(57)【要約】  本発明は、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体に、その治療法に、および前記化合物を含む医薬組成物に関する。より具体的に、本発明は、過剰活性なＲａｓおよび／もしくはＲａｃまたはシグナリング経路を特徴とする癌を処置するための、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体または前記化合物を含む医薬組成物に関する。
2016534129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールおよび（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が、９０％を超える（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、９５％を超える（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、９９％を超える（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール。
【請求項６】
前記組成物が、９０％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、９５％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、９９％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール。
【請求項１０】
前記組成物が、０．５％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、０．５％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
対象に治療有効量の請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物を投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項１６】
前記癌が、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌がグリオーマである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記グリオブラストーマが、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌を処置するための、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
前記癌が、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記癌がグリオーマである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記グリオブラストーマが、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
癌を処置するための薬物の製造における、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
前記癌が、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記癌がグリオーマである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記グリオブラストーマが、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ここに規定する通りの、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置において用いるための、立体異性体および互変異性体を含む、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2016534129.tif 000046
［式中、
ｍは、１または２であり、
ｑは、０または１であり、
Ｒ1は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；ならびに各々１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、複素環、およびヘテロアリールから選択され、
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、または
Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接の原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ6は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ7は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロゲン、アルキルアミノ、およびＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択され、
Ｒ8は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ9は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグであって、
但し、前記化合物は、メフロキンではない、
上記化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグ。
【請求項３１】
Ｒ2が、不飽和または飽和の、単環式または多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ2がフェニルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
ｍが２であり、ｑが０である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３４】
前記化合物が、
【化２−１】
2016534129.tif 000047
【化２−２】
2016534129.tif 000048
【化２−３】
2016534129.tif 000049
【化２−４】
2016534129.tif 000050
および薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグから選択される、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３５】
前記化合物が、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
および薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグから選択される、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３６】
前記化合物が、前述の化合物の（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）異性体、またはそれらのラセミ混合物から選択される、請求項３４または３５に記載の化合物。
【請求項３７】
前記化合物が、化合物の鏡像異性的に純粋な（Ｒ，Ｓ）または（Ｓ，Ｒ）立体異性体から選択される、請求項３４または３５に記載の化合物。
【請求項３８】
前記癌がグリオーマである、請求項３０〜３７の何れか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３９】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記グリオブラストーマが、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマから選択される、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
治療有効量の請求項３０〜３７の何れか一項に記載の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
ここに規定する通りの、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置のための薬物の製造における、立体異性体および互変異性体を含む、式（Ｉ）の化合物
【化３】
2016534129.tif 000051
［式中、
ｍは、１または２であり、
ｑは、０または１であり、
Ｒ1は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；ならびに各々１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、複素環、またはヘテロアリールから選択され、
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、または
Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接の原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ6は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ7は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロゲン、アルキルアミノ、およびＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択され、
Ｒ8は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ9は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグであって、
但し、前記化合物は、メフロキンではない、
上記化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグの使用。
【請求項４３】
Ｒ2が、不飽和または飽和の、単環式または多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
Ｒ2がフェニルである、請求項４２に記載の使用。
【請求項４５】
ｍが２であり、ｑが０である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４６】
前記化合物が、
【化４−１】
2016534129.tif 000052
【化４−２】
2016534129.tif 000053
【化４−３】
2016534129.tif 000054
【化４−４】
2016534129.tif 000055
および薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグから選択される、請求項４２に記載の使用。
【請求項４７】
前記化合物が、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
および薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグから選択される、請求項４２に記載の使用。
【請求項４８】
前記化合物が、前述の化合物の（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）異性体、またはそれらのラセミ混合物から選択される、請求項４６または４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記化合物が、化合物の鏡像異性的に純粋な（Ｒ，Ｓ）または（Ｓ，Ｒ）立体異性体から選択される、請求項４６または４７に記載の使用。
【請求項５０】
前記癌がグリオーマである、請求項４２〜４９の何れか一項に記載の使用。
【請求項５１】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記グリオブラストーマが、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマから選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
立体異性体および互変異性体を含む、式（Ｉ）の化合物
【化５】
2016534129.tif 000056
［式中、
ｍは、１または２であり、
ｑは、０または１であり、
Ｒ1は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；ならびに各々１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、複素環、およびヘテロアリールから選択され、
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、または
Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接の原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ6は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ7は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロゲン、アルキルアミノ、およびＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択され、
Ｒ8は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ9は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグであって、
但し、前記化合物は、メフロキンではない、
上記化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグを投与することを含む、対象における改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置する方法。
【請求項５４】
Ｒ2が、不飽和または飽和の、単環式または多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｒ2がフェニルである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ｍが２であり、ｑが０である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が、
【化６−１】
2016534129.tif 000057
【化６−２】
2016534129.tif 000058
【化６−３】
2016534129.tif 000059
【化６−４】
2016534129.tif 000060
および薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグから選択される、請求項５３に記載の使用。
【請求項５８】
前記化合物が、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
および薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグから選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が、前述の化合物の（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）異性体、またはそれらのラセミ混合物から選択される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が、化合物の鏡像異性的に純粋な（Ｒ，Ｓ）または（Ｓ，Ｒ）立体異性体から選択される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌がグリオーマである、請求項５３〜６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記グリオブラストーマが、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ａ）請求項１〜１３に記載の組成物、または立体異性体および互変異性体を含む、式（Ｉ）の化合物
【化７】
2016534129.tif 000061
［式中、
ｍは、１または２であり、
ｑは、０または１であり、
Ｒ1は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；ならびに各々１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、複素環、およびヘテロアリールから選択され、
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、または
Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接の原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ6は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ7は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロゲン、アルキルアミノ、およびＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択され、
Ｒ8は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ9は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
あるいは薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグに、カーゴ化合物、物質、および／または分子を共有結合的にコンジュゲートさせてコンジュゲートを形成させること、ならびに
ｂ）前記コンジュゲートが癌細胞に接触するように、前記コンジュゲートを癌細胞に曝露すること
を含む、
カーゴ化合物、物質、および／または分子を癌細胞に選択的に送達するための方法。
【請求項６５】
式１の化合物がメフロキンではない、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記コンジュゲートを前記癌細胞にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記カーゴ物質／化合物／分子が細胞毒性化合物である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記カーゴが癌治療用である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記カーゴが、癌細胞の選択的画像化のための画像化分子である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記カーゴが、ｉｎ  ｖｉｖｏでグリオーマ細胞を死滅させる能力を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
癌を処置するための、請求項６８に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項７２】
前記癌がグリオーマである、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
前記癌がグリオーマである、請求項６９に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項７５】
前記グリオーマがグリオブラストーマである、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
ａ）
ｉ）１細胞段階の胚に、胚の色素沈着の発生をブロックする物質を注射する工程、および／または
ｉｉ）前記胚をインキュベートするのに用いるためのインキュベータのタンク水に、フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）を加える工程
によりゼブラフィッシュの胚の色素沈着を妨げる工程と、
ｂ）前記胚をインキュベータに配置し、前記ゼブラフィッシュの胚を受精後２日間（２ｄｐｆ）成長させる工程と、
ｃ）前記ゼブラフィッシュを収集し、ゼブラフィッシュに麻酔する工程と、
ｄ）非標識の、または色素標識した、または導入遺伝子発現性の癌細胞、例えば、脳腫瘍のグリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞の原発腫瘍からの細胞を、前記胚の脳室中に注射する工程と、
ｅ）誤って注射された胚を任意に除去する工程と、
ｆ）前記ゼブラフィッシュを、例えば約３〜４時間、麻酔から回復させる工程と、
ｇ）生存し、泳いでいるゼブラフィッシュを、マルチウエルプレートまたは同様の容器中に分配する工程と、
ｈ）試験濃度の試験化合物を前記ウエルまたは容器に加える工程と、
ｉ）前記ウエルまたは容器中のタンク水を、定期的に、例えば毎日、前記同じ薬物濃度を含む水と交換する工程と、
ｊ）前記ゼブラフィッシュを経時的にモニタリングして、前記ゼブラフィッシュの脳におけるグリオーマ（グリオブラストーマ）細胞の増大または低減を決定することにより、グリオーマの処置において評価される薬物の有効性を確立する工程と
を含む、グリオーマを処置するための試験化合物を評価するためのスクリーニングアッセイ。
【請求項７７】
５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物、４−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドおよび４−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物から選択される、請求項３０、４２、または５３の何れか一項に記載の化合物。
【請求項７８】
５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物、４−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドおよび４−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物から選択される、請求項３０、４２、または５３に記載の化合物。
【請求項７９】
【化８−１】
2016534129.tif 000062
【化８−２】
2016534129.tif 000063
から選択される、請求項３０、４２、または５３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照によりここに援用される、２０１３年９月９日出願のスウェーデン出願第ＳＥ１３５１０４１−７号、２０１３年９月９日出願の米国仮特許出願第６１／８７５，４２０号、２０１３年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６１／９１７，５８１号、および２０１４年６月１９日出願の米国仮特許出願第６２／０１４，１６３号に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の下に優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体、治療におけるその使用、および前記化合物を含む医薬組成物に関する。具体的に、本発明は、癌を処置するための、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体、およびその化合物を含む医薬組成物に関する。本発明は、このような化合物を同定するためのアッセイにさらに関する。本発明は、化合物の送達および／または画像化方法に対する、癌細胞特異的な非クラスリン依存性空胞形成の使用にも関する。
【発明の背景】
【０００３】
グリオーマは、グリア細胞から生じる、脳または脊椎において始まるタイプの腫瘍である。グリオーマの殆どは頭蓋内腫瘍であり、毎年１０００００人中おおよそ７人の個体が罹患し、脳腫瘍の最も一般的な形態となっている。グリオーマは、細胞型により、グレードにより、および位置により分類される。グリオーマは、組織学的な特徴を共有する特定のタイプの細胞に従って命名される。主なタイプのグリオーマには、脳室上衣腫（上衣細胞）、星細胞腫（星状膠細胞）、乏突起細胞腫（乏突起膠細胞）、および混合性膠種（様々なタイプの神経膠からの細胞を含む）がある。グリオーマはグレードに従ってさらに分類され、グレードは腫瘍の病理学的評価によって決定される。ＷＨＯ（世界保健機関）によると、グリオーマはＩからＩＶまでグレード付けされるが、グレードＩは最も進行していない疾患（予後が最もよい）であり、グレードＩＶは最も進行した疾患（予後が最も悪い）である。グレードＩのグリオーマ（例えば、血管中心性グリオーマ、毛様細胞性星細胞腫、乳頭状グリア神経細胞性腫瘍（ＰＧＮＴ）、下垂体細胞腫）は比較的良性であり、増殖速度が遅く、外科的切除単独の後に治癒する可能性がある。グレードＩＩの腫瘍（例えば、乏突起細胞腫、脳室外神経細胞腫、乏突起星細胞腫、および星細胞腫）は、同様にゆっくりと増殖するが、毛様細胞性星細胞腫と異なり、隣接組織をゆっくりと浸潤することにより悪性進行を起こしやすく、より高グレードの悪性に進行し得る。グレードＩＩＩの病変（例えば、未分化星細胞腫、未分化乏突起星細胞腫、および未分化ガングリオグリオーマ）には悪性の組織学的エビデンスがあり、外科的切除と後続の化学療法との両方を必要とする。ＷＨＯのグレードＩＶの呼称（例えば、グリオブラストーマ、胎児性新生物、膠肉腫）は極めて悪性であり、急速な疾患の進行および一定に致死的な結果を伴う、有糸分裂が活発な腫瘍である。グリオーマも、脳における幕状骨膜の上にあるか、または下にあるかの位置に従って分類することができる。腫瘍はテント上（幕状骨の上）、テント下（幕状骨の下）、または脳橋（脳幹の橋に位置する）の何れかである。
【０００４】
多形神経膠芽腫（ＧＢＭまたはグレードＩＶの星細胞腫）は最も一般的で悪性度の高いグリオーマであり、高増殖速度、高悪性度の侵襲性、ならびに放射線療法および化学療法に対する抵抗性を特徴とする。生存の著しい増大をもたらす化学−照射の取組みを伴う処置戦略における改善に関わらず、腫瘍の再発のため、生存時間の中央値はおよそ１５か月に依然として限られている。よって、新たな治療法が必要とされており、腫瘍発生の背後にある生物学を理解することは、新たな効率的な処置を見出して患者の生存を増強する上で非常に重要である。
【０００５】
腫瘍の発生は、細胞の生物学における根本的な変化をまねき、癌をもたらす、プロトオンコジーンにおける機能獲得変異または腫瘍抑制遺伝子における機能喪失変異の何れかであり得る、体細胞性の、ときには遺伝性の変異を伴う。このような改変はしばしば、分裂促進的なシグナルの伝達、または細胞周期、アポトーシス、老化、細胞接着、もしくはＤＮＡ修復経路の制御因子の増強を伴う。何百もの多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の試料をゲノム研究することにより、ＧＢＭのゲノム背景に対する包括的な見識がみちびかれ、ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／ＮＦ１／ＲＡＳにおける改変を有する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ／ＲＡＳ）発がん経路、ＴＰ５３／ＭＤＭ２／ＭＤＭ４／ｐ１４ＡＲＦの変更における変更を有するｐ５３経路、および最後に、ＲＢ１／ＣＤＫ４／ｐ１６ＩＮＫ４Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂにおける改変を有する細胞周期の制御経路を含めた、通常活性化される中心となるシグナル伝達経路における機能の獲得と喪失の両方が明らかにされており、ほとんどのＧＢＭ腫瘍は３つの経路全てに遺伝子改変を有する。その結果、細胞増殖はあおられ、生存および浸潤の性質は増強され、腫瘍細胞の老化、アポトーシス、および細胞周期チェックポイントの活性化は妨げられる。一貫して、悪性グリオーマは、最も高悪性度のヒトの癌の中にあり、ＣＮＳにおける悪性腫瘍の大多数を代表する。ＧＢＭは、腫瘍の外科的切除ならびに付随する化学療法および放射線療法に基づいた積極的な治療法を実行した場合でも本質的に不治であり、疾患の再発のため、３年を超えて生存する患者は３〜５％にすぎない。
【０００６】
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、少数が存在することが頻繁であるが、動物に異種移植した場合に腫瘍を生じる能力がある一方、残りの非ＣＳＣ腫瘍塊は殆どの場合、生じることができない。癌幹細胞と呼ばれる、幹／前駆細胞の特徴を有するＧＢＭ細胞の小集団は、新たな腫瘍の成長の種をまくことができ、悪性病変、転移、腫瘍の再発を主に駆動し、放射線ベースの治療法および化学療法に対する抵抗性を促進するものと考えられている。グリオーマを処置するのに用いられる現在の黄金基準の化学療法は、ＤＮＡ複製を主に標的化する抗新生物であるテモゾロミド（ＴＭＺ）である。ＴＭＺは、ＣＳＣを標的化する上で重症の副作用および限定された有効性を伴う。腫瘍開始性のＣＳＣは比較的無活動であると考えられており、細胞分裂に関連する細胞内プロセスを標的化する現在の治療戦略（例えば、ＴＭＺ）後に疾患が再発する一因となり得る。ＣＳＣの性質を有する腫瘍開始性の細胞は、腫瘍原性の潜在性が高く増殖速度が低いグリオブラストーマにおいて同定されており、正常の幹細胞との表現型のいくつか類似性、例えば、ＣＤ１３３遺伝子発現および神経幹細胞で通例発現される他の遺伝子を表す。ＣＳＣは、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびニューロンに分化し、脳の新たな位置に分散することが示されている。
【０００７】
遺伝子研究により関与する遺伝子生成物を同定することで、遺伝子改変により獲得される機能を中和する一連の薬物をもたらす、いくつかの他の形態の癌と異なり、グリオブラストーマの遺伝学の複雑さおよび多様性は、治療的な標的化に対する単純な戦略を妨げていた。腫瘍発生の根底となる異常を中和することに注目する新たな取組みには、現在まで限られた成功しかなかった。
【０００８】
細胞起源が様々であり、遺伝的背景が様々である神経系における癌は極めて多様であり、様々なメカニズムにより生涯の様々な時期に出現する。神経学的腫瘍には、末梢の腫瘍、例えば、様々な神経鞘腫瘍（nerve sheet tumor）、神経線維腫（神経線維肉腫、神経線維腫症）、神経鞘腫／シュワン細胞腫（聴神経腫、神経芽細胞腫、脊髄および脳の腫瘍、例えば、髄膜腫、血管外皮細胞腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、上衣細胞腫、脈絡叢腫瘍、神経節神経腫、網膜芽細胞腫、神経細胞腫、髄芽腫、髄上皮腫、グリオーマ、乏突起細胞腫から全てが含まれる。
【０００９】
脳腫瘍、例えばグリオブラストーマにおいて、ＰＲＣ２活性は、増大するよりむしろ阻害される（Ｌｅｗｉｓ，ＰＷ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、８５７〜８６１）。グリオーマでは、ＲＮＡｉ媒介性の弱毒化またはＰＲＣ２活性の薬理学的阻害は、アポトーシスまたはＢｒｄＵ組入れに殆どまたは全く効果がないが、遺伝子発現を変化させる（Ｎａｔｓｕｍｅ  Ａ（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７３、４５５９；Ｃｈａｎ，Ｋ．−Ｍ．ら（２０１３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２７、９８５〜９０）。このようなＰＲＣ２活性の低下は、発現した場合にグリオーマを駆動することが知られている遺伝子の発現の上昇をもたらす抑制解除のもととなる。さらに、グリオーマ細胞のゲノムにおいて誤った位置に局在化したＰＲＣ２も、知られている腫瘍抑制因子を含めた、いくつかの遺伝子の遺伝子発現の増大をまねく（Ｃｈａｎ，Ｋ．−Ｍ．ら（２０１３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２７、９８５〜９０）。したがって、グリオーマにおいてＰＲＣ２活性が低下すると癌をあおることが予想される。
【００１０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７６７（ＷＯ／２０１３／０５９９４４）は、多様な癌疾患を含めた機能亢進性のポリコーム２複合体（ＰＲＣ２）に関連する疾患を処置するための、
一般式
【００１１】
【化１】
2016534129.tif 000003
【００１２】
の化合物を開示している。提供される実験データは、リンパ腫細胞系および乳癌細胞系に対するものである。あらゆるタイプの神経系の癌に対する証拠は示されていない。さらに、グリオーマは、機能亢進性ポリコーム２複合体（ＰＲＣ２）に関連する疾患と考えられていない。
【００１３】
さらに、α−２−ピペリジル−２−フェニル−４−キノリンメタノールは、２−フェニル基のない対応する化合物よりも、トリのマラリアに対して非常に効果的であり、様々な２−アリール置換基を含む類似化合物の合成が示唆された。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９４６）、６８、２７０５〜８。これらの化合物のどれも癌といかなる関係もない。
【００１４】
ビブリオコレラ（Vibrio cholera）においてバイオフィルム形成をする、２−（４−クロロフェニル）−キノリン−４−イル）−（ピペリジン−２−イル）メタノールおよびピペリジン−２−イル（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールを含めた小分子インヒビターが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（２０１１）、７（４）、１１７６−１１８４、およびＯｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０１３）、１５（６）、１２３４−１２３７に開示されている。
【００１５】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７２７６（ＷＯ／２０１３／１２６６６４）およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２）、５５、３１１３〜３１２１は、ヒトの癌における多剤耐性を逆転する、化合物（２−（４−メトキシフェニル）キノリン−４−イル）−（ピペリジン−２−イル）メタノール（ＮＳＣ２３９２５）の光学活性な立体異性体の使用を開示している。この開示は、他の化学療法と併用したＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）ＭＤＲ１トランスポーター複合体の機能の標的化に関し、化合物自体の抗新生物性効果は請求していない。
【００１６】
グリオーマ癌患者に対して現在極めて劣る予後を改善し得る、独特の作用機序を有するものを含めた、新規なグリオーマ治療法を開発することが引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、新たな化合物である、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体に、治療におけるその使用に、および前記化合物を含む医薬組成物に関する。より具体的に、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体または前記化合物を含む医薬組成物に関する。さらにより具体的に、本発明は、グリオーマを処置するための、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体または前記化合物を含む医薬組成物に関する。本発明は、このような化合物を同定するためのアッセイにさらに関する。本発明は、腫瘍細胞を選択的に死滅させることができ、身体の他の細胞型に最小の効果を有する分子を提供することを目的とする。
【００１８】
腫瘍開始性の癌細胞は、他の幹様細胞同様、癌の選択的標的化、癌、具体的に、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌、例えばグリオーマ、より具体的にグリオブラストーマ（ここでは、多形神経膠芽腫、またはＧＢＭとも呼ぶ）の処置を可能にし得る独特な分子上の特徴を有する。本発明は、腫瘍細胞および／または癌幹細胞を選択的に死滅させることができ、身体の他の細胞型に対して最小の効果を有する化合物を提供することに関する。より具体的に、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌、例えば、それだけには限定されないが、膵臓、肺、甲状腺、尿路、結腸直腸、唾液腺(salivary)、前立腺、腸、皮膚、血液学的／リンパ系悪性腫瘍、グリオーマ、および頸部の癌の処置における、２，４−二置換キノリン誘導体の調製および使用に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性および／または下流のシグナリング経路を有する癌、ならびに特異的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞に選択的な、新たな非クラスリン依存性空胞形成細胞死のメカニズムの使用にも関する。選択的な空胞形成は、例えば、所望の化合物または物質を癌細胞、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞に選択的に送達するのに、または癌細胞、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞の選択的画像化に用いるための画像化分子を送達するのに用いてもよい。本発明の化合物を、または癌細胞、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞において前記の同じ選択的空胞形成のメカニズムを誘発するあらゆる他の適切な化合物を用いてこの選択的空胞形成を実現してもよい。そのうえ、本発明は、癌、具体的にグリオーマ、特にグリオブラストーマの処置において有効なこのような化合物、および／または前記の癌、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞に細胞特異的な空胞形成を誘発する化合物を同定するための新規なゼブラフィッシュのスクリーニングアッセイにも関する。
【００２０】
本発明の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するのに用いるための、立体異性体および互変異性体を含む、式（Ｉ）の化合物
【００２１】
【化２】
2016534129.tif 000004
【００２２】
［式中、
ｍは、１、２、または３であり、
ｑは、０または１であり、
Ｒ1は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；および不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、複素環、およびヘテロアリールから選択され、各々１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されており、
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、または
Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接の原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ6は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ7は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロゲン、アルキルアミノ、およびＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択され、
Ｒ8は、ＨおよびＣ１〜Ｃ３アルキルから選択され、
Ｒ9は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヘテロ芳香族、またはフェニルである］
あるいは式（Ｉ）の化合物（複数可）の薬学的に許容される塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグである。
【００２３】
例えば、式Ｉの化合物はメフロキンではない。例えば、Ｒ２は無置換のピリジルではない。
【００２４】
例えば、本発明は、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３の化合物から選択される、式Ｉの化合物に関する。
【００２５】
例えば、本発明は、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、およびＳ２９の化合物から選択される式Ｉの化合物に関する。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ｍが１または２である式Ｉの化合物である。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ｑが０である式Ｉの化合物である。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ｍが２であり、ｑが０である式Ｉの化合物である。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、Ｒ２が不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環である式Ｉの化合物である。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、Ｒ２がフェニルである式Ｉの化合物である。
【００３１】
本発明の別の一側面は、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグから選択される化合物である。
【００３２】
さらに別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の治療において用いるための、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグから選択される化合物である。
【００３３】
さらに別の一側面は、グリオーマ、具体的にグリオブラストーマの処置において用いるための、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグから選択される化合物である。
【００３４】
別の一側面は、治療有効量の
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグから選択される化合物、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００３５】
別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の治療において用いるための、５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物、４−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドおよび４−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグから選択される化合物である。
【００３６】
別の一側面は、治療有効量の、５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物、４−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドおよび４−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグから選択される化合物、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００３７】
具体的に、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置において用いるための、前述の化合物全ての、Ｒ，Ｓおよび／またはＳ，Ｒ異性体の好ましい使用に関する。
【００３８】
本発明のさらなる一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオーマを処置するための使用に関する。
【００３９】
本発明のさらなる一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオブラストーマを処置するための使用に関する。
【００４０】
さらに別の一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための薬物の製造における使用に関する。
【００４１】
さらに別の一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオーマを処置するための薬物の製造における使用に関する。
【００４２】
さらに別の一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオブラストーマを処置するための薬物の製造における使用に関する。
【００４３】
さらに別の一側面は改変されたＲａｓ／Ｒａｃに関連する癌を処置するための方法であり、ここで上記に規定する立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを、このような処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【００４４】
さらに別の一側面はグリオーマを処置するための方法であり、ここで上記に規定する立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを、このような処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【００４５】
さらに別の一側面はグリオブラストーマを処置するための方法であり、ここで上記に規定する立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを、このような処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【００４６】
本発明は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む組成物も提供する。組成物は、９０％を超え、９５％を超え、または９９％を超える（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【００４７】
いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【００４８】
本発明は、１％未満の、０．７％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、キラル的に精製された（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールも提供する。
【００４９】
本発明は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む組成物も提供する。組成物は、９０％を超え、９５％を超え、または９９％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【００５０】
いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【００５１】
本発明は、１％未満の、０．７％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、キラル的に精製された（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールも提供する。
【００５２】
本発明の別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置において用いるための、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物である。
【００５３】
本発明のさらなる一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオーマを処置するための使用に関する。
【００５４】
本発明のさらなる一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオブラストーマを処置するための使用に関する。
【００５５】
さらに別の一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための薬物の製造における使用である。
【００５６】
さらに別の一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【００５７】
さらに別の一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオブラストーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【００５８】
さらに別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃに関連する癌を処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【００５９】
さらに別の一側面は、グリオーマを処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【００６０】
さらに別の一側面は、グリオブラストーマを処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【００６１】
本発明の別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置における使用のための、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物である。
【００６２】
本発明のさらなる一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物のグリオーマの処置における使用に関する。
【００６３】
本発明のさらなる一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物のグリオブラストーマを処置するための使用に関する。
【００６４】
さらに別の一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための薬物の製造における使用である。
【００６５】
さらに別の一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【００６６】
さらに別の一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオブラストーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【００６７】
さらに別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃに関連する癌を処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【００６８】
さらに別の一側面は、グリオーマを処置するための方法であり、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【００６９】
さらに別の一側面は、グリオブラストーマを処置するための方法であり、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【００７０】
本発明は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、９０％を超える、９５％を超える、または９９％を超える（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【００７１】
本発明は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、９０％を超える、９５％を超える、または９９％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【００７２】
本発明は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを選択的に調製するための方法も提供する。
【００７３】
例えば、メチル化されている（Ｓ）−Ｌ−ピペコリン酸をトリチル化することにより、２，４−ジブロモキノリンから産生されたグリニヤール試薬による面選択的付加に適する、キラルのピペリジンカルボアルデヒド材料を産生する可能性がもたらされる。次いで、単一の単離されたＲ，Ｓ異性体を、好適な４−クロロフェニルボロン酸の鈴木カップリング反応にかけ、このトリチル基を同時に脱保護した後、所望の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールが得られる。
【００７４】
例えば、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールは、（Ｓ）−Ｌ−ピペコリン酸を塩化チオニルで、対応するエステルに、例えばメチル（２Ｓ）−１−ピペリジン−２−カルボキシレートに変換し、引き続きメタノール、またはキラルのカルボキシレートを形成させるのに適する他の試薬で処理することにより、いくつかの工程において産生される。次いで、中間体のエステルを、適切な保護基、例えばトリチル基で保護して、窒素保護されているカルボキシレート、例えばメチル（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボキシレートを形成させ、次いでこれを、例えば、適切な試薬、例えばＬｉＡｌＨ4で還元することにより、対応するアルコールに変換する。次いで、［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノールを、適切な酸化剤、例えば塩化オキサリルと反応させることにより（例えば、Ｓｗｅｒｎ酸化）対応するアルデヒドに変換し、得られた（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボアルデヒドを、次いで、好適な試薬、例えば２，４−ジブロモキノリンからインサイチューで産生された面選択的なグリニヤール試薬と反応させて、単一のＲ，Ｓ異性体である、（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノールを得る。次いで、このブロモ化合物を好適なフェニルボロン酸（例えば、４−クロロフェニルボロン酸）との鈴木カップリングにかけて、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノールを得、このＮ−保護基（例えば、トリチル）を除去した後、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールが生成される。
【００７５】
好ましくは、生成された（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールは、１％未満、０．７％未満、０．５％未満、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む。
【００７６】
本発明は、大多数のヒトの癌に観察される、空胞形成の増大をまねく脱制御された経路、例えば、増大したＲａｓ／Ｒａｃおよび／または下流のシグナリング経路を有する癌に有用であってもよい。具体的に、癌は全てのタイプの固形腫瘍、ならびに上昇したレベルまたはＲａｓおよび／またはＲａｃの過剰活性に関連する血液学的な癌、例えば、副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、子宮内膜、造血性／リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上部呼吸消化器（upper aerodigstive tract）、尿路の組織における癌を含んでもよい（Ｉａｎ  Ａ．Ｐｒｉｏｒ．、Ｐａｕｌ  Ｄ  Ｌｅｗｉｓ、Ｃａｒｌａ  Ｍａｔｔｏｓ（２０１２）「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７２、２４５７〜２４６７）。
【００７７】
より具体的に、ここに記載する化合物および方法で処置するための癌は、グリオーマの分類に関する全タイプのグリオーマ、すなわち、上衣細胞腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、ならびに４グレード全て（グレードＩ〜ＩＶ）の、全ての可能な位置における混合グリオーマを含んでもよい。好ましくは、グリオーマのタイプは星細胞腫である。より好ましくは、星細胞腫はグリオブラストーマ、例えばＧＢＭである。グリオブラストーマは、例えば、前神経(proneural)の、古典的な(classical)、および間葉系のグリオブラストーマから選択してもよい。
【００７８】
一側面において、本発明の化合物は、併用治療において用いるためのものである。例えば、本発明の化合物での対象の処置は、癌の外科的切除を含んでもよい。例えば、本発明の化合物との併用治療は、放射線治療の投与も含んでもよい。例えば、本発明の化合物との併用治療は、さらなる抗癌剤の投与、および／またはここに記載する治療法との併用も含んでもよい。このような併用治療は、同時、逐次、または交互であり得る。
【００７９】
本発明は、物質、例えば、治療用ＤＮＡ、遺伝子生成物、細胞毒性剤、抗体、細胞浸潤性ペプチド、ナノ粒子、または他の薬剤を、誘発性マクロピノサイトーシスによって細胞中へ送達するための、前述の化合物の使用にも関する。
【００８０】
本発明は、所望の分子または物質、特に治療薬を、癌細胞、例えばグリオブラストーマへ送達するための、上記に規定する化合物の使用にさらに関する。このような分子／物質には、ｉｎ  ｖｉｖｏでグリオーマ細胞を死滅させ得る、治療用ＤＮＡ、遺伝子生成物、細胞毒性剤、抗体、細胞浸潤性ペプチド、ナノ粒子または他の薬剤が含まれる。また、本発明の化合物（複数可）を用いて、グリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞へ画像化分子を選択的に送達することにより、癌細胞、例えばグリオブラストーマ細胞に特異的な画像化を実現する可能性がもたらされる。
【００８１】
本発明のさらなる一側面は、このような抗発癌性化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、および脳腫瘍に対抗して活性な化合物を同定するためのスクリーニングツールである。前記新規なスクリーニングアッセイを、以下により詳細に記載する。
【００８２】
最後に、本発明の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性を有する癌細胞、具体的にグリオーマ細胞におけるマクロピノサイトーシス媒介性細胞死を選択的に変調するための方法である。
【００８３】
別段の規定がなければ、ここで用いる技術および科学用語は全て、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において、単数形は、文脈による別段の指示が明らかになければ複数も含む。ここに記載するものに対して同様または等価である方法および材料を、本発明を実行または試験する上で用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。ここに言及する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は全て、参照により援用される。ここに引用する参考文献は、本発明に対する先行技術であるとは認められない。抵触の場合には、定義を含めた本明細書により規制されよう。加えて、材料、方法、および例は説明にすぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００８４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、バクイノール−１の効果および用量反応曲線を示すグラフを表す。（Ａ、Ｂ）および（Ｃ〜Ｋ）はそれぞれ、ＤＭＳＯまたはバクイノール−１での処理時のＧＳＣの細胞周期に対する影響：様々なＧＳＣ密度に対する生存性アッセイ（ＡＴＰ）におけるバクイノール−１濃度の用量反応（Ｃ）、バクイノール−１でＧＳＣを処理し１日目（Ｄ）、ＴＭＺでＧＳＣを処理し１日目（Ｅ）、バクイノール−１でマウスグリアを処理し１日目（Ｆ）、バクイノール−１で線維芽細胞を処理し１日目（Ｇ）、バクイノール−１でＧＳＣを処理し２日目（Ｈ）、バクイノール−１でＧＳＣを処理し３日目（Ｉ）、バクイノール−１でＧＳＣを処理し４日目（Ｊ）、バクイノール−１で線維芽細胞を処理し４日目（Ｋ）。
【図２】図２は、スタウロスポリン（１０ｍＭ）またはＤＭＳＯと比較した場合の、５ｍＭから３０ｍＭのバクイノール−１でＧＳＣを５分から６００分処理した後、カスパーゼ３およびカスパーゼ７をカスパーゼアッセイおよび蛍光定量したバクイノール−１による非アポトーシス死の誘発を示す棒グラフである。Ｘ軸上の濃度はマイクロモルである。
【図３】図３は、指摘する通り、バクイノール−１で５分から２６時間処理したＧＳＣのウエスタンブロット分析を示す。細胞抽出物を、リン光体−ＭＫＫ４（Ｐ−ＭＫＫ４）およびリジン２７のヒストンＨ３トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）に対して免疫ブロットした。
【図４】図４は、マウス脳の免疫組織化学染色画像（Ａ、Ｂ）およびステープルダイアグラムにおける対応する統計学的分析（Ｃ、Ｄ）を示す。ＤＭＳＯ（Ａ）またはバクイノール−１（Ｂ）で処理したＧＳＣ異種移植した脳に対する、抗ヒトＧＦＡＰ抗体での免疫組織化学染色。ＧＦＡＰ陽性（Ｃ）および壊死領域（Ｄ）の定量も示す。
【図５】図５は（Ｒ，Ｓ；Ｓ２０）、（Ｓ，Ｒ；Ｓ２１）、（Ｓ，Ｓ；Ｓ２２）、および（Ｒ，Ｒ；Ｓ２３）と割り当てたバクイノール−１（Ｓ１０）の異なる４つの異性体を示す。個々の異性体を立体選択的に合成すると、異なる薬理学的活性が観察され、Ｒ，ＳおよびＳ，Ｒ異性体は、Ｒ，ＲおよびＳ，Ｓ異性体に比べて優れたｉｎ  ｖｉｔｒｏの活性を示すことが指摘された（表４も参照されたい）。
【図６Ａ】図６Ａは、ラセミ体のバクイノール−１（ＮＳＣ１３３１６）の、鏡像異性体的に純粋なバクイノール−１ＲＳおよびバクイノール−１ＳＲでの、比較上の全身（血漿）曝露を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２０ｍｇ／ｋｇを単回経口投与した後の、比較上の脳曝露を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、バクイノール−１ＲＳ（Ｓ２０）およびメフロキンの、ヒト線維芽細胞に対する細胞毒性を比較するグラフであり、図７Ｂは、バクイノール−１ＲＳ（Ｓ２０）およびメフロキンの、グリオブラストーマ細胞（Ｕ３０１３）に対する細胞毒性を比較するグラフである。
【００８６】
図で用いた略語：ＧＳＣ：グリオーマ幹細胞、ＨＦＳ：ヒト線維芽細胞、ＥＳＣ：マウス胚幹細胞、ＴＭＺ：テモゾロミド、ｍＧｌｉａ：マウスグリア細胞、Ｖａｃｑ：バクイノール−１、Ｓｔａ：スタウロスポリン、ＲＬＵ：相対的発光。
【発明の詳細な説明】
【００８７】
本発明の前述および他の側面を、ここに提供する記載および方法に関して、今からより詳細に記載する。本発明は様々な形態で具体化してもよいことを理解されたく、ここに記載する態様に対して限定的であると理解してはならない。むしろ、これらの態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように、また当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供するものである。
【００８８】
本発明をここに記載するのに用いる用語は、特定の態様を記載する目的にすぎず、本発明を限定しようとするものではない。本発明の態様の記載において用いる、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の指摘が明らかになければ、複数形も含むものとされる。また、本明細書で用いる「および／または」は、関連して列挙する１つ以上のアイテムのあらゆる全ての可能な組合せを意味し、包含するものである。さらに、本明細書で用いる「約」の語は、測定可能な値、例えば、化合物の量、用量、時間、温度などに言及する場合、特定する量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。範囲を使用する場合は（例えば、ｘからｙまでの範囲）、測定可能な値が約ｘから約ｙまでの範囲、またはその中のあらゆる範囲、例えば、約ｘ1から約ｙ1までであることを意味する。「含む」および／または「含んでいる」の語は、本明細書で用いる場合、記載する特徴、整数、工程、操作、エレメント、および／または成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、エレメント、成分、および／またはこれらの群の存在または付加を除外しないことがさらに理解されよう。別段の規定がなければ、本明細書で用いる科学および技術用語を含めた全ての用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【００８９】
本発明は、新しい化合物である、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体に、治療におけるその使用に、および前記化合物を含む医薬組成物に関する。より具体的に、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体、または前記化合物を含む医薬組成物に関する。さらにより具体的に、本発明は、グリオーマを処置するための、ある種の２，４−二置換キノリン誘導体、または前記化合物を含む医薬組成物に関する。本発明は、このような化合物を同定するためのアッセイにさらに関する。本発明は、腫瘍細胞を選択的に死滅させることができ、身体の他の細胞型に最小の効果を有する分子を提供することを目的とする。
【００９０】
標的化処置の開発を受け入れられるグリオブラストーマ細胞およびグリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）における細胞プロセスを同定する目的で、構造上多様な小分子のライブラリーを用いて表現型のスクリーニングを行い、キニン誘導体であるＮＳＣ１３３１６が、グリオブラストーマ細胞およびＧＳＣの生存性を確かに損ない、マクロピノサイトーシス媒介性細胞死を刺激する、唯一のヒット分子であるという結果となった。ＮＳＣ１３３１６を合成化学的に拡大することにより潜在性の増大した一連の構造類似体が得られ、これらはグリオブラストーマ細胞およびＧＳＣにおいて独特な表現型の応答を誘発することからバクイノール（表１）と命名された。バクイノールは、ナノモル濃度で非アポトーシス細胞死を刺激するが、非アポトーシス細胞死は、膜の小疱形成（blebbing）およびラフリング、細胞の円形化、大量のマクロピノサイトーシス性の空胞蓄積、ＡＴＰ枯渇、ならびに他の細胞型に対して効果を及ぼさずにＧＢＭの前神経の、古典的な、および間葉系のサブクラスのグリオブラストーマ細胞およびＧＳＣの細胞膜の最終的な破壊および細胞溶解を特徴とする。ゲノムワイドのｓｈＲＮＡスクリーニングにより、バクイノールは空胞を誘発するために、および細胞毒性効果を発揮するために、ＭＡＰキナーゼＭＫＫ４を速やかに活性化し、ＭＡＰキナーゼＭＫＫ４に依存的であることが明らかになっている。ｉｎ  ｖｉｖｏの異種移植片モデルは、バクイノール−１の高耐用性およびＧＢＭ腫瘍特異性を実証し（表１、Ｓ１０）、バクイノール−１は経口投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで優れた薬物動態および脳曝露を表し、ゼブラフィッシュおよびマウスモデルにおけるヒトＧＢＭの腫瘍の浸潤および成長を大幅に減弱する。
【００９１】
本発明のバクイノール（化合物（複数可））は、グリオーマブラストーマ細胞において非クラスリン依存性空胞形成を誘発することが示された。クラスリン非依存性エンドサイトーシス、例えばマクロピノサイトーシスは、液相中で、液体、溶質、膜、リガンド、分子、および粒子の非特異的な細胞取込みをもたらす。このメカニズムは、特異的なシグナリング経路を活性化することにより誘発されるが、このシグナリング経路は、原形質膜の動力学における変更、例えば、アクチン動力学における変化に起因する変更をまねく。このタイプのエンドサイトーシスは、崩壊するときに大型で不規則な形状の、液体が充填されたエンドサイトーシス空胞の形成をもたらす、原形質膜のラフリングの結果である。このプロセスの選択的活性化（targeted activation）により、液体の取込みは大量に上昇することができ、このプロセスに粒子の非選択的な取込みが並行する。
【００９２】
根底となるメカニズムによって規定される通り、クラスリン非依存性エンドサイトーシスは、他のエンドサイトーシス経路と区別される。エンドサイトーシスとファゴサイトーシスの両方と異なり、クラスリン非依存性エンドサイトーシスは、活性を調和させるカーゴ／受容体分子の相互作用によって制御されない。代わりに、チロシンキナーゼ受容体、インテグリン、ＧＰＣＲ、または他の細胞表面受容体の活性化は、細胞表面でのアクチン重合の選択的であるが全体的な上昇をまねくことができ、細胞外液体を貪食する遠位縁に近い膜のラフリングがもたらされる（Ｈａｉｇｌｅｒら、１９７９；ＭｅｒｃｅｒおよびＨｅｌｅｎｉｕｓ、２０１２；Ｓｗａｎｓｏｎ、２００８）。よって、ラフリングが歪曲して開くと、細胞表面膜にクレーター様のカップができ、ラフリングが閉鎖した後カップが閉鎖し、空胞が原形質膜から分離される。それゆえ、このメカニズムは、細胞の細胞表面ファクターとの相互作用により、およびこのプロセスを駆動するシグナリング経路の活性化により、高度に制御されている。細胞型の選択性は、したがって極めて高いことがある。このタイプの空胞形成の活性化の結果、その他の場合には不透過性の細胞が易透化する。これは、多くの病原体（すなわち、原生動物、細菌、およびウイルス）のこのメカニズムによる細胞の侵入、ならびに抗原提示細胞、例えば樹状細胞による抗原の捕獲により例証される（Ｍｅｒｃｅｒ  Ｊ．、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ  Ａ．（２０１２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５、４９０〜４９９；Ｐｈｅｙ，Ｌｉｍ；Ｇｌｅｅｓｏｎ，ＰＡ．（２０１１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、８９、８３６〜８４３）。このタイプの空胞形成の根底にある細胞内シグナリング経路は、特異的なタンパク質、例えば、Ｎａ＋／Ｈ＋交換、Ｒｈｏ様ＧＴＰアーゼ（例えば、ＲａｃまたはＣｄｃ４２）、ｐ２１活性化キナーゼＩ（ＰＡＫ１）、ならびにプロテインキナーゼおよびプロテインリパーゼを伴う。マクロピノサイトーシスの過剰刺激は、細胞質内空胞の大量蓄積および非アポトーシス死をもたらし得る。細胞質内空胞形成の起源、メカニズム、および結果は、誘発物質の性質、および空胞が拡大する細胞型に応じて変動する。空胞はしばしば一掃され、よって可逆的であり得る。
【００９３】
マクロピノサイトーシスはＲａｓの活性化を必要とする。様々な癌が、ラット肉腫（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ）遺伝子における変異に関連しており、これらの遺伝子は、増殖刺激に応答して様々な細胞における細胞増殖、成長、および分化のための主要な制御機能を有する小型ＧＴＰアーゼであるＲａｓタンパク質をコードする。恒常的に活性なＲａｓをもたらす変異は、よって、非制御の細胞成長、運動性、および増殖をあおることができる。したがって、過剰活性のＲａｓをもたらす変異は、全てのヒトの癌のおよそ３０％に見出され、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性が、それだけには限定されないが、膵臓、肺、甲状腺、尿路、肺、結腸直腸、唾液、前立腺、腸、皮膚、血液学／リンパ系の悪性腫瘍、および頸部の癌を含めた大多数のヒトの癌において報告されている。バクイノールの効果は、過剰活性のＲａｓまたはＲａｓ／Ｒａｃ経路が存在する他の癌のタイプにも拡張すると考えられている。
【００９４】
腫瘍開始性癌細胞は、他の幹様細胞同様、癌、具体的に、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌、例えばグリオーマ、より具体的にグリオブラストーマ（ここでは多形神経膠芽腫、またはＧＢＭとも呼ぶ）を処置するために、癌の選択的標的化に対する扉を開く、独特の分子の特徴を有する。本発明は、腫瘍細胞および／または癌幹細胞を選択的に死滅させることができ、身体の他の細胞型に対して最小の効果を有する化合物を提供することに関する。より具体的に、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌、例えば、それだけには限定されないが、膵臓、肺、甲状腺、尿路、結腸直腸、唾液、前立腺、腸、皮膚、血液学的／リンパ系悪性腫瘍、グリオーマ、および頸部の癌の処置における、２，４−二置換キノリン誘導体の調製および使用に関する。
【００９５】
さらに、本発明は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性および／または下流のシグナリング経路を有する癌、ならびに具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞に選択的な、新たな非クラスリン依存性空胞形成細胞死のメカニズムの使用にも関する。選択的な空胞形成は、例えば、所望の化合物または物質を癌細胞、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞に選択的に送達するのに、または癌細胞、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞の選択的画像化に用いるための画像化分子を送達するのに用いてもよい。本発明の化合物を、または癌細胞、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞において前記の同じ選択的空胞形成のメカニズムを誘発するあらゆる他の適切な化合物を用いてこの選択的空胞形成を実現してもよい。そのうえ、本発明は、癌、具体的にグリオーマ、特にグリオブラストーマの処置において有効なこのような化合物、および／または前記の癌、具体的にグリオーマ細胞、特にグリオブラストーマ細胞に特異的な空胞形成を誘発する化合物を同定するための新規なゼブラフィッシュのスクリーニングアッセイにも関する。
【００９６】
その結果、本発明の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するのに用いるための、立体異性体および互変異性体を含む、式（Ｉ）の化合物
【００９７】
【化３】
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【００９８】
［式中、
ｍは、１、２、または３であり、
ｑは、０または１であり、
Ｒ1は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；および不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、および複素環、またはヘテロアリールから選択され、各々１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されており、
Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、または
Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接の原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、および１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ6は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ7は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ハロゲン、アルキルアミノ、およびＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択され、
Ｒ8は、ＨおよびＣ１〜Ｃ３アルキルから選択され、
Ｒ9は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヘテロ芳香族、またはフェニルである］
あるいは式（Ｉ）の化合物（複数可）の薬学的に許容される塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグである。例えば、式Ｉの化合物はメフロキンではない。例えば、Ｒ２は無置換のピリジルではない。
【００９９】
例えば、本発明は、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３の化合物から選択される、式Ｉの化合物に関する。
【０１００】
例えば、本発明は、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、およびＳ２９の化合物から選択される式Ｉの化合物に関する。
【０１０１】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ｍが１または２である式Ｉの化合物である。
【０１０２】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ｑが０である式Ｉの化合物である。
【０１０３】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ｍが２であり、ｑが０である式Ｉの化合物である。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、Ｒ２が不飽和または飽和、単環式または多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環である式Ｉの化合物である。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、Ｒ２がフェニルである式Ｉの化合物である。
【０１０６】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、Ｒ２がヘテロアリールである式Ｉの化合物である。
【０１０７】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、Ｒ２が無置換のピリジルではない式Ｉの化合物である。
【０１０８】
いくつかの態様において、本発明は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、およびＳ２９から選択される化合物の使用に関する。
【０１０９】
本発明のさらなる一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオーマを処置するための使用に関する。
【０１１０】
本発明のさらなる一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオブラストーマを処置するための使用に関する。
【０１１１】
さらに別の一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための薬物の製造における使用に関する。
【０１１２】
さらに別の一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオーマを処置するための薬物の製造における使用に関する。
【０１１３】
さらに別の一側面は、立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグの、グリオブラストーマを処置するための薬物の製造における使用に関する。
【０１１４】
さらに別の一側面は改変されたＲａｓ／Ｒａｃに関連する癌を処置するための方法であり、ここで上記に規定する立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを、このような処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【０１１５】
さらに別の一側面はグリオーマを処置するための方法であり、ここで上記に規定する立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを、このような処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【０１１６】
さらに別の一側面はグリオブラストーマを処置するための方法であり、ここで上記に規定する立体異性体および互変異性体を含む式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを、このような処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【０１１７】
本発明のある種の態様に従って、ここに記載する方法および使用において用いる、実質的に全ての本発明の組成物は、ＲＳエナンチオマーである。ほんの少量のＳＲ（またはあらゆる他の）エナンチオマーが存在する。本発明の組成物のＲＳエナンチオマーは、ＳＲエナンチオマーまたはＲＳ／ＳＲラセミ混合物よりも治療上有効であるため、これは有利である。特定の態様において、生成される本発明の組成物には、重量で５％未満のＳＲエナンチオマーが存在する。他の特定の態様において、生成される本発明の組成物には、重量で４、３、２、または１％未満のＳＲエナンチオマーが存在する。好ましい一態様において、本発明の組成物には、重量で２％未満のＳＲエナンチオマーが存在する。より好ましい一態様において、本発明の組成物には、重量で１％未満のＳＲエナンチオマーが存在する。
【０１１８】
本発明は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む組成物も提供する。組成物は、９０％を超え、９５％を超え、または９９％を超える（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【０１１９】
いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【０１２０】
本発明は、１％未満の、０．７％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、キラル的に精製された（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールも提供する。
【０１２１】
本発明は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む組成物も提供する。組成物は、９０％を超え、９５％を超え、または９９％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【０１２２】
本発明は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む組成物も提供する。組成物は、９０％を超え、９５％を超え、または９９％を超える（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【０１２３】
いくつかの態様において、組成物は、１％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、および／または（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含むことができる。
【０１２４】
本発明は、１％未満の、０．７％未満の、０．５％未満の、または０．１％未満の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む、キラル的に精製された（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールも提供する。
【０１２５】
本発明の別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置において用いるための、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物である。
【０１２６】
本発明のさらなる一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオーマを処置するための使用に関する。
【０１２７】
本発明のさらなる一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオブラストーマを処置するための使用に関する。
【０１２８】
さらに別の一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための薬物の製造における使用である。
【０１２９】
さらに別の一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【０１３０】
さらに別の一側面は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオブラストーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【０１３１】
さらに別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃに関連する癌を処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【０１３２】
さらに別の一側面は、グリオーマを処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【０１３３】
さらに別の一側面は、グリオブラストーマを処置するための方法であり、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【０１３４】
本発明の別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌の処置における使用のための、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物である。
【０１３５】
本発明のさらなる一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物のグリオーマの処置における使用に関する。
【０１３６】
本発明のさらなる一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物のグリオブラストーマを処置するための使用に関する。
【０１３７】
さらに別の一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌を処置するための薬物の製造における使用である。
【０１３８】
さらに別の一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【０１３９】
さらに別の一側面は、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物の、グリオブラストーマを処置するための薬物の製造における使用である。
【０１４０】
さらに別の一側面は、改変されたＲａｓ／Ｒａｃに関連する癌を処置するための方法であり、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【０１４１】
さらに別の一側面は、グリオーマを処置するための方法であり、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【０１４２】
さらに別の一側面は、グリオブラストーマを処置するための方法であり、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグ、あるいは（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む組成物を、このような処置を必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与する。
【０１４３】
本発明は、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールおよび（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノールを調製するための方法も提供する。合成は、例えば、Ｌｅｏｎの修飾であってもよい（Ｌｅｏｎ，Ｂ．ら（２０１３）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５（６）、１２３４〜７）。
【０１４４】
簡潔に述べると、メチル化されている（Ｓ）−Ｌ−ピペコリン酸をトリチル化することにより、２，４−ジブロモキノリンから産生されたグリニヤール試薬による面選択的付加に適する、キラルのピペリジンカルボアルデヒド材料を産生する可能性がもたらされる。次いで、単一の単離されたＲ，Ｓ異性体を、好適な４−クロロフェニルボロン酸の鈴木カップリング反応にかけ、このトリチル基を同時に脱保護した後、所望の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールが得られる。
【０１４５】
例えば、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールは、（Ｓ）−Ｌ−ピペコリン酸を塩化チオニルで、対応するエステルに、例えばメチル（２Ｓ）−１−ピペリジン−２−カルボキシレートに変換し、引き続きメタノール、またはキラルのカルボキシレートを形成させるのに適する他の試薬で処理することにより、いくつかの工程において産生される。次いで、中間体のエステルを、適切な保護基、例えばトリチル基で保護して、窒素保護されているカルボキシレート、例えばメチル（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボキシレートを形成させ、次いでこれを、例えば、適切な試薬、例えばＬｉＡｌＨ4で還元することにより、対応するアルコールに変換する。
【０１４６】
次いで、［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノールを、適切な酸化剤、例えば塩化オキサリルと反応させることにより（例えば、Ｓｗｅｒｎ酸化）対応するアルデヒドに変換し、得られた（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボアルデヒドを、次いで、好適な試薬、例えば２，４−ジブロモキノリンからインサイチューで産生された面選択的なグリニヤール試薬と反応させて、単一のＲ，Ｓ異性体である、（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノールを得る。次いで、このブロモ化合物を好適なフェニルボロン酸（例えば、４−クロロフェニルボロン酸）との鈴木カップリングにかけて、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノールを得、このＮ−保護基（例えば、トリチル）を除去した後、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールが生成される。
【０１４７】
好ましくは、生成された（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールは、１％未満、０．７％未満、０．５％未満、または０．１％未満の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを含む。
【０１４８】
図１に示す通り、ＧＳＣの周期（cycling）に対するバクイノールの効果は（図１Ａ、Ｂ）、バクイノール−１が、培養したＧＳＣの速やかかつ選択的な死滅を誘発すること、およびバクイノール−１は細胞密度による影響をわずかに受ける（図１Ｃ）ことを指摘する。バクイノール−１はＴＭＺよりはるかに優れた有効性を有し（図１Ｅ）、ｍＧｌｉａおよび線維芽細胞同様ＧＳＣに対して選択的であり、他の細胞型はＧＳＣよりも高濃度で毒性を表す。さらに、他の細胞型における毒性は、ＧＳＣの死滅を引き起こす空胞形成と無関係である。
【０１４９】
バクイノール−１による非アポトーシス死の誘発を示す図２に示す通り、バクイノール−１によるカスパーゼ活性化の非存在はスタウロスポリンに比べて明白であり、スタウロスポリンは、知られているアポトーシス誘発物質であり、アポトーシス死の速やかで顕著な増大をまねく。
【０１５０】
図３は、バクイノール−１で５分から２６時間処理したＧＳＣのウエスタンブロット分析を示す。これらのデータは、Ｐ−ＭＫＫ４の速やかな増大、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の阻害効果の喪失を指摘する。
【０１５１】
ヒトＧＳＣ（１０００００個）を免疫欠損マウスに移植し、発達させて末期にし（６週）、その後バクイノール−１  １（１５μＭ、０．５μＬ／時間）を注入によって脳中に１週間投与した。バクイノール−１処置したマウスにおける腫瘍サイズの顕著な低減および壊死領域の減弱を、図４Ａ、Ｂに示す（マウス脳の免疫組織化学染色画像）。統計学的分析による定量によりこれらの結果が確認される（図４ＣおよびＤ、ｎ＝６匹／群）。これらのデータは、マウスにおけるグリオブラストーマのヒトモデルにおける末期の腫瘍発達の効果的な低減を説明するものである。免疫組織学的染色を、ＤＭＳＯ（Ａ）またはバクイノール−１（Ｂ）で処置したＧＳＣ異種移植した脳に対して、抗ヒトＧＦＡＰ抗体で行った。ＧＦＡＰ陽性（Ｃ）および壊死領域（Ｄ）の定量。
【０１５２】
図５に示す通り、バクイノール−１の個々の異性体を立体選択的に合成すると、特質的な薬理学的活性が観察され、Ｒ，ＳおよびＳ，Ｒ異性体は、Ｒ，ＲおよびＳ，Ｓ異性体に比べて優れたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示すことが指摘された。バクイノール−１（ラセミ体）、バクイノール−１ＲＳ、およびバクイノール−１ＳＲの薬物動態を、ＮＭＲＩ（ＳＲ／ＲＳ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｖｒａｃ）マウスにおいて、２または２０ｍｇ／ｋｇのバクイノール−１をそれぞれ単一静脈内（ｉ．ｖ．）または経口（ｐ．ｏ．）投与した後に決定した。血液および脳試料を以下の名目上の時間点に動物から採取した：投薬後１５、３０、および６０分、ならびに２、４、６、８、２４、４８、７２、および１４４時間（ｎ＝３／時間点あたり）。バクイノール−１の生物分析上の定量を、血漿および脳試料において、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。ここに記載するデータは、対応するＳＲ異性体または以前に記載されている立体異性体混合物（バクイノール−１、ＮＳＣ１３３１６）に比して優れたバクイノール−１ＲＳの脳曝露と、一方で化合物の全身曝露を最小にすることを実証するものである。例１１、図６を参照されたい。理論に拘泥しようとするものではないが、グリオーマは症候学的にＣＮＳに限定され、優先的に脳曝露される化合物は臨床的に効果的である可能性が高く、全身性の副作用の危険性が低い。
【０１５３】
抗マラリアのキノリンメタノールメフロキンである、
【０１５４】
【化４】
2016534129.tif 000006
【０１５５】
（（２，８−ビス（トリフルオロメチル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール）は、アポトーシスを活性化し、自己貪食を阻害することによりグリオーマ細胞の生存性を低減することが提唱されている（Ｇｅｎｇ，Ｙ．ら（２０１０）Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１２（５）、４７３〜８１）。研究により、メフロキンは１０マイクロモルの濃度で、Ｕ８７グリオーマ細胞の生存性の大まかに５０％の低減をもたらすことが指摘されているが、適切な用量反応評価はなされておらず、化合物があらゆる濃度で全てのグリオーマ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させることを指摘するデータは表されていない。バクイノール−１は、対照的に、代替のメカニズムであるマクロピノサイトーシスの過剰活性化により、比較上の濃度で細胞培養物の完全な死滅をもたらす。加えて、バクイノール−１の効果は、カスパーゼ（アポトーシス）依存的でもなく、自己貪食性の空胞の顕著な蓄積ももたらさない。よって、メフロキンのグリオーマ毒性効果が、バクイノールの一連の化合物に拡張することは予想外である。例１２および図７におけるデータは、両化合物が線維芽細胞に対して比較上の細胞毒性を表す一方、メフロキンは試験した極めて高い濃度でのみグリオーマ細胞を全て死滅させることを実証するものである。細胞死に対する比較上のＩＣ９５値は、バクイノール−１ＲＳ＝８．９μＭであり、メフロキン＝２５．２μＭである。抵抗性および腫瘍の再発の発生を避けるために、全ての癌細胞を完全に枯渇させることが有効な癌治療の決定的な構成要素であるため、このデータは、この点でバクイノール−１ＲＳの優位性を示すものである。
【０１５６】
さらに、高濃度（＞１０μＭ）のメフロキンは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および非ホジキンリンパ腫の生存性を低下させることが示されたが、メフロキンの神経学的な癌に対する効果に対するデータは表されていない（ＵＳ２００３／０２１６４２６）。癌は、病態生理学的に、病因的に、および遺伝学的ベースの両方において極めて可変的であるため、ＣＬＬおよびリンパ腫からグリオーマへの治療法の拡張は直感的でもなく、明白でもない。
【０１５７】
ヒト患者由来のグリオーマブラストーマ細胞の、非クラスリン依存性空胞形成に対する予想外の選択的脆弱性により、この選択性を利用する本発明の方法論が可能になる。グリオブラストーマ細胞と他のグリオーマ細胞との間には類似性があるため、このメカニズムは全タイプのグリオーマ細胞に存在し得、よってバクイノールは、全タイプのグリオーマ細胞および異常なＲａｓ／Ｒａｃ活性を有する他の癌細胞において空胞形成を誘発する。
【０１５８】
よって、他の細胞型に影響を及ぼさずに癌細胞を特異的に標的化する、新たな一連の構造類似体（バクイノール）が同定された。本発明の化合物は、グリオブラストーマ細胞における非クラスリン依存性空胞形成を誘発し、非アポトーシス性のメカニズムによって細胞死をもたらすことが示された。グリオブラストーマ細胞と他のグリオーマ細胞との間には類似性があるため、このメカニズムは全タイプのグリオーマ細胞に存在し、よってバクイノールは全タイプのグリオーマ細胞において空胞形成を誘発すると考えられる。マクロピノサイトーシスの、過剰活性または過剰発現性のＲａｓ／Ｒａｃに対する知られている依存性のため、この脆弱性は、Ｒａｓ／Ｒａｃ活性における改変に関連する他の形態の癌にも拡張する可能性がある。これらの類似体は、癌、具体的に、前神経の、古典的な、および間葉系のグリオブラストーマを含めたグレードＩ〜ＩＶのグリオーマを標的化する新たな処置および治療法に対する扉を開くものである。また、グリオーマ、例えばグリオブラストーマを処置するためのこのような化合物／類似体を同定するための新たなゼブラフィッシュベースのアッセイを、本発明の一部として開示する。例えば、その全文が参照によってここに具体的に援用される、Ｋｉｔａｍｂｉら、Ｃｅｌｌ、１５７、１〜１６、２０１４を参照されたい。
【０１５９】
グリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞における空胞形成を誘発する、本発明の化合物、または他の同様の化合物を用いて、ある種の所望の物質を選択的にグリオーマ細胞に送達することを実現し得る。これらの物質は、疾患を処置するための治療用物質であってよく、またはこれらは例えば、グリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞を選択的に画像化するための、画像化分子、例えばコントラスト分子であってもよい。より詳細には、このような新規な取組みを、グリオーマ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで死滅させ得る、治療用ＤＮＡ、遺伝子生成物、抗体、細胞浸潤性ペプチド、ナノ粒子、または他の薬剤を標的化送達するのに利用することができる。例えば、本発明の化合物（複数可）を、その他の点では非選択性の細胞毒性化合物、例えばテモゾロミドの選択性を改善するのに用いてもよい。したがって、空胞形成の選択的プロセスは、実験上または確立された治療薬剤の、腫瘍サイズを低減し、もしくは腫瘍細胞を死滅させるための、または可視化のための、腫瘍標的化の様式における送達をもたらす。
【０１６０】
本発明の有用性を以下に例示するが、例えば、ある範囲の小型の巨大分子を、このクラスリン非依存性空胞形成によって細胞に標的化することができる。ここに記載する化合物は、細胞浸潤性ペプチドを送達する効率に寄与し得る。Ｋａｐｌａｎ，ＩＭ；Ｗａｄｉａ，ＪＳ；Ｄｏｗｄｙ，ＳＦ．、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＴＡＴ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｎｔｅｒｓ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．」、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００５）、１０２、２４７〜２５３；Ｊｏｎｅｓ  ＡＴ、「Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ：ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．」、Ｊ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ（２００７）、１１、６７０〜６８４）
さらに、ここに記載する化合物は、プリオンタンパク質を含めたインタクトなタンパク質の取込みを媒介し得る。Ｍａｇｚｏｕｂ，Ｍ；Ｓａｎｄｇｒｅｎ  Ｓ；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｐ；Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ａら、「Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（２００６）、３４８、３７９〜３８５。Ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｈ、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｓ；Ｗｅｉ，ＦＹら、「ＢＥＴＡ２／ＮｅｕｒｏＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００５、５４、２８５９〜２８６６。Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ＫＰ；Ｄａｌｙ，ＮＬ；Ｂｒｏｗｎ，ＤＬ；Ｓｔｏｗ  ＪＬら、「Ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｃｙｓｔｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＣｏＴＩ−ＩＩ  ｉｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００７）、３９、２２５２〜２２６４．Ｋｈｅｌｅｆ，Ｎ；Ｇｏｕｎｏｎ，Ｐ；Ｇｕｉｓｏ，Ｎ；「Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｉｎｔｏ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．」、Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００１）、３、７２１〜７３０．Ｐｏｕｓｓｉｎ，Ｃ；Ｆｏｔｉ，Ｍ；Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，ＪＬ；Ｐｕｇｉｎ，Ｊ．「ＣＤ１４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）、２７３、２０２８５〜２０２９１。
【０１６１】
ここに記載する化合物は、ＤＮＡの細胞内取込みを媒介し得る。Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ａ、Ｓａｎｄｇｒｅｎ  Ｓ、Ｌｉｌｊａ  Ｊ、Ｂｒａｔｔ、Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，Ｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００７）、２８２、２７８９７〜２７９０４。
【０１６２】
ここに記載する化合物は、小分子のルシファーイエローおよび高分子量のデキストランの細胞内取込みを標的化し得る。Ｚａｎｄｇｒｅｎ，ＫＪ；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｊ；Ｍｉｒａｎｄａ−Ｓａｋｓｅｎａ，Ｍら、「Ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．」、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．（２０１０）、６（４）、ｅ１０００８６６。Ｃｏｍｍｉｓｓｏ，Ｃ；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＳＭ；Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ，ＪＪ：Ｇｒａｂｏｃｋａ，Ｅ．ら、「Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｐｐｌｙ  ｒｏｕｔｅ  ｉｎ  Ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ（２０１３）４９７、６３３〜６３７。
【０１６３】
ここに記載する化合物は、操作されたナノ粒子およびウイルス様粒子の取込みも標的化し得る。Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＳＭ、Ｍｏｒａｎ  ＫＡ、Ｓｌｏｓａｒ  ＪＬ．ら、「Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ  ｂｙ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ（２００８）、８７、４１８〜４２８。Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ，Ｌ；Ｔｏｒｎｅｓｅｌｌｏ，ＭＬ；Ｔａｇｌｉａｍｏｎｔｅ，Ｍ；Ｇａｌｌｏ，ＲＣら、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００６）、８０、９１３４〜９１４３。
【０１６４】
ここに記載する化合物は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、ならびにコントラスト分子の標的化結合または取込み時に改善され得る他の画像化方法でも有用であり得る。非クラスリン依存性エンドサイトーシス、例えばマクロピノサイトーシスの非選択的取込みプロセスは、（Ｋｅｒｒ，ＭＣ；Ｔｅａｓｄａｌｅ，ＲＤ；「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．」、Ｔｒａｆｆｉｃ（２００９）、１０、３６４〜３７１）、誘発された空胞形成の細胞の選択性に基づく標的化送達、例えば本発明に記載されているものに対する扉を開くものである。
【０１６５】
よって、これは小型から大型の範囲の巨大分子の、細胞外環境から細胞の原形質への送達に対する主要なメカニズムを代表する。したがって、グリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞において、経路における細胞外または細胞内の構成要素を選択的に標的化することによる非クラスリン依存性空胞形成の変調は、小型から大型の範囲の分子の治療薬剤を送達するための標的化戦略をまねくことができ、グリオーマ組織および細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化された可視化に用いることができる。
【０１６６】
本発明のさらなる一側面は、脳腫瘍に対して活性な化合物を同定するのに用いる新規なスクリーニングツールである。本発明の新規なアッセイにより、このような化合物をｉｎ  ｖｉｖｏの設定において速やかに評価できるようになり、特徴、例えば、ゼブラフィッシュおよび移植された細胞に対する化合物の急性／慢性の毒性効果、移植された細胞の増殖、ならびに脳実質中への細胞の遊走、ゼブラフィッシュ組織中への化合物の浸潤を全て並行して評価してもよい。これらの特徴により、本発明の異種移植モデルは、齧歯動物モデルにおいて引き続き評価する化合物の数を減少させる、強力なツールになる。ゼブラフィッシュのスクリーニングアッセイは、以下の通り行う：
ゼブラフィッシュの１細胞段階の胚（接合体）をＭＩＴＦａモルホリノと注射して（Ｌｉｓｔｅｒ，ＪＡら、「Ｎａｃｒｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒａｌ−ｃｒｅｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ．」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．（１９９９）、１２６（１７）：３７５７〜６７）、色素沈着を妨げる。色素沈着を妨げて、発達中の胚のあらゆる表現型が容易に可視化できるようになる。これは、１細胞段階の胚にＭＩＴＦａモルホリノを注射することにより、または０．００３％フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）（タンク水１Ｌ中０．００３％１−フェニル−２−チオ尿素＝最終濃度６０μｇ／ｍｌ）を胚に加えることにより何れかで、実現することができる。胚をインキュベータで２日間成長させ、その後収集し、トリカインを用いて麻酔し、ペトリ皿でアガロース（低融点）中に包埋する。
【０１６７】
トリカイン（３−アミノ安息香酸エチルエステル、エチル３−アミノベンゾエートとも呼ばれる）を、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号Ａ−５０４０）から粉末形態で入手する。これはＡｒｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩｎｃからＦｉｎｑｕｅｌ（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｃ−ＦＩＮＱ−ＵＥ）としても入手できる。トリカイン溶液を、スクリューキャップ付きガラス壜中で以下を合わせることにより、サカナの麻酔用に作製する：トリカイン粉末４００ｍｇ、ＤＤ水９７．９ｍｌ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）約２．１ｍｌ。ｐＨを約７に調節する。この溶液を冷凍室に貯蔵する（トリカインが古くなるため、できるだけ少量を購入する）。トリカインを麻酔として用いるために、以下：トリカイン溶液４．２ｍｌおよび清浄タンク水約１００ｍｌを２５０ｍｌビーカー中で合わせる。包埋後、アガロースを固化させ、新鮮なトリカイン１０ｍｌをペトリ皿に加える。ペトリ皿を顕微鏡下に配置し、マイクロインジェクション針にグリオーマ細胞を充填し、各注入が、細胞およそ３０００個を含む液体およそ２０〜５０ｎｌを放出するようにマイクロインジェクターの圧力を較正する。細胞を、脳室中に手操作で注射し、次いで胚を顕微鏡下で観察し、誤って注射した胚を除去する。注射した胚の残りを新たな皿に取り、トリカイン処理したタンク水を除去し、正常なタンク水で置きかえ、動物を３〜４時間回復させる。３〜４時間後、動物を肉眼で点検して泳いでいることをチェックし、次いで動物をマルチウエルプレート（胚３個／９６ウエルプレート（１ウエルあたり体積３００μｌ）、胚６個／６ウエルプレート（１ウエルあたり体積１ｍｌ））に分配する。次いで、必要とされる濃度の薬物をプレートに加える。薬物処理したタンク水を毎日交換し、魚に対する効果を手操作でモニタリングする。３〜４時間で、およそ５００個の胚にグリオーマ幹細胞、またはグリオーマ細胞を注射することができる。したがって、この迅速で効率的な新たなスクリーニング方法により、多くの新薬候補を、グリオブラストーマまたはグリオーマの処置に対して評価することができる。
【０１６８】
ここに記載するゼブラフィッシュのスクリーニングアッセイは、グリオーマ、特に難治性のグリオブラストーマの選択的な処置に効果的な化合物を同定するのに用いられており、本発明の一側面は、このような癌の治療法におけるこれらの化合物の使用である。グリオーマ細胞に選択的な、新たな空胞形成のメカニズムも決定されており、これを用いてさらに感受性の形態の癌に、および、例えば、治療法または画像化方法において用いるための所望の化合物／分子（例えば、カーゴ化合物）を選択的に送達してもよい。
【０１６９】
本発明の目的では、単独の、またはラジカルの一部としての何れかの「アルキル」の語には、一般式ＣnＨ2n+1の、直鎖または分枝鎖のアルキルが含まれる。
【０１７０】
ｍとｎの両方が整数であり、ｍ＞ｎである「Ｃｍ〜Ｃｎアルキル」の語は、炭素原子ｍからｎ個を有するアルキルを意味する。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、およびイソプロピルが含まれる。
【０１７１】
本発明の目的では、別段の特定がなく、または文脈から明らかでなければ、「ハロゲン」の語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ；好ましくはＦ、Ｃｌ、およびＢｒ；特にＦおよびＣｌを意味する。
【０１７２】
「アルコキシ」の語は、式−ＯＲのラジカルを意味し、式中、Ｒは、ここで規定するアルキル部分である。
【０１７３】
「アルキルアミノ」の語は、式−ＲＮＨＲ1Ｒ2のラジカルを意味し、式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2はここで規定するアルキル部分である。
【０１７４】
「炭素環」の語は、環に炭素のみ（Ｃ、ＣＨ、またはＣＨ2）を含む環状部分を意味する。
【０１７５】
「ヘテロアリール」の語は、炭素、およびＮ、Ｏ、またはＳから選択される１つ以上の原子を環に含む環状部分を意味する。
【０１７６】
「多環式」の語は、例えば、融合または架橋されている環を意味する。
【０１７７】
不飽和環状部分は、芳香族または非芳香族の何れかであってもよく、１つまたはいくつかの二重結合または三重結合を環に含んでもよい。
【０１７８】
「任意の」または「任意に」は、引き続き記載されるイベントまたは状況が生じてもよいが、必ず生じる必要はなく、記述が、イベントまたは状況が生じる場合、および生じない場合を含むことを意味する。
【０１７９】
特定される立体配置を有する、本発明の化合物におけるあらゆるキラル中心は、よく知られているＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇの順位則を用いてＲまたはＳと示される。また、あらゆる構造式において、特定される立体配置を有するキラル中心（すなわち、ＲまたはＳ）は、Ｒに対する結合が紙面から出て読者の側に向かうことを示す
【０１８０】
【化５】
2016534129.tif 000007
【０１８１】
、およびＲに対する結合が紙面から出て読者から離れた方に向かうことを示す
【０１８２】
【化６】
2016534129.tif 000008
【０１８３】
を用いて示してもよい。本明細書で用いる「化合物」は、その化合物に対して具体的なテキスト内に別段の特定がなければ、その立体異性体および互変異性体、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和化合物、水和物、複合体、エステル、プロドラッグ、および／もしくはプロドラッグの塩を含めた化合物自体を意味する。ただし、例えば、所与の位置の（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を指摘することにより別段の指摘がある場合、混合物、または純粋もしくは実質的に純粋な形態の何れかにおける、本発明の化合物の立体異性体全てが企図される。その結果、本発明の化合物は、エナンチオマーもしくはラセミ体もしくはジアステレオマーの形態において、またはそれらの混合物として存在してもよい。調製のためのプロセスは、ラセミ体またはエナンチオマーを出発材料として利用することができる。ラセミ体またはジアステレオマーの生成物を調製する場合、これらは、例えば、クロマトグラフィーまたは分別再結晶である、従来の方法によって分離することができる。
【０１８４】
「溶媒和化合物」の語は、例えば、式（Ｉ）の化合物および溶媒により形成される、変動性の化学量論の複合体を意味する。溶媒は、溶質の生物学的活性を妨害してはならない、薬学的に許容される溶媒、例えば水である。
【０１８５】
本発明のいくつかの化合物は、本発明の範囲内にやはり包含されるものとされる互変異性型において存在することができる。「互変異性体」は、その構造が、原子の配列において顕著に異なるが、容易かつ迅速な平衡状態において存在する化合物を意味する。本発明の化合物は異なる互変異性体として描写してもよいことを理解されたい。化合物が互変異性型を有する場合、全ての互変異性型が本発明の範囲内であるものとされ、化合物の名称はいかなる互変異性型を排除しないことも理解されたい。
【０１８６】
本発明の化合物、塩、およびプロドラッグは、いくつかの互変異性型において存在することができ、このような互変異性型が本発明の範囲内に含まれる。互変異性体は、溶液中互変異性体のセットの混合物として存在する。固体形態では、通常１つの互変異性体が優勢である。１つの互変異性体を記載することがあっても、本発明は、本発明の化合物の全ての互変異性体を含む。
【０１８７】
本明細書で用いる「塩」、例えば、薬学的に許容される塩の語は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫化水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、および酒石酸塩を含めた酸付加塩；アルカリ金属陽イオン、例えば、Ｎａ+、Ｋ+、Ｌｉ+、アルカリ土類金属塩、例えば、Ｍｇ2+もしくはＣａ2+、または有機アミン塩を含むことができる。
【０１８８】
「薬学的に許容される塩」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなく、ヒトの組織および下等動物の組織と接触させて用いるのに適し、理にかなった損益比で釣り合っている塩を意味する。薬学的に許容される塩は当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９７７、６６：１〜１９において薬学的に許容されるを詳細に記載している。塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にインサイチューで、または遊離塩基の官能基を適切な有機酸と反応させることにより別々に、調製することができる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩（digluconate）、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩（heptonate）、ヘキサノエート、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩（lactobionate）、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（pectinate）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩（undecanoate）、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、および非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミン陽イオンが含まれ、それだけには限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが含まれる。
【０１８９】
薬学的に許容される塩には、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸と形成される酸付加塩；または有機酸、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシナフトエ酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、２−ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、サリチル酸、コハク酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリメチル酢酸と形成される酸付加塩；または親化合物に存在する酸プロトンの何れかが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンによって置きかえられる場合に形成される塩；または有機もしくは無機の塩基との配位が含まれる。許容される有機塩基には、例えば、ジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエタノールアミン、およびトロメタミンが含まれる。許容される無機塩基には、例えば、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムが含まれる。
【０１９０】
本発明の目的で、「薬学的に許容される」は、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にも、その他の点でも望ましくないことがない医薬組成物を調製するのに有用であることを意味し、獣医学上およびヒトの薬剤上の使用に許容されるものを含む。
【０１９１】
少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、例えば、補助剤、希釈剤、または担体と混合した、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグを含む医薬組成物もここに提供する。
【０１９２】
「有効量」の語は、処置する患者に対して治療効果を付与する化合物の量を意味する。効果は客観的でも（すなわち、何らかの試験もしくはマーカーによって測定可能である）、または主観的でも（すなわち、対象に効果の徴候または感触をもたらす）よい。
【０１９３】
ここに記載し、請求する本発明に従って化合物を調合する上で用いるための薬学的に許容される賦形剤は、例えば、ビヒクル、補助剤、担体、または希釈剤であり、これらは当業者にはよく知られている。ここに請求し、開示する化合物を調合する上で有用な製薬上の賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）に見出される。
【０１９４】
ここで用いる「代謝産物」の語は、本発明の化合物、またはｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の前記化合物に同様の活性を表す、薬学的に許容されるその塩、多形、もしくは溶媒和化合物の代謝の生成物を意味する。
【０１９５】
ここで用いる「混合する」の語は、合わせる、ブレンドする、撹拌する、振盪する、回旋する、または扇動することを意味する。「撹拌する」の語は、混合する、振盪する、扇動する、または回旋することを意味する。「扇動する」の語は、混合する、振盪する、撹拌する、または回旋することを意味する。
【０１９６】
「プロドラッグ」の語は、対象の身体内の代謝または加水分解のプロセスによって、本発明の範囲内の式を有する有効薬剤に変換されるあらゆる化合物を含むものとされる。適切なプロドラッグを選択および調製するための慣例的な手順は、例えば、その全文が参照によってここに援用される、Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｓｌｏａｎｅ，Ｋ．Ｂ．編集；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２に記載されている。本発明の化合物は、プロドラッグ、例えば薬学的に許容されるプロドラッグとして調製することもできる。「プロ−ドラッグ」および「プロドラッグ」の語はここで交換可能に用いられ、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性な親薬物を放出するあらゆる化合物を意味する。プロドラッグは医薬品の多数の望ましい質（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、製造性など）を増強することが知られているので、本発明の化合物はプロドラッグ形態において送達することができる。よって、本発明は、本願で特許請求される化合物のプロドラッグ、それを送達する方法、およびそれを含む組成物を網羅するものとされる。「プロドラッグ」の語には、１つ以上のプロ−部分、例えば、アミノ酸部分または他の水溶性化（water-solubilizing）部分に共有結合的に連結されている本発明の化合物が含まれる。本発明の化合物は、加水分解、酸化、および／または酵素による放出のメカニズムによって、プロ−部分から放出されてもよい。一態様において、本発明のプロドラッグ組成物は、水溶性の増大、安定性の改善、および薬物動態プロファイルの改善の付加利益を表す。プロ−部分を、所望のプロドラッグの性質を得るように選択してもよい。例えば、プロ−部分、例えば、アミノ酸部分、または他の水溶性部分、例えばホスフェートを、溶解性、安定性、バイオアベイラビリティ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏの送達もしくは取込みに基づいて選択してもよい。「プロドラッグ」の語は、このようなプロドラッグを対象に投与した場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の活性な親薬物を放出する、共有結合しているあらゆる担体を含むものともされる。本発明のプロドラッグは、親化合物に対して、ルーチンの操作またはｉｎ  ｖｉｖｏの何れかで修飾を切断するような方法で、化合物に存在する官能基を修飾することによって調製する。プロドラッグには本発明の化合物が含まれ、本発明の化合物では、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはカルボニル基があらゆる基に結合しており、これらの基はｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて、それぞれ遊離のヒドロキシル、遊離のアミノ、遊離のスルフヒドリル、遊離のカルボキシ、または遊離のカルボニル基を形成してもよい。
【０１９７】
プロドラッグの例には、それだけには限定されないが、エステル（例えば、アセテート、ジアルキルアミノアセテート、ホルメート、ホスフェート、サルフェート、およびベンゾエート誘導体）、ならびにヒドロキシ官能基のカーバメート（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）、カルボキシル官能基のエステル基（例えば、エチルエステル、モルホリノエタノールエステル）、Ｎ−アシル誘導体（例えば、Ｎ−アセチル）Ｎ−マンニッヒ塩基、シッフ塩基、およびアミノ官能基のエナミノン、式Ｉの化合物におけるケトンおよびアルデヒド官能基のオキシム、アセタール、ケタール、およびエノールエステルなどが含まれ、Ｂｕｎｄｅｇａａｒｄ，Ｈ．、「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」、ｐ１〜９２、Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）を参照されたい。
【０１９８】
バクイノールは元来キラル中心を２つ含んでいるので、表１において評価する化合物は、（Ｒ，Ｓ）、（Ｓ，Ｒ）、（Ｒ，Ｒ）、および（Ｓ，Ｓ）異性体を含む、４つの立体異性体として存在する。バクイノール−１（表１、Ｓ１０）の個々の立体異性体をキラル分離し、Ｘ線結晶回折およびＮＭＲ分析を用いて絶対立体化学に割り当てると、（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）異性体（表１、それぞれＳ２０およびＳ２１）は（Ｓ，Ｓ）および（Ｒ，Ｒ）（表１、それぞれＳ２２およびＳ２３）異性体よりも優れた活性を表すことが見出された（図５）。
【０１９９】
本発明の化合物は、本明細書に開示する合成経路に従って、または文献から知られている合成方法を適用して調製してもよい。
【０２００】
式（Ｉ）の化合物において、
【０２０１】
【化７】
2016534129.tif 000009
【０２０２】
ここで上記に記載した通り、ｍは１または２であり、ｑは０または１である。
【０２０３】
いくつかの態様において、ｑは０であり、すなわち本発明の化合物は式（Ｉａ）によって表してもよい。
【０２０４】
【化８】
2016534129.tif 000010
【０２０５】
他の態様において、ｑは１であり、すなわち、本発明の化合物は式（Ｉｂ）によって表してもよい。
【０２０６】
【化９】
2016534129.tif 000011
【０２０７】
いくつかの態様において、ｍは１であり、すなわち、本発明の化合物は式（Ｉｃ）によって表してもよい。
【０２０８】
【化１０】
2016534129.tif 000012
【０２０９】
他の態様において、ｍは２であり、すなわち、本発明の化合物は式（Ｉｄ）によって表してもよい。
【０２１０】
【化１１】
2016534129.tif 000013
【０２１１】
いくつかの特定の態様において、ｑは０であり、ｍは２である。
【０２１２】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1はＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ1はＨまたはメチルである。
【０２１３】
いくつかの態様において、Ｒ1はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、例えば、Ｒ1はメチルである。
【０２１４】
他の態様において、Ｒ1はＨであり、すなわち、本発明の化合物は式（Ｉｅ）によって表してもよい。
【０２１５】
【化１２】
2016534129.tif 000014
【０２１６】
好ましい一態様において、−ＯＲ1は適切なプロドラッグエステル、ホスフェートエステル、スルホネートエステル、水和物、アセタール、ヘミアセタール、またはあらゆる他の加水分解可能な、もしくは酵素により加水分解可能な基であり、基は細胞内で切断される。
【０２１７】
例えば、Ｒ1はＣ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）−、例えば、アセチル、プロピオニル、もしくはブチリルであってよく、または、Ｒ1は、ベンゾイル、もしくは適切なカルボキシルエステルを形成するあらゆる他の部分、または対応するホスフェートエステル、もしくはスルホネートエステルであってもよい。
【０２１８】
いくつかの他の特定の態様において、ｑは０であり、ｍは２であり、Ｒ1はＨである。
【０２１９】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、および１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和もしくは飽和の、単環式もしくは多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環から選択される。
【０２２０】
いくつかの態様において、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、飽和単環式もしくは多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環、および１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよいフェニルから選択される。
【０２２１】
Ｒ2が、１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和もしくは飽和の、単環式もしくは多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環である場合、前記環は、例えば、不飽和または飽和の単環式もしくは多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環、例えば、架橋または非架橋のＣ６〜Ｃ１０シクロアルキル、例えば、シクロヘキシルおよびオクタヒドロ−１Ｈ−２，５−メタノインデニル；あるいはフェニルであってもよい。
【０２２２】
いくつかの他の態様において、Ｒ2は、１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、不飽和もしくは飽和の、単環式もしくは多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環であり、例えば、Ｒ2は、不飽和または飽和の単環式もしくは多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環、例えば、非架橋または架橋のＣ６〜Ｃ１０シクロアルキル、例えば、シクロヘキシルおよびオクタヒドロ−１Ｈ−２，５−メタノインデニル、あるいはフェニルである。
【０２２３】
いくつかの態様において、Ｒ2は、１つ以上のＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよい、飽和単環式もしくは多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環であり、例えば、Ｒ2は、飽和単環式もしくは多環式Ｃ６〜Ｃ１０炭素環、例えば、非架橋または架橋のＣ６〜Ｃ１０シクロアルキル、例えば、シクロヘキシルおよびオクタヒドロ−１Ｈ−２，５−メタノインデニル；あるいはフェニルである。
【０２２４】
いくつかの態様において、Ｒ2は、１つ以上のＲ7ラジカルで、例えば、１、２、または３つのＲ7ラジカルで任意に置換されていてもよいフェニルであり、すなわち、本発明の化合物は式（Ｉｆ）によって表してもよく、
【０２２５】
【化１３】
2016534129.tif 000015
【０２２６】
式中、ｓは０から５までの、または０から４までの、または０から３までの、または０から２までの整数であり、例えば、ｓは０または１である。いくつかの態様において、ｓは０である。いくつかの態様において、ｓは１である。いくつかの態様において、ｓは２である。
【０２２７】
式（Ｉｈ）の化合物のいくつかの態様において、ｓは少なくとも１であり、少なくとも１つのＲ7ラジカルはパラ位置である。式（Ｉｈ）の化合物のいくつかの態様において、ｓは１であり、Ｒ7はパラ位置である。
【０２２８】
【化１４】
2016534129.tif 000016
【０２２９】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、例えばＦおよびＣｌ、ならびに１つ以上のハロゲンで任意に置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、例えばＣ１〜Ｃ３アルキル、例えば、メチルから独立に選択され；またはＲ3およびＲ4は、これらが付着している隣接する原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、例えばＦおよびＣｌ、ならびにＣ１〜Ｃ６アルキル、例えば、Ｃ１〜Ｃ３アルキルから選択される。
【０２３０】
いくつかの態様において、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、ハロゲン、例えばＦおよびＣｌ、ならびにＣ１〜Ｃ６アルキル、例えばＣ１〜Ｃ３アルキル、例えばメチルから独立に選択される。
【０２３１】
いくつかの態様において、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈおよびハロゲンから、例えば、Ｈ、Ｆ、およびＣｌ、またはＨおよびＣｌから独立に選択される。
【０２３２】
いくつかの他の態様において、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキル、例えばＣ１〜Ｃ３アルキル、例えばメチルから独立に選択される。
【０２３３】
さらに他の態様において、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキル、例えば、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、例えばメチルから独立に選択される。
【０２３４】
さらに他の態様において、Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接する原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、例えばＦおよびＣｌ、およびＣ１〜Ｃ６アルキル、例えば、Ｃ１〜Ｃ３アルキルから選択され；例えば、Ｒ3およびＲ4は、これらが付着している隣接する原子と一緒になってベンゼン環を形成し、Ｒ5はＨである。
【０２３５】
いくつかの態様において、Ｒ3はここで上記に規定した通りであるが、Ｈとは異なる。例えば、Ｒ3はＨとは異なり、Ｒ4とＲ5の両方はＨである。
【０２３６】
いくつかの態様において、Ｒ4はここで上記に規定した通りであるが、Ｈとは異なる。例えば、Ｒ4はＨとは異なり、Ｒ3とＲ5の両方はＨである。
【０２３７】
いくつかの態様において、Ｒ5はここで上記に規定した通りであるが、Ｈとは異なる。例えば、Ｒ5はＨとは異なり、Ｒ3とＲ4の両方はＨである。
【０２３８】
いくつかの態様において、Ｒ3とＲ5の両方はＨとは異なる。例えば、Ｒ3およびＲ5はここで上記に規定した通りであるが、Ｈとは異なり、Ｒ4はＨである。
【０２３９】
いくつかの他の態様において、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は全てＨである。
【０２４０】
式（Ｉ）において、部分Ｒ6はＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、例えばメチルである。いくつかの態様において、Ｒ6はＨである。
【０２４１】
ここで上記に記述した通り、Ｒ2が、不飽和もしくは飽和の、単環式もしくは多環式Ｃ３〜Ｃ１０炭素環である場合、前記環は１つ以上のＲ7ラジカルで置換されていてもよい。このような各Ｒ7ラジカルは、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、例えば、Ｃ３〜Ｃ１０アルコキシ、例えば、メトキシ；およびハロゲン、例えばＦおよびＣｌ、特にＣｌ；ならびにＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9から独立に選択される。
【０２４２】
いくつかの他の態様において、少なくとも１つのＲ7は、ハロゲン、例えばＦおよびＣｌ、特にＣｌである。
【０２４３】
Ｒ7がＮＲ8Ｃ（Ｏ）ＯＲ9である場合、Ｒ8は、ＨおよびＣ１〜Ｃ３アルキル、特にＨから選択され、Ｒ9はＣ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ8はＨであり、Ｒ9はＣ１〜Ｃ６アルキル、例えばｔｅｒｔ−ブチルである。
【０２４４】
上記より、式（Ｉ）の化合物は、様々な特徴に関して変動してもよいと思われる。このような特徴は、整数ｑおよびｍ、ならびにＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の同一性に関する。別段の指摘がなく、または文脈から明白に明らかでなければ、式（Ｉ）の化合物の様々な特徴を、独立にかつ自由に組み合わせて、本発明の範囲内の多数の態様を生じてもよく、これらの態様は全て式（Ｉ）によって網羅されることが企図される。
【０２４５】
改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌、具体的にグリオーマ、例えばグリオブラストーマの処置において用いるための本発明の化合物の例は、
（２−フェニルベンゾ［ｈ］キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（６，８−ジクロロ−２−（（２Ｒ，３ａＳ，５Ｒ）−オクタヒドロ−１Ｈ−２，５−メタノインデン−２−イル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（（４−クロロフェニル）アミノ）−６−メチルキノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（８−クロロ−２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（６，８−ジクロロ−２−フェニルキノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（３−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（３，４−ジクロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カルバメート、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（７−クロロ−２−フェニルキノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（２，４−ジクロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（６−クロロ−２−フェニルキノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−エチニルフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン、
（２−（４−メトキシフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール、
（６，８−ジクロロ−２−（トリフルオロメチル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−シクロヘキシルキノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール、
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、
（Ｓ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、および
（Ｒ）−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノール
または薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和化合物、もしくはプロドラッグである。
【０２４６】
本発明の化合物の例には、５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物、４−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドおよび４−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物が含まれる。
【０２４７】
本発明の化合物の例には、５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物、４−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドおよび４−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジプロピルベンズアミドの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物、（Ｒ）−（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールおよび（Ｓ）−（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）（２−（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）キノリン−４−イル）メタノールの混合物が含まれる。
【０２４８】
本発明の化合物の立体異性体および互変異性体が、本発明の範囲内にさらに含まれる。
【０２４９】
本発明の好ましい一態様は、前述の化合物の（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）ラセミ体異性体の使用である。
【０２５０】
前述の化合物の（Ｒ，Ｓ）または（Ｓ，Ｒ）の単一のエナンチオマーの使用がより好ましい。
【０２５１】
特に、（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノールの（Ｒ，Ｓ）または（Ｓ，Ｒ）の単一の異性体、すなわち以下の化合物：（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メタノール、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メタノールから選択される使用である。
【０２５２】
本発明の化合物は、あらゆる適切な手段により、例えば、経口で、例えば、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、水性懸濁剤もしくは油性懸濁剤、または液剤、エリキシル剤、シロップ剤、カプセル剤、顆粒剤、または散剤の形態において；舌下に；頬側に；非経口的に、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内（intrasternal）注射または注入技術（例えば、滅菌注射用水性または非水性溶液または懸濁液として）により投与することができる。非経口投与には、パイロジェンフリーであり、必要なｐＨ、等張性、オスモル濃度、および安定性を有する、非経口的に許容される水性または油性の懸濁剤、エマルジョンまたは溶液剤を使用する。当業者であれば、適切な製剤を調製することが十分にでき、多くの方法が文献に記載されている。薬物送達方法の簡潔な総説は、科学文献にも見出される［例えば、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）］。
【０２５３】
本発明の化合物を投与する可能な方法の他の例には、鼻粘膜への投与を含めた経鼻投与、例えば吸入スプレーよる；または直腸投与、例えば坐剤の形態における；非毒性の薬学的に許容されるビヒクルもしくは希釈剤を含む用量単位製剤における投与がある。
【０２５４】
好ましくは、本発明の化合物を、処置する対象の脳に送達するように最適化された方法において非経口投与する。一態様において、化合物は腹腔内投与用に調合される。好ましい一態様において、化合物は脳室内投与用に調合される。
【０２５５】
本発明の化合物は、即時放出または持続放出に適する形態において投与することもできる。即時放出または持続放出は、本発明の化合物を含む適切な医薬組成物の使用により、または特に持続放出の場合は、装置、例えば皮下埋め込みもしくは浸透圧ポンプの使用により実現することができる。本発明の化合物は、リポソームを用いて投与することもできる。担体または他の材料の正確な性質は投与経路に依存するものであり、当業者であれば適切な溶液を調製することができ、多くの方法が文献に記載されている。経口投与用の例示的な組成物には、例えば、バルクを付与するための微結晶性セルロース、懸濁化剤としてアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロース、および甘味剤または香味剤、例えば、当技術分野では知られているものを含むことができる懸濁剤、例えば、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、および／もしくはラクトース、ならびに／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、および滑沢剤、例えば、当技術分野では知られているものを含むことができる即時放出錠剤が含まれる。本発明の化合物は、舌下および／または頬側投与により、口腔によって送達することもできる。成形錠剤（moled tablets）、圧縮錠剤、または凍結乾燥錠剤は、用いてもよい、例示的な形態である。例示的な組成物には、本発明の化合物（複数可）を、速溶性の希釈剤、例えば、マンニトール、ラクトース、スクロース、およびまたはシクロデキストリンと調合するものが含まれる。高分子量の賦形剤、例えば、セルロース（ａｖｉｃｅｌ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も、このような製剤に含まれる。このような製剤は、粘膜の付着を助ける賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸共重合体（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ）、および放出を制御する薬剤、例えばポリアクリル酸共重合体（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４）も含むことができる。滑沢剤、流動促進剤（glidant）、香味剤、着色剤、および安定剤も、製作および使用を容易にするために加えてもよい。
【０２５６】
経鼻エアロゾル剤または吸入投与のための例示的な組成物には、食塩水溶液が含まれ、これは、例えば、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、および／または他の可溶化剤もしくは分散剤、例えば、当技術分野では知られているものを含むことができる。
【０２５７】
非経口投与用の例示的な組成物には、注射用の溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれ、これは、例えば、適切な非毒性の、非経口投与に許容される希釈剤または溶媒、例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液、等張の塩化ナトリウム溶液、合成のモノグリセリドもしくはジグリセリド、およびオレイン酸を含めた脂肪酸、またはＣｒｅｍａｐｈｏｒを含む油もしくは他の適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を含むことができる。
【０２５８】
直腸投与用の例示的な組成物には坐剤が含まれ、これは、例えば、適切な非刺激性の賦形剤、例えば、カカオ脂、合成グリセリドエステル、またはポリエチレングリコールを含むことができ、これらは常温で固体であるが、直腸の孔で液化および／または溶解して薬物を放出する。
【０２５９】
本発明の文脈において、哺乳動物、特にヒトに投与する用量は、理にかなった時間枠にわたって哺乳動物において治療応答をもたらすのに十分でなければならない。当業者であれば、用量は、特定の化合物の効力、患者の年齢、状態、および体重、処置中の状態の程度、担当の医師の推薦、投与に選択される治療法または治療法の併用、ならびに疾患の段階および重症度を含めた様々な因子に依存することを認められよう。用量は、投与の、経路（投与形態）、タイミングおよび頻度により、やはり決定される。本発明の経口投与は、指摘する効果に用いる場合、ヒト成人に対して、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の間、最も好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間の範囲である。経口投与に対して、組成物は、好ましくは、処置しようとする患者に用量を症候性に調節するために有効成分０．５から１０００ミリグラムを含む個々の単位、例えば、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２００、４００、５００、６００、および８００ｍｇにおいて、錠剤の形態または他の提示形態において提供される。
【０２６０】
非経口的、特に脳室内または腹腔内で、最も好ましい用量は、一定速度の注入の間約０．００１から約１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲である。有利には、本発明の化合物は、単一用量において、例えば１日１回もしくはより頻回で投与してもよく、または１日２、３、もしくは４回の分割用量において投与される合計一日量（total daily dosage）でもよい。
【０２６１】
本発明の化合物はまた、グリオーマ、例えばグリオブラストーマの処置において有用である少なくとも１つの第２の治療薬と併用して使用または投与してもよい。治療薬は、同じ製剤中でも、または同時もしくは逐次的な投与用に別々の製剤中でもよい。本発明の化合物はまた、組合せ治療において用いても、またはさらなる治療法、例えば、外科手術、および／または照射、および／または化学療法を含む他の治療戦略と併用して投与してもよい。
【０２６２】
本明細書で用いる「化合物」は、この化合物に対する特定の請求項の範囲内に別段の特定がなければ、式（Ｉ）の化合物自体、ならびに薬学的に許容されるその塩、水和物、複合体、エステル、プロドラッグ、および／またはプロドラッグの塩を意味する。好ましい一態様において、Ｒ１は適切なプロドラッグエステル、ホスフェートエステル、スルホネートエステル、水和物、アセタール、ヘミアセタール、またはあらゆる他の加水分解可能な、もしくは酵素により加水分解可能な基であり、基は細胞内で切断される。
【０２６３】
本発明の目的では、「改変されたＲａｓ／Ｒａｃ活性に関連する癌」の語は、Ｒａｓおよび／もしくはＲａｃにおける変異、またはＲａｓおよび／もしくはＲａｃの異常な活性に関連する全てのタイプの癌、例えば、副腎、自律神経節、胆管、骨、乳房、中枢神経系、頸部、子宮内膜、造血系／リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上部呼吸消化管、尿路の組織における癌を含むものと理解されたい［Ｉａｎ  Ａ．Ｐｒｉｏｒ．、Ｐａｕｌ  Ｄ  Ｌｅｗｉｓ、Ｃａｒｌａ  Ｍａｔｔｏｓ（２０１２）Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７２、２４５７〜２４６７］。
【０２６４】
本発明の目的では、「グリオーマ」の語は、全てのタイプのグリオーマ、すなわち、上衣細胞腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、および混合膠腫、全グレードのグリオーマ、グレードＩ〜ＩＶのグリオーマ腫瘍、ならびに全ての位置における、テント上、テント下、および脳橋におけるグリオーマ腫瘍を含むものと理解されたい。「グリオブラストーマ」は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）またはグレードＩＶの星細胞腫と同義であると理解されたい。
【０２６５】
「エンドサイトーシス」の語は、分子（例えば、タンパク質）を貪食することにより、細胞が分子を吸収するエネルギー使用性のプロセスを意味する。エンドサイトーシスには、クラスリン媒介性エンドサイトーシスが含まれる。非クラスリン依存性エンドサイトーシスの例には、例えば、カベオラ、マクロピノサイトーシス、およびファゴサイトーシスが含まれる。本発明は、特に、カベオラに無関係のタイプの非クラスリン依存性エンドサイトーシス、例えばマクロピノサイトーシスに関する。
【０２６６】
「空胞形成」の語は、全ての動物細胞に存在する、膜結合した細胞小器官を意味する。空胞は、溶液中に無機分子および酵素を含めた有機分子を含む水で満たされている、本質的に封入されているコンパートメントであるが、ある場合には貪食した固体を含んでもよい。空胞は、細胞内で、多重膜の小胞が融合して大型の小胞を形成することにより、または原形質膜でのエンドサイトーシスから形成することができる。空胞には基本的な形状またはサイズはなく、その構造は細胞の必要性に応じて変動する。
【０２６７】
「癌幹細胞」の語は、動物モデルまたは患者において新たな腫瘍を形成することができる癌／腫瘍細胞を意味し、腫瘍開始性／誘発性細胞と同義として用いられる。グリオブラストーマに関して、前記癌細胞は、グリオブラストーマ癌幹細胞と表記される。
【０２６８】
本明細書および特許請求の範囲を通して用いられる「処置すること」の語は、防止的治療法、対症療法、または治効ある治療法を包含する。よって「処置する」（または処置）の語は、患者を疾患もしくは状態の徴候および症状から解放し、または疾患もしくは障害に罹患している患者の状態を寛解させるために患者を処置する（もしくは患者の処置）だけでなく、無症候性の患者を予防的に処置して疾患または状態の開始または進行を妨げることも包含する。一態様において、処置は、患者を疾患もしくは状態の徴候および症状から解放し、または疾患もしくは障害に罹患している患者の状態を寛解させ、または疾患もしくは状態の進行を妨げることである。
【０２６９】
本明細書で用いる「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、疾患、状態、または障害と戦う目的での患者のマネージおよびケアを記載するものであり、疾患、状態、もしくは障害の症状もしくは合併症を寛解させるための、または疾患、状態、もしくは障害を除去するための、本発明の化合物の投与を含む。「処置」の語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞または動物モデルの処置も含むことができる。
【０２７０】
「患者（複数可）」の語には、哺乳動物（ヒトを含む）患者（複数可）（または「対象（複数可）」）が含まれる。本明細書で用いる「対象」は、「それを必要とする対象」と交換可能であり、その両方とも、ウイルス感染が一役を担う障害を有する対象、または集団全体に対して癌を発症するリスクが増大している対象を意味する。「対象」には哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、ヒトまたは好適な非ヒトの哺乳動物、例えば、霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、またはブタであってもよい。一態様において、哺乳動物はヒトである。
【０２７１】
本発明の一側面は、以下を含む組合せ生成物である：
（Ａ）ここで先に規定した、本発明の化合物、ならびに
（Ｂ）本発明の化合物（Ａ）および第２の治療薬（Ｂ）の各々が、薬学的に許容される賦形剤との混合物において調合される、グリオブラストーマの処置において有用な第２の治療薬。このような組合せ生成物により、第２の治療薬と組み合わされた本発明の化合物の投与を提供するものであり、よって、このような製剤の少なくとも１つが本発明の化合物を含み、少なくとも１つが第２の治療薬を含む、別々の製剤として提示してもよく、または組み合わされた調製物として提示し（すなわち、調合し）（すなわち、本発明の化合物および他の治療薬を含む単一の製剤として提示し）てもよい。
【０２７２】
本発明の一側面は、ここで先に規定した本発明の化合物、および第２の治療薬を、薬学的に許容される賦形剤、例えば、補助剤、希釈剤、または担体と一緒に含む医薬製剤である。
【０２７３】
本発明のさらに別の一側面は、以下：
（ａ）薬学的に許容される賦形剤、例えば、補助剤、希釈剤、または担体との混合物における、ここで先に規定した本発明の化合物を含む医薬製剤、および
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、例えば、補助剤、希釈剤、または担体との混合物における、第２の治療薬を含む医薬製剤であり、各構成要素（ａ）および（ｂ）は、他と組み合わせて投与するのに適する形態において提供する。
【０２７４】
上記に規定した本発明の化合物は、所望の化合物、物質、および／または分子の、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグリオーマ細胞への選択的送達に用いることができる。これら所望の物質／化合物／分子は、例えば、グリオーマ細胞の選択的死滅のための治療用化合物、またはグリオーマ細胞の選択的画像化のための画像化分子、例えば、コントラスト分子であってもよい。治療用化合物は、細胞毒性化合物、治療用ＤＮＡ、抗体、遺伝子生成物、ナノ粒子、またはｉｎ  ｖｉｖｏでグリオーマ細胞を死滅させる能力を有する他の薬剤であってもよい。
【０２７５】
本発明の一側面は、よって、所望の化合物、物質、または分子、例えば、細胞毒性化合物、治療用ＤＮＡ、抗体、遺伝子生成物、ナノ粒子、またはナノ粒子、またはｉｎ  ｖｉｖｏでグリオーマ細胞を死滅させる能力を有する他の薬剤の、グリオーマ細胞選択的送達のための、上記（Ｉ）に規定する化合物の使用である。
【０２７６】
本発明のさらなる側面は、グリオーマ、例えばグリオブラストーマの処置のための、上記に規定した選択的送達の使用である。
【０２７７】
別の一側面は、グリオーマ細胞を画像化するための、画像化分子、例えば、コントラスト分子またはコントラスト剤を、グリオーマ細胞選択的に送達するための、上記（Ｉ）に規定した化合物の使用である。
【０２７８】
本発明のさらなる一側面は、以下の工程を含む、脳腫瘍を処置するための試験化合物の能力を評価するためのゼブラフィッシュのスクリーニングアッセイである：
ａ）ゼブラフィッシュの胚の色素沈着を妨げる工程、
ｂ）受精後２日間（２ｄｐｆ）容器中で胚をインキュベートする工程、
ｃ）ゼブラフィッシュに麻酔する工程、
ｄ）非標識の、または色素標識した、または導入遺伝子発現性の脳腫瘍細胞または細胞を、胚の脳室中に注射する工程、
ｅ）ゼブラフィッシュを麻酔から回復させる工程、
ｆ）生存し、泳いでいるゼブラフィッシュを、多数のチャンバーを有する容器中に分配する工程、
ｇ）試験化合物を、少なくとも１つの容器のチャンバーに加える工程、
ｈ）ゼブラフィッシュを経時的にモニタリングして、ゼブラフィッシュの脳における細胞の増大または低減を決定することにより、試験化合物の有効性を確立する工程。
【０２７９】
例えば、脳腫瘍はグリオーマである。
【０２８０】
例えば、癌細胞は、非標識の、または色素標識した（例えば、細胞トラッカー（cell tracker））、または導入遺伝子発現性の（例えば、ＧＦＰ／ＲＦＰもしくはルシフェラーゼ）もしくはドキシサイクリン／テトラサイクリンもしくはタモキシフェン誘発性構築物）癌細胞、または脳腫瘍グリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞の原発腫瘍からの細胞である。
【０２８１】
例えば、麻酔はトリカインで遂行する。
【０２８２】
例えば、色素沈着は、１細胞段階の胚に、物質、例えば、胚の色素沈着の発生をブロックするモルホリノ、例えば、ＭＩＴＦａ  ｍＲＮＡに対するモルホリノを注射することにより、または胚をフェニルチオ尿素に曝露することにより妨げる。
【０２８３】
例えば、多くの試験化合物を一度に、しかし多くの試験化合物のうち１つを容器中にゼブラフィッシュの胚を含むチャンバーに加えてアッセイする。
【０２８４】
本発明のさらなる一側面は、以下の工程を含む、グリオーマ、例えばグリオブラストーマを処置するための化合物の治療潜在性／有効性を評価するためのゼブラフィッシュのスクリーニングアッセイである：
ｉ）以下によりゼブラフィッシュ胚の色素沈着を妨げる工程
ｉ）１細胞段階の胚に、物質、例えば、胚の色素沈着の発生をブロックするモルホリノ、例えば、ＭＩＴＦａ  ｍＲＮＡに対するモルホリノを注射する工程、および／または
ｉｉ）フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）を、胚をインキュベートするのに用いるインキュベータのタンク水に加える工程、
ｊ）ゼブラフィッシュの胚をインキュベータのタンクに入れ、胚を、受精後２日間（２ｄｐｆ）インキュベータ中で成長させる工程、
ｋ）ゼブラフィッシュを、例えばペトリ皿または同様の容器中に収集し、例えば、ペトリ皿または同様中のアガロース（低融点）に包埋したトリカインを用いることにより、ゼブラフィッシュを麻酔する工程、
ｌ）非標識の、または色素標識した（例えば、細胞トラッカー）、または導入遺伝子発現性の（例えば、ＧＦＰ／ＲＦＰもしくはルシフェラーゼ）もしくはドキシサイクリン／テトラサイクリンもしくはタモキシフェン誘発性構築物）癌細胞、または脳腫瘍グリオーマ細胞、例えばグリオブラストーマ細胞の原発腫瘍からの細胞を、胚の脳室中に注射する工程、
ｍ）誤って注射した胚を任意に除去する工程、
ｎ）麻酔薬を含むタンク水、例えばトリカイン処理したタンク水を、ペトリ皿または容器中、正常のタンク水で置きかえる工程、
ｏ）ゼブラフィッシュを、例えば約３〜４時間、回復させる工程、
ｐ）生存し、泳いでいるゼブラフィッシュを、マルチウエルプレートまたは同様の容器に分配する工程、
ｑ）ウエルまたは容器に、必要とされる濃度の薬物を加える工程、
ｒ）ウエルまたは容器中のタンク水を定期的に、例えば毎日、前記同じ薬物濃度を含む水と交換する工程、
ｓ）ゼブラフィッシュの脳におけるグリオーマ（グリオブラストーマ）細胞の増大または低減を決定することにより、例えば、ゼブラフィッシュを肉眼的にモニタリングすることにより、ゼブラフィッシュを経時的にモニタリングして、グリオーマの処置において評価した薬物の有効性を確立する工程。
【０２８５】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、カーゴ化合物と接続され、または接触している、ここに記載する化合物である。
【０２８６】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、カーゴ化合物と接続され、または接触している、式（Ｉ）の化合物である。
【０２８７】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、カーゴ化合物と接続され、または接触している、表１から選択される化合物である。
【０２８８】
ここでＳ１からＳ２９と呼ぶ化合物の式を、ここの以下の表１に示す。
表１
【０２８９】
【表１−１】
2016534129.tif 000017
【０２９０】
【表１−２】
2016534129.tif 000018
【０２９１】
【表１−３】
2016534129.tif 000019
【０２９２】
【表１−４】
2016534129.tif 000020
【０２９３】
【表１−５】
2016534129.tif 000021
【０２９４】
*ＮＣＩ／ＤＴＰ  オープンケミカルリポジトリ（Open Chemical Repository）によって提供される化合物
ここで用いる「約」の語は、およそ、の領域において、大まかに、または周辺を意味する。「約」の語を数字の範囲と組み合わせて用いる場合、記載する数値を上回り、および下回る境界を拡張することにより、その範囲を修飾するものである。全般的に、ここで用いる「約」の語は、記載する値を２０％の変動で上回り、または下回る数値を修飾するものである。
【０２９５】
移行句においても、または請求項の本文においても、本開示で用いる「含む」および「含んでいる」の語は、制限のない（open-ended）意味を有すると解釈されたい。すなわち、この語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含む」の句と同義に解釈されたい。プロセスの文脈において用いる場合、「含んでいる」の語は、そのプロセスが列挙する工程を少なくとも含むが、付加的な工程を含んでもよいことを意味する。分子、化合物、または組成物の文脈において用いる場合、「含んでいる」の語は、化合物または組成物が列挙する特徴または構成要素を少なくとも含むが、さらなる特徴または構成要素も含んでもよいことを意味する。
【０２９６】
ここで用いるパーセント値および比率は全て、別段の指摘がなければ、重量によるものである。本発明の他の特徴および利点は、様々な例から明らかである。提供する例は、本発明を実践する上で有用な様々な構成要素および方法論を説明するものである。例は、本発明を限定するものではない。本開示に基づいて、当業者であれば、本発明を実践するのに有用な他の構成要素および方法論を同定および使用することができる。
【０２９７】
［実施例］
別段の記述がなければ、溶媒および試薬は全て市販の供給源から得たものであり、さらなる精製またはキャラクタリゼーションをせずに用いた。空気または湿度に感受性の試薬を伴う反応は全て、乾燥機で乾燥させたガラス器具を用いて、窒素またはアルゴン雰囲気下で行った。テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン、およびジエチルエーテルは、ナトリウム金属上で還流することにより脱水し、必要に応じて新たに蒸留した。別段の指摘がなければ、反応は全て周囲温度（１８〜２５℃）で行った。マイクロ波が補助する反応は、ＢＩＯＴＡＧＥ、Ｍｏｄｅｌ：Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  Ｅｘｐ．ＥＵ  ３５５３０１、０１１５９４−５０Ｘにおいて行った。反応は、磁気的に撹拌し、ＭｅｒｃｋからのＴＬＣシリカゲル６０Ｆ  ２５４アルミニウムシートを用いて薄層クロマトグラフィーによってモニタリングし、２５４ｎｍのＵＶ光線およびニンヒドリンチャー（ninhydrin char）で分析した。フラッシュクロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋからの（６０〜１２０メッシュ、ｐＨ＝６．５〜７．５）シリカゲルで行った。分取ＨＰＬＣを、塩基性または酸性何れかの溶出プロトコールを用いて、Ｇｉｌｓｏｎ３０５  ＨＰＬＣシステム上で行った。塩基性条件下の精製には、Ｇｉｌｓｏｎ３０５  ＨＰＬＣシステムにＸｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（５μｍ、３０ｍｍ×７５ｍｍ）カラムを装着し、化合物を、５０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ１０）を含むアセトニトリルおよびＨ2Ｏの勾配系を用いて溶出した。酸性の精製には、Ｇｉｌｓｏｎ３０５ＨＰＬＣシステムにＡＣＥ５  Ｃ８（５μｍ、３０ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを装着し、化合物を、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルおよびＨ2Ｏの勾配系を用いて溶出した。プロトン核磁気共鳴分析（1Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ−ＩＩＩ  ５００ＭＨｚシステム上、周囲温度で重水素内部ロックを用いて、Ｔｏｐｓｐｉｎ−３ソフトウエア、またはＴｏｐｓｐｉｎ−１ソフトウエアを用いたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ−Ｉ  ＤＰＸ  ４００ＭＨｚシステムを用いて記録した。最終化合物は全て、ＬＣＭＳまたはＨＰＬＣ／ＵＰＬＣによって決定して、純度９５％以上に精製した。化合物のピーク面積が、ＵＶおよびＬＣＭＳ／ＵＰＬＣクロマトグラムの合計ピーク面積の９５％を上回った場合、ならびにＭＳスペクトルが予想されたｍ／ｚおよび同位体比を生成した場合、化合物を純粋とみなした。
【０２９８】
以下の化合物が、ＮＣＩ／ＤＴＰオープンケミカルリポジトリによって提供された：ＮＳＣ１３４８０（Ｓ１）、ＮＳＣ３０５７８７（Ｓ２）、ＮＳＣ１５７５７１（Ｓ３）、ＮＳＣ４３７７（Ｓ４）、ＮＳＣ３０５７５８（Ｓ５）、ＮＳＣ１４２２４（Ｓ６）、ＮＳＣ２４５０（Ｓ７）、ＮＳＣ１３３１６（Ｓ１０）、ＮＳＣ１６００１（Ｓ１１）、ＮＳＣ２３９２４（Ｓ１２）、ＮＳＣ１３０９７（Ｓ１３）、ＮＳＣ２３９２５（Ｓ１５）、ＮＳＣ３２２６６１（Ｓ１７）、およびＮＳＣ１３４６６（Ｓ１８）。式（Ｉ）による化合物を調製するための一般的な３方法を、例１、２、および９においてさらに説明する。新規な化合物Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２７、Ｓ２９、ならびに化合物Ｓ２６およびＳ２８（Ｌｅｏｎ、Ｂ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２０１３、１５、１２３４〜１２３７によって記載されている）を、例３から９に記載する通りに調製した。Ｓ２０の立体選択的合成を例１０に表す。
【０２９９】
例１．バクイノール−１（Ｓ１０、ＮＳＣ１３３１６）の合成。一般的方法Ａ
【０３００】
【化１５】
2016534129.tif 000022
【０３０１】
反応条件：（ａ）（４−クロロフェニル）アセトフェノン、ＫＯＨ、ＥｔＯＨ、５１％、（ｂ）ＭｅＯＨ、Ｈ2ＳＯ4、５７％、（ｃ）８、ＮａＮＨ2、ベンゼン、１４％、（ｄ）ＨＣｌ、ＮａＯＨ、６３％、（ｅ）Ｂｒ2、ＨＢｒ、６８％、（ｆ）Ｎａ2ＣＯ3、ＥｔＯＨ、５５％、（ｇ）ＥｔＯＨ、ＮａＢＨ4、６６％。メチル６−ベンズアミドヘキサノエート（８）の合成：（ｈ）ＳＯＣｌ2、ＭｅＯＨ、９９％、（ｉ）安息香酸、ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ＤＩＰＥＡ、６３％。
２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−カルボン酸（中間体１）。撹拌しているイサチン（３０．０ｇ、２０４ｍｍｏｌ）の５００ｍＬエタノール溶液に、４−クロロアセトフェノン（４７．０ｇ、２４４ｍｏｌ）を１ポーションにおいて加えた。水酸化カリウムのフレーク（２２．８ｇ、４０８ｍｍｏｌ）を数ポーションにおいて加え、反応を１４時間、加熱還流した。反応を水１リットルで希釈し、酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で洗浄した。水層を氷浴中で冷却し、氷酢酸で酸性化した。沈殿した生成物をろ過し、希釈した冷酢酸で洗浄し、真空中で乾燥させて分析上純粋な中間体１（２９．５ｇ、５１％）を得た。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．２）1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.59 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.82 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 2H). LC-MS (ESI+): m/z 284.5 [M+H]+.
メチル２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−カルボキシレート（中間体２）。撹拌している１（５００ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液に、濃硫酸（０．４５ｍＬ）を加えた。反応混合物を６時間、加熱還流した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（２０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製材料を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、オフホワイト固体の中間体２（４０２ｍｇ、７６％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.26-8.14 (m, 3H), 7.78 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.07 (s, 3H). LC-MS (ESI+): m/z 298.3 [M+H]+.
メチル６−ベンズアミド−２−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−カルボニル）ヘキサノエート（中間体３）。室温のナトリウムアミド（３．１０ｇ、０．０８ｍｏｌ）のベンゼン（１００ｍＬ）溶液に、中間体２（１０．０ｇ、０．０３ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌し、メチル６−ベンズアミドヘキサノエート（中間体８、９．６ｇ、０．０３８ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２４時間、９０℃で撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、水で希釈した。粗製化合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて中間体３（２．０４ｇ、１３．９％）を得た。ＴＬＣ：４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．１）1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (s, 1H), 8.49 - 8.29 (m, 3H), 8.19 - 8.04 (m, 2H), 7.90 - 7.75 (m, 3H), 7.74 - 7.55 (m, 3H), 7.47 (m, 3H), 4.96 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.2 - 3.4 (m, 4H), 1.97 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.44 (m, 2H). LC-MS (ESI+): m/z 516 [M+H]+ (純度78%).
６−アミノ−１−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）ヘキサン−１−オン（中間体４）。中間体３（１０ｇ、０．０１９ｍｏｌ）を６Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）に懸濁し、１１０℃で４８時間還流した。出発材料の生成物への完全な変換に対して、反応をＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物のｐＨを、１０％水酸化ナトリウム水溶液を用いて１０〜１２に調節し、粗製生成物をクロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、粗製の中間体４（３．９４ｇ）を得（純度６３％）、これを次の工程において直接用いた。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．３）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.35 - 7.84 (m, 4H), 7.74 (s, 1H), 7.65 - 7.33 (m, 4H), 4.00 (s, 1H), 3.18 - 2.78 (m, 1H), 1.90 (d, J = 74.6 Hz, 2H), 1.38 - 0.69 (m, 5H). LC-MS (ESI+): m/z 353 [M+H]+.
６−アミノ−２−ブロモ−１−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）ヘキサン−１−オン臭化水素酸塩（中間体５）。中間体４（３．０ｇ、８．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、臭化水素酸（４７％水溶液、２０ｍＬ）を加えた。反応混合物を３０分間、室温で撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、懸濁液を９０℃に加熱したが、そのとき臭素（１．３５ｇ、８．５２ｍｍｏｌ）を２０分かけて反応混合物に加えた。反応混合物を室温に冷却し、水（５０ｍＬ）で希釈した。得られた固体をろ過し、数ポーションのジエチルエーテルで洗浄した。得られた粗製中間体５（２．４７ｇ、６８．３％）をさらなる精製をせずに次の工程に用いた。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．１）1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.62 (s, 1H), 8.42 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.89 (m, 1H), 7.70 (m, 5H), 6.01 (m, 1H), 2.86 (m, 2H), 2.27 (m, 1H), 2.08 (m, 1H), 1.87 - 1.47 (m, 4H). LC-MS (ESI+): m/z 433 [M+H]+ (純度52.6 %).
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノン（中間体６）。粗製６−アミノ−２−ブロモ−１−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）ヘキサン−１−オン臭化水素酸塩（中間体５、２．５０ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）をエタノール（６０ｍＬ）に溶解し、１５％炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）をそれに加えた。反応を１時間撹拌した。ＴＬＣにより、出発材料の完全な変換が示された。反応混合物を、ブフナー漏斗を通してろ過し、エタノール層を減圧下で蒸発させた。粗製化合物を、１００〜２００メッシュのシリカゲルとともに、ヘキサン中１５％酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製して、中間体６（１．１ｇ、５５％）を得た。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．５）1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.19 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.85 - 7.75 (m, 2H), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.31 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 2.24 (m, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.30 (m, 2H). LC-MS (ESI+): m/z 352 [M+H]+ (純度99.4 %).
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール（Ｓ１０、バクイノール−１、ＮＳＣ１３３１６）。中間体６（３．０ｇ、８．５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でエタノールに溶解した。反応混合物を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（１０８ｍｇ、１７．１ｍｍｏｌ）をポーションにおいて反応混合物に加えた。反応を６０分間、０℃で撹拌し、ＴＬＣによりモニタリングした。反応を水（５ｍＬ）でクエンチし、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を酢酸エチルと水との間で分配し、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を、溶離液としてヘキサン中１５％酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物Ｓ１０（ＮＳＣ１３３１６）（２．０６ｇ、６６．３％）を得た。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．２）1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (m, 3H), 8.15 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.77 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.3 Hz, 3H), 5.73 (m, 1H), 5.33 - 5.03 (m, 1H), 3.46 -3.20 (m, 1H), 3.07 - 2.76 (m, 2H), 2.42 (m, 1H), 1.77 - 0.98 (m, 6H). LC-MS (ESI+): m/z 353 [M+H]+ (純度99.4 %).
メチル６−アミノヘキサノエート（中間体７）。窒素雰囲気下、撹拌している６−アミノカプロン酸（５０．０ｇ、０．３８ｍｏｌ）の無水メタノール（６５０ｍＬ）溶液に、塩化チオニル（４７．６ｇ、０．４０ｍｏｌ）を０℃で滴下添加した。反応混合物を１０分間撹拌し、次いで９０℃で３時間還流した。反応が完了した後、溶媒を蒸発乾固し、白色固体を得た。得られた固体をヘキサンで洗浄して所望の中間体７  ６９ｇ（収率：９９％）を得た。ＴＬＣ：１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（Ｒf：０．２）1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (s, 3H), 3.66 - 3.50 (s, 3H), 2.72 (m, 2H), 2.29 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.54 (m, 4H), 1.30 (m, 2H). LC-MS (ESI+): m/z 146 [M+H]+ (純度100 %).
メチル６−ベンズアミドヘキサノエート（中間体８）。メチル６−アミノヘキサノエート（中間体７、１７．８ｇ、０．０９８ｍｏｌ）のＤＭＦ（１５０ｍＬ）溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１９．０５ｇ、０．１２２ｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（１６．４７ｇ、０．１２２ｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（３１．７２ｇ、０．２４５ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌し、安息香酸（１０ｇ、０．０８ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌し、次いで水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて所望の中間体８（１２．７６ｇ、６２．５％）を得た。ＴＬＣ：１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（Ｒf：０．５）1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.47 (m, 3H), 3.57 (s, 3H), 3.24 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.54 (m, 4H), 1.30 (m, 2H). LC-MS (ESI+): m/z 250 [M+H]+ (純度66%).
例２．バクイノール−１（Ｓ１０、ＮＳＣ１３３１６）の合成。一般的方法Ｂ。
【０３０２】
【化１６】
2016534129.tif 000023
【０３０３】
反応条件：（ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−ピペリジン、ｓｅｃ−ＢｕＬｉ、ＴＭＥＤＡ、ＴＨＦ、２７％、（ｂ）ＮａＢＨ4、ＥｔＯＨ、７２％、（ｃ）ＨＣｌ、Ｅｔ2Ｏ、ＭｅＯＨ、８０％。
ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−フェニルキノリン−４−カルボニル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体９）。０℃に冷却した、撹拌しているｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−１−カルボキシレート（１．０ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に、ＴＭＥＤＡ（２ｍＬ）およびｓｅｃ−ブチルリチウム（シクロヘキサン中１．４Ｍ、５ｍＬ、７．０６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、２時間撹拌した。化合物２（１．４２ｇ、５．４３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液を反応混合物に加え、撹拌を０℃でさらに２時間続けた。反応混合物をＲＴにゆっくりと温め、３時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、反応混合物を塩化アンモニウム飽和溶液（４０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×４０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（４０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製残渣を得た。粗製材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、黄色固体の中間体９（６００ｍｇ、２７％）を得た。ＴＬＣ：５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．４）1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.3-8.15 (m, 5H), 7.94-7.81 (m, 1H), 7.68-7.61 (m, 1H), 7.60-7.55 (m, 2H), 5.72-5.68 (m, 1H), 4.02-3.92 (m, 1H), 3.05-2.97(m, 1H), 2.18-2.05 (m, 2H), 1.78-1.65 (m, 4H), 1.38 (s, 9H). LC-MS (ESI+): m/z 451 [M+1]、5.21 RT (純度87.19%); HPLC純度: 81.76%.
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体１０）。撹拌している中間体９（４００ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（８ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、ＮａＢＨ4（７２ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を加え、反応を２時間撹拌した。出発材料が完全に消費された後、反応を水（２０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製材料を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、オフホワイト固体の中間体１０（ラセミ体）（１８０ｍｇ、７２％）を得た。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．２５）。1H NMR (400 MHz, CD3OD): (ラセミ体) δ 8.6-8.35 (m, 1H), 8.15-8.05 (m,4H), 7.81-7.72 (m, 1H), 7.75-7.51 (m, 3H), 5.8-5.6 (m, 1H), 4.7-4.55 (m, 1H), 4.11-3.95 (m, 1H), 3.44-3.15 (m, 1H), 1.95-1.41 (m,6H) , 1.34 (s, 9H). LC-MS (ESI+): m/z 453.5 [M+H]+. UPLC純度: 28.03%および68.16% (ラセミ体)
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール塩酸塩（Ｓ１０、ＮＳＣ１３３１６）。０℃に冷却した、撹拌している中間体１０（８０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に、０℃で、エーテル中４Ｍ  ＨＣｌ（０．１７ｍＬ、３．５３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に温め、４時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、揮発性物質を減圧下で蒸発させ、粗製材料をエーテル（２×１０ｍＬ）と粉砕して、オフホワイト固体の化合物Ｓ１０（バクイノール−１、ＮＳＣ１３３１６）（５０ｍｇ、８０％）を得た。ＴＬＣ：４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．１）1H NMR (400 MHz, CD3OD-d4): (ラセミ体) δ 8.56-8.45 (m, 2H), 8.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.20-8.12 (m, 3H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.77-7.74 (m, 2H), 6.05-5.7 (m, 1H), 3.73-3.64 (m, 1H), 3.48-3.40 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.99-2.94 (m, 1H), 1.90-1.80 (m, 4H), 1.52-1.29 (m, 2H). LC-MS: (ラセミ体) 54.37%は4.28 RTのもの、43.27%は4.37 RTのもの; 353.3 (M+1) UPLC (純度): (ラセミ体) 64.25% +33.21%. LC-MS (ESI+): m/z 353 [M+H]+
例３．Ｓ１４の合成
【０３０４】
【化１７】
2016534129.tif 000024
【０３０５】
反応条件：（ａ）ＮａＢＨ４、ＥｔＯＨ、７２％、（ｂ）ＮａＨ、ＭｅＩ、ＤＭＦ、６３％、（ｃ）ＨＣｌ、ジオキサン、３６％。
【０３０６】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体１０）を、例２に記載した通りに調製した。
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（メトキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体１１）。０℃に冷却した、撹拌している中間体１０（１４０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（１８．５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を不活性な雰囲気下で加え、１０分間撹拌した。ヨウ化メチル（０．０２３ｍＬ、０．３７１ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、これをゆっくりと室温に温め、１時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２５ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗製残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、無色濃厚シロップ状の中間体１１（９０ｍｇ、６２．５％）を得た。さらなる精製なしで用いたＴＬＣ：１：３ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（Ｒf：０．６）ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ+）：（ラセミ体）ｍ／ｚ４６７．６［Ｍ＋Ｈ］+．ＨＰＬＣ（純度）：（ラセミ体）純度６１．３７％は１６．５１ＲＴのものおよび純度３２．７５％は１６．１４ＲＴのもの。
２−（４−クロロフェニル）−４−（メトキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン塩酸塩（Ｓ１４）。０℃に冷却した、撹拌している中間体１１（９０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（０．２ｍＬ、０．７７ｍｍｏｌ）を不活性な雰囲気下で滴下添加し、１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料が完全に消費された後、揮発性物質を真空中で蒸発させて粗製材料を得、これを分取ＨＰＬＣ−ＭＳによって精製して、無色ゴム状固体のＳ１４（２５ｍｇ、３６％）を得た。ＴＬＣ：１：３ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（Ｒf：０．１）1H NMR (400 MHz, CD3OD) (ラセミ体): δ 8.30 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.23-8.18 (m, 1H), 8.13 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.88-7.84 (m, 1H), 7.71-7.68 (m, 1H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H),5.40-5.07(m,1H) 3.70-3.52 (m, 1H), 3.47-3.44 (m, 1H), 3.38 (s, 3H), 3.06-2.99 (m, 1H), 1.91-1.60 (m, 4H), 1.50-1.29 (m, 2H). LC-MS (ESI+): (ラセミ体) m/z 367.3 [M+H]+. HPLC純度: (ラセミ体) 63.41%は15.64 RTのものおよび35.68 %は16.78 RTのもの。
【０３０７】
例４．Ｓ１９の合成
【０３０８】
【化１８】
2016534129.tif 000025
【０３０９】
反応条件：（ａ）ＨＣｌ、ジオキサン、３４％、（ｂ）ホルムアルデヒド、Ｎａ（ＯＡｃ）3ＢＨ、ＤＣＭ、５５％、（ｃ）ＮａＢＨ4、ＥｔＯＨ、２５％。
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノン（中間体２６）。０℃に冷却した、撹拌している中間体９（１５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）溶液に、１、４−ジオキサン（０．１７ｍＬ）中４Ｎ  ＨＣｌを加えた。反応混合物を室温にゆっくりと温め、２時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、揮発性物質を減圧下で蒸発させ、残渣をエーテル（２×１０ｍＬ）と粉砕して粗製材料を得た。粗製残渣を、分取精製（mass-directed purification）によって精製して、オフホワイト固体の中間体２６（４０ｍｇ、３４％）を得た。ＴＬＣ：２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．３）1HNMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.37 (s, 1H), 8.31 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.29-8.20 (m, 2H), 7.91-7.86 (m, 1H), 7.73-7.69 (m, 1H), 7.61-7.58 (m, 2H), 5.26-5.23 (m, 1H), 3.64-3.61 (m, 1H), 3.21-3.20 (m, 1H), 2.14-2.09 (m, 1H), 1.99-1.91 (m, 2H), 1.78-1.64 (m, 3H). LC-MS: 98.29%; 351 (M+1); (カラム; X-Bridge C-18 (50 × 3.0 mm, 3.5 μm); RT 3.51分; 水中0.05% TFA: ACN; 0.80 ml/分). UPLC (純度): 96.23%.
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノン（中間体１２）。０℃に冷却した、撹拌している中間体２６（１４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、ホルムアルデヒド水溶液（３７％、０．１ｍＬ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、２０分間撹拌した。ＮａＢＨ（ＯＡｃ）3（１６９ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を２時間続けた（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製残渣を得た。粗製材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、無色濃厚シロップ状の中間体１２（８０ｍｇ、５５％）を得た。ＴＬＣ：４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．５）。1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.29-8.28 (m, 2H), 8.20-8.13 (m, 2H), 7.84 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.67-7.58 (m, 3H),4.55(m,1H), 3.35 (s, 3H), 2.60 (m, 2H), 1.88-1.85 (m, 3H), 1.81-1.78 (m, 3H), 1.57-1.53 (m, 2H). LC-MS (ESI+): m/z 365 [M+H]+ 74.13% (純度)、4.53 RT; UPLC純度: 77.47%
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（１−メチルピペリジン−２−イル）メタノール（Ｓ１９）。０℃に冷却した、撹拌している中間体１２（８０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）溶液に、ＮａＢＨ4（１７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加え、反応を１時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（１０ｍＬ）、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製材料を得、これを分取ＨＰＬＣによって精製して、オフホワイト色固体のＳ１９（２０ｍｇ、２５％）を得た。ＴＬＣ：４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．１）1H NMR (400 MHz, CD3OD): (ラセミ体) δ 8.26 (s, 1H), 8.22-8.17 (m, 3H), 8.20-8.18 (m, 1H), 8.13-8.10 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.86 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.20-6.18 (m, 1H), 3.72-3.68 (m, 1H), 3.54-3.51 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.22-3.21 (m, 1H), 1.93-1.72 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 1H), 1.16-1.13 (m, 1H). LC-MS (ESI+): m/z 367.4 [M+H]+. UPLC純度: (ラセミ体) 78.21%は1.99 RTのものおよび17.75%は2.02 RTのもの
例５．Ｓ１６の合成
【０３１０】
【化１９】
2016534129.tif 000026
【０３１１】
反応条件：（ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−ピロリジン、ｓｅｃ−ＢｕＬｉ、ＴＭＥＤＡ、ＴＨＦ、２７％、（ｂ）ＮａＢＨ４、ＥｔＯＨ、８５％、（ｃ）ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、９１％。
ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−カルボニル）ピロリジン−１−カルボキシレート（中間体１３）。−７８℃に冷却した、撹拌しているｔｅｒｔ−ブチルピロリジン−１−カルボキシレート（５００ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、ＴＭＥＤＡ（１ｍＬ、ｃａｔ）、引き続きｓｅｃ−ＢｕＬｉ（シクロヘキサン中１．４Ｍ、２．７３ｍＬ、３．８２ｍｍｏｌ）を加え、２時間撹拌した。２（８７３ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を、温度を−７８℃に維持した反応混合物に加え、さらに１時間継続した。反応混合物を室温にゆっくりと温め、２時間撹拌し（ＴＬＣによりモニタリングした）、飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液（２０ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２×２５ｍＬ）で抽出し、有機抽出物を合わせ、水（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製材料を得た。粗製残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、無色濃厚シロップ状の中間体１３（３５０ｍｇ、２７％）を得た。ＴＬＣ：５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．４）1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.31-8.16 (m, 5H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.69-7.63 (m, 1H), 7.59-7.56 (m, 2H), 5.44-5.41 (m, 1H), 3.65-3.49 (m, 2H), 2.36-2.20 (m, 1H), 2.01-1.98 (m, 3H), 1.28 (s, 9H). LC-MS: m/z 437.5 [M+H]+、4.87 RT (純度95.27%). UPLC純度: 95.51%
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレートオキシレート（carboxylateoxylate）（中間体１４）。０℃に冷却した、撹拌している１３（２００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（５ｍＬ）溶液に、ＮａＢＨ4（３４．６ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をポーションごとに添加し、１時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、反応を水（１５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×１５ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（１５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製残渣を得た。粗製材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、オフホワイト固体の中間体１４（１７０ｍｇ、８５％）を得た。ＴＬＣ：３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．４）。1H NMR (400 MHz, CD3OD): (ラセミ体) δ 8.19-8.10 (m, 5H), 7.78-7.75 (m, 1H), 7.56-7.55 (m, 3H), 6.08-5.82 (m, 1H), 4.44-4.43 (m, 1H), 3.60-3.40 (m, 1H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.25-2.23 (m, 2H), 2.12-2.11 (m, 2H), 1.45 (s, 9H). LC-MS: (ラセミ体) 62.59%は4.68 RTのもの、36.11%は4.87 RTのもの; 439.5 [M+H]+. HPLC純度: (ラセミ体) 67.22%は12.53 RTのもの、31.72%は13.20 RTのもの。
（２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル）（ピロリジン−２−イル）メタノール塩酸塩（Ｓ１６）。０℃に冷却した、撹拌している中間体１４（１７０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）溶液に、エーテル（０．３８ｍＬ、１．５５ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＨＣｌを加えた。反応混合物を室温に温め、１６時間撹拌した（ＴＬＣによりモニタリングした）。出発材料が完全に消費された後、揮発性物質を減圧下で濃縮し、粗製残渣をエーテル（２×１０ｍＬ）と粉砕して、オフホワイト固体のＳ１６（１２０ｍｇ、９１％）を得た。ＴＬＣ：６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（Ｒf：０．２）1H NMR (400 MHz, CD3OD): (ラセミ体) δ 8.64-8.58 (m, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.23-8.16 (m, 3H), 8.08-8.02 (m, 1H), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.22-6.21 (m, 1H), 6.03-6.02 (m,1H), 4.22-4.20 (m, 1H), 4.05-4.04 (m, 1H), 3.43-3.39 (m, 1H), 3.26-3.20 (m, 1H), 2.33-2.11 (m, 3H), 1.95-1.93 (m, 1H), 1.60-1.5 (m, 1H). LC-MS: (ラセミ体) 56.61%は3.84 RTのもの、42.80%は3.98 RTのもの; 339.2 (M+1); (カラム; X-Bridge C-18 (50 × 3.0 mm, 3.5 μm); 5 mM NH4OAc: ACN; 0.80 ml/分); UPLC (純度): (ラセミ体) 65.82%は1.87 RTのもの、32.19%は1.93 RTのもの。
【０３１２】
例６．Ｓ９の合成
【０３１３】
【化２０】
2016534129.tif 000027
【０３１４】
反応条件：（ａ）ｉ）ｉＰｒＭｇＣｌ−ＬｉＣｌ、ＴＨＦ、ｉｉ）ｔｅｒｔ−ブチル２−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート、５８％、（ｂ）ＴＦＡ、ＤＣＭ、９９％、（ｃ）（４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）メチル）フェニル）ボロン酸、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4、Ｃｓ2ＣＯ3、ジオキサン、３７％。
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体２４）。２，４−ジブロモキノリン（５００ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解した。ｉ−ＰｒＭｇＣｌ  ＬｉＣｌ（１．４７ｍＬ、１．３Ｍ、１．９ｍｍｏｌ）を、室温でゆっくりと滴下添加し、引き続きＮ−ｂｏｃピペリジン−２−アルデヒド（４８３．１ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を加えた。ＬＣ−ＭＳ分析によりマグネシウム試薬の消費をチェックしながら、混合物を４時間撹拌した。反応が完了した後、飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液を加え、混合物をＥｔＯＡｃで３回抽出した。溶媒を蒸発させ、生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝１／４）により精製し、ヘプタン中で粉砕して白色固体の中間体２４（４７４ｍｇ、５８％）を得た。1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ 8.22 (dd, J=8.5, 0.9 Hz, 1 H), 7.97 (dd, J=8.6, 0.8 Hz, 1 H), 7.62 - 7.73 (m, 2 H), 7.55 (ddd, J=8.3, 6.9, 1.4 Hz, 1 H), 5.66 (t, J=4.5 Hz, 1 H), 4.31 (q, J=5.1 Hz, 1 H), 3.83 (d, J=13.1 Hz, 1 H), 3.71 (br. s., 1 H), 3.19 (ddd, J=14.3, 13.1, 4.0 Hz, 1 H), 1.87 - 1.98 (m, 1 H), 1.77 (tt, J=9.5, 4.5 Hz, 1 H), 1.59 (tt, J=8.1, 4.0 Hz, 1 H), 1.42 - 1.54 (m, 2 H), 1.21 - 1.41 ppm (m, 10 H).
（２−ブロモキノリン−４−イル）（ピペリジン−２−イル）メタノール（中間体２５）。中間体２４（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を５ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、１００マイクロリットルのＴＦＡを加えた。５時間後、反応を飽和Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ≒１１）でクエンチし、有機層をデカントした。水層をＤＣＭで３回抽出し、残渣を減圧下で濃縮して白色粉末状の粗製中間体２５を得、これをさらに精製またはキャラクタリゼーションせずに次の工程において直接用いた。
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（ヒドロキシ（ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）ベンジル（メチル）カーバメート（Ｓ９）。フラスコに、１，４−ジオキサン（７９０μＬ）中、中間体２５（３８．１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、（４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−（メチル）アミノ）メチル）フェニル）ボロン酸（３５．６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）4（１３．７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を充填した。フラスコを３回脱気した。混合物に、Ｃｓ2ＣＯ3（７７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ（５００μＬ）溶液を加えた。フラスコを再び、３回脱気した。反応混合物を７５℃で１時間撹拌した。室温に冷却した後、水を加え、水層をＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機層を合わせ、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製物を逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体のＳ９  ２０．０ｍｇ（３７％）を得た。1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ 8.21 (s, 1 H), 8.13 - 8.20 (m, 3 H), 7.96 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 7.66 - 7.77 (m, 1 H), 7.45 - 7.56 (m, 1 H), 7.38 (br. s., 2 H), 5.48 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 4.50 (br. s., 2 H), 3.00 - 3.12 (m, 2 H), 2.75 - 2.98 (m, 3 H), 2.69 (td, J=12.1, 2.7 Hz, 1 H), 1.45 - 1.80 (m, 13 H), 1.04 - 1.44 ppm (m, 3 H). 13C NMR (CDCl3 ,101MHz): δ 156.7, 148.9, 148.5, 148.4, 147.4, 139.5, 138.8, 130.7, 129.3, 127.8, 126.1, 125.0, 124.7, 123.0, 116.5, 79.8, 72.7, 61.2, 46.9, 41.0, 28.5, 26.1, 25.1, 24.3 ppm.
例７．Ｓ２０およびＳ２２の立体選択的合成
【０３１５】
【化２１】
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【０３１６】
ａ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［メトキシ（メチル）カルバモイル］ピペリジン−１−カルボキシレート：
【０３１７】
【化２２】
2016534129.tif 000029
【０３１８】
２２℃で、（Ｓ）−（Ｌ）−Ｎ−Ｂｏｃ−ピペコリン酸（０．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．４ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２．２ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）、引き続きＨＡＴＵ（１．２ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５分間撹拌した。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（２０ｍｌ）中に注いだ。有機相を分離し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２５ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、次いで真空中で蒸発させた。得られた無色の油を、ヘプタン中２０％酢酸エチルで溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけた。分画を収集し、蒸発させ、真空下で２４時間乾燥させた。無色油状の表題化合物（５４６ｍｇ、９２％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ１３Ｈ２４Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ２７３．１８１４を必要とし、ｍ／ｚ２７３に見られた。
ｂ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート：
【０３１９】
【化２３】
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【０３２０】
ＬｉＡｌＨ4（ＴＨＦ中１Ｍ、３．０ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）をポーションにおいて、０℃のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［メトキシ（メチル）カルバモイル］ピペリジン−１−カルボキシレート（５２５ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液に加えた。次いで、反応混合物を３０分間、室温で混合した。反応混合物を０℃に冷却し、５％ＫＨＳＯ4水溶液（１０ｍＬ）を滴下添加することにより、注意深くクエンチした。次いで、混合物をＥｔＯＡｃ（２×１５ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液およびＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。次いで、ＥｔＯＡｃをＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。無色油状の表題化合物（３９２ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ、収率９５％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ11Ｈ19ＮＯ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ２１４．１４４３を必要とし、ｍ／ｚ２１４に見られた。
ｃ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート
【０３２１】
【化２４】
2016534129.tif 000031
【０３２２】
２，４−ジブロモキノリン（０．４５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、無水テトラヒドロフランに溶解した。ｉ−ＰｒＭｇＣｌ  ＬｉＣｌ複合体の１．３Ｍテトラヒドロフラン（１．５ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）溶液を、０℃でゆっくりと滴下添加した。反応混合物を室温で３０分間、撹拌した。無水ＴＨＦに溶解したアルデヒドｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート（ｖａｃｑｍｇ０１５）（１．６ｍｍｏｌ）を、室温で反応混合物に加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。（ＨＰＬＣ分析により、Ｄ１／Ｄ２ジアステレオ異性体比約１．０：１．３の生成物に５５％が変換されたことが示された）。反応が完了した後、ＮＨ4Ｃｌ飽和溶液を加え、混合物をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、食塩水（２５ｍＬ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、次いで真空中で蒸発させた（粗製物６８０ｍｇ）。得られた無色の油を、ヘプタン中酢酸エチル（１：３）で溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけた。分画１０〜１７（１０ｍＬ）を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１３９ｍｇ、２１％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ20Ｈ26ＢｒＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４２１．１１２７を必要とし、ｍ／ｚ４２１に見られた。分画２０〜３０（１０ｍｌ）を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１６２ｍｇ、２５％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ20Ｈ26ＢｒＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４２１．１１２７を必要とし、ｍ／ｚ４２１に見られた。
ｄ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート
【０３２３】
【化２５】
2016534129.tif 000032
【０３２４】
（２Ｓ）−２−［（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１３９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）およびボロン酸（６２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、Ｎ2下、ＤＭＦ（１．７ｍＬ）に溶解し、ＰｄＣｌ2（ｄｐｐｆ）（２．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）および２Ｍ  Ｋ2ＣＯ3（０．４９ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加え、反応を９０℃で一夜加熱した。（ＨＰＬＣ−ＭＳにより９９％の変換が示された）。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン１：３）により精製し、真空下で乾燥させた。白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１１１ｍｇ、７４％）。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ26Ｈ29ＣｌＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４５３．１９４５を必要とし、ｍ／ｚ４５３に見られた。
【０３２５】
同じ手順を用いて、（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートから出発して、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートを得た。白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（６５ｍｇ、３７％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ26Ｈ29ＣｌＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４５３．１９４５を必要とし、ｍ／ｚ４５３に見られた。
ｅ）（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２０）および（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２２）
【０３２６】
【化２６】
2016534129.tif 000033
【０３２７】
ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１０９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。Ｅｔ2Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌ（１．４５ｍＬ、１．４５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を一夜、室温に温めた。形成した沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させて粗製生成物（ＨＰＬＣで６８ｍｇ純度８５％）を得た。粗製材料をアセトニトリル（２ｍＬ）およびアンモニア２５％（１ｍＬ）に溶解し、分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ：ＮＨ3／ＮＨ4ＨＣＯ3（５０ｍＭ）５から３５％）によって精製した。分画を収集し、真空下で乾燥させて白色固体のＳ２０（４２．５ｍｇ、収率５０％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ21Ｈ21ＣｌＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ３５３．１４２１を必要とし、ｍ／ｚ３５３に見られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.19 (d, J = 8.21 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.53 Hz, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.94 (d, J = 8.53 Hz, 1H), 7.66 - 7.77 (m, 1H), 7.51 - 7.56 (m, 1H), 7.49 (d, J = 8.53 Hz, 2H), 5.45 (d, J = 3.47 Hz, 1H), 3.06 - 3.21 (m, 2H), 2.74 (dt, J = 2.69, 11.93 Hz, 1H), 1.72 (d, J = 12.64 Hz, 1H), 1.57 (d, J = 13.27 Hz, 1H), 1.29 - 1.46 (m, 2H), 1.06 - 1.22 (m, 2H)  13C NMR (101 MHz, クロロホルム-d) δ 155.7, 148.3, 147.2, 138.1, 135.5, 130.6, 129.3, 128.9, 128.9, 126.3, 124.7, 122.7, 116.0, 72.5, 59.9, 46.9, 26.0, 25.0, 23.9
同じ手順を用いて、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートから出発して、（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２２）を得た。粗製材料をアセトニトリル（２ｍＬ）および２５％アンモニア（１ｍｌ）に溶解し、分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ：ＮＨ3／ＮＨ4ＨＣＯ3（５０ｍＭ）５から３５％）によって精製した。分画を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体のＳ２２（２８．５ｍｇ、収率５４％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ21Ｈ21ＣｌＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ３５３．１４２１を必要とし、ｍ／ｚ３５３に見られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.18 - 8.22 (m, 1H), 8.14 - 8.18 (m, 2H), 8.02 (s, 1H), 7.95 (dd, J = 0.63, 8.53 Hz, 1H), 7.74 (ddd, J = 1.26, 7.03, 8.45 Hz, 1H), 7.55 (ddd, J = 1.42, 6.95, 8.37 Hz, 1H), 7.48 - 7.52 (m, 2H), 5.26 (d, J = 4.42 Hz, 1H), 3.08 (d, J = 12.00 Hz, 1H), 2.90 - 2.98 (m, 1H), 2.56 (dt, J = 2.69, 11.77 Hz, 1H), 1.76 - 1.85 (m, 1H), 1.50 - 1.64 (m, 3H), 1.42 (td, J = 3.67, 12.24 Hz, 1H), 1.21 - 1.35 (m, 1H).  13C NMR (101 MHz, クロロホルム-d) δ 155.6, 149.0, 148.4, 137.9, 135.6, 130.6, 129.5, 129.0, 128.8, 126.4, 125.0, 122.9, 115.7, 72.5, 61.0, 46.2, 29.4, 25.9, 24.2
例８．Ｓ２１およびＳ２３の立体選択的合成
【０３２８】
【化２７】
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【０３２９】
ａ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［メトキシ（メチル）カルバモイル］ピペリジン−１−カルボキシレート：
【０３３０】
【化２８】
2016534129.tif 000035
【０３３１】
（Ｒ）−（Ｄ）−Ｎ−Ｂｏｃ−ピペコリン酸（０．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．４ｍＬ）に溶解し、２２℃で、ジイソプロピルエチルアミン（２．２ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）、引き続きＨＡＴＵ（１．２ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５分間撹拌した。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（２０ｍｌ）中に注いだ。有機相を分離し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２５ｍｌ）および食塩水（２５ｍｌ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、次いで真空中で蒸発させた。得られた無色の油を、ヘプタン中２０％酢酸エチルで溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけた。分画を収集し、蒸発させ、真空下で２４時間乾燥させた。無色油状の表題化合物（５４６ｍｇ、９２％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ13Ｈ24Ｎ2Ｏ4［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ２７３．１８１４を必要とし、ｍ／ｚ２７３に見られた。
ｂ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート
【０３３２】
【化２９】
2016534129.tif 000036
【０３３３】
ＬｉＡｌＨ4（ＴＨＦ中１Ｍ、２．６ｍＬ、２．６４ｍｍｏｌ）をポーションにおいて、０℃のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［メトキシ（メチル）カルバモイル］ピペリジン−１−カルボキシレート（４８０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に加えた。反応混合物を、次いで、室温で３０分間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、５％ＫＨＳＯ4水溶液（１０ｍＬ）を滴下添加することにより注意深くクエンチした。次いで、混合物をＥｔＯＡｃ（２×１５ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液およびＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。次いで、ＥｔＯＡｃをＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。無色油状の表題化合物（２７３ｍｇ、収率７３％）を得た。
ｃ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート
【０３３４】
【化３０】
2016534129.tif 000037
【０３３５】
２，４−ジブロモキノリン（０．３７ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフランに溶解した。ｉ−ＰｒＭｇＣｌ  ＬｉＣｌ複合体の１．３Ｍテトラヒドロフラン溶液（１．３ｍＬ、１．６６ｍｍｏｌ）を、０℃でゆっくりと滴下添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。無水ＴＨＦに溶解したＴｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート（０．２７ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を室温で反応混合物に加え、室温で４時間撹拌した。（ＨＰＬＣ分析により、Ｄ３／Ｄ４ジアステレオ異性体比約１．０：１．３の生成物への９９％の変換が示された）。反応が完了した後、ＮＨ4Ｃｌ飽和溶液を加え、混合物をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、食塩水（２５ｍＬ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、次いで真空中で蒸発させた（粗製物収量６８０ｍｇ）。得られた無色の油を、ヘプタン中酢酸エチル（３：１）で溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけた。分画１４〜２２（１０ｍＬ）を収集し、真空下で乾燥させて白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１５６ｍｇ、２９％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ20Ｈ26ＢｒＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４２１．１１２７を必要とし、ｍ／ｚ４２１に見られた。分画２８〜３８（１０ｍＬ）を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１５０ｍｇ、２８％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ20Ｈ26ＢｒＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４２１．１１２７を必要とし、ｍ／ｚ４２１に見られた。
ｄ）ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート
【０３３６】
【化３１】
2016534129.tif 000038
【０３３７】
ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１５６ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）および４−クロロフェニルボロン酸（６９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、をＮ2下、２−メチルテトラヒドロフラン（１．９ｍＬ）に溶解し、ＰｄＣｌ2（ｄｐｐｆ）（３．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）および２Ｍ  Ｋ2ＣＯ3（０．７４ｍＬ、１．４８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加え、反応を９０℃で一夜加熱した。（ＨＰＬＣ−ＭＳにより９９％の変換が示された）。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン１：３）により精製し、真空下で乾燥させた。白色固体の化合物ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１４１ｍｇ、８４％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ26Ｈ29ＣｌＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４５３．１９４５を必要とし、ｍ／ｚ４５３に見られた。
【０３３８】
（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートから出発して、同じ手順を用いてｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートを得た。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン１：３）により精製し、真空下で乾燥させた。白色固体のｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１５０ｍｇ、９３％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ26Ｈ29ＣｌＮ2Ｏ3［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ４５３．１９４５を必要とし、ｍ／ｚ４５３に見られた。
ｅ）（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２１）および（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２３）
【０３３９】
【化３２】
2016534129.tif 000039
【０３４０】
ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレート（１５６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１．７ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。Ｅｔ2Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌ（１．７ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を一夜、室温に温めた。形成した沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させて粗製生成物（ＨＰＬＣで６８ｍｇ、純度８５％）を得た。粗製材料をアセトニトリル（２ｍＬ）およびアンモニア２５％（１ｍＬ）に溶解し、分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ：ＮＨ3／ＮＨ4ＨＣＯ3（５０ｍＭ）５から３５％）によって精製した。分画を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体の（Ｓ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２１）（８２ｍｇ、収率６７％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ21Ｈ21ＣｌＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ３５３．１４２１を必要とし、ｍ／ｚ３５３に見られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.19 (dd, J = 1.11, 8.69 Hz, 1H), 8.13 - 8.17 (m, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.93 (dd, J = 0.63, 8.53 Hz, 1H), 7.72 (ddd, J = 1.26, 7.03, 8.45 Hz, 1H), 7.50 - 7.54 (m, 1H), 7.46 - 7.50 (m, 2H), 5.44 (d, J = 3.47 Hz, 1H), 3.15 (td, J = 1.86, 11.77 Hz, 1H), 3.10 (td, J = 3.00, 11.37 Hz, 1H), 2.73 (dt, J = 2.84, 12.00 Hz, 1H), 1.67 - 1.76 (m, 1H), 1.53 - 1.61 (m, 1H), 1.29 - 1.44 (m, 2H), 1.06 - 1.21 (m, 2H).  13C NMR (101 MHz, クロロホルム-d) δ 155.7, 148.3, 147.3, 138.1, 135.5, 130.6, 129.3, 128.9, 128.9, 126.3, 124.7, 122.7, 116.0, 72.5, 59.9, 46.9, 26.0, 25.0, 23.9
ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル（ヒドロキシ）メチル］ピペリジン−１−カルボキシレートから出発して、同じ手順を用いて、（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｒ）−ピペリジン−２−イルメタノール（Ｓ２３）を得た。粗製材料をアセトニトリル（２ｍＬ）および２５％アンモニア（１ｍＬ）に溶解し、分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ：ＮＨ3／ＮＨ4ＨＣＯ3（５０ｍＭ）５から３５％）によって精製した。分画を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体の表題化合物（５５ｍｇ、収率４８％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ21Ｈ21ＣｌＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ３５３．１４２１を必要とし、ｍ／ｚ３５３に見られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.19 (dd, J = 0.95, 8.53 Hz, 1H), 8.10 - 8.16 (m, 2H), 7.99 (s, 1H), 7.93 (dd, J = 0.95, 8.53 Hz, 1H), 7.73 (ddd, J = 1.26, 6.79, 8.37 Hz, 1H), 7.50 - 7.55 (m, 1H), 7.46 - 7.50 (m, 2H), 5.23 (d, J = 4.74 Hz, 1H), 3.06 (d, J = 11.69 Hz, 1H), 2.91 (td, J = 5.17, 8.29 Hz, 1H), 2.56 (dt, J = 2.84, 11.85 Hz, 1H), 1.77 (td, J = 1.58, 12.95 Hz, 1H), 1.48 - 1.62 (m, 3H), 1.34 - 1.48 (m, 1H), 1.19 - 1.33 (m, 1H).  13C NMR (101 MHz, クロロホルム-d) δ 155.6, 149.1, 148.4, 137.9, 135.6, 130.6, 129.5, 129.0, 128.8, 126.4, 125.0, 122.9, 115.8, 72.5, 61.1, 46.3, 29.3, 25.8, 24.2
当業者であれば、開示する物質に対する代替的な合成経路を見出してもよい。上記に表した非限定的な例は、本発明の範囲を限定しようとするものでは決してない。Ｓ１０、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３の調製も、Ｎ−Ｂｏｃ−２−ピペリジニルアルデヒドを用いて、または当業者には知られている他の保護基で任意に保護して、例７および８における通りに実現することができる。
【０３４１】
当業者であれば、Ｓ１０、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３の調製も、対応する２−ピペリジニルエステル、Ｗｅｉｎｒｅｂアミド、または他の活性カルボン酸誘導体を用いて、結果として得られたケトンを引き続き還元することにより、例７および８における通りに実現することができる。
キラルクロマトグラフィー
Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３の立体選択的な単離も、分取キラルクロマトグラフィーを用いて実現することができる。本発明の範囲に限定しようとするものではないが、一例において、以下の一般的方法を用いて、それぞれＳ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３を最高５０ｍｇ精製した。
分析系（アキラル方法）：ＬＣ０５
カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−５ＳＩＬ、４．６×２５０ｍｍ
移動相Ａ：ヘプタン＋０．１％ジエチルアミン（ＤＥＡ）、移動相Ｂ：エタノール＋０．１％ＤＥＡ
イソクラティック方法：移動相Ａ／Ｂ８０／２０＋ＤＥＡ
温度：３５℃、注入体積：２５μＬ、流量：１ｍＬ／分、ＵＶ：２６５ｎｍ
分析系（キラル方法）：ＬＣ０５
カラム：ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ−Ｈ、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ
移動相Ａ：ヘプタン＋０．１％ＤＥＡ、移動相Ｂ：エタノール＋０．１％ＤＥＡ
イソクラティック方法：移動相Ａ／Ｂ７０／３０＋ＤＥＡ
温度：３５℃，注入体積：５μＬ、流量：１ｍＬ／分、ＵＶ：２６５ｎｍ
分析系（キラル方法）：ＬＣ０５
カラム：ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＯＤ−Ｈ、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ
移動相Ａ：ヘプタン＋０．１％ＤＥＡ、移動相Ｂ：エタノール＋０．１％ＤＥＡ
イソクラティック方法：移動相Ａ／Ｂ９０／１０＋ＤＥＡ
温度：２２℃、注入体積：５μＬ、流量：１ｍＬ／分、ＵＶ：２６５ｎｍ
分取アキラル方法（Ｋｎａｕｅｒ）：ＬＣ０７
カラム：ＫｒｏｍａｓｉｌＳｉｌｉｃａ１０ｍｍ（１００Ａ）５０×１９０ｍｍ
移動相Ａ：ヘプタン、移動相Ｂ：エタノール＋０．２％ＤＥＡ
イソクラティック系：ヘプタン／エタノール＋０．２％ＤＥＡ５０／５０
温度：室温、注入体積：０．５〜１０ｍＬ、流量：１００ｍＬ／分、ＵＶ：２６５ｎｍ
【０３４２】
【化３３】
2016534129.tif 000040
【０３４３】
Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、およびＳ２３の立体選択的単離も、当業者には知られているキラル結晶化方法を用いて実現することができる。
【０３４４】
例９．５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリル（Ｓ２４）の混合物の合成。一般的方法Ｃ。
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体２７）の混合物、ならびにｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（中間体２８）の混合物：
２，４−ジブロモキノリン（５０２ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（４．５ｍＬ）に溶解した。ｉ−ＰｒＭｇＣｌ*ＬｉＣｌ（１．４７ｍＬ、ＴＨＦ中１．３Ｍ、１．９１ｍｍｏｌ）を、室温、Ｎ2雰囲気下で滴下添加し、引き続きｔｅｒｔ−ブチル２−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート（４８６ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）溶液を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。ＮＨ4Ｃｌ（飽和水溶液）を加え、混合物をＥｔＯＡｃで４回抽出した。有機溶液を合わせ、食塩水で２回洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ4）。溶媒を蒸発させて粗製生成物（１．０２ｇ）を得、これをフラッシュクロマトグラフィーによって精製して（ＥｔＯＡｃ／ｉ−ヘキサンの勾配１０：９０から３０：７０）中間体２７および２８を得た。
中間体２７．分画３４〜６０、２０５ｍｇ、２８％、白色固体。ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ４２１［Ｍ＋Ｈ］+。
中間体２８：分画７０〜９０、２１２ｍｇ、２９％、白色固体。ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ４２１［Ｍ＋Ｈ］+。
【０３４５】
中間体２７および２８の相対的な立体化学をそれぞれ、化合物Ｓ２０〜Ｓ２３の合成における同じ中間体の相対保持比の順序に比較することにより決定した。
【０３４６】
中間体２７（２１ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、３−シアノ−４−メチルフェニルボロン酸（１０ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ2*ＣＨ2Ｃｌ2（２．７ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（４０μＬ、０．２３０ｍｍｏｌ）のジオキサン水溶液（０．５５ｍＬ、１０％Ｈ2Ｏ）をＮ2雰囲気下、８０℃で１５時間加熱した。反応混合物をＭｅＣＮで希釈し、ろ過し、塩基性条件を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。純粋な分画を合わせ、溶媒を減圧下で除去し、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（２−（３−シアノ−４−メチルフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（Ｓ）−（２−（３−シアノ−４−メチルフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（８．５ｍｇ）の混合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ４５８［Ｍ＋Ｈ］+。
【０３４７】
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（Ｒ）−（２−（３−シアノ−４−メチルフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレートおよびｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（Ｓ）−（２−（３−シアノ−４−メチルフェニル）キノリン−４−イル）（ヒドロキシ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート（８．５ｍｇ）の混合物を、ＣＨ2Ｃｌ2（０．５ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ2Ｏ中１Ｍ  ＨＣｌ（１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を蒸発により除去し、５−（４−（（Ｒ）−ヒドロキシ（（Ｓ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルおよび５−（４−（（Ｓ）−ヒドロキシ（（Ｒ）−ピペリジン−２−イル）メチル）キノリン−２−イル）−２−メチルベンゾニトリルの混合物を、ＨＣｌ塩（白色固体、８．２ｍｇ、２工程にわたる収率４２％）として得た。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ ppm 8.65 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 8.50 (s, 2 H) 8.44 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.33 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 8.16 - 8.26 (m, 1 H) 7.99 - 8.11 (m, 1 H) 7.81 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.11 (s, 1 H) 3.73 (d, J=11.4 Hz, 1 H) 3.47 (d, J=11.1 Hz, 1 H) 3.19 (t, J=12.3 Hz, 1 H) 2.72 (s, 3 H) 1.58 - 1.97 (m, 4 H) 1.23 - 1.49 (m, 2 H). MS (ESI+) m/z 358 [M+H]+.
化合物Ｓ２５〜Ｓ２９を、例９および表２において説明する一般的方法Ｃに従って調製した。
表２．化合物Ｓ２５〜Ｓ２９に対する合成の詳細および分析データ
【０３４８】
【表２−１】
2016534129.tif 000041
【０３４９】
【表２−２】
2016534129.tif 000042
【０３５０】
*化合物Ｓ２６の調製には、Ｎ−tＢＯＣ保護した中間体およびＳ２６をそれぞれ、分取逆相ＨＰＬＣによって酸性条件を用いて精製し、白色固体のトリフルオロ酢酸塩Ｓ２６を得た。
例１０．バクイノール−１ＲＳ（Ｓ２０）の立体選択的合成
バクイノール−１ＲＳの立体選択的合成を、以下のスキームに従って、Ｌｅｏｎの修飾に基づいてデザインした（Ｌｅｏｎ，Ｂ．ら（２０１３）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５（６）、１２３４〜７）。
【０３５１】
【化３４】
2016534129.tif 000043
【０３５２】
簡潔に述べると、メチル化（Ｓ）−Ｌ−ピペコリン酸をトリチル化することにより、２，４−ジブロモキノリンから産生したグリニヤール試薬による面選択的付加に適する、キラルのピペリジンカルボアルデヒド材料を産生する可能性がもたらされた。単一の単離されたＲ，Ｓ異性体を、次いで、好適な４−クロロフェニルボロン酸の鈴木カップリングにかけ、トリチル基を同時に脱保護した後、所望の（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノールを得た。
メチル（２Ｓ）−ピペリジン−２−カルボキシレート。
【０３５３】
（Ｓ）−（Ｌ）−ピペコリン酸（１．５ｇ、１１．６１ｍｍｏｌ）を、Ｎ2下、メタノール（１１．６ｍＬ）に加えた。−１０℃で、この溶液に塩化チオニル（１．６９ｍＬ、２３．２３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。反応混合物を室温に温め、１８時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、真空下で乾燥させた。粗製物を次の工程において用いた。
メチル（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボキシレート。
【０３５４】
メチル（２Ｓ）−ピペリジン−２−カルボキシレート（１．６６ｇ、１１．５９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１３ｍＬ）に溶解し、次いでＥｔ3Ｎ（４．８５ｍＬ、３４．７８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に、トリチルブロミド（３．７５ｇ、１１．５９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応をＮＨ4Ｃｌ／２８％ＮＨ3（６ｍＬ、２：１）で加水分解した。溶液をＥｔ2Ｏ（２０ｍＬ）とＨ2Ｏ（２０ｍＬ）との間で分配した。層を分離し、水層をＥｔ2Ｏ（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１：２：９７、Ｅｔ3Ｎ：ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）により精製して白色泡沫状の表題化合物（２．２１ｇ、５０％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ26Ｈ27ＮＯ2［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ３８６．２１２０を必要とし、ｍ／ｚに見られた。
［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノール。
【０３５５】
乾燥機で乾燥させ、撹拌子（Ｎ２）およびコンデンサを装着した三口フラスコ（１００ｍＬ）にＴＨＦ（１０ｍＬ）を加えた。この溶液に、ＬｉＡｌＨ４（０．４７ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を加え、撹拌して懸濁液を形成させた。この懸濁液にメチル（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボキシレート（２．２ｇ、８．４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温で３時間撹拌した。（３０分後に濃厚懸濁液となり、ＴＨＦを１０ｍｌ加えた）。次いで、反応混合物を、ＮａＯＨ（１ｍＬ、１Ｍ）およびＨ2Ｏ（２ｍＬ）で注意深くクエンチした。溶液は肉眼的に濃厚になり、撹拌がより困難になった。次いでＭｇＳＯ4を加え、溶液を、ジクロロメタン３００ｍＬとともにセライトのパッドを通過させた。次いで、これを真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１：１：９８、Ｅｔ3Ｎ：ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2）により精製して、白色泡沫状の表題化合物（１．７ｇ、９９％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ25Ｈ27ＮＯ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ３５８．２１７０を必要とし、ｍ／ｚ１１６［Ｍ−Ｔｒ＋Ｈ］+に見られた。
（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボアルデヒド。
【０３５６】
乾燥機で乾燥させ、撹拌子（Ｎ2）を装着したフラスコ（１００ｍＬ）に、ＣＨ2Ｃｌ2（５．７ｍＬ）を加え、次いで−７８℃にした。この溶液に、（ＣＯＣｌ）2（０．６１ｍＬ、７．１３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。次に、ＤＭＳＯ（０．８４ｍＬ、１１．９ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（３．３ｍＬ）溶液を滴下添加した。これを１０分間撹拌し、次いで［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノール（１．７ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（４．２８ｍＬ）溶液を加えた。懸濁液を１．５時間撹拌し、次いでＥｔ3Ｎ（２．６５ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）を加え、さらなる１．５時間撹拌した。次いで−７８℃の浴槽を除去し、ＮＨ4Ｃｌ／２８％ＮＨ3（２０ｍＬ、２：１）を加え、溶液をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）とＨ２Ｏ（３０ｍＬ）との間で分配した。層を分離し、水層をＣＨ2Ｃｌ2（３×７０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１：９：９０、Ｅｔ3Ｎ：ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）により精製して、白色固体の表題化合物（１．５４ｇ、９１％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ25Ｈ25ＮＯ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量は、ｍ／ｚ３５５．１９３６を必要とし、ｍ／ｚ１１４［Ｍ−Ｔｒ＋Ｈ］+に見られた。
（Ｓ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）［（２Ｒ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノール。
【０３５７】
２，４−ジブロモキノリン（１．６１ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）を、無水テトラヒドロフランに溶解した。ｉ−ＰｒＭｇＣｌ  ＬｉＣｌ複合体の１．３Ｍテトラヒドロフラン溶液（６．６ｍＬ、８．６６ｍｍｏｌ）を、０℃で、ゆっくりと滴下添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。無水ＴＨＦに溶解した（２Ｒ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−カルボアルデヒド（１．５４ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応が完了した後、ＮＨ4Ｃｌ（飽和）／ＮＨ3（２８％）溶液を加え、混合物をＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、食塩水（２５ｍＬ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、次いで真空中で蒸発させた。得られた油をＴＥＡ：酢酸エチル：ヘプタン（１：１０：９０）で溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけた。分画を収集し、真空下で乾燥させて、白色固体の表題化合物（１．１８８ｍｇ、４９％）を得た。Ｃ34Ｈ32ＢｒＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ５６３．１６９８を必要とし、ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）（ＡＣＥＣ８  １０〜９０％ＭｅＣＮ１．５分（０．１％ＴＦＡ  ｐＨ２）（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ15Ｈ18ＣｌＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+はｍ／ｚ３２１．０６０２を必要とし、ｍ／ｚ３２１に見られた（トリチル基が酸性条件下で除去される）。
（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノール：
（Ｒ）−（２−ブロモキノリン−４−イル）［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノール（６１３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）および４−クロロフェニルボロン酸（１８０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、Ｎ2下、２−ＭｅＴＨＦ（５．５ｍＬ）に溶解し、ＰｄＣｌ2（ｄｐｐｆ）（７１ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）および２Ｍ  Ｋ2ＣＯ3（２．２ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加え、反応を一夜９０℃で加熱した。ろ過し、真空下で乾燥させて表題化合物（６５０ｍｇ、９９％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ40Ｈ35ＣｌＮ2Ｏ［Ｍ＋Ｈ］+に対する正確な質量はｍ／ｚ５９４．２４３７を必要とし、ｍ／ｚ３５３に見られた（トリチル基が酸性条件下で除去される）。
（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール：
（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］［（２Ｓ）−１−（トリフェニルメチル）ピペリジン−２−イル］メタノール（８１０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をＥｔ2Ｏ（４６ｍＬ）に溶解し、引き続き５Ｍ  ＨＣｌ（５，７ｍＬ）を加えた。室温で４時間撹拌した後、溶液をＥｔ2Ｏ（６０ｍＬ）とＨ2Ｏ（６０ｍＬ）との間で分配した。水層をＥｔ2Ｏ（３×５０ｍＬ）で抽出した。次いで、水層を６Ｍ  ＮａＯＨで塩基性化し、次いでＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（Ｅｔ3Ｎ：ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2、１：１：９８）により精製して（Ｒ）−［２−（４−クロロフェニル）キノリン−４−イル］（２Ｓ）−ピペリジン−２−イルメタノール（２６４ｍｇ、５５％）を得た。この材料を分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ｈ2Ｏ中０．１％）５から９０％）により精製した。分画を収集し、真空下で濃縮し、ｐＨをｐＨ１３に調節し、水相をＣＨ2Ｃｌ2  ３×５０ｍｌで抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2相をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて、白色固体の表題化合物（２８０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、収率６０％）を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）Ｃ２１Ｈ２１ＣｌＮ２Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する正確な質量はｍ／ｚ３５３．１４２１を必要とし、ｍ／ｚ３５３に見られた。
【０３５８】
例１１．バクイノール−１立体異性体の薬物動態学的評価
バクイノール−１ＲＳおよびバクイノール−１ＳＲは、以前に試験した異性体混合物（バクイノール−１（ラセミ体）、ＮＳＣ１３３１６）よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏの有効性が優れているため、バクイノール−１の個々の異性体（ＲＳおよびＳＲ）対、４つの異性体全ての立体異性体混合物（ＲＳ／ＳＲ／ＲＲ／ＳＳ、ＮＳＣ１３３１６）のｉｎ  ｖｉｖｏの薬物動態学的パラメータを、ノンコンパートメント解析により調査するのが望ましかった。
【０３５９】
バクイノール−１（ラセミ体）、バクイノール−１ＲＳ、およびバクイノール−１ＳＲの薬物動態を、ＮＭＲＩ（ＳＲ／ＲＳ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｖｒａｃ）マウスにおいて、２または２０ｍｇ／ｋｇのバクイノール−１をそれぞれ単一静脈内（ｉ．ｖ．）または経口（ｐ．ｏ．）投与した後に決定した。血液および脳試料を以下の名目上の時間点に動物から採取した：投薬後１５、３０、および６０分、ならびに２、４、６、８、２４、４８、７２、および１４４時間（ｎ＝３／時間点あたり）。バクイノール−１の生物分析上の定量を、血漿および脳試料において、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０３６０】
薬物動態を、複合（平均）プロファイルからノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）により計算した。名目上のサンプリング回数および用量レベルを、ＮＣＡの計算に用いた。
表３．ラセミ体バクイノール−１（Ｖｒａｃ）、バクイノール−１RS（ＲＳ）、およびバクイノール−１SR（ＳＲ）をマウスに２ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）または２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）投与した後の薬物動態学的パラメータの概要
【０３６１】
【表３】
2016534129.tif 000044
【０３６２】
Ｖｒａｃ、ＲＳ、およびＳＲを投薬した動物は全て、試験化合物に全身的に曝露された。血漿および脳の濃度は１４４時間まで検出可能であり、分析したが、ＳＲ異性体２ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与は例外で、７２時間まで検出可能であった。脳組織におけるＣmaxは、ｉ．ｖ．およびｐ．ｏ．投与後の両方とも、ＳＲまたはＶｒａｃに比べて、ＲＳがかなり高いことが観察された。脳／血漿の相対的曝露比（ＡＵＣlast（脳）／ＡＵＣlast（血漿））は、ＲＳの経口投薬後は１．６であったが、ＳＲでは０．９、Ｖｒａｃでは０．６にすぎなかった。Ｃｍａｘ曝露比（Ｃmax（脳）／Ｃmax（血漿）はこの所見に一致し、ＲＳでは２．２、ＳＲは０．７、およびＶｒａｃは０．６をもたらした。
【０３６３】
投薬した化合物全ての多相排泄曲線はｉ．ｖ．投与後に見ることができ、排泄半減期は、ｉ．ｖ．またはｐ．ｏ．投与後５２〜９６時間の間であった。図６Ａおよび６Ｂを参照されたい。このデータは、バクイノール−１ＲＳは、対応するＳＲ異性体または以前に記載された立体異性体混合物（バクイノール−１、ＮＳＣ１３３１６）に比べて、脳曝露は優れている一方、化合物の全身曝露を最小にすることを示すものである。
【０３６４】
例１２．メフロキンとの比較
バクイノール−１ＲＳ（Ｓ２０）およびメフロキンを、標準方法を用いて、グリオブラストーマ細胞（Ｕ３０１３）およびヒト線維芽細胞に対するこれらの相対的な細胞毒性に対して評価した。細胞死に対する比較上のＩＣ９５値は、ＩＣ９５（バクイノール−１ＲＳ）＝８．９μＭであり、ＩＣ９５（メフロキン）＝２５．２μＭである。図７Ａおよび７Ｂを参照されたい。前記のＩＣ９５値は、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏの癌細胞およびＣＳＣ生存性アッセイ」という表題の以下のセクションに記載する方法に従って決定したものである。
【０３６５】
例１３．薬理学的アッセイ
Ｓ１〜Ｓ２３の前述の化合物が、癌細胞、例えばグリオーマ癌を選択的に変調する能力を、当技術分野において知られているアッセイを用いて、または新規なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイによって決定する。ここに記載する化合物の生理活性を以下のアッセイに従って試験した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの表現型選択性スクリーニングアッセイ
グリオーマ癌細胞またはグリオーマ幹細胞（ＧＳＣ）の標的化処置に感受性である経路を同定するために、表現型のスクリーニングを行って、胚性幹細胞またはヒト線維芽細胞に影響を及ぼさずにグリオーマ癌細胞またはＧＳＣに対して活性である化合物を同定した。接着性のＧＳＣ培養物を、Ｐｏｌｌａｒｄら（Ｐｏｌｌａｒｄ  ＳＭ、（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、４、５６８〜５８０）による２症例の多形神経膠芽腫から独立に産生し、Ｕ３０１３ＭＧおよびＵ３０４７ＭＧと呼び、スクリーニングし、再スクリーニングし、ファロイジン染色に従って観察される表現型の変化に対するＮＩＨ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｅｔ  ＩＩの化合物１３６４個を用いて確認した。２３７個の化合物が２日後に効果を示し、６３個の化合物がＧＳＣに対する選択効果を示した。６３個の化合物がＵ３０１３ＭＧおよびＵ３０４７ＭＧ  ＧＳＣに対して、ならびに７つの他に確立されたＧＳＣ培養物である、Ｕ３０２４ＭＧ、Ｕ３０１７ＭＧ、Ｕ３０３１ＭＧ、Ｕ３０３７ＭＧ、Ｕ３０８６ＭＧ、Ｕ３０５４ＭＧ、Ｕ３０６５ＭＧに活性であると確認された。マイクロアレイ分析により、以下のサブクラス：前神経、Ｕ３０１３ＭＧ、Ｕ３０４７ＭＧ、Ｕ３０６５ＭＧ；間葉系Ｕ３０２４ＭＧ、Ｕ３０３７ＭＧ、Ｕ３０５４ＭＧ；古典的Ｕ３０１７ＭＧ、Ｕ３０３１ＭＧ、Ｕ３０８６ＭＧと一致するプロファイルが確立された。６３個の化合物を、Ｕ３０１３ＭＧ  ＧＣＳおよびヒト線維芽細胞における細胞毒性、アポトーシス、および細胞の生存性を定量することにより回復アッセイにおいて、ならびにＦＡＣＳによる細胞周期分析において試験した。回復アッセイは、異なる濃度の化合物を２日間、引き続き化合物なしでさらなる２日間、インキュベートすることにより行った。２５個の化合物には可逆性の効果があり、３８個には永久的な効果があったが、３個の化合物（Ｓ１０を含む）のみに、急性効果を引き起こしたのと同じ濃度で不可逆性の効果があった。
選択性および有効性の分析
ＧＳＣと他の細胞型からなる混合の培養物に対する化合物の選択性を評価するために、懸滴ベースの混合培養手順を開発した。混合の培養物の設定におけるグリオーマ細胞（グリオブラストーマ）に対する選択効果を評価するために、Ｕ３０１３ＭＧ  ＧＳＣを細胞トラッカーレッドで、線維芽細胞を細胞トラッカーグリーン蛍光色素で共培養物に対して標識した。細胞は、化合物の非存在下では層に組織化した。化合物と１日インキュベートした後、ＧＳＣに対して致死的な濃度のヒットを含む培養物は組織化できず、殆どがＧＳＣの顕著な減少をまねき、ヒト線維芽細胞に対する効果はなく、または微々たるものであった。毒性を測定するために、増大濃度の前述のヒット１７個を１０ｄｐｆの水に投与すると、６個のヒット（Ｓ１０を含む）はゼブラフィッシュの発生にいかなる効果も発揮しなかったが、残りのヒットの存在下で胚は死滅し、腐食し、または卵黄の浮腫を表したことが明らかになった。これらのデータは、Ｓ１０は、他の細胞の存在下で、選択的かつ効果的にグリオーマ癌細胞、特にグリオブラストーマ癌細胞、またはグリオーマ／グリオブラストーマ癌幹細胞を選択的かつ効果的に死滅させ、現在の治療法を凌ぐ優れた選択性を提供することを示唆するものである。
ゼブラフィッシュのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性アッセイ
ゼブラフィッシュにおいてＧＢＭに対する異種移植モデルを開発して、１７個のヒットがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を妨げる能力を試験した。細胞トラッカーレッドで標識したＵ３０１３ＭＧ  ＧＳＣ  ３０００個を４８〜５２ｈｐｆの幼生の脳室中に頭蓋内注射した。１７個のヒットを各々、同定された最低の有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性濃度の卵水（egg water）に投与し、１０日後に腫瘍の発生を評価した。このアッセイにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの設定における化合物の速やかな評価が可能になり、特徴、例えば、ゼブラフィッシュおよび移植された細胞に対する化合物の急性／慢性毒性効果、移植された細胞の増殖、および脳実質中への細胞の遊走、ゼブラフィッシュの組織中への化合物の浸潤が全て並行して評価された。これらの特徴によりこの異種移植モデルは強力なツールとなり、齧歯動物モデルにおける評価に持ち込む込み得る化合物の数は減少した。この実験を行うのは容易かつ迅速であるため、脳腫瘍に対して活性な化合物を同定するための強力なスクリーニングツールとしてこのアッセイを用いる可能性も指摘された。このアッセイでは、Ｓ１０は腫瘍サイズを顕著に低減した。これらのアッセイに基づいて、さらなる試験が化合物Ｓ１０に注目し、本発明者らは、Ｓ１０を、そのキノリン−アルコール骨格のためバクイノール−１と命名する。Ｓ１０処理したＧＳＣは高い細胞毒性を表し、ＡＴＰ枯渇によって測定される生存性の完全な喪失をまねき、ヒト線維芽細胞との混合の共培養物においてＧＳＣを選択的に標的化した。Ｓ１０は、ＥＳＣ、ヒト線維芽細胞、または骨肉腫細胞には影響を及ぼさなかったが、細胞周期のＳ期およびＧ２／Ｍ期における細胞の比率を速やかに低下させた。心臓血管毒性を、ｅｘ−ｖｉｖｏの成年ゼブラフィッシュの心臓における心拍動の周波数スペクトル分析（frequency spectral analysis）に基づいて近年確立されたモデルを用いて評価した（Ｋｉｔａｍｂｉら、（２０１２）ＢＭＣ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２、３）。心毒性を表した４個のヒットを除いて、残りの化合物（Ｓ１０を含む）では些少な効果が観察され、または効果は観察されなかった。このデータは、Ｓ１０の認容性は良好であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的であり、ゼブラフィッシュに観察される心毒性はなく、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍環境でグリオーマ／グリオブラストーマ癌細胞またはグリオーマ／グリオブラストーマ癌幹細胞を選択的に死滅させることを示唆するものである。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの癌細胞およびＣＳＣ生存性アッセイ
例Ｓ１〜Ｓ２３が、グリオーマ／グリオブラストーマ癌細胞またはグリオーマ／グリオブラストーマ癌幹細胞において細胞毒性を選択的に誘発する能力を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた存在下、グリオーマ幹細胞系Ｕ３０１３におけるＡＴＰ生成を定量することにより決定した。細胞を、１ｎＭから５０μＭの範囲の段階希釈の化合物に２４時間曝露し、陰性対照（ｄｍｓｏ、細胞死なし）および陽性対照（スタウロスポリン、完全な細胞死）に関して生存性を評価した。典型的に、評価した化合物の有効性範囲（ＥＣ50）は、０．５〜２０μＭの範囲であった（表４）。３０００細胞／ｃｍ２を用いた用量反応アッセイにおいてＳ１０の存在下におけるＧＳＣの生存性の評価は、２４時間後に５０％有効濃度の中央値（ＥＣ50）が２．３６μＭであったことを示し、それに比べてグリオーマ／グリオブラストーマを処置するのに通常用いる薬物であるテモゾロミドが示すＥＣ50は１３９μＭであった。Ｓ１０のＥＣ50は、インキュベート２、３、および４日目で大まかに同様のままであった。２４時間後の線維芽細胞のＥＣ50は１８．７μＭであり、より長時間の曝露でわずかに減弱したＥＣ50を表した（９６時間で２３μＭ）。個々の異性体のエナンチオ特異的な薬理学を決定するために、ラセミ体Ｓ１０の個々の異性体（Ｓ２１〜Ｓ２３）を評価した。Ｓ２０およびＳ２１は、Ｓ１０に関して、等しく、または増大した効力を示したが、異性体Ｓ２２およびＳ２３は大幅に減弱した活性を示した。
【０３６６】
【表４】
2016534129.tif 000045
【０３６７】
これらのデータは、評価した化合物Ｓ１〜Ｓ２３は、グリオーマ／グリオブラストーマ癌細胞に対して強力な細胞毒性効果を示し、現在の標準的治療法（ＴＭＺ）に対して大幅な改善をもたらすことを実証するものである。加えて、Ｓ１０のＲ，ＳおよびＳ，Ｒ立体異性体（すなわち、それぞれＳ２０およびＳ２１）は、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｒ異性体（すなわち、それぞれＳ２２およびＳ２３）に比べて、グリオーマ癌細胞に対して大幅に増大した効力を示すことが示される。
細胞毒性のマルチパラメータ表現型解析
アポトーシスの特有な特徴は、呼吸鎖の脱共役に伴うＡＴＰの急速な減少である。そこで、ＧＳＣの死滅を、アポトーシスインヒビターであるＱ−ＶＡＤの存在下で試験した。ＦＡＣＳ分析により生存細胞および死細胞に対してゲーティングすることで、Ｓ１０投与（７．５μＭ、７時間インキュベート）は、スタウロスポリン（１μＭ、７時間インキュベート）同様、死細胞の顕著かつ大幅な増大をまねくことが明らかになった。しかし、Ｑ−ＶＡＤは、３時間および７時間に、Ｓ１０処理した細胞を死滅からほんの中程度レスキューした。Ｓ１０  ７．５または１５μＭを含む培養物中、活性な切断されたカスパーゼ−３に対する染色では、ビヒクル（ＤＭＳO）処理した培養物に比べて、免疫反応性細胞の数のいかなる増大も明らかにならかったが、ドキソルビシン（１０μＭ）は陽性細胞の顕著な増大を引き起こした。カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７の酵素活性を、５〜３０μＭから増大濃度のＳ１０を加えて２、１５、３０、６０、１２０、１２０、２４０、３６０、および６００分後に測定した。６０分以内に活性の速やかな増大を引き起こしたスタウロスポリンと異なり、Ｓ１０は、ＤＭＳＯ対照に比べて、いかなる濃度または時間点でカスパーゼ活性に対する効果がなかった。Ｓ１０によるＡＴＰの速やかな枯渇により、ゆえに本発明者らはミトコンドリアを調べることになった。ミトコンドリアおよび小胞体におけるテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）の蓄積は、これらの膜電位によって駆動される。ミトコンドリアにおけるＴＭＲＥの組入れは、Ｓ１０による影響を、大部分受けなかった。これらの結果は、Ｓ１０誘発性のＧＳＣ死滅は非アポトーシス性のメカニズムによって生じ、活性なミトコンドリアの破壊を伴わないことを示す。陽性対照としてＡＴＰを投与するレシオメトリーによるカルシウム画像化を用いて、サイトゾルのカルシウム流出はＳ１０によって影響を受けないことが見出された。
【０３６８】
死滅がオートファゴソームの形成に関与するか否かを調べるために、確立されているオートファゴソームマーカーである微小管関連タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）に対する抗体で、Ｓ１０刺激した細胞の免疫蛍光染色を行った。Ｓ１０の投与は免疫反応性のいかなる増大ももたらさず、対照細胞と同様のままであり、ほんの少々の点状構造があった。これにより、自己貪食性の細胞活性は、グリオーマ／グリオブラストーマ細胞では、Ｓ１０によって増大せず、または阻害されない可能性があることが示唆される。Ｓ１０処理したＧＳＣに対する走査型電子顕微鏡により、細胞の速やかな円形化、および細胞表面膜上で膜の陥入が歪曲してクレーター様のカップになる外観が明らかになり、エンドサイトーシス様の活性が指摘された。一貫して、高倍率の細胞のライブ画像化により、細胞をＳ１０に曝露して数秒内に出現する、球状の突出、小疱の形成が明らかになった。標準の位相差顕微鏡（phase contrast optics）では、ライブ画像化により、Ｓ１０曝露（１５μＭ）数分以内に、細胞膜の顕著な収縮、引き続き破裂をもたらす非制御の拡張が先行する、細胞の円形化、および大量の膜のラフリングの形成、および細胞膜の破裂による細胞の最終的な死滅が明らかになった。Ｎｏｍａｒｓｋｉ（干渉位相差）顕微鏡（optics）でのライブ画像化は、３．５μＭのＳ１０後１０分以内に細胞内空胞の速やかな形成および膜の陥入を示し、空胞形成は用量依存的に増大した。空胞のサイズおよび数は時間とともに増大し、細胞質の大型の空胞での転置（displacement）、最終的に細胞の破裂をまねいた。これらの結果は、Ｓ１０によるエンドサイトーシス様の活性の誘発を確証するものである。
【０３６９】
細胞の画像化を用いて、マクロピノサイトーシスに起因する空胞の特徴である、サイズの様々な大型の空胞は透明として明らかに観察された。マクロピノサイトーシスの別の独特な特徴は、膜のラフリングの間に細胞膜の突出の下で捕捉された液体の、大型な非選択性の内部移行である（Ｓｃｈｍｉｄｔら（２０１１）ＥＭＢＯ  Ｊ、３０、３６４７〜３６６１；ＷａｔｔｓおよびＭａｒｓｈ（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１０３、１〜８）。よって、細胞外相の液体トレーサーの速やかな組入れは、マクロピノソームの特徴である。Ｓ１０の存在下でルシファーイエロー（ＬＹ）を媒体に加えることで、殆どまたは全ての細胞において２０分以内にトレーサーの組入れをまねき、空胞内にトレーサーが出現した。ＬＹの内部移行は非刺激のＧＳＣに時折観察されたが、Ｓ１０処理した細胞に比べて非常に低率であった。液相トレーサーはまた、早期にクラスリンコーティングしたエンドソームに侵入することができ、一方マクロピノサイトーシスはクラスリン非依存性プロセスである。マクロピノサイトーシスタイプのクラスリン非依存性エンドサイトーシスは、空胞−Ｈ＋タイプ−ＡＴＰアーゼの特異的なインヒビターであるバフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ−Ａ）に感受性である（Ｂｈａｎｏｔら（２０１０）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、８、１３５８〜１３７４；Ｋａｕｌら（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、１９、１０３４〜１０４３；Ｏｖｅｒｍｅｙｅｒら（２０１１）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ、１０、６９）。ＧＳＣを１００ｎＭ  Ｂａｆ−Ａと短時間（１時間）インキュベートしても、単独でＬＹの取込みに対して効果がなかったが、Ｓ１０誘発性のＬＹ取込みを完全に抑止した。
【０３７０】
マクロピノサイトーシスは、ワートマニンによるＰＩ３Ｋ（Ｌｅｈｎｅｒら（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１０、８３９〜８４２）、ダイナソー（dynasore）によるダイナミン（Ｇｏｌｄら（２０１０）ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、５、ｅ１１３６０）、およびサイトカラシンＤによるアクチン（Ｇｒｉｍｍｅｒら（２００２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１５、２９５３〜２９６２）の活性のかく乱に対しても感受性でもあり、これらは全て、ＧＣＳにおけるＳ１０誘発性ＬＹ取込みを完全に妨げた。
【０３７１】
７．５ｕＭ濃度のＳ１０に６時間曝露したＧＣＳに対して行った透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、細胞における大量の空胞形成の誘発が定量的に確認された。クラスリンコーティングしたエンドソームはサイズが規則的であり、二重膜により縁どられている。ＧＳＣに観察される多数の空胞は大型であり、殆どが空で、単一の膜により縁どられており、細胞質のコートの非存在を表し、マクロピノソームと一致する特徴であった（Ｏｖｅｒｍｅｙｅｒら（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６、９６５〜９７７）。Ｓ１０により誘発される透明な空胞は、高電子密度のオルガネラの残骸または分解された細胞質成分を典型的に含む、リソソーム、オートリソソーム、および後期エンドソームと異なっていた（Ｄｕｎｎ（１９９０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１０、１９３５〜１９４５；Ｏｖｅｒｍｅｙｅｒら（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６、９６５〜９７７）。膨潤した小胞体およびミトコンドリア、ならびに歪められた二重層構造の核膜が時折観察され、時折異常な空胞の膜融合が示唆された。溶解しかかっている細胞では、空胞が、細胞膜の多くが破裂する点まで拡張しているのが典型的であった。マクロピノソームは、およそ０．５〜５．０μｍからの様々なサイズ範囲を表し、ＴＥＭにより定量したＳ１０誘発性空胞の範囲と一致した（７．５μＭ濃度、６時間）。透明な空胞であり、リソソームから分離されているのにかかわらず、マクロピノサイトーシスの空胞は、後期エンドソームおよびリソソームのマーカーであるＬＡＭＰ１をリクルートする（Ｏｖｅｒｍｅｙｅｒら、（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６、９６５〜９７７）。一貫して、Ｓ１０（７．５μＭ）は、刺激６時間後にＧＳＣにおけるＬＡＭＰ１免疫蛍光の速やかかつ顕著な増大をまねき、これは時折、膜の突出にも関連した。
【０３７２】
これらの結果は、一括して、壊死様の細胞死をもたらす破局的な空胞形成をまねく、Ｓ１０による大量のマクロピノサイトーシスの開始に対する証拠を提供するものである。
関係づけられる細胞経路を同定するためのｓｈＲＮＡスクリーニング
ｓｈＲＮＡライブラリーでのゲノムワイドのスクリーニングを用いて、Ｓ１０誘発性マクロピノサイトーシスに対する経路を同定した。この取組みは、経路における主要な因子を枯渇すると、ＧＳＣはＳ１０誘発性の死滅に対して不応性になるという考えに基づくものであった。ヒトモジュール１（様々なシグナリング経路に関連する遺伝子）、ヒトモジュール２（疾患関連の遺伝子）、およびヒトモジュール３（細胞表面、細胞外、およびＤＮＡ結合に関連する遺伝子）にグループ分けした１５３７７個の遺伝子を網羅するｓｈＲＮＡ８２５００個からなる、３つの異なるＤＥＣＩＰＨＥＲプールしたレンチウイルスのｓｈＲＮＡライブラリーを用いて、Ｕ３０１３ＭＧ  ＧＳＣを形質導入した。４日後、Ｓ１０  １４μＭを１日間加え、その後細胞を標準培地で５か月培養した。その後、生存細胞を解離し、さらに拡大した。生存細胞は、顕著に異なる細胞外観を表し、細胞突出を有する細長い形態を失っており、その代わり小型で円形であった。得られたＳ１０抵抗性ＧＳＣは、線維芽細胞同様（ＥＣ50  １８．７±０．０６μＭ）、ＧＳＣ生存性に対して１４．３±１．１６μＭのＥＣ50を表した。抵抗性のＧＳＣから調製したＤＮＡを配列決定することにより、ＭＡＰ２Ｋ４  ｓｈＲＮＡウイルスの存在の顕著な濃縮が明らかになった。ＭＡＰ２Ｋ４によりコードされるＭＫＫ４のリン酸化を活性化するための、ＧＳＣの蛍光染色およびウエスタンブロット分析により、Ｓ１０による速やかかつ明白な活性化が明らかになった。ホスホ−ＭＫＫ４は、Ｓ１０曝露５分以内に増大し、少なくとも２６時間の刺激の間、同様のレベルにとどまった。独立した５個のｓｈＲＮＡによるＭＡＰ２Ｋ４活性の抑止は、Ｓ１０処理したＧＳＣのＥＣ50生存性の値の顕著な増大をまねいた。ホスホ−ＭＫＫ４に対する免疫染色により、Ｓ１０処理細胞における細胞質の点状の染色が明らかになった。これらの結果は、ＧＳＣのＳ１０誘発性の死滅を実行する、シグナリング経路における決定的な結節としてＭＫＫ４の活性化を同定するものである。ＭＫＫ４はその後、Ｓ１０誘発性マクロピノサイトーシスに必要とされるタンパク質であることが確認された。よって、ＭＡＰ２Ｋ４をノックダウンした後、骨肉腫細胞で見られたもの同様、Ｓ１０は空胞形成およびＬＹ組入れを誘発することができず、死滅に対する抵抗性はＳ１０によって誘発されるマクロピノサイトーシスの不完全な形成に関連することが示された。よって、ＧＳＣにおけるマクロピノサイトーシスおよび死滅に対する感受性の特有の特徴は、ＭＫＫ４活性を必要とする。
ＳＡＲ分析
化合物を、発光ベースのＡＴＰ定量によって生存性を測定する、標準の１１ポイントの用量反応アッセイにおいて試験し、有効性に決定的である主要な位置化学的および立体化学的な特徴が明らかになった（表１および２を参照されたい）。
【０３７３】
例１４．ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍成長および浸潤のＳ１０による減弱
ｉｖ、ｉｐ、および経口投与後、血漿および脳曝露のｉｎ  ｖｉｖｏの薬物動態学的分析により、長時間の半減期および優れたバイオアベイラビリティが明らかになった。ゼブラフィッシュの異種移植片グリオブラストーマモデルを、Ｓ１０が腫瘍の発生を阻害する有効性に対する定量分析に、および宿主の脳における細胞の浸潤の定量に開発した。蛍光標識したＵ３０１３ＭＧ  ＧＳＣを、ゼブラフィッシュの４８〜５２ｈｐｆの幼生の脳室中に頭蓋内注射した。１週間以内に、ＧＳＣは速やかに拡大し、脳室内に腫瘍細胞塊を形成し、脳を浸潤し始めた。発達中の腫瘍は、ヒトの核抗原に対する染色により、ヒト起源であることが確認された。ＧＳＣ移植したゼブラフィッシュを、Ｓ１０（１５μＭ）を水槽水に１０日間適用することにより処理した。オリジナルの腫瘍塊から浸潤性の細胞の平均距離を測定することによって、面積、蛍光レベル、および浸潤を定量化することにより腫瘍のサイズを決定した。Ｓ１０処置した動物は、腫瘍成長の顕著な減弱を示した。さらに、脳実質への細胞の遊走は低下し、腫瘍浸潤に対する効果が指摘された。
【０３７４】
Ｓ１０が腫瘍の進行を減弱する能力を、ヒトＧＢＭに対するマウスモデルにおいて、次に試験した。Ｎｏｄ／ＳＣＩＤマウスに１０００００個のＵ３０１３Ｍ  ＧＳＣを頭蓋内注射し、得られた腫瘍を７週間発達させた。マウスは全て、脳を切開する間に公然と観察される、宿主の脳に浸潤する大型かつ高度に空胞化した腫瘍を表し、大型の壊死面積をしばしば表した。腫瘍の組織病理学的分析により、偽柵状配列構造の壊死の領域、有糸分裂細胞、および広範な微小血管の増殖を含む、多形神経膠芽腫のいくつかの特徴が示された。腫瘍は、ヒトネスチン（ｈＮｅｓｔｉｎ）およびヒトＧＦＡＰ（ｈＧＦＡＰ）に対して極めて免疫反応性であった。細胞を移植した６週間後に、Ｓ１０（１５μＭ、０．５μＬ／時間）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を、浸透圧ミニポンプによって、オリジナルの細胞沈着の部位中に投与した。処置１週間後、動物を組織学的分析用に収集した。Ｓ１０投与開始時に癌のステージが進行していたにもかかわらず、壊死による脳組織の喪失は、ビヒクルに比べてＳ１０で処置した動物では顕著かつ大幅に低減しており、腫瘍は一様に小型であった。一貫して、腫瘍の浸潤、ならびにｈＧＦＡＰおよびｈＮｅｓｔｉｎの免疫活性の領域は、Ｓ１０処置動物で大幅に低減した。Ｓ１０処置したマウスにおける腫瘍は、明確な辺縁で囲まれておらず、Ｓ１０が、腫瘍成長を停止させ、腫瘍塊内と辺縁周辺の両方に残存するグリオブラストーマ細胞の密度を低減したことが指摘された。大量のＬＡＭＰ１染色が、Ｓ１０投与１週間後に腫瘍細胞塊内に観察され、殆どまたは全ての細胞が免疫反応性を表し、ビヒクルを投与したマウスはＬＡＭＰ１を欠いていた。これらの結果は、Ｓ１０はｉｎ  ｖｉｔｒｏと同様のｉｎ  ｖｉｖｏ経路を活性化すること、宿主の脳では染色が観察されなかったことから、この経路の活性化はＧＢＭに選択的であること、および投与すると腫瘍の成長を減弱する能力があることを示す。
【０３７５】
Ｓ１０の、経口および腹腔内注射によるｉｎ  ｖｉｖｏのバイオアベイラビリティを調査した。ｉｖ、ｉｐ、および経口投与後の血漿および脳曝露のｉｎ  ｖｉｖｏの薬物動態学的生物分析により、長時間の半減期（ｔ1/2＝２０時間）および優れたバイオアベイラビリティ（Ｆ＝６９％）が明らかになった。第２の送達レジメンでは、経口による処置（２０ｍｇ／ｋｇ）を、１日２回５日間行った。処置をＧＢＭの末期、すなわちＵ３０１０Ｍ  ＧＣＳを移植した６週間後に開始し、処置開始時からの生存の中央値および危険率をスコア付けした。Ｓ１０処置した動物は、生存の中央値１２日（ｎ＝９匹）を示し、それに比べてＤＭＳＯ処置した動物では７日（ｎ＝９匹）だった（９５％ＣＩ比０．２１０９〜０．９５５７の間）。２つの生存曲線の比較により危険率２．２９３が指摘され、非処置群における死亡率は、Ｓ１０処置群の死亡率の２倍を超えることが指摘された。
【０３７６】
これらの結果は、Ｓ１０は、マウス異種移植片モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏの認容性が良好であり、好ましい薬物動態学的プロファイルを有し、末期のＧＢＭでも平均余命を延長することを指摘するものである。
細胞培養物
ＧＳＣを、以前に記載されている方法を用いて（Ｓｕｎ、２００８）、Ｎ２、Ｂ２７、ＥＧＦ、およびＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を補った無血清培地で増殖させた。培養皿を、使用前に１０ｕｇ／ｍｌのＬａｍｉｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で３時間プレコーティングし、コンフルエントの細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１：３から１：５に分割した。ヒト骨肉腫および線維芽細胞細胞系を、以前に記載されている通り（Ｂｒｕｓｅｒｕｄら（２００５）Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１３１、３７７〜３８４；Ｈｏｖａｔｔａら（２００３）Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ、１８、１４０４〜１４０９）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補ったＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で培養した。Ｒ１のｍＥＳＣｓを、以前に記載されている通り、懸濁液中、Ｎ２サプリメント、０．４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）、１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子、および１０００Ｕ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した（Ａｎｄａｎｇら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ、４５１、４６０〜４６４）。細胞を、トリプシン処理で解離した（Ｔｒｙｐｌｅ  Ｅ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  １×、Ｇｉｂｃｏ）。実験用に、ｍＥＳＣを、０．２％ゼラチンコーティングしたプレート上で増殖させた。一次マウスグリア細胞培養用に、Ｐ０期の新生仔マウスを取り、脳組織を分離し、公開されているプロトコールに従って培養した（Ｔａｍａｓｈｉｒｏら（２０１２）Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ、ｅ３８１４）。
動物の維持および組織の収集
動物実験は全て、国家のガイドラインおよび地域の倫理委員会（national guidelines and local ethical committee）Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍｓ  Ｄｊｕｒｆｏｒｓｏｋｓｅｔｉｓｋａ  Ｎａｍｎｄに従って行った。野生型Ｃ５７オスマウスおよびＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ）を、ゆったりと収容し、認可されたプロトコールに従って実験を行った。還流および固定を、以前に記載されている通りに行った（Ｄｅｆｅｒｒａｒｉら（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ、１９、１０１〜１１４；Ｐｈｉｅｌら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ、４２３、４３５〜４３９）。還流したマウスから脳を切り出し、４℃で一夜、ＰＢＳ中４％ＰＦＡに移した。野生型ゼブラフィッシュを、２８．５℃および標準の摂食、ケア、および卵収集の条件下に維持した。自然交配により胚を収集し、Ｋｉｍｍｅｌらに従って段階づけた（Ｋｉｍｍｅｌら（１９９５）Ｄｅｖ  Ｄｙｎ、２０３、２５３〜３１０）。胚を、受精後時間（ｈｐｆ）および受精後日数（ｄｐｆ）において段階づけし、収集した胚を、０．１％トリカインを用いて最初に麻酔し、氷上に維持し、４％パラホルムアルデヒド中様々な段階で一夜固定し、次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴｗ）を含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。
小分子スクリーニングの設定および表現型分析
Ｔｈｅ  ＮＣＩ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ  ＩＩ小分子ライブラリーを、Ｅｘｃｅｌ用ＪＣｈｅｍ（ＣｈｅｍＡｘｏｎ）ソフトウエアを用いてインシリコ分析して、１３６４個の小分子を、生物学的試験に適用できる化学および構造上の適合性に関して、同定し、グループ分けした。同定したサブセットを、次いで、ＮＣＩ／ＤＴＰ  Ｏｐｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から１０ｍＭ  ＤＭＳＯ保存溶液として得た。一次スクリーニングに、９６ウエル透明底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、ＧＳＣに対するスクリーニングに用いる３時間前にラミニン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングし、またはｍＥＳＣに用いる３時間前に０．２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、または線維芽細胞、骨肉腫、もしくは一次マウスグリア細胞に用いる３０分前に無菌１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄の何れかを行った。スクリーニング前に、ラミニンもしくはゼラチンもしくはＰＢＳを９６ウエルプレートから除去し、細胞を、１ウエルあたりそれぞれの媒体１００μｌ中細胞１００００個の量に希釈した。細胞を各ウエルに分配し、一夜インキュベートした。プレートの外周のウエルはスクリーニングに用いず、各レーンに対する対照としてとっておいた。一次スクリーニングを、２濃度の（５μＭおよび３０μＭ）、ＧＳＣ（Ｕ３０１３およびＵ３０４７）、線維芽細胞、ならびにｍＥＳＣに対して行った。化合物を手操作で各ウエルにピペッティングし、ＧＳＣまたは線維芽細胞または骨肉腫またはマウスグリア細胞を２４時間インキュベートし、引き続き細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定した。ｍＥＳＣスクリーニング用に、細胞を４日間増殖させ、コロニーを形成させた。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、製造元の指示に従ってファロイジンおよびＤＡＰＩのＰＢＳ溶液と３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＣＤカメラを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡を用いて画像化した。次いで、画像を、正常（非処理もしくはＤＭＳＯ処理同様）、ルーズまたは融合（細胞の形状がよりアメーバに近く、凝集物を形成した）、および小型（細胞質が破裂し、かつ／もしくはサイズが劇的に低下した死細胞）の３つのカテゴリーにグループ分けした。各カテゴリーを代表する選択したウエルを、共焦点画像化に採択した。ｍＥＳＣに対して、化合物ありまたはなしで４日培養後、コロニーの明視野画像を上記の設定で得た。ｍＥＳＣの画像を、生存（表現型上正常なＥＳＣコロニー）または死滅（死滅もしくはコロニーを形成できない何れかの単一のｍＥＳＣ細胞）にグループ分けした。一次スクリーニングから、試験した各分子の効果を記述し、ＧＳＣ間（Ｕ３０１３、Ｕ３０４７）、ならびにｍＥＳＣおよび線維芽細胞と比較して、ＧＳＣのみに影響を及ぼす化合物を同定した。次いで、同定した化合物を他のＧＳＣ系統のパネル（Ｕ３０１３、Ｕ３０４７、Ｕ３０２４、Ｕ３０３１、Ｕ３０３７、Ｕ３０８６、Ｕ３０５４、Ｕ３０６５）に曝露し、効果を記述した。
【０３７７】
マクロピノサイトーシスの様々なインヒビターでの処理には、ＧＳＣをインヒビターと３０分間、最初にプレインキュベートし、次いでＳ１０を加え、およそ５時間インキュベートし、引き続きルシファーイエロー（ＬＹ）を加え、２０分間インキュベートした。次いで、培地を洗い流し、新鮮な培地を置きかえ、プレートを画像化に採択した。ＬＹを含む細胞のパーセントをスコア付けし、そのデータでグラフをプロットした。
多重パラメーターアッセイ
ＧＳＣ／線維芽細胞／ｍＧｌｉａ細胞における、細胞の生存性、細胞毒性、およびアポトーシスを測定するために、上記に記載した手順を用いて、細胞を３８４ウエルマイクロタイタープレートで増殖させた。１ウエルあたり合計１００００個の細胞を分配し、それぞれの増殖培地４５μｌ中で一夜インキュベートした。次いで、試験化合物をウエルに移して最終体積５０μｌにし、プレートをそれぞれ２４、４８、７２、または９６時間、さらにインキュベートした。細胞の生存性、細胞毒性、およびアポトーシスを、製造元の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、およびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ９  Ａｓｓａｙを用いて測定した。カスパーゼ３およびカスパーゼ７の時間依存的な放出を測定するために、カラム１〜１１の各列に、１００％ＤＭＳＯ中化合物３ｍＭ〜５００μＭの連続的な１１ポイントの用量反応希釈が２０μｌ／ウエルとなるように、９６ウエルＰＰマイクロタイター化合物プレート（ＮＵＮＣ）を調製した。陰性（１００％ＤＭＳＯ）および陽性（ＤＭＳＯ中１ｍＭスタウロスポリン）対照をそれぞれカラム１２の１〜４列および５〜８列に配置した。プレートを、ＦｌｅｘＤｒｏｐ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて１ウエルあたり増殖培地１８０μｌで希釈し、得られた化合物溶液５μｌを、増大性の時間点（５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、６００分）に４つずつ、上記に記載した通り、１ウエルあたり培地４５μｌ中７０％のコンフルエントに増殖させたＧＳＣを含む３８４ウエル透明黒底マイクロタイタープレートに、９６ウエルピペッティングヘッドを付けたＣｙＢｉＷｅｌｌ（ＣｙＢｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて移し、引き続きインキュベートした。化合物を加えた最後の時間の後、プレートをインキュベータから取り出し、新たに調製したＣａｓｐａｓｅＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を、製造元の推奨に従ってプレートの各ウエルに加えた。Ｖｉｃｔｏｒ３  ＦＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）マイクロタイタープレートリーダーを用いて発光を測定し、放出されたカスパーゼ３／７のレベルを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ６．０２）ソフトウエアを用いて、対照に対して定量した。
【０３７８】
化合物のＧＳＣ生存性の用量反応阻害を決定し、空胞形成の誘発を決定するために、９６ウエルＰＰ（ＮＵＮＣ）化合物プレートを上記に記載した通りに調製し、カラム１〜１１に１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭから０．１７ｕＭまでの各化合物の段階希釈をもたらした（１０μｌ／ウエル）。陰性（１００％ＤＭＳＯ）および陽性（１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭ  Ｓ１０）対照をそれぞれ、カラム１２の１〜４列および５〜８列に配置した。ウエルを、対応する増殖培地１９０μｌで希釈し、各ウエルの化合物溶液５μｌを４つずつ、増殖培地４５μｌ中７０％コンフルエントのＧＳＣを含む、滅菌３８４ウエル透明黒底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）のウエルに移した。プレートを２４時間インキュベートし、その後プレートをインキュベータから取り出し、各ウエルを、３７℃および５％ＣＯ２で、Ｏｐｅｒｅｔｔａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて明視野で画像化して、各濃度での空胞の蓄積を決定した。次いで、プレートを室温に放冷し、各ウエルを新鮮なＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬２５μｌで処理した。プレートを１５分間振盪し、発光を、Ｖｉｃｔｏｒ３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）マイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。合計の発光を、対照に対して標準化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ６．０２）ソフトウエアを用いて曲線の適合を行った。
【０３７９】
混合培養アッセイを行うために、細胞を、製造元の指示に従って、使用１時間前に、細胞トラッカーレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または細胞トラッカーグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で個別に標識した。次いで、標識した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、それぞれの培地に再懸濁した。合計２０００個の細胞（赤で標識した１０００個および緑で標識した１０００個）を、ペトリ皿の蓋上、最終体積５０μｌの培地（化合物ありまたはなし）を測定する液滴上にピペッティングした。次いで、蓋を、ＰＢＳ２０ｍｌを含む１０ｃｍペトリ皿上に注意深くひっくり返した。プレートを一夜インキュベートし、引き続き８％ＰＦＡ  ５０μｌを用いて細胞を固定して最終濃度４％ＰＦＡとした。固定した細胞を、ガラス底ペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に直ちに移し、共焦点画像化に直ちに採択した。
【０３８０】
希釈および回復アッセイを行うために、ＧＳＣを解離し、スクリーニングに関して９６ウエルプレート中に分配した。一次スクリーニングから表現型を生成する化合物を加え、プレートを２日間インキュベートした。生成された表現型を記録し、引き続き化合物を含む培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、化合物を含まない新鮮な増殖培地を加え、プレートを２日間インキュベートした。その後、細胞を固定し、上記に記載した通りファロイジンおよびＤＡＰＩで染色し、表現型を記録した。ＦＡＣＳベースの細胞周期プロファイリングには、ＧＳＣを７０％コンフルエントに増殖させ、指摘した濃度のＤＭＳＯまたは化合物の何れかに一夜曝露し、引き続き解離し、ＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁した。次いで、細胞を、７５％エタノール中で一夜固定し、ＰＢＳ中で再水和した後、先に記載されている通り、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ）染色を行った（Ａｎｄａｎｇら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ、４５１、４６０〜４６４）。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳｃａｎ機器上、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエアを用いて行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した。アポトーシスおよび死滅したＧＳＣのパーセント値を、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ）で二重染色することにより定量し、データをフローサイトメトリーにより獲得した。ＧＳＣをＤＭＳＯ、Ｓ１０、またはスタウロスポリンで処理し、処理後トリプシン処理し、次いで、インキュベーションバッファー１００μｌ、アネキシンＶ２μｌ、およびＰＩ２μｌ中に懸濁し、室温の暗所に１０分間維持した。１時間以内に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳｃａｎ機器上ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエアを用いて行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した。
【０３８１】
レシオメトリーによるカルシウムの画像化および定量を、細胞にＦｕｒａ−２／ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）をローディングすることによって行い、Ｃａ２＋の画像化を、（Ｕｓｏｓｋｉｎら（２０１０）ＰＮＡＳ、１０７、１６３３６〜１６３４１）に従って行ったが、Ｆｕｒａ−２／ＡＭの最終濃度が１μＭであり、実験をクレブスバッファー中３７℃で行ったことが異なった。ＤＲ／Ｒｏ＝（Ｒ−Ｒｏ）／Ｒｏを計算して細胞応答を測定し、式中、ＲはＦ３４０／Ｆ３８０比であり、Ｒｏは各刺激開始前のベースライン比（刺激前の３つのデータポイントの平均）である。Ｃａ２＋獲得レートは、刺激間０．１〜０．２Ｈｚ、刺激中１Ｈｚであった。ＧＳＣに致死的である最低濃度の化合物を手操作で適用した。化合物を、４〜５分間隔で、結果的に１〜２分間適用した。４から５個の化合物を各プレート上で試験し、引き続き各実験の終わりに陽性対照としてＡＴＰ刺激した。刺激の経過の間ＤＲｍａｘ／Ｒｏの最大応答が０．２を超える場合、所与の刺激に応答する細胞を計数した。典型的に、顕微鏡の１視野に１００から１５０個の細胞が記録された。
【０３８２】
細胞外液体の取込みを、ルシファーイエロー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、画像化することにより、化合物で６時間処理した細胞においてモニタリングした。あるいは、ルシファーイエローを１５分加えた後、化合物を加え、細胞を、化合物の存在下で４〜６時間インキュベートし、その後洗浄し、画像化した。共焦点顕微鏡、倒立蛍光顕微鏡、またはＯｐｅｒｅｔｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）細胞画像化システムを用いて画像を得た。細胞中の活性なミトコンドリアおよび小胞体を可視化するために、活性なミトコンドリア膜電位を可視化するためのＴＭＲＥ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＥＲトラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ、製造元が供給する指示に従って用いた。
【０３８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの毒性試験
ゼブラフィッシュモデルを用いて、スクリーニングから進行したヒットの、発達毒性および心毒性を評価した。発達毒性試験では、１細胞段階のゼブラフィッシュ胚を９６ウエルプレート中に分配し（１ウエルあたり卵水２００μｌ中胚３個）、対照としてＤＭＳＯ、または様々な濃度の化合物に曝露した。卵水（化合物ありまたはなし）を６時間ごとに再配置し、胚を３日間成長させた。胚を毎日モニタリングし、５日間成長させた後表現型を記録した。心毒性アッセイでは、本発明者らが以前に公開した手順に従って成年心臓のｅｘ  ｖｉｖｏ培養を行った（Ｋｉｔａｍｂｉら（２０１２）ＢＭＣ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２、３）。オスゼブラフィッシュからの成年心臓を化合物に曝露し、心拍動に対する効果を記録し、開発した方法を用いて分析した（Ｋｉｔａｍｂｉら（２０１２）ＢＭＣ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２、３）。
切片化
凍結させた凍結切片を調製するために、固定後のマウス脳またはゼブラフィッシュ胚を、ＰＢＳ中３０％スクロースに移し、４℃で２日間インキュベートし、その後スクロース溶液をｃｒｙｏｆｒｅｅｚｅ培地で置きかえ、４℃で１日間インキュベートした。ｃｒｙｏｆｒｅｅｚｅ培地中の組織を、次いで、凍結させてブロックにし、クリオスタット上で１４μｍの切片にした。切片を、先に記載されている通り、プレコーティングしたスライドガラス上に収集した（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、６１１、３〜１８；ＫｉｔａｍｂｉおよびＨａｕｐｔｍａｎｎ（２００７）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ、７、５２１〜５２８）。パラフィン切片化用に、単離した脳を固定し、他に記載されている標準的プロトコールを用いて、パラフィン包埋用に処理加工した（Ｈｅｗｉｔｓｏｎら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、６１１、３〜１８）。６μｍの薄切片を、ミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊｕｎｇ）を用いて調製した。プラスチック切片を調製するには、以前に記載されている通り、ゼブラフィッシュの胚を４％ＰＦＡ中に固定し、５０％、７５％、８５％、および９５％エタノール水溶液中で各１５分脱水し、ＪＢ４樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）に包埋した（ＫｉｔａｍｂｉおよびＭａｌｉｃｋｉ（２００８）Ｄｅｖ  Ｄｙｎ、２３７、３８７０〜３８８１）。厚さ５μｍの切片を、ミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊｕｎｇ）を用いて調製し、デジタルカメラ（Ａｘｉｏｃａｍ、Ｚｅｉｓｓ）で写真撮影し、顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）上に搭載した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウエアを用いて画像を処理加工した。
組織学
ヘマトキシリンおよびエオシン染色用に、パラフィン切片化したマウス脳を、キシレン中で手短に脱パラフィンし、アルコール勾配中水まで水和し、Ｍｅｙｅｒのヘマトキシリン（細胞質）およびエオシン（核）を用いて染色し、次いで、アルコール勾配中で脱水し、キシレン中で清澄にした。他に記載されている通り、搭載にＰｅｒｍｏｕｎｔを用いた（Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００８）ＣＳＨ  Ｐｒｏｔｏｃ、４９８６）。ゼブラフィッシュＪＢ４プラスチック切片を処理加工し、以前に記載されているプロトコールを用いて染色に採択した（ＫｉｔａｍｂｉおよびＭａｌｉｃｋｉ（２００８）Ｄｅｖ  Ｄｙｎ、２３７、３８７０〜３８８１）。染色した切片を、デジタルカメラ（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）を搭載した顕微鏡で写真撮影した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）ソフトウエアを用いて画像を処理加工した。
免疫染色
凍結切片化したマウスまたはゼブラフィッシュの脳を有する、プレコーティングしたスライドグラスを室温に解凍し、ＰＢＳで手短に洗浄してｃｒｙｏｆｒｅｅｚｅ培地を除去した。次いで、マウス脳切片を、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）免疫組織化学染色または免疫蛍光染色の何れかのために処理加工し、ゼブラフィッシュ切片を、免疫蛍光染色用に採択した。ＤＡＢ免疫染色手順は、以前に記載されている通りに行った（ＴｏｌｅｄｏおよびＩｎｅｓｔｒｏｓａ（２０１０）Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１５、２７２〜２８５）。免疫試薬の洗浄および希釈は、実験を通して０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて行った。内在性ペルオキシダーゼ活性のクエンチングを、０．５％Ｈ２Ｏ２で３０分間処理して実現し、引き続きＰＢＳ−Ｔ中１０％正常ロバ血清と室温で１時間インキュベートして非特異的な結合を回避した。一次抗体ヒトＧＦＡＰ（１：５００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはヒトネスチン（１：１０００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を４℃で一夜インキュベートした。ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて検出を行い、０．６％ジアミノベンチジンおよび０．０１％Ｈ２Ｏ２とＡＢＣ増幅（ＡＢＣ  Ｋｉｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて発色させた。免疫染色後、切片を全てスーパーフロストスライドガラス上に搭載し、自然乾燥させ、脱水し、封入剤Ｄ．Ｐ．Ｘ．（Ｓｉｇｍａ）で覆った。免疫蛍光染色用に、切片またはカバーガラス上に増殖させたＧＳＣをＰＢＳ−Ｔで手短に洗浄し、１０％正常ロバ血清中で３０分間ブロックした（ブロッキング溶液）。ブロッキング後、以前に記載されている通り（Ｍａｒｍｉｇｅｒｅら、２００６）、ブロッキング溶液中の、抗ＬＣ３抗体（１：５００希釈、Ｎａｎｏｔｏｏｌｓ）または抗ＬＡＭＰ１抗体（１：５００希釈、ａｂｃａｍ）または抗ホスホ（Ｓ２５７／Ｔｈｒ２６１）−ＳＥＫ１／ＭＫＫ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＮｅｓｔｉｎ（１：１０００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗ヒト核抗原抗体（１：５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）または抗活性化切断カスパーゼ３抗体（Ａｓｐ１７５）（１：１００希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からなる一次抗体溶液とインキュベートし、引き続き試料をフルオロフォアコンジュゲートした二次抗体（Ａｌｅｘａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とインキュベートし、免疫蛍光封入剤（Ｄａｋｏ）を搭載した。
細胞抽出物およびイムノブロッティング
ホールセル抽出物を、ＳＤＳ−バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）、およびホスファターゼインヒビター［２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２０ｍＭベータ−グリセロールリン酸］、および１％ＳＤＳ）中に調製した。試料を、以前に記載されている通り、ウエスタンブロットにより以下の抗体で分析した（Ａｒａｎｄａら（２００８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２８、５８９９〜５９１１）：抗−ヒストンＨ３（Ａｂｃａｍ）、抗トリメチル（Ｌｙｓ２７）−ヒストンＨ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、および抗−ホスホ（Ｓ２５７／Ｔｈｒ２６１）−ＳＥＫ１／ＭＫＫ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０３８４】
インシリコＡＤＭＥ予測
薬物類似性、固有の水溶性、および受動的Ｃａｃｏ２膜透過性、および経口吸収性の予測を、スウェーデン、ウプサラ大学薬学部（Department of Pharmacy, Uppsala University）のＵＤＯＰＰによって開発された計算モデルを用いて行った。モデルは、薬物および薬物様分子の注意深く監督されたデータセットに基づく。モデルを訓練するのに用いた溶解性および透過性のデータは、過去２０年の間にＵＤＯＰＰで開発され、最適化され、検証された、高度に制御されたアッセイを用いて測定された。
ライブ画像化
細胞のライブ画像化を、透明黒底３８４ウエルＴＣ  ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中、指摘された倍率のＯｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、５％ＣＯ２および３７℃下に維持した生存細胞チャンバーを用いて行った。画像および動画は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて処理加工した（Ｒａｓｂａｎｄ、Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７−２０１２）。
走査型電子顕微鏡
７０％コンフルエントに増殖させたＧＳＣをトリプシン処理し、ＤＭＳＯまたは７．５μＭ  Ｓ１０を含む増殖培地１ｍｌに再懸濁した。細胞をＤＭＳＯまたは７．５μＭ  Ｓ１０に６時間曝露した。再懸濁した細胞を、ポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）の表面上に直接滴下した。ポリカーボネートフィルターは、ＧＰ  Ｐｌａｓｔｉｃ  ＡＢ（Ｇｉｓｌａｖｅｄ、スウェーデン）によって特別に調製され、Ｓｅｍｐｏｒｅ  ＡＢ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）によって供給された。フィルターを、下から陰圧の吸引を適用するとフィルターの中央に細胞を流れさせる流路でデザインされた気密装置に装着した。陰圧吸引約２分後、細胞培地を完全に除去したら、これらを引き続き、ＪＥＯＬ  ＪＦＣ−１２００  Ｆｉｎｅ  Ｃｏａｔｅｒ（ＪＥＯＬ、東京、日本）で２分間、イオン化金で厚さ４０Åにコーティングした。直径１ｃｍの各フィルターの合計面積を、ＳＥＭ顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＭ  ５１５、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）を用いて調べた。試験で用いたＳＥＭ方法は、ＣＳＦにおけるヒト免疫不全ウイルスを早期に検出したものである（Ｓｏｎｎｅｒｂｏｒｇら（１９８９）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１５９、１０３７〜１０４１）。
透過型電子顕微鏡
ＧＳＣを７０％コンフルエントに増殖させ、ＤＭＳＯまたは７．５μＭ  Ｓ１０の何れかに６時間曝露した。次いで、細胞を０．１  Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４中２．５％（重量／体積）グルタールアルデヒドを用いて室温で３０分間手短に固定し、その後ペトリ皿を掻き取り、さらなる固定のためエッペンドルフ管中に移し、４℃で貯蔵した。次に細胞を０．１Ｍリン酸バッファー中ですすぎ、遠心分離した。ペレットを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中２％（重量／体積）四酸化オスミウム中４℃で２時間、後固定し（post fixed）、エタノール、引き続きアセトン中で脱水し、ＬＸ−１１２（Ｌａｄｄ）に包埋した。超薄の切片（４０〜５０ｎｍ）を、Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＵＣ  ６ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を用いて切断した。切片を、酢酸ウラニル、引き続きクエン酸鉛で際立たせ、１００ｋＶでＴｅｃｎａｉ  １２  Ｓｐｉｒｉｔ  Ｂｉｏ  ＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ）で調べた。Ｖｅｌｅｔａカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いてデジタル画像を撮影した。電子顕微鏡写真を、以前に記載されている通りに得た（Ｒｕｚｚｅｎｅｎｔｅら（２０１２）ＥＭＢＯ  Ｊ、３１、４４３〜４５６）。
ｓｈＲＮＡスクリーニング
７０％コンフルエントに増殖させたＧＳＣを、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｄｕｌｅ１、２、および３からなるＤＥＣＩＰＨＥＲプールしたレンチウイルスのｓｈＲＮＡライブラリーにより、以前に記載されているプロトコールを用いて形質導入した（Ｐａｓｉｎｉら、２００８）。次いで、上首尾に形質導入した細胞を、ピューロマイシンを用いて選択し、対照としてＤＭＳＯ、または様々な濃度のＳ１０を含む増殖培地に再塗抹した。曝露２４時間後、ＤＭＳＯまたはＳ１０含有増殖培地を、通常の増殖培地で置きかえ、プレートがコンフルエントになるまで細胞を増殖させた。細胞を洗浄し、収集し、以前に記載されている通りにゲノムＤＮＡ抽出およびバーコード増幅用に調製した（Ｐａｓｉｎｉら（２００８）Ｇｅｎ  Ｄｅｖ、２２、１３４５〜１３５５）。次いで、増幅したバーコードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ  ２０００シーケンサー上のシーケンシングに採択し、引き続き、このスクリーニングにおいて濃縮したｓｈＲＮＡのヒットの統計学的分析を行った。
ウイルス生成、形質導入、および薬物処置
ＭＡＰ２Ｋ４（ＣＬＬ−Ｈ−０１６２５１）用のｓｈＲＮＡ構築物をＣｅｌｌｅｃｔａから得た。各構築物１０μｇを、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４ｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド８μｇ、ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミド４μｇと混合し、ベクターを、リン酸カルシウム法を用いて２９３ＦＴ細胞中に形質導入した（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２、４５６〜４６７）。レンチウイルスの上清を、感染後２４時間および４８時間に収集し、０．４５μＭタンパク質低結合性フィルター（ＴＰＰ、カタログ番号９９７４５）を通してろ過して、デブリおよび２９３ＦＴ細胞を除去した。ウイルス上清を、４℃、４０００ｇで一夜遠心分離することにより濃縮した。次いで、ＧＳＣを、４μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９２６８）を含む培地で、濃縮したウイルスで４８時間形質導入し、およそ８０％の形質導入効率が得られた。次に、ウイルス上清を新鮮な培地で置きかえ、形質導入した細胞を４８時間維持し、選択マーカーを発現させた。その後、細胞をトリプシン処理によって分割し、ピューロマイシンを用いて選択した（１．５μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１１３８−０３）。選択後、細胞の分画をｑＰＣＲ分析用に収集して、ノックダウン効率を試験した。残存する細胞を、１０ｃｍ組織培養プレートに維持した。薬物処理を生存した、形質導入した細胞を、空胞の形成およびＡＴＰ合成を分析するために３８４ウエルプレート中に分割した。
ゼブラフィッシュ異種移植片実験
２ｄｐｆ（受精後日数）のゼブラフィッシュの幼生を、ゼブラフィッシュブックに記載されているプロトコールを用いて、トリカインを用いて麻酔した（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ（２０００）Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ、第４版、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）。麻酔した幼生を、幼生の型（larval molds）（ＫＬＳ）を用いて作製したアガロースプラットホーム上に包埋し、卵水中トリカインを充填して胚を麻酔下に維持した。グリオーマ（グリオブラストーマ）細胞を、上記に記載した通り、細胞トラッカーレッドで標識し、胚１個あたり細胞約３０００個を注射した。注射後、胚をモニタリングし、非注射または部分的に注射された胚を除去した。注射した胚を、メチレンブルーを含まない卵水中で３０分間回復させ、次いで、９６ウエルプレートに移した。胚３個を、化合物ありまたはなしの、卵水２００μｌを含む各ウエル中に移した。新鮮な卵水（化合物ありまたはなし）を１０日間、６時間ごとに補充し、引き続き胚を麻酔し、上記に記載した通り、４％ＰＦＡ中で固定した。
Ｓ１０のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験
Ｓ１０のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験をＳＡＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、インドで行って、オスＢＡＬＢ／ｃマウスにＳ１０を単一静脈内、腹腔内、および経口投与した後のＳ１０の血漿薬物動態および脳分布を決定した。血液試料（およそ６０μＬ）を、各マウスの眼窩後神経叢から収集した。血漿および脳試料は、投薬後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２、および１４４時間（ｉ．ｖ．）；０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、および２４時間（ｉ．ｐ．）、ならびに０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、および１４４時間（ｐ．ｏ．）に得た。血液の遠心分離によって血漿を収集し、分析まで−７０℃で貯蔵した。採血直後に脳試料を各マウスから収集した。組織試料（脳）を、氷冷したリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を用いてホモジナイズし、ホモジネートを分析まで−７０℃未満で貯蔵した。ホモジネートの合計体積は組織重量の３倍であった。血漿および脳試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて定量し、血漿ではＬＬＯＱ＝１．０３ｎｇ／ｍＬ、脳ではＬＬＯＱ＝１０．２５ｎｇ／ｍＬであった。Ｓ１０に対する血漿および脳の濃度−時間データを、薬物動態学的分析に用いた。脳の濃度を、ホモジネートの合計体積および脳重量を考慮して（すなわち、希釈ファクターは３であった）、ｎｇ／ｍＬからｎｇ／ｇに変換した。薬物動態学的分析を、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ（バージョン６．３）のＮＣＡモデルを用いて行った。
マウス異種移植片実験
ＧＳＣをトリプシンで解離し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に維持し、細胞の生存性を、実験の前および後にトリパンブルーを用いてチェックした。マウスの外科手術を、無菌技術を用いて行い、６から８週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、イソフルランと酸素との混合気体を用いて麻酔した。マウスを、他に記載されている通り定位固定装置上に位置付け（Ｃｅｔｉｎら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔ、１、３１６６〜３１７３）、マイクロモーターコードレスハンドドリル（Ａｎｇｔｈｏｓ）を用いて、マウスの前頭皮質上の頭蓋骨に小さな口径の孔を作製した（座標は、吻側から十字縫合に１ｍｍ、外側から正中線に２ｍｍ、および深さ２．５ｍｍであった）。５μｌ  ＰＢＳ中細胞１０００００個を充填したＨａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジ（１０μｌ）を用いて、５分の時間をかけて細胞を線条体にゆっくりと送達した。注射手順後、ニードルを５分間適所に維持して材料の逆流を最小にし、次いで５分の時間をかけてゆっくりと除去した。次いで、手術後、穿孔の孔を、骨ろうで充填した。脳内投薬用に、ＰＢＳ希釈標準溶液中Ｓ１０  １５μＭを含むＡｌｚｅｔマイクロ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ  Ｍ１００７Ｄ）を、製造元のプロトコールに従って調製した。浸透圧ポンプを細胞注射６週間後に埋め込んで、最高７日間、Ｓ１０の腫瘍部位へ持続的に送達させた（０．５μＬ／時間、合計体積１００μＬ）。マウスを麻酔した後、切開を行って、細胞注射用に以前に作製した穿頭孔を露出させ、清浄にして骨ろうをすべて除去した。ポンプを挿入し、カニューレチップ（cannula tip）を穿頭孔中に位置付け、適所に接着した。Ｓ１０の経口投薬の認容性および標準化に、野生型Ｃ５７オスマウスに、様々な用量のＳ１０を（５０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／１日２回、２０ｍｇ／ｋｇ／日）１週間、標準的な経口胃管栄養法を用いて投与した。マウスを、体重減少および苦痛（distress）の徴候に対してモニタリングした。投薬レジメンは、２０ｍｇ／ｋｇ／日が十分に認容されることを指摘した。よって、ＧＳＣ注射６週間後のＮＯＤＳＣＩＤマウスに５日間、Ｓ１０を経口的に投薬した。
マウスのカプランメイヤー実験
カプランメイヤー実験に、本発明者らは、上記に記載した通り、Ｕ３０１３ＭＧからＧＳＣ１０００００個をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注射した。次いでマウスを６週間モニタリングし、次いで経口投与レジメンを開始した。マウスに水２００μｌ、または２０ｍｇ／ｋｇに対応する水中Ｓ１０の何れかを、経口胃管栄養法によって投与した。合計９匹の動物を各処置用に採択した（対照、Ｓ１０）。経口投与を１日１回５日間続け、引き続き投与を停止し、動物が人道的なエンドポイントに到達するまでモニタリングし、その後屠殺した。
同等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに、他の特定の形態において具体化することができる。前述の態様は、したがって、ここに記載する本発明に対する限定よりむしろ、全ての側面において説明的であると考えられる。よって、本発明の範囲は、前述の記載によるよりむしろ、添付の特許請求の範囲によって指摘されるものであり、特許請求の範囲の同等の意味および範囲内に入る変更は全て、ここに包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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