(57)【要約】  一般式：      Ｘ１ＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｘ２Ｎ４Ｎ５ＧＧＧＮ６Ｘ３Ｎ７      （Ｉ）            を有する、医薬組成物中に使用しうる阻害性オリゴヌクレオチドが開示される。式（Ｉ）中、Ｃはシチジンまたはその誘導体であり、シチジン誘導体は、５−メチルシチジン、シトシン塩基および／またはシチジンヌクレオシド糖に関与する化学修飾を有するシチジン様ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ブロモシチジン、５−ヒドロキシシチジン、リボシチジンならびにシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドからなる群から選択され、Ｇはグアノシンまたはその誘導体であり、グアノシン誘導体は、７−デアザグアノシンならびにグアニン塩基および／またはグアノシンヌクレオシド糖に関与する化学修飾を有するグアノシン様ヌクレオチドからなる群から選択され、Ｘ１およびＸ３は０〜１２個の塩基を有する任意のヌクレオチド配列であり、各ヌクレオチドは互いに独立しており、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドを有する任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３は各々独立して任意のヌクレオチドであり、Ｎ４およびＮ７はピリミジンまたは修飾ピリミジンであり、Ｎ５はプリンまたは修飾プリンであり、Ｎ６は修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、ヌクレオチドＮ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７のうち少なくとも２つは修飾プリンまたは修飾ピリミジンである。
2016505265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
Ｘ１ＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｘ２Ｎ４Ｎ５ＧＧＧＮ６Ｘ３Ｎ７      （Ｉ）
を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、
Ｃはシチジンまたはその誘導体であり、シチジン誘導体は、５−メチルシチジン、シトシン塩基および／またはシチジンヌクレオシド糖に関与する化学修飾を有するシチジン様ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ブロモシチジン、５−ヒドロキシシチジン、リボシチジンならびにシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドからなる群から選択され、
Ｇはグアノシンまたはその誘導体であり、グアノシン誘導体は、７−デアザグアノシンならびにグアニン塩基および／またはグアノシンヌクレオシド糖に関与する化学修飾を有するグアノシン様ヌクレオチドからなる群から選択され、
Ｘ１およびＸ３は０〜１２個の塩基を有する任意のヌクレオチド配列であり、各ヌクレオチドは互いに独立しており、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドを有する任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３は各々独立した任意のヌクレオチドであり、
Ｎ４およびＮ７はピリミジンまたは修飾ピリミジンであり、
Ｎ５はプリンまたは修飾プリンであり、
Ｎ６は修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、
ヌクレオチドＮ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７のうち少なくとも２つは修飾プリンまたは修飾ピリミジンであること
を特徴とする、阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
一般式：
Ｘ１ＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｘ２Ｎ４Ｎ５ＧＧＧＮ６Ｘ３Ｎ７      （Ｉ）
を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、
Ｃはシチジンまたは請求項１で規定されたその誘導体であり
Ｇはグアノシンまたは請求項１で規定されたその誘導体であり
Ｘ１およびＸ３は０〜６個の塩基を有する任意のヌクレオチド配列であり、各ヌクレオチドは互いに独立しており、Ｘ２は０または１個のヌクレオチドであり、
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３は各々独立した任意のヌクレオチドであり、
Ｎ４およびＮ７はピリミジンまたは修飾ピリミジンであり、
Ｎ５はプリンまたは修飾プリンであり、
Ｎ６は修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、
ヌクレオチドＮ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７のうち少なくとも２つは修飾プリンまたは修飾ピリミジンであること、ならびに
前記オリゴヌクレオチドが２０個以下のヌクレオチドを含むこと
を特徴とする、請求項１に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
一般式：
Ｎ１ＣＣＴＧＧｐｙｐｕＧＧＧｐｘＡＧｐｙ      （ＩＩ）
を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、
Ｃはシチジンまたは請求項１で定義されたその誘導体であり、
Ｇはグアノシンまたは請求項１で定義されたその誘導体であり、
Ｎ１は任意のヌクレオチドであってもヌクレオチドでなくてもよく、
ｐｙはピリミジンまたは修飾ピリミジンヌクレオチドであり、
ｐｕはプリンまたは修飾プリンヌクレオチドであり、
ｐｘは修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、
ヌクレオチドｐｙ、ｐｕおよびｐｘのうち少なくとも２つが、７−デアザ−デスオキシグアノシン、７−デアザ−２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、ジアミノプリン、６−チオ−デスオキシグアノシン、６−Ｏ−メチル−デスオキシグアノシン、７−デアザ−イノシン、７−デアザ−７−ヨードデスオキシグアノシン、７−アミノプロパルギルデスオキサグアノシン、２−フルオロ−シトシンおよび５−メチルシトシンからなる群から選択される修飾プリンまたは修飾ピリミジンであること
を特徴とする、請求項１または２に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
一般式：
Ｎ１ＣＣＴＧＧｐｙｐｕＧＧＧ      （ＩＩＩ）
を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、Ｃ、Ｇ、Ｎ１、ｐｙおよびｐｕが、前記請求項のいずれかに定義された意味を有することを特徴とする、請求項３に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｐｙが５−メチル−ｄＣ、５−ブロモ−ｄＣおよび５−オクタジエニル−ｄＣからなる群から選択される５−置換シチジンであり、
Ｐｕが７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ、イノシンおよび７−デアザ−イノシンからなる群から選択される７−デアザプリン誘導体であり、ＰｘがｄＡまたは５−インド−ｄＵであることを特徴とする、請求項３に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列ｄＣ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＺ＊ｍＥ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＡ＊ｄＡ＊ｄＧ＊ｄＴを有することを特徴とする、請求項１に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列ｄＣ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ＢＣ＊ｄＥ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ＪＵ＊ｄＡ＊ｄＧ＊ｄＴを有することを特徴とする、請求項１に記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
一般式（ＩＶ）：
Ｘ１ＡＡＴＧＧｐｙｐｕＧＧＧｐｘＡＧｐｙ      （ＩＶ）
を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、
Ｐｙは５−メチル−ｄＣ、５−ブロモ−ｄＣおよび５−オクタジエニル−ｄＣからなる群から選択される５−置換シチジンであり、
Ｐｕは７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ、イノシンおよび７−デアザ−イノシンからなる群から選択される７−デアザプリン誘導体であり、ＰｘはｄＡまたは５−インド−ｄＵであり、
ＰｘはｄＡ、５−置換デオキシウリジおよび５−インド−ウリジンであり、Ｘ１は任意のヌクレオチドであってもヌクレオチドでなくてもよいこと
を特徴とする、阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
強力な効力を有するＴＬＲアンタゴニストとして使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって発症する疾患の予防および／または治療に使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の阻害性オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の阻害性オリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１種の添加剤および／または担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって発症する疾患の治療に用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に免疫学および免疫療法の分野に関し、より詳細には免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）組成物ならびにＴｏｌｌ様受容体を介した免疫反応を阻害および／または抑制するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は特定の免疫細胞上に存在し、自然免疫反応に関与することが明らかにされている。脊椎動物におけるＴｏｌｌ様受容体ファミリーはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と呼ばれるタンパク質から構成されており、細菌、真菌、寄生生物およびウイルスに由来する病原体に関連する分子パターンを認識することが知られている。ＴＬＲは、哺乳動物が異分子を認識し免疫反応を開始するための重要な手段であり、また自然免疫反応と適応免疫反応とを関連付ける手段でもある。ＴＬＲはさらに、自己免疫疾患、伝染性疾患および炎症性疾患などを含む多くの疾患の発症や、ＴＬＲを介した活性化の制御にも関与していることがわかっている。適切な薬剤を用いることによって、疾患への治療介入の手段を提供できる可能性がある。
【０００３】
ＴＬＲには、細胞表面に存在して細胞外の病原体を検出し、それに対する反応を開始させるものがある。また、細胞内部に存在して細胞内の病原体を検出し、それに対する反応を開始させるものもある。
【０００４】
細菌ＤＮＡや合成ＤＮＡ中に存在するある種の非メチル化ＣｐＧモチーフは、免疫系を活性化し、抗腫瘍活性を誘導することがわかっている。別の研究により、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが免疫反応を刺激することがわかっている。その後の研究では、細菌ＤＮＡや合成ＤＮＡ中に存在する非メチル化ＣｐＧモチーフをＴＬＲ９が認識することが示された。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに別の修飾を施した場合も、ＴＬＲ９を介した免疫反応のモジュレータとしての作用に影響しうる。さらに構造活性相関研究により、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドによるものとは異なる特定の免疫反応プロファイルを誘導する合成モチーフおよび新規ＤＮＡ系化合物が突き止められた。
【０００５】
ＴＬＲの選択的局在とそこから生じるシグナル伝達から、免疫反応におけるそれらの役割がある程度明らかになる。免疫反応には自然反応と適応反応とがあり、反応に関与する細胞のサブセットに基づいている。例えば、遅延型過敏症などの古典的な細胞媒介性機能や、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化に関与するヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、Ｔｈ１細胞である。この反応は、病原体やその抗原（例えばウイルス感染、細胞内病原体、腫瘍細胞）に対する身体の自然反応で、その結果ＩＦＮ−γが分泌され、同時にＣＴＬが活性化される。また、Ｂ細胞活性化のためのヘルパー細胞として関与するＴｈ細胞はＴｈ２細胞である。Ｔｈ２細胞は細菌や寄生生物に反応して活性化されることがわかっており、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の分泌を介して身体の適応免疫反応（例えばＩｇＥ産生や好酸球活性化）を起こしうる。免疫反応の種類は抗原暴露に反応して産生されるサイトカインに影響され、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞によって分泌されるサイトカインの相違は、これら２つのサブセットの生物学的機能の相違によるものでありうる。特定の疾患、例えば喘息やアレルギーなどでは、身体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスはＴｈ２環境に傾いている。
【０００６】
ＴＬＲの活性化は免疫反応の開始に関与するが、ＴＬＲを介して非制御下で免疫系が刺激されると、免疫力の低下した対象におけるある種の疾患は悪化する可能性がある。既に、複数のグループが、合成オリゴデオキシオリゴヌクレオチド類（ＯＤＮ）の炎症性サイトカイン阻害剤としての利用を示している。これらの阻害性ＯＤＮは、２つのトリプレット配列、すなわち近位「ＣＣＴ」トリプレットおよび遠位「ＧＧＧ」トリプレットを必要とする。これらのトリプレットを含む阻害性ＯＤＮに加えて、ＣｐＧを含むＯＤＮによってＴＬＲ−９を介した活性化を阻害することの可能な、別の特定のＤＮＡ配列が、複数のグループによって報告されている。これらの「阻害性」または「抑制性」モチーフはポリ「Ｇ」（例えば「ＧＧＧＧ」）配列や「ＧＣ」配列を多く含み、メチル化されやすく、哺乳動物や特定のウイルスのＤＮＡ中に存在する。
【０００７】
別の研究では、ポリＧを含むＯＤＮがＴＬＲのアンタゴニストとして働くという見解を疑問視している。ＧＧＧＧストリングを含むＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与により強力な抗ウイルス活性および抗がん活性が見られること、またこれらの化合物の投与が血清ＩＬ−１２濃度の上昇を引き起こすことが示されている。さらに、ｐｏｌｙＧ配列を含むＣｐＧオリゴ類がＴＬＲ９の活性化を介して免疫反応を誘導することも知られている。
【０００８】
また、グアノシンストリングを含むオリゴヌクレオチドが四重体構造（テトラッド）を形成し、アプタマーとして働き、トロンビン活性を阻害することが示されている。したがって、一本鎖と複数鎖のうちいずれの構造が、後に不均質な高分子凝集体を形成してＴＬＲ９活性化を効率的に抑制するのかは明らかでない。Ｇ−テトラッドが存在するため、それらの免疫学的挙動および薬理学的挙動の予測は不可能である。オリゴヌクレオチド中にポリＧ配列が存在すると、その細胞内濃度や局在性も変化する可能性がある。
【０００９】
細菌ＤＮＡ中の特定モチーフに対する反応は、脊椎動物の自然免疫の重要な機能である。細菌ＤＮＡが哺乳類のＢリンパ球（Ｂ細胞）の分裂を促進することは長く知られているが、哺乳類のＤＮＡには通常そのような機能はない。この免疫認識が、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むモチーフの中心に存在する特定のＤＮＡ配列を対象とするものであるというこの発見は、分子免疫学的アプローチの分野を開拓した。
【００１０】
ＣｐＧ部位またはＣＧ部位は、塩基の線状配列において、その長さ方向に沿ってシトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドに隣接しているＤＮＡ領域である。「ＣｐＧ」は「−Ｃ−リン酸−Ｇ−」の省略表現である。すなわち、シトシンとグアニンが１つのリン酸のみによって分離されており、リン酸が任意の２つのヌクレオシドをＤＮＡ中で結合している。この「ＣｐＧ」表記は、この線状配列を、シトシンとグアニンのＣＧ塩基対と区別するために用いられる。
【００１１】
ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されて、例えば５−メチルシトシンを形成しうる。哺乳動物においては、遺伝子中のシトシンをメチル化することで遺伝子発現を抑制できる。哺乳動物では、７０％〜８０％のＣｐＧシトシンがメチル化されている。
【００１２】
いわゆるＣｐＧＤＮＡの免疫刺激作用を、好ましいフランキング配列であるＣｐＧモチーフにおいて、ＣｐＧジヌクレオチドを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて再現することができる。最適な配列構成は、ヒトＴＬＲ９ではヘキサヌクレオチドＧＴＣｐＧＴＴであり、マウスＴＬＲ９ではＧＡＣｐＧＴＴであることが見いだされている。ＣｐＧを含むＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）は種々の免疫系細胞に多くの影響を及ぼすことが報告されており、例えば一次Ｂ細胞をアポトーシスから保護したり、細胞周期移行を促進したり、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の誘導、抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化、マウスでのＩｇＧ２ａの誘導などによって、免疫反応をＴｈ１型免疫反応に傾けたりする。
【００１３】
ＣｐＧＤＮＡの免疫調節作用における、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によるシグナル伝達の関与が報告されている。ＣｐＧＤＮＡは配列非特異的経路を介して細胞に取り込まれ、エンドソーム部分に移動し、そこで配列特異的な方法でＴＬＲ９と相互作用すると考えられている。ＴＬＲ９シグナル伝達経路により多くの免疫機能関連遺伝子が誘導されるが、中でも特にＮＦ−ＫＢを介したサイトカインおよびケモカインの分泌誘導が顕著である。
【００１４】
ＴＬＲは、病原体中に存在する特定の分子構造（病原体関連分子パターン、ＰＡＭＰ）を認識する受容体の大きなファミリーであり、パターン認識受容体（ＰＲＲ）とも呼ばれる。ＰＲＲを発現する免疫細胞はＰＡＭＰを認識すると活性化され、最適の適応免疫反応を起こす。１０個の異なるＴＬＲサブタイプ、すなわちＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０からなるＰＲＲが確認されている。このようなＴＬＲは、二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ３）、リポ多糖（ＬＰＳ）（ＴＬＲ４）、細菌フラジェリン（ＴＬＲ５）、抗ウイルス小分子化合物や一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ７やＴＬＲ８）、細菌ＤＮＡまたはＣｐＧＯＤＮ（ＴＬＲ９）の認識に関与するとされており、Ｕｈｌｍａｎｎら（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，６：２０４−１７に総説されている。
【００１５】
ＵＳ２００５／０２３９７３３には、免疫阻害活性を有するオリゴヌクレオチドが記載されており、これは配列ＸａＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３ＹｂＮ４ＧＧＧＺｃを含むものである。このような配列はモチーフ５’ＣＣ−Ｌｉ−ＧＧＧを含み、リンカー（Ｌｉ）はＮ１Ｎ２Ｎ３ＹｂＮ４を意味し、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４は各々独立して任意のヌクレオチドを表し、Ｙｂは任意のヌクレオチド配列であってよく、ｂは８〜２１の整数である。
【００１６】
ＷＯ２０１１／００５９４２には、修飾された免疫刺激モチーフを含むオリゴヌクレオチド系ＴＬＲアンタゴニストが開示されており、これは構造５−Ｎｍ−Ｎ３Ｎ２Ｎ１ＣＧＮ１Ｎ２Ｎ３−Ｎｍ−３’を有するものである。このＣＧは修飾された免疫刺激モチーフであり、Ｃはシトシンまたはピリミジンヌクレオチド誘導体であり、Ｇはグアノシンまたはプリンヌクレオチド誘導体である。
【００１７】
ＷＯ２０１１／００５９４２には、親オリゴヌクレオチドでは免疫刺激性であるが、誘導体オリゴヌクレオチドでは免疫刺激性を示さないオリゴヌクレオチドモチーフが開示されている。この誘導体オリゴヌクレオチドは親オリゴヌクレオチドに基づくが、オリゴヌクレオチドモチーフへの１個以上の修飾を有することで免疫刺激性が低下したり失われたりしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ある種の核酸分子が、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ９、ＴＬＲ８およびＴＬＲ７を介したシグナル伝達を選択的に阻害することがわかっている。これらの核酸分子は、２〜約５０、好ましくは４〜３０、より好ましくは５〜２０、特に好ましくは６〜１５ヌクレオチド長の阻害性オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮＨ  ＯＤＮ）である。阻害性ＯＤＮには、ＴＬＲ９、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７またはＴＬＲ３の１種のみを選択的に阻害するものもあり、またＴＬＲ９、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７およびＴＬＲ３の２種以上を選択的に阻害するものもある。この阻害性ＯＤＮは、単独で、互いに組み合わせて、あるいは他の薬剤、例えば小分子ＴＬＲ阻害剤や、グルココルチコイド、細胞分裂抑制剤、抗体などの免疫抑制分子と組み合わせて、さらには免疫刺激性ＣｐＧ核酸分子やＴＬＲアゴニストと組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫反応を調節することができる。
【００１９】
良好な、好ましくはより優れた生物学的活性を有する新たな阻害性オリゴヌクレオチドが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、一般式（Ｉ）：
Ｘ１ＣＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｘ２Ｎ４Ｎ５ＧＧＧＮ６Ｘ３Ｎ７      （Ｉ）
（式中、
Ｃはシチジンまたはその誘導体であり、シチジン誘導体は、５−メチルシチジン、シトシン塩基および／またはシチジンヌクレオシド糖に関与する化学修飾を有するシチジン様ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−置換シチジン、５−ブロモシチジン、５−ヒドロキシシチジン、リボシチジン、β−Ｄ−アラビノフラノシドシチジンならびに２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシドシチジンからなる群から選択され、
Ｇはグアノシンまたはその誘導体であり、グアノシン誘導体は、７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−Ｏ−メチル−７−デアザグアノシン、イノシン、２’−デオキシイノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシンならびにグアニン塩基および／またはグアノシンヌクレオシド糖に関与する化学修飾を有するグアノシン様ヌクレオチドからなる群から選択され、
Ｘ１およびＸ３は０〜１２個の塩基を有する任意のヌクレオチド配列であり、各ヌクレオチドは互いに独立しており、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドを有する任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３は各々独立した任意のヌクレオチドであり、
Ｎ４およびＮ７はピリミジンまたは修飾ピリミジンであり、
Ｎ５はプリンまたは修飾プリンであり、
Ｎ６は修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、
ヌクレオチドＮ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７のうち少なくとも２つは修飾プリンおよび／または修飾ピリミジンである）
を有する阻害性オリゴヌクレオチドを開示する。
【００２１】
好ましい一実施形態において、一般式（Ｉ）を有する前記阻害性オリゴヌクレオチドは上記の意味を有し、
Ｘ１およびＸ３は０〜６個の塩基を有する任意のヌクレオチド配列であり、各ヌクレオチドは互いに独立しており、Ｘ２は０または１個のヌクレオチドであり、
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３は各々独立した任意のヌクレオチドであり、
Ｎ４およびＮ７はピリミジンまたは修飾ピリミジンであり、
Ｎ５はプリンまたは修飾プリンであり、
Ｎ６は修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、
ヌクレオチドＮ４、Ｎ５、Ｎ６およびＮ７のうち少なくとも２つは修飾プリンまたは修飾ピリミジンであり、
前記オリゴヌクレオチドは２０個以下のヌクレオチドを含む。
【００２２】
特に好ましい一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは一般式（ＩＩ）：
Ｘ１ＣＣＴＧＧｐｙｐｕＧＧＧｐｘＡＧｐｙ      （ＩＩ）
（式中、
Ｃはシチジンまたは上記で定義されたその誘導体であり、
Ｇはグアノシンまたは上記で定義されたその誘導体であり、
Ｘ１は任意のヌクレオチドであってもヌクレオチドでなくてもよく、
ｐｙはピリミジンまたは修飾ピリミジンヌクレオチドであり、
ｐｕはプリンまたは修飾プリンヌクレオチドであり、
ｐｘは修飾ピリミジン、Ａまたは修飾プリンであり、
ヌクレオチドｐｙ、ｐｕおよびｐｘのうち少なくとも２つが、７−デアザ−デスオキシグアノシン、７−デアザ−２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、ジアミノプリン、６−チオ−デスオキシグアノシン、６−Ｏ−メチル−デスオキシグアノシン、７−デアザ−イノシン、７−デアザ−７−ヨードデスオキシグアノシン、７−アミノプロパルギルデスオキサグアノシン、２−フルオロ−シトシンおよび５−メチルシトシンからなる群から選択される修飾プリンまたは修飾ピリミジンである）
を有する。
【００２３】
式（ＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、
Ｐｙが５−メチル−ｄＣ、５−ブロモ−ｄＣおよび５−オクタジエニル−ｄＣからなる群から選択される５−置換シチジンであり、
Ｐｕが７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ、イノシンおよび７−デアザ−イノシンからなる群から選択される７−デアザプリン誘導体であり、
ＰｘがｄＡまたは５−インド−ｄＵである、阻害性オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
ＰｘはｄＡ、５−置換デオキシウリジンおよび５−インドウリジンである。
【００２４】
一般式（ＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドの特に好ましい一実施形態において、
Ｐｙは５−メチル−ｄＣを意味し、かつ／またはＰｕは７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇもしくは７−デアザ−イノシンを意味し、かつ／またはＰｘは５−置換−２’−デオキシウリジンを意味する。
【００２５】
一般式（ＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドの別の好ましい一実施形態において、Ｘ１はゼロである。
【００２６】
一般式（ＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドの特に好ましい一実施形態において、Ｐｘは５−置換−２’−デオキシウリジンを意味する。
【００２７】
一般式（ＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドの特に好ましい一実施形態において、
Ｐｙは５−メチル−ｄＣを意味し、かつ／または
Ｐｕは７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇもしくは７−デアザ−イノシンを意味し、Ｐｘは５−置換−２’−デオキシウリジンを意味し、Ｘ１はゼロである。
【００２８】
別の好ましい一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは配列番号２５０６４、２５０７０、２５０７１、２５０７７、２５０７８、２５０７９、２５０８０、１０６９１８、１０６９１９、１０６９２０、１０６９２１、１０６９２４、１０６９２７、１０６９２９、１０６９３０、１０６９３１および１０６９３７のうち１つを有する。
【００２９】
特に好ましい一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは配列番号２５０７８を有する。
【００３０】
特に好ましい一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは配列番号１０６９１８を有する。
【００３１】
特に好ましい一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは配列番号１０６９１９を有する。
【００３２】
別の好ましい一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは配列番号１０６９３０を有する。
【００３３】
特に好ましい阻害性オリゴヌクレオチドは、一般式（ＩＩＩ）：
Ｘ１ＣＣＴＧＧｐｙｐｕＧＧＧ      （ＩＩＩ）
を有し、
式中、Ｃ、Ｇ、Ｎ１、ｐｙおよびｐｕは上記で定義された意味を有する。
【００３４】
特に好ましくは、式（ＩＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドであって、
式中、
Ｐｙが５−メチル−ｄＣ、５−ブロモ−ｄＣおよび５−オクタジエニル−ｄＣからなる群から選択される５−置換シチジンであり、
Ｐｕが７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ、イノシンおよび７−デアザ−イノシンからなる群から選択される７−デアザプリン誘導体であり、
ＰｘがｄＡまたは５−インド−ｄＵである、阻害性オリゴヌクレオチドである。
【００３５】
一般式（ＩＩＩ）を有する阻害性オリゴヌクレオチドの特に好ましい実施形態において、
Ｐｙは５−メチル−ｄＣを意味し、かつ／またはＰｕは７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇもしくは７−デアザ−イノシンを意味し、かつ／またはＸ１はヌクレオチドではないことを意味する。
【００３６】
別の好ましい一実施形態において、本阻害性オリゴヌクレオチドは一般式（ＩＶ）：
Ｘ１ＡＡＴＧＧｐｙｐｕＧＧＧｐｘＡＧｐｙ      （ＩＶ）
（式中、
Ｐｙは５−メチル−ｄＣ、５−ブロモ−ｄＣおよび５−オクタジエニル−ｄＣからなる群から選択される５−置換シチジンであり、
Ｐｕは７−デアザ−ｄＧ、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ、イノシンおよび７−デアザ−イノシンからなる群から選択される７−デアザプリン誘導体であり、
ＰｘはｄＡまたは５−インド−ｄＵである。
ＰｘはｄＡ、５−置換デオキシウリジンおよび５−インド−ウリジンであり、
Ｘ１は任意のヌクレオチドであってもヌクレオチドでなくてもよい）
を有する。
【００３７】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ７／ＴＬＲ９アンタゴニストである。
【００３８】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ９アンタゴニストである。
【００３９】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＶ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ７アンタゴニストである。
【００４０】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ７／ＴＬＲ９／ＴＬＲ３アンタゴニストである。
【００４１】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ３アンタゴニストである。
【００４２】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ７アンタゴニストである。
【００４３】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ９アンタゴニストである。
【００４４】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ３／ＴＬＲ７／ＴＬＲ８／ＴＬＲ９アンタゴニストである。
【００４５】
特に好ましい一実施形態において、式（ＩＩ）の阻害性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ７／ＴＬＲ８／ＴＬＲ９アンタゴニストである。
【００４６】
上記でより詳細に説明された前記式を有する本発明の阻害性オリゴヌクレオチドは、強力な効力を有するＴＬＲアンタゴニストとして好ましく用いられる。本発明の阻害性オリゴヌクレオチドは、自己免疫疾患、炎症、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、癌、感染症および敗血症などの自然免疫反応やＴｈ１様免疫反応が関与する多くの症状を治療するために用いることができる。本発明の阻害性オリゴヌクレオチドは、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患（例えば乾癬）、アレルギー、喘息、または細菌やウイルスなどの病原体によって発症する疾患の予防に用いることができる。自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、多発性硬化症および真性糖尿病などが挙げられる。ＴＬＲシグナル伝達は神経発生と関連があり、神経変性疾患の発症に関与することが明らかになっている。したがって、グリア細胞中のＴＬＲシグナル伝達の阻害によって、アルツハイマー病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病などの神経変性疾患の予防または治療を行ってもよい。
【００４７】
本発明の阻害性オリゴヌクレオチドは、医薬組成物中で使用することができる。このような組成物はオリゴヌクレオチドのみを含有してもよく、あるいは賦形剤や増量剤などの、適切な薬剤投与に必要な、生理学的に許容される添加剤および／または担体を含有してもよい。本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、糖衣錠、または注射や点滴に適した溶液の形でありうる。好ましい投与経路は、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与または髄腔内投与である。肺疾患などの場合、本アンタゴニストを吸入により投与することが好ましい。
【００４８】
医薬組成物は、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、喘息、または細菌やウイルスなどの病原体によって発症する疾患の予防または治療に用いることができる。
【００４９】
本発明の開示において、特に断りのない限り以下の意味を有する用語や定義が使用される。
【００５０】
「オリゴヌクレオチド」とは一般に、結合した複数のヌクレオシド単位を含むポリヌクレオチドを指す。このようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムやｃＤＮＡなどの既存の核酸源から得ることができるが、合成法により製造することが好ましい。好ましい実施形態において、各ヌクレオシド単位は、野生種オリゴヌクレオチドとは異なるような種々の化学修飾や置換、例えば修飾ヌクレオシド塩基および／または修飾糖単位などを含むことができるが、これらに限定されない。化学修飾の例は当業者に公知であり、例えばＵｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」に記載されている。ヌクレオチド、ならびにその誘導体および合成法は、Ｈａｂｅｒｍｅｈｌら、Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆｃｈｅｍｉｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００８に記載されている。
【００５１】
ヌクレオシド残基は、公知である多くのヌクレオシド間結合のいずれかによって、互いに結合しうる。このようなヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、ホスホノアセテート、ホスホノアセテートエステル、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンなどのヌクレオシド間結合が挙げられるが、これらに限定されない。「オリゴヌクレオチド」は、１以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドをも包含する。本明細書において、「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含むかどうかにかかわらず、これらのヌクレオシド間結合のいずれかを有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明示的に意図するものとする。特定の好ましい実施形態において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００５２】
「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は一般に、ペントース部分の２’位水酸基が置換されて２’−置換または２’−置換リボヌクレオシドとなっているリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。特定の態様において、このような置換体は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基で置換されたリボヌクレオシドを含み、このようなヒドロカルビル基またはアリール基は、無置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシまたはアミノ基などで置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換−アラビノシドとしては、例えば２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、２’−フルオロアラビノヌクレオシド（ＦＡＮＡ）、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルアラビノシド、２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
「３’」は、方向を表すために用いられる場合、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおいて、ある領域や位置が、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の別の領域または位置から見て３’（下流）方向にあることを指す。
【００５４】
「５’」は、方向を表すために用いられる場合、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおいて、ある領域や位置が、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の別の領域または位置から見て５’（上流）方向にあることを指す。
【００５５】
「約」は一般に、その厳密な数が重要ではないことを意味する。したがって、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は重要ではなく、含有するヌクレオシド残基が１〜２個少ない、あるいは１〜数個多いオリゴヌクレオチドも、上記の各実施形態のオリゴヌクレオチドと同等であるとみなされる。
【００５６】
「アゴニスト」とは一般に、細胞の受容体に結合して反応を誘導する物質を指す。アゴニストは多くの場合、リガンドなどの天然の物質の作用を模倣する。
【００５７】
「アンタゴニスト」とは一般に、アゴニストの効果を弱める物質を指す。
【００５８】
「アジュバント」とは一般に、ワクチンや抗原などの免疫原性物質に添加され、投与を受けたホストにおける、この混合物に暴露された際の該薬剤への免疫反応を強化または増強する物質を指す。
【００５９】
「気道炎症」としては一般に喘息が挙げられるが、これに限定されない。
【００６０】
「アレルゲン」とは一般に、抗原、または通常はタンパク質である分子の抗原部分を指し、暴露された対象にアレルギー反応を起こす。一般に、対象がアレルゲンに対してアレルギーを有することは、例えば適切な検査やこの技術分野において公知の任意の方法によって明らかになる。分子への暴露によってアレルギー性免疫反応を示す対象が少数であっても、該分子はアレルゲンであると言われる。
【００６１】
「アレルギー」とは一般に、炎症を特徴とする不適当な免疫反応を指し、食物アレルギーや呼吸器アレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
「抗原」とは一般に、抗体またはＴ細胞抗原受容体による認識・選択的結合の対象となることによって免疫反応を起こす物質を指す。抗原としては、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。抗原は天然由来であっても合成由来であってよく、一般にその抗原に特異的な免疫反応を誘導する。
【００６３】
「自己免疫疾患」とは一般に、免疫系によって「自己」成分が攻撃を受ける疾患を指す。
【００６４】
「ＴＬＲを介した疾病」または「ＴＬＲを介した疾患」とは一般に、１種以上のＴＬＲの活性化が寄与因子となっている何らかの病的状態を意味する。このような状態には、自己免疫疾患（例えば乾癬）、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、喘息、または細菌やウイルスなどの病原体によって発症する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
「生理学的に許容される」とは一般に、ＩＲＯ化合物の有効性を妨げず、細胞、細胞培養物、組織または生命体などの生体系に適合する物質を指す。好ましくは、生体系は脊椎動物などの生物である。
【００６６】
「担体」は一般に、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソームカプセル、または医薬製剤に用いられるこの技術分野において公知の他の物質を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特徴が適用の際の投与経路に依存することは理解されるであろう。これらの物質を含む薬学的に許容される製剤の調製については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に記載されている。
【００６７】
「併用投与」とは一般に、免疫反応を調節するために少なくとも２種の異なった物質を、時間的に十分に近接させて投与することを指す。併用投与は、少なくとも２種の異なった物質を、単回投与または複数回投与において同時に投与すること、および数日以下の時間間隔を開けて任意の順序で投与することを指す。
【００６８】
「相補的な」とは一般に、核酸とハイブリッド形成できることを意味する。このようなハイブリッド形成は通常、相補的なストランド間の水素結合により生じ、好ましくはワトソン−クリック型またはフーグスティーン型塩基対を形成するが、他の水素結合様式や塩基スタッキングによってハイブリッド形成することもできる。
【００６９】
「有効量」または「十分量」とは一般に、有益な効果など、所望の生物学的影響を与えるのに十分な量を指す。したがって、「有効量」または「十分量」は投与時の状況に依存する。併用投与される抗原への免疫反応を調節する組成物を投与する場合、ＩＲＯ化合物と抗原の有効量は、抗原だけを投与した場合に起こる免疫反応に対して所望の調節を実現するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回で投与することができる。
【００７０】
「組み合わせて」とは一般に、患者の疾患または障害の治療過程において、ＩＲＯ化合物と、ＩＲＯ化合物の免疫調節効果を低下させない、疾患または障害の治療に有用な薬剤とを投与することを意味する。このような併用治療にはまた、ＩＲＯ化合物および／または別の薬剤の、独立した２回以上の投与を含みうる。ＩＲＯ化合物および／または該薬剤の投与は、同一経路で行われても異なる経路で行われてもよい。
【００７１】
「個体」または「対象」または「脊椎動物」は一般に、ヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物としては通常ヒトが挙げられるが、これに限定されない。
【００７２】
「ヌクレオシド」とは一般に、通常リボースまたはデオキシリボースである糖と、プリンまたはピリミジン塩基とからなる化合物を指す。
【００７３】
「ヌクレオチド」とは一般に、糖に結合したリン酸基を含むヌクレオシドを指す。
【００７４】
本明細書において、「ピリミジンヌクレオシド」または「ｐｙ」は、ヌクレオシドの塩基部分がピリミジン塩基（例えばシトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））であるヌクレオシドを言う。同様に、「プリンヌクレオシド」または「ｐｕ」は、ヌクレオシドの塩基部分がプリン塩基（例えばアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））であるヌクレオシドを言う。
【００７５】
「アナログ」と「誘導体」とは交換可能に使用することができ、一般に修飾塩基および／または糖を有する任意のプリンおよび／またはピリミジンのヌクレオチドまたはヌクレオシドを指す。修飾塩基とは、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル以外の塩基である。修飾糖とは、リボース、２’デオキシリボース以外の、オリゴヌクレオチドの骨格に用いうる任意の糖である。
【００７６】
「阻害」または「抑制」は一般に、そのような阻害や抑制がなければ反応の誘導および／または刺激により生じるはずである反応の減弱または反応に質的差異が現れることを指す。
【００７７】
「非ヌクレオチドリンカー」とは一般に、ヌクレオチドを含む結合以外の方法でオリゴヌクレオチドと結合しうる任意の結合または部分を指す。このようなリンカーの長さは、好ましくは約２〜約２００オングストロームである。
【００７８】
「ヌクレオチド結合」とは一般に、２個のヌクレオシドの３’水酸基と５’水酸基とをリン含有結合を介して直接的に結合させる直接３’−５’結合を指す。
【００７９】
「オリゴヌクレオチドモチーフ」とは、ジヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド配列を意味する。「１個以上の修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフ」とは、親オリゴヌクレオチドでは免疫刺激性であるが、誘導体オリゴヌクレオチドは免疫刺激性ではないオリゴヌクレオチドモチーフを意味する。このような誘導体オリゴヌクレオチドは、親オリゴヌクレオチドに基づくが、１個以上の修飾を有している。
【００８０】
「ＣｐＧ」とは、特定の配列（例えばＧＴ−ＣｐＧ−ＴＴまたはＧＡ−ＣｐＧ−ＴＴ）において免疫刺激性である可能性を有し、シトシンまたはシトシンアナログと、グアニンまたはグアニンアナログとを含むジヌクレオチドモチーフを指す。
【００８１】
本明細書の配列における略語の意味は、以下のとおりである。
ＢＣ      ５−ブロモ−ｄＣ
Ｅ        ７−デアザ−ｄＧ（ｄＥに同じ）
ｄＥ      ７−デアザ−ｄＧ
Ｄ        ｄスペーサー、非塩基
ＤＩ      ７−デアザ−２’−デオキシイノシン
ｄＺ      ５−メチル−ｄＣ
ｆａＣ    ２’−ＦＡＮＡ−Ｃ（ＦＡＮＡは２’−フルオロアラビノ核酸を意味する）
ｆｒＡ    ２’−フルオロ−Ａ
ｆｒＣ    ２’−フルオロ−Ｃ
ｆｒＧ    ２’−フルオロ−Ｇ
Ｉ        ２’−デオキシ−イノシン
Ｊ        Ｃ３スペーサ
ＪＣ      ５−インド−ｄＣ
ＪＧ      ７−デアザ−７−インド−ｄＧ
ＪＵ      ５−ヨードデオキシウリジン
ｍＡ      ２’−Ｏ−メチル−Ａ
ｍＣ      ２’−Ｏ−メチル−Ｃ
ｍＥ      ７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ
ｍＧ      ２’−Ｏ−メチル−Ｇ
Ｏ        ８−オキソ−ｄＧ
ＯＤＣ    ５−オクタジエニル−ｄＣ
ＰＣ      ５−プロピニル−ｄＣ
ＰＧ      ７−アミノプロパルギル−ｄＧ
Ｑ        ８−オキソ−ｄＡ
Ｖ        ２，６−ジアミノプリンヌクレオシド
βＡ      ＬＮＡ−Ａ
βＧ      ＬＮＡ−Ｇ
βＺ      ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ
６ＭＧ    ６−Ｏ−メチル−ｄＧ
６ＴＧ    ６−チオ−ｄＧ
８Ｇ      ７−デアザ−８−アザ−ｄＧ
【００８２】
「治療」とは一般に、有益なまたは所望の結果を得ることを意図するアプローチを指し、症状の軽減や、疾患進行の遅延または改善を含みうる。
【００８３】
第１の態様において、本発明は免疫阻害性オリゴヌクレオチド（ＩＮＨ  ＯＤＮ）化合物を提供する。「ＩＮＨ  ＯＤＮ」とは、１種以上のＴＬＲのアンタゴニストである免疫調節オリゴヌクレオチド化合物を指し、この化合物はオリゴヌクレオチドモチーフＣＣ−Ｌｉ−ＧＧＧと少なくとも２個の修飾とを含み、このオリゴヌクレオチドモチーフは（例えば非メチル化ＣｐＧを有していたとしても）免疫刺激性ではない。この化合物の含有する連続した非修飾グアノシンヌクレオチドは４個未満である。このような修飾は、オリゴヌクレオチド５’末端に存在しても、オリゴヌクレオチドモチーフに隣接する配列中に存在しても、かつ／またはオリゴヌクレオチドモチーフ内に存在してもよい。これらの修飾によって、ＩＲＯ化合物はＴＬＲ調節性免疫刺激を抑制する。このような修飾は、オリゴヌクレオチドモチーフに隣接する、またはオリゴヌクレオチドモチーフ内のヌクレオチド／ヌクレオシドの塩基、糖残基および／またはリン酸骨格に対して施されてもよい。
【００８４】
本発明はＣＧジヌクレオチドに修飾を有するオリゴヌクレオチド配列を包含するが、このような配列はＴＬＲ９への免疫刺激作用は有さない。ＷＯ２０１１／００５９４２に開示されている化合物とは対照的に、本発明の分子はＴＲＬ９調節性免疫刺激を抑制する。本明細書に開示される化合物は、免疫阻害性オリゴヌクレオチド（ＩＮＨ  ＯＤＮ）である。
【００８５】
好ましい実施形態において、本発明のＩＮＨ  ＯＤＮ化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。本発明の重要な態様を、実施例および図面に示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１Ａ〜図１Ｅに、本発明において合成し、試験したＯＤＮを示す。
【図２】ｄＧ＊をｄＥ＊で置換したＯＤＮの生物活性を示す。
【図３】ｄＧ＊をｍＥ＊で置換したＯＤＮの生物活性を示す。
【図４】ｄＧ＊を非塩基残基Ｄで置換したＯＤＮの生物活性を示す。
【図５】ｄＴヌクレオチドを５−ヨードデオキシウリジン（ＪＵ）で置換した場合の影響を示す。
【図６】１回目のスクリーニングステップの結果をまとめたものである。
【図７】７Ａおよび７Ｂに、２回目のスクリーニングに用いた配列を示す。
【図８】２回目のスクリーニングの結果をまとめたものである。
【図９】７−デアザイノシン置換により阻害強度が上昇することを示す。
【図１０】５’ｄＴの欠失を伴う、５−メチル−ｄＣ（ｄＺ）と７−デアザ−ｄＧ（ｄＥ）との組合せの影響を示す。
【図１１】鎖長の短いＯＤＮの阻害効果を示す。
【図１２】２回目の実験から見出された最適候補をまとめたものである。
【図１３】ＧＧＧストレッチの３’側におけるＪＵ置換が阻害効果を著しく上昇させることを示す。
【図１４】ＧＧＧストレッチの他の位置におけるＪＵ置換により得られた効果を示す。
【図１５】３回目のスクリーニングに用いた配列を示す。
【図１６】Ｇストレッチの３’側におけるｄＡの５−インド−Ｕによる置換を含む３個の置換を組み合わせた場合の活性阻害の増強を示す。
【図１７】５−ｍｅ  ｄＣの代わりに５−ブロモｄＣを用いてもよいことを示す。
【図１８】活性阻害に関して、５−ｍｅ  ｄＣを５−オクタジエニル−ｄＣ（ＯＤＣ）で置換してもよいことを示す。
【図１９】５−メチル−ｄＣを５−メチル−ＬＮＡ−Ｃで置換した場合の影響を示す。
【図２０】５−メチル−ｄＣを５−ブロモ−ｄＣにより修飾したアナログのデータを示す。
【図２１】図２１Ａ、図２１Ｂおよび図２１Ｃは、修飾された強力なアンタゴニストの親である非修飾ＯＤＮがＴＬＲ９を刺激しないことを示すデータをまとめたものである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８７】
３回のスクリーニングにおいて、ＵＳ２００５／０２３９７３３に配列番号４（配列５’ｄＴ＊ｄＣ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＣ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＡ＊ｄＡ＊ｄＧ＊ｄＴ）として記載されているプロトタイプＴＬＲアンタゴニストよりも強力な阻害活性を示す、修飾ヌクレオチドアナログを含む新規ＴＬＲアンタゴニストが確認された。
【００８８】
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの生物活性を、以下に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により測定した。
【００８９】
ヒトＴＬＲ９、マウスＴＬＲ９またはヒトＴＬＲ７を６ｘＮＦ−ｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトと共に発現する、安定に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞およびその使用は、文献（Ｂａｕｅｒら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８（１６），９２３７−４２、Ｈｅｉｌら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３（５６６３），１５２９−９、Ｊｕｒｋら（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６（７），１８１５−２６）に詳細に記載されている。
【００９０】
安定なトランスフェクタント（２．５×１０４細胞／ウェル）を一晩かけて平板培養し、まず様々な量の阻害性ＯＤＮと培養した後、各アゴニストを添加した。ヒトＴＬＲ９の場合には０．５μＭ  ＯＤＮ  １０１０３（Ｌｕｇａｎｉｎｉら（２００８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２，１１１１−１１２０に記載の配列）、マウスＴＬＲ９の場合には０．５μＭ  ＯＤＮ  １８２６（Ｂａｕｅｒら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８（１６），９２３７−４２に記載のとおり）、ヒトＴＬＲ７の場合には２μＭ  Ｒ８４８（Ｊｕｒｋら（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６（７），１８１５−２６に記載のとおり）と共に、加湿した３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）内で１６時間培養した。実験は２回ずつ行った。細胞をＯｎｅＧｌｏ（登録商標）（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を用いて溶解し、室温で１０分間インキュベートした後、ルシフェラーゼ遺伝子活性を測定した。
【００９１】
ＯＤＮを添加しなかった細胞のレポーター遺伝子活性を基準として、刺激指数を計算した。ＴＬＲアゴニストのみの活性を１００％とし、阻害性ＯＤＮ存在下での活性の阻害を求めた。
【００９２】
実施例１
阻害活性の上昇が最も大きかったのは、２〜３個の化学修飾を有するＯＤＮであった。１回目のスクリーニングでは、ｄＧを、７−デアザ−ｄＧ（＊ｄＥ＊）、７−デアザ−２’−Ｏ−メチル−Ｇ（ｍＥ＊）、イノシン（Ｉ＊）、ジアミノプリン（Ｖ＊）、８−オキソ−ｄＧ（Ｏ＊）およびその他の種々のヌクレオチドアナログで置換した。合成し試験したＯＤＮを図１Ａ〜図１Ｅに示す。
【００９３】
ＯＤＮは、主としてｄＣ＊ｄＣ＊とｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊との間に１個の置換を含むが、この置換はｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊内に位置することもある。
【００９４】
上記の方法で測定した、１個の変異を有するＯＤＮ（＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＧ＊のうちいずれか１個のｄＧ＊がｄＥ＊で置換されている）の生物活性を、図２および図３に示す。図３から明らかなように、最大の生物活性は、ＧＧＧモチーフの最初のＧを修飾ヌクレオチドで置換した場合に得られた。図２および図３は、ＥおよびｍＥで置換した場合の活性を示している。
【００９５】
図４は１個のｄＧ＊を非塩基残基Ｄで置換した場合を示しており、阻害活性は大きく低下している。
【００９６】
図５は、ｄＴヌクレオチドを５−ヨードデオキシウリジン（ＪＵ）で置換した場合の影響を示している。意外なことに、３’末端のｄＴヌクレオチドを５−ヨードデオキシウリジンで置換すると（ＯＤＮ２３６５５）、誘導体の阻害活性は上昇した。
【００９７】
図６は、１回目のスクリーニングステップの結果をまとめたものである。この図６には修飾された塩基が示されており、左欄には、使用した修飾ヌクレオチドがより詳細に記載されている。
【００９８】
実施例２
上記の方法を用いて２回目のスクリーニングを行った。オリゴヌクレオチドは２個の置換を有し、その配列は図７に示されている。
【００９９】
図８は、２回目のスクリーニングの結果をまとめたものである。５−メチル−Ｃ（ｄＺ）と７−デアザｄＧ（ｄＥ）または２’−ＯＭｅ−Ｇ（ｍＥ）とを組み合わせたもので置換すると、阻害活性が上昇することがわかった。これはオリゴヌクレオチド２５０７７において観察される。さらに、配列の５’ｄＴの欠失により、阻害活性は上昇する（２５０７７と２５０６４との比較）。
【０１００】
図９は、７−デアザイノシン置換により阻害強度が上昇することを示している（特に２５０８０参照）。
【０１０１】
図１０は、５’ｄＴの欠失を伴う、５−メチル−ｄＣ（ｄＺ）と７−デアザ−ｄＧ（ｄＥ）との組合せの影響を示している。２５０６９で表される化合物が最も有効な阻害性ＯＤＮである。
【０１０２】
図１１は、鎖長の短いＯＤＮの阻害効果を示している。５−Ｍｅ−Ｃおよびデアザ−ｄＧ／ｄＩはＴＬＲ９への効果を上昇させる。デアザ−ｄＧ／ｄＩの挿入により、ＯＤＮのＴＬＲ９への効果は上昇する。鎖長の短い阻害性ＯＤＮはＴＬＲ９のみを阻害し、ＴＬＲ７は阻害しない。化合物２５０８８に示されるように５’側を伸長しても、ＤＩ置換と組み合わせた場合には効果は上昇する。
【０１０３】
実施例２の結論として、関連範囲における修飾の影響を以下のように要約できる。
・Ｇストレッチの５’側に５−メチル−Ｃを含むＯＤＮはすべて、ｈＬＴＲ９細胞系およびｍＴＬＲ９細胞系に対する活性向上を示す。
・ＧストレッチのＧ１位における最も効果的な塩基変更は
７−デアザ−ｄＧ（ｄＥ）
７−デアザ−２’ＯＭｅ−Ｇ（ｍＥ）
デアザ−ｄＩ（ＤＩ）
である。
・５’ｄＴの欠失により効果はさらに向上する。
【０１０４】
２回目の実験から見出された最適候補を図１２にまとめる。
【０１０５】
図１３は、ＧＧＧストレッチの３’側におけるＪＵ置換が阻害効果を著しく上昇させるという驚くべき効果を示すものである。これは、化合物１０６２１９の生物活性から理解される。
【０１０６】
図１４は、該配列の他の位置におけるＪＵ置換により得られた驚くべき効果を示している。この結果は予想外であった。
【０１０７】
実施例３
３回目のスクリーニングではさらなる変異体についての試験を行った。使用したオリゴヌクレオチドは、図１５に示すように、主として３個の置換を含むものであった。
【０１０８】
図１６に示すように、Ｇストレッチの３’側ｄＡの５−インド−Ｕによる置換を含む３個の置換を組み合わせた場合に、活性阻害の予想外の増強が観察された。
【０１０９】
図１７は、５−ｍｅ  ｄＣの代わりに５−ブロモｄＣを用いてもよいことを示している。
【０１１０】
図１８は、活性阻害に関して、５−ｍｅ  ｄＣを５−オクタジエニル−ｄＣ（ＯＤＣ）で置換してもよいことを示している。
【０１１１】
図１９は、５−メチル−ｄＣを５−メチル−ＬＮＡ−Ｃで置換した場合の影響を示している。
【０１１２】
図２０は、５−メチル−ｄＣを５−ブロモ−ｄＣにより修飾したアナログのデータを示している。
【０１１３】
実施例４
上記の試験方法により結果を得た。ＩＮＨ−ＯＤＮの免疫刺激活性を測定するために、アゴニスト（１０１０３）は添加していない。１０１０３は別のバイアル中で陽性対照として用いられる。
【０１１４】
修飾された強力なアンタゴニストの親である非修飾ＯＤＮがＴＬＲ９を刺激しないことを示すデータを、図２１Ａ、図２１Ｂおよび図２１Ｃにまとめている。
【０１１５】
【表１】
2016505265.tif 000003
【０１１６】
図２１Ｄは、非修飾の親ＯＤＮ２０８８および２１１４のＴＬＲ９阻害活性がＯＤＮ２０８８中のＣＧジヌクレオチドモチーフとは無関係であることを示している。これは、ＣからＡへの置換により生じたＡＧジヌクレオチドモチーフが、阻害活性に対する有意な影響が見られないことから理解される。
【０１１７】
図２１Ｅは、ＯＤＮ２１１４がＴＬＲ９免疫刺激活性を有さないことを示している。
【０１１８】
実施例５
Ｂ細胞または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）におけるサイトカイン分泌阻害アッセイ
【０１１９】
Ｂ細胞またはｐＤＣを、１０倍単位で容量設定されたＩＮＨ−ＯＤＮ（０．００１〜１０μＭ）の存在下、アゴニストＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９）またはイミキモド（ＴＬＲ７）で刺激する。培地として、１０％ＦＣＳと５０μＭ２−メルカプトエタノールとを添加したＲＰＭＩまたはＤＭＥＭを使用する。２４時間〜７２時間後、９６ウェルマイクロタイタープレートにおける培養物上清中のサイトカイン濃度を、標準法（ＥＬＩＳＡ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ）により測定する。
【０１２０】
実施例６
ｉｎ  ｖｉｖｏ阻害活性測定（サイトカイン／ケモカイン分泌阻害）
【０１２１】
マウスにＩＮＨ−ＯＤＮを、皮下、筋肉内、粘膜、腹腔内または鼻腔内投与後、皮下に刺激性ＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９）、ポリ−ＩＣ（ＴＬＲ３）またはイミキモド（ＴＬＲ７）を接種する。ＴＬＲアゴニストの投与の３時間後にマウスを犠死させ、血清を調製した。ＩＬ−１２ｐ４０やＩＰ−１０などのサイトカイン濃度を標準法（ＥＬＩＳＡ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ）で測定する。
【０１２２】
実施例７
関節リウマチのコラーゲン抗体誘発モデルおよびコラーゲン誘発モデル（Ｍａｋｉｎｏら、Ｊ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．，２０１２，７９，１２９−１３８等に記載）
【０１２３】
マウスに抗マウスＩＩ型コラーゲン抗体をｉｐ投与する。３日後、マウスに５０μｇのＬＰＳをｉｐ投与する。ＴＬＲアンタゴニストを０．１〜２５ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日または１日おきに５〜７日間、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．またはｉ．ｎ．投与する。処置後、マウスを犠死させ、関節腫脹を評価する。罹患関節の全ＲＮＡを調製し、ハウスキーピング遺伝子を基準とした炎症性ｍＲＮＡ（ＮＬＰＲ３、ＡＩＭ２、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αなど）の濃度をＲＴ−ＰＣＲにより測定する。さらに、炎症性サイトカインおよびケモカインの血清濃度を標準法により測定することもできる。マウスをアンタゴニストで処置すると、炎症性サイトカインおよびタンパク質濃度は有意に低下するだろう。
【０１２４】
ＴＬＲアンタゴニストは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の存在下、ウシまたはニワトリＩＩ型コラーゲンをマウスに接種（尾部から注入、２００μｇ）することにより関節リウマチを誘発した類似モデルでも有効であると考えられる。マウスをＴＬＲアンタゴニストで処置すると、疾患の発症に関与する、ＴＬＲ３／７および９に誘発されたサイトカイン産生の阻害が低下するだろう。
【０１２５】
実施例８
文献（Ｒｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１８９，４６１２−４６２０）に記載されているイミキモド誘発乾癬を利用した。
【０１２６】
マウスを剃毛し、アルダラクリーム（５％イミキモド含有、７０〜７５ｍｇ）を少なくとも５日間連続して塗布する。ＴＬＲアンタゴニストを塗布処置１日目から毎日（または１日おきに、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｎ．）投与する。マウス皮膚の紅斑、鱗屑および硬さを毎日観察する。別の実験では、背中から得た皮膚試料をＨＥ染色し、組織学的に評価する。
【０１２７】
実施例９
（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスを用いたマウスループスモデルを使用した。
【０１２８】
（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスの処置を、マウスの約２５％がタンパク尿を呈し始めた疾患発症時（月齢４ヶ月）に開始する。マウスに、週２回５ヶ月間、ＩＮＨ−ＯＤＮ（用量０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ）をｓ．ｃ．投与する。５ヶ月間処置した後（月齢９ヶ月）、尿タンパクと抗体レベルを測定する。１ヶ月後に抗ｄｓＤＮＡ抗体を測定し、腎臓のＩｇＧ沈着を組織学的に評価する。ＩＮＨ−ＯＤＮ処置により、ループスマウスの腎臓における抗ｄｓＤＮＡ抗体およびＩｇＧ沈着は減少する。ＩＮＨ−ＯＤＮで処置したループスモデルマウスでは、タンパク尿および糸球体腎炎が軽快し、その結果ＩＮＨ−ＯＤＮ処置マウスの生存率は上昇する。
【０１２９】
実施例１０
ＭＲＬ−Ｆａｓ（ｌｐｒ）マウスループスモデル
【０１３０】
ＭＲＬ−Ｆａｓ（ｌｐｒ）マウスを、週２回１０週間、ｓ．ｃ．もしくはｉ．ｐ．注射または経鼻的にＩＮＨ−ＯＤＮで処置し、最終投与から約３日後に犠死させる。血清試料を２週間ごとに採取し、抗ｄｓＤＮＡ抗体の血清中濃度を調べる。試験終了後（第１０週）に、腎臓をＯＣＴ媒体中で凍結させ、腎臓切片のＩｇＧ沈着を免疫組織化学法により調べる。尿を隔週で採取し、タンパクを検査する。ＩＮＨ−ＯＤＮ処置により、ループスマウスの腎臓における抗ｄｓＤＮＡ抗体およびＩｇＧ沈着は減少する。
【０１３１】
実施例１１
ＩＮＨ−ＯＤＮによる、８．３−ＮＯＤマウスにおける糖尿病発症の遅延
【０１３２】
８．３−ＮＯＤマウス（３〜４週齢）に、ＩＮＨ−ＯＤＮまたは対照化合物（ＰＢＳまたは非刺激性および非阻害性ＯＤＮ）を、０．１ｍｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの用量で週３回注射する。マウスを６週間観察し、糖尿病の自然発症割合を調べる。ＩＮＨ−ＯＤＮで処置した雌マウスの糖尿病発症は、ＰＢＳまたは非刺激性ＯＤＮを注射したマウスと比較して遅延する。同様に、クロロキン処置（例えば毎日１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）したマウスも糖尿病発症が遅延する。したがって、内因性ＴＬＲ７／ＴＬＲ９の活性化は、８．３−ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症に寄与している。
【図１Ａ】
2016505265.tif 000004
【図１Ｂ】
2016505265.tif 000005
【図１Ｃ】
2016505265.tif 000006
【図１Ｄ】
2016505265.tif 000007
【図１Ｅ】
2016505265.tif 000008
【図２】
2016505265.tif 000009
【図３】
2016505265.tif 000010
【図４】
2016505265.tif 000011
【図５】
2016505265.tif 000012
【図６】
2016505265.tif 000013
【図７Ａ】
2016505265.tif 000014
【図７Ｂ】
2016505265.tif 000015
【図８】
2016505265.tif 000016
【図９】
2016505265.tif 000017
【図１０】
2016505265.tif 000018
【図１１】
2016505265.tif 000019
【図１２】
2016505265.tif 000020
【図１３】
2016505265.tif 000021
【図１４】
2016505265.tif 000022
【図１５】
2016505265.tif 000023
【図１６】
2016505265.tif 000024
【図１７】
2016505265.tif 000025
【図１８】
2016505265.tif 000026
【図１９】
2016505265.tif 000027
【図２０】
2016505265.tif 000028
【図２１Ａ】
2016505265.tif 000029
【図２１Ｂ】
2016505265.tif 000030
【図２１Ｃ】
2016505265.tif 000031
【図２１Ｄ】
2016505265.tif 000032
【図２１Ｅ】
2016505265.tif 000033
【配列表】
2016505265000001.app
【国際調査報告】
2016505265.tif 000034
2016505265.tif 000035
2016505265.tif 000036
2016505265.tif 000037
2016505265.tif 000038
2016505265.tif 000039