もしくはそれらのフラグメントは、精製されたまたは少なくとも部分的に精製されたタンパク質もしくはペプチドとして（例えば、６０％より高い純度を有する）供給され得る。上記組成物のこのような抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に曝露されている集団のうちの少なくとも４０％に存在し得る。本発明の概念のいくつかの実施形態において、上記抗原組成物のキャリアは、薬学的キャリアであり、例えば、ワクチン（例えば、治療ワクチン）の製剤化において使用される。代替の実施形態において、上記キャリアは、不溶性キャリアであり、そこでは、上記抗原のうちの少なくとも２種が、互いから識別可能である。このような不溶性キャリアは、診断アッセイにおいて有用であり、別個のかつ識別可能な位置（例えば、アレイ状に）配置された抗原を有する固体キャリア、および異なるかつ識別可能な粒子集団に抗原が配置されている懸濁可能な粒子を含む。
【００１４】
本発明の主題の別の実施形態は、哺乳動物におけるレプトスピラ症の診断において使用するための抗原組成物であり、上記抗原組成物は、キャリアと会合した２種以上の抗体反応性抗原を含む。上記抗原は、レプトスピラ症に曝露されたか、そうでなければ罹患した集団に由来する血清から得られた抗体と、既知の、定量された、および／もしくは別の方法で特徴付けられた、反応性（例えば、相互作用の強度）を有する。このような実施形態のうちのいくつかにおいて、このような抗原に関する上記既知の抗体反応性は、レプトスピラ症患者によって産生される抗体の結合親和性の上三分位数の中で平均される。同様に、本発明の概念の他のこのような実施形態において、レプトスピラ症患者において産生され、１種以上のこのような抗原に対して指向される抗体の平均量は、上三分位数の中にある。同様に、他のこのような実施形態において、反応性は、レプトスピラ症感染の活動状態によって特徴付けられる。上記抗原のうちの少なくとも２種は、疾患パラメーターとの既知の関連（例えば、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性のレプトスピラ症感染、潜伏性のレプトスピラ症感染、再発性のレプトスピラ症感染、レプトスピラ症保菌状態、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫）を有する。適切な抗原としては、以下が挙げられる：ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１、ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピートＡ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔ１５４−１７３またはそれらのフラグメント。このような抗原もしくはそれらのフラグメントは、精製されたかまたは少なくとも部分的に精製されたタンパク質もしくはペプチド（例えば、６０％より高い純度を有する）として供給され得る。上記組成物のこのような抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に曝露されている集団のうちの少なくとも４０％に存在し得る。いくつかの実施形態において、上記キャリアは、不溶性キャリアであり、そこでは、上記抗原のうちの少なくとも２種は、互いから識別可能である。このような不溶性キャリアは、診断アッセイにおいて有用であり、別個のかつ識別可能な位置（例えば、アレイ状に）配置された抗原を有する固体キャリア、および異なるかつ識別可能な粒子集団に抗原が配置されている懸濁可能な粒子を含む。あるいは、いくつかの実施形態において、上記キャリアは、マトリクス（例えば、多孔性膜もしくは線維状シート）に分布した懸濁可能な粒子を含み、ここで上記マトリクスは、孔、間質空間（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｓｐａｃｅ）、もしくは流体がマトリクスを通って流れることを可能にする他の開口部を含む。
【００１５】
本発明の主題のさらに別の実施形態は、哺乳動物においてレプトスピラ症ワクチンとして使用するための抗原組成物であり、ここで上記抗原組成物は、キャリアと会合した２種以上の抗体反応性抗原を含む。上記抗原は、レプトスピラ症に曝露されたか、そうでなければ罹患した集団に由来する血清から得られる抗体と既知の、定量された、および／もしくは別の方法で特徴付けられた反応性（例えば、相互作用の強度）を有する。このような実施形態のうちのいくつかにおいて、このような抗原に関する上記既知の抗体反応性は、レプトスピラ症患者によって産生される抗体の結合親和性の上三分位数の中で平均される。同様に、本発明の概念の他のこのような実施形態において、レプトスピラ症患者で産生され、１種以上のこのような抗原に対して指向される抗体の平均量は、上三分位数の中にある。同様に、他のこのような実施形態において、反応性は、レプトスピラ症感染の活動状態によって特徴付けられる。上記抗原のうちの少なくとも２種は、疾患パラメーターとの既知の関連（例えば、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性のレプトスピラ症感染、潜伏性のレプトスピラ症感染、再発性のレプトスピラ症感染、レプトスピラ症保菌状態、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫）を有する。適切な抗原としては、以下が挙げられる：ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１、ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピートＡ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔ１５４−１７３またはそれらのフラグメント。このような抗原もしくはそれらのフラグメントは、精製されたかまたは少なくとも部分的に精製されたタンパク質もしくはペプチド（例えば、６０％を超える純度を有する）として供給され得る。上記組成物のこのような抗原のうちの少なくとも２種は、レプトスピラ症に曝露されている集団のうちの少なくとも４０％に存在し得る。本発明の概念のいくつかの実施形態において、上記抗原組成物のキャリアは、薬学的キャリアであり、例えば、ワクチン（例えば、治療ワクチン）の製剤化において使用される。このような組成物は、アジュバントをさらに含み得る。
【００１６】
本発明の主題の種々の目的、特徴、局面および利点は、同様の番号が同様の構成要素を表す添付の図面とともに、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、レプトスピラ免疫優性抗原の同定のためのプロテオームアレイを生成するための方法を模式的に示す。
【００１８】
【図２】図２は、代表的プロテオームマイクロアレイの全ての部位に存在するペプチドマーカーに対する抗体を使用してインターロゲートした上記マイクロアレイの顕微鏡写真である。
【００１９】
【図３】図３は、健常コントロール個体、急性のレプトスピラ症、および回復期レプトスピラ症を有する個体に由来する血清でインターロゲートした一連のレプトスピラプロテオームアレイから観察されたシグナル強度のヒートマップであり、多くのタンパク質およびペプチド抗原に対する差次的応答を図示する。
【図３−１】図３は、健常コントロール個体、急性のレプトスピラ症、および回復期レプトスピラ症を有する個体に由来する血清でインターロゲートした一連のレプトスピラプロテオームアレイから観察されたシグナル強度のヒートマップであり、多くのタンパク質およびペプチド抗原に対する差次的応答を図示する。
【図３−２】図３は、健常コントロール個体、急性のレプトスピラ症、および回復期レプトスピラ症を有する個体に由来する血清でインターロゲートした一連のレプトスピラプロテオームアレイから観察されたシグナル強度のヒートマップであり、多くのタンパク質およびペプチド抗原に対する差次的応答を図示する。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、健常個体および急性期のレプトスピラ症患者に由来する血清（図４Ａ）、ならびに健常個体および回復期レプトスピラ症患者に由来する血清（図４Ｂ）に関する差次的な反応性および交叉反応性の抗原のシグナル強度およびＢＨｐ値を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、健常個体および急性期のレプトスピラ症患者に由来する血清（図４Ａ）、ならびに健常個体および回復期レプトスピラ症患者に由来する血清（図４Ｂ）に関する差次的な反応性および交叉反応性の抗原のシグナル強度およびＢＨｐ値を示す。
【００２１】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、種々のコントロール群における個体に由来する血清での一連のレプトスピラプロテオームアレイのインターロゲーションからの結果を示す。図５Ａは、種々の個体に由来するシグナル強度のヒートマップを示す。図５Ｂは、特徴付けられた抗原の数が増える場合の、種々のコントロール群に関する累積シグナル強度を示す。
【００２２】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、種々の免疫優性抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ａは、多くの個々の抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ｂは、抗原の組み合わせに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ａ−１】図６Ａおよび図６Ｂは、種々の免疫優性抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ａは、多くの個々の抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ｂは、抗原の組み合わせに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ａ−２】図６Ａおよび図６Ｂは、種々の免疫優性抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ａは、多くの個々の抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ｂは、抗原の組み合わせに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、種々の免疫優性抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ａは、多くの個々の抗原に関するＲＯＣ曲線を示す。図６Ｂは、抗原の組み合わせに関するＲＯＣ曲線を示す。
【００２３】
【図７】図７は、レプトスピラプロテオームアレイ結果を確認するために使用される一連のイムノブロットの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
本発明の主題は、レプトスピラ症の診断、予防、および処置のための装置、システムおよび方法を提供する。マイクロアレイアプローチは、レプトスピラ症の異なる期の感染集団に由来する血清でおよび非感染個体に由来するコントロール血清で、レプトスピラインタロガンスの潜在的抗原のインターロゲーションを可能にするために、上記生物のプロテオームの全てもしくは一部を示すために利用される。これは、上記疾患の期もしくはステージに特徴的な免疫応答およびその応答の程度の特徴付けを（例えば、シグナル強度を、適切なコントロールのものと比較することによって）もたらす特異的抗原の同時の同定を可能にする。レプトスピラ症の種々のステージを表す集団の中での特徴的な抗原の同定は、上記疾患の診断およびステージ決定において有用なタンパク質抗原の同定を可能にする。免疫応答の程度の特徴付けは、レプトスピラ症の高感度アッセイにおいておよび上記疾患の予防もしくは処置のためのワクチンにおいて特に有用である高親和性、高アビディティー、および／もしくは高度に発現された抗体（すなわち、免疫優性抗原）をもたらす抗原の選択を可能にする。一局面において、天然および組換えのレプトスピラインタロガンスのポリペプチドを含む組成物は、患者診断のために使用され得る。別の局面において、天然および／もしくは組換えのレプトスピラインタロガンスのポリペプチドを含む組成物は、予防および／もしくは治療ワクチンとして使用され得る。抗原の選択のための富化分析のための、血清診断抗原もしくはワクチン抗原を同定するための、および上記タンパク質に対する抗体に関する診断アッセイを作り出すための方法もまた、企図される。
【００２５】
レプトスピラ症に対するヒト免疫応答を特徴付ける他の試みにおいて、本発明者らは、上記タンパク質抗原研究が免疫系による認識のために無作為に選択されないことを見出した。プロテオームスケールで数千もの潜在的抗原にわたって抗体応答を特徴付けすることは、抗原性に関する分子特徴が正確に分類されることを可能にする。さらに、このようなアレイアプローチは、特徴付けされるサンプルの同じセットから種々の抗体クラスおよびサブクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）の応答の迅速かつ便利な特徴付けを可能にし、種々のレプトスピラ種および血清型から、および種々の哺乳動物宿主からの結果を直接比較するために利用され得る。プロテオームマイクロアレイの使用が、有利なことには、潜在的抗原の範囲を制限する先行技術のアプローチでは同定されない有用なレプトスピラインタロガンス抗原の同定を可能にするということが認識されるはずである。従って、例えば、表面タンパク質に焦点を当てる方法によっては同定されない潜在的に有用な抗原が、同定され得る。さらに、免疫優性抗原の同定は、抗体応答をもたらすだけでなく、むしろレプトスピラ症の血清学的検出において、およびレプトスピラインタロガンスに曝露された個体における予防的もしくは治療的免疫応答を誘導するワクチンにおいて、特に有用である強力かつ活発な抗体応答をもたらすレプトスピラインタロガンス抗原の利用を可能にする。
【００２６】
本明細書で同定される全ての刊行物は、各個々の刊行物もしくは特許出願が、参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されたかのように、同程度に参考として援用される。援用される参考文献中の用語の定義もしくは使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と一致しないもしくは矛盾する場合には、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。
【００２７】
本明細書の説明においておよび以下の特許請求の範囲全体を通じて使用される場合、「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」、および「ｔｈｅ（この、その、上記）」の意味は、状況が別段明確に規定しなければ、複数形への言及を含む。また、本明細書の説明において使用される場合、「ｉｎ（〜に、〜中で、〜においてなど）」の意味は、状況が別段明確に規定しなければ、「ｉｎ（〜に、〜中で、〜においてなど）」および「ｏｎ（〜の上で、〜に接してなど）」を含む。
【００２８】
本明細書での値の範囲の記載は、上記範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡便法として働くことを意図するに過ぎない。本明細書で別段示されなければ、範囲内の各個々の値は、それが個々に本明細書に記載されるかのように、本明細書に援用される。本明細書で記載される全ての方法が、本明細書で別段示されなければ、またはそうでなければ状況によって明らかに矛盾しなければ、任意の適切な順序で行われ得る。任意のおよび全ての例、もしくは本明細書のある種の実施形態に関して提供される例示的文言（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ（〜のような、例えば）」）の使用は、本発明をよりよく明らかにすることを意図するに過ぎず、別段特許請求される本発明の範囲に対する限定を提示しない。本明細書中の文言が、発明の実施に本質的な任意の特許請求されていない要素を含むと解釈されるべきではない。
【００２９】
本明細書で開示される本発明の代替の要素もしくは実施形態のグループ分けは、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書で見出される他の要素との任意の組み合わせにおいて参照され得、特許請求され得る。グループの１以上のメンバーが、簡便さおよび／もしくは特許性の理由で、グループ中に含められ得るかもしくはグループから削除され得る。何らかのこのような包含もしくは削除が起こる場合、本明細書は、改変された上記グループを含むとここで考えられ、従って、追加で使用される全てのマーカッシュグループの記載要件を満たす。
【００３０】
上記で示されるように、本発明の主題のいくつかの実施形態において、プロテオームマイクロアレイは、レプトスピラ症と関連する免疫優性抗原を同定するために使用され得る。任意の適切なマイクロアレイ形式が使用され得る（平面のマイクロアレイ、流体もしくは懸濁されたマイクロアレイ、およびマイクロウェルプレートが挙げられる）。平面マイクロアレイの使用の一般的アプローチは、図１に図示される。例示的プロセスの詳細は、以下の実施例に提供される。図１に示されるように、ゲノムＤＮＡは、レプトスピラ種１１０（この場合には、レプトスピラインタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ株Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）およびＰＣＲ  １２０を使用して増幅されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から得られ得る。いくつかの実施形態において、全てのＯＲＦを増幅するのに対して、他の実施形態では、ＰＣＲプライマーが、利用可能なＯＲＦのサブセットを増幅するために選択され得る。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびＪｏｈｎ  Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＣＶＩ）のような情報源からのゲノムデータは、潜在的に抗原性の特徴とともに、潜在的に生物学的な重要性を有するタンパク質を含むＯＲＦを同定するために使用され得る。ＰＣＲプライマーは、適切なクローニングベクター１３０（例えば、直線状のプラスミド）へのＰＣＲ生成物の挿入を可能にするアダプター配列を含むように設計され得る。このようなクローニングベクターは、他の有用な配列（例えば、その後の単離を可能にするタグ（例えば、ポリヒスチジン）および／もしくは免疫認識を可能にするタグ（例えば、ヘマグルチニン）を提供するペプチド配列をコードする配列）を含み得る。いくつかの実施形態において、長いＯＲＦを複数のセグメントに分割することは必要であり得、その結果、上記ＯＲＦの長さは、その後のクローン性の増殖も発現も妨げない。適切なクローニングベクターへの挿入後に、このようなベクターは、増殖のためのコンピテント細胞に移入され得る。形質転換された細胞は、適切な選択手順（例えば、抗生物質抵抗性）によって同定され得、分離され得、その内容物は、各クローニングされたＯＲＦからタンパク質および／もしくはペプチドを生成するために１５０、インビトロ転写１４０に供され得る。このような個々のタンパク質もしくはペプチドの各々は、潜在的な抗原を表す。
【００３１】
このようにして生成された潜在的な抗原は、次いで、例えば、個々のインビトロ転写生成物をマイクロアレイチップの個々の部位にプリントすることによって１６０アレイを生成するために使用され得る。このようなアレイはまた、レプトスピラＯＲＦから生じる物質（例えば、上記ベクターと関連するペプチド（例えば、ポリヒスチジンおよびヘマグルチニン））、コントロール物質、または上記アレイの配向および／もしくは自動化特徴付けに有用である物質を含まない試験部位を含み得る。アレイが、個々の部位の複製物を含み得る（これは、プリントエラーからの回復を可能にするにあたって、および全体のアレイ性能を改善するにあたって有用であり得る）ということは認識されるはずである。上記アレイは、次いで、抗体含有サンプルでプローブされるかもしくはインターロゲートされる１７０。適切なサンプルとしては、レプトスピラ症の異なるステージ（すなわち、急性、慢性、回復、保菌者）にある感染個体に由来する血清、血漿、もしくは他の流体、およびレプトスピラ症が風土病である地域出身の個体、あるいはレプトスピラ症が存在しない地域出身の個体（すなわち、ナイーブサンプル）に由来するコントロールサンプルが挙げられる。このようなサンプルに由来する抗体と、試験部位内のタンパク質もしくはペプチドとの間の複合体形成は、上記アレイを、上記サンプル中に見出される抗体に対して指向される二次抗体結合剤１８０（例えば、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＤ）でインターロゲートすることによって可視化され得る。このような二次抗体は、検出可能な「タグ」を有し得、これらは、直接可視化され得る（例えば、蛍光色素もしくは蛍光タンパク質）か、または間接的に可視化され得る（例えば、ビオチンもしくは酵素）。間接的に可視化されるタグを有する二次抗体を利用する実施形態において、その後の加工処理工程、例えば、標識されたアビジン／ストレプトアビジンとのインキュベーションもしくは検出可能な生成物を生じる酵素基質とのインキュベーションが、行われ得る。上記インビトロ転写プロセス１４０がまた、上記ＰＣＲ増幅ＯＲＦと関連するタンパク質およびペプチドに加えて、上記ベクター１３０を支持するために使用される細胞に由来する関連しないタンパク質およびペプチドを生成し得ること、およびサンプルがこのような関連しないタンパク質およびペプチドに指向される抗体を含み得ると考えられることは認識されるはずである。このような状況において、サンプルは、上記アレイをインターロゲートするにあたって使用する前に、このような関連しないタンパク質（例えば、細胞溶解物、外因性ＤＮＡを受容しなかったインビトロ翻訳プロセスの生成物、またはＰＣＲ生成物を受容しなかったベクターでの形質転換後のインビトロ翻訳プロセスに由来する生成物）で処理され得る。
【００３２】
適切な個体に由来するサンプルでの上記アレイのインターロゲーションおよび二次抗体結合剤での抗体結合の可視化の後に、上記アレイ研究の結果は、アレイスキャナー１９０を使用して決定され得る。上記アレイスキャナーの形式および設計は、上記アレイの形式および設計に依存する。例えば、懸濁されかつ個々に調和させた粒子の流体アレイは、個々の粒子を同定およびサンプルに由来する抗体との複合体形成に特徴的である各々からのシグナル（例えば、蛍光）を測定し得るフローサイトメーターもしくは類似のデバイスを使用してスキャンされ得る。同様に、平面アレイでの研究からの結果は、デジタルカメラ、顕微鏡、光学スキャナー、もしくは他の画像取得デバイスを使用して、および個々の試験部位の同定およびサンプル由来の抗体との複合体形成と関連するシグナル（例えば、蛍光、リン光、発光など）の測定を可能にするソフトウェアをその後使用して、スキャンされ得る。このような平面アレイは、データ取得の間に直角、斜角、もしくはエピタキシャル照射（ｅｐｉｔａｘｉａｌ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）によって照射もしくは励起され得るか、または代わりに、一次元もしくは二次元の導波路（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）として作用する基材上に生成され得、表面プラズモン共鳴によって照射もしくは励起を提供し得ることは、認識されるはずである。あるいは、マイクロウェルプレートを使用して生成されるアレイは、マイクロウェルプレートリーダーを使用して特徴付けられ得る。サンプル由来の抗体と、上記アレイのタンパク質もしくはペプチドとの間の複合体形成を表すシグナルは、抗体複合体形成１９５の程度という尺度を提供するように定量され得る。例えば、アレイ上のコントロールサンプルもしくはコントロール部位から観察されるものに対して小さいが統計的に有意なシグナルは、上記アレイの抗原との複合体形成が起こったが、上記抗体の親和性、アビディティーもしくは全体的な抗体応答が比較的弱いことを示し得る。あるいは、コントロールサンプルもしくはコントロール部位から観察されるものおよび／または上記アレイ上の他の同定された抗原に対して大きなシグナルは、上記抗原が免疫優性抗原（すなわち、高親和性および／もしくは高アビディティーの抗体を誘導するか、または比較的高濃度の抗体の形成を誘導する抗原）であることを示し得る。あるいは、抗原は、上記少なくとも２種の抗原に対して患者において産生される抗体の平均的な結合親和性、平均的な結合アビディティー、および平均量のうちの少なくとも１つが、患者において産生される抗体の結合親和性、結合アビディティー、および量の上三分位数の中にある場合に、免疫優性と考えられ得る。このような免疫優性抗原は、アッセイおよびワクチンにおける使用に魅力的な標的である。
【００３３】
図１に記載される基本的な方法が、レプトスピラ症の早期診断（すなわち、強いシグナルを提供する抗原を利用することによって）、およびレプトスピラ症の特定のステージもしくは状態の同定の両方において有用である抗原もしくは抗原の一団を同定することにおける有用性を有することは、認識されるはずである。例えば、レプトスピラ症の急性例からのサンプルの結果は、この疾患を診断および処置するにあたって、医師を助ける試験を開発するために、回復中もしくは回復期患者の症例からのサンプルの結果と比較され得る。同様に、レプトスピラ症の早期ステージおよび後期ステージに特徴的な免疫優性抗原の同定は、顕著な免疫応答を誘発する可能性のある抗原性物質を同定することによって、上記疾患の予防および／もしくは処置において有用なワクチンの開発を助け得る。このような免疫優性抗原は、個々に使用され得るか、またはパネルとしてグループ分けされ得る。このようなパネルは、アッセイの感度を改善するにことおいて、感染の正確なステージ決定を提供するにことおいて、および防御免疫および／もしくは治療的免疫を提供することにおいて、有用性を有し得る。組み合わせでの抗原が、単一の実体のみからの専用実施権もしくは非専用実施権が必要とされるようなものであれば、これは、獲得されねばならないライセンスの数が原因で、現在同定されている組換えタンパク質に基づくアッセイを作り出すことを思いとどまっている診断キット製造業者にとって魅力的である。
【００３４】
本発明の概念の１つの企図される実施形態は、キャリアと会合した複数の抗体反応性抗原を含み得る抗原組成物である。上記抗原のうちの少なくとも２種は、（ｉ）レプトスピラ症に罹患した集団の血清に対する定量されかつ既知の相対的抗体反応性、および（ｉｉ）疾患パラメーター（例えば、上記疾患のステージ、上記疾患の継続期間、臨床転帰、および以前の曝露）との既知の関連を有し得る。上記複数の抗原が、ＬＩＣ１１３５２、ＬＩＣ１２５４４、ＬＩＣ１２６３１、ＬＩＣ１０４６４−ｓ１、ＬＩＣ１１５７３、ＬＩＣ１１３３５、ＬＩＣ２０３０１、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１０１９１、ＬＩＣ１１３８９、ＬＩＣ１１４３７、ＬＩＣ２００８７、ＬＩＣ１０６２３、ＬＩＣ１０９９８、ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ１０４９１−ｓ１、ＬＩＣ１３０５０、ＬＩＣ１１２１０、ＬＩＣ１０５２４、ＬＩＣ１１４５６、ＬＩＣ１２４７６、ＬＩＣ１１５７０、ＬＩＣ１３２４４、ＬＩＣ１３２３８、ＬＩＣ１１８８５、ＬＩＣ１１００８、ＬＩＣ１３２４２、ＬＩＣ１１３３６、ＬＩＣ２０２５０、ＬＩＣ１０５２５、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２．１、ＬＩＣ２０１１８、ＬＩＣ１０９７３、ＬＩＣ１０４６４−ｓ２、ＬＩＣ１０４０６、ＬＩＣ１２１８０、ＬＩＣ１１０７４、ＬＩＣ１０５４６、ＣｏｐＬｉｇＡＵ（ユニーク）：リピートＡ７’−１３、ＣｏｐＬｉｇＢＵ（ユニーク）：リピートＢ７’−１２、およびＣｏｐＬｉｇＢ：リピート１−１６，ｎｔ１５４−１７４３、またはそれらのフラグメントからなる群より選択されることが好ましい。
【００３５】
本発明の概念の抗原が、既知の反応性を有し得、このような既知の反応性が、種々の因子もしくはパラメーターによって特徴付けられ得ることが予期される。しかし、このような既知の反応性が、免疫原性の強度および／もしくはレプトスピラ感染の時間経過によって特徴付けられることが好ましい。上記パラメーターが、上記疾患の活動状態、上記病原体への以前の曝露、上記病原体への曝露の継続期間、慢性感染、過去の疾患、活発な感染、不活発な感染、上記病原体の感染に対する少なくとも部分的な免疫、および／または処置に際しての転帰であることが一般に好ましい。上記疾患パラメーターは、レプトスピラ症への以前もしくは現在の曝露、急性、潜伏性、もしくは再発性の感染、およびレプトスピラ症の感染に対する少なくとも部分的な免疫からなる群より選択され得る。
【００３６】
本発明の概念の抗原が、集団全体を通じて特徴的分布を有し得ることがさらに予期される。企図される実施形態において、上記抗原のうちの少なくとも２種、または上記抗原のうちの上記少なくとも２種に対する抗体は、上記少なくとも２種の抗原に曝露された集団のうちの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９０％超に存在し得る。必要に応じて、上記少なくとも２種の抗原に対して患者で産生された抗体の平均的な結合親和性および平均量のうちの少なくとも一方は、患者において産生された抗体の結合親和性および量の上三分位数の中にある。
【００３７】
本発明の概念のいくつかの実施形態において、記載される方法を使用して同定される抗原（もしくはそれらのフラグメント）および／またはそれらに対して指向される抗体は、哺乳動物のレプトスピラ症の診断において、および／または哺乳動物のレプトスピラ症の診断に適した診断デバイスもしくはシステムにおいて利用され得る。類似の実施形態において、記載される方法を使用して同定される抗原（もしくはそれらのフラグメント）および／またはそれらに対して指向される抗体は、哺乳動物においてレプトスピラ症を診断するための方法において利用され得る。このような抗原は、個々に使用され得る。好ましい実施形態において、このような抗原もしくはこのような抗原に対して指向される抗体のうちの２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、もしくは２０種より多くが、試験目的のパネルとして使用され得る。このようなタンパク質もしくはペプチド抗原は、組換えであり得、そして少なくとも部分的に精製され得る。使用されるタンパク質もしくはペプチド抗原の純度は、ｗ／ｗベースで、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは９９％超であり得る。診断デバイスもしくは方法は、レプトスピラ症の同定、レプトスピラ症のステージ決定、もしくはその両方に対して指向され得る。上記診断デバイスもしくは方法は、任意の適切なイムノアッセイ形式（凝集、比濁法、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光異方性、および免疫蛍光が挙げられる）を使用し得る。直接的、間接的、もしくは「サンドイッチ」アッセイ法もしくは形式が、使用され得る。適切な診断デバイスおよび方法は、フローアッセイ、マイクロウェルプレートアッセイ、およびラテラルフローアッセイが挙げられる。このようなアッセイにおいて、１種以上の成分が、キャリア（例えば、固体もしくは不溶性の相（例えば、プラスチック表面、ガラス表面、紙もしくは線維状の表面、または粒子の表面））に結合もしくはカップリングされる。複数の抗原を利用するアッセイにおいて、このような抗原もしくはこのような抗原に対する抗体は、互いから識別可能であるように試験表面に分布させられ得る。例えば、個々の抗原もしくは抗体は、マイクロウェルプレートの異なるウェルに、または平面の試験表面上の識別可能なおよび／もしくは別個の部位に固定され得る。あるいは、個々の抗原もしくは個々の抗原に対する抗体は、色、サイズ、および／もしくは蛍光発光によって識別可能である粒子の種々の集団にカップリングされ得る。本発明の概念のさらに他の実施形態において、上記診断デバイスは、フロー試験もしくはストリップ試験であり、ここでは、フローのための経路、開口部、もしくはチャネルを含む支持体（例えば、多孔性膜もしくは線維状シート）を通る流体のフローが、試験成分を反応性部位を通過させる。このような実施形態において、個々の抗原もしくは個々の抗原に対する抗体の同定は、上記支持体上の特徴的な位置にインジケーター（例えば、着色したバンドもしくは縞模様）が出現することを通じて確認され得る。
【００３８】
別の実施形態において、レプトスピラ症を有する患者の可能性を推定するための方法は、患者から得られた血清サンプル中で、１種以上の抗原、またはそれらの改変体に対する自己抗体反応性を決定する工程を包含する。次いで、患者がレプトスピラ症を有する可能性は、上記疾患を有すると診断された患者の血清由来の参照サンプルから推定され得、その結果、選択された抗原に対する増大したもしくは低下した自己抗体反応性は、上記患者における上記疾患の可能性の増大と正に相関し得る。
【００３９】
本発明の概念の別の実施形態は、レプトスピラ症を有する個体に由来する血清を使用して同定された、免疫原性量の１種以上の抗原（もしくはそれらのフラグメント）を、キャリア（例えば、生理学的に受容可能なビヒクル）と組み合わせて含むワクチン調製物である。同様の実施形態において、本発明の概念の１種以上の抗原（もしくはそれらのフラグメント）は、ワクチンにおける使用によって、レプトスピラ症を処置および／もしくは予防するための方法において使用され得る。このようなワクチンは、予防的および／もしくは治療的であり得る。好ましい実施形態において、ワクチン調製物は、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、もしくは２０種より多くのレプトスピラ抗原を含み、そのうちの少なくともいくつかは、免疫優性抗原である。このようなタンパク質もしくはペプチド抗原は、組換えであり得、そして少なくとも部分的に精製され得る。上記使用されるタンパク質もしくはペプチド抗原の純度は、ｗ／ｗベースで、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは９９％超であり得る。このようなワクチンはまた、免疫応答を増強することが知られた有効量の免疫学的アジュバントを含み得る。被験体を免疫化するために、上記免疫原性タンパク質（複数可）もしくはペプチド（複数可）は、非経口的に、通常は、筋肉内注射もしくは皮下注射によって投与され得る。しかし、他の投与様式もまた、受容可能である。例えば、上記ワクチンは、経口的に、もしくは粘膜経路（例えば、鼻、消化管もしくは生殖部位）を介して、投与され得る。適切なワクチン製剤は、ビヒクル中に有効量の活性成分を含む。予防ワクチン中の有効量は、標的哺乳動物におけるレプトスピラ感染症の発生を予防、改善、低下するために十分な量である。治療ワクチン中の有効量は、標的哺乳動物におけるレプトスピラ感染症の細菌負荷量を減少させる、症状を低下させる、および／もしくは経過を短くするために十分な量である。上記有効量は、当業者によって容易に決定される。上記活性成分は、代表的には、上記組成物のうちの約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲に及び得るか、または適切であれば、さらにより高くてもよいし、より低くてもよい。投与される量は、ワクチン接種される被験体の年齢、体重、および物理的状態のような因子に依存する。本発明の主題のワクチンは、所望の有効性に必要な場合、単一用量もしくは複数用量で投与され得る。
【００４０】
ワクチンにおける使用に関して記載されるように同定されるタンパク質もしくはペプチド抗原は、単離され得、凍結乾燥され得、そしてワクチン調製の前に安定化され得る。次いで、上記ワクチンは、適切な濃度へと調節され得、必要に応じて、適切なワクチンアジュバントと合わされ得、使用のためにパッケージされ得る。代表的なアジュバントとしては、以下が挙げられる：界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシル−グリセロール、およびプルロニックポリオール）、ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポール）、ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ＭＰＬ、ジメチルグリシン（ａｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ））、タフトシン、オイルエマルジョン、アラム、およびこれらの混合物。このような免疫原性生成物は、ワクチン製剤における使用のためにリポソームへと封入され得るか、あるいはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）もしくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなタンパク質または他のポリマーに結合体化され得る。
【００４１】
本発明の主題の一局面において、記載されるゲノムアプローチを、ポイントオブケア試験を構築して、レプトスピラ症を診断するために適用した。よって、レプトスピラインタロガンス血清型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ株Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０ゲノムのうちの６１％を構成するタンパク質マイクロアレイチップを、開発した。チップ製作は、３工程プロセスを要した：（１）各選択されたＯＲＦのＰＣＲ増幅、（２）インビボ組換えクローニングおよび（３）インビトロ転写−翻訳反応、続いて、マイクロアレイチッププリント。タンパク質を、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）タグの両方とともに発現させた。このことは、これらタグに対する抗体が、マイクロアレイチップ品質を評価するために使用されることを可能にした。図２に示されるように、プリントした試験部位のうちの９６％は、いずれかのタグに対して陽性であった。
【００４２】
このようなマイクロアレイからの結果を、有意な抗体複合体形成に関するカットオフとして、コントロール（すなわち、ＤＮＡなしで行われる）反応の生成物から生じる試験部位の平均強度より上の２．５を超える標準偏差のシグナル強度を使用して評価した。サルバドール／ブラジルにおけるレプトスピラ症の実験室確認症例の血清、ならびに陰性コントロールの種々のセットを、ＩｇＧとの複合体形成についてプローブした。２３の差次的に反応性の（ｐ≦１０−４）免疫優性抗原のセットを、コントロールと比較した場合に、回復期サンプル（ｎ＝８０）の中で同定した。そのうちの１６はまた、急性期サンプル（ｎ＝５０）の中で差次的に反応性（ｐ＜０．０２）であった。このセットにおけるこれら１６抗原のうちの８および残りの７抗原のうちの３に関しては、増加する反応性（ｐ＜０．０４）を急性期から回復期まで検出した。このことは、これらの抗原が、防御免疫に関連する可能性があるということを示唆する。これらタンパク質のうちのいくつか（例えば、ＬｉｐＬ３２、ならびにレプトスピラ免疫グロブリン様タンパク質ＬｉｇＡおよびＬｉｇＢのユニークドメイン）が、このアプローチの確証を提供する血清反応性抗原として以前に記載されていたことは、注目に値する。このような実施形態によって同定されるレプトスピラ抗原は、表１に列挙される。
【表１−１】
2016503011.tif 000003
【表１−２】
2016503011.tif 000004
個々の抗原と関連する生成物は、表２に示される。
【表２−１】
2016503011.tif 000005
【表２−２】
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【００４３】
本明細書で記載されるプロテオームアレイアプローチを利用し、上記プロテオームアレイをレプトスピラインタロガンスでの自然なヒト感染に由来するサンプルでインターロゲートしたところ、以下の抗原（表３に列挙する）もまた、免疫優性抗原であることが示された。
【表３】
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本明細書で記載されるプロテオームアプローチが、レプトスピラ症に対する活発な免疫応答と関連する免疫優性抗原としてこれまで未知の多くのタンパク質を同定したことは、認識されるべきある。驚くべきことに、多くのレプトスピラタンパク質を同定したところ、これらは、生物の表面に発現されず、従来のアプローチを使用すると、潜在的な抗原性部位とは考えられない。
【００４４】
上記のように、本発明の概念の一実施形態は、いくつかの抗原（ここで上記抗原は、単独であるか、または１種以上の他の組換えタンパク質との組み合わせである）に対する抗体の診断検査のような方法において、種々の異なる形式において使用するためのレプトスピラ症疾患レプトスピラインタロガンス種タンパク質の部分的精製タンパク質および／もしくは組換えタンパク質を有する組成物である。このような診断アッセイは、レプトスピラインタロガンス、もしくは代わりに、別のレプトスピラ症疾患レプトスピラ種に対する抗体に関するものであり得る。このような組成物、デバイス、もしくは方法が、レプトスピラ症の診断の実験補助のために使用され得るものの、それは、上記感染のステージ決定のために、および／もしくは抗生物質治療の転帰を評価するために有用でもあり得る。表４に示されるように、上記プロテオームマイクロアレイを使用して同定された単一の抗原は、例えば、レプトスピラ症を有する急性期の患者と回復期の患者との間を区別するために使用され得る。単一の抗原での結果が示されるが、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、もしくは２０種を超えるレプトスピラ抗原での結果が、より正確でそして／または感度の高い結果を提供し得ることはが企図される。
【表４】
2016503011.tif 000008
【００４５】
企図される方法はまた、抗原を選択するための富化分析を含む。本明細書で記載されるシステムおよび方法を使用すると、レプトスピラインタロガンスゲノムのうちの１／３に由来する血清診断抗原のうちの９０％超が、同定され得ることが企図される。
【実施例】
【００４６】
（方法）
【００４７】
ヒト研究プロトコル：  プロトコルは、Ｙａｌｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＯｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの治験審査委員会によって承認された。サンプルを、レプトスピラ症の高風土病伝播を有する共同体に住んでいる感染患者および健常個体、ならびに書面によるインフォームドコンセントを受けた参加者から得た。サルバドール市出身の血液ドナーは、匿名であった。米国の健常個体由来の血清は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｉｒｖｉｎｅ）にあるＧｅｎｅｒａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒの匿名ボランティアから得た。集めた後、コード番号を各患者に対して設定して、全てのサンプルを使用前に匿名扱いにした。
【００４８】
ヒトサンプル：  １１４名のコントロールヒト血清サンプルおよび１６０名のレプトスピラ症の症例の検査で確認された血清のコレクションで評価を行った。コントロールサンプルは、（ｉ）カリフォルニア／米国（ここでは、レプトスピラ症の風土病伝播は存在しない）出身の健常者に由来する２９の血清；（ｉｉ）サルバドール／ブラジル（レプトスピラ症の風土病伝播がある都市）出身の血液ドナーに由来する３５の血清、および（ｉｉ）同じ都市にある高リスクの都市スラム共同体におけるコホート研究に登録した健常被験体に由来する５０の血清であった。１９９６年４月から２０１０年８月まで、サルバドール市出身および地方出身の患者を含め、スラム共同体の同じ状態において積極的な病院ベースのサーベイランスの間に症例を同定した。この期間の間に、重症レプトスピラ症の１５２９名のＭＡＴ確認症例を同定した。その中で、本発明者らは、８０名の急性期および８０名の回復期の血清を選択して、この研究を行った。血清サンプルを無作為に選択したので、急性期サンプルおよび回復期サンプルは必ずしも対にならない。急性期サンプルを、患者が入院した際に集め、回復期サンプルを、入院して少なくとも１４日後の回復しつつある患者（標準的な抗生物質治療を受けていても受けていなくてもよい）から集めた。検査での確認を、血清転換の基準（力価では４倍の上昇もしくはＭＡＴにおいて１：８００の単一力価）に従って定義した。
【００４９】
マイクロアレイ標的選択：  上記アレイを構成するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の選択を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）およびＪｏｈｎ  Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＪＣＶＩ）データベースにおいて入手可能なレプトスピラインタロガンス血清型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ株Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０ゲノムアノーテーションを考慮して行った。使用した基準は、潜在的に生物学的な重要性と、潜在的に抗原性の特徴とを有するタンパク質を含んだ。
【００５０】
ＰＣＲ増幅およびハイスループット組換えクローニング：  選択されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲによって増幅し、ｐＸＩベクターへとハイスループットＰＣＲ組換えクローニング法を使用してクローニングした。簡潔には、ＯＲＦを、５ｎｇのＬ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ血清型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ株Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０を使用して、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）で製造業者のプロトコルに従って増幅した。サイクリング条件は、以下のとおりであった：９４℃で２分間、９４℃で９０秒、５５℃で１５秒、５０℃で１５秒、６８℃で２分間を３１サイクル、および６８℃で１０分間の最終伸長。プライマーは、増幅される遺伝子に隣接する５９および３９末端へと組みこまれ、直線状にしたｐＸＩベクターのクローニング部位に相同である２０ｂｐ  ＯＲＦ特異的配列および特有の２０ｂｐアダプター配列を含んだ（それぞれ、ＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧおよびＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡ）。３ｋｂより大きな遺伝子を、配列間で少なくとも１５０ヌクレオチドの重複を維持して、より小さなセグメントとしてクローニングした。このようなセグメント化ＯＲＦを、遺伝子ＩＤと、続けて文字「ｓ」およびセグメントの番号とで称した（例えば、ＬＩＣ１０５０２−ｓ４）。ｌｉｇＡおよびｌｉｇＢ遺伝子（それぞれ、ＬＩＣ１０４６５およびＬＩＣ１０４６４）を、上記タンパク質の構造に存在する反復Ｂｉｇドメイン（ＬｉｇＢ  リピート  ７−１２、ＬｉｇＡ  リピート  ７−１３およびＬｉｇＡ／Ｂ  リピート  １−６）［２０］に対してフラグメント化した。これらは、潜在的な診断マーカーおよび／もしくはワクチン候補として記載されてきた。失敗のために最大でさらに３回までの増幅を試みた。これらは、ＰＣＲ条件を調節することによっておおよそ取り戻した。全てのＰＣＲ反応を、クローニング前にゲル電気泳動によって正確な挿入物サイズについて確認した。
【００５１】
上記ｐＸＩプラスミドは、Ｎ末端に６×ＨｉｓタグおよびＣ末端にヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードする。上記プラスミドを、ＢａｍＨＩでの消化によって直線状にし、ＰＣＲによって増幅して、アクセプターベクターを生成した。４０ｎｇの直線状にしたｐＸＩベクター、１μＬのＯＲＦ  ＰＣＲ反応物および１０μｌのスーパーコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５−ａ細胞（ＭｃＬａｂ）を含む反応物を、氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で１分間熱ショックを与え、氷上で１分間冷却した。１８０μｌのＳ．Ｏ．Ｃ培地を添加し、細胞を、３７℃で１時間培養した。上記反応混合物全体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充した１．１ｍＬのＬＢに添加し、３７℃で一晩、激しく曝気しながらインキュベートした。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ  ＵＳＡ）でコロニー選択なしで抽出し、ゲル電気泳動によって分析して、挿入物サイズを確認した。最大でさらに２回までのクローニングを行って、効率を増大させ、形質転換のためにＰＣＲ容積を倍加することによって再開した。５００ｂｐ未満の挿入物およびいくつかの無作為に選択したものを有する全てのプラスミドを、挿入物特異的プライマーを使用するＰＣＲによって、挿入物存在について確認した。上記マイクロアレイを血清サンプルでプローブした後、血清反応性抗原を同定し、その対応するプラスミドを配列決定した。上記挿入物を、全ての場合において確認した。
【００５２】
マイクロアレイ製作およびインターロゲーション：  アレイ製作のために、ＤＮＡの精製したミニ調製物（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を、製造業者の説明書に従って、Ｅ．ｃｏｌｉベースのインビトロ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）反応システム（ＲＴＳ  Ｋｉｔ，  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ，  ＵＳＡ）における発現のために使用した。１０μＬの反応を３８４ウェルプレートで行い、３００ｒｐｍの振盪の下で１６時間、２６℃でインキュベートした。コントロール反応を、ＤＮＡの非存在下で行って（「ＮｏＤＮＡ」コントロール）、ＩＶＴＴ反応自体によって与えられるバックグラウンドを評価した。プロテアーゼインヒビター混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ，  ＵＳＡ）および終濃度０．５％  ｖ／ｖまでのＴｗｅｅｎ−２０を上記反応物に添加し、次いで、これを混合し、遠心分離にかけて、いずれの沈殿物もペレットにし、プリントする前に気泡を除去した。粗製上清を、ニトロセルロース被覆ガラスＦＡＳＴスライド（Ｗｈａｔｍａｎ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）の上に、Ｏｍｎｉ  Ｇｒｉｄ  １００マイクロアレイプリンター（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）を使用して直ぐにプリントした。さらに、アレイを、複数の陰性コントロール反応物、マウス、ラットおよびヒトのＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  ＵＳＡ）を含むＩｇＧ混合物の陽性コントロールスポット、ならびに精製エプスタインバーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ１）タンパク質（これは、ヒトの大半によって認識される）（血清品質のマーカーとして働かせる）でプリントした。
【００５３】
タンパク質発現を、それぞれのタグに対して、モノクローナル抗ポリヒスチジンタグ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，  ＵＳＡ）および抗ヘマグルチニンタグ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ，  ＵＳＡ）で上記アレイをプローブすることによって検証した。アレイを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）で３０分間最初にブロックし、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１：４００希釈した抗タグ抗体で一晩プローブした。次いで、アレイを、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１：１０００希釈したビオチン化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  ＵＳＡ）の中で１時間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジン結合体化ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ  Ｐ３（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ）とともに１時間インキュベートした。各インキュベーションの後、スライドを、０．０５％  ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＴＢＳ）で３回洗浄した。Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）および蒸留水でのさらなる洗浄を行い、上記スライドを、スキャンする前に短時間の遠心分離によって風乾した。スライドを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ共焦点レーザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）でスキャンし、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）を使用して強度を定量した。
【００５４】
ヒト血清でのインターロゲーションのために、サンプルを、終濃度１０％  ｖ／ｖの１０ｍｇ／ｍＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物（ＭｃＬａｂ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を含むＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１：１００希釈し、３０分間、室温で、一定の混合下でインキュベートして、ＩＶＴＴ反応におけるＥ．ｃｏｌｉタンパク質へのバックグラウンド反応性を除去した。Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質−抗体複合体を、上記マイクロアレイに添加する前に、遠心分離によって上記サンプル希釈混合物から除去した。アレイを、３０分間、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒでブロックし、次いで、希釈サンプルで一晩、４℃において穏やかに振盪しながらインキュベートした。ビオチン化抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃ−ｃフラグメント特異的，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  ＵＳＡ）を、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１：２０００希釈し、上記アレイとともに１時間周囲温度でインキュベートした。各インキュベーションの後に、スライドをＴＴＢＳで３回洗浄し、結合した抗体を、上記のように、ストレプトアビジン結合体化ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ  Ｐ３とともに１時間インキュベートすることによって検出した。ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ  Ｐ３とのインキュベーション後、マイクロアレイ結果を、蛍光強度のスキャンによって定量化した。
【００５５】
マイクロアレイデータ分析：  スポット強度を、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）を使用して定量した。生データを、各スポットに関して平均ピクセルシグナル強度として得て、全ての強度を、スポット特異的バックグラウンドに対して自動的に較正した。各アレイに関して、コントロールＩＶＴＴ反応（すなわち、ＤＮＡなしコントロール）の平均を、バックグラウンド反応性を最小限にするために、スポットシグナル強度から差し引いた。タンパク質を、上記タグのいずれかに関するシグナル強度が、ＤＮＡなしコントロール反応平均＋２．５標準偏差より大きかった場合に、発現されているとみなした。同じカットオフを、集めた血清サンプルを使用してインターロゲートした反応性タンパク質を同定するために適用した。データ分析を、公的に利用可能なＲ統計ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇで得られる）を使用して行った。分散を安定化するために、ＶＳＮ正規化を生データに適用し、グループを、ベイズ正規化ｔ検定（Ｂａｙｅｓ  ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）によって比較した。ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）の方法を使用して、偽発見率を制御し、その結果、０．０５より小さいｐ値を有意とみなし、その対応するタンパク質を、差次的に反応性とみなした。ヒストグラムに関しては、１Ｅ−１４より小さなＢＨ補正ｐ値を、１Ｅ−１６として割り当てた。多重分類子（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を、「ｅ１０７１」  Ｒ統計ソフトウェアを使用する線形および非線形Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ（ＳＶＭｓ）を使用して生成した。受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線のプロットを、「ＲＯＣＲ」  Ｒ統計ソフトウェアで作成した。感度および特異度を、得られたＲＯＣ曲線から決定した。急性期および／もしくは回復期血清サンプルがこの研究のために選択された上記レプトスピラ症患者の臨床的特徴を、四分位（ＩＱＲ）範囲とともに頻度および中央値を使用して記載した。カイ二乗検定もしくはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ／Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して、急性期レプトスピラ症患者の臨床症状と、回復期患者の臨床症状とを比較した。患者の臨床的特徴と、タンパク質マイクロアレイにおいて最良の性能を提示した３種の抗原に対する急性期血清のシグナルの強度との間の関連を、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定によって評価した。
【００５６】
イムノストリップブロッティング：  急性期もしくは回復期サンプルの群のいずれかに関して差次的に反応性の抗原に対応する選択されたクローンを、５時間のＩＶＴＴ反応（ＲＴＳ  Ｋｉｔ，  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ，  ＵＳＡ）に製造業者の説明書に従って供した。プロテアーゼインヒビター混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ，  ＵＳＡ）、Ｔｗｅｅｎ−２０およびメタノールを、それぞれ、０．５％および１０％  ｖ／ｖの終濃度に添加した。上記反応物を混合し、遠心分離にかけて気泡を除去した。未精製の上清を、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ２４０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）の上に、１μＬ／ｃｍでＢｉｏＪｅｔディスペンサー（ＢｉｏＤｏｔ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）を使用してプリントし、３ｍｍの膜ストリップに切断した。次いで、個々の膜ストリップを、ＴＴＢＳ  ５％  無脂肪乳中で３０分間ブロックした。血清サンプルを、終濃度２０％  ｖ／ｖのＥ．ｃｏｌｉ溶解物を含むＴＴＢＳ  ５％  無脂肪乳中で１：２５０希釈し、３０分間室温で撹拌しながらインキュベートした。次いで、ブロックしたストリップを、１時間の間、希釈した血清とともにインキュベートし、ＴＴＢＳで６回洗浄した。アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  ＵＳＡ）を、ＴＴＢＳ  ５％  無脂肪乳中で１：５０００希釈し、各ストリップに、１時間、室温で撹拌しながら適用した。ＴＴＢＳで６回洗浄した後、ＴＢＳでさらに３回洗浄し、反応性のバンドを、１工程のニトロブルーテトラゾリウムクロリド／５−ブロモ−４−クロロ−３９−インドリルホスフェート（Ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）  ｐ−トルイジン塩（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）発色緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）とともに２分間室温でインキュベートすることによって可視化した。酵素反応を、上記膜ストリップを水道水の流水に曝すことによって停止させ、上記膜ストリップを風乾し、その後、２，４００ｄｐｉで市販のデスクトップスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｆｉｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）を使用してスキャンした。画像をグレースケールに変換し、バンド強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／で入手可能）を使用して定量した。
【００５７】
代表的な結果
【００５８】
抗原選択：  上記アレイに含めるタンパク質を選択するために使用される基準から、２，２４１のＯＲＦが提供され、これは、レプトスピラインタロガンスプロテオームのうちの６１％に相当した。合計で、上記アレイは、全長タンパク質およびタンパク質セグメントを含め、２，３６１の抗原を含んだ。タンパク質発現を、上記アレイを抗Ｈｉｓおよび抗ＨＡでプローブすることによって評価したところ、タンパク質スポットのうちの９７％超がＨｉｓタグもしくはＨＡタグのいずれかに対して陽性であると確認された。
【００５９】
ヒトＩｇＧ抗体プロフィール：  この研究で使用される血清を、表１にまとめられかつ方法の節で記載される５群に分類した。血清のうちの大部分（８８％）を、男性被験体から得て、年齢中央値は、３４歳齢であった（ＩＱＲ：  ２４〜４５歳齢）。入院前までの症状の継続期間中央値は、６日（ＩＱＲ：  ５〜８日）であった。黄疸および急性呼吸窮迫症候群は、それぞれ、患者のうちの８７％および１３％で起こった。腎障害は頻繁であり（クレアチニン中央値：  ４．０［ＩＱＲ：  ２．０〜６．４］ｍｇ／ｄＬ）、上記患者のうちの３０％は、腹膜透析もしくは血液透析を受けた。集中治療を上記患者のうちの２０％に提供し、３％が死亡した。
【００６０】
アレイ結果を要約するヒートマップを、図３に示し、２３９の個体サンプルの各々に関する４２の反応性抗原の反応性の概観を示す。個々の検体を、列で示し、米国出身の健常コントロール、高風土病地域群出身の健常コントロール、急性期患者および回復期患者によってグループ分けする。抗原（行で示す）を、健常コントロールよりも症例において有意に反応性であるものに従って組織化する。これらの抗原を、「差次的に反応性」（ＤＲ）と称し、３つのセクションに分ける：急性期患者および回復期患者の両方に関して差次的に反応性であると同定された抗原、急性期患者についてのみ差次的に反応性であると同定された抗原、ならびに回復期患者についてのみ差次的に反応性の抗原。抗原の第２のセットを、健常コントロールおよび症例において同程度に等しく反応性であると同定し、「交叉反応性」（ＣＲ）と称した。交差反応性抗原から認められるバックグラウンド反応性は、３群全ての間で類似であった。
【００６１】
レプトスピラ症陽性症例とレプトスピラ症陰性症例との間を識別し得る抗原を同定する目的に向かって、分析は、急性期患者および回復期患者と、高風土病伝播を有する地域出身の健常個体との比較に基づき得る。このような比較の結果は、図４Ａおよび図４Ｂに見られ得る。このような地域に住んでいる健常個体は、レプトスピラポリサッカリドおよびタンパク質にいくらかのバックグラウンド反応性を示し得るので、レプトスピラ症患者の中では血清反応性を有するが、健常個体の中は有しない抗原の同定は、現在のレプトスピラ症症例を識別するにあたって有用であり得る。このサンプルセットにおいて使用された高風土病コントロール全部が、レプトスピラ症に関してＭＡＴ陰性であった。分析におけるバイアスを回避するために、収集地域に住んでいる、１０名のＭＡＴ陽性および１０名のＭＡＴ陰性の健常個体から得たサンプルからのマイクロアレイに対して検出されるＩｇＧ反応性を比較した。両方の群に関して観察された全体的な反応性は低く、感染した患者に関して検出される（以下に記載されるとおり）反応性抗原の大部分は、ＭＡＴ陽性もしくはＭＡＴ陰性の健常個体のいずれに対しても反応性ではなかった。従って、ＭＡＴ陰性高風土病コントロールを、分析のために使用した。
【００６２】
このサンプルセットは、反応性抗原として、上記アレイにプリントされた抗原全部のうちの約１．３％である３０抗原を同定した。これらのうち１８が、高風土病地域群出身のコントロール個体と比較して、回復期サンプルに由来するＩｇＧ抗体に有意により結合した。急性期サンプルにおいて、上記ＩｇＧ抗体応答は、３５の血清反応性抗原もしくは上記アレイのうちの１．５％を同定した。そのうちの１６が急性期症例と陰性症例との間を識別した。ＬｉｐＬ３２、ＬｉｇＡ  リピート  ７−１３およびＬｉｇＢ  リピート  ７−１２抗原は、回復期群および急性期群の両方に関して平均して３種の最も反応性の標的であった。１０の差次的に反応性の抗原を、急性期群と回復期群との間で重複する（すなわち、共通する）として同定した。
【００６３】
レプトスピラ症の風土病伝播を有する地域に住んでいる健常個体の中でのバックグラウンド反応性を特徴付けるために、米国（ここではレプトスピラ症は風土病でない）出身のコントロール群、ブラジル人血液ドナー、および高風土病地域出身の健常個体に関する累積抗原反応性を比較した。代表的結果のヒートマップを、図５Ａに示す。これは、コントロール群のうちのいずれかに対するカットオフを上回る平均シグナル強度を有する全ての抗原の反応性を示す。米国コントロールおよびブラジル人血液ドナーと比較して、高風土病地域群においてより高い全体的反応性が観察された。上記アレイ上の全抗原に対する累積シグナル強度の分析（図５Ｂ）は、レプトスピラ症曝露にナイーブである米国の健常被験体が最低の全体的反応性を、続いて、サルバドール出身の血液ドナー、その次に、高風土病地域出身の健常個体が示したことを示す。風土病地域に住んでいる血液ドナーは、米国のナイーブ被験体より僅かに高い反応性を有したが、例示的サンプルセットで観察された差異は、統計的に有意でなかった。しかし、高風土病伝播を有する地域に在住する健常個体における全体的なバックグラウンド反応性は、ブラジル出身の血液ドナーもしくは米国コントロールのいずれよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００６４】
各患者に関する反応性抗原全ての平均シグナル強度もまた、患者のＭＡＴ力価と比較した。ＭＡＴ結果は、レプトスピラＬＰＳに結合し、ＩｇＭ免疫グロブリンサブタイプとＩｇＧ免疫グロブリンサブタイプとの間を識別しない凝集抗体に主に依存する。全ての急性期サンプルおよび回復期サンプルを、ＭＡＴによって感染に関して検査で確認したところ、３倍の増加が、急性期群に由来するサンプルと比較して、回復期サンプルの力価中央値で観察された（すなわち、８００から３，２００へ）。急性期群と比較して、回復期群の抗原シグナル強度の一般的な増大が観察された（図ＸＸＸ１およびＸＸＸ２を参照のこと）。このサンプルセットを使用して、これら２つのアプローチの間で相関を生むことは可能でない。理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、これは、ＭＡＴ抗原およびタンパク質抗原がこれら患者集団において種々の抗体プールを同定するということを示し得ると考えている。
【００６５】
血清診断抗原のＲＯＣ分析：  レプトスピラ症症例を識別するにあたって差次的に反応性の抗原の精度を決定するために、個々の抗原のＲＯＣ曲線を生成し、各抗原のＡＵＣを決定した。急性期および回復期サンプルを、高風土病地域コントロール群に対して別個に分析し、感度および特異度を、ＳＶＭ計算アプローチを使用して両群に関して計算した。次いで、ＡＵＣが減少する順および生成された複数の抗原のＲＯＣ曲線によって抗原をランク付けした。急性期群の例示的な単一抗原ＲＯＣを、図６Ａに示す；類似の計算を、回復期群に由来するサンプルについても行った。両方の群に関して、疑陽性率を、高風土病地域の健常コントロール群に由来するデータを使用して計算した。
【００６６】
急性期患者に関しては、Ｌｉｇタンパク質の非同一ドメイン（ＬｉｇＡ  リピート  ７−１３およびＬｉｇＢ  リピート  ７−１２）は、最良の感度および特異度を提供し（ＡＵＣ＝０．８９４−０．８５７）、それにＬｉｐＬ３２（ＬＩＣ１１３５２，  ＡＵＣ＝  ０．８４１，  表２）が続いた。疾患が回復期へと進むにつれて、これらの抗原の精度は上がり、その結果、ＬｉｐＬ３２は、最良の性能（ＡＵＣ＝０．９８６）を達成し、それにＬｉｇＡ  リピート  ７−１３（ＡＵＣ＝０．９６５）およびＬｉｇＢ  リピート  ７−１２（ＡＵＣ＝０．９６８）が続いた。改善された精度を有する３種の抗原（すなわち、ＬｉｇＡ  リピート７−１３、ＬｉｇＢ  リピート７−１２およびＬｉｐＬ３２）のうちのいずれも、急性期血清サンプルで試験した場合に、高いシグナル強度を（関連した患者の臨床的特徴として）有すると見出されなかった。ＧｒｏＥＬファミリーの熱ショックタンパク質（ＬＩＣ１１３３５）もまた、血清反応性であると同定し、急性期および回復期両方の患者に関して感度が高かった（それぞれ、９０．０％および９２．０％）が、特異度は低かった（５３．８％および６２．５％）。別の熱ショックタンパク質であるＤｎａＫ（ＬＩＣ１０５２４）は、回復期群に関して血清反応性を示したが、本発明者らは、急性期群においてこの抗原に対する有意なレベルのＩｇＧを検出できなかった。毒性関連タンパク質Ｌｏａ２２（ＬＩＣ１０１９１）は、急性患者に関して非常に低い感度（３６．０％）を示し、回復期群に関して血清反応性でないとみなされた。同様に、ＬｉｐＬ３１（ＬＩＣ１１４５６）に対するＩｇＧ応答は、急性患者の間でのみ検出され、８２％感度および６８．８％特異度という診断精度であった。
【００６７】
驚くべきことに、いくつかの新規抗原（これに関して、血清反応性は以前に全く記載されていない）を本発明者らが同定した。仮定タンパク質ＬＩＣ１０２１５は、健常患者を急性期患者もしくは回復期患者のいずれかから識別するために、それぞれ、９２．０％および８６．０％の感度、ならびに６７．５％および８３．８％の特異度を提供した。ＬＩＣ１０２１５は、Ｌｉｇタンパク質のドメインおよびＬｉｐＬ３２の次に、急性期症例を健常個体から識別するために非常に有用であることが解った。回復期群に関しては、ＬＩＣ２００８７（外膜タンパク質として註釈が付けられた抗原）は、Ｌｉｇタンパク質のドメインおよびＬｉｐＬ３２の次に最良の精度を提供し、９６．０％感度および８６．３％特異度であった。
【００６８】
本明細書で利用される新規のアレイ化抗原アプローチはまた、１１の差次的に反応性の抗原の組み合わせが急性のレプトスピラ症症例の検出のために優れた感度および特異度（それぞれ、７８．０％および８７．５％）を可能にするのに対して、４種の抗原の組み合わせが、回復期症例に関して最良の精度（９８．０％感度および９４．０％特異度）を提供するという予期しない知見を可能にした（図６Ｂを参照のこと）。
【００６９】
イムノブロッティングによるアレイの検証：  １１の差次的に反応性の抗原（急性期もしくは回復期の群のいずれかに関して最も有意な抗原に対応する）を、ニトロセルロース膜にプリントし、３ｍｍストリップ（イムノストリップ）に切断した。これらを、無作為に選択した、非常に風土病性の地域出身の２０名の健常コントロール、２０名の急性期のレプトスピラ症、および２０名の回復期のレプトスピラ症の個体に由来する血清でインターロゲートした。健常個体は、これらの抗原に対してより低い反応性を示したのに対して、レプトスピラ症患者は、上記抗原のうちの大部分に対して強く反応した（図７）。抗原強度を定量し、群を、Ｃｙｂｅｒ−Ｔから適合させたベイズ正規化ｔ検定を使用して比較した。急性期群および回復期群の両方に関して、Ｌｉｇタンパク質のドメインは、最良の単一抗原識別を提供し、それにＬｉｐＬ３２が続いた。抗原ＬＩＣ１０２１５、ＬＩＣ１０４８６、ＬＩＣ１１２７１、ＬＩＣ２００８７およびＬＩＣ１１５７３は、イムノストリップに対して何ら血清反応性を示さなかった。本発明者らは、イムノストリップ上のこれらタンパク質抗原に関して観察されたより低い反応性が、上記イムノストリップとアレイプラットフォームとの間の技術的差異に起因し得ると仮定している。
【００７０】
既に記載されているものの他に、より多くの改変が本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく考えられることは、当業者にとって明らかであるはずである。本発明の主題は、従って、添付の特許請求の範囲の精神にあるものを除いて制限されるべきではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈するにあたって、全ての用語は、状況と一致して、可能な限り最も広い様式で解釈されるべきである。特に、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む、包含する）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含する）」は、排他的でない様式で要素、構成要素、もしくは工程に言及すると解釈されるべきであり、その言及された要素、構成要素、もしくは工程が存在し得るか、または利用され得るか、明示的に言及されていない他の要素、構成要素、もしくは工程と組み合わされ得ることを示す。本明細書および特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．．およびＮからなる群より選択される何かのうちの少なくとも１つに言及する場合、その本文は、その群のただ１つの要素を、Ａ＋Ｎでも、Ｂ＋Ｎなどでもなく、要すると解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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