(57)【要約】本発明は、ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体、特に、タニビルマブ軽鎖のＮ‐末端にヒトＮｏｔｃｈ１の１１〜１２番目のｃａｌｃｉｕｍ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ‐類似ドメインが結合した新規の形態の二重標的抗体、これをコードする遺伝子、この遺伝子を含む組み換え発現ベクター、この組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞及びこの宿主細胞を培養して二重標的抗体を製造する方法、前記二重標的抗体を含む薬剤学的組成物及びヒトＤＬＬ４（ｈＤＬＬ４）を発現する細胞株とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の共培養によりＮｏｔｃｈ１活性を測定することを特徴とする前記二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法に関する。
2016505244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦＲ‐２とＤＬＬ４を標的とする二重標的抗体。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体の末端にＤＬＬ４の拮抗剤が結合されることを特徴とする請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体はタニビルマブ（Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂ）またはこれの変移体であることを特徴とする請求項２に記載の二重標的抗体。
【請求項４】
前記ＤＬＬ４の拮抗剤は人間Ｎｏｔｃｈ１受容体の１１〜１２番目のカルシウム結合ＥＧＦ‐類似ドメインであることを特徴とする請求項２に記載の二重標的抗体。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体の軽鎖Ｎ‐末端にＤＬＬ４の拮抗剤が結合されていることを特徴とする請求項２に記載の二重標的抗体。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体とＤＬＬ４の拮抗剤はアミノ酸リンカーにより結合されていることを特徴とする請求項５に記載の二重標的抗体。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体は配列番号１〜３から選択される何れかの配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４〜６から選択される何れかの配列を有する軽鎖可変領域からなることを特徴とする請求項３に記載の二重標的抗体。
【請求項８】
前記ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体は配列番号１の重鎖可変領域と配列番号４の軽鎖可変領域、配列番号２の重鎖可変領域と配列番号５の軽鎖可変領域、または、配列番号３の重鎖可変領域と配列番号６の軽鎖可変領域からなることを特徴とする請求項７に記載の二重標的抗体。
【請求項９】
前記ＤＬＬ４の拮抗剤でる人間Ｎｏｔｃｈ１受容体の１１〜１２番目のカルシウム結合ＥＧＦ‐類似ドメインは配列番号７のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の二重標的抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９の中何れか一項による二重標的抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０によるＤＮＡを含む組み換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１による組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２による宿主細胞を培養し、これらの培養物から二重標的抗体を分離することを特徴とする二重標的抗体の製造方法。
【請求項１４】
前記二重標的抗体はプロチンＡ親和性カラム、ＳＰ−せぱロースカラム及びサイズ排除クロマトグラフィーをもってＦＰＬＣを利用し、追加製剤することを特徴とする請求項１３に記載の二重標的抗体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜９の中何れか一項による二重標的抗体を含む血管新生関連疾患の治療用薬剤学的組成物。
【請求項１６】
前記血管新生関連疾患は腫瘍（癌）、腫瘍の成長と転移、加齢性黄斑変性、糖尿病網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎及び慢性炎症から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１７】
前記癌は大腸癌、結腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直腸癌、頭頚部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経細胞芽腫、黒色腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫から選択された１種であることを特徴とする請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１８】
ヒトＤＬＬ４（ｈＤＬＬ４）を発現する細胞株又は組み換え細胞株とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の共培養によりＮｏｔｃｈ１活性を測定することを特徴とする請求項１〜９の中何れか一項による二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法。
【請求項１９】
前記Ｎｏｔｃｈ１活性は、ＮＩＣＤの発現量を測定することを特徴とする請求項１８に記載の二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法。
【請求項２０】
前記ＮＩＣＤの発現量は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、免疫組織化学染色法、免疫染色法、免疫蛍光染色法及びルシフェラーゼアッセイからなる群より選択される方法で測定することを特徴とする請求項１９に記載の二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法。
【請求項２１】
前記ｈＤＬＬ４を発現する細胞株はｈＤＬＬ４過発現２９３細胞株（２９３‐ｈＤＬＬ４）であることを特徴とする請求項１８に記載の二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法。
【請求項２２】
前記共培養は（ａ）ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養する段階および、（ｂ）ｈＤＬＬ４を発現する２９３細胞株または、組み換え細胞株と二重標的抗体を反応させた後、前記（ａ）段階で培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞に処理して共培養する段階と、を含むことを特徴とする請求項１８に記載の二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦＲ‐２を標的とする抗体の末端にＤＬＬ４に対する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）が連結されて、ヒトＤＬＬ４をさらに標的する新規の形態の二重標的抗体、前記抗体をコードするＤＮＡ及びこれを含む組み換え発現ベクター、また、前記組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞及びこれを用いた前記二重標的抗体の製造方法、前記二重標的抗体を含む薬剤学的組成物及び前記二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、内皮細胞の成長、分裂、移動などにより、既存の血管から新たな血管が生成されるメカニズムであり、傷の治癒や女性の生理周期を含む正常な成長過程において重要な役割を担当しており（Ｒｉｓａｕ，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６７１，１９９７）、且つ、非正常的に過剰な血管新生は、腫瘍の成長と転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、加齢性黄斑変性（ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＲＭＤ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）のような疾患に決定的な役割を行うと知られている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００）。
【０００３】
１９７１年、Ｄｒ．Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎにより、腫瘍の成長と転移は、血管新生依存的であり、そのため、抗血管新生に焦点を合わせた治療法は、固形癌に対する新たな治療剤になることができるという仮説が提起された後、過剰な血管新生のメカニズムの抑制に関する研究は、多数の研究陣の関心を引いてきた（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｋｅｒｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：９６７，２００５）。血管新生過程の進行様相は、血管新生誘発因子と血管新生阻害因子の総合的なバランスによって決定され、様々な段階における複雑で順次の過程によって行われる。その過程について説明すると、まず、腫瘍や傷ついた組織から分泌する血管内皮増殖因子（Ｖａｓｉｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）をはじめ様々な血管新生誘発因子が周辺にある既存の血管内皮細胞の当該受容体に結合することで、血管内皮細胞を活性化させて血管内皮細胞の透過性を増加させ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）のようなプロテアーゼを分泌することで、血管内皮細胞周辺の基底膜と細胞外基質を分解して、血管内皮細胞が既存の毛細管から離脱して血管新生誘発因子を分泌する組織に向かって移動／増殖する。移動／増殖した血管内皮細胞は、血管内チューブ構造をなし、最後に、血管内皮細胞の構造的支持台である血管周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）が流入して、安定して成熟した血管形成が行われる。
【０００４】
上述のように、ＶＥＧＦ及びこれと結合するＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）のシグナル伝逹を阻害して窮極的に血管新生を抑制することで、腫瘍の成長と転移をはじめ、加齢性黄斑変性、糖尿病網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎及び慢性炎症を含む様々な疾患に対する治療効果を奏することができる点が明らかになるに伴い、ＶＥＧＦの活性を抑制するための様々な薬物の開発が行われている。
【０００５】
具体的に説明すると、ＶＥＧＦは、１９８９年のジェネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社のＤｒ．Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａグループによってタンパク質の分離・精製及びｃＤＮＡクローニングが行われた（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６，１９８９）。ＶＥＧＦ‐Ａとも称するＶＥＧＦは、現在まで４個のイソ型（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）が存在すると知られており、そのうち、ＶＥＧＦ１６５は、胎盤以外のすべてのヒト組織で最も豊かなものと報告されている（Ｔｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１９４７，１９９１）。ＶＥＧＦは、その受容体であるＶＥＧＦＲ‐１とＶＥＧＦＲ‐２／ＫＤＲに対して非常に高い親和度を有して結合するが、主に、ＶＥＧＦＲ‐２を介してそのシグナルを伝達することで、血管内皮細胞の増殖と移動などの血管新生に関するメカニズムを誘導すると知られている。このような理由で、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ‐２は、ＶＥＧＦによって誘導される血管新生のメカニズムを抑制するための主要標的となっており、これに関して多数の論文がこれらを扱っている（Ｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｈｉｃｋｌｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，８：５７９，２００８；Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：５５４４ｓ，２００７）。
【０００６】
例えば、ジェネンテク社のアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）は、ＶＥＧＦ‐Ａを標的とするヒト化抗体（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３３３：３２８，２００５）であり、２００４年に転移性結腸直腸癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、２００６年に非小細胞肺癌（ｎｏｎ‐ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、また、２００８年にＨｅｒ‐２  ｎｅｇａｔｉｖｅ転移性乳癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）に対して、それぞれ米国のＦＤＡ認証を取得しており、多形神経膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｔｉｆｏｒｍｅ、ＧＢＭ）及び腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）に対して認証を取得し、現在も適応症を拡大するために様々な固形癌腫に対して臨床試験を行っている。それだけでなく、同一会社で発売したルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）は、加齢性黄斑変性の主様相である黄斑周りの過剰な血管新生を抑制するために、網膜に注射したときにその透過性を良好にするためにアバスチンからＦａｂ切片のみを切断して製造された抗体であり（Ｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｄｒｇｕｓ，２０：１６７，２００６）、ウェット型加齢性黄斑変性（ｗｅｔ‐ＡＲＭＤ）に対する治療薬として、２００６年に米国ＦＤＡ認証を取得している。
【０００７】
ＶＥＧＦを標的とする他の治療用抗体としては、リジェネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）社のＶＥＧＦ‐ｔｒａｐがある（Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９９：１１３９３，２００２）。これは、ＶＥＧＦＲ‐１の第二の免疫グロブリンドメインとＶＥＧＦＲ‐２の第三の免疫グロブリンドメインをヒトのＦｃに融合した形態の水溶性「おとり受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」であり、まだ米国ＦＤＡ認証を取得していないが、転移性乳癌と転移性肺癌、転移性結腸直腸癌またホルモン不応性前立腺癌（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）などに対して、現在、Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ段階を進めている。
【０００８】
一方、ＶＥＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ‐２を標的とする血管新生抑制抗体には、イムクローン（Ｉｍｃｌｏｎｅ）社のＩＭＣ‐１１２１Ｂ（ＥＰ１９１６００１Ａ２）とＵＣＢ社のＣＤＰ‐７９１（ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４６１９）、また、本発明者らが開発して臨床試験を進めているタニビルマブ（Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂ、ＴＴＡＣ‐０００１）（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）などがある。
【０００９】
ＩＭＣ‐１１２１Ｂは、完全ヒトＦａｂライブラリーから選別されたモノクローナル抗体であり、現在、転移性乳癌に対してＰｈａｓｅ  ＩＩＩ段階を進めており、２０１０年に胃癌に対するＰｈａｓｅ  ＩＩＩ段階に進んでおり、ＵＣＢ社のＣＤＰ‐７９１は、ヒト化抗体であり、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｄｉ‐Ｆａｂ形態で非小細胞肺癌に対して、現在、Ｐｈａｓｅ  ＩＩ段階を進めている。この抗体は、Ｆｃを有していないため、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）や補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を期待することができない。
【００１０】
最後に、本発明者らが開発したタニビルマブ（Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂ，ＴＴＡＣ‐０００１）は、完全ヒトＳｃＦｖライブラリーから選別されたモノクローナル抗体であり、ＶＥＧＦＲ‐２を標的とするとともに、同時にマウスやラット由来のｆｌｋ‐１（ＶＥＧＦＲ‐２相同体）に対しても反応性を有する唯一の抗体であり、これは、イムクローン社のＩＭＣ‐１１２１Ｂと区別される重要な特徴の一つである（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）。特に、タニビルマブが示す異種間交差反応性（ｃｒｏｓｓ‐ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）は、動物疾患モデルに対する研究を可能とすることで、今後、特定の癌腫に対する抗癌剤の開発を段階的に進めて、関連研究をより容易に終了するようにすることができる。
【００１１】
このようにＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ‐２を標的とする研究は、最近５年間、飛躍的に発展し、多数の治療剤が市場及び臨床研究を介して開発されている。
【００１２】
一方、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２シグナル伝逹によりＴｉｐ  ｃｅｌｌに分化した細胞は、ＤＬＬ４を強く発現させて、周辺の細胞に存在するＮｏｔｃｈ１受容体と結合し、このようにＮｏｔｃｈ１シグナル伝達系が活性化した細胞は、ｓｔａｌｋ  ｃｅｌｌに分化して正常な血管ｔｕｂｅ構造を形成するが、これは、ＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達系が、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２経路とともに血管新生に最も重要なメカニズムの一つである点を立証するものである（Ｄｕｆｒａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：５１３２〜５１３７，２００８）。
【００１３】
前記ＤＬＬ４は、Ｎｏｔｃｈ受容体に対するリガンドの一つであり、哺乳動物には、現在まで４種類のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１〜４）と、５種類のＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ‐１、Ｊａｇｇｅｄ‐２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４）が存在すると知られており、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の場合、一細胞のＮｏｔｃｈリガンドが他の細胞のＮｏｔｃｈ受容体に結合することで始まるが、必ず、互いに異なる細胞間の直接的な相互作用を介してのみ活性化する（Ｂｒａｙ  ＳＪ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（９）：６７８，２００６）。
【００１４】
ＮｏｔｃｈリガンドがＮｏｔｃｈ受容体に結合すると、まず、ＡＤＡＭ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅが活性化し、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞膜の外側近接部位が切れ、次いで、ｇａｍｍａ‐ｓｅｃｒｅｔａｓｅ複合体が活性化してＮｏｔｃｈ受容体の細胞膜の内側近接部位を切り、ＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ）が遊離され、このＮＩＣＤは、核に移動、ＲＢＰＪ／ＣＳＬ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒと結合して、Ｈｅｓ、Ｈｅｙのようなｂａｓｉｃ  ｈｅｌｉｘ‐ｌｏｏｐ‐ｈｅｌｉｘタンパク質などのＮｏｔｃｈターゲット遺伝子の発現を誘導する。このようにＮｏｔｃｈシグナル伝達系は、当該細胞が置かれている状況に応じて、増殖／分化／消滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などの運命を決定し、正常幹細胞及び癌幹細胞の維持にも重要な役割をする。
【００１５】
基本的にすべてのＮｏｔｃｈ受容体がすべてのＮｏｔｃｈリガンドと結合することができるが、このような様々な結合の組み合わせは、当該細胞が置かれた微細環境で選択的に調節される。例えば、ＤＬＬ４は、胎児の発達過程で血管新生の際に内皮細胞に強く発現され、周辺内皮細胞に発現するＮｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ４と結合するが、このうち、ＤＬＬ４‐Ｎｏｔｃｈ１結合が排他的に最も重要であり（Ｙａｎ  Ｍ，Ｖａｓｃ  Ｃｅｌｌ，２０１１）、この結合により血管新生が行われる。このような事実は、遺伝子欠損実験などにより明らかになっている（Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，２００４；Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，２００４）。
【００１６】
したがって、ＤＬＬ４‐Ｎｏｔｃｈ１結合を阻害すると血管新生を抑制することができ、これにより腫瘍などの様々な疾患を治療することができる。すでに癌の治療においてＡｖａｓｔｉｎ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）などを用いてＶＥＧＦを抑制すると、血管形成が抑制されて腫瘍のｐｅｒｆｕｓｉｏｎが減少するに伴い腫瘍の大きさが減少する一方、ＤＬＬ４を標的として周辺細胞から発現するＮｏｔｃｈ１との結合を抑制すると血管が非正常的に多く生成（ｈｙｐｅｒｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）されるが、完全な機能を行うことができず（ｎｏｎ‐ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）腫瘍のｐｅｒｆｕｓｉｏｎが減少し、結果、腫瘍の大きさが減少する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，７（５）：３２７，２００７）という点が立証されている。
【００１７】
興味深い事実は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社の研究チームで行ったいくつかの癌細胞株を用いた異種移植動物実験でＶＥＧＦとＤＬＬ４を抑制する抗体をともに投与する際にそれぞれを別に抑制した場合に比べて、癌の成長が著しく強く阻害されたということである（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４４（７１２２）：１０８３，２００６）。これは、ＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１経路によるシグナル伝逹が単純にＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２経路によって活性化するだけではなく、二つの経路によるシグナル伝逹を同時に阻害することで、より効率的な腫瘍などの様々な血管新生関連疾患の治療が可能であることを示唆する。
【００１８】
また、ＤＬＬ４抑制は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２経路阻害剤に敏感な腫瘍及び耐性のある腫瘍の両方に効果があることが明らかになったが（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，４４４（７１２２）：１０８３、２００６；Ｎｏｇｕｅｒａ‐Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，４４４（７１２２）：１０３２．２００６）、これは、現在、ＶＥＧＦを遮断するＡｖａｓｔｉｎのような薬物を投与する際に頻繁に発生する耐性（最初からＡｖａｓｔｉｎが利かないｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、時間が経ってＡｖａｓｔｉｎの薬効が徐々に低下するａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅの二つの場合ともに）克服に非常に重要な手がかりを提供している。
【００１９】
また、ＤＬＬ４抑制が直接的に腫瘍内の癌幹細胞の頻度を低減し、腫瘍成長を抑制するという事実が、Ｏｎｃｏｍｅｄ社の研究チームによって明らかになり（Ｈｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．，２００９）、これは、ＤＬＬ４抑制が癌の再発を根本的に遮断する可能性があることを示唆する。最後に、現在、癌の治療に使用されている抗癌化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎなどの抗体治療剤に対する耐性がＮｏｔｃｈシグナル伝達系と多く関係しており、ＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１経路の抑制は、このような抗癌化学療法又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎのような抗体治療剤の耐性も克服する可能性がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，１８０６（２）：２５８，２０１０）。
【００２０】
上述のように、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２及びＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１の二つの経路によるシグナル伝逹を同時に阻害することで、より効率的な腫瘍などの様々な血管新生関連疾患の治療が可能になるが、依然としてそのための効率的な薬品の開発が行われておらず、これに関する開発が切実に要求されている状況である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００
【非特許文献２】Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｋｅｒｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：９６７，２００５
【非特許文献３】Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６，１９８９
【非特許文献４】Ｔｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１９４７，１９９１
【非特許文献５】Ｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｈｉｃｋｌｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，８：５７９，２００８
【非特許文献６】Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：５５４４ｓ，２００７
【非特許文献７】Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３３３：３２８，２００５
【非特許文献８】Ｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｄｒｇｕｓ，２０：１６７，２００６
【非特許文献９】Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９９：１１３９３，２００２
【非特許文献１０】Ｄｕｆｒａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：５１３２〜５１３７，２００８
【非特許文献１１】Ｂｒａｙ  ＳＪ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（９）：６７８，２００６
【非特許文献１２】Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，７（５）：３２７，２００７
【非特許文献１３】Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４４（７１２２）：１０８３，２００６
【非特許文献１４】Ｎｏｇｕｅｒａ‐Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，４４４（７１２２）：１０３２．２００６
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，１８０６（２）：２５８，２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、前記のような問題を解決するために、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２及びＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１の二つの経路によるシグナル伝逹をより効率的に同時に阻害することで、腫瘍など様々な血管新生関連疾患を治療することができる治療剤を開発するために鋭意研究を重ねた結果、ＶＥＧＦＲ‐２とＤＬＬ４を同時に標的する二重標的抗体が効率的にそのような効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２３】
これにより、本発明は、ＶＥＧＦＲ‐２に対する抗体及びＤＬＬ４に対する拮抗剤が結合され、ＶＥＧＦＲとＤＬＬ４を同時に標的する二重標的抗体を提供することを一つの目的とする。
【００２４】
本発明の他の目的は、前記二重標的抗体をコードするＤＮＡ及びこれを含む組み換え発現ベクターを提供することである。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、前記組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞及びこれを用いて本発明に係る二重標的抗体を製造する方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに他の目的は、前記二重標的抗体を含む薬剤学的組成物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＤＬＬ４に結合するＮｏｔｃｈ１の１１番目、１２番目のＥＧＦ‐類似ドメインのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】本発明に係るベクターＰＭＣ‐２０１  ｖ２１３を図式化して示す図である。
【図３】本発明に係るベクターを２９３‐Ｔ細胞を用いて任意発現させた後、精製した二重標的抗体の生産をＳＤＳ‐ＰＡＧＥを介して確認した結果を示す図である。
【図４】本発明に係る二重標的抗体のＶＥＧＦＲ‐２及びヒトＤＬＬ４に対する結合能をＥＬＩＳＡにより分析した結果を示す図である。
【図５】本発明に係る二重標的抗体のヒトＤＬＬ４に対する結合能をＢｉａｃｏｒｅにより分析した結果を示す図である。
【図６】本発明に係る二重標的抗体のヒトＤＬＬ４に対する結合能をＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにより分析した結果を示す図である。
【図７】本発明に係る二重標的抗体のＨＵＶＥＣに対する細胞増殖分析（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）結果を示す図である。
【図８】本発明に係る二重標的抗体がヒトＤＬＬ４に結合するＮｏｔｃｈ‐Ｆｃの結合を競争的に阻害する現象をＦＡＣＳを用いて分析した結果を示す図である。
【図９】本発明に係る二重標的抗体がＮｏｔｃｈ‐１によるプロモーター活性化を阻害することをｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発光値で分析した結果を示す図である。
【図１０】本発明に係る二重標的抗体とＨＵＶＥＣをｈＤＬＬ４がコーティングされた培養プレートで培養した際に、Ｎｏｔｃｈ‐１の活性化によって細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）が増加することを阻害する現象をウェスタンブロットにより分析した結果を示す図である。
【図１１】本発明に係る二重標的抗体とＨＵＶＥＣをｈＤＬＬ４を発現する２９３細胞株と共培養した際に、Ｎｏｔｃｈ‐１の活性化によって細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）が増加することを阻害する現象をウェスタンブロットにより分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における熟練された専門家によって通常理解されていることと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法及び以下に記述する実験方法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
【００２９】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、ＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体の末端にＤＬＬ４の拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）が結合された二重標的抗体を提供する。
【００３０】
本発明に係る二重標的抗体は、血管新生をより効率的に抑制することで血管新生によって発生する疾患を抑制する効能を有し、本発明に係る二重標的抗体は、ＶＥＧＦＲ‐２とＤＬＬ４それぞれの標的に対する結合能があることが確認され、ＨＵＶＥＣ増殖抑制実験によりＶＥＧＦＲ‐２のみを単独標的する抗体、例えば、タニビルマブ（Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂ）に比べて優れたＨＵＶＥＣ増殖抑制能があることが確認された。
【００３１】
本発明における用語「二重標的抗体」は、一つ以上のターゲットに結合能又は拮抗能を有する抗体を意味し、二つの互いに異なるターゲットに対する結合能又は拮抗能を有する抗体が結合された形態又は一つのターゲットに対する結合能を有する抗体と他のターゲットに対する拮抗能を有する物質が結合されている抗体を意味する。
【００３２】
また、本発明における用語「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含み、二つの全体長さの軽鎖及び二つの全体長さの重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の断片も使用されることができる。抗体分子の断片とは、少なくとも抗原結合機能を有している断片を意味し、単一鎖（ｓｉｎｇｌｅ‐ｃｈａｉｎ）Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）、Ｆ（ａｂ´）２、単一ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）などを含む。
【００３３】
好ましくは、本発明に係る二重標的抗体は、血管新生因子又はそのような血管新生因子に対する受容体に特異的な抗体と、血管新生拮抗剤、すなわち、血管新生因子又はそのような血管新生因子受容体に対する拮抗剤が結合された形態である。
【００３４】
本発明に係る二重標的抗体において、ＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体は、ＶＥＧＦＲ‐２に結合してＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２シグナル伝逹を阻害する特性を有する抗体であれば制限なく使用可能であり、タニビルマブ（Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂ）又はベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、又はこれらの変異体が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３５】
また、ＤＬＬ４の拮抗剤は、ＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝逹を阻害する特性を有する物質であれば制限なく使用可能であり、特に、Ｎｏｔｃｈ１の細胞内ドメインが欠失された水溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が好ましいが、これに限定されるものではなく、より好ましくは、ＤＬＬ４の拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、特に、ＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ１受容体の１１〜１２番目のＥＧＦ‐類似ドメイン（以下、「Ｎｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙ」とする）が使用されることができる。
【００３６】
ＤＬＬ４の拮抗剤は、ＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体の重鎖又は軽鎖のＮ‐末端又はＣ‐末端などに制限なく結合されることができるが、好ましくは、重鎖又は軽鎖のＮ‐末端、より好ましくは、軽鎖のＮ‐末端に結合されることができる。
【００３７】
本発明で提供されるＰＭＣ‐２０１と称する最も好ましい二重標的抗体は、ＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体の末端、特に、軽鎖Ｎ‐末端にＤＬＬ４の拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、特に、ＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙが連結された形態であり、ＶＥＧＦＲ‐２特異的抗体は、タニビルマブ及びその変異体であることを特徴とする。
【００３８】
本発明における「血管新生」は、血管内皮細胞が増殖し再構成されて既存に存在する血管ネットワークから新たな血管を形成する細胞現象を意味する。このような血管新生には、血管新生、内皮細胞成長、血管安定性及び血管形成を促進する血管新生因子が関与する。前記血管新生因子は、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリー、ＰＩＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ‐ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーのメンバー、ＤＬＬ４、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エプリン、Ｄｅｌ‐１、線維芽細胞増殖因子（酸性（ａＦＧＦ）及び塩基性（ｂＦＧＦ））、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、インターロイキン‐８（ＩＬ‐８）、レプチン、ミドカイン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ‐ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子、特に、ＰＤＧＦ‐ＢＢ又はＰＤＧＦＲ‐β、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換増殖因子‐α（ＴＧＦ‐α）、形質転換増殖因子‐β（ＴＧＦ‐β）、腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／血管透過因子（ＶＰＦ）などが含まれ、特にこれに制限されない。
【００３９】
本発明における用語「血管新生拮抗剤」は、血管新生、血管形成、又は好ましくない血管透過性を直接又は間接的に抑制する低分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組み換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲート又は二重標的抗体を意味する。また、前記血管新生抑制剤は、血管新生因子又はその受容体に結合して血管新生活性を遮断する物質を含む。例えば、血管新生抑制剤は、血管形成剤に対する抗体又は他の拮抗剤、例えば、ＶＥＧＦ‐Ａ又はＶＥＧＦ‐Ａの水溶性受容体（例えば、水溶性ＫＤＲ受容体又はＦｌｔ‐１水溶性受容体）、ＶＥＧＦ‐トラップ、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）２、Ｎｏｔｃｈ１水溶性受容体及びおとり（ｄｅｃｏｙ）、又は前記物質のリガンドに対する結合能を維持する切片などを含むが、これに限定されるものではない。
【００４０】
上述のように、本発明は、特に好ましい形態でＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体の末端にＤＬＬ４の拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、特に、ＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙが連結された形態の二重標的抗体を提供するが、本発明におけるＶＥＧＦＲ‐２に特異的な抗体は、タニビルマブ又はその変異体であることが好ましく、本発明に係るＶＥＧＦＲ‐２に特異的な抗体は、配列番号１〜配列番号３から選択されるいずれか一つの配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４〜配列番号６から選択されるいずれか一つの軽鎖可変領域からなることが好ましい。
【００４１】
特に好ましくは、配列番号１の重鎖可変領域と配列番号４の軽鎖可変領域、配列番号２の重鎖可変領域と配列番号５の軽鎖可変領域又は配列番号３の重鎖可変領域と配列番号６の軽鎖可変領域からなることが好ましく、前記ＶＥＧＦＲ‐２に特異的な抗体は、可変領域に定常領域をさらに含むことができ、ＶＥＧＦＲ‐２に対する結合能力を有する限り、その断片又はアミノ酸変異が生じたものを用いる場合も本発明の権利範囲に含まれることは、通常の技術者にとって自明である。
【００４２】
【表１】
2016505244.tif 000003
【００４３】
また、本発明におけるＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙは、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなることが好ましいが、ＤＬＬ４に対する拮抗能を維持する限り、アミノ酸の変異、欠失及び挿入が生じた変異体も本発明の権利範囲に含まれることもまた通常の技術者にとって自明である。
【００４４】
本発明に係る二重標的抗体において、ＶＥＧＦＲ‐２に特異的に結合する抗体とＤＬＬ４の拮抗剤は、リンカーによる結合、化学的な直接結合又は遺伝工学融合（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ）などの様々な方法によって連結されることができ、好ましくは、リンカーによる結合、より好ましくは、アミノ酸リンカーによって結合されることができる。本発明に係る好ましいアミノ酸リンカーは、配列番号８に記載の配列を有する。
【００４５】
【表２】
2016505244.tif 000004
【００４６】
これにより、本発明に係る二重標的抗体の軽鎖Ｎ‐末端にアミノ酸リンカーを介してＤＬＬ４に対するＮｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙが連結された二重標的抗体の軽鎖‐アミノ酸リンカー‐Ｎｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙタンパク質は、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００４７】
【表３】
2016505244.tif 000005
【００４８】
また、本発明では、前記二重標的抗体をコードするポリヌクレオチド配列及びこれを含む組み換えベクターを提供する。
【００４９】
前記二重標的抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、前記配列番号１〜１０に記載のアミノ酸配列から本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に導き出すことができる。また、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をコードするポリヌクレオチドが二重標的抗体のＮ‐末端に位置するようにして、本発明に係る二重標的抗体の生産に用いられることができる。
【００５０】
本発明における用語「組み換えベクター」とは、適当な宿主細胞で標的タンパク質を発現することができる発現ベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を言う。
【００５１】
本発明における「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能を行うように核酸発現調節配列と標的タンパクをコードする核酸配列が機能的に連結されていることを意味する。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野においてよく知られた遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位‐特異的ＤＮＡの切断及び連結は、当該技術分野において周知の酵素などを使用して容易に行うことができる。
【００５２】
本発明の好適な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終始コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンヘンサーのような発現調節エレメント以外にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終始コドンは、一般的に免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部とみなし、遺伝子作製物が投与されたときに個体において必ず作用を示すべきであり、コード配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）に存在すべきである。一般のプロモーターは、構成的又は誘導性であってもよい。原核細胞には、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７プロモーターがあるが、これに制限されない。真核細胞には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えば、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターだけでなく、β‐アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これに制限されない。
【００５３】
前記発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性薬に対する耐性又は表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されることができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が処理された環境で選別マーカーを発現する細胞のみが生存するため、形質転換された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターの場合、複製が開始する特定の核酸配列である複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができる。
【００５４】
外来遺伝子を挿入するための組み換え発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミドなどの様々な形態のベクターを使用することができる。組み換えベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の各種の宿主細胞で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を有して自然状態と類似の形態の外来タンパク質を大量に生産することができるベクターが好ましい。
【００５５】
本発明に係る二重標的抗体を発現させるために様々な発現宿主／ベクター組み合わせが用いられることができる。真核宿主に好適な発現ベクターとしては、これに限定されるものではないが、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節配列が含まれる。細菌宿主に使用することができる発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、ｇｔ１０とｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体と例示されることができるファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性一本鎖のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２プラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
【００５６】
他の一様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。前記組み換えベクターは、宿主細胞に挿入されて形質転換体を形成する。前記ベクターの好適な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス‐ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）のような原核細胞であってもよい。また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような真菌、ピキア・パストリス属（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スキゾサッカロマセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のような酵母、それ以外の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞のような真核細胞であってもよい。また、植物、哺乳動物から由来してもよい。好ましくは、サル腎培養細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ  ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であるが、これに限定されない。特に、ＣＨＯ細胞が好ましい。
【００５７】
本発明における「宿主細胞への形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織又は気管に取り入れるいかなる方法も含まれ、当分野において公知のように宿主細胞に応じて好適な標準技術を選択して行うことができる。かかる方法には、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素線維を用いた撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。
【００５８】
他の一様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、本発明に係る二重標的抗体を製造する方法を提供する。
【００５９】
本発明に係る二重標的抗体は、遺伝子組み換え方法で発現及び精製して取得することが好ましいが、具体的に、抗体の重鎖可変領域又は重鎖全体領域をコードする遺伝子配列及び軽鎖可変領域又は軽鎖全体領域をコードする遺伝子配列を一つのベクター又は二つのベクターで別に発現させてもよく、この際、重鎖又は軽鎖のＮ‐末端に該当する部位にアミノ酸リンカー及び／又はＤＬＬ４の拮抗剤をコードする遺伝子配列を連結して、細胞発現システムで発現させ、本発明に係る二重標的抗体を製造してもよく、これに限定されるものではない。
【００６０】
具体的に、前記二重標的抗体の製造方法は、本発明の二重標的抗体をコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入して組み換えベクターを製造する段階と、前記組み換えベクターを宿主細胞に形質転換させて培養する段階と、前記培養された形質転換体から二重標的抗体を分離、精製する段階と、を含むことができる。
【００６１】
具体的に、組み換えベクターが発現する形質転換体を栄養培地で培養することで、二重標的抗体を大量生産することができ、培地と培養条件は、宿主細胞に応じて慣用のものを適宜選択して用いることができる。培養の際に細胞の生育とタンパク質の大量生産に適するように温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適宜調節することができる。
【００６２】
前記のように組み換え生産されたペプチド又はタンパク質は、培地又は細胞分解物から回収することができる。膜結合型の場合、好適な界面活性剤溶液（例えば、トリトン‐Ｘ１００）を使用するか又は酵素的切断によって膜から遊離されることができる。二重標的抗体の発現に使用された細胞は、凍結‐解凍順化、音波処理、機械的破壊又は細胞分解剤のような様々な物質的又は化学的手段によって破壊することができ、通常の生化学分離技術によって分離、精製が可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））。電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫カラムクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、等電点フォーカシング及びその様々な変化及び複合方法などが利用可能であるが、これに限定されない。
【００６３】
さらに他の様態として、本発明は、前記二重標的抗体を含む血管新生抑制用又は癌治療用組成物を提供する。本発明における用語「抗癌」とは、「予防」及び「治療」を含み、ここで、「予防」とは、本発明の抗体を含む組成物投与によって癌が抑制又は遅延されるすべての行為を意味し、「治療」とは、本発明の抗体投与によって癌の症状が好転するか、良好に変更するすべての行為を意味する。
【００６４】
本発明の組成物で治療することができる癌又は癌腫は、特に制限されず、固形癌及び血液癌を含む。好ましくは、大腸癌、結腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直腸癌、頭頚部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経細胞芽腫、黒色腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫又は神経膠腫などを含む。
【００６５】
本発明における抗癌組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。経口投与の際には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造されることができる。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多数回投薬形態に製造することができる。また、前記抗癌組成物は、典型的に膜を通過した移動を容易にする界面活性剤を含むことができる。このような界面活性剤は、ステロイドから誘導されたものであるか、Ｎ‐［１‐（２，３‐ジオレオイル）プロピル‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性脂質、又はコレステロールヘミサクシネート、ホスファチジルグリセロールなどの各種化合物などがある。
【００６６】
さらに他の様態として、本発明は、前記二重標的抗体、又は二重標的抗体を含む組成物を個体に投与して癌を治療し、癌の成長を抑制する方法を提供する。本発明に係る二重標的抗体を含む組成物は、癌細胞又はそれらの転移を治療するために、又は癌の成長を抑制するために薬学的に効果的な量で投与されることができる。癌の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び程度、現在の治療法の種類、治療回数、投与形態及び経路などの様々な要因に応じて異なり、当該分野における専門家によって容易に決定されることができる。本発明における組成物は、前記薬理学的又は生理学的成分をともに投与するか順次投与してもよく、また、追加の従来の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次又は同時に投与してもよい。このような投与は、単一又は多重投与であってもよい。前記要素をすべて考慮して、副作用のない最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されることができる。
【００６７】
本発明における「個体」とは、本発明の二重標的抗体を投与して、軽減、抑制又は治療することができる状態又は疾患であるか、そのような虞のある哺乳動物を意味し、好ましくは、ヒトを意味する。
【００６８】
本発明における「投与」とは、ある適切な方法で個体に所定の物質を取り入れることを意味し、本発明の二重標的抗体を含む組成物の投与経路は、目標組織に逹することができる限り、いかなる一般的な経路を介して投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与されてもよく、これに制限されない。しかし、経口投与の際に、タンパク質は、消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護するために剤形化することが好ましい。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されることができる。
【００６９】
また、本発明では、ヒトＤＬＬ４（ｈＤＬＬ４）を発現する細胞株又は組み換え細胞株とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の共培養によりＮｏｔｃｈ１活性を測定することを特徴とする前記二重標的抗体のＤＬＬ４拮抗効能の測定方法を提供する。
【００７０】
本発明において、前記Ｎｏｔｃｈ１活性は、ＮＩＣＤの発現量を測定することを特徴とし、ＮｏｔｃｈリガンドがＮｏｔｃｈ受容体に結合すると、まず、ＡＤＡＭ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅが活性化してＮｏｔｃｈ受容体の細胞膜外側近接部位が切れ、次いで、ｇａｍｍａ‐ｓｅｃｒｅｔａｓｅ複合体が活性化してＮｏｔｃｈ受容体の細胞膜内側近接部位を切り、ＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ）が遊離され、このＮＩＣＤは核に移動、ＲＢＰＪ／ＣＳＬ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒと結合し、Ｈｅｓ、Ｈｅｙのようなｂａｓｉｃ  ｈｅｌｉｘ‐ｌｏｏｐ‐ｈｅｌｉｘタンパク質などのＮｏｔｃｈターゲット遺伝子の発現を誘導する。
【００７１】
ＮＩＣＤの発現量の測定は、直接的には、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫染色法（ｉｍｍｕｎｏ‐ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ）、及び間接的には、ルシフェラーゼアッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）からなる群から選択される方法を用いて測定することを特徴とするが、これに限定されるものではなく、当業界における公知のタンパク質発現測定法を制限なく使用することができる。本発明では、好ましくは、ウェスタンブロット方法を使用してＮＩＣＤの発現量を測定した。
【００７２】
前記ヒトＤＬＬ４（ｈＤＬＬ４）を発現する細胞株又は組み換え細胞株とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の共培養は、具体的に、（ａ）ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養する段階と、（ｂ）ｈＤＬＬ４を発現する２９３細胞株（２９３‐ｈＤＬＬ４）と二重標的抗体を反応させた後、前記（ａ）段階で培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞に処理して共培養する段階と、を含む方法を用いて培養することができ、本発明の実施例において、前記共培養方法を用いて二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１によりＮｏｔｃｈ‐１活性化によって現れるＮＩＣＤ発現量が減少することを確認した。
【００７３】
また、Ｎｏｔｃｈ１活性は、ＮＩＣＤの発現量を測定することを特徴とする二重標的抗体のｈＤＬＬ４拮抗効能の測定方法は、本発明の他の実施例で確認したように、ＮＩＣＤ量をルシフェラーゼアッセイ方法を用いて測定することで、ＮＩＣＤプロモーター活性程度を測定することができ、ｈＤＬＬ４がコーティングされたプレートにヒト臍帯静脈内皮細胞と二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１を処理して培養した後、ＨＵＶＥＣ細胞内のＮＩＣＤの量を測定し、二重標的抗体のｈＤＬＬ４拮抗効能を測定することができる。
【００７４】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００７５】
実施例１：二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１臨時生産用発現ベクターの製造
ｈＤＬＬ４に結合するＮｏｔｃｈ１  ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｃｏｙ（Ｎｏｔｃｈ１の１１〜１２番目のｃａｌｃｉｕｍ‐結合ＥＧＦ−類似ドメイン）をコードするＤＮＡは、当該ドメインのアミノ酸塩基配列（図１及び配列番号７）を把握した後、遺伝子合成（ｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを含む、ＧｅｎｅＡｒｔ、ドイツ）により確保した。
【００７６】
前記７７個のアミノ酸塩基配列を１３個のアミノ酸からなるＧ４Ｓリンカー（Ｓ  ＧＧＧＧ  ＳＧＧＧＧＳ  ＧＳ）を用いてタニビルマブ（国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７号に開示されたＴＴＡＣ０００１参照）発現ベクターの軽鎖Ｎ‐末端部分にクローニングして、２９３‐Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ‐１１２６８ＴＭ）で発現が最適化した二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１発現ベクターを製造した（図２）。確認された組み換えベクターは、「ＰＭＣ‐２０１‐ｖ２１３」と称した。
【００７７】
実施例２：二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１の生産及び同定
完成された発現ベクターＰＭＣ‐２０１‐ｖ２１３を２９３Ｔ細胞に形質導入による任意発現を誘導した後、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによりその発現可否を確認した。形質導入は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１６６８‐０１９、米国）を用いており、その方法は、製造社の説明にしたがった。略述すると、αＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）が入っている６‐ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に１ウェルあたり５×１０５個の２９３Ｔ細胞を接種した後、加湿が維持されるＣＯ２（５％）培養器を使用して３７℃で２４時間放置することで、細胞密度が８０〜９０％程度になるように粗密に培養した。組み換えベクター２μｇ（ＰＭＣ‐２０１‐ｖ２１３）と６μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００をそれぞれ２５０μｌの無血清のαＭＥＭ培地に希釈し、常温で５分間放置した。
【００７８】
ＤＮＡ希釈液とｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００希釈液を交ぜて常温で２０分間反応させ、ＤＮＡ‐ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００複合体が形成されるようにした。培養された細胞で既存の培地を除去した後、ＤＮＡ‐ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００複合体５００μｌと無血清のαＭＥＭ培地５００μｌを各ウェルに添加して、３７℃条件のＣＯ２培養器で６時間培養した。透析ウシ胎児血清が２０％含まれたαＭＥＭ培地１ｍｌを追加して４８〜７２時間培養した後、その上澄みのみを分離して抗体の発現可否をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより確認した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥは、当業界で一般的に使用される方法を準用し、使用された試料は次のとおりである：１２％ＳＤＳ‐ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ０００１０、米国）、ＨＲＰ‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ｋａｐｐａ）抗体、また、ＨＲＰ‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）。
【００７９】
その結果、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１が発現されたことを確認することができ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティーカラム、ＳＰ‐ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム、サイズ排除カラムを用いたＦＰＬＣにより純度９５％以上の精製された抗体を取得することができた（図３）。
【００８０】
実施例３：二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１の結合能試験
３‐１：ＶＥＧＦＲ‐２及びｈＤＬＬ４に対する結合能試験
二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１がＶＥＧＦＲ‐２及びｈＤＬＬ４に対して結合するかを確認する結合能アッセイをＥＬＩＳＡを用いて実施した。このために、９６‐ウェルプレートにＶＥＧＦＲ‐２のＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ１〜３（以下、ＶＥＧＦＲ‐２ＥＣＤ）とＤＬＬ４をそれぞれ１μｇ／ｍｌの濃度でウェルに分注し、室温で２時間コーティングした後、２％の脱脂乳／ＰＢＳを用いて室温でｂｌｏｃｋｉｎｇ反応を２時間行った。
【００８１】
Ｂｌｏｃｋｉｎｇが終了したプレートをＰＢＳで洗浄した後、室温で予め準備した様々な濃度（０．１８〜３０００ｎｇ／ｍｌ）のＴａｎｉｂｉｒｕｍａｂとＰＭＣ‐２０１をＶＥＧＦＲ‐２ＥＣＤあるいはｈＤＬＬ４がコーティングされたウェルに入れて、室温で１時間反応させた。反応が終了した後、ＰＢＳを用いて洗浄し、次に、２次抗体としてＨＲＰ‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を１：２０００に希釈して添加し、常温で３０分間反応させた後、ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５５２１４、米国）を用いて発色反応を誘導し、２Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液５０μｌずつを添加して発色反応を中止した。発色反応の測定は、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて、吸光度４５０ｎｍと６５０ｎｍで行われる。
【００８２】
その結果、ＶＥＧＦＲ‐２には、ＴａｎｉｂｉｒｕｍａｂとＰＭＣ‐２０１が類似の結合能を示すことを確認した一方、ｈＤＬＬ４には、ＰＭＣ‐２０１のみが結合能を有することを確認した（図４）。
【００８３】
３‐２：ＰＭＣ‐２０１とｈｕｍａｎ  ＤＬＬ４の親和度分析
ＰＭＣ‐２０１のｈｕｍａｎ  ＤＬＬ４に対する解離定数（Ｋｄ、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を確認するために、ＢＩＡＣＯＲＥＲ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＣＭ５  ｃｈｉｐを使用した。解離定数は、Ｋｍ値の類似値であり、酵素‐基質複合体において酵素の基質に対する親和性の指標として使用され、値が低いほど酵素と基質の親和度が高いことを意味する。
【００８４】
試料の固定化は、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である４００ｍＭ  ＥＤＣ（Ｎ‐ｅｔｈｙｌ‐Ｎ´‐（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、１００ｍＭ  ＮＨＳ（Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ８．５）を使用し、再生バッファーとしては２０ｍＭの水酸化ナトリウム、固定化バッファーとしては１ＸＰＢＳに希釈した後、ｐＨ５．０の１０ｍＭのアセテート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に分析試料を１／４０に希釈した。固定化範囲としては４０００ＲＵ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｕｎｉｔ）で固定化した。分析試料の吸着性測定バッファーは、ＨＢＳ‐ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。抗原としては、ＤＬＬ４を測定濃度４．９、９．７、１９．５、３９．１、７８．１、１５６．３、３１２．５ｎＭでＨＢＳ‐ＥＰバッファーを使用し、最終容積が２００μｌになるように段階別に希釈した。７個の濃度のうち５個の濃度を選択してｆｉｔｔｉｎｇした。再生バッファーは、実際分析する前に予備に１５６．３ｎＭ試料を結合段階、解離段階を経た後、水酸化ナトリウムを利用ベースライン（ｂａｓｅ  ｌｉｎｅ）の＋１０％程度再生されるかを確認した後、使用濃度を選択した。分析流速は３０μｌ／ｍｉｎであり、結合区間は６０秒、解離区間は３００秒とし、分析試料の親和度を測定した。
【００８５】
各バッチ別の親和度を分析した結果、ＰＭＣ‐２０１、Ｎｏｔｃｈ‐１Ｆｃでそれぞれの親和度を確認し、本発明における二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１が、Ｎｏｔｃｈ‐１Ｆｃに比べて親和度が高いことを確認した（図５）。
【００８６】
３‐３：細胞表面に発現するｈＤＬＬ４とＰＭＣ‐２０１の結合能測定
ＥＬＩＳＡとＢｉａｃｏｒｅは、ｓｏｌｉｄ‐ｐｈａｓｅに固定されたｈＤＬＬ４に対するＰＭＣ‐２０１の結合能を確認したものであり、ＰＭＣ‐２０１が細胞表面に発現するｈＤＬＬ４に結合するか否かを確認するために、ＦＡＣＳ分析を行った（図６）。
【００８７】
先ず、ｈＤＬＬ４（配列番号１２アミノ酸配列）を発現する２９３ｐｏｏｌと細胞株を作製するために、ＧｅｎｅＡｒｔのＧｅｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｒにより、ｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを行ったｈＤＬＬ４のコード配列（配列番号１１塩基配列）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）の制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの位置にクローニングし、ｐｃＤＮＡ‐ｈＤＬＬ４を構築した。次に、前記ｐｃＤＮＡ‐ｈＤＬＬ４ベクターを２９３細胞に形質導入した。形質導入は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１６６８‐０１９、米国）を用いており、その方法は、製造社の説明にしたがった。略述すると、αＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）が入っている１００ｍｍのプレートに１×１０６個の２９３細胞を接種した後、加湿が維持されるＣＯ２（５％）培養器を使用して、３７℃で２４時間培養することで、細胞密度が２０％程度になるようにした。ベクター１６μｇ（ＤＬＬ４  ｐｃＤＮＡ３．１）と４０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００をそれぞれ１ｍｌの無血清のαＭＥＭ培地に希釈し、常温で５分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ後、ＤＮＡ希釈液とｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００希釈液を交ぜて常温で２０分間反応させ、ＤＮＡ‐ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００複合体が形成されるようにした。培養された細胞で既存の培地を除去した後、ＤＮＡ‐ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ２０００複合体１ｍｌと無血清のαＭＥＭ培地９ｍｌを各ウェルに添加し、加湿が維持される３７℃のＣＯ２培養器で６時間培養した後、透析ウシ胎児血清が１０％含まれたＤＭＥＭ培地に変えた。次に、３７℃で７２時間培養し、Ｔｒｙｐｓｉｎ‐ＥＤＴＡを使用して細胞を分離した後、透析ウシ胎児血清が１０％含まれたＤＭＥＭ培地とｎｅｏｍｙｃｉｎ（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ）を添加して培養した。７２時間後、同じ条件でＧ４１８濃度を１ｍｇ／ｍｌに増加させた培地に変えて、コロニーが形成されるまで１週間前後に培養した。コロニーが形成されたプレートでそれぞれのコロニーをＴｒｙｐｓｉｎｅ‐ＥＤＴＡ処理し、２４ウェルプレートに移して透析ウシ胎児血清が１０％含まれたＤＭＥＭ培地とｎｅｏｍｙｃｉｎ（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ）を添加して培養する一方、生長するすべてのコロニーを集めて、ｐｏｏｌ状態に培養した。
【００８８】
１週間後、ｐｏｏｌ状態でａｎｔｉ‐ｈＤＬＬ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国）でＦＡＣＳ分析を行ってｈＤＬＬ４発現を確認してから使用し、選別された単一コロニー２３種はこれらをそれぞれ６‐ｗｅｌｌプレートと１００ｍｍプレートで継代しながら、透析ウシ胎児血清１０％とｎｅｏｍｙｃｉｎ（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ）が含まれたＤＭＥＭ培地で培養した。単一コロニーのうちｈＤＬＬ４をよく発現する細胞１種を選択して、２９３‐ｈＤＬＬ４と称し、移行、ＰＭＣ‐２０１のＤＬＬ４の拮抗効能関連分析に用いた。
【００８９】
ＰＭＣ‐２０１が２９３‐ＤＬＬ４  ｐｏｏｌによく結合するかを確認するためにＦＡＣＳ分析を実施した。まず、十分な数（ＦＡＣＳサンプルあたり１×１０６以上）の２９３‐ＤＬＬ４  ｐｏｏｌを培養した後、これらをＴｒｙｐｓｉｎ‐ＥＤＴＡでｓｉｎｇｌｅ‐ｃｅｌｌ化し、１ｘ  ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（０．２％ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）２ｍｌを添加してよく交ぜ、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄みを捨て、沈殿した細胞に１０ｎＭ濃度のＰＭＣ‐２０１、Ｎｏｔｃｈ‐１  Ｆｃ、Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂでｉｃｅで２０分間１次染色した後、１ｘ  ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、ＰＥ‐ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体で２次染色（ｉｃｅで２０分）した後、洗浄した。次に、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で測定した。
【００９０】
細胞表面に発現するｈＤＬＬ４に対する結合可否を測定した結果、ＰＭＣ‐２０１は、Ｎｏｔｃｈ‐１Ｆｃに類似の結合能を示すことを確認した（図６）。
【００９１】
実施例４：二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１処理後、ＨＵＶＥＣの増殖能分析
本発明に係る二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１処理後、血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ、スイス）の増殖能変化を確認するために、細胞増殖能分析を実施した。ＨＵＶＥＣの培養は、２０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、線維芽細胞増殖因子（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）３ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加したｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ‐ｆｒｅｅ  Ｍ１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を使用し、細胞培養は、加湿された５％のＣＯ２混合空気条件の３７℃培養器で培養した。血管内皮細胞の生存率分析のために、これら細胞を２４‐ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルの密度で２４時間培養した。次に、Ｍ１９９培地で２回洗浄した後、１％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）が含まれたＭ１９９培地の低い血清濃度条件で６時間培養した。様々な濃度の抗体を細胞に３０分間前処理した後、２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を処理した。４８時間培養後、ＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）を２時間処理して４５０ｎｍ波長での吸光度を測定することで、各条件での細胞増殖能を比較した。
【００９２】
その結果、初代培養したＨＵＶＥＣ細胞に対する細胞増殖能アッセイにより、二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１がＶＥＧＦによって誘発されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖能を親抗体であるタニビルマブ（Ｔａｎｉｂｉｒｕｍａｂ）に比べてより強力に阻害することができることを確認した（図７）。
【００９３】
実施例５：ＦＡＣＳを用いた競争的ｈｕｍａｎ  ＤＬＬ４結合能分析
２９３‐ｈＤＬＬ４細胞株に結合するｈＮｏｔｃｈ１‐ＦｃにＰＭＣ‐２０１が競合的に結合するかを確認するためにＦＡＣＳ分析を実施した。まず、十分な数（ＦＡＣＳサンプルあたり細胞数１×１０６以上）の２９３‐ｈＤＬＬ４を培養した後、これらをＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理して、単一細胞に分離した後、１  Ｘ  ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（０．２％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）２ｍｌを添加した。次に、単一細胞に分離した細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄みを捨て、沈殿した細胞に１６μｇ／ｍｌ濃度のタニビルマブ又はＰＭＣ‐２０１とＡｌｅｘａ‐４８８（Ｚｅｎｏｎ、＃Ｚ‐２５４０２）をラベリングしたｒｈＮｏｔｃｈ１‐Ｆｃを１μｇ／ｍｌでともに入れて、氷で３０分間１次染色した後、１Ｘ  ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、次に、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で測定した。
【００９４】
その結果、ＨＵＶＥＣに結合するｒｈＮｏｔｃｈ１‐Ｆｃの結合が、ＰＭＣ‐２０１によって幾何平均（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ）で見たとき、４倍以上減少したことを確認した。一方、タニビルマブの場合、抗体非処理群と類似に、ｒｈＮｏｔｃｈ１‐Ｆｃの結合を阻害することができなかった（図８）。
【００９５】
実施例６：Ｎｏｔｃｈ‐１の一プロモーター活性分析
１×１０５個のＬＳ１７４Ｔ細胞（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；ＡＴＣＣ、ＣＬ‐１８８ＴＭ）を１０％のウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ培地に２４時間培養し、Ｃｉｇｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（＃３３６８４１  ＣＣＳ‐０１４Ｌ、ＱＩＡＧＥＮ）に含まれたＮｏｔｃｈ  Ｃｉｇｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＤＮＡ  ０．８μｇとｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（＃１１６６８‐５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μｌをｏｐｔｉ‐ＭＥＭ  ｍｅｄｉａ  １００μｌと交ぜて２０分間静置した後、よく交ぜて、トランスフェクションの際に、４００μｌ  ｏｐｔｉ‐ＭＥＭを添加して６時間培養した。６時間後、１０％のウシ胎児血清が含まれＭＥＭ培地に培地を交換した後。一晩中培養した。翌日、１×１０５個の２９３‐ｈＤＬＬ４細胞にタニビルマブとＰＭＣ‐２０１（それぞれ２０ｍｇ／ｍｌ）を交ぜて１時間前処理（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）した後、Ｎｏｔｃｈ  Ｃｉｇｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＤＮＡがトランスフェクションされたＬＳ１７４Ｔ細胞と２４時間共培養（ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ）した。ＤＡＰＴ（５ｍＭ）は、前処理せず、トランスフェクションされたＬＳ１７４Ｔ細胞に２９３‐ｈＤＬＬ４細胞とともに交ぜて、２４時間共培養（ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ）した。
【００９６】
ＤＡＰＴ（Ｎ‐［Ｎ‐（３，５‐Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）‐Ｌ‐ａｌａｎｙｌ］‐Ｓ‐ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｔ‐ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ）は、一般的にＮｏｔｃｈ１活性を抑制すると知られており、γ‐ｓｅｃｒｅｔａｓｅの活性を抑制して、ＮＩＣＤの生産増加を減少させる役割をする（Ａｎｄｒｅａ  Ｇｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，：３（７）：６８８，２００２；Ｉｅ‐Ｍｉｎｇ  Ｓｈｉｈ  ａｎｄ  Ｔｉａｎ‐Ｌｉ  Ｗａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６７：１８７９，２００７）。
【００９７】
２４時間共培養した後、Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．＃  Ｅ１９１０；Ｐｒｏｍｅｇａ）に含まれた溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）で溶解した後、基質とＡＴＰを交ぜ、Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して発光程度を測定した。
【００９８】
その結果、ＬＳ１７４Ｔ細胞のＮｏｔｃｈ‐１活性化によって示されるＮＩＣＤのプロモーター活性化が、抗体を処理していない比較群に比べて、二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１を処理した場合に、ＤＡＰＴ処理群だけＮＩＣＤのプロモーター活性化が減少したことを確認した（図９）。
【００９９】
実施例７：Ｎｏｔｃｈ‐１の活性化による細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）増加分析
６‐ウェルプレートに組み換えｈＤＬＬ４を１μｇ／ｍｌの濃度で一晩中（１６時間）コーティングした。１ＸＰＢＳで洗浄した後、各ウェル（ｗｅｌｌ）にヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、タニビルマブ、ＰＭＣ‐２０１（２０μｇ／ｍｌ）濃度で１時間処理した後、処理した抗体溶液を除去し、５×１０５個のＨＵＶＥＣとＩｇＧ、タニビルマブ、ＰＭＣ‐２０１（２０μｇ／ｍｌ）を交ぜて６‐ウェルプレートにそれぞれ処理した。２４時間培養後、溶解バッファー（最終１％ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｘ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用して細胞を溶解した後、細胞溶解液を集めてエッペンチューブに移して、９５℃で１０分間加熱した後、氷で冷やした後、ＢＣＡ定量法を用いて全体タンパク質を定量した後、実施例２のウェスタンブロット法と同じ方法でＮＩＣＤを測定した。
【０１００】
この際、１次抗体としては、Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｎｏｔｃｈ１（Ｖａｌ１７４４）（Ｄ３Ｂ８）抗体（Ｒａｂｂｉｔ）を１：１０００に、β‐ａｃｔｉｎ抗体（Ｒａｂｂｉｔ）は１：２０００に、５％、０．０５％ＴＢＳＴで満たされたｓｋｉｍ  ｍｉｌｋに希釈し、２次抗体としては、ａｎｔｉ‐Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  ＨＡＦ００８）を１：１０００に希釈して使用した。
【０１０１】
その結果、ＨＵＶＥＣ細胞でｈＮｏｔｃｈ‐１活性化によって現れるＮＩＣＤの量が、親抗体であるタニビルマブに比べて、ＤＬＬ４をターゲッティングする二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１によって相当減少していることを確認した（図１０）。
【０１０２】
一方、ｈＤＬＬ４をコーティングせず、細胞培養と共培養（ｃｏ‐ｃｕｌｔｕｒｅ）だけでＮＩＣＤを検出する分析方法のために、以下を行った。
【０１０３】
先ず、６‐ウェルプレートにＨＵＶＥＣを５×１０５細胞／ウェルで２４時間培養した。次に、２９３‐ｈＤＬＬ４（ヒトＤＬＬ４過発現２９３細胞株）２．５×１０５細胞／ウェルとｈＩｇＧ、ＰＭＣ‐２０１（１０μｇ／ｍｌ）ＤＡＰＴ（５μＭ）を１時間処理した後、抗体（ｈＩｇＧ、ＰＭＣ‐２０１）とＤＡＰＴが処理された２９３‐ｈＤＬＬ４細胞を抗体溶液を除去していない状態で、前記６‐ウェルプレートに初期培養されたＨＵＶＥＣに添加して２４時間共培養した。比較群としては２９３‐Ｔ細胞株を処理してＨＵＶＥＣと共培養した。
【０１０４】
このように、２４時間共培養された細胞を溶解バッファー（ｆｉｎａｌ  １％ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１ｘ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用して細胞を溶解した後、細胞溶解液を集めてエッペンチューブに移し、９５℃で１０分加熱した後、氷で冷やした後、ＢＣＡ定量法を用いて全体タンパク質を定量した後、実施例２のウェスタンブロット法と同じ方法でＮＩＣＤを測定した。
【０１０５】
その結果、ＨＵＶＥＣ細胞でＮｏｔｃｈ‐１活性化によって現れるＮＩＣＤの量が、ｈＩｇＧに比べて、ＤＬＬ４をターゲッティングする二重標的抗体ＰＭＣ‐２０１によって５０％未満に減少したことを確認した（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る二重標的抗体は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ‐２及びＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈ１の二つの経路によるシグナル伝逹をより効率的に同時に阻害することにより、腫瘍などの様々な血管新生関連疾患を治療することができ、特に、新生血管治療剤を単独で使用するに伴い発生する耐性を克服することができ、癌幹細胞を直接ターゲッティングすることにより、癌の再発を根本的に防止することができるという利点がある。
【０１０７】
したがって、本発明に係る二重標的抗体及びこれを含む薬学的組成物は、血管新生関連疾患、特に、癌を治療するために有用に使用することができる。
【０１０８】
以上、本発明における内容の特定の部分を詳細に説明しているが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であって、これによって本発明の範囲が制限されることはない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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