(57)【要約】本発明は、血管透過性亢進の阻害が必要である動物における動物の血管透過性亢進を阻害する方法を提供する。本方法は、血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を動物に投与することを含む。本方法は、動物の体脂肪量を考慮した有効量のダナゾール化合物を動物に投与することを含む。また、本発明は、動物の内皮細胞の細胞骨格を調節するための方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管透過性亢進の阻害が必要である動物における血管透過性亢進を阻害する方法であって、前記方法は、
ａ．前記動物の体脂肪量を決定するステップと、
ｂ．前記動物の体脂肪量に対応する血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を前記動物に投与するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記決定するステップは前記動物の肥満度指数（ＢＭＩ）を計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ダナゾール化合物は経口で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ダナゾール化合物は、約０．５ｍｇ／ＢＭＩ単位／日〜約１．０ｍｇ／ＢＭＩ単位／日の量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ダナゾール化合物は、１日２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ダナゾール化合物の量は、前記動物のＢＭＩが２６未満である場合、約２ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ダナゾール化合物の量は、前記動物のＢＭＩが２６未満である場合、約５ｍｇ／日である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ダナゾール化合物の量は、前記動物のＢＭＩが２６〜３５である場合、約２ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ダナゾール化合物の量は、前記動物のＢＭＩが２６〜３５である場合、約１０ｍｇ／日である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ダナゾール化合物の量は、前記動物のＢＭＩが３５を超える場合、約５ｍｇ／日〜約４５ｍｇ／日である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ダナゾール化合物の量は、前記動物のＢＭＩが３５を超える場合、約１５ｍｇ／日である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記動物は、血管透過性亢進により媒介される疾患又は状態が存在するために前記ダナゾール化合物を必要としている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ダナゾール化合物の投与は、前記疾患又は状態の診断後直ちに開始される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患又は状態は糖尿病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患又は状態はアテローム性動脈硬化である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患又は状態は高血圧である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患又は症状は、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、加齢黄斑変性、脳浮腫、脈絡膜浮腫、脈絡膜炎、冠状動脈微小血管疾患、大脳微小血管疾患、イールズ病疾患、傷害によって引き起こされる浮腫、高血圧に関連する浮腫、糸球体血管漏出、出血性ショック、アーヴァインガス症候群、虚血、黄斑浮腫、腎炎、腎症、腎炎性水腫、ネフローゼ症候群、神経障害、浮腫による臓器不全、子癇前症、肺水腫、肺高血圧症、腎不全、網膜浮腫、網膜出血、網膜静脈閉塞、網膜炎、網膜症、無症候性脳梗塞、全身性炎症反応症候群、移植糸球体症、ブドウ膜炎、血管漏出症候群、硝子体出血、又はフォンヒッペルリンダウ病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患又は状態は黄斑浮腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患又は状態は神経障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は状態は網膜症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患又は状態は糖尿病の血管合併症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記血管合併症は、浮腫、低密度リポタンパク質の内皮下空間内蓄積、加速性アテローム性動脈硬化症、脳血管壁の促進老化、心筋浮腫、心筋線維症、拡張機能障害、糖尿病性心筋症、糖尿病母体の胎児の肺発育遅延、１つ又は複数の肺生理学的パラメータの変化、易感染性亢進、腸間膜の血管過生、糖尿病性神経障害、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、並びに皮膚の紅化、変色、乾燥、及び潰瘍である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血管合併症は浮腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記血管合併症は糖尿病性心筋症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記血管合併症は糖尿病性神経障害である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記血管合併症は糖尿病性黄斑浮腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記血管合併症は糖尿病性網膜症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記糖尿病性網膜症は非増殖性糖尿病性網膜症である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血管合併症は糖尿病性神経障害である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物は、血管透過性亢進により媒介される疾患又は状態の１つ又は複数の早期兆候又は発症素因があるために前記ダナゾール化合物を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患又は状態は、糖尿病、高血圧、又はアテローム性動脈硬化である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管透過性亢進は、脳、横隔膜、十二指腸筋肉組織、脂肪、心臓、腎臓、大型血管、肺、腸間膜、神経、網膜、骨格筋、皮膚、又は精巣に、或いはそれらの付近に見出される連続内皮の血管透過性亢進である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記連続内皮は、脳、心臓、肺、神経、又は網膜に、或いはそれらの付近に見出される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記血管透過性亢進は、腎臓、膵臓、副腎、内分泌腺、又は腸に、或いはそれらの付近に見出される有窓内皮の血管透過性亢進である，請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記有窓内皮は腎臓に見出される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ダナゾール化合物はダナゾールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ダナゾール化合物は、徐放性製剤中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記徐放性製剤は、リポソーム及びポリサッカライドからなる群から選択される成分を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記動物はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
血管透過性亢進の阻害が必要である動物における血管透過性亢進を阻害するための方法であって、前記方法は、血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を前記動物に投与することを含み、前記量は前記動物の体脂肪量に対応する方法。
【請求項４１】
動物の内皮細胞の細胞骨格を調節するための方法であって、前記方法は、
ａ．前記動物の体重を決定するステップと、
ｂ．前記動物の体重に対応する血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を前記動物に投与するステップと、を含む方法。
【請求項４２】
前記決定するステップは、前記動物の肥満度指数（ＢＭＩ）を計算することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞骨格の調節は、アクチンストレスファイバー形成の阻害を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞骨格の調節は、皮層アクチン環の形成を引き起こすか、増加させるか、又は長期化させることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞骨格の調節は、ＲｈｏＡの阻害を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記動物はヒトである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管透過性亢進並びに血管透過性亢進に起因する浮腫及び他の有害作用を阻害するための方法に関する。また、本発明は、内皮細胞の細胞骨格を調節するための方法に関する。本発明の方法は、ダナゾール化合物を、動物の体脂肪量を考慮して動物に投与することを含む。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮は、あらゆる血管の内側を内張りしている。血管内皮は、血液と組織及び器官とのインターフェースとしての役割を果たしている。内皮は、血液流動区画の完全性を維持するが、水、イオン、小分子、巨大分子、及び細胞を制御された様式で通過させる半透過性障壁を形成する。このプロセスの調節異常は、下層組織への血管漏出をもたらす。流体が組織へと漏出すると浮腫が引き起こされ、様々な疾患において重篤で生命にかかわる結果となる場合がある。したがって、好ましくはその最も初期の段階で浮腫を低減させ、内皮障壁を生理的状態へと回復させる方法を有することは非常に望ましいだろう。
【０００３】
内皮は、血液から組織実質への分子交換を制御する重要なゲートキーパーである。内皮は、主に、血液が運ぶ分子に対する特定の血管床の透過性を制御する。内皮細胞障壁の透過性及び選択性は、様々な血管床の微少血管構造の内側を覆う内皮の構造及びタイプに強く依存する。様々な器官の微小血管床の内側を覆う内皮細胞は、３つの一次形態のカテゴリー：類洞内皮、有窓内皮、及び連続内皮に分類することができる構造的差異を示す。
【０００４】
類洞内皮（「不連続内皮」とも呼ばれる）は、大きな細胞間間隙及び細胞内間隙を有しているが、基底膜を有しておらず、分子が、毛細管腔から組織及び組織から毛細管腔へと最小限の制限しか受けずに移動することを可能にする。類洞内皮は、肝臓、脾臓、及び骨髄に見出される。
【０００５】
有窓内皮は、６０〜８０ｎｍの直径を有する窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）と呼ばれる、多数の円形経細胞開口部が存在することを特徴とする。有窓内皮は、腎臓（糸球体、尿細管周囲毛細血管、及び上行直細血管）、膵臓、副腎、内分泌腺、及び腸を含む、小分子の迅速な交換を必要とする組織及び器官に見出される。窓は、成熟した健康な糸球体にあるものを除いて、薄い隔膜で覆われている。非特許文献１を参照されたい。
【０００６】
連続内皮は、窓又は大型間隙を含んでいない。その代わり、連続内皮は、途切れない内皮細胞単層を特徴とする。体内のほとんどの内皮は、連続内皮であり、連続内皮は、脳（血液脳関門）、横隔膜、十二指腸筋肉組織、脂肪、心臓、腎臓の幾つかの区域（乳頭微少血管構造、下行直細血管）、大型血管、肺、腸間膜、神経、網膜（血液網膜関門）、骨格筋、精巣、並びに体内の他の組織及び器官に又はその周囲に見出される。
【０００７】
連続内皮での内皮輸送は、一般的な意味で、傍細胞経路及び経細胞経路により生じると考えることができる。傍細胞経路は、内皮間接合部（ＩＥＪ）による内皮細胞間の経路である。非撹乱連続内皮では、水、イオン、及び小分子は、拡散及び対流により傍細胞的に輸送される。また、かなりの量の水（最大４０％）が、アクアポリンと呼ばれる水輸送膜チャネルを介して経細胞的に内皮細胞障壁を越える。様々な刺激により、ＩＥＪの組織が乱される場合があり、それにより内皮障壁の間隔が開口する。これらの細胞間間隙が形成されると、流体、イオン、巨大分子（例えば、タンパク質）、及び他の血漿成分は、内皮細胞間を無制限に通過することができる。この傍細胞性透過性亢進は、結果的に組織及び器官に損傷をもたらす浮腫及び他の有害作用を生じさせる。
【０００８】
経細胞経路は、アルブミン及び他の血漿タンパク質等の巨大分子の内皮細胞を越える能動輸送に関与しており、このプロセスは「トランスサイトーシス」と呼ばれる。巨大分子の輸送は、カベオラと呼ばれる小胞で生じる。連続内皮はほとんど全て、カベオラをほとんど有していない脳及び精巣にある連続内皮を除いて、カベオラを多く有している。トランスサイトーシスは、カベオラが連続的に出芽し、原形質膜から分裂して、細胞外へと移行し、その後、反対側の原形質膜と結合及び融合し、そこでカベオラが、その内容物をエキソサイトーシスにより間質へと放出することを含む多段階プロセスである。トランスサイトーシスは、選択的であり、正常な生理学的条件下では厳密に制御されている。
【０００９】
経細胞経路の根本的重要性の認識は、ますます増大している。血漿タンパク質、特に血漿タンパク質の６５％に相当するアルブミンのトランスサイトーシスは、経血管膨張圧勾配を制御することができるため、特に興味深い。したがって、当然のとのながら、アルブミン及び他の血漿タンパク質のトランスサイトーシスが、基底レベルを超えると、それらの組織タンパク濃度が増加し、次いでは、内皮障壁を越えて水が移動することになり、それにより浮腫が生じることになるだろう。
【００１０】
また、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、トランスサイトーシスにより内皮細胞を越えて輸送される。高脂血症では、ＬＤＬのトランスサイトーシスの著しい増加が、アテローム発生の初期事象として検出されている。ＬＤＬは、内皮下空間に蓄積し、膨張した基底層及び細胞外マトリックス内に捕捉される。高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍａ）において内皮下にリポタンパク質が蓄積すると、その後、粥状斑形成をもたらす事象のカスケードが起こる。進行アテローム性動脈硬化病変には、ＩＥＪの開口、並びにＬＤＬ及びアルブミンの大規模で非制御的な通過が伴う場合があることが報告されている。
【００１１】
血管合併症は、糖尿病の典型的特徴である。この疾患は、大血管のレベルでは、アテローム性動脈硬化プロセスの亢進として現れると考えられる。微小血管症に関しては、網膜、腎糸球体、及び神経の微小血管構造の変質は、非常に多数の臨床合併症を引き起こすが、糖尿病が、腸間膜、皮膚、骨格筋、心臓、脳、及び肺等の他の器官の微小血管構造にも影響を及ぼし、更なる臨床合併症を引き起こすことを示す研究の例は絶え間なく増え続けている。これらの血管床の全てでは、血管透過性の変化は、糖尿病性内皮細胞機能不全の典型的特徴を表わすと考えられる。
【００１２】
連続内皮では、糖尿病の初期段階における血漿巨大分子の毛細血管透過性亢進は、ＩＥＪの不安定化によってではなく、経内皮小胞輸送の増大（つまり、トランスサイトーシスの増加）により説明される。加えて、脳の内皮細胞を含む、糖尿病患者の内皮細胞は、正常と比較して数が増加したカベオラを含有していることが報告されており、糖化タンパク質、特に糖化アルブミンは、内皮細胞により吸収され、それらの天然形態よりもかなり早い速度でトランスサイトーシスされる。更に、巨大分子のトランスサイトーシスの増加は、糖尿病の初期段階を過ぎても継続するプロセスであり、治療しないでおくと、この疾患の経過にわたって、糖尿病性組織及び器官における浮腫の原因となると考えられる。この浮腫は、次いで、組織及び器官の損傷に結びつく。同様な巨大分子の経細胞輸送の増加は、高血圧でも報告されている。
【００１３】
また、傍細胞性透過性亢進は、糖尿病及び糖尿病の血管合併症の要因である。傍細胞経路のＩＥＪには、接着接合（ＡＪ）及び密着接合（ＴＪ）が含まれる。糖尿病は、ＡＪ及びＴＪの両方におけるあるタンパク質の含有量、リン酸化、及び局在化を変化させ、それにより、内皮障壁透過性の増加に寄与する。
【００１４】
先述の考察を支持するために、及び更に詳しい情報については、以下の文献を参照されたい：非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５、非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９。
【００１５】
有窓内皮での内皮輸送も、トランスサイトーシス及び傍細胞経路により生じる。加えて、内皮輸送は、窓により生じる。有窓内皮は、窓が存在するため、水及び小さな親水性溶質に対して著しく高い透過性を示す。
【００１６】
窓は、隔膜により覆われている場合もあり、又は覆われていない場合もある。隔膜化窓を有する内皮の位置には、内分泌組織（例えば、膵島及び副腎皮質）、胃腸粘膜、及び腎尿細管周囲毛細血管が含まれる。隔膜化窓を有する有窓内皮の血漿タンパク質透過性は、連続内皮の血漿タンパク質透過性を超えることはない。
【００１７】
非隔膜化窓を有する内皮の位置には、腎臓の糸球体が含まれる。糸球体有窓内皮は、窓内に伸長する糖被（いわゆる「シーブプラグ（ｓｅｉｖｅ  ｐｌｕｇ）」）及びより弱く結合する糖タンパク質の内皮細胞表層により覆われている。機能的選択透過性研究の数学的分析により、窓に存在するものを含む糸球体内皮細胞糖被及びその結合表層は、血中の血漿タンパク質の最大９５％の保持を説明すると結論付けられている。
【００１８】
糸球体内皮の窓の喪失は、糖尿病性腎症、移植糸球体症、子癇前症、糖尿病、腎不全、シクロスポリン腎症、血清病腎炎、及びＴｈｙ−１腎炎を含む、幾つかの疾患におけるタンパク尿症に関連することが見出されている。ストレスファイバーのアクチン再編成、及び特に解重合は、窓の形成及び維持に重要であることが見出されている。
【００１９】
有窓内皮に関する考察の裏付けとして、及び更なる情報については、以下の文献を参照されたい：非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６。
【００２０】
類洞内皮での内皮輸送は、トランスサイトーシスにより、並びに細胞間間隔（内皮間スリット）及び細胞内間隔（窓）により生じる。アクチンフィラメント妨害薬で類洞内皮を処理すると、間隙数のかなりの迅速な増加を誘導することができ、アクチン細胞骨格が覆っている内皮層の多孔度を制御していることが示される。他の細胞骨格変更薬が、窓の直径を変化させることが報告されている。したがって、窓に関連する細胞骨格は、恐らくは、類洞内皮（ｓｉｎｕｓｏｄｉａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｕｉｕｍ）での内皮ろ過の重要な機能を制御するだろう。肝臓では、閉窓（窓の喪失）は、内皮の透過性の低下を引き起こし、老化、アテローム発生、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、線維症、肝不全、並びに原発性及び転移性肝癌を含む幾つかの疾患及び状態の病因に関連している。上記の裏付けとして、及び更なる情報については、以下の文献を参照されたい：非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５。
【００２１】
糖尿病性網膜症は、最も一般的な糖尿病性眼疾患であり、米国成人の失明の主要原因である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  概況報告書、２００９年、ｗｗｗ．ｎｅｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ／ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．ａｓｐ）。２０００年に、世界保健機構は、米国における糖尿病の罹患者数が１７，７０２，０００人であるとする報告を発表した。また、この報告書には、罹患者数は、２０３０年には３０，３１２，０００人に上昇すると予想されると記載されていた（Ｗｉｌｄ、２００４年）。糖尿病性網膜症は、微小動脈瘤、網膜内出血及び滲出、血管の捻れ、網膜内微小血管異常（ＩＲＭＡ）、及び前網膜新血管形成を含む、網膜血管構造の進行性及び累積性の変化である（非特許文献３６）。前網膜新血管形成は、硝子体出血、網膜剥離、線維症、及び恒久的視力喪失に結び付く場合がある。また、糖尿病性網膜症は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を含み、これは、中心視に関与するか又は中心視を脅かす流体の血管外漏出である。糖尿病のほとんどの視力喪失は、ＤＭＥによるものである（非特許文献３７）。血管透過性増加及び浮腫は、このプロセスの初期段階で生じる。血管透過性及び浮腫を効果的に治療すると、網膜組織が恒久的に損傷する前に、これらの糖尿病合併症を改善又は遅延させることができる（非特許文献３８、非特許文献３９、及び非特許文献４０）。
【００２２】
臨床的に重要な糖尿病性黄斑浮腫（ＣＳＭＥ）の一次治療は、網膜レーザ光凝固及び硝子体内ラニビズマブを含む。漏出の区域に対する網膜レーザ光凝固は、中程度の視力喪失を５０％（３０％から１５％まで）低減し、疾患の進行を遅延することができる。しかしながら、レーザ療法は、幾つかの場合では効能が欠如し、施術が不快であり、治療を繰り返す必要があり、経時的に増加する場合がある中心窩熱傷及び瘢痕を含む切除性網膜損傷のリスクがあることにより制限を受ける（非特許文献４１、非特許文献４２）。硝子体内ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））は、２０１２年７月３０日にＤＭＥ治療用に認可された。この抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）療法、眼への注射は、有効であることが示されたが、幾つかの理由：免疫反応のリスク、緑内障、局所眼刺激、又は完全な視力喪失に結び付く場合がある眼内炎（ｅｎｄｏｐｔｈａｌｍｉｔｉｓ）の発症のため、投与することができない患者がある。加えて、毎月繰り返される施術の治療コストが高いため、多くの患者にとって費用の負担が難しい。
【００２３】
糖尿病性網膜症、特にＤＭＥの有効な経口薬は、血糖、高血圧、及び血中脂質の制御等の、一般処置以外には存在しない。糖尿病性網膜症及びＤＭＥを効果的に治療することができる新規薬に対する、重要ではあるが満たされていない臨床上の必要性が存在する（非特許文献４３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１９巻：１４６３〜１４７１頁（２００８年）
【非特許文献２】Ｆｒａｎｋら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、３３５巻：４１〜４７頁（２００９年）；
【非特許文献３】Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、３３５巻：２７〜４０頁（２００９年）
【非特許文献４】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｙｓｔ．Ｆｉｂｒｏｓ．、７巻（６号）：５１５〜５１９頁（２００８年）
【非特許文献５】Ｖｉａｚｚｉら、  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．Ｒｅｓ．、３１巻：８７３〜８７９頁（２００８年）
【非特許文献６】Ａｎｔｏｎｅｔｔｉら、第１４章、３４０〜３４２頁、「Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ」（Ｅｌｉａ  Ｊ．Ｄｕｈ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年）
【非特許文献７】Ｆｅｌｉｎｓｋｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０巻：９４９〜９５７頁（２００５年）
【非特許文献８】Ｐａｓｃａｒｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５２巻（１号）：６５〜７６（２００４年）
【非特許文献９】Ｂｏｕｃｈａｒｄら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、４５巻：１０１７〜１０２５頁（２００２年）
【非特許文献１０】Ａｒｓｈｉら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８０巻（８号）：１１７１〜１１８４頁（２０００）
【非特許文献１１】Ｖｉｎｏｒｅｓら、Ｄｏｃｕｍｅｎｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ、９７巻：２１７〜２２８頁（１９９９年）
【非特許文献１２】Ｏｏｍｅｎら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２９巻：１０３５〜１０４０頁（１９９９年）
【非特許文献１３】Ｖｉｎｏｒｅｓら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．、１９４巻：４９７〜５０５頁（１９９８年）
【非特許文献１４】Ａｎｔｏｎｅｔｔｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７巻：１９５３〜１９５９頁（１９９８年）
【非特許文献１５】Ｐｏｐｏｖら、Ａｃｔａ  Ｄｉａｂｅｔｏｌ．、３４巻：２８５〜２９３頁（１９９７年）
【非特許文献１６】Ｙａｍａｊｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７２巻：９４７〜９５７頁（１９９３年）
【非特許文献１７】Ｖｉｎｏｒｅｓら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２５巻：６４８〜６６３頁（１９９３年）
【非特許文献１８】Ｂｅａｌｓら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４５巻：１１〜１９頁（１９９３）
【非特許文献１９】Ｃａｌｄｗｅｌｌら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．、３３巻（５号）：１６１０〜１６１９（１９９２年）
【非特許文献２０】Ｓａｔｃｈｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２９６巻：Ｆ９４７〜Ｆ９５６頁（２００９年）
【非特許文献２１】Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１８巻：３３１〜３３５頁（２００９年）
【非特許文献２２】Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１９巻：１４６３〜１４７１頁（２００８年）
【非特許文献２３】Ｂａｌｌｅｒｍａｎｎ、Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６巻：１９〜２５頁（２００７年）
【非特許文献２４】Ｔｏｙｏｄａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５６巻：２１５５〜２１６０頁（２００７年）
【非特許文献２５】Ｓｔａｎ「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  Ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ」６７９〜６８８頁、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｉｒｄ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２００７年）
【非特許文献２６】Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ及びＡｎｔｏｈｅ、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ」、４２〜６９頁、Ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  Ｉ  （Ｍｏｎｃａｄａ及びＨｉｇｇｓ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００６年）
【非特許文献２７】Ｙｏｋｏｍｏｒｉ、Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、４１巻：１〜４頁（２００８年）
【非特許文献２８】Ｓｔａｎ、「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  Ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ」、６７９〜６８８頁、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｉｒｄ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２００７年）
【非特許文献２９】ＤｅＬｅｖｅ、「Ｔｈｅ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ」、１２２６〜１２３８頁、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｉｒｄ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２００７年）
【非特許文献３０】Ｐｒｉｅｓ及びＫｕｅｂｌｅｒ、「Ｎｏｒｍａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ」、１〜４０頁、Ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  Ｉ（Ｍｏｎｃａｄａ及びＨｉｇｇｓ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００６年）
【非特許文献３１】Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ及びＡｎｔｏｈｅ、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ」、４２〜６９頁、Ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  Ｉ（Ｍｏｎｃａｄａ及びＨｉｇｇｓ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００６年）
【非特許文献３２】Ｂｒａｅｔ及びＷｉｓｓｅ、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１巻：１〜１７頁（２００２年）；
【非特許文献３３】Ｋａｎａｉら、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ、２４４巻：１７５〜１８１頁（１９９６）
【非特許文献３４】Ｋｅｍｐｋａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１７６巻：３８〜４８頁（１９８８年）
【非特許文献３５】Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．、１７８巻：２４１〜２４９頁（１９８７年）
【非特許文献３６】Ｂｏｙｄら、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ２００８年、Ｓ１３４〜１３９頁
【非特許文献３７】Ｍｏｓｓら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １９９８年；１０５巻：９９８〜１００３頁
【非特許文献３８】Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２００８年；８巻：２６３〜２６９頁
【非特許文献３９】Ｓａｎｄｅｒら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００７年；４８巻：３９８３〜３９８７頁
【非特許文献４０】Ａｎｔｏｎｅｔｔｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００６年；５５巻：２４０１〜２４１１頁
【非特許文献４１】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ（登録商標）、Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ、２００８年
【非特許文献４２】Ｍａｅｓｈｉｍａら、Ｒｅｔｉｎａ．２００４年；２４巻：５０７〜５１１頁
【非特許文献４３】Ｒｙａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ  Ｐｈａｒｍ．２００７年；６４巻（１７Ｓｕｐｐｌ，１２）：Ｓ１５〜２１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の１つの実施形態は、血管透過性亢進の阻害が必要である動物における血管透過性亢進を阻害するための方法であって、動物の体脂肪量を決定すること、及び動物の体脂肪量に対応する血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を動物に投与することを含む方法に関する。本発明の更に別の実施形態は、血管透過性亢進の阻害が必要である動物における血管透過性亢進を阻害するための方法であって、血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を動物に投与することを含み、その量が、動物の体脂肪量に対応する方法に関する。
【００２６】
１つの態様では、決定ステップは、動物の肥満度指数（ＢＭＩ）を計算することを含む。
別の態様では、ダナゾール化合物は、経口で投与することができる。更に別の態様では、ダナゾール化合物は、約０．５ｍｇ／ＢＭＩ単位／日〜約１．０ｍｇ／ＢＭＩ単位／日の量で投与することができる。更に別の態様では、ダナゾール化合物は、１日２回投与することができる。更に別の態様では、ダナゾール化合物の量は、動物のＢＭＩが２６未満である場合、約２ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日である。更に別の態様では、ダナゾール化合物の量は、動物のＢＭＩが２６未満である場合、約５ｍｇ／日である。別の態様では、ダナゾール化合物の量は、動物のＢＭＩが２６〜３５である場合、約２ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日である。１つの態様では、ダナゾール化合物の量は、動物のＢＭＩが２６〜３５である場合、約１０ｍｇ／日である。更に別の態様では、ダナゾール化合物の量は、動物のＢＭＩが３５を超える場合、約５ｍｇ／日〜４５ｍｇ／日である。更に別の態様では、ダナゾール化合物の量は、動物のＢＭＩが３５を超える場合、約１５ｍｇ／日である。
【００２７】
他の態様では、動物は、血管透過性亢進による媒介される疾患又は状態が存在するため、ダナゾール化合物を必要としている。ダナゾール化合物の投与は、疾患又は状態の診断後直ちに開始することができる。種々の態様では、疾患又は症状は、以下のものであってもよい：糖尿病、アテローム性動脈硬化症、高血圧、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、加齢黄斑変性、脳浮腫、脈絡膜浮腫、脈絡膜炎、冠状動脈微小血管疾患、大脳微小血管疾患、イールズ病（Ｅａｌｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、傷害によって引き起こされる浮腫、高血圧に関連する浮腫、糸球体血管漏出、出血性ショック、アーヴァインガス症候群（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇａｓｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、虚血、黄斑浮腫、腎炎、腎症、腎炎性水腫、ネフローゼ症候群、神経障害、浮腫による臓器不全、子癇前症、肺水腫、肺高血圧症、腎不全、網膜浮腫、網膜出血、網膜静脈閉塞、網膜炎、網膜症、無症候性脳梗塞、全身性炎症反応症候群、移植糸球体症、ブドウ膜炎、血管漏出症候群、硝子体出血、又はフォンヒッペル−リンダウ病。好ましい態様では、疾患又は状態は、黄斑浮腫、神経障害、網膜症、又は糖尿病の血管合併症であり得る。
【００２８】
血管合併症は、以下のものであってもよい：浮腫、低密度リポタンパク質の内皮下空間内蓄積、加速性アテローム性動脈硬化症、脳血管壁の促進老化、心筋浮腫、心筋線維症、拡張機能障害、糖尿病性心筋症、糖尿病母体の胎児の肺発育遅延、１つ又は複数の肺生理学的パラメータの変化、易感染性亢進、腸間膜の血管過生、糖尿病性神経障害、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、並びに皮膚の紅化、変色、乾燥、及び潰瘍。好ましい態様では、血管合併症は、浮腫、糖尿病性心筋症、糖尿病性神経障害、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、又は糖尿病性腎症であってもよい。
【００２９】
種々の態様では、動物は、血管透過性亢進により媒介される疾患又は状態の１つ又は複数の初期兆候又は発症素因があるため、ダナゾール化合物を必要としている。１つの態様では、疾患又は状態は、糖尿病、高血圧、又はアテローム性動脈硬化症である。
【００３０】
１つの態様では、血管透過性亢進は、脳、横隔膜、十二指腸筋肉組織、脂肪、心臓、腎臓、大型血管、肺、腸間膜、神経、網膜、骨格筋、皮膚、又は精巣に又はそれらの付近に見出される連続内皮の血管透過性亢進であってもよい。１つの態様では、連続内皮は、脳、心臓、肺、神経、又は網膜に又はそれらの付近に見出される。
【００３１】
更に別の態様では、血管透過性亢進は、腎臓、膵臓、副腎、内分泌腺、又は腸に又はそれらの付近に見出される有窓内皮の血管透過性亢進である。１つの態様では、有窓内皮は、腎臓に見出される。
【００３２】
本発明のダナゾール化合物は、ダナゾールであってもよい。
本発明のダナゾール化合物は、徐放性製剤中にあってもよい。１つの態様では、徐放性製剤は、リポソーム及びポリサッカライドからなる群から選択される成分を含む。
【００３３】
本発明の動物は、ヒトであってもよい。
本発明の別の実施形態は、動物の内皮細胞の細胞骨格を調節するための方法であって、動物の体重を決定すること、及び動物の体重に対応する血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を動物に投与することを含む方法に関する。１つの態様では、決定ステップは、動物の肥満度指数（ＢＭＩ）を計算することを含む。別の態様では、細胞骨格の調節は、アクチンストレスファイバー形成を阻害することを含む。更に別の態様では、細胞骨格の調節は、皮層アクチン環の形成を引き起こすか、増加させるか、又は長期化させることを含む。更に別の態様では、細胞骨格の調節は、ＲｈｏＡを阻害することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】経内皮細胞単層のＨＲＰ透過性の低下の変化率を示す図である。２４時間処理した細胞のＨＲＰ透過性に対するダナゾール効果の用量応答性。データは、各々が三重反復で実施された３つの別々の実験で算出した平均＋ＳＥＭとして示されている。＊＝媒体に対してＰ値＜．０５。
【図２】ダナゾールのＴＥＥＲ応答：媒体と比べて０．１μｍの経時的効果を示す図である。ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートで増殖させた内皮細胞の単層内外のＴＥＥＲを測定した。より高い抵抗は、より大きな障壁完全性と等しい。
【図３】Ｆ−アクチン皮層再編成及びダナゾールを示す図である。網膜内皮細胞は、ローダミン結合ファロイジンで染色した。細胞は、処理（トロンビン接触は１５分のみ）の３時間後に固定した。処理群：媒体対照（図３Ａ）、０．１μｍダナゾール（図３Ｂ）、１μｍダナゾール（図３Ｃ）、１０μｍダナゾール（図３Ｄ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（図３Ｅ）、ＴＮＦ−α＋０．１μｍダナゾール（図３Ｆ）、０．１Ｕ／ｍＬトロンビン（図３Ｇ）、及びトロンビン＋μｍダナゾール（図３Ｈ）。
【図４】基線ＢＭＩによる、基線からの網膜厚の最小二乗平均変化を示す図である。治療及び基線ＢＭＩ間の相互作用が有意であるため、最小二乗平均及びＰ値は、２５％、５０％、及び７５％ＢＭＩ四分位数で評価される。最終ＡＮＣＯＶＡモデルは、治療効果、基線からの日数、基線網膜厚、及びＢＭＩを含む。Ｐ値により、各活性群をプラセボ群と比較する：多重比較調整には、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）−Ｈｓｕ法を適用する。
【図５】内皮細胞の初期増殖を防止するその能力の尺度として、ＨＵＶＥＣ細胞をダナゾールと共にインキュベーションした後で測定したＯＤレベルを示す図である。
【図６】内皮細胞の管形成を防止するその能力の尺度として、ダナゾールと共にインキュベーションした後に撮影したＨＵＶＥＣ細胞の画像を示す図である。図６Ａは対照を示し、図６Ｂは１μΜダナゾールを示し、図６Ｃは１０μΜダナゾールを示し、図６Ｄは５０μΜダナゾールを示し、図６Ｅは５０μΜのＬＹ２９４００２を示す。
【図７】内皮細胞浸潤を防止するそれらの能力の尺度として、ＨＵＶＥＣ細胞をダナゾールで処理した後で測定した蛍光を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、一般的に、血管透過性亢進の阻害が必要である動物における血管透過性亢進を阻害するための改良方法に関する。本方法は、動物の体脂肪量を決定すること、及び動物の体脂肪量に対応する血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を投与することを含む。血管透過性亢進を治療するためのダナゾール化合物の使用は、ダナゾール化合物が投与されている動物の体脂肪量に感受性のあることが明らかとなっている。本発明は、個体に基づいて用量を調整することにより、ダナゾール化合物を投与して、血管透過性亢進を阻害するための改良方法を提供する。より詳しくは、より高い体脂肪量を有する個体は、血管透過性亢進を阻害するために効果的に治療するためには、より低い脂肪量を有する個体よりも高用量のダナゾール化合物を必要とする。理論により束縛されないが、これは、ダナゾール化合物が脂溶性であることよると考えられる。したがって、体脂肪量が高い個体では、個体の体内にある脂肪により吸収されるため、ダナゾール化合物の一部が失われる。
【００３６】
用語「体脂肪量（ｂｏｄｙ  ｆａｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ）」は、本明細書で使用される場合、動物の脂肪量を指し、これらに限定されないが、動物の肥満度指数（ＢＭＩ）、体脂肪率、除脂肪体重、及び体表面積を計算することを含む複数の方法で決定することができる。或いは、有資格者は、個体を定性的に評価して、体脂肪量分類に分類することができる。好ましい実施形態では、体脂肪量は、動物のＢＭＩにより測定される。
【００３７】
ＢＭＩは、本明細書で使用される場合、動物の体重及び身長から計算される値である。疾病対策予防センター（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈｙｗｅｉｇｈｔ／ｂｍｉ／ａｄｕｌｔ＿ｂｍｉ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によると、ＢＭＩは、ほとんどの人々に対して身体肥満の信頼できる指標を提供し、健康問題に結びつく場合がある体重分類をスクリーニングするために使用される。ＢＭＩは、体脂肪を直接測定するものではないが、水面下体重測定又は二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ；体脂肪、硬骨、及び筋肉の量を決定する低レベルＸ線）等の、体脂肪の直接尺度と相関すると考えられている（Ｍｅｉ  Ｚら、Ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｂｏｄｙ−ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎｄｅｘｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｆａｔｎｅｓｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２００２年；７５９７〜９８５頁；Ｇａｒｒｏｗ  ＪＳ及びＷｅｂｓｔｅｒ  Ｊ．Ｑｕｅｔｅｌｅｔ’ｓ  ｉｎｄｅｘ  （Ｗ／Ｈ２）  ａｓ  ａ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｆａｔｎｅｓｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  １９８５年；９巻：１４７〜１５３頁）。ＢＭＩは、成人及び小児の両方とも同じ方法で算出される。ＢＭＩの計算は、下記の数式に基づいていてもよい：
数式：体重（ｋｇ）／［身長（ｍ）］２
メートル法では、ＢＭＩの数式は、キログラムで表わした体重を、メートルで表わした身長の２乗で割ったものである。身長は、一般的にセンチメートルで測定されるため、センチメートルで表わした身長を１００で割って、メートルで表わした身長を得る。
【００３８】
数式：体重（ｌｂ）／［身長（ｉｎ）］２×７０３
ポンド（ｌｂ）で表わした体重を、インチ（ｉｎ）で表わした身長の２乗で割り、それに換算係数７０３を掛けることにより、ＢＭＩを計算する。
【００３９】
２０歳以上の成人の場合、ＢＭＩは、全ての年代及び男女両方ともで同じである標準体重状態分類を使用して解釈される。その一方で、子供及び十代の場合、ＢＭＩの解釈は、年齢及び性別の両方に特異的である。成人のＢＭＩ範囲に関連した標準体重状態分類は、表１に示されている。
【００４０】
【表１】
2016503794.tif 000003
【００４１】
ＢＭＩ数及び身体肥満間の相関はかなり強いが、相関は、性別、人種、及び年齢により変動する。これらの変動には、以下の例が含まれる（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ＡＭ及びＪｅｂｂ  ＳＡ．Ｂｅｙｏｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．２００１年、８月；２巻（３号）：１４１〜７頁；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｄら、Ｈｏｗ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｓ  ＢＭＩ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｆａｔｎｅｓｓ  ａｃｒｏｓｓ  ａｇｅ，ｓｅｘ  ａｎｄ  ｅｔｈｎｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ？  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １９９６年；１４３巻：２２８〜２３９頁）。ＢＭＩが同じ場合、女性は、男性よりも多くの体脂肪を有する傾向がある。ＢＭＩが同じ場合、年上の人々は、平均して、より若い成人よりも多くの体脂肪を有する傾向がある。高度に訓練されたスポーツ選手は、高いＢＭＩを有する場合があるが、それは、身体肥満の増加ではなく筋肉増加のためである。
【００４２】
体脂肪量及びＢＭＩは正相関し、つまり、ＢＭＩの増加は、体脂肪量の増加を意味する。
体脂肪率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｏｄｙ  ｆａｔ）又は体脂肪率（ｂｏｄｙ  ｆａｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）は、本明細書で使用される場合、動物の全体重で割った動物の脂肪の全質量である。体脂肪は、必須体脂肪及び貯蔵体脂肪を含む。必須体脂肪は、生命及び性機能を維持するのに必要である。女性の必須体脂肪の割合は、出産及び他のホルモン機能の要求により、男性の必須体脂肪よりも多い。必須脂肪の割合は、男性では２〜５％及び女性では１０〜１３％である。（ＡＣＥ（２００９年）Ｗｈａｔ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｆａｔ  ｌｏｓｓ？  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  （ＡＣＥ）．Ａｓｋ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｂｌｏｇ．１２月２日、２００９年）。貯蔵体脂肪は、脂肪組織中の脂肪蓄積を含み、その一部は、胸部及び腹部の内部器官を防御している。最低推奨総体脂肪率は、上記で報告されている必須脂肪率値を超えている。体脂肪率を決定するためには、カリパスによる測定、又は生体電気インピーダンス分析（動物の体内を通過する際の電流の速度を測定する）、水面下体重測定、二重Ｘ線吸収スキャンの使用による測定等の、幾つかの方法が利用可能である。体脂肪率は、身長又は体重に関わらず、動物の相対的な身体組成を直接計算する唯一の身体測定であるため、健康状態レベルの尺度である。
【００４３】
典型的な体脂肪率は、以下の通りである。
男性体脂肪率：２０〜３９歳：８％〜１９％；４０〜５９歳：１１％〜２１％；６０〜７９歳：１３％〜２４％。
【００４４】
女性体脂肪率：２０〜３９歳：２１％〜３２％；４０〜５９歳：２３％〜３３％；及び６０〜７９歳：２４％〜３５％。
体脂肪量及び体脂肪率は正相関しており、つまり、体脂肪率の増加は、体脂肪量の増加を意味する。
【００４５】
除脂肪体重（ＬＢＭ）は、本明細書で使用される場合、全体重から体脂肪重量を減算することにより計算される身体組成の補数であり、全体重は、非脂肪＋脂肪である。数式にすると以下の通りである。
【００４６】
除脂肪体重＝体重−体脂肪：ＬＢＭ＝ＢＷ−ＢＦ。
除脂肪体重＋体脂肪＝体重：ＬＢＭ＋ＢＦ＝ＢＷ。
非脂肪である総体重の割合は、通常引用されないが、典型的には６０〜９０％であろう。その代わりに、補数である体脂肪率が計算され、それは、典型的には１０〜４０％である。
【００４７】
体脂肪量及び除脂肪体重は負相関し、すなわち、除脂肪体重の減少は、体脂肪量の増加を意味する。
体表面積（ＢＳＡ）は、本明細書で使用される場合、測定された又は計算された人体の表面積である。直接測定せずにＢＳＡを算出するために、種々の計算法が発表されている。以下の数式では、ＢＳＡは、ｍ２で表わされており、Ｗはｋｇで表わされている体重であり、Ｈは、ｃｍで表わされている身長である。最も広く使用されているのは、デュボイスの式である（Ｄｕ  Ｂｏｉｓ  Ｄ，Ｄｕ  Ｂｏｉｓ  ＥＦ（１９１６年６月）．「Ａ  ｆｏｒｍｕｌａ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｔｈｅ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｉｆ  ｈｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｂｅ  ｋｎｏｗｎ．」Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７巻（６号）：８６３〜７１頁；Ｖｅｒｂｒａｅｃｋｅｎ，Ｊら、（２００６年４月）．「Ｂｏｄｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ−ｗｅｉｇｈｔ，ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ，ａｎｄ  ｏｂｅｓｅ  ａｄｕｌｔｓ．Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｓｔｕｄｙ．」Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ５５巻（４号）：５１５〜２４頁）。
【００４８】
ＢＳＡ＝０．００７１８４×Ｗ０．４２５×Ｈ０．７２５
体脂肪量及びＢＳＡは正相関し、つまり、ＢＳＡの増加は、体脂肪量の増加を意味する。
【００４９】
動物の体脂肪量に対応するダナゾール化合物を投与するステップは、より高い体脂肪量の個体は、血管透過性亢進を阻害するのに有効な量のダナゾール化合物を個体が受領するように、より低い体脂肪量の個体よりも高い用量の血管透過性亢進を阻害するダナゾール化合物を必要とするという現象を考慮にいれた量のダナゾール化合物を投与することを含んでいてもよい。個体の体脂肪量が、上記で考察された尺度のいずれかによって既知となれば、適切な量のダナゾール化合物を決定することができる。例えば、限定ではないが、体脂肪量がＢＭＩにより測定される場合、動物のＢＭＩに基づくダナゾール化合物の量は、約０．５ｍｇ／ＢＭＩ単位／日〜約１．０ｍｇ／ＢＭＩ単位／日の量であってもよく、又は特に、約０．５ｍｇ／ＢＭＩ単位／日、約０．６ｍｇ／ＢＭＩ単位／日、約０．７ｍｇ／ＢＭＩ単位／日、約０．８ｍｇ／ＢＭＩ単位／日、約０．９ｍｇ／ＢＭＩ単位／日、又は約１．０ｍｇ／ＢＭＩ単位／日の量であってもよい。本発明の別の態様では、動物のＢＭＩに基づくダナゾール化合物の１日量は、動物のＢＭＩが２６未満の場合、約２ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日であってもよい。好ましい態様では、ダナゾール化合物の１日量は、動物のＢＭＩが２６未満である場合、約５ｍｇ／日である。更に別の態様では、動物のＢＭＩに基づくダナゾール化合物の１日量は、動物のＢＭＩが２６〜３５の場合、約２ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日であってもよい。好ましい態様では、ダナゾール化合物の１日量は、動物のＢＭＩが２６〜３５である場合、約１０ｍｇ／日である。更に別の態様では、動物のＢＭＩに基づくダナゾール化合物の１日量は、動物のＢＭＩが３５を超える場合、約５ｍｇ／日〜約４５ｍｇ／日であってもよい。好ましい態様では、動物のＢＭＩに基づくダナゾール化合物の１日量は、動物のＢＭＩが３５を超える場合、約１５ｍｇ／日である。
【００５０】
「血管透過性亢進」は、本明細書では、基底レベルと比較して増加した血管内皮の透過性を意味するように使用される。「血管透過性亢進」は、本明細書で使用される場合、傍細胞性透過性亢進及びトランスサイトーシス性透過性亢進を含む。
【００５１】
「傍細胞性透過性亢進」は、本明細書では、基底レベルと比較して増加した傍細胞輸送により引き起こされる血管透過性亢進を意味するように使用される。「傍細胞性の透過性亢進」の他の特徴は下記に記載されている。
【００５２】
「傍細胞輸送」は、本明細書では、内皮の内皮細胞間の内皮間接合部（ＩＥＪ）を介するイオン、分子、及び流体の移動を意味するように使用される。
「トランスサイトーシス性透過性亢進」は、本明細書では、基底レベルと比較して増加したトランスサイトーシスにより引き起こされる血管透過性亢進を意味するように使用される。
【００５３】
「トランスサイトーシス」は、本明細書では、内皮の内皮細胞を横切る巨大分子及び付随的液相血漿成分の能動輸送を意味するように使用される。「トランスサイトーシス」の他の特徴は、下記に記載されている。
【００５４】
「基底レベル（ｂａｓａｌ  ｌｅｖｅｌ）」は、本明細書では、正常組織又は器官に見出されるレベルを指すように使用される。
「阻害すること」、「阻害する」、及び類似の用語は、本明細書では、低減、遅延、又は防止することを意味するように使用される。
【００５５】
動物は、同動物がその時点で血管透過性亢進により媒介される疾患又は状態を有しているか、そのような疾患又は状態の初期徴候を示すか、又はそのような疾患又は状態を発生する素因を有している場合に、本発明による治療を「必要性している（ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｏｆ）」。
【００５６】
「媒介される」及び類似の用語は、本明細書では、血管透過性亢進により引き起こされるか、血管透過性亢進に関与するか、又は血管透過性亢進により悪化することを意味するように使用される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は複数を意味する。
本発明は、上記では、特に、動物の体脂肪量に対応する量のダナゾール化合物を個体に投与することにより血管透過性亢進を阻害するための改良方法として記載されている。本方法は、下記に記載されている、ダナゾール化合物の投与により血管透過性亢進を阻害するための一般的方法の改良である。本方法は、血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を血管透過性亢進の阻害が必要である動物に投与することを含む。本発明による血管透過性亢進の阻害は、傍細胞性透過性亢進及びトランスサイトーシス性透過性亢進の阻害を含む。最近の証拠によると、トランスサイトーシス性透過性亢進は、多くの疾患及び状態において最終的に組織及び器官の損傷に結び付くプロセスの第一歩であることが示されている。したがって、本発明は、それらに見られる組織及び器官の損傷を低減、遅延、又は更に潜在的には防止することができる、疾患及び状態における初期介在手段を提供する。
【００５８】
また、本発明は、連続内皮を含むか又は連続内皮を取り囲む任意の組織又は器官に存在する血管透過性亢進を阻害するための改良方法を提供する。上述のように、連続内皮は、脳（血液脳関門）、横隔膜、十二指腸筋肉組織、脂肪、心臓、腎臓の幾つかの区域（乳頭微少血管構造、下行直細血管）、大型血管、肺、腸間膜、神経、網膜（血液網膜関門）、骨格筋、皮膚、精巣、臍静脈、並びに体内の他の組織及び器官に又はそれらの周囲に存在する。好ましくは、連続内皮は、脳、心臓、肺、神経、又は網膜に又はそれらの周囲に見出されるものである。
【００５９】
また、本発明は、有窓内皮を含むか又は有窓内皮を取り囲む任意の組織又は器官に存在する血管透過性亢進を阻害するための改良方法を提供する。上述のように、有窓内皮は、腎臓（糸球体、尿細管周囲毛細血管、及び上行直細血管）、膵臓、副腎、内分泌腺、及び腸に又はそれらの周囲に存在する。好ましくは、有窓内皮は、腎臓に見出されるもの、特に腎臓の糸球体に見出されるものである。
【００６０】
更に、血管透過性亢進により媒介される任意の疾患又は状態は、本発明の方法により治療することができる。そのような疾患及び状態には、糖尿病、高血圧、及びアテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００６１】
特に、脳、心臓、腎臓、肺、腸間膜、神経、網膜、骨格筋、皮膚、及び連続内皮又は有窓内皮を含む他の組織又は器官の血管合併症を含む、糖尿病の血管合併症は、本発明により治療することができる。これらの血管合併症には、浮腫、ＬＤＬの内皮下空間蓄積、加速化アテローム性動脈硬化症、及び以下のものが含まれる：脳（血管壁の老化促進）、心臓（心筋浮腫、心筋線維症、拡張機能障害、糖尿病性心筋症）、腎臓（糖尿病性腎症）、肺（糖尿病母体の胎児の肺発育遅延、幾つかの肺生理学的パラメータの変化、及び易感染性亢進）、腸間膜（血管肥厚）、神経（糖尿病性神経障害）、網膜（黄斑浮腫及び糖尿病性網膜症）、及び皮膚（紅化、変色、乾燥、及び潰瘍）。
【００６２】
糖尿病性網膜症は、概算で２１００万人の米国人糖尿病患者のおよそ２５％に影響を及ぼす失明の主要原因である。その発症及び進行は、集中的な血糖管理及び血圧管理により低減することができるが、１型真性糖尿病を有するほぼ全ての患者及び２型真性糖尿病を有する患者の６０％超は、最終的に糖尿病性網膜症を発症する。糖尿病性網膜症には、２つの段階がある。第１段階の非増殖性網膜症は、この疾患の初期段階であり、血管透過性の増加、微小動脈瘤、浮腫、及び最終的には血管閉鎖を特徴とする。血管新生は、非増殖期の要素ではない。この段階中のほとんどの視力喪失は、網膜黄斑、網膜の中央域に蓄積する流体によるものである。この流体の蓄積は、黄斑浮腫と呼ばれ、一時的又は恒久的な視力減退を引き起こす場合がある。糖尿病性網膜症の第２段階は、増殖性網膜症と呼ばれ、異常な新血管形成を特徴とする。残念ながら、この異常な血管新生は、眼、網膜瘢痕組織、糖尿病性網膜剥離、又は緑内障において出血を引き起こす場合があるため、非常に損傷性であり、それらはいずれも視力減退又は失明を引き起こす場合がある。黄斑浮腫も、増殖期に生じる場合がある。
【００６３】
糖尿病性神経障害は、糖尿病の一般的な重篤合併症である。糖尿病性神経障害には４つの主要なタイプがある：末梢神経障害、自律神経障害、神経根神経叢（ｒａｄｉｃｕｌｏｐｌｅｘｕｓ）神経障害、及び単神経障害。最も一般的なタイプの糖尿病性神経障害である末梢神経障害の徴候及び症状には、以下のものが含まれる：無感覚又は痛み若しくは温度の変化を感じる能力の低減（特に足及びつま先）、刺痛感又は灼熱感、鋭痛、歩行時の疼痛、非常に軽い接触に対しても極端な感受性があること、筋脱力、歩行困難、及び重篤な足の障害（潰瘍、感染症、変形、並びに硬骨痛及び関節痛等）。自律神経障害は、心臓、膀胱、肺、胃、腸、性器、及び眼を制御する自律神経系に影響を及ぼすものであり、これらの区域のいずれかに問題が生じる場合がある。神経根神経叢神経障害（糖尿病性筋萎縮症、大腿神経障害、又は近位神経障害とも呼ばれる）は、通常、臀部、肩部、又は腹部の神経、通常は身体の一方の側の神経に影響を及ぼす。単神経障害は、典型的には腕、脚、又は顔の１つの神経のみに対する損傷を意味する。糖尿病性神経障害の一般的な合併症には、以下のものが含まれる：肢（例えば、つま先、足、又は脚）の喪失、シャルコー関節、尿路感染症、尿失禁、低血糖意識障害（致命的である場合さえある）、低血圧、消化器の異常（例えば、便秘、下痢、悪心、及び嘔吐）、性機能不全（例えば、勃起不全）、及び発汗の増加又は減少。症状は、軽度から苦痛、機能不能、及び致命的にまで及ぶ場合があることが見てとれる。
【００６４】
糖尿病性腎症は、米国の末期腎臓疾患の最も一般的な原因である。これは、腎臓の糸球体毛細血管に影響を及ぼし、腎臓のろ過能力を低下させる、糖尿病の血管合併症である。腎症は、まず過剰ろ過の出現及びその後のミクロアルブミン尿症により徴候が示される。重症タンパク尿及び進行性の腎機能低下は、末期腎疾患に進行する。典型的には、腎症の徴候が全く現われないうちに、通常は、網膜症が診断されている。糖尿病による末期腎臓疾患の患者には、通常、腎移植が推薦される。移植を受けた患者の５年生存率は、約６０％であり、それに比べて、透析患者の５年生存率は２％に過ぎない。
【００６５】
高血圧は、典型的には、長年にわたって進行し、最終的にほとんどすべての人に影響を及ぼす。管理不良高血圧は、心臓発作、うっ血性心不全、卒中、末梢動脈疾患、腎不全、動脈瘤、眼損傷、及び記憶又は理解に関する問題を含む、重大な健康問題のリスクを増加させる。
【００６６】
アテローム性動脈硬化症も徐々に進行する。アテローム性動脈硬化症は、冠動脈、頚動脈、末梢動脈、又は微小血管構造に影響を及ぼす場合があり、アテローム性動脈硬化症の合併症には、以下のものが含まれる：冠動脈疾患（アンギナ又は心臓発作を引き起こす場合がある）、冠状動脈微小血管疾患、頚動脈疾患（一過性の虚血性発作又は脳卒中を引き起こす場合がある）、末梢動脈疾患（熱及び寒さに対する感受性の喪失、又は更には組織死を引き起こす場合がある）、及び動脈瘤。
【００６７】
本発明により治療することができる更なる疾患及び状態には、以下のものが含まれる：急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、加齢黄斑変性、脳浮腫、脈絡膜浮腫、脈絡膜炎、冠状動脈微小血管疾患、大脳微小血管疾患、イールズ病、傷害（例えば、外傷又は熱傷）により引き起こされる浮腫、高血圧に伴う浮腫、糸球体血管漏出、出血性ショック、アーヴァインガス症候群、虚血、黄斑浮腫（例えば、血管閉塞、眼球内手術後（例えば、白内障手術）、ブドウ膜炎、又は色素性網膜炎により引き起こされるもの、それに加えて糖尿病により引き起こされるもの）、腎炎（例えば、糸球体腎炎、血清病腎炎、及びＴｈｙ−１腎炎）、腎症、腎炎性水腫、ネフローゼ症候群、神経障害、組織浮腫（例えば、敗血症における又は外傷による）による臓器不全、子癇前症、肺水腫、肺高血圧症、腎不全、網膜浮腫、網膜出血、網膜静脈閉塞（例えば、分岐静脈閉塞又は中心静脈閉塞）、網膜炎、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症に加えて、アテローム硬化性網膜症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、高血圧網膜症、放射線網膜症、鎌状赤血球網膜症、及び末熟児網膜症）、  無症候性脳梗塞、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、移植糸球体症、ブドウ膜炎、血管漏出症候群、硝子体出血、及びフォンヒッペルリンダウ病。加えて、多発性硬化症を治療するために使用されるものを含むある薬物は、血管透過性亢進を引き起こすことが知られており、ダナゾールは、それらの薬物を使用する際に、この不要な副作用を低減するために使用することができる。遺伝性血管浮腫又は後天性血管浮腫は、本発明により治療することができる疾患及び状態から明示的に除外される。
【００６８】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書では、疾患又は状態の症状、持続期間、又は重症度を低減すること（全体的に又は部分的に）を意味するように使用される。疾患を治癒すること又は疾患若しくは状態を予防することも考慮されるが、疾患又は状態の治療とは別のものである。
【００６９】
最近の証拠によると、トランスサイトーシス性透過性亢進は、多くの疾患及び状態において最終的に組織及び器官の損傷に結び付くプロセスの第一歩であることが示されている。したがって、本発明は、それらに見られる組織及び器官の損傷を低減、遅延、又は更に潜在的には予防することができる、疾患及び状態の初期介在手段を提供する。例えば、動物は、本発明により治療可能な疾患又は状態（上記に記載の疾患及び状態）の１つと診断されれば直ちに治療することができる。或いは、そのような疾患又は状態の初期徴候を有するか、又はそのような疾患又は状態の発症素因を有する動物を、症状が現れる前に治療することが好ましい。糖尿病、高血圧、及びアテローム性動脈硬化症の初期徴候及びリスク因子はよく知られており、これらの初期徴候又はリスク因子を示す動物の治療は、疾患又は状態の症状が現れる前に（つまり、予防的に）開始することができる。
【００７０】
例えば、糖尿病と診察されている患者の治療は、診断の直後に開始することができる。特に、糖尿病は、好ましくは、血管合併症の症状が全く現れないうちにダナゾール化合物で治療されるべきであるが、これは、ほとんどの糖尿病は、診断時にはそのような症状を示しているため、通常は可能ではない（以下を参照）。或いは、糖尿病患者は、非増殖性糖尿病性網膜症が軽症（つまり、軽度の微小動脈瘤及び網膜内出血）である間に治療されるべきである。Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ、９頁（Ｅｌｉａ  Ｄｕｈ医師編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年）を参照されたい。そのような早期治療は、黄斑浮腫を予防し、網膜症が増殖性糖尿病性網膜症に進行することを予防する最善の可能性を提供するだろう。また、糖尿病性網膜症の存在は、糖尿病の他の微小血管合併症が存在するか又は発症する徴候と考えられ（上記文献４７４〜４７７頁を参照）、早期治療は、これらの更なる合併症も予防又は低減することができる。無論、糖尿病の血管合併症であるより進行した疾患及び状態も、治療して有益な結果を得ることができる。
【００７１】
しかしながら、上述のように、血管合併症は、糖尿病と診断された時には既に存在していることが多い。したがって、糖尿病の初期徴候及び発症素因を有する患者を予防的に治療することが望ましい。これらの初期徴候及びリスク因子には、以下のものが含まれる：高値であるが糖尿病と分類するほど高くはない空腹時血糖（「糖尿病前症」）、高インスリン血症、高血圧、脂質異常症（高コレステロール、高トリグリセリド、高低密度リポタンパク質及び低レベルの高密度リポタンパク質のうちの少なくともいずれか）、肥満（２５を超える肥満度指数）、無活動、４５歳を超える年齢、不適切睡眠、糖尿病の家族歴、少数民族、妊娠性糖尿病の病歴、及び多嚢胞性卵巣症候群の病歴。
【００７２】
同様に、高血圧と診察された患者の治療は、診断の直後に開始することができる。高血圧は、典型的には、いかなる症状も引き起こさないが、予防的治療は、高血圧の発症素因（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｔｉｏｎ）を有する患者に開始することができる。高血圧のリスク因子には、以下のものが含まれる：年齢、人種（高血圧は、黒人に多く発症する）、家族歴（高血圧は、家族性である）、体重過多又は肥満、活動の欠如、喫煙、食事塩分過多、食事カリウム不足、食事ビタミンＤ不足、飲酒過多、高いストレスレベル、ある慢性状態（例えば、高コレステロール、糖尿病、腎臓病、及び睡眠時無呼吸症）、及びある薬物の使用（例えば、経口避妊薬、アンフェタミン、ダイエット錠剤、並びに幾つかの風邪薬及びアレルギー薬）。
【００７３】
アテローム性動脈硬化と診察された患者の治療は、診断の直後に開始することができる。しかしながら、アテローム性動脈硬化症の初期徴候又は発症素因を有する患者を予防的に治療することが好ましい。アテローム性動脈硬化症の初期徴候及びリスク因子には、以下のものが含まれる：年齢、動脈瘤又は初期心臓疾患の家族歴、高血圧、高コレステロール、高トリグリセリド、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、喫煙、身体活動の欠如、不健康な食事、及び高いレベルのＣ反応性タンパク質。
【００７４】
血管透過性亢進を阻害するための本発明の方法は、血管透過性亢進を阻害する必要のある動物に、有効量のダナゾール化合物を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「ダナゾール化合物」は、ダナゾール、ダナゾールのプロドラッグ、並びにダナゾール及びそのプロドラッグの薬学的に許容される塩を意味する。
【００７５】
ダナゾール（１７ａ−プレグナ−２，４−ジエン−２０−イノ［２，３−ｄ］−イソオキサゾール−１７β−オール）は、既知の合成ステロイドホルモンである。その構造は、以下の通りである。
【００７６】
【化１】
2016503794.tif 000004
【００７７】
ダナゾールを作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第３，１３５，７４３号明細書及び英国特許第９０５，８４４号明細書を参照されたい。  また、ダナゾールは、バー・ファーマシューティカルズ社（Ｂａｒｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ラネット社（ＬａｎｎｅｔｔＣｏ．，Ｉｎｃ．）、サノフィ・アベンティス・カナダ（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｃａｎａｄａ）、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びパーチェム・トレーディング社（Ｐａｒｃｈｅｍ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｌｔｄ．）を含む、多くの供給業者から商業的に入手可能である。
【００７８】
「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグを動物に投与すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性親薬物（この場合は、ダナゾール）が放出されるあらゆる化合物を意味する。ダナゾールのプロドラッグには、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて遊離ヒドロキシルを生成することができる任意の基にヒドロキシル基が結合されているダナゾールが含まれる。ダナゾールのプロドラッグの例には、ダナゾールのエステル（例えば、アセタート、ホルマート、ベンゾアート誘導体）が含まれる。
【００７９】
ダナゾール及びそのプロドラッグの薬学的に許容される塩には、以下のものに由来する塩等の従来の毒性のない塩が含まれる：無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、サリチル酸、シュウ酸、アスコルビン酸等）、又は塩基（薬学的に許容される金属陽イオン又はΝ，Ν−ジベンジルエチレンジアミン、Ｄ−グルコサミン、又はエチレンジアミンに由来する有機陽イオンの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩）。塩は、従来法で、例えば、遊離塩基形態の化合物を酸で中和することにより調製される。特に、ダナゾール等のイソオキサゾールは弱塩基性物質であり、強酸を付加すると酸付加塩を、強酸のエステル（例えば、無機又は有機濃スルホン酸のエステル、好ましくは、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、臭化エチル、臭化プロピル、臭化ブチル、臭化アリル、硫酸メチル、ベンゼンスルホン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｅｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ｐ−トルエン−スルホン酸メチル、塩化ベンジル等の、低級アルキルエステル、低級アルケニルエステル、又は低級アラルキルエステル等）を付加すると第四級アンモニウム塩を形成するだろう。米国特許第３，１３５，７４３号明細書を参照されたい。
【００８０】
上述のように、ダナゾール化合物は、血管透過性亢進を阻害するために、及び血管透過性亢進により媒介される疾患又は状態を治療するために使用することができる。そのために、治療を必要性とする動物にダナゾール化合物が投与される。好ましくは、動物は、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、又はヒト等の哺乳動物である。最も好ましくは、動物はヒトである。
【００８１】
本発明の化合物（つまり、ダナゾール、ダナゾールのプロドラッグ、又はそれらのいずれか１つの薬学的に許容される塩）の有効な剤形、投与方法、及び用量は、本明細書で提供されている指針を使用して経験的に決定することができる。当業者であれば理解するように、投与量は、治療される特定の疾患又は状態、疾患又は状態の重症度、投与経路（複数可）、治療期間、動物に投与されている任意の他の薬物の種類、動物の年齢、大きさ、及び生物種、並びに医学及び獣医学分野において知られている同様の要因に応じて変わるだろう。一般的に、本発明の化合物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに効果的な最低用量である化合物の量だろう。しかしながら、１日用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医又は獣医により決定されるだろう。必要に応じて、有効な１日用量は、１日を通じて適切な間隔で別々に投与される、２、３、４、５、又は６回以上の分割用量として投与してもよい。化合物の投与は、許容される応答が達成されるまで継続されるべきである。
【００８２】
ダナゾール化合物は、血管新生を阻害することが以前に報告されている。国際公開公報第２００７／００９０８７号パンフレットを参照されたい。驚くべきことに、非常に意外にも、本発明の実施では、ダナゾール化合物は、血管新生を阻害するために以前に報告されている用量よりも約１００〜１０００倍低く、他の疾患及び状態の治療のために、現在患者に投与されている量（典型的には、成人ヒトの場合、２００〜８００ｍｇ／日）よりもかなり低い最適用量で使用することができる。ダナゾール化合物をより低い用量で使用すると、あらゆる著しい副作用、恐らくは全ての副作用が回避されるはずであり、それは、本発明による疾患及び状態の早期又は予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ）治療に特に有利であろう。
【００８３】
特に、血管透過性亢進を阻害するためのダナゾール化合物の有効用量は、０．１ｎｇ／ｋｇ／日〜３５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは４０ｎｇ／ｋｇ／日〜５．０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは１００ｎｇ／ｋｇ／日〜１．５ｍｇ／ｋｇ／日であろう。また、有効用量は、０．０００１μΜ〜５μΜ、好ましくは０．１μΜ〜１．０μΜ、より好ましくは０．１μΜ〜０．５μΜ、最も好ましくは約０．１μΜの関連流体（例えば、血液）中濃度をもたらすことになる量であろう。また、有効用量は、約０．１７％以下（重量／重量）、好ましくは０．０００３４％〜０．１７％、最も好ましくは０．００３４％〜０．０１７％の、治療される組織又は器官中での濃度をもたらすことになる量であろう。局所的に又は局部的に投与される場合、好ましくは、ダナゾール化合物は、０．０００１μΜ〜５μΜ、好ましくは０．１μΜ〜１．０μΜ、より好ましくは０．１μΜ〜０．５μΜ、最も好ましくは約０．１μΜの濃度で、又は約０．１７％（重量／重量）以下、好ましくは０．０００３４％〜０．１７％、最も好ましくは０．００３４％〜０．０１７％の濃度で投与されることになる。成人ヒトに経口で投与される場合、用量は、好ましくは約１ｎｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは、用量は、約１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、最も好ましくは、用量は、好ましくは１日当たり２回の等しい用量で投与される約１０ｍｇ／日〜約９０ｍｇ／日であるだろう。更に、ダナゾールは、細胞及び組織に蓄積すると予想され、したがって、初期（負荷）用量（例えば、１日当たり１００ｍｇ）は、ある期間後に（例えば、２〜４週間）、著しい副作用を起こさずに、恐らくはいかなる副作用も起こさずに無期限に投与ことができる、より低い維持用量（例えば、１日当たり１ｍｇ）に低減することができる。本明細書で使用される場合、ダナゾール化合物の「血管透過性亢進阻害量」は、この段落の上記に記載されている量を意味すると規定される。
【００８４】
また、本発明は、動物の内皮細胞の細胞骨格を調節するための改良方法を提供する。本方法は、有効量のダナゾール化合物を動物に投与することを含む。本発明のこの実施形態は、ダナゾールがＦ−アクチンストレスファイバー形成を阻害し、皮層アクチン環の形成を引き起こし、スフィンゴシン−１ホスファート（ＳＩＰ）による皮層アクチン環の形成を増強及び長期化させ、ＲｈｏＡを阻害し、ＶＥ−カドヘリンのリン酸化を増加させ、障壁安定化ＧＴＰａｓｅを活性化させ、微小管を安定させると考えられるという発見に基づく。細胞骨格の調節は、血管透過性亢進を低減し、血管透過性過少（つまり、基底レベルよりも低い透過性）を増加させることができ、それにより内皮の恒常性を回復させる。したがって、血管透過性亢進により媒介される疾患及び症状を治療することができ（上記を参照）、血管透過性過少により媒介される疾患及び症状も治療することができる。後者のタイプの疾患及び症状には、肝臓老化、アテローム発生、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、肝臓の線維症、肝不全、並びに原発性及び転移性肝癌が含まれる。
【００８５】
本発明は、動物の体脂肪量を決定し、動物の体脂肪量に対応する血管透過性亢進阻害量のダナゾール化合物を動物に投与することにより、動物の内皮細胞の細胞骨格を調節するための方法を更に提供する。１つの態様では、決定ステップは、動物の体脂肪量を計算することを含む。上記で考察されているように、動物の体脂肪量は、これらに限定されないが、動物の肥満度指数（ＢＭＩ）、体脂肪率、除脂肪体重、及び体表面積を含む、複数の方法で測定することができる。好ましい実施形態では、体脂肪量は、動物のＢＭＩにより測定される。
【００８６】
内皮細胞の細胞骨格を調節するための方法は、有効量のダナゾール化合物を動物に投与することを含む。「ダナゾール化合物」及び「動物」は、上記に示されているものと同じ意味を有する。
【００８７】
本発明の、細胞骨格を調節するための化合物（つまり、ダナゾール、ダナゾールのプロドラッグ、又はそれらのいずれか１つの薬学的に許容される塩）の有効剤形、投与方法、及び用量は、本明細書で提供されている指針を使用して経験的に決定することができる。当業者であれば理解するように、投与量は、治療される特定の疾患又は状態、疾患又は状態の重症度、投与経路（複数可）、治療期間、動物に投与されている任意の他の薬物の種類、動物の年齢、大きさ、及び生物種、並びに医学及び獣医学分野において知られている同様の要因に応じて変わるだろう。一般的に、本発明の化合物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに効果的な最も低い用量である化合物の量となるであろう。しかしながら、１日用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医又は獣医により決定されることになろう。必要に応じて、有効な１日用量は、１日を通じて適切な間隔で別々に投与される、２、３、４、５、又は６回以上の分割用量として投与してもよい。化合物の投与は、許容される応答が達成されるまで継続されるべきである。
【００８８】
特に、内皮細胞の細胞骨格を調節するためのダナゾール化合物の有効用量は、０．１ｎｇ／ｋｇ／日〜３５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは４０ｎｇ／ｋｇ／日〜５．０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは１００ｎｇ／ｋｇ／日〜１．５ｍｇ／ｋｇ／日であろう。また、有効用量は、０．０００１μΜ〜５μΜ、好ましくは０．１μΜ〜１．０μΜ、より好ましくは０．１μΜ〜０．５μΜ、最も好ましくは約０．１μΜの、関連流体（例えば、血液）中の濃度をもたらすことになる量であろう。また、有効用量は、約０．１７％以下（重量／重量）、好ましくは０．０００３４％〜０．１７％、最も好ましくは０．００３４％〜０．０１７％の、治療される組織又は器官中での濃度をもたらすことになる量であろう。局所的に又は局部的に投与される場合、好ましくは、ダナゾール化合物は、０．０００１μΜ〜５μΜ、好ましくは０．１μΜ〜１．０μΜ、より好ましくは０．１μΜ〜０．５μΜ、最も好ましくは約０．１μΜの濃度で、又は約０．１７％（重量／重量）以下、好ましくは０．０００３４％〜０．１７％、最も好ましくは０．００３４％〜０．０１７％の濃度で投与されることになる。成人ヒトに経口で投与される場合、用量は、好ましくは約１ｎｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは、用量は、約１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、最も好ましくは、用量は、好ましくは１日当たり２回の等しい用量で投与される約１０ｍｇ／日〜約９０ｍｇ／日であるだろう。更に、ダナゾールは、細胞及び組織に蓄積すると予想され、したがって、初期（負荷）用量（例えば、１日当たり１００ｍｇ）は、ある期間後に（例えば、２〜４週間）、著しい副作用を起こさずに、恐らくはいかなる副作用も起こさずに無期限に投与ことができる、より低い維持用量（例えば、１日当たり１ｍｇ）に低減することができる。
【００８９】
本発明の化合物（つまり、ダナゾール、そのプロドラッグ、及びそれらのいずれかの薬学的に許容される塩）は、経口的に、経鼻的に、非経口的に（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内）、経皮的に、眼内に、及び局所的に（頬側及び舌下を含む）を含む、任意の好適な投与経路により、治療のために動物患者に投与することができる。一般的に、本発明により治療可能な任意の疾患又は状態の場合は、経口投与が好ましい。眼の疾患及び症状を治療するための好ましい投与経路は、経口、眼内、及び局所である。経口が最も好ましい。薬物の経口投与によるそのような疾患及び状態の治療の成功は、以前に報告されていないため、ダナゾール化合物の経口投与により眼の疾患を治療することができることは全く予期しない驚くべきことである。
【００９０】
脳の疾患及び症状を治療するための好ましい投与経路は、経口及び非経口である。経口が最も好ましい。
本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体との、及び随意に１つ又は複数の他の化合物、薬物、又は他の物質との混合物中の活性成分として、本発明の１つ又は複数の化合物を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合しており、動物にとって有害でないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。選択した投与経路に関わらず、本発明の化合物は、当業者に公知の従来方式により薬学的に許容される剤形に製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。
【００９１】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤、又は水性若しくは非水性液体中の液剤若しくは懸濁剤、又は水中油型若しくは油中水型の液体乳剤、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又は香錠として（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴム等の不活性基材を使用する）等の形態であってもよく、各々は、活性成分として所定量の本発明の１つ又は複数の化合物を含有する。また、本発明の１つ又は複数の化合物は、ボーラス剤、舐剤、又はパスタ剤として投与することができる。
【００９２】
経口投与用の本発明の固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、顆粒剤等）には、活性成分（つまり、ダナゾール、ダナゾールのプロドラッグ、それらのいずれか１つの薬学的に許容される塩、又は先述のものの組み合わせ）は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は下記のいずれか等の１つ又は複数の薬学的に許容される担体と混合されている：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸等の賦形剤又は増量剤、（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び／又はアラビアゴム等の結合剤、（３）グリセロール等の湿潤剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、じゃがいも又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、（５）パラフィン等の溶解遅延剤、（６）第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、（７）例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等の湿潤剤；（８）カオリン及びベントナイト粘土等の吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物等の滑沢剤、及び（１０）着色剤。また、カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤を含んでいてもよい。類似タイプの固形組成物は、ラクトース又は乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用する軟充填ゼラチンカプセル及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。
【００９３】
錠剤は、随意に１つ又は複数の副成分と共に圧縮又は成形することにより作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、又は架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤、又は分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することにより作製することができる。
【００９４】
錠剤、並びに糖剤、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤等の本発明の医薬組成物の他の固形剤形は、随意に、割線入りであってもよいし、腸溶性コーティング及び医薬品製剤化技術分野において周知の他のコーティング等のコーティング及びシェルを備えて調製されていてもよい。また、それらは、所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／又はマイクロスフェアを様々な割合で使用して、それら中の活性成分の遅延又は制御放出を提供するように製剤化することができる。それらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過により滅菌することができる。また、これら組成物は、随意に乳白剤を含有していてもよく、好ましくは胃腸管のある部分では、活性成分のみを又は活性成分を優先的に、遅延した様式で放出する組成物であってもよい。使用することができる組成物の埋込みの例は、ポリマー物質及びワックスが含まれる。また、活性成分は、マイクロカプセル化されていてもよい。
【００９５】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、活性成分に加えて、以下のもの等のこの技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有していてもよい：例えば、水又は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、油状物（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル，及びそれらの混合物等の他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤。
【００９６】
また、経口組成物は、不活性希釈剤に加えて、湿潤剤、乳化剤、及び懸濁化剤、甘味料、香味料、着色剤、芳香剤、及び保存剤等の補助剤を含むことができる。
懸濁剤は、有効成分に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びポリオキシエチレンソルビタンのエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、及びトラガント、及びそれらの混合物等の懸濁化剤を含有していてもよい。
【００９７】
本発明の１つの実施形態では、ダナゾール化合物は、徐放性製剤中にある。本明細書で使用される場合、用語「徐放性」は、ダナゾール化合物及び／又は医薬組成物を、例えば、ポリサッカライド、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア、乾燥粉末、又は経皮送達システムと共に製剤化すると得られる、制御された又は持続的な放出を指す。本発明の他の制御放出組成物には、動物に投与すると、ｉｎ  ｓｉｔｕで固形物又はゲルを形成する液体が含まれる。更に、用語「徐放性製剤」は、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及びポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラート、及びヒドロゲルの架橋又は両親媒性ブロックコポリマー等の、薬物の制御放出を達成するのに有用である種類の生分解性ポリマーを含む。好ましい実施形態では、徐放性製剤は、リポソーム、ポリサッカライド、及びそれらの組み合わせ等の成分を含む。
【００９８】
また、本発明は、眼の治療に好適な医薬品を提供する。そのような医薬品には、医薬組成物、医薬デバイス、及び医薬移植片（組成物又はデバイスであってもよい）が含まれる。
【００９９】
本発明の１つ又は複数の化合物を眼球に眼内注射するための医薬製剤（組成物）には、液剤、乳剤、懸濁液、粒剤、カプセル剤、マイクロスフェア剤、リポソーム剤、マトリックス剤等が含まれる。例えば、米国特許第６，０６０，４６３号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１０１５８２号明細書、及び国際出願公開第２００４／０４３４８０号パンフレットを参照されたい。これらの完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、眼内注射用の医薬製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、懸濁化剤、増粘剤、又は粘性増強剤（ヒアルロン酸ポリマー等）を含有していてもよい、１つ又は複数の薬学的に許容される無菌等張水性又は非水性液剤、懸濁剤、又は乳剤と組み合わせて、本発明の１つ又は複数の化合物を含んでいてもよい。好適な水性及び非水性担体の例には、水、生理食塩水（好ましくは、０．９％）、デキストロース水溶液（好ましくは、５％）、緩衝液、ジメチルスルホキシド、アルコール、及びポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）が含まれる。また、これらの組成物は、湿潤剤及び乳化剤及び分散剤等の補助剤を含有していてもよい。加えて、注射可能な医薬品形態の長期吸収は、ポリマー及びゼラチン等の、吸収を遅延させる作用剤の包含によりもたらされてもよい。注射可能なデポー製剤は、ポリ乳酸−ポリグリコリド等の生分解性ポリマーで作られているマイクロカプセル又はマイクロスフェアに薬物を組み込むことにより作製することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、及びポリ無水物が含まれる。また、デポー注射可能製剤は、眼組織と適合性を有するリポソーム（ジパルミトイルホスファチジルコリン等の通常成分で構成されている）又はマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより調製される。薬物のポリマー又は脂質に対する割合、特定のポリマー又は脂質成分の性質、使用されるリポソームのタイプ、及びマイクロカプセル又はマイクロスフェアがコーティングされているか否かに応じて、マイクロカプセル、マイクロスフェア、及びリポソームからの薬物放出速度を制御することができる。
【０１００】
また、本発明の化合物は、眼移植片として外科的に投与することができる。例えば、ポリビニルアルコール又はポリ酢酸ビニルの拡散可能障壁を有しており、本発明の１つ又は複数の化合物を含有する貯蔵容器を、強膜に又は強膜上に移植することができる。別の例として、本発明の１つ又は複数の化合物は、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ無水物等のポリマー、又はセバシン酸等の脂質で作られているポリマーマトリックスに組み込んでもよく、強膜上に又は眼に移植してもよい。これは、通常、角膜の後ろに開けた小さな切開口を使用して、局所的又は局部的に麻酔をかけた動物で達成される。その後、マトリックスを切開口から挿入し、強膜に縫合する。
【０１０１】
また、本発明の化合物は、眼に局所投与することができ、本発明の好ましい実施形態は、眼への適用に好適な局所医薬組成物である。眼への適用に好適な局所医薬組成物には、液剤、懸濁剤、分散剤、滴剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、及び軟膏剤が含まれる。例えば、米国特許第５，４０７，９２６号明細書、並びに国際出願公開第２００４／０５８２８９号パンフレット、国際出願公開第０１／３０３３７号パンフレット及び国際出願公開第０１／６８０５３号パンフレットを参照されたい。これらの完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
眼への適用に好適な局所製剤は、水性又は非水性基材中に本発明の１つ又は複数の化合物を含む。また、局所製剤は、以下のものが含まれていてもよい：吸収促進剤、透過促進剤、増粘剤、粘性増強剤、ｐＨを調整及び維持するための作用剤、浸透圧を調整するための作用剤、保存剤、界面活性剤、緩衝剤、塩（好ましくは、塩化ナトリウム）、懸濁化剤、分散剤、可溶化剤、安定剤、及び／又は等張化剤。眼への適用に好適な局所製剤は、好ましくは、本発明の１つ又は複数の化合物の眼への吸収又は透過を促進する吸収促進剤又は透過促進剤、及び／又は本発明の１つ又は複数の化合物の眼における滞留時間を増加させることが可能な増粘剤又は粘性増強剤を含むだろう。国際出願公開第２００４／０５８２８９号パンフレット、国際出願公開第０１／３０３３７号パンフレット、及び国際出願公開第０１／６８０５３号パンフレットを参照されたい。例示的な吸収促進剤／透過促進剤には、メチスルホニルメタン（ｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）を単独で、又はジメチルスルホキシド、カルボン酸、及び界面活性剤との組み合わせで含む。例示的な増粘剤及び粘性増強剤には、以下のものが含まれる：デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライドゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）、セルロース系ポリマー（ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、カルボキシル含有ポリマー（アクリル酸のポリマー又はコポリマー等）、ポリビニルアルコール、及びヒアルロン酸、又はそれらの塩。
【０１０３】
眼の治療に好適な液体剤形（例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、及び滴剤）は、本発明の１つ又は複数の化合物を、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、及びエタノール等の媒体に、例えば可溶化、分散化、懸濁化させて、例えば、溶液、分散液、又は懸濁液を形成することにより調製することができる。また、必要に応じて、医薬製剤は、湿潤剤又は乳化剤、及びｐＨ緩衝剤等の、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート等の少量の非毒性補助物質を含有していてもよい。
【０１０４】
眼の治療に好適な水溶液及び懸濁液には、本発明の１つ又は複数の化合物に加えて、保存剤、表面活性剤、緩衝剤、塩（好ましくは、塩化ナトリウム）、等張化剤、及び水を含んでいてもよい。懸濁液が使用される場合、粒子径は、眼刺激を最小限に抑えるために、１０μｍ未満であるべきである。溶液又は懸濁液が使用される場合、眼に送達される量は、眼から過剰に溢れるのを回避するために、５０μｌを超過するべきでない。
【０１０５】
眼の治療に好適なコロイド懸濁剤は、一般的に微粒子から形成される（つまり、マイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロカプセル、又はナノカプセルである。マイクロスフェア及びナノスフェアは、一般的に、製剤が捕捉、吸収、又はそうでなければ含有されるポリマーマトリックスの一体化粒子であり、マイクロカプセル及びナノカプセルの場合は、製剤が実際に封入されている）。これらの微粒子のサイズの上限は、約５μ〜約１０μである。
【０１０６】
眼の治療に好適な眼科用軟膏剤は、鉱油、液体ラノリン、白色ワセリン、上記の２つ又は３つ全ての組み合わせ、又はポリエチレン−鉱油ゲル等の適切な基材中に本発明の１つ又は複数の化合物を含んでいる。随意に保存剤が含まれていてもよい。
【０１０７】
眼の治療に好適な眼科用ゲル剤は、Ｃａｒｐｏｂｏｌ−９４０等の親水性基材、又はエタノール、水、及びプロピレングリコールの組み合わせ（例えば、４０：４０：２０の比率）に懸濁された本発明の１つ又は複数の化合物を含んでいる。ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はアンモニア化グリチルリチナート等のゲル化剤が使用される。随意に、保存剤及び／又は等張化剤が含まれていてもよい。
【０１０８】
眼の治療に好適なヒドロゲルは、当技術分野で「ヒドロゲル」と呼ばれる製剤が、典型的には、「増粘」溶液又は懸濁液と呼ばれる製剤よりも高い粘性を有することを除いて、増粘剤又は粘性増強剤として上記に列挙されているもの等の膨潤性ゲル形成ポリマーを組み込むことにより形成される。また、製剤は、そのような事前に形成されたヒドロゲルとは対照的に、眼への適用後にｉｎ  ｓｉｔｕでヒドロゲルを形成するように調製されていてもよい。そのようなゲル剤は、室温では液体だが、体液と接して設置されると、より高い温度でゲル化する（したがって、「温度可逆性」ヒドロゲルと名付けられている）。この特性を付与する生体適合性ポリマーには、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド誘導体、並びにエチレンオキシド及びプロピレンオキシドのＡＢＡ型ブロックコポリマー（一般的に「ポロキサマー」と呼ばれ、ＢＡＳＦ−Ｗａｙｎｄｏｔｔｅ社から商標Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）として入手可能である）。
【０１０９】
好ましい分散剤は、リポソームであり、その場合、製剤は、リポソーム（水性区画及び脂質二分子膜を交互に含む微小小胞）内に封入される。
点眼薬は、１つ又は複数の分散剤、可溶化剤、又は懸濁化剤も含む水性又は非水性基材と共に製剤化することができる。滴剤は、単純な点眼器蓋付ボトルにより、又は特別に形作られた閉鎖具により液体内容物を滴下送達するのに適したプラスチックボトルにより送達することができる。
【０１１０】
また、本発明の化合物は、眼に挿入される薬物含浸固体担体により局所的に適用することができる。薬物放出は、一般的に、ポリマーの溶解又は生侵食、浸透、又はそれらの組み合わせにより達成される。幾つかのマトリクス式送達系を使用することができる。そのような系には、本発明の所望の化合物を含浸又は浸漬させた親水性ソフトコンタクトレンズ、並びに眼に配置した後で取り除く必要のない生分解性又は可溶性デバイスが含まれる。これらの可溶性眼科用インサートは、眼にとって忍容可能であり、投与される本発明の化合物と適合する任意の分解性物質で構成されていてもよい。そのような物質には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、アクリル酸エチル、及びビニルピロリドンのポリマー及びコポリマー、並びに架橋ポリペプチド又はキチン等のポリサッカライド。
【０１１１】
本発明の化合物の他の種類の（つまり、非眼科用）局所投与用又は経皮投与用の剤形には、散剤、噴霧剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、貼付剤、滴剤、及び吸入剤が含まれる。活性成分は、薬学的に許容される担体と、任意の緩衝液と、又は必要な場合がある噴射剤と、無菌条件下で混合することができる。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、及びゲル剤は、活性成分に加えて、動物脂及び植物脂、油状物、ろう、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物等の賦形剤を含有していてもよい。散剤及び噴霧剤は、活性成分に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はそれらの物質の混合物等の賦形剤を含有していてもよい。噴霧剤は、クロロフルオロ炭化水素、及びブタン及びプロパン等の揮発性非置換炭化水素等の通例の噴射剤を更に含有していてもよい。経皮貼付剤は、本発明の化合物の体内への徐放送達を提供するという更なる利点を有する。そのような剤形は、エラストマーマトリックス材料等の適切な媒体に本発明の１つ又は複数の化合物を溶解、分散、又はそうでなければ組み込むことにより作製することができる。また、吸収促進剤を使用して、化合物の経皮フラックスを増加させることができる。そのようなフラックスの速度は、律速膜を提供すること、又はポリマーマトリックス又はゲルに化合物を分散させることのいずれかにより制御することができる。薬物含浸固形担体（例えば、包帯）を局所投与に使用することもできる。
【０１１２】
医薬製剤には、吸入又は吹送による投与又は経鼻投与に好適なものが含まれる。吸入により上気道（鼻）又は下気道に投与する場合、本発明の化合物は、注入器、ネブライザー、又は加圧パック、又はエアゾル噴霧を送達する他の便利な手段により便利に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適なガス等の好適な噴射剤を含んでいてもよい。加圧エアゾルの場合、用量単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定してもよい。
【０１１３】
或いは、吸入又は吹送による投与の場合、組成物は、乾燥粉末、例えば、本発明の１つ又は複数の化合物とラクトース又はデンプン等の好適な粉末基材との粉末混合物の形態をとっていてもよい。粉末組成物は、例えば、カプセル又はカートリッジ、又は例えば、吸入器、注入器、若しくは計量式吸入器の補助より粉末を投与することができるゼラチン又はブリスターパックの単位剤形で提供されてもよい。
【０１１４】
鼻腔内の投与の場合、本発明の化合物は、プラスチックボトルアトマイザー又は計量式吸入器による等、点鼻剤又は液体噴スプレーにより投与することができる。液体スプレーは、加圧パックから便利に送達される。典型的なアトマイザーは、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｗｉｎｔｒｏｐ社）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｒｉｋｅｒ社）である。
【０１１５】
点鼻薬は、１つ又は複数の分散剤、可溶化剤、又は懸濁化剤も含む水性又は非水性基材と共に製剤化することができる。滴剤は、単純な点眼器蓋付ボトルにより、又は特別に形作られた閉鎖具により液体内容物を滴下送達するのに適したプラスチックボトルにより送達することができる。
【０１１６】
非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、以下のものと組み合わせて本発明の１つ又は複数の混合物を含む：１つ又は複数の薬学的に許容される無菌等張水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液、又は乳剤、或いは使用直前に無菌注射用溶液又は分散液に再構成することができ、酸化防止剤、緩衝剤、製剤を目的受容者の血液と等張性にする溶質、又は懸濁剤、又は増粘剤を含んでいてもよい無菌粉末。また、薬剤コーティングステントを使用してもよい。
【０１１７】
本発明の医薬組成物に使用することができる好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することにより、分散剤の場合は、必要とされる粒子径を維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより維持することができる。
【０１１８】
また、これらの組成物は、湿潤剤及び乳化剤及び分散剤等の補助剤を含有していてもよい。また、組成物は、糖及び塩化ナトリウム等の等張剤等を含むことが望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬品形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる作用剤の包含によりもたられてもよい。
【０１１９】
幾つかの場合、薬物の効果を延長するためには、皮下注射又は筋肉内注射した薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水に溶けにくい結晶性又は非晶質性の材料の液体懸濁液を使用することにより達成することができる。その後、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで、溶解速度は、結晶サイズ及び結晶形態に依存する場合がある。或いは、非経口投与薬物の吸収遅延は、油状媒体に薬物を溶解又は懸濁することにより達成される。
【０１２０】
注射可能なデポー形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリド等の生分解性ポリマーで薬物の微小封入マトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマーの割合、及び使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリオルトエステル及びポリ無水物が含まれる。また、デポー注射可能製剤は、体組織と適合性であるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターによるろ過により滅菌することができる。
【０１２１】
製剤は、単位用量の又は複数回用量の密閉容器、例えばアンプル及びバイアルで提供することができ、凍結乾燥状態で保存することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用の水を添加するだけでよい。即時調製型の注射溶液及び懸濁液は、上記に記載されているタイプの無菌の散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
【０１２２】
ダナゾール化合物は、血管透過性亢進又は細胞骨格の機能不全を含む疾患又は状態を治療するために単独で投与してもよい。或いは、ダナゾール化合物は、疾患又は状態を治療するのに好適な１つ又は複数の他の治療又は薬物と組み合わせて投与してもよい。例えば、ダナゾール化合物は、別の治療又は薬物の前に、別の治療又は薬物と共に（同時を含む）、又は別の治療又は薬物の後に投与することができる。別の薬物の場合、薬物及びダナゾール化合物は、別々の医薬組成物で投与してもよく、又は同じ医薬組成物の一部として投与してもよい。好適な薬物は、米国特許出願第１２／８２０，３２５号明細書に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
実施例の幾つかで示されているように、本発明者らは、ダナゾールを、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）患者に経口治療薬として投与すると、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定したところ、中央亜領域網膜厚（ｃｅｎｔｒａｌ  ｓｕｂｆｉｅｌｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の低減がもたらされることを決定した。加えて、ヒト内皮細胞をダナゾールで処理した前臨床ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、内皮障壁機能が増強され、それに伴って血管透過性が低下したことを示している。ＶＥＧＦを標的とする薬物の眼内注射とは異なり、ダナゾールは、経口で投与し、安全特性は十分に証明されている。
【０１２４】
また、血管透過性に対するダナゾールの効果を、網膜、臍部、脳、及び腎臓の微小血管に由来するヒト内皮細胞を使用して研究した。これらの知見は、ダナゾールには、血管透過性に対する二相性用量応答が存在することを示す（図１）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで、ヒト内皮細胞の単層での西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の遊走を追跡すると、ダナゾールは、１００〜５００ナノモル濃度で、経細胞通過の低減を示した。しかしながら、濃度を増加させると、ダナゾールの有益効果は逆行し、傍細胞透過性の増加に結び付いた。また、ダナゾールの有益効果は非常に迅速であると考えられた。ファロイジン染色及び経電気的内皮抵抗（ＴＥＥＲ、ｔｒａｎｓｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）モデルにより示されたように、内皮細胞は、障壁増強濃度のダナゾールと接触させて数分内に、ｆ−アクチン皮層環形成及び内皮障壁機能の増加を示した（図２及び３）。更に、これらの濃度のダナゾールは、ＴＮＦ−α等の炎症促進性分子又はトロンビンで刺激すると、ストレスファイバーの形成を妨害した（図３）。
【０１２５】
本発明の更なる目的、利点、及び新規な特徴は、当業者であれば、以下の非限定的な例を考慮することにより明白になるだろう。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：
この例は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の患者に対するダナゾールの経口投与が、重大な有害事象を示すことなく、安全であることを示す。ダナゾールは、ＢＭＩ用量調整様式でＤＭＥを低減させることができ、視力を改善させる傾向がある。図１及び２に示されているように、ダナゾールは、内皮細胞に対して二相性効果を示す場合がある。ダナゾールは、低用量では血管漏出を減少させるが、より高い濃度では、血管透過性の増加が観察される。この二相性効果は、下記で考察される様々なＢＭＩにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのダナゾールの有効性により支持された。
【０１２７】
ＤＭＥに関するダナゾールの安全性及び効力を評価するために、カナダのＳｔ．Ｍｉｃｈａｅｌ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにて、１２週間の無作為化プラセボ対照二重盲検治験を実施した。ＤＭＥを罹患しており、中央亜領域網膜厚が３００μｍ以上である患者が参加した。安全性設定集団は、合計３４人の患者で構成されていた。効能評価集団（ｎ＝２３）は、４週間の治療で治験薬の８０％以上を完了した安全性設定集団の患者で構成されていた。主要評価項目は、１２週間の治療に対して中央亜領域網膜厚が基線から変化することであり、副次的評価項目は、治療の１２週目で、網膜体積及び早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ、Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｓｔｕｄｙ）最高矯正視力（ＢＣＶＡ、ｂｅｓｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｖｉｓｕａｌ  ａｃｕｉｔｙ）が基線から変化することであった。試験した３つのダナゾール用量は、１０ｍｇ（５ｍｇ、１日２回）、３０ｍｇ（１５ｍｇ、１日２回）、及び９０ｍｇ（４５ｍｇ、１日２回）であった。治療は全て、１日に２回経口で投与した。
【０１２８】
最初の重要な知見は、網膜の厚さに対するダナゾールの効果が、基線肥満度指数に依存したことであった（ＢＭＩ；Ｐ＝．０１）。より低いＢＭＩ値では、より低いダナゾール用量が、効果的に網膜厚を低減させたが、より高いＢＭＩでは、より高い用量がより効果的であった（図４）。経験的に規定して、１１％を超える網膜厚の減少を、臨床的に重要であるとみなした。プラセボ群での２９％（７人の患者のうちの２人）と比較して、１５ｍｇ用量を受容した被験者のほぼ全員（８６％、７人の患者のうちの６人）が、１２週で網膜厚の著しい減少を示した。また、網膜体積は、プラセボ（Ｐ＝．０５）と比較して、１５ｍｇの群では減少した。
【０１２９】
ＩＣＤ−９−ＣＭ視力喪失のＢＣＶＡ変化については、被験者の３６％が、治療により少なくとも１つのカテゴリーで改善を示した。プラセボ群は、改善を示した被験者の割合が最も低くかったが（１４％）、ダナゾールで治療した全患者の４７％は、少なくとも１つのカテゴリーが改善された。
【０１３０】
いずれの群でも基線又は１２週目で高眼圧症は検出されず、治験薬関連重大有害事象は報告されなかった。３つの治療関連有害事象が生じ（末梢性浮腫、乾癬、及びうつ状態の悪化）、いずれも活性化合物に関連する可能性が高いと考えられた。
【０１３１】
プラセボ群での７人中２人の患者と比較して、３０ｍｇのダナゾールを受容した患者のほぼ全員が、１２週間の治療後にＯＣＴの臨床的関連変化を示した（６／７）。治療群では、来院４回目（１２週目）で、ＥＴＤＲＳライン（５文字）による少なくとも１つのＢＣＶＡの明白な改善傾向があった。視力は網膜厚の変化よりも体積変化とより高度に関連していたため、この傾向は、網膜体積の変化で、より顕著である可能性がある。また、ダナゾールの効果がＢＭＩ依存性であることが観察された。つまり、網膜厚に対する３０ｍｇのダナゾール用量の効果は、基線ＢＭＩが増加すると共により著しくなったが（つまり、網膜厚をより多く減少させた）、１０ｍｇの用量は、基線ＢＭＩが増加すると共にそれほど顕著ではなくなった。これは、ダナゾールの性質が親油性であることと一致している。また、網膜厚の変化に対する治療効果は、基線網膜厚に依存していたことが示された。全無作為化患者の基線網膜厚中央値は、４００μｍであった。基線網膜厚が＞４００μｍの患者は、網膜厚が≦４００μｍの患者よりも、ダナゾールによる高い治療効果を示した。この相互作用は、ＢＣＶＡでは観察されなかった。
【０１３２】
実施例２：
この例は、２つの異なる用量のダナゾールをＤＭＥ患者に経口投与した際の効力及び安全性を示す。
【０１３３】
無作為化プラセボ対照並行二重盲検治験を実施して、２つの用量（１日当たり１ＢＭＩ当たり０．５ｍｇ、及び１日当たり１ＢＭＩ当たり１．０ｍｇ）のダナゾールをＤＭＥの成人患者に投与した際の効力及び安全性を実証する。症例数は、４５０人の無作為化患者である。効力は、プラセボ（ラクトース及びステアリン酸マグネシウム）と比較した視力（ＶＡ）の改善により決定することができる。加えて、２つの経口ＢＭＩ関連用量のダナゾールの効力及び忍容性を、プラセボ（ラクトース及びステアリン酸マグネシウム）と比較して、腹側黄斑厚（ＣＭＴ）及びＶＡ応答者状態の変化によりモニターする。
【０１３４】
患者が治験登録基準を満たし、書面によるインフォームドコンセントが得られたら、患者のＢＭＩ及びウエスト／ヒップ比を計算する。２つの用量の経口のダナゾール（又はプラセボ）を、１２週間にわたってＤＭＥの成人患者に投与し、その後４週間休薬して、効果の後退を決定する。休薬期間後、１２週間の非盲検延長治験（Ｏｐｅｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ）を患者に依頼して、至適量のダナゾールの効果持続期間を評価することができる。被験者の３０％が、最初の１２週間の主治験のうち４週間の治療を完了したら、ダナゾールの至適用量を決定することができる。全体にわったて、血漿ダナゾールレベルを収集及びモニターする。
【０１３５】
用量、方法、及び投与：ダナゾールは、経口用量で、２つの１日用量に分割された１ＢＭＩ当たり１ｍｇ又は１ＢＭＩ当たり０．５ｍｇで投与する。ダナゾール及び対応するプラセボを、空腹時に、つまり食事の１時間前又は食事の２時間後に、朝１回投与する２つのカプセル、及び夕方１回投与する２つのカプセルとして、１２週間１日２回投与する。投与されるダナゾールの総１日用量は、主要１２週治験相中、１日当たり１ＢＭＩ当たり０．５ｍｇ及び１日当たり１ＢＭＩ当たり１ｍｇになるだろう。中間分析（下記で考察されている）により決定される至適用量のダナゾールを、非盲検延長治験中１２週間の間１日２回投与することになる。
【０１３６】
プラセボ（ラクトース及びステアリン酸マグネシウム）を経口投与し、２つの１日用量に分割する。
標準糖尿病治療薬を、ダナゾールと共に同時に投与することができる。そのような薬物には、患者の普段の糖尿病薬、高血圧治療薬、抗脂質薬が含まれていてもよい。
【０１３７】
ダナゾール又はプラセボを患者に１２週間投与し、その後４週間の休薬し、その後、１６週目に、患者の視力後退を評価し、１２週非盲検延長治験への登録を依頼することになる。
【０１３８】
１日当たりの用量（４つのカプセルでの）は、下記の表２〜４に示されているように（「Ｃａｐ」はカプセルを指す）、１ＢＭＩ分類当たり０．５ｍｇ又は１ＢＭＩ分類当たり１．０ｍｇの１日用量のプラセボと等しい。
【０１３９】
【表２】
2016503794.tif 000005
【０１４０】
【表３】
2016503794.tif 000006
【０１４１】
【表４】
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【０１４２】
効力決定：基線から１２週まで早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）に従って読まれた最高矯正視力（ＢＣＶＡ）文字の変化を、プラセボと比較する。二次的尺度には、基線から１２週までの光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって測定される中央黄斑厚さ（ＣＭＴ）の変化；１２週での基線から１０文字ＢＣＶＡ以上の視力（ＶＡ）の変化；及び臨床的に著しい異常な検査結果を含む有害事象の頻度及び重症度が含まれる。
【０１４３】
統計方法：一次分析は、次の２つの比較集団：（１）１ＢＭＩ当たり０．５ｍｇのダナゾール対プラセボ；（２）１ＢＭＩ当たり１．０ｍｇのダナゾール対プラセボにおける、基線から１２週目まで変化したＢＣＶＡ文字の多重比較である。読まれた基線文字を共変量として用い、治療の主用効果を用いた共分散（ＡＮＣＯＶＡ）の混合効果分析を、一次分析として実施することになる。両眼のデータが幾つかの被験者で使用可能になるため、混合効果を使用する。多重度は、プラセボに対する各活性集団のダネット比較を用いて考慮することになる。
【０１４４】
二次分析では、基線から１２週目までの治療及びプラセボ間のＣＭＴの変化の差を検討する。基線ＣＭＴの共変量調整を用いる混合効果モデルを使用して、ＣＭＴ変化を評価する。ダネット比較を行って、多重度誤差を修正することになる。
【０１４５】
共変量として含まれる読まれた基線ＢＣＶＡ文字を用いたロジスティックスリンク関数を使用する一般的な評価式（ＧＥＥ）モデルを使用して、１２週目で応答者状態を評価する（１０文字以上の獲得と規定する）。
【０１４６】
実施例３：ダナゾールの血管新生に対する効果（比較）
Ａ．ＨＵＶＥＣ細胞増殖
プロトコール：
初代培養のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＥＧＭ−２増殖培地を、Ｃａｍｂｒｅｘ社（ウォーカーズビル、メリーランド州）から取得した。２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補完された培地で、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の組織培養フラスコで継代した。６０〜８０％コンフルエンスが得られたら、供給業者が指定する通りにトリプシンを使用して継代培養を実施した。
【０１４７】
２継代目のＨＵＶＥＣの凍結保存アンプルを解凍し、９６ウエル組織培養プレートに、５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。ダナゾールの５０ｍＭストック溶液をエタノールで調製し、培地中のＦＣＳを５％に増加させて、ダナゾールの溶解を維持した。０．１〜１００μΜの範囲の終濃度のダナゾールを含有する培地を用いて、細胞を三重反復で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）処理した。２４、４８、及び７２時間のインキュベーショを実施し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製（マジソン、ウィスコンシン州）のＣｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイを使用して細胞増殖を決定した。簡潔に述べると、各ウエルから培地を吸引し、細胞を、３７℃に温めた２００μｌのＣａｍｂｒｅｘ社製Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で洗浄した。１００μｌの希釈ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ溶液（１５μｌストック＋０．１％ＦＣＳを含有する８５μｌのＥＧＭ−２）を各ウエルに添加し、更に４時間インキュベートした。光学密度は、マイクロプレートリーダにより、５３０ｎｍのフィルターを使用し、ブランクを引いた後で決定し、データをＯＤ±標準偏差として示した。ウエル中のエタノールの終濃度は０．２％未満であり、細胞増殖又は生存度に影響を及ぼさなかった。
【０１４８】
データは全て三重反復で実施した代表的な実験として示されている。サブセット間の差異を、マイクロソフト社エクセル（登録商標）でスチューデントｔ検定を使用して分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１４９】
結果、観察、及び考察：
ダナゾールの存在下で初代ＨＵＶＥＣを培養すると、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ増殖アッセイから得られたＯＤは、時間及び用量依存的な様式で減少した（図１）。ｃｅｌｌｔｉｔｅｒアッセイは、アッセイ溶液が、デヒドロゲナーゼ酵素により細胞数に直接相関するホルマザン色素に還元されることに基づく。
【０１５０】
２４時間のダナゾール処理は、非常に高い用量でのみ効果的であると考えられた。アッセイＯＤの有意な減少（ｐ値＜０．０５）は、１０μΜ以上のダナゾールの濃度において見られた。ゼロ用量の（ｎｉｌ）ウエルで検出されたＯＤは、０．４１４±０．０６であり、１０μΜダナゾールでの処理は、ＯＤを０．２８８±０．０３７に減少させ、一方、１００μΜダナゾールは、０．１６２±０．０１７に減少させた。これは、それぞれ３０％及び６５％の阻害パーセントに相当する。
【０１５１】
４８時間後、観察された阻害は、１μΜのレベルでさえ有意であった。４８時間後得られたゼロ用量の読取値は、培地で０．６２９±０．０９５に増加し、１μΜダナゾールにより０．３７８±０．０３７に、１０μΜダナゾールにより０．２４１±０．０１２に、及び１００μΜダナゾールにより０．１９±０．０３３に低減した（又は、それぞれ４０％、６１％、及び７０％＞阻害パーセント）。
【０１５２】
７２時間後、試験したダナゾール処理は全て、ＨＵＶＥＣ増殖の有意な低減を示した。ゼロ用量のウエルで得られたＯＤは、１．１１３±０．０５４であり、０．１μΜダナゾールでの処理後、０．７９８±０．０３７に、１μΜダナゾールでの処理後、０．４８４±０．０２２に、１０μΜダナゾールでの処理後、０．２２９±０．０１６に、及び１００μΜダナゾールでの処理後、０．１５６±０．０１８に低下した（それぞれ２８％、５７％、８０％、及び８６％の阻害）。
【０１５３】
全ての１００μΜダナゾール用量から得られたＯＤ試験は、全ての時点で一定で有り、細胞増殖がこの濃度で完全に停止したことを示す。
要約すると、ダナゾールは、内皮細胞増殖の強力な阻害を示した。
【０１５４】
Ｂ．ＨＵＶＥＣ管形成
プロトコール：  
ＨＵＶＥＣによる毛細管様構造の形成を調査するために、血管新生系：内皮細胞管形成アッセイ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｂｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（サンホゼ、カリフォルニア州）から購入し、製造業者のプロトコールに従って使用した。簡潔に述べると、１００，０００個のＨＵＶＥＣを、５％ＦＣＳの存在下で９６ウエル組織培養プレートの再水和マトリゲルプラグに播種し、管形成を誘導した。ダナゾールを、１μΜ、１０μΜ、又は５０μΜの終濃度になるように添加し、ＬＹ２９４００２（陽性対照）を５０μΜで添加した。１８時間後、ウエルを、倒立顕微鏡に設置したＫｏｄａｋ社製ＤＣＳ  Ｐｒｏ  ＳＬＲ／Ｎデジタルカメラ（ロチェスター、ニューヨーク州）を使用して撮影した。エタノール処理ウエルは、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）が細胞分化に何らかの効果を有していたか否かを決定するために含めた。
【０１５５】
結果、観察、及び考察：
ダナゾールが、ＨＵＶＥＣによる管様構造の形成を防止することができるか否かを解明するために、マトリゲルプラグを含む９６ウエルプレートを使用した。内皮細胞は、血管新生物質の存在下で培養し、細胞外マトリックススキャフォールドを供給すると、おおよそ毛細管と似た構造に分化するだろう。ダナゾールと共に増殖させたＨＵＶＥＣは、対照よりも薄くて、あまりはっきりとしない相互接続部を有する、より少数の組織化構造を示した（図２を参照。Ａ＝対照、Ｂ＝１μΜダナゾール、Ｃ＝１０μΜダナゾール、Ｄ＝５０μΜダナゾール、及びＥ＝５０μΜ  ＬＹ２９４００２）。５０μΜダナゾールでの処理は、プラグにあるＨＵＶＥＣの単離コロニーに結び付き、それらは、非常に少数の薄い接続部又は血管管腔空間を有していた。ダナゾールの効果は、陽性対照化合物ＬＹ２９４００２と非常に類似していた。使用した媒体が影響を及ぼさないことを保証するため、使用した最高用量のダナゾールに対応する濃度のエタノールでウエルを処理したが、管形成に対する影響は観察されなかった（データ非表示）。これらのデータは、５０μΜのダナゾールが、管形成の効果的な阻害剤であることを示す。１μΜ又は１０μΜのダナゾールは、管形成に効果を示さなかった。
【０１５６】
Ｃ．ＨＵＶＥＣ浸潤
プロトコール：
ＢｉｏＣｏａｔマトリゲル浸潤チャンバーを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（サンホゼ、カリフォルニア州）から購入した。インサートを、使用前に、加湿インキュベータ中で、５００μｌのＨＢＳＳを用いて２時間３７℃にて再水和させた。０．１％ＦＣＳを含有する温ＥＧＭ−２で、トリプシン処理ＨＵＶＥＣを２回洗浄し、全体積が２５０μｌで１００，０００個の細胞を、浸潤インサートの上部チャンバーに付加した。ダナゾール及び対照化合物を、１０μΜ及び１００μΜの終濃度で上部リザバーに添加した。５％ＦＣＳで補完された７５０μｌのＥＧＭ−２を底部チャンバーに添加して、浸潤を開始させ、プレートを２４時間インキュベートした。非浸潤細胞を、湿潤綿棒を用いて上部チャンバーから取り除き、その後、インサートをＨＢＳＳで２回洗浄した。その後、インサートを、ＨＢＳＳで調製した１０μΜカルセインＡＭに浸漬して、４時間インキュベートした。蛍光を、励起４８５ｎｍ及び発光５９５ｎｍでマイクロプレートリーダを用いて決定した。ＬＹ２９４００２、及び構造上類似しているが不活性である化合物ＬＹ３０３５１１は、は、この実験ではそれぞれ陽性対照及び陰性対照としての役目を果たした。
【０１５７】
結果：
結果は図７に示されている。データは全て三重反復で実施した代表的な実験として示されている。サブセット間の差異を、マイクロソフト社エクセル（登録商標）でスチューデントｔ検定を使用して分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１５８】
多孔性のマトリゲルコーティングインサートを使用して、ダナゾールが、内皮細胞の浸潤又は遊走を妨害することができるか否かを決定した（図７）。研究に使用した系では、内皮細胞の反対側のチャンバーにＦＣＳを添加した後、細胞の有意な増加が蛍光色素により検出された。（５６７４ＦＵ±７７〜７１４３±５１６）。１０μΜ及び１００μΜ濃度のダナゾールは効果を示さなかったが、ＬＹ２９４００２は、細胞浸潤をほとんど完全に衰退させた（５８１４±１５３）。これらのデータは、ＦＣＳ中に存在する因子が、ＨＵＶＥＣによる、細胞外マトリックスを消化するプロテアーゼの産生を誘導し、その後、走化性勾配に沿った遊走を誘導することを示している。ダナゾールは、このモデルでは、ＨＵＶＥＣの浸潤及び遊走の明白な阻害効果を示さない。
【０１５９】
Ｄ．ＨＵＶＥＣ遊走
プロトコール：
アッセイを実施して、引掻遊走アッセイ（ｓｃｒａｔｃｈ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）における、ＨＵＶＥＣの遊走に対するダナゾールの効果を決定した。８継代目のＨＵＶＥＣ、ロット番号８７５０（Ｌｏｎｚａ社から取得）を、６ウエルプレート（ＩＣＳ  ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ社）中の内皮増殖培地−２（ＥＧＭ−２）完全培地（Ｌｏｎｚａ社から取得）に播種した。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８〜７２時間インキュベートして、コンフルエント単層を達成した。その後、単層を１０００μｌピペット先端で「引っ掻き」、温ＥＧＭ−２培地で２回洗浄した。最終洗浄培地を吸引し、新しいＥＧＭ−２培地、又は一連の濃度のダナゾール濃度（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｄ８３９９）を含有する新しいＥＧＭ−２培地で置換した。損傷を受けた単層を撮影し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータでプレートを更に２４時間インキュベートした。ウエルを再び撮影した。  各画像の間隙を、アドビ（登録商標）フォトショップ（登録商標）ソフトウェアを使用して測定した。間隙測定は、間隙のピクセル数として示されている。
【０１６０】
結果：
３つの別々の実験の結果は、下記の表５に示されている。表５を見ると分かるように、このアッセイでは、５０μΜ、７５μΜ、及び１００μΜのダナゾールが、ＨＵＶＥＣ遊走を有意に阻害することが見出された。このアッセイで使用したＥＧＭ−２培養培地は、上記の項目Ｃに記載のマトリゲルモデルで使用したＦＣＳと比較して、多様な増殖因子を含有する。増殖因子のこの差が、２つのモデルを使用して得られた結果の差を説明することができる。
【０１６１】
【表５】
2016503794.tif 000008
【０１６２】
実施例４：ＨＵＶＥＣ単層の血管透過性に対するダナゾールの効果
プロトコール：
アッセイを実施して、ＨＵＶＥＣ単層の透過性に対するダナゾールの効果を決定した。５〜１０継代目のＨＵＶＥＣ、ロット番号７０１６（Ｌｏｎｚａ社から取得）を、２４ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ社製２４ウエルＴｈｉｎｃｅｒｔ（登録商標）細胞培養インサート、＃６６２６１０、又はＩＳＣ  ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ社、＃Ｔ−３３００−１５）のウエルに位置する１ミクロン孔径インサートに、内皮増殖培地−２（ＥＧＭ−２）（Ｌｏｎｚａ社から取得）を使用して播種した。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８〜７２時間培養して、コンフルエンスを達成し、隙間のない単層を発達させた。その後、培地を取り除き、新しい培地又は一連の濃度のダナゾール濃度を含有する新しい培地（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｄ８３９９）で置換した。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃ＲＴＮＦＡＩ）及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β；Ｓｉｇｍａ社、＃１−９４０１）を、各々１０ｎｇ／ｍｌの終濃度で適切なウエルに添加した。ＴＮＦα及びＩＬ−Ιβは、透過性を誘導し、透過性を最大１０倍増加させることができる。最後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃Ｎ１００、１．２５ｍｇ／ｍｌ）を、１：２５０の最終稀釈で各ウエルに添加した。ＨＲＰは、約４４，０００の分子量を有する大型分子である。最終体積は、各ウエルの上部チャンバーでは３００μｌであり、底部チャンバーでは７００μｌであった。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで更に２４時間インキュベートした。このインキュベーション後、インサートを除去及び廃棄した。インサート上の細胞の目視検査は、単層が全て依然として無傷であることを示した。
【０１６３】
ＨＲＰ通過画分を評価するために、底部チャンバーの、その結果生じた溶液の１５μｌを、９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに移した（各反応は、三重反復で実施した）。次に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）を、各ウエルに添加し、室温で５分間発色させた。１００μｌの０．１８Ｎ酸性溶液を添加することにより、発色を停止させた。各ウエルのＯＤを、４５０ｎｍマイナス５３０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダを使用して決定した。対照に対する透過性の阻害パーセントを算出した。３つの別々の試験の平均は、表６に示されている。
【０１６４】
表６を見ると分かるように、２５．０μΜ以上の濃度のダナゾールは、実際に血管透過性を増加させた。１０．０μΜの濃度は、血管透過性に対して、ほとんど又はまったく効果を示さなかった。０．１μΜ〜５．０μΜの濃度のダナゾールが、血管透過性を低下させ、０．１μΜ〜０．５μΜが最適であった。用量−反応曲線は、０．００１μΜ〜（又は恐らくは更に低い）０．００５μΜの濃度に第２の阻害ピークがあるため、非常に興味深い。したがって、ダナゾールが示す、血管透過性に関する用量応答曲線は、非常に驚くべきものであり、予想外のものである。
【０１６５】
実施例３に示されているように、５０μΜ〜１００μΜの濃度が、ダナゾールと共に１８〜２４時間インキュベーションした後で、ＨＵＶＥＣ増殖、遊走、及び管形成の阻害を得るのに必要とされるだろう。この実施例４に示されているように、血管新生を阻害するためのこれらの至適濃度は、２４時間後に血管透過性を劇的に増加させるだろう（表２を参照）。反対に、血管透過性を阻害するために使用される至適濃度（０．１μΜ〜０．５μΜ）は、２４時間では血管新生に有意な効果を示さない。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
実施例５：血管透過性に対するダナゾール効果
９継代目のヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）を、８０％のコンフルエンスが得られるまで、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社、ウォーカーズビル、メリーランド州）で継代した。その後、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、細胞を継代フラスコから剥離させ、その結果生じた懸濁液中の細胞を計数して、生存度及び細胞数を両方とも決定した。細胞懸濁液の生存度は、この実験では９０％を超えていた。
【０１６８】
その後、細胞を、２４ウエルウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ社製Ｔｈｉｎｃｅｒｔ細胞培養インサート、＃６６２６１０）のウエルの３００μｌのＥＧＭ−２完全培地（Ｌｏｎｚａ社から取得）に配置したインサート（１ミクロン孔径）に播種した。その後、７００μｌのＥＧＭ−２を底部チャンバーに配置し、プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８時間インキュベートし、コンフルエント単層を達成した。経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）測定は、全てのインサートが半透過性障壁を確立したのを確認するために、ＥＶＯＭ２電圧抵抗計に接続されたＳＴＸ１００電極（両方ともＷｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して測定した。測定を実施するために、１つのプローブを各ウエルに配置し、上部チャンバーに１つの電極及び底部チャンバーに１つの電極とした。
【０１６９】
その後、細胞を、二重反復で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）以下のように処理した。ＥＧＭ−２培地を、インサートから注意深くデカントし、０．５％ウシ胎仔血清、及びＶＥＧＦ及びヒドロコルチゾンを除いてＥＧＭ−２補完物を含有するＩＭＤＭ培地で置換した（いずれもＬｏｎｚａ社製）。幾つかのウエルでは、ＩＭＤＭ培地は、１０倍連続希釈したダナゾール（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｄ８３９９）を含有していた。４％蛍光標識ヒト血清アルブミンを含有する３０μｌの溶液を、各ウエルの上部チャンバーに添加する前に、プレートを５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４時間インキュベートした。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで更に１８時間インキュベートした。
【０１７０】
このインキュベーションの後、インサートを除去及び廃棄し、底部チャンバーの２００μｌの培地を、９６ウエル黒色蛍光プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に三重反復で移した。その後、各ウエルの蛍光を、３４０ｎｍの励起波長及び４７０ｎｍの発光波長で測定した。その後、各インサートの平均蛍光単位（ＦＵ）を算出し、二重反復測定値を平均した。結果は表３に示されている。
【０１７１】
【表７】
2016503794.tif 000010
【０１７２】
表からわかるように、最低濃度のダナゾール（０．０１μΜ）が、最大の阻害（約１０％）をもたらした。無細胞で実施した対照ウエルは、下部チャンバーで４０００を超えるＦＵをもたらし、網膜内皮単層が選択的に透過性であることを示した。
【０１７３】
実施例６：３つの異なる内皮細胞単層のＴＥＲに対するダナゾールの効果
アッセイを実施して、ヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）の経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対するダナゾールの効果を決定した。そのために、１５００００個の１４継代目のヒト網膜内皮細胞を、２４ウエルウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ社製Ｔｈｉｎｃｅｒｔ細胞培養インサート、＃６６２６１０）のウエルの３００μｌのＥＧＭ−２完全培地（Ｌｏｎｚａ社から取得）に配置されたインサート（１ミクロン孔径）に播種した。その後、プレートを、５％ＣＯ２の３７℃のインキュベータで更に２４時間インキュベートした。インキュベーションした後、培地を注意深くデカントし、新しいＥＧＭ−２又は１μΜ終濃度のダナゾールを含有する新しいＥＧＭ−２のいずれかで置換した。プレートを、インキュベータに戻し、更に１４４時間培養した。また、８継代目のヒト脳内皮細胞及び８継代目のヒト臍帯静脈内皮細胞を使用して、アッセイを同じ様式で実施した。
【０１７４】
各インサートの初期ＴＥＲ測定値は、ＳＴＸ１００電極に接続されたＥＶＯＭ２電圧抵抗計（両方ともＷｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を使用して測定した。また、測定は、２４、４８、７２、及び１４４時間で測定した。結果は、下記の表８、９、及び１０に示されている。データは全て、ブランクインサートのＴＥＲを差し引いたインサートのＴＥＲ測定値／ｃｍ２として示されている。
【０１７５】
【表８】
2016503794.tif 000011
【０１７６】
【表９】
2016503794.tif 000012
【０１７７】
【表１０】
2016503794.tif 000013
【０１７８】
表からわかるように、ダナゾールは、網膜内皮細胞単層及び臍帯静脈内皮細胞単層のＴＥＲ測定値を高めた（イオン透過性が低減した）。ダナゾールは、最も早い時点を除いて、脳内皮細胞単層のＴＥＲに大きな効果を示さないと考えられた。ＴＥＲは、細胞単層を横切る電気抵抗の測定値である。ＴＥＲは、障壁完全性の指標であり、イオン透過性と相関する。
【０１７９】
実施例７：Ａｋｔリン酸化に対するダナゾール効果
アッセイを実施して、ヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）のＡｋｔリン酸化に対するダナゾールの効果を決定した。細胞を、２５ｃｍ２フラスコ中、２％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ社）を含有するＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社、ウォーカーズビル、メリーランド州）中でほぼコンフルエンスに達するまで増殖させた。その後、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して、細胞を継代フラスコから剥離した。その結果生じた懸濁液中の細胞を計数し、９６ウエルプレートのＥＧＭ−２培地に１×１０４細胞／ウエルで播種した。プレートを、５％ＣＯ２で３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、ＥＧＭ−２培地（対照）又は種々の濃度のダナゾールのいずれかの２００μｌを添加し、プレートを更に２時間インキュベートした。このインキュベーションの後、４％ホルムアルデヒドで細胞を直ちに固定し、冷却した。Ａｋｔのリン酸化の程度を、製造業者のプロトコールに従って、Ａｋｔシグナル伝達細胞活性化ＥＬＩＳＡキット（ＡＫＴＳ４７３用ＣＡＳＥ（商標）キット；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フレデリック、メリーランド州）を使用して決定した。ＡＫＴＳ４７３用のＣＡＳＥ（商標）キットは、総Ａｋｔタンパク質に対する活性化（リン酸化）Ａｋｔタンパク質の量を、比色検出を用いた従来型ＥＬＩＳＡ形式を使用した並行分析で定量化する。Ａｋｔリン酸化部位は、セリン４７３であり、２つ並行アッセイの一方で使用される抗体の１つにより認識され、活性化Ａｋｔタンパク質の測定を提供する。他方の並行アッセイで使用される他の抗体は、Ａｋｔを認識し、総Ａｋｔタンパク質の測定を提供する。いずれの一次抗体も、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して検出される。製造業者の発色溶液を１０分間添加し、その後製造業者の停止溶液を添加すると、比色測定で測定することができる結果がもたらされる。
【０１８０】
結果は、下記の表１１に示されている。表から分かるように、全濃度のダナゾールが、Ａｋｔリン酸化（活性化）の増加を引き起こした。
【０１８１】
【表１１】
2016503794.tif 000014
【０１８２】
これらの結果は、実施例４で得られた血管透過性用量応答曲線の可能性としてあり得る説明を提供すると考えられる。実施例４に示されているように、低用量のダナゾールは透過性を低減させたが、高用量は透過性を増加させた。Ｓ４７３におけるＡｋｔのあるレベルのリン酸化は、透過性を低減させるが（この試験では、０．５〜５．０μΜ濃度）、Ｓ４７３におけるＡｋｔの過剰リン酸化は、透過性の増加を引き起こす（この試験では、１０〜５０μΜ濃度）と考えられる。
【０１８３】
実施例８：網膜内皮細胞単層のＴＥＲに対するダナゾール及びステロイド受容体アンタゴニストの効果
アッセイを実施して、ヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）の経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対するダナゾール及びステロイド受容体アンタゴニストの効果を決定した。  そのために、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製組織培養ウエルインサート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ  ２４ウエルＴｈｉｎｃｅｒｔ細胞培養インサート、＃６６２６１０）を、５μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ社）でコーティングした。その後、１２継代目のヒト網膜内皮細胞を、３００μｌのＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）体積中１インサート当たり１２０，０００個の細胞で、ウエルの上部チャンバーに播種した。下部チャンバーの体積は、７００μｌのＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）であった。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８時間培養し、完全な単層を確立した。インキュベーションの終了時に、ＥＶＯＭ２電圧抵抗計に接続されたＳＴＸ２プローブ（両方ともＷｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を使用して、インサート全てについてＴＥＲ測定値を測定し、内皮障壁の完全性を確認した。インサートは全て、無細胞インサートと比較して抵抗の上昇を示した。
【０１８４】
その後、培地を注意深くデカントし、幾つかの添加剤を有する新しいＥＧＭ−２、及び幾つかの添加剤を有していない新しいＥＧＭ−２で置換した。添加剤は、ダナゾール、ヒドロキシフルタミド（アンドロゲン受容体アンタゴニスト）、フルベストラント（ｆｌｕｖｅｓｔｒａｎｔ）（エストロゲンアンタゴニスト）、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（対照）であった。添加剤のストック溶液は全て、ダナゾールを除いて、ＤＭＳＯ中１０ｍＭで作製した。ダナゾールストック溶液は、エタノール中１０ｍＭであった。添加剤の２００μΜ作業用希釈液は全て、同じ溶媒で作製した。その後、各添加剤の２００ｎＭ希釈液、並びにエタノール及びＤＭＳＯ（対照）の等価な希釈の２００ｎＭ希釈液をＥＧＭ−２培地で作製し、ダナゾール及び他の添加剤の各々又は培地（対照）を、下記の表に示されている組み合わせ及び終濃度でウエルに添加した。その後、プレートを、インキュベータに戻し、３０分、６０分、１２０分、及び２４時間時に、各インサートのＴＥＲ測定値を、上記に記載のように測定した。ＴＥＲは、インサートの読取値からバックグラウンド測定値（空インサート）を差し引き、インサートの表面積（０．３３ｃｍ２）で割ることにより算出した。結果は、下記の表１２に示されている。
【０１８５】
【表１２】
2016503794.tif 000015
【０１８６】
表１２から分かるように、ダナゾール及びフルベストラントは、対照（未処理）と比較して、ＴＥＲ測定値を増加させたが（透過性を低減させた）、ヒドロキシフルタミドは、測定値を低減させた（透過性を増加させた）。ダナゾールは、ヒドロキシフルタミドにより引き起こされる低下を防止した。これは、ダナゾールが、これらの細胞のアンドロゲン受容体を占有しているという証拠であり得る。ダナゾール及びフルベストラントは、幾つかの時点で相加的な結果を示した。
【０１８７】
実施例９：アクチンストレスファイバー形成に対するダナゾールの効果
傍細胞経路のＩＥＪには、ＡＪ及びＴＪが含まれる。アクチン細胞骨格は、各接合部に結合しており、アクチン再構成により接合部の完全性を制御する。アクチンフィラメントがストレスファイバーに再編成されることにより、それらを引き離す機械的な力が接合部にかかる結果となり、細胞収縮及び形態変化が引き起こされる。アクチン重合のプロセスは非常に動的であり、それにより、アクチン構造の迅速な再編成、並びに厚い皮質アクチン環及びストレスファイバーの非存在を特徴とする静止表現型から、皮質アクチンが薄いか又は存在せず、ストレスファイバーが多量に存在する活性化細胞表現型への移行が可能になる。また、アクチン細胞骨格は、恐らくはカベオラの運動を制御することにより、トランスサイトーシスに関与すると考えられる。
【０１８８】
ヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）を、Ｆａｌｃｏｎ  Ｏｐｔｉｌｕｘ（登録商標）アッセイプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の、２００μｌの全体積のＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）に、１ウエル当たり１０００個の細胞で播種した。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８時間培養した。その後、培地を除去し、０．１％ウシ胎仔血清を補完した２００μｌのＩＭＤＭ培地で置換した（いずれもＬｏｎｚａ社製）。細胞を、これらの増殖因子及び血清枯渇条件下で１時間培養し、アクチン重合を抑制した。その後、ダナゾール（０．１μΜ又は１０μΜ終濃度）又はＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０μΜ終濃度）（陽性対照）を添加した。これらの化合物を添加した直後に、ＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍｌの終濃度）を添加した。５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで３０分間インキュベーションした後、培地を吸引し、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中３．６％のホルムアルデヒドで１０分間室温にて固定した。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を使用して５分間透過処理した。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、細胞に、ＰＢＳで１：４０に希釈した５０μｌのローダミン−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加してＦ−アクチンを染色し、室温で２０分間細胞上に残しておいた。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。その後、１００μｌのＰＢＳを各ウエルに添加し、ローダミンフィルター（ｅｘ５３０／ｅｍ５９０）を備えた倒立顕微鏡を使用して、細胞を観察及び撮影した。
【０１８９】
こうした結果は、ダナゾールが、ストレスファイバーの発生能力に影響を及ぼしたことを示していた。ダナゾールで処理すると、細胞は、用量に応じて異なる染色パターンを示した。より低いダナゾール用量（０．１μΜ）では、細胞質の全体にわたる拡散染色が観察された。これは、安定化事象又は休止表現型を示している可能性がある。より高いダナゾール用量（１０．０μΜ）では、複数の焦点を有するストレスファイバーが検出された。これらの知見は、より低いダナゾール用量が透過性を阻害し、より高いダナゾール用量は透過性を増加させるという上記の結果（上記の実施例を参照）と相関している。ＴＮＦαは細胞を刺激し、強く染色された焦点を有するストレスファイバーの強力な発生に結びついた。ダナゾール及びＬＹ２９４００２は、ＴＮＦαによるストレスファイバー発生を示す細胞数を減少させた。
【０１９０】
実施例１０：アクチンストレスファイバー形成に対するダナゾールの効果
ヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）を、１μｇ／ｃｍ２フィブロネクチンでコーティングされたＦａｌｃｏｎ  Ｏｐｔｉｌｕｘ（登録商標）アッセイプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の、２００μｌの全体積のＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）に、１ウエル当たり３０００個の細胞で播種した。その後、プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８時間培養した。その後、培地を除去し、２．０％ウシ胎仔血清で補完された２００μｌのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（登録商標）培地で置換した（いずれもＬｏｎｚａ社製）。細胞を、これらの増殖因子及び血清枯渇条件下で一晩培養し、アクチン重合を抑制した。  その後、培地を除去し、ダナゾール（０．１μΜ、１μΜ、又は１０μΜ）又はＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０μΜ）（陽性対照）を含有する、２．０％ウシ胎仔血清で補完された新しいＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地で置換した。これらの化合物と共に、５％のＣＯ２の３７℃インキュベータで３０分間インキュベーションした後、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（２５ｎｇ／ｍｌの終濃度）を添加した。５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで更に３０分間インキュベーションした後、培地を吸引し、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中３．６％のホルムアルデヒドで１０分間室温にて固定した。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して５分間透過処理した。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで１：４０に希釈した５０μｌのローダミン−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を細胞に添加してＦ−アクチンを染色し、室温で２０分間細胞上に残しておいた。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。核を対比染色するために、１００μｌの３μΜ  ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール，ジラクタート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）溶液を、各ウエルに添加した。５分後、細胞を、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。その後、１００μｌのＰＢＳを各ウエルに添加し、ローダミンフィルター（ｅｘ５３０／ｅｍ５９０）及びＤＡＰＩフィルター（ｅｘ３５０／ｅｍ４６０）を備えた倒立顕微鏡を使用して、細胞を観察及び撮影した。
【０１９１】
こうした結果は、ダナゾールが、ストレスファイバーの発生能力に影響を及ぼしたことを示していた。ダナゾールで処理すると、細胞は、適用した用量に応じて異なるストレスファイバー形成パターンを示した。最も低いダナゾール用量（０．１μΜ）では、細胞質の全体にわたる拡散したＦアクチン染色が観察された。１．０μΜのダナゾールでは、拡散染色が依然として観察されたが、ほとんどの細胞の境界付近にストレスファイバー及び焦点が視認できた。最も高いダナゾール用量（１０．０μΜ）では、拡散染色はもはや存在せず、ストレスファイバー発生及び焦点が見られた。より低い用量のダナゾールで見られた染色は、核周囲染色パターンを示し、パクリタキセル（微小管を安定化及び重合化することが知られているタキソール化合物）で観察されるものと類似した微小管安定化を示した。ＶＥＧＦでは、強力なストレスファイバー発生があった。ダナゾールは、用量依存的な様式ででＶＥＧＦパターンを変更した：（ｉ）最も低い０．１μΜダナゾール用量は、ストレスファイバーをあまり目立たなくし、幾つかの拡散染色が現われた；（ｉｉ）１．０μΜ用量は、より少数の厚いストレスファイバーを示したが、接触面には焦点が見られた；及び（ｉｉｉ）最も高い１０．０μΜのダナゾール用量は、焦点を有する強力なストレスファイバー発生を示した。ＬＹ２９４００２は、ＶＥＧＦで見られる強力なストレスファイバー発生を防止し、拡散染色を示した。
【０１９２】
実施例１１：血管内皮カドヘリン（ＶＥカドヘリン）リン酸化に対するダナゾールの効果
１２継代目のヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）を、フィブロネクチンでコーティングした（１μｇ／ｃｍ２）１０ｃｍ２組織培養プレートで、ＥＧＭ−２培養培地（Ｌｏｎｚａ社）を使用して、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータにてコンフルエンスになるまで増殖させた。完全なコンフルエンスが達成されたら、培地を、０．５％ウシ胎仔血清及びＬ−グルタミンで補完された２００μｌのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地で置換した（いずれもＬｏｎｚａ社製）。細胞を、これらの増殖因子及び血清枯渇条件下で２４時間培養した。  その後、培地を除去し、ダナゾール（０．１μΜ、１μΜ、又は１０μΜ）又はエタノール（媒体対照）を含有する、０．５％ウシ胎仔血清及びＬ−グルタミンで補完された新しいＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地で置換した。５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで１５分間インキュベーションした後、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（５０ｎｇ／ｍｌの終濃度）を添加し、プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで更に１５分間インキュベートした。
【０１９３】
プレートを直ちに処理して、以下のように細胞を溶解した。ＰＢＳ及び溶解緩衝液（ホスファターゼ阻害剤溶液１及び２（Ｓｉｇｍａ社）、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ社）、及び２ｍＭ終濃度のオルトバナジン酸ナトリウムで補完された、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ）を４℃に冷却した。細胞を５ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、５００μｌの氷冷溶解緩衝液で溶解した。その結果生じたタンパク質抽出物を、１．７ｍｌの微量遠心チューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心することにより、細胞残屑を除去した。その後、４５０μｌの清澄溶液を、１０μｌのＣ１９抗ＶＥカドヘリンポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）でコーティングした２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するチューブに移した（コーティングは、製造業者のプロトコールに従って実施した）。その後、抽出物及びビーズを、オービタルシェーカで一晩４℃にてインキュベートして、抽出物からＶＥカドヘリンを捕捉した。  その後、ビーズを、氷冷溶解緩衝液で４回洗浄した。タンパク質をビーズから放出するために、２０％還元色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＳＤＳローディング色素中で、ビーズを１０分間７５℃に加熱した。
【０１９４】
放出されたタンパク質を、１２０ボルトで１時間、４−２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で分離した。ゲル中のリン酸化及び総タンパク質を決定するために、Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）ｄｉａｍｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＳＹＰＲＯ（登録商標）ｒｕｂｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）タンパク質染色を、製造業者のプロトコールに従って連続して実施した。ゲルを撮影し、濃度測定は、Ｋｏｄａｋ社製イメージステーションを使用して実施した。結果は、下記の表１３に示されている。
【０１９５】
【表１３】
2016503794.tif 000016
【０１９６】
表から分かるように、ダナゾールは、ＶＥ−カドヘリンリン酸化の増加を引き起こした。ＶＥＧＦは、ＶＥ−カドヘリンリン酸化（過剰リン酸化）の更に大きな増加を引き起こしたが、これはダナゾールにより改善された。ＶＥ−カドヘリンは、ＡＪの成分であり、ＶＥ−カドヘリンのリン酸化は、残基に応じて様々な効果を示し得る。一般的に、ＶＥカ−ドヘリンのチロシンリン酸化は、ＡＪ解体及び透過性増加に結び付く。しかしながら、セリン６６５のリン酸化は、障壁機能の低下に関連するＶＥ−カドヘリンの迅速だが可逆的な内部移行を引き起こす。内在化されたＶＥ−カドヘリンが、ＡＪと複合体を形成するスキャフォールドタンパク質である細胞質ｐ１２０の増加を駆動するフィードバックループが存在すると考えられる。この上方制御は、Ｒａｃｌ、Ｒａｐ−１、及びＣｄｃ４２のような障壁安定化ＧＴＰａｓｅの増加と関連する活性ＲｈｏＡの減少を誘導する。この実験で観察された、低用量ダナゾール処理後のＶＥ−カドヘリンリン酸化の増加は、障壁安定化ＧＴＰａｓｅの活性化に結び付くと考えられる。加えて、ダナゾールは、ＶＥＧＦにより誘導される不安定化リン酸化事象を防止することができる。
【０１９７】
実施例１２：網膜内皮細胞単層のＴＥＲに対するダナゾール及びステロイド受容体アンタゴニストの効果
アッセイを実施して、ヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）の経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対するダナゾール及びステロイド受容体アンタゴニストの効果を決定した。  そのために、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製組織培養ウエルインサート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ  ２４ウエルＴｈｉｎｃｅｒｔ細胞培養インサート、＃６６２６１０）を、５μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチンでコーティングした。  その後、１３継代目のヒト網膜内皮細胞を、３００μｌのＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）の体積中１インサート当たり１２０，０００個の細胞でウエルの上部チャンバーに播種した。  下部チャンバーの体積は、７００μｌのＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）であった。プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで４８時間培養して、完全な単層を確立した。インキュベーションの終了時に、ＥＶＯＭ２電圧抵抗計に接続されたＳＴＸ２プローブ（両方ともＷｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を使用してＴＥＲ測定値を、インサート全てについて測定して、内皮障壁の完全性を確認した。インサートは全て、無細胞インサートと比較して抵抗の上昇を示した。
【０１９８】
その後、培養培地を注意深くデカントし、幾つかの添加剤を有する新しいＥＧＭ−２、及び添加剤を有しない新しいＥＧＭ−２で置換した。添加剤は、ダナゾール、ヒドロキシフルタミド（アンドロゲン受容体アンタゴニスト）、フルベストラント（エストロゲンアンタゴニスト）、テストステロン、エストラジオール、及びＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（対照）であった。添加剤のストック溶液は全て、ダナゾールを除いて、ＤＭＳＯ中１０ｍＭで作製した。ダナゾールストック溶液は、エタノール中１０ｍＭであった。添加剤の２００μΜ作業用希釈液は全て、同じ溶媒で作製した。その後、各添加剤の２００ｎＭ希釈液、並びにエタノール及びＤＭＳＯ（対照）の同等の希釈の２００ｎＭ希釈液をＥＧＭ−２培地で作製し、ダナゾール及び他の添加剤の各々又は培地（対照）を、下記の表に示されている組み合わせ及び終濃度でウエルに添加した。その後、プレートを、インキュベータに戻し、５分、３０分、６０分、及び２４時間時に、各インサートのＴＥＲ測定値を、上記に記載のように測定した。ＴＥＲは、インサートの読取値からバックグラウンド測定値（空インサート）を差し引き、インサートの表面積（０．３３ｃｍ２）で割ることにより算出した。結果は、下記の表１４に示されている。
【０１９９】
表１４から分かるように、対照（未処理）と比較して、ダナゾールはＴＥＲ測定値を増加させ、ヒドロキシフルタミドは読取値を低減させ、テストステロンは、読取値を非常にわずかに低減させ、フルベストラントは実質的に効果を示さなかった。ダナゾールは、ヒドロキシフルタミドにより引き起こされる低減、及びテストステロンで見られる非常にわずかな低減を防止した。実施例８の結果と同様に、これは、ダナゾールが、これらの細胞のアンドロゲン受容体を占有しているという証拠であり得る。
【０２００】
【表１４】
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【０２０１】
実施例１３：アクチンストレスファイバー形成に対するダナゾールの効果
６継代目のヒト腎糸球体微小血管内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １２８、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの独占販売店）、カークランド、ワシントン州）及び１２継代目のヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの独占販売店）、カークランド、ワシントン州）を、５μｇ／ｃｍ２フィブロネクチンでコーティングした１６チャンバースライドガラスに、全体積が２００μｌのＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社）中１ウエル当たり２０００個の細胞で播種した。その後、プレートを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで、毎日培地を交換して４８時間培養した。その後、ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｌｏｎｚａ社）で希釈した試験化合物（ダナゾール、ＴＮＦα、及びＳＩＰ）を添加して、以下の終濃度にした：ダナゾール（１μΜ）（Ｓｉｇｍａ社）、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社）、及びＳＩＰ（１μΜ）（Ｓｉｇｍａ社）。スライドを、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで、１５分間、３０分間、又は２４時間、試験化合物と共にインキュベートした。このインキュベーション後、培地を吸引し、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中３．６％のホルムアルデヒドで１０分間室温にて固定した。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を使用して、細胞を５分間透過処理した。その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで１：４０に希釈した５０μｌのローダミン−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を細胞に添加してＦ−アクチンを染色し、室温で２０分間細胞上に残しておいた。  その後、全てのウエルを、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。その後、１００μｌのＰＢＳを各ウエルに添加し、ローダミンフィルター（ｅｘ５３０／ｅｍ５９０）を備えた倒立顕微鏡を使用して、細胞を観察及び撮影した。
【０２０２】
結果は、ダナゾールが、腎糸球体微小血管内皮細胞でのストレスファイバーの発生能力に影響を及ぼしたことを示した。ダナゾールのみで処理すると、細胞は、１５分で核周囲染色を示し、３時間で細胞の全体にわたる拡散染色を示し、細胞の多くは波状縁を有しており、２４時間では未処理対照と同じような染色を示した。ＴＮＦαのみでは、ストレスファイバーが常時観察され、ストレスファイバーを示す細胞の数及びファイバーの厚さは、時間と共に増加した。ダナゾールは、ストレスファイバー形成及びファイバーの厚さを常時減少させ、皮層アクチン環及び波状縁は、３時間後から視認できた。ＳＩＰのみで処理した細胞は、アクチン皮層環を示し、１５分後から発生し、３時間で最も強くなった。細胞は、２４時間で未処理対照と同じような形態に戻りつつあった。ダナゾールは、皮層環を増強すると考えられた。また、拡散染色は、特に１５分及び２４時間で観察された。
【０２０３】
ダナゾールのみで処理した網膜内皮細胞の場合、細胞は、１５分で核周囲染色を示し、３時間で細胞の全体にわたる拡散染色を示し、細胞の多くは波状縁を有し、２４時間では未処理対照と同じような染色を示した。ＴＮＦαのみでは、ストレスファイバーが常時観察され、ストレスファイバーを示す細胞の数及びファイバーの厚さは、１５分から３時間まで増加し、インキュベーションの２４時間後に減少した。ダナゾールは、ストレスファイバーの形成及び／又はファイバーの厚さを常時減少させた。拡散染色は、１５分及び２４時間で観察され、皮層アクチン環は３時間で視認できた。ＳＩＰのみで処理した細胞は、アクチン皮層環を示し、１５分後から発生し、３時間で最も強くなった。細胞は、２４時間で未処理対照と同じような形態に戻りつつあった。ダナゾールは、３時間で皮層環を増強すると考えられた。また、拡散染色は、特に１５分及び２４時間で観察された。
【０２０４】
ＳＩＰ（スフィンゴシン−１ホスファート）は、血管内皮の形成及び維持に非常に重要な機能を果たす。ＳＩＰは、アクチン細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｉｏｎ）に対するその効果により血管内皮の組織化及び障壁機能を促進する構成的シグナル伝達入力である。特に、ＳＩＰは、皮層アクチンファイバーの形成及び接着結合の構造に関与する。ＳＩＰの欠乏は、血管漏出及び浮腫に結びつき、ＳＩＰは、内皮細胞機能不全を改善し、障壁機能を回復させることができる。
【０２０５】
この実験では、ダナゾールは、網膜内皮細胞及び糸球体内皮細胞の両方でＳＩＰの保護効果を強化する能力を示した。また、ダナゾールは、これらのタイプの内皮細胞の両方で、ＴＮＦαにより誘導されたストレスファイバーの形成を改善した。拡散核周囲染色は、ダナゾールのみで処理された細胞で見られる。
【０２０６】
実施例１４：ＥＣＩＳに対するダナゾールの効果
アッセイを実施して、ヒト腎糸球体微小血管内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １２８、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの独占販売店）、カークランド、ワシントン州）又はヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの独占販売店）、カークランド、ワシントン州）の経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対するダナゾールの効果を決定した。８ウエル多重電極プレート（８Ｗ１０Ｅ）を備えた電気的細胞−基質インピーダンス感知（ＥＣＩＳ）システム（ＥＣＩＳＺθ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ社から入手）を使用して、電気抵抗を測定した。１ウエル当たり１００μｌの体積のフィブロネクチンを添加し、プレートを５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで３０分間インキュベートすることにより、プレートの各ウエルを、ＨＢＳＳ中５μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチンでコーティングした。フィブロネクチン溶液を除去し、４００μｌのＥＧＭ−２培養培地（Ｌｏｎｚａ社）を各ウエルに添加した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに接続し、電気的に安定させた。ＥＧＭ−２培地を吸引し、１ウエル当たり１００，０００個の細胞を含有する、２００μｌのＥＧＭ−２培養培地で置換した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに再接続し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで２４時間インキュベートした。ＥＧＭ−２培地を吸引し、１ウエル当たり４００μｌの新しいＥＧＭ−２培養培地で置換した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに再接続し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで６時間インキュベートした。試験化合物のＨＢＳＳ濃縮溶液を調製し、インキュベータに入れて平衡化した。その後、試験化合物を、以下の終濃度：ダナゾール（１μΜ）（Ｓｉｇｍａ社）及びＳＩＰ（１μΜ）（Ｓｉｇｍａ社）で、適切なウエルに添加した。ＥＣＩＳ（抵抗）を９０時間モニタした。
【０２０７】
網膜内皮細胞では、１．０μΜダナゾール単独では、未処理細胞と比較してＥＣＩＳの増加を示し、処理の約１．５〜２．０時間後から始まり、５時間続いた。ＳＩＰ単独では、未処理細胞と比較してＥＣＩＳの増加を示し、それは、処理の１５分後以内に始まり、約３時間続いた。ダナゾール及びＳＩＰの組み合わせは、ＳＩＰ単独及び未処理細胞と比較してＥＣＩＳ増加させ、この増加したＥＣＩＳは、約９０時間続いた。したがって、ダナゾールは、ＳＩＰの初期効果を増強し、ＳＩＰが存在した実験の全体にわたって、より高い抵抗を維持する能力を示した。
【０２０８】
糸球体内皮細胞は、異なるパターンを示した。ダナゾール単独では、処理後約３０時間までＥＣＩＳに効果を示さなかった。ダナゾール単独では、未処理細胞と比較して、約３０から約９０時間までＥＣＩＳが増加し、最大の増加は約６０〜９０時間で生じた。また、ＳＩＰ単独では、処理後約３０時間までＥＣＩＳに効果を示さなかった。ＳＩＰ単独では、未処理細胞と比較して、約３０から約６０時間までＥＣＩＳが増加した。ダナゾール及びＳＩＰの組み合わせでは、処理後約３０時間までＥＣＩＳに効果を示さなかった。この組み合わせは、未処理細胞、ＳＩＰ単独、及びダナゾール単独で比較して、ＥＣＩＳを増加させた。特に、この組み合わせは、未処理細胞と比較して、約３０から約７０時間までＥＣＩＳを増加させ、ＳＩＰ単独でと比較して、約３０から７５時間までＥＣＩＳを増加させ、ダナゾール単独と比較して、約３０から約５０時間までＥＣＩＳを増加させた。
【０２０９】
実施例１５：ＥＣＩＳに対するダナゾールの効果
アッセイを実施して、ヒト腎糸球体微小血管内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １２８、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの独占販売店）、カークランド、ワシントン州）の経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対するダナゾールの効果を決定した。８ウエル多重電極プレート（８Ｗ１０Ｅ）を備えた電気的細胞−基質インピーダンス感知（ＥＣＩＳ）システム（ＥＣＩＳＺθ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓから入手）を使用して、電気抵抗を測定した。１ウエル当たり５０μｌの体積のフィブロネクチンを添加し、プレートを５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで３０分間インキュベートすることにより、プレートの各ウエルを、ＨＢＳＳ中５μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチンでコーティングした。フィブロネクチン溶液を除去し、２００μｌのＥＧＭ−２培養培地（Ｌｏｎｚａ社）を各ウエルに添加した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに接続し、電気的に安定させた。ＥＧＭ−２培地を吸引し、１ウエル当たり４０，０００個の６継代目の細胞を含有する、２００μｌのＥＧＭ−２培養培地で置換した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに再接続し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで２４時間インキュベートした。ＥＧＭ−２培地を吸引し、１ウエル当たり２００μｌの新しいＥＧＭ−２培養培地で置換した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに再接続し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで更に２４時間インキュベートした。ＥＧＭ−２培地を吸引し、１ウエル当たり２００μｌの、デキサメタゾンを含まない新しいＥＧＭ−２培地で置換した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに再接続し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで一晩インキュベートした。最後に、ＥＧＭ−２培地を吸引し、１ウエル当たり２００μｌの、デキサメタゾンを含まない新しいＥＧＭ−２培養培地で置換した。プレートを、ＥＣＩＳＺθシステムに再接続し、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで２時間インキュベートした。試験化合物のＨＢＳＳ濃縮溶液を調製し、インキュベータに入れて平衡化した。その後、試験化合物を、以下の終濃度：ダナゾール（１μΜ）（Ｓｉｇｍａ社）及びデキサメタゾン（１μΜ）（Ｓｉｇｍａ社）で、適切なウエルに添加した。ＥＣＩＳ（抵抗）を９０時間モニターした。
【０２１０】
ダナゾール単独では、未処理細胞と比較して、ＥＣＩＳが増加し、約３時間から始まり約９０時間まで続いた。増加は、約１２時間から約１５時間までが最も大きかった。デキサメタゾンと比較して、ダナゾールは同様のパターンを示したが、ＥＣＩＳ（ＴＥＲ）の増強はそれほど大きくなかった。
【０２１１】
実施例１６：ＲｈｏＡに対するダナゾールの効果
内皮細胞骨格の再構成は、内皮の多くの機能のなかでも中心的なものである。小型ＧＴＰ−結合タンパク質のＲｈｏファミリーは、Ｆ−アクチン細胞骨格動力学の重要な調節因子であると特定されている。Ｒｈｏファミリーは、３つのイソ型、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、及びＲｈｏＣを含む。ＲｈｏＡ活性の活性化は、内皮細胞の顕著なストレスファイバー形成に結び付く。トロンビンによる内皮細胞の刺激は、Ｒｈｏ  ＧＴＰ及びミオシンリン酸化を増加させ、これは、細胞収縮性の増加と一致する。ＲｈｏＡの阻害は、この応答及び障壁機能の喪失を阻止し、Ｒｈｏが血管透過性に重要な役割を果たしていることを示す。
【０２１２】
この実験は、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社、デンバー、コロラド州から購入した市販のＲｈｏ活性化アッセイ（ＧＬＩＳＡ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って実施した。簡潔に述べると、８継代目又は１２継代目のヒト網膜内皮細胞（ＡＣＢＲＩ  １８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カークランド、ワシントン州）を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータにて、フィブロネクチンでコーティングした（１μｇ／ｃｍ２）６ウエル組織培養プレートで、ＥＧＭ−２培養培地（Ｌｏｎｚａ社）を使用して培養した（３ｍｌの総体積中３０，０００細胞／ウエル）。その後、培地を吸引し、０．１％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＩＴＳＳ（インスリン、トランスフェリンナトリウムセレン）（いずれもＬｏｎｚａ社製）で補完されたＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地で置換して、細胞を血清枯渇状態にし、ＲｈｏＡのバックグラウンドレベルを低減させた。細胞を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベータで２４時間培養した。ＨＢＳＳで希釈した試験化合物を、細胞に添加する前にインキュベータに入れて平衡化した。その後１５０μｌの試験化合物を適切な培養ウエルに添加し、プレートをインキュベータ内で更に１５分間インキュベートした。その後、トロンビンを適切なウエルに添加した。１分後、細胞を、１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、次にプロテアーゼ阻害剤で補完された１００μｌのＧＬＩＳＡ溶解緩衝液で溶解した。抽出物を掻き取って、微量遠心チューブに移し、ＲｈｏＡの活性型を保存するために氷中に移した。その後、全抽出物を４℃で２分間１０，０００ｒｐｍで遠心することにより残屑を取り除いた。上清を新しいチューブに移し、氷中に戻した。ＧＬＩＳＡアッセイ及びタンパク質定量のために各抽出物の一部を取り出した。タンパク質濃度は全て１０％以内であり、抽出物は、達成濃度（１ウエル当たり１５μｇの総タンパク質に相当）で使用した。キットに提供されている試薬を使用してＧＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０２１３】
１２継代目の網膜内皮細胞の結果は、下記の表１５に示されている。予想通り、トロンビンにより誘導された活性ＲｈｏＡレベルは非常に高かった。試験化合物は全て、トロンビン誘導性ＲｈｏＡ活性化を阻害した。
【０２１４】
８継代目の網膜内皮細胞の結果は、下記の表１６に示されている。予想通り、トロンビンにより誘導された活性ＲｈｏＡレベルは非常に高かった。試験化合物は全て、トロンビン誘導性ＲｈｏＡ活性化を阻害した。
【０２１５】
【表１５】
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【０２１６】
【表１６】
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【０２１７】
実施例１７：血管透過性亢進の動物モデル
ニュージーランド白ウサギに、０．２１５ｍｇ／ｋｇのダナゾールを経口で１日２回で７日間投与した。その後、ウサギに血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を１回硝子体内注射して、網膜の血管漏出を生成した。その後、２４時間後に、フルオレセインナトリウムを注射し、眼の蛍光をＦｌｕｏｒｏｔｒｏｎ（Ｏｃｕｍｅｔｒｉｃｓ社）を使用して測定した（５回の測定を平均した）。１羽の対照（プラセボ）ウサギは、網膜に２５０個の蛍光単位を有し、そこに血管漏出があることを示した。１羽のダナゾール処置されたウサギは、１６個の蛍光単位を示し、これは、ダナゾールが血管漏出の９４％低減を引き起こしたことを表わす。
【０２１８】
本発明の先述の記載は、例示及び説明のために提示されているものである。更に、この記載は、本発明を本明細書で開示された形態に限定するためのものではない。したがって、上記の教示及び関連技術分野の技能又は知識と整合性を持つ変更及び改変は、本発明の範囲内にある。上述の実施形態は、本発明を実施するために知られている最良の形態を説明し、当業者が、そのような又は他の実施形態の、及び特定の用途又は本発明の使用に必要とされる種々の改変を有する発明を使用することを可能にすることが更に意図されている。添付の特許請求の範囲は、従来技術により許容される程度に代替的な実施形態を含むように解釈されることが意図されている。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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