(57)【要約】  抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントは，（１）配列番号：１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，又は３８から選択されたＣＤＲＨ１配列と，（２）配列番号：１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，又は３９から選択されたＣＤＲＨ２配列と，（３）配列番号：１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，又は４０から選択されたＣＤＲＨ３配列とを備える，重鎖可変領域と，（１）配列番号：４１，４４，４７，５０，５３，５６，５９，又は６２から選択されたＣＤＲＬ１配列と，（２）配列番号：４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，又は６３から選択されたＣＤＲＬ２配列と，（３）配列番号：４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，又は６４から選択されたＣＤＲＬ３配列とを備える，軽鎖可変領域とを含む。例えば，糖尿病網膜症，加齢黄斑変性，又は癌のようなＶＥＧＦ関連疾患を治療，又は予防する方法は，前記抗体を用いる。
2016530244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，
（１）配列番号：１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，又は３８から選択されたＣＤＲＨ１配列と，（２）配列番号：１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，又は３９から選択されたＣＤＲＨ２配列と，（３）配列番号：１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，又は４０から選択されたＣＤＲＨ３配列とを備える，重鎖可変領域を備え，
前記抗体はＶＥＧＦの活性を中和する能力を有する，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項２】
抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，
（１）配列番号：４１，４４，４７，５０，５３，５６，５９，又は６２から選択されたＣＤＲＬ１配列と，（２）配列番号：４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，又は６３から選択されたＣＤＲＬ２配列と，（３）配列番号：４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，又は６４から選択されたＣＤＲＬ３配列とを備える，軽鎖可変領域を備え，
前記抗体はＶＥＧＦの活性を中和する能力を有する，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，
（１）配列番号：１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，又は３８から選択されたＣＤＲＨ１配列と，（２）配列番号：１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，又は３９から選択されたＣＤＲＨ２配列と，（３）配列番号：１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，又は４０から選択されたＣＤＲＨ３配列とを備える，重鎖可変領域をさらに備える，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，
前記抗体の前記重鎖可変領域，及び前記軽鎖可変領域はそれぞれ，
配列番号：１及び配列番号：９，又は
配列番号：２及び配列番号：１０，又は
配列番号：３及び配列番号：１１，又は
配列番号：４及び配列番号：１２，又は
配列番号：５及び配列番号：１３，又は
配列番号：６及び配列番号：１４，又は
配列番号：７及び配列番号：１５，又は
配列番号：８及び配列番号：１６
の配列を備える，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，前記抗体は，配列番号：６６，配列番号：６７，及び配列番号：６８の一つ以上の配列に結合する，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，前記抗体は単クローン性抗体である，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントであって，前記抗体はヒト化抗体又はヒト抗体である，抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体，又はその結合フラグメントを用いてＶＥＧＦ関連疾患を治療又は予防する方法であって，前記抗体又は結合フラグメントの有効量を，それを必要とする患者に投与することを含む，方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって，前記ＶＥＧＦ関連疾患は，異常血管新生，又は腫瘍成長である，方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって，前記ＶＥＧＦ関連疾患は，糖尿病網膜症，又は加齢黄斑変性である，方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ＶＥＧＦ抗体に関し，特にそのような抗体の生成及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は，脈管形成（胚形成中に血管を作る過程）及び血管新生（既存の血管から新たな血管を形成する過程）を刺激し得る信号蛋白質である。例えば怪我の後のように血液循環が不十分なときに，ＶＥＧＦは，その血管新生の特性により，組織への酸素供給を回復し得る。
【０００３】
組織内のＶＥＧＦが過剰発現すると，病気の状態となり得る。例えば，ＶＥＧＦの過剰発現は，網膜内の血管疾患（例えば，糖尿病網膜症）につながる。さらに，固形腫瘍は，成長に必要な栄養分を与える十分な血液の供給なしに，制限された大きさを超えて成長することはできない。この制限を超えるために，固形腫瘍は，固形腫瘍が成長し転移することを可能にするＶＥＧＦを発現する。
【０００４】
ＶＥＧＦファミリーメンバーは，ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，及びＰＧＦ（胎盤増殖因子）を含む。これらのうち，ＶＥＧＦ−Ａは，最も重要な因子であり，正常な及び病気の血管新生（即ち，血管形成）を制御する。ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄとはリンパ管形成を制御する。ＶＥＧＦ−Ａは，いくつかのプロテインアイソフォーム―ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８９，及びＶＥＧＦ２０６（添え字は蛋白質の長さを示す）を含み，それらは，異なる生理学的性質及び細胞外蛋白質分解を介して、生理学的な機能を制御することができる。例えば，ＶＥＧＦ１２１は，ヘパリンと結合することができない唯一のＶＥＧＦであり，それゆえに細胞表面に付着することができない。ＶＥＧＦ１６５は，外分泌の性質を有し，細胞外マトリックスに付着することができる。これらのうち，ＶＥＧＦ１８９は，多くの塩基性アミノ酸を有する（高ｐＩ値）蛋白質であり，細胞表面にほとんど完全に吸着される。ＶＥＧＦ１６５は，生理学的活性を有する主要なアイソフォームである。細胞外プロテアーゼによって分解されたＶＥＧＦは，その生理学的利用能に影響を及ぼす。例えば，プラスミンは，ＶＥＧＦ１６５又はＶＥＧＦ１８９を分断し，生理活性を保持する最初の１１０個の残基を含む断片を遊離し得る。しかしながら，プラスミンは，ＶＥＧＦ断片を消化して，その有糸分裂活性を減少させることもできる。
【０００５】
正常な組織における血管形成は，ＶＥＧＦによって制御される。この過程において，いくつかの分化型上皮細胞が異なる役割を果たす。例えば，端細胞は，端細胞を超えて増殖し血管管腔を形成する，柄細胞を形成するかもしれない。正常な状態の下では，血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と抗ＶＥＧＦとは，調和して存在する。それゆえに，血管は正常に形成され分化され得る。腫瘍が増殖する過程では，このバランスが失われ，腫瘍の周囲に血管の網が形成されることにより腫瘍細胞によって必要とされる血液と栄養分が供給され，それにより腫瘍細胞は増殖及び転移し続けることができる。
【０００６】
１９７０年代から，ＶＥＧＦの生理学上の機能は徐々に解明されてきた。血管新生の抑制は癌を抑制し治癒することができるとの理論に基づき，医薬品が開発されてきた。これらの医薬品のいくつかは市場に現れてきた。現在，主要な抗血管新生抗体医薬品は，アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）である。２０１１年，米国におけるアバスチン（登録商標）の総売上高は６１．９３億ドルに到達した（Ｍｅｄ．Ａｄ．Ｎｅｗｓ，２０１１年１０月）。アバスチン（登録商標）は，肺癌，乳癌，結腸癌，腎臓癌，脳癌，及びその他の悪性腫瘍の治療に有効である。腫瘍の周囲の血管収縮をもたらすことに加えて，アバスチン（登録商標）は，他の化学療法薬が腫瘍に浸潤してそれらの効果を発揮する手助けもする。
【０００７】
抗ＶＥＧＦ試薬は有用な医薬品となり得るので，ＶＥＧＦ関連の疾患の治療又は抑制に用いることができる抗体が今も望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の実施形態は，ＶＥＧＦ機能を抑制することができる抗体に関する。その抗体は，多クローン又は単クローン抗体であり得る。
【０００９】
一つの側面において，本発明は，ＶＥＧＦの活性を中和させることが可能な抗ＶＥＧＦ抗体に関する。本発明の一実施形態に係る抗体は，多クローン又は単クローン抗体であり得る。本発明の実施形態に従えば，抗体は，癌の成長や転移のような，ＶＥＧＦの望まれない活性に関わる疾患を予防することができる。
【００１０】
本発明の実施形態に従えば，抗体又はその結合フラグメント（例えば，そのｓｃＦｖ，Ｆａｂ，又はＦ（ａｂ）２断片）は，ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，及びＣＤＲＨ３配列を備える重鎖可変領域（ＶＨ）を備え，ＣＤＲＨ１配列は配列番号：１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，又は３８から選択され，ＣＤＲＨ２配列は配列番号：１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，又は３９から選択され，ＣＤＲＨ３配列は配列番号：１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，又は４０から選択される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態に従えば，抗体又はその結合フラグメント（例えば，そのｓｃＦｖ，Ｆａｂ，又はＦ（ａｂ）２断片）は，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，及びＣＤＲＬ３配列を備える軽鎖可変領域（ＶＬ）を備え，ＣＤＲＬ１配列は配列番号：４１，４４，４７，５０，５３，５６，５９，又は６２から選択され，ＣＤＲＬ２配列は配列番号：４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，又は６３から選択され，ＣＤＲＬ３配列は配列番号：４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，又は６４から選択される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態に従えば，抗体又はその結合フラグメント（例えば，そのｓｃＦｖ，Ｆａｂ，又はＦ（ａｂ）２断片）は，ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，及びＣＤＲＨ３配列を備える重鎖可変領域（ＶＨ）と，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，及びＣＤＲＬ３配列を備える軽鎖可変領域（ＶＬ）とを備え，ＣＤＲＨ１配列は配列番号：１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，又は３８から選択され，ＣＤＲＨ２配列は配列番号：１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，又は３９から選択され，ＣＤＲＨ３配列は配列番号：１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，又は４０から選択され，ＣＤＲＬ１配列は配列番号：４１，４４，４７，５０，５３，５６，５９，又は６２から選択され，ＣＤＲＬ２配列は配列番号：４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，又は６３から選択され，ＣＤＲＬ３配列は配列番号：４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，又は６４から選択される。
【００１３】
本発明の上記実施形態のいずれかに従えば，抗体又はその結合フラグメント（例えば，そのｓｃＦｖ，Ｆａｂ，又はＦ（ａｂ）２断片）は，配列番号６６，６７，及び／又は６８の配列を有する一つ以上のＶＥＧＦ上のエピトープに結合し得る。
【００１４】
別の側面において，本発明は，ＶＥＧＦの活性を中和させることが可能な抗ＶＥＧＦ抗体を，それを必要とする対象に投与することにより，糖尿病網膜症や癌（癌の成長や転移）のようなＶＥＧＦ関連疾患を治療又は予防する方法に関する。
【００１５】
上記いずれかの実施形態に従えば，抗体は単クローン抗体であり得る。上記いずれかの実施形態に従えば，抗体はヒト化抗体又は完全なヒト抗体であり得る。
【００１６】
本発明の他の側面及び利点は，以下の説明及び付加された請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は，本発明の実施形態に従うファージライブラリを用いて抗ＶＥＧＦ抗体を生成するための模式図である。
【００１８】
【図２】図２は，本発明の実施形態に従うファージライブラリを用いて抗ＶＥＧＦ抗体を生成するための代表的な方法を示す模式図である。
【００１９】
【図３Ａ】図３Ａは，本発明の抗体の重鎖可変領域を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは，本発明の抗体の軽鎖可変領域を示す。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａは，本発明の実施形態に従う抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域配列のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，及びＣＤＲＨ３を，アバスチン（登録商標）のものと比較した図である。
【００２１】
【図４Ｂ】図４Ｂは，本発明の実施形態に従う抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域配列のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，及びＣＤＲＬ３を，アバスチン（登録商標）のものと比較した図である。
【００２２】
【図５】図５は，本発明の全長抗体の評価のための様々なアッセイを示す模式図である。
【００２３】
【図６Ａ】図６Ａは，ＶＥＧＦの三次元構造を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは，本発明の実施形態に従うアラニン走査による結合エピトープ領域を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは，本発明の実施形態に従う，結合エピトープ領域を決定するためのアラニン走査による，遺伝的変異によって特徴付けられるＶＥＧＦのＥＬＩＳＡにおけるＶＥＧＦ結合を示す。
【００２４】
【図７】図７は，本発明の様々な抗ＶＥＧＦ抗体によるＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣの遊走への影響を測定するための仕組みを示す模式図である。
【００２５】
【図８】図８は，本発明の様々な抗ＶＥＧＦ抗体の様々な分析及び測定の結果を示す。
【００２６】
【図９】図９は，本発明の抗ＶＥＧＦ抗体によるＶＥＧＦ誘発腫瘍の成長の阻害のｉｎ  ｖｉｖｏ分析のためのフローチャートを示す。
【００２７】
【図１０Ａ】図１０Ａは，様々な抗ＶＥＧＦ抗体によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の抑制結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは，各抗体の平均結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［定義］
ここで用いられる「抗体」という用語は，免疫グロブリン分子，又はその免疫学的な活性部，即ち，抗原結合部，又はその断片を広く参照する。従って，抗体は少なくとも一つ（好ましくは二つ）の重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）と，少なくとも一つ（好ましくは二つ）の軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ）とを備える。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに，超変異性の領域，即ち，より保存された領域，即ち「フレームワーク領域」（ＦＲ）に点在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）に細分することができる。ＶＨ及びＶＬの各々は，ＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３，ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端まで並べられた三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される。（参照してここに組み入れられる，Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 及びChothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照）。
【００２９】
ここで用いられる，ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，及びＣＤＲＨ３（又はＨＣＤＲ１，ＨＣＤＲ２，及びＨＣＤＲ３）はそれぞれ，重鎖可変（ＶＨ）領域における三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を参照し，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，及びＣＤＲＬ３（又はＬＣＤＲ１，ＬＣＤＲ２，及びＬＣＤＲ３）はそれぞれ，軽鎖可変（ＶＬ）領域における三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を参照する。
【００３０】
抗体は，重鎖又は軽鎖定常部からの一つ以上の定常部を含んでもよい。重鎖定常部は三つのドメインＣＨ１，ＣＨ２，及びＣＨ３を備え，軽鎖定常部は一つのドメインＣＬを備える。重鎖及び／又は軽鎖の可変領域は，抗原と相互に作用する結合ドメインを含み，一方で抗体の定常部は，典型的には，免疫系の様々な細胞（例えば，エフェクター細胞）や古典的な補体系の第一構成要素（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への，抗体の結合を媒介する。
【００３１】
ここで用いられる「免疫グロブリン」という用語は，免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされた一つ以上のポリペプチドからなる蛋白質を参照する。ヒト免疫グロブリン遺伝子は無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子だけでなく，カッパ，ラムダ，アルファ（ＩｇＡ１，及びＩｇＡ２），ガンマ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４），デルタ，イプシロン，及びミュー定常部遺伝子を含む。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ＫＤａ又は２１４アミノ酸）はＮＨ２末端（１１０アミノ酸の周囲の）における可変領域遺伝子と，ＣＯＯＨ末端におけるカッパ又はラムダ定常部遺伝子とによってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ＫＤａ又は４４６アミノ酸）は同様に，可変領域遺伝子（１１６アミノ酸の周囲の）と，上記定常部遺伝子のうちの一つ，例えばガンマ（３３０アミノ酸の周囲をコードする）とによってコードされる。
【００３２】
抗体の「抗原結合性フラグメント」（又は，「抗体部」若しくは「フラグメント」），又は「抗体の結合フラグメント」という用語は，全長抗体のフラグメントを参照し，フラグメントは抗原に特異的に結合する能力を保持する。抗体の抗原結合性フラグメントの例は，（ｉ）ＶＬ，ＶＨ，ＣＬ，及びＣＨｌドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント，（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジによって連結された二つのＦａｂフラグメントを備える二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２，（ｉｉｉ）ＶＨ，及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント，（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬ，及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント，（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６），及び（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが，これらには限られない。
【００３３】
さらに，Ｆｖフラグメントの二つのドメインＶＬ，及びＶＨは，別々の遺伝子によってコードされるが，それらは，遺伝子組み換えを用いて合成リンカーによって結合されることができ，合成リンカーは，ＶＬ，及びＶＨ領域が一組となって一価の分子を形成する蛋白質の一本鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば，Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。）として，それらが作られることを可能にする。このような一本鎖抗体も，抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に含まれる。これらの抗体フラグメントは，当業者に知られる従来の手法を用いて得ることができ，そのフラグメントは無傷の抗体と同じ方法で有用性のために選別される。
【００３４】
［本発明の実施形態］
本発明の実施形態は，抗ＶＥＧＦ抗体，及びそれら抗体の使用方法に関する。使用方法は，癌のようなＶＥＧＦに関連する疾患の治療，予防，又は診断を含んでもよい。本発明の抗体は，全てのクラスの多クローン抗体又は単クローン抗体，ヒト抗体，及び遺伝子工学によって作成されたヒト化抗体のような，いかなる適切な抗体を含んでもよい。
【００３５】
本発明の実施形態に従えば，抗ＶＥＧＦ抗体はファージディスプレイ法を用いて作られてもよい。抗体を作成するファージディスプレイ及び組み合わせ方法は，技術分野において知られている（例えば，Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．５，２２３，４０９，Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２，Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），  Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５，及びＨｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１参照。）。
【００３６】
図１はファージディスプレイ法を用いて抗ＶＥＧＦ抗体を作成するための一般戦略を概説する。ファージディスプレイ法によって，完全抗体の代わりに，Ｆａｂ，又はｓｃＦｖが典型的には作成される。しかしながら，これらの手順を完全抗体フレームワークに加えることにより，完全抗体が作成されてもよい。ファージディスプレイ法では，マウスが抗原（即ち，ＶＥＧＦ，そのフラグメント，ＶＥＧＦを含む融合蛋白質のフラグメント）で免疫される。それから，免疫化マウス（ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲによる）由来の可変領域からのＤＮＡフラグメントと，ファージの外皮蛋白質とを融合することにより，ライブラリを構築する。所望のＣＤＲ配列を有するファージを，標的となる抗原と結合させ，標的となる抗原（例えば，ＶＥＧＦ）をプレート又はビーズにコーティングするバイオパニング，ＥＬＩＳＡ，又はＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）によって，濃縮することができ，ファージを抗原と結合させる。それから，結合していないファージを洗い流す。結合した陽性クローンを回収して増幅する。陽性クローンを精製するため，パニング／濃縮工程を数回繰り返してもよい。これらの陽性クローンからの配列（即ち，可変配列）を抗体フレームワーク内に構築し，全長構築物を作ることができる。これらの全長構築物から抗体を作成し，試験のために精製してもよい。試験はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを含んでもよい。
【００３７】
本発明の実施形態に従い，以下の実施例を用いてファージディスプレイ法について詳細に説明する。
実施例１：免疫化工程
【００３８】
組み換え型のヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製，カタログ番号２９３−ＶＥ／ＣＦ）を抗原として用いた。この抗原は，初期免疫化のためのフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ），及びブースター注射のためのフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）又はＴｉｔｅｒＭａｘとともに，マウスを免疫化するために適切なスケジュールに従って用いられた。表１に免疫化スケジュールの一例を示す。
【表１】
2016530244.tif 000003
実施例２：ＥＬＩＳＡによる血清力価測定
【００３９】
ＥＬＩＳＡプレート（例えば，９６−ウェルプレート）を，組み換え型のヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）でコートした。測定用試料をコートしたプレートに加え，コートした蛋白質と結合させた。結合しなかった抗体を除去するために洗浄した後，結合した抗体を，第二抗体（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ）とともに評価した。結合した第二抗体の量は，ＨＲＰに適切な基質を用いて推定することができる。例えば，３，３´，５，５´‐テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），３，３´‐ジアミノベンジジン（ＤＡＢ），又は２，２´‐アジノ‐ビス（３‐エチルベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を，ＨＲＰの発色基質として用いてもよい。表２は一例の結果を示す。
【表２】
2016530244.tif 000004
ファージディスプレイ法
実施例３．ｓｃＦｖ／Ｆａｂ抗体ライブラリの構築
【００４０】
本発明の実施形態に従えば，ファージパニングを用いて抗体を生成してもよい。図２に示されるように，免疫化マウスからｃＤＮＡライブラリを構築してもよい。上述したように，例えば，組み換え型のヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）でマウスを免疫化してもよい。マウスを殺処分し，全ＲＮＡを抽出するために脾臓を除去した。それから，ＲＴ−ＰＣＲを用いて抗体フラグメント（例えば，ＶＨ，ＶＬ，重鎖（Ｆｄ）又は軽鎖）を得た。これらのフラグメントは，Ｆａｂライブラリを構築するために用いられてもよい。さらに，これらのフラグメントを，ＰＣＲを用いて集めて，ｓｃＦｖのための抗体ｃＤＮＡフラグメントを作成し，ｓｃＦｖライブラリを構築するために用いた。一つの例において，Ｆａｂライブラリは１．０２×１０９の多様性を有し，ｓｃＦｖライブラリは３．１２×１０９の多様性を有する。
実施例４．スクリーニングのためのファージの調製
【００４１】
上記（ｓｃＦｖ又はＦａｂ）ライブラリストックの各々を，１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２％グルコース（２ＹＴＡＧ）とを含む２×ＹＴ培地に植え付け，３７°ＣでＯＤ（６００ｎｍ）が０．５に到達するまで振とうして成長させた。そして，１：２０の割合でヘルパーファージを加えることにより，この培養物を，Ｍ１３ＫＯ７又はハイパーヘルパーファージに感染させた。結果としての培養物を，振とうせずに３０分間，３７°Ｃのウォーターバスでインキュベートした。
【００４２】
その後，４，０００ｒｐｍで１５分間回転することにより，感染した細胞を収集した。採取した細胞を，１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２５μｇ／ｍｌのカナマイシン（２ＹＴＡＫ）とを含む２×ＹＴ内で穏やかに再懸濁し，３０°Ｃで一晩振とうしてインキュベートした。
【００４３】
一晩経過した培養物を１０，０００ｒｐｍで２０分間回転し，細胞を収集した。上清にＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％  ＰＥＧ  ８０００，２．５Ｍ  ＮａＣｌ；  １／５量）を加えた。溶液を混合し，４°Ｃで１時間以上放置した。それから，１０，０００ｒｐｍで２０分間回転させた。その後，上清を吸引した。
【００４４】
ペレットを４０ｍｌの殺菌水に再懸濁し，１２，０００ｒｐｍで１０分間回転させることにより，残留している細菌の残骸のほとんどを除去した。１／５量のＰＥＧ／ＮａＣｌを，再度上清に加えた。それをよく混合し，４°Ｃで１時間以上放置した。
【００４５】
それを，再度１０，０００ｒｐｍで２０分間回転させ，上清を吸引した。そして，ペレットをＰＢＳに再懸濁し，１２，０００ｒｐｍで１０分間回転させることにより，残留している細菌の残骸のほとんどを除去した。
【００４６】
上述したものは，ファージの調製の一例である。この例は説明のためのみのものであり，保護範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば，様々な修正やバリエーションが可能であることを理解するであろう。ＥＬＩＳＡプレート又はＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いてファージをスクリーニングしてもよい。
実施例５．ＥＬＩＳＡプレートを用いた選択
【００４７】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を，ウェルあたり１μｇ／１００μｌの抗原（例えば，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の組み換え型ヒトＶＥＧＦ）でコートした。ｐＨ７．４のＰＢＳ内，又はｐＨ９．６，５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム内において，抗原のコーティングを，４°Ｃで一晩行った。それから，ウェルをＰＢＳで３回すすぎ，ウェルあたり３００μｌＰＢＳ‐５％脱脂乳（ＭＰＢＳ）で，３７°Ｃで１．５時間ブロックした。その後，ＰＢＳで３回すすいだ。
【００４８】
それから，５％ＭＰＢＳ内における１０１１個から１０１２個のファージ１００μｌ。溶液を３７°Ｃで９０分間インキュベートし，試験溶液を捨ててＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。
【００４９】
各ウェルに１００μｌのＰＢＳを加えた。それを３７°Ｃで６０分間インキュベートし，ＰＢＳＴで３回，ＰＢＳで１回洗浄した。過剰なＰＢＳをプレートから振り出し，３７°Ｃで３０分間の連続的な回転とともに，１００μｌ，１００ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えることにより，ファージを溶出した。急速な中和のため，溶出した１００μｌのファージにトリス緩衝液（５０μｌ，１Ｍ，ｐＨ７．４）を加えた。
【００５０】
指数関数的に成長しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ１の培養物１０ｍｌを採取し，１５０μｌの溶出したファージに加えた。また，１００μｌのＴＧ１培養物も免疫プレートに加えた。両方の培養物を振とうせずに３７°Ｃで３０分間インキュベートして感染させた。１０ｍｌ，及び１００μｌの感染したＴＧ１細菌をプールし，４０００ｒｐｍで１５分間回転させた。細菌のペレットを，２×ＴＹに再懸濁し，大きな２ＹＴＡＧプレートの上に蒔いた。細菌を３０°Ｃで一晩成長させた。
実施例６．Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いた選択
【００５１】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を，１ｍｌのＰＢＳで３回，予め洗浄し，２％ＭＰＢＳに再懸濁した。ファージ（０．３ｍｌ）を，０．５ｍｌの２％ＰＢＳＭ，及び上記の洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）と混合した。その結果として生じた懸濁液を，ローテータ上で３０分間予めインキュベートした。
【００５２】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を除去し，ＶＥＧＦ（ｂｉｏｔｉｎ‐ｌａｂｅｌｅｄ）を加えた。結果として生じた混合物を，ローテータ上で９０分間混合した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を，１ｍｌのＰＢＳで３回，予め洗浄し，２％ＭＰＢＳに再懸濁した。そして，これをローテータ上で９０分間インキュベートした。
【００５３】
ファージ‐ＶＥＧＦ混合物を，ローテータ上でさらに３０分間，平衡にしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に加えた。それから，１ｍｌの０．０５％ＰＢＳＴ，２％ＰＢＳＭ，及びＰＢＳで洗浄した。それから，結合したファージを１００ｍＭのＴＥＡ１ｍｌで溶出した。インキュベーションの間，急速な中和のため，溶出したファージの追加に備えて，チューブと，０．５ｍｌの１ＭトリスｐＨ７．４とを調製した。
【００５４】
指数関数的に成長しているＴＧ１の培養物６ｍｌを採取し，ＴＥＡ溶出ファージを加えた。また，４ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＴＧ１培養物をビーズに加えた。両方の培養物を，振とうせずに３７°Ｃ（ウォーターバス）で３０分間インキュベートした。  
【００５５】
感染したＴＧ１細菌をプールし，４０００ｒｐｍで１５分間回転させた。ペレット状の細菌を１ｍｌの２×ＹＴに再懸濁し，大きな２ＴＹＡＧプレート上に蒔いた。その細菌を３０°Ｃで一晩成長させた。
実施例７．次ラウンドのファージの調製
【００５６】
上記の一晩成長させた細菌プレートに，１５％グリセリンを含む５−６ｍｌの２×ＹＴを加え，ガラススプレッダでコロニーをほぐした。５０−１００μｌの擦り取られた細菌を１００ｍｌの２×ＹＴＡＧに加えた。６００ｎｍでのＯＤが０．５となるまで，３７°Ｃで振とうして，細菌を成長させた。この培養物１０ｍｌを，１：２０の割合でヘルパーファージを加えることにより，Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージに感染させた。感染した培養物を振とうせずに３７°Ｃでインキュベートした。
【００５７】
感染した細胞を４０００ｒｐｍで１５分間回転させ，細菌を回収した。ペレットを，５０ｍｌの２×ＹＴＡＫに穏やかに再懸濁し，培養物を振とうして３０°Ｃで一晩インキュベートした。
【００５８】
一晩経過した培養物４０ｍｌを採取し，１０，０００ｒｐｍで２０分間回転させて，上清を回収した。上清に，１／５量（８ｍｌ）のＰＥＧ／ＮａＣｌを加え，よく混合し，４°Ｃで１時間以上放置した。上清を１０，０００ｒｐｍで２０分間回転させ，吸引した。ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し，１２０００ｒｐｍで１０分間回転させ，残留している細菌の残骸のほとんどを除去した。
実施例８．ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦ陽性ファージのスクリーニング
【００５９】
個々のコロニーを，プレートから，２００μｌの２×ＹＴＡＧ９６−ウェルプレートにインキュベートし，振とうして３７°Ｃで一晩成長させた。９６−ウェルを移植デバイスとして用いて，５０μｌの種菌を，プレートから，ウェルあたり２００μｌの２×ＹＴＡＧを含有する第２の９６−ウェルプレートに移植し，振とうして３７°Ｃで２時間成長させた。第２のプレートの各ウェルに，５０μｌの２×ＹＴＡＧを，１０９ｐｆｕのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージとともに加え，３７°Ｃで３０分間静置し，その後，３７°Ｃで１時間振とうした。
【００６０】
プレートを４０００ｒｐｍで３０分間回転させ，上清を吸引した。ペレットを３００μｌの２×ＹＴＡＫに再懸濁し，振とうして３０°Ｃで一晩成長させた。混合物を４０００ｒｐｍで３０分間回転させ，培養物の上清１００μｌをファージＥＬＩＳＡに用いた。
【００６１】
ウェルあたり１μｇ／１００μｌの蛋白質抗原で，ＥＬＩＳＡプレートをコートした。ウェルをＰＢＳで３回すすぎ，ウェルあたり３００μｌの２％ＭＰＢＳで３７°Ｃで２時間ブロックした。ウェルをＰＢＳで３回すすいだ。１００μｌのファージ培養物の上清を，既に詳述したように加え，３７°Ｃで９０分間インキュベートした。試験溶液を捨てて，ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰ抗Ｍ１３抗体を２％ＭＰＢＳで適切に希釈したものを加え，３７°Ｃで９０分間インキュベートし，ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００６２】
反応混合物を基質溶液（ＴＭＢ）で発生させた。１Ｍの硫酸５０μｌを加えることにより，反応を停止させた。色は黄色に変わった。６５０ｎｍ及び４５０ｎｍにおけるＯＤを読み取った。ＯＤ４５０からＯＤ６５０を減じることにより，読み取り値を得た。
【００６３】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標），及びＥＬＩＳＡプレート法によるバイオパニングの結果の一例を図３Ａ及び３Ｂに示す。図３Ａは，これらのクローンの重鎖可変領域の配列（配列番号：１，配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，配列番号：８）を示し，図３Ｂはこれらのクローンの軽鎖可変領域の配列（配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２，配列番号：１３，配列番号：１４，配列番号：１５，配列番号：１６）を示す。
【００６４】
これらのクローンの重鎖及び軽鎖可変領域の配列は明らかにされており，図３Ａ及び３Ｂにそれぞれ示される。図４Ａ及び４Ｂに示すように，重鎖ＣＤＲ１（即ち，ＣＤＲＨ１）の配列は，配列番号：１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，及び３８であり，ＣＤＲＨ２の配列は，配列番号：１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，及び３９であり，ＣＤＲＨ３の配列は，配列番号：１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，及び４０であり，軽鎖ＣＤＲ１（即ち，ＣＤＲＬ１）の配列は，配列番号：４１，４４，４７，５０，５３，５６，５９，及び６２であり，ＣＤＲＬ２の配列は，配列番号：４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，及び６３であり，ＣＤＲＬ３の配列は，配列番号：４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，及び６４である。
【００６５】
一つ以上のＣＤＲＨ及び／又はＣＤＲＬ配列（又は相同の配列）を含有する抗体（又はそのフラグメント）がＶＥＧＦと結合することを予期することができ，治療用途を有することを，当業者は理解するであろう。例えば，ある抗体，又はそのフラグメント（例えば，Ｆａｂ，ｓｃＦｖ，Ｆ（ａｂ´）２等）は，これらのクローン内に示される一つ，二つ，又は三つのＣＤＲ配列（又は相同の配列）を備える重鎖又は軽鎖を含有してもよい。ある抗体，又はそのフラグメントは，各々が一つ以上のこれらの配列（又は相同の配列）を備える重鎖及び軽鎖の両方を含有してもよい。本発明の実施形態に従えば，相同の配列は，標的配列と比較して，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，又はそれより高い配列同一性を備えてもよい。本発明の実施形態に従えば，相同の配列は，好ましくは８０％以上，より好ましくは９０％以上，そして最も好ましくは９５％以上の，配列同一性を有する。
実施例９．全長抗体の発現
【００６６】
ファージパニングから得られた可変領域配列を，抗体フレームワークの定常部に挿入して，全長抗体を作成してもよい。例えば，抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨ及びＶＬチェーンをコードする遺伝子を，抗体の定常部を含有する発現ベクターに挿入してもよい。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞をベクターでトランスフェクトし，構築した。ベクターをトラスフェクトするために以下の手順を用い，３０ｍｌ量のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞の懸濁液に構築した。トランスフェクションの間，細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地に保持してもよい。
【００６７】
トランスフェクションの約２４時間前，ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞を，２×１０６細胞／ｍｌで１５ｍｌ通過させた。３７°Ｃで８％ＣＯ２のインキュベータ内にフラスコを配置した。それから，３７．５μｇのプラスミドＤＮＡを，全量が１．５ｍｌとなるまで１．５ｍｌの無菌１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。別のチューブで，３７．５μｌのＰＥＩ（２．０ｍｇ／ｍｌ）を１．５ｍｌ無菌１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。
【００６８】
ＤＮＡ，及びＰＥＩ溶液を室温で５分間放置した。チューブを反転させて溶液を穏やかに混合した後，チューブを室温で約１０‐２０分間静置した。ＤＮＡ‐ＰＥＩ混合物をＦ２９３細胞に加え，トラスフェクトした細胞を，３７°Ｃ，８％ＣＯ２のインキュベータ内で，１３５−１５０ｒｐｍで回転している電子軌道振とう機プラットフォームに４時間インキュベートした。その後，同量の新しい培養液を３０ｍｌの全量に加え，細胞を５−７日間培養した。それから，蛋白質精製及び定量化のために，細胞を回収した。
【００６９】
図５に示すように，精製した全長抗体の結合親和性について（例えば，ＢＩＡｃｏｒｅ，又は他の適切な方法を用いて）分析してもよい。全長抗体，又はそのフラグメントを，ＶＥＧＦ上にエピトープを位置付けるために用いてもよい。また，ＶＥＧＦ誘導レセプターのリン酸化，又はＶＥＧＦ誘導細胞の増殖又は遊走のような全長抗体の機能について分析してもよい。
実施例１０．ＢＩＡｃｏｒｅを用いた親和性測定及びカイネティクス分析
【００７０】
治療薬としての使用のためには，抗体は，標的となる分子（例えば，ＶＥＧＦ）との高い親和性を有するのが好ましい。ＶＥＧＦと結合する様々な抗体の親和性及びカイネティクスを，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００上での表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析のような，適切な装置を用いて調査してもよい。例えば，多周期動態学（ＭＣＫ）法と，その関連するソフトウェアを用いて，結合カイネティクスを測定し分析した。
【００７１】
一例として，ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を，５０−１５０応答単位（ＲＵ）の範囲内でＲｍａｘに到達する密度で，ＣＭ５チップ上で固定した。
【００７２】
この例において，カイネティクス分析パラメータを以下のようにとった。データ収集率１Ｈｚ，双検出モード，温度２５°Ｃ，濃度単位：ｎＭ，バッファ  Ａ  ＨＢＳ−ＥＰ。５個の複写物で測定を行った。様々な装置設定は，以下のとおりである。
【００７３】
キャプチャー，流路２−１，チップＣＭ５，再生１を選択。
【００７４】
リガンドキャプチャーを選択，パラメータを次のように設定。接触時間：１２秒，流速：１０μＬ／分，安定期間：９０秒。（５０−１５０応答単位（ＲＵ）の範囲内）（リガンドとして，ＢＤ２の抗ＶＥＧＦ抗体及び変異体）。
【００７５】
サンプルを選択，パラメータを次のように設定。接触時間：３００秒，流速：４０μＬ／分，解離時間：５００秒。
【００７６】
再生を選択，パラメータを次のように設定。再生溶液：２５ｍＭグリシン  ｐＨ１．５，接触時間：６０秒，流速：３０μＬ／分，安定期間：１２０秒。
【００７７】
流れる緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋）でＶＥＧＦを段階的に希釈。得られた一連の濃度は，１０，５，２．５，１．２５，０．６２５，０．３１２５，０．１５６２５，０及び１．２５ｎＭ（繰り返し）である。ラック位置に従って，サンプルを準備し，位置付ける。
【００７８】
ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアで結果を評価した。空のフローセルから応答を差し引くことにより，結合応答を緩衝効果のために補正した。ｋａ又はｋｏｎ（会合速度又はｏｎ速度），及びｋｄ又はｋｏｆｆ（解離速度又はｏｆｆ速度）を評価するために，１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いた。ｋｏｆｆ及びｋｏｎの比から，ＫＤ（又はＫｄ）の値を決定してもよい（即ち，ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。あるいは，ミカエリス・メンテン式と同様に，平衡カイネティクスに基づいて，抗体濃度の機能としての安定状態結合型濃度から，解離定数（Ｋｄ値）を推定してもよく，一次反応カイネティクスを当てはめることにより，結合の進行が湾曲した部分から，ｏｎ速度（ｋｏｎ）を推定することができる。（試薬の一つが一定の濃度に保たれているので，反応は一次反応である。）それから，ｋｏｆｆ速度をＫＤ及びｋｏｎから導き出してもよい。あるいは，プローブ上に固定された複合体は洗浄されるので，複合体の指数関数的減衰からｋｏｆｆを得てもよい。
実施例１１．エピトープマッピング
【００７９】
ＶＥＧＦへの結合抗体に含まれる残留物を解明するために，エピトープマッピング実験を行った。具体的には，抗体結合に重要なＶＥＧＦ上の残留物を特定するために，アラニンスキャニング法を用いた。これらのＶＥＧＦ変異体のカイネティクス及び親和性を，上記と同じ方法で評価した。種々の抗体と組み合わせた種々の変異体で評価を行うことができる。これらの結合の研究結果から，ＶＥＧＦ上の重要な残留物だけでなく，ＣＤＲ内の重要な残留物も特定できるであろう。
【００８０】
ＶＥＧＦはそのレセプターに結合し，その生物学的機能を発現する。ＶＥＧＦ上の結合面は明らかにされている。図６Ａは，ＶＥＧＦ１６５とそのレセプター（ＶＥＧＦレセプターＩＩ）結合面の三次元構造を示す。抗ＶＥＧＦ抗体が診療所において有用であるために，抗体は，ＶＥＧＦがそのレセプターと結合するのと競合又は干渉するように，おそらく同じ面又はその近くに結合したであろう。
【００８１】
図６Ａは，ＶＥＧＦ１６５にエピトープをマップする変異体を調製するために選ばれた四つの領域（Ｃ，Ｄ，Ｅ，及びＨ）を示す。これらの四つの領域（配列番号：６５−６８）における配列を，図６Ｂに示す。このアプローチでは，ＶＥＧＦ１６５におけるどの残基が，抗体と結合するために重要であるかを確かめるために，アラニン置換を用いる。技術分野において一般的に知られている部位特異的突然変異誘発法で，様々なアラニン置換変異体を作ってもよい。発現ベクターに変異体を加え，適切な細菌細胞，酵母細胞，又は哺乳類細胞にトランスフェクトして，変異ＶＥＧＦを作ることができる。これらの蛋白質発現手法は技術分野において周知である。これらの研究に基づき，アラニン置換によって明らかにされたように，抗体の結合に重要な四つの領域における様々な残基には，図６Ｂに示される配列において下線を付した。
【００８２】
ＶＥＧＦ１６５の四つの変異体（即ち，図６Ｂにおいて下線が付された残基をアラニン置換したもの）を，ＶＥＧＦ１６５Ｃ（Ｆ１７Ａ，Ｍ１８Ａ，Ｙ２１Ａ，及びＹ２５Ａ），ＶＥＧＦ１６５Ｄ（Ｉ４６Ａ，Ｋ４８Ａ），ＶＥＧＦ１６５Ｅ（Ｄ６３Ａ，Ｌ６６Ａ），及びＶＥＧＦ１６５Ｈ（Ｍ８１Ａ，Ｉ８３Ａ，Ｑ８９Ａ，Ｇ９２Ａ）と呼ぶ。
【００８３】
以下に説明するように，様々な抗体の，ＶＥＧＦ１６５上のエピトープへの結合を調べるため，これらのＶＥＧＦ１６５の変異体を，未変性のＶＥＧＦ１６５とともに用いた。
実施例１２．エピトープマッピング分析
【００８４】
上記と同様のやり方で，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）又はＥＬＩＳＡプレートを使用して，結合分析を行うことができる。
【００８５】
簡単に説明すると，ウェルあたり１００μｌの，天然のＶＥＧＦ１６５，又は上述したＶＥＧＦ１６５の変異体で，ＥＬＩＳＡプレートを，４°Ｃで一晩コートした。過剰な液体を捨てるためにＥＬＩＳＡプレートをひっくり返すことにより，ウェルをＰＢＳで３回すすぎ，ウェルあたり３００ｕｌの５％ＭＰＢＳで，３７°Ｃで２時間ブロックした。それから，ウェルを再びＰＢＳで３回すすいだ。
【００８６】
２倍の段階希釈において，各試験抗ＶＥＧＦ抗体１００ｕｌを加える。ポジティブコントロールとして，アバスチン（登録商標）を用いた。それから，プレートを３７°Ｃで９０分間インキュベートする。試験溶液を捨て，ウェルをＰＢＳで３回洗浄する。
【００８７】
ＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ抗体を５％ＭＰＢＳで適切に希釈（１：１００００）したものを，各ウェルに加える。３７°Ｃで６０分間インキュベートし，その後，ウェルをＰＢＳで３回洗浄する。
【００８８】
基質溶液ＴＭＢ１００ｕｌで発生させる。１Ｍの硫酸５０ｕｌを加えて反応を停止させる。色は黄色に変わった。６５０ｎｍと４５ｎｍにおけるＯＤを読み取る。ＯＤ４５０読み取り値からＯＤ６５０読み取り値を減じることにより，抗体結合の程度を示す値を得る。
【００８９】
図６Ｃは，種々の抗体と天然のＶＥＧＦ１６５，及び四つのＶＥＧＦ１６５の変異体，即ち，ＶＥＧＦ１６５Ｃ，ＶＥＧＦ１６５Ｄ，ＶＥＧＦ１６５Ｅ，及びＶＥＧＦ１６５Ｈとの結合分析の結果を示す。
【００９０】
アバスチン（登録商標）（ポジティブコントロール）を用いた場合，ＶＥＧＦ１６５Ｃ，ＶＥＧＦ１６５Ｄ，及びＶＥＧＦ１６５Ｅ変異体への結合は実質的に変わらず，このことは，アバスチン（登録商標）に対する結合部位がこれらの領域には位置しないことを示唆している。しかしながら，アバスチン（登録商標）とＶＥＧＦ１６５Ｈの間の結合は完全に破壊されており，このことはアバスチン（登録商標）結合部位がこの領域に位置し，配列番号６８に示される残基のアラニン置換が結合を損なわせたことを示す。これらの結果は，ＶＥＧＦ１６５上のアバスチン（登録商標）に対する結合部位（エピトープ）がＨ領域，即ち，配列番号６８に位置することを示す。
【００９１】
ＢＤ２抗体，ＢＫ３Ａ３抗体，及びＢＨ３Ｇ１２抗体は，アバスチン（登録商標）と同様に振る舞った。即ち，ＶＥＧＦ１６５Ｃ，ＶＥＧＦ１６５Ｄ，及びＶＥＧＦ１６５Ｅへの結合の有意な損失はなかったが，ＶＥＧＦ１６５Ｈとの結合は実質的に失われた。これらの結果は，ＢＤ２抗体，ＢＫ３Ａ３抗体，及びＢＨ３Ｇ１２抗体に対する結合部位（エピトープ）もまた，Ｈ領域，即ち，配列番号６８に位置することを示す。
【００９２】
一方，ＢＨ３Ｄ４抗体，ＢＨ３Ａ１２抗体，ＢＨ３Ｆ５抗体，Ｈ３抗体−１Ｂ１，及びＢＨ３Ｃ３抗体に対するエピトープは，アバスチン（登録商標）とは異なる。ＢＨ３Ｄ４抗体に対するエピトープは，二つの領域（Ｄ及びＨ）を含み得るが，ＢＨ３Ａ１２抗体に対するエピトープは，三つの領域（Ｄ，Ｅ，Ｈ）を含み得る。
【００９３】
興味深いことに，ＢＨ３Ｆ５抗体，Ｈ３抗体−１Ｂ１，及びＢＨ３Ｃ３抗体は，四つの変異体ＶＥＧＦ蛋白質の全てに，よく結合する。これらの結果は，これらの三つの抗体に対するエピトープがこれら四つの領域（Ｃ，Ｄ，Ｅ，及びＨ）に位置しないことを示す。
【００９４】
これらの結果から，上記の抗体は，ＶＥＧＦ上のＤ，Ｅ，及び／又はＨ領域においてエピトープに結合するか，Ｃ，Ｄ，Ｅ，及びＨ領域の外側のエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし，いずれの抗体も領域Ｃには結合しない。
実施例１３．ＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣの増殖分析
【００９５】
ＶＥＧＦは，その血管新生の特性で知られている。それは，ＶＥＧＦレセプターに結合することができ，レセプターのリン酸化をもたらし，新たな血管を形成する結果となり得るシグナル伝達につながる。新たな血管形成（血管新生）は，ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のような，血管内皮細胞の増殖を含む。従って，抗体がＶＥＧＦ機能をブロックする能力を有するか調べるために，抗体がＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖を阻止し得るか調べてもよい。この分析は，以下のように行われてもよい。
【００９６】
アバスチン（登録商標）（ポジティブコントロール），又は抗体のテストサンプルを，１０％のＦＢＳ−ＤＭＥＭで希釈して，一連の異なる濃度，例えば，８００ｎｇ／ｍｌ，２倍の段階希釈を作成する。９６−ウェルプレートの各ウェルに，１００μｌの抗体溶液を加える。試験は二通り，又は三通り行ってもよい。
【００９７】
ＣＨＯ  ｈＶＥＧＦをＭｅｄｉｕｍ２００（ヒト大血管内皮細胞の培養のための無菌の液体培地であり，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹより入手可能）で５０ｎｇ／ｍｌに希釈する。プレート上の各ウェルに，５０μｌのＣＨＯ  ｈＶＥＧＦを加える。それから，プレートを室温で３０分間インキュベートする。
【００９８】
インキュベーションの後，細胞を回収し，Ｍｅｄｉｕｍ２００において，８×１０４細胞／ｍｌまで再懸濁する。５０μｌの細胞培養液の一定分量を，プレート上の各ウェルに加える。プレートを，５％ＣＯ２のインキュベータ内において，３７°Ｃで９６時間インキュベートする。
【００９９】
インキュベーションの後，２０μｌのＷＳＴ−１細胞増殖分析リガンド（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手可能）を，各ウェルに加える。プレートを，５％ＣＯ２のインキュベータ内において，３７°Ｃで４時間インキュベートする。それから，ＯＤの差（Ａ４５０ｎｍ−Ａ６５５ｎｍ）を導くために，ＥＬＩＳＡリーダを用いて４５０ｎｍと６５５ｎｍにおける吸光度を測定する。
実施例１４．ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化分析
【０１００】
上記のとおり，ＶＥＧＦのそのレセプターへの結合は，レセプターリン酸化をもたらす。それゆえに，抗体の活性を分析する別の方法は，そのようなレセプターリン酸化を阻害する能力を分析することである。この分析方法の一つは，以下のとおりである。
【０１０１】
ＨＵＶＥＣ細胞を，６−ウェル皿において３７°Ｃで１６時間，成長因子飢餓（２％ＦＢＳ）とともに９０％コンフルエンスまで成長させる。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と様々な量の抗体（５０，１０，２，０．４，０．０８ｎＭ）とを含む混合物を調製し，３７°Ｃで３０分間インキュベートする。
【０１０２】
１６時間の飢餓状態後，培養液を除去し，様々な量の抗体溶液の調製した混合物とともに，ＨＵＶＥＣ細胞を，ＲＴで１０分間インキュベートする。
【０１０３】
２ｍｌのＰＢＳ（１×ホスタファーゼ阻害剤とともに）で一度，細胞を洗浄する。それから，１５０ｕｌの１×サンプリングバッファ（１×ホスタファーゼ阻害剤とともに）を加えて，細胞を溶解させる。
【０１０４】
細胞を１００°Ｃで１０分間煮沸する。細胞培養液の一定分量（２５ｕｌ）を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流す。蛋白質バンドを，使用前に新しいメタノールに浸漬したＰＶＤＦ膜に，１００Ｖ，４°Ｃで７０分間移植する。
【０１０５】
膜を，ＴＢＳＴバッファ内の５％乳又は第一抗体で，４°Ｃで一晩ブロックした。それから，膜を，抗ＶＥＧＦＲ２（１：１０００希釈），及び抗ホスホＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）（１：１０００希釈）でブロット（ウェスタンブロット）する。
【０１０６】
膜を，ＴＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で，ＲＴにおいて１０分間，３回洗浄し，その後，ＲＴにおいて１時間，第二抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００希釈）を加える。
【０１０７】
膜を再度，ＴＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で，ＲＴにおいて１０分間，３回洗浄する。それから，フェムトＥＣＬ（強化された化学発光）で染色する。
実施例１５．ＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣの遊走分析
【０１０８】
上記のとおり，ＶＥＧＦの，そのレセプターへの結合は，レセプターリン酸化をもたらし，シグナル伝達，及びＨＵＶＥＣ増殖につながる。新たな血管を形成するため，ＨＵＶＥＣ細胞は遊走して新たな管状構造を形成する。それゆえに，抗体の活性を分析する別の方法は，そのようなＨＵＶＥＣ遊走を阻害するそれらの能力を分析することである。この分析方法の一つは，以下のとおりである。
【０１０９】
抗ＶＥＧＦ抗体のＨＵＶＥＣ遊走への影響を調べるため，ポアを有する膜によって分離された二つのチャンバーを有するＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイシステム（例えば，３μｍポア；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  Ｎ．Ｊ．）を用いて，ＨＵＶＥＣ細胞の遊走活性を評価した。図７に示されるように，ＨＵＶＥＣ細胞を，上のチャンバーで，２％ＦＢＳを含有するＭｅｄｉｕｍ２００内で成長させる。この例における細胞数は，２００μｌ中に５×１０４個である。下のチャンバーには，２％ＦＢＳを含有する６５０μｌのＭｅｄｉｕｍ２００，１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ，及び様々な濃度のテスト抗体を置く。
【０１１０】
細胞を，３７°Ｃで２２時間インキュベートする。インキュベーション期間の後，膜の上側を綿棒で擦り，遊走しなかった細胞を除去する。それから，膜の下側の細胞の数を，倍率１００×の顕微鏡で数える。三つの無作為の視野から細胞数を得る。データは平均値±ＳＤで表される。各グループ間の活性を比較するために，ｔ検定を用いる。Ｐ値＜０．０５が，統計的に有意であると考えられる。
【０１１１】
図８は，ＢＩＡｃｏｒｅ結合分析と三つの異なるＶＥＧＦ阻害分析（以下に説明する）の結果をまとめたものである。アバスチン（登録商標）の結果も比較のために示す。比較から分かるように，クローンのいくつかは，アバスチン（登録商標）の活性と同様の活性を示す。例えば，ＢＨ３Ｃ３（０．２７１ｎＭ），ＢＨ３Ｇ１２（０．２６３ｎＭ），ＢＫ３Ａ３（０．３３６ｎＭ），ＢＨ３Ｆ５（０．２３３ｎＭ），ＢＨ３Ｄ４（０．２９６ｎＭ），及びＢＤ２（０．２１ｎＭ）に対するヒトＶＥＧＦ結合親和性は，アバスチン（登録商標）のそれと同様である。
実施例１６．異種移植片モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害分析
【０１１２】
上記のとおり，ＶＥＧＦは腫瘍の成長及び転移に必須である。上記のｉｎ  ｖｉｖｏ分析は，本発明の抗体が，ＶＥＧＦの様々な生物学的機能を阻害するのに有効であることを証明する。それゆえに，これらの抗体もまた，ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の成長及び転移の阻害に有効であろうことを，期待するかもしれない。ｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの効果を確かめるために，腫瘍異種移植片モデルを，マウスに用いた。
【０１１３】
このｉｎ  ｖｉｖｏ分析の方法を図９に示す。図９に示されるように，マウスに麻酔をかけ，麻酔したマウスの背中の外側の領域に腫瘍細胞を注射した（右側，ｓｃ，２００μｌ／マウス）。
【０１１４】
腫瘍を，体積≧１５０ｍｍ３となるまで成長させた後，図９に示すように，マウスを，アバスチン（登録商標）（ポジティブコントロールとして）と，０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥＧＦ抗体とで処理した。一週間に二回，抗体を注射した。
【０１１５】
次の３−６週の間，腫瘍の大きさとマウスの体重とを，週二回測定した。試験の最後に，マウスを殺処分し，腫瘍を取り除いて秤量する。腫瘍の体積を，Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２で計算した。ここで，Ｖは体積，ａとｂはそれぞれ，長さと幅である。
【０１１６】
図１０Ａは様々な処理グループ（一つのブランクコントロールグループ，アバスチン（登録商標）グループ，及び８個の異なる抗ＶＥＧＦグループ，ＢＤ２，ＢＨ３Ｇ１２，ＢＫ３Ａ３，ＢＨ３Ｄ４，ＢＨ３Ａ１２，Ｈ３１Ｂ１，ＢＨ３Ｃ３，及びＢＨ３Ｆ５）に対する，テスト期間（２１日間）中の腫瘍成長の結果を示す。その結果が図１０Ｂに示す表にまとめられている。図１０Ｂの表は，ＮＣ（コントロール），アバスチン（登録商標），及び８個の抗体に対する成長率（０日の腫瘍量の％）を示す。図１０Ｂの表のデータから分かるように，８個の抗ＶＥＧＦ抗体の全ては，ｉｎ  ｖｉｖｏでの異種移植片モデルにおける腫瘍成長の縮小に有効である。アバスチン（登録商標）と比較して，ＢＨ３Ｄ４，ＢＫ３Ａ３，及びＢＨ３Ｇ１２は，腫瘍成長の阻害に，より有効である。
処理方法
【０１１７】
上記のとおり，本発明の抗体は，ＶＥＧＦ機能の阻害に有効である。それゆえに，これらの抗体を，糖尿病網膜症及び癌のような，ＶＥＧＦ関連疾患の治療のための治療薬として用いてもよい。本発明の実施形態に従えば，抗体は単クローン抗体であってもよい。そのような抗体は，ヒト化抗体，又はヒト抗体であってもよい。本発明の実施形態に従えば，そのような治療や予防を必要とする患者に，有効量の抗体が与えられるであろう。
【０１１８】
「処理すること」又は「処理」とは，一つ以上の上記障害を持つ患者に，その障害，障害の症状，障害に次ぐ病気状態，又は障害体質の治療，苦痛の緩和，除去，治癒，予防，又は改善の目的で，抗体，又はその混合物を投与することを指す。「予防すること」又は「予防」とは，上記障害の発生をなくすこと，又は減らすことを指す。技術分野において理解されるように，「予防する」又は「予防」は，そのような障害の発生の完全な（１００％）回避を必要としない。そのかわりに，障害の可能性，又は程度の低下は，予防の成功と考えられるであろう。
【０１１９】
「有効量」とは，治療される患者の内側に望ましい結果を作り出すことができる量を指す。治療法は，単独で，又は他の薬や療法との組み合わせで行うことができる。ＳＪＳ，及びＴＥＮのような皮膚障害の治療のため，局所的に，又は内部的に（例えば注射によって）治療薬を届けてもよい。
【０１２０】
必要となる一回分の投与量は，投与経路の選択；処方の特徴；患者の病気の特徴；患者の大きさ，重さ，表面積，年齢，性別；他の投与されている薬；及び付き添いの医師に依存する。適切な投与量は，０．０１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。これらの投与量レベルの変動は，技術分野においてよく知られているように，最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調節することができる。適切な配達媒体（例えば，ポリマー微粒子や埋め込み装置）への治療薬の被包は，配達の効率を高めるかもしれない。
【０１２１】
上記の例は，本発明の実施形態の様々な側面と効用を証明する。本発明は限られた数の実施形態について説明されているが，この開示の恩恵を受ける当業者は，ここに開示された発明の範囲から逸脱しない他の実施形態も考案し得ることが分かるであろう。従って，本発明の範囲は，添付の請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｃ（２）】
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【図６Ｃ（３）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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