(57)【要約】  化合物のための製剤を作製する方法であって、前記化合物と相互作用する少なくとも１つの基を備えた化合物相互作用剤を決定する工程と、前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを、少なくとも１つの親水性ドメインと共役させることによって、キャリア剤を作製する工程と、前記製剤を作製するように前記化合物と前記キャリア剤とを組み合わせる工程とを含む、方法。前記キャリア剤を作製する工程は、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを前記少なくとも１つの疎水性ドメインと共役させることをさらに含んでいてもよい。【選択図】図２
2016503012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物のための製剤を作製する方法であって、
前記化合物と相互作用する少なくとも１つの基を備えた化合物相互作用剤を決定する工程と、
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを、少なくとも１つの親水性ドメインと共役させることによって、キャリア剤を作製する工程と、
前記製剤を作製するように前記化合物と前記キャリア剤とを組み合わせる工程とを備えている、方法。
【請求項２】
前記キャリア剤を作製する工程が、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを前記少なくとも１つの疎水性ドメインと共役させることをさらに備えている、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、少なくとも１つの脂質を備えている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの親水性ドメインが、少なくとも１つの親水性オリゴマーまたは少なくとも１つの親水性ポリマーを備えている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記親水性オリゴマーまたは前記親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリンまたはポリペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの親水性ドメインが、少なくとも１つのイオン性基を備えている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの親水性ドメインが、少なくとも１つのカルボン酸基、少なくとも１つのアミン基、少なくとも１つの糖基または少なくとも１つの多糖基を備えている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物相互作用ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸基または少なくとも１つのペプチド基を備えている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前期化合物相互作用ドメインが、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基、キノロン基、イソキノロン基、もしくは、前記化合物、前記化合物の一部、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタンアミン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタノール、９Ｈ−フルオレン−９−アミン、ナフタレン、１，１’−ビ−２−ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、カンプトテシン、カンプトテシン類似体、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ミトキサントロン、タモキシフェン、トレチノイン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＤ、クルクミン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ及びボルテゾミブから選択される分子の残基である基、またはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物相互作用ドメインが、フルオレニルメチルオキシカルボニル基またはその誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤が複合体を形成している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体が、ミセル、エマルジョン、クリーム、リポソーム、球晶、固体脂質ナノ粒子、ヒドロゲルまたは立方相リポゲルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基が、前記化合物に対する親和性を有している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミノ酸基または前記ペプチド基が、前記化合物に対する親和性を有する少なくとも１つのペンダント基を備えている、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基が、π−πスタッキング、疎水性相互作用または水素結合を介して前記化合物と相互作用する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのトコフェロール、少なくとも１つの疎水性オリゴマーまたは少なくとも１つの疎水性ポリマーを備えている、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリイソブタン、ポリエステル、ポリペプチドまたはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、ファルネシルチオサリチレート基を備えている、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記キャリアシステムが、少なくとも１０％の薬物ロード容量を提供する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記キャリアシステムが、少なくとも２０％の薬物ロード容量を提供する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記キャリアシステムが、少なくとも３０％の薬物ロード容量を提供する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、クルクミン、インドメタシン、タモキシフェンまたはドキソルビシンである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物がパクリタキセルであり、前記親水性ドメインがポリエチレングリコールであり、前記相互作用ドメインがフルオレニルメチルオキシカルボニル基またはその誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記キャリアの前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが、前記少なくとも１つの親水性ドメインに共有結合されている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
キャリア剤の前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが、前記少なくとも１つの親水性ドメインに共有結合されていると共に前記少なくとも１つの疎水性ドメインに共有結合されている、請求項２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
化合物を患者に送達させるための製剤であって、
前記化合物と、前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた少なくとも１つの親水性ドメインを備えたキャリア剤とを備えている、製剤。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記キャリア剤が、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに備えている、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
化合物を患者に送達させるための製剤を作製する方法であって、
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた少なくとも１つの親水性ドメインを備えたキャリア剤を提供する工程と、
前記化合物と前記キャリア剤とを組み合わせる工程とを備えている、方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記キャリア剤が、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに備えている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物と共に使用するためのキャリア剤であって、前記化合物と相互作用する少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた少なくとも１つの親水性ドメインを備えている、キャリア剤。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに備えている、請求項３１に記載のキャリア剤。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、少なくとも１つの脂質を備えている、請求項３２に記載のキャリア剤。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの親水性ドメインが、少なくとも１つの親水性オリゴマーまたは少なくとも１つの親水性ポリマーを備えている、請求項３１または３２に記載のキャリア剤。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの親水性オリゴマーまたは前記少なくとも１つの親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリンまたはポリペプチドである、請求項３４に記載のキャリア剤。
【請求項３６】
前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項３５に記載のキャリア剤。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの親水性ドメインが、少なくとも１つのイオン性基を備えている、請求項３１または３２に記載のキャリア剤。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの親水性ドメインが、少なくとも１つのカルボン酸基、少なくとも１つのアミン基、少なくとも１つの糖基または少なくとも１つの多糖基を備えている、請求項３１または３２に記載のキャリア剤。
【請求項３９】
前記化合物相互作用ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸基または少なくとも１つのペプチド基を備えている、請求項３１または３２に記載のキャリア剤。
【請求項４０】
前期化合物相互作用ドメインが、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基、キノロン基、イソキノロン基、もしくは、前記化合物、前記化合物の一部、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタンアミン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタノール、９Ｈ−フルオレン−９−アミン、ナフタレン、１，１’−ビ−２−ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、カンプトテシン、カンプトテシン類似体、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ミトキサントロン、タモキシフェン、トレチノイン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＤ、クルクミン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ及びボルテゾミブから選択される分子の残基である基、またはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項４１】
前記化合物相互作用ドメインが、フルオレニルメチルオキシカルボニル基またはその誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項４２】
前記製剤が複合体を形成している、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項４３】
前記複合体が、ミセル、エマルジョン、クリーム、リポソーム、球晶、固体脂質ナノ粒子、ヒドロゲルまたは立方相リポゲルである、請求項４２に記載のキャリア剤。
【請求項４４】
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基が、前記化合物に対する親和性を有している、請求項３１または３２に記載のキャリア剤。
【請求項４５】
前記アミノ酸基または前記ペプチド基が、前記化合物に対する親和性を有する少なくとも１つのペンダント基を備えている、請求項３９に記載のキャリア剤。
【請求項４６】
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基が、π−πスタッキング、疎水性相互作用または水素結合を介して前記化合物と相互作用する、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのトコフェロール、少なくとも１つの疎水性オリゴマーまたは少なくとも１つの疎水性ポリマーを備えている、請求項３２〜４６のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリイソブタン、ポリエステル、ポリペプチドまたはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項３２〜４６のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインが、ファルネシルチオサリチレート基を備えている、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５０】
前記キャリアシステムが、少なくとも１０％の薬物ロード容量を提供する、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５１】
前記キャリアシステムが、少なくとも２０％の薬物ロード容量を提供する、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５２】
前記キャリアシステムが、少なくとも３０％の薬物ロード容量を提供する、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５３】
前記化合物が、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、クルクミン、インドメタシン、タモキシフェンまたはドキソルビシンである、請求項３１〜５２のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５４】
前記化合物がパクリタキセルであり、前記親水性ドメインがポリエチレングリコールであり、前記相互作用ドメインがフルオレニルメチルオキシカルボニル基またはその誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項３１〜５２のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５５】
前記キャリアの前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが、前記少なくとも１つの親水性ドメインに共有結合されている、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５６】
キャリア剤の前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが、前記少なくとも１つの親水性ドメインに共有結合されていると共に前記少なくとも１つの疎水性ドメインに共有結合されている、請求項３２〜５４のいずれか１項に記載のキャリア剤。
【請求項５７】
化合物により患者を処置する方法であって、
製剤を患者に送達する工程を備えており、
前記製剤が、前記化合物と、前記化合物と相互作用する少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを備えているキャリア剤とを備えており、
前記少なくとも１つの化合物相互作用基が、少なくとも１つの親水性ドメインと共役させられている、方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記キャリア剤が、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに備えている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記製剤が、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により形成されている、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基、キノロン基、イソキノロン基、及び、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタンアミン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタノール、９Ｈ−フルオレン−９−アミン、ナフタレン、１，１’−ビ−２−ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、カンプトテシン、カンプトテシン類似体、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ミトキサントロン、タモキシフェン、トレチノイン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＤ、クルクミン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ及びボルテゾミブから選択される分子の残基である基、またはそれらの誘導体から選択される少なくとも１つの基に結合させられた、少なくとも１つの親水性ポリマーを備えている物質の組成物。
【請求項６１】
前記親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリンまたはポリペプチドである、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記親水性ポリマーがポリアルキレンオキシドである、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記少なくとも１つの基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基またはカルバゾール基である、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの基がフルオレニルメチルオキシカルボニル基である、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの基が、少なくとも１つのアミノ酸基または少なくとも１つのペプチド基を介して、前記少なくとも１つの親水性ポリマーに結合されている、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記組成物が、ポリエチレングリコール−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ポリエチレングリコールが、少なくとも１ＫＤａの分子量を有している、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ポリエチレングリコールが、およそ１ＫＤａ〜１０ＫＤａの範囲の分子量を有している、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
少なくとも１つの疎水性基をさらに備えており、前記少なくとも１つの基が前記疎水性基と前記少なくとも１つの親水性ポリマーとの間に配置されている、請求項６０〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの疎水性基が、脂質、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリイソブタン、ポリエステル、ポリペプチドまたはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを備えている、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの疎水性基が、少なくとも１つの脂質基を備えている、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記少なくとも１つの疎水性基が、少なくとも１つのオレイル基を備えている、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記組成物が、ミセル、エマルジョン、クリーム、リポソーム、球晶、固体脂質ナノ粒子、ヒドロゲルまたは立方相リポゲルを形成している、請求項６０〜７３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７３６，１００号の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の利益
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって与えられた認可番号ＡＩ０６８０２１、ＧＭ０６７０８２、ＨＬ０９１８２８及びＧＭ０８５０４３の下で、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
以下の情報は、以下に開示される技術及びそのような技術が典型的に使用可能であり得る環境を理解するにあたって、読者の助けとなるように提供される。本願で使用される用語は、本文書中において特に明記しない限り、任意の特定の狭い解釈に限定されることを意図するものではない。本願に記載された参考文献は、技術やその背景の理解を容易し得るものである。本願に引用される全ての参考文献の開示は、参照により組み込まれる。
【０００４】
難水溶性は、薬物候補を臨床応用へと進展させるための主要なハードルの一つである。ほとんどの製薬会社は、経口的に送達可能な薬剤に注目している。しかしながら、全ての薬物が経口により生物学的に利用可能というわけではない。例えば、生物学的利用能は、投与量における、例えば体循環系に到達する未変化薬物の割合として規定され得る。いくつかの化合物／薬剤はおそらく消化管で分解され、いくつかはあまりに上皮内層にとってあまりに有害であり、多くの場合には、いったん吸収された血液中の遊離薬物の持続時間は非常に短い。薬物候補は、これらの問題の任意の１つまたは組み合わせによって、（製薬業界で一般的な慣行として）薬物開発を中止または停止されることがある。
【０００５】
そのため、化合物の分散及び／または可溶化は、経口、局所または全身経路のいずれを通じてであろうと体内に投与／吸収されることとなる多くの薬剤にとって不可欠な最初のステップである。両親媒性剤（親水性セグメントまたは頭部と疎水性セグメントまたは尾部を有する）は、例えば、界面活性剤や、ミセル、エマルジョン、クリーム、リポソーム、固体−脂質ナノ粒子のような様々な脂質ベースの製剤などであって、難溶性薬物の製剤システムにおいて頻繁に使用される。脂質ベースの製剤は、例えば、リポソーム、エマルジョン及びミセルなどであって、その優れた安全性プロファイルにより、生体内（in vivo）における用途において魅力的な薬物送達システムである。水溶性ポリマー、ポリマーベースのヒドロゲル及びポリマーナノ粒子もまた、経口、局所および全身用途に有用な薬物送達システムである。
【０００６】
現在、癌および感染性疾患の治療のための臨床の場において、様々な種類の脂質薬物製剤が使用されている。脂質製剤を決定するための現在のアプローチは、現存する既製成分から適切な出発物質を選択することによる試行錯誤プロセスを用いている。キャリアとしての合成分子に基づくより洗練された取り組みであっても、製剤は未だ経験的なものであり、メカニズムに基づくものではない。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、化合物のための製剤を作製する方法は、前記化合物と相互作用する少なくとも１つの基を備えた化合物相互作用剤を決定する工程と、前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を含んだ少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを、少なくとも１つの親水性ドメインと（に）共役または結合させることによって、キャリア剤を作製する工程と、前記製剤を作製するように前記化合物と前記キャリア剤とを組み合わせる工程とを含んでいる。いくつかの実施形態では、前記キャリア剤を作製する工程は、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを前記少なくとも１つの疎水性ドメインと（に）共役または結合させることをさらに含んでいる。
【０００８】
前記少なくとも１つの親水性ドメインは、例えば、少なくとも１つの親水性オリゴマーまたは少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいてもよい。用語「ポリマー」は、一般的に、高い相対分子量を有し、低い相対分子量（モノマー）の分子に実際にまたは概念的に由来する繰り返し単位を含む構造を有する分子を示している。用語「オリゴマー」は、一般的に、中間的な相対分子量を有し、低い相対分子量（モノマー）の分子に実際にまたは概念的に由来する繰り返し単位を含む構造を有する分子を示している。一般的には、ポリマーは、１より多い繰り返し単位またはモノマー単位を有する化合物であり、より典型的には、１０より多い繰り返し単位またはモノマー単位を有する化合物である。一方、オリゴマーは、１より多く２０より少ない繰り返し単位またはモノマー単位を有する化合物であり、より典型的には、１０より少ない繰り返し単位を繰り返し単位またはモノマー単位を有する化合物である。いくつかの実施形態では、前記親水性オリゴマーまたは前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリンまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコールである。前記少なくとも１つの親水性ドメインは、例えば、少なくとも１つのイオン性基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性ドメインは、少なくとも１つのカルボン酸基、少なくとも１つのアミン基、少なくとも１つの糖基または少なくとも１つの多糖基を含んでいる。
【０００９】
前記化合物相互作用ドメインは、例えば、少なくとも１つのアミノ酸基または少なくとも１つのペプチド基を含んでいてもよい。前記アミノ酸基または前記ペプチド基は、例えば、前記化合物に対する親和性を有する少なくとも１つのペンダント基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前期化合物相互作用ドメインが、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基、キノロン基、イソキノロン基、もしくは、前記化合物、前記化合物の一部もしくは前記化合物の全部、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタンアミン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタノール、９Ｈ−フルオレン−９−アミン、ナフタレン、１，１’−ビ−２−ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、カンプトテシン、カンプトテシン類似体（例えば、ヒドロキシルカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びホモカンプトセシン）、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、ヒドロキシカンプトテシン、ミトキサントロン、タモキシフェン、トレチノイン、ビタミンＡ（例えば、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及び、ベータカロテンなどのプロビタミンＡカロテノイド）、ビタミンＥ（例えば、トコフェロール及びトコトリエノール）、ビタミンＫ（例えば、フィロキノンまたはメナキノン）、ビタミンＤ（例えば、コレカルシフェロールまたはエルゴカルシフェロールなどのセコステロイド）、クルクミン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ及びボルテゾミブから選択される分子の残基である基、またはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを含んでいる。いくつかの実施形態では、前記化合物相互作用ドメインが、フルオレニルメチルオキシカルボニル基またはその誘導体のうち少なくとも１つを含んでいる。
【００１０】
前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基は、例えば、前記化合物に対する親和性を有していてもよい。前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基は、例えば、π−πスタッキング、疎水性相互作用または水素結合を介して前記化合物と相互作用してもよい。
【００１１】
前記製剤は、例えば、複合体を形成していてもよく、前記複合体は、例えば、ミセル、エマルジョン、クリーム、リポソーム、球晶、固体脂質ナノ粒子、ヒドロゲルまたは立方相リポゲルであってもよい。
【００１２】
前記少なくとも１つの疎水性ドメインは、例えば、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのトコフェロール（例えば、ビタミンＥ）、少なくとも１つの疎水性オリゴマーまたは少なくとも１つの疎水性ポリマーを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの疎水性ドメインは、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリイソブタン、ポリエステル、ポリペプチドまたはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを含んでいる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの疎水性ドメインは、ファルネシルチオサリチレート（ＦＴＳ）基を含んでいる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの疎水性ドメインは、少なくとも１つの脂質を含んでいる。
【００１３】
前記キャリアシステムは、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、さらには少なくとも４０％の薬物ロード容量を提供してもよい。通常、前記キャリアシステムの前記薬物ロード容量は、前記化合物相互作用ドメインにより増加させられる。同様に、安定性もまた増加させられ得る。例えば、本願の両親媒性キャリアシステムは、本願の両親媒性キャリアシステムの疎水性ドメイン及び親水性ドメインのみを含む両親媒性分子よりも高いロード容量を有することとなる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性ドメインは、少なくとも１ＫＤａ（例えば、およそ１ＫＤａ〜１０ＫＤａの範囲）の分子量を有しており、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインは、およそ３００Ｄａ〜２ＫＤａの範囲の分子量を有しており、前記少なくとも１つの疎水性ドメインは、少なくとも２ＫＤａ（例えば、およそ２ＫＤａ〜２０ＫＤａの範囲）の分子量を有している。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性ドメインは、およそ１ＫＤａ〜５ＫＤａの範囲の分子量を有しており前記少なくとも１つの疎水性ドメインは、およそ２ＫＤａ〜５ＫＤａの範囲の分子量を有している。これらのドメインは、例えば、単一または複数の鎖を含んでいてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記化合物は薬物である。薬物は、身体に効果（例えば、医薬または治療効果、中毒効果、機能増強効果または別の効果）を有する生物学的活性物質である。いくつかの実施形態では、前記化合物は、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、クルクミン、インドメタシン、タモキシフェンまたはドキソルビシンである。いくつかの実施形態では、前記化合物がパクリタキセルであり、前記親水性ドメインがポリエチレングリコールを含み、前記相互作用ドメインがフルオレニルメチルオキシカルボニル基またはその誘導体のうち少なくとも１つを含んでいる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記キャリアの前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインは、前記少なくとも１つの親水性ドメインに共有結合されている。いくつかの実施形態では、キャリア剤の前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインは、前記少なくとも１つの親水性ドメインに共有結合されていると共に前記少なくとも１つの疎水性ドメインに共有結合されている。
【００１７】
別の態様では、化合物を患者に送達させるための製剤は、前記化合物と、少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた少なくとも１つの親水性ドメインを含んだキャリア剤とを含んでいる。前記化合物相互作用ドメインは、前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を含んでいる。いくつかの実施形態では、前記キャリア剤は、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに備えている。
【００１８】
別の態様では、化合物を患者に送達させるための製剤を作製する方法は、少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた少なくとも１つの親水性ドメインを含んだキャリア剤を提供する工程であって、前記化合物相互作用ドメインが前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を含んでいる工程と、前記化合物と前記キャリア剤とを組み合わせる工程とを含んでいる。いくつかの実施形態では、前記キャリア剤は、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに含んでいる。
【００１９】
別の態様では、物質の組成物は、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基、キノロン基、イソキノロン基、及び、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタンアミン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタノール、９Ｈ−フルオレン−９−アミン、ナフタレン、１，１’−ビ−２−ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、カンプトテシン、カンプトテシン類似体、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ミトキサントロン、タモキシフェン、トレチノイン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＤ、クルクミン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ及びボルテゾミブから選択される分子の残基である基、またはそれらの誘導体から選択される少なくとも１つの基に結合させられた、少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいる。前記親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリンまたはポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、前記親水性ポリマーはポリアルキレンオキシドである。前記親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコールであってもよい。前記ポリエチレングリコールは、例えば、少なくとも１ＫＤａの分子量を有していてもよい。いくつかの実施形態では、前記ポリエチレングリコールは、およそ１ＫＤａ〜１０ＫＤａの範囲の分子量を有している。前記少なくとも１つの基は、例えば、少なくとも１つのアミノ酸基または少なくとも１つのペプチド基を介して、前記少なくとも１つの親水性ポリマーに結合されていてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基、キノロン基、イソキノロン基またはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基またはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンジルオキシ基、イソブトキシカルバメート基、ナフチルアセチル基、カルバゾール基である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル基またはそれらの誘導体である。前記組成物は、例えば、ポリエチレングリコール−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2であってもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの疎水性基をさらに含んでおり、前記少なくとも１つの基が前記疎水性基と前記少なくとも１つの親水性ポリマーとの間に配置されている。前記少なくとも１つの疎水性基は、例えば、脂質、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリイソブタン、ポリエステル、ポリペプチドまたはそれらの誘導体のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの疎水性基は、少なくとも１つの脂質基を備えている。前記少なくとも１つの疎水性基は、例えば、少なくとも１つのオレイル基を含んでいてもよい。
【００２２】
さらなる態様では、化合物と共に使用するためのキャリア剤は、前記化合物と相互作用する前記少なくとも１つの基を含んだ少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた少なくとも１つの親水性ドメインを含んでいる。いくつかの実施形態では、前記キャリア剤は、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに含んでいる。
【００２３】
また、さらなる態様では、化合物により患者を処置する方法は、前記化合物と、前記化合物と相互作用する少なくとも１つの基を備えた少なくとも１つの化合物相互作用ドメインを含んだキャリア剤とを含んでいる製剤を患者に送達する工程を含んでいる。前記少なくとも１つの化合物相互作用基は、少なくとも１つの親水性ドメインと共役させられている。いくつかの実施形態では、前記キャリア剤は、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインが前記少なくとも１つの親水性ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインとの間に配置されるように、前記少なくとも１つの化合物相互作用ドメインと共役させられた前記少なくとも１つの疎水性ドメインをさらに含んでいる。前記製剤は、上述の方法により形成されていてもよい。
【００２４】
本願のシステム、方法及び組成物は、それらの特性及び付随する利点と共に、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を考慮することにより、最もよく認識及び理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明を概略的表現にて説明するにあたり、以下に添付の図面を参照するが、これらの図面は必ずしも正確な縮尺ではない。
【００２６】
【図１】図１は、ＪＰ４−０３９（疎水性の、安定ニトロキシドラジカル抗酸化剤ベースのペプチド−ＴＥＭＰＯ−（２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ−））の溶解性試験にて検討した種々のアミノ酸誘導体の構造を示す。
【図２】図２は、本願のＪＰ４−０３９のいくつかの代表的な試験に用いられたＰＥＧ脂質とＰＥＧ−リポペプチドとの複合体の化学構造を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、リポペプチド４ミセルのクライオＥＭ画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、リポペプチドとＪＰ４−０３９リポペプチドとの複合体のクライオＥＭ画像を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、リポペプチドミセルと薬物リポペプチドとの複合体の、提案された理想化モデルを示す。
【図４】図４は、ＰＥＧ−リポペプチド４ミセルにより促進されたＪＰ４−０３９の可溶化の試験を示す。
【図５】図５は、リポペプチド４単独、並びに、リポペプチド４（−◆−）とＪＰ４−０３９とを重量比１００：２．５（−■−）及び１００：５（−▲−）で備えたものにおける蛍光消光試験の結果を示す。
【図６】図６は、−●−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、…○…Ｔｗｅｅｎ  ８０、−▼−ＰＥＧ２０００−オレイン酸エステル、−△−リポペプチド５（ＰＥＧ2,000−α−Ｃｂｚ−ε−オレイルリシン）、−■−リポペプチド１（ＰＥＧ2,000−α−Ｆｍｏｃ−ε−オレイルリシン）、−□−リポペプチド２（ＰＥＧ1,000−α−Ｆｍｏｃ−リシル−α−Ｆｍｏｃ−ε−ジオレイル−リシン）、−◆−リポペプチド３（［ＰＥＧ2,000−リシル−（α，ε−ジ−Ｆｍｏｃ−ε−オレイルリシン）2）］、及び、−◇−リポペプチド４（ＰＥＧ5,000−リシル−［リシル−（α，ε−ジ−Ｆｍｏｃ−ε−オレイルリシン）2］2）の、界面活性剤のラット赤血球における溶血活性の比較を示す。
【図７】図７は、ＪＰ４−０３９を含むゴマ油−卵ＰＣのエマルジョンのコロイド安定性及び薬物ロード容量における共界面活性剤の効果を示し、ゴマ油−卵ＰＣのエマルジョン（ＳＯＰＣ）、ＰＣの２０％をＰＥＧ−ＯＡに置き換えたＳＯＰＣ、リポペプチド５，６，７における調製直後（黒棒）及び７日目（薄灰色棒）の薬剤の取り込みの速度を、これらの製剤からＪＰ４−０３９を回収した後に測定して、これらのデータより初期％（暗灰色）を計算した（データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として示した）。
【図８】図８は、マウスへの全身放射線照射に対する、エマルジョン中に製剤されたＪＰ４−０３９の生体内での放射線緩和活性の試験を示し、該マウスには、エマルジョン単独（黒丸）またはエマルジョン中に製剤されたＪＰ４−０３９（白丸、２０ｍｇ／ｋｇ、放射線照射の２４時間後）を腹腔内注射した。
【図９Ａ】図９Ａは、ＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2ミセル中に製剤されたドキソルビシンまたはＤＯＸの増強された抗腫瘍活性を、相対的な腫瘍体積の変化により示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2ミセル中に製剤されたＤＯＸを投与後の体重変化を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＰＥＧ5000−ＶＥ2（ＰＥＧ−ＶＥ2）の合成を示し、ＶＥはビタミンＥを表す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＰＥＧ5000−Ｆｍｏｃ−ＶＥ2（ＰＥＧ−ＦＶＥ2）の合成を示す。
【図１１】図１１は、ＰＥＧ−ＦＶＥ2ミセル中に製剤されたＤＯＸの透析アッセイにおける放出の動態の試験を示す。
【図１２】図１２は、ＰＥＧ−ＦＶＥ2ミセル中に製剤化されたＤＯＸが、マウス乳癌モデル（４Ｔ１．２）に皮下注射された際において、遊離ＤＯＸまたはＤＯＸＩＬ（登録商標）（ペンシルバニア州ホーシャムのJanssen Biotech社から入手可能なドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤）よりも優れた抗腫瘍活性を表すこと（Ｐ＜０．０１（１０ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ＶＥ2／ＤＯＸに対して）；Ｐ＜０．００１（ＤＯＸＩＬに対して））を示す。
【図１３】図１３は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃの合成経路、及び、キャリア−薬物の分子間π−πスタッキングに基づいて理想的に自己会合したＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／パクリタキセルまたはＰＴＸの概略図を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、４Ｔ１．２マウス乳癌細胞株における生体内での腫瘍細胞の阻害を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３における生体内での腫瘍細胞の阻害を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５における生体内での腫瘍細胞の阻害を示す。図１４Ｃは、ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５における生体内での腫瘍細胞の阻害を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、前記腫瘍、生理食塩水及びＴＡＸＯＬと比較した、３種の用量におけるＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの治療効果についての生体内における試験（種々のグループ（ｎ＝５）における４Ｔ１．２マウス乳癌移植片を備えたマウス）を示し、腫瘍成長は、相対的な腫瘍体積として経時的（最初の注射後の日数）にプロットされる。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、前記腫瘍、生理食塩水及びＴＡＸＯＬと比較した、３種の用量におけるＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの治療効果についての生体内における試験（種々のグループ（ｎ＝５）における４Ｔ１．２マウス乳癌移植片を備えたマウス）を示し、（切除後に測定した）平均腫瘍重量を規定し、対照として生理食塩水で処置したマウスを用いて腫瘍成長阻害率（ＩＲ）を計算した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本願の図面に概ね記載及び図示される実施形態の構成要素は、記載された例示の実施形態に加えて、広く様々な異なる構成に配置及び設計されてもよいことが容易に理解されるものである。したがって、各図面に代表される例示の実施形態についての以下のより詳細な説明は、該実施形態の範囲を限定するものではなく、単に例示の実施形態を代表するのみである。
【００２８】
本明細書を通じて「一実施形態では」または「ある実施形態では」（または同様の記載）は、本実施形態に関して説明される特定の特徴、構造または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じて様々な箇所において現れる「一実施形態では」、「ある実施形態では」または同様の記載の句は、必ずしも全てが同一の実施形態を示すものではない。
【００２９】
さらに、記載される特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な手段により組み合わせられてもよい。以下の説明では、実施形態が十分に理解されるために、多くの具体的な詳細が提供される。しかしながら、関連技術の当業者であれば、様々な前記実施形態は、１つ以上の上記具体的な詳細を用いずに、または他の方法、構成要素、材料などを用いて実施され得ることを理解するであろう。他の例では、公知の構造、材料または操作は、不明瞭になることを避けるため、詳細には図示または説明されない。
【００３０】
本願および添付の特許請求の範囲では、単数形（"a"、"an"及び"the"）は、他に文脈が明確に指定していない限り、複数に対する言及を含む。したがって、例えば、「相互作用セグメント」への言及は、複数のそのような相互作用セグメント及び当業者に知られたそれらの同等物を含み、他も同様である。また、「前記相互作用セグメント」への言及は、複数のそのような相互作用セグメント及び当業者に知られたそれらの同等物を含み、他も同様である。本願では、数値範囲の列挙は、単に、範囲内に入るそれぞれ別々の値を参照する簡略化表記方法として用いられることが意図されるのみである。本願において他に示されない限り、それぞれの個々の数値は、中間の範囲と同様に、本願に独立して記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に他に示されない限り、または文章に明確に否定的に示されない限り、本願に記載の全ての方法は、任意の適切な順序で行われ得る。
【００３１】
既存の脂質ベースの製剤は、親水性薬剤（例えば、リポソーム製剤）または疎水性薬剤（例えば、リポソーム、ミセル、エマルジョン製剤のため）のいずれに対しても、より好適に適用可能である。しかし、このような製剤は、典型的には、中程度の疎水性または中程度の親水性しかない多くの薬物には、あまり適していない。界面活性剤内及びエマルジョンの油コア内において、疎水性の低い薬剤と親油性の高い脂肪族鎖との混合が不十分だと、薬物負荷能力が低くなることや、製剤が不安定になることがある。最初に油コアと混合された薬物は、エマルジョン粒子の界面にゆっくりと移動する傾向があり、やがて粒子から解離させられる。また、中程度の疎水性または親水性を有する薬物は、リポソーム製剤から漏れる問題も有している。
【００３２】
市場で入手可能な製剤目的で使用される両親媒性または界面活性剤分子は、全てではなくともそのほとんどが、限定されたまたは非常に単純な界面構造のドメインを（わずかでも存在するならば）有している。ほとんどの場合、疎水性基は、界面または中間ドメインを用いずに親水性基に共有結合している。両親媒性または界面活性剤分子の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎｓ、ＰＥＧ−アルキルエーテルまたはエステル、ＰＥＧ−リン脂質共役体、ＳＤＳ、オレイン酸または他の脂肪酸、モノ−、ジ−またはトリ−グリセリド、胆汁酸、リン脂質、コレステロール誘導体及びトコフェロール（ビタミンＥ）誘導体を含んでいる。一般的に、両親媒性界面活性剤の界面領域（すなわち、親水性の頭部と疎水性の尾部との間の領域）は、薬物製剤プロセスまたは手法において過小評価されている。しかしながら、該界面領域は、薬物製剤において、熱力学の原理に従いもっと重要とみなされるべきである。その点では、何らかのメカニズムに限定されることはないが、中程度の疎水性しか備えていない難水溶性薬物は、油コアにとっては親水性が高すぎると共に水相にとっては疎水性が高すぎるため、脂質ベースのシステムにおける安定性の問題があると考えられる。時間の経過により薬物が最初の油コアから界面に向かって移動することは、この相溶性が乏しいという問題により起こると考えられる。該難水溶性薬物は水相内には移動しないため、移動は該界面領域で停止することとなる。該界面領域における局所濃度が増加した結果、薬物の局所的な過飽和を引き起こすことになり、続いて活性医薬成分が結晶化／沈殿して、やがて製剤が残される。該界面領域において局所濃度が増加すると、製剤が不安定となる。このようなメカニズムは、従来の脂質ベースの製剤の多くにおいて、乏しい水溶性と中程度でしかない疎水性を呈する化合物／薬物にとってロード容量が低く不安定性であるという問題があることの理由を明らかにする。
【００３３】
本願のシステム、方法及び組成物は、従来の両親媒性の製剤に関する製剤の問題の困難性を低減または除去するための戦略を提供する。いくつかの実施例では、合理的に設計された本願の両親媒性または界面活性剤分子（キャリア剤）は、例えば、親水性セグメントまたはドメインと疎水性セグメントまたはドメインとの間に（すなわち、それらの間の界面領域に）、有効な化合物、薬物相互作用セグメントまたは薬物相互作用ドメインを有している。該相互作用またはドメインは、（例えば、化合物／薬剤に対する親和性を有する）化合物／薬物相互作用ドメインとして作用し、例えば、小分子化合物ライブラリからスクリーニングされてもよい。薬物相互作用性のモチーフ、化合物または基は、一度同定されると、両親媒性剤または両親媒性分子にモジュール方式で組み込まれ、それによって薬物相互作用ドメインを形成してもよい。例えば、そのようなドメインは、脂質または疎水性アンカーと、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコールもしくはＰＥＧ）または他の親水性基（例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、もしくは荷電残基または親水性残基を備えたポリペプチド）との間に、導入されていてもよい。その全体的な構造は、水（親水性）と油（疎水性）相との界面に位置する薬物相互作用領域を備えた界面活性剤活性を有している。このような設計は、全ての疎水性または親水性化合物と共に使用するのに適切である可能性がある一方で、従来の製剤よりも優れている中程度の疎水性または親水性を備えた化合物を収容する。加えて、ペンダント基として薬物相互作用ドメインを十分な量含む分枝鎖または直鎖状の骨格構造を備えたポリマーは、同様に、薬物と複合体を形成し得る。本願の薬物／分子は、多様な構造を備えた薬物分子のための広範な用途を有している。本願のいくつかの実施例では、疎水性のセグメント、領域またはドメインは、本願の製剤のためのキャリア剤の中には存在しない。この点において、薬物相互作用ドメインは、一度同定されると、親水性基に組み込まれてもよく、親水性基に結合されてもよい。
【００３４】
キャリア−薬物相互作用及び時間依存性の分散処理を通じて、制御された薬物の放出は、例えば、リポソーム、ハイドロゲル、顆粒、ペレット及び他の物理的形態などの形態の薬物−キャリア投与方法により達成され得る。本願のキャリア剤は、主として薬物の代表的な例に関連して説明されるが、本願の該キャリア剤は、他の化合物または分子と関連して使用するのに適切であり得る。
【００３５】
いくつかの実施例では、両親媒性物質／分子の界面領域は、アミノ酸またはペプチドセグメント等の相互作用セグメントを挿入することによって修飾（例えば、拡大（enlarged）及び／または拡張（expanded））され得る。さらに、アミノ酸または他の残基上に、薬物相互作用能力を示すペンダント基が組み込まれてもよい。このようなペンダント基は、例えば、薬物製剤を安定化する方法として、キャリア−薬物相互作用を高めるためのπ−π疎水性／芳香族環スタッキングまたは水素結合相互作用が可能であってもよい。
【００３６】
（本願の両親媒性剤において使用される、または、薬物相互作用性のセグメント、領域またはドメインと親水性のセグメント、領域またはドメインとを含む本願の薬剤において使用される）化合物／薬剤相互作用性のセグメント、領域またはドメインは、例えば、高められた水溶性を有する保護されたアミノ酸または保護アミノ酸のＰＥＧ共役体のような個々のモチーフの溶解度試験を通じて、例えば、実験により決定されてもよい。検出の方式は、例えば、結晶形成の抑制／消滅のための（例えば、顕微鏡下における）視覚によるものであってもよく、そのような視覚による検出方式は、光学密度（ＯＤ）の読み取り、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または、水溶液中でナノ構造体を溶液にすることが容易な難水溶性遊離薬物の可溶性画分のための任意の他の適切な測定方法によるものであってもよい。本願の相互作用セグメント、領域またはドメインにおいて使用するのに適切な基の例は、以下に限定されるものではないが、十分に水溶性のアミノ酸誘導体のような小分子の一部として、フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ基（ＣｂｚまたはＺ）及びイソブトキシカルバメート基を含んでいる。該相互作用セグメント、領域またはドメインが相互作用することとなる化合物または化合物の一部は、該相互作用セグメント、領域またはドメイン中においても使用され得る。例えば、該化合物またはその一部上の反応基（該化合物／一部の本来のもの、または、その上に修飾により作成されたもののいずれか）は、該化合物／一部の残基をキャリア剤中に結合するために用いられ得る。固相支持体上に固定化されたモチーフは、例えば、同定プロセスに対して有用であってもよく、該同定プロセスは、例えば、修飾されていない固相支持体と比較して試験される特定の薬剤を結合または吸着することによるものであってもよい。
【００３７】
上記モチーフは、例えば、追加的または代替的に、荷電特性、芳香環構造、水素結合能力などのような特定の薬剤の公知の構造的特徴に基づいて理論的に予測されてもよい。例えば、ナフチルアセチル基は、Ｆｍｏｃ基と同等の活性であることが予測され、実験により確認されている。
【００３８】
本願の薬剤中におけるＦｍｏｃ基、その誘導体及び類する基（例えば、カルバゾール、キノロン、イソキノロン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタンアミン、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メタノール、９Ｈ−フルオレン−９−アミン、ナフタレン及びＢｉｎｏｌ）は、例えば、パクリタキセル（ＰＴＸ）から、ステロイド、キサンテンベースおよびポルフィリンベースの光力学薬剤、そして疎水性ペプチドにまで及ぶ、一連の異種の薬物を製剤するにあたって有効であり、薬物ロード容量および薬物滞留性の両方が大幅に改善されることが見出されている。これらのデータは、「製剤の化学キャリア（chemophors）」として適格なＦｍｏｃのような基が、様々な医薬剤との相互作用において強力な活性を示し、そのため、キャリア−薬剤相溶性を改良する特性を示すことを示唆している。あらゆる機構に制限されることなく、そのような相互作用の分子基盤は、Ｆｍｏｃ単位のコンパクト縮合芳香環構造と、例えば１つ以上の芳香環を有する薬物（または他の化合物）の分子との間の、通常はファンデルワールス相互作用よりも強いπ−πスタッキング相互作用の結果生じると考えられる。
【００３９】
薬物相互作用性のモチーフ、基または薬剤は、例えば、脂質ベースの界面活性剤に、（界面領域における）相互作用セグメント上のペンダント基（例えば、ペプチド側鎖またはペンダント基）として組み入れられ、それによって、以下の３つの異なるドメインを備えた両親媒性／界面活性剤デザイナー分子を形成してもよい：親水性の頭部基またはセグメント（例えば、ＰＥＧ）、拡張中間セグメントまたは界面領域（相互作用セグメント）、及び疎水性のセグメント、尾部領域またはアンカー領域（例えば、脂質）。該界面領域でのモチーフ配列の構成は、例えば、連続または不連続であってもよく、直鎖状または分枝鎖状であってもよい。脂質鎖の数は、例えば、０〜４以上に変化させられてもよい。
【００４０】
したがって、本願のキャリア剤は、実験的アプローチ及び／または理論的な予測に基づいて選択された１つ以上の薬物相互作用モチーフを組み入れることによって、個別最適化された設計がされてもよい。また、疎水性鎖または脂質鎖を備えていない親水性セグメント−薬物相互作用モチーフ共役体であっても、モチーフ−モチーフ相互作用の性質に応じて、例えば、ミセル、可溶性複合体または薬物がロードされたヒドロゲルを形成し得るような用途を有していてもよい。ヒドロゲルは、例えば、遅い／遅延させられた放出機能を伴う局所適用として用いられてもよい。
【００４１】
上述のように、ＰＥＧ鎖は、本願の親水性セグメントにおいて用いられてもよい。ＰＥＧ鎖は、例えば、他の親水性基に置き換えられてもよく、該他の親水性基は、例えば、親水性能を有するカルボキシル基もしくはアミン基、または他の親水性のポリマー、糖などを含む。
【００４２】
本願のキャリア剤／分子は、例えば、薬剤とのミセルを包接複合体として形成するのに単独で用いてもよく、例えば、混合ミセルにおいて、共界面活性剤を添加して、薬物がロードされたミセル、エマルジョン、クリーム、リポソーム、球晶、固体脂質ナノ粒子、ヒドロゲル、立方相リポゲルなどを形成する他の脂質成分と共に用いられてもよい。概して、本願の両親媒性界面活性剤またはキャリア剤は、化合物／薬物のための界面安定化剤として作用し、製剤の安定性を向上させると共に薬物負荷能力を増加させる。
【００４３】
本願のキャリア剤は、薬物相互作用セグメント／モチーフを備え、共重合または化学修飾を通じて作製された（疎水性−親水性繰り返し単位または親水性繰り返し単位を含む）ポリマーであってもよい。薬物相互作用ドメインと結合または共役させられた親水性ドメイン及び疎水性ドメインを含むキャリア剤の場合には、薬物相互作用セグメント／モチーフは、疎水性セグメント内、または親水性と疎水性セグメントとの境界のいずれかにおいて組み入れられていてもよい。例えば、親水性セグメントは、以下に限定されるものではないが、ＰＥＧ、または、親水性残基もしくは親水性誘導体に富むペプチド配列であってもよい。疎水性セグメントは、例えば、少なくとも１つのポリメチルアクリル基、少なくとも１つのポリエチレン基、少なくとも１つのポリスチレン基、少なくとも１つのポリイソブタン基、少なくとも１つのポリエステル基、少なくとも１つのポリペプチド基または任意のそれらの誘導体を含んでいてもよい。上述のように、薬物相互作用モチーフは、例えば、少なくとも１つのＦｍｏｃ基（例えば、アミノ酸残基のペンダント基）であってもよい。
【００４４】
上記薬剤は、例えば、胃液もしくは腸液中における薬物吸収を増強するため、及び／または、残留時間を増加させるため、例えば、経口投与薬剤用の「薬物調剤（drug dispenser）」であってもよい。また、該薬剤は、例えば、局所適用または粘膜適用における透過速度を増加させるために用いられてもよい。さらに、該薬剤は、体内注射用のコロイド製剤として用いられてもよい。
【００４５】
細胞表面分子に特異的なリガンドは、細胞取り込みの速度または特異性を促進するために、例えば、末端位置において本願の親水性セグメント（例えば、ＰＥＧ））内に組み入れられてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本願のボトムアップアプローチは、例えば、相互作用ドメインを選択することから始まり、続いてキャリア剤（例えば、両親媒性剤、界面活性剤またはポリマー）を構築して、その後に、例えば、ミセル製剤、エマルジョン製剤、リポソーム製剤、ヒドロゲル製剤または特定の薬物のための別の製剤などの製剤を開発する。また、薬物／化合物の相互作用機能を含む天然または合成分子もまた使用されてもよく、例えば、親水性、相互作用性及び疎水性などの指向を備えた分子を生成するために、これらの分子が界面活性剤中に導入されてもよい。このようなモチーフは、特定の薬剤と結合／溶解／会合するように、疎水性ドメイン／セグメントと共に作用してもよい。本願の設計原理は、生体内薬物送達（in vivo drug delivery）の改善のために、例えば、脂質及びポリマーシステムなどを使用する多くの薬物に拡張されてもよい。この点において、本手法は、中程度に疎水性または中程度に親水性であって、従来の製剤によっては効果的に製剤化できない様々な種類の治療薬を製剤化するための広範な用途を提供する。
【００４７】
追加の疎水性剤及び親水性剤のための多鎖のＰＥＧ化されたミセルを形成する両親媒性剤または界面活性剤の用途は、以下の表１の代表的な例において示される。疎水性かつ嵩高い分子の例は、ＪＰ４−０３９、疎水性、ペプチド−ＴＥＭＰＯ−（２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシル−）ベースの安定ニトロキシドラジカル酸化防止剤；パクリタキセル（抗がん化学療法剤）；タクロリムスまたはＦＫ５０６（免疫抑制剤）；シクロスポリンＡ（免疫抑制剤）；エオシンＹ（光力学療法に用いられる、縮合芳香族環構造を備えた薬剤）；ローズベンガル（光力学療法に用いられる、縮合芳香族環構造を備えた薬剤）；プロトポルフィリンＩＸ（光力学療法に用いられる、縮合芳香族環構造を備えた薬剤）；及び、エピガロカテキンガレートまたはＥＣＧＣ（緑茶抽出物、強力な親水性の酸化防止剤かつ既知の化学療法増感剤）を含む。
【００４８】
追加の疎水性剤のための親水性／脂質鎖を備えていない単鎖のＰＥＧ化された脂質−オレイルアミド誘導体またはＰＥＧ−ペプチド共役体の用途は、以下の表２の代表的な例において示される。疎水性かつ嵩高い分子の例は、インドメタシン（非ステロイド性抗炎症薬）、タモキシフェン（ホルモン受容体陽性乳癌のための内分泌（抗エストロゲン）療法に使用される、エストロゲン受容体用のリガンド）;クルクミン（抗腫瘍性、抗酸化性、抗関節炎性、抗アミロイド性、抗虚血性及び抗炎症性が示されている生薬化合物）を含む。メトキシ−ＰＥＧ５５０−α−Ｆｍｏｃ−リシル−ε−オレイルアミドの場合には、薬物：界面活性剤の重量比を１：２０として水和させることにより、ミセル溶液が薬物−界面活性剤混合物から容易に調製された。該薬物−界面活性剤混合物は、油、シロップまたはゲルとなるため、このような混合物は、ソフトもしくはハードカプセルとして、またはシロップとしてパッケージされ得る。メトキシ−ＰＥＧ１０００−α−Ｆｍｏｃ−リシル−ε−（α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃリシン）では、薬物−キャリア混合物は、水和前に固体状態となる。インドメタシン−キャリア複合体が水和された際、それは粘性のリポゲル形態となり、完全に水和された状態に達するには３０分〜１時間かかる。この遅い水和プロセスは、本薬剤の遅く時間を定められた放出に有用であり得る。タモキシフェン及びクルクミンにおける薬物−キャリア複合体は、水和により安定性が１時間以下の懸濁液を形成する。薬剤相互作用性のセグメント、領域またはドメインに共役された親水性のセグメント、領域またはドメインのみを含むキャリア剤上にロードされたパクリタキセルＰＴＸについての追加の代表的な試験は、以下に示される。
【００４９】
ＥＣＧＣを用いた試験では、ＥＣＧＣがリン酸緩衝生理食塩水またはＰＢＳ中においてかなり水溶性の高い化合物であることにかかわらず、その多芳香環構造は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ４−リポペプチドとの相互作用を促進し、その結果、薬物とキャリアとの特定の比率の範囲内で溶解する複合体となるが、該薬物とＰＥＧ−Ｆｍｏｃ４−リポペプチドとの比率が臨界閾値を超えた際には溶液でなくなることが発見された。この結果は、２つの要素の間で複合体形成が起こったことを明確に示している。さらに、水溶液中の遊離ＥＣＧＣは、空気に晒した際に容易に酸化され、溶液をＰＢＳ中において調製した後２４時間の間に黄色の生成物となったが、ＥＣＧＣ−リポペプチド複合体は、１週間の期間保存した際、該酸化反応を予防または遅延させた。複合体形態におけるＥＣＧＣの酸素に対する保護の正確なメカニズムは不明である。何らかの機構に限定するものではないが、より溶存酸素にアクセスしにくい比較的疎水性の環境における薬物を有していること、及び、ＵＶ吸収性のＦｍｏｃ−基を含むリポペプチドによる遮蔽効果が、酸化プロセスの遅延に寄与している可能性があると考えられる。
【００５０】
ビタミンＥのような疎水性剤は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−リポペプチド含有物から調製されたミセルまたはエマルジョン中に容易に組み入れられ得る。この点において、これらのリポペプチドは、通常の界面活性剤として作用し、疎水性剤の可溶化及び製剤プロセスが促進された。
【００５１】
【表１】
2016503012.tif 000003
【００５２】
【表２】
2016503012.tif 000004
【００５３】
上述のように、本願の製剤の代表的な例のいくつかは、は、疎水性ニトロキシドラジカル抗酸化剤ＪＰ４−０３９のエマルジョンおよびミセル製剤を含む（例えば、図３Ｃを参照）。ＪＰ４−０３９の場合には、薬物相互作用ドメインは、一連の保護されたアミノ酸誘導体から同定された。この点において、ＪＰ４−０３９はある程度のペプチド特性を有しているため、本発明者らはＪＰ４−０３９と相互作用する可能性がある構造要素をアミノ酸誘導体から探した。リシンは、後の共役操作を単純化し得る３つの直交保護された官能基を有しているため、代表的な試験では、リシンに対して特別な注意を払った。
【００５４】
ＪＰ４−０３９のアルコール溶液を生理食塩水で希釈することにより、制限された水溶性及び該化合物の高い結晶性の結果として、即座に結晶形成が誘発される。本発明者らは、水溶液中におけるＪＰ４−０３９の結晶化を阻害することが可能な種々のＮ−保護基を用いて、いくつかの容易に入手可能なアミノ酸誘導体を同定した。顕微鏡による試験によれば、リジン誘導体のうち１つが、用量依存的な様式において生理食塩水中のＪＰ４−０３９結晶の大きさ及び数を効果的に減らし、最終的には十分な量においてＪＰ４−０３９結晶の形成を完全に排除することが示された。いくつかの試験では、本発明者らは、α−ＮＨ２の位置に様々な修飾基を有するε−ＢＯＣ−リシン誘導体の群を比較した。様々なモル比における結晶阻害能力に基づいて、もっとも嵩高いＦｍｏｃを備えたアミノ酸が最も強力であることが判明し、中型のイソブチルオキシカルボニルおよびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を備えたアミノ酸が続いて強力であり、小型のｔ−Ｂｏｃ及び最小のアセチル基を備えたアミノ酸は最も効果が小さかった（表３）。図１は、表３のＪＰ４−０３９の溶解性試験において試験された様々なアミノ酸誘導体の構造を示す。本発明者らは、α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシルの遊離カルボキシル基をメトキシＰＥＧ１０００により置換してエステルとし、それはまだ遊離酸誘導体の完全な能力を保っていることを見出した（図示せず）。表３には、以下の名称が使用されている：Ｕ−最初は可溶だが５分後には不安定；Ｖ−ベシクルを形成；Ｉ−不溶；Ｓ−可溶。
【００５５】
【表３】
2016503012.tif 000005
【００５６】
表３の代表的な試験における上記群において、本発明者らは、ＪＰ４−０３９用の最も強力な薬物相互作用基としてＦｍｏｃアミン保護基を同定した。α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔＢｏｃ保護されたリシンは、固相ペプチド合成に広く用いられている容易に入手可能なアミノ酸誘導体である。さらに、そのような基を備えたジペプチドが本質的に抗炎症活性を有していてもよいことが示されている。
【００５７】
図２に示すように、表面領域に様々な数のα−Ｆｍｏｃまたはα−Ｃｂｚリシン残基を備えた７つのＰＥＧ−リポペプチド及び対照のＰＥＧ−脂質共役体が合成された。単鎖ＰＥＧ−リポアミノ酸誘導体１は、まずモノメトキシＰＥＧ−ＯＨをα−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシンとエステル化し、次にｔ−Ｂｏｃ基を脱保護し、その後塩化オレオイルにより末端キャップすることにより合成された。２つの連続したα−Ｆｍｏｃ−リシン残基との二重鎖リポペプチドは、モノメトキシＰＥＧ−α−Ｆｍｏｃ−リシル−α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ2−リシンを、エステル化し、ε−ジオレオイルリシンによりエンドキャップして、ＰＥＧ−リポペプチド２を得ることにより作製した。ＰＥＧ−リポペプチド３及び４は、１つまたは３つのリジン架橋を介して塩化オレオイルに結合した２つまたは４つのＦｍｏｃ−α−リシル基を備えたモノメトキシＰＥＧ−リシン共役体を末端キャップすることにより調製された。該長鎖脂質の尾部により、これらのＰＥＧ誘導体が、ミセル内で互いに堅く会合できるように、または、追加の脂質成分によりエマルジョンまたはリポソーム製剤に固定されることができる。１〜３つの連続したα−Ｃｂｚ−リシル基を含む追加の脂質単鎖メトキシ−ＰＥＧ−リポペプチド（ＰＥＧ−リポペプチド５〜７）は、同様に合成された。メトキシＰＥＧ2,000−カルバモイルーＰＯＰＥ（８）は、公開されている方法論に従い、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンをホスゲンで活性化されたメトキシＰＥＧ2,000と反応させることにより合成された。
【００５８】
０．１Ｍ  ＫＨＣＯ3中で調製されたα−Ｆｍｏｃ−ε−ｔＢｏｃ−リシンの動的光散乱による粒子サイズ測定により、粒子の大部分が直径２〜５ｎｍを有していたことが明らかになり、このことは、これらがミセルであることを示している。全てのＰＥＧ脂質及びリポペプチド共役体は、水中において透明な分散液を容易に形成しており、該懸濁液はα−Ｆｍｏｃ−リシル単位を含むＰＥＧ−リポペプチドより作製され、それにより粘度が顕著に増加するが、このことは互いに自ら絡まり合った長尺なワーム状ミセル会合体（フィロミセル（filomicelle））の存在を示している。測定された臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値は３．４〜６．８μΜであり、長い脂肪族鎖を備えた非イオン性界面活性剤について報告されたものに匹敵する範囲である（表４）。
【００５９】
【表４】
2016503012.tif 000006
【００６０】
様々な数のＦｍｏｃ及びオレオイルを含むメトキシＰＥＧリポペプチド誘導体は、生理食塩水中にて薬物：キャリアのモル比が１：１．５〜１：１５でＪＰ４−３０９を可溶化させる活性があった。可溶な混合ミセルを形成するのに必要となるキャリアと薬物との間の最小のモル比に基づくと、テトラ−α−Ｆｍｏｃ−リシル基（４）を備えた共役体が、２つのＦｍｏｃリシル基を含む共役体２及び３よりも効率的であり、単一のＦｍｏｃリシル基を含む共役体１により形成された混合ミセルは、長期的には不安定であった（表４）。
【００６１】
十分なキャリア−薬物の比が与えられると、ＰＥＧ−リポペプチド４は、結晶形成の兆候が長期間（１月以上）見られず、該長期間にわたって安定な薬剤を保持するのに効果的であった。用量依存性の可溶化作用の関係は、リポペプチド４と一定量のＪＰ４−０３９とにおいて確立され、キャリア：薬物の最小のモル比は、およそ１．６：１であった（図４参照）。これに対し、同等のＰＥＧ−α−Ｃｂｚ−リシル脂質共役体をこれらの比にしても、ＪＰ４−０３９の結晶加速度を遅くすることのみはできたが、安定なＪＰ４−０３９含有ミセル溶液を形成することはできない（図示しない）。リシルドメインのないＰＥＧ−脂質共役体を形成する対照のミセルであるメトキシＰＥＧ2,000−カルバモイル−ＰＯＰＥ８は、同等のモル比では不活性であった（図示しない）。
【００６２】
Ｆｍｏｃ基は、それ自身を含めた他の芳香族部分との疎水性相互作用及びπ−πスタッキング相互作用を提供可能な、嵩高い縮合フルオレニルメチル環構造を含む。該環構造をリシンと連結させるカルバモイル結合は、水素結合能力を提供することも可能である。Ｆｍｏｃは、同じ基を有する個々の短鎖ペプチドの平行相互作用を促進し、これによりしばしば長いナノ会合体が形成される。例には、相互接続された管状構造を形成してヒドロゲルに変化するＦｍｏｃ含有短鎖ペプチド、並びに、リポペプチド３（図示しない）及び４（図３Ａ及び３Ｂ参照）が含まれる。何らかのメカニズムまたはモデルに限定されるものではないが、α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシン及びα−Ｆｍｏｃ−リシル含有リポペプチド共役体がＪＰ４−０３９の可溶化に必要とされることは、複数のＦｍｏｃ含有化合物に囲まれた１つのＪＰ４−０３９を含み、該複数のＦｍｏｃ含有化合物が薬物−キャリア及びキャリア同士の間の水素結合、親水性協同的相互作用及び疎水性協同的相互作用の組み合わせを通じて互いに保持されているモデルを示唆している（図３Ｃ参照）。界面に拘束された配された４つのＦｍｏｃ−基を有し、高いＦｍｏｃ基の局所濃度を有するリポペプチド４は、完全な可溶化を達成するために必要な薬物に対するキャリアのモル比が最も小さく（表４及び図を参照）、試験された群の中で最高の性能を提供する。図４の可溶化試験では、様々な量の４重鎖ＰＥＧ5,000−リシル−［リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−オレオイル−リシン）2］2をＣＨＣｌ3中でＪＰ４−０３９と混合し、続いて溶媒を蒸発させ、生理食塩水で水和して薬物がロードされたミセルを調製した。可溶化されたＪＰ４−０３９の量は、上澄みからＯＤ448測定により決定した。
【００６３】
上述のＦｍｏｃ−ＪＰ４−０３９相互作用モデルは、本発明者らによる蛍光消光試験により裏付けられた。この点において、混合ミセル中において薬物及びキャリア分子が互いに物理的に会合させられていることを証明するために、本発明者らは、蛍光消光アッセイを用いて基−基相互作用を試験した。図５は、各リポペプチド４のＦｍｏｃ基を源とする固有の蛍光の蛍光スペクトルを示す（励起波長３００ｎｍにおける）。各リポペプチド４としては、ＪＰ４−０３９を有さないリポペプチド４（−◆−）、ＪＰ４−０３９を有するリポペプチド４であって重量比１００：２．５（−■−）及び１００：５（−◆−）のものが挙げられる。大規模な消光効果は、薬物／キャリアのモル比が１：４〜５の所にＪＰ４−０３９が加えられた際に記録された。電子豊富なニトロキシド基は、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）により標識された短鎖ＤＮＡと近い距離に配された際の、５−ＴＡＭＲＡ用の強い蛍光消光剤として知られている。したがって、本発明者らによるデータは、ＪＰ４−０３９が、リポペプチド４ミセル中のＦｍｏｃ基から近い距離にあることを示している。本発明者らはまた、ＦｍｏｃとＪＰ４−０３９の間の相互作用をさらに確認するため、２次元核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を実施した。その結果によると、ＪＰ４−０３９は、それが分子の残りの部分よりも環構造に近い距離を有するミセル会合体内において、Ｆｍｏｃ基によって囲まれていることが示された。
【００６４】
Ｆｍｏｃは、ＪＰ４−０３９がロードされたミセルにおいてキャリア−薬物相互作用に関与する唯一の基でなくてもよい。クライオＥＭ画像は、薬物がロードされたミセルは見える構造を通じて明らかな電子高密度領域を有していることを示し、一方、何もロードされていない管状ミセルでは、そのコア領域は電子が少ない。このことは、ＪＰ４−０３９が広範な再編成プロセスを通じて界面及び脂質部分の両方を含む領域に組み入れられてもよく、また、その代わりに、界面に位置するＦｍｏｃ基に沿って分布するＪＰ４−０３９によって作られる比較的密な外殻の該投射画像の単なる結果であり得ることを示唆している。
【００６５】
本発明者らはまた、ＰＥＧ−脂質及びリポペプチド共役体から調製したプレーンミセルのラット赤血球上における溶血活性を調査し、その結果を、２つの広く用いられているエトキシル化非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ  ８０）と比較した。図６の試験では、ラット赤血球（１％）を、示された濃度の界面活性剤と共に３７℃で２時間培養した。このような培養の後、上澄みを慎重に取り出し、ＯＤ540ｎｍで測定して、完全な溶血が発生した条件下におけるＯＤ値に基づいて計算した。図６に示すように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が５ｍＭで１００％の溶血を示したが、Ｔｗｅｅｎ  ８０及び本試験で報告された全てのＰＥＧ−脂質共役体では、この濃度またはこの濃度未満では有意な溶血（＜２％）は見られなかった。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本願の薬物がロードされたエマルジョンを安定化するために、１つ以上の共界面活性剤が用いられてもよい。ＪＰ４−０３９のためのスタンドアロンのミセル製剤としてのα−Ｆｍｏｃ−リシル含有リポペプチドの優れた可溶化活性とは対照的に、１〜３つのα−Ｃｂｚ−リシル基を線形の形態で含むリポペプチドは、ＪＰ４−０３９と安定な混合ミセルを形成できない（図示しない）。しかしながら、本発明者らは、それらが共界面活性剤として機能し、本発明者が以前にＪＰ４−０３９の滞留性能に乏しいことを見出していた大豆ホスファチジルコリン−ゴマ油エマルジョン製剤を安定化することを見出した。薬物の約１５〜３０％は、製造から７日後に（ＰＥＧ化されたまたはＰＥＧ化されていない）エマルジョンから分離された。大豆ホスファチジルコリンの２０モル％が等量のα−Ｃｂｚ−リシルを含むリポペプチドにより置換された際に、薬物滞留率が大幅に改善された。さらに、添加された共界面活性剤はまた、超音波処理によるエマルジョンの調製を高速化した。致死量の放射線に暴露した２４時間後に腹腔内ルート経由の単回注射により動物に投与した際には、改善されたエマルジョン製剤により製剤されたＪＰ４−０３９は、顕著な放射線防護効果を示し、動物の生存（生存時間及び全体的な生存率の両方において）が対照群よりも改善されていたことを示した（図８参照）。これにより、これらの製剤において製剤されたＪＰ４−０３９は、生体内（in vivo）での薬理学的活性があることが確認された。図８は、マウスの全身放射線照射に対して生体内での放射線緩和活性を示す。図８の試験では、全てのマウスに０．８Ｇｙ／分の線量率で９．５Ｇｙの全身線量を照射した。該マウスには、エマルジョン単独（黒丸）またはエマルジョン中で製剤されたＪＰ４−０３９（白丸、２０ｍｇ／ｋｇ、照射後２４時間）を腹腔内注射した。マウスが体重の２０％を失うか瀕死に見えるまで（その時点でマウスを安楽死させた）、マウスの経過を観察した。
【００６７】
上述のシステムは、非常に実用的である。この点において、アミノ酸誘導体及びＰＥＧは、両方とも高純度で容易に入手可能である。Ｆｍｏｃおよびｔ−Ｂｏｃ保護／脱保護及びカップリングに関する化学は全て十分に研究されており、界面領域において選択されるモチーフを導入する際の柔軟性を有し得る。高効率のポリマー補助された液相合成方式は、クロマトグラフィー精製工程を使用せずにＰＥＧ化されたリポペプチドのグラム量を調製するために採用された。上記モジュール設計により、同様の一般的な構造及び自己会合特性を共有し、なお界面領域においてモチーフを変更するための柔軟性を備えた一連の化合物を生成することができる。さらに、上記段階的なプロセスは、薬物相互作用基の同定から、個別最適化された設計の界面活性剤の合成、ミセル、リポソームまたはエマルジョンベースの薬物製剤システムにまで、スムーズな移行を可能にする。ＪＰ４−０３９に関連して上述したプロセスは、ＪＰ４−０３９以外の治療剤の生体内送達を改善するための様々な種類の新しい脂質及びポリマーシステムの開発にまで容易に拡張され得る。
【００６８】
例えば、表５は、薬物相互作用ドメイン（Ｆｍｏｃ）が含まれることにより、パクリタキセルまたはＰＴＸの負荷能力、及び、ＰＥＧ5000−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2及びＰＥＧ5000−ＦＴＳミセルがロードされたＰＴＸの安定性が顕著に改善されることを実証している。ここで、ＦＴＳはファルネシルチオサリチレート基を示す。
【００６９】
【表５】
2016503012.tif 000007
【００７０】
同様に、図９Ａおよび図９Ｂは、ＰＥＧ5k−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2ミセル中に製剤されたドキソルビシンまたはＤＯＸの増強された抗腫瘍活性を示す。図９Ａは、腫瘍の相対的な体積の変化を示し、図９Ｂは、投与後の体重の変化を示す。図９Ａおよび９Ｂの試験では、同系マウスの乳癌モデル（４Ｔ１．２）を、種々のＤＯＸ製剤の治療効果を調べるために用いた。マウスを無作為に８つの群（ｎ＝５）に分けて、ＰＢＳ（対照）、ＤＯＸ（５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）を、リポソーム／  ＤＯＸ（５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）、ＤＯＸがロードされたＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2ミセル（５、１０ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）及びＤＯＸがロードされたＰＥＧ5K−ＦＴＳ2（５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）を、それぞれ１日目、４日目及び７日目にそれぞれ静脈内投与した。腫瘍のサイズを、デジタルノギスを用いて週３回測定した。種々の群における全てのマウスの体重を、３日毎に測定した。
【００７１】
表６のデータは、薬物相互作用ドメインのＦｍｏｃを含むことによって、ＰＥＧ−ビタミンＥベースのミセルシステムにおけるＤＯＸの負荷容量を顕著に向上させることを実証している。表６では、以下の記号が使用されている：ＰＥＧ−ＶＥ2…ＰＥＧ−ビタミンＥ2、ＰＥＧ−ＦＶＥ2…ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ビタミンＥ2、ＤＬＣ…ロード容量、及び、ＤＬＥ…ロード効率。
【００７２】
【表６】
2016503012.tif 000008
【００７３】
図１０Ａは、ＰＥＧ5000−ＶＥ2（ＰＥＧ−ＶＥ2）の合成を示し、図１０Ｂは、ＰＥＧ5000−Ｆｍｏｃ−ＶＥ2（ＰＥＧ−ＦＶＥ2）の合成を示し、これらは以下に記載される実験項においてさらに説明される。図１１に示されるように、ＰＥＧ−ＦＶＥ2ミセル中に製剤されたＤＯＸは、透析アッセイで検査されたところ、遅い放出動態を示した。図１２は、ＰＥＧ−ＦＶＥ2ミセル中に製剤されたＤＯＸは、マウスの乳癌モデル（４Ｔ１．２）に皮下投与された際において、遊離ＤＯＸまたはＤＯＸＩＬよりも優れた抗腫瘍活性を示すことを表している（Ｐ＜０．０１（１０ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ＶＥ2／ＤＯＸに対して）；Ｐ＜０．００１（ＤＯＸＩＬに対して））。
【００７４】
上述のように、いくつかの本願の実施形態では、どの疎水性のセグメント、領域またはドメインも、本願のキャリア剤の薬物または化合物相互作用ドメインとは共役させられていない。この点において、薬剤／化合物相互作用ドメインは、一度同定されると、親水性基に組み入れられてもよく、共役させられてもよく、結合させられてもよい。いくつかの代表的な試験では、単純で、明確に規定され、かつスケールアップが容易なキャリアであるＰＥＧ5K−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2共役体（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2）は、パクリタキセルまたはＰＴＸのための高いロード容量、優れた製剤安定性及び低い全身毒性を提供することが示された。いくつかの代表的な実施形態では、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦｍｏｃは、上述のように、薬剤／化合物分子と相互作用する機能的な構成単位としてキャリア内に組み入れられた。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2は３ステップ合成経路により合成され、ＰＴＸと容易に相互作用して小さな粒子サイズ（２５〜３０ｎｍ）の混合ナノミセルを形成した。ＰＴＸのロード容量は、約３６％であった。何らかのメカニズムに限定されるものではないが、得られるミセルシステムにおけるＰＴＸの取り込みは、大部分がＦｍｏｃ／ＰＴＸのπ−πスタッキング相互作用を介して達成されると考えられており、このことは蛍光消光研究及び13Ｃ−ＮＭＲにより立証された。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2ミセル中で製剤されたＰＴＸは、持続的な放出動態を示し、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングによる生体内分布の試験は、Ｃｙ５．５により標識されたＰＴＸが腫瘍部位へと効果的に送達されたことを示した。ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2（ＭＴＤ＞１２０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）のための最大耐量は、ほとんどの既報のＰＴＸ製剤の最大耐量より高いことが見出され、生体内での治療試験は、Bristol-Myers Squibb社から入手可能な臨床的に用いられているＰＴＸ製剤であるタキソール（登録商標）よりも顕著に改善された抗腫瘍活性を示した。
【００７５】
いくつかの試験では、Ｆｍｏｃ含有ＰＥＧ−脂質共役体は、いくつかの疎水性剤を製剤する際において、脂質モチーフを備えていない同等物よりも効果的であることが見出された。脂質モチーフを備えていないＦｍｏｃ−ＰＥＧ共役体であるＰＥＧ5000−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2）は、ＰＴＸの可溶化に非常に有効であることが見出された。さらに、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2は、ＰＴＸを製剤する際において、疎水性／脂質セグメント、領域またはドメインであるＰＥＧ5000−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−オレイン酸−リシン）2（ＰＥＧ−（Ｆｍｏｃ−ＯＡ）2）を備えた同等物よりも顕著に効果的であった。
【００７６】
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2は、図１３に示される３ステップにより容易に合成された。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2は、水溶液中において小サイズ（２５〜３０ｎｍ）のミセルを容易に形成した。ネガティブ染色ＥＭは、均一に分散された球状粒子を示した。これはＥＭにおいて管状形態を示したＰＥＧ−（Ｆｍｏｃ−ＯＡ2とは異なるものであり、繊維状のミセルが形成されたことを示している。ＰＥＧ−ＯＡ2は、球状ミセルを形成することが知られている。まとめると、これらのデータは、Ｆｍｏｃ及び脂質モチーフの両方がＰＥＧ−（Ｆｍｏｃ−ＯＡ）2の特有の構造の形成に寄与していることを示唆している。
【００７７】
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2は、ＰＴＸを備えた混合ミセルを容易に形成し、ＰＴＸをロードしても、ＤＬＳにより測定される粒子のサイズに及ぼされた影響は最小限であった。粒子のサイズが小さいこと及び粒子が均一に分布していることは、ネガティブ染色ＴＥＭによってさらに確認された。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2及びＰＴＸがＣＤＣｌ3中において混合された際に、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2及びＰＴＸの両方からの信号が明確に検出されたことが示された。これに対し、Ｆｍｏｃ及びＰＴＸにおける全てのプロトン信号は、重水中において抑制されており、このことは、水溶液中で自己会合した粒子のコア領域内のＰＴＸが、完全にカプセル化されていることを示している。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ共役体のＣＭＣ値はわずか５．２４４μΜであり、これは、血液区画に注射された時に著しく希釈されるにあたり満足のいく安定性を保持するのに十分な程度に小さい。
【００７８】
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＡに比べて著しく増強されたキャリア／ＰＴＸ相溶性は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃにおいて達成された。表７において実証されたように、安定なＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ複合体が水溶液中において容易に形成され、そのロード容量は最大３６％（ｗ／ｗ）であり、他の製剤に比べて目覚ましく高いＰＴＸ容量を示している。最大ＰＴＸロード容量が１５％に達し、溶液中で数時間安定する脂質含有界面活性剤ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＡと比較すると、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃは、薬物ロード容量と製剤安定性の両方において目覚ましい改善を示した。
【００７９】
【表７】
2016503012.tif 000009
【００８０】
臨床試験における長期保存には一般的に凍結乾燥が必要であるため、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ複合体の凍結及び凍結乾燥の影響を試験した。凍結乾燥後、得られたＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの白色粉末は、凍結保護剤を何ら添加されることなく水に容易に溶解して、透明な溶液を再構成した。凍結乾燥及び再構成後において、サイズ分布の大きな変化は観察されなかった。
【００８１】
製剤の安定性の重要な指標として、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸからのＰＴＸの放出態様を透析法により評価し、比較用にＴＡＸＯＬを試験した。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ複合体は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中３７℃において、持続的放出プロファイルを示した。最初の２４時間の後、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸから放出されたのは捕捉されたＰＴＸのわずか１９．３％であり、一方で、ＴＡＸＯＬ製剤からはＰＴＸの４０．４％が放出された。７２時間後であっても、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸから放出されたのはＰＴＸのわずか２３．５％であった。何らかのメカニズムに限定されるものではないが、強力なキャリア−薬物相互作用は、本願のＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸが生理的環境においてＰＴＸの安定な製剤として機能することを可能とし、このことは、血流中における循環期間を長くすることや、受動的標的化を通じて腫瘍中に蓄積される機会が増強されること、及び、早期の漏洩に起因する細胞毒性薬物の早期放出を低減させることに寄与し得る。
【００８２】
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの生体内における運命をさらに調査するため、近赤外蛍光（ＭＲ）イメージングを利用して静脈内注射後のマウスにおけるＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの生体内分布を追跡した。本試験では、Ｃｙ５．５の（近赤外蛍光プローブ）をＰＴＸに共役させ、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃとの複合体を形成した。該複合体を、ＣＬ−１ヒト前立腺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに注射した。Ｃｙ５．５−ＰＴＸは、投与から２４時間後では、大部分が腫瘍内に見られ、主要臓器内には明らかな蓄積はなかった。９６時間後であっても、実質的な量の信号が主要部位に残っていた。９６時間後の試験が終了した後、主要臓器及び腫瘍を摘出し、生体外（ex vivo）イメージングを行った。肺及び腎臓には軽度の蛍光信号のみが検出され、弱い信号が肝臓及び脾臓には検出され、細網内皮系（ＲＥＳ）を通じた複合体のクリアランスの低減が示されている。しかしながら、Ｃｙ５．５−ＰＴＸの強い蛍光信号は腫瘍部位内に記録されており、これは、クレモフォールＥＬ／エタノールにより可溶化された遊離Ｃｙ５．５−ＰＴＸの運命とは顕著に異なっていた。該遊離Ｃｙ５．５−ＰＴＸでは、主な分布は肝臓内に観測されていた（このことは、速やかに排除されることが示唆されている）。何らかのメカニズムに限定されるものではないが、腫瘍組織でのＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ−Ｃｙ５．５の効率的かつ腫瘍選択的な蓄積は、その小さなサイズ（３０ｎｍ未満）、増強された浸透性及び滞留性またはＥＰＲ効果の十全な活用、並びに、長期化された循環及び増強された受動的標的化の機会に貢献する優れた生体内安定性に起因し得る。
【００８３】
次に、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの最大耐量（ＭＴＤ）を、その生体内の安全性プロファイルを評価するため、腫瘍を有さないマウスにおいて試験した。ＴＡＸＯＬは、市販の比較対照として利用した。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの５種の異なる用量及びＴＡＸＯＬの３種の用量を、ＢＡＬＢ／  ｃマウスにおいて静脈内注射により試験し、これらの動物の体重及び毒性の徴候を監視した。表８に示すように、ＴＡＸＬは、最大用量２０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇにおいて耐えられるものであり、いくつかの異常な活動（例えば、痙攣及び遅運動など）が注射直後のマウスのほとんどで観察されたものの、マウスの死亡は回避された。ＴＡＸＯＬと比較して、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸは、改善された安全性プロファイルを示した。ＴＡＸＯＬの最大耐量よりも６倍高い１２０  ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇもの高用量であっても、マウスの死亡及び著しい体重減少は、試験の全期間にわたって観察されなかった。このＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの高いＭＴＤは、最も報告されているＰＴＸミセル製剤に匹敵し、上に示したような高い製剤安定性、遅い放出プロファイル、及び主要な器官に蓄積する傾向がより少ないことと一致している（これは、臨床の癌治療における治療効果を増強するための、ＰＴＸのより広範な用量範囲（dosage window）を提供し得る）。
【００８４】
【表８】
2016503012.tif 000010
【００８５】
また、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの腫瘍阻害効果を、試験管内（in vitro）及び生体内の両方で調査した。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの試験管内での細胞毒性を、マウス転移性乳癌細胞株４Ｔ１．２と、２つのヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３及びＤＵ１４５とにより評価した。図１４Ａ〜１４Ｃに示すように、すべての処理された癌細胞株において、ＰＴＸ含有ナノ粒子はＴＡＸＯＬよりも強力な細胞毒性を示したが、キャリア自体は試験された濃度では細胞に対して明らかな毒性を示さなかった。何らかのメカニズムに限定されるものではないが、増加したＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの細胞毒性は、例えば、ＰＴＸの腫瘍細胞への進入が促進されたことに起因し得る。本試験では、該細胞株は、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ、薬物を含まないＰＥＧ−Ｆｍｏｃ及びＴＡＸＯＬにより７２時間処理され、腫瘍細胞の阻害は、ＭＴＴアッセイにより測定された（*ｐ＜０．０５または**ｐ＜０．０１は、ＴＡＸＯＬ及びＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ処理細胞の間におけるスチューデントのｔ検定によって測定された）。
【００８６】
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの生体内での治療効果を、同系マウス乳癌モデル（４Ｔ１．２）を有するマウスにより試験した。４Ｔ１．２は、転移性の高い癌細胞株として知られており、図１５Ａに実証されるように、急速な腫瘍成長が生理食塩水で処置したマウスの群において観察された。１０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ体重の用量でタキソールを処置したマウスでは、腫瘍体積の増加が若干遅延された結果が得られた。ＴＡＸＯＬと比較して、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸは、治療の際に、同じ用量でより強力な抗腫瘍活性を示した（ｐ＜０．０２）。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの高いＭＴＤが実証されたので、ＴＡＸＯＬで可能なものよりも高い用法容量が、より有効な治療のために提供される。したがって、２０及び４０ｍｇ／ｋｇでの増加されたＰＴＸ用量もまた、該試験に組み入れられた。ＰＴＸの用量がＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸ中で２０及び４０ｍｇ／ｋｇに上昇した際に（ｐ＜０．００１）、腫瘍阻害のさらなる増強が達成され、生理食塩水群と比べて６０〜７０％の腫瘍成長阻害率となった（図１５Ｂ）。ＴＡＸＯＬを２０〜２５ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇの用量で単回注射した後に、毒性および死亡の深刻な兆候が生じたことが実証されている。しかしながら、マウスの死亡は、ＴＡＸＯＬの最大耐量を大きく超えた高用量のＰＴＸの６度の連続注射を含む１６日間の処置後においても観察されなかった。体重減少は、２０ｍｇ／ｋｇの処置群においては観察されず、わずかな体重減少（７〜８％）が、試験最後における４０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ（ＴＡＸＯＬのＭＴＤよりも２倍高用量）の連続注射の後に認められた。ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ／ＰＴＸの顕著に増強された腫瘍抑制効果と安全性は、その生物物理学的特性及び腫瘍選択的な送達と明確に一致している。
【００８７】
本システム、方法および組成物は、化合物／薬物キャリア剤またはシステムの開発のための、メカニズムを基礎としたアプローチを提供する。上述のように、古典的な脂質ベースの薬物キャリアシステムは、既製の界面活性剤と油に依存しており、通常は正しい出発材料のための試行錯誤による選択プロセスを含む。多くの場合、オイルコアまたは脂質二重層内にうまく収まらない疎水性の低い薬物のために、ロード容量と製剤安定性は制限されている。本アプローチは、いくつかの点において、従来の脂質ベースの製剤のアプローチとは根本的に異なる。本アプローチは、活性成分と相互作用することが可能な単純な構造要素（モチーフまたはドメイン）を選択することにより開始するボトムアップアプローチである。この化合物／薬剤相互作用ドメインは、その後、親水性領域と、または、親水性ドメインと疎水性ドメインとの間（例えば、１つ以上の疎水性脂質鎖と親水性ＰＥＧブラシとの間など）に会合させられる。本願の両親媒性物質の場合には、薬剤相互作用セグメントは界面領域に配され、それにより、例えば、さほど疎水性の高くない薬物が、よりストリンジェントの低い疎水性環境下で組み入れられることが可能になる。
【実施例】
【００８８】
１．ＪＰ４−０３９の試験
【００８９】
１（ａ）．材料及び方法
α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシン、ジ−Ｂｏｃ−リシン、ＤＣＣ、ＮＨＳ、ＴＦＡ、ＴＥＡは、ＡＡＰＰＴＥＣ社より入手した。無水ＴＨＦは、ベルギー国ヘールのAcros Organic社より入手した。分子量１０００、２０００及び５０００のモノメトキシＰＥＧ、エオシンＹ、ＤＭＡＰ、ニンヒドリン、塩化オレオイル、ゴマ油及び他の明示されない試薬の純粋な化学物質は、ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich社より入手した。Ｌ−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン及び大豆ホスファチジルコリン（９５％）は、ノースカロライナ州モリスビルのAvanti Polar Lipids社より購入した。ＪＰ４−０３９は、既知の手順を用いてAsymchem社により合成した。
【００９０】
１（ｂ）．ＪＰ４−０３９の可溶化剤及び結晶化阻害剤としての保護されたアミノ酸誘導体のスクリーニング
飽和重炭酸ナトリウム溶液５ｍＬに溶解させられたα−ＮＨ2−ε−Ｂｏｃ−リシン（１ｍｍｏｌ）に、ＴＨＦ５ｍＬに溶解させられた４倍過剰量の無水酢酸またはクロロギ酸イソブチルをそれぞれ５分かけて添加することによって、α−アセチル−ε−Ｂｏｃ−リシンまたはα−イソブトキシカルボニル−ε−Ｂｏｃ−リシンをそれぞれ合成した。ＴＨＦを反応混合物から除去し、残った混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈した。有機相を、２０ｍＬの飽和ＮａＨＣＣ、生理食塩水、クエン酸（０．５Ｍ）及び水を順に用いて洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。固体残渣を酢酸エチル／ヘキサン混合物より再結晶化した。これらの誘導体を、市販の一連のリシン、フェニルアラニン及びグリシンのアミン保護された誘導体と共に、０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液中に、１〜１００ｍＭの溶液または懸濁液として調製した。その間に、メタノール５μＬに溶解させられた０．４４７μｇのＪＰ４−０３９を、９６ウェルのポリスチレンプレートの各ウェルに添加した。アミノ酸溶液／懸濁液１００μＬを該メタノール溶液に添加して、よく混合した。各ウェル中のサンプルの物理的状態を、褐色結晶が物理的に現れる間、２時間かけて定期的に目視検査した。２０分後に、サンプルのいくつかを顕微鏡下で写真撮影した。
【００９１】
１（ｃ）．ＰＥＧ−アミノ酸または−ペプチド−脂質共役体の合成
モノメトキシＰＥＧ2,000−α−Ｆｍｏｃ−ε−オレオイルリシン（１）：モノメトキシＰＥＧ2,000ＯＨ（１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＣ（２．２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ）を備えたα−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン（２ｍｍｏｌ）と、ＣＨ2Ｃｌ2中にて室温で一晩エステル化させた。固体沈殿物を、濾過により除去した。該濾液を、蒸発により濃縮した。１０倍容量の冷エチルエーテルを用いてＰＥＧ誘導体を沈殿させ、該ＰＥＧ誘導体を同じ溶媒で３回洗浄した。ＤＭＡＰを除去するために、冷エタノールを用いた追加の洗浄を行った。ＰＥＧ−α−のＦｍｏｃ−ε−ｔ−ＢＯＣリシンエステルをＣＨ2Ｃｌ2４ｍＬに溶解し、ＴＦＡ４ｍＬを加えて室温で２０分間Ｂｏｃ基を脱保護させた。ＣＨ2Ｃｌ2の大半を除去した後、冷エーテルを用いてＰＥＧ−α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ2−リシンエステルを沈殿させ、同一の溶媒でさらに２回洗浄した。該ＰＥＧ−α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ2−リシンエステルを、塩化オレオイル（２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（２ｍｍｏｌ）により２０分間末端キャップした。３度のエーテル沈殿及び２度のエタノール沈殿により、ＰＥＧ−α−Ｆｍｏｃ−ε−オレオイルリシンエステル（１）を精製した。収率はＰＥＧ2,000に関して８７％であった。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）  δ  ７．６９−７．１９（ｍ，８Ｈ），５．２３−５．２２（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．９８−４．９５（ｍ，２Ｈ），４．１２−４．１０（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．５２（ＰＥＧピーク），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．１７（ｍ，２Ｈ），２．０９−１．８８（ｍ，６Ｈ），１．２７−１．１６（ｍ，２８Ｈ），０．７７（ｔ，３Ｈ）。
【００９２】
モノメトキシＰＥＧ1,000−α−Ｆｍｏｃ−リシル−α−Ｆｍｏｃ−ε−（ジオレオイル−リシル）リシン（２）：ＰＥＧ−α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ2−リシンエステル（１ｍｍｏｌ）を、ＴＥＡ４ｍｍｏｌ、α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン（１．５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．７ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（１．５ｍｍｏｌ）と、ＣＨ2Ｃｌ2：ＴＨＦ＝１：１中０℃にて２０分間反応させた後、室温で一晩反応させた。該反応は、ニンヒドリン試験において陰性の結果が出ることによって、完了したと決定された。モノメトキシＰＥＧ1,000−α−Ｆｍｏｃ−リシル−α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃリシンエステルを、冷エーテル及びエタノール沈殿、ＴＦＡ脱保護、続くエーテル沈殿及び洗浄により精製し、ＰＥＧ１，０００−α−Ｆｍｏｃ−リシル−α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ2リシンエステルを得た。このε−ＮＨ2末端を備えたＰＥＧ1,000誘導体を、ＴＥＡ４ｍｍｏｌ、ＤＣＣ（１．７ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（１．５ｍｍｏｌ）により予め活性化されたＮ，Ｎ’−ジオレオイルリシン（１．５ｍｍｏｌ）により一晩末端キャップした。得られた化合物２を、エーテル及びエタノール沈殿を用いて同様に精製した。メトキシＰＥＧ1,000を備えた化合物２の収率は、約７５％である。1Ｈ  ＮＭＲ  δ７．７０−７．２０（ｍ，２４Ｈ），５．３５−５．３４（ｍ，２Ｈ），５．１４−５．０９（ｍ，６Ｈ），４．２７−４．２２（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．６１（ＰＥＧピーク），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．０７（ｍ，６Ｈ），２．０１−１．９７（ｍ，６Ｈ），１．４９−１．２３（ｍ，４０Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ）。
【００９３】
モノメトキシＰＥＧ2,000−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−オレオイルリシン）2（３）：メトキシＰＥＧ2,000−ＯＨ（１ｍｍｏｌ）を、ジ−ｔ−Ｂｏｃ−リシン（２ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２．２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ）を用いて、ＣＨ2Ｃｌ2中にて一晩エステル化し、続いてエーテル及びエタノール沈殿工程を行い、ＰＥＧ−ジ−Ｂｏｃ−リシンエステルを得た。ＴＦＡ脱保護とエーテル沈殿及び洗浄とを行った後、該ＰＥＧ−リシンエステルを、ＴＥＡ４ｍｍｏｌ、α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン（３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３．５ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（３ｍｍｏｌ）と、ＣＨ2Ｃｌ2：ＴＨＦ＝１：１中０℃にて２０分間共役させた後、室温で一晩共役させた。該反応は、ニンヒドリン試験時の陰性により、完了したことが確認された。モノメトキシＰＥＧ−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2を、冷エーテル及びエタノール沈殿により精製し、ＴＦＡ脱保護し、続いてエーテル沈殿及び洗浄により、ＰＥＧ−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ２−リシン）2を得た。このε−ＮＨ2−リシン末端を備えたＰＥＧ誘導体を、ＴＥＡ４ｍｍｏｌ及び塩化オレオイル４ｍｍｏｌにより２０分間末端キャップした。慣例のエーテルおよびエタノール沈殿及び洗浄を行った後、精製された化合物３を７２％の収率で得た。1Ｈ  ＮＭＲ  δ  ７．３６−７．３４（ｍ，１６Ｈ），５．３５−５．３０（ｍ，４Ｈ），５．１４−５．０９（ｍ，４Ｈ），４．２７−４．２２（ｍ，６Ｈ），３．７０−３．６１（ＰＥＧピーク），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．０７（ｍ，６Ｈ），２．０１−１．９７（ｍ，６Ｈ），１．４９−１．２３（ｍ，６２Ｈ），０．８９（ｔ，６Ｈ）。
【００９４】
モノメトキシＰＥＧ5,000−リシル−［リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−オレオイルリシン）2］2（４）：ＰＥＧ5,000に由来するＰＥＧ−リシンエステル（１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＣ（３．５ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（３ｍｍｏｌ）を備えたジ−ｔ−Ｂｏｃ−リシン（３ｍｍｏｌ）、と、ＣＨ2Ｃｌ2：ＴＨＦ＝１：１中０℃にて２０分間共役させた後、室温で一晩共役させた。該反応は、ニンヒドリン試験時により、完了したことが確認された。モノメトキシＰＥＧ5,000−リシル−（ジ−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2を、冷エーテル及びエタノール沈殿により精製した。ＴＦＡ脱保護し、続いてエーテル沈殿及び洗浄により、ＰＥＧ−リシル−（α−ＮＨ2−ε−ＮＨ2−リシン）2を得た。このテトラε−ＮＨ2末端を備えたＰＥＧ−リシン誘導体を、ＤＣＣ（６ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（５ｍｍｏｌ）と、ＣＨ2Ｃｌ2：ＴＨＦ＝１：１中０℃にて２０分間共役させた後、室温で一晩共役させた。該反応は、ニンヒドリン試験時の陰性により、完了したことが確認された。モノメトキシＰＥＧ5,000−リシル−［リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2］2を、冷エーテル及びエタノール沈殿により精製し、ＴＦＡ脱保護し、続いてエーテル沈殿及び洗浄により、ＰＥＧ−リシル−［リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ＮＨ2−リシン）2］2を得た。その後、塩化オレオイル（８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１０ｍｍｏｌ）により２０分間末端キャップし、続いてエーテル及びエタノール沈殿及び洗浄を行って、化合物４を７９％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲ  δ  ７．３６−７．３４（ｍ，３２Ｈ），５．３５−５．２７（ｍ，８Ｈ），５．１４−５．０９（ｍ，７Ｈ），４．２７−４．２２（ｍ，６Ｈ），３．７０−３．６１（ＰＥＧピーク），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．０７（ｍ，９Ｈ），２．０１−１．９７（ｍ，９Ｈ），１．４９−１．２３（ｍ，１３０Ｈ），０．８９（ｔ，６Ｈ）。
【００９５】
メトキシＰＥＧ2,000−α−Ｃｂｚ−ε−オレオイル−リシン（５）、ＰＥＧ2,000−α−Ｃｂｚ−リシル−α−Ｃｂｚ−ε−オレオイル−リシン（６）、メトキシＰＥＧ2,000−α−Ｃｂｚ−リシル−α−Ｃｂｚ−リシル−α−Ｃｂｚ−リシル−ε−オレオイル−リシン（７）及びメトキシＰＥＧ2,000−カルバモイル−１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＯＰＥ））（８）。種々の数のα−Ｃｂｚ−リシン残基及び単一のオレオイル鎖を備えた３種のＰＥＧ−リシル−脂質共役体を、１〜３回の繰り返しサイクルにおけるα−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃリシンの代わりにα−Ｃｂｚ−ε−Ｂｏｃリシン化合物を用いること以外は、化合物１と同様にして合成及び精製した。対照の界面活性剤であるオレイン酸ＰＥＧ2,000を、メトキシＰＥＧ2,000を塩化オレオイルと反応させることにより調製した。ＰＥＧ−リン脂質共役体は、ホスゲンにより活性化されたメトキシＰＥＧ2,000をＰＯＰＥ及びＴＥＡと反応させた後、エーテル沈殿を行うことにより合成した。
【００９６】
リポペプチド５の1Ｈ  ＮＭＲ：1Ｈ  ＮＭＲ  δ  ７．２９−７．１９（ｍ，５Ｈ），５．２３−５．２２（ｍ，２Ｈ），４．９８−４．９５（ｍ，２Ｈ），４．１２−４．１０（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．５２（ＰＥＧピーク），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．１７（ｍ，２Ｈ），２．０９−１．８８（ｍ，６Ｈ），１．２７−１．１６（ｍ，２８Ｈ），０．７７（ｔ，３Ｈ）。
【００９７】
リポペプチド６の1Ｈ  ＮＭＲ：1Ｈ  ＮＭＲ  δ  ７．３７−７．２９（ｍ，１０Ｈ），５．３７−５．３５（ｍ，２Ｈ），５．１２−５．０９（ｍ，４Ｈ），４．２５−４．２２（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．６４（ＰＥＧピーク），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．１７（ｍ，４Ｈ），２．０３−１．８９（ｍ，６Ｈ），１．４０−１．２４（ｍ，３４Ｈ），０．９０（ｔ，３Ｈ）。
【００９８】
リポペプチド７の1Ｈ  ＮＭＲ：1Ｈ  ＮＭＲ  δ  ７．３６−７．３４（ｍ，１５Ｈ），５．３５−５．３４（ｍ，２Ｈ），５．１４−５．０９（ｍ，６Ｈ），４．２７−４．２２（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．６１（ＰＥＧピーク），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２１−３．０７（ｍ，６Ｈ），２．０１−１．９７（ｍ，６Ｈ），１．４９−１．２３（ｍ，４０Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ）。
【００９９】
ＰＥＧ−ＰＯＰＥ化合物８の1Ｈ  ＮＭＲ：1Ｈ  ＮＭＲ  δ  ５．３５−５．３４（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．６４（ＰＥＧピーク），３．９２−３．９６（ｍ，４Ｈ），３．５７−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），２．２９−２．２８（ｍ，２Ｈ），１．３７−１．２７（ｍ，５０Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ）。
【０１００】
１（ｄ）．臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
ＣＭＣは、より疎水性であるミセルのコアの微小環境に組み入れられた際のエオシンＹにおける最大吸収のレッドシフトに基づいて決定された。蒸留水中で調製された一連の界面活性剤溶液に、エオシンＹ溶液を１ｍＭの最終濃度となるまで添加して、室温で３０分間培養した。ＯＤ542nmを測定して界面活性剤の濃度に対してプロットし、それによりＣＭＣ値を推定した。
【０１０１】
１（ｅ）．ＪＰ４−０３９を備えたミセル製剤またはＪＰ４−０３９を備えないミセル製剤の調製
アミノ酸誘導体またはリポペプチドの乾燥薄膜を、一定の渦流を用いて透明な溶液が形成されるまで適当な水溶液と水和させることにより、典型的なミセルを調製した。その最終濃度は、約１００〜２００ｍｇ／ｍｌである。まず、リポペプチド、アミノ酸誘導体またはニトロキシド化合物を、クロロホルムに溶解した。該溶液をガラス試験管に分注して、十分に混合し、その後、一定の窒素流を吹き付けて溶媒の大部分を除去した。高真空を２時間適用することにより、残留溶媒を除去した。ミセルに促進されたＪＰ４−０３９の可溶化作用を測定するために、薬剤に対する界面活性剤の種々のモル比を適用し、それにより水中に界面活性剤−薬物混合物を作製した（ＪＰ４−０３９の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬであった）。少なくとも３０分後には、該サンプルを１３，０００ｒｐｍで短時間遠心分離した。該上清の半分を回収し、等量のエタノールを添加して、それによりミセル薬物複合体を溶解／破壊した。ＯＤ４４８ｎｍを使用して該サンプル中の薬物の量を定量した。
【０１０２】
１（ｆ）．粒子サイズの測定
ミセル粒子の流体力学的サイズを推定するために、薬物を組み入れた界面活性剤または薬物を組み入れていない界面活性剤の溶液を、乾燥膜から蒸留水中に調製した。サンプルを蒸留水でさらに１０倍に希釈し、粒径分析計を用いたレーザー動的光散乱（Zetasizer Nano ZS装置、英国ウスターシャー州のMalvern Instruments社より入手可能）によってサイズを測定した。エマルジョン粒子のサイズ測定は、生理食塩水で１００倍希釈した後、Coulter N4粒径分析計を用いて行った。
【０１０３】
１（ｇ）．リポペプチド４のミセル及びリポペプチド４−ＪＰ４−０３９複合体のクライオＥＭ
乾燥リポペプチド膜を蒸留水中に最終濃度１００ｍｇ／ｍｌで水和することによって、上記ミセルを調製した。調査されたサンプルは、リポペプチド４（Ａ）単独、及び、モル比１．６：１で作製されたリポペプチド４−ＪＰ４−０３９複合体（Ｂ）１．６であった。サンプルのうち４つは、蒸留水で５倍に希釈し、直ちにQuantifoil社製孔開きグリッド（ドイツ国イエナのQuantifoil Micro Tools社より入手可能）上に塗布して、ろ紙によりブロットし、FEI VitrobotTM Mark III（オレゴン州ヒルズボロのFEI社から入手可能）を用いて液体エタン中でプランジ凍結した。低線量（１０〜１５ｅ-／Å2）の投影画像を、２９，０００〜５０，０００倍の公称倍率及び１．０〜２．５μｍの範囲のアンダーフォーカス値でFEI Tecnai TF20電子顕微鏡を用いて、４Ｋ×４ＫGatan社製ＣＣＤカメラ（ペンシルベニア州ウォーレンデールのGatan社より入手可能）で収集した。
【０１０４】
リポペプチド４の管状ミセルの直径（〜１００カウント）及び棒状のＪＰ４−０３９リポペプチド４混合ミセルの長さ（〜２４０カウント）を、Gatan Digital Micrographソフトウェア（ペンシルベニア州ウォーレンデールのGatan社より入手可能）の密度プロットツールを用いて測定した。
【０１０５】
選択されたリポペプチドのクライオ電子顕微鏡（クライオＥＭ）画像により、２０ｍｇ／ｍＬの化合物３（図示しない）及び４（図３Ａ及び３Ｂ）に長い管状の自己会合構造が存在することが確認した。該管状構造は、厚さ２．８〜４．０ｎｍ（３．５±０．４ｎｍ，ｎ＝２２）の電子光中心領域を有しており、該領域は脂質鎖で構成されているミセルのコアと推定され得る。該光コアは、電子密度の高い周壁に囲まれており、該周壁はＦｍｏｃ−リシンを含む界面領域と推定され得る。該管状構造の平均直径は、該電子密度の高い壁の中間点同士の間の距離より測定され、〜５．６±０．４ｎｍである。該電子密度の高い領域の厚さは、電子光中心領域の厚さの〜１／３〜１／２である。ＰＥＧ鎖は、電子密度が十分に高くないため、クライオＥＭによっては見えない。リポソームの表面上に表示されている既報の脂質アンカーＰＥＧ５，０００−ＰＥ共役体は、厚さ１０〜１５ｎｍである。このパラメータがこれらの管状ＰＥＧ−リポペプチドミセルに適用されると仮定すると、該ＰＥＧ層を含む全体的な直径は、２７〜４０ｎｍの範囲であると考えられる。
【０１０６】
ＪＰ４−０３９がロードされたミセルは、著しく減少した粘度を示した。レーザー動的光散乱法により測定した該粒子サイズは、ＪＰ４−０３９がロードされたＰＥＧ−リポペプチド４にとって、空のミセルよりも小さかった（表４）。ＪＰ４−０３９が存在した際には、クライオＥＭ画像は、多くの小さなドット（〜９０％、ｎ＝３８８、図３Ｂ）と切り詰められた棒状構造（〜１０％）との混合物を示した。該ドット及び棒の直径は、リポペプチド単独のサンプル中に観察された管状ミセルの直径よりもわずかに小さかった。該棒状構造は、長さが−３０〜３００ｎｍの範囲でばらついており、長さの中央値は６０ｎｍ未満であった。クライオＥＭ上におけるＪＰ４−０３９がロードされたミセルのサイズ分布は、レーザー動的光散乱法により得られた結果と一致する。遊離薬物の結晶の兆候はなかった（図３Ｂ参照）。
【０１０７】
１（ｈ）．蛍光消光試験
ＪＰ４−０３９を備えたミセル製剤またはＪＰ４−０３９を備えていないミセル製剤を、０，０．２５または０．５ｍｇのＪＰ４−０３９を含んだ１０ｍｇのリポペプチド４を用いて、生理食塩水３００μｌを水和させる方法により調製した。上記蛍光強度は、３００ｎｍの励起波長及び３５０ｎｍ〜５００ｎｍの様々な発光波長を用いて、Synergy H１ハイブリッドリーダー（バーモント州ウィヌースキーのBioTek社より入手可能）に記録した。
【０１０８】
１（ｉ）．ミセル製剤の1Ｈ  ＮＭＲスペクトル分析
１００ｍＭ  ＮａＣｌ（リポペプチド４用）または１００ｍＭ  ＫＨＣＯ3（α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシン用）を含むＤ2Ｏ中において、（ＪＰ４−０３９または４−アセトアミド−ＴＥＭＰＯを備えているまたは備えていない）α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔＢｏｃ−リシンより、ミセルを調製した。Bruker社製４００ＭＨｚ  ＮＭＲ（マサチューセッツ州ビレリカのBruker社より入手可能）を用いて１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録し、正確なプロトン積分値を確保するためにリサイクルパルスの２０秒の遅延を用いた。初期の試験では、ｄ−ＤＭＳＯを代替溶媒として用いた。
【０１０９】
１（ｊ）．溶血アッセイ
新たに採取したラットの血液に、抗凝固剤を添加し、１０容量の冷ＰＢＳを用いて（１５００ｒｐｍで１０分間）３度洗浄することにより、該ラットの血液からラット赤血球（ＲＢＣ）を分離した。次に、赤血球を氷冷ＤＰＢＳにより２％ｗ／ｖまで希釈し、即座に溶血アッセイに利用した。１ｍＬの希釈されたＲＢＣ懸濁液を、種々の濃度（０〜５ｍＭ）のＰＥＧ−リポペプチド、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でそれぞれ処理し、その後振とう培養機中にて３７℃で２時間培養した。該サンプルを４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、そして各サンプルからの上澄み１００μＬを、９６ウェルプレート内に移した。ヘモグロビンの放出は、マイクロプレートリーダーを用いて５４０ｎｍでの吸光度によって測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＤＰＢＳで処理したＲＢＣを、それぞれ、陽性対照および陰性対照とみなした。ヘモグロビン放出を、以下のように計算した：（ＯＤサンプル−ＯＤ陰性対照）／（ＯＤ陽性対照−ＯＤ陰性対照）×１００％
【０１１０】
１（ｋ）．ＪＰ４−０３９のエマルジョン製剤及び安定性
ＪＰ４−０３９（４ｍｇ）を、ゴマ油（１００ｍｇ）及び大豆ホスファチジルコリン（５０ｍｇ）により構成されるエマルジョンに製剤化した。または、ＪＰ４−０３９（４ｍｇ）を、ゴマ油（１００ｍｇ／ｍＬ）、大豆ホスファチジルコリン（４０ｍｇ）と、オレイン酸ＰＥＧ2,000（２９．６ｍｇ／ｍＬ、０．０１２８ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ2,000−α−ＣＢｚ−ε−オレオイル−リシン（３２．５ｍｇ／ｍＬ、０．０１２８ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ2,000−α−ＣＢｚ−α−ＣＢｚ−ε−オレオイル−リシン（３５．９ｍｇ／ｍＬ、０．０１２８ｍｍｏｌ）、またはＰＥＧ2,000−α−ＣＢｚ−リシル−α−ＣＢｚでリシル−α−ＣＢｚ−ε−オレオイル−リシン（３９．３ｍｇ／ｍＬ、０．０１２８ｍｍｏｌ）のいずれかの共界面活性剤と共に構成されるエマルジョンに製剤化した。全ての成分をクロロホルムに溶解して十分に混合し、次に溶媒をＮ2流の下で除去し、その後２時間真空乾燥した。油性残渣を生理食塩水に懸濁し、最大出力２０ｍＷのプローブ式超音波処理器を用いて、サイズが１５０〜２５０ｎｍより小さくなるまで、Ｎ2流の下で６０分間氷浴下において超音波処理した。初期粒径を、レーザー動的光散乱法（Coulter N4粒径分析計）によって推定した。該サンプル中の任意の沈殿物を除去するための低速遠心分離を行った後、新たに調製した製剤と４℃で７日間保存した製剤との薬物ロード率を測定した。有機成分を、渦流下において等量のクロロホルムを用いて３回抽出した。該有機相を併せて、溶媒を窒素気流下で除去した。該残渣を、クロロホルム１ｍｌを用いて再溶解した。薬物含有量を、ＯＤ448nmの数値を用いて測定した。
【０１１１】
１（ｌ）．マウスにおける全身放射線照射に対する放射線緩和活性
すべてのマウスに、137Cs J.L. Shepherd Mark 1 照射器（カリフォルニア州サンフェルナンドのJ.L.Shepherd & Associatesより入手可能）により０．８Ｇｙの／分の線量率で照射された全身線量９．５Ｇｙを照射した。次に、該マウスを２つの群に分割した（各群あたりマウス１０〜１５匹）。これらのマウスに、放射線照射した２４時間後、エマルジョン中に製剤したＪＰ４−０３９または対照製剤単独を、腹腔内注射した。ＪＰ４−０３９の用量は、２０ｍｇ／ｋｇであった。マウスが体重の２０％を失うか瀕死に見えるまで（その時点でマウスを安楽死させた）、マウスの経過を観察した。
【０１１２】
２．パクリタキセルの試験
【０１１３】
２（ａ）．両親媒性剤中で製剤されたＰＴＸ
２（ａ）（ｉ）．材料
パクリタキセル（９８％）は、AK Scientific社（カリフォルニア州ユニオンシティ）より購入した。コハク酸無水物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、９−フルオレニルカルボニルクロリド（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨは、全てSigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）より購入した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）は、Alfa Aesar社（マサチューセッツ州ワードヒル）より購入した。４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）は、Calbiochem-Novabiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。ＦＴＳは、公開された文献に従って合成及び精製した。
【０１１４】
２（ａ）（ｉｉ）．ＰＥＧ5K−ＦＴＳ2及びＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2の合成
ＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2を、分子量５０００ＤａのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨより、溶液縮合反応により合成した。コハク酸無水物（５当量）を、ＰＥＧのＯ末端上に、ジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）中でＤＭＡＰ（５当量）を用いて一晩かけてカップリングさせた。冷エーテルを添加することによりＰＥＧ化された分子を沈殿させ、該分子をエーテルで２度洗浄した。カップリング剤としてＮＨＳ（３当量）及びＤＣＣ（３当量）を用いて、トリスをＣＨ2Ｃｌ2中で１日の間カップリングさせた。冷エーテルを添加することによりＰＥＧ化された分子を沈殿させ、該分子をエーテルで２度洗浄した。アセトニドは、ＴｓＯＨをアセトン中で触媒として用いていた。Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（２当量）及びＮＥｔ３（３当量）を用いて、Ｆｍｏｃ基をＣＨ2Ｃｌ2中で一晩かけてＯＨとカップリングさせた。冷エーテルを添加することによりＰＥＧ化された分子を沈殿させ、該分子をエーテルで２度洗浄した。１％ＴｓＯＨ（ＣＨ2Ｃｌ2中）を用いて処理することにより、アセトニド基を除去した。カップリング剤としてＤＣＣ（４当量）及びＤＭＡＰ（０．４当量）を用いて、ＦＴＳ（４当量）をカップリングさせた。冷エーテルを添加することによりＰＥＧ化された分子を沈殿させ、該分子をエーテルで２度洗浄した。この分子を凍結乾燥することにより、白色粉末を得た。
【０１１５】
２（ａ）（ｉｉｉ）．ＰＴＸがロードされたミセルの調製及びキャラクタリゼーション
ＰＴＸ（クロロホルム中１０ｍＭ）及びＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2複合体（クロロホルム中１０ｍＭ）を、様々なキャリア／薬物比で混合した。有機溶媒を窒素流により除去し、それによって薬物／キャリア混合物の薄膜を形成した。該膜を１時間真空乾燥して、残留溶媒を除去した。ＤＰＢＳを添加して薄膜を水和させ、薬物がロードされたミセルを形成した。組み入れられなかったＰＴＸ（沈殿物）を、シリンジフィルター（細孔径２２０μｍ）を用いて濾過することにより除去した。薬物を含まないＰＴＸが可溶化されたＰＥＧ5K−ＦＴＳ2ミセルを、同様に上記のようにして調製した。
【０１１６】
該ミセルの粒子径を、Zetasizer（ＤＬＳ）（Zetasizer Nano ZS装置、英国ウスターシャー州のMalvern社より入手可能）により測定した。該ミセル濃度を、１ｍｇ／ｍＬに維持した。
【０１１７】
薬物ロード効率を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Alliance 2695-2998システム）により定量化した。逆相のＬＩＣＨＲＯＳＰＨＥＲ（登録商標）  １００  ＲＰ−１８（５μｍ）カラム及びメタノール／水（８０：２０、ｖ／ｖ）により構成される移動相を用いた。ＬＩＣＨＲＯＳＰＨＥＲは、ドイツ国ダームスタッドの移動相より入手可能なクロマトグラフィー用吸着材である。ＰＴＸがロードされたミセルをＭｅＯＨで希釈し（ミセル溶液／ＭｅＯＨ＝１／９、ｖ／ｖ）、それによって薬剤がロードされたミセルを解離させた。流速を０．８ｍｌ／分に設定し、カラム溶出液を紫外／可視検出器を用いて２２７ｎｍにて検出した。薬物ロード容量（ＤＬＣ）及び薬物ロード効率（ＤＬＥ）は、以下の式に従って計算した：
ＤＬＣ（％）＝［使用した薬物の重量／（ポリマーの重量＋使用した薬物の重量）］×１００％
ＤＬＥ（％）＝（使用した薬物の重量／導入した薬物の重量）×１００％
【０１１８】
本発明者らは、遊離薬物及びＰＴＸがロードされたミセルのサイズ変化を経過観察した。その安定性は、経過観察期間中に目立ったサイズ変化がなかったことを示していた。
【０１１９】
２（ｂ）．親水性剤中で製剤されたＰＴＸ
２（ｂ）（ｉ）．材料
パクリタキセル（９８％）は、AK Scientific社（カリフォルニア州ユニオンシティ）より購入した。α−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシン、ジ−Ｂｏｃ−リシン、Ｎ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミドは（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）は、Acros Organic社（ベルギー国ヘール及び米国ニュージャージー州）より入手した。モノメトキシＰＥＧ5000、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ニンヒドリン及び他の明示されない試薬の純粋な化学物質は、Sigma-Aldrich社（ニュージャージー州セントルイス）より購入した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液は、全てInvitrogen社（ニューヨーク州グランドアイランド）より購入した。本試験に用いられた全ての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。
【０１２０】
２（ｂ）（ｉｉ）．細胞培養
４Ｔ１−２は、マウス転移性乳癌細胞株である。ＰＣ−３及びＤＵ１４５は、二つのアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞株である。それらを全て、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中において、５％ＣＯ2を含む加湿環境下にて３７℃で培養した。
【０１２１】
２（ｂ）（ｉｉｉ）．ＰＥＧ5K−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2）の合成
以下の本発明者らの公開された方法によって、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2を大規模に合成した。まず、１当量のモノエトキシＰＥＧ5000を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中において、過剰量のジ−Ｂｏｃ−リシン及びＤＣＣと共に、ＤＭＡＰを添加して混合し、室温で４８時間反応させた。該混合物を氷冷エーテル中で濾過及び沈殿させた後、冷エタノール及びエーテルで洗浄して、精製されたＰＥＧ5000−ジ−Ｂｏｃ−リシンを得た。次に、該ＰＥＧ誘導体をＤＣＭ／ＴＦＡ（１：１、ｖ／ｖ）により室温で２時間処理し、続いて溶媒を除去し、冷エーテル沈殿させて、冷エタノール及びエーテルにより洗浄した。その後、脱保護されたＰＥＧ5000−リシン−ＮＨ2を、ＮＨＳ、ＤＣＣで予め活性化させた過剰量のα−Ｆｍｏｃ−ε−Ｂｏｃ−リシン及び少量のＤＭＡＰと、ＤＣＭ中にて３７℃で４時間混合した。ニンヒドリン試験が陰性になるまで（これは、遊離アミノ基が存在しないことを示す）、該反応を３７℃で行った。該反応混合物を氷冷エーテル沈殿させた後、冷エタノール及びエーテルにより洗浄した。得られた材料を水に溶解して、２２０ｎｍのろ紙で濾過し、続いて凍結乾燥を行うことにより、精製されたＰＥＧ5K−リシル−（α−Ｆｍｏｃ−ε−ｔ−Ｂｏｃ−リシン）2を得た。
【０１２２】
２（ｂ）（ｉｖ）．ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ミセルの調製及び生物物理学的キャラクタリゼーション
ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ナノミセルを調製するため、薄膜水和法を利用した。クロロホルム中のＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2及びＰＴＸを、ガラス管中において指定されたモル比でよく混合した。穏やかな窒素流による有機溶媒の除去を通じて、キャリア／薬物混合物の薄膜を、生成した。痕跡量の溶媒は、２時間の真空によりさらに除去した。その後、該膜を渦流によりＤＰＢＳ中に水和及び懸濁し、それによってＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ナノミセルの透明な溶液を得た。取り込まれなかった任意の薬物を、２２０ｎｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを通して濾過することにより除去した。
【０１２３】
ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ナノミセルのサイズ分布を、Malvern Zeta Nanosizerを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）により調査し、ネガティブ染色後にその形態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察した。蛍光プローブとしてピレンを用いて、前に報告したようにＣＭＣの測定を行った。ミセル内にＰＴＸを定量化するため、ＰＴＸをメタノールにより抽出し、ＵＶ検出器を備えたWaters Alliance 2695-2998高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムにより、ＲＰ−１８カラム（２５０ｍＬミリメートル×４．６ミリメートル）を用いて、該ＰＴＸを室温で２２７ｎｍにて検出した。０．８ｍＬ／分の流速における移動相として、メタノール／水（８０：２０、ｖ／ｖ）の混合物を用いた。薬物ロード容量（ＤＬＣ）及び効率（ＤＬＥ）を、上述のようにして計算した。
【０１２４】
２（ｂ）（ｖ）．粒子サイズにおける凍結乾燥／再溶解の影響
１ｍＬのＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2（ＤＰＢＳ中）を上述のようにして調製し、ＰＴＸ濃度を１ｍｇ／ｍＬに維持した。この透明な溶液を一晩かけて凍結及び凍結乾燥させて、白色粉末を得た。該粉末を蒸留水１ｍＬにより再溶解して、透明な溶液を得た。ＰＴＸがロードされたミセルの凍結乾燥／再溶解の前後の粒子サイズを、Zetasizerを用いてＤＬＳにより記録した。
【０１２５】
２（ｂ）（ｖｉ）．蛍光消光
様々な薬物／キャリアモル比のＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ミセルを、ＤＰＢＳ中において上述のようにして調製し、Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2及びＴＡＸＯＬを対照として利用した。全ての群において、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2の濃度を比較のために０．４４μＭに固定した。該サンプルを９６ウェルプレート内に配し、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダーを用いて、２７０ｎｍの励起波長及び３００ｎｍ〜４６０ｎｍの発光波長にて該サンプルの蛍光強度を調査した。
【０１２６】
２（ｂ）（ｖｉｉ）．試験管内での薬物放出動態
２ｍＬのＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2（ＤＰＢＳ中）（ＰＨ＝７．４）（１ｍｇ  ＰＴＸ／ｍＬ）を調製して透析袋（ＭＷＣＯ  １２ｋＤａ、Spectrum Laboratories社製）内に配し、該袋を、０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ８０を含むＤＰＢＳ２００ｍＬの入ったタンク内で、３７℃で緩やかに振とうさせつつ培養した。予定された時点（０、１、２、４、８、２４、４８及び７２時間）において、該透析袋内に残っていたＰＴＸの濃度を、ＨＰＬＣにより上述のようにして測定した。ＴＡＸＯＬ製剤（６ｍｇ  ＰＴＸ／ｍＬ、Cremophor EL／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中）をＤＰＢＳにより希釈して１ｍｇ／ｍＬの最終ＰＴＸ濃度とし、対照として利用した。
【０１２７】
２（ｂ）（ｖｉｉｉ）．試験管内での細胞毒性
マウス転移性乳癌細胞株４Ｔ１．２と、２つのヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３及びＤＵ１４５とを、ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ２の試験管内での細胞毒性を評価するために利用した。細胞は、ウェルあたり１０００セル（４Ｔ１．２）、２０００セル（ＤＵ１４５）及び３０００セル（ＰＣ−３）で、９６ウェルプレートに播種した。２４時間後に、６．２５〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲のＰＴＸ濃度のＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2またはＴＡＸＯＬを用いて、細胞を処理した。７２時間後に、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、５ｍｇ／ｍｌ）２０μＬを各ウェルに添加した。４時間培養した後、培地を除去し、ＤＭＳＯ１５０μＬを各ウェルに添加して、ホルマザン結晶を可溶化した。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて、基準波長６３０ｎｍとして５５０ｎｍにて検出し、細胞生存率を以下の式に基づいて計算した。未処理細胞は、対照として含めた。
％細胞毒性＝［１−（ＯＤ処理−ＯＤブランク）／（ＯＤ対照−ＯＤブランク）］×１００％
【０１２８】
２（ｂ）（ｉｘ）．動物
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週間）を、Charles River（カリフォルニア州デイビス）より購入し、ＡＡＡＬＡＣガイドラインに従って病原体を含まない条件下で飼育した。全ての動物に関連した実験は、施設のガイドラインに完全に準拠して行われ、ピッツバーグ大学における動物使用及びケア管理諮問委員会（Animal Use and Care Administrative Advisory Committee）によって承認された。
【０１２９】
２（ｂ）（ｘ）．最大耐量（ＭＴＤ）試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に７群（Ｎ＝４）に分割し、ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2（３０、５０、７５、１００及び１２０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）またはＴＡＸＯＬ（１５、２０及び２５ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）を静脈内投与した。次に、マウスの生存及び体重変化について、経時観察を１０日間行った。ＭＴＤは、動物が死ぬこと、一般的外見が著しく変化すること、全実験期間にわたる体重減少が１５％を超えることのいずれも引き起こすことのないＰＴＸの用量により決定した。
【０１３０】
２（ｂ）（ｘｉ）．蛍光光学イメージング
ＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ナノミセルの生体内分布を調査するため、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングを近赤外蛍光色素Ｃｙ５．５で標識されたＰＴＸを用いて行った。ＰＴＸ−Ｃｙ５．５／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2混合ナノミセル（０．４  ＰＴＸ−Ｃｙ５．５  ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを、ＣＬ１異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。予定された時刻に、マウスを麻酔して、６３０ｎｍにおける励起及び７００ｎｍにおける発光による３０秒の露光時間を用いて、Carestream Molecular ImagingのIn-Vivo Imaging FX Proによりスキャンした。イメージング研究の終了時に、すべてのマウスを殺処分し、生体外イメージングのために主要臓器及び腫瘍を切除した。
【０１３１】
２（ｂ）（ｘｉｉ）．生体内治療効果
同系マウス乳癌モデル（４Ｔ１．２）を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に２×１０5の４Ｔ１．２細胞を皮下接種することにより作成し、腫瘍の大きさが〜５０ｍｍ3に達した際に処置を開始した。マウスを５つのグループ（ｎ＝５）に無作為に分割し、生理食塩水、ＴＡＸＯＬ（１０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）及びＰＴＸ／ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ2（１０，２０及び４０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）をそれぞれ静脈内注射した。腫瘍体積をノギスで測定し、以下の式に基づいて計算した：（Ｌ×Ｗ2）／２、ここで、Ｌは最長の、Ｗは最短の腫瘍直径（ｍｍ）である。該データを、相対的な腫瘍体積（ＲＴＶ、所与の時点での腫瘍容積を、最初の治療より前の腫瘍体積で割ったもの）として示した。腫瘍が潰瘍を発症したときに、マウスを殺処分した。製剤の潜在的毒性を評価するために、全てのマウスの体重変化は、治療の過程全体の間にも測定した。実験の終了時に腫瘍を採取して、腫瘍重量を測定した。腫瘍増殖阻害率（ＩＲ）は、以下のようにして計算した：１−（ＰＴＸを処置した群の腫瘍重量の平均／生理食塩水を処置した群の腫瘍重量の平均）×１００％。
【０１３２】
２（ｂ）（ｘｉｉ）．統計分析
２つのグループ間における両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行い、ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。複数のグループ間における有意性を評価するために一方向ＡＮＯＶＡを行い、ｐ＜０．０５の場合には、続いて両側スチューデントｔ検定を行った。
【０１３３】
３．ドキソルビシンの試験
【０１３４】
３（ａ）．材料
Ｆｍｏｃ−ＦＴＳシステムによる試験用のドキソルビシンまたはＤＯＸ（＞９９％）は、LC Laboratories（マサチューセッツ州ウーバン）より購入した。Ｌ−αーホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−ＯＣＨ3は、Avanti（登録商標） Polar Lipids社（アラバマ州アラバスター）より購入した。コレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）より購入した。
【０１３５】
未修飾リポソームを、ＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を７：３：０．５のモル比にて構成した。脂質成分のクロロホルム溶液を混合し、穏やかなＮ2流下で蒸発させた後、真空下において少なくとも４時間蒸発させた。乾燥した脂質膜を、硫酸アンモニウム（１２３ｍｍｏｌ）を用いて４℃で一晩かけて水和した。短時間渦動させた後、続いて懸濁液を３ワットの電力で１時間プローブ超音波処理した。硫酸アンモニウムを含有するリポソームを、生理食塩水で予め平衡化させていたカラムに通過させた。リポソーム懸濁液は、その後ＤＯＸ生理食塩溶液と混合した。最終的なリポソーム／ＤＯＸは、ゲルクロマトグラフィーを用いて生成され、それによりカプセル化されていないＤＯＸを除去した。ＤＯＸ生理食塩溶液を、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）／メタノール（ＭｅＯＨ）（１：１、ｖ／ｖ）の混合液中において、トリエチルアミン（２当量）とともに攪拌して、ＤＯＸ−ＨＣｌから塩酸を除去した。薬物を含まないＤＯＸ可溶化ミセルを、ＰＴＸがロードされたミセルと同様にして調製した。
【０１３６】
ビタミンＥ及びＦｍｏｃのよる試験用のＤＯＸは、AK Scientific社（カリフォルニア州ユニオンシティ）より購入した。メトキシ−ＰＥＧ5,000−ＯＨ、コハク酸無水物、Ｂｏｃ−ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨは、全てSigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）より購入した。Ｄ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）は、東京化成工業社（オレゴン州ポートランド）より購入した。ＤＣＣは、Alfa Aesar社（米国マサチューセッツ州）より購入した。ＤＭＡＰは、Calbiochem-Novabiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。本試験で用いた全ての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。
【０１３７】
３（ｂ）．ＤＯＸがロードされたＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2のための生体内における腫瘍治療試験
種々のＤＯＸ製剤の治療効果を調査するため、同系マウス乳癌モデル（４Ｔ１．２）を使用した。１×１０5の４Ｔ１．２細胞（ＰＢＳ２００μＬ中）を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に皮下接種させた。マウスの腫瘍が〜５０ｍｍ3の腫瘍体積に達したときに治療を開始し、その日を１日目とした。１日目に、これらのマウスを無作為に８群（ｎ＝５）に分割して、１日目、４日目、７日目にそれぞれ、ＰＢＳ（対照）、ＤＯＸ（５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）を、リポソーム／ＤＯＸ（５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）を、ＤＯＸがロードされたＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＴＳ2ミセル（５、１０ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）及びＤＯＸがロードされたＰＥＧ5K−ＦＴＳ2（５ｍｇ  ＤＯＸ／ｋｇ）を静脈内投与した。腫瘍のサイズをデジタルノギスで週に３度測定し、以下の式により計算した：（Ｌ×Ｗ2）／２、ここで、Ｌは最長の、Ｗは最短の腫瘍直径（ｍｍ）である。各群の間で比較するために、相対的な腫瘍体積（ＲＴＶ）を、各測定時点において計算した（ＲＴＶは、所与の時点での腫瘍容積を最初の治療より前の腫瘍体積で割ったものに等しい）。腫瘍が２０００ｍｍ3に達したとき、マウスを殺処分した。種々の群からの全てのマウスの体重を、３日毎に測定した。
【０１３８】
３（ｃ）．ＰＥＧ5K−ＶＥ2（ＰＥＧ−ＶＥ2）の合成
まず、（Ｂｏｃ）リシン（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４当量）を、カップリング剤としてＤＣＣ（３当量）及びＤＭＡＰ（０．１当量）を用いて、ＰＥＧ5Kの−ＯＨ末端上にＤＣＭ中で一晩かけてカップリングさせた。冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて、ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ジＢｏｃエステルを沈殿させて３回洗浄した。次に、ＤＣＭ中にて５０％トリフルオロ酢酸で処理することにより、Ｂｏｃ基を除去した。冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて、得られた（ＰＥＧ5K−リシンエステル）を沈殿させて３回洗浄した。続いて、ビタミンＥコハク酸（６当量）を、リシンのアミノ基にカップリングさせて、ＰＥＧ5K−ＶＥ2を得た。最終生成物を、冷エタノールおよびエーテルをそれぞれ用いて３回沈殿及び洗浄させた。最終生成物を凍結乾燥させて、白色粉末を得た。該合成経路を図１０Ａに示す。
【０１３９】
３（ｄ）．ＰＥＧ5K−Ｆｍｏｃ−ＦＶＥ2（ＰＥＧ−ＦＶＥ2）の合成
ＰＥＧ−ＦＶＥ2を、分子量５０００ＤａのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨより、溶液相縮合反応により合成した。Ｆｍｏｃ−ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４当量）を、カップリング剤としてＤＣＣ（４当量）およびＤＭＡＰ（０．２当量）を用いて、ＰＥＧの−ＯＨ末端上にＤＣＭ中で一晩かけてカップリングさせた。冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて、Ｆｍｏｃ−ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）ＰＥＧエステルを沈殿させて３回洗浄した。次に、ＤＣＭ中にて５０％トリフルオロ酢酸で処理することによりＢｏｃ基を除去し、冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて、Ｆｍｏｃ−リシルＰＥＧエステルを沈殿させて３回洗浄した。Ｂｏｃ−ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２当量）を、カップリング剤としてＤＣＣ（２当量）及びＤＭＡＰ（０．１当量）を用いて、Ｆｍｏｃ−リシルＰＥＧエステルのＮＨ2末端にＤＣＭ中で一晩かけて結合させた。冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて、ジ−ＢｏｃＰＥＧエステルを沈殿及び３回洗浄させた。その後、ＤＣＭ中にて５０％トリフルオロ酢酸で処理することによりＢｏｃ基を除去し、冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて、ジＮＨ2ＰＥＧエステルを沈殿させて３回洗浄した。得られた白色粉末の沈殿物を、真空下で乾燥させた。ビタミンＥコハク酸（４当量）を、ＤＣＣ（４当量）及びＤＭＡＰ（０．２当量）の支援を受けて、リシンの脱保護されたアミノ基にカップリングさせた。冷エタノール及びエーテルをそれぞれ用いて得られたＰＥＧ−ＦＶＥ2を沈殿させて３回洗浄した。最終生成物を連続して水に対する透析及び凍結乾燥させて、白色粉末を得た。該合成経路を図１０Ｂに示す。
【０１４０】
３（ｅ）．ＤＯＸがロードされたＰＥＧ−ＶＥ2及びＰＥＧ−ＦＶＥ2ミセルの調製及び生物物理学的キャラクタリゼーション
まず、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（１：１、ｖ：ｖ）中にて３モル当量のトリエチルアミンによりＤＯＸ・ＨＣｌを中和し、それによって親化合物からＨＣｌを除去した。種々のキャリア／薬物モル比にて、ＤＯＸ（１０ｍＭ、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ中）をＰＥＧ−ＦＶＥ2（クロロホルム中１０ｍＭ）に加えた。まず、該有機溶媒を窒素流により除去し、それによって薬物／キャリア混合物の乾燥薄膜を形成した。該乾燥膜を高真空下で２時間乾燥させて、残留溶媒の全痕跡を除去した。該混合物膜は、その後、さらなる超音波処理をすることなく、生理食塩水中に再溶解した。同様にして、ＤＯＸがロードされたＰＥＧ−ＶＥ2を調製した。薬物製剤化ミセルの平均直径を、動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価した。ミセル内にロードされたＤＯＸ濃度を、検出器セットを備えたＨＰＬＣによって２２７ｎｍにて調査した。薬物ロード容量（ＤＬＣ）及び薬物ロード効率（ＤＬＥ）を、上述のようにして計算した。
【０１４１】
３（ｆ）．試験管内での放出動態
放出媒体としての０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０（ｗ／ｖ）を含むＤＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）を用いて、ＤＯＸの生体内放出動態を透析法により実行した。遊離ＤＯＸを、対照として使用した。２ｍＬのＤＯＸがロードされたＰＥＧ−ＶＥ2またはＰＥＧ−ＦＶＥ2のナノ製剤（１ｍｇ  ＤＯＸ／ｍＬ）を、透析チューブ（ＭＷＣＯ＝１２ｋＤａ、Spectrum Laboratories社製）内に封止した。パラフィルムで覆われたビーカー内において、該透析チューブを放出媒体５００ｍＬ中に浸漬した。該ビーカーを、振とう培養機中にて３７℃で１００ｒｐｍに維持した。種々の時点で、該透析チューブに保持されたＤＯＸの濃度を、検出器セットを備えたＨＰＬＣによって２２７ｎｍにて調査した。値は、３つのサンプルの平均値として報告した。
【０１４２】
３（ｇ）．生体内における抗腫瘍治療研究
種々のＤＯＸ製剤の治療効果を評価するため、同系マウス乳癌モデル（４Ｔ１．２）を用いた。まず、２×１０5の４Ｔ１．２細胞（生理食塩水２００Ｌ中）を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に皮下接種させた。マウスの腫瘍が５０〜１００ｍｍ3の体積に達した際に、これらのマウスを５つのマウス５匹からなる群に無作為に割当して、その日を１日目とした。マウスには、ＰＢＳ（対照）、遊離ＤＯＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＤＯＸＩＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＤＯＸがロードされたＰＥＧ−ＶＥ2（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＤＯＸがロードされたＰＥＧ−ＦＶＥ2（１０及び２０ｍｇ／ｋｇ）を、静脈内に３回、３日間隔で、それぞれ１日目、４日目、７日目に投与した。１、４、７、１０、１２、１５、１８、２１、２５日目に、腫瘍のサイズをデジタルノギスで測定し、以下の式に従って計算した：（Ｌ×Ｗ2）／２、ここで、Ｌ及びＷは、それぞれ各腫瘍の長さ及び幅である。各群の間でより優れた比較をするために、相対的な腫瘍体積（ＲＴＶ）を、各測定時点において計算した（ＲＴＶ＝所与の時点での腫瘍容積／最初の治療より前の腫瘍体積）。腫瘍が２０００ｍｍ3に達した際または重度の潰瘍に発達した際のいずれかが先に来た時点でマウスを殺処分して、該腫瘍を秤量した。
【０１４３】
前述の詳細な説明および添付の図面は、現時点での代表的ないくつかの実施形態を明らかにする。様々な修正、追加及び代替設計は、前述の詳細な説明ではなく以下の特許請求の範囲により示される本願の範囲から逸脱することなく、前述の教示に照らして当業者にとって当然に明らかになるであろう。特許請求の範囲の均等物の意図及び範囲内に入る全ての変更および変形は、該特許請求の範囲内に包含されることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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