(57)【要約】本発明は、疾患の分子的分類、具体的には、肺癌の予後および治療選択のための分子マーカー、ならびにそれらの使用の方法およびシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）試料中の表1からの少なくとも4種のCCGを含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；
（2）試験値を、
（a）バイオマーカーのパネルから選択された、CCGを含む複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けすること；および
（b）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることであって、CCGへ与えられる重みの組み合わせが、複数の試験遺伝子の発現へ与えられる全重みの少なくとも40％である、重み付き発現を組み合わせること
によって、提供する工程；ならびに
（3）試験値を、
（a）試験値が複数の試験遺伝子の高い発現を反映する場合、不利な分類；または
（b）試験値が複数の試験遺伝子の低いかまたは正常な発現を反映する場合、有利な分類
と相関させる工程
を含む、肺癌を分類するインビトロの方法。
【請求項２】
複数の試験遺伝子の少なくとも75％が表2からのCCGである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
遺伝子のパネルおよび複数の試験遺伝子が、各々、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの上位3種の遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
遺伝子のパネルおよび複数の試験遺伝子が、各々、パネルFのCCGを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
不利な分類が、（a）予後不良、（b）癌進行の可能性の増加、（c）癌再発の可能性の増加、（d）癌特異的死亡の可能性の増加、または（e）特定の計画による処置に対する応答の可能性の減少からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
不利な分類が、癌特異的死亡の可能性の増加である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
不利な分類が、化学療法を含む処置に対する応答の可能性の減少である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
有利な分類が、（a）予後良好、（b）癌進行の可能性の増加の欠如、（c）癌再発の可能性の増加の欠如、（d）癌特異的死亡の可能性の増加の欠如、または（e）特定の計画による処置に対する応答の可能性の増加からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
有利な分類が、癌特異的死亡の可能性の増加の欠如である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
有利な分類が、化学療法を含む処置に対する応答の可能性の増加である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、肺癌を有する患者の予後および／または特定の処置に対する患者における応答の可能性を決定する方法：
患者由来の試料を入手する工程；
試料中の少なくとも4種のCCGを含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定する工程；
（1）遺伝子のパネルから選択された、少なくとも75％、少なくとも85％、または少なくとも95％がCCGである複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（2）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；ならびに
複数の試験遺伝子の発現の増加を、予後不良および／または特定の処置計画に対する応答の可能性の増加と相関させる工程。
【請求項１２】
少なくとも4種のCCGへ与えられる重みの組み合わせが、複数の試験遺伝子の全ての発現へ与えられる全重みの少なくとも40％である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
決定工程が、
腫瘍試料中の6〜200種のCCGの各々から転写されたmRNAの量の測定；および
腫瘍試料中の1種または複数種のハウスキーピング遺伝子のmRNAの量の測定
を含む、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも8種のCCGの発現が決定され、重み付けされる、請求項11または12または13記載の方法。
【請求項１５】
特定の処置計画が化学療法を含む、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
試験値を参照値と比較する工程をさらに含み、試験値が参照値より大きい場合に、予後不良および／または特定の処置計画に対する応答の可能性の増加との相関がなされる、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
6〜約200種のCCGの発現レベルが測定される、請求項11〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
特定の処置計画が補助化学療法を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、肺癌を有する患者における癌を処置する方法：
患者由来の試料中の少なくとも4種のCCGを含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；
（1）遺伝子のパネルから選択された、少なくとも60％または75％がCCGである複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けすること、および、（2）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程であって、複数の試験遺伝子の発現のレベルの増加が、予後不良および／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性の増加を示す、工程；ならびに
予後不良および／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性の増加が示されるか否かに少なくとも一部分基づき、抗癌薬を患者へ投与するか、または化学療法を含む処置計画を推奨するかもしくは処方するかもしくは開始する工程。
【請求項２０】
仕切られた容器に、
少なくとも5種の試験遺伝子のPCR増幅のための複数のPCRプライマー対であって、少なくとも8種の試験遺伝子の全ての10％未満、30％、または40％未満が非CCGである、複数のPCRプライマー対；および
少なくとも1種のハウスキーピング遺伝子のPCR増幅のための1種以上のPCRプライマー対
を含む、肺癌を有する患者における癌の予後を予測するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性を決定するためのキット。
【請求項２１】
仕切られた容器に、
少なくとも5種の試験遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする複数のプローブであって、少なくとも8種の試験遺伝子の全てのうち10％未満、30％、または40％未満が非CCGである、複数のプローブ；および
少なくとも1種のハウスキーピング遺伝子とハイブリダイズする1種または複数種のプローブ
を含む、肺癌を有する患者における癌の予後を予測するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性を決定するためのキット。
【請求項２２】
仕切られた容器の中の、
試験遺伝子のうちの1種をPCR増幅するためのPCRプライマー対を各々が含む、少なくとも50％、少なくとも60％、または少なくとも80％がCCGである5または10〜300種の試験遺伝子のPCR増幅のための第一の複数のPCR反応混合物；および
少なくとも1種のハウスキーピング遺伝子のPCR増幅のための第二の複数のPCR反応混合物
から本質的になるキット。
【請求項２３】
CCGが試験遺伝子の総数の10％以上を構成する、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４】
CCGが試験遺伝子の総数の20％以上を構成する、請求項20〜22のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５】
患者における癌の予後を予測するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する患者における応答の可能性を決定するために、肺癌を有する患者に由来する試料中の試験遺伝子の発現を決定するための診断用製品の製造のための、
（1）少なくとも4種のCCGのPCR増幅のために適当な複数のPCRプライマー対；および
（2）少なくとも1種のハウスキーピング遺伝子のPCR増幅のために適当な1種または複数種のPCRプライマー対
の使用であって、
発現のレベルの増加が、予後不良または患者における応答の可能性の増加を示す、使用。
【請求項２６】
複数のPCRプライマー対が、少なくとも8種のCCGのPCR増幅のために適当である、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
複数のPCRプライマー対が、10％以下、30％、または50％未満が非CCGである4〜約300種の試験遺伝子のPCR増幅のために適当である、請求項25または26記載の使用。
【請求項２８】
複数のPCRプライマー対が、少なくとも25％がCCGである20〜約300種の試験遺伝子のPCR増幅のために適当である、請求項25または26記載の使用。
【請求項２９】
患者における癌の予後を予測するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する患者における応答の可能性を決定するために、肺癌を有する患者に由来する試料中の試験遺伝子の発現を決定するための診断用製品の製造のための、
（1）少なくとも4種のCCGとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする複数のプローブ；および
（2）少なくとも1種のハウスキーピング遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする1種または複数種のプローブ
の使用であって、
発現のレベルの増加が、予後不良または患者における応答の可能性の増加を示す、使用。
【請求項３０】
複数のプローブが、少なくとも8種の異なるCCGとのハイブリダイゼーションのために適当である、請求項28記載の使用。
【請求項３１】
複数のプローブが、10％以下、30％、または50％未満が非CCGである4〜約300種の試験遺伝子とのハイブリダイゼーションのために適当である、請求項28または29記載の使用。
【請求項３２】
複数のプローブが、少なくとも25％がCCGである20〜約300種の試験遺伝子とのハイブリダイゼーションのために適当である、請求項28または29記載の使用。
【請求項３３】
肺癌を有する患者における癌の予後を予測するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性を決定するためのシステムであって、
試料中の少なくとも4種のCCGを含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための、患者に由来する試料または遺伝子のパネルから発現されたmRNA由来のcDNA分子を含有している試料分析器；ならびに
（a）遺伝子のパネルから選択された、少なくとも50％、少なくとも75％がCCGである少なくとも4種の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、（b）試験遺伝子の各々の決定された発現を重み付けし、（c）試験値を提供するよう重み付き発現を組み合わせるための、第一のコンピュータプログラム；ならびに
予め決定された予後および／または特定の処置計画に対する応答の予め決定された可能性と各々関連している1種または複数種の参照値と試験値を比較するための第二のコンピュータプログラム
を含むシステム。
【請求項３４】
肺癌を有する患者における癌の予後を予測するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性を決定するためのシステムであって、
（1）患者由来の試料中の少なくとも4種のCCGを含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための、腫瘍試料、遺伝子のパネルから発現されたRNA、またはそのようなRNAから合成されたDNAを含有している試料分析器；ならびに
（2）（a）遺伝子のパネルから選択された少なくとも4種の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、（b）試験遺伝子の各々の決定された発現を重み付けし、（c）試験値を提供するよう重み付き発現を組み合わせるためにプログラムされた第一のコンピュータサブシステムであって、少なくとも4種のCCGに与えられる重みの組み合わせが、複数の試験遺伝子の全ての発現に与えられる全重みの少なくとも40％である、第一のコンピュータサブシステム；ならびに
（3）予め決定された予後および／または特定の処置計画に対する応答の予め決定された可能性と各々関連している1種または複数種の参照値と試験値を比較するためにプログラムされた第二のコンピュータサブシステム
を含むシステム。
【請求項３５】
試験値と1種または複数種の参照値との間の比較を表示するかまたは比較工程の結果を表示するディスプレイモジュールをさらに含む、請求項33または請求項34記載のシステム。
【請求項３６】
CCGが、表5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23のいずれかにリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種の遺伝子である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
CCGが、表5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23のいずれかにリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種の遺伝子である、請求項20〜24のいずれか一項記載のキット。
【請求項３８】
CCGが、表5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23のいずれかにリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種の遺伝子である、請求項25〜32のいずれか一項記載の使用。
【請求項３９】
CCGが、表5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23のいずれかにリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種の遺伝子である、請求項33〜35のいずれか一項記載のシステム。
【請求項４０】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルから選択される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルから選択される、請求項20〜24のいずれか一項記載のキット。
【請求項４２】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルから選択される、請求項25〜32のいずれか一項記載の使用。
【請求項４３】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルから選択される、請求項33〜35のいずれか一項記載のシステム。
【請求項４４】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルである、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルである、請求項20〜24のいずれか一項記載のキット。
【請求項４６】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルである、請求項25〜32のいずれか一項記載の使用。
【請求項４７】
CCGが、表1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、もしくは15のいずれかにリストされた遺伝子、または表21、22、23、24、もしくは25のいずれかにリストされたパネルFのサブパネルである、請求項33〜35のいずれか一項記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる（2013年2月21日に出願された）米国仮出願第61/767,490号、（2013年7月31日に出願された）第61/860,470号、および（2013年10月23日に出願された）第61/894,733号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、疾患の分子的分類、具体的には、肺癌の予後および治療選択のための分子マーカー、ならびにそれらの使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は、米国内の全ての死亡のおよそ25％の原因となっている重大な公衆衛生問題である。様々な癌のために多くの処置が考案されているが、これらの処置はしばしば副作用の重症度に関して変動する。どの程度攻撃的に癌を処置すべきかを決定するためには、医師が患者の癌の悪性度を知ることが有用である。
【０００４】
初期の非小細胞肺癌（NSCLC）は、切除可能なIA期、IB期、IIA期、IIB期、およびIIIA期からなる。病期は、腫瘍サイズおよび節関与によって定義される。5年生存率は、IA期における70％からIIIA期における20％までの範囲にわたる。複数の大規模補助（adjuvant）治験は、補助化学療法の小さい利益（生存率の4％の改善）しか見出しておらず、利益の大部分は、より高い病期に集中していた。現在のガイドラインは、II期およびIII期における補助処置を支持している。しかしながら、IA期においては、しばしば、可能性のある副作用が、小さい利益より勝っているため、処置は禁忌である。IB患者の一部には補助化学療法が与えられるが、IB期の処置は推奨されていない。従って、IA期またはIB期の肺癌を有する患者は、手術後に、痛みを伴う高価な補助化学療法を受けるべきか、癌が再発するリスクを冒すべきかの困難な決断に直面する。Price & Slevin,Difficult Decisions:Chemotherapy in Lung Cancer,POSTGRAD.MED.J.(1989)65:291-298（非特許文献1）。化学療法の限定された全体的利益、NSCLC患者における高頻度の併存症、および治療の高頻度の重篤な副作用のため、特定の治療計画に対する応答を予測するための新規の改善されたツールが、深刻に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Price & Slevin,Difficult Decisions:Chemotherapy in Lung Cancer,POSTGRAD.MED.J.(1989)65:291-298
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、その発現が細胞周期を密接に追う遺伝子（以下にさらに定義されるような「細胞周期遺伝子」、「CCG」、または「CCP遺伝子」）の発現が、肺癌における適切な治療の選択および予後の決定において特に有用であるという驚くべき発見に一部分基づく。
【０００７】
従って、本発明の一つの局面は、以下の工程を含む、肺癌を有する患者における予後および／または特定の処置計画に対する応答の可能性を決定する方法を提供する：患者由来の試料中の少なくとも6種、8種、または10種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む複数の試験遺伝子の発現を決定する工程、ならびに複数の試験遺伝子の発現の増加を、予後不良および／もしくは特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程、または、任意で（b）複数の試験遺伝子の発現の増加の欠如を、予後良好および／もしくは処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如と相関させる工程を含む。いくつかの態様において、肺癌は腺癌である。いくつかの態様において、肺癌は定型肺カルチノイドである。いくつかの態様において、肺癌は非定型肺カルチノイドである。
【０００８】
いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも8種の細胞周期遺伝子、または少なくとも10種、15種、20種、25種、もしくは30種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む。いくつかの態様において、試験遺伝子の少なくともある割合（例えば、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、または99％）は、細胞周期遺伝子である。いくつかの態様において、試験遺伝子は全て細胞周期遺伝子である。
【０００９】
いくつかの態様において、腫瘍試料中の複数の試験遺伝子の発現を決定する工程は、腫瘍試料中の6〜約200種の細胞周期遺伝子の各々から転写されたmRNAの量の測定；および腫瘍試料中の1種以上のハウスキーピング遺伝子のmRNAの量の測定を含む。
【００１０】
一つの態様において、予後および／または特定の処置計画に対する応答の可能性を決定する方法は、（1）肺癌を有する患者由来の腫瘍試料中の少なくとも4種または少なくとも8種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；（2）（a）遺伝子のパネルから選択された、少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも85％が細胞周期遺伝子である複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（b）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；ならびに（3）（a）複数の試験遺伝子の全体発現のレベルの増加を、予後不良および／もしくは特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程、または（b）試験遺伝子の全体発現の増加の欠如を、予後良好および／もしくは処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如と相関させる工程を含む。いくつかの態様において、肺癌は腺癌である。いくつかの態様において、肺癌は定型肺カルチノイドである。いくつかの態様において、肺癌は非定型肺カルチノイドである。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、上記工程（2）において提供された試験値を、1種以上の参照値と比較する工程、および試験値を特定の処置計画に対する応答の可能性の増加と相関させる工程をさらに含む。任意で、参照値より大きい試験値は、化学療法を含む処置に対する応答の可能性の増加と相関させられる。いくつかの態様において、試験値が、少なくともいくらかの量（例えば、少なくとも0.5倍、0.75倍、0.85倍、0.90倍、0.95倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、もしくはそれ以上、または0.5標準偏差、0.75標準偏差、0.85標準偏差、0.90標準偏差、0.95標準偏差、1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、もしくは10標準偏差、もしくはそれ以上）参照値より大きい場合、試験値は、処置（例えば、化学療法を含む処置）に対する応答の可能性の増加と相関させられる。
【００１２】
いくつかの態様において、特定の処置計画に対する応答の可能性を決定する方法は、（1）肺癌を有する患者由来の腫瘍試料中の少なくとも4種または少なくとも8種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；（2）（a）細胞周期遺伝子が、試験値の少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも85％に寄与するよう重み付けされるよう、遺伝子のパネルから選択された複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（b）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；ならびに（3）（a）参照より大きい試験値を、予後不良および／もしくは特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程、または（b）参照より大きくない試験値を、予後良好および／もしくは処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如と相関させる工程を含む。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、以下の工程を含む、肺癌を有すると同定された患者における癌を処置する方法を提供する：（1）患者由来の腫瘍試料中の少なくとも4種または少なくとも8種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；（2）（a）細胞周期遺伝子が、試験値の少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも85％に寄与するよう重み付けされるよう、遺伝子のパネルから選択された複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（b）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；（3）（a）複数の試験遺伝子の全体発現のレベルの増加を、予後不良および／もしくは特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程、または（b）試験遺伝子の全体発現の増加の欠如を、予後良好および／もしくは処置に対する応答の可能性の増加の欠如と相関させる工程；ならびに（4）工程（3）における結果に少なくとも一部分基づき、特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）を推奨するか、処方するか、もしくは投与する工程を含む。いくつかの態様において、肺癌は腺癌である。いくつかの態様において、肺癌は定型肺カルチノイドである。いくつかの態様において、肺癌は非定型肺カルチノイドである。
【００１４】
本発明は、仕切られた容器に、10％未満、30％、または40％未満が非細胞周期遺伝子である少なくとも8種の試験遺伝子とハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチド；および少なくとも1種のハウスキーピング遺伝子とハイブリダイズする1種以上のオリゴヌクレオチドを含む、肺癌を有する患者における予後を決定するためかつ／または肺癌を有する患者における特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性を予測するための診断キットをさらに提供する。オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件の下での試験遺伝子とのハイブリダイゼーションのためのハイブリダイズするプローブ、または試験遺伝子のPCR増幅のために適当なプライマーであり得る。一つの態様において、キットは、仕切られた容器の中の、試験遺伝子のうちの1種をPCR増幅するためのPCRプライマー対を各々含む、少なくとも30％もしくは50％、少なくとも60％、または少なくとも80％が細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）である5または10〜約300種の試験遺伝子のPCR増幅のための第一の複数のPCR反応混合物；および少なくとも1種の対照（例えば、ハウスキーピング）遺伝子のPCR増幅のための第二の複数のPCR反応混合物から本質的になる。いくつかの態様において、キットは、試験遺伝子の発現（全ての試験遺伝子またはサブセットの全体発現のいずれか）を表す試験値を計算し、この試験値を参照値と比較するための、1種以上のコンピュータソフトウェアプログラムを含む。いくつかの態様において、そのようなコンピュータソフトウェアは、細胞周期遺伝子が、試験値の少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも85％に寄与するよう重み付けされるよう、試験遺伝子を重み付けするためにプログラムされる。いくつかの態様において、そのようなコンピュータソフトウェアは、試験値が（例えば、予め決定された量を超えて）参照値より大きい場合に、患者が、化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性の増加を有することを通知する（例えば、表示する）ためにプログラムされる。
【００１５】
本発明は、試験遺伝子の全体発現のレベルの増加が、可能性の増加を示し、試験遺伝子の全体発現の増加の欠如が、可能性の増加の欠如を示すものとして、患者における予後を決定するためかつ／または化学療法を含む処置計画に対する応答の可能性を予測するため、肺癌を有する患者に由来する腫瘍試料中の試験遺伝子の発現を決定するための診断用製品の製造のための（1）少なくとも4種または少なくとも8種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチド；および（2）少なくとも1種の対照（例えば、ハウスキーピング）遺伝子にハイブリダイズする1種以上のオリゴヌクレオチドの使用も提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、試験遺伝子のPCR増幅のために適当なPCRプライマーである。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、試験遺伝子とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするプローブである。いくつかの態様において、複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも50％、70％もしくは80％もしくは90％が細胞周期遺伝子である4〜約300種の試験遺伝子とのストリンジェントな条件の下でのハイブリダイゼーションのためのプローブであるか、またはそれらの試験遺伝子のPCR増幅のために適当である。いくつかの他の態様において、複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも30％、40％、50％、70％もしくは80％もしくは90％が細胞周期遺伝子である20〜約300種の試験遺伝子のためのハイブリダイゼーションプローブであるか、またはそれらの試験遺伝子のPCR増幅のために適当である。
【００１６】
本発明は、以下のものを含む、肺癌を有する患者における予後および／または肺癌を有する患者における特定の処置計画に対する応答の可能性を決定するためのシステムをさらに提供する：（1）腫瘍試料中の少なくとも4種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための、腫瘍試料、遺伝子のパネルから発現され、試料から抽出されたmRNA分子、またはmRNA分子からのcDNA分子を含有している試料分析器；（2）（a）遺伝子のパネルから選択された、少なくとも50％、少なくとも75％は細胞周期遺伝子である少なくとも4種の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、（b）試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（c）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせるための、第一のコンピュータプログラム；および（3）予め決定された予後または特定の処置に対する応答の可能性と各々関連している1種以上の参照値と試験値を比較するための第二のコンピュータプログラム。
【００１７】
いくつかの態様において、本発明は、以下のものを含む、肺癌を有する患者における予後および／または肺癌を有する患者における特定の処置計画に対する応答の可能性を決定するためのシステムを提供する：（1）腫瘍試料中の少なくとも4種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための、腫瘍試料、遺伝子のパネルから発現され、試料から抽出されたmRNA分子、またはmRNA分子からのcDNA分子を含有している試料分析器；（2）（a）遺伝子のパネルから選択された少なくとも4種の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、（b）細胞周期遺伝子が、試験値の少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも85％に寄与するよう重み付けされるよう、試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（c）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせるための、第一のコンピュータプログラム；および（3）予め決定された予後または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性と各々関連している1種以上の参照値と試験値を比較するための第二のコンピュータプログラム。いくつかの態様において、システムは、試験値と1種以上の参照値との間の比較を表示するかまたは比較工程の結果を表示するディスプレイモジュールをさらに含む。
【００１８】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、適当な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
【００１９】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】CCPスコア四分位群およびアウトカム尺度としての疾患生存を使用した、臨床試料セット1のI期およびII期のカプランマイヤープロットである。
【図２】低CCP群から高CCP群を区別するためのCCP平均値およびアウトカム尺度としての疾患生存を使用した、臨床試料セット1のIB期のみのカプランマイヤープロットである。
【図３】二つの独立のIB期コホートにおけるCCPスコアの分布を示す。
【図４】セット1およびセット2を組み合わせたIB期試料におけるCCPスコアのカプランマイヤー生存分析である。
【図５】組み合わせIB期試料におけるCCPおよび処置のカプランマイヤー生存分析である。
【図６】本発明のある種の局面および態様において有用なシステムの一例の図示である。
【図７】本発明のコンピュータ実装方法の一例を図示するフローチャートである。
【図８】異なるサイズのCCGパネルについての予測力の図示である。
【図９】実施例2の組み合わせコホートにおけるCCPスコアの分布を示す。
【図１０】実施例2の組み合わせコホートにおけるCCPスコアのカプランマイヤー生存分析である。
【図１１】実施例3におけるCCPスコアが処置利益をどのように予測するかを示す。
【図１２】コホート間のCCPスコアについてのハザード比の一貫性を示す。
【図１３】コホート間の病理学的病期についてのハザード比の一貫性を示す。
【図１４】（実施例4における訓練研究において示されたような）予後スコアの関数としての予測される5年疾患死亡リスクを示す。
【図１５】（実施例4における訓練研究において示されたような）単独の病理学的病期によって予測されるものに対する、予後スコアによって予測される5年疾患死亡リスクを示す。
【図１６】一つの態様において低リスク患者と高リスク患者との間の境界値としてPS= 27のカットオフ値を用いた、（実施例4におけるバリデーション研究において示される）予後スコアの関数としての予測される5年疾患死亡リスクを示す。
【図１７】（実施例4におけるバリデーション研究において示される）予後スコアのカプランマイヤー生存分析である。
【図１８】（実施例4におけるバリデーション研究において示される）単独の病理学的病期によって予測されるものに対する、予後スコアによって予測される5年疾患死亡リスクを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、その発現が細胞周期を密接に追う遺伝子（「細胞周期遺伝子」または「CCG」）が、肺癌を分類するための、例えば、予後および／または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む計画）に対して特定の患者が応答する可能性を決定するための、特に強力な遺伝子であるという発見に一部分基づく。
【００２２】
「細胞周期遺伝子」および「CCG」とは、本明細書において、その発現レベルが細胞周期を通した細胞の進行を密接に追う遺伝子をさす。例えば、Whitfield et al.,MOL.BIOL.CELL(2002)13:1977-2000を参照すること。「細胞周期進行」または「CCP」という用語も、本願において使用され、一般に、CCGと交換可能である（即ち、CCP遺伝子はCCGであり；CCPスコアはCCGスコアである）。より具体的には、CCGは、細胞周期のいくつかの期と一致する周期的な発現の増減を示す。例えば、STK15およびPLKは、G2/Mにおいてピーク発現を示す。Id。しばしば、CCGは、例えば、DNAの合成または修復、染色体凝縮、細胞分裂等において、明白な認識された細胞周期関連機能を有する。しかしながら、いくつかのCCGは、細胞周期における明瞭な直接の役割を有することなく、細胞周期を追う発現レベルを有する。例えば、UBE2Sは、ユビキチン結合酵素をコードするが、その発現は細胞周期を密接に追う。従って、本発明によるCCGは、細胞周期における認識された役割を有していなくてもよい。例示的なCCGは、表1、2、3、5、6、7、8、および9にリストされる。CCGの広範囲の（網羅的ではない）リストを含む、CCGについてのより完全な考察は、国際出願番号PCT/US2010/020397（公開番号WO/2010/080933）に見出され得る（例えば、WO/2010/080933の表1を参照すること）。国際出願番号PCT/US2010/020397（公開番号WO/2010/080933（対応する米国出願第13/177,887号も参照すること））および国際出願番号PCT/US2011/043228（公開番号WO/2012/006447（関連する米国出願第13/178,380号も参照すること））ならびにそれらの内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【００２３】
特定の遺伝子がCCGであるか否かは、Whitfield et al.,MOL.BIOL.CELL(2002)13:1977-2000；Whitfield et al.,MOL.CELL.BIOL.(2000)20:4188-4198；WO/2010/080933（段落番号［0039］）に教示されたものを含む、当技術分野において公知の任意の技術によって決定され得る。下記表1のCCGは、全て、本発明において有用なCCGのパネル（「パネルA」）を形成する。本書の全体にわたって詳細に示されるように、個々のCCG（例えば、表1のCCG）およびこれらの遺伝子のサブセットも、本発明において使用され得る。
【００２４】
（表１）
2016515800.tif 000002
2016515800.tif 000003
2016515800.tif 000004
2016515800.tif 000005
2016515800.tif 000006
2016515800.tif 000007
＊本発明において有用なCCGの124遺伝子サブセット（「パネルB」）。ABIアッセイIDとは、特定の遺伝子のためのApplied Biosystems Inc.（Foster City, CA）から市販されている遺伝子発現アッセイについてのカタログID番号を意味する。
【００２５】
下記実施例1および2に示されるように、CCGの発現の増加（例えば、より高いCCP遺伝子発現を反映するCCPスコアまたは試験値）を示す腫瘍を有する患者は、そのような増加を示さない腫瘍を有する患者より、予後不良を有するが、化学療法を含む処置に対してよく応答することが、驚くべきことに発見された。従って、本発明の一つの局面は、以下の工程を含む、肺癌を有する患者における予後および／または肺癌を有する患者における特定の処置計画に対する応答の可能性を決定する方法を提供する：患者由来の腫瘍試料中の少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、または少なくとも8種、9種、10種、または12種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む複数の試験遺伝子の発現を決定する工程、ならびに複数の試験遺伝子の発現の増加を、予後不良および／または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程。
【００２６】
本明細書に記載された本発明の態様は、肺癌を含む。肺癌には、本明細書において使用されるように、腺癌、非定型肺カルチノイド、および定型肺カルチノイドが少なくとも含まれる。
【００２７】
本明細書に記載された本発明のいくつかの態様は、CCP遺伝子発現が参照より大きい場合、本発明による高いCCP遺伝子発現（例えば、本願の全体にわたって様々な態様において記載されるCCP遺伝子のパネルの高い発現；そのようなパネルの高い発現に由来するかまたはそれを反映する試験値等）を、特定の臨床的特色（例えば、予後不良；肺癌再発の可能性の増加；化学療法に対する応答の可能性の増加等）と（または、任意で、発現が参照より小さい場合には、もう一つの特色、例えば、予後良好と）相関させる工程を含む。本書の全体にわたって、そのような態様が記載される場合には常に、本発明のさらなる関連する態様は、相関工程に加えてまたは相関工程の代わりに、以下の工程の一方または両方を含み得る：（a）高いCCP発現（もしくはそれに由来するかもしくはそれを反映する試験値）に少なくとも一部分基づき、患者がその臨床的特色を有すると結論付ける（もしくは、それを有するとして患者を分類する）工程；または（b）高いCCP発現（もしくはそれに由来するかもしくはそれを反映する試験値）に少なくとも一部分基づき、患者がその臨床的特色を有することを通知する工程。
【００２８】
限定ではなく例示として、本書に記載された一つの態様は、以下の工程を含む、患者における肺癌の予後または化学療法に応答するそのような患者の可能性を決定する方法である：（1）少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、もしくは15種、またはそれ以上の細胞周期遺伝子（例えば、パネルF；パネルH、I、J、L、M、N、およびOのいずれか；または表21〜25のいずれかのパネルFのサブパネル等のCCG）を含む複数の試験遺伝子の発現を決定する工程、ならびに（2）複数の試験遺伝子の高い発現を、患者における肺癌の予後不良または化学療法に対する応答の可能性の増加と相関させる工程。前段落によると、この態様のこの記載は、二つのさらなる関連する態様の記載を含むものと理解される。即ち、以下の工程を含む、患者における肺癌の予後または化学療法に応答するそのような患者の可能性を決定する方法：（1）少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、もしくは15種、またはそれ以上の細胞周期遺伝子（例えば、パネルF；パネルH、I、J、L、M、N、およびOのいずれか；または表21〜25のいずれかのパネルFのサブパネル等のCCG）を含む複数の試験遺伝子の発現を決定する工程、ならびに（2）（a）複数の試験遺伝子の高い発現に少なくとも一部分基づき、患者が肺癌の予後不良または化学療法に対する応答の可能性の増加を有すると結論付ける工程、または（2）（b）複数の試験遺伝子の高い発現に少なくとも一部分基づき、患者が肺癌の予後不良または化学療法に対する応答の可能性の増加を有することを通知する工程。
【００２９】
特定のアッセイまたは分析のアウトプット（例えば、高いCCG発現、参照値より大きいCCG発現が組み入れられた試験値等）を、臨床的な事象またはアウトカム（例えば、再発、進行、癌特異的死亡等）の可能性（例えば、増加、増加の欠如、減少等）と相関させる工程を含む、本書に記載された各態様において、そのような相関は、特定のアッセイまたは分析のアウトプットに少なくとも一部分基づく、臨床的な事象またはアウトカムが起こるリスクまたは可能性の割り当てを含み得る。いくつかの態様において、そのようなリスクは、事象またはアウトカムが起こる確率（％）である。いくつかの態様において、患者は、リスク群（例えば、低リスク、中リスク、高リスク等）に割り当てられる。いくつかの態様において、「低リスク」とは、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％より低い確率（％）である。いくつかの態様において、「中リスク」とは、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％より高く、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、または75％より低い確率（％）である。いくつかの態様において、「高リスク」とは、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％より高い確率（％）である。
【００３０】
本明細書において使用されるように、特定の情報を「通知すること」とは、他の者にそのような情報を知らせるか、または何か（例えば、コンピュータ）にそのような情報を転送することを意味する。本発明のいくつかの方法において、患者の予後または再発のリスクが通知される。いくつかの態様において、そのような予後またはリスクの予測に到達するために使用された情報（例えば、複数のCCGを含むバイオマーカーのパネルの発現レベル、臨床的または病理学的な要因等）が通知される。この通知は、聴覚的（例えば、口頭）、視覚的（例えば、書面）、電子的（例えば、コンピュータシステム間で転送されたデータ）等であり得る。いくつかの態様において、癌分類の通知には、癌分類を通知するレポートの生成が含まれる。いくつかの態様において、レポートは、紙のレポート、聴覚的レポート、または電子的レポートである。いくつかの態様において、レポートは、コンピューティングデバイス（例えば、ハンドヘルドデバイス、デスクトップコンピュータ、スマートデバイス、ウェブサイト等）に表示されかつ／または記憶される。いくつかの態様において、癌分類は、医師に通知される（例えば、分類を通知するレポートが、医師に提供される）。いくつかの態様において、癌分類は、患者に通知される（例えば、分類を通知するレポートが、患者に提供される）。癌分類の通知は、分類を具体化する情報（例えば、データ）をサーバーコンピュータへ転送し、（例えば、サーバーから表示される情報の閲覧、サーバーから仲介ユーザまたはエンドユーザのデバイスへ転送された1個以上のファイルの形態での情報のダウンロード等によって）仲介ユーザまたはエンドユーザがそのような情報にアクセスすることを許可することによっても達成され得る。
【００３１】
本発明の態様が、事実（例えば、患者の予後または患者の再発の可能性）の結論付けを含む場合には常に、これは、（例えば、図7に示されるように）典型的には、患者試料中のCCGの状態に関する情報を組み入れるアルゴリズムを実施した後、そのような事実を結論付けるコンピュータプログラムを含み得る。
【００３２】
いくつかの態様において、複数の遺伝子の発現の決定は、そのような発現を通知するレポートを受容する工程を含む。いくつかの態様において、このレポートは、定性的にそのような発現を通知する（例えば、「高い」または「増加」）。いくつかの態様において、このレポートは、そのような発現が組み入れられたスコア（例えば、予後スコア、再発スコア等）を通知することによって、間接的に、そのような発現を通知する。
【００３３】
いくつかの態様において、方法は、（1）肺癌を有する患者から試料を入手する工程；（2）腫瘍試料中の少なくとも2種、4種、5種、6種、7種、または少なくとも8種、9種、10種、または12種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、またはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；（3）（a）遺伝子のパネルから選択された、少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも90％が細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、またはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）である複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（b）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；ならびに（4）（a）複数の試験遺伝子の発現のレベルの増加を、予後不良および／もしくは特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程、または（b）試験遺伝子の全体発現の増加の欠如を、予後良好および／もしくは処置に対する応答の可能性の増加の欠如と相関させる工程を含む。いくつかの態様において、相関工程の代わりに（任意で、相関工程に加えて）、方法は、（4）（a）複数の試験遺伝子の発現の増加に少なくとも一部分基づき、患者が予後不良および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加を有すると結論付ける工程、もしくは（b）複数の試験遺伝子の発現の増加の欠如に少なくとも一部分基づき、患者が予後良好および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如を有すると結論付ける工程；ならびに／または（4）（a）複数の試験遺伝子の発現の増加に少なくとも一部分基づき、患者が予後不良および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加を有することを通知する工程、もしくは（b）複数の試験遺伝子の発現の増加の欠如に少なくとも一部分基づき、患者が予後良好および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如を有することを通知する工程を含む。いくつかの態様において、試験遺伝子は、細胞周期遺伝子が試験値の少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％に寄与するよう重み付けされるよう、重み付けされる。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子の20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、または少なくとも99％、または100％が、細胞周期遺伝子である。他に示されない限り、「試料の入手」とは、本明細書において「提供または入手」を意味する。
【００３４】
従って、いくつかの態様において、方法は、（1）肺癌を有すると同定された患者に由来する腫瘍試料を入手する工程；（2）腫瘍試料中の少なくとも2種、4種、6種、8種、または10種の細胞周期遺伝子（例えば、表1〜11またはパネルA〜H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子）を含む遺伝子のパネルの発現を決定する工程；ならびに（3）（a）細胞周期遺伝子が、試験値の少なくとも20％、50％、少なくとも75％、または少なくとも90％に寄与するよう重み付けされるよう、遺伝子のパネルから選択された複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（b）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；ならびに（4）（a）複数の試験遺伝子の発現のレベルの増加を、予後不良および／もしくは特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加と相関させる工程、または（b）複数の試験遺伝子の発現のレベルの増加の欠如を、予後良好および／もしくは特定の処置に対する応答の可能性の増加の欠如と相関させる工程を含む。いくつかの態様において、相関工程の代わりに（任意で、相関工程に加えて）、方法は、（4）（a）複数の試験遺伝子の発現の増加に少なくとも一部分基づき、患者が予後不良および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加を有すると結論付ける工程、もしくは（b）複数の試験遺伝子の発現の増加の欠如に少なくとも一部分基づき、患者が予後良好および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如を有すると結論付ける工程；ならびに／または（4）（a）複数の試験遺伝子の発現の増加に少なくとも一部分基づき、患者が予後不良および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加を有することを通知する工程、もしくは（b）複数の試験遺伝子の発現の増加の欠如に少なくとも一部分基づき、患者が予後良好および／もしくは特定の処置計画に対する応答の可能性の増加の欠如を有することを通知する工程を含む。
【００３５】
CCP遺伝子発現レベルを含む本明細書に記載された各態様において、本発明は、そのような発現レベルに由来し、そのような発現レベルが組み入れられており、かつ／または、少なくともある程度、そのような発現レベルを反映する試験値またはスコア（例えば、CCPスコア等）を含むさらなる関連する態様を包含する。換言すると、本発明の様々な方法、システム等において、未処理のCCP遺伝子発現のデータまたはレベルが必ずしも使用されなくてもよく；そのような数または長さに由来する試験値またはスコアが使用されてもよい。典型的には、そのような試験値は、（本書に詳細に記載されるような）参照値と比較され、方法は、高い試験値（または高いCCP遺伝子発現に由来し、高いCCP遺伝子発現が組み入れられており、かつ／または、少なくともある程度、高いCCP遺伝子発現を反映する試験値）を、予後不良と相関させることになるであろう。本発明は、患者の予後、特定の処置計画に対する患者の応答の可能性、乳癌再発を有する患者または患者の試料の可能性等を決定するために試験値またはスコアが使用される対応する態様を、必要な変更を加えて、包含する。
【００３６】
本発明は、一般に、患者由来の組織試料または細胞試料、特に、腫瘍試料において、少なくとも2種のCCGを含む遺伝子のパネルの状態を決定する工程を含む。本明細書において使用されるように、遺伝子（または遺伝子のパネル）の「状態の決定」とは、遺伝子またはその発現産物の物理的、化学的、または遺伝学的な特徴の存在、欠如、または程度／レベルの決定をさす。そのような特徴には、発現レベル、活性レベル、変異、コピー数、メチル化状態等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性を決定するために使用されるCCGに関して、特に有用な特徴には、発現レベル（例えば、mRNA、cDNA、またはタンパク質のレベル）および活性レベルが含まれる。特徴は、直接（例えば、CCGの発現レベルをアッセイすることによって）アッセイされてもよいし、または間接的に（例えば、その発現レベルがCCGの発現レベルと相関している遺伝子のレベルをアッセイして）決定されてもよい。
【００３８】
「異常な状態」とは、特定の試料中のマーカーの状態が、平均的な試料（例えば、健常試料、平均的な疾患試料）に一般に見出される状態と異なることを意味する。例には、変異、上昇、減少、存在、欠如等が含まれる。「上昇した状態」とは、上記の特徴（例えば、発現またはmRNAレベル）のうちの1個以上が正常レベルより高いことを意味する。一般に、これは、後述されるようなインデックス値と比較した特徴（例えば、発現またはmRNAレベル）の増加を意味する。反対に、「低い状態」とは、上記の特徴（例えば、遺伝子発現またはmRNAレベル）のうちの1個以上が正常レベルより低いことを意味する。一般に、これは、後述されるようなインデックス値と比較した特徴（例えば、発現）の減少を意味する。これに関して、「陰性状態」とは、一般に、特徴が存在しないかもしくは検出不可能であること、または、配列分析のケースにおいては、（完全もしくは部分的な遺伝子欠失を含む）有害な配列バリアントが存在することを意味する。
【００３９】
遺伝子発現は、RNAレベル（即ち、mRNAもしくは非コードRNA（ncRNA））（例えば、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、siRNA、およびpiRNA）またはタンパク質レベルのいずれかで決定され得る。mRNAレベルでの遺伝子発現の測定は、mRNAに対応するcDNAのレベルの測定を含む。腫瘍試料中のタンパク質のレベルは、当技術分野において公知の任意の技術、例えば、HPLC、質量分析、または選択されたタンパク質に特異的な抗体の使用（例えば、IHC、ELISA等）によって決定され得る。
【００４０】
いくつかの態様において、腫瘍試料中の試験遺伝子を含む遺伝子のパネルから転写されたRNAの量が測定される。さらに、腫瘍試料中の1種以上のハウスキーピング遺伝子のRNAの量も測定され、試験遺伝子の発現を規準化するかまたは較正するために使用される。「規準化遺伝子」および「ハウスキーピング遺伝子」という用語は、本明細書において後に定義される。
【００４１】
「複数の試験遺伝子」を含む本発明の態様において、複数の試験遺伝子は、複数の試験遺伝子の少なくとも50％、75％、または80％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも2種、3種、または4種の細胞周期遺伝子を含み得る。他のそのような態様において、複数の試験遺伝子は、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも5種、6種、7種、または少なくとも8種の細胞周期遺伝子を含む。本書の情況から明らかであるように、遺伝子のパネルとは複数の遺伝子である。いくつかの態様において、これらの遺伝子は、患者由来の1個以上の試料において共にアッセイされる。
【００４２】
いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも8種、10種、12種、15種、20種、25種、または30種の細胞周期遺伝子を含む。
【００４３】
本発明および本明細書中の開示を承知した当業者には明白であるように、「腫瘍試料」とは、1種以上の腫瘍細胞、または1種以上の腫瘍由来のDNA、RNA、もしくはタンパク質を含有している、癌患者から入手された生物学的試料を意味する。例えば、癌患者の腫瘍組織から入手された組織試料は、本発明において有用な腫瘍試料である。組織試料は、FFPE試料または新鮮な凍結試料であり得、好ましくは、主として腫瘍細胞を含有している。癌患者の腫瘍に由来する単一の悪性細胞も、有用な腫瘍試料である。そのような悪性細胞は、患者の腫瘍から直接入手されてもよいし、または患者の体液（例えば、血液、尿）から精製されてもよい。従って、1種以上の腫瘍細胞または腫瘍由来のRNAもしくはタンパク質を含有している血液、尿、痰、および唾液のような体液も、本発明を実施する目的のための腫瘍試料として有用であり得る。いくつかの態様において、癌（例えば、肺癌）を有する患者は、その癌を有すると診断されている。
【００４４】
当業者は、（例えば、mRNAまたはマイクロRNAの発現、コピー数等をアッセイするための）マイクロアレイ分析、定量的リアルタイムPCR（商標）（「qRT-PCR（商標）」、例えば、TaqMan（商標））、免疫分析（immunoanalysis）（例えば、ELISA、免疫組織化学）、配列決定（例えば、定量的配列決定）等を含むが、これらに限定されない、組織または細胞の試料中の遺伝子またはタンパク質の状態を決定するための様々な技術に精通している。遺伝子によってコードされたポリペプチドの活性レベルは、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルとほぼ同様に使用され得る。しばしば、より高い活性レベルは、より高い発現レベルを示し、より低い活性レベルは、より低い発現レベルを示す。従って、いくつかの態様において、本発明は、CCGの発現レベルではなく、またはCCGの発現レベルに加えて、CCGによってコードされたポリペプチドの活性レベルが決定される、上述の方法のいずれかを提供する。当業者は、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、および11にリストされた例示的なCCGによってコードされたものを含む、様々なそのようなタンパク質の活性を測定するための技術に精通している。本発明の方法は、使用される特定の技術と無関係に実施され得る。
【００４５】
好ましい態様において、試験遺伝子の発現の規準化において使用するため、1種以上の規準化（しばしば「ハウスキーピング」と呼ばれる）遺伝子の発現も入手される。本明細書において使用されるように、「規準化遺伝子」とは、関心対象の遺伝子（例えば、試験遺伝子）の測定された発現を較正するかまたは規準化するために、その発現が使用される遺伝子をさす。重要なことに、規準化遺伝子の発現は、癌のアウトカム／予後と無関係であるべきであり、規準化遺伝子の発現は、全ての腫瘍試料の間で極めて類似している。規準化は、異なる試料の間の試験遺伝子の発現の正確な比較を保証する。この目的のため、当技術分野において公知のハウスキーピング遺伝子を使用することができる。ハウスキーピング遺伝子は、当技術分野において周知であり、例には、GUSB（グルクロニダーゼ、β）、HMBS（ヒドロキシメチルビラン合成酵素）、SDHA（コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットA、フラボタンパク質）、UBC（ユビキチンC）、およびYWHAZ（チロシン3-モノオキシゲナーゼ／トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ζポリペプチド）が含まれるが、これらに限定されない。1種以上のハウスキーピング遺伝子を使用することができる。好ましくは、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、または15種のハウスキーピング遺伝子が、組み合わせ規準化遺伝子セットを提供するために使用される。そのような規準化遺伝子の遺伝子発現の量は、単純な加法によって、または定義されたアルゴリズムによって、平均化され、共に組み合わせられる。本発明の方法および組成物において使用するための特に有用なハウスキーパー遺伝子のいくつかの例には、下記表Aにリストされたものが含まれる。
【００４６】
（表Ａ）
2016515800.tif 000008
＊実施例1においてCCGを規準化し、CCPスコアを生成するために使用されたハウスキーピング遺伝子のサブセット
【００４７】
遺伝子についてのRNAレベルを測定するケースにおいて、一つの便利で高感度のアプローチは、逆転写反応後のリアルタイム定量的PCR（商標）（qPCR）アッセイである。典型的には、サイクル閾値（Ct）、即ち、バックグラウンドを超えた蛍光がqPCR反応から検出可能となるサイクル数が、各試験遺伝子および各規準化遺伝子について決定される。
【００４８】
1種以上の規準化遺伝子の全体発現は、等しく（単純な加法もしくは平均化）または異なる予め定義された係数によって重み付けされた全ての規準化遺伝子の発現を組み合わせることによって生成され得る「規準化値」によって表され得る。例えば、最も単純に、規準化値CtHは、単一の規準化遺伝子のサイクル閾値（Ct）であってもよいし、または2種以上、好ましくは、10種以上または15種以上の規準化遺伝子のCt値の平均であってもよく、このケースにおいて、予め定義された係数は1/Nである（Nは使用された規準化遺伝子の総数である）。従って、CtH = (CtH1 + CtH2 + ... CtHn) / N。当業者に明白であるように、そのような規準化遺伝子の発現の重み付けにおいては、使用される規準化遺伝子および各規準化遺伝子に与えられることが望まれる重みに依って、任意の係数（0/N〜N/N）を規準化遺伝子に与えることができる。即ち、CtH = xCtH1 + yCtH2 + ... zCtHn（x + y + ... + z = 1）。
【００４９】
上述のように、本発明の方法は、一般に、CCGのパネルの発現のレベルを決定する工程を含む。現代のハイスループット技術によれば、しばしば、数十、数百、または数千の遺伝子の発現レベルを決定することが可能である。実際、全トランスクリプトーム（即ち、ゲノム内の転写された各配列）の発現のレベルを決定することが可能である。次いで、そのような包括的なアッセイを実施した後、転写物の1種以上のサブセット（即ち、パネル、または、しばしば、本明細書において使用されるように、複数の試験遺伝子）を情報学的に分析することができる。試料中の数百または数千の転写物の発現を測定した後、例えば、試験値を入手するため、個々の試験遺伝子の発現レベル値を組み合わせることによって、本発明による主にCCGを含む試験遺伝子のパネルまたは複数の試験遺伝子の発現を（例えば、情報学的に）分析することができる。
【００５０】
当業者に明白であるように、本発明において提供される試験値は、細胞周期遺伝子から実質的に構成された（または細胞周期遺伝子によって実質的に表されるよう重み付けされた）複数の試験遺伝子の全体発現レベルを表すことができる。一つの態様において、本発明の方法における試験値を提供するため、試験遺伝子について測定されたCtをCtHに対して規準化することによって、試験遺伝子についての規準化された発現を入手することができる。即ち、ΔCt1 = (Ct1 - CtH)。このように、単純な加法もしくは平均化（即ち、等しい重み付け）または異なる予め定義された係数のいずれかによって、全ての試験遺伝子の規準化された発現を組み合わせることによって、複数の試験遺伝子の全体発現が組み入れられた試験値を提供することができる。例えば、最も単純なアプローチは、全ての試験遺伝子の規準化された発現の平均化である：試験値 = (ΔCt1 + ΔCt2 + ... + ΔCtn) / n。当業者に明白であるように、使用される試験遺伝子に依って、本発明における異なる試験遺伝子に異なる重みが与えられてもよい。複数の遺伝子の発現を使用した本書が開示する各ケース（例えば、「［患者由来の腫瘍試料中の］複数の試験遺伝子の発現の決定」または「複数の試験遺伝子の発現の増加の、応答の可能性の増加との相関」）において、これは、いくつかの態様において、この複数の遺伝子の全体発現が組み入れられているか、それを表すか、またはそれに対応する試験値の使用（例えば、「［患者由来の腫瘍試料中の］複数の試験遺伝子の発現を表す試験値の決定」または「複数の試験遺伝子の発現を表す試験値の増加［または参照値より高い試験値］の、応答の可能性の増加との相関」）を含む。
【００５１】
本明細書に報告されたCCP現象が認識された後は、試験パネルのための個々のCCGの選択が、いくつかの態様において、多少任意であり得ることが決定された。換言すると、多くのCCGが、相互に極めてよい代理であることが見出された。従って、任意のCCG（またはCCGのパネル）が、本発明の様々な態様において使用され得る。本発明の他の態様において、最適化されたCCGが使用される。特定のCCGが本発明の方法および組成物においてよく機能するか否かを査定する一つの方式は、CCG（例えば、全ての公知のCCG、CCGの具体的なセット等）の発現平均値との相関を査定することによる。平均値と特によく相関するCCGは、例えば、アッセイ内のノイズを低下させるため、本発明のアッセイにおいてよく機能すると予想される。
【００５２】
126種のCCGおよび47種のハウスキーピング遺伝子の発現を、本発明のいくつかの態様において使用するための好ましい遺伝子を決定するため、CCGおよびハウスキーピングの平均値と比較した。CCG発現平均値との相関によって選択されたCCGの順位、および予測値による順位は、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、および19に与えられる。
【００５３】
いくつかのCCGは、平均値とよく相関しない。本発明のいくつかの態様において、そのような遺伝子は、よく相関するものとは別に、グループ化、アッセイ、分析等され得る。これは、これらの非相関遺伝子が関心対象の臨床的特色（例えば、予後、治療応答等）に独立に関連している場合、特に有用である。従って、本発明のいくつかの態様において、非相関遺伝子は、相関遺伝子と共に分析される。いくつかの態様において、CCG平均値との相関が0.5未満、0.4未満、0.3未満、0.2未満、0.10未満、0.09未満、0.08未満、0.07未満、0.06未満、0.05未満、0.04未満、0.03未満、0.02未満、0.01未満である場合、そのCCGは非相関である。
【００５４】
アウトカムまたはその他の臨床データのない96種の商業的に入手された匿名腫瘍FFPE試料に対して、126種のCCGおよび47種のHK（ハウスキーピング）遺伝子のアッセイを実行した。作業仮説は、アッセイが、同一の基礎現象（CCGについては腫瘍における細胞周期増殖、HK遺伝子については試料濃度）を変動する精度で測定するであろうということであった。生物学的活性の最適の利用可能な推定である、個々の遺伝子と全候補遺伝子の平均値との間のピアソン相関係数によって、アッセイを順位付けした。全体CCG平均値との相関によるこれらの126種のCCGについての順位は、表2に報告される。
【００５５】
（表２）
2016515800.tif 000009
2016515800.tif 000010
【００５６】
低い平均発現を有するCCG、試料失敗を生じたアッセイ、0.58未満の相関を有するCCG、および0.95未満の相関を有するHK遺伝子を除外した後、56種のCCGのサブセット（パネルG）および36種のHK候補遺伝子が残った。これらのサブセットに対して相関係数を再計算し、順位をそれぞれ表3および4に示した。
【００５７】
（表３）（「パネルG」）
2016515800.tif 000011
【００５８】
（表４）
2016515800.tif 000012
【００５９】
パネルFのCCGを、下記表5に示されるように、CCG平均値との相関によって同様に順位付けした。
【００６０】
（表５）
2016515800.tif 000013
【００６１】
本発明の態様に含めるための具体的なCCGを選択する時、各遺伝子の個々の予測力を、重要性によって順位付けするために使用することができる。本発明者らは、個々の各遺伝子の予測力によって、下記表6に示されるように、パネルCのCCGを順位付けし得ることを決定した。パネルFのCCGは、下記表7に示されるように、同様に順位付けされ得る。
【００６２】
（表６）
2016515800.tif 000014
【００６３】
（表７）
2016515800.tif 000015
【００６４】
従って、本発明の様々な局面の各々のいくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19にリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、またはそれ以上のCCGを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、以下の遺伝子のうちの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、または20種を含む：ASPM、BIRC5、BUB1B、CCNB2、CDC2、CDC20、CDCA8、CDKN3、CENPF、DLGAP5、FOXM1、KIAA0101、KIF11、KIF2C、KIF4A、MCM10、NUSAP1、PRC1、RACGAP1、およびTPX2。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、以下の遺伝子のうちの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、または20種を含む：TPX2、CCNB2、KIF4A、KIF2C、BIRC5、RACGAP1、CDC2、PRC1、DLGAP5/DLG7、CEP55、CCNB1、TOP2A、CDC20、KIF20A、BUB1B、CDKN3、NUSAP1、CCNA2、KIF11、およびCDCA8。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種もしくは全部を含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号2および3、2〜4、2〜5、2〜6、2〜7、2〜8、2〜9、または2〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、または9種もしくは全部を含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号3および4、3〜5、3〜6、3〜7、3〜8、3〜9、または3〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、または8種もしくは全部を含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号4および5、4〜6、4〜7、4〜8、4〜9、または4〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、または7種もしくは全部を含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、1〜13、1〜14、または1〜15のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、または15種もしくは全部を含む。
【００６５】
いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2；1および2〜3；1および3〜4；1および4〜5；1および5〜6；1および6〜7；1および7〜8；1および8〜9；1および9および10；1および10および11；1および3；1および2〜4；1および3〜5；1および4〜6；1および5〜7；1および6〜8；1および7〜9；1および8〜10；1および9および11；1および4；1および2〜5；1および3〜6；1および4〜7；1および5〜8；1および6〜9；1および7〜10；1および8〜11；1および5；1および2〜6；1および3〜7；1および4〜8；1および5〜9；1および6〜10；1および7〜11；1および6；1および2〜7；1および3〜8；1および4〜9；1および5〜10；1および6〜11；1および7；1および2〜8；1および3〜9；1および4〜10；1および5〜11；1および8；1および2〜9；1および3〜10；1および4〜11；1および9；1および2〜10；1および3〜11；1および10；1および2〜11；1および11；2および3；2および3〜4；2および4〜5；2および5〜6；2および6〜7；2および7〜8；2および8〜9；2および9および10；2および10および11；2および4；2および3〜5；2および4〜6；2および5〜7；2および6〜8；2および7〜9；2および8〜10；2および9および11；2および5；2および3〜6；2および4〜7；2および5〜8；2および6〜9；2および7〜10；2および8〜11；2および6；2および3〜7；2および4〜8；2および5〜9；2および6〜10；2および7〜11；2および7；2および3〜8；2および4〜9；2および5〜10；2および6〜11；2および8；2および3〜9；2および4〜10；2および5〜11；2および9；2および3〜10；2および4〜11；2および10；2および3〜11；2および11；3および4；3および4〜5；3および5〜6；3および6〜7；3および7〜8；3および8〜9；3および9および10；3および10および11；3および5；3および4〜6；3および5〜7；3および6〜8；3および7〜9；3および8〜10；3および9および11；3および6；3および4〜7；3および5〜8；3および6〜9；3および7〜10；3および8〜11；3および7；3および4〜8；3および5〜9；3および6〜10；3および7〜11；3および8；3および4〜9；3および5〜10；3および6〜11；3および9；3および4〜10；3および5〜11；3および10；3および4〜11；3および11；4および5；4および5〜6；4および6〜7；4および7〜8；4および8〜9；4および9および10；4および10〜11；4および6；4および5〜7；4および6〜8；4および7〜9；4および8〜10；4および9〜11；4および7；4および5〜8；4および6〜9；4および7〜10；4および8〜11；4および8；4および5〜9；4および6〜10；4および7〜11；4および9；4および5〜10；4および6〜11；4および10；4および5〜11；4および11；5および6；5および6〜7；5および7〜8；5および8〜9；5および9および10；5および10〜11；5および7；5および6〜8；5および7〜9；5および8〜10；5および9〜11；5および8；5および6〜9；5および7〜10；5および8〜11；5および9；5および6〜10；5および7〜11；5および10；5および6〜11；5および11；6および7；6および7〜8；6および8〜9；6および9および10；6および10〜11；6および8；6および7〜9；6および8〜10；6および9〜11；6および9；6および7〜10；6および8〜11；6および10；6および7〜11；6および11；7および8；7および8〜9；7および9および10；7および10〜11；7および9；7および8〜10；7および9〜11；7および10；7および8〜11；7および11；8および9；8および9〜10；8および10〜11；8および10；8および9〜11；8および11；9および10；9および10〜11；または遺伝子番号9および11を含む。
【００６６】
いくつかの態様において、複数の試験遺伝子の全体発現が組み入れられているかまたはそれを表す試験値は、1種以上の参照値（またはインデックス値）と比較され、任意で、予後不良もしくは予後良好（例えば、より短い予想される術後無転移生存）または化学療法を含む処置に対する応答の可能性の増加もしくは増加の欠如と相関させられる。いくつかのケースにおいて、そのような値は、特に、下記実施例において、「スコア」と呼ばれる。いくつかの態様において、参照値より大きい試験値（または参照値と比べて、試験遺伝子の発現の増加を表す試験値）を、予後不良および／または化学療法を含む処置に対する応答の可能性の増加と相関させることができる。いくつかの態様において、試験値が少なくともいくらかの量（例えば、少なくとも0.5倍、0.75倍、0.85倍、0.90倍、0.95倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、もしくはそれ以上、または0.5標準偏差、0.75標準偏差、0.85標準偏差、0.90標準偏差、0.95標準偏差、1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、もしくは10標準偏差、もしくはそれ以上）参照値を越えている場合、その試験値は、参照値（例えば、閾インデックス値）「より大きい」と見なされ、従って、予後不良および／または化学療法を含む処置に対する応答の可能性の増加と相関させられる。
【００６７】
例えば、インデックス値は、（生検材料中の癌組織の周囲の組織を含む）関心対象の患者から入手された正常な試料に見出される遺伝子発現レベルが組み入れられているかまたはそれを表すことができ、そのケースにおいて、このインデックス値より有意に高い腫瘍試料中の発現レベルは、例えば、特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の増加を示すであろう。
【００６８】
あるいは、インデックス値は、多様な癌集団または集団のサブセットからの個体のセットについての平均発現レベルが組み入れられているかまたはそれを表すことができる。例えば、癌（例えば、肺癌）を有する患者の無作為抽出において遺伝子または遺伝子パネルの平均発現レベルを決定することができる。この平均発現レベルは「閾インデックス値」と呼ばれ得、この値より高い試験値または閾インデックス値によって表される発現より高い発現を表す試験値（または少なくともこの値より高い量）を有する患者は、この値より低い試験値を有する者より、予後良好および／または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の大きい可能性を有すると予想される。
【００６９】
あるいは、インデックス値は、臨床データおよび追跡データが入手可能であり、疾患のアウトカム、例えば、特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答によって患者を定義しカテゴリ化するために十分な、類似したアウトカムを有する複数の訓練患者（例えば、肺癌患者）における特定の遺伝子または遺伝子パネルの平均発現レベルが組み入れられているかまたはそれを表すことができる。例えば、下記実施例を参照すること。例えば、「予後不良インデックス値」または「応答良好インデックス値」は、「予後不良」または「予後／応答良好」、例えば、比較的短い予想される生存（例えば、全生存、無疾患生存、無遠隔転移生存等）；化学療法を含む処置の後の（例えば、RECIST基準による）完全応答、部分応答、または安定を有すると特徴決定された複数の訓練癌患者から生成され得る。「応答良好インデックス値」または「応答不良インデックス値」は、「良好予後」または「応答不良」、例えば、化学療法を含む処置の後の（例えば、RECIST基準による）完全応答、部分応答、または安定の欠如を有すると定義された複数の訓練癌患者から生成され得る。従って、例えば、特定の遺伝子または遺伝子パネルの応答良好インデックス値は、「応答良好」を有する患者における特定の遺伝子または遺伝子パネルの発現の平均レベルを表すことができ、特定の遺伝子または遺伝子パネルの応答不良インデックス値は、「応答不良」を有する患者における特定の遺伝子または遺伝子パネルの発現の平均レベルを表す。従って、関連する遺伝子または遺伝子パネルの発現の決定されたレベルが、遺伝子または遺伝子パネルの応答不良インデックス値より、遺伝子または遺伝子パネルの応答良好インデックス値に近い場合、患者は応答良好を有する可能性がより高いと結論付けることができる。他方、関連する遺伝子または遺伝子パネルの発現の決定されたレベルが、遺伝子または遺伝子パネルの応答良好インデックス値より、遺伝子または遺伝子パネルの応答不良インデックス値に近い場合、患者は応答不良を有する可能性がより高いと結論付けることができる。
【００７０】
あるいは、インデックス値はこのように決定されてもよい：患者をリスク群へ割り当てるため、細胞周期平均値についての閾値を設定することができる。最適の閾値は、（1 - 特異度）に対して感度をプロットする受信者動作特性（ROC）曲線に基づき選択される。細胞周期平均値の各増分について、その値を閾値として使用して、試験の感度および特異度を計算する。実際の閾値は、当業者の必要条件（例えば、望まれる感度または特異度の程度等）によってこれらのメトリクスを最適化する値になるであろう。図1およびそれに関する本明細書中の考察は、実験的に決定されバリデートされた閾値の決定を証明する。
【００７１】
図1および表20に示されるように、CCGのパネル（例えば、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、もしくは10種、またはそれ以上のCCG）は、応答を正確に予測することができる。当業者は、遺伝子のパネル（即ち、複数の遺伝子）の発現を決定する様々な方式に精通している。特定の患者から入手された試料（試料全体、または細胞のサブセット、または試料由来の単一の細胞）において、全パネル遺伝子の平均発現レベル（規準化または絶対）を決定することによって、遺伝子のパネルの発現を決定することができる。これに関して、発現の増加とは、平均発現が、参照におけるこれらの遺伝子の平均発現レベルより高いこと（例えば、正常患者よりも高いこと；同一の癌を有する患者のような参照集団における平均発現レベルを表すことが決定されたインデックス値より高いこと等）を意味するであろう。あるいは、パネル内の遺伝子の少なくとも数種（例えば、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、またはそれ以上）または少なくともある割合（例えば、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％）の平均発現レベル（規準化または絶対）を決定することによって、遺伝子のパネルの発現を決定してもよい。あるいは、パネル内の各遺伝子を表すアナライト（例えば、mRNA、cDNA、タンパク質）の絶対コピー数を決定することによって、遺伝子のパネルの発現を決定し、遺伝子間でこれらを合計するかまたは平均化してもよい。
【００７２】
「応答」（例えば、特定の処置計画に対する応答）とは、当技術分野において周知の用語であって、その公知の意味に従って本明細書において使用される。一例として、「応答」の意味は、癌型依存的であって、肺癌における応答は、前立腺癌における応答とは異なるものを意味し得る。しかしながら、各々の癌型およびサブタイプにおける「応答」は、当業者に明白に理解される。例えば、応答の客観的基準には、処置の間、癌患者が改善する時（「応答」）、現状を維持する時（「安定化」）、または悪化する時（「進行」）を定義している、発行されたルール（例えば、腫瘍サイズの変化等）のセットである固形癌効果判定基準（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors）（RECIST）が含まれる。例えば、Eisenhauer et al.,EUR.J.CANCER(2009)45:228-247を参照すること。「応答」には、生存メトリクス（例えば、「無疾患生存」（DFS）、「全生存」（OS）等）も含まれ得る。いくつかのケースにおいて、RECIST基準には、（a）完全応答（CR）：全ての転移の消失；（b）部分応答（PR）：ベースラインのLDの和を参照とした、転移病巣の最長径（LD）の和の少なくとも30％の減少；（c）安定（SD）：処置開始以降、PRと認定するためには縮小が不十分であり、PDと認定するためには最小のLDの和を参照とした増加が不十分；（d）進行（PD）：処置開始以降の、最小のLDの和を参照とした、標的転移病巣のLDの和の少なくとも20％の増加、または1個以上の新しい病巣の出現が含まれ得る。
【００７３】
下記実施例に示されるように、CCG発現の増加は、特定の処置（例えば、化学療法を含む処置）に対する応答の可能性の増加とよく相関する。本明細書において使用されるように、「特定の処置」とは、少なくともいくつかの定義されたパラメータを有する医学的な管理計画をさす。これらは、単独の特定の治療剤；薬剤の特異的な組み合わせ（例えば、FOLFOX、FOLFIRI）；特定の薬剤（例えば、5-フルオロウラシル）もしくは薬剤の部分的組み合わせ（例えば、白金化合物とタキサン）を少なくとも含む薬剤と、他の薬剤もしくは介入（例えば、手術、放射線）との組み合わせ；外科的介入もしくはその他の介入（例えば、腫瘍の外科的切除、放射線治療）；またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、「補助」化学療法としても公知の、腫瘍の外科的切除後の化学療法）の投与（処方を含む）を含み得る。「化学療法」とは、本明細書において使用されるように、当技術分野において周知である慣習的な意味を有する。いくつかの態様において、特定の処置（例えば、化学療法を含む処置計画）は、白金に基づく化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）とタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタクセル）および／またはゲムシタビンとの併用を含む。
【００７４】
多くの肺癌患者および医師にとって、（時に周囲の健常組織を含む）腫瘍を除去する手術が、標準治療である。手術は一部の患者を完治させることができ、補助化学療法は、衰弱させ、高価であるため、補助化学療法を試みるべきであるか否かの決断は、より困難である。いくつかの態様において、CCGの発現の増加は、補助化学療法に対する応答の可能性の増加と相関する（従って、いくつかの態様において、CCGの発現が増加している場合、補助化学療法が投与されるか、推奨されるか、または処方される）。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子の発現が組み入れられているかまたはそれを表す試験値に少なくとも50％以上寄与するようCCGが重み付けされる場合、CCGを含む複数の試験遺伝子の発現の増加は、補助化学療法に対する応答の可能性の増加と相関する（従って、いくつかの態様において、複数の試験遺伝子の発現が増加している場合、補助化学療法が投与されるか、推奨されるか、または処方される）。
【００７５】
本明細書において使用されるように、特色またはアウトカムを有する患者の確率が参照確率または参照値を越える場合、その患者は、その臨床的特色またはアウトカム（例えば、応答）の「可能性の増加」を有する。参照確率は、一般的な関連患者集団における特色またはアウトカムの確率であり得る。例えば、一般的な肺癌患者集団（または特異的な亜集団、例えば、Ia期、Ib期、またはII期の肺癌患者）における（例えば、化学療法を含む処置に対する）応答の確率がX％であり、特定の患者が、本発明の方法によってY％の応答の確率を有すると決定され、かつY ＞ Xである場合、その患者は、応答の「可能性の増加」を有する。いくつかの態様において、Y - X = 少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、または90である場合、その患者は、応答の可能性の増加を有する。あるいは、上述のように、閾値または参照値が決定され、特定の患者の応答の確率が、その閾値または参照と比較されてもよい。応答の予測は、予後を予測するための努力であるため、「予後の予測」とは、時に、応答の予測をさすために本明細書において使用されるであろう。
【００７６】
同様に、予後とは、しばしば相対的な意味で使用される。しばしば、患者が予後不良を有すると言われる時、これは、その患者が、他の（例えば、平均的な）患者より不良の予後（または患者が異なる臨床的徴候を有する場合より不良の予後）を有することを意味する。従って、他に明示されるかまたは前後関係が明白に他のことを示さない限り、「予後不良」には「より不良の予後」が含まれ、「予後良好」には「より良好な予後」が含まれる。本書中の他の箇所に記述されるように、予後には、患者の癌再発、癌転移、または新たな原発癌の可能性が含まれ得る。これらのケースにおいて、「予後不良」とは、患者がこれらの臨床的アウトカムのうちの一つの（前段落に記述されたような）「可能性の増加」を有することを意味する。予後には、生存（例えば、全生存、無疾患生存、無遠隔転移生存等）の可能性も含まれ得る。これらのケースにおいて、「予後不良」とは、（a）患者の（推定）予想生存時間が、参照量より低い量（例えば、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、もしくは20年）であること；または（b）患者が、ある量の時間（例えば、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、20年、またはそれ以上）を越えた生存の（前段落に記述されたような）「可能性の減少」を有することのいずれかを意味する。当然、「予後良好」については、反対のことが当てはまるであろう。
【００７７】
表6および7に示されるように、個々のCCGは、応答を極めてよく予測することができる。従って、本発明のいくつかの態様は、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11、またはパネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはKのいずれかにリストされた単一のCCGの発現を決定する工程、および発現の増加を応答の可能性の増加と相関させる工程を含む。
【００７８】
図1および表20は、CCGのパネル（例えば、2種、3種、4種、5種、または6種のCCG）が応答を正確に予測し得ることを示す。従って、いくつかの局面において、本発明は、複数のCCGを含む遺伝子のパネル（例えば、複数の試験遺伝子）の状態を決定する工程を含む、癌を分類する方法を提供する。例えば、遺伝子のパネル（または複数の試験遺伝子）の発現の増加とは、正常患者におけるこれらの遺伝子の平均発現レベルより高い（または正常平均発現レベルを表すことが決定されたインデックス値より高い）特定の患者における全てのパネルまたは試験遺伝子の平均発現レベルをさすことができる。あるいは、遺伝子のパネルの発現の増加とは、平均正常発現レベルと比較された、パネル内の遺伝子のうちの少なくとも数種（例えば、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、もしくはそれ以上）または少なくともある割合（例えば、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％）の発現の増加をさすことができる。
【００７９】
いくつかの態様において、パネルは、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、70種、80種、90種、100種、200種、またはそれ以上のCCGを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくとも10種、15種、20種、またはそれ以上のCCGを含む。いくつかの態様において、パネルは、5〜100種のCCG、7〜40種のCCG、5〜25種のCCG、10〜20種のCCG、または10〜15種のCCGを含む。いくつかの態様において、CCGは、パネルの少なくともある割合を構成する。従って、いくつかの態様において、パネルは、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％、CCGを含む。いくつかの好ましい態様において、パネルは、少なくとも10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、70種、80種、90種、100種、200種、またはそれ以上のCCGを含み、そのようなCCGは、パネル内の遺伝子の総数の少なくとも50％、60％、70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上を構成する。いくつかの態様において、CCGのパネルは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子を含む。いくつかの態様において、パネルは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子のうちの2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、またはそれ以上を含む。いくつかの態様において、本発明は、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかのCCGの状態を決定する工程、ならびにパネルの発現の増加を、予後不良および／または処置計画に対する応答の可能性の増加と相関させる工程を含む、予後を決定しかつ／または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む計画）に対する応答を予測する方法を提供する。
【００８０】
CCG（表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」に示される）のいくつかのパネルは、予後を決定しかつ／または特定の処置に対する応答を予測するために有用である。
【００８１】
（表８）「パネルC」
2016515800.tif 000016
＊これらの遺伝子は、本発明のいくつかの態様において、26遺伝子サブセットパネル（「パネルD」）として使用され得る。
【００８２】
（表９）「パネルE」
2016515800.tif 000017
＊これらの遺伝子は、本発明のいくつかの態様において、31遺伝子サブセットパネル（「パネルF」）として使用され得る。
【００８３】
（表１０）「パネルG」
2016515800.tif 000018
＊ CCP遺伝子（パネルH）
＊＊ ハウスキーピング対照遺伝子（パネルI）
【００８４】
（表１１）「パネルJ」
2016515800.tif 000019
＊ CCP遺伝子（パネルK）
＊＊ ハウスキーピング対照遺伝子
∧ 内部対照遺伝子
【００８５】
上記表2〜7と同様に、表10および11のCCP遺伝子を、CCP平均値との相関および独立の予測値（p値）によって順位付けした。平均値との相関による順位は、下記表12〜14に示される。p値による順位は、下記表15および16に示される。
【００８６】
（表１２）
2016515800.tif 000020
【００８７】
（表１３）
2016515800.tif 000021
【００８８】
（表１４）
2016515800.tif 000022
【００８９】
（表１５）
2016515800.tif 000023
【００９０】
（表１６）
2016515800.tif 000024
【００９１】
平均値との相関（表2、3、および5）およびp値（表6および7）による各遺伝子の順位を、2種の異なる組み合わせ順位を導出するために使用した。表17は、以下の式によって計算された、最も高い重み付けなしの組み合わせスコアによって、表10のCCP遺伝子を順位付けしたものである：各遺伝子についての組み合わせスコア = (1/(表2の相関)) + (1/(表3の相関)) + (1/(表5の相関)) + (1/(表6のp値)) + (1/(表7のp値))。表18は、以下の式によって計算された、（平均値との相関より大きい重みをp値に与える）最も高い重み付き組み合わせスコアによって、表10のCCP遺伝子を順位付けしたものである：各遺伝子の組み合わせスコア = (2/(表2の相関)) + (3/(表3の相関)) + (5/(表5の相関)) + (7/(表6のp値)) + (10/(表7のp値))。
【００９２】
（表１７）
2016515800.tif 000025
【００９３】
（表１８）
2016515800.tif 000026
【００９４】
上記の表2〜7ならびに表15および16と同様に、表9のパネルFのCCP遺伝子を、下記実施例3として報告される研究において独立の予測値（p値）によって順位付けした。これらの順位は、下記表19に示される。
【００９５】
（表１９）
2016515800.tif 000027
【００９６】
CCGサインにおいて、アッセイされる特定のCCGは、しばしば、CCGの総数ほど重要ではない。アッセイされるCCGの数は、多くの要因、例えば、技術的な制約、コストの考慮、なされる分類、試験される癌、望まれる予測力のレベル等に依って変動し得る。例えば、アッセイされるmRNAのプールがより大きいことは、異常値によって引き起こされる「ノイズ」がより少なく、試験の全体予測力を低下させるアッセイエラーの機会がより少ないことを意味するため、本発明によってアッセイされるパネル内のCCGの数の増加は、一般的に、有利である。しかしながら、コストおよびその他の考慮が、一般に、この数を限定するであろう。サインのためのCCGの最適の数を見出すことが望ましい。
【００９７】
CCGサインの予測力は、しばしば、CCGのある数を越えると、有意に増加しなくなることが発見された。サインのための細胞周期遺伝子の最適の数を決定するため、平均値の予測力を、パネルCのCCGのうちの1〜30種の無作為に選択されたセットについて試験した（図1）。これは、本発明のいくつかの態様について、有意に改善された予測力を提供するパネル内のCCGの閾数を証明する（10種、15種、または10〜15種）。いくつかの態様において、CCGのはるかに小さいパネルが、疾患アウトカムの予後を予測しかつ／または治療応答／利益を予測するために十分である（例えば、表21〜25のパネルFの「サブパネル」）。より大きいCCGセットのはるかに小さいサブセット（即ち、より小さいCCGサブパネル）の性能を評価するため、本発明者らは、サインに含まれるCCGの数の関数として、パネルCからのCCGがアウトカムをどの程度よく予測するかを比較した（図1）。下記表20および図1に示されるように、小さいCCGサイン（例えば、2種、3種、4種、5種、6種のCCG等）は、有意な予測因子である。
【００９８】
（表２０）
2016515800.tif 000028
＊ 1000種の無作為に選出されたCCGのサブセット（サイズ1〜6）について
【００９９】
この説明の一部として提出された表21〜25は、パネルFから選択された多数のサブパネルの予測力（一変量p値および多変量p値の両方）を示すことによって、本発明のこの特色をさらに例示する。理解され得るように、パネルFから選択された2遺伝子サブパネルおよび3遺伝子サブパネルは、各々、実施例1〜3に記載されたコホートにおける肺癌予後を有意に予測する。パネルFの上位10種の遺伝子（即ち、表19のようにp値によって順位付けられたパネルFの遺伝子）から選択された全ての4遺伝子サブパネル、5遺伝子サブパネル、および6遺伝子サブパネルについても、同様である。従って、本書に記載された本発明の各態様において、遺伝子のパネル（または複数の試験遺伝子等）が表21〜25のいずれかのサブパネルを含むさらなる態様が存在する。非限定的な例として、本発明は、以下の工程を含む、肺癌を有する患者の予後または患者における癌再発の可能性を決定する方法を提供する：（1）患者から試料を入手する工程；（2）試料中の表21〜25のいずれかから選択されたパネルFのサブパネルを含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定する工程；（3）（i）サブパネルの遺伝子が、試験値の少なくとも25％に寄与するよう（例えば、集合的に）重み付けされるよう、遺伝子のパネルから選択された複数の試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（ii）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせることによって、試験値を提供する工程；ならびに（4）試験値に少なくとも一部分基づき、予後不良もしくは予後良好または癌再発の可能性の増加もしくは増加の欠如を有するとして患者を分類する工程。
【０１００】
いくつかの態様において、サイン内のCCGの最適の数（nO）は、以下が真である場合に必ず見出され得る。
(Pn+1 - Pn) < CO
Pは予測力であり（即ち、Pnは、n種の遺伝子を含むサインの予測力であり、Pn+1はn+1種の遺伝子を含むサインの予測力であり）、COは最適化定数である。予測力は、サインのp値を含むが、これに限定されない、当業者に公知の多くの方式で定義され得る。COは、特定の制約に基づき、当業者によって選択され得る。例えば、コストが重要な要因でなく、極めて高いレベルの感度および特異度が望まれる場合、予測力の些細な増加のみが無視されるよう、COは極めて低く設定され得る。他方、コストが決定的であり、中程度のレベルの感度および特異度が許容される場合、予測力の有意な増加のみが、サイン内の遺伝子数の増加を保証するよう、COはより高く設定され得る。
【０１０１】
あるいは、遺伝子数の関数としての予測力のグラフを（図1のように）プロットし、このプロットの二次導関数をとることができる。二次導関数が予め決定された値（CO'）へ減少する点が、サイン内の遺伝子の最適の数であり得る。
【０１０２】
図1は、本発明のCCGパネルにおけるCCGの最適の数の経験的な決定を例示する。パネルFの31種のCCGの無作為に選択されたサブセットを、別個のCCGサインとして試験し、各々について予測力（即ち、p値）を決定した。図1が示すように、p値は、約10〜約15種のCCGで有意に改善されなくなり、従って、いくつかの態様において、予後パネルにおけるCCGの最適数が約10〜約15であることが示された。従って、本発明のいくつかの態様は、約10〜約15種のCCGを含む遺伝子のパネルの状態を決定し、CCGの発現の増加が、予後不良（または特定の処置、例えば、化学療法を含む処置に対する応答の可能性の増加）を示すものとする工程を含む、肺癌を有する患者における予後（または特定の処置計画に対する応答の可能性）を予測する方法を提供する。いくつかの態様において、パネルは約10〜約15種のCCGを含み、CCGは、パネルの少なくとも90％を構成する（または少なくとも75％に寄与するよう重み付けされる）。他の態様において、パネルは、CCGに加えて、パネルの予測力を有意に増加させる（即ち、パネルがCCGのみからなる場合より予測力を有意によくする）1種以上の付加的なマーカーを含む。（表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」にリストされたもののいずれかを含む）CCGの他の組み合わせが、本発明を実施するために使用されてもよい。
【０１０３】
いくつかの態様において、パネルは、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCGを含む。いくつかの態様において、パネルは、5〜100種のCCG、7〜40種のCCG、5〜25種のCCG、10〜20種のCCG、または10〜15種のCCGを含む。いくつかの態様において、CCGは、パネルの少なくともある割合を構成する。従って、いくつかの態様において、パネルは、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％、CCGを含む。いくつかの態様において、CCGは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」にリストされた遺伝子のいずれかである。いくつかの態様において、パネルは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上の遺伝子を含む。いくつかの態様において、パネルは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかの遺伝子の全てを含む。
【０１０４】
上述のように、本発明のCCGの多くが、CCG平均値との相関を決定するためにも、パネル内の相対的な予測値を決定するためにも、分析された（表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、および19を参照すること）。従って、いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19にリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、またはそれ以上のCCGを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、以下の遺伝子のうちの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、または20種を含む：ASPM、BIRC5、BUB1B、CCNB2、CDC2、CDC20、CDCA8、CDKN3、CENPF、DLGAP5、FOXM1、KIAA0101、KIF11、KIF2C、KIF4A、MCM10、NUSAP1、PRC1、RACGAP1、およびTPX2。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号2および3、2〜4、2〜5、2〜6、2〜7、2〜8、2〜9、または2〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、または9種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号3および4、3〜5、3〜6、3〜7、3〜8、3〜9、または3〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、または8種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号4および5、4〜6、4〜7、4〜8、4〜9、または4〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、または7種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、1〜13、1〜14、または1〜15のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、または15種もしくは全てを含む。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明は、以下の工程を含む、肺癌患者の予後または特定の処置に応答する患者の可能性を決定する方法を提供する：（1）患者由来の試料中の複数のCCG（例えば、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子）を含む複数の遺伝子の測定された発現レベルを入手する工程；（2）患者の肺癌に関連する1種以上の臨床パラメータ（例えば、年齢、性別、喫煙、病期、処置、腫瘍サイズ、胸膜浸潤）を含む（または反映する）患者についての臨床スコアを入手する工程；（3）（1）において入手された測定されたレベルおよび（2）において入手された臨床スコアから組み合わせ試験値を導出する工程；（4）組み合わせ試験値を、参照患者集団における複数の遺伝子の測定された発現レベルおよび1種以上の臨床パラメータを含む（または反映する）臨床スコアから導出された組み合わせ参照値と比較する工程；ならびに（5）（a）組み合わせ参照値より大きい組み合わせ試験値を、予後不良（もしくは特定の処置に対する応答の可能性の増加）と相関させる工程、または（5）（b）組み合わせ参照値以下の組み合わせ試験値を、予後良好（もしくは特定の処置に対する応答の可能性の減少）と相関させる工程。
【０１０６】
いくつかの態様において、組み合わせスコアには、CCPスコア、ならびに年齢、性別、喫煙、病期、処置、腫瘍サイズ、および胸膜浸潤のうちの単一のパラメータまたは組み合わせが含まれる（単一の臨床パラメータまたは臨床パラメータの組み合わせは、組み合わせスコアの「臨床スコア」成分と呼ばれ得る）。CCP、年齢、および腫瘍サイズは、連続的な数値変数であり得る。性別、喫煙、処置、および胸膜浸潤は、二値型の数値変数（例えば、はい = X、いいえ = Y）であり得る。腫瘍病期は、特定の臨床的病期に割り当てられた特定の値による数値変数であり得る（例が以下に示される）。
【０１０７】
いくつかの態様において、組み合わせスコアは、以下の式に従って計算される：
（1）組み合わせスコア = A * (CCPスコア) + B * (臨床スコア)
【０１０８】
いくつかの態様において、臨床スコアは、肺癌予後のための（または特定の処置に対する応答を予測するための）臨床的な計算図表による患者のスコアである。いくつかの態様において、組み合わせスコアは、以下の式1の修飾バージョンに従って計算される：
（2）組み合わせスコア = C * (A * (CCPスコア) + B * (臨床スコア)) + D
CおよびDは、各々、独自の係数、付加的な関数、または予め決定された定数を含む付加的な変数（例えば、他の遺伝子の発現）であり得る。いくつかのそのような態様において、C = 20およびD = 15である。
【０１０９】
いくつかの態様において、CCPスコアは、任意で、より高い値がより高い発現を示すよう、対照遺伝子の重み付けなしの平均値によって規準化された、分析されているCCP遺伝子（例えば、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子）の発現についてのCT値の重み付けなしの平均値である（いくつかの態様において、1単位は発現の2倍の変化と等価である）。いくつかの態様において、CCPスコアは、-8〜8または-1.6〜3.7の範囲である。
【０１１０】
一つの特定の態様において、臨床スコアは、以下に示されるような患者の腫瘍病期に割り当てられた数値によって表される。
【０１１１】
2016515800.tif 000029
【０１１２】
式1（またはCおよびDが各々0である式2）を利用した本発明の一つの態様において、A =0.34かつB = 0.49である。式1（またはCおよびDが各々0である式2）を利用したもう一つの態様において、A = 0.33かつB = 0.52である。式1（またはCおよびDが各々0である式2）を利用した一つの態様において、A = 0.33かつB = 0.52であり、「臨床スコア」は、上に示されたような病理学的病期を含む（またはそれからなる）。式2を利用した一つの態様において、A = 0.33、B = 0.52、C = 20、D = 15であり、Bの「臨床スコア」は、上に示されたような病理学的病期を含む（またはそれからなるかもしくは本質的になる）。
【０１１３】
いくつかの態様において、A = 0.34かつB = 0.49； A = 0.95、B = 0.61；A = 0.57かつB = 0.39；またはA = 0.58かつB = 0.41である。いくつかの態様において、A、B、C、および／またはDは、これらの値の丸めの範囲内にある（例えば、Aは0.945〜0.954または0.325〜0.334であり、Bは0.515〜0.524であり、他も同様である）。いくつかの態様において、A、B、C、および／またはDは、これらの値の±1％以内、±2％以内、±3％以内、±4％以内、±5％以内、±10％以内、±15％以内、±20％以内、±25％以内、±30％以内、±35％以内、±40％以内、±45％以内、±50％以内である（例えば、Aは0.29〜0.37であり、Bは0.46〜0.58であり、他も同様である）。いくつかのケースにおいて、式は、指定された係数の全てを有していなくてもよい（従って、対応する変数が組み入れられていなくてもよい）。いくつかの態様において、Aは、0.9〜1、0.9〜0.99、0.9〜0.95、0.85〜0.95、0.86〜0.94、0.87〜0.93、0.88〜0.92、0.89〜0.91、0.85〜0.9、0.8〜0.95、0.8〜0.9、0.8〜0.85、0.75〜0.99、0.75〜0.95、0.75〜0.9、0.75〜0.85、または0.75〜0.8である。いくつかの態様において、Bは、0.40〜1、0.45〜0.99、0.45〜0.95、0.55〜0.8、0.55〜0.7、0.55〜0.65、0.59〜0.63、または0.6〜0.62である。
【０１１４】
いくつかの態様において、Aは、0.1〜0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.2〜0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.3〜0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.4〜0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.5〜0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.6〜0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.7〜0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.8〜0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.9〜1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または1〜1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または1.5〜2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または2〜2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または2.5〜3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または3〜3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または3.5〜4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または4〜4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または4.5〜5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または5〜6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または6〜7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または7〜8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または8〜9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または9〜10、11、12、13、14、15、もしくは20；または10〜11、12、13、14、15、もしくは20；または11〜12、13、14、15、もしくは20；または12〜13、14、15、もしくは20；または13〜14、15、もしくは20；または14〜15もしくは20；または15〜20であり；Bは、0.1〜0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.2〜0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.3〜0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.4〜0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.5〜0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.6〜0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.7〜0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.8〜0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または0.9〜1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または1〜1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5��5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または1.5〜2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または2〜2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または2.5〜3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または3〜3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または3.5〜4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または4〜4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または4.5〜5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または5〜6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または6〜7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または7〜8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または8〜9、10、11、12、13、14、15、もしくは20；または9〜10、11、12、13、14、15、もしくは20；または10〜11、12、13、14、15、もしくは20；または11〜12、13、14、15、もしくは20；または12〜13、14、15、もしくは20；または13〜14、15、もしくは20；または14〜15もしくは20；または15〜20である。いくつかの態様において、A、B、および／またはCは、これらの値の丸めの範囲内にある（例えば、Aは0.45〜0.54であり、他も同様である）。
【０１１５】
本発明による分析の結果は、しばしば、医師、遺伝相談員、および／または患者（または研究者のようなその他の利害関係者）に、上記関係者のうちのいずれかに通知または伝達され得る伝達可能な形態で通知されるであろう。そのような形態は、変動することができ、有形または無形であり得る。結果は、説明文書、図表、写真、チャート、画像、またはその他の視覚的形態で具体化され得る。例えば、様々な遺伝子についての発現または活性のレベルを示すグラフまたは配列変動情報が、結果の説明において使用され得る。付加的な標的遺伝子についてのそのような情報を示す図表も、試験結果を示すために有用である。文書および視覚的形態は、紙、フロッピーディスク、コンパクトディスク等のようなコンピュータ読取り可能媒体のような有形媒体に記録されてもよいし、または無形媒体、例えば、電子メールもしくはインターネット上もしくはイントラネット上のウェブサイトの形態の電子的媒体に記録されてもよい。さらに、結果は、音声形態で記録され、電話、ファクシミリ、無線携帯電話、インターネット電話等を介して、任意の適当な媒体、例えば、アナログもしくはデジタルのケーブル線、光ファイバケーブル等を通して伝達されてもよい。
【０１１６】
従って、試験結果に関する情報およびデータは、世界中の任意の場所で作製され、異なる場所に伝達され得る。例示的な例として、発現レベル、活性レベル、または配列決定（または遺伝子型決定）のアッセイが、米国外で実施される時、試験結果に関する情報およびデータは、生成され、上記のような伝達可能な形態で準備され、次いで、米国内へ輸入され得る。従って、本発明は、少なくとも1個の患者試料について、（a）発現レベルまたは（b）活性レベルのうちの少なくとも1種に関する情報の伝達可能な形態を作製する方法も包含する。方法は、（1）本発明の方法によって上記（a）または（b）のうちの少なくとも1種を決定する工程；および（2）決定工程の結果を伝達可能な形態で具体化する工程を含む。伝達可能な形態は、そのような方法の産物である。
【０１１７】
そのような発現、活性、および／または配列のデータ（実際、本発明によって入手される任意のデータ）を分析するための技術は、しばしば、そのような分析を遂行することができる1種以上のコンピュータシステムまたはその他のプロセシングシステムにおいてハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実装されるであろう。
【０１１８】
従って、本発明は、以下のものを含む、腫瘍試料中の遺伝子発現を決定するためのシステムをさらに提供する：（1）試料（例えば、腫瘍試料）中の少なくとも2種、4種、6種、8種、または10種の細胞周期遺伝子を含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための、肺癌を有する患者由来の試料、または患者試料由来のmRNA分子、または遺伝子のパネルから発現されたmRNA由来のcDNA分子を含有している試料分析器；（2）（a）遺伝子のパネルから選択された少なくとも4種の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、（b）試験遺伝子の各々の決定された発現を重み付けし、（c）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせるための、第一のコンピュータプログラム（試験遺伝子の少なくとも20％、50％、少なくとも75％、または少なくとも90％は細胞周期遺伝子である）（または細胞周期遺伝子は、試験値の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、または100％に寄与するよう重み付けされる）；ならびに（3）（a）癌再発もしくは癌進行のリスクの予め決定された程度および／または（b）特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置計画）に対する応答の可能性の予め決定された程度と各々関連している1種以上の参照値と、試験値を比較するための第二のコンピュータプログラム。いくつかの態様において、システムは、試験値と1種以上の参照値との間の比較を表示するかまたは比較工程の結果を表示するディスプレイモジュールをさらに含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、試料中の試験遺伝子を含む遺伝子のパネルから転写されたRNAの量が測定される。さらに、試料中の1種以上のハウスキーピング遺伝子のRNAの量も測定され、上記のように、試験遺伝子の発現を規準化するかまたは較正するために使用される。
【０１２０】
いくつかの態様において、複数の試験遺伝子には、複数の試験遺伝子の少なくとも50％、75％、または80％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも2種、3種、または4種の細胞周期遺伝子が含まれる。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子には、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも5種、6種、もしくは7種、または少なくとも8種の細胞周期遺伝子が含まれる。
【０１２１】
いくつかの他の態様において、複数の試験遺伝子には、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも8種、10種、12種、15種、20種、25種、または30種の細胞周期遺伝子が含まれる。
【０１２２】
試料分析器は、例えば、配列決定機、リアルタイムPCR機、マイクロアレイ装置を含む、遺伝子発現の決定において有用な任意の装置であり得る。
【０１２３】
コンピュータベースの分析ファンクションは、任意の適当な言語および／またはブラウザにおいて実装され得る。例えば、それは、C言語によって、好ましくは、Visual Basic、SmallTalk、C++等のようなオブジェクト指向の高レベルプログラミング言語を使用して実装され得る。アプリケーションは、Windows（商標）98、Windows（商標）2000、Windows（商標）NT等を含むMicrosoft Windows（商標）環境のような環境に適合するよう書き込まれ得る。さらに、アプリケーションは、MacIntosh（商標）、SUN（商標）、UNIX、またはLINUXの環境のために書き込まれてもよい。さらに、ファンクションステップは、ユニバーサルなまたはプラットフォーム非依存性のプログラミング言語を使用して実装されてもよい。そのようなマルチプラットフォームプログラミング言語の例には、ハイパーテキストマークアップ言語（HTML）、JAVA（商標）、JavaScript（商標）、Flashプログラミング言語、コモンゲートウェイインタフェース／構造化照会言語（CGI/SQL）、PERL（practical extraction report language）、AppleScript（商標）、およびその他のシステムスクリプト言語、プログラミング言語／構造化照会言語（PL/SQL）等が含まれるが、これらに限定されない。HotJava（商標）、Microsoft（商標）Explorer（商標）、またはNetscape（商標）のようなJava（商標）またはJavaScript（商標）によって可能なブラウザが使用され得る。アクティブコンテンツウェブページが使用される時、それらはJava（商標）アプレットまたはActiveX（商標）コントロールまたはその他のアクティブコンテンツテクノロジーを含み得る。
【０１２４】
分析ファンクションは、コンピュータプログラムプロダクトにおいて具体化され、上記のシステムまたはその他のコンピュータもしくはインターネットに基づくシステムにおいて使用されてもよい。従って、本発明のもう一つの局面は、プロセッサが遺伝子状態分析を実施することを可能にするための、コンピュータ読取り可能プログラムコードまたはそこで具体化された命令を有するコンピュータ使用可能媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトに関する。これらのコンピュータプログラム命令は、コンピュータまたはその他のプログラミング可能機器において実行される命令が、上記のファンクションまたはステップの実装のための手段を作出するようなマシンを作製するため、コンピュータまたはその他のプログラミング可能機器へロードされ得る。コンピュータ読取り可能なメモリまたは媒体に記憶された命令が、分析を実装する命令手段を含む製品を作製するよう、コンピュータまたはその他のプログラミング可能機器に特定の様式で機能するよう命令することができるこれらのプログラム命令が、コンピュータ読取り可能なメモリまたは媒体に記憶されてもよい。コンピュータまたはその他のプログラミング可能機器において実行される命令が、上記のファンクションまたはステップを実装するためのステップを提供するよう、コンピュータによって実装されるプロセスを作製するため、一連のオペレーションステップがコンピュータまたはその他のプログラミング可能機器において実施されることを引き起こすため、コンピュータプログラム命令が、コンピュータまたはその他のプログラミング可能機器にロードされてもよい。
【０１２５】
従って、本発明の一つの局面は、患者が特定の処置計画に対する応答の可能性の増加を有するか否かを決定するためのシステムを提供する。概して述べると、システムは、（1）患者のCCG状態データ（例えば、発現レベル、活性レベル、バリアント）および任意で臨床パラメータデータ（例えば、臨床的病期）を受容し、記憶し、かつ／または検索するためのコンピュータプログラム；（2）この患者データについて問い合わせるためのコンピュータプログラム；（3）この患者データに基づき、再発の可能性の増加が存在するか否かを結論付けるためのコンピュータプログラム；ならびに任意で（4）この結論の出力／表示のためのコンピュータプログラムを含む。いくつかの態様において、結論の出力のためのこの手段は、ヘルスケア従事者へ結論を知らせるためのコンピュータプログラムを含み得る。
【０１２６】
そのようなコンピュータシステムの一例は、図6に例示されたコンピュータシステム［600］である。コンピュータシステム［600］は、患者データをコンピュータシステム［600］へ入力するため、少なくとも1個のインプットモジュール［630］を含み得る。コンピュータシステム［600］は、患者が応答の可能性の増加もしくは減少を有するか否かを示すため、かつ／またはコンピュータシステム［600］によって決定された提案される処置を示すため、少なくとも1個のアウトプットモジュール［624］を含み得る。コンピュータシステム［600］は、少なくとも1個のインプットモジュール［630］および少なくとも1個のアウトプットモジュール［624］と連絡している少なくとも1個のメモリモジュール［606］を含み得る。
【０１２７】
少なくとも1個のメモリモジュール［606］には、例えば、磁気テープドライブ、フロッピーディスクドライブ、VCDドライブ、DVDドライブ、光ディスクドライブ等を含むが、これらに限定されない、様々な形態にあり得るリムーバブルストレージドライブ［608］が含まれ得る。リムーバブルストレージドライブ［608］は、リムーバブルストレージユニット［610］からの読み出しおよび／またはリムーバブルストレージユニット［610］への書き込みが可能であるよう、リムーバブルストレージユニット［610］と適合性であり得る。リムーバブルストレージユニット［610］は、コンピュータ読み取り可能なプログラムコードもしくは命令および／またはコンピュータ読み取り可能データが記憶されているコンピュータ使用可能な記憶媒体を含み得る。例えば、リムーバブルストレージユニット［610］は、患者データを記憶することができる。フロッピーディスク、磁気テープ、光ディスク等を含むが、これらに限定されない、リムーバブルストレージユニット［610］の例は、当技術分野において周知である。少なくとも1個のメモリモジュール［606］には、コンピュータ読取り可能なプログラムコードもしくは命令および／またはコンピュータ読取り可能なデータを記憶するために使用され得るハードディスクドライブ［612］も含まれ得る。
【０１２８】
さらに、図1に示されるように、少なくとも1個のメモリモジュール［606］は、ソフトウェア、コンピュータ読取り可能なコードまたは命令が、リムーバブルストレージユニット［616］からコンピュータシステム［600］へ転送され得るよう、インターフェース［614］、およびインターフェース［614］と適合性のリムーバブルストレージユニット［616］をさらに含み得る。インターフェース［614］およびリムーバブルストレージユニット［616］の対の例には、例えば、リムーバブルメモリチップ（例えば、EPROMまたはPROM）およびそれに関連したソケット、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース等が含まれる。コンピュータシステム［600］は、ランダムアクセスメモリ（RAM）のような補助メモリモジュール［618］も含み得る。
【０１２９】
コンピュータシステム［600］は、少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］を含み得る。少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］は、任意の数のデバイスからなり得ることが理解されるべきである。少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］は、マイクロプロセッサまたはマイクロコントローラまたは中央処理装置のようなデータ処理デバイスを含み得る。少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］は、DMA（ダイレクトメモリアクセス）プロセッサ、総合通信プロセッサデバイス（integrated communication processor device）、カスタムVLSI（超大規模集積回路）デバイス、またはASIC（特定用途向け集積回路）デバイスのようなもう一つの論理機構を含み得る。さらに、少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］は、本明細書に記載された処理ファンクションを実施するために設計されているその他の型のアナログまたはデジタルの回路を含み得る。
【０１３０】
図6に示されるように、コンピュータシステム［600］において、少なくとも1個のメモリモジュール［606］、少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］、および補助メモリモジュール［618］は、全て、コミュニケーションバス、システムボード、クロスバー等であり得るコミュニケーションインフラストラクチャー［620］を通して機能的に連結されている。コミュニケーションインフラストラクチャー［620］を通して、コンピュータプログラムコードまたは命令またはコンピュータ読取り可能データが、転送され交換され得る。インプットインターフェース［626］は、少なくとも1個のインプットモジュール［626］をコミュニケーションインフラストラクチャー［620］に機能的に接続することができる。同様に、アウトプットインターフェース［622］は、少なくとも1個のアウトプットモジュール［624］をコミュニケーションインフラストラクチャー［620］に機能的に接続することができる。
【０１３１】
少なくとも1個のインプットモジュール［630］は、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、スキャナ、および当技術分野において公知のその他のインプットデバイスを含み得る。少なくとも1個のアウトプットモジュール［624］は、例えば、コンピュータモニタ、テレビモニタ、または少なくとも1個のインプットモジュール［630］のタッチスクリーンのようなディスプレイスクリーン；プリンタ；ならびにオーディオスピーカーを含み得る。コンピュータシステム［600］は、モデム、コミュニケーションポート、イーサネットカードのようなネットワークカード、およびイントラネットまたはインターネットにアクセスするための新しく開発されたデバイスも含み得る。
【０１３２】
少なくとも1個のメモリモジュール［606］は、少なくとも1個のインプットモジュール［630］を介して入力され、少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］を介して処理された患者データを記憶するよう構成され得る。本発明に関連する患者データには、CCGについての発現レベル、活性レベル、コピー数、および／または配列情報が含まれ得る。本発明に関連する患者データには、患者の疾患に関連する臨床パラメータ（例えば、年齢、腫瘍サイズ、節状態、腫瘍病期）も含まれ得る。年齢、性別、および人種／民族性、ならびに食事情報のような生活習慣データを含むが、これらに限定されない、処置決定／推奨を行うのに有用であることを医師が見出し得るその他の患者データが、システムへ入力されてもよい。その他の可能な型の患者データには、現在または過去に経験された症状、患者の疾病、薬物治療、および医学的手技の履歴が含まれる。
【０１３３】
少なくとも1個のメモリモジュール［606］には、記憶されたコンピュータ実装方法が含まれ得る。少なくとも1個のプロセッサモジュール［602］が、コンピュータ実装方法のソフトウェアまたはコンピュータ読取り可能命令コードを実行するために使用され得る。コンピュータ実装方法は、患者データに基づき、患者が再発、進行、または特定の処置に対する応答の可能性の増加を有するか否かを示し、可能な処置のリスト等を生成するよう構成され得る。
【０１３４】
ある種の態様において、コンピュータ実装方法は、再発または進行の可能性の増加を有するとしてまたは有していないとして患者を同定するよう構成され得る。例えば、コンピュータ実装方法は、特定の患者が再発の可能性の増加を有することを医師に知らせるよう構成され得る。あるいは、またはさらに、コンピュータ実装方法は、様々なクエリーに対する回答／についての結果に基づき、特定の処置の課程を実際に提案するよう構成され得る。
【０１３５】
図7は、本発明のコンピュータシステム［600］によって実装され得る本発明のコンピュータ実装方法［700］の一つの態様を例示する。方法［700］は、3個のクエリーのうちの1個（［710］、［711］）から、連続的にまたは実質的に同時に開始する。これらのクエリーのいずれかに対する回答／についての結果が「はい」である場合［720］、方法は、患者が再発または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置）に対する応答の可能性の増加を有すると結論付ける［730］。これらのクエリーの全てに対する回答／についての結果が「いいえ」である場合［721］、方法は、患者が再発または特定の処置計画（例えば、化学療法を含む処置）に対する応答の可能性の増加を有していないと結論付ける［731］。次いで、方法［700］は、さらなるクエリーに進むか、特定の処置の推奨を行うか（［740］、［741］）、または単純に終了し得る。
【０１３６】
クエリーが連続的に実施される時、それらは、図7によって提案された順序またはその他の順序でなされ得る。その後のクエリーがなされるか否かは、前のクエリーについての結果／回答にも依存し得る。図7に例示された方法のいくつかの態様において、例えば、方法は、最初に臨床パラメータに関して尋ね［711］、再発または特定の処置に対する応答の可能性の増加を有するとして患者を同定する1種以上の臨床パラメータを、患者が有する場合には、方法は、そのように結論付けるか［730］、または、任意で、CCG状態を尋ねることによって確認するが、患者がそのような臨床パラメータを有していない場合には、方法は、CCG状態を尋ねることに進む［710］。上述のように、以上のクエリーの順序は修飾され得る。いくつかの態様において、1個のクエリー（例えば、［710］）に対する「はい」の回答は、患者が再発リスクの増加を有することを確認するため、残りのクエリーのうちの1個以上を促す。
【０１３７】
いくつかの態様において、本発明のコンピュータ実装方法［700］はオープンエンドである。換言すると、図7中の見かけの第一工程［710および／または711］は、実際は、より大きいプロセスの一部を形成していてもよく、このより大きいプロセスの中で、第一工程／クエリーである必要はない。付加的な工程が上述のコアの方法へ追加されてもよい。これらの付加的な工程には、到達した結論をヘルスケア従事者（または患者本人）に知らせる工程；例示された方法［700］によって到達した結論を、患者の診断、予後、処置等に関する付加的なまたは精密な結論に到達するためのその他の事実または結論と組み合わせる工程；処置についての推奨（例えば、「患者は補助化学療法を受けるべきである／受けないべきである」）を行う工程；付加的なバイオマーカー、臨床パラメータ（例えば、年齢、腫瘍サイズ、節状態、腫瘍病期）またはその他の有用な患者情報（例えば、診断時年齢、全身的な患者の健康等）に関する付加的なクエリーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
上記のコンピュータ実装方法［700］に関して、クエリーに対する回答は、回答のため患者データの検索を開始する方法によって決定され得る。例えば、それぞれのクエリー［710、711］に回答するため、患者データが、CCG状態（例えば、CCG発現レベルデータ）および／または臨床パラメータ（例えば、腫瘍病期、計算図表スコア等）について検索され得る。そのような比較がまだ実施されていない場合、方法は、患者が異常な（例えば、上昇した、低い、陰性の）状態を有するか否かを決定するため、これらのデータを参照と比較することができる。さらに、またはあるいは、方法は、クエリーのうちの1個以上［710、711］をコンピュータシステム［100］のユーザ（例えば、医師）に提示することができる。例えば、クエリー［710、711］は、アウトプットモジュール［624］を介して提示され得る。次いで、ユーザは、インプットモジュール［630］を介して、「はい」もしくは「いいえ」を回答するか、または他の値（例えば、CCG状態が組み入れられているかもしくはそれを表す数値または定性的な値）を提供することができる。次いで、方法は、受容された回答に基づき進むことができる。同様に、結論［730、731］は、アウトプットモジュール［624］を介して、コンピュータ実装方法のユーザに提示され得る。
【０１３９】
従って、いくつかの態様において、本発明は、コンピュータ読取り可能媒体に保管された患者のCCG状態に関する情報へアクセスする工程；患者から入手された試料が、少なくとも2種のCCGを含む複数の試験遺伝子の発現の増加（例えば、CCGが試験値に少なくとも50％寄与するよう重み付けされている、この複数の試験遺伝子の発現が組み入れられているかまたはそれを表す、参照値より高い試験値）を示すか否かを決定するため、この情報について尋ねる工程；患者が特定の処置計画に応答する定量的または定性的な可能性（例えば、「その増加」）を出力する［または表示する］工程を含む方法を提供する。本発明のコンピュータ実装態様に関して本明細書において使用されるように、「表示する」とは、任意の知覚手段によって情報を通知することを意味する。例には、例えば、コンピュータスクリーンまたはコンピュータのコマンドで印刷された紙による視覚的ディスプレイ、および聴覚的ディスプレイ、例えば、コンピュータによって生成または記録された患者の遺伝子型の聴覚的表現が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
本発明の実施は、従来の生物学の方法、ソフトウェア、およびシステムも利用し得る。本発明のコンピュータソフトウェアプロダクトは、典型的には、本発明の方法の論理工程を実施するためのコンピュータ実行可能な命令を有するコンピュータ読取り可能媒体を含む。適当なコンピュータ読取り可能媒体には、フロッピーディスク、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ROM/RAM、磁気テープ等が含まれる。基本的なコンピュータ利用の生物学の方法は、例えば、Setubal et al.,INTRODUCTION TO COMPUTATIONAL BIOLOGY METHODS(PWS Publishing Company,Boston,1997)；Salzberg et al.(Ed.),COMPUTATIONAL METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(Elsevier,Amsterdam,1998)；Rashidi & Buehler,BIOINFORMATICS BASICS:APPLICATION IN BIOLOGICAL SCIENCE AND MEDICINE(CRC Press,London,2000)；およびOuelette & Bzevanis,BIOINFORMATICS:A PRACTICAL GUIDE FOR ANALYSIS OF GENE AND PROTEINS(Wiley & Sons,Inc.,2nd ed.,2001)に記載されている；米国特許第6,420,108号も参照すること。
【０１４１】
本発明は、プローブ設計、データの管理、分析、および装置作動のような多様な目的のため、様々なコンピュータプログラムプロダクトおよびソフトウェアも利用し得る。米国特許第5,593,839号；第5,795,716号；第5,733,729号；第5,974,164号；第6,066,454号；第6,090,555号；第6,185,561号；第6,188,783号；第6,223,127号；第6,229,911号；および第6,308,170号を参照すること。さらに、本発明は、米国出願第10/197,621号（米国公開第20030097222号）；第10/063,559号（米国公開第20020183936号）、第10/065,856号（米国公開第20030100995号）；第10/065,868号（米国公開第20030120432号）；第10/423,403号（米国公開第20040049354号）に示されるようなインターネットのようなネットワークによって遺伝子情報を提供する方法を含む態様を有し得る。
【０１４２】
そのような発現、活性、および／または配列のデータ（実際、本発明によって入手される任意のデータ）を分析するための技術は、しばしば、そのような分析を遂行することができる1個以上のコンピュータシステムまたはその他の処理システムにおいて、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実装されるであろう。
【０１４３】
従って、本発明の一つの局面は、本発明の上記の方法に関係するシステムを提供する。一つの態様において、本発明は、以下のものを含む、患者の予後および／または患者が特定の処置計画に応答するか否かを決定するためのシステムを提供する：
（1）試料中の少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上のCCG（例えば、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；またはパネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子）を含む複数の試験遺伝子の発現レベルを決定するための、試料、遺伝子のパネルから発現された試料由来のRNA、またはRNAから合成されたDNAを含有している試料分析器；
（2）（a）複数の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、
（b）試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、
（c）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせるための、
第一のコンピュータプログラム（少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上のCCGに与えられる重みの組み合わせは、複数の試験遺伝子の全ての発現に与えられる全重みの少なくとも40％（または50％、60％、70％、80％、90％、95％、もしくは100％）である）；ならびに
（3）予め決定された再発もしくは進行の可能性または予め決定された特定の処置計画に対する応答の可能性と各々関連している1種以上の参照値と試験値を比較するための第二のコンピュータプログラム。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、50％、75％、または90％はCCGである。いくつかの態様において、試料分析器は、試料中の少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上のCCGを含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための試薬を含有している。いくつかの態様において、試料分析器は、下記のようなCCG特異的な試薬を含有している。
【０１４４】
もう一つの態様において、本発明は、以下のものを含む、試料（例えば、腫瘍試料）中の遺伝子発現を決定するためのシステムを提供する：（1）試料中の少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上のCCGを含む遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための、肺癌を有する患者に由来する試料、遺伝子のパネルから発現された試料由来のRNA、またはRNAから合成されたDNAを含有している試料分析器；（2）（a）遺伝子のパネルから選択された少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上の試験遺伝子に関する遺伝子発現データを受容し、（b）試験遺伝子の各々の決定された発現を、予め定義された係数によって重み付けし、（c）試験値を提供するため、重み付き発現を組み合わせるための、第一のコンピュータプログラム（少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上のCCGに与えられる重みの組み合わせは、複数の試験遺伝子の全ての発現に与えられる全重みの少なくとも40％（または50％、60％、70％、80％、90％、95％、もしくは100％）である）；ならびに（3）予め決定された肺癌の癌再発または進行のリスクの程度と各々関連した1種以上の参照値と試験値を比較するための第二のコンピュータプログラム。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、50％、75％、または90％は、CCGである。いくつかの態様において、システムは、試験値の1種以上の参照値との比較に少なくとも一部分基づき、患者の予後を決定し、かつ／または患者の癌再発もしくは進行のリスクの程度を決定する（例えば、定量化する）ためのコンピュータプログラムを含む。
【０１４５】
いくつかの態様において、システムは、試験値と1種以上の参照値との間の比較を表示するか、または比較工程の結果を表示するか、または患者の予後および／もしくは癌再発もしくは進行のリスクの程度を表示するディスプレイモジュールをさらに含む。
【０１４６】
好ましい態様において、試験遺伝子を含む遺伝子のパネルから転写されたRNA（および／またはそれから逆転写されたDNA）の試料中の量が測定される。さらに、試料中の1種以上のハウスキーピング遺伝子のRNA（および／またはそれから逆転写されたDNA）の量も測定され、上記のように、試験遺伝子の発現を規準化するかまたは較正するために使用される。
【０１４７】
いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも2種、3種、または4種のCCGを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも5種、6種、7種、または少なくとも8種のCCGを含む。従って、いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19にリストされた上位2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、またはそれ以上のCCGを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、以下の遺伝子のうちの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、または20種を含む：ASPM、BIRC5、BUB1B、CCNB2、CDC2、CDC20、CDCA8、CDKN3、CENPF、DLGAP5、FOXM1、KIAA0101、KIF11、KIF2C、KIF4A、MCM10、NUSAP1、PRC1、RACGAP1、およびTPX2。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号2および3、2〜4、2〜5、2〜6、2〜7、2〜8、2〜9、または2〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、または9種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号3および4、3〜5、3〜6、3〜7、3〜8、3〜9、または3〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、または8種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のい��れかの遺伝子番号4および5、4〜6、4〜7、4〜8、4〜9、または4〜10のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、または7種もしくは全てを含む。いくつかの態様において、複数の試験遺伝子は、少なくとも数種のCCG（例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、またはそれ以上のCCG）を含み、この複数のCCGは、表2、3、5、6、7、12、13、14、15、16、17、18、または19のいずれかの遺伝子番号1および2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、1〜13、1〜14、または1〜15のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、または15種もしくは全てを含む。
【０１４８】
いくつかの他の態様において、複数の試験遺伝子は、複数の試験遺伝子の少なくとも20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、または90％、好ましくは、複数の試験遺伝子の100％を構成する、少なくとも8種、10種、12種、15種、20種、25種、または30種のCCGを含む。
【０１４９】
試料分析器は、例えば、配列決定機（例えば、Illumina HiSeq（商標）、Ion Torrent PGM、ABI SOLiD（商標）シーケンサー、PacBio RS、Helicos Heliscope（商標）等）、リアルタイムPCR機（例えば、ABI 7900、Fluidigm BioMark（商標）等）、マイクロアレイ装置等を含む、遺伝子発現の決定において有用な任意の装置であり得る。
【０１５０】
一つの局面において、本発明は、CCG状態情報（例えば、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子）を入手する工程、およびCCG状態に基づき、癌患者のための処置を推奨するか、処方するか、または投与する工程を含む、癌患者を処置する方法を提供する。例えば、本発明は、以下の工程を含む、癌患者を処置する方法を提供する：
（1）少なくとも4種（または5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、30種、もしくはそれ以上）のCCGを含む複数の試験遺伝子の発現レベルを決定する工程；
（2）工程（1）における決定に一部分基づき、
（a）患者が複数の試験遺伝子の発現の増加を有する（例えば、CCGは複数の試験遺伝子の発現の増加の決定に少なくとも50％寄与するよう重み付けされている）場合、化学療法（例えば、補助化学療法）を含む処置計画、または
（b）患者が複数の試験遺伝子の発現の増加を有しない（例えば、CCGは複数の試験遺伝子の発現の増加の決定に少なくとも50％寄与するよう重み付けされている）場合、化学療法を含まない処置計画
のいずれかを推奨するか、処方するか、または投与する工程。
【０１５１】
一つの局面において、本発明は、上記の方法において使用するための組成物を提供する。そのような組成物には、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のいずれかにリストされたCCGを含むが、これらに限定されないCCG（またはそれによってコードされた核酸またはそれに相補的な核酸）にハイブリダイズする核酸プローブ；そのようなCCGまたはそれによってコードされた核酸の全部または一部を選択的に増幅するために適当な核酸プライマーおよびプライマー対；そのようなCCGによってコードされたポリペプチドに免疫学的に結合する抗体；複数の核酸プローブを含むプローブセット、核酸プライマー、抗体、および／またはポリペプチド；これらのいずれかを含むマイクロアレイ；これらのいずれかを含むキット等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、本発明は、上記の方法において使用するためのコンピュータの方法、システム、ソフトウェア、および／またはモジュールを提供する。
【０１５２】
いくつかの態様において、本発明は、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子のうちの少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上に選択的にハイブリダイズすることができる単離されたオリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する。「プローブ」および「オリゴヌクレオチド」（「オリゴ」）という用語は、核酸に関して使用される時、比較的短い核酸断片または配列を交換可能にさす。本発明は、本発明の方法において有用なプライマーも提供する。「プライマー」とは、適正な条件の下で、適正なコンパニオン試薬と共に、標的核酸（例えば、標的遺伝子）を選択的に増幅することができるプローブである。核酸に関して、プライマーはプローブとしても一般に役立ち得るため、「プローブ」とは、「プライマー」を包含して、本明細書において使用される。
【０１５３】
プローブは、一般に、任意の適当なサイズ／長さを有し得る。いくつかの態様において、プローブは、約8〜200塩基、15〜150塩基、15〜100塩基、15〜75塩基、15〜60塩基、または20〜55塩基の長さを有する。それらは、検出可能なマーカーによって標識され得、適当な検出マーカーには、放射性同位体、フルオロフォア、ビオチン、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、酵素基質、リガンド、および抗体等が含まれるが、これらに限定されない。Jablonski et al.,NUCLEIC ACIDS RES.(1986)14:6115-6128；Nguyen et al.,BIOTECHNIQUES(1992)13:116-123；Rigby et al.,J.MOL.BIOL.(1977)113:237-251を参照すること。実際、プローブは、様々な分子生物学的適用のため、慣習的な様式で修飾されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドプローブを作製し使用するための技術は、当技術分野において慣習的である。
【０１５４】
本発明によるプローブは、上述のハイブリダイゼーション／増幅／検出技術において使用され得る。従って、本発明のいくつかの態様は、複数のCCGの検出、増幅、および／または定量化においてマイクロアレイにおいて使用するために適当なプローブセットを含む。いくつかの態様において、プローブセットは、ある割合のCCGに対するプローブを有し、例えば、プローブセットは、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％、CCGに特異的なプローブからなる。いくつかの態様において、プローブセットは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子のうちの少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、40種、45種、50種、60種、70種、80種、90種、100種、125種、150種、175種、200種、250種、300種、350種、400種、450種、500種、600種、700種、もしくは800種、またはそれ以上、または全てに対するプローブを含む。そのようなプローブセットは、5,000種、10,000種、20,000種、50,000種、100,000種、200,000種、300,000種、400,000種、500,000種、600,000種、700,000種、800,000種、900,000種、または1,000,000種、またはそれ以上の異なるプローブを含む高密度アレイへ組み入れられ得る。他の態様において、プローブセットは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のCCGのうちの1種以上の少なくとも一部分を含む核酸を増幅するためのプライマー（例えば、プライマー対）を含む。
【０１５５】
本発明のもう一つの局面において、本発明の予後予測を実施するためのキットが提供される。キットは、キットの様々な成分のための担体を含み得る。担体は、例えば、バッグ、ボックス、チューブ、ラックの形態の容器または支持体であり得、任意で、仕切られている。担体とは、出荷および保管の間の安全のための包まれた閉じ込めを定義し得る。キットは、上述の検出技術を使用した、1種以上のCCGおよび1種以上のハウスキーピング遺伝子マーカーの状態の決定において有用な様々な成分を含む。例えば、キットは、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子のmRNAまたはcDNAと高ストリンジェンシーの下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含み得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、RT-PCR反応におけるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。いくつかの態様において、キットは、遺伝子のパネルの発現レベルを決定するための試薬（例えば、プローブ、プライマー、およびまたは抗体）を含み、パネルは、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％、99％、または100％、CCG（例えば、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のCCG）を含む。いくつかの態様において、キットは、高々2500種の遺伝子の発現レベルを決定するための試薬（例えば、プローブ、プライマー、およびまたは抗体）からなり、これらの遺伝子のうちの少なくとも5種、10種、15種、20種、30種、40種、50種、60種、70種、80種、90種、100種、120種、150種、200種、250種、またはそれ以上が、CCG（例えば、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」のCCG）である。
【０１５６】
検出キット内のオリゴヌクレオチドは、放射性同位体、フルオロフォア、ビオチン、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、酵素基質、リガンド、および抗体等を含むが、これらに限定されない、任意の適当な検出マーカーによって標識され得る。Jablonski et al.,Nucleic Acids Res.,14:6115-6128(1986)；Nguyen et al.,Biotechniques,13:116-123(1992); Rigby et al.,J.Mol.Biol.,113:237-251(1977)を参照すること。あるいは、キットに含まれるオリゴヌクレオチドは、標識されておらず、その代わり、ユーザが使用時にオリゴヌクレオチドを標識することができるよう、1種以上のマーカーがキット内に提供される。
【０１５７】
本発明のもう一つの態様において、検出キットは、1種以上のCCGによってコードされた1種以上のタンパク質と選択的に免疫反応性の1種以上の抗体、または、任意で、付加的なマーカーを含有している。例には、表1、2、3、5、6、7、8、9、10、もしくは11；パネルA、B、C、D、E、F、G、H、J、もしくはK；または表21〜25のパネルFの「サブパネル」の遺伝子によってコードされたタンパク質に免疫学的に結合する抗体が含まれる。そのような抗体を作製し使用する方法は、当技術分野において周知である。
【０１５８】
検出技術において有用な様々な他の成分も、本発明の検出キットに含まれ得る。そのような成分の例には、Taqポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、標的DNA配列の増幅のために適当な他のプライマー、RNase A等が含まれるが、これらに限定されない。さらに、検出キットは、好ましくは、ヒト試料を使用して本発明の予後予測法を実施するためのキットの使用に関する説明書を含む。本発明の一つの態様において、CCGスコアは、15種のハウスキーパー遺伝子（HK）によって規準化された31種のCCGのRNA発現から計算される。CCGおよびHK遺伝子の相対数は、CCGスコアの分散を最小化するために最適化される。CCGスコアは、より高い値がより高い発現を示すよう、HK遺伝子の重み付けなしの平均値によって規準化された、CCG発現についてのCT値の重み付けなしの平均値である。いくつかの態様において、1単位は発現の2倍の変化と等価である。いくつかの態様において、CCGスコアは、訓練セットにおいて決定された平均値によって中心化される。
【０１５９】
いくつかの態様において、CCGスコアの測定誤差（se = 0.10）および欠測値の効果を推定するため、市販の前立腺試料に対して希釈実験が実施される。いくつかの態様において、濃度が、全部で31種のCCGのうち10種が失敗する点に減少した時、CCGスコアは安定したままであり得る。いくつかの態様において、9個を越える欠測値を有する試料には、CCGスコアが割り当てられない。
【０１６０】
いくつかの態様において、試料をFFPE試料ブロックから入手することができる。いくつかの態様において、5μm切片を試料ブロックから切り出すことができる。いくつかの態様において、切片を、ヘマトキシロンおよびエオシン（H＆E）によって染色することができる。いくつかの態様において、病理学者が腫瘍区域をマークすることができる。いくつかの態様において、H＆E染色切片に隣接した10μm切片を切り出すことができる。いくつかの態様において、未染色切片上の腫瘍区域を、H＆E染色上のマークされた区域との整列によって同定する。いくつかの態様において、腫瘍区域を手動でマクロ解剖（macro-dissected）する。いくつかの態様において、試料を、キシレン抽出によって脱パラフィンした後、エタノールによって洗浄する。いくつかの態様において、試料を、プロテイナーゼKによって一晩処理する。いくつかの態様において、試料をRNA抽出に供する。いくつかの態様において、Qiagen miRNAeasyキットを使用してRNA抽出を実施する。いくつかの態様において、可能性のあるゲノムDNA混入を除去するため、RNAをDNASE Iによって処理する。いくつかの態様において、RNAをcDNAに変換する。合成されたcDNAは、リプリケート前増幅反応のための鋳型として役立つ。いくつかの態様において、試料をTaqman（商標）低密度アレイ（TLDA,Applied Biosystems）において実行する。
【０１６１】
いくつかの態様において、CCPスコアの計算のための生データは、TLDAアレイからの遺伝子のCt値と等しい。いくつかの態様において、CCPスコアは、より高い値がより高い発現を示すよう、ハウスキーパー遺伝子の重み付けなしの平均値によって規準化された、細胞周期遺伝子発現についてのCt値の重み付けなしの平均値である。いくつかの態様において、CCPスコアは、市販の訓練セットにおいて決定された平均値によって中心化される。
【０１６２】
本発明の一つの態様において、初期肺腺癌試料を、肺組織における中心化定数を定義する目的のための「訓練」コホートとして使用することができる。いくつかの態様において、CCPスコアへの平均化の前に、CCP遺伝子のトリプリケート発現平均値を中心化するために、これらの定数を使用することができる。いくつかの態様において、訓練コホートにおけるCCPスコアの分布は、臨床試料セットのいずれかにおける分布に類似している。
【０１６３】
本発明の一つの態様において、初期肺腺癌を有する患者試料を研究することができる。いくつかの態様において、IASLC病期分類ガイドラインの第6版による病期分類基準を使用して、患者を選択することができる。いくつかの態様において、性別、民族性、喫煙状態、再発、および生命状態を含むその他の臨床データを収集することができる。
【０１６４】
一つの態様において、コホートについての生存データには、無疾患生存（DFS、手術から最初の再発または再発についての最後の追跡までの時間）および全生存（OS、手術から死亡または生存についての最後の追跡までの時間）が含まれる。いくつかの態様において、再発なしの死亡は、死亡の時点で打ち切られ、癌関連死亡事象として含まれない。
【０１６５】
いくつかの態様において、コホートは、疾患生存をアウトカム変数として使用して、コックス比例ハザード分析によって分析され得る。いくつかの態様において、連続変数には、CCPスコア、ならびに病期（数値、1A = 1、1B = 2、IIa = 3、IIB = 4）、補助処置（カテゴリ、y/n）、年齢、喫煙状態（数値、なし = 1、過去 = 2、現在 = 3）、および性別（男／女）を含む臨床パラメータが含まれる。いくつかの態様において、IA期とその他の病期との間の処置アウトカムの既知の差を説明するため、補助処置および病期についての交互作用項が導入され得る。いくつかの態様において、CCPスコアの予後値についての検定統計量は、縮小モデル（全臨床変数、CCPスコアなし）に対する完全モデル（全臨床変数＋CCPスコア）についての尤度比である。
【０１６６】
いくつかの態様において、一変量分析が、病期、CCPスコア、および性別が疾患生存と有意に相関していることを示し得る。いくつかの態様において、病期についてのp値は、0.05以下であり得る。いくつかの態様において、病期についてのp値は、0.01以下であり得る。いくつかの態様において、病期についてのp値は、0.00以下であり得る。いくつかの態様において、病期についてのp値は、0.0001以下であり得る。いくつかの態様において、p値は、0.00045以下であり得る。いくつかの態様において、CCPスコアについてのp値は、0.05以下であり得、いくつかの態様において、CCPスコアについてのp値は、0.01以下であり得る。いくつかの態様において、CCPスコアについてのp値は、0.0013以下であり得る。いくつかの態様において、性別についてのp値は、0.05以下であり得、いくつかの態様において、病期についてのp値は、0.054以下であり得る。
【０１６７】
いくつかの態様において、CCPスコアが、全臨床パラメータのモデルに追加された時、疾患生存の有意な予測因子であることが、多変量分析によって示され得る。いくつかの態様において、CCPスコアは、0.05以下であり得る。いくつかの態様において、CCPスコアは、0.0175以下であり得る。いくつかの態様において、ハザード比は1.52以上であり得る。いくつかの態様において、95％信頼区間は1.04および2.24に等しいかもしれない。いくつかの態様において、最低CCP四分位群は、98％の5年生存期待値を有する。いくつかの態様において、最高CCP四分位群は、60％の5年生存率を有する。
【０１６８】
いくつかの態様において、I期およびII期の患者は、四つのCCP四分位群の全てに広がっている。従って、いくつかの態様において、臨床病期分類基準に加えて、リスク推定に依って、処置考慮を修飾するために、CCPスコアを使用することができる。
【０１６９】
いくつかの態様において、IB期試料を、別に分析することができる。いくつかの態様において、IB期患者については、CCPスコアが、アウトカムの有意な予測因子である。いくつかの態様において、CCPスコアp値は、0.05以下である。いくつかの態様において、CCPスコアp値は、0.02以下である。いくつかの態様において、CCPスコアは、高リスク群（平均値より上）および低リスク群（平均値より下）についての閾値として使用され得る。いくつかの態様において、低リスク群は、95％以上の生存率を有し得る。いくつかの態様において、高リスク群は、75％以下の生存率を有し得る。いくつかの態様において、最高CCP四分位群におけるIB期試料は、80％以上の5年生存率を有する。いくつかの態様において、最低CCP四分位群におけるIB期試料は、30％以下の5年生存率を有する。
【０１７０】
いくつかの態様において、CCPスコアは、（急速に進行する癌を同定することによって）予後因子として作用するのみならず、（細胞周期の混乱に対して最も感受性が高いであろう癌を同定することによって）処置利益の指標ともなり得る。いくつかの態様において、検定統計量は、縮小モデル（全臨床変数、CCPスコアなし、交互作用項なし）に対する完全モデル（全臨床変数、CCPスコア、およびCCP：補助処置交互作用項）についての尤度比である。いくつかの態様において、CCPスコアおよび補助処置についての交互作用は、0.05レベルで公式には有意でない。いくつかの態様において、CCPスコアについての交互作用は、0.07以下である。いくつかの態様において、最高CCP四分位群における未処置の患者は、30％以下の生存率を有する。いくつかの態様において、最低CCP四分位群における未処置の患者は、70％以上の生存率を有する。いくつかの態様において、最高CCP四分位群における補助治療によって処置された患者は、70％以上の生存率を有する。いくつかの態様において、高いCCPスコアは、補助化学療法に対する応答のより高い可能性と強く相関する。
【０１７１】
本発明のもう一つの局面において、一変量および多変量のコックス比例ハザードモデルからのp値および標準化されたハザード比によってCCPの予後値が評価される。いくつかの態様において、エンドポイントは、手術の5年以内の疾患による死亡であり得る。いくつかの態様において、疾患による死亡は、再発後の死亡として定義され得る。いくつかの態様において、追跡不能であるか、または他の原因で死亡した患者は、分析から打ち切られる。
【０１７２】
いくつかの態様において、一変量p値は部分尤度比に基づく。いくつかの態様において、多変量p値は、縮小モデルに対する完全モデルからの偏差の変化についての部分尤度比に基づく。いくつかの態様において、完全モデルは、全ての関連する共変量を含む。いくつかの態様において、縮小モデルは、評価されている共変量を除く全ての共変量、および評価されている共変量を含む交互作用項を含む。いくつかの態様において、ハザード比は、CCPスコアの1標準偏差の増加に関連したリスクの増加を表すために標準化される。
【０１７３】
いくつかの態様において、CCPスコアは、多変量コックス比例ハザードモデルにおいて臨床変数と組み合わせられ得る。いくつかの態様において、年齢、性別、喫煙状態、病期、補助処置、胸膜浸潤、および／または腫瘍サイズについての臨床データが含まれる。いくつかの態様において、病期と処置との交互作用項が含まれる。
【０１７４】
いくつかの態様において、カテゴリ臨床変数は、患者アウトカムの最大の可能性のある可変性を説明するためにコードされる。いくつかの態様において、病期は、2レベルカテゴリ変数（I、II）ではなく4レベルカテゴリ変数（IA、IB、IIA、IIB）としてコードされ得る。いくつかの態様において、比較的有意でないp値が、病期に関連している可能性がある。
【０１７５】
いくつかの態様において、コホートを組み合わせることの適切性が査定され得る。いくつかの態様において、当該の臨床変数、コホートを指定する変数、および交互作用項からなるコックス比例ハザードモデルを、臨床変数の各々について構築することができる。いくつかの態様において、交互作用項は、両側尤度比検定において0.05より大きいp値を有し得る。
【０１７６】
いくつかの態様において、比例ハザード仮定の適切性が評価され得る。いくつかの態様において、CCPスコアのハザード比についての時間依存性は支持されない。いくつかの態様において、CCPスコアが非線形効果を有する可能性が評価される。いくつかの態様において、CCPスコアについての二次および三次の多項式が、コックス比例ハザードモデルにおいて検定されるが、5％レベルで有意ではなかった。
【０１７７】
いくつかの態様において、当該の臨床変数、CCPスコア、および交互作用項からなるコックス比例ハザードモデルが、各々の入手可能な臨床変数について構築される。いくつかの態様において、交互作用項についてのp値は、0.05より大きい。
【０１７８】
いくつかの態様において、各患者についての変数には、年齢、性別、喫煙状態、病期、補助処置、腫瘍サイズ、胸膜浸潤、コホート、および／またはCCPスコアが含まれる。いくつかの態様において、年齢は定量的変数である。いくつかの態様において、性別は二値変数（男性、女性）である。いくつかの態様において、喫煙状態は3レベルカテゴリ変数（なし、過去、現在）である。いくつかの態様において、病理学的病期は、第7版TNM分類による。いくつかの態様において、病理学的病期は、4レベルカテゴリ変数（IA、IB、IIA、IIB）である。いくつかの態様において、補助処置は二値変数（いいえ、はい）である。いくつかの態様において、腫瘍サイズは定量的変数である。いくつかの態様において、腫瘍サイズはセンチメートルで測定される。いくつかの態様において、胸膜浸潤は二値変数（いいえ、はい）である。いくつかの態様において、コホートは2レベルカテゴリ変数である。いくつかの態様において、CCPスコアは定量的変数である。
【０１７９】
いくつかの態様において、一変量分析が、CCPスコアの5年生存を予測する能力を査定する。いくつかの態様において、p値は0.05以下である。いくつかの態様において、p値は0.01以下である。いくつかの態様において、p値は0.001以下である。いくつかの態様において、p値は0.0003以下である。いくつかの態様において、多変量分析が、CCPの5年生存を予測する能力を査定する。いくつかの態様において、p値は0.05以下である。いくつかの態様において、p値は0.01以下である。いくつかの態様において、p値は0.007以下である。いくつかの態様において、標準化されたハザード比は、1.50に等しい。いくつかの態様において、95％信頼区間は1.11および2.02に等しい。いくつかの態様において、多変量分析からの結果は、CCPスコアが、多くの臨床変数と無関係の、有意な量の予後情報を捕獲し得ることを示す。いくつかの態様において、低いCCPスコアを有する患者についての5年疾患生存は92％以上である。いくつかの態様において、中間のCCPスコアを有する患者についての5年疾患生存は79％以下である。いくつかの態様において、高いCCPスコアを有する患者についての5年疾患生存は73％以下である。
【０１８０】
本発明のもう一つの局面において、CCPスコアと補助処置からの絶対的な利益との間の関係が分析される。いくつかの態様において、CCPスコアは、補助治療によって処置された患者において生存を予測するために使用され得る。
【０１８１】
いくつかの態様において、一連の観察されたCCPスコアにおいて、補助処置を受けた患者と補助処置を受けなかった患者との間の5年疾患関連死予測リスクの絶対的な差を評価するため、Zhang & Klein（Confidence bands for the difference of two survival curves under the proportional hazards model,LIFETIME DATA ANALYSIS(2001)7:243-254）の技術を使用することができる。いくつかの態様において、疾患関連死のハザードの処置による絶対的な差が、高いCCPスコアを有する患者について、低いCCPスコアを有する患者より大きいか否かを検定するため、コンプレックスコントラストコーディング（complex contrast coding）を使用することができる。
【０１８２】
いくつかの態様において、他の共変量の効果について調整した後、2種の処置の間（または処置を受ける患者と処置を受けない患者との間）の生存の差について検定するため、Zhang & Kleinの方法を使用することができる。いくつかの態様において、絶対的な処置利益の推定は、一連の観察されたCCPスコアにおいて、ポイントワイズ（pointwise）信頼バンドと共に計算され得る。
【０１８３】
いくつかの態様において、疾患関連死のハザードの補助処置による絶対的な減少が、高いCCPスコアを有する患者について、低いCCPスコアを有する患者より有意に大きいか否かを検定するため、コントラストコーディングを使用することができる。いくつかの態様において、中央値をカットオフ点として使用して、CCPスコアを、高いまたは低いとしてカテゴリ化することができる。いくつかの態様において、各患者は、四つの群のうちの一つに割り当てられ得る：補助処置ありの高CCP（ht）、補助処置なしの高CCP（hu）、補助処置ありの低CCP（lt）、および補助処置なしの低CCP（lu）。いくつかの態様において、帰無仮説は、H0：ht - hu = lt - luである。いくつかの態様において、帰無仮説は、H0：ht - hu - lt + lu = 0である。いくつかの態様において、帰無仮説は、コンプレックスコントラストベクトルc = (1,-1,-1,1)を適用することによって、5年疾患関連死をアウトカムとして使用して、コックス比例ハザード回帰によって検定され得る。いくつかの態様において、低いCCPスコアを有する患者と比較して、高いCCPスコアを有する患者について、有意に大きい絶対的な処置利益が示される。いくつかの態様において、p値は0.05以下である。いくつかの態様において、p値は0.01以下である。いくつかの態様において、p値は0.0060以下である。いくつかの態様において、CCPスコアと絶対的な処置利益との間の関連は、コンプレックスコントラストモデルにおいて、年齢、性別、喫煙状態、病期、腫瘍サイズ、および胸膜浸潤状態を調整した後、有意性を維持する。いくつかの態様において、p値は0.05以下である。いくつかの態様において、p値は0.024以下である。
【０１８４】
本発明のもう一つの局面において、病理学的病期の予後スコア（pStage）とCCP発現スコアとの組み合わせを、補助処置なしのI期およびII期の患者においてモデル化することができる。いくつかの態様において、DC値を処理部位（processing site）によって中心化し、qPCRおよびマイクロアレイのデータにおけるCCPスコアの標準偏差の比によってスケーリングすることができる。いくつかの態様において、アウトカム尺度は5年疾患特異生存である。いくつかの態様において、CCPとpStageとの組み合わせについての係数を、二変量コックス比例ハザードモデルから導出する。いくつかの態様において、病理学的病期を、数値変数（IA = 1、IB = 2、IIA = 3、IIB = 4）としてモデル化する。いくつかの態様において、コックスPHモデルをコホートによって層化することができる。いくつかの態様において、コホートは個々に評価される。いくつかの態様において、最終モデルのための係数は、全てのコホートの組み合わせに由来し得る。いくつかの態様において、最終予後スコアは、0〜80の値を表すようスケーリングされ得る。
【０１８５】
いくつかの態様において、CCPスコアおよび病理学的病期についてのハザード比は、様々なコホートの間で一貫している。いくつかの態様において、CCPは、病理学的病期と共に、肺癌死亡率についての最もよい予測を提供する。いくつかの態様において、予後スコア = 20 * (0.33 * CCPスコア + 0.52 * 病期) + 15である。いくつかの態様において、p値は0.05以下である。いくつかの態様において、p値は0.01以下である。いくつかの態様において、p値は0.001以下である。いくつかの態様において、p値は0.00078以下である。
【０１８６】
いくつかの態様において、組み合わせスコアは、単独の病理学的病期に基づき同一のリスクを割り当てられた患者について、5年肺癌死亡リスクを鑑別することができる。いくつかの態様において、病理学的病期は、単独で、5年癌特異的死亡リスクの推定を提供することができる。いくつかの態様において、IA期は、12.6％以下の5年癌特異的死亡リスク推定を提供する。いくつかの態様において、IB期は、22.6％の5年癌特異的死亡リスク推定を提供する。いくつかの態様において、IIA期は、38.4％以上の5年癌特異的死亡リスク推定を提供する。いくつかの態様において、IIB期は、60％以上の5年癌特異的死亡リスク推定を提供する。いくつかの態様において、予後スコアは、6％〜24％の範囲の5年リスク推定によってIA期患者を分離するために使用され得る。いくつかの態様において、予後スコアは、10％〜42％の範囲の5年リスク推定によってIB期患者を分離するために使用され得る。いくつかの態様において、予後スコアは、21％〜63％の範囲の5年リスク推定によってIIA期患者を分離するために使用され得る。いくつかの態様において、予後スコアは、32％〜75％の範囲の5年リスク推定によってIIB期患者を分離するために使用され得る。
【０１８７】
いくつかの態様において、予め定義された予後スコア（PS）は、各患者について計算される。いくつかの態様において、PSカット点は、カット点以下のPSを有するIA期患者の百分率が可能な限り85％に近くなるよう、決定される。
【０１８８】
いくつかの態様において、CCPおよびPSの5年肺癌死亡率との関連は、コックス比例ハザードモデル、尤度比検定、または両方を使用して評価される。いくつかの態様において、マンテルコックスログランク検定が、カット点以下のPSスコアを有する患者と、カット点より大きいスコアを有する患者との間の、5年肺癌死亡率の差を評価するために使用される。
【０１８９】
いくつかの態様において、PSが5年肺癌特異的生存を予測するために使用され得る。いくつかの態様において、低リスクおよび高リスクは、IA期患者におけるPSの85％百分位として予め定義されたカットオフによって分類され得る。いくつかの態様において、低リスク患者群と高リスク患者群との間には平均リスクの有意差が存在する。
【０１９０】
いくつかの態様において、低PS群の患者は、高PS群の患者より有意に有利な5年生存を有する。いくつかの態様において、ログランクp値は、少なくとも3.8×10-7である。
【０１９１】
いくつかの態様において、リスク層化は、単独の病理学的病期と比較して、PSによって改善される。いくつかの態様において、病理学的病期1Aを有する患者は、5年以内の疾患特異的死亡の18％のリスクを有する。いくつかの態様において、病理学的病期IBを有する患者は、5年以内の疾患特異的死亡の28％のリスクを有する。いくつかの態様において、病理学的病期IIAを有する患者は、5年以内の疾患特異的死亡の42％のリスクを有する。いくつかの態様において、病理学的病期IIBを有する患者は、5年以内の疾患特異的死亡の60％のリスクを有する。いくつかの態様において、病理学的病期は、CCPスコアと組み合わせられ、単独の病理学的病期によって同一のリスクを割り当てられた患者に、有意に詳細なリスクを割り当てる能力をもたらす。
【０１９２】
いくつかの態様において、CCPスコアは、単独で、有意な予後マーカーである。いくつかの態様において、CCPスコアは、一変量分析を使用して評価される。いくつかにおいて、一変量p値は少なくとも0.05である。いくつかにおいて、一変量p値は少なくとも0.01である。いくつかにおいて、一変量p値は少なくとも0.001である。いくつかにおいて、一変量p値は少なくとも0.0001である。いくつかにおいて、一変量p値は少なくとも0.00001である。いくつかにおいて、一変量p値は少なくとも0.0000011である。いくつかの態様において、CCPスコアは多変量分析を使用して評価される。いくつかの態様において、CCPスコアは多変量分析を使用して評価される。いくつかにおいて、多変量p値は少なくとも0.05である。いくつかにおいて、多変量p値は少なくとも0.01である。いくつかにおいて、多変量p値は少なくとも0.005である。
【０１９３】
いくつかの態様において、PSの予後値は一変量分析によって評価される。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.01である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.001である。いくつかの態様において、p値は少なくとも2.8×10-11である。いくつかの態様において、PSの予後値は二変量分析によって評価される。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.01である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.093である。いくつかの態様において、病理学的病期およびCCPスコアの予後スコアへの組み合わせは、単独の病理学的病期によっては提供されない有意な予後情報を捕獲する。
【０１９４】
いくつかの態様において、PSの予後値は、一変量モデルを使用して、IA期およびIB期の癌において別々に評価される。いくつかの態様において、ハザード比は1.67である。いくつかの態様において、95％信頼区間は1.27および2.29である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.01である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.001である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.0027である。いくつかの態様において、PSの予後値は、二変量モデルを使用して、IA期およびIB期の癌において別々に評価される。いくつかの態様において、ハザード比は1.74である。いくつかの態様において、95％信頼区間は1.16および2.61である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、病理学的病期およびCCPスコアの予後スコアへの組み合わせは、IA期〜IB期の疾患に制限された時、単独の病理学的病期によっては提供されない有意な予後情報を捕獲する。
【０１９５】
本発明のもう一つの態様において、CCP発現および病理学的病期は、肺カルチノイドを有すると診断された患者における術後死亡リスクについての予後を査定するために使用され得る。
【０１９６】
いくつかの態様において、CCPスコアは、IA期、IB期、IIA期、IIB期、およびIIIB期の肺カルチノイド患者において生成され得る。いくつかの態様において、アウトカム尺度は生存である。
【０１９７】
いくつかの態様において、CCPの死亡率との関連は、コックス比例ハザードモデルを使用して評価される。いくつかの態様において、一変量分析におけるp値は、少なくとも0.05である。いくつかの態様において、一変量分析におけるp値は、少なくとも0.01である。いくつかの態様において、一変量分析におけるp値は、少なくとも0.00125である。いくつかの態様において、多変量分析におけるp値は、少なくとも0.05である。いくつかの態様において、多変量分析におけるp値は、少なくとも0.01である。いくつかの態様において、多変量分析におけるp値は、少なくとも0.0035である。
【０１９８】
本発明のもう一つの態様において、CCP発現および病理学的病期は、肺カルチノイドを有すると診断された患者における術後死亡リスクについての予後を査定するために使用され得る。
【０１９９】
いくつかの態様において、疾患は、二つの組織学的群：非定型および定型に分けられ得る。いくつかの態様において、病期は、4レベルカテゴリ変数としてコードされ得る。いくつかの態様において、病期は、IA、IB、IIA/IIB、およびIIIA/IIIB/IVからなり得る。
【０２００】
いくつかの態様において、CCPと疾患による死亡との関連は、コックス比例ハザードモデルを使用して評価され得る。いくつかの態様において、コックス比例ハザードモデルの一変量分析が、CCPと肺カルチノイドによる死亡との関連を評価するために使用され得る。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.01である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.0014である。いくつかの態様において、CCPと無疾患生存との関連は、コックス比例ハザードモデル化を使用して評価され得る。いくつかの態様において、コックス比例ハザードモデルの一変量分析が、CCPと無疾患生存との関連を評価するために使用され得る。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.01である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.006である。
【０２０１】
いくつかの態様において、非定型カルチノイド患者におけるCCPと疾患を伴う死亡との関連は、コックス比例ハザードモデルを使用して評価され得る。いくつかの態様において、一変量分析は非定型カルチノイド患者におけるCCPと疾患を伴う死亡との関連を評価するために使用され得る。いくつかの態様において、CCPは、疾患の再発を伴う死亡の高度に有意な予測因子である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.05である。いくつかの態様において、p値は少なくとも0.0102である。
【０２０２】
（表２１）
2016515800.tif 000030
2016515800.tif 000031
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【０２０３】
（表２２）
2016515800.tif 000037
2016515800.tif 000038
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【０２０４】
（表２３）
2016515800.tif 000102
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2016515800.tif 000104
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【０２０５】
（表２４）
2016515800.tif 000106
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【０２０６】
（表２５）
2016515800.tif 000110
2016515800.tif 000111
2016515800.tif 000112
【実施例】
【０２０７】
実施例1
NSCLC腺癌における予後および予測のツールとして本明細書に記載された発現プロファイルは、31種のCCP遺伝子（パネルF）および1試料当たりのRNA含量を規準化するために使用される15種のハウスキーピング遺伝子（表A）から構成されていた。遺伝子パネルは、国際出願PCT/US2010/020397（公開番号WO/2010/080933）にさらに記載される。
【０２０８】
CCGスコア
CCGスコアは、15種のハウスキーパー遺伝子（HK）によって規準化された31種のCCG（パネルF）のRNA発現から計算された。CCG（31）およびHK遺伝子（15）の相対数は、CCGスコアの分散を最小化するために最適化された。CCGスコアは、より高い値がより高い発現を示すよう、HK遺伝子の重み付けなしの平均値によって規準化されたCCG発現についてのCT値の重み付けなしの平均値である。1単位は発現の2倍の変化と等価である。CCGスコアは、訓練セットにおいて再び決定された平均値によって中心化された。
【０２０９】
CCGスコアの測定誤差（se = 0.10）および欠測値の効果を推定するため、市販の前立腺試料のうちの4個に対して、希釈実験が実施された。濃度が、全部で31種のCCGのうち10種が失敗する点に減少する時、CCGスコアが安定したままであることが見出された。この結果に基づき、9個を越える欠測値を有する試料には、CCGスコアが割り当てられなかった。
【０２１０】
実験手法
各FFPE試料ブロックから、5μm切片を切り出し、ヘマトキシロンおよびエオシンによって染色した。病理学者が腫瘍区域をマークした。H＆E染色切片に直接隣接してさらに2個の10μm切片を切り出した。未染色切片上の腫瘍区域を、H＆E染色上のマークされた区域との整列によって同定し、エッペンドルフチューブへ手動でマクロ解剖した。切片を、キシレン抽出によって脱パラフィンした後、エタノールによって洗浄した。プロテイナーゼKと共に一夜インキュベートした後、脱パラフィン組織を、製造業者の説明書に従って、Qiagen miRNAeasyキットを使用して、RNA抽出に供した。可能性のあるゲノムDNA混入を除去するため、全RNAをDNASE Iによって処理した。最終RNA収量をNanodrop分光光度計で決定した。
【０２１１】
各試料について、500ngのRNAを、high capacity cDNA archiveキット（Applied Biosystems）を使用して、cDNAに変換した。新たに合成されたcDNAは、レプリケート前増幅反応のための鋳型として役立った。反応の各々は、3μl cDNA、およびサイン内の46種の遺伝子（15種のハウスキーピング遺伝子、31種の細胞周期遺伝子）全てのためのTaqman（商標）アッセイのプールを含有していた。46種の遺伝子について、個々のPCR反応に接種するために十分な全コピーを、低コピー試料からも生成するため、前増幅を14サイクル実行した。前増幅反応を1：20希釈した後、Taqman（商標）低密度アレイ（TLDA,Applied Biosystems）にロードした。CCPスコアの計算のための生データは、TLDAアレイからの46種の遺伝子のCt値であった。CCPスコアは、より高い値がより高い発現を示すよう、ハウスキーパー遺伝子の重み付けなしの平均値によって規準化された、細胞周期遺伝子発現についてのCt値の重み付けなしの平均値であった。1単位は発現の2倍の変化と等価である。CCPスコアを、市販の訓練セットにおいて決定された平均値によって中心化した。
【０２１２】
市販の試料
初期（IA、IB、IIA、IIB）肺腺癌試料を二つの供給元から購入した。この試料セットを、肺組織における中心化定数を定義するための「訓練」コホートと見なした。CCPスコアへの平均化の前に、これらの定数を、CCP遺伝子のトリプリケート発現平均値を中心化するために使用した。これは、CCP遺伝子平均を計算する時、異常値遺伝子の不当な影響を与えることを回避した。CCPスコアを上記のように確認した。この訓練コホートにおけるCCPスコアの分布は、臨床試料セットのいずれかにおける分布に類似していた。
【０２１３】
臨床試料セット1
初期肺腺癌を有する全部で200個の患者試料を、この研究において使用した。これらの患者は、1995〜2001年の間に確認されたコホートから選択された。病期分類基準は、IASLC病期分類ガイドラインの第6版に従った。コホートの臨床パラメータは、表Bに要約される。
【０２１４】
（表Ｂ）
2016515800.tif 000113
【０２１５】
199個の試料について、上記のように、CCPスコアを生成した。1個の試料は腫瘍を含有していなかった。38個の試料は、進行期（IIIA、IIB、IV）のものであり、分析から除外された。2個の試料は、未定義の転移状態（Mx）を有しており、分析から除去された。32人の患者が、術前補助（neoadjuvant）処置を受けていた。これは病期分類に影響を与える可能性があり、以前の病期分類が入手可能でなかったため、術前補助処置された試料は、分析から省かれた。4個の試料が、同時の癌のため除外され、1個の患者試料は重複していた。最終分析のため、137個のI期およびII期の試料が残った（表Cを参照すること）。
【０２１６】
（表Ｃ）
2016515800.tif 000114
【０２１７】
コホートについての生存データには、無疾患生存（DFS、手術から最初の再発または再発についての最後の追跡までの時間）および全生存（OS、手術から死亡または生存についての最後の追跡までの時間）が含まれていた。全部で45例の再発および50例の死亡が、分析に含まれた137個の試料において観察された。しかしながら、再発が先行した死亡は32例のみであって、多数の死亡事象が、疾患と無関係であったことが示唆された。再発なしの死亡は、死亡の時点で打ち切られ、癌関連死亡事象として含まれなかった。「再発を伴う死亡」アウトカム尺度は、DS（疾患生存）と呼ばれる。
【０２１８】
DSをアウトカム変数として使用して、コックス比例ハザード分析によって、コホートを分析した。連続変数としてのCCPスコアに加えて、モデル内の臨床パラメータには、病期（数値、1A = 1、1B = 2、IIa = 3、IIB = 4）、補助処置（カテゴリ、y/n）、年齢、喫煙状態（数値、なし = 1、過去 = 2、現在 = 3）、および性別（男性／女性）が含まれていた。さらに、IA期と残りの病期との間の処置アウトカムの既知の差を説明するため、補助処置および病期についての交互作用項が導入された。CCPスコアの予後値についての検定統計量は、縮小モデル（全臨床変数、CCPスコアなし）に対する完全モデル（全臨床変数＋CCPスコア）についての尤度比である。
【０２１９】
一変量分析において、病期（p = 0.000045）、CCPスコア（p = 0.0013）、および性別（p = 0.054）のみが、疾患生存と有意に相関した（表Dを参照すること）。
【０２２０】
（表Ｄ）
2016515800.tif 000115
【０２２１】
多変量分析において、CCPスコアは、全臨床パラメータのモデルに追加された時、疾患生存の有意な予測因子のままであった（p = 0.0175、HR 1.52、95％CI 1.04、2.24）。CCPスコア四分位群を使用したI期およびII期のコホートについてのカプランマイヤー分析は、図2に示される。最低CCP四分位群は、98％の5年生存予想を有し、最高CCP四分位群は、60％の5年生存率を有する。CCP四分位群内の病期分布は表Eに示される。
【０２２２】
（表Ｅ）
2016515800.tif 000116
【０２２３】
I期およびII期の患者は、いずれも、四つのCCP四分位群の全てに広がっており、このことから、高リスクの患者が最低病期群に存在し、低下したリスクを有する患者がより高い病期において見出され得るという仮定が支持された。従って、臨床病期分類基準に加えて、リスク推定に依って、処置考慮を修飾するため、CCPスコアを使用することができる。
【０２２４】
初期NSCLCの臨床的に最も関連する亜群、IB期における予後サインの値を調査するため、セット1のIB期試料のサブセットにおいて、生存分析を実施した。全部で66人の患者が、IB期として分類され、そのうちの62人が合格CCPスコアを有しており、分析のために使用された。IB期亜群内で、CCPスコアは、アウトカムの有意な予測因子のままであった（p = 0.02）。高リスク群（平均値より上）および低リスク群（平均値より下）についての閾値としてCCPスコア平均値を使用したところ、異なる生存率（95％対75％）を有する二つの患者群を同定することができた（図3）。
【０２２５】
臨床試料セット2
第一の分析の結果を確認するため、2001〜2005年の間に確認された患者コホートの第二の独立のコホートからの試料を分析した。全部で57個の試料をRNAのために処理し、以前のコホートと同様に、CCPスコアを決定した。96％の合格率で、55個の試料がCCPスコアを受容した。試料の質、成功率、およびCCPスコア分布は、IB期試料の以前のセットに類似していた。セット1およびセット2からのIB期試料のCCPスコアの分布は、図4に示される。二つのIBセットの臨床的特徴も、第二のコホートにおけるより最近の手術日および追跡日を除き、類似していた。より最近のコホートは、近年の補助処置のより攻撃的な使用を反映して、補助処置を受けた試料のより高い割合を有していた（47％対14％）。喫煙者の百分率は、より古いコホート（25％対47％）と比較してわずかに低かった。両方のコホートにおいて、男性は、より高いリスクを有しており、第二セットにおいてはよりそうであったが、性別とアウトカムとの間の交互作用は、多重検定のための調整の後、有意ではなかった。
【０２２６】
このセット2 IB期コホートについてのコックス比例ハザード分析を、上記のように実施した。全生存（17事象）および疾患生存（9事象）が、セット2について、アウトカム変数として入手可能であった。一変量分析において、性別および処置は、全生存および疾患生存の有意な予測因子であった。多変量分析においては、性別、処置、およびCCPスコアが、アウトカムを予測した。二つのIB期コホートについての結果の要約は、表F（試料セット1）および表G（試料セット2）に見出され得る。さらに、腫瘍サイズ（最大直径）および胸膜浸潤が、分析のために利用可能であった。いずれのパラメータも多変量分析において有意でなかった。
【０２２７】
（表Ｆ）
2016515800.tif 000117
【０２２８】
（表Ｇ）
2016515800.tif 000118
【０２２９】
組み合わせIB期試料
統計力を最大にするため、IB期試料の両方のセットを、コックスPH分析のために組み合わせた。表Hに示される結果は、1 CCPスコア単位当たり1.5のハザード比を有する、疾患アウトカムの強力な予後マーカーとして、CCPスコアを支持する。
【０２３０】
（表Ｈ）
2016515800.tif 000119
【０２３１】
IB期におけるCCPスコアの分布は、＜-2から＞2の範囲に及ぶため、最低CCPスコアを有する患者群と最高CCPレベルを有する患者セットとの間のハザード比は、ほぼ7倍に上昇する。組み合わせIB期試料についてのCCPスコア四分位群を使用したカプランマイヤー生存分析（図5を参照すること）は、最低CCP四分位群が80％の5年生存率を有し、最高CCPスコア四分位群についての5年生存率は30％へ低下することを示す。
【０２３２】
処置利益の予測
NSCLC腺癌の予後マーカーとして本明細書において適用されたRNAサインは、増殖遺伝子の発現を測定する。化学療法は、細胞周期の必須の過程を妨害することによって、急速に増殖する細胞を優先的に標的とする。従って、本発明者らは、従来の多重遺伝子パネルとは対照的に、CCPスコアは、（急速に進行する癌を同定することによって）予後因子として作用するのみならず、（細胞周期の妨害に対して最も感受性が高いであろう癌を同定することによって）処置利益の指標ともなり得ると仮定した。IB期試料の組み合わせコホートは、この疑問を解明するために十分な数の処置された患者を有していた。
【０２３３】
CCPスコアの予測力について検定するため、CCPスコアおよび補助処置についての交互作用項をモデルに追加した。検定統計量は、縮小モデル（全臨床変数、CCPスコアなし、交互作用項なし）に対する完全モデル（全臨床変数、CCPスコア、およびCCP：補助処置交互作用項）についての尤度比である。CCPスコアおよび補助処置についての交互作用は0.05レベルで公式には有意でなかったが、強い傾向（p = 0.07）を示した。重要なことに、交互作用係数は、高CCPスコアがより多くの処置利益を受容するという仮定を支持した。処置された試料群および未処置の試料群における閾値としてCCP平均値を使用した生存プロットが、図6に示される。カプランマイヤープロットは、二つの結論を例証している。第一に、CCPスコアの予後力は、未処置の試料において最も顕著であり、高CCP群と低CCP群との間に生存率の強力な分離（高CCP 30％対低CCP 70％）が存在する。第二に、おそらく最も予想外に、高CCP患者のうち、補助処置を受けた患者は、はるかに改善されたアウトカムを示し、生存率が低CCP患者群に近い（高CCP未処置30％、高CCP処置70％）。従って、高CCPスコアは、補助化学療法に対する応答（応答の最も重要な尺度のうちの1種、即ち、生存を含む）のより高い可能性と強く相関する。
【０２３４】
実施例2
序論
この実施例2は、実施例における分析を付加的な試料の分析と組み合わせることによって、上記実施例1において要約された研究をさらに拡大する。他に示されない限り、この実施例2における全ての方法（例えば、試料調製、遺伝子発現分析、CCPスコア計算、統計分析等）は、実施例1に記載された通りであった。この研究においては、CCPスコアが、381個のFFPE試料の（本明細書において組み合わせコホートと呼ばれる）組み合わせ試料コホートからのI〜II期NSCLC ADC患者に適用された。
【０２３５】
患者集団
組み合わせコホートからの患者に関する詳細な情報は、表Iに提供される。組み合わせコホートは、本明細書において「S1」および「S2」と呼ばれる二つの別々の起源コホートからの患者試料の集合であった。S1コホート：186個のFFPE試料およびマッチする臨床データを、185人の切除可能なI期NSCLC ADC患者から入手した。177人の患者に由来する試料が、合格CCPスコアを生じた。2人の患者は、病期および補助処置に関係する臨床データが欠落しているため省かれ、術後12日目に死亡した1人の患者が省かれた。S2コホート：294個のFFPE試料および293のマッチする臨床記録を、切除可能な非小細胞肺腺癌を有する患者から入手した。207人の患者が、I〜II期であり、合格CCPスコアおよびS1コホートと比較可能な完全な臨床データを有していた。
【０２３６】
（表Ｉ）
2016515800.tif 000120
【０２３７】
統計分析
本発明者らは、一変量および多変量のコックス比例ハザードモデルからのp値および標準化されたハザード比によってCCPの予後値を評価した。エンドポイントは、手術の5年以内の疾患による死亡であった。疾患による死亡とは、再発後の（既知の場合、疾患の）死亡として定義された。追跡不能であるか、または他の原因で死亡した患者は、最終観察時に打ち切られた。
【０２３８】
この報告における全てのp値が両側である。一変量p値は、部分尤度比に基づいていた。多変量p値は、（評価されている共変量を除く全ての共変量および評価されている共変量を含む交互作用項を含む）縮小モデルに対する（全ての関連する共変量を含む）完全モデルからの偏差の変化についての部分尤度比に基づいていた。異なる遺伝子発現分析プラットフォームに対応するハザード比を比較するため、ハザード比は、CCPスコアの1標準偏差増加に関連したリスクの増加を表すよう標準化された。
【０２３９】
臨床変数より優れた予後情報
第一の目標は、実施例1における結果（即ち、CCPスコアが、従来の臨床パラメータによって捕獲されるものに、有意な量の予後情報を追加すること）をさらにバリデートすることであった。これは、多変量コックス比例ハザードモデルにおいて、CCPスコアを臨床変数と組み合わせることによって達成された。理想的には、これらのモデルは、可能な限り多くの関連する臨床変数を含むであろう。組み合わせコホートにおいて、本発明者らは、年齢、性別、喫煙状態、病期（第7版TNM）、補助処置、胸膜浸潤、および腫瘍サイズについての臨床データを入手することができた。本発明者らは、補助処置の影響が病期によって異なり得ると仮定し、従って、この情報が入手可能であったコホートにおいて病期と処置との交互作用項を含めた。
【０２４０】
CCPスコアの予後力を可能な限り保存的に測定するため、本発明者らは、患者アウトカムの最大の可能な可変性を説明するような方式で、カテゴリ臨床変数をコードし、モデルに臨床変数を本質的に過剰適用した。例えば、病期を、2レベルカテゴリ変数（I、II）ではなく4レベルカテゴリ変数（IA、IB、IIA、IIB）としてコードした。これは、（余分な自由度のため、そして、おそらく、各カテゴリ内により少ない患者を有するため）病期に関連した比較的有意でないp値をもたらしたが、この余分な情報を多変量モデルに含めることによって、CCPスコアのような他の変数が有意に達することがより困難になる。
【０２４１】
FFPEコホートの組み合わせ
S1コホートおよびS2コホートを組み合わせることの適切性を査定するため、S1コホートとS2コホートとの間の臨床的な違いが、5年疾患関連死に関連しているか否かを本発明者らは検定した。この目的のため、本発明者らは、当該の臨床変数、コホートを指定する変数、および交互作用項からなるコックス比例ハザードモデルを、上にリストされた臨床変数の各々について構築した。多重比較のための調整の後、交互作用項は、いずれも、両側尤度比検定において5％レベルで有意でなかった。
【０２４２】
比例ハザードおよび非線形効果
これらのデータについて比例ハザード仮定の適切性を評価するため、スケーリングされたシェーンフェルド残差対非変換時間のプロットを使用した。CCPスコアのハザード比についての時間依存性を支持する証拠は、見出されなかった。本発明者らは、CCPスコアが非線形効果を有する可能性も調査した；CCPスコアについての二次および三次の多項式を、コックス比例ハザードモデルにおいて検定したが、5％レベルで有意ではなかった。
【０２４３】
CCPスコアハザード比の不均一性についての検定
本発明者らは、当該の臨床変数、CCPスコア、および交互作用項からなるコックス比例ハザードモデルを、入手可能な各臨床変数について構築した。これらの交互作用項は、いずれも、5％レベルで有意に達しなかった。
【０２４４】
変数のモデリング：各患者の変数には、定量的変数としての年齢、二値変数（男性、女性）としての性別、3レベルカテゴリ変数（なし、過去、現在）としての喫煙状態、4レベルカテゴリ変数（IA、IB、IIA、IIB）としての病理学的病期（第7版TNM分類）、二値変数（いいえ、はい）としての補助処置、定量的変数としての最も近いミリメートルに丸められたセンチメートルの腫瘍サイズ、二値変数（いいえ、はい）としての胸膜浸潤、2レベルカテゴリ変数としてのコホート、および定量的変数としてのCCPスコアが含まれていた。
【０２４５】
結果
図9は、組み合わせコホートの381人の患者におけるCCPスコアの分布を示す。一変量および多変量のコックス比例ハザード分析モデルからの完全な結果が、表Jに提供される。組み合わせコホートにおいて、CCPは、再び、一変量分析（p値：0.0003）および多変量分析（p値：0.007、標準化されたHR：1.50、95％CI：1.11〜2.02）において最も有意な予測因子であった。多変量分析からの結果は、CCPスコアが、S1コホートおよびS2コホートについて、入手可能な多くの臨床変数と無関係の、有意な量の予後情報を捕獲し得たことを示す。図10は、CCPスコアに対する5年生存のカプランマイアープロットを示す。5年疾患生存は、低いCCPを有する患者において92％、中間のCCPスコアを有する患者において79％、高いCCPスコアを有する患者において73％であった。
【０２４６】
（表Ｊ）
2016515800.tif 000121
【０２４７】
実施例3
この実施例3は、S2コホートにおけるCCPスコアと補助処置からの絶対的な利益との間の関係を分析することによって、上記実施例1および2において要約された研究をさらに拡大する。他に示されない限り、この実施例3における全ての方法（例えば、試料調製、遺伝子発現分析、CCPスコア計算、統計分析等）が、実施例1および2に記載された通りであった。S2コホートの患者に関する詳細な情報は、実施例2の説明において既に提供されている。ここで注目すべきことに、S2の207人のアドレス可能な患者には、補助治療を受容した46人の患者が含まれていた。S2からの処置された患者のセットは、補助処置を受容していない患者（カプランマイヤー推定77.56％、95％CI 69.46％〜83.76％）と比較して、5年生存（カプランマイヤー推定92.25％、95％CI 77.70％〜97.46％）の有意な改善（p = 0.030、HR = 0.32）を示した。
【０２４８】
この実施例3においては、補助処置からの絶対的な利益（処置された患者の生存から未処置の患者の生存を引いたもの）が、低いCCPを有するスコア患者より、高いCCPスコアを有する患者において大きいことが仮定された。この仮説を検定するため、2種の方法を使用した。第一の方法において、本発明者らは、観察されたCCPスコアの範囲において、補助処置を受容しなかった患者に対する、補助処置を受容した患者についての5年疾患関連死予測リスクの絶対的な差を評価するため、ZhangおよびKlein（Confidence bands for the difference of two survival curves under the proportional hazards model,LIFETIME DATA ANALYSIS(2001)7:243-254）の技術を実装した。第二の方法において、本発明者らは、疾患関連死のハザードの処置による絶対的な差が、低いCCPを有するスコア患者より、高いCCPスコアを有する患者において大きいか否かを検定するため、コンプレックスコントラストコーディングを利用した。
【０２４９】
ZhangおよびKleinの方法は、他の共変量の効果を調整した後に、2種の処置の間（または処置を受容する患者と処置を受容しない患者との間）の生存の差について検定するために特に使用され得る。本発明者らは、CCPスコアの効果を調整した後に、処置された患者と未処置の患者との間の5年疾患関連死の差を評価するため、この方法を使用した。より具体的には、本発明者らは、S2患者集団において観察されたCCPスコアの範囲において、ポイントワイズ信頼バンドと共に、絶対的な処置利益の推定を計算した（図11）。
【０２５０】
コントラストコーディングは以下のように使用された：補助処置による疾患関連死のハザードの絶対的な減少が、低いCCPを有するスコア患者より、高いCCPスコアを有する患者において有意に大きいか否かを検定するため、本発明者らは、中央値をカットオフ点として使用して、CCPスコアを高いまたは低いとしてカテゴリ化し、各患者を四つの群のうちの一つに割り当てた：補助処置ありの高CCP（ht）、補助処置なしの高CCP（hu）、補助処置ありの低CCP（lt）、および補助処置なしの低CCP（lu）。帰無仮説
H0 ： ht - hu = lt - lu
または等価に
H0 ： ht - hu - lt + lu = 0
を、コンプレックスコントラストベクトルc = (1,-1,-1,1)を適用することによって、5年疾患関連死をアウトカムとして使用して、コックス比例ハザード回帰によって検定した。この分析は、低いCCPスコアを有する患者と比較して、有意に大きい、高いCCPスコアを有する患者についての絶対的な処置利益を示した（p = 0.0060）。CCPスコアと絶対的な処置利益との間の関連は、コンプレックスコントラストモデルにおいて、年齢、性別、喫煙状態、病期、腫瘍サイズ、および胸膜浸潤状態を調整した後、有意性を維持した（p = 0.024）。
【０２５１】
実施例4
この実施例4は、NSCLC患者における術後癌特異的死亡リスクについての予後を査定（予測）するため、CCP発現と病理学的病期とを組み合わせたスコアをモデル化し、次いで、バリデートすることによって、上記実施例1および2において要約された研究をさらに拡大する。他に示されない限り、この実施例4における全ての方法（例えば、試料調製、遺伝子発現分析、CCPスコア計算、統計分析等）が、実施例1および2に記載された通りであった。S1コホートおよびS2コホートの患者に関する詳細な情報は、実施例2および3の説明において既に提供されている。
【０２５２】
訓練
ディレクターズコンソーシアム（Director's Consortium）（DC）コホート（Shedden et al.,Nat.Med.(2008)14:822-827）ならびに上記実施例のS1およびS2からの公に入手可能なマイクロアレイデータから、病理学的病期の予後スコア（pStage）およびCCP発現スコアの組み合わせを、補助処置なしのＩ期およびII期の患者においてモデル化した。プラットフォームに関連した差を調整するため、DC値を処理部位によって中心化し、qPCRおよびマイクロアレイのデータにおけるCCPスコアの標準偏差の比によってスケーリングした。495人の患者のモデリングセットには、DCコホートからの179人の患者および組み合わせS1/S2コホートからの316人の患者が含まれていた。アウトカム尺度は、5年疾患特異的生存であった。CCPおよびpStageの組み合わせについての係数を、病理学的病期が数値変数（IA = 1、IB = 2、IIA = 3、IIB = 4）としてモデル化された二変量コックス比例ハザードモデルから導出した。コックスPHモデルをコホートによって層化した。各予後因子の一貫した寄与を保証するため、全てのコホートを個々に評価した。最終モデルについての係数は、全てのコホートの組み合わせから導出された。最終予後スコアは、0〜80の値を表すようスケーリングされた。
【０２５３】
図12および13に示されるように、CCPスコアおよび病理学的病期についてのハザード比は、様々なコホートの間で一貫していた。病理学的病期は、CCPと共に、特に、以下の式によって、肺癌死亡率の最もよい予測を提供した：予後スコア = 20 * (0.33 * CCPスコア + 0.52 * stage) + 15。図14は、組み合わせ予後スコアに対して死亡リスクをプロットしたものである。CCPおよび病理学的病期の個々の性能は、下記表Kに示される。
【０２５４】
（表Ｋ）
2016515800.tif 000122
【０２５５】
図15に示されるように、組み合わせスコアは、単独の病理学的病期に基づき同一のリスクを割り当てられた患者について、5年肺癌死亡リスクを鑑別した。具体的には、組み合わせS1/S2コホートにおいて、単独の病理学的病期は、12.6％（IA期）、22.6％（IB期）、38.4％（II期A）、および60％（II期B）という5年癌特異的死亡リスクの推定を提供した。同一のコホートにおいて、予後スコアは、6％〜24％の範囲の5年リスク推定によってIA期患者を分離することができた。同様に、リスク推定の識別の増加が、IB期（10％〜42％）、II期A（21％〜63％）、およびII期B患者（32％〜75％）について観察された。
【０２５６】
バリデーション
単独のCCPスコアおよび上記に記述／導出された組み合わせ予後スコアの両方を、大きい独立のコホートにおいてバリデートした。このバリデーションのため集合した二つのコホート（V1およびV2）の650人の患者は、以下の基準を満たした：第7版IASLC病期分類によってI〜II期NSCLC ADC；完全な外科的切除；術前補助処置なし；手術の12週以内の補助化学療法または放射線なし。患者コホートの特徴は、下記表Lに示される。
【０２５７】
（表Ｌ）
2016515800.tif 000123
＊ 胸膜浸潤データは17人の患者については入手可能でなかった。
【０２５８】
外科的に切除されたI〜II期肺腺癌からのアーカイブに保管されたFFPE試料を入手し、試料を実施例1および2に記載されたようにCCPスコアを導出するために処理した。上述の予め定義された予後スコア（PS）を、各患者について計算した。IA期患者における肺癌特異的生存の発表された推定に一致して、カット点以下のPSを有するIA期患者の百分率が、可能な限り85％に近くなるよう、PSカット点を決定した。
【０２５９】
上記のように、統計分析を実施した。CCPおよびPSの5年肺癌死亡率との関連を、コックス比例ハザードモデルおよび尤度比検定を使用して評価した。マンテルコックスログランク検定を、カット点より上のスコアを有する患者に対する、カット点以下のPSスコアを有する患者についての5年肺癌死亡率の差を評価するために使用した。p値は全て両側である。
【０２６０】
図16は、PSによる5年肺癌特異的生存の予測を示す。低リスクおよび高リスクは、IA期患者におけるPSの85％百分位として予め定義されたカットオフによって分類された。二つの患者群における平均リスクの間には有意差が存在する。
【０２６１】
図17は、低PS群の患者が、高PS群の患者より有意に有利な5年生存を有していたことを示す（ログランクP = 3.8×10-7）。
【０２６２】
図18は、単独の病理学的病期と比較した、PSによって改善されたリスク層化を示す。具体的には、18％、28％、42％、および60％のリスクにおけるデータ点のクラスタが、それぞれ病理学的病期IA、IB、IIA、およびIIBについての5年疾患特異的死亡のパーセントリスクを表す。しかしながら、上記訓練研究から導出されたモデルによって、病理学的病期をCCPスコアと組み合わせた時、単独の病理学的病期によって全て同一のリスクを割り当てられるであろう患者に、有意に詳細なリスクを割り当てることが可能である。各病理学的病期についてのPSによるリスクの範囲は、図18のデータ点の水平延長によって示され、下記表Mに要約される。
【０２６３】
（表Ｍ）
2016515800.tif 000124
【０２６４】
下記表Nは、単独のCCPスコアが、臨床変数についての調整の後に有意な予後マーカーであることを示す、ハザード比およびp値を提供する。一変量および多変量のコックス比例ハザード分析からの結果が示される。胸膜浸潤の多変量分析および一変量分析は、147の事象を含む633人の患者を含んでいた。他の全ての一変量分析は、152の事象を含む650人の患者を含んでいた。胸膜浸潤データは17人の患者については入手可能でなかった。
【０２６５】
（表Ｎ）
2016515800.tif 000125
＊ ハザード比はCCPスコアの四分位範囲について報告される。
# ハザード比は最も近いmmに丸められてcmで報告される。
【０２６６】
下記表Oは、一変量モデルおよび二変量モデルにおけるPSおよび病理学的病期の別々の予後値を示す。病理学的病期およびCCPスコアの予後スコアへの組み合わせは、単独の病理学的病期によっては提供されない有意な予後情報を捕獲する。分析は、152の事象を含む650人の患者を含んでいた。
【０２６７】
（表Ｏ）
2016515800.tif 000126
＊ ハザード比はPSスコアの四分位範囲について報告される。
【０２６８】
下記表Pは、IA〜IB期疾患に制限された時の、一変量モデルおよび二変量モデルにおけるPSおよび病理学的病期の別々の予後値を示す。病理学的病期およびCCPスコアの予後スコアへの組み合わせは、IA〜IB期疾患に制限された時、単独の病理学的病期によっては提供されない有意な予後情報を捕獲する。分析は、101の事象を含む540人の患者を含んでいた。
【０２６９】
（表Ｐ）
2016515800.tif 000127
＊ ハザード比はPSスコアの四分位範囲について報告される。
【０２７０】
実施例5
この実施例5は、肺カルチノイドを有すると診断された患者における術後死亡リスクについての予後を査定する（予測する）ため、CCP発現および病理学的病期を組み合わせて、実施例1における方法を、付加的な試料の分析と組み合わせることによって、上記実施例1および2において要約された研究をさらに拡大する。他に示されない限り、この実施例5における全ての方法（例えば、CCPスコア計算、統計分析等）が、実施例1および2に記載された通りであった。
【０２７１】
この研究においては、公に入手可能なマイクロアレイデータ（Rousseaux et al.,Ectopic Activation of Germline and Placental Genes Identifies Aggressive Metastasis-Prone Lung Cancers.Sci.Transl.Med.(2013)186:66）から、IA期、IB期、IIA期、IIB期、およびIIIB期の肺カルチノイド患者について、上記のようにCCPスコアを生成した。23個のカルチノイド試料を分析した（IA期を有する11人の患者、IB期を有する7人の患者、IIAを有する2人の患者、II期Bを有する2人の患者、およびII期IBを有する1人の患者）。アウトカム尺度は生存であった。
【０２７２】
CCPの死亡率との関連を、コックス比例ハザードモデルを使用して評価した。コックス比例ハザードモデルの一変量分析および多変量分析からの結果は、下記表Qに提供される。肺カルチノイド患者において、CCPが、一変量分析および多変量分析において最も有意な予測因子であった。
【０２７３】
（表Ｑ）
2016515800.tif 000128
【０２７４】
実施例6
この実施例6は、肺カルチノイドを有すると診断された患者における術後死亡リスクについての予後を査定する（予測する）ため、CCP発現および病理学的病期を組み合わせて、実施例1における方法を、付加的な試料の分析と組み合わせることによって、上記実施例1および2において要約された研究をさらに拡大する。他に示されない限り、この実施例6における全ての方法（例えば、試料調製、遺伝子発現分析、CCPスコア計算、統計分析等）が、実施例1および2に記載された通りであった。
【０２７５】
この研究において、99個の肺カルチノイド試料についてCCPスコアを上記のように生成した。患者が、おそらくは手術合併症のため、手術の6日後および13日後に死亡したため、2個の試料を除去した。1個の試料は未定義の転移状態を有し、分析から除去された。1個の試料は、病期分類データが欠落していたため除去され、2個の試料は明白な追跡日付を含んでいなかったため除去され、大細胞神経内分泌癌と診断された2個の試料は、意味のあるアウトカム分析を入手するために十分な試料が存在しなかったため除去された。
【０２７６】
91個の試料が生存分析において使用され、6例の死亡に再発が先行した。疾患は二つの組織学的群：非定型（16例、再発6例、疾患を伴う死亡4例）および定型（75例、再発5例、疾患を伴う死亡2例）に分けられる。病期は、4レベルカテゴリ変数（IA、IB、IIA/IIB、およびIIIA/IIIB/IV）としてコードされた。
【０２７７】
肺カルチノイド患者における、CCPと、疾患を伴う死亡および無疾患生存の両方との関連を、コックス比例ハザードモデルを使用して評価した。コックス比例ハザードモデルの一変量分析からの結果が、表Rに提供される。肺カルチノイド患者において、CCPは、疾患を伴う死亡の最も有意な予測因子であり、再発の高度に有意な予測因子である。
【０２７８】
（表Ｒ）
2016515800.tif 000129
【０２７９】
非定型カルチノイド患者における、CCPと疾患を伴う死亡との関連を、単独で、コックス比例ハザードモデルを使用して評価した。非定型カルチノイド患者において、CCPは、疾患の再発を伴う死亡の高度に有意な予測因子である（N = 14、4事象、p値0.0102）。
【０２８０】
本明細書において言及された刊行物および特許出願は、全て、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願が、個々の刊行物または特許出願が各々参照によって組み入れられると具体的に個々に示されたかのごとく、参照によって本明細書に組み入れられる。刊行物および特許出願への単なる言及は、それらが本願に対する先行技術であるとの承認を必ずしも構成しない。
【０２８１】
以上、本発明を、理解の明確のため、例示および例によってある程度詳細に説明したが、ある種の変化および修飾を、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施することが可能であることは、明白であろう。
【図１】
2016515800.tif 000130
【図２】
2016515800.tif 000131
【図３】
2016515800.tif 000132
【図４】
2016515800.tif 000133
【図５】
2016515800.tif 000134
【図６】
2016515800.tif 000135
【図７】
2016515800.tif 000136
【図８】
2016515800.tif 000137
【図９】
2016515800.tif 000138
【図１０】
2016515800.tif 000139
【図１１】
2016515800.tif 000140
【図１２】
2016515800.tif 000141
【図１３】
2016515800.tif 000142
【図１４】
2016515800.tif 000143
【図１５】
2016515800.tif 000144
【図１６】
2016515800.tif 000145
【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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2016515800.tif 000149
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