(57)【要約】  本発明は、ヘリコバクター・ピロリ感染症の治療又は予防に使用される、ストレプトコッカス・サーモフィルスの株又はその細胞画分に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリ感染症を治療又は予防するために使用されるストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項２】
Ｈ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させることができることを特徴とする、請求項１に記載のＳ．サーモフィルス株。
【請求項３】
ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＳ．サーモフィルス株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳ．サーモフィルス株から得られる細胞画分であって、Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防するために使用するためにＨ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させることができるものである、細胞画分。
【請求項５】
Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防するために使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳ．サーモフィルス株又は請求項４に記載の細胞画分を含む組成物。
【請求項６】
乾燥重量１グラム当たり、少なくとも１０５ｃｆｕ、好ましくは少なくとも１０６ｃｆｕの請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳ．サーモフィルス株を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
栄養組成物であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
酪農製品であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロバイオティクス分野に関するものである。特に本発明はヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori：ピロリ菌）感染症の治療又は予防のためのストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国ヨーグルト協会（National Yogurt Association：ＮＹＡ）又は米国にある国際生命科学研究所（International Life Science Institute：ＩＬＳＩ）により近年承認された定義によると、プロバイオティクスは十分量摂取した際に基本栄養分を超える健康上の利点をもたらす生きた微生物である。プロバイオティクス細菌は、乳業において一般的に用いられるラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属及びラクトコッカス属に属する種内にあると説明されている。プロバイオティクスは病原微生物の発生を妨げることによって及び／又は免疫系により直接的に作用することによって消化管内の細菌叢のレベルで介入すると考えられている。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ピロリ（H. pylori））は、世界の人口の５０％を超える人の胃粘液層に定着している螺旋状のグラム陰性菌である。Ｈ．ピロリに感染した個体の大部分は無症候性であるが、その胃上皮には炎症の兆候が見られ、Ｈ．ピロリに感染した個体の１５％〜２０％が疾患を発症する。実際、Ｈ．ピロリは、慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾患、萎縮症、異形成、形成異常、胃癌及び胃粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫の主な原因物質である（非特許文献１及び非特許文献２のレビューを参照されたい）。
【０００４】
感染の際、Ｈ．ピロリは、細菌によって産生される幾つかの付着分子（アドヘシン）、例えばＢａｂＡタンパク質及びＳａｂＡタンパク質を通じて胃上皮の（lining）胃上皮細胞に特異的に結合する。胃上皮細胞への付着によって、細菌が液体流、蠕動運動及び粘液層の脱落から保護される。Ｈ．ピロリの胃粘膜への付着は、胃上皮細胞内のシグナル伝達経路を誘導し、酸化ストレスを介した胃上皮細胞の損傷及び萎縮、アポトーシス及び／又は自食機構を引き起こす。したがって、Ｈ．ピロリの胃上皮細胞への付着は、胃粘膜の感染の確立において重要な工程である。
【０００５】
Ｈ．ピロリに感染した患者における標準的な治療は、プロトンポンプ阻害剤（Proton Pump Inhibitor：ＰＰＩ）を伴う２つの抗生物質、いわゆる三剤療法（triple therapy）である。しかしながら、三剤療法によるＨ．ピロリの除菌率は抗生物質耐性又は低コンプライアンスのために低下している。さらに、幾つかが臨床試験中ではあるものの、未だに市販されている有効なワクチンはない。
【０００６】
上述から、Ｈ．ピロリ感染症の治療又は予防のための三剤療法の代替療法又は補完療法が必要とされていると考えられる。
【０００７】
プロバイオティクスの使用が、Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防するための三剤療法に対する代替療法又は補完療法として提案されてきている。例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）は、強力な抗菌物質であるロイテリン（reuterin）（３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド）を産生するため、Ｈ．ピロリの増殖を阻害するための候補プロバイオティクスであるとみなされている（特許文献１）。非特許文献３は、Ｈ．ピロリ株の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する、いくつかのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）株を見出している。非特許文献４は、阻害ペプチド（バクテリオシン）を産生し、Ｈ．ピロリを強力に阻害する、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）株（ＢＢ１８）を開示している。非特許文献５は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）株ＣＤ２が胃内Ｈ．ピロリ負荷（load）を低減することができることを見出しており、それはこの株の上昇したアルギニンデイミナーゼ活性に起因している可能性があり、それによりＨ．ピロリからアルギニンを奪い、それらの成長及び増殖を阻害している可能性があることを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３１３６８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fox and Wang 2007
【非特許文献２】Polk and Peek 2010
【非特許文献３】Boyanova et al. 2009
【非特許文献４】Simova et al. 2009
【非特許文献５】Linsalata et al. 2004
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、細菌種ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．サーモフィルス（S. thermophilus））が、Ｈ．ピロリ株の負荷をｉｎ  ｖｉｖｏで低下させることができることを見出した。
【００１１】
したがって、本発明の主題は、ヘリコバクター・ピロリ感染症を治療又は予防するために使用されるストレプトコッカス・サーモフィルス株である。
【００１２】
上記ストレプトコッカス・サーモフィルスは、医薬組成物及び機能性食品を含む、薬剤として使用することができる。
【００１３】
上記Ｓ．サーモフィルス株は、Ｈ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させることができる。
【００１４】
好ましい実施の形態において、上記Ｓ．サーモフィルス株は、ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株である。この株は本出願人により、ブダペスト条約に従って、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris）に１９９４年１２月３０日に寄託された。この株は国際公開第９６／２０６０７号に開示されている。この株はまた、ＤＮ−００１  １４７とも称される。
【００１５】
本発明はまた、親株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０に由来する突然変異株又は遺伝子形質転換株も包含するが、ただしこれら株はＨ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させることができるものである。Ｈ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させるＳ．サーモフィルス株の能力を評価する方法は、以下の実施例に記載されている。これら突然変異株又は遺伝子形質転換株は、親株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０の１又は複数の内在性遺伝子が突然変異されて、例えば、それらの代謝的特性のいくらか（例えば、糖を発酵させるそれらの能力、酸性に対するそれらの耐性、消化管中の輸送に対するそれらの生存、それらの酸性化後特性又はそれらの代謝産物産生）が改変されている株とすることができる。それらはまた、例えば、追加の生理的特徴を上記遺伝子形質転換株に付与するための、又は、遺伝子形質転換株を介して投与することが望まれる治療若しくはワクチンの目的のタンパク質の発現を可能にするための、目的の１又は複数の遺伝子による親株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０の遺伝子形質転換の結果得られる株とすることもできる。これらの突然変異株又は遺伝子形質転換株は、ランダム突然変異誘発若しくは部位特異的変異誘発についての従来の技法、並びに、Biswas et al., 1993及びMaguin et al., 1996に記載されているもの等のストレプトコッカス（Streptococcus）の遺伝子形質転換により、又は、Yu et al., 2008に記載されているもの等の「ゲノムシャッフリング」として知られている技法により、親株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株から得ることができる。
【００１６】
本発明の主題はまた、Ｈ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させることができる、Ｓ．サーモフィルス株、好ましくは、ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株から得ることができる細胞画分でもあり、ただし、該細胞画分は、Ｈ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷を低下させることができ、Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防するために使用されるものである。該細胞画分は特に、該株の培養物から得られるＤＮＡ調製物又は細菌壁（bacterial wall）調製物である。細胞画分はまた、これら株の培養上清又は画分とすることができる。この使用に好適な細胞画分は、例えば、Ｈ．ピロリに感染している対象の胃におけるＨ．ピロリ株の負荷に対するそれらの特性を試験することにより、選択することができる。
【００１７】
本発明の主題はまた、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株、又は本発明による細胞画分を含む、Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防するために使用される組成物でもある。
【００１８】
本発明の組成物では、上記株を、生菌か死菌かを問わない全細菌の形態で使用することができる。代替的には、上記株を細菌溶解物の形態で使用することができる。細菌細胞は生存細胞（living, viable cells）として存在することが好ましい。
【００１９】
本発明の組成物は投与、特に経口投与に適した任意の形態とすることができる。これには例えば固体、半固体、液体及び粉末が含まれる。液体組成物は一般的に、例えば飲料として投与がより容易であることから好ましい。
【００２０】
組成物は、乾燥重量１グラム当たり少なくとも１０５コロニー形成単位（Colony Forming Units：ｃｆｕ）、好ましくは少なくとも１０６ｃｆｕの上述される少なくとも１つの細菌株を含むことができる。
【００２１】
組成物は更に、ストレプトコッカス・サーモフィルスのその他の株、及び／又は、本発明による株以外の細菌株、特にラクトバチルス、ビフィドバクテリウム及びラクトコッカス株（複数の場合もあり）等のプロバイオティクス株（複数の場合もあり）を含むことができる。
【００２２】
好ましい実施の形態において、組成物は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株、ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２１株（ＤＮ−００１  ３３９とも称される）及びラクトバチルス・ブルガリクスＣＮＣＭ  Ｉ−１５１９株（ＤＮ−１００  １８２とも称される）、並びに任意に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）株、好ましくは、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）ＣＭＣＭ  Ｉ−１５１８（ＤＮ−１１４  ００１とも称される）を含む。これらすべての株は国際公開第９６／２０６０７号に記載されている。
【００２３】
細菌が生存細菌の形態である場合、組成物は典型的に組成物の乾燥重量１グラム当たり１０５ｃｆｕ〜１０１３ｃｆｕ、好ましくは少なくとも１０６ｃｆｕ、より好ましくは少なくとも１０７ｃｆｕ、更により好ましくは少なくとも１０８ｃｆｕ、最も好ましくは少なくとも１０９ｃｆｕを含み得る。液体組成物の場合、これは概して、１０４ｃｆｕ／ｍｌ〜１０１２ｃｆｕ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０５ｃｆｕ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０６ｃｆｕ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも１０７ｃｆｕ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１０９ｃｆｕ／ｍｌに相当する。
【００２４】
組成物は、医薬組成物、又は、食料製品、補助食品及び機能性食品を含む栄養組成物とすることができる。より具体的には、組成物は、医薬組成物及び機能性食品を含む、薬剤とすることができる。
【００２５】
「補助食品」は、通常食料品に使用される化合物から作製されるが、錠剤、粉末剤、カプセル剤、頓服水剤の形態又は通常栄養物（aliments）とは関連のない任意の他の形態であり、健康に有益な効果を有する製品を指す。「機能性食品」も健康に有益な効果を有する栄養物である。特に、補助食品及び機能性食品は、疾患、例えば慢性疾患に対する生理的効果、すなわち保護効果又は治癒効果を有することができる。
【００２６】
本発明による栄養組成物には、離乳食、乳児用調合乳又は乳児用フォローオン調合乳（infant follow-on formula）も含まれる。本組成物は栄養補給食品若しくは医薬品、栄養補助食品又はメディカルフードであるのが好ましい。
【００２７】
組成物は酪農製品、好ましくは発酵酪農製品とすることができる。発酵製品は液体の形態で存在していても又は発酵液を乾燥することによって得られる乾燥粉末の形態で存在していてもよい。酪農製品の例としては、凝固、撹拌又は飲用形態の発酵乳及び／又は発酵ホエー、チーズ、並びにヨーグルトが挙げられる。
【００２８】
発酵製品は、発酵野菜、例えば凝固、撹拌又は飲用形態の発酵大豆、発酵シリアル及び／又は発酵果物とすることもできる。
【００２９】
好ましい実施の形態では、発酵製品は生鮮製品である。厳しい熱処理工程に供されていない生鮮製品には、細菌株が生存形態で存在するという利点がある。
【００３０】
さらに本発明の主題は、Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防する薬剤の製造への上で規定されるＳ．サーモフィルス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株又は上で規定される組成物の使用である。
【００３１】
さらに本発明の主題は、Ｈ．ピロリ感染症の治療又は予防を必要とする対象においてＨ．ピロリ感染症を治療又は予防する方法であって、上記対象に治療的に有効な量の上で規定されるＳ．サーモフィルス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株又は上で規定される組成物を投与することを含む、方法である。
【００３２】
治療的に有効な量の決定は、特に本明細書で与えられる詳細な開示を鑑みて当業者にとって既知である。
【００３３】
さらに本発明の主題は、Ｈ．ピロリ感染症を治療又は予防する薬剤を製造する方法であって、上で規定されるＳ．サーモフィルス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株又は上で規定される細胞画分を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤に組み込むことを含む、方法である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、治療又は予防は、とりわけ感染症の予防、及び／又はＨ．ピロリの負荷の低減を包含する。治療又は予防は、下記に言及されるＨ．ピロリに関連する症状の少なくとも１つへの対処も包含する。
【００３５】
Ｈ．ピロリ感染症を診断する方法は当該技術分野において既知である。例としては、Ｈ．ピロリ感染症の診断は、血液抗体試験、便中抗原試験又は炭素尿素呼気試験による確認によって為され得る。診断は内視鏡検査での生検後のウレアーゼ試験、組織学的検査、微生物培養又は定量リアルタイムＰＣＲによっても為され得る。
【００３６】
Ｈ．ピロリ感染症に関連する症状又は疾患は、胃痛、腹痛、吐き戻し（regurgitation）、嘔吐（vomiting）、げっぷ、鼓腸、吐き気、慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾患、萎縮症、異形成、形成異常、胃癌及び胃粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫である。
【００３７】
本発明は、Ｈ．ピロリ株の負荷をｉｎ  ｖｉｖｏで低下させるＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株の能力を例証する実施例及び添付の図面に言及する、以下の更なる記載からより明白に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】非感染マウス、Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、対照製品を与えられたマウス、又はＨ．ピロリＳＳ１に感染し、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株により処理されたマウスの、処理の直前（第１バー）、処理の３週間後（第２バー）及び屠殺の直前（第３バー）に測定した、２つの独立した実験について得た体重（グラムで表す）変化を示す。
【図２】（ｉ）Ｈ．ピロリに感染していないマウス、（ｉｉ）Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、対照製品（非発酵乳）を与えられたマウス、及び（ｉｉｉ）Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０により処理されたマウスにおける抗Ｈ．ピロリ抗体を用いた免疫組織化学によって得た感染症のスコアを示す。スコアの定義：０：感染した腺なし、１：わずかな感染した腺、２：２５％の感染した腺、３：２５％〜５０％の感染した腺、４：５０％を超える感染した腺。
【図３】（ｉ）Ｈ．ピロリに感染していないマウス、（ｉｉ）Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、対照製品（非発酵乳）を与えられたマウス、及び（ｉｉｉ）Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０により処理されたマウスにおけるリアルタイムＰＣＲによって得られたＨ．ピロリＳＳ１  ＤＮＡの定量を示す。
【図４】非感染マウス、Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、対照製品を与えられたマウス、又はＨ．ピロリＳＳ１に感染し、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株により処理されたマウスの、処理の直前（第１バー）、処理の３週間後（第２バー）及び屠殺の直前（第３バー）に測定した、２つの独立した実験について得た、体重（グラムで表す）変化を示す。
【図５】（ｉ）Ｈ．ピロリに感染していない、（ｉｉ）Ｈ．ピロリＳＳ１に感染しているが、対照製品（非発酵乳）を与えられた、及び（ｉｉｉ）Ｈ．ピロリＳＳ１に感染し、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０により処理された、（マウスの胃１グラム当たりのｃｆｕ（コロニー形成単位）で表した）プレート上の細菌培養物によって得られたＨ．ピロリＳＳ１の定量を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３９】
実施例１：  組織学的方法及びｑＲＴ−ＰＣＲ法によって決定した、マウスモデルにおけるＨ．ピロリの負荷に対するＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株の効果
【００４０】
１．１  材料及び方法
ヘリコバクター・ピロリ
マウス胃粘膜への非常に良好な定着能力を有するＨ．ピロリＳＳ１株（Lee et al., 1997）を使用した。株の同一性は遺伝子ｇｌｍ、ｈｓｐＡ及びｖａｃＡを配列決定することにより調べた（Raymond et al., 2004、Espinoza et al., 2011、Zhang et al., 2007）。
【００４１】
ストレプトコッカス・サーモフィルス
Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株で発酵させた乳製品を以下のように準備した：Ｍ１７中で第１の培養物を凍結株から調製して、３７℃で１７時間インキュベートした。第２の培養物を、第１の培養物から１％接種することによって酵母抽出物（２ｇ／Ｌ）で強化した脱脂乳中で調製して、３７℃で１７時間インキュベートした。第３の培養物を、第２の培養物から１％接種することによって酵母抽出物（２ｇ／Ｌ）で強化した乳中で調製して、ｐＨが４．７に達するまで３７℃でインキュベートした。最後に製品を、ｐＨが４．８に達するまで、酵母抽出物（２ｇ／Ｌ）で強化した乳に１％の第３の培養物を接種することによって調製した。製品を−８０℃で保存した。細菌の計数を４８時間のインキュベーション後、Ｍ１７中で行った。細菌数は１．５×１０９ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００４２】
マウス
ＳＰＦ（Specific Pathogen Free：特定病原体除去）として試験された５週齢のＢＡＬＢ／ｃＢｙ／Ｊ雌マウス（Charles River, France）４０匹を以下の群に分けた：１５匹の２群のマウスを感染させ、１０匹の１群のマウスを非感染対照として使用した。マウスにビタミン含量の少ない食物を与え、Ｈ．ピロリにより誘導される病変発生を促進した。
【００４３】
感染（８週間）
６週齢のマウスに１日間、含水食餌（hydric diet）を与えた後、翌朝２５０μＬのＨ．ピロリＳＳ１株の濃縮懸濁液（５匹のマウスに対して１〜２皿のペトリ皿のＨ．ピロリ）を強制給餌した。マウスを通常の食餌とともにケージに入れた。次いで、再び夕方にマウスに含水食餌を与えた。このプロトコルを３日間繰り返した。
【００４４】
処理（６週間）
感染の８週後、マウスを、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０を含有する乳製品で６週間処理した。水の代わりに１日に付き１ケージ当たり１２０ｇの乳製品を哺乳瓶で与えた。哺乳瓶は毎日交換した。動物１匹当たりの摂取した製品量を評価するために、哺乳瓶を秤量した。さらに、マウスを処理の直前、処理の３週間後、及び屠殺の直前に秤量した（結果を図１に示す）。
【００４５】
マウス対照群に酵母抽出物（２ｇ／Ｌ）で強化した（すなわち全くＳ．サーモフィルス株を含まない）乳を与えた。
【００４６】
屠殺
マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。開腹を行った。胃を摘出し、胃粘膜を生理血清で洗浄した。
【００４７】
胃を食道から十二指腸までの中間で切断した。胃の右半分は、噴門を取り除いた後、この胃の半分を生理血清中に入れ、分子研究に使用した。胃の左半分は組織学的検査に使用した。
【００４８】
組織学的検査
胃の左半分を一晩３．７％ホルモールで固定し、７０％エタノールで洗浄した後、パラフィン包埋して、３μｍ厚の切片を作製した。
【００４９】
免疫組織化学的検査を、抗Ｈ．ピロリ抗原抗体（antibody anti-H. pylori antigens）：一次抗体：抗Ｈ．ピロリ抗体（Dako、Ｒｅｆ．Ｂ０４７１）；二次抗体及びＤＡＢ：Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（ＤＡＢ）（Dako、Ｒｅｆ．Ｋ４０１１）を用いて行った。
【００５０】
分子研究（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
右側の胃を、ポッターエルベージェムホモジナイザを用いて０．２ｍｌの生理血清中でホモジナイズした（破壊した）（胃組織を含むチューブと、胃組織を含まないチューブとを秤量して、組織重量を調べた）。
【００５１】
総ＤＮＡを、メーカーの推奨に従ってＡｒｒｏｗ  Ｓｔｏｏｌ  ＤＮＡキット（NorDiag, Norway）を用いて破砕した胃から抽出した。それぞれの破砕した胃で、総ＤＮＡを１８０μＬのＴＲＩＳバッファー（１０ｍＭ）中に再懸濁した。
【００５２】
Ｈ．ピロリのＤＮＡの存在を、リアルタイムＰＣＲによってＤＮＡ抽出物中で定量化した。増幅は、Oleastro et al. (2003)に記載の方法に従ってＨ．ピロリ中に２つのコピーで存在する２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするプライマーを用いて行った。２０μｌの混合物（ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ、Menard et al., 2002に記載のプライマーＨＰＹ−Ａ及び（et）ＨＰＹ−Ｓ  ２０μＭ、ＬＣ−Ｒｅｄ  ６４０で５’標識されているとともに、３’リン酸化されているセンサープローブ及びフルオレセインで３’標識されているアンカープローブ（両プローブともOleastro et al. 2003に記載されている）２０μＭ、酵素を含有するバッファー（１０×、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓキット、Roche Diagnostics））に対して、２００ｎｇ／μｌのＤＮＡ  ５μｌを添加して、以下のプログラムを用いてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ROCHE）で増幅した：
変性：９５℃  １０分
増幅：５０サイクル    ２０℃／秒
９５℃  ０秒
６０℃  ２０秒
７２℃  １２秒
融合：９５℃  ０秒
３８℃  ５０秒  ２０℃／秒
【００５３】
１．２  結果
免疫組織化学的検査によって得た感染症のスコアを図２に示す。これらの結果は、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株により発酵させた乳製品の、Ｈ．ピロリに感染したマウスへの投与は、乳対照による処理によって得たスコアと比較して、感染症のスコアを（有意ではないが）低下させることを示す。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲによって得た結果を図３に示す。これらの結果は、マウスにおいて、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株により発酵させた乳製品での処理は、乳対照での処理と比較して、Ｈ．ピロリの負荷を有意に低下させることを示す。
【００５５】
実施例２：  微生物学的方法により決定したマウスモデルにおけるＨ．ピロリの負荷に対するＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株の効果
【００５６】
２．１  材料及び方法
この実験のための材料及び方法は、以下を除く、Ｈ．ピロリ株、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株、マウス、マウスの感染、処理及び屠殺に関しては、上記の実施例１に記載したものと同じである：
Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株の細菌数は１．４３×１０９ｃｆｕ／ｍＬとし；
処理したマウスの体重変化は図４に示し；
マウスの右半分の胃のみを微生物学的研究に用いた。
【００５７】
微生物学的研究：  Ｈ．ピロリの培養
半分の胃を、ポッター型ホモジナイザを用いて０．２ｍｌの生理血清にブロウし（browed）（チューブは胃とともに及び胃なしで液体とともに秤量して組織の正確な重量を推定する）、１００μＬの希釈液（１０−１〜１０−４）を、１０％血液で強化した、ピロリ培地ＧＳＳＡ（Ｇｌａｘｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ａ（２０μｇ／ｍｌのバシトラシン、１．０７μｇ／ｍｌのナリジクス酸、０．３３μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ、及び１０μｇ／ｍｌのバンコマイシン））を含有するペトリ皿に播いた。細菌の計数を微好気条件下で５日間〜７日間のインキュベーションの後に３７℃で行った。Ｈ．ピロリを、表現型及び生化学挙動（形態、ウレアーゼ及びオキシダーゼアッセイ）により同定した。
【００５８】
２．２  結果
Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株についての微生物学により得た結果を図５に示す。これらの結果は、マウスにおいて、ＣＮＣＭ  Ｉ−１５２０株で発酵させた乳製品による処理は、乳対照による処理と比較して、有意にＨ．ピロリの負荷を低下させることを示す。
【００５９】
参考文献
【表１】
2016505239.tif 000002
【図１】
2016505239.tif 000003
【図２】
2016505239.tif 000004
【図３】
2016505239.tif 000005
【図４】
2016505239.tif 000006
【図５】
2016505239.tif 000007
【国際調査報告】
2016505239.tif 000008
2016505239.tif 000009