(57)【要約】  本明細書には、成形脱水胎盤組成物およびその美容組成物の使用方法が記載される。この組成物には多数の美容用途がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の外見を変化させるための美容方法であって、前記患者の認識される欠陥を特定することと、前記欠陥の外見が変化するように、前記欠陥の中にまたはそれに隣接させて胎盤組成物を設置することにより、前記欠陥を変化させることとを含み、前記胎盤組成物が成形微粉化胎盤組織を含む、美容方法。
【請求項２】
しわ軽減、口唇拡大術、コラーゲン補充療法および豊顔術からなる群より選択される、請求項１に記載の美容方法。
【請求項３】
前記胎盤組成物が、成形微粉化羊膜と、任意選択で微粉化生体適合性ポリマーとを含む、請求項１に記載の美容方法。
【請求項４】
前記微粉化生体適合性ポリマーが可塑性ポリマーである、請求項３に記載の美容方法。
【請求項５】
生体適合性可塑性ポリマーをさらに含む微粉化胎盤組織を含む、成形胎盤組成物。
【請求項６】
前記微粉化胎盤組織が生体適合性架橋剤で架橋されている、請求項５に記載の成形胎盤組成物。
【請求項７】
前記生体適合性可塑性ポリマーが生体適合性架橋剤で架橋されている、請求項６に記載の成形胎盤組成物。
【請求項８】
患者の外見を変化させるための美容方法であって、対象に成形胎盤組成物を投与することを含み、前記成形胎盤組成物が、微粉化胎盤組織を含む既定のサイズおよび形状を有し、前記組成物が、既定の期間、そのサイズおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集性を有する、美容方法。
【請求項９】
予め選択した崩壊速度および／または強度を有する成形胎盤組成物を作製する方法であって、得られる前記成形胎盤組成物が、前記予め選択した崩壊速度および／または強度を有するように、圧縮力、圧縮速度、密度および／または粒子サイズを調節することを含む、方法。
【請求項１０】
前記粒子サイズが約２５０μｍよりも大きい、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子サイズが約７５μｍ〜約１５０μｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子サイズが約７５μｍ未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
予め選択した強度および／または剛性を有する成形胎盤組成物を作製する方法であって、得られる前記成形胎盤組成物が、前記予め選択した強度および／または剛性を有するように、圧縮力、圧縮速度、密度および／または粒子サイズを調節することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１３年９月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／８７６，１９１号の利益を主張するものであり、上記出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、成形胎盤組成物を使用する方法、特に、美容状態を含めた患者の状態の処置に成形脱水胎盤組成物を使用する方法に関する。例示的な美容状態としては、しわの処置、組織増大、口唇および目の拡大、育毛、瘢痕の抑制および／または軽減などが挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
（最新技術）
胎盤組織成分、例えば単離された羊膜および絨毛膜ならびにその積層物などは、創傷被覆および創傷治癒の土台として当該技術分野で公知である。胎盤組織は通常、待機的帝王切開術後に回収される。胎盤は、２つの主要な組織の層、すなわち羊膜および絨毛膜を有する羊膜からなる。羊膜組織は羊膜嚢の最内層であり、羊水と直接接している。羊膜嚢には羊水が含まれており、胎児環境を保護している。組織学的評価から、羊膜の膜層は、単層の上皮細胞、薄い細網線維（基底膜）、厚く緻密な中間層および線維芽細胞層からなることが示されている。羊膜の線維層（すなわち、基底膜）には、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩＩ型コラーゲンのほか、フィブロネクチンおよびラミニンを含めた細胞接着生理活性因子が含まれている。胎盤組織成分を含む創傷被覆または創傷治癒組成物はこれまで、羊膜層および／または絨毛膜層などの個々の層が、移植片の１つ成分または個別の成分を形成する、移植片の形状であるのが通常であった。
【０００４】
このような組織移植片は、重要な医学的利益をもたらすものではあるが、患者の内部臓器または身体部分に挿入するための低侵襲性の手段とするには極めて薄く、構造面で十分な適格性に欠ける。
【０００５】
胎盤組織成分、特に羊膜は、組織移植片としてのその有益な用途に加え、米国特許出願公開第２０１４／０１０６４４７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通り、幹細胞動員因子として作用することが明らかにされている。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書には、脱水微粉化胎盤組成物を、様々な状態を処置する各種の美容用途のために患者の体内または体表に非侵襲的に導入することができる形状およびサイズに成形する、独自のアプローチが記載される。
【０００７】
本発明は、部分的には、成形脱水微粉化胎盤組織、例えば羊膜、絨毛膜、中間組織層、ワルトン膠質およびその任意の組合せまたはその積層物などからなる組成物、ならびにその美容組成物が、単独もしくは美容的インプラントの一部として使用した場合に重要な利益をもたらすという発見に関する。したがって、上記の成形脱水微粉化胎盤組成物には多数の美容用途がある。
【０００８】
本発明は、一態様では、既定のサイズおよび形状を有する成形脱水胎盤組成物、例えば羊膜、絨毛膜、中間組織層、ワルトン膠質などおよびその任意の組合せまたはその積層物の新規使用方法に関する。いくつかの実施形態では、上記の組成物は、羊膜と、任意選択で１つまたは複数の他の胎盤組織または臍帯成分、例えば絨毛膜、中間組織層、ワルトン膠質およびその任意の組合せなどとを含む。本発明の方法に使用する胎盤組成物は、少なくとも成形脱水胎盤組成物が対象内に導入されるまで、そのサイズおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集性を有する。
【０００９】
一実施形態では、羊膜組成物または絨毛膜組成物などの成形胎盤組成物の密度は、胎盤組成物を任意の所望の形状に形成することができるために十分であり、成形胎盤組成物を対象内に導入する際にその形状が維持されるのに十分なものである。例えば、胎盤組成物の密度は、少なくとも約１．２ｇ／ｃｍ３〜約１０ｇ／ｃｍ３、好ましくは２ｇ／ｃｍ３〜約８ｇ／ｃｍ３の範囲内にある。このような成形胎盤組成物は、本明細書に以下に記載されるように侵襲性が最小限に抑えられた手段を用いて導入するか、従来の侵襲性の手段によって導入することが可能である。これにより、主治医は、処置の目的、患者の年齢および状態、ならびに当業者に周知の他の要因を考慮に入れ、有意に柔軟に患者の処置を行うことが可能になる。
【００１０】
別の実施形態では、成形脱水胎盤組成物は、胎盤組成物を対象に導入する際に分解、分裂、崩壊または断片化しないように十分な凝集性を有する。成形組成物の適切な密度および凝集性は、導入目的、使用する胎盤組成物の量、投与／導入の方法および投与する具体的な身体部分に基づいて、当業者が決定することができる。成形脱水胎盤組成物の所望の形状は、少なくとも対象内に導入されるまで維持される。
【００１１】
成形脱水胎盤組成物は導入後に侵食されるよう設計されており、侵食の期間は、成形脱水羊膜の密度および凝集力ならびにそのサイズによって決まる。侵食時に胎盤組成物から増殖因子および他の生物学的因子が経時的に放出され、これにより、投与／導入した位置での上記因子の持続的放出がもたらされる。
【００１２】
関連する態様では、得られる成形脱水微粉化組成物が、少なくとも投与または実施されるまでそのサイズおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集塊を有するように、１つまたは複数の脱水微粉化胎盤組織成分と、任意選択で充填剤またはその任意の組合せとを、適切な圧縮圧力下、例えば約１〜約５０００ＭＰａの範囲の圧力下で、既定の時間、例えば約１０秒〜約１０分またはそれ以上の間、圧縮することによって、既定のサイズおよび形状の成形脱水胎盤組成物を得る。好ましい圧力としては、約１０〜１０００ＭＰａまたは約２０〜約５００ＭＰａが挙げられる。好ましい時間としては、約０．５〜９分または１〜５分が挙げられる。
【００１３】
圧縮前、非多孔性の成形型で圧縮を実施することが可能な程度に、微粉化胎盤組成物を脱水する。換言すれば、脱水微粉化胎盤組成物中の含水量は、非多孔性の成形型で本発明の組成物を形成するための圧縮を実施することができるように十分に低いものである。例えば、脱水微粉化胎盤組成物の含水量は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満または約５％未満であるのが好ましい。
【００１４】
適切な手段を用いて微粉化胎盤組成物を圧縮し所望の密度および凝集性を得ることは、当業者の理解の範囲内である。例えば、任意の所望のサイズおよび形状の加圧成形型を用いて微粉化胎盤組成物を圧縮し、所望のサイズおよび形状を得ることができる。
【００１５】
脱水微粉化胎盤組成物をある形状の成形型に入れ、圧縮後に胎盤組成物がその成形型の形状になるように圧力をかける任意の成形技術の選択は、当業者の範囲内である。成形胎盤組成物は、ピン状、釘状、樽状、矢状および膜状などの任意の所望の形状をとり得る。ある特定の実施形態では、得られる成形脱水胎盤組成物は、移植片中に中空または空隙を有し得る。成形組成物の空隙は、レーザーを用いて組成物内に、または組成物を通過するように溝を生じさせることによって設けることができる。当業者であれば、成形胎盤組成物を成形した後、それにレーザー穴あけによる空洞形成などの二次成形処理を施して、成形胎盤組成物の表面積を増大させてもよいことが理解されよう。
【００１６】
一実施形態では、組成物中に含まれるタンパク質、増殖因子、および他の生物学的因子の変性を最小限に抑えるため、制御された温度下で脱水微粉化胎盤組成物の圧縮を実施する。成形により成形型内の温度が上昇することが多いため、温度上昇を抑えるため、成型工程にヒートシンクを用いてもよい。
【００１７】
本発明は特に、成形胎盤組成物の使用方法に関する。一実施形態では、成形胎盤組成物は、身体部分または皮下に直接挿入することができる細針の形態である。例えば、断裂した靭帯または腱に隣接する領域内に成形胎盤組成物を直接挿入することにより、有意な量の増殖因子が供給され治癒が促進される。断裂した靭帯または腱は、足首、膝、肘、手首、肩などに位置するものであり得る。別の実施形態では、このような細針をしわの下などの皮下に挿入して両方の塊を供給し、胎盤組成物の塊が消散すると、その少なくとも一部が組織のその場所での成長に置き換わって、しわが長期間除去されるように、組織の成長を促進する増殖因子、コラーゲン等を供給しながら、しわを抑制または除去することができる。なおさらには、成形胎盤組成物を用いて、瘢痕を軽減または抑制したり、口唇を拡大したりするほか、形成外科手術時に治癒を促進して瘢痕を軽減することができる。なおさらには、成形胎盤組成物を用いて頬などの組織を増大させ、顔貌を豊満にすることができる。
【００１８】
本発明は、患者の外見を変化させるための美容方法を提供し、この方法は、患者の認識される欠陥を特定することと、前記欠陥の外見が変化するように、前記欠陥の中にまたはそれに隣接して胎盤組成物を設置することにより、前記欠陥を変化させることとを含み、胎盤組成物は、成形微粉化羊膜および／または成形微粉化絨毛膜を含む。同様に、前記美容方法が、しわ軽減、口唇拡大術、コラーゲン補充療法および豊顔術からなる群より選択される、上記方法も提供される。別の態様では、前記胎盤組成物が、成形微粉化羊膜と、任意選択で微粉化生体適合性ポリマーとを含む、上記方法が提供される。同様に、前記微粉化生体適合性ポリマーが可塑性ポリマーである、上記方法も企図される。
【００１９】
組成物の一実施形態では、生体適合性可塑性ポリマーをさらに含む微粉化胎盤組織を含む、成形胎盤組成物が提供される。別の態様では、微粉化胎盤組織が生体適合性架橋剤で架橋されている、上記成形胎盤組成物が提供される。同様に、可塑性ポリマーが生体適合性架橋剤で架橋されている、上記成形胎盤組成物も提供される。
【００２０】
美容方法の一実施形態では、本発明は、患者の外見を変化させるための美容方法を提供し、この方法は、対象に成形胎盤組成物を投与することを含み、前記成形胎盤組成物は、微粉化胎盤組織を含む既定のサイズおよび形状を有し、前記組成物は、エクスビボおよびインビボで、既定の期間、そのサイズおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集性を有する。
【００２１】
別の方法の実施形態では、予め選択した崩壊速度および／または強度を有する成形胎盤組成物を作製する方法を提供し、前記方法は、得られる成形胎盤組成物が、予め選択した崩壊速度および／または強度を有するように、圧縮力、圧縮速度、密度および／または粒子サイズを調節することを含む。さらに本発明は、粒子サイズが約２５０μｍよりも大きい上記方法を提供する。さらに、粒子サイズが約７５μｍ〜約１５０μｍである上記方法、および粒子サイズが約７５μｍ未満である上記方法が提供される。
【００２２】
また別の方法の実施形態では、本発明は、予め選択した強度および／または剛性を有する成形胎盤組成物を作製する方法を包含し、前記方法は、得られる成形胎盤組成物が、予め選択した強度および／または剛性を有するように、圧縮力、圧縮速度、密度および／または粒子サイズを調節することを含む。
【００２３】
本発明の利点のいくつかは、一部については以下の説明に記載され、一部については、その説明から明らかになるか、以下に記載する態様を実施することによって知ることができるものである。以下に記載する利点は、添付の「特許請求の範囲」で具体的に指摘される要素および組合せによって実現および達成される。上記の全般的な説明および以下の詳細な説明はともに、単に例示および説明するためのものであり、限定するためのものではないことを理解するべきである。
【００２４】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付図面（１つまたは複数）は、以下に記載するいくつかの態様を説明するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本明細書に記載される成形脱水羊膜組成物を作製する工程の概略流れ図である。
【図２】おおよその直径が約２５０μｍ、約７５μｍ〜約１５０μｍおよび約７５μｍ未満の粒子サイズで作製した成形微粉化羊膜組成物のヤング率および破損応力を示す図である。
【図３Ａ】示される圧縮力を用いて形成された成形微粉化羊膜組成物のヤング率および破損応力を示す図である。
【図３Ｂ】示される圧縮速度を用いて形成された成形微粉化羊膜組成物のヤング率および破損応力を示す図である。
【図３Ｃ】示される圧縮サイクル数を用いて形成された成形微粉化羊膜組成物のヤング率および破損応力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（詳細な説明）
本開示を開示し説明する前に、特定の組成物、方法またはそのような組成物の調製またはその使用は、当然変化し得ることから、以下に記載する態様はそれらに限定されるわけではないと理解するべきである。同様に、本明細書で使用される用語は単に特定の態様を説明するのが目的であって、限定することを意図するものではないことも理解するべきである。
【００２７】
本明細書および以下の特許請求の範囲では、多数の用語に言及するが、それらは次に挙げるような意味を有すると定義される。
【００２８】
本明細書および添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き複数形の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「生物活性剤」に言及する場合、２つ以上のこのような薬剤の混合物などがこれに包含される。
【００２９】
「任意選択の」または「任意選択で」は、そのあとに記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、およびその記載にはその事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とが含まれることを意味する。例えば、「任意選択の洗浄段階」という語句は、その洗浄段階を実施しても実施しなくてもよいことを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「対象」という用語は、限定されないが、ヒト、家畜、飼い馴らされたペットなどの哺乳動物対象を含めた任意の脊椎動物を指す。
【００３１】
本明細書で使用される「羊膜」という用語は、中間組織層が無傷であるか、実質的に除去されている羊膜を含む。
【００３２】
本明細書で使用される「羊膜組成物」という用語は、羊膜を含む脱水微粉化組成物を指す。組成物は任意選択で、１つまたは複数の他の胎盤組織成分、および／または本明細書に記載されるかもしくは当業者に明らかな他の因子（例えば、可塑剤、生理活性物質、充填剤など）を含み得る。
【００３３】
「充填剤」という用語は、羊膜以外の組成物の任意の成分を指す。充填剤としては、他の胎盤組織成分のほか、コラーゲン、ヒアルロン酸、生体適合性可塑剤などを含めたポリマーが挙げられる。一実施形態では、コラーゲンとして、ヒトコラーゲン、コラーゲン誘導体、ヒトコラーゲン誘導体および胎盤組織から調製されたコラーゲン、例えば非ヒト抗原を実質的に含まないコラーゲン材料などが挙げられる。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩＩ型コラーゲンを含有する羊膜の線維層（すなわち、基底膜）から調製されるものである。本明細書に記載されるコラーゲン充填剤は、たとえあるとしても、組成物の羊膜または絨毛膜などの胎盤成分中に存在するコラーゲンから分離されている。いくつかの態様では、コラーゲンは、エラスチン、フィブロネクチンおよび／またはラミニンを含めた他の成分を含まないか、または実質的に含まない。
【００３４】
「非ヒト抗原」という用語は、ヒトに導入すると免疫原性を示し、免疫応答の症状発現（例えば、炎症など）に対して医学的処置を必要とする望ましくない免疫応答を誘発する、非ヒト起源の任意の物質（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸またはその組合せ）を指す。本明細書での定義では、非ヒト抗原によって誘導される免疫応答は、体液性免疫応答であっても、細胞性免疫応答であっても、その両方であってもよい。
【００３５】
「胎盤組織」または「胎盤組織成分」は、胎盤および任意選択で臍帯の周知の任意のあらゆる成分を指し、限定されないが、羊膜、絨毛膜、中間組織層、ワルトン膠質などの臍帯成分などがこれに含まれる。好ましい一実施形態では、胎盤組織は臍帯成分を含み、別の実施形態では、このような臍帯成分（例えば、ワルトン膠質、臍帯静脈および動脈ならびに周囲膜）は含まれない。
【００３６】
「成形する」、「成形（された）」または「成形（すること）」という用語は、微粉化胎盤組織と、任意選択で充填剤とを加圧下で圧縮して、エクスビボまたはインビボのいずれかで使用するために、既定の期間、既定のサイズ、形状、密度および凝集性を有する成形胎盤組成物が作製されるように、実際の成形型の使用、加圧下での押出し、型打ち、または任意の加圧方法などの任意の形態の加圧成形を含む。
【００３７】
「含む」という用語は、列挙される要素はいずれも必ず含まれ、任意選択でその他の要素が含まれていてもよいことを意味する。「〜から実質的になる」は、列挙される要素はいずれも必ず含まれ、列挙される要素の基礎となる新規な特徴に実質的に影響を及ぼす要素は除外され、任意選択でその他の要素が含まれていてもよいことを意味する。「〜からなる」は、列挙される要素以外の要素はすべて除外されることを意味する。これらの用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００３８】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、限定されないが、ヒト、家畜、飼い馴らされたペットなどの哺乳動物対象を含めた任意の脊椎動物を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「生体適合性」という用語は、対象内への植え込みまたは注射に適した材料を指す。様々な態様では、生体適合材料は、対象に植え込まれると、毒性作用も有害作用も引き起こさない。
【００４０】
「改変胎盤組織」という用語は、組織を洗浄、消毒および／または分割することによって改変された胎盤組織全体を含めた胎盤組織の任意のあらゆる成分ならびに羊膜、絨毛膜、臍帯などの胎盤組織の分離された成分を指す。改変組織は上皮層および／または線維芽細胞層などの細胞層を維持し得る。改変胎盤組織は、胎盤組織の１つまたは複数の層の積層、胎盤組織の微粉化、小分子、タンパク質（例えば、増殖因子、抗体）、核酸（例えば、アプタマー）、ポリマー、または他の物質の化学吸着または物理吸着などのさらなる改変を含み得る。
【００４１】
「の十分な量」という用語は、所望の効果を発揮するのに、例えば、インビボまたはインビトロのいずれかで組成物近傍または組成物上に経時的に幹細胞動員を誘発するのに十分な組成物の量を指す。羊膜または絨毛膜組成物などの胎盤組成物の「十分な量」は、限定されないが、使用する胎盤組成物の種類および／または量、使用する充填剤の種類および／または量、意図される臓器および／または処置される身体部分の種類および／または大きさ、処置される臓器および／または身体部分の疾患または損傷の重症度、ならびに投与経路などの様々な要因に応じて異なる。「十分な量」の決定は、本明細書に提供される開示に基づいて当業者が決定し得るものである。
【００４２】
「幹細胞動員因子」という用語は、幹細胞を動員し、上記因子の発生源に向かって遊走させることが可能な任意の全ての因子を指す。幹細胞動員因子の非限定的な例は、１つまたは複数のＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインであり得る。
【００４３】
「幹細胞動員」という用語は、羊膜または絨毛膜組成物などの胎盤組成物に対する幹細胞の直接的または間接的な走化性を指す。組成物中の幹細胞動員因子（例えば、細胞走化性を誘導するケモカイン）が組成物から放出され、幹細胞を羊膜組成物に向かって遊走するように誘導する場合、動員は直接的であり得る。一態様では、組成物中の幹細胞動員因子が組成物から放出され、これが付近の細胞に因子（例えば、ケモカイン）を放出するよう誘導し、これがさらに幹細胞を組成物に向かって遊走するよう誘導する場合、動員は間接的であり得る。さらには、幹細胞動員は、直接的な因子と間接的な因子の両方を包含し得る。
【００４４】
本明細書で使用される「罹患（した）」という用語は、病的状態にあるか、病的状態になりやすいことを特徴とする臓器および／または身体部分を指し、ここでは、疾患は幹細胞による処置に対して感受性がある。
【００４５】
本明細書で使用される「損傷（した）」という用語は、当該技術分野での通常の意味を有するように使用され、臓器および／または身体部分に対する任意の全ての種類の損傷を含み、ここでは、損傷は幹細胞による処置に対して感受性がある。
【００４６】
「植え込み可能な」という用語およびその派生語は、装置を対象の内外に挿入すること、埋め込むこと、植え込むこと、あるいは別の方法で急性的または慢性的に装着または設置することが可能であることを意味する。
【００４７】
本明細書では、読者の利便性を考慮して表題または副題が用いられることがあるが、これは本発明の範囲に影響を及ぼすことを意図するものではない。さらに、本明細書で使用される一部の用語については、以下でさらに具体的に定義する。
【００４８】
「処置」または「処置すること」という用語は、疾患または状態に関する限りにおいて、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を予防すること、疾患もしくは状態の発生を抑制すること、疾患もしくは状態を軽減もしくは解消すること、および／または疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を緩和することを含む。
【００４９】
本明細書では、読者の利便性を考慮して表題または副題が用いられることがあるが、これは本発明の範囲に影響を及ぼすことを意図するものではない。さらに、本明細書で使用される一部の用語については、以下でさらに具体的に定義する。
【００５０】
Ｉ．成形脱水微粉化胎盤組成物を含む組成物
本明細書には成形脱水胎盤組成物およびその美容組成物が記載される。このような組成物は、国際特許出願第２０１２／１１２４１０号のほか、米国特許仮出願第６１／４４２，３４６号、同第６１／５４３，９９５号および米国特許出願公開第２０１４／００５０７８８号に記載されている微粉化した羊膜から調製される。上記出願の内容は、その全体が参照により具体的に組み込まれる。「微粉化（された）」という用語は、ミクロンおよびサブミクロンサイズの粒子を含むことを意味すると理解される。
【００５１】
一態様では、本発明は、（ａ）成形脱水微粉化胎盤組成物と、任意選択で（ｂ）生物学的に許容される充填剤、美容上許容される成分などを含めた生物学的に許容される添加剤とを含む、組成物に関する。このような充填剤および／または成分は、成形組成物の１つまたは複数の特性、例えば色、潤滑性、凝集性、安定性、抗酸化特性、柔軟性および分解速度などを増強するために用いられる。
【００５２】
例えば、本発明は、充填剤、安定剤、緩衝剤または美容成分を一切添加せずに使用することができる成形脱水胎盤組成物を含む。あるいは、本発明は、成形脱水胎盤組成物と、少なくとも１つの賦形剤、例えば充填剤、安定剤、緩衝剤、着色剤、崩壊剤などと、任意選択で１つまたは複数の美容成分とを含む。着色剤は、本来であればほぼ透明な胎盤組成物の位置を特定し、意図される処置部位に適切に設置することを容易にするものであるのが好ましい。崩壊剤は、成形脱水胎盤組成物が対象に導入された後にインビボで侵食されるか、または崩壊する速度を修正するものである。
【００５３】
組成物は、微粉化胎盤組成物、例えば、微粉化羊膜および／または微粉化絨毛膜を含むのが好ましい。さらに別の態様では、組成物は、微粉化胎盤を含む、成形脱水胎盤組成物を含む。さらに別の態様では、組成物は、上皮層が胎盤から実質的に除去された微粉化胎盤を含む、成形脱水胎盤組成物を含む。さらに、組成物は、微粉化羊膜を含む、成形脱水羊膜を含む。さらに別の態様では、組成物は、上皮層が羊膜から実質的に除去された微粉化羊膜を含む、成形脱水羊膜を含む。
【００５４】
当業者には理解されるように、成形胎盤組成物が既定の密度を有する凝集塊を有する限り、本発明の成形脱水胎盤組成物は、加圧下で任意の形状またはサイズに圧縮される。
【００５５】
あるいは、成形脱水胎盤組成物が成形型の形状およびサイズになり、所望の凝集性および密度を示すように、脱水微粉化胎盤組成物を所望の形状またはサイズを有する任意の成形型に入れて圧縮する。所望の形状およびサイズの成形型を形成するのに、シリコーン、レジン、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）またはステンレス鋼などの適切な成形材料を選択することは、当業者の範囲内にある。
【００５６】
本明細書に記載される成形脱水胎盤組成物は、少なくとも患者内に導入する期間全体を通じて、好ましくは対象に導入された後インビボで既定の期間、胎盤組成物の形状が維持されるように、水吸収率が低いと有利である。胎盤組成物はインビボで侵食され、胎盤組成物中に含まれる増殖因子および他の生物学的因子を放出することが理解される。したがって、成形脱水胎盤組成物の形状の保持は、その形状が侵食を受けるか、侵食され始めても、全体的な形状が保持されることを意味する。
【００５７】
ＩＩ．成形脱水胎盤成分を含む組成物の作製方法
図１は、成形脱水微粉化胎盤材料、例えば羊膜を回収、処理および調製する段階の概要（１００）および特定の態様を示している。個々の段階に関するより詳細な説明および考察を以下に述べる。最初に、同意を得た患者から選択的帝王切開術後に胎盤組織を収集する（段階１１０）。この材料を従来の組織保存法で保存して適切な処理場所または処理施設まで輸送し、確認および評価を実施する（段階１２０）。次いで、粗処理、処理および組織層の分離を実施する（段階１３０）。次いで、許容される組織を汚染除去し（段階１４０）、脱水する（段階１４５）。汚染除去および脱水した後、羊膜組成物の成分（例えば、個々の、または移植片としての羊膜、中間組織層および／または絨毛膜）を微粉化する（段階１５０）。微粉化した成分を加圧下で所望の形状またはサイズに圧縮／成形する（段階１６０）。各段階の詳細を以下に記載する。
【００５８】
最初の組織収集（段階１１０）
本明細書に記載される成形脱水羊膜組成物の作製に使用する成分は胎盤由来のものである。胎盤の入手源は様々なものであり得る。一態様では、胎盤は、哺乳動物、例えばヒト、ならびに限定されないが、ウシ、ブタなどを含めた他の動物などに由来するものである。ヒトの場合、胎盤の回収は病院で行われ、この場合、帝王切開による出産の際に胎盤を収集するのが好ましい。出産間近の母親を指すドナーは、可能な限り移植に最も安全な組織が得られるよう設計された包括的スクリーニング過程を自発的に受ける。スクリーニング過程では、通常の血清学的検査を用いて、１型および２型ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体（抗ＨＩＶ−１および抗ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルスＩ型およびＩＩ型に対する抗体（抗ＨＴＬＶ−Ｉ、抗ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ＣＭＶおよび梅毒に関して、ならびに１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検査する核酸について検査するのが好ましい。上に挙げた検査について、当業者に理解されるように、時間の経過とともに、または意図する胎盤組成物の用途に応じて、上記のものよりも多くの検査、上記のものよりも少ない検査または上記のものとは異なる検査が望まれるまたは必要とされることがあることから、これらは単に例示的なものである。
【００５９】
ドナーの情報およびスクリーニング検査の結果を検討することにより、そのドナーが許容されるかどうかを判断する。さらに、分娩時に培養物を採取して細菌、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）またはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の有無を判定する。ドナーの情報、スクリーニング検査および分娩時培養物がいずれも十分なものであれば（すなわち、何らリスクが認められないか、許容可能なレベルのリスクが認められる場合）、ドナーは医長による承認を受け、その組織標本は初期段階で適格であるとされ、のちの処理および評価に供される。
【００６０】
上記の選択基準を満たすヒト胎盤は、のちに処理を実施する処理場所または処理研究室まで輸送する際に、生理食塩水の入った無菌輸送バッグに入れ、湿った氷の入った容器内に保管するのが好ましい。
【００６１】
スクリーニング検査および分娩時培養の結果がすべて得られる前に胎盤を収集する場合、そのような組織にはラベルを付け、隔離して保管する。胎盤は、必要なスクリーニング評価および分娩時培養に合格して初めて、その組織の処理および使用が安全であると明言され、のちの処理が承認され、医長から最終的な承認を得る。
【００６２】
材料の確認および評価（段階１２０）
処理施設または処理研究所に到着したとき、積荷を開け、無菌輸送バッグ／容器が未だ密封状態で冷却材の中にあり、ドナーに関するしかるべき書類が入っており、書類のドナー番号が組織の入った無菌輸送バッグの番号と一致することを確認する。次いで、組織の入った無菌輸送バッグをのちの処理のための準備が整うまで冷蔵庫で保管する。
【００６３】
組織の粗処理（段階１３０）
のちの処理に向けて組織の準備が整ったとき、胎盤組織をさらに処理するのに必要な無菌材料を制御環境内の中間準備領域に集め、制御環境内に導入する準備をする。一態様では、胎盤を室温で処理する。制御された環境が製造フードである場合、従来の無菌的技術を用いて、無菌材料を開封しフード内に設置する。制御された環境がクリーンルームである場合、無菌材料を開封し、滅菌した布で覆われたカートに載せる。作業台はすべて、従来の無菌的技術を用いて、滅菌した布で覆い、無菌材料および処理設備も同じく従来の無菌的技術を用いて、滅菌した布の上に置く。
【００６４】
産業界で認められている従来の汚染除去法に従って処理設備を汚染除去した後、制御環境内に導入する。設備は、組織標本に接近したり、不用意に組織標本によって汚染されたりする機会を最小限に抑えるため、制御環境内に戦略的に設置する。
【００６５】
次に、制御環境内で無菌輸送バッグから胎盤を取り出し、処理用滅菌洗面器に無菌状態で移す。滅菌洗面器に室温または室温前後の高張生理食塩水（例えば、１８％ＮａＣｌ）を入れる。胎盤を穏やかにもみほぐして血餅を分離させ、胎盤組織が室温に達するようにして、胎盤成分（例えば、羊膜および絨毛膜）が互いに分離しやすくする。周囲温度まで温めた後（例えば、約１０〜３０分後）、処理用滅菌洗面器から胎盤を取り出し、視診するために処理用トレーに羊膜層を下にして平らに置く。
【００６６】
胎盤に変色、デブリまたは他の汚染物、臭気および損傷の徴候がないかどうかを検査する。このほか、組織の大きさも記録する。この時点で、組織がのちの処理に許容されるものであるかどうかを判断する。
【００６７】
次に、羊膜と絨毛膜を慎重に分離する。一態様では、この処置で使用する材料および設備には、処理用トレー、１８％生理食塩水、滅菌４×４スポンジおよび滅菌Ｎａｌｇｅｎｅジャー２本が含まれる。次いで、胎盤組織を入念に調べて、羊膜と絨毛膜を分離することができる領域（通常は端）を見つける。羊膜は、絨毛膜上に薄い不透明な膜として見られる。
【００６８】
線維芽細胞層は、滅菌ガーゼ片または綿棒で羊膜の両面に穏やかに触れることによって確認される。線維芽細胞層は被験材料に張り付いている。羊膜を処理用トレーに基底膜層を下にして置く。鈍器、セルスクレーパーまたは滅菌ガーゼを用いて、残った血液はすべて除去する。この段階も同じく、羊膜が破れないよう十分に注意を払って実施しなければならない。羊膜の洗浄は、羊膜が滑らかになり外観が乳白色になれば完了する。
【００６９】
ある特定の態様では、線維芽細胞層を露出させるため、海綿層とも呼ばれる中間組織層を羊膜から実質的に除去する。除去する中間組織層の量に関する「実質的に除去する」という用語は、本明細書では、羊膜から中間組織層の約９０％超、約９５％超または約９９％超を除去することと定義される。この除去は羊膜から中間組織層を剥離することによって実施され得る。あるいは、ガーゼまたは適切な拭取り繊維で中間組織層を拭き取ることによって、羊膜から中間組織層除去してもよい。次いで、得られた羊膜を、以下に記載する工程を用いて汚染除去することができる。
【００７０】
ある特定の態様では、羊膜の基底層を露出させるため、羊膜上に存在する上皮層を実質的に除去する。除去する上皮の量に関する「実質的に除去する」という用語は、本明細書では、羊膜から上皮細胞の約９０％超、約９５％超または約９９％超を除去することと定義される。羊膜層に残存している上皮細胞の有無は、当該技術分野で公知の技術を用いて評価することができる。例えば、上皮細胞層を除去した後、処理ロットの代表的な組織試料を標準的な顕微鏡検査スライドに載せる。次いで、エオシンＹ染色を用いて組織試料を染色し、以下に記載する通りに評価する。次いで、試料にカバーガラスをかけ、静置する。染色するのに十分時間が経過してから、拡大下で視覚的に観察する。
【００７１】
上皮層は当該技術分野で公知の技術によって除去することができる。例えば、セルスクレーパーを用いて、上皮層を羊膜から削り落とすことができる。その他の技術としては、特に限定されないが、膜の凍結、セルスクレーパーを用いた物理的除去、または非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤およびヌクレアーゼへの上皮細胞の曝露が挙げられる。次いで、上皮層を除去した組織を評価して、基底膜が損傷を受けておらず、無傷のままであることを確認する。この段階は、処理段階の完了後、次の節に記載されるように組織を脱水する前に実施する。例えば、顕微鏡分析用に代表的な移植片の試料を取り出す。組織試料を標準的なスライドに載せ、エオシンＹで染色し、顕微鏡で見る。上皮が存在する場合、敷石状の細胞として見られる。
【００７２】
本明細書に記載される方法では、羊膜中の細胞成分をすべて除去するわけではない。この技術は当該技術分野では「脱細胞化」と呼ばれる。脱細胞化は一般に、上皮細胞および線維芽細胞を含む羊膜中に存在する全細胞の物理的および／または化学的処理を伴う。例えば、上皮細胞の除去は任意選択であるが、羊膜間質層に存在する線維芽細胞層は、中間組織層を除去しても無傷である。ここでは、線維芽細胞は線維芽細胞層に存在する。
【００７３】
胎盤組織がワルトン膠質である場合、以下の例示的な手順を用いることができる。解剖用メスまたは鋏を用いて、絨毛盤から臍帯を切断する。静脈および動脈を特定した後、臍帯の静脈または動脈の１本に沿って縦方向に切開する。臍帯を切開した後、手術用鋏および鉗子を用いて、ワルトン膠質から静脈壁および動脈壁を切り離すことができる。次に、羊膜を切ることによって、ワルトン膠質から羊膜の外層を除去する。ここでは、成分としてワルトン膠質のみが残るように、臍帯の外膜を除去する。したがって、本明細書で使用されるワルトン膠質は、臍帯外膜および臍帯血管を含まない。ワルトン膠質を切って細片にすることができる。一態様では、細片は約１〜４ｃｍ×１０〜３０ｃｍ、厚さ約１．２５ｃｍであるが、用途によってはこれ以外の厚さも可能である。
【００７４】
化学的汚染除去（段階１４０）
以下に記載する技術を用いて、胎盤組織を化学的に汚染除去することができる。一態様では、羊膜を室温で汚染除去する。一態様では、段階１３０で得られた羊膜（例えば、中間組織層の有無を問わない羊膜）を次の段階のために滅菌Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ジャーに入れることができる。一態様では、以下の手順を用いて羊膜を洗浄することができる。Ｎａｌｇｅｎｅジャーに無菌的に１８％高張生理食塩水を満たし、密閉する（または蓋で密閉する）。次いで、ジャーを振盪台に置き、３０〜９０分間攪拌することによって、羊膜から汚染物がさらに除去される。振盪台が重要な環境（例えば、製造フード）にない場合、Ｎａｌｇｅｎｅジャーを制御／無菌環境に戻して開ける。滅菌鉗子を用いるか、無菌的に内容物を傾瀉することによって、１８％高張生理食塩水の入ったＮａｌｇｅｎｅジャーから羊膜を静かに取り出し、空のＮａｌｇｅｎｅジャーに入れる。次いで、羊膜の入ったこの空のＮａｌｇｅｎｅジャーに、予め混合した抗生物質溶液を無菌状態で満たす。一態様では、予め混合した抗生物質溶液は、ストレプトマイシン硫酸塩およびゲンタマイシン硫酸塩などの抗生物質のカクテルからなる。このほか、ポリミキシンＢ硫酸塩およびバシトラシンまたは現在もしくは将来入手可能なこれと同様の抗生物質などの他の抗生物質も適している。さらに、抗生物質溶液は、羊膜の温度が変化したり、羊膜が損傷したりしないように、加える時点で室温であるのが好ましい。次いで、羊膜と抗生物質が入ったこのジャーまたは容器を密閉するか蓋をして振盪台に置き、好ましくは６０〜９０分間攪拌する。このように羊膜を抗生物質溶液中で振盪または攪拌することにより、組織から汚染物および細菌がさらに除去される。任意選択で、羊膜を洗浄剤で洗浄してもよい。一態様では、羊膜を０．１〜１０％、０．１〜５％、０．１〜１％または０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）洗浄液で洗浄することができる。
【００７５】
振盪台が重要な環境（例えば、製造フード）になかった場合、羊膜と抗生物質の入ったジャーまたは容器を重要な環境／無菌環境に戻して開ける。滅菌鉗子を用いて、羊膜をジャーまたは容器から静かに取り出し、滅菌水または通常の生理食塩水（０．９％生理食塩水）の入った滅菌洗面器に入れる。羊膜を滅菌水／通常の生理食塩水中の適当な位置で少なくとも１０〜１５分間浸す。組織から抗生物質溶液およびその他の汚染物が除去されやすくするために羊膜を少し攪拌してもよい。少なくとも１０〜１５分経過すれば、羊膜は脱水およびさらなる処理を実施できる状態になる。
【００７６】
絨毛膜の場合、以下の例示的な手順を用いることができる。羊膜から絨毛膜を分離し、線維層から血餅を除去した後、絨毛膜を１８％生理食塩水で１５分〜６０分間すすぐ。最初のすすぎサイクルでは、実験室用の加熱板を用いて、１８％生理食塩水を滅菌容器中で加熱し、溶液の温度を約４８℃にする。溶液を傾瀉し、絨毛膜組織を滅菌容器に入れ、傾瀉した生理食塩水を容器に注加する。容器を密閉して振盪板の上に置き、１５分〜６０分間攪拌する。１時間の振盪浴の後、絨毛膜組織を取り出し、２つ目の加熱攪拌浴に入れ、さらに１５分〜６０分間のすすぎサイクルを実施する。任意選択で、羊膜を汚染除去するために、絨毛膜組織を上記のように洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄液）で洗浄してもよい。容器を密閉し、加熱せずに１５分〜１２０分間攪拌する。次に、絨毛膜組織を脱イオン水（脱イオン水２５０ｍｌ×４）で毎回激しく振ってすすぐことにより洗浄する。組織を取り出し、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｗ／ＥＤＴＡ溶液の入った容器に入れる。容器を密閉して１時間攪拌し、制御された温度下に８時間置く。絨毛膜組織を取り出し、滅菌水を用いてすすぐ。目視検査を実施し、変色した線維状の血液物質が残っていれば絨毛膜組織から取り除く。絨毛膜組織は、褐色に変色した痕跡が全くみられず、乳白色の外観を呈しているべきである。
【００７７】
胎盤組織がワルトン膠質である場合、以下の例示的な手順を用いることができる。ワルトン膠質を滅菌Ｎａｌｇｅｎｅジャーに移す。次に、室温の１８％高張生理食塩水を加えて組織をすすぎ、ジャーを密閉する。ジャーを３０〜６０分間攪拌する。インキュベーション後、ジャーを汚染除去し、無菌の場所に戻す。組織を清潔な滅菌Ｎａｌｇｅｎｅジャーに移し、１８％ＮａＣｌで予熱する（約４８℃）。容器を密閉して振盪板の上に置き、６０〜９０分間攪拌する。
【００７８】
すすぎ後、ジャーを汚染除去し、無菌の場所に戻す。組織を取り出し、抗生物質溶液中に入れる。容器を密閉し、振盪台で６０〜９０分間攪拌する。インキュベーション後、ジャーを１℃〜１０℃で最大２４時間、冷蔵保存し得る。
【００７９】
次に、ワルトン膠様質を滅菌水約２００ｍＬの入った滅菌洗面器に移す。組織を１〜２分間洗浄し、滅菌水約３００ｍｌの入った滅菌Ｎａｌｇｅｎｅジャーに移す。ジャーを密閉し、振盪機の上に３０〜６０分間置く。インキュベーション後、ジャーを無菌の場所に戻す。ワルトン膠様質は、褐色に変色した痕跡が全くみられず、乳白色の外観を呈しているべきである。
【００８０】
脱水（段階１４５）
一態様では、上記の胎盤組織もしくはその成分またはその任意の組合せを処理して組織移植片（すなわち、積層物）にし、次いでこれを微粉化し得る。別の態様では、胎盤組織またはその個々の成分を個別に脱水した後、単独で、または成分の混合物として微粉化し得る。一態様では、組織（すなわち、個々の膜または移植片）を化学的脱水によって脱水した後、凍結乾燥する。一態様では、組織中に存在する残留水分を実質的に（すなわち、９０％超、９５％超または９９％超）または完全に除去する（すなわち、組織を脱水する）ために十分な量の極性有機溶媒と、十分な時間、羊膜、絨毛膜および／または中間層を接触させることによって、化学的脱水段階を実施する。溶媒はプロトン性であっても非プロトン性であってもよい。本明細書において有効な極性有機溶媒としては、限定されないが、アルコール、ケトン、エーテル、アルデヒドまたはその任意の組合せが挙げられる。非限定的な具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、テトラヒドロフラン、エタノール、イソプロパノールまたはその任意の組合せが挙げられる。一態様では、胎盤組織を室温で極性有機溶媒と接触させる。追加の段階は一切必要なく、以下に述べるように組織を直接凍結乾燥することができる。
【００８１】
化学的脱水後、残留水分および極性有機溶媒をすべて除去するため、組織を凍結乾燥する。一態様では、凍結乾燥前に羊膜、絨毛膜および／または中間層を適切な乾燥用固定具に載せてもよい。例えば、１つまたは複数の羊膜の細片を適切な乾燥用固定具に載せてもよい。次に、絨毛膜を羊膜の上に置く。この態様では、羊膜／絨毛膜組織移植片が得られる。あるいは、羊膜の細片を第一の乾燥用固定具に載せ、絨毛膜の細片を第二の乾燥用固定具に載せてもよい。乾燥用固定具は、胎盤組織を平らに広げた状態で全体を受容するだけの広さがあるのが好ましい。一態様では、乾燥用固定具はＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製またはＤｅｌｒｉｎ（登録商標）製であるが、これらの材料はＤｕＰｏｎｔ社が発明し販売しているアセタール樹脂エンジニアリングプラスチックの商標名であり、ジョージア州マリエッタのＷｅｒｎｅｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ社からも購入することができる。ほかにも、耐熱性および耐切断性があり、湿組織を受容するのに適した形状にすることができる適切な材料があれば、これを乾燥用固定具に用いることができる。
【００８２】
組織を乾燥用固定具に載せた後、乾燥用固定具を凍結乾燥機に入れる。組織の脱水には、加熱脱水などの他の技術よりも凍結乾燥機を用いる方が効率的かつ完全であり得る。胎盤組織内に氷晶が形成されると、組織内の細胞外マトリックスが損傷を受ける可能性があるため、一般にはこれを避けるのが望ましい。凍結乾燥前に胎盤組織を化学的に脱水することによって、この問題を回避することができる。
【００８３】
別の態様では、脱水段階は組織に熱を加えることを伴う。一態様では、羊膜、絨毛膜および／または中間層を適切な乾燥用固定具に載せ（上記のように個々の細片として、または積層物として）、乾燥用固定具を滅菌Ｔｙｖｅｘ（Ｔｙｖｅｋ（登録商標）とも呼ばれる；またはこれと同様の通気性および耐熱性があり密封可能な材料）製の脱水バッグに入れ、密封する。通気性のある脱水バッグは、組織が過度に急激に乾燥するのを防ぐ。複数の乾燥用固定具を同時に処理する場合、各乾燥用固定具をそれぞれのＴｙｖｅｘ製バッグに入れるか、あるいは複数の乾燥フレームを保持するよう設計された適切な取付けフレームに各乾燥用固定具を入れ、次いでフレーム全体をこれよりも大きい単一の滅菌Ｔｙｖｅｘ製脱水バッグに入れ、密封する。
【００８４】
次いで、１つまたは複数の乾燥器具の入ったＴｙｖｅｘ製脱水バッグを、約３５〜５０℃に予熱した非真空オーブンまたはインキュベーターに入れる。Ｔｙｖｅｘ製バッグをオーブンに３０〜１２０分間入れておく。一態様では、加熱段階を約４５℃の温度で４５分間実施して、組織を乾燥させ過ぎたり焦げさせたりせずに十分に乾燥させ得る。任意の具体的なオーブンに用いる具体的な温度および時間については、標高、オーブンのサイズ、オーブンの温度の精度、乾燥用固定具に使用する材料、同時に乾燥させる乾燥用固定具の数、乾燥用固定具の単一または複数のフレームを同時に乾燥させるかどうかを含めた他の因子に基づいて校正および調整する必要がある。
【００８５】
一態様では、脱水工程の速度および均一性を増大させる脱水装置を用いて、胎盤組織または他の成分を脱水し得る。胎盤組織移植片の乾燥に適した代表的な脱水装置については米国特許出願公開第２０１４／００５０７８８号および同第２０１４／００５１０５９号に記載されている。上記出願の内容はその全体が参照により組み込まれる。
【００８６】
微粉化胎盤成分の調製（段階１５０）
上記の胎盤組織またはその成分および任意選択で羊膜組成物のその他の成分を個別に、または組織移植片の形態で脱水した後、脱水した組織（１つまたは複数）および／またはその他の成分を微粉化する。微粉化成分は当該技術分野で公知の機器を用いて作製することができる。例えば、Ｒｅｔｓｃｈ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ４００を用いて、本明細書に記載される微粉化組成物を作製することができる。微粉化組成物中の材料の粒子サイズも、微粉化組成物の用途に応じて異なり得る。一態様では、微粉化組成物は、約５００μｍ未満、約４００μｍ未満、約３００μｍ未満、約２００μｍ未満、約１００μｍ未満、約７５μｍ未満、約５０μｍ未満、約２５μｍ未満、約２０μｍ未満、約１５μｍ未満、約１０μｍ未満、約９μｍ未満、約８μｍ未満、約７μｍ未満、約６μｍ未満、約５μｍ未満、約４μｍ未満、約３μｍ未満、約２μｍ未満、または約２μｍ〜約４００μｍ、約２５μｍ〜約３００μｍ、約２５μｍ〜約２００μｍ、約２５μｍ〜約１５０μｍもしくは約７５μｍ〜約１５０μｍの粒子を有する。一態様では、微粉化組成物は、直径が約１５０μｍ未満、約１００μｍ未満、約７５μｍ未満または約５０μｍ未満の粒子を有する。他の態様では、さらに大きい直径の粒子（例えば、約２５０μ超または約１５０μｍ〜約３５０μｍ）が望ましい。いずれの場合も、粒子の直径は、その最も長い軸に沿って測定されるものである。粒子サイズは組成物中の粒子の平均サイズとして定義される。
【００８７】
一実施形態では、粒子サイズをナノ範囲まで減少させ得る。当業者には理解されるように、胎盤成分のナノ粒子は、創傷に適用する際に密度を増大させ、かつ／または放出速度を増大させるのに望ましい場合がある。微粉化粒子の粒子サイズは、約０．０５μｍ〜約２μｍ、約０．１μｍ〜約１．０μｍ、約０．２μｍ〜約０．８μｍ、約０．３μｍ〜約０．７μｍまたは約０．４μｍ〜約０．６μｍであるのが好ましい。あるいは、微粉化粒子の粒子サイズは、少なくとも約０．０５μｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．２μｍ、少なくとも約０．３μｍ、少なくとも約０．４μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約０．６μｍ、少なくとも約０．７μｍ、少なくとも約０．８μｍ、少なくとも約０．９μｍまたは少なくとも約１μｍである。あるいは、微粉化粒子の粒子サイズは、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．８μｍ未満、約０．７μｍ未満、約０．６μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．３μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満または約０．０５μｍ未満である。
【００８８】
一態様では、最初の微粒子化は機械的粉砕または細断によって実施する。別の態様では、微粒子化を低温粉砕によって実施する。この態様では、粉砕工程前および粉砕工程中、組織の入った粉砕ジャーを統合された冷却システムの液体窒素で冷却し続ける。このため、試料が砕けやすくなり、かつ不安定な成分が保存される。さらに、羊膜、中間組織層および／または絨毛膜中のタンパク質の変性が最小限に抑えられるか、または防止される。一態様では、Ｒｅｔｓｃｈ社製のＣｒｙｏＭｉｌｌをこの態様で使用することができる。
【００８９】
本明細書に記載される成形脱水羊膜組成物の作製に使用する成分の選択は、最終用途に応じて異なり得る。例えば、胎盤組織または羊膜、絨毛膜、中間組織層、ワルトン膠質もしくはその任意の組合せなどの個々の成分を互いに混合した後、微粉化し得る。別の態様では、１つまたは複数の胎盤組織、羊膜、絨毛膜、中間組織層またはその任意の組合せ（すなわち、積層物）からなる１つまたは複数の組織移植片を微粉化し得る。さらなる態様では、１つまたは複数の羊膜、絨毛膜、中間組織層またはその任意の組合せからなる１つまたは複数の組織移植片を、個別の成分として羊膜、絨毛膜、中間組織層またはその任意の組合せと混合した後、微粉し得る。
【００９０】
様々な成分の量は成形脱水胎盤組成物の用途に応じて異なり得る。一態様では、成形脱水胎盤組成物が羊膜（中間組織層の有無は問わない）と中間組織層とからなる場合、羊膜と中間組織層との重量比は、約１０：１〜約１：１０、約９：１〜約１：１、約８：１〜約１：１、約７：１〜約１：１、約６：１〜約１：１、約５：１〜約１：１、約４：１〜約１：１、約３：１〜約１：１、約２：１〜約１：１または約１：１である。別の態様では、成形脱水胎盤組織移植片が羊膜（中間組織層の有無は問わない）と絨毛膜とからなる場合、絨毛膜と羊膜との重量比は、約１０：１〜約１：１０、約９：１〜約１：１、約８：１〜約１：１、約７：１〜約１：１、約６：１〜約１：１、約５：１〜約１：１、約４：１〜約１：１、約３：１〜約１：１、約２：１〜約１：１または約１：１である。
【００９１】
粒子サイズの分離は、粒子の懸濁液を形成させて滅菌水中で微粉化材料を分画することにより達成することができる。懸濁液の最上部には主として最も小さい粒子が含まれ、懸濁液の最下部には主として最も重い粒子が含まれることになる。分画により粒子サイズが分離され、分画を繰り返すことにより微粉化粒子が様々なサイズに分離される。このように分離した粒子は、成形胎盤組織移植片の作製および所望の医療用途に最も適するように、粒子サイズを所望の比で組み合わせることができる。当業者には理解されるように、粒子サイズが異なれば、以下で述べるように、成形胎盤組成物の異なる密度および凝集塊を生じる。
【００９２】
成形羊膜組成物の調製およびその組成（段階１６０）
本発明は、脱水微粉化粒子の粒子サイズを考慮することによって、本明細書に記載される成形組成物のインビボ崩壊速度を予め選択することができるという発見に一部基づく。以下の実施例に示されるように、粒子のサイズを変化させることにより、成形組成物の崩壊速度に予測可能な変化をもたらすことができる。したがって、本発明はまた、限定されないが、予め選択したインビボ崩壊速度を有する成形羊膜組成物を含めた成形胎盤組成物を作製する方法であって、羊膜組成物を加圧下で成形することを含み、予め選択した崩壊速度を有する成形羊膜組成物が得られるように、前記成形前に粒子サイズを調節することを含む、方法を提供する。一実施形態では、微粉化組成物の粒子サイズを減少させることにより、インビボ崩壊速度を減少（低下）させることができる。
【００９３】
本発明はまた、脱水微粉化粒子の粒子サイズ、用いる圧縮力および圧縮力を加える速度を考慮することによって、本明細書に記載される成形組成物の強度および／または剛性を予め選択することができるという発見に一部基づく。以下の実施例に示されるように、１つまたは複数の上記パラメータを変化させることにより、成形組成物の剛性および／または強度に予測可能な変化をもたらすことができる。したがって、本発明はまた、予め選択した強度および／または剛性を有する成形胎盤組成物を作製する方法であって、胎盤組成物を加圧下で成形することを含み、予め選択した強度および／または剛性を有する成形胎盤組成物が得られるように、前記成形前に１つまたは複数の上記パラメータを調節することを含む、方法を提供する。一実施形態では、微粉化組成物の粒子サイズを減少させるが、上記の他の因子はそれぞれ維持することにより、成形組成物の強度を増大させ。一実施形態では、用いる圧縮力を増大させることにより、成形組成物の強度を増大させ得る。一実施形態では、用いる圧縮速度を減少させることにより、成形組成物の強度を増大させ得る。
【００９４】
脱水微粉化成分、例えば微粉化した羊膜および任意選択で絨毛膜、中間組織層ならびにその任意の組合せを好ましくは非多孔性の成形型に入れて圧力をかけると、成形型によって定められる所望の形状およびサイズになる。多孔性の成形型はあまり好ましくはないが、成形時に水または他の溶媒を流出させることができれば、そのような成形型でも本発明の方法に使用し得ると考えられる。
【００９５】
圧縮力、圧縮速度および圧縮サイクル数は、成形微粉化胎盤組成物の形成時に変化させることができる。一態様では、微粉化胎盤の成形に用いる圧縮力は、１０ニュートン〜１０００ニュートンである。好ましい実施形態では、微粉化胎盤の成形に用いる圧縮力は、１００ニュートン〜４００ニュートンである。圧縮力は意図する用途に応じて異なり得る。例えば、成形組成物の強度および／または剛性を大きくする必要がある用途には、より大きな力が必要になる。
【００９６】
一態様では、微粉化胎盤または胎盤組織の成形に用いる圧縮速度は、０．００１ｍｍ／秒〜５ｍｍ／秒である。好ましい実施形態では、微粉化胎盤または胎盤組織の成形に用いる圧縮速度は、０．００８ｍｍ／秒〜１．５ｍｍ／秒である。圧縮速度は意図する用途に応じて異なり得る。例えば、成形組成物の強度および／または剛性を大きくする必要がある用途には、より遅い速度が必要になる。
【００９７】
成形胎盤組成物は、少なくとも成形胎盤組成物が対象に導入されるまで、そのサイズおよび形状を維持するのに十分な密度および凝集塊を有する。成形胎盤組成物の凝集力は、部分的には微粉化成分の粒子サイズによって決まる。例えば、より大きな粒子サイズを有する脱水微粉化成分では、より小さい粒子サイズの脱水微粉化成分からなる成形胎盤組成物と同じ密度の成形羊膜組成物を得るのに、より高い圧縮圧力および／または長い圧縮時間が必要である。換言すれば、同じ圧縮条件下で得られた成形脱水羊膜組成物では、粒子サイズの大きい組成物の方が、粒子サイズの小さい組成物よりも密度が小さく、速い速度で分離する。
【００９８】
限定されないが羊膜組成物を含めた脱水微粉化胎盤組成物の粒子サイズは、組成物中に存在する増殖因子および他の活性分子の放出速度にも影響を及ぼす。理論に束縛されるものではないが、他の要因がすべて同じである場合、粒子サイズが小さいほど組成物内の成分の全表面積が大きくなると考えられる。表面積を大きくすれば、微粉化胎盤、例えば羊膜および／またはその他の成分などからの因子の放出が増大し、かつ／または放出速度が増大し得る。粒子を小さくすれば、圧縮率を向上させ、強度の増大させることが可能であると考えられる。大きい粒子で作製した成形微粉化胎盤組成物は、小さい粒子で作製したものよりも速く崩壊し得る。したがって、微粉化成分の粒子サイズを最適化することにより、所望の凝集性、表面積を有し、対象に投与したときに所望の最終結果をもたらす成形胎盤組成物を得ることができる。
【００９９】
任意選択で、微粉化成分を成形型に導入する前に、１つまたは複数の接着剤と混合することができる。このような接着剤の例としては、特に限定されないが、フィブリンシーラント、シアノアクリレート、ゼラチンおよびトロンビン製品、ポリエチレングリコールポリマー、アルブミンおよびグルタルアルデヒド製品が挙げられる。工程に使用する接着剤は、接着剤と微粉化胎盤組成物の混合物の含水量が、非多孔性の成形型で圧縮できる程度に低くなるように、微粉化胎盤組成物と混合する前に脱水するべきである。
【０１００】
羊膜、中間組織層および／または絨毛膜などの胎盤成分に加えて、微粉化の前および／または後に、脱水した追加の成分を組成物に添加することができる。一態様では、脱水した充填剤を添加することができる。充填剤の例としては、限定されないが、心膜の同種異系移植片、無細胞真皮の同種異系移植片、精製Ｉ型コラーゲン、ヒトコラーゲン、バイオセルロースポリマーもしくはコポリマー、生体適合性合成ポリマーもしくはコポリマーフィルム、精製小腸粘膜下組織、膀胱無細胞マトリックス、死体筋膜、骨片（海綿骨片および皮質骨片を含む）またはその任意の組合せが挙げられる。
【０１０１】
別の態様では、微粉化の前および／または後に、脱水した生理活性物質を組成物に添加し得る。生理活性物質としては、限定されないが、自己血液採取／分離製品もしくは期限切れの保存血から得られる血小板濃縮物のいずれかを用いて血小板濃縮物から得られる天然の増殖因子；骨髄吸引液；濃縮ヒト胎盤臍帯血幹細胞、濃縮羊水幹細胞もしくはバイオリアクターで増殖させた幹細胞に由来する幹細胞；または抗生物質が挙げられる。生理活性物質を添加した成形脱水胎盤組成物を目的とする部位に適用すると、生理活性物質がその部位に経時的に送達される。したがって、本明細書に記載される成形脱水胎盤組成物は、対象に投与する場合、生理活性物質および他の美容薬剤の送達装置として有用である。放出プロファイルは、とりわけ成形胎盤組成物の作製に使用する成分および胎盤組成物中に含まれる粒子のサイズの選択に基づいて修正することが可能である。
【０１０２】
可塑剤
さらに別の態様では、微粉化胎盤組成物成分と、少なくとも１つの可塑剤とを混合する。当業者であれば、可塑剤の生体適合性、可塑剤がインビボで羊膜組成物の分解または侵食速度に及ぼす影響、可塑剤が成形／圧縮工程を促進する混合物の特性に及ぼす影響、ならびに／あるいは可塑剤が組成物の強度、柔軟性、堅牢性、疎水性および／または親水性に及ぼす影響に基づき、適切な可塑剤を選択するであろう。いくつかの態様では、可塑剤と微粉化胎盤組成物成分の混合物の含水量が、非多孔性の成形型で圧縮できる程度に十分低くなるように、微粉化胎盤組成物成分と混合する前に可塑剤を脱水および／または微粉化する。
【０１０３】
「可塑剤」および「可塑化剤」という用語は、本発明では互換的に使用され得る。可塑剤は、組成物または組成物から形成される製品の力学的特性を修正するために添加することができる任意の薬剤または薬剤の組合せを包含し得る。
【０１０４】
いかなる理論または作用機序にも束縛されるものではないが、組成物中の成分間に流れを作るまたはこれを増強することを含み得る設計目標の下、可塑剤は、例えば、結晶化度を低下させる、ガラス転移温度（Ｔｇ）を低下させる、または組成物内の成分間の分子間力を減少させるために添加することができる。修正される力学的特性としては、特に限定されないが、ヤング率、引張り強度、衝撃強度、引裂き強度および破損歪みが挙げられる。可塑剤はモノマー、ポリマーもしくはコポリマーまたはその組合せであってよく、共有結合の有無を問わず組成物に添加することができる。可塑化と溶解度は、可塑剤を選択するうえで、例えば極性など、溶媒を選択する際の検討事項と類似の検討事項を伴うという点で類似している。さらに、共重合を介して組成物の分子構造を変化させる共有結合を介して、可塑剤を添加することができる。
【０１０５】
可塑化剤の例としては、特に限定されないが、低分子量ポリマー、例えば単ブロックポリマー、多ブロックポリマーおよびコポリマーなど；オリゴマー、例えば、限定されないが乳酸のエチル終端オリゴマーを含めた乳酸オリゴマー；環状乳酸とグリコール酸のダイマー；有機小分子；ヒドロキシル基の有無を問わない水素結合形成有機化合物；脂肪族ヒドロキシルを有する低分子量ポリオールなどのポリオール；アルカノール、例えばブタノール、ペンタノールおよびヘキサノールなど；糖アルコールおよび無水糖アルコール；ポリ（アルキレングリコール）などのポリエーテル；エステル、例えばクエン酸エステル、フタル酸エステル、セバシン酸エステルおよびアジピン酸エステルなど；ポリエステル；脂肪酸；飽和および不飽和脂肪酸；脂肪アルコール；コレステロール；ステロイド；リン脂質、例えばレシチンなど；タンパク質、例えば動物性タンパク質および植物性タンパク質など；油、例えば植物油および動物油など；シリコーン；アセチル化モノグリセリド；ジグリセリド；トリグリセリド；アミド；アセトアミド；スルホキシド；スルホン；ピロリドン；オキサ酸；ジグリコール酸；ならびにその任意の類似体、誘導体、コポリマーおよび組合せが挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、可塑剤としては、限定されないが、その他のポリオール、例えば、カプロラクトンジオール、カプロラクトントリオール、ソルビトール、エリスリトール、グルシドール、マンニトール、ソルビトール、スクロースおよびトリメチロールプロパンなどが挙げられる。他の実施形態では、可塑剤としては、限定されないが、グリコール、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、メチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、２，３−ブチレングリコール、スチレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコールなど；グリコール−エーテル、例えば、モノプロピレングリコールモノイソプロピルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルおよびジエチレングリコールモノエチルエーテルなど；ならびにその任意の類似体、誘導体、コポリマーおよび組合せが挙げられる。
【０１０７】
他の実施形態では、可塑剤としては、限定されないが、グリコールエステル、例えば、ジエチレングリコールジベンゾアート、ジプロピレングリコールジベンゾアート、メチレングリコールカプラート−カプリラートなどのエステル；モノステアリン酸エステル、例えば、グリセロールモノステアラートなど；クエン酸エステル；有機酸エステル；芳香族カルボン酸エステル；脂肪族ジカルボン酸エステル；脂肪酸エステル、例えば、ステアリン酸エステル、オレイン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステルおよびセバシン酸エステル；トリアセチン；ポリ（エステル）、例えば、フタル酸ポリエステル、アジピン酸ポリエステル、グルタミン酸ポリエステルなど、フタル酸エステル、例えば、フタル酸ジアルキル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル、フタル酸イソプロピル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジオクチル、フタル酸ジイソノニルおよびフタル酸ジイソデシルなど；セバシン酸エステル、例えば、セバシン酸アルキル、セバシン酸ジメチル、セバシン酸ジブチルなど；ヒドロキシル−エステル、例えば、乳酸エステル、乳酸アルキル、乳酸エチル、乳酸ブチル、グリコール酸アリル、グリコール酸エチルおよびグリセロールモノステアラートなど；クエン酸エステル、例えば、アセチルクエン酸アルキル、アセチルクエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリヘキシル、クエン酸アルキル、クエン酸トリエチルおよびクエン酸トリブチルなど；ヒマシ油のエステル、例えば、リシノール酸メチルなど；芳香族カルボン酸エステル、例えば、トリメリト酸エステル、安息香酸エステルおよびテレフタル酸エステルなど；脂肪族ジカルボン酸エステル、例えば、アジピン酸ジアルキル、アジピン酸アルキルアリルエーテルジエステル、アジピン酸ジブトキシエトキシエチル、アジピン酸ジイソブチル、セバシン酸エステル、アゼライン酸エステル、クエン酸エステルおよび酒石酸エステルなど；および脂肪酸エステル、例えば、グリセロール、モノアセタート、ジアセタート、またはトリアセタートおよびスルホコハク酸ジエチルナトリウムなど；ならびにその任意の類似体、誘導体、コポリマーおよび組合せが挙げられる。
【０１０８】
他の実施形態では、可塑剤としては、限定されないが、エーテルおよびポリエーテル、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレン／プロピレングリコール）などのポリ（アルキレングリコール）；ＰＥＧ誘導体、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）など；およびエステル−エーテル、例えば、ジエチレングリコールジベンゾアート、ジプロピレングリコールジベンゾアートおよびトリエチレングリコールカプラート−カプリラートなど；ならびにその任意の類似体、誘導体、コポリマーおよび組合せが挙げられる。
【０１０９】
他の実施形態では、可塑剤としては、限定されないが、アミド、例えば、オレイン酸アミド、エルカ酸アミドおよびパルミチン酸アミドなど；アルキルアセトアミド、例えば、ジメチルアセトアミドなど；スルホキシド、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など；ピロリドン、例えば、ｎ−メチルピロリドンなど；スルホン、例えば、テトラメチレンスルホンなど；酸、例えば、オキサ一酸、３，６，９−トリオキサウンデカン二酸、ポリオキサ二酸などのオキサ二酸、アセチル化クエン酸のエチルエステル、アセチル化クエン酸のブチルエステル、アセチル化クエン酸のカプリルエステルおよびジメチロールプロピオン酸などのジグリコール酸など；ならびにその任意の類似体、誘導体、コポリマーおよび組合せが挙げられる。
【０１１０】
他の実施形態では、可塑剤としては、限定されないが、エポキシ化大豆油；亜麻仁油；ヒマシ油；ヤシ油；分画ヤシ油を含めた植物油；エポキシ化タル油酸エステル；ならびに脂肪酸、例えばステアリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびセバシン酸などのエステル；限定されないが、アンゲリカ油、アニス油、アルニカ油、オレンジ精油、吉草油、バジル精油、ベルガモット油、セイボリー油、ブッコノキ精油、樟脳、カルダモン精油、カッシア油、ヘノポジ油、キク油、シナヨモギ精油、シトロネラ油、レモン油、柑橘油、コスタス油、クルクマ油、アザミ油、エレミ油、タラゴン油、ユーカリ油、ウイキョウ油、マツ葉油、マツ油、シダ精油、ガルバナム油、ガウルテリア精油、ゼラニウム油、ユソウボク油、オウシュウサイシン油、イリス油、オトギリソウ油、ショウブ根油、カミツレ油、シベリアモミ油、ニンニク油、コリアンダー油、カラウェー油、月桂樹精油、ラベンダー油、レモングラス油、ロベージ油、ベイ油、ホップ精油、メース油、マジョラム油、マンダリン油、メリッサ油、メントール、セイヨウノコギリソウ精油、ハッカ油、オニサルビア油、ニクズク油、甘松油、チョウジ油、ネロリ油、ニアウリ、オリバナム油、オノニス精油、オポプラナックス（ｏｐｏｐｒａｎａｘ）油、オレンジ油、オレガノ油、オルトシフォン油、パチョリ油、パセリ油、プチグレン油、ハッカ油、タンジー油、シタン油、バラ油、ローズマリー油、ヘンルーダ油、サビナ精油、サフラン油、セージ油、ビャクダン油、サッサフラス油、セロリ油、カラシ油、イブキジャコウソウ精油、イモーテル油、モミ油、ティーツリー油、テレビン油、タイム油、杜松油、乳香油、ヒソップ油、ヒマラヤスギ油、ケイヒ油およびイトスギ油を含めた精油；ならびに例えば魚油などのその他の油；ならびに上記の油の任意の類似体、誘導体、コポリマーおよび組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、当業者は、上記可塑化剤のいずれか１つまたはその任意の組合せを除外するために１つまたは複数の特定の可塑化剤を選択し得ることを理解するべきである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、可塑化剤は水溶性の成分を含み得る。他の実施形態では、可塑剤を修飾して水溶性にし得る。いくつかの実施形態では、可塑化剤は脂溶性の成分を含み得る。他の実施形態では、可塑化剤を修飾して脂溶性にし得る。溶媒中、例えば、インビボで存在する体液中などでの可塑剤の挙動を変更するために任意の官能基を付加することができる。
【０１１３】
架橋
さらなる態様では、成形胎盤組成物のインビボ分解または侵食速度ならびに脱水微粉化成分の密度および凝集性を、例えば架橋によって修正し得る。例えば、羊膜を中間組織層、絨毛膜または第二の羊膜組織などの他の成分と架橋することができる。例えば、微粉化の前および／または後に組成物（例えば、胎盤、羊膜、絨毛膜、中間組織層、その他の成分あるいはその個々の成分および／または組織移植片としての任意の組合せ）に架橋剤を添加することができる。一般に、架橋剤は非毒性かつ非免疫原性である。成分を架橋剤で処理する場合、架橋剤は同じものであっても異なるものであってもよい。一態様では、胎盤、羊膜、中間組織層、絨毛膜および／またはその他の成分を個別に架橋剤で処理するか、別法では、胎盤、羊膜、中間組織層、絨毛膜および／またはその他の成分を同じ架橋剤で一緒に処理し得る。ある特定の態様では、胎盤、羊膜、中間組織層、絨毛膜および／またはその他の成分を２つ以上の異なる架橋剤で処理し得る。羊膜および／またはその他の成分を処理する条件は様々なものであり得る。他の態様では、胎盤、羊膜、中間組織層、絨毛膜および／またはその他の成分を微粉化した後、微粉化組成物を架橋剤で処理し得る。一態様では、架橋剤の濃度は、約０．１Ｍ〜約５Ｍ、約０．１Ｍ〜約４Ｍ、約０．１Ｍ〜約３Ｍ、約０．１Ｍ〜約２Ｍまたは約０．１Ｍ〜約１Ｍである。架橋された成分の含水量が、非多孔性の成形型で圧縮または成形できる程度に十分低くなるように、脱水前に成分を架橋するのが好ましい。
【０１１４】
ある特定の態様では、成形脱水胎盤組成物を架橋剤で処理し得る。胎盤組成物の含水量が低レベル、例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満または約５％未満に維持されるように、圧縮前および微粉化の前または後に胎盤組成物にガス／ヒューム架橋を施すのが好ましい。架橋剤は一般に、タンパク質と反応して共有結合を生じることができる官能基を２つ以上有する。一態様では、架橋剤は、タンパク質上に存在するアミノ基と反応することができる基を有する。このような官能基の例としては、限定されないが、ヒドロキシル基、置換または非置換アミノ基、カルボキシル基およびアルデヒド基が挙げられる。一態様では、架橋剤はジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドなどであり得る。別の態様では、架橋剤はカルボジイミド、例えば、（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）などであり得る。他の態様では、架橋剤は、酸化デキストラン、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［アルファ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物、ビス−［ベータ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、ビス−［スルホスクシンイミジル］スベラート、ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオナート、ジスクシンイミジルスベラートおよび１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、二官能性オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）であり得る。
【０１１５】
一態様では、糖が架橋剤であり、この場合、糖は羊膜および／またはその他の成分などの胎盤成分中に存在するタンパク質と反応して共有結合を形成することができる。例えば、糖は、メイラード反応によりタンパク質と反応することができる。メイラード反応は、糖の還元によってタンパク質のアミノ基が非酵素的にグリコシル化されることから始まり、その結果、共有結合が形成される。架橋剤として有用な糖の例としては、限定されないが、Ｄ−リボース、グリセロース、アルトロース、タロース、エルテオース（ｅｒｔｈｅｏｓｅ）、グルコース、リキソース、マンノース、キシロース、グロース、アラビノース、イドース、アロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セリビオース（ｃｅｌｌｉｂｉｏｓｅ）、ゲンチビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトースまたはその任意の組合せが挙げられる。
【０１１６】
本明細書に記載される美容組成物は、局所処置、全身処置のいずれを望むかに応じて、また処置の対象となる領域に応じて、多数の方法で投与することができる。一態様では、投与は注射によるものであり得る。他の態様では、成形脱水胎盤組成物を対象の体内に適用されるように製剤化し得る。他の態様では、成形脱水胎盤組成物を局所に、真皮下に、または皮下に適用し得る。
【０１１７】
ＩＩＩ．成形微粉化羊膜を含む組成物の用途
本明細書に記載される成形脱水羊膜を含む組成物には多数の美容用途がある。本明細書に記載される成形微粉化胎盤組成物の粒子サイズ、密度、強度、崩壊速度、および他の特性は、意図する用途に基づいて変更することができる。例えば、崩壊時間を長くし、かつ／または因子の放出時間を長くする必要がある応用には、粒子サイズを小さくし、かつ／または密度を高くした成形微粉化胎盤組成物を用いることができる。逆に、崩壊時間を短くし、かつ／または因子放出を迅速にする必要がある応用には、粒子サイズを大きくし、かつ／または密度を低くした成形微粉化胎盤組成物を用いることができる。
【０１１８】
本明細書に記載される成形胎盤組成物は、限定されないが、軟部組織のリモデリング、充填または再建、しわ、皮線および瘢痕、熱傷、潰瘍、軟部組織増大、顔面脂肪萎縮症の処置を含めた様々な美容的処置に鎮痛剤および抗炎症剤として有用である。ここに挙げた可能な用途は網羅的なものではないことが意図され、ほかにも多数の実施形態が存在する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、組成物が注射可能な性状であるため、針、シリンジ、注射器、カニューレ、套管針または他の任意の適切なアプリケーターによる非侵襲的な経皮送達が可能になる。小径針（例えば、２７Ｇ）を使用することが可能であり、このことは、顔面のしわおよびひだ、睡眠時無呼吸、鼻唇溝、顔面脂肪消失（脂肪萎縮症）、声帯不全、頭蓋顔面増大の処置およびＸ線撮影の組織標識の際に価値のある特性である。
【０１２０】
美容応用
ヒトの皮膚は表皮と真皮とからなる複合材料である。皮膚の表皮の最外層は角質層である。角質層の下が表皮である。表皮の下には真皮乳頭と呼ばれる真皮の最外層があり、さらにその下には網状真皮および皮下層がある。
【０１２１】
皮膚には保護、吸収、色素形成、知覚、分泌、排泄、体温調節および免疫過程の調節を含めた多数の機能がある。これらの皮膚機能は、例えば加齢、過剰な日光曝露、喫煙、外傷および／または環境因子によって負の影響を受け、これが皮膚の構造を変化させ、皮膚のバリア機能の障害および表皮細胞のターンオーバー低下を招き得る。コラーゲンおよびエラスチンが損傷を受けると、適切に収縮する能力が失われ、皮膚にしわが発生するほか、皮膚の表面が粗くなる。しわは通常、皮膚の加齢に関連する皮膚の変形であり、日光に曝露された皮膚に発生しやすい。加齢が進むと、顔面ならびに身体の他の領域に、重力、日光曝露のほか、例えば、笑ったり、咀嚼したり、目を細めたりするなどの長年にわたる顔面筋の運動による影響が現れ始める。皮膚が老化する、または不健康な状態になると、しわ、たるみおよび皮膚線条が現れ、皮膚のきめが粗くなり、ビタミンＤ合成能が低下する。このほか、老化した皮膚は薄くなり、コラーゲン、エラスチンおよびグリコサミノグリカンの変化により真皮表皮境界面が平坦になる。老化した皮膚は通常、厚さ、弾性および下層組織との接着性の低下によって特徴付けることができる。
【０１２２】
加齢、環境因子、日光への曝露およびその他の要素、例えば体重減少、出産、疾患（例えば、挫瘡および癌）および外科手術などにより皮膚が損傷を受けると、皮膚輪郭の欠陥および他の皮膚の異常が生じることが多い。認識される皮膚輪郭の欠陥およびその他の認識される皮膚の異常を直すため、人々は、フェイスリフトおよびスキンタックなどの美容外科手術に頼ることが多い。しかし、美容外科手術は一般に、費用が高く、侵襲性であり、施術領域に瘢痕が残る可能性があるほか、正常な生物学的および生理学的機能に影響を及ぼすことがある。このため、依然として代替療法が必要とされている。
【０１２３】
本発明は、患者の皮膚増大の方法を提供する。一実施形態では、患者の皮膚増大の方法は、増大を必要とすると認識された患者の顔面または身体の領域に本発明の成形胎盤組成物を注入するか、別の方法で投与することを含み、患者の顔面または身体の領域を成形胎盤組成物の投与前の領域に比して増大させる。本発明の文脈における「皮膚増大」は、外部からの作用または効果によって患者（例えば、ヒト）の皮膚およびそれに関連する領域の自然な状態に生じる何らかの変化を指す。皮膚増大によって変化し得る非限定的な皮膚の領域としては、表皮、真皮、皮下層、脂肪、立毛筋、毛幹、汗孔、皮脂腺またはその組合せが挙げられる。
【０１２４】
理論に束縛されるものではないが、本発明の成形脱水胎盤組成物は、短期間、長期間のいずれでも増大に寄与すると考えられる。換言すれば、増大の対象となる領域に組成物を投与すれば、成形組成物が存在することによって短期間の増大がもたらされ得る。さらに、胎盤成分がその領域に幹細胞を動員して定着させ、長期間の増大をもたらし得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目尻のしわ、鼻唇溝（「笑線」）、マリオネット線、眉間のしわ（「眉間しわ線」）またはその組合せを治療するために、患者に本発明の成形胎盤組成物を注入するか、別の方法で投与することを含む。本発明の成形胎盤組成物は、線、皮線、および他のしわを膨らませ、より滑らかで、より若々しい外見を取り戻すのに役立ち得る。本発明の成形胎盤組成物は、単独で使用しても、１つもしくは複数のほかの注入可能な組成物、レーザー処置などのリサーフェシング技法またはフェイスリフトなどの修正技法と併用してもよい。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の成形胎盤組成物を用いてほかにも、顔面の皮線のある領域またはくぼんだ領域を増大させ、かつ／あるいは患者の顔面および身体の領域の豊満さを付加または増大し得る。増大を必要とする顔面および／または身体の領域は、例えば、加齢、外傷、疾患、病気、環境因子、体重減少、出産またはその組合せなどの結果であり得る。本発明の成形胎盤組成物を注入するか、別の方法で投与し得る患者の顔面または身体の領域の非限定的な例としては、目の下、こめかみ、頬上部、頬下部、顎、口唇、下顎輪郭、額、眉間、眉尻、頬、上唇と鼻の間の領域、鼻（鼻梁など）、首、臀部、腰、胸骨、または顔面もしくは身体の他の任意の部分またはその組合せが挙げられる。
【０１２７】
さらなる態様では、本発明の成形胎盤組成物を用いて、特に限定されないが、しわ、くぼみ、または他の皮線（例えば、眉間のしわ、額のしわ、目尻のしわ、マリオネット線）、皮膚線条、内部および外部瘢痕（傷害、創傷、事故、咬創または外科手術による瘢痕など）またはその組合せを含めた皮膚の欠陥を処置し得る。いくつかの実施形態では、本発明の成形胎盤組成物を用いて、例えば、目の「くぼみ」、くまの原因となる目立つ血管および目立つ瞼頬溝を修正し得る。本発明の成形胎盤組成物はほかにも、例えば、下眼瞼形成術による眼窩脂肪体の積極的除去後の眼窩の修正または頬脂肪の積極的除去もしくは自然消失後の頬下部修正に使用し得る。一実施形態では、本発明の成形胎盤組成物を用いて、鼻形成術、皮膚移植、または他の外科手術による不整の結果、例えば脂肪吸引術によるくぼみなどを修正し得る。他の実施形態では、本発明の成形胎盤組成物を顔面または身体の瘢痕（例えば、創傷、水疱または挫瘡瘢痕）の修正に使用し得る。いくつかの実施形態では、顔面再形成のために本発明の成形胎盤組成物を患者に注入するか、別の方法で投与する。本発明の方法を用いる顔面再形成は、頸部が弛緩している患者、またはやつれた顔、長い顔、下膨れの顔、非対称の顔、丸ぽちゃの顔の患者、あるいは局所的に脂肪委縮のある顔、中顔面後退、眼のくぼみおよび／またはその任意の組合せを有する患者で達成し得る。
【０１２８】
一実施形態では、本発明の方法は、認識される皮膚の欠陥、例えば癌または挫瘡などの疾患または病気を原因とする皮膚の欠陥などを治療するために、本発明の成形胎盤組成物を患者に注入するか、別の方法で投与することを含む。欠陥は、疾患または病気のよる直接的結果であっても間接的結果であってもよい。例えば、皮膚の欠陥は、疾患または病気を原因とするものであっても、疾患または病気の治療を原因とするものであってもよい。
【０１２９】
本願では以下の略記を用いる：
略記    定義
ｃｍ    センチメートル
℃      セ氏度
ｇ／ｃｍ３       グラム／立方センチメートル
ＭＰａ  メガパスカル
μｍ    マイクロメートル
ｍｇ    ミリグラム
ｍｌ    ミリリットル
ｍｍ    ミリメートル
ｍｍ／分        ミリメートル／分
ｍｍ／秒        ミリメートル／秒
Ｍ      モル
Ｎ      ニュートン
ｒｐｍ  回転／分
ＮａＣｌ        塩化ナトリウム
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、本明細書に記載および特許請求される化合物、組成物および方法を作製し評価する方法を当業者に完全に開示し説明するために記載され、単に例示を意図するものであって、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関しては正確を期するよう努めたが、いくらかの誤差および偏差を考慮に入れるべきである。特に明示されない限り、一部とは重量部のことであり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近の圧力である。反応条件、例えば、記載される工程から得られる生成物の純度および収率を最適にするために用い得る成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、および他の反応の範囲および条件には、多数の変動および組合せが存在する。このような工程条件の最適化に必要とされるのは、妥当で日常的な実験のみである。
【０１３１】
実施例１．微粉化組成物の調製
この実施例で微粉化粒子の作製に使用する羊膜／絨毛膜組織移植片を、米国特許出願公開第２００８／００４６０９５号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている工程により作製した。５０ｍＬバイアルに組織移植片（４ｃｍ×３ｃｍ）と９．５ｍｍの粉砕鋼球２個を入れた後、バイアルを密閉した。バイアルを凍結ブロックに入れ、凍結ブロックを凍結棚に入れた。凍結棚を液体窒素の入ったジュワー瓶に入れた。組織試料を最大３０〜６０分間、気相冷却した。ジュワー瓶から凍結棚を取り出し、凍結棚から凍結ブロックを取り出した。凍結ブロックを粉砕機（ＳＰＥＸ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０１０）の中に入れ、１，５００ｒｐｍ、２０分に設定した。２０分が経過した後、組織を検査して微粉化を確認した。必要であれば、組織をさらに３０〜６０分間、再びジュワー瓶に入れ、粉砕機に移してさらに２０分間、十分に微粉化した。組織が十分に微粉化された後、一連の米国標準ＡＳＴＭふるいを用いて分級した。ふるいは次のような順序で設置した：３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍおよび１２５μｍ。微粉化した材料を５０ｍＬバイアルから３５５μｍのふるいに移した。微粉化粒子を十分に分離するため、各ふるいを個別に振動させた。ふるいを用いて微粉化粒子を効率的に分離した後、粒子サイズが３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍおよび１２５μｍの微粉化粒子を別々のバイアルに収集した。
【０１３２】
実施例２．微粉化粒子を含む成形胎盤組織組成物の調製
雌型と雄型を有する三日月形の成形型を成形脱水胎盤組織組成物の調製に用いた。実施例１で調製した微粉化羊膜／絨毛膜粒子１０ｍｇを雌型に入れた。微粒子を含むように雄型を適切な位置に設置した後、成形型に適切な時間の間、適切な圧力をかけ、成形型のサイズおよび形状を有する成形胎盤組織組成物を得た。
【０１３３】
一実施形態では、成形型は非多孔性の成形型であり、脱水胎盤組織の含水量は約２５％重量／重量未満である。別の実施形態では、含水量は２５％重量／重量を上回り、余分な水分を除去するため多孔性の成形型を用いる。あるいは、圧縮時に溶媒が蒸発して組織内に小さい空隙が生じるように、脱水胎盤組織に少量（例えば、１０重量パーセント以下）の生体適合性有機溶媒を添加してもよい。
【０１３４】
実施例３．粒子サイズが成形胎盤組織組成物の特性に及ぼす影響
直径１ｍｍの成形型に微粉化胎盤組織を挿入し、４００Ｎの力を１ｍｍ／秒の速度で加えて圧縮した。おおよその直径が約２５０μｍ超、約７５μｍ〜約１５０μｍおよび約７５μｍ未満の３種類のサイズの微粉化粒子を試験した。破損応力およびヤング率を測定した。圧縮試験は０．５ｍｍ／分の速度で実施した。
【０１３５】
成形微粉化組成物（「プラグ」）を崩壊および分解の速度についてさらに試験した。成形微粉化羊膜プラグを生理食塩水中、３７℃で時間を漸増させてインキュベートした。
【０１３６】
結果：粒子サイズがヤング率および破損応力に及ぼす影響を図２に示す。７５μｍ未満の粒子サイズを有する成形組成物は、一貫して最大の圧縮荷重に最小の歪みで耐えたため、ヤング率が最も大きくなった。大きい粒子サイズで作製したプラグは、小さい粒子サイズで作製したプラグよりも短時間のうちに生理食塩水中で崩壊した。プラグは生理食塩水中、３７℃で少なくとも６週間、形状および形態を維持した。生理食塩水中でインキュベートすると、プラグが膨潤した。生理食塩水中では、１時間後にプラグの長さが２４０％増大するのが観察された。
【０１３７】
実施例４．圧縮力、圧縮速度およびサイクル数が成形胎盤組織組成物の特性に及ぼす影響
微粉化胎盤組織（粒子サイズ約７５μｍ未満）を直径１ｍｍの成形型に挿入し、圧縮した。成形羊膜組成物形成時の圧縮力が及ぼす影響を圧縮速度１ｍｍ／秒で試験した。成形羊膜組成物の形成時に圧縮速度が及ぼす影響を圧縮力４００Ｎで試験した。成形羊膜組成物の形成時に圧縮サイクルの増加が及ぼす影響を圧縮力４００Ｎおよび圧縮速度１ｍｍ／秒で試験した。破損応力およびヤング率を測定した。圧縮試験は０．５ｍｍ／分の速度で実施した。
【０１３８】
成形微粉化組成物を崩壊および分解の速度についてさらに試験した。成形微粉化羊膜プラグを生理食塩水中、３７℃で時間を漸増させてインキュベートした。
【０１３９】
結果：圧縮力がヤング率および破損応力に及ぼす影響を図３Ａに示す。４００Ｎで圧縮したプラグが最大の圧縮荷重に最小の歪みで耐えたため、ヤング率が最も大きくなった。異なる圧縮力で作製したプラグには、崩壊プロファイルの有意な差はみられなかった。しかし、機械で圧縮したプラグの方が手作業で圧縮したプラグよりも長い時間、形状が維持された。
【０１４０】
圧縮速度がヤング率および破損応力に及ぼす影響を図３Ｂに示す。０．００８ｍｍ／秒（０．５ｍｍ／分）で圧縮したプラグが最大の圧縮荷重に最小の歪みで耐えたため、ヤング率が最も大きくなった。異なる圧縮速度で作製したプラグには、生理食塩水中での崩壊プロファイルの有意な差はみられなかった。
【０１４１】
圧縮サイクル数がヤング率および破損応力に及ぼす影響を図３Ｃに示す。毎回４００Ｎで２サイクル圧縮したプラグが最も剛性の高い（最もヤング率の大きい）プラグとなった。毎回４００Ｎで３サイクル圧縮したプラグが最も強度の高い（最も破損応力の大きい）プラグとなった。
【０１４２】
実施例５．成形胎盤組織組成物のインサイチュー試験
成形微粉化羊膜プラグをシリンジまたは套管針に挿入し、ブタの肩の筋組織内に注入した。組織を生理食塩水中でインキュベートし、３０分後、３時間後または３日後に切開し調べた。
【０１４３】
結果：各時点で成形微粉化羊膜プラグの形状は維持されていた。３日後、組織内のプラグの長さが最大６０％伸長していた。
【０１４４】
本明細書に記載される化合物、組成物および方法には様々な修正および変形を施すことができる。本明細書を検討し、本明細書に開示される化合物、組成物および方法を実践すれば、本明細書に記載される化合物、組成物および方法のその他の態様が明らかになるであろう。本明細書および実施例は例示的なものとして見なされることが意図される。
【０１４５】
適切な架橋剤および手順の詳細な説明については、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８１５，７４７号に記載されており、上記出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
微粉化胎盤組織の詳細な説明については、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８１５，７８４号および２０１３年８月９日に出願された米国特許出願第１３／９６３，９８４号に記載されており、上記出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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