(57)【要約】  本発明は、ヒト血管内皮細胞増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）およびヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）に結合する化合物に関し、がん、特に、胃がん、肝細胞癌、卵巣がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんおよび乳がんを含め、ＶＥＧＦＲ２およびＡｎｇ２によって引き起こされる固形腫瘍を処置するのに有用であろう。  【選択図】【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物であって、
２つの一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）ポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、
（ａ）この抗体が、２つの同一の重鎖（ＨＣ）と２つの同一の軽鎖（ＬＣ）とを含み、それぞれのＨＣが、アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４によって与えられる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、それぞれのＬＣが、アミノ酸配列が配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５によって与えられる軽鎖可変領域（ＬＶＣＲ）を含み、
（ｂ）２つのｓｃＦｖポリペプチドが同一であり、それぞれが、ＬＣＶＲに作動可能に連結するＨＣＶＲを含み、それぞれのＨＣＶＲが、配列番号２１または配列番号２２に与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのＬＣＶＲが、配列番号２３または配列番号２４に与えられるアミノ酸配列を有し、
（ｃ）２つのリンカーが、ｓｃＦｖポリペプチドの１つのアミノ末端に対し、抗体の１つのＨＣのカルボキシ末端にそれぞれ作動可能に連結する、同一のグリシンを豊富に含むリンカーである、化合物。
【請求項２】
２つのｓｃＦｖポリペプチドが、それぞれ、１つのｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲのアミノ末端に作動可能に連結する１つのｓｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲのカルボキシ末端を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号１に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１３に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１４に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号３に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１５に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号４に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１３に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２２に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２４に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項７】
抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）とを含み、それぞれのＨＣが、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのＬＣが、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項８】
抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号５に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１６に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号６に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１７に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号７に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１８に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号８に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１６に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号１９または配列番号２０のいずれかに与えられる同一のアミノ酸配列を有する、請求項１または７に記載の化合物。
【請求項１３】
それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号１９に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号２０に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を有する、化合物。
【請求項１６】
それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２０】
それぞれの第１のポリペプチドは、それぞれの第２のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、他の第１のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、それぞれの第１のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
哺乳動物細胞であって、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含み、この細胞は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞。
【請求項２２】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される２つの第１のポリペプチドと、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で請求項２１に記載の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセス。
【請求項２３】
請求項２２に記載のプロセスによって得ることができる化合物。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物と、許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
有効な量の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物を、がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２６】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がんまたは肝細胞癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
治療に使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
がんの処置に使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、請求項２９に記載の使用のための化合物。
【請求項３１】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がんまたは肝細胞癌である、請求項２９に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。さらに特定的には、本発明は、ヒト血管内皮細胞増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）およびヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）に結合する化合物に関し、がん、特に、胃がん、肝細胞癌、卵巣がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんおよび乳がんを含め、ＶＥＧＦＲ２およびＡｎｇ２によって引き起こされる固形腫瘍を処置するのに有用であろう。
【背景技術】
【０００２】
がんの典型的な特徴は、継続して起こる新しい血管の生成であり、これは血管新生と呼ばれる。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）経路は、血管新生の制御において重要なシグナル伝達カスケードであり、ヒトＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦ経路の鍵となる受容体である。ラムシルマブ（ＩＭＣ−１１２１Ｂ）は、ヒトＶＥＧＦＲ２を標的とするＩｇＧ１抗体であり、特定の臨床研究で抗腫瘍効果があることが示されている（例えば、Ｚｈｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１３）１９：６６１４を参照）。
アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）およびＡｎｇ２は、血管新生を制御する別の鍵となる経路のメンバーである。Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は、内皮細胞に特異的な受容体チロシンキナーゼＴｉｅ２に結合する、分泌される因子である。Ａｎｇ１は、周細胞によって構成的に分泌され、Ｔｉｅ２受容体を介して血管の完全性を安定なものとする。Ａｎｇ２は、刺激（例えば、創傷治癒、腫瘍成長）に対する応答のときにのみ内皮細胞から放出され、血管の萌出を助長し、Ｔｉｅ２シグナル伝達を介して周細胞−内皮細胞相互作用を阻害する。ヒトＡｎｇ２に対する抗体は、ＶＥＧＦブロッカーであるアフリベルセプトと組み合わせて投薬されると、腫瘍成長を阻害し、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍血管系を減少させることが示されている（Ｄａｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１３）７３（１）：１０８）。複数の研究段階のＡｎｇ２抗体が、現在臨床試験中である。
血管新生のＶＥＧＦ経路およびＡｎｇ／Ｔｉｅ２経路を両方とも阻害することで、がんに対する転帰を向上させる可能性が提案されている（例えば、Ｄａｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１３）７３：１０８）。現在、ＶＥＧＦＲ２抗体とＡｎｇ−２抗体の併用投与は、２つの別個の製品の注射または注入、または抗体混合物を一緒に配合した製剤の投与のいずれかを必要とする。別個に投与すれば、投薬の量および時間調整を柔軟にすることができるが、注入時間が長くなることにより、患者のコンプライアンスおよび不便さという課題が起こり得る。一緒に配合した製剤は、投薬の量はある程度柔軟に変えられるが、２種類の異なる抗体が異なる分子特徴を有するため、両方の抗体の化学的および物理的な安定さを可能にする配合条件を見つけることに課題がある場合がある。さらに、併用投与または一緒に配合した製剤は、２つの薬物治療の費用が相加的にかかる。
ＷＯ２０１２／００９７０５号は、抗体を含む足場材に固定された１つ以上のモジュール認識ドメイン（ＭＲＤ）を含有する複合体を開示した。Ａｎｇ２は、この複合体のＭＲＤ部分であると考えられるものとして列挙されており、ＶＥＧＦＲ２抗体は、ＭＲＤを固定し得る抗体として明記されている。ＶＥＧＦＲ２抗体に固定されたＡｎｇ２に対するＭＲＤは、例示されていなかった。Ｂｒｏｗｎら（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ（２０１０）９（１）：１４５）は、ヒトモノクローナルＡｎｇ２抗体３．１９．３を開示した。ＳＷ６２０異種移植研究では、３．１９．３は、マウスＶＥＧＦＲ２に結合するモノクローナル抗体ＤＣ１０１と組み合わせて投薬された。
ヒトＡｎｇ２に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）部分に融合したＩｇＧ１骨格またはＩｇＧ４骨格のＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含有するＶＥＧＦＲ２抗体部分を含有する化合物（化合物ＡおよびＢ）を作成するとき、本発明の一部の出願人によって、発現および安定性の問題が観察された。具体的には、驚くべきことに、遊離した軽鎖のミスペアリングのため、組み換えによって発現された材料が化学的に不安定であり、生成物が許容できない品質を有するといったことが観察された。本発明の一部の出願人によって観察されたように、細胞培養から得られた物質の化学的な不安定性および生成物の品質を向上させるように操作された化合物からは、予想できないことだが、Ｍａｂ−ダイアボディ生成に起因して生成物の異種混合度が増した特定の化合物が得られた。
ヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２の両方に結合し、効果をなくすことによって２つの血管新生の経路を阻害する化合物を提供することが依然として必要である。特に、Ａｎｇ２  ｓｃＦｖの使用に起因するＡｎｇ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの顕著な結合活性を犠牲にせず、１つの化合物内にＶＥＧＦＲ２抗体とＡｎｇ２  ｓｃＦｖ一緒に存在することに起因する顕著なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイ活性を犠牲にせずに、ヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２の両方に結合し、効果をなくすことによって２つの血管新生の経路を阻害する化合物を提供することが依然として必要である。また、ヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２の両方に結合し、効果をなくすことによって２つの血管新生の経路を阻害し、上に列挙した安定性および生成物の異種混合度の問題の少なくとも１つを回避する化合物を提供することも依然として必要である。
【発明の概要】
【０００３】
従って、本発明の一実施形態は、化合物であって、
２つの一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）ポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、
（ａ）この抗体が、２つの同一の重鎖（ＨＣ）と２つの同一の軽鎖（ＬＣ）とを含み、それぞれのＨＣが、アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４によって与えられる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、それぞれのＬＣが、アミノ酸配列が配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５によって与えられる軽鎖可変領域（ＬＶＣＲ）を含み、
（ｂ）２つのｓｃＦｖポリペプチドが同一であり、それぞれが、ＬＣＶＲに作動可能に連結するＨＣＶＲを含み、それぞれのＨＣＶＲが、配列番号２１または配列番号２２に与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのＬＣＶＲが、配列番号２３または配列番号２４に与えられるアミノ酸配列を有し、
（ｃ）２つのリンカーが、ｓｃＦｖポリペプチドの１つのアミノ末端に対し、抗体の１つのＨＣのカルボキシ末端にそれぞれ作動可能に連結する、同一のグリシンを豊富に含むリンカーである、化合物を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、化合物であって、２つの一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）ポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、２つのｓｃＦｖポリペプチドが、それぞれ、１つのｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲのアミノ末端に作動可能に連結する１つのｓｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲのカルボキシ末端を含む、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号１に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１３に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１４に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号３に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１５に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号４に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１３に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２２に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２４に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）とを含み、それぞれのＨＣが、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのＬＣが、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号５に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１６に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号６に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１７に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号７に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１８に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号８に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１６に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号１９または配列番号２０のいずれかに与えられる同一のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号１９に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つのｓｃＦｖポリペプチドに２つのリンカーによって融合した抗体を含み、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号２０に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。表１に示されるように、２つの第１のポリペプチドは、抗体のＨＣと、リンカーと、ｓｃＦｖポリペプチドとを含み、２つの第２のポリペプチドは、抗体のＬＣを含む。
一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、さらに、化合物であって、２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、それぞれの第１のポリペプチドは、それぞれの第２のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、他の第１のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、それぞれの第１のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、
（ａ）抗体は、２つの同一の重鎖（ＨＣ）と、２つの同一の軽鎖（ＬＣ）とを含み、それぞれのＨＣは、アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４によって与えられる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、それぞれのＬＣは、アミノ酸配列が配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５によって与えられる軽鎖可変領域（ＬＶＣＲ）を含み、
（ｂ）２つのｓｃＦｖポリペプチドが同一であり、それぞれが、ＬＣＶＲに作動可能に連結するＨＣＶＲを含み、それぞれのＨＣＶＲが、配列番号２１または配列番号２２に与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのＬＣＶＲが、配列番号２３または配列番号２４に与えられるアミノ酸配列を有し、
（ｃ）２つのリンカーは、ｓｃＦｖポリペプチドの１つのアミノ末端に対し、抗体の１つのＨＣのカルボキシ末端にそれぞれ作動可能に連結する、同一のグリシンを豊富に含むリンカーである、
化合物を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲのカルボキシ末端が、ＨＣＶＲのアミノ酸に作動可能に連結する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号１に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１３に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１４に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号３に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１５に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２１に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２３に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号４に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号１３に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＨＣＶＲは、配列番号２２に与えられるアミノ酸配列を有し、ｓｃＦｖポリペプチドのそれぞれのＬＣＶＲは、配列番号２４に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）とを含み、それぞれのＨＣは、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのＬＣは、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号５に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１６に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号６に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１７に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号７に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１８に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、抗体のそれぞれのＨＣは、配列番号８に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのＬＣは、配列番号１６に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号１９または配列番号２０のいずれかに与えられる同一のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号１９に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し、２つのリンカーによって融合したヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）に結合する抗体を含むヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する化合物であって、それぞれのｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号２０に与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）およびヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する化合物であって、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）およびヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する化合物であって、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）およびヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する化合物であって、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）およびヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する化合物であって、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）およびヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する化合物であって、それぞれの第１のポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、さらに、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含むヒトＶＥＧＦＲ２（配列番号３２）およびヒトＡｎｇ２（配列番号３３）に結合する化合物であって、それぞれの第１のポリペプチドは、それぞれの第２のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、他の第１のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、それぞれの第１のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成する、化合物を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ２に対する解離平衡定数ＫＤが約３００ｐＭ〜約１４００ｐＭであり、ヒトＡｎｇ２に対するＫＤが約３００ｐＭ〜約８００ｐＭである本発明の化合物を提供する。本発明の化合物は、さらに、ヒトＶＥＧＦＲ２に対するｋｏｎ速度が約０．１×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１〜約０．５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１であり、ヒトＡｎｇ２に対するｋｏｎ速度が約１×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１〜約３×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１であることを特徴とする。本発明の化合物は、さらに、ヒトＶＥＧＦＲ２に対するｋｏｆｆ速度が約０．１×１０−４ｓｅｃ−１〜約０．５×１０−４ｓｅｃ−１であり、ヒトＡｎｇ２に対するｋｏｆｆ速度が約０．８×１０−４ｓｅｃ−１〜約１．２×１０−４ｓｅｃ−１であることを特徴とする。ＫＤ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの値は、アッセイの章の「結合反応速度、アフィニティおよび選択性」に記載されるような、２５℃での結合反応速度によって達成される。
本発明の化合物は、高アフィニティでヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＡｎｇ２に結合する。本開示の目的のために、用語「高アフィニティ」は、ヒトＶＥＧＦＲ２に対するＫＤが約１５００ｐＭ未満であり、ヒトＡｎｇ２に対するＫＤが約１０００ｐＭ未満であることを指す。ＫＤ値は、アッセイの「結合反応速度、アフィニティおよび選択性」の章に記載されるような、２５℃での結合反応速度によって達成される。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞であって、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含み、この細胞は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞であって、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含み、この細胞は、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１６のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞であって、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含み、この細胞は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１７のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞であって、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含み、この細胞は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１８のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞であって、配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含み、この細胞は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１６のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される２つの第１のポリペプチドと、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で本発明の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセスを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号９の２つの第１のポリペプチドと、配列番号１６の２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で本発明の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセスを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１０の２つの第１のポリペプチドと、配列番号１７の２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で本発明の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセスを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１１の２つの第１のポリペプチドと、配列番号１８の２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で本発明の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセスを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１２の２つの第１のポリペプチドと、配列番号１６の２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で本発明の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセスを提供する。
上述のプロセスの一実施形態では、本発明の哺乳動物細胞中の２つのポリヌクレオチド配列は、同じ核酸分子の一部である。
一実施形態では、本発明は、上述のプロセスのいずれかによって得ることができる化合物を提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明の化合物と、許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、がんを処置することが必要な患者に投与することを含み、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、がんを処置することが必要な患者に投与することを含み、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌であるである、方法を提供する。さらなる実施形態では、これらの方法は、シスプラチン、カルボプラチン、リポソームのドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁物のためのタンパク質結合粒子パクリタキセル、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびイリノテカン）およびセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
さらなる実施形態では、これらの方法は、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブおよびデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）からなる群から選択される１つ以上の免疫腫瘍療法薬と組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、１つ以上の免疫腫瘍療法と組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を、がんを処置することが必要な患者に投与し、がんが、膀胱がん、腎がん、前立腺がんまたは精巣がんであり、免疫腫瘍療法薬が、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される、方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、乳がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、乳がんを処置する方法を提供する。さらなる実施形態では、乳がんを処置するこれらの方法は、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁物のためのタンパク質結合粒子パクリタキセル、イキサベピロンおよびカペシタビンからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、卵巣がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、卵巣がんを処置する方法を提供する。さらなる実施形態では、卵巣がんを処置するこれらの方法は、シスプラチン、カルボプラチンおよびリポソームのドキソルビシンからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、胃がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、胃がんを処置する方法を提供する。さらなる実施形態では、胃がんを処置するこれらの方法は、ラムシルマブと組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、肝細胞癌を処置することが必要な患者に投与することを含む、肝細胞癌を処置する方法を提供する。さらなる実施形態では、肝細胞癌を処置するこれらの方法は、ラムシルマブと組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、有効な量の本発明の化合物を、直腸結腸がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、直腸結腸がんを処置する方法を提供する。さらなる実施形態では、直腸結腸がんを処置するこれらの方法は、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびイリノテカン）およびセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせて、同時、別個または逐次に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、治療に使用するための本発明の化合物を提供する。一実施形態では、本発明は、がんの処置に使用するための本発明の化合物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、がんの処置に使用するための本発明の化合物であって、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がんまたは肝細胞癌である化合物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、がんの処置に使用するための本発明の化合物であって、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である化合物を提供する。さらなる実施形態では、がんの処置に使用するために、シスプラチン、カルボプラチン、リポソームのドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁物のためのタンパク質結合粒子パクリタキセル、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびイリノテカン）およびセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
さらなる実施形態では、がんの処置に使用するための、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される１つ以上の免疫腫瘍療法薬と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
さらなる実施形態では、がんの処置に使用するための、がんが、膀胱がん、腎がん、前立腺がんまたは精巣がんであり、免疫腫瘍療法薬が、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される１つ以上の免疫腫瘍療法薬と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
一実施形態では、本発明は、乳がんの処置に使用するための本発明の化合物を提供する。さらなる実施形態では、乳がんの処置に使用するための、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁物のためのタンパク質結合粒子パクリタキセル、イキサベピロンおよびカペシタビンからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
一実施形態では、本発明は、卵巣がんの処置に使用するための本発明の化合物を提供する。さらなる実施形態では、卵巣がんの処置に使用するための、シスプラチン、カルボプラチンおよびリポソームのドキソルビシンからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
一実施形態では、本発明は、胃がんの処置に使用するための本発明の化合物を提供する。さらなる実施形態では、胃がんの処置に使用するための、ラムシルマブと同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
一実施形態では、本発明は、肝細胞癌の処置に使用するための本発明の化合物を提供する。さらなる実施形態では、肝細胞癌の処置に使用するための、ラムシルマブ群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
一実施形態では、本発明は、結腸直腸がんの処置に使用するための本発明の化合物を提供する。さらなる実施形態では、直腸結腸癌の処置に使用するための、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびイリノテカン）およびセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と同時、別個または逐次に組み合わせた本発明の化合物。
一実施形態では、本発明は、がんの処置のための医薬を製造するための本発明の化合物の使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、がんの処置のための医薬を製造するための本発明の化合物の使用であって、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がんまたは肝細胞癌である、使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、がんの処置のための医薬を製造するための本発明の化合物の使用であって、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、使用を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、がんの処置のための医薬を製造するための、シスプラチン、カルボプラチン、リポソームのドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁物のためのタンパク質結合粒子パクリタキセル、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシルおよびイリノテカン）およびセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせた、同時、別個または逐次の本発明の化合物の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明の化合物は、操作された、天然に存在しないポリペプチド複合体である。本発明のＤＮＡ分子は、本発明の化合物中のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、天然に存在しないＤＮＡ分子である。
本発明の化合物の抗体部分は、操作されたＣＤＲを有し、ヒトゲノム配列から誘導されるフレームワークおよび定常領域と同一または実質的に同一（実質的にヒト）である、ヒト由来である抗体のいくつかの部分（フレームワーク、ヒンジ領域および定常領域のすべてまたは一部）を有するように設計される。完全にヒトのフレームワーク、ヒンジ領域および定常領域は、ヒト生殖細胞系配列、天然に存在する体細胞変異を有する配列および操作された突然変異を有する配列である。本発明の化合物の抗体部分は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含有する、完全にヒトのフレームワーク、ヒンジ領域または定常領域から誘導されるフレームワーク、ヒンジ領域または定常領域を含んでいてもよい。さらに、本発明の化合物の抗体部分は、好ましくは、ヒトに実質的に非免疫原性である。
本発明の化合物の抗体部分は、ＩｇＧ型抗体であり、鎖内ジスルフィド結合および鎖間ジスルフィド結合を介して共有結合により安定化された４つのアミノ酸鎖（２つの「重」鎖と２つの「軽」鎖）を含む。それぞれの重鎖は、Ｎ末端ＨＣＶＲと重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）とで構成される。それぞれの軽鎖は、ＬＣＶＲと軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）とで構成される。特定の生体系で発現する場合、ネイティブヒトＦｃ配列を有する抗体は、Ｆｃ領域でグリコシル化される。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位にある抗体のＦｃ領域で起こる。Ｎ−グリカンは、典型的には、アスパラギンに固定された。抗体は、同様に他の位置でグリコシル化されてもよい。
場合により、本発明の化合物の抗体部分は、Ｆｃ受容体が介在する炎症機構に関わり、またはエフェクター機能を低下させる補体を活性化させる能力のため、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域から誘導されるＦｃ部分を含有する。
さらに、本発明の特定の化合物の抗体部分は、ＩｇＧ４−ＰＡＡ  Ｆｃ部分を含有する。ＩｇＧ４−ＰＡＡ  Ｆｃ部分は、位置２２４でのセリンからプロリンへの突然変異、位置２３０でのフェニルアラニンからアラニンへの突然変異、および位置２３１でのロイシンからアラニンへの突然変異を有する。Ｓ２２４Ｐ突然変異は、半抗体の生成（ＩｇＧ４抗体における半分子の動的交換の現象）を防ぐヒンジ突然変異である。Ｆ２３０ＡおよびＬ２３１Ａの突然変異は、すでに低いヒトＩｇＧ４アイソタイプのエフェクター機能をさらに下げる。
ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡ分子は、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に対してＨＣＶＲをコードするＤＮＡが作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒトおよび他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に対してＬＣＶＲをコードするＤＮＡが作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子に変換することができる。ヒトおよび他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ定常領域またはλ定常領域であってもよい。
「一本鎖フラグメント可変」または「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖポリペプチド」は、ｓｃＦｖリンカー分子を介して連結した抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、操作された、天然に存在しない一本鎖の折りたたまれたポリペプチドを指す。本発明の化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、操作されたＣＤＲを有し、また、ヒトゲノム配列から誘導されるフレームワークと同一または実質的に同一（実質的にヒト）である、ヒト由来であるｓｃＦｖのいくつかの部分（フレームワークのすべてまたは一部）を有するように設計された、操作された天然に存在しないｓｃＦｖである。完全ヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列、天然に存在する体細胞変異を有する配列および操作された突然変異を有する配列である。本発明の化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含有する、完全にヒトのフレームワークから誘導されるフレームワークを含んでいてもよい。さらに、本発明の化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、好ましくは、ヒトに実質的に非免疫原性である。場合により、本化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、ＨＣＶＲのシステイン４４からＬＣＶＲのシステイン１００までの４４〜１００のジスルフィドを有していてもよい（Ｃｙｓ４４およびＣｙｓ１００の番号付けは、ｓｃＦｖポリペプチドの第１のアミノ酸から始まる番号付けと対応する）。このようなｓｃＦｖポリペプチドでは、ＨＣＶＲドメインおよびＬＣＶＲドメインは、ＨＣＶＲ−ｓｃＦｖリンカー−ＬＣＶＲまたはＬＣＶＲ−ｓｃＦｖリンカー−ＨＣＶＲのいずれかの順序であってもよい。ｓｃＦｖリンカーは、柔軟性のグリシンを豊富に含むペプチドリンカーであってもよく、これにより、ＨＣＶＲ鎖およびＬＣＶＲ鎖を、抗原を認識するための機能性モノマー単位として折りたたむことができる。場合により、ｓｃＦｖリンカーは、グリシンを豊富に含むリンカー、例えば、２ｘ  Ｇ４Ｓリンカー、３ｘ  Ｇ４Ｓリンカー、４ｘ  Ｇ４Ｓリンカーまたは５ｘ  Ｇ４Ｓリンカーであってもよい。
抗体に対するｓｃＦｖの融合によって、発現および分泌の間に複数の構造を作成することができる。第１に、抗体に融合したｓｃＦｖ要素は、分子内相互作用によって独立して折りたたまれる能力を有し、これによって、同じポリペプチドの中に位置する個々のＨＣＶＲ要素およびＬＣＶＲ要素が折りたたまれ、Ｍａｂ−ｓｃＦｖと呼ばれる２つの別個の自家単位を生成することができる。第２に、代替となる折りたたみ経路によって、抗体に融合したｓｃＦｖ要素は、分子間相互作用によって折りたたまれる能力を有し、それによって、１つのポリペプチド中に存在するＨＣＶＲが、隣接するポリペプチド中に存在するＬＣＶＲとともに折りたたまれ、Ｍａｂ−ダイアボディと呼ばれる１つの一緒に折りたたまれた種を生成することができる。
用語「リンカー」および「ｓｃＦｖリンカー」は、両方とも、グリシンを豊富に含むペプチドリンカーを指す。「リンカー」は、本発明の特定の実施形態では、抗体をｓｃＦｖに連結するために利用され、「ｓｃＦｖリンカー」は、本発明の特定の実施形態では、ｓｃＦｖのＬＣＶＲをｓｃＦｖのＨＣＶＲに連結するために利用される。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、さらに好ましくは１０〜５０アミノ酸を有するグリシンを豊富に含むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態では、前記グリシンを豊富に含むペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３およびｎ＝３、４、５または６）または（ｘ＝４およびｎ＝２、３、４または５）である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、前記グリシンを豊富に含むペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝４およびｎ＝２、３、４または５（すなわち、それぞれ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）または  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７）である。
本発明のポリヌクレオチドは、この配列が発現制御配列に作動可能に連結した後に、宿主細胞内で発現する。この発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡと一体化した部分として、宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを含有し、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞を検出することができる。
本発明の化合物は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞内で簡単に産生されるだろう。宿主細胞は、当該技術分野で周知の技術を用いて培養される。
目的のポリヌクレオチド（例えば、上の化合物のポリペプチドおよび発現制御配列をコードするポリヌクレオチド）配列を含有するベクターを、周知の方法によって宿主細胞に移動させることができ、この方法は、細胞宿主の種類に依存して変わる。
種々のタンパク質精製方法を使用してもよく、このような方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：  ８３−８９（１９９０）およびＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ（１９９４）に記載される。
本発明の別の実施形態では、化合物または化合物をコードする核酸は、単離された形態で与えられる。本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、細胞環境でみられる他の高分子種を含まないか、または実質的に含まないタンパク質、ペプチドまたは核酸を指す。「実質的に含まない」は、本明細書で使用される場合、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸が、存在する高分子種の８０％より多く（モル基準で）、好ましくは、９０％より多く、さらに好ましくは９５％より多く含まれることを意味する。
本発明の化合物またはこの化合物を含む医薬組成物を、非経口経路（例えば、皮下および静脈内）によって投与してもよい。本発明の化合物を、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに、１回投薬または複数回投薬で患者に投与してもよい。本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（１９９５）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、本明細書に開示されるような化合物と、１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む。
用語「処置すること」（または「処置する」または「処置」）は、存在する症状、障害、状態または疾患の進行または重篤度を遅らせるか、中断させるか、阻止するか、軽減するか、止めるか、低減するか、逆行させることを指す。患者は、哺乳動物、好ましくは、ＶＥＧＦＲ２および／またはＡｎｇ２の阻害から利益を受け得る疾患、障害または状態を有するヒトを指す。
「結合する」は、本明細書で使用される場合、ヒトＶＥＧＦＲ２またはヒトＡｎｇ２に対する化合物、抗体またはｓｃＦｖポリペプチドのアフィニティに関して、特に示されていない限り、本明細書に記載されるような本質的に２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーの使用による方法を含め、当該技術分野で公知の一般的な方法によって決定される場合に、ＫＤが約１×１０−８Ｍ未満、好ましくは、約１×１０−９Ｍ未満であることを意味することを意図している。本発明の化合物に関して本明細書で使用される用語「選択的」または「選択性」は、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定される場合、ヒトＡｎｇ１のような標的ファミリーのメンバーを含めた他のタンパク質に結合する化合物よりも約１０００分の１、約５００分の１、約２００分の１、約１００分の１、約５０分の１または約１０分の１の低いＫＤで標的（例えば、ヒトＡｎｇ２）に結合する化合物を指す。これに加えて、またはこれに代えて、Ａｎｇ２に選択的な本発明の化合物は、本明細書で以下の実施例に記載する方法によってアッセイしたとき、ヒトＡｎｇ２に結合するが、ヒトＡｎｇ１には結合しないか、または最低限しか結合しない。
「有効な量」は、研究者、医師または他の臨床医によって求められる組織、系、動物、哺乳動物またはヒトに対し、生物学的または医学的な応答を誘発するか、または望ましい治療効果を誘発する本発明の化合物の量、または本発明の化合物を含む医薬組成物の量を意味する。化合物の有効な量は、例えば、疾患の状態、個人の年齢、性別および体重、および化合物個人において望ましい応答を誘起する能力のような因子によって変わってもよい。有効な量は、化合物の毒性または有害な影響よりも、治療に有益な効果が勝る量でもある。
本発明を、さらに以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【０００５】
（実施例１：化合物の発現および精製）
化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆの抗体部分、ｓｃＦｖ部分および抗体−リンカー−ｓｃＦｖのポリペプチド、およびこれらをコードするヌクレオチド配列を以下の「アミノ酸およびヌクレオチド配列」という表題の章に列挙する。それに加え、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆの抗体部分、ｓｃＦｖ部分および抗体−リンカー−ｓｃＦｖの配列番号を表１に示す。
限定されないが、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆを含む本発明の化合物を、本質的に以下に示すように製造し、精製することができる。適切な宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ）は、あらかじめ定められた最適なＨＣ−リンカー−ｓｃＦｖ：ＬＣベクター比（例えば、１：３または１：２）を用いた化合物を分泌するための発現系、またはＨＣ−リンカー−ｓｃＦｖおよびＬＣの両方をコードする１つのベクター系を用いて一時的または安定にトランスフェクトされていてもよい。化合物が分泌した澄んだ培地は、任意の多くの一般的に使用される技術を用いて精製されてもよい。例えば、この培地を、簡便には、Ｆａｂフラグメントのために、適合するバッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４））で平衡状態にしたＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用してもよい。このカラムを洗浄し、非特異的な結合要素を除去してもよい。結合した化合物を、例えば、ｐＨ勾配（例えば、ｐＨ７の２０ｍＭのＴｒｉｓバッファーから、ｐＨ３．０の１０ｍＭクエン酸ナトリウムまで、またはｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水から、ｐＨ３．０の１００ｍＭのグリシンバッファーまで）によって溶出させてもよい。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって化合物のフラクションを検出し、その後、溜めておいてもよい。さらなる精製は、意図する用途に応じて任意である。一般的な技術を用い、化合物を濃縮し、および／または滅菌濾過してもよい。可溶性凝集物およびマルチマーを、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダルクロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去してもよい。これらのクロマトグラフィー工程後の化合物の純度は、９５％より大きい。生成物をすぐに−７０℃で凍結させてもよく、または凍結乾燥してもよい。
【表１】
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（アッセイ）
（結合反応速度、アフィニティおよび選択性）
ヒトＡｎｇ２およびヒトＶＥＧＦＲ２に対する本発明の化合物の結合反応速度、アフィニティおよび選択性を、当該技術分野で公知の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を使用することによって決定してもよい。
複数の種の可溶性Ａｎｇ２（ヒト、カニクイザル、マウス、ウサギおよびイヌ）およびＶＥＧＦＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ヒト、カニクイザル、ウサギおよびイヌ）の結合速度および平衡解離定数（ＫＤ）を、本発明の化合物について、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴方法を用い、２５℃または３７℃で決定してもよい。ヒトＡｎｇ２およびＶＥＧＦＲ２−ＥＣＤは、それぞれＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入されてもよい。抗体を捕捉するためのタンパク質Ａの表面は、以下の方法を用いて調製されてもよい。ＣＭ４（Ｂｉａｃｏｒｅ  番号ＢＲ−１００５−３４）またはＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ  番号ＢＲ−１０００−９９）に対する可溶性タンパク質Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３９２０２）の固定は、ＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング方法（Ｂｉａｃｏｒｅ  番号ＢＲ−１０００−５０）を用いて調製されてもよい。簡単にいうと、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注入することによって、４つのフローセルすべての表面を活性化してもよい。この後、可溶性タンパク質Ａを１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）で５０〜１００μｇ／ｍＬになるまで希釈し、フローセル（Ｆｃ）２、３または４に流速１０μＬ／分で７分間かけて固定してもよい。チップ表面に残る未反応部位を、エタノールアミンを１０μＬ／分で７分間注入することによってブロックしてもよい。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  番号ＢＲ−１００６−６９）であってもよい。ランニングバッファーで希釈することによって、化合物サンプルを１μｇ／ｍＬで調製してもよい。ランニングバッファーでの２倍の段階希釈を用い、５０ｎＭ〜１．５６ｎＭの範囲の別個の濃度のＡｎｇ２リガンドを調製してもよい。それぞれの分析サイクルは、一連の別個の５工程からなっていてもよい。（１）別個のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４）での化合物を捕捉し、（２）すべてのＦｃの上に、５０μＬ／分で、２５０μＬ（表面接触時間３００秒）の個々の濃度のＡｎｇ２またはＶＥＧＦＲ２−ＥＣＤを注入し（ｋｉｎｊｅｃｔを用いる）、（３）２０分間かけてバッファー流に戻し、解離段階をモニタリングし、（４）１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）１０μＬ（接触時間３０秒）の注入によってチップ表面を再生し、（５）１５μＬ（接触時間４５秒）のＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファーの注入によってチップ表面を平衡状態にする。得られたデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアバージョン４．１を用い、標準的なダブルリファレンスを使用し、１：１の結合モデルへのフィッティングによって処理し、解離速度（ｋｏｎ、単位Ｍ−１ｓ−１）、解離速度（ｋｏｆｆ、単位ｓ−１）を決定してもよい。平衡解離定数（ＫＤ）の計算は、以下の関係ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算されてもよく、モル濃度単位で表される。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆは、２５℃でヒトＡｎｇ２に結合し、ＫＤは４０７ｐＭ〜６７３ｐＭの範囲である（表２）。化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆは、２５℃でヒトＶＥＧＦＲ２−ＥＣＤに結合し、ＫＤは、５２８ｐＭ〜１１１０ｐＭである（表３）。これらの本発明の化合物は、ヒトＡｎｇ２およびヒトＶＥＧＦＲ２の両方に高いアフィニティを示す。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆは、ヒトＡｎｇ２に対し、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体と匹敵する結合反応速度およびアフィニティを示した（表４および表５）。このことは、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体の強力な結合反応速度が、化合物Ｆで保持されることを示す。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆは、匹敵する高いアフィニティでヒト、カニクイザル、マウスウサギおよびイヌのＡｎｇ２に結合し、化合物Ｆは、匹敵する高いアフィニティでヒト、カニクイザル、ウサギおよびイヌのＶＥＧＦＲ２に結合する。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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（ヒトＴｉｅ２に対するヒトＡｎｇ２の相互作用の阻害）
本発明の化合物による、ヒトＡｎｇ２の受容体ヒトＴｉｅ２に対するヒトＡｎｇ２の結合の遮断を、固相ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定してもよい。上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイを使用し、この化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲ配列およびＬＣＤＲ配列を有するＡｎｇ２抗体に対し、本発明の化合物の匹敵する遮断活性を確立してもよい。
このアッセイのために、高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  番号２５９２）を４μｇ／ｍｌ（１００μｌ中）の組み換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号３１３−ＴＩ）を用いて室温で一晩コーティングしてもよい。このプレートをＴＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水）で３回洗浄してもよく、次いで、３００μｌ／ウェルの遮断バッファー（０．５％  ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ）（ＢＳＡ：Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  番号００１−０００−１６２；ＩｇＧを含まず、プロテアーゼを含まない）を用い、オービタルシェーカー上、室温で１〜２時間かけて遮断してもよい。遮断工程の間、別個のプロピレンマルチウェルプレート中、７５μｌの２倍試験抗体（遮断バッファーで１：３で段階希釈された）を、７５μｌの２倍のビオチン化ヒトＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号ＢＴ６２３）（これも遮断バッファーで希釈）とともに加えてもよい。次いで、抗体／ビオチン化Ａｎｇ２混合物を３７℃で１時間インキュベートしてもよい（最終的なビオチン化Ａｎｇ２濃度は１００ｎｇ／ｍｌであった）。Ｔｉｅ２−ＦｃでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートから遮断溶液を除去してもよく、その後、５０μｌ／ウェルの抗体／ビオチン化Ａｎｇ２混合物を加えてもよい（ウェル２個ずつ）。次いで、プレートを、プレートシーラーで覆い、オービタルシェーカーの上で、室温で２時間インキュベートしてもよい。次いで、プレートを３回洗浄し、その後、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号ＤＹ９９８、遮断バッファーで１：２００に希釈されていてもよい）を加えてもよい。次いで、プレートを、プレートシーラーで覆い、オービタルシェーカーの上で、室温で４５分間インキュベートしてもよい。次いで、プレートを再び、３回洗浄してもよい。
次いで、１００μｌ／ウェルのＯｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＴＭＢ基質（室温まで加温しておいてもよい）（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ  番号ＴＭＢＷ−１０００−０１）を加えることによって、プレートを現像してもよい。室温で１０分かけて現像を進めてもよい（プレートをアルミニウム箔で覆ってもよい）。１００μｌ／ウェルの酸停止溶液（ＴＭＢ停止溶液、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ  番号ＬＳＴＰ−１０００−０１）を用い、現像を止めてもよい。プレートをオービタルシェーカー上で混合してもよく、その後、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０）で、ＳＯＦＴｍａｘ  ＰＲＯ  ５．４．１ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて４５０ｎｍで読み取ってもよい。Ａ４５０値は、Ｔｉｅ−２−Ｆｃに結合したままのビオチン化Ａｎｇ２の量を反映している。Ａ４５０値の減少は、Ｔｉｅ−２−Ｆｃに対するビオチン化Ａｎｇ２の結合の遮断を反映していた。
Ｔｉｅ−２−Ｆｃに対するＡｎｇ２の結合阻害のＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用い、Ｌｏｇ変換されたＸ値を用いて計算してもよい。ｌｏｇ変換されたデータについて非線形回帰（曲線あてはめ）分析（Ｓ字形の用量応答、傾き可変）を行い、ＩＣ５０値を得てもよい。１回より多い実験が行われる場合、実験間の幾何平均ＩＣ５０値（および信頼区間９５％）を計算してもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆと、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体は、それぞれ、幾何平均ＩＣ５０値（ｎ＝２）が０．０３４ｎＭおよび０．０２７ｎＭである。化合物Ｆは、用量依存的に、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体に匹敵する程度まで、ヒトＴｉｅ−２−Ｆｃに対するヒトＡｎｇ２の結合を遮断する。このデータは、化合物のＡｎｇ２  ｓｃＦｖポリペプチド部分が、このアッセイで、Ａｎｇ２抗体の有効性に匹敵する有効性を維持していることを示す。
（Ａｎｇ２の効果をなくすと、Ｔｉｅ２のリン酸化を誘発するが、Ａｎｇ１が介在するリン酸化を誘発しない）
本発明の化合物による、ヒトＡｎｇ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞における阻害を、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が用量依存的な溶液でヒトＴｉｅ２に結合し、ヒトＴｉｅリン酸化を誘発する細胞ベースアッセイで測定してもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイを使用し、本発明の化合物が、Ａｎｇ２の効果を選択的になくすが、Ａｎｇ１が介在するＴｉｅ−２受容体のリン酸化は効果は選択的になくさない能力について評価してもよい。Ａｎｇ２抗体、Ａｎｇ１抗体およびコントロールヒトＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプ抗体は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれていてもよい。
全長ヒトＴｉｅ２受容体（Ｃ末端の３つのＦＬＡＧタグを有する）の安定なトランスフェクションによって、ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞株を作成してもよい。ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞を、Ｈａｍｓ  Ｆ−１２（ＣｅｌｌＧｒｏ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  番号１０−０８０−ＣＶ）、１０％熱不活化したＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  番号１００８２−１４７）、１Ｘ  抗生物質−抗真菌薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  番号１５２４０−０６２）、１．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ  番号３０−２３４−ＣＩ）、１０μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  番号５４０４１１）および０．０７８％  炭酸水素ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｃｌｏｎｅ  番号ＳＨ３００３３．０１）の完全培地中で維持してもよい。
このアッセイのために、内部の６０ウェルのポリリジンコーティングされた９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  番号３５６６４０）中、ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞を１０，０００細胞／ウェル（１００ｕｌ成長培地中）になるまで再懸濁させてもよい。２００μｌのＤ−ＰＢＳを、蒸発を低減するために、縁部のウェルに入れてもよい。細胞を３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で一晩インキュベートしてもよい。次の日に、細胞を１回洗浄し、培地を、０．１％  ＢＳＡを含有する１００μｌの無血清成長培地（Ｓｉｇｍａ  番号Ａ７９７９、低内毒素）と置き換えてもよい。次いで、細胞を無血清培地中、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で７．５〜２４時間かけて飢えさせてもよい。飢餓期間の間、化合物（最終濃度の６倍）を、ポリプロピレンプレート中、０．１％ＢＳＡを含有する無血清成長培地で、１：２で段階希釈してもよい。ヒトＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号６２３−ＡＮ、Ｄ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで再構築）およびヒトＡｎｇ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  番号９２３−ＡＮ、Ｄ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで再構築）も、０．１％ＢＳＡを含有する無血清成長培地で最終濃度の６倍まで希釈してもよい。次いで、ポリプロピレンプレート中、化合物およびＡｎｇ２またはＡｎｇ１のリガンドを１：１の比率で混合してもよく、３７℃で１時間インキュベートしてもよい。次いで、化合物／リガンド混合物を５０μｌ／ウェルで細胞に加えてもよく（処置あたり３個ずつのウェルで）、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で、１３分〜２１時間インキュベートしてもよい。化合物の最終濃度範囲は、０．０６２５〜２８３ｎＭであってもよく、ヒトＡｎｇ２およびＡｎｇ１の最終濃度は、それぞれ、０．３μｇ／ｍｌ（約６ｎＭ）および０．５μｇ／ｍｌ（約８．９ｎＭ）であってもよい。インキュベーション時間後、細胞から培地をすばやく完全に除去してもよく、冷たい１Ｘ  Ｔｒｉｓ  Ｌｙｓｉｓバッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  番号Ｒ６０ＴＸ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）６０μｌ／ウェルに細胞を溶解してもよく、このバッファーは、新しく加えたプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（１Ｘ  プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｓｉｇｍａ  番号Ｐ８３４０；１Ｘ  ホスファターゼ阻害剤カクテル２、Ｓｉｇｍａ  番号Ｐ５７２６；１Ｘ  ホスファターゼ阻害剤カクテル３、Ｓｉｇｍａ  番号Ｐ００４４；１ｍＭ  最終的な活性化されたオルトバナジウム酸ナトリウム（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  番号５６７５４０））を含んでいてもよい。次いで、プレートを氷上に１０分間置いてもよく、その後、低速のオービタルシェーカーの上に、４℃で２５分間置いてもよい。次いで、プレートを密閉し、−８０℃で凍結させてもよい。
ホスホ−Ｔｉｅ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のヒトホスホ−Ｔｉｅ２  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット、番号ＤＹＣ２７２０）の分析をする前日に、高結合性ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ、番号６５５０８１）を、１Ｘ  ＥＬＩＳＡコーティングバッファー（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ  番号ＣＯＡＴ−１０００−０１）中、４μｇ／ｍｌマウス抗−ヒトの全Ｔｉｅ２捕捉抗体を用い、４℃で一晩コーティングしてもよい。
ホスホ−Ｔｉｅ２測定の日に、溶解物を含有するプレートを氷上で解凍してもよい。コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを洗浄バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する１Ｘ  ＴＢＳＴ）で洗浄し、３００μｌ／ウェルの遮断バッファー（１％  ＢＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  番号００１−０００−１６２；ＩｇＧを含まず、プロテアーゼも含まない）、０．０１％ナトリウムアジド）を用い、オービタルシェーカー上、（プレートシーラーで覆いつつ）室温で最短で１時間かけて遮断してもよい。遮断中、ポリプロピレンプレート中、溶解物を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む冷たい溶解バッファーで１：５または１：１０に希釈してもよい。ＥＬＩＳＡプレートを遮断し、４回洗浄してもよく、１００μｌ／ウェルの希釈した溶解物（またはホスホ−Ｔｉｅ２  ＥＬＩＳＡ標準）を加え、シーラーで覆い、オービタルシェーカー上、室温で２時間インキュベートしてもよい。プレートを４回洗浄してもよく、１００μｌ／ウェルのＨＲＰがコンジュゲートしたマウス抗−ホスホチロシン（バイアル上で、ＴＢＳＴ／０．１％ＢＳＡで推奨されるように希釈）を加えてもよい。次いで、プレートをシーラーで覆い、オービタルシェーカー上、室温で２時間インキュベートしてもよい。次いで、プレートを６回洗浄してもよく、ウェルから確実に液体を除去してもよい。次いで、１００μｌ／ウェルのＯｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＴＭＢ基質（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ  番号ＴＭＢＷ−１０００−０１）を加えることによって、プレートを現像してもよい。アルミニウム箔で覆い、プレートを室温で２０分または３０分かけて現像してもよい。１００μｌ／ウェルの酸停止溶液（ＴＭＢ停止溶液、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ  番号ＬＳＴＰ−１０００−０１）を用い、現像を止めてもよい。次いで、プレートをオービタルシェーカー上で混合してもよい。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０）で、ＳＯＦＴｍａｘ  ＰＲＯ  ５．４．１ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて４５０ｎｍで読み取ってもよい。サンプルのホスホ−Ｔｉｅ２値は、標準曲線から得られてもよく（４パラメータロジスティックフィッティング）、５または１０の希釈因子を掛け算してもよい。阻害率は、以下の式によって計算されてもよい。（処置のｐＴｉｅ２値−Ａｎｇ２のみの処置の平均ｐＴｉｅ２値）／（ｐＴｉｅ２のみの平均中央値−Ａｎｇ２のみの処置の平均ｐＴｉｅ２値）＊１００。
Ａｎｇ２によって誘発されるホスホ−Ｔｉｅ２の阻害のＩＣ５０値を、Ｌｏｇ変換されたＸ値を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて決定してもよい。ｌｏｇ変換されたデータについて非線形回帰（曲線あてはめ）分析（Ｓ字形の用量応答、傾き可変）を行い、ＩＣ５０値を得てもよい。１回より多い実験が行われる場合、実験間の幾何平均ＩＣ５０値（および信頼区間９５％）を計算してもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆは、ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞において、ヒトＡｎｇ２によって誘発されるホスホ−Ｔｉｅ２の効果を用量依存的になくし、このＩＣ５０は０．５８７ｎＭ（ｎ＝３）であり、一方、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体は、ＩＣ５０が０．７７３ｎＭである。この結果は、化合物Ｆが、ＣＨＯ−Ｔｉｅ−２において、ポジティブコントロールＡｎｇ１抗体と比較して、Ａｎｇ２によって誘発されるホスホ−Ｔｉｅ２の効果をなくすが、ヒトＡｎｇ１によって誘発されるホスホ−Ｔｉｅ２の効果をなくさないことを示す。さらに、このデータは、化合物ＦのＡｎｇ２  ｓｃＦｖポリペプチド部分が、このアッセイにおいて、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体に匹敵する有効性を維持していることを示す。
（ＶＥＧＦ１６５の効果をなくすと、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘発した）
ヒトＶＥＧＦＲ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞における阻害を、ＶＥＧＦＲ２を発現する細胞株について、用量依存的な様式で、ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦ１６５の結合が、ＶＥＧＦＲ２リン酸化を誘発する細胞ベースアッセイで測定してもよい。上述のアッセイを使用し、本発明の化合物が、用量依存的な様式で、ＶＥＧＦ１６５が介在するＶＥＧＦＲ２受容体のリン酸化の効果を選択的になくす能力を評価してもよい。ＶＥＧＦＲ２抗体および無関係な抗体ヒトＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプは、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれていてもよい。
このアッセイのために、ＶＥＧＦＲ２を発現するヒトＥＣＦＣ（臍帯血の内皮前駆細胞から誘導される、内皮コロニーを生成する細胞）（Ｅｎｄｇｅｎｉｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロット１００５０６−１４−Ｐ４、１０〜１２継代）を、内部の６０ウェルのコラーゲンＩコーティングされた９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  番号３５−４４０７）中の成長培地：ＥＧＭ−２ＭＶ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ  番号ＣＣ−４１４７）に１４，０００細胞／ウェル（１００μｌ清澄培地中）で接種してもよい。これに含まれるＥＧＭ−２ＭＶ  Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔ袋の要素を５００ｍｌのＥＢＭ−２基本培地に加え、最終ＦＢＳ濃度が１０％になるように調節してもよい（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  番号１００８２−１４７、熱不活化したもの）。２５０μｌの成長培地を、蒸発を低減するために、縁部のウェルに入れてもよい。細胞を３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で一晩インキュベートしてもよい。次の日に、培地を除去し、０．１％  ＢＳＡを含有する１００μｌの無血清成長培地（Ｓｉｇｍａ  番号Ａ７９７９、低内毒素）と置き換えてもよい。次いで、細胞を、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で６時間半かけて飢えさせてもよい。飢餓期間の間、化合物（最終濃度の６倍）を、ポリプロピレンプレート中、ＥＢＭ−２／０．１％  ＢＳＡで、１：２で段階希釈してもよい。ヒトＶＥＧＦ１６５を、ＥＢＭ−２／０．１％ＢＳＡで最終濃度の６倍まで希釈してもよい。化合物（またはＥＢＭ−２／０．１％  ＢＳＡ培地のみ）を２５μｌで細胞に３個ずつ加えてもよく、細胞を３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で４５分間インキュベートしてもよい。細胞を、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で、２５μｌの６Ｘ  ＶＥＧＦ１６５を用いて５分間処理してもよい（化合物の最終濃度範囲は、０．０１８〜３００ｎＭであってもよく、ヒトＶＥＧＦ１６５の最終濃度は、０．１６ｎＭであってもよい）。培地を細胞から除去してもよく、細胞を、６０μｌ／ウェルで、新しく加えた１Ｘ  プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（ホスホ−ＶＥＧＦＲ２アッセイキットに含まれる）を含む冷たい１Ｘ  Ｔｒｉｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  番号Ｒ６０ＴＸ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解してもよい。プレートを氷上に１０分間置いてもよく、その後、低速のオービタルシェーカーの上で、４℃で２０分間置いてもよい。次いで、プレートを密閉し、−８０℃で凍結させてもよい。
ホスホ−ＶＥＧＦＲ２の測定の日に、溶解物を含有するプレートを氷上で解凍してもよい。ホスホ−ＶＥＧＦＲ２のレベルを、ホスホ−ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１０５４）全細胞溶解物キット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  番号Ｋ１５１ＤＪＤ）を用いて測定してもよい。ホスホ−ＶＥＧＦＲ２に対する抗体であらかじめコーティングしたＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅアッセイプレートを、１５０μｌ／ウェルの遮断バッファー（ＴＢＳＴ中の３％ブロッカーＡ）を用い、オービタルシェーカー上、（プレートシーラーで覆いつつ）室温で最短で１時間かけて遮断してもよい。プレートを１Ｘ  Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ洗浄バッファーで３回洗浄してもよく、ウェルあたり５０μｌの溶解物を加えてもよい（シーラーで覆い、オービタルシェーカー上、室温で１時間インキュベートしてもよい）。プレートを３回洗浄し、２５μｌ／ウェルの１Ｘ  ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧＴＭがコンジュゲートした抗−全ＶＥＧＦＲ２（製造業者の推奨する抗体希釈剤で希釈）を加えてもよく、プレートをシーラーで覆い、オービタルシェーカー上、室温で１時間インキュベートしてもよい。プレートを３回洗浄し、ウェルから確実に液体を除去してもよい。１５０ｕｌ／ウェルの１Ｘ  ＲｅａｄバッファーＴをこのプレートに加えてもよく、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ＭＡ６０００ですぐに読み取ってもよい。阻害率は、以下の式によって計算されてもよい。（処置のシグナル値−ＶＥＧＦ＋ｈｕＩｇＧ処置の平均シグナル値）／（飢餓培地のみの平均シグナル値−ＶＥＧＦ＋ｈｕＩｇＧ  処置の平均シグナル値）＊１００。
ＶＥＧＦ１６５によって誘発されるホスホ−ＶＥＧＦＲ２の阻害のＩＣ５０値を、Ｌｏｇ変換されたＸ値を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて決定してもよい。ｌｏｇ変換されたデータについて非線形回帰（曲線あてはめ）分析（Ｓ字形の用量応答、傾き可変）を行い、ＩＣ５０値を得てもよい。１回より多い実験が行われる場合、実験間の幾何平均ＩＣ５０値（および信頼区間９５％）を計算してもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆは、ＥＣＦＣにおいて、ヒトＶＥＧＦ１６５によって誘発されるホスホ−ＶＥＧＦＲ２の効果を用量依存的になくし、ＩＣ５０平均が０．８３ｎＭ（ｎ＝３）であり、一方、ＩＭＣ−１１２１Ｂは、ＩＣ５０平均が０．５２ｎＭ（ｎ＝３）である。このことは、この化合物のＶＥＧＦＲ２抗体部分は、この細胞ベースアッセイにおいて、ＩＭＣ−１１２１Ｂに匹敵する化合物Ｆにおける有効性を維持していたことを示している。
（ＶＥＧＦ１６５の効果をなくすと、細胞増殖を誘発した）
本発明の化合物による、ヒトＶＥＧＦＲ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞における阻害を、ＶＥＧＦ１６５が、用量依存的な様式でヒトＶＥＧＦＲ２の増殖を誘発する細胞ベースアッセイで測定してもよい。本発明の化合物が、ＶＥＧＦＲ２を介するヒトＶＥＧＦ１６５によって誘発される増殖の効果をなくす能力を、ヒトＨＭＶＥＣ−ｄ（皮膚微小血管内皮細胞）で測定してもよい。ＶＥＧＦＲ２、Ａｎｇ２および無関係なヒトＩｇＧ４  ＰＡＡ抗体は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれていてもよい。
新生男児の包皮からヒト皮膚微小血管内皮細胞を単離してもよく、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２およびアセチル化ＬＤＬの発現について確認してもよい。ＨＭＶＥＣ−ｄを、５００ｍｌ培地について示されるような完全成長培地ＭＣＤＢ１３１（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  番号１５−１００−ＣＶ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  番号ＳＨ３００３４．０１）、１Ｘ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  番号１５１４０）、ＭＧＶＳ補助物質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  番号Ｓ−００５−２５）中で維持してもよく、これに、４．９％  ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌ  ヒドロコルチゾン、３ｎｇ／ｍｌ  ヒトＦＧＦ、１０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、１ｎｇ／ｍｌ  ヒトＥＧＦおよび０．０８ｍＭ  ジブチリル環状ＡＭＰを含むように追加してもよい。
このアッセイのために、５継代でのＨＭＶＥＣ−ｄ細胞を、あらかじめ加温しておいた清澄培地で１回洗浄してもよく、内部の６０ウェルの壁が白く、底部が透明の９６ウェルプレート（ＢＤ  番号３５−３３７７）中、２，０００細胞／ウェル（１００μｌの成長培地中）になるように再懸濁させてもよい。蒸発を低減するために、縁部のウェルに２５０μｌの補助物質を含まない培地を加えてもよい。４倍濃度での化合物およびヒトＶＥＧＦ１６５（Ｌｏｔ  ＡＬＹ−ＢＥ０１２４１−０３３）を、ポリプロピレンプレート中、補助物質を含まない培地で１：４に段階希釈してもよい。化合物（または補助物質を含まない培地のみ）を、５０μｌ／ウェルで３個ずつ細胞に加えてもよく、その後、５０μｌ／ウェルの４Ｘ  ＶＥＧＦ１６５に加えてもよい。プレートを３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で５日間インキュベートしてもよい。化合物の最終濃度範囲は、０．０１２〜８００ｎＭであってもよく、ヒトＶＥＧＦ１６５の最終濃度は、０．５ｎＭであってもよい。
インキュベーション期間の後、プレートおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  番号Ｇ７５７１）を室温で３０分間かけて平衡状態にしてもよい。１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬を加えてもよく、プレートをオービタルシェーカーに室温で２分間置いてもよい。プレートをさらに１０分間インキュベートし、次いで、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ３  Ｍｏｄｅｌ  １４２０リーダーで発光を記録してもよい（積分時間１秒間）
ＶＥＧＦ１６５によって誘発される増殖の阻害のＩＣ５０値を、Ｌｏｇ変換されたＸ値を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて決定してもよい。培地のみの値を、曲線の最も高い点として含めてもよく、培地のみのＸ値（濃度）を、最も高いＸ値よりも１０倍高い値に設定してもよい。また、ＶＥＧＦのみの値を、曲線の最も低い点として含めてもよく、ＶＥＧＦのみの濃度を、最も低いＸ値より１００分の１低い値に設定してもよい。ｌｏｇ変換されたデータについて非線形回帰（曲線あてはめ）分析（Ｓ字形の用量応答、傾き可変）を行い、ＩＣ５０値を得てもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆは、ＩＭＣ−１１２１Ｂと同様に、ヒトＶＥＧＦ１６５によって誘発されるＨＭＶＥＣ−ｄの増殖の効果を用量依存的になくし、ＩＣ５０平均は、それぞれ１９．２４ｎＭおよび３１．３６ｎＭである（ｎ＝２）。このことは、化合物のＶＥＧＦＲ２抗体部分が、この細胞ベースアッセイにおいて、ＩＭＣ−１１２１Ｂに匹敵する化合物Ｆにおける有効性を維持していることを示す。
（ＶＥＧＦ１６５によって誘発されるコード生成の阻害）
ＶＥＧＦによって誘発されるコード生成のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ同時培養系で測定してもよい。上述のアッセイを使用し、本発明の化合物による、ＶＥＧＦによって誘発されるコード生成の阻害を測定してもよい。ＶＥＧＦＲ２抗体は、ポジティブコントロールとして含まれてもよい。
このアッセイのために、脂肪から誘導される幹細胞（ＡＤＳＣ；Ｌｏｎｚａ  番号ＰＴ５００６、ロット番号ＯＦ４５０５−０１）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  番号４３１０８２）において、ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ  番号ＣＣ３２０２）内で培養してもよい。内皮コロニーを生成する細胞（ＥＣＦＣ；Ｌｏｎｚａ、ロット番号ＥＧＴ−ＥＣＦＣ１００５０６ｒ）を、コラーゲンＩでコーティングされたフラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ番号３５６４８６）において、５％熱不活化したＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  番号１００８２−１４７）を追加したＥＧＭ−２ＭＶ培地中で培養してもよい。４〜６継代のＡＤＳＣを培養フラスコから集めてもよく、これをＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  番号ＳＨ３００２８．０３）で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ  番号１２６０５−０１０）で洗浄してもよい。ＡＤＳＣ細胞を、１０μｇ／ｍｌ  インスリン、１μＭ  デキサメタゾン、３０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリンおよび５０μｇ／ｍｌ  トブラマイシン）を追加した基本培地（ＭＣＤＣ−１３１（Ｇｉｂｃｏ  番号１０３７２−０１９））に懸濁してもよい。生存細胞数を決定してもよく、細胞を、黒色の底が透明の９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  番号３５３２１９）に、１００μｌの基本培地中、４×１０４細胞／ウェルになるように接種してもよい。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、固定してもよい。次の日に、７〜１０継代のＥＣＦＣを上述のように基本培地中に集めてもよく、生存細胞数を４×１０４細胞／ｍｌに調節してもよい。ＡＤＳＣ細胞から培地を除去してもよく、１００μｌのＥＣＦＣ細胞懸濁物をそれぞれのウェルに加えてもよい。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートし、ＡＤＳＣ単層の上部に細胞を固定してもよい。ＩＭＣ−１１２１Ｂおよび本発明の化合物を８０μｇ／ｍｌになるまで基本培地で希釈してもよく、次いで、基本培地を用いて１：３に段階希釈し、一連の９点の用量応答を作成してもよい。化合物のそれぞれの希釈物５０μｌを同時培養物に加えてもよい。基本培地中で調製した８０ｎｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦ溶液（Ｒ＆Ｄ  番号２９３−ＶＥ／ＣＦ、ＤＰＢＳ中、５０μｇ／ｍｌ）５０μｌを、同時培養物と化合物の組み合わせに加えてもよい。化合物およびｒｈＶＥＧＦの最終濃度は、それぞれ２０μｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌであってもよい。このアッセイのポジティブコントロールは、化合物が存在せず、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦを含んでいてもよい。このアッセイのネガティブコントロールは、ｒｈＶＥＧＦを含まない基本培地を含んでいてもよい。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートし、コードを作成してもよい。
インキュベーション期間終了時に、それぞれのウェルから培地を吸引してもよく、１００ｕｌの室温の８０％エタノールを注意深く加えてもよい。プレートを室温で２０分間インキュベートしてもよい。エタノール溶液を吸引してもよく、ウェルを１５０ｕｌ  ＤＰＢＳで２回洗浄してもよい。抗−ｈｕＣＤ３１（Ｒ＆Ｄ  番号ＡＦ８０６アフィニティ精製されたヒツジＩｇＧ、２００ｕｇ／ｍｌ）およびＭＡＢ  Ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ，α−Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ−Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ  番号Ｃ６１９８）を、それぞれ、２．５％  ＦＢＳ／ＤＰＢＳで１：２５０に希釈してもよい。１００μｌの抗体混合物をこのウェルに加えてもよく、３７℃、５％ＣＯ２でプレートを２時間インキュベートしてもよい。次いで、プレートを吸引してもよく、ウェルを１５０ｕｌ  ＤＰＢＳで２回洗浄してもよい。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗−ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  番号Ａ１１０１５）を１：４００に希釈してもよく、Ｈｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  番号Ｈ３５７０）を２．５％  ＦＢＳ／ＤＰＢＳで１：１０００に希釈してもよく、１００μｌ／ウェルをプレートに加えてもよい。光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートしてもよい。次いで、ウェルを１５０μｌ  ＤＰＢＳで２回洗浄してもよい。１５０μｌ  ＤＰＢＳをそれぞれのウェルに加えてもよく、プレートを黒色の接着シール（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  番号６０５０１７３）で密閉してもよい。
Ｔｕｂｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｉｏ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを用い、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）でプレートを読み取ってもよい。全管領域（Ｔｏｔａｌ  Ｔｕｂｅ  Ａｒｅａ）のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で、化合物濃度に対してｎＭでプロットしてもよい。化合物濃度を、ｌｏｇデータに変換してもよく、阻害のＩＣ５０値を非線形回帰（Ｓ字形の用量応答、傾き可変）によって計算してもよい。それぞれの実験は、３回分の平均を表していてもよく、３回分の実験は、幾何平均として表されてもよく、９５％信頼区間が計算されてもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆは、ＡＤＳＣ／ＥＣＦＣ同時培養系において、ヒトＶＥＧＦによって誘発されるコード生成を用量依存的にＩＭＣ−１１２１Ｂに匹敵する程度まで阻害し、平均ＩＣ５０は、それぞれ６．０４ｎＭおよび５．６ｎＭである（ｎ＝３）。このことは、化合物のＶＥＧＦＲ２抗体部分が、この細胞ベースアッセイにおいて、ＩＭＣ−１１２１Ｂに匹敵する化合物Ｆにおける有効性を維持していることを示す。
（Ａｎｇ２によって誘発される血管成長の抑制）
Ａｎｇ２抗体による生理学的血管新生のｉｎ  ｖｉｖｏでの抑制を、マウスの網膜の血管成長モデルにおいて測定してもよい。上述のアッセイを使用し、本発明の化合物が、マウス網膜における生理学的な血管新生を抑制する能力を試験してもよい。
このアッセイのために、妊娠した雌マウスによって子マウスが生まれる日をＰ０（出生後日数０）と表記してもよい。出産後、匹敵する分子のモル量を維持するために、２日目および４日目（Ｐ２およびＰ４）の子マウスに、ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇ２抗体または１３．５ｍｇ／ｋｇの化合物を注射してもよい。Ｐ５に、マウスを殺してもよく、眼を取り出してもよく、これをホルマリンで５時間かけて固定してもよく、ＰＢＳで洗浄してもよい。
次いで、網膜を切除してもよく、１：２００に希釈した抗−ＣＤ３１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；クローンＭＥＣ１３．３；Ｃａｔａｌｏｇ  ５５３３７０）および１：２００に希釈した抗−ＳＭＡ−ＦＴＩＣ（Ｓｉｇｍａ；Ｃｌｏｎｅ１Ａ４  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｆ３７７７）で染色してもよい。抗−ＣＤ３１で処理された網膜について、１：４００に希釈した抗−Ｒａｔ  Ａｌｅｘａ−６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｃａｔａｌｏｇ  ７１２−６０６−１５３）を二次抗体として使用してもよい。網膜の獲得を、Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉを用いて行ってもよく、血管の成長、漏出する端細胞の数および網状構造の再構築の定量化を、ＦＩＪＩソフトウエアを用いて行ってもよい。共焦点Ｎｉｋｏｎ  Ａ１を用い、高倍率画像を獲得してもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｆと、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ−２Ａｂは、匹敵する程度に血管の成長を抑制し、内皮端細胞の数および血管密度の両方を減少させ、周細胞の被覆率を高める（表７）。このｉｎ  ｖｉｖｏモデルからのこれらの結果は、化合物のＡｎｇ２  ｓｃＦｖポリペプチド部分が、化合物ＦのｓｃＦｖポリペプチド部分と同じＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを有するＡｎｇ２抗体に匹敵する機能および有効性を維持していることを示す。
【表７】
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（物理安定性、化学安定性および生成物の品質）
凝集度、発現中の均質性、物理安定性および化学安定性を含め、生成物の品質を評価し、課題を特定し、適切さを確認する。
（遊離軽鎖のミスペアリング）
化合物Ａ（配列番号３８の２つの第１のポリペプチドおよび配列番号３９の２つの第２のポリペプチド）および化合物Ｂ（配列番号４０の２つの第１のポリペプチドおよび配列番号３９の２つの第２のポリペプチド）の精製および分析の間に、化合物の抗体部分からの非共有結合性軽鎖の存在を検出する。ミスフォールディングされた種を除去するための精製によって所望の生成物の最終的な収率が悪くなる。化合物の抗体部分のＶＨおよびＶＬと、ｓｃＦｖポリペプチドのドメインの折りたたみとの界面の不安定性は、両方とも、この問題に関与していることがわかっている。この軽鎖ミスペアリングの問題をなくすために、化合物の抗体部分のフレームワーク中の突然変異が使用されるが、この問題は、単に減るだけであり、解決はしていない。ｓｃＦｖポリペプチド中の多くの生殖細胞系フレームワークを試したが、発現プロフィールは向上しない。望ましい許容レベルの軽鎖ミスペアリング結果を得るために、化合物の抗体部分のＣＤＲおよびフレームワークの操作と、ｓｃＦｖポリペプチドの操作を組み合わせることが必要である。
質量分光分析から、非共有結合により会合しているか、または共有結合した種として、化合物Ａと会合する遊離ＬＣの存在を確認する。ＬＣ会合率をさらに定量するために、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲルブチル−ＮＰＲ  ４．６ｍｍ  ＩＤ×１０ｃｍ、２．５ｕｍ；ＴＯＳＯＨ  カタログ番号４２１６８）方法を使用する。この分析において、タンパク質サンプルをＢｕｔｙｌ−ＮＰＲカラムに注入し、その疎水性に従って溶出させる。弱い疎水性相互作用によって、モノマー、凝集物および会合した種々の状態のＬＣ種を、溶出中に逐次分離する。５０ｍＭ  リン酸カリウム、１Ｍ  硫酸アンモニウム（ｐＨ６．７）の１ｍｇ／ｍｌバッファー溶液および５０μｇのサンプルをＴＳＫｇｅｌブチル−ＮＰＲカラムに流速１ｍｌ／分でＡｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ  １２６０システムに注入するように方法を改良した。５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．７）中、１Ｍ  硫酸アンモニウムからゼロまでの塩勾配を用い、３個のタンパク質ピークが分離され、フラクション化される。それぞれのフラクション化されたピークをＬＣＭＳによって分離し、モノマーＭａｂ−ｓｃＦｖ、１つの余分のシステイン化ＬＣを含むビ−システイン化Ｍａｂ−ｓｃＦｖ、２つの余分なシステイン化ＬＣを含むビ−システイン化Ｍａｂ−ｓｃＦｖであると同定される。ＬＣＭＳによって確認されたピークの割り当てを用い、最終的なクロマトグラフ（Ａ２１４検出）を積分し、合計ＬＣ会合率を計算する。
上述のように行われた実験において、酸化を固定するための化合物ＢのＭ１１１Ｌ突然変異を有する化合物は、５５％のＬＣ会合度を示すことがわかった。ＶＲ２およびフレームワークの可変ドメインの操作によって、最終的な分子である化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅおよび化合物Ｆは、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析によって検出される場合、検出可能なＬＣの会合を示さなかったことがわかった（表８）。
【表８】
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（Ｍａｂ−ダイアボディの作成）
本発明の化合物におけるＭａｂ−ダイアボディ／Ｍａｂ−ｓｃＦｖ比率の測定を容易にするために、以下の処理を行う。典型的には、２０μｇの本発明の化合物を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ遠心分離濾過デバイスを用い、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）とバッファーを交換する。サンプルを、約３０μｌになるまで濃縮し、次いで、１μｌの新たに調製したＦＡＢｒｉｃａｔｏｒ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ、カタログ番号Ａ０−ＦＲ１−０２０；２０００Ｕを３０μｌのｄｄＨ２Ｏに溶解）を加え、３７℃で一晩インキュベートする。消化したサンプル（１μｌ）について、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ質量分析計を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ分析を行う。サンプルをＰＬＲＰ−Ｓ  ５０×１．０ｍｍ、１０００Å、５ｕｍ逆相カラム（Ｐｒｏｘｅｏｎ、カタログ番号ＰＬ１３１２−１５０２）に流速０．３ｍｌ／分、カラム温度８０℃で入れる。アセトニトリル中、ＴＥＡの勾配を用い、サンプルをカラムから溶出させる。溶出物を、この流れを用いて最初に２１４ｎｍのＵＶによって分析し、次いで、高感度モード、正の極性を用い、獲得範囲４００〜４０００ｍ／ｚでの分析のために質量分析計に向かわせる。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｂは、１％未満のＭａｂ−ダイアボディを示す。酸化および軽鎖ミスペアリングの問題を減らすために化合物Ｂに対して行われたすべての改変を組み込んだ化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅは、驚くべきことに、約５〜６％のＭａｂ−ダイアボディを有していた。化合物Ｆに組み込まれる配列の変化は、化合物Ｂに匹敵する１％未満のＭａｂ−ダイアボディを含むＭａｂ−ダイアボディ率であった。
（酸化）
温度保持ストレスにさらし得るさまざまな配合状態を製造することによって、本発明の化合物の化学安定性を評価してもよい。化学安定性の変化を、確立されたＬＣＭＳペプチドマッピング技術によってモニタリングしてもよい。簡単にいうと、試験物を得て、１０ｍＭ  クエン酸塩、ｐＨ  ５．０、１０ｍＭ  クエン酸塩、ｐＨ６．５、１Ｘ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の配合バッファーで最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、それぞれのバッファー中、４℃で排他的に透析し、確実に完全にバッファーを交換してもよい。次いで、バッファーを交換したサンプルを、４℃または４０℃で４週間インキュベートしてもよく、その後、サンプルを以下のようにＬＣＭＳによって分析してもよい。ストレスを受けた材料を、８Ｍグアニジンにバッファー交換し、ＤＴＴを用いた還元前に変性させ、その後のヨードアセトアミドによるアルキル化を行ってもよい。次いで、還元し、アルキル化したタンパク質を、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）とバッファー交換し、２０：１のモル比で、３７℃で４時間、トリプシンで消化してもよい。１μＬの氷酢酸を加え、消化を止めてもよい。消化したペプチドフラグメントの分離は、０．２％ギ酸水溶液であらかじめ平衡状態にしたＺｏｒｂａｘ  １．８μｍ  Ｃ１８  ２．１ｍｍ×５０ｍｍに捕捉し、その後に、０．３ｍｌ／分で操作された０．２％ギ酸アセトニトリル溶液を用いて溶出させることによって達成されてもよい。溶出したペプチドを、１走査／秒で３００ｍ／ｚ〜２０００ｍ／ｚの陽イオンモードで走査するように設定されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ−ＱＴＯＦセットを用い、すぐに分析してもよい。ＥＳＩ源を、４０００Ｖに設定し、温度を３５０℃に設定して、ネブライザガスを４０ｐｓｉに、コーンガスを１２ｐｓｉに設定してもよい。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｂｉｏ−ｃｏｎｆｉｒｍソフトウエアを使用し、トリプチンペプチドマススペクトルをタンパク質配列にアラインメントしてもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｂは、ｐＨ８．０、４０℃での温度ストレスにさらされたとき、化合物のＶＥＧＦＲ２抗体部分の重鎖について、位置Ｍ１１１での１４．２％の酸化を示す。この位置での酸化に関連する問題を回避するために、化合物Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦにおいてメチオニン１１１をロイシンに変える１つの部分突然変異を行い、この位置での化学修飾の可能性をなくす。
（雄カニクイザルに対する１回の静脈内投薬後の血漿薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ））
カニクイザルにおいて、１回の静脈内投薬の後に、本発明の化合物のＰＫおよびＰＤを測定してもよい。
雄カニクイザル（ｎ＝２／群）を、本発明の化合物の１回の静脈内投薬量を投与してもよい。血液を投薬から２〜６７２時間後にサンプリングし、３つのＥＬＩＳＡ方法を用い、化合物の血漿中濃度を定量するために血漿を単離してもよい。
全ヒトＩｇＧ方法は、ＥＬＩＳＡフォーマットを利用し、本発明の化合物の濃度を測定してもよい（全ヒトＩｇＧ）。標準、コントロールおよび試験サンプルを、マイクロタイタープレートに固定されたヤギ抗−ヒトＦ（ａｂ’）２とともにインキュベートしてもよい。インキュベーション後、マウス抗−ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）をウェルに加えてもよい。結合していない酵素を洗い流したら、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液をウェルに加えてもよい。酸性溶液を加えることによって発色現像を止めてもよく、光学密度を、６３０ｎｍに対して波長補正の設定を用い、４５０ｎｍで測定してもよい。アッセイ範囲は、３０〜７００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
ＶＥＧＦＲ２抗原捕捉方法は、本発明の化合物の濃度を測定するためのＥＬＩＳＡフォーマットを利用してもよい（ＶＥＧＦＲ２抗原の捕捉）。標準、コントロールおよび試験サンプルを、ヒトＶＥＧＦＲ２でコーティングされたマイクロタイタープレートでインキュベートしてもよい。インキュベーション後、マウス抗−ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）をウェルに加えてもよい。結合していない酵素を洗い流したら、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液をウェルに加えてもよい。酸性溶液を加えることによって発色現像を止めてもよく、光学密度を、６３０ｎｍに対して波長補正の設定を用い、４５０ｎｍで測定してもよい。アッセイ範囲は、８０〜２０００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
Ａｎｇ２抗原捕捉方法は、本発明の化合物の濃度を測定するためのＥＬＩＳＡフォーマットを利用してもよい（Ａｎｇ２抗原の捕捉）。標準、コントロールおよび試験サンプルを、Ａｎｇ２でコーティングされたマイクロタイタープレートでインキュベートしてもよい。インキュベーション後、マウス抗−ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）をウェルに加える。結合していない酵素を洗い流したら、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液をウェルに加えてもよい。酸性溶液を加えることによって発色現像を止めてもよく、光学密度を、６３０ｎｍに対して波長補正の設定を用い、４５０ｎｍで測定してもよい。アッセイ範囲は、３０〜７００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．３を用い、ノンコンパートメント分析を行ってもよい。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  ｖ１１を用いてプロットを作成してもよく、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を用いてデータ処理を行ってもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Ｅおよび化合物Ｆについて、１、１０および２５ｍｇ／ｋｇを１回投薬した後、ＰＫを測定した。化合物Ｅについて、３種類すべてのアッセイで測定される場合、最終的な半減期は、投薬群に依存して、８．９６〜３７．９時間の範囲内であり（表９）、一方、化合物Ｆの最終的な半減期は、投薬群に依存して、１８．６〜７９．５時間の範囲内であった（表１０）。これらの結果は、３種類の異なる結合活性、化合物の異なる部分のそれぞれの測定から得られ、それぞれ、化合物Ｅと比較して、化合物Ｆの最終的な半減期が高いことが示される。
【表９】
2016531084.tif 000010
【表１０】
2016531084.tif 000011
[配列表]
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号１（抗体のＨＣＶＲ−化合物Ｃ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＥＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２（抗体のＨＣＶＲ−化合物Ｄ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＬＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３（抗体のＨＣＶＲ−化合物Ｅ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４（抗体のＨＣＶＲ−化合物Ｆ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＬＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５（抗体のＨＣ−化合物Ｃ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＥＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号６（抗体のＨＣ−化合物Ｄ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＬＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号７（抗体のＨＣ−化合物Ｅ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号８（抗体のＨＣ−化合物Ｆ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＬＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号９（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｃ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＥＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１０（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｄ）
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配列番号１１（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｅ）
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配列番号１２（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｆ）
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配列番号１３（抗体のＬＣＶＲ−化合物Ｃおよび化合物Ｆ）
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配列番号１４（抗体のＬＣＶＲ−化合物Ｄ）
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配列番号１５（抗体のＬＣＶＲ−化合物Ｅ）
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配列番号１６（抗体のＬＣ−化合物Ｃおよび化合物Ｆ）
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配列番号１７（抗体のＬＣ−化合物Ｄ）
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配列番号１８（抗体のＬＣ−化合物Ｅ）
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配列番号１９（ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ）
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配列番号２０（ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｆ）
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配列番号２１（ＳｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲ−化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ）
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配列番号２２（ＳｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲ−化合物Ｆ）
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配列番号２３（ＳｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲ−化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ）
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配列番号２４（ＳｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲ−化合物Ｆ）
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配列番号２５（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチドのＤＮＡ−化合物Ｃ）
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配列番号２６（抗体のＬＣのＤＮＡ−化合物Ｃおよび化合物Ｆ）
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配列番号２７（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチドのＤＮＡ−化合物Ｄ）
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配列番号２８（抗体のＬＣのＤＮＡ−化合物Ｄ）
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配列番号２９（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチドのＤＮＡ−化合物Ｅ）
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配列番号３０（抗体のＬＣのＤＮＡ−化合物Ｅ）
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配列番号３１（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチドのＤＮＡ−化合物Ｆ）
ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＡＴＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号３２（ヒトＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ）
ＡＳＶＧＬＰＳＶＳＬＤＬＰＲＬＳＩＱＫＤＩＬＴＩＫＡＮＴＴＬＱＩＴＣＲＧＱＲＤＬＤＷＬＷＰＮＮＱＳＧＳＥＱＲＶＥＶＴＥＣＳＤＧＬＦＣＫＴＬＴＩＰＫＶＩＧＮＤＴＧＡＹＫＣＦＹＲＥＴＤＬＡＳＶＩＹＶＹＶＱＤＹＲＳＰＦＩＡＳＶＳＤＱＨＧＶＶＹＩＴＥＮＫＮＫＴＶＶＩＰＣＬＧＳＩＳＮＬＮＶＳＬＣＡＲＹＰＥＫＲＦＶＰＤＧＮＲＩＳＷＤＳＫＫＧＦＴＩＰＳＹＭＩＳＹＡＧＭＶＦＣＥＡＫＩＮＤＥＳＹＱＳＩＭＹＩＶＶＶＶＧＹＲＩＹＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＰＦＶＡＦＧＳＧＭＥＳＬＶＥＡＴＶＧＥＲＶＲＩＰＡＫＹＬＧＹＰＰＰＥＩＫＷＹＫＮＧＩＰＬＥＳＮＨＴＩＫＡＧＨＶＬＴＩＭＥＶＳＥＲＤＴＧＮＹＴＶＩＬＴＮＰＩＳＫＥＫＱＳＨＶＶＳＬＶＶＹＶＰＰＱＩＧＥＫＳＬＩＳＰＶＤＳＹＱＹＧＴＴＱＴＬＴＣＴＶＹＡＩＰＰＰＨＨＩＨＷＹＷＱＬＥＥＥＣＡＮＥＰＳＱＡＶＳＶＴＮＰＹＰＣＥＥＷＲＳＶＥＤＦＱＧＧＮＫＩＥＶＮＫＮＱＦＡＬＩＥＧＫＮＫＴＶＳＴＬＶＩＱＡＡＮＶＳＡＬＹＫＣＥＡＶＮＫＶＧＲＧＥＲＶＩＳＦＨＶＴＲＧＰＥＩＴＬＱＰＤＭＱＰＴＥＱＥＳＶＳＬＷＣＴＡＤＲＳＴＦＥＮＬＴＷＹＫＬＧＰＱＰＬＰＩＨＶＧＥＬＰＴＰＶＣＫＮＬＤＴＬＷＫＬＮＡＴＭＦＳＮＳＴＮＤＩＬＩＭＥＬＫＮＡＳＬＱＤＱＧＤＹＶＣＬＡＱＤＲＫＴＫＫＲＨＣＶＶＲＱＬＴＶＬＥＲＶＡＰＴＩＴＧＮＬＥＮＱＴＴＳＩＧＥＳＩＥＶＳＣＴＡＳＧＮＰＰＰＱＩＭＷＦＫＤＮＥＴＬＶＥＤＳＧＩＶＬＫＤＧＮＲＮＬＴＩＲＲＶＲＫＥＤＥＧＬＹＴＣＱＡＣＳＶＬＧＣＡＫＶＥＡＦＦＩＩＥＧＡＱＥＫＴＮＬＥ
配列番号３３（ヒトＡｎｇ２）
ＹＮＮＦＲＫＳＭＤＳＩＧＫＫＱＹＱＶＱＨＧＳＣＳＹＴＦＬＬＰＥＭＤＮＣＲＳＳＳＳＰＹＶＳＮＡＶＱＲＤＡＰＬＥＹＤＤＳＶＱＲＬＱＶＬＥＮＩＭＥＮＮＴＱＷＬＭＫＬＥＮＹＩＱＤＮＭＫＫＥＭＶＥＩＱＱＮＡＶＱＮＱＴＡＶＭＩＥＩＧＴＮＬＬＮＱＴＡＥＱＴＲＫＬＴＤＶＥＡＱＶＬＮＱＴＴＲＬＥＬＱＬＬＥＨＳＬＳＴＮＫＬＥＫＱＩＬＤＱＴＳＥＩＮＫＬＱＤＫＮＳＦＬＥＫＫＶＬＡＭＥＤＫＨＩＩＱＬＱＳＩＫＥＥＫＤＱＬＱＶＬＶＳＫＱＮＳＩＩＥＥＬＥＫＫＩＶＴＡＴＶＮＮＳＶＬＱＫＱＱＨＤＬＭＥＴＶＮＮＬＬＴＭＭＳＴＳＮＳＡＫＤＰＴＶＡＫＥＥＱＩＳＦＲＤＣＡＥＶＦＫＳＧＨＴＴＮＧＩＹＴＬＴＦＰＮＳＴＥＥＩＫＡＹＣＤＭＥＡＧＧＧＧＷＴＩＩＱＲＲＥＤＧＳＶＤＦＱＲＴＷＫＥＹＫＶＧＦＧＮＰＳＧＥＹＷＬＧＮＥＦＶＳＱＬＴＮＱＱＲＹＶＬＫＩＨＬＫＤＷＥＧＮＥＡＹＳＬＹＥＨＦＹＬＳＳＥＥＬＮＹＲＩＨＬＫＧＬＴＧＴＡＧＫＩＳＳＩＳＱＰＧＮＤＦＳＴＫＤＧＤＮＤＫＣＩＣＫＣＳＱＭＬＴＧＧＷＷＦＤＡＣＧＰＳＮＬＮＧＭＹＹＰＱＲＱＮＴＮＫＦＮＧＩＫＷＹＹＷＫＧＳＧＹＳＬＫＡＴＴＭＭＩＲＰＡＤＦ
配列番号３４
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３５
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３６
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３７
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３８（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ａ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３９（抗体のＬＣ−化合物Ａおよび化合物Ｂ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＤＮＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＹＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＡＫＡＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４０（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ｂ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＴＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【配列表】
2016531084000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月4日(2015.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物であって、
２つの第１のポリペプチドと２つの第２のポリペプチドとを含み、
この化合物が、
（ａ）それぞれの第１のポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）それぞれの第１のポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列を有し；
（ｃ）それぞれの第１のポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）それぞれの第１のポリペプチドが、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を有する
ことからなる群から選択される、化合物。
【請求項２】
それぞれの第１のポリペプチドが、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、それぞれの第２のポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
それぞれの第１のポリペプチドは、それぞれの第２のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、他の第１のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、それぞれの第１のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物と、許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５】
がんの処置に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、請求項５に記載の使用のための化合物。
【国際調査報告】
2016531084.tif 000012
2016531084.tif 000013
2016531084.tif 000014