(57)【要約】  本発明は、一般に、脆弱Ｘ症候群および他の認知障害の処置のためのメタドキシン療法に対する奏効性を判定するための方法に関する。本発明はまた、メタドキシン療法に奏効するであろう個体を同定することに関する。
2016530536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタドキシン処置を受けた脆弱Ｘ症候群または他の認知障害を有する被験体においてメタドキシン治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記被験体由来のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；
ｂ）前記サンプルにおいてＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；
ｃ）工程ｂ）で決定されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量に対する工程（ａ）で決定されたリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の比を計算すること；および
ｄ）工程ｃ）の計算比を非罹患被験体から測定された計算比と比較すること、
を含んでなり、工程ｃ）の計算比が非罹患被験体の計算比と類似している場合に、その処置が有効であることが示される、方法。
【請求項２】
脆弱Ｘ症候群または他の認知障害を有する被験体がメタドキシン治療計画から利益を得るかどうかを決定する方法であって、
ａ）前記被験体由来のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；
ｂ）前記サンプルにおいてＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；
ｃ）工程ｂ）で決定されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量に対する工程（ａ）で決定されたリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の比を計算すること；および
ｄ）工程ｃ）の計算比を非罹患被験体から測定された計算比と比較すること、
を含んでなり、工程ｃ）の計算比が非罹患被験体の計算比より高い場合に、その被験体がメタドキシン治療計画から利益を得るであろうことが示される、方法。
【請求項３】
脆弱Ｘ症候群または他の認知障害を有する被験体においてメタドキシン治療計画をモニタリングする方法であって、
ａ）第１の期間に、前記被験体由来の第１のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；
ｂ）前記第１の期間に、前記第１のサンプルにおいて、ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；
ｃ）工程ｂ）で決定されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量に対する工程ａ）で決定されたリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の第１の比を計算すること；
ｄ）第２の期間に、前記被験体由来の第２のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；
ｅ）前記第２の期間に、前記第２のサンプルにおいて、ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；
ｆ）工程ｅ）で決定されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量に対する工程ｄ）で決定されたリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の第２の比を計算して第２の比を得ること；
ｄ）前記第１の比と前記第２の比を比較すること
を含んでなる、方法。
【請求項４】
前記第２の比が前記第１の比より低い場合に、その処置が有効であることが示される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記測定工程がイムノアッセイを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが全血またはその画分である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＭＢＣがリンパ球または単球である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年９月９日出願の仮出願第ＵＳＳＮ６１／８７５，３８４号、２０１３年９月２６日出願の第ＵＳＳＮ１４／０３８２５８号、および２０１４年５月９日出願の仮出願第ＵＳＳＮ６１／９９１，３５１号の優先権および利益を主張するものであり、これらの内容はそれぞれそれらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、脆弱Ｘ症候群および他の認知障害の処置のためのメタドキシン療法に対する奏効性を判定するための方法に関する。本発明はまた、メタドキシン療法に奏効するであろう個体を同定することに関する。
【背景技術】
【０００３】
脆弱Ｘ症候群(fragile X Syndrome)（ＦＸＳ）は、その名称が意味するように、マップ位置Ｘｑ  ２７．３で中期染色体の同腕染色分体ギャップとして表される脆弱部位に関連する。脆弱Ｘ症候群は、Ｘ染色体上に位置する脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）遺伝子の５’非翻訳領域の突然変異によって引き起こされる遺伝的な障害である。ＦＸＳを引き起こす突然変異は、脆弱Ｘ精神遅滞遺伝子ＦＭＲ１中のＣＧＧリピートに関連する。ほとんどの健常者では、ＣＧＧリピートの総数は１０未満〜４０の範囲であり、平均は約２９である。脆弱Ｘ症候群では、このＣＧＧ配列が２００〜１，０００を超えて繰り返される。被験体が約２００を超えるＣＧＧリピートを有する場合、その脆弱Ｘ遺伝子は過剰にメチル化されるようになり、遺伝子は沈黙する。結果として、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）が産生されないか、または低レベルでしか産生されず、被験体はＦＸＳの兆候を示す。
【０００４】
ＦＭＲ１遺伝子の前変異拡大（５５〜２００ＣＧＧリピート）は一般集団で頻繁に見られ、推定保有率は女性２５９人に１人、男性８１２人に１人である。前変異の保有者は、不安などの感情問題が共通しているが、一般に正常なＩＱを有する。高齢男性の前変異保有者（５０歳以上）は、進行性の意図振戦および運動失調を発症する。これらの運動障害は、多くの場合、記憶喪失、不安、および実行機能の欠陥、引きこもりまたは過敏性行動、および認知症を含む進行性の認知・行動問題を伴う。この障害は脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）と呼ばれている。ＦＸＴＡＳを有する被験体の磁気共鳴画像法から、中小脳脚および隣接する小脳白質におけるＴ２強調シグナル強度の増強が明らかである。
【０００５】
ＦＸＳは、浸透率の低いＸ連鎖優性障害として分離している。いずれの性別でも、脆弱Ｘ突然変異を有する場合には知的障害を示し得るが、重篤度は様々である。ＦＸＳを有する小児および成人は、自閉症様の特徴および傾向を含む、様々な程度の知的障害または学習障害および行動・感情問題を有する。ＦＸＳを有する幼児は、座り方、歩き方および話し方の学習などの発達のマイルストーンに遅れを有する場合が多い。罹患小児は頻繁なかんしゃく、注意欠陥、頻繁な発作（例えば、側頭葉発作）を有する場合があり、多くの場合、高い不安を示し、打ちのめされやすく、感覚過覚醒障害、消化管障害を示すことがあり、会話障害および手をひらひらさせる、手を噛むなどの異常行動を示す場合がある。
【０００６】
ＦＸＳは、被験者由来のサンプル（例えば、血液サンプル、口内サンプル）に対して行われる確立された遺伝子検査によって診断することができる。この検査は、ＣＧＧリピートの数に基づき被験者のＦＭＲ１遺伝子に突然変異または前変異が存在するかどうかを判定する。
【０００７】
ＦＸＳを有する被験体は自閉症も有する場合がある。自閉症と診断された全小児の約５％がＦＭＲ１遺伝子に突然変異を有し、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）も有する。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、ＦＸＳを有する男性のおよそ３０％、女性の２０％に見られ、ＦＸＳ者のさらに３０％が、ＡＳＤ診断を持たずに自閉症症状を示す。知的障害がＦＸＳの顕著な特徴であるが、ＦＸＳ者は、軽度症例では内気、目を合わさない、および社交不安から、重度罹患では手をひらひらさせる、手を噛むおよび保続的会話までにわたる自閉症的特徴を示す場合が多い。ＦＸＳ者は、注意欠陥および多動、発作、感覚刺激に対する過敏性、強迫性行動および消化管機能の変化などの自閉症に関連する他の症状も示す。ＦＭＲ１突然変異は、単一のタンパク質（ＦＭＲＰ）の発現を抑制するか、または大幅に低下させる。ＦＭＲＰの不在下での脳発達は、ＦＸＳの主な症状を生じさせると思われる。
【０００８】
中核症状に加え、ＦＸＳを有する小児は、易刺激性、攻撃および自傷行為などの重篤な行動障害を有する場合が多い。ＦＸＳを有する男性（８〜２４歳）の最近の研究では、２か月の観察期間での自傷行為は被験者の７９％、攻撃行動は７５％と報告された。
【０００９】
ＦＸＳを有するヒトに対する現在利用可能な治療計画としては、例えば、行動修正ならびに抗鬱薬および抗精神病薬を含む一定範囲の投薬（ＦＸＳの治療としてはＦＤＡにより承認されていない）による処置が含まれる。認知行動療法は、ＦＸＳおよび自閉症者において言語および社会化を改善するために使用されている。近年では、非定型抗精神病薬リスペリドンによる薬理学的処置が、自閉症者の治療において非薬理学的アプローチを増強するために一般に使用されている。自閉症小児におけるリスペリドンの無作為化プラセボ対照試験では、異常行動チェックリストおよび臨床全般印象改善の易刺激性サブスケールに有意な改善が示された(McCracken, J. T., et al., N. Engl. J. Med. 347:314-321 (2002))。しかしながら、有害事象は、体重増加、食欲増加、疲労、傾眠、目眩、および流涎を含んだ。社会的孤立およびコミュニケーションはリスペリドンの投与により改善されず、錐体外路系症状およびジスキネジアなどの有害な副作用は自閉症の小児においてリスペリドンと関連付けられた。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、メタドキシン処置を受けた脆弱Ｘ症候群または他の認知障害を有する被験体においてメタドキシン治療計画の有効性を評価する方法であって、前記被験体由来のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；前記サンプルにおいてＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の比を計算すること、および前記計算比を非罹患被験体から測定された計算比と比較することによる方法を提供する。前記被験体の計算比が既知の非罹患被験体に関する計算比に類似している場合、その処置は有効である。
【００１１】
また、本発明により、脆弱Ｘ症候群または他の認知障害を有する被験体がメタドキシン治療計画から利益を得るかどうかを判定する方法であって、前記被験体由来のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；前記サンプルにおいてＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の比を計算すること、および被験体計算比を非罹患被験体から測定された計算比と比較することによる方法が提供される。前記被験体計算比が既知の非罹患被験体の計算比より高い場合、その被験体はメタドキシン治療計画から利益を得ると思われる。
【００１２】
また、本発明により、脆弱Ｘ症候群または他の認知障害を有する被験体においてメタドキシン治療計画をモニタリングする方法であって、第１の期間に、前記被験体由来の第１のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；前記第１の期間に、前記第１のサンプルにおいて、ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；前記ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の第１の比を計算すること；第２の期間に、前記被験体由来の第２のサンプルにおいて、リン酸化されたＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量を測定すること；前記第２の期間に、前記第２のサンプルにおいて、ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量を測定すること；ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の総量に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の量の第２の比を計算すること、および前記第１の比を前記第２の比と比較することによる方法が提供される。前記第２の比が前記第１の比より低い場合、その処置は有効である。
【００１３】
いくつかの態様では、前記測定工程は、イムノアッセイを含む。いくつかの実施態様では、前記サンプルは全血またはその画分である。いくつかの実施態様では、前記サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施態様では、ＰＭＢＣはリンパ球または単球である。
【００１４】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の実施には本明細書に記載されているものと類似または等価な方法および材料が使用可能であるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載されている総ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、それらの全内容が明示的に引用することにより本明細書の一部とされる。矛盾があれば、定義を含む本明細書が優先する。加えて、本明細書に記載の材料、方法、および例は単に例示であり、限定することを意図するものではない。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになり、それらに包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおける恐怖条件付けに対するビヒクル（Ｖ）またはメタドキシン（Ｍ）（１００、１５０、または２００ｍｇ／ｋｇ）の１日１回、７日の腹腔内（ｉｐ）投与の効果を示す。具体的には、パネルＡは、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇのメタドキシンの効果を示す。パネルＢは、ビヒクルまたは１００ｍｇ／ｋｇのメタドキシンの効果を示す。パネルＣは、ビヒクルまたは２００ｍｇ／ｋｇのメタドキシンの効果を示す。示されているデータは平均±平均の標準誤差（ｓｅｍ）、１群につきマウスＮ＝１０である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびＮＳ＝有意でない。
【図２】図２は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおける社会的接近行動に対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日の腹腔内投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊ｐ＜０．０５および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３】図３は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおけるＹ迷路自発的交替行動（パネルＡ）、Ｙ迷路報酬交替行動（パネルＢ）またはＹ迷路水迷路空間弁別（パネルＣ）に対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日の腹腔内投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびＮＳ＝有意でない。
【図４】図４は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおけるＴ迷路報酬交替行動に対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日の腹腔内投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５】図５は、Ｎ＝１０野生型（ＷＴ）またはＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）２か月齢マウス群における連続小路課題での行動に対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）による１日１回、７日処置の効果を示す。この装置の連続小路は探索マウスに段階的に不安を増す環境を提供した。従って、小路から降りた場合に不安と評価される。加えて、総合的な活動レベルもこの装置で定量することができた。
【図６】図６は、２か月齢Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおけるＥＲＫ（ＥＲＫ活性の指標）（パネルＡ）およびＡｋｔ（Ａｋｔ活性の指標）（パネルＢ）の全脳リン酸化レベルに対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日の腹腔内投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝５である。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびＮＳ＝有意でない。
【図７】図７は、６か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおける恐怖条件付けに対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日間のｉｐ投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１およびｎｓ＝有意でない。
【図８】図８は、匂いの嗅ぎ合い(sniffing bouts)の回数または匂い嗅ぎの持続時間により測定される、６か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおける社会的接近行動（パネルＡおよびＣ）および社会的記憶行動（パネルＢおよびＤ）に対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日間のｉｐ投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびｎｓ＝有意でない。
【図９】図９は、６か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおけるＥＲＫ（パネルＡ）およびＡｋｔ（パネルＢ）の全脳リン酸化レベルに対するビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回、７日間のｉｐ投与の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびｎｓ＝有意でない。
【図１０】図１０は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおける恐怖条件付けに対する７日間の１５０ｍｇ／ｋｇでのメタドキシン（Ｍ）の１日１回ｉｐ投与またはビヒクル（Ｖ）もしくは１５０および３００ｍｇ／ｋｇメタドキシンの経口投与（ｐｏ）の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。具体的には、パネルＡは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスおよび野生型マウスにおけるビヒクルによるｉｐおよび経口処置を示す。パネルＢは、野生型マウスにおけるメタドキシンによるｉｐおよび経口処置を示す。パネルＣは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるメタドキシンによるｉｐおよび経口処置を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびｎｓ＝有意でない。
【図１１】図１１は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスにおける社会的接近（パネルＡ）および社会的記憶（パネルＢ）に対する７日間のビヒクル（Ｖ）１５０もしくは３００ｍｇ／ｋｇでのメタドキシン（Ｍ）の１日１回、ｉｐ投与または経口投与（ｐｏ）の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、およびｎｓ＝有意でない。
【図１２】図１２は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）および野生型（ＷＴ）マウスにおける、フローサイトメトリーを用いて評価されるリンパ球バイオマーカーに対する７日間のビヒクル（Ｖ）または１５０もしくは３００ｍｇ／ｋｇでのメタドキシン（Ｍ）の１日１回、ｉｐ投与または経口投与（ｐｏ）の効果を示す。示されているバイオマーカーは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスまたは野生型マウスにおけるｐＡｋｔ（パネルＡ）およびｐＥＲＫ（パネルＢ）である。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１およびｎｓ＝有意でない。
【図１３】図１３は、２か月齢の野生型（ＷＴ）およびＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの脳領域におけるｐＥＲＫレベルに対する７日間のビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回ｉｐ投与の効果を示す。分析領域は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスまたは野生型マウスにおける海馬（パネルＡ）、前頭前皮質（パネルＢ）、および線条体（パネルＣ）であった。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１およびｎｓ＝有意でない。
【図１４】図１４は、２か月齢の野生型（ＷＴ）およびＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの脳領域におけるｐＡｋｔレベルに対する７日間のビヒクル（Ｖ）または１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン（Ｍ）の１日１回ｉｐ投与の効果を示す。分析領域は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスまたは野生型マウスにおける海馬（パネルＡ）、前頭前皮質（パネルＢ）、および線条体（パネルＣ）であった。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につきマウスＮ＝１０である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１およびｎｓ＝有意でない。
【図１５】図１５は、Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウス由来のニューロン海馬培養物における糸状仮足密度（パネルＡ）、長さ（パネルＢ）、および幅（パネルＣ）に対するビヒクル（Ｖ）または３００μＭメタドキシン（Ｍ）による５時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍである（野生型、Ｎ＝２０ニューロンおよびＦｍｒ１ノックアウトマウス、Ｎ＝２０ニューロン）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、およびｎｓ＝有意でない。
【図１６】図１６は、Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）または野生型（ＷＴ）マウスの４００μＭ海馬切片における基底ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成に対するビヒクル（Ｖ）または３００μＭメタドキシン（Ｍ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理の効果を示す。示されているデータは平均±ｓｅｍ、１群につき切片Ｎ＝６である。＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本発明は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）および他の認知障害を有する個人に関するメタドキシン療法に対する奏効性に関連するバイオマーカーの同定に関する。具体的には、メタドキシン処置は、被験体サンプルにおける総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比を正常な比に戻すことが発見された。正常な比とは、正常な（すなわち、非罹患）被験体において見られる総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比を意味する。さらに、予期されないことに、リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質と総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比におけるこれらの変化は血液において検出され得ることが発見された。
【００１８】
よって、本発明は、メタドキシン処置を受けた被験体をＦＸＳまたは他の認知障害に関してモニタリングするための方法であって、被験体サンプルにおける総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比を決定することによる方法を提供する。この比は、認知障害に罹患していない被験体から得られた比などの対照比と比較される。正常な対照比に類似する被験体比は、その処置が有効であることを示す。
【００１９】
加えて、本発明は、メタドキシン処置から利益を得るであろう、認知障害を有する被験体を選択する方法であって、被験体サンプルにおいて総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫまたはＡｋｔタンパク質の比を決定することによる方法を提供する。この比は、認知障害に罹患していない被験体から得られた比などの対照比と比較される。正常な対照比を超える被験体比は、その被験体がメタドキシン処置から利益を得る可能性があることを示す。これに対して、正常対照比を超える比を有さない被験体は、メタドキシン処置から利益を得られないかもしれない。
【００２０】
この比の計算は本明細書では一方法のみ記載されるが、当業者に自明のように逆数の計算を包含するものと理解されるべきである。また、本明細書に記載の比の計算は有用な比較数値の提供に有益であるが、リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質と総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質レベルの間、および試験被験体と対照被験体の間の絶対的差異の計算も使用可能であり、本発明の実施において有効に使用される。
【００２１】
定義
「精度」は、測定または計算された量（検査報告値）の、その実際の（または真の）値との整合の程度を意味する。臨床精度は、誤分類された転帰（偽陽性（ＦＰ）または偽陰性（ＦＮ））に対する真の転帰（真の陽性（ＴＰ）または真の陰性（ＴＮ）の割合に関し、他の指標の中でも、感度、特異度、陽性的中率（ＰＰＶ）もしくは陰性的中率（ＮＰＶ）として、または尤度、オッズ比として表すことができる。
【００２２】
「バイオマーカー」は、本発明において、限定されるものではないが、タンパク質、核酸、および代謝産物を、それらの多形、突然変異、変異体、修飾、サブユニット、断片、タンパク質−リガンド複合体、および分解産物、タンパク質−リガンド複合体、エレメント、関連代謝産物、および他の分析物またはサンプル由来指標とともに包含する。バイオマーカーは、変異タンパク質または変異核酸も含み得る。バイオマーカーはまた、非血中因子または健康状態の非分析物生理学的マーカー、例えば、本明細書で定義される「臨床パラメーター」、ならびにこれもまた本明細書で定義される「従来検査リスク因子(traditional laboratory risk factors)」も包含する。バイオマーカーはまた、数学的に生成された計算指数、または時間的傾向および差異を含む、以上の測定値のうちいずれか１以上の組合せも含む。利用可能であれば、かつ、そうではないことが本明細書に記載されない限り、遺伝子産物であるバイオマーカーは、国際Human Genome Organization Naming Committee（ＨＧＮＣ）により割り当てられた公式文字略記または遺伝子記号に基づいて識別され、米国国立バイオテクノロジー情報センター(US National Center for Biotechnology Information)（ＮＣＢＩ）ウエブサイトの、このファイリングのデータに一覧化されている。
【００２３】
「臨床指標」は、単独でまたは細胞の収集物または生物において生理状態を評価する他のデータとともに使用される任意の生理学的データである。この用語は前臨床指標を含む。
【００２４】
「臨床パラメーター」は、被験体の健康状態の総ての非サンプルもしくは非分析物バイオマーカー、または限定されるものではないが、年齢（Ａｇｅ）、民族的背景（ＲＡＣＥ）、性別（Ｓｅｘ）、または家族歴（ＦａｍＨＸ）などの他の特徴を包含する。
【００２５】
「ＦＮ」は、病態検査に関して疾患被験体を非疾患または正常として不正確に分類することを意味する偽陰性である。
【００２６】
「ＦＰ」は、病態検査に関して正常被験体を疾患を有するとして不正確に分類することを意味する偽陽性である。
【００２７】
「式」、「アルゴリズム」または「モデル」は、１以上の連続的またはカテゴリー的インプット（本明細書では「パラメーター」と呼ばれる）をとりかつ「指数」または「指数値」と呼ばれることもあるアウトプット値を計算する、任意の数学的な等式、アルゴリズム的、分析的もしくはプログラムされたプロセス、または統計学的技術である。「式」の限定されない例としては、合計、比、および回帰オペレーター、例えば、係数または指数、バイオマーカー値変換および標準化（限定されるものではないが、性別、年齢または民族的背景などの臨床パラメーターに基づく標準化スキームを含む）、規則および指針、統計分類モデル、および履歴集団で訓練したニューラルネットワークが含まれる。パネルおよび組合せの構築においては、構造的および協同統計分類アルゴリズム、およびとりわけ相互相関、主成分分析(Principal Components Analysis)（ＰＣＡ）、因子回転、ロジスティック回帰（ＬｏｇＲｅｇ）、線形判別分析(Linear Discriminant Analysis)（ＬＤＡ）、固有遺伝子線形判別分析(Eigengene Linear Discriminant Analysis)（ＥＬＤＡ）、サポートベクターマシン(Support Vector Machines)（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト(Random Forest)（ＲＦ）、再帰分割木(Recursive Partitioning Tree)（ＲＰＡＲＴ）、ならびに他の関連の決定木分類技術、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ（ＳＣ）、ＳｔｅｐＡＩＣ、Ｋｔｈ最近傍、ブースティング、決定木、ニューラルネットワーク、ベイジアンネットワーク、サポートベクターマシン、および隠れマルコフモデルなどの確立された技術を含む、パターン認識特徴を用いるリスク指数構築の方法が特に着目される。当業者に周知のコックスモデル、ワイブルモデル、カプラン・マイヤーモデルおよびグリーンウッドモデルを含む他の技術も、生存期間およびイベントまでの時間のハザード分析に使用可能である。これらの技術の多くは、変数増加選択(forward selection)、変数減少選択(backwards selection)、またはステップワイズ変数選択、所与のサイズの可能性のある総てのパネルの完全調査、遺伝的アルゴリズムなどの選択的技術とそれぞれ組み合わせたものが有用であり、またはそれらはそれ自体、それらの固有の技術においてバイオマーカー選択法を含み得る。これらは、付加的バイオマーカーとモデルの改良との間のトレードオフを定量するため、過剰適合の最小化を助けるために赤池情報量規準(Akaike's Information Criterion)（ＡＩＣ）またはベイズ情報量規準(Bayes Information Criterion)（ＢＩＣ）などの情報量基準と組み合わせてよい。結果として得られる予測モデルは他の試験で妥当性の検証を行ってもよく、またはブートストラップ、一個抜き(Leave-One-Out)（ＬＯＯ）および１０倍交差検証（１０−Ｆｏｌｄ  ＣＶ）などの技術を用い、それらが元々訓練された試験において交差検証を行ってもよい。様々な段階で、偽発見率は、当技術分野で公知の技術に従った値の順列によって評価可能である。「医療経済効用関数(health economic utility function)は、標準治療への診断的または治療的介入の導入の前と後の両方で、適用可能な理想患者集団における一定範囲の臨床転帰の期待確率の組合せから導き出された式である。この関数は、このような介入の精度、有効性および性能の特徴の評価値、ならびに各転帰に関連するコストおよび／または値測定（有用性）の評価を含み、これらは実際の医療費（サービス、供給、装置および薬物など）から、および／または各転帰をもたらす質調整生存年(quality adjusted life year)（ＱＡＬＹ）当たりの許容可能な評価値として導き出すことができる。ある転帰の予測集団サイズに各転帰の期待効用を掛けた積の、総ての予測転帰に関する合計は、所与の標準治療の総医療経済的効用である。（ｉ）介入による標準治療に関して計算された総医療経済効用と（ｉｉ）介入無しの場合の標準治療に関する総医療経済効用の間の差は、介入による医療経済コストまたは値の総合尺度をもたらす。これはそれ自体、単位介入当たりのコストに到達するために、また、市場位置、価格設定、および医療制度の受け入れの仮定などの決定を導くために、分析される全患者群の中で（または単に介入群の中で）分割してよい。このような医療経済効用関数は、介入の費用有用性を比較するために慣用されるが、医療精度が快く支払うＱＡＬＹ当たりの許容可能な値、または新たな介入に要される許容可能な費用効果のある臨床性能特徴を評価するために変換することもできる。
【００２８】
本発明の診断（または予後）介入では、各転帰（疾患分類診断検査においてＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、またはＦＮであり得る）のコストが異なるので、医療経済効用関数は、臨床状況および個々の転帰コストおよび値に基づき、特異度よりも感度、またはＮＰＶよりもＰＰＶに優先的に有利であり得、従って、より直接的な臨床または分析性能尺度とは異なり得る医療経済性能および値の別の尺度をもたらす。これらの異なる測定値および相対的トレードオフは一般に、完全な試験の場合にのみ、誤り率ゼロ（ａ．ｋ．ａ．、ゼロ予測被験体転帰誤分類またはＦＰおよびＦＮ）で収束し、総ての性能尺度は、程度は異なるが、不完全よりも有利となる。
【００２９】
「測定する」または「測定」あるいはまた「検出する」または「検出」は、臨床サンプルまたは被験体由来サンプル内の所与の物質のいずれかの存在、不在、量（量は有効量であってもよい）（このような物質の定性的または定量的濃度レベルを含む）を評価すること、またはそうでなければ、被験体の非分析物臨床パラメーターの値または類別を評価することを意味する。
【００３０】
「陰性的中率」または「ＮＰＶ」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）または総ての検査結果のうちの真の陰性画分により計算される。陰性的中率はまた、検査を意図する集団のその疾患の有病率および検査前確率によって本質的に影響を受ける。例えば、検査、例えば、臨床診断検査の特異度、感度、ならびに陽性的中率および陰性的中率を考察しているO'Marcaigh A S, Jacobson R M, "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results," Clin. Ped. 1993, 32(8): 485-491参照。多くの場合、連続的診断検査測定値を用いた二重病態分類アプローチに関して、感度および特異度は、Pepe et al, "Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic, Prognostic、またはScreening Marker," Am. J. Epidemiol 2004, 159 (9): 882-890による受診者動作特性(Receiver Operating Characteristics)(ROC)曲線により概要が示され、また、曲線下面積（ＡＵＣ）または単一の値しかとらない検査（またはアッセイ）カットポイントの全範囲にわたって検査、アッセイ、または方法の感度および特異度の提示を可能とする指標であるｃ−統計量により概略が示される。例えば、また、Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures," chapter 14 in Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burtis and Ashwood (eds.), 4.sup.th edition 1996, W.B. Saunders Company, pages 192-199;およびZweig et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease," Clin. Chem., 1992, 38(8): 1425-1428も参照。尤度関数、オッズ比、情報理論、予測値、較正（適合度を含む）、および再分類測定を用いた別のアプローチは、Cook, "Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction," Circulation 2007, 115: 928-935により概要が示されている。最後に、ある検査により定義される対象コホート内のハザード比および絶対的および相対的リスク比は、臨床精度および有用性のさらなる測定値である。規準限界、判別限界、およびリスク閾値を含めた複数の方法が異常値または疾患値を定義するためによく使用される。
【００３１】
「分析精度」は、測定プロセス自体の再現性および予測可能性を意味し、変動の係数、ならびに異なる時間、使用者、器具および／または試薬での同じサンプルまたは対照の一致率および較正の検定などの測定値で概要が示される。新規バイオマーカーを評価する上でのこれらおよびその他の考慮事項もVasan, 2006に要約されている。
【００３２】
「性能」は、とりわけ、臨床および分析精度、他の分析的およびプロセスの特徴、例えば、使用上の特徴（例えば、安定性、使用の容易さ）、医療経済価値、および検査の成分の相対的コストを含む、診断または予後検査の全体的有用性および質に関する用語である。これらの因子はいずれもより優れた性能、従って、検査の有用性、の供給源となり得、適当であれば、ＡＵＣ、結果までの時間、保存寿命などの適当な「性能マトリックス」により測定することができる。
【００３３】
「陽性的中率」または「ＰＰＶ」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）または総ての陽性検査結果の真の陽性画分により計算される。陽性的中率は、検査を意図する集団のその疾患の有病率および検査前確率によって本質的に影響を受ける。
【００３４】
「リスク」は、本発明において、処置に対する奏功性の場合には、あるイベントが特定の期間に起こる確率に関し、被験体の「絶対的」リスクまたは「相対的」リスクを意味し得る。絶対的リスクは、適切な期間コホートに関する実際の測定後観察に関して、または適切な期間追跡された統計的に検証された履歴コホートから開発された指数値に関して測定することができる。相対的リスクは、低リスクコホートまたは平均集団リスクの絶対的リスクのいずれかと比較した場合の被験体の絶対的リスクの比を意味し、臨床リスク因子がどのように評価されるかによって異なり得る。所与の検査結果に関する陰性イベントに対する陽性イベントの割合であるオッズ比もまた無変換のために慣用される（オッズは式ｐ／（１−ｐ）に従い、式中、ｐはイベントの確率であり、（１−ｐ）はイベントが起こらない確率である）。
【００３５】
「リスク評価」または「リスクの評価」は、本発明において、あるイベントまたは病態が起こり得る確率、オッズ、または尤度、イベントの発生もしくはある病態からの変換の割合の推定を行うことを包含する。リスク評価はまた、将来の臨床パラメーター、従来の検査リスク因子値、または他のＦＸＳ指数の、これまでの測定集団に対して絶対的または相対的観点での予測を含んでなり得る。本発明の方法は、奏功者または非奏功者であると定義される被験体のカテゴリーのリスクスペクトルをこのように診断および定義する処置に対する奏功性の連続的またはカテゴリー的測定を行うために使用することができる。カテゴリー的シナリオでは、本発明は、正常被験体コホートと奏効に関してより高いリスクのその他の被験体コホートとを判別するために使用することができる。
【００３６】
「サンプル」は、本発明において、被験体から単離された生体サンプルであり、例として、限定されるものではないが、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳細胞、または他の任意の分泌、排泄、またはその他の体液を含み得る。「サンプル」は、単細胞または多細胞または細胞の断片を含み得る。サンプルはまた、組織サンプルでもある。サンプルはまたは、脳細胞またはリンパ球を含む。好ましくは、サンプルは、リンパ球または単球などの末梢血単核細胞である。
【００３７】
「感度」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）または疾患被験体のうちの真の陽性画分により計算される。
【００３８】
「特異度」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）または非疾患または正常被験体のうちの真の陰性画分により計算される。
【００３９】
「統計的に有意」とは、変化が偶然によってのみ起こる（「偽陽性」であり得る）．と思われるものよりも大きいことを意味する。統計的有意性は、当技術分野で公知のいずれの方法によって判定してもよい。有意性の慣用尺度は、所与のデータ点と少なくとも同等の極端な結果を得る確率を呈するｐ値を含み、このデータ点は偶然だけによる結果と仮定する。結果は０．０５以下のｐ値で有意性が高いとみされる。好ましくは、ｐ値は０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１以下である。
【００４０】
「被験体」は、本発明において、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、ＦＸＳの動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は雄性であっても雌性であってもよい。被験体はＦＸＳもしくは他の認知障害を有するか、または有することが疑われる。
【００４１】
「ＴＮ」は、病態検査が非疾患または正常被験体を正確に分類することを意味する真の陰性である。
【００４２】
「ＴＰ」は、病態検査が正確に疾患被験体を分類することを意味する真の陽性である。
【００４３】
「従来の検査リスク因子」は、被験体サンプルから単離されたまたは被験体サンプルに由来し、かつ、臨床検査室において現行評価され、従来のグローバルリスク評価アルゴリズムにおいて使用されるバイオマーカーに相当する。他の従来の脆弱Ｘの検査リスク因子は当業者に公知である。
【００４４】
本発明の方法
本明細書に開示される方法は、メタドキシン処置ならびに／またはＦＸＳおよび他の認知障害に対する療法を受けている被験体で、また、ＦＸＳおよび他の認知障害を有すると診断された被験体に対して使用される。
【００４５】
本発明の方法は、被験体においてＦＸＳおよび他の認知障害の処置をモニタリングするために、また、メタドキシン処置から利益を得るであろう被験体を選択するために有用である。
【００４６】
一般に、ＦＸＳの徴候および症状は５つのカテゴリー：知能および学習；脆弱Ｘに一般に伴うまたは脆弱Ｘと特徴を共有する身体的、社会的および感情的、会話および言語、ならびに感覚障害に入る。例えば、ＦＸＳを有する個人は知的機能障害、社交不安、言語障害および特定の感覚に対する感受性を有する。
【００４７】
認知障害は、心理過程の機能不全／障害が中核症状をなす一群の障害を含む。認知障害は、神経原性認知障害または行動認知障害を含む。
【００４８】
認知障害は、発達障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症スペクトラム障害、アルツハイマー病、統合失調症および脳血管疾患を含む。
【００４９】
自閉症スペクトラム障害および自閉症症状は、脆弱Ｘ症候群を有する個人に一般に随伴する。自閉症の徴候および症状としては、顕著な言語遅滞、社会性およびコミュニケーションの問題、ならびに異常な行動および関心が含まれる。自閉症性障害を有する多くの人が知的障害も有する。
【００５０】
被験体サンプルにおける総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比の決定は、モニタリングされるＦＸＳまたは他の認知障害の治療経過を考慮する。この方法では、生体サンプルは処置を受けている被験体から提供される。所望により、生体サンプルは、処置前、処置中、または処置後の様々な時点で被験体から得られる。次に、総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比が計算され、対照値と比較される。対照値は、ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質状態に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比が既知である対照個人もしくは集団、または指数値である。参照サンプルまたは指数値は、疾患の無い（例えば、ＦＸＳまたは他の認知障害に罹患していない）１以上の個人から採取され得るか、または由来し得る。あるいは、参照サンプルまたは指数値は処置前の被験体から採取され得るか、または由来し得る。例えば、サンプルは、初期処置を受けていない被験体から、処置の進行をモニタリングするためにその後の処置の後に採取することができる。参照サンプルまたは指数値は、初期処置後の被験体から採取され得るか、または由来し得る。例えば、サンプルは、初期処置、およびＦＸＳに対するその後の処置を受けた被験体から、処置の進行をモニタリングするために採取することができる。
【００５１】
別の実施態様では、参照値は指数値またはベースライン値である。指数値またはベースライン値は、ＦＸＳまたは他の認知障害に罹患していない個人からの総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比の混合サンプルである。
【００５２】
処置の有効性は、被験体から経時的に得られたサンプルにおける総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比を決定し、それらの比を比較することによってモニタリングすることができる。例えば、第１のサンプルは、被験体が処置を受ける前に得ることができ、１以上のその後のサンプルは、被験体の処置後または処置中に採取される。
【００５３】
「効能がある」とは、処置が、ＦＸＳまたは他の認知障害を有さない被験体からの比と同等の、総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比をもたらすことを意味する。有効性は、ＦＸＳを診断、識別、または処置するための任意の既知の方法に関して決定することができる。
【００５４】
リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔおよび総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質は、イムノアッセイなどの当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
【００５５】
本発明の性能および精度の評価
本発明の性能、および従って絶対的および相対的臨床有用性は、上記で示したような複数の方法で評価することができる。診断的、予測的または予後的検査、アッセイ、または方法の精度は、その検査、アッセイ、または方法の、メタドキシン処置に奏効性のある被験体と奏効性のない被験体を判別する能力に関し、総ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質に対するリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の比に基づく。この正常と異常の間の比の差は好ましくは、統計的に有意である。
【００５６】
従って、被験体の状態を評価するための提案される医学的検査、アッセイ、または方法の精度および有用性の評価において、感度および特異度の両方を常に考慮に入れるべきであり、感度および特異度はカットポイントの範囲にわたって有意に変動し得るので、感度および特異度が報告されるのがどのカットポイントかに留意すべきである。とり得る総てのカットポイント値を包含するＡＵＣなどの統計量の使用は、本発明を使用するほとんどのカテゴリーリスク尺度に好ましいが、連続的リスク尺度の場合には、認められた結果に対する適合度および較正の統計量または他のゴールドスタンダードが好ましい。
【００５７】
このような統計量を用い、「許容可能な程度の診断精度」は、本明細書では、ＡＵＣ（検査またはアッセイのＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．６０、望ましくは少なくとも０．６５、より望ましくは少なくとも０．７０、好ましくは少なくとも０．７５、より好ましくは少なくとも０．８０、最も好ましくは少なくとも０．８５である検査またはアッセイと定義される。
【００５８】
「極めて高い程度の診断精度」とは、ＡＵＣ（検査またはアッセイのＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．８０、望ましくは少なくとも０．８５、より望ましくは少なくとも０．８７５、好ましくは少なくとも０．９０、より好ましくは少なくとも０．９２５、および最も好ましくは少なくとも０．９５である検査またはアッセイを意味する。
【００５９】
いずれの検査の予測値も、その検査の感度および特異度、ならびに検査する集団におけるその病態の有病率に依存する。ベイズの定義に基づくこの概念は、スクリーニングされる病態が個人または集団に存在する尤度（検査前確率）が大きいほど、陽性検査の妥当性が大きく、また、結果が真の陽性である尤度も高い。従って、病態が存在する尤度が低い任意の集団においてある検査を用いることの問題は、陽性結果が限定された値を有する（すなわち、偽陽性である可能性が高い）ということである。同様に、極めて高リスクの集団では、陰性検査結果が偽陰性である可能性が高い。
【００６０】
結果として、ＲＯＣおよびＡＵＣは、低い疾患有病率と判定された集団（年間１％未満の発生率（罹患率）、または示された計画対象期間にわたって１０％未満の累積有病率を有する集団と定義される）において検査の臨床有用性について誤解を招くおそれがある。あるいは、本開示の他所に定義される絶対的リスク比および相対的リスク比は、臨床有用性の程度を決定するために使用可能である。検査する被験体の集団はまた、検査の測定値によって四分位数に分類することもでき、この場合、最上位の四分位数（集団の２５％）は治療不奏効性に関して最高の相対的リスクを有する被験体の群を含んでなり、最下位四分位数は、治療不奏効性に関して最低の相対的リスクを有する被験体の群を含んでなる。一般に、低有病率集団において最上位四分位数から最下位四分位数まで相対的リスクが２．５倍を超える検査またはアッセイから導かれた値は、「高い程度の診断精度」を有すると見なされ、また、各四分位数の相対的リスクが５倍から７倍であるものが「極めて高い程度の診断精度」を有すると見なされる。しかしながらやはり、各四分位数の相対的リスクが１．２倍〜２．５倍に過ぎない検査またはアッセイから導かれた値も依然として臨床上有用で有り、疾患のリスク因子として広く使用され、このようなものは、総コレステロールを用いる場合、および将来のイベントのそれらの予測に関する多くの炎症性バイオマーカーのためのものである。このような診断精度のより低い検査は多くの場合、前述のグローバルなリスク評価指数を用いて行われる場合と同様に、治療介入の有意義な臨床閾値を導くために、付加的なパラメーターと組み合わせなければならない。
【００６１】
医療経済効用関数は、所与の検査の性能および臨床値を測定するさらにもう１つの手段であり、潜在的なカテゴリー検査転帰をそれぞれについて臨床および経済値の実際の尺度に基づいて重み付けすることからなる。医療経済効用関数は、正しい分類の利益および検査被験体の誤分類のコストに対して経済値を具体的に割り付けるので、医療経済性能は精度に密接に関係する。性能尺度として、検査の目標価格を超過して、検査ごとに（コストを調べる前に）医療経済値に増加をもたらす性能レベルを達成するために試験を必要とすることも特別なことではない。
【００６２】
臨床アルゴリズムの構築
いずれの式を用いて結果を合わせ、本発明の実施に有用な指数としてもよい。上記で指摘したように、限定されるものではないが、種々の他の指標の中でも、確率、尤度、メタドキシンに奏効する絶対的または相対的変化などの指数を示すことができる。これは、特定の期間または計画対象期間、または残りの生涯リスクの間関するものであってよく、または単に別の参照被験体集団と比較した場合の指数として提供されてもよい。
【００６３】
本明細書には種々の好ましい式が記載されるが、本明細書および上記定義で述べたものの以外のタイプのいくつかのモデルおよび式も当業者に周知である。使用される実際のモデルタイプまたは式はそれ自体、訓練集団におけるその結果の性能および精度の特徴に基づき、潜在的モデルの分野から選択することができる。好ましい式は、幅広いクラスの統計分類アルゴリズム、特に、判別分析の使用を含む。判別分析の目標は、従前に特定された特徴のセットから集合の要素を予測することである。線形判別分析(linear discriminant analysis)（ＬＤＡ）の場合、いくつかの規準による群間の分離を最大にする特徴の線形組合せが特定される。特徴は、異なる閾値を用いた固有遺伝子に基づくアプローチ(eigengene based approach with different thresholds)（ＥＬＤＡ）または多変量分散分析に基づくステッピングアルゴリズム(stepping algorithm based on a multivariate analysis of variance)（ＭＡＮＯＶＡ）を用いて、ＬＤＡ向けに特定することができる。Ｈｏｔｅｌｌｉｎｇ−Ｌａｗｌｅｙ統計量に基づく分離無しの確率を最小にする変数増加アルゴリズム、変数減少アルゴリズム、およびステップワイズアルゴリズムを実行することができる。
【００６４】
固有遺伝子に基づく線形判別分析(Eigengene-based Linear Discriminant Analysis)（ＥＬＤＡ）は、Shen et al. (2006)により開発された特徴選択技術である。この式は、最も重要な固有ベクターに関連する特徴を特定するために、改変された固有の分析を用い、多変量フレームワーク内で特徴（例えば、バイオマーカー）を選択する。「重要な」とは、いくつかの閾値に対して分類されようとしているサンプル間の差異においてほとんどの変動を説明する固有のベクターと定義される。
【００６５】
サポートベクターマシン(support vector machine)（ＳＶＭ）は、２つのクラスを分離する超平面の発見を試みる分類式である。この超平面は、超平面からの正確なマージン距離であるデータ点としてのサポートベクターを含む。そのデータの現次元に分離する超平面が存在しないと思われる場合には、元の変数の非線形関数をとることによりそのデータがより大きな次元に移されることにより、ディメンショナリティーが大幅に拡大される(Venables and Ripley, 2002)。必要とされるわけではないが、ＳＶＭのための特徴のフィルタリングは予測を向上させる場合が多い。最良の単変量特徴を選択するためには、ノンパラメトリック・クラスカル・ウォリス（ＫＷ）検定を用いて、サポートベクターマシン用に特徴（例えば、バイオマーカー）を特定することができる。ランダムフォレスト（ＲＦ、Breiman, 2001）または再帰分割（ＲＰＡＲＴ、Breiman et al., 1984）はまた、最も重要なバイオマーカーの組合せを特定するために個別にまたは組み合わせて使用することができる。ＫＷおよびＲＦは両方とも、全特徴からいくつかの特徴が選択されることを必要とする。ＲＰＡＲＴは、利用可能なバイオマーカーのサブセットを用いて単一の分類木を作出する。
【００６６】
ＥＲＫおよび／またはＡｋｔの個々のリン酸化の測定の結果を、それらの予測式への提示の前に、情報的により有価な形態とするよう前処理するために、他の式も使用可能である。中でも注目すべきは、対数関数またはロジスティック関数、正規分布位置またはその他の分布位置などの、集団の平均値などに関する一般的な数学変換のいずれかを用いたバイオマーカー結果の標準化は総て、当業者によく知られている。年齢、性別(gneder)、人種、または性(sex)などの臨床パラメーターに基づく標準化セットが特に注目され、この場合、特定の式が単独でクラス内の被験体に、臨床パラメーターを連続的に連結してインプットとして使用される。他の場合では、分析物に基づくバイオマーカーを連結して計算変数とすることができ、次にこれは式に表される。
【００６７】
正規化され得る１名の被験体の個々のパラメーター値に加え、総ての被験体、または任意の既知のクラスの被験体に関する総合的な予測式もそれ自体、D'Agostino et al, (2001) JAMA 286:180-187に概略が示される技術または他の同等の標準化および再較正技術に従い、集団の期待有病率および平均バイオマーカーパラメーターに関する補正に基づいて、再較正またはそうでなければ補正することができる。このような疫学的補正統計量は、読み取り可能なマシンであり得るそのモデルに提供された過去のデータのレジストリを介して、またはそうでなければ場合によっては保存されているサンプルまたはこのようなパラメーターおよび統計量の履歴研究のための参照の後ろ向きクエリを介して、絶えず捕捉、確認、改良および更新することができる。式の再較正または他の補正の対象となり得るさらなる例は、Pepe, M. S. et al, 2004によるオッズ比の制限に関する研究；ＲＯＣ曲線に関するCook, N. R., 2007で使用されている統計量が含まれる。最後に、類別子式それ自体の数値結果は、絶対的リスクに対して較正し、および類別子またはリスク式の数値結果を変更するための信頼区間を提供するために、実際の臨床集団および試験結果および観察されたエンドポイントに対するその参照により処理後変換を行うことができる。この例は、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｉｎｃ．（レッドウッド・シティー、カリフォルニア州）社のＯｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ製品の再発スコア式のアウトプットを参照して選択される、実際の臨床試験を用いて導き出される、絶対的リスク、およびリスクに関する信頼区間の提示である。さらなる改良は、類別子またはリスク式のアウトプットに基づき、年齢または性などのそれらの臨床パラメーターによって定義および選択される、試験のより小さな部分集団に対して補正することである。
【実施例】
【００６８】
実施例１：一般法
本明細書に記載の実施例は一般に下記の試薬および方法を用いて実施した。
【００６９】
試験動物
まず、Ｆｍｒ１ノックアウトマウス（ＫＯ２）マウス（Ｔｈｅ  Ｄｕｔｃｈ−Ｂｅｌｇｉｕｍ  Ｆｒａｆｇｉｌ  Ｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、１９９４）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、野生型（ＷＴ）同腹子をＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで作成し、８世代を超えてＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに対して繰り返し戻し交配した。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスを、１２時間明暗周期（午前７時から午後７時まで点灯；試験は明期に行った）の温度および湿度制御室で同じ遺伝子型の群内で飼育した。食餌および水を自由摂取させつつ、飼育室内で室温および湿度を継続的に記録した。試験は、行動試験中２または６か月齢の健康なＦｍｒ１ノックアウトマウスおよびそれらの野生型同腹子（処置群当たりマウスＮ＝１０）で行った。マウスは市販のプラスチックケージで飼育し、試験はＵＫ  Ａｍｉｎａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）  Ａｃｔ、１９８６の要件に従って行った。総ての試験は、遺伝子型および薬物処置に対して盲検として行った。動物には実験を行う前に１週間の最小環境馴順化期間を設けた。環境馴順化期間には予防または治療処置は投与しなかった。
【００７０】
薬物
試験１（実施例２）では、メタドキシンを生理食塩水に溶かし、７日間、１００、１５０、または２００ｍｇ／ｋｇ／１日１回の用量で腹腔内投与した。試験２（実施例３）のｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、メタドキシンを生理食塩水に溶かし、７日間、１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内用量または１５０または３００ｍｇ／ｋｇ／日（容量０．１ｍｌ）の経口用量で投与した。試験２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、メタドキシンを５時間、３００μＭの濃度で投与した。総ての場合で、生理食塩水をビヒクル（対照）として使用した。
【００７１】
行動試験
社会的相互作用および社会的認知記憶：マウスは、接近、追跡、匂い嗅ぎ、グルーミング、攻撃的遭遇、交尾、養育行動、ネスティング、および身を寄せ合って群れで眠るなどの、容易にスコア化される社会的行動を営む社会的な種である。マウスにおける社会的接近は、初見マウスに対する匂い嗅ぎの時間によって評価した。
【００７２】
マウスを、新鮮な木材チップを床に敷いた、成体のホームケージと同桁のサイズの試験アリーナ／ケージ（４０×２３×１２ｃｍケージ、マウスの観察を助けるためにパースペックスの蓋を持つ）に置いた。試験前に数匹の試験に用いないマウスをこの装置に置くことで、バックグラウンドのマウスの匂いをつけた。マウスは試験の１０〜１５分前にこの試験室に移した。試験対象および若年個体をこの試験ケージに同時に置いた。試験マウスによる刺激若年個体の匂い嗅ぎおよび近接追跡（尾から＜２ｃｍ）として定義される社会調査の対面の総時間および回数を３分間評価した。３０分後、同じ刺激若年個体を用いて試験を繰り返した。収集したデータパラメーターは習得および認知のための匂い嗅ぎの対面の総時間および総数であった。トライアル２／トライアル１＋２と定義される社会的記憶比を導いた。従って、記憶なし（例えば、２０／（２０＋２０）＝０．５および記憶あり（例えば、１０／（２０＋１０）＝＜０．５）。
【００７３】
Ｙ迷路交替行動：  ２つの課題を実施した。１つ目は、アーム選択間の自発的交替行動のアンラーニングアセスメントであった。２つ目は空間参照記憶課題であり、ここでは、動物は２つのアームのうちどちらに食餌報酬があったかを学習しなければならなかった。この訓練の開始の前日に、マウスにこの迷路を５分間自由に探索させた。次に、これらのマウスは、餌が左のアームに置かれていたものと、餌が右のアームに置かれていたものの２つのトライアルを受けた。この手順により、これらのアームのうち一方の偏好が生じるのを防いだ。
【００７４】
Ｙ水迷路：  透明なパースペックスＹ迷路に２０℃の水を２ｃｍまで入れた。これはマウスを一方のアームの遠位端の出口チューブまでパドリングした後に迷路を離れるよう誘導した。この迷路を顕著な視覚的刺激に取り囲まれた部屋の中央に置いた。
【００７５】
報酬付きＴ迷路交替行動：  高架または壁のあるＴ字型の装置（水平に配置）を用いた。マウスをＴの基部に置き、このステムの他端に隣接するゴールアームの一方を選択させる。２回のトライアルを迅速に連続して行い、２回目のトライアルは、最初の選択の記憶を反映してマウスにそれまでにいなかったアームを選択するように要求した（自発的交替行動）。この傾向はマウスを空腹にさせ、マウスが交替行動を起こせば好みの餌の報酬を与えることによって強化された。具体的には、このＴ迷路に対する４日間の順化期間の後に、マウスを、アーム選択を変えて甘いコンデンスミルクを報酬として受けるよう訓練した。
【００７６】
連続小路：  この装置は、４つの連続する直線上に配置された、塗装木材製の不安を増す小路（各連続する小路は薄い色を塗り、低い壁を備え、かつ／または手前の小路よりも狭くなっていた）からなった。各セクションまたは小路は２５ｃｍの長さであった。小路１は、高さ２５ｃｍの壁を備え、８．５ｃｍ幅であり、黒に塗られていた。０．５ｃｍ下がって小路２となり、これはまた８．５ｃｍ幅であるが、高さ１．３ｃｍの壁を備え、灰色であった。１．０ｃｍ下がって小路３となり、これは３．５ｃｍ幅であり、高さ０．８ｃｍの壁を備え、白色であった。０．４ｃｍ下がって小路４となり、これはまた白色であったが、１．２ｃｍ幅であり、高さ０．２ｃｍの壁であった。この装置は、小路１の裏を５０ｃｍの高さでスタンドに固定することによって高架とした。マウスが落ちた場合にアーム３と４の下にパディングを設けた。各マウスを小路１の閉鎖末端に壁に向けて置いた。タイマーをスタートし、１）試験の全長（５分）＋各アームに入る潜時、および２）小路１で過ごす時間を測定した。マウスが４本の脚を総て次の小路に置いた場合に、その小路に入ったと見なした。各小路で過ごす総時間（４本の脚総て）を記録した。
【００７７】
文脈的恐怖条件付け：  恐怖条件付け試験では、マウスを新規な環境（暗チャンバー）に置き、および合図と電気フットショック（０．２ｍＡ  １秒（試験１）または０．７ｍＡ  ０．５秒（試験２））の対を与えた。次に、初期トレーニングとして試験した際に、マウスは不動反応(Blanchard, 1969)または恐怖条件付けと呼ばれる自然の防御応答を示した。不動反応時間は、マウスが呼吸をせずに不動挙動で過ごした時間として定義された。このデータは試験期間に対するパーセンテージとして表した。トレーニングセッションの２４時間後に、マウスを５分間、ショック提供のないトレーニングチャンバーで試験し、不動反応挙動を観察した。
【００７８】
統計学：  多変量分散分析を用いて、データの群の差異を評価した。行動データについて反復測定ＡＮＯＶＡを行った。各ＡＮＯＶＡにおける統計学的に有意な効果を、ニューマン−コイルス検定（試験１）またはチューキー検定（試験２）を用い、事後比較で追跡した。０．０５未満のｐ値を有意と見なした。
【００７９】
生化学試験
リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔ：  Ｒａｓ−Ｍｅｋ−ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴｏＲシグナル伝達経路は、シナプスの可塑性の変化の基礎にある遺伝子転写の変化に依存する活性の媒介に関与する(Klann and Dever, 2004)。リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の発現は、Lopez Verrilli (Lopez Verrilli et al., 2009)により従前に記載されているようにウエスタンブロット解析によって測定した。用いた抗体は、Ａｋｔ（１／１０００）およびキナーゼ（ＥＲＫ）１／２（１／２０００）に対する抗リン酸特異的抗体であった(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)。ホスホ−ＥＲＫに対する抗体は、ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）におけるリン酸化を検出し、ホスホ−Ａｋｔに対する抗体は、ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）におけるリン酸化を検出する。総ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２タンパク質含量およびリン酸化ＥＲＫ  およびＡｋｔは、抗ホスホ−Ａｋｔ抗体（１／１０００）および抗ホスホ−ＥＲＫ抗体（１／２０００）(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)で膜をブロットすることにより評価した。ＡｋｔまたはＥＲＫのリン酸化は、同じサンプル中のタンパク質含量に対して正規化し、基底レベルを１００％として、基底状態に対する変化の％として表した。タンパク質付加量は、膜を剥離し、β−アクチン抗体（１／１０００）(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で再ブロットすることによって評価した。血液リンパ球でのリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔタンパク質の発現は、フローサイトメトリーにより測定した。リンパ球のバイオマーカーの決定のために、ＦＡＣＳｔａｒ  ｐｌｕｓ(Becton Dickinson)を４８８ｎｍに合わせた励起レーザーとともに用い、ＦＩＴＣからの緑色蛍光（ＧＳＴ）を、５１５〜５４５ｎｍバンドパスフィルターを通して採取した。平均ＦＩＴＣ蛍光強度を参照細胞の蛍光に対して計算した。平均細胞蛍光強度（ＭＦＩ）は、細胞当たりに結合したＡｂ分子の平均数に正比例する。
【００８０】
ニューロンの形態：  海馬細胞培養物を、妊娠胎生１７．５日目（Ｅ１７．５）の野生型およびＦｍｒ１  ＫＯ胎児マウスから調製した。マウスを頚椎脱臼により殺し、摘出した海馬細胞を１５ｍｍマルチウェルバイアル（Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｉｍａｒｉａ）に播種した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで５日後、薬物処置後の樹状突起棘形態形成のモニタリングを助けるために緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をトランスフェクトした(Ethell and Yamaguchi, 1999; Ethell et al., 2001, Henkemeyer et al., 2003)。樹状突起棘はｉｎ  ｖｉｔｒｏ１６日目（ＤＩＶ）前後に見られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ１７日目に培養物を３００μＭ濃度のメタドキシンで５時間処理した。
【００８１】
ＧＦＰトランスフェクトニューロンの糸状仮足密度を、スタックトＺｅｉｓｓ共焦点で生成した画像（４０×対物レンズ、２０×０．２μｍのスタック）のＳｈｏｌｌ分析を行うことによって定量した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエアを用い、同心円の均等間隔の円（総て２０μｍ）を各ニューロンの細胞体の前後に描き、次に、糸状仮足の量を円ごとに計数した。計数値の平均を対応のない両側スチューデントのＴ検定を用いて比較した。
【００８２】
ＧＦＰトランスフェクトニューロンの突起棘の成熟度を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて解析した。突起棘形態測定分析のため、各ニューロンについて７０〜１００μｍの２か所の遠位樹状セグメントを選択した。各突起棘に関して、長さと幅を測定した。長さは突起の基部から先端までの距離と定義され；幅は突起棘の長軸に対して垂直の最大距離として定義された。測定値は対応のない両側スチューデントのＴ検定を用いて比較し、多重比較のためのＡＮＯＶＡ補正を行った。
【００８３】
ｄｅ  ｎｏｖｏ海馬タンパク質合成：  海馬横断面切片（４００μｍ）を６週齢のＦｍｒ１ノックアウトおよびＷＴマウスから得た。タンパク質合成アッセイは、個々の哺乳動物細胞で、またヘテロ細胞集団でグローバルなタンパク質合成のモニタリングおよび定量を可能とする非放射性の蛍光活性化細胞選別に基づくアッセイであるｓｕｒｆａｃｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＳＵｎＳＥＴ）法(Hoeffer, 2011)を用いて従前に記載されたように行った。この試験で用いたメタドキシンの濃度は３００μＭであった。
【００８４】
実施例２：脆弱Ｘ症候群のＦｍｒ１ノックアウトマウスモデルにおける学習および記憶欠陥ならびに生化学的異常に対するメタドキシン（１００〜２００ｍｇ／ｋｇ）処置の効果（試験１）
行動分析
文脈的恐怖条件付け：  最初の試験では、Ｎ＝１０のＷＴおよびＦｍｒ１ノックアウトマウス群における恐怖条件付けに対するビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン１日１回、７日間の腹腔内投与の効果を調べた。ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、試験セッション中の不動反応の減少に反映される恐怖条件付けパラダイムにおいて学習の欠損を示した（図１、パネルＡ（ｐ＜０．０００１））。メタドキシン投与は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける学習欠損効果を逆転させ、メタドキシン処置マウスはメタドキシン処置ＷＴマウスとは異なっていたので（ｐ＜０．０５）、この逆転は部分的なものであった。この試験を繰り返し、Ｎ＝１０のＷＴおよびＦｍｒ１ノックアウトマウス群における恐怖条件付けに対するビヒクル、１００または２００ｍｇ／ｋｇメタドキシン１日１回、７日間の腹腔内投与の用量依存効果を検討した（図１、パネルＢおよびＣ）。この試験において、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置ＷＴマウスに比べて学習欠損を示し（ｐ＜０．０００１）、最初の試験の再現となった。１００ｍｇ／ｋｇメタドキシンは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスの欠損の逆転をもたしたが（Ｐ＜０．０５）、メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置野生型マウスとは異なっていたことから（ｐ＜０．０００１）、これは部分的な逆転であった。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスで見られた学習欠損は、２００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．メタドキシンによる処置の後に完全に逆転された（処置されたＦｍｒ１マウスはビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスとは異なっていたが（Ｐ＜０．０００１）、メタドキシン処置ＷＴマウスとは異なっていなかった）。メタドキシン処置は、どちらの試験でもＷＴマウスに対して効果はなかった（図１、パネルＡ〜Ｃ）。
【００８５】
社会的接近：  ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、匂いの嗅ぎ合いにより示される社会的接近の低さを示した（図２（ｐ＜０．０００１））。７日間の１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンでの腹腔内処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスの社会的接近を増やした（ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスと比べてｐ＜０．０００１）。メタドキシンで処置されたＦｍｒ１ノックアウトマウスは、ＷＴマウスの効果に近づく傾向はあったものの、メタドキシン処置ＷＴマウスとは異なっていた（ｐ＜０．０５）。メタドキシン処置はＷＴマウスに効果は無かった。
【００８６】
Ｙ迷路自発的交替行動：  Ｎ＝１０のＷＴまたはＦｍｒ１ノックアウトマウス群における自発的交替行動に対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンによる処置の効果を図３パネルＡに示す。ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置ＷＴマウスよりも低い自発的交替行動を示した（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるビヒクル処置に比べて自発的交替行動を増やしたが（ｐ＜０．０００１）、メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスに比べて欠損を示した（ｐ＜０．０１）。従って、メタドキシンは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに見られる欠損の部分的逆転をもたらした。
【００８７】
Ｙ迷路参照記憶課題：  Ｎ＝１０のＷＴまたはＦｍｒ１ノックアウトマウス群における報酬付き参照記憶学習に対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンによる処置の効果を図３パネルＢに示す。ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置ＷＴマウスよりも低い適当なアーム選択を行った（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスとは異なっていなかったので、メタドキシン処置は、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに比べてこの欠損を軽減していた（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置はＷＴマウスに効果は無かった。
【００８８】
Ｙ水迷路左右弁別：  Ｎ＝１０のＷＴまたはＦｍｒ１ノックアウトマウス群における嫌悪的動機付け空間弁別学習に対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンによる処置の効果を図３パネルＣに示す。ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置ＷＴマウスよりも不適切なアーム選択の回数が多いことを示した。この欠損はメタドキシン処置により軽減された。
【００８９】
Ｔ迷路報酬付き交替行動課題：  Ｎ＝１０のＷＴまたはＦｍｒ１ノックアウトマウス群における報酬交替行動作業記憶に対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンによる処置の効果を図４に示す。ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置ＷＴマウスに比べて正しいアームに到達する潜時が長いことを示した（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるビヒクル処置に比べてこの欠損を軽減し（ｐ＜０．０００１）、メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはＷＴマウスよりも応答が遅かったことから（ｐ＜０．０００１）この逆転は部分的なものであった。
【００９０】
連続小路：  Ｎ＝１０のＷＴまたはＦｍｒ１ノックアウトマウス群における連続小路課題での行動に対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンによる処置の効果を図５に示し、以下にさらに記載する。
【００９１】
連続小路試験は、不安（小路１進入潜時）および活動過多（小路２〜４）を効果的に測定した。小路１から連続小路２、３、および４への進行は、ますます低くなる壁と狭くなり、より露出度の高くなる開放的アームを有するますます明るい色になる環境に曝されることを伴う。開放的アームで費やす時間および開放的アームへの進入は不安の指標となり；逆に、より開放的なアームで費やす時間が増えることは、活動過多を表した。これらの因子は、活動過多を伴う一定範囲の不安様行動を一括して取り扱う高感度試験を可能とした。
【００９２】
小路１：  Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはＷＴマウスよりも大きい不安を示した（ｐ＜０．００１）。完全な正常化が見られたので、メタドキシンで処置したＦｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに比べて不安の改善を示した（ｐ＜０．００１）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトとメタドキシン処置ＷＴマウスの間に差異は無かった。また、メタドキシン処置はＷＴマウスに効果は無かった。
【００９３】
小路２：  ＷＴマウスは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスと比べた場合、小路２で低い活性を示した（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置はＦｍｒ１ノックアウトマウスの活動過多を軽減したが（ｐ＜０．００１）、メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトとＷＴマウスは異なっていたことから（ｐ＜０．００１）、この活動過多の逆転は部分的なものであった。メタドキシン処置はＷＴマウスに対して効果はなかった。
【００９４】
小路３：  Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ＷＴマウスに比べて活動過多を示した（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスとは異なっていなかったことから、この活動過多はメタドキシンにより逆転されたものではなかった。メタドキシン処置はＷＴマウスに対して効果はなかった。
【００９５】
小路４：  Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ＷＴマウスに比べて活動過多を示した（ｐ＜０．０１）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスよりも低い活動を示したことから（ｐ＜０．０１）、メタドキシン処置はこの活動過多を逆転していた。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったことから、この効果は正常化を表した。メタドキシン処置はＷＴマウスに対して効果はなかった。
【００９６】
全体的に見れば、特定の理論に縛られることを望むものではないが、連続小路試験は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはＷＴマウスに比べて不安および活動過多の増大を呈するということを示したと考えられる。メタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるこの不安および活動過多を軽減したが、ＷＴマウスは影響を受けないままであった。
【００９７】
生化学的分析
ＥＲＫおよびＡｋｔのリン酸化：  Ｎ＝５のＦｍｒ１ノックアウトまたはＷＴマウスにおける、脳のＥＲＫまたはＡｋｔの全脳リン酸化に対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンいずれかの腹腔内処置の効果を図６に示す。リン酸化レベルは全ＥＲＫに対するリン酸化物の比として評価した。この比の増大はＥＲＫの活性化を示した。ＥＲＫのリン酸化は、ビヒクル対照に比べてビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスで増大したが（ｐ＜０．００１）、この効果は脆弱Ｘ症候群を有するヒト対象で見られるＥＲＫの異常な活性化を再現した(Wang et al., 2012)。メタドキシン処置ＷＴマウスと比べた場合に差異は見られなかったので、この効果はメタドキシン処置により低減された（ｐ＜０．０１）。メタドキシンは、ＷＴマウスのＥＲＫのリン酸化またはいずれのマウスにおいても総ＥＲＫレベルに対して効果は無かった。総ＡＫＴに対するリン酸化Ａｋｔの比はまた、ビヒクル処置ＷＴマウスに比べてビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスで増大した（ｐ＜０．０００１）。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは対照と差異が無かったので、メタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるリン酸化Ａｋｔの相対レベルを低減した（ｐ＜０．０１）。メタドキシン処置はＷＴマウスに対して、またはいずれのマウスにおいても総Ａｋｔレベルに対して効果は無かった。
【００９８】
実施例３：Ｆｍｒ１ノックアウト脆弱Ｘマウスモデルにおけるメタドキシンの評価（試験２）
６か月齢Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるメタドキシンの行動効果
文脈的恐怖条件付け：  最初の試験では、Ｎ＝１０の６か月齢ＷＴおよびＦｍｒ１ノックアウトマウス群における恐怖条件付けに対するビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン１日１回、７日間の腹腔内投与の効果を調べた。ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウス（ＫＯ−Ｖ）は、試験セッション中の不動反応の減少に反映される、ビヒクル処置ＷＴマウス（ＷＴ−Ｖ）と比べた場合の恐怖条件付けパラダイムにおける学習欠損を示した（図７（ｐ＜０．０００１））。メタドキシン投与は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける学習欠損効果を逆転させた（ｐ＜０．０００１  ＫＯ−Ｍ−１５０対ＫＯ−Ｖ）。メタドキシン処置ＫＯマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、これは完全な逆転であった。
【００９９】
社会的接近および社会的記憶：  社会的接近データ（最初のトライアル１）を図８パネルＡ（匂いの嗅ぎ合いの回数）およびパネルＣ（匂い嗅ぎの持続時間）に示す。匂いの嗅ぎ合い社会的記憶データ（トライアル２、トライアル１の２４時間後）を図８パネルＢ（匂いの嗅ぎ合いの回数）およびパネルＤ（匂い嗅ぎの持続時間）に示す。これらの結果を以下にさらに考察する。
【０１００】
トライアル１では、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ＷＴマウスに比べ、匂いの嗅ぎ合いの回数は多く（ｐ＜０．０００１）（図８パネルＡ参照）、匂い嗅ぎの持続時間は少なかった（ｐ＜０．０００１）（図８パネルＣ）。これらの社会的相互作用欠損は、他の研究者らによりＦｍｒ１ノックアウトマウスで報告されているものに一致する(Thomas et al., 2011)。対面の回数および匂い嗅ぎの持続時間の両方に関して、メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは匂いの嗅ぎ合いの回数の測定値に関してメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、メタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける異常の逆転をもたらした（ｐ＜０．０００１  それぞれＫＯ−Ｍ−１５０対ＫＯ−Ｖ）。匂い嗅ぎの持続時間の測定値に関して救済が示されたものの、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置のＷＴマウスに比べて差異があるままであったので（ｐ＜０．０５）、この効果は部分的なものであった。メタドキシンは、ＷＴマウスに対して効果は無かった。これらのデータは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける異常な社会的接近行動がメタドキシンにより救済されたことを示した。
【０１０１】
トライアル２では、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、野生型マウスに比べて匂いの嗅ぎ合いの回数の増加と匂い嗅ぎの持続時間の増加の両方を示した（各測定に関してｐ＜０．０００１、それぞれ図８パネルＢおよびＤ）。これは順化の失敗、従って、社会的記憶の欠損を反映した。メタドキシン処置は、これらの差異を軽減した（ｐ＜０．０００１  ＫＯ−Ｍ−１５０対ＫＯ−Ｖ）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスとメタドキシン処置ＷＴマウスの間の差異が維持されたことから（ｐ＜０．０５）、この匂いの嗅ぎ合いの回数の逆転は部分的なものであった。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトとメタドキシン処置ＷＴマウスの間に差異は見られかったことから、このメタドキシンによる逆転は、匂い嗅ぎの持続時間に関しては完全なものであった。メタドキシン処置は、ＷＴマウスに対して効果は無かった。これらのデータは、メタドキシンがＦｍｒ１ノックアウトマウスにおける社会的記憶障害を軽減したことを示した。この社会的記憶欠損の軽減を、社会的記憶比（実施例１に記載）の計算により以下に示す。
【０１０２】
社会的記憶比は、匂いの嗅ぎ合いの持続時間：トライアル２／トライアル１＋２として定義された。従って、記憶無しの例は、例えば、２０／（２０＋２０）＝０．５であり、記憶有りの例は、例えば、１０／（２０＋１０）＝＜０．５である。
【０１０３】
計算された社会的記憶比は次の通りであった。
ＷＴ−Ｖ  トライアル２／トライアル１＋トライアル２：１２．４／１２．４＋２６．８＝０．３、＜０．５  記憶有り
ＫＯ−Ｖ  トライアル２／トライアル１＋トライアル２：３２５／３２５＋２４．１＝０．９、記憶無し
ＷＴ−Ｍ  トライアル２／トライアル１＋トライアル２：１２．５／３８．５＋１２．５＝０．２、＜０．５  記憶有り
ＫＯ−Ｍ  トライアル２／トライアル１＋トライアル２：１２．７／２８．４＋１２．７＝０．３、＜０．５  記憶有り
【０１０４】
６か月齢Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるメタドキシンの生化学的効果
Ｎ＝１０のＦｍｒ１ノックアウトまたはＷＴマウスにおける全脳ｐＥＲＫに対する７日間の１日１回、ビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシンいずれかのｉｐ処置の効果（図９パネルＡ）および上記挙動試験後の脳のｐＡｋｔ（図９、パネルＢ）を図９に示す。具体的には、図９パネルＡは、従前の試験で見られたようにＷＴマウスに比べてＦｍｒ１ノックアウトマウスで増加したｐＡｋｔの脳レベルを示す（Ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、メタドキシン処置は、脳のｐＡｋｔにおけるこの増加を逆転していた（ｐ＜０．０００１  ＫＯ−Ｍ−１５０対ＫＯ−Ｖ）。図９パネルＢは、従前の試験で見られたようにＷＴマウスに比べてＦｍｒ１ノックアウトマウスで増加したｐＥＲＫの脳レベルを示す（ｐ＜０．０００１  ＫＯ−Ｍ−１５０対ＫＯ−Ｖ）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、この増加はメタドキシン処置により逆転されていた（ｐ＜０．０００１）。
【０１０５】
２か月齢マウスの行動に対する腹腔内または経口投与後のメタドキシンの効果
図１０は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウトおよびＷＴマウスにおける恐怖条件付けに対する７日間の１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ用量または１５０および３００ｍｇ／ｋｇ経口用量でのメタドキシン投与の効果を示す。具体的には、図１０パネルＡは、ビヒクルのｉｐおよび経口処置後のＦｍｒ１ノックアウトおよびＷＴマウスから得られた恐怖条件付けデータを示す。ビヒクルの投与経路に関する差異は無かった。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ｉｐおよび経口経路を介したビヒクル処置後、ＷＴマウスに比べて不動反応行動の減少を示した（各場合でｐ＜０．０００１）。図１０パネルＢは、ＷＴマウスにおける両投与経路によるメタドキシン処置の効果を示す。効果は見られなかった。図１０パネルＣは、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるｉｐ  １５０ｍｇ／ｋｇおよび経口１５０および３００ｍｇ／ｋｇメタドキシン処置がＦｍｒ１ノックアウトマウスに見られる不動反応行動の減少を逆転したことを示す（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１、およびｐ＜０．０００１、それぞれＫＯ−Ｍ−ｉｐ、ＫＯ−Ｍ−ｐｏ１５０、およびＫＯ−Ｍ−ｐｏ  ３００対ＫＯ−Ｖ−ｉｐおよびＫＯ−Ｖ  ｐｏ）。１５０ｍｇ  ｐｏメタドキシンによる投与効果は、３００ｍｇ／ｋｇ  ｐｏメタドキシンの投与効果と異ならなかった。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける１５０および３００ｍｇ／ｋｇ経口メタドキシンの効果は、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐメタドキシンの効果と異ならなかった。各場合において、メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、この逆転は完全なものであった。
【０１０６】
図１１は、Ｆｍｒ１ノックアウトおよびＷＴマウスにおける社会的接近および社会的記憶に対する７日間の１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐまたは１５０および３００ｍｇ／ｋｇ経口用量でのメタドキシンの投与の効果を示す。具体的には、図１１パネルＡは、Ｆｍｒ１ノックアウトまたはＷＴマウスにおける社会的接近行動に対するビヒクルまたは１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐまたは１５０および３００ｍｇ／ｋｇ経口でのメタドキシンの効果を示す。ビヒクルによるｉｐまたは経口処置後、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスの匂い嗅ぎ行動の持続時間は、ＷＴマウスに比べて減少した（各場合でｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置はいずれの用量でもＷＴマウスに効果は無かった。しかしながら、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ、１５０ｍｇ／ｋｇ、および３００ｍｇ／ｋｇ経口でのメタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに見られる社会的接近の欠損の逆転をもたらした（ｐ＜０．０００１  それぞれＫＯ−Ｍ−ｐｏ１５０およびＫＯ−Ｍ−ｐｏ３００対ＫＯ−Ｖ  ｐｏ）。経口メタドキシンのこの効果は、１５０〜３００ｍｇ／ｋｇの間では用量依存的でなかった。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、この逆転は完全なものであった。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐメタドキシンの効果は、１５０ｍｇ／ｋｇ経口または３００ｍｇ／ｋｇ経口メタドキシンの効果と異ならなかった。図１１パネルＢは、Ｆｍｒ１ノックアウトまたはＷＴマウスにおける社会的記憶に対する１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐまたは１５０および３００ｍｇ／ｋｇ経口でのビヒクルまたはメタドキシンの効果を示す。ビヒクルによるｉｐまたは経口処置後、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスの匂い嗅ぎ行動の持続時間は、ＷＴマウスに比べて増加した（各場合でｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置はいずれの用量でもＷＴマウスに効果は無かった。しかしながら、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ、１５０ｍｇ／ｋｇ経口、および３００ｍｇ／ｋｇ経口でのメタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに見られる社会的接近の欠損の逆転をもたらした（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０５、およびｐ＜０．０１  それぞれＫＯ−Ｍ−ｉｐ１５０、ＫＯ−Ｍ−ｐｏ１５０、およびＫＯ−Ｍ−ｐｏ  ３００対ＫＯ−Ｖ−ｉｐおよびＫＯ−Ｖ  ｐｏ）。メタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスはメタドキシン処置ＷＴマウスと異ならなかったので、この逆転は完全なものであった。Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐメタドキシンの効果は、１５０ｍｇ／ｋｇ経口または３００ｍｇ／ｋｇ経口メタドキシンの効果と異ならなかった。また、１５０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇの間ではこれらの経口メタドキシン処置の効果に用量依存性は無かった。
【０１０７】
２か月齢マウスにおける腹腔内または経口投与後の生化学マーカーに対するメタドキシンの効果
末梢リンパ球：  図１２は、２か月齢のＦｍｒ１ノックアウトおよびＷＴマウスにおけるフローサイトメトリーにより決定された、リンパ球ｐＡｋｔ（図１２パネルＡ）およびｐＥＲＫ（図１２パネルＢ）に対する７日間の１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐまたは１５０ｍｇ／ｋｇおよび３００ｍｇ／ｋｇ経口用量でのメタドキシンの投与の効果を示す。具体的には、図１２パネルＡは、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスが、同等のビヒクル処置を受けたＷＴマウスに比べてリンパ球Ａｋｔのリン酸化の増大を呈したことを示す（ｉｐ投与および経口投与の両方に関してｐ＜０．０００１）。ｐＡｋｔレベルは、同じ処置を受けたメタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスとＷＴマウスの間で異ならなかったので、７日間の１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐまたは１５０ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇ経口用量でのメタドキシン処置は、過剰に活性化されたＡｋｔを正常化した。図１２パネルＢは、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスが同等のビヒクル処置を受けたＷＴマウスに比べてリンパ球ＥＲＫのリン酸化の増大を示したことを示す（ｉｐ投与および経口投与の両方に関してｐ＜０．０００１）。ｐＥＲＫレベルは、同じ処置を受けたメタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスとＷＴマウスの間で異ならなかったので、７日間の１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐまたは１５０ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇ経口用量でのメタドキシン処置は、過剰に活性化されたＥＲＫを正常化した。
【０１０８】
脳領域：  図１３は、海馬、前頭前皮質、および線条体のｐＥＲＫレベルに対する7日間の１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン投与の効果を示す。ｐＥＲＫレベルは、３つの脳領域の総てでＷＴマウスに比べてＦｍｒ１ノックアウトマウスで増加していた（総ての場合でｐ＜０．０００１）。ｐＥＲＫレベルは、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに比べてメタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて低下した（総ての場合でｐ＜０．０００１）。ＫＯ−Ｍ群とＷＴ−Ｍ群の間で海馬および線条体に差異は無く、ＥＲＫの活性化の完全な逆転を示す。前頭前皮質における効果は部分的なものであり、ＫＯ−Ｖ群とＫＯ−Ｍ群には差異があるままであった（ｐ＜０．０５）。メタドキシンはＷＴマウスに対して効果は無かった。
【０１０９】
図１４は、海馬、前頭前皮質および線条体のｐＡｋｔレベルに対する７日間の１５０ｍｇ／ｋｇメタドキシン投与の効果を示す。ｐＡｋｔレベルは、３つの脳領域の総てでＷＴマウスに比べてＦｍｒ１ノックアウトマウスで増加していた（総ての場合でｐ＜０．０００１）。ｐＡｋｔレベルは、３つの脳領域の総てでビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスに比べてメタドキシン処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて低下した（総ての場合でｐ＜０．０００１）。総ての場合で、ＫＯ−Ｍ群とＷＴ−Ｍ群の間で差異は無く、Ａｋｔの活性化の完全な逆転を示す。メタドキシンはＷＴマウスに対して効果は無かった。脳および血液で上昇したリン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔレベルの減少はＦｍｒ１ノックアウトマウスの行動結果の改善と相関しており、このことは、リン酸化レベルがメタドキシン処置応答のバイオマーカーであることを示唆する。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦｍｒ１ノックアウトマウス由来の樹状突起糸状仮足密度および初代海馬ニューロンの成熟に対するメタドキシンの効果
図１５（パネルＡ〜Ｃ）は、３００μＭメタドキシンによる５時間の処置の効果を示す。樹状突起は、それぞれ神経細胞体からの距離に基づいて１０μｍの１０セグメントに分けた（左から右へ近位から遠位）。突起棘密度は、セグメント３では、ＷＴマウス由来ニューロンに比べてＦｍｒ１ノックアウトマウス由来ニューロンで増加していた。具体的には、図１５パネルＡは、ニューロンの糸状仮足密度を示す。Ｆｍｒ１ノックアウトマウス由来の初代海馬ニューロンは、糸状仮足密度の増加を示した（ｐ＜０．００１）。３００μＭメタドキシンによる処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるニューロンの糸状仮足密度の異常な増加を軽減した（ｐ＜０．００１）。Ｆｍｒ１ノックアウトマウス由来ニューロンは、未熟な特徴を有し、より長く（図１５パネルＢ（ｐ＜０．０１））、かつ、幅の狭い（図１５パネルＣ（ｐ＜０．０１））糸状仮足を示した。メタドキシン処置は、この糸状仮足長の増大を逆転させ（図１５パネルＢ（ｐ＜０．０１））、幅の減少を逆転させた（図１５パネルＣ（ｐ＜０．００１））。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｍｒ１ノックアウトマウスにおけるｄｅ  ｎｏｖｏ海馬タンパク質合成に対するメタドキシンの効果
図１６は、Ｆｍｒ１ノックアウトまたはＷＴマウス由来４００μＭ海馬切片における基底ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成に対するビヒクルまたは３００μＭメタドキシンのいずれかによる処置の効果を示す。タンパク質合成は、ビヒクル処置ＷＴ対照海馬よりもビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウトマウス由来海馬で高かった（ｐ＜０．０００１）。メタドキシン処置は、Ｆｍｒ１ノックアウトマウス海馬におけるタンパク質合成速度を低下させた。Ｆｍｒ１ノックアウトマウス由来海馬はメタドキシン処置ＷＴマウス由来海馬よりも高いタンパク質合成速度を維持していたことから（ｐ＜０．００１）、この効果は部分的なものであった。
【０１１２】
【表１】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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