(57)【要約】  本発明は、肝臓癌関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ及びこれを含む高効率二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に関し、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、細胞内に効率的に伝達されるようにするために、二重らせんＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性物質及び疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合を利用して接合された形態の構造を持ち、水溶液で前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子形態に転換されることができる。前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に含まれたｓｉＲＮＡは、肝臓癌関連遺伝子、特にＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡであることが好ましい。また、本発明は、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法及び前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む癌、特に肝臓癌を予防または治療するための薬剤学的組成物に関する。
2016531563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２００番から選択されたいずれか一つの配列を有するセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖からなるＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
配列番号１、１０、１３、５６、９９、１０２、１８０、１９７、１９９または２００番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列を持つセンス鎖とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖を含むことを特徴とする請求項１に記載のＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、一つ以上の化学的変形(chemical modification) を含むことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載のＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記化学的変形は、ヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による変形；ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置き換えられた変形；ヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への変形; 及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への変形から選択された一つ以上の変形であることを特徴とする請求項４に記載のＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡ のアンチセンス鎖の５’末端に一つ以上のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が結合されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載のＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
下記の構造式１の構造を持つ二重らせんオリゴＲＮＡ構造体:
［構造式１］
2016531563.tif 000014
前記構造式１で、Ａは親水性物質、Ｂは疏水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味して、ＲはＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【請求項８】
下記の構造式２の構造を持つことを特徴とする請求項７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体:
［構造式２］
2016531563.tif 000015
前記構造式２で、Ｓは、請求項７に記載のｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味して、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、請求項７に記載の構造式１での定義と同様である。
【請求項９】
下記の構造式３の構造を持つことを特徴とする請求項８に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体:
［構造式３］
2016531563.tif 000016
前記構造式３で、Ａ、Ｂ、 Ｘ、 Ｙ、Ｓおよび ＡＳ は、請求項８に記載の構造式２での定義と同様であり、５’および３’は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する。
【請求項１０】
ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡは、請求項１から請求項６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項７から請求項９のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記親水性物質の分子量は、２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項７から請求項１０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成された群から選択されるいずれか一つあることを特徴とする請求項１１に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１３】
前記疏水性物質の分子量は、２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項７から請求項１０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１４】
前記疏水性物質は、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、及びリポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１５】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コテスタニルモルメートおよびコリスタニルアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１６】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１７】
前記Ｘ、ＹおよびＺ表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項７から請求項１６のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１８】
前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１９】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２０】
前記親水性物質に受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌＩｇａｎｄ）が追加的に結合されたことを特徴とする請求項７から請求項１６のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２１】
前記リガンドは、ターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ） 及びマンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２２】
請求項７から請求項２１のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項２３】
互いに異なる配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合されて構成されることを特徴とする請求項２２に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、請求項７から請求項２１のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または請求項２２または請求項２３に記載のナノ粒子を有効性分として含む薬学的組成物。
【請求項２５】
前記薬学的組成物は、癌を防または治療するための薬学的組成物であることを特徴とする請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記癌は、癌は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、すい臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌及び肺癌で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記肝臓癌は、 ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）であることを特徴とする請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項２４から請求項２７のいずれかに記載の組成物を含む凍結乾燥された形態の剤形。
【請求項２９】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、請求項７から請求項２１のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、請求項２２または請求項２３に記載のナノ粒子、または請求項２４から請求項２８のいずれかに記載の組成物または剤形を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
【請求項３０】
前記癌は、癌は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、すい臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌及び肺癌で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の癌の防または治療方法。
【請求項３１】
前記肝臓癌は、 ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）であることを特徴とする請求項３０に記載の癌の防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓癌関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡおよびこれを含む高効率二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に関し、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、細胞内に効率的に伝達されるようにするために、二重らせんＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性物質および疏水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合を利用して接合された形態の構造を持ち、水溶液で前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の疏水性相互作用によってナノ粒子形態に転換されることができる。前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に含まれたｓｉＲＮＡは、肝臓癌関連遺伝子、特にＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的なｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【０００２】
また、本発明は、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む癌、特に肝臓癌を予防または治療するための薬剤学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病治療のための治療剤開発および標的検証において重要なツールである。この技術で、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」という）は、 その役割が発見された以後、多様な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）で配列特異的にｍＲＮＡに作用することが明らかになった（Ｓｉｌｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２００５，８３：７６４−７７３）。長い鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖はＤｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１〜２３塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ，ｂｐ）でプロセッシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、以下「ｓｉＲＮＡ」という）に変換されて、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合してガイド（アンチセンス）鎖が、ターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程を介してターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＲＥＣＥＮＴ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２．１，５０３−５１４）。
【０００４】
ベルトラン（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究グループの研究によると、同じターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡがアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べてｓｉＲＮＡが生体内／外（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果が優れて、該当効果が長く持続される効果を持つと明らかになった（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２．２９６：１０００−１００４）。また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体ベース医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇ）に比べて適用できる対象が画期的に拡大する可能性がある長所を持つ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｏｗａｒｄｓ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｓｅ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ．ＭＯＬＥＣΜＬＡＲ ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６ １３（４）：６６４−６７０）。
【０００５】
ｓｉＲＮＡなどの優れた効果および多様な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、ｓｉＲＮＡの安定性改善と細胞伝達効率改善によって、ｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達されなければならない（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．２００６ Ｊａｎ；１１（１−２）：６７−７３）。
【０００６】
前記問題を解決するために、体内安定性改善のためにｓｉＲＮＡの一部ヌクレオチドまたは骨格（ｂｏａｃｋｂｏｎｅ）を核酸分解酵素抵抗性を持つように変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するかウィルス性ベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、リポソームまたはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等の伝達体の利用などに対する研究が活発に試みられている。
【０００７】
アデノウィルスやレトロウィルスなどのウィルス性ベクターを利用した伝達システムは、形質注入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および発ガン性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。一方、ナノ粒子を含む非ウィルス性（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ）伝達システムは、ウィルス性伝達システムに比べて細胞伝達効率は低い方であるが、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高く、ターゲット特異的に伝達が可能で、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞または組織に吸収（ｕｐｔａｋｅ）および内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）等の改善された伝達効果が高いだけでなく、細胞毒性および免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が殆どない長所を有していて、現在はウィルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法と評価されている（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡ ｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３；１１７（１２）：３６２３−３６３２）。
【０００８】
前記非ウィルス性伝達システムのうちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を利用する方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの様々な高分子を使用ことによってナノ粒子を形成して、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に伝達する形態を持つ。ナノ伝達体を利用する方法のうち主に活用される方法は、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）等があるが、この中でリポプレックスを利用した方法は、カチオン性脂質で構成されて細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）のアニオン性脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して、細胞内で（に）伝達する役割をする（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１５；９３（２１）：１１４９３−８，１９９６）。
【０００９】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進された薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を持つようにして、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ １１；４３２（７０１４）：１７３−８，２００４）。この時ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））またはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合された化学物質の性質によりｓｉＲＮＡの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡはカチオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を持つ伝達体となる（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１６，２００８）。特に高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は薬品伝達運搬体として使われる他のシステムである、小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等に比べてその大きさが小さく分布が非常に一定で、自発的に形成される構造であるため、製剤の品質管理および再現性確保が容易である長所がある。
【００１０】
また、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を介して、ｓｉＲＮＡの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許公報第８８３４７１号参照）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的変形およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは生体内での低い安定性とターゲット組織への伝達がスムーズでない短所は依然として残る。このような短所を解決するために、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡのような二重らせんオリゴＲＮＡに親水性および疏水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、前記構造体は、疏水性物質の疏水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）と命名された自己組み立てナノ粒子を形成することになるが（大韓民国登録特許公報第１２２４８２８号参照）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を収得できる長所を持つ。
【００１１】
一方、韓国では、人口４人中１人が癌（死亡原因１位）で死亡して、毎年診断方法と資料収集方法の発展と人口の高齢化と環境変化などによってその数が顕著に増加する傾向にある。また、世界的な癌発生及び癌による死亡も増加する傾向にあって癌征服のための予防、診断及び治療技術は人類共通の緊急な課題である（ＢＴ技術動向報告書、主要疾患別新薬開発動向、生命工学政策研究センター、２００７、叢書第７２冊）。
【００１２】
癌は、世界的に最も多い死亡者を出す疾病の一つで、革新的な癌治療剤の開発はこれに対する治療時発生する医療費を節減できると同時に高付加価値を創り出すことができる。癌の治療は、手術、放射線治療、化学療法、生物学的治療に区分されるが、この中で化学療法は、化学物質で癌細胞の増殖を抑制したり殺す治療法であり、抗癌剤によって現れる毒性は、相当部分正常細胞でも現れるため、一定程度の毒性を示し、抗癌剤が効果を示すが一定期間使用後には効果が喪失される耐性が発生するので、癌細胞に選択的に作用して耐性が生じない抗癌剤の開発が切に望まれる（癌征服の現住所Ｂｉｏｗａｖｅ  ２００４．６（１９））。近年、癌に対する分子遺伝情報の確保を通じて癌の分子的特性を標的にした新しい抗癌剤の開発が進行されており、癌細胞だけが持っている特徴的な分子的標的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ）をねらう抗癌剤は、薬剤耐性が生じないとの報告もある。したがって、癌細胞だけ持っている特徴的な分子的標的を狙った遺伝子治療剤の開発を通じて既存抗癌剤に比べて効果が優れて副作用が少ない治療剤の開発が可能である。
【００１３】
ＲＮＡ干渉現象を利用して高い特異性と効率で遺伝子発現を阻害できることが知られた以後癌に対する治療剤として多様な遺伝子をターゲットにするｓｉＲＮＡが研究されている。これらの遺伝子は、腫瘍遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を始め、抗−アポトーシス物質（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、テロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、成長因子受容体遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ）、信号伝達物質（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）等で癌細胞の生存に必要な遺伝子の発現を阻害させたりアポトーシスを誘導することが主な方向である（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００６；２３：１７−３４）。
【００１４】
Ｇａｎｋｙｒｉｎは、２６Ｓプロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）の調節複合体であるｐ２８遺伝子産物で、ｐ２８ＧＡＮＫとも呼ばれ、腫瘍抑制遺伝子であるｐＲｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とｐ５３の活性を調節する細胞周期調節因子で腫瘍タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。Ｇａｎｋｙｒｉｎが過発現されると、ｐＲｂのリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）が増加して、ｐ１６ＩＮＫ４ａの活性が阻害されて細胞分裂進行が加速される（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；１３（４）：４５３−６８）。Ｇａｎｋｙｒｉｎが減ると、ｐＲｂのリン酸化が減少して、ｃａｓｐａｓｅ−８、９媒介アポトーシスが増加して肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）動物モデルで腫瘍成長抑制が観察された（Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ２８ＧＡＮＫ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００５；１２８（７）：２０２９−４１）。
【００１５】
また、ＢＭＩ−１（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｌｏｎｅｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  １）は、転写抑制因子で、造血幹細胞と神経幹細胞を調節する役割をする。ＢＭＩ−１は知らされた酵素的活性はないが、染色質（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）の構造と腫瘍抑制タンパク質であるｐ１６（ｉｎｋ４ａ）とｐ１４（Ａｒｆ）の転写活性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調節するＰＲＣ１複合体（ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｅｌｘ−１）の核心調節因子である（ＢＭＩ１  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１；１１２（１０）：２７２９−４１）。正常細胞でＢＭＩ−１シグナルがなければ、細胞周期が進行してアポトーシスが抑制されて分裂が進行される。種々の癌でＢＭＩ−１が過発現することが確認され、ＢＭＩ−１の発現が抑制されると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ上で細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、コロニー形成（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が明らかに阻害されることが観察された（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＢＭＩ−１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ。Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；１０１（２）：３７９−３８６）。
【００１６】
前記考察した通り、ＧａｎｋｙｒｉｎとＢＭＩ−１の癌治療剤ターゲットとしての可能性は提示されている状況であるが、まだＧａｎｋｙｒｉｎとＢＭＩ−１に対するｓｉＲＮＡ治療剤及びこれの伝達技術に対する技術開発は僅かな状況で、特異的かつ高効率でＧａｎｋｙｒｉｎとＢＭＩ−１の発現を阻害できるｓｉＲＮＡ治療剤及びこれの伝達技術に対する市場の需要は非常に高い状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、前記のような問題点を解決しようと、Ｇａｎｋｙｒｉｎまたは ＢＭＩ−１に特異的でありかつ非常に高い効率でその発現を阻害できる新規ｓｉＲＮＡおよびこれを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、およびそのような二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法を提供するところにある。
【００１８】
また、本発明の他の目的は、前記Ｇａｎｋｙｒｉｎまたは ＢＭＩ−１特異的なｓｉＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を有効性分として含む癌、特に肝臓癌予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、前記Ｇａｎｋｙｒｉｎまたは ＢＭＩ−１特異的なｓｉＲＮＡまたは、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を利用して癌を予防または治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明では配列番号１〜200番で構から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）である第１のオリゴヌクレオチドとそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖である第２のオリゴヌクレオチドからなる肝臓癌関連遺伝子であるＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１ 特異的ｓｉＲＮＡを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で構成されたナノ粒子の模式図。
【図２】本発明に係る配列番号１、１０２または２０１番の配列をセンス鎖として含むｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子の大きさ（ｓｉｚｅ）及びＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）の測定グラフで、ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｇａｎｋは配列番号１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子；ＳＡＭｉＲＮＡ−ＢＭＩは、配列番号１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子；ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｇａｎｋ＋ＢＭＩは、配列番号１及び配列番号１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を示す。
【図３】本発明の配列番号１〜１００番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの１ｎＭ濃度で形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子（ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）発現阻害量グラフ。
【図４】本発明の配列番号１〜１００番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２ｎＭ濃度で形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフ。
【図５】本発明の配列番号１０１〜２００番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの１ｎＭ濃度で形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフ。
【図６】本発明の配列番号１０１〜２００番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２ｎＭ濃度で形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフ。
【図７】本発明の配列番号１、１０、１２、３５、５６、６１、８１、８８、９９番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを２種の肝臓癌細胞に低濃度で処理してターゲット遺伝子の発現阻害量を確認したグラフ、  Ａ：Ｈｅｐ３Ｂ細胞株  Ｂ：Ｈｕｈ−７細胞株。
【図８】本発明の配列番号１０２、１２４、１２５、１８０、１８３、１９３、１９７、１９８、１９９、２００番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを二種の肝臓癌細胞に低濃度で処理してターゲット遺伝子の発現阻害量を確認したグラフ、  Ａ：Ｈｅｐ３Ｂ細胞株  Ｂ：Ｈｕｈ−７細胞株。
【図９】本発明の配列番号１、１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０％）を確認したグラフ、  Ａ：配列番号１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのＩＣ５０  Ｂ：配列番号１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのＩＣ５０。
【図１０】本発明の配列番号１、１０２、２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを２種の癌細胞に形質転換させて該当ｓｉＲＮＡによるコロニー形成分析（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ，ＣＦＡ）を介してコロニー形成抑制を確認した写真、  Ａ：配列番号１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのコロニー形成分析  Ｂ：配列番号１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのコロニー形成分析。
【図１１】本発明の配列番号１、１０２、２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時ターゲット遺伝子の発現阻害を確認したグラフ。
【図１２】本発明の配列番号１、１０２、２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時示される細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）減少を確認したグラフ。
【図１３】本発明の配列番号１０２及び２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんＲＮＡ構造体を含むナノ粒子の肝臓癌モデル尾静脈投与によるターゲット遺伝子発現阻害を確認したグラフで、最後の投与後４８時間が経過した時点の腫瘍組織で配列番号２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんＲＮＡ構造体を含むナノ粒子が投与された対照群対比配列番号１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんＲＮＡ構造体を含むナノ粒子が投与された実験群で発現するターゲット遺伝子のｍＲＮＡ量を確認したグラフで、ｘ軸の各数字は個体を示す。
【図１４】本発明の配列番号１、１０２、２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんＲＮＡ構造体を含むナノ粒子の肝臓癌モデル尾静脈投与による肝臓癌成長抑制効果を確認したグラフで、ナノ粒子投与による肝臓癌成長抑制程度を血清内ＡＦＰ数値を確認する。ＤＰＢＳは、溶媒であるＤＰＢＳだけを投与した対照群;２０１は配列番号２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔで投与した対照群；１は配列番号１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を５ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔで投与した実験群;１０２は配列番号１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔで投与した実験群;１＋１０２は同量の配列番号１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体と配列番号１０２番の配列をセンス鎖として含むｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（各配列当たり処理された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の量は２．５ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔずつである）で投与した実験群；ｓｏｒａｐｅｎｉｂは陽性対照群を意味する。
【００２２】
≪発明を実施するための形態≫
本発明では配列番号１〜２００番から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）である第１のオリゴヌクレオチドとそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖である第２のオリゴヌクレオチドからなる肝臓癌関連遺伝子である ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを提供する。
本発明における「ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ（ｓ）」とは、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１タンパク質をエンコードする遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓ）を意味する。
【００２３】
また、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１に対する特異性が維持される限り、前記配列番号１〜配列番号２００に係る配列を含むセンス鎖またはそれに相補的なアンチセンス鎖で、一つまたは２以上の塩基が置換、欠失、または挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡも本発明の権利範囲に含まれることは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明である。
【００２４】
前記配列番号１〜１００番は、Ｇａｎｋｙｒｉｎに特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列で、配列番号１０１〜２００番は、ＢＭＩ−１に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列である。
本発明に係るｓｉＲＮＡは、好ましくは配列番号１、１０、１３、５６または９９番に係るＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、または配列番号１０２、１８０、１９７、１９９または２００番に係るＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、
さらに好ましくは、配列番号１、１０または９９番に係るＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、または 配列番号１０２、１９９または２００番に係るＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、
最も好ましくは、配列番号１番に係るＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、または配列番号１０２番に係るＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００２５】
本発明に係るｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなることが好ましく、前記配列番号１〜配列番号２００番から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖およびこれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
【００２６】
本発明で提供されるＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡは、該当遺伝子を暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合することができるように設計された塩基配列を持つので、該当遺伝子の発現を効果的に抑制できることを特徴とする。また、前記ｓｉＲＮＡの３’末端に一つまたは二つ以上の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）されたヌクレオチドを持つ構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含んでもよく、
【００２７】
また、前記ｓｉＲＮＡの生体内安定性向上のために、核酸分解酵素抵抗性付与および非特異的免疫反応減少のための様々な変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含んでもよい。前記ｓｉＲＮＡを構成する第１または第２オリゴヌクレオチドの変形は一つ以上のヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による変形；ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置き換えられた変形；及びヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への変形から選択された一つ以上の変形が組み合わせて使用でき、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への変形も使用可能である（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．５５：ｐｐ６１−６５ ２００４，ＵＳ ５，６６０，９８５，ＵＳ ５，９５８，６９１，ＵＳ ６，５３１，５８４，ＵＳ ５，８０８，０２３，ＵＳ ６，３２６，３５８，ＵＳ ６，１７５，００１; Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９−１１４３，２００３；ＲＮＡ、９：１０３４−１０４８，２００３； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５，２００３; Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３８(１７) ５７６１−５７７３，２０１０; Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３９(５) １８２３−１８３２, ２０１１）。
【００２８】
本発明で提供されるＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡは、該当遺伝子の発現を低下させるだけでなく、該当タンパク質の発現を顕著に阻害させる。また、癌の治療において使用される癌特異的ＲＮＡｉと典型的な組み合わせられる（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）治療方法である放射線や化学療法の感受性を向上させると知られているので（Ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＲＮＡｉ−ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３４（１）:１−２、２０１１）、本発明のＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを既存の放射線または化学療法と並行使用できる。
【００２９】
また、本発明のＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡ及びＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを同時に使用する場合、該当遺伝子の発現が同時に阻害されて癌細胞の成長を明確に阻害できる特徴を持つ。
【００３０】
本発明の他の様態として、肝臓癌関連遺伝子、特に、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの生体内への効率的な伝達および安定性向上のために、ｓｉＲＮＡの両末端に親水性物質および疏水性物質が接合された形態の接合体を提供する。
【００３１】
前記のとおりｓｉＲＮＡに親水性物質および疏水性物質が結合されたｓｉＲＮＡ接合体の場合、疏水性物質の疏水性相互作用によって自己組み立てナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国特許登録番号第１２２４８２８号参照）、このような接合体は、体内への伝達効率および体内での安定性がきわめて優秀なだけでなく、粒子の大きさが非常に均一してＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であるため、薬物としての製造工程が簡単である長所がある。
【００３２】
一つの好ましい具体例として、本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式(１)のような構造を持つことが好ましい: 
［構造式１］
2016531563.tif 000003
前記構造式(１)で、Ａは親水性物質、Ｂは疏水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味して、Ｒは ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【００３３】
前記ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡは、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異性が維持される限り、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１遺伝子の結合部位と１００％塩基配列が相補的な場合、すなわち完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）することだけでなく、一部塩基配列が一致しない場合、すなわち不完全一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）があるものも含まれる。このようなｓｉＲＮＡは、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部に対して少なくとも７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より一層好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を持つ配列で構成されてもよい。
【００３４】
このようなｓｉＲＮＡは、二本鎖デュプレックスまたは、一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、一本鎖ポリヌクレオチドとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）等が挙げられるがこれに限定されるない。
【００３５】
より好ましくは、本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式(２)の構造を持つ: 
［構造式２］
2016531563.tif 000004
前記構造式(２)で、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、前記構造式(１)での定義と同様であり、Ｓは、 ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する。
【００３６】
より好ましくは、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式３の構造を持つ: 
［構造式３］
2016531563.tif 000005
前記構造式３で、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、ＸおよびＹは、前記構造式１での定義と同様であり、５’および３’は、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する。
【００３７】
前記構造式１〜構造式３でのＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が一つ〜三つ結合されてもよく、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡが使用されてもよいことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００３８】
前記構造式１〜構造式３での親水性物質は分子量が２００〜１０，０００であるカチオン性または非イオン性高分子物質であることが好ましく、さらに好ましくは１，０００〜２，０００である非イオン性高分子物質である。例えば、親水性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるのではない。
【００３９】
前記構造式１〜構造式３での疏水性物質（Ｂ）は、疏水性相互作用を介して構造式１〜構造式３に係るオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割をする。前記疏水性物質は、分子量が２５０〜１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）等が使用されるが、これに制限されず、本発明の目的に合致するものであればいかなる疏水性物質も使用可能である点は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００４０】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コテスタニルモルメートおよびコリスタニルアミンからなる群で選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されるが、この時、グリセリドの脂肪酸としては、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和脂肪酸が好ましい。
【００４１】
特に、前記疏水性物質の中でも飽和または不飽和炭化水素やコレステロールが、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができる長所を有している点から好ましい。
【００４２】
前記疏水性物質は、親水性物質の反対側末端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）に結合され、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合されても構わない。
【００４３】
本発明に係る構造式１〜構造式３での親水性物質ブロックまたは疏水性物質とＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡは単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合（ＸまたはＹ）によって結合される。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質、または疏水性物質とＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの末端で共有結合して、必要に応じて特定環境で分解が可能な結合を提供する限り特に限定されるのではない。したがって、前記リンカーは、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造過程中ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡおよび／または親水性物質（または、疏水性物質）を活性化するために結合させるいかなる化合物も使用されることができる。前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のうちいずれでもよい。この時、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結合があり、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合などがあるが、これに限定されない。
【００４４】
また、前記構造式１〜構造式３でのＲ（または、ＳおよびＡＳ）で表されるＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡは、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１に特異的に結合できる特性を持つｓｉＲＮＡならばいずれも制限なしに使用可能で、好ましくは本発明では配列番号１〜２００から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖で構成される。
【００４５】
本発明に係るｓｉＲＮＡは、好ましくは配列番号１、１０、１３、５６または９９番に係るＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、または配列番号１０２、１８０、１９７、１９９または２００番に係るＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、さらに好ましくは、配列番号１、１０または９９番に係るＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、または 配列番号１０２、１９９または２００番に係るＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、最も好ましくは、配列番号１番に係るＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、または配列番号１０２番に係るＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００４６】
一方、腫瘍（ｔｕｍｏｒ）の組織は非常に堅固で正常組織に比べて拡散制限（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を持つが、このような拡散制限は、腫瘍成長に必要な栄養分、酸素及び二酸化炭素のような老廃物の移動に悪影響を与えるので、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を介して周辺に血管を形成することによって拡散制限を克服する。血管新生を介して形成された腫瘍組織内血管は、腫瘍の種類によって１００ｎｍ〜２ｕｍほどの隙間を持つ緩い血管構造（ｌｅａｋｙ  ａｎｄ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ）を持つ。したがって、ナノ粒子は、正常組織の組織化された毛細血管に比べて緩い血管構造を含む癌組織の毛細血管内皮（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）を通過しやすくなって血液内循環過程中腫瘍間質（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ）に接近が容易になり、また腫瘍組織の中にはリンパ管（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｄｒａｉｎａｇｅ）がなく薬物が蓄積される結果を示すが、これをＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果という。ナノ粒子が、このような効果によって腫瘍組織特異的に伝達しやすいことを受動的ターゲッティング（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）という（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２００８  Ｊａｎ−Ｆｅｂ;２６（１）:５７−６４）。能動的ターゲッティング（ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、標的物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）がナノ粒子に結合した場合で、ナノ粒子をターゲット組織での蓄積を増進（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）させたり、ターゲット細胞中にナノ粒子が伝達される内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を改善することが報告された（Ｄｏｅｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｕｐｔａｋｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  Ｏｃｔ;２６（１０）:５５２−８．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ａｕｇ  ２１）。能動的ターゲッティングは、ターゲット細胞表面特異的または過発現している炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）と結合できる能力を持つ物質（ターゲッティングモイエティ、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を利用する（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ:ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００６;５（８）:１９０９−１９１７）。
【００４７】
したがって、本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれから形成されたナノ粒子にターゲッティングモイアティが備わると、効率的にターゲット細胞への伝達を促進して、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達されて高いターゲット遺伝子発現調節機能を示し、他臓器および細胞への非特異的なＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの伝達を防止することができる。
【００４８】
これにより、本発明は、前記構造式１〜構造式３に係る構造体にリガンド（Ｌ）、特に受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌＩｇａｎｄ）が追加的に結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を提供して、例えば構造式１に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体にリガンドが結合された形態は、下記の構造式４のような構造を持つ: 
［構造式４］
2016531563.tif 000006
前記構造式４で、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、前記構造式１〜構造式３での定義と同様であり、Ｌは受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド、Ｚは、単純共有結合または親水性物質ブロック内の親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカーを意味して、ｉは、１〜５の整数、好ましくは１〜３の整数である。
【００４９】
前記構造式４でのリガンドは、好ましくはターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を持つターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド；または、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般にｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ ａｃｉｄは互いに交差使用されており、本発明での葉酸は、自然状態または人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）等のヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）をはじめとする糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）等の化学物質などで選択されるが、これに限定されるのではない。
【００５０】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、前記ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する方法を提供する。
【００５１】
本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する過程は、例えば、
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）をベースに親水性物質を結合させる段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記ＲＮＡ一本鎖５’末端に疏水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すれば固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖を分離精製する段階；及び
（６）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングにより二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含んでなる。
【００５２】
本発明での固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が好ましいが、ＣＰＧである場合、径は４０〜１８０ｕｍであることが好ましく、５００〜３０００Åの孔隙の大きさを持つことが好ましい。
【００５３】
前記段階（５）以後、製造が完了されると、精製されたＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して、目的するＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖が製造されたか否かを確認することができる。前記製造方法において（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階（４）は、（１）段階以前または（１）段階〜（５）段階のうちいずれか一つの過程中に実行されても構わない。
【００５４】
また、（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖と相補的配列を含むＲＮＡ一本鎖は、５’末端にリン酸基が結合された形態で利用されたことを特徴とする製造方法であってもよい。
【００５５】
一方、本発明は、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に追加的にリガンドが結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法を提供する。
【００５６】
リガンドが結合されたＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含むオリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、例えば、
（１）機能基が結合されている固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）機能基−親水性物質が結合されている固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に疏水性物質を共有結合させる過程で合成する段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体から機能基−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階；
（６）前記機能基を利用して親水性物質末端にリガンドを結合してリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体一本鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングによりリガンド−二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含んでなる。
【００５７】
前記（６）段階以後、製造が完了すると、リガンド−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して目的するリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的なＲＮＡが製造されたかを確認することができる。製造されたリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングによりリガンド−二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造することができる。前記製造方法において（３）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階（４）は、独立的な合成過程として（１）段階以前または（１）段階〜（６）段階のうちいずれか一つの過程中実行されても構わない。
【００５８】
本発明のさらに他の様態として、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を提供する。
【００５９】
すでに先に説明したとおり、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、疏水性および親水性物質を共に含んでいる両親媒性であり、親水性の部分は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用を介して親和力を有していて外側へ向かうようになり、疏水性物質は、それらの間の疏水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を介して内側へ向かうようになり、熱力学的に安定したナノ粒子を形成するようになる。すなわち、ナノ粒子の中心に疏水性物質が位置するようになり、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの外側方向に親水性物質が位置して、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子は、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの細胞内伝達向上およびｓｉＲＮＡ効能を向上させる。
【００６０】
本発明に係るナノ粒子は、同じ配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体だけで形成されてもよく、互いに異なる配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で構成されることを特徴とするが、本発明での互いにことなる配列を持つｓｉＲＮＡは、他のターゲット遺伝子、例えばＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的なｓｉＲＮＡであってもよく、同じターゲット遺伝子特異性を持ちながらその配列が異なる場合も含まれて解釈される。
【００６１】
また、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的なｓｉＲＮＡ以外に他の癌特異的ターゲット遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が本発明に係るナノ粒子に含まれてもよい。
【００６２】
また、本発明は他の様態として、Ｇａｎｋｙｒｉｎおよび/またはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体および/または前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含む癌予防または治療用組成物を提供する。
【００６３】
本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎおよび/またはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体および/または前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を有効性分として含む組成物は、癌細胞の増殖及び癌細胞の死滅を誘導して癌の予防または治療効果を現す。したがって、本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎ及び／またはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ及びこれを含む組成物は、該当遺伝子が過発現すると報告された肝臓癌をはじめとして胃癌、肺癌、すい臓癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌及び腎臓癌をはじめとする様々な癌の予防または治療に効果がある。
【００６４】
特に、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む癌予防または治療用組成物には、
配列番号１〜１００番から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号１、１０、１３、５６または９９番に係る配列から選択されたいずれか一つの配列、らに好ましくは配列番号１、１０または９９番に係る配列、最も好ましくは配列番号１番に係る配列を含むセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＧａｎｋｙｒｉｎ特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または
配列番号１０１〜２００番から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号１０２、１８０、１９７、１９９および２００番から選択されたいずれか一つの配列、らに好ましくは配列番号１０２、１９９または２００番に係る配列、最も好ましくは、配列番号１０２番の配列を含むセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が含まれてもよく、
前記Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合された形態で含まれてもよい。
【００６５】
また、ＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１以外の他の癌特異的ターゲット遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ、またはこれを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が、本発明に係る組成物に追加的に含まれてもよい。
【００６６】
前記のとおり、Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ、または前記Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡと共に、追加的に他の癌特異的ターゲット遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を全て含む癌予防または治療用組成物を利用する場合、よく癌治療に利用される併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）のように相乗的な効果を奏することができる。
【００６７】
本発明に係る組成物が予防または治療できる癌は、肝臓癌、胃癌、大腸癌、すい臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌及び肺癌などが例示されるが、これに限定されるのではない。
【００６８】
また、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含む癌予防または治療用組成物に含まれるナノ粒子もＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で選択されたいずれか一つの構造体だけで純粋に構成されてもよく、Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合された形態で構成されてもよい。
【００６９】
本発明の組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造してもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効性分と両立可能であるべきで、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形で製剤化して提供することが好ましい。凍結乾剤形燥製造のために本発明が属する技術分野で通常知られている方法が使用でき、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらには、当分野の適正な方法でまたはレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００７０】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる有効性分などの含有量および投与方は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決めることができる。また、散剤、精製、カプセル剤、液剤、注射剤、軟こう剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化することができて、単位投与量または多投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【００７１】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口投与が可能である。本発明に係る薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されず、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度等によりその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができる。また、臨床投与のために、公知の技術を利用して本発明の薬剤学的組成物を適した剤形で製剤化することができる。
【００７２】
本発明では、本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ、 前記ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、またはこれを含む組成物またはナノ粒子を癌の予防および治療のための薬剤の製造に利用する用途を提供する。
【００７３】
また、本発明は、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、これを含む組成物またはナノ粒子を予防または治療を要する患者に投与することを含む癌の予防および治療方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７４】
以下、添付された実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、このような実施例は本発明の技術的思想の内容と範囲を簡単に説明するための例示するものであって、これによって本発明の技術的範囲が限定されたり変更されるのではない。また、このような例示に基づいて本発明の技術的思想の範囲の中で様々な変形と変更が可能であることは当業者には当然である。
【００７５】
実施例１．Ｇａｎｋｙｒｉｎ及びＢＭＩ−１の目標塩基配列デザイン及びｓｉＲＮＡの製造
Ｇａｎｋｙｒｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ_００２８１４）またはＢＭＩ−１遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ_００５１８０）に結合できる目標塩基配列（センス鎖）を遺伝子別に１００種ずつデザインして、前記目標塩基配列の相補的配列であるアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡを製造した。
【００７６】
まず、バイオニア（株）で開発された遺伝子デザインプログラム（Ｔｕｒｂｏ ｓｉ−Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を使用して、該当遺伝子のｍＲＮＡ配列でｓｉＲＮＡが結合できる目標塩基配列をデザインした。本発明に係る肝臓癌連遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、１９個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二本鎖構造である。また、ある遺伝子の発現を阻害しない配列のｓｉＲＮＡであるｓｉＣＯＮＴ（配列番号２０１）を製造した。前記ｓｉＲＮＡは、β−シアノエチルホスホロアミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結して製造した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９−４５５７，１９８４）。具体的に、ＲＮＡ合成機（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，ＢＩＯＮＥＥＲ，ＫＯＲＥＡ）を使用して、ヌクレオチドが付着された固形支持体上で、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）およびキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）からなる一連の過程を繰り返して望む長さのＲＮＡを含む反応物を収得した。前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、センスとアンチセンスＲＮＡ鎖を結合させて、目的する二本鎖ｓｉＲＮＡ(配列番号１〜２０１)を製造した(表１参照)。
【００７７】
【表１】
2016531563.tif 000007
2016531563.tif 000008
2016531563.tif 000009
2016531563.tif 000010
2016531563.tif 000011
【００７８】
実施例２．二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）の製造
本発明で製造した二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ ＬＰ）は、下記の構造式５のような構造を持つ:
［構造式５］
2016531563.tif 000012
。
【００７９】
前記構造式５で、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；ＰＥＧは親水性物質でポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）； Ｃ２４は疏水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡセンス鎖末端の方向性を意味する。
【００８０】
前記構造式５でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、既存特許(大韓民国公開特許公報第２０１２−０１１９２１２号)の実施例１に記載された方法により製造された３’ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ、Ｍｎ=２，０００）−ＣＰＧを支持体として先述した方式のとおりβ−シアノエチルホスホロアミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法により３’末端部位にポリエチレングリコールが結合されたセンス鎖の二重らせんオリゴＲＮＡ−親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンを５’末端に結合して望むＲＮＡ−高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、先述した反応を介してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【００８１】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖とＲＮＡ高分子構造体をＣＰＧから引き離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を介して保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【００８２】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ高分子構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、配列番号１、１０２および２０１番の配列をｓｉＲＮＡのセンス鎖として含ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体(以下、それぞＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＢＭＩ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＣＯＮＴ という。)をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【００８３】
実施例３．二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ ＬＰ）からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の製造および大きさ測定
前記実施例２で製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ ＬＰ）は、二重らせんオリゴＲＮＡの末端に結合された疏水性物質の間の疏水性相互作用によってナノ粒子、すなわちミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）を形成するようになる（図１参照）。
【００８４】
ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＢＭＩ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＣＯＮＴ からなるナノ粒子の大きさＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）分析を介して該当ＳＡＭｉＲＮＡＬＰで構成されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の形成を確認した。
【００８５】
実施例３−１．ナノ粒子の製造
前記ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋを１．５ｍｌ  ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕffｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に５０μｇ/ｍｌの濃度で溶解した後、−７５℃、 ５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥を介してナノ粒子パウダーを製造した後、溶媒であるＤＰＢＳに溶解して均質化されたナノ粒子を製造した。 ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋ＋ＢＭＩの場合、前記ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＧａｎｋとＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＢＭＩを各々０．７５ｍｌ  ＤＰＢＳ（Ｄμｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕffｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に５０μｇ/ｍｌの濃度で溶解した後、−７５℃、 ５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥を介してナノ粒子パウダーを製造した後、溶媒であるＤＰＢＳに溶解して均質化されたナノ粒子を製造して、二種類の物質を混合して配列番号１番と配列番号１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を製造した。
【００８６】
実施例３−２．ナノ粒子の大きさ及び多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ、以下「ＰＤＩ」という）測定
ゼータ電位測定機（ｚｅｔａ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を介して前記ナノ粒子の大きさを測定した。実施例３−１で製造された均質化されたナノ粒子は、ゼータ電位測定機（Ｎａｎｏ−ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ、英国）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率（Ｒｅfｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）は１．４５９、吸収率（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）は０．００１にして、溶媒であるＤＰＢＳの温度２５℃ およびそれに応じた粘度（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）は１．０２００および屈折率は１．３３５の値を入力して測定した。１回の測定は１５回繰り返しで構成された大きさ測定からなり、これを６回繰り返した。 前記ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＢＭＩ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋ＋ＢＭＩも同じ方法で測定した。
【００８７】
ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋで構成されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｇａｎｋ）の場合、約８３ｎｍの大きさ（ｓｉｚｅ）と０．２４のＰＤＩ値を持って、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＢＭＩで構成されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−ＢＭＩ）の場合、８０ｎｍの大きさと０．２２のＰＤＩを含むことが確認された。 ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−Ｇａｎｋ＋ＢＭＩで構成されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｇａｎｋ＋ＢＭＩ）の場合、約８５ｎｍの大きさ（ｓｉｚｅ）と０．２６のＰＤＩ値を含むことが確認された（図２参照）。ＰＤＩ値が低いほど該当粒子が均等に分布していることを示す数値で、本発明のナノ粒子は非常に均一な大きさで形成されることが分かった。
【００８８】
実施例４．ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞株でｓｉＲＮＡを利用したターゲット遺伝子の発現抑制確認
前記実施例１で製造された配列番号１番〜２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用してヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を形質転換させて、前記形質転換された肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞株でターゲット遺伝子の発現様子を分析した。)
【００８９】
実施例４−１．ヒト肝臓癌細の細胞株の培養
韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｂａｎｋ，Ｋｏｒｅａ）から入手したヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）の細胞株EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)培養培地（ＧＩＢＣＯ/Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ/ｖ）牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ/ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ/ｍｌ）で３７℃、 ５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９０】
実施例４−２．ヒト肝臓癌細の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓfｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例４−１で培養された１×１０５肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）の細胞株を３７℃で５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で１２−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＥＭＥＭで培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【００９１】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏfｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１〜２００番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ/μｌ）の０. ２または１μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が０. ２または１ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【００９２】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＥＭＥＭ培養培地１ｍｌずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９３】
実施例４−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例４−２で形質注入された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【００９４】
実施例４−３−１．形質注入された細胞からＲＮＡ分離およびｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を利用して、前記実施例４−２で形質注入された細胞株から全ＲＮＡを抽出して、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ/ｄＴ２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を利用して、下記の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌエッペンドルフチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ/ｄＴ２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）でチューブ当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸溜水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーを混成化して、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【００９５】
実施例４−３−２．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの相対定量分析
前記実施例４−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを介して 肝臓癌疾患関連遺伝子ｍＲＮＡの相対量を下記の方法で定量した。９６−ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに前記実施例４−３−１で製造されたｃＤＮＡを蒸溜水で５倍希釈して、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、ＧａｎｋｙｒｉｎqＰＣＲプライマー（Ｆ、Ｒそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ/μｌ；ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ、表２参照）を１μｌ入れて混合液を作った。一方、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）のGAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。前記混合液が入った９６−ｗｅｌｌプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を利用して下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰り返し行って、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ収得したターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子を介して補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を利用してＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１〜配列番号１００をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図３、４）。またＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１０１〜２００番をセンス鎖として持つ）が処理された実験群は前記方法と同じ方法でＢＭＩ−１ ｑＰＣＲプライマーとＧＡＰＤＨ ｑＰＣＲプライマーを利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡを相対的定量した（図５、６）。高効率のｓｉＲＮＡを選別するために、０．２ｎＭと１ｎＭ濃度で各遺伝子に対するｍＲＮＡ発現量が共通して高く減少したｓｉＲＮＡを選択した（配列番号１、１０、１３、５６、９９、１０２、１８０、１９７、１９９、２００番の配列をセンス鎖として持つ）。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
実施例５．ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−７）細胞株で高効率のｓｉＲＮＡ選定及びＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０％）測定
前記実施例４−３−２で選定された配列番号１、１０、１３、５６、９９、１０２、１８０、１９７、１９９、２００及び２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用してヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−７）を形質転換させて、前記形質転換された肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、ｈｕｈ−７）の細胞株でターゲット遺伝子の発現様子を分析して高効率のｓｉＲＮＡを選定して、最も効率が高いｓｉＲＮＡのＩＣ５０を測定してｓｉＲＮＡ性能を確認した。
【００９８】
実施例５−１．ヒト肝臓癌細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞株は、実施例４−１と同じ条件で培養した。
韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂａｎｋ，ＫＣＬＢ）から入手したヒト肝臓癌細胞（Ｈｕｈ−７）細胞株をＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、 ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９９】
実施例５−２．ヒト肝臓癌細胞株で目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例５−１で培養されたＨｅｐ３Ｂ細胞株は、４−２と同じ条件で培養した後、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、１０、１３、５６、９９、２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ及び先行文献のｓｉＲＮＡ（Ｇａｎｋ_Ｒｅｆ、ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＵＡＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０８、ＵＳ  ２００８／００７１０７５  Ａ１，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（１ｐｍｏｌｅ／μｌ） ０．０４、０．２または１μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が０．０４、０．２または、１ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１０２、１８０、１９７、１９９、２００、２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ及び先行文献のｓｉＲＮＡ（ＢＭＩ_Ｒｅｆ、ＣＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＧＴＴＡＣＣＴ、ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．２０９、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２０１０ Ｆｅｂ;１０１（２）:３７９−８６）（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．００８、０．０４または０．２μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が０．００８、０．０４ ｎＭまたは０．２ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて形質注入用溶液を製造した。
【０１００】
また、前記実施例５−１で培養された１×１０５Ｈｕｈ−７細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に１２−ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）に分株した。一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、１０、１３、５６、９９、２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ及び先行文献（Ｇａｎｋ_Ｒｅｆ）のｓｉＲＮＡ （１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．０４、０．２または１μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が０．０４、０．２または１ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。 前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１０１】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ １６４０培養培地１ｍｌずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１０２】
前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１０２、１８０、１９７、１９９、２００、２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ及び先行文献のｓｉＲＮＡ （ＢＭＩ_ｒｅｆ、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２０１０ Ｆｅｂ;１０１（２）:３７９−８６）（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．００８、０．０４または０．２μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が０．００８、０．０４ｎＭまたは０．２ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。
【０１０３】
実施例５−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例５−２で形質注入された細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用して実施例４−３と同じ方法でターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した（図７、８）。２種の肝臓癌細胞でターゲット遺伝子発現阻害量観察を通じて各ｓｉＲＮＡの効能が明確に確認できて、配列番号１、１０、１３、１０２、１９７及び１９９番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡは非常に低い濃度でも比較的高いターゲット遺伝子発現阻害を示すことを確認した。
【０１０４】
実施例５−４．ＩＣ５０測定
前記実施例５−３で確認された高効率のｓｉＲＮＡ中各遺伝子に対して一種ずつ選定してＩＣ５０の確認を通じて、該当ｓｉＲＮＡの性能を確認した。前記実施例５−１で培養されたＨｅｐ３Ｂ細胞株は、４−２と同じ条件で培養した後、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国） １．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５ μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、１０２及び２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（０．０１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．８、４μｌまたは１、１０２及び２０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ （１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．２、１または５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が８ｐＭ、４０ｐＭ、０．２ｎＭ、１ｎＭまたは５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて形質注入用溶液を製造した。
【０１０５】
また、前記実施例５−１で培養された１×１０５Ｈｕｈ−７細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に１２−ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分株した。一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、１０２及び２０１番ｓｉＲＮＡ（０．０１ｐｍｏｌｅ／μｌ） ０．８、４μｌまたは、１、１０２及び２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ （１ ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．２、１または５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が８ｐＭ、４０ｐＭ、０．２ｎＭ、１ｎＭまたは５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて形質注入用溶液を製造した。
【０１０６】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ １６４０培養培地１ｍｌずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１０７】
形質注入された細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を利用して実施例４−３と同じ方法でターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した（図９）。配列番号１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのＩＣ５０は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株で４０〜２００ｐＭの間で観察されて、Ｈｕｈ−７細胞株で８〜４０ｐＭの間で観察されて、配列番号１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡのＩＣ５０はＨｅｐ３ＢとＨｕｈ−７細胞株でいずれも８〜４０ｐＭで観察されて、本発明で選定されたｓｉＲＮＡの高効率を再確認した。
【０１０８】
実施例６．コロニー形成分析（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を通したＧａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの抑制能力確認
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）がコロニー形成分析（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を通じて細胞の癌化（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を測定する方法は、半定量的（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）であり、癌細胞が保有している細胞の接触による細胞成長抑制の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）及び固定−非依存的（ａｎｃｈｏｒａｇｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）である表現型的特性に起因する。前記分析方法は、癌細胞に特定坑癌物質を処理した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で該当物質による癌細胞の生存を確認する用途と使用される（Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（５）:２３１５−９）。
【０１０９】
前記実施例５−４で選定された高効率のＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡによって癌細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ）阻害程度を確認するために、コロニー形成分析（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ、ＣＦＡ）を行った。前記実施例５−１で培養されたＨｅｐ３ＢとＨｕｈ７ｃｅｌｌを径３５ｍｍのシャーレ（ｐｅｔｒｉ−ｄｉｓｈ）にそれぞれ１ｘ１０４で接種した後、２０時間が経過した時実施例５−４と同じ方法で５ｎＭまたは２０ｎＭの濃度で形質転換した。形質転換された細胞は、３日ごとに培養培地を交換して、形質転換後１０日または１４日が経過した日にＤｉｆｆ  Ｑｕｉｋ（Ｓｙｓｍｅｘ，Ｊａｐａｎ）を通じて染色してコロニー形成程度を比較した（図１０）。配列番号１番及び１０２番は、配列番号２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡで処理された場合、対照群に比べて濃度依存的に非常に低い程度のｃｏｌｏｎｙが形成されることを確認することができた。
【０１１０】
実施例７．Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡとＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの組み合わせによるターゲット遺伝子の発現阻害及び細胞成長阻害確認
前記実施例５−４で確認された高効率のｓｉＲＮＡである配列番号１番と１０２番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの組み合わせをＩＣ５０以上の濃度である５、２０ｎＭで形質転換させて二つの遺伝子の発現が同時に阻害される場合のターゲット遺伝子の発現阻害程度と細胞成長阻害効果のシナジーを確認した。
【０１１１】
実施例７−１．ヒト肝臓癌細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例５−１で培養された１×１０５Ｈｕｈ−７細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に１２−ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分株した。一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、１０２及び２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ （１ｐｍｏｌｅ／μｌ）５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度がそれぞれ５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１１２】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ １６４０培養培地１ｍｌずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１１３】
実施例７−２．Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡとＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの組み合わせによるターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例７−１で形質注入された細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用して実施例４−３と同じ方法でターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した（図１１）。ヒト肝臓癌細胞Ｈｕｈ−７細胞株でターゲット遺伝子発現阻害量観察を通じて同時に処理されたｓｉＲＮＡによるターゲット遺伝子の発現阻害が確認できて、特に、配列番号１番と１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡで共に処理された場合でもターゲット遺伝子の発現阻害が同時に行われることを観察することができた。
【０１１４】
実施例７−３．Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡとＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの組み合わせによる細胞成長阻害確認
Ｇａｎｋｙｒｉｎ特異的ｓｉＲＮＡとＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの組み合わせによるターゲット遺伝子の発現阻害を通じて細胞成長阻害確認を行った。
前記実施例４−１で培養されたＨｅｐ３Ｂ細胞株は、４−２と同じ条件で培養した後、培地を除去した後、各ウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分株した。 一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、１０２及び２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ （１ｐｍｏｌｅ／μｌ）５または２０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度がそれぞれ５または２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１１５】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μｌずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ １６４０培養培地１ｍｌずつ分株した後７２時間３７℃で５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１１６】
細胞数確認を通じて、配列番号２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡが処理された実験群と対比して細胞生存力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した（図１２）。配列番号１番と１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡで共に処理した場合、濃度依存的に細胞生存力が減少することが確認できて、これは一つの遺伝子の発現を抑制した時現れる成長抑制効果よりさらに優れるものと確認された。
【０１１７】
実施例８．動物モデルでＧａｎｋｙｒｉｎ及び／またはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子のターゲット遺伝子発現阻害及び肝臓癌成長阻害確認
ｉｎ ｖｉｖｏ上で選定されたＧａｎｋｙｒｉｎまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡの効果を確認するために、二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を製造した後、マウス肝臓癌モデルに投与してターゲット遺伝子発現阻害及び肝臓癌成長抑制を確認した。
【０１１８】
実施例８−１．マウス肝臓癌モデル（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ）の製造
前記実施例４−１で培養されたヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ３Ｂ細胞株２Ｘ１０６ｃｅｌｌをヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）に肝臓器（左肝葉）に移植して肝臓癌モデルを確立後、肝臓癌発生血清内マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であるα−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＦＰ）量を測定して腫瘍細胞が形成されることを確認した。血清内ＡＦＰ数値が１，０００ｎｇ／ｍｌ程度になった時、ＡＦＰ量により実験群を群当たり５匹ずつ振り分けた。
【０１１９】
実施例８−２．二重らせんオリゴ高分子構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）によるターゲット遺伝子の発現阻害
前記実施例２で合成された配列番号１０２及び２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含む二重らせんオリゴ高分子構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）を前記実施例３−１の方法で均質なナノ粒子を製造した。対照群は、配列番号２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−ＣＯＮＴ）、実験群は、配列番号１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−ＢＭＩ）に設定した。前記ナノ粒子は、５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔで投与されて、投与液量は１００μｌ  ｉｎ  ＤＰＢＳ、１ｍｌ注射器（０．２５ｍｍ×８ｍｍ，３１Ｇａｕｇｅ，ＢＤ３２８８２０，ＵＳＡ）を利用して２回繰り返しで前記実施例８−１で製造されたマウス肝臓癌モデルに尾静脈投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して、信頼度を高めるためにブラインドテスト（Ｂｌｉｎｄ  ｔｅｓｔ）で進行した。最後の投与後４８時間が経過した時点で、マウスの肝臓癌組織を分離した。前記分離した癌組織から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用して実施例４−３と同じ方法でターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した（図１３）。１個体で発現阻害が低く現れたが、その個体を除いて平均７０％ほどターゲット遺伝子であるＢＭＩ−１の発現が阻害されることを確認して、最大８０％ほどターゲット遺伝子の発現が阻害された個体も確認（個体＃２、４、５）されて、本発明に係る二重らせんオリゴ高分子構造体からなるナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ上優れたターゲット遺伝子発現阻害効果を確認した。
【０１２０】
実施例８−３．二重らせんオリゴ高分子構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）による肝臓癌成長阻害確認
前記実施例２で合成された配列番号１、１０２及び２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含む二重らせんオリゴ高分子構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰ）を前記実施例３−１の方法で均質なナノ粒子を製造した。陰性対照群は溶媒であるＤＰＢＳ、配列番号２０１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−ＣＯＮＴ）、実験群は、配列番号１番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｇａｎｋ）、配列番号１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−ＢＭＩ）及び配列番号１番と１０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ配列を含む二重らせんオリゴ高分子構造体を同量混ぜて製造されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｇａｎｋ＋ＢＭＩ）、陽性対照群としてリン酸化酵素抑制剤であるｓｏｒａｐｅｎｉｂに設定した。 前記ナノ粒子は、５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔで投与されて、投与液量は１００μｌ  ｉｎ  ＤＰＢＳ、１ｍｌ注射器（０．２５ｍｍ×８ｍｍ，３１Ｇａｕｇｅ，ＢＤ３２８８２０，ＵＳＡ）を利用して２週間１４回繰り返しで前記実施例８−１で製造されたマウス肝臓癌モデルに尾静脈投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して、信頼度を高めるためにブラインドテスト（Ｂｌｉｎｄ  ｔｅｓｔ）で進行した。陽性対照群であるｓｏｒａｐｅｎｉｂは、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔの量で２週間１４回繰り返し前記実施例８−１で製造されたマウス肝臓癌モデルに経口投与（ｐｅｒ ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）した。初投与後２、６、１０、１４日が経過した時点で血液内ＡＦＰ数値を測定して、癌の成長程度を確認した（図１４）。Ｇａｎｋｙｒｉｎ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡまたはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子が投与された実験群は対照群に比べて血液内ＡＦＰ数値が２０％〜３０％ほど減少する結果を示して、ＧａｎｋｙｒｉｎとＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡが共に含まれているナノ粒子が投与された実験群は、初投与後１０日が経過した時点で、陽性対照群よりもＡＦＰ数値が若干低く観察されて、１４日が経過した時点でＡＦＰ数値が陰性対照群に比べて４０％ほど減少する結果を示して前記Ｇａｎｋｙｒｉｎ及び／またはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴ高分子構造体からなるナノ粒子の優れた坑癌効能を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明に係るＧａｎｋｙｒｉｎ及び／またはＢＭＩ−１特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む癌治療用組成物は副作用なしに高い効率でＧａｎｋｙｒｉｎ及び／またはＢＭＩ−１の発現を抑制して、癌、特に肝臓癌治療効果を上げることができるので、現在適切な治療剤がない肝臓癌の治療に非常に有用に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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