(57)【要約】  一つの態様において、本出願は、リン脂質、トリグリセリド、コレステロールエステルおよび遊離コレステロールからなる群から選択される成分の混合物を含み、所望によりさらに天然抗酸化剤、ユビキノールおよびビタミンＥからなる群から選択される薬剤を含む合成ＬＤＬナノ粒子および該合成ナノ粒子の製造法を開示する。開示した合成ＬＤＬナノ粒子は、親油性薬物およびプロドラッグを、静脈内注射後ＬＤＬ受容体を発現する細胞標的に送達できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)４.０より大きいｌｏｇＰを有する親油性抗癌剤；
ｂ)リン脂質(ＰＬ)；および
ｃ)トリグリセリド(ＴＧ)；
を含む安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子であって、４０〜８０nmの粒子径を有する、ＬＤＬナノ粒子。
【請求項２】
ＬＤＬナノ粒子が６０nmの平均粒度分布を有する、請求項１に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項３】
リン脂質がホスホチジルコリン、ホスホチジルエタノールアミン、対称または不斉１,２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン類、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン、卵リン脂質、卵ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、卵レシチン、大豆レシチン、レシチン(ＮＯＳ)およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項４】
さらにコレステロールエステル(ＣＥ)またはコレステロール(Ｃ)またはコレステロールエステルとコレステロールの混合物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項５】
コレステロールエステルがコレステロールのＣ１６−２２エステル、コレステロールおよびこれらの混合物からなる群から選択され；そしてトリグリセリドがダイズ油、トリオレイン、トリパルミチン酸グリセリルおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項６】
さらにトリオレイン、天然抗酸化剤、ＢＨＴ、ユビキノール、ユビキノール１０、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、リコピン、レチニル誘導体およびベータカロテンまたはこれらの混合物からなる群から選択される薬剤を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項７】
親油性抗癌剤が抗癌剤である、請求項１〜６のいずれかに記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項８】
抗癌剤がタキサン、ａｂｅｏ−タキサン、カンプトテシン、エポチロン、ククルビタシン、クアシノイドおよびアントラサイクリンからなる群から選択される、請求項７に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項９】
抗癌剤がアクラルビシン、カンプトテシン、マソプロコール、パクリタキセル、ペントスタチン、アムルビシン、クラドリビン、シタラビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、酢酸エリプチニウム、エピルビシン、エトポシド、フォルメスタン、フルベストラント、イダルビシン、ピラルビシン、トポテカン、バルルビシンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、請求項７に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項１０】
抗癌剤のプロドラッグが、
【化１】
2016530331.tif 000226
【化２】
2016530331.tif 000227
【化３】
2016530331.tif 000228
【化４】
2016530331.tif 000229
〔式中、−ＡＬＬ１、−ＡＬＬ２、−ＡＬＬ３および−ＡＬＬ４は各々独立して水素または
式
【化５】
2016530331.tif 000230
の酸不安定親油性基であり、ここで、
Ｒはヒドロキシル担持癌化学療法剤であり；
式１または１.１について：
Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり；
Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり；
ＹはＯ、ＮＲ’またはＳから選択され、ここで、Ｒ’は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ＺはＯまたはＳであり；
ＱはＯまたはＳであり、ＴはＯまたはＳである、に記載のＬＤＬナノ粒子。；
式２について：
Ｒ２はＣ１−Ｃ２２アルキルであり；
ＴはＯまたはＳであり、
Ｘは水素またはメシレート、スルホネートおよびハロゲン(Ｃｌ、ＢｒおよびＩ)からなる群から選択される脱離基である。〕
およびそれらの分離されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体またはこれらの混合物からなる群から選択される酸不安定親油性分子接合体(ALLMC)である、請求項７に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項１１】
親油性抗癌剤が４.０より大きい、６.０より大きいまたは８.０より大きいｌｏｇＰを有する、請求項１〜１０のいずれかに記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項１２】
ＰＬ：ＴＧ：ＣＥ：Ｃの重量比が７３：１２：２：１〜７８：１２：２：１の範囲であり；所望によりさらにトリオレイン、天然抗酸化剤、ＢＨＴ、ユビキノール、ユビキノール１０、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、リコピン、レチニル誘導体およびベータカロテンまたはこれらの混合物からなる群から選択される添加剤を含む、請求項４に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項１３】
ＰＬ：ＴＧ：ＣＥ：Ｃの重量比が７７：１０：２：１である、請求項１２に記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項１４】
さらにＰ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、Ｐ４０７、SYNPERONICS、PLURONICSおよびKOLLIPHORまたはこれらの混合物からなる群から選択されるポロクサマーを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のＬＤＬナノ粒子。
【請求項１５】
ａ)４.０より大きいｌｏｇＰを有する親油性抗癌剤；ｂ)リン脂質(ＰＬ)；およびｃ)トリグリセリド(ＴＧ)を含む安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子の製造方法であって、
１)親油性抗癌剤、リン脂質およびトリグリセリドを合わせて混合物を形成し；
２)混合物を揮発性溶媒に溶解することにより均質化し；
３)溶媒を除去し；
４)緩衝液中で混合物を形成することにより粗いエマルジョンを形成させて、エマルジョン混合物を形成し；
５)マイクロフルイダイザー装置中でエマルジョン混合物を１００nm以下の粒子調製物を製造するのに十分な時間微流化し；そして
６)ナノ粒子調製物を０.２２ミクロンフィルターを通して滅菌して、平均粒子径４０nm〜８０nmの範囲を有する合成ＬＤＬナノ粒子を得る
工程を含む、方法。
【請求項１６】
合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子混合物において、リン脂質がホスホチジルコリン、ホスホチジルエタノールアミン、対称または不斉１,２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン類、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン、卵リン脂質、卵ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、卵レシチン、大豆レシチン、レシチン(ＮＯＳ)およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＬＤＬナノ粒子がさらにコレステロールのＣ１６−２２エステル、コレステロールおよびこれらの混合物からなる群から選択されるコレステロール(Ｃ)またはコレステロールエステル(ＣＥ)を含み；トリグリセリドがダイズ油、トリオレイン、トリパルミチン酸グリセリルおよびこれらの混合物からなる群から選択される；またはコレステロールとコレステロールエステルの混合物を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法により製造された、ａ)４.０より大きいｌｏｇＰを有する親油性抗癌剤；ｂ)リン脂質(ＰＬ)；およびｃ)トリグリセリド(ＴＧ)を含む安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子。
【請求項１９】
患者における癌の処置法であって、患者に請求項１〜１４および請求項１８のいずれかに記載の安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子の治療有効量をこのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
癌が白血病、神経芽腫、神経膠芽腫癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎臓メラノーマ、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年９月１３日出願の米国仮出願６１／８７７,５２１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
要約
本発明は、薬物送達に適する構造化サブミクロン粒子(ナノ粒子)を製造するために使用する組成物およびそれらの製造に関する。ここに開示する方法によって製造した粒子の構造は、望ましい生物学的および物理的性能をもたらす。一つの面において、粒子の構造は、製剤成分および粒子の製造に使用する処理工程の選択により決定される。粒子の性能を決定する構造要素は、粒子径(および集団の粒度分布)、粒子形、粒子電荷および粒子内の個々の成分、特に粒子表面の成分の分布を含む。
【０００３】
粒子性能
ナノ粒子は、非経腸薬物送達において特別の利点を有する。ナノ粒子は血液細胞より小さく、血液に懸濁され、体内の種々の組織に輸送され得る。微生物より小さいため、非経腸製品の最終滅菌に使用するフィルターを通過する。腫瘍の急速に拡大している脈管構造が本質的に漏出性であるため、ナノ粒子は毛細血管を離れ、流れの少ない腫瘍の細胞外空間に捕捉される。
【０００４】
本発明に係るナノ粒子は独特の生物学的性能を有する。一つの面において、本発明のナノ粒子は、いかなるタンパク質も使用することなく製造されるという理由もあって、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子、ＬＤＬ様ナノ粒子または脂質エマルジョン(ＬＤＥ)と呼ばれる。投与後、これらの粒子は外来性とは認識されず、すなわち、これらは網内系の組織のクリアランスプロセスの引き金を引くタンパク質で被覆されていない。さらに、これらの粒子は、オプソニン作用および食作用を阻害する成分で被覆されていた。事実、これらの粒子は内在性成分として認識され、コレステロールを必要とする細胞の表面上に発現される受容体により認識されるａｐｏタンパク質の被覆を受ける。このコーティング後、これらの粒子は、高度にコレステロールを必要とする細胞に、リポタンパク質受容体介在エンドサイトーシスにより優先的に取り込まれる。このような細胞は、急速に分裂している組織、特に固形および液性腫瘍組織のものを含む。
【０００５】
一つの態様において、本発明の構造化ナノ粒子は、非経腸投与される製剤における有用な負荷薬物を運搬するように設計される。本送達系に関して特に興味深い薬物は、高親油性のために水への溶解度が低いかまたは極めて低い薬物である。一つの態様において、本発明のナノ粒子で送達するのに適するほど十分な親油性がない送達すべき薬物を、送達する薬物のプロドラッグとして働き、高度に親油性の誘導体の製剤により適するようにし得る。これらの粒子は、商業的に妥当な保存期間を可能にするために製造された製剤で十分に化学的かつ物理的に安定であるように設計される。
【０００６】
必要な粒子の特徴：
一つの面において、これらの粒子の有利な性質は、粒子の径、形、組成および電荷に起因し得る。一つの面において、本粒子は、毛細血管を通って滑らかに移動するように実質的に球状であってよく、平均６０nmの狭い粒度分布を有し得る。一つの面において、粒度分布範囲は約４０〜８０nmである。組成物は、コレステロール、他の脂質および界面活性剤を含み、粒子構造を規定するために使用するポリマーの添加を伴いまたは伴わない。一つの態様において、正の表面荷電を、カチオン性界面活性剤の使用により達成する。小粒子の基本的特性が固有の不安定性を生じる。粒子径が小さくなるに連れて、分散系の単位質量当たりの界面面積が増大し、界面エネルギーも増大する。この増大したエネルギーは粒子を合体させ、低い総エネルギーを有する大型粒子を形成する傾向がある。
【０００７】
極度な粒子径減少は、薬物溶解度の顕著な増加を生じ得る。ナノ粒子中の物質は、同一組成のより大きい粒子よりも、粒子を離れ、周囲の溶液に移行する傾向がはるかに高い。この現象は、生体膜を通して輸送される薬物の利用能を増加し得るが、ナノ粒子自体の物理的不安定性も生じ得る。この不安定性は、物質が大粒子に移行するに連れて小粒子が消失するオストワルド熟成で見られる。ナノ粒子の物理的安定性は、界面エネルギーを減少させるのに適正なレベルで適切な界面活性剤および添加物を使用し、分散を維持するために粒子の表面電荷を制御し、そしてオストワルド熟成を軽減するために狭い粒度分布で粒子を製造することにより改善し得る。
【０００８】
一つの態様において、本発明の粒子における高薬物負荷は、薬物またはその親油性プロドラッグを溶解し、それが標的部位で細胞内に遊離されるまでナノ粒子から離れる傾向を抑制する、親油性不活性成分の粒子コアを形成することにより達成される。
【０００９】
粒子の製造：
極めて重要な課題が、適正な径、構造、電荷および安定性を有する粒子の製造において提起される。均質ナノ粒子は、溶液からのナノ粒子物質の沈殿または大型粒子の径縮小のいずれかにより形成できる。全ての成分を必要な構造に沈殿させる単一の物質系がありそうにないため、不均質構造のナノ粒子を沈殿法で製造するのは容易ではない。
【００１０】
粒子径縮小はエネルギーを必要とし、このエネルギーは原体成分の分子を集合させる力を遮断し、粒子と周囲の媒体の間の界面間接触面積を増加させるために必要である。エネルギーは、ナノ粒子の製造に使用するプロセスから取得しなければならない。有用であるために、径縮小によりナノ粒子を製造するプロセス、すなわち、原体製剤にエネルギーを供給するシステムは、制御可能かつ拡張可能でなければならない。ナノ粒子製造に有用であることが証明されている技術は、超音波処理および高圧均質化を含む。２０,０００Hzを超える機械的振動の形の超音波エネルギーは、流体中の粒子径を縮小するために使用されている。流体中の高周波機械的振動は、微少な真空の泡の急速な形成および崩壊を起こす(キャビテーション)。このプロセスにおける高速局所質量移動は、流体上および懸濁粒子上に極めて高い剪断を与える。高剪断はまた流体を、開口部を経てまたは極めて狭い通路に、高圧で圧入することによっても流系で形成できる。プロセスを最適化するための十分な制御パラメータを備えた、プロセス流体の流動流に対する超音波および／または高圧均質化操作を使用する多くの処理装置が当分野で知られ、かつ利用可能である。
【００１１】
合成ＬＤＬナノ粒子(ｓＬＤＬ)：
一つの態様において、本発明は、生体により“天然”であると認識されるのに、正常ヒトＬＤＬ粒子組成物と十分に類似した脂質組成物を含む合成ＬＤＬナノ粒子を提供する。生体により“天然”であると認識されるために、これらの合成ＬＤＬナノ粒子は、親油性薬物またはプロドラッグの、ＬＤＬ受容体発現組織、特にＬＤＬ受容体を過発現する腫瘍組織への選択的送達に有効となる。合成ＬＤＬナノ粒子は、ここに記載するように製造されまたは当業者に知られる方法により製造されてよい。ここで使用する“合成”は、化学合成により製造されたことを意味する。
【００１２】
一つの態様において、平均ＬＤＬナノ粒子径は６０nmであるが、４０nm〜１００nmであり得る。いくつかの態様において、ＬＤＬナノ粒子の径は５０nm〜６０nmである。送達される薬物またはプロドラッグを特定の重量比のリン脂質(ＰＬ)、トリグリセリド(ＴＧ)およびコレステリルエステル(ＣＥ)のマイクロエマルジョンと複合体化できる。一つの態様において、ＰＬ：ＴＧ：ＣＥ比は３６：５：１である。いくつかの態様において、リン脂質は卵黄ホスファチジルコリン(ＰＣ)または１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン(ＤＭＰＣ)である。使用できる適当なトリグリセリドは、ダイズ油(ＳＯ)、トリオレイン(ＴＯ)およびトリパルミテートならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。使用できる適当なコレステリルエステルは、オレイン酸コレステリル(ＣＯ)またはパルミチン酸コレステリル(ＣＰ)またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。他の態様において、エマルジョンのサイズを変えるために、コア脂質、ＣＥおよびＴＧの組成を変える。他の態様において、脂質の比は、ＰＬ：ＴＧ：ＣＥの３０：６：１重量比である。使用できる他の比は、３７：７：１のＰＬ：ＴＧ：ＣＥおよび２０：３：０.５のＰＬ：ＴＧ：ＣＥである。いくつかの態様において、コレステリルエステルをマイクロエマルジョンから除外する。ある態様において、薬物またはプロドラッグを、７：１の比のＰＬおよびＴＧのマイクロエマルジョンと複合体化できる。
【００１３】
マイクロエマルジョンは、脂質を、３０nmフィルターのようなナノメートルフィルターから押し出すことにより製造できる。例えば、脂質を、４０℃で２０μM  ＢＨＴおよびＮ２と十分な時間(例えば、約１時間)超音波処理し、その後一つのフィルターまたは一連のフィルターを通して押し出し、適当なサイズを有する脂質粒子を得る。一つの態様において、マイクロエマルジョンを０.１μm(１００nm)フィルター、次いで０.０３μm(３０nm)フィルターから押し出し、単離する。他の態様において、マイクロフルダイザー装置を使用して組成物を製造できる。
【背景技術】
【００１４】
背景
体内の他の細胞を害することなく癌細胞を選択的に殺すことができる標的化癌治療剤は、癌の臨床処置の大幅な改善を示す。癌処置レジメンにおいて化学療法剤で癌細胞を直接標的とする戦略の開発が非常に望ましい。これは、毒性副作用の軽減または排除、標的化部位への薬物のより効率的な送達および投与する薬物の用量削減およびその結果としての健康な細胞への毒性の低減および化学療法レジメンの費用軽減をもたらす。抗体を使用する化学療法薬物のターゲティングは１９５８年から文献に現れている。癌細胞への選択的送達のための抗体へのコンジュゲーションによる薬物のターゲティングは、抗体のサイズが大きく(ＭＷ＝１２５〜１５０キロダルトンまたはKD)、それゆえに、固形腫瘍に浸透する能力が比較的低いことから、あまり成功していない。代替的戦略は、ターゲティングベクターとして、腫瘍細胞に独特なまたは腫瘍細胞で過発現される受容体を特異的に認識する小型ターゲティングリガンドおよびペプチドの使用である。このような構築物は分子量２〜６KDであり、固形腫瘍への容易な浸透を可能にする。
【００１５】
細胞増殖および成長の増加は癌の特質である。細胞増殖の増加は、細胞コレステロールの高回転率と関係する。膜合成および成長のためにコレステロールを必要とする細胞は、血中のコレステロールの主要な輸送体である血漿低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)の受容体介在エンドサイトーシスまたはデノボ合成によりコレステロールを獲得し得る。ＬＤＬは、ＬＤＬ受容体(ＬＤＬＲ)として知られる受容体により細胞に取り込まれ、ＬＤＬは、受容体と共に、エンドソーム内の細胞に取り込まれ、輸送される。エンドソームは酸性化され、これがＬＤＬをＬＤＬ受容体から放出させ、ＬＤＬ受容体は、表面にリサイクルされ、そこで、さらなるＬＤＬ粒子取り込みに参加できる。多種多様な組織における腫瘍が、血漿ＬＤＬが枯渇していない範囲で、ＬＤＬを必要とする量が高いことを示す多数の証拠がある。癌様細胞へのＬＤＬの移入増加は、これらの腫瘍における上昇したＬＤＬ受容体(ＬＤＬＲ)によると考えられている。ＬＤＬＲの発現数が多いことが知られるいくつかの腫瘍は、白血病、肺腫瘍、結腸直腸腫瘍および卵巣癌のある種の形態を含む。インビボ研究は、ＬＤＬＲが脳悪性腫瘍に出現することを示す。Leppala et al.は、ＰＥＴ造影を使用し、インビボで99mTc_LDLがヒト脳腫瘍に局在化するが、正常脳ではしないことを証明した。
【００１６】
これは、ＬＤＬ受容体が、ＧＢＭおよび他の悪性腫瘍においてＬＤＬ粒子を利用する抗腫瘍薬物の送達のための特異な分子標的である可能性を示唆する。この可能性についいての試験が、Maranhaoおよび共同研究者により行われた。低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)に似せた脂質組成を有する無タンパク質マイクロエマルジョン(ＬＤＥ)を、ラットにおける代謝研究で使用して、天然のリポタンパク質を有するＬＤＥと比較した。インキュベーション研究はまた、ＬＤＥが、特異的受容体によるリポタンパク質の認識のためのリガンドである、ａｐｏ  Ｅを含む多種多様なアポリポタンパク質を取り込むことも示した。
【発明の概要】
【００１７】
癌化学療法剤の親油性誘導体：
アーバー・セラピューティクスは、正常体循環で高い安定性を有し、ＬＤＬ粒子の脂質コアに保持されるが、エンドソームの酸性環境で活性化学療法剤を容易に放出する、癌化学療法剤の特異な親油性誘導体を開発している。その開示を全体として本明細書に取り込む、米国特許８,４４０,７１４号を参照のこと。
【００１８】
他の態様において、式３ａまたは３ｂ
【化１】
2016530331.tif 000002
〔式中、Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯ、ＮＲ’またはＳから選択され、ここで、Ｒ’は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、ＺはＯまたはＳから選択され、ＱはＯまたはＳであり、ＴはＯまたはＳである。〕
の活性化学療法化合物が提供される。本化合物の一つの面において、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯまたはＳであり、ＺはＯであり、ＱはＯであり、ＴはＯである。式３ａまたは３ｂの活性化化合物は、該活性化化合物がヒドロキシル担持癌化学療法剤(ＨＢＣＣＡ)と縮合したとき、酸不安定親油性接合体の製造に使用し得る。ここで定義するＨＢＣＣＡは、一般的に例えば、式１、１ａ、１ｂ、１.１、２および２ａにおける残基または基“Ｒ”で表され、ＨＢＣＣＡが結合して酸不安定、親油性分子接合体を形成していないならば、ＨＢＣＣＡはまた、ＨＢＣＣＡが１個以上のヒドロキシル(−ＯＨ)基により官能化され得るため、式“Ｒ−ＯＨ”を有するとしても表され得る。
【００１９】
一つの態様において、式１、１.１または式２
【化２】
2016530331.tif 000003
〔式中、Ｒはヒドロキシル担持癌化学療法剤であり、式１または１.１に関してＲ１は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯ、ＮＲ’またはＳから選択され、ここで、Ｒ’は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、ＺはＯまたはＳであり、ＱはＯまたはＳであり、ＴはＯまたはＳであり、式２に関してＲ２はＣ１−Ｃ２２アルキルであり、ＴはＯまたはＳであり、Ｘは水素またはメシレート、スルホネートおよびハロゲン(Ｃｌ、ＢｒおよびＩ)からなる群から選択される脱離基である。〕
の酸不安定親油性分子接合体(ＡＬＬＭＣ)およびそれらの分離されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体またはこれらの混合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。化合物１.１は純粋ｓｙｎ異性体、純粋ａｎｔｉ異性体およびｓｙｎ異性体とａｎｔｉ異性体の混合物およびそれらのジアステレオマーを含む。
【００２０】
他の態様において、Ｒがヒドロキシル担持癌化学療法剤であり、Ｒ１が水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２がＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹがＯまたはＳであり、ＺがＯであり、ＱがＯであり、ＴがＯである、式１または１.１の上記酸不安定親油性分子接合体が提供される。式２の酸不安定親油性分子接合体の一つの面において、Ｒ２がＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＴがＯであり、Ｘが水素であるかまたはＣｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。他のバリエーションにおいて、Ｒ２がＣ９−Ｃ２２である。式１ａ、１ｂまたは式２ａ
【化３】
2016530331.tif 000004
を含む上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、Ｒがヒドロキシル担持癌化学療法剤(ＨＢＣＣＡ)であり、式１ａまたは１ｂに関してＲ１が水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２がＣ５−Ｃ２２アルキルであり、式２ａに関してＲ２がＣ１−Ｃ２２アルキルであり、Ｘが水素であるかまたはＣｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。この化合物の一つのバリエーションは、式１ａまたは１ｂ化合物のカーボネート(すなわち、−ＯＣ(Ｏ)Ｏ−)が、カーボネート基がスルホネート基に置き換えられている式１ａの対応するスルホネート(すなわち、−ＯＳ(Ｏ)Ｏ−)であるものである。化合物１ｂは、純粋ｓｙｎ異性体、純粋ａｎｔｉ異性体およびｓｙｎ異性体とａｎｔｉ異性体の混合物およびそれらのジアステレオマーを含む。
【００２１】
式１、２、１ａおよび２ａの化合物の他のバリエーションにおいて、Ｒ１が水素またはＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２がエイコセン酸(ｃｉｓ異性体、ｔｒａｎｓ異性体および異性体混合物を含む)のＣ１９残基、オレイン酸のＣ１７残基およびエライジン酸のＣ１７残基からなる群から選択される炭素残基のような不飽和脂肪酸の炭素残基である。ここで使用する脂肪酸の“炭素残基”(例えば、Ｃ１７残基、Ｃ１９残基など)は、脂肪酸のカルボキシル炭素を除く炭素鎖を意味する。
【００２２】
上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、ヒドロキシル担持癌化学療法剤は、タキサン類、ａｂｅｏ−タキサン類、カンプトテシン類、エポチロン類、ククルビタシン類、クアシノイド類、アントラサイクリン類およびそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、ヒドロキシル担持癌化学療法剤は、アクラルビシン、カンプトテシン、マソプロコール、パクリタキセル、ペントスタチン、アムルビシン、クラドリビン、シタラビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、酢酸エリプチニウム、エピルビシン、エトポシド、フォルメスタン、フルベストラント、イダルビシン、ピラルビシン、トポテカン、バルルビシンおよびビンブラスチンからなる群から選択される。
【００２３】
一つの態様において、式１、１.１または式２
【化４】
2016530331.tif 000005
〔式中、Ｒはヒドロキシル担持癌化学療法剤であり、式１または１.１に関してＲ１は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯ、ＮＲ’またはＳから選択され、ここで、Ｒ’は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、ＺはＯまたはＳであり、ＱはＯまたはＳであり、ＴはＯまたはＳであり、式２に関してＲ２はＣ１−Ｃ２２アルキルであり、ＴはＯまたはＳであり、Ｘは水素またはメシレート、スルホネートおよびハロゲン(Ｃｌ、ＢｒおよびＩ)からなる群から選択される脱離基である。〕
の酸不安定親油性分子接合体(ＡＬＬＭＣ)およびそれらの分離されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体またはこれらの混合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。化合物１.１は、純粋ｓｙｎ異性体、純粋ａｎｔｉ異性体およびｓｙｎ異性体とａｎｔｉ異性体の混合物およびそれらのジアステレオマーを含む。
【００２４】
他の態様において、式１または１.１の上記酸不安定親油性分子接合体であって、ここで、Ｒがヒドロキシル担持癌化学療法剤であり、Ｒ１が水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２がＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹがＯまたはＳであり、ＺがＯであり、ＱがＯであり、ＴがＯであるものを提供する。式２の酸不安定親油性分子接合体の一つの面において、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＴはＯであり、Ｘが水素であるかまたはＣｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。他のバリエーションにおいて、Ｒ２がＣ９−Ｃ２２である。式１ａ、１ｂまたは式２ａ
【化５】
2016530331.tif 000006
を含む上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、Ｒがヒドロキシル担持癌化学療法剤(ＨＢＣＣＡ)であり、式１ａまたは１ｂに関してＲ１が水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２がＣ５−Ｃ２２アルキルであり、式２ａに関してＲ２がＣ１−Ｃ２２アルキルであり、Ｘが水素であるかまたはＣｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。この化合物の一つのバリエーションは、式１ａまたは１ｂ化合物のカーボネート(すなわち、−ＯＣ(Ｏ)Ｏ−)が、カーボネート基がスルホネート基に置き換えられている式１ａの対応するスルホネート(すなわち、−ＯＳ(Ｏ)Ｏ−)であるものである。化合物１ｂは、純粋ｓｙｎ異性体、純粋ａｎｔｉ異性体およびｓｙｎ異性体とａｎｔｉ異性体の混合物およびそれらのジアステレオマーを含む。
【００２５】
式１、２、１ａおよび２ａの化合物の他のバリエーションにおいて、Ｒ１が水素またはＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２がエイコセン酸(ｃｉｓ異性体、ｔｒａｎｓ異性体および異性体混合物を含む)のＣ１９残基、オレイン酸のＣ１７残基およびエライジン酸のＣ１７残基からなる群から選択される炭素残基のような不飽和脂肪酸の炭素残基である。ここで使用する脂肪酸の“炭素残基”(例えば、Ｃ１７残基、Ｃ１９残基など)は、脂肪酸のカルボキシル炭素を除く炭素鎖を意味する。上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、ヒドロキシル担持癌化学療法剤は、タキサン類、ａｂｅｏ−タキサン類、カンプトテシン類、エポチロン類、ククルビタシン類、クアシノイド類、アントラサイクリン類およびそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、ヒドロキシル担持癌化学療法剤は、アクラルビシン、カンプトテシン、マソプロコール、パクリタキセル、ペントスタチン、アムルビシン、クラドリビン、シタラビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、酢酸エリプチニウム、エピルビシン、エトポシド、フォルメスタン、フルベストラント、イダルビシン、ピラルビシン、トポテカン、バルルビシンおよびビンブラスチンからなる群から選択される。上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、接合体は図１８、１９および２０における化合物から選択される。一つのバリエーションにおいて、基−ＡＬＬ１、−ＡＬＬ２、−ＡＬＬ３〜−ＡＬＬｎの１個のみが−ＡＬＬ基であり、残りが水素である。他のバリエーションにおいて、基−ＡＬＬ１、−ＡＬＬ２、−ＡＬＬ３〜−ＡＬＬｎの２個が−ＡＬＬ基である。
【００２６】
他の態様において、ａ)単一ジアステレオ異性体の形の上記化合物の治療有効量；およびｂ)薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物が提供される。他の面において、医薬組成物は経口投与に適するかまたは液体製剤として非経腸投与に適する。他の面において、組成物は、経口、非経腸、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、筋肉内、直腸、鼻腔内、リポソーム、皮下および髄腔内からなる群から選択される経路による投与に適する。他の態様において、患者に上記の化合物または組成物のいずれか一つの化合物または組成物の治療有効量をこのような処置を必要とする患者に投与することを含む、患者における癌の処置法を提供する。本方法の一つの面において、癌は白血病、神経芽腫、神経膠芽腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎癌および黒色腫からなる群から選択される。本方法の他の面において、癌は肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および頭頸部癌からなる群から選択される。本方法の他の面において、本方法は、接合されていないヒドロキシル担持癌化学療法剤と比較したとき、癌細胞により表される抵抗度の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または少なくとも５０％減少を提供する。
【００２７】
他の態様において、患者への癌化学療法剤の投与と関係する化学療法剤の副作用を軽減するかまたは実質的に排除する方法を提供し、該方法は、患者に式１、１.１または式２
【化６】
2016530331.tif 000007
〔式中、Ｒはヒドロキシル担持癌化学療法剤であり、式１または１.１に関してＲ１は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯ、ＮＲ’またはＳから選択され、ここで、Ｒ’は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、ＺはＯまたはＳであり、ＱはＯまたはＳであり、ＴはＯまたはＳであり、式２に関してＲ２はＣ１−Ｃ２２アルキルであり、ＴはＯまたはＳであり、Ｘは水素またはメシレート、スルホネートおよびハロゲン(Ｃｌ、ＢｒおよびＩ)からなる群から選択される脱離基である。〕
の酸不安定親油性分子接合体またはそれらの分離されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体またはこれらの混合物の治療有効量を投与することを含む。化合物１.１は、純粋ｓｙｎ異性体、純粋ａｎｔｉ異性体およびｓｙｎ異性体とａｎｔｉ異性体の混合物およびそれらのジアステレオマーを含む。上記の一つのバリエーションにおいて、Ｒ２がＣ９−Ｃ２２アルキルである。一つの面において、本方法は、患者の癌細胞における癌化学療法剤の高濃縮を提供する。他の面において、本方法は、患者への接合されていない癌化学療法剤の投与と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％または少なくとも５０％高濃度の癌化学療法剤を癌細胞に送達する。
【００２８】
他の態様において、式３ａまたは３ｂ
【化７】
2016530331.tif 000008
〔式中、Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ５−Ｃ２２アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯ、ＮＲ’またはＳから選択され、ここで、Ｒ’は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、ＺはＯまたはＳから選択され、ＱはＯまたはＳであり、ＴはＯまたはＳである。〕
の化合物が提供される。本化合物の一つの面において、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ２はＣ５−Ｃ２２アルキルであり、ＹはＯまたはＳであり、ＺはＯであり、ＱはＯであり、ＴはＯである。式３ａまたは３ｂの活性化化合物は、該活性化化合物がヒドロキシル担持癌化学療法剤(ＨＢＣＣＡ)と縮合したとき、酸不安定親油性接合体の製造に使用し得る。ここで定義するＨＢＣＣＡは、一般的に例えば、式１、１ａ、１ｂ、１.１、２および２ａにおける残基または基“Ｒ”で表され、ＨＢＣＣＡが結合して酸不安定、親油性分子接合体を形成していないならば、ＨＢＣＣＡはまた、ＨＢＣＣＡが１個以上のヒドロキシル(−ＯＨ)基により官能化され得るため、式“Ｒ−ＯＨ”を有するとしても表され得る。
【００２９】
同様に、酸不安定、親油性分子接合体を形成するためにＨＢＣＣＡと縮合し得る酸不安定親油性基(すなわち、活性化化合物の“−ＡＬＬ”基)は、一般的に“Ｒ−Ｏ−ＡＬＬ”として表される。したがって、１個を超える−ＡＬＬ基がＨＢＣＣＡ基と縮合または接合しているならば、各−ＡＬＬ基を独立して−ＡＬＬ１、−ＡＬＬ２、−ＡＬＬ３〜−ＡＬＬｎ(ここで、ｎは−ＡＬＬ基と接合または共役し得る癌化学療法剤上の利用可能なヒドロキシル基の数である)と命名してよい。式１および２について例示されるように、例えば、指定されるＨＢＣＣＡ基および−ＡＬＬ基を下に示す。
【化８】
2016530331.tif 000009
【００３０】
ＨＢＣＣＡ基が２個の−ＡＬＬ基を有するパクリタキセルである酸不安定、親油性分子接合体(ＡＬＬＭＣ)の例を次に示す。
【化９】
2016530331.tif 000010
【００３１】
パクリタキセルの酸不安定分子接合体の上記代表例において、−ＡＬＬ１および−ＡＬＬ２の各々は独立して水素であるかまたはここに定義する−ＡＬＬ基である。１個を超えるヒドロキシル基を有するＨＢＣＣＡ基について、近づき難い１個以上のヒドロキシル基は、酸不安定親油性基が形成できないならば、−ＡＬＬ基として示される基は水素である。
【００３２】
上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、ヒドロキシル担持癌化学療法剤は、タキサン類、ａｂｅｏ−タキサン類、カンプトテシン類、エポチロン類、ククルビタシン類、クアシノイド類、アントラサイクリン類およびそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。上記酸不安定親油性分子接合体の他の面において、ヒドロキシル担持癌化学療法剤は、アクラルビシン、カンプトテシン、マソプロコール、パクリタキセル、ペントスタチン、アムルビシン、クラドリビン、シタラビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、酢酸エリプチニウム、エピルビシン、エトポシド、フォルメスタン、フルベストラント、イダルビシン、ピラルビシン、トポテカン、バルルビシンおよびビンブラスチンからなる群から選択される。
【００３３】
本組成物または製剤で用い得る代表的化学療法剤を図Ａ、ＢおよびＣに開示する。上記の一つの面において、化学療法剤はART-207である。
【化１０】
2016530331.tif 000011
【００３４】
ＬＤＬ受容体の過発現と結果としての体循環からのＬＤＬ粒子の高取込みによる、癌組織への化学療法化合物の選択的かつ特異的送達の大きな可能性を捕らえることは、該薬剤に正常組織が曝されることによる毒性副作用に至らないために、ＬＤＬ粒子の脂質コアに封入されたままにし、血漿に拡散しないように、癌化学療法剤が高親油性であることを必要とする。さらに、ＬＤＬ粒子とその化学療法ペイロードが、エンドソームの酸性環境へのＬＤＬ受容体介在取込みにより癌細胞に取り込まれたら、ＬＤＬ受容体はＬＤＬ粒子から解離し、細胞表面にリサイクルされ、ＬＤＬ粒子はその脂質内容物およびその親油性化学療法剤を酵素およびエンドソームの酸性環境に遊離する。
【００３５】
さらにこの期待の妥当性は、Maranhaoおよび共同研究者により示され、彼らは富コレステロールマイクロエマルジョンまたはナノ粒子調製物(ＬＤＥ)が、血流への注射後癌組織に濃縮することを証明した。ＬＤＥと結合したパクリタキセル親油性誘導体の細胞毒性、薬物動態、動物に対する毒性および治療効果は、市販のパクリタキセルと同等であった。結果は、ＬＤＥ−パクリタキセルオレアートが安定であったことを示した。複合体中の薬物の細胞増殖抑制活性は、市販の製剤で使用されている媒体Cremophor ELの細胞毒性により、市販のパクリタキセルと比較して低下した。新生物培養細胞における競争実験は、パクリタキセルオレアートおよびＬＤＥが、ＬＤＬ受容体経路により一緒に内部移行することを示した。マウスの耐容性は、致死量(ＬＤ５０)が市販の製剤より９倍高いほど顕著であった(それぞれＬＤ５０＝３２６μMおよび３７μM)。ＬＤＥは、正常隣接組織と比較して、パクリタキセルオレアートを腫瘍では約４倍に濃縮する。等モル投与量で、パクリタキセルオレアートとＬＤＥの結合は、市販のパクリタキセルと比較したとき、薬物動態パラメータの顕著な変化をもたらした(それぞれｔ１／２＝２１８分および１８４分、ＡＵＣ＝１,３３４μg−ｈ／mLおよび７０７μg−ｈ／mLおよびＣＬ＝０.１２５mL／分および０.２３６mL／分)。複合体の治療有効性は、処置マウスにおける腫瘍成長の減少、生存率の増加および治癒率により示されるとおり、市販のパクリタキセルより顕著に大きかった。Maranhao et al.は、ＬＤＥ−パクリタキセルオレアートが安定な複合体であり、パクリタキセルと比較して、毒性が顕著に低下し、活性が増強され、これは、臨床使用における治療指数の改善に至り得ることを示した。Maranhaoおよび共同研究者は、この予備的動物試験結果を乳癌患者によるパイロット臨床試験で追跡した。ＬＤＥナノエマルジョンと結合したパクリタキセルの腫瘍取込み、薬物動態および毒性を評価するために、臨床試験を乳癌患者で行った。乳房切除術の２４時間前に、１４Ｃ−オレイン酸コレステリル−ナノエマルジョンと結合した３Ｈ−パクリタキセルオレアートまたはCremophor EL中の３Ｈ−パクリタキセルを、血液サンプルならびに腫瘍および正常乳房組織の切片を採取するために５名の患者に注射した。３週間隔で投与するパクリタキセル−ナノエマルジョンのパイロット臨床試験を、１７５mg／ｍ２および２２０mg／ｍ２の投与量で難治性進行乳癌の患者で実施した。ナノエマルジョンと結合したパクリタキセルオレアートの半減期(ｔ１／２)はパクリタキセルより長かった(それぞれｔ１／２＝１５.４±４.７時間および３.５±０.８０時間)。この二つの投与量で乳房悪性組織による１４Ｃ−コレステリルエステルナノエマルジョンおよび３Ｈ−パクリタキセルオレアートの取込みは正常乳房組織より３倍多く、毒性は最小であった。これらの結果は、薬物動態パラメータが改善され、薬物が新生物組織に濃縮され、かつパクリタキセルの毒性が減少するため、このパクリタキセル−ナノエマルジョン製剤が乳癌の処置において有利であり得ることを示唆する。ＬＤＬ様脂質エマルジョンを用いる小規模ヒト治験についてのMaranhao研究室の追加報告は、エマルジョンのコアに取り込まれた親油性薬物が腫瘍組織に���的化され、副作用が顕著に減少することを示した。エマルジョン調製の困難さ、長時間の超音波処理による製造および粒子径選択のための長時間の遠心分離により、さらなる臨床研究および開発は中断している。
【００３６】
我々は、この癌化学療法剤の特異な酸不安定、親油性のプロドラッグ誘導体を含む、十分に親油性の化学療法剤用の送達製剤として、ナノ粒子“シュードＬＤＬ”脂質マイクロエマルジョンをどのようにして製造するかを発見した。一つの態様において、親油性化学療法剤は４より大きいＬｏｇＰ測定値または計算値を有する。さらに動物腫瘍モデルにおいて、癌化学療法剤の酸不安定、親油性分子の接合体は、ナノ粒子、ＬＤＬ様脂質エマルジョンで投与したとき、新生物／腫瘍組織への選択的送達により毒性が減少し、かつ有効性が増加するため、腫瘍を縮小させるのに、より有用であることを証明した。
【００３７】
一つの態様において、本明細書は、ａ)親油性抗癌剤；ｂ)リン脂質(ＰＬ)；およびｃ)トリグリセリド(ＴＧ)を含む安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子であって、１００nm未満、９０nm未満または８０nm未満の粒子径を有するＬＤＬナノ粒子を開示している。ここでいう安定な合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子は、密閉容器中、遮光して保存したとき、約２５℃で９０日より長い、１２０日より長い、１８０日より長いまたは１年より長い保存期間を有すると定義されるナノ粒子である。他の面において、ナノ粒子は、密閉容器中、遮光して保存したとき、約２５℃で１年を超えるまたは約２年以上の保存期間を有する。ＬＤＬナノ粒子の一つの面において、粒子径分布は４０〜８０nmである。他の面において、粒子径分布は５０〜６０nmである。また、一つの面において、ＬＤＬナノ粒子は６０nmの平均粒度分布を有する。他の面において、ＬＤＬナノ粒子は約５０nmの平均粒度分布を有する。他の面において、リン脂質はホスホチジルコリン、ホスホチジルエタノールアミン、対称または不斉１,２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン類、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン、卵リン脂質、卵ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、卵レシチン、大豆レシチン、レシチン(ＮＯＳ)およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３８】
他の面において、ＬＤＬナノ粒子は、さらにコレステロールエステル(ＣＥ)またはコレステロール(Ｃ)またはコレステロールエステルとコレステロールの混合物を含む。他の面において、コレステロールエステルはコレステロールのＣ１６−２２エステル、コレステロールおよびこれらの混合物からなる群から選択され、そしてトリグリセリドはダイズ油、トリオレイン、トリパルミチン酸グリセリルおよびこれらの混合物からなる群から選択される。上記の一つの面において、コレステロールのエステルはオレイン酸コレステリル、パルミチン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリルおよびリノレン酸コレステリルからなる群から選択される。他の面において、ＬＤＬナノ粒子は、さらにトリオレイン、天然抗酸化剤、ＢＨＴ、ユビキノール、ユビキノール１０、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、リコピン、レチニル誘導体およびベータカロテンまたはこれらの混合物からなる群から選択される成分を含む。他の面において、親油性抗癌剤は抗癌剤または該抗癌剤のプロドラッグである。上記の一つの面において、ＰＬ：ＴＧ比は８：１〜３：１の範囲であり得る。他の面において、ＰＬ：ＴＧ：ＣＥ比は８：１：０.５〜３：１：０.１の範囲であり得る。他の面において、親油性抗癌剤：ＰＬ：ＴＧの比は１：１０：３〜１：３：０.５の範囲であり得る。他の面において、親油性抗癌剤：ＰＬ：ＴＧ：ＣＥの比は１：１０：３：１〜１：３：０.５：０.１の範囲であり得る。
【００３９】
他の面において、抗癌剤はタキサン、ａｂｅｏ−タキサン、カンプトテシン、エポチロン、ククルビタシン、クアシノイドおよびアントラサイクリンからなる群から選択される。他の面において、抗癌剤は、アクラルビシン、カンプトテシン、マソプロコール、パクリタキセル、ペントスタチン、アムルビシン、クラドリビン、シタラビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、酢酸エリプチニウム、エピルビシン、エトポシド、フォルメスタン、フルベストラント、イダルビシン、ピラルビシン、トポテカン、バルルビシンおよびビンブラスチンからなる群から選択される。さらに別の面において、抗癌剤のプロドラッグは、ここにおよび図Ａ、ＢおよびＣに開示するような酸不安定親油性分子接合体である。ある特定の面において、酸不安定親油性分子接合体はART-207である。
【化１１】
2016530331.tif 000012
【００４０】
上記の他の面において、親油性抗癌剤は４.０、６.０または８.０を超えるｌｏｇＰを有する。一つの面において、ＰＬ：ＴＧ：ＣＥ：Ｃの重量比は７３：１２：２：１〜７８：１２：２：１の範囲であり、所望によりさらにトリオレイン、天然抗酸化剤、ＢＨＴ、ユビキノール、ユビキノール１０、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、リコピン、レチニル誘導体およびベータカロテンまたはこれらの混合物からなる群から選択される添加剤を含む。一つのバリエーションにおいて、ＰＬ：ＴＧ：ＣＥ：Ｃの重量比は７７：１０：２：１である。一つの面において、天然抗酸化剤はコエンザイムＱ１０、レスベラトロール、プテロスチブベンおよびこれらの混合物から選択される。他の面において、親油性抗癌剤対トリグリセリドの比は１：１〜０.６：１である。他の面において、ＬＤＬナノ粒子は、６.０〜８％wt/wtの総固形成分を含む。他の面において、ＬＤＬナノ粒子は５.０〜７.０％wt/wtの総脂質成分を含む。一つのバリエーションにおいて、ＬＤＬナノ粒子は、さらにＰ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、Ｐ４０７、SYNPERONICS、PLURONICSおよびKOLLIPHORまたはこれらの混合物からなる群から選択されるポロクサマーを含む。
【００４１】
他の態様において、ａ)親油性抗癌剤；ｂ)リン脂質(ＰＬ)；およびｃ)トリグリセリド(ＴＧ)を含む安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子の製造法が提供され、該方法は、１)親油性抗癌剤、リン脂質およびトリグリセリドを合せて混合物を形成し；２)混合物を揮発性溶媒に溶解することにより均質化し；３)溶媒を除去し；４)緩衝液中で混合物を形成することによりエマルジョン混合物として、粗いエマルジョンを形成し；５)マイクロフルダイザー装置中でエマルジョン混合物を１００nm以下の粒子製剤を製造するのに十分な時間微細流動化し；そして６)ナノ粒子製剤を０.２２ミクロンフィルターを通して滅菌して、４０nm〜８０nmの範囲の合成ＬＤＬナノ粒子を得ることを含む。一つのバリエーションにおいて、リン脂質がホスホチジルコリン、ホスホチジルエタノールアミン、対称または不斉１,２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン類、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン、卵リン脂質、卵ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、卵レシチン、大豆レシチン、レシチン(ＮＯＳ)およびこれらの混合物からなる群から選択される合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子混合物が提供される。他の面において、ＬＤＬナノ粒子は、さらにコレステロールのＣ１６−２２エステル、コレステロールおよびこれらの混合物からなる群から選択されるコレステロール(Ｃ)またはコレステロールエステル(ＣＥ)を含み、トリグリセリドはダイズ油、トリオレイン、トリパルミチン酸グリセリルおよびこれらの混合物からなる群から選択されるかまたはコレステロールとコレステロールエステルの混合物である。上記の一つの面において、低速混合が、２００〜８００rpm、約２００rpm、４００rpm、６００rpmまたは８００rpmの速度で行われる。他の面において、温かい粗いエマルジョン混合物の微細流動化が、約４５〜６５℃の処理温度で行われる。上記方法の他の面において、溶媒除去が減圧下に行われる。他の態様において、ここに開示する方法により製造した、ａ)親油性抗癌剤；ｂ)リン脂質(ＰＬ)；およびｃ)トリグリセリド(ＴＧ)を含む安定な、合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子が提供される。上記の一つの態様において、合成ＬＤＬナノ粒子を開示する方法のいずれかにより製造し、ここで、ＬＤＬナノ粒子は静脈内注射によりアポリポタンパク質による被覆物になり、細胞ＬＤＬ受容体により認識され、内部移行される。
【００４２】
他の態様において、患者に上記態様、面およびバリエーションのいずれかの、安定な合成低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)ナノ粒子の治療有効量を、このような処置を必要とする患者に投与することを含む、患者における癌の処置方法を提供する。本方法の他の面において、癌は白血病、神経芽腫、神経膠芽腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、腎臓メラノーマ、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および頭頸部癌からなる群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な記載：
脂質ベース薬物およびプロドラッグ製剤の開発：
薬物／プロドラッグ取り込み能力、粒子径および安定性の最適化。ナノ粒子脂質ベース“シュードＬＤＬ”製剤の製造のための一般法は、Arbor Therapeutics, LLC Standard Operating Procedures; ART 001 Coarse Emulsion Preparation Rev. 1, ART 002 Microfluidics Model 110P Gen II (MF) Rev 1およびART 003 Nicomp 380 ZLS Particle Size Analyses Rev. 1に見られる。これらのＳＯＰの例外を記す。
【００４４】
略語：ＰＣ  −  ホスファチジルコリン、ＴＧ  −  トリグリセリド、ＴＣ  −  総コレステロール、ＦＣ  −  遊離コレステロール、ＣＥ  −エステル化コレステロール、Ｕ  −  ユビキノール、ＶｉｔＥ  −  ビタミンＥ(混合型トコフェロール)、Ｐ１８８  −  ポロクサマー１８８、ＤＭＰＣ  −  １,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、ＰＳ  −  ホスホチジルセリン；ＭＦＰ  −  マイクロフルダイザー処理、ＩＣ  −  インタラクションチャンバー、ＩＣＪ  −  インタラクションチャンバージャケット；ＴＳＰＭ  −  全固形プレミックス；ＲＥＭ  −  得られるエマルジョン；％  −  総固体パーセント、ＴＬ％  −  総脂質パーセント、Ｗ／Ｖ  −  重量対体積；取込％  −  マイクロフルダイザー処理および滅菌０.２２μm濾過後に製剤に取込されたART-207のパーセント；ｍｆｇ  −  製造；Pre-mix  −  予混合物；ＮＤ  −  未検；ＢＤＬ  −  検出限界以下。Ｒ  −  抵抗。
【００４５】
下記表に示した抗癌剤についてのｌｏｇＰ計算値の全ては、ChemAxonのｌｏｇＰ予測変数を使用するwww.chemicalize.orgでオンラインで行った。ChemAxonアルゴリズムはVellarkad N. Viswanadhan et al., Journal of Chemical Information and Computer Sciences 1989 29 (3), 163-172に基づく。
【表１】
2016530331.tif 000013
【００４６】
使用した物質
【表２】
2016530331.tif 000014
【００４７】
使用した装置
【化１２】
2016530331.tif 000015
【００４８】
ART-207の分析的定量化：
ＬＤＬ様脂質エマルジョンナノ粒子におけるART-207濃度の定量化用の分析法開発は、約１８ヶ月かけて開発した方法であった。
使用した方法の概要および改変
【表３】
2016530331.tif 000016
【００４９】
使用した３個のＨＰＬＣ法は類似した。エマルジョンサンプルをこの時間の間非希釈で注入した。全ての方法はPhenomenex ４.６×５０mm Luna ５μ C18(2) 100A、部品番号00B-4252-E0カラム、流速：１.５mL／分、検出：２３０nm、カラム温度：４０℃および注入体積：可変を使用した。
これらの３方法の各々の勾配の表および注入体積は次のとおりである。
Ａ＝アセトニトリル          Ｂ＝％０.０１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４水
【表４】
2016530331.tif 000017
【００５０】
タキサン＿プロドラッグ.Mを応答の直線性を決定するために使用し、それは０.６〜５.２mg／mLでART-207についてＲ２＝０.９９９７であることが示された。
【００５１】
タキサン＿プロドラッグ.Mをまたインビトロ細胞毒性試験用に製造したエマルジョンの定量にも使用した。
【００５２】
全てのタキサン＿プロドラッグ.M法は、前の注入からの続く注入へのエマルジョン成分の持越を示した。この持越の一部はART-207ピークと共溶出した。サンプルの合間の緩衝液ブランクはあまり参考にならなかった。５０／５０クロロホルム／メタノールの１００μL注入を使用する３分カラム洗浄法はこの持越を相当減少させた。ＭＴＤ試験のための無薬物製剤の分析は、以前の分析法では証明不可能であった分析サンプル中の薬物の不在を示した。ブランク減算は、エマルジョンがART-207と同時に溶出するピークを有したため、不適であった。
【００５３】
エマルジョン成分持越問題を解決する新規方法を開発した。４０℃に対して高めのカラム温度５５℃は、エマルジョン粒子の液化および溶解を良好に助けることが可能であり、これらがカラム洗浄液としてカラムから洗い出されることを可能にする。勾配は高アセトニトリル濃度から開始し、勾配をより浅くして、不純物を分割させた。無薬物エマルジョンの分析を実施し、結果の“検出限界以下”表記を確認した。
【００５４】
脂質エマルジョン中のART-207の定量に使用するＨＰＬＣ分析法は、Agilent 1100クォータナリポンプおよび単波長系で実施するタキサン試験.M、Rev.０である。カラムはPhenomenex ４.６×５０mm Luna ５μ C18(2) 100A、部品番号00B-4252-E0である。方法条件は：流速：１.５mL／分、検出：２３０nm、カラム温度：５５℃および注入体積：１μLである。勾配表は次のとおりである。
【表５】
2016530331.tif 000018
【００５５】
ART-207の典型的保持時間は、この方法で±５.８分である。脂質エマルジョンサンプル調製物は、９部イソプロパノール中１部エマルジョンである(１：１０)。応答の直線性は、類似アセトニトリル／水Ｃ１８法で０.６〜５.２mg／mLでART-207についてＲ２＝０.９９９７であった。定量化を、外部標準から計算した感度係数を使用して達成する。データを表に示す。このＭＴＤ試験用の脂質エマルジョンの調製中、ART-207の濃度の説明できない変動が観察され、試験した。外部標準を、１mLの溶媒に溶解した約１mgのART-207を使用して調製した。精度および一貫性は、外部標準調製物を１００mLの溶媒に溶解した１００mgのART-207に変えたとき改善した(タキサン試験.M、Rev.１)。タキサン試験.M、Rev.１法を使用して、ＭＴＤ試験用に調製したエマルジョン中のART-207の濃度を再測定し、修正した。最初に報告された値(タキサン試験.M、Rev.０)およびより正確な再測定した値(タキサン試験.M、Rev.１)を次の表に示す。
【表６】
2016530331.tif 000019
【００５６】
２０１３年３月１１日に、感度係数ならびにサンプルエリアカウントを決定するために使用した標準エリアカウントの注入毎の変動の影響を減らすために、注入体積を１μLから３μLに増やした、タキサン試験.M、Rev.２。
【００５７】
ブラケッティング外部標準および二回サンプル分析をART-207の分析的定量化に使用しており、標準操作手順  −  ART 005、製剤されたART-207のＨＰＬＣ分析に規定する、タキサン試験.M、Rev. 3。
【００５８】
２８７の分析的定量化(ロット番号ISI-30052013-1)。
ＬＤＬ様脂質エマルジョンナノ粒子中のART-287濃度の定量化のためにタキサン試験.M、Rev 3”分析法を使用した。得られたエマルジョンの滅菌０.２２μm濾過は、下記実験におけるART-207含量に顕著な影響を与えなかった。全ての調製した粗い懸濁液の粒子径は常に４００〜８００nmの範囲であり、ＭＦ処理中の粒子径縮小率に影響しなかった。ＭＦ処理体積は、特記しない限り１００mlであった。下記実験の全てに関して、マスターテーブル１、２および３も参照のこと。
【実施例】
【００５９】
実験１. 初期製剤を使用する無薬物脂質エマルジョンの調製
粒子径に対する不連続経路対再循環モード(フィードリザーバーへの物質の返還)および制御された(≦６０℃)ＩＣＪ温度の影響を試験するため。
【表７】
2016530331.tif 000020
【００６０】
【表８】
2016530331.tif 000021
【００６１】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.103.1)。
【表９】
2016530331.tif 000022
【００６２】
ＭＦＰ。図１は、２０分の処理に等しい(一つの不連続経路は約３０秒)４０回の不連続経路の後、粒子径が５５〜６０nmプラトーに達することを示す。ＭＦＰを８０回の不連続経路の後に分離し、物質を濾過した。０.２２μm濾過後、粒子径は５５nmから６３nmにわずかに増加した。約６０〜６５℃(ＩＣジャケット温度)での不連続経路を経る処理は、先の試験で産生した脂質製剤と比較して粒子径を改善しなかった。
【表１０】
2016530331.tif 000023
【００６３】
粒子径分析および安定性。得られたエマルジョンは不安定であった。図２および表１ｃにおいて、粒子径は３６日かけて６３nmから７９nmに増加した。
【表１１】
2016530331.tif 000024
【００６４】
実験２. 初期製剤を使用する無薬物脂質エマルジョンの調製
得られた粒子径に対する低い(＜３０℃)ＩＣＪ温度(すなわちＩＣジャケットの“局所”冷却)の影響。
【表１２】
2016530331.tif 000025
【００６５】
【表１３】
2016530331.tif 000026
【００６６】
粗いエマルジョンを調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.104.1)。ＭＦ処理を再循環モードで実施した。
【表１４】
2016530331.tif 000027
【００６７】
２ａ. 角氷をＩＣジャケットの周りに置いた。１０分のＭＦ処理後、粒子径は４３９nm(粗いエマルジョン)から６６nmに縮小し、２０分後、約５８nmでプラトーに達した。３０分までのさらなる処理は粒子径を減少させなかった(図３)。
【００６８】
２ｂ. 冷却媒とＩＣを良好に接触させ、さらに温度を下げるために、氷を下部トレイから出し、１０℃に設定したグリコール浴を使用してインタラクションチャンバー(周りのパイプラインおよび背圧チャンバーと共に)を１０℃グリコールに浸した。これらの冷却条件は、粒子径を４３nmへとさらに縮小させた(図３)。
【表１５】
2016530331.tif 000028
【００６９】
無薬物製剤の粒子径分析。図４、表１ｃおよび２ｃにおいて、得られた粒子径は、＜３０℃温度で処理後、６０℃処理と比較して有意に小さかった。両処理条件とも不安定粒子に終わった。６３nmから７９nmおよび４５nmから８２nmへの粒子径増加が、それぞれロット番号002.103.1および002.104.1で観察された。
2016530331.tif 000029
【００７０】
実験３. 初期製剤を使用するART-207含有脂質エマルジョンの調製。初期製剤のART-207(ロット番号AW-001-243)取り込み能力および粒子径および安定性に対するART-207の影響を試験。
【表１６】
2016530331.tif 000030
【００７１】
【表１７】
2016530331.tif 000031
【００７２】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.105.1)。
【表１８】
2016530331.tif 000032
【００７３】
ＭＦＰ。図５において、粒子径は、１０〜２０℃で３０分の処理後、約１３０nmでプラトーまたは抵抗(抵抗１−Ｒ１)に達した。温度を５０〜６０℃に上げると、粒子径の１００nmへの縮小とＲ２への到達をもたらした。温度を１０〜２０℃に再冷すると、７７nmへのさらなる粒子径縮小が生じた。ＭＦＰを停止し、物質を濾過した。濾過後、粒子径の７７nmから８２nmへのわずかな増加が観察された。
【００７４】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は３.１４mg／mlであった。データは、本製剤の調製に使用した薬物の９８％が脂質粒子に取り込まれたことを示す(表３ｃ)。
【表１９】
2016530331.tif 000033
【００７５】
ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは不安定であった。図６および表３ｃは、３５日で粒子径が８２nmから１９６nmに増加したことを示す。
2016530331.tif 000034
【００７６】
ART-207の製剤への添加は、得られたエマルジョンの安定性を顕著に低下させた。
【００７７】
実験４. ART-207含有脂質エマルジョン(ロット番号AW-001-243)の調製。薬物取り込み能力および得られたナノ粒子の安定性に対する、ＴＣの量を同一に維持して、リン脂質含量を増加させ、ＦＣ／ＣＥ比を低下させた影響(表４ｂおよび４ａ)。
【表２０】
2016530331.tif 000035
【００７８】
【表２１】
2016530331.tif 000036
【００７９】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.108.1)。
【表２２】
2016530331.tif 000037
【００８０】
ＭＦＰ。図７において、粒子径は、約６０℃で４０分の処理後、約１２５nmでＲ１に到達した。温度を約２０℃まで下げると、粒子径の８０nmまでの縮小およびＲ２への到達をもたらした。温度を５０℃に上げると、粒子径の約１０８nmへの増加が生じた。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の１０８nmから１２９nmへの増加が観察された。
【表２３】
2016530331.tif 000038
【００８１】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は４.８１mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の７４％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表４ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは不安定であった。図８および表４ｃにおいて、粒子径は１４日で１２９nmから１８４nmに増加した。
【表２４】
2016530331.tif 000039
【００８２】
リン脂質含量増加およびＦＣ／ＣＥ比減少は、ART-207粒子含量を増やしたが、得られたエマルジョンの安定性は改善しなかった。
【００８３】
実験５. ART-207含有脂質エマルジョン(ロット番号AW-001-243)の調製
薬物取り込み能力および得られたナノ粒子の安定性に対するさらなるリン脂質濃度の増加およびＣＥ；およびＢの減少の影響。温度制御戦略を最適化するため：実験番号４の温度を２０℃から６０℃に増加させると、粒子径の望ましくない増加が生じた。
【表２５】
2016530331.tif 000040
【００８４】
【表２６】
2016530331.tif 000041
【００８５】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.109.1)。
【表２７】
2016530331.tif 000042
【００８６】
ＭＦＰ。図９において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、約１０５nmでＲ１に到達する。温度を約２０℃まで下げると、粒子径の７３nmへの縮小とＲ２への到達をもたらした。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の増加は観察されなかった。
【００８７】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は５.５mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８５％が脂質粒子に取り込まれたことを示す(表５ｃ)。得られた粒子の薬物含量は先の実験より高く、コーティング物質(リン脂質)の増加が薬物取り込みを促進することを示す(表３ａ、３ｃ、４ａおよび４ｃ参照)。
【表２８】
2016530331.tif 000043
【００８８】
ART-207含有製剤の粒子径分析。得られた粒子径(表５ｃ)は、先の実験(表４ｃ)と比較して小さかったが、エマルジョンは極めて不安定であった。図１０および表５ｃにおいて、粒子径は１４日で７４nmから１４９nmに、そして３３日で７４nmから１６９nmに増加した。
【表２９】
2016530331.tif 000044
【００８９】
さらなるリン脂質の増加およびＣＥおよび続いてＴＣ含量の減少は、小さな粒子および製剤がART-207を取り込む高い(先の実験番号４と比較して)能力をもたらしたが、得られたエマルジョンの安定性は改善しなかった。この実験を繰り返すと同じような結果となり、処理パラメータが再現でき、再現性のある結果となることを示す。
【００９０】
実験６. ART-207含有脂質エマルジョン(ロット番号AW-001-243)の調製。ART-207含量増加は得られた粒子の安定性を減少させ、実験番号６は、粒子径および安定性に対するART-207濃度減少の影響を測定するために実施した。
【表３０】
2016530331.tif 000045
【００９１】
【表３１】
2016530331.tif 000046
【００９２】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.111.1)。
【表３２】
2016530331.tif 000047
【００９３】
ＭＦＰ。図１１において、粒子径は約６０℃で２０分の処理後約６６nmでＲ１に到達する。温度を約２０℃まで下げると、粒子径の４２nmまでの縮小が生じた。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の４２nmから４７nmへの増加が観察された。
【表３３】
2016530331.tif 000048
【００９４】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は１.８６mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８７％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表６ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンはこれまでの製剤より安定であった。図１２および表６ｃにおいて、粒子径は２４日で４７nmから６６nmに増加した。
【表３４】
2016530331.tif 000049
【００９５】
ART-207の減少および高リン脂質含量維持(表６ａおよびｂ)は、ａ)実験番号５で先に達成されたサイズと比較して有意に小さな粒子径(表５ａ、ｂ、ｃおよび６ａ、ｂ、ｃもまた参照)およびｂ)より安定な粒子(先の実験で得られたエマルジョンと比較して)をもたらした。
【００９６】
実験７. ART-207含有脂質エマルジョンの調製(ロット番号AW-001-243)
ART-207取り込み、粒子径および安定性に対するトリグリセリド含量低下の影響。
【表３５】
2016530331.tif 000050
【００９７】
【表３６】
2016530331.tif 000051
【００９８】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.111.2)。
【表３７】
2016530331.tif 000052
【００９９】
ＭＦＰ。図１３において、粒子径は、約６０℃で２０分の処理後、約１０５nmでＲ１に到達した。温度を約２０℃まで、そしてさらに１０℃まで下げると、粒子径の１０５nmから１１８nmへのさらなる増加およびＲ２への到達をもたらした。５０〜６０℃に温度を再び上げると、９０nmへの粒子径の縮小および９４nmでの次の抵抗点への到達をもたらした。さらに３０分約２５℃で処理すると粒子径は９４nmから８４nmに縮小した。ＭＦＰを停止し、濾過した粒子径の８４nmから６６nmへの縮小が濾過後に観察された。
【表３８】
2016530331.tif 000053
【０１００】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は３.８８mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の６０％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(７ｃ)。低トリグリセリド含量の粒子のART-207取り込み能力は減少した。ART-207含有製剤の粒子径分析。ART-207含有エマルジョンは、実験番号３〜６で処理した高トリグリセリドの製剤と比較して、より安定であった。図１４および表７ｃにおいて、粒子径は、３８日で６６nmから７５nmに増加しなかった。さらに３０日(計６８日)で粒子径は９２nmに増加した。
【表３９】
2016530331.tif 000054
【０１０１】
したがって、トリグリセリド含量増加および高リン脂質含量維持は、適度に小さく、適正に安定な粒子をもたらした。低トリグリセリドエマルジョンのART-207取り込み能力は有意に低下した。リン脂質増加は、ART-207含量が増加した小さな粒子をもたらした；リン脂質の増加は粒子安定性を改善しなかった；ART-207含量減少は粒子径減少および安定性改善をもたらした；ＴＧ含量、したがって、ＴＧ／ART-207比の約２から１への減少は粒子径縮小、安定性改善をもたらしたが、製剤のART-207取り込み能力を低下させた。
【０１０２】
ＴＧ／ART-207比は、製剤のART-207取り込み能力の決定に重要な必要条件であると考えられる；高いＴＧ／ART-207比は製剤のART-207取り込み能力を増加させるが、粒子安定性を脅かし、比を下げると製剤安定性を改善するが、ART-207取り込み能力を低下させる。エマルジョン製剤のART-207取り込み、粒子径および安定性を最適化させる少なくとも二つの可能な方法がある：主製剤成分の比の最適化。
【０１０３】
実験８. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-001-243)の調製
ART-207取り込み、粒子径および安定性に対するポロクサマーＰ１８８(１％Ｖ／Ｗ)添加の影響を試験。ポロクサマーは非イオン性ポリ(エチレンオキシド)(ＰＥＯ)−ポリ(プロピレンオキシド)(ＰＰＯ)コポリマーである。ポロクサマーは臨床適用で広く使用されている(１)。Ｐ１８８が脂質単層に挿入され、膜を封する能力(２)は、恐らく表面張力を低下させることによる脂質粒子の安定性への有用性を示唆する。ナノ粒子のＰ１８８コーティングは、インビボ適用に特に関係する血清タンパク質およびマクロファージ取込みによるオプソニン作用(３)を減少させる。本出願にとって最も重要なＰ１８８の特性の一つは、脂質ナノ粒子のＰ１８８コーティングがアポリポタンパク質Ｅの結合を阻止しないことである(４)。
【０１０４】
参考文献：
1. Hitesh R. Patel et al. “Poloxamers: A pharmaceutical excipient with therapeutic behaviors”. 2009. International Journal of PharmTech Research, Vol.1, No.2, pp 299-303.
2. Guohui Wu et al. “Interaction between Lipid Monolayers and Poloxamer 188: An X-Ray Reflectivity and Diffraction Study”. 2005. Biophysical Journal Volume 89 November 2005 3159-3173.
3. Zhang, Wen-li et al. “Stealth tanshinone IIA-loaded solid lipid nanoparticles: effects of poloxamer 188 coating on in vitro phagocytosis and in vivo pharmacokinetics in rats”. 2009. Acta Pharm Sin, 44: 1421-1428.
4. Parag Aggarwal et al. “Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy”. 2009. Advanced Drug Delivery Reviews 61, 428-437.
【０１０５】
【表４０】
2016530331.tif 000055
【０１０６】
【表４１】
2016530331.tif 000056
【０１０７】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.116.1)。
【表４２】
2016530331.tif 000057
【０１０８】
ＭＦＰ。図１５において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、６０nmに到達した。この時点で温度を約２０℃に低下させ、粒子径の縮小が温度低下によりさらに促進できるか否かを決定した。さらに２０分の処理は、粒子径の６０nmから７３nmへの有意な増加をさせた。温度を約６０℃まで再び上昇させると、粒子径の５６nmへの縮小と抵抗点(Ｒ２)への到達をもたらした。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の５６nmから６２nmへの増加が観察された。
【表４３】
2016530331.tif 000058
【０１０９】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は６.０７mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の９３.７％が脂質粒子に取り込まれたことを示す(８ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは不安定であった。図１６および表８ｃにおいて、粒子径はわずか４日後に６２nmから１４６nmに増加した。
【表４４】
2016530331.tif 000059
【０１１０】
１％(Ｖ／Ｗ)のＰ１８８添加は、得られたエマルジョンの不安定化作用を有した。最大耐性用量(ＭＴＤ)試験のための脂質ベース無薬物およびART-207含有製剤の調製。
【０１１１】
実験９. 無薬物脂質エマルジョンの調製
【表４５】
2016530331.tif 000060
【０１１２】
【表４６】
2016530331.tif 000061
【０１１３】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.118.0)。
【表４７】
2016530331.tif 000062
【０１１４】
ＭＦＰ。図１７において、粒子径は、約６０℃で３５分の処理後４５nmに到達した。ＭＦＰを停止し、物質を濾過した。濾過後、粒子径の４５nmから４７nmへの増加が観察された。
【表４８】
2016530331.tif 000063
【０１１５】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は検出限界以下であった。
【０１１６】
無薬物製剤の粒子径分析。得られたエマルジョンは少なくとも１３日間安定であった。図１８および表９ｃにおいて、粒子径は１３日間増加しなかった。次の４７日(計６０日)で、粒子径は７９nmに増加した(図１８および表９ｃ)。
【表４９】
2016530331.tif 000064
【０１１７】
データは、無薬物高ＰＣおよびＴＧ含有製剤の処理は、小さくかつ比較的安定な粒子をもたらすことを示す。
【０１１８】
実験１０. ART-20含有脂質エマルジョンの調製7(ロット番号AW-001-243)。最大耐性用量試験用ART-207含有エマルジョンの製造。
【表５０】
2016530331.tif 000065
【０１１９】
【表５１】
2016530331.tif 000066
【０１２０】
１５０mlの粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.119.4)。
【表５２】
2016530331.tif 000067
【０１２１】
ＭＦＰ。図１９において、粒子径は、約６０℃で４５分の処理後、約１０６nmでＲ１に到達する。温度を約２０℃まで下げると、粒子径の７２nmまでの縮小が生じた。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の７２nmから７８nmへの増加が観察された。
【表５３】
2016530331.tif 000068
【０１２２】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 0)は６.１３mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の９１％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１０ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは不安定であった。図２０および表１０ｃにおいて、粒子径は２２日で７８nmから２１８nmに増加した。
【表５４】
2016530331.tif 000069
【０１２３】
この実験の結果は実験番号５の結果に類似し、ａ)粗いエマルジョン調製および処理における一貫性およびｂ)ART-207含有製剤について未解決の安定性問題を示す。ART-207の目標投与量。ＭＴＤ試験について製剤化ART-207の計画される投与量は次のとおりであった。６４.４mg／ml、４６mg／ml、３４mg／mlおよび２２mg／kg(mpk)。全ての試験品をマウスに静脈内(ｉｖ)注射で投与した。計画される投与量を達成するための注射量を表１１ａに示す。
【表５５】
2016530331.tif 000070
【０１２４】
ART-207の目標濃度を達成するためのエマルジョン希釈物調製。ＭＴＤ試験のための製剤化ART-207の計算した目標濃度は次のとおりであった。６.１３、４.３８mg／ml、３.２２mg／mlおよび２.１１mg／ml。ART-207の４.３８mg／ml、３.２２mg／mlおよび２.１１mg／ml目標濃度を達成するために、ＨＰＬＣで測定したエマルジョンロット番号002-119-4(６.１３mg／mlのART-207)(タキサン＿試験.M, Rev 0)を、酢酸緩衝化食塩水(ｐＨ５.５)で１.４倍、１.９倍および２.９倍希釈して、計算濃度とした。それぞれ４.３８mg／ml(ロット番号002-119-3)、３.２２mg／ml(ロット番号002-119-2)および２.１１mg／ml(ロット番号002-119-1)。全ての製剤を濾過し、未希釈ロットのART-207含量およびその希釈誘導物をＨＰＬＣで分析した(表１１ｂ)。
【表５６】
2016530331.tif 000071
ＤＦ＊  −  希釈計数、ＴＳＰＭ＊＊  −  総固形プレミックス。
【０１２５】
開始ロット番号002-119-4(６.１３mg／mlのART-207)から、ART-207の目標濃度までの希釈は、得られたロット002-119-3、002-119-2および002-119-1の脂質含量の引き続く低下を生じる。“希釈対独立製剤”は、次のものに基づいた。ａ)同一脂質製剤を使用するART-207の異なる濃度の独立製剤は、顕著に異なる粒子径を有するエマルジョンを生じるが、一方希釈は粒子径に影響しない(表１１ｄ)；この方法は、類似粒子径に取り込まれたART-207の目標濃度を達成し、そしてｂ)脂質の毒性作用が生じるならばシリーズにおける最高脂質含量を有し、脂質含量がロット番号002-119-4(６.１３mg／mlのART-207)と同一である媒体対照で十分に表されるであろう(表１１ｃ)。
【表５７】
2016530331.tif 000072
ＤＦ＊  −  希釈計数；ＴＳＰＭ＊＊  −  総固形プレミックス；ＲＥＭ＊＊＊  −  得られたエマルジョン
【表５８】
2016530331.tif 000073
ＤＦ＊  −  希釈計数；ＴＳＰＭ＊＊  −  総固形プレミックス；ＲＥＭ＊＊＊  −  得られたエマルジョン
【０１２６】
約２０mlの次のロットを試験場所に輸送した；ロット番号002-118-00、無薬物製剤(媒体対照)；ロット番号002-119-4、製剤化ART-207(６.１３mg／ml)；ロット番号002-119-3、製剤化ART-207(３.９８mg／ml)；ロット番号002-119-2、製剤化ART-207(３.０２mg／ml)；ロット番号002-119-1、製剤化ART-207(２.０１mg／ml)。各ロットの１０mlサンプルを保持した。エマルジョン調製物中のART-207定量化は、“タキサン＿試験.M, Rev 1”法を改善した(上記“分析的開発”セクション参照)。輸送したサンプルの修正ART-207濃度は表１１ｆである。表１１ｆは、タキサン＿試験.M, Rev 1法で測定したART-207の濃度が全試験ロットで顕著に高いことを示す。
【表５９】
2016530331.tif 000074
【０１２７】
動物の処置を２０１３年１月２２日から２０１３年１月２６日まで行った。動物試験で使用した２０１３年２月０９日修正投与量を表１１ｇに示す。
【表６０】
2016530331.tif 000075
【０１２８】
ＭＴＤ試験は２個の大きな相からなる。
連続５日間の処置(Ｑ１Ｄ×５)：パクリタキセル、製剤化ART-207および媒体対照(無薬物製剤)の静脈注射による投与；腫瘍サイズおよびマウス体重評価；バイタルサイン評価；処置終了後２週間の動物のモニタリング；腫瘍サイズおよびマウス体重評価；およびバイタルサイン評価。投与したエマルジョン溶液に残った物質を、処置相終了後にアーバー・セラピューティクスに返送した。ART-207含量は、ＭＴＤ試験で使用した全製剤で評価した。返送した物質の評価は、保管した物質と一緒に実施した。
【０１２９】
表１１ｈは、ＭＴＤ試験場所から返送されたタキサン＿試験.M Rev. 1法で評価した物質を示し、保持した物質は、全試験ロットで類似の薬物含量を有する。データは、製剤化ART-207の良好な安定性および研究場所での適切な物質取り扱いを示す。
【表６１】
2016530331.tif 000076
【０１３０】
ＭＴＤ試験で残った物質およびアーバーに返送された物質の粒子径をその輸送日に評価した。返送された物質の評価を保管した物質と共に実施した。安定性データを表１３ｋに示し、０日目からＭＴＤ処置相終了までの粒子径のモニタリングを反映する。試験場所から返送されたエマルジョンの粒子径は、保持された物質よりわずかに高かった。０日目(製造日)から、媒体対照の粒子径は変わらなかった。ART-207含有粒子で顕著なサイズ増加が観察された(表１１ｉ)。
【表６２】
2016530331.tif 000077
【０１３１】
我々は、ＭＴＤ試験場所および保管した物質両者の、ＭＴＤ試験に使用したエマルジョンの粒子径のモニタリングを、製造日から開始して２３日間延長した。図２１は、媒体対照の粒子径がモニタリングの間変化せず、ART-207含有粒子では有意なサイズ増加が観察されたことを示す。
【表６３】
2016530331.tif 000078
【０１３２】
現在の脂質製剤および処理技術は、目標量の薬物取り込みおよび許容される粒子径への縮小を可能にするが、得られた粒子の安定性は問題のままである。全ての薬物含有脂質製剤で時間と共に顕著なサイズの増加が観察された。ＭＴＤ(ＡＴＬ−１およびＡＴＬ−２)試験で製剤化ART-207は、有効性、選択性および明瞭な毒性副作用の不在を示した(正式報告“EVALUATION OF THE TOLERABILITY OF FORMULATED ART-207 WHEN ADMINISTERED INTRAVENOUSLY TO NONTUMORED AND TUMORED ATHYMIC NUDE MICE.” SOUTHERN RESEARCH INSTITUTE, BIRMINGHAM, AL 35255-5305)。
【０１３３】
無腫瘍担持雌無胸腺NCr-nu/nuマウスおよびヒトMDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片を皮下移植された雌無胸腺NCr-nu/nuマウスに静脈内投与したときの、製剤化ART-207の有効性および耐容性の評価(実験ＡＴＬ−２)。パクリタキセルを対照化合物として包含させた。
【０１３４】
腫瘍モデル：
４６匹のマウスに、インビボ継代由来ヒトMDA-MB-231乳房腫瘍の断片を移植した。処置開始日の腫瘍断片移植１３日目に、３０匹の動物の個々の腫瘍１０８〜６００mg重量(１０８〜６００mm３サイズ)に増殖した。選択した腫瘍を有する３０匹の動物を、１３日目の全群の平均腫瘍重量が互いにできるだけ近くなるように、６処置群に割り振った(平均腫瘍重量３０５〜３１３mg範囲、中央腫瘍重量２４５〜２９４mg範囲)。実験ＡＴＬ−１およびＡＴＬ−２は、処置１日目の１日目に各々群あたり５匹の非腫瘍担持マウスを含み、計３０匹のマウスからなった。全ての処置剤を、１日目から開始して、連続５日間１日１回静脈内(ＩＶ)投与した(Ｑ１Ｄ×５)。７２.６mg／kg、４７.１mg／kg、３５.７mg／kgおよび２３.７mg／kgの製剤化ART-207投与量は、製剤化ART-207の分子量１２１９.６およびパクリタキセルの分子量８５３.９に基づきそれぞれ１５mg／kgパクリタキセル投与量の３.４ｘ、２.２ｘ、１.７ｘおよび１.１ｘモル当量である。
【０１３５】
実験ＡＴＬ−１
群１〜４の動物を、それぞれ７２.６mg／kg、４７.１mg／kg、３５.７mg／kgおよび２３.７mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207で処置し、マウスに各処置日に正確に個々の動物の体重に対して注入量が０.２１mL／２０ｇ体重として投与した。群５(エマルジョン対照)の動物は無薬物製剤で処置した(注入量０.２１mL／２０ｇ体重)。群６の動物１５mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルで処置した(注入量０.１mL／１０ｇ体重)。
【０１３６】
実験ＡＴＬ−２
群１〜４の動物を、それぞれ７２.６mg／kg、４７.１mg／kg、３５.７mg／kgおよび２３.７mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207で処置し、マウスに正確に個々の動物の体重に対して注入量が０.２１mL／２０ｇ体重として投与した。群５(エマルジョン対照)の動物は無薬物製剤で処置した(注入量０.２１mL／２０ｇ体重)。群６の動物１５mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルで処置した(注入量０.１mL／１０ｇ体重)。
【０１３７】
実験ＡＴＬ−１
製剤化ART-207でのＩＶ処置は死亡例なく耐容性であった。処置は、製剤化ART-207をそれぞれ７２.６mg／kg、４７.１mg／kg、３５.７mg／kgおよび２３.７mg／kg／注射の投与量で投与したとき、１％(０.３ｇ)、５％(１.１ｇ)、１％(０.３ｇ)および３％(０.６ｇ)の最大平均体重減少をもたらした。製剤化ART-207の最大耐性量(ＭＴＤ、処置終了１４日目まで死亡させずまたは２０％を超える体重減少を起こさない用量と定義)は、本実験で７２.６mg／kg／注射を超えた(試験したパクリタキセル投与量の３.４ｘ当量)。
【０１３８】
Ｑ１Ｄ×５スケジュール(群５)でのエマルジョン対照のＩＶ処置は死亡例または体重減少なく耐容性であった。Ｑ１Ｄ×５スケジュール(群６)での１５mg／kg／注射投与量のパクリタキセルのＩＶ処置は死亡例なく耐容性であり、６％(１.３〜１.５ｇ)の最大平均体重減少をもたらした。パクリタキセルのＭＴＤは、本実験で１５mg／kg／注射以上であった。全群の実験中の平均体重変化を図２２に示す。
【表６４】
2016530331.tif 000079
【０１３９】
図２２。マウスを６群に分けた(各群５匹のマウス)。全ての試験品を連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号５は無薬物脂質製剤(黒色点線、白四角)を投与され、群１〜４は製剤化ART-207を２３.７mg／kg、３５.７mg／kg、４７.１mg／kgおよび７２.６mg／kg投与された(黒色四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、評価日の各Ｒｘおよび媒体処置群の平均マウス体重を示す。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。本グラフにおいて、１３日目を０日または処置の最初の日と定義する。
【０１４０】
実験ＡＴＬ−２
エマルジョン対照群(群５)のヒトMDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片は５匹のマウス全てで進行的に増殖した。動物の体重は増加した。しかしながら、腫瘍重量で補正したマウス体重は、実験中有意な変化はなかった(図２３)。１匹の動物(動物１)は、腫瘍潰瘍化により２６日目に屠殺した。
【０１４１】
Ｑ１Ｄ×５スケジュールで７２.６mg／kg、４７.１mg／kg、３５.７mg／kgおよび２３.７mg／kg／注射の投与量での製剤化ART-207でのＩＶ処置(それぞれ群１〜４)は死亡例なく耐容性であった。７２.６mg／kg／注射の投与量での製剤化ART-207の投与は、最大平均体重減少４％(０.９ｇ)を生じ、２６日目および２８日目に観察された。３つの低投与量の製剤化ART-207で処置された群の動物は、実験中体重増加した。平均腫瘍重量で補正したマウス体重に、実験中有意な変化はなかったことは注目に値する(図２３)。製剤化ART-207のＭＴＤは本実験で７２.６mg／kg／注射を超えた(試験したパクリタキセル投与量の３.４ｘ当量)。
【０１４２】
製剤化ART-207での処置は、腫瘍増殖抑制に極めて有効であった。試験した全４つの投与量での製剤化ART-207の投与は、用量依存性の、統計的有意なヒトMDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片増殖阻害をもたらした。７２.６mg／kg／注射の投与量での処置は、２例で完全腫瘍退縮をもたらし、１例で動物は実験終了日である４７日目まで無腫瘍のままであった。腫瘍の増殖は、個々の動物の腫瘍体積倍増に到達する時間を比較したとき、エマルジョン対照群における腫瘍の増殖と統計的に差があった(公式ＳＲＩ報告も参照のこと)。腫瘍増殖は処置終了後も阻止され続けた。７２.６mg／kg／注射の投与量で処置した群の５個の腫瘍のうち３個が、試験が終了するまで抑制され続け、残りの群の腫瘍は、用量応答方式で、処置後種々の時間に再び増殖し始め、投与量が多ければ多いほど、再増殖まで長かった。
【０１４３】
Ｑ１Ｄ×５スケジュールでの１５mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルでのＩＶ処置(群６)は毒性であり、２匹の動物が死亡し(両方とも１９日目に死亡)、さらに２匹の動物を瀕死となったため屠殺した(２０日目および２１日目)。処置は、最後の処置の日である１７日目に平均体重減少１％(０.３ｇ)をもたらしたが、個々の動物は死亡前にさらに体重を減らした。パクリタキセルのＭＴＤは本実験で１５mg／kg／注射以下であった。生存動物の腫瘍は処置に応答し、重量が１３日目の１８０mgから４７日目の３２mgに減少した。全群の実験中の平均体重変化を図２３にグラフで示す。
【表６５】
2016530331.tif 000080
【０１４４】
図２３。マウスを６群に分けた(各群５匹のマウス)。全ての試験品を連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号５は無薬物脂質製剤(黒色点線、白四角)を投与され、群１〜４は製剤化ART-207を２３.７mg／kg、３５.７mg／kg、４７.１mg／kgおよび７２.６mg／kgを投与された(黒色四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、評価日の各Ｒｘおよび媒体処置群の平均マウス体重を示す。腫瘍担持マウス体重を腫瘍の重量で補正した。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。本グラフにおいて、１３日目を０日または処置の最初の日と定義する。
【０１４５】
製剤化ART-207での処置、エマルジョン対照およびパクリタキセルに対するＳＣ移植ヒトMDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片の応答を、図２４に平均腫瘍重量変化としてグラフとして示す。
【表６６】
2016530331.tif 000081
【０１４６】
図２４。マウスを６群に分けた(各群５匹のマウス)。全ての試験品を連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号５は無薬物脂質製剤(黒色点線、白四角)を投与され、群１〜４は製剤化ART-207を２３.７mg／kg、３５.７mg／kg、４７.１mg／kgおよび７２.６mg／kgを投与された(黒色四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。“０日目”(点線)は、処置の最初の日に評価した全群の平均腫瘍重量を表す。曲線の各点は、各Ｒｘおよび媒体処置群の対応する評価日の平均腫瘍重量を表す。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。本グラフにおいて、１３日目を０日または処置の最初の日と定義する。
【０１４７】
動物生存(図２５)。パクリタキセルで処置した群において、５匹中４匹の動物が、該薬物の明白な毒性により１１日目より前に死亡した。媒体処置群において、４匹の動物を、腫瘍サイズが過度に大きくなったために１８日目に屠殺した。製剤化ART-207の最低(２３.７mpk)投与量で処置した群において、４匹の動物を大きな腫瘍のために屠殺したが、３０日目であった。３５.７mpk、４７.１mpkおよび７２.６mpkのART-207で処置した動物は、パクリタキセルを投与された動物とは対照的に、処置の全経過中、生存し、活動的であり、体重減少は観察されなかった。７２.６mpkのART-207群の一部マウスは、投与後１１日目に無腫瘍となり、本実験の最後まで腫瘍がないままであった(図２５)。
【表６７】
2016530331.tif 000082
【０１４８】
図２５。マウスを６群に分けた(各群５匹のマウス)。全ての試験品を、０日目から開始して連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号５は無薬物脂質製剤(黒色点線、白四角)を投与され、群１〜４は製剤化ART-207を２３.７mg／kg、３５.７mg／kg、４７.１mg／kgおよび７２.６mg／kgを投与された(黒色四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。原理証明インビボ試験の結果は、我々の化合物の、明白な毒性副作用を伴わない、標的化送達および有効性の指標である。これは、本実験で最大耐性量に到達しなかった大きな原因であった。
【０１４９】
実験１２. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-001-243)の調製
粒子径および安定性に対する添加したＰ１８８(０.２５％、Ｖ／Ｗ)の効果を試験。Ｐ１８８は、予め処理したエマルジョンロット番号002.121.4(マスターテーブル３参照)に、磁気撹拌プレート上で撹拌しながら最終濃度０.２５％(Ｖ／Ｗ)まで添加した。混合物をマイクロフルダイザーでさらに処理した。
【表６８】
2016530331.tif 000083
【０１５０】
【表６９】
2016530331.tif 000084
【０１５１】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.122.0)。
【表７０】
2016530331.tif 000085
【０１５２】
ＭＦＰ。図２６において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、約７１nmでＲ１に到達する。ＭＦＰを停止し、物質を滅菌濾過した。濾過後、粒子径の７１nmから８０nmへの増加が観察された。
【表７１】
2016530331.tif 000086
【０１５３】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 0)は５.６３mg／mlであった。これらのデータは、この製剤の調製に使用した薬物の８３.９％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１２ｃ)。得られたエマルジョンの低いART-207濃度は、さらなるＭＦ処理および処理前にＭＦを平衡化するために使用した緩衝液での考えられる希釈により説明がつくであろう。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは不安定であった。図２７および表１２ｃは、３５日で粒子径が５７日で８０nmから１９７nmに増加したことを示す。
【表７２】
2016530331.tif 000087
【０１５４】
結果は、粗エマルジョン工程後での０.２５％のＰ１８８の添加は、得られた製剤の安定性を改善しないことを示唆する。
【０１５５】
実験１３. ART-20含有エマルジョン7(ロット番号AW-001-243)の調製
得られた粒子径および安定性に対するＰ１８８(０.２５％、Ｖ／Ｗ)、ＴＧ／ART-207比減少およびさらにＣＥおよびその後のＴＣの減少の影響の試験。Ｐ１８８をＴＳＰＭに添加した。
【表７３】
2016530331.tif 000088
【０１５６】
【表７４】
2016530331.tif 000089
【０１５７】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.123.11)。
【表７５】
2016530331.tif 000090
【０１５８】
ＭＦＰ。図２８において、粒子径は、約６０℃で２０分の処理後、約６８nmでＲ１に到達する。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表１３ｃ)。濾過は粒子径に影響しなかった。残りの物質をさらに約２０℃で１０分処理した(図２８)。これにより粒子径が６４nmまで縮小し、Ｒ２と考えられた。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表１３ｃ)。濾過は、粒子径の５７nmへの顕著な縮小をもたらした。温度を６０℃に上げ、残りの物質を２０分処理した。さらなる処理は、粒子径を６６nmまで増加させ、Ｒ３に到達した。ＭＦＰを停止し、残りの物質回収し、濾過した(表１３ｃ)。濾過後に顕著なサイズ増加は観察されなかった。
【表７６】
2016530331.tif 000091
【０１５９】
ＨＰＬＣ分析。ART-207含量をエマルジョンロット番号002.123.13(タキサン＿試験.M, Rev 0)でのみ試験し、３.７１mg／mlと等しかった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の７４.２％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１３ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。図２９および表１３ｃは、ロット番号002.123.11の粒子径が５６日かけて６８nmから７３nmに増加し、ロット番号002.123.13の粒子径が５６日かけて６９nmから７０nmに増加したことを示した。エマルジョンロット番号002.123.12の粒子径は、３０日かけて５７nmから６７nmに増加した。ａ)ＴＧ含量を低下させ、続いてＰＣ／ＴＧ比を上昇することによるＴＧ／ART-207比の減少；ｂ)ＣＥおよび続いて総コレステロール含量の減少；およびｃ)ＴＳＰＭ工程でのＰ１８８(０.２５％、Ｖ／Ｗ)添加かなり安定なエマルジョンをもたらした。Ｐ１８８非存在下で、ＴＧ／ART-207およびＰＣ／ＴＧ比の同様の操作(実験番号７)は不安定エマルジョンをもたらした。高ＴＧ／ART-207および低ＰＣ／ＴＧ比でのＴＳＰＭへのＰ１８８の添加(実験番号８および１２)も、安定なエマルジョンを産生しなかった。
【０１６０】
図２８および２９において、６０℃でのＭＦ処理停止(ロット番号002.123.11および002.123.13)は、粒子径６８〜６９nmの安定なエマルジョンをもたらし、２０℃終点(ロット番号002.123.12)は、最初は小型の約５７nm粒子を生じるが、このサイズは直ぐに約６６nmに増加し、このレベルで安定化する。得られたエマルジョンロット番号002.123.13で測定したART-207含量は、高ＴＧ／ART-207および低ＰＣ／ＴＧ比を有する製剤(実験番号４〜５および１０〜１２)のもの(４.８〜６.１mg／ml)より著しく低かった(３.７mg／ml)。実験番号４〜５および１０〜１２の製剤と対照的に、この実験で得られた物質(ロット番号002.123.13)は極めて安定であった。
【０１６１】
ART-207は脂質粒子に対する不安定化効果を有する可能性があり、それゆえに、ロット番号002.123.13で達成された安定性は低薬物含量が原因である。ロット番号002.123.13の安定性と実験番号３、６および７で得られるエマルジョン(同等または低い薬物含量)の安定性の比較は、現在の物質の安定性の改善を明らかに証明する。
【表７７】
2016530331.tif 000092
【０１６２】
実験は、ＴＧ／ART-207比およびＰＣ／ＴＧ比、ＴＳＰＭ工程での０.２５％のＰ１８８の添加および処理温度は得られたエマルジョン製剤の安定性に重要であるが、これらの操作が薬物取り込みを低下させることを示す。脂質製剤の高薬物含量および高安定性の両者を達成するために、１.０を超えるＴＧ／ART-207比の徐々の増加および短鎖リン脂質の添加を考慮し得る。
【０１６３】
実験１４. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-001-243)の調製
Ｐ１８８含有製剤のART-207取り込み、得られた粒子径および安定性に対するＤＭＰＣおよびＴＧ／ART-207比低下の影響の試験。ＤＭＰＣを、質量等価のＰＣの代わりにＴＳＰＭに添加した。
【表７８】
2016530331.tif 000093
【０１６４】
【表７９】
2016530331.tif 000094
【０１６５】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.125.2)。
【表８０】
2016530331.tif 000095
【０１６６】
ＭＦＰ。図３０において、粒子径は、約６０℃で１０〜２０分の処理後、約９９nmでＲ１に到達する。温度を約２０℃に低下させた。低温でのさらなる処理は、粒子径の約１１９nm(Ｒ２)への増加を生じた。温度を約６０℃まで徐々に上げると、粒子径は６０分の処理およびＲ３到達後８４nmに縮小した。サンプルを回収し、濾過した(表１４ｃ)。濾過は、粒子径の８４nmから６７nmへの顕著な縮小をもたらした。処理および安定性に対する増加させたＰ１８８濃度の影響を試験するために、Ｐ１８８を物質の残りに最終濃度０.５％(Ｖ／Ｗ)まで添加した。約６０℃でさらに３０分のさらなる処理により粒子径変化は生じなかった。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表１４ｃも参照のこと)。濾過により、粒子径の８３nmから６６nmへの縮小が生じた。
【表８１】
2016530331.tif 000096
【０１６７】
ＨＰＬＣ分析。ART-207含量をエマルジョンロット番号002.125.22(タキサン_試験.M、Rev 0)でのみ試験し、３.９７mg／mlと同等であった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の７９%が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１４c)。ART-207含有製剤の粒子径分析。図３１および表１４ｃにおいて、５４日にわたり、ロット番号002.125.21またはロット番号002.125.22で粒子径増加は観察されなかった。
【表８２】
2016530331.tif 000097
【０１６８】
Ｐ１８８と共に短鎖リン脂質(ＤＭＰＣ)の添加および低ＴＧ／ART-207比は、安定なエマルジョンをもたらした。Ｐ１８８の０.５％(Ｖ／Ｗ)への増加は、得られたエマルジョンの安定性に影響しなかった。得られたエマルジョンロット番号002.123.22で測定したART-207含量は、ＤＭＰＣを製剤に添加していない実験番号１３で観察された３.７mg／mlと比べて高く、３.９７mg／mlであった。
【０１６９】
実験１５. 無薬物エマルジョンの調製。無薬物高リン脂質エマルジョンの粒子径および安定性に対するＰ１８８の効果の試験。
【表８３】
2016530331.tif 000098
【０１７０】
【表８４】
2016530331.tif 000099
【０１７１】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.131.2)。
【表８５】
2016530331.tif 000100
【０１７２】
ＭＦＰ。図３２において、粒子径は約６０℃で２０分の処理後４１nmに到達した。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後粒子径の変化は観察されなかった。
【表８６】
2016530331.tif 000101
【０１７３】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 1)は検出限界以下であった。無薬物製剤の粒子径分析。得られたエマルジョンは３９日安定であった(図３３および表１５ｃ)。図３３において、粒子径は最初の２日で４２nmから４５nmに増加した。３日目から３９日目までの期間に、粒子径は４５nmから４９nmに増加した。
【表８７】
2016530331.tif 000102
【０１７４】
当初の２〜３日の粒子径増加はほとんど全ての製剤で観察されており、これは高圧下で環境温度と異なる加工後のエマルジョン製剤の平衡化および安定化を反映している。
【０１７５】
実験１６. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-004-13)の調製
製剤のART-207取り込み、粒子径および安定性に対するＴＧ／ART-207比(１から１.３５まで)の徐々の増加の効果の試験。
【表８８】
2016530331.tif 000103
【０１７６】
【表８９】
2016530331.tif 000104
【０１７７】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.134.2)。
【表９０】
2016530331.tif 000105
【０１７８】
ＭＦＰ。図３４において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、約８１nmでＲ１に到達し、温度を約２０℃に低下させた。低温でのさらなる処理は、約８４nmまで粒子径を増加させた(Ｒ２)。温度の約６０℃までの上昇は、５０分の処理およびＲ３への到達後、粒子径の７６nmへの縮小をもたらした。サンプルを回収し、濾過した。濾過後、粒子径変化は観察されなかった。
【表９１】
2016530331.tif 000106
【０１７９】
ＨＰＬＣ分析。ART-207含量を得られたエマルジョンで測定し(タキサン＿試験.M, Rev 1)、４.７１mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８９％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１６ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。図３５において、７６nmから８２nmへの粒子径の初期増加が最初の２日間で起こり、その後３７日間粒子径は変化しなかった。
【表９２】
2016530331.tif 000107
【０１８０】
それゆえに、ＴＧ／ART-207比の１から１.３５への増加は、安定性に影響することなく、製剤のART-207取り込み能力を増加させた。得られた粒子は、低ＴＧ／ART-207比由来の粒子より大きかった。
【０１８１】
実験１７. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-004-13)の調製
ART-207取り込み、粒子径および得られたエマルジョンの安定性に対するＤＭＰＣおよびＴＧ／ART-207比増加(１から１.３４まで)の効果の試験。ＤＭＰＣを、質量等価のＰＣの代わりにＴＳＰＭに添加した。
【表９３】
2016530331.tif 000108
【０１８２】
【表９４】
2016530331.tif 000109
【０１８３】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.136.2)。
【表９５】
2016530331.tif 000110
【０１８４】
ＭＦＰ。図３６において、粒子径は、約６０℃で１０分の処理後、約７０nmに到達した。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表１７ｃ)。滅菌濾過後に７０nmから５８nmへの粒子径縮小が観察された。第一抵抗点(Ｒ１)には到達しなかったが、粒子径は安定性アッセイ用にサンプルを回収するには十分小さかった。残りの物質の６０℃でのさらなる処理は粒子径を変化させなかった(Ｒ１)。温度を約２０℃に低下させた。低温でさらに３０分の処理は粒子径を変化させなかった(Ｒ２)。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表１７ｃ参照)。濾過は、粒子径の６８nmから４２nmへの劇的な縮小をもたらした。温度を６０℃に上げ、残りの物質をさらに２０分処理した。さらなる処理は、粒子径の６８nmから６６nmへの縮小をもたらし、Ｒ３に到達した。ＭＦＰを停止し、残りの物質回収し、濾過した(表１７ｃ)。濾過後、粒子径の６６nmから５９nmへの縮小が観察された。
【表９６】
2016530331.tif 000111
【０１８５】
ＨＰＬＣ分析。ART-207含量を全ての得られたエマルジョンで測定し(タキサン＿試験.M, Rev 1)、４.３mg／ml(ロット番号002.136.21)、４.２２mg／ml(ロット番号002.136.22)および４.５mg／ml(ロット番号002.136.23)であった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８１.９、８０.４および８５.７％が、それぞれロット002.136.21、002.136.22および002.136.23の脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１７ｃ)。
【０１８６】
ART-207含有製剤の粒子径分析。図３７において、ロット番号002.136.21および002.136.23について最初の２日で観察される粒子径の最初の１〜３nmの増加の後、粒子径はその後３４日変化しなかった。エマルジョンロット番号002.136.22の粒子径は、保存した最初の２日で７nm増加し、３４日で４９nmから５５nmまで増加した。得られたエマルジョン全て、安定として特徴付けることができる。
【表９７】
2016530331.tif 000112
【０１８７】
高温での処理は、低温処理物質と比較して大きな粒子となったが、約６０℃で処理した物質の安定性は、約２０℃処理エマルジョンと比較して高い。６０℃で処理したロット番号002.136.21および002.136.23は、モニタリングの全経過中、顕著により安定であったが、ロット番号002.136.22(約２０℃で処理)は１日目に粒子径が４２nmから５３nmに増加し始め、１０日目に漸く安定化した(図３７)。ＴＧ／ART-207比の１から１.３４への増加およびＤＭＰＣの添加は、実験番号１６で得られたエマルジョンと比較して、小さな粒子と、得られた製剤の本質的に同一のART-207取り込み能力および安定性をもたらした。
【０１８８】
実験１８. 無薬物脂質エマルジョンの調製
無薬物製剤の粒子径および安定性に対するホスホチジルセリン(ＰＳ)の効果の試験。ＰＳを、ＤＭＰＣおよびＰ１８８の代わりに製剤成分として使用し得る。
【表９８】
2016530331.tif 000113
【０１８９】
【表９９】
2016530331.tif 000114
【０１９０】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.137.3)。
【表１００】
2016530331.tif 000115
【０１９１】
ＭＦＰ。図３８において、粒子径は、約６０℃で２０分の処理後、４９nmに達した。ＭＦＰを停止し、物質を濾過した。濾過後粒子径の変化は観察されなかった。
【表１０１】
2016530331.tif 000116
【０１９２】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 1)は検出限界以下であった。無薬物製剤の粒子径分析。得られたエマルジョンは安定であった。３３日にわたり粒子径の顕著な増加はなかった(図３９および表１８ｃ)。
【表１０２】
2016530331.tif 000117
【０１９３】
実験１９. ART-207含有脂質エマルジョン(ロット番号AW-004-13)の調製。ART-207含有製剤の粒子径および安定性に対するホスホチジルセリン(ＰＳ)の影響を試験した。Ｐ１８８とＤＭＰＣの組み合わせおよびまた低い(１.３４)ＴＧ／ART-207比を実験番号１７で使用して、得られたエマルジョンの安定性および目標粒子径を達成した。我々はＰＳを、Ｐ１８８およびＤＭＰＣを含まず、高い(２.７)ＴＧ／ART-207比を有するＴＳＰＭに添加した。
【表１０３】
2016530331.tif 000118
【０１９４】
【表１０４】
2016530331.tif 000119
【０１９５】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.137.4)。
【表１０５】
2016530331.tif 000120
【０１９６】
ＭＦＰ。図４０において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、約８６nmでＲ１に到達した。粒子径が目標にはるかに及ばなかったためサンプルを回収せず、温度を約２０℃に低下させた。８６nmから５０nmへの粒子径縮小が、約２０℃でのさらなる処理の間にに観察された。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表１９ｃ)。濾過後、粒子径の変化は観察されなかった。第一抵抗点(Ｒ１)には到達しなかったが、粒子径は安定性アッセイ用にサンプルを回収するには十分小さかった(Ｒ２)。温度を６０℃に上げ、残りの物質をさらに２０分処理した。粒子径の５０nmから８２nmへの増加があり、Ｒ３に到達した。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(図４３および表１９ｃ)。濾過後、粒子径の変化は観察されなかった。温度を約２５℃に下げ、残りの物質を２０分さらに処理すると、粒子径は８２nmから５３nmに縮小し、Ｒ４に到達した。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、滅菌濾過した(図４０および表１９ｃ)。濾過後、粒子径の変化は観察されなかった。
【表１０６】
2016530331.tif 000121
【０１９７】
ＨＰＬＣ分析。ART-207含量を全ての得られたエマルジョンで測定し(タキサン＿試験.M, Rev 1)、４.７９mg／ml(ロット番号002.137.41)、５.０１mg／ml(ロット番号002.137.42)および４.８９mg／ml(ロット番号002.137.43)であった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の９１.２、９５.４および９３.１％が、それぞれロット002.137.41、002.137.42および002.137.43の脂質粒子に取り込まれたことを示した(表１９ｃ)。
【０１９８】
ART-207含有製剤の粒子径分析。図４１および表１９ｃは、高ART-207取り込み能力にも関わらず、全ての得られたエマルジョンは不安定であったことを示した。３３日後、粒子径は全ての処理ロットで増加した。
【表１０７】
2016530331.tif 000122
【０１９９】
高温での処理は、低温処理と比較して大きな粒子をもたらしたが、約６０℃で処理した物質の安定性は約２０℃処理エマルジョンと比較して高い。例えば、６０℃で処理したロット番号002.137.42は保存１８日間比較的安定であるが、ロット番号002.137.41および002.137.43は１日目から粒子径が増加した(図４１)。このＰＳ含有製剤の薬物取り込み能力は、おそらく高(２.７)ＴＧ／ART-207比のために高い。２.５％(Ｗ／Ｗ)の負に荷電したＰＳの高ＴＧ／ART-207比を有する物質への添加は得られたエマルジョンの安定性を改善しない。
【０２００】
実験２０． 無薬物エマルジョンの調製。無薬物製剤の粒子径および安定性に対するＰ１８８、ＤＭＰＣおよび低ＴＧの影響の試験。
【表１０８】
2016530331.tif 000123
【０２０１】
【表１０９】
2016530331.tif 000124
【０２０２】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.137.3)。
【表１１０】
2016530331.tif 000125
【０２０３】
ＭＦＰ。図４２は、粒子径が、約６０℃で２０分の処理後、３９nmに到達したことを示す。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後粒子径変化は示されなかった。
【表１１１】
2016530331.tif 000126
【０２０４】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 1)は検出限界以下であった。無薬物製剤の粒子径分析。得られたエマルジョンは安定であった。粒子径の３８nmから４２.５nmへの有意ではない増加が２７日で観察された(図４３および表２０ｃ)。
【表１１２】
2016530331.tif 000127
【０２０５】
実験２１. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-004-13)の調製。実験番号１７を繰り返して、ART-207取り込み、粒子径および得られたエマルジョンの安定性に対するＤＭＰＣ／Ｐ１８８およびＴＧ／ART-207比１.３４の有利な効果を確認した。
【表１１３】
2016530331.tif 000128
【０２０６】
【表１１４】
2016530331.tif 000129
【０２０７】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.140.2)。
【表１１５】
2016530331.tif 000130
【０２０８】
ＭＦＰ。図４４において、粒子径は、約６０℃で２０分の処理後、約６８nmでＲ１に到達した。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(表２１ｃも参照のこと)。濾過後、粒子径の６８nmから５８nmへの縮小が示された。温度を約２３℃に下げ、残りの物質をさらに２０分処理した。これは粒子径の６５nmの縮小をもたらし、Ｒ２に到達した。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(図４４および表２１ｃ)。濾過後、粒子径の６５nmから４６nmへの縮小が示された。次いで温度を約６０℃まで上げ、残りの物質を２０分さらに処理すると粒子径の６８nmへの増加がもたらされ、Ｒ３に到達した。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(図４４および表２１ｃ)。濾過後、粒子径の６８nmから５９nmへの縮小が観察された。温度を約２０℃に下げ、残りの物質をさらに２０分処理した。これはＲ４に到達下粒子径を変化させなかった。ＭＦＰを停止し、サンプルを回収し、濾過した(図４４および表２１ｃ)。濾過後、粒子径が６７nmから４９nmへ縮小した。
【表１１６】
2016530331.tif 000131
【０２０９】
ＨＰＬＣ分析。ART-207含量を全ての得られたエマルジョンで測定し(タキサン＿試験.M, Rev 1)、４.４２mg／ml(ロット番号002.140.21)、４.１mg／ml(ロット番号002.140.22)、４.５mg／ml(ロット番号002.140.23)および４.３５mg／ml(ロット番号002.140.24)であった。データは、それぞれロット002.140.21、002.140.22、002.140.23および002.140.24で、この製剤の調製に使用した薬物の８４.２％、７８.１％、８５.７％および８２.９％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２１ｃ)。
【０２１０】
ART-207含有製剤の粒子径分析。図４５において、６０℃で処理したエマルジョンロット番号002.140.21および002.140.23は高度に安定であった。最初の約５〜７nm粒子径増加(保存の最初の５日)がロット番号002.140.22および002.140.24で観察された。いずれのロットも、６日目までに約５３〜５５nmで安定化した。
【表１１７】
2016530331.tif 000132
【０２１１】
高温での処理は、低温処理と比較して大きな粒子をもたらすが、約６０℃で処理した物質の安定性は約２０℃処理エマルジョンと比較して高かった。粒子径および安定性の観点で、この結果は実験番号１７の結果に類似した。ロット番号002.140.2製剤の薬物取り込み能力は、類似のＴＧ／ART-207比を有する他の実験と類似した。ＴＧ／ART-207比約１.３〜１.４の範囲は、再現性のあるART-207取り込み能力および得られたエマルジョンの安定性をもたらした。
【０２１２】
有効性および安定性試験のための無薬物およびART-207含有製剤調製
実験２２. 無薬物エマルジョン媒体対照の調製。有効性試験のための無薬物エマルジョンの調製。
【表１１８】
2016530331.tif 000133
【０２１３】
【表１１９】
2016530331.tif 000134
【０２１４】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.151.5)。
【表１２０】
2016530331.tif 000135
【０２１５】
ＭＦＰ。図４６において、粒子径は約６０℃で２０分の処理後４１nmに到達した。ＭＦＰを停止し、物質を濾過した。濾過後、粒子径の４１nmから３７nmへの縮小が観察された。
【表１２１】
2016530331.tif 000136
【０２１６】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は検出限界以下であった。無薬物製剤の粒子径分析。得られたエマルジョンは３３日間安定であった。図５０において、粒子径は３３日間変化しなかった。次の９日(計４２日)、粒子径は４７nmに増加した(図４７および表２２ｃ)。
【表１２２】
2016530331.tif 000137
【０２１７】
実験２３. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-004-24)の調製
有効性試験用ART-207含有エマルジョン調製物の製造。
【表１２３】
2016530331.tif 000138
【０２１８】
【表１２４】
2016530331.tif 000139
【０２１９】
１５０mlの粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.151.8)。
【表１２５】
2016530331.tif 000140
【０２２０】
ＭＦＰ。図４８において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、７８nmに到達する。さらに３０分の約６０℃での処理は粒子径を有意に縮小させず、Ｒ２と考えられた。温度を２０℃に下げ、さらに４５分処理した。２０℃での処理は粒子径の増加をもたらし、Ｒ２と考えられた。ＭＦＰを停止し、物質を滅菌濾過した。濾過後、粒子径の７６nmから６１nmへの縮小が観察された。
【表１２６】
2016530331.tif 000141
【０２２１】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は５.２６mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の９８.９％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２３ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは安定であった。図４９および表２３ｃにおいて、粒子径は３３日にわたり変化しなかった。翌９日間(計４２日)、約３.５〜４nmの増加が観察された。
【表１２７】
2016530331.tif 000142
【０２２２】
１.３１のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＭＦ処理は、９８.９％のART-207取り込み能力を有する安定なエマルジョンをもたらした。
【０２２３】
実験２４. 有効性試験用ART-207含有バックアップエマルジョン(ロット番号AW-004-24)の調製。有効性試験候補としてＴＧ／ART-207比を１.４に上げたART-207含有エマルジョンの製造。
【表１２８】
2016530331.tif 000143
【０２２４】
【表１２９】
2016530331.tif 000144
【０２２５】
１３０mlの粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.153.1)。
【表１３０】
2016530331.tif 000145
【０２２６】
ＭＦＰ。図５０は、粒子径が、約６０℃で３９分の処理後、７８nmに達することを示す。温度を２０℃に下げ、物質をさらに３９分処理した。２０℃でのＭＦ処理は粒子径を縮小させず、Ｒ２と考えられた。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の７８nmから６６nmへの縮小が示された。
【表１３１】
2016530331.tif 000146
【０２２７】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.６８mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の９３.５％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２４ｃ)。
【０２２８】
ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは安定であった。図５１および表２４ｃは、粒子径が４１日にわたり有意に変化しなかったことを示す。
【表１３２】
2016530331.tif 000147
【０２２９】
１.３９のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＭＦ処理は、９３.５％のART-207取り込み能力を有する安定なエマルジョンをもたらした。
【０２３０】
実験２５. 有効性試験用ART-207含有バックアップエマルジョン(ロット番号AW-004-24)の調製。有効性試験の候補としてさらに１.５まで上げたＴＧ／ART-207比を有するART-207含有エマルジョンを製造するため。
【表１３３】
2016530331.tif 000148
【０２３１】
【表１３４】
2016530331.tif 000149
【０２３２】
１３０mlの粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.153.2)。
【表１３５】
2016530331.tif 000150
【０２３３】
ＭＦＰ。図５２において、粒子径は、約６０℃で５２分の処理後、７２nmに到達する。続いて、温度を２０℃に下げ、物質をさらに２６分処理した。２０℃でのＭＦ処理は、粒子径を６６nmへわずかに縮小させ、Ｒ２に到達した。ＭＦＰを停止し、物質を滅菌濾過した。濾過後、粒子径の６６nmから５３nmへの縮小が観察された。
【表１３６】
2016530331.tif 000151
【０２３４】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.３８mg／mlであった。この製剤の調製に使用した薬物の９２.２％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２５ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンはかなり安定であった。図５３および表２５ｃは、４９日で粒子径が５３nmから６２nmに増加したことを示す。
【表１３７】
2016530331.tif 000152
【０２３５】
１.４７のＴＧ／ART-207比を有する製剤ミックスのＭＦ処理は、９２.２％のART-207取り込み能力を有する安定なエマルジョンをもたらした。有効性試験のためのエマルジョンの選択。ART-207含有エマルジョンロット番号002.151.8を、粒子径(６２nm)およびART-207含量(５.２６mg／ml)に基づき有効性試験用に選択した。無薬物エマルジョンロット番号002.151.5を、媒体対照として有効性試験用に選択した(表２５ａおよび２５ｄ)。
【表１３８】
2016530331.tif 000153
【０２３６】
ART-207の目標投与量。有効性試験のために計画される製剤化ART-207の投与量は次のとおりであった。１０５.２mg／kg、７８.９mg／kgおよび５２.６mg／kg(mpk)。全ての試験品をマウスに静脈内(ｉｖ)注射で投与した。計画される投与量を達成するための注射量を表２５ｅに示す。
【表１３９】
2016530331.tif 000154
【０２３７】
約４５mlのロット番号002.151.5および約(≧)８０mlのロット番号002.151.8を試験場所に輸送した：ロット番号002.151.5  −  無薬物製剤(媒体対照)；ロット番号002.151.8  −  製剤化ART-207(５.２６mg／ml)。各ロットの約１０mlサンプルを保管した。
【０２３８】
有効性試験は、ＭＴＤ試験に関して上に記載したものに類似する２個の大きな相からなる：残った物質を、処置終了後アーバー・セラピューティクスに返送した。有効性試験で使用した全製剤について、ART-207含量を評価した(タキサン＿試験.M, Rev 2)。返送された物質の評価は、保管した物質と一緒に実施した。表２５ｅは、製造日に評価した物質、試験場所から戻された物質および保持された物質が、全試験ロットで類似する薬物含量を有したことを示す。データは、製剤化ART-207の良好な安定性およびまた試験場所での適切な物質取り扱いを示す。
【表１４０】
2016530331.tif 000155
【０２３９】
有効性試験で残った物質およびアーバーに戻された物質の粒子径を評価した。返送された物質の評価は、保管した物質と一緒に実施した。安定性データを表２５ｆに示し、４２日間の粒子径の追跡を反映する。試験場所から戻された無薬物エマルジョンの粒子径は、保管した物質のものと同一であった。試験場所から戻されたART-207含有エマルジョンの粒子径は、保管した物質より１０nm大きかった。
【表１４１】
2016530331.tif 000156
【０２４０】
我々は、試験場所およびアーバーで保管した物質両者の、有効性試験に使用したエマルジョンの粒子径のモニタリングを、製造日から開始して５５日間延長した。図５４は、媒体対照の粒子径がこの期間の間変化せず、ART-207含有粒子は４２日安定であったことを示す。４２日目から開始するART-207含有エマルジョンの粒子径増加が観察された。ART-207エマルジョンの可能性のある細菌汚染。(以前にモニターしたエマルジョンは、取り扱いにより汚染されたとき、類似する急速な粒子径増加を示した。)
【表１４２】
2016530331.tif 000157
【０２４１】
４２日目から始まるART-207含有エマルジョンの粒子径変化が観察されたにも関わらず、試験場所に／から輸送されたエマルジョンおよび保持されたサンプルのいずれも、動物処置期間中安定であった。ART-207含有エマルジョンでの動物処置は、製造日から２２日経過後完了した。試験ＡＴＬ−３で、製剤化ART-207は、パクリタキセル処置動物と比較して、同等または高い腫瘍抑制効果を示し、体重減少が有意に少なく、動物生存率の２倍増加を提供した(正式報告“EVALUATION OF THE ANTITUMOR EFFICACY OF FORMAULTED ART-207 WHEN ADMINISTERED INTRAVENOUSLY TO ATHYMIC NUDE MICE IMPLANTED SUBCUTANEOUSLY WITH HUMAN MDA-MB-231 MAMMARY TUMOR XENOGRAFTS.”  Southern Research Institute, Birmingham, AL 35255-5305も参照のこと)
【０２４２】
ヒトMDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片を移植皮下(ＳＣ)した雌、無胸腺NCr-nu/nuマウスに２種の異なるスケジュールで投与したときの、製剤化ART-207での静脈内(ＩＶ)処置の抗腫瘍活性を評価するために実験ＡＴＬ−３を実施した。パクリタキセルを対照化合物として包含させた。
【０２４３】
腫瘍モデル：
１５８匹のマウスに、インビボ継代由来のヒトMDA-MB-231乳房腫瘍の断片を移植した。処置開始日である腫瘍断片移植１０日目に９０匹の動物の個々の腫瘍は８８〜２１６mg重量(８８〜２１６mm３サイズ)に増殖した。選択した９０匹の腫瘍を有する動物を、１０日目の全群の平均腫瘍重量が互いにできるだけ近くなるように、９処置群に割り当てた(平均腫瘍重量１４７〜１５４mg範囲、中央腫瘍重量１４４〜１５３mg範囲)。５.２６mg／mL製剤を異なる注射量で投与することにより、種々の製剤化ART-207投与量を達成した。１０５.２mg／kg、７８.９mg／kgおよび５２.６mg／kgの製剤化ART-207投与量は、製剤化ART-207の分子量１２１９.６およびパクリタキセルの分子量８５３.９に基づき、それぞれ１５mg／kgのパクリタキセル投与量の４.９ｘ、３.７ｘ、２.５ｘモル投与量であった。時点は、製剤化ART-207、媒体対照およびパクリタキセルでの処置開始日から開始して示す。
【０２４４】
試験設計：
本試験は、処置開始日に群あたり１０匹のマウスの９群の、計９０匹のヒトMDA-MB-231乳房腫瘍担持マウスからなり、群１の０日目マウスは、製剤化ART-207処置を１１日目以降追加するまで未処置であった：７８.９mg／kg／注射投与量の製剤化ART-207を、１１〜１５日目まで連続５日間、１日１回(Ｑ１Ｄ×５)静脈内(ＩＶ)投与した。群２、３および４の動物は、それぞれ１０５.２mg／kg、７８.９mg／kgおよび５２.６mg／kg／注射の投与量で、０日目に開始してＱ１Ｄ×５スケジュール(０〜４日目)でＩＶ投与される製剤化ART-207で処置した。群５(エマルジョン対照)の動物を、無薬物製剤で０日目から開始するＱ１Ｄ×５スケジュールでＩＶ処置した。群６の動物は、１５mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルで、０日目から開始するＱ１Ｄ×５スケジュールでＩＶ処置した。群７の動物は、７８.９mg／kg／注射の投与量で、０日目から開始して４日毎(０日目、４日目および８日目)の３回の注射(Ｑ４Ｄ×３)でＩＶ投与する製剤化ART-207で処置した。群８の動物(エマルジョン対照)を、無薬物製剤で０日目から開始してＱ４Ｄ×３スケジュールでＩＶ処置した。群９の動物を、１８.９mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルで０日目に開始して、Ｑ４Ｄ×３スケジュールでＩＶ処置した。
【０２４５】
Ｑ１Ｄ×５スケジュール：１０５.２mg／kg／注射の投与量でのＱ１Ｄ×５スケジュールの製剤化ART-207でのＩＶ処置(群２)は致死的であり、１０匹中８匹の動物を死亡させ(５日目および６日目に死亡)、さらに１匹の動物は５日目に瀕死であるために屠殺した。処置は、４日目に観察された８％(１.９ｇ)の最大平均体重減少を伴った。本群で生存したマウスの１匹は、５６日目に無腫瘍であった(図５５〜５７)。
【０２４６】
７８.９mg／kg／注射の投与量でのＱ１Ｄ×５スケジュールの製剤化ART-207でのＩＶ処置(群３)は毒性であり、１０匹中６匹の動物を死亡させ(５日目および６日目に死亡)、４日目に７％(１.５ｇ)の最大平均体重減少が観察された。４匹の生存マウスの腫瘍の増殖は、製剤化ART-207処置により抑制され、そのうち２匹の動物は５６日目に無腫瘍であり、残りは５６日目に腫瘍重量３２〜４０mgであった(図５５〜５７)。
【０２４７】
５２.６mg／kg／注射の投与量でのＱ１Ｄ×５スケジュールの製剤化ART-207でのＩＶ処置(群４)は死亡例なく耐容性であり、４日目に観察される２％(０.４ｇ)の最大平均体重減少を伴った。５２.６mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207での処置は、MDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片の増殖阻止に極めて有効であった。処置は、９匹の完全腫瘍退縮をもたらし、そのうち６匹の動物は、５６日目に無腫瘍のままであった。５２.６mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207で処置した群の腫瘍の増殖は、個々の動物の腫瘍体積倍増に到達する時間を比較したとき、対照群の腫瘍の増殖と統計学的に異なった(群１対群４：Ｐ＜０.００１)(図５５〜５７)。
【０２４８】
Ｑ１Ｄ×５スケジュールのエマルジョン対照でのＩＶ処置(群５)は死亡例または平均体重減少なく耐容性であった。中央腫瘍は、９.２日で３個の腫瘍が体積倍増に達し、１１日目目に１,６８０mg重量に達した。未処置対照群とＱ１Ｄ×５スケジュールでのエマルジョン対照処置群の腫瘍の増殖は、個々の動物の３個の腫瘍が体積倍増に到達する時間を比較したとき、統計学的に異ならなかった(群１対群５：Ｐ＝０.８１０)(図５５〜５７)。
【０２４９】
Ｑ１Ｄ×５スケジュールでの１５mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルでのＩＶ処置(群６)は、１０日匹中１匹の動物を死亡させた(２日目に死亡)。さらに１匹の動物を運動失調により１２日目に屠殺した。処置は、６日目に観察される１０％(２.２ｇ)の平均体重減少をもたらした。１５mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルでの処置は、MDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片の増殖阻止に有効であった。処置は５匹の完全腫瘍退縮をもたらし、そのうち４匹の動物は、５６日目に無腫瘍のままであった。１５mg／kg／注射の投与量でＱ１Ｄ×５スケジュールのパクリタキセルで処置した群の腫瘍の増殖は、個々の動物の腫瘍体積倍増に到達する時間を比較したとき、対照群の腫瘍の増殖と統計学的に異なった(群１対群６：Ｐ＜０.００１)(図５５〜５７)。いずれもＱ１Ｄ×５スケジュールでＩＶ投与したとき、５２.６mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207で処置した群(群４)の腫瘍の再増殖は１５mg／kg／投与量でのパクリタキセルで処置した群(群６)より遅く(群４の＞４５.９日の中央腫瘍増殖遅延、５６日目に６匹の無腫瘍マウス対群６の３１.８日の中央腫瘍増殖、５６日目に４匹の無腫瘍マウス)；この腫瘍増殖の差異は、個々の動物の腫瘍体積倍増に到達する時間を比較したとき、２群間で統計学的に差はなかった(群４対群６、Ｐ＝０.１３３)(図５５)。
【表１４３】
2016530331.tif 000158
【０２５０】
図５５  マウスを５群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を、０日目から開始して連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号２〜４は、１０５.２mg／kg(緑色)、７８.９mg／kg(赤色)および５２.６mg／kg(黄色)の製剤化ART-207を投与された。群番号５は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、対応する評価日の各薬物および媒体処置群の平均腫瘍重量を示す。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。
【０２５１】
【表１４４】
2016530331.tif 000159
図５６  マウスを５群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を、０日目から開始して連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号２〜４は、製剤化ART-207の１０５.２mg／kg(緑色)、７８.９mg／kg(赤色)および５２.６mg／kg(黄色)を投与された。群番号５は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、評価日の各薬物および媒体処置群の平均マウス体重を示す。腫瘍担持マウス体重を腫瘍の重量で補正した。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。
【０２５２】
【表１４５】
2016530331.tif 000160
図５７  マウスを６群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を、０日目から開始して連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号２〜４は、製剤化ART-207の１０５.２mg／kg(緑色)、７８.９mg／kg(赤色)および５２.６mg／kg(黄色)を投与された。群番号５は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。群番号６は、１５mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、対応する評価日の各薬物および媒体処置群の平均腫瘍重量を示す。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。
【０２５３】
高用量(７８.９mg／kg)ART-207の毒性に対する腫瘍サイズの影響を明確にし、進行腫瘍の増殖抑制に対する製剤化ART-207の能力を試験するために、平均腫瘍サイズ約１４６０mgのマウスでの実験を実施した。未処置対照群(群１)のヒトMDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片は、全１０匹のマウスで１１日目まで徐々に増殖した。動物は１１日目まで体重が増加した。中央腫瘍は１０.１日に３個の腫瘍が体積倍増に達し、１１日目に１,４６１mg(平均群腫瘍重量)重量に達した(公的報告参照)。３匹の動物を１１日目に腫瘍潰瘍化のため屠殺した。残った７匹のマウスを、１１日目に開始するＱ１Ｄ×５スケジュールで７８.９mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207でＩＶ処置した。７匹中２匹の動物が死亡し(１８日目に死亡)、動物は、１８日目に観察される１５％(３.５ｇ)の最大平均体重減少を経験した(図５８)。本群の製剤化ART-207投与に関係する死亡率は、同じ投与量の群５での製剤化ART-207の投与と関係する死亡率(１０匹中、６匹のマウス死亡、６０％)より低かった(７匹中、２匹のマウス死亡、２９％)(表２５ｇ)。
【表１４６】
2016530331.tif 000161
【０２５４】
【表１４７】
2016530331.tif 000162
図５８。マウスを２群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を、０日目から開始して連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号１は０日目から１１日目まで注射を受けておらず、その後新しい７８.９mg／kgでのＱ１Ｄ×５が開始された(黒線、白四角)。群番号５は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。曲線の各点は、評価日の各薬物および媒体処置群の平均マウス体重を示す。腫瘍担持マウス体重を腫瘍の重量で補正した。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。製剤化ART-207処置は腫瘍増殖を有効に阻止した：中央腫瘍重量は１１日目の１,０２９mg(７匹のマウスに基づく)から６０日目の１０４mgに減少した(図５９)。
【０２５５】
【表１４８】
2016530331.tif 000163
図５９。マウスを２群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を、０日目から開始して連続５日間静脈内(ｉｖ)注射によりマウスに投与した。群番号１は０日目から１１日目まで注射を受けておらず、その後新しい７８.９mg／kgでのＱ１Ｄ×５が開始された(黒線、白四角)。群番号５は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。曲線の各点は、対応する評価日の各薬物および媒体処置群の平均腫瘍重量を示す。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。
【０２５６】
得られたデータは、製剤化ART-207が、その毒性作用を著しく減少させながら、進行腫瘍を有効に抑制したことを証明する。進行腫瘍を有する動物へのART-207の高投与量の投与に関係する致死率の低下は、腫瘍組織による製剤化ART-207の選択的細胞取込みを支持し、腫瘍サイズが変動する患者における投与量を安全に調節する機会を提供する。一単位の投与後の腫瘍の継続的抑制は、シュードＬＤＬナノ粒子製剤化ART-207が有効性の延長を示すことを示唆する。製剤化ART-207による単回Ｑ１Ｄ×５単位での最初のＡＴＬ−３および大きな腫瘍を有する動物に投薬した第二の試験(図５９)の両試験において処置した腫瘍(図５５)では遅い再増殖が見られる。これは、活発には分裂していないが、なお増殖している腫瘍細胞へのプロドラッグ／薬物の腫瘍取り込みおよび隔離により説明できる。これらの細胞が細胞分裂期に入ったら、隔離された薬物はその毒性効果を発揮する。(パクリタキセルは、分裂中の細胞にしか有効ではない。)
【０２５７】
Ｑ４Ｄ×３スケジュール：７８.９mg／kg／注射の投与量のＱ４Ｄ×３スケジュールでの製剤化ART-207のＩＶ投与(群７)は死亡例なく耐容性であり、８日目に観察される２％(０.４ｇ)の平均体重減少をもたらした。７８.９mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207での処置は、MDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片の増殖阻止に極めて有効であった。処置は３匹の完全腫瘍退縮をもたらし、全３匹の動物とも５６日目に無腫瘍のままであった。７８.９mg／kg／注射の投与量の製剤化ART-207で処置した群における腫瘍の増殖は、個々の動物の腫瘍が体積倍増に到達する時間を比較したとき、未処置対照群(群１対群７、Ｐ＜０.００１)およびエマルジョン対照群(群７対群８、Ｐ＜０.００１)の腫瘍の増殖と比較して、統計学的に異なっていた(図６０ａおよび６０ｂ)。
【０２５８】
Ｑ４Ｄ×３スケジュールでのエマルジョン対照でのＩＶ処置(群８)は死亡例または平均体重減少なく耐容性であった。中央腫瘍は、１０.７日に３個の腫瘍が体積倍増に到達し、１１日目に１,１６３mg重量に到達した。個々の動物の腫瘍が体積倍増に到達する時間を比較したとき、未処置対照群とＱ４Ｄ×３スケジュールで投与するエマルジョン対照処置群の間の腫瘍の増殖(群１対群８、Ｐ＝０.２５２)、２個のエマルジョン対照群間の腫瘍の増殖にも統計学的差はなかった(Ｑ１Ｄ×５スケジュールおよびＱ４Ｄ×３スケジュールで投与したとき、群５対群８、Ｐ＝０.３４８)。(図６０ａおよび６０ｂ)
【０２５９】
Ｑ４Ｄ×３スケジュールで１８.９mg／kg／注射の投与量でのパクリタキセルのＩＶ処置(群９)は死亡例または平均体重減少なく耐容性であった(図６０ｂ)。１８.９mg／kg／注射の投与量でのパクリタキセル処置は、MDA-MB-231乳房腫瘍異種移植片の増殖阻止に極めて有効であった(図６０ａ)。処置は、１匹の完全腫瘍退縮を提供した。Ｑ４Ｄ×３スケジュールで１８.９mg／kg／注射の投与量のパクリタキセルで処置した群の腫瘍の増殖は、個々の動物の腫瘍が体積倍増に到達する時間を比較したとき、未処置対照群(群１対群９、Ｐ＜０.００１)およびエマルジョン対照群(群８対群９、Ｐ＜０.００１)の腫瘍の増殖と統計学的に異なった。
【０２６０】
【表１４９】
2016530331.tif 000164
図６０ａ。マウスを３群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を静脈内(ｉｖ)注射により０日目、５日目および９日目にマウスに投与した。群番号７は、７８.９mg／kgの製剤化ART-207を投与された(赤色線、黒色四角)。群番号８は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。群番号９は１８.９mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、対応する評価日の各薬物および媒体処置群の平均腫瘍重量を示す。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。
【０２６１】
【表１５０】
2016530331.tif 000165
図６０ｂ。マウスを３群に分けた(各群１０匹のマウス)。全ての試験品を静脈内(ｉｖ)注射により１日目、５日目および９日目にマウスに投与した。群番号７は７８.９mg／kgの製剤化ART-207を投与された(赤色線、黒色四角)。群番号８は無薬物脂質製剤を投与された(黒色点線、白四角)。群番号９は１８.９mg／kgのパクリタキセルを投与された(青色点線、白丸)。曲線の各点は、評価日の各薬物および媒体処置群の平均マウス体重を示す。腫瘍担持マウス体重を腫瘍の重量で補正した。平均群カットオフは群あたり２匹の動物である。ＭＴＤ(ＡＴＬ−１,２)および有効性(ＡＴＬ−３)試験の両者とも、ＭＴＤ未満の濃度のパクリタキセルと比較して、製剤化ART-207の同等なまたは高い腫瘍抑制効果を証明した。パクリタキセルとは対照的に、製剤化ART-207の腫瘍抑制効果は、顕著な体重減少を伴わなかった。パクリタキセルと比較して、製剤化ART-207での処置は、有意な動物生存率増加および無腫瘍動物の数の増加をもたらした(表２５ｈ)。
【０２６２】
【表１５１】
2016530331.tif 000166
【０２６３】
実験２６. エマルジョン含有ART-207(ロット番号AW-004-24)の調製
目的：製剤の粒子径、安定性およびART-207取り込み能に対するＴＧ／ART-207比の影響を体系的に試験するため。
【表１５２】
2016530331.tif 000167
【０２６４】
【表１５３】
2016530331.tif 000168
【０２６５】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.156.1)。
【表１５４】
2016530331.tif 000169
【０２６６】
ＭＦＰ。図６１は、粒子径が、約６０℃で３０分の処理後、６９nmでＲ１に到達することを示す。ＭＦＰを停止し、物質を滅菌濾過した。濾過後、粒子径の６９nmから６２nmへの縮小が観察された。
【表１５５】
2016530331.tif 000170
【０２６７】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.０５mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８３％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２６ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは高度に安定であった。図６２および表２６ｃにおいて、粒子は４２日にわたり増加しなかった。
【表１５６】
2016530331.tif 000171
【０２６８】
０.９７のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＭＦ処理は、高度に安定な約６０nm粒子をもたらした。この製剤のART-207取り込み能力は８３％であった。低い薬物取り込み能力は、ＴＧ／ART-207比１に基づき予測された。
【０２６９】
ＰＫ／ＰＤ試験用ART-207含有製剤の調製
実験２７. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-004-24)の調製。ＰＫ／ＰＤ試験用ART-207含有製剤を調製するためおよび製剤の粒子径、安定性およびART-207取り込み能力に対するＴＧ／ART-207比の影響を体系的に試験するため。
【表１５７】
2016530331.tif 000172
【０２７０】
【表１５８】
2016530331.tif 000173
【０２７１】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.156.3)。
【表１５９】
2016530331.tif 000174
【０２７２】
ＭＦＰ。図６３は、粒子径が、約６０℃で５０分の処理後、７５nmでＲ１に到達することを示す。温度を２０℃に下げ、物質をさらに２０分処理した。２０℃でのＭＦ処理は、７８nmへの粒子径のわずかな増加をもたらし、Ｒ２に到達した。ＭＦＰを停止し、物質を滅菌濾過した。濾過後、粒子径の７８nmから６２nmへの縮小が観察された。
【表１６０】
2016530331.tif 000175
【０２７３】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.８mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の９４％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２７ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。ART-207含有エマルジョンは高度に安定であった。図６４および表２７ｃにおいて、粒子径は４３日にわたり変化しなかった。
【表１６１】
2016530331.tif 000176
【０２７４】
１.１７のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＴＭＦ処理は、高度に安定な約６０nm粒子をもたらした。この製剤のART-207取り込み能力は９４％であった。高い薬物取り込み能力(実験２６に記載した製剤に比して)は、高いＴＧ／ART-207比に基づき予測された。≧３０mlのロット番号002.156.3のサンプルを試験場所に輸送した；ロット番号002.156.3の約１０ml  サンプルを保管した。
【０２７５】
物質を輸送の日に特徴付けした。データを表２７ｄに示す。
【表１６２】
2016530331.tif 000177
【０２７６】
表２７ｄは、ＨＰＬＣにより測定したART-207含量が製造日よりわずかに少ないが、粒子径は変わらなかったことを示す。動物の処置を単回静脈内注射により実施した。
【表１６３】
2016530331.tif 000178
【０２７７】
動物への投薬に使用しなかった物質を、処置終了後アーバー・セラピューティクスに返送した。ART-207含量を評価した。返送した物質の評価は、保管した物質と一緒に実施した。表２７ｆは、タキサン＿試験.M Rev. 2法により評価したＰＫ／ＰＤ試験場所から返送された物質および保持された物質の薬物含量が類似することを示す。ART-207含量は、輸送日と比較して有意に低下していなかった。製造日と比較したART-207含量の低下が観察された(表２７ｃおよび２７ｆ)。
【表１６４】
2016530331.tif 000179
【０２７８】
ＰＫ／ＰＤ試験で残った物質およびアーバーに返送された物質の粒子径を、その輸送日に試験した。返送物質の評価は、保管した物質と一緒に実施した。データを表２７ｇに示し、０日目からＰＫ／ＰＤ処置相の最後までの粒子径のモニタリングを反映する。試験場所から返送されたエマルジョンの粒子径は、保持物質と比較してわずかに(有意ではない)大きかった。製剤化ART-207の粒子径は、製造日からＰＫ／ＰＤ試験の投薬日まで変化しなかった(表２７ｃおよび２７ｇ)。返送されたおよび保持された物質の粒子径も同様に有意差はなかった。
【表１６５】
2016530331.tif 000180
【０２７９】
製剤化ART-207は、ＰＫ／ＰＤ試験(ＡＴＬ−４および５)で選択性を示した。データは、ＬＤＬ受容体を能動的に発現する臓器による製剤化ART-207の選択的細胞取込みを示唆する(正式報告“DETERMINATION OF PLASMA AND TISSUE CONCENTRATIONS OF ART-207 AND PACLITAXEL IN NONTUMORED AND TUMORED MICE AFTER A SINGLE INTRAVENOUS INJECTION WITH FORMULATED ART-207 OR PACLITAXEL.” Southern Research Institute, Birmingham, AL 35255-5305もまた参照のこと)
【０２８０】
実験ＡＴＬ−４およびＡＴＬ−５：無腫瘍担持雌無胸腺NCr-nu/nuマウスおよび皮下(ＳＣ)ヒトMDA-MB-231乳房腫瘍担持雌無胸腺NCr-nu/nuマウスへの製剤化パクリタキセルまたはART-207の単回静脈内(ＩＶ)注射後の血漿、脳、心臓、肝臓、肺および腫瘍におけるパクリタキセルおよびART-207由来パクリタキセル濃度を測定するため(実験ＡＴＬ−５のみ)。
【０２８１】
腫瘍モデル；実験ＡＴＬ−４。動物は非腫瘍担持であった。
実験ＡＴＬ−５：マウスに、インビボ継代由来のヒトMDA-MB-231乳房腫瘍の断片を移植した。腫瘍断片移植日を０日目と指定した。処置日１日前の腫瘍断片移植２３日目に３０匹の動物の個々の腫瘍は９０８〜１,４３７mg重量(９０８〜１,４３７mm３サイズ)に増殖した。選択した３０匹の動物を、２３日目の全群の平均腫瘍重量が互いにできるだけ近くなるように、１０処置群に割り当てた(平均腫瘍重量１,０５６〜１,１７８mg範囲、中央腫瘍重量９０８〜１,１５２mg範囲)。ＡＴＬ−４およびＡＴＬ−５の量実験での処置剤を同じ日に投与した。
【０２８２】
実験ＡＴＬ−４：本試験は、処置１日前の１日目には各群３匹の非腫瘍担持マウスの１０群、計３０匹のマウスからなった。全処置剤を、２日目に単回ＩＶ注射で投与した。群１〜５の動物は、７０mg／kg投与量の製剤化ART-207で処置した。群６〜１０の動物は、１８.９mg／kgの投与量のパクリタキセルで処置した。７０mg／kgの製剤化ART-207投与量は、製剤化ART-207の分子量１２１９.６およびパクリタキセルの分子量８５３.９に基づき、１８.９mg／kg投与量のパクリタキセルの２.６ｘモル投与量であった。
【０２８３】
実験ＡＴＬ−５
本試験は、処置１日前、腫瘍片移植２３日目には各群３匹のヒトMDA-MB-231乳房腫瘍担持マウスの１０群、計３０匹のマウスからなった。全処置剤を、２４日目に単回ＩＶ注射で投与した。群１〜５の動物を７０mg／kgの投与量の製剤化ART-207で処置した。群６〜１０の動物を１８.９mg／kgの投与量のパクリタキセルで処置した。７０mg／kgの製剤化ART-207投与量は、１８.９mg／kgのパクリタキセル投与量の２.６ｘモル投与量であった。
【０２８４】
パクリタキセル、ART-207およびART-207由来パクリタキセルの血漿濃度。製剤化ART-207の単回ＩＶ投与量を投与されたマウスについて、６４０μg／mLのART-207の平均ピーク血漿濃度(Ｃｍａｘ)が、投与５分(０.０８３時間)後に観察された(最も早い時点)；この時点の血漿中のパクリタキセルの平均濃度は、２.２４８μg／mL(２２３７ng／mL)であった。ART-207は、その後血漿から除去され、２.８時間の明白な最終排泄半減期を有した；製剤化ART-207を投与された動物の血漿におけるパクリタキセルの明白な最終排泄半減期は遅く、１１.５時間であった。ART-207の低除去速度(２２.０mL／時間／kg)およびART-207の定常状態での小体積の分布(８８.０mL／kg)は、本化合物の限定的代謝／排泄／組織分布の指標である。血漿中のART-207のＡＵＣlastは２７９４時間・μg／mLであり、パクリタキセルのそれは１４.４時間・μg／mLであり、ART-207に対する全身暴露がパクリタキセルより約２００倍大きかったことを示す(図６５)。パクリタキセルの単回ＩＶ投与量を投与されたマウスについて、３２.９μg／mLのパクリタキセルの平均ピーク血漿濃度が、投与５分(０.０８３時間)後に観察された(最も早い時点)；その後、パクリタキセルは血漿から除去され、１.０時間の明白な最終排泄半減期を有した。血漿中のパクリタキセルのＡＵＣlastは３７.７時間・μg／mLであった。パクリタキセルの全身クリアランス(５００mL／時間／kg)および定常状態でのパクリタキセルの分布体積(６５８mL／kg)は、ART-207で測定された対応する値より高かった。パクリタキセルの相対組織分布は、製剤化ART-207を与えたマウスで観察されるものに類似したが、パクリタキセルの平均ピーク組織濃度は、２.６倍高いモル投与量投与量の製剤化ART-207を投与されたマウスよりもパクリタキセルを投与されたマウスで高かった。
【０２８５】
血漿中のART-207およびパクリタキセルの平均濃度の経時変化
【表１６６】
2016530331.tif 000181
図６５  腫瘍担持および／または非腫瘍担持マウスを５群に細分した(各群３匹のマウス)。全マウスに、７０mg／kgの製剤化ART-207を静脈内注射した。単回ボーラス注射後、５分、３０分、６０分、２４０分および４８０分後に血液サンプルを採取した。各時点は３匹のマウスを表す。血漿濃度を、分析した各時点の濃度曲線下面積(ＡＵＣ)で表す。ＡＵＣlast値(０時から最後の定量化可能サンプルの時間曲線に対する最後の平均濃度下面積)に基づき、パクリタキセルを注射したマウスにおけるパクリタキセルへの全身暴露は、非腫瘍担持マウスと腫瘍担持マウスで類似した。パクリタキセルを投与した非腫瘍担持マウスおよび腫瘍担持マウスのパクリタキセルレベルの差は有意ではなかった(図６６)。データは、腫瘍の有無が血漿パクリタキセル含量に影響せず、それゆえに、パクリタキセルが腫瘍組織を選択的に標的する能力のないことを示した。
【０２８６】
【表１６７】
2016530331.tif 000182
図６６。非腫瘍担持マウスを５群に細分した(各群３匹のマウス)。全マウスに、１８.９mg／kgのパクリタキセルを静脈内注射した。単回ボーラス注射後、５分、３０分、６０分、２４０分および４８０分後に血液サンプルを採取した。各時点は３匹のマウスを表す。組織濃度を、０時から検体が定量化可能であった最後の時点(８時間)の濃度曲線下面積(ＡＵＣ)として表す。０時から最後の定量化可能サンプルの時間曲線に対する最後の平均濃度下面積(ＡＵＣlast)を、線形／対数台形公式を使用して計算した。ART-207処置腫瘍担持動物におけるART-207由来パクリタキセルの血漿濃度は、ART-207処置非腫瘍担持マウスと比較して有意に低い(図６７)。データは、ART-207由来パクリタキセルの血漿濃度に対する腫瘍の顕著な影響を証明し、パクリタキセルと比較して、製剤化ART-207の改善されたターゲティング能を示唆する。
【０２８７】
【表１６８】
2016530331.tif 000183
図６７。腫瘍担持マウスを５群に細分した(各群３匹のマウス)。全マウスに、７０mg／kgの製剤化ART-207を静脈内注射した。単回ボーラス注射後、５分、３０分、６０分、２４０分および４８０分後に血液サンプルを採取した。各時点は３匹のマウスを表す。組織濃度を、０時から検体が定量化可能であった最後の時点(８時間)の濃度曲線下面積(ＡＵＣ)として表す。０時から最後の定量化可能サンプルの時間曲線に対する最後の平均濃度下面積(ＡＵＣlast)を、線形／対数台形公式を使用して計算した。製剤化ART-207を注射した非腫瘍担持マウスと腫瘍担持マウスのパクリタキセル血漿濃度差は有意であった。製剤化ART-207およびパクリタキセルの分布体積をｉｖ投薬後評価したとき、製剤化ART-207の分布体積は、パクリタキセルより有意に低く(６倍)、製剤化ART-207が血管系内に残り、組織に分配されないことを示す。長く循環するシュードＬＤＬナノ粒子製剤は、腫瘍組織に濃縮し続けることができる。これは、ＡＴＬ−２およびＡＴＬ−３試験の両者における製剤化ART-207の有効性延長の観察と一致する。また、増殖しているが、分裂していない腫瘍細胞への、本製剤の腫瘍組織細胞取り込みは、これらの細胞が細胞分裂を始めたら細胞毒性効果を発揮するためのプロドラッグ／薬物の貯蔵所を提供する。タキサン類の細胞毒性効果は、分裂中の細胞でのみ現れる。増殖しているが、分裂していない細胞における薬物の貯蔵所は、全ての腫瘍細胞がある時点で分裂しているとは限らず、これらの静止細胞が腫瘍再発に至る分裂を始めたとき、貯蔵所に存在する薬物により殺されるために、望ましい。
【０２８８】
パクリタキセルおよびART-207を注射されたマウスにおけるパクリタキセルの臓器分布。臓器を採取し、前もってのＰＢＳまたは食塩水での灌流または濯ぎをすることなく分析した。製剤化ART-207で観察され、報告された分布の体積の小ささのために、我々は、パクリタキセル部分の局所遊離をもたらす製剤化ART-207組織分布および処理のより特異的な指標であるART-207由来パクリタキセルの分布にデータ分析の焦点を絞った。非腫瘍担持マウスのパクリタキセル組織レベルは、パクリタキセルを注射されたマウスと比較して、ART-207を注射されたマウスで有意に低かった(図６８)。
【０２８９】
【表１６９】
2016530331.tif 000184
図６８。非腫瘍担持マウスを５群に細分した(各群３匹のマウス)。全マウスに７０mg／kgの製剤化ART-207または１８.９mg／kgのパクリタキセルを静脈内注射した。血液サンプルおよび臓器を単回ボーラス注射後、５分、３０分、６０分、２４０分および４８０分後に採取した。各時点は３匹のマウスを表す。組織濃度を、０時から検体が定量化可能であった最後の時点(８時間)の濃度曲線下面積(ＡＵＣ)として表す。０時から最後の定量化可能サンプルの時間曲線に対する最後の平均濃度下面積(ＡＵＣlast)を、線形／対数台形公式を使用して計算した。パクリタキセルまたは製剤化ART-207を注射された非腫瘍担持マウスのパクリタキセルレベルの差は評価した全組織で有意であった(ｐ＜０.０５)。腫瘍担持マウスパクリタキセルレベルは、パクリタキセルを注射したマウスと比較してART-207を注射したマウスの全非標的臓器で低かったが、腫瘍組織におけるパクリタキセル濃度は、製剤化ART-207を注射したマウスで有意に高かった(図６９、７０)。結果は、パクリタキセル血漿濃度データと一致し、製剤化ART-207による腫瘍部位の選択的ターゲティングを示唆する。
【０２９０】
【表１７０】
2016530331.tif 000185
図６９。腫瘍担持マウスを５群に細分した(各群３匹のマウス)。全マウスに７０mg／kgの製剤化ART-207または１８.９mg／kgのパクリタキセルを静脈内注射した。血液サンプルおよび臓器を単回ボーラス注射後、５分、３０分、６０分、２４０分および４８０分後に採取した。各時点は３匹のマウスを表す。組織濃度を、０時から検体が定量化可能であった最後の時点(８時間)の濃度曲線下面積(ＡＵＣ)として表す。０時から最後の定量化可能サンプルの時間曲線に対する最後の平均濃度下面積(ＡＵＣlast)を、線形／対数台形公式を使用して計算した。パクリタキセルまたは製剤化ART-207を注射された非腫瘍担持マウスのパクリタキセルレベルの差は評価した全組織で有意であった(ｐ＜０.０５)。
【０２９１】
【表１７１】
2016530331.tif 000186
図７０。腫瘍担持マウスを５群に細分した(各群３匹のマウス)。全マウスに７０mg／kgの製剤化ART-207または１８.９mg／kgのパクリタキセルを静脈内注射した。単回ボーラス注射後、５分、３０分、６０分、２４０分および４８０分後に腫瘍を採取した。各時点は３匹のマウスを表す。組織濃度を、０時から検体が定量化可能であった最後の時点(８時間)の濃度曲線下面積(ＡＵＣ)として表す。０時から最後の定量化可能サンプルの時間曲線に対する最後の平均濃度下面積(ＡＵＣlast)を、線形／対数台形公式を使用して計算した。製剤化ART-207で処置した非腫瘍担持マウスおよび腫瘍担持マウスの両者で、パクリタキセルの最高で同等の濃度が肝臓、肺および腫瘍組織で観察され(図６８、６９)、これは主要なＬＤＬ受容体発現部位である。得られたデータは、ＬＤＬ受容体を能動的に発現する臓器による製剤化ART-207の選択的細胞取込みを示唆し、製剤化ART-207の細胞内在化のＬＤＬ受容体依存性機構を示唆する。ＰＫ／ＰＤデータは、パクリタキセルと比較して製剤化ART-207の効力は類似するかまたは高いが、同時に製剤化ART-207で観察される毒性は低いことを示す、有効性および毒性試験の結果と一致する。
【０２９２】
実験２８. ART-207含有エマルジョン(ロット番号AW-004-24)の調製。製剤の粒子径、安定性およびART-207取り込み能力に対するＴＧ／ART-207比(表２８ｂ)の効果を体系的に試験するため。
【表１７２】
2016530331.tif 000187
【０２９３】
【表１７３】
2016530331.tif 000188
【０２９４】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号002.158.2)。
【表１７４】
2016530331.tif 000189
【０２９５】
ＭＦＰ。図７１において、粒子径は、約６０℃で１０分の処理後、１０２nmに到達する。ＭＦＰを停止し、物質を滅菌濾過した。濾過後、粒子径の１０２nmから８１nmへの縮小が観察された。
【表１７５】
2016530331.tif 000190
【０２９６】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.７４mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８９.６％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２８ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。ART-207含有エマルジョンは安定であった。図７２および表２８ｃにおいて、粒子径は３７日にわたり増加しなかった。
【表１７６】
2016530331.tif 000191
【０２９７】
１.３２のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＭＦ処理は、高度に安定な約７０nm粒子をもたらした。この製剤のART-207取り込み能力は８９.６％であった。薬物取り込み能力は、１.１７のＴＧ／ART-207比を有する製剤と比較して、増加しなかった(実験２７)。
【０２９８】
実験２９. ART-207含有エマルジョンの調製。製剤の粒子径、安定性およびART-207取り込み能力に対するＴＧ／ART-207比(表３３ｂ)の影響を体系的に試験するため。
【表１７７】
2016530331.tif 000192
【０２９９】
【表１７８】
2016530331.tif 000193
【０３００】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号005.1.2)。
【表１７９】
2016530331.tif 000194
【０３０１】
ＭＦＰ。図７３において、粒子径は、約６０℃で１０分の処理後、７７nmに到達した。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径変化は観察されなかった。
【表１８０】
2016530331.tif 000195
【０３０２】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.７４mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８９.５％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表２９ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンはかなり安定であった。図７４および表２９ｃにおいて、粒子径は３５日にわたり４nm増加したことを示す。
【表１８１】
2016530331.tif 000196
【０３０３】
１.６のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＭＦ処理は比較的安定な約７５nm粒子をもたらした。モニタリング期間にわたり観察されたロット番号005.1.2の粒子径のわずかな増加は、高ＴＧ／ＡＲＴ比に付随する不安定性の初期サインを示唆する。この製剤のART-207取り込み能力は８９.５％であり、１.１７および１.３２のＴＧ／ART-207比を有する製剤と比較して増加しなかった(それぞれ実験２７および２８)。データは、ＴＧ／ART-207比は１.２〜１.３範囲で最適あることを示唆する。
【０３０４】
実験３０. ART-207含有エマルジョンの(ロット番号AW-004-24)調製。約９０〜１００nmのART-207含有粒子を製造するためおよびその薬物取り込み能力および安定性を試験するため。実験２８および２９で得られた粒子径が目標値を下回ったため(約９０〜１００nm)、ＭＦ処理圧を１０,０００PSIに下げた。ＴＧ／ＡＲＴ比は１.３５であった。
【表１８２】
2016530331.tif 000197
【０３０５】
【表１８３】
2016530331.tif 000198
【０３０６】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号005.2.2)。
【表１８４】
2016530331.tif 000199
【０３０７】
ＭＦＰ。図７５において、粒子径は、約６０℃で１０分の処理後、１０５nmに到達する。ＭＦＰを停止し、物質を濾過した。濾過後、粒子径の顕著な変化は観察されなかった。
【表１８５】
2016530331.tif 000200
【０３０８】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンのART-207含量(タキサン＿試験.M, Rev 2)は４.８５mg／mlであった。このデータは、この製剤の調製に使用した薬物の８９.３％が脂質粒子に取り込まれたことを示した(表３０ｃ)。ART-207含有製剤の粒子径分析。得られたART-207含有エマルジョンは高度に安定であった。図７６および表３０ｃは、粒子径が３５日にわたり変化しなかったことを示す。
【表１８６】
2016530331.tif 000201
【０３０９】
１.３５のＴＧ／ART-207比を有する製剤のＭＦ処理は、高度に安定な約１０５nm粒子をもたらした。この製剤のART-207取り込み能力は、このＴＧ／ART-207比で予測されるとおり８９.３％であった。得られたデータは、現在の製剤が少なくとも４０〜１００nm範囲の安定な粒子を産生する能力を有することを示す。
【０３１０】
組成および比。４０〜１００nm範囲の安定な無薬物および薬物含有ナノ粒子を産生する製剤成分の特定の比を有する独特な組成。重量／体積(Ｗ／Ｖ)パーセントとして計算した総固体の最適範囲は６.５〜７.５％(ＴＳ、％)である。重量／体積(Ｗ／Ｖ)パーセントとして計算した総脂質の最適範囲は５.５〜６.５％(ＴＬ、％)である。主成分の比を表３０ｄに示す。
【表１８７】
2016530331.tif 000202
正確な組成および詳細については、添付物、マスターテーブル２および３参照。
【０３１１】
ＴＧ／ART-207比。ＴＧの濃度および具体的にＴＧ／ART-207比は薬物含有エマルジョンの安定性を決定する主因子である。ＴＧ／ART-207比の最適範囲は０.９７〜１.４である。図７７は、０.９７を超えるＴＧ／ART-207比の増加はART-207取り込みを促進するが、同時に不安定な粒子とすることを示す。ART-207取り込みは、ＴＧ／ART-207比約１.３〜１.４で最高かつプラトーに達する。ＴＧ／ART-207比のさらなる増加は製剤の薬物取り込み能力を増強させず、さらには、不安定ナノ粒子に終わる。
【０３１２】
【表１８８】
2016530331.tif 000203
図７７。製剤のART-207取り込み能力(黒線、左軸)および粒子径増加(黒色点線、右軸)に対するＴＧ／ART-207比の影響。ART-207取り込み能力(すなわち得られたエマルジョンの薬物含量)を、このエマルジョンの調製物について秤量した薬物重量のパーセントとして表す。粒子径増加は、製造日に対する経時的粒子径変化パーセントとして表す。
【０３１３】
処理温度。低温(約２０℃)での物質処理は小さな粒子を産生するが、６０℃での処理はより安定なエマルジョンをもたらす。図７８は、約２０℃での処理が約５５nm薬物含有ナノ粒子をもたらし、一方６０℃処理が約６５nm薬物含有ナノ粒子を産生することを示す。保存中の約１５％粒子径増加は、約２０℃で処理した物質でのみ観察された(図７８)。“小型”および“大型”ナノ粒子の両者とも同程度の量のART-207を含んだ。
【０３１４】
【表１８９】
2016530331.tif 000204
図７８. 保存中の粒子径(黒線、左軸)および粒子径増加パーセント(黒色点線、右軸)の処理温度依存性。
【０３１５】
２８７の取り込みのための脂質ベースの製剤の開発。２８７取り込み能力、粒子径および安定性の最適化。下記実験の全てに関して、またマスターテーブル１、２および３(添付書類II)参照。
【０３１６】
実験３１. ２８７含有脂質エマルジョン(ロット番号ISI-30052013-1)の調製。ART-207含有ナノ粒子の調製のために開発した製剤が、プロドラッグ誘導体ではなく親油性薬物である、構造が異なる２８７を取り込む能力を試験するため。
【表１９０】
2016530331.tif 000205
【０３１７】
【表１９１】
2016530331.tif 000206
【０３１８】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号005.16.2)。緩衝液：１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.４。
【表１９２】
2016530331.tif 000207
取込１、％−製剤に使用した２８７の量に対する；取込２、％−製造日にエマルジョンで測定した２８７含量に対する；
【０３１９】
【表１９３】
2016530331.tif 000208
【０３２０】
ＭＦＰ。図７９において、粒子径は、５５〜６５℃で１００分の処理後、約８０.６nmでＲ１に到達した。ＭＦＰを停止し、濾過した。濾過後、粒子径の８０.６nmから５６.４nmへの縮小が観察された(図７９)。
【表１９４】
2016530331.tif 000209
【０３２１】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンの２８７含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は２.８１mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の５５.３％しか脂質粒子に取り込まれていないことを示した(表３１ｃ)。無濾過エマルジョンのＨＰＬＣ測定した薬物含量は４.４０mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８６.６％が脂質粒子に取り込まれたことを示し、製剤化２８７の相当な割合(約３６％)がＭＦ処理の最終濾過工程で失われたことを示す。ＨＰＬＣデータは、濾過後の粒子径の顕著な縮小と一致する。データは、得られたエマルジョンの粒子径不均一性およびフィルター上での大２８７含有粒子の保持を示唆する。室温で２８日の保存後、得られたエマルジョンの２８７含量の２.８１mg／mlから２.６４mg／mlへの減少(６％)が観察されなかった(表３１ｃ)。２８７含有製剤の粒子径分析。図８５および表３９ｄは、粒子径が６日にわたり５３.２nmから７２.６.４nmに増加し、その後６７nmの範囲で安定化したことを示す。粒子径の変化は２８日目まで観察されなかった(図８０)。
【表１９５】
2016530331.tif 000210
【０３２２】
粒子径分析データは、ａ)最終濾過工程後のナノ粒子径および２８７含量の減少；およびｂ)得られたエマルジョンおよび製剤化２８７の相対的安定性を示すＨＰＬＣデータと一致する。エマルジョンを１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.４中で調製した。
【０３２３】
実験３２. ２８７含有脂質エマルジョンの調製。ART-207を含有する安定なナノ粒子の調製用に開発したＤＭＰＣ含有製剤が構造が異なる２８７を取り込む能力を試験するため。
【表１９６】
2016530331.tif 000211
【０３２４】
【表１９７】
2016530331.tif 000212
【０３２５】
粗い懸濁液を調製し、ＭＦ処理した(ロット番号005.14.2)。緩衝液：酢酸(１０mM)緩衝化食塩水ｐＨ５.５。
【表１９８】
2016530331.tif 000213
取込１、％−製剤に使用した２８７の量に対する；取込２、％−製造日にエマルジョンで測定した２８７含量に対する。
【０３２６】
【表１９９】
2016530331.tif 000214
【０３２７】
ＭＦＰ。図８１において、粒子径は、約６０℃で３０分の処理後、約９９nmでＲ１に到達した。温度を約２０℃まで下げると、粒子径の１６１.７nmへの増加が生じた。温度を６０℃に上げ、３０分処理すると、粒子径は９７nmに縮小し、Ｒ２に到達した(図８１)。ＭＦＰを停止し、物質を濾過した。濾過後、粒子径の９７.７nmから４７.５nmへの縮小が観察された(図８１)。
【表２００】
2016530331.tif 000215
【０３２８】
ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣで測定した得られたエマルジョンの２８７含量(タキサン＿プロドラッグ.M)は２.８１mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の５５.４％しか脂質粒子に取り込まれなかったことを示した(表３２ｃ)。無濾過エマルジョンのＨＰＬＣ測定した薬物含量は４.５６mg／mlであった。データは、この製剤の調製に使用した薬物の８９.９％が脂質粒子に取り込まれたことを示し、製剤化２８７の相当な割合(約３８％)が最終濾過工程で失われたことを示す。ＨＰＬＣデータは、濾過後の粒子径の顕著な縮小と一致する。データは、得られたエマルジョンの粒子径不均一性およびフィルター上での大２８７含有粒子の保持を示唆する。室温で２６日の保存後、得られたエマルジョンにおける２８７含量または粒子径の変化は観察されなかった(表３２ｃ)。２８７含有製剤の粒子径分析。２６日の間に有意な粒子径変化は観察されなかった(図８２および表３２ｃ)。データは、同じ脂質製剤を使用したときの、得られたエマルジョンのART-207含有エマルジョンに類似する高安定性を示す。
【表２０１】
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【０３２９】
粒子径分析データは、ａ)最終濾過工程後のナノ粒子径および２８７含量の顕著な減少；およびｂ)得られたエマルジョンおよび製剤化２８７の高安定性を示すＨＰＬＣデータと一致する。エマルジョンを１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.４注で調製した。ＤＭＰＣの添加は、２８７含有エマルジョンの安定性を著しく高めた。ＤＭＰＣの類似の効果がART-207含有エマルジョンで観察された。
【０３３０】
組成および比。４０〜１００nm範囲の安定な無薬物および薬物含有ナノ粒子を産生する製剤成分の特定の比を有する独特な組成。重量／体積(Ｗ／Ｖ)パーセントとして計算した総固体の最適範囲は６.９〜７.１％(ＴＳ、％)である。重量／体積(Ｗ／Ｖ)パーセントとして計算した総脂質の最適範囲は６.１〜６.３％(ＴＬ、％)である。データは、ART-207に最適化した脂質製剤が、広範な親油性の構造的に多様な化合物を含む安定なナノ粒子エマルジョンの産生に適することを示す。主成分の比の例を表３２ｅに示す。
【表２０２】
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正確な組成および詳細については、マスターテーブル５および６を参照のこと。
【０３３１】
【表２０３】
2016530331.tif 000218
【０３３２】
【表２０４】
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【表２０５】
2016530331.tif 000220
【０３３３】
【表２０６】
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【表２０７】
2016530331.tif 000222
【０３３４】
２８７を含む製剤の主成分の組成および比の例を次のマスターテーブル４および５に示す：
【表２０８】
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【０３３５】
【表２０９】
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【０３３６】
【表２１０】
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【０３３７】
上記のART-207の代表的実験ならびにここに開示する製剤および化合物に加えて、上記の方法を本明細書に開示する選択した化合物でも実施し、結果は上記と実質的に一致することは。
【０３３８】
多数の態様、側面およびバリエーションがここで提供されているが、当業者は、態様、側面およびバリエーションのある種の修飾、並べ替え、付加および組み合わせならびにある種の下位の組み合わせを認識する。添付する特許請求の範囲は、態様、側面およびバリエーションの全てのこのような修飾、並べ替え、付加および組み合わせならびにある種の下位の組み合わせがその範囲内に包含されると解釈される。本明細書をとおして引用した全文献は、引用により本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【０３３９】
(原文に記載なし)
【図Ａ】
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【図Ｂ】
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【図Ｃ】
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【国際調査報告】
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