(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）の電荷移動複合体とビオチン結合性分子、好ましくは、ストレプトアビジンとを含んでなる発光複合体、およびビオチン化化合物の検出のためのその使用に関する。本発明はまた、ＡＱＣの電荷移動複合体と生体分子とを含んでなるコンジュゲートの使用、およびＡＱＣナノシステムの発光特性に基づくサンプルに基づく生体分子の結合相手の検出のためのその使用に関する。2016503158.tif 000009
2016503158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン結合性分子と、一般式（Ｉ）の少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）としてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体（ＣＴＣ）：
Ｍｎ＋Ｍ’ｎ´−      （Ｉ）
［式中、
金属ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は、同じまたは異なる金属であり、
Ｍｎは、その酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、
Ｍ’ｎ’は、その還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、
Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、
ｎおよびｎ’はそれぞれ、ＭおよびＭ’の金属原子数であり、かつ、
ｎはｎ’より小さい］
とを含有する複合体であって、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない、複合体。
【請求項２】
前記ビオチン結合性分子がストレプトアビジンまたは機能的に等価なその変異体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記金属ＭおよびＭ’が遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
金属ＭおよびＭ’が遷移金属Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕおよびそれらの組合せ、より好ましくは、Ａｕ、Ａｇおよびそれらの組合せから独立に選択される、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
ｎおよびｎ’が２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の金属原子数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
ｎとｎ’との差が５〜５０原子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記電荷移動複合体が、原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記ω−ヒドロキシ酸が、ｍが２〜３０の値を有する一般式（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）を有し、かつ／または、前記ω−メルカプト酸が、ｐが２〜３０の値を有する一般式ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ配位子を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
（ｉ）少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）としてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体であって、請求項１に定義される式Ｉを有し、かつ、前記金属ＡＱＣのＭおよびＭ’は同じまたは異なる金属であり、Ｍｎはその酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、Ｍ’ｎ’はその還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、ｎおよびｎ’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
（ｉｉ）ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含有するパーツキット。
【請求項１０】
サンプル中のビオチン化分子の検出のための方法であって、
（ｉ）前記サンプルと請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体とを、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の接触後に、ＡＱＣの励起波長での前記サンプルの励起に応答したＡＱＣによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のＡＱＣにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す、方法。
【請求項１１】
前記ビオチン化分子が核酸、ポリペプチドまたは多糖である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビオチン結合性分子が、ビオチンのそれよりも低いビオチン結合性分子に対する親和性を示すビオチン類似体との複合体として提供される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビオチン類似体が４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸（ＨＡＢＡ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生体分子と、一般式（Ｉ）の少なくとも２つの異なるサイズの金属ＡＱＣとしてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体：
Ｍｎ＋Ｍ’ｎ’−    （Ｉ）
［式中、
金属ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は、同じまたは異なる金属であり、
Ｍｎは、その酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、
Ｍ’ｎ’は、その還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、
Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、
ｎおよびｎ’はそれぞれ、ＭおよびＭ’の金属原子数であり、かつ、
ｎはｎ’より小さい］
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および／またはω−メルカプト酸配位子に共有結合されている、コンジュゲート。
【請求項１５】
前記生体分子が核酸、多糖およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記ポリペプチド生体分子が抗体である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記金属ＭおよびＭ’が遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記遷移金属がＡｕ、ＡｇおよびＣｕからなる群から選択される、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
ｎおよびｎ’が２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の金属原子数である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
ｎとｎ’との差が５〜５０原子である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
ω−ヒドロキシ酸が、ｍが２〜３０の値を有する一般式（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）を有し、かつ／または、ω−メルカプト酸が、ｐが２〜３０の値を有する一般式ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ配位子を有する、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
その表面において第１の反応性基で官能基化されているＡＱＣの電荷移動複合体を、前記第１の反応性基と反応し得る基を含有する生体分子と反応させることを含んでなる、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲートの製造方法。
【請求項２３】
前記生体分子内の基が、前記反応工程の前に生体分子対の予備官能基化により導入されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の反応性基が活性化カルボキシル基である、請求項２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
第１の反応性基と反応し得る生体分子中の基が活性化ヒドロキシル基または活性化アミノ基である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、
（ｉ）前記サンプルを請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させる工程、ここで、前記コンジュゲートの生体分子は、前記生体分子が前記標的分子に結合するのに十分な条件下で、前記標的分子に特異的に結合する、および
（ｉｉ）前記生体分子と前記標的分子との間の複合体形成を検出する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２７】
前記標的分子が第１のポリペプチドであれば、前記コンジュゲートの一部を形成する生体分子は第２のポリペプチドおよびアプタマーからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のポリペプチドが抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的分子が第１の核酸であれば、前記コンジュゲートの一部を形成する生体分子は、第１の核酸と特異的にハイブリダイズする第２の核酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的分子が多糖であれば、前記コンジュゲートの一部を形成する生体分子はレクチンであり、または前記標的分子がレクチンであれば、結合相手は多糖である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的分子が細胞、細菌、ウイルス、もしくは酵母細胞内に存在するか、またはポリマー、ポリマー膜もしくはポリマー粒子に固定化されている、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞内成分を検出するための方法であって、１以上の細胞内成分を請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のＡＱＣ−ＣＴＣを含んでなるコンジュゲートと接触させることを含んでなり、生体分子が、前記細胞内成分と特異的に結合し、それにより顕微鏡による１以上の細胞内成分の検出を可能とする結合相手である、方法。
【請求項３３】
前記結合相手がポリペプチドおよび核酸からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）の電荷移動複合体に結合された目的の生体分子に対する結合相手を用いて生体分子を検出するための方法および試薬に関する。本発明はまた、金属原子量子クラスターの電荷移動複合体とビオチン化分子とを用いる競合的結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド、タンパク質、脂質などの生体分子と蛍光色素のコンジュゲーションは、生体分子の検出、単離、および／または同定に有用であり得る。このコンジュゲートは一般に、色素と所与の標的または結合相手に結合し得る薬剤を連結することから得られる。タンパク質または核酸の検出用マーカーとしての使用が意図される色素に望ましいと思われる様々な特性が存在する。これらとしては、それが取り囲むマトリックスに影響を及ぼさずに励起される能力、容易な検出、高い量子収率、媒体への適合性、安定性、長い平均寿命、非毒性、経時的発光パラメーターの再現性、およびヌクレオチドまたは他の望ましい標的への色素の結合を可能とする反応性基の存在を含み得る。
【０００３】
今日、２００ｎｍを超える極めて大きなストークスシフト1マイクロ秒を超える遅い減衰時間を有することが知られる唯一の蛍光系は、希土類元素イオンに基づく。しかしながら、マトリックスへのそれらの組み込みが困難であるためにそれらが蛍光特性を失わないこと、各希土類元素に対応する固定された特定の励起、発光およびストークスシフト特性が存在するので変化を受けにくいこと、および高価で希少な材料であることといった複数の欠点を示す。これらの系の例は、Sardar, D.K. et al., Biophotonics, January 2008; Resch-Genger, U., Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology II Springer Series on Fluorescence, 2010, Volume 9, Part 1, 3-40; Harma H. et al., Analytical Chemistry, 2005, 77, 2643-2648；US7465747B2；US2010/0224831A1およびUS4283382に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、発光プローブとして使用することができ、かつ、希土類元素に基づく色素を含有するコンジュゲートのこれらの欠点を克服する、生体分子への蛍光色素のコンジュゲートが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、驚くことに、ＡＱＣの電荷移動複合体がストレプトアビジンと相互作用してそれらの蛍光発光の強度の増強をもたらすこと、および、この効果をビオチンまたはビオチン結合性分子の存在下で逆転させ得ることを見出した。いずれの理論にも縛られることを望むものではないが、ＡＱＣの電荷移動複合体とストレプトアビジンとの相互作用はＡＱＣの立体構造変化をもたらし、その結果、強度の増加が起こると考えられるとともに、ＡＱＣの電荷移動複合体はビオチン結合性ポケットを介してストレプトアビジンと相互作用し、その結果、ストレプトアビジンに対するビオチンの親和性がより高いために、ビオチンまたはビオチン結合性分子の存在下で相互作用が逆転されると考えられる。
【０００６】
ＡＱＣは金属遷移元素を含んでなるので、これらは、ＡｕまたはＡｇなどの、極めて低濃度で存在する場合には毒性のないものから選択することができる。さらに、これらの元素は天然に非常に豊富にあるため、これは完全に持続可能な方法となる。加えて、ＡＱＣおよびＡＱＣを含有する複合体は、下記の利点を示す：
・自然光および室温下で、少なくとも１年の保存期間、それらの特性を失うことなく安定であること、
・３〜１０のｐＨ範囲で安定であること、
・乾燥形態であってもそれらの蛍光特性を失うことなく濃縮乾固可能であること、
・一度乾燥させたものを、それらの蛍光特性を失うことなく再溶解可能であること、および
・希土類元素に基づく発光系で使用される濃度よりも低い濃度で使用されること。
【０００７】
この知見は、ビオチンまたはビオチン化分子の検出を目的とした、ＡＱＣの電荷移動複合体の、ストレプトアビジンまたはビオチン結合性分子の存在下での使用を可能とする。
【０００８】
よって、第１の態様において、本発明は、ビオチン結合性分子と、一般式（Ｉ）の少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）としてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体：
Ｍｎ＋Ｍ’ｎ´−      （Ｉ）
［式中、
金属ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は、同じまたは異なる金属であり、
Ｍｎは、その酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、
Ｍ’ｎ’は、その還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、
Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、
ｎおよびｎ’はそれぞれ、ＭおよびＭ’の金属原子数であり、かつ、
ｎはｎ’より小さい］
とを含有する複合体であって、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない複合体に関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
（ｉ）少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）としてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体であって、請求項１に定義される式Ｉを有し、かつ、前記金属ＡＱＣのＭおよびＭ’は同じまたは異なる金属であり、Ｍｎはその酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、Ｍ’ｎ’はその還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−は静電相互作用により結合され、ｎおよびｎ’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
（ｉｉ）ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含有するパーツキットに関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、サンプル中のビオチン化分子の検出のための方法であって、
（ｉ）前記サンプルと本発明の複合体とを、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の接触後に、ＣＴＣの励起波長での前記サンプルの励起に応答したＣＴＣによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のＣＴＣにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す方法に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、生体分子と、一般式（Ｉ）の少なくとも２つの異なるサイズの金属ＡＱＣとしてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体：
Ｍｎ＋Ｍ’ｎ’−    （Ｉ）
［式中、
金属ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は、同じまたは異なる金属であり、
Ｍｎは、その酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、
Ｍ’ｎ’は、その還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、
Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、
ｎおよびｎ’はそれぞれ、ＭおよびＭ’の金属原子数であり、かつ、
ｎはｎ’より小さい］
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および／またはω−メルカプト酸配位子に結合されているコンジュゲートに関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、サンプル中の生体分子を検出するため、または細胞内成分を検出するための本発明のコンジュゲートに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ストレプトアビジンの存在下であって、（Ａ）ビオチン化オリゴヌクレオチドの不在下、（Ｂ）０．１ｍｍｏｌのビオチン化オリゴヌクレオチドの存在下、および（Ｃ）０．５ｍｍｏｌのビオチン化オリゴヌクレオチドの存在下における、ＡＱＣ−ＣＴＣの発光スペクトルを示す図である。
【図２】図２は、ストレプトアビジンおよびＨＡＢＡの存在下であって、（Ａ）ビオチン化オリゴヌクレオチドの不在下、および（Ｂ）ビオチン化オリゴヌクレオチドの存在下における、ＡＱＣ−ＣＴＣの発光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（「免疫反応する」）抗原結合部位を含有する分子を意味する。非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体が挙げられる。構造的には、最も単純な天然の抗体（例えば、ＩｇＧ）は、４本のポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により内部連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含んでなる。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きなファミリーである。用語「免疫グロブリン分子」には、例えば、ハイブリッド抗体、または変異型抗体、およびそれらのフラグメントが含まれる。抗体の抗原結合機能は天然抗体のフラグメントによって遂行され得ることが示されている。これらのフラグメントは、「抗原結合単位」と総称される。抗原結合単位は、それらの分子構造に基づいて「一本鎖」（「Ｓｃ」）型および「非一本鎖」（「Ｎｓｃ」）型に大別される。また、「抗体」という用語には、無脊椎動物および脊椎動物を含む様々な種に起源する免疫グロブリン分子も包含される。抗体または抗原結合単位に適用される場合の「ヒト」という用語は、ヒト遺伝子またはそのフラグメントにより発現された免疫グロブリン分子を意味する。非ヒト（例えば、齧歯類または霊長類）抗体に適用される場合の「ヒト化」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントである。ほとんどの部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでなってもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに精密化し、ヒトの体内に導入された際の免疫原性を最小化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的に総ての、少なくとも１つの、一般には２つの可変ドメインを含んでなり、この場合、総てまたは実質的に総てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、総てまたは実質的に総てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般にヒト免疫グロブリンのそれの、少なくとも一部も含んでなり得る。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語「およそ」は、明示された値からの若干の変動、好ましくは、明示された値の１０パーセント以内を意味する。しかしながら、用語「およそ」は、例えば、使用する実験技術によってより大きな変動の許容を意味する場合もある。当業者ならば、明示された値の前記変動を理解し、それらは本発明の範囲内である。さらに、より正確な記載を提供するために、本発明に示す量的表現のいくつかは「およそ」という用語を付けて記載しない。用語「およそ」は明示的に使用されるか、またはそうでなければ、本明細書に示される各量は実際に示される量を表すことを試み、それはまた、実験条件による、および／またはこのような所与の値に関する測定からの当量および近似を含め、当技術分野で一般的な知識に基づいて合理的に推測されるような所与の値を表すことを試みるものである。
【００１６】
ＡＱＣと略される用語「原子量子クラスター」は、本明細書では、金属原子量子クラスターとして理解される。金属原子量子クラスターは、本発明において、好ましくは３０９以下の金属原子を有するゼロ酸化状態の金属原子によりもっぱら形成される（Ｍｎ、ｎ＜３０９）。ＡＱＣは時間が経っても安定である。好ましくは、本発明のＡＱＣは、およそ０．３〜２．２ｎｍ、好ましくはおよそ０．３〜２ｎｍ、より好ましくはおよそ０．３〜１．８ｎｍのサイズを有する。これらの金属ＡＱＣはもはや「金属」様の挙動をせず、それらの挙動は分子様となる。したがって、これらのクラスターには、ナノ粒子、微粒子または金属材料には概して見られない新たな特性が見られる。よって、ＡＱＣの物理化学的特性は、ナノ／微粒子の特性から単純に推定することはできない。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「アビジン」は、鳥類、爬虫類および両生類の卵白および組織に見られ、ビオチンと高い親和性で結合する能力を有する糖タンパク質、ならびにストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどのアビジンビオチン結合性分子の任意の発現形態または人工形態（engineered form）を意味する。この用語には、ニワトリ(Gallus gallus)の卵に天然に見られるアビジン（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿２０５３２０．１／ＧＬ４５３８４３５３ｅｎ）ならびに他の種における前記タンパク質のオーソログが含まれる。
【００１８】
「結合相手」は、本明細書で使用する場合、それが結合する結合相手または標的分子に対して結合選択性を示す分子を意味する。結合物質は、抗体またはタンパク質などのポリペプチド、ポリペプチドに基づく毒素、アミノ酸、ヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物、またはそれらの組合せといった生体分子であり得る。結合物質はまた、ハプテン、薬物、金属キレーターなどのイオン錯化剤、微粒子、合成または天然ポリマー、細胞、ウイルス、または本発明の色素分子を含むその他の蛍光分子であってもよい。
【００１９】
用語「生体サンプル」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、培養細胞、骨髄；血液；血液細胞（例えば、白血球細胞、赤血球など）；腹水；組織または細針生検サンプル；細胞含有体液；浮遊核酸；痰；尿；脳脊髄液、腹腔液；胸膜液；乳管洗浄液または気管支肺胞洗浄液などの洗液または洗浄液；穿刺液；掻爬物；骨髄検体；組織生検；外科検体；他の体液、分泌物、および／または排泄物；および／またはそれらからの細胞を含む生体起源の任意のサンプルを意味する。いくつかの実施形態では、サンプルは、患者から得られた細胞を含んでなる。これらの細胞は、例えば、血液、骨髄から、および／または固体器官に由来する組織からのもの、例えば、脳、脾臓、骨、心臓、血管、肺、腎臓、肝臓、下垂体、内分泌腺、リンパ節、初代細胞分散物、腫瘍細胞などであり得る。生体サンプルは、限定されるものではないが、組織学的目的で採取された凍結切片または固定切片を含む、組織切片を含み得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、限定されるものではないが、血液、リンパ液、腹水、婦人科体液および尿を含む体液であり得る。サンプルは、限定されるものではないが、生検（例えば、微細穿刺吸引または組織生検）、手術、および体液採取物（例えば、血液、リンパ液など）を含む、当技術分野で公知の多様な方法のいずれによって被験体から得てもよい。生体サンプルはまた、上記のサンプルのいずれかを処理することにより誘導されるいずれの材料も含む。誘導サンプルは、例えば、生体サンプルから抽出された、あるいはサンプルにｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、または特定の成分の単離および／もしくは精製といった技術を施すことによって得られる核酸もしくはタンパク質を含む。
【００２０】
用語「生体分子」は、当業者に知られている通りに本明細書で使用され、例えば、タンパク質、多糖、炭水化物、脂質、核酸およびオリゴヌクレオチドなどの大型のポリマー分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、および天然物などの小分子を含む、生物により産生される任意の有機分子またはこのような化合物の人工的に産生される任意の誘導体を意味する。
【００２１】
用語「ビオチン結合性分子」は、本明細書で使用する場合、ビオチンまたは任意のビオチン化合物と強く、しかしながら非共有的に結合し得るいずれの化合物も包含することが意図される。
【００２２】
用語「ビオチン化分子」は、修飾ビオチンまたはビオチン類似体と、生体分子、例えば、核酸分子（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ分子、核酸類似体、およびヌクレオチド配列、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはそれらの任意の改変物を含有するまたは組み込んだ任意の分子を含む）、タンパク質（糖タンパク質、酵素、ペプチドライブラリーまたはディスプレー生成物および抗体またはそれらの誘導体を含む）、ペプチド、炭水化物または多糖、脂質などといった別の部分とのコンジュゲートと理解されるべきであり、ここで、これらの他の部分は修飾ビオチンまたはビオチン類似体に共有結合されている。多くのビオチン化配位子は市販されているかまたは標準的な方法によって製造することができる。生体分子、例えば、核酸分子またはタンパク質分子をビオチンとカップリングさせるための方法は当技術分野で周知である(Bayer and Wilchek, Methods in Molec. Biology 10, 143. 1992)。
【００２３】
用語「電荷移動複合体」は、ＣＴ複合体、または電子供与体−受容体複合体とも呼ばれ、本明細書では、少なくとも２つのＡＱＣの会合体であって、電荷の一部、すなわち、電子がこれらのＡＱＣ間で受け渡され、その結果、一方のＡＱＣの酸化形態が形成され、他方のＡＱＣの還元形態が形成される場合と理解される。得られる静電相互作用、すなわち、静電引力は、その分子複合体に安定化力を供する。電荷が移動されるＡＱＣ源は電子供与体と呼ばれ、受容側のＡＱＣは電子受容体と呼ばれる。本発明では、
・Ｍｎは、その複合体内でより小さいＡＱＣである電子供与体であり、
・Ｍ’ｎ’は、その複合体内でより大きいＡＱＣである電子受容体である。
【００２４】
ＣＴＣは、ナノソームを崩壊させることによって形成される。ナノソームを崩壊させる工程は、従前に合成されたナノソームの不安定化プロセスである。この工程は、種々の機構によって達成できる。好ましい実施形態では、ナノソームを崩壊させる、またはナノソームを不安定化させる工程は超遠心分離の手段によりなされるが、熱処理またはｐＨ変化など、当技術分野で公知の他の任意の手段もナノソームの崩壊に有用であり得る。電荷移動機構は、ナノソームを崩壊させる工程中に生じる。したがって、ナノソームが不安定化され、一般式（Ｉ）の電荷移動複合体が形成される。
【００２５】
本発明において使用するためのＣＴＣを得るには、様々な方法が存在する。
【００２６】
１つの方法は、ＡＱＣとしてのＭｎおよびＭ’ｎ’の水溶液を作製する工程を含んでなる。好ましくは、両溶液はおよそ同濃度のＡＱＣを含み、すなわち、両溶液は等モルまたはおよそ等モルである。さらなる工程において、両溶液を混合し、一緒に撹拌して電子移動機構を生じさせる。好ましい実施形態では、反応温度は２０℃〜８０℃である。別の実施形態では、反応時間は５分〜３時間である。
【００２７】
本発明において使用するための電荷移動複合体、特に、有機配位子をさらに含んでなる電荷移動複合体（ここで、前記有機配位子は、原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸などの両親媒性分子である）を得るための別法は、下記の工程：
ａ）ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸とを水性媒体中、塩基の存在下で混合することによりナノソームを作製する工程、
ｂ）工程ａ）で作製された混合物に少なくとも１つの金属塩を添加する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を還元する工程、および
ｄ）工程ｃ）で得られた混合物中に存在するナノソームを崩壊させる工程
を含んでなる。
【００２８】
用語「ナノソーム」は、本明細書において、人工的に調製されたナノメートルサイズの小胞を意味する。したがって、用語「ナノソーム」は、脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の各末端において、または脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖の後ろから３番目のχ、後ろから２番目のψの位置において１つずつ結合した２つの親水基を有する１層の両親媒性分子（例えば、脂質）により形成される、球状ナノ超分子構造を意味する。
【００２９】
本発明のナノソームの前記単層を形成する両親媒性分子は、
・脂肪鎖の一末端における、小胞の外面にある例えばカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、カルボン酸基（ＣＯＯ−）またはリン酸基（ＰＯ４−）などの親水基および
・脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖の後ろから３番目のχ、後ろから２番目のψの位置における、または脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の最後のωの位置における、例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、または−ＮＲ−などの基での置換（ここで、Ｒは、脂肪鎖の他の末端においてまたは前記脂肪鎖の親水基に対する最終的な位置において、小胞の内部に向かって配置されるナノソームを形成し得る、短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表し、前記基は、１０ｎｍ以下、好ましくはおよそ５ｎｍ以下、より好ましくは０．８〜４ｎｍの内径を有するナノキャビティーを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径は、およそ１．５〜１．８ｎｍである）
を含んでなる。
【００３０】
好ましい実施形態では、用語「ナノソーム」は、ω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸により形成される球状ナノ超分子構造を意味する。この特定の実施形態では、ナノソームは、上記で定義されるω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）を含んでなる。ナノソーム中に存在するω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸は、酸基−ＣＯＯＨ（または対応する酸の塩が使用される場合には−ＣＯＯ−）をナノシステム、すなわち、ナノソームの外面に向け、かつ、−ＯＨおよび−ＳＨ基をナノソームの内腔を形成している内部に向けた、球状単層を形成しており、その結果、２つのおよその同心球が形成され、または文献で呼称されているように脂肪酸「ｂｏｌａ」の形態となる。この球状単層は、およそ２〜１０ｎｍ、好ましくはおよそ５ｎｍの厚さを有し得る。
【００３１】
ナノソームの内腔は閉じられている。前記内腔の内径は１０ｎｍ以下、好ましくはおよそ５ｎｍ以下であり、より好ましくは、前記内腔の内径はおよそ０．８〜４ｎｍである。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティーの直径は、およそ１．５〜１．８ｎｍである。ナノソームのこの特定の実施形態では、前記ナノキャビティーは、ヒドロキシル−ＯＨ、およびメルカプト−ＳＨ基により形成されるが、これらの官能基を、金属とも相互作用する−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、ナノソームを形成し得る短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表す）などの他のものに交換することも可能である。
【００３２】
ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸を混合することによりナノソームを調製する工程ａ）における塩基として、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクチルアンモニウム、水酸化トリエチルベンジルアンモニウム、水酸化トリ−ｎ−オクチルメチルアンモニウム、水酸化トリメチルデシルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウムまたは対イオンなどの嵩のある基を有する他の任意の水酸化物、好ましくは、水酸化テトラブチルアンモニウムを使用することができる。
【００３３】
工程ｂ）では、遷移金属の金属塩またはそれらの組合せが使用可能である。金属塩の非限定的な例は、遷移金属の硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、リン酸塩、水酸化塩、シアン酸塩、カルボン酸塩、チオリンゴ酸塩、チオグルコサート(thioglucosates)である。単独の金属塩としてまたは他の金属塩と組み合わせて使用されるこれらの金属塩の例は、ＡｇＮＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＡｇ、Ａｇ３ＡｓＯ４、ＡｇＢｒＯ３、ＡｇＢｒ、Ａｇ２ＣＯ３、ＡｇＣｌＯ３、ＡｇＣｌ、ＡｇＣｒＯ４、ＡｇＯＣＮ、ＡｇＩＯ３、ＡｇＩ、Ａｇ２Ｏ、ＡｇＣｌＯ４、Ａｇ３ＰＯ４、Ａｇ２ＳＯ４、Ａｇ２Ｓ、Ａｇ２ＳＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＣｕＢｒ２、ＣｕＩ２、Ｃｕ２Ｓ、ＣｕＳＣＮ、ＣｕＣＮ、ＣｕＣＯ３、Ｃｕ２Ｏ、Ｃｕ（ＯＨ）２、Ｃｕ（ＮＯ３）２、Ｃｕ（ＣｌＯ４）２、Ｃｕ（ＨＣＯ２）２またはＣｕ（ＣＯ２ＣＨ３）２である。組み合わせて使用される金の金属塩の非限定的な例は、ＨＡｕＣｌ４、ＡｕＣｌ、ＡｕＣｌ３、ＨＡｕＣｌ４、ＨＡｕＣｌ４・ａｑ、ＫＡｕＣｌ４、ＬｉＡｕＣｌ４，（ＣＨ３）２ＳＡｕＣｌ、Ｃ３Ｈ９ＡｕＣｌＰ、Ｃ６Ｈ１５ＡｕＣｌＰ、Ｃ１８Ｈ１５ＡｕＣｌＰ、Ｃ８Ｈ１１ＡｕＣｌＰ、Ｃ５Ｈ５ＡｕＣｌ３Ｎ、（Ｃ４Ｈ９）３ＰＡｕＣｌ、Ｃ２７Ｈ３６ＡｕＣｌＮ２、Ｃ２１Ｈ１２ＡｕＣｌＦ９Ｐ、Ｃ２０Ｈ２７ＡｕＣｌＰ、Ｃ３３Ｈ４９ＡｕＣｌＰ、Ｃ４２Ｈ６３ＡｕＣｌＯ３Ｐ、Ｃ２１Ｈ２４ＡｕＣｌＮ２、Ｃ３５Ｈ４９ＡｕＦ６ＮＯ４ＰＳ２または（Ｃ２０Ｈ１５ＡｕＦ６ＮＯ４ＰＳ２）・２Ｃ７Ｈ８である。
【００３４】
工程ｃ）で得られる混合物を還元するために工程ｃ）で使用される還元系または還元剤の非限定的な例は、ＮａＢＨ４、ＤＩＢＡＨ、ＬｉＡｌＨ４、Ｎ２Ｈ４またはＳｎＣｌ２およびまた、次亜リン酸ナトリウム、アミン、糖、有機酸、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ＵＶ−ＶＩＳ照射、超音波および光還元などのより温和な還元剤であり得る。
【００３５】
本方法の工程ｂ）およびｃ）の後、「ＡＱＣを含んでなるナノソーム」が形成される。これらの「ＡＱＣを含んでなるナノソーム」は、それらの内腔に、少なくとも２つの異なるサイズのＡＱＣ、すなわち、ＭｎおよびＭ’ｎ’を含んでなる、すなわち、封入されている。
【００３６】
これらの「ＡＱＣを含んでなるナノソーム」の特定の例は、これらのナノシステム内部の金粒子合成を記載しているGaillard, C., Journal of Colloid and Interface Science, 2209, 337, 2, 610-613に記載されている。
【００３７】
ナノソームを崩壊させる工程は、従前に合成されたナノソームの不安定化プロセスである。この工程は、種々の機構によって達成できる。好ましい実施形態では、ナノソームを崩壊させる、またはナノソームを不安定化させる工程は超遠心分離の手段によりなされるが、熱処理またはｐＨ変化など、当技術分野で公知の他の任意の手段もナノソームの崩壊に有用であり得る。電荷移動機構は、ナノソームを崩壊させる工程中に生じる。したがって、ナノソームが不安定化され、一般式（Ｉ）の電荷移動複合体が形成される。
【００３８】
それらの内腔に、少なくとも２つの異なる大きさのＡＱＣ、すなわち、ＭｎおよびＭ’ｎ’を含んでなるナノソーム以外の他のナノシステムを崩壊させることにより、本発明で使用される電荷移動複合体を得ることも可能である。
【００３９】
用語「ナノシステム」は、１層または２層の両親媒性分子により形成される球状ナノ超分子構造を意味し、ここで、前記両親媒性分子は、ナノシステムの内部にナノキャビティーを形成する。特に、ナノシステム(nansosytem)は、およそ２０ｎｍ以下、好ましくは１８ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下の外径を有する。ナノシステムの内部は１０ｎｍ以下、好ましくはおよそ５ｎｍ以下、より好ましくは０．８〜４ｎｍの内径を有する少なくとも１つのナノキャビティーを含んでなる。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径はおよそ１．５〜１．８ｎｍである。ナノシステムの非限定的な例はナノソームであるが、ミセル、逆ミセル、ナノエマルションまたはマイクロエマルションでもある。好ましい実施形態では、ナノシステムはナノソームである。
【００４０】
「球状」とは、それが球に形が似た幾何学的立体図形を有することを意味する。
【００４１】
ナノシステムを形成する両親媒性分子は、同じであっても異なっていてもよく、好ましくは、２つの異なるタイプの分子であり、各分子は親水性と親油性の両特性を有する。
【００４２】
親油性の特性は、一般に炭化水素部分、例えば、ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）ｎ−（３０＞ｎ＞２、好ましくは２０＞ｎ＞１０）の形態の脂肪鎖である基によって与えられる。
【００４３】
親水性の特性は、親水基によって与えられる。親水基は、荷電基であっても極性非荷電基であってもよい。荷電基は陰イオン基から選択され、好ましくは、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩およびリン酸塩からなる群から選択される。極性非電荷基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲおよび−ＮＲ−（ここで、Ｒは、短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機アルキル基、好ましくは、メチル、エチルまたはプロピル基を表す）からなる群から選択される。
【００４４】
両親媒性分子は、１つの脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖とそれに結合された１つの親水基、または脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の各末端に１つずつ結合された２つの親水基を有し得る。
【００４５】
用語「ミセル」は、両親媒性分子凝集体意味する。水性媒体中で、この分子凝集体の親油性ドメインはミセルの内部に向かって配向し、親水性ドメインは媒体と接している。「逆ミセル」では、分子は、親油性領域が外部に、親水性領域が内部に曝されるように構成される。当技術分野の現状では、用語「マイクロエマルション」はまた、「逆ミセル」を意味しても使用され、すなわち、「マイクロエマルション」は、「逆ミセル」の特定の実施形態である。用語「マイクロエマルション」は、ナノメートルサイズの液滴により形成される熱力学的に安定な、少なくとも３つの成分（水、油性および両親媒性化合物として一般に知られる有機溶媒）の単相の系を意味する。限定されるものではないが、本発明に関しては、水滴が有機媒体中に分散されている油中水型マイクロエマルションの使用が、特に注目される。これらの油中水型マイクロエマルションとしては、水滴内に、例えば、ラジカル光開始剤などの何らかの開始剤を導入する手段によって重合されるアクリルモノマー、例えば、アクリルアミドまたは１，６−ヘキサンジオールジアクリレートを含有するマイクロエマルションに関する重合マイクロエマルションの使用も、その安定性のために注目される。したがって、マイクロエマルションの液滴がより耐性となり得る。
【００４６】
用語「ナノエマルション」は、熱力学的に不安定であるが化学的または物理的プロセスによって一時的に安定化され、ナノメートル液滴により形成される、少なくとも３成分（水、有機溶媒および安定化化合物）の２相系を意味する。ナノメートル液滴の形成は、当技術分野の現状で知られているエマルションからナノエマルションを区別するというだけであり、したがって、用語「ナノエマルション」は一般に、液滴がナノメートルサイズであるエマルションを意味する。
【００４７】
特定の実施形態では、ナノシステムは、ナノソーム、ミセルおよび逆ミセルからなる群から選択され、好ましくは、ナノシステムはナノソームである。
【００４８】
ナノシステムが逆ミセルである特定の実施形態では、逆ミセルは、少なくとも２つの異なる界面活性剤を含んでなり、少なくとも１つは、その極性基としてチオール基またはチオエーテル基を含んでなる。より詳しい実施形態では、少なくとも２つの界面活性剤は、アルコールエトキシレートおよびω−メルカプト酸である。
【００４９】
ナノシステムの内腔は閉じられている。前述のように、前記内腔の内径は、１０ｎｍ以下、好ましくはおよそ５ｎｍ以下であり、より好ましくは、前記内腔の内径はおよそ０．８〜４ｎｍである。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティーの直径は、およそ１．５〜１．８ｎｍである。
【００５０】
クラスターの励起および発光波長の概算見積りは、Ｊｅｌｌｉｕｍモデル（例えば、J. Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, B. Bhushan, Springer Verlag編, 2011参照）の手段による概算によって決定することができる。このモデルは、どちらかといえば概算の様式で、クラスターの禁制エネルギーバンドギャップ、したがって、その発光バンドギャップの位置を予測する。クラスターの励起バンドギャップは、次に、発光バンドギャップから、特定の大きさのクラスターにおけるストークスシフトがおよそ５０〜１００ｎｍであることを考慮して予測することができる。下表の表１は、この様式に従うＡｕまたはＡｇのＡＱＣに関する理論データを示し、すなわち、およその励起波長λｅｘｃ．および発光波長λｅｍ．は、前記Ｊｅｌｌｉｕｍモデル：Ｅｅｍ＝ＥＦ／Ｎ１／３（ここで、Ｅｅｍ＝発光エネルギー；Ｎ＝ＡＱＣの原子の数；およびＥＦ＝金および銀では同じおよそ５．５ｅＶであるＦｅｒｍｉレベル）の手段によってＡｕまたはＡｇのＡＱＣにおいて±５０ｎｍの誤差を用いて算出したものである。
【００５１】
【表１】
2016503158.tif 000003
【００５２】
これらの値はまた、実際に、ナノシステムがナノシステムの内腔においてＯＨおよびＳＨ基と他の配位子との交換反応を行わせるように作製される場合には変更可能である。限定されるものではないが、交換される配位子は、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−から選択することができ、ここで、Ｒは、ナノソームを形成し得る短鎖有機基を表す。
【００５３】
言い換えれば、特定の励起波長および発光波長を得るために使用されるクラスターのタイプは、上記の表から決定することができる。よって、例えば、励起波長３００ｎｍ、発光波長６００ｎｍおよびストークスシフト３００ｎｍの系を得るためには、下記のクラスターサイズが選択されるべきである：
・励起クラスター（「供与体」、Ｍｎ）：Ｍ３／Ｍ５、
・発光クラスター（「受容体」、Ｍ’ｎ’）：Ｍ’１２／Ｍ’２０。
【００５４】
本発明の範囲内で、用語「遷移金属の組合せ」は、少なくとも２つの異なる遷移金属の原子を有するＡＱＣ、ならびにある単一の遷移金属のＡＱＣが、異なる大きさの少なくとも２つのＡＱＣが、同じ遷移金属を有するＡＱＣ、異なる遷移金属を有するＡＱＣ、または同じもしくは異なる二金属の組合せを有するＡＱＣとなり得るように、第１のものとは異なる別の遷移金属のＡＱＣの存在下に存在する場合を意味する。
【００５５】
用語「検出する(detect)」、「検出(detecting)」などは、定量的ならびに定性的測定を包含する。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＦＩＳＨ」は、染色体上の特定のＤＮＡ配列とハイブリダイズする標識核酸プローブの使用を介して、染色体上の特定のＤＮＡ配列を検出または位置決定するための方法を意味する。
【００５７】
「固定化」とは、例えば、あるデバイスの表面に直接または間接的に結合されることを意味し、共有結合または非共有的結合（例えば、水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力、または疎水性相互作用）による結合を含む。「翻訳後修飾」とは、その翻訳後のタンパク質の化学的修飾を意味する。これには、限定されるものではないが、官能基の付加（例えば、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、メチル化、ホルミル化、酸化、またはビオチン化）、タンパク質またはペプチドの付加（例えば、ユビキチン化）、アミノ酸の化学的性質の変更（例えば、脱アミノ化または脱メチル化）、および構造変化（例えば、ジスルフィド架橋またはタンパク質分解性切断）が含まれる。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「免疫細胞化学（ＩＣＣ）」としても知られる用語「免疫組織化学（ＩＨＣ）」は、細胞に対して適用される場合、病理診断におけるツールを意味し、ここで、モノクローナル抗体のパネルが、未分化新生物の示差診断において（例えば、リンパ腫、癌腫および肉腫を診断するため）、ある腫瘍種および他の疾患に特異的なマーカーを明らかにするため、悪性リンパ腫を診断および表現型決定のため、ならびにウイルス抗原、癌タンパク質、ホルモン受容体、および増殖関連核タンパク質の存在を証明するために使用可能である。
【００５９】
用語「キット」は、本明細書で使用する場合、輸送および保存を可能とするように包装された、本発明の方法を実施するために必要な種々の試薬を含有する製品を意味する。キットの成分を包装するのに好適な材料としては、結晶、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、ボトル、バイアル、紙、または外被が含まれる。
【００６０】
文字「ｎ」および「ｎ’」は、各ＡＱＣの遷移金属原子数を意味する。上記で述べたように、ｎはｎ’（ｎ＜ｎ’）より小さい。好ましくは、ｎとｎ’との最小の差は、金属原子５個である。好ましい実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子であり、特定の実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜２５原子であり、別の実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜１５である。
【００６１】
電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子であり、好ましくは、少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子は、ω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子から選択され、ここで、ｍおよびｐは２〜３０の値を有し、好ましくは、ｍおよびｐは１０〜２０の値を有する。特定の実施形態では、ｍおよびｐは、１５の値を有する。別の特定の実施形態では、ｍおよびｐは１１の値を有する。
【００６２】
ｍとｐの値は、異なっていても同じであってもよい。ｍとｐが異なっている場合、それらの間の差は、炭素６個未満、好ましくは、ｍとｐとの値の差は１〜４である。好ましい実施形態では、ｍとｐは同じである。少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子から選択される場合、酸基−ＣＯＯＨ（または対応する酸の塩が使用される場合には−ＣＯＯ−）はナノ化合物の外面に向けられ、−ＯＨ基および−ＳＨ基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−に向けられる。
【００６３】
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−ＯＨ基、またはメルカプト−ＳＨ基以外の官能基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−を有し、ここで、Ｒは、ＡＱＣまたはイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子のヒドロキシル−ＯＨまたはメルカプト−ＳＨ基をそれらもまたＡＱＣの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「核酸プローブ」は、染色体上の特定のＤＮＡ配列を認識してそれとハイブリダイズする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど）配列を意味する。
【００６５】
用語「スペーシング基」または「スペーサー」は、２つ以上の部分構造を接続する化学構造を意味する。これらのスペーサーは、本出願の下記で列挙する。スペーシング基の原子およびスペーシング基内の鎖の原子はそれら自体、化学結合によって接続される。好ましいスペーサーとしては、直鎖または分岐型、飽和または不飽和型の炭素鎖である。これらの炭素鎖はまた、鎖内または鎖の末端に１以上のヘテロ原子も含んでよい。「ヘテロ原子」とは、酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される。スペーシング基はまた、鎖の一部または鎖の原子の１つにある置換として環式基または芳香族基を含んでもよい。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、当技術分野で理解されているようなその種々の形態のデオキシリボ核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離された核酸分子、ベクターＤＮＡ、および染色体ＤＮＡを意味して互換的に使用される。「核酸」は、任意の形態のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。単離された核酸分子の例としては、限定されるものではないが、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞内で維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子が含まれる。一般に、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてその核酸に自然状態で隣接している配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、「単離された」ＤＮＡ分子などの核酸分子は一般に、組換え技術により作出された場合には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学前駆体もしくは化学的に合成された場合には他の化学物質を含まない。
【００６７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味して互換的に使用される。ポリマーは、直鎖、環式、または分岐であり得る。ポリマーは修飾アミノ酸を含んでいてもよいし、非アミノ酸が挿入されていてもよい。用語は、例えば、スルホン化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、トランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、例えば、アルギニン化、ユビキチン化、または標識成分のコンジュゲーションなどの他の任意の操作を介して修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用する場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤ型またはＬ型両方の光学異性体、およびアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸を意味する。
【００６８】
用語「保護基」は、本明細書で使用する場合、分子内の反応性基に結合された場合にその反応性をマスク、低減または抑制する原子の群を意味する。
【００６９】
用語「反応性基」は、本明細書で使用する場合、別の化学基と反応して共有結合を形成し得る、すなわち、好適な反応条件下で共有結合的反応性がある、一般に、別の物質に結合点を供する基を意味する。反応性基は一般に、求核試薬、求電子物質および光活性化基が含まれる。反応性基の例としては、限定されるものではないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハライド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、硝石（nitre）、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、硫酸、アセタール、ケタール、アンハイドライド、サルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、シュードウレア、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が含まれる。反応性官能基にはまた、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを作製するために使用されるものも含まれる。これらの官能基のそれぞれを調製する方法は当技術分野で周知であり、それらの特定の目的への適用または特定の目的に向けた改変は当業者の能力の範囲内である（例えば、Sandler and Karo, eds., Organic Functional Group Preparations. Academic Press, San Diego, 1989参照）。
【００７０】
用語「サンプル」、本明細書で使用する場合、その最も広い意味で使用され、検出される生体分子を含有するサンプルを意味する。いくつかの実施形態では、サンプルは、土壌、水、もしくは空気などの環境サンプルであるか、または廃水流、水源、供給ライン、または製造ロットから採取されたものなどの工業源からのサンプルである。別の実施形態では、サンプルは、生物サンプルである。
【００７１】
本発明で使用する場合、「特異的結合」という表現は、第１の分子が第２の分子に、その２分子間の三次元構造の相補性の存在によって、非特異的結合よりも実質的に高い親和性で特異的に結合する能力を意味し、その結果、前記第１の分子と第２の分子との間の結合は好ましくは、反応混合物中に存在する他の分子に対する前記分子のいずれの結合にも先だって起こる。前記結合から生じた複合体が１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有する場合に、２分子の結合に高い親和性が存在すると理解される。
【００７２】
用語「ストレプトアビジン」は、本明細書で使用する場合、ストレプトミセス・アビディニイ(Streptomyces avidinii)（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ０００８４．１）由来のタンパク質、ならびにアビジンと同様に定義されるストレプトアビジンのオーソログ、ホモログおよびフラグメントに相当する。
【００７３】
本明細書で定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、一般に、（１）低いイオン強度および高い洗浄温度、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を使用するか；（２）ハイブリダイゼーションの際に、ホルムアミド、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤を、４２℃で７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに使用するか；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を、４２℃、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中での洗浄と、その後の５５℃℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄とともに使用する。中等度のストリンジェント条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定することができ、上記のものよりも低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度のストリンジェント条件の例は、３７℃、一晩の、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中でのインキュベーションと、その後のフィルターの約３７〜５０℃、１×ＳＳＣ中での洗浄である。当業者ならば、必要に応じ、プローブ長などの因子に適合させるために温度、イオン強度などをどのように調節すればよいかが分かるであろう。いくつかの実施形態では、生体分子の検出のために結合相手として使用されるヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２００などのヌクレオチド長であり得る。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、そのいずれかの誘導体、およびそのいずれかの組合せを含んでなり得る。オリゴヌクレオチドの組成によらず、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と等価なオリゴヌクレオチドの各単位が「ヌクレオチド」と呼ばれる。
【００７４】
用語「タグ」、本明細書で使用する場合、特異的結合性分子が入手可能であり、したがって、前記タグを有するポリペプチドの検出／精製を可能とするいずれのアミノ酸配列にも関する。
【００７５】
用語「ω−ヒドロキシ酸」、本明細書で使用する場合、一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ（式中、ｍは２〜３０の値を有する）を有する化合物を意味する。
【００７６】
用語「ω−メルカプト酸」は、本明細書で使用する場合、一般式ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（式中、ｍは２〜３０の値を有する）を有する化合物を意味する。
【００７７】
発明の詳細な説明
ＡＱＣ−ＣＴＣとビオチン結合性分子の非共有結合複合体
本発明者らは、ストレプトアビジンがＡＱＣ−ＣＴＣと相互作用してそれらの蛍光強度の増強をもたらすこと、およびこの結合はビオチンまたはビオチン化分子の存在下で逆転させて、それにより、ＡＱＣ−ＣＴＣおよびストレプトアビジンを含んでなる複合体の蛍光強度の低下をもたらし得ることを見出した。
【００７８】
よって、第１の態様において、本発明は、ビオチン結合性分子と、一般式（Ｉ）の少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）としてのＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体：
Ｍｎ＋Ｍ’ｎ´−      （Ｉ）
［式中、
金属ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は、同じまたは異なる金属であり、
Ｍｎは、その酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、
Ｍ’ｎ’は、その還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、
Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、
ｎおよびｎ’はそれぞれ、ＭおよびＭ’の金属原子数であり、かつ、
ｎはｎ’より小さい］
とを含有し、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない複合体に関する。
【００７９】
少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）の電荷移動複合体、特に、有機配位子をさらに含んでなる電荷移動複合体（ここで、前記有機配位子は、原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸などの両親媒性分子である）は、下記の工程：
ａ）ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸とを水性媒体中、塩基の存在下で混合することによりナノソームを作製する工程、
ｂ）工程ａ）で作製された混合物に少なくとも１つの金属塩を添加する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を還元する工程、および
ｄ）工程ｃ）で得られた混合物中に存在するナノソームを崩壊させる工程
を含んでなる。
【００８０】
用語「ナノソーム」は、本発明の範囲内で、人工的に作製されたナノメートルサイズの小胞に関する。したがって、用語「ナノソーム」は、脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の各末端の一方に、または脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖の後ろから３番目のχ、後ろから２番目のψの位置に結合された２つの親水基を有する一層の両親媒性分子（例えば、脂質）により形成された球状のナノメートル超分子構造を意味する。
【００８１】
本発明のナノソームの前記単層を形成する両親媒性分子は、
・脂肪鎖の一末端における、小胞の外面にある例えばカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、カルボン酸基（ＣＯＯ−）またはリン酸基（ＰＯ４−）などの親水基および
・脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖の後ろから３番目のχ、後ろから２番目のψの位置における、または脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の最後のωの位置における、例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、または−ＮＲ−などの基での置換（ここで、Ｒは、脂肪鎖の他の末端においてまたは前記脂肪鎖の親水基に対する最終的な位置において、小胞の内部に向かって配置されるナノソームを形成し得る、短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表し、前記基は、１０ｎｍ以下、好ましくはおよそ５ｎｍ以下、より好ましくは０．８〜４ｎｍの内径を有するナノキャビティーを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径は、およそ１．５〜１．８ｎｍである）
を含んでなる。
【００８２】
好ましい実施形態では、用語「ナノソーム」は、ω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸により形成される球状ナノ超分子構造を意味する。この特定の実施形態では、ナノソームは、上記で定義されるω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）を含んでなる。ナノソーム中に存在するω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸は、酸基−ＣＯＯＨ、（または対応する酸の塩が使用される場合には−ＣＯＯ−）をナノシステム、すなわち、ナノソームの外面に向け、かつ、−ＯＨおよび−ＳＨ基をナノソームの内腔を形成している内部に向けた、球状単層を形成しており、その結果、２つのおよその同心球が形成され、または文献で呼称されているように脂肪酸「ｂｏｌａ」の形態となる。この球状単層は、およそ２〜１０ｎｍ、好ましくはおよそ５ｎｍの厚さを有し得る。
【００８３】
ナノソームの内腔は閉じられている。前記内腔の内径は１０ｎｍ以下、好ましくはおよそ５ｎｍ以下であり、より好ましくは、前記内腔の内径はおよそ０．８〜４ｎｍである。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティーの直径は、およそ１．５〜１．８ｎｍである。ナノソームのこの特定の実施形態では、前記ナノキャビティーは、ヒドロキシル−ＯＨ、およびメルカプト−ＳＨ基により形成されるが、これらの官能基を、金属とも相互作用する−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、ナノソームを形成し得る短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表す）などの他のものに交換することも可能である。
【００８４】
ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸を混合することによりナノソームを調製する工程ａ）における塩基として、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクチルアンモニウム、水酸化トリエチルベンジルアンモニウム、水酸化トリ−ｎ−オクチルメチルアンモニウム、水酸化トリメチルデシルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウムまたは対イオンなどの嵩のある基を有する他の任意の水酸化物、好ましくは、水酸化テトラブチルアンモニウムを使用することができる。
【００８５】
工程ｂ）では、遷移金属の金属塩またはそれらの組合せが使用可能である。金属塩の非限定的な例は、遷移金属の硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、リン酸塩、水酸化塩、シアン酸塩、カルボン酸塩、チオリンゴ酸塩、チオグルコサート(thioglucosates)である。単独の金属塩としてまたは他の金属塩と組み合わせて使用されるこれらの金属塩の例は、ＡｇＮＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＡｇ、Ａｇ３ＡｓＯ４、ＡｇＢｒＯ３、ＡｇＢｒ、Ａｇ２ＣＯ３、ＡｇＣｌＯ３、ＡｇＣｌ、ＡｇＣｒＯ４、ＡｇＯＣＮ、ＡｇＩＯ３、ＡｇＩ、Ａｇ２Ｏ、ＡｇＣｌＯ４、Ａｇ３ＰＯ４、Ａｇ２ＳＯ４、Ａｇ２Ｓ、Ａｇ２ＳＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＣｕＢｒ２、ＣｕＩ２、Ｃｕ２Ｓ、ＣｕＳＣＮ、ＣｕＣＮ、ＣｕＣＯ３、Ｃｕ２Ｏ、Ｃｕ（ＯＨ）２、Ｃｕ（ＮＯ３）２、Ｃｕ（ＣｌＯ４）２、Ｃｕ（ＨＣＯ２）２またはＣｕ（ＣＯ２ＣＨ３）２である。組み合わせて使用される金の金属塩の非限定的な例は、ＨＡｕＣｌ４、ＡｕＣｌ、ＡｕＣｌ３、ＨＡｕＣｌ４、ＨＡｕＣｌ４・ａｑ、ＫＡｕＣｌ４、ＬｉＡｕＣｌ４，（ＣＨ３）２ＳＡｕＣｌ、Ｃ３Ｈ９ＡｕＣｌＰ、Ｃ６Ｈ１５ＡｕＣｌＰ、Ｃ１８Ｈ１５ＡｕＣｌＰ、Ｃ８Ｈ１１ＡｕＣｌＰ、Ｃ５Ｈ５ＡｕＣｌ３Ｎ、（Ｃ４Ｈ９）３ＰＡｕＣｌ、Ｃ２７Ｈ３６ＡｕＣｌＮ２、Ｃ２１Ｈ１２ＡｕＣｌＦ９Ｐ、Ｃ２０Ｈ２７ＡｕＣｌＰ、Ｃ３３Ｈ４９ＡｕＣｌＰ、Ｃ４２Ｈ６３ＡｕＣｌＯ３Ｐ、Ｃ２１Ｈ２４ＡｕＣｌＮ２、Ｃ３５Ｈ４９ＡｕＦ６ＮＯ４ＰＳ２または（Ｃ２０Ｈ１５ＡｕＦ６ＮＯ４ＰＳ２）・２Ｃ７Ｈ８である。
【００８６】
工程ｃ）で得られる混合物を還元するために工程ｃ）で使用される還元系または還元剤の非限定的な例は、ＮａＢＨ４、ＤＩＢＡＨ、ＬｉＡｌＨ４、Ｎ２Ｈ４またはＳｎＣｌ２およびまた、次亜リン酸ナトリウム、アミン、糖、有機酸、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ＵＶ−ＶＩＳ照射、超音波および光還元などのより温和な還元剤であり得る。
【００８７】
本方法の工程ｂ）およびｃ）の後、「ＡＱＣを含んでなるナノソーム」が形成される。これらの「ＡＱＣを含んでなるナノソーム」は、それらの内腔に、少なくとも２つの異なるサイズのＡＱＣ、すなわち、ＭｎおよびＭ’ｎ’を含んでなる、すなわち、封入されている。
【００８８】
これらの「ＡＱＣを含んでなるナノソーム」の特定の例は、これらのナノシステム内部の金粒子合成を記載しているGaillard, C., Journal of Colloid and Interface Science, 2209, 337, 2, 610-613に記載されている。
【００８９】
ナノソームを崩壊させる工程は、従前に合成されたナノソームの不安定化プロセスである。この工程は、種々の機構によって達成できる。好ましい実施形態では、ナノソームを崩壊させる、またはナノソームを不安定化させる工程は超遠心分離の手段によりなされるが、熱処理またはｐＨ変化など、当技術分野で公知の他の任意の手段もナノソームの崩壊に有用であり得る。電荷移動機構は、ナノソームを崩壊させる工程中に生じる。したがって、ナノソームが不安定化され、一般式（Ｉ）の電荷移動複合体が形成される。
【００９０】
一実施形態では、金属性ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は遷移金属またはそれらの組合せから選択され、好ましくは、遷移金属はＡｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、それらはＡｕ、Ａｇ、Ｃｕおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、遷移金属はＡｕ、Ａｇおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００９１】
蛍光の励起波長および発光波長はＡＱＣのサイズに依存するので、必要なサイズのＡＱＣの形成を指定することにより、励起波長および発光波長を選択することができる。
【００９２】
好ましい実施形態では、少なくとも２つのＡＱＣとしてのＭｎとＭ’ｎ’との間で１個の電子だけが移動し、したがって、イオン形態Ｍｎ＋、すなわち、Ｍｎの酸化形態、およびＭ’ｎ’−、すなわち、Ｍ’ｎ’の還元形態が生じ、ここで、「＋」は正電荷であり、「−」は負電荷である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ｎおよびｎ’は、２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の金属原子数である。いくつかの実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子である。
【００９４】
さらなる実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子、または５〜２５原子である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＣＴＣは、原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、アビジン、ストレプトアビジン、または実質的にビオチン結合能を保有し、ＡＱＣ−ＣＴＣの蛍光発光パラメーターの少なくとも１つに変化をもたらす様式でＡＱＣ−ＣＴＣと相互作用するその任意の変異体である。アビジンまたはストレプトアビジン類似体または変異体がそれらのビオチン結合能を保有しているかどうかを検出するための方法は当技術分野で広く知られており、例えば、光ファイバーのチップに結合された一層の分子がその分子層から反射された白色光に干渉縞を作り出すという、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）に基づくＷＯ２０１２０５８６３５に記載の方法が含まれる。光ファイバーのチップに結合された分子の数の変化は、干渉縞に測定可能なシフトを生じる。この波長のシフトは、分子層の厚さの直接的尺度である。さらに、このシフトは実時間で測定できることから、詳細は述べないが、会合速度および解離速度を決定することができる。
【００９７】
あるアビジンまたはストレプトアビジン変異体がＡＱＣ−の蛍光発光のパラメーターの少なくとも１つに変化をもたらす様式でＡＱＣ−ＣＴＣと相互作用するかどうかを決定するために好適な方法も当業者に利用可能であり、例えば、ＡＱＣ−ＣＴＣをストレプトアビジン変異体と接触させ、蛍光強度の変化（増強）を判定する、本出願の実施例１に記載の方法が含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子はストレプトアビジンであり、またはそれぞれ天然ストレプトアビジンまたはアビジンの結合親和性の少なくとも５０パーセント以上といったビオチンに対する実質的結合活性を保持するアビジンフラグメントも使用可能である。好ましくは、ビオチンに対するアビジン変異体の親和性は、少なくとも１０１５Ｍ−１、１０１４Ｍ−１、１０１３Ｍ−１、１０１２Ｍ-１、１０１０Ｍ−１または１０９Ｍ−１である。
【００９９】
便宜上、本明細書において、用語「アビジン」および「ストレプトアビジン」は、本明細書で使用する場合、ビオチン結合能およびＡＱＣ−ＣＴＣによる蛍光発光に対する効果が実質的に保存されている、これらの結合対メンバーのビオチン結合フラグメント、突然変異体、およびコアフォームを包含するものとする。アビジンおよびストレプトアビジンは、商業的供給者から入手可能である。さらに、ストレプトアビジンおよびアビジンをコードする核酸配列、ならびにストレプトアビジンおよびアビジンアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６５０８２；Ｘ０３５９１；ＮＭ−−２０５３２０；Ｘ０５３４３；Ｚ２１６１１；およびＺ２１５５４に見出すことができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明における使用に好適なアビジンおよびストレプトアビジン変異体としては、限定されるものではないが、
・「コアストレプトアビジン」、すなわち、ストレプトアビジン残基１３〜１３８、１４〜１３８、１３〜１３９および１４〜１３９を含み得る全長ストレプトアビジンポリペプチドの末端切断型。例えば、Pahler et al., (J Biol Chem 1987:262:13933-37)参照、
・ビオチンとの強い結合を保持するストレプトアビジンおよびアビジンの末端切断型（例えば、Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09)（コアストレプトアビジン変異体１６〜１３３および１４〜１３８を記載）、米国特許第６，０２２，９５１号参照）、
・実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム。Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011参照、
・潜在的Ｔ細胞エピトープまたはリンパ球エピトープを除去するように部位特異的突然変異誘発により改変された突然変異体などの免疫原性が低減された突然変異体。Meyer et al., Protein Sci 2001;10:491-503参照、
・実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するアビジンの突然変異体およびアビジンのコアフォームを使用可能である。Hiller et al., J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80参照、
・グリコシル化の完全または部分的修飾から生じるものなどのアビジンの化学修飾から生じる変異体およびそれらのフラグメント、ならびにニュートラアビジンとして知られる完全に脱グリコシル化されたアビジン変異体、
・ＷＯ０５０４７３１７Ａ１に記載されているようなアビジン突然変異体、
・ＷＯ０６０４５８９１に記載されているようなアビジン様タンパク質、
・ＷＯ０１９８３４９に記載されているような組換えアビジン、
・ＷＯ００２７８１４に記載されているようなアビジン変異体、
・ＷＯ０６０８４３８８に記載されているようなモノマーストレプトアビジン、
・ＷＯ０６０５８２２６に記載されているような修飾ストレプトアビジンダイマー、
・ＷＯ０４０１８５０９に記載されているようなビオチン結合能を有するタンパク質、
・ＷＯ９８４０３９６に記載されているようなビオチンに対してより高い親和性を有するストレプトアビジン、
・ＷＯ９６４０７６１に記載されているような修飾ストレプトアビジンおよびアビジン  分子、
・ＷＯ９７１１１８３に記載されているようなストレプトアビジン突然変異体、
・ＷＯ９６２４６０６に記載されているような親和性が改変されたストレプトアビジン
が含まれる。
【０１０１】
エクストラアビジン(Extravidin)（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ニュートラアビジン（NeutrAvidin）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびニュートラライト(NeutraLite)（Ｂｅｌｏｖｏ）などの種々のアビジン変異体が市販されている。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、ストレプトアビジンの機能的に等価な変異体である。本明細書で使用される場合、ストレプトアビジンの「機能的に等価な変異体」は、ストレプトアビジンのビオチン結合能を実質的に保有するポリペプチドと理解される。ストレプトアビジンＶの機能的に等価な変異体には、ストレプトアビジン(strpetavidin)とそれらの全長にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の類似性または同一性を示すポリペプチドが含まれる。
【０１０３】
用語「非共有結合的に結合される」とは、本明細書で使用する場合、ビオチン結合性分子および電荷移動複合体が、ＣＴＣ−ＡＱＣの原子とビオチン結合性分子の原子との間に共有結合を含まない分子間力により相互作用することを示すために使用される。いくつかの実施形態では、ＣＴＣ−ＡＱＣおよびビオチン結合性分子は、水素結合、疎水性相互作用、イオン結合またはそれらの組合せにより連結される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＣＴＣは、それに結合された有機配位子をさらに含んでなる。ＣＴＣに結合され得る「有機配位子」は少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子であり、好ましくは、前記少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子は、ω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）配位子およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子から選択され、ここで、ｍおよびｐは２〜３０の値を有し、好ましくは、ｍおよびｐは１０〜２０の値を有する。特定の実施形態では、ｍおよびｐは１５の値を有する。別の特定の実施形態では、ｍおよびｐは１１の値を有する。ｍとｐの値は、異なっていても同じであってもよい。ｍとｐが異なる場合、それらの間の差は炭素６個未満であり、好ましくは、ｍとｐとの値の差は１〜４である。好ましい実施形態では、ｍとｐは同じである。少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）配位子およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子から選択される場合、酸基−ＣＯＯＨ（または対応する酸の塩が使用される場合には−ＣＯＯ−）はナノ化合物の外面に向けられ、−ＯＨ基および−ＳＨ基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−に向けられる。
【０１０５】
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−ＯＨ基、またはメルカプト−ＳＨ基以外の官能基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−を有し、ここで、Ｒは、ＡＱＣまたはイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子のヒドロキシル−ＯＨまたはメルカプト−ＳＨ基をそれらもまたＡＱＣの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子がストレプトアビジンである場合、本発明による複合体は、４つのストレプトアビジンモノマーを含有し、可変数のＣＴＣ−ＡＱＣを有するホモテトラマーである。いくつかの実施形態では、前記複合体は、ストレプトアビジンのホモテトラマーおよび複合体当たり少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１６、少なくとも２０またはそれを超えるＣＴＣ−ＡＱＣにより形成される。
【０１０７】
ＡＱＣ−ＣＴＣおよびビオチン結合性分子を含んでなるパーツキット
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）少なくとも２つの異なるサイズの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）としてのＭｎおよびＭ’ｎの電荷移動複合体であって、上記で定義される式Ｉを有し、かつ、前記金属ＡＱＣのＭおよびＭ’は同じまたは異なる金属であり、Ｍｎはその酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、Ｍ’ｎ’はその還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−は静電相互作用により結合され、ｎおよびｎ’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
（ｉｉ）ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含んでなるパーツキットに関する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、ストレプトアビジンまたは本発明の複合体に関して言及されるビオチン結合性分子のいずれかである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、金属原子量子クラスターの金属ＭおよびＭは’、遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される。いくつかの実施形態では、金属原子量子クラスターの金属ＭおよびＭ’は、遷移金属Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕおよびそれらの組合せ、より好ましくは、Ａｕ、Ａｇおよびそれらの組合せから独立に選択される。いくつかの実施形態では、ｎおよびｎ’は、２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の値の金属原子数をとる。いくつかの実施形態では、ｎとｎ’との差は、５〜５０原子である。いくつかの実施形態では、電荷移動複合体は、一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ（式中、ｍは２〜３０の値を有する）またはＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（式中、ｍは２〜３の値を有する）を有する原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、ここで、ｍとｐの値およびそれらの値の間の差に関する種々の実施形態は、本発明の複合体に関して記載されている通りである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、キットの成分は個別の容器内に見られる。
【０１１１】
キットの成分を包装するのに好適な材料としては、結晶、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、ボトル、バイアル、紙、または外被などが含まれる。さらに、本発明のキットは、キット内にある種々の成分の同時使用、逐次使用または個別使用に関する説明書を含み得る。前記説明書は、印刷物の形態、または電子保存媒体（磁気ディスク、テープなど）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）などの、対象者が読むことができるように説明書を保存することができる電子支援の形態であり得る。それに加えてまたはその代わりに、媒体は前記説明書を提供するインターネットアドレスを含み得る。
【０１１２】
ＡＱＣ−ＣＴＣを用いたビオチン化分子の検出のための競合アッセイ
本発明者らは、ＡＱＣ−ＣＴＣの蛍光強度がストレプトアビジンの存在下で増強されること、およびこの蛍光の増強がビオチンまたはビオチン化分子の存在下で逆転され、それにより、ＡＱＣ−ＣＴＣの蛍光強度の変化を測定することによってサンプル中のビオチンまたはビオチン化分子の検出を可能とすることを見出した。いずれの理論にも縛られることを望むものではないが、ＡＱＣ−ＣＴＣはビオチン結合性分子と、ＡＱＣ−ＣＴＣにより発せられる蛍光強度の増強をもたらすように相互作用することができると考えられる。この結合はビオチンまたはビオチン類似体の存在下では逆転し、ＡＱＣ−ＣＴＣの発光およびそれらの蛍光の低下をもたらす。
【０１１３】
一態様において、本発明は、サンプル中のビオチン化分子の検出のための方法であって、
（ｉ）前記サンプルと請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体を、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の接触後に、ＡＱＣの励起波長での前記サンプルの励起に応答したＡＱＣによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のＡＱＣにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す方法に関する。
【０１１４】
第１の工程において、ビオチン化分子を含有する可能性のあるサンプルを、ビオチン結合性分子とＣＴＣ−ＡＱＣを含んでなる組成物と接触させる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、金属原子量子クラスターの金属ＭおよびＭ’は、遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される。いくつかの実施形態では、ＭおよびＭ’は、遷移金属Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕおよびそれらの組合せ、より好ましくは、Ａｕ、Ａｇおよびそれらの組合せから独立に選択される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ｎおよびｎ’は、２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の金属原子数である。いくつかの実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＡＱＣ−ＣＴＣは、原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎに結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子は、一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ（式中、ｍは２〜３０の値を有する）またはＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（式中、ｍは２〜３の値を有する）を有し、ここで、ｍとｐの値およびそれらの値の間の差に関する種々の実施形態は、本発明の複合体に関して記載されている通りである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、アビジン、ストレプトアビジン、または実質的にビオチン結合能を保有し、ＡＱＣ−ＣＴＣの蛍光発光パラメーターの少なくとも１つに変化をもたらす様式でＡＱＣ−ＣＴＣと相互作用するその任意の変異体である。アビジンまたはストレプトアビジン類似体または変異体がそれらのビオチン結合能を保有しているかどうかを検出するための方法は当技術分野で広く知られており、例えば、光ファイバーのチップに結合された一層の分子がその分子層から反射された白色光に干渉縞を作り出すという、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）に基づくＷＯ２０１２０５８６３５に記載の方法が含まれる。光ファイバーのチップに結合された分子の数の変化は、干渉縞に測定可能なシフトを生じる。この波長のシフトは、分子層の厚さの直接的尺度である。さらに、このシフトは実時間で測定できることから、会合速度および解離速度を決定することができる。
【０１１９】
あるアビジンまたはストレプトアビジン変異体がＡＱＣ−の蛍光発光のパラメーターの少なくとも１つに変化をもたらす様式でＡＱＣ−ＣＴＣと相互作用するかどうかを決定するために好適な方法も当業者に利用可能であり、例えば、ＡＱＣ−ＣＴＣをストレプトアビジン変異体と接触させ、蛍光強度の変化（増強）を判定する、本出願の実施例１に記載の方法が含まれる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子はストレプトアビジンであり、またはそれぞれ天然ストレプトアビジンまたはアビジンの結合親和性の少なくとも５０パーセント以上といったビオチンに対する実質的結合活性を保持するアビジンフラグメントも使用可能である。好ましくは、ビオチンに対するアビジン変異体の親和性は、少なくとも１０１５Ｍ−１、１０１４Ｍ−１、１０１３Ｍ−１、１０１２Ｍ-１、１０１０Ｍ−１または１０９Ｍ−１である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、「ビオチン結合性分子」は、ＡＱＣ−ＣＴＣとビオチン結合性分子の非共有結合複合体に関して定義される。いくつかの実施形態では、本発明における使用に好適なアビジンおよびストレプトアビジン変異体としては、限定されるものではないが、コアストレプトアビジン、ストレプトアビジンおよびアビジンの末端切断型（例えば、Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09)（コアストレプトアビジン変異体１６〜１３３および１４〜１３８を記載）（米国特許第６，０２２，９５１号）；実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム（Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011参照）；免疫原性が低減されたストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム、例えば、潜在的Ｔ細胞エピトープまたはリンパ球エピトープを除去するように部位特異的突然変異誘発により改変された突然変異体（Meyer et al., Protein Sci 2001;10:491-503参照）；実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するアビジンの突然変異体およびアビジンのコアフォーム（Hiller et al.. J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80参照）；グリコシル化の完全または部分的修飾から生じるものなどのアビジンの化学修飾から生じる変異体およびそれらのフラグメント、ならびにニュートラアビジンとして知られる完全に脱グリコシル化されたアビジン変異体；ＷＯ０５０４７３１７Ａ１に記載されているようなアビジン突然変異体；ＷＯ０６０４５８９１に記載されているようなアビジン様タンパク質；ＷＯ２００１９８３４９に記載されているような組換えアビジン；ＷＯ００２７８１４に記載されているようなアビジン変異体；ＷＯ０６０８４３８８に記載されているようなモノマーストレプトアビジン；ＷＯ０６０５８２２６に記載されているような修飾ストレプトアビジンダイマー、ＷＯ０４０１８５０９に記載されているようなビオチン結合タンパク質、ＷＯ９８４０３９６に記載されているようなビオチンに対してより高い親和性を有するストレプトアビジン；ＷＯ９６４０７６１に記載されているような修飾ストレプトアビジンおよびアビジン分子；ＷＯ９７１１１８３に記載されているようなストレプトアビジン突然変異体；ＷＯ９６２４６０６に記載されているような親和性が改変されたスストレプトアビジンが含まれ、ならびにエクストラアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ニュートラアビジン  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびニュートラライト(NeutraLite)（Ｂｅｌｏｖｏ）などの種々のアビジン変異体が市販されている。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ビオチン化分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、チラミン、多糖、イオン錯化部分、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン／プソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、ポリマー、ポリマー微粒子、生体細胞またはウイルスである。より一般には、基質はペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸である。
【０１２３】
一実施形態では、ビオチン化分子はアミノ酸（保護されているか、またはホスホネート、炭水化物、もしくはＣ１〜Ｃ２５カルボン酸により置換されているものを含む）であるか、またはペプチドもしくはタンパク質などのアミノ酸のポリマーである。ペプチドの好ましいコンジュゲートは、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは、５〜３６個のアミノ酸を含有する。好ましいペプチドとしては、限定されるものではないが、ニューロペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびプロテインキナーゼ基質が含まれる。好ましいタンパク質コンジュゲートとしては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、フィコビリタンパク質およびその他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素、ケモカインおよび増殖因子が含まれる。ある好ましい態様では、複合タンパク質は、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリン、アロフィコシアニンＢ、Ｂ−フィコエリトリン、およびフィコエリトリシアニンなどのフィコビリタンパク質である（例えば、Ｒｏｅｄｅｒｅｒ（１９９８）に対する米国特許第５，７１４，３８６号参照）。
【０１２４】
一実施形態では、生体分子は抗体（完全抗体、抗体フラグメント、および抗体血清などを含む）、アミノ酸、アンギオスタチンまたはエンドスタチン、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン（例えば、アミドビオチン、ビオシチン、デスチオビオチンなど）、血液成分タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノゲン、プラスミノーゲンなど）、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、ＩｇＧ結合タンパク質（例えば、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、Ａ／Ｇタンパク質など）、蛍光タンパク質（例えば、フィコビリタンパク質、エクオリン、緑色蛍光タンパク質など）、増殖因子、ホルモン、レクチン（例えば、コムギ胚芽凝集素、コンカナバリン(conconavalin)Ａなど）、リポ多糖、金属結合タンパク質（例えば、カルモジュリンなど）、微生物またはその一部（例えば、細菌、ウイルス、酵母など）、ニューロペプチドおよび他の生物学的に活性な因子（例えば、デルモルフィン、デルトロピン、エンドモルフィン、エンドルフィン、腫瘍壊死因子など）、非生体微粒子（例えば、磁性流体、金、ポリスチレンなどの粒子）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド毒素（例えば、アパミン、ブンガロトキシン、ファロイジンなど）、リン脂質結合タンパク質（例えば、アネキシンなど）、小分子薬物（例えば、メトトレキサートなど）、構造タンパク質（例えば、アクチン、フィブロネクチン、ラミニン、微小管結合タンパク質、チューブリン(tublin)など）、またはチラミドが含まれる。
【０１２５】
別の実施形態では、生体分子は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸ポリマーである。好ましい核酸ポリマーは、一本鎖もしくは多重鎖の天然もしくは合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるか、あるいはモルホリン誘導体化ホスフェートなどの非通常リンカー、またはＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド核酸が組み込まれている。核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合、それは一般に５０個未満のヌクレオチド、より一般には２５個未満のヌクレオチドを含有する。
【０１２６】
別の実施形態では、生体分子は炭水化物であり、一般に、デキストラン、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロースおよびセルロースなどの多糖類である。あるいは、炭水化物は多糖であり、リポ多糖である。好ましい多糖コンジュゲートは、デキストランコンジュゲート、またはリポ多糖コンジュゲートである。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、ビオチン結合性分子に対してビオチンよりも低い親和性を示すビオチン類似体との複合体として提供される。これらのビオチン類似体は、ビオチンの不在下でビオチン結合性分子と結合することができる。もしサンプルがビオチン化分子を含有すれば、ビオチンはビオチン結合部位に対するそのより高い親和性のためにビオチン結合性分子から前記類似体を解離させ、その結果、オリゴビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用のために発光最大強度に低下を生じる。
【０１２８】
好適なビオチン類似体としては、１×１０−１３Ｍより大きいＫＤでビオチン結合性分子と結合する化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、ビオチン類似体は、１×１０−１３Ｍ〜１×１０−８Ｍ、１×１０−１２Ｍ〜１×１０−９Ｍ、または１×１０−１１Ｍ〜１×１０−９Ｍ、１０−１３Ｍ〜１０−４Ｍ、１０−１２Ｍ〜ｌ０−４、１０−１１Ｍ〜１０−４Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−４Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−４Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−４Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−４Ｍ、または１０−６Ｍ〜１０−４ＭのＫＤでビオチン結合性分子と結合する。本発明における使用のために好適なビオチン類似体としては、限定されるものではないが、ＨＡＢＡ（４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）、２−アジドビオチン、２−アジドビオチニルアデニレート、２−プロパルギル（２−プロピニル）ビオチン、ｓｔｒｅｐタグＩＩペプチド配列（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）（配列番号１）(Schmidt TGM and Skerra A, Nature Prot. 2007, 2, 1528-1535)、２−イミノビオチン、ビオシチン（−ビオチノイル−Ｌ−リシン）、ビオチンエチレンジアミン、ビオチンカダベリン、ビオチン−Ｘカダベリン、ＤＳＢ−Ｘデスチオビオシチン（−デスチオビオチノイル−Ｌ−リシン，）およびＤＳＢ−Ｘビオチンエチレンジアミンおよびクロロアセチル化ビオチン誘導体（ＣＡＢＩ）またはＷＯ２０１２０５８６３５に記載のビオチン類似体が含まれる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、固相支持体に結合される。固相支持体の非限定的な例としては、ポリマー（例えば、アガロース、セファロース、セルロース、ニトロセルロース、アルギネート、テフロン（登録商標）、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、シリコーンなど）、ガラス、シリカ、セラミック、および金属が挙げられる。このような固相支持体は、粒子（微粒子を含む）、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバーストリップ、チューブ、ウェル、プレート（例えば、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートを含むマイクロプレートなど）、繊維、キャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイチップなどのいずれの形態を採ってもよい。いくつかの実施形態では、ビオチン結合部分は、固相支持体の表面に結合されている。いくつかの実施形態では、固相支持体の表面は、多孔質、粒子状、繊維状、織物状、または焼結された表面などの不規則な表面を含んでなる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、固相支持体は、マイクロプレート、マイクロアレイチップ、および微粒子から選択される。いくつかの実施形態では、固相支持体は、少なくとも部分的にポリマーから構成される。いくつかの実施形態では、微粒子固相支持体は、単分散または多分散球状ビーズを含んでなる。単分散微粒子は実質的にサイズが均一である（すなわち、それらの直径の標準偏差は５パーセント未満である）が、多分散微粒子はサイズが多様である。いくつかの実施形態では、微粒子は、全体が同じポリマーで構成されるか、または微粒子のコアが１つのポリマーから構成され、外層（または「シェル」）が別のポリマーから構成されるコア−シェルポリマーである。いくつかの実施形態では、微粒子は磁性である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ビオチン結合部分は、ビオチン結合部分のアミノ基またはスルフヒドリル基を介して固相支持体に結合されている。このようないくつかの実施形態では、固相支持体の表面は、遊離アミン基またはスルフヒドリル基と反応し得る基を含んでなる。このような基の非限定的な例としては、カルボキシ、活性ハロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル、活性化２−置換エチルカルボニル、活性エステル、ビニルスルホニル、ビニルカルボニル、アルデヒド、エポキシなどが挙げられる。このような基には、その基を遊離アミン基またはスルフヒドリル基と反応可能とするために付加的な反応物の使用を必要とするものがある。付加的反応物の非限定的な例としては、臭化シアノゲン、カルボニルジイミダゾール、グルタルアルデヒド、ヒドロキシルスクシンイミド、塩化トシルなどが挙げられる。
【０１３２】
多くの固相支持体が当技術分野で公知であり、当業者ならば、意図される適用に応じて好適な固相支持体を選択することができる。同様に、その表面にビオチン結合部分が結合された固相支持体が市販されていない場合には、当業者は固相表面にビオチン結合部分を付着させる好適な方法を選択することができる。このような方法の例は、例えば、米国特許出願第ＵＳ２００８／０２２００４  Ａｌ号に記載されている。
【０１３３】
接触工程（ｉ）は、ビオチン化分子とビオチン結合性分子の結合に十分な条件下で行われる。
【０１３４】
「結合に十分な条件」という用語は、ビオチン化分子がビオチン結合性分子に結合することができる、例えば、温度、塩濃度、ｐＨおよびタンパク質濃度などの条件を意味する。厳密な結合条件は、アッセイの性質によって異なる。ビオチン化分子とビオチン結合性分子の結合は１００％の結合は必要としないと理解される。いくつかの実施形態では、本質的に１００％が結合され、すなわち、少なくとも５０％が結合され、少なくとも７５％が結合され、少なくとも８０％が結合され、少なくとも８５％が結合され、または少なくとも９５％が結合される。結合のための温度は１５℃から３７℃まで可変であるが、好ましくは、室温〜約３０℃である。結合反応におけるビオチン結合性分子の濃度またはビオチン結合性分子とＡＱＣ−ＣＴＳを含有する複合体の濃度は特に限定されない。いくつかの実施形態では、濃度は様々であるが、好ましくは、約１０ｐＭ〜１０ｎＭであろう。
【０１３５】
本発明による競合アッセイを用いてビオチン化分子の決定のための方法の第２の工程では、工程（ｉ）の接触の結果としてのＡＱＣ−ＣＴＣによる蛍光発光の強度の変化が決定される。当業者には、強度が、ビオチン化分子の存在下で変化する蛍光発光の唯一のパラメーターであることが理解されるであろう。よって、いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）における決定は、発光波長の決定、蛍光の平均寿命の決定または電荷移動複合体の異方性の決定を含まない。
【０１３６】
本発明の方法の第２の工程を行うために、接触工程（ｉ）が行われた後に得られたサンプルに検出可能な光学的応答を得るために選択された波長の光を照射し、光学的応答を検出するための手段で観察する。
【０１３７】
当業者は、ＡＱＣ−ＣＴＣから蛍光発光を得るために必要とされる励起波長が本方法で使用されるＣＴＣの厳密な性質に依存することを理解するであろう。励起波長は、慣例の技術により、当業者によって決定可能である。例えば、クラスターの励起および発光波長の概算見積りは、Ｊｅｌｌｉｕｍモデル（例えば、J. Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, B. Bhushan, Springer Verlag編, 2011参照）の手段による概算によって決定することができる。このモデルは、どちらかといえば概算の様式で、クラスターの禁制エネルギーバンドギャップ、したがって、その発光バンドギャップの位置を予測する。クラスターの励起バンドギャップは、次に、発光バンドギャップから、特定の大きさのクラスターにおけるストークスシフトがおよそ５０〜１００ｎｍであることを考慮して予測することができる。下表の表１は、この様式に従うＡｕまたはＡｇのＡＱＣに関する理論データを示し、すなわち、およその励起波長λｅｘｃ．および発光波長λｅｍ．は、前記Ｊｅｌｌｉｕｍモデル：Ｅｅｍ＝ＥＦ／Ｎ１／３（ここで、Ｅｅｍ＝発光エネルギー；Ｎ＝ＡＱＣの原子の数；およびＥＦ＝金および銀では同じおよそ５．５ｅＶであるＦｅｒｍｉレベル）の手段によってＡｕまたはＡｇのＡＱＣにおいて±５０ｎｍの誤差を用いて算出したものである。
【０１３８】
【表２】
2016503158.tif 000004
【０１３９】
本発明の色素化合物に照射するのに有用な器具としては、限定されるものではないが、ハンドヘルド紫外線灯、水銀アーク灯、キセノン灯、レーザーおよびレーザーダイオードが含まれる。これらの照射光源は場合により、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、スタンダードもしくはミニ蛍光計、またはクロマトグラフィー検出器に内蔵される。
【０１４０】
サンプルにビオチンまたはビオチン化分子が存在すると、ブランクサンプル、すなわち、ビオチンまたはビオチン化分子を欠いたサンプルの存在下でのＣＴＣの蛍光に比べて、またはサンプルと接触させる前の蛍光に比べて、ＣＴＣにより発光される蛍光の強度の低下がもたらされる。
【０１４１】
用語「蛍光の低下」は、本明細書で使用する場合、蛍光の強度の低下を意味する。いくつかの実施形態では、サンプル中の蛍光は、ビオチン化生体分子またはビオチンの存在下、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％（すなわち、蛍光は、ビオチン化分子の不在下での蛍光に比べて（すなわち、ビオチンまたはビオチン化分子を含有しないサンプルにおける蛍光に比べて）またはサンプルの添加前の蛍光発光に比べて検出不能である）低下する。
【０１４２】
光学的応答は、場合により、目視によるか、または以下のデバイス：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー操作デバイス、蛍光計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかの使用によるか、または光電子増倍管などのシグナルを増幅するための手段によって検出される。サンプルがフローサイトメーターを用いて検査される場合、サンプルの検査は場合により、サンプルの一部をそれらの蛍光応答に従って選別することを含む。
【０１４３】
ＡＱＣ−ＣＴＣと生体分子を含んでなるコンジュゲート
上記のＣＴＣ−ＡＱＣは、一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨを有するω−ヒドロキシ酸配位子および一般式ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）を有するω−メルカプト酸の存在に(by the presence or)よってさらに修飾されてよい。有機配位子のヒドロキシル基およびメルカプト基はＡＱＣの金属原子と相互作用する。有機配位子の両親媒性のために、カルボキシル基は複合体の外部に露出し、したがって、タンパク質、核酸およびその他の生体分子とのコンジュゲーションに利用可能である。これらのコンジュゲートは、蛍光プローブ、バイオマーカーまたは造影剤として特に適している。これらのナノシステムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で生物システムに使用可能である。
【０１４４】
別の態様において、本発明は、生体分子と、一般式（Ｉ）の少なくとも２つの異なるサイズの金属ＡＱＣ、ＭｎおよびＭ’ｎ’の電荷移動複合体：
Ｍｎ＋Ｍ’ｎ’−    （Ｉ）
［式中、
金属ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は、同じまたは異なる金属であり、
Ｍｎは、その酸化形態Ｍｎ＋で存在するより小さいＡＱＣであり、
Ｍ’ｎ’は、その還元形態Ｍ’ｎ’−で存在するより大きいＡＱＣであり、
Ｍｎ＋とＭ’ｎ’−とは静電相互作用により結合され、
ｎおよびｎ’はそれぞれ、ＭおよびＭ’の金属原子数であり、かつ、
ｎはｎ’より小さい］
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターＭｎおよびＭ’ｎ’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および／またはω−メルカプト酸配位子に結合されているコンジュゲートに関する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、金属性ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は遷移金属またはそれらの組合せから選択され、好ましくは、遷移金属はＡｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、それらはＡｕ、Ａｇ、Ｃｕおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、遷移金属はＡｕ、Ａｇおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１４６】
蛍光の励起波長および発光波長はＡＱＣのサイズに依存するので、必要なサイズのＡＱＣの形成を指定することにより、励起波長および発光波長を選択することができる。
【０１４７】
好ましい実施形態では、少なくとも２つのＡＱＣとしてのＭｎとＭ’ｎ’との間で１個の電子だけが移動し、したがって、イオン形態Ｍｎ＋、すなわち、Ｍｎの酸化形態、およびＭ’ｎ’−、すなわち、Ｍ’ｎ’の還元形態が生じ、ここで、「＋」は正電荷であり、「−」は負電荷である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ｎおよびｎ’は、２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の金属原子数である。いくつかの実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子である。
【０１４９】
さらなる実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子、または５〜２５原子である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ω−ヒドロキシ酸は一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨを有し、式中、ｍは２〜３０の値を有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ω−メルカプト酸は一般式ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨを有し、式中、ｐは２〜３０の値を有する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ｍおよびｐは１０〜２０の値を有する。特定の実施形態では、ｍおよびｐは１５の値を有する。別の特定の実施形態では、ｍおよびｐは１１の値を有する。ｍおよびｐの値は、異なっていても同じであってもよい。ｍとｐが異なる場合、それらの間の差は炭素６個未満であり、好ましくは、ｍとｐとの値の差は１〜４である。好ましい実施形態では、ｍとｐは同じである。少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）配位子およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子から選択される場合、酸基−ＣＯＯＨ（または対応する酸の塩が使用される場合には−ＣＯＯ−）はナノ化合物の外面に向けられ、−ＯＨ基および−ＳＨ基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−に向けられる。
【０１５３】
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−ＯＨ基、またはメルカプト−ＳＨ基以外の官能基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−を有し、ここで、Ｒは、ＡＱＣまたはイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子のヒドロキシル−ＯＨまたはメルカプト−ＳＨ基をそれらもまたＡＱＣの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
【０１５４】
本発明によるコンジュゲートに組み込むことができる好適な生体分子としては、ＡＱＣ−ＣＴＣを用いたビオチン化分子の検出のための競合アッセイに関して上述した生体分子のいずれもが含まれる。好ましい実施形態では、生体分子は、核酸、多糖およびポリペプチドからなる群から選択される。好ましくは、生体分子は抗体である。
【０１５５】
ＣＴＣ−ＡＱＣで検出可能に標識された結合相手を用いた生体分子の検出方法
生体分子とＣＴＣ−ＡＱＣを含んでなるコンジュゲートは、生体分子と結合相手との間で形成された複合体内のＣＴＣ−ＡＱＣの蛍光発光を追跡することにより、生体分子の結合相手を検出するために使用することができる。よって、別の態様において、本発明は、サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、
（ｉ）前記サンプルを本発明によるコンジュゲートと接触させる工程、ここで、前記コンジュゲートの生体分子は、前記生体分子が前記標的分子に結合するのに十分な条件下で、前記標的分子に特異的に結合する、および
（ｉｉ）前記生体分子と前記標的分子との間の複合体形成を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
【０１５６】
本方法は、第１の工程において、標的分子を含有することが疑われるサンプルに、ＡＱＣと前記標的分子の結合相手である生体分子との電荷移動複合体を含んでなるコンジュゲートを接触させることを含んでなり、その接触工程が前記生体分子と、前記生体分子と特異的に結合する部分との結合に十分な条件下で行われる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、金属性ＡＱＣの金属ＭおよびＭ’は遷移金属またはそれらの組合せから選択され、好ましくは、遷移金属はＡｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、それらはＡｕ、Ａｇ、Ｃｕおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、遷移金属はＡｕ、Ａｇおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１５８】
蛍光の励起波長および発光波長はＡＱＣのサイズに依存するので、必要なサイズのＡＱＣの形成を指定することにより、励起波長および発光波長を選択することができる。
【０１５９】
好ましい実施形態では、少なくとも２つのＡＱＣとしてのＭｎとＭ’ｎ’との間で１個の電子だけが移動し、したがって、イオン形態Ｍｎ＋、すなわち、Ｍｎの酸化形態、およびＭ’ｎ’−、すなわち、Ｍ’ｎ’の還元形態が生じ、ここで、「＋」は正電荷であり、「−」は負電荷である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ｎおよびｎ’は、２〜３０９、２〜１０２、２〜５５、または２〜２５の金属原子数である。いくつかの実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子である。
【０１６１】
さらなる実施形態では、ｎとｎ’との差は５〜５０原子、または５〜２５原子である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ω−ヒドロキシ酸は一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨを有し、式中、ｍは２〜３０の値を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ω−メルカプト酸は一般式ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨを有し、式中、ｐは２〜３０の値を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ｍおよびｐは１０〜２０の値を有する。特定の実施形態では、ｍおよびｐは１５の値を有する。別の特定の実施形態では、ｍおよびｐは１１の値を有する。ｍおよびｐの値は、異なっていても同じであってもよい。ｍとｐが異なる場合、それらの間の差は炭素６個未満であり、好ましくは、ｍとｐとの値の差は１〜４である。好ましい実施形態では、ｍとｐは同じである。少なくとも２つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）配位子およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子から選択される場合、酸基−ＣＯＯＨ（または対応する酸の塩が使用される場合には−ＣＯＯ−）はナノ化合物の外面に向けられ、−ＯＨ基および−ＳＨ基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−に向けられる。
【０１６５】
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−ＯＨ基、またはメルカプト−ＳＨ基以外の官能基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−を有し、ここで、Ｒは、ＡＱＣまたはイオン化ＡＱＣとしてのＭｎ＋およびＭ’ｎ’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖Ｃ１−Ｃ４の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω−メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）配位子のヒドロキシル−ＯＨまたはメルカプト−ＳＨ基をそれらもまたＡＱＣの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
【０１６６】
生体分子と標的分子の好適なペアは表２に示される通りである。
【０１６７】
【表３】
2016503158.tif 000005
【０１６８】
検出される標的分子が左の欄に記載されている分子のいずれかである場合、ＣＴＣ−ＡＱＣで検出可能に標識される生体分子は右の欄に定義されると考えられる。逆に、検出される標的分子が右の欄に記載される分子のいずれかである場合、ＡＱＣの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は左の欄に定義される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、生体分子は、標的分子に共有結合する。いくつかの実施形態では、生体分子は標的分子に非共有結合的に結合する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、検出される標的分子は抗原またはハプテンであり、この場合、ＡＱＣの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は、前記抗原と特異的に結合する抗体である。他の実施形態では、検出される標的分子は抗体であり、この場合、ＡＱＣの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は、前記抗体により認識される抗原である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、検出される標的分子は核酸であり、この場合、ＡＱＣの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は、前記核酸と特異的にハイブリダイズする核酸である。用語「特異的にハイブリダイズする」は、本明細書で使用する場合、高ストリンジェント条件または中等度ストリンジェント条件下で２つのポリヌクレオチドのハイブリダイズを可能とする状態を意味する。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算である。一般に、長いプローブほど適切なアニーリングに高温を要し、短いプローブほど低温を要する。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融解温度より低い環境中に存在する場合に変性ＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に望まれる相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度は高くなる。結果として、相対温度が高いほど反応条件がよりストリンジェントとなる傾向にあり、温度が低いほどストリンジェントが低いことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および解説に関しては、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)参照。
【０１７２】
生体分子の、サンプル中の結合相手との結合を促進するのに好適な条件は、当業者により、本明細書の教示および以下に示す実施例に基づいて決定することができる。例えば、抗体抗原結合は多くの場合、疎水性の相互作用（いわゆる疎水結合）に依存し、したがって、非特異的結合を低減し、特異的抗原抗体結合を増強するために、モル範囲の高塩濃度を使用することができる。
【０１７３】
生体適用では、サンプルと標的生体分子に対する結合相手との接触工程は、一般に当技術分野で公知の方法に従って調製される水溶液、ほぼ水性の溶液または水性混和溶液中で行われる。検出可能に標識された結合相手の厳密な濃度は試験条件および所望の結果に依存するが、一般に約１ナノモル〜１ミリモルまたはそれを超える範囲である。最適濃度は、最小のバックグラウンド蛍光で満足のいく結果が達成されるまでの系統的変動により決定される。
【０１７４】
第２の工程では、本発明によるコンジュゲートを用いた標的分子の検出方法は、ＡＱＣの電荷移動複合体で検出可能に標識された生体分子と標的分子との間の複合体形成を検出することを含む。
【０１７５】
複合体形成の検出は、好適な波長での励起時にＡＱＣの電荷移動複合体により発光された蛍光を検出することによって行うことができる。
【０１７６】
一般に、複合体の検出は、サンプル中になお存在する結合していない、検出可能に標識された生体分子から複合体を分離した後に行われる。サンプル中になお存在する結合していない、検出可能に標識された生体分子から複合体を分離するためには、様々な方法が当業者に利用可能である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、標的分子は支持体に固定化され、これにより、サンプルから支持体を分離することにより検出可能に標識された生体分子とともに形成された複合体の回収が可能となる。結合相手の固定化に使用できる好適な支持体は、限定されるものではないが、本発明による競合アッセイに関して上記で定義されたいずれのものも含まれる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、結合していない、検出可能に標識された結合相手からの複合体の分離は、ＣＴＣ−ＡＱＣで検出可能に標識された生体分子とは異なる、標的分子に対する第２の結合相手を用いて行われる。これにより、検出可能に標識された生体分子と標的分子と第２の結合相手を含んでなる三元複合体の回収が可能となる。例えば、検出される標的分子がポリペプチドであって、検出可能に標識された生体分子が抗体である場合、前記ポリペプチドと前記検出可能に標識された生体分子との間の複合体は、標的分子に特異的であり、かつ、第２の抗体と標的分子の結合が立体障害により妨げられることがないように、標的分子の異なる領域を認識する第２の抗体を用いて分離することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、タグを含有する。本発明において使用可能な好適なタグとしては、限定されるものではないが、ペプチドに基づくタグが含まれる。このタグは一般にポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。様々なタグポリペプチドおよびそれらの対応する抗体が当技術分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５(Field et al., Mol Cell Biol, 1988;8:2159-2165)；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology 1985;5:3610-3616)；単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 1990;3:547-553)が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド(Hopp et al., BioTechnology 1988;6:1204-1210)；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science 1993;255:192-194)；チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J Biol Chem 1991;266:15163-15166)；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990,;87:6393-6397)が含まれる。好ましい実施形態では、精製タグは、ポリヒスチジンタグである。なおさらに好ましい実施形態では、精製タグはヘキサヒスチジンタグである。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、複合体が結合されていない、検出可能に標識された生体分子から分離された後に、余分な標識生体分子を除去するためにする複合体を少なくとも１回洗浄する。洗浄工程は、生体分子および結合相手に依存するいずれの適当な方法で行ってもよい。サンプルは任意の好適な媒体、例えばＰＢＳなどのバッファーで洗浄してよい。媒体はＴｗｅｅｎ２０などの潜在を含有してもよい。サンプルは任意の各洗浄につき好適な時間、例えば、１〜３０分、または３〜１０分間洗浄してよい。洗浄は前記細胞の担体の穏やかな振盪または揺動を含み得る。洗浄温度は、細胞が生存可能であり、かつ、結合が破壊されないような温度である。例えば、それは２０〜４５℃または３０〜４０℃である。一般に、それは約３７℃または室温である。生体分子と結合相手の複合体の洗浄に好適なプロトコールは、当技術分野で周知である。
【０１８０】
検出可能に標識された生体分子と標的分子との間の複合体の検出は、標的分子と会合したＡＱＣ−ＣＴＣの蛍光発光を検出することを含む。蛍光発光が検出されれば、これは工程（ｉｉ）において、検出可能な量の生体分子が標的分子とともに回収されたこと、したがって、そのサンプルが標的分子を含有していたことを意味する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、標的分子の検出はウエスタンブロットにより行うことができ、この場合、標的分子をゲル電気泳動により分離し、ブロッティングメンブレンに転写し、検出可能に標識された生体分子と接触させる。あるいは、いくつかの実施形態では、標的分子を生体分子(biomoelcule)と接触させた後、その生体分子と標的分子の相互作用が保存される条件下で分離する。次に、前記複合体は、その複合体の分離に使用される支持体内の蛍光を測定することによって検出することができる。分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーなどのいずれの好適な手段によって行ってもよい。いくつかの実施形態では、複合体の分離はゲル電気泳動により行われ、この場合、検出はゲル内蛍光検出により行われる。
【０１８２】
ＡＱＣの電荷移動複合体を励起するための好適な手段および条件、ならびにＡＱＣの電荷移動複合体の蛍光発光を検出するための手段および条件は、本発明による競合的方法に関して記載されており、本発明の方法に等しく適用可能である。
【０１８３】
生体分子とＡＱＣの電荷移動複合体とを含んでなるコンジュゲートの作製方法
別の態様において、本発明は、生体分子とＡＱＣ電荷移動複合体とを含んでなるコンジュゲートの作製方法に関する。ＡＱＣの電荷移動複合体はω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子により安定化され、ここで、ＡＱＣは有機配位子のω−ヒドロキシ基およびω−メルカプト基に結合され、カルボキシ基は露出したままとなり、その後これが対象分子とカップリングするために利用できる。
【０１８４】
よって、別の態様において、本発明は、本発明による電荷移動複合体と生体分子のコンジュゲートの作成方法に関し、前記方法は、その表面において第１の反応性基で官能基化されたＡＱＣの電荷移動複合体を、第１の反応性基と反応し得る第２の反応性基を含有する生体分子と反応させることを含んでなる。
【０１８５】
ＡＱＣの電荷移動複合体は、ＡＱＣの外部に露出しているカルボキシル基を含有する有機酸を含有する。よって、いくつかの実施形態では、生体分子内の対応する反応性基と反応し得る反応性基を導入するために、カルボキシル基を直接活性化することが可能である。ＡＱＣの電荷移動複合体の有機酸に組み込むことができる代表的な反応性基としては、限定されるものではないが、カルボン酸基、カルボン酸活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、マレイミド基、反応性カルバミン酸基およびチオカルバミン酸基、およびα−ハロアセトアミド基（−ＮＨ−Ｃ（−Ｏ）−ＣＨ２−Ｘ）が含まれる。他の好適な官能基としては、環状付加物（例えば、４＋２環状付加生成物、ならびにアセチレンおよびアジドを提供するためのジエンおよびジエノフィル（クリックケミストリー））とカップリングさせることができる基が含まれる。一実施形態では、反応性基は、カルボン酸基（−ＣＯ２Ｈ）またはその活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）である。
【０１８６】
カルボン酸基およびカルボン酸活性エステルは、タンパク質およびペプチド内のリシン残基のアミノ基、ならびにオリゴヌクレオチドプローブ（−Ｃ（−Ｏ）−ＮＨ−結合）に導入された第一級アミノ基を含むアミノ基に対して反応性がある。マレイミド基は、タンパク質、ペプチド、およびオリゴヌクレオチド（−Ｎ［Ｃ（−Ｏ）ＣＨ２ＣＨＣ（−Ｏ）］−Ｓ−結合）に対して天然の、またはそれに導入されたスルフヒドリル基に対して反応性である。反応性カルバミン酸基およびチオカルバミン酸基はアミノ基に対して反応性であって、尿素（−ＮＨ−Ｃ（−Ｏ）−ＮＨ−）およびチオ尿素（−ＮＨ−Ｃ（−Ｓ）−ＮＨ−）結合を与える。α−ハロアセトアミド基はチオール基に対して反応性であって、−ＮＨ−Ｃ（−Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−結合を与える。環状付加を介してコンジュゲーションし得る官能基としては、４＋２環状付加結合を形成する反応をするジエン（例えば、フラン）およびジエノフィル（例えば、アルケンおよびアルキン）が含まれる。リンカーアームは、相補的反応性材料（例えば、生体分子）に天然の、または組み込まれている、それぞれジエノフィルおよびジエンに対するジエンまたはジエノフィル反応性のいずれかを含むように修飾することができる。クリックケミストリーもまた、コンジュゲーションに使用可能である。リンカーアームは、相補的反応性材料（例えば、生体分子）に天然の、または組み込まれている、それぞれアジドまたはアセチレンに対する好適なアセチレン（例えば、Ｈ−Ｃ＝Ｃ−Ｒ）またはアジド（例えば、Ｒ’−Ｎ−Ｎ＋−Ｎ−）反応性を含むように修飾することができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、有機酸中に天然に存在するカルボン酸基またはその活性エステルを、生体分子中に見られるアミノ基と反応させることにより行われる。活性化エステルの例としては、限定されるものではないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ｐ−スルホ−テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、限定されるものではないが、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）などの通常のカルボジイミドを用いて活性化されたカルボン酸；および限定されるものではないが、０−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、（２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート）（ＴＣＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１−ベンゾアリウアゾリオキシトリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＢＯＰ）などのウロニウム塩またはホスホニウム塩で活性化された；カルボン酸またはそれらの組合せが挙げられる。好ましい実施形態では、カルボン酸は、カルボジイミド、好ましくはＥＤＣを用いて活性化される。
【０１８８】
生体分子がポリペプチドである場合、反応性アミノ基はリシン残基中に天然に見られ、それにより、それ以上修飾しなくても生体分子のコンジュゲーションを可能とする。生体分子がポリヌクレオチドである場合、一実施形態では、生体分子は、アミノ基の組み込みにより修飾することができる。これは通常、アミノ修飾オリゴヌクレオチドを用いたポリヌクレオチドの合成の際に行われる。選択されたポリヌクレオチドにアミノ基を導入するための方法は、すなわち、ＷＯ２０１１１３１６９３、Kojima N. and Komatsu Y., (Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2012 Mar; Chapter 4:Unit 4.48.1-23. doi: 10.1002/0471142700.nc0448s48)およびVasilyeva SV et al. (Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2011; 30: 753-67)に記載されている。生体分子がオリゴ糖または多糖である場合、アミノ基は、例えば、ＵＳ５３０６４９２およびPorro et al., (Mol. Immunol., 1985, 22:907-919)に記載されているように還元的アミノ化により挿入することができる。
【０１８９】
ＡＱＣの電荷移動複合体中の反応性基は、ＡＱＣ中の反応性基と生体分子中の反応性基との間の反応が立体障害によって妨げられることを避けるために、有機酸中のカルボキシ基に直接カップリングさせることができか、あるいは、スペーサー基またはリンカー基によってこの基に連結することができる。同様に、反応性基とコンジュゲートされる生体分子はまた、その反応を妨げるために生体分子の骨格の間にスペーサー基を含む。いくつかの実施形態では、生体分子に結合された反応性基と有機酸を介してＡＱＣに結合された対応する反応性基の両方がリンカー基を含む。好適なリンカー部分は、炭素、窒素、酸素、水素およびハロゲンから選択される１〜約５０個の原子を含む。代表的に基としては、アルキレン基（例えば、−（ＣＨ１）ｎ−、ここで、ｎは１〜１２である）、フェニレン基（例えば、ｏ−、ｍ−、およびｐ−Ｃ６Ｈ４−）、ならびにアルキレンオキシド基（例えば、エチレンオキシド、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、ここで、ｍは１〜５でした）。他の好適な基としては、−Ｃ（＝Ａ１）−Ｌ１−、−Ｃ（＝Ａ１）ＮＨ−Ｌ１−、−Ｃ（＝Ａ１）ＮＨ−Ｌ１−ＮＨ−、ここで、Ａ１はＯおよびＳから選択され、Ｌ１は上記のリンカー基のいずれかである）が含まれる。
【０１９０】
ＡＱＣの活性化電荷移動複合体は、保護基を用いた保護形態として提供することができる。保護基の例は、T. W. Greene and P. G. Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, (Wiley, 第2版 1991), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (1992)、およびHarrison and Harrison et al., COMPENDIUM OF SYNTHETIC ORGANIC METHODS, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons. 1971-1996)に見出せる。代表的なアミノ保護基には、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などが含まれる（また、Boyle, A. L. (Editor), CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000も参照）。代表的なヒドロキシ保護基としては、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されているもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが含まれる。さらに、ヒドロキシ基は、ａ−メチル−６−ニトロピペロンイルオキシカルボニルなどの光除去基のより保護することもできる(McGall, G. H. and Fidanza, J. A., Photolithographic synthesis of high-density olignucleotide arrays, DNA ARRAYS METHODS AND PROTOCOLS, Rampal J. B.編, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 170:71-101 (2001), Humana Press, Inc., NY; Boyle, Ann L. (編), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000)。
【０１９１】
細胞内成分を標識するための方法
別の実施形態では、本発明は、１以上の細胞内成分をＡＱＣ−ＣＴＣと前記細胞内成分と特異的に結合する生体分子とを含んでなるコンジュゲートに接触させ、それにより、顕微鏡による１以上の細胞内成分の検出を可能等することを含んでなる、細胞内成分をｉｎ  ｖｉｖｏ標識するための方法に関する。
【０１９２】
一実施形態では、生体分子は、１以上の細胞内コンパートメントで発現されるポリペプチドと特異的に結合するポリペプチドであり、この場合、本発明によるＡＱＣ−ＣＴＣを含んでなるコンジュゲートは免疫組織化学に使用可能である。
【０１９３】
別の実施形態では、生体分子は、対象とする核酸配列と特異的にハイブリダイズする(hibrdises)核酸であり、この場合、本発明によるＡＱＣ−ＣＴＣを含んでなるコンジュゲートは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に使用可能である。一般に、ＦＩＳＨ法は、下記の工程：（ａ）検討下の組織または他の生体材料を支持体（例えば、スライドガラスまたはマイクロタイターウェルの壁面に固定化する工程、（ｂ）ＦＩＳＨプローブの標的核酸への接近性を高めるために組織または材料を処理する工程、（ｃ）標的核酸を含有する組織または材料をプローブと接触させて特異的なハイブリダイゼーション複合体を形成する工程、（ｄ）複合体のハイブリダイゼーション後洗浄により、標的に特異的にハイブリダイズされていないプローブを選択的に除去する工程、および（ｅ）標的核酸分子とハイブリダイゼーション複合体を形成したプローブの検出を含む。このような方法は、Gall and Pardue, (1981) Methods of Enzymology 21:470-480; Henderson, (1982) International Review of Cytology, 76: 1-46;およびAngerer, et al., (1985) in Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow and Hollaender, 編) vol. 7, pp. 43-65, Plenum Press, New Yorkを含む多くの文献に記載されている。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、生体分子は、ポリペプチドおよび核酸からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
【０１９５】
コンジュゲートは、色素化合物と対象サンプル成分との間の接触を促進するようにサンプルと接触させる。一般に、コンジュゲートまたはコンジュゲートを含有する溶液を単にサンプルに加える。本発明の特定の結合相手は、生体細胞の膜を透過しない傾向があり、ひと度、生存細胞内にあれば、一般によく保持される。原形質膜に透過性とする処理、例えば、エレクトロポレーション、ショック処理または高い細胞外ＡＴＰは、結合相手を細胞に導入するために使用可能である。あるいは、結合相手は、例えば、加圧マイクロインジェクション、スクレープローディング(scrape loading)、パッチクランプ法、または食作用により、物理的に細胞に挿入することができる。
【０１９６】
被験体由来のいずれの組織サンプルを使用してもよい。使用可能な組織サンプルの例としては、限定されるものではないが、乳房、前立腺、卵巣、結腸、肺、子宮内膜、胃、唾液腺または膵臓が含まれる。組織サンプルは、限定されるものではないが、外科的切除、吸引または生検を含む様々な手順によって得ることができる。組織は新鮮物であっても、または冷凍されていてもよい。一実施形態では、組織サンプルは固定されるか、またはパラフィンに包埋される。組織サンプルは従来の方法論［例えば、"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 第3版 (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel編, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.参照］により固定（保存）してよい。例としては、中性緩衝ホルマリン、ブアン液(Bouin’s)またはパラホルムアルデヒドを、組織サンプルの固定に使用してよい。
【０１９７】
細胞成分と会合したＣＴＣ−ＡＱＣの検出は、下記のデバイスＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャニングデバイス、蛍光計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかを使用するか、または光電子増倍管などのシグナルを増幅するための手段によって行うことができる。サンプルがフローサイトメーターを用いて検査される場合、サンプルの検査は場合により、サンプルの一部をそれらの蛍光応答に従って選別することを含む。
【０１９８】
本発明を下記の実施例により説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲の単に例示であって、限定ではないと解釈されるべきである。
【実施例】
【０１９９】
試薬
ストレプトアビジン（ストレプトミセス・アビディニイ由来、アフィニティー精製、≧１３Ｕ／ｍｇ）およびオリゴ−ビオチン（３６ｂｐオリゴヌクレオチド−ビオチン、
【化１】
2016503158.tif 000006
は、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈから購入し、それ以上精製せずに用い、文献および製造者により推奨されているような保存溶液：水中、ストレプトアビジン０．５ｍｇ／ｍＬおよびＴＥバッファー（トリス−ＥＤＴＡバッファー溶液、ｐＨ＝８．０、Ｆｌｕｋａ）中、オリゴ−ビオチン１ｎＭを作製した。
【０２００】
ＡＱＣ−ＣＴＣは標準的プロトコールにより合成した。５．４ｍＬの水と必要量の水酸化テトラブチルアンモニウム（水中４０％、Ｆｌｕｋａ）中、激しく撹拌しながら、１６−ヒドロキシパルミチン酸（９８％、Ａｌｄｒｉｃｈ）（２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）の水溶液を１６−メルカプトパルミチン酸（９０％、Ａｌｄｒｉｃｈ）の水溶液（０．６２２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）と、基準中央値が得られるまで混合した。得られたナノソーム溶液に、容量４００μＬのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（塩化Ａｕ（ＩＩＩ）水和物、金属塩基９９．９９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）（５．８ｍｇ／ｍＬ）溶液を加え、その後、４００μＬのＮａＢＨ４（９６％、Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（０．０５Ｍ）により還元した。この溶液を３５℃で１時間撹拌した。ＡＱＣ−ＣＴＣを得るために、この溶液をＢｅｃｋｍａｎ  Ａｉｒｆｕｇｅ（登録商標）Ａｉｒ−Ｄｒｉｖｅｎ超遠心機にて９０，０００ｒｐｍで１時間、超遠心分離にかけ、分離上清としてＡＱＣ−ＣＴＣを得た。この超遠心分離工程は、従前に合成されたナノソームを崩壊させる不安定化工程である。前記工程は、様々な大きさのＡＱＣからＡＱＣ−ＣＴＣを得るために必要である。
【０２０１】
実施例１  ＡＱＣ−ＣＴＣのストレプトアビジン蛍光増強によるビオチン化オリゴヌクレオチドの検出
表１に示すように、１５μＬのＡＱＣ−ＣＴＣ（１５０ｍｇ／Ｌ）、５５μＬのストレプトアビジン溶液（水中０．５ｍｇ／ｍＬ）および漸増量のオリゴ−ビオチン溶液（ＴＥバッファー中１ｎＭ）を含有する３種類の異なる溶液を作製した。１時間のインキュベーション後、各サンプルの蛍光を測定した。
【０２０２】
【表４】
2016503158.tif 000007
【０２０３】
図１は、種々の溶液：（Ａ）ストレプトアビジンを含むＡＱＣ−ＣＴＣ、（Ｂ）ストレプトアビジンと０．１ｍｍｏｌのオリゴ−ビオチンを含むＡＱＣ−ＣＴＣ、および（Ｃ）ストレプトアビジンと０．５ｍｍｏｌのオリゴ−ビオチンを含むＡＱＣ−ＣＴＣの２５０ｎｍの励起における発光スペクトルを示す（Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｖａｒｉａｎ蛍光分光光度計を用い、光路３×３ｍｍおよび用量４５μＬの石英セル中で測定）。このスペクトルは、６００ｎｍに発光極大を示し、これはオリゴ−ビオチンを添加すると低下し、この発光極大はオリゴ−ビオチンの量を増すにつれ低下する。
【０２０４】
実施例２  ＡＱＣ−ＣＴＣのストレプトアビジン／ＨＡＢＡ蛍光増強／消光によるビオチン化オリゴヌクレオチド検出
表２に示すように、示された容量のストレプトアビジン溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）に０．２５μＬのＨＡＢＡ溶液（１０ｍＭ）および０．５μＬのＡＱＣ−ＣＴＣ溶液（およそ１５０ｍｇ／Ｌ）を加えて２種類の溶液を作製した。次に、この溶液Ｂに０．５μＬのオリゴ−ビオチン溶液（１ｎＭ）を加え、両サンプルを３０分間インキュベートした。
【０２０５】
【表５】
2016503158.tif 000008
【０２０６】
図２は、異なる溶液（Ａ）ＨＡＢＡとストレプトアビジンを含むＡＱＣ−ＣＴＣ、および（Ｂ）ＨＡＢＡ、ストレプトアビジンと０．５μＬのオリゴ−ビオチンを含むＡＱＣ−ＣＴＣの２５０ｎｍの励起における発光スペクトルを示す（Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｖａｒｉａｎ蛍光分光光度計を用い、光路３×３ｍｍおよび用量４５μＬの石英セル中で測定）。図２に示すように、オリゴ−ビオチンの添加は、オリゴ−ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用のために発光極大強度の低下をもたらす。
【０２０７】
実施例３  タンパク質分子とナノソームのカップリングのための方法
新たに作製したＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）の水溶液を、ｐＨ９ホウ酸バッファー中のナノソーム溶液に加えた。５分間中速で撹拌した後、ｐＨ９ホウ酸バッファー中、このタンパク質溶液を加えた。撹拌を２時間続け、最終的なタンパク質−ナノソームコンジュゲートを、遠心分離限外濾過により精製した。
【図１】
2016503158.tif 000010
【図２】
2016503158.tif 000011
【配列表】
2016503158000001.app
【国際調査報告】
2016503158.tif 000012
2016503158.tif 000013
2016503158.tif 000014
2016503158.tif 000015
2016503158.tif 000016