(57)【要約】  一群の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体が合成され、これらはＮ−Ｏ結合の切断による還元活性化を前提にプロドラッグであることが判明し、細胞毒性活性に関する機能的生体内細胞アッセイにおいて、遊離薬物の活性に近づく形で遊離薬物を効果的に放出しながら、それでもなお生体外ＤＮＡアルキル化条件に対し本質的に安定した状態を維持する。代表的プロドラッグの生体内抗腫瘍活性の評価は、意図されるプロドラッグが、遊離薬物自体（ＣＢＩ−インドール２）の効力に近づき、有効性を超えることを示しており、これは不活性プロドラッグが生体内で遊離薬物を効果的に放出するだけでなく、生体内における制御された放出または標的を絞った放出に関連する、付加的な利点をもたらすことも示すものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉによって表される環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体。
【化１】
2016515577.tif 000033
（式中、
ＲはヒドリドまたはＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルであり、
Ｒ3は以下のとおり表される基から成る群から選択され、
【化２】
2016515577.tif 000034
式中、
Ｒ4は以下のとおり表される基から成る群から選択され、
【化３】
2016515577.tif 000035
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルおよびハロゲンから成る基の群から選択され、
Ｒ9は−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）から成る基の群から選択される。）
【請求項２】
Ｒがヒドリドまたはメチルである、請求項１に記載の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体。
【請求項３】
Ｒ3が下記の基の一方または他方であり、
【化４】
2016515577.tif 000036
Ｒ4が下記の基の一方または他方である、
【化５】
2016515577.tif 000037
請求項１に記載の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体。
【請求項４】
下記の式によって表される、請求項１に記載の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体。
【化６】
2016515577.tif 000038
【請求項５】
下記の式によって表される、請求項１に記載の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体。
【化７】
2016515577.tif 000039
【請求項６】
下記の１つ以上から成る群から選択される式によって表される、請求項１に記載の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールＣＢＩ誘導体。
【化８】
2016515577.tif 000040
【化９】
2016515577.tif 000041
（式中、Ｒ、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は前に定義したとおりである。）
【請求項７】
薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散させた増殖性疾患を阻害する量の請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が、下記のうちの一方もしくは他方、または両方である、請求項７に記載の組成物。
【化１０】
2016515577.tif 000042
および
【化１１】
2016515577.tif 000043
【請求項９】
哺乳動物における増殖性疾患を治療するための方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
前記増殖性疾患が白血病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、下記のうちの一方もしくは他方、または両方である、請求項９に記載の方法。
【化１２】
2016515577.tif 000044
および
【化１３】
2016515577.tif 000045
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／８０６，２１２号の優先権を主張するものである。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所／国立癌研究所からの助成金ＣＡ４１９８６に従って政府支援を受けて行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、プロドラッグ抗癌剤およびその使用に関する。特に、本発明はＣＢＩ−ＴＭＩおよびＣＢＩ−インドール2の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールプロドラッグに関する。
【背景技術】
【０００３】
下記のデュオカルマイシンＳＡ（化合物１）［Ichimura et al., J.Antibiot.1990, 43:1037-1038］およびＣＣ−１０６５（化合物２）［Martin et al., J.Antibiot.1981, 34:1119-1125］
【化１】
2016515577.tif 000002
は、デュオカルマイシンＡ［Takahashi et al., J.Antibiot.1988, 41:1915-1917］、ヤタケマイシン［Igarashi et al., J.Antibiot.2003, 56:107-113］（下記）も含む、並外れて効力が高い天然由来の抗腫瘍薬の中でも最も幅広く認識されている２つである。
【０００４】
【化２】
2016515577.tif 000003
この独特の区分の天然物の抗腫瘍特性は、ＤＮＡを配列選択的にアルキル化する能力にから導き出される。［デュオカルマイシンＳＡについては以下を参照されたい：(a) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1994, 116:1635-1656；ヤタケマイシンについては以下を参照されたい：(b) Parrish et al., J.Am.Chem.Soc.2003, 125:10971-10976; (c) Trzupek et al., Nat.Chem.Biol.2006, 2:79-82; (d) Tichenor et al., J.Am.Chem.Soc.2007, 129:10858-10869；ＣＣ−１０６５については以下を参照されたい：(e) Hurley et al., Biochemistry 1988, 27:3886-3892; (f) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.1994, 2:115-135; (g) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1991, 113:3980-3983; (h) Boger et al., Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.1991, 88:1431-1435; (i) Boger et al.,J.Am.Chem.Soc.1990, 112:4623-4632; (j) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1991, 113:3980-3983；デュオカルマイシンＡについては以下を参照されたい：(k) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1990, 112:8961-8971; (l) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1991, 113:6645-6649; (m) Boger et al., Med.Chem.Lett.1992, 2:759-765.(n) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1993, 115:9872-9873; (o) Boger et al., Chem.-Biol.Interactions 1990, 73:29-52。レビュー：(a) Boger et al., Angew.Chem., Int.Ed.Engl.1996, 35:1438-1474; (b) Boger et al., Acc.Chem.Res.1995, 28:20-29; (c) Boger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995, 92:3642-3649; (d) Boger et al., Acc.Chem.Res.1999, 32:1043-1052; (e) Tichenor et al., Natural Prod.Rep.2008, 25:220-226; (f) MacMillan et al., J.Med.Chem.2009, 52:5771-5780; (g) Searcey et al., Curr.Pharm.Des.2002, 8:1375-1389; および(h) Tse et al., Chem.Biol.2004, 11:1607-1617.］
【０００５】
該天然物に関する綿密な研究の結果、それらの合成非天然エナンチオマー［(a) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1988, 110:1321-1323; (b) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1988, 110:4796-4807; (c) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1992, 114:10056-10058; (d) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1993, 115:925-9036.(e) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1996, 118:2301-2302; (f) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1997, 119:311-325; (g) Boger et al., Chem.Rev.1997, 97:787-828; (h) Tichenor et al., J.Am.Chem.Soc.2004, 126:8396-8398; (i) Tichenor et al., J.Am.Chem.Soc.2006, 128:15683-15696; (j) MacMillan et al., J.Am.Chem.Soc.2009, 131:1187-1194.］および主要類似体がそれらのＤＮＡアルキル化における選択性、効率および触媒を制御する基礎的特徴の多くを定義付けてきた結果、構造、反応性および生物学的活性の間の関係を詳しく理解できるようになった。［上記引用および以下を参照されたい：(a) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1997, 119:4977-4986; (b) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1997, 119:4987-4998; (c) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.1997, 5:263-276.］
【０００６】
下記のＣＢＩ（１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンツ−［ｅ］インドール−４−オン）
【０００７】
【化３】
2016515577.tif 000004
は、該発明者および共同研究者らが１９８９年に初めて紹介して以来、デュオカルマイシン群の合成類似体の中で最も研究されている１つである。［(a) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1989, 111:6461-6463; (b) Boger et al.,  J.Org.Chem.1990, 55:5823-5832; (c) Boger et al., Tetrahedron Lett.1990, 31:793-796; (d) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.1991, 1:55-58; (e) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1992, 114:5487-5496; (f) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1994, 116:5523-5524; (g) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.1995, 3:761-775; (h) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1994, 116:7996-8006; (i) Parrish et al., Bioorg.Med.Chem.2003, 11:3815-3838; (j) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1990, 112:5230-5240.］
【０００８】
ＣＢＩアルキル化サブユニットは合成的にアクセス性が高く、天然物と同一のＤＮＡアルキル化特性を有するだけでなく［(a) Boger et al., J.Org.Chem.1992, 57:2873-2876; (b) Boger et al., J.Org.Chem.1995, 60:1271-1275; (c) Boger et al., Synlett 1997, 515-517; (d) Kastrinsky et al., J.Org.Chem.2004, 69:2284-2289; (e) Lajiness et al., J.Org.Chem.2010, 76:583-587; (f) Drost et al., J.Org.Chem.1991, 56:2240-2244; (g) Aristoff et al., J.Org.Chem.1992, 57:6234-6239; (h) Mohamadi et al., J.Med.Chem.1994, 37:232-239;および(i) Ling et al., Heterocycl.Commun.1997, 3:405-408］、下記のＣＣ−１０６５の天然由来のアルキル化サブユニット（化合物２）
【０００９】
【化４】
2016515577.tif 000005
に比べ安定性が４倍、効力が４倍も高く、下記のデュオカルマイシンＳＡ（化合物１）
【化５】
2016515577.tif 000006
の安定性および効力に近付く。ＣＢＩベースの類似体は、動物モデルにおける生体内抗腫瘍活性に効果を示すことも既に立証されていることから、新しいプロドラッグ設計を含む、天然物の構造機能的特徴の検証対象として卓越した合成代替物となってきた。［(a) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.1995, 3:1429-1453;および(b) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.1991, 1:115-120.］
【００１０】
該天然物および関連する下記のＣＢＩ−インドール2（化合物５）
【化６】
2016515577.tif 000007
［(a) Boger et al., Bioorg. Med.Chem.1995, 3:1429-1453;および(b) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.1991, 1:115-120］を含む類似体の初期全合成の過程において［(a) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1988, 110:1321-1323; (b) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1988, 110:4796-4807; (c) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1992, 114:10056-10058; (d) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1993, 115:9025-9036; (e) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1996, 118:2301-2302; (f) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.1997, 119:311-325; (g) Boger et al., Chem.Rev.1997, 97 ;787-828; (h) Tichenor, M.S.; Kastrinsky et al., J.Am.Chem.Soc.2004, 126 ;8396-8398; (i) Tichenor et al., J.Am.Chem.Soc.2006, 128:15683-15696; (j) MacMillan et al., J.Am.Chem.Soc.2009, 131:1187-1194］（前述）、下記の化合物４
【００１１】
【化７】
2016515577.tif 000008
など、ウィンシュタインＡｒ−３’スピロ環化をまだ経ていない状態の合成フェノール前駆体は、細胞増殖アッセイ、ＤＮＡアルキル化研究および生体内抗腫瘍モデルにおいて、同等物を含有する環化シクロプロパンに等しい効力を有し、それらと区別がつかないことが判明した。
【００１２】
この区別不能な挙動により、フェノールの保護は、生体内で切断されて活性薬物を放出し得る不活性プロドラッグを調製するための、特に効果的な部位をもたらす。［カルゼルシンについては以下を参照されたい：(a) Li et al., Cancer Res.1992, 52:4904-4913; (b) van Tellingen et al., Cancer Res.1998, 58:2410-2416；ＫＷ−２１８９については以下を参照されたい：(c) Kobayashi et al., Cancer Res.1994, 54:2404-2410; (d) Nagamura et al., Chem.Pharm.Bull.1995, 43:1530-1535；他のＣＢＩカルバメートプロドラッグについて：(e) Boger et al., Synthesis 1999, 1505-1509; (f) Wang et al., Bioorg.Med.Chem.2006, 14:7854-7861; (g) Li et al., Tetrahedron Lett.2009, 50:2932-2935;および(h) Wolfe et al., J.Med.Chem.2012, 55:5878-5886.］この保護および放出戦略を使用するプロドラッグは、生体内でのフェノール放出が、選択的な腫瘍細胞の送達または切断を可能とし得る特徴に連結される領域で開発されてきたが、驚くことに、今のところ研究が為されてきたプロドラッグ区分はほとんどない。［グリコシド系プロドラッグについて：(a) Tietze et al., Bioorg.Med.Chem.2001, 9:1929-1939; (b) Tietze eet al., Angew.Chem.Int.Ed.2006, 45:6574-6577;および(c) Tietze et al., Bioorg.Med.Chem.2008, 16:6312-6318。還元活性化プロドラッグについて：(a) Hay et al., J.Med.Chem.2003, 46:5533-5545; (b) Hay et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.1999, 9:2237-2242; (c) Tercel et al., Angew.Chem.Int.Ed.2011, 50:2606-2609; (d) Townes et al., Med.Chem.Res.2002, 11:248-253;および(e) Boger et al., J.Org.Chem.1999, 64:8350-8362。他のプロドラッグについては以下を参照されたい：(a) Zhao et al., J.Med.Chem.2012, 55:766-782;および(b) Pors et al., K.; Chem.Commun.2011, 47:12062-12064.］
【００１３】
デュオカルマイシンを対象に検証が為されてきたプロドラッグ戦略は、大別して主に２種類ある。最も幅広く検証されている戦略は、加水分解的または酵素的に切断され得るフェノールのアルキル化を活用する。多数のグループがそのようなエステルおよびカルバメートのプロドラッグを検証し［カルゼルシンについては以下を参照されたい：(a) Li et al., Cancer Res.1992, 52:4904-4913; (b) van Tellingen et al., Cancer Res.1998, 58:2410-2416；ＫＷ−２１８９については以下を参照されたい：(c) Kobayashi et al., Cancer Res.1994, 54:2404-2410; (d) Nagamura et al., Chem.Pharm.Bull.1995, 43:1530-1535；他のＣＢＩカルバメートプロドラッグについては以下を参照されたい：(e) Boger et al., Synthesis 1999, 1505-1509; (f) Wang et al., Bioorg.Med.Chem.2006, 14:7854-7861; (g) Li et al., Tetrahedron Lett.2009, 50:2932-2935;および(h) Wolfe et al., J.Med.Chem.2012, 55:5878-5886］、それらの誘導体のうちの２つ、ＫＷ−２１８９［Kobayashi et al., Cancer Res.1994, 54:2404-2410］およびカルゼルシン［Li et al., Cancer Res.1992, 52:4904-4913］を臨床試験に持ち込んだ。注目すべき最近の一例［Wang et al., Bioorg.Med.Chem.2006, 14:7854-7861］を例外として、これらは伝統的に、生体内投与後に遊離薬物の迅速な放出を可能にするよう設計されており、また典型的に薬物の物理的特性（例：溶解性）を改善する機能性を組み入れている。
【００１４】
第２の、ただしさほど広範に探究されているわけではないアプローチは、還元活性化され得る機能性の開発が関係する。［Wolkenberg et al., Chem.Rev.2002, 102:2477-2495.］過去の例としてＤｅｎｎｙによるフェノール薬物のアリールアミン変異形（variant）へのニトロ前駆体［Hay et al., J.Med.Chem.2003, 46:5533-5545］、Ｌｅｅによるテザー型（tethered）キノン還元後の切断の対象となるエステルの使用［Townes et al., Med.Chem.Res.2002, 11:248-253］、そして該発明者および共同研究者らによる、還元活性化後に類似のｏ−スピロ環化を経るマイトマイシン様キノン前駆体に関する報告が挙げられる［Boger et al., J.Org.Chem.1999, 64:8350-8362］。
【００１５】
より最近では、該発明者および共同研究者らが、低酸素腫瘍環境と、その環境において活性Ｎ−Ｏ結合を切断し得るグルタチオンなど還元性求核試薬とを潜在的に活用するよう設計された、一連のＮ−アシルＯ−アミノフェノールプロドラッグを紹介した（下記）
【００１６】
【化８】
2016515577.tif 000009
［Jin et al., J.Am.Chem.Soc.2007, 129:15391-15397および米国特許第８，３７７，９８１号；および(b) Lajiness et al., J.Med.Chem.2010, 53:7731-7738］。有意には、そのような還元性チオールの細胞内濃度は血清内濃度の１００倍にもなることから察するに、より伝統的なカルバメートと異なり、そのような還元活性プロドラッグは優先的細胞内放出の対象となり得る。そのようなプロドラッグの挙動の前例は、天然物ＦＲ９００４８２およびこれに関連する、ヒドロキシルアミンヘミケタールを含有し、Ｎ−Ｏ結合の還元性切断によって不可逆的に活性化される、同族体［(a) Paz et al., J.Am.Chem.Soc.1997, 119:5999-6005;および(b) Williams et al., Chem.Biol.1997, 4:127-137;およびTepe et al., Tetrahedron 2002, 58:3553-3559］において認められ得る。
【００１７】
該発明者および共同研究者らによる初期の研究において、顕著な範囲のプロドラッグ安定性およびＮ−Ｏ結合傾向が、弱いＮ−Ｏ結合の周囲における電子的立体環境が微妙に変動する状況でさえも観察された。有意には、複数のそのようなプロドラッグに関する生体内評価により、バランスの取れたＮ−Ｏ安定性／反応性を示すプロドラッグは遊離薬物の効力に近付き、遊離薬物自体の有効性を大幅に超えることが実証されたことから察するに、そのようなプロドラッグは制御された放出または標的を絞った放出に関連する利点をもたらし得る。
【発明の概要】
【００１８】
還元活性化を使用して遊離薬物放出を構造的に微調整するという、前述の実証された能力に基づき、Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールモチーフの独特な環状変異形が検証され、特に有用であると認められた。本明細書では、還元性切断により、如何なる異物も随伴しない活性化合物を提供し得る下記の２つの特異的な環状オキサジノンＮ−Ｏ  ＣＢＩプロドラッグ（化合物＋６および＋７）
【００１９】
【化９】
2016515577.tif 000010
の合成および生物学的評価を、意図される化合物から成る属の例示的実施例として使用する。
【００２０】
より一般的には、意図される化合物は下記の式Ｉ
【化１０】
2016515577.tif 000011
（式中、Ｒはヒドリド（Ｈ）またはＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルであり、Ｒ3は以下のとおり表される基から成る群から選択され、
【００２１】
【化１１】
2016515577.tif 000012
式中、Ｒ4は以下のとおり表される基から成る群から選択され、
【００２２】
【化１２】
2016515577.tif 000013
上記の構造式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、−（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）およびハロゲンから成る群から選択される。）
で表現され得る。上記の式のＲ9は−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1−Ｃ6アルキル）、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）から成る群から選択される。
【００２３】
哺乳動物における癌または白血病など増殖性疾患の治療方法も意図される。該方法に従って、直前に記載の２つの化合物のうちの１つなど、式Ｉの化合物の有効量が、それを必要としている哺乳動物へ投与される。さらに別の態様において、癌または白血病など増殖性疾患の治療用薬剤の製造における、式Ｉの化合物の使用が意図される。
【００２４】
注意点として、本明細書で使用する構造式において、波線は記載の原子に対する未定義の立体化学の化学的結合を意味する。同じく注意点として、読みやすさを改善し、見掛け上の重複を最小限に抑えるため、広義に記述される構造要素の任意の組み合わせが、別途明記される場合を除き、特定の実施形態において提示され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｗ７９４ＤＮＡにおける化合物（＋）−７によるＤＮＡアルキル化を示す、ＤＮＡ配列決定ポリアクリルアミドゲルの放射能写真である。活性化が発生しないと化合物（＋）−７によるＤＮＡアルキル化は全く観察されないが（レーン７）、チオールを添加（Ｌ−グルタチオン）すると遊離薬物が放出される結果、観察部位での（＋）−ＣＢＩ−インドール2（レーン６）によるＤＮＡアルキル化（レーン８および９）が発生する。２３℃で２時間（ｈ）のＤＮＡ作用因子培養、ＥｔＯＨ沈殿による非結合因子の除去、および３０分間の加熱分解（１００℃）に続き、８％のＰＡＧＥ変性および放射能写真撮影。レーン１、対照ＤＮＡ；レーン２〜５、サンガーＧ、Ｃ、Ａ、およびＴの配列決定反応；レーン６、化合物（＋）−４（１×１０-5Ｍ）；レーン７、化合物（＋）−７（１×１０-5Ｍ）；レーン８〜９、化合物（＋）−７（１×１０-5Ｍ）を３７℃にて１ＭのＬ−グルタチオンで１２時間および２４時間にわたり培養させたもの。この化合物（＋）−７のＤＮＡアルキル化挙動は、同じく無細胞アッセイにおいてＤＮＡの効果的なアルキル化に失敗する化合物（＋）−３ｃ（図２）の挙動と類似していると判明したが、Ｌ−グルタチオンの添加による活性化後、ＤＮＡを効果的にアルキル化する。
【図２】ｗ７９４ＤＮＡにおける化合物３ｃＤＮＡアルキル化を示す、ＤＮＡ配列決定ポリアクリルアミドゲルの放射能写真である。活性化が発生しないと化合物（＋）−３ｃによるＤＮＡアルキル化は全く観察されないが（レーン７）、チオールを添加（Ｌ−グルタチオン）すると遊離薬物が放出される結果、観察部位での（＋）−ＣＢＩ−インドール2（レーン６）によるＤＮＡアルキル化（レーン８および９）が発生する。２３℃で２時間（ｈ）のＤＮＡ作用因子培養、ＥｔＯＨ沈殿による非結合因子の除去、および３０分間の加熱分解（１００℃）に続き、８％のＰＡＧＥ変性および放射能写真撮影。レーン１、対照ＤＮＡ；レーン２〜５、サンガーＧ、Ｃ、Ａ、およびＴの配列決定反応；レーン６、化合物（＋）−４（１×１０-5Ｍ）；レーン７、化合物（＋）−３ｃ（１×１０-3Ｍ）；レーン８〜９、化合物（＋）−３ｃ（１×１０-5Ｍ）を３７℃にて１ＭのＬ−グルタチオンで１２時間および４８時間にわたり培養させたもの。
【図３】ｗ７９４ＤＮＡの熱誘導性鎖切断を示す、ＤＮＡ配列決定ポリアクリルアミドゲルの放射能写真である；２３℃で４８時間のＤＮＡ作用因子培養、ＥｔＯＨ沈殿による非結合因子の除去、および３０分間の加熱分解（１００℃）に続き、８％のＰＡＧＥ変性および放射能写真撮影。レーン１、対照ＤＮＡ；レーン２〜５、サンガーＧ、Ｃ、Ａ、およびＴの配列決定反応；レーン６〜８、化合物（＋）−４（１×１０-4〜１×１０-6Ｍ）；レーン９〜１１、化合物（＋）−６（１×１０-2〜１×１０-4Ｍ）。
【図４】ｗ７９４ＤＮＡの熱誘導性鎖切断を示す、ＤＮＡ配列決定ポリアクリルアミドゲルの放射能写真である；２３℃でｔ時間のＤＮＡ作用因子培養、ＥｔＯＨ沈殿による非結合因子の除去、および３０分間の加熱分解（１００℃）に続き、８％のＰＡＧＥ変性および放射能写真撮影。レーン１、対照ＤＮＡ；レーン２〜５、サンガーＧ、Ｃ、Ａ、およびＴの配列決定反応；レーン６〜１１、化合物（＋）−４（１×１０-4Ｍ、ｔ＝２、４、６、８、２４、４８時間）；レーン１２〜１５、化合物（＋）−６（１×１０-2Ｍ、ｔ＝２、４、６、８時間）。
【図５】ｗ７９４ＤＮＡの熱誘導性鎖切断を示す、ＤＮＡ配列決定ポリアクリルアミドゲルの放射能写真である；２３℃で４８時間のＤＮＡ作用因子培養、ＥｔＯＨ沈殿による非結合因子の除去、および３０分間の加熱分解（１００℃）に続き、８％のＰＡＧＥ変性および放射能写真撮影。レーン１、対照ＤＮＡ；レーン２〜５、サンガーＧ、Ｃ、Ａ、およびＴの配列決定反応；レーン６、化合物（＋）−４（１×１０-4Ｍ）；レーン７〜９、化合物（±）−１９（１×１０-3〜１×１０-5Ｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本発明および付帯する請求項において、以下の用語は以下の意味を有する。
本明細書で使用する「１つの」（「a」及び「an」）という冠詞は、その冠詞の文法上の１つの目的語または複数の目的語（すなわち少なくとも１つの目的語）を指す。例を挙げると、「１つの要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用する「ヒドロカルビル」という言葉は、直鎖および分枝鎖の脂肪族基のほか、炭素と水素のみ含有する脂肪族の基またはラジカルを含む、非芳香族基を表す略称である。よって、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基が意図されるが、厳密に言えばヒドロカルビル基でもあるフェニル基やナフチル基など芳香族炭化水素は、本明細書では後述する通り、アリール基またはアリールラジカルと呼ばれる。
特定の脂肪族ヒドロカルビル置換基が意図される場合、その基、すなわちＣ1−Ｃ6アルキル、メチルまたはｔｅｒｔブチルが列挙される。典型的なヒドロカルビル基は１個から４個の炭素原子、好ましくは１個または２個の炭素原子を含有する。
特に好適なヒドロカルビル基はアルキル基である。結果として、一般化された、ただしより好適な置換基を、本発明において列挙される置換基のいずれにおいても、「ヒドロカルビル」という記述子を「アルキル」に入れ替えることによって列挙することができる。
【００２７】
アルキル基の例としてメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。適切なアルケニル基の例としてエテニル（ビニル）、２−プロペニル、３−プロペニル、１，４−ブタジエニル、１−ブテニル、２−ブテニルおよび３−ブテニルが挙げられる。アルキニル基の例としてエチニル、２−プロピニル、１−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、および１−メチル−２−プロピニルが挙げられる。
熟練者であれば理解するように、Ｃ1アルケニル基など存在し得ない置換基は「ヒドロカルビル」という言葉に包含されることを意図されないが、２個以上の炭素原子を有する置換基は意図される。
「ヒドロカルビル」という言葉を使用する際は通常の化学用語接尾辞命名法に従うが、例外として、末尾の「イル」を削除し、適切な接尾辞を加えるという通常の慣行に必ずしも従うとは限らず、それは結果的な名称が１つまたは複数の置換基に類似する可能性があるためである。よって、ヒドロカルビルエーテルは、通常の化学用語命名法に従う場合に、より適切と考えられるように、「ヒドロカルボキシ」基ではなく「ヒドロカルビルオキシ」基と呼ばれる。ヒドロカルビルオキシ基の例としてメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、アリルオキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、およびｔｅｒｔ−ブトキシ基が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用する「環状構造」という用語は、イミダゾリル基またはフェニル基など単環、もしくはナフチル基、プリニル基、インドリル基またはデカリニル基に存在するような２つの縮合基、もしくはビフェニル基に存在するような２つの連結環を含有し得る環状置換基を意味する。
「シクロヒドロカルビル」または「炭素環式」という用語は単独で、または複合的に、５個から約１２個の炭素原子、好ましくは約５個から約１０個の炭素原子を含有する環状ヒドロカルビル基（または環）を意味する。そのようなシクロヒドロカルビル基の例としてシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘプチニル、１−デカリニルおよび２−デカリニルなどが挙げられる。
【００２９】
「アリール」という用語は単独で、または複合的に、芳香族環系を意味する。そのような環系の例としてフェニル環系、ナフチル環系およびビフェニル環系が挙げられる。
ヘテロシクリル（ヘテロシクロ）は、環中に１個から４個の、飽和環または部分飽和環中の独立に窒素、酸素または硫黄の原子であるヘテロ原子（非炭素）を含有する、単一の五員環または六員環、もしくは縮合型または連結型の５，５−環系、５，６−環系または６，６−環系である。そのようなヘテロシクリル基の例としてピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モノホリニル基、チアモルホリニル基、オキサチアゾリル基、１，２，３−トリアゾリル基、１，２，４−トリアゾリル基、ピラゾリル基、１，２，４−オキサジアジニル基およびアゼピニル基およびビピペリジニル基が挙げられる。
【００３０】
「ヘテロアリール」基は、好ましくは環中に１個、または２個、または３個または４個の炭素以外の原子を含有する芳香族複素環である。これらのヘテロ原子は独立に窒素、硫黄または酸素であってもよい。ヘテロアリール基は、単一の五員環または六員環、あるいは２つの六員環または１つの五員環と１つの六員環、もしくは連結型の５，５−員環、５，６−員環または６，６−員環をビピリジニル基中に有する縮合環系である。付加的なヘテロアリール基の例としてピリジル、ピラジル、ピリミジニル、およびピリダジニルなど六員環置換基、１，３，５−、１，２，４−、または１，２，３−のトリアジニル基、イミダジル基、フラニル基、チオフェニル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、１，２，３−、１，２，４−、１，２，５−、または１，３，４−のオキサジアゾリル基およびイソチアゾリル基など五員環置換基、ベンゾチオフラニル基、イソベンゾチオフラニル基、ベンツイソオキサゾリル基、ベンツオキサゾリル基、プリニル基およびアンスラニリル基など六／五員縮合環置換基、そして１，２−、１，４−、２，３−および２，１−のベンゾピロニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、シノリニル基、キナゾリニル基および１，４−ベンツオキサジニル基など六／六員縮合環置換基が挙げられる。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
デュオカルマイシンクラスに属する化合物とその使用に関連する、環状Ｎ−アシルＯ−アミノ還元活性プロドラッグから成る新規の属が開示される。これらの化合物は酵素的放出を必要とせず、またそのような設計上の活性化の恩恵に与り得る他のフェノール系薬物の実例である。
【００３２】
意図される化合物は下記の式Ｉ
【化１３】
2016515577.tif 000014
（式中、Ｒはヒドリド（Ｈ）またはＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルであり、Ｒ3は以下のように表される基から成る群から選択される
【００３３】
【化１４】
2016515577.tif 000015
（式中、Ｒ4は以下のように表される基から成る群から選択される
【００３４】
【化１５】
2016515577.tif 000016
（上記の構造式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、−（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）およびハロゲンから成る群から選択される）））
で表現され得る。上記の式のＲ9は−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1−Ｃ6アルキル）、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル）から成る群から選択される。
【００３５】
ヒドリド（Ｈ）およびメチル（Ｃ1ヒドロカルビル）は好適なＲ基である。好適なＲ3基は
【化１６】
2016515577.tif 000017
である一方、好適なＲ4置換基は
【化１７】
2016515577.tif 000018
である。
【００３６】
好適な式Ｉの化合物の例として下記の構造式で表される化合物が挙げられ、式中、Ｒは好ましくはヒドリドまたはメチルであり、他のＲ基は上記の定義通りである。
【化１８】
2016515577.tif 000019
【化１９】
2016515577.tif 000020
【００３７】
下記の化合物（＋）６および＋（７）が特に好適である。
【化２０】
2016515577.tif 000021
【００３８】
医薬組成物および治療方法
哺乳動物における癌または白血病など増殖性疾患を治療するための医薬組成物も意図される。そのような組成物は、前述の式Ｉの分子を薬学的有効量（増殖性疾患を阻害する量）、薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散させたものを含有する。
意図される式Ｉの化合物は、癌細胞、または白血病など別の増殖性疾患の細胞を対象哺乳動物の生体外または生体内にて治療および好ましくは死滅させるための医薬組成物に使用され得る。よって、上記組成物は治療対象細胞と接触する。そのように治療される細胞は、生体内の場合は身体から排除されるまで、または生体外研究における所望の様々な回数にわたり、式Ｉの化合物と接触する。この治療は一般的に複数回繰り返される。
【００３９】
式Ｉの化合物を含有する組成物を投与される哺乳動物は、ヒト、チンパンジーまたはゴリラなど類人猿、カニクイザルまたはマカクなどサルをはじめとする霊長類、ラット、マウスまたはウサギなど実験動物、イヌ、ネコ、ウマなど愛玩動物、もしくは雌牛または去勢雄牛、ヒツジ、コヒツジ、ブタ、ヤギ、リャマなど食用動物のうち、癌性疾患の治療を必要としているものであってもよい。
【００４０】
意図される組成物は、投薬を必要としている哺乳動物へ、増殖に対し有効な用量レベルで投与される。そのレベルは典型的に、体重１ｋｇ当たり約１００〜約３０００μｇを十分に投与対象の血漿または血清へ提供する量であり、切断活性化されるデュオカルマイシン型プロドラッグ化合物（＋）６自体の分子量を、本明細書で意図される他のプロドラッグ化合物の様々な分子量を視野に入れ計算する際の基礎として使用する。
【００４１】
【化２１】
2016515577.tif 000022
用量は投与対象および増殖性細胞の負荷次第で変動し得る。特定の状況における最適な用量の判定は、当業者が備えている技能の範囲内である。
マウス白血病細胞を使用した、ある生体外研究において、化合物（＋）６および（＋）７それぞれについて、約１ｎＭおよび約０．３ｎＭのＩＣ50が認められた。化合物（＋）４と（＋）６とを比較した、ある生体内研究において、化合物（＋）６が化合物（＋）４に比べ独特に広い治療濃度域が指摘され、同研究において化合物（＋）４を６０〜５００μｇ／ｋｇの範囲で投与した結果、試験マウスの早期死亡が発生した一方、化合物（＋）６を２５００μｇ／ｋｇ投与した結果、１年間の期間においてマウス１０匹中６匹が生存し、より低い次の２つの用量（同じ時点で１０００μｇ／ｋｇと５００μｇ／ｋｇ）では１０匹中４匹が生存した。以下はデータである。
【００４２】
式Ｉの化合物を含有する組成物を、投与対象の癌負荷および必要性について適応させたスケジュールに基づき、当該技術分野において周知のとおり、繰り返し投与する。典型的な投与は１か月間に複数回、筋肉内（im）投与、血管内（iv）投与または内部非経口（ip）投与の形で行われ、通常は投与後に安静期間が続き、その後、投与対象が疾患のない状態になるまで投与および安静の期間がさらに続くか、または予防を目的とする、より長い期間が続く。
本発明の医薬組成物を調製するため、不活性の、薬学的に許容される担体または希釈剤を使用する。希釈剤は通常、液体である。
液体医薬組成物の例として、内部非経口（intraparenteral）（ｉｐ）、筋肉内（ｉｍ）または血管内（ｉｖ）での投与に適する溶液が挙げられる。水、エタノール、またはプロピレングリコールを含む溶媒中の活性成分の滅菌水溶液または滅菌溶液が、非経口投与に適する液体組成物の例である。
滅菌溶液は、所望の溶媒系に活性成分を溶解し、その後、得られた溶液を膜フィルターで濾過して滅菌するか、あるいは滅菌条件下で既に滅菌済みの溶媒に滅菌化合物を溶解することによって調製され得る。
好ましくは、該医薬組成物は単位容量形態である。そのような形態の場合、組成物は適量の活性尿素を含有する単位用量へと分けられる。単位用量形態は包装された調剤、すなわち離散的量の調剤を例えばバイアルまたはアンプルに収めたパッケージであってもよい。
【００４３】
結果
化合物２０の加溶媒分解
化合物２０をＣＨ3ＯＨ（１．５ｍＬ）に溶解した。ＣＨ3ＯＨ溶液を水性緩衝液（ｐＨ２、１．５ｍＬ）と混合した。緩衝液は４：１：２０（容積比）それぞれ、１．０Ｍのクエン酸、０．２ＭのＮａ2ＨＰＯ4、およびＨ2Ｏを含有した。混合後、加溶媒分解溶液を密閉し、２５℃にて暗所で保管した。
溶液のＵＶスペクトルを最初の２日間に３〜４回、そして２〜４週間にわたり１日１回測定した。ＵＶモニタリングを、さらなる変化が検出されなくなるまで継続した。３８０ｎｍでの長波長吸収と２５５ｎｍでの短波長吸収のモニタリングを行った。時間と自然対数の比較に関するグラフの勾配の最小二乗処理を基に、短波長（２５５ｎｍ）にて記録されたデータから加溶媒分解率定数および半減期を計算した［（ＡFinal−ＡInitial）／（ＡFinal−Ａ）］。
【００４４】
ｐＨ２の緩衝液：１．０Ｍのクエン酸：０．２Ｍの  Ｎａ2ＨＰＯ4：Ｈ2Ｏ（４：１：２０）
ｔ1/2＝２７．８時間、ｋ＝８．３×１０-6ｓ-1
ｐＨ３の緩衝液：０．１Ｍのクエン酸：０．２Ｍの  Ｎａ2ＨＰＯ4：Ｈ2Ｏ（４：１：２０）
ｔ1/2＝２９３時間、ｋ＝６．６×１０-7ｓ-1
【００４５】
Ｎ−Ｏプロドラッグの安定性および反応性
そのようなオキサジノンの化学的反応性はほとんど知られていないことから、下記のＢｏｃ保護プロドラッグ（化合物１２および１５）
【化２２】
2016515577.tif 000023
について、代表的な酸性条件、塩基性条件の下、そしてそれらの合成過程全体を通じて行われた観察結果を基に、安定性および遊離薬物放出傾向を検証した結果、化合物１２と１５はいずれも安定性が著しく高く、また化合物１５はすべての検証条件下で化合物１２に比べ反応性が高く、安定性が低いことが判明した。酸性媒体（４ＮのＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ、２３℃）中、化合物１２および１５はそれぞれ２４時間と２時間の半減期（ｔ1/2）を示した（初回Ｂｏｃ脱保護後）。
【００４６】
完全プロドラッグ化合物６はさらに安定性が高く、２３℃の条件で４ＮのＨＣｌ／ＥｔＯＡｃおよび１：１のＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2中で７２時間超および３０時間の半減期を示した。化合物１２は塩基性条件に曝露された場合に安定性があり、多様な溶媒中（ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ／Ｈ2Ｏ、２３℃）でＮａＨＣＯ3対し５日間以上反応しなかった。それに比べ、未置換オキサジノン化合物１５は２３℃の条件でＴＨＦ／Ｈ2Ｏ中のＮａＨＣＯ3に対しては安定していたが、同じ条件下でＭｅＯＨにゆっくり消費された（ｔ1/2＝７０時間）。
【００４７】
いずれのオキサジノンもモデル求核試薬に対して著しく安定性が高いと認められ、化合物１５はより安定性が高い化合物１２に比べ切断が素早く、チオールがアミンよりもはるかに効果的に反応した（下記の表１）。Ｎ−Ｏ結合の求核性切断に対して化合物１２の安定性が化合物１５よりも高いことは、従前の観察と一致する、二次窒素と比較した場合の三次窒素の立体障害に起因すると考えられる。［Lajiness et al., J.Med.Chem.2010, 53:7731-7738］最後に、２つのプロドラッグのうち安定性がより高いもの（化合物６）でさえ、還元条件下（Ｈ2、Ｐｄ／Ｃ、ＭｅＯＨ、２３℃、１時間またはＭｏ（ＣＯ）6、ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ、環流、３時間）で急速に切断された。
【００４８】
【表１】
2016515577.tif 000024
プロドラッグ化合物６の安定性を、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液（ｔ1/2＞４週間）、ヒト血漿（ｔ1/2＞１週間、５％未満の遊離薬物）、およびマウス血漿（ｔ1/2＞４８時間）中で検証した結果、Ｎ−Ｏ結合がこれらの条件下で著しく安定していることが実証された。対照的に、より反応性が高いプロドラッグ化合物７はｐＨ７．０のリン酸緩衝液中での反応が遅く（ｔ1/2＝１週間）、ヒト血漿中（ｔ1/2＝４日間）またはマウス血漿中（ｔ1/2＞４８時間、５％未満の遊離薬物）での切断が遅いと認められた。
【００４９】
生物学的特性
ＤＮＡアルキル化特性
予想と整合的に、還元活性化の源泉が存在しない場合、プロドラッグ化合物（＋）−６は無細胞システム［(a) Boger et al., Tetrahedron 1991, 47:2661-2682;および(b) Boger et al., J.Am.Chem.Soc.2001, 123:5878-5891］において、遊離薬物化合物（＋）−４が効果的となる場合に比べ濃度が１０００倍の高さであってもＤＮＡをアルキル化する能力がないと認められた（図３および４）。同様に、プロドラッグ化合物（＋）−７は無細胞アッセイにおいて意図的に活性化しないとＤＮＡをアルキル化できなかった一方、Ｌ−グルタチオンを添加したところ、効果的な、時間依存性の遊離薬物放出と低速ＤＮＡアルキル化反応が促進され、これは親遊離薬物と同一の選択性を伴って進行した（図１）。
【００５０】
下記の遊離薬物化合物１９
【化２３】
2016515577.tif 000025
は、化合物（＋）−６の還元性切断後に放出されたものであり、化合物（＋）−４と同様の形でＤＮＡをアルキル化すると認められ、これはＣ５−カルボキサミドがＤＮＡアルキル化特性と親薬物化合物４の能力を有意に変えるわけではないことを意味する（図５）。
【００５１】
これらの研究は、Ｎ−Ｏプロドラッグの生体外細胞毒性活性および生体内抗腫瘍活性はプロドラッグ化合物３、６または７自体に由来するとは考えにくく、遊離フェノールを放出する還元性切断の結果であり、この放出が効果的なＤＮＡアルキル化因子および効力のある細胞毒性化合物であることを示唆する。さらに、これらの研究は、チオールは単独でこの還元活性化を、Ｎ−Ｏ結合の求核性切断を通じて提供する能力があるが、同様に作用する他の還元機構を妨げるわけではないことを意味する。
【００５２】
生体外細胞毒性活性
化合物６および７の双方のほか、これらの前駆体化合物１２と１５についても、Ｌ１２１０マウス白血病細胞を使用する細胞毒性アッセイにおける細胞成長阻害を試験し、これと併せて遊離薬物化合物１９および関連する対照化合物に関する試験も行った（下記の表２）。
【００５３】
【表２】
2016515577.tif 000026
プロドラッグ化合物（＋）−６は０．９９ｎＭのＩＣ50を示すと認められたのに比べ、より反応性が高いプロドラッグ化合物（＋）−７のＩＣ50は０．３０ｎＭであると認められた。スピロ環化の補助に必要なＣ５置換基（例：ＨまたはＯＭｅ）をｓｅｃｏ−ＣＢＩ−インドール2誘導体は、化合物（＋）−６に比べ１００倍以上、化合物（＋）−７（ＩＣ50＞１００ｎＭ、Ｌ１２１０）に比べ３５０倍のＩＣ50値を示す。［(a) Jin et al., J.Am.Chem.Soc.2007, 129:15391-15397;および(b) Lajiness et al., J.Med.Chem.2010, 53:7731-7738.］
【００５４】
化合物（＋）−６と化合物（＋）−７のとの間における３倍の差は、Ｎ−Ｏ切断に対する総体的反応性の違いを反映しており、反応性が高いプロドラッグほど、アッセイ時の条件下では遊離薬物の立体障害を増大させてしまう。プロドラッグの非天然エナンチオマー、化合物（−）−６と（−）−７は、天然エナンチオマーに比べ効力が２００分の１にも満たないと認められた。親遊離薬物１９をラセミ混合物として試験した結果、ｓｅｃｏ−（＋）−ＣＢＩ−インドール2に比べ効力が２．５分の１であると認められ、これは天然エナンチオマーが（＋）−ＣＢ−インドール2の活性にかなり近いことを意味する。複合的に、これらの研究は、プロドラッグ化合物６およびプロドラッグ化合物７がアッセイ条件下で効果的に、ただし急速または完全に切断されて遊離薬物を提供することを意味するが、それはこれらのＩＣ50値が遊離薬物化合物１９自体より８倍〜２５倍の高さの範囲にあるからである。
【００５５】
生体外ではこのように効力が遊離薬物に比べ低くなるとは言え、それでもなお、いずれのプロドラッグもサブナノモル量の細胞効力を示し、効力は臨床的に最も使用されている抗腫瘍剤より強い。さらに、それらの内在的な化学的安定性は、それらが化合物３ｃ同様、化学的安定性と還元性切断傾向との間で適切なバランスを保つことにより、遊離薬物自体よりも有効性が高い生体内抗腫瘍活性を示すことを示唆するものである。
【００５６】
生体内抗腫瘍活性
機能的細胞アッセイの結果は、化合物（＋）−６の効力が親薬物化合物１９より低く、また化合物（＋）−７より低いことを示しているが、遊離薬物の低速放出は生体内では親化合物の顕著な効力および内在的毒性を背景に、遊離であると証明され得る。［Wolfe et al., J.Med.Chem.2012, 55:5878-5886.］したがって、環状Ｎ−Ｏプロドラッグの生体内抗腫瘍血清の予備的評価を、伝統的に使用されるＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに内部非経口的に移植させたＬ１２１０マウス白血病細胞から成る抗腫瘍モデルでのｓｅｃｏ−ＣＢＩ−インドール2（化合物４）と併せて実施して、新規のデュオカルマイシン誘導体の初期比較を行った（下記の表３）。
【００５７】
【表３】
2016515577.tif 000027
【００５８】
プロドラッグ化合物（＋）−６について６０〜２５００μｇ／ｋｇ（判定されたＩＣ50に合わせて尺度を加減）およびｓｅｃｏ−ＣＢＩ−インドール2（化合物４）について６０〜５００μｇ／ｋｇの用量範囲と、この区分の化合物に伝統的に使用される投与スケジュール（１日目、５日目および９日目、計３回の内部非経口投与）を採用した。微妙であるが重要な、これらの研究における付加的観察結果は、プロドラッグ投与は動物の注入部位において、遊離薬物よりもかなり良好に許容されるということであった。
【００５９】
ｓｅｃｏ−ＣＢＩ−インドール2［化合物（＋）−４］を、プロドラッグ化合物（＋）−６の潜在的有効性と比較して小さい治療濃度域を強調するよう、最適用量（６０または１００μｇ／ｋｇ）を超える範囲（６０〜５００μｇ／ｋｇ）で投与した。［(a) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.1995, 3:1429-1453;および(b) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.1991, 1:115-120;およびa) Jin et al., J.Am.Chem.Soc.2007, 129:15391-15397;および(b) Lajiness et al., J.Med.Chem.2010, 53:7731-7738］以前観察された通り、化合物（＋）−４を用量６０μｇ／ｋｇで投与した結果、研究終了時点（３６６日経過）での長期生存率（Ｔ／Ｃ＞２８４）はわずか１０分の１であった。さらに高い用量範囲（１００〜５００μｇ／ｋｇ）では、化合物（＋）−４は薬物毒性に起因する動物の早期死亡に繋がる毒性があると証明された。
顕著には、化合物（＋）−６を投与した結果、２５００μｇ／ｋｇの用量（Ｔ／Ｃ＞１５００）での長期生存率は１０分の６で、次に低い２通りの線量、１０００μｇ／ｋｇ（Ｔ／Ｃ＞１１３０）と５００μｇ／ｋｇ（Ｔ／Ｃ＞１１４２）での長期生存率は１０分の４であった。化合物（＋）−６の投与に対する応答が非常に顕著であったため、研究期間を３６６日間（１年間）に延長し、この期間における生存動物は長期生存に該当するが、遅発性毒性の証拠はない。
【００６０】
化合物（＋）−６の用量（２００μｇ／ｋｇ）は化合物（＋）−４の最適用量（６０μｇ／ｋｇ）より３倍高い程度であるが、この場合でさえ、プロドラッグの結果が遊離薬物を上回った（Ｔ／Ｃ３８６対２８４）。これらのデータは、化合物（＋）−６がたとえ４０倍高い用量でも化合物（＋）−４の特徴的毒性を被るほどでなく、また化合物（＋）−４の狭い３０〜１００μｇ／ｋｇの用量範囲に比べ、治療濃度域がはるかに広く（２００〜２５００μｇ／ｋｇ超）［(a) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.1995, 3:1429-1453;および(b) Boger et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.1991, 1:115-120;およびa) Jin et al., J.Am.Chem.Soc.2007, 129:15391-15397;および(b) Lajiness et al., J.Med.Chem.2010, 53:7731-7738］、また生体内ではるかに高い、並外れた有効性を有することを意味する。
プロドラッグ化合物（＋）−６は、この初期探究の範囲を超える、はるかに高い用量レベルまたは代替的用量スケジュールの恩恵に預かり得ると考えられ、またそのような、より高い用量は、はるかに有効性が高いと考えられる。これらの研究は、遊離薬物が生体内で放出されることを直接立証するわけではなく、また遊離薬物放出の部位または機構を定義するものでもないが、実際、環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールプロドラッグの生体内挙動が、遊離薬物の制御型低速放出または標的を絞った細胞内還元性切断、いずれかの恩恵に与ることを示唆するものである。
【００６１】
結論
２つの新規の環状Ｎ−アシルＯ−アミノフェノールデュオカルマイシン関連のプロドラッグの実例、化合物（＋）−６および（＋）−７を合成し、プロドラッグとしてのこれらの生体外および生体内での抗腫瘍活性を分析した。該プロドラッグは還元活性化を前提として設計されているが、おそらく、弱いＮ−Ｏ結合を切断し得る還元性求核試薬におけるそのような低酸素腫瘍細胞の存在の増加に起因する、低炭素腫瘍細胞環境内での遊離薬物放出を伴う選択的切断の能力を有する。
【００６２】
２つの候補プロドラッグのうち、Ｎ−メチルオキサジノン化合物（＋）−６は化合物（＋）−７より安定性が高いと判明したが、いずれも酸性環境や塩基性環境はもとより、モデル求核試薬との反応に対しても著しく安定性が高いことが判明した。いずれのプロドラッグも無細胞アッセイにおいてはＤＮＡのアルキル化に効果的と認められなかったが、Ｎ−Ｏプロドラッグ化合物３ｃのように、チオール（Ｌ−グルタチオン）によってＤＮＡアルキル化向けに活性化されると認められた。保護的Ｎ−Ｏ結合の切断に対するこの反応性は、より反応性の高いプロドラッグ化合物（＋）−７（ＩＣ50＝０．３０ｎＭ）よりも効力が低いＩＣ50を示す（０．９９ｎＭ）、より安定性の高いプロドラッグ化合物（＋）−６での、生体外細胞毒性活性に反映された。プロドラッグ化合物（＋）−６は、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液、マウス血漿およびヒト血漿中でも安定していると認められ、この期間を延長して（３６６日間）実施された白血病マウスモデルにおいて生体外で検証したところ、遊離薬物の有効性を大幅に超える、並外れた有効性を示すと認められた（Ｔ／Ｃ＞１５００、Ｌ１２１０、１年後に１０匹中６匹が生存）。プロドラッグ化合物（＋）−６は、遊離薬物より有効性がはるかに広い治療濃度域を示し、遊離薬物の４０倍以上の用量が可能であるが、示した生体内効力は遊離薬物の３倍以内であった。明らかに、化合物（＋）−６の生体内挙動は、活性遊離薬物の制御型放出または細胞内還元性切断、いずれかの恩恵に与る。化合物６の生体内挙動に関するこれらの態様および関連する態様については現在調査中である。
【００６３】
実験例
全般
試薬グレードの試薬および溶媒を購入し、さらなる精製を加えずに使用した。保存ヒト血漿にクエン酸ナトリウムを抗凝結剤として添加したものをＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入し、−２０℃で保管した。ＴＨＦを新たにナトリウムベンゾフェノンケチルから蒸留した。反応はすべて、オーブン乾燥させたガラス器を使用してアルゴン雰囲気下で実施した。真空状態での蒸発および濃縮を２０℃で実施した。ＴＬＣを、ＥＭＤ社製プリコート型ＳｉＯ2  ６０Ｆ２５４ガラスプレートを使用し、ＵＶ光（２５４または３６６ｎｍ）で可視化して実施した。キラル相ＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製ＨＰＬＣを使用してセミ分取（semi-preparative）Ｄｉａｃｅｌ社製ＣｈｉｒａｌＣｅｌ  ＯＤカラム（０．４６ｃｍ×２５ｃｍ）上で、流速７ｍＬ／分およびλ＝２５４ｎｍでのＵＶ検出を条件として実施した。施光度を、Ｒｕｄｏｌｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製Ａｕｔｏｐｏｌ  ＩＩＩ型自動施光計（λ＝５８９ｎｍ、２５℃）上で判定した。
【００６４】
ＮＭＲ（1Ｈまたは13Ｃ）を、Ｂｒｕｎｋｅｒ社製ＤＲＸ−５００およびＤＲＸ−６００  ＮＭＰ型分光光度計上で２９８Ｋにて記録した。残留溶媒ピークを内部参照として使用した。連結定数（Ｊ）（Ｈ，Ｈ）はＨｚ単位で示される。連結パターンは一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、三重項（ｔ）、四重項（ｑ）、多重項（ｍ）、または広域一重項（ｂｒ）として指定される。ＩＲスペクトルをＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３８０  ＦＴ−ＩＲ分光高度計に記録し、測定は綿密に行った。高分解能（resolution）質量スペクトルデータをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製項分解脳ＬＣ／ＭＳＤ−ＴＯＦ上で取得し、検出質量はｍ／ｚ単位で表され、ｍは分子イオンを表す。試験対象化合物それぞれの純度（９５％超）を、Ａｇｉｌｅｎｔ社製１１００ＬＣ／ＭＳ型装置上で、ＺＯＲＢＡＸ社製ＳＢ−Ｃ１８型カラム（３．５ｍｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、流速０．７５ｍＬ／分、２２０および２５４ｎｍでの検出）を使用して、１０〜９８％のアセトニトリル／水／０．１％のギ酸勾配を条件に判定した。
【００６５】
略語一覧
ＣＢＩ、１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ−［ｃ］ベンツ［ｅ］インドール−４−オン。ＤＰＰＡ、ジフェニルホスホリルアジド。ＬｉＨＭＤＳ、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド。ＴＨＦ、テトラヒドロフラン。ＢｎＳＨ、ベンジルチオール。ＢｎＯＨ、ベンジルアルコール。ＢｎＮＨ2、ベンジルアミン。ＥｔＯＡｃ、酢酸エチル。ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド。ＭｅＯＨ、メタノール。
【００６６】
材料および方法
化学
合成
プロドラッグ化合物６および７をいずれも共通の中間体、下記のカルボン酸化合物９から合成した（スキーム１）。
【００６７】
スキーム1
【化２４】
2016515577.tif 000028
カルボン酸化合物９は、臭化アリール化合物８［Wolfe et al., J.Med.Chem.2012, 55:5878-5886］のフェニルリチウム媒介金属ハロゲン交換と、その後の有機リチウム中間体のＣＯ２捕捉（ｇ）により調製され、化合物９は素晴らしい収率で提供された。
【００６８】
Ｎ−メチルオキサジノン１１を化合物９から、３段階の手順で生産した。第１に、酸塩化物を原位置で塩化オキサリルと触媒ＤＭＦを使用して形成し、その後、Ｎ−メチルヒドロキシルアミンで凝結し、ヒドロキサム酸化合物１０を素晴らしい収率で生産した。ベンジルエーテル保護基をパラジウム触媒水素化によって除去し、フェノール化合物１１を、反応時間が長すぎると観察されるＮ−Ｏ切断による副産物化合物１８の競合形成を避けるよう、６０分間のみ実行される反応で得た。スワーン酸化条件に化合物１１を曝露させた後、主要なオキサジノンを閉じ、化合物１２を適度な収率で得た。
これは新規かつ独特の、Ｎ−Ｏ結合の「酸化」形成方法であり、推定上、その後の分子内フェノール置換向けのジメチルスルホキソニウム陽イオンとしてのヒドロサキム酸の活性化を含む。対照的に、また興味深いことに、そのようなオキサジノンを、トリフェニルホスフィン（Ｐｈ3Ｐ）とジエチルアジドカルボキシレート（ＤＥＡＤ）を使用してヒドロキサム酸化合物１３の光延型反応を通じて調製することを試みた結果、下記のロッセン転位誘導型イソシアネートを通じてカルバメート生成物のみ得られた（スキーム２）。
【００６９】
ラセミ型Ｎ−メチルオキサジノン化合物１２をその２つのエナンチオマーへ、５％のｉＰｒＯＨ／ヘキサンを溶離剤として使用するキラル相（ＣｈｉｒａｌＣｅｌ  ＯＤ）ＨＰＬＣによって分割し、各エナンチオマーを、化合物（＋）−およびｅｎｔ−（−）−６を提供するＢｏｃ群の酸触媒型脱保護に従うＥＤＣＩを使用して化合物１６と結合した。
【００７０】
スキーム2
【化２５】
2016515577.tif 000029
遊離ＮＨを担持するオキサジノン化合物７を、下記の総体的合成手順に軽微な変更を加えた程度の同様の形で調製した（スキーム３）。
【００７１】
スキーム3
【化２６】
2016515577.tif 000030
化合物９の活性化トリアジンエステルを、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）とＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）との反応後に生成し、原位置にてヒドロキシルアミンで捕捉して、対応するヒドロキサム酸を提供した。化合物１３を提供するためのベンジルエーテルの水素化分解と、化合物１３をスワーン酸化条件に曝露させた後のオキサジノン閉塞により化合物１５が提供されたが、水素化過程での競合Ｎ−Ｏ切断は、二次ヒドロキサム酸のおかげで一層容易となり、反応は反応時間に対して、より敏感であった。化合物１５を、１５％のｉＰｒＯＨ／ヘキサンを溶離剤として使用するキラル相（ＣｈｉｒａｌＣｅｌ  ＯＤ）ＨＰＬＣにより分割した。
【００７２】
化合物１５の各エナンチオマーのＢｏｃ脱保護に続いてＥＤＣＩを使用して化合物１６と連結しても化合物７は生成されなかったが、これはおそらく酸性オキサジノンの競合反応が原因である。したがって、カルボン酸化合物１６をまず、ペンタフルオロフェニルエステル化合物１７として活性化し、連結反応に使用して、化合物（＋）−７およびｅｎｔ−（−）−７を取得した。
【００７３】
主要な化合物６および７に加え、親となるＮ−メチルアミド化合物１８を、化合物１０の水素化時間の延長により調製した結果、ベンジルエーテルが除去され、キサム酸が切断された。化合物１８の酸触媒Ｂｏｃ脱保護、そして放出された遊離アミンと化合物１６のＥＤＣＩによる連結により、下記の親遊離薬物化合物１９がラセミ酸として生産された（スキーム４）。
【００７４】
スキーム4
【化２７】
2016515577.tif 000031
【００７５】
ｔｅｒｔ−ブチル１，２−ジヒドロ−５−（ベンジルオキシ）−１−（クロロメチル）−６−（カルボン酸）−ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボキシレート（化合物９）
化合物８（２０６ｍｇ、０．４０９ｍｍｏｌ）を、新たに蒸留した無水ＴＨＦ（４．１ｍＬ）に溶解し、−７８℃まで冷却した。フェニルリチウム（０．２３ｍＬ、２．０ＭのＴＨＦ溶液）を滴下した。４５分後、反応混合物をＣＯ2（ｇ）で１０分間泡立てた後、０℃までゆっくり昇温させた。反応混合物に２ＮのＨＣｌを添加し、急冷した。結果的に生じたスラリーをＥｔ2Ｏで抽出した（３回）。有機抽出物を結合し、Ｈ2Ｏ（２回）、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、２０〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配溶離）により、化合物９（１８０ｍｇ、９４％）を黄褐色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)δ7.72 (br, 2H), 7.52 (d, J = 7 Hz, 1H), 7.38-7.32 (m, 3H), 7.25 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.11-4.01 (m, 3H), 3.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 7.5, 11 Hz, 1H) 1.51 (s, 9H).13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δ154.9, 151.4, 136.7, 136.1, 130.2, 129.1, 128.4, 128.2, 128.1, 127.5, 127.2, 126.7, 125.7, 121.4, 117.1, 114.7, 97.2, 79.8, 69.9, 52.4, 47.6, 27.9.IR (フィルム) νmax 2980, 2903, 1693, 1415, 1141 cm-1.ESI-TOF HRMS m/z 468.1569 (M+H+, C26H26ClNO5の計算値468.1572).
【００７６】
ｔｅｒｔ−ブチル１０−（クロロメチル）−５−メチル−４−オキソ−９，１０−４Ｈ−ピロロ［３’，２’：５，６］ナフト［１，８−デ］［１，２］オキサジン−８（５Ｈ）−カルボキシレート（化合物１２）
無水ＣＨ2Ｃｌ2（８．５ｍＬ）中のカルボン酸化合物９（１９９ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ）を０℃にて、（ＣＯＣｌ）2（４２μＬ、０．５１０ｍｍｏｌ）で処理した。ＤＭＦを１適加え、反応混合物を１時間撹拌した。１時間後、ＭｅＮＨＯＨ−ＨＣｌ（１７７ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ3Ｎ（０．２９ｍＬ、２．１３ｍｍｏｌ）、３滴のＨ2Ｏ、およびＴＨＦ（２１．３ｍＬ）の予混合溶液をカニューレにより添加した。添加完了後、反応混合物が室温まで昇温するまで１時間置いた。反応混合物を減圧条件下で濃縮した後、２ＮのＨＣｌ水溶液で希釈した。水相をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。有機抽出物を結合し、Ｈ2Ｏ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。粗固体（２０９ｍｇ、９９％）を、さらなる精製を加えずにそのまま使用した。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４９７．１８５４  （Ｍ＋Ｈ+、Ｃ27Ｈ29ＣｌＮ2Ｏ5は４９７．１８３８が必要）。
【００７７】
Ｎ−メチルヒドロキサム酸化合物１０（２０９ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で無水ＣＨ3ＯＨ（８．４ｍＬ）に溶解した。１０％のＰｄ／Ｃ（４４ｍｇ、０．００４２ｍｍｏｌ）を添加し、大気をＨ2と入れ替えた。反応混合物を２５℃で１時間撹拌した。反応混合物をＥｔ2Ｏで希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）で濾過し、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、ＥｔＯＡｃ溶離）により精製し、化合物１１（７８ｍｇ、４５％）をオレンジ色の泡沫として得た。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４０７．１３６７（Ｍ＋Ｈ+、Ｃ20Ｈ23ＣｌＮ2Ｏ5は４０７．１８６８が必要）。
【００７８】
無水ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍＬ）中で−７８℃にて撹拌した（ＣＯＣｌ）2溶液（２４μＬ、０．２８０ｍｍｌ）を、３ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2を滴下したＭｅ2ＳＯ（４４μＬ、０．５７０ｍｍｏｌ）で処理した。１０分後、１２ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の化合物１１（７８ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）を滴下した。添加後、反応混合物が−１０℃まで昇温するまで２時間置いた。反応物に飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液を加えて急冷し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶離）により精製し、化合物１２（１２．７ｍｇ、１７％）を明るい黄色の固体として得た。1H NMR (アセトン-d6, 600 MHz)δ7.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.77 (br, 1H), 6.63 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.21 (m, 2H), 4.14 (m, 1H), 4.00 (dd, J = 11.1, 3.6 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 8.4, 11.4 Hz, 1H), 3.56 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).13C NMR (アセトン-d6, 150 MHz)δ161.8, 153.7, 153.3, 144.8, 131.2, 130.0, 127.9, 123.9, 121.6, 118.5, 118.1, 99.2, 82.7, 54.7, 48.7, 45.5, 36.2, 29.5.IR (フィルム) νmax 2978, 1702, 1404, 1141 cm-1.ESI-TOF HRMS m/z 389.1268 (M+H+, C20H21ClN2O4の計算値389.1263).
【００７９】
エナンチオマーを、準調製用Ｄｉａｃｅｌ社製ＣｈｉｒａｌＣｅｌ（登録商標）ＯＤカラム（０．４６ｃｍ×２５ｃｍ）上で５％のｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン溶離により分割した。α＝１．１４
（１Ｓ）−１２：［α］23D−３５（ｃ１．２２、ＴＨＦ）、天然エナンチオマー。
（１Ｒ）−１２：［α］23D＋４０（ｃ０．４２、ＴＨＦ）、非天然エナンチオマー。
【００８０】
Ｎ−（２−（１０−（クロロメチル）−５−メチル−４−オキソ−５，８，９，１０−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３’，２’：５，６］ナフト［１，８−デ］［１，２］オキサジン−８−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（化合物６）
Ｎ−メチルオキサジノン化合物１２（６．８ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ中の４ＮのＨＣｌに溶解し（０．５ｍＬ）、混合物を室温で１５分間撹拌させた。溶媒を窒素流下で除去し、残留物を無水ＤＭＦ中に再溶解した（０．３４ｍＬ）。ＥＤＣＩ（１０．０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）および化合物１６（６．１ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２５℃で２０時間撹拌させた。反応物にＨ2Ｏを添加して急冷し、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を、２ＮのＨＣｌ水溶液（３回）、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（５回）および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。有機抽出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、４０％のＴＨＦ／トルエン）により精製し、化合物６（５．７ｍｇ、５６％）を黄色の固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ11.84 (s, 1H), 11.73 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.21 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.09 (br, 1H), 7.90 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.74 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.50-7.47 (m, 2H), 7.43 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.21 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.91 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 4.65 (dd, J = 11.4, 2.4 Hz, 1H), 4.39 (m, 1H), 4.09-4.04 (m, 1H), 4.03-4.01 (m, 1H), 3.58 (s, 3H).13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz) 160.3, 159.5, 159.4, 150.1, 142.9, 136.6, 133.4, 131.77, 131.70, 130.6, 128.5, 128.4, 127.04, 127.02, 126.9, 123.4, 121.5, 121.3, 120.5, 119.7, 119.5, 118.2, 117.0, 112.8, 112.27, 112.24, 106.2, 103.3, 98.9, 54.9, 47.5, 40.7, 34.9.ESI-TOF HRMS m/z 590.1592 (M+H+, C33H24ClN5O4の計算値590.1589).
(1S)-6: [α]23D +54 (c 0.38, THF), 天然エナンチオマー.(1R)-6: [α]23D -57 (c 0.24, THF), 非天然エナンチオマー.
【００８１】
ｔｅｒｔ−ブチル１０−（クロロメチル）−４−オキソ−９，１０−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３’，２’：５，６］ナフト［１，８−デ］［１，２］オキサジン−８（５Ｈ）−カルボキシレート（化合物１５）
無水ＴＨＦ（２．０ｍＬ）中のカルボン酸化合物９（１９１ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を２５℃にて、ＣＤＭＴ（７８．０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１３４μＬ、１．２２ｍｍｏｌ）で処理した。２時間後、２．０ｍＬのＤＭＦ中のＮＨ2ＯＨ−ＨＣｌ（３１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６時間撹拌した。６時間後、反応混合物をＨ2Ｏを加えて急冷し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。有機層を結合し、２ＮのＨＣｌ水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶離）により精製し、ヒドロキサム酸（１３０ｍｇ、９３％のＢＲＳＭ）を明褐色の泡沫として得た。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４８３．１６７７（Ｍ＋Ｈ+、Ｃ26Ｈ27ＣｌＮ2Ｏ5は４８３．１６８１が必要）。
【００８２】
ヒドロキサム酸（１３０ｍｇ）を、アルゴン雰囲気下で無水ＣＨ3ＯＨ（３．３６ｍＬ）に溶解した。１０％のＰｄ／Ｃ（２８．６ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を添加し、大気をＨ2と入れ替えた。反応混合物を２５℃で５０時間撹拌した。反応混合物をＥｔ2Ｏで希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）で濾過し、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、ＥｔＯＡｃ溶離）により精製し、化合物１３（４６ｍｇ、５６％のＢＲＳＭ）をオレンジ色の泡沫として得た。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ３９３．１２０８（Ｍ＋Ｈ+、Ｃ19Ｈ21ＣｌＮ2Ｏ5は３９３．１２１２が必要）。
【００８３】
無水ＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）中で−７８℃にて撹拌した（ＣＯＣｌ）2溶液（１４．７μＬ、０．１７５ｍｍｌ）を、２ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2を滴下したＭｅ2ＳＯ（２７．３μＬ、０．３５１ｍｍｏｌ）で処理した。１０分後、６ｍＬの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の化合物１３（４６ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を滴下した。添加後、反応混合物が−１０℃まで昇温するまで２時間置いた。反応混合物に飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液を加えて急冷し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶離）により精製し、化合物１５（９ｍｇ、２７％）を黄褐色の固体として得た。1H NMR (アセトン-d6, 600 MHz)δ8.04 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.79 (br, 1H), 7.66 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.22-4.16 (m, 3H), 4.01 (dd, J = 11.1, 3.6 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 8.1, 11.4 Hz, 1H), 1.57 (s, 9H).13C NMR (THF-d8, 150 MHz)δ161.9, 153.5, 152.8, 144.2, 130.5, 129.0, 126.5, 122.4, 118.9 118.3, 116.1, 98.0, 81.6, 53.9, 47.3, 42.3, 28.6.IR (フィルム) νmax 2920, 1660, 1409, 1139, 758 cm-1.ESI-TOF HRMS m/z 375.1120 (M+H+, C19H19ClN2O4の計算値375.1106).
【００８４】
エナンチオマーを、準調製用Ｄｉａｃｅｌ社製ＣｈｉｒａｌＣｅｌ（登録商標）ＯＤカラム（０．４６ｃｍ×２５ｃｍ）上で１５％のｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン溶離により分割した。α＝１．１９。
（１Ｓ）−１５：［α］23D−１７（ｃ０．３９、ＴＨＦ）、天然エナンチオマー。
（１Ｒ）−１５：［α］23D＋１９（ｃ０．３０、ＴＨＦ）、非天然エナンチオマー。
【００８５】
ペルフルオロフェニル  ５−（１Ｈ−インドール−２−カロボキサミド）−１Ｈ−インドール−２−カルボキシレート（化合物１７）
化合物１６（２０ｍｇ、０．０６２ｍｍｌ）、Ｃ6Ｆ5ＯＨ（１７．２ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（３５．５ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌを結合し、ＤＭＦ（０．６２ｍＬ）で懸濁し、混合物を２５℃にて３時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ2Ｏで洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。化合物１７（２５ｍｇ、８３％）を黄褐色固体として単離した。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ12.44 (s, 1H), 11.72 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.74 (dd, J = 10.8, 1.8 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.22 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.08 (t, J = 7.8 Hz, 1H).13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δ159.5, 156.9, 141.6, 139.9, 138.3, 136.6, 135.6, 132.5, 131.6, 127.0, 126.4, 124.2, 123.5, 123.2, 121.6, 121.5, 119.7, 112.89, 112.88, 112.2, 111.9, 103.4.IR (フィルム) νmax 3360, 3256, 1721, 1646, 1515, 994 cm-1.ESI-TOF HRMS m/z 486.0890 (M+H+, C24H12F5N3O3の計算値486.0872).
【００８６】
Ｎ−（２−（１０−（クロロメチル）−４−オキソ−５，８，９，１０−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３'，２'：５，６］ナフト［１，８−デ］［１，２］オキサジン−８−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（化合物７）
化合物１５（３．２ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ中の４ＮのＨＣｌに溶解し（０．３ｍＬ）、混合物を室温で１０分間撹拌させた。溶媒を窒素流下で除去し、残留物を無水ＤＭＦ中に再溶解した（０．２ｍＬ）。Ｅｔ3Ｎ（５．９μＬ、０．０４２ｍｍｏｌ）および化合物１７（４．９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２５℃で２０時間撹拌させた。反応物にＨ2Ｏを添加して急冷し、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、４０％のＴＨＦ／トルエン）により精製し、化合物７（１．０７ｍｇ、２２％）を黄色の固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ11.83 (s, 1H), 11.73 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.16 (br, 1H), 8.02 (br, 1H), 7.71 (br, 1H), 7.68 (d, J = 18 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 9.3, 2.4 Hz, 1H), 7.49-7.46 (m, 2H), 7.43 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.21 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 9Hz, 1H), 4.64 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.35 (br, 1H), 4.08-3.99 (m, 2H).13CNMR (DMSO-d6, 150 MHz) 161.9, 160.3, 159.4, 143.2, 136.6, 133.4, 131.8, 131.7, 130.8, 128.6, 128.4, 127.9, 127.0, 124.8, 123.5, 121.6, 119.8, 119.5, 118.3, 112.8, 112.3, 112.2, 106.9, 106.1, 103.3, 98.7, 66.9, 66.5, 54.9, 47.3, 40.7 δ.ESI-TOF HRMS m/z 576.1423 (M+H+, C32H22ClN5O4の計算値576.1433).
(1S)-7: [α]23D  +18 (c 0.06, アセトン), 天然エナンチオマー.
(1R)-7: [α]23D -16 (c 0.07, アセトン), 非天然エナンチオマー.
【００８７】
ｔｅｒｔ−ブチル１，２−ジヒドロ−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−６−（メチルカルバモイル）ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボキシレート（化合物１８）
1H NMR (アセトン-d6, 600 MHz)δ10.66 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.74 (br, 1H), 7.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.21 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.14-4.09 (m, 2H), 3.95 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.68 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 3.01 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δ171.5, 154.7, 151.5, 141.7, 135.5, 130.6, 126.1, 123.1, 122.2, 117.0, 113.3, 99.6, 80.2, 52.3, 47.6, 40.2, 28.0, 26.1.IR (フィルム) νmax 2924, 1697, 1615, 1539, 1403, 1327, 1137, 760 cm-1.ESI-TOF HRMS m/z 391.1422 (M+H+, C20H23ClN2O4の計算値391.1419).
【００８８】
３−（５−（１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）−１Ｈ−インドール−２−カルボニル）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−１，２−ジヒドロベンゾ−［ｅ］インドール−６−カルボキサミド（化合物１９）
化合物１８（１５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ中の４ＮのＨＣｌに溶解し（１ｍＬ）、混合物を室温で１５分間撹拌させた。溶媒を窒素流下で除去し、残留物を無水ＤＭＦ中に再溶解した（０．７６ｍＬ）。ＥＤＣＩ（２１．９ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）および化合物１６（１４．６ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２５℃で２２時間撹拌させた。反応物にＨ2Ｏを添加して急冷し、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を、２ＮのＨＣｌ水溶液（３回）、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（５回）および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。有機抽出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧条件下で濃縮した。残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、４０％のＴＨＦ／トルエン）により精製し、化合物１９（７．１ｍｇ、３１％）を濃黄色の固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ11.74 (d, J = 16.2 Hz, 2H), 10.48 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.07-8.06 (m, 1H), 7.95 (br, 1H), 7.90 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.50-7.47 (m, 2H), 7.43 (s, 1H), 7.24-7.18 (m, 3H), 7.07 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 10.2 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.01 (d, J = 9 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 7.2, 10.8 Hz, 1H), 2.77 (s, 3H).13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δ171.2, 159.7, 159.1, 154.0, 142.2, 136.3, 135.3, 132.9, 131.5, 131.2, 130.8, 130.0, 126.74, 126.72, 125.9, 123.3, 123.1, 122.7, 121.2, 119.4, 118.9, 117.7, 114.9, 112.5, 112.0, 111.8, 105.4, 103.0, 101.4, 54.5, 47.3, 40.8, 25.9.IR (フィルム) νmax 3293, 2953, 1613, 1516, 1402, 1241, 1138 cm-1.ESI-TOF HRMS m/z 592.1744 (M+H+, C33H26ClN5O4の計算値592.1746).
【００８９】
３−（５−（１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）−１Ｈ−インドール−２−カルボニル）−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−６−カルボキサミド（化合物２０）
【化２８】
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【００９０】
化合物１８（１１．３ｍｇ、２８μｍｏｌ）を０．６ｍＬのアセトニトリル中で、１，８−ジアザビシクロ−［５．４．０］ウンデス−７−エン（ＤＢＵ、１２．９μＬ、０．０８６ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で９０分間撹拌させた。９０分後、溶媒を減圧条件下で蒸発させ、残留物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ2、ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物２０（１．５ｍｇ、収率１５％）を黄色の泡沫として得た。1H NMR (アセトン-d6, 600 MHz)δ7.48 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.78 (br, 1H), 6.65 (br, 1H) 4.05-3.99 (m, 2H), 3.03 (m, 1H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 1.64 (dd, J = 7.2, 4.2 Hz, 1H), 1.52 (s, 9H), 1.49 (t, J = 4.2 Hz, 1H).13C NMR (アセトン-d6, 150 MHz)δ185.5, 172.6, 153.1, 142.7, 140.7, 132.6, 131.3, 127.5, 123.8, 109.5, 101.2, 83.8, 54.5, 35.0, 33.3, 29.0, 27.5, 25.4.ESI-TOF HRMS m/z 355.1656 (M+H+, C20H22N2O4の計算値355.1652).
【００９１】
ＤＮＡアルキル化に関する研究
ＤＮＡアルキル化アッセイについて詳しくはBoger et al., Tetrahedron 1991, 47:2661-2682を参照のこと。ＤＮＡアルキル化反応を、２５℃にて、天然物向けの単一の主要アルキル化部位を含有する５’−32Ｐ末端標識化ｗ７９４ＤＮＡを使用して実施した。化合物（＋）−７および（＋）−３ｃのグルタチオン還元活性化を、指定された時間について、３７℃にて１ＭのＬ−グルタチオンを使用して実施した。
【００９２】
細胞増殖阻害アッセイ
Ｌ１２１０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１９）マウスのリンパ性白血病細胞について、化合物による細胞増殖阻害を試験した。細胞群（血球系での判定通り、１ｍＬ当たり１×１０6超）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を含有する適量の、最終濃度が１ｍＬ当たり細胞３０，０００個となる、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修正型Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）で希釈した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）社製Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））の各ウェルに、細胞培地溶液を１００μＬずつ、マルチチャンネルピペットを使用して添加した。培養物を３７℃にて、５％のＣＯ2と９５％の加湿空気から成る雰囲気中で２４時間培養した。試験化合物を以下の通り、プレートに添加した：試験物質をＤＭＳＯ中で１ｍＭの濃度まで希釈し、１０倍連続希釈を、別々の９６ウェルプレート上で実施した。新しい培養物培地（１００μＬ）を、細胞の各ウェルに添加して、ウェル毎に培地が２００μＬとなるようにし、続いて各試験試薬を２μＬ添加した。化合物の試験を複数回（２回以上）、０〜１００ｎＭまたは０〜１０００ｎＭの範囲で６通りの濃度で実施した。添加後、培地をさらに７２時間培養した。
【００９３】
ＩＣ50の値を設定するため、ホスファターゼアッセイを以下の通り実施した：各細胞中の培地を除去し、ホスファターゼ溶液１００μＬ（３０ｍＬの０．１ＭのＮａＯＡｃ中に１００ｍｇのホスファターゼ基質、ｐＨ５．５、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００緩衝液）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃にて５分間培養した。所定の培養時間経過後、０．１ＮのＮａＯＨを５０μＬずつ各ウェルに添加し、４０５ｎｍでの吸収を９６ウェルプレート読取装置を使用して判定した。吸収は生存細胞数に直接比例することを基に、ＩＣ50の値が計算され、報告される値は４回以上の判定の平均値を表す（標準偏差±１０％）。
【００９４】
生体内抗腫瘍活性
０日目に、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスに同系Ｌ１２１０細胞（１×１０6）を腹腔内（i.p.）注射した。１０匹のマウスを無作為に選び、化合物（＋）−４および（＋）−６の対照賦形剤群または治療群へ割り当て、用量は化合物（＋）−４については注射１回当たり６０、１００、２５０および５００μｇ／ｋｇ、化合物（＋）−６については注射１回当たり６０、２００、５００，１０００および２５００μｇ／ｋｇであった。化合物（＋）−４と（＋）−６は１００％ＤＭＳＯで配合された。いずれの化合物も１日目、５日目および９日目に腹腔内（i.p.）注射された。腫瘍細胞注射後、動物のモニタリングを毎日行い、週２回、体重を測定した。治療群と対照群の生存率（Ｔ／Ｃ）は、各治療群における総生存日数を対照群の総生存日数で割り、商に１００を掛けた値とした。動物試験はすべて、カンザス大学医療センター（ＫＵＭＣ）の動物施設において、ＫＵＭＣのＩＡＣＵＣ動物福祉委員会のガイドラインを厳格に順守して行われた。（ＩＡＣＵＣ承認第２００９−１８３７号）。
【００９５】
本発明で引用される特許、特許出願および文献はそれぞれ、参照により組み入れられる。
【００９６】
上記の説明および例は例示目的であり、限定的と解釈されるべきではない。本発明の精神と目的の範囲内でさらに他の変形が考えられ、当業者にとっては容易に自明となる。
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際調査報告】
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