(57)【要約】局在術中超音波マーキング；全身注射による腫瘍検出；および腫瘍のナノシェル促進超音波切除のための分解性シリカナノシェルを使用する方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミンまたはポリカルボン酸官能性付与表面層を含む分解性ナノ鋳型と、
式Ｉ：
【化１】
2016505475.tif 000009
式中、Ｒ１−Ｒ４は、Ｈ、Ｄ、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルケニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルケニル、置換もしくは無置換の複素環、置換もしくは無置換のアリール、置換もしくは無置換の混合環系、置換もしくは無置換のアルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、エーテル、アミノ、カルボキサミド、ケチミン、アルジミン、イミド、アゾ、アジド、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロ、ニトロソ、チオール、スルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスフェート、ボロナート、ボロノ、ボリノおよびシリルエーテルからなる群より独立して選択され；
Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも１つは、置換もしくは無置換のアルコキシであり、かつ
Ｒ１−Ｒ４のうちの３つがメトキシ基である場合、第４のＲ基は、Ｄ、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルケニル、置換もしくは無置換の複素環、置換もしくは無置換のアリール、置換もしくは無置換の混合環系、置換もしくは無置換の（Ｃ２−Ｃ１８）アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、エーテル、アミノ、カルボキサミド、ケチミン、アルジミン、イミド、アゾ、アジド、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロ、ニトロソ、チオール、スルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスフェート、ボロナート、ボロノ、ボリノおよびシリルエーテルからなる群から選択される
の構造を含む化合物の層とを含むナノ構造体。
【請求項２】
Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも２つが置換もしくは無置換のアルコキシ基である請求項１記載のナノ構造体。
【請求項３】
Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも３つが置換もしくは無置換のアルコキシ基である請求項１記載のナノ構造体。
【請求項４】
Ｒ１−Ｒ３が置換もしくは無置換のアルコキシ基であり、Ｒ４は置換もしくは無置換の（Ｃ２−Ｃ１８）アルコキシ基である請求項１記載のナノ構造体。
【請求項５】
前記分解性ナノ鋳型がポリアミン官能性付与表面層を含むか、前記ポリアミンがポリマー骨格上に第１級アミン基を有するアミノ酸もしくは脂肪族アミンのホモポリマーであるか、または前記ナノ鋳型がカチオン頭部基を有するカチオン性ポリマーもしくは分子アンカーを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項６】
前記ポリアミンが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンおよびポリオルニチンである請求項５記載のナノ構造体。
【請求項７】
前記脂肪族アミンがポリエチレンイミンである請求項５記載のナノ構造体。
【請求項８】
前記分解性ナノ鋳型が、ポリアミンもしくはポリカルボン酸官能性付与ポリスチレンまたはラテックス表面層を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項９】
前記ナノ鋳型が、１０ｎｍ〜３０００ｎｍの大きさである請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項１０】
前記層が、鉄(III)エトキシドをさらに含む請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項１１】
前記ナノ構造体が高温で焼成されて、中空シリカナノ構造体または中空シリカ鉄ナノ構造体を提供するように前記ナノ鋳型を分解する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項１２】
前記ナノ構造体が有機溶剤で処理され、中空シリカナノ構造体または中空シリカ鉄ナノ構造体を提供するように、前記ナノ鋳型を溶解する請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項１３】
前記ナノ構造体が中空ナノシェルである請求項１〜１２のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項１４】
前記中空ナノシェルが１０ｎｍ〜３０００ｎｍの直径を有する請求項１３記載のナノ構造体。
【請求項１５】
ペルハロカーボンが前記ナノ構造体に導入されている請求項１１または１２記載のナノ構造体。
【請求項１６】
前記ペルハロカーボンが、液体または気体のペルフルオロカ―ボン（ＰＦＣ）である請求項１５記載のナノ構造体。
【請求項１７】
対象における腫瘍をイメージングする方法であって、
前記対象に請求項１〜１６のいずれか１項に記載のナノ構造体を投与すること、および
超音波により前記ナノ構造体を検出することにより、腫瘍をイメージングすること
を含む方法。
【請求項１８】
対象における腫瘍を治療する方法であって、
請求項１５または１６記載のナノ構造体を前記対象に投与すること、
前記腫瘍を損傷するように強力集束超音波（ＨＩＦＵ）を使用することにより前記腫瘍内に位置するナノ構造体を加熱すること、
を含む方法。
【請求項１９】
腫瘍内の前記ナノ構造体における前記ペルフルオロカ―ボン液を合体させ、ＨＩＦＵにより気泡を形成することをさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が悪性腫瘍である請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ポリスチレンまたはラテックスビーズをポリアミン、ポリアミノ酸、カチオン性ポリマーまたはカチオン頭部基を有する分子アンカーと溶液中で混合し、分解性ナノ鋳型を形成すること；
アルコキシシランが分解性ナノ鋳型の表面上に積層されるように、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラアルコキシシランを溶液に添加すること、
を含む請求項１記載のナノ構造体を製造する方法。
【請求項２２】
前記ポリアミンのポリスチレンビーズに対する比が１：１から１０：１ｖ／ｖまでであることを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
鉄(III)エトキシド／トリメチルホウ酸が前記溶液に添加される請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
遠心分離を用いることにより、前記ナノ構造体を水溶液から単離すること；
アルコール系溶媒を用いて前記ナノ構造体を洗浄すること；
遠心分離により前記ナノ構造体を回収すること、
真空下で前記ナノ構造体を乾燥することをさらに含む請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ナノ構造体を中空シリカナノ構造体または中空シリカ鉄ナノ構造体を得るために焼成することをさらに含む請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１１、１２、１５または１６記載の中空シリカナノ構造体。
【請求項２７】
請求項２５記載の方法によって作製された中空シリカナノシェル。
【請求項２８】
前記ナノシェルが多孔質である請求項２６または２７記載の中空シリカナノシェル。
【請求項２９】
前記ナノシェルが約１ｎｍ〜約１００ｎｍの孔を有する請求項２８記載の中空シリカナノシェル。
【請求項３０】
前記ナノシェルが、少なくとも１００ｍ２／グラム〜１０００ｍ２／グラムの表面積を有する請求項２９記載の中空シリカナノシェル。
【請求項３１】
前記ナノシェルが、テトラアルコキシシランまたは無置換のトリアルコキシシランを用いて作製されたナノシェルと比較して、より脆弱である請求項２８記載の中空シリカナノシェル。
【請求項３２】
前記ナノシェルが、液体または気体のペルフルオロカーボン充填ナノシェルである請求項２６または２７記載の中空シリカナノシェル。
【請求項３３】
前記中空シリカナノシェルが、標的組織への中空シリカナノシェルの静脈内送達または直接送達の両方において、Ｂモードおよび造影超音波のために、ＨＩＦＵによって活性化できる請求項３１または３２記載の中空シリカナノシェル。
【請求項３４】
前記中空シリカナノシェルの存在が、定方向イメージングおよび切除治療のためのＨＩＦＵの活性化により検出できる請求項３１または３２記載の中空シリカナノシェル。
【請求項３５】
がんまたは腫瘍をイメージングする方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象に、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を投与すること；および
対象を超音波イメージング画像化すること、
を含み、ＨＳＮが検出可能な信号を発信し、かつＨＳＮが前記腫瘍またはがんの部位に集中する方法。
【請求項３６】
前記ＨＳＮに、気体または液体のペルフルオロカーボンが充填されている請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記ＨＳＮに鉄がドープされている請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ＨＳＮの直径が約１０〜３０００ｎｍである請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
がんまたは腫瘍を治療する方法であって、
がんまたは腫瘍を有する対象に、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を投与すること；および
ＨＳＮに前記腫瘍またはがんの部位で熱を発生させ、それによって腫瘍またはがん細胞を殺す周波数を、ＨＳＮに接触させること
を含む方法。
【請求項４０】
ＨＳＮのキャビテーションおよび破裂を生じる周波数をＨＳＮに接触させることをさらに含む請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＳＮに、気体または液体のペルフルオロカーボンが充填されている請求項３９または４０記載の方法。
【請求項４２】
過形成組織に請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルを投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍の過形成組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触させることを含む過形成を治療する方法。
【請求項４３】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルを固形腫瘍組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触させること、任意には、液化した組織を除去し、液化した組織の場所に治療薬を送達することを含む肝臓がんを治療する方法。
【請求項４４】
前記治療薬が、化学療法薬、リポソーム製剤、腫瘍崩壊ウィルスまたはそのいずれかの組み合わせを含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルを子宮筋腫組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍の子宮筋腫組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触させることを含む子宮筋腫を治療する方法ことを特徴とする、方法。
【請求項４６】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルを乳房組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがんまたは子宮筋腫組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触させることを含む乳がんまたは乳腺線維嚢胞症を治療する方法。
【請求項４７】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルを胸部組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触させることを含む前立腺癌を治療する方法。
【請求項４８】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルをがん組織に投与することと、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触することを含む頭部および頸部がんを治療する方法。
【請求項４９】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のナノシェルをがん組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーをナノシェルに接触することを含む腎細胞がん腫を治療する方法。
【請求項５０】
前記液化組織を除去する請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記液化組織が存在した空洞に治療薬を注入する請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記治療薬が化学療法薬、リポソーム製剤、腫瘍崩壊ウィルスまたはそのいずれかの組み合わせを含む請求項５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１２年９月２８日付で出願された米国特許仮出願第６１／７０７，７９４号および２０１３年７月１２日付で出願された米国特許仮出願第６１／８４５，７２７号に基づき、米国特許法第１１９条に規定された優先権を主張するものであり、参照することによりその開示が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本開示は、ナノ構造体ならびにその作製方法および使用方法に関する。特に、本開示は、薬物送達、イメージング、遺伝子導入、がん治療および検出に有用な中空ナノシェルを提供する。
【背景技術】
【０００３】
スクリーニングのための現在の標準的な超音波技術は、腫瘍によりって５〜１０ｍｍの大きさのものを確実に検出可能である。腫瘍をより早い時期に検出することにより、外科医は、より少量の組織を切除するだけでよくなり、患者にとっても、再発しにくくなる。外科的切除は、現在でも、再発、進行、最終的には病気の拡がりを防止するために、乳癌などの大部分の固形臓器がんに対して最も有効な治療である。従って、小さな腫瘍を正確に同定し、場所を突き止める必要性が増している。
【０００４】
乳癌に対しては、複数の大規模な前向き無作為化研究において、マンモグラフィスクリーニングが死亡率を１５〜２５％減少させることが示されている。このデータは、スクリーニング確度のさらなる向上が、生存率を増加させ得ることを示唆している。マンモグラフィの感度は、Ｘ線写真上、高密度乳房組織における非石灰化腫瘤に対しては低くなる。北米では、乳房超音波検査は、ほとんどの場合、触診またはマンモグラフィに基づいて気になる部分に限定される標的検査である。ＭＲＩは、ハイリスクの女性をスクリーニングすること、シリコーンインプラントを評価すること、恐らくはネオアジュバンド化学療法に対する反応をモニタすることについては極めて有益である。ＭＲＩは、乳房温存療法（ＢＣＴ）に対する患者の適格性を決定するために手術前に採用され始めている。残念ながら、乳房温存の転帰の改善についての手術前ＭＲＩの利点は証明されていない。さらに、手術前ＭＲＩは、生検を増やし、乳房切除率を増大させる偽陽性率が比較的高い、費用のかかる処置である。現在は、乳房全体の超音波スクリーニングは直径が〜１０ｍｍの腫瘍を確実に検出することが可能である。マンモグラフィーや標準的な超音波検査（超音波（ＵＳ））による評価後もなお疑わしい病変に対しては、造影超音波検査（ＣＥＵＳ）が問題解決法であると想定されている。
【０００５】
強力集束超音波（ＨＩＦＵ）は、温度を局所的に上げて腫瘍を局所的に加熱して切除するために採用されている。ＨＩＦＵは、大半の放射線技術と比較して、腫瘍外部の損傷を最小限に抑える低侵襲療法であり、しかもかなりの低コストである。ＨＩＦＵ中のガイドのため、および腫瘍の温度をモニタするために、ＭＲＩがしばしば採用される。ＨＩＦＵはまた、超音波補助局所薬物送達のためにも用いられる。例えば、腫瘍の近傍で薬物担持リポソームを破壊するためにＨＩＦＵを用いることができる。現在、米国では、ＨＩＦＵは、子宮筋腫を治療するために認可されているが、国際的には、様々な種類のがんを治療するためにも用いられている。ＨＩＦＵ療法は、他の種類の放射線よりも利点がある。その理由は、超音波エネルギーは、腫瘍とトランスデューサとの間の組織には蓄積効果がなく、そのためその同じ腫瘍に多くの治療を可能とするからである。これは、前立腺がんなどの転移性および持続性の難しい癌をコントロールするのに特に有用である。造影超音波検査（ＣＥＵＳ）は、ＨＩＦＵと共に用いて、ＨＩＦＵの間の出力（メカニカルインデックス）を低下させる。従来のＨＩＦＵ−ＣＥＵＳは、ＣＥＵＳ造影剤（従来の微小気泡）の継続投与を必要とする。なぜなら、ＣＥＵＳ造影剤は、腫瘍内で良好に保持されず、ＨＩＦＵ治療は非常に時間がかかるからである。
【発明の概要】
【０００６】
乳癌のワイヤ限局切除手術から報告された断端陽性率は約２０〜５０％で、それにより二度目の手術（再切除）を必要とする。しかし、手術前にＣＴのガイド下で放射性シードを腫瘍に注入すると、検体の中心に放射性シードが位置するように外科医が切除の方向を常に再設定できるので、再切除率は半減する。残念ながら放射性シードを局在させることには安全面で困難があり、単一の病巣にしか局在させられず、放射性シードを埋め込むために切開が必要であるため、めったに用いられない。安全な代替物として、本開示は、気体充填中空鉄ドープシリカ粒子を提供し、それは超音波をガイドとする複数の病巣の外科手術にさえ使用できる。鉄ドープの機能はシリカシェルを生分解性にすることである。この粒子はゾルゲル法でポリスチレン鋳型上に合成され、ついで中空で固いミクロシェルまたはナノシェルを作るために焼成される。鉄ドープされたシリカシェルはオルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）と鉄（III）エトキシドから得られ、焼成によって固いメソ多孔性のシェルを形成する。このミクロシェルまたはナノシェルは、ペルフルオロペンタン（ＰＦＰ）の蒸気または液体で充填されている。フルオラス相は水溶性が極めて低いために多孔性のシェル内に包含されている。粒子の官能性、信号持続性および音響特性の試験が、超音波用ゲル、トリ胸肉、ヒトの乳腺切除組織などを含む様々なファントムで何度も行われた。インビトロ研究では、連続的な粒子画像化時間が約４５分間に達し、５日以上持続するとみられた。また、生体中への粒子注入持続性の研究がマウスの腫瘍モデルで行われ、注入後１０日間信号が存在することを示して、インビトロ研究データと一致した。このシリカ球体は強力集束超音波（ＨＩＦＵ）の感作物質としても使用され得る。従来の超音波造影剤は軟らかい殻（例えば、アルブミン）に包まれた気泡を基にしたもので、生体内での残留性（分）が低く、連続灌流中のリスクが高い（心臓圧迫）といういくつかの潜在的欠点がある。寒天組織のファントムモデル中でのＨＩＦＵ切除における予備インビトロ試験の結果は、ＨＩＦＵに対する感作効果を発現させるには、ごくわずかの粒子（粒子径によるが、寒天１ｍｌに対し約１〜１０μｇの粒子）で充分であることを示している。また本開示は、液体ペルフルオロカーボンを粒子に充填する技術も提供し、この液体ペルフルオロカーボンは、ＨＩＦＵに曝露されると気化し、それによって気体充填粒子と比較して感度をより増加させる。
【０００７】
本開示は、以下からなる方法と組成物を提供する。（１）静脈注射で腫瘍を見つけ出すために純粋シリカと生分解性鉄ドープシリカナノシェルが使用できる。シリカシェルは末期の腫瘍に集積する傾向があるため、単回急速静注法で腫瘍の検知ができる。既存技術は、腫瘍の画像化に血流の動態を使う目的で、造影超音波用の軟粒子を注入することに依存している。シリカシェルはその代りに腫瘍中に単に保持されて、その存在だけが腫瘍の存在を示すのに使われる。（２）ナノシェル促進超音波切除術１：強力集束超音波（ＨＩＦＵ）は、現在米国で子宮筋腫の治療に使用されている（閉経後の女性の３０％は子宮筋腫がある）。またカナダと英国では前立腺がん、肝臓がん、およびその他の固形がんの治療にも使用されている。従来の超音波造影剤は、より低い出力でより速く治療し、望ましくないまたは目標からそれた熱損傷を避けるためによく使用される。造影剤を使わないＨＩＦＵは、腫瘍中の組織温度を５０〜９０℃まで上げて効果を出す。造影剤を使うとＨＩＦＵによる治療を改善する少なくとも二つの追加的な効果がある。先ず、造影剤は超音波を減衰させて造影剤の存在部分に堆積された局所的な熱を増加させる。次に、キャビテーションを起こす造影剤は血管系を含む組織に機械的損傷を与えるため、ＨＩＦＵは腫瘍も攻撃する。従来のＨＩＦＵ用造影剤は、組織に保持されず循環時間が短かったため、連続的に注入する必要があった。シリカナノシェルは数時間循環し続け、末期の腫瘍に選択的に保持される。このことは単回注入のみならず治療時間の短縮も可能にし、リスクをかなり低くする。（３）ナノシェル促進超音波切除術２：実験によると５００ｎｍ径のナノシェルは液体ペルフルオロカーボンで充填できる。この液体充填によって高出力超音波がナノシェルを合体させて１ｍｍ径の気泡に変換させる新しい用途が可能になる。このことにより、この粒子を腫瘍への血管供給をふさぐために使用することが可能になる。液体充填された５００ｎｍ径のナノシェルが高出力超音波によって多数の１ｍｍ径の気泡に変換され得ることを示すデータが得られている。（４）画像化モード：本開示は、この粒子を組織に５０マイクロリットル注入しただけでカラードップラー超音波による画像化において高度な造影能があることを示す。
【０００８】
他の実施形態において、本開示の組成物と方法はナノシェル促進超音波切除術（ＨＩＦＵ）と、ウィルス療法またはリポソームもしくははポリマー製剤、または化学療法剤の投与との組み合わせを含む。この実施形態では、薬剤の投与は、（ａ）局所的：超音波との相互作用によるキャビテーションと破裂に続く本開示のナノシェル組成物によるキャビテーションで誘発される機械的切除によって液状化された組織の空洞への治療薬の送達、または（ｂ）全身的：切除治療の後に起こる炎症反応による、病巣切除部での腫瘍崩壊ウィルス、抗体治療、あるいは化学療法剤の送達と保持の促進、である。
【０００９】
他の実施形態において、ナノシェルとＨＩＦＵによる「組織の穴あけ」が液体または気体のペルフルオロカーボンを充填した本開示のナノシェルによって行われ、ＨＩＦＵの使用がナノシェルのメカニカルキャビテーションを起こして注入部分の組織を液状化する。液状化組織はバキュームで除去されて空洞ができ、大量の組織を迅速に切除するためには、さらにＨＩＦＵの適用ため追加のナノシェルを繰り返し充填してその空洞を大きく、深くしてすることができる。
【００１０】
さらに他の実施形態においては、極度に長期の生体内超音波イメージングのためにフッ素化トリアルコキシシランで官能性を付与された液体ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）充填ナノシェルからなる長期イメージングマーカーが提供される。フッ素化トリアルコキシシランは粒子を「濡れなく」する。これはペルフルオロカーボンの粒子からの抜けや粒子の分解を防ぐ。
【００１１】
本開示の組成物と方法は、良性前立腺過形成の治療、肝臓がんの組み合わせ治療、子宮筋腫の液状化、乳腺線維嚢胞症の液状化、前立腺がんの治療、乳がんの非外科的治療、頭部と頸部のがんの組み合わせ治療、乳がんおよび前立腺がんに対する長期マーカー、および組織切除が利用できる他の疾患や方法に使用することができる。
【００１２】
本開示は液体ペルフルオロカーボン充填ナノシェルの作製方法を提供する。一実施形態では、ペルフルオロカーボン充填ナノシェルは超音波感応を改善するために様々なアルコキシシランによって官能性を付与される。
【００１３】
また本開示は、対象に本開示のナノシェルを投与すること、およびナノシェルの局在化を同定するために対処うをイメージングすることを含むがんのがんイメージング方法を提供する。
【００１４】
本開示は、本開示のナノシェルを過形成組織に投与し、ナノシェルを充分な量のエネルギと接触させ、破壊およびキャビテーションを引き起こし、そしてナノシェル周辺の過形成組織を充分に液状化することを含む過形成の治療方法を提供する。
【００１５】
本開示は、本開示のナノシェルをがん組織に投与し、充分なエネルギでＨＩＦＵをナノシェルに適用し、破壊およびキャビテーションを引き起こし、ナノシェル周辺のがん組織を充分に液状化し、任意には、液状化組織を除去し、液状化組織の部位に治療薬を送達することを含む固形がんおよび各種のがん（例えば、肝臓がん）の治療方法を提供する。
【００１６】
また本開示は、本開示のナノシェルを子宮筋腫組織に投与し、ナノシェルを充分なエネルギと接触させ、破壊およびキャビテーションを引き起こし、ナノシェル周辺の子宮筋腫組織を充分液状化させることを含む子宮筋腫の治療方法を提供する。
【００１７】
また本開示は、本開示のナノシェルを乳房組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがんまたは乳腺線維腺腫組織を液化するのに充分なエネルギーで、ナノシェルにＨＩＦＵを適用することを含む乳癌または乳腺線維嚢胞症を治療する方法を提供する。
【００１８】
また本開示は、本開示のナノシェルを胸部組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーで、ナノシェルにＨＩＦＵを適用することを含む前立腺がんを治療する方法を提供する。
【００１９】
また本開示は、本開示のナノシェルをがん組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーで、ナノシェルにＨＩＦＵを適用することを含む頭部および頸部がんを治療する方法を提供する。
【００２０】
また本開示は、本開示のナノシェルをがん組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーで、ナノシェルにＨＩＦＵを適用することを含む腎細胞癌腫を治療する方法を提供する。
【００２１】
上記実施形態のいずれにおいても、液化組織を除去することができる。さらなる実施形態においては、液化組織が存在する、または存在した空洞に治療薬を注入することができる。なおさらなる実施形態においては、治療薬が化学療法薬、リポソーム製剤、腫瘍崩壊ウイルス、抗体、タンパク質、ポリペプチド、低分子量薬剤またはそのいずれかの組み合わせを含む。
【００２２】
本開示は、ポリアミンまたはポリカルボン酸により官能性を付与された表面層を含む分解性ナノ鋳型；および式Ｉの構造を含む化合物の層を含むナノ構造体を提供する。    
【化１】
2016505475.tif 000003
式中、Ｒ１−Ｒ４は、Ｈ、Ｄ、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルケニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルケニル、置換もしくは無置換の複素環、置換もしくは無置換のアリール、置換もしくは無置換の混合環系、置換もしくは無置換のアルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、エーテル、アミノ、カルボキサミド、ケチミン、アルジミン、イミド、アゾ、アジド、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロ、ニトロソ、チオール、スルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスフェート、ボロナート、ボロノ、ボリノおよびシリルエーテルからなる群より独立して選択され；Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも１つは、置換もしくは無置換のアルコキシであり、かつＲ１−Ｒ４のうちの３つがメトキシ基である場合、第４のＲ基は、Ｄ、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、置換または無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルケニル、置換もしくは無置換の複素環、置換もしくは無置換のアリール、置換もしくは無置換の混合環系、置換もしくは無置換の（Ｃ２−Ｃ１８）アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、エーテル、アミノ、カルボキサミド、ケチミン、アルジミン、イミド、アゾ、アジド、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロ、ニトロソ、チオール、スルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスフェート、ボロナート、ボロノ、ボリノおよびシリルエーテルからなる群より選択される。他の実施形態では、Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも２つが置換もしくは無置換のアルコキシ基である。別の実施形態では、Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも３つが置換もしくは無置換のアルコキシ基である。さらに他の実施形態では、Ｒ１−Ｒ３は置換もしくは無置換のアルコキシ基であり、Ｒ４は置換もしくは無置換の（Ｃ２−Ｃ１８）アルコキシ基である。先行のいずれかのまた別の実施形態においては、分解性ナノ鋳型が、ポリアミン官能性付与表面層であって、ポリアミンがポリマー骨格上に第１級アミン基を有するアミノ酸または脂肪族アミンのホモポリマーであるポリアミン官能性付与表面層を含むか、またはナノ鋳型が、カチオン性ポリマーもしくはカチオン性頭部基を有する分子アンカーを含む。他の実施形態においては、ポリアミンが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンおよびポリオルニチンからなる群より選択される。他の実施形態においては、脂肪族アミンがポリエチレンイミンである。さらに他の実施形態においては、分解性ナノ鋳型は、ポリアミンまたははポリカルボン酸官能性付与ポリスチレンまたはラテックス表面層を含む。上記のいずれかのなおさらに他の実施形態においては、ナノ鋳型は、１０ｎｍ〜３０００ｎｍの大きさである。上記のいずれかのさらに他の実施形態においては、層は鉄(III)エトキシドをさらに含む。さらなる実施形態においては、ナノ構造体が高温で焼成されて、中空シリカナノ構造体または中空シリカ鉄ナノ構造体を提供するようにナノ鋳型を分解する。他の実施形態においては、ナノ構造体は、有機溶剤で処理され、中空シリカナノ構造体または中空シリカ鉄ナノ構造体を提供するように、ナノ鋳型を溶解する。上記のいずれかの、さらに他の実施形態においては、ナノ構造体は中空ナノシェルである。さらに他の実施形態においては、中空ナノシェルは、１０ｎｍ〜３０００ｎｍの直径を有する。さらに他の実施形態においては、ペルハロカーボンがナノシェル中に導入される。さらに他の実施形態においては、ペルハロカーボンは、液体または気体のペルフルオロカ―ボン（ＰＦＧ）である。
【００２３】
また本開示は、先行のいずれかの実施形態のナノ構造体を対象に投与すること、および超音波によりナノ構造体を検出することにより、腫瘍をイメージングすることを含む対象の腫瘍をイメージングする方法を提供する。
【００２４】
また本開示は、上記実施形態のいずれかのナノ構造体を対象に投与すること、腫瘍に損傷を与えるように強力集束超音波（ＨＩＦＵ）を使用することにより腫瘍内に位置するナノ構造体を加熱することを含む、対象者における腫瘍を治療する方法を提供する。さらに他の実施形態においては、本方法は、腫瘍内のナノ構造体中の液体のパーフルオロカ―ボンを合体させ、ＨＩＦＵにより気泡を形成することを含む。さらに他の実施形態では、腫瘍は悪性腫瘍である。
【００２５】
また本開示は、本開示のナノシェルを含むナノ構造体を製造する方法であって、ポリスチレンまたはラテックスビーズを、溶液中でポリアミン、ポリアミノ酸、カチオン性ポリマーまたはカチオン性頭部基を有する分子アンカーと混合し、分解性ナノ鋳型を形成すること、アルコキシシランが分解性ナノ鋳型の表面上に積層されるように、モノ、ジ、トリ、またはテトラアルコキシシランを水溶液に添加することを含む方法を提供する。一実施形態においては、ポリアミンのポリスチレンビーズに対する比は、１：１〜１０：１ｖ／ｖである。他の実施形態においては、鉄（III）エトキシド／トリメチルホウ酸が溶液に添加される。上記のいずれかのさらに他の実施形態においては、本方法は、遠心分離を利用することにより、ナノ構造体を水溶液から単離すること；アルコール系溶媒を用いてナノ構造体を洗浄すること；遠心分離によりナノ構造体を回収すること；そして真空下でナノ構造体を乾燥することをさらに含む。他の実施形態においては、この方法は、ナノ構造体を焼成して中空シリカナノ構造体または中空シリカ鉄ナノ構造体を得ることをさらに含む。
【００２６】
また本開示は、上記実施形態のいずれかの、または上記方法のいずれかによって開発された中空シリカナノ構造体を提供する。一実施形態においては、中空シリカナノシェルは多孔質である。他の実施形態においては、ナノシェルは約１ｎｍ〜約１００ｎｍの孔を有する。さらに他の実施形態においては、ナノシェルが少なくとも１００ｍ２／グラム〜１０００ｍ２／グラム（例えば、約４００ｍ２／グラム）の表面積を有する。さらに他の実施形態においては、ナノシェルは、テトラまたは無置換のトリアルコキシシランを用いて作製されたナノシェルと比較して、より脆弱である。他の実施形態においては、ナノシェルは、液体または気体のペルフルオロカーボン充填ナノシェルである。さらに他の実施形態においては、中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）は、中空シリカナノシェルの経静脈または直接送達のいずれにおいても、Ｂモードおよび造影超音波のためのＨＩＦＵによって活性化可能である。さらに他の実施形態においては、中空シリカナノシェルの存在は、定方向イメージングおよび切除治療のためのＨＩＦＵの活性化により検出可能である。
【００２７】
また本開示は、がんまたは腫瘍をイメージングする方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象に、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を投与すること、および対象を超音波イメージングすることを含み、ＨＳＮが検出可能な信号を発信し、さらにＨＳＮが腫瘍またはがん部位に集中する。一実施形態においては、ＨＳＮは、気体または液体のペルフルオロカーボンで充填されている。他の実施形態においては、ＨＳＮに鉄がドープされている。さらに他の実施形態においては、ＨＳＮの直径は、約１０ｎｍ〜３０００ｎｍである。
【００２８】
また本開示は、がんまたは腫瘍を治療する方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象に、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を投与すること、およびＨＳＮが腫瘍またはがん部位で熱を発生させ、それによって腫瘍またはがん細胞を殺す周波数をＨＳＮに接触させることを含む。一実施形態では、本方法は、ＨＳＮのキャビテーションおよび破裂を生じる周波数をＨＳＮに接触させる工程をさらに含む。さらに他の実施形態では、ＨＳＮは、気体または液体のペルフルオロカーボンで充填されている。
【００２９】
また本開示は、過形成を治療する方法であって、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を過形成組織に投与すること、および破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍の過形成組織を液化するのに充分なエネルギーとナノシェルを接触させることを含む方法を提供する。
【００３０】
また本開示は、肝臓がんを治療する方法であって、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を固形腫瘍組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーとナノシェルを接触させること、任意には、液化された組織を除去し、液化された組織の部位に治療薬を送達することを含む方法を提供する。さらに他の実施形態においては、治療薬は化学療法薬、リポソーム製剤、腫瘍崩壊ウィルスまたはそのいずれかの組み合わせを含む。
【００３１】
また本開示は、子宮筋腫を治療する方法であって、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を子宮筋腫組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍の子宮筋腫組織を液化するのに充分なエネルギーとナノシェルを接触させることを含む方法を提供する。
【００３２】
また本開示は、乳がんまたは乳腺線維嚢胞症を治療する方法であって、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を乳房組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがんまたは子宮筋腫組織を液化するのに充分なエネルギーとナノシェルを接触させることを含む方法を提供する。
【００３３】
また本開示は、前立腺がんを治療する方法であって、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を胸部組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーとナノシェルを接触させることを含む方法を提供する。
【００３４】
頭部および頸部がんを治療する方法は、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）をがん組織に投与すること、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーとナノシェルを接触させることを含む。
【００３５】
また本開示は、腎細胞癌腫を治療する方法であって、上記実施形態で述べたように鉄がドープされた、またはドープされていない中空シリカナノシェル（ＨＳＮ）を癌組織に投与するステップと、破壊およびキャビテーションを引き起こすのに充分な、かつナノシェルの近傍のがん組織を液化するのに充分なエネルギーと接触させることとを含む方法を提供する。
【００３６】
上記実施形態および治療方法のいずれにおいても、液化組織が除去される。さらに他の実施形態においては、液化された組織が存在した空洞に治療薬が注入される。さらに他の実施形態においては、治療薬は、化学療法薬、リポソーム製剤、腫瘍崩壊ウィルスまたはそのいずれかの組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】中空シリカ粒子の電子顕微鏡像を示す。５００ｎｍの鉄ドープシリカナノシェルの透過電子顕微鏡像。薄い壁（純粋なシリカナノシェルについては１０ｎｍ、また鉄ドープのナノシェルについては約４０ｎｍ）および均一のサイズであることに注目されたい。超音波イメージングについては、粒子はガスで充填される。標的化については、シリカシェルは官能性が付与される。
【図１Ｂ】中空シリカ粒子の電子顕微鏡像を示す。５００ｎｍの鉄ドープシリカナノシェルの走査電子顕微鏡。薄い壁（純粋なシリカナノシェルについては１０ｎｍ、また鉄ドープのナノシェルについては約４０ｎｍ）および均一のサイズであることに注目されたい。超音波イメージングについては粒子はガスで充填される。標的化については、シリカシェルは官能性が付与される。
【図１Ｃ】中空シリカ粒子の電子顕微鏡像を示す。（右）１００ｎｍの中空シリカナノ粒子の透過電子（ＴＥＭ）顕微鏡像（スケールバーは１００ｎｍ）。薄い壁（純粋なシリカナノシェルについては１０ｎｍ、また鉄ドープのナノシェルについては約４０ｎｍ）および均一のサイズであることに注目されたい。超音波イメージングについては粒子はガスで充填される。標的化については、シリカシェルは官能性が付与される。
【図２】インビボでのマイクロシェルイメージングを示す。（Ａ）ヒートマップとしてのインビボシリカシェル信号はマウスモデルの卵巣がん（赤色矢印）内でオーバレイする。信号の大半は、腫瘍の辺縁における血管構造からのものである。（Ｂ）動脈（緑色矢印）および静脈（青色矢印）の断面が、ナノシェルによって高解像度で明瞭にマーキングされている。この結果は、１ｍｍ解像度と一致する。
【図３Ａ】インビボモデルにおける持続性を示す。コントロールマイクロバブル５０μｌ、シェル２μｍ、およびシェル５００ｎｍをニュージーランドホワイトラビットの大腿に注射し、４日間にわたって画像化した。左の欄にはコントロールマイクロバブルが示されている。１ｍｌ当たり１０８個のマイクロバブルを含有する５０μｌが注射された。注射は全て、シーメンズセコイアを用いるカラードップラによって、７ＭＨｚで１．９のＭＩで画像化された。０日は、注射の１５分以内での画像化に対応する。シリカ粒子のどちらの製剤の注射も、信号が４日間持続したことに注目されたい。マイクロバブルは１０８が投与された（左欄）。
【図３Ｂ】インビボでの注射量比較を示す。ＰｙＶｍＴ腫瘍細胞を播種したＮｕ/Ｎｕマウスを〜１０００ｍｍ３まで成長させ、その後、５００ｎｍのＦｅドープＳｉＯ２ナノシェルを注射した。２つの異なる注射量、５０μｌおよび１００μｌを４ｍｇ/ｍｌのナノシェル濃度でテストした。動物を、最初の注射後に、また注射後１、２４または７２時間で画像化した。各画像は、異なる動物に由来するものであり、非常に高い動物対動物および注射対注射の一致性を示すことに注目されたい。
【図４Ａ】切除した乳房組織への体外注射を示す。は、ガス充填Ｆｅドープシリカ５００ｎｍＦＩＴＣ官能性付与ナノ球体を、腫瘍縁に沿って切除乳房組織へ１００μｌ注射することによって得られた超音波カラードップラ画像。注：非対称的コントラストは、シャドーウィングに因る。
【図４Ｂ】切除した乳房組織への体外注射を示す。画像図４Ａに見られる注射部位の横断面部からの５倍の蛍光顕微鏡走査。緑色領域は、ナノ球体の表面上に結合されたＦＩＴＣからの蛍光に起因する。
【図４Ｃ】人間の乳房腫瘍組織における定置型ガス充填マイクロシェルのカラードップライメージング（ＣＤＩ）を示す。１滴の墨汁で染めた２ｍｇ/ｍｌ懸濁液２ミクロンシリカ粒子を１００μＬ注射した。（左）〜４×１０１０マイクロシェルのＣＤＩ。明るい領域は、５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ ≒ １００μＭ３＝１００μＬである。２回の注射によって、既知の腫瘍の輪郭を明瞭に示す。（右）墨汁染料を示す注射領域の写真。
【図５Ａ】マウスでのガス充填マイクロシェルのテストを示す。腹腔内ＩＧＲＯＶ−１卵巣腫瘍のある切開したＮｕ/Ｎｕマウス（赤い矢印参照：画像の右側の白い腫瘤）。２００μｇのＰＦＰ充填２μｍ粒子が３ｍｌの生理食塩水に希釈され、腹膜に注入され、その後、血液中に潅流された。全ての画像に対して、赤色矢印は腫瘍を示し、緑色矢印は脊柱を示し、青色矢印はマウスの臀部を示す。
【図５Ｂ】マウスでのガス充填マイクロシェルのテストを示す。準ＩＶ注射後の１時間の腫瘍の断面を介する粒子のＣＰＳ画像化。全ての画像に対して、赤色矢印は腫瘍を示し、緑色矢印は脊柱を示し、青色矢印はマウスの臀部を示す。
【図５Ｃ】マウスでのガス充填マイクロシェルのテストを示す。準ＩＶ注射後１時間の腫瘍の断面を介するＢモード画像。全ての画像に対して、赤色矢印は腫瘍を示し、緑色矢印は脊柱を示し、青色矢印はマウスの臀部を示す。
【図５Ｄ】マウスでのガス充填マイクロシェルのテストを示す。粒子からの信号の統合ヒートマップを示すためにＣＰＳ画像化およびＢモードからのいくつかのフレームを用いるオーバレイ画像。全ての画像に対して、赤色矢印は腫瘍を示し、緑色矢印は脊柱を示し、青色矢印はマウスの臀部を示す。
【図６】葉酸塩官能性付与シリカシェルの細胞エンドサイトーシスの共焦点結果を示す。（左）葉酸塩標的リガンドで官能性を付与した後、ナノシリカシェル（緑色）がヒーラ細胞によって容易にエンドサイトーシスされる。ナノシェル（緑色）が膜内にあることに注目されたい。（右）葉酸塩標的シリカＮＳの選択性。葉酸塩標的ＮＰ（緑色）は、ＨＦＦ−１正常細胞と比較して、葉酸塩レセプタリッチヒーラがん細胞（赤色）を高度に選択することを示す。
【図７】大気泡刺激前後での、液体充填された２μｍＳｉＯ２シェル（２００μｇ／ｍｌ）のＣＰＳ画像化を示す。（Ａ）ＭＩが０．９７では、液体粒子が伝統的ＣＥＵＳ気泡と同様に振る舞い、出現する。（Ｂ）ＭＩが１．９では、大気泡刺激が観察される。
【図８Ａ】健康なＮｕ／Ｎｕマウスを用いる体内分布研究を示す。マウスに尾静脈を介して、１００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）のガス充填５００ｎｍＦｅドープＳｉＯ２ナノシェルで標識化されたＩｎ−１１１が注射され、その後、ガンマシンチグラフィによって画像化された。０時間―注射の際の画像化。
【図８Ｂ】健康なＮｕ／Ｎｕマウスを用いる体内分布研究を示す。マウスに尾静脈を介して、１００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）のガス充填５００ｎｍＦｅドープＳｉＯ２ナノシェルで標識化されたＩｎ−１１１が注射され、その後、ガンマシンチグラフィによって画像化された。注射後１時間での画像化。
【図８Ｃ】健康なＮｕ／Ｎｕマウスを用いる体内分布研究を示す。マウスに尾静脈を介して、１００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）のガス充填５００ｎｍＦｅドープＳｉＯ２ナノシェルで標識化されたＩｎ−１１１が注射され、その後、ガンマシンチグラフィによって画像化された。注射後２４時間での画像化。
【図８Ｄ】健康なＮｕ／Ｎｕマウスを用いる体内分布研究を示す。マウスに尾静脈を介して、１００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）のガス充填５００ｎｍＦｅドープＳｉＯ２ナノシェルで標識化されたＩｎ−１１１が注射され、その後、ガンマシンチグラフィによって画像化された。注射後７２時間での画像化。
【図８Ｅ】健康なＮｕ／Ｎｕマウスを用いる体内分布研究を示す。マウスに尾静脈を介して、１００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）のガス充填５００ｎｍＦｅドープＳｉＯ２ナノシェルで標識化されたＩｎ−１１１が注射され、その後、ガンマシンチグラフィによって画像化された。個々の臓器の質量によって正規化された収集した臓器のガンマカウンタ読み取り値。
【図９】インビボでのナノシェル促進超音波切除術を示す。（Ａ）６０秒間暴露した後、ナノシェル促進することなく、かなりエネルギ的な超音波切除によって、熱的病巣が発生する。（Ｂ）機械的および熱的の両方の損傷が、等価パワーでの超音波切除の僅か３０秒後にナノシェル促進により生成する。
【図１０Ａ】切除した乳房組織の体外ＨＩＦＵを示す。４ｍｇ／ｍｌのＰＦＣ液体充填５００ｎｍナノシェルを５０μｌ、体外で腫瘍内に注射した。カラードップラ超音波画像化は、ＨＩＦＵトランスデューサのより良好な標的化を可能とするナノシェルの配置を表示する。
【図１０Ｂ】切除乳房組織の体外ＨＩＦＵを示す。４ｍｇ／ｍｌのＰＦＣ液体充填５００ｎｍナノシェルを５０μｌ、体外で腫瘍内に注射した。ＨＩＦＵ前の組織のＢモード画像。
【図１０Ｃ】切除乳房組織の体外ＨＩＦＵを示す。４ｍｇ／ｍｌのＰＦＣ液体充填５００ｎｍナノシェルを５０μｌ、体外で腫瘍内に注射した。ＨＩＦＵは、２％デューティサイクルにおいて１．１ＭＨｚおよび３ＭＰａで１分間、適用される。気泡キャビテーション／形成は、容易に観察される。
【図１０Ｄ】切除乳房組織の体外ＨＩＦＵを示す。４ｍｇ／ｍｌのＰＦＣ液体充填５００ｎｍナノシェルを５０μｌ、体外で腫瘍内に注射した。ＨＩＦＵ後、ポケット（黒点）が液化組織で充填される。
【図１１Ａ】Ｐｙ８１１９腫瘍持ちＮｕ／Ｎｕマウスにおけるインビボでのナノシェル促進ＨＩＦＵを示す。５００ｎｍ液体ＰＦＰ充填ナノシェルを８００μｇ、静脈内に投与した。ＨＩＦＵは、投与から２４時間後に、２％デューティサイクルにおいて３ＭＰａおよび１．１ＭＨｚで1分間適用した。ＨＩＦＵ前。
【図１１Ｂ】Ｐｙ８１１９腫瘍持ちＮｕ／Ｎｕマウスにおけるインビボでのナノシェル促進ＨＩＦＵを示す。５００ｎｍ液体ＰＦＰ充填ナノシェルを８００μｇ、静脈内に投与した。ＨＩＦＵは、投与から２４時間後に、２％デューティサイクルにおいて３ＭＰａおよび１．１ＭＨｚで1分間適用した。ＨＩＦＵ中、収束帯域で、気泡移動／発生が認められる。
【図１１Ｃ】Ｐｙ８１１９腫瘍持ちＮｕ／Ｎｕマウスにおけるインビボでのナノシェル促進ＨＩＦＵを示す。５００ｎｍ液体ＰＦＰ充填ナノシェルを８００μｇ、静脈内に投与した。ＨＩＦＵは、投与から２４時間後に、２％デューティサイクルにおいて３ＭＰａおよび１．１ＭＨｚで1分間適用した。ＨＩＦＵ後、ＨＩＦＵ焦点の黒色化領域は液体化組織である。
【図１２Ａ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。注射直後の画像化。
【図１２Ｂ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。（Ｂ）注射直後１日目の画像化。
【図１２Ｃ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。（Ｃ）注射後３日目の画像化。
【図１２Ｄ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。（Ｄ）注射後５日目の画像化。
【図１２Ｅ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。（Ｅ）注射後７日目の画像化。
【図１２Ｆ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。（Ｆ）注射後１０日目の画像化。
【図１２Ｇ】腫瘍内ナノシェル超音波画像化寿命を示す。４ｍｇ／ｍｌの濃度で５００ｎｍＰＦＰガス充填Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルを５０μｌ、８匹のＰｙ８１１９腫瘍持ちマウスの腫瘍内に注射し、カラードップラ画像化により画像形成した。メカニカルインデックスは、画像化周波数７ＭＨｚで１．９であった。（Ｇ）測定されプロットされたカラードップラ信号幅対注射後の時間。エラーバーは、標準偏差を意味する。
【図１３】シリカシェルのペグ化のための模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合単数形「ａ」、「および（and）」および「その（the）」は、文脈上明白に他の意味に解す場合を除き、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ナノシェル」への言及は、複数のこのようなナノシェルを含み、「細胞」への言及は、１つまたはそれ以上の細胞および当業者に既知のその等価物への言及を含み、以下同様である。
【００３９】
また、「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（include）」、「含む（includes）」および「含む（including）」は、交換可能であり、限定を意図するものではない。
【００４０】
様々な実施形態の説明が用語「含む（comprising）」を使用する場合、当業者は、時には特定の例で、実施形態を、代替的に用語「から本質的になる（consisting essentially of）」または「からなる（consisting of）」を用いて記載できることを理解するであろう、ということがさらに理解されるべきである。
【００４１】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術の分野における通常の知識を有する者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において述べられるものと類似の、または同等の任意の方法および試薬は、開示した方法および組成物を実施する際に使用可能であるが、典型的な方法および材料を以下に記載する。
【００４２】
本明細書において記載される全ての刊行物は、刊行物において述べられ、しかも本明細書における説明に関連して使用され得る方法論を説明し、開示する目的のために、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。本文を通じて上で述べた刊行物は、本願の出願日前にその開示に対して単に提供される。先行の開示により、このような開示を前日付けにするような権利は発明者らには与えられていないことを承認するものとして解釈されるべきものは、本明細書には何もない。さらに、本開示において明確に定められている用語と類似の、またはそれと同一である、１つまたはそれ以上の刊行物において提示されているいずれかの用語に関して、本開示に明確に提供されている用語の定義は、全ての点において制御する。
【００４３】
マイクロバブル系造影剤は、超音波（ＵＳ）エコー信号を増強するために、臨床的に使用される。商品化された超音波造影剤は、空気（Ａｌｂｕｎｅｘ、Ｌｅｖｏｖｏｓｔ（登録商標）、Ｓｏｎｏｖｉｓｔ）またはペルフルオロカ―ボンガス（Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）、Ｏｐｔｉｓｏｎ）のいずれかをカプセル化した脂質、ポリマーまたはタンパク質シェルを有する。これらの微小気泡は、カラードップラ、パワードップラまたは商業的に利用可能な造影剤に特異的な画像化技術を用いて、比較的低い音圧で有意なコントラストを生み出す。特に微小気泡共鳴での超音波（ＵＳ）パルスは、０．３未満のメカニカルインデックス（ＭＩ）で微小気泡崩壊を誘起する。ＭＩは、ピーク負圧の送信周波数の平方根に対する比であり、超音波エネルギの尺度である。微小気泡崩壊によって、刺激アコースティックエミッション（ＳＡＥ）と称するドップラ画像化での色として見える２つの連続超音波パルス間に非相間が生じる。微小気泡崩壊は、造影剤に特異的な画像化方法でも検出可能であるが、これらの技術は、かなり低いＭＩで非崩壊性超音波圧力に暴露された際の微小気泡の非線形挙動を検出するように開発されたものである。微小気泡が非線形的に反応する間、組織は超音波に線形的に反応するため、これらの技術は微小気泡の存在に極めて感応し易く、単一の微小気泡を検出可能である。微小気泡の非線形応答は、超音波に暴露されると伸縮する能力に関連しており、カプセル化しているシェルの弾性によって制御される。ティーマン（Tiemann）他は、空気充填シアノアクリル酸微小気泡のＳＡＥを用いて、ゼラチンに投入された粒子の定常ボーラスからドップラ画像化によって高信号が得られることを証明した。しかしながら、連続画像化時間は短く、粒子の大きさは全てが均一ではない。一般に、超音波造影剤を静脈内に投与して、脈管構造を研究するが、微小気泡の典型的な大きさ（１〜５μｍ）のため、脈管構造から漏れ出ることは不可能である。これにより、超音波造影剤は、血管新生による異常な腫瘍脈管構造を研究することによる腫瘍の検出および診断に採用されているのみである。
【００４４】
最近では、超音波造影剤としてシリカ粒子が探索されている。リン（Lin）他は、液体を充填したプラスチックビーカー内において高いＭＩでＣＰＳを用いて中空シリカカプセルをテストした。フウ（Hu）他は、低いＭＩ（０．０６）で画像化可能である中空シリカマイクロ球体を開発し、雄ラットの睾丸に注射してＣＥＵＳで画像化した。ワン（Wang）他は、ペルフルオロへキサン液をメソポーラスシリカナノシェルに効果的にカプセル化し、その後、インビボで熱的切除ＨＩＦＵを実施することができた。シリカシェルまたは他のいかなる硬いシェルＣＥＵＳも、腫瘍を見つけるために他のグループにより使用されていない。
【００４５】
中空シリカナノシェルは、薬物送達および画像化に潜在的に適用可能である。中空シリカナノシェルは、優れた長期安定性を有する均一で安定した壁面構造を有する。この大きさは、その形成にポリマー鋳型を用いることにより、ポリマー鋳型を形成するために使用する乳化重合から対応可能な明確に規定された直径に制御することができる。シリカシェルの多孔度は、ガス、薬物の充填および放出に好都合であるか、またはＸ線もしくは磁気造影剤のための重元素（例えば金属ナノ粒子）または磁性酸化物を含有するために使用する。中空シリカシェルの表面は、標的タンパク質、抗体、細胞または組織とも組み合わせ可能である生体官能基をグラフトすることにより容易に官能性を付与化される。さらに、本開示は、シェルの剛性／脆弱性が特定の使用、超音波の周波数等に対して選択的に準備可能であることを証明する。
【００４６】
中空シリカ球体を作るために、コロイド鋳型法や多層（ＬｂＬ）自己集合法などの多数の方法が使用されている。コロイド粒子は金、銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛およびポリマービーズのコアシェル型ナノ球体の作製に使用されたが、無機物質の鋳型はコアシェル型球体から除去するのが難しい。ポリマーを鋳型とした中空球体は、その寸法や均質性が表面の官能基の種類と密度に左右されるため、寸法制御が難しい。多層法の基本は、堆積された帯電種間の静電気引力である。しかしこの方法は多数の合成段階を含むため、大規模生産には実用的でない。中空シリカナノ粒子技術の課題は、均質で安定したシェル壁をもつ中空シリカナノシェルを作る便利で安価な方法を見つけることと、同時にこのシェルが適度な多孔性を有し、粒径分布が狭いことである。
【００４７】
現在、中空ナノシェルの均一な粒径分布を実現する拡大可能で安価な方法はない。薬剤の送達と検出に現在使用されているナノ粒子は非中空である。中空ナノシェルは、最大積載量の薬剤、造影剤またはその他の物質を充填する可能性を提供する。また外表面と内表面は異なった官能性を付与することができる。
【００４８】
過去１０年間、中空シリカナノ粒子の製造は、薬剤送達、超音波画像化、触媒、フィルター、フォトニックバンドギャップ材料などの用途があるために、強い関心を引いてきた。報告された製造手順では、コロイド鋳型法と多層（ＬｂＬ）自己集合法が最も一般的に使用されている。使用されているコロイド鋳型には金、銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛およびポリマービーズが含まれている。ポリスチレンビーズは安価で寸法が容易に変化できるため魅力的なナノスケール鋳型である。さらに、その表面は化学的または物理的手法で官能性を付与することができる。最後に、ポリスチレン鋳型は焼成または溶解によって容易に除去できるため、中空粒子を作るのに非常に適している。焼成によってラテックスのコアが除去されて中空のＳｉＯ２のナノ粒子が得られる。例えば、ナノ粒子の寸法と均質性は表面の官能基の密度にある程度左右され、寸法制御が難しくなる。
【００４９】
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）は、ｐＨ依存性の構造を有する最も単純なポリアミノ酸の一つであり、規則正しく並んだシリカ構造の多くの合成に使用されている。
【００５０】
本開示は、寸法と空隙率が制御でき、安定で均質な壁を有し、薬剤送達および造影材料に使用できる中空シリカナノシェルの合成方法を提供する。具体的には、本開示は、例えばアルコキシシラン（例えば、ＲＳｉ（ＯＲ’）３−トリアルコキシシラン、Ｒ２Ｓｉ（ＯＲ’）２−ジアルコキシシラン、Ｒ３Ｓｉ（ＯＲ’）−モノアルコキシシラン）および任意で鉄（III）エトキシドの開始比率を変更したり混合速度または反応時間を変化させたり、あるいはポリスチレン鋳型の寸法や濃度を変化させることによって、寸法および空隙率が改変できる生分解性鉄ドープシリカナノシェルの生成方法を提供する。
【００５１】
Ｆｅ−ＳｉＯ２ナノシェルはオルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）と鉄エトキシドをアミノ・ポリスチレン鋳型の上でゾルゲル反応させて合成される。粒子は非常に機械的安定性が良く、保管や合成後の修飾に有利であるが、このことは超音波適用には理想的ではない。粒子からのコントラスト信号は、粒子内の気体または液体のペルフルオロカーボンが超音波励振下で急速に膨張してナノシェルが粉々になり、それが連続した超音波パルスに脱相関をもたらすことによって生成される。ナノシェルが高度に機械的安定性である結果、実際には粒子のごく一部のみが超音波によって画像化される。従って、本開示は超音波造影剤としてのナノシェルの効率を増大させる方法と組成物を提供する。その方法は、粒子の硬いシリカシェルを機械的に弱める過程を含む。しかし、ナノシェルの合成に使用するＴＭＯＳの量を減らしても、通常は薄いシェルを有する弱い粒子は得られず、代わりに砕けたり折れたりしたシェルができる。これは、ナノシェルが製造工程で「島」状になることによって、ＴＭＯＳが鋳型表面で多層状に直接重合するよりもむしろ重合シロキサンのより小さなコロイドが鋳型表面に集結するというモデルに近いと思われる。シロキサンのネットワーク中で重合できるホウ酸トリメチル（ＴＭＢ）のようなドーパントが、シェルの機械的安定性を改善することが実証されている。このため、不安定化改変（例えば、不純物）をシェルに導入してオルトケイ酸テトラメチルと共重合させることが、シリカネットワークに穴やくぼみを作ることによってシェルを機械的に弱くするということが検討された。
【００５２】
本開示は、シリカシェルの機械的強度を、アルコキシシランに結合した嵩高いＲ−基を導入することで改変する方法とそれによる組成物を提供する。例えば、ＴＭＯＳと重合する嵩高い有機Ｒ−基を有するトリアルコキシシランを使用してシェルを提供するが、Ｒ−基は、５５０℃の焼成工程に耐えられず、シェルに「空洞」や「細孔」を残す。これによりオングストローム−ナノメーター級の穴／くぼみ／細孔がシリカシェルのいたるところに作られ、それがシェルをより脆くし、超音波の励振下で破壊されるようにする。粒子は、開始時の元のシランに存在しているケイ素の量に基づく化学量論的置換を使用することによって様々なＲ−基で置換され、首尾よく合成された。
【００５３】
一つの実施形態では、中空シリカナノシェルを作製する方法は、（ａ）置換アルコキシシランを含むシリカシェル前駆体および任意で鉄（III）エトキシドを、ポリアミノ酸またはポリアミンで官能性を付与されたナノ鋳型粒子に堆積させてコアシェル型球体を与える工程であって、前記ポリアミノ酸またはポリアミンは、第一級アミン基がポリマー骨格に付いたアミノ酸または脂肪族アミンのホモポリマーを含むことができる工程と、（ｂ）その鋳型粒子を焼成または有機溶剤の使用によって除去し、多孔性のシリカナノシェルを有する中空シリカ球体を提供する工程であって、ナノシェルの細孔の寸法はアルコキシシラン（例えば、トリ−、ジ−、またはモノアルコキシシラン）の置換側基によって決まる工程を含む。
【００５４】
また本開示は、中空ナノ構造体（例えばナノシェル）を生成する際の中間体を含むナノ構造体を提供し、該ナノ構造体は、ポリアミンまたはポリカルボン酸官能性付与表面層を含む分解性ナノ鋳型と、アルキル置換アルコキシシラン層と、任意には鉄(III)エトキシドとを備える。上記のように、ナノ鋳型には、アミノ化、ポリアミン−カチオン性コーティングが適用でき、その後、アルキル置換アルコキシシランでその鋳型をコーティング可能な任意の分解性材料が使用できる。例えば、ナノ鋳型は、ポリスチレンビーズとすることができる。このようなポリスチレンビーズは、容易に合成され、その大きさは容易に変更可能である。ナノ鋳型は、一般に、ナノメータ断面（例えば、直径、幅等）を有する。例えば、ナノ鋳型は、実質的に球形であってもよく、直径が約１０ｎｍから３μｍまでであってもよい。鋳型は、シリカ材料でコーティングされる。一実施形態では、式Ｉの構造を有する化合物の層は、鋳型上にコーティングされる。
【化１】
2016505475.tif 000004
式中、Ｒ１−Ｒ４はＨ、Ｄ、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルケニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルケニル、置換もしくは無置換の複素環、置換もしくは無置換のアリール、置換もしくは無置換の混合環系、置換もしくは無置換のアルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、エーテル、アミノ、カルボキサミド、ケチミン、アルジミン、イミド、アゾ、アジド、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロ、ニトロソ、チオール、スルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスフェート、ボロナート、ボロノ、ボリノおよびシリルエーテルからなる群から独立して選択され；ここで、Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも１つは、置換もしくは無置換のアルコキシであり、かつＲ１−Ｒ４のうちの３つがメトキシ基である場合、第４のＲ基は、Ｄ、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）アルキニル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルキル、置換もしくは無置換の（Ｃ１−Ｃ１８）シクロアルケニル、置換もしくは無置換の複素環、置換もしくは無置換のアリール、置換もしくは無置換の混合環系、置換もしくは無置換の（Ｃ２−Ｃ１８）アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、エーテル、アミノ、カルボキサミド、ケチミン、アルジミン、イミド、アゾ、アジド、シアネート、イソシアネート、ニトレート、ニトリル、イソニトリル、ニトロ、ニトロソ、チオール、スルフィド、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアネート、イソチオシアネート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスフェート、ボロナート、ボロノ、ボリノおよびシリルエーテルからなる群より選択される。他の実施形態では、Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも２つは、置換もしくは無置換のアルコキシ基である。他の実施形態では、Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも３つは、置換もしくは無置換のアルコキシ基である。さらに他の実施形態では、Ｒ１−Ｒ３は置換もしくは無置換のアルコキシ基であり、Ｒ４は置換もしくは無置換の（Ｃ２−Ｃ１８）アルコキシ基である。例えば、式IIの一般構造を有するアルキル置換アルコキシシランを使用することができる。
【化２】
2016505475.tif 000005
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は置換もしくは無置換のアルキルであり、Ｒ４は独立した置換もしくは無置換のアルキルである。他の実施形態では、Ｒ１−Ｒ４は、置換もしくは無置換のアルキル、置換もしくは無置換のヘテロアルキル、置換もしくは無置換のアルケニル、置換もしくは無置換のヘテロアルケニル、置換もしくは無置換のアルキニル、置換もしくは無置換のヘテロアルキニル、置換もしくは無置換のシクロアルキル、置換もしくは無置換のシクロアルケニルおよび置換もしくは無置換のアリールからなる群より独立して選択される。アルキルは、ハロ置換アルキルであってもよい。例えば、一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はハロ置換アルキルである。他の実施形態では、ハロ置換はフッ素（例えば、フッ化アルキル）であってもよい。一実施形態では、トリアルコキシシランがトリエトキシシランまたはトリメトキシシランである場合、Ｒ４はＣ２−Ｃ１８置換もしくは無置換のアルキルである。上記のように、本開示は、上記式で述べたように、トリアルコキシシランの大きさまたはＲ４を変更することにより空隙率を変更する方法を提供する。このように、本開示の中間体は、（孔の大きさまたはナノシェルの脆弱性に基づいて）望ましいＲ４基で生成可能であり、さらに焼成によってナノ鋳型を除去するか、または鋳型のその他の除去により、望ましい空隙率を有するナノシェルが得られる。
【００５５】
シロキサンネットワーク中への「不純物」の導入に使用されるシランは、より大きなまたは異なった構造のくぼみや細孔を生成するのに充分な複数の置換Ｒ−基を有する、トリ−、ジ−、またはモノアルコキシシランであってもよい。例えば、上記または本明細書中の他の部分に記載の一般的な方法を使用し、ペンタフルオロフェニルトリエトキシシランとオルトケイ酸テトラメチルを１：１．７のモル比で使用してナノシェルが合成された。さらに、最大メカニカルインデックスでの気体充填シリカ粒子の連続イメージング耐用時間は、これまでは約１５分であった。ペンタフルオロフェニルトリエトキシシランで置換された粒子は、ドップラ信号が存続し続けるときは、最大ＭＩでのイメージング耐用時間が二時間以上である。
【００５６】
また、以下に述べるようにＦｅ−ＳｉＯ２ナノシェルは、機械的切除試薬のみならず強力集束超音波（ＨＩＦＵ）感作物質としても開発中である。ＨＩＦＵの励振下で、ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）（液体または気体）充填ナノシェルは組織を機械的に損傷して液状化するに充分なほど破壊的なキャビテーションを起こす。この破壊は超音波力を当てるＨＩＦＵ振動子の焦点容積内に収まる。ナノシェル表面の官能性の相違がキャビテーションに必要なＨＩＦＵの閾値に影響を与えられることが観察されている。このように、ナノシェル表面の「濡れ性」を、例えば高度なフルオラス官能基を使用して改変することにより、粒子中のペルフルオロカーボンの気体または液体が完全に膨張してシリカシェルを粉々にするのに必要なエネルギーを改変できる。表１からわかるように、様々なフルオラスシランを使用して様々な程度の官能性を付与すると、最少メカニカルインデックスでの画像化閾値とＨＩＦＵに必要な出力の両方において、測定可能な相違が応答に見られる結果となっている。「％粒子質量追加」とは、粒子に官能性を付与するために加えられたフッ素化シランの、粒子質量に対する相対的な量をいう。表１の結果から、粒子表面に与えられた官能性が異なると、超音波下での効果が異なり、イメージングとＨＩＵＦとの閾値の増減は両方、粒子表面に官能性を付与するＲ−基の構造と量に左右されることが示唆される。
【表１】
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【００５７】
一実施形態では、本開示は、例えば、モノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−アルコキシシラン、ケイ酸、ケイ酸ナトリウム等に由来するケイ素原子を有するケイ素含有化合物から生成された中空シリカ球体を提供する。例えば、任意の数の市販のアルコキシシランを使用することが可能である（例えばhttp:[//][www.]gelest.com/GELEST/Forms/GeneralPages/prod_list.aspx)?pltype=l&classtype=silanes&alpha=65;を参照されたい）（括弧はハイパーリンクを排除するために導入された）；アルコキシシランのそのリストは、かなり広範囲に亘り、当技術において容易に同定可能である）。例えば、簡潔であるが完全に網羅しているわけではないリストは、（３−アセトアミドプロピル）トリメトキシシラン、２［アセトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリエトキシシラン、アセトキシエチルトリエトキシシラン、アセトキシエチルトリメトキシシラン、アセトキシメチルトリエトキシルシラン、アセトキシメチルトリメトキシシラン、３−アセトキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アセトキシプロピルトリメトキシシラン、３−（Ｎ−アセチル−４―ヒドロキシプロリルオキシ）プロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（Ｗ−アセチルロイシル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アクリルアミドプロピルトリメトキシシラン、３−アクリルアミドプロピルトリス（トリメチルシロキシ）シラン、Ｎ−（３−アクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、（アクリルオキシメチル）フェネチルトリメトキシシラン、アクリルオキシメチルトリメトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）メチルビス（トリメチルシロキシ）シラン、（３−アクリルオキシプロピル）メチルジエトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシラン、Ｎ−アリル−アザ−２，２−ジメトキシシラシクロペンタン、３−（Ｎ−アリルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、アリルジメトキシシラン、アリルメチルジメトキシシラン、１１−アリルオキシウンデシルトリメトキシシラン、ｍ−アリルフェニルプロピルトリエトキシシラン、アリルトリエトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、４−アミノ−３，３−ジメチルブチルメチルジメトキシシラン、Ｎ−３−［アミノ（ポリプロピレンオキシ）］アミノプロピルトリメトキシシラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルジメチルメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルト���メトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン、３−（ｍ−アミノフェノキシ）プロピルトリメトキシシラン、ｍ−アミノフェニルトリメトキシシラン、ｐ−アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルジエトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリス（メトキシエトキシエトキシ）シラン、１１−アミノウンデシルトリエトキシシラン、（アジドメチル）フェネチルトリメトシキシラン、ｐ−アジドメチルフェニルトリメトキシシラン、３−アジドプロピルトリエトキシシラン、４−（アジドスルフォニル）フェネチルトリメトキシシラン、６−アジドスルフォニルヘキシルトリエトキシシラン、および１１−アジドウンデシルトリメトキシシランを含む。本開示は、シリカネットワークに欠損を導入するために、多くの他のテトラアルコキシシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、またはモノアルコキシシランを含むことが可能である。一実施形態では、テトラアルコキシシランは、鉄(III)エトキシドと混合されて、ドープ鉄シリカナノシェルを生成する。一実施形態では、ケイ素含有化合物は、反応してシリカシェルを形成する前に、酸性条件下で加水分解される。
【００５８】
さらに本開示は中空シリカ球体の合成方法を提供する。工業用のポリスチレンまたはラテックスのビーズと、それをポリアミンまたはポリカルボン酸塩で官能性を付与した誘導体が、本開示で鋳型として使用できる。本開示で使用されるポリマーコア鋳型は、粒径分布が狭くてもよく、約１０ｎｍ〜約３μｍ（一般的に、約２０〜４０、４０〜６０、８０〜１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、より大きくてもよい）の範囲で選択できる。ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）または他のポリアミンは、本開示においてコア鋳型混合物とともに使用できる。ケイ素含有化合物（上の段落で述べたように）を単独でまたは鉄（III）エトキシドとの混合物で加えて、ポリスチレンビーズ上にシリカゲルシェルの堆積を起こす条件下で反応させ、均質なシリカ層を鋳型の上に形成させる。次いでポリスチレンコアとポリアミン層を焼成または溶剤抽出によって除去する。どちらの方法でコアを除去しても、均質で多孔性の安定したシリカシェルを有する中空シリカ球体が得られる。
【００５９】
本開示で使用されるポリスチレンビーズ、およびポリアミンまたはポリカルボン酸塩で官能性を付与した（モノアミンで官能性を付与したものではない）表面を有するポリスチレンまたはラテックスのビーズは、ポリサイエンス社（Polysciences Inc.）およびインビトロゲン社（Invitrogen Co.）から購入できる。鋳型の寸法は、多数がエマルション重合によって作られるので、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４５ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１０００ｎｍまたは２０００ｎｍが可能で、それより小さいまたは大きい寸法（例えば、１０ｎｍ乃至２０００ｎｍ）の鋳型も使用できる。これらのビーズは単分散マイクロスフェアで、固形分２．０〜４．０％（ｗ／ｖ）水性懸濁物として販売用に包装されている。これらの寸法は一般的に製造者のバッチごとに１０％程度のばらつきがある。本開示の方法によってコーティングすると寸法が１０〜１５ｎｍ増加するが、溶剤洗浄によって少し縮み、焼成されるとさらに縮む。大きいものは小さいものよりもより縮む傾向がある。これは部分的な脱水が原因であり、シェルは、最初にシリカゲルコーティングとして形成され、そして水の除去に際し、様々な水和の程度を有するシリカに脱水が生じるためである。焼成すると、ビーズは多孔性シリカゲルの固い中空ボールとなり、それ以上は寸法が変化しない。
【００６０】
本開示は、良好な形の球体を高収量で得られる、ポリアミンまたはポリアミノ酸でコーティングされた鋳型の使用を提供する。本開示で使用されるポリアミンは、ポリマー骨格に第一級アミン基を有するアミノ酸または脂肪族アミンのホモポリマーである。このようなポリアミノ酸は、固体とその溶液を含むポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリオルニチンである。脂肪族アミンのホモポリマーの１つにポリエチレンイミンがある。モノアミンを持つポリスチレンビーズやラテックスビーズ自体はシリカシェルを堆積させる鋳型となり得る。本開示で使用されるポリアミノ酸の濃度は、ポリアミノ酸濃度の高い場合に起こるポリアミノ酸単独鋳型による非中空シリカ球体の形成を避けるために、低い水準に保たれる。
【００６１】
下記のスキームに示すように、ポリアミンで官能性を付与されたポリスチレンビーズはシリカと鉄のシェルを形成する。
2016505475.tif 000007
【００６２】
スキーム１の略図にあるように、ポリスチレンまたはラテックスのビーズは、加水分解されたシリカ前駆体（例えばテトラアルコキシシラン）溶液が加えられる前に、ポリアミノ酸またはポリアミンでコーティングされた鋳型と混合される。ビーズの分散物と０．１％（ｗ／ｖ）のポリアミノ酸水溶液がリン酸緩衝液に加えられる。０．１％（ｗ／ｖ）のポリアミノ酸と２．７５％（ｗ／ｖ）のポリスチレンビーズの体積比は１：１〜１０：１で、一般的には約４：１である。ポリスチレンビーズの緩衝液中での最終的な濃度は、１:１０００〜１：１００００（ｗ／ｖ）で、一般的には約１：６７０（ｗ／ｖ）である。
【００６３】
本開示の１つの方法がスキーム２に描かれている。スキーム２に示すように、シリカシェル前駆体（例えばテトラアルコキシシラン）と鉄（III）エトキシドがアミンでコーティングされたまたは官能性を付与されたポリスチレンまたはラテックスのビーズの混合物に加えられる。温度、ｐＨ、比率および反応時間などの反応条件を適切に選択することにより、縮重合が起きてシリカと酸化鉄ゲルのシェルがポリスチレンビーズ上に堆積する。コアシェル型球体が回収され、洗浄され、高温で焼成されてポリマーのコアが除去され、中空のシリカ−鉄球体が得られる。鉄（III）エトキシドの添加は任意であり、シェルの経時的生分解性を改善するために提供されるということが認められる。さらに、鉄（III）エトキシドの包含は、シリカナノシェルの超音波特性とイメージング耐用時間を改変するために利用することもできる。
【００６４】
鋳型粒子は、例えばラテックスまたはポリスチレンビーズでよい。次に鋳型粒子はポリアミノ酸基またはポリアミン基を含ませるために処理される。鋳型粒子は表面がアミン基ですでに官能性が付与されているものを購入してもよい。ポリアミノ酸基またはポリアミン基はシリカの堆積を促進する。そしてシリカシェルは鋳型上に堆積する。一実施態様では、鋳型ナノ構造体は分解されて本開示の中空ナノ構造体を提供する。他の実施形態では鋳型ナノ構造体は分解されない。
【００６５】
ナノ構造体は鋳型物質を分解してもしなくても使用できる。バッチ製造は簡単である。できた中空球体の特性が、ナノ構造を分子医薬や、超高感度のラマン、生体分子、細胞イメージング、および超音波イメージングに適用できるようにする。
【００６６】
本開示のナノ構造体の生成において、様々なポリマーが鋳型ナノ構造体として使用できる。例えば、ｏ−ポリアクリルアミドおよびポリ（塩化ビニル）、カルボキシル化ポリ（塩化ビニル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、および塩化ビニル−ビニルアルコ−ル−酢酸ビニル共重合体などが使用できる。
【００６７】
４０〜３０００ｎｍの範囲の単一サイズのポリスチレン球体が容易に入手できるので、多孔性シェル壁を有する中空シリカナノ粒子の単一分散物を高収量で合成するための大量生産鋳型が提供できる。ポリマー球体は、水溶液中のポリ−Ｌ−リジンおよび他のアミノポリマーの単層を容易に吸着し、その単分子層はケイ酸とアルコキシシランのゲル化のための塩基性触媒コーティングとしての役割を担う。
【００６８】
反応は一般的に室温で行われる。反応系での加水分解されたトリアルコキシシランまたはアルコキシシランの最終的な濃度は約１０−３Ｍ〜５×１０−３Ｍで、一般的には約２×１０−３Ｍである。加水分解されたアルコキシシランの有用な濃度は、均質で安定なシリカシェルを粒径分布の狭い鋳型の周囲に形成し、その鋳型を基にした高収量をもたらす。加水分解されたアルコキシシランの濃度が高いと充分な厚さのシリカシェルが得られず、非中空のシリカコロイドが副生成物として得られ、それが反応条件によっては不規則な形になる。アルコキシシランはシェル形成のためには加水分解される必要はないが、アルコキシシランの加水分解はシェル形成の速度を上げる。
【００６９】
コアシェル型球体は遠心分離によって溶液から単離できる。沈降物はイオン交換水に分散させ遠心分離することで洗浄できる。この工程に続いて球体はエタノールで洗浄される。本開示のこれらの洗浄工程は、余剰の反応物質とリン酸緩衝液を除去するためであり、任意に選択できる。遠心分離で純粋なコアシェル型球体を回収した後に、ポリスチレンコアを除去することができるが、後加工や使用目的によっては望ましくないことがある。
【００７０】
コアナノ鋳型構造を除去するために様々な方法を使うことができる。ポリスチレンコアの除去に使用できるこのような方法の２つに焼成と溶解があり、焼成が好ましい。溶解によってコアを除去するためには、コアシェルの沈降物をトルエンまたは他の溶剤に懸濁させ、その混合物を室温で１時間撹拌し、次いで遠心分離で回収する。洗浄作業をもう３回繰り返し、次に中空球体をエタノールで二回洗浄する。この工程で使用される第１の溶剤は、そのポリマーコアに対して、ジクロロメタン、クロロホルム、エチレンジアミン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、またはその他の溶剤まで拡張される。本開示の最終生成物は最後のペレットを乾燥（例えば、真空下６０℃で４８時間）して得られる。焼成によってポリスチレンコアを除去するためには、コアシェル型球体を、コアシェル型粒子が微粉末になるまで室温で一晩乾燥させ、次いで空気中で４００〜９００℃、３〜１８時間、一般的には５５０℃で１８時間加熱する。温度の上昇下落速度は、０．１℃／分〜１０℃／分、一般的には１℃／分である。
【００７１】
上記のナノシェルはイメージングおよび治療用の様々な超音波手法に使用できる。例えば、シリカナノシェルの超音波イメージングは固定されており、超音波下で非線形的に応答することは期待されないが、シェルが所定の超音波圧で破砕されるよう設計され、ドップライメージングに伴う信号を生み出すのみならず、膨張収縮できるペルフルオロカーボンの気体を放出し、それが分解するまで非線形信号を生成する。この設計によって、粒子はドップラモダリティによるだけではなく、コントラスト・パルス・シークェンシング（ＣＰＳ）イメージングや高調波イメージングのようなコントラストに特化したイメージングモダリティによっても画像化できる。気体と周囲環境の間に実質的な音響インピーダンスの不整合があるため、両方のイメージング法について信号を発生することが可能である。
【００７２】
ＰＦＣガスが充填された分解性ナノシェルは、超音波エネルギを減衰させてナノシェルの存在部分に堆積された局所的な熱を増加させ、これにより組織を熱的に切除することができる。第二の切除方法も、組織に機械的損傷を起こして機械的切除に至らせるナノシェルによるキャビテーションという形でのナノシェルと超音波の相互作用によってもたらされる。超音波の出力およびシェルの厚さを最適化することにより、キャビテーション要素を主要な応答とすることができ、それにより組織の破壊が極めて局限的となる。
【００７３】
さらに下記の実験は、ナノシェルが液体のペルフルオロカーボンで充填できることを示している。この液体充填によって、高出力超音波がナノシェルを合体させて１ｍｍ大の気泡に変換する新しい適用が可能になる。このことは、粒子を腫瘍への血管供給をふさぐために使用することを可能にする。高出力超音波によって液体充填ナノシェルが１ｍｍ径の気泡に変換され得ることを示すインビトロ試験のデータが得られている。
【００７４】
一つの実施形態では、ナノシェル促進ＨＩＦＵと、ウィルス性治療／リポソーム、またはポリマー製剤／化学療法剤（局所投与）との組み合わせを実施することができる。例えば、本開示の液体または気体のペルフルオロカーボンを充填したナノシェルの局所注入後に、注入部位で組織を液状化するために機械的キャビテーションが利用される。液状化された組織はバキュームで除去され、後に空洞が残る。その空洞は様々な製剤で再度満たすことができる。いくつもの異なった治療薬で満たされた空洞は、外科手術が最適治療とならないがん、類繊維腫、およびその他の異常増殖組織のような病変組織部位に対して、長期的な薬剤放出と保持のための薬剤貯蔵場所として機能する。空洞に加えられる治療薬は、腫瘍病巣の付近でゆっくりと放出されることで有益となる、腫瘍崩壊ウィルス、リポソームカプセル化ウィルス、リポソーム製剤または化学療法薬剤のポリマー製剤などであってもよい。１００％キャビテーションＨＩＦＵまたは大部分キャビテーションＨＩＦＵの使用により、切除される組織の体積を正確に制御することができる。切除療法の後に一般的に起こる炎症反応は、特に病巣切除部での腫瘍崩壊ウィルス、抗体療法、あるいは化学療法剤の送達と保存を促進し得る。これは外科手術が最適治療とならないがん、類線維腫およびその他の異常増殖を治療するのに理想的である。
【００７５】
他の実施形態では、ナノシェルおよびＨＩＦＵによる「組織の穴あけ」工程が使用される。本開示の液体または気体のペルフルオロカーボンを充填したナノシェルの局所注入後に、機械的キャビテーションが注入部位で組織を液状化するために使用される。この液状化した組織を吸引で除去すると、空洞が作り出され、その空洞は追加されたナノシェルで充填でき、そのナノシェルは、大量の組織を迅速に切除する目的でさらに空洞を大きく深くするために使うことができる。
【００７６】
他の実施形態では、長期イメージングマーカーが提供される。この実施形態では、フッ素化アルコキシシランで官能性を付与された液体ペルフルオロカーボン充填ナノシェルが長期のインビボ超音波イメージングに使用される。フッ素化アルコキシシランは粒子を「濡れなく」する。これは、粒子からのＰＦＣの抜けや、粒子の分解を防ぐ。
【００７７】
本開示のナノシェル（任意には、液体または気体が充填された）は、そのナノ構造体を単独で薬剤組成物として投与もよいが、対象への送達に適した薬学的に許容できる担体と共に製剤化することもできる。
【００７８】
本開示による医薬組成物は、担体、賦形剤、添加剤または助剤を使用して対象に投与するのに適した形に本開示のナノ構造体を含むように製造することができる。よく使用される担体や助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトール及び他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン類、セルロースとその誘導体、動植物性油脂、ポリエチレングリコール、および滅菌水、アルコール、グリセロール、多価アルコール等の溶剤がある。静脈内用ビヒクルには、体液および栄養補給剤がある。防腐剤には、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性気体がある。他の薬学的に許容され得る担体には、溶液、塩などの非毒性賦形剤、防腐剤、緩衝剤などがあり、例えばレミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）第１５版、イーストン：マーク出版（Easton: Mack Publishing Co.）１９７５年の１４０５〜１４１２頁および１４６１〜１４８７頁、および国民医薬品集１４巻（The National Formulary XIV.）、第１４版（米国薬剤師会（American Pharmaceutical Association）ワシントン、１９７５年）に記載されており、その内容は本開示に援用する。医薬組成物の様々な成分のｐＨと正確な濃度は、当該分野のありふれた技術に従って調節される。「グッドマンおよびギルマンの治療学の薬理学的基礎（Goodman and Gilman's, The Pharmacological Basis for Therapeutics）」第７版を参照されたい。
【００７９】
本開示による医薬組成物は、局所的にまたは全身的に投与してよい。「有効用量」は、測定可能なＳＥＲＳ信号を充分に提供できる本開示によるナノ構造体の量を意味する。この用途に効果的な量は、もちろん組織と組織の深さ、送達経路およびその他によって決まる。
【００８０】
一般的に、インビトロ試験で使用される投与量は、医薬組成物の投与に役立つ分量の指針を提供し、動物モデル実験は特定のインビボ技術の有効投与量を決定するのに使用することができる。様々な考察が、例えばLanger, Science, 249: 1527, (1990); Gilman et al. (eds.) (1990)に記載されており、いずれも本明細書に参照として組み込まれる。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「有効量の投与すること」は、本開示の医薬組成物を対象に投与または適用し、その組成物に意図する機能を発揮させる方法を含むことを意味する。
【００８２】
医薬組成物は、注入（例えば、皮下、静脈などの）、経口投与、吸入、経皮投与あるいは直腸投与などの簡単な方法で投与することができる。投与経路によっては、医薬組成物を物質でコーティングして、医薬組成物を不活性化し得る酵素、酸、およびその他の自然条件から保護することもできる。また、医薬組成物は非経口的に投与したり腹腔内に投与したりすることもできる。グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、およびそれらの混合物中、および油中の分散物を製造することもできる。通常の保管および使用条件下では、この分散物に微生物の増殖を防ぐための防腐剤を加えてもよい。
【００８３】
注入使用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌水分散液、および滅菌注入溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉体が挙げられる。組成物は簡単に注射できる限りは一般的に滅菌液体である。一般的には、組成物は製造保管条件下で安定であり、最近や真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されている。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよびその他）、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶剤や分散媒とすることができる。適度の流動性は、例えばレシチンなどをコーティングしたり、必要な粒径を維持したり、分散物の場合は界面活性剤を使用することで保持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤や防黴剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより実現できる。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、マンニトールやソルビトールのようなポリアルコール、あるいは塩化ナトリウムなどが組成物に使用される。注入組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどを加えることでもたらすことができる。
【００８４】
滅菌注入溶液は、必要量の医薬組成物を適当な溶剤に、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたはそれらの組合せと共に包含させ、次いで濾過滅菌して製造することができる。通常、分散物は、塩基性分散媒および上に列挙したものの中から必要な成分を含む滅菌ビヒクルに医薬組成物を加えて製造される。
【００８５】
医薬組成物は、例えば不活性希釈剤や消化吸収される食用担体を用いて経口投与することができる。また、医薬組成物とその他の成分は、硬シェルゼラチンカプセルまたは軟シェルゼラチンカプセルに封入することも、錠剤に圧縮することも、対象の食事に直接加えることもできる。経口投与に関しては、医薬組成物は賦形剤と組み合わせて、経口摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形で使用することができる。このような組成物や製剤は少なくとも１重量％の有効化合物を含んでいるであろう。組成物や製剤の成分比率は、もちろん多様であり、使いやすさのためには単位重量の約５％〜８０％である。
【００８６】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、以下の、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；および蔗糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、ウィンターグリーン油、サクランボ香味料などの着香料を含んでいてもよい。投与単位の形態がカプセルの場合、上述の種類の物質に加えて液体の担体を含有することができる。コーティング材料として、またはその他投与単位の物理的形態を改変するための様々な物質が他にもあり得る。
【００８７】
例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、セラック、砂糖、またはその両方でコーティングできる。シロップまたはエリキシル剤は、薬剤、甘味剤として蔗糖、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、着色料、サクランボ香味料やオレンジ香味料などの着香料を含有することができる。もちろん、あらゆる投与単位形態を製造するのに使用されるあらゆる物質は薬学的に純粋であり、その使用量は実質的に無毒性でなければならない。また、医薬組成物は、徐放性の調製品や製剤に組み込むこともできる。
【００８８】
このように、「薬学的に許容され得る担体」は、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、防黴剤、等張剤、吸収遅延剤などを含むことを意図している。このような媒体や薬剤を、薬学的に有効な物質に使用することは当該分野では公知である。追加の有効化合物も組成物に組み込むことができる。
【００８９】
以下の実施例は本開示の説明を意図するものであって、制限するものではない。それらは一般的に使用されるものであるが、当業者に公知の他の方法を代わりに使用してもよい。
実施例
【００９０】
実施例１
加水分解テトラメトキシシラン溶液の調製
１４．０ｍＬのテトラメトキシシランを０．０１Ｍの塩酸１００ｍＬに加える。混合物を室温で１５分間撹拌する。溶液はシリカシェルを直接堆積させるための前駆体として使用する。
【００９１】
実施例２
１００ｎｍ径のアミンポリスチレンビーズを用いたコアシェル型シリカ球体の合成
４．０ｍＬの２．６％ｗ／ｖの１００ｎｍ径アミンポリスチレンビーズ、１６ｍＬの０．１％ポリ−Ｌ−リジン溶液および７５ｍＬの０．１Ｍのリン酸緩衝液を１５０ｍＬのナシ型フラスコ内で混合する。２ｍＬの加水分解テトラメトキシシランを加え、渦流攪拌装置を使用して３０００ｒｐｍの速度で混合物を激しく撹拌する。撹拌を室温で５分間続け、混合物を２本の５０ｍＬ遠心分離管に移す。遠心分離で白い沈降物が回収される。そのコアシェル型粒子を脱イオン水に懸濁し、渦流攪拌装置で５分間撹拌し、再び遠心分離で沈降させる。洗浄工程をもう一度繰り返し、続いてエタノールで洗浄する。１８５ｍｇのコアシェル型粒子を６０℃で４８時間真空乾燥する。
【００９２】
実施例３
２００ｎｍ径アミンポリスチレンビーズを用いたコアシェル型シリカ球体の合成
１００ｎｍ径アミンポリスチレンビーズを２００ｎｍ径アミンポリスチレンビーズと置き換える他は、合成工程は実施例２と同様である。
【００９３】
実施例４
２００ｎｍ径アミンポリスチレンビーズを用いたチタニアコアシェル型シリカ球体の合成
２．０ｍＬの２．６％ｗ／ｖの１００ｎｍ径アミン官能性付与ポリスチレンビーズと８０ｍＬの無水エタノールを１５０ｍＬのナシ型フラスコ内で混合する。１Ｍのチタンｔ−ブトキシドのエタノール溶液を２．０ｍＬ加え、渦流攪拌装置を使用して３０００ｒｐｍの速度で混合物を激しく撹拌する。撹拌を室温で２分間続け、混合物を２本の５０ｍＬ遠心分離管に移す。遠心分離で白い沈降物が回収される。そのコアシェル型粒子を無水エタノールに懸濁し、渦流攪拌装置で５分間撹拌し、再び遠心分離で沈降させる。洗浄工程をもう一度繰り返す。１２０ｍｇのコアシェル型ポリスチレン／チタニア粒子を６０℃で４８時間真空乾燥する。
【００９４】
実施例５
焼成によるポリマーコアの除去
１０ｍｇの乾燥コアシェル型シリカ粒子を加熱炉に入れ、５℃／分の速度で４５０℃まで温度を上げる。コアシェル型粒子を空気中で４５０℃４時間焼成し、次に温度を５℃／分の速度で室温まで下げる。３．２ｍｇの中空シリカ球体の最終製品が白い粉末として得られる。収率は、鋳型球体の数に基づいてほぼ定量できる。通常はより多量の乾燥コアシェル型シリカ粒子が焼成される。
【００９５】
実施例６
トルエン中での溶解によるポリマーコアの除去
１０ｍｇの乾燥コアシェル型シリカ球体を２０ｍＬのトルエンに懸濁し、混合物をマグネティック・スターラーで１時間撹拌する。遠心分離で固形物が回収される。洗浄工程をもう３回繰り返し、次いで粒子を６０℃で４８時間真空乾燥する。３．７ｍｇの中空シリカ球体が白い粉末として得られる。若干の残留ポリスチレンがまだ赤外スペクトル測定で確認される。この物質のＴＥＭ写真は、シリカ壁に吸着されたポリスチレンによると恐らく厚いシェル壁を示す。
【００９６】
実施例７
添加エチレンジアミンでの溶解によるコアの除去
１０ｍｇの乾燥コアシェル型球体を５ｍＬのエチレンジアミンと１５ｍＬのジクロロメタンの混合物に懸濁させ、マグネティック・スターラーで１時間撹拌する。遠心分離で固形物が回収される。洗浄工程をもう３回繰り返し、次いで粒子を６０℃で４８時間真空乾燥する。３．５ｍｇの中空シリカ球体が白い粉末として得られる。実施例５と比較すると、この方法では殆どすべてのポリスチレンコアが除去される。
【００９７】
実施例８
中空シリカ球体の３−アミノプロピル（トリメトキシ）シランによる官能性付与
１００ｎｍの鋳型で作製した１ｍｇの焼成中空シリカ球体を、１％の３−アミノプロピル（トリメトキシ）シランのアセトン溶液２ｍＬに懸濁する。混合物をマグネティック・スターラーで２時間ゆっくりと撹拌し、次いで遠心分離で粒子を回収する。回収した粒子をエタノールで洗浄し、室温で２４時間真空乾燥する。
【００９８】
表２．単離した中空シリカ球体の粒径および粒径の鋳型寸法とポリスチレンコア除去法に対する依存性
【表２】
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【００９９】
実施例９
鉄（III）エトキシド溶液を調製するために、２０ｍｇの鉄（III）エトキシドを計量し、１ｍｌの無水エタノールに懸濁し、次いで均質な茶色の透明溶液になるまで超音波発生浴中で超音波分解する（〜１〜３時間）。次いで鉄（III）エトキシド溶液を必要になるまでデシケーター中で保存する。
【０１００】
鉄ドープシリカナノシェルの合成を開始するために、鉄（III）エトキシド溶液を超音波発生浴中に９０分置いて、形成されている可能性のあるあらゆる沈降物やナノ結晶物質を溶解する。エッペンドルフチューブ内で、５０μｌのアミノ−ポリスチレン鋳型を１ｍｌの無水エタノールに懸濁する。次に、１０μｌの鉄エトキシド溶液と粒径に合わせた量のオルトケイ酸テトラメチル（２００ｎｍ径以下の粒子には３．１μｌ、２００ｎｍ径超の粒子には２．７μｌ）を加える。次に、溶液を脈動過流撹拌装置により３０００ｒｐｍで粒子径に応じて５または６時間撹拌するが、大きなナノシェルを完全に形成するためには６時間が必要である。次に粒子を遠心分離機でペレット状にし（速度と時間は使用する遠心分離機によって変わる）、上澄みを捨てる。粒子をエタノールに再度懸濁し、再びペレット状にして上澄みを捨てる。この工程をもう２回繰り返し、すべての過剰物と未反応物を除去する。次いで粒子を室温で夜通し乾燥させ、５５０℃で１８時間焼成する。その後、粒子はエッペンドルフチューブに乾燥状態で保存される。
【０１０１】
シリカナノシェルは、ケイ酸、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラエチルおよび上述の様々なドーパントを使用したゾルゲル反応をポリスチレン鋳型上で行うことにより、高度に再現性のある方法で合成できる。次に粒子を焼成してポリスチレンコアを除去すると、脱水された硬いナノ多孔性シェルが残る。図１Ａと図１Ｂは５００ｎｍ径の鉄ドープシリカナノシェルの透過電子顕微鏡法と走査電子顕微鏡法の画像である。図１Ｃはドープされていないシリカナノシェルを示す。合成には、あらゆる細胞への付着（ＰＥＩ）やがん細胞に対するエンドサイトーシス（葉酸）を増加させることが知られているコーティングによる官能性付与が容易に加えられることに留意されたい。
【０１０２】
ペルフルオロカーボン含有ナノシェル
ナノシェルに液体を充填するため、乾燥シェルをシュレンク管の中に入れて中身を抜き、管を飽和ペルフルオロペンタンの液体で満たし、管に水を注入し、溶液を振ってシェルを封入された液体ペルフルオロペンタン中に分散させた。液体のペルフルオロカーボンは水溶性が極めて低いため、長期間（少なくとも数か月）多孔性のシェル内に含有される。さらに、水の表面張力が高いので、水が毛管現象で多孔性シェルの外表面に入り、フルオラス相をシェル壁の孔の中に封じ込める。液体のＰＦＣが充填された分解性ナノシェルは手術前に注入できて、注入部位で保持されて局所マーカーとして作用することができる。
【０１０３】
手術中の局所超音波マーカー
この用途で、広範囲の生体内試験が行わている。ナノシェルを気体で充填するため、乾燥シェルをシュレンク管に入れて中身を抜き、管を飽和ペルフルオロペンタンの蒸気で満たし、管に水を注入し、溶液を振ってシェルを分散させた。ペルフルオロカーボンの蒸気は水溶性が極めて低いため、多孔性のシェル内に含有される。さらに、水は表面張力が高いので、水が毛管現象で多孔性シェルの外表面に入ってフルオラス相をシェル壁の孔の中に封じ込める。気体充填シェルは分散状態で超音波撹拌によって調製できて、分散状態で残り、表面が帯電しているため気体を少なくとも数週間保持する。気体充填分解性ナノシェルは、手術前に注入できて、注入部位に保持されて局所マーカーとして作用することができる。ナノシェルの最適投与量を検討するため、乳房組織に増殖するＰｙＶｍＴ腫瘍を一匹につき二個持つヌードマウスモデルを使用した。マウスは５００ｎｍ径のＦｅ−ＳｉＯ２−ＦＩＴＣナノシェルを注入され、カラードップラー超音波により最初の注入後と、注入の１時間後、２４時間後、７２時間後に画像化された。図３Ｂに示すように５０μｌと１００μｌの注入量の間には信号の質的差異がほとんどない。さらに、７２時間後にはほとんど差が見られず、画像化しない場合には粒子はペルフルオロペンタンの気体を保持しており、このことは、少なくとも手術前日に患者に粒子を注入するが可能であろうことを示している。図３Ｂでは、表示されているそれぞれの画像は別々のマウスから得られたもので、５００ｎｍ径Ｆｅ−ドープＳｉＯ２ナノシェルの性能の高い一貫性と再現性を示している。
【０１０４】
さらに、ナノシェルをヒトの乳腺切除組織を使って生体外で試験した。乳房温存手術に応用するために、切除する腫瘍の位置を正確に突き止めるのを助ける目的で放射性シードやガイドワイヤが現在埋め込まれているのと同じ手法で、ＣＴをガイドとしてこれらの粒子を手術前注入することを目標とする。そのため粒子が外科的切除前と外科的切除中に静止していることが望ましい。図４Ａに示すように、粒子は腫瘍境界の隣に正確に注入され、局在化部位から運び去られず、それによって腫瘍境界をより完全に縁どるために腫瘍の周囲に複数回注入することが可能になる。図４Ｂは、注入部分の断面の蛍光顕微鏡画像を示す。蛍光は、粒子表面と共有結合しているＦＩＴＣのものであり、数平方ミリメートルの領域に限定される蛍光が最初に注入された量と一致していて、粒子が注入部位に局在していることが再確認される。
【０１０５】
全身注入による腫瘍の検出
ナノシェルは上記のように気体で充填されるか、または液体のペルフルオロカーボンで充填される。腹腔内にＩＧＲＯＶ−１卵巣腫瘍を有する二匹のＮｕ／Ｎｕマウスに第二の全身注入法を使って生体ＣＰＳイメージングの試験を行った。２μｍまたは５００ｎｍ径のＰＦＰ充填シェル２００μｇを３ｍｌの生理食塩水で希釈し、腹膜（ＩＰ）に注入した。ＣＰＳイメージング装置を使って高ＭＩで断続的に二時間以上粒子をイメージングした。腹腔内注入はネズミ科動物のモデルでの全身送達に以前から使用されている。
【０１０６】
これらのマウスは末期の１ｃｍまでの腫瘍の腫瘤を持っていた。（図５Ａの赤い矢印）。図５Ｂ〜図５Ｄでは、下部の境界（青い矢印）が実物のマウスの下部で、下部にある小山のような領域（緑の矢印）が脊柱である。図５Ｄを作成するのに画像処理技術が使用され、それは（ａ）超音波とマウスの呼吸による動きを補正し、（ｂ）少数の連続した映像間の明暗度の違いを解釈して単一粒子からの信号を選択し、（ｃ）超音波検査全体から粒子の信号を統合し、そして（ｄ）粒子からの信号を赤と黄のヒートマップとしてグレースケールの画像に重ね合わせて表示する。図５Ｄに示すように、粒子が発した信号は注入後１時間経って腫瘍の中にはっきりと見られた。このことは、注入後数時間の生体内での単一の事象からの小さな信号でさえ、容易に視覚化する能力を説明している。市販の軟らかいＣＥＵＳ用気泡では、腫瘍に貼りつかず、組織内や循環における耐用時間が短すぎて腫瘍に蓄積されないため、この画像化が不可能であることに留意されたい。代わりに、市販の軟らかい微小気泡での画像化については、ボーラス静注が一般的に使用され、腫瘍への灌流動態が注意深く測定されなければならない。
【０１０７】
粒子が一時間血液循環中に残留し、肝臓にのみ集積することを示すために、健康なＮｕ／ＮｕマウスにＤＴＰＡ（インジウムキレート剤）と結合した５００ｎｍ径の気体充填分解性シリカシェルを使用して生体内分布の研究を行った。これは粒子が内部で他の組織にほとんど貼りつかず、それによって腫瘍への局在を可能にすることを示す。２ｍｇの粒子に１００μＣｉ以下のインジウム−１１１を使って放射性同位体によるラベル付けをした。４匹のヌードマウスをこの実験に使用した。それぞれのマウスに尾の静脈から１００μｌを静脈注射した。最初の注入中、注入の１時間後、２４時間後、７２時間後にガンマシンチグラフィでマウスを撮像した。７２時間後マウスを殺し、内臓を取り出してガンマカウンターに入れて、放射能レベルを測定した。図８Ｄに見られるように、７２時間後でさえ、若干の信号が血液中で検知できて、それは若干の粒子がまだ循環し、腫瘍の血管系の長期的イメージングが行える可能性があることを示している。
【０１０８】
ナノシェル促進超音波切除術１型：
気体充填粒子が標準ＨＩＦＵよりもはるかに速くＨＩＦＵによって組織を変性できることを実証するために一組の動物実験を行った。標準ＨＩＦＵは加熱によって腫瘍組織を変性させるため、長時間高周波を当てる必要がある。シリカシェル使用のＣＥＵＳによるＨＩＦＵは、キャビテーションによって迅速に組織の液状化を起こすので、処理が非常に速い一方で、高度に局限的である。この方法での切除の実用性を確立するために４匹の健康なニュージーランド白ウサギ（４ｋｇ以下）を使用した。負圧のピークが３ＭＰａである連続的な８００ＫＨｚの純音波形を使用して所定の超音波エネルギを当てたときに、組織内で測定可能な応答を起こすのに要する時間をナノシェルによる促進で減らせることがわかった。図９Ａに見られるように、高エネルギの超音波だけで６０秒間の曝露により肝臓に熱損傷を与えることができる。しかし、ナノシェルによる促進では機械的損傷も加わって同じ大きさの領域が３０秒で生成される。その液状化領域の外では、おそらく超音波が液状化組織によって強く分散されているためにナノシェルが両方の処理を促進していることを示す熱切除区域があることに留意されたい。これは、液状化領域に近い細胞を変性し、それによって腫瘍からがん細胞が逸脱しないようにしているため、腫瘍治療に有利であろう。
【０１０９】
ナノシェル促進超音波切除術２型：
ナノシェルの液体ペルフルオロカーボンによる充填は、まず真空下でバイアル瓶中の粒子の中身を抜き、次に注射器で液体ＰＦＣをバイアル瓶に注入して行われる。次いで、溶液が超音波分解され、水が溶液に加えられてさらに超音波分解される。二つの溶液は混じり合わないが、液体の分離相は見られない。これは液体ＰＦＣがナノシェルの中にあることを示している。液体ＰＦＣがナノシェル内で気体に変わり、それに続いて市販の診断用超音波装置を使ってインビトロで合体が行われる。音が透過する容器に懸濁状態で入っているナノシェルはＣＰＳ画像装置を使って様々なメカニカルインデックス（ＭＩ）において撮像される。図７Ａおよび図７Ｂに見られるように、超音波の機械力はＭＩ０．９７から１．９へと上げられて、それに刺激された合体の約１ｍｍ径の気泡ができる。
【０１１０】
１００ｎｍ径のシリカナノ球体の表面に、がん細胞を特異的に標的化して侵入するように葉酸で官能性を付与した。１００ｎｍ径の中空シリカナノ粒子３ｍｇを１ｍＬの無水エタノールに懸濁して、次に、アミンでＮＳ表面を修飾するために１時間０．３μＬの３−アミノプロピルシランを加えた。アミンの表面コーティング反応が完了すると、ナノ粒子をペレット化してエタノールで二度、ＤＭＳＯで一度洗浄し、アミン修飾ナノ球体を１ｍＬのＤＭＳＯに再懸濁した。この懸濁物に２０μｇのイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）スクシンイミジルエステルと、何種類かの量（２μｇ、２０μｇまたは２００μｇ）の葉酸スクシンイミジルエステルを加え、室温で３時間混合した。スクシンイミジルエステルは分離し、ＦＩＴＣと葉酸塩をアミンコーティングと結合させた。ＦＩＴＣと葉酸塩で修飾された粒子を遠心分離で回収し、ＤＭＳＯと脱イオン水で洗浄し、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁して、動的光散乱（ＤＬＳ）特性解析とエンドサイトーシスの実験を行った。蛍光共焦点顕微鏡によって、ナノ球体の表面上の葉酸塩の量が増えるとより多くのナノ球体が頸部のがん細胞株であるＨｅＬａがん細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれることがわかった（図６左）。この結果は、葉酸塩で標的化された直径３２７ｎｍの大きさのナノ球体粒子が比較的容易に得られ、ＨｅＬａ細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれることを示す。
【０１１１】
２０μｇのＦＩＴＣと２００μｇの葉酸塩とで官能性を付与されたシリカＮＳを使ってがん細胞の選択的標的化実験を行った。ＨｅＬａ細胞と正常細胞株であるヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ−１）を別々のフラスコで培養し、それぞれの細胞質をインビトロゲン・セルトラッカー（Invitrogen CellTracker）染料で別々の色に着色した。つぎにその二種類の細胞株を一緒に混ぜ合わせて葉酸塩を含まない完全培地で５％のＣＯ２を含む３７℃の湿潤雰囲気下において２４時間培養した。その後、葉酸塩で標的化されたＮＳを細胞と共にさらに24時間培養した。次に細胞をＤＰＢＳで３回洗浄して過剰のＮＳを除去し、４％のＰＦＡを含むＤＰＢＳ溶液で固定し、さらにＤＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で視覚化するための試料を作製するためにプロロング・ゴールド（Prolong Gold）褪色防止剤で覆った。蛍光顕微鏡下において、ＮＳの大部分が、ＨＦＦ−１正常細胞に比べてより高い割合で葉酸塩レセプターの多いＨｅＬａがん細胞と相互作用し、またそれを標的とする傾向のあることがわかった（図６の右）。
【０１１２】
静脈注射されるマウスモデルでのシリカナノシェルの最適投与量と耐用時間の決定
ＩＧＲＯＶ−１卵巣がん細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）を、１０％のウシ胎仔血清と１％の抗生物質抗真菌物質（antibiotics-antimycotics）（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ（Gibco）、インビトロゲン・カナダ社（Invitrogen Canada, Inc.）、カナダ、オンタリオ州バーリントン）中で保存する。注入の準備をするため、細胞をトリプシン処理し、血清不含培地で１×１０７個／ｍｌの濃度に再懸濁する。細胞の生存能力はトリパンブルー色素排除試験法で判定する。６〜８週齢のメスのＮｕ／Ｎｕマウス（チャールズリバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories））の腹膜に１０６個の細胞（１００μｌ）を接種する。腫瘍は一週間に三回カリパスで測定する。腫瘍が約１０００ｍｍ３となったら（すなわち１週間半〜２週間半後に）、その動物を実験に供する。蛍光標識された１００ｎｍまたは５００ｎｍ径の粒子２ｍｌを尾の静脈からマウスに注入する。実験は二種類の投与量、すなわち２ｍｌの滅菌生理食塩水中に１００μｇおよび５００μｇで行う。１００μｇ／２ｍｌは血管系内で粒子を観察するのに最少の撮像可能投与量で、５００μｇ／２ｍｌはマウスに注入される最大量である。
【０１１３】
粒子の循環での耐用時間を延ばすために、標的化されたものもされないものも含め全ての寸法の粒子をペグ化する。ナノ粒子のペグ化は生体内でのナノ粒子の循環をかなり増やし、粒子が腫瘍床に集積して免疫反応を減らすことを可能にする。中空シリカ粒子のペグ化は周知のケイ素の化学と、多数の製造者を介して市場で入手できるＰＥＧ・シラン製品によって実施可能である。粒子ペグ化の基本スキームを図１３に示す。さらに、アミノＰＥＧシランも市販されていて、これは、ＮＨＳ結合化学、および３−アミノプロピルシランで先に行った（図６）ようにＮＨＳと葉酸塩をＰＥＧの一級アミンと結合する粒子の標的化能力を保存する。カルボキシルＰＥＧシラン製品も市販されていて非標的化粒子と標的化粒子が同じ（負の）表面帯電を保つように、非標的化粒子に対して使用される。
【０１１４】
良好な統計的検出力を得るため、それぞれの粒径と投与量について、５匹のマウスの５個の腫瘍（処方全体では２０匹のマウスの２０個の腫瘍）を用いる。マウスは、注入後、０時間、１時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に撮像され、その後殺される。複数の撮像時点により、腫瘍中と循環中の残留状態を判定できる。各撮像時点において、３０画像以上の連続した超音波映像が腫瘍と肝臓で撮像される。それぞれの場所で、動きアーチファクトを最小限にするために超音波振動子を適切な位置に固定する。超音波ゲルを塗布し、局所の血液循環に悪影響を与えないように振動子を腫瘍に強く押し付けないようにする。最大の腫瘍断面での撮像面を目視で選択することにより、病変部の中央を貫いて連続画像を撮像する。シーメンス・セコイア（Siemens Sequoia）スキャナー（補助スキャナーとしてＧＥロジク（Logiq）Ｅ９を使用）を使用し、コントラスト最適化画像化モダリティにより超音波撮像を行う。予備試験のデータが示す最大粒子信号を達成するために、スキャン中は最大出力を当てる。後処理後、粒子の存在を強調表示し、選択した対象領域（ＲＯＩ）での後処理によって組織背景から分離された粒子の平均明度を計算して粒子を定量する。同じ後処理の演算手順と変数を全部のデータセットに一貫して適用すると、全試料の粒子信号を定量的に比較できる。粒子の最適な投与量と大きさは、腫瘍と肝臓との平均明度比率を最大にすることで決定する。この比率は腫瘍への粒子の結合の指標としても利用できる。粒子が腫瘍内をどれほどよく灌流するかに応じて、腫瘍体積の一部をＲＯＩとして選択できる。しかしながら、一貫した基準を構築するためには、肝臓について可能なかぎり最大の対象領域を選択する。７２時間でマウスを安楽死させた後、腫瘍と肝臓を固定し、組織学のために薄片にする。組織学薄片の蛍光画像と明視野画像を撮り、超音波画像と（処理前と処理後について）比較する。粒子の存在と分布は文書化し組織学によって確認する。
【０１１５】
他の実験においては、ＨＩＦＵ治療法とＨＩＦＵに支援された投薬療法にも適用できるため、前立腺がんモデルを使用する。ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）を１０％のウシ胎仔血清と１％の抗生物質抗真菌物質（antibiotics-antimycotics）（シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）を加えたＲＰＭＩ培地（ギブコ、インビトロゲン・カナダ社、カナダ、オンタリオ州バーリントン）で保存する。注入の準備をするため、細胞をトリプシン処理し、血清不含培地で１×１０７個／ｍｌの濃度に再懸濁する。細胞の生存能力はトリパンブルー色素排除試験法で判定する。６〜８週齢のオスのＮｕ／Ｎｕマウス（チャールズリバー・ラボラトリーズ）の腹膜に１０６個の細胞（１００μｌ）を接種する。腫瘍は一週間に三回カリパスで測定する。腫瘍が約１０００ｍｍ３となれば（すなわち１週間半〜２週間半後に）、マウスを実験に供する。蛍光標識された１００ｎｍまたは５００ｎｍ径の粒子２ｍｌを尾の静脈からマウスに注入する。２ｍｌの滅菌生理食塩水中に１００μｇおよび５００μｇの２種類の投与量を使用する。１００μｇ／２ｍｌは血管系で粒子を観察するのに最少の撮像可能投与量で、５００μｇ／２ｍｌはマウスに安全に注入できる最大量である。良好な統計的検出力を得るため、それぞれの粒径と投与量について、５匹のマウスの５個の腫瘍（処方全体では２０匹のマウスの２０個の腫瘍）を用いた。マウスは、注入後、０時間、１時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に撮像され、その後殺される。予備試験のデータが示す最大粒子信号を達成するために、スキャン中は最大出力を当てる。後処理後、粒子の存在を強調表示し、選択した対象領域（ＲＯＩ）での後処理によって組織背景から分離された粒子の平均明度を計算して粒子を定量する。粒子の最適な投与量と大きさは、腫瘍と肝臓との平均明度比率を最大にすることで決定する。７２時間後にマウスを安楽死させた後、腫瘍と肝臓を固定し、組織学のために薄片にする。組織学薄片の蛍光画像と明視野画像を撮り、超音波画像と（処理前と処理後について）比較する。粒子の存在と分布は文書化し組織学によって確認する。
【０１１６】
静脈注射シリカナノシェルによる画像化可能最少腫瘍体積の決定
非標的化ナノシェルの最適粒径（１００ｎｍ対５００ｎｍ）と最適投与量（１００μｇ／２ｍｌ対５００μｇ／２ｍｌ）が決定されれば、標的化を研究する。最適粒径と最適投与量を、非標的化粒子対葉酸塩標的化粒子について試験する。腫瘍からの信号の強度を比較する。６〜８週齢のメスのＮｕ／Ｎｕマウス（チャールズリバー・ラボラトリーズ）の腹腔内に１０６個の細胞（１００μｌ）を接種する。腫瘍は一週間に三回カリパスで測定する。腫瘍が約１ｃｍ３となったら（すなわち１週間半〜２週間半後に）、マウスを実験に供する。蛍光標識された２ｍｌの標的化粒子と被標的化粒子を尾の静脈からマウスに注入する。実験は葉酸塩標的化粒子について１０匹のマウス（１０個の腫瘍）で行い、非標的化粒子については先に撮像された５匹のマウスを補うために５匹のマウス（５個の腫瘍）で行う。マウスは、注入後、０時間、１時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に撮像される。複数の撮像時点により、腫瘍中と循環中の残留状態を測定できる。各撮像時点において、３０画像以上の連続した超音波画像が腫瘍と肝臓で撮像される。葉酸塩標的化粒子の性能は、腫瘍と肝臓の平均明度比率を測定することにより非標的化粒子と比較される。葉酸塩標的化粒子が非標的化粒子以上に腫瘍の増大を促進しないと判定されれば、追加のマウス１０匹（１０個の腫瘍）を使用してａＶ｜３３−標的粒子で同じ実験を行う。
【０１１７】
別の実験では、非標的化ナノシェルの最適粒径（１００ｎｍ対５００ｎｍ）と最適投与量（１００μｇ／２ｍｌ対５００μｇ／２ｍｌ）が決定されれば、標的化を研究する。最適粒径と最適投与量を、非標的化粒子対葉酸塩標的化粒子について試験する。腫瘍からの信号の強度を比較する。６〜８週齢のオスのＮｕ／Ｎｕマウス（チャールズリバー・ラボラトリーズ）の腹腔内に１０６個のＬＮＣａＰ前立腺がん細胞（１００μｌ）を接種する。蛍光標識された２ｍｌの標的化粒子と非標的化粒子を尾の静脈からマウスに注入する。実験は葉酸塩標的化粒子について１０匹のマウス（１０個の腫瘍）で行い、非標的化粒子については先に撮像された上記の５匹のマウスを補うために５匹のマウス（５個の腫瘍）で行う。マウスは、注入後、０時間、１時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に撮像される。各撮像時点において、３０画像以上の連続した超音波画像が腫瘍と肝臓で撮像される。葉酸塩標的化粒子の性能は、腫瘍と肝臓の平均明度比率を測定することにより非標的化粒子と比較される。葉酸塩標的化粒子が非標的化粒子以上に腫瘍の増大を促進しないと判定されれば、追加のマウス１０匹（１０個の腫瘍）を使用してαＶβ３標的粒子で同じ実験を行う。
【０１１８】
７２時間後にマウスを安楽死させた後、腫瘍と肝臓を固定し、組織学のために薄片にする。組織学薄片の蛍光画像と明視野画像を撮り、超音波画像と（処理前と処理後について）比較する。粒子の存在と分布は文書化し組織学によって確認する。
【０１１９】
静脈注射シリカナノシェルによる画像化可能最少腫瘍体積の決定
静脈注射によって画像化できる最少腫瘍寸法を決定するために、最適な粒子の種類、標的化、注入量、撮像時点を使用する。検知できる最少腫瘍寸法を検討するため、マウスの一群をがん細胞接種後、３日目、７日目および１４日目に調べる。従来からのカリパスによる測定と共に、腫瘍の直交断面の超音波画像を２点撮影し、腫瘍の体積を推定する。組織学的解析のため、腫瘍全体を再切除した。組織学から得られた腫瘍の体積を究極の標準として使用し、撮像により検出される腫瘍体積と比較する。実験は４０匹のマウスの４０個の腫瘍で繰り返される。
【０１２０】
ＨＩＦＵ用の気体および液体充填ナノシェルの有効性試験
上記の試験が完了したら、最適なナノシェルのＨＩＦＵ試薬としての性能を検討する。二つの方式で研究される。先ず、気体充填粒子の単回急速静注法を使用し、次いで腫瘍が非促進ＨＩＦＵと比較して低出力（メカニカルインデックス）の超音波で熱的に切除できるかを判定する。腫瘍は１０匹のマウスで増殖される。マウスの半分には最適粒子を１回急速静注し、他の半分は対照試料とし、目標２で検討された最大の５００μｇ／２ｍｌとする。腫瘍中の粒子を観察した後、腫瘍の温度をＭＲＩで監視しながら粒子に高密度超音波を当てる。ＨＩＦＵを使用した対照試験を腫瘍持ちのマウスで行うが、促進用のシリカシェルは使用しない。腫瘍の温度を５０℃に上げるための最少メカニカルインデックスを、マイクロシェルを急速静注したマウスとしないマウスの両方について測定する。静脈内投与が腫瘍温度上昇のためのメカニカルインデックスを充分に低下させない場合は、粒子を直接腫瘍に注入する。ヒトの乳腺切除組織の実験では、粒子が腫瘍組織の注入部位に正確に保持されていることを示す。
【０１２１】
別の実験では、ＰＦＣの液体または気体を充填した粒子の単回急速静注法が、腫瘍組織の大部分を液状化し切除し、腫瘍に供給を行う周囲の血管系を損傷するために使用される。純粋に低デューティサイクルＨＩＦＵによる機械的およびキャビテーション応答と、高デューティサイクルＨＩＦＵによる熱的要素を含むものとの両方を調査する。腫瘍は、ＨＩＦＵのデューティサイクルまたは適用周波数を変えて６つの群に分けられた３０匹のマウスで増殖される。各グループの５匹のマウスはＰＦＣ液体充填ナノシェルの単回急速注入を受け、ナノシェルはＨＩＦＵの前に２４時間マウスの体内を循環する。予備試験では１．１ＭＨｚ、３ＭＰａでデューティサイクルが２％のＨＩＦＵは腫瘍組織を高速で機械的に切除するがナノシェルの存在下で熱損傷を起こすには不十分であることが示され、実験の出発点として使用される。マウスに当てられるＨＩＦＵは、1分、３ＭＰａで、デューティサイクルが２％、１０％、５０％、ＨＩＦＵ周波数が１．１または３．３ＭＨｚのいずれか（３種のデューティサイクル×２種の周波数＝６群）である。追加の１０匹のマウスを使った腫瘍増殖マウスに関する対照試験をＨＩＦＵを使用して行うが、促進用シリカシェルは使用しない。ＨＩＦＵの後、従来の微小気泡を使用して（この手法は腫瘍の状態評価のために従来から臨床的に使用されている）腫瘍血管系の特性を判定する。超音波解析の後、腫瘍を再切除して組織学的に調査する。ナノシェルの効果と機械的損傷と熱的損傷の比率を、超音波解析と組織学解析の両方で特性評価する。
【０１２２】
二番目は、液体充填粒子の急速静注法を使用して、ミリメートル大の気泡が腫瘍の血管系に生成されて腫瘍に供給を行う毛細血管を破壊するかを判定する。まず、腫瘍の血管系の特徴を、従来の微小気泡を使用して（この方法は腫瘍の状態評価のために従来から臨床的に使用されている）判定する。次に、液体充填シリカナノ粒子の単回急速静注法を使用して、ＨＩＦＵによって腫瘍への血流が妨げられるかを判定する。１０匹のマウスに２個ずつの腫瘍が増殖される。マウスの半数には最適な液体粒子を単回急速静注し、残りの半数は対照試料として使用される。投与量は、目標２で検討された最大の５００μｇ／２ｍｌとする。腫瘍中の粒子を観察した後、腫瘍の温度をＭＲＩで監視しながら粒子にＨＩＵＦを当てる。ＨＩＦＵを使用した対照試験を腫瘍持ちのマウスで行うが、促進用のシリカシェルは使用しない。次に、粒子に刺激を与えて大きな１ｍｍ径の気泡とし（下記の画像を参照）、腫瘍の血管系を従来の微小気泡を使いＣＥＵＳで精査する。
【０１２３】
キャビテーションを起こすナノシェルおよびＨＩＦＵ
ナノシェルをヒトの乳腺切除組織を使って生体外で試験した。乳房温存手術に応用するため、切除する腫瘍の位置を正確に突き止めるのを助ける目的で放射性シードやガイドワイヤが現在埋め込まれているのと同じ手法で、ＣＴをガイドとしてこれらの粒子を手術前注入することを目標とする。そのため、粒子が外科的切除前と外科的切除中に静止している。図１０Ａに示すように、粒子は腫瘍境界の隣に正確に注入され、局在化部位から運び去られず（断面顕微鏡観察でも確認される）、それによって腫瘍境界をより完全に縁どるために腫瘍の周囲に複数回注入することが可能になる。図１０Ｂは、注入部分の断面の蛍光顕微鏡画像を示す。蛍光は、粒子表面と共有結合しているＦＩＴＣのものであり、数平方ミリメートルの領域に限定される蛍光が最初に注入された量と一致していて、粒子が注入部位に局在していることが再確認される。
【０１２４】
ナノシェルをヒトのキャビテーションＨＩＦＵ治療に使用できる可能性があることを実証するために、ＰＦＰ液体充填の５００ｎｍ径ナノシェルを乳腺切除組織の腫瘍内に注入し、ＨＩＦＵを行った。図１１Ａに見られるように、ナノシェルはカラードップラ超音波イメージングではっきりと見ることができる。ＨＩＦＵを活性化させると（図１１Ｃ）、キャビテーションと気泡の生成はカラードップラー信号が発生するところではっきりと見ることができる。ＨＩＦＵを当てる前の図１１Ｂの画像を、ＨＩＦＵを当てた後の図１１Ｄの画像と比較すると、腫瘍の中に空洞をはっきりと見ることができる。バキュームや注射器を使って空洞内から液状化した組織を引出し、そのくぼみに治療薬や追加のナノシェルを再度満たすことは、本願明細書の他の部分に記載してあるように可能である。
【０１２５】
上記に明示したように、２μｍ径ナノシェルは腹膜（ＩＰ）内の末期腫瘍を超音波で検知できることを示した。ガンマシンチグラフィーとカラードップラ超音波を使用して、腫瘍内に投与された５００ｎｍ径ナノシェルが腫瘍によく保持されることが実証された。さらに、ナノシェルをＨＩＦＵ治療のために腫瘍に集積するのと同様、複数の腫瘍を容易に検知し画像化するために使用できることを実証するため、ナノシェルを放射性１１１−インジウム−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸塩）で標識化し、マウスに増殖させたＰｙ８１１９乳房腫瘍に注入した。各々のマウスは２個の腫瘍を両脇腹に１個ずつ埋め込まれた。ＤＴＰＡはナノシェル表面に共有結合的に固定された。これは、インジウムの公知のキレート剤であり、様々なナノ製剤の生体内分布の研究に一般に使用されている。各々のマウスは尾の静脈から４ｍｇ／ｍｌの濃度のナノシェルを１００μｌ、投与量当たり１５〜２０μＣｉで注入され、平面ｙ−シンチグラフィーイメージングが図８Ａ〜図８Ｄに示すように行われた。７２時間後、マウスは殺されて臓器が取り出され、臓器全体の放射能がｙ−カウンターで測定された。図８Ａは粒子が初めにマウスの全身に拡がり、初期において肝臓に多く集積していることを示す。しかし、図８Ａに見られるように最初のナノシェル注入直後でも腫瘍の輪郭（画像中央のマウスの下部に近い脇腹の両側の突起物）がマウスの下部に見られる。腫瘍の画像は図８Ｃおよび図８Ｄのように時間と共にはっきりと見えるようになる。腫瘍に保持されたナノ粒子は、様々な生体内腫瘍モデルについて文書化されている浸透と保持の促進（ＥＰＲ）作用の成果であると仮定される。腫瘍中の血管系は発達が不充分で、循環、排液、漏出が悪いため、巨大分子やナノ粒子を腫瘍の中に閉じ込めて保持する。さらに、それぞれの腫瘍に保持されているナノシェルの量は、腫瘍1グラム当たりの注入投与量のパーセント値がほぼ等しいことで証明されるように（図８Ｅ）、腫瘍の質量を基準にするとほぼ一定である。
【０１２６】
ナノシェルがこの腫瘍モデルに集積できると判定されると、ナノシェルはＰｙ８１１９乳房腫瘍を持つ同じＮｕ／Ｎｕマウスに静脈注射された。ＰＦＰ液体充填ナノシェルは、ＨＩＦＵ適用前に、24時間循環され腫瘍に集積させられた。ＨＩＦＵは、３ＭＰａおよび１．１ＭＨｚ、デューティサイクル２％で1分間当てられた。ＨＩＦＵを当てるとナノシェルは砕かれ、ナノシェル中の液体ペルフルオロカーボンは音波による液滴蒸発を起こして（図１２Ｂ）キャビテーションを開始する。このキャビテーションは、ＨＩＦＵの焦点容積内の組織を液状化するのに充分強力であるが（図１２Ｃ）、焦点容積外の組織は影響を受けずに残る。図１１は５００ｎｍ径のＦｅ−ＳｉＯ２ナノシェルに充填されたペルフルオロカーボンがＨＩＦＵの感作物質として、特に生体内組織の機械的キャビテーションと液状化とを促進するために使用できることを証明している。
【０１２７】
長期イメージングマーカー
ＰＦＣ気体充填ナノシェルが長期の超音波イメージングに使用できることはすでに示されている。鉄ドープナノシェルは８匹のＰｙ８１１９乳房腫瘍をもつＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍中に注入された。粒子はカラードップラ超音波で１０日の期間に渡って撮像された（図１３Ａ〜図１３Ｆ）。カラードップラ信号の幅が測定され、時間に対してグラフ化された（図１３Ｇ）。信号が１０日間持続し、時間が経つにつれて直線的に画像と共に衰退することがわかった。同時に撮像されるナノシェルの数を最大限にするために、より高いメカニカルインデックス（１．９）（超音波出力）が適用された。高いメカニカルインデックスを使用した結果、粒子の反射性が高いことによる相当度の影付けが見られた。この影付けは、超音波下では過剰に大きなカラードップラー尾部として見られ、Ｙ軸のカラードップラー信号を粉飾している（図１３Ｄ）。この観察された影による妨害を克服するために、信号の幅は、信号の領域の代わりに信号の衰退を測定するのに使用された。
【０１２８】
しかし、１０日経つと信号が見られなくなった。信号をさらに長く体内で保つために、ナノシェル中のペルフルオロカーボンが抜けるのを防ぎ、体液中のあらゆる成分がナノシェルに侵入することを防ぐ必要がある。これを達成するために提案された方法は、ナノシェルの表面をフッ素化し「濡れない」表面を作ることである。これはナノシェルをペルフルオロカーボン溶液に懸濁させ、次いで過剰のフッ素化アルコキシシラン（例えばペルフルオロオクチルトリエトキシシランのようなトリアルコキシシラン）を加えればできる。アルコキシシランをさらにフッ素化すれば、ＰＦＣ液体への溶解性がさらに増大し、ナノシェルから抜け出すＰＦＣがより少なくなる。この溶液は、次に超音波分解浴でガス抜きされてナノシェル内の気体が除去され、それにより液体ペルフルオロカーボンがナノシェルに充填され封じ込められ、次いで過流攪拌装置で混合される。シラン反応とフルオラス相は効果的にナノシェル全体の孔をふさぎ、局所環境でのナノシェルの相互反応を劇的に減らす。これは、ナノシェルが生体内での無限の耐用時間を得て超音波イメージング画像化モダリティによって撮像されるのに役立つ。
【０１２９】
ナノシェルＨＩＦＵ促進局所（ＩＴ）薬剤送達
ＨＩＦＵはナノシェルの静脈注射後に腫瘍を切除するために使用される。残留がん細胞を除去するために、ナノ製剤（ドキシル（Doxil））がＨＩＦＵで作られたくぼみに注入される。高温療法が、ナノ製剤と同様に薬剤も保持する腫瘍の能力を増大させることはすでに観察されている。ドキシルはＦＤＡに承認されているため使用されるが、他の治療法をドキシルに代えることも可能である。ナノ製剤は、組織の機能的な空隙に比べて比較的寸法が大きいため、一般的に組織内への浸透性が悪いことが知られている。その結果、多くのナノ製剤は腫瘍全体にまんべんなく効果的に薬剤を送達することができない。さらに、腫瘍内に治療薬を注入することは、腫瘍からすぐに薬が放散されるだけでなく腫瘍内圧が高いこともあって効果のないことがしばしば証明されている。腫瘍の中心部内にくぼみを作ることにより、腫瘍の中心部が効果的に薬剤の貯蔵所となり得ると、以前は粒子の腫瘍への侵入を妨げていた拡散性の悪さがかえって薬剤の抜けを防ぐのに有利となる。キャビテーションを起こすＨＩＦＵが巨大分子や薬剤の腫瘍中での保持を促進できる証拠がある。腫瘍をもつ３群の３０匹の動物（１群あたり１０匹で、ＨＩＦＵおよびドキシル使用の群、ドキシルだけの群、ＨＩＦＵだけの群）を、ドキシルと組み合わせたＨＩＦＵの効果を調査するために使用する。上記のように、ＬＮＣａＰ腫瘍を腹膜内に増殖させる。動物は、上記の目標での知見に基づく用量のナノシェルを受ける。ナノシェルは高周波音波を当てられる前に、２４時間循環させられる。ＨＩＦＵは目標３で決定された最適条件で1分間当てられる。液体は機械的キャビテーションを受けた腫瘍領域から除去され、空洞は、各々の動物の体重当たりの標準総投与量を反映した投与量のドキシルで満たされる。ＨＩＦＵだけの群では、空洞は生理食塩水で満たされる。ドキシルだけの群では、腫瘍内注入で送達される。マウスは１０週間にわたり毎週ナノシェル／ＨＩＦＵ／治療薬による治療を受ける。病気の進行は、毎日カリパスで腫瘍の大きさを測定し、毎週超音波で診断して監視される。１０週間後、マウスは殺され、腫瘍および臓器は組織学的に解析される。
【０１３０】
ナノシェルＨＩＦＵ促進による腫瘍崩壊局所（ＩＴ）ウィルス性治療
腫瘍崩壊ウィルスは局所的に注入されると極めて効果的であることが知られているが、多くの腫瘍は圧力と密度が高いため充分な投与量を注入することが困難である。キャビテーションＨＩＦＵは、静脈注射後に腫瘍内部にくぼみを作るために使用される。残留がん細胞を除去するために、腫瘍崩壊ウィルスがくぼみに注入される。ＵＣＳＤは、いくつかの効果的な腫瘍崩壊ウィルスを開発し、専有技術は、適切な受容体さえ発現しない細胞のトランスフェクションを可能にする。これは、局所転移がある場合も効果的な腫瘍治療を可能にする。なぜならば、ウィルスは一旦細胞にトランスフェクトすると、複製を続けてさらに細胞をトランスフェクトするからである。キャビテーションＨＩＦＵは、トランスフェクションのための生存能力のある細胞を残すため、最適の方法である。腫瘍を持つ３群の３０匹の動物（１群あたり１０匹で、ＨＩＦＵとリポソームでカプセル化された腫瘍崩壊ウィルス使用の群、ＨＩＦＵと腫瘍崩壊ウィルス使用の群、腫瘍崩壊ウィルスだけの群）を、腫瘍崩壊ウィルスと組み合わせたＨＩＦＵの有効性を調査するために使用する。目標１に記載のように、ＬＮＣａＰ腫瘍を腹膜内に増殖させる。動物は、上記の目標での知見に基づく用量のナノシェルを受ける。ナノシェルは高周波音波を当てられる前に、２４時間循環させられる。ＨＩＦＵは腫瘍内にくぼみをつくるため、１．１ＭＨｚ、３ＭＰａで、低デューティサイクルで1分間当てられる。液体は真空ラインで除去され、くぼみは、各々の動物の体重当たりの標準総投与量（マウス１匹に５×１０９ｐｆｕ以下）を反映した投与量のカプセル化腫瘍崩壊ウィルスまたは腫瘍崩壊ウィルスで満たされる。腫瘍崩壊ウィルスだけの群では、腫瘍内注入で送達される。マウスは１０週間にわたり毎週ナノシェル／ＨＩＦＵ／治療薬による治療を受ける。病気の進行は、毎日カリパスで腫瘍の大きさを測定し、毎週超音波で診断して監視される。１０週間後、マウスは殺され、腫瘍と臓器は組織学的に解析される。
【０１３１】
本明細書には多数の実施形態が記載されている。しかしながら、本開示の精神と範囲から逸脱することなく、多様な改変が行われ得ることを理解すべきである。従って、他の実施形態は下記の請求項の範囲に包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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