(57)【要約】  本発明は、トケイソウである、チャボトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）および／またはクダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）、好ましくは、クダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）の種子の脂質抽出物に関し、前記脂質抽出物は、抽出物の総重量に対して３〜１００重量％の不けん化物を含む、不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ種子油であることを特徴とする。またかかる抽出物を製造する方法、および前記抽出物を含む組成物、特に皮膚科学的またはまたは医薬組成物または食品としてのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トケイソウ種子であって、チャボトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）および／またはクダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）、好ましくはクダモノトケイソウの種子由来の脂質抽出物であって、該脂質抽出物が、抽出物の総重量に対して３〜１００重量％の不けん化物を含む、不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ種子油であることを特徴とする抽出物。
【請求項２】
脂質抽出物が、下記特徴を有する不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ種子油であることを特徴とする、請求項１に記載の抽出物：
2016534982.tif 000037
【請求項３】
脂質抽出物が、下記特徴を有する不けん化物であることを特徴とする、請求項１に記載の抽出物：
2016534982.tif 000038
【請求項４】
脂質抽出物が、下記連続工程を含む製造方法を使用して得られることを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の抽出物：
ａ）粗製または精製トケイソウ油の分子蒸留；
ｂ）任意で、不けん化物の抽出；
ｃ）工程a)の後で得られた不けん化物中に濃縮された油、または工程ｂ）の後に得られた不けん化物の回収。
【請求項５】
工程ｂ）が下記連続工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抽出物：
ｉ）工程ａ）の後で得られた不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ油のけん化；
ｉｉ）続いて適当な溶媒を使用する不けん化物の抽出。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抽出物を製造する方法であって、下記連続工程を含む製造方法：
ａ）粗製または精製トケイソウ油の分子蒸留；
ｂ）任意で、不けん化物の抽出；
ｃ）工程a)の後で得られた不けん化物中に濃縮された油、または工程ｂ）の後に得られた不けん化物の回収。
【請求項７】
工程ｂ）が下記連続工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載の製造方法：
ｉ）工程ａ）の後で得られた不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ油のけん化；
ｉｉ）続いて適当な溶媒を使用する不けん化物の抽出。
【請求項８】
遠心分離機型の分子蒸留装置およびスクレイプトフィルム(ｓｃｒａｐｅｄ  ｆｉｌｍ）型の分子装置から選択された装置を用いて分子蒸留工程ａ）を行うことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
有効成分としての請求項１〜５のいずれか１項に記載のトケイソウ種子の脂質抽出物、および適当な賦形剤を含む組成物。
【請求項１０】
組成物の総重量に対して０．０１重量％〜２０重量％の該脂質抽出物を含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚用組成物、医薬組成物もしくは機能性食品としてまたはこれらにおいて使用するための、請求項９もしくは１０に記載の組成物、または請求項１〜５のいずれか１項に記載の抽出物。
【請求項１２】
皮膚もしくは粘膜細胞の代謝を刺激、回復もしくは調節するために使用、ならびに／または皮膚組織に関連する障害を予防および／もしくは治療するために使用するための、請求項１１に記載の組成物または抽出物。
【請求項１３】
下記適用の1つ以上に使用するための、請求項１２に記載の組成物または抽出物：
−抗加齢剤；
−治癒剤
−皮膚もしくは粘膜のホメオスタシスの低下の予防および／もしくは維持；
−抗酸化剤；
−抗炎症剤；
−痩身剤もしくは抗セルライト剤；
−皮膚のストレッチマークの予防もしくは治療；
−脱色剤。
【請求項１４】
肌の早期老化、特に光誘発肌老化を予防もしくは遅延、有利には、しわ、輪郭もしくはマイクロレリーフの悪化を予防、減少および／または治療するために使用するための請求項１２に記載の組成物または抽出物。
【請求項１５】
皮膚および粘膜の機械的性質を強化するために使用、特に衰えた皮膚、たるんだ皮膚、ゆるんだ皮膚、垂れた皮膚および／もしくは薄い皮膚に対抗するために使用、ならびに／または皮膚の弾力性もしくは硬さを強化および／もしくは回復させるために使用するための請求項１２に記載の組成物または抽出物。
【請求項１６】
治癒を促進するために使用するための、請求項１２または１３に記載の組成物または抽出物。
【請求項１７】
表面瘢痕、脆弱唇および口唇炎、ストレッチマーク、刺創および咬傷後の皮膚、皮膚擦過傷、皮膚斑および／または痂皮ならびに脆弱肌および敏感肌からなる群から選択される病状または状態の予防および／または治療に使用するための、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物または抽出物。
【請求項１８】
皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の状態および／または外観を改善するため、有利には皮膚の硬さ、弾力性もしくは張性を改善するための美容ケア方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抽出物または請求項９もしくは１０に記載の組成物を経口または局所経路で投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抽出物または請求項９もしくは１０に記載の組成物を経口または局所経路で投与することを含む、ツッパリ感を伴うドライスキンのための美容処置方法。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抽出物または請求項９もしくは１０に記載の組成物を経口または局所経路で投与することを含む、シルエットを再構築し「オレンジピール」効果を制限する美容処置方法。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれか１項に定義されたような脂質抽出物を含む機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トケイソウ種子である、チャボトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）およびクダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）、好ましくは、クダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）種子由来の脂質抽出物、および適当な賦形剤および前記チャボトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）およびクダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）由来の種子脂質抽出物を含む化粧組成物、皮膚用組成物または栄養補助組成物に関する。発明者は、驚いたことにトケイソウ種子、好ましくクダモノトケイソウ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）種子由来の脂質抽出物が、所望の美容的、皮膚科学的または栄養補助的性質を有することを発見した。 
【０００２】
さらに本発明の主題は、トケイソウ種子由来脂質抽出物を抽出する過程であり、前記過程を使用して得ることができる抽出物である。また本発明は皮膚、粘膜または皮膚付属器官の疾患または病状の予防または治療に使用するための前記組成物または前記抽出物に関する。最終的には、本発明は、皮膚、皮膚付属器官または粘膜の美容ケア方法であって、それらの状態または外観を改善する観点から、前記組成物または抽出物の投与を伴う方法に関する。 
【０００３】
トケイソウ
トケイソウ(Passiflora）科は約５００種からなる。この種は、暖かくて穏やかな熱帯地域、特にアメリカ大陸にしばしば分布するが、アジア、オーストラリアおよび熱帯アフリカではむしろ珍しい。
【０００４】
植生態
該植物は低木またはつる性植物の形態である。葉は互生でしばしば単純な浅裂状または掌状である。花は直径９ｃｍに達することがあり、両性または単性で整正である。花は白および紫で、キリストの茨の冠を象徴する花糸を伴う糸状の花弁状の付属器官を有する。長さが４〜５ｃｍの果実は長円形で、しばしば黄色からオレンジ色である。
最も広く分布している種は特にチャボトケイソウ（P. incarnata）およびクダモノトケイソウ（P. edulis）である。
【０００５】
植物化学物質の性状
チャボトケイソウ（P. incarnata）：フラボノイドファミリーとして表される主要成分は葉に大量に存在し、高濃度のイソビテキシンを含有する。また少量の単純なインドールアルカロイド（ハルメン、ハルミンなど）、糖類(ラフィノース、スクロース、フルクトースおよびグルコースなど）、ならびに精油および、この植物に起因する鎮静および抗けいれん効果を引き起こす分子といわれるマルトールも含有する。
クダモノトケイソウ（P. edulis）：特異的な化合物であるパッシフロリン（シクロプロパントリテルペングリコシド）が乾燥葉のメタノール抽出物から同定されている（E.Bombardelliら、1975）。チャボトケイソウ（P. incarnata）中では見いだされないフラボノイドであるイソオリエンチン、ならびに微量の精油およびチャボトケイソウ（P. incarnata）と同一のアルカロイドを含有する。果実の果肉はフラボノイド（スカフトシド、イソスカフトシド、イソオリエンチン、オリエンチン、イソビテキシンおよびルテオリンの誘導体など）（M.L.Zeraik、J.H.Yariwake-2010）およびアスコルビン酸(約６０ｍｇ／１００ｇ）を含有する。
果肉はグリコシル化されたシアノゲン誘導体(プルナシン、サンブニグリンおよびアミグダリン、ならびに最近同定された２つのマンデロニトリル−β−ルチノシド）も含有する（D.ChassagneおよびJ.Crouzet, 1998；D.S.Seigler, 2002）。
【０００６】
毒性
シアノゲン成分は様々なトケイソウの品種の地上部に主に含まれる。
【０００７】
種子の特性
種子はクダモノトケイソウ（P. edulis）果実の６〜１２％を構成し、以下を含む：
・ポリフェノール（血管弛緩および抗酸化効果を持つ物質である、ピセアタンノール（レスベラトロールに近い構造）およびその二量体であるスキルプシンＢ）（Ｓ．Ｓａｎｏ；Ｋ．Ｓｕｇｉｙａｍａ；Ｔ．Ｉｔｏ，２０１１）。
・油（植物ステロール（カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、アベナステロールなどを０．２％含有）を含有する１８％の溶質；６０％〜７３％のリノール酸（オメガ６）、１４％〜２０％のオレイン酸および４６５ｐｐｍのトコフェノール類）（Ｇ．Ｐｉｏｂｏｍ，Ｎ．Ｂａｒｏｕら、２００６；Ｒ．ｄｅ  Ｖ．Ｖ．Ｌｏｐｅｓら）。
・糖およびプロテイン
【背景技術】
【０００８】
従来技術
食品用途
果実は先史時代から摂取されていたと思われる。１６世紀のペルーでは優れたトケイソウ（Passiflora）の花がすでに治療薬と考えられており、トケイソウの多くの品種が一般的な治療適用のために多くの国でいまだに使用されている。
【０００９】
医療用途
トケイソウ(しばしば地上部、時に果実）は、世界中で、精神安定剤、鎮静剤、利尿剤および鎮痛剤としてしばしば使用されている（全て「Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ：ｒｅｖｉｅｗ ｕｐｄａｔｅ．Ｋ．Ｄｈａｗａｎ，Ｓ．Ｄｈａｗａｎ，Ａ．Ｓｈａｒｍａ，２００４」に記載）。マルトールおよびそのいくつかの誘導体はこの鎮静効果に関与している。
【００１０】
この作用はチャボトケイソウ（P. incarnata）においてより持続的でより顕著であると報告されている。チャボトケイソウ（P. incarnata）抽出物はモルヒネ依存を食い止めることができると言われている。抗炎症効果もクダモノトケイソウ（P. edulis）の葉の抽出物において証明されている。
【００１１】
様々なポリフェノールファミリーは、クダモノトケイソウ（Ｐ．ｅｄｕｌｉｓ）の地上部の抗酸化およびたんぱく質抗糖化効果（Ｍ．Ｒｕｄｎｉｃｋｉら，２００７）にほぼ確実に大きく寄与している。
【００１２】
クダモノトケイソウ（Ｐ．ｅｄｕｌｉｓ）果皮のメタノール抽出物の抗低血圧効果および繊維が豊富な脱脂種子の抽出物のコレステロール低下効果も証明されている。果実の煎じ汁の抗腫瘍効果は、腫瘍の浸潤、転移および血管新生に関与するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２およびＭＭＰ９）の阻害を介している。
皮膚−美容用途
クサトケイソウ（Ｐ．ｆｏｅｔｉｄａ）の葉は、炎症性皮膚疾患の治療のためにブラジルで使用されている。モーリシャスおよびロドリゲスではＰ．ｓｕｂｅｒｏｓａ（クロミノトケイソウ）の葉の煎じ汁が皮膚疾患の治療のために入浴に使用されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＧｌａＳｂｏｘ（登録商標）システム中で張力をかけられた真皮等価物中にトケイソウ濃縮物（ＭＪ）存在下もしくは非存在下赤色ストレッチマーク線維芽細胞（ＦＶＲ）により生じた収縮力。Ａ：最初の６時間の詳細；Ｂ：全体の曲線統計：二元配置分散分析法、次いでフィッシャー検定。〇ＦＶＲ；▽ＦＶＲ＋ＭＪ０．００５％；□ＦＶＲ＋ＭＪ０．０５％ｘ軸：時間（時間）；ｙ軸：力（任意単位／１００万細胞）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細
出願人は、チャボトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）種子および／またはクダモノトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）の種子の脂質抽出物が、これまでに開示されていない美容的および皮膚科的性質を示すことを見出した。特に、かかるトケイソウ脂質抽出物がそれらの特定の特徴のためにそのように使用されるのは初めてである。
【００１５】
本発明の主題は、適当な賦形剤を伴ってもよいトケイソウ種子の脂質抽出物を含む組成物である。該組成物は有利には化粧組成物、医薬組成物、皮膚組成物、栄養組成物である。前記組成物は好ましくは経口または外用局所経路の投与用に製剤化される。
【００１６】
本発明の主題は、トケイソウ種子である、チャボトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）および／またはクダモノトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）、好ましくは、クダモノトケイソウ（Ｐ．ｅｄｕｌｉｓ）の種子の脂質抽出物に関し、抽出物の総重量に対して、前記脂質抽出物が３重量％〜１００重量％、有利には４重量％〜１００重量％の不けん化物を含む不けん化物画分中で濃縮されたトケイソウ種子油であることを特徴とする。
【００１７】
不けん化物画分中で濃縮されたトケイソウ種子油は、元の油の脂肪酸を含み、濃縮トケイソウ油の脂肪酸分布は濃縮前のトケイソウ油の分布と同一である。同様に、不けん化化合物およびそのそれぞれの分布は、出発油および濃縮油中でも同一である。一方、油はその不けん化物画分中で濃縮され、特に、油の総重量に対して、３重量％を超える不けん化物、有利には４重量％を超える不けん化物、さらに有利には４．５重量％を超える不けん化物を含む。
【００１８】
不けん化物画分中で濃縮されたトケイソウ種子油は、有利には１２〜２２の炭素原子、より有利には１４〜２０炭素原子を有する脂肪酸を含む。これらの脂肪酸は、飽和、一価不飽和または多価不飽和であってよい。  
【００１９】
クダモノトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）の粗製油の特徴の一例を下記表１に述べる。 
【００２０】
【表１】
2016534982.tif 000002
【００２１】
不けん化物画分は、有利には大部分がトコフェロール、トコトリエノールおよびステロールから構成される。スクアレンも見られる。
【００２２】
不けん化物画分中トコフェロール含有量は、有利には０．１〜３重量％。より有利には０．５〜３重量％、さらに有利には１〜３重量％のトコフェロールの間で変化する。トコフェロールの中でも、α−トコフェロール、β−トコフェロール、δ−トコフェロールおよびγ−トコフェロールが有利に見出される。これらのトコフェロールは、トコフェロールの総重量の、有利には６０〜１００重量％、より有利には８０〜１００重量％の割合を占める。
【００２３】
不けん化物画分中、トコトリエノール含有量は、不けん化物画分の総重量に対して、有利には５〜２５重量％。より有利には８〜２５重量％、さらに有利には１０〜２０重量％のトコトリエノールの間で変化する。トコトリエノールの中でも、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、δ−トコトリエノールが有利に見出される。これらのトコトリエノールは、トコトリエノール総重量の、有利には６０〜１００重量％、より有利には８０〜１００重量％を構成する。
【００２４】
不けん化物画分中、ステロール含有量は、不けん化物画分の総重量に対して、有利には３０〜６０重量％、より有利には３５〜５５重量％、さらに有利には４０〜５０重量％のステロールの間で変化する。ステロールの中でも、カンペステロール、スチグマステロール、β−シトステロールおよびΔ７−スチグマステロールが有利に見出される。これらのステロールは、不けん化物画分の総重量に対して、有利には６０〜１００重量％、より有利には７０〜９０重量％を構成する。
【００２５】
不けん化物画分中、スクワレン含有量は、不けん化物画分の総重量に対して、有利には１０〜３５重量％、より有利には１５〜３０重量％、さらに有利には１５〜２５重量％のスクワレンの間で変化する。
【００２６】
したがって、不けん化物画分は、有利にはトコフェロール、トコトリエノール、ステロールおよびスクアレンを含み、好ましくは前記特定した含有量で含む。また不けん化物画分は、他の不特定の不けん化物を含んでもよい。有利には非特定の不けん化物の含有量は、不けん化物画分の総重量に対して、３０重量％未満、より有利には０〜２５重量％である。
【００２７】
本発明の第１の変形によれば、脂質抽出物は、不けん化物画分中で濃縮されたトケイソウ種子油である。有利には油の総重量に対して、３〜１５重量％を含む。有利には下記仕様を有する。
【００２８】
【表２】
2016534982.tif 000003
【００２９】
不けん化物画分は、前述のようなものである。
【００３０】
本発明の第２の変形によれば、脂質抽出物は不けん化物画分である。この不けん化物画分は、前述のようなものである。
【００３１】
脂質抽出物は、有利には下記連続工程を含む過程を使用し得られる:
ａ）粗製または精製トケイソウ油の分子蒸留; 
ｂ）任意で、不けん化の抽出;
ｃ）工程a)の後で得られた不けん化中に濃縮された油または工程b)の後で得られた不けん化物の回収。
【００３２】
不けん化物が豊富な油を回収したい場合には、工程ｂ）は行わない。 
【００３３】
不けん化物画分を回収したい場合には、工程b)を行う。この工程b)は、有利には下記連続工程を含む:
ｉ．工程a)の後で得られた不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ油のけん化;
ｉｉ．続いて適当な溶媒を用いた不けん化物の抽出。 
この過程は後述する。
【００３４】
さらなる本発明の主題は、下記連続工程を含む発明の抽出物を製造するための方法（過程）である:
ａ）粗製または精製トケイソウ油の分子蒸留; 
ｂ）任意で、不けん化物の抽出;
ｃ）工程a)の後で得られた不けん化物中に濃縮された油または工程b)の後で得られた不けん化物の回収。
【００３５】
トケイソウ種子から出発し、該方法は、当業者に公知の技術、例えば圧搾、溶媒抽出、超臨界圧下、より具体的には、圧搾もしくは超臨界圧下、好ましくは圧搾を使用して、油の最初の抽出工程を含む。油は当業者に公知の技術を使用して精製してもしなくてもよく、好ましくは精製しない油である。この油を、その後分子蒸留にかけ、その不けん化物画分中で濃縮した油(または濃縮物)を得る。
【００３６】
油は数種の方法：
・機械的プレスによるコールドプレス、ツインスクリュー押出機によるプレスなどの物理的抽出;
・有機溶媒(脂肪族アルカン、アルコール、塩素化溶媒、フッ素化溶媒)を使用する化学的抽出;
・例えば二酸化炭素単独および/または共溶媒と一緒に使用する超臨界媒体における抽出
を用いて抽出しうる。 
【００３７】
粗製トケイソウ油の抽出に対しては、機械的プレスによるコールドプレスが優先される。
【００３８】
粗製トケイソウ油は、物理的精製（水での脱ガム、高温脱臭による脱酸）および化学的精製（水での脱ガムまたは酸処理によるリン脂質除去、塩基性溶液を使用する遊離脂肪酸の中和、脱色、脱ろうおよび脱臭）などの当業者に公知の方法を用いて精製しうる。
【００３９】
前記で得た粗製トケイソウ油は、有利には分子蒸留過程を経てその不けん化物画分中で濃縮される。
【００４０】
不ケン化物画分は、アルカリ性塩基を長時間作用させた後にも水に不溶性のままであり、有機溶媒で抽出しうる脂肪の画分である。植物油のほとんどの不ケン化物には、５つの主要な物質群、すなわち飽和または不飽和炭化水素、脂肪族またはテルペン性アルコールである、ステロール、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド色素およびキサントフィルが含まれる。
【００４１】
この分子蒸留工程は、好ましくは遠心分離機型の分子蒸留装置およびスクレイプトフィルム（ｓｃｒａｐｅｄ  ｆｉｌｍ）型の分子装置の中から選択される装置を用いることによって行われる。
【００４２】
遠心分離機型の分子蒸留装置は、当業者に知られている。例えば、出願ＥＰ  ４９３  １４４号にはこの型の分子蒸留装置が記載されている。一般に、蒸留される生成物を、高速で回転している円錐ローターの加熱表面（熱表面）上に薄層として広げる。蒸留装置内を真空にする。これらの条件下では、不ケン化物のような油の成分の熱表面から蒸発は起こるが沸騰はせず、油およびその成分、特に不ケン化物（これらの生成物は壊れやすいと考えられている）は蒸発中に分解しないという利点がある。
【００４３】
スクレイプトフィルム型の分子蒸留装置も、当業者に知られている。一般に、これらは、蒸留を行う生成物を蒸発表面（熱表面）上で連続的に広げることができる回転スクレーパーを備えた蒸留室を含んでいる。生成物蒸気は、蒸留室の中央に置かれた冷却フィンガー（ｃｈｉｌｌｅｄ  ｆｉｎｇｅｒ）によって凝縮される。フィードおよび真空周辺システムは、遠心分離蒸留装置のものに極めて類似している（フィードポンプ、真空油拡散ベーンポンプなど）。ガラスフラスコ中の残渣および留出物の回収は、重力流によって得られる。
【００４４】
分画工程の後、不ケン化物含量が高い蒸留画分は、有利には出発油の３〜１５重量％となり、トリグリセリド含量が高い蒸留画分は有利には出発油の８５〜９７重量％を示す。
【００４５】
したがって、この過程は不ケン化化合物の化学変化または劣変を引き起こさず、不飽和度の大きい画分が保存されたことも明らかにされた。従って、濃縮トケイソウ油の脂肪酸分布は、濃縮前のトケイソウ油の脂肪酸分布と同一である。
【００４６】
分子蒸留工程後、得られた生成物は、任意で当業者に公知の過程を使用して脱臭および/または脱色されうる。
【００４７】
このようにして得られた不けん化物画分中で濃縮されたトケイソウ油は、前記特徴を有する。 
【００４８】
不けん化物を豊富にした油を回収したい場合には、工程ｂ）は行わない。 
【００４９】
不けん化物画分を回収したい場合には、工程ｂ）を行う。この工程は、有利には下記連続工程を含む：
ｉ．工程ａ）の後で得られた不けん化物画分中に濃縮されたトケイソウ油のけん化；
ｉｉ．続いて適当な溶媒を用いた不けん化物の抽出。
【００５０】
トケイソウ油の不けん化物は、当業者に公知の方法を使用して得ることができる。例えば、不けん化物画分中で濃縮されたトケイソウ油をけん化し、次に適当な溶媒を使用してこの不けん化物を抽出して得ることができる。次にこの抽出物を完全に石けん分が除去できるまで洗浄し、溶媒を蒸発させる。最終的には、不けん化物を水蒸気で脱臭し、窒素ストリッピングにかけて溶媒を残らず除去する。 
【００５１】
このようにして得られたトケイソウ油の不けん化物は、有利には前記特徴を有する。  
【００５２】
本発明において、トケイソウ種子の脂質抽出物は、それ自体不けん化物画分中で濃縮された油、不けん化物画分、前記示した仕様を有する不けん化物画分からなる群から選択される。  
【００５３】
さらに本発明の主題は、活性成分として本発明に記載のトケイソウ種子の脂質抽出物および適当な賦形剤を含む組成物である。
【００５４】
組成物は、組成物の総重量に対して前記脂質抽出物を０．０１〜２０重量％含む。
【００５５】
抽出物は、１以上の適切な賦形剤を含んでもよい化粧組成物、皮膚用組成物もしくは医薬組成物のような組成物中に活性剤として有利に使用される。組成物は、トケイソウの脂質抽出物に加えて、その他の活性化合物を少なくともひとつさらに含んでもよい。当該その他の化合物は、上記に示した全ての化合物およびその機能的な等価物の中から選択しうる。
【００５６】
当該その他の化合物は、特に、皮膚軟化剤、保湿剤、ケラチン合成活性化剤、ケラチン調節剤、角質溶解剤、皮膚バリア再構築剤（皮膚脂質合成活性化剤）、ＰＰＡＲ作動剤（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）、ＲＸＲまたはＬＸＲ作動剤、皮脂調節剤、抗刺激剤、緩和剤、抗炎症剤、抗酸化剤および抗加齢剤、脱色素剤または色素脱失（ｈｙｐｏ／ｄｅｐｉｇｍｅｎｔｉｎｇ）剤、着色剤、脂肪分解剤もしくは脂質生成阻害剤または抗セルライト剤もしくは痩身剤、無機または有機のサンフィルターおよびサンスクリーン、抗真菌化合物、防腐剤、抗菌剤、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス、抗生物質、免疫調節剤などの皮膚用品または化粧品で従来使用される活性成分の中から選択しうる。
【００５７】
より具体的には、組み合わせて使用できる皮膚バリアの治癒および／または再構築剤は、有利にはパンテノール（ビタミンＢ５）、アラビノガラクタン、酸化亜鉛、セラミド、コレステロール、スクアランおよびリン脂質である。
【００５８】
組み合わせて使用できる皮脂調節剤は、有利には５−α還元酵素阻害剤からなる群から選択される。亜鉛（ならびに、グルコン酸塩、サリチル酸塩およびピログルタミン酸塩のような亜鉛誘導体）およびスピロノラクトンも皮脂抑制活性を有する。その他の皮脂調節剤またはリノール酸のような皮脂の質に作用する脂質源も対象である。
【００５９】
抗炎症および／または抗刺激および／または緩和剤は、アラビノガラクタンであってよい。
【００６０】
組み合わせて使用できる日焼け防止活性成分は、有利には、ＵＶＢおよび／またはＵＶＡのサンフィルターおよびサンスクリーンであって、例えば、所望の保護レベルに応じてその選択および濃度を適合させることができる当業者には公知の無機および／または有機のスクリーンまたはフィルターである。
【００６１】
組み合わせて使用できる防腐剤は、たとえば、通常化粧品で使用されるもの、カプリル誘導体、たとえば、カプリロイルグリシンおよびグリセリルカプリレートなど、ヘキサンジオール、レブリン酸ナトリウム、ならびに亜鉛および銅誘導体(グルコネートおよびPCA)のような抗菌活性を有する分子（疑似防腐剤）である。
【００６２】
本発明の抽出物と組み合わせを推奨される活性成分の中でも、植物抽出物から作られているものが挙げられる。具体的には：
・植物油、例えば大豆油および／または菜種種子油、アボカド油（ＷＯ２００４／０１２４９６、ＷＯ２００４／０１２７５２、ＷＯ２００４／０１６１０６、ＷＯ２００７／０５７４３９）、ルピナス油、有利にはスイート白色ルピナス油（ＷＯ９８／４７４７９）、またはこれら油の混合物など；
・保湿および／または皮膚軟化、治癒および／または皮膚バリア再構築作用、抗炎症および／または抗刺激および／または緩和作用で特に有用な、動植物油の油脂蒸留物または濃縮物、特にヒマワリ油、より具体的には、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｅｘｐａｎｓｃｉｅｎｃｅから市販されている不けん化物リッチヒマワリ油（Ｓｏｌｉｎｅ（登録商標）、ＷＯ２００１／２１１５０）のようなヒマワリのリノール酸濃縮物、アボカド油、菜種種子油、コーン油型の不けん化物リッチ油；
・治癒および／または皮膚バリア再構築作用および抗加齢および抗炎症作用で特に使用される、植物または植物油の不けん化物、有利には、国際出願ＷＯ０１／２１６０５に記載された方法を使用して得ることができるアボカドフラン（Ａｖｏｃａｄｏｆｕｒａｎｅ（登録商標））、アボカドおよび／またはダイズ不けん化物、より具体的にはアボカドフラン不けん化物およびダイズ不けん化物の混合物、有利にはそれぞれの割合が約１：３〜２：３の混合物（Ｐｉａｓｃｌｅｄｉｎｅ（登録商標）など）、ダイズ不けん化物（国際出願ＷＯ０１／５１５９６に記載された方法を使用して得られるものなど）、ステロール不けん化物（典型的にはステロール、メチルステロールおよびトリテルペンアルコールの含量が不けん化物の総重量に対して２０〜９５重量％、好ましくは４５〜６５重量％である不けん化物）、植物ステロール、ステロールのエステルおよびビタミン誘導体；
・ペプチドまたは植物アミノ酸の複合体、特にアボカドペプチド（国際出願ＷＯ２００５／１０５１２３に記載されたもの）、ルピンペプチド（国際出願ＷＯ２００５／１０２２５９に記載されたもの）、キノアペプチド（国際出願ＷＯ２００８／０８０９７４に記載されたもの）、マカペプチド（国際出願ＷＯ２００４／１１２７４２に記載されたもの）、大豆ペプチド（発酵または未発酵）、コメペプチド（国際出願ＷＯ２００８／００９７０９に記載されたもの）のペプチドまたは植物アミノ酸（特に、保湿および／または軟化作用（アボカド）、ケラチン調節作用（ルピン、キノア）、皮膚バリアにおける治癒および／またはリストラクチュアリング作用（マカ、キノア、大豆）、抗炎症作用および／または抗刺激作用および／または緩和作用（ルピン、キノア）、抗酸化剤（アボカド）、抗加齢（ルピン、マカ）、色素沈着（コメ）に有用である）、ゴミシ（ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ）ペプチド（特許出願ＦＲ ０９５５３４４に記載されたもの）、アカシアアクロスタキア（Ａｃａｃｉａ  ｍａｃｒｏｓｔａｃｈｙａ）の種子の抽出物（出願ＷＯ２０１１／０６４４０２に記載されたもの）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）の種子の抽出物（出願ＷＯ２０１１／０６４４０１に記載された抽出物）；トケイソウ種子のペプチドおよびオシディック（ｏｓｉｄｉｑｕｅｓ）抽出物（特許出願ＦＲ１２６２２３４に記載されたものなど）
・植物糖類、特にアボカドの糖類（出願ＷＯ２００５／１１５４２１に記載されたものなど）、ケラチン調節、皮膚バリア治癒および／または再構築作用、抗炎症および／または抗刺激および／または緩和作用で特に有用である；
・ブチルアボカデート（５α  Ａｖｏｃｕｔａ（登録商標））、５−α還元酵素阻害剤（ＷＯ０１／５２８３７およびＷＯ０２／０６２０５）、典型的にはニキビおよびふけで増加する脂漏分泌の調節剤；
・ポリフェノールが豊富な抽出物、より具体的には、アボカド果実の抽出物（出願ＦＲ１０６１０５５に記載されたものなど）、マカの葉の抽出物（出願ＦＲ１０６１０４７に記載されたものなど）およびフウチョウソウ（Ｇｙｎａｎｄｒｏｐｓｉｓ  ｇｙｎａｎｄｒａ）の地上部の抽出物（出願ＦＲ１０６１０５１に記載されたものなど）；
・治癒促進に特に有用なルペオール（ＦＲ２８２２８２１、ＦＲ２８５７５９６）；
・保湿性で特に高く評価されるクプアスバター；である。
【００６３】
本発明の抽出物と組み合わせを推奨される活性成分の中でも、オキサゾリン類が挙げられる。具体的には、２−ウンデシル−４−ヒドロキシメチル−４−メチル−１，３−オキサゾリン、２−ウンデシル−４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリン、（Ｅ）−４，４−ジメチル−２−ヘプタデカ−８−エニル−１，３−オキサゾリン、４−ヒドロキシメチル−４−メチル−２−ヘプタデシル−１，３−オキサゾリン、（Ｅ）−４−ヒドロキシメチル−４−メチル−２−ヘプタデカ−８−エニル−１，３−オキサゾリン、２−ウンデシル−４−エチル−４−ヒドロキシメチル−１，３−オキサゾリン（好ましくは、ＯＸ−１００またはＣｙｃｌｏｃｅｒａｍｉｄｅ（登録商標）と呼ばれる２−ウンデシル−４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリン；ＷＯ２００４０５００５２、ＷＯ２００４０５００７９およびＷＯ２００４１１２７４１）からなる群から選択されてもよい。これらは特に抗炎症および／または抗刺激および／または緩和、抗酸化、脱色素、免疫調節作用で特に有用である。
【００６４】
これら全ての組み合わせは、トケイソウ種子の抽出物に加えて少なくとも一つの他の活性化合物を含有し、２、３、４またはそれ以上の上記した活性化合物を含有してよい。
【００６５】
本発明の組成物は、局所投与、経口、直腸、膣、鼻、耳または気管支投与、および非経口投与に適した様々な形態の製剤に製剤化しうる。有利には本発明の組成物は、局所投与または経口投与に適した形態の製剤に製剤化される。
【００６６】
第一の変形によれば、様々な製剤は局所適用に適し、特にクリーム、エマルジョン、ミルク、軟膏、ローション、オイル、水性もしくは水−アルコールもしくはグリコール溶液、粉末、パッチ、スプレー、シャンプー、ワニスまたは任意の他の外用製品が挙げられる。
【００６７】
示された仕様を有するトケイソウ種子の抽出物を含有する組成物は、化粧用途、医薬用途、皮膚用途または栄養補助用途を特に目的とする。
【００６８】
化粧、医薬または皮膚用途において、該組成物は有利には局所投与に適した形態の製剤に製剤化される。トケイソウ種子の脂質抽出物、すなわち不けん化物画分中で濃縮された油、不けん化物画分からなる群から選択されるそれ自体を含む組成物は、化粧用途、医薬用途または皮膚用途を特に目的とする。 
【００６９】
栄養食品または美容食品用途（「美容食品」（cosmet-food））のために、該組成物は有利には経口投与に適した製剤の形態に製剤化される。
【００７０】
本発明のさらなる主題は、皮膚用組成物、医薬組成物、または機能性食品として、または、皮膚用組成物、医薬組成物、または機能性食品において使用するための本発明の抽出物または本発明の組成物である。
【００７１】
機能性食品は従来の食品または食品の外観を有する食品であって、通常の食品の一部であり、かつ通常の栄養機能を超えるまたは慢性疾患のリスクを下げる有用な生理的効果を提供する特徴を有する。
【００７２】
本発明の抽出物、特に不けん化物画分中で濃縮されたクダモノトケイソウ（Passiflore edulis）油は: 
・酸素障害から真皮を守ることに寄与; 
・ヒアルロン酸の生合成を増加させることにより、真皮の保湿や皮膚の弾力性を促進;
・原線維形成および真皮の細胞外マトリックスの再構築を増加し真皮の接着および弾力性をより良くすることに寄与; 
・正常なヒト線維芽細胞の増殖を増加; 
・赤色ストレッチマークの線維芽細胞により生じる収縮力を低下; 
・脂肪細胞分解を促進; 
・メラニン形成に関する遺伝子発現を抑制
することを示している。 
【００７３】
有利には、本発明の組成物または抽出物は、皮膚および/または粘膜および/または皮膚付属器の疾患または病状を予防および/または治療するために使用される。特に、本発明の組成物または抽出物は、皮膚および粘膜細胞の代謝を刺激、回復もしくは調節、および/または皮膚組織に関連する疾患を予防および/または治療するために使用される。 
【００７４】
特に本発明の抽出物は、下記適用の1つ以上に使用しうる:
・抗加齢剤; 
・治癒剤;
・皮膚もしくは粘膜のホメオスタシスの低下の予防および／もしくは維持; 
・抗酸化剤; 
・抗炎症剤;
・痩身剤および/または抗セルライト剤;
・皮膚ストレッチマークの予防または治療; 
・脱色剤。
【００７５】
さらに特に、本発明の組成物または抽出物は、早期肌老化、特に 光誘発肌老化を予防もしくは遅延するために使用しうる。したがって、本発明の組成物または抽出物は、しわ、輪郭もしくはマイクロレリーフの悪化を予防、減少および／または治療することを目的とするクリームまたは剤形に有用である。
【００７６】
線維芽細胞の増殖に及ぼす作用、特にコラーゲンに及ぼす作用を通して、本発明の組成物または抽出物は、皮膚および粘膜の機械的性質を強化するために、特に衰えた皮膚、たるんだ皮膚、垂れた皮膚および／もしくは薄い皮膚に対抗するため、ならびに／または皮膚の弾力性もしくは硬さを強化および／もしくは回復させるために使用しうる。
【００７７】
本発明の組成物または抽出物は、脂肪組織の劣化の予防および/または治療のためにも使用しうる。
【００７８】
特に本発明の組成物または抽出物は、アレルギー反応、炎症性反応、刺激反応もしくは病状もしくは皮膚、皮膚付属器(髪および爪)および/または未熟、正常もしくは成熟/加齢粘膜(歯茎、歯周組織、生殖器粘膜)のバリアもしくはホメオスタシスの障害を予防および/または治療することを目的とする。 
【００７９】
本発明の組成物または抽出物は、治癒促進にも使用しうる。したがって、本発明の組成物または抽出物は、表面瘢痕、脆弱唇および口唇炎、ストレッチマーク、刺創および咬傷後の皮膚、皮膚擦過傷、皮膚斑および／または痂皮ならびに脆弱肌および敏感肌からなる群から選択される病状または状態の予防および／または治療に使用しうる。そのため本発明の組成物または抽出物は、特に皮膚ストレッチマークの予防もしくは治療のために適用される。 
【００８０】
本発明に記載の「皮膚ストレッチマークの予防」と言う表現は、美容的または皮膚科学的処置の一環として、妊娠のようなストレッチマークの発症が起きることが知られている事象の前またはその間に組成物を適用することにより、ストレッチマークを予防もしくは少なくともストレッチマークの形成を縮小、すなわちその長さ、幅および/または深さを縮小する作用を意味する。本発明に記載の「皮膚ストレッチマークの治療」とは、美容的または皮膚科学的処置の一環として、すでに形成したストレッチマークすなわちその長さ、幅および/または深さの退縮を生じさせる、すなわち退縮させる、すなわち再吸収する作用を意味する。 
【００８１】
従って、本発明で使用される組成物は、ストレッチマークが形成されそうな皮膚の領域、形成されつつあるストレッチマークを含む領域またはすでに形成されたストレッチマークを含む領域ですら適用しうる。 
【００８２】
有利には、本発明の組成物または抽出物は:
・皮膚、たとえば、ニキビ、酒さまたは紅斑性酒さ（rosacea erythema）、乾癬、血管疾患、おむつかぶれ、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触皮膚炎、刺激性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎（新生児頭部皮膚炎）、乾癬、敏感肌、反応肌、ドライスキン（乾皮症）、乾燥肌、皮膚の赤み、皮膚紅斑、老化または光老化した皮膚、光過敏肌、色素沈着肌（肝斑、炎症後色素沈着など）、脱色した皮膚（白斑）、蜂巣炎に罹った皮膚、皮膚弛緩症、妊娠線のある皮膚、ふけ、あかぎれ、刺創、咬創、特に胸の亀裂、日焼け、すべての種類の光線による炎症、化学薬品、身体的（たとえば妊婦のサポートウェア）、細菌剤、真菌またはウイルス剤、寄生虫剤（シラミ、ダニ、白癬、コナダニ、皮膚糸状菌）、放射線剤による刺激あるいは先天性免疫欠乏症（抗菌ペプチド）または後天性免疫欠乏症（細胞性、体液性、サイトカイン）による刺激など、および／または
・粘膜、たとえば、歯肉炎に罹った歯茎および歯周組織（新生児の敏感な歯茎、喫煙による衛生上の問題またはその他）、歯周病、または男性もしくは女性の内性器もしくは外性器領域の炎症を伴う生殖器粘膜など、および／または
・皮膚付属器官、たとえば、未熟、正常または成熟した爪（割れやすい、脆い爪など）および毛髪（脱毛症、ふけ、多毛症、脂漏性皮膚、毛嚢炎）、特に頭皮疾患（アンドロゲン性、急性、局所性、瘢痕性、先天性脱毛症、新生児脱毛症、化学療法／放射線療法が原因の円形脱毛症あるいは休止期脱毛、成長期脱毛、毛髪ジストロフィー、抜毛癖、白癬または油性もしくは乾燥性ふけ）など
の反応、障害または病状の予防および／または治療に用いてよい。
【００８３】
本発明は、本発明の抽出物または本発明の組成物を経口もしくは局所経路で投与することを含む、皮膚および／または皮膚付属器官および／または粘膜の状態および／または外観を改善する観点、有利には皮膚の硬さ、弾力性もしくは張性を改善する観点からのそれらの美容ケア方法にも関する。
【００８４】
さらに本発明の主題は、本発明の抽出物または本発明の組成物を経口もしくは局所経路で投与することを含む、ツッパリ感を伴うドライスキンの美容処置のための方法である。
【００８５】
さらに本発明の主題は、本発明の抽出物または本発明の組成物を経口もしくは局所経路で投与することを含む、シルエットを再構築し「オレンジピール」効果を制限するための美容処置方法である。
【００８６】
本発明の最後の主題は、前記に定義した脂質抽出物を含む機能性食品である。 機能性食品は:
１）酪農製品:例えば、チーズ、バター、ミルクおよび他の乳飲料、乳製品を含む混合品またはスプレッド、アイスクリームおよびヨーグルト;
２）脂肪含有製品  例えば、マーガリン、スプレッド、マヨネーズ、料理用脂肪、焼き物用油およびビネグレット;
３）穀類含有製品  例えば、パン、パスタ、調理、オーブンで焼くまたは加工されたパン、パスタ、
４）菓子  例えば、チョコレート、スウィーツ、チューインガム、プリン、トッピング、ソルベ、アイシングおよび他のガーニッシュ; 
５）アルコールまたはノンアルコール飲料  例えば、ソーダもしくは他のノンアルコール飲料、フルーツジュース、ダイエタリーサプリメント、 Boost（登録商標）およびEnsure（登録商標）などにより販売されている飲料などの飲料形態の代用食品;
６）種々の製品  例えば、卵、スープ、既成のパスタソース、調理済み食事および他の同じ種類の製品などの加工食品
の中から選択しうる。 
【００８７】
本発明の組成物は、混合、注入、投入、配合、吸収、捏和および噴霧のような手法を使用して、何らの変更なしに、食品、栄養補助食品、ダイエタリー製品、特に高タンパク質製品、飲料に直接配合することができる。
【００８８】
本発明の化合物および組成物の投与方法、投与スケジュールおよび最適な医薬形状は、医薬的処置（治療）、特に、患者または動物に適した皮膚的または獣医的処置を考慮した一般的な基準、たとえば、患者または動物の年齢または体重、患者または動物の全身状態の重症度、処置に対する耐性、注意すべき副作用、皮膚タイプなどにしたがって決定しうる。
【００８９】
書誌参照
Georges PIOMBO et al, OCL vol. 13 no. 2-3 March-June 2006
Martina RUDNICKI et al., Food Chemistry 100 (2007) 719-724
David CHASSAGNE and Jean CROUZET, Phytochemistry, vol. 49, no. 3 pp 757-759, 1998
Ezio BOMBARDELLI et al. Phytochemistry, 1975, Vol. 14, pp 2661-2665
Shoko SANO et al. Agric. Food Chem., 2011, 59, 6209-6213
Kamaldeep DHAWAN et al. Journal of Ethnopharmacology 94 (2004) 1-23
Zerark et al. Microchemical Journal 96(2010), 86-91
R. de V. Vieira Lopes et al. Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 2010, 112, 1253-1262
Seigler et al. Phytochemistry 60 (2012), 873-882
【実施例】
【００９０】
実施例1:本発明の濃縮物
本発明の濃縮物の一実施例は、不けん化物画分中で濃縮されたクダモノトケイソウ(P. Edulis）の粗製油である。抽出物は分子蒸留により調製される。
この抽出物は下記重量分布を有する: 
【００９１】
【表３】
2016534982.tif 000004
【００９２】
トコフェロールは下記重量分布を有する:
【００９３】
【表４】
2016534982.tif 000005
【００９４】
トコトリエノールは下記重量分布を有する:
【００９５】
【表５】
2016534982.tif 000006
【００９６】
ステロールは下記重量分布を有する:
【００９７】
【表６】
2016534982.tif 000007
【００９８】
実施例2:局所経路での適用のための組成物
局所経路での適用のための数種の組成物を以下に示す。トケイソウ種子の脂質抽出物、すなわち不けん化物画分中で濃縮された油および不けん化物からなる群から選択されるそれ自体が、下記に示す実施例の組成を有する、クレンジングウォーター、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、オイル、乳液、ローション、シャンプー、フォームおよびスプレー製品などの種々の化粧品に組み込まれうる。
【００９９】
【表７】
2016534982.tif 000008
【０１００】
【表８】
2016534982.tif 000009
【０１０１】
【表９】
2016534982.tif 000010
【０１０２】
【表１０】
2016534982.tif 000011
【０１０３】
【表１１】
2016534982.tif 000012
【０１０４】
【表１２】
2016534982.tif 000013
【０１０５】
【表１３】
2016534982.tif 000014
【０１０６】
【表１４】
2016534982.tif 000015
【０１０７】
【表１５】
2016534982.tif 000016
【０１０８】
【表１６】
2016534982.tif 000017
【０１０９】
【表１７】
2016534982.tif 000018
【０１１０】
【表１８】
2016534982.tif 000019
【０１１１】
【表１９】
2016534982.tif 000020
【０１１２】
【表２０】
2016534982.tif 000021
【０１１３】
【表２１】
2016534982.tif 000022
【０１１４】
【表２２】
2016534982.tif 000023
【０１１５】
【表２３】
2016534982.tif 000024
【０１１６】
【表２４】
2016534982.tif 000025
【０１１７】
【表２５】
2016534982.tif 000026
【０１１８】
【表２６】
2016534982.tif 000027
【０１１９】
【表２７】
2016534982.tif 000028
【０１２０】
【表２８】
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【０１２１】
【表２９】
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【０１２２】
実施例3:本発明の抽出物の生物学的活性試験
試験の抽出物は、実施例1において濃縮されたものであり、試験において、「トケイソウ濃縮物」と呼ぶ。別段の指示がない限り。パーセンテージは試験組成物の総重量に対する濃縮物の重量を表す。
【０１２３】
Ａ．インビトロ活性-遺伝子発現の調節
不けん化物画分中に濃縮された油（明細書の後半ではトケイソウ濃縮物と呼ぶ）による遺伝子発現の調節の分析は、２つの異なるモデル:正常なヒト線維芽細胞およびメラニン化再構成表皮、で行った。
【０１２４】
１）正常ヒト線維芽細胞における遺伝子発現における効果
正常ヒト線維芽細胞におけるトケイソウ濃縮物の効果を、真皮の生態、結合組織の再構築および老化に関わる遺伝子の発現において、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎマイクロ流体カードによって測定した。
【０１２５】
ａ．材料および方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を０．０１％および０．０５％トケイソウ濃縮物の存在下２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を溶解し、総ＲＮＡを抽出しアッセイした。遺伝子発現の相違点をＴａｑＭａｎカードで定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。発現における変化の解析および統計的分析はデータアシストソフトウェア（Ｄａｔａ  Ａｓｓｉｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（アプライド・バイオシステムズ社）を使用して行った。
【０１２６】
ｂ．結果
トケイソウ濃縮物は有意に下記機能に関する遺伝子発現を調節した(表７参照):
【０１２７】
【表３０】
2016534982.tif 000031
【０１２８】
１）抗酸化反応
トケイソウ濃縮物は、抗酸化酵素、ミトコンドリアペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ脱水素酵素、カタラーゼ（加齢によりその活性は低下する）およびグルタチオン合成酵素（グルタチオンの合成を触媒するグルタチオン合成酵素（抗酸化分子）を誘導した。従ってこれらの遺伝子を増加させることによりトケイソウ濃縮物は酸化ダメージに対する真皮の防護に寄与する。
【０１２９】
２）細胞外マトリックスのホメオスタシス
トケイソウ濃縮物は、水を保持し、組織構造および皮膚弾力性を支持し細胞移動を調節する能力が知られているポリサッカライドであるヒアルロン酸の合成に関与する酵素、ヒアルロン酸合成酵素２を誘導した。したがってトケイソウ濃縮物は、ヒアルロン酸の生合成を増加させることにより、真皮の水和および弾力性を促進する。
トケイソウ濃縮物は、１，４および７型コラーゲン、フィブリリン（弾性繊維の１成分）、リシルヒドロキシラーゼ１（弾性繊維の形成に関与する酵素）、フィブロモジュリンおよびルミカン（繊維の形成を調節する小プロテオグリカン）、フィブロネクチンおよびＭＭＰ３（コラーゲンネットワークの再構築に関与する）をコードする遺伝子の発現を誘導した。したがって、トケイソウ濃縮物は、原線維発生の増加や真皮細胞外マトリックスの再構築に寄与し真皮の接合や弾力をより良くする。
【０１３０】
２）メラニン化再構成表皮における遺伝子発現における効果
色素沈着に関わる遺伝子の発現に対するトケイソウ濃縮物の効果を、メラニン化再構成表皮において、ＴａｑＭａｎマイクロ流体カードでｑＲＴ−ＰＣＲを使用して評価した。
【０１３１】
ａ．材料および方法
原発性ヒトメラニン細胞（ダークフォトタイプのドナーからの）を含有する再構築表皮サンプルを０．０１％および０．０５％トケイソウ濃縮物の存在下２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、組織を溶解し、総ＲＮＡを抽出しアッセイした。ＴａｑＭａｎカードを使用し定量的ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現の相違点を分析した。発現における変化の解析および統計的分析はデータアシストソフトウェア（Ｄａｔａ  Ａｓｓｉｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（アプライド・バイオシステムズ社）を使用して行った。
【０１３２】
ｂ．結果
トケイソウ濃縮物は、メラニン形成に関与する、チロシナーゼおよびＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）の両者の遺伝子発現を有意に抑制した（表８参照）。チロシナーゼは、メラニン細胞によるメラニン生成における鍵となる酵素であるが、ＭＩＴＦはメラニン形成過程に関与する酵素のメラニン細胞分化および転写を調節する。これらの発現における減少はトケイソウ濃縮物の脱色作用を示唆している。またトケイソウ濃縮物は、ＮＧＦ神経成長因子受容体、特に神経原性炎症に関与するニューロトロピンの発現を減少させた。
【０１３３】
【表３１】
2016534982.tif 000032
【０１３４】
Ｂ．真皮細胞外マトリックスにおける作用
線維芽細胞スクリーニングは真皮マトリックスのホメオスタシスにおけるトケイソウ濃縮物の潜在的効果を示しているので、我々は、線維芽細胞の増殖や細胞外マトリックスの主要な成分を産生する能力におけるトケイソウ濃縮物の効果を最初に調べることによりその可能性を確認することを試みた。またストレッチマーク線維芽細胞モデルは、これらの特定の細胞により発現する力におけるトケイソウ濃縮物の弛緩効果を表するために使用した。
【０１３５】
１．正常ヒト線維芽細胞の増殖に対する効果
ａ．材料および方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を０．００５％および０．０１％トケイソウ濃縮物が存在する１％ＦＣＳ培養液または１０％ＦＣＳ培養液（陽性対照）中で７２時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞増殖を化学発光ＥＬＩＳＡ法を使用してＢｒｄＵアッセイにより評価した。ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）は、チミジン類縁体であり、細胞周期中に増殖する細胞のＤＮＡに取り込まれる。
【０１３６】
ｂ．結果
トケイソウ濃縮物は、有意に正常ヒト線維芽細胞の増殖を増加させた（表９）。
【０１３７】
【表３２】
2016534982.tif 000033
【０１３８】
２．真皮マトリックス成分の発現に対する効果
ａ．材料および方法
正常ヒト真皮線維芽細胞を０．００５％および０．０５％トケイソウ濃縮物が存在する１％ＦＣＳ培養液または５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（基準）中で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、総ＲＮＡを抽出し、アッセイおよびレトロ転写した。コラーゲンＩおよびエラスチンの遺伝子発現はリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。
【０１３９】
ｂ．結果
トケイソウ濃縮物は、有意にコラーゲンＩ型およびエラスチンの遺伝子発現（表１０）、細胞外真皮マトリックスの成分および多数の高分子を増加させた。
【０１４０】
【表３３】
2016534982.tif 000034
【０１４１】
３．ストレッチマーク線維芽細胞モデルにおける弛緩効果
ＧｌａＳｂｏｘ（登録商標）システムは、新しいストレッチマーク（赤色）から採取した線維芽細胞におけるトケイソウ濃縮物の弛緩効果を評価するために使用した。
ＧｌａＳｂｏｘ（登録商標）システムにより真皮の等価物の中での線維芽細胞により発現した収縮力の測定ができる。
赤色ストレッチマークからの線維芽細胞は、健常な皮膚の線維芽細胞よりもより大きな収縮力を発現する。
【０１４２】
ａ．材料および方法
１人の同じ患者においてバイオプシー後採取した健常な皮膚からの線維芽細胞および赤色ストレッチマークからの線維芽細胞を培地にいれた。真皮の等価物を線維芽細胞（健常な皮膚もしくは赤色ストレッチマークの）とコラーゲン溶液を混合して調製した。この混合液をＧｌａＳｂｏｘ（登録商標）の長方形のウェル中に注いだ。０．００５％または０．０５％トケイソウ濃縮物を含むまたは不含の培地を加えた。二つのフレキシブルシリコンビームを各ウェルにつけた。したがって、真皮等価物はひずみゲージ（「センサー」）を備えた二つのビームの間で進展する。線維芽細胞により発現した収縮力の影響下で、シリコンビームが変形する；これがひずみゲージの電気的抵抗値において変化として転換される。このリアルタイムで測定された変動が、真皮等価物内で発現した力を表す。等尺性力を２４時間測定した。
【０１４３】
ｂ．結果
赤色ストレッチマーク線維芽細胞は、隣接する健常な皮膚線維芽細胞よりも有意に強い収縮力を生じた（結果示さず）。トケイソウ濃縮物は赤色ストレッチマーク線維芽細胞により生じた収縮力を有意に低下させた（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１４４】
図１：ＧｌａＳｂｏｘ（登録商標）システム中で張力をかけられた真皮等価物中にトケイソウ濃縮物（ＭＪ）存在下もしくは非存在下赤色ストレッチマーク線維芽細胞（ＦＶＲ）により生じた収縮力。
Ａ：最初の６時間の詳細；Ｂ：全体の曲線
統計：二元配置分散分析法、次いでフィッシャー検定。
〇ＦＶＲ；▽ＦＶＲ＋ＭＪ０．００５％；□ＦＶＲ＋ＭＪ０．０５％
ｘ軸：時間（時間）；ｙ軸：力（任意単位／１００万細胞）
ＧｌａＳｂｏｘ（登録商標）曲線（表１１）の解析は、曲線下面積ＡＵＣ，最大収縮および勾配がトケイソウ濃縮物の存在下で有意に減少するので、トケイソウ濃縮物が収縮力だけではなく赤色ストレッチマーク線維芽細胞の収縮率も低下させることを示す。
【０１４５】
【表３４】
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【０１４６】
４．結論
これらの結果は、赤色ストレッチマーク線維芽細胞により生じる収縮力の低下に及ぼす作用や真皮マトリックスにおける再密度向上（ｒｅ−ｄｅｎｓｉｆｙｉｎｇ）効果を通して、トケイソウ濃縮物の抗ストレッチマーク効果を示す。
【０１４７】
Ｃ．痩身効果：ヒト脂肪組織の脂肪分解に及ぼす効果
ヒト白色脂肪組織は、脂肪細胞脂肪分解過程により放出される脂肪酸の形態で、体内の他の組織にエネルギー分子を提供することによって基礎的な代謝機能を実行する：脂肪細胞は、貯蔵されたトリグリセリドを脂肪酸とグリセロールに加水分解することでエネルギー貯蔵量を動かす；このようにして血流に放出された脂肪酸をエネルギー目的のため他の組織が使用しうる。トケイソウ濃縮物の脂肪細胞脂肪分解に及ぼす効果を、3次元で培養されたヒト成熟脂肪細胞に貯蔵されているトリグリセリドが加水分解されている間に放出されたグリセロールのアッセイによって評価した。
【０１４８】
ａ．材料および方法
５人のドナー（正常−加重もしくは肥満）から採取した皮下脂肪組織のバイオプシー由来の成熟脂肪細胞を単離しペプチドゲルに封入し、培養下で生存と生物学的機能性を与える。封入された成熟脂肪細胞を０．００１％および０．００５％トケイソウ濃縮物存在下または１０μＭフォルスコリン（基準）中で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、放出されたグリセロールをアッセイキット（Ｒａｎｄｏｘ）を使用して培養液中でアッセイし、得られた値をキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で評価したＤＮＡ量を用いて標準化した。
【０１４９】
ｂ．結果
脂肪細胞によるグリセロールの放出は、試験された５人のドナーのそれぞれにおいてトケイソウ濃縮物で増加した。表６は、５人のドナーに観察された効果の平均を示す：トケイソウ濃縮物は有意にグリセロールの放出を刺激するので、痩身効果の恩恵に向けて脂肪細胞脂肪分解を促進する。
【０１５０】
【表３５】
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【図１】
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【国際調査報告】
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