(57)【要約】本発明は、特に固体表面である表面(1)の生体適合性を改善する方法、および、生体適合性の表面を介して生物学的系と接触される、例えばインプラント、センサー、または、細胞培養容器である装置(3)に関する。特に細胞培養物および組織において、表面の生体適合性を、簡便に、且つ、多数の異なる表面について改善するため、本発明では、表面(1)を反応性ラジカル(2)と接触させることが企図される。本発明の装置(3)は、本発明の方法により処理された生体適合性の表面(1)を有する。2016529015.tif 000006
2016529015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に固体表面である表面(1)の生体適合性を改善する方法であって、表面(1)が反応性ラジカル(2)の少なくとも一つの種と接触される、方法。
【請求項２】
生物学的反応を引き起こし、且つ、細胞または組織傷害効果を有する、表面(1)の活性中心(4)を、反応性ラジカル(2)が不活性化する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
反応性ラジカル(2)が、少なくとも一つの酸素ラジカル、窒素ラジカル、炭素ラジカル、硫黄ラジカルおよび/またはハロゲンラジカルを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
反応性ラジカル(2)が、ラジカル開始剤(5)の分解により生じる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ラジカル開始剤(5)が、表面(1)と接触され、インサイチューで反応性ラジカル(2)に変換される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
ラジカル開始剤(5)が、光分解により、放射線分解により、熱分解により、プラズマを用いて、または、化学的および/若しくは生物学的反応により、反応性ラジカル(2)に変換される、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
反応性ラジカル(2)が、
(a)フェントン反応；
(b)過酸化物からの光分解；
(c)水、若しくは、ヒドロキシラジカルに放射線分解可能なその他の酸素化合物の放射線分解；または
(d)好ましくは水若しくは過酸化物である、プラズマ処理によりヒドロキシラジカルに変換可能な酸素化合物のプラズマ反応
により形成されるヒドロキシラジカルである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
表面(1)が、貴金属、貴金属化合物若しくは合金、またはポリマーを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
表面(1)が、インプラント、センサー、または細胞培養容器に属するものである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に記載の方法によって処理された生体適合性の表面(1)を介して生物学的系と接触される、例えばインプラント、センサー、または細胞培養容器である装置(3)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に固体表面である表面の生体適合性を改善する方法に関する。
【０００２】
本発明はさらに、生体適合性の表面を介して生物学的系と接触される、例えばインプラント、センサーまたは細胞培養容器である装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的系と接触する材料は高い生体適合性を有さねばならない。即ち、(I)材料は、生物学的系に対して有害な作用を有してはならず、そして、(II)生物学的環境が、例えば、腐食、生分解等々の材料変化を引き起こしてはならない。
【０００４】
材料の生体適合性を高めるためには、表面を改変させる多様な機械的、化学的、および物理的方法がある。機械的改変（例えば、研磨または研削）により特定の表面微細構成または表面粗度が得られ、表面の汚れが除かれ、また、後の分子による結合のための吸着特性が改善されるであろう（I. Milinkovic, R. Rudolf, K.T. Raic, Z. Aleksic, V. Lazic, A. Todorovic, D. Stamenkovic, Materiali in tehnologije／Materials and Technology 46 (2012) 251-256(非特許文献1)）。
【０００５】
表面は、特有の試薬による直接的な反応により、表面における分子の共有結合により、例えばプラズマエッチング、切断、または、重合、およびプラズマ浸漬イオン注入のようなプラズマ利用技術により、化学的に改変され得る（P.K. Chu, J.Y. Chen, L.P. Wang, N. Huang, Mater. Sci. Eng., R36 (2002) 143-206(非特許文献2)）。
【０００６】
Liu、ChuおよびDingは、生物医薬的使用のためのチタンおよびチタン合金の表面改変の種々の可能性についての概論を提供する（X. Liu, P.K. Chu, C. Ding, Mater. Sci. Eng., R47 (2004) 49-121(非特許文献3)）。化学的には、チタン表面は酸またはアルカリにより処理できる。化学的改変にはその他、ゾルゲルコーティング、陽極酸化、化学蒸着および生化学的改変が含まれる。チタン表面は物理的手法では、溶射（例えば、火炎溶射若しくはプラズマ溶射）、物理的蒸着、または、イオン注入および沈着により改変できる。チタン表面の生体適合性は電気化学的には、陽極酸化、および、ヒドロキシアパタイトによる電気泳動または陰極析出の助けにより高められる（K. -H. Kim, N. Ramaswamy, Dent. Mater. J. 28 (2009) 20-36(非特許文献4)）。
【０００７】
ポリマー表面の改変にはさらに種々の物理的および化学的方法が記述されている（F. Abbasi, H. Mirzadeh, A. -A. Katbab, Polym. Int. 50 (2001) 1279-1287(非特許文献5)）。シリコンポリマーの表面改変のための最も慣例の物理的方法は、プラズマおよびレーザー処理、並びに、コロナ放電である。シリコンポリマーの表面は化学的には、エッチング、酸化、加水分解、官能基化、並びに、「表面グラフト」により改変され得る。
【０００８】
列記されたすべての方法により、表面の特性は、種々の方法で生体適合性を高めるために変化させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】I. Milinkovic, R. Rudolf, K.T. Raic, Z. Aleksic, V. Lazic, A. Todorovic, D. Stamenkovic, Materiali in tehnologije／Materials and Technology 46 (2012) 251-256
【非特許文献２】P.K. Chu, J.Y. Chen, L.P. Wang, N. Huang, Mater. Sci. Eng., R36 (2002) 143-206
【非特許文献３】X. Liu, P.K. Chu, C. Ding, Mater. Sci. Eng., R47 (2004) 49-121
【非特許文献４】K. -H. Kim, N. Ramaswamy, Dent. Mater. J. 28 (2009) 20-36
【非特許文献５】F. Abbasi, H. Mirzadeh, A. -A. Katbab, Polym. Int. 50 (2001) 1279-1287
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、特に細胞培養物および組織に対する表面の生体適合性を簡単な手法により改善することを可能とし、しかも、特に固体表面である多種多様の表面について適用できる、表面を処理するための方法を提供するという課題に基づく。
【００１１】
本発明において、上記課題は、表面が反応性ラジカルの少なくとも一つの種により処理されることにより解決される。最初に述べた装置は、その生体適合性表面が本発明の方法の一つにより処理されることによって、この課題を解決する。
【００１２】
本発明により、反応性ラジカルの少なくとも一つの種による表面処理が、表面を無毒化し、そしてそれにより表面の生体適合性を改善することが驚くべきことに示された。従来の方法とは異なり、例えば、追加の層を表面に加えることなく、表面は反応性ラジカルにより無毒化され、それにより生物学的系に対する生体適合性が高められる。
【００１３】
別の利点は、ラジカルが極めて様々な手法により生成でき、それにより本方法を多種多様の材料要求に適応できることにある。例えば、熱感受性の表面の生体適合性を改善する場合、ラジカルは例えばフェントン反応により室温で生産することができる。表面を可能な限り化学物質なしで処理したい場合には、ラジカルの生産に、例えば、光分解または放射線分解を使用できる。
【００１４】
「反応性ラジカル」は、反応性である少なくとも一つの不対電子を持つ原子または分子である。反応性ラジカルは通常、非常に早く、多くは一秒よりも短い時間内に反応する。「反応性ラジカルの少なくとも一つの種」は、ただ一つの種のラジカル（ラジカル原子、ラジカルイオン、ラジカル分子またはラジカル分子イオン）によってのみ表面が処理される態様も、様々な種類のラジカルが表面と接触する態様も含む。本発明における「生体適合性の改善」は、表面の無毒化、従って、反応性ラジカルと接触されなかった未処理の表面と比較して、本発明の処理を受けた表面は細胞傷害性がより少ない、即ち、細胞および/または組織への有害性が少ないことによって示される。改善された生体適合性は、未処理表面、および、反応性ラジカルで一度処理された表面を、細胞培養物と接触させ、そしてその後、溶液中の細胞活性を確認する細胞毒性試験により決定できる。本発明の方法によって細胞活性は少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、そして、特に好ましくは50〜100％増大され得る。
【００１５】
本発明の溶液は、各々別個に有利な、任意で互いに組み合わせることができる態様により改善できる。これらの態様およびそれに結び付いた利点について以下に詳述する。
【００１６】
本方法の一態様において、表面の生物学的反応を引き起こし、そして、細胞および/または組織傷害作用を有する活性中心を、反応性ラジカルは不活性化できる。従って、反応性ラジカルによる処理により、表面上の細胞毒性反応を引き起こす活性中心を意図的に（systematically）、且つ、特異的に不活性化できる。表面上の反応性ラジカルは、化学反応を引き起こし、活性中心を生じ、そしてそれにより細胞毒性効果を有すると予想されたので、この点は驚くべき、且つ、予期されなかったことである。細胞毒性反応を引き起こす活性中心は、細胞および/または組織傷害作用を有する細胞表面上の一原子または一物質である。これらの活性中心は反応性ラジカルにより、意図的に、且つ、特異的に、例えば、細胞毒性でない物質に変換されて不活性化されるか、または、例えば、反応性の分解により細胞表面から抜き出される。
【００１７】
別の態様においては、反応性ラジカルは少なくとも、酸素ラジカル、窒素ラジカル、炭素ラジカル、硫黄ラジカルの一つの種、および/または、ハロゲンラジカルの一つの種を含み得る。反応性酸素ラジカルには、一つの酸素原子に少なくとも一つの不対電子に存在するすべてのラジカルが含まれる。酸素ラジカルの例は、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、ペルオキシラジカルまたはアルコキシラジカルである。窒素ラジカルの例は、一酸化窒素およびアジ化物である。炭素ラジカルは、例えば三重項カルベンおよびアルキルラジカルを含み、そして、硫黄ラジカルには、例えばチイルラジカルが含まれる。ハロゲンラジカルは、その他に加えてクロロラジカルおよびブロモラジカルを含む。
【００１８】
さらに別の態様においては、反応性ラジカルはラジカル開始剤の分解によって生産することができる。ラジカル開始剤とは、少なくとも一つの反応性ラジカルに変換できる分子を指す。例えば、塩素（Cl2）分子における塩素-塩素結合、または臭素（Br2）分子における臭素-臭素結合は光の作用により開裂され、そして分子ラジカル開始剤はそれにより反応性ラジカルに変換される。
【００１９】
一態様においては、表面は、反応性ラジカルとは異なり通常安定であるラジカル開始剤と接触され、そして、ラジカル開始剤は続いてインサイチューで反応性ラジカルに変換される。この方法により確実に、表面全体が均一に処理される。
【００２０】
ラジカル開始剤は光分解、放射線分解、熱分解、プラズマの使用、並びに/または、例えば電気化学的のような化学的、および/若しくは、例えば酵素的のような生物学的反応により、反応性ラジカルに変換できる。従って、ラジカルの生産は、例えば、光（例えばUV放射、または、レントゲンおよびその他の電離放射線の使用）を用いた非熱的手段のような種々の手段で、および、処理する表面の特性に合致させて、行うことができる。例えば、過酸化水素のFe(II)イオン、または、例えば、酸性溶媒中での高反応性ヒドロキシラジカルの形成により分解されるCu(II)、Ti(III)、Cr(II)若しくはCo(II)であるその他の遷移金属イオンとの反応による化学的または電気化学的フェントン反応の形である化学的変換も同様に室温で可能である。
【００２１】
本発明の方法のさらに別の態様において、反応性ラジカルはヒドロキシラジカルであり得る。ヒドロキシラジカルは、例えば、水などの生物学的に安心な物質から簡単な方法で生産できる。ヒドロキシラジカルは具体的には次の方法：
a)フェントン反応；
b)過酸化物の光分解；
c)水、若しくは、ヒドロキシラジカルに放射線分解可能なその他の酸素化合物の放射線分解；または
d) 好ましくは水若しくは過酸化物である、ヒドロキシラジカルのプラズマ処理により変換可能な酸素化合物のプラズマ反応
により形成できる。
【００２２】
その生体適合性が本発明の方法によって改善される表面は、例えば、貴金属、貴金属化合物若しくは合金、またはポリマーを含み得る。例えば金などの貴金属はしばしばバイオセンサーにおける電極、および、インプラント材料として使用される。インプラントおよび細胞培養容器はしばしば、生物学的環境中において例えば腐食などの材料変化を起こさないものの、細胞系に対して細胞および/または組織傷害作用を有するポリマーから作成され、従って、本発明の方法の使用によりその生体適合性を改善することができる。
【００２３】
別の態様において、表面はインプラント、センサーまたは細胞培養容器のものであり得る。利点は、インプラント、センサーまたは培養容器が最初に製造され、そしてその後、本発明に従って処理できる点である。特定の種類の表面または特定の表面型についての材料の要求に適合させた種々の方法を提供するのに特に適した反応性ラジカルを使用できるため、本発明の方法は普遍的である、即ち、あらゆる種類の表面およびあらゆる表面型に適用できる。
【００２４】
本発明によればさらに、例えばインプラント、センサーまたは細胞培養容器である、前述の方法の一つにより処理された、生物学的系と接触される生体適合性の表面を持つ装置が意図される。装置は、反応性ラジカルによる処理前の表面と反応性ラジカル処理された表面との比較により、細胞培養物と接触された場合に、後者が明確により高い細胞活力を示すという、簡単な手法により確認され得る、改善された生体適合性を持つ表面により特徴付けられる。本発明の装置のさらなる特徴は、生物学的反応を引き起こし、そして、細胞および/または組織傷害性を有する活性中心が、意図的に不活性化される、即ち、生物学的に不活性な分子に変換されるか、または、例えば、生物学的に活性な金イオンの場合には、表面から分離されることである。
【００２５】
以下、図面および具体的な実験と関連付けた態様によって本発明をより詳細に説明する。態様において例示的に示される特徴の組み合わせは、上記説明に従い、本発明の装置または本発明の方法の特定の適用事例に必要な特性に応じて、さらなる特徴により補足されうる。また同様に、上記説明に従い、具体的な適用事例においてその特徴の効果が問題とならない場合、記載された態様における個々の特徴を省略してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面において、同じ機能および/または同じ構造の要素は同じ引用符号が用いられる。
【００２７】
【図１】第一の態様における、表面の生体適合性を改善するための本発明の方法の概念図を示す。
【図２】第二の態様における、表面の生体適合性を改善するための方法の概念図を示す。
【図３】金表面から分離した金量と細胞活性との関係に関するグラフを示す。
【図４ａ】移植のための機械的に研磨した金表面のAFM像および断面調査を示す。
【図４ｂ】移植後の機械的に研磨した金表面のAFM像および断面調査を示す。
【図４ｃ】移植のための「フェントン研磨」金表面のAFM像および断面調査を示す。
【図４ｄ】マウス腹腔中に移植した後の「フェントン研磨」金表面のAFM像および断面調査を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図1の概念図中では固体表面である表面1の生体適合性を改善するための本発明の方法による第一の態様について、図1の模式的なイラストに関連して説明する。表面1は反応性ラジカル2と接触される。ラジカルは総数n個の不対電子（・によって示される）を有することができる。ラジカルが2個の不対電子を含む場合はジラジカルと称され、3個の不対電子である場合はトリラジカルと称される、等々。
【００２９】
表面1は、その生体適合性が改善されるべき、例えばインプラント、センサーまたは細胞培養容器である装置3の表面であり得る。
【００３０】
反応性ラジカル2は、表面1の、生物学的反応を引き起こし、そして、細胞および/または組織傷害作用を有する活性中心4を不活性化するように作用する。活性中心4は図中において、その中に星が見られる丸によって模式的に示され、その星は、活性中心4の細胞毒性効果、即ち、細胞または組織傷害性特性を象徴する。
【００３１】
図1の右側に示されるように、反応性ラジカル2は表面1の活性中心4を不活性化する。不活性化は、図1の右側の上に示されるように、例えば、活性中心4が表面から剥がれて、そこから分離することにより起こり得る。不活性化はまた、図1の右下において、細胞傷害作用を示す星が最早存在しないことによって象徴されるように、活性中心4が反応性ラジカル2によって最早細胞または組織傷害作用を示さないように変換されることであってもよい。
【００３２】
図2は本発明の方法のさらなる態様を示す。図2の態様では、ラジカル開始剤5の分解により反応性ラジカル2が発生する。反応性ラジカル2と比べてラジカル開始剤5は安定であり、即ち、より反応性が低く且つ寿命が長い。図2に示す態様の方法では、最初に、ラジカル開始剤5は装置3の表面1と接触される。続いて、ラジカル開始剤5はインサイチューで、即ち、正にその場で、反応性ラジカル2に変換される。変換に関して、ラジカル開始剤5は、分解剤6によって反応性ラジカル2に変換される。
【００３３】
分解剤6は、ラジカル開始剤5の反応性ラジカル2への分解に作用する化学物質若しくは酵素、または、例えば、UV、レントゲン若しくはイオン化放射である放射、または、例えば温度若しくは圧力であるパラメーターの変化であり得る。そのため、表面1の種類および性状に従って、本発明により改善される生体適合性を除いて表面1の特性を改変させない分解剤6、および、ラジカル開始剤5の変換方法を選択することができる。例えば、光分解（光放射）または放射線分解（イオン化放射）を用いて、表面1の生体適合性を温度上昇なしに改善できる。これは特に温度感受性の表面にとって有利である。
【００３４】
分解剤6を用いてラジカル開始剤5が反応性ラジカル2に変換された後（図2の右側）、本発明の第二の態様の方法は、図1に示される方法と同様に、表面1の活性中心4を意図的に不活性化することにより、反応性ラジカル2が表面1の生体適合性を改善して進行する。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の教示は具体的な実験結果を元にして説明される。
【００３６】
1. 金層の細胞毒性の低下
ステンレス鋼の針金上のガルバニック沈着による金層の細胞活性を、ガンマ線殺菌後に調べた。成人ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF細胞）を用いた細胞毒性試験により、未処理、および、酸素ラジカル処理金層を検査した。そのために針金から溶離物を調製し、そして、比色定量分析（TTC分析）を用いて、NHDF細胞の細胞活性に対するそれらの影響を調べた（詳細な記述については、N. Saucedo-Zeni et al., Int. J. Oncol. 41 (2012) 1241-1250参照）。
【００３７】
フェントン溶液を用い、そして、過酸化水素のUV光分解により、ラジカルを生産した。次のフェントン溶液の組成を用いた：
2016529015.tif 000003
。
全処理時間に120分かかり、5分毎に「古い」フェントン溶液を新しいフェントン溶液により置換した。
【００３８】
H2O2からUV光分解によりラジカルを得るために、「705 UV Digester」(Metrohm、スイス)を使用した。0.3％のH2O2溶液を使用して金層を30分間処理することで、金層が完全に無毒化されることが示された。
【００３９】
未処理金層で細胞活性が20〜60％でしかなかったのに、反応性酸素ラジカルによる上記処理後の金層における細胞活性は事実上100％に達し、即ち、金層はラジカル処理によって完全に無毒化された。
【００４０】
続いて、「ICP発光分光分析装置 Optima 2100 DV」（PerkinElmer、米国）を使ったICP-AESにより、使用したフェントン溶液の金含量について調べた。それにより、分離した金量が多い程細胞活性が高いことが確認された（図3参照）。
【００４１】
金インプラントから遊離する金イオンが生物学的活性を有することが公知である（A. Larsen, K, Kolind, D.S. Pedersen, P. Doering, M.O. Pedersen, G. Danscher, M. Penkowa, M. Stoltenberg, Histochem. Cell. Biol. 130 (2008) 681-692；G. Danscher, A. Larsen, Histochem. Cell. Biol. 133 (2010) 367-373）。これらは、細胞毒性試験に用いた組織体（ヒト皮膚線維芽細胞）については明らかに毒性である。図3からは従って、分離した金原子が、生物学的反応を引き起こす、表面における活性中心であることが明白である。この活性中心の分離によって表面は無毒化される。
【００４２】
2. マウス腹腔中への金板の移植
次に6個の金板（大きさ：15mm×5mm×0.05mm）を酸化アルミニウム粉末で機械的に研磨した。機械的に研磨した金板の内3個を、続いて、フェントン溶液を用いて産生した酸素ラジカルで処理した。そのために、
2016529015.tif 000004
からなる常に新しく調製された溶液に金板を浸漬した。フェントン反応をH2O2（Merck）の添加により開始し、そして、金板をこの溶液に5分間曝露した。全処理時間が120時間となるように、この工程を12回繰り返した。フェントン溶液中ｃH2O2およびｃFe2+の割合は恒常的に10：1であった。
【００４３】
機械的に研磨した金板、および、フェントン処理した金板の両方について、AFM像を撮り（図4aおよび4c参照）、そして、表面上の粗度係数（表1参照）を決定した。AFM測定は、「NanoScope I」（Digital Instruments、米国）を用いて接触様式で行った。
【００４４】
金板をマウス腹腔に移植した（マウス一匹当たり金板一つ）。14日後にマウスから金板を取り出し、そして、金表面の新たなAFM像を撮り（図4bおよび4d）、粗度係数を決定した（表1参照）。
【００４５】
AFM像および粗度係数に基づき、単に機械的研磨により処理された金表面がマウス腹腔内において滑らかになり、つまり、生物学的に活性な、即ち細胞傷害性の金がインプラントから分離することが明らかになった。一方、機械的に研磨され、そして続いてラジカルで処理された金表面は、表面の反応性ラジカルによる処理により活性中心が不活性化されるため、表面の粗度に変化はない。そのため腹腔内において金表面から金は分離しなかった。これは、インプラントをラジカルにより前処理することによって、より高い生体適合性（影響を受けないこと）が示されることを実証した。
【００４６】
（表１）異なる処理を受けた金表面の粗度係数
2016529015.tif 000005
【００４７】
引用符号
1 表面
2 反応性ラジカル
3 装置（例えば、インプラント、センサーまたは細胞培養容器）
4 活性中心
5 ラジカル開始剤
6 分解剤
【図１】
2016529015.tif 000007
【図２】
2016529015.tif 000008
【図３】
2016529015.tif 000009
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
2016529015.tif 000013
【国際調査報告】
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2016529015.tif 000015
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