(57)【要約】  本発明は、遺伝子改変の効率の向上及び／又は遺伝子改変媒体の使用の低減のために、細胞と遺伝子改変媒体との間の距離を低下させることによって改良された動物細胞の遺伝子改変方法に関する。
2016530895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞に形質導入する方法であって、
気体透過性且つ液体不透過性である材料を有する装置の中に培地と、動物細胞と、遺伝子改変媒体とを加える工程であって、前記動物細胞は１ミリリットルの培地あたり３百万〜２０百万細胞の濃度であり、前記動物細胞は気体透過性且つ液体不透過性である前記材料と接触し、気体透過性且つ液体不透過性である前記材料は水平位置にある、該工程と、
ある期間を与え、それにより前記遺伝子改変媒体が前記細胞の少なくとも一部に形質導入するように機能する工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記動物細胞は１ミリリットルの培地あたり４百万〜２０百万細胞の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物細胞は１ミリリットルの培地あたり５百万〜２０百万細胞の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物細胞は１ミリリットルの培地あたり６百万〜２０百万細胞の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記装置における前記培地は、前記期間の少なくとも一部の間静置状態になく、それによって前記遺伝子改変媒体が前記細胞の少なくとも一部に形質導入するように機能する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変媒体はレンチウイルスから構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
気体透過性且つ液体不透過性である前記材料は、気体透過性材料支持部に接触するとともに周囲の気体に接触している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記装置に加えられる前記動物細胞の量に対する前記遺伝子改変媒体の数の比が２以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
動物細胞に形質導入する方法であって、
ａ）気体透過性且つ液体不透過性である材料から構成されている水平な細胞増殖表面を有する気体透過性の装置の中に、培地と、ある量の動物細胞とを加えるとともに、気体透過性且つ液体不透過性である前記材料に向かって動物細胞が沈下することを可能にする工程であって、これにより前記動物細胞が第１の細胞濃度であり、培地は第１の培地高であり、且つ培地は第１の培地量であり、前記第１の細胞濃度は前記動物細胞の量を前記第１の培地量で割ったものであり、前記第１の培地高は、前記細胞増殖表面が水平位置にあるときの前記培地の最高位から前記培地の最低位までの距離によって定義されている、該工程と、
ｂ）前記装置から前記第１の培地量の一部を除去して前記装置の中に第２の培地量を残す工程であって、動物細胞は第２の細胞濃度であり、前記第２の細胞濃度は前記第１の細胞濃度よりも高く、培地は、前記細胞増殖表面が水平位置にあるときの前記培地の最高位から前記培地の最低位までの距離によって定義されている第２の培地高である、該工程と、
ｃ）前記装置の中に遺伝子改変媒体を加える工程と、
ｄ）前記遺伝子改変媒体が前記動物細胞の少なくとも一部に形質導入するための期間を与える工程と、
ｅ）ある量の培地を前記装置の中に加える工程と、
ｆ）前記動物細胞の少なくとも一部が前記細胞増殖表面上に存在しており、前記細胞増
殖表面が水平位置に向けられており、且つ、細胞培養に好適な周囲の気体が気体透過性且つ液体不透過性である前記材料と接触するような位置に、前記装置が向けられているときに、動物細胞が量において増大するための培養時間の期間を与える工程と、を備える方法。
【請求項１０】
前記第２の細胞濃度は１ミリリットルの培地あたり４百万〜２０百万動物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の細胞濃度は１ミリリットルの培地あたり５〜１０百万動物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養時間後の形質導入動物細胞の量が、前記装置の中に加えられる動物細胞の量を上回る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子改変媒体を加える工程の前に、前記装置に複数のビーズが加えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズが磁場に対して暴露され、前記ビーズに付着していない動物細胞が除去されることによって、動物細胞の所望の亜集団が前記装置内に残る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁場は、気体透過性材料支持部に接触している磁石によって生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記磁石の表面は気体透過性の前記細胞増殖表面に対して平行である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記磁石の表面は平行且つ前記細胞増殖表面の１．２７ｃｍ（０．５インチ）以内である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
動物細胞に形質導入する方法であって、
ａ）気体透過性且つ液体不透過性である材料から構成されている水平な細胞増殖表面を有する気体透過性の装置の中に、培地と、動物細胞とを加える工程であって、これにより、前記動物細胞は１ｍｌあたり３百万動物細胞を上回る第１の細胞濃度であり、前記培地は第１の培地量であり、前記培地は第１の培地高であり、前記第１の細胞濃度は、前記動物細胞の量を前記第１の培地量で割ったものであり、前記培地高は、前記細胞増殖表面が水平位置にあるときの前記培地の最高位から前記培地の最低位までの距離である、該工程と、
ｂ）前記装置の中に遺伝子改変媒体を加える工程と、
ｃ）前記遺伝子改変媒体が前記動物細胞の少なくとも一部に形質導入するための期間を与える工程と、
ｄ）ある量の培地を前記装置の中に加えることによって、前記第１の細胞濃度よりも低い第２の細胞濃度と、前記第１の培地高よりも大きい第２の培地高とを確立する工程と、
ｅ）前記動物細胞の少なくとも一部が前記細胞増殖表面上に存在しており、前記細胞増殖表面が水平位置に向けられており、且つ、細胞培養に好適な周囲の気体が気体透過性且つ液体不透過性である前記材料と接触するような位置に、前記装置が向けられているときに、動物細胞が前記培地で培養されるための期間を与える工程と、を備える方法。
【請求項１９】
前記第２の細胞濃度は１ｍｌあたり１００，０００動物細胞より低い、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の培地高は２．０ｃｍ超である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の培地高は５．０９ｃｍ超である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変の効率の向上及び／又は遺伝子改変媒体の使用の低減のために、細胞と遺伝子改変媒体との間の距離を低下させることによって改良された動物細胞の遺伝子改変方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、「細胞の形質導入の改良された方法（ＩＭＰＲＯＶＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮ）」と題する、２０１３年９月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８８１，２５９号の利益を主張し、本明細書にその全体を参照として組み込む。
【０００３】
本明細書に引用される各出願、特許、及び論文や、各出願、特許、及び論文に引用される各文献又は参照文献（交付された各特許、「出願の引用文献」の手続中を含む）、係属中の米国特許出願第１０／９６１，８１４号（以下、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）‘８１４）、係属中の米国特許出願第１３／４７５，７００号（以下、ベラ（Ｖｅｒａ）‘７００）、係属中の米国特許出願第１３／４９３，７６８号（以下、ベラ‘７６８）、係属中の米国特許出願第１１／９５２，８４８号（以下、ウィルソン‘８４８）、係属中の米国特許出願第１４／３１３，７０２号（以下、ウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）‘７０２）、及びそれらの出願及び特許の何れかに対応する、その優先権を主張する、又はその両方である、各ＰＣＴ及び外国出願又は特許、及び各出願の引用文献に引用又は参照された各文献は、引用によって本明細書に援用される。
【０００４】
遺伝子改変されている細胞は、一般に形質導入と称されるプロセスを経た後に、一般に形質導入細胞と称される。形質導入は、遺伝子を改変する媒体が細胞に入ることを可能にする様々な手法によって行われることができる。このような遺伝子改変媒体には、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、又は細胞膜透過性を増加させる化学試薬の使用が含まれる。トランスフェクション及び形質転換も、また、遺伝物質を細胞の中に導入する一般的な手段である。
【０００５】
ウイルスベクターの場合、使用される種類にバリエーションがあり、このような種類には、レンチウイルスや、レトロウイルスや、アデノウイルスが含まれ、ナノ工学による物質さえ含まれ得る。エレクトロポレーションの場合、細胞は、プラスミドなど遺伝子を改変する媒体が該細胞に入ることを可能にする電圧に対して暴露される。主要な課題は、細胞が形質導入される効率を向上させることである。効率の向上には、所与の細胞集団内において形質導入される細胞の数の改良や、所与の集団内の所与の数の細胞を遺伝的に作り変えるのに必要な遺伝子改変媒体の量の低減が含まれ得る。
【０００６】
レンチウイルスは、細胞の形質導入に関連する利点及び問題点の好例を提供する。レンチウイルスは、主として、インビトロ系に遺伝子産物を導入するために使用されるリサーチツールである。ハイスループット形式のＲＮＡ干渉技術を使用して特定の遺伝子の発現をブロックすることにレンチウイルスを使用するため、大規模な共同努力が進行中である。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現によって、特定の遺伝子の発現が抑制され、したがって、研究者はモデル系において所与の遺伝子の必要性と影響とを調べることが可能となる。これらの研究は、ある遺伝子産物をブロックして疾病を治療することを目的とする新規な薬剤の開発の先駆けとなり得る。
【０００７】
Ｔ細胞療法の分野において、新たに生まれた１つの適用は、標的抗原に対する特異性（
典型的には、モノクローナル抗体の特異性）を有する形質導入Ｔ細胞を与えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生産するために、Ｔ細胞をインビトロで遺伝的に作り変えることである。このようにして、多数のＣＡＲ  Ｔ細胞がＴ細胞療法における使用のために生成され得る。ＣＡＲ  Ｔ細胞の形質導入は、また、活性化シグナル、増殖、サイトカインの産生、及びエフェクター機能の増大した細胞を与え得る。このアプローチにより、患者特異的ながん治療が大いに改良される可能性が高い。患者のＴ細胞の採集に続いて、該細胞は、その患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられるＣＡＲを発現するように遺伝子操作され、その後、その患者に注入して戻される。該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原を提示するがん細胞を認識して死滅させる。
【０００８】
本発明の目的は、特に、Ｔ細胞の形質導入に関するとき、任意の所与の集団サイズについて形質導入プロセスの完了時に形質導入されている細胞の量を増加させることによって該プロセスを改良すること、該プロセスにおいて使用される遺伝子改変媒体の量を低減すること、及び／又は該プロセスのコスト及び複雑さを低減することである。
【０００９】
Ｔ細胞の培養及び／又はＴ細胞形質導入プロセスにおける一般的な工程は、抗体によって染色されている磁気ビーズを使用して、より大きな混合集団から細胞の標的亜集団を選択することである。例えば、幹性Ｔ細胞（ｓｔｅｍ  Ｔ  ｃｅｌｌ）などの細胞の亜集団は、白血球の集団から選択され得る。該抗体を認識する亜集団の細胞がビーズに結合すると、集団全体は、装置から取り除かれるとともに磁場を流れ過ぎる。これにより、ビーズは磁場により捕捉されて、それらビーズに付着している細胞の該亜集団が主要な集団から単離される。このプロセスを液体が流れることを要求しない静置装置の中で行うことを選び、フローシステムを使用して該亜集団を単離する必要を排除できる場合には、プロセスが大幅に簡略化され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞と培地とを含む気体透過性でない細胞培養装置の断面図。
【図１Ａ】細胞と、培地と、遺伝子改変媒体とを含む気体透過性でない細胞培養装置の断面図。
【図２】細胞と培地とを含む気体透過性の細胞培養装置の断面図。
【図２Ａ】細胞と培地とを含む気体透過性の細胞培養装置の断面図。
【図２Ｂ】細胞と、培地と、遺伝子改変媒体とを含む気体透過性の細胞培養装置の断面図。
【図２Ｃ】細胞と培地とを含む気体透過性の細胞培養装置の断面図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
細胞の亜集団の単離及び／又は動物細胞の形質導入のプロセスを改良する本発明のある実施形態が開示されている。
本発明の一実施形態では、気体透過性且つ液体不透過性である材料から構成されている細胞増殖表面を有する装置の中に動物細胞と培地とを置き、ここで、該動物細胞は、０．３ｃｍの高さの培地で静置細胞培養方法を使用して従来の組織培養フラスコの中で該動物細胞を培養することにより達成可能な最高細胞濃度（細胞／ミリリットル）を上回る濃度で培地中に存在し、それによって、任意の所与の細胞と任意の所与の遺伝子改変媒体との間の距離を減少させるプロセスにより、細胞に形質導入するのに必要な遺伝子改変媒体の量を低減するための方法が開示されている。
【００１２】
別の実施形態では、気体透過性且つ液体不透過性である材料から構成されている細胞増殖表面を有する装置の中に動物細胞と培地とを置くプロセスであって、該動物細胞は、０．３ｃｍの高さの培地で静置細胞培養方法を使用して従来の組織培養フラスコの中で該動物細胞を培養することによって達成可能な最高細胞濃度を上回る濃度で培地中に存在する
、該プロセスにより、細胞に形質導入するのに必要な遺伝子改変媒体の量を低減するための方法が開示されている。この高い濃度において、基準点（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｉｎｔ）が該細胞の初期生存率であるとして、該装置の中に遺伝子改変媒体が加えられ、細胞生存率が初期生存率の所与の割合未満よりも低下しないような期間が、その遺伝子改変媒体が該細胞に形質導入するために与えられる。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、気体透過性材料から構成されている細胞増殖表面を有する装置の中に培地と動物細胞とを置き、ここで、該動物細胞は、０．３ｃｍの高さの培地で静置細胞培養方法を使用してフラスコの中で該細胞を培養することによって達成可能な最高細胞濃度を上回る濃度で培地中にあり、それによって、該動物細胞に形質導入する遺伝子改変媒体の使用を低減するための方法が開示されている。この高い細胞濃度において、基準点が該培地の初期グルコース濃度であるとして、該装置の中に遺伝子改変媒体が加えられるとともに、初期グルコース濃度の指定される割合又は最低グルコース濃度未満にまで該培地のグルコース濃度が減少させられないような期間が、その遺伝子改変媒体が該細胞に形質導入するために与えられる。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、気体透過性且つ液体不透過性である材料から構成されている増殖表面を有する装置の中に、培地と、動物細胞と、遺伝子改変媒体とを加えることであって、ここで、該細胞は１ミリリットルの培地あたり３百万〜２０百万細胞の濃度であり、該培地は気体透過性且つ液体不透過性である該材料と接触する、ことと、その後、該細胞の少なくとも一部に形質導入するように遺伝子改変媒体が機能する期間を与えることと、により細胞に形質導入するための方法が開示されている。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、気体透過性の細胞培養装置内の１ミリリットルの培地あたりの細胞の濃度を増加させることであって、該装置は第１の細胞濃度で細胞を含み、培地は第１の培地高であり、且つ該培地は第１の培地量であって、第１の細胞濃度は細胞の量を第１の培地量で割ったものであり、第１の培地高は、細胞増殖表面が水平位置にあるときの該培地の最高位から該培地の最低位までの距離によって定義されている、ことと、該装置から第１の培地量の一部を除去して該装置の中に第２の培地量を残し、それによって、第１の培地量の一部の除去の後に該細胞が第２の細胞濃度であることであって、ここで、第２の細胞濃度は第１の細胞濃度よりも高く、培地は、細胞増殖表面が水平位置にあるときの該培地の最高位から該培地の最低位までの距離によって定義されている第２の培地高である、ことと、装置の中に遺伝子改変媒体を加えることと、ある期間を与えられることにより該細胞の少なくとも一部に形質導入するように遺伝子改変媒体が機能することと、によって細胞に形質導入するための方法が開示されている。続く工程は、形質導入細胞の集団サイズを拡大するために実行されることができ、該工程では、ある量の培地を該装置の中に加えることと、該細胞の少なくとも一部が細胞増殖表面上に存在しており、該細胞増殖表面が水平位置に向けられており、且つ、細胞培養に好適な周囲の気体が気体透過性且つ液体不透過性である該材料と接触するような位置に、その装置が向けられているときに、該培地で細胞が培養されるための期間を与えることとによって実行され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、より大きな集団から細胞の亜集団を単離する方法が開示されている。その方法では、細胞の集団と培地とコーティングされている磁気ビーズとが気体透過性且つ液体不透過性である材料を備える装置の中に加えられ、細胞の集団が磁気ビーズに付着するための期間が与えられ、装置の中のビーズは磁場に対して暴露され、また、磁場により磁気ビーズが装置の中に留まる一方で培地と細胞の集合とが除去され、それによって、該細胞のより大きな集団から該細胞の該亜集団が分離される。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、より大きな集団から細胞の亜集団を単離する方法が開示されている。その方法では、細胞の集団と培地とコーティングされている磁気ビーズとが気
体透過性且つ液体不透過性である材料を備える装置の中に加えられ、細胞の集団が磁気ビーズに付着するための期間が与えられ、装置の中のビーズは磁場に対して暴露され、また、磁場により磁気ビーズが装置の中に留まる一方で該培地と該細胞の集合とが除去され、それによって、該細胞のより大きな集団から該細胞の該亜集団が分離される。該装置の中の該細胞は、その後、本明細書に記載の任意の方法を使用して形質導入される。
【００１８】
動物細胞の遺伝子改変に有利な本発明の一実施形態は、図１及び図１Ａに示される従来のプロセスを、図２、図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示される新規のプロセスと比較することによって最も理解される。図１は、気体透過性でない細胞増殖表面２０を有する、フラスコなどの従来の静置細胞培養装置１０の断面図を示す。この例では、培地３０は１００ｃｍ２の細胞増殖表面上に０．３ｃｍの典型的な高さで存在する。したがって、３０ｍｌの培地が１００ｃｍ２の細胞増殖表面上に存在し、０．３ｍｌ／ｃｍ２の培地対細胞増殖表面積の比をもたらす。従来知識にしたがい、細胞４０（丸として示す）は、１ｍｌあたり２百万細胞以下の典型的な濃度で存在し、したがって、最大で６０百万個の細胞が装置の中に存在する（すなわち、１ｍｌあたり２百万細胞に培地の３０ｍｌを掛ける）。装置の１００ｃｍ２の細胞増殖表面積において、細胞は、したがって、該細胞が細胞増殖表面に向かって重力によって沈下すると、０．６百万細胞／ｃｍ２の表面密度で存在する（すなわち、６０百万個の細胞を表面積の１００ｃｍ２で割る）。図２は、気体透過性の装置１００（例えば、ウィルソン‘８１４、ベラ‘７００、ベラ‘７６８、ウィルソン‘８４８、ウェルチ‘７０２に記載のもの、及び市販のＧ−Ｒｅｘ（登録商標）装置）の断面図を示しており、それらの装置は、従来の装置を十分に越える高さで培地が存在することを支持し又は可能としあるいはその両方であり、且つ、従来の培養装置よりもより高い表面密度で細胞が存在することを可能にする。この例では、細胞４０（丸として示す）は、静置培養の状態であり、気体透過性且つ液体不透過性である細胞増殖表面１６０から構成された装置の底に重力によって沈下している。培地１３０は、１００ｃｍ２の細胞増殖表面積を有する気体透過性且つ液体不透過性である細胞増殖表面１６０上に１０ｃｍの高さで存在し、１０００ｍｌの培地量と１０ｍｌ／ｃｍ２の培地量対細胞増殖表面積の比とをもたらす。１ｍｌあたり２百万細胞の細胞濃度で、２十億個の細胞が装置の中に存在する。該細胞は、濃度が１ミリリットルあたり２百万細胞と同等であるにもかかわらず、図１の従来のフラスコにおける表面密度の３３倍（すなわち、２０百万細胞／ｃｍ２を０．６百万細胞／ｃｍ２で割る）を超える２０百万細胞／ｃｍ２の表面密度で存在する。
【００１９】
続く記載では、図２の気体透過性の装置において、どのようにして遺伝子改変媒体と細胞との間の距離を低減して形質導入効率を上げることができるかを示す。図１Ａは、プラス・マーク（＋）により示される遺伝子改変媒体５０が培地に加えられた後の、図１の従来のフラスコ装置の断面図を示す。この例において、遺伝子改変媒体の量と細胞の量との比は１対１である。この比が、この例示の実施形態において示される１対１の比のみではなく、任意の所望の比であってよいことを、当業者は理解するだろう。該遺伝子改変媒体の比重は、細胞の比重よりも低く、該遺伝子改変媒体が細胞の如く装置の底に沈下することが妨げられるような比重である。図２Ａは、培地がその第１の高さ（１０ｃｍ）から第２の高さ（１ｃｍ）に低減され、それによって細胞濃度をその第１の細胞濃度（１ｍｌあたり２百万）から第２の細胞濃度（１ｍｌあたり２０百万）まで増加させた後の、図２の気体透過性の装置の断面図を示す。つまり、細胞濃度は１０倍（すなわち、１ｍｌあたり２百万から１ｍｌあたり２０百万）に増加させられた。重要なことに、これは従来の装置の１ｍｌあたり２百万の濃度よりも１０倍高い。図２Ｂは、プラス・マーク（＋）として示される遺伝子改変媒体１５０が培地に加えられた後の、図２Ａの気体透過性の装置を示す。この例では、遺伝子改変媒体の量と細胞の量との比は１対１である。この例では、１ミリリットルあたりの細胞は、図２の気体透過性の装置においては図１の従来のフラスコ装置における１０倍に濃縮されているので、その気体透過性の装置における任意の所与の遺伝子改変媒体と任意の所与の細胞との間の距離を従来のフラスコ装置に対して低下させ
る能力は、培地高の低減に伴う細胞濃度の増加に比例している。つまり、培地高が低下するにつれて、遺伝子改変媒体と細胞との間における距離が低下する。したがって、任意の所与の遺伝子改変媒体について、ブラウン運動によって細胞と接触する可能性がより高い。接触の頻度が増加することによって、任意の所与の遺伝子形質導入媒体の細胞形質導入の確率が増加する。
【００２０】
形質導入効率をさらに向上させるためには、培地の静置状態と細胞を装置の底に動かすように該細胞に作用する重力との結果である該細胞の静置位置から該細胞を動かすことが有利である場合がある。図２Ｃは、培地を静置状態から装置内における強制的な運動の非静置状態へと動かすことによって成し遂げられる、培地の全体に分布している状態にある細胞を示す。これは、例えば、装置を振る又は回すなど手で装置を動かす程度に簡単であってもよいが、好適には、一貫性のため、任意の数のより制御される機構の使用（オービタルシェイカー、シェーカープレート、又は培地を振動させるか、混合するか、撹拌する任意の機構若しくは方法の使用を含む）によって装置又は培地に動きを与えることによって行われてもよい。つまり、培地を細胞が装置の底に向かって沈下することを可能にする静置状態の反対である強制的な運動の状態に置くことにより、細胞は底から培地の全体に分布している状態へと動かされる。培地の全体に分布している状態では、細胞は、遺伝子改変媒体と接触する可能性がより一層高い。
【００２１】
気体透過性の装置では、細胞が、増加された濃度で培地にあるとともに遺伝子改変媒体の存在下にある期間の後、その細胞集団を、形質導入の状態から細胞培養の状態へと移すことができる。したがって、培地はより高い高さへと戻すことができ、又は、細胞は遺伝子改変媒体を洗浄されるとともに、集団拡大のために１つ以上の気体透過性の装置内に再懸濁させることができる。
【００２２】
従来の形質導入の方法に対する本発明の形質導入方法の利点は多い。細胞と遺伝子改変媒体との間の距離の低減によって、任意の所与の時間の間、接触の確率が増加する。接触が増加した状態では、遺伝的に作り変えられる細胞の比率の増加が可能である。また、従来のプロセスと比較して等しい比率の遺伝的に作り変えられた細胞の集団を得るために、より少ない量の遺伝子改変媒体しか使用しないでよい。さらに、細胞の形質導入プロセスが行われる期間を低減することができる。培地がその第１の高さから第２の高さまで低減されるときに装置が取り扱われて動かされる場合のような装置の移動時に細胞が撹拌されないことを確実にすべく、好適には、気体透過性の装置の壁が剛直であることを、当業者は理解するだろう。そのように装置を動かすことで、細胞増殖表面上の静置位置から培地中に細胞が移動し、それによって、培地高を低減する最中に細胞が失われる虞がある。つまり、細胞は、培地が除去されるとき、装置の表面上の静置位置にあるのが好適である。細胞培養バッグは剛直ではなく、バッグが取り扱われるときに細胞がバッグの壁上の静置状態から培地内の分布の状態へと動かされることから、気体透過性の装置は従来の細胞培養バッグでないことが好適である。
【００２３】
気体透過性の装置の中の細胞を高い濃度で持続可能な期間は、細胞代謝に依存している。Ｔ細胞の培養実験において得られる知見に基づくと、細胞が細胞増殖表面上に静置されている際に培地高（すなわち、量）を低減することによって細胞濃度が１ｍｌあたり４百万細胞まで増加させられるとき、遺伝子改変プロセスの完了前の時間の期間は、好適には２４時間以内である。言い換えると、培地高は、好適には、該培地高がその第１の高さからその第２の高さへと低減された後、４８時間を超える期間の間は、低下状態にはない。細胞が細胞増殖表面上に静置されている際に培地高（すなわち、量）を低減することによって細胞濃度が１ｍｌあたり４百万細胞を超えて１ｍｌあたり８百万まで増加させられるとき、遺伝子改変プロセスの完了前の時間の期間は、好適には２４時間を超えない。細胞が細胞増殖表面上に静置されている際に培地高（すなわち、量）を低減することによって
細胞濃度が１ｍｌあたり８百万細胞を超えて１ｍｌあたり１６百万まで増加させられるとき、遺伝子改変プロセスの完了前の時間の期間は、好適には１２時間以下である。細胞が細胞増殖表面上に静置されている際に培地高（すなわち、量）を低減することによって細胞濃度が１ｍｌあたり１６百万細胞を超えて１ｍｌあたり３２百万まで増加させられるとき、遺伝子改変プロセスの完了前の時間の期間は、好適には６時間以下である。
【００２４】
前述の例は、気体透過性且つ液体不透過性である材料から細胞増殖表面が構成されている気体透過性の装置において、細胞に対する遺伝子改変媒体の量の比が従来の気体透過性でない静置装置の比と同じである場合に、細胞濃度を一時的に増加させることによって、どのように効率が向上させられ得るかを示している。また、この方法を、従来の装置が可能にするのと同じ形質導入効率を得るために必要な遺伝子改変媒体の数を低減するために使用することも可能である。この場合、形質導入効率は、遺伝子改変される細胞集団の割合を指す。実際例えば、気体透過性でないフラスコなどの従来の静置細胞培養装置において得られるのと同じ形質導入効率を得るべく、気体透過性の装置内の遺伝子改変媒体対細胞の比を、従来の装置に要求される比に対して反比例して低減させ得る。例えば、ウイルスベクターなどの感染因子が遺伝子改変媒体である場合、感染因子対感染標的の比（また、一般に感染多重度（すなわち、ＭＯＩ）とも称される）は、Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）などの気体透過性の静置装置、又は引用される関連出願において記載される任意の気体透過性の装置における細胞濃度に対する、フラスコなどの従来の静置装置における細胞濃度の比に基づいて、低減され得る。例えば、気体透過性の装置における細胞がフラスコの濃度の１０倍である図１から図２Ｃに関連した前述の記載では、遺伝子改変媒体がウイルスベクターである場合、レンチウイルスなどのウイルスベクター数を低減し得る。これは、このプロセスのコストを低減することにおいて有用であり得る。例えば、フラスコにおけるＭＯＩが５である場合、気体透過性の装置におけるＭＯＩは５未満であり得るとともに、形質導入効率が減少しない可能性がある。
【００２５】
本発明を適用するにあたり、細胞を高い表面密度（すなわち、細胞／ｃｍ２）まで培養した後、細胞濃度を増加させるために培地高を低減する、第１の工程を実行する必要はない。単に、細胞と培地とを、その細胞濃度が、フラスコなどの従来の培養装置及びフラスコが依存する形質導入プロセスの細胞濃度を上回るような態様で、気体透過性材料から構成されている細胞増殖表面を有する装置の中に移せばよい。好適には、細胞濃度は２百万細胞／ｍｌ超（３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０、又はそれ以上を含む）である。その濃度は５などの丁度の整数である必要はなく、好適には２百万細胞／ｍｌより高い濃度範囲の任意の数であってよいことを、当業者は理解するだろう。好適には、細胞濃度は２百万細胞／ｍｌを超えて３０百万細胞／ｍｌを超えず、より好適には、３百万細胞／ｍｌを超えて２０百万細胞／ｍｌまでであり、より一層好適には、４百万細胞／ｍｌを超えて２０百万細胞／ｍｌまでであり、また最も好適には、５百万細胞／ｍｌを超えて２百万細胞／ｍｌまでである。しかしながら、範囲は限定されず、例えば、１０百万細胞／ｍｌ〜２０百万細胞／ｍｌの範囲も本発明の範囲内であることを、当業者は理解する。目的は、細胞培養装置内で実行される従来の形質導入方法と比較して培地１ミリリットルあたりの細胞標的の数を増加させ、それによって、任意の所与の細胞と任意の所与の形質導入媒体との間の距離を低下させることである。
【００２６】
重要な点は、培地の上側の表面にある気体−培地界面以外の表面を介して細胞が酸素を得ることを可能にすることである。好適には、細胞は、細胞が存在する表面を介して酸素を得る。気体透過性且つ液体不透過性である細胞増殖表面上に細胞が存在する状態において、周囲の気体は、その気体透過性の表面の反対側と接触する。周囲の気体は、その気体透過性材料と受動的に接触するだけでよい。つまり、細胞が酸素運搬をもっぱら気体−培地界面に依存していない場合に有利である。このように、細胞は、気体透過性の表面が存
在する場合、該細胞が気体−液体界面からどのくらい遠いかには無関係に酸素を得る。また、１つの壁（好適には、細胞が接触する壁）が気体透過性である限り、気体−液体界面が完全に排除される装置及びプロセスを構成することも、有利であり得る。
【００２７】
本発明において形質導入プロセスが生じ得る期間は細胞濃度によって制限され、それによって、細胞濃度の増加に比例して培地に代謝需要が課される。１つの例として、Ｔ細胞は、Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）気体透過性装置の中で、１１ｃｍの培地高（１１ｍｌ／ｃｍ２の培地量対表面積の比）において、およそ５００，０００細胞／ｃｍ２の開始濃度で培養され、該培地は、細胞がおよそ１ｍｌあたり３百万のピーク濃度に達するまで、供給なしで１１日間までの期間の間、集団サイズを拡大することができた。その時点において、生存率は、追加の２日までの間におよそ３〜５％を超えて減少することはなかった。したがって、細胞の集団が増加するとき、長い期間にわたって細胞が培地から栄養素を消費したことを、当業者は理解するだろう。したがって、細胞は、１ｍｌあたり３百万を十分に超える非常に高い濃度で１日以上、生存率を実質的に損なうことなく培地中に存在することが期待できる。多くの形質導入手順は１日以内に、また、多くは数時間以内に完了することができることから、１）従来の静置培養方法と静置細胞培養装置（例えば、フラスコの装置）とを使用して、又は２）気体透過性の静置細胞培養装置（例えば、ウィルソン‘８１４、ウィルソン‘８４８、ウィルソン‘７００、ベラ‘７６８、ウェルチ‘７０２、及び／又はＧ−Ｒｅｘ（登録商標）（商標）の装置）による高い表面密度の静置細胞培養方法を使用して達成可能な細胞濃度を上回る細胞濃度の細胞の集団に形質導入する見込みがある。２４時間以内にプロセスを完了することが望ましい形質導入プロセスのために、適切な細胞濃度を決定するとともに形質導入する方法の一例を後述する。このようなプロセスは、以下より構成され得る：
工程Ａ。フラスコの細胞濃度を上回り、好適には、およそ１ｍｌあたり２百万を超える（例えば、前述の１ｍｌあたり３百万、１ｍｌあたり４百万、１ｍｌあたり５百万、１ｍｌあたり６百万、その他を含む）細胞濃度で細胞を存在させる。グルコースの減少を測定して、該グルコースがおよそ５０ｍｇ／ｄｌより多い（より好適には８０ｍｇ／ｄｌ以上である、また、最も好適には１００ｍｇ／ｄｌ以上である）ままとなるまでの期間の長さを決定する。これに代えて、その細胞集団の初期生存率を測定して、ある割合で（好適には２０％以下、より好適には１０％以下、より一層好適には５％以下、また、最も好適には、全くない）初期生存率が減少するまでの期間の長さを決定してもよい。したがって、２４時間以内の期間にわたる好適なグルコース及び／又は生存率の条件に順応する、形質導入プロセスの開始時の細胞濃度を選択することが好ましい。好ましい状態では、形質導入期間全体においてグルコースの好ましい減少及び／又は生存率の好ましい値が維持されている限り、任意の開始細胞濃度が許容可能であることを、当業者は理解するだろう。したがって、開始細胞濃度と期間との間においてトレードオフがある。
【００２８】
工程Ｂ。細胞が存在している培地に遺伝子改変媒体を加える。細胞の量に対する遺伝子改変媒体量の比は、従来の細胞濃度の限界値（例えば、フラスコ及び他の気体透過性でない静置培養装置とプロセスとを代表する限界値である１ｍｌあたり２百万細胞）内で行われる形質導入と比較して形質導入効率を向上させることが分かっている任意の比であってよい。好適には、該比は１以上、より好適には１〜５、また、最も好適には１〜２である。細胞濃度を上昇させて１の比を提供することにより、従来の細胞濃度である時よりも細胞と遺伝子改変媒体とが互いに近づくことから、形質導入される細胞の割合の増加が期待される。遺伝子改変媒体のコスト又は入手可能性が重要である場合、従来の方法と比較して高い細胞濃度と結果として生じる細胞及び遺伝子改変媒体の間のより近い距離とにより、１の比における従来の方法の割合と同様の割合の細胞が形質導入される期待を有して、該比を１未満まで低減することができる。目的が形質導入される細胞の数を増加させることであっても、又は遺伝子改変媒体の使用を低減することであっても、該プロセスにおいて遺伝子改変媒体と細胞との強制的な混合を要求する必要はない。しかし、これによって
遺伝子改変媒体の使用が最小化されるか、形質導入される細胞の数が増加する場合は、該強制的な混合を行ってよい。
【００２９】
気体透過性の装置の主要な利点は、細胞が装置の壁（好適には、細胞が存在する細胞増殖表面）を通じて移動する酸素へのアクセスを得つつ、従来とは異なる培地高で培地が存在することを可能にする能力である。好適には、細胞は、周囲の気体に接触している気体透過性且つ液体不透過性である細胞増殖表面に向かって沈下している。気体透過性材料を使用する場合、液体不透過性の非多孔質シリコンが、その高い酸素透過容量によって好まれる。ウィルソン‘８１４、ベラ‘７００、ベラ‘７６８、ベラ‘７００、及び／又はウィルソン‘８４８の装置と方法とを使用して、細胞集団を小さい量から大きい量へ増大することができる。その後、ベラ‘７００及び／又はウェルチ‘７０２の方法と装置とを使用して細胞を濃縮することができる。しかし、ベラ‘７００の方法（装置内において１ミリリットルの培地あたり２百万細胞超の従来とは異なる高い濃度に細胞を置くべく、培地の除去後直ちに装置から細胞が除去される）とは異なり、形質導入の次の工程が生じている間、細胞は装置内に留まってよく、また、装置は形質導入装置として機能することもできる。これに代えて、細胞は、該細胞が存在した任意の装置から移されて気体透過性の装置の中に加えられてもよく、それによって、高い細胞濃度で形質導入の工程が生じることができる。主要な利点は、高い細胞濃度（好適には、前述の範囲内の）を生成する能力である。
【００３０】
形質導入効率を向上させるプロセスは、以下を含む任意の数の工程によって実施されることができることを、当業者は理解するだろう：
ａ）気体透過性且つ液体不透過性である増殖表面を有する装置に動物細胞を加える工程、
ｂ）第１の培地の高さのもと、第１の細胞濃度において、細胞が増殖表面に向かって沈下することを可能にする工程、
ｃ）任意選択で、第２の細胞濃度に細胞の量が拡大することを可能にする工程
ｄ）第１の高さから、より低い第２の高さへ培地を低減し、それによって、第１の細胞濃度及び第２の細胞濃度を上回る第３の細胞濃度を生成する工程、
ｄ）ある量の遺伝子改変媒体を加える（好適には、前述した細胞量に対する比の何れかで）工程、
ｅ）トランスフェクションのための期間（好適には、細胞生存率及び／又はグルコース濃度が好ましい限界値内に留まる）を与える工程、
ｆ）培地の高さを新規のレベルへ上昇させるべく、追加の培地を加える工程、
ｇ）形質導入された細胞集団の量を拡大させるべく、細胞を培養する工程。
【００３１】
細胞を培養する必要はないことを、当業者は理解するだろう。例えば、形質導入効率を向上させるプロセスは、以下のように単純であってよい：
ａ）気体透過性且つ液体不透過性である増殖表面を有する装置に動物細胞と培地とを加える工程、
ｂ）第１の培地の高さのもと、静置組織培養フラスコにおいて該動物細胞を培養する場合に可能な細胞濃度を上回る第１の細胞濃度において、又は任意選択で、予め認定された好ましい範囲内において単に選択した細胞濃度において、該細胞が増殖表面に向かって沈下することを可能にする工程、
ｃ）ある量の遺伝子改変媒体を加える（好適には、細胞量に対する前述の比のうちの何れかで）工程、
ｄ）トランスフェクションのための期間（好適には、細胞生存率及び／又はグルコース濃度が好ましい限界値内に留まる）を与える工程。
【００３２】
Ｔ細胞の培養及び／又はＴ細胞形質導入プロセスにおける一般的な工程は、コーティン
グされている磁気ビーズを使用して、細胞のより大きな混合集団から細胞の標的亜集団を選択することである。コーティングは、典型的には、その細胞に結合する抗体である。細胞の標的亜集団がビーズに付着するための期間を与えた後に、全体の細胞集団と培地が磁場を流れ過ぎることによって、ビーズがその磁場により捕捉され、そのビーズに付着している該細胞の亜集団は、それによって、該混合集団から単離される。静置装置の中でそのプロセスを行うことを選び、フローシステムを使用して該亜集団を単離する必要を排除できる場合には、プロセスが大幅に簡略化され得る。該静置装置が、コーティングされているビーズによって標的とされる亜集団に従来の方法よりも効率的な手段で形質導入することが可能であった場合には、さらに大幅なプロセスの簡略化が生じ得る。
【００３３】
細胞の混合集団と、培地と、コーティングされているビーズとが加えられる気体透過性の装置（前述の任意の方法により構成されており、引用される関連出願のうちの何れにおけるものを含む）を使用することによって、改良されたプロセスが達成される。ビーズと細胞とは静置培養方法によって気体透過性材料に向かって沈下することができ、また、接触を増加させる意図でビーズと細胞とが動くように強制することを選ぶ場合には、細胞とビーズとの接触を増加させるために、培地を混合する従来の方法によって（例えば、装置を振る又は撹拌することによって）装置の中の培地を非静置状態に置くことができる。何れの場合にも、細胞とビーズとが互いに付着する所与の期間の後、ビーズは、装置内にビーズを捕捉する磁場に対して暴露される。その後、培地とビーズに付着していない細胞とが除去されて、細胞の所望の亜集団が装置内に残る。
【００３４】
細胞の該亜集団が正の選択（すなわち、ビーズに付着する細胞が所望の亜集団である）の１つである場合、該亜集団は、その後、前述の方法のうちの何れかによって形質導入され得る。細胞の該亜集団が負の選択（すなわち、ビーズに付着する細胞が所望の亜集団ではない）の１つである場合、除去される集団（すなわち、ビーズに付着していない集団）が前述の方法のうちの何れかによって形質導入され得る。負の選択であって形質導入に同じ装置が使用される場合、ビーズに付着していない集団の除去後に、その磁場が終結され、ビーズが装置から除去され、またビーズに付着していなかった細胞の該集団が装置に戻されることができ、それによって、該集団は前述の方法のうちの何れかによって形質導入されることができる。該細胞を培養する追加の工程は、引用される関連出願を含む本発明の記載される方法のうちの何れかを使用することで行われてよく、所望の場合には、該細胞からビーズを任意選択で分離することが後に続く。
【００３５】
好ましい実施形態では、ビーズは、幹性Ｔ細胞に結合する抗体（例えば、ＣＤ４５ＲＡ、Ｃ６２Ｌ、及びＣＣＲ７）によってコーティングされる。別の好ましい実施形態では、ビーズは、制御性Ｔ細胞に結合する抗体（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５  ブライト、及びＣＤ１２７  ロウ）によってコーティングされる。好適には、細胞の混合集団は白血球の集団である。
【００３６】
好ましい実施形態では、磁場は、気体透過性の細胞増殖表面に接触する気体透過性材料支持部に接触している磁石によって生成される。好適には、磁石の表面は、気体透過性の細胞増殖表面に対して平行である。より好適には、磁石の表面は、気体透過性の細胞増殖表面に対して平行であって１．２７ｃｍ（０．５インチ）以内であり、より一層好適には０．７６２ｃｍ（０．３インチ）以内、また最も好適には０．５０８ｃｍ（０．２インチ）以内である。
【００３７】
用語、形質導入は、本明細書で使用されるように限定しておらず、細胞に接触している遺伝子改変媒体に依存する細胞の遺伝子改変の任意の形態を含むように広く定義される。好適には、気体透過性の装置は、透析膜などの半透膜によって区画化されていない。つまり、装置は、好適には、半透膜によって少なくとも一部が隣接された区画であって、細胞
の存在する分離区画を有さない。好適には、装置の底は、培地高の低減時、及び／又は動物細胞の培養時において、平坦及び水平な状態にある気体透過性の細胞増殖表面から構成されている。好適には、気体透過性材料は、細胞培養プロセス及び／又は形質導入プロセスの間中、培地と接触している。好適には、気体透過性材料は、周囲の気体と気体透過性材料支持部（例えば、ウィルソン‘８１４の段落［０１３６］に記載のもの）とに接触している。
【００３８】
また、培地高はウィルソン‘８１４（例えば、例１及びテーブル１）において記載される従来の知識よりもはるかに大きい高さであってよいことを、当業者は理解するだろう。また、ウィルソン‘８１４の例１及びテーブル１では、培地高が従来の知識（２．０ｃｍ）を超える任意の高さであってよいことが示され、例１及びテーブル１にしたがって培地が増加されるにつれて利点が生じ続けることから、その任意の高さは３．０２ｃｍ、５．０９ｃｍ、１０．２０ｃｍ、１５．３１ｃｍ、及び２０．３９ｃｍの高さのみではなく、例えば２．５ｃｍ、３．０３ｃｍ、４．０ｃｍ、及び１５．３２ｃｍなどの任意の中間の高さの高さを含むことを、当業者は理解するだろう。高い培地高の利益は、ベラ‘７００において（例９、例１１に記載されるように）、及びベラ‘７００の多くの他の例においてさらに記載される。ベラ‘７００から、例えば、１０ｃｍの培地高と１００，０００細胞／ｍｌの細胞濃度とを有して１，０００，０００細胞／ｃｍ２の細胞表面密度から細胞を拡大させることが効率的なプロセスであることを確認することができる。患者間の拡大速度のばらつきが大きく、拡大開始のために細胞同士の連絡が十分に密であることを確実にすることを助けるべく表面密度を従来の方法よりも高くする要望がある場合、１０ｃｍの培地高と３００，０００細胞／ｍｌの細胞濃度とを有して３，０００，０００細胞／ｃｍ２の細胞表面密度から細胞を拡大させることは、よい選択である場合がある。しかし、低い細胞表面密度も有益であることが、ベラ‘７００において示されている。
【００３９】
また、本発明は範囲を識別し、該範囲内の数が含まれることを、当業者は理解する。このことは、また、引用される関連出願（特に、ウィルソン‘８１４及びベラ‘７００）にも適用される。さらに、ベラ‘７００において、細胞培養実験は何れもフィブロネクチン、そのフラグメント、又はそれらの混合物に依存しないことを、当業者は知るだろう。
【００４０】
また、ベラ‘７００に記載されるように、従来とは異なる低い細胞表面密度の任意の数から従来とは異なる高い細胞表面密度の任意の数に細胞を拡大させることによって利益が得られることを、当業者は理解する。例えば、ベラ‘７００では、例１４におけるＣＡＲ
Ｔの拡大を含む、多くの例が記載され、ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団に形質導入及び拡大を行うときに本発明において有益となり得る。
【００４１】
また、ベラ‘７００に記載の培地高を低減する方法（例えば、ベラ‘７００の図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、及び図２２Ｃと、関連する文章とを含むもの）は、本発明において培地高を低減することに対して有益であり得ることを、当業者は理解するだろう。
【００４２】
本明細書に記載の発明の精神から逸脱することなく本開示の内容に変更を加えることができることを、当業者は理解する。したがって、記載の実施形態及び例に本発明の範囲を限定することを意図しない。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によって解釈されるものである。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【国際調査報告】
2016530895.tif 000009
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