(57)【要約】  本発明は、細胞への形質導入後のエンドソーム内閉じ込めを克服するのに遺伝子操作された、遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる人工転写因子に関する。そのような人工転写因子は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位に融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる。特に、これらの形質導入可能な人工転写因子は、膜結合型受容体タンパク質、核内受容体タンパク質、またはハプロ不全遺伝子の産物によって引き起こされる疾患または調節される疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化または抑制タンパク質ドメイン、核局在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位に融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる、人工転写因子。
【請求項２】
前記遺伝子プロモーターが受容体遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項３】
前記遺伝子プロモーターが核内受容体遺伝子のプロモーターである、請求項１または２に記載の人工転写因子。
【請求項４】
前記遺伝子プロモーターがハプロ不全遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項５】
前記エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位がカテプシン切断部位である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項６】
前記エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位がカテプシンＢ切断部位である、請求項５に記載の人工転写因子。
【請求項７】
前記エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位が配列番号２８のカテプシンＢ切断部位である、請求項６に記載の人工転写因子。
【請求項８】
配列番号６４〜８９、１４４〜１４７、１５６〜１６１、１７４〜１７７、１８８、１９１〜１９３、２００〜２０５、２１８〜２２０、および２２７〜２４４からなる群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含んでなる、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項９】
配列番号６４〜８９、１４４〜１４７、１５６〜１６１、１７４〜１７７、１８８、１９１〜１９３、２００〜２０５、２１８〜２２０、および２２７〜２４４からなる群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含んでなる請求項１に記載の人工転写因子であって、最大で３個の個々のジンクフィンガーモジュールが代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールと交換された、および／または、最大で１２個の個々のアミノ酸が交換された、人工転写因子。
【請求項１０】
前記活性化または抑制タンパク質ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ２−５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、ＬＫＬＦ、Ｎ−ＫＲＡＢ、Ｃ−ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、およびＥＲＤからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１１】
前記核局在化配列が、リジン残基、それに続くリジン若しくはアルギニン残基、それに続く１つのアミノ酸、それに続くリジン若しくはアルギニン残基を含む塩基性アミノ酸のクラスター、または配列番号３７のＳＶ４０  ＮＬＳである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１２】
前記タンパク質形質導入ドメインが、配列番号２０のＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、配列番号２１のｍＴ０２、配列番号２２のｍＴ０３、配列番号２３のＲ９、および配列番号２４のＡＮＴＰからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１３】
エンドソームプロテアーゼ感受性リンカーを通して配列番号２５〜２７の膜融合性ペプチドに連結された、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１４】
ポリエチレングリコール残基をさらに含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１５】
遺伝子プロモーターからの発現を増加または減少することに用いるための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工転写因子を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項の人工転写因子の作製に用いる、配列番号２８９〜３１９の発現コンストラクトを含有する、大腸菌宿主細菌。
【請求項１８】
遺伝子発現の調節が治療に有益である疾患を治療することに用いるための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１９】
治療上有効な量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、遺伝子発現の調節が治療に有益である疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞への形質導入後のエンドソーム内閉じ込めを克服するように遺伝子操作された遺伝子プロモーターおよびタンパク質形質導入ドメインを特異的に標的にするポリダクチルジンクフィンガータンパク質（複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質）（polyductyl zinc finger protein）を含んでなる人工転写因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工転写因子は遺伝子発現を調節する有用なツールであることが提案されている（Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526）。天然の転写因子の多くは、遺伝子の転写を抑制または活性化することを通して遺伝子発現に影響を及ぼすが、ある特定のＤＮＡ配列を認識する複合体特異的ドメインをもつ。このため、転写因子の特異性および標的遺伝子を改変しようとしても、転写因子は魅力ある操作対象ではない。しかし、転写因子のある特定の類は数個のいわゆるジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含み、そのジンクフィンガードメインは組み立てユニット的（modular）であるので遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、３つのＤＮＡ塩基対をほぼ非依存的に標的とする短い（３０アミノ酸）ＤＮＡ結合モチーフである。よって、数個のそのようなジンクフィンガーが融合されたものを含むタンパク質は、長いＤＮＡ配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）はヒトゲノム全体でただ一つだけと言ってもよい１８塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ標的を認識する。当初は全くコンテキストに依存しないと思われていたが、より詳細な解析からジンクフィンガーに関するいくらかのコンテキスト特異性が明らかになった（Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231）。ＺＦモジュールの結合特異性を変えるジンクフィンガー認識表面でのある特定のアミノ酸の変異は、大部分の５’−ＧＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＡＮＮ−３’、および幾つかの５’−ＴＮＮ−３’コドンの定義された（defined）ＺＦビルディングブロックをもたらした（例えば、いわゆるＢａｒｂａｓモジュール、Dreier B., Barbas C.F. 3rd et al., 2005, J Biol Chem 280, 35588-35597を参照されたい）。初期の人工転写因子の研究では、既知の３ｂｐ標的配列をもつ予め選択されたジンクフィンガーを組み合わせることに基づいた合理的な設計に注目が集まったが、ジンクフィンガーのある特定のコンテキスト特異性を認識するには、細菌若しくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、コンパートメント化（compartmentalized）リボソームディスプレイ、またはＦＡＣＳ分析を用いた生体内選択などの高度な方法を用いて調べられる大きなジンクフィンガーライブラリーの作製を必要とした。
【０００３】
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いて、ヒトゲノム内ＤＮＡ遺伝子座を高度に特異的に標的とすることができる。よって、これらのジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性をもつタンパク質ドメインを特異的なプロモーター配列に輸送して着目遺伝子の発現の調節をもたらすのに理想的なツールである。転写のサイレンシングに好適なドメインは、Ｎ末端としてのクルッペル関連ドメイン（ＫＲＡＢ）（配列番号１）またはＣ末端（配列番号２）ＫＲＡＢドメイン、Ｓｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ、配列番号３）、およびＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ、配列番号４）であり、一方で遺伝子転写の活性化は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６（配列番号５）またはＶＰ６４（ＶＰ１６の反復四量体、配列番号６）ドメインを通して達成される（Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）。転写活性を付与すると考えられるさらなるドメインは、ＣＪ７（配列番号７）、ｐ６５−ＴＡ１（配列番号８）、ＳＡＤ（配列番号９）、ＮＦ−１（配列番号１０）、ＡＰ−２（配列番号１１）、ＳＰ１−Ａ（配列番号１２）、ＳＰ１−Ｂ（配列番号１３）、Ｏｃｔ−１（配列番号１４）、Ｏｃｔ−２（配列番号１５）、Ｏｃｔ−２＿５ｘ（配列番号１６）、ＭＴＦ−１（配列番号１７）、ＢＴＥＢ−２（配列番号１８）、およびＬＫＬＦ（配列番号１９）である。くわえて、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１（http://amigo.geneontology.org/cgi bin/amigo/term_details?term=GO:0001071）によって定義されるタンパク質の転写活性のあるドメインは標的タンパク質の転写調節を達成すると考えられている。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質および調節ドメインを含んでなる融合タンパク質は人工転写因子と呼ばれる。
【０００４】
特異的な特徴は高度に保存されるため、低分子薬物は所与のタンパク質ファミリーのある特定のメンバータンパク質を常に選択的に標的とすることができるわけではない。一方、生物学的製剤は抗体ベースの新規薬物に示されるように高い特異性をもたらす。しかし、これまでの生物学的製剤は実質的にすべて細胞外に作用する。とりわけ、上記人工転写因子は、治療上有用であるように遺伝子転写に影響を及ぼすのに好適であろうと思われる。しかし、そのような因子の作用部位−核−への送達は容易には達成されず、よって、例えばレトロウイルス送達での中継よる治療的な人工転写因子の方法の有用性は免疫原性や細胞形質導入の可能性などのこの方法の欠点の全てで妨害される（Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082-9091）。
【０００５】
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は細胞膜をまたぐ細胞質基質／核質へのタンパク質移行を促進することが示された。ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド（配列番号２０）、ｍＴ０２（配列番号２１）、ｍＴ０３（配列番号２２）、Ｒ９（配列番号２３）、ＡＮＴＰ（配列番号２４）などの短いペプチドは積み荷タンパク質に融合したとき、細胞タイプに依存しないマクロピノサイトーシス（macropinocytotic）取り込みを誘導することが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。細胞質基質に達した際にそのような融合タンパク質は生体活性を有することが示された。興味深いことに、誤って折り畳まれたタンパク質でさえもタンパク質形質導入の後に機能的になることができ、これはおそらく細胞内シャペロンに作用による可能性が最も高い。しかし、治療用の積み荷（therapeutic cargo）を細胞に送達するためにタンパク質形質導入ドメインを使用することの大きな障害は、そのようなタンパク質が核などの他の細胞小器官局在するためにエンドソームコンパートメントから脱出することが制限されることである（Koren E and Torchilin V.P., 2012, Trends in Mol Med 18, 385-393）。タンパク質形質導入の後の積み荷タンパク質のエンドソーム脱出を増加させる必要性は長年認識されており、エンドソーム脱出を高める２つの主な方法が用いられている：まず最初に、ＨＡ２（配列番号２５）、ＫＡＬＡ（配列番号２６）、またはＧＡＬＡ（配列番号２７）などのいわゆる膜融合性ペプチドの共送達が細胞の細胞質基質へのタンパク質形質導入を増やすことが示された。いったんエンドソーム内に入ると、これらのペプチドはエンドソーム膜と相互作用でき、これらの小胞の破裂を導いてその内容物を遊離する。次に、エンドソームコンパートメントを壊すことが知られているクロロキンなどのリソソーム作用剤は積み荷タンパク質のエンドソームからの脱出を増やすことが示された。エンドソーム脱出を増やす他の方法は、融合性脂質およびＰＥＩなどの膜破壊性ポリマーに関係する（El Sayed A. et al., 2009, AAPS J 11, 13-22）。今までのところ、タンパク質形質導入後の積み荷タンパク質のエンドソーム脱出を増加させる方法は、エンドソーム膜を破壊可能な作用剤を必要とする。
【０００６】
既知の薬物標的の大部分は、多くの場合標的以外への少なからぬ作用を伴う低分子の薬物の作用によって刺激または阻止される受容体分子である。そのような受容体の例は、ヒスタミンＨ１受容体またはアルファ−およびベータ−アドレナリン受容体であり、一般に遺伝子オントロジーＧＯ：０００４８８８およびＧＯ：０００４９３０によって定義されるタンパク質である。
【０００７】
血管作動性のエンドセリン系はさまざまな疾患の発症に重要な役割を果たす。エンドセリンは一方では血液の供給の調節に係わり、他方では低酸素症によって誘発される次々と起きる事象において主要な役割を果たしている。エンドセリンは例えば血液脳関門または血液網膜関門の破壊および新血管形成に係わる。エンドセリンさらに神経変性、痛みの感覚の閾値の調節に関与し、口渇感にさえも係わる。エンドセリンは眼内圧の調節にも関与する。
【０００８】
エンドセリンの作用はその同族（cognate）受容体、通常は血管を囲む平滑筋細胞に位置する主にエンドセリン受容体Ａによって媒介される。エンドセリン系に−全身的または局所的に−影響を及ぼすことは、くも膜下出血または脳出血などの多くの疾患の治療にとって興味を引くことである。またエンドセリンは多発性硬化症の経過にも影響する。エンドセリンは、（肺）高血圧症に寄与し、動脈性低血圧症、心筋症、並びにレイノー症候群、異型狭心症、および他の心血管疾患にも寄与する。エンドセリンは糖尿病性腎症および糖尿病性網膜症に係わる。さらに眼では、エンドセリンは、緑内障性神経変性、網膜静脈閉塞症、巨細胞性動脈炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、中心性漿液性脈絡網膜症、レーバー病（Morbus Leber）、スザック症候群、眼球内出血、網膜神経膠症、およびある特定の病的状態において役割を果たす。
【０００９】
眼はバランスのとれた充分な灌流に強く依存してその高い酸素要求を満たす精巧な器官である。充分に安定した酸素要求量を供給し損なうことは虚血再灌流傷害を引き起こし、正常眼内圧または正常化された眼内圧にもかかわらず疾患が進行する緑内障患者で見られるようなグリアの活性化および神経傷害をもたらす。不充分な血液供給はまた低酸素症を導いて、糖尿病性網膜症の間または加齢黄斑変性で明らかなように、さらなる網膜損傷の可能性とともに制御の効かない（run-away）新血管新生を引き起こす。眼組織灌流は複雑な制御下にあり、血圧、眼内圧、および血管径を調節する局所的な因子に依存する。そのような局所的な因子は、例えば、言及されたエンドセリン、強い血管収縮活性をもつ短いペプチドである。エンドセリンの３つのアイソフォーム（ＥＴ−１、ＥＴ−２、およびＥＴ−３）は、血管壁に局在する内皮細胞によって分泌される前駆体分子からエンドセリン変換酵素によって産生される。成熟ＥＴに対する２つの同族受容体が知られ、ＥＴＲＡおよびＥＴＲＢである。ＥＴＲＡは血管壁を形成し、血管収縮を促進する平滑筋細胞に局在する一方で、ＥＴＲＢは主に内皮細胞に発現し、一酸化窒素の放出を促進することによって血管拡張的に作用して、よって平滑筋弛緩を引き起こす。ＥＴＲＡおよびＥＴＲＢは、Ｇタンパク質共役７回膜貫通型へリックス（ｈｅｌｉｘ）受容体の大きな類に属する。ＥＴのＥＴＲＡまたはＥＴＲＢへの結合はＧタンパク質活性化をもたらし、細胞内のカルシウム濃度の増加を起こし、それによって多様な細胞応答を引き起こす。
【００１０】
薬理学的にＥＴ系に影響を及ぼすことが、網膜静脈閉塞症、緑内障性神経変性、網膜色素変性症、巨細胞性動脈炎、中心性漿液性脈絡網膜症、多発性硬化症、視神経炎、関節リウマチ、スザック症候群、放射線網膜症、網膜神経膠症、線維筋痛、および糖尿病性網膜症の間などに、ＥＴレベルが上昇してＥＴが有害に作用する場合に有用なことが分かるかもしれない。この目的のために、ＥＴＲＡの下方制御が疾患の転帰を調節するのに役立つことになる。しかし、ある状況下では、ＥＴＲＡの上方制御、つまりＥＴに対する感度を上げることが、例えば、角膜の外傷または角膜潰瘍から回復する間の角膜の創傷治癒を促進するのに望ましいことがありうる。
【００１１】
ＥＴＲＢによって媒介されるシグナリングは、例えば、がん幹細胞維持および腫瘍増殖の間、病態生理学的過程につながっている。くわえて、ＥＴＲＢの上方制御は緑内障性神経変性に関連し、一方、ＥＴＲＢの阻害は緑内障において神経保護作用があることが示された。さらにＥＴＲＢは炎症の間に上方制御される。
【００１２】
リポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌細胞壁構成成分はさまざまな疾患の発症に重要な役割を果たす。体内のＬＰＳの存在は免疫系によって対処される必要がある細菌感染を示す。ＬＰＳはグラム陰性菌の一般的な構成成分であるので、ＬＰＳは免疫系を活性化しうるいわゆる危険シグナル（danger signal）を構成する。ＬＰＳは、細菌感染またはウイルス感染に関連するさまざまな危険シグナルまたは病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識に関与するＴｏｌｌ様受容体の大きなファミリーのメンバーであるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）によって認識される。ＬＰＳの危険シグナルとしての認識は自然免疫の重要な部分ある一方で、ＴＬＲ４受容体の過剰な刺激または長期の刺激は慢性炎症に関連する病態につながる。例としては、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、およびＨＩＶ−ＨＣＶ同時感染などの肝疾患がある。ＴＬＲ４シグナリングに関連する他の疾患は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、乾癬、クローン病、ブドウ膜炎、コンタクトレンズ関連角膜炎、および角膜炎である。くわえて、ＴＬＲ４によって媒介されるシグナリングはがんの進行および化学療法に対する抵抗性に関与する。
【００１３】
免疫グロブリンアイソタイプＥ（ＩｇＥ）は獲得免疫系の一部であり、それ自体感染症および腫瘍性形質転換に対する防御に関与する。ＩｇＥは顆粒細胞および好塩基球に局在する高親和性ＩｇＥ受容体（ＦＣＥＲ１）によって結合される。ＩｇＥのＦＣＥＲ１への結合は、アレルゲンと呼ばれる特異的な抗原を介するこれらの複合体の架橋結合が続き、顆粒細胞および好塩基球からのさまざまな因子の放出を導いてアレルギー反応を引き起こす。これらの因子には、ヒスタミン、ロイコトリエン、さまざまなサイトカイン、およびリゾチーム、トリプターゼ、またはβ−ヘキソサミニダーゼがある。これらの因子の放出は、アレルギー性鼻炎、ぜんそく、湿疹、およびアナフィラキシーなどのアレルギー疾患に関連する。
【００１４】
核内受容体はリガンド活性化転写因子のタンパク質スーパーファミリーである。他の大部分の細胞受容体と違って、それらは細胞質基質または核質に局在する可溶性タンパク質である。核内受容体のリガンドは親油性分子であり、それらには、ステロイドおよび甲状腺ホルモン、脂肪酸および胆汁酸、レチノイン酸、ビタミンＤ３、並びにプロスタグランジンがある（McEwan I.J., Methods in Molecular Biology: The Nuclear Receptor Superfamily, 505, 3-17）。リガンドが結合すると核内受容体は二量体化し、リガンド応答性遺伝子プロモーター内の特異的な転写因子特異的ＤＮＡ応答エレメントへの結合が起こり、遺伝子発現の活性化または抑制を引き起こす。核内受容体がステロイドなどの多くの広い範囲で作用するホルモンの活性および重要な代謝産物の活性を媒介することに関与することを考えれば、核内受容体の機能不全および機能障害は多くの疾患の自然経過に係わる。
【００１５】
核内受容体の活性を調節する作動剤または拮抗剤の使用が治療目的で採用されている。作動剤のデキサメタゾンなどのコルチコステロイドを使用したグルココルチコイド受容体（ＮＲ３Ｃ１）機能の調節は、炎症性疾患に影響する一般的な臨床診療である。核内受容体活性の別の調節は経口の避妊法で例示され、そこにおいて、エストロゲン受容体（ＥＳＲ１／ＥＲ）およびプロゲステロン受容体の活性化は女性の卵受精を防ぐのに使われる。別の例では、フルタミドまたはビカルタミドなどの抗アンドロゲンを用いてアンドロゲン受容体（ＡＲ）を塞ぐことがＡＲ依存性の前立腺がんの治療に有用なことが証明された。さらに、エストロゲン合成およびエストロゲンの利用可能性を妨げることによるエストロゲン受容体の妨害は女性の乳がんまたは男性の女性化乳房症に対する標準的な治療である。
【００１６】
遺伝子変異は多くの遺伝性疾患の中心となる。一般的には、そのような変異はその継承遺伝的性質の様式の点で優性または劣性に分類でき、優性変異は遺伝子コピーが１つだけ−それが母系でも父系でも−が影響を受けたときでも疾患表現型を引き起こすことができ、劣性変異では疾患を引き起こすには母系と父系の両方の遺伝子コピーが変異に必要とされる。優性変異は２つの一般的な機構、ドミナントネガティブ作用またはハプロ不全のいずれか１つによって疾患を引き起こすことができる。ドミナントネガティブ変異の場合、遺伝子産物は有害である新しい異常な機能を獲得し、疾患表現型を引き起こす。例としては、変異時にそのタンパク質複合体の適切な機能を妨げる多量体のタンパク質複合体のサブユニットがある。また、優性遺伝する疾患はハプロ不全によって引き起こされる可能性もあり、そこにおいて、疾患を引き起こす変異は疾患遺伝子を不活性化し、有効遺伝子数を下げる。これらに状況下で、第二の、完全な遺伝子コピーは正常な機能に充分な遺伝子産物を供給できない。約１２，０００個のヒト遺伝子がハプロ不全であると推定され（Huang et al., 2010, PLoS Genet. 6(10), e1001154）、約３００個の遺伝子が疾患に関連することが知られている。
【００１７】
ニューロンの生存はミトコンドリアの機能に非常に大きく依存し、ミトコンドリアの機能障害は多くの神経変性障害の中心となる（Karbowski M., Neutzner A., 2012, Acta Neuropathol 123(2), 157-71）。ＡＴＰの形でエネルギー供給するその本質的な機能の他に、ミトコンドリアは、カルシウム緩衝、多様な異化過程および代謝過程、並びにプログラム細胞死に大きく関与する。ミトコンドリアのこの重要な機能は、ミトコンドリアを維持し、ミトコンドリアの機能障害およびそれに続く細胞死を防ぐのに適所で多くの細胞機構に反映される（Neutzner A. et al., 2012, Semin Cell Dev Biol 23, 499-508）。これらの過程の中で中心的な役割は、バランスのとれたミトコンドリアの形態をもつ動的なミトコンドリアネットワークを維持することである。これは、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１、Ｍｆｆ、ＭｉＤ４９、およびＭｉＤ５１の場合はミトコンドリアの分裂を、またはＭｆｎ１、Ｍｆｎ２、およびＯＰＡ１の場合はミトコンドリア細管（mitochondrial tubules）の融合を促進するいわゆるミトコンドリアのモルフォゲンによって達成される。ミトコンドリアの融合の消失はＡＴＰ産生の消失を促進することおよびこの過程を神経変性障害に関連するニューロンの細胞死につなげるアポトーシス性の刺激に対して細胞を鋭敏化することが知られているので、ミトコンドリアの形態のバランスをとることが必須である。
【００１８】
ミトコンドリアの融合過程で鍵となる役割を果たすのはｏｐｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  １またはＯＰＡ１である。ＯＰＡ１はＯＰＡ１遺伝子によってコードされる大きなＧＴＰａｓｅであり、ミトコンドリアの融合に必須である。くわえて、ＯＰＡ１はクリステの構成要素として内部ミトコンドリア構造の維持に重要な役割を担う。ＯＰＡ１遺伝子発現の下方制御が融合の消失に起因するミトコンドリアの断片化を引き起こし、細胞をアポトーシス性の刺激に対して鋭敏化することが示された。ＯＰＡ１の変異は約７０％のケジェール（Kjer）視神経症または常染色体優性視神経萎縮（ＡＤＯＡ）の原因であると特定された。たいていの集団では、ＡＤＯＡは１／１０，０００〜３／１００，０００で見られ、幼児期に始まる緩徐に進行する視力の低下を特徴とする。視力障害は軽度から法的盲におよび、不可逆であり、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のゆっくりとした変性によって引き起こされる。しかしたいていの場合、ＡＤＯは非症候性であり、約１５％の患者で感音性難聴などの眼球外の神経筋症状発現が見られる。現在まで、この疾患に対する実行可能な治療はない。興味深いことに、ある特定のＯＰＡ１対立遺伝子は正常眼圧緑内障に関係するが高眼圧緑内障には関係せず、やはり正常なミトコンドリアの生理機能の維持にはＯＰＡ１が重要であることが強調された。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位に融合された遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる人工転写因子、並びにそのような人工転写因子を含んでなる医薬組成物に関する。さらに本発明は、そのような人工転写因子の、遺伝子の発現を調節するための使用、およびそのような遺伝子発現の調節が有益である疾患の治療における使用に関する。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明の人工転写因子によって標的とされる遺伝子プロモーターは受容体遺伝子プロモーターである。
【００２１】
別の特定の実施形態では、本発明の人工転写因子によって標的とされる遺伝子プロモーターは核内受容体遺伝子プロモーターである。
【００２２】
別の特定の実施形態では、本発明の人工転写因子によって標的とされる遺伝子プロモーターはハプロ不全遺伝子プロモーターである。
【００２３】
特定の実施形態では、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位は、カテプシン切断部位、好ましくはカテプシンＢ認識部位、例えば、カテプシンＢのインビトロでの基質であるプロレニン（ＱＰＭＫＲＬＴＬＧＮ、配列番号２８）に含まれるカテプシンＢ認識部位である。
【００２４】
別の特定の実施形態では、本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位に融合された遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる人工転写因子変異体に関する。
【００２５】
特定の実施形態では、受容体遺伝子プロモーターはエンドセリン受容体Ａプロモーター（配列番号２９）である。別の特定の実施形態では、本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、エンドセリン受容体Ａレベルを低下または増加させることに用いるための、エンドセリンによって調節される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエンドセリンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００２６】
別の特定の実施形態では、受容体遺伝子プロモーターはエンドセリン受容体Ｂプロモーター（配列番号３０）である。別の特定の実施形態では、本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、エンドセリン受容体Ｂレベルを低下または増加させることに用いるための、エンドセリンによって調節される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエンドセリンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００２７】
別の特定の実施形態では、受容体遺伝子プロモーターはＴｏｌｌ様受容体４プロモーター（配列番号３１）である。別の特定の実施形態では、本発明は、リポ多糖に対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、Ｔｏｌｌ様受容体４レベルを低下または増加させることに用いるための、リポ多糖によって調節される疾患の治療で用いるための、特に眼疾患の治療で用いるための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるリポ多糖によって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００２８】
別の特定の実施形態では、受容体遺伝子プロモーターは高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットアルファ（ＦｃＥＲ１Ａ）プロモーター（配列番号３２）である。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、高親和性ＩｇＥ受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、ＩｇＥによって調節される疾患の治療で用いるための、特に眼疾患の治療で用いるための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるＩｇＥによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００２９】
別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はグルココルチコイド受容体プロモーター（配列番号３３）である。この特定の実施形態では、本発明は、グルココルチコイドに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、グルココルチコイド受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、グルココルチコイドによって調節される疾患の治療で用いるための、特にグルココルチコイドによって調節される眼疾患の治療で用いるための、グルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のグルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるグルココルチコイドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００３０】
別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はアンドロゲン受容体プロモーター（配列番号３４）である。この特定の実施形態では、本発明は、テストステロンに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、アンドロゲン受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、テストステロンによって調節される疾患の治療で用いるためのアンドロゲン受容体プロモーターを標的とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のアンドロゲン受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるテストステロンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００３１】
別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はエストロゲン受容体プロモーター（配列番号３５）である。この特定の実施形態では、本発明は、エストロゲンに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、エストロゲン受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、エストロゲンによって調節される疾患の治療で用いるためのエストロゲン受容体プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のエストロゲン受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエストロゲンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００３２】
さらに本発明は、ハプロ不全遺伝子プロモーターからの発現を増やすことに用いるための、そのようなハプロ不全遺伝子プロモーターによって引き起こされる疾患または影響される疾患の治療でのそのような人工転写因子の使用に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のハプロ不全遺伝子プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるハプロ不全によって引き起こされる疾患または調節される疾患を治療する方法に関する。
【００３３】
特定の実施形態では、ハプロ不全遺伝子プロモーターはＯＰＡ１プロモーター（配列番号３６）である。この特定の実施形態では、本発明は、ＯＰＡ１遺伝子の発現を高めることに用いるための、低いＯＰＡ１レベルによって引き起こされる疾患または変化する疾患の治療で用いるための、特に眼疾患の治療で用いるための、人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるＯＰＡ１によって影響される疾患を治療する方法に関する。
【００３４】
さらに本発明は、本発明の人工転写因子をコードする核酸、それらを含んでなるベクター、およびそのようなベクターを含んでなる宿主細菌に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１：プロテアーゼ感受性形質導入可能人工転写因子を用いた遺伝子発現の調節  タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、エンドソーム特異的プロテアーゼ切断部位（ＰＳ）、転写調節活性をもつドメイン（ＲＤ）、核局在化配列（ＮＬＳ）、および遺伝子（Ｇ）のプロモーター領域（Ｐ）に特異的なポリダクチルジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質を含んでなる人工転写因子はエンドサイトーシス機構を介して細胞に入る。図１Ａでは、そのような人工転写因子は、エンドソームコンパートメント（ｅ）内部に閉じ込められ、効率的に核（ｎ）に到達できない。図１Ｂでは、エンドソーム特異的プロテアーゼ（ハサミで表わす）はエンドソームが成熟する間に活性化され、ＰＳを認識し、人工転写因子を切断することによって、ＰＴＤをＲＤ−ＮＬＳ−ＺＦnから分離する。エンドソーム小胞の破裂後、その時点で切断された人工転写因子はエンドソームコンパートメントを離れることができ、核に輸送される。図１Ｃを参照されたい。遺伝子Ｇのプロモーター領域Ｐのその標的部位に結合して、ｍＲＮＡ（ｍ）の生成は調節ドメインＲＤの転写調節活性に依存して上方制御または下方制御（＋または−）される。
【図２】図２：ＥＴＲＡを標的にする人工転写因子の活性  ＨｅＬａ細胞に、ＳＩＤドメインを含むＥＴＲＡ特異的人工転写因子であるＡＯ７４Ｖの発現プラスミドと、ＥＴＲＡプロモーターを含むガウシアルシフェラーゼ／ＳＥＡＰリポータープラスミドを共トランスフェクションした（ＡＯ７４Ｖ）。ＡＯ７４Ｖの代わりにＹＦＰを発現する細胞を対照（ｃ）とした。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＳＥＡＰ活性に対して正規化し、相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬｕＡ）として対照の百分率割合で表わした。
【図３】図３：ＥＴＲＡ特異的人工転写因子は内在ＥＴＲＡ遺伝子の発現を抑制できる  （Ａ）＋（Ｂ）テトラサイクリン誘導可能なプロモーターの制御下でＥＴＲＡ＿ＴＳ＋７４を標的とするＥＴＲＡ特異的人工転写因子ＡＯ７４Ｖを安定的に発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞（ＡＯ７４Ｖと表示）をテトラサイクリン（ｔｅｔ）で２４時間処理するか未処理のままとし、ＥＴＲＡ  ｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。安定的に取り込まれた空ベクター（Ｍと表示）またはジンク複合体形成に関与するシステイン残基の全てを欠く不活性型のＡＯ７４Ｖ（Ｃと表示）を含む細胞を対照とした。発現コンストラクトをこれらの細胞に存在するＦｌｐＩｎ部位に相同性組み換えによって組み込む（パネルＡの細胞）、またはＴＡＬＥＮ媒介二本鎖修復を介してＡＡＶＳ１安全な領域（safe harbor）に組み込んだ（パネルＢの細胞）。  （Ｃ）ＡＯ７４Ｖ（ＡＯ７４Ｖと表示）、非活性ＡＯ７４Ｖ（Ｃと表示）、または空ベクター対照（Ｍと表示）のテトラサイクリン誘導可能な発現コンストラクトをＡＡＶＳ１座に含むＨｅＬａ細胞をテトラサイクリン（ｔｅｔ）で２４時間誘導するか未処理のままとし、ＥＴＲＡ  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで定量した。３回の独立した実験の、非誘導細胞に対するテトラサイクリン誘導細胞のＥＴＲＡ発現の平均倍率変化（ＦＣ）を示す。エラーバーは標準偏差を表わす。
【図４】図４：ＥＴＲＡ特異的人工転写因子はＥＴ−１依存性カルシウムシグナリングを遮断する  ＳＩＤドメインを含有するＥＴＲＡ特異的人工転写因子であるＡＯ７４Ｖのテトラサイクリン誘導可能な発現コンストラクトを安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞を１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで誘導する（Ｂ）、または未誘導のままおいて（Ａ）、０（黒丸）、１００（白丸）、または１０００（三角）ｎｇ／ｍｌのＥＴ−１で処理した。カルシウム流を測定し、秒単位での時間（ｔ）に対するベースラインの百分率割合で相対蛍光（ＲＦ）として表わした。
【図５】図５：ＥＴＲＡ特異的人工転写因子はヒト子宮平滑筋細胞のＥＴ−１依存性収縮を遮断する  ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳはヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ）のＥＴ−１依存性収縮を妨げる。ｈＵｔＳＭＣを三次元コラーゲン格子（lattice）に埋め込んだ。Ｃ＝対照としてバッファーで処理した細胞Ｂ＝バッファーとＥＴ−１で処理した細胞Ｖ＝ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳとＥＴ−１で処理した細胞ＲＬＡ＝対照（Ｃ）の％での相対格子面積詳細は後述する。
【図６】図６：ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳと比較したＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳのエンドソーム脱出の増加  ＨｅＬａ細胞を１μＭのカテプシンＢ非感受性ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳ（ＮＰＳと印す）またはカテプシンＢ感受性ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳ（ＰＳと印す）を含むＯｐｔｉＭＥＭ培地中で２時間インキュベーションした。細胞を固定し、抗ｍｙｃエピトープ抗体を用いて染色して人工転写因子を検出し、画像を取得した。画像解析を用いて人工転写因子の核内移行（ＮＩ）を決定し、最大蛍光シグナルの百分率割合として表わした。１回の実験あたり細胞が２００個の３回の独立した実験の平均を示す。
【図７】図７：カテプシンＢ認識部位を含むことによって、ルシフェラーゼリポーターアッセイにおいてＥＴＲＡ特異的人工転写因子の活性が増加する  ハイブリッドＣＭＶ／ＴＳ＋７４（ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳ／ＮＰＳの標的部位）の制御下のガウシアルシフェラーゼ、および恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞を、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳ（カテプシン部位を含む−ＰＳと表示）またはＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳ（カテプシン部位を含まない−ＮＰＳと表示）で処理した。システイン残基と複合体を形成する亜鉛の全てを欠くＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳの不活性変異体での処理を対照（Ｃと表示）として使用した。ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼ活性を処理の２４時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性を分泌アルカリホスファターゼ活性に対して正規化し、対照の百分率割合として表わした。３回の独立した、３連の技術的反復を含む実験の平均を示す。一元配置分散分析をテューキーＨＳＤポストホックテストともに用いて統計的有意性を解析した。Ｃ、ＮＰＳ、およびＰＳと表示した群には有意差がある（Ｐ＜０．０５）。
【図８】図８：カテプシンＢ認識部位を含むことにより、ルシフェラーゼリポーターアッセイにおいてＴＬＲ４特異的人工転写因子の活性が増加する  ハイブリッドＣＭＶ／ＴＳ−２２２（ＴＬＲ４−２２２ＡｒｅｐＳ／ＮＰＳの標的部位）の制御下のガウシアルシフェラーゼ、および恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞を、ＴＬＲ４−２２２ＡｒｅｐＳ（カテプシン部位を含む−ＰＳと表示）またはＴＬＲ４−２２２ＡｒｅｐＳＮＰＳ（カテプシン部位を含まない−ＮＰＳと表示）で処理した。関連のない人工転写因子での処理を対照とした（Ｃと表示）。ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼ活性を処理の２４時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性を分泌アルカリホスファターゼ活性に対して正規化し、対照の百分率割合として表わした。３回の独立した、３連の技術的反復を含む実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表わす。
【図９】図９：カテプシンＢ認識部位を含むことにより、ルシフェラーゼリポーターアッセイにおいてＡＲ特異的人工転写因子の活性が増加する  ハイブリッドＣＭＶ／ＴＳ−２３６（ＡＲ−２３６ＡｒｅｐＳ／ＮＰＳの標的部位）の制御下のガウシアルシフェラーゼ、および恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞を、ＡＲ−２３６ＡｒｅｐＳ（カテプシン部位を含む−ＰＳと表示）またはＡＲ−２３６ＡｒｅｐＳＮＰＳ（カテプシン部位を含まない−ＮＰＳと表示）で処理した。関連のない人工転写因子での処理を対照とした（Ｃと表示）。ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼ活性を処理の２４時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性を分泌アルカリホスファターゼ活性に対して正規化し、対照の百分率割合として表わした。３回の独立した、３連の技術的反復を含む実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表わす。
【図１０】図１０：カテプシンＢ認識部位を含むことにより、ルシフェラーゼリポーターアッセイにおいてＦｃＥＲ１Ａ特異的人工転写因子の活性が増加する  ハイブリッドＣＭＶ／ＴＳ−１４７（ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳ／ＮＰＳの標的部位）の制御下のガウシアルシフェラーゼ、および恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞を、ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳ（カテプシン部位を含む−ＰＳと表示）またはＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳＮＰＳ（カテプシン部位を含まない−ＮＰＳと表示）で処理した。関連のない人工転写因子での処理を対照とした（Ｃと表示）。ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼ活性を処理の２４時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性を分泌アルカリホスファターゼ活性に対して正規化し、対照の百分率割合として表わした。３回の独立した、３連の技術的反復を含む実験の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表わす。
【図１１】図１１：ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳでの処置はヒト冠状血管のＥＴ−１依存性収縮を減らす  単離したヒト冠状血管リングを１μＭのＥＴＲＡ特異的カテプシンＢ感受性人工転写因子ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳまたはバッファー対照で３日間インキュベーションした。次に血管リングをワイヤーミオグラフに載せ、血管収縮薬Ｕ４６６１９に対する血管の反応と、ＥＴ−１濃度の増加に対する血管の反応を測定した。血管のＥＴ−１反応はＵ４６６１９反応の百分率割合として表わした。１名のヒト提供者心臓の１つの条件につき８つの血管の平均を示す。エラーバーは標準偏差を表わす。
【図１２】図１２：ヒト化ＮＳＧマウスのＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳでの処置はアナフィラキシーショックの誘発に続く遅発性死亡につながる  抗ジニトロフェニル（抗ＤＮＰ）ＩｇＥ抗体注射の５日前および２日前に、ヒト化ＮＳＧマウス（ヒトＣＤ３４+細胞を移植したＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇnull）を媒体（ｃと表示）またはＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳで処置した。ＤＮＰ−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミンに結合したＤＮＰ）の注射を使用してアナフィラキシーを誘発し（＋ＡＳと表示）、ＢＳＡの注射を対照とした（−ＡＳと表示）。分単位での時間（ｔ［分］と表示）を越えて生存する動物（ＮＯＳＡ）の数を示す。媒体で処置したマウス（丸）でのアナフィラキシーの誘発が動物の急死につながった（アナフィラキシーの誘発の１０分後に生存した動物はいなかった）、一方でＦＣＥＲ１Ａ特異的人工転写因子ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳでの前処理は処置をうけた動物の長期の生存をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位に融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、遺伝子プロモーター、例えば、受容体遺伝子プロモーター、特に膜結合型受容体遺伝子プロモーター若しくは核内受容体遺伝子プロモーター、またはハプロ不全遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる人工転写因子、並びにそのような人工転写因子を含んでなる医薬組成物に関する。さらに本発明は、遺伝子、例えば、膜結合型受容体遺伝子若しくは核内受容体遺伝子などの受容体遺伝子、またはハプロ不全遺伝子の発現を調節するための、およびその遺伝子にコードされるタンパク質、本発明の転写因子によって標的とされるプロモーター、例えば、膜結合型受容体タンパク質若しくは核内受容体タンパク質などの受容体タンパク質、またはハプロ不全遺伝子によって作られるタンパク質によって引き起こされる疾患または調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用に関する。
【００３７】
本発明の文脈において、プロモーターは当該技術分野において周知の通り遺伝子の調節領域として定義される。やはり本発明の文脈において、遺伝子は当該技術分野において周知であるように、調節配列および結果としてタンパク質またはＲＮＡの産生をもたらす遺伝子産物の配列を含むゲノム領域として定義される。
【００３８】
本発明の文脈において、遺伝子プロモーターを「特異的に」標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、タンパク質がそのＤＮＡ標的に対して２０ｎＭ以下の結合親和力を有することを意味する。
【００３９】
本発明の文脈において、膜結合型受容体遺伝子は、細胞外リガンドに結合して、細胞膜をまたいでリガンド結合のシグナルを中継して細胞応答を引き起こすことができるタンパク質またはタンパク質複合体の一部であるタンパク質の産生を引き起こす。やはり本発明の文脈において、核内受容体遺伝子は、細胞透過性リガンドに結合でき、その同族リガンドに結合して遺伝子発現の調節のために転写因子として作用できるか、または転写因子を補助できる核または細胞質基質に局在する可溶性タンパク質の産生を引き起こす。
【００４０】
本発明の文脈において、ハプロ不全遺伝子は、２つの機能遺伝子コピーがゲノムにある場合に限り、あらゆる状況下でもすべての細胞タイプにおいて充分な遺伝子産物の産生を引き起こすことができる遺伝子として定義される。よって、ハプロ不全遺伝子の１つの遺伝子コピーの変異は、幾つかまたは全ての生理学的環境下で生物の幾つかまたは全ての細胞における不充分な遺伝子産物産生を引き起こす。
【００４１】
本発明の文脈において、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位は、エンドソームコンパートメントに常在するプロテアーゼによって配列特異的に認識および切断されるペプチド配列である。やはり本発明の文脈において、タンパク質形質導入ドメインは、人工転写因子などのタンパク質を、細胞膜をまたいで細胞内コンパートメントに輸送できるペプチドとして定義される。
【００４２】
多くの疾患の治療が細胞受容体シグナリングを調節することに基づく。例としては、ベータ遮断薬がベータアドレナリン受容体の機能を阻害する高血圧、セロトニン取り込み阻害薬が作動体濃度を増加してセロトニン受容体シグナリングを増加するうつ病、またはプロスタグランジン類似体がプロスタグランジン受容体を活性化し、次いで眼内圧を減少する緑内障がある。伝統的に、受容体作動剤または拮抗剤のいずれかの形態での低分子が治療目的で受容体シグナリングに強い影響を及ぼすのに使用される。しかし、細胞受容体シグナリングは、直接的に受容体タンパク質発現の調節することによっても影響を受ける可能性がある。
【００４３】
受容体発現レベルの直接的な調節を受けることができる病理過程は例えば次のものがある：心筋のベータ−アドレナリン受容体の下方制御は術後心不全のリスクと関連するので、先天性心疾患に起因する鬱血性心不全の患者はこの受容体の上方制御から恩恵を受けることになる。パーキンソン病では、ドーパミン系薬物を用いた治療はドーパミン受容体の利用可能性を抑制し、よってドーパミン受容体の上方制御はドーパミン系薬物の有効性を向上することになる。てんかんでは、海馬におけるカンナビノイド受容体の不充分な発現が疾患の病因に係わり、カンナビノイド受容体の上方制御はてんかん患者ための実行可能な治療法であることになる。
【００４４】
発育不全を引き起こすインスリン様成長因子Ｉ受容体などの受容体タンパク質のハプロ不全によって引き起こされる遺伝子疾患などに関して、残りの機能受容体遺伝子のさらなる活性化が患者にとって有益であることになる。さらにとりわけ、病態を形成する自己免疫の誘導および持続はＴｏｌｌ様受容体からの不適切なシグナリングに関連する。よって、Ｔｏｌｌ様受容体の下方制御はさまざまな自己免疫疾患の悪循環を断ち切る。アレルギー疾患では、高親和性ＩｇＥ受容体を通したＩｇＥ媒介シグナリングの防止はアレルギー反応を管理するのに有用である。がんでは、成長因子受容体の下方制御または細胞外マトリックス受容体の上方制御は腫瘍の進行の防止に有益である。
【００４５】
そのような受容体分子のなかには、受容体を細胞膜に固定する７回膜貫通ドメインおよびＧタンパク質依存シグナルカスケードを特徴とする、いわゆる７回膜貫通型またはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのタンパク質由来のタンパク質がある。そのようなタンパク質の例は、エンドセリン受容体ＡおよびＢである。他の受容体タンパク質、例えば、リポ多糖の受容体、Ｔｏｌｌ様受容体４、またはＩＬ−４受容体などのさまざまなサイトカイン受容体はただ一つの膜貫通ドメインを介して固定される。他の受容体は、多量体タンパク質複合体からなり、例えば、ＩｇＥ抗体の高親和性受容体はアルファ、ベータ、およびガンマ鎖からなり、Ｔ細胞受容体はアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびゼータ鎖からなる。よって、大きく異なる作用機序をもつさまざまなタンパク質ファミリー由来のタンパク質が「受容体分子」という用語のもとに包含される。
【００４６】
本発明で考慮される受容体は、ＨＴＲ１Ａ、ＨＴＲ１Ｂ、ＨＴＲ１Ｄ、ＨＴＲ１Ｅ、ＨＴＲ１Ｆ、ＨＴＲ２Ａ、ＨＴＲ２Ｂ、ＨＴＲ２Ｃ、ＨＴＲ４、ＨＴＲ５Ａ、ＨＴＲ５ＢＰ、ＨＴＲ６、ＨＴＲ７、ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ４、ＣＨＲＭ５、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＡＤＯＲＡ３、ＡＤＲＡ１Ａ、ＡＤＲＡ１Ｂ、ＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＤＲＡ２Ｂ、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＡＤＲＢ１、ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＢ３、ＡＧＴＲ１、ＡＧＴＲ２、ＡＰＬＮＲ、ＧＰＢＡＲ１、ＮＭＢＲ、ＧＲＰＲ、ＢＲＳ３、ＢＤＫＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＣＮＲ１、ＣＮＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、ＣＣＫＡＲ、ＣＣＫＢＲ、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ５ＡＲ１、ＧＰＲ７７、ＤＲＤ１、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、ＤＲＤ５、ＥＤＮＲＡ、ＥＤＮＲＢ、ＧＰＥＲ、ＦＰＲ１、ＦＰＲ２、ＦＰＲ３、ＦＦＡＲ１、ＦＦＡＲ２、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４２、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、ＧＡＬＲ３、ＧＨＳＲ、ＦＳＨＲ、ＬＨＣＧＲ、ＴＳＨＲ、ＧＮＲＨＲ、ＧＮＲＨＲ２、ＨＲＨ１、ＨＲＨ２、ＨＲＨ３、ＨＲＨ４、ＨＣＡＲ１、ＨＣＡＲ２、ＨＣＡＲ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＣＹＳＬＴＲ１、ＣＹＳＬＴＲ２、ＯＸＥＲ１、ＦＰＲ２、ＬＰＡＲ１、ＬＰＡＲ２、ＬＰＡＲ３、ＬＰＡＲ４、ＬＰＡＲ５、Ｓ１ＰＲ１、Ｓ１ＰＲ２、Ｓ１ＰＲ３、Ｓ１ＰＲ４、Ｓ１ＰＲ５、ＭＣＨＲ１、ＭＣＨＲ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ、ＭＣ５Ｒ、ＭＴＮＲ１Ａ、ＭＴＮＲ１Ｂ、ＭＬＮＲ、ＮＭＵＲ１、ＮＭＵＲ２、ＮＰＦＦＲ１、ＮＰＦＦＲ２、ＮＰＳＲ１、ＮＰＢＷＲ１、ＮＰＢＷＲ２、ＮＰＹ１Ｒ、ＮＰＹ２Ｒ、ＰＰＹＲ１、ＮＰＹ５Ｒ、ＮＰＹ６Ｒ、ＮＴＳＲ１、ＮＴＳＲ２、ＯＰＲＤ１、ＯＰＲＫ１、ＯＰＲＭ１、ＯＰＲＬ１、ＨＣＲＴＲ１、ＨＣＲＴＲ２、Ｐ２ＲＹ１、Ｐ２ＲＹ２、Ｐ２ＲＹ４、Ｐ２ＲＹ６、Ｐ２ＲＹ１１、Ｐ２ＲＹ１２、Ｐ２ＲＹ１３、Ｐ２ＲＹ１４、ＱＲＦＰＲ、ＰＴＡＦＲ、ＰＲＯＫＲ１、ＰＲＯＫＲ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＴＧＤＲ、ＰＴＧＤＲ２、ＰＴＧＥＲ１、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＧＥＲ３、ＰＴＧＥＲ４、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＧＩＲ、ＴＢＸＡ２Ｒ、Ｆ２Ｒ、Ｆ２ＲＬ１、Ｆ２ＲＬ２、Ｆ２ＲＬ３、ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３、ＲＸＦＰ４、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５、ＴＡＣＲ１、ＴＡＣＲ２、ＴＡＣＲ３、ＴＲＨＲ、ＴＡＡＲ１、ＵＴＳ２Ｒ、ＡＶＰＲ１Ａ、ＡＶＰＲ１Ｂ、ＡＶＰＲ２、ＯＸＴＲ、ＣＣＲＬ２、ＣＭＫＬＲ１、ＧＰＲ１、ＧＰＲ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ２６、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３３、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４２、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ６１、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ６３、ＧＰＲ６５、ＧＰＲ６８、ＧＰＲ７５、ＧＰＲ７８、ＧＰＲ７９、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ８３、ＧＰＲ８４、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ８７、ＧＰＲ８８、ＧＰＲ１０１、ＧＰＲ１１９、Ｏ３ＦＡＲ１、ＧＰＲ１３２、ＧＰＲ１３５、ＧＰＲ１３９、ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１４２、ＧＰＲ１４６、ＧＰＲ１４８、ＧＰＲ１４９、ＧＰＲ１５０、ＧＰＲ１５１、ＧＰＲ１５２、ＧＰＲ１５３、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ１６１、ＧＰＲ１６２、ＧＰＲ１７１、ＧＰＲ１７３、ＧＰＲ１７４、ＧＰＲ１７６、ＧＰＲ１８２、ＧＰＲ１８３、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＰＡＲ６、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１、ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＲＧＰＲＸ４、ＯＰＮ３、ＯＰＮ５、ＯＸＧＲ１、Ｐ２ＲＹ８、Ｐ２ＲＹ１０、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ３、ＴＡＡＲ４Ｐ、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８、ＴＡＡＲ９、ＣＣＢＰ２、ＣＣＲＬ１、ＤＡＲＣ、ＣＡＬＣＲ、ＣＡＬＣＲＬ、ＣＲＨＲ１、ＣＲＨＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＩＰＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＬＰ２Ｒ、ＧＣＧＲ、ＳＣＴＲ、ＰＴＨ１Ｒ、ＰＴＨ２Ｒ、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＶＩＰＲ１、ＶＩＰＲ２、ＢＡＩ１、ＢＡＩ２、ＢＡＩ３、ＣＤ９７、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＬＳＲ３、ＥＬＴＤ１、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４Ｐ、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ６４、ＧＰＲ９７、ＧＰＲ９８、ＧＰＲ１１０、ＧＰＲ１１１、ＧＰＲ１１２、ＧＰＲ１１３、ＧＰＲ１１４、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２３、ＧＰＲ１２４、ＧＰＲ１２５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１３３、ＧＰＲ１４４、ＧＰＲ１５７、ＬＰＨＮ１、ＬＰＨＮ２、ＬＰＨＮ３、ＣＡＳＲ、ＧＰＲＣ６Ａ、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＧＲＭ１、ＧＲＭ２、ＧＲＭ３、ＧＲＭ４、ＧＲＭ５、ＧＲＭ６、ＧＲＭ７、ＧＲＭ８、ＧＰＲ１５６、ＧＰＲ１５８、ＧＰＲ１７９、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＴＡＳ１Ｒ１、ＴＡＳ１Ｒ２、ＴＡＳ１Ｒ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＳＭＯ、ＧＰＲ１０７、ＧＰＲ１３７、ＯＲ５１Ｅ１、ＴＰＲＡ１、ＧＰＲ１４３、ＴＨＲＡ、ＴＨＲＢ、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＢ、ＲＯＲＣ、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｈ５Ｐ、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ２、ＶＤＲ、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ４Ｇ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧ、ＡＲ、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＰＧＲ、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＨＴＲ３Ａ、ＨＴＲ３Ｂ、ＨＴＲ３Ｃ、ＨＴＲ３Ｄ、ＨＴＲ３Ｅ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＲＡ２、ＧＡＢＲＡ３、ＧＡＢＲＡ４、ＧＡＢＲＡ５、ＧＡＢＲＡ６、ＧＡＢＲＢ１、ＧＡＢＲＢ２、ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＢＲＧ１、ＧＡＢＲＧ２、ＧＡＢＲＧ３、ＧＡＢＲＤ、ＧＡＢＲＥ、ＧＡＢＲＱ、ＧＡＢＲＰ、ＧＡＢＲＲ１、ＧＡＢＲＲ２、ＧＡＢＲＲ３、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、ＧＬＲＡ３、ＧＬＲＡ４、ＧＬＲＢ、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＧＲＩＤ１、ＧＲＩＤ２、ＧＲＩＫ１、ＧＲＩＫ２、ＧＲＩＫ３、ＧＲＩＫ４、ＧＲＩＫ５、ＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＧＲＩＮ３Ａ、ＧＲＩＮ３Ｂ、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＡ２、ＣＨＲＮＡ３、ＣＨＲＮＡ４、ＣＨＲＮＡ５、ＣＨＲＮＡ６、ＣＨＲＮＡ７、ＣＨＲＮＡ９、ＣＨＲＮＡ１０、ＣＨＲＮＢ１、ＣＨＲＮＢ２、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＢ４、ＣＨＲＮＧ、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、Ｐ２ＲＸ１、Ｐ２ＲＸ２、Ｐ２ＲＸ３、Ｐ２ＲＸ４、Ｐ２ＲＸ５、Ｐ２ＲＸ６、Ｐ２ＲＸ７、ＺＡＣＮ、ＡＧＥＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＬＩＬＲＡ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＡ５、ＬＩＬＲＡ６、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３ａ、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、ＬＩＬＲＢ６、ＬＩＬＲＢ７、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＧＦＲａ１、ＧＦＲａ２、ＧＦＲａ３、ＧＦＲａ４、ＮＰＲ１、ＮＰＲ２、ＮＰＲ３、ＮＰＲ４、ＮＧＦＲ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ２、ＥＲＢ３、ＥＲＢ４、ＩＮＳＲ、ＩＲＲ、ＩＧ１Ｒ、ＰＤＧＦアルファ、ＰＤＧＦベータ、Ｆｍｓ、Ｋｉｔ、Ｆｌｔ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＢＦＲ２、ＶＧＲ１、ＶＧＲ２、ＶＧＲ３、ＥＰＡ１、ＥＰＡ２、ＥＰＡ３、ＥＰＡ４、ＥＰＡ５、ＥＰＡ７、ＥＰＡ８、ＥＰＢ１、ＥＰＢ２、ＥＰＢ３、ＥＰＢ４、ＥＰＢ６、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＵＦＯ、ＴＹＲＯ３、ＭＥＲＫ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＲＯＮ、ＭＥＴ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＰＴＫ７、およびＫＩＴによってコードされるヒト受容体分子である。
【００４７】
考慮されるさらなる受容体は、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、レプチン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子アルファ、リンフォトキシン、プロラクチン、オンコスタチンＭ、白血病阻止因子、コロニー刺激因子、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＥ、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、アドレノメデュリン、アンジオポエチン、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質、エリトロポイエチン、線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、増殖分化因子９、肝細胞増殖因子、肝細胞がん由来増殖因子、インスリン様成長因子、インスリン、遊走刺激因子、ミオスタチン、血小板由来成長因子、トロンボポエチン、血管内皮成長因子、胎盤増殖因子、結合組織成長因子、および成長ホルモンを認識するヒト受容体である。
【００４８】
さらに考慮されるのは、ヒト以外のホモログ遺伝子、例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、またはマウスの遺伝子によってコードされる受容体；並びに植物ホモログ受容体遺伝子、例えば、小麦、大麦、トウモロコシ、米、ライムギ、エンバク、ダイズ、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、アマ、豆類、タバコ、または家畜飼料用草などの作物に見られる遺伝子、およびリンゴ、ナシ、バナナ、柑橘類、ブドウなどの果実植物に見られる遺伝子によってコードされる受容体である。
【００４９】
膜に固定された、膜貫通タンパク質からなるまたは膜貫通タンパク質を含むほとんど全ての他の細胞受容体と対照的に、核内受容体は１つのポリペプチドにリガンド結合と転写因子活性を組み入れる可溶性タンパク質である。核内受容体は細胞質基質または核質のいずれかに局在し、そこでリガンドが結合すると活性化されて二量体化し、莫大な転写プログラムを制御する活性な転写因子になる。細胞の外側でそのリガンドと結合し、細胞膜をまたいでシグナルを細胞に伝達する上記の膜に固定された受容体と違って、核内受容体は細胞膜を通過してその同族受容体へのアクセスを得ることができる脂肪親和性のリガンドと結合する。くわえて、大部分の受容体は、目的の細胞での効果を達成する前の複雑なシグナル増幅機構に依存する。他方では、核内受容体はリガンドの結合を細胞応答に直接変換する。
【００５０】
多くの疾患の治療が核内受容体シグナリングを調節することに基づく。例としては、グルココルチコイドがグルココルチコステロイド受容体を活性化する炎症性の過程、アンドロゲン受容体の拮抗剤が有益な治療効果を有する前立腺がん、またはエストロゲン受容体シグナリングを遮断することが有用であると分かっている乳がんがある。伝統的に、核内受容体作動剤または拮抗剤のいずれかの形態での低分子が治療目的で受容体シグナリングに強い影響を及ぼすのに使用される。しかし、核内受容体シグナリングは、核内受容体タンパク質発現の直接的な調節によっても影響される可能性があり、そのような調節が本発明の主題である。
【００５１】
本発明で考慮される核内受容体は、ヒト遺伝子ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ４Ｇ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＰＧＲ、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＢ、ＲＯＲＣ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＴＨＲＡ、ＴＨＲＢ、およびＶＤＲによってコードされるヒト核内受容体である。
【００５２】
さらに、ヒト以外の核内受容体、例えば、言及されたヒト核内受容体遺伝子に関連する遺伝子によってコード化されるブタ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、またはネズミの転写因子が考慮される。
【００５３】
発育不全を引き起こすインスリン様成長因子Ｉ受容体ハプロ不全、または優性視神経萎縮を引き起こすＯＰＡ１ハプロ不全などの遺伝子プロモーターのハプロ不全によって引き起こされる遺伝子疾患などに関して、残りの機能遺伝子コピーのさらなる活性化が患者にとって有益である。本発明の人工転写因子はハプロ不全遺伝子プロモーターからの発現を増加でき、よってハプロ不全に関連する疾患の治療に好適である。
【００５４】
ハプロ不全に関連する以下のヒト遺伝子およびそのそれぞれのプロモーター並びに本発明の人工転写因子を用いた治療を受け入れる疾患が本発明で考慮される：ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＦＢＮ１、ＥＬＮ、ＴＣＯＦ１、ＥＮＧ、ＧＬＩ３、ＴＣＦ４、ＧＲＮ、ＮＫＸ２−１、ＳＯＸ１０、ＳＨＯＸ、ＭＣ４Ｒ、ＧＡＴＡ３、ＮＫＸ２−５、ＴＢＸ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＰＡＸ６、ＬＭＸ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＰＡＸ９、ＳＯＸ９、ＴＲＰＶ４、ＳＰＡＳＴ、ＴＢＸ５、ＴＷＩＳＴ１、ＥＨＭＴ１、ＦＯＸＣ２、ＴＢＸ３、ＴＮＸＢ、ＤＳＰ、ＯＰＡ１、ＴＲＰＳ１、ＲＵＮＸ２、ＳＣＮ１Ａ、ＨＯＸＤ１３、ＮＳＤ１、ＳＡＴＢ２、ＰＲＰＦ３１、ＳＯＸ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＰＣ、ＲＡＩ１、ＰＡＸ３、ＺＥＢ２、ＳＬＣ４０Ａ１、ＡＦＧ３Ｌ２、ＫＣＮＱ２、ＳＡＬＬ１、ＰＰＡＲＧ、ＧＤＦ５、ＧＣＨ１、ＭＹＨ９、ＳＡＬＬ４、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＦ１、ＲＡＤ５１、ＰＫＤ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＨ３ＴＣ２、ＳＢＤＳ、ＳＩＸ６、ＫＲＩＴ１、ＳＬＣ３３Ａ１、ＰＡＲＫ２、ＡＢＣＡ４、ＭＹＯＣ、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＲＥＢＢＰ、ＦＧＦ３、ＭＹＦ６、ＭＰＺ、ＩＴＰＲ１、ＥＤＮ３、Ｃ３、ＴＹＲＰ１、ＯＦＣ１２、ＡＴＭ、ＦＯＸＰ２、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＣＯＣＨ、ＰＩＴＸ１、ＥＹＡ１、ＦＯＸＣ１、ＫＬＦ１、ＧＡＴＡ４、ＫＩＴ、ＭＹＣＮ、ＣＯＬ５Ａ１、ＲＮＦ１３５、ＭＩＲ１４６Ａ、ＳＩ、ＮＬＲＰ１２、ＮＤＵＦＡ１３、ＳＰＲＥＤ１、ＲＥＥＰ１、ＳＬＣ６Ａ１９、ＣＨＤ７、ＮＣＦ１、ＩＲＦ６、ＲＸＦＰ２、ＺＭＰＳＴＥ２４、ＡＴＬ１、ＥＧＬＮ１、ＮＬＲＰ３、ＫＩＦ１Ｂ、ＢＣＭＯ１、ＳＬＣ６Ａ２０、ＦＯＸＬ２、ＲＴＮ４Ｒ、ＴＳＣ１、ＷＷＯＸ、ＰＯＬＧ２、ＬＧＩ１、ＲＥＣＱＬ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＡＴＰ２Ｃ１、ＫＣＮＱ４、ＲＰＳ１９、ＡＢＣＣ６、ＳＴＸＢＰ１、ＮＢＮ、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ２、ＡＧＲＰ、ＳＴＫ１１、ＫＣＮＪ１０、ＬＨＸ４、ＦＧＦ１０、ＬＩＧ４、ＡＣＶＲＬ１、ＣＡＶ３、ＧＤＦ６、ＳＭＡＤ４、ＭＹＢＰＣ３、ＩＲＳ２、ＭＳＨ６、ＡＢＣＣ８、ＧＡＲＳ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＯＲＣＮ、ＰＨＥＸ、ＡＲＸ、ＤＭＤ、ＴＰＭ１、ＮＯＴＣＨ１、ＡＢＬ１、ＲＹＲ１、ＰＴＨ１Ｒ、ＰＡＸ８、ＰＡＸ２、ＢＲＡＦ、ＭＡＰＴ、ＭＣ３Ｒ、ＫＣＮＨ２、ＬＭＮＡ、ＫＲＴ５、ＳＯＤ１、ＩＧＦ１、ＭＮＸ１、ＨＮＦ１Ａ、ＳＬＣ２Ａ１、ＧＣＫ、ＧＡＢＲＧ２、ＦＵＳ、ＤＳＧ２、ＤＣＣ、ＯＦＣ１、ＣＨＲＮＡ４、ＢＲＣＡ１、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２、ＡＴＰ２Ａ２、ＡＬＸ４、ＭＩＴＦ、ＳＩＸ３、ＳＭＡＲＣＢ１、ＲＡＮＢＰ２、ＧＤＮＦ、ＭＹＣ、ＡＴＰ１Ａ２、ＳＬＣ６Ａ４、ＦＯＸＧ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ１、およびＳＥＲＰＩＮＡ６。
【００５５】
さらに考慮されるのは、ハプロ不全プロモーターの制御下の、ヒト以外の遺伝子、例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、またはマウスの遺伝子、およびそれらのヒトホモログ遺伝子、植物遺伝子、例えば、小麦、大麦、トウモロコシ、米、ライムギ、エンバク、ダイズ、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、アマ、豆類、タバコ、または家畜飼料用草などの作物に見られる遺伝子、およびリンゴ、ナシ、バナナ、柑橘類、ブドウなどの果実植物に見られる遺伝子である。
【００５６】
人工転写因子は遺伝子発現を調節するのに有用であり、よって遺伝子発現の調節が有益である疾患の治療に有用である。従来の薬物は例えば作動剤または拮抗剤の作用によってある特定のタンパク質の活性を調節する。一方で、人工転写因子は遺伝子発現を増加または減少させることによってこれらのタンパク質の利用可能性を変える。
【００５７】
タンパク質活性の調節を通して作用する治療的に活性のある低分子を伝統的な低分子を用いた方法で特定することは、さまざまな物質の類からの多種多様な異なる分子な中の広範囲に及ぶ多大な時間を必要とするスクリーニング手順に依存し、今のところ低分子によって遺伝子発現を調節することはできない。対照的に、本発明の人工転写因子は全て、高度に定義された全体組成をもつ同じ物質の類に属する。２つの大きく異なるプロモーター配列を標的とする２つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づいた人工転写因子は、全体的に類似した三次構造とともに８５％もの最小アミノ酸配列同一性を有し、（下記の）標準化された方法によって迅速且つ経済的な方法で作製できる。よって、本発明の人工転写因子は、１つの類の分子内に、全体的に類似した組成と、非常に広範で多岐にわたる標的に対する非常に高い特異性を兼ね備える。生物学的製剤の全てに関して、抗薬物抗体の形態での免疫原性および関連する免疫応答が懸念される。しかし、ジンクフィンガーモジュールは高度に保存され、そのため本発明の人工転写因子を適用した後にそのような免疫応答は少ないか若しくは存在しないことになり、またはそのような免疫応答は標的部位結合および機能を保持したまま免疫原性を消す全体構造への小さな変化によって回避若しくはさらに最小化されうる。さらに、ポリエチレングリコールを含む本発明の人工転写因子の変更は免疫原性を減らすと考えられる。
【００５８】
人工転写因子は特定の遺伝子のプロモーター領域に特異的に作用するように適応させて作られるので、人工転写因子の使用によって、さらに密接に関連するタンパク質を選択的に標的とすることが可能になる。これは密接に関連するタンパク質でさえもプロモーター領域が緩やかにしか保存されていないことに基づく。本発明による人工転写因子の高度な選択性を利用して、人工転写因子を用いて個々に対処可能である所与のタンパク質ファミリーのある特定のメンバーが多くの場合組織特異的に発現することに基づいた薬物作用の組織特異的な標的でさえも可能である。
【００５９】
くわえて、人工転写因子の薬品への製剤化はこれまでの経験に頼ることができ、さらに薬品開発過程をはかどらせる。
【００６０】
しかし、遺伝子発現の調節を通して作用する際に効果的であるためには人工転写因子は細胞の核コンパートメントに存在する必要がある。これまで、人工転写因子の治療のための送達方法の選択肢は、トランスフェクションによるプラスミドＤＮＡの形態かまたはウィルスベクターを用いることによるかのいずれかである。治療目的のプラスミドトランスフェクションは有効性が低く、一方、ウィルスベクターには免疫原性の可能性が非常に高いので、ある特定の治療を繰り返し適用して使用するのには限りがある。よって、人工転写因子を送達する他の様式、例えば、核酸としての形態に代わってタンパク質の形態が必要とされる。
【００６１】
人工転写因子のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）によって媒介される細胞内送達は、新しいやり方で人工転写因子の高選択性および汎用性を利用する新規の方法である。タンパク質形質導入ドメインは、細胞膜障壁を横切って積み荷タンパク質を細胞内に送達できる小さいペプチドである。そのようなタンパク質形質導入ドメインは、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ｍＴ０２、ｍＴ０３、Ｒ９、ＡＮＴＰなどである。細胞取込みの様式は恐らくエンドサイトーシスにより、ＴＡＴペプチドは積み荷タンパク質に融合したとき、細胞タイプに依存しないマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘導できることが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。細胞膜障壁を横切る間にエンドソーム小胞内に取り込まれるのが細胞に入る最初の段階である。形態的にエンドソームコンパートメントの内側は細胞の外側と同一である。よって、エンドソーム局在は細胞質局在または核質局在と同等ではない。しかし、恐らくエンドソームコンパートメントの漏れやすさおよび／または膜統合性を調節する点で積み荷若しくはタンパク質形質導入ドメインの幾つかの固有の特性を通して、送達されたタンパク質はエンドソームから脱出し、他の真の細胞内標的の達することができる。膜作用性の融合性ペプチドＴＡＴ−ＨＡ２またはＧＡＬＡまたはＫＡＬＡペプチドなどの他のペプチドの共送達は、エンドソーム小胞の崩壊にいくらか起因して、送達されたタンパク質のエンドソーム脱出を向上する。実際に、エンドソーム膜を崩壊可能な機構は、タンパク質形質導入ドメインを用いて送達された積み荷タンパク質のエンドソーム脱出を増加する技術水準である。
【００６２】
しかし、膜破壊剤は期待されたほど効率的に送達を促進しない。これはタンパク質形質導入ドメインの固有の性質に起因するかもしれない。タンパク質形質導入ドメインは細胞膜と強い相互作用をすることが知られている。この強力な膜相互作用はタンパク質インターナリゼーションおよびタンパク質送達を起こす機構の一部である。よって、エンドソームへのインターナリゼーション後、タンパク質形質導入ドメインと、今度はエンドソーム膜の内側とのこの強力な膜相互作用は、実際にはエンドソーム小胞の破裂後でも再分配を阻害しうる。ＴＡＴ融合人工転写因子は主にエンドソームコンパートメントに常在し、核に局在するものも幾らかありうる。興味深いことに、ＴＡＴ人工転写因子を染色した細胞の大部分では、エンドソーム膜が明らかにＴＡＴ融合タンパク質で修飾されて、破裂したエンドソーム小胞が細胞質基質に対して開いているのが見られ、エンドソーム膜破裂後でも送達されたタンパク質の相当量がエンドソームに閉じ込められていることと一致した。よって、細胞への取り込みには必須である一方で、いったんタンパク質形質導入が起こるとタンパク質形質導入ドメインは効率的な細胞小器官局在を妨げる。
【００６３】
エンドソームはプロテアーゼを捕捉することや、リソソームコンパートメントとの融合およびエンドソームの内容物のタンパク質分解前の小胞ｐＨの低下を示すことなど、成熟してリソソーム的な特徴を獲得することが知られている非常に動的な細胞小器官である。内腔タンパク質分解活性の増加によって達成されるエンドソームの成熟の過程は、タンパク質形質導入ドメインを用いて送達される治療用タンパク質はタンパク質分解に供されるので、そのようなタンパク質にとって有害である。しかし、この過程を利点に変えることができる。エンドソームの成熟は順序的な過程であり、そこでは異なるプロテアーゼ群がｐＨ依存的に異なる段階で活性化される。興味深いことに、タンパク質処理に関与する過程の初期に活性化されるプロテアーゼは、タンパク質の一般的な加水分解に必須の成熟時後期に活性化されるプロテアーゼと比べてより配列特異的である。ところでタンパク質形質導入ドメインと積み荷タンパク質の間に初期エンドソームプロテアーゼのための切断部位を取り込むことによって、治療用タンパク質がエンドソーム内腔に到達した際に治療用タンパク質は配列特異的に切断され、タンパク質形質導入ドメインは積み荷タンパク質から分離される。よって、ＴＡＴによって媒介される人工転写因子の送達の後に高い頻度で観察可能なエンドソームの破裂時には、積み荷タンパク質はタンパク質形質導入ドメインの固有の性質のために、もはやエンドソーム膜の内部に結合しておらず、細胞質基質に脱出するために膜から離される（図１）。
【００６４】
エンドソームコンパートメント内で活性があるプロテアーゼは、ｐＨ最適条件や配列特異性の点で異なる特徴をもつ多様なプロテアーゼの大きなファミリーのカテプシンである。例えば、カテプシンＢはｐＨ最適条件が中性のｐＨ前後であり、このプロテアーゼがＴＡＴ積み荷融合タンパク質処理エンドソームプロテアーゼとして良い選択となる配列特異性がある。しかし、カテプシンＨ、Ｌ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、Ｏ、Ｆ、Ｖ、Ｘ、Ｗ、Ｄ、またはＥなどの他のカテプシンも、エンドソームコンパートメントに到達するとタンパク質形質導入ドメインをその積み荷から分離するために有用でありうる。ある特定のカテプシンの組織および細胞タイプ特異的発現を利用して、そのような治療薬の細胞小器官局在の増加および効果的な治療作用は、これらの組織または細胞に特異的なカテプシン認識部位を含むことによってある特定の細胞タイプに限定できる。
【００６５】
本発明におけるカテプシンＢ部位などのプロテアーゼ認識部位を使用して人工転写因子などの積み荷タンパク質のエンドソーム脱出を向上することは技術水準を超えている。公知の方法と違って、さらなるエンドソーム小胞破裂が誘導されることなく、積み荷タンパク質はエンドソームに入った後にタンパク質形質導入ドメインから分離されてベースライン（base-line）小胞破裂に続いてエンドソームから効率的に脱出可能になる。
【００６６】
既知の例では、タンパク質形質導入の選択性を上げることを唯一の目的として細胞透過性ペプチドがプロテアーゼ認識部位とともに使用された（ＥＰ２３９９９３９、国際公開第２００８／０６３１１３号）。阻害性ペプチドでタンパク質形質導入ドメインを覆うことによって、細胞膜をまたぐ積み荷輸送が防止される。この阻害性ペプチドは組織および／または細胞タイプ特異的細胞外プロテアーゼに遭遇すると切断されて細胞膜をまたぐタンパク質輸送が可能になる。これらの技術水準の例は、本発明に記載のエンドソーム脱出の増加を導く具体的な構築物とは実質的に異なる。
【００６７】
別の既知の例では、エンドソームプロテアーゼ認識部位がタンパク質形質導入ドメインとともに使用された（国際公開第２００５／００３３１５号）。この例では、提供された手順は（トランスフェクションのために使用される）ＤＮＡの細胞への輸送方法である。エンドソームプロテアーゼ部位はＤＮＡ複合体のエンドソーム経路を介した移行を確認するマーカーとして使用されただけであり、ＤＮＡのエンドソーム脱出を向上するためではなかった。
【００６８】
このエンドソームプロテアーゼ認識部位をマーカーとして使用するという記載とは対照的に、本発明の構築物は機能タンパク質のエンドソーム脱出の増加をもたらすものであり、ＤＮＡ複合体の移行の経路を検出するマーカーを提供するものではない。
【００６９】
さらに、本発明の人工転写因子は核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでなる。考慮される核局在化配列は、遺伝子オントロジーＧＯ：０００８１３９によって定義されるタンパク質への結合を通した核内移行を与えるアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基（Ｋ）それに続くリジン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）残基、それに続く任意のアミノ酸（Ｘ）、それに続くリジン若しくはアルギニン残基（Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492）を含む一群の塩基性アミノ酸またはＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号３７）があり、ＳＶ４０  ＮＬＳが好ましい。
【００７０】
本発明の人工転写因子はまた、Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、およびＥＲＤドメインなどの、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の他の転写活性のあるタンパク質ドメインも含みうる。好ましくはＫＲＡＢまたはＳＩＤである。考慮される活性化タンパク質ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４（ＶＰ１６の反復四量体）、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ２−５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、およびＬＫＬＦなどの、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の転写的に活性のあるドメインである。好ましくは、ＶＰ６４およびＡＰ−２である。
【００７１】
五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質を含む本発明の人工転写因子もまた考慮され、そこにおいて個々のジンクフィンガーモジュールは交換されてそれぞれの核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和力を向上し、または忍容性を上げるためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的性状を変える。
【００７２】
本発明の人工転写因子のドメインは短い柔軟なリンカーによって連結されてもよい。短く柔軟なリンカーは２〜８個の好ましくはグリシンおよびセリンであるアミノ酸をもつ。考慮される具体的なリンカーはＧＧＳＧＧＳ（配列番号３８）である。人工転写因子はその検出および処理を容易にするエピトープタグなどのマーカーをさらに含んでもよい。
【００７３】
ＴＡＴ−ＨＡ２、ＧＡＬＡ、またはＫＡＬＡなどの膜融合性ペプチドの共送達はタンパク質形質導入後の積み荷タンパク質のエンドソーム脱出を増加させることが示された。しかし、そのようなペプチドの共送達は、生体系における構成成分の分布および除去挙動の推定される違いをもつ２つの構成要素系−膜融合性ペプチドと治療用タンパク質−を意味するので恐らくタンパク質送達を生体内で増加させる実行可能な選択肢ではない。
【００７４】
膜融合性ペプチドの治療用タンパク質への組み込みは、上記のこの２つの構成要素についての問題を回避するのにより良い選択肢である。しかし、これらの融合性ペプチドはエンドソーム膜のための融合誘起剤として作用するために、大きさの点、相互作用の可能性、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸配列にいくつかの制約がある。よって、単に融合性ペプチドを積み荷タンパク質に組み込むことは、まだエンドソーム脱出を増やす実行可能な選択肢ではない。
【００７５】
しかし、膜融合性ペプチドを本発明の人工転写因子にエンドソームプロテアーゼ感受性リンカードメインを介して組み込むことは、積み荷タンパク質と膜融合性ペプチドのエンドソーム内腔への同時送達を可能にする。エンドソームの内部に入ると、人工転写因子のタンパク質形質導入ドメインからの分離が起こり、くわえて膜融合性ペプチドの遊離が起こる。膜融合性ペプチドの複数の反復を含むことによって、エンドソームプロテアーゼ部位で融合性ペプチドサブユニットを各々分離して、複数の膜融合性ペプチドがエンドソームに送達され、それによってエンドソームの破裂を増やす。
【００７６】
所与のプロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は機能的な人工転写因子の作製を成功させるのに決定的に重要である。生体内での標的遺伝子発現を調節する人工転写因子に関して、人工転写因子は標的遺伝子のゲノムコンテキスト中のその標的部位に結合しなければならない。これにはＤＮＡ標的部位が接近可能であることを必要とされ、この領域の染色体ＤＮＡはヌクレオソームにおいてヒストンのまわりに密に詰まった状態ではなく、メチル化などのＤＮＡ修飾は人工転写因子の結合を妨害しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は密に詰まった状態で、転写的に不活性である一方で、活発に転写される遺伝子の転写開始点（−１０００〜＋２００ｂｐ）のすぐ近くは、内在転写因子およびＲＮＡポリメラーゼなどの転写機構が接近可能でなければならない。よって、いずれの所与の標的遺伝子のその領域内から標的部位を選択することは、所望の生体内機能をもつ人工転写因子の作製の成功率を大きく高めることになる。
【００７７】
ヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）プロモーター領域内の標的部位の選択
ヒトＥＴＲＡ遺伝子のプロモーター領域を（Ｇ／ＣＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。３つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択され、ＥＴＲＡ＿ＴＳ−３７（配列番号３９）、ＥＴＲＡ＿ＴＳ−５０（配列番号４０）、およびＥＴＲＡ＿ＴＳ＋７４（配列番号４１）とした。転写開始の２０００ｂｐ上流のＥＴＲＡ遺伝子の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００７８】
ヒトエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＲＢ）プロモーター領域内の標的部位の選択
ヒトＥＴＲＢ遺伝子のプロモーター領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。２つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択され、ＥＴＲＢ＿ＴＳ−１１４９（配列番号４２）およびＥＴＲＢ＿ＴＳ−４８７（配列番号４３）とした。転写開始の２０００ｂｐ上流のＥＴＲＢ遺伝子の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００７９】
ヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）プロモーター領域内の標的部位の選択
ヒトＴＬＲ４遺伝子のプロモーター領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。２つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択され、ＴＬＲ４ＴＳ−５５（配列番号４４）、ＴＬＲ４＿ＴＳ−２２２（配列番号４５）、およびＴＬＲ４＿ＴＳ−２７６（配列番号４６）とした。転写開始の２０００ｂｐ上流のＴＬＲ４遺伝子の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００８０】
ヒト高親和性ＩｇＥ受容体Ａ（ＦＣＥＲ１Ａ）プロモーター領域内の標的部位の選択
ヒトＦＣＥＲ１Ａ遺伝子の転写開始点を含んでなるプロモーター領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。２つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択され、ＩｇＥＲ＿ＴＳ−１４７（配列番号４７）およびＩｇＥＲ＿ＴＳ１７（配列番号４８）とした。転写開始の２０００ｂｐ上流のＦＣＥＲ１Ａ遺伝子の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００８１】
ヒトＴＧＦｂＲ１遺伝子内の標的部位の選択
ヒトＴＧＦｂＲ１遺伝子の転写開始点を含んでなるプロモーター領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。１つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択され、ＴＧＦ＿ＴＳ−３９０（配列番号４９）とした。転写開始の２０００ｂｐ上流のＴＧＦｂＲ１遺伝子の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００８２】
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体遺伝子プロモーター内の標的部位の選択
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体遺伝子の転写開始点を含む１０００ｂｐを含んでなるプロモーター領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。プロモーターにおける３〜４つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択された。グルココルチコイド受容体遺伝子プロモーターに見出された標的部位はＧＲ＿ＴＳ１（配列番号５０）、ＧＲ＿ＴＳ２（配列番号５１）、ＧＲ＿ＴＳ３（配列番号５２）であり、アンドロゲン受容体に対する標的部位はＡＲ＿ＴＳ１（配列番号５３）、ＡＲ＿ＴＳ２（配列番号５４）、ＡＲ＿ＴＳ３（配列番号５５）、およびＡＲ＿ＴＳ−２３６（配列番号５６）である。エストロゲン受容体遺伝子プロモーターで特定された標的部位はＥＲ＿ＴＳ１（配列番号５７）、ＥＲ＿ＴＳ２（配列番号５８）、およびＥＲ＿ＴＳ３（配列番号５９）である。転写開始の２０００ｂｐ上流のグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、およびアンドロゲン受容体の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００８３】
ヒトＯＰＡ１遺伝子プロモーター内の標的部位の選択
ヒトＯＰＡ１オープンリーディングフレームの開始コドンの１０００ｂｐ上流領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはグアニンヌクレオチド、Ｃはシトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。４つの標的部位、ＯＰＡ＿ＴＳ１（配列番号６０）、ＯＰＡ＿ＴＳ２（配列番号６１）、ＯＰＡ＿ＴＳ３（配列番号６２）、およびＯＰＡ＿ＴＳ−１６５（配列番号６３）が選ばれた。ＯＰＡ１オープンリーディングフレームの調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまたさらに考慮する。
【００８４】
受容体遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子
特異的な遺伝子標的部位を標的とする六量体ジンクフィンガータンパク質は改変酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択された。標的部位および酵母ｃｙｃ１ミニマルプロモーターを含んでなるキメラ酵母プロモーターの制御下でオーレオバシジンＡ耐性遺伝子を含む酵母を、ＧＡＬ４活性化ドメインに融合した六量体ジンクフィンガータンパク質からなるハイブリッドを活性化する転写因子ための発現プラスミドのプラスミドライブラリーで形質転換した。そのようなハイブリッド転写因子が上記キメラ酵母プロモーターに結合すると、オーレオバシジンＡ耐性遺伝子が転写され、六量体ジンクフィンガーと試験される標的部位の間の相互作用の強さに応じてこの抗生物質に対する耐性を与える。増加する選択圧を用いて、特異的な標的部位に対する強い結合親和力をもつ六量体ジンクフィンガータンパク質が選択される。特異的に標的するそのようなジンクフィンガータンパク質はタンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写活性化ドメインＶＰ６４、または阻害ドメインＮ−ＫＲＡＢ、Ｃ−ＫＲＡＢ、若しくはＳＩＤに融合して人工転写因子を得る。カテプシンＢ感受性人工転写因子を作製するには、カテプシンＢ部位をＴＡＴタンパク質形質導入ドメインと、核局在化配列、ジンクフィンガータンパク質、および調節ドメインからなる人工転写因子の間に導入する。
【００８５】
ＥＴＲＡ特異的六量体ジンクフィンガーは、ＥＴＲＡ−３７Ｂ（配列番号６４）、ＥＴＲＡ−３７Ｄ（配列番号６５）、ＥＴＲＡ−５０Ａ（配列番号６６）、ＥＴＲＡ−５０Ｂ（配列番号６７）、ＥＴＲＡ−５０Ｃ（配列番号６８）、ＥＴＲＡ−５０Ｄ（配列番号６９）、ＥＴＲＡ−５０Ｅ（配列番号７０）、ＥＴＲＡ−５０Ｆ（配列番号７１）、ＥＴＲＡ−５０Ｇ（配列番号７２）、ＥＴＲＡ−５０Ｈ（配列番号７３）、ＥＴＲＡ−５０Ｉ（配列番号７４）、ＥＴＲＡ−５０Ｊ（配列番号７５）、ＥＴＲＡ−５０Ｋ（配列番号７６）、ＥＴＲＡ−５０Ｌ（配列番号７７）、ＥＴＲＡ−５０Ｍ（配列番号７８）、ＥＴＲＡ＋７４Ｅ（配列番号７９）、ＥＴＲＡ＋７４Ｖ（配列番号８０）、ＥＴＲＡ＋７４Ｒ（配列番号８１）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＡ（配列番号８２）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＢ（配列番号８３）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＣ（配列番号８４）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＤ（配列番号８５）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＥ（配列番号８６）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＦ（配列番号８７）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＧ（配列番号８８）、およびＥＴＲＡ＋７４ＡＨ（配列番号８９）である。結果として得られるＥＴＲＡ特異的カテプシンＢ感受性ＶＰ６４−（ａｋｔ）またはＳＩＤ−（ｒｅｐＳ）含有転写因子は、ＥＴＲＡ＋７４Ｅａｋｔ（配列番号９０）、ＥＴＲＡ＋７４ＥｒｅｐＳ（配列番号９１）、ＥＴＲＡ＋７４Ｒａｋｔ（配列番号９２）、ＥＴＲＡ＋７４ＲｒｅｐＳ（配列番号９３）、ＥＴＲＡ＋７４Ｖａｋｔ（配列番号９４）、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳ（配列番号９５）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＡａｋｔ（配列番号９６）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＡｒｅｐＳ（配列番号９７）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＢａｋｔ（配列番号９８）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＢｒｅｐＳ（配列番号９９）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＣａｋｔ（配列番号１００）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＣｒｅｐＳ（配列番号１０１）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＤａｋｔ（配列番号１０２）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＤｒｅｐＳ（配列番号１０３）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＥａｋｔ（配列番号１０４）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＥｒｅｐＳ（配列番号１０５）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＦａｋｔ（配列番号１０６）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＦｒｅｐＳ（配列番号１０７）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＧａｋｔ（配列番号１０８）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＧｒｅｐＳ（配列番号１０９）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＨａｋｔ（配列番号１１０）、ＥＴＲＡ＋７４ＡＨｒｅｐＳ（配列番号１１１）、ＥＴＲＡ−３７Ｂａｋｔ（配列番号１１２）、ＥＴＲＡ−３７ＢｒｅｐＳ（配列番号１１３）、ＥＴＲＡ−３７Ｄａｋｔ（配列番号１１４）、ＥＴＲＡ−３７ＤｒｅｐＳ（配列番号１１５）、ＥＴＲＡ−５０Ａａｋｔ（配列番号１１６）、ＥＴＲＡ−５０ＡｒｅｐＳ（配列番号１１７）、ＥＴＲＡ−５０Ｂａｋｔ（配列番号１１８）、ＥＴＲＡ−５０ＢｒｅｐＳ（配列番号１１９）、ＥＴＲＡ−５０Ｃａｋｔ（配列番号１２０）、ＥＴＲＡ−５０ＣｒｅｐＳ（配列番号１２１）、ＥＴＲＡ−５０Ｄａｋｔ（配列番号１２２）、ＥＴＲＡ−５０ＤｒｅｐＳ（配列番号１２３）、ＥＴＲＡ−５０Ｅａｋｔ（配列番号１２４）、ＥＴＲＡ−５０ＥｒｅｐＳ（配列番号１２５）、ＥＴＲＡ−５０Ｆａｋｔ（配列番号１２６）、ＥＴＲＡ−５０ＦｒｅｐＳ（配列番号１２７）、ＥＴＲＡ−５０Ｇａｋｔ（配列番号１２８）、ＥＴＲＡ−５０ＧｒｅｐＳ（配列番号１２９）、ＥＴＲＡ−５０Ｈａｋｔ（配列番号１３０）、ＥＴＲＡ−５０ＨｒｅｐＳ（配列番号１３１）、ＥＴＲＡ−５０Ｉａｋｔ（配列番号１３２）、ＥＴＲＡ−５０ＩｒｅｐＳ（配列番号１３３）、ＥＴＲＡ−５０Ｊａｋｔ（配列番号１３４）、ＥＴＲＡ−５０ＪｒｅｐＳ（配列番号１３５）、ＥＴＲＡ−５０Ｋａｋｔ（配列番号１３６）、ＥＴＲＡ−５０ＫｒｅｐＳ（配列番号１３７）、ＥＴＲＡ−５０Ｌａｋｔ（配列番号１３８）、ＥＴＲＡ−５０ＬｒｅｐＳ（配列番号１３９）、ＥＴＲＡ−５０Ｍａｋｔ（配列番号１４０）、およびＥＴＲＡ−５０ＭｒｅｐＳ（配列番号１４１）である。カテプシンＢ非感受性人工転写因子はＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳ（配列番号１４２）である。対照目的の亜鉛を配位するシステイン残基の全てを欠くＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳの不活性型はＥＴＲＡ＋７４Ｖｍｕｔ＿ｒｅｐＳ（配列番号１４３）である。
【００８６】
ＥＴＲＢ特異的六量体ジンクフィンガーは、ＥＴＲＢ−１１４９Ｈ（配列番号１４４）、ＥＴＲＢ−１１４９Ｎ（配列番号１４５）、ＥＴＲＢ−４８７Ｃ（配列番号１４６）、およびＥＴＲＢ−４８７Ｅ（配列番号１４７）である。結果として得られるＥＴＲＢ特異的カテプシンＢ感受性ＶＰ６４−（ａｋｔ）またはＳＩＤ−（ｒｅｐＳ）含有転写因子は、ＥＴＲＢ−１１４９Ｈａｋｔ（配列番号１４８）、ＥＴＲＢ−１１４９ＨｒｅｐＳ（配列番号１４９）、ＥＴＲＢ−１１４９Ｎａｋｔ（配列番号１５０）、ＥＴＲＢ−１１４９ＮｒｅｐＳ（配列番号１５１）、ＥＴＲＢ−４８７Ｃａｋｔ（配列番号１５２）、ＥＴＲＢ−４８７ＣｒｅｐＳ（配列番号１５３）、ＥＴＲＢ−４８７Ｅａｋｔ（配列番号１５４）、およびＥＴＲＢ−４８７ＥｒｅｐＳ（配列番号１５５）である。
【００８７】
ＴＬＲ４特異的六量体ジンクフィンガーは、ＴＬＲ４−５５Ｂ（配列番号１５６）、ＴＬＲ４−５５Ｅ（配列番号１５７）、ＴＬＲ４−２２２Ａ（配列番号１５８）、ＴＬＲ４−２２２Ｂ（配列番号１５９）、ＴＬＲ４−２７６Ｂ（配列番号１６０）、およびＴＬＲ４−２７６Ｃ（配列番号１６１）である。結果として得られるＴＬＲ４特異的カテプシンＢ感受性ＶＰ６４−（ａｋｔ）またはＳＩＤ−（ｒｅｐＳ）を含有する転写因子は、ＴＬＲ４−５５Ｂａｋｔ（配列番号１６２）、ＴＬＲ４−５５ＢｒｅｐＳ（配列番号１６３）、ＴＬＲ４−５５Ｅａｋｔ（配列番号１６４）、ＴＬＲ４−５５ＥｒｅｐＳ（配列番号１６５）、ＴＬＲ４−２２２Ａａｋｔ（配列番号１６６）、ＴＬＲ４−２２２ＡｒｅｐＳ（配列番号１６７）、ＴＬＲ４−２２２Ｂａｋｔ（配列番号１６８）、ＴＬＲ４−２２２ＢｒｅｐＳ（配列番号１６９）、ＴＬＲ４−２７６Ｂａｋｔ（配列番号１７０）、ＴＬＲ４−２７６ＢｒｅｐＳ（配列番号１７１）、ＴＬＲ４−２７６Ｃａｋｔ（配列番号１７２）、およびＴＬＲ４−２７６ＣｒｅｐＳ（配列番号１７３）である。
【００８８】
ＦＣＥＲ１Ａ特異的六量体ジンクフィンガーは、ＩｇＥＲ−１４７Ａ（配列番号１７４）、ＩｇＥＲ−１４７Ｇ（配列番号１７５）、ＩｇＥＲ＋１７Ｇ（配列番号１７６）、およびＩｇＥＲ＋１７Ｉ（配列番号１７７）である。結果として得られるＦＣＥＲ１Ａ特異的カテプシンＢ感受性ＶＰ６４−（ａｋｔ）またはＳＩＤ−（ｒｅｐＳ）含有転写因子は、ＩｇＥＲ−１４７Ａａｋｔ（配列番号１７８）、ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳ（配列番号１７９）、ＩｇＥＲ−１４７Ｇａｋｔ（配列番号１８０）、ＩｇＥＲ−１４７ＧｒｅｐＳ（配列番号１８１）、ＩｇＥＲ＋１７Ｇａｋｔ（配列番号１８２）、ＩｇＥＲ＋１７ＧｒｅｐＳ（配列番号１８３）、ＩｇＥＲ＋１７Ｉａｋｔ（配列番号１８４）、およびＩｇＥＲ＋１７ＩｒｅｐＳ（配列番号１８５）である。カテプシンＢ非感受性人工転写因子はＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳＮＰＳ（配列番号１８６）である。対照目的の亜鉛を配位するシステイン残基の全てを欠くＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳの不活性型はＩｇＥＲ−１４７Ａｍｕｔ＿ｒｅｐＳ（配列番号１８７）である。
【００８９】
ＴＧＦｂＲ１特異的六量体ジンクフィンガータンパク質はＴＧＦ−３９０Ａ（配列番号１８８）である。結果として得られるＴＧＦｂＲ１特異的カテプシンＢ感受性ＶＰ６４−（ａｋｔ）またはＳＩＤ−（ｒｅｐＳ）含有転写因子はＴＧＦ−３９０Ａａｋｔ（配列番号１８９）およびＴＧＦ−３９０ｒｅｐＳ（配列番号１９０）である。
【００９０】
別の実施形態では、本発明に記載の特定の膜結合型受容体遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号６４〜８９、１４４〜１４７、１５６〜１６１、１７４〜１７７、および１８８のジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質を含んでなり、そこにおいて、最大で３個、好ましくは１若しくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節し、および／またはそこにおいて、最大で１２個、最も好ましくは１若しくは２個の個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換される。
【００９１】
特定の実施形態では、受容体遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号６４〜８９、１４４〜１４７、１５６〜１６１、１７４〜１７７、および１８８のジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質を含んでなり、そこにおいて、随意に最大で３個、好ましくは１若しくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節し、および／またはそこにおいて、随意に最大で１２個、最も好ましくは１若しくは２個の個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換され、およびそこにおいて、転写調節ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ２−５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、ＬＫＬＦ、Ｎ−ＫＲＡＢ、Ｃ−ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、若しくはＥＲＤである。より具体的に、本発明はエンドソーム特異的部位がカテプシンＢ切断部位であるそのような人工転写因子、およびエンドソーム特異的部位が潜在的な免疫原性または切断特異性若しくは切断効率を最小限にするように変えられたカテプシンＢ切断部位であるそのような人工転写因子に関する。
【００９２】
核内受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
核内受容体プロモーター内の特異的な標的部位を標的とする特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３（Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605）を用いてＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセット（Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810）から構成され、または改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択される。グルココルチコイド受容体を標的とする、活性化カテプシンＢ感受性形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、ＧＲ＿ＺＦＰ１（配列番号１９１）、ＧＲ＿ＺＦＰ２（配列番号１９２）、およびＧＲ＿ＺＦＰ＿３（配列番号１９３）は、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写活性化ドメインＶＰ６４に融合され、人工転写因子ＧＲ１ａｋｔ（配列番号１９４）、ＧＲ２ａｋｔ（配列番号１９５）、およびＧＲ３ａｋｔ（配列番号１９６）が得られる。負の調節活性をもつ形質導入可能なカテプシンＢ感受性人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質はタンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写抑制ドメインＳＩＤに融合され、人工転写因子ＧＲ１ｒｅｐ（配列番号１９７）、ＧＲ２ｒｅｐ（配列番号１９８）、およびＧＲ３ｒｅｐ（配列番号１９９）が得られた。
【００９３】
ＡＲ特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＡＲ＿ＺＦＰ１（配列番号２００）、ＡＲ＿ＺＦＰ２（配列番号２０１）、ＡＲ＿ＺＦＰ３（配列番号２０２）、ＡＲ−２３６Ａ（配列番号２０３）、ＡＲ−２３６Ｂ（配列番号２０４）、およびＡＲ−２３６Ｃ（配列番号２０５）である。結果として得られるＡＲ特異的カテプシンＢ感受性ＶＰ６４−（ａｋｔ）またはＳＩＤ−（ｒｅｐＳ）を含有する人工転写因子は、ＡＲ１ａｋｔ（配列番号２０６）、ＡＲ１ｒｅｐＳ（配列番号２０７）、ＡＲ２ａｋｔ（配列番号２０８）、ＡＲ２ｒｅｐＳ（配列番号２０９）、ＡＲ３ａｋｔ（配列番号２１０）、ＡＲ３ｒｅｐＳ（配列番号２１１）、ＡＲ−２３６Ａａｋｔ（配列番号２１２）、ＡＲ−２３６ＡｒｅｐＳ（配列番号２１３）、ＡＲ−２３６Ｂａｋｔ（配列番号２１４）、ＡＲ−２３６ＢｒｅｐＳ（配列番号２１５）、ＡＲ−２３６Ｃａｋｔ（配列番号２１６）、およびＡＲ−２３６ＣｒｅｐＳ（配列番号２１７）である。
【００９４】
エストロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能カテプシンＢ感受性人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ＥＲ＿ＺＦＰ１（配列番号２１８）、ＥＲ＿ＺＦＰ２（配列番号２１９）、およびＥＲ＿ＺＦＰ＿３（配列番号２２０）は、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写活性化ドメインＶＰ６４に融合され、人工転写因子ＥＲ１ａｋｔ（配列番号２２１）、ＥＲ２ａｋｔ（配列番号２２２）、およびＥＲ３ａｋｔ（配列番号２２３）が得られる。負の調節活性をもつ形質導入可能なカテプシンＢ感受性人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質は、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写抑制ドメインＳＩＤに融合され、人工転写因子ＥＲ１ｒｅｐ（配列番号２２４）、ＥＲ２ｒｅｐ（配列番号２２５）、およびＥＲ３ｒｅｐ（配列番号２２６）が得られる。
【００９５】
五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質を含む本発明の人工転写因子もまた考慮され、そこにおいて個々のジンクフィンガーモジュールは交換されてそれぞれの核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和力を向上し、または忍容性を上げるためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的性状を変える。
【００９６】
別の実施形態では、本発明による特定の核内受容体遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号１９１〜１９３、２００〜２０５、２１８〜２２０のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含んでなり、そこにおいて、最大で３個、好ましくは１若しくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節し、および／またはそこにおいて、最大で１２個、例えば、１２、１１、１０、若しくは９、特に８、７、６、若しくは５、好ましくは４若しくは３、最も好ましくは１若しくは２個の個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換される。
【００９７】
特定の実施形態では、核内受容体遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号１９１〜１９３、２００〜２０５、２１８〜２２０のジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質を含んでなり、そこにおいて、随意に最大で３個、好ましくは１若しくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節し、および／またはそこにおいて、随意に最大で１２個、最も好ましくは１若しくは２個の個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換され、およびそこにおいて、転写調節ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ２−５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、ＬＫＬＦ、Ｎ−ＫＲＡＢ、Ｃ−ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、若しくはＥＲＤである。より具体的に、本発明はエンドソーム特異的部位がカテプシンＢ切断部位であるそのような人工転写因子、およびエンドソーム特異的部位が潜在的な免疫原性または切断特異性若しくは切断効率を最小限にするように変えられたカテプシンＢ切断部位であるそのような人工転写因子に関する。
【００９８】
ハプロ不全遺伝子プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３（Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605）を用いてＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセット（Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810）から構成され、または改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択される。
【００９９】
ＯＰＡ１特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＯＰＡ１＿ＺＦＰ１（配列番号２２７）、ＯＰＡ１＿ＺＦＰ２（配列番号２２８）、ＯＰＡ１−９１６Ｂ（配列番号２２９）、ＯＰＡ１−９１６Ｃ（配列番号２３０）、ＯＰＡ１−９１６Ｄ（配列番号２３１）、ＯＰＡ１−９１６Ｅ（配列番号２３２）、ＯＰＡ１−１８Ｂ（配列番号２３３）、ＯＰＡ１−１８Ｃ（配列番号２３４）、ＯＰＡ１−１８Ｄ（配列番号２３５）、ＯＰＡ１−１８Ｅ（配列番号２３６）、ＯＰＡ１−１６５Ａ（配列番号２３７）、ＯＰＡ１−１６５Ｂ（配列番号２３８）、ＯＰＡ１−１６５Ｃ（配列番号２３９）、ＯＰＡ１−１６５Ｄ（配列番号２４０）、ＯＰＡ１−１６５Ｅ（配列番号２４１）、ＯＰＡ１−１６５Ｆ（配列番号２４２）、ＯＰＡ１−１６５Ｇ（配列番号２４３）、およびＯＰＡ１−１６５Ｈ（配列番号２４４）である。対応するＯＰＡ１特異的カテプシンＢ感受性人工ＶＰ６４含有転写因子は、ＯＰＡ＿ａｋｔ１（配列番号２４５）、ＯＰＡ＿ａｋｔ２（配列番号２４６）、ＯＰＡ１−９１６Ｂａｋｔ（配列番号２４７）、ＯＰＡ１−９１６Ｃａｋｔ（配列番号２４８）、ＯＰＡ１−９１６Ｄａｋｔ（配列番号２４９）、ＯＰＡ１−９１６Ｅａｋｔ（配列番号２５０）、ＯＰＡ１−１８Ｂａｋｔ（配列番号２５１）、ＯＰＡ１−１８Ｃａｋｔ（配列番号２５２）、ＯＰＡ１−１８Ｄａｋｔ（配列番号２５３）、ＯＰＡ１−１８Ｅａｋｔ（配列番号２５４）、ＯＰＡ１−１６５Ａａｋｔ（配列番号２５５）、ＯＰＡ１−１６５Ｂａｋｔ（配列番号２５６）、ＯＰＡ１−１６５Ｃａｋｔ（配列番号２５７）、ＯＰＡ１−１６５Ｄａｋｔ（配列番号２５８）、ＯＰＡ１−１６５Ｅａｋｔ（配列番号２５９）、ＯＰＡ１−１６５Ｆａｋｔ（配列番号２６０）、ＯＰＡ１−１６５Ｇａｋｔ（配列番号２６１）、およびＯＰＡ１−１６５Ｈａｋｔ（配列番号２６２）である。
【０１００】
五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質を含む本発明の人工転写因子もまた考慮され、そこにおいて個々のジンクフィンガーモジュールは交換されてそれぞれの核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和力を向上し、または忍容性を上げるためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的性状を変える。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明に記載のハプロ不全遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号２２７および２４４のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含んでなり、そこにおいて、最大で３個、好ましくは１若しくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節し、および／またはそこにおいて、最大で１２個、最も好ましくは１若しくは２個の個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換される。
【０１０２】
特定の実施形態では、ハプロ不全遺伝子プロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号２２７および２４４のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含んでなり、そこにおいて、随意に最大で３個、好ましくは１若しくは２個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節し、および／またはそこにおいて、随意に最大で１２個、最も好ましくは１若しくは２個の個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換され、およびそこにおいて、転写調節ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ２−５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、ＬＫＬＦ、Ｎ−ＫＲＡＢ、Ｃ−ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、若しくはＥＲＤである。より具体的に、本発明はエンドソーム特異的部位がカテプシンＢ切断部位であるそのような人工転写因子、およびエンドソーム特異的部位が潜在的な免疫原性または切断特異性若しくは切断効率を最小限にするように変えられたカテプシンＢ切断部位であるそのような人工転写因子に関する。
【０１０３】
受容体プロモーター活性の調節における人工転写因子の活性
人工転写因子の、受容体プロモーターによって駆動される転写に影響を及ぼす可能性を評価するために、ルシフェラーゼリポーターアッセイが採用された（図２）。この目的のために、ＥＴＲＡプロモーターから発現を駆動することができるＨｅＬａ細胞を、人工転写因子発現プラスミドとデュアルリポータープラスミドで共トランスフェクションした。デュアルリポータープラスミドは、ＮＥＧ−ＰＧ０４およびＥＦ１ａ−ＰＧ０４プラスミド（ジーンコピア、メリーランド州ロックビル）をベースとした、ＥＴＲＡプロモーター制御下の分泌ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を、恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の遺伝子とともに含んだ。この共トランスフェクションは３：１の人工転写因子発現プラスミド：リポータープラスミド比で行われ、リポータープラスミドでトランスフェクションした細胞での人工転写因子発現の存在を確実にした。ガウシアルシフェラーゼおよびＳＥＡＰ活性は製造業者の推奨（ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット（Gaussia Luciferase Glow Assay Kit）、ピアス社；ＳＥＡＰレポータージーンアッセイケミルミネセンス（SEAP Reporter Gene Assay Chemiluminescence）、ロシュ）に従って測定した。ルシフェラーゼ値はＳＥＡＰ活性に対して正規化し、１００％に設定した黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する対照細胞と比較した。トランスフェクションされた細胞の上澄みのルシフェラーゼとＳＥＡＰ活性の比率を測定することによって、受容体プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現のＳＥＡＰ発現に対する正規化は、人工転写因子プラスミドでトランスフェクションした細胞でのみ可能であった。この方法は異なる実験間のトランスフェクション効率の違いを説明および正規化するのに有用であることが分かり、所与の受容体プロモーターの人工転写因子によって媒介される調節の定量を可能にした。ルシフェラーゼ発現の検証は少なくとも３回、３重に行い、平均をだして、対照トランスフェクションされた細胞と比較し、相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬｕＡ）として対照の百分率割合で表わし、ＳＥＭを示すエラーバーとともにプロットした。対照細胞と比較して、ＡＯ７４Ｖの発現はＥＴＲＡプロモーター駆動発現を３．２％に抑えた。
【０１０４】
内在遺伝子におけるＥＴＲＡ＿ＴＳ＋７４結合部位のＥＴＲＡ特異的人工転写因子ＡＯ７４Ｖに対する接近可能性
調節活性を発揮するためには、人工転写因子は内在ゲノム領域のコンテキストにおいてその標的部位に結合できる必要がある。ＥＴＲＡ＋７４Ｖジンクフィンガータンパク質（配列番号８０）を含む人工転写因子がＥＴＲＡ遺伝子（ＥＴＲＡ＿ＴＳ＋７４、配列番号４１）中のその標的部位に結合できるか否かを分析するために、テトラサイクリン誘導可能なプロモーターの制御下でＡＯ７４Ｖの発現コンストラクトを含む安定な細胞系が作製された。これらの細胞をテトラサイクリンで２４時間誘導することによりＡＯ７４Ｖタンパク質（配列番号２６３）が産生される一方で、テトラサイクリンが存在しないときは、ＡＯ７４Ｖは産生されなかった。図３Ａに示されるように、非誘導細胞またはＤＮＡ結合能を欠くＡＯ７４Ｖの不活性変異体若しくは空ベクター対照を発現する細胞と比較して、ＡＯ７４Ｖの発現はＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞でのＥＴＲＡ  ｍＲＮＡのほぼ完全な消失を引き起こした。図３Ａの細胞はＦｌｐＩｎ部位に組み込まれた発現コンストラクトを含み、一方、図３Ｂに示されるＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞はＡＡＶＳ１安全領域遺伝子座にテトラサイクリン誘導可能な発現コンストラクトを含んだ。またこれらの細胞では、ＡＯ７４Ｖの発現はＥＴＲＡ発現のほぼ完全な抑制を引き起こしたが、不活性ＡＯ７４Ｖの発現はそれを引き起こさなかった。ＡＯ７４Ｖのテトラサイクリン誘導可能な発現コンストラクト、不活性ＡＯ７４Ｖ、または空ベクター対照を安定してＡＡＶＳ１座に含むＨｅＬａ細胞（図３Ｃ）を用いたテトラサイクリンでのＡＯ７４Ｖの誘導はやはりＥＴＲＡ発現の強い抑制をもたらしたが、不活性ＡＯ７４Ｖの発現ではそのような結果にはならなかった。まとめると、内在ＥＴＲＡプロモーターのＥＴＲＡ＿ＴＳ＋７４標的部位は人工転写因子にとって接近可能であり、ＳＩＤ負の調節ドメインを含む人工転写因子はこの標的部位に結合して、ＥＴＲＡ発現の抑制を許容する位置に存在する。
【０１０５】
ＥＴＲＡ特異的人工転写因子発現後のＥＴ−１依存性カルシウムシグナリングの評価
ＥＴＲＡ作動剤ＥＴ−１はＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞内のカルシウム流を刺激する。したがって、ＥＴＲＡ発現の抑制は、ＥＴ−１刺激後の細胞内カルシウム濃度のそのような変化を抑えることが予想される。ＡＯ７４Ｖ（配列番号２６３）を発現するＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘをテトラサイクリンで４８時間誘導し、０、１００、１０００ｎＭのＥＴ−１で処理した。カルシウム流はカルシウム感受性蛍光色素（カルシウム５アッセイキット（Calcium 5 Assay Kit）、モレキュラーデバイス）を用いて自動蛍光プレートリーダー（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３、モレキュラーデバイス）で測定した。テトラサイクリンで誘導しなかった細胞を対照とした。図４Ａに示されるように、ＥＴ−１は人工転写因子を発現しない細胞の細胞内カルシウム濃度の濃度依存的増加を誘導できる一方で、ＥＴＲＡ特異的人工転写因子を発現する細胞はもはやＥＴ−１刺激に応答しない（図４Ｂ）。これらのデータは、この人工転写因子の発現後のＥＴＲＡタンパク質の欠損に起因するＥＴＲＡ依存シグナリングの消失と一致する。
【０１０６】
ＥＴＲＡ特異的人工転写因子の適用後のヒト子宮平滑筋細胞のＥＴ−１依存性収縮の評価
平滑筋細胞（ＳＭＣ）はＥＴＲＡを発現し、ＥＴ−１への曝露後に収縮することができる。抗ＥＴＲＡプロモーター人工転写因子ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳ（配列番号１４２）の効果を測定するために、ヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ）をモデル系として使用した。この目的のために、ｈＵｔＳＭＣを三次元コラーゲン格子に埋め込み、１μＭのＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳまたはバッファー対照で３日間処理した後、０または１００ｎＭのＥＴ−１に曝露した。タンパク質処理またはバッファー処理は２４時間毎に繰り返した。格子をその支持体（support）から剥離しＥＴ−１を加えた後、格子の収縮を観察した。図５に示されるように、ＥＴ−１に曝された対照格子はＥＴ−１で処理されない格子と比較して約７８％収縮する。対照的に、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳで処理された格子はＥＴ−１で処理されなかった対照格子と比較してＥＴ−１の存在下で顕著に収縮しなかった。これは、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＮＰＳでの処理後のｈＵｔＳＭＣのＥＴ−１誘導収縮の完全阻止と一致する。図４に示されるデータは、ＥＴ−１添加の９時間後の、３回の独立した６連で行った実験の平均格子面積を表わす。一般的な線形一変量モデルを採用したＳＰＳＳソフトウェアパッケージでの統計解析は、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＮＰＳの阻止作用について高い有意性を明らかにした（＊＊はｐ＜０．００１を表わす）。
【０１０７】
カテプシンＢ感受性ＥＴＲＡ特異的人工転写因子の核局在の増加
エンドソーム特異的プロテアーゼ切断部位の付加が本発明の人工転写因子の細胞小器官標的を実際に向上か否かを評価するために、ＨｅＬａ細胞をＥＴＲＡ特異的人工転写因子タンパク質ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳ（カテプシンＢ部位を欠き、負の調節ドメインＳＩＤを含むＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳの変異体）またはカテプシンＢ感受性ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳタンパク質で形質導入し、核局在を蛍光顕微鏡観察とそれに続く画像解析によって解析した。図６に示されるように、カテプシンＢ切断部位の取り込みは人工転写因子の平均濃度を４．７倍増加させた。カテプシンＢ感受性ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳで形質導入された細胞はまた、人工転写因子の核へのより均一な取り込みを示し、７５％の細胞が最大で４７．５％の最大濃度に達した。一方で７５％のカテプシンＢ非感受性ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳで形質導入された細胞は最大濃度１０．４％未満である。これらのデータは、残りの人工転写因子からＴＡＴタンパク質形質導入ドメインの分離をもたらすエンドソームコンパートメントのＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳのカテプシンＢ依存性切断と一致する。これにより、確率的な小胞破裂（stochastic vesicle rupture）が起こるとＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳの人工転写因子部分のエンドソームコンパートメントからの効率的な脱出が可能になる。
【０１０８】
カテプシンＢ部位の包含は、ルシフェラーゼリポーターアッセイにおける形質導入可能な人工転写因子の活性を増加させる
上記のように、タンパク質形質導入の後、カテプシンＢ感受性ＥＴＲＡ特異的人工転写因子ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳは、カテプシンＢ非感受性ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳと比較してより効率的に核コンパートメントに局在する。この核局在の増加が転写調節の点での活性の増加に転化するか否かを評価するために、ルシフェラーゼリポーターアッセイを採用した。この目的のために、ハイブリッドＣＭＶ／ＥＴＲＡ＿ＴＳ＋７４プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼからなるリポーターコンストラクトおよび分泌アルカリホスファターゼを含むＨＥＫ２９３細胞を１μＭのＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳ、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳ、または対照として不活性型のＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳで２時間処理し、ルシフェラーゼ活性および分泌アルカリホスファターゼ活性を処理の２４時間後に測定した。図７に示されるように、ルシフェラーゼ活性はＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳでの処置後に、対照と比較して５７．９＋／−５．８％に減少した。一方でＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳでの処理はルシフェラーゼ活性を８７．２＋／−８．２％に減らす。これらのデータはカテプシンＢによって媒介されるエンドソーム脱出の増加に起因する人工転写因子の核局在の増加は転写調節の点での活性の増加に転化するという考えを支持する。
【０１０９】
それぞれの人工転写因子に応答するハイブリッドＣＭＶプロモーター下のルシフェラーゼを含むリポーター細胞株を用いて、ＴＬＲ４、ＡＲ、またはＦｃＥＲ１Ａプロモーターを標的とするカテプシンＢ感受性人工転写因子と、それぞれのカテプシンＢ非感受性変異体と比較したとき、類似の結果が得られた。図８に示されるように、カテプシンＢ感受性ＴＬＲ４−２２２ＢｒｅｐＳ人工転写因子での好適なリポーター細胞の処理は、相対ルシフェラーゼ活性を対照の処理をした細胞と比較して６１．３＋／−６．９％に減じた。一方、カテプシンＢ非感受性ＴＬＲ４−２２２ＢｒｅｐＳＮＳＰでの処理はルシフェラーゼ活性の抑制をもたらさなかった。同様に、カテプシンＢ切断可能ＡＲ−２３６ＡｒｅｐＳでの好適なリポーター細胞の処理は、対照の処理をした細胞と比較して５２＋／−１１％の相対ルシフェラーゼ活性の減少をもたらした。一方、ＡＲ−２３６ＡｒｅｐＳＮＰＳでの処理はルシフェラーゼ活性を対照の処理をした細胞の８５＋／−１１％に減らしただけであった。さらに、カテプシンＢ感受性ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳでの好適なリポーター細胞の処理は、対照処理の細胞と比較して５２．７＋／−１２．９％の相対ルシフェラーゼ活性の減少を引き起こした。一方で、対応するカテプシンＢ非感受性ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳＮＰＳは対照細胞と比較してルシフェラーゼ活性の減少を引き起こさなかった。まとめると、カテプシンＢ切断部位の形質導入可能な人工転写因子への包含は、その的確な核局在だけでなく転写調節の点でのその活性も大きく高める。よって、細胞膜に高い親和性をもつタンパク質形質導入ドメインを人工転写因子からエンドソームプロテアーゼの作用によって分離することは、エンドソーム小胞の破裂後に活性のある人工転写因子が効率的に出ていくことを可能にする。
【０１１０】
ＥＴＲＡ特異的カテプシンＢ感受性人工転写因子はヒト組織において活性を示す
ＥＴＲＡ特異的人工転写因子の作用を通したＥＴＲＡ発現の抑制は、エンドセリン依存性の、ＥＴＲＡによって媒介される細胞シグナリングを妨げることが予想される。エンドセリンは最も強力な既知の血管収縮薬であるので、エンドセリン受容体ＥＴＲＡの下方調節はエンドセリン依存性血管収縮を妨げることが予想される。ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳがＥＴＲＡレベルに影響を及ぼすことができ、エンドセリン依存性血管収縮を妨げることができるか否かを評価するために、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳで処理された生体外ヒト血管の血管収縮を測定した。この目的のために、単離されたヒト冠動脈血管リングを１μＭのＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳの存在下で３日間インキュベーションした。媒体でのインキュベーションを対照とした。血管収縮性を評価するために、血管リングをワイヤーミオグラフに載せ、ＥＴＲＡ非依存性血管収縮薬Ｕ４６６１９およびエンドセリン濃度の増加に対する血管反応を測定した。図１１に示されるように、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳでの処理は媒体で処理した対照血管と比較して相対的なエンドセリン依存性血管収縮を減少させた。これらのデータは、ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳの死作用（die action）を通してＥＴＲＡタンパク質レベルの減少およびそれに続くヒト冠状動脈のエンドセリン依存性血管収縮の減少をもたらすＥＴＲＡ遺伝子発現の下方調節と一致する。
【０１１１】
ＦＣＥＲ１Ａ特異的カテプシンＢ感受性人工転写因子ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳは、ヒト化マウスモデルのアナフィラキシーショックにおける活性を示す。
【０１１２】
多価抗原の結合を通して顆粒細胞または好塩基球上のＩｇＥ受容体を架橋することは、これらの細胞からのヒスタミンなどのアレルギーメディエーターの放出を引き起こす。例えば、アレルゲンへの全身曝露の後の、その過程の系活性化の場合、ヒスタミンの全身性の放出が起こり、他のアレルギーメディエーターと一緒になってアナフィラキシーショックをもたらす。アナフィラキシーショックは、浮腫、血圧の降下、および低体温を特徴とする。動物でのアナフィラキシーのモデルを作るために、次の方法が適用される：動物を特定のＩｇＥ抗体、例えばジニトロフェニル（ＤＮＰ）に対して産生された抗体の注射によって感作する。注射された特定のＩｇＥは顆粒細胞および好塩基球上のＩｇＥ受容体に結合し、アレルギーメディエーターの放出にむけてこれらの細胞を刺激する。これらの細胞を活性化するためには、高いモル比でＢＳＡに結合したＤＮＰを注射し、結合して、ＩｇＥ受容体の架橋をその結合した特異的抗ＤＮＰ  ＩｇＥを通して導く。
【０１１３】
ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳはＦＣＥＲ１Ａ−プロモーターを標的とし、ＩｇＥ受容体の消失を導き、アレルギーメディエーターの放出はＩｇＥ受容体に非常に大きく依存するので、この人工転写因子での前処理はアナフィラキシーの誘導を妨げることになる。この人工転写因子はヒトＦＣＥＲ１Ａプロモーターに対して選択され、マウスＦＣＥＲ１Ａプロモーターからの発現を抑制しないことが予想されるので、生体内モデルでのＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳの活性を評価するためにヒト化マウスモデル（ｈＮＳＧ）を選んだ。ｈＮＳＧモデルは、疑似のヒト免疫系をマウスに作り出すことができるヒトＣＤ３４＋幹細胞が移植された、重度に免疫が低下した状態のＮＳＧマウスに基づく。図１２に示されるように、抗ＤＮＰ  ＩｇＥ／ＤＮＰ−ＢＳＡを用いたアナフィラキシーの誘導の５日前および２日前にＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳ人工転写因子で２度の前処置をされたｈＮＳＧマウスは、対照動物と比較してアナフィラキシーショックに対する感受性が低かった。媒体で処置された対照動物のアナフィラキシーは誘導の１０分後にその動物が急死する一方で、ＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳで処置された動物はアナフィラキシーを６０分間生存した。これらのデータはＩｇＥＲ−１４７ＡｒｅｐＳでの処置の後のＩｇＥＲ活性の減少を通してアナフィラキシーが抑制されることを明らかに指し示すものである。
【０１１４】
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合（ペグ化）が人工転写因子に溶解度を増加させ、その腎クリアランスを減少させ、その免疫原性を制御するために考慮された。大きさが１〜４０キロダルトンの範囲のアミンおよびチオール反応性ポリエチレングリコールが考慮された。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いて、人工転写因子の部位特異的ペグ化を達成した。本発明の人工転写因子にアミノ酸を含む唯一の必須チオール基は、亜鉛配位に必須のジンクフィンガーモジュールに位置するシステイン残基である。これらのチオール基はその亜鉛配位するペグ化に利用できず、よって１つまたは幾つかのシステイン残基の本発明の人工転写因子への包含はチオール特異的ポリエチレングリコール試薬を使用したペグ化のための遊離チオール基を提供する。
【０１１５】
医薬組成物
本発明はまた上記で定義された人工転写因子を含んでなる医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、とりわけヒトに対する非経口全身投与用組成物、特に静脈内投与用組成物、吸入用組成物、および局所投与用組成物、特に眼部局所投与用組成物、例えば点眼剤、眼部用ジェル若しくはスプレーとしての組成物、または硝子体内、結膜下、傍眼球（parabulbar）若しくは眼球後投与用の組成物である。特に好ましいのは、点眼剤および眼部用ジェル、並びに硝子体内、結膜下、傍眼球または眼球後投与用の組成物である。該組成物は活性成分を単独、または好ましくは薬理学的に許容される担体とともに含んでなる。さらに徐放製剤が考慮される。活性成分の投与量は、治療される疾患、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。
【０１１６】
さらに経口送達に有用な医薬組成物、特に、好適にカプセル化された活性成分を含んでなるか、そうでなければ腸内での分解から保護された組成物が考慮される。例えば、そのような医薬組成物は膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含んでもよく、腸溶性コーティングによって包まれてもよい。
【０１１７】
医薬組成物は活性成分を約１％〜約９５％含んでなる。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤、眼部用ジェルなどである。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法、例えば、従来の混合、溶解または凍結乾燥法を用いて調製される。
【０１１９】
活性成分の溶液、また懸濁液または、分散液、とりわけ、例えば、活性成分を単独または担体、例えば、マンニトールとともに含んでなる凍結乾燥組成物の場合、使用前に作ることができる等張水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましい。医薬組成物は滅菌してもよく、並びに／または賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤および／若しくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩および／若しくは緩衝剤を含んでなっていてもよく、それ自体公知の方法、例えば、従来の溶解および凍結乾燥法を用いて調製される。前記溶液または懸濁液は、増粘剤、典型的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、若しくはゼラチン含んでいてもよく、または可溶化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）も含んでなっていてもよい。
【０１２０】
油中の懸濁液は慣習的に注射目的で植物油、合成油、または半合成油を油成分として含んでなる。それらについては、酸成分として８〜２２個、とりわけ１２〜２２個の炭素原子をもつ長鎖脂肪酸を含む液体脂肪酸エステルが特記されうる。これらの脂肪酸エステルのアルコール構成成分は最大で６個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコール、とりわけ、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ひまし油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油がとりわけ有用である。
【０１２１】
注射可能薬製剤の製造は通常無菌状態下で実施され、例えば、アンプルまたはバイアルへの充填や容器の密封も同様である。
【０１２２】
非経口投与に関して、水溶性の活性成分、例えば、水溶性の塩の水溶液、または粘性増加物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラン、および所望の場合、安定剤を含む水性注射懸濁液がとりわけ好適である。活性成分は、随意に賦形剤とともに、凍結乾燥物の形態であることもでき、好適な溶媒を加えることによって非経口投与前に溶液にすることができる。
【０１２３】
吸入用組成物は、噴霧剤の形態、スプレー剤、ミストとして、または滴剤の形態で投与できる。噴霧剤は、定量吸入器またはネブライザー、すなわち、特定量の薬剤を好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスを用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された薬剤の短いバーストの形態で、気道または肺に送達する装置を用いて送達できる溶液または懸濁液から調製される。ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含む吸入粉末スプレー剤も提供できる。
【０１２４】
好ましくは、点眼剤は涙液と等張（２９５〜３０５ｍＯｓｍ／ｌ）の組成を与える好適な薬剤を含んでなる活性成分の等張水溶液である。考慮される薬剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに組成物は、ｐＨを５〜８、好ましくは７．０〜７．４に維持するために、緩衝剤、例えば、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはトリスバッファー（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）含んでなる。組成物は、抗菌性保存剤、例えば、パラベン、塩化ベンザルコニウム、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）などの第四級アンモニウム塩をさらに含んでもよい。点眼剤はゲル状の点眼剤を作り出すキサンタンガム、および／またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、若しくはポリビニルピロリドンなどの他の増粘剤をさらに含んでもよい。
【０１２５】
治療法における人工転写因子の使用
さらに本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、エンドセリン受容体レベルを低下または増加させるための、エンドセリンによって調節される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための上記のようにエンドセリン受容体Ａプロモーターを対象とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のエンドセリン受容体Ａプロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエンドセリンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【０１２６】
エンドセリンによって調節される疾患は、例えば、本態性高血圧症、肺高血圧症、慢性心不全などの心血管疾患、および慢性腎不全である。くわえて、放射線不透過性物質適用の前、その間、およびその後の腎保護は、エンドセリン応答を鈍らせることによって達成される。くわえて、多発性硬化症はエンドセリン系によって悪影響を受ける。
【０１２７】
エンドセリンによって調節されるさらなる疾患は、糖尿病性腎疾患、または緑内障性神経変性、眼血液循環の血管異常調節、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、黄斑浮腫、加齢黄斑変性、視神経症、中心性漿液性脈絡網膜症、網膜色素変性症、スザック症候群、およびレーバー遺伝性視神経萎縮症などの眼疾患である。
【０１２８】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエンドセリンによって調節される疾患を治療する方法に関する。特に本発明は、有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、緑内障性神経変性、眼血液循環の血管異常調節、特に、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、黄斑浮腫、視神経症、中心性漿液性脈絡網膜症、網膜色素変性症、およびレーバー遺伝性視神経萎縮症を治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジット（deposits）の眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１２９】
さらに本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、エンドセリン受容体Ｂレベルを低下または増加させるための、エンドセリンによって調節される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための上記のようにエンドセリン受容体Ｂプロモーターを対象とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のエンドセリン受容体Ｂプロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエンドセリンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【０１３０】
ＥＴ−１依存性ＥＴＲＢ媒介人工転写因子によって調節される疾患は、ある種のがん、神経変性、および炎症関連障害である。
【０１３１】
さらに本発明は、ＬＰＳに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、ＴＬＲ４レベルを低下または増加させることに用いるための、ＬＰＳによって調節される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための上記のようにＴＬＲ４プロモーターを対象とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のＴＬＲ４プロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるＬＰＳによって調節される疾患を治療する方法に関する。ＬＰＳによって調節される疾患は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、乾癬、クローン病、ブドウ膜炎、コンタクトレンズ関連角膜炎、角膜炎、化学療法に対するがんの抵抗性などである。
【０１３２】
さらに本発明は、ＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体に対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、ＦＣＥＲ１レベルを低下または増加させることに用いるための、ＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体によって調節される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための上記のようにＦＣＥＲ１Ａプロモーターを対象とする人工転写因子に関する。
【０１３３】
同様に本発明は、治療上有効な量のＦＣＥＲ１Ａプロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体によって調節される疾患を治療する方法に関する。ＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体によって調節される疾患は一般に、クームス・ゲル分類（Gell P. and Coombs R. (eds), 1968, Clinical Aspects of Immunology, Blackwell Scientific, Oxford）によるＩ型反応である。そのような反応としては、アレルギー性鼻炎、ぜんそく、アトピー性皮膚炎、花粉アレルギー、食品アレルギー、花粉症（hay fever）、呼吸器系アレルギー、ペットアレルギー、ダストアレルギー、チリダニアレルギー、アレルギー性蕁麻疹、アレルギー性肺胞炎、アレルギー性アスペルギルス症、アレルギー性気管支炎、アレルギー性眼瞼炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性真菌性副鼻腔炎、アレルギー性胃腸炎、アレルギー性間質性腎炎、アレルギー性角膜炎、アレルギー性喉頭炎、アレルギー性紫斑病、アレルギー性尿道炎、アレルギー性血管炎、湿疹、アナフィラキシーなどが挙げられる。
【０１３４】
さらに本発明は、核内受容体リガンドに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、核内受容体のレベルを低下または増加させることに用いるための、そのような核内受容体によって調節される疾患の治療で用いるための上記のように核内受容体のプロモーター領域を標的とするように構築された人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の核内受容体プロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体リガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【０１３５】
核内受容体リガンドによって調節される疾患は、例えば、副腎不全、副腎皮質不全、アルコール依存症、アルツハイマー病、アンドロゲン不応症、神経性無食欲症、大動脈瘤、大動脈弁硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、注意欠陥多動性障害、自閉症、無精子症、原発性胆汁性肝硬変、双極性障害、膀胱がん、骨がん、乳がん、心血管疾患、心血管心筋梗塞、セリアック病、胆汁うっ滞、慢性腎不全およびメタボリックシンドローム、肝硬変、口蓋裂、結腸直腸がん、先天性副腎皮質形成不全、冠状動脈性心疾患、停留精巣、深部静脈血栓症、認知症、うつ病、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、子宮内膜がん、Ｓ錐体増強症候群、本態性高血圧症、家族性部分型リポジストロフィー、神経膠芽腫、グルココルチコイド抵抗性、グレーブス病、高血清脂質レベル、高アポβリポタンパク質血症（hyperapobetalipoproteinemia）、高脂血症、高血圧症、高トリグリセリド血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、尿道下裂、不妊症、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血性心疾患、脂肪肝、肺がん、エリテマトーデス、大うつ病性障害、男性乳がん、代謝血漿脂質レベル、メタボリックシンドローム、偏頭痛、多発性硬化症、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、非ホジキンリンパ腫、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、卵巣がん、パーキンソン病、子癇前症、プロゲステロン抵抗性、前立腺がん、偽性低アルドステロン症、乾癬、精神統合失調症、精神病、網膜色素変性症−３７、統合失調症、硬化性胆管炎、性転換、皮膚がん、ケネディーの球脊髄性萎縮症、心筋梗塞に対する感受性、乾癬に対する感受性、精巣がん、１型糖尿病、２型糖尿病、子宮がん、およびめまいである。
【０１３６】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、副腎不全、副腎皮質不全、アルコール依存症、アルツハイマー病、アンドロゲン不応症、神経性無食欲症、大動脈瘤、大動脈弁硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、注意欠陥多動性障害、自閉症、無精子症、原発性胆汁性肝硬変、双極性障害、膀胱がん、骨がん、乳がん、心血管疾患、心血管心筋梗塞、セリアック病、胆汁うっ滞、慢性腎不全およびメタボリックシンドローム、肝硬変、口蓋裂、結腸直腸がん、先天性副腎皮質形成不全、冠状動脈性心疾患、停留精巣、深部静脈血栓症、認知症、うつ病、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、子宮内膜がん、Ｓ錐体増強症候群、本態性高血圧症、家族性部分型リポジストロフィー、神経膠芽腫、グルココルチコイド抵抗性、グレーブス病、高血清脂質レベル、高アポβリポタンパク質血症（hyperapobetalipoproteinemia）、高脂血症、高血圧症、高トリグリセリド血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、尿道下裂、不妊症、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血性心疾患、脂肪肝、肺がん、エリテマトーデス、大うつ病性障害、男性乳がん、代謝血漿脂質レベル、メタボリックシンドローム、偏頭痛、多発性硬化症、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、非ホジキンリンパ腫、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、卵巣がん、パーキンソン病、子癇前症、プロゲステロン抵抗性、前立腺がん、偽性低アルドステロン症、乾癬、精神統合失調症、精神病、網膜色素変性症−３７、統合失調症、硬化性胆管炎、性転換、皮膚がん、ケネディーの球脊髄性萎縮症、心筋梗塞に対する感受性、乾癬に対する感受性、精巣がん、１型糖尿病、２型糖尿病、子宮がん、およびめまいを治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１３７】
さらに本発明は、グルココルチコイド受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、グルココルチコイド受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、グルココルチコイド受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いるための上記のようにグルココルチコイド受容体を対象とする人工転写因子に関する。
【０１３８】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるグルココルチコイド受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、グルココルチコイド抵抗性、２型糖尿病、肥満、冠動脈アテローム性硬化症、冠動脈疾患、ぜんそく、セリアック病、エリテマトーデス、うつ病、ストレス、およびネフローゼ症候群である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１３９】
さらに本発明は、アンドロゲン受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、アンドロゲン受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、アンドロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いるための上記のようにアンドロゲン受容体を対象とする人工転写因子に関する。
【０１４０】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるアンドロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、前立腺がん、男性乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、精巣がん、冠動脈疾患、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、肥満、アンドロゲン不応症、骨粗しょう症、変形性関節症、２型糖尿病、アルツハイマー病、偏頭痛、注意欠陥多動性障害、うつ病、統合失調症、無精子症、子宮内膜症、およびケネディーの球脊髄性萎縮症である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１４１】
さらに本発明は、エストロゲン受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えることに用いるための、エストロゲン受容体レベルを低下または増加させることに用いるための、エストロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いるための上記のようにエストロゲン受容体を対象とする人工転写因子に関する。
【０１４２】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエストロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、前立腺がん、子宮がん、アルコール依存症、偏頭痛、大動脈瘤、心筋梗塞に対する感受性、大動脈弁硬化症、心血管疾患、冠動脈疾患、高血圧症、深部静脈血栓症、グレーブス病、関節炎、多発性硬化症、肝硬変、Ｂ型肝炎、慢性肝疾患、胆汁うっ滞、尿道下裂、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、アルツハイマー病、パーキンソン病、偏頭痛、めまい、神経性無食欲症、注意欠陥多動性障害、認知症、うつ病、精神病、子宮内膜症、および不妊症である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１４３】
さらに本発明は、不充分な遺伝子産生（gene production）発現によって引き起こされる病理学的表現型を緩和するために遺伝子産生を生理的レベルに回復させるのに用いるための、上記のようにハプロ不全遺伝子のプロモーター領域を標的とするように構築された人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のハプロ不全遺伝子プロモーターを対象とする人工転写因子を投与することを含んでなるハプロ不全によって調節される疾患を治療する方法に関する。
【０１４４】
本発明で考慮される疾患は、レリー・ヴェル軟骨骨形成異常、ＴＤＰ４３封入を伴う前頭側頭葉変性症、Ｋｌｅｅｆｓｔｒａ症候群、ディジョージ症候群、神経線維腫症Ｉ型、ピット・ホプキンス症候群、小頭症を伴う下顎顔面形成異常、ウィリアムズ・ボイレン症候群、常染色体優性エーラー・ダンロス症候群Ｉｖ型、セピアプテリン還元酵素欠損症に起因するドーパ反応性ジストニア、眼皮膚白皮症ＩＩ型、スミス・マゲニス症候群、副甲状腺機能低下症、感音性難聴および腎疾患（Ｈｄｒ）、スティックラー症候群Ｉ型、モワット・ウィルソン症候群、症候群性小眼球症３、エーラー・ダンロス症候群ＩＩＩ型、無虹彩症、偽性副甲状腺機能低下症Ｉａ型、早期乳児てんかん性脳症４、皮膚脆弱性羊毛状毛症候群、ミラー・ディッカー脳回欠損症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、毛髪鼻指節骨症候群Ｉ型、耳歯異形成、コロボーマを伴う耳歯症候群（otodental syndrome）、筋強直性ジストロフィー１型、トリーチャー・コリンズ症候群１、家族性化膿性汗腺炎１、エーラー・ダンロス症候群Ｉ型、短指症精神遅滞症候群、口蓋心臓顔面症候群、尺骨乳房症候群、屈曲肢異形成症、早期乳児てんかん性脳症５、コーレン・デ・フリース症候群（Koolen-De Vries syndrome）、全前脳胞症５、症候群性小眼球症６、ドラベ症候群、グルコーストランスポーター１欠損症１、脳内鉄沈着を伴う神経変性症３、常染色体劣性若年性パーキンソン病２、合多指症１、大動脈弁上狭窄症、優性視神経萎縮１、カーニー複合１型、パリスター・ホール症候群、ホルト・オーラム症候群、アルファ地中海貧血症／精神遅滞症候群、てんかん発作、良性家族性新生児１、アラジール症候群１、短指症Ｃ型、骨髄性悪性腫瘍を合併する家族性血小板異常症、膵臓非形成および先天性心欠損症、テロメア関連肺線維症および／または骨髄不全１、鏡像運動症２、言語障害１、常染色体優性難聴９、ケニー・キャフェイ症候群１型、毛細血管拡張性運動失調症、頭頂孔、ファインゴールド症候群１、ネイル・パテラ症候群、常染色体優性精神遅滞１、全前脳胞症３、長骨の欠損および／または鏡像を呈する多指趾症を伴うまたは伴わない先天性内反足、ソトス症候群１、ロイス・ディエツ症候群４型、特発性大脳基底核石灰化症３、三角頭２、中心核ミオパチー３、小脳性運動失調症を伴うまたは伴わない認知障害、家族性部分型リポジストロフィー４型、正中神経の単神経障害、ワールデンブルグ症候群４ｃ型、ワールデンブルグ症候群４ｂ型、非定型溶血性尿毒症症候群５、常染色体優性痙性対麻痺４２、偽性副甲状腺機能低下症、常染色体優性痙性対麻痺３１、ミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺４、脊髄小脳性運動失調症２７、シャルコー・マリー・トゥース病２ａ２型、常染色体優性オーディトリーニューロパチー１、合多指症２、肢帯型筋ジストロフィー１ｃ型、脳回欠損１、脊髄小脳性運動失調症１５、エーラス・ダンロス様症候群、遺伝性運動感覚ニューロパチーＩＩｃ型、低身長顔貌異常および発達遅滞を伴う有毛性肘、アクセンフェルド・リーガー症候群３型、発作性舞踏病アテトーゼを伴う家族性乳児痙攣、急性脊髄性白血病、シャルコー・マリー・トゥース病２ｄ型、感音性難聴を伴う先天性白内障、低身長および精神遅滞を伴うダウン症様顔貌、常染色体優性難聴５、白内障を伴うまたは伴わない高フェリチン血症、斜顔裂１、常染色体優性難聴２ａ、早期乳児てんかん性脳症１、Ｘ連鎖性自閉症への感受性２、アッシャー症候群ＩＩＩａ型、血小板減少橈骨欠損症候群、常染色体劣性ルビノー症候群、肺静脈異常を伴う肺胞毛細血管異形成、弾力繊維性仮性黄色腫、家族性高インスリン性低血糖症１、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、イミノグリシン尿症、チャージ症候群、ウィルムス腫瘍、無虹彩症、泌尿生殖器奇形および精神遅滞症候群、ファロー四徴（症）、常染色体優性痙性対麻痺４、家族性進行性硬化症、クレスト症候群、常染色体優性エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー２、涙腺および唾液腺の形成不全症、網膜芽腫、ダウリング・ドゴー病（Dowling-Degos disease）、原発性肺高血圧症１、クラリーノ症候群、仙椎無形成症候群、プラダー・ウィリー症候群、グレイグ尖頭多合指症候群、若年性ポリポーシス／遺伝性出血性末梢血管拡張症候群、限局性白皮症（Piebald trait）、肢帯型筋ジストロフィー１ｂ型、ベスレムミオパチー、カウデン病、マルファン症候群、腎性低マグネシウム血症２、網脈絡膜症を伴うまたは伴わない小頭症、リンパ浮腫または精神遅滞  食道がんに伴う胼胝腫、歌舞伎症候群１、ヤコブセン症候群、横隔膜ヘルニア、先天性橋本甲状腺炎、開放隅角緑内障１、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、ドーパ反応性ジストニア、発作性運動誘発性ジスキネジア１、原発性萌出不全、ダリエル・ホワイト病、常染色体優性皮膚弛緩症１、コルネリア・デランゲ症候群症候群１、鎖骨頭蓋異形成症、口腔顔面裂１、ファン・デル・ウンデ症候群１、ケルビム症、脳海綿状血管奇形、家族性肥大型心筋症４、ｃａｒｄｉｏ−ｆａｃｉｏ−ｃｕｔａｎｅｏｕｓ症候群、短指症Ｄ型、基底細胞母斑症候群、軟骨無形成症、頭頂孔２、ポトツキ・シェファー症候群（Potocki-Shaffer syndrome）、常染色体優性先天性角化不全症２、言語障害および自閉症的特徴を伴う精神遅滞、Ｔ細胞免疫不全を伴う常染色体優性無汗性外胚葉形成不全症、コルチコステロイド結合グロブリン欠乏症、舞踏病アテトーゼ、甲状腺機能低下症および新生児呼吸窮迫症、原発性コエンザイムＱ１０欠損症１、デュアン・橈側列症候群、家族性片麻痺性片頭痛２、鏡像運動症１、ナジェ型四肢顔面骨形成不全症１、掌蹠点状角化症Ｉａ型、並びに無嗅覚症を伴うまたは伴わない低ゴナドトロピン性性腺機能低下症２である。
【０１４５】
さらに本発明は、ＯＰＡ１産生を増加させることに用いるための、ＯＰＡ１よって影響される疾患の治療で用いるための、特にそのような眼疾患の治療で用いるための上記のようにＯＰＡ１プロモーターを対象とする人工転写因子に関する。ＯＰＡ１によって調節される疾患は、常染色体優性神経萎縮症、常染色体優性神経萎縮プラス、および正常眼圧緑内障である。
【０１４６】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるＯＰＡ１によって影響される疾患を治療する方法に関する。特に本発明は、正常眼圧緑内障または優性視神経萎縮に関連する神経変性を治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１４７】
さらに本発明は、ＴＧＦｂＲ１産生を増加または減少させることに用いるための、ＴＧＦｂＲ１よって影響される病理過程の治療で用いるための、特にそのような眼におけるそのような病理過程の治療で用いるための上記のようにＴＧＦｂＲ１プロモーターを対象とする人工転写因子に関する。ＴＧＦｂＲ１によって調節される病理過程は、眼の手術後の不適合な創傷治癒である。
【０１４８】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、ＴＧＦＢＲ１によって影響される疾患を治療する方法に関する。特に本発明は、正常眼圧緑内障または優性視神経萎縮に関連する神経変性を治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【０１４９】
植物における人工転写因子の使用
さらに本発明は、遺伝子産物生成を向上する植物プロモーターを標的とする人工転写因子の使用に関する。好ましくは、人工転写因子をコードするＤＮＡは植物定着微生物または植物の形質導入用ベクターにクローニングされる。代替的に、人工転写因子は局所適用に好適な組成物で直接植物に適用される。
【０１５０】
ヒト以外の動物における人工転写因子の使用
さらに本発明は、遺伝子産物産生を増強するヒト以外の動物プロモーター、ハプロ不全を標的とする人工転写因子の使用に関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要としているヒト以外の動物への局所適用に好適な組成物の状態で直接適用される。
【実施例】
【０１５１】
ＤＮＡプラスミドのクローニング
クローニングの全工程に関して、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼはニュー・イングランド・バイオラボから購入する。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）はプロメガから購入する。標準的なＰＣＲ反応には全て、高忠実度のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）を適用する。ＤＮＡ断片およびプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄキット、またはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓキット（マッハライ・ナーゲル社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて単離する。オリゴヌクレオチドはシグマ−アルドリッチから購入する。新たに作製されたプラスミドの関連ＤＮＡ配列はすべて、シークエンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社）によって確認した。
【０１５２】
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
ＧＮＮおよび／またはＣＮＮおよび／またはＡＮＮ結合ジンクフィンガー（ＺＦ）モジュールを含む六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改変を含むGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。ＧＮＮ、ＣＮＮ、およびＡＮＮ  ＺＦモジュールをコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）に挿入し、それぞれｐＡＮ１０４９（配列番号２６４）、ｐＡＮ１０７３（配列番号２６５）、およびｐＡＮ１６７０（配列番号２６６）を得た。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ライブラリーの段階的構築はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターで行う。個々のクローニングの各工程の間の、非機能性タンパク質を導く複数のＺＦモジュールの挿入を避けるために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（および１つのＺＦＰ、２つのＺＦＰ、または３つのＺＦＰを含有するその派生製品）、並びにｐＡＮ１０４９、ｐＡＮ１０７３、またはｐＡＮ１６７０を１つの制限酵素と最初にインキュベーションし、その後ＳＡＰで処理する。酵素をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを用いて除去した後、第２の制限エンドヌクレアーゼを加える。
【０１５３】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬのクローニングは、５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＸｈｏＩ、ＳＡＰで処理し、その後続いてＳｐｅＩで処理することによって行なう。１０μｇのｐＡＮ１０４９（１６個の異なるＧＮＮ  ＺＦモジュールの放出）またはｐＡＮ１０７３（１５個の異なるＣＮＮ  ＺＦモジュールの放出）またはｐＡＮ１６７０（１５個の異なるＡＮＮ  ＺＦモジュールの放出）をＳｐｅＩ、ＳＡＰとインキュベーションし、その後続いてＸｈｏＩとインキュベーションすることによってインサートを作製する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬの作製のために、７μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬをＡｇｅＩで切断し、脱リン酸化し、ＳｐｅＩで切断する。１０μｇのｐＡＮ１０４９またはｐＡＮ１０７３またはｐＡＮ１６７０にそれぞれＳｐｅＩ、ＳＡＰを加え、その後続いてＸｍａＩを加えることによってインサートを得る。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬのクローニングを、１４μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬをＡｇｅＩ、ＳＡＰで処理し、その後ＳｐｅＩで処理して切断されたベクターを得ることによって行なった。ＳｐｅＩ、ＳＡＰとインキュベーションし、その後続いてＸｍａＩとインキュベーションすることによって２０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬから３ＺＦＰＬインサートを放出させた。
【０１５４】
１、２、および３つのＺＦＰを含むライブラリーのライゲーション反応を、３：１のインサート：ベクターのモル比で、２００ｎｇの切断ベクター、４００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｌの総容積でＲＴ（室温）にて一晩行なった。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのライゲーション反応は、２００μｌの総容積に、２０００ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬ、５００ｎｇの３ＺＦＰＬインサート、４０００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含み、それを十等分して２０μｌにして、別々にＲＴで一晩インキュベーションした。ライゲーション反応の一部を各ライブラリーに要するクローンの数に応じて数種の方法で大腸菌に形質転換した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬの作製のためには、３μｌのライゲーション反応を直接、大腸菌ＮＥＢ５−アルファのヒートショック形質導入に使用した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬのライゲーション反応のプラスミドＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌ＮＥＢ５−アルファに形質転換した（ＥｑｕｉＢｉｏ社のＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓエレクトロポレーション装置またはエッペンドルフのＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶおよび２５μＦ、バイオ・ラッドの２ｍｍエレクトロポレーションキュベット）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーのライゲーション反応をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットにかけ、ＤＮＡを１５μｌの脱イオン水に溶出した。約６０ｎｇの脱塩したＤＮＡを５０μｌのＮＥＢ１０−ベータエレクトロコンピテント大腸菌（ニュー・イングランド・バイオラボ）と混ぜ、エレクトロポレーションを、ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰｌｕｓまたはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶ、２５μＦ、および２ｍｍエレクトロポレーションキュベットを用いて製造業者の推奨通りに行なった。各ライブラリーについて複数のエレクトロポレーションを行い、その後細胞を直接貯えてライブラリーサイズを増やした。ヒートショック形質導入またはエレクトロポレーションの後、ＳＯＣ培地を細菌に加えた。３７℃にて２５０ｒｐｍで１時間インキュベーションした後、３０μｌのＳＯＣ培養物を連続希釈してアンピシリン含有ＬＢプレートに播いた。翌日、得られたライブラリークローンの総数を決定した。くわえて、各ライブラリーの１０個のクローンを選んでプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素切断によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドの少なくとも３つをシークエンシングしてライブラリーの多様性を確かめた。残りのＳＯＣ培養物を１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に移し、３７℃にて２５０ｒｐｍで一晩培養した。それらの細胞を使用して各ライブラリーのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ＤＮＡを調製した。
【０１５５】
酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを適合プレイベクターに移す。その目的のために、ｐＧＡＤ１０（クロンテック）のマルチプルクローニングサイトに、ベクターをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＯＡＮ９７１（ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣ、配列番号２６７）およびＯＡＮ９７２（ＡＡＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧ、配列番号２６８）を挿入することによって変更した。結果として得られたベクターｐＡＮ１０２５（配列番号２６９）を切断し、脱リン酸化した。６ＺＦＰライブラリーインサートをＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬから出した。ライゲーション反応およびＮＥＢ１０−ベータエレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションを、上記でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーについて記載したように行なった。
【０１５６】
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを改良プレイベクターｐＡＮ１３７５（配列番号２７０）にも移す。このプレイベクターは次のように構築された：ｐＲＳ３１５（配列番号２７１）をＡｐａＩ／ＮａｒＩで切断し、アニールしたＯＡＮ１１４３（ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣ、配列番号２７２）およびＯＡＮ１１４４（ＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧ、配列番号２７３）を挿入してｐＡＮ１３７３（配列番号２７４）を得た。ｐＡＮ１０２５からのＳｐｈＩインサートを、ＳｐｈＩで切断したｐＡＮ１３７３にライゲーションしてｐＡＮ１３７５を得た。
【０１５７】
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを改良プレイベクターｐＡＮ１９２０（配列番号２７５）にも移す。
【０１５８】
いっそうさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーをプレイベクターｐＡＮ１９９２（配列番号２７６）に挿入する。
【０１５９】
酵母ワンハイブリッドスクリーニング用のベイトプラスミドのクローニング
各ベイトプラスミドについて、その中央に１８ｂｐの潜在的な人工転写因子標的部位を含む６０ｂｐ配列を選択し、制限酵素切断解析のためにＮｃｏＩ部位を含める。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断したｐＡｂＡｉ（クロンテック）に直接ライゲーションすることを可能にする５’ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’ＸｈｏＩ部位を作るようにオリゴヌクレオチドを設計してアニールする。生成物をＮｃｏＩで切断して、シークエンシングをしてベイトプラスミドの構築を確認する。
【０１６０】
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエＹ１Ｈ  Ｇｏｌｄはクロンテックから購入し、ＹＰＤ培地およびＹＰＤ寒天はＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ社から購入した。合成ドロップアウト（ＳＤ）培地は、２０ｇ／ｌのグルコース、６．８ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、９．７ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（全てＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ社から）、１．４ｇ／ｌの酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、６．７ｇ／ｌの酵母窒素ベース、０．１ｇ／ｌのＬ−トリプトファン、０．１ｇ／ｌのＬ−ロイシン、０．０５ｇ／ｌのＬ−アデニン、０．０５ｇ／ｌのＬ−ヒスチジン、０．０５ｇ／ｌのウラシル（全てシグマ−アルドリッチから）を含有した。ＳＤ−Ｕ培地はウラシルを除く全ての構成成分を含み、ＳＤ−ＬはＬ−ロイシンを入れずに調製した。ＳＤ寒天プレートはリン酸ナトリウムを含まないが、１６ｇ／ｌのＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（ＢＤ）を含有した。オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）はクロンテックから購入した。
【０１６１】
ベイト酵母株の調製
２０μｌの総容積中で約５μｇの各ベイトプラスミドをＢｓｔＢＩで直線化し、反応混合物の半分をサッカロマイセス・セレビシエＹ１Ｈ  Ｇｏｌｄのヒートショック形質導入に直接使用する。酵母細胞を形質導入の前日に５ｍｌのＹＰＤ培地に播種するのに使用し、ローラー上でＲＴにて一晩培養する。１ミリリットルのこの前培養物を新鮮なＹＰＤ培地で１：２０に希釈し、３０℃にて２２５ｒｐｍで２〜３時間インキュベーションする。各形質導入反応について、１ＯＤ600の細胞を遠心分離によって採取し、酵母細胞を１ｍｌの滅菌水で１回洗い、１ｍｌのＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム）で１回洗う。そして最終的に、酵母細胞を５０μｌのＴＥ／ＬｉＡｃに再懸濁し、５０μｇのサケ精巣由来の一本鎖ＤＮＡ（シグマ−アルドリッチ）、１０μｌのＢｓｔＢＩで直線化したベイトプラスミド（上記）、および３００μｌのＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム、５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０）と混ぜる。細胞とＤＮＡをローラー上でＲＴにて２０分間インキュベーションし、その後４２℃の水浴に１５分間置く。そして最終的に、酵母細胞を遠心分離によって集め、１００μｌも滅菌水に再懸濁し、ＳＤ−Ｕ寒天プレート上に広げる。３０℃で３日間インキュベーションした後、各形質導入反応からＳＤ−Ｕ上に成長している８個のクローンを選び、それらのオーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する感受性を分析する。前培養をローラー上でＲＴにて一晩培養した。各培養物について、ＯＤ600を測定し、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調整した。この最初の希釈から、さらなる５回の１：１０希釈工程を、滅菌水を用いて調製した。各クローンについて、各希釈工程の５μｌを、ＳＤ−Ｕ、ＳＤ−Ｕ  １００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｕ  １５０ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｕ  ２００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡを含む寒天プレート上にスポットした。３０℃で３日間インキュベーションした後、ＳＤ−Ｕ上で良好に成長し、ＡｂＡに最も感受性がある３個のクローンをさらなる分析のために選ぶ。ベイトプラスミドの酵母ゲノムへの安定的な組み込みをＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃｈｅｃｋ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１（クロンテック）で製造業者の取扱説明書に従って確かめる。３個のうち１個クローンを後に続くＹ１Ｈスクリーニングに使用する。
【０１６２】
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質導入
約５００μｌの酵母ベイト株の前培養物を１ＬのＹＰＤ培地に希釈し、３０℃および２２５ｒｐｍでＯＤ600＝１．６〜２．０まで（およそ２０時間）インキュベーションする。細胞をスイングアウトローターで遠心分離によって集める（５分、１５００×ｇ、４℃）。エレクトロコンピテント細胞の調製をBenatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各形質導入反応について、４００μｌのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を１μｇの６ＺＦＰライブラリーをコードするプレイプラスミドと混ぜ、氷上で３分間インキュベーションする。細胞−ＤＮＡ懸濁液を予め冷やした２ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母細胞懸濁液の全てが形質転換されるまで、複数回のエレクトロポレーション反応（ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓエレクトロポレーション装置またはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶおよび２５μＦ）を行う。エレクトロポレーション後、酵母細胞を１００ｍｌのＹＰＤ：１Ｍソルビトールの１：１混合物に移し、３０℃且つ２２５ｒｐｍで６０分間インキュベーションする。細胞を遠心分離によって集め、１〜２ｍｌのＳＤ−Ｌ培地に再懸濁する。２００μｌに分注したものを１０００〜４０００ｎｇ／ｍｌのＡｂＡを含有する１５ｃｍＳＤ−Ｌ寒天プレートに広げる。くわえて、５０μｌの細胞懸濁液を使って１／１００および１／１０００希釈を作り、５０μｌの未希釈細胞および希釈細胞をＳＤ−Ｌ上に播く。プレートを全て３０℃で３日間インキュベーションする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体を含むプレートから計算する。未希釈細胞を含むＳＤ−Ｌプレートは全ての形質転換体の成長を示す一方で、プレイ６ＺＦＰがそのベイト標的部位への結合が成功した場合にのみＡｂＡ含有ＳＤ−Ｌプレートにはコロニーが形成された。
【０１６３】
正の相互作用の検証と６ＺＦＰをコードするプレイプラスミドの回復
初期解析のために、４０個のかなり大きいコロニーを最も高い濃度のＡｂＡを含むＳＤ−Ｌプレートから採り、酵母細胞を１０００〜４０００ｎｇ／ｍｌのＡｂＡを含むＳＤ−Ｌ上に再度二回ストリークして単一コロニーを得た。各クローンについて、１個のコロニーを使って５ｍｌのＳＤ−Ｌ培地に播種し、細胞をＲＴで一晩培養する。翌日、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調整し、５つのさらなる１／１０希釈物を調製し、５μｌの各希釈工程を、ＳＤ−Ｌ、ＳＤ−Ｌ  ５００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、１０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  １５００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２５００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ３０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｌ  ４０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡプレート上にスポットする。クローンをその高ＡｂＡ濃度で成長する能力に従ってランクづける。最も良好に成長したクローンから、５ｍｌの初期ＳＤ−Ｌ前培養を用いて細胞を沈降させ、１００μｌの水または残存培地に再懸濁する。５０Ｕのリチカーゼ（lyticase）（シグマ−アルドリッチ、Ｌ２５２４）の添加後、細胞を水平振とう機で３７℃および３００ｒｐｍにて数時間インキュベーションする。生成したスフェロプラストを１０μｌの２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を加えることによって溶解し、１分間ボルテックスすることによって激しく混ぜ、−２０℃で少なくとも１時間凍らせる。その後、２５０μｌのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＰｌａｓｍｉｄキットのＡ１バッファーおよびスパチュラ先一杯分のガラスビーズ（シグマ−アルドリッチ、Ｇ８７７２）を加え、チューブを１分間ボルテックスすることによって激しく混ぜる。標準的なＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄキットプロトコールを続ける前に、２５０μｌのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＰｌａｓｍｉｄキットのＡ２バッファーを加え、ＲＴで少なくとも１５分間インキュベーションすることによってプラスミドの単離をさらに向上する。３０μｌの溶出緩衝液で溶出後、５μｌのプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５アルファにヒートショック形質導入によって形質転換する。２個の別々のコロニーをアンピシリン含有ＬＢプレートから採り、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートをシークエンシングする。各標的部位に対する６ＺＦＰ中のコンセンサス配列について、得られた結果を解析する。
【０１６４】
分泌ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ組み合せアッセイ用の遺伝子プロモーターのクローニング
プロモーター領域を含むＤＮＡ断片をｐＡＮ１４８５（ＮＥＧ−ＰＧ０４、ジーンコピア（GeneCopeia））またはｐＡＮ１４８６（ＥＦ１ａ−ＰＧ０４、ジーンコピア）にクローニングし、ハプロ不全遺伝子プロモーターの制御下の分泌ガウシアルシフェラーゼおよび恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌胚性（embryonic）アルカリホスファターゼを含み、ルシフェラーゼのアルカリホスファターゼシグナルに対する正規化を可能にするリポータープラスミドが得られる。
【０１６５】
形質導入可能人工転写因子活性を試験するための安定したルシフェラーゼ／分泌アルカリホスファターゼリポーター細胞株の作製用のリポータープラスミドのクローニング
ハイブリッドＣＭＶ／人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼを、恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼとともに含むリポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含む４２ｂｐをｐＡＮ１６６０のＡｆｌＩＩＩ／ＳｐｅＩにクローニングした（配列番号２７７）。これらのリポーターコンストラクトは、ＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ（インビトロジェン）細胞などのＦｌｐＩｎ部位含有細胞への安定した組み込みのためのＦｌｐＩｎ部位を含む。
【０１６６】
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
Ｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）によって作製、または酵母ワンハイブリッドによって選択されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を、標準的な手順（ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ）を用いて哺乳類細胞における、着目したジンクフィンガーアレイ、ＳＶ４０  ＮＬＳ、３×ｍｙｃエピトープタグ、およびＮ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５５−配列番号２７８）、Ｃ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５８−配列番号２７９）、ＳＩＤドメイン（ｐＡＮ１２５７−配列番号２８０）、またはＶＰ６４活性化ドメイン（ｐＡＮ１５１０−配列番号２８１）の間の融合タンパク質としての発現用の哺乳類発現ベクターにクローニングする。
【０１６７】
安定的にトランスフェクションされた、テトラサイクリン誘導可能細胞作製用プラスミドを次にように作製した：ポリダクチルジンクフィンガードメイン、調節ドメイン（Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＶＰ６４）、ＳＶ４０  ＮＬＳ、および３×ｍｙｃエピトープタグを含んでなる人工転写因子をコードするＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（インビトロジェン）にＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩを用いてクローニングする。
【０１６８】
安定的にトランスフェクションされた、テトラサイクリン誘導可能細胞作製用プラスミドを次にように作製した：ポリダクチルジンクフィンガードメイン、調節ドメイン（Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＶＰ６４）、およびＳＶ４０  ＮＬＳを含んでなる人工転写因子をコードするＤＮＡ断片をｐＡＮ２０７１（配列番号２８２）ＥｃｏＲＶ／ＡｇｅＩにクローニングする。これらの人工転写因子発現プラスミドは、ＡＡＶＳ１  Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶＳ１  Ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（ジーンコピア）との共トランスフェクションによってヒトゲノムのＡＡＶＳ１座に組み込まれる。
【０１６９】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、４．５ｇ／ｌ  グルコース、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（全てシグマ−アルドリッチから）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ2、３７℃にて培養する。ルシフェラーゼリポーターアッセイのために、７０００個のＨｅＬａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播いた。翌日、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（キアゲン）を製造業者の取扱説明書に従って使用して共トランスフェクションを行う。３：１の比率で人工転写因子およびルシフェラーゼをコードするＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ調製物を用いる。トランスフェクションの６時間後および２４時間後に、培地をウェルあたり１００μｌの新鮮なＤＭＥＭで取り換えた。
【０１７０】
Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株の作製および維持
安定した、テトラサイクリン誘導可能なＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株をＦｌｐリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔを用いて、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株をｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ標的部位ベクターおよびｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターをトランスフェクションすることによって作製する。誘導可能な２９３発現細胞株の作製のために、着目した遺伝子を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ発現ベクターを、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組み換えを介してＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株のＦＲＴ部位に組み込む。安定したＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）発現細胞株を、（ＤＭＥＭ；１０％  Ｔｅｔ−ＦＢＳ；２ｍＭ  グルタミン；１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン、および１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン）を含む選択培地で維持する。遺伝子発現を誘導するために、テトラサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。
【０１７１】
ＴＡＬＥＮを用いる安定して人工転写因子を発現する細胞株の作製および維持
テトラサイクリン誘導可能なプロモーターの制御下で安定して人工転写因子を発現する細胞株を作製するために、細胞を、着目した人工転写因子を含むｐＡＮ２０７１をベースとした発現コンストラクト並びにＡＡＶＳ１  Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶＳ１  Ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（ジーンコピア）プラスミドで、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン、トランスフェクション試薬）を製造業者の推奨に従って用いて共トランスフェクションする。トランスフェクションの８時間後に成長培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な成長培地を加えた。トランスフェクションの２４時間後、Ｔｅｔ仕様ＦＢＳ（テトラサイクリンを含まないＦＢＳ、タカラ）を含み、抗生物質を含まない成長培地に細胞を１：１０の比率で分けた。トランスフェクションの４８時間後、ピューロマイシン選択を細胞タイプに特異的な濃度で開始し、細胞を選択圧下で７〜１０日保持した。安定細胞のコロニーを貯め、選択培地中で維持した。
【０１７２】
ルシフェラーゼ／ＳＥＡＰプロモーター活性組み合せアッセイ
ＨｅＬａ細胞を、人工転写因子発現コンストラクト並びにハプロ不全プロモーターの制御下の分泌ガウシアルシフェラーゼおよび恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼ（ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット（Gaussia luciferase Glow Assay Kit）、ピアス社；ＳＥＡＰレポータージーンアッセイケミルミネセンス、ロシュ）をもつプラスミドで共トランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、細胞培養上清を集め、ルシフェラーゼ活性およびＳＥＡＰ活性を、Ｓｅｃｒｅｔｅ−Ｐａｉｒ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅアッセイ（ジーンコピア）またはＳＥＡＰリポーター遺伝子アッセイ（ロシュ）を用いて測定した。ジンクフィンガードメインの全てのシステイン残基をセリン残基に交換した不活性人工転写因子用の発現プラスミドとの共トランスフェクションを対照とした。ルシフェラーゼ活性をＳＥＡＰ活性に対して正規化し、対照の百分率割合として表わした。
【０１７３】
タンパク質形質導入後の人工転写因子活性を評価するためのルシフェラーゼリポーターアッセイ
それぞれの人工転写因子に対して適切な標的部位を含むハイブリッドＣＭＶプロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下のＳＥＡＰを含む安定したＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞を調製した。ＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ細胞をｐＡＮ１６６０、ｐＡＮ２２１０（配列番号２８３）、ｐＡＮ１７０５（配列番号２８４）、ｐＡＮ２００１（配列番号２８５）、ｐＡＮ２１２２（配列番号２８６）、またはｐＡＮ２１００（配列番号２８７）でトランスフェクションして、ＥＴＲＡ（ＴＳ−７４）、ＥＴＲＡ（ＴＳ＋５０）、ＦＣＥＲ１Ａ（ＴＳ−１４７）、ＴＬＲ４（ＴＳ−２２２）、ＴＧＦｂＲ１（ＴＳ−３９０）、またはＡＲ（ＴＳ−２３６）をそれぞれ標的とする人工転写因子を試験するための細胞株を作製した。
【０１７４】
これらの細胞をＯｐｔｉＭｅｍ中で、適切な人工転写因子（１μＭ）または対照としてバッファー、関連のない人工転写因子若しくは不活性人工転写因子で２時間処理した。タンパク質形質導入の後に細胞を採取し、通常成長培地に再び播く。ルシフェラーゼおよびＳＥＡＰ活性を２４時間後に製造業者の推奨（ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット、サーモサイエンティフィック；ＳＥＡＰレポータージーンアッセイケミルミネセンス、ロシュ）に従って測定した。ルシフェラーゼの値をＳＥＡＰ活性に対して正規化し、１００％に設定した対照細胞と比較した。
【０１７５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現レベルの決定
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、トータルＲＮＡを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを１０μｌ／ｍｌのβ−メルカプトエタノールを含むＲＬＴ  Ｐｌｕｓ溶解バッファーに再懸濁する。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを用いたホモジナイゼーションの後、溶解物の全てをｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに移してゲノムＤＮＡを除去する。同容積の７０％エタノールを加え、全溶解物をＲＮｅａｓｙスピンカラムに移す。数回の洗浄工程の後、ＲＮＡを最終容積が３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶出する。さらに使用するまでＲＮＡを−８０℃で保存する。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国）を製造業者の取扱説明書に従って用いてｃＤＮＡの合成を行う。２μｌ  １０×バッファー、０．８μｌ  ２５×ｄＮＴＰミックス、２μｌ  １０×ＲＴランダムプライマー、１μｌ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、および４．２μｌ  Ｈ2Ｏを含む２０μｌの総反応容積中でｃＤＮＡ合成を行う。最終容積が１０μｌのＲＮＡを加え、反応を次の条件下で行う：２５℃で１０分、それに続いて３７℃で２時間、および８５℃で５分の最終工程。１μｌの２０×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１０．０μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ともにアプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国）、および８μｌのＨ2Ｏを含む２０μｌの総反応容積中で定量ＰＣＲを実施する。各反応に１μｌのｃＤＮＡを加える。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国）を使用して次の条件下でｑＰＣＲを行う：５０℃で２分間の開始工程の後に、９５℃で１０分間の第一の変性並びに９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルからなるさらなる工程が続く。
【０１７６】
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
人工転写因子とＴＡＴタンパク質形質導入ドメインの間にＨｉｓ6タグ融合タンパク質として大腸菌で発現するためのｐＥＴ４１ａ＋（ノバジェン）をベースとする細菌発現ベクターｐＡＮ９８３（配列番号２８８）に、ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩを用いる標準的な手順で人工転写因子をコードするＤＮＡ断片をクローニングする。配列番号２８のカテプシンＢ切断部位を含むカテプシンＢ感受性人工転写因子の発現のために、人工転写因子をコードするＤＮＡ断片を標準的な手順（ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ）を用いて細菌発現用ベクターｐＡＮ１６８８（配列番号２８９）にクローニングする。
【０１７７】
ＥＴＲＡ、ＦｃＥＲ１Ａ、ＴＬＲ４、ＡＲ、ＯＰＡ１、またはＴＧＦｂＲ１を標的とする、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な大腸菌宿主細菌でのカテプシンＢ感受性形質導入可能人工転写因子の細菌による産生用の発現コンストラクトは、ｐＡＮ１６８８、ｐＡＮ１８８０（配列番号２９０）、ｐＡＮ１９６６（配列番号２９１）、ｐＡＮ２０５４（配列番号２９２）、ｐＡＮ２０５６（配列番号２９３）、ｐＡＮ２０５８（配列番号２９４）、ｐＡＮ２０６０（配列番号２９５）、ｐＡＮ２０６２（配列番号２９６）、ｐＡＮ２０６４（配列番号２９７）、ｐＡＮ２１０４（配列番号２９８）、ｐＡＮ２１１２（配列番号２９９）、ｐＡＮ２１１４（配列番号３００）、ｐＡＮ２１１６（配列番号３０１）、ｐＡＮ２１３２（配列番号３０２）、ｐＡＮ２１３４（配列番号３０３）、ｐＡＮ２１５９（配列番号３０４）、ｐＡＮ２１６０（配列番号３０５）、ｐＡＮ２１６１（配列番号３０６）、ｐＡＮ２２８６（配列番号３０７）、ｐＡＮ２２８７（配列番号３０８）、ｐＡＮ２２８８（配列番号３０９）、ｐＡＮ２２８９（配列番号３１０）、ｐＡＮ２２９０（配列番号３１１）、ｐＡＮ２２９１（配列番号３１２）、ｐＡＮ２２９２（配列番号３１３）、ｐＡＮ２２９３（配列番号３１４）、ｐＡＮ２３２３（配列番号３１５）、ｐＡＮ２３２６（配列番号３１６）、ｐＡＮ２３２８（配列番号３１７）、ｐＡＮ２３３１（配列番号３１８）、およびｐＡＮ２３３４（配列番号３１９）である。
【０１７８】
人工転写因子タンパク質の作製
所与の人工転写因子用の発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００μＭ  ＺｎＣｌ2を補充した１ｌのＬＢ培地でＯＤ600が０．８〜１に達するまで培養し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで２時間誘導した。細菌を遠心分離によって採取し、細菌溶解物をソニケーションによって調製し、封入体を精製した。この目的のために、封入体を遠心分離（５０００ｇ、４℃、１５分）によって集め、２０ｍｌの結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．５）で３回洗った。精製した封入体を３０ｍｌの結合バッファーＡ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）に氷上で１時間可溶化した。可溶化した封入体を４℃にて１３，０００ｇで４０分間遠心分離し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターを通してろ過した。ヒスチジンタグ人工転写因子を結合バッファーＡおよび溶出バッファーＢ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）を用いてＡｋｔａｐｒｉｍｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア）のＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムで精製した。精製した人工転写因子を含む画分を貯め、ＳＩＤドメインを含む人工転写因子の場合はバッファーＳ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ７．５）に対して、またはＫＲＡＢドメインを含む人工転写因子はバッファーＫ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ８．５）に対して４℃で一晩透析した。透析に続いて、タンパク質試料を１４，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離し、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターチップ（ミリポア）を用いて滅菌ろ過した。ＶＰ６４活性化ドメインを含む人工転写因子については、タンパク質を可溶性画分（結合バッファー：５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；溶出バッファー：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）から、Ｈｉｓ−Ｂｏｎｄ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ノバジェン）を製造業者の推奨に従って用いて作製した。タンパク質をＶＰ６４−バッファー（５５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、４００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2）に対して透析した。
【０１７９】
ＥＬＤＩＡ（酵素結合ＤＮＡ相互作用アッセイ）を用いた人工転写因子のＤＮＡ結合活性の決定
ＢＳＡで予めブロックされた（pre-blocked）ニッケルコートプレート（ピアス社）を洗浄バッファー（２５ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３時間洗う。プレートに精製した人工転写因子を保存バッファーに飽和する条件（５０ｐｍｏｌ／ウェル）下でコーティングし、ＲＴで少し振とうしながら１時間インキュベーションする。３回の洗浄工程の後、１×１０-12〜５×１０-7Ｍの、６０ｂｐのプロモーター配列を含むアニールされたビオチン化オリゴを、結合バッファー（１０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％  グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１００μＭ  ＺｎＣｌ2）中で非特異的競合物（competitor）（０．１ｍｇ／ｍｌ  サケ精子由来ｓｓＤＮＡ、シグマ）の存在下で、結合人工転写因子とともにＲＴで１時間インキュベーションする。洗浄（５時間）後、ウェルを３％  ＢＳＡでＲＴにて３０分間ブロックする。抗ストレプトアビジンＨＲＰを結合バッファーにＲＴで１時間加える。５回の洗浄工程の後、ＴＭＢ基質（シグマ）を加え、ＲＴで２〜３０分間インキュベーションする。ＴＭＢストップ溶液（シグマ）を加えることによって反応を止め、試料吸光度を４５０ｎｍで読み取る。リガンド結合速度論のデータ解析をＨｉｌｌに従ってシグマプロットＶ８．１を用いて行う。
【０１８０】
タンパク質形質導入
培養密度が約８０％にまで成長した細胞を２時間〜１２０時間、０．０１〜１μＭの人工転写因子で処置または模擬処理し、随意に２４時間毎に人工転写因子をＯｐｔｉＭＥＭまたは成長培地に３７℃で加える。随意に１０〜５００μＭのＺｎＣｌ2を成長培地に加える。免疫蛍光のために、細胞をＰＢＳで１回洗い、トリプシン処理し、さらなる試験のためにカバーガラス上に播く。
【０１８１】
免疫蛍光
細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１５％トリトンＸ−１００で１５分間処理し、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックし、マウス抗ＨＡ抗体（１：５００、Ｈ９６５８、シグマ）またはマウス抗ｍｙｃ（１：５００、Ｍ５５４６、シグマ）で一晩インキュベーションする。試料をＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗い、アレクサフルオル５４６結合ヤギ抗マウス抗体（１：１０００、インビトロジェン）でインキュベーションし、ＤＡＰＩ（１：１０００の１ｍｇ／ｍｌ、３分間、シグマ）を用いて対比染色する。蛍光顕微鏡観察を用いて試料を解析する。
【０１８２】
ウェスタンブロッティング
タンパク質レベルを測定するために、ＲＩＰＡバッファー（ピアス社）を用いて細胞を溶解し、タンパク質溶解物をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーと混ぜる。タンパク質を粗そ大きさに従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、エレクトロブロッティングを用いてニトロセルロース膜に移す。マウスまたはウサギで産生させた特異的な一次抗体を用いてタンパク質の検出を行う。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体および発光に基づく検出（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ、ピアス社）、または赤外線レーザースキャナーを用いて検出および定量される蛍光性ＤｙＬｉｇｈｔ７００若しくはＤｙＬｉｇｈｔ８００を結合した二次抗体のいずれかによって一次抗体の検出を行う。
【０１８３】
ミトコンドリアの機能の測定
フローサイトメトリー解析のために、処理した細胞を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて採取する。模擬処理をした細胞を対照として使用する。ミトコンドリア膜電位を測定するために、細胞をＦＡＣＳバッファーＰ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ  ４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、シグマ）、１０ｎＭ  テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、シグマ））に再懸濁し、分析前に３７℃で３０分間インキュベーションする。ミトコンドリア膜電位を消失させる５０μＭ  カルボニルシアニド  ３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ、シグマ）での処理を対照とした。ミトコンドリア量の測定のために、細胞をＦＡＣＳバッファーＭ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ、および１００ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（インビトロジェン））に再懸濁し、分析前に３７℃で３０分間インキュベーションする。ミトコンドリアのＲＯＳ測定のために、細胞をＦＡＣＳバッファーＲ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ、および５μＭ  ＭｉｔｏＳＯＸ（インビトロジェン））に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーＲ２（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）に再懸濁する。フローサイトメトリー解析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いてＣｙＡｎADP（ダコ社）で行う。
【０１８４】
細胞アポトーシスの測定
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ＥＭグレードパラホルムアルデヒド（ピアス社、２８９０８）でＲＴにて３０分間固定する。次に、細胞をＰＢＳ中の０．１５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００でＲＴにて１５分間透過処理した後、ＰＢＳ中の１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでＲＴにて１時間ブロッキングする。試料をブロッキングバッファーで希釈したマウス抗シトクロムｃ抗体（ＢＤバイオサイエンス、５５６４３２、１：１０００）とともに４℃で一晩インキュベーションする。細胞をブロッキングバッファーで１５分間、３回洗浄し、その後アレクサフルオル５４６結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン）でＲＴにて１時間インキュベーションする。アポトーシスの尺度としてシトクロムｃ放出を盲検観察者（blinded observer）による蛍光顕微鏡観察によって解析する。模擬処理をした細胞を対照とした。
【０１８５】
カルシウム流測定
細胞を９６ウェルのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）細胞ＢＩＮＤ（登録商標）プレートに播き、加湿インキュベーター（３７℃；５％ＣＯ2）内で付着させる。翌日、カルシウム５アッセイキット（モレキュラーデバイス、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて細胞を次のように載せた：懸濁細胞に関して、ローディングバッファーをＨＢＳＳ／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の２倍溶液として調製し、１ウェル当たり１００μｌを１００μｌの培養培地を入れたウェルに加える。付着細胞に関して、ローディングバッファーをＨＢＳＳ／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の１倍溶液として調製し、１ウェル当たり１００μｌを培養培地吸引後にウェルに直接加える。指示のあるときは、最終ウェル濃度が２．５ｍＭになるようにプロベネシドをローディングバッファーに加える。リガンドの希釈については、ＨＢＳＳ／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を使用する。カルシウムアッセイを製造業者の取扱説明書に従ってＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（モレキュラーデバイスモレキュラーデバイス、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）上で実施する。データ分析をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアを用いて行う。
【０１８６】
ヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ）格子収縮アッセイ
２５０μｌの無菌ウシコラーゲン（３．１ｍｇ／ｍｌ；＃５００５−Ｂ、Ｎｕｔａｃｏｎ社）を、ｐＨ７．４になるように３０μｌの１０×ＰＢＳおよび２２．５μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨと混ぜた。２００μｌのＳＭＣ培地２中の２５０００個のｈＵｔＳＭＣを中和したコラーゲンに加え、静かに混ぜ、２４ウェル組織培養プレートに移し、３７℃、５％ＣＯ2で４５分間重合させた。重合させた後、５００μｌのＳＭＣ成長培地２を加えた。人工転写因子で処理するために、重合直後並びに２４時間後および４８時間後に再度、１μＭ  ＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳＮＰＳまたは対照として適切な量のバッファーを加えた。重合の７２時間後に、静かに揺らすか、またはスパチュラを用いて格子を血管壁から剥がし、１００ｎＭのＥＴ−１またはバッファー対照を加えた。格子をスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた画像解析によって格子面積を求めた。
【０１８７】
ヒト冠血管収縮アッセイ
ヒト冠状動脈を切断し、長さ約２ｍｍの環状セグメントに切り、一つ一つ９６ウェル培養プレートのウェルに置いた。血管をペニシリン（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、および１μＭＥＴＲＡ＋７４ＶｒｅｐＳまたは媒体対照を補充した２５０μｌのＲＰＭＩ培地中でインキュベーションした。血管を３７℃で空気中５％ＣＯ2の加湿雰囲気で３日間インキュベーターにて培養した。培地を２４時間毎に交換した。培地交換の１時間前に３ｎＭ  エンドセリンを血管に加えた。インキュベーションに続いて、血管をＰＳＳ（１１９．０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳ０4、２４．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、および１１．１ｍＭ  グルコース）を含むミオグラフバス（ＤＭＴ）に載せ、９５％Ｏ2および５％ＣＯ2で通気し、３７℃の温度で維持した。組織をカリウムＰＳＳ（ＫＰＳＳ；６２．５ｍＭ）に３回曝し、ＰＳＳで洗い、ベースラインに戻らせた。次に組織をＵ４６６１９（１００ｎＭ）の曝した後、ブラジキニン（１０μＭ）とともにインキュベーションした。次いで組織を洗い、ベースラインに戻らせ、累積濃度反応曲線（０、１、３、１０、３０、１００、３００ｎＭ  エンドセリン−１）のエンドセリン−１に曝した。
【０１８８】
ヒト化ＮＳＧマウスにおけるアナフィラキシーの測定
少なくとも２５％のヒトＣＤ４５＋細胞の生着レベルをもつヒト化ＮＳＧマウス（２頭の動物／群−ジャクソン研究所）を、アナフィラキシーの誘発の９６時間前および４８時間前に、ＩｇｅＲ−１４７ＡｒｅｐＳ（３０ｍｇ／ｋｇ静注）または媒体対照で処置した。マウスを抗ＤＮＰ  ＩｇＥ（３μｇ静注）を用いて感作し、ＤＮＰ−ＢＳＡ（５００μｇ静注）または対照としてＢＳＡ（５００μｇ静注）で処置してアナフィラキシーを起こした。アナフィラキシー刺激誘因を加えた直後の３０分間は５分毎に、次の９０分間は１５分毎に、続く２時間は３０分毎に直腸温を測定することによって体温を評価した。体温が３０℃未満に落ちた場合には動物を安楽死させた。
【図１】
2016515595.tif 000002
【図２】
2016515595.tif 000003
【図３】
2016515595.tif 000004
【図４】
2016515595.tif 000005
【図５】
2016515595.tif 000006
【図６】
2016515595.tif 000007
【図７】
2016515595.tif 000008
【図８】
2016515595.tif 000009
【図９】
2016515595.tif 000010
【図１０】
2016515595.tif 000011
【図１１】
2016515595.tif 000012
【図１２】
2016515595.tif 000013
【配列表】
2016515595000001.app
【国際調査報告】
2016515595.tif 000014
2016515595.tif 000015
2016515595.tif 000016
2016515595.tif 000017