(57)【要約】  本発明は、任意の標的膜、細胞膜、細胞膜の構成要素、またはその他の細胞構成要素から分離された細胞膜をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質含有膜修飾するための融合混合物であって、正荷電両親媒性分子Ａおよび芳香族分子Ｂを含み、分子種Ａおよび分子種Ｂが、１：０．０２〜１：２モル／モルのＡ：Ｂ比で存在する融合混合物に関する。
2016515548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の脂質膜、細胞膜、細胞膜の構成要素、またはその他の細胞構成要素から分離された細胞膜をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質含有膜修飾するための融合混合物であって、正荷電両親媒性分子Ａおよび分子Ｂを含み、分子種Ｂが芳香族分子であり、分子種Ａおよび分子種Ｂが、１：０．０２〜１：２モル／モルのＡ：Ｂ比で存在する前記融合混合物。
【請求項２】
前記融合混合物が、水性溶液中に存在することを特徴とする、請求項１に記載の融合混合物。
【請求項３】
前記融合混合物が、少なくとも１つの添加剤Ｚを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の融合混合物。
【請求項４】
添加剤Ｚとしての、合成脂質分子、天然脂質分子、細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、タンパク質−脂質混合物、核酸、ナノ粒子（磁性、蛍光性、等）、もしくは薬理有効成分、またはそれらからなる混合物を特徴とする、請求項３に記載の融合混合物。
【請求項５】
最大４６モル％という前記添加剤Ｚの分率を特徴とする、請求項４に記載の融合混合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一つに記載の融合混合物と脂質含有膜を接触させることで、融合混合物が膜と融合することを特徴とする、任意の脂質膜、細胞膜、細胞膜の構成要素、またはその他の細胞構成要素から分離された細胞膜をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質含有膜修飾するための方法。
【請求項７】
成分Ｚとして核酸を選択することより、同時にトランスフェクションが行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記融合混合物中の成分Ｚとしてのビオチン含有物質の選択により、同時に標的膜のビオチン化が行われる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
さらなる膜が、この融合混合物によってビオチン化されないことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ビオチン化膜を磁性粒子と結合させ、続いて、磁力により、非ビオチン化膜から分離させるステップを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合混合物と標的膜とからなる生成物が、融合が起きた後に融合性であり、さらなる脂質含有膜とのさらなる融合が行われることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
膜への融合後に細胞内に取り込まれる成分Ｚとしての薬理有効物質の選択を特徴とする、請求項６〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
薬理作用に加えて芳香族構成要素を有する成分Ｚの選択を特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意の脂質膜、細胞膜、細胞膜の構成要素、またはその他の細胞構成要素から分離された細胞膜をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質含有膜修飾するための融合混合物（Ｆｕｓｉｏｎｓｍｉｓｃｈｕｎｇ）、およびこの混合物との融合により脂質含有膜修飾するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用途では、医薬品有効物質を標的細胞に導入する方法に対する需要が存在する。
【０００３】
Ｋｈａｌｉｌ等（Ｉ．Ａ．  Ｋｈａｌｉｌ，  Ｋ．  Ｋｏｇｕｒｅ，  Ｈ．  Ａｋｉｔａ，  Ｈ．  Ｈａｒａｓｈｉｍａ、２００６年、Ｕｐｔａｋｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＲＥＶＩＥＷＳ、第５８巻、第１号、３２〜４５ページ）（非特許文献１）からは、エンドサイトーシスによるＤＮＡ取込み法と非エンドサイトーシスによるＤＮＡ取込み法との間で区別をすることが公知である。科学界では、この総説に基づき、ＤＮＡ取込みの主要経路は、リポプレックス（カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体とも呼ばれる）を利用してエンドサイトーシス経路で起こると見なされている。エンドサイトーシスと呼ばれるのは、細胞外高分子の小胞への取込みである。それによると、１９９０年代半ばまで前提されていた、リポプレックスの脂質の、細胞膜との融合に続く高分子の直接的取込みは根拠がなく、せいぜいのところ非常にわずかな割合で関与している。
【０００４】
この仮定の証拠をもたらしたのは、電子顕微鏡写真により、エンドサイトーシス後の小胞中のＤＮＡを示した、Ｆｒｉｅｎｄ等の研究である（Ｆｒｉｅｎｄ  ＤＳ，  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ＤおよびＤｅｂｓ  ＲＪ（１９９６年）Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２７８：４１〜５０ページ（非特許文献２））。この取込み経路は、ＷｅｉｊｕｎとＳｚｏｋａ  Ｊｒ．（Ｗｅｉｊｕｎ  ＬｉとＦｒａｎｃｉｓ  Ｃ．  Ｓｚｏｋａ  Ｊｒ、２００７年、Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４３８〜４４９ページ（非特許文献３））によって証明される。
【０００５】
カチオン性リポソームの製造には、カチオン性脂質を使用することができる。出発構成要素からのカチオン性リポソームの形成は、制御が困難であることが公知であるが、なぜなら、出発物質からは様々な構造が形成され得るからである。それゆえ、リポソームの形成には、前もって規則的に、いわゆるヘルパー脂質としての中性脂質をカチオン性脂質に混合するが、なぜなら、カチオン性脂質単独では、リポソーム形成を保証できないことが明白であるからである。前記の文献、Ｋｈａｌｉｌ等（非特許文献１）から公知であるように、ヘルパーとしては、例えば、ＤＯＰＥまたはコレステロールを使用する（Ｋｈａｌｉｌ等、４０ページ、右段、第１段落（非特許文献１））。
【０００６】
ヘルパー脂質は、例えば、１つの親水性領域、および二重結合を含むか、または含まない１つの疎水性領域（とりわけ、Ｃ１０〜Ｃ３０）を有する。両領域とも中性特性を有する。それにより、高い電荷密度および分子種（Ｍｏｌｅｋｕｅｌｓｏｒｔｅ）Ａの正荷電分子間の反発力が中和される。この効果が、系の安定化をもたらす。それゆえ、ヘルパー脂質の使用は不可欠であり、その上、系のトランスフェクション効率を高める。ヘルパー脂質の分率は、最大７０％重量／重量に調整される。適した分子は、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジエライドイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジフィタノールｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、または１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）である。
【０００７】
中性ヘルパー脂質を含む正荷電融合混合物は、例えば、ＷＯ２０１１／００３４０６Ａ２（特許文献１）から公知である。開示される融合混合物は、分子種Ａ（カチオン性脂質）、分子種Ｂ（蛍光マーカ）、および中性ヘルパー脂質である分子種Ｃからなる、それぞれ具体的な組成物に基づく。ここでは、リポソームの、付着性細胞の細胞膜、およびその原形質膜との融合が起こり、ただし、分子種Ａ：Ｂ：Ｃの１：０．１：１重量／重量という比率が提案される。
【０００８】
Ｃｓｉｓｚａｒ等（Ｃｓｉｓｚａｒ  Ａ．等、Ｎｏｖｅｌ  Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１０年、２１、５３７〜５４３ページ）（非特許文献４）からは、カチオン性脂質（分子種Ａ）、中性脂質（分子種Ｃ）、および芳香族脂質（分子種Ｂ）から構成されており、その中では分子種Ａ：Ｂ：Ｃが、１：０．１：１重量／重量の比率で存在する融合性リポソーム系が公知である。分子種ＡとしてはＤＯＴＡＰが、分子種Ｂとしては、親油性蛍光分子、例えば、ＤｉＯ、ＤｉＲ、Ｂｏｄｉｐｙ標識脂質、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ−Ｒｈｏｄａｍｉｎ標識脂質、およびＦＩＴＣ標識脂質が使用される。ヘルパー脂質Ｃとしては、ＤＯＰＥが使用される。これらの混合物が、リポソームの構築、さらには、細胞蛍光標識、タンパク質の取込み、細胞膜の機能化、有効成分取込み、ＤＮＡ取込み等に使用される。著者等は、これら３成分の相乗的相互作用のみが効果的な融合性混合物をもたらすということを明確に指摘する。
【０００９】
Ｋｌｅｕｓｃｈ等（Ｋｌｅｕｓｃｈ  Ｃｈ．等、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌｉｐｉｄｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐａｒｔｓ  ｏｆ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１１年、１６、２２１〜２５０ページ）（非特許文献５）も同じく、１／０．１／１重量／重量の比率の分子種Ａ：Ｂ：Ｃからなるカチオン性リポソーム系を開示し、ただし、２つの蛍光分子（分子種Ｂ）が、相次いで起こる２つの機能を有する。生物学的に重要でない蛍光成分が、まず、細胞の原形質膜と、中性脂質（分子種Ｃ）および正荷電脂質（分子種Ａ）を含む融合性リポソームの脂質二重層との間の迅速な膜融合を促進する。細胞性膜への挿入後には、細胞膜の蛍光表示、および／またはそこで進行する輸送過程の蛍光表示を、第２の蛍光成分の定量によって行うことができる。それゆえ、この融合性リポソーム系は、４つの成分を有し（分子種Ａ、分子種Ｃ、および２回の分子種Ｂ）、３成分システムに関するＣｓｉｓｚａｒ等（非特許文献４）またはＷＯ２０１１／００３４０６（特許文献１）の場合と同様に、厳密に定義されかつ固定的な互いの比率においてのみ開示されている。
【００１０】
それゆえ、従来技術から公知の融合混合物の不利点は、効果的な融合性混合物を達成するための、分子種Ａ、ＢおよびＣの狭い濃度範囲、ならびに少なくとも３つの成分の相乗的相互作用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／００３４０６Ａ２
【特許文献２】ＤＥ１０２００９０３２６５８
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｈａｌｉｌ等（Ｉ．Ａ．  Ｋｈａｌｉｌ，  Ｋ．  Ｋｏｇｕｒｅ，  Ｈ．  Ａｋｉｔａ，  Ｈ．  Ｈａｒａｓｈｉｍａ、２００６年、Ｕｐｔａｋｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＲＥＶＩＥＷＳ、第５８巻、第１号、３２〜４５ページ）
【非特許文献２】Ｆｒｉｅｎｄ  ＤＳ，  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ＤおよびＤｅｂｓ  ＲＪ（１９９６年）Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２７８：４１〜５０ページ
【非特許文献３】Ｗｅｉｊｕｎ  ＬｉとＦｒａｎｃｉｓ  Ｃ．  Ｓｚｏｋａ  Ｊｒ、２００７年、Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４３８〜４４９ページ
【非特許文献４】Ｃｓｉｓｚａｒ  Ａ．等、Ｎｏｖｅｌ  Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１０年、２１、５３７〜５４３ページ
【非特許文献５】Ｋｌｅｕｓｃｈ等（Ｋｌｅｕｓｃｈ  Ｃｈ．等、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌｉｐｉｄｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐａｒｔｓ  ｏｆ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１年、１６、２２１〜２５０ページ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、任意の脂質膜、細胞膜、細胞膜の構成要素、またはその他の細胞構成要素から分離された細胞膜をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質含有膜修飾するための、少数の分子種からなる単純に構成された融合混合物を提供することである。この融合混合物は、任意の脂質膜と融合するべきである。細胞膜の型、および使用される、融合混合物の構成要素に依存して、融合を迅速かつ効果的に実施可能にするためには、融合混合物の構成要素は、とりわけ比較的大きい濃度範囲にわたって、互いに存在可能であるべきである。
【００１４】
さらに、融合混合物は、容易に製造可能であるべきである。
【００１５】
さらに、この融合混合物を用いた効果的な膜融合法を提供することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この課題は、特許請求項１に記載の融合混合物、および特許請求項６に記載の方法によって解決される。これに関する有利な形態は、それぞれその請求項に関連する特許請求項から明らかになる。
【００１７】
任意の脂質膜、例えば、細胞膜、細胞膜の構成要素、またはその他の細胞構成要素から分離された細胞膜をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質含有膜修飾するための融合混合物は、正荷電両親媒性分子Ａ、および芳香族分子である分子Ｂを含む。その際、分子種ＡおよびＢは、１：０．０２〜１：２モル／モルの比率で存在する。
【００１８】
驚くべきことに、従来技術および従来の定説に反し、任意の脂質膜との融合混合物の融合を再現可能かつ効果的に達成するためには、中性ヘルパー脂質の形態での分子種Ｃが必須ではないということが認識された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】芳香族化合物含有リポソームで処理してから５分後のＣＨＯ細胞を示す。リポソームの撮影を、蛍光顕微鏡検査および明視野顕微鏡検査により観察し、フローサイトメトリーを利用して定量化した。スケール＝５０μｍ。使用した分子種比Ａ：Ｂに依存した蛍光顕微鏡写真（左段）および明視野写真（中央段）およびフローサイトメトリー測定（右段）を示す。
【図２】芳香族化合物含有リポソームで処理してから５分後のＣＨＯ細胞のＤｉＲ強度を示す。１：０．０２モル／モル以上の分子種比Ａ：Ｂ（ここではＤＯＴＡＰ：ＤｉＲ）では、強度Ｉと、混合物が好ましくは使用される濃度Ｃとの間に直線関係が認められ、その結果、リポソームは、融合によって取り込まれる（図１Ｂ）。このプロセスが、ＣＨＯ細胞に向かうか、またはＣＨＯ細胞内への、制御された効果的な物質供給を可能にする。
【図３】融合混合物と融合した後のＤＯＰＣ巨大小胞を示す（蛍光写真（上）および明視野写真（下））。
【図４】筋細胞膜断片を含有する融合混合物と融合した後のＤＯＰＣ巨大小胞を示す。
【図５】処理から２４時間後の、トランスフェクションされた細胞のＧＦＰシグナル分布（Ａ）およびＤｉＲシグナル分布（Ｂ）を示す。
【図６】線維芽細胞の細胞膜をビオチン化することによる、線維芽細胞／筋細胞混合培養からの、初代筋細胞の精製を示す。
【図７】培地中の遊離ドキソルビシン、リポソーム性ドキソルビシン（１：０．１モル／モルのＤＯＰＣ：Ｄｏｘ）、および融合リポソーム中に取り込まれたドキソルビシン（１：０．１モル／モルのＤＯＴＡＰ：Ｄｏｘ）で１０分間処理した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞を示す。その芳香族性分子構造により、ドキソルビシン取込みおよび細胞内でのドキソルビシン濃縮が、蛍光顕微鏡検査で検出可能である。スケールバー＝５０μｍ。
【図８】処理から５分後のＣＨＯ細胞のＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ強度を示す：組成Ａ（ＤＯＴＡＰ）およびＢ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ）の、または組成Ａ（ＤＯＴＡＰ）、Ｂ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ）およびＣ（ＤＯＰＥ）のリポソームで処理した後の蛍光強度の比較。混合比Ａ：ＢおよびＡ：Ｂ：Ｃは、広い範囲にわたって変化させた。
【図９】組成Ａ（ＤＯＴＡＰ）およびＢ（ＤｉＲ）のリポソームとＣＨＯ細胞を融合させた。３つの異なるモル混合比（Ａ：Ｂ）、１：１；１：１．５および１：２モル／モルを検査した。位相差写真と蛍光写真。スケールバーは５０μｍ（すべての写真に有効）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明による融合混合物中では、分子種Ａおよび分子種Ｂが、１：０．０２〜１：２モル／モルのＡ：Ｂ比で存在する。好ましくは、１：０．０５〜１：１モル／モルというＡ：Ｂ比が存在する。このモル混合比は、公知の混合比に比べて、驚くべきことに幅広い。
【００２１】
有利には、本発明による融合混合物が、水性懸濁液中に存在してもよい。
記載の比率範囲Ａ：Ｂでは、さらなる脂質成分の不在下で、再現可能な膜融合の実施が可能であるということが、本発明の枠内で認識され、実験的な証拠を手がかりに示された。
【００２２】
驚くべきことに、記載の比率の両親媒性分子Ａおよび芳香族化合物Ｂが、融合のための十分な前提条件であると認識された。
【００２３】
本発明による融合混合物の場合、従来技術の混合物よりも容易に製造可能であることが有利であるが、なぜなら従来技術の混合物は、少なくとも３つの分子種を含むからである。
【００２４】
特に有利には、記載の範囲内にある両方の分子種ＡおよびＢを選択することにより、詳しくは、前記融合混合物を利用してどの物質を細胞表面および細胞内へと近づけるべきであるかにかかわらず、再現可能に膜融合を実施できるようになる。その際、融合は、早い時間に、つまり任意の脂質膜またはその構成要素もしくは断片と前記融合混合物が接触してから数分間のうちに起こる。融合は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施可能である。
【００２５】
本発明による融合混合物は、例えば、
１．合成の脂質分子および脂質混合物、
２．天然の脂質分子または脂質混合物、
３．細胞質タンパク質および膜貫通タンパク質、
４．タンパク質−脂質混合物、
５．様々な核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、
６．非常に様々なナノ粒子（磁性、蛍光性、等）、
７．薬理有効成分、または他の化学物質、または生体物質
のような、少なくとも１つの添加剤Ｚで補足されてもよい。
【００２６】
この際、付加的な成分Ｚの分率が、通常は、前記融合混合物の４６モル％を超過すべきでないということを顧慮すべきである。当然のことながら、Ｚは、添加剤Ｚの種類、およびその基盤にある、ＡおよびＢを含む前記融合混合物の種類に応じて、１〜４６モル％のあらゆる可能な中間値をとり得る。使用目的に応じて、複数の異なる添加剤が、本発明による融合混合物中に存在することも可能である。
【００２７】
複数の添加剤Ｚ１〜Ｚｎが融合混合物に添加されている場合、これらのＺ１〜Ｚｎが、通常は、同じく最大４６モル％という総分率を有する。
【００２８】
本発明による融合混合物は、合成モデル膜（小胞）との融合においても、原形質膜または細胞小器官膜およびそれらの構成要素または断片も含めた細胞性膜との融合に関しても使用できる。
【００２９】
このように融合させた膜粒子は、有利なことに、引き続き、融合特性を有し得るため、これらの膜粒子は、他の膜とのさらなる融合に使用できることになる。そのような融合は、それぞれの（中間）生成物の融合特性が与えられている限り何度も繰り返すことができる。
【００３０】
融合は、懸濁液中において、および付着膜（ａｄｈａｅｒｉｅｒｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎ）の表面上で実施可能である。
【００３１】
本発明による正荷電融合混合物は、分子種ＡおよびＢを、１：０．０２〜１：２モル／モルというＡ：Ｂ比で含有する。その際、分子種Ｂは、分子種Ａに対するあらゆる中間値をとり得る、つまり、１：０．０２、１：０．０３、１：０．０４、．．．１：１．９６、１：１．９７、１：１．９８、１；１．９９、１：２というＡ：Ｂ比で、およびこれらの記載の中間値に対するさらなるあらゆる中間値、例えば、１：０．００２５、１：０．００３２、１：０．００３９、１：１．９８６または１：１．９９９で存在し得る。
【００３２】
分子種Ａ
分子種Ａの基準は、
（ａ）分子が、少なくとも１つまたは複数の正電荷を有する親水性領域を有するため、分子の親水性部分の総電荷が正であること、および
（ｂ）分子が、それに加えて、二重結合を含むか、または含まない疎水性領域、好ましくはＣ１０〜Ｃ３０−画分を有することである。
【００３３】
この分子Ａの役割は、静電力により、前記融合混合物を負荷電（細胞）膜の近くに運ぶことである。二重結合は、生成するリポソームの膜が弾性になるという有利な効果を有し得るため、リポソームの、細胞膜との融合が容易になる。例えば、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）
ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）
（１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）
といった分子が適している。
【００３４】
第１の例として、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（クロリド塩））を挙げる。
【００３５】
分子種Ｂ
本発明による融合混合物の分子種Ｂは、芳香族分子である必要がある。それは、分子種Ｂそれ自体が芳香族化合物であるか、または少なくとも１つの芳香族基を含有するということを意味し得る。つまり、分子種Ｂは、少なくとも１つの非局在電子系を有する必要がある。さらなる疎水性領域同様に親水性領域も明確に可能であるが、どうしても必要である訳ではない。それらの、融合効率への影響は、個別に評価するべきである。
【００３６】
蛍光色素または色素標識脂質、例えば、
−  ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ）、
−  １，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＲ）、
−  Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  ＤＨＰＥ）、
−  ２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５００／５１０  Ｃ１２−ＨＰＣ）、
−  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）ＤＨＰＥ）、
または、例えば、レスベラトロール、クルクミン、５−ヒドロキシフラボンといったポリフェノール、
または、例えば、ビタミンＥ、ビタミンＡ、もしくはビタミンＫといったビタミン、
または、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセルといった細胞増殖抑制剤、
または、他の薬理有効性芳香族物質のような分子が適している。
【００３７】
さらに、ＤＥ１０２００９０３２６５８（特許文献２）で開示される、分子種Ｂの化合物すべてが、本発明による融合混合物の分子種に適した分子である。
【００３８】
分子種Ａの基準を満たす全分子が、任意のやり方で、分子種Ｂの基準を満たす全分子と組み合わせ可能である。このことは、本発明による融合混合物の特別な利点である。迅速かつ効果的に融合を行うためには、使用目的および意図に応じて、成分ＡおよびＢを組み合わせる。本発明による簡単な実験検査が、あらかじめ与えられた任意の脂質膜を対象に、および本発明による融合混合物を用いた融合の意図される目的を対象に、分子種ＡおよびＢに関して、前記融合混合物の必須および／または最適な構成要素をもたらす。
【００３９】
分子種Ａとして、例えば、ＤＯＴＡＢを選択すると、分子種Ｂとして、例えば、ＤｉＯ、ＤｉＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＤＨＰＥ、ポリフェノール、芳香族ビタミン、または芳香族細胞増殖抑制剤が選択可能であるため、例えば、ＤＯＴＡＢ／ＤｉＯ、ＤＯＴＡＢ／ＤｉＲ、ＤＯＴＡＢ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ、ＤＯＴＡＢ／ポリフェノールといった組み合わせが生じることになる。その際、ＤＯＴＡＢは、分子種Ａの別の例、例えば、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢ、またはＤＯＴＭＡで交換することも可能である。モル混合比が１：０．０２から１：２の間にある限り、これらの、分子種ＡおよびＢの組み合わせすべてが、本発明に含まれる。モル混合比は、とりわけ１：０．０５から１：１の間にもあり得る。
【００４０】
分子種ＡおよびＢを含む、本発明による混合物の構成要素を、任意選択の添加剤Ｚと一緒に、好ましくは同時に、有機溶媒、好ましくは、クロロホルム、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサン、へプタン、またはこれらからなる混合物中に望みのモル比で取り込む。有機溶媒中での均質化後に、有機溶媒を除去する。
【００４１】
乾燥させた均質な混合物を、好ましくはｐＨ値が７付近の水性溶液中に取り込み、改めて均質化する。この形態で、混合物は長期保存可能であり、例えば、４℃において少なくとも１〜２ヶ月保存可能である。このステップは、本発明による方法の準備に利用される。緩衝液中では、前記融合混合物は、数週間にわたる保管に適している。
【００４２】
添加された分子種を含む前記融合混合物は、有利には、リポソームへと形成される。
【００４３】
続いて、さらなる添加剤Ｚ、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質、タンパク質、ナノ粒子、または薬理有効成分が添加されてもよい。
【００４４】
本発明による融合混合物との融合相手としては、あらゆる種類の脂質含有膜を使用する。
【００４５】
本発明の枠内では、カチオン性脂質Ａおよび芳香族分子Ｂとしての分子種ＡおよびＢが、有利には、特許請求項１に相応する、考えられるあらゆる混合物中で存在し得ることが認識された。
【００４６】
有利には、規則的に本発明により、相手ＡおよびＢが融合混合物を形成し高効率で標的膜と融合するようになる。このためには中性ヘルパー脂質は必要ではない。
【００４７】
本発明による融合混合物中の１：０．０２モル／モル以上のＡ：Ｂモル比では、融合リポソームから細胞膜への制御された物質輸送が起こる。それは、分子種Ａおよび分子種Ｂからなる融合混合物中において、この、分子種Ｂの最低限供給量（Ｍｉｎｄｅｓｔａｎｇｅｂｏｔ）が存在するべきであるということを意味する。
【００４８】
有利には、芳香族化合物濃度（Ｃと表す）と被処理細胞中の芳香族化合物の強度（Ｉと表す）との間の直線関係が、例えば、フローサイトメトリーを利用して確認できる、Ａに対する比率にある分子種Ｂを選択する。このことは、例えば、およそ１：０．０２の分子種比Ａ：Ｂから、１：２モル／モルのＡ：Ｂ比まで生じる。この依存性は、一般的な勾配関数（Ｓｔｅｉｇｕｎｇｓｆｕｎｋｔｉｏｎ）Ｙ＝ｍ★ｘ＋ｂ、つまりここではＩ＝ｍ★Ｃ＋ｂ、ｍ＞０に対応する。
【００４９】
本発明の枠内では、当業者が両分子種ＡおよびＢに関して、分子種Ｂの濃度Ｃに依存して分子種Ｂの強度Ｉとの直線関係が、ｍ＞０で存在するかまたは調整される比率を選択する限り常に、前記融合混合物の、膜との融合が起こるということが認識された。
【００５０】
本発明による融合混合物は、（標的）膜と融合する。その際、またはそれに続いて、場合によっては内腔中の、または他の方法で前記融合混合物に結合した添加剤Ｚが、細胞表面または細胞内へと解放される。このことは、同様に、分子種Ｂにも当てはまる場合があり、その分子種Ｂは、膜との融合後に、少なくとも部分的には細胞内部へと解放され得る。
【００５１】
これは、従来技術によるとＤＮＡまたは他の薬理有効成分の輸送用途に利用される、従来技術により公知のエンドサイトーシスとは異なる方法である。
【００５２】
標的膜は、合成膜、もしくは細胞性膜、または膜画分であってもよい。標的膜は、本方法の最中に前記融合混合物と融合する、機能的および構造的に完全な膜であり得る。有利かつ驚くべきことに、記載の比率での分子種ＡおよびＢの使用により、あらゆる膜型が、本発明による融合混合物と融合できるようになる。
【００５３】
それゆえ、この融合法は、本発明によると、融合混合物または融合リポソームを、例えば、１：５０〜１：２００（混合物：細胞培地；ｖ／ｖ）という比率で脂質含有膜と接触させることを想定する。希釈後に、改めて混合物を均質化し、細胞上に加える。接触は、長時間継続する必要はない。膜と前記融合混合物との間での数分間、例えば、１〜１０分間の接触で完全に十分である。このことは、エンドサイトーシスを介する明らかにゆっくりと進行する分子取込みによる公知の方法に比べて明白な利点である。
【００５４】
特に有利には、様々なさらなる方法ステップを、本発明による融合混合物の、膜との融合と組み合わせることができる。
【００５５】
蛍光分子Ｂの選択により、この蛍光分子を、例えば、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーを利用して、膜または細胞中で検出できる。共役二重結合を有する芳香族化合物は、共役のサイズに応じて、蛍光強度が異なる。前記の蛍光物質のような、蛍光性の強い分子種Ｂは、蛍光顕微鏡検査を用いて、膜中ですでに難なく検出可能である。
【００５６】
成分Ｚとしての核酸の選択により、融合と並び、同時にトランスフェクションが行われる。融合に伴うトランスフェクションは、有利なことに、例えば、リポフェクタミンを用いた、従来技術によるトランスフェクションよりも明らかに効果的である。
【００５７】
特に有利には、前記融合混合物中の成分Ｚとしてのビオチン含有物質の選択により、同時に標的膜のビオチン化が行われる。この方法ステップは、特に有利には、標的膜がビオチン化されさらなる方法ステップのために準備されるよう取り計らう。この標的膜に、有利には、続いて、例えば、磁性粒子を付着させることができる。
【００５８】
特に有利な一方法では、細胞混合物中において１つの膜型がビオチン化され、混合物中の別の膜型は、この融合混合物によってビオチン化されない。その場合、この方法は、ビオチン化膜を磁性粒子と結合させ、続いて、磁力により、非ビオチン化膜から分離させるさらなるステップを含み得る。この、融合が仲介するビオチン化は、きわめて有利には、ビオチン化され、磁化された膜をビオチン化されていない、非磁化膜から分離するために、混合培養の精製法が実施可能であるよう取り計らう。このような精製法は、特に有利には、高度の精製膜をもたらす。
【００５９】
本発明の特に有利なさらなる一形態では、前記融合混合物と標的膜とからなる（中間）生成物が、融合が起きた後に融合性である。それにより、特に有利には、さらなる脂質含有膜とのさらなる融合を実施できるようになる。
【００６０】
この結果、有利には、生成する細胞および／または膜が、再度、脂質膜と融合できるようになる。対応する（中間）生成物が、融合特性を有するか、または融合性のままである限り、相応に融合ステップを繰り返すことができる。
【００６１】
これらの様々な方法ステップは、分子種ＡおよびとりわけＢ、ならびに場合によってはＺの選択により、互いに組み合わせ可能であるため、複数の方法が同時に行われることになる。模範的には、有効成分放出を伴う膜およびＤＮＡの標識、および精製法、およびトランスフェクションを挙げる。
【００６２】
前記融合混合物の希釈媒体としては、添加物（血清）を含むか、または含まない細胞培養培地、およびあらゆる水性緩衝液が使用可能である。
【００６３】
分子種ＡおよびＢならびに場合によってはＺを含む本発明による融合混合物は、溶媒中において、有利には融合リポソームとして存在する。
【００６４】
分子種Ｂが蛍光芳香族分子である場合、分子種ＡおよびＢを単独で使用することにより、（モデル）膜染色が、本発明による方法に伴うかもしれない。
【００６５】
それゆえ、本発明による方法を用いると、付加的に添加される成分Ｚの種類に応じて、同時に、
−  Ｚが核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）である限り、トランスフェクションが行われる。
−  Ｚがビオチンを含む分子である限り、ビオチン化が行われる。このビオチン化は、その方法によると、様々な膜型がビオチン化形態または非ビオチン化形態で存在する細胞分離法に使用できる。
−  ＺまたはＢが薬理有効物質である限り、そのような薬理有効物質が細胞内に導入される。この場合、分子種Ｚは、分子種Ｂと同一であり得る。分子種Ｂは、まず標的膜と融合し、次いで細胞内に取り込まれる。
【００６６】
例示的実施形態
以下では、例示的実施形態および添付の図面を手がかりに、本発明をより詳細に説明するが、これにより本発明が制限されるものではない。
【実施例】
【００６７】
第１の例示的実施形態（図１および図２）：細胞懸濁液中での融合（１：０．００５〜１：０．２モル／モルの分子種Ａ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＲ）からなる融合混合物の、ＣＨＯ細胞との融合）。
【００６８】
第１の例示的実施形態は、融合混合物中の分子種ＡおよびＢの、請求されるモル比を検証する。
【００６９】
フローサイトメトリー測定においては、下図に記載のＸ軸およびＹ軸のラベルが、その上方に配置された測定結果にも適用される。
【００７０】
ＤｉＲの融合誘導性濃度範囲を特定するために、融合混合物の成分、ここではＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）およびＤｉＲ（分子種Ｂ）を、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から、クロロホルム中において１：０．００５〜１：２モル／モルの比率で混合した。
【００７１】
結果としては、１：２以上の分子種モル比Ａ：Ｂ（つまり、例えば１：３モル／モルの分子種Ａ：Ｂ）からは、融合混合物中での両物質の均質化が困難であることが確認できるが、なぜならそれらの物質が凝集するからである。それゆえ、本発明の状況では、融合混合物中の分子種Ｂの分率が高すぎるような融合混合物は回避するべきである。
【００７２】
芳香族化合物Ｂを加えた脂質分子Ａの均質化後に、真空下に有機溶媒を除去した。乾燥させた混合物をｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液中に取り込み、超音波浴中で２０分間、均質化した。
【００７３】
懸濁液中の融合混合物の最終濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＤＭＥＭ培地中での１／１００ｖ／ｖ希釈後に、リポソーム懸濁液の５００μｌをおよそ１００，０００個の付着性ＣＨＯ細胞に加え、５分間、３７℃においてインキュベートした。
【００７４】
図１は、顕微鏡写真（ＤｉＲの蛍光および明視野写真）を左段および中央段に、ならびにこれに対応するフローサイトメトリー測定を右段に示す。それぞれ、ＣＨＯ細胞を融合混合物で処理した。それぞれ処理開始、つまり融合混合物を細胞と接触させてから５分後の結果を示す。
【００７５】
１：０．００５の分子種比Ａ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＲ）では、シグナル分布は点状パターンに対応する、図１を参照（顕微鏡検査およびフローサイトメトリー）。これは、分子種Ｂのエンドサイトーシスによる取込みプロセスを示唆する。
【００７６】
それに対して、１：０．０２モル／モル以上の分子種比Ａ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＲ）では、融合リポソームから細胞膜への制御された物質輸送が起こる。これは、分子種Ａおよび分子種Ｂからなる融合混合物中では、分子種Ｂのこの最低限供給量が存在するべきであるということを意味する。
【００７７】
芳香族化合物濃度ＣＤｉｒと被処理細胞中の芳香族化合物の強度ＩＤｉｒとの間の直線関係が、フローサイトメトリーを用いて確認され、詳しくは、例えば、およそ１：０．０２の分子種比Ａ：Ｂから、１：０．２のＡ：Ｂ比まで認められる（図２）。
【００７８】
実際には、この直線関係が、１：２モル／モルのＡ：Ｂ比まで生じる（図示されていない）。この依存性は、一般的な勾配関数Ｙ＝ｍ★ｘ＋ｂ、つまりここではＩＤｉｒ＝ｍ★ＣＤｉｒ＋ｂ、ｍ＞０に対応する。
【００７９】
本発明の枠内では、当業者が両分子種ＡおよびＢに関して、分子種Ｂの濃度Ｃに依存して分子種Ｂの強度Ｉとの直線関係が、ｍ＞０で存在するかまたは調整される比率を選択する限り常に、融合混合物の、膜との融合が起こるということが認識された。
【００８０】
１：０．０２未満の分子種比Ａ：Ｂでは、リポソームはエンドサイトーシスにより取り込まれ（図１のＡ列を参照）、その結果は、ある強度値の周りに脈絡なくばらつく。これは、正荷電リポソームが、１：０．０２モル／モルの分子種比Ａ：Ｂを越える芳香族分子Ｂの添加により、膜融合により別の膜に到達するということを推論させる。
【００８１】
第２の例示的実施形態（図３）：モデル膜との融合（分子種Ａ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＯ）からなる１：０．１モル／モルというモル比Ａ：Ｂの融合混合物の、ＤＯＰＣモデル膜との融合）
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンからなる単層巨大小胞を、２５０ｍＭの糖溶液（ｐＨ７．４、４ｍＭのイミダゾール／ＨＣｌで調整）中、１．３Ｖおよび１０Ｈｚの交流により膨張させた。小胞溶液１００μｌを、あらかじめアビジンで被覆し２５０ｍＭのブドウ糖溶液１．８ｍｌで満たした測定チャンバに移した。さらに、融合小胞（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＯ＝１：０．１モル／モル）１００μｌを添加した。融合小胞の調製は、例１のように行う。サンプルホルダをカバーガラスで覆い、温度を３７℃に高めた。
【００８２】
図３Ａは、膜融合が起きた後のＤＯＰＣ巨大小胞（矢印）を示す。小さい、顕微鏡的に分解不可能な融合小胞から大きな単層ＤＯＰＣモデル膜への蛍光の転移が、完全な膜融合の証拠である。その上、融合は、制御されながら、かつ融合小胞とＤＯＰＣ巨大小胞の外膜との間でのみ起こる。それに対して、内部小胞は、図３Ａと比べた図３Ｂ（明視野）で認識できるように、未染色のままである（矢印）。
【００８３】
この実験は、融合による、融合混合物の、標的の外膜への特異的な取込みを証明する。
【００８４】
第３の例示的実施形態（図４）：細胞性膜断片との融合−１：０．１モル／モルというモル比の分子種Ａ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＯ）の、ＨＬ−１細胞の単離原形質膜との融合、およびこの融合性膜画分の、ＤＯＰＣ巨大小胞とのさらなる融合。
ＨＬ１細胞（筋細胞細胞株）を、２００ｍＯｓｍのＰＢＳ緩衝液中において浸透圧膨張させた。続いて、ホモジナイザー中で細胞を細砕した。細胞核およびミトコンドリアを、遠心分離により残余膜から分解することができた。残余画分は、細胞の、ジストログリカンを含む原形質膜、ＥＲ膜、およびリソソーム膜を含有する。この画分を、２５０ｍＭ糖／イミダゾール／ＨＣｌからなる緩衝溶液中に取り込んだ。
【００８５】
原形質膜含有融合リポソームを生み出すために、１／１０の体積比で、その画分を、ＤＯＴＡＰ：ＤｉＯ（１：０．１モル／モル）からなる融合リポソームと融合した。
【００８６】
第２の融合（Ｃ、Ｄ）を、原形質膜含有融合リポソームとＤＯＰＣ巨大小胞との間で開始した。
【００８７】
すべてのＤＯＰＣ巨大小胞は、蛍光標識を伴わずに製造した。
【００８８】
図４Ａは、ＤＯＴＡＰおよびＤｉＯからなる融合混合物との融合後の巨大小胞を示す（緑色チャンネル）。
【００８９】
図４Ｂは、ＤＯＴＡＰおよびＤｉＯからなる融合混合物との融合後の同一巨大小胞を、抗ジストログリカン抗体染色して示す（赤色チャンネル）。
【００９０】
融合に成功した場合、緑色がＤｉＯからＤＯＰＣ巨大小胞に転移した（緑色チャンネル、図４Ａ）。赤色チャンネル（４Ｂ）は、シグナルを示さなかった、つまりジストログリカンの不在を示した（陰性対照）。
【００９１】
筋細胞のＰＭ画分を、融合混合物ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）およびＤｉＯ（分子種Ｂ）と融合した（第１の融合）。次いで、原形質膜タンパク質ジストログリカンが、融合により、ＤＯＰＣ巨大小胞膜に転移した（第２の融合）。
【００９２】
このことは、抗ジストログリカン−Ａｔｔｏ６３３−抗体での免疫染色により示すことができた（赤色チャンネル）。
【００９３】
図４は、原形質膜画分を含まない融合リポソーム（Ａ、Ｂ）、および原形質膜画分を含む融合リポソーム（Ｃ、Ｄ）との融合後のＤＯＰＣ巨大小胞を示す。ＤｉＯの緑色は、膜融合によって、巨大小胞に転移した。同じく、融合により、原形質膜タンパク質ジストログリカンが、小胞膜に導入された。このことは、赤色の抗ジストログリカン染色で示された。
【００９４】
第４の例示的実施形態（図５）：トランスフェクション−懸濁液中におけるＤＯＴＡＰ／ＤｉＲ／ＤＯＰＥ（１：０．１：１モル／モル）／プラスミド複合体の、ＣＨＯ細胞との融合
融合リポソームの成分、ここではＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／ＤｉＲを、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から１／１／０．１モル／モルという比率で、クロロホルム中において混合した。脂質の均質化後に、真空下に有機溶媒を除去した。乾燥させた混合物を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４の緩衝溶液中に取り込み、超音波浴中で２０分間、均質化した。融合混合物の最終濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００９５】
融合混合物２０μｌに、ｅＧＦＰプラスミド２μｇを加えて、１０分間、超音波浴中で再び均質化した。続いて、融合混合物／プラスミド複合体を１：１００ｖ／ｖにＰＢＳで希釈し、およそ１０００００個のＣＨＯ細胞（懸濁液）に加え、２０分間、３７℃においてインキュベートした。ｅＧＦＰ発現と同様に融合効率も、フローサイトメトリーで測定した。対照としては、未処理ＣＨＯ細胞、およびリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて典型的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用した。
【００９６】
図５Ａは、３つのサンプルのＧＦＰ強度分布を示す。トランスフェクトされた両サンプルとも、未処理対照と比べて明らかにシフトされた強度プロファイルを示した。相違点は、特に、プロファイル分布において現れる。リポフェクタミンサンプルのトランスフェクション効率は、およそ６０％にあり、著しく異なったＧＦＰ強度を示す。つまり、高いＧＦＰ発現を有する細胞が存在する一方で、他の細胞は、非常にわずかにしかＧＦＰを発現しない。そのような細胞の分析は、たいていの場合きわめて困難であるか、または妥当性がない。
【００９７】
それに対して、融合混合物を用いた本発明の方法によりトランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率は、７５％を上回る。典型的なトランスフェクションに対する利点は、全細胞の均質な発現レベルにある。つまり、図５Ｂは、融合リポソーム／プラスミド複合体で処理された細胞でのトランスフェクション効率が、融合効率と相関関係にあることを示す。融合効率は、ＤｉＲシグナル分布を手がかりに算出され、９０〜９５％という値を有する。
【００９８】
第５の例示的実施形態（図６）：懸濁液中におけるＤＯＴＡＰ：ＤｉＯ：ＣａｐＢｉｏｔｉｎ−ＤＨＰＥ（１：０．０５：０．１モル／モル）の、初代心臓線維芽細胞との融合による原形質膜ビオチン化。
Ａ：Ｂ：Ｚ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＯ：成分ＺとしてのｃａｐＢｉｏｔｉｎ−ＤＨＰＥ）からなる融合混合物の成分を、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から、１：０．０５：０．１モル／モルというＡ：Ｂ：Ｚ比で、クロロホルム中において混合し均質化した。引き続き、例１の記載に相応して融合リポソームを調製した。
【００９９】
ビオチン化された融合リポソーム１０μｌをＤＭＥ培地に１：１００希釈し、続いて、心臓線維芽細胞（１００〜６００万個）を融合混合物中に再懸濁した。１〜３分間インキュベーションした後−この時間は、線維芽細胞の融合には十分であったが、筋細胞集団はまだ融合していなかった−、細胞を２回、ＰＢＳで洗浄し、ペレット化し、磁性抗ビオチンビーズ溶液１００μｌに再懸濁し、２０分間、４℃でインキュベートした。融合したすべての線維芽細胞は、ビオチン−抗ビオチン結合を介して、磁性ビーズで標識された。
【０１００】
この細胞集団は、磁場中のクロマトグラフィーカラムを利用すると、懸濁液から保持された。純粋な筋細胞集団は、磁場によって保持されず、収集された。
【０１０１】
図６は、２つの細胞集団を示す。アクチン染色は、両方ともの細胞型（筋細胞および線維芽細胞）を標識し、筋細胞特異的抗体α−アクチニンは、免疫染色において筋細胞のみを視覚化する。出発培養の比率は、およそ５０：５０にあり、記載の方法により、およそ、９５％の筋細胞に対する５％の線維芽細胞にシフトする。
【０１０２】
目下のところ、同じように純粋な筋細胞培養を得るための方法は存在しない。融合が制御するビオチン化法は、他の細胞型を用いても適用可能である。
【０１０３】
第６の例示的実施形態（図７）：融合リポソームから癌細胞へのドキソルビシン放出
ドキソルビシンは、今日では、医薬薬剤として化学療法において使用される。ドキソルビシンは、細胞核内のＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡ合成を妨害する。ドキソルビシンは、芳香族分子構造を有し、ここでは、直接的に分子種Ｂとして、および正荷電リポソームの構成要素として、リポソーム膜と細胞膜との間の膜融合の誘導に関して検査した。癌細胞へのドキソルビシンの挿入（Ｅｉｎｓｃｈｌｅｕｓｕｎｇ）を証明するために、先立つ融合に続いて、以下の実験を行った。
【０１０４】
融合リポソームの成分、ＤＯＴＡＰ（分子種Ａ）およびドキソルビシン（分子種Ｂ）を、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から、１：０．１モル／モルという比率で、クロロホルム中において混合した。
【０１０５】
芳香族性ドキソルビシンを加えた脂質分子の均質化後に、真空下に有機溶媒を除去した。乾燥させた混合物をｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液中に取り込み、超音波浴中で２０分間、均質化した。融合混合物の最終濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＤＭＥＭ培地中での１／１００ｖ／ｖ希釈後に、融合混合物の５００μｌをおよそ１００，０００個の付着性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞に加え、１０分間、３７℃においてインキュベートした。
【０１０６】
対照としては、もう１つの細胞サンプルを、融合混合物を含まない培養培地中で同量のドキソルビシン（２μｇ）とインキュベートした。従来の用量は、１ｍｇ／ｍｌである。
【０１０７】
さらに、ドキソルビシンを中性ＤＯＰＣリポソーム（分子種Ａを含まない）中に挿入し（１：０．１モル／モルの比率のＤＯＰＣ：Ｄｏｘ）、別のサンプルと同じ濃度（２μｇ／ｍｌ）で、付着性細胞に加えた。ドキソルビシン取込みは、いずれの場合も、蛍光顕微鏡検査で観察した。続いて、結果を互いに比較した。
【０１０８】
図７は、１０分間のインキュベーション後の、明視野での顕微鏡写真（左段）および対応する蛍光顕微鏡写真（緑色チャンネル、右段）を示す。最も効果的なドキソルビシン取込みは、融合リポソームの使用時に認められた（図７Ｃ）。この場合、投入された全細胞が、細胞核中において強度のドキソルビシン蛍光シグナルを示した。
【０１０９】
ドキソルビシンのこのように迅速な、細胞核への挿入は、これまで公知ではない。最も頻繁に適用されたドキソルビシンインキュベーション時間は、２４〜７２時間である。
【０１１０】
培地中の遊離ドキソルビシンを用いた対照（図７Ａ）は、わずかな蛍光シグナルを示し、ＤＯＰＣ／Ｄｏｘ混合物は、シグナルを示さない（図７Ｂ）。エンドサイトーシスが仲介する物質輸送プロセスは、完全に進行するためには、通常は、より長い時間を必要とする（数時間から数日間まで）。
【０１１１】
図７Ｃは、細胞核内でのＤｏｘの、ＤＮＡとのインターカレーションを示し、それゆえ、迅速な取込みおよび薬理有効物質としての使用と同時にＤＮＡ色素としての使用を示す。
【０１１２】
この方法を用いると、癌細胞を数分間以内に細胞増殖抑制剤で処理することが可能である。
【０１１３】
第７の例示的実施形態（図８）：それぞれ様々なモル分率の分子種Ｂを用いて、分子種Ａ（ＤＯＴＡＰ：）およびＢ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ）から製造されたリポソームと分子種Ａ（ＤＯＴＡＰ：）、Ｂ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ）およびＣ（ＤＯＰＥ）から製造されたリポソームとの間での蛍光強度の比較。
この例示的実施形態では、Ａ／Ｂ型のリポソームで処理後、およびＡ／Ｂ／Ｃ型のリポソームで処理後のＣＨＯ細胞の蛍光強度を、互いに直接に比較した。比較的低い濃度の分子種Ｂを使用すると、つまり、０．１〜０．４μｇ／ｍｌの濃度範囲、またはＡ／Ｂの場合は１／０．００５〜１／０．０２、およびＡ／Ｂ／Ｃの場合は１／０．００５／１〜１／０．０２／１というモル混合比では、リポソームの取込みはエンドサイトーシスを介して起こり、Ａ／Ｂ型とＡ／Ｂ／Ｃ型との間では蛍光強度の差は認識できない。さらに、Ａ／Ｂの場合は１／０．０２まで、およびＡ／Ｂ／Ｃの場合は１／０．０２／１までの範囲での強度は、およそ同じ、低いレベルにある。それゆえ、使用される芳香族化合物濃度（分子種Ｂ）と測定された、芳香族化合物の強度との間では、ほとんど直線性が存在しない（図８）。１：０．０２モル／モル以上のＡ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）モル混合比、および１：０．０２：１モル／モル以上のＡ：Ｂ：Ｃ（ＤＯＴＡＰ：ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ：ＤＯＰＥ）モル混合比では、両方の場合とも膜融合が誘導される。もっとも、この際、３つの成分（Ａ／Ｂ／Ｃ）からなるリポソームと比べて、分子種ＡおよびＢのみから構成されているリポソームを用いると明らかにより効果的に融合、それゆえ分子の転移が起こる。図８では、このことが、１／０．０３５または１／０．０３５／１〜１／０．５または１／０．５／１というモル混合比に関して示されている。図８において、μｇ／ｍｌで表されるＢの濃度から読み取れるように、両方の場合とも分子種Ｂの使用量は同じであるにもかかわらず、Ａ／Ｂ／Ｃリポソームに対するＡ／Ｂリポソームの明らかな優位が、明確に読み取れる。１：０．０２モル／モル以上のモル混合比Ａ：Ｂでは、融合、および融合リポソームから細胞膜への制御された物質輸送が起こり、この物質輸送は、芳香族化合物濃度と、被処理細胞中の芳香族化合物の強度との間の直線関係を伴う。このことは、図８では、１：０．５のモル混合比Ａ：Ｂまで示されているが、例えば、図９が、第８の例示的実施形態との関連で示すように、この混合比Ａ：Ｂは、１：２まで拡張可能である。
【０１１４】
分子種ＢとしてＤｉＯ、ＤｉＲ、またはドキソルビシンが使用された、前記の例示的実施形態１〜７とは異なり、本例示的実施形態では、別の１つの分子種Ｂ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−ＤＨＰＥ）が効果的に検査された。
【０１１５】
第８の例示的実施形態（図９）：付着性ＣＨＯ細胞との融合（１：０．５〜１：２モル／モルの分子種Ａ：Ｂ（ＤＯＴＡＰ：ＤｉＲ）からなる融合混合物の融合）
第８の例示的実施形態は、第１の例示的実施形態と比べて、分子種Ａに対する、より高い分率の分子種Ｂを検証する。位相差写真は、分子種Ｂの分率が高い場合でも、処理後の細胞が活発なままであり、形態学的変化が進行しないということを示す。それゆえ、生体適合性は非常に高い。蛍光写真は、リポソーム中の色素分率の上昇と共に高まる細胞の色素取込みを具体的に示す。
【図２】
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【図５】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【国際調査報告】
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