(57)【要約】本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ、特にインビトロで合成されたｍＲＮＡのキャップ形成効率を定量化する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明に従う方法は、キャップされた及びキャップのないｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡサンプルを提供することと、キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、キャップ特異的結合物質を提供することと、対照と比較した複合体の量を定量的に判定し、それによって、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することと、を含む。【選択図】図１
2016515216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡキャップ形成効率の定量化方法であって、
キャップされたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡサンプルを提供することと、
キャップ特異的結合物質と前記キャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、前記キャップ特異的結合物質を提供することと、
対照と比較した前記複合体の量を定量的に判定し、それによって、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することと、を含む方法。
【請求項２】
前記キャップが、式Ｉの構造を有し、
【化９】
2016515216.tif 000011
式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、
Ｒ３は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または欠失し、
Ｒ４は、ＮＨ２であり、
Ｒ５は、ＯＨ、ＯＣＨ３、及びハロゲンから選択され、
ｎは、１、２、または３であり、
Ｍは、前記ｍＲＮＡのヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸塩基がグアニンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャップが式ＩＩの構造を持つｍ７Ｇキャップであり、
【化１０】
2016515216.tif 000012
式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、ＮＨ２であり、
Ｒ５は、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｍは、前記ｍＲＮＡのヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記キャップ特異的結合物質が、真核生物開始因子４Ｅ（ｅＩＦ−４Ｅ）、核キャップ結合タンパク質亜単位１、核キャップ結合タンパク質亜単位２、及び核キャップ結合複合体からなる群から選択されるキャップ特異的結合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャップ特異的結合物質が、キャップ特異的抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記キャップ特異的結合物質が、抗ｍ７Ｇ抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
前記複合体の量を定量的に判定する前記ステップが、ＥＬＩＳＡアッセイを実施することを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記複合体の量を定量的に判定する前記ステップが、前記複合体と関連する検出可能なシグナルを測定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能なシグナルが、前記キャップ特異的結合物質と直接関連している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能なシグナルが、前記キャップ特異的結合物質と結合する二次薬剤を介して、前記キャップ特異的結合物質と間接的に関連している、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記二次薬剤が二次抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能なシグナルが、蛍光シグナル、比色シグナル、または放射シグナルである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光シグナルが、前記キャップ特異的結合物質と直接または間接的に関連する酵素により、酵素基質を発色、化学蛍光（ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）、または化学発光産物へと転換することによって産生される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素基質が、ｐ−ピトロフェニルリン酸ニナトリウム塩（ＰＮＰＰ）、２，２´−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、及び３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素が、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対照が、既定量のキャップされたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡサンプルを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対照が、既定量の合成されたキャップを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することが、前記ｍＲＮＡサンプル中のキャップされたｍＲＮＡの絶対量を定量化することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することが、前記ｍＲＮＡサンプル中のキャップされたｍＲＮＡの割合を定量化することを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、基質上に前記ｍＲＮＡを捕捉するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍＲＮＡが、前記ｍＲＮＡのポリＡ尾部に結合するポリＴオリゴによって捕捉される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｍＲＮＡが、ポリＡ結合タンパク質または抗体によって捕捉される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記基質が、マイクロプレート、磁気ビーズ、粒子、ポリマービーズ、クロマトグラフィー樹脂、濾紙、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、シリカゲル、またはヒドロゲルである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質が、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされている、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリＴオリゴまたは前記ポリＡ結合タンパク質もしくは抗体が、ビオチン化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｍＲＮＡサンプルが、インビトロで合成される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化するためのキットであって、
キャップ特異的結合物質と、
前記キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体を検出するための１つ以上の試薬と、
キャップされたｍＲＮＡを定量化するための対照と、を含むキット。
【請求項２９】
前記キャップ特異的結合物質が、キャップ特異的抗体である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記キャップ特異的抗体が、抗ｍ７Ｇ抗体である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記キットが、ＲＮＡを捕捉するための基質をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法に従って、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化するステップを含む、ｍＲＮＡの製造方法。
【請求項３３】
前記方法が、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することからの結果に基づいた製造条件を調節するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記定量化ステップが、ｍＲＮＡロットを解放する前に実行される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法に従って製造されたｍＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日出願された米国仮特許出願第６１／７８４，２５３号の優先権を主張し、この開示の全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）治療は、様々な疾患の処置に対する益々重要な方策となりつつある。効果的なｍＲＮＡ治療は、患者への効果的なｍＲＮＡの送達及び患者の身体内のｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の効率的な産生を必要とする。ｍＲＮＡ送達及びインビボのタンパク質産生を最適化するために、適切なキャップは、典型的には、構築物の５´末端で必要とされ、それは、ｍＲＮＡを分解から保護し、好結果のタンパク質翻訳を促進する。したがって、キャップ形成効率の正確な特性は、治療用途のためのｍＲＮＡの品質を決定するために特に重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、ｍＲＮＡ、特に、インビトロで合成されたｍＲＮＡのキャップ形成効率を正確及び定量的に判定する改善された方法を提供する。上で考察した通り、適切なキャップ形成は、インビボでの好結果のタンパク質産生において重要である。しかしながら、本発明に先立って、ほとんどのキャップアッセイは、定性的であり、それは、ｍＲＮＡ系治療製品の質及び関連する安全性及びインビボでの使用の有効性を評価するのに十分でない。実際には、本発明に先立って、サンプル中のｍＲＮＡの永住的な変化を伴わないキャップ形成効率の定量化を可能にする利用可能な方法はない。下に詳細を記載する通り、本発明は、部分的に、キャップ特異的結合物質（例えば、キャップ特異的抗体）と、ＥＬＩＳＡなどの単純な技術を使用してキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成及び定量化に基づいている。したがって、本発明は、ｍＲＮＡキャップ形成効率を評価するための単純で信頼のできる効率的で定量的な方策を提供する。本発明は、ｍＲＮＡの製造中及び最終治療製品中の活性医薬成分（ＡＰＩ）としてのｍＲＮＡの特徴付けのための品質管理のために特に有用である。
【０００４】
一態様において、本発明は、ｍＲＮＡキャップ形成効率の定量化方法であって、キャップされた及びキャップのないｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡサンプルを提供するステップを含むことと、キャップ特異的結合物質と、キャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、キャップ特異的結合物質を提供することと、対照と比較した複合体の量を定量的に判定し、それによって、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することと、を含む方法を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本発明の発明的方法を使用して、式Ｉの構造を有するキャップを定量化し得、
【化１】
2016515216.tif 000003
式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、
Ｒ３は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または欠失し、
Ｒ４は、ＮＨ２であり、
Ｒ５は、ＯＨ、ＯＣＨ３、及びハロゲンから選択され、
ｎは、１、２、または３であり、
Ｍは、ｍＲＮＡのヌクレオチドである。
【０００６】
いくつかの実施形態において、核酸塩基はグアニンである。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明の発明的方法を使用して、式ＩＩの構造を持つｍ７Ｇキャップを定量化し得、
【化２】
2016515216.tif 000004
式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、ＮＨ２であり、
Ｒ５は、ＯＨまたはＯＣＨ３であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｍは、ｍＲＮＡのヌクレオチドである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、好適なキャップ特異的結合物質は、キャップ特異的結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、好適なキャップ特異的結合物質は、キャップ特異的抗体である。いくつかの実施形態において、好適なキャップ特異的抗体は、抗ｍ７Ｇ抗体である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明に従う発明的方法は、ＥＬＩＳＡアッセイを実施することによって、キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の量を定量的に判定するステップを伴う。
【００１０】
いくつかの実施形態において、複合体と関連する検出可能なシグナルを測定することによって、複合体の量を定量的に判定するステップ。いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、キャップ特異的結合物質に直接関連している。いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルが、キャップ特異的結合物質を結合する二次薬剤を介して、キャップ特異的結合物質と間接的に関連している。いくつかの実施形態において、好適な二次薬剤は、二次抗体である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、好適な検出可能なシグナルは、蛍光シグナル、比色シグナル、または放射シグナルである。いくつかの実施形態において、好適な蛍光シグナルは、キャップ特異的結合物質と直接または間接的に関連する酵素により、酵素基質を、発色、化学蛍光（ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）、または化学発光産物へと転換することによって、産生される。いくつかの実施形態において、好適な酵素基質は、ｐ−ニトロフェニルリン酸ニナトリウム塩（ＰＮＰＰ）、２，２´−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、及び３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、好適な酵素は、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、定量的な判定に好適な対照は、既定量のキャップされたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡサンプルである。いくつかの実施形態において、定量的な判定に好適な対照は、既定量の合成されたキャップを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することは、ｍＲＮＡサンプル中のキャップされたｍＲＮＡの絶対量を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化することは、ｍＲＮＡサンプル中のキャップされたｍＲＮＡの割合を定量化することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明に従う発明的方法は、基質上にｍＲＮＡを捕捉するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡ尾部に結合するポリＴオリゴによって捕捉される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ポリＡ結合タンパク質または抗体によって捕捉される。いくつかの実施形態において、好適な基質は、マイクロプレート、磁気ビーズ、粒子、ポリマービーズ、クロマトグラフィー樹脂、濾紙、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、シリカゲル、またはヒドロゲルである。いくつかの実施形態において、基質は、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡを捕捉するために使用されるポリＴオリゴまたはポリＡ結合タンパク質もしくは抗体は、ビオチン化される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明に従う発明的方法を使用して、インビトロで合成されたｍＲＮＡサンプルのｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化する。
【００１６】
とりわけ、本発明は、本明細書に記載される本発明の方法を実施するための組成物及びキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化するためのキットであって、キャップ特異的結合物質と、キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体を検出するための１つ以上の試薬と、キャップされたｍＲＮＡを定量化するための対照と、を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、好適なキャップ特異的結合物質は、キャップ特異的抗体である。いくつかの実施形態において、好適なキャップ特異的抗体は、抗ｍ７Ｇ抗体である。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ｍＲＮＡを捕捉するために基質をさらに含有する。
【００１７】
本出願で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、等価物として使用される。約／およそを伴いまたは伴わずに、本出願で使用される任意の数字は、関連技術分野の当業者によって理解される任意の正常な変動を網羅することを意味する。
【００１８】
他の特徴、目的、及び本発明の利点は、以下の詳細な記載において明らかである。しかしながら、本発明の実施形態を示しながら、詳細な記載が、限定ではなく、例示としてのみ、与えられることを理解するべきである。本発明の範囲内での様々な変更及び修正は、詳細な記載から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面は、例示目的のためであり、決して制限するものではない。
【００２０】
【図１】一次マウスモノクローナル抗ｍ７Ｇキャップ抗体が、ｍＲＮＡのキャップに特異的に結合する、本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡに基づく実施形態の例示的な図解を示す。ｍＲＮＡは、ビオチン化されたオリゴ−ｄＴプライマーとそのポリ（Ａ）尾部のハイブリダイゼーションを介して、固体基質上に間接的に捕捉され、これが、ストレプトアビジンをコーティングした固体基質に直接結合される。
【図２】本発明の様々な実施形態に存在する例示的なｍＲＮＡのキャップされた構造及びキャップのない構造の図表である。
【図３】ＥＬＩＳＡを介して測定される、分泌ヒトα−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）タンパク質レベルの定量化を実証する棒グラフである。検出されたタンパク質は、投与の６時間後、脂質ナノ粒子（ＧＬＡ  ｍＲＮＡをカプセル化した３０ｕｇ）の単回投与を介して、静脈内に送達されるＧＬＡ  ｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図４】ＥＬＩＳＡによって測定される、キャップされた及びキャップのないｍＲＮＡの様々な量におけるキャップ形成の定量化を実証する例示的なグラフを示す。検出されたシグナルは、ＲＮＡサンプル中のキャップ構造を有する抗キャップ抗体の相互作用から生じる。
【図５】ＥＬＩＳＡによって測定される、標準Ｎ７メチルキャップされたＲＮＡと共に、社内でのキャップ形成及び商業的に合成されたキャップされたｍＲＮＡの定量化を実証する例示的な棒グラフを示す。検出されたシグナルは、ＲＮＡサンプル中のキャップ構造を有する抗キャップ抗体の相互作用から生じる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本発明が、より容易に理解されるために、特定の用語を最初に定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書全体にわたって記載される。
【００２２】
親和性：当該技術分野において既知の通り、「親和性」は、特定のリガンドが結合する（例えば、非共有結合的に関連する）機密度の尺度及び／またはそれがそのパートナーから分離する速度または頻度である。当該技術分野において既知の通り、任意の様々な技術を利用して、親和性を判定し得る。多くの実施形態において、親和性は、特異的結合の尺度を表す。
【００２３】
アニールまたはハイブリダイゼーション：本明細書で使用する場合、用語「アニール」、「ハイブリダイゼーション」、及び文法的等価物は、ワトソン−クリック塩基対または非標準塩基対を介して、複合体を形成するために十分相補的であるヌクレオチド配列の間の複合体（二重鎖またはハイブリッドとも称される）の形成を指す。アニーリングまたはハイブリッド形成配列は、安定したハイブリッドを提供するために完全に相補的である必要はないと理解されるであろう。多くの場合、安定したハイブリッドは、塩基の約１０％未満が不適正塩基対である場合に形成されるであろう。したがって、本明細書で使用する場合、用語「相補的」は、約９０％以上の相同性（例えば、約９５％以上、約９８％以上、または約９９％以上の相同性）がある場合に、特定の条件下で、その補体を伴い安定した二重鎖を形成する核酸分子を指す。当業者は、より低い相補性を有するものはハイブリタイズしないが、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が、安定してハイブリダイズするようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの推定及び調節の仕方を理解する。ハイブリダイゼーション条件及びパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ及びＡｕｓｕｂｅｌ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪを参照されたい。２つの核酸分子の間の相補性は、全ての核酸の塩基が一致した場合に、「完全」、「絶対的」、「完璧」であると言われ、それ以外は、「部分的」であると言われる。
【００２４】
抗体：本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、典型的には、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、典型的には、順番に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥそれぞれを規定する、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類される。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含むことで知られる。各テトラマーは、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する、２つの同一の対のポリペプチド鎖から構成される。各鎖のＮ終端は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）は、これらの軽鎖及び重鎖それぞれを指す。抗体は、特定の抗原（例えば、ｍ７ＧｍＲＮＡキャップ）に対して特異的であり得る。抗体またはその抗原は、分析物または結合パートナーのいずれかであり得る。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化によって産生されるよく特徴付けられたいくつかのフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体が、ジスフィルド結合によってＶＨ−ＣＨ１と連結される軽鎖である、Ｆ（ａｂ）´２、Ｆａｂのダイマーを産生する。Ｆ（ａｂ）´２は、穏やかな条件下で、還元されて、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊し得、それによって（Ｆａｂ´）２ダイマーをＦａｂ´モノマーへと転換する。Ｆａｂ´モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記載のために、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。様々な抗体フラグメントが、無傷の抗体の消化の観点から規定されるが、当業者は、かかるＦａｂ´フラグメントが、化学的にまたは組み換えＤＮＡ方法論を利用することによってのいずれかでデノボ合成され得ることを理解するであろう。したがって、用語「抗体」は、本明細書で使用される通り、全体の抗体の改変または組み換えＤＮＡ方法論を使用する合成されたデノボのいずれかによって産生される抗体フラグメントも含む。いくつかの実施形態において、抗体は、単鎖抗体、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖が、共に連結して（直接またはペプチドリンカーを通って）、連続ポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、直接連結されるか、ペプチドコードしているリンカーによって連結されるかのいずれかのＶＨ−及びＶＬ−コードしている配列を含む核酸から発現され得る共有結合的に結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３を参照、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの構造は、抗体Ｖ領域からの、化学的に分離されるが自然に凝集した軽及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるｓｃＦｖ分子へ転換するために存在する。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号及び同第５，１３２，４０５号及び同第４，９５６，７７８号を参照されたい。
【００２５】
およそ：本明細書で使用する場合、１つ以上の対象の値に適用される通り、用語「およそ」または「約」は、述べられた基準値と類似する値を指す。特定の実施形態において、用語「およそ」または「約」は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に含まれる値の範囲を指す。
【００２６】
結合物質：本明細書で使用する場合、用語「結合物質」は、任意の分子、例えば、タンパク質（例えば、ペプチド、抗体など）、核酸、オリゴヌクレオチド、標的に結合する化学化合物（例えば、抗原、ヌクレオチド、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）を含む。結合物質は捕捉剤とも称される。
【００２７】
化合物及び薬剤：用語「化合物」及び「薬剤」は、本明細書において互換的に使用される。それらは、任意の天然に存在するまたは天然に存在しない（すなわち、合成または組み換え）分子、例えば、生体高分子（例えば、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質）、有機もしくは無機分子、または生物材料から作製された抽出物、例えば、細菌、植物、真菌、または動物（特に、ヒトを含む哺乳類）細胞もしくは組織を指す。化合物は、単一の分子または少なくとも２つの分子の混合物または複合体であり得る。
【００２８】
対照：本明細書で使用する場合、用語「対照」は、結果が比較される標準であるという当該技術分野で既知の意味を有する。典型的には、対照は、変数についての結論を出すためにかかる変数を分離することによって実験における完全性を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、対照は、比較器を提供するための試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。１つの実験において、「試験」（すなわち、試験される変数）が適用される。第２の実験において、「対照」は、試験される変数が適用されない。いくつかの実施形態において、対照は、既存対照（すなわち、既に実施された試験もしくはアッセイ、または既に知られている量もしくは結果の）である。いくつかの実施形態において、対照は、印刷または別の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。対照は、正の対照または負の対照であり得る。
【００２９】
検出可能なシグナル：本明細書で使用する場合、用語「検出可能なシグナル」は、人間または機械によって検出または測定され得るシグナルを指す。いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、シグナルの強度が、シグナルに関連する化合物の量に関連する（例えば、比例する）ように、定量化され得る。信号の性質によって、検出可能なシグナルは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって、検知、測定、または定量化され得る。「検出可能なシグナル」は、本出願において「検出可能な薬剤」または「検出可能な部分」とも称される。
【００３０】
キット：本明細書で使用する場合、用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達系を指す。かかる送達系は、ある場所から別の場所への様々な診断もしくは治療試薬（例えば、適切な容器におけるオリゴヌクレオチド、抗体、酵素など）、及び／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための指示書など）の保存、輸送、または送達を可能にする系を含み得る。例えば、キットは、関連性のある試薬及び／または支持材料を含有する１つ以上の同封物（例えば、箱）を含む。本明細書で使用する場合、用語「フラグメント化キット」は、それぞれが全キット構成要素のサブ部分を含有する２つ以上の別個の容器を含む送達系を指す。容器は、意図される受容者に一緒にまたは別々に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイにおいて使用するための酵素を含有し得、第２の容器は、オリゴヌクレオチドを含有する。用語「フラグメント化キット」は、米連邦食品医薬品化粧品法の第５２０（ｅ）節に規定される分析物特異的試薬（ＡＳＲ´ｓ）を含有するキットを包含することが意図されるが、それに限定されない。実際、それぞれが全キット構成要素のサブ部分を含有する２つ以上の別個の容器を含む送達系は、用語「フラグメント化キット」に含められる。その一方、「複合キット」は、単一容器（例えば、所望の構成要素それぞれを収容する単一箱中に）中に全ての構成要素を含有する送達系を指す。用語「キット」は、フラグメント化キット及び複合キットの両方を含む。
【００３１】
標識付き：本明細書で使用する場合、用語「標識付き」は、検出可能なシグナル、薬剤、または部分の化合物への付着を指す。検出可能なシグナルの定義を参照されたい。
【００３２】
ヌクレオシド：用語「ヌクレオシド」または「核酸塩基」は、本明細書で使用する場合、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）、ウラシル（「Ｕ」）、チミン（「Ｔ」）、及び炭水化物のアノマー炭素（炭水化物の１´−炭素原子）と核酸塩基との間のＮ−グリコシド結合によって炭水化物に結合するそれらの類似体、例えば、Ｄ−リボース（ＲＮＡにおける）または２´−デオキシ−Ｄ−リボース（ＤＮＡにおける）を指す。核酸塩基がプリン、例えば、ＡまたはＧであるとき、リボース糖は、一般的に、プリンの複素環のＮ９位置に付着している。核酸塩基がピリミジン、例えば、Ｃ、Ｔ、またはＵであるとき、糖は、一般的に複素環のＮ１位置に付着している。炭水化物は置換または非置換であり得る。置換リボース糖は、炭素原子のうちの１つ以上、例えば、２´−炭素原子が、各Ｒが、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ５〜Ｃ１４アリールである、同じもしくは異なるＣｌ、Ｆ、−−Ｒ、−−ＯＲ、−−ＮＲ２またはハロゲン基のうちの１つ以上で置換されるものを含むが、これらに限定されない。リボースの例としては、リボース、２´−デオキシリボース、２´，３´−ジデオキシリボース、２´−ハロリボース、２´−フルオロリボース、２´−クロロリボース、及び２´−アルキルリボース、例えば、２´−Ｏ−メチル、４´−α−アノマーヌクレオチド、１´−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４０６７−７４［１９９１］）、２´−４´−及び３´−４´−結合及び他の「ロックされた」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾が挙げられる（ＷＯ９８／２２４８９、ＷＯ９８／３９３５２、ＷＯ９９／１４２２６）。
【００３３】
ヌクレオチド：用語「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、モノマー単位として、またはポリヌクレオチドポリマー内で、リン酸化形態（ヌクレオシドのリン酸エステル）におけるヌクレオシドを意味する。「ヌクレオチド５´−三リン酸」は、５´位置に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、リボース糖の構造的特徴を具体的に指摘するために、時折、「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」、及び「ｄｄＮＴＰ」として示される。三リン酸エステル基は、様々な酸素の部分のための硫黄置換、例えば、α−チオ−ヌクレオチド５´−三リン酸を含み得る。ヌクレオチドは、モノ−、ジ−、またはトリ−リン酸化形態において存在し得る。ヌクレオチド中に存在するリボースの炭素原子は、塩基の骨格鎖番号と区別するためにプライム記号（´）で示される。ポリヌクレオチド及び核酸の化学的性質の概説について、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい。
【００３４】
核酸：用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、互換的に使用され得る。それらは、ヌクレオチドモノマーのポリマー、またはその類似体、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびにそれらの組み合わせを指す。ヌクレオチドは、起源が、ゲノム、合成または半合成であり得る。別途記載のない限り、用語は、合成骨格鎖を有する核酸様構造、ならびに増幅産物を包含する。当業者によって理解されるであろう通り、これらのポリマーの長さ（すなわち、それが含有するヌクレオチドの数）は、しばしば、それらの意図された機能や用途に応じて、広く変化し得る。ポリヌクレオチドは、直鎖状、分枝状直鎖状、または環状分子であり得る。ポリヌクレオチドはまた、関連した対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ＋、Ｎａ＋などを有する。ポリヌクレオチドは、全てデオキシリボヌクレオチドから、全てリボヌクレオチドから、またはそれらのキメラ混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間核酸塩基及び糖類似体から構成され得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、用語「オリゴヌクレオチド」は、約５〜約１５０ヌクレオチド、例えば、約１０〜約１００ヌクレオチド、約１５〜約７５ヌクレオチド、または約１５〜約５０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指すように本明細書で使用される。本明細書全体を通して、オリゴヌクレオチドが、文字の配列（例えば、アデノシン、グアノシン、及びチミジンそれぞれを指す４つの基礎文字、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴから選択される）によって表されるときはいつでも、ヌクレオチドは、左から右に５´〜３´の順序で表される。「ポリヌクレオチド配列」は、ポリマーに沿ったヌクレオチドモノマーの配列を指す。別途示されない限り、ポリヌクレオチド配列が表されるときはいつでも、ヌクレオチドが、左から右に５´〜３´の方向にあることが理解されるであろう。
【００３６】
核酸、ポリヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドは、標準ヌクレオチド塩基からなり得るか、またはイソ−Ｃ及びイソ−Ｇ塩基を含むがこれらに限定されないヌクレオチドアイソフォーム類似体で置換され得、それは、標準塩基よりも多少許されて、ハイブリダイズされ得、相補的アイソフォーム類似体塩基と優先的にハイブリダイズされる。多くのかかるアイソフォーム塩基は、例えば、Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５２，５３−６３に記載される。天然に存在するヌクレオチドモノマーの類似体は、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−メチルグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１２０１−１２０９［１９９５］）、ニトロインドール、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、擬似シトシン、擬似イソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン（Ｓｅｅｌａ、米国特許第６，１４７，１９９号）、７−デアザグアニン（Ｓｅｅｌａ、米国特許第５，９９０，３０３号）、２−アザプリン（Ｓｅｅｌａ、ＷＯ０１／１６１４９）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、０−６−メチルグアニン、Ｎ−６−メチルアデニン、Ｏ−４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン、「ＰＰＧ」（Ｍｅｙｅｒ、米国特許第６，１４３，８７７号及び同第６，１２７，１２１号、Ｇａｌｌ、ＷＯ０１／３８５８４）、及びエテノアデニン（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５−３９４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）を含む。
【００３７】
用語「３´」は、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域または位置から、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド３´（すなわち、下流）における領域または位置を指す。用語「５´」は、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域または位置から、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド５´（すなわち、上流）における領域または位置を指す。用語「３´末端」及び「３´終端」は、核酸分子に関連して本明細書で使用される場合、終端ペントース糖の３´炭素に付着する遊離ヒドロキシル基を含有する核酸の末端を指す。用語「５´末端」及び「５´終端」は、核酸分子に関連して本明細書で使用される場合、終端ペントース糖の５´炭素に付着する遊離ヒドロキシル基またはリン酸基を含有する核酸分子の末端を指す。本発明のいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、その５´終端にポリアデノシンの管を含む。
【００３８】
一次及び二次抗体：本明細書で使用する場合、用語「一次抗体」は、典型的には、対象の標的に直接結合する抗体を指す。用語「二次抗体」は、本明細書で使用する場合、同じく、対象の標的に結合している、別の（一次）抗体と結合する抗体を指す。
【００３９】
標的：本明細書で使用する場合、用語「標的」は、対象の分子を指す。
【００４０】
（発明を実施するための形態）
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化するための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、キャップ特異結合物質（例えば、キャップ特異的抗体）とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成及び定量的判定に基づいたｍＲＮＡキャップ形成効率の定量化方法を提供する。
【００４１】
本発明の様々な実施形態は、インビトロのｍＲＮＡ合成のキャップ形成効率を定量化するのに有用である。したがって、本発明は、ｍＲＮＡを製造するため、及び、特に、治療用途でのｍＲＮＡの安全性、有効性、及び商業的実行可能性を評価するための重要な品質管理方策を提供する。
【００４２】
本発明の様々な態様は、以下の節において詳細に記載される。節の使用は、本発明を限定するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。
【００４３】
ｍＲＮＡキャップ形成及び／またはメチル化
典型的には、真核生物のｍＲＮＡは、それらの５´終端で「キャップ」構造を有し、それは翻訳において重要な役割を果たす。例えば、キャップは、ｍＲＮＡ代謝において重要な役割を果たしており、核内のＲＮＡ転写物の処理及び成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡ安定性、及びタンパク質へのｍＲＮＡの効率的な翻訳の様々な度合を変えるために必要とされる。５´キャップ構造は、真核生物細胞及び真核生物ウイルスｍＲＮＡのタンパク質合成の開始及びインビボでのｍＲＮＡ処理及び安定性に関与する（例えば、Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ，９：６４５−６５３（１９７６）；Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６６：２３５（１９７７）；Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｌｅｔｔｅｒ９６：１−１１（１９７８）；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３５：１７３−２０７（１９８８）を参照されたい）。ｍＲＮＡの翻訳の開始に必要な仕組みの構成要素である特異的キャップ結合タンパク質が存在する（例えば、Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｃｅｌｌ，４０：２２３−２４（１９８５）；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３５：１７３−２０７（１９８８）を参照されたい）。ｍＲＮＡのキャップは、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅによって認識される（Ｇｉｎｇｒａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：９１３−９６３（１９９９）；Ｒｈｏａｄｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０３３７−３０４０，（１９９９））。５´キャップ構造はまた、５´−エクソヌクレアーゼ活性への耐性を提供し、その不在はｍＲＮＡの急速分解をもたらす（例えば、Ｒｏｓｓ，Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５：１−１４（１９８８）；Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３２：６８１−６９４（１９８３）を参照されたい）。多くの真核細胞遺伝子及び真核生物ウイルス遺伝子の一次転写物は、これらの転写物のコード領域内に介在配列（イントロン）を除去するための処理を必要とするので、キャップの利点はまた、かかるプレｍＲＮＡの安定化にも及ぶ。
【００４４】
インビトロで、キャップされたＲＮＡは、ウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽翻訳系などの様々なインビトロの翻訳系におけるキャップのない転写物より効率的に翻訳されると報告された（例えば、Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：２７３４−２７３８（１９７７）；Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，２７９：６９２（１９７９）を参照されたい）。この作用はまた、ある程度、インビトロの翻訳系に存在するエキソリボヌクレアーゼからのＲＮＡの保護、ならびに他の要因に起因すると考えられる。
【００４５】
天然に存在するキャップ構造は、三リン酸架橋を介して第１の転写されたヌクレオチドの５´−末端に結合される７−メチルグアノシンを含み、Ｎが任意のヌクレオシドであるｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｎのジヌクレオチドキャップをもたらす。インビボで、キャップは酵素的に付加される。キャップは、核に付加され、酵素のグアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。ＲＮＡの５´終端末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に起こる。終端ヌクレオシドは、典型的には、グアノシンであり、全ての他のヌクレオチド、すなわち、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）ＧｐＮｐＮｐに対して逆方向である。
【００４６】
インビトロの転写によって産生されるｍＲＮＡの一般的なキャップは、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇであり、それは、その５´終端におけるキャップ構造を有するＲＮＡを得るためにインビトロのＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼでの転写におけるジヌクレオチドキャップとして使用された。キャップされたｍＲＮＡのインビトロの合成のための一般的な方法は、転写の開始剤としての形態ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）の予め形成されたジヌクレオチドを用いる。ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、擬対称性ジヌクレオチドを使用する欠点は、転写伸長のために、Ｇまたはｍ７Ｇ部分のいずれかの３´−ＯＨの開始求核剤として機能する性質である。言い換えると、ｍ７Ｇ及びＧ部分の両方上の３´−ＯＨの存在は、不適切な方向における最大半分のキャップを組み込むｍＲＮＡを引き起こす。これは、転写反応のイオン条件に応じて、およそ同等な比率における、形態ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐＧ（ｐＮ）ｎ及びＧ（５´）ｐｐｐｍ７Ｇ（ｐＮ）ｎの２つの異性体のＲＮＡの合成を引き起こす。異性体形態における変化は、インビトロの翻訳に悪影響を及ぼし得、均質な治療製品には望ましくない。
【００４７】
現在までに、インビトロの翻訳実験において使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常形態は、アンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）であり、それは、一般的に、２´または３´ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される修飾されたキャップ類似体である。ＡＲＣＡ及び三重メチル化キャップ類似体は、正方向に組み込まれる。リボース環の２´または３´ＯＨ基のいずれかでのｍ７Ｇの化学修飾は、２´ＯＨ基がホスホジエステル結合に関与しないにも関わらず、キャップが単独で、正方向に組み込まれることをもたらす。（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ´ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。Ｎ７でのグアノシンのメチル化及び３´Ｏ−メチル化及び５´二リン酸合成のための選択的な手順が確立された（Ｋｏｒｅ，Ａ．ａｎｄ  Ｐａｒｍａｒ，Ｇ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２５：３３７−３４０，（２００６）及びＫｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２５（３）：３０７−１４，（２００６）。
【００４８】
ＲＮＡの転写は、通常、ヌクレオシド三リン酸（通常、プリン、Ａ、またはＧ）で開始する。インビトロの転写は、典型的には、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などのファージＲＮＡポリメラーゼ、ファージポリメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡテンプレート、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ）、及びマグネシウム塩を含有する緩衝液を含む。キャップされたＲＮＡの合成は、転写反応におけるキャップ類似体（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＧ）の組み込みを含み、いくつかの実施形態において、それは、組み換えグアニリルトランスフェラーゼの付加によって組み込まれる。過剰なｍ７ＧｐｐｐＧ対ＧＴＰ（４：１）は、各転写物が５´キャップを有するであろう機会を増加させる。インビトロで転写されたｍＲＮＡのキャップ形成のためのキットは、市販されており、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）を含む。ＧＴＰが、転写物の伸長のために必要とされるときに、ＧＴＰ濃度が比率を制限するようになるので、合計ＲＮＡ収率は、低いが、これらのキットは、典型的には、２０％のキャップのないＲＮＡに８０％のキャップされたＲＮＡを与えるであろう。しかしながら、現在、サンプル中のｍＲＮＡの永久的な変化を伴わないキャップ形成効率の定量化を可能にする利用可能な技術／方法はない。
【００４９】
キャップ形成効率を推定する方法は当該技術分野において既知である。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ジヌクレオチド、全ての４つのリボヌクレオチド三リン酸、［α−３２Ｐ］ＧＴＰ、及びＧが、プロモーターの後に特定された第１のリボヌクレオチドである短いＤＮＡテンプレートと共にインキュベートされ得る（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ”，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）を参照されたい）。Ｇ残基の５′側上の任意のヌクレオチドは、最近接の転移によるリボヌクレアーゼＴ２消化後に、３２Ｐ−標識付き３′−リン酸基を得る。次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーは、５′−終端産物から、ＲＮＡにおける内部位置に起因する標識付きヌクレオシド３′−リン酸を溶解するために、使用される。５´終端産物は、２つの種類がある。キャップのないＲＮＡは、標識付きグアノシン５′−三リン酸３′−リン酸を生じさせる（ｐ３Ｇｐ＊、＊は標識付きリン酸基を示す）。キャップされたＲＮＡは、使用されるキャップ類似体の性質に応じて、様々な５′終端構造を生じさせる（キャップ類似体がｍ７Ｇｐ３Ｇであるとき、ｍ７Ｇｐ３Ｇｐ＊及びＧｐ３ｍ７Ｇｐ＊）。
【００５０】
しかしながら、これらの方法の主な欠点は、全サンプルは、放射性にされるか、または別途破壊され、したがって、その後の治療用途には使用できない。理論的には別個の定量化反応は治療合成反応と共に実行され得るが、かかる取り合わせは不適切である。同時であるが、別個のサンプルは、内部オペレーターエラー及び反応条件における微小な変化のため、本質的に可変である。これは、ある所与の日の標準曲線上の点の値が翌日のものと同じでない可能性がある標準曲線を使用する定量化において特に当てはまる。キャップ形成効率を計算することにおいて正確な結果を得るために、治療合成反応から得られた代表的なサンプル、キャップ形成効率が対照と比較して評価され得るサンプルを使用するのが望ましく、それは、治療合成反応におけるキャップ形成効率を表す。
【００５１】
したがって、本発明は、サンプル中のｍＲＮＡキャップ形成効率を直接定量化する改善された方法を提供する（例えば、インビトロの合成反応からの代表的な一定分量サンプル）。本発明のいくつかの実施形態は、キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成を可能にする条件下での、キャップ特異的結合物質の使用を含む。キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成は、キャップされた産物の正の対照またはキャップのない産物の負の対照に対して、複合体の量の定量的判定を可能にする（すなわち、キャップされたｍＲＮＡ）。言い換えると、結合は、サンプル中のキャップされたｍＲＮＡ標的の量及びサンプルが得られる反応におけるキャップ形成効率を示す。したがって、いくつかの実施形態において、複合体の量を定量的に判定するステップは、キャップ特異的結合物質が抗体またはｍＲＮＡキャップと特異的に結合する他のタンパク質であるＥＬＩＳＡ型アッセイを実施することを含む。（図１参照）複合体形成は、キャップ特異的結合物質（例えば、マウス抗ｍ７Ｇ抗体と結合するヤギ抗マウス抗体）に対して特異的な検出剤の添加によって定量化され得、それは、キャップされたｍＲＮＡの量に直接比例して、シグナルを産生する。本発明の実施形態を使用して、インビトロの転写されたｍＲＮＡ、単離された真核生物ｍＲＮＡ、及びウイルスＲＮＡを含む幅広い種類のＲＮＡ種のキャップ形成効率を定量化し得る。本発明の実施形態を使用して、キャップ構造及び本明細書に記載のキャップ類似体のいずれかを定量化し得る。
【００５２】
本明細書に記載の本発明の方法は、一般的に、ｍＲＮＡキャップのいかなる種類の定量化に適している。いくつかの実施形態において、キャップは、式Ｉの構造を有し、
【化３】
2016515216.tif 000005
【００５３】
式中、Ｂは核酸塩基であり、Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、Ｒ３は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または欠失し、Ｒ４はＮＨ２であり、Ｒ５は、ＯＨ、ＯＣＨ３、及びハロゲンから選択され、ｎは、１、２、または３であり、Ｍはヌクレオチド、すなわち、ｍＲＮＡの第３の塩基である。特定の実施形態において、Ｂはグアニンであるが、任意の核酸塩基であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは、２´−Ｏ−メチル残基が、塩基１のリボース環の２´ＯＨ基に（すなわち、式ＩのＲ５位置に）存在するｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、キャップは、式ＩＩの構造を有し、
【化４】
2016515216.tif 000006
式中、Ｒ２はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ４はＮＨ２であり、Ｒ５はＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ６はＨまたはＣＨ３であり、ＭはｍＲＮＡのヌクレオチドである。
【００５５】
キャップ類似体は、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣからなる群から選択される化学的構造、非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称的キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ、ｍ７，２´ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２´ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３´ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３´ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ´ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
好ましい実施形態において、キャップは、三リン酸架橋を介して第１の転写されたヌクレオチドの５´−末端に結合される７−グアニル酸メチル（「ｍ７Ｇ」）であり、Ｎが任意のヌクレオシドであるｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｎをもたらす。本発明の実施形態において使用されるｍ７Ｇキャップの好ましい実施形態は、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇである。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはキャップがない。（図２Ａ）キャップのないｍＲＮＡは、サンプル中に存在し得（すなわち、インビトロの転写反応における不完全なキャップ形成の結果として）、かつ／または使用され得、サンプル中のキャップのない種の定量的レベルに対する対照。いくつかの実施形態において、キャップは、キャップ０構造である。（図２Ｂ）。キャップ０構造は、塩基１及び２に付着されたリボースの２´−Ｏ−メチル残基を欠いている。いくつかの実施形態において、キャップはキャップ１構造である。（図２Ｃ）キャップ１構造は塩基１に２´−Ｏ−メチル残基を有する。いくつかの実施形態において、キャップはキャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基１及び２に付着された２´−Ｏ−メチル残基を有する。
【００５８】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体は、当該技術分野において既知であり、その多くは市販されている。これらは、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ３´−ＯＣＨ３及び２´−ＯＣＨ３キャップ類似体を含む（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用される追加のキャップ類似体は、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、及び参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０９３，３６７号及び同第８，３０４，５２９号に記載されるキャップ類似体（ビオチン化されたキャップ類似体を含む）を含む。
【００５９】
キャップされたｍＲＮＡの産生
本明細書に記載される定量的方法に好適なキャップされたｍＲＮＡは、当該技術分野において既知の任意の方法によって産生され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、キャップされたｍＲＮＡは、インビトロの転写によって産生され、本来、ＲＮＡファージポリメラーゼを使用するＲＮＡの合成のため、Ｋｒｉｅｇ及びＭｅｌｔｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５５：３９７−４１５）によって開発された。典型的には、これらの反応は、少なくともファージＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）、ファージポリメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡテンプレート、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、及びマグネシウム塩を含有する緩衝液を含む。ＲＮＡ合成収率は、ヌクレオチド濃度を増加させ、マグネシウム濃度を調節し、無機ピロホスファターゼを含めることによって最適化され得る（米国特許第５，２５６，５５５号；Ｇｕｒｅｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５：２０７−２１３（１９９１）；Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，１０３３−１０３７（１９８８）；Ｗｙａｔｔ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：７６４−７６９（１９９１））。いくつかの実施形態は、インビトロの転写物の大規模合成のための市販のキットを使用する（例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ａｍｂｉｏｎ）。これらの反応で合成されたＲＮＡは、通常、リボースの５´位置に三リン酸を有する５´終端ヌクレオチドを特徴とする。典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ及び使用されるプロモーターの組み合わせに応じて、このヌクレオチドは、グアノシンであるが、アデノシンではあり得ない（例えば、Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ１４（２００４）を参照されたい）。これらの反応において、全ての４つのヌクレオチドは、典型的に、等モル濃度で含まれ、それらのいずれも制限されない。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態は、回分式反応であり、つまり、全ての構成要素を組み合わせ、次いで、反応が終了するまでＲＮＡの重合を促進するために、約３７℃でインキュベートする。典型的には、回分式反応は便宜上使用され、それらの実験のために、かかる反応から必要な量のＲＮＡを得る。いくつかの実施形態において、「供給回分式」システム（例えば、Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｂａｔｃｈ  ａｎｄ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ）（１９９７）を参照されたい）を使用して、インビトロの転写反応の効率を増加させる。全ての構成要素を組み合わせ、しかしまた一方で、ヌクレオチド及びマグネシウムなどの追加量のいくつかの試薬を経時的に添加して、一定の反応条件を維持しようと試みる。その上、いくつかの実施形態において、反応のｐＨは、それを経時的に監視し、必要に応じてＫＯＨを添加することによって７．４に保持され得る。
【００６２】
キャップされたＲＮＡをインビトロの転写によって合成するために、キャップ類似体（例えば、Ｎ−７メチルＧｐｐｐＧ、すなわち、ｍ７ＧｐｐｐＧ）は、転写反応に含められる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、他のヌクレオチドのいずれかのように容易にキャップ類似体を組み込み、つまり、キャップ類似体に対する偏りはない。いくつかの実施形態において、キャップ類似体は、酵素グアニリルトランスフェラーゼによって、５´終端に組み込まれるであろう。いくつかの実施形態において、キャップ類似体は、５´三リン酸を有しないので、５´終端のみに組み込まれるであろう。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用するいくつかの実施形態において、それらのそれぞれのプロモーターの＋１ヌクレオチドは、通常Ｇ残基であり、ＧＴＰ及びｍ７ＧｐｐｐＧの両方が転写反応において同等の濃度存在する場合、それらは、それぞれ＋１位置に組み込まれる同等の機会を有する。いくつかの実施形態において、ｍ７ＧｐｐｐＧは、ＧＴＰよりも数倍高い濃度でこれらの反応において存在して、転写物が５´キャップを有するであろう機会を増加させる。いくつかの実施形態において、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）キット（Ｃａｔ．＃１３４４，Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）は、製造業者の指示に従って使用され、そこでは、キャップとＧＴＰとの比率が４：１（６ｍＭ：１．５ｍＭ）であることが推奨される。いくつかの実施形態において、反応におけるキャップ類似体とＧＴＰとの比率が増加するにつれ、キャップされたＲＮＡとキャップのないＲＮＡとの比率も比例して増加する。キャップ形成効率の考慮事項は、収率の考慮事項と均衡をとらなければならない。転写反応におけるキャップ類似体とＧＴＰとの比率の増加は、キャップ及びＧＴＰ定数の合計濃度を保持するときにＧＴＰの濃度が制限されるので、合計ＲＮＡのより低い収率をもたらす。したがって、最終ＲＮＡ収率は、転写物の伸長に必要であるＧＴＰ濃度に依存する。他のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）は過剰に存在する。
【００６３】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、選択の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからのインビトロの転写によって合成される。いくつかの実施形態において、インビトロの転写は、グアニリルトランスフェラーゼを介したＧＴＰの酵素共役によって、塩基１のリボース環の２´ＯＨ基に２´−Ｏ−メチル残基を有する５´キャップ構造、キャップ１（図２Ｃ）の付加を含む。いくつかの実施形態において、インビトロの転写は、グアニリルトランスフェラーゼを介したＧＴＰの酵素共役によって、２´−Ｏ−メチル残基を欠いている５´キャップ構造、キャップ０（図２Ｂ）の付加を含む。いくつかの実施形態において、インビトロの転写は、グアニリルトランスフェラーゼを介したＧＴＰの酵素共役によって、本明細書に記載されるキャップ構造のいずれかの５´キャップの付加を含む。いくつかの実施形態において、およそ２００ヌクレオチド長の３´ポリ（Ａ）尾部（ゲル電気泳動法によって判定される）は、ポリＡポリメラーゼと共にＡＴＰの付加によって組み込まれた。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）尾部はおよそ１００〜２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）尾部は約５０〜３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、インビトロの転写産物は、５´及び３´非翻訳領域を含む。
【００６４】
ｍＲＮＡを捕捉するための固体基質
いくつかの実施形態において、キャップされたｍＲＮＡは、キャップ特異的結合物質と接触させる前に、固体基質上に捕捉される。これらの実施形態は、固体基質の種類によって限定されない。かかる実施形態の唯一の必要条件は、固体基質がキャップされたｍＲＮＡと、いくつかの実施形態においては、キャップのないｍＲＮＡとも直接または間接的に結合することができなければならないことである。基質は、マイクロプレート、磁気ビーズ、粒子、ポリマービーズ、クロマトグラフィー樹脂、濾紙、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、シリカゲル、またはヒドロゲルであり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、固体担体は、キャップされたまたはキャップのないｍＲＮＡに結合する第１の捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、一本鎖のｍＲＮＡ中の配列に対応する（すなわち、と相補的な）一本鎖のポリヌクレオチド配列である。したがって、固体担体に結合するとき、ポリヌクレオチドの第１の捕捉剤は、ｍＲＮＡとハイブリダイズされ得る。特定の例において、第１の捕捉剤は、ｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズすることができるポリチミジン管（例えば、オリゴ−ｄＴ）である。いくつかの実施形態において、非翻訳３´の領域が第１の捕捉剤によって標的化され得る（例えば、相補的な配列のオリゴヌクレオチド）。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの遺伝子特異的コード領域は標的化され得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、約１０〜５０ヌクレオチド長、例えば、約１０ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。
【００６６】
幅広い種類の核酸配列は、捕捉を促進するために、固体担体に結合され得る。同様に、ポリヌクレオチド捕捉剤が固体担体に直接または間接的に付着される方式は、いかなる方法においても制限されるべきではない。例えば、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド捕捉剤は、合成担体からの切断ではなく、脱保護に好適な方式で、表面上で合成され得る（例えば、Ｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５（１４）：２７９２−２７９９（１９９７）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド捕捉剤は、単離機能上の好適な官能基の表面の官能基との反応によって表面に、共有結合的に結合され得る（例えば、Ｇｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１７（９−１１）：１７１７−１７２４（１９９８）を参照されたい）。
【００６７】
特定の実施形態において、ポリチミジン管オリゴヌクレオチドは、ビオチン化され、それにより、アビジンまたはストレプトアビジンコーティングされた固体担体と結合することができる。ビオチン化されたポリチミジン管オリゴヌクレオチドは市販されている（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。あるいは、ポリチミジン管オリゴヌクレオチドまたは任意の他のポリヌクレオチド捕捉剤は、特注合成され得、当業者に既知の方法に従ってビオチン化される。例えば、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基は、終末デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、合成オリゴヌクレオチドの３´終端に酵素的に付加され得る（例えば、Ｒｉｌｅｙ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，５：３３３−３３７（１９８６）を参照されたい）。幅広い種類のアビジン及びストレプトアビジンコーティングされた固体担体も市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ９６−ウェルストレプトアビジンコーティングされたマイクロプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは、従来の手段によって、例えば、市販のＤＮＡ合成機上で、ホスホラミダイト化学を介して、合成され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：３４０３−３４０９（１９９２）に記載される固相担体上で合成される。手短に言えば、脱保護後、スクシニル結合を介して担体に結合されるデオキシシチミジンの５´ヒドロキシルは、ジクロロメタン／ジイソプロピルエチルアミンなどの適切な溶媒におけるクロロ−（ジイソプロポレチルアミノ）−メトキシホスフィンとの反応によって、ホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅｄ）される。テトラゾールで活性化した後、５´−ホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅｄ）チミジンは、５´−トリチル−Ｏ−３´−アミノ−３´−デオキシヌクレオシドと反応して、ヌクレオシド部分がホスホロアミド酸結合によって共有結合的に連結されるヌクレオシド−チミジンダイマーを形成する。オリゴヌクレオチドの残部は標準ホスホラミダイト化学によって合成される。スクシニル結合を切断した後、３´終端アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、酸処理、例えば、室温で１８〜２０時間の８０％の水性酢酸により、ホスホロアミド酸連結を切断することによって産生される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤はタンパク質である。ｍＲＮＡと選択的に結合する任意のタンパク質が使用され得る。いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤タンパク質は、ｍＲＮＡの３´末端と結合する（例えば、ポリ（Ａ）結合タンパク質）。他の実施形態において、第１の捕捉剤タンパク質は、ｍＲＮＡの５´末端に結合する（例えば、抗−ｍ７Ｇ抗体）。第１の捕捉剤として機能し得る例示的なタンパク質は、ポリ（Ａ）結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）、抗ｍ７Ｇ抗体、及びそれらの抗原結合フラグメント、及び真核生物開始因子４Ｅ（ｅＩＦ−４Ｅ）を含む。キャップ依存性ｍＲＮＡキャップ依存性捕捉の方法は、以前に記載され（Ｅｄｅｒｙ，Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１５：３３６３−３３７１（１９９５））；米国付与前公開第２００７／０２８１３３６号）、本発明の実施形態に適応され得る。
【００７０】
固体担体表面への第１の捕捉剤の化学付着の方法（タンパク質または核酸のいずれか）は、固定化されるために、固体担体表面上での求電子基との捕捉剤の求核基（例えば、アミンまたはチオール）の反応を伴い得る。あるいは、求核剤は、担体上に存在し得、求電子（例えば、活性化カルボン酸）は、抗単離機能上に存在し得る。いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、クリック化学によって固体担体に付着され得る。いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、随意に銅触媒の存在下で、アルキンとアジドの１，３−付加環化を介して付着される。クリック化学を使用する方法は、当技術分野で既知であり、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−９９（２００２）及び  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１７：５２−５７（２００６）に記載されるものを含む。
【００７１】
本発明いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、標準Ｎ−エチル−Ｎ´−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）アミン結合手順によって固体基質に直接付着される。アミン結合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びＮ−エチル−Ｎ´−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物でのカルボキシメチル基の修飾によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを表面マトリックス内へ導入する。次いで、これらのエステルは、アミン及び捕捉部分上の他の求核基と自発的に反応して、共有結合を形成する。これは非常に安定しており、一般的な表面官能基化技術である。いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６のコーティング緩衝液を使用して、固体基質に直接結合される。
【００７２】
アミノ基、カルボン酸基、イソシアント、イソチオシアネート、及びマレイミド基で誘導体化された固体担体の多数の種類は、市販されており、第１の捕捉剤の基質への結合を促進し得る。
【００７３】
第１の捕捉剤がタンパク質であるいくつかの実施形態において、タンパク質は、既知の方法に従ってビオチン化され得、その後、アビジンまたはストレプトアビジンコーティングされた固体基質に結合される。ストレプトアビジン検出のための、特異的にビオチン化された抗体及び他のタンパク質または一次アミンにビオチン標識を伴うペプチド（リジン及びＮ−終端）、タンパク質の表面上の最も豊富な反応基に対する標識試薬及びキットは、市販されている。例えば、ストレプトアビジンコーティングされたＥＬＩＳＡマイクロプレートは、ビオチン化されたポリＡ結合タンパク質相互作用タンパク質（ＰＡＩＰ２）でコーティングされ得る。いくつかの実施形態において、市販のヒト組み換え型ＰＡＩＰ２は、カルボジイミド架橋剤ＥＤＣ（ＥＤＡＣ）を使用して、Ｃ−終端を特異的にビオチン化するためにアミン修飾ビオチン標識によってビオチン化される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、タグを付けられるか、または別途修飾されて、基質への結合を促進する。例えば、第１の捕捉剤がタンパク質（例えば、ＰＡＢＰ）である実施形態において、タンパク質は、組み換えで産生され得、タグ付けされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）でタグ付けされる。いくつかの実施形態において、第１の捕捉剤は、ＦＬＡＧタグ付け、ＨＡタグ付け、Ｈｉｓタグ付けまたはｍｙｃタグ付けされる。
【００７５】
特定の実施形態において、第１の捕捉剤を使用する必要はない。上で参照した通り、本発明の実施形態は、定量化されるために、インビトロの合成されたｍＲＮＡのサンプル内へのビオチン化されたキャップ類似体の組み込みを含む。例えば、Ｋｏｒｅらに対する米国特許第８，３４４，１１８号を参照し、参照により本明細書に組み込まれる。ビオチン化されたキャップされたｍＲＮＡサンプルは、アビジンまたはストレプトアビジンコーティングされた固体基質に直接結合され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、第２の捕捉剤は、同様に第１の捕捉剤と結合する固体基質に直接結合される。いくつかの実施形態において、第２の捕捉剤はストレプトアビジンまたはアビジンであり、それはビオチン化された第１の捕捉剤と結合し得る（例えば、ビオチン化されたポリ（Ａ）結合タンパク質）。いくつかの実施形態において、第２の捕捉剤はプロテインＡまたはプロテインＧである。いくつかの実施形態において、第２の捕捉剤はグルタチオンである。いくつかの実施形態において、第２の捕捉剤は、ニッケルコーティングされた基質、例えば、Ｎｉセファロース、ＮＴＡ−アガロース、Ｈｉｓ６０  Ｎｉ、ＨｉｓＰｕｒ樹脂、またはＴＡＬＯＮ樹脂である。いくつかの実施形態において、第２の捕捉剤は、第１の捕捉剤に対して特異的である抗体、例えば、抗ＨＡまたは抗ｍｙｃ抗体である。
【００７７】
本明細書に記載の方法の正確さは、部分的には、それらの順応性によることが理解されるであろう。上述の取り合わせの全ての構成が、本開示によって意図される。例えば、いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはその３´末端によって（例えば、固定化されたオリゴ−ｄＴまたはポリＡ結合タンパク質のポリＡ尾部へのハイブリダイゼーションによって）捕捉され、キャップの存在は、キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の形成によって定量化される。しかしながら、他の実施形態において、その５´末端によって、例えば、またはキャップが、ストレプトアビジンコーティングされたプレートとの相互作用によってビオチン化される場合、キャップされたｍＲＮＡと固体担体上に固定化されたキャップ特異的結合物質との間の複合体の形成によって、キャップされたｍＲＮＡを補足することが可能である）。次いで、キャップされたｍＲＮＡの存在は、露出されたポリＡ尾部に直接結合する第１の検出剤の添加によって定量化され得る（すなわち、ポリＡ結合タンパク質が捕捉剤ではなく、検出剤として機能し得る）。ポリＡ−尾部への第１の捕捉剤の結合は、検出可能なシグナルを産生する第２の捕捉剤の添加によって可視化され得る（例えば、ＨＲＰ接合抗ＰＡＢＰ抗体）。
【００７８】
キャップ特異的結合物質
「キャップ特異的結合物質」は、本明細書で使用する場合、上述の通りｍＲＮＡキャップまたはキャップ類似体に選択的に結合する任意の物質（タンパク質、小分子など）を指す。本発明に好適なキャップ特異的結合物質は、ｍＲＮＡキャップまたはキャップ類似体（例えば、本明細書に記載のもの）に、特異的にまたは選択的に結合し、結合事象は検出可能であることが望ましい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、キャップ特異的結合物質はタンパク質である。特定の実施形態において、タンパク質は真核生物開始因子４Ｅ（「ｅＩＦ−４Ｅ」）である。ｅＩＦ−４Ｅは、キャップ系ｍＲＮＡ精製において使用され（例えば、Ｅｄｅｒｙ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＣＡＰｔｕｒｅ）”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：３３６３−３３７１（１９９５）を参照されたい）、そのキャップ特異的結合特性は、本発明での使用に適応できる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、キャップ特異的結合物質は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣに特異的に結合する抗体、非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称的キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ、ｍ７，２´ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２´ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３´ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３´ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）を含むが、これらに限定されないキャップ特異的抗体である。キャップ特異的抗体は、標準方法を使用して産生され得る。例示的な抗ｍ７Ｇ抗体は、以下に詳細が記載される。
【００８１】
他のキャップ特異的結合タンパク質が、本発明の実施形態で使用されてもよい。これらは、核キャップ結合タンパク質亜単位１、核キャップ結合タンパク質亜単位２、核キャップ結合複合体などを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、キャップ特異的結合タンパク質は、修飾されて（例えば、ビオチン化されるかまたはタグ付けされる）、固体担体への結合を促進する。例えば、ＧＳＴ−ｅＩＦ−４Ｅに基づくキャップ結合アッセイは、当該技術分野において既知である（例えば、ＭｃＫｒａｃｋｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“５´−ｃａｐｐｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ”，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，１１：３３０６−３３１８（１９９７）を参照されたい）。
【００８３】
上述のように、キャップ特異的結合物質とキャップされたｍＲＮＡとの間の複合体の量の定量的判定は、複合体の形成に関連した検出可能なシグナルを測定することを含む。いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、キャップ特異的結合物質に直接関連している。いくつかの実施形態において、そこでは、キャップ特異的結合物質と結合する二次薬剤を介して、検出可能なシグナルがキャップ特異的結合物質に間接的に関連している（例えば、二次薬剤がキャップ特異的結合物質に対する抗体である以下のＥＬＩＳＡ考察）。検出可能なシグナルが直接または間接的にキャップ特異的結合物質に関連しているかどうかに関わらず、検出可能なシグナルは、蛍光シグナル、比色シグナル、または放射シグナルであり得る。一般的に、シグナルの強度は、サンプル中のキャップされたｍＲＮＡ標的のおよその量に直接比例する。シグナルはまた、フィコエリトリン、アレクサ５３２、ストレプトアビジン−フィコエリトリン、及びストレプトアビジン−アレクサ５３２の群から選択され得る。いくつかの実施形態において、シグナルは、酵素活性（すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、化学発光、放射能、赤外線放射、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または当業者に既知の任意の他の方法によって検知される。
【００８４】
抗ｍ７Ｇキャップ抗体
いくつかの実施形態において、キャップ特異的結合タンパク質は抗ｍ７Ｇ抗体である。抗ｍ７Ｇ抗体は当該技術分野において既知であり、市販されている。本発明の実施形態で使用するための抗ｍ７Ｇ抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｒｅｄｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍ７Ｇ−５´Ｐ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，６：２１７９−２１９１（１９７９）に記載されるものを含む。特定の実施形態において、抗体は、マウスモノクローナル抗ｍ７Ｇ−ｃａｐ抗体である（例えば、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販される）。
【００８５】
ｍ７Ｇキャップ及びキャップ類似体に対する追加の抗体は、本発明の範囲内に包含され、当業者に周知の方法によって産生され得る。本明細書で使用する場合、抗ｍ７Ｇ抗体は、ｍＲＮＡｍ７Ｇキャップの任意のエピトープに特異的に結合する任意の抗体またはそのフラグメント抗体を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、所定のタンパク質もしくはペプチド、またはそれらのフラグメントに特異的に反応する免疫グロブリン及びそのフラグメントを含むと意図される。例えば、用語「抗体」は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはそのフラグメント））、及び抗体フラグメントを含む。好適な抗体はまた、マウス抗体、ヤギ抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、接合抗体（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒に接合または融合する抗体）、及び抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「抗体フラグメント」は、例えば、抗体の抗原−結合または可変領域などの無傷の抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、及びＦｖフラグメント、三量体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四量体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体分子が挙げられる。用語「抗体フラグメント」は、複合体を形成するために、特異的抗原に結合することによって抗体のように働く任意の合成されたまたは遺伝子組み換えされたタンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントは、単離されたフラグメント、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ＳｃＦｖタンパク質」）によって結合される組み換え型単鎖ポリペプチド分子、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。
【００８７】
抗ｍ７Ｇ抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して生成され得る。例えば、抗体生成のためのプロトコルは、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）に記載される。典型的には、抗体は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラマ、サメ、または他の適切な宿主内で生成され得る。あるいは、抗体は、ニワトリ内で作製され得、ＩｇＹ分子を生成する（Ｓｃｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＬＴＥＸ１３（５）：８０−８５（１９９６））。いくつかの実施形態において、本発明に好適な抗体は、類人猿抗体である。例えば、ヒヒにおいて治療的に有用な抗体を産生するための一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開第ＷＯ９１／１１４６５号（１９９１），及びＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４６：３１０（１９９０）で見出され得る。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ハイブリードーマ法を使用して調製され得る（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−４０（１９８３）））。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体はまた、組み換え法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，１６６，４５２号を参照されたい）。
【００８８】
Ｂ細胞の不死化によってモノクローナル抗体を産生することに関連する多くの困難は、ファージディスプレイ法を使用して、大腸菌内の抗体フラグメントを操作及び発現することによって克服され得る。高親和性モノクローナル抗体の回収を確実にするために、組み合わせの免疫グロブリンライブラリーは、典型的に、大きいレパートリーサイズを含まなければならない。典型的な方略は、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成するために、免疫化したマウスのリンパ球または脾臓細胞から得たｍＲＮＡを使用する。重鎖及び軽鎖遺伝子はＰＣＲによって別々に増幅され、ファージクローニングベクター内に連結される。１つが重鎖遺伝子を含有し、１つが軽鎖遺伝子を含有する２つの異なるライブラリーが産生される。ファージＤＮＡは、各ライブラリーから単離され、重鎖及び軽鎖配列は、共に連結され、一括されて、組み合わせのライブラリーを形成する。各ファージは、ランダムな一組の重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを含有し、大腸菌感染の際に、感染細胞中の抗体鎖の発現を導く。対象の抗原を認識する抗体を識別するために、ファージライブラリーは、プレーティングされ、プラーク中に存在する抗体分子はフィルターに転移される。フィルターは、標識付き抗原と共に放射活性を持ってインキュベートされ、次いで、洗浄されて、過剰な非結合リガンドを除去する。オートラジオグラム上の放射性スポットは、抗原と結合する抗体を含有するプラークを認識する。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーを産生するのに有用なクローニング及び発現ベクターは、例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥクローニングシステム（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から得られ得る。
【００８９】
同様の方略が高親和性ｓｃＦｖを得るために用いられ得る。例えば、Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９  ３１４（１９９６）を参照されたい。大きいレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーは、全ての既知のＶＨ、Ｖｋ、及びＶλ遺伝子ファミリーに応じたＰＣＲプライマーを使用して、Ｖ遺伝子を非免疫化ヒトドナーから単離することによって構築され得る。増幅後、Ｖｋ及びＶλプールは、１つのプールを形成するために組み合わされる。これらのフラグメントは、ファージミドベクター内に連結される。次いで、ｓｃＦｖリンカー、（Ｇｌｙ４，Ｓｅｒ）３は、ＶＬフラグメントのファージミド上流内に連結される。ＶＨ及びリンカーＶＬフラグメントは、増幅され、ＪＨ領域上に集められる。結果として生じるＶＨリンカーＶＬフラグメントは、ファージミドベクター内に連結される。ファージミドライブラリーは、上述の通りフィルターを使用して、または免疫チューブ（Ｎｕｎｃ；Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を使用して、洗浄され得る。同様の結果は、免疫化ウサギのリンパ球または脾臓細胞から組み合わせの免疫グロブリンライブラリーを構築することによって、かつピキアパストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中のｓｃＦｖ構築物を発現することによって、達成され得る。例えば、Ｒｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１３：２５５  ２６０（１９９５）を参照されたい。さらに、適切なｓｃＦｖの単離後、より高い結合親和性及びより遅い解離速度を有する抗体フラグメントは、ＣＤＲ３変異誘発及び鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）などの親和性成熟過程によって得られ得る。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＲ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ，７８：１８１  １８８（１９９８）；Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，２：１８１  １９６（１９９６）を参照されたい。
【００９０】
抗体フラグメントの別の形態は、単一ＣＤＲをコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。かかる遺伝子は、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するために、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって、調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６（１９９１）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐ．１６６  １７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ１９９５）；及びＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐ．１３７  １８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照されたい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本発明に好適な抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。非ヒト抗体のヒト化形態は、非ヒトＩｇに由来する最小配列を含有するキメラＩｇ、Ｉｇ鎖、またはフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、またはＡｂの他の抗原−結合部分配列など）である。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的に「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類相補性判定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列に置換することによって達成される（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−６，（１９８８））。かかる「ヒト化」抗体は、実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されたキメラＡｂ（米国特許第４，８１６，５６７号）である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基及び恐らくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類Ａｂｓ中の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲからの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲからの残基（ドナー抗体）によって置き換えられるヒトＩｇ（レシピエント抗体）を含む。場合によっては、対応する非ヒト残基は、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基に取って代わる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体、または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列におけるいずれにも見出されない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、全てとは言えないにしてもほとんどのＣＤＲ領域が、非ヒトＩｇのものに対応し、全てとは言えないにしてもほとんどのＦＲ領域がヒトＩｇ共通配列のものである少なくとも１つ、及び典型的に２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。
【００９２】
高親和性抗ｍ７Ｇ抗体の使用は、定量的特異性にとって重要である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に好適な抗ｍ７Ｇ抗体またはそのフラグメントは、およそ５００ｎＭ以上、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、５００ｆＭ、４００ｆＭ、３００ｆＭ、２００ｆＭ、１００ｆＭ、５０ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭの結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適な抗ｍ７Ｇ抗体またはそのフラグメントは、およそ５００ｎＭ〜１ｆＭ、５００ｎＭ〜１０ｆＭ、５００ｎＭ〜１００ｆＭ、５００ｎＭ〜１ｐＭ、１０ｎＭ〜１ｆＭ、１０ｎＭ〜１００ｆＭ、１０ｎＭ〜１ｐＭ、１ｎＭ〜１ｆＭ、１ｎＭ〜１００ｆＭ、１ｎＭ〜５００ｆＭ、１ｎＭ〜１ｐＭ、１ｎＭ〜１０ｐＭ、１ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、１ｎＭ〜５００ｐＭの範囲の結合親和性を有する。
【００９３】
ＥＬＩＳＡに基づくｍＲＮＡキャップ定量化
本発明のいくつかの実施形態は、固体基質（例えば、ストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレートまたは３８４ウェルまたはその他）に結合する第１の捕捉剤（例えば、ビオチン標識付きポリ−ｄＴオリゴ）を使用するＥＬＩＳＡに基づくアッセイを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）合成の間のキャップ形成効率の定量化のための発明の方法を必要とする。第１の捕捉剤は、インビトロの合成されたｍＲＮＡと結合するために使用される。一旦結合すると、キャップ特異的結合物質は、その抗原として、ｍ７Ｇキャップ部分を標的とする。いくつかのＥＬＩＳＡに基づく実施形態において、一次キャップ特異的結合物質は、抗ｍ７Ｇ抗体（例えば、マウスモノクローナル抗ｍ７Ｇ抗体）である。二次標識付き抗体は、可視化／定量化のために使用される（図１参照）。いくつかの実施形態において、キャップ特異的結合物質は、別のキャップ特異的タンパク質（例えば、ｅＩＦ−４Ｅ）であり、二次抗体は、キャップ特異的タンパク質に対して特異的である。いくつかの実施形態において、二次抗体は、検出剤であるか、またはそれを提供し、例えば、検出可能な基質を産生するために酵素活性を有する。様々な発色／蛍光剤が置換及び適用され得る。特注合成されたビオチン化されたキャップ（ｍ７ＧｐｐｐＧ−ビオチン）は、正の対照として使用され得る。これは、適切な特徴付けに不可欠である、新たに合成されたｍＲＮＡ構造物上のキャップ形成部分を直接定量化するための新たな方法を表す。ＥＬＩＳＡアッセイ及び条件の最適化のためのプロトコルは、当該技術分野において既知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，“Ｅｌｉｓａ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，ＴＥＣＨ  ＴＩＰ＃６５（２０１０）（ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅｓ／ＴＲ００６５−ＥＬＩＳＡ−ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆで入手可能）を参照されたい。
【００９４】
したがって、本発明のＥＬＩＳＡに基づく実施形態において、二次薬剤は、選択的なキャップ結合物質に対して特異的な抗体である。いくつかの実施形態において、二次薬剤は、放射性または蛍光で標識付けされる。好ましい実施形態において、二次薬剤は、基質を検出可能産物に変換する酵素を含む。いくつかの実施形態において、酵素はアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼである。産物は、発色、化学蛍光（ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）、または化学発光であり得る。特定の実施形態において、基質は、ｐ−ピトロフェニルリン酸ニナトリウム塩（ＰＮＰＰ）、２，２´−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、または３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）からなる群から選択される。特定の実施形態において、産物は、発色性であり、３７０〜６５２ナノメートルの光を吸収する。上述の通り、シグナルの強度は、基質上に捕捉されたおよその量のキャップされたＲＮＡ標的に比例する。
【００９５】
対照を使用して、キャップされたｍＲＮＡの量を定量化し得る。いくつかの実施形態において、対照は、既定量のキャップされたｍＲＮＡを有するｍＲＮＡサンプルを含む。いくつかの実施形態において、対照は、所定量の合成されたキャップを含む。いくつかの実施形態において、特注合成されたビオチン化されたキャップ（ｍ７ＧｐｐｐＧ−ビオチン）は、正の対照として使用される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、アッセイは、当業者に周知の方法による較正曲線を確立することによって定量的になされる。言い換えると、免疫反応の度合は、既知の標準と未知のサンプルの光学密度との目視比較によって定性的にもしくは半定量的に、または既知のキャップ濃度のいくつかのサンプルを使用して調製された標準曲線との分光光度的な比較によって定量的に判定され得る。例えば、定量化は、一次抗体のエピトープを保持し、固体基質によって結合され得るｍ７Ｇキャップ標準または標準物質一式を作製することによって実施され得る。これらの標準または標準物質は連続的に希釈され、標準または標準物質の試験された濃度それぞれからの結果として生じるシグナル値は、標準曲線を生成するために使用され、キャップされた標準または標準物質の濃度対結果として生じるシグナル値を図示する。一旦標準定量的曲線が、確立されると、アッセイは、標準曲線上に結果として生じるシグナルを示すことによって、サンプル中のキャップされたｍＲＮＡのレベルを判定するために使用される。
【００９７】
キット
本発明は、本発明に従い本発明の方法を実行するのに有用な様々な試薬及び材料を含むキットをさらに提供する。本明細書に記載される定量的な手順は、診断研究所、実験室、または民間試験所によって実施され得る。本発明は、これらの異なる設定で使用することができるキットを提供する。
【００９８】
例えば、本発明の方法に従ってキャップ特異的結合物質を提供することによって、ｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャップ形成効率を定量化するための材料及び試薬は、キット中に共に集められる。特定の実施形態において、発明のキットは、ｍＲＮＡキャップと複合体を特異的に形成する少なくとも１つ以上の試薬、随意に複合体の形成を検出するための薬剤、及び本発明の方法に従ってキットを使用するための指示書を含む。
【００９９】
各キットは、好ましくは、手順を特異的にさせる試薬を含む。したがって、ｍＲＮＡキャップ形成効率を検出／定量化するために、キャップを有する複合体を特異的に形成する試薬は、抗体であり得る。キットは、複合体の形成を検出する検出剤または二次薬剤（例えば、ＨＲＰ−接合抗体）も含み得る。キットは、ｍＲＮＡ（例えば、ビオチン化された９６ウェルプレート）の単離のために随意に第２の捕捉剤と接合する固体基質も含み得る。キットは、第１の捕捉剤、例えば、ｍＲＮＡと特異的に相互作用するタンパク質またはオリゴヌクレオチドも含み得る。
【０１００】
本発明に従うキットまたは他の製造品は、様々な試薬を保持するために１つ以上の容器を含み得る。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ（例えば、プレフィルドシリンジ）、アンプルを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、本明細書に記載される対照レベルを判定するための好適な対照レベルまたは対照サンプルを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、本発明の１つ以上の方法に従ってキットを使用するための指示書を含み得、インビトロの転写及びキャップ形成のための指示書を含み得る。
【実施例】
【０１０２】
実施例１：ｍＲＮＡの合成
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）及びヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを、各それぞれの遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからインビトロ転写によって合成した。インビトロの転写は、グアニリルトランスフェラーゼを介したＧＴＰの酵素的接合によって、塩基１のリボース環の２´ＯＨ基に２´−Ｏ−メチル残基を有する５´キャップ構造、キャップ１の付加を含んだ。およそ２００ヌクレオチド長の３´ポリ（Ａ）尾部（ゲル電気泳動法によって判定される）を、ポリＡポリメラーゼと共に、ＡＴＰの付加によって組み込んだ（以下の詳細な反応条件を参照されたい）。インビトロの転写産物は、以下の配列において、それぞれ、Ｘ及びＹとして表される５´及び３´非翻訳領域を含んだ。
【０１０３】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号１）
【化５】
2016515216.tif 000007
【０１０４】
コドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（配列番号２）
【化６】
2016515216.tif 000008
【０１０５】
Ｘ１／Ｙ１及びＸ２／Ｙ２の５´及び３´ＵＴＲ配列は以下の通りであった。
【０１０６】
Ｘ１＝ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（配列番号３）
【０１０７】
Ｘ２＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号４）
【０１０８】
Ｙ１＝ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣ（配列番号５）
【０１０９】
Ｙ２＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号６）
【０１１０】
ｍＲＮＡの合成を、完全なリボヌクレアーゼを含まない条件下で実施した。全てのチューブ、バイアル、ピペットチップ、ピペット、緩衝液などがヌクレアーゼを含まない必要があった。メッセンジャーＲＮＡを線状化ＤＮＡテンプレートから合成した。所望のｍＲＮＡ前駆体（ＩＶＴ）構築物を産生するために、約１００ｕｇの線状化ＤＮＡ、ｒＮＴＰ（３．３３ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ阻害剤、ピロホスファターゼ、及び反応緩衝液（１０×、８００ｍＭのヘペス（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのスペルミジン、２５０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．７）の混合物を、２．２４ｍｌの最終容量にリボヌクレアーゼを含まない水で調製した。反応混合物を２０〜１２０分間３７℃でインキュベートした。完了の際に、混合物をさらに１５分間、デオキシリボヌクレアーゼＩで処理し、適宜反応を停止させた。
【０１１１】
前述のＩＶＴステップからの精製されたｍＲＮＡ産物を６５℃で１０分間変性させた。別々に、一部のＧＴＰ（２０ｍＭ）、Ｓ−アデノシルメチオニン、リボヌクレアーゼ阻害剤、２´−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、及びグアニリルトランスフェラーゼを、８．３ｍｌの最終濃度へと反応緩衝液（１０×、５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）と共に混合した。変性の際に、ｍＲＮＡを氷上で冷却し、次いで、反応混合物に添加した。組み合わせた溶液を２０〜９０分間３７℃でインキュベートした。完了の際に、一定分量のＡＴＰ（２０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼ、及び尾引き反応緩衝液（１０×、５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）を添加し、合計反応混合物を約２０〜４５分間、３７℃でさらにインキュベートした。完了の際に、最終反応混合物は反応を停止し、適宜精製される。
【０１１２】
実施例２：ビオチン−ストレプトアビジン系オリゴ−ｄＴ捕捉ＥＬＩＳＡを使用するキャップ形成効率の定量化
この実施例は、キャップ形成効率を定量化するために例示的なＥＬＩＳＡ方法を示す。例示的な実施形態を図１に示す。市販のストレプトアビジンマイクロプレートを、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。市販の５´ビオチンオリゴｄＴ２０を、１００μｌの最終容量において１〜５ｐｍｏｌ／ウェルで添加し、１時間、室温（ＲＴ）で、インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、遮断緩衝液３２０μＬ（０．０１ＭのＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．１５％のＴｗｅｅｎ２０）で１時間遮断した。
【０１１３】
メッセンジャーＲＮＡサンプルを、１０分間、９４℃で変性させ、３０分間、室温でインキュベートした。２０ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌのｍＲＮＡを含有する１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（４×ＳＳＣ、２０ｍＭのヘペス、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５％のＴｗｅｅｎ２０）を各ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートした。プレートを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【０１１４】
一次抗体、マウスモノクローナル抗ｍ７Ｇキャップ（１００μｌの一定分量における１：２０００〜１：２５０００希釈）をプレートの各ウェルに適用し、およそ１時間、室温でインキュベートした。プレートを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、１００μｌの二次抗体、ヤギ抗マウスＨＲＰ接合抗体（１：４０，０００希釈）を各ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートした。プレートを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【０１１５】
一次抗体及び二次抗体の相互作用を検出するために、ＴＭＢ（３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン）発色基質溶液を、製造業者の支持に従って調製し、１００μｌの一定分量において、各ウェルに添加し、１５分間、室温でインキュベートした。反応を１００μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止した。
【０１１６】
ＨＲＰを検出するときにＴＭＢは認識可能な程度の青色を産生した。Ｈ２ＳＯ４の添加後、色は４５０ｎｍでの、最大吸光度で黄色に変化し、それはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用して読み取られた。
【０１１７】
４５０ｎｍでの吸光度を有するウェルはキャップされたｍＲＮＡの存在を示したことが見出される。サンプル当たりのキャップされたｍＲＮＡの定量的測定を、サンプルの平均吸光度値に続いて、ストレプトアビジンコーティングされたプレートに結合され、マウスモノクローナルｍ７Ｇキャップ抗体（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出されるビオチン接合ｍ７Ｇキャップ小分子の連続的に希釈された正の対照から生成された標準曲線（濃度対吸光度を図示する）の補間から判定する。
【０１１８】
実施例３：ポリＡ結合タンパク質系捕捉ＥＬＩＳＡを使用するキャップ形成効率の定量化
この実施例は、ポリＡ結合タンパク質コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用する別の例示的なＥＬＩＳＡ方法を示す。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）を使用する１μｇ／ｍｌのポリＡ結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）でコーティングする。その後、プレートを洗浄し、遮断緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、２％のＢＳＡ）で遮断し、１時間、室温でインキュベートする。次いで、プレートを、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄する。
【０１１９】
ｍＲＮＡサンプルを、１０分間、９４℃で変性させ、３０分間、室温で、インキュベートする。次いで、サンプルを、ＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（４×ＳＳＣ、２０ｍＭのヘペス、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５％のＴｗｅｅｎ２０）においておよそ（２０ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ）の濃度に希釈する。およそ１００μｌを各ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートする。
【０１２０】
一次抗体、マウスモノクローナル抗ｍ７Ｇキャップ（１００μｌの一定分量における１：２０００〜１：２５０００希釈）をプレートの各ウェルに適用し、およそ１時間、室温でインキュベートする。プレートを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて、１：４０，０００希釈でヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ接合二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ３１４３９）を添加し、１時間、室温でインキュベートする。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＴＭＢを調製し、上記の通り添加する。室温で１５分間インキュベートした後、反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止させ、プレートを上記の通り４５０ｎｍで読み取る。
【０１２１】
代替的な実施形態において、市販のマイクロプレートを、ＰＡＩＰ２に特異的な抗体が予めコーティングされたその上に使用する。０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌでの１００μｌの市販のヒト組み換え型ＰＡＩＰ２（Ｃｕｓａｂｉｏ（登録商標））を、コーティング緩衝液（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）を使用して、各ウェルに添加し、続いて、１時間室温でインキュベートする。ヒト組み換え型ＰＡＩＰ２の存在は、固定化抗体に制約される。任意の非結合物質を除去した後、ｍＲＮＡサンプルをキャップ形成効率定量化のために上記の通り、ウェルに添加する。一次抗体、マウスモノクローナル抗ｍ７Ｇキャップ（１００μｌの一定分量における１：２０００〜１：２５０００希釈）をプレートの各ウェルに適用し、およそ１時間、室温でインキュベートする。プレートを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄する。洗浄後、１００μｌの二次抗体、ヤギ抗マウスＨＲＰ接合抗体（１：４０，０００希釈）を各ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートする。プレートを３回洗浄し、続いて、ＴＭＢ発色基質溶液を添加する。発色現像を停止し、色の強度を測定し、キャップされたｍＲＮＡの量を、上記の通り標準曲線を使用して定量化する。
【０１２２】
実施例４：インビボのタンパク質産生上のｍＲＮＡ５´キャップ形成の評価
この実施例において、我々は、インビボのタンパク質産生上のｍＲＮＡ５´キャップ形成の影響及びｍＲＮＡ系治療の有効性に対するその潜在的影響を評価する。具体的には、我々は、ファブリ病で欠乏しているα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）のインビボの産生上の５´キャップ形成の影響を評価する。ファブリ病は、重度の腎機能障害、角化血管腫、及び心室拡大及び僧帽弁閉鎖不全を含む循環障害を特徴とするＸ結合遺伝性リソソーム蓄積症である。ファブリ病はまた、抹消神経系に影響を及ぼし、四肢における苦悶の灼熱痛の発症を引き起こす。ファブリ病は、酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）の欠乏によって引き起こされる。α−ＧａｌＡは、様々な複合糖質の終端α−ガラクトシル部分を切断するリソソームグリコヒドロラーゼである。ファブリ病は、中性スフィンゴ糖脂質、セラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ）の異化の遮断、ならびに細胞内及び血流中の酵素基質の蓄積をもたらす。
【０１２３】
ヒトα−ＧａｌＡ、ＧＬＡをコードするｃＤＮＡ及び遺伝子を単離し、配列決定した。ヒトα−ＧａｌＡは、Ｎ終端３１アミノ酸がシグナルペプチドである４２９アミノ酸ポリペプチドとして発現される。ヒト酵素は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現された（Ｄｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３５６，８０４号；Ｉｏａｎｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．１１９：１１３７（１９９２））；及びｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｃａｌｈｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９０／１１３５３）。
【０１２４】
ファブリ病を患っている個体は、ヒトα−ＧａｌＡを用いた酵素補充療法によって処置され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５８，５７４号を参照されたい）。α−ＧａｌＡ欠乏の発現を調節し、または補い、ひいては、根底にある欠乏を改善するさらなる方策が、関連する障害のための適切な治療法の開発に有用であり得る。かかる方策は、現存の遺伝子欠陥を補正することが可能であり、かつ／または１つ以上の標的細胞に有益な機能を提供することが可能である核酸の細胞内送達（例えば、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ）の方法を含む。標的組織及び細胞への成功裏の送達後、組成物及び核酸は標的細胞をトランスフェクトし、核酸（例えば、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ）は、対象の遺伝子産物（例えば、α−ＧＡＬＡ）へと翻訳され得るか、さもなければ、対象の遺伝子産物の存在または発現を調節／制御し得る。かかる方法は、以前に記載された。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第２０１１／０２４４０２６号を参照されたい。
【０１２５】
この実施例において、我々は、インビボのタンパク質産生上の５´キャップ形成の影響を評価した。ヒトＧＬＡ  ｍＲＮＡを、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからのインビトロの転写によって合成し、それは、続いて、キャップ０またはキャップ１のいずれかの５´キャップ構造を付加した（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６：１２３９−１２４９（２００５））。ゲル電気泳動法によって判定されたおよそ２００ヌクレオチド長の３´ポリ（Ａ）尾部も付加された。ＧＬＡ  ｍＲＮＡ中に存在する５´及び３´不飽和領域は、以下に示される配列番号７におけるＸ及びＹとして表される。
【０１２６】
α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡ（配列番号７）：
【化７】
2016515216.tif 000009
【０１２７】
Ｘ＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号４）
【０１２８】
Ｙ＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号６）
【０１２９】
ポリＡ挿入物（ＣＯ−ＧＬＡ−ポリＡ）を有するコドン最適化α−ガラクトシダーゼも、いくつかの実施形態において利用される。（配列番号８）
【化８】
2016515216.tif 000010
【０１３０】
ＧＬＡｍＲＮＡを、使用時まで−８０℃で１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で水中に保存した。全てのｍＲＮＡ濃度を、吸収（２６０ｎｍのγｍａｘ）により判定した。
【０１３１】
ＧＬＡキャップ０ｍＲＮＡ、ＧＬＡキャップ１ｍＲＮＡ、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ、及び他の対照のインビボの送達のために好適な配合物は、１つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質、及びペグ化脂質を用いる変化する比率の多成分脂質混合物を含む。カチオン性脂質は、（排他的ではないが）ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，１０７：２７６−２８７（２００５））、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（サンプル、Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２８：１７２−１７６（２０１０））、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：１８６４−１８６９（２０１０））、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジウム系などを含み得る。ヘルパー脂質は、（排他的ではないが）ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１´−ｒａｃ−グリセロｌ））、コレステロールなどを含み得る。ペグ化脂質は、（排他的ではないが）Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合的に付着した最大５ｋＤａ長のポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る。ｍＲＮＡの脂質カプセル化を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在を伴う及び伴わないＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを実施することによって計算した。粒径（動的光散乱（ＤＬＳ））及びゼータ電位を、１×ＰＢＳ及び１ｍＭのＫＣｌの溶液中それぞれでＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて判定した。
【０１３２】
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの一定分量の５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を混合し、３ｍＬの最終容量へと、エタノールで希釈した。別々に、ＣＯ−ＧＬＡ  ｍＲＮＡ（キャップ０またはキャップ１）の水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬ貯蔵物から調製した。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入し、振盪して、２０％のエタノール中に最終懸濁液を生じさせた。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝０．７２ｍｇ／ｍＬのＧＬＡ  ｍＲＮＡ（カプセル化）。Ｚａｖｅ＝８５．５ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝６１．９ｎｍ、Ｄｖ（９０）＝１１３ｎｍ）。
【０１３３】
ｍＲＮＡがＣ１２−２００系脂質内にカプセル化されたときに、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ内に組み込まれたキャップの種類がタンパク質産生に影響を与えたかどうかを判定するために、野生型（ＣＤ−１）マウスにキャップされたＧＬＡ  ｍＲＮＡ種を注射し、その後、ヒトＧＬＡタンパク質産生を監視した実験を実行した。キャップされたｍＲＮＡ種は、キャップ０（２´−Ｏ位置で非メチル化）及びキャップ１（２´−Ｏメチル化）を含んだ。
【０１３４】
各研究の開始時におよそ６〜８週間の年齢の雄のＣＤ−１マウスを使用して、前述の研究を実施した。サンプルを、カプセル化されたＧＬＡ、ＥＰＯ、ＦＩＸ、またはＡＩＡＴ  ｍＲＮＡの３０マイクログラムの等価合計投与量の単回ボーラス尾静脈注射によって導入した。ＧＬＡタンパク質の血清濃度を６時間で判定した。全ての動物を、用量投与（±５％）の６時間後にＣＯ２窒息によって安楽死させ、続いて、開胸及び末端心臓血液採取をした。全血液（最大取得可能な容量）を、安楽死させた動物上の心臓穿刺によって、血清分離器チューブ内へ採取し、少なくとも３０分間室温で凝血させ、１０分間、９３００ｇで、２２℃±５℃で、遠心分離し、血清を抽出した。６時間での中間血液採取のために、およそ４０〜５０μＬの全血液を、顔面静脈穿刺または尾部切除によって採取した。未処置動物から採取されたサンプルを、研究動物との比較のためベースラインＧＬＡレベルとして使用する。各マウスの肝臓及び脾臓を採取し、３つの部分に分配し、１０％の中性緩衝ホルマリンまたはスナップ冷凍のいずれかで保存し、８０℃で保存した。
【０１３５】
ヒトＧＬＡタンパク質産生を酵素様免疫吸収分析アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）によって測定した。二次（検出）抗体としてウサギ抗ＲｅｐｌａｇａｌＩｇＧを伴う、捕捉抗体としてヒツジ抗ＲｅｐｌａｇａｌＧ−１８８ＩｇＧを用いて、標準ＥＬＩＳＡ手法に従った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧを、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の活性化のために使用した。２０分後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を停止させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ機器上の吸収（４５０ｎｍ）によって、検出を監視した。未処置マウス血清及びヒトＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）タンパク質を、負及び正の対照、それぞれとして使用した。
【０１３６】
図３に示す通り、Ｃ１２−２００系脂質ナノ粒子中に充填されたＣＯ−ＧＬＡ  ｍＲＮＡのキャップされた種の静脈内注射後、ヒトＧＬＡタンパク質の実質的なレベルは、６時間以内にマウス血清において検出され得る。とりわけ、キャップ０構造のものに対してキャップ１構造を有するｍＲＮＡを用いるときに統計的にタンパク質生産の著しい増加がある。これらの結果は、ｍＲＮＡ合成過程のキャップ形成効率を特徴付け、定量化する能力を有することの重要性を実証した。
【０１３７】
実施例５：オリゴｄＴコーティングしたプレートを使用するキャップＥＬＩＳＡ
この実施例は、キャップ形成定量化アッセイにおけるオリゴｄＴコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの使用を実証する。具体的には、ＬＮＡ強化オリゴ−Ｔ２０（Ｅｘｉｑｏｎ）を、１００μｌのコーティング緩衝液緩衝液（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）における０．１ｐｍｏｌ／ウェル〜５００ｐｍｏｌ／ウェルの範囲のＮｕｎｃイモビライザーアミノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）におけるそれらの結合効率のために試験した。プレートを、室温で回転させながら１．５時間インキュベートし、２００μｌの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、紙タオル上で軽く叩いて乾燥させた。ｍＲＮＡ結合能力を、１００μｌの結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）における７．８ｎｇ／ウェル〜５００ｎｇ／ウェルの範囲のキャップされた／キャップのないｍＲＮＡで試験し、室温で回転させながら９０分間インキュベートした。プレートを２００μｌの結合緩衝液で３回洗浄し、紙タオル上で軽く叩いて乾燥させた。２μｌの抗ｃａｐ抗体（Ｓｙｓｙ）を、２０μｌの最終容量におけるＺｅｎｏｎ西洋ワサビペルオキシダーゼマウスＩｇＧ１標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＲＰに直接接合した。ＨＲＰ接合抗体を、遮断緩衝液（１×ＰＢＳ、２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）において０．８μｌ／ｍｌで混合し、１００μｌ／ウェルで添加し、室温で回転させながら１時間インキュベートした。プレートを２００μｌの結合緩衝液で３回洗浄し、紙タオル上で軽く叩いて乾燥させた。ＴＭＢ  ＥＩＡ基質溶液を製造業者の指示に従って調製した。１００μｌのこれを各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。１００μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって、１０分後、反応を停止し、４５０ｎｍでＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用して読み取った。図４は、ＥＬＩＳＡによって測定されたキャップされた及びキャップのないｍＲＮＡにおけるキャップ形成の定量化の例示的な結果を示す。検出されたシグナルは、ＲＮＡサンプル中のキャップ構造を有する抗キャップ抗体の相互作用から生じる。
【０１３８】
この実施例は、キャップ形成の定量化が捕捉する基質としてオリゴｄＴコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、最適化され得ることを実証する。
【０１３９】
実施例６：オリゴｄＴ捕捉ＥＬＩＳＡを使用するキャップ形成効率の定量化
この実施例において、我々は、様々なｍＲＮＡサンプル中のキャップ形成効率が、オリゴｄＴ捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、効果的に定量化され得ることをさらに実証した。
【０１４０】
具体的には、オリゴｄＴコーティングされたｍＲＮＡ捕捉プレートを、Ｎｕｎｃイモビライザーアミノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のウェル当たり１００μｌのコーティング緩衝液における５０ｐｍｏｌのＬＮＡ強化オリゴ−Ｔ２０（Ｅｘｉｑｏｎ）と結合することによって、調製した。プレートを室温で回転させながら１．５時間インキュベートした。プレートを、２００μｌの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、紙タオル上で軽く叩いて乾燥させた。Ｎ７メチルキャップされたオリゴ［Ｎ７ＭｅＧｐｐｐ］−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡを、標準曲線測定のため合成した（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。２００ｂｐのポリＡ尾部と商業的に、または社内で５００ｂｐのポリＡ尾部と合成された６４ｎｇのＮ７メチルキャップされたオリゴ及び６４ｎｇのキャップされたｍＲＮＡを、１００μｌのＲＮＡ結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）におけるウェル毎に添加し、室温で回転させながら９０分間インキュベートした。プレートを２００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、紙タオル上で軽く叩いて乾燥させた。２μｌの抗ｃａｐ抗体（Ｓｙｓｙ）を、２０μｌの最終容量におけるＺｅｎｏｎ西洋ワサビペルオキシダーゼマウスＩｇＧ１標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＲＰに直接接合した。ＨＲＰ接合抗体を、遮断緩衝液（１×ＰＢＳ、２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）において０．８μｌ／ｍｌで混合し、１００μｌ／ウェルで添加し、室温で回転させながら１時間インキュベートした。プレートを２００μｌの結合緩衝液で３回洗浄し、紙タオル上で軽く叩いて乾燥させた。ＴＭＢ  ＥＩＡ基質溶液を製造業者の指示に従って調製した。１００μｌのこれを各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。１００μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって、１０分後、反応を停止し、４５０ｎｍでＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用して読み取った。図５は、ＥＬＩＳＡによって測定された様々なｍＲＮＡサンプル（例えば、特定の社内のホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ、市販のＦＦＬ  ｍＲＮＡ、及び標準Ｎ７メチルキャップされたＲＮＡ）におけるキャップ形成の定量化の例示的な結果を示す。
【０１４１】
この実施例は、ＥＬＩＳＡ（オリゴｄＴ捕捉ＥＬＩＳＡなど）を使用して、ｍＲＮＡサンプル中のキャップ形成効率を効果的に定量化し得ることを実証する。
【０１４２】
等価物及び範囲
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものでははく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【０１４３】
特許請求の範囲において、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」などの冠詞は、その反対が示されるか、または別途文脈から明白でない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。したがって、例えば、「１つの抗体」への言及は、複数のかかる抗体を含み、「その細胞」への言及は、当業者などに既知の１つ以上の細胞への言及を含む。群の１つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記載は、その反対が示されるか、または別途文脈から明白でない限り、１つ、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している場合に、満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つの要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している実施形態を含む。本発明は、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品または過程を提示するか、それらにおいて用いられるか、または別途それらに関連している実施形態を含む。さらに、本発明は、列挙された請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、節、記述用語などが別の請求項に導入される全ての変化形、組み合わせ、及び順列を包含することが理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同一の基本請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１つ以上の制限を含むように修正され得る。さらに、請求項が組成物を唱える場合に、別途示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示の目的のうちのいずれか１つのために組成物を使用する方法が含まれ、本明細書に開示された作製方法のうちのいずれかまたは当該技術分野において既知の他の方法に従い組成物を作製する方法が含まれることが理解されるべきである。
【０１４４】
要素が、一覧として、例えば、Ｍａｒｋｕｓｈ群形式で提示される場合、要素の各亜群も開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ることが理解されるべきである。一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして見なされる場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様が、かかる要素、特徴などから構成されるか、または本質的に構成されることが理解されるべきである。簡潔さを目的として、それらの実施形態は、本明細書で具体的に逐語的には記載されていない。用語「含む」は開かれており、追加の要素またはステップの包含を許容することが意図されることを留意されたい。
【０１４５】
範囲が与えられている場合、終点を含む。さらに、別途示されるか、または別途文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が別途明確に指示しない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態の状態範囲内の任意の特定の値または部分範囲をとることができることが理解されるべきである。
【０１４６】
その上、先行技術範囲内の本発明の任意の特定の実施形態が、請求項のうちのいずれか１つ以上から明らかに除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は、当業者に既知であると見なされるので、除外が明らかに本明細書に記載されていない場合でも除外され得る。本発明の組成物のいずれの特定の実施形態も、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、あらゆる理由により、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。
【０１４７】
上記及び本文全体を通して考察された出版物は、単にそれらの開示が本出願の出願日以前であるために提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明者らが、先行開示のためにかかる開示に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【０１４８】
他の実施形態
当業者は、前述のものが単に本発明の特定の好ましい実施形態を表すことを容易に理解するであろう。上述の手法及び組成物に対する様々な変更及び修正が、以下の特許請求の範囲に記載される通り、本発明の精神または範囲から逸脱することなくなされ得る。
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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