(57)【要約】  本発明は、患者における炎症性腸疾患を（ｉ）診断、（ｉｉ）その転帰を予後予測、又は（ｉｉｉ）その発症リスクを予測するための、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率及び／又はレベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。本発明はまた、炎症性腸疾患の処置にも関する。本発明はさらに、炎症性腸疾患を診断／予後予測するための上記方法において、及び炎症性腸疾患の処置において有用である、キットに関する。特定の実施態様では、炎症性腸疾患はクローン病である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験者の生物学的試料中の、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）の結果を、ｉ）健康な被験者の同質の生物学的試料中に典型的に見られるこれらの制御性Ｔリンパ球の数及び／若しくは濃度及び／若しくは比率に対応する対照標準値と、並びに／又は、ｉｉ）炎症性腸疾患を患う患者の同質の生物学的試料中に典型的に見られるこれらの制御性Ｔリンパ球の数及び／若しくは濃度及び／若しくは比率に対応する対照標準値と比較する工程；及び
（ｃ）工程（ａ）及び／又は適宜工程（ｂ）の結果（群）から、被験者が炎症性腸疾患に患っているかどうかを推定する工程
を含む、被験者が炎症性腸疾患を患っているかどうかをインビトロで決定する方法。
【請求項２】
患者の生物学的試料中の、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程を含む、炎症性腸疾患に患っている患者における炎症性腸疾患の転帰をインビトロで予後予測する方法。
【請求項３】
以下の工程：
（ａ）患者の生物学的試料中の、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程；及び
（ｂ）工程ａ）の結果から該患者の予後を推定する工程
を含む、請求項２記載の炎症性腸疾患の転帰をインビトロで予後予測する方法。
【請求項４】
被験者が炎症性腸疾患を発症するリスクがあるかどうかをインビトロで予測する方法であって、
ａ）被験者の生物学的試料中の、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程；
ｂ）同質の試料についての参照値に比べて工程（ａ）の低い数値は該被験者が炎症性腸疾患を発症するリスクがあることを示すものとして、工程（ａ）の結果から該被験者が炎症性腸疾患を患うリスクがあるかどうかを予測する工程
を含む、方法。
【請求項５】
処置の最中の被験者の生物学的試料中の、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率をモニタリングする工程を含む、炎症性腸疾患の予防的又は治療的処置の効力をインビトロでモニタリングする方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患がクローン病である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
生物学的試料が、大腸粘膜試料、消化管の生検試料、大腸生検試料、小腸生検試料、血液試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む血液分画からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
炎症性腸疾患の処置用の医薬品としての使用のためのＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球。
【請求項９】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球が、処置しようとする被験者から得られた自己リンパ球である、請求項８記載の使用のための制御性Ｔリンパ球。
【請求項１０】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球が、一次培養細胞又は樹立細胞株である、請求項８〜９のいずれか一項記載の使用のための制御性Ｔリンパ球。
【請求項１１】
炎症性腸疾患の処置においてＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を活性化及び／又はその増殖を誘導するための医薬品としての使用のための、
（ｉ）Ｆ．プラウスニッツィ菌株；及び／又は
（ｉｉ）弱毒生菌Ｆ．プラウスニッツィ株；及び／又は
（ｉｉｉ）死菌Ｆ．プラウスニッツィ株；及び／又は
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも１つの菌株の少なくとも１つの断片；及び／又は
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つが負荷された抗原提示細胞（ＡＰＣ）
を含む組成物。
【請求項１２】
抗原提示細胞が、処置しようとする被験者から得られた抗原提示細胞である、請求項１１記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定するための手段を含む、ＩＢＤを発症するリスクを診断、予後予測及び／若しくは予測するための、並びに／又はＩＢＤの処置の効力をモニタリングするためのキット。
【請求項１４】
−包装材料；
−既知の量の：
（ｉ）Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球集団、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｉｉ）単離されたＦ．プラウスニッツィ菌株、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｉｉｉ）単離された弱毒生菌Ｆ．プラウスニッツィ株、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｉｉｉｉ）単離された死菌Ｆ．プラウスニッツィ株、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｖ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つの菌株の少なくとも１つの断片、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つが負荷された；混合物（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）の少なくとも１つが負荷された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは単離されたＡＰＣ、又はその医薬組成物、並びに
−場合により、「薬物」（ｉ）〜（ｖｉ）又はその医薬組成物が、ＩＢＤを患う又はＩＢＤを発症するリスクのある被験者における、ＩＢＤ、好ましくはクローン病の予防及び／又は処置において有効であることを示す、該包装材料と共に含まれるラベル又は添付文書
を含む、炎症性腸疾患を処置又は予防するためのキット。
【請求項１５】
ａ）Ｆ．プラウスニッツィ及び場合により酪酸塩の存在下でＡＰＣ（抗原提示細胞）を培養し、これによりＦ．プラウスニッツィが負荷されたＡＰＣを得る工程、及び
ｂ）未感作ＣＤ４ Ｔ細胞を、
○工程ａ）で得られたＦ．プラウスニッツィの負荷されたＡＰＣ、
○場合により、ＩＬ−２、及び
○場合により、酪酸塩
の存在下で培養し、これにより、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を得る工程
を含む、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を得るためのプロセス。
【請求項１６】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における炎症性腸疾患を処置又は予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者における炎症性腸疾患を（ｉ）診断、（ｉｉ）その転帰を予後予測、又は（ｉｉｉ）その発症リスクを予測するための、腸内フローラの微生物に特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球、特にフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率及び／又はレベルを決定することからなる工程を含む方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、炎症性腸疾患の処置にも関する。
【０００３】
本発明はさらに、炎症性腸疾患を診断／予後予測するための上記方法において、及び炎症性腸疾患の処置において有用である、キットに関する。
【０００４】
特定の実施態様では、炎症性腸疾患はクローン病である。
【０００５】
発明の背景
腸粘膜は、食物及び共生細菌から発生した非常に多様な抗原に常に曝されている。それ故、不適切な免疫応答を防ぎ、かつ腸管恒常性を維持するために、腸の免疫系は多様な制御経路を発達させてきた。近年の研究により、消化管の細菌が、局所免疫応答及び全身免疫応答を形作る上で主要な役割を果たしていることが判明した（Honda, K. & Littman, D.R., Annu Rev Immunol 30, 759-795, 2012）。マウスにおいて同定された制御機序の１つは、特定の細菌による、様々なエフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞のサブセットの誘導であり、その適切な平衡が、腸管恒常性の維持に必要とされる（Honda, K. & Littman, D.R., Annu Rev Immunol 30, 759-795, 2012）。
【０００６】
腸免疫系のいずれかの制御経路の崩壊により、慢性的な炎症、特に炎症性腸疾患（本明細書において以後「ＩＢＤ」と略称する）に至り得る（Maloy, K.J. & Powrie, F.. Nature 474, 298-306, 2011）。
【０００７】
炎症性腸疾患は、消化管の慢性的かつ再発性の炎症によって特徴付けられる一群の炎症状態である。２つの最も一般的なＩＢＤの型は、クローン病及び潰瘍性大腸炎である。潰瘍性大腸炎は結腸（大腸）及び直腸に限定されているが、クローン病は口から肛門までの消化管のあらゆる部分に発症し得るが、通常、小腸及び／又は結腸に発症する。炎症性腸疾患の徴候は、発症する腸管の領域に依存する（Baumgart及びSandbom, Lancet, 369 : 1641-1657, 2007）。しかし、該症状はこの疾病に特異的ではない。症状としては、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、骨盤領域における重度の内部筋痙攣／筋攣縮、体重減少、貧血が挙げられる。それ故、診断は一般的に、大腸内視鏡検査及び病理学的病変の生検と合わせて、血中の炎症マーカーの評価によって確立される。
【０００８】
発病機序には、腸内微生物叢の存在によって駆り立てられた粘膜免疫系の不適切かつ進行中の活性化が関与する。ＩＢＤは、ヒト糞便中の２つの最も豊富な門であるバクテロイデス門及びフィルミテクス門（特にクロストリジウム綱）の低下した多様性によって特徴付けられる。特に、クローン病患者、特に回腸に発症した患者の腸内微生物叢において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィのレベルが一貫して減少しているようである（Sokol, H., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105, 16731-16736, 2008; Willing, B., et al., Inflamm Bowel Dis 15, 653-660, 2009）。
【０００９】
腸管恒常性に関与する制御経路の１つは、腸粘膜における制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）の蓄積又は局所的誘導に依拠する（Tanoue, T. & Honda, K., Semin Immunol 24, 50-57, 2012）。転写因子フォークヘッドボックスｐ３（Ｆｏｘｐ３）を発現するＣＤ４ Ｔ細胞は最もよく知られているＴレグである。これらの細胞の中で、２つのサブタイプを区別することができる。天然Ｔレグは胸腺において自己抗原に応答して分化し、自己反応性免疫応答を防ぐ（Sakaguchi, et al., Cell 133, 775-787, 2008）。誘導性Ｔレグ（ｉＴレグ）は、末梢において、通常型ＣＤ４ Ｔ細胞から、共生細菌などの非自己抗原による慢性的な攻撃をはじめとする様々な条件下で分化し、かつそれは組織恒常性に対する強力な寄与因子である（Bilate, A.M. & Lafaille, J.J., Annu Rev Immunol 30, 733-758, 2012）。マウスでは、Ｆｏｘｐ３ ｉＴレグ細胞は腸粘膜、特に結腸において豊富であり、そこで結腸炎の予防に重要な役割を果たす（Atarashi, K., et al., Science 331, 337-341, 2011）。近年の研究により、腸内微生物叢の常在クロストリジウム細菌のカクテルが、マウス大腸粘膜固有層（ＬＰ）におけるＦｏｘｐ３ ｉＴレグの強力な誘導因子であることが実証された（Atarashi, K., et al., Science 331, 337-341, 2011）。Ｆｏｘｐ３ Ｔレグはまた、ヒト腸粘膜にも存在するが、その正確な起源、分布、及びＩＢＤの予防に対する寄与は依然として解明されていない。実際に、Ｆｏｘｐ３の突然変異に因るＦｏｘｐ３ Ｔレグの不活性化が結腸炎に常に伴うわけではなく、健康なドナーの正常な粘膜よりもＩＢＤ患者の炎症の起こっている粘膜の方が、正常な抑制能を有するように思われるＦｏｘｐ３細胞の数が多い（Buckner, J.H., Nat Rev Immunol 10, 849-859, 2010）。それ故、他のＴレグ又は他の抑制機序がヒトにおける大腸免疫恒常性を制御する可能性があると推論された。さらに、ヒトにおける微生物叢により誘導されたＴレグの存在及び可能性ある役割は依然として省みられていない。
【００１０】
今日、ヒトにおける大腸免疫恒常性の維持に関与し、かつＩＢＤの予防に関与する、細胞機序又は分子機序を同定することに大きな関心が持たれている。実際に、これらの細胞／機序は、ＩＢＤ、特にクローン病の診断及び予後予測に有用な価値あるバイオマーカーであり、ＩＢＤを処置するための治療戦略を開発するのに有用であろう。
【００１１】
発明の説明
ヒトにおける腸管恒常性に関与する細胞及び／又は機序を発見する試みにおいて、本発明者らは、ヒト大腸粘膜において、制御性Ｔリンパ球の新たなサブセット、すなわち、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低い表現型によって特徴付けられるＦｏｘｐ３陰性ＩＬ−１０分泌制御性Ｔリンパ球のサブセット（本明細書において以後「ＤＰ８α Ｔレグ」と略称する）を同定した。特に、本発明者らはＤＰ８α Ｔレグを同定し、そのレパートリーはヒト微生物叢における主要な細菌であるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（本明細書において以後「Ｆ．プラウスニッツィ」と略称する）の認識に向けられる。
【００１２】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Abuzakouk et al.（Eur J Gastroenterol Hepatol 10, 325-329, 1998）によって健康な被験者の小腸粘膜において初めて同定された。近年、研究により、これらのＴ細胞は、遺伝的素因のあるヒトに起こる小腸の自己免疫疾患であるセリアック病に罹患した患者において減少していることが報告された（Carton et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 16, 961-968, 2004）。しかし、現在までにこれらのどの研究も、Ｆ．プラウスニッツィにより活性化されたＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＴレグが腸管恒常性に関与するのは言うまでもなく、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＴ細胞が制御活性を有するＴリンパ球のサブセットであることを開示も又はさらには示唆もしていない。
【００１３】
さらに、本発明者らは、これらのＤＰ８α制御性Ｔリンパ球（本明細書において以後「Ｔレグ」と略称する）は、大腸から血液中へと循環することができ、よって、それらを大腸粘膜においてだけでなく直接血中においても定量することができることを意外にも発見した。
【００１４】
ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性ＰＢＬ（末梢血リンパ球）はエクスビボでＴレグマーカーを欠失していたが、本発明者らは、これらの細胞の一部が、Ｆ．プラウスニッツィに特異的に反応し、そして選別及びインビトロでの増殖後に全てがＴレグマーカー及び機能を獲得したことを発見した。
【００１５】
本発明者らはまた、Ｆ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８α制御性Ｔリンパ球の度数が、健康な被験者と比較して、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者の血中及び炎症の起こった粘膜において減少していることを発見した。
【００１６】
それ故、この新たに記載されたＦ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８αＴレグは、ＩＢＤを診断、予後予測するための、及び被験者がＩＢＤを発症するリスクがあるかどうかを予測するための、新たな信頼性のあるバイオマーカーを提供する。
【００１７】
その他にも、Ｆ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８αＴレグが腸管恒常性において重要な役割を果たすという発見はまた、ＩＢＤの処置のための新たな治療戦略を提供する。特に、Ｆ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８αＴレグは、その特異な特徴のお蔭で、ＩＢＤ処置の状況で養子移植の目的に有用であり得る。実際に、本発明者らは、殆どのＴレグ細胞とは対照的に、ＤＰ８αＴレグが、インビトロでＴ細胞受容体（本明細書では以後「ＴＣＲ」と略称する）の刺激下で増殖した（アネルギーではない）（すなわち、Ｆ．プラウスニッツィが負荷された抗原提示細胞と共にＤＰ８αＴレグをインキュベートすると、これらのＴレグの増殖が誘導された）ことを示した。さらに、本発明者らは、ＤＰ８αＴレグ由来の細胞株が、インビトロでの増殖能と共に、高い表現型安定性を有することを示した。
【００１８】
さらに、ＩＢＤの予防的又は治療的処置（特に免疫抑制剤、生物学的製剤、又は腸内有益菌）の効力を、処置された被験者の生物学的試料（例えば血液及び大腸粘膜）中のＦ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８αＴレグのレベルを決定することによって評価することができる。さらに、生物学的試料中のＤＰ８αＴレグレベルはまた、再発を予測するためのバイオマーカーとして使用され得、よって、処置の変更を見込み得る。
【００１９】
［定義］
本明細書において使用される「生物学的試料」は、大腸粘膜試料、消化管の生検試料、大腸生検試料、小腸生検試料、血液試料、血液分画、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からなり得る。好ましくは、生物学的試料は大腸粘膜試料又は血液試料である。
【００２０】
「ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球」、「ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型によって特徴付けられる制御性Ｔリンパ球」及び「ＤＰ８αＴレグ」という表現は同義語として使用され、これは、その表面に少なくとも表面抗原分類分子ＣＤ３、ＣＤ４、並びにα／αホモダイマーからなる表面抗原分類分子ＣＤ８（その発現レベルは、α／βヘテロダイマーからなる表面抗原分類分子ＣＤ８を発現しているＴリンパ球上での発現レベルよりも低い）を発現かつ提示するリンパ球（一次培養細胞又は一次培養細胞から得られた樹立細胞株）を指す。
【００２１】
したがって、「ＣＤ８αα低い表現型を有する細胞」という表現は、該細胞が、ＣＤ８α／β表現型を有するＴリンパ球によって発現されるα鎖の量よりも少ない量のホモダイマーα／αを発現することを意味する。加えて、ＣＤ８αα低い表現型を有する細胞はヘテロダイマーα／βを発現しない。
【００２２】
ＤＰ８αＴレグはまた、Ｆｏｘｐ３＋Ｔレグ上に通常見られるマーカー（例えばＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３）を発現又は過剰発現し、好ましくは活性化及び共刺激マーカー（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ）、接着マーカー（例えばＬＦＡ−１、ＬＦＡ３、及びＩＣＡＭ−１）、ＩＬ−７Ｒ（ＣＤ１２７）を特に大腸粘膜固有層において発現する。さらに、これらのＴリンパ球は、Ｆｏｘｐ３の発現の欠失によって特徴付けられる（「Ｆｏｘｐ３陰性」又は「Ｆｏｘｐ３−」Ｔリンパ球と呼ばれる）。
【００２３】
活性化されると、ＤＰ８αＴレグは、少なくともＩＦＮ−γ及びインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）と、あるとしても僅かなＩＬ−２を分泌する。好ましくは、これらの細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７及びＩＬ−２２を発現しない。
【００２４】
好ましくは、ＤＰ８αＴレグは、粘膜固有層リンパ球（本明細書において以後「ＬＰＬ」と略称される）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞に由来するリンパ球、又はそれから導かれた樹立細胞株である。
【００２５】
ＬＰＬは好ましくは大腸粘膜の組織試料から得られる。ＬＰＬは、当業者には周知の任意の適切な方法によって得ることができる。ＬＰＬを得るためのプロセスは、以下の工程を含み得る：
−大腸粘膜の組織試料中の上皮から粘膜固有層を分離して、単離された粘膜固有層を得る工程、
−単離された粘膜固有層をコラゲナーゼ及びＤＮＡアーゼで消化し、消化された粘膜固有層を得る工程、
−消化された粘膜固有層を濾過して、粘液及び大きな残骸を含まない粘膜固有層の細胞を得る工程、
−粘膜固有層の該細胞を遠心分離にかけて、粘膜固有層の生細胞を得る工程、及び
−例えば、表面マーカーＣＤ３を発現している細胞の選択による又は選択的培養による、ＬＰＬの選択の工程。
【００２６】
大腸粘膜の組織試料中の上皮からの粘膜固有層（ＬＰ）の分離は、例えば、組織試料を撹拌下でＥＤＴＡ緩衝液中、例えば３０分間インキュベートし、その後、例えばＰＢＳなどの緩衝液中で剥ぎ取りかつ洗浄することによって行なわれる。このようにして単離された粘膜固有層を、その後、１mm2の断片へと刻み、培養培地、例えば、ペニシリン（１０％）及びゲンタマイシン（０．１mg/ml；Sigma-Aldrich）を含有するＲＰＭＩで洗浄する。該組織断片を、その後、コラゲナーゼ及びＤＮＡアーゼ（各２mg/ml；Sigma-Aldrich）を用いて、３７℃で振盪しながら消化する。粘液及び大きな残骸を４０μmのセルストレーナー（BD）を通しての濾過によって取り除く。その後、生細胞がフィコール勾配遠心分離によって得られる。その後、ＬＰＬを、表面マーカーＣＤ３を発現している細胞の選択によって又は選択的培養によって選択し得る。リンパ球を得るための選択培養の一例は、細胞を放射線照射されたフィーダー細胞の存在下でＰＨＡ（植物性血球凝集素）を用いて刺激するという培養である。
【００２７】
ＰＢＬを、当業者には周知の任意の適切な方法によって得ることができる。例えば、ＰＢＬは、水簸によって血液試料から得られる。
【００２８】
ＰＢＬはまたＰＢＭＣからも単離され得る。
【００２９】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、当業者には周知の任意の適切な方法によって得ることができる。例えば、ＰＢＭＣは、血液試料から、好ましくはＥＤＴＡなどの抗凝固剤を含む血液試料から、フィコール勾配遠心分離によって得られる。
【００３０】
本発明の脈絡において、ＤＰ８αＴレグは、Ｆ．プラウスニッツィに特異的であり（Ｆ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８α Ｔレグとも呼ばれる）、すなわち、それらはＦ．プラウスニッツィに特異的なＴ細胞受容体を発現し、よってそれらはＦ．プラウスニッツィが負荷された抗原提示細胞に特異的に反応する。
【００３１】
「抗原提示細胞」（本明細書において以後「ＡＰＣ」と略称する）という用語は、抗原を貪食／内部移行及び処理した後に、その表面上に主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成した処理された抗原を提示する、細胞を意味することを意図する。好ましくは、本発明において使用されるＡＰＣは、職業的ＡＰＣ、より好ましくは樹状細胞、マクロファージ、単球、γδＴリンパ球（Himoudi. J Immunol., 188(4):1708-16, 2012）だけでなく、Ｆ．プラウスニッツィの抗原に特異的なＢ細胞受容体を発現し、かつさらにこの抗原を内部移行しＭＨＣクラスＩＩ分子と会合させてその表面でこの抗原を提示することのできるＢリンパ球である。本発明において有用なＡＰＣはまた、非職業的ＡＰＣであってもよい。非職業的ＡＰＣは、主要組織適合性遺伝子複合体を構成的に発現しないが、適切なサイトカインを用いて刺激されると、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現がトリガーされる。非職業的ＡＰＣは、非職業的ＡＰＣがその表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するようにそれらを刺激する方法と共に当業者には周知であり、これは例えば、Sundstrom JB及びAnsari AA, Transpl Immunol, 4: 273-289, 1995に記載されている。本発明の脈絡において、「Ｆ．プラウスニッツィが負荷されたＡＰＣ」及び「Ｆ．プラウスニッツィの断片が負荷されたＡＰＣ」は、Ｆ．プラウスニッツィ又は適宜その断片が、ＡＰＣによって内部移行及び処理されることを可能とし、その後、Ｆ．プラウスニッツィ又はこの細菌の断片由来の処理された抗原が、ＡＰＣの表面上に、主要組織適合性遺伝子複合体、例えばＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）と会合して提示されることを可能とするような培養条件下及び十分な時間をかけて、ＡＰＣを、それぞれＦ．プラウスニッツィ又はこの細菌の断片と共にインキュベートしたことを意味する。
【００３２】
本明細書において使用されるＤＰ８αＴレグ集団に関して「単離された」又は「精製された」という用語は、天然の対応物を全く有さないか、又は、例えば大腸組織又は体液（例えば血液）などの正常な若しくは疾病を有する組織において、天然に付随する、他の細胞型をはじめとする他の成分から分離若しくは精製されているかのいずれかである、細胞集団を指す。典型的には、単離された細胞集団は、該集団を得た天然源と比較して、ＤＰ８αＴレグについて少なくとも２倍、４倍、８倍、１０倍、２０倍又はそれ以上強化されている。ＤＰ８α制御性Ｔリンパ球の単離された集団において、ＤＰ８α制御性Ｔリンパ球の数は、該集団の総細胞数の少なくとも５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、又は最も好ましくは９８％、又は９９％を示す。
【００３３】
ＤＰ８α制御性Ｔリンパ球（又はＤＰ８α制御性Ｔリンパ球集団）の単離は、これらの細胞に対して独特な表面マーカーの選択的発現を使用することによって行なうことができる。特に、ＤＰ８α制御性Ｔリンパ球は初回は、細胞表面タンパク質ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α／αの正の選択を通して、二回目は細胞表面タンパク質Ｆｏｘｐ３の負の選択（すなわちＦｏｘｐ３＋細胞の枯渇）を通して選別され得る。場合により、その後、細胞集団を、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ３及びＩＣＡＭ−１及びＣＤ１２７からなる群より選択された少なくとも１つ、好ましい順に、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、又は全部の細胞表面タンパク質（群）の正の選択を通してさらに精製する。
【００３４】
細胞表面タンパク質の有無に基づいた選択を実施するための方法は当業者には周知である。例えば、これらの細胞を、選択された細胞表面タンパク質に選択的に結合する抗体を使用した免疫学的選択によって単離／精製し得る。
【００３５】
「免疫学的選択」という用語は、抗体又はその断片に対するタンパク質の特異的結合によって、試料に由来する特定の細胞表面タンパク質を提示する細胞、又は試料中の関心対象の細胞表面タンパク質を含む細胞を、選択、及び場合によりその数を定量することを指す。本発明の方法に有用な好ましい免疫学的選択法としては、細胞染色、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズによる精製（選択された細胞表面抗原に対して指向された抗体を用いてコーティングされた磁気ビーズを使用して）などが挙げられる。
【００３６】
「炎症性腸疾患」という用語は、Baumgart及びSandbom（Lancet, 369 : 1641-1657, 2007）によって記載されているような、消化管の慢性的かつ再発性の炎症によって特徴付けられる一群の炎症状態を指す。本発明の脈絡において、ＩＢＤは好ましくはクローン病又は潰瘍性大腸炎である。より好ましくはＩＢＤはクローン病である。
【００３７】
「フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ」（「Ｆ．プラウスニッツィ」と略称される）は、フィルミテクス門、クロストリジア網、クロストリジウム目、クロストリジウム科、及びフィーカリバクテリウム属に分類されたヒト腸内フローラの共生細菌である。この用語は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィの全ての菌株を指す。「フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ菌株」によって、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ種に属する全ての細菌を意味する。
【００３８】
Ｆ．プラウスニッツィに関して「単離された」又は「精製された」という用語は、少なくとも５０％、好ましい順に７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はより好ましくは１００％の純度を有するＦ．プラウスニッツィ集団を指す。
【００３９】
本発明の脈絡において、Ｆ．プラウスニッツィ（例えば生菌、弱毒生菌、又は死菌Ｆ．プラウスニッツィ）に言及する場合の「免疫学的断片」という用語は、一旦ＡＰＣによって負荷されると、該断片に由来する処理された抗原が主要組織適合性遺伝子複合体、特にＭＨＣ ＩＩと複合体を形成することが可能となり、該複合体はＡＰＣの表面に提示され、よってそれはＴＣＲ認識を通してＤＰ８αＴレグを活性化／その増大をトリガーすることができる、Ｆ．プラウスニッツィの任意の部分を意味することを意図する。
【００４０】
本発明の脈絡において、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球に関する「の比率」という表現は、所与の細胞の全集団に対する、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率を意味することを意図する。例えば、ＣＤ４＋リンパ球集団に対するＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率は、ＣＤ４＋リンパ球の全集団に対する、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率である。
【００４１】
本明細書において使用される「被験者」及び「患者」という用語はヒトを示す。
【００４２】
「必要とする被験者」によって、ＩＢＤを患う又は患い易い個体、ＩＢＤ疾患を発症するリスクのある個体、あるいは、ＩＢＤを患った後に寛解した個体を意味する。
【００４３】
「健康な被験者」という用語は、ＩＢＤを患っていない被験者を指す。
【００４４】
「処置する」という用語は、治療的方法及び予防的方法の両方、すなわち、ＩＢＤを患う個体の容態を治癒、改善、及び／又は寿命を延長することを目的とした方法を包含することを意味する。それはまた、ＩＢＤの出現を予防することを目的とした方法だけでなく、再発を予防することを目的とした方法にも言及する。
【００４５】
本明細書において使用される、ＩＢＤに適用される場合の、「予防する」という用語は、ＩＢＤの発症が遅延又は予防されることを意味することを意図する。
【００４６】
「有効量」によって、処置／予防しようとする疾患を処置／予防することのできる化合物の濃度を達成するのに十分な量を意味する。このような濃度は、当業者によって慣用的に決定され得る。実際に投与される化合物の量は、典型的には、処置しようとする容態、選択される投与経路、投与された実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重度などをはじめとする関連する環境に鑑みて医師によって決定されるだろう。
【００４７】
本明細書において使用される「ＩＢＤを発症するリスクのある」という用語は、将来、ＩＢＤを患う傾向がより高いことを示す。
【００４８】
［発明の詳細な説明］
炎症性腸疾患を診断、予後予測、及びそれを発症するリスクを予測する方法
炎症性腸疾患の診断法
第一の態様では、本発明は、
（ａ）被験者の生物学的試料中の、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）の結果を、ｉ）健康な被験者の同質な生物学的試料中に典型的に見られるこれらの制御性Ｔリンパ球の数及び／若しくは濃度及び／若しくは比率に対応する対照標準値と、並びに／又は（ｂ）炎症性腸疾患を患う患者の同質な生物学的試料中に典型的に見られるこれらの制御性Ｔリンパ球の数及び／若しくは濃度及び／若しくは比率に対応する対照標準値と比較する工程；及び
（ｃ）工程（ａ）及び／又は適宜工程（ｂ）の結果（群）から、被験者が炎症性腸疾患を患っているかどうかを推定する工程
を含む又はからなる、被験者が炎症性腸疾患に患っているかどうかをインビトロで決定する方法に関する。
【００４９】
実施態様によっては、該方法は、診断しようとする被験者の生物学的試料を準備又は入手することからなる第一の工程を含む。
【００５０】
好ましくは、本発明のこの態様では、診断しようとする被験者は、炎症性腸疾患を患うことが疑われ、したがって、該方法を実施して、被験者が実際に炎症性腸疾患に患っているかどうかを確認することができる。
【００５１】
好ましくは、生物学的試料は、大腸粘膜試料、血液試料、又は血液分画、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。
【００５２】
好ましい実施態様では、工程（ａ）を、血液試料又は血液分画を用いて実施する。この実施態様は特に有利である、なぜなら、血液試料の回収は、ＩＢＤを診断するために現在要求される標準的な検査である大腸内視鏡検査及び大腸生検を実施するよりも、より簡単かつ侵襲性が低いからである。
【００５３】
工程（ｂ）に使用される「対照標準値」は、例えば、所与の被験者集団（例えば、健康な被験者、ＩＢＤを患っている患者、寛解している患者）の生物学的試料（例えば大腸粘膜、血液など）中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率及び／又は数及び／又は濃度を決定し、そして平均値又は中央値を得ることによって得ることができる。
【００５４】
当業者には明らかであろうように、試験しようとする被験者の生物学的試料中において決定されたＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型の比率、数及び／又は濃度と対照との比較の性質、及び、工程（ｃ）で出された結論は、対照の性質に依存するだろう。
【００５５】
対応する健康な被験者の対照標準値と、等価、類似又はそれよりも大きい、試験しようとする被験者の生物学的試料中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＤＰ８αＴレグの比率、数又は濃度は、患者がＩＢＤを患っていないことを示し得る。
【００５６】
これとは対照的に、対応する健康な被験者の対照標準値よりも低い、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＤＰ８αＴレグの比率、数又は濃度の値は、患者がＩＢＤを患っていることを示し得る。
【００５７】
同様に、対応するＩＢＤ患者の対照標準値と等価、類似又はそれよりも低い、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＤＰ８αＴレグの比率、数又は濃度は、患者がＩＢＤを患っていることを示し得る。
【００５８】
炎症性腸疾患を患う患者の予後予測をする方法
本発明の第二の態様は、患者における炎症性腸疾患の転帰をインビトロで予後予測する方法に関し、該方法は、患者の生物学的試料中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程を含む又はからなり、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の比率が高ければ高いほど、予後はより良好である。
【００５９】
本発明のこの態様の実施態様は、以下の工程：
（ａ）患者の生物学的試料中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程；及び
（ｂ）工程ａ）の結果から該患者の予後を推定する工程
を含む又はからなる。
【００６０】
実施態様によっては、該方法は、炎症性腸疾患を患う患者から生物学的試料を準備又は入手することからなる第一工程を含む。
【００６１】
好ましい実施態様では、工程（ａ）は、血液試料又は血液分画を用いて実施する。
【００６２】
炎症性腸疾患を患う患者では、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の低いレベルは、悪い予後を示すようである。逆に、これらの特異的Ｔレグの数が多ければ多いほど、予後はより良好となる。
【００６３】
したがって、工程ａ）におけるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度がゼロであるか又は低い測定値は悪い予後の指標となり、一方、工程ｂ）におけるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の高いレベルの測定値は、良好な予後の指標となる。
【００６４】
本明細書全体を通して使用されているような「悪い予後」という用語は、早期な再発を起こしそうであり、及び／又は最近開始された新規な処置に応答しないようである、患者を指す。「良好な予後」という用語は、長期の寛解期を有するようであり、及び／又は最近開始された新規な処置に良好な応答を示すようである、患者を指す。
【００６５】
上記に示されているように、工程ａ）において決定されたＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率は、この容態を患う患者における炎症性腸疾患の転帰の予後の評価を与える。それ故、本発明のインビトロでの方法の好ましい実施態様では、予後を評価するために、生物学的試料中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率と可能性ある転帰（再発、短期間又は長期間の寛解、重度な病型への進行）との間の関係を示した標準的な検量曲線に、工程ａ）で得られた数値をあてはめる。
【００６６】
標準的な検量曲線は、転帰が既知である患者の大規模コホートにおいてＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定することによって得ることができる。
【００６７】
１つの実施態様では、生物学的試料を、患者が任意の療法を受ける前に入手する。
【００６８】
別の実施態様では、生物学的試料を、ＩＢＤの処置開始後、特に、以下に開示されているような本発明による処置の開始後に入手する。
【００６９】
炎症性腸疾患を発症するリスクを予測する方法
本発明者らは、患者、特に患者の血液、及び患者の大腸粘膜における、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球のレベルは、腸の免疫学的恒常性、及び炎症性腸疾患の発症と関連していることを示した。
【００７０】
それ故、本発明の第三の態様は、被験者が炎症性腸疾患を発症するリスクがあるかどうかをインビトロで予測する方法に関し、該方法は、
ａ）被験者の生物学的試料中におけるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程；
ｂ）工程（ａ）の結果から、被験者が炎症性腸疾患を患うリスクがあるかどうかを予測する工程
を含む又はからなり、同質の試料の基準値と比較して工程（ａ）での低い値は、該被験者が炎症性腸疾患を発症するリスクがあることを示す。
【００７１】
実施態様によっては、該方法は、試験しようとする被験者の生物学的試料を準備又は入手することからなる第一工程を含む。
【００７２】
好ましい実施態様では、工程（ａ）を血液試料又は血液分画を用いて実施する。
【００７３】
本発明の第三の態様では、試験しようとする被験者は、炎症性腸疾患にまだ患っていない。
【００７４】
１つの実施態様では、基準値（Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率）は、炎症性腸疾患を患っていない被験者の生物学的試料において決定された数値であり、該生物学的試料は、試験しようとする被験者のそれと同質である。工程（ａ）で決定された数値が低ければ低いほど、将来、炎症性腸疾患を発症するリスクは高くなる。
【００７５】
ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有するＦ．プラウスニッツィに特異的な制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率の決定
本発明の第一から第三の態様におけるＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有するＦ．プラウスニッツィに特異的な制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定する工程は、典型的には、２つの工程で行なわれる：
−ｉ）表面タンパク質ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８αの存在に基づいた、及び場合により表面タンパク質ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ３及びＩＣＡＭ−１及びＣＤ１２７の全て又は一部の存在に基づいた正の選択と、ｉｉ）ＦＯＸＰ３及びＣＤ８βなどの、非ＤＰ８αＴレグに特異的な表面マーカーを含む細胞に対する負の選択とを組み合わせたものを使用した、工程（Ｉ）の免疫学的選択。
【００７６】
ＤＰ８αＴレグの表面に提示されたタンパク質に特異的な標識抗体を使用した免疫選別法は、ＤＰ８αＴレグの定量に特に適している。これらの方法は当技術分野において公知である。本発明の方法に有用な好ましい免疫学的選択／免疫選別法としては、フローサイトメトリー、特に蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００７７】
−Ｆ．プラウスニッツィに特異的な工程（Ｉ）で得られたＤＰ８αＴレグの数を決定する工程（ＩＩ）。そうするために、工程（Ｉ）で得られたＤＰ８αＴレグを、Ｆ．プラウスニッツィに特異的な細胞の活性化を可能とする条件下で、Ｆ．プラウスニッツィ又はＦ．プラウスニッツィの断片が負荷されたＡＰＣと接触させることができる。例えば、Ｆ．プラウスニッツィ誘導性ＤＰ８αＴレグの比率は、Ｆ．プラウスニッツィ又はＦ．プラウスニッツィの断片が負荷されたＡＰＣと接触させた後、制御性Ｔ細胞によって典型的には分泌されるサイトカイン、特にＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１０を分泌する、工程（Ｉ）で得られたＤＰ８αＴレグの数を（例えばフローサイトメトリーによって）測定することによって決定することができる。工程（ＩＩ）を実施するために使用されるＡＰＣは、職業的ＡＰＣであっても、非職業的ＡＰＣであってもよい。好ましくは、ＡＰＣは職業的ＡＰＣであり、それらはより好ましくは、樹状細胞、マクロファージ、又は単球からなる群より選択される。
【００７８】
１つの実施態様では、工程（Ｉ）を工程（ＩＩ）の前に実施する。あるいは、工程（ＩＩ）を工程（Ｉ）の前に実施してもよい。
【００７９】
本出願の実施例に提供されたプロトコールを例えば使用し得る。
【００８０】
炎症性腸疾患を処置又は予防する方法
養子免疫療法
第四の態様では、本発明は、このような療法を必要とする被験者における炎症性腸疾患を処置又は予防する方法に関し、該方法は、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の単離された集団の治療有効量を患者に投与する工程を含む又はからなる、養子免疫療法である。
【００８１】
本発明の第五の態様は、炎症性腸疾患の処置の医薬品として使用するための、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球、好ましくは制御性リンパ球の単離された集団に関する。
【００８２】
好ましくは、本発明のこれらの態様を実施するために使用されたＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球を、粘膜固有層から（すなわち粘膜固有層リンパ球）又は血液から（すなわち末梢血リンパ球）単離する。
【００８３】
好ましい実施態様では、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の単離された集団を、処置しようとする被験者から入手する（すなわち自己リンパ球）。自己リンパ球の使用が特に有利である、なぜなら、レシピエントによる投与されたリンパ球の拒絶が回避されるからである。
【００８４】
代替的な好ましい実施態様では、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の単離された集団は、同種リンパ球であり、すなわち、Ｔレグは、処置しようとする被験者ではないヒトドナーから得られる。
【００８５】
処置しようとする被験者による同種リンパ球の拒絶は、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型によって特徴付けられる制御性Ｔリンパ球の単離された集団の投与前及び／又は投与後に、免疫抑制剤を患者に投与することによって防御され得る。好ましくは、ヒトドナーは健康なドナーである。
【００８６】
この代替的な実施態様の主な利点は、同種リンパ球集団を、直ちに入手可能であるリンパ球バンク内から選択することができることである。
【００８７】
拒絶を最も強力に誘発する移植組織の表面上の抗原は、血液型（ＡＢＯ）抗原及び主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質（ヒトでは白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質とも呼ばれる）である。それ故、拒絶のリスクを制限するために、これらの抗原に関して投与しようとする患者と最善に適合する同種リンパ球集団が選択されるだろう。
【００８８】
主要組織適合性遺伝子複合体（すなわちＭＨＣ）として知られる第６染色体上に位置する領域を形成する遺伝子クラスターによってコードされるＨＬＡタンパク質は、移植片拒絶において重要な役割を果たす。
【００８９】
ＭＨＣ遺伝子は多遺伝子性であり、すなわち、どの個体も複数の異なるＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を有する。
【００９０】
ＭＨＣ遺伝子はまた多型でもあり、すなわち、各遺伝子の多くの変異体がヒト集団に存在する。各々のＭＨＣクラスＩ受容体は、可変α鎖及び比較的保存されたβ２−ミクログロブリン鎖からなる。３つの異なり高度に多型のクラスＩα鎖遺伝子が同定された。これらは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃと呼ばれる。ヒトにおいては、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱと呼ばれる、ＭＨＣクラスＩＩ［α］鎖及び［β］鎖遺伝子の３つの対が存在する。
【００９１】
したがって、患者／ドナーのマッチングを決定するために、患者及びドナーの両方のクラスＩ ＨＬＡ−Ａ、クラスＩ ＨＬＡ−Ｂ、クラスＩ ＨＬＡ−Ｃ、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＰ、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＱ、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ、及び／又は「ＡＢＯ」血液型抗原を比較しなければならない。
【００９２】
ＭＨＣ（ＨＬＡ）抗原及び血液型（ＡＢＯ）抗原の分類を、当業者に周知の様々な手段によって実施することができる。例えば、分類は、（ｉ）特定のＭＨＣ分子に特異的な抗体を使用してドナー細胞又はレシピエント細胞上の標的化ＭＨＣ分子の存在を検出するという血清学的検査によって、例えばリンパ球細胞障害性試験によって；又は（ｉｉ）ＭＨＣ対立遺伝子のＤＮＡのヌクレオチド配列の直接的な分析によって（例えば、配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を使用した方法、及び／又は、様々なＭＨＣ対立遺伝子に存在する独特な配列を検出するように設計された配列特異的オリゴヌクレオチドが結合したＤＮＡチップを使用する蛍光検出法の使用によって）実施され得る。
【００９３】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球
本発明の第四及び第五の態様に使用されるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球集団は、どの実施態様であれ、一次培養細胞又は一次培養細胞から導かれた樹立細胞株である。
【００９４】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球は、生物学的試料から単離され得る。該生物学的試料は、「定義」の章で上記に定義された通りであり得る。
【００９５】
好ましい実施態様では、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球は、血液試料又は大腸粘膜試料から単離される。
【００９６】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の単離は、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球によって発現されている又は発現されていない表面タンパク質による正及び負の選択を使用することによって実施され得る。細胞表面タンパク質の有無に基づいた細胞の単離法／選択法は当業者には周知である。例えば、これらの細胞は、選択された細胞表面タンパク質に選択的に結合する抗体を使用した免疫学的選択／免疫選別によって単離／精製され得る。ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の単離／精製は、本発明の実施例１の「細胞の単離及び細胞株の作製」と題した段落に記載されているように実施され得る。
【００９７】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球を、以下のプロセスに従って未感作ＣＤ４ Ｔ細胞からも得ることができる。
【００９８】
本発明はまた、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を得るための、プロセス、特にインビトロでのプロセスに関し、該プロセスは、以下の工程を含む：
ａ）Ｆ．プラウスニッツィの存在下、及び場合により酪酸塩の存在下でＡＰＣ（抗原提示細胞）を培養し、これによりＦ．プラウスニッツィが負荷されたＡＰＣを得る工程、及び
ｂ）未感作ＣＤ４ Ｔ細胞を、
○工程ａ）で得られたＦ．プラウスニッツィが負荷されたＡＰＣ、
○場合により、ＩＬ−２、及び
○場合により、酪酸塩
の存在下で培養し、これにより、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を得る工程。
【００９９】
工程ａ）の目的は、Ｆ．プラウスニッツィが負荷されたＡＰＣを得ることである。
【０１００】
ＡＰＣは「定義」の章で上記に定義されている通りであり得る。
【０１０１】
好ましい実施態様では、工程ａ）で使用されるＡＰＣは単球及び／又は単球由来未熟樹状細胞である。
【０１０２】
単球は、例えば、当業者に周知の任意の方法によってＰＢＭＣから得ることができる。例えば、単球は、MiltenyiのＣＤ１４マイクロビーズポジティブセレクションキットを使用してＰＢＭＣから単離される。
【０１０３】
単球由来未熟樹状細胞は、当業者には周知の任意の方法によって単球から得ることができる。例えば、単球由来未熟樹状細胞は、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球（ＣＤ１４＋）を培養することによって得られる。ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下での単球の培養は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間、例えば３日間であり得る。ＩＬ−４の濃度は、２００ IU/mlから５００ IU/ml、好ましくは２００ IU/mlから３００ IU/ml、例えば２００ IU/mlであり得る。ＧＭ−ＣＳＦの濃度は、１００ IU/mlから１０００ IU/ml、好ましくは５００ IU/mlから１０００ IU/ml、例えば１０００ IU/mlであり得る。
【０１０４】
工程ａ）の培養は、１０時間から１６時間、好ましくは１２時間から１４時間行なわれ得る。
【０１０５】
工程ａ）では、単球及び／又は単球由来未熟樹状細胞を任意の適切な培養培地中で培養し得る。単球及び／又は単球由来未熟樹状細胞の培養に適した培養培地は当業者には周知である。
【０１０６】
例えば、培養工程ａ）は、好ましくはウシ胎児血清、ヒト血清アルブミン又はヒト血漿の補充された、ＲＰＭＩを含む又はからなる培地中で行なわれ得る。
【０１０７】
工程ｂ）の目的は、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞から、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球への分化を誘導することである。
【０１０８】
未感作ＣＤ４ Ｔ細胞は、表現型ＣＤ４ ＣＤ４５ ＲＡ＋ＲＯ−によって特徴付けられる。
【０１０９】
未感作ＣＤ４ Ｔ細胞を、当業者には周知の任意の方法によってＰＢＭＣ又はＰＢＬから得ることができる。例えば、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞は、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞のためのEasySepネガティブセレクションキット（STEMCELL technologies）を使用してＰＢＭＣ又はＰＢＬから得られる。
【０１１０】
工程ｂ）の培養は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間、例えば４〜１２日間、好ましくは４〜１０日間、より好ましくは４〜６日間行なわれ得る。
【０１１１】
工程ｂ）の培養は、例えば、４、５又は６日間行なわれる。
【０１１２】
工程ｂ）の培養は、任意の適切な培養培地中で行なわれ得る。未感作ＣＤ４ Ｔ細胞、単球、及び／又は単球由来未熟樹状細胞の培養に適した培養培地は当業者には周知である。
【０１１３】
例えば、培養工程ｂ）は、好ましくはヒト血清のプールが補充されたＲＰＭＩを含む又はからなる培地中で行なわれ得る。
【０１１４】
ＩＬ−２は、工程ｂ）において、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞の分化又は増殖の効率を改善するために使用され得る。ＩＬ−２は、例えば、工程ｂ）の培養培地に加えられる。
【０１１５】
酪酸塩を工程ａ）及び／又は工程ｂ）に使用して、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞の分化の効率を改善させ得る。
【０１１６】
酪酸塩は、例えば、工程ａ）の培養培地及び／又は工程ｂ）の培養培地に加えられる。
【０１１７】
培養培地中の酪酸塩の濃度は、好ましくは、０．１２５mMから０．５mM、より好ましくは０．１２５mMから０．２５mMで含まれる。例えば、培養培地中の酪酸塩の好ましい濃度は、０．１４５mMである。
【０１１８】
酪酸塩（「ブタン酸塩」とも呼ばれる）は、酪酸（ブタン酸としても知られる）の共役塩基である。酪酸塩の式はＣ４Ｈ７Ｏ２−である。
【０１１９】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を得るためのプロセスは、例えば、実施例８に開示されている。
【０１２０】
一次培養細胞は、生存組織（例えば組織試料又は血液試料）から直接単離された細胞である。これらの細胞は、その単離後に非常に僅かな集団倍加しか経なかった。
【０１２１】
一次培養細胞から導かれた細胞株の作製法は当業者には公知であり、これには特に、Gregori et al.（Methods Mol Biol., 677: 31-46, 2011）によって記載された方法が挙げられる。例えば、Ｔ細胞株を、Fonteneau et al.（J Immunol 159, 2831-2839, 1997）によって記載されているように、ＰＨＡ、放射線照射されたフィーダー細胞、及びＩＬ−２による刺激によって作製することができる。
【０１２２】
好ましくは、本発明の第四及び第五の態様を実施するために使用されたＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球集団を、どの実施態様であれ、事前に活性化及び増大させた。
【０１２３】
Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の活性化及び／又は増大（「増殖」とも呼ばれる）は、これらのＴレグを、Ｆ．プラウスニッツィに特異的な細胞が活性化されることを可能とする条件下で、Ｆ．プラウスニッツィ又はＦ．プラウスニッツィの断片が負荷されたＡＰＣと接触させることによって行なわれ得る。活性化は、ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球（細胞株又は一次細胞）が、制御性Ｔ細胞によって典型的には分泌されるサイトカイン、特にＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１０を発現するかどうかを決定することによって評価され得る。
【０１２４】
ＡＰＣは職業的ＡＰＣであっても、非職業的ＡＰＣであってもよい。好ましくは、ＡＰＣは職業的ＡＰＣである。より好ましくは、ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、又は単球からなる群より選択される。
【０１２５】
ＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の増殖を、ＣＤ３活性化及び／又はＣＤ２８活性化時にエクスビボ（又はインビトロ）でトリガーすることもできる（例えば、増殖を、これらの表面タンパク質に対して指向される抗体を使用することによって誘導することができる）。
【０１２６】
本発明の第四の態様による方法の好ましい実施態様は、以下の工程を含む又はからなる：
（ｉ）Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球集団を単離する工程；
（ｉ’）場合により、工程（ｉ）のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球集団から細胞株を作製する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性Ｔリンパ球集団、又は適宜工程（ｉ’）の細胞株を、これらの細胞を、
−ＣＤ３及び／又はＣＤ２８経路（群）を活性化するのに適した化合物（例えば、抗ＣＤ３抗体ＣＤ２８抗体、酢酸ミリスチン酸ホルボール及び／又はカルシウムイオノホア）；及び／又は
−Ｆ．プラウスニッツィ又はＦ．プラウスニッツィの断片が負荷されたＡＰＣ
を含む培養培地中で培養することによって、活性化及び／又は増大させる工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する活性化及び／又は増大された制御性Ｔリンパ球を治療有効量で患者に投与する工程。
【０１２７】
好ましくは、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球集団は、処置しようとする被験者から単離される。
【０１２８】
本発明の脈絡において、本発明の第四及び第五の態様を実施するために使用されるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球は、どの実施態様であれ、好ましくは有効量で（すなわち、投与された被験者において過度に負の作用を引き起こすことなく、ＩＢＤを処置／予防することのできる量で）医薬組成物へと製剤化される。
【０１２９】
処置しようとする被験者において必要とされるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の投与量は、数多くの因子、共同刺激分子（例えばサイトカインなど）の存在及び性質、投与形態、被験者の年齢、体重、容態、投与経路、投与頻度、医薬組成物中の他の成分、及び疾患の重度に応じて変動し得る。一般的に、ＩＢＤの処置又は予防に使用するためのＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球は、約１０５の細胞/kgから約１０８個の細胞/kg、あるいは約１０７個の細胞/kgから約１０８個の細胞/kg、好ましくは約０．１×１０６個の細胞/kgから５×１０６個の細胞/kgの範囲で投与され得る。
【０１３０】
適切な投与経路の例としては、粘膜表面（例えば直腸、大腸、小腸、消化管など）への非経口経路（例えば筋肉内、皮下、静脈内、経動脈的に、腹腔内など）が挙げられるがこれらに限定されない。実施態様によっては、投与は複数の場所に行なわれ得る。
【０１３１】
好ましくは、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球、又はこれらのＴレグを含む医薬組成物は、腹腔内に、及び／又は消化管に、及び／又は粘膜表面（好ましくは大腸粘膜）に投与される。
【０１３２】
活発な免疫療法
第六の態様では、本発明は、このような療法を必要とする被験者における炎症性腸疾患を処置又は予防する方法に関し、該方法は、
（ｉ）単離されたＦ．プラウスニッツィ菌株；
（ｉｉ）単離された弱毒生菌Ｆ．プラウスニッツィ株；
（ｉｉｉ）単離された死菌Ｆ．プラウスニッツィ株；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも１つの菌株の少なくとも１つの断片；
（ｖ）化合物（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つが負荷された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは単離されたＡＰＣ
からなる群より選択された少なくとも１つの化合物の治療有効量を投与することによる、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球のインビボでの活性化及び／又はその増殖の誘導の工程を含む又はからなる。
【０１３３】
第七の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の処置におけるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を活性化及び／又はその増殖を誘導するための医薬品としての、
（ｉ）Ｆ．プラウスニッツィ菌株；及び／又は
（ｉｉ）弱毒生菌Ｆ．プラウスニッツィ株；及び／又は
（ｉｉｉ）死菌Ｆ．プラウスニッツィ株；及び／又は
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも１つの菌株の少なくとも１つの断片；及び／又は
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つが負荷された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは単離されたＡＰＣ
を含む組成物に関する。
【０１３４】
本明細書に記載のＦ．プラウスニッツィ菌株（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、断片（ｉｖ）、及び負荷されたＡＰＣ（ｖ）は好ましくは医薬組成物へと製剤化される。
【０１３５】
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）をＡＰＣに負荷するためのプロトコールは当業者には周知である。
【０１３６】
本出願の実施例に提供されたプロトコールが例えば使用され得る。
【０１３７】
（ｖ）のＡＰＣを、処置しようとする被験者から（自己ＡＰＣ）、又はドナー（同種ＡＰＣ）から得ることができる。好ましくは、ＡＰＣを、処置しようとする被験者から得る。
【０１３８】
（ｖ）のＡＰＣがドナーから得られる場合、投与されたＡＰＣの拒絶のリスクを制限するために、好ましくは同種ＡＰＣは、それらが処置しようとする被験者と最善に適合するように選択される。上記のように、患者／ドナーのマッチングを決定するために、被験者及びドナーの両方のクラスＩ ＨＬＡ−Ａ、クラスＩ ＨＬＡ−Ｂ、クラスＩ ＨＬＡ−Ｃ、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＰ、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＱ、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ、及び／又は「ＡＢＯ」血液型抗原を比較しなければならない。
【０１３９】
好ましくは、ＡＰＣは職業的ＡＰＣである。より好ましくは、ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、単球、又は、Ｆ．プラウスニッツィの抗原に特異的なＢ細胞受容体を発現し、かつさらに内部移行してクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合してその表面にこの抗原を提示することができるＢリンパ球からなる群より選択される。
【０１４０】
Ｆ．プラウスニッツィ菌株（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、断片（ｉｖ）、及び負荷されたＡＰＣ（ｖ）は、医薬組成物において有効量で、すなわち、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の活性化及び／又は増大を誘導することのできる量で使用され、よって、投与されたＴレグは、投与された被験者において過度の負の作用を引き起こすことなくＩＢＤを処置／予防することができる。
【０１４１】
処置しようとする被験者においてＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の活性化及び／又は増大を誘導するのに必要とされる、Ｆ．プラウスニッツィ菌株（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、断片（ｉｖ）、及び負荷されたＡＰＣ（ｖ）の投与量は、使用される具体的な抗原（すなわち化合物（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ））又はその組合せ、共同刺激分子（例えばサイトカインなど）の存在及び性質、投与形態、被験者の年齢、体重、容態、投与経路、投与頻度、医薬組成物中の他の成分、及び疾患の重度をはじめとする、数多くの因子に応じて変動し得る。
【０１４２】
一般的には、本発明の第六及び第七の態様によるＩＢＤの処置又は予防に使用するために負荷されたＡＰＣは、約１０３個の細胞/kgから約１０７個の細胞/kg、好ましくは約１０５個の細胞/kgから１０６個の細胞/kgの範囲内で投与され得る。Ｆ．プラウスニッツィ菌株は、約１０４個の細菌/kgから約１０８個の細菌/kg、あるいは約１０６個の細菌/kgから約１０７個の細菌/kg、好ましくは約１０５個の細菌/kgから約１０６個の細菌/kgの範囲内で投与され得る。弱毒生菌Ｆ．プラウスニッツィ株は、約１０４個の細菌/kgから約１０８個の細菌/kg、あるいは１０６個の細菌/kgから約１０７個の細菌/kg、好ましくは約１０５個の細菌/kgから約１０６個の細菌/kgの範囲内で投与され得る。死菌Ｆ．プラウスニッツィ株は、約１０４個の細菌/kgから約１０８個の細菌/kg、あるいは約１０６個の細菌/kgから約１０７個の細菌/kg、好ましくは約１０５個の細菌/kgから約１０６個の細菌/kgの範囲内で投与され得る。
【０１４３】
適切な投与経路の例としては、粘膜表面（例えば直腸、大腸、小腸、消化管など）への非経口経路（例えば筋肉内、皮下、静脈内、経動脈的に、腹腔内など）が挙げられるがこれらに限定されない。実施態様によっては、投与は複数の場所に行なわれ得る。
【０１４４】
また、化合物（ｉ）から（ｖ）、特に負荷されたＡＰＣを、適切なリンパ組織に、特に粘膜に関連したリンパ組織に直接投与してもよい。
【０１４５】
有利な実施態様では、化合物（ｉ）から（ｖ）、又はこれらの１つ以上の化合物を含む医薬組成物を、腹腔内に及び／又は粘膜表面に（例えば直腸、大腸、小腸、消化管など）及び／又は腸の粘膜に関連したリンパ組織及び／又は腸に関連したリンパ組織（すなわちパイエル板、リンパ濾胞、及び／又は粘膜固有層）に投与する。
【０１４６】
本明細書において使用される「医薬組成物」という用語は、それが投与される濃度で、処置しようとする被験者にとって有害ではなくかつ過度に毒性ではない、キャリア媒体又は希釈剤を指す。
【０１４７】
さらに、医薬組成物は、活性物質（すなわち、本発明の第四及び第五の態様の脈絡では、Ｆ．プラウスニッツィ菌株に特異的なＤＰ８αＴレグ；本発明の第五及び第七の態様の脈絡では、Ｆ．プラウスニッツィ菌株（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、断片（ｉｖ）及び負荷されたＡＰＣ（ｖ））の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ有害ではない。
【０１４８】
薬学的に許容される担体は、投与形態及び活性物質（すなわち、本発明の第四及び第五の態様の脈絡では、Ｆ．プラウスニッツィ菌株に特異的なＤＰ８αＴレグ；本発明の第五及び第七の態様の脈絡では、Ｆ．プラウスニッツィ菌株（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、断片（ｉｖ）及び負荷されたＡＰＣ（ｖ））の性質に応じて、当業者によって慣用的に選択され得る。適切な医薬組成物の例としては、生理的水（ＮａＣｌ ０．９％）、塩溶液（例えばリンガー液）、ヒト血清アルブミン溶液などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
活性物質が生細胞である場合、該生細胞にとって毒性がないように医薬組成物は注意深く選択されなければならない。
【０１５０】
炎症性腸疾患の処置の効力をモニタリングする方法
第八の態様では、本発明はさらに、処置の最中の被験者の生物学的試料中におけるＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率をモニタリングすることを含む、炎症性腸疾患の予防的処置又は治癒的処置の効力をモニタリングする方法を提供する。
【０１５１】
処置の経過中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率の増加は、処置が効果的であることを示し得る。
【０１５２】
好ましくは、処置は、免疫抑制剤（特に、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、タクロリムス、シクロスポリン）、生物学的製剤（特に、モノクローナル抗体、例えば抗ＴＮＦα抗体）、腸内有益菌（すなわち、宿主に対して健康上の恩恵を付与し得る生きている微生物）、又は抗生物質を含む又はからなる。
【０１５３】
あるいは、処置は、Ｆ．プラウスニッツィ（生菌、弱毒生菌；及び／又は死菌Ｆ．プラウスニッツィ株）の投与を含む又はからなる。好ましくは、腸内有益菌及びＦ．プラウスニッツィは、上記のような医薬組成物へと製剤化される。
【０１５４】
好ましくは、生物学的試料は、大腸粘膜試料、血液試料、又は血液分画、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。
【０１５５】
本発明によるキット
本発明は、本発明の上記の方法及び使用において有用なキットを提供する。
【０１５６】
本発明の第九の態様は、ＩＢＤを診断、予後予測、及び／若しくはその発症リスクを予測するための、並びに／又は、ＩＢＤの処置の効力をモニタリングするためのキットに関する。このようなキットは、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定するための手段を含む。このような手段は、ＤＰ８αＴレグに特異的な表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ３及びＩＣＡＭ−１及びＣＤ１２７）の存在に基づいた正の選択を可能とする、これらのタンパク質に特異的な抗体、及び、負の選択を実施するための非ＤＰ８αＴレグに特異的な表面マーカー（例えばＦＯＸＰ３及びＣＤ８β）に特異的な抗体を含む。
【０１５７】
キットに使用される抗体を、検出可能な化合物、例えばフルオロフォア又は放射性化合物を用いて標識することができる。あるいは、該キットはさらに、標識されていない一次抗体に結合する、検出可能な化合物で標識された、二次抗体を含む。
【０１５８】
１つの実施態様によると、該キットは、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定するための手段の他に、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球を既知の数及び／又は濃度及び／又は比率で含む１つ以上の対照試料（「対照標準値」）を含み、前記の数及び／又は濃度及び／又は比率は、所与の被験者集団（例えば、健康な被験者、ＩＢＤを患っている患者、寛解している患者、疾患を発症するリスクのある患者）を示す。
【０１５９】
さらに、該キットは、ｉ）被験者がＩＢＤを発症するリスクがあるかどうかを予測する、及び／又はｉｉ）ＩＢＤを診断する、及び／又はｉｉｉ）ＩＢＤを予後予測する際の該キットの使用説明書を含み得る。
【０１６０】
該キットはまた、生物学的試料中のＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率と、可能性ある疾患の転帰（再発、短期間又は長期間の寛解、重度な病型への進行）との間の関係を示した、標準的な検量曲線を含み得る。
【０１６１】
標準的な検量曲線は、転帰が既知である患者の大規模コホートにおいてＦ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する制御性Ｔリンパ球の数及び／又は濃度及び／又は比率を決定することによって得ることができる。
【０１６２】
本発明の第十の態様はさらに、
−包装材料；
−既知の量の：
（ｉ）Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性リンパ球集団、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｉｉ）単離されたＦ．プラウスニッツィ菌株、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｉｉｉ）単離された弱毒生菌Ｆ．プラウスニッツィ株、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｉｉｉｉ）単離された死菌Ｆ．プラウスニッツィ株、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｖ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つの菌株の少なくとも１つの断片、又はその医薬組成物；及び／又は
（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つが負荷された；化合物（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）の少なくとも１つが負荷された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは単離されたＡＰＣ、又はその医薬組成物、及び／又は
−「薬物」（ｉ）〜（ｖｉ）又はその医薬組成物が、ＩＢＤを患う又はＩＢＤを発症するリスクのある被験者における、ＩＢＤ、好ましくはクローン病の予防及び／又は処置において有効であることを示す、該包装材料と共に含まれるラベル又は添付文書
を含む又はからなる、炎症性腸疾患を処置又は予防するためのキットに関する。
【０１６３】
特定の実施態様では、本明細書に記載の製品は、薬物（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群より選択された少なくとも１つの薬物を用いての処置についての禁忌のリストをさらに示す、ラベル又は添付文書を含む。
【０１６４】
好ましくは、Ｆ．プラウスニッツィに特異的なＣＤ４＋ＣＤ８αα低いＦｏｘｐ３陰性表現型を有する単離された制御性リンパ球集団は、活性化された集団である。
【０１６５】
実施態様のいずれか１つによる本発明の第一から第十の態様の好ましい実施において、炎症性腸疾患はクローン病である。
【０１６６】
学術雑誌の記事若しくは抄録、公開された特許出願、発行された特許、又は任意の他の参考文献をはじめとする本明細書に引用された全ての参考文献を、引用された参考文献に提示された全てのデータ、表、図、及び文章を含め、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６７】
本発明はさらに、以下の図面及び実施例によって説明されるだろう。しかし、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、ＣＤ４とＣＤ８α又はＣＤ８βのいずれかとの共発現についての、新たに分離したＣＤ３ ＬＰＬのフローサイトメトリー分析の結果を示す。それは、ダブルポジティブなＣＤ４ＣＤ８ααＴリンパ球（ＤＰ８α）が健康な大腸粘膜の粘膜固有層に高い頻度で出現し、そのＣＤ４ＣＤ８αα表現型は培養液中で依然として安定であることを示した。（ａ）１２人のドナーのＣＤ３腸管上皮細胞間リンパ球の中で、ＣＤ８α又はＣＤ８βを共発現しているＣＤ４ Ｔ細胞の代表的な度数；＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応ｔ検定）。（ｂ）ＣＤ３又はＣＤ３ＣＤ４ ＬＰＬ（ｎ＝１８）の中でのＣＤ４ＣＤ８αα低い細胞の度数。（ｃ）培養液中での数回の継代後、ＦＡＣＳにより選別されたＤＰ８α大腸ＬＰＬから得られた、（４つの代表的な）細胞株による、ＣＤ４と、ＣＤ８βではなくＣＤ８αとの安定な共発現。
【図２】図２は、ＣＤ４とＣＤ８α又はＣＤ８βのいずれかとの共発現についての、新たに分離した腸管上皮細胞間リンパ球のフローサイトメトリー分析を示す。それは、健康な大腸粘膜の上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）中のダブルポジティブなＣＤ４ＣＤ８Ｔリンパ球の存在を示した。８人のドナーのＣＤ３ ＩＥＬの中でＣＤ８α又はＣＤ８βを共発現しているＣＤ４ Ｔ細胞の代表的なドットプロット（図２ａ）及び度数（図２ｂ）；＊＊Ｐ＜０．０１（対応ｔ検定）。
【図３】図３は、フローサイトメトリーによって評価された、ＤＰ８α ＬＰＬの制御性表現型を示す。（代表的な３つの対の）自己ＤＰ８α ＬＰＬ株とＣＤ４ ＬＰＬ株の表現型の比較。
【図４】図４は、フローサイトメトリーによって評価された、ＤＰ８α ＬＰＬの制御性表現型を示す。（代表的な３つの）健康な大腸粘膜から新たに分離されたＣＤ３ ＬＰＬの中のＤＰ８αリンパ球及びＣＤ４リンパ球の表現型。
【図５】図５は、フローサイトメトリーによって評価された、ＤＰ８α ＬＰＬの制御性表現型を示す。（代表的な３つの）ＤＰ８α細胞株による転写因子の発現。
【図６】図６は、フローサイトメトリーによって評価された、ＤＰ８α ＬＰＬの制御性表現型及びサイトカインプロファイルを示す。（ａ）ＢＦＡの存在下で抗ＣＤ３抗体を用いて５時間刺激された（代表的な３つの）ＤＰ８α ＬＰＬ株におけるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−２についての細胞内染色。（ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定された４８時間かけて抗ＣＤ３抗体によって活性化された（黒いヒストグラム）又は活性化されていない（白いヒストグラム）ＤＰ８α ＬＰＬ株（ｎ＝３）の上清中のＩＬ−１０。
【図７】図７は、ＤＰ８α ＬＰＬのマーカー及びサイトカインプロファイルを示す。（ａ）フローサイトメトリーによって評価された、健康な大腸粘膜固有層試料から新たに分離されたＤＰ８α ＬＰＬによる転写因子の発現。（ｂ）図６ａにおいて評価されているような、大腸粘膜固有層試料から新たに分離されたＤＰ８α ＬＰＬによって産生されたサイトカイン。（ｃ）ＥＬＩＳＡによって測定された４８時間かけて抗ＣＤ３抗体によって活性化されたＤＰ８α ＬＰＬ株及びＣＤ４ ＬＰＬ株（ｎ＝３）の上清中のＩＬ−１０。
【図８】図８は、フローサイトメトリーによって評価されたＤＰ８α ＬＰＬ株の制御機能を示す。（ａ）ＤＰ８α ＬＰＬは、ＣＤ８３及びＣＤ８６のアップレギュレーションの阻害によって示されるように、活性化ＣＤ４リンパ球によって誘導されたｉＤＣの成熟を遮断し、この阻害は、抗ＣＴＬＡ−４抗体及び抗ＬＦＡ−１抗体によって部分的に中和される。未熟ＤＣを、ＤＰ８α ＬＰＬ及び抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＬＦＡ−１抗体の存在下又は非存在下で、活性化ＣＤ４リンパ球（ＣＤ４０Ｌを発現している）と共に５日間インキュベートした。ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現レベルを、ゲーティングにかけたＣＤ３陰性細胞で測定した：ＣＤ８３及びＣＤ８６のＲＦＩ（相対蛍光強度）についての代表的なヒストグラム及び中央値；（ｎ＝６、３つの細胞株を用いて実施された２回の実験）；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊Ｐ＜０．０５（対応ｔ検定）。（ｂ）ＣＦＳＥの希釈率によって測定されるような、ＤＰ８αＬＰＬ株Ｃ１１４、Ｃ１３９及びＣ１９２によるＣＤ４ ＰＢＬの増殖応答の阻害。健康なドナーのＰＢＭＣから選別されたＣＤ４ ＰＢＬを、ＤＰ８αＬＰＬの存在下又は非存在下において１：１の比で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激した：刺激されていない（白色のヒストグラム）、刺激された（黒いヒストグラム）、及びＤＰ８αＬＰＬの存在下で刺激された（灰色のヒストグラム）ＣＤ８陰性リンパ球（ｎ＝１８：３つの細胞株を用いて実施された６回の実験）の平均的なＣＦＳＥの希釈率を示した代表的なサイトメトリーデータ及びヒストグラム；＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応ｔ検定）。（ｃ）示されたＥ：Ｔ比でのＤＰ８αＬＰＬによるＣＤ４リンパ球増殖の阻害％。（ｄ）抗ＩＬ−１０抗体又は抗ＴＧＦ−βＲ遮断抗体の存在下又は非存在下での１：１の比でのＤＰ８αＬＰＬによるＣＤ４リンパ球増殖の抑制％；＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応ｔ検定）。
【図９】図９は、ＤＰ８αＬＰＬ株が、腸内共生細菌のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆ）に特異的に応答することを示す。（ａ）抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体若しくは関連抗体の存在下若しくは非存在下で一晩かけてＦが負荷された、又は負荷されていない、あるいはＢ、Ｌ若しくはＥが負荷された同種単球と共に３日間共培養した後の、ＤＰ８αＬＰＬ株（ｎ＝４）の増殖応答（ＶＰＤの希釈率）のフローサイトメトリー分析：ＶＰＤの低い細胞の平均比率（ｎ＝６：３つのＤＰ８αＬＰＬ株を用いて実施された２回の独立した実験；＊＊Ｐ＜０．０１（対応ｔ検定））。（ｂ）抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体若しくは関連抗体の存在下若しくは非存在下で一晩かけてＦ（１：５）が負荷された、又は負荷されていない、又はＢ、Ｌ若しくはＥが負荷された同種単球により６時間刺激した後の、ＤＰ８αＬＰＬ株（ｎ＝４）のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０応答のフローサイトメトリー分析：独立した実験における、ＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１０を産生するＤＰ８α細胞の平均％、並びにＩＬ−１０又はＩＦＮ−γを分泌する細胞の比率（４つの細胞株を用いて実施された２〜７回の実験：Ｃ１１４：黒丸；Ｃ１３９：白丸；Ｃ１９２：白い四角、及びＣ１４０：黒い四角）；＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応ｔ検定）。
【図１０】図１０は、Ｆ反応性ＣＤ４ＣＤ８αα低い（ＤＰ８α）Ｔリンパ球が健康な被験者の血液中に存在することを示す。（ａ）１８人のドナーの血液中のＤＰ８α Ｔリンパ球の度数のフローサイトメトリー分析：ＣＤ３及びＣＤ３ＣＤ４ ＰＢＭＣの中のＤＰ８αリンパ球の比率。（ｂ）抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体又は関連抗体の存在下又は非存在下におけるＦに対する、並びにＢ、Ｌ及びＥに対する、ＤＰ８α末梢血Ｔ細胞の増殖応答（ＶＰＤ希釈率％）。ＰＢＭＣを抗体及び／又は示された細菌と共に、細菌：ＰＢＭＣの比１：１で５日間培養した：いくつかのドナーのＰＢＭＣ中のＶＰＤ低いＤＰ８αＴ細胞の比率；＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊Ｐ＜０．０１（対応ｔ検定）。（ｃ）Ｆと共に５日間共培養したＰＢＭＣの中の対を成したＤＰ８α Ｔ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞のＶＰＤ希釈率％；＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応ｔ検定）。
【図１１】図１１は、ＣＤ４ＣＤ８α低いＰＢＬ（ＤＰ８α ＰＢＬ）から得られた細胞株（ｎ＝３）が、制御性ＤＰ８α ＬＰＬ株に表現型的に及び機能的に類似していることを示す。（ａ）ＤＰ８αＰＢＬ株は、ＣＤ４ ＰＢＬ株とは対照的に、Ｔレグ表現型を有していた。（ｂ）インビトロでのＤＰ８α ＰＢＬ株によるＣＤ４ Ｔリンパ球増殖の代表的な阻害（ｎ＝６：３つの細胞株を用いて実施された２回の実験）。（ｃ）ＥＬＩＳＡによって測定されるような、抗ＣＤ３抗体を用いての刺激時のＤＰ８α ＰＢＬ株によるＩＬ−１０の分泌。（ｄ）ＤＰ８α ＰＢＬ株によるＤＣ成熟の代表的な阻害（ｎ＝６：３つの細胞株を用いて実施された２回の実験）。（ｅ）Ｆ、Ｂ、Ｌ若しくはＥが負荷された又は負荷されていない単球に対するＤＰ８α ＰＢＬ株のＩＬ−１０及びＩＦＮ−γ応答：ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０分泌細胞の代表的な比率（２〜３つの細胞株を用いて実施された３回の実験）。＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応ｔ検定）。
【図１２】図１２は、ＤＰ８α ＬＰＬ及びＰＢＬの度数が、それぞれ健康な粘膜及び血液試料と比較して、ＩＢＤ患者の試料においてより低く、そして、活動性ＩＢＤ患者のＰＢＬのＦに対する応答は、健康なドナー及び寛解しているＩＢＤ患者のＰＢＬと比較して低下していることを示す。（ａ）ＩＢＤ患者の炎症が起こった粘膜（黒丸、ｎ＝１４）及びＣＣ患者の健康な大腸粘膜（白丸、ｎ＝１８）から新たに分離したＣＤ３ ＬＰＬ中のＤＰ８αリンパ球の代表的な度数。＊Ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｂ）ＩＢＤ患者（黒丸、ｎ＝３０）及び健康なドナー（白丸、ｎ＝１８）におけるＤＰ８α ＰＢＬの代表的な度数。＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｔ検定）。（ｃ）Ｆと共に５時間共培養した後の、健康なドナー（ＨＤ）（ｎ＝２１）又はＩＢＤ患者（ｎ＝２０）のＤＰ８α ＰＢＭＣの増殖応答（ＶＰＤ低い細胞％）のフローサイトメトリー分析；＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｔ検定）。（ｄ）寛解している（Ｒ）及び活発な疾患を有する（Ａ）Ｌ１及びＬ３クローン病患者のＰＢＭＣ中のＦ応答性（ＶＰＤ低い）ＤＰ８α細胞％。＊Ｐ＜０．０５（マンホイットニー検定）。
【０１６９】
実施例１：材料及び方法
細胞の単離及び細胞株の作製
ＰＢＭＣを、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者（表Ｉ）及び健康な被験者から得た。正常な腸粘膜及び炎症を起こした腸粘膜を、それぞれ、放射線療法又は化学療法を受けなかった大腸癌手術を受けている患者から、及び、ＩＢＤ（クローン病又は潰瘍性大腸炎）手術を受けている患者（表ＩＩ）から得た。
【０１７０】
【表１】
2016531284.tif 000002
【０１７１】
【表２】
2016531284.tif 000003
【０１７２】
単球及びＰＢＬを、水簸（DTC platform、CHU、ナント、フランス）によって健康なドナーの血液から得た。正常な大腸粘膜を、腫瘍から約１０cm下流で採取された、外科的に切除された組織から得た。正常な粘膜について、粘膜固有層を、ＥＤＴＡ緩衝液中でのインキュベート（３０分間）後に上皮から分離し、その後、１mm2の断片に刻み、そしてペニシリン（１０％）及びゲンタマイシン（０．１mg/ml Sigma-Aldrich）を含有するＲＰＭＩを用いて洗浄した。組織断片を、３７℃で振盪しながら、コラゲナーゼ及びＤＮＡアーゼ（各々２mg/ml Sigma-Aldrich）を用いて消化した。粘液及び大きな残骸を、４０μmのセルストレイナー（BD）を通しての濾過によって除去した。生細胞をフィコール勾配遠心分離によって得た。この試験は、地域医学倫理委員会によって承認された。全ての患者がインフォームドコンセント用紙に署名した。細胞株の作製のために、ＣＤ３ＣＤ４及びＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８α低いＬＰＬ及びＰＢＬを、ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ（Becton Dickinson）での選別によって単離した。Ｔ細胞株を、Fonteneau et al.（J Immunol 159, 2831-2839, 1997）によって記載されているように、ＰＨＡ、放射線照射されたフィーダー細胞、及びＩＬ−２を用いての刺激によって作製した。Ｔ細胞増殖の抑制アッセイのために、ＣＤ４ Ｔ細胞を磁気ビーズ（130-045-101 Miltenyi）を使用してＰＢＭＣから単離した。未熟ＤＣを、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０μg/ml）（GIBCO（登録商標））及び１０％ＳＶＦ（PAA）の補充されたＲＰＭＩ １６４０中、８０ng/mlのＩＬ４及び９０ng/mlのＧＭ−ＣＳＦ（AbCys）と共に２×１０６個の細胞/mlで５日間培養された単球から得た。樹状細胞の成熟は、ＣＤ４０Ｌを発現している活性化ＣＤ４リンパ球又はＣＤ４細胞株との共培養によって誘導された。
【０１７３】
フローサイトメトリー
ＣＤ８αＬＰＬ亜集団は、ＰｅｒＣＰにコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体（345766）、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体（参考番号555346）及びＡＰＣにコンジュゲートした抗ＣＤ８α抗体（参考番号555369）又は抗ＣＤ８α抗体（参考番号641058）との共染色によって同定された。ＤＰ８αＰＢＬは、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、及び抗ＣＤ８抗体（上記）との共染色によって、並びに、ＣＤ８αβＴ細胞が発現するよりも少ない量のＣＤ８αを発現しているＣＤ３ＣＤ４細胞をゲーティングすることによって同定された。以下の抗体を使用して、ＣＤ８α及びＣＤ４ ＬＰＬ及びＰＢＬの表現型を決定した（エクスビボ並びに細胞株）：フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートした抗ＣＤ２５抗体（参考番号555432）、抗ＣＴＬＡ４抗体（参考番号555853）、抗ＬＡＧ３抗体（参考番号514782）、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（参考番号335853）、抗ＬＦＡ１抗体（555384）、抗ＬＦＡ３抗体（555921）、抗ＩＣＡＭ１抗体（555511）、抗ＴＣＲαβ抗体（参考番号555548）、抗ＣＤ１０３抗体（参考番号550260）、抗ＦＯＸＰ３抗体（参考番号17477771）、抗ＧＡＴＡ３抗体（参考番号560574）、抗ＴＢＥＴ抗体（参考番号125825）、抗ＲＯＲγｃ抗体（参考番号12698880）、（全てBecton Dickinsonから購入）抗ＣＤ８０抗体（参考番号IM2729U）、抗ＣＤ８３抗体（参考番号IM2218U）、抗ＣＤ８６抗体（参考番号IM1976U）、抗ＧＩＴＲ抗体（参考番号FAB689）、（Beckmanから購入）、及びＰＥにコンジュゲートした抗ヒトＴＣＲ Ｖβ鎖（Immunotech Beckman Coulter）。以下の色及びアイソタイプの適合した対照抗体を使用して、染色特異性を確認した：ＡＰＣにコンジュゲートしたマウスＩｇＧ１（参考番号555751）、ＰＥにコンジュゲートしたマウスＩｇＧ１（参考番号555749）、及びＰＥにコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２ａｋ（参考番号555574）（全てBecton Dickinsonから購入）。各々の蛍光色素で１回染色したビーズ（Comp Beads Becton Dickinson）をコンペンセーション設定のために使用した。細胞（２×１０５個）を、暗闇中４℃で３０分間かけて、抗体を含有しているＰＢ／０．１％ＢＳＡ中で染色した。細胞を洗浄し、１０５個の細胞をFACScalibur又はCanto IIフローサイトメーターの生細胞ゲートで取得し、Diva又はCellQuestソフトウェア（BD）を使用して分析した。データをFlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いてさらに分析した。
【０１７４】
抑制アッセイ：ＣＤ４増殖及びＤＣ成熟の阻害
新たに選別されたＣＤ４ ＰＢＬ（５×１０４個）を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中５μM ＣＦＳＥ（Invitrogen）と共に１５分間インキュベートし、洗浄し、その後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ビーズ（Miltenyi）を１：１の比で用いて、ＤＰ８α Ｔレグ又はＣＤ４ ＬＰＬ株の存在下又は非存在下で、示されたエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で刺激した。ＣＤ８陰性Ｔ細胞の中からの標的ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を、ＤＰ８α ＬＰＬ又はＣＤ４ ＬＰＬの存在下又は非存在下で、及び抗ＩＬ−１０抗体又は抗ＴＧＦ−β抗体の存在下又は非存在下で５日目に、ＣＦＳＥの希釈率のフローサイトメトリー分析によって評価した。ＣＤ４ ＬＰＬ株を、ＤＰ８α細胞株及び抗ＣＴＬＡ−４抗体若しくは抗ＬＦＡ−１抗体の存在下又は非存在下で、２〜３日間、未熟同種ＤＣ（１：１の比）と共に培養した。細胞を、ＡＰＣにコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体（参考番号555335）及びＰＥにコンジュゲートした抗ＣＤ８０抗体（参考番号IM2729U）、ＰＥにコンジュゲートした抗ＣＤ８３抗体（参考番号IM2218U）、又はＰＥにコンジュゲートした抗ＣＤ８６抗体（参考番号IM1976U）を用いて染色した。ＣＤ３陰性細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現レベルを決定した。
【０１７５】
細胞内サイトカインアッセイ
ＰＢＭＣを、プレートに結合させた０．１μg/mlのＣＤ３抗体（OKT3 eBioscience）又は細菌と共に１：１の比で６時間インキュベートした。Ｔ細胞株（ＬＰＬ及びＰＢＬ）を、抗ＣＤ３抗体（上記）と共に、又は、５：１の比で様々な細菌と共に一晩事前にインキュベートしておいた同種単球の混合物と共に１：１の比でインキュベートした。サイトカインの分泌を防ぐために、１０μg/mlのブレフェルジンＡ（Sigma-Aldrich）を前回の６時間の刺激の間に加えた。末梢血Ｔ細胞及び細胞株を、ＰｅｒＣＰとコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体、及びＡＰＣにコンジュゲートした抗ＣＤ８α抗体（上記のような）を用いて染色した。その後、細胞をＰＢＳ／４％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）中で１０分間かけて固定し、そして洗浄した。その後、サイトカイン特異的抗体を、室温で３０分間かけて加えた。試薬の希釈及び洗浄を、０．１％ＢＳＡ及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ（Sigma-Aldrich）を用いて実施した。サイトカインの分泌を、ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８α低い及びＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８α陰性ＰＢＭＣにおいて、及びＤＰ８α又はＣＤ４陽性細胞株においてフローサイトメトリーによって評価した。実験によっては、サイトカインで標識されたＤＰ８α細胞株の中のＶβ標識及び細胞内標識をさらに分析した。以下の抗体を使用した：ＰＥにコンジュゲートした抗ＩＬ−２抗体（参考番号559334）、抗ＩＬ−４抗体（参考番号554486）、抗ＩＬ−５抗体（参考番号554395）、抗ＩＬ−１０抗体（参考番号562400）、抗ＴＮＦα抗体（参考番号554418）、及び抗ＩＬ−２２抗体（参考番号515303）及びＡＰＣにコンジュゲートした抗ＩＬ−１３抗体（参考番号554571）、抗ＩＦＮ−γ抗体（参考番号554551）及び抗ＩＬ−１７抗体（参考番号51717871）。遮断実験のために、抗ＨＬＡクラスＩＩ腹水（本発明者らの研究室で作製されたクローン２０６）及び無関係のマウスＩｇＧを使用した。
【０１７６】
ＥＬＩＳＡによるＴ細胞によるサイトカインの産生
Ｔ細胞（２００μl中１０５個）を、０．１μg/mlのプレートに結合させた抗ＣＤ３抗体（OKT3, eBioscience）を用いて刺激した。上清中のＩＬ−１０のレベルを、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によって測定した。
【０１７７】
細菌培養液
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＡ２−１６５（Ｆ）を、嫌気的なチャンバー中のＬＹＢＨＩ培地（０．５％酵母抽出液（Difco）、セロビオース（１mg/ml；Sigma-Aldrich）、マルトース（１mg/ml；Sigma-Aldrich）、及びシステイン（０．５mg/ml；Merck）の補充されたブレインハートインフュージョン培地）中で３７℃で２０時間増殖させた。バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）ＶＰＩ−５４８２（Ｂ）及びラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）（ATCC 393）（Ｌ）を、嫌気的なチャンバー中のそれぞれウィルキンス・チャルグレン培地（３３g/L；Oxoid）及びＬＹＢＨＩ培地中、３７℃で２０時間増殖させた。エシェリヒア・コリ  Ｋ１２（E.coli）（Ｅ）を、ルリア・ベルターニ培地（２０g/L；Invitrogen）中で撹拌しながら（８０r.p.m.）３７℃で２０時間増殖させた。各細菌株についての上清及びペレットが、４℃で１７００ｇで１５分間の遠心分離によって得られた。
【０１７８】
細菌によるＴリンパ球増殖のアッセイ
リンパ球（ＰＢＭＣ又は細胞株）を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、１μMのＶＰＤ（BD Bioscience）又は上記のようなＣＦＳＥ（１つのケースでは）と共に暗闇で３７℃で１５分間インキュベーションすることにより標識した。細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地中で２回洗浄した。Ｆ、Ｂ、Ｌ及びＥを、高速で１５分間超音波処理し、その後、ＶＰＤで標識されたＰＢＭＣと共に１：１の比で、又は、ゲンタマイシン（０．１mg/ml）の存在下で単球と共に（５：１の比で）一晩かけて共培養した。細菌が負荷された又は負荷されずに残された単球を洗浄し、ＶＰＤで標識された細胞（１〜１．５×１０５個）と１：５の比で混合した。３〜７日間後、Ｔ細胞の増殖を、ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８α低い及びＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８α陰性ＰＢＭＣ中、又はＣＤ４又はＣＤ８α陽性Ｔ細胞中のＶＰＤ（又はＣＦＳＥ）希釈率のフローサイトメトリー分析によって評価した。特異的な抗体を４８時間毎に又は関係のないマウスＩｇＧを添加することによってＨＬＡクラスＩＩ依存性を分析した。
【０１７９】
統計分析
統計分析を、GraphPad Prism version 5.0（GraphPadソフトウェア）を用いて実施した。対応及び対応のないｔ検定並びにマンホイットニー検定を、図の説明文に示されているように使用した。Ｐ＜０．０５を有意差と判断した。
【０１８０】
実施例２：ダブルポジティブＣＤ４ＣＤ８ααＴリンパ球（ＤＰ８α）は、ヒト大腸粘膜固有層において頻繁に出現する
大腸癌（ＣＣ）患者の健康な大腸粘膜の上皮又は粘膜固有層から単離されたＴ細胞によるＣＤ４とＣＤ８α又はＣＤ８βとの共発現を分析した。ＣＤ３粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）のかなりの割合が、ＣＤ４とＣＤ８αとを共発現していたが、ＣＤ８βとは共発現していなかった（図１ａ）。ＣＤ８αレベルは可変的であり、かつＣＤ８αβＴ細胞よりも低かった（データは示されていない）。その後、ＣＤ４ＣＤ８αα低いＬＰＬ（以後、ＤＰ８αＬＰＬと称する）を定量した（図１ｂ）。それらは、平均して８．５％のＣＤ３ ＬＰＬ（範囲３．１〜１６．２）及び１３．３％のＣＤ４ ＬＰＬ（範囲５．９〜２４．８）として構成されていた。上皮では、より少ない割合のＴ細胞がＣＤ４とＣＤ８αとを共発現し（平均値２．４％、範囲０．７〜５．６）、また、これらのいくつかは、高いレベルのＣＤ８α又はＣＤ８βを発現し（図２）、これは、以前に記載されたＣＤ４ＣＤ８αβ大腸ＩＥＬサブセットに相当するようである（Sarrabayrouse et al. Int J Cancer 128, 2923-2932, 2011）。
【０１８１】
その後、選別されていない及びＦＡＣＳで選別されたＤＰ８α、ＣＤ４、及びＣＤ８αβ ＬＰＬ株を、ＤＰ８α ＬＰＬの表現型安定性及び多クローン性を評価するように導いた。培養中のどの時点でも、選別されたＤＰ８α細胞株によるＣＤ８の発現は保存された（図１ｃ、データは示されていない）。選別されていないＬＰＬ株（ｎ＝３）の中のＤＰ８αリンパ球は、そのＣＤ８及びＣＤ４対応物（それぞれ１１〜１２及び９〜１６）と同じくらい多くの明確に異なるＶβ鎖（１０〜１４）を発現していたが、前者（３６〜５０％）より後者（６０〜９１％）とより多くのＶβ鎖を共有していた（データは示されていない）。それ故、ＤＰ８αＴ細胞は、ヒト大腸粘膜のＬＰにおいて豊富であり、そこでそれらはＣＤ４ ＬＰＬとは表現型が明確に異なるポリクローナルＴ細胞サブセットを示す。
【０１８２】
実施例３：ＤＰ８α大腸ＬＰＬ株は、Ｔレグ表現型及び機能を示す
その後、ＤＰ８αヒト大腸ＬＰＬが、そのＣＤ４相同体と比較してＴレグ表現型を有するかどうかが問われた。代表的な３つの中の１つのＤＰ８α ＬＰＬ株によって示されているように（図３）、ＤＰ８α ＬＰＬは、Ｆｏｘｐ３−Ｔレグマーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３）、活性化及び共刺激マーカー（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ）、及び接着マーカー（例えばＬＦＡ−１、ＬＦＡ３、及びＩＣＡＭ−１）の発現又は過剰発現によって、その自己ＣＤ４対応物とは異なっていた。しかし、Ｆｏｘｐ３−Ｔレグとは対照的に、ＤＰ８α ＬＰＬはＩＬ−７Ｒ（ＣＤ１２７）を発現し、かつＦｏｘｐ３を欠失していた。エクスビボでのＤＰ８α ＬＰＬの大部分は、ＩＬ−７Ｒ（ＣＤ１２７）の低い発現を除いて同一な表現型を示した（図４）。ＤＰ８α ＬＰＬ株及びＤＰ８α ＬＰＬは、Ｔｂｅｔ及びＧａｔａ３を発現していた（図５及び図７ａ）。前者はＲＯＲγｃも欠失していた（図５）。多クローン性の活性化時に、ＤＰ８α細胞株はＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを分泌したが（約５０％の細胞）、ＩＬ−２については分泌したとしても僅かであり（図６ａ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７又はＩＬ−２２を全く分泌しなかった（データは示されていない）。エクスビボではＤＰ８α ＬＰＬはＤＰ８α細胞株と同じサイトカインプロファイルを示した（図７ｂ）。重要なことには、ＲＴ−ＰＣＲ（データは示されていない）及びＥＬＩＳＡによって示されているように、活性化されたＤＰ８α ＬＰＬ株（図６ｂ）はＩＬ−１０を分泌したが、そのＣＤ４対応物は分泌しなかった（図７ｃ）。それ故、ＤＰ８α ＬＰＬは、Ｔレグの細胞表面マーカー及びサイトカインプロファイルを示すが、Ｆｏｘｐ３は欠失している。その後、インビトロでのこれらの細胞の制御能について取り組んだ。
【０１８３】
実施例４：ヒトＤＰ８α ＬＰＬの制御特性
Ｆｏｘｐ３ Ｔレグと同様に、ＤＰ８α ＬＰＬ株は、ＣＴＬＡ−４及びＬＦＡ−１依存的に（図８ａ）、ＣＤ８６、ＣＤ８３（図８ａ）及びＣＤ８０（データは示されていない）のアップレギュレーションの阻害によって明らかであるように、未熟樹状細胞の成熟を阻害した。ＤＰ８α ＬＰＬ株はまた、使用される全てのエフェクター・標的比で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって誘導されるＣＤ４ Ｔ細胞増殖を阻害し（図８ｂ及び８ｃ）、この阻害は、抗ＩＬ１０抗体によって部分的に遮断されたが、抗ＴＧＦ−βＲ抗体によっては遮断されなかった（図８ｄ）。重要なことには、ＣＤ４ ＬＰＬ株はこれらの制御特性を欠失していた（データは示されていない）。これらのアッセイ中に、ＤＰ８α ＬＰＬ株が、Ｆｏｘｐ３ Ｔレグで報告されていたのとは対照的に、インビトロでのＣＤ３の活性化時に増殖したことが観察された（データは示されていない）。
【０１８４】
実施例５：ＤＰ８α ＬＰＬ株は、腸内共生細菌と特異的に反応する
クロストリジウムＩＶ及びＸＩＶ群に属する細菌は、マウス大腸ＬＰにおけるＦｏｘｐ３ Ｔレグの顕著な誘導因子であり、また、これらのいくつかのＴレグは、クロストリジウム抗原に特異的なＴＣＲを発現している。それ故、ＤＰ８α ＬＰＬの微生物叢に対する反応性を、４つの細菌株を使用して評価した：ＩＢＤ患者の糞便に減少したレベルで存在し、ＰＢＭＣによるＩＬ−１０の発現を誘導することが示された、クロストリジウムＩＶ群の主要なヒト腸内細菌であるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆ）（Sokol et al. Proc Natl Acad Sci USA 105, 16731-16736, 2008）、マウスにおいてＦｏｘｐ３ Ｔレグの分化／増大を促進し得るバクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ）及びラクトバチルス・カゼイ（Ｌ）（Honda, K. & Littman, D.R., Annu Rev Immunol 30, 759-795, 2012）、及び病原性共生生物である可能性があるエシェリヒア・コリ（Ｅ）。ＤＰ８α ＬＰＬ株は、これらの細菌のみと共にインキュベートした場合には、サイトカインを増殖又は分泌しなかった（データは示されていない）。これとは対照的に、それらは、その増殖によって示されるように、Ｆが負荷された単球には系統的に応答したが、単球のみ、又はＢ、Ｌ及びＥの細菌が負荷された単球に対しては応答しなかった（図９ａ）。両方の応答が、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体によって抑制されたが、関連のない抗体によっては抑制されなかった。ＤＰ８α ＬＰＬ株はまた、ＭＨＣクラスＩＩ依存的に、Ｆが負荷された単球に対して特異的に応答し、６時間の刺激の間にＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０を分泌した。驚くべきことに、ＬＰＬ株の２０％〜６０％以下の細胞がこのアッセイにおいてＦ反応性（サイトカイン陽性）であった（図９ｂ）。これとは対照的に、ＣＤ４ ＬＰＬ株は、細菌が負荷された単球に対して増殖応答又はサイトカイン応答を全く示さなかった（データは示されていない）。ＤＰ８α ＬＰＬ株では、Ｆ反応性細胞は、試験された２１個中２〜５個のＶβ鎖を発現した（データは示されていない）。重要なことには、これらのＶβ鎖を発現しているＣＤ４ ＬＰＬは、Ｆが負荷された単球には応答せず（データは示されていない）、これらの応答がスーパー抗原に起因したという可能性は除外された。それ故、ＤＰ８α ＬＰＬ株は、ＡＰＣ及びＭＨＣクラスＩＩ依存的にフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィに特異的に反応した高い比率の細胞を含有していたが、そのＣＤ４対応物は含有していなかった。
【０１８５】
実施例６：ＤＰ８α制御性Ｔ細胞はＰＢＬ中に存在する
ＣＤ４ＣＤ８αα低いＴ細胞は、健康なドナーにおいて平均して２．５％のＣＤ３ ＰＢＬ（範囲０．１〜５．８％）及び３．７％のＣＤ４ ＰＢＬ（範囲０．１〜７．８％）を示したことが判明した（図１０ａ）。これらの細胞が、大腸粘膜を起源とするＴレグであり得るかどうかを決定するために、制御マーカー（ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、及びＬＡＧ３）の発現、及びＦに対するその反応性を評価した。エクスビボでは、大半のＣＤ４ＣＤ８αα低いＰＢＬがこれらのマーカーを欠失していた（データは示されていない）。それにも関わらず、これらの細胞のかなりの比率が、ＭＨＣクラスＩＩ依存的にＦとの５日間の培養で増殖したが（ＶＰＤの平均希釈率％は２２．７、範囲７．８〜４９．７）、他の細菌とでは全く増殖しなかったか又ははるかに低いレベルでしか増殖しなかった（図１０ｂ）。ＣＤ４ＣＤ８αα低いＰＢＬと比較して、ＣＤ４ ＰＢＬは、Ｆに対してはるかに低い増殖応答を生じ（ＶＰＤの平均希釈率％：３．８、範囲０．３〜１４．３）（図１０ｃ）、かつＥに対しては応答しなかった（データは示されていない）。ＣＤ４ＣＤ８αα低いＰＢＬがＴレグであり得るかどうかをさらに決定するために、ＣＤ４ＣＤ８αα低い（ＤＰ８α）ＰＢＬ株を、３人の健康な被験者から得た。１つの細胞株は、ＣＤ４と低レベルのＣＤ８αとの共発現についてエクスビボで選別されたＣＤ３ ＰＢＬから得られた。２つの追加のＤＰ８α細胞株及び１つのＣＤ４細胞株は、Ｆと共に５日間培養したＰＢＭＣから類似した選別法を使用して得られた。両方の条件下で、１回目の選別により、６０〜７０％の純度を有するＣＤ４ＣＤ８αα低い細胞が得られた。純粋なＤＰ８α及びＣＤ４ ＰＢＬ株（データは示されていない）が２回目の選別から得られた。意外なことに、ＤＰ８α細胞株は、培養液中に高いレベルのＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、及びＬＡＧ−３を発現していた（図１１ａ）。これとは対照的に、ＣＤ４ ＰＢＬ株はＣＴＬＡ−４を欠失し、かつそのＤＰ８α対応物よりも低いレベルでＣＤ２５及びＬＡＧ−３を発現していた（図１１ａ）。ＤＰ８α ＰＢＬ株はＩＬ−１０も分泌し（図１１ｃ）、かつＣＤ４リンパ球の増殖及び樹状細胞の成熟を阻害した（図１１ｂ及び１１ｄ）。これらの株の中の９〜３１％の細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ依存的に、他の細菌が負荷された単球に応答してではなく、Ｆが負荷された単球に応答して、ＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１０を分泌したが（図１１ｅ）、ＩＬ−２又はＩＬ−４を分泌しなかった（データは示されていない）。これとは対照的に、ＣＤ４ ＰＢＬ株は、ＩＬ−１０を分泌せず、制御機能を欠失し、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２及びＩＬ−４を、Ｆが負荷された単球に応答して分泌することができなかった（データは示されていない）。それ故、大半のＣＤ４ＣＤ８αα低いＰＢＬは、循環しているＤＰ８αＴレグであるようである。なぜなら、それらは、制御マーカー及び機能を培養液中において獲得し、これらの細胞の一部はＦに対して反応したが、そのＣＤ４対応物はこれらの特性を欠いていたからである。
【０１８６】
実施例７：健康なドナーと比較して炎症性腸疾患患者においてのＤＰ８α ＬＰＬ及びＰＢＬの低下した度数、並びにＦに対するＤＰ８α ＰＢＬの低下した反応性
本発明者らは、ＤＰ８α ＬＰＬ及びＰＢＬの高い割合が、Ｆに特異的であったことを示し、かつ以前に、この細菌がＩＢＤ患者の腸内細菌叢に低下したレベルで存在することが示されたので、本発明者らは、ＤＰ８α細胞の度数が、非ＩＢＤドナーと比べてＩＢＤ患者において変化していたかどうかを問うた（患者及び健康な被験者の特徴については上記の表１及び２を参照）。ＣＤ３ ＬＰＬの中のＤＰ８α細胞の平均的な度数は、結腸直腸癌患者の健康な粘膜よりも、ＩＢＤ患者の炎症の起こった大腸粘膜における方がより低いようであった（それぞれ４．８％、範囲０．９〜９．９、及び８．５％、範囲３．１〜１６）（図１２ａ）。さらに、ＣＤ３ ＰＢＬの中のＣＤ４ＣＤ８αα低い（ＤＰ８α）リンパ球の平均的な割合は、健康なドナーよりもＩＢＤ患者の方が低かった（それぞれ０．４％、範囲０．１〜１．３、及び２．５％、範囲０．１〜５．７）（図１２ｂ）。
【０１８７】
以前に報告されたクローン病患者の腸内微生物叢におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィの低下したレベルは、Ｆ特異的Ｔレグの産生に影響を及ぼしている可能性がある。この仮説に取り組むために、本発明者らは、健康な被験者及びＩＢＤ患者に由来するＤＰ８α ＰＢＬのＦに対する増殖応答を比較した。健康なドナー由来のＤＰ８α ＰＢＬは、ＦとＰＢＭＣの共培養時に系統的に増殖したが（５日目のＶＰＤ低いＤＰ８αＰＢＬの平均％：２０．２、範囲２．６〜４８．９）（図１２ｃ）、単独で又はＥと共に培養した場合には増殖しなかった（データは示されていない）。類似の増殖が、２０人中９人のＩＢＤ患者に由来するＰＢＭＣ中で観察された。残りの患者では、ＤＰ８α ＰＢＬは全く増殖しなかったか（ｎ＝５）、又は非特異的にしか増殖せず、すなわち、Ｅと同程度にしか及び／又はＦという細菌の非存在下と同程度にしか増殖しなかった（ｎ＝６）。結果として、ＩＢＤ患者（ＩＢＤ）由来のＤＰ８αＰＢＬのＦに対する平均的な特異的応答は、健康なドナー（ＨＤ）よりも低かった（５日目のＶＰＤ低い細胞％：６．３、範囲：０〜２９．４）（図１２ｃ）。回腸に併発したクローン病患者（モントリオール分類のＬ１及びＬ３のステージ）は、腸内微生物叢におけるＦの明瞭な欠損を示すので、本発明者らは、これらの患者の寛解が、Ｆに対するＤＰ８αＰＢＬの回復した応答と関連があるかどうかを評価した。
【０１８８】
寛解中のＬ１及びＬ３患者に由来するＤＰ８α ＰＢＬ（ｎ＝４）は、Ｆに対して特異的に増殖した（平均１３．６、範囲４．３〜２２）。これとは対照的に、このような応答は、活動的な疾患を有する患者においては有意により度数が低かった（１０人中２人）（平均２．８、範囲０〜１９．４）（図１２ｄ）。
【０１８９】
実施例８：Ｆ．プラウスニッツィ及び／又は酪酸塩によるＤＰ８α制御性Ｔ細胞分化のインビトロにおける誘導
材料及び方法
（ｉ）細胞
未感作ＣＤ４ Ｔ細胞を、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞のためのEasySepネガティブセレクションキット（STEMCELL technologies）を使用してＰＢＭＣ又はＰＢＬから得る。単球を、MiltenyiのＣＤ１４マイクロビーズポジティブセレクションキットを使用してＰＢＭＣから単離する。未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、ＩＬ−４（２００IU/ml）及びＧＭ−ＣＳＦ（１０００IU/ml）と共に３日間培養した単球（ＣＤ１４＋）から調製する。該細胞はまた、ｍｏ−ｉＤＣ（単球由来未熟樹状細胞）とも呼ばれる。
【０１９０】
（ｉｉ）ＤＰ８αＴレグの誘導法
未熟ＤＣを、酪酸塩の存在下又は非存在下で、解凍したＦ．プラウスニッツィ細菌と共に１：１の比で一晩かけて共培養した。その後、ｉＤＣをＩＬ−２の存在下で未感作ＣＤ４細胞に５日間かけて加える。
【０１９１】
あるいは、酪酸塩を後で、未感作ＣＤ４ Ｔ細胞と同時に加える。ＤＰ８α誘導を、ＣＤ３−ＰＥ抗体（フィコエリトリン）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体、ＣＤ８−ＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン）を用いての標識によって測定する。結果を、刺激されていないＣＤ４ Ｔ細胞、ｉＤＣのみで刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞、及びＥ．コリが負荷されたｉＤＣによって刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞を用いて得られた結果と比較する。
【０１９２】
結果
誘導の結果を以下の表３に示す。
【表３】
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【０１９３】
Ｆ．プラウスニッツィと共に一晩かけて事前に培養しておいた単球又は単球由来未熟樹状細胞（ｍｏ−ｉＤＣ）による４〜６日間かけての未感作ＣＤ４ Ｔ細胞の刺激は、一部の未感作ＣＤ４ Ｔ細胞上に低レベルのＣＤ８αの発現を誘導する（それぞれ、平均値２．９％、範囲１．２〜４．６％、及び平均値３％、範囲１．５〜６．９％）。これとは対照的に、単球又はｉＤＣにＥ．コリを負荷すると、非常に僅かなＤＰ８α細胞しか出現しない（それぞれ平均値１．２％、範囲０．６〜２．４％、及び平均値１．７、範囲０．９〜２．４％）
【０１９４】
その後、ＤＰ８αリンパ球の誘導に対する短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の影響を試験する：腸内微生物叢によって産生された酪酸塩、酢酸塩、及びプロピオン酸塩。Ｆ．プラウスニッツィが負荷されたｉＤＣへの酪酸塩（０．１４５mM）の培養液中への添加は、ＤＰ８α表現型を獲得した未感作ＣＤ４ Ｔ細胞の割合（平均値６％、範囲１．８〜１６．５％）を強く増加させる。これとは対照的に、プロピオン酸塩及び酢酸塩は、ＤＰ８α細胞の度数に対して全く又は殆ど影響を及ぼさない。
【０１９５】
Ｆ．プラウスニッツィが負荷されたｉＤＣ及び酪酸塩によって誘導されたＤＰ８αリンパ球をＦＡＣＳ Ａｒｉａを用いて選別することによって、ＤＰ８α細胞株が得られる。これらの細胞株はまた、制御特性も有する：制御マーカー（ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ及びＬＡＧ−３）の発現、ＩＬ−１０の分泌、及びＣＤ４ Ｔ細胞増殖の誘導。
【０１９６】
それに加えて、Ｆ．プラウスニッツィはｍｏ−ｉＤＣ（ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦと共に３日間培養することによって得られる）の成熟を誘導し、かつ、これらの細胞によるＩＬ−１０の分泌を誘導する。さらに、酪酸塩の存在下でＦ．プラウスニッツィによって誘導されたｉＤＣの成熟は、ＣＤ８０及びＣＤ８３の低下した発現（しかしＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲではない）によって示されるように阻害され、そしてＩＬ−１０の分泌は増加する。
【０１９７】
これらのデータは、インビトロでＦ．プラウスニッツィと共に一晩かけて共培養された単球又はｍｏ−ｉＤＣを用いて未感作ＣＤ４ Ｔリンパ球を短時間培養することによってＤＰ８αＴレグが誘導され得、また、酪酸塩は、おそらくＤＣ成熟の阻害を通して及び／又はｉＤＣによるＩＬ−１０分泌の増強を通して、この誘導を増強し得ることを示す。あるいは、酪酸塩は、Ｆ．プラウスニッツィによって誘導されたＤＰ８α Ｔレグの増大を刺激する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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