(57)【要約】  本発明は、ウイルス不活性化生物学的液体又は乾燥混合物及びその調製物に関する。主として、本発明は、限定されるものではないが、血小板原料に由来する混合物に関する。
2016503789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス安全性のある生物学的液体混合組成物を生物学的原料から調製するための方法であって、該方法は、
該原料を提供する工程と、
両親媒性ポリマーを提供する工程と、
該原料を、ウイルス不活性化が可能な溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）、及び該両親媒性ポリマーで処理する工程と、
該処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、該Ｓ／Ｄを除去する工程と、
非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含み、
該方法は、少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理を含み、
これによって、ウイルス安全性のある生物学的液体混合組成物を得る、方法。
【請求項２】
前記Ｓ／Ｄを除去する工程により、油抽出の更なる工程が省略される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＩＣ樹脂が、カラム中に充填される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記原料が、細胞、細胞粒子及び／又は細胞小器官を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記原料が、血液バフィーコートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記原料が、血小板を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記原料が、複数のドナーからプールされた血小板富化分画である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記両親媒性ポリマーが、炭化水素系界面活性剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記両親媒性ポリマーが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記原料が、先ず初めに前記Ｓ／Ｄに接触させられ、次に前記両親媒性ポリマーに接触させられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＰＶＰの濃度が、約０．０１〜０．９ｍＭの範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＰＶＰの濃度が、約０．０１〜０．３ｍＭの範囲である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＰＶＰの濃度が、約０．０２５〜０．３ｍＭの範囲である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＨＰＭＣの濃度が、約０．０１〜０．３ｍＭの範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記樹脂を有機溶媒及び／又は塩を含む溶液で洗浄する工程と、該洗浄工程後に得られる分画を回収し、前記非結合分画と混合する工程と、を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機溶媒が、エタノールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記塩が、ＮａＣｌである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理が、熱不活化を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記物質を濃縮する工程を更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記物質を乾燥させることによって、ウイルス安全性のある生物学的乾燥混合物とする工程を更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的原料から生物学的液体混合組成物を調製するための方法であって、該方法は、
該原料を提供する工程と、
ＰＶＰ及び／又はＨＰＭＣを提供する工程と、
該原料を、ウイルス不活性化が可能な溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）、及び該ＰＶＰ及び／又はＨＰＭＣで処理する工程と、
該処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、該Ｓ／Ｄを除去する工程と、
非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、ウイルス不活性化生物学的液体又は乾燥混合物に関し、また、その調製物に関する。主として、本発明は、限定されるものではないが、ウイルス不活性化血小板抽出物及びその調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、止血及び治癒において根本的な役割を果たす、小さくて不規則な形の無核細胞である。血小板は、あらかじめ合成されたタンパク質の完全なアレイを含み、その中にはシグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、膜タンパク質、及び調節タンパク質がある。血小板は、成長因子（ＧＦ）、サイトカイン、及びケモカインなどの多くの生理活性分子を含む血小板顆粒を含有することに主に起因して、治癒損傷における組織再生及び治癒の主要段階に関与する。
【０００３】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血小板成長因子は、次の創傷治癒カスケード：炎症、増殖、及び組織修復段階の全ての段階における中心的存在である。
【０００４】
研究により、血小板由来成長因子は、血管形成、有糸分裂誘発、細胞増殖、好中球及びマクロファージ、コラーゲン合成、創面収縮、細胞外マトリックス合成、上皮形成、並びに走化性を刺激することが示されている。
【０００５】
血小板は、例えば止血を改善するために、輸血で日常的に使用される。近年、血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）（ＰＲＰゲル、血小板ゲル、ＰＲＰクロットなどとも呼ばれる）の形態で用いられることが多くなっている。典型的には、ＰＲＰは、一定限度の量の血漿に濃縮された自己血小板からなるエクスビボ調製物である（Ｌａｃｃｉ  ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ  Ａ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｍａｒ；８３（１）：１〜９）。
【０００６】
局所適用の場合、ＰＲＰは、通常、トロンビン及び／又はＣａＣｌ２を加えることによって活性化され、トロンビン（内因性又は外因性）とフィブリノーゲンとの間の相互作用によってフィブリンゲルが形成される。活性化すると、血小板は活発に脱顆粒し、ＧＦを含む様々なメディエーターを放出する（Ｌａｃｃｉ  ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ  Ａ，２０１０）。注射でのＰＲＰの使用は現在、小さいが急成長している市場分野となっている。軟組織及び硬組織の増強においてＰＲＰを使用する理論的根拠は、非治癒損傷における組織再生を増進する、創傷成熟、脈管化、及び上皮形成を早める、瘢痕形成を低減する、並びに術後の合併症及び死亡率を低減するその能力である（Ｌａｃｃｉ  ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ  Ａ，２０１０）。
【０００７】
活性化ＰＲＰを種々の細胞型と一緒に使用する研究は、因子、例えばＰＲＰから放出された成長因子が、細胞増殖を誘起することができることを示し（例えば、Ｋａｎｎｏら、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ．２００５  Ｍａｒ；６３（３）：３６２〜９；Ｂｅｒｔｒａｎｄ−Ｄｕｃｈｅｓｎｅら、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｐｅｒｉｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｆｅｂ；４５（１）：８７〜９３；Ｋａｋｕｄｏら、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２００８  Ｎｏｖ；１２２（５）：１３５２〜６０）、ヒト内皮細胞の血管新生能力を調節できることを示し（Ｓｕｌｐｉｃｅら、Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＶＥＧＦ−Ａ  ａｎｄ  ＨＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｓｅｐ；１０１（９）：５２５〜３９；Ｒｕｇｈｔｔｉら、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｅｌ−ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．２００８  Ｊａｎ；６（１）：１２〜７）、及び骨誘導特性を誘起できることを示している（Ｉｎｔｉｎｉ  Ｇ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００９  Ｏｃｔ；３０（２８）：４９５６〜６６）。更に、活性化ＰＲＰは、インビトロ細胞成長を支援し、かつ、骨髄腫細胞、融合細胞、肝細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞などの多くの標的細胞の生存能力を、ウシ胎児血清による支援レベルと同等又はそれより優れたレベルで維持することが見出された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ：ａ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ？Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００３  Ｊｕｌ；４２（２）：６７〜７４）。
【０００８】
ＰＲＰ及び放出される成長因子は、現在、主に整形外科及び口腔外科における様々な外科的組織再生治療で用いられている（Ｎｕｒｄｅｎら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００８  ｍａｙ  １；１３：３５３２〜４８）。整形外科では、ＰＲＰは、主に、膝関節形成術、腰椎固定術のため、また、椎間板変性において用いられる（Ｎｕｒｄｅｎら、２００８参照）。歯科及び顎顔面外科手術におけるＰＲＰの用途としては、主に、チタンインプラントの圧密、上顎洞底挙上術、及び骨再形成が挙げられる（Ｎｕｒｄｅｎら、２００８参照）。ＰＲＰは、腱及び靱帯修復、顔面美容整形手術及び再建手術、慢性的な皮膚創傷の治癒、眼科学、顔面神経再生のため、並びに心臓手術及び肥満手術において使用されることも多くなっている（Ｎｕｒｄｅｎら、２００８参照）。
【０００９】
しかしながら、自己ＰＲＰ及び放出因子の現行の使用の重大な短所は、標準化ができていないことにある。注目すべきことに、ＰＲＰの調製のための種々の手作業による、半自動化及び完全自動化システムは市販されおり、これらは調製時間、血小板収率及び収集効率などのパラメータで異なる（Ｍａｚｚｕｃｃｏら、Ｎｏｔ  ｅｖｅｒｙ  ＰＲＰ−ｇｅｌ  ｉｓ  ｂｏｒｎ  ｅｑｕａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｆｏｕｒ  ＰＲＰ−ｇｅｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｆｉｂｒｉｎｅｔ，ＲｅｇｅｎＰＲＰ−Ｋｉｔ，Ｐｌａｔｅｌｔｅｘ  ａｎｄ  ｏｎｅ  ｍａｎｕａｌ  ｐｒｅｃｅｄｕｒｅ．Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．２００９  Ａｕｇ；９７（２）：１１０〜８）。
【００１０】
別の重要な可変項目は、血小板活性化のために使用される手法であり［自己、異種若しくは組換えトロンビン、塩化カルシウム又はバトロキソビン（Ｒｏｚｍａｎ  Ｐ，Ｂｏｌｔａ  Ｚ著、Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｗｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｏｌ  Ａｌｐ  Ｐａｎｏｎｉｃａ  Ａｄｒｉａｔ．２００７  Ｄｅｃ；１６（４）：１５６〜６５）］、これにより顆粒放出の効率及び分泌されたＧＦの量に影響を及ぼし得る（Ｒｏｚｍａｎ  Ｐ，Ｂｏｌｔａ  Ｚ，２００７）。更に、血小板は、機械的応力、及び周囲環境の変化に非常に敏感であるので、意図する活性化段階に先立って、加工中に、血小板が活性化されたり、ＧＦが放出される場合がある（Ｍａｚｚｕｃｃｏら、２００９）。この制御されていない活性化は、異なるＰＲＰ調製システムを使用する場合、最終生産物の組成の変動性を更に増加させ得る。その上、自己ＰＲＰ調製の主な固有の欠点は、血小板ＧＦの含有量が個体間で異なるため、準最適な結果を招く可能性があることである。最後に、自己ＰＲＰを扱う仕事をするに当たっては、専用の機械、使い捨てＰＲＰ処理キット、及び訓練された人材の必要性による経済的負担を考慮する必要がある。
【００１１】
背景技術としては、Ｓｕら、「Ａ  ｖｉｒａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．２００９  Ａｕｇ；９７（２）：１１９〜１２８；Ｂｕｒｎｏｕｆら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖｉｒａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ，ＥＧＦ  ａｎｄ  ＩＧＦ，ａｎｄ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｏｆ  ＰＤＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ」．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０  Ａｕｇ  ６；５６（４）：１５１〜６０；及び米国特許公開第２０１２−０１５６３０６号が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様では、本発明は、ウイルス安全性のある生物学的液体混合物を調製するための方法に関し、該方法は、生物学的液体混合物を提供する工程と、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、Ｓ／Ｄで処理された混合物を両親媒性ポリマーに接触させる工程と、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、かつ／又は油抽出によってＳ／Ｄを除去する工程と、ＨＩＣからのフロースルー分画及び／又は油抽出からの液体分画を含む物質を回収する工程と、この物質を少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理に供する工程と、を含む。
【００１３】
本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーは、非毒性である。
【００１４】
更に、本発明の他の実施形態では、両親媒性ポリマーは、炭化水素系界面活性剤である。
【００１５】
更に、本発明の他の実施形態では、両親媒性ポリマーは、約３．５キロダルトン〜約４０キロダルトン未満の範囲の平均分子量を有する。
【００１６】
本発明の一実施形態では、平均分子量は、約３０キロダルトンである。
【００１７】
更に、本発明の他の実施形態では、炭化水素系界面活性剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【００１８】
本発明の一実施形態では、ＰＶＰは、約３０キロダルトン（ｋＤａ）の平均分子量を有する。
【００１９】
本発明の一実施形態では、ＨＩＣは、Ｓ／Ｄで処理され、かつポリマーに接触させた混合物をＨＩＣに導入する（load）工程と、有機溶媒及び／又は塩を含む溶液で洗浄する工程と、洗浄された分画を回収する工程とを含む。
【００２０】
本発明の一実施形態では、有機溶媒はエタノールである。
【００２１】
本発明の一実施形態では、塩はＮａＣｌである。
【００２２】
本発明の他の実施形態では、少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理が、熱不活性化を含む。
【００２３】
本発明の一実施形態では、本方法は、物質を濃縮する工程を更に含む。
【００２４】
本発明の一実施形態では、本方法はウイルス安全性のある血小板抽出物を調製する方法であり、生物学的液体混合物は、血小板富化分画である。
【００２５】
本発明の一実施形態では、回収された物質は、ＨＩＣの洗浄された分画と組み合わされたＨＩＣフロースルー分画を含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本発明の方法により得られる、ウイルス安全性のある生物学的液体混合物に関する。
【００２７】
本発明の一実施形態では、ＰＶＰ  Ｋ２５の濃度は、０．１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）未満の範囲である。
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、ＰＶＰ  Ｋ２５の濃度は、０．１％（ｗ／ｗ）〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００２９】
本発明の一実施形態では、ウイルス安全性のある生物学的液体混合物中のＰＶＰ  Ｋ１７、Ｋ２５、Ｋ３０の濃度は、０．０１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、生物学的液体混合物は、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦが富化された血小板抽出物である。
【００３１】
別の態様において、本発明は、Ｓ／Ｄを含む生物学的液体混合物から溶媒−界面活性剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法に関し、この方法は、Ｓ／Ｄを含む混合物を提供する工程と、この混合物を両親媒性ポリマーに接触させる工程と、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、かつ／又は油抽出によって、混合物からＳ／Ｄを除去する工程と、ＨＩＣからのフロースルー分画及び／又は油抽出からの液体分画を含む物質を回収する工程と、を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーは、非毒性である。
【００３３】
本発明の一実施形態では、生物学的液体混合物は、血小板富化分画である。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、この混合物はケモカイン、サイトカイン、成長因子、栄養因子、又はこれらの混合物を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態では、ＨＩＣは、有機溶媒及び／又は塩を含む溶液で洗浄する工程と、洗浄された分画を回収する工程とを含む。
【００３６】
本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーは、炭化水素系界面活性剤である。
【００３７】
本発明の一実施形態では、炭化水素系界面活性剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【００３８】
本発明の一実施形態では、有機溶媒はエタノールである。
【００３９】
本発明の一実施形態では、塩はＮａＣｌである。
【００４０】
本発明の一実施形態では、回収された物質は、洗浄された分画と組み合わされたフロースルー分画を含む。
【００４１】
本発明の方法の一実施形態では、原料を先ず初めにＳ／Ｄに接触させ、次いで両親媒性ポリマーに接触させる。
【００４２】
本方法のいくつかの実施形態では、Ｓ／Ｄで処理された原料中のＰＶＰ濃度は、約０．０１〜０．９ｍＭ、０．０１〜０．３ｍＭ、又は０．０２５〜０．３ｍＭの範囲である。
【００４３】
本方法のいくつかの実施形態では、Ｓ／Ｄで処理された原料中のＨＰＭＣ濃度は、約０．０１〜０．３ｍＭの範囲である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本方法は、前記物質を乾燥させることによって、生物学的乾燥混合物とする工程を更に含む。
【００４５】
ある特定の態様においては、生物学的原料から生物学的液体混合組成物を調製するための方法が開示される。この方法は、原料を提供する工程と、ＰＶＰ及び／又はＨＰＭＣを提供する工程と、原料を、ウイルス不活性化が可能な溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）、及びＰＶＰ及び／又はＨＰＭＣで処理する工程と、処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによってＳ／Ｄを除去する工程と、ＨＩＣからの非結合分画を含む材料を回収する工程と、を含む。
【００４６】
ある特定の態様においては、開示された方法によって得られる生物学的液体混合組成物が開示される。
【００４７】
一実施形態では、前記組成物は、約０．０７〜６ｍＭ、０．０７〜２ｍＭ、又は０．１７〜２ｍＭの範囲のＰＶＰの濃度を含む。
【００４８】
別の実施形態では、前記組成物は、約０．０７〜１．５ｍＭの範囲のＨＰＭＣの濃度を含む。
【００４９】
ある特定の態様において、両親媒性ポリマーと、ケモカイン、成長因子、サイトカイン、栄養因子及びこれらの混合物からなる群から選択される血小板由来タンパク質と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物であって、該両親媒性ポリマーが、約０．０７〜６ｍＭの範囲の濃度のＰＶＰ、又は約０．０７〜１．５ｍＭの範囲の濃度のＨＰＭＣである、組成物が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Ｓ／Ｄ除去よりも前に溶解物をヘパリンに接触させることによって得られる血小板抽出物で処理された３Ｔ３線維芽細胞の増殖を示す（処理２及び４）。Ｓ／Ｄ除去よりも前に溶解物をヘパリンに接触させることなく調製された血小板抽出物は、対照としての役割を果たした（処理１及び３）。
【図２】Ｓ／Ｄ除去よりも前に又はＳ／Ｄ除去中に、溶解物を低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）と接触させることによって調製された血小板抽出物で処理された３Ｔ３線維芽細胞の増殖を示す（処理２）。Ｓ／Ｄ除去よりも前に、溶解物を低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）に接触させることなくＳ／Ｄ除去後に得られる血小板抽出物は、対照としての役割を果たした（処理１）。
【図３】異なる分子量のＰＶＰポリマー：ＰＶＰ  Ｋ２５−処理３、又はＰＶＰ  Ｋ３０−処理７の存在下で、Ｓ／Ｄ除去後に得られる抽出物で処理された３Ｔ３線維芽細胞の増殖を示す。
【図４】異なる濃度のＰＶＰを含む抽出物で処理された３Ｔ３線維芽細胞の増殖を示す。試料１７（処理１７）及び試料１９（処理１９）は、Ｓ／Ｄ除去の第２の洗浄において異なり、ここでは、それぞれ０．１％のＰＶＰ及び０．５％のＰＶＰが使用された。
【図５】ＰＶＰ  Ｋ２５の存在下でのＳ／Ｄ除去後（処理１）又はヘパリンの存在下でのＳ／Ｄ除去後（処理２）に得られる、大規模な血小板抽出物で処理された３Ｔ３線維芽細胞の増殖を示す。  加えて、全ての図は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって計算されたＲ２適合値、半有効濃度（ＥＣ５０）、及び９５％信頼区間のＥＣ５０値を含む。
【図６】手術実施後２週間目のラットの背側の皮弁（ｆｌａｐ）（３×１０ｃｍ）を示す。この皮弁は、頭蓋から尾部へ向かう方向に持ち上げられた。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、試料が組織学的分析用に採取された、別々の領域を示す。Ａは、尾部皮弁付着部に最も近く、したがって最も治癒し、一方Ｅは、皮弁の頭蓋側端部にあり、高レベルの壊死（暗色）を示している。腹部及び胸部の内臓を、腹側正中切開（皮弁の中心に沿った線）を通して除去した。
【図７】正常な皮膚及び治癒中の皮膚についての典型的な染色パターンを示す：Ｈ＆Ｅ染色（表皮過形成、スコア１、治癒プロセス完了後の表皮、スコア０）、皮膚及び上皮増殖についてのＰＣＮＡ染色（増殖組織、スコア１、並びに正常組織、スコア０）及びケラチン６染色（治癒中の皮膚についての基底層上染色、スコア１、並びに正常な皮膚についての基底層染色、スコア０）。
【図８】組織鉗子を使用して創傷床から領域Ａ〜Ｃ（図６を参照）内で皮弁を緩やかに引っ張ることによって試験されたときの、２週間後のラット背側皮弁の付着等級についてのスコアを示す。皮弁（ｓｋｉｎ  ｆｌａｐ）の基底組織への付着を、皮膚の正常な領域への付着に対して比較し、以下のように１〜３に等級付けした：１＝付着なし〜低い付着、２＝低いが正常な付着に近い、又は３＝皮弁と下にある組織との間のほぼ正常な付着。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、ウイルス安全性のある血小板抽出物などのウイルス安全性のある生物学的液体混合物を調製するための方法に関する。血小板は、組織再生及び治癒過程の主要段階に関与する因子の完全なアレイを含む。現在、創傷治癒を促進するために、（患者由来の）全自己活性化血小板が用いられている。しかしながら、全自己血小板の使用には、複数の欠点、とりわけ標準化が欠如していること、患者自身の血小板に治癒に必要な因子が不足している場合があること、血小板因子の混合物を調製するために特殊な装置が必要であること、手順は時間がかかり、かつ患者自身が行う追加の工程を必要とすること、及び医学的に訓練された人材を必要とすること、が存在する。これらの問題は、例えば、複数のドナーから調製された血小板抽出物を用いることによって解決され得る。
【００５２】
しかしながら、ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。更に、血小板抽出物の製造において追加の工程を含むことは、その中に含まれる因子の回収及び活性を損ない得る。
【００５３】
これらのウイルス不活性化の方法のうちの１つは、「溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理」である。
【００５４】
この不活性化は、Ｓ／Ｄによる処理及びＳ／Ｄの除去を含む。特定の成長因子の回収率は、ＨＩＣによるＳ／Ｄ除去の後に解決されることが、本発明により見出された。
【００５５】
特定の血小板因子、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びｂＦＧＦは、Ｓ／Ｄ除去よりも前に、かつ／又はＳ／Ｄ除去中に、Ｓ／Ｄで処理された物質を、非毒性の両親媒性分子であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）に接触させることによって増加し得ることが、本発明により見出された。
【００５６】
本発明によるＳ／Ｄで処理された物質をＰＶＰ及びＨＰＭＣに接触させることは、ＰＤＧＦ−ＡＢ及び他の血小板因子、例えばＰＤＧＦ−ＢＢ並びにｂＦＧＦの回収率の増加又は富化をもたらすことが見出された。
【００５７】
Ｓ／Ｄ除去中にＳ／Ｄで処理された物質をヘパリン及び低分子量ヘパリン（両者ともに、特定の成長因子に結合することが知られている）に接触させることは、因子の回収率を増加させたが、一方、Ｓ／Ｄで処理された物質を（両親媒性特性を有する）完全に異なる化合物であるＰＶＰに接触させることが、Ｓ／Ｄ除去中の成長因子の回収率に及ぼす同様な有益な効果を有したという点において、これらの発見は驚くべきことである。
【００５８】
また、特定の試験条件下でのＰＶＰ  Ｋ３０、Ｋ２５、Ｋ１７及びＫ１２の添加が、Ｓ／Ｄ除去を損なうことがなかったために、この発見は驚くべきことである。
【００５９】
血小板由来の因子の混合物を含む原料からＳ／Ｄを除去するために本発明による方法を使用することは、因子の高い回収率、高い生物活性及びＳ／Ｄの効率的な除去をもたらすことが見出された。
【００６０】
Ｓ／Ｄ除去の際にＰＶＰ  Ｋ１２、Ｋ１７、Ｋ３０又はＰＶＰ  Ｋ２５を使用することは、血小板成長因子／栄養因子の回収率を増加させることが見出された。Ｋ３０を使用しての回収率は、Ｋ２５を使用しての回収率よりも高いことが見出された。ＰＶＰ  Ｋ２５を使用して得られた物質、したがってＰＶＰ  Ｋ２５を含む物質は、ＰＶＰ  Ｋ３０を含む、ＰＶＰ  Ｋ３０を使用して得られた物質よりも高い増殖活性を有した。
【００６１】
この結果は、Ｓ／Ｄを効率的に除去するＨＩＣの能力を維持しながら、血小板因子混合物に接触させるＰＶＰ  Ｋ２５の濃度を０．５％又は０．１７ｍＭ以下に低減させて（したがって、Ｓ／Ｄ除去後に得られる抽出物中で、ＰＶＰを０．５％又は０．１７ｍＭ以下に減少させて）、それでもなお因子の回収率の増加を得ることが可能であることも示している。
【００６２】
この結果は、抽出物中の異なる量の、例えば０．１％（０．０３ｍＭ）及び０．５％（０．１７ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ２５存在は、その活性に影響を及ぼさないことを示している。
【００６３】
この結果は、特定の濃度におけるヘパリン及び硫酸デキストランとは異なり、最終抽出物中のＰＶＰの存在は、トロンビン活性を阻害しなかったことを示している。ＰＶＰのこの特性は、特に血小板抽出物（「血小板抽出物」は、生物学的液体混合組成物の１種である）のための送達剤としてフィブリンシーラントを使用する場合、重要である。
【００６４】
この結果は、大規模プロセスにおけるＰＶＰ  Ｋ２５の存在下の成長因子の回収率及び活性が、小規模におけるものに匹敵することを示している。
【００６５】
これらの結果は、使用されるＰＶＰの種類及びその濃度（例えば、混合物中のＰＶＰのｗ／ｗ又は容量モル濃度）がＳ／Ｄ除去を損なわないという条件では、増加した生物学的効力を有する最終抽出物を得るために、ＰＶＰがＳ／Ｄ除去の際に有利に使用され得ることを示唆している。
【００６６】
一実施形態では、Ｓ／Ｄ除去工程中に、生物学的原料をエタノール及びＮａＣｌと組み合わせたＰＶＰに接触させた後に、血小板抽出物が得られる。この抽出物は、白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（Ｗａｓｈｅｄ  Ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｒｅｄｕｃｅｄ）（ＷＡＰ−ＬＲ）出発物質（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）中、及びＳ／Ｄ除去前の物質中の比率と同様の、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＴＧＦ−β１；ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ；ＴＧＦ−β１／ｂＦＧＦ；及びＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ比率を含む。
【００６７】
これらの発見は、本発明による生物学的液体混合組成物を調製するための道を開いた。
【００６８】
本発明の方法は、Ｓ／Ｄの除去後のサイトカイン、成長因子、ケモカイン、及び／又は栄養因子の回収率を増加させて、血小板抽出物を調製することを可能にする。
【００６９】
ウイルス安全性のある生物学的液体混合組成物を生物学的原料から調製するための方法が開示され、この方法は、原料を提供する工程と、両親媒性ポリマーを提供する工程と、原料を、ウイルス不活性化が可能な溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）、及び該両親媒性ポリマーで処理する工程と、処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、Ｓ／Ｄを除去する工程と、非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含み、ここで、該方法は、少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理を含み、これによって、ウイルス安全性のある生物学的液体混合組成物を得る。
【００７０】
一態様では、本発明は、ウイルス安全性のある生物学的液体混合物を調製するための方法を提供し、この方法は、
原料を提供する工程と、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、
Ｓ／Ｄで処理された物質を非毒性の両親媒性ポリマーに接触させる工程と、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、かつ／又は油抽出により、Ｓ／Ｄを除去する工程と、この物質を、少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理に供する工程と、を含む。
【００７１】
原料の例としては、血液などの体液；血液分画、クレオプレシピテート、細胞培養物、親油性のタンパク質性作用物質；細胞、細胞粒子及び／又は細胞小器官；細胞溶解物；血小板溶解物；血液バフィーコート；動物組織抽出物、例えば、ウシ肺、ウシ腸若しくは動物骨抽出物ゼラチン、ウシ血清アルブミン、並びにラノリンなどの動物由来の水混和性脂肪が挙げられるが、これらに限定されない。この原料は、複数のドナーに由来していてもよい。
【００７２】
一態様では、溶媒−界面活性剤（Ｓ／Ｄ）を含む生物学的原料から、Ｓ／Ｄを除去するための方法が開示され、この方法は、原料を提供する工程と、両親媒性ポリマーを提供する工程と、原料をＳ／Ｄ、及び両親媒性ポリマーで処理する工程と、処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、Ｓ／Ｄを生物学的原料から除去する工程と、非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含む。
【００７３】
一実施形態では、前記Ｓ／Ｄを除去する方法により、油抽出の更なる工程が省略される。
【００７４】
本発明の方法は、油抽出分割（partition）の工程なしで、Ｓ／Ｄを除去するために使用され得ることが見出された。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、ウイルス安全性のある血小板抽出物を調製するための方法に関し、この方法は、１以上のドナーから血小板富化分画を提供する工程と、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理を行う工程と、Ｓ／Ｄで処理された物質を非毒性の両親媒性ポリマーに接触させる工程と、Ｓ／Ｄを除去する工程と、この物質を、少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理に供する工程と、を含む。
【００７６】
用語「血小板抽出物」は、血小板由来因子を含む生物学的混合物を指す。典型的には、抽出物は細胞を含まない。
【００７７】
一実施形態では、本発明の方法は、血小板溶解物を調製する工程を含む。用語「溶解物」は、細胞膜を破壊することによって細胞が破壊されときに得られる溶液を指す。血小板の溶解及び血小板に捕獲された因子（例えば、様々な血小板成長因子及び／又は栄養因子）の放出は、血小板富化分画を凍結及び解凍することによって、Ｓ／Ｄ処理によって、超音波処理によって［Ｓｌｅｚａｋら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖ１６６  ｐ４８９〜５０５］、フレンチプレスによって［Ｓａｌｇａｎｉｃｏｆｆら、（１９７５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ｖ３８５  ｐ３９４〜４１１］、かつ／又は当該技術分野において既知の任意の他の方法によって行われ得る。
【００７８】
本発明の一実施形態では、血小板の溶解は、血小板富化分画を凍結・解凍した後、Ｓ／Ｄ処理を行うことによって実施される。典型的には、血小板の溶解は、無細胞血小板溶解物を生じさせる。
【００７９】
用語「ウイルス安全性のある生物学的液体混合物」は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理に供された混合物及び／又は組成物を指す。
【００８０】
用語「ウイルス安全性のある血小板抽出物」は、少なくとも２つの直交するウイルス不活性化処理に供された抽出物を指す。
【００８１】
用語「ウイルス不活性化処理」及び「ウイルスを不活性化する」は、ウイルスが溶液中に維持されるが、例えば、それらの脂質被膜を溶解することによって生育不能にされること、及び／又は、例えば、サイズ排除技術によって、ウイルスが溶液から物理的に除去される状況を指す。
【００８２】
用語「直交するウイルス不活性化処理」は、ウイルスを不活性化するために、少なくとも２つの異なり、かつ独立した処理を実施することを含む。以下の非限定的な処理の例のうちの２つ以上の組み合わせを使用することができる。すなわち、熱不活性化処理、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理、ナノ濾過処理、低ｐＨ処理、紫外線照射処理、及びチオシアン酸ナトリウム処理。
【００８３】
「溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化処理」は、典型的には、脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープウイルス又は脂質被覆ウイルスを不活性化するプロセスを指す。この処理は、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又はポリソルベート８０など）及び溶媒［リン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）、リン酸ジアルキル又はリン酸トリアルキルなど］の添加によって実施され得る。脂質被覆ウイルスを非活性化するために用いられる溶媒−界面活性剤の組み合わせは、例えば、ＴｎＢＰとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の組み合わせ、ポリソルベート８０とコール酸ナトリウムの組み合わせ、及び他の組み合わせなど、当該技術分野において周知である任意の溶媒−界面活性剤の組み合わせであり得る。
【００８４】
使用する溶媒／界面活性剤の濃度は、例えば、米国特許第５０９４９６０Ａ号及び同第４７８９５４５Ａ号で実施されるような、当該技術分野において一般的に用いられる濃度であり得る。本発明の一実施形態では、０．１％超のＴｎＢＰと０．１％超のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の組み合わせが用いられる。本発明の別の実施形態では、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．３％のＴｎＢＰの組み合わせが用いられる。典型的には、溶媒−界面活性剤がウイルスを不活性化する条件は、５〜８のｐＨ値で１０〜１００ｍｇ／ｍＬの溶媒／界面活性剤、及び２〜３７℃の温度にて３０分〜２４時間からなる。しかしながら、溶媒／界面活性剤の他の組み合わせ、及び他の好適な条件が、当業者には明らかであろう。この不活性化は、Ｓ／Ｄによる処理及びＳ／Ｄの除去を含む。
【００８５】
「熱不活性化」は、典型的には、熱が脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を破壊するプロセスを指す。「熱不活性化」は、用語「低温殺菌」と置き換え可能である。熱不活化は、５９．５〜６０．５℃の範囲の温度にて９〜１０．５時間にわたって行われ得る。例えば、不活性化は、６０℃にて１０時間にわたって行われ得る。スクロース及びグリシンなどの安定化剤が、熱不活性化工程中に物質に添加され得る。
【００８６】
「ナノ濾過」は、典型的には、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）２０Ｎ、３５Ｎ、及び７５Ｎ；Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／７０（商標）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０（商標）などのナノメートルスケールのフィルターを使用することによって、脂質エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスを試料から除外するプロセスを指す。フィルターは、７０ｎｍ未満、好ましくは１５〜５０ｎｍの孔径を有し得る。しかしながら、サンプルからウイルスを低減又は排除するのに十分な孔径を有する任意の膜を、ナノ濾過で採用することができる。ナノ濾過によって除去されるウイルスは、エンベロープを有するもの［例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス］、及びエンベロープのないもの（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス）であり得る。
【００８７】
低ｐＨ処理は、典型的には、エンベロープウイルスに対して有効である。本発明の一実施形態では、血小板溶解物は、低ｐＨ、典型的にはｐＨ  ４にさらされ、６時間〜２１日間続く。「低ｐＨ処理」は用語「酸性ｐＨ不活性化」と置き換え可能である。
【００８８】
本発明の一実施形態では、抽出物調製物の第１のウイルス不活性化工程は、エンベロープウイルスを排除するための血小板の溶媒−界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理を含む。Ｓ／Ｄ処理はまた、血小板の溶解、及びそれらの含有物の溶液中への放出を促進する。最適なエンベロープウイルス不活性化では、凝集物除去（例えば、濾過による）を含むサブ工程が、Ｓ／Ｄ処理工程中に行われ得る。
【００８９】
用語「複数のドナーからの血小板富化分画」は、少なくとも２つの個体から得られる血小板富化物質を指す。個体は、ヒト又は他の哺乳類であり得る。いくつかの実施形態では、血小板は、５〜１２のドナーから採取される。
【００９０】
用語「血小板富化分画」は、血小板の濃度が血液中で通常認められる血小板の濃度より高い血漿組成物を指す。特定の実施形態では、血小板濃度は、血小板の通常のベースライン濃度、例えば、血小板約２００，０００個／μＬよりも高い。例えば、血小板濃度は、血液中の通常の濃度の少なくとも１．１、１．２．１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００倍若しくはそれ以上であってもよい。特定の実施形態では、血小板富化分画は、血小板が、約２００，０００個／μＬ、３００，０００個／μＬ、４００，０００個／μＬ、５００，０００個／μＬ、６００，０００個／μＬ、７００，０００個／μＬ、８００，０００個／μＬ、９００，０００個／μＬ、１，０００，０００個／μＬ、１，１００，０００個／μＬ、１，２００，０００個／μＬ、１，３００，０００個／μＬ、１，４００，０００個／μＬ、１，５００，０００個／μＬ、１，６００，０００個／μＬ、１，７００，０００個／μＬ、１，８００，０００個／μＬ、１，９００，０００個／μＬ、又は２，０００，０００個／μＬを超える血小板濃度を有する。
【００９１】
血小板富化物質を得ることができる分画としては、血液分画、血漿分画、アフェレーシスから得た洗浄及び白血球低減を行った血小板、及びアフェレーシスから得た血小板が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、複数のドナーからプールした洗浄及び／又は白血球低減血小板が、血小板抽出物の調製のための出発物質として使用される。
【００９２】
抽出物を調製するための出発物質として洗浄血小板を使用することで、血漿不純物が減少した（ＩｇＧ及びフィブリノーゲンレベルが低減した）非凝血性血小板抽出物を得ることができる。
【００９３】
典型的には、用語「血小板出発物質」は、本発明の方法で使用するために複数のドナーから得た、血小板富化分画を指す。血小板富化分画は、例えば、全血単位から、血液分画から、及び／又は血漿分画から分離され得る。血小板富化分画は、アフェレーシス献血から得ることができる。出発物質は、洗浄及び／又は白血球低減され得る。本発明の一実施形態では、血小板富化分画は、洗浄及び白血球低減を行い、アフェレーシス献血から得られる。一実施形態において、アフェレーシス白血球低減収集単位中の血小板の最小数は、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｏｆ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」に明記されている通り、約３．０×１０１１以上である。
【００９４】
用語「洗浄血小板」は、洗浄工程に供された血小板を指す。洗浄手順の間、血小板の損失も起こり得る。洗浄は、少量のデキストロースと共に、又は少量のデキストロースなしで、０．９％の塩化ナトリウムを、用いて行われ得る。洗浄手順は、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｏｆ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」に詳述されている通りに行われ得る。本発明の一実施形態では、洗浄は次のように行われる。血小板物質単位を緩やかな条件下で遠心分離する。次に、上澄みを廃棄し、血小板ペレットを、緩やかな条件下において生理食塩水で（洗浄の合間に遠心分離しながら）少なくとも２回洗浄する。洗浄され、再懸濁された血小板は、本発明の方法で使用するまで凍結させることができる。
【００９５】
用語「白血球低減」は、全血中の白血球含有量未満の白血球含有量を指す（全血中の含有量は、血液単位当たり約１〜１０×１０９白血球である）。任意の白血球の低減方法（例えば、濾過による）を用いて、白血球低減単位（leukocyte-reduced unit）を得ることができる。白血球の低減は、アフェレーシス中に実施され得る。典型的には、約５×１０６個未満の白血球を含有する血小板の白血球低減単位を、血小板抽出物の調製のための出発物質として使用する。
【００９６】
用語「アフェレーシス」は、典型的には、一部（例えば、血小板）が分離されて保持され、残りはドナーに返血される、単一ドナーからの採血を指す。単一ドナーから得られるアフェレーシス血小板の一単位は、約３．０×１０１１個又はそれ以上の血小板を含有し得る。本発明の一実施形態では、単一ドナーから得られるアフェレーシス血小板の一単位は、最大６．０×１０１１個までの血小板を含有する。多くの場合、１回の献血中に６×１０１１個を超える血小板が存在するときには、献血単位は２つの別個のバッグに分けられる。
【００９７】
用語「両親媒性（amphiphilic）ポリマー」又は「両親媒性（amphipathic）ポリマー」は、親水性（水に対して親和性を有する、極性）特性及び親油性（脂質に対して親和性を有する）特性の両方を有するポリマーである。親油性基は、典型的には、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎの長鎖（ｎ＞４）などの大きな炭化水素部分である。一実施形態では、親水性基は、以下の分類のうちの１つに入る。
１．荷電基：
アニオン性．Ｒによって表される分子の親油性部分を有する例は、
カルボキシレート：ＲＣＯ２−；
スルフェート：ＲＳＯ４−；
スルホネート：ＲＳＯ３−；
ホスフェート：リン脂質中の荷電官能基
カチオン性．例：
アミン：ＲＮＨ３＋
２．極性、非荷電基．例は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）などの大きなＲ基を有するアルコール、及び長いアルキル鎖を有するオリゴエチレングリコールである。
【００９８】
多くの場合、両親媒性種は、いくつかの親油性部分、いくつかの親水性部分、又はこの両方を有する。タンパク質及び一部のブロックコポリマーはこのような例である。
【００９９】
両親媒性化合物は、親油性（典型的には炭化水素）構造と親水性極性官能基（イオン性又は非荷電のいずれかの）を有する。
【０１００】
親油性及び親水性部分の両方を有する結果として、いくつかの両親媒性化合物は、水中で溶解することができ、かつ、非極性有機溶媒中である程度まで溶解することができる。
【０１０１】
水性溶媒及び有機溶媒からなる非混和性の二相系中に配置される場合、両親媒性化合物は、２つの相に分割されるであろう。疎水性部分及び親水性部分の範囲は、分割の範囲を決定する。
【０１０２】
非毒性両親媒性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、酸化ポリエチレン（ＰＥＯ）、ポリ（２−アクリルアミドヘキサデシルスルホン酸（ＰＡＭＣ１６Ｓ）、リポポリ（２−メチル−２−オキサゾリン類（ＬｉｐｏＰＯｘｓ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）のような遺伝子治療に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）−アクリルアミドメタン（ＴＨＡＭ）カチオン性ポリマーから誘導された両親媒性ポリマー、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）系ポリマーである。
【０１０３】
典型的には、用語「非毒性」は、使用される投与量及び濃度で患者に対して非毒性であり、即時的又は長期的のいずれかでも、健康に悪影響を引き起こすことがない生成物、物質、又は化学化合物を指す。非毒性又は生理学的に安全な化合物は、５００ｍｇ／ｋｇ以上、より適切には９５０ｍｇ／ｋｇ以上、及び最適には２０００ｍｇ／ｋｇ以上のＬＤ５０（ラット）を有する化合物として理解される。
【０１０４】
本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーは、炭化水素系界面活性剤である。
【０１０５】
用語「炭化水素系界面活性剤」は、液体の表面張力、２つの液体間の界面張力、又は液体と固体との間の界面張力を低下させる炭化水素化合物である。炭化水素界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、及び分散剤として作用し得る。
【０１０６】
用語「接触させる」は、本明細書では広義に使用され、例えば、Ｓ／Ｄで処理された物質又は原料中で、両親媒両親媒性ポリマーを、存在する対象因子（例えば、成長因子、サイトカイン、ケモカイン及び／又は栄養因子）と十分に近接する状態にもっていき、該両親媒性ポリマーと該因子との間で結合相互作用が生じるようにする、任意のタイプの組み合わせ作用を指す。接触させるは、両親媒性ポリマーをＳ／Ｄで処理された物質に混合する、混和する並びに／若しくは添加すること、及び／又は両親媒性ポリマーをＨＩＣカラムを洗浄するために使用される緩衝液に、並びに／若しくはＳ／Ｄを抽出するために使用される油中に添加することを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
ポリマーは、約２００〜５００００ダルトン以下の平均分子量を有することができる。本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。ＰＶＰは、１２〜３０Ｋの範囲内であるか、又は約１２、１３、１４、１５、１６、１１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０Ｋであり得る。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーは、３５００〜４００００ダルトンの範囲の平均分子量を有するポリビニルピロリドンである。例えば、使用されるＰＶＰは、３５００ダルトンの平均分子量及び／又は１０．２〜１３．８の範囲のＫ値、８０００ダルトンの平均分子量及び／又は１６．０〜１８．０の範囲のＫ値、３００００ダルトンの平均分子量及び／又は２２．５〜２７．０の範囲のＫ値、又は４００００ダルトンの平均分子量及び／又は２７．０〜３２．４の範囲のＫ値を有することができる。異なる両親媒性ポリマー及び／又は異なる平均分子量を有する同一のポリマーの組み合わせは、Ｓ／Ｄで処理された物質に接触させるよう使用され得る。一実施形態では、Ｓ／Ｄ除去の前に（例えば、材料をカラムに導入する前に）、３００００ダルトンの平均分子量を有するＰＶＰがＳ／Ｄで処理された物質に添加され、次いで３００００ダルトンの分子量を有するＰＶＰが、カラムを洗浄するために使用される緩衝液に添加される。
【０１０９】
（０．３ｍＭ）１％以上のＰＶＰ  Ｋ２５の濃度は、ＳＤＲ後の物質中のＳ／Ｄ物質、すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の許容可能な限界以上の存在をもたらすことを見出した。
【０１１０】
本発明の一実施形態では、両親媒性ポリマーを、Ｓ／Ｄで処理された物質に、０．０１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）未満の濃度範囲以内で、０．１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）未満の濃度範囲以内で、又は０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．５％（ｗ／ｗ）未満の濃度範囲以内で接触させる。
【０１１１】
次の工程では、Ｓ／Ｄ除去工程が行われる。用語「溶媒−界面活性剤除去（Ｓ／Ｄ除去）」は、Ｓ／Ｄ処理で使用した溶媒−界面活性剤の大部分の除去を指す。溶媒−界面活性剤の除去は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばＣ−１８シリカ充填剤並びにＳＤＲ（溶媒−界面活性剤除去）ＨｙｐｅｒＤ；油抽出；これらの組み合わせ若しくは当該技術分野において既知の任意の他の方法を使用することを含む。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、油抽出が溶媒−界面活性剤を除去するために使用される。
【０１１３】
液液抽出は、「溶媒抽出」及び「分割（partitioning）」、又は「除去分割」としても知られ、２つの異なる不混和性の液体中のそれらの相対的溶解度に基づいて化合物を分離するための方法である。これは、１つの液相から別の液相への物質の抽出である。２つの不混和性液体は、油及び水性液体であり得る。しばしば、このような場合、油及び水性分割を使用する物質の除去は、「油抽出」と呼ばれる。溶媒／界面活性剤を含む水性溶液へ油を添加し、混合して、水と油との間で分割させることにより、溶媒／界面活性剤の大部分が油相中に残ることになる。
【０１１４】
本発明の別の実施形態では、ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ（空隙体積が三次元架橋疎水性アクリルポリマーで満たされている、シリカビーズからつくられたクロマトグラフィー充填剤）を使用して、溶媒−界面活性剤を除去する。ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤは、有利には、疎水性相互作用の混合モード吸着を伴い、分子排除効果に関連する［Ｇｕｅｒｒｉｅｒ  Ｌら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｏｒｂｅｎｔ  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ」．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ｆｅｂ  ３；６６４（１）：１１９〜１２５］。
【０１１５】
用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）」は、例えば、疎水性ポリマー樹脂が充填されたカラムを指す。一般的に、混合物を、充填された樹脂を含むカラムを通して特定の流速で移動させて、Ｓ／Ｄ物質が除去される。ＨＩＣは、バッチ式で行うことができる。
【０１１６】
疎水性樹脂は、当該技術分野において周知である。非限定的な例は、例えば、Ｃ−１８シリカ充填剤及びＳＤＲ（溶媒−界面活性剤除去）ＨｙｐｅｒＤである。
【０１１７】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、すなわち、Ｓ／Ｄで処理され、かつポリマーに接触させた物質をＨＩＣに導入する工程と、低濃度の有機溶媒（例えば、５〜１５％の濃度範囲のエタノール）及び／又は塩（例えば、０．２〜１．２Ｍの濃度のＮａＣｌ）を任意選択で含む、水性溶液で洗浄する工程と、洗浄物質を回収する工程と、を含む、方法によって行うことができる。
【０１１８】
塩の非限定的な例は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２等である。
【０１１９】
有機溶媒の非限定的な例は、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコール等である。
【０１２０】
用語「ＨＩＣに導入する（loading to HIC）」は、物質をカラムに適用することを指す。しかしながら、所望される場合、同一の樹脂を「バッチ式」で使用してＳ／Ｄ材料を除去することができる。本明細書で使用される「バッチ式」は、樹脂及び混合物が、例えば撹拌タンク、バッチリアクター又は容器内で一緒にインキュベートされ、吸着が連続的な様式で行われる技術を一般的に指す。本発明の一実施形態では、容器、例えば管内で混合物を樹脂に接触させ、インキュベーション時間後に、容器が遠心分離され、血小板由来因子を含む上澄みが回収される（Ｓ／Ｄ材料は、沈殿物中に存在する）。バッチ方式は、容器又はバッチリアクター内で行うことができる。
【０１２１】
用語「Ｓ／Ｄで処理され、かつポリマーに接触させた物質」は、上述のようにウイルス不活性化のためにＳ／Ｄに供され、両親媒性ポリマーに接触させた物質を意味する。
【０１２２】
ＨＩＣカラムに導入された材料は、結合緩衝液中で溶解され得る。カラムは、例えば、カラムを結合緩衝液で洗浄することにより、物質を導入する前に平衡化され得る。
【０１２３】
用語「平衡化」は、カラムが、特定のｐＨ値、特定の両親媒性ポリマー濃度及びイオン強度といった特定の緩衝液条件に達するようにすること、及び／又はカラムが該特定の緩衝液条件に達するように調整することを指す。本発明の一実施形態において、カラムの調整は、カラムにＳ／Ｄで処理され、かつポリマーに接触させた物質を導入する前に、所定のｐＨ値及びイオン強度を有する平衡化緩衝液でカラムを洗浄することによって行われる。本発明の一実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ  ６．８〜７．４）、並びに０．２％（総体積に対するｗ／ｗ）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び０．１％の両親媒性ポリマーを含む。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、生物学的液体混合物から溶媒−界面活性剤（Ｓ／Ｄ）を除去するための方法は、Ｓ／Ｄ処理された混合物を、非毒性の両親媒性ポリマーに接触させる工程と、該混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び／又は油抽出に供することによって、Ｓ／Ｄを混合物から除去する工程と、ＨＩＣからのフロースルー分画及び／又は油抽出からの液体分画を含む物質を回収する工程と、を含む。
【０１２５】
他の実施形態では、ＨＩＣは、有機溶媒及び／又は塩を含む溶液で洗浄する工程を含む。
【０１２６】
本発明の他の実施形態では、回収された材料は、ＨＩＣの洗浄分画と組み合わされたフロースルー分画を含む。
【０１２７】
用語「結合緩衝液」は、Ｓ／Ｄで処理され、かつポリマーに接触させた物質のクロマトグラフィーカラムへの導入の際に使用される緩衝液を指す。多くの場合、材料を導入する前及び／又は導入する間にカラムを調整するために用いられる平衡化緩衝液は、結合緩衝液と呼ばれる。本発明の一実施形態では、結合緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ  ６．８〜７．４）、並びに０．２％（総体積に対するｗ／ｗ）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び０．１％の両親媒性ポリマーを含む。
【０１２８】
ＨＩＣはまた、ＨＩＣを平衡化緩衝液及び／又は結合緩衝液で洗浄する工程と、非結合物質を回収する工程と、を含むことができる。
【０１２９】
フロースルー又は非結合物質は、典型的には、平衡で使用したのと同じ緩衝液、及び／又は混合物をカラムに導入するのに使用した緩衝液（「結合緩衝液」）で導入されたカラムを洗浄した後に回収される分画を指す。
【０１３０】
用語「洗浄」は、Ｓ／Ｄ除去工程中に、カラムへの導入及び／又はカラムの平衡化のために使用した溶液又は条件（condition）と同じ若しくは異なる溶液又は条件で、及び／又は前の工程で使用した溶液と同じ若しくは異なる溶液でカラムを洗浄することを指す。洗浄条件は、因子が洗浄され／非結合となるのに対し、Ｓ／Ｄがカラム／樹脂に実質的に結合したままであるような条件である。
【０１３１】
洗浄条件は、塩濃度の増加及び／又は溶液中の有機溶媒を含むことを伴ってもよい。
【０１３２】
血小板抽出物は、成長因子、栄養因子、ケモカイン及び／又はサイトカインの混合物を含んでもよい。
【０１３３】
用語「成長因子」は、典型的には、細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する作用剤を指す。成長因子の例としては、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−ｂ１、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ｂＦＧＦ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
用語「栄養因子」は、典型的には、細胞の分化及び／又は生存を刺激する作用剤を指す。栄養因子の例としては、接着分子、骨形成タンパク質、サイトカイン、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＧＤＮＦ、ヘパリン結合成長因子、インスリン様成長因子、ニューロトロフィン、セマフォリン、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦ）β、チロシンキナーゼ受容体リガンド、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
用語「サイトカイン」は、典型的には、細胞から分泌され、細胞間通信で広範囲に使用されるシグナル伝達分子の類別である細胞由来シグナル伝達タンパク質分子を指す。免疫細胞はサイトカインを放出する。
【０１３６】
血小板因子は、成長活性、サイトカイン、ケモカイン活性及び／又は栄養活性を有し得る。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、本発明の方法により得られる複数のドナーから誘導された、活性でかつウイルス安全性のある（少なくとも二重にウイルス不活性化された）血小板抽出物、及びその使用に関する。ウイルス安全性のある血小板抽出物は、生理活性血小板細胞成長因子、ケモカイン、サイトカイン及び／又は栄養因子の混合物を含む。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、溶媒−界面活性剤（Ｓ／Ｄ）などの両親媒性毒性分子を、両親媒性毒性分子を含む生物学的液体混合物から除去するための方法に関する。この方法は、両親媒性毒性分子を含む生物学的液体混合物を提供する工程と、この混合物を、ＰＶＰなどの非毒性両親媒性ポリマーに接触させる工程と、両親媒性毒性分子を混合物から除去する工程と、を含む。
【０１３９】
典型的には、両親媒性毒性分子として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、Ｂｒｉｊ（ポリエチレングリコールラウリルエーテル、例えば、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ５８）、ＩＧＥＰＡＬ（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、例えば、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
用語「生物学的液体混合物」は、組換え成分及び／又は組換え血小板由来因子（例えば、ケモカイン、成長因子、サイトカイン、栄養因子又はこれらの組み合わせ）を含む生物学的原料及び／又は液体から得られる任意のタイプの液体物質を指す。「生物学的原料」としては、典型的には、限定されるものではないが、全血漿又は血液分画、例えば、低温析出後の血漿、クリオプレシピテート、血漿又は血清；精液；痰；糞便；汗；唾液；鼻粘液；脳脊髄液；多血小板血漿放出物ＰＲＰ−Ｒ（ＰＲＰ−放出物）などの血小板由来の分画；及び尿から得られる調製物、並びに細胞が調製物中に分泌する生体物質を含有する又はもとは細胞内部に存在し、細胞の溶解又は細胞の活性化などの様々な操作に起因して液体調製物に放出された物質を含有する細胞培養液から得られる液体が挙げられる。
【０１４１】
用語「クリオプレシピテート」は、全血より調製した凍結血漿から得られる血液成分を指す。クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、通常は０〜４℃の温度で解凍すると、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含む沈殿による上清が形成されることで得ることができる。この沈殿物は例えば遠心分離によって回収することができる。ＢＡＣ溶液は、例えば、米国特許第６，１２１，２３２号及び国際公開第９８３３５３３号に記載されるように、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチン等を更に含む。
【０１４２】
一実施形態では、本発明によるＳ／Ｄを除去するための方法は、生物学的液体調製物のウイルス不活性化のためのプロセス後に使用することができる。血液及び血漿調製物などの生体由来の液体調製物は、複数の生物学的に有用な化合物を精製することができる原料物質として用いられる。かかる化合物の例としては、免疫グロブリン、第ＶＩＩＩ因子、アルブミン、α−１−アンチトリプシン（a 1 anti trypsine）、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、ＰＰＳＢ、フィブリノーゲン、及びトロンビン（プロトロンビン）が挙げられる。更に、ホルモン、成長因子、酵素、リガンド及び抗体などの様々な生物学的生成物は、細胞培養液から得られる生物学的調製物から単離される。
【０１４３】
更に、別の態様では、本発明は、０．０７〜６ｍＭの濃度範囲のＰＶＰ及びケモカイン、成長因子、サイトカイン、栄養因子又はこれらの混合物を含む血小板由来タンパク質組成物を含む医薬組成物に関する。
【０１４４】
０．９ｍＭ（最終生成物で６ｍＭ）の濃度のＰＶＰを使用してＳ／Ｄの除去を実行することは、１７０ｐｐｍの最終濃度まで、Ｔｒｉｔｏｎの９８％の除去をもたらすことが本明細書で示されている。カラム処理後に物質中に残留する微量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、最終生成物中でＴｒｉｔｏｎの痕跡が検出されなくなるまで後続処理加工において除去された。これらの結果を踏まえると、０．９ｍＭよりも高い濃度でＰＶＰを使用することは、下流では除去され得ない濃度におけるカラムから溶出をもたらし得る。
【０１４５】
用語「医薬組成物」は、被験体に投与されるとき、局所及び／又は全身作用によって、生理学的及び／又は生物学的効果（例えば、細胞増殖、細胞運動性、細胞間相互作用、及び／又は細胞の形体的変化の誘導）を誘導する物質の任意の化合物若しくは組成物又は構成成分の組み合わせを指す。
【０１４６】
Ｓ／Ｄ除去中にＰＶＰ  Ｋ１２及びＰＶＰ  Ｋ２５を使用することによって、ＷＡＰ出発物質中の比率に匹敵する因子の比率を有する組成物を得ることが可能である。
【０１４７】
約０．３〜０．４の範囲のＰＤＧＦ−ＡＢ／ＴＧＦ−β１、約４１〜約１０２の範囲のＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ、約１５００〜約１７００の範囲のＴＧＦ−β１／ｂＦＧＦ、及び／又は約６．０〜１２．５の範囲のＶＥＧＦ／ｂＦＧＦを有する組成物が開示される。
【０１４８】
本明細書で使用する用語「被験体」は、ヒトを含む哺乳類起源の動物を含む。一実施形態では、被験体はヒトである。
【０１４９】
本発明により調製されたウイルス安全性のある血小板抽出物は、任意の治療目的に使用され得る。
【０１５０】
本発明の抽出物は、任意の治療的使用に、例えば、被験体の損傷組織の治癒を促進するために好適である。血小板抽出物は、標的領域への注射用に又は静脈内投与用に使用され得、包帯、発泡体、パッド、及びマトリックス上に適用される／投与されることができ、並びに／又は局所適用のためにフィブリンシーラントと組み合わされて使用され得る。抽出物は、包帯、パッド、発泡体、及びマトリックスなどの様々な送達剤から、所望の場所の中／上に放出され得る。この剤は、天然及び／又は合成材料で作製され得る。かかる物質の例としては、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［ＰＨＥＭＡ］、寒天、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）、自己組織化ペプチド［ＳＡＰ］、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
ＰＶＰを含む、本発明により得られた血小板抽出物と組み合わせてのフィブリンシーラントの投与は、インビボでの治癒に著しく良好な効果を有した。すなわち、これは、組織学的検査を使用して示されるように、フィブリンシーラント単独群又はシャム群（同じ皮弁作製処置を受けたが、皮弁閉鎖の前にいかなる処置も適用されなかった動物）と比較して、皮弁付着を促進し、治癒プロセスを加速した。
【０１５２】
用語「任意の治療目的」は、化粧用途のため、及び／又は被験体における任意の疾病、疾患、又は病状のための、任意の治癒的又は予防的治療を指す。例示的な治療目的としては、移植片統合の改善；内部又は外部創傷の早期治癒（すなわち、非処置の創傷又は他の既知の創傷治療に比べて創傷を迅速に治癒させること）；血管形成、有糸分裂誘発、細胞増殖、好中球及びマクロファージ、コラーゲン合成、遊走、創面収縮、細胞外マトリックス合成、上皮形成、及び走化性を刺激することが必要な任意の外傷又は病状の治療；組織生成、再生、又は再組織化、上皮形成、新血管形成、又は血管形成が必要な外傷又は病状の治療；瘢痕形成を少なくすること；術後合併症及び死亡率を低減すること；例えば外科的皮弁破損部、切断部又は潰瘍などの治癒などための、軟組織の治癒（例えば皮膚創傷の治癒）、が挙げられるが、これらに限定されない。開示された組成物は、局所的経路又は非経口経路によって投与され得る。
【０１５３】
血小板抽出物は、整形外科（例えば、骨修復、関節軟骨修復、膝関節形成術、腰椎固定術、及び椎間板変性において）；口腔外科；歯科及び顎顔面外科（例えば、チタンインプラントの圧密、上顎洞底挙上術、及び骨再形成）；筋肉、腱及び靱帯修復のため；顔面成形手術及び再建外科；慢性的な皮膚創傷の治癒、皮膚火傷治癒、眼科学；顔面神経再生、末梢神経修復、中枢神経系（ＣＮＳ）修復（脊椎及び／又は脳外科手術）、視神経修復、神経圧迫症候群修復、脳神経修復、坐骨神経修復；心臓手術、胃腸手術及び肥満手術などであるが、これらに限定されない、様々な手術分野で使用される。抽出物は、患者の身体部位の表面上に投与され得る。用語「表面」は、裸眼視力で見ることができる外部表面、及び生物の内部構造の一部である内部身体部位の表面を指す。外部表面としては、顔の皮膚、喉、頭皮、胸、背中、耳、首、手、肘、臀部、膝、及び他の皮膚部位が挙げられるが、これらに限定されない。内部身体部位の例としては、外部環境に露出される体腔又は解剖学的開口部、及び鼻孔、唇、耳、子宮、膣、及び卵巣などの生殖器部、肺、肛門、脾臓、肝臓、心筋、並びに胃腸管などの内部器官が挙げられるが、これらに限定されない。表面は、出血性又は非出血性部位であってよい。あるいは、抽出物は、例えば、皮内、腹腔内、皮下、髄腔内、胸骨内、頭蓋内、脳内、筋肉内、及び／又は静脈内に注射によって投与され得る。抽出物はまた、点滴によって投与され得る。
【０１５４】
本発明はまた、本発明による抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、炎症治療、組織治癒、臓器再構築、及び／又は組織再生の方法を提供する。
【０１５５】
本発明による抽出物は、種々の細胞型、例えば幹細胞の成長、増殖、分化及び／又は維持を促進するために使用され得る。この目的のために、抽出物は、インビボ及び／又はインビトロの用途において、単独で又はフィブリンシーラントと組み合わせて使用され得る。一実施形態では、抽出物は、生体適合性のインプラントと共に、例えばインビボのティシューエンジニアリングのために、並びにインビトロの細胞培養のために使用され得る。
【０１５６】
用語「治療的有効量」は、疾病、疾患、又は病状を予防する又は治療する（ある症状又は全ての症状を緩和する）のに必要な用量を指す。有効量は、組成物の投与に応答した、疾病の経過中の任意の変化に基づいて判断され得る。有効用量は、被験体の年齢及び体重、疾患及びその重症度（例えば、早期か末期か）、並びに当業者によって認識され得る他の要因に応じて変えることができる。
【０１５７】
抽出物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含むことも可能である。本明細書で使用する用語「賦形剤」は、抽出物に添加される不活性物質を指す。典型的には、賦形剤は、医薬組成物の最終製剤中で使用される材料である。賦形剤は、例えば、貯蔵中に活性物質が化学安定性及び／又は生物活性を維持するのを確実にするよう、製造プロセスを支援するために、かつ／又は審美的理由で（例えば、色）添加され得る。添加される賦形剤は、一般に、安全かつ非毒性である。
【０１５８】
本発明による血小板抽出物は、外科用封止剤と組み合わされて使用され得る。生物学的封止剤（例えば、フィブリノーゲン及びトロンビン成分で調製されるフィブリンシーラントなど）、アクリル酸、シアノアクリル酸、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーなどの合成封止剤、並びに、例えばゼラチン−ホルムアルデヒド−レゾルシノール（ＧＦＲ）接着剤などの生物学的材料及び合成材料の混合物から作られた半合成封止剤などであるが、これらに限定されない、異なる種類の外科用封止剤を、血小板抽出物と組み合わせて使用することができる。本発明の一実施形態では、血小板抽出物は、フィブリンシーラント成分と組み合わせて使用される。本発明の別の実施形態では、血小板抽出物は合成封止剤と共に使用される。
【０１５９】
所望される場合、本発明の方法によって得られる血小板抽出物は、例えば、凍結乾燥、超臨界流体技術、スプレー凍結乾燥、スプレーコーティング、従来の噴流床による乾燥などのスプレーコーティングの改変型、霧化がない溶媒蒸発に基づく他の乾燥法（例えば、真空乾燥、Ｘｅｒｏｖａｃ１、泡沫乾燥、膜乾燥）若しくはスプレー乾燥によって乾燥させることができる。乾燥の前に、抽出物は抗凍結剤と配合され得る。
【０１６０】
用語「抗凍結剤」は、凍結中に活性成分（例えば、成長因子、ケモカイン、サイトカイン及び／又は栄養因子）の化学安定性及び／又は生物活性を維持するために溶液に添加される物質を指す。抗凍結剤の非限定的な例としては、例えば、単糖類としてグルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、ガラクトース、及びリボシドサッカライド（ribosedisaccharides）；二糖類としてスクロース、ラクトース、マルトース、及びトレハロース；並びに二糖類、オリゴ糖（Disaccharides oligosaccharides）などの炭水化物を挙げることができるが、これらに限定されない。他の群はポリオール（糖アルコール：マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びイソマルト）である。炭水化物とは別に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの他のポリマーを抗凍結剤として使用することが可能であり、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）若しくはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、又はアミノ酸並びにポリアミンなども可能である。
【０１６１】
用語「凍結乾燥」は、典型的には、物質を凍結した後、例えば昇華によって、生体反応又は化学反応の助けとならないレベルまで水分濃度を低減させるプロセスを指す。得られた凍結乾燥生物的物質は、比較的長期間にわたって貯蔵することが可能である。貯蔵後、凍結乾燥物質は、粉末として使用することができるか、又は様々な量の水溶液の添加によって復元することができる。復元の間に添加される量は、凍結乾燥前の溶液の体積と同様か、それより少ないか（出発物質の体積と比較すると抽出物の濃縮物が得られる）、又はそれより多い（出発物質の体積と比較すると抽出物の希釈物が得られる）場合がある。
【０１６２】
所望により、血小板抽出物は、長期貯蔵の目的で又は粉末として使用するために、例えば、凍結された状態で又は固体として保存され得る。
【０１６３】
例えば、本発明の方法によって得た血小板抽出物は、長期貯蔵を目的として、例えば−１８℃又はそれより低い温度で冷凍保存されることができ、又は（例えば、凍結乾燥された）固体として保存され得る。血小板抽出物はまた、例えば２℃〜８℃の温度で冷蔵され得る。
【０１６４】
凍結乾燥された抽出物は、固体として使用されてもよく、又は使用に先立って薬学的に許容可能な担体中で復元されてもよい。用語「薬学的に許容可能な担体」は、ヒトへの投与又は動物への投与に適した任意の希釈剤及び／又はビヒクルを指す。担体は、生理食塩水、塩化ナトリウム溶液、乳酸加リンガー（ＬＲ）、通常生理食塩水中の５％デキストロース、及び注射用水などであるが、これらに限定されない、当該技術分野において周知の担体のいずれかから選択することができる。
【０１６５】
フィブリンシーラントと共に投与する場合、抽出物は、封止成分（トロンビン又はフィブリノーゲン）のうちの１つにおいて復元することができるか、又は別の希釈剤又はビヒクルの中で別々に復元されることができる。
【０１６６】
有利には、凍結乾燥サイクル及びその製剤は、例えば緊急な使用を必要とする止血及び治癒を容易にするため、例えばフィブリンシーラント内での抽出物の非常に迅速な復元を可能とすることができ、この場合には、復元は数秒以内に有利に行われる。本発明の一実施形態では、迅速な復元を可能にするため、アルブミンが製剤中に用いられる。
【０１６７】
本発明の方法により得られる抽出物は、濃縮され得る。濃縮は、任意の工程で、例えば、Ｓ／Ｄ除去工程の直後に又は後工程で行うことができる。濃縮は、材料の透析濾過によって、かつ／又は凍結乾燥された抽出物を、凍結乾燥前のその体積よりも小さい体積に復元することによって、達成され得る。
【０１６８】
本発明はキットを提供する。キットは、本発明による抽出物を含む容器を含み得る。抽出物は、固形物形態で、例えば凍結乾燥されて、溶液として、又は凍結した形態であり得る。抽出物が固形で提供される場合には、キットは、固形抽出物を復元するための薬学的に許容可能な担体を有する容器を更に含み得る。キットは、抽出物を患者に注射するための１つ以上の注射器及び／又は注射針を更に含み得る。キットは、使用説明書を更に含み得る。説明書は、抽出物を患者に投与するための方法を説明していてもよい。本発明はまた、フィブリンシーラント、合成封止剤、及び／又は別の可能な送達剤の成分を収容する容器と、本発明の抽出物を収容する容器と、使用説明書と、を含むキットに関する。任意に、本発明の抽出物は、フィブリンシーラントの一成分の容器の中に入れられてもよい。また、本発明は、凍結乾燥された抽出物を収容する容器と、復元溶液又は担体を収容する容器と、使用説明書とを含むキットに関する。
【０１６９】
フィブリンシーラント成分は、血液組成物から調製され得る。血液組成物は、全血液、又は血液の一部、すなわち、血漿などの全血液の生成物であり得る。
【０１７０】
本発明の一実施形態において、フィブリノーゲン成分は、トラネキサム酸及びアルギニン若しくはリジン、又は混合物、若しくはアルギニン及びリジン、又はそれらの薬学的に許容可能な塩を更に含み得る血漿由来のタンパク質の溶液である生物活性成分（ＢＡＣ）からなる。ＢＡＣは、クリオプレシピテート、特に濃縮クリオプレシピテート由来であってよい。
【０１７１】
ＢＡＣ組成物は、塩酸アルギニンなどの安定化剤を含み得る。一般的に、ＢＡＣ中のフィブリノーゲンの量は、約４０〜約６０ｍｇ／ｍＬの範囲である。ＢＡＣの溶液中のトラネキサム酸の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬでありうる。塩酸アルギニンの量は、約１５〜約２５ｍｇ／ｍＬでありうる。
【０１７２】
必要に応じて、溶液は生理学的適合性を有するｐＨ値に緩衝化される。緩衝液は、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及びビヒクルとしての注射用水から構成されうる。グリシンは組成物中に約６〜約１０ｍｇ／ｍＬの量で存在してよく、クエン酸ナトリウムは約１〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲でよく、塩化ナトリウムは約５〜約９ｍｇ／ｍＬの範囲でよく、塩化カルシウムは約０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬの濃度でよい。必要に応じて、ＢＡＣ成分は、３〜６０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンを含むよう希釈され得る。希釈は、例えば、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム及び注射用水を含む溶液を使用して行うことができる。
【０１７３】
一実施形態では、使用されるトロンビン成分は、１００〜１２００ＩＵ／ｍＬの範囲であり得る。
【０１７４】
所望の場所に液体フィブリンシーラント製剤を適用する際、フィブリノーゲン含有成分とトロンビン含有成分とは任意の所望の範囲の比で適用することができる。例えば、フィブリノーゲン成分の濃度が３〜６０ｍｇ／ｍＬであり、トロンビン成分の濃度が約１０〜１２００ＩＵ／ｍＬである場合、これらの２つの成分はそれぞれ、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１等の比で混合することができる。本発明の一実施形態では、液体フィブリンシーラントの成分は、３：１の比で適用される。
【０１７５】
別の実施形態では、ＢＡＣ組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度を、例えば、米国特許第７，１２５，５６９号及び国際公開第０２０９５０１９号に記載の方法を用いて、１５μｇ／ｍＬ以下、例えば５μｇ／ｍＬ以下のプラスミノーゲンにまで低下させる。この場合、トラネキサム酸、アプロチニン又は任意の他の繊維素溶解阻害剤をＢＡＣに添加する必要はない。
【０１７６】
フィブリンシーラントは、Ｃａ２＋、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）などのクロットの形成を促す成分を含むことも可能であり、これらの成分は、別々の成分として提供されるか又はフィブリンシーラント成分と配合され得る。
【０１７７】
血液組成物由来のフィブリンシーラント成分は、典型的には、感染性粒子から精製される。精製手順は、ナノ濾過、溶媒／洗浄剤処理によって、及び／又は当技術分野で既知の任意の他の方法によって、実施され得る。
【０１７８】
用語「感染性粒子」は、微生物又はプリオンのような微細粒子を指し、これらは生物有機体の細胞に感染するか又は伝搬し得る。感染性粒子はウイルス粒子であってもよい。
【０１７９】
本発明に従って調製される血小板抽出物は、種々の細胞型、例えば、線維芽細胞及び幹細胞、例えば、内皮幹細胞、例えば、ＨＵＶＥＣと共に使用され得る。細胞型は、意図する治療的使用に従って決定され得る。例えば、椎間板の再生では、脊索由来の細胞を含む細胞組成物を使用することができる。血管形成の誘発では、内皮幹細胞を使用することができる。
【０１８０】
以下の例は例示であり、限定するものではない。
【実施例】
【０１８１】
材料及び方法
白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）調製物
血小板物質単位（白血球低減アフェレーシス血小板単位）を収集し、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｏｆ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ」（２００９年１２月）に従って処理し、ＦＤＡ及びＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの適用法令及び規則に適合させた。各単位は、およそ２００ｍＬの量を有した。各単位は、検査され、ＦＤＡの規制、要件、及びガイドラインに基づいて輸血可能な血液成分の提供にふさわしいと判断された単一ドナーから採取された。ＦＤＡによって承認されたキット及び方法（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体；Ｃ型肝炎ウイルス抗体；ヒトＴ細胞白血球ウイルス１型及び２型抗体；ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型抗体；核酸増幅検査（nucleic acid technology testing）（ＮＡＴ）によるＨＩＶ−１；ＮＡＴによるＨＣＶ  ＲＮＡ；ＮＡＴによるウエストナイルウイルスＲＮＡ；及び梅毒血清検査）を用いることによって、赤血球抗体に対し非反応性であり、かつこれらウイルスに対して陰性であることが判明した単位のみが含まれた。白血球低減アフェレーシス収集単位中の血小板の最小数は、情報の回状に定められた通り、３．０×１０１１以上（単一全血単位中の血小板の数は、５．５×１０１０以上）であった。
【０１８２】
全単位は、洗浄工程まで、輸血の推奨条件下で維持された（ＦＤＡによって承認された血液採取、処理、及び貯蔵システムの使用法を参照のこと）。
【０１８３】
洗浄手順
各単位は、無菌条件下で次の通りに洗浄された。
１．各単位は、室温にて４６５８×ｇで６分にわたって遠心分離された（破砕回転翼（rotor break）は使用しなかった）。こうした緩やかな条件下で、細胞の破損は回避された。
２．上澄みを廃棄し、無菌連結された（無菌状態を維持するために、閉鎖システムにおいて容器間で液体を移送する方法）２００ｍＬの生理食塩水中で血小板ペレットを復元した。
３．工程１で指定されたのと同じ条件で第２の遠心分離を行った。
４．生理食塩水を廃棄し、ペレット化血小板を無菌連結された生理食塩水２００ｍＬの中に再懸濁した。
５．洗浄され、再懸濁された血小板を−２０〜−３０℃で凍結した。凍結工程は、先の工程から４時間以内に行われた。
【０１８４】
白血球低減血小板アフェレーシス単位の慎重に実施された上記収集及び洗浄手順は、血液収集センターで行われた（Ｒｏｃｋ  Ｒｉｖｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ／ＦＤＡ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  ＃２４９）。最終ＷＡＰバッグは、調製日から２か月以内に実験用に供給された。これらの単位は、ドライアイスの上で凍結された状態で受領した。
【０１８５】
更なる処理の前に、個々の凍結単位（バッグ）を解凍し、次いで一緒にプールし、又は凍結及び解凍しながら一緒にプールした。解凍処理は、ＲＫ１頭上撹拌機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたステンレス鋼のプロペラを使用して３０ＲＰＭで撹拌しながら、２５℃で行った。
【０１８６】
成長因子の回収率
試料中のいくつかの成長因子の濃度を、特定の市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ  ＵＳＡによるＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ：ヒトＴＧＦ−β１カタログ番号ＤＢ１００Ｂ、ヒトＦＧＦ塩基性カタログ番号ＨＳＦＢ００Ｄ、ヒトＶＥＧＦカタログ番号ＤＶＥ００、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢカタログ番号ＤＨＤ００８、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢカタログ番号ＤＢＢ００、及びヒトＥＧＦカタログ番号ＤＥＧ００）を使用して検出かつ測定した。以下の全ての実験において、成長因子の含量を、試料をクロマトグラフィー樹脂に導入する前に（ＳＤＲ前の物質）、及び樹脂から試料を回収した後に（溶媒及び界面活性剤除去後；ＳＤＲ後の物質）溶解物中で測定し、Ｓ／Ｄ除去後の成長因子の回収の百分率を計算した。
【０１８７】
細胞の計数
３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ線維芽細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＣＣＬ９２）を、接着性単層として増殖させた。２〜３日毎に、顕微鏡を用いて、フラスコを集密について調べた。
【０１８８】
計数手順は、以下のように行った。
−培養基を吸引した。
−細胞層を１０ｍＬのＰＢＳで簡単に濯ぎ、全ての微量の血清を除去した。
−５ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（それぞれ０．０５％及び０．０２％）溶液を、１７５ｃｍ２のフラスコごとに添加し、細胞層がプレート表面から外れるまで（通常３〜５分以内）倒立顕微鏡下で細胞を観察した。
−１０ｍＬの完全成長培地［４ｍＭのグルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０３−０２０−１Ｂ）、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ；カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）／アンフォテリシン（０．２５μｇ／ｍＬ）溶液（Ｐ／Ｓ／Ａ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０３−０３３−１Ｂ）を補充した、４．５ｇ／ｌのグルコースを含有するＤＭＥＭ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０１−０５５−１Ａ］を添加し、浮遊細胞凝集塊／集塊群を、均質の細胞懸濁液が得られるまで、緩やかに上下に数回ピペット操作することによって分散させた。
−細胞懸濁液を５０ｍＬの管に移し、スインギングバケットローター内で、室温にて１０００×ｇで４分間遠心分離した。
−上澄み（培地を含有する）を捨て、ペレット（細胞を含有する）を、３〜１０ｍＬの新鮮な上記の完全成長培地中に再懸濁させた。
−１０μｌの細胞懸濁液を、細胞計数用に血球計算器中に仕込んだ。
【０１８９】
増殖アッセイ
１日目：
細胞を計数し（上記に詳述したように）、完全成長培地（ＧＭ）で細胞２５，０００個／ｍＬの濃度まで希釈し、細胞溶液からの１００μｌを播種し、９６ウェルプレートの列Ｂ〜Ｇに付着させた（２５００細胞毎ウェルの最終細胞濃度）。列Ａ及びＨは空のまま残した。プレートを、５％のＣＯ２を含む水ジャケット付きインキュベータ内で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０１９０】
２日目：
成長培地を吸引し、プレートに付着した細胞を、飢餓培地［４ｍＭのグルタミン、１％のＭＥＭ−ＥＡＧＬＥ非必須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ；カタログ番号０１−３４０−１Ｂ、１％のヒト血清アルブミン（Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ  ２５、Ｔａｌｅｃｒｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＰ／Ｓ／Ａ（上記で列挙した濃度のもの）を補充した、４．５ｇ／ｌのグルコースを含有するＤＭＥＭ：］（ＳＭ）で２回洗浄し、（各洗浄毎に約１００μｌ／ウェル）、新鮮な１００μｌ／ウェルのＳＭを全てのウェル（列Ａ〜Ｈ）に添加した。プレートを、５％のＣＯ２を含む水ジャケット付きインキュベータ内で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０１９１】
３日目：
１０μｌの非希釈の又は系列希釈された被験物質／抽出物（所定の処理に従って調製）を、ウェルに添加し（３部ずつ）、５％のＣＯ２を含む水ジャケット付きインキュベータ内で３７℃にて、更に４８時間インキュベートした。希釈試料を、飢餓培地による１：２又は１：３の６倍又は９倍の系列希釈を行うことによって調製した。
【０１９２】
４日目：
１０μｌの細胞増殖測定用試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号１１−６４４−８０７；この試薬は、９６ウェルプレートフォーマットを使用して、細胞集団中の細胞増殖、成長、生存率及び化学感受性の非放射性の分光測光定量用に使用されるよう設計されている）を各ウェルに添加した。５％のＣＯ２を含む水ジャケット付きインキュベータ内で３７℃にて４時間の追加のインキュベーション後、培地のみを含有するブランクウェル（列Ａ＋Ｈ）で機器のブランキングを行った後に、この９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡ読み取り器で４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで読み取った。
【０１９３】
結果の評価
各ウェル毎に別個に、６５０ｎｍでＥＬＩＳＡ読み取り器から得られた結果を、４５０ｎｍで得られた結果から減じた。この値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって更に解析した。バックグラウンド読み取りを低減するために、未処置のウェル（試験物質で処置されていない細胞を含有する）について得られた結果を、同じ９６ウェルプレート上のウェルの全ての値から減じた。この得られた結果を使用して、物質の濃度の対数に対して、Ｓ字状用量反応曲線をプロットした。加えて、Ｒ２適合値、半有効濃度（ＥＣ５０）、及び９５％信頼区間のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって計算した。
【０１９４】
トロンビン活性
トロンビン活性を、ＳＴａｒｔ４血液凝固装置（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した凝固時間測定によって評価した。このアッセイは、欧州薬局方アッセイ手順、１９９７、０９０３、ｐ．８５８の改変型である。簡単に言うと、トロンビン標準を、０．１％のフィブリノーゲン含量のフィブリノーゲン溶液（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）と混合することによって検量線を作成した。次いで異なる被験抽出物試料中のトロンビン濃度を、それらの凝固時間によって、検量線から計算する（濃度は検量線から内挿される）。測定の前に、被験抽出物試料を、トロンビン１６ＩＵ／ｍＬ（Ｏｍｒｉｘ，Ｉｓｒａｅｌ）と１：１（ｗ／ｗ）で混合し、トロンビン８ＩＵ／ｍＬの最終濃度に達した。検量線については、同じトロンビン１６ＩＵ／ｍＬの溶液を、１：１（ｗ／ｗ）で、トロンビン希釈緩衝液（０．４％のクエン酸三ナトリウム二水和物、０．９％の塩化ナトリウム及び１％のＢＳＡ、ｐＨ＝７．５）と混合することによって、トロンビン８ＩＵ／ｍＬの標準試料を調製した。処理に対して陽性の対照試料は、同じトロンビン１６ＩＵ／ｍＬの溶液を、Ｓ／Ｄで処理されず、かつヘパリン、ＬＭＷＨ又はＰＶＰを含有しない血小板抽出物試料（実施例１のように調製）と１：１（ｗ／ｗ）で混合することによって作製した。トロンビン活性を、カラム処理の前後に各溶解物中で測定した。結果は、対照試料（１００％のトロンビン活性とみなす）に対して示される。
【０１９５】
以下の実験で使用したＰＶＰ
下の表３０には、異なるＰＶＰの濃度ｗ／ｗ及びそれらの対応するｍＭでの濃度が示されている。
【０１９６】
ＰＶＰはそのＫ値、又はＦｉｋｅｎｔｓｃｈｅｒの粘度係数（これは、平均分子量、重合度、及び固有粘度の関数である）によって特性が決定される。可溶性Ｋｏｌｌｉｄｏｎ等級の平均分子量は、欧州及び米国で有効な薬局方におけるＫ値の点から表わされる。
【０１９７】
ＰＶＰポリマーは、モノマーが一緒に結合する重合反応によって製造される。重合反応の終結を調節することによって、異なる分子量のＰＶＰが製造される。このことが、それぞれがＭＷの独自の範囲を有する、異なる種類のＰＶＰを起こさせるもとである。ＰＶＰのＭＷを決定するために、いくつかの方法がある。
【０１９８】
Ｋ値及び粘度は、置き換え可能でないことに留意されたい。Ｋ値は、水中の粘度から計算される。
【０１９９】
以下の全ての実験において、列挙されたＰＶＰの百分率は、ｗ／ｗ又はｍＭである。また、酢酸塩／グリシン／ＨＳＡの百分率は、ｗ／ｗとして計算される。
【０２００】
以下の全ての血小板溶解調製物において、プールしたＷＡＰの浸透圧モル濃度は、約２６０〜２８０ｍＯｓであった［Ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３３００（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用することによって測定した］。プロセスを通じて浸透圧モル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、緩衝液の浸透圧モル濃度を監視し、必要であれば、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、該緩衝液の浸透圧モル濃度をＷＡＰ出発物質の浸透圧モル濃度に合わせて調整した。
【０２０１】
実施例１：Ｓ／Ｄで処理され、ヘパリンと混合され、かつＳ／Ｄ除去に供された、プールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製した血小板抽出物
以下の実施例において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるＳ／Ｄ除去中の未分画ヘパリン［ヘパリンナトリウム−Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  ５０００ｉ．ｕ．／１ｍＬ（注用）Ｂｏｄｅｎｅ（ＰＴＹ）Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ］を含有することの、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦの回収率に及ぼす効果を検討した。ヘパリンはいくつかの成長因子に結合することが知られているという理由から、ヘパリンを試験した。ヘパリンは、広範囲の分子量を有し、未分画ヘパリンとは、特定のより狭い範囲の分子サイズの単離又は選別がなかったことを意味する。
【０２０２】
Ｓ／Ｄ除去を、ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ溶媒−界面活性剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ）を使用して行った。ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤは、空隙体積が三次元架橋疎水性アクリルポリマーで満たされている、シリカビーズからつくられたクロマトグラフィー充填剤である。ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤは、疎水性相互作用の混合モード吸着を伴い、分子排除効果に関連する［Ｇｕｅｒｒｉｅｒ  Ｌら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｏｒｂｅｎｔ  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ」．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ｆｅｂ  ３；６６４（１）：１１９〜１２５］。
【０２０３】
２ｍＬの樹脂を直径１ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄカラムに充填した（小規模実験）。Ｓ／Ｄで処理された血小板溶解物試料を、５〜１２個のバッグ（各バッグは、１人のドナーから得られる）から得られた９６５〜２３２８ｇのプールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）を使用して調製した。２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン及び０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）Ｗ／Ｗ（最終体積溶液から）をプールしたＷＡＰに添加した。次の工程で、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰをこの溶液に加え、溶液をインキュベートし、血小板溶解及び抗ウイルス処理のために室温（２２±２℃）にて２時間にわたり（チューブ回転装置で）混合した。次いで保存溶解物をバイアルに小分けし（１４ｍＬずつ）、凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。使用前に、小分けした溶解物を３７℃の水浴中で解凍し、５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、いかなる粒子状物質も除去し、ローラーミキサー上で少なくとも５分間混合した。
【０２０４】
Ｓ／Ｄで処理された溶解物を導入する前に、樹脂を充填したカラムを、１０ｍＬの純水で洗浄し、溶解物の緩衝液に従いヘパリンを含む又は含まない１０ｍＬの酢酸塩−グリシン−ＨＳＡ緩衝液（ｐＨ  ６．８〜７．４）（「ＡＧＡ」と簡略された；濃度は上記の通りである；以下の実験では、全てのＡＧＡは６．８〜７．４のｐＨで使用した）（ヘパリンを含む又は含まないＡＧＡ）で平衡化した。次の工程では、１０ｍＬのＳ／Ｄで処理された溶解物を、試料２及び４（５ＩＵのヘパリン／ｍＬ（５０μｌのヘパリンを５０ｍＬの血小板溶解物に添加した）でインキュベートされたもの）以外をカラムに導入し、その後溶解物をカラムに導入した。流速を、最大０．４ｍＬ／分に保持した。カラムに導入する前に、ヘパリンを含む又は含まない全ての試料を、チューブ回転装置で室温（２２±２℃）にて２０分間混合した。残りのＳ／Ｄで処理された溶解物質（カラムに導入されていないもの）を、１．５ｍＬのバイアルに移し、成長因子濃度測定の分析用に−８０℃で保持し、これを導入対照／ＳＤＲ前の物質とみなした。
【０２０５】
溶解物の導入後に、カラムに、それぞれ１０ｍＬの異なる緩衝液（下表１に示すような）を導入した。各緩衝液は、異なる成分を異なる濃度で含有した。この緩衝液のいくつかでは、ヘパリンをＮａＣｌ／エタノールと混合した。流速を０．８ｍＬ／分以下に保持した。導入後、及び緩衝液で洗浄後にカラムから得られた全ての分画を採集して混合し、回収された物質を、１ｍＬのアリコートに分割し、成長因子の回収率の測定に進むまで−８０℃以下で凍結させ続けた。この物質は、ＳＤＲ除去後の物質とみなされた。
【０２０６】
異なる成長因子の回収率（ＳＤＲ前の物質に対する％）を表２に示す。
【０２０７】
【表１】
2016503789.tif 000003
【０２０８】
【表２】
2016503789.tif 000004
【０２０９】
表２に提示した結果は、物質をＳＤＲカラムに導入する前の、Ｓ／Ｄで処理された血小板溶解物のヘパリンとのインキュベ−ション（処理２及び４対１及び３）が、約５３％〜約９３までの又は９７％までのｂＦＧＦの回収率における劇的な増加をもたらしたことを示している。ＰＤＧＦ−ＢＢの回収率も増加したが、より少ない程度であった。
【０２１０】
ＳＤＲカラムに導入する前のヘパリンとのインキュベーション及びヘパリンによる追加の洗浄工程の組み合わせを含んだ処理２及び４は、得られたＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢを含む血小板抽出物の顕著な濃縮をもたらし、ヘパリン含有緩衝液の使用に先立って、ヘパリンを含有しない緩衝液でカラムを洗浄した処理２とは対照的に、導入の直後にヘパリンを含有する緩衝液で洗浄することによる処理４で更に増加している（それぞれ、６１％及び９２％）。
【０２１１】
したがって、この結果は、Ｓ／Ｄの除去、例えばＨＩＣによる除去の前に、Ｓ／Ｄで処理された血小板溶解物をヘパリンに接触させることが、特定の成長因子、例えば、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢの回収率を有利に増加させ得ることを示している。
【０２１２】
実施例２：Ｓ／Ｄ除去前に溶解物をヘパリンと混合することにより調製された血小板抽出物の線維芽細胞増殖に及ぼす効果
以下の実施例において、Ｓ／Ｄ除去前に溶解物をヘパリンに接触させることによって調製された血小板抽出物の３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ線維芽細胞増殖に及ぼす生物学的効果を検討した。表１に記載された異なる４つの工程に従って調製された４つの抽出物を調べた。結果を図１に示す。
【０２１３】
細胞増殖結果（図１）は、ＳＤＲカラムへの導入の前にヘパリンとのインキュベーションを含む処理２及び４から得られた試料が、ヘパリンとインキュベートされなかった処理１及び３によって得られる試料よりも、増殖誘導において著しく有効であったことを示している。処理２及び４によって得られる試料は、それぞれ０．９９及び０．８９のＥＣ５０を有したが、一方処理１及び３によって得られる試料は、それぞれ２．９３及び２．４のＥＣ５０を有した。
【０２１４】
これらの結果は、より高いＧＦ回収率をもたらした、Ｓ／Ｄ除去前のヘパリンとのインキュベーションが、線維芽細胞増殖アッセイによって反映されるように、生物学的効果をも改善したことを立証している。
【０２１５】
実施例３：Ｓ／Ｄ除去工程前のＳ／Ｄで処理された溶解物の低分子量ヘパリンとの混合の効果
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、１５ｋＤａの未分画ヘパリンに比べて約４．５ｋＤａの平均分子量を有するヘパリンである。臨床現場においては、ＬＭＷＨは、未分画ヘパリンを超えるいくつかの薬理学的利点及び実際的な利点を有する。ＬＭＷＨは、細胞及びタンパク質に対する非特異的結合がより少なく、より長い血漿半減期を有し、したがって、皮下投与され得ることが示されている（Ｈｉｒｓｈ及びＲａｓｃｈｋｅら、Ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｈｅｐａｒｉｎ：ｔｈｅ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  ＡＣＣＰ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈｅｓｔ．２００４；１２６：１８８Ｓ〜２０３Ｓ）。
【０２１６】
以下の実験においては、ＨＩＣによるＳ／Ｄ除去工程中に使用された様々な条件が、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦの回収率に及ぼす効果を検討した（表３中の異なる条件を参照）。この実験では、エノキサパリンナトリウム（Ｃｌｅｘａｎｅ，Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）を、低分子量ヘパリンとして使用した。
【０２１７】
表３中に詳述された条件下で上記の実験で詳述された通りに、溶解物を調製し、次いでＳＤＲカラムに導入した。導入の前に、導入された溶解物の緩衝液を使用して、平衡化を行った。導入後、及び緩衝液による洗浄後にカラムから得られた全ての分画を回収し、混合して、総成長因子回収率を計算した。処理２は、上記のヘパリンについて行ったものと同様な方法での５ＩＵ／ｍＬのエノキサパリンとのインキュベーションを含んだ。結果を表４に示す。
【０２１８】
【表３】
2016503789.tif 000005
【０２１９】
【表４】
2016503789.tif 000006
【０２２０】
表４に提示された結果は、Ｓ／Ｄ除去工程前の、エノキサパリンでのＳ／Ｄ処理された血小板溶解物のインキュベーション（処理２対１）、及び追加のエノキサパリン含有洗浄工程が、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びｂＦＧＦの回収率を増加させたことを示している。
【０２２１】
しかしながら、５ＩＵ／ｍＬの未分画ヘパリンとの接触後（表１中の処理４；上記実施例１）のＰＤＧＦ−ＢＢ及びｂＦＧＦについての回収率（それぞれ、９２％及び９７％）は、５ＩＵ／ｍＬのエノキサパリンとの接触後（それぞれ７５％及び６２％）よりも高かった。
【０２２２】
エノキサパリンの濃度の増加（３０ＩＵ／ｍＬ；データを示さず）を伴う追加の実験は、成長因子の回収率においていかなる顕著な変化ももたらさなかった。
【０２２３】
実施例４：Ｓ／Ｄ除去前に溶解物を低分子量ヘパリンと混合することによって調製された血小板抽出物の線維芽細胞増殖に及ぼす効果
以下の実施例において、実施例３に記載された通りに調製された血小板抽出物の細胞増殖に及ぼす効果を検討した。細胞計数及び増殖アッセイを、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ線維芽細胞を使用して、「材料及び方法」項で記載した通りに行った。結果を図２に示す。
【０２２４】
この結果（図２）は、線維芽細胞増殖が、ＬＭＷＨとインキュベートしなかった試料（試料１／処理１、ＥＣ５０  ０．１１）と比べて、ＬＭＷＨとインキュベートした試料（試料２／処理２、ＥＣ５０  ０．０５）でより高かったことを示している。
【０２２５】
これらの結果は、Ｓ／Ｄ除去の前の低分子量ヘパリンとのインキュベーションが、いくつかの成長因子の回収率を増加させ（実施例３）、生物学的効果をも改善することを立証している。
【０２２６】
実施例５：Ｓ／Ｄ除去前の血小板溶解物とＰＶＰとの混合が成長因子回収率に及ぼす効果
前の実施例においては、Ｓ／Ｄ除去前に、溶解物を、特定の成長因子に結合することが知られている未分画ヘパリン及びＬＭＷＨに接触させた。
【０２２７】
以下の実施例では、両親媒性特性を有する、完全に異なる化合物であるＰＶＰが、ＨＩＣカラムによるＳ／Ｄ除去後の成長因子回収率に及ぼすその効果について探索された。
【０２２８】
本実施例では、ＨＩＣによるＳ／Ｄ除去工程の前又は除去工程中に、ＰＶＰが添加される、又はＰＶＰが添加されない（対照）、異なるＳ／Ｄ除去条件を試験した。上記に列挙した市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、以下の成長因子、すなわち、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦの回収率を検討した。２種類のＰＶＰ、すなわち、Ｋ２５（２２．５〜２７．０のＫ値及び３００００Ｄａの平均分子量を有するＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）２５、カタログ番号０２２８６  Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；及びＫ３０（２７．０〜３２．４のＫ値及び４００００Ｄａの平均分子量を有するポビドンＫ−３０、カタログ番号Ｐ１４５４  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｆｇ  ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）について試験を行った。
【０２２９】
実施例１に詳述した通りに、また、表５に詳述したＳ／Ｄ除去条件を使用することによって、溶解物を調製してＳＤＲカラムに導入した。導入の前に、導入された溶解物の緩衝液を使用して、平衡化を行った。導入後、及び緩衝液１並びに緩衝液２による洗浄後にカラムから得られた全ての分画を回収し、混合して、成長因子回収率を計算した。成長因子の回収率の結果（上記に説明したよう計算したもの）を表６に示す。ＰＶＰを含む、全ての導入される試料も、上述した方法でＰＶＰと共にインキュベートした。
【０２３０】
【表５】
2016503789.tif 000007
【０２３１】
【表６】
2016503789.tif 000008
【０２３２】
この結果は、ＳＤＲカラムによるＳ／Ｄ除去前及びＳ／Ｄ除去中のＳ／Ｄで処理された血小板溶解物のＰＶＰとの接触が、ＳＤＲカラムからの成長因子の回収率に大きく影響を与えたことを示している。
【０２３３】
また、この結果は、Ｓ／Ｄ除去工程中に、エタノール及びＮａＣｌと組み合わせたＰＶＰが、ＰＶＰ単独よりも成長因子の回収率の増加においてより有効であったことを示している（処理７対９、及び３対５を比較）。
【０２３４】
この結果はまた、より低い分子量のＰＶＰを使用することが、成長因子の回収率を更に増加させることを示している（処理３を７と比較）。
【０２３５】
Ｓ／Ｄで処理された溶解物をＳ／Ｄ除去工程に供する場合、成長因子の回収率の増加は、Ｓ／Ｄ除去工程の前にかつ／又はＳ／Ｄ除去工程中に、Ｓ／Ｄで処理された溶解物をＰＶＰに接触させることによって達成することができると結論付けることができる。
【０２３６】
実施例６：Ｓ／Ｄ除去前に、かつＳ／Ｄ除去中に使用されるＰＶＰポリマーの分子量の線維芽細胞増殖に及ぼす効果
以下の実施例において、Ｓ／Ｄ除去前に、かつＳ／Ｄ除去中にＳ／Ｄで処理された溶解物に接触させるＰＶＰの分子量の、細胞増殖に及ぼす効果を検討した。
【０２３７】
表５中の処理３及び７について記載されたＳ／Ｄ除去手順（実施例５）に従って調製した血小板溶解物試料を使用した。
【０２３８】
細胞計数及び細胞増殖アッセイを、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ線維芽細胞を使用して、「材料及び方法」項で記載した通りに行った。
【０２３９】
結果を図３に示す。
【０２４０】
この結果は、ＰＶＰ  Ｋ２５を含む試料３が、ＰＶＰ  Ｋ３０を含む試料７（ＥＣ５０＝１．９５）よりも高い増殖速度を有した（ＥＣ５０＝０．３４）ことを示している。実施例５に示したように、処理７から得られた成長因子の回収率は、処理３から得られた成長因子の回収率よりも高かったが、処理３で回収された成長因子の活性は、処理７で回収された成長因子の活性よりも一層有効である。
【０２４１】
これらの結果は、生物学的効果の増加を得るためには、より低い分子量のＰＶＰ（例えば、ＰＶＰ  Ｋ２５）が有利に使用され得ることを示唆している。
【０２４２】
実施例７：Ｓ／Ｄ除去前及びＳ／Ｄ除去中の異なる濃度のＰＶＰの、成長因子の回収率に及ぼす効果
以下の実施例は、Ｓ／Ｄ除去工程中にＰＶＰ、エタノール及び／又はＮａＣｌを使用することが、ＳＤＲカラムからの成長因子の回収率を増加させること示す前の結果を実証することを目的とする。Ｓ／Ｄ除去工程中の異なる条件の効果を検討し、ＳＤＲ後の物質中のいくつかの成長因子の回収率を、上記の通りに測定した（ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦ）。
【０２４３】
ＰＶＰ  Ｋ２５（上記と同様）をこれらの実験で使用した。下表７に詳述されるＳ／Ｄ除去条件を使用して、実施例１で上述したように、溶解物を調製してＳＤＲカラムに導入した。導入前に、平衡化を、ＡＧＡ（上記の濃度）＋０．１％（０．０３ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ２５で行った。全ての試料は、ＡＧＡ緩衝液中にて０．１％（０．０３ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ２５の最終濃度（上記の濃度）を含有した。全ての導入される試料を、導入前に上述の通りにＰＶＰとインキュベートした。導入後、及び緩衝液による洗浄後にカラムから得られた全ての分画を回収し、混合して、成長因子回収率を計算した。成長因子回収率の結果（ＳＤＲ前の物質に対する％）は、表８に提示されており、総成長因子回収率が最高のものから最低のものへと列挙されている。
【０２４４】
１つの目的は、最終生成物中のＰＶＰを低減しようとするものであった。前の実施例で記載したいくつかの実験においては、試料を１％の比較的高いＰＶＰ最終濃度でインキュベートした（実施例５）。場合によっては、試料体積（６カラム体積）でカラムに導入後に、カラムを０．１％の比較的低いＰＶＰで洗浄した。しかしながら、体積で最も大きい分画は、導入された試料（６カラム体積）であるために、生成物中のＰＶＰを低減するための最適の方法は、例えば、導入される試料を１％（０．３ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ２５に代えて、０．１％（０．０３ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ２５の最終濃度でインキュベートすることにより、導入される試料中のＰＶＰ濃度を低減することである。
【０２４５】
【表７】
2016503789.tif 000009
【０２４６】
【表８】
2016503789.tif 000010
＊  ＳＤＲカラム前に対する％
【０２４７】
この結果は、前述の結果を立証し、Ｓ／Ｄ除去工程中に、溶解物をＰＶＰ単独に接触させる場合よりも、溶解物をエタノール及びＮａＣｌと組み合わせたＰＶＰに接触させる場合に、ＳＤＲカラムからの最も高い成長因子の回収率が得られたことを示している。
【０２４８】
この結果はまた、生成物中のＰＶＰ濃度を０．５％（０．１７ｍＭ）以下まで低減させることが可能であることを示している。
【０２４９】
実施例８：血小板抽出物中の異なる濃度のＰＶＰの線維芽細胞増殖に及ぼす効果
実施例７で調製された試料の細胞増殖に及ぼす増殖効果を、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ線維芽細胞を使用して、「材料及び方法」の項に記載された通りに検討した。
【０２５０】
この実験では、同様の量の成長因子の回収率を示す、試料１７及び１９の細胞増殖活性を検討した。これらの２つの試料間の主な相違点は、試料１７は、０．１％（０．０３ｍＭ）のＰＶＰを含む第２の洗浄緩衝液により調製されており、これに対して試料１９は、０．５％（０．１７ｍＭ）のＰＶＰを含む第２の洗浄緩衝液で調製されていたことであった（表７参照）。この相違点は、異なるＰＶＰ濃度を有する２つの抽出生成物をもたらした。
【０２５１】
この結果は、低いＰＶＰ濃度を含む試料１７の細胞増殖活性（０．１％のＰＶＰで調製；ＥＣ５０＝２．３）が、より高いＰＶＰ濃度を含む試料１９のものと（０．５％のＰＶＰで調製；ＥＣ５０＝２．８７）同様であったことを示している。
【０２５２】
この結果（図４）は、生成物中のより高い量のＰＶＰが、増殖レベルに影響を及ぼさなかったことを示している。
【０２５３】
実施例９：ＰＶＰのトロンビン活性に及ぼす効果
以下の実施例は、Ｓ／Ｄ除去中にＰＶＰ又はヘパリンを使用して調製された血小板抽出物が、トロンビン活性に影響を及ぼすかどうかを検討することを目的とした。
【０２５４】
トロンビンは、血液凝固の重要な酵素であり、血液凝固カスケードの最初の工程として活性化される。トロンビンは、可溶性フィブリノーゲンを不溶性のフィブリンのストランドに変換するセリンプロテアーゼとして作用し、同様に多くの他の血液凝固関連反応を触媒する。
【０２５５】
ヘパリン及びＬＭＷＨの血液凝固に及ぼす効果は既知であって、主として抗血液凝固用に医薬品で使用される［Ｍａｃｈｏｖｉｃｈ  Ｒら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ」．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７８；１７３：８６９〜８７５］。
【０２５６】
トロンビン活性を、上述の通りに、凝固時間測定によって評価した。表９に示す結果は、対照試料（１００％のトロンビン活性とみなされる）に対するものである。
【０２５７】
【表９】
2016503789.tif 000011
＊  対照試料に対するトロンビン活性（％）
＊＊  実施例１の処理２及び４に従って調製
＊＊＊  実施例３の処理２に従って調製
＊＊＊＊  実施例７の処理１７に従って調製
【０２５８】
この結果は、未分画ヘパリン又はＬＭＷＨを含む血小板抽出物試料では、インビトロでトロンビン活性に及ぼす阻害効果があったが、一方、ＰＶＰを含む血小板抽出物試料では阻害効果が検出されなかったことを示している。
【０２５９】
実施例１０：大規模プロセスにおいて調製された、Ｓ／Ｄで処理され、ＰＶＰ  Ｋ２５でインキュベートされ、ＰＶＰ  Ｋ２５によりＳＤＲカラムから洗浄された、プールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）から調製された血小板抽出物
この実験においては、Ｓ／Ｄ除去前のＰＶＰの添加の成長因子の回収率に及ぼす効果を、大規模において評価した（上記実験では、小規模プロセスが行われた）。この実験では、ＰＶＰ  Ｋ２５を使用した。
【０２６０】
溶解物を以下の通りに調製した。すなわち、血小板溶解物を、１２個のバッグから得られた２３２８ｇのプールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）を使用して調製した。２５５ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（最終濃度は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４、となるように）及び０．２％  Ｗ／Ｗ（溶液の最終体積に対する）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｔａｌｅｃｒｉｓ  ＵＳＡ）を、プールしたＷＡＰに加えた。次の工程において、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｗ／ｗ）を、３０ＲＰＭで混合しながらプールした試料にゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、Ｓ／Ｄ処理を２つのパートに分割した。第１のパートでは、試料を３０分間連続して撹拌し、２３〜２７℃にて５０１６×ｇで１０分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して濾過した。第２のパートでは、濾過した物質を、２５℃に調整した水浴中に浸したステンレス鋼のポットに注ぎ、透明溶液中でウイルス不活性化プロセスを続けるために、３０ＲＰＭで更に２時間混合した。ＰＶＰ  Ｋ２５を、Ｓ／Ｄで処理された溶解物に添加し、０．１％（ｗ／ｗ）（０．０３ｍＭ）の最終濃度にして、３０ＲＰＭで撹拌しながら２５℃で２０分間インキュベートした。粒子状物質を除去するため、５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ＰＰ２フィルターを使用して試料を濾過した。
【０２６１】
次に、３００ｍＬのＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ溶媒−界面活性剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ）が充填されたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６  ＵＷ／ＷＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ  １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。カラムを、９００ｍＬの酢酸塩−グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸Ｎａ、１０ｍＭのグリシン、０．１％（０．０３ｍＭ）のＰＶＰ及び０．２％のＨＳＡを含む、ｐＨ  ６．８〜７．４）で平衡化した。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理及びＰＶＰ処理された血小板溶解物（１６２０ｍＬの血小板物質を含有）を、カラムに導入し、続いて、０．５％（０．１７ｍＭ）のＰＶＰ及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（上記と同一濃度）でカラムを洗浄した。これに続いて、１２．５％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ、０．１％（０．０３ｍＭ）のＰＶＰ及び０．２％のＨＳＡを含有する１，２００ｍＬの酢酸塩−グリシン緩衝液で洗浄した。次に、カラムを３００ｍＬの精製水で洗浄した。導入後及び緩衝液での洗浄後のカラムから、全ての分画を含む抽出物を混合して、回収した。抽出物中の成長因子の回収率を測定し、計算した。
【０２６２】
総体積３６００ｍＬをカラムから回収した。回収した物質を、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を連続的に使用して濾過した。
【０２６３】
ＰＤＧＲ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ｂＦＧＦ及びＥＧＦの回収率を上述のように計算した。
【０２６４】
【表１０】
2016503789.tif 000012
＊  ＳＤＲカラム前に対する％
【０２６５】
表１０に提示した結果は、大規模で行われる場合、エタノール及びＮａＣｌと組み合わせて低濃度のＰＶＰを使用するときに、ＳＤＲカラムからの比較的高い成長因子回収率が維持されることを示している。ＳＤＲ後の抽出物中のＰＶＰの濃度は、０．１７％（０．０５７ｍＭ）であった。
【０２６６】
実施例１１：Ｓ／Ｄ除去前に、かつＳ／Ｄ除去中に溶解物を低濃度のＰＶＰ  Ｋ２５に接触させることによって大規模プロセスで調製された血小板抽出物の線維芽細胞の細胞増殖に及ぼす効果
前の実施例においてＰＶＰ  Ｋ２５で調製された試料の細胞増殖に及ぼす効果を、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ線維芽細胞を使用して、上述の通りに実施した。試料（図５で処理１の印を付けた）の活性を、実施例１に記載されたヘパリンとの接触によって調製された溶解物（図５で処理２の印をつけた）の活性と比較した。
【０２６７】
増殖結果を図５に示す。
【０２６８】
この結果は、大規模プロセスで調製された血小板抽出物試料が、ヘパリンで調製された血小板抽出物試料の増殖効果（ＥＣ５０＝０．０４７）よりも高い、明白な増殖効果（ＥＣ５０＝０．０２４）を有したことを示している。
【０２６９】
これらの結果は、開示されたような大規模ＳＤＲカラムから回収された血小板抽出物が、高い成長因子回収率を有し、したがって大規模プロセスで行われる場合に生物活性を有することを裏付けている。
【０２７０】
実施例１２：Ｓ／Ｄ材料除去前及び／又はＳ／Ｄ材料除去中にＰＶＰを使用することの、ＳＤＲ後の物質中のＳ／Ｄ物質の残留レベルに及ぼす効果
前の実験のセットにおいて、Ｓ／Ｄ除去工程の前に、かつ／又はＳ／Ｄ除去工程中に、血小板溶解物をＰＶＰ、エタノール及び／又はＮａＣｌに接触させると同時に、成長因子の回収率の増加が得られることを示した。
【０２７１】
溶解物からの有効なＳ／Ｄ除去を確実にするために、ＰＶＰがＳＤＲ樹脂のＳ／Ｄ結合能力を低減しないことを実証することは重要である。
【０２７２】
以下の実験のセットにおいて、実施例１０に記載されたものと同一の条件下でＳ／Ｄ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰ）除去の有効性を評価した。
【０２７３】
留意すべきは、血液由来製品中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰの双方の許容可能な限度は５ｐｐｍ未満であることである。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰの濃度を、Ｓ／Ｄ除去工程の前に（ＳＤＲ前の物質）及びＳ／Ｄ除去工程後（ＳＤＲ後の物質）に測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、紫外線検出器を使用する逆相ＨＰＬＣによって決定し、ＴｎＢＰは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。
【０２７４】
結果を以下の表１１に示す。
【０２７５】
【表１１】
2016503789.tif 000013
【０２７６】
上記実験おいて、インキュベーション／平衡化／洗浄を、最大０．５％（０．１７ｍＭ）の濃度のＰＶＰ  Ｋ２５の存在下で行った。
【０２７７】
この結果は、前の実験において成長因子回収に有効であることが認められた最大０．５％の濃度のＰＶＰ  Ｋ２５の存在下でＳ／Ｄ物質の除去を行うことが、カラムのＳ／Ｄ除去性能に影響を及ぼさなかったことを示している。
【０２７８】
インキュベーション／平衡化／洗浄を１％（０．３ｍＭ）の濃度のＰＶＰ  Ｋ２５及びＫ３０の存在下で行った追加の実験（図５に示すような小規模プロセスで行った）は、ＳＤＲ後にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在をもたらした。結果を以下の表１２に示す。
【０２７９】
【表１２】
2016503789.tif 000014
【０２８０】
有利なことに、１％（０．３ｍＭ）未満の濃度のＰＶＰ  Ｋ２５の存在下でＳ／Ｄ除去を行うことが、Ｓ／Ｄ除去工程中の成長因子回収率の増加をもたらし、これと同時に溶解物からの有効なＳ／Ｄ除去を確実にすることが結論付けられた。
【０２８１】
実施例１３：Ｓ／Ｄで処理され、ＰＶＰ  Ｋ２５に接触させ、かつＳ／Ｄ除去に供された、ＷＡＰから調製された血小板抽出物中のいくつかの成長因子間の比率
以下の実施例は、開示されたように調製された血小板抽出物中のいくつかの成長因子間の比率を示し、また、得られた比率が、出発物質中のものに匹敵するかどうか、及び試料をクロマトグラフィー樹脂に導入する前の溶解物（ＳＤＲ前の物質）中のものに匹敵するかどうかを検討している。ＳＤＲ前の物質（又は抽出物）及びＳＤＲ後の物質を、実施例１０に記載した通りに調製した。
【０２８２】
ＴＧＦ−β１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを、上述の特定の市販ＥＬＩＳＡキットを使用して、３つ全ての試験物質（ＷＡＰ出発物質、ＳＤＲ前の物質、及びＳＤＲ後の物質）において測定し、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１／ｂＦＧＦ、及びＶＥＧＦ／ｂＦＧＦの間の比率を計算した。成長因子のレベル及び比率を、それぞれ下の表１３及び１４に示す。
【０２８３】
【表１３】
2016503789.tif 000015
【０２８４】
【表１４】
2016503789.tif 000016
【０２８５】
この結果は、Ｓ／Ｄ除去工程中にエタノール及びＮａＣｌと組み合わせたＰＶＰ  Ｋ２５に接触させた血小板溶解物が、出発物質中の比率及びＳ／Ｄ除去前の物質中の比率と同様なＰＤＧＦ−ＡＢ／ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１／ｂＦＧＦ、及びＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ比率を有する抽出物をもたらすことを示している。
【０２８６】
開示されたようにＳ／Ｄ除去を行うことが、Ｓ／Ｄ除去前の物質と同様である因子の比率を含む血小板抽出物をもたらすことを結論付けることができる。
【０２８７】
実施例１４：Ｓ／Ｄ除去工程前及び／又はＳ／Ｄ除去工程中に溶解物をヘパリン、硫酸デキストラン又はＰＶＰ  Ｋ２５に接触させることにより調製される血小板抽出物中の成長因子の回収率
以下の実施例は、Ｓ／Ｄ除去工程中に溶解物をヘパリン、硫酸デキストラン又はＰＶＰに接触させることにより調製された異なる血小板抽出物中の成長因子の回収率を比較する。回収率を上述した通りに計算した。ヘパリンを含む血小板抽出物を、１０〜１３個のバッグから得られた、１９００〜２５００ｇのプールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）を使用して調製した。２０９〜３８５ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を、最終濃度が２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４、となるように添加し、０．２％  ｗ／ｗ（最終濃度）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｔａｌｅｃｒｉｓ  ＵＳＡ）を、プールしたＷＡＰに加えた。１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｗ／ｗ）を、５０ＲＰＭで混合しながらプールした試料にゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を行った。最初に、試料を３０分間連続して撹拌した後、２０及び３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して連続的に濾過した。次に、濾過した物質を、２５℃に調整された水浴に浸漬したビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、５０ＲＰＭにて更に２時間混合した。
【０２８８】
２９５ｍＬのＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ溶媒−界面活性剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ）が充填されたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６  ＵＷ／ＷＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ  １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。導入した試料のそれぞれの緩衝液で、平衡化を行った。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理された血小板溶解物（１６２０ｍＬの血小板物質を含有）を、カラムに導入し、続いて、０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（上記と同一濃度）で洗浄した。１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、５ＩＵ／ｍＬのヘパリン（ヘパリンナトリウム−Ｆｒｅｓｅｎｉｕｍ  ５０００ＩＵ／ｍＬ、Ｂｏｄｅｎｅ（ＰＴＹ）Ｌｔｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）、及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（上記と同一の濃度）を使用して行われた。これに続いて、１０％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（上記と同一の濃度）で第２の洗浄工程を行った。最後にカラムを３００ｍＬの精製水で洗浄した。洗浄工程中に得られたフロースルー及び全ての分画を回収し、プールした（約３．６リットル）。回収した材料を、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を連続的に使用して濾過した。
【０２８９】
硫酸デキストランを含む血小板抽出物を、１０個のバッグから得られた、１８００〜２０５０ｇのプールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）を使用して調製した。１９７〜２２４ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液を、最終濃度が２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４、となるように添加し、０．２％ｗ／ｗ（最終体積の溶液に対して）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｔａｌｅｃｒｉｓ  ＵＳＡ）を、プールしたＷＡＰに加えた。１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰ（ｗ／ｗ）を、５０ＲＰＭで混合しながらプールした試料にゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、Ｓ／Ｄ処理を２つのパートに分割した。最初に、試料を３０分間連続して撹拌した後、２０及び３μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して濾過した。次に、濾過した物質を、２５℃に調整された水浴に浸漬したビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、５０ＲＰＭにて更に２時間混合した。
【０２９０】
硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｎａｄａ；カタログ番号Ｄ４９１１）を最終濃度１％（ｗ／ｗ）になるように試料に添加し、５０ＲＰＭにて２０分間攪拌しながら２５℃でインキュベートした。粒子状物質を除去するため、５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ＰＰ２フィルターを使用して試料を濾過した。
【０２９１】
次に、２９５ｍＬのＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ溶媒−界面活性剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ）が充填されたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６  ＵＷ／ＷＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ  １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。１％の硫酸デキストラン及び０．２％のＨＳＡを含有する９００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液でカラムを平衡化させた。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理及び硫酸デキストラン処理された血小板溶解物（１６２０ｍＬの血小板物質を含有）を、カラムに導入し、続いて、１２．５％のエタノール、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１％の硫酸デキストラン、及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（上記と同一濃度）で洗浄した。これに続いて、１％の硫酸デキストラン及び０．２％のＨＳＡを含有する６００ｍＬの酢酸塩−グリシン緩衝液（上記と同一の濃度）で洗浄した。次に、カラムを３００ｍＬの精製水で洗浄した。総体積３０００ｍＬをカラムから回収した。回収した材料を、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して濾過した。
【０２９２】
ＰＶＰを含む血小板抽出物を、実施例１０に記載された通りに調製した。
【０２９３】
比較の成長因子の回収率を以下の表１５に示す。
【０２９４】
【表１５】
2016503789.tif 000017
＊  ４つの独立した抽出調製物間の平均値
＊＊  ６つの独立した抽出調製物間の平均値
＊＊＊  ＳＤＲ前の物質に対する％
【０２９５】
この結果は、Ｓ／Ｄ除去工程中にＰＶＰ  Ｋ２５に接触させることによる抽出物の調製が、溶解物を硫酸デキストラン又はヘパリンに接触させるものと比較して、同様な成長因子の回収率をもたらし、いくつかの成長因子に関しては（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢ）更に優れた成長因子の回収率をもたらしたことを示している。
【０２９６】
好都合なことに、ＰＶＰを含む血小板抽出物は、特定の濃度のヘパリン（上記実施例に示す）及び硫酸デキストラン（データ示さず）に比べて、インビトロのトロンビン活性に対して阻害効果を有さない。
【０２９７】
実施例１５：開示されたように調製された血小板抽出物のインビボモデルにおける皮膚治癒に及ぼす効果
血流低下に起因する組織虚血は、外科的皮弁破損部に対する主要な寄与因子である。
【０２９８】
この実験では、改良型ＭｃＦａｒｌａｎｅラット移植皮弁モデル（ＭｃＦａｒｌａｎｅら、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔ  Ｓｕｒｇ（１９６５）３５：１７７）を使用して、開示されたように調製した血小板抽出物の皮弁治癒を促進する上での能力を評価した。
【０２９９】
３５０〜４５０ｇの体重の１６匹のオスのスプラーグ−ドーレイラット（処置群当たりｎ＝４）を、本試験で使用した。
【０３００】
外科的処置：
背側の体毛を手術の１日前に除去し、皮膚を露出させた。手術当日に、動物に１用量のブプレノルフィンＳＱ注射（０．０５ｍｇ／Ｋｇ）の形態の術前鎮痛剤及び術前抗生剤（エンフロキサシン；１０ｍｇ／Ｋｇ）を投与した。イソフルラン吸入（約１〜４％）によって、麻酔剤を投与した。グルコン酸クロロヘキシジン及び７０％のイソプロピルアルコールを使用して手術部位を前処置した。約１０×３ｃｍのサイズの３つの辺を有する長方形の背側全層皮弁を作製した。この皮弁の縁部を、皮弁が尾側縁部に沿って付着したままで３つの側面上で切開した（頭方向から尾方向に）。皮弁を鈍的剥離によって持ち上げ、皮弁の露出した下にある背表面を、１）ＰＶＰを含む抽出物、ｉｉ）ヘパリンを含む抽出物、又はｉｉｉ）注射用水（ＷＦＩ；対照Ｉとして）を含む１．５ｍＬのフィブリンシーラント（３ｍｇ／ｍＬの最終濃度のヒトフィブリノーゲン、及び２５０ＩＵ／ｍＬの最終濃度のヒトトロンビンを含むＢＡＣ２成分から調製したもの）で徐々に滴下被覆した。抽出物の調製並びに投与された材料の調製及び抽出物の適用手順は以下を参照されたい。封止剤が適用されたら、皮弁をその解剖学的位置に戻した。
【０３０１】
皮弁を取り囲む皮膚の縁部に近接させ、封止剤が反応してゲル様コンシステンシーを形成するのに必要な初期時間の際に、緩やかな圧力を加えることによってデッドスペースを作らないようにしながら、皮弁をその正確な解剖学的位置に再配置した。次いで、４−０の非吸収性単繊維縫合材料を使用して、皮弁切開部分を一定の単純連続縫合パターンで縫合し、その正確な解剖学的位置に戻した。
【０３０２】
対照群（「対照ＩＩ」と呼ぶ）は、同じ皮弁作製処置を受けたが、皮弁閉鎖の前に下にある背面にいかなる処置も施されなかった。
【０３０３】
抽出物調製：
２種の血小板抽出調製物を検討した。すなわち、一方はＰＶＰを含み（実施例１０のＰＶＰの通りに調製）、及び他方はヘパリンを含んだ（実施例１４の通りに調製）。次いで両抽出物を、安定化、低温殺菌及び以下のような酢酸塩−グリシン緩衝液に対する透析濾過による安定化剤の除去の工程にかけた。
【０３０４】
試料１グラム当たり１グラムのスクロースを、スクロースが完全に溶解するまで、混合しながら（約２２℃で）抽出物質にゆっくりと加えた。次に、溶液を３７±１℃まで温め、抽出物質１ｇ当たり０．１１ｇのグリシンを、混合しながら、かつ０．５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを６．８〜７．４に調整しながら、溶液にゆっくりと加えた。ｐＨ調整は、グリシンが完全に溶解するまで行われた。その後、抽出物質１ｇ当たり０．８ｇのスクロースを、完全に溶解するまで３７℃で混合しながら徐々に加えた。スクロース及びグリシンは、低温殺菌工程中の安定化剤としての役割を果たすように溶液に添加された。次に、連続的に混合しながら（５０ＲＰＭ）６０℃にて１０時間にわたって熱処理することによって、溶液を低温殺菌した。（安定化剤の添加によって形成された）得られた粘性溶液を清潔な容器に移すため、最大総重量１４，０００〜１４，３００ｇ（約１２，０００ｍＬ）まで酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４）で希釈した。２  Ｏｍｅｇａ  １０ｋＤａカセット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を備えるＣｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、酢酸塩−グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４）に対して透析濾過を行うことによって、溶液から安定化剤を除去した。透析濾過工程は次の通りに行われた。初めに、試料を１８００ｍＬの体積まで濃縮し、溶液体積を１，８００±２００ｍＬに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積１０，８００ｍＬの酢酸塩グリシン緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４）に対して透析を行った。次に、透析した溶液を４１０〜４４５ｍＬになるまで濃縮した。
【０３０５】
安定化のため、マンニトールを最終濃度２％  ｗ／ｗになるまで溶液に添加した。凝集物質を除去するため、溶液を１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター及び０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルターに通して濾過した。滅菌濾過は、０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルターを使用し、無菌条件下で行われた。
【０３０６】
次に、得られた溶液を高圧滅菌したガラス製バイアルの中に分注し（４ｍＬ）、凍結乾燥し、窒素雰囲気下及び６０ｋＰａ（０．６Ｂａｒ）の不完全真空下で高圧滅菌したゴム栓で密封した。
【０３０７】
ＢＡＣ２（フィブリノーゲン含有成分）＋抽出物の調製：
凍結乾燥した抽出物のバイアルキャップを無菌的に開け、１ｍＬの無菌注射用水（ＷＦＩ）を、凍結乾燥した抽出物のバイアルに（気泡をつくらないために、上下にピペット操作することなく又は渦撹拌することなく）ゆっくりと加えた。キャップを無菌的にバイアルの元の場所に配置し、抽出粉末が完全に復元されるまで、バイアルを約５分間室温で、チューブ回転装置／ロッカに配置した。
次に、２ｍＬのＢＡＣ２（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラント；Ｏｍｒｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．のフィブリノーゲン成分；ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のように６０ｍｇのフィブリノーゲン／ｍＬを含む）を、（６ｍｇのフィブリノーゲン／ｍＬにするために）１２０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのグリシン、９５ｍＭのアルギニン塩酸塩、１ｍＭの塩化カルシウムを含有する、１８ｍＬのＢＡＣ２希釈緩衝液、ｐＨ  ７．０〜７．２、と無菌的に混合した。バイアルを、少なくとも５分間、緩やかに撹拌した。
【０３０８】
次いで、２ｍＬの希釈したＢＡＣ２（６ｍｇのフィブリノーゲン／ｍＬ）を、針を取り付けていない注射器に引き込み、上述した１ｍＬの再水和した抽出物−ヘパリン、抽出物−ＰＶＰ又はＷＦＩと混合した。このバイアルを、使用するまで室温でチューブ回転装置／ロッカに約５分間配置した。
【０３０９】
被験物質の調製及び適用：
ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）適用装置の黄色の三重管腔のカテーテルチップをその基部で切断し、１６Ｇ単一管腔Ｖｅｎｆｌｏｎ（商標）静脈内カテーテル（針なし）又は他の適切なサイズのカテーテルで置き換えた。バイアルコネクタ及び注射器をこの装置から取り外した。３ｍＬの注射器のうちの１本を１ｍＬの注射器で置き換え、１ｍＬのトロンビン成分（ＥＶＩＣＥＬフィブリンシーラント；Ｏｍｒｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．）をバイアルから直接無菌的に１ｍＬの注射器に引き上げた。ＢＡＣ２＋ヘパリンを含む血小板抽出物、ＢＡＣ２＋ＰＶＰを含む血小板抽出物、又はＢＡＣ２＋ＷＦＩ（上記のように調製したもの）の３ｍＬを無菌的に３ｍＬの注射器に引き上げた。
【０３１０】
２本の注射器（一方は１ｍＬのトロンビンを含み、他方は３ｍＬのＢＡＣ２及び抽出物又はＷＦＩ溶液を含む）を、青色の筒式注射器ホルダー（新しいＥＶＩＣＥＬ（登録商標）適用キットから）に配置し、トロンビン及び試験用溶液の両方が同時に投与され得るように、提供されたプラスチック製の青色エンドコネクタを両プランジャの両端の上に配置した。上述のように、１）ＰＶＰを含む抽出物、ｉｉ）ヘパリンを含む抽出物又はｉｉｉ）注射用水（ＷＦＩ；対照Ｉとして）を含む１．５ｍＬの総体積のフィブリンシーラントを、３（抽出物を含む又は含まないフィブリン含有成分）：１（トロンビン成分）［１．１２５ｍＬ：０．３７５ｍＬ］の体積比で投与した。
【０３１１】
ラットに投与された物質１ｍＬ当たりの成長因子の濃度（上記のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した）を表１６に示す（１．５ｍＬの体積を投与した）。
【０３１２】
【表１６】
2016503789.tif 000018
【０３１３】
評価：手術後１４日目に動物に麻酔をかけ、その後、ＣＯ２への曝露によって殺処分した。皮弁の健康な（非壊死性及び軟組織）領域の下にある組織への付着を、以下のランク付け（不良から最適まで）、すなわち、１−皮弁の付着なし、２−部分的付着、及び３−正常に近い又は正常な皮弁の付着、に従って評価した。
【０３１４】
種々の処置群についてのスコアリング／等級を表１７に示す。
【０３１５】
【表１７】
2016503789.tif 000019
＊  ＦＳ−フィブリンシーラント
【０３１６】
この結果は、ＰＶＰを含む血小板抽出物と組み合わせてフィブリンシーラントを投与することが、ヘパリンを含む血小板抽出物と共にフィブリンシーラントを投与することと同様な、皮弁付着を促進する上での明白な効果を有し、両者共に、ＦＳ単独又は対照ＩＩよりも優れていたことを示している。
【０３１７】
一旦巨視的な評価が完了したら、皮弁を、横縁部に隣接する約０．５ｃｍの正常な皮膚を含めて採集した。腹部及び胸部臓器を胸部正中線切開を通して除去した。採集した組織を、１０％の中性緩衝ホルマリン中に配置した。適切な固定後に、組織切片を、正常組織及び皮弁が各組織切片内に含まれるような様式で、皮弁の右側面に対して垂直に、尾側端部から約２ｃｍごとに採取し、これらは、図６のように領域Ａ〜Ｅで示す。これらの組織切片を処理し（浸潤し、パラフィン中に埋設し）、次いでミクロトームを使用してパラフィンブロックの切片を作製した（５マイクロメートル）。これらの切片をＳｕｐｅｒ  Ｆｒｏｓｔ＋ＴＭスライド上に載せ、組織学的及び免疫組織学的検査によって評価した。
【０３１８】
ヘマトキシリン＆エオシン染色：パラフィン埋包皮膚／創傷切片のスライドを、６０℃で３０分間インキュベートし、キシレン（１００％）で５分間、スライドを２回洗浄することによって脱パラフィン化し、その後ＤＤＷ（１００〜７０％）中の減少する濃度のエタノール中で、各濃度において５分間再水和した。このスライドをヘマトキシレン（すぐ使用可能な溶液）で８分間染色し、水で濯ぎ、１％のＨＣｌ／７０％のエタノール中に数秒浸し、次いでエオシン（ＤＤＷ中０．５％）で６分間染色した。次に、切片を、７０％のエタノールで、２回の素早い浸漬によって洗浄した。その後、スライドを、９５％のエタノールで５分間、１回、無水エタノールで５分間、２回、更にキシレン（１００％）で３分間、２回洗浄することで脱水し、次いでＥｎｔｅｌｌａｎ封入剤（ＭＥＲＣＫ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  Ｇｅｒｍａｎｙ）で封入した。
【０３１９】
免疫組織化学染色：パラフィン埋包皮膚切開切片のスライドを、上記の通りに調製した。このスライドを、ブロッキング溶液（１０％の正常血清）で１時間インキュベートし、続いて以下の一次抗体、すなわち、ケラチン６、ケラチン１、ケラチン１４を標的とする抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）、ＰＣＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、のうちの１つと、４℃で一晩インキュベートした。翌日に、スライドをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで洗浄し、対応する二次ビオチン結合抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で１時間インキュベートした。ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、検出を行った。次いで、スライドを水で濯ぎ、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで３０秒間対比染色し、次に７０％のエタノールへの２回の素早い浸漬により洗浄した。その後、スライドを、９５％のエタノールで５分間、１回、無水エタノールで５分間、２回、更にキシレン（１００％）で１０分間、２回洗浄することで脱水し、次いでＥｎｔｅｌｌａｎ封入剤（ＭＥＲＣＫ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  Ｇｅｒｍａｎｙ）で封入した。
【０３２０】
分析評価基準
表皮過形成：表皮の厚さによって測定される過形成応答を、Ｈ＆Ｅ染色によって決定し、ここでは、試料の表皮の厚さが、６つ超の有核層を包含するよう少なくとも１つの視野で観察される場合、１と採点した。６つ以下の層が全セクション上で観察された試料は、０と採点した。
【０３２１】
皮膚過増殖：過増殖性顆粒組織を、増殖する核のＰＣＮＡ染色を利用して評価し、ここでは、視野（４０倍）当たり１０個超の核が皮膚切開領域で計数される場合、スコア１を割り当てた。スコア０は、１０個以下の核が計数される場合に割り当てた。
【０３２２】
基底層上ケラチン６：基底層上ケラチン６は、創傷が、褐色の染色によって表れるＫ６染色の広範な分布を示した場合に、１と採点した。
【０３２３】
基底層上の増殖：非治癒創傷は、ＰＣＮＡ染色によって観察される、創傷の隙間における基底層の上のいくつかの層内に増殖する細胞を示す。基底層上の増殖が、試料の少なくとも１つの領域において観察された場合、１と採点する。治癒が進んだ際には、増殖は基底層のみで観察され、この場合は０と採点する。
【０３２４】
まとめると、全てのマーカーについて、０のスコアは、スコア１よりもより進んだ治癒段階を表す。
【０３２５】
図７は、本試験からの４つの試験されたマーカーについての代表的な染色を示している。表皮過形成、皮膚過増殖、基底層上のケラチン６染色及び基底層上の増殖（左側パネル）を１と採点した。代表的な視野が、Ｈ＆Ｅ染色（表皮過形成）、ＰＣＮＡ染色（皮膚並びに表皮増殖）及びケラチン６染色について提示されている。表皮過形成パネル中の黄色の矢印は、表皮の厚さを示している。Ｋ６パネル中の黄色の矢印は、褐色の染色で提示されたＫ６ケラチン分布を示した。赤い矢印は、増殖細胞のＰＣＮＡ陽性の核を示している。
【０３２６】
表１８に示すように、ＦＳ＋ＰＥＸ−ＰＶＰで処理された皮弁は、４つの異なる治癒マーカーについて、シャム処置又はＦＳで処置された皮弁より進んだ治癒を示し、すなわち、より多くの動物を０と採点した（スコア０及び１の定義については、「方法」を参照）。ＦＳ＋ＰＥＸ−ＰＶＰで処置された創傷は、表皮過形成の低減、皮膚線維芽細胞並びに皮膚ケラチノサイト増殖の低減及びケラチン６染色の減少を含む、活性創傷のいくつかの特性において著しい低減を示した。過形成の低減は、正常な皮膚への表皮特性の薄化を意味する。皮膚線維芽細胞及び基底層上のケラチノサイト増殖（ＰＣＮＡ染色によって示される）の低減は、成熟マトリックス及び真皮並びに表皮の再構築を特徴付け、基底表皮における単細胞層に限定されたケラチン６染色の減少は、皮膚特性の正常化を特徴付けている。これと対比して、対照（ＦＳ）処置されたラットの皮弁は、初期の未成熟治癒段階を示した。
【０３２７】
【表１８】
2016503789.tif 000020
【０３２８】
実施例１６：Ｓ／Ｄで処理され、ＰＶＰ  Ｋ１２でインキュベートされ、ＰＶＰ  Ｋ１２の存在にてＳＤＲカラムに供され、安定化剤で処理され、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）システムで濃縮されかつ凍結乾燥された、プールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）からの血小板溶解調製物の大規模プロセス
この実験においては、Ｓ／Ｄ除去中のＰＶＰ  Ｋ１２の添加の成長因子の回収率に及ぼす効果を、大規模プロセスで評価した（実施例１０参照）。より低い分子量の（ＬＭＷ）−ＰＶＰ、例えばＰＶＰ  Ｋ１２は、蓄積されることなく迅速な腎臓除去を先ず可能にするために、より高い分子量のＰＶＰ（ＰＶＰ  ２５）よりも非経口薬剤の処方に適している。また、欧州の一部の国、例えば、ドイツ及びオーストリアでは、このような１８までのＫ値を有する低分子量ＰＶＰ型のみが注射用に承認されている。
【０３２９】
血小板溶解物試料を、１０個のバッグから得られた１９５８ｇのプールした白血球低減洗浄アフェレーシス血小板（ＷＡＰ）を使用して調製した。２１４ｍＬの酢酸塩グリシン、最終濃度は２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ  ６．８〜７．４（ＡＧＡ緩衝液）、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｔａｌｅｃｒｉｓ  ＵＳＡ、０．２％ｖ／ｖの最終濃度）を、プールしたＷＡＰに加えた。次の工程において、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰを、それぞれ１％及び０．３％（ｖ／ｖ）の最終濃度で、３０ＲＰＭで混合しながら、ゆっくりと加えることによって、Ｓ／Ｄ処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となる可能性を回避するため、Ｓ／Ｄ処理を２つの工程に分割した。第１の工程では、試料を３０分間連続して撹拌し、２３〜２７℃にて５０１６×ｇで１０分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を通して濾過した。次いで、濾過した物質を、２５℃に調整した水浴中に浸したステンレス鋼のポットに注ぎ、透明溶液中でウイルス不活性化プロセスを続けるために、３０ＲＰＭで更に２時間混合した。ＰＶＰ  Ｋ１２（１２のＫ値及び３５００Ｄａの平均分子量を有するポリビニルピロリドンＫ１２、カタログ番号２７６１４２５００  Ａｃｒｏｓ  ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｓ／Ｄ処理された溶解物に、０．３％（ｗ／ｗ）、すなわち、０．８５７ｍＭの最終濃度になるように加え、３０ＲＰＭで撹拌しながら２５℃で２０分間インキュベートした。粒子状物質を除去するため、５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ＰＰ２フィルターを使用して試料を濾過した。
【０３３０】
次に、３００ｍＬのＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ溶媒−界面活性剤除去クロマトグラフィー樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ）が充填されたＸＫ５０液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びＵＡ−６  ＵＶ／ＶＩＳ検出器＋Ｔｙｐｅ  １１記録計（ＩＳＣＯ，ＮＥ，ＵＳＡ）と共に使用して、Ｓ／Ｄ除去を行った。カラムを、０．３％（０．８５７ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ１２を含有する９００ｍＬのＡＧＡ緩衝液（上記の通りの）で平衡化した。１８００ｍＬのＳ／Ｄ処理及びＰＶＰ処理された血小板溶解物（１６２０ｍＬの血小板物質を含有）を、カラムに導入し、続いて、０．３％（０．８５７ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ１２を含有する６００ｍＬのＡＧＡ緩衝液（上記の通りのもの）でカラムを洗浄した。これに続いて、１２．５％のエタノール、１ＭのＮａＣｌ及び０．３％（０．８５７ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ１２を含有する６００ｍＬのＡＧＡ緩衝液で洗浄した。成長因子回収率の計算用に、フロースルー及び洗浄分画を採集し、混合した。
【０３３１】
総体積３０００ｍＬをカラムから回収した。回収した物質を、３及び１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター、並びに０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して連続的に濾過した。
【０３３２】
ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの回収率を上記のように計算し、以下の表１９に示す。
【０３３３】
【表１９】
2016503789.tif 000021
＊  ＳＤ前の工程に対する比較
＊＊  詳細な条件については、実施例１０を参照
【０３３４】
表１９に提示した結果は、ＰＶＰ  Ｋ２５の存在下のＳＤＲカラムからの成長因子の高い回収率が、低分子量ＰＶＰ、例えばＰＶＰ  Ｋ１２を使用する場合に維持されることを示している。
【０３３５】
次に、濾過した物質を、２５℃に調整した水浴中に浸したステンレス鋼ポットに注ぎ、３０ＲＰＭで混合した。ウイルス熱不活性化のための調製においては、安定化処置を３つの工程で行った。先ず初めに、１００％のスクロース（ｗ／ｗ）を、この物質に少しずつ加えた。スクロースが完全に溶解したら、溶液を３７℃に温め、１０％のグリシン（ｗ／ｗ）を、ｐＨ  ６．９〜７．１でゆっくりと加えた。安定化剤添加の最後の工程では、８０％のスクロース（ｗ／ｗ）を加え、完全に溶解するまで更に混合した。次いで、熱ウイルス不活性化工程を、２０ＲＰＭで撹拌しながら、５９．５〜６０．５℃で１０時間行った。
【０３３６】
ウイルス不活性化工程の終わりに、４０％の酢酸塩−グリシン緩衝液（ｗ／ｗ）を、３７℃にて３０ＲＰＭで混合しながら溶液に加えた。次いで溶液を、３μｍのＳａｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｎ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して濾過した。次に、濃縮及び安定化剤除去処理を、４  Ｏｍｅｇａ（商標）Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）１０ｋＤａカセット（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐ）を備えるＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）ＵＦ  Ｈｏｌｄｅｒシステムを使用して、３工程で行った。先ず初めに、この物質を、１８００ｍＬの最終体積まで濃縮した。第２の工程では、安定化緩衝液を新鮮な緩衝液で置き換えるために、１０８００ｍＬの酢酸塩−グリシン緩衝液を、溶液の体積を１６００〜２０００ｍＬに維持しながら徐々に加えた。第３に、透析工程の終わりに、試料を５６０ｍＬの最終体積まで濃縮した。
【０３３７】
マンニトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、この物質に加え、２％（ｗ／ｗ）の最終濃度にした。次に、この物質を、１．２μｍのＳａｒｔｏｐｕｒｅ  ３００フィルター、０．４５μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルター並びに０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２  ３００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．Ａ．，Ａｕｂａｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を連続的に使用して濾過した。次に、８０個のガラス製バイアルを、４ｍＬのこの溶液で充填し、Ｅｐｓｉｌｏｎ２−８Ｄ凍結乾燥機（Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ  ＧｍｂＨ）を使用して凍結乾燥した。
【０３３８】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰの濃度を、Ｓ／Ｄ除去工程の前に（ＳＤＲ前の物質）並びにＳ／Ｄ除去工程後に（ＳＤＲ後の物質）及び生産工程の終わりに（最終）測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、紫外線検出器を使用する逆相ＨＰＬＣによって決定し、ＴｎＢＰは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。
【０３３９】
結果を以下の表２０に示す。
【０３４０】
【表２０】
2016503789.tif 000022
【０３４１】
この結果は、成長因子の回収に有効であることが見出された、０．３％（０．８５７ｍＭ）の濃度のＰＶＰ  Ｋ１２の存在下でＳ／Ｄ除去を行うことが、ＳＤＲ後の中間物質におけるＴｎＢＰの有効な除去及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のほぼ完全な除去をもたらしたこと（出発物質の残留は２％未満）を示している。カラム後の物質中に残留した微量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、後続処理において除去した。
【０３４２】
実施例１７：Ｓ／Ｄ除去カラムへの導入中に、血小板溶解物を、異なる濃度において異なる分子量を有するＰＶＰに接触させることの成長因子回収率に及ぼす効果
この実施例の目的は、異なる濃度において異なる分子量を有するＰＶＰの、Ｓ／Ｄ除去後の成長因子回収率に及ぼす効果を検討することであった。
【０３４３】
この実施例では、ＨＩＣ  Ｓ／Ｄ除去工程の前及びＨＩＣ  Ｓ／Ｄ工程後の、４つの異なる分子量のＰＶＰの添加などの、異なるＳ／Ｄ除去条件について、試験を行った。ＥＬＩＳＡにより決定される以下の成長因子、すなわち、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦの回収率を検討した。
【０３４４】
この実施例では、ＰＶＰ  Ｋ１２（１２のＫ値及び３５００Ｄａの平均分子量を有するポリビニルピロリドンＫ１２、カタログ番号２７６１４２５００  Ａｃｒｏｓ  ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＶＰ  Ｋ１７（１７の平均Ｋ値及び８０００Ｄａの平均分子量を有するポリビニルピロリドンＫ１６〜１８、カタログ番号２２７４６５００  Ａｃｒｏｓ  ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＶＰ  Ｋ２５及びＰＶＰ  Ｋ３０を使用した。
【０３４５】
上記実施例５に詳述したように、溶解物を調製し、ＳＤＲカラムに導入した。全てのＳ／Ｄ除去条件を、表２１に詳述する。導入の前に、導入される溶解物の緩衝液を使用して、平衡化を行った。全ての導入した試料はまた、ＳＤＲの適用前に、上述した方法で、ＰＶＰとインキュベートした。導入後、及び緩衝液による洗浄後にカラムから得られた全ての分画を回収し、混合して、成長因子回収率を計算した。
【０３４６】
成長因子の回収率の結果（上記に説明したよう計算したもの）を表２２に示す。
【０３４７】
【表２１】
2016503789.tif 000023
【０３４８】
【表２２】
2016503789.tif 000024
＊  成長因子の回収率（％）
【０３４９】
この結果は、各ＰＶＰの濃度の増加が、成長因子、特にＰＤＧＦ−ＡＢ及びｂＦＧＦの回収率の増加と相関することを示している。また、成長因子の回収率の増加は、同一のモル濃度においては分子量が増加したＰＶＰで観察される：例えば、ＰＶＰ  Ｋ１２、Ｋ１７、Ｋ２５又はＫ３０を０．３ｍＭで使用することが、それぞれ１７、４２、５５及び６２％のＰＤＧＦ−ＡＢの回収率をもたらした。
【０３５０】
Ｓ／Ｄ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰ）除去の有効性を評価するために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰの濃度を、Ｓ／Ｄ除去工程の前に（ＳＤＲ前の物質）及びＳ／Ｄ除去工程後（ＳＤＲ後の物質）に測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は、紫外線検出器を使用する逆相ＨＰＬＣによって決定し、ＴｎＢＰは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。
【０３５１】
【表２３】
2016503789.tif 000025
【０３５２】
この結果は、ＨＩＣカラムによるＳ／Ｄ除去工程中のＳ／Ｄの有効な除去を示している。全てのＴｎＢＰは除去されるが、ＰＶＰを０．４ｍＭ以上の濃度で使用する場合、ＳＤＲ後の物質中にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の幾分の残留物が認められる。上の実施例１６、表２０では、中間物質中の残留するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ここで提示された濃度よりもわずかに高い）が、提示された生産工程に対して下流で除去されたことが示されている。
【０３５３】
実施例１８：ＰＶＰをＳ／Ｄ除去の異なる工程で使用することの成長因子の回収率に及ぼす効果
Ｓ／Ｄ除去カラムへのＰＶＰ適用の複数の工程のうちのどの工程で、成長因子の回収率に及ぼすＰＶＰの最大効果を有するのかを特定するために、３つのＳ／Ｄ除去工程への異なる濃度のＰＶＰの添加の試験を行った。
【０３５４】
この実施例では、Ｓ／Ｄ除去工程中のＧＦの回収率を、表２４に示すような異なる組み合わせでの、血小板溶解物、平衡緩衝液及び洗浄緩衝液への０．５％（ｗ／ｗ）（０．６３ｍＭ）のＰＶＰ  Ｋ１７の添加によって試験した。
【０３５５】
ＥＬＩＳＡを使用して、以下の成長因子、すなわち、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦの回収率を検討した。表２４に示す、各処理において平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液を使用したことを除けば、上記の大規模プロセスにおいて、実施例５に詳述された通りに、溶解物を調製し、ＳＤＲカラムに導入した。フロースルー及び洗浄分画を採集し、混合して、成長因子の回収率を計算した。
【０３５６】
成長因子の回収率の結果（上記に説明したよう計算したもの）を表２５に示す。
【０３５７】
【表２４】
2016503789.tif 000026
＋：ＰＶＰ  Ｋ１７を０．５％（０．６３ｍＭ）で添加
−：ＰＶＰ  Ｋ１７の添加無し
＊  ＳＤＲ前の物質に対する％
【０３５８】
【表２５】
2016503789.tif 000027
＊  ＳＤＲ前の物質に対する％
【０３５９】
３つの工程において、０．５％のＰＶＰ  Ｋ１７を、血小板溶解物に（処理＃１）、平衡化緩衝液に（処理＃５）又は洗浄緩衝液に（処理＃７）の１つの工程にのみ添加した。
【０３６０】
血小板溶解物のみへのＰＶＰ  Ｋ１７の添加又は平衡化緩衝液のみへのＰＶＰ  Ｋ１７の添加は、同様に低い成長因子の回収率をもたらし、一方、洗浄緩衝液のみへのＰＶＰ  Ｋ１７の添加は、２つの他の処理に比べて、ＧＦの回収率における最低の改善をもたらした。
【０３６１】
３つの追加の処理（処理＃２、＃３及び＃６）は、３つの条件のうちの２つの間での組み合わせを含み、一方処理＃４は、全ての３つの条件の組み合わせを含んだ。
【０３６２】
この結果は、ＨＩＣカラムからのＧＦ回収率を増加させる上で最も有効な単一の工程は、平衡化緩衝液へのＰＶＰの添加であることを示している。更に、ＧＦの最も高い回収率は、ＰＶＰの溶解物への添加と平衡化緩衝液中のＰＶＰの組み合わせを使用して達成された。
【０３６３】
Ｓ／Ｄ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰ）除去の有効性を評価するために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰの濃度を、Ｓ／Ｄ除去工程の前に（ＳＤＲ前の物質）及びＳ／Ｄ除去工程後（ＳＤＲ後の物質）に測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、紫外線検出器を使用する逆相ＨＰＬＣによって決定し、ＴｎＢＰは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。
【０３６４】
【表２６】
2016503789.tif 000028
【０３６５】
この結果は、ＨＩＣカラムによるＳ／Ｄ除去工程中のＳ／Ｄの有効な除去を示している。全てのＴｎＢＰが、全ての処理物において除去されたが、ＰＶＰを平衡化緩衝液中及び血小板溶解物中の両方で使用する場合に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の幾分の残留物がＳＤＲ後の物質中で認められた。しかしながら、上記実施例１６では、ここで提示された濃度よりも高い濃度の、中間物質中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が、後続処理において除去されたことが示されている。
【０３６６】
平衡化緩衝液へのＰＶＰの添加並びに洗浄緩衝液へのＰＶＰの添加は、ＨＩＣカラムによるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００除去の有効性を著しく損なうことなく、成長因子の高い回収率をもたらした。
【０３６７】
実施例１９：Ｓ／Ｄ除去前の血小板溶解物とＨＰＭＣとの混合が成長因子回収率に及ぼす効果
他の両親媒性ポリマーが、ＨＩＣカラムによるＳ／Ｄ除去工程中に成長因子の回収率を改善するために使用され得るかどうかを試験するために、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を以下の実施例で探究した。
【０３６８】
ＨＰＭＣは、経口医薬品の賦形剤並びに徐放性成分及び食品産業における乳化剤として、現在広く使用されている天然の多官能性炭水化物ポリマーである。
【０３６９】
この実施例では、２つの異なる濃度のＨＰＭＣ（１０ｋＤａ、カタログ番号４２３２３８  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を、ＨＩＣ  Ｓ／Ｄ除去工程の前に、かつＨＩＣ  Ｓ／Ｄ除去工程中に試験した。添加剤なしのＳ／Ｄ除去工程を、対照として試験した。
【０３７０】
上記実施例５に詳述したように、溶解物を調製し、ＳＤＲカラムに導入した。ＨＰＭＣ単独（ＮａＣｌ及びＥｔＯＨを含まない）の効果を調べるために、この実施例では、１５ｍＬの体積の１緩衝液のみを、洗浄用に使用した。すべての条件を表２７に詳述する。導入の前に、導入された溶解物で使用したものと同じ緩衝液を使用して平衡化を行った。フロースルー及び洗浄液を収集し、混合して、成長因子の回収率を計算した。成長因子の回収率の結果（上記に説明したよう計算したもの）を表２８に示す。ＨＰＭＣを含む全ての導入した試料を、上記の方法でＨＰＭＣでインキュベートした。
【０３７１】
ＥＬＩＳＡを使用して、以下の成長因子、すなわち、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｂ（塩基性）ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦの回収率を調べた。
【０３７２】
【表２７】
2016503789.tif 000029
【０３７３】
【表２８】
2016503789.tif 000030
＊  ＳＤＲカラム前に対する％
【０３７４】
この結果は、ＳＤＲカラムによるＳ／Ｄ除去前に、かつＳ／Ｄ除去後に、Ｓ／Ｄで処理された血小板溶解物をＨＰＭＣに接触させることが、ＳＤＲカラムからの成長因子の回収率を改善したことを示している。
【０３７５】
また、この結果は、Ｓ／Ｄ除去工程中のＨＰＭＣの高い濃度が、成長因子の回収率の増加をもたらしたことを示している。
【０３７６】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｎＢＰの濃度を、Ｓ／Ｄ除去工程の前に（ＳＤＲ前の物質）及びＳ／Ｄ除去工程後（ＳＤＲ後の物質）に測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、紫外線検出器を使用する逆相ＨＰＬＣによって決定し、ＴｎＢＰは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。
【０３７７】
結果を以下の表２９に示す。
【０３７８】
【表２９】
2016503789.tif 000031
【０３７９】
この結果は、成長因子回収に有効であることが認められた最大０．３％の濃度のＨＰＭＣの存在下でＳ／Ｄ物質の除去を行うことが、カラムのＳ／Ｄ除去性能に影響を及ぼさなかったことを示している。
【０３８０】
【表３０】
2016503789.tif 000032
【０３８１】
実施例２０：Ｓ／Ｄで処理され、ＰＶＰ  Ｋ１２に接触させ、かつＳ／Ｄ除去に供された、ＷＡＰから調製された血小板抽出物中のいくつかの成長因子間の比率
以下の実施例は、開示されたように調製された血小板抽出物中のいくつかの成長因子間の比率を示し、また、得られた比率が、出発物質中のものに匹敵するかどうか、及び試料をクロマトグラフィー樹脂に導入する前の溶解物（ＳＤＲ前の物質）中のものに匹敵するかどうかを検討している。ＳＤＲ前の物質（又は抽出物）及びＳＤＲ後の物質を、実施例１６に記載した通りに調製した。
【０３８２】
ＴＧＦ−β１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを、上述の特定の市販ＥＬＩＳＡキットを使用して、３つ全ての試験物質（ＷＡＰ出発物質、ＳＤＲ前の物質、及びＳＤＲ後の物質）において測定し、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１／ｂＦＧＦ、及びＶＥＧＦ／ｂＦＧＦの間の比率を計算した。成長因子のレベル及び比率を、それぞれ下の表３１及び３２に示す。
【０３８３】
【表３１】
2016503789.tif 000033
【０３８４】
【表３２】
2016503789.tif 000034
【０３８５】
この結果は、Ｓ／Ｄ除去工程中にエタノール及びＮａＣｌと組み合わせたＰＶＰ  Ｋ１２に接触させた血小板溶解物が、出発物質中の比率及びＳ／Ｄ除去前の物質中の比率と同様なＰＤＧＦ−ＡＢ／ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１／ｂＦＧＦ、及びＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ比率を有する抽出物をもたらすことを示している。
【０３８６】
開示されたようにＳ／Ｄ除去を行うことが、Ｓ／Ｄ除去前の物質と同様である因子の比率を含む血小板抽出物をもたらすことを結論付けることができる。
【０３８７】
〔実施の態様〕
（１）  ウイルス安全性のある生物学的液体混合組成物（viral-safe biological liquid mixture composition）を生物学的原料から調製するための方法であって、該方法は、
該原料を提供する工程と、
両親媒性ポリマーを提供する工程と、
該原料を、ウイルス不活性化が可能な溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）、及び該両親媒性ポリマーで処理する工程と、
該処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、該Ｓ／Ｄを除去する工程と、
非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含み、
該方法は、少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理を含み、
これによって、ウイルス安全性のある生物学的液体混合組成物を得る、方法。
（２）  前記Ｓ／Ｄを除去する工程により、油抽出の更なる工程が省略される、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記ＨＩＣ樹脂が、カラム中に充填される、実施態様１又は２に記載の方法。
（４）  前記原料が、細胞、細胞粒子及び／又は細胞小器官を含む、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記原料が、血液バフィーコートである、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
【０３８８】
（６）  前記原料が、血小板を含む、実施態様１〜５のいずれかに記載の方法。
（７）  前記原料が、複数のドナーからプールされた血小板富化分画である、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。
（８）  前記両親媒性ポリマーが、炭化水素系界面活性剤である、実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
（９）  前記両親媒性ポリマーが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０）  前記原料が、先ず初めに前記Ｓ／Ｄに接触させられ、次に前記両親媒性ポリマーに接触させられる、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。
【０３８９】
（１１）  前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＰＶＰの濃度が、約０．０１〜０．９ｍＭの範囲である、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１２）  前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＰＶＰの濃度が、約０．０１〜０．３ｍＭの範囲である、実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３）  前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＰＶＰの濃度が、約０．０２５〜０．３ｍＭの範囲である、実施態様１〜１２のいずれかに記載の方法。
（１４）  前記Ｓ／Ｄで処理された原料中の前記ＨＰＭＣの濃度が、約０．０１〜０．３ｍＭの範囲である、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１５）  前記方法が、前記樹脂を有機溶媒及び／又は塩を含む溶液で洗浄する工程と、該洗浄工程後に得られる分画を回収し、前記非結合分画と混合する工程と、を更に含む、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０３９０】
（１６）  前記有機溶媒が、エタノールである、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  前記塩が、ＮａＣｌである、実施態様１５又は１６に記載の方法。
（１８）  前記少なくとももう１つの直交するウイルス不活性化処理が、熱不活化を含む、実施態様１〜１７のいずれかに記載の方法。
（１９）  前記物質を濃縮する工程を更に含む、実施態様１〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０）  前記物質を乾燥させることによって、ウイルス安全性のある生物学的乾燥混合物とする工程を更に含む、実施態様１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０３９１】
（２１）  生物学的原料から生物学的液体混合組成物を調製するための方法であって、該方法は、
該原料を提供する工程と、
ＰＶＰ及び／又はＨＰＭＣを提供する工程と、
該原料を、ウイルス不活性化が可能な溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）、及び該ＰＶＰ及び／又はＨＰＭＣで処理する工程と、
該処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、該Ｓ／Ｄを除去する工程と、
非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含む、方法。
（２２）  実施態様１〜２１のいずれかに記載の方法により得られる生物学的液体混合組成物。
（２３）  約０．０７〜６ｍＭの範囲のＰＶＰの濃度を含む、実施態様２２に記載の組成物。
（２４）  約０．０７〜２ｍＭの範囲のＰＶＰの濃度を含む、実施態様２２又は２３に記載の組成物。
（２５）  約０．１７〜２ｍＭの範囲のＰＶＰの濃度を含む、実施態様２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【０３９２】
（２６）  約０．０７〜１．５ｍＭの範囲のＨＰＭＣの濃度を含む、実施態様２２に記載の組成物。
（２７）  ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はｂＦＧＦが富化された血小板抽出物である、実施態様２２〜２６のいずれかに記載の組成物。
（２８）  両親媒性ポリマーと、ケモカイン、成長因子、サイトカイン、栄養因子及びこれらの混合物からなる群から選択される血小板由来タンパク質と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物であって、該両親媒性ポリマーが、約０．０７〜６ｍＭの範囲の濃度のＰＶＰ、又は約０．０７〜１．５ｍＭの範囲の濃度のＨＰＭＣである、組成物。
（２９）  前記血小板由来タンパク質が、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｂＦＧＦ又はこれらの混合物である、実施態様２８に記載の組成物。
（３０）  組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び／又は炎症の治療における使用のための、実施態様２２〜２９のいずれかに記載の組成物。
【０３９３】
（３１）  前記組織が、軟組織である、実施態様３０に記載の組成物。
（３２）  局所的又は非経口な使用のための、実施態様２２〜２９のいずれかに記載の組成物。
（３３）  実施態様２２〜２９のいずれかに記載の組成物を含む容器。
（３４）  実施態様３３に記載の容器を含むキット。
（３５）  フィブリノーゲン含有成分を含む容器を更に含む、実施態様３４に記載のキット。
【０３９４】
（３６）  トロンビン含有成分を含む容器を更に含む、実施態様３４又は３５に記載のキット。
（３７）  必要とする被験体における、組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び／又は炎症の治療のための方法であって、有効量の実施態様２２〜２９のいずれかに記載の組成物を、該被験体に適用する工程を含む、方法。
（３８）  溶媒−界面活性剤（Ｓ／Ｄ）を含む生物学的原料からＳ／Ｄを除去するための方法であって、該方法は、
該原料を提供する工程と、
両親媒性ポリマーを提供する工程と、
該原料をＳ／Ｄ、及び該両親媒性ポリマーで処理する工程と、
該処理された原料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に接触させることによって、該Ｓ／Ｄを該生物学的原料から除去する工程と、
非結合分画を含む物質をＨＩＣから回収する工程と、を含む、方法。
（３９）  前記Ｓ／Ｄを除去する工程により、油抽出の更なる工程が省略される、実施態様３８に記載の方法。
（４０）  実施態様３８に記載の工程を含むことによって得られる生物学的組成物。
【図１】
2016503789.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016503789.tif 000042
【国際調査報告】
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2016503789.tif 000044