(57)【要約】  糖尿病を予防または治療するための新規なＩＮＧＡＰペプチドならびにその組成物および使用方法が提供される。詳細には、β細胞新生活性およびインスリン強化活性を有し、インビボ使用のために十分に安定性であるＩＮＧＡＰの１９アミノ酸ペプチドについて記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、配列番号５、または配列番号６に規定した配列を含むペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、被験者における、膵臓β細胞新生を誘導する、膵臓β細胞再生を誘導する、グルコース恒常性を改良する、および／または高血糖症を反転する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体であって、前記アナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体は、前記ペプチドの生物活性を有する、アナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体。
【請求項４】
前記アナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体は、前記ペプチドと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する請求項３に記載のアナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体。
【請求項５】
前記生物活性は、前記ペプチドの細胞、または受容体結合特異性である請求項４に記載の融合タンパク質のアナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体。
【請求項６】
前記生物活性は、被験者における、膵臓β細胞新生を誘導する能力、膵島細胞再生を誘導する能力、グルコース恒常性を改良する能力、および／または高血糖症を反転する能力である請求項４に記載の融合タンパク質のアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体。
【請求項７】
配列番号４、配列番号５、または配列番号６のペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項８】
発現ベクターを形成するために発現制御配列へ機能的に連結している請求項７に記載の核酸分子であって、前記発現ベクターは、適切な細胞内で増殖させられる請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチド、または、アナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体、および医薬上許容される担体、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物は、経口投与するために適合する請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、注射により投与するために適合する請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
膵臓の状態または疾患を予防または治療するための方法であって、請求項９に記載の組成物のペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体を投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
前記状態または疾患は、代謝障害である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記状態または疾患は、β細胞関連障害である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記状態または疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、または糖尿病の合併症である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アポトーシスまたはネクローシスによるβ細胞死が被験者において予防または阻止される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
膵臓細胞の機能性は、被験者において改善または回復される請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
被験者において血漿中インスリンレベルが増加させられる請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験者において膵臓β細胞の数もしくは大きさが増加させられる、および／または膵臓管細胞からのβ細胞再生が刺激される請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
被験者においてグルコース恒常性が回復もしくは改善される、および／または高血糖症が反転される請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、注射、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下で投与される請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、一日一回経口投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験者は、ヒトである請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、第二治療薬とともに投与される請求項９に記載の方法。
【請求項２５】
前記第二治療薬は、前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体と同時に投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第二治療薬、および、前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は連続的に投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二治療薬は、１型糖尿病または２型糖尿病のための治療薬である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二治療薬は、アナキンラである請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載のペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体、および、医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む膵臓機能不全症を治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、膵臓管細胞からのβ細胞再生を刺激することができる請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の生物活性を有する請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記生物活性は、膵臓管様細胞または管関連細胞が成長および増殖するのを刺激する能力である請求項３１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本出願は、その内容が参照により明確に組み込まれる２０１３年２月１５日に出願の米国仮特許出願第６１／７６５２０３号明細書に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、糖尿病を治療および予防するための膵島β細胞の新生、または再生活性を備えるＩＮＧＡＰペプチド、ならびにそれらの組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界中で一億人を越える人々が真性糖尿病に罹患している。米国では、糖尿病に罹患した人々の推定医療費は年間およそ１，３６０億ドルである。真性糖尿病は、膵臓が十分な量のインスリンを分泌できないことを特徴とする代謝障害であり、血糖値の大きな変動を生じさせ、短期的および長期的両方の生理学的結果をもたらすことがある。１型糖尿病（インスリン依存性真性糖尿病、もしくはＩＤＤＭ）を有する患者における血糖値上昇（高血糖症）から発生する長期的合併症には、網膜症、神経障害、腎症およびその他の血管合併症が含まれる。低血糖値（低血糖症）は、糖尿病性の昏睡、発作、偶発症候、無酸素症、脳損傷、認知機能低下および死亡を引き起こす可能性がある。
【０００４】
非インスリン依存性真性糖尿病もしくはＮＩＤＤＭとしても公知である２型糖尿病は、結果として血糖値上昇を生じさせる損傷したグルコース代謝を特徴とする進行性疾患である。２型糖尿病の患者は、高血糖症性シグナルに応答して膵臓β細胞が適切な量のインスリンを分泌する障害を生じさせる膵臓β細胞機能の損傷および標的組織でのインスリン作用に対する耐性（インスリン耐性）を示す。
【０００５】
２型糖尿病の最新の治療は、インスリン耐性を反転させ、腸管グルコース吸収を制御し、肝グルコース産生を正常化し、β細胞のグルコース感知およびインスリン分泌を改善することを目指している。糖尿病に対する最新治療には欠点があるため、１型糖尿病および２型糖尿病のための新規な治療ならびに新規な診断法および予後診断法は高度に望ましい。
【０００６】
ますます多くの確証が、１型糖尿病および２型糖尿病の根底には不適正なβ細胞質量が存在することを指摘している。このため、糖尿病患者におけるβ細胞の再生は糖尿病研究の重要な目標である。近年、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でのβ細胞の再生および新規な膵島形成を誘導するための新規の戦略の開発にますます関心が高まってきた（Ｂａｇｇｉｏ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ  Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，２００６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ，５７，２６５−２８１（非特許文献１））。このため、残存しているβ細胞質量の拡大を刺激する能力または膵島新生活性を備える生物活性分子の同定が、生来の膵臓の再生能を活用するために極めて重要である。
【０００７】
膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）は、部分閉塞したハムスター膵臓由来の粗抽出物中で最初に同定された１６．８ｋＤａのタンパク質である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７，３３４−３４１（非特許文献２）；米国特許第５８３４５９０号明細書（特許文献１））。ＩＮＧＡＰは膵臓および十二指腸で発現し、幾つかの種では膵島新生を誘導することが証明されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３９，２５６−２６２（非特許文献３）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２４０，８７５−８８４（非特許文献４））。構造的には、ＩＮＧＡＰは、一次配列に基づいて４サブファミリーに分類される、２５を超えるメンバーを含む分泌Ｃ型レクチンのＲｅｇファミリーのメンバーである（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，９，２６３５−２６４１（非特許文献５）；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ．，１９９９，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｓｕｒｇ  ６：２５４−２６２（非特許文献６））。
【０００８】
ＩＮＧＡＰは、ラット、マウス、ハムスターおよびヒトの主として消化管組織（膵臓、胃、肝臓）内で同定されている大きなＲｅｇ３サブファミリーに属する（Ｒａｆａｅｌｏｆｆ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９，２１００−２１０９（非特許文献７））。Ｒｅｇタンパク質は遍在性であるにもかかわらず、Ｒｅｇタンパク質の機能もしくは作用機序について余り多くは知られていない。Ｒｅｇ１はβ細胞分裂誘発因子であると考えられるが、Ｒｅｇ３ファミリーの機能についてはほとんど知られていない。
【０００９】
多数の研究は、Ｒｅｇが特異的細胞表面受容体に結合し、複数のシグナル伝達経路を活性化できることを示唆している。この受容体仮説を支持する論拠は、ＩＮＧＡＰの生物活性がこのタンパク質の１５アミノ酸フラグメント（アミノ酸１０４〜１１８）、つまり高度に保存されたＩＧＬＨＤＰモチーフおよびＲｅｇファミリーの他のメンバー内では見いだされない固有の配列ＳＨＧＴＬＰＮＧＳからなるＩＮＧＡＰペプチド（ＩＮＧＡＰ−Ｐ）によって媒介されると思われることである（Ｒａｆａｅｌｏｆｆ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９，２１００−２１０９（非特許文献８））。合成ＩＮＧＡＰペプチドは、ハムスターおよびマウスにおいて新規の膵島形成を誘導し、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病を反転させることにおいてこのタンパク質と同等に有効であることが実証されているので（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３９，２５６−２６２（非特許文献９）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２４０，８７５−８８４（非特許文献１０））、このため受容体にとって可能性のあるリガンドである。合成ＩＮＧＡＰ−Ｐの生物学的作用は、インビトロおよびインビボの両方において広範に研究されてきた。現在までに、ＩＮＧＡＰ−Ｐは、１）脱分化膵島由来管様構造からの機能的ヒト膵島のインビトロ再生を誘導する（Ｊａｍａｌ．，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，１２，７０２−７１２（非特許文献１１）、２）齧歯類、イヌおよびカニクイザルにおいてβ細胞質量の拡大を用量依存性で刺激する（Ｌｉｐｓｅｔｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，４８，１２７−１３７（非特許文献１２）；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐａｎｃｒｅａｓ，３４，１０３−１１１（非特許文献１３））、および３）インスリン分泌およびβ細胞のサイズを増加させ、インビトロでラット新生児膵島におけるβ細胞機能に関連する数種の遺伝子の発現をアップレギュレートする（Ｂａｒｂｏｓａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ，１３６，７８−８４（非特許文献１４）；Ｂｏｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ，１３１，９７−１０２（非特許文献１５））ことが証明されている。これらの重要な結果が得られた後に、ヒトにおける有効性および安全性を調査するための臨床試験が実施され、ＩＮＧＡＰ−Ｐは２型糖尿病を有する患者における９０日後のグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡｌＣ、もしくはＡＩＣ）の減少および１型糖尿病を有する患者におけるＣペプチド分泌の有意な増加によって確証されたグルコース恒常性の改善を含むシグナル効果を有することが見いだされた（Ｄｕｎｇａｎ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，２５，５５８−５６５（非特許文献１６））。
【００１０】
これらのデータがＩＮＧＡＰ−Ｐは膵島新生活性およびインスリン分泌促進活性のどちらも有することを示唆しているにもかかわらず、動物実験およびヒト臨床試験から１５−ｍｅｒのＩＮＧＡＰ（ＩＮＧＡＰ−Ｐ）には安定性が欠如することは明白である。したがって、必要とされる血清中および組織中閾値レベルを研究するためには極めて大用量が投与されなければならない。不良な安定性は、さらに例えば薬物製剤、局所的注射部位反応についての患者の承諾および高額のコストに関する問題を引き起こす。このため、ＩＮＧＡＰ−Ｐに比較して、インビボでの匹敵する、もしくはより大きな生物活性および／またはより大きな安定性もしくはより長い半減期を備えるＩＮＧＡＰアナログが必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５８３４５９０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂａｇｇｉｏ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ  Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，２００６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ，５７：２６５−２８１
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７，３３４−３４１
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３９，２５６−２６２
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２４０，８７５−８８４
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，９，２６３５−２６４１
【非特許文献６】Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ．，１９９９，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｓｕｒｇ  ６：２５４−２６２
【非特許文献７】Ｒａｆａｅｌｏｆｆ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９，２１００−２１０９
【非特許文献８】Ｒａｆａｅｌｏｆｆ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９，２１００−２１０９
【非特許文献９】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３９，２５６−２６２
【非特許文献１０】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２４０，８７５−８８４
【非特許文献１１】Ｊａｍａｌ．，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，１２,７０２−７１２
【非特許文献１２】Ｌｉｐｓｅｔｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，４８，１２７−１３７
【非特許文献１３】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐａｎｃｒｅａｓ，３４，１０３−１１１
【非特許文献１４】Ｂａｒｂｏｓａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ，１３６，７８−８４
【非特許文献１５】Ｂｏｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ，１３１，９７−１０２
【非特許文献１６】Ｄｕｎｇａｎ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，２５，５５８−５６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
我々は以前に、ＲＥＧ３タンパク質の異種間哺乳動物ファミリーのメンバーであり（図１９を参照）、膵島再生のハムスターモデルにおいて管細胞がβ膵島細胞へ分化するのを誘導できる、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）と呼ばれる膵臓タンパク質を同定した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ，１９８３，３５：６３−７２；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９８８，３７：３３４−３４１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９９６，３９：２５６−２６２）。アミノ酸１０４〜１１８を含有するＩＮＧＡＰタンパク質の１５−ｍｅｒペプチドフラグメント（ＩＮＧＡＰ−Ｐ）は、ＩＮＧＡＰの生物活性の中心であると同定された。
【００１４】
ＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ−Ｐはどちらも管細胞の膵島への分化を誘導することが証明されている。膵島再生のヒトインビトロモデルでは、ＩＮＧＡＰ−Ｐは膵臓発生転写因子であるＰＤＸ−１の発現増加および新規膵島の同時形成を誘導する（Ｊａｍａｌ．，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，２００３，１０：９８７−９９６；Ｊａｍａｌ．，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，２００５，１２：７０２−７１２）。動物モデルでは、ＩＮＧＡＰ−Ｐは、インビトロでの管細胞増殖および管上皮と関連する細胞からの膵島細胞再生を誘導し、正常成体のマウス、ハムスターおよびイヌの膵臓における新規な膵島形成を導く。糖尿病のＳＴＺ処置Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルでは、ＩＮＧＡＰ−Ｐは糖尿病状態を反転させた（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｎｃｒｅａｓ，２００７，３４：１０３−１１１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，２００４，２４０：８７５−８８４（２００４）；Ｋａｐｕｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＮＧＡＰ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｄｕｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｎｏｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｉｃｅ，７１ｓｔ  ＡＤＡ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，２０１１）。確立された（非初発の）自己免疫ＴＩＤＭのＮＯＤマウスモデルにおいて、免疫モジュレーターであるＩＬ−１２インヒビターのリソフィリン（ｌｉｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）と併用したＩＮＧＡＰ−Ｐは高血糖症の寛解およびインスリンペレットの必要の排除を誘導した（Ｔｅｒｓｅｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｑｕｅ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６８ｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ｅｄ．ＡＤＡ），Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ，２００８；Ｔｅｒｓｅｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，２０１２、ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。組織学的検査は、新規膵島の証拠を確認した。
【００１５】
ヒト臨床試験では、ＩＮＧＡＰ−ＰはＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭ両方の患者を対象とする１相および２相臨床試験で評価されてきた（Ｄｕｎｇａｎ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，２００９，２５：５５８−５６５）。３カ月間にわたるＩＮＧＡＰ−Ｐの一日一回の注射は、Ｔ１ＤＭ患者における刺激されたＣペプチド分泌の統計的有意な増加およびＴ２ＤＭ患者におけるＣペプチドレベル上昇に向かう傾向を誘発した。グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）は、Ｔ２ＤＭ患者においては−０．６％（ｐ＜０．０１２５）減少し、Ｔ１ＤＭ患者においては−０．４％（ｐ＜０．０６）減少した。
【００１６】
これらの高度に前途有望な結果が得られたにもかかわらず、ＩＮＧＡＰ−Ｐの相当に短い血漿半減期は、ＩＮＧＡＰ−Ｐを治療薬として使用することについての課題を依然として提示している。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって本明細書では、ＩＮＧＡＰ−Ｐの一つ以上の生物活性を維持している、治療薬として開発するために適切なＩＮＧＡＰペプチドが提供される。一つの実施形態では、本発明のペプチドは、ＩＮＧＡＰ−Ｐに比較して、インビボでの匹敵する、もしくはより大きな生物活性および／またはより大きな安定性もしくはより長い半減期を有する。
【００１８】
本明細書の一つの実施形態では、配列番号４または配列番号６に規定した配列を含むペプチドが提供される。
【００１９】
本明細書のまた別の実施形態では、配列番号４または配列番号６に規定した配列からなるペプチドが提供される。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、膵臓β細胞新生を誘導する、膵臓β細胞再生を誘導する、被験者におけるグルコース恒常性を改良する、および／または高血糖症を反転する。
【００２１】
本明細書では、本発明のペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体であって、前記ペプチドの生物活性を有するアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体もまた提供される。アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は、本発明のペプチドと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有していてよい。生物活性は、例えば、前記ペプチドの細胞もしくは受容体結合特異性、膵臓β細胞新生を誘導する能力、膵島細胞再生を誘導する能力、被験者におけるグルコース恒常性を改良する能力および／または高血糖症を反転する能力であってよい。
【００２２】
本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子もまた提供される。核酸分子は、発現ベクターを形成するために発現制御配列へ機能的に連結していてよいが、このとき上記発現ベクターは、適切な細胞内で増殖させられる。
【００２３】
本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体および医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物もまた提供される。一つの実施形態では、組成物は経口投与に適合する。また別の実施形態では、組成物は注射による投与に適合する。
【００２４】
また別の実施形態では、膵臓の状態もしくは疾患を予防もしくは治療するための方法であって、それを必要とする被験者に本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体または組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一つの実施形態では、状態もしくは疾患は、代謝障害である。また別の実施形態では、状態もしくは疾患は、β細胞関連障害である。また別の実施形態では、状態もしくは疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病または糖尿病の合併症である。
【００２５】
一部の実施形態では、被験者におけるアポトーシスもしくはネクローシスによるβ細胞死は、本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体または組成物を投与する工程によって予防もしくは阻止される。他の実施形態では、被験者における膵臓細胞の機能性が改良もしくは回復させられる、被験者における血漿中インスリンレベルが増加させられる、被験者における膵臓β細胞の数もしくはサイズが増加させられる、被験者における膵臓管細胞からのβ細胞再生が刺激される、被験者におけるグルコース恒常性が回復もしくは改良させられる、および／または被験者における高血糖症が反転させられる。
【００２６】
本発明のペプチドおよび組成物は、注射、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下投与されてよい。一つの実施形態では、ペプチドおよび組成物は、一日一回経口投与される。
【００２７】
特定の実施形態では、被験者はヒトである。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、第二治療薬とともに投与される。第二治療薬は、本発明のペプチドと同時に投与されてよい、または第二治療薬およびペプチドは連続的に投与されてよい。一つの実施形態では、第二治療薬は、１型糖尿病または２型糖尿病のための治療薬である。また別の実施形態では、第二治療薬はアナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）である。
【００２９】
本発明のペプチドおよび医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む、膵機能不全症を治療するための医薬組成物もまた提供される。一つの実施形態では、ペプチドもしくは組成物は、膵臓管細胞からのβ細胞再生を刺激することができる。また別の実施形態では、ペプチドもしくは組成物は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の生物活性を有する。一つの実施形態では、生物活性は、膵臓管様細胞もしくは管関連細胞が成長および増殖するのを刺激する能力である。
【００３０】
本明細書に記載した本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体をコードする核酸分子もまた提供される。核酸分子は、例えば、発現ベクターを形成するために発現制御配列へ連結されていてよいが、このとき上記発現ベクターは適切な細胞内で増殖させられる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載したペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体および医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本明細書では、さらにまた膵臓の状態もしくは疾患を予防もしくは治療するための方法であって、それを必要とする被験者に本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体または組成物を投与する工程を含む方法が提供される。本明細書に提供した方法では、被験者は、例えば齧歯類、イヌ、ブタ、霊長類またはヒトであってよい。
【００３３】
一つの実施形態では、状態もしくは疾患は、代謝障害、例えばβ細胞関連障害である。状態もしくは疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病または糖尿病の合併症であってよい。
【００３４】
他の実施形態では、被験者におけるβ細胞アポトーシスが予防または阻止される、被験者における膵臓細胞の機能性が改良または回復させられる、被験者における血漿中インスリンレベルが増加させられる、および／または被験者における膵臓細胞の数もしくはサイズが増加させられる。特定の実施形態では、膵臓細胞はβ細胞である。
【００３５】
さらにまた別の実施形態では、被験者におけるβ細胞新生が刺激される、および／またはグルコース恒常性が改良される、および／または被験者におけるインスリンが強化される。
【００３６】
以下では本発明の特定の実施形態について実施例および添付の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１は、ＩＮＧＡＰがＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞中での増殖に及ぼす作用を示す図である。（図１Ａ）ＩＮＧＡＰはＢｒｄＵ取り込みを増加させた。ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞は、チャンバースライド内で２４時間にわたり指示した量のＩＮＧＡＰ−Ｐもしくはｒ−ＩＮＧＡＰを用いて処置した。エキセンジン４（Ｅｘｅｎｄｉｎ  ４）（Ｅｘ４）およびＥＧＦをコントロールとして使用した。５０μΜのＢｒｄＵを処置の最後の３時間の間に添加し、その後にメタノール中で固定してＢｒｄＵについて免疫染色した。データは、ＩＮＧＡＰ処置対未処置コントロールにおけるＢｒｄＵ（＋）細胞の比率（％）として提示した。結果は、三回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（未処置コントロールに比較して、（＊：ｐ＜０．０５、§：ｐ＜０．００１）。
【図１Ｂ】図１は、ＩＮＧＡＰがＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞中での増殖に及ぼす作用を示す図である。（図１Ｂ）ＩＮＧＡＰはＲＩＮ−ｍ５Ｆ中でのＥｒｋ１／２のリン酸化を誘導した。６０ｍｍ組織培養皿中で蒔種したＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞（１×１０６）を指示した時間にわたりＩＮＧＡＰを用いて処置した。ブロット（３０μｇのタンパク質）は、抗Ｅｒｋ１／２−ホスホ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体を用いてプロービングし、抗完全Ｅｒｋ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いてストリッピング／再プロービングし、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用してデンシトメトリーにより定量した。
【図１Ｃ】図１は、ＩＮＧＡＰがＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞中での増殖に及ぼす作用を示す図である。（図１Ｃ）ホスホ−Ｅｒｋ１／２対全Ｅｒｋ１／２の比率として測定され、０分の時点に比較した倍率変化として示した相対的Ｅｒｋ１／２リン酸化の定量。結果は、三〜八回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（＊：ｐ＜０．０５、§：ｐ＜０．０１、¶：ｐ＜０．００１；†：指示した時点に対してのみ二回の実験を実施した）。
【図２】図２は、蛍光標識ｒＩＮＧＡＰが細胞表面上でキャップを形成することを示す図である。チャンバースライド内で蒔種したＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞を指示した時間にわたり３７℃または氷上で、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８反応性色素を用いて標識した５０ｎＭのｒＩＮＧＡＰとともにインキュベートし、氷上の４％パラホルムアルデヒド中で固定した。（Ａ）細胞を１５分間にわたり氷上で予備冷却し、３０分間にわたりｒＩＮＧＡＰおよびＣＴＢ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４、５μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともにインキュベートした。（Ｂ）トランスフェリン（２５μｇ／ｍＬ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて同様に実施した。（Ｃ）、（Ｄ）３７℃で、ＣＴＢおよびトランスフェリンとともに各々１時間のインキュベーション。（Ｅ）、（Ｆ）細胞は５時間もしくは２４時間にわたり標識ｒＩＮＧＡＰとともにインキュベートし、最後の１時間にわたり５０ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ９９（ＬＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて共染色した。核は封入剤（Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に含まれるＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。バーは２０μｍである。
【図３】図３は、１００μΜのウォルトマンニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）およびサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｄ）によって部分的に阻害された蛍光標識ｒＩＮＧＡＰの結合および内在化を示す図であり、マクロピノサイトーシスを示唆している。チャンバースライド内で蒔種したＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞は、ウォルトマンニン（１００μΜ）もしくはサイトカラシンＤ（２５μｇ／ｍＬ）の存在下でＤｙＬｉｇｈｔ４８８反応性色素を用いて標識した５０ｎＭのｒ−ＩＮＧＡＰを用いて５時間にわたりインキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。（Ａ）ｒＩＮＧＡＰ、インヒビターなし、（Ｂ）陰性コントロール、（Ｃ）ウォルトマンニン、（Ｄ）サイトカラシンＤ。核は封入剤（Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に含まれるＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。
【図４】図４は、ＦＡＭ標識ＩＮＧＡＰ−ＰがＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞の細胞質中へ迅速に内在化させられたことを示す図である。チャンバースライド中で増殖させた細胞を指示した時間にわたりＦＡＭ標識ＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて処置し、４％のＰＦＡで固定した。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）細胞は、図２に示したように１時間にわたりＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで染色した。（Ｃ）、（Ｅ）固定細胞を０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて１０分間にわたり透過化し、５％のヤギ血清中でブロッキングし、抗ＥＥＡ１ウサギ一次抗体（Ａｂｃａｍ、１：２００）を用いて４℃で一晩プロービングし、その後に室温で１時間にわたり二次ロバ抗ウサギＤｙＬｉｇｈｔ５９４共役抗体（１：５００）を用いてプロービングした。核は封入剤（Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に含まれるＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。
【図５】図５は、ＦＡＭ−ＩＮＧＡＰ−Ｐの内在化がサイトカラシンＤによっては阻害されるがウォルトマンニンによっては阻害されないことを示す図である。チャンバースライド内で増殖させた細胞は、サイトカラシンＤ（２５μｇ／ｍＬ）またはウォルトマンニン（１００ｎＭ）の存在下で１時間にわたりＦＡＭ標識ＩＮＧＡＰ−Ｐ（１６．７μΜ）を用いて処置し、上述したように固定して画像撮影した。（Ａ）ＦＡＭ−ＩＮＧＡＰ−Ｐ、（Ｂ）ＤＭＳＯコントロール、（Ｃ）サイトカラシンＤ、（Ｄ）ウォルトマンニン。
【図６】図６は、蛍光標識ｒＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ−Ｐの結合および内在化についてのモル過剰競合アッセイを示す図である。チャンバースライド内で蒔種したＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞はＦＡＭ−ＩＮＧＡＰ−Ｐとともに１時間（左パネル）、またはＤｙＬｉｇｈｔ４８８  ｒＩＮＧＡＰとともに５時間（右パネル）インキュベートした。（Ａ、Ｂ）インヒビターなし、（Ｃ、Ｄ）１６７μΜ（１０倍モル過剰）のＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて、（Ｅ、Ｆ）１μΜ（２０倍モル過剰）のｒＩＮＧＡＰを用いて。
【図７Ａ】図７は、ＩＮＧＡＰ−Ｐおよびｒ−ＩＮＧＡＰによって誘導されたシグナル伝達事象へのＲａｓ−Ｒａｆ活性化の関係を示す図である。（図７Ａ）Ｒａｓ活性化は、Ｒａｓ−ＧＴＰ  ＥＬＩＳＡによって測定した。１×１０６個の細胞を４８時間にわたり６０ｍｍプレート内で蒔種し、その後に無血清培地中で２４時間にわたり飢餓させた。細胞は指示した時間にわたり３７℃で成長因子を用いて処置した。次にプレートを氷上に配置し、氷温ＰＢＳを用いて洗浄し、その後にプロテアーゼインヒビター（ＮＥＢ）のカクテルを含有する１５０μＬのＭｇ＋溶解バッファー中で細胞溶解を実施した。Ｒａｓ−ＧＴＰ  ＥＬＩＳＡのために１０μＬの細胞溶解物を使用し、タンパク質の量によって示度を正規化した（ＤＣタンパク質アッセイ、Ｂｉｏｒａｄ社）。結果は０分の時点を１として、比較した倍率変化として示し、点線状の横線として示した。結果は、三回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（未処置コントロールに比較して、＊：ｐ＜０．０５、§：ｐ＜０．００１、¶：Ｐ＜０．００１）。
【図７Ｂ】図７は、ＩＮＧＡＰ−Ｐおよびｒ−ＩＮＧＡＰによって誘導されたシグナル伝達事象へのＲａｓ−Ｒａｆ活性化の関係を示す図である。（図７Ｂ）ホスホ対全ｃＲａｆの比率としてウエスタンブロット／デンシトメトリー（ＩｍａｇｅＪ）によって測定し、点線状の横線として示した（＝１）０分時点に比較して計算したｃ−Ｒａｆリン酸化における倍率変化。結果は、三回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（未処置コントロールに比較して、＊：ｐ＜０．０５、§：ｐ＜０．０１、¶：Ｐ＜０．００１）。
【図８Ａ】図８は、薬理学的インヒビターがＩＮＧＡＰ、ＥＧＦおよびＥｘ−４によるＥｒｋ１／２リン酸化に及ぼす作用を示す図である。１×１０６個の細胞を４８時間にわたり６０ｍｍプレート内で蒔種し、その後に無血清培地中で２４時間にわたり飢餓させた。増殖因子を添加する前に、細胞は３０〜４０分間にわたり、百日咳毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ：Ｐｔｘ）（２４時間の前処置）を除き、指示したインヒビターを用いて前処置した。増殖因子を用いた１０分間の処置後、実験方法に記載したように、細胞を氷上に配置して溶解させた。ブロット（３０μｇのタンパク質）をホスホ−Ｅｒｋ１／２抗体（もしくはストリッピング後の全Ｅｒｋ抗体）とともにインキュベートし、ＥＣＬ試薬を使用して展開させた。全Ｅｒｋおよび０分時点コントロール（＝１、点線として示した）に比較したＥｒｋリン酸化の定量は、上述したように実施した。（図８Ａ）ＧＰＣＲ（Ｐｔｘ、１００ｎｇ／ｍＬ）、アデニル酸シクラーゼ（ＳＱ２２５３６、２５０μΜ）およびＰＫＡのインヒビター（ＰＫｉ、１００μΜ；Ｈ８９、１μΜ）。
【図８Ｂ】図８は、薬理学的インヒビターがＩＮＧＡＰ、ＥＧＦおよびＥｘ−４によるＥｒｋ１／２リン酸化に及ぼす作用を示す図である。１×１０６個の細胞を４８時間にわたり６０ｍｍプレート内で蒔種し、その後に無血清培地中で２４時間にわたり飢餓させた。増殖因子を添加する前に、細胞は３０〜４０分間にわたり、百日咳毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ：Ｐｔｘ）（２４時間の前処置）を除き、指示したインヒビターを用いて前処置した。増殖因子を用いた１０分間の処置後、実験方法に記載したように、細胞を氷上に配置して溶解させた。ブロット（３０μｇのタンパク質）をホスホ−Ｅｒｋ１／２抗体（もしくはストリッピング後の全Ｅｒｋ抗体）とともにインキュベートし、ＥＣＬ試薬を使用して展開させた。全Ｅｒｋおよび０分時点コントロール（＝１、点線として示した）に比較したＥｒｋリン酸化の定量は、上述したように実施した。（図８Ｂ）ＰＫＣ（Ｂｉｓ、１μΜ）、ＰＩ３Ｋ（Ｗｍ、１００μΜ）、Ｓｒｃ（ＰＰ２、１００μΜ）、ＥＧＦＲのインヒビター（ＡＧ１４７８、１００μΜ）およびＲａｆインヒビター１（Ｒ−１、１００μΜ）、または溶媒としてのＤＭＳＯ（＊：ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ＧＰＣＲシグナル伝達の阻害がＲａｓ活性化の減少を生じさせたことを示す図である。６０ｍｍプレート内で増殖させたＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞は、２４時間にわたりＰｔｘを用いて前処置し、その後に１、３、５および１０分間にわたり増殖因子を添加した。細胞をＭｇ＋溶解バッファー中で収集し、図４で記載したようにＲａｓ−ＧＴＰ  ＥＬＩＳＡを受けさせた。結果は、三回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（未処置コントロールに比較して、＊：ｐ＜０．０５、§：ｐ＜０．００１、¶：Ｐ＜０．００１）。
【図１０】図１０は、ｒＩＮＧＡＰ結合のライブ画像撮影を示す図である。時間的経過は次のように示した。（Ａ）０分後、（Ｂ）２分後、（Ｃ）５分後、（Ｄ）１５分後、（Ｅ）２０分後、および（Ｆ）３０分後。白色の太い矢印は膜結合ＩＮＧＡＰを示す。細い矢印は細胞内ＩＮＧＡＰを示す。そして、赤色矢印は死細胞を示す。画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。
【図１１】図１１は、ｒＩＮＧＡＰがクラスリン（Ａ）もしくはカベオリン（Ｂ、Ｃ）のいずれとも共局在しないことを示す図である。細胞はＤｙＬｉｇｈｔ−５９４−ｒＩＮＧＡＰとともに１、１５分間（Ａ、Ｂ）もしくは３時間（Ｃ）にわたりインキュベートし、４％のＰＦＡ中で固定し、ウサギ抗クラスリンもしくは抗カベオリン抗体を用いて４℃で一晩プロービングし、その後にＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて検出した。核は封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  ＨａｒｄＳｅｔ封入剤）中に含まれるＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。矢頭は膜結合ｒＩＮＧＡＰを示し、矢印はｒＩＮＧＡＰを示す。
【図１２】図１２は、曝露１時間後、およびその後に洗浄して、標識ＩＮＧＡＰの非存在下での５時間（Ａ）もしくは２４時間（Ｂ）の追跡期間後のＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｒＩＮＧＡＰの内在化を示す図である。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ９９（５０ｎＭ）を添加し、その１時間後に４％のＰＦＡ中で固定した。核は封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  ＨａｒｄＳｅｔ封入剤、Ｖｅｃｔｏｒ社）中に含まれるＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。
【図１３】図１３は、１時間のインキュベーション後の２４時間の連続曝露（Ａ）または２４時間の追跡（Ｂ）後のＦＡＭ−ＩＮＧＡＰ−Ｐの内在化を示す図である。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ９９（５０ｎＭ）を添加し、その１時間後に４％のＰＦＡ中で固定した。核は封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  ＨａｒｄＳｅｔ封入剤、Ｖｅｃｔｏｒ社）中に含まれるＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。
【図１４】図１４は、ＩＮＧＡＰ−Ｐ内在化が氷上および脂質ラフトインヒビターフィリピン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）の存在下で阻害されることを示す図である。８ウエルチャンバースライド内で増殖させたＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞を３７℃（Ａ）または氷上（Ｂ）または１μｇ／ｍＬのフィリピンの存在下のいずれかで１時間にわたりＦＡＭ−ＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて処置した。ＩＮＧＡＰ−Ｐは緑色で示した。核は封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  ＨａｒｄＳｅｔ封入剤）中に含まれるＤＡＰＩ（青色）を用いて対比染色した。画像はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を用いて撮影した。
【図１５】図１５は、ＩＮＧＡＰ、ＥＧＦおよびＥｘ−４を用いて処置したＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞内でのＡｋｔリン酸化の定量を示す図である。Ｒａｓ−ＧＴＰ  ＥＬＩＳＡについてのＭｇ＋溶解バッファー中で調製したサンプルからの細胞溶解液は、製造業者の取扱説明書にしたがってＡｋｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）によってアッセイし、本明細書に記載したようにタンパク質の量によって正規化した。結果は、０時点（＝１、点線として示した）と比較した倍率変化を示しており、少なくとも三回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（＊：ｐ＜０．０５、§：ｐ＜０．０１、¶：ｐ＜０．００１）。
【図１６】図１６は、薬理学的インヒビターがＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞の増殖に及ぼす作用を示す図である。細胞をチャンバースライド内で蒔種し、指示したインヒビターを用いた３０〜４０分間の前処理にかけ、その後に増殖因子を添加して２４時間インキュベートした。５０ｍΜのＢｒｄＵを処置の最後の３時間の間に添加し、その後にメタノール中で固定してＢｒｄＵについて免疫染色した。データは、処置対未処置コントロール内のＢｒｄＵ（＋）細胞の比率（％）として提示した。結果は、三回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．である（未処置コントロールに比較して、＊：ｐ＜０．０５、†：ｐ＜０．００１）。
【図１７Ａ】図１７は、ＩＮＧＡＰタンパク質の配列および三次元構造を示す図である。（図１７Ａ）はアミノ酸（ａａ）配列を示す。ＩＮＧＡＰ−Ｐは黒色で下線が付けられており、保存フランキングａａは緑色である。
【図１７Ｂ】図１７は、ＩＮＧＡＰタンパク質の配列および三次元構造を示す図である。（図１７Ｂ）は、ＩＮＧＡＰ−ＰがｒＩＮＧＡＰの外側ループ上に位置することを示す（黒色、隣接するＩＷおよびＧＷは緑色である）。
【図１７Ｃ】図１７は、ＩＮＧＡＰタンパク質の配列および三次元構造を示す図である。（図１７Ｃ）は生物種を越えてＲｅｇ３タンパク質内のＩＮＧＡＰ−Ｐと対応するペプチド配列との相同性を示す。矢印は、拡張ＩＮＧＡＰ−Ｐペプチド内へ包含されるために考察された保存ａａを示している。
【図１８】図１８は、三つの拡張ＩＮＧＡＰ−ＰアナログがＲＩＮｍ５Ｆ細胞内でのＥｒｋ１／２活性化に及ぼす作用を示す図である。ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞（１×１０６／６０ｍｍの培養皿）は、１ｎＭおよび１０ｎΜのｒＩＮＧＡＰタンパク質、ＩＮＧＡＰ−Ｐ（１５−ｍｅｒ）または１９−ｍｅｒのアナログ（１倍の１６７ｎＭもしくは１０倍の１．６７μΜで）を用いて１０分間処置した。Ｅｒｋ１／２活性化の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用してウエスタンブロット上で実施し、ホスホ−Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）対全Ｅｒｋ１／２の比率として決定した。データはコントロール（ＰＢＳ）に比較した処置細胞内での倍率変化として示し、ｒＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ−Ｐ（１５−ｍｅｒ）については六回の独立実験および１９−ｍｅｒのアナログについては二回の独立実験の平均値±Ｓ．Ｅ．として表示した。各実験において各処置に対して２〜３枚の個別のプレートを使用した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、¶：ｐ＜０．００１）。
【図１９】図１９は、ＩＮＧＡＰ−１９のＲＩＮｍ５Ｆ細胞への結合がｒＩＮＧＡＰの結合に似ていることを示す図である。８ウエルのガラス製チャンバースライド内で増殖させたＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞を５０ｎＭのＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｒＩＮＧＡＰ（Ａ）、８．３５μΜのＩＮＧＡＰ−Ｐ（Ｂ）もしくは８．３５μΜのＩＮＧＡＰ−１９（Ｃ）のいずれかとともに３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、氷上で４％パラホルムアルデヒドにて固定した。スライドに、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄを使用して核の対比染色のために装填し、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０下で試験した。矢印は膜結合ｒＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ−１９を示すが、矢頭は内在化ＩＮＧＡＰ−Ｐを指す。（Ｄ）は、ＦＡＭ単独（陰性コントロール）を用いた染色を示す。
【図２０】図２０は、血清の存在下でのＩＮＧＡＰ−Ｐ（上）およびＩＮＧＡＰ−１９（下）の分解プロファイルを示している。５０μΜのペプチドは、指示した時間にわたり、２５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをＨＰＬＣによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、ＨＰＬＣプロファイルを図示したようにスーパーインポーズした。
【図２１】図２１は、ＦＢＳ中のペプチドのインビトロインキュベーションの時間的経過試験を示しており、このとき（上）はＩＮＧＡＰ−ＰＣペプチドを示し、（下）はＩＮＧＡＰ−１９Ｃペプチドを示す。５０μΜのＩＮＧＡＰ−ＰＣおよびＩＮＧＡＰ−１９Ｃは、指示した時間にわたり２５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをＨＰＬＣによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、ＨＰＬＣプロファイルを図示したようにスーパーインポーズした。（Ｂ）では、血清の存在下では４８時間にわたりＩＮＧＡＰ−１９Ｃについて分解が見られないことを見て取ることができる。
【図２２Ａ】図２２は、ＩＮＧＡＰアナログペプチドがＲＩＮｍ５Ｆ細胞内でのＥｒｋ１／２活性化に及ぼす作用を示す図である。（図２２Ａ）はＩＮＧＡＰ−Ｐ（１６７ｎＭ；ｎ＝２）と同一濃度でアナログを比較したパイロット試験の結果を示している。
【図２２Ｂ】図２２は、ＩＮＧＡＰアナログペプチドがＲＩＮｍ５Ｆ細胞内でのＥｒｋ１／２活性化に及ぼす作用を示す図である。（図２２Ｂ）は、ＩＮＧＡＰ−Ｐ、ＩＮＧＡＰ−１９およびＩＮＧＡＰ−１９Ｃの低用量および高用量の比較を示している。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞の処置およびＥｒｋ１／２活性化の定量は、図１１について記載したように実施した。
【図２３】図２３は、ヒト膵島由来洞管様構造（ＤＬＳ）から膵島再生を誘導する際のｒＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰの１５−ｍｅｒペプチド（ＩＮＧＡＰ−Ｐ）の相対有効性を示す図である。膵島の特性（変化率（％）、インスリン陽性構造の数／処置後の構造の総数）を処置前レべルと比較した（＊ｐ＜０．０５）。
【図２４】図２４は、ｒＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ−Ｐ処置が糖尿病性マウスの血糖値に及ぼす作用を示している。ＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ）の単回ｉｐ注射により慢性糖尿病性にされたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、７週間にわたりｒＩＮＧＡＰ（５ｎｇ）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ（５００μｇ）もしくはＰＢＳを用いて処置した。データはｍｍｏｌ／Ｌで表示し、平均値±ＳＥＭである。ＳＴＺ−ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＳＴＺ−ｒＩＮＧＡＰ（ｎ＝６）、およびＳＴＺ−ＩＮＧＡＰ−Ｐ（ｎ＝７）、処置対ＰＢＳ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２５Ａ】図２５は、ＩＮＧＡＰがヒト成体管細胞内でＰｄｘ−１発現を誘導したことを示す図である。（図２５Ａ）は、時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した、１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて処置したＨＰＤＥ細胞における経時的なＰｄｘ−１  ｍＲＮＡ発現変化を示す図である。データは平均値±ＳＥＭとして提示した（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝三回の独立測定）。
【図２５Ｂ】図２５は、ＩＮＧＡＰがヒト成体管細胞内でＰｄｘ−１発現を誘導したことを示す図である。（図２５Ｂ）は、時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した、様々な用量のｒＩＮＧＡＰを用いて１５分間処置したＨＰＤＥ細胞におけるＰｄｘ−１  ｍＲＮＡ発現変化を示す図である。データは平均値±ＳＥＭとして提示した（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝三回の独立測定）。
【図２５Ｃ】図２５は、ＩＮＧＡＰがヒト成体管細胞内でＰｄｘ−１発現を誘導したことを示す図である。（図２５Ｃ）は、ＨＰＤＥ未処置細胞（ＣＴＬ）および１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて処置した細胞内での２４時間後のＰｄｘ−１発現の代表的なウエスタンブロットを示す図である。同等量の全タンパク質を（β−アクチンを用いて示したように）各レーンに装填した。データは平均値±ＳＥＭとして提示した（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝三回の独立測定）。
【図２５Ｄ】図２５は、ＩＮＧＡＰがヒト成体管細胞内でＰｄｘ−１発現を誘導したことを示す図である。（図２５Ｄ）は、（図２５Ｃ）において見られるように、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して定量した、Ｐｄｘ−１タンパク質における増加率（％）のグラフ表示を示す図である。データは平均値±ＳＥＭとして提示した（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝三回の独立測定）。
【図２６Ａ】図２６は、ＩＮＧＡＰ−Ｐが発生中のエンドクリン分化に関係する発生転写因子の協調発現を誘導したことを示す図である。時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した（＊ｐ＜０．０５）、ＮｅｕｒｏＤ１（図２６Ａ）、ＩＡ−１（図２６Ｂ）およびＭａｆＡ（図２６Ｃ）ｍＲＮＡの経時的な発現変化を示した。
【図２６Ｂ】図２６は、ＩＮＧＡＰ−Ｐが発生中のエンドクリン分化に関係する発生転写因子の協調発現を誘導したことを示す図である。時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した（＊ｐ＜０．０５）、ＮｅｕｒｏＤ１（図２６Ａ）、ＩＡ−１（図２６Ｂ）およびＭａｆＡ（図２６Ｃ）ｍＲＮＡの経時的な発現変化を示した。
【図２６Ｃ】図２６は、ＩＮＧＡＰ−Ｐが発生中のエンドクリン分化に関係する発生転写因子の協調発現を誘導したことを示す図である。時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した（＊ｐ＜０．０５）、ＮｅｕｒｏＤ１（図２６Ａ）、ＩＡ−１（図２６Ｂ）およびＭａｆＡ（図２６Ｃ）ｍＲＮＡの経時的な発現変化を示した。
【図２６Ｄ】図２６は、ＩＮＧＡＰ−Ｐが発生中のエンドクリン分化に関係する発生転写因子の協調発現を誘導したことを示す図である。時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した（＊ｐ＜０．０５）、ＮｅｕｒｏＤ１（図２６Ａ）、ＩＡ−１（図２６Ｂ）およびＭａｆＡ（図２６Ｃ）ｍＲＮＡの経時的な発現変化を示した。
【図２７Ａ】図２７は、ＩＮＧＡＰが２４時間後にＨＰＤＥ細胞中でのインスリンおよびグルコキナーゼの発現を誘導することを示す図である。（図２７Ａ）は、１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐ（１×ＩＮＧＡＰ）の非存在下（Ｃｔｒｌ）もしくは存在下での２４時間後のインスリン発現を示す図である。
【図２７Ｂ】図２７は、ＩＮＧＡＰが２４時間後にＨＰＤＥ細胞中でのインスリンおよびグルコキナーゼの発現を誘導することを示す図である。（図２７Ｂ）は、５ｎＭのｒＩＮＧＡＰ（ｒＩＮＧＡＰ）の非存在下（Ｃｔｒｌ）もしくは存在下での２４時間後にＲＴ−ＰＣＲによって検出されたグルコキナーゼの発現を示す図である。
【図２７Ｃ】図２７は、ＩＮＧＡＰが２４時間後にＨＰＤＥ細胞中でのインスリンおよびグルコキナーゼの発現を誘導することを示す図である。（図２７Ｃ）は、ＥＬＩＳＡによる１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐ（１×ＩＮＧＡＰ）もしくは５ｎＭのｒＩＮＧＡＰ（ｒＩＮＧＡＰ）の非存在下（Ｃｔｒｌ）もしくは存在下での培養中で２４時間後のＨＰＤＥ細胞溶解液中で検出されたＣペプチドのレベルを示す図である。
【図２８Ａ】図２８は、集団化ＨＰＤＥ細胞が膵島ＤＬＳ−ＩＬＳモデルを模倣し、ＩＮＧＡＰによって誘発されたエンドクリン分化を強化することを示す図である。（図２８Ａ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に包埋されたＨＰＤＥ細胞は、培養中で５日後に集団を形成した。１０日後、集団は嚢胞性になった。１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて７日間処置した場合、ＨＰＤＥ嚢胞性構造は充実性膵島様集団に戻った（位相差顕微鏡検査、代表的写真）。
【図２８Ｂ】図２８は、集団化ＨＰＤＥ細胞が膵島ＤＬＳ−ＩＬＳモデルを模倣し、ＩＮＧＡＰによって誘発されたエンドクリン分化を強化することを示す図である。（図２８Ｂ）時間適応未処置コントロールの倍率変化として表示した、１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐ（ＩＮＧＡＰ−Ｐ）もしくは５ｎＭのｒＩＮＧＡＰ（ｒＩＮＧＡＰ）を用いて７日間にわたり処置したＨＰＤＥ集団中でのインスリン、グルカゴンおよびＰＰＹ  ｍＲＮＡの発現における変化を示した（＊ｐ≦０．０５）。
【図２９】図２９は、ＨＰＤＥ細胞のマトリゲル包埋がＩＮＧＡＰ処置後のエンドクリン分化を強化したことを示す図である。１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐ（ＩＮＧＡＰ）を用いずに（コントロール）または用いて７日間後に集団化したＨＰＤＥ集団の免疫蛍光分析を示した。サイトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）ｌ９（ＣＫ１９）、ＰＤＸ−１、Ｃ−ペプチドおよびＧｌｕｔ−２の免疫検出（代表的な写真）。ＩＮＧＡＰ処置後、ＣＫ１９を廃棄し、ＰＤＸ−１を核（矢印）へ移動させると、Ｃ−ペプチド（矢印）およびＧｌｕｔ２が出現した。
【図３０Ａ】図３０は、膵島−ＤＬＳ変換を示す図である。Ｉ．形態学および免疫蛍光。倒立顕微鏡（Ａ〜Ｃ）およびＩＦ（免疫蛍光）顕微鏡（Ｄ−Ｆ）は、膵島が主としてインスリンおよびβ細胞（Ｄ）を含む充実性球状構造（Ａ）であることを証明した。８日間の培養期間を通して、ＤＬＳ形成巣が形成され、拡大し（Ｂ、Ｅ）、最終的には膵島と置換した。これらのＤＬＳは中空で、ＣＫ＋管上皮細胞（Ｆ）の不均質集団である嚢胞性構造（Ｃ）であった。ＤＬＳ形成の形態学的評価は管（緑色、ＣＫ＋）細胞頻度と正相関しており（ｒ２＝０．７４、ｐ＜０．００１）、エンドクリン（赤色、インスリン／グルカゴン／ソマトスタチン／ＰＰ＋）細胞頻度（ｒ２＝０．６４、ｐ＜０．００１）（Ｇ）とは逆相関していた。
【図３０Ｂ】図３０は、膵島−ＤＬＳ変換を示す図である。ＩＩ．アポトーシス。初期ＤＬＳ形成は、ＥＬＩＳＡによって評価したように、顕著なアポトーシスを特徴とした（（Ａ）第０日に比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。ＴＵＮＥＬに基づく第１日培養の試験は、アポトーシス細胞が主としてβ細胞であることを指示した（Ｂ）。
【図３０Ｃ】図３０は、膵島−ＤＬＳ変換を示す図である。ＩＩＩ．ＤＬＳの増殖。ＢｒｄＵ取り込みの免疫組織化学的評価（Ａ）および定量的評価（Ｂ）は、ＤＬＳ細胞が相当に静止性の膵島細胞と比較して高度に増殖性であることを示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３１】図３１は、膵島−ＤＬＳ変換、前駆細胞マーカーの発現を示す図である。免疫組織化学的分析および免疫蛍光分析は、ＤＬＳ細胞がＰＤＸ１、ネスチンおよびビメンチンを含む膵島前駆細胞と関連するマーカーを発現することを示した。
【図３２】図３２は、ＩＮＧＡＰ−Ｐ処置後のＤＬＳ−ＩＬＳ再生、形態学および免疫組織化学を示す図である。１６７ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐを用いた４日間にわたるＤＬＳの処置は、適切なレベルの成体膵島機能マーカーを発現し、ＤＬＳに比較してＣＫ発現をダウンレギュレートするＩＬＳの形成を誘導した。
【図３３Ａ】図３３は、ＤＬＳ−ＩＬＳ再生、機能を示す図である。インスリン含量（図３３Ａ）およびグルコース誘導性インスリン分泌（図３３Ｂ）の評価は、ＩＬＳが同等のインスリン貯蔵量およびそれらが由来する初期膵島への分泌能力を有することを指示した（膵島に対して、＊ｐ＜０．０１）。
【図３３Ｂ】図３３は、ＤＬＳ−ＩＬＳ再生、機能を示す図である。インスリン含量（図３３Ａ）およびグルコース誘導性インスリン分泌（図３３Ｂ）の評価は、ＩＬＳが同等のインスリン貯蔵量およびそれらが由来する初期膵島への分泌能力を有することを指示した（膵島に対して、＊ｐ＜０．０１）。
【図３４Ａ】図３４は、ＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞増殖を増加させたことを示す図である。単層（図３４Ａ）中または集団としてのＭａｔｒｉｇｅｌ（図３４Ｂ）中で培養したＨＰＤＥ細胞は、７日間にわたり１６７ｎＭのＩＮＧＡＰペプチド（１倍）を用いて処置した。次に増殖マーカーであるＰＣＮＡについて染色し、ＰＣＮＡ＋／核の総数のパーセンテージを計算した（＊ｐ≦０．０５）。ＣＴＲＬは未処置コントロールである。
【図３４Ｂ】図３４は、ＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞増殖を増加させたことを示す図である。単層（図３４Ａ）中または集団としてのＭａｔｒｉｇｅｌ（図３４Ｂ）中で培養したＨＰＤＥ細胞は、７日間にわたり１６７ｎＭのＩＮＧＡＰペプチド（１倍）を用いて処置した。次に増殖マーカーであるＰＣＮＡについて染色し、ＰＣＮＡ＋／核の総数のパーセンテージを計算した（＊ｐ≦０．０５）。ＣＴＲＬは未処置コントロールである。
【図３５Ａ】図３５は、Ｋｉｎｅｔｗｏｒｋｓ（商標）Ｂｒｏａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｃｒｅｅｎを使用してＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞中でのプロテインキナーゼ活性化に及ぼす作用を示す図である（ＫＰＰＳ  １．３、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社）。（図３５Ａ〜Ｃ）、ＰＢＳ（コントロール）、８３５ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐおよび１ｎＭのｒＩＮＧＡＰ各々を用いて２０分間処置したＨＰＤＥ細胞からの様々なホスホプロテインキナーゼのＫｉｎｅｔｗｏｒｋｓウエスタンブロット結果、（図３５Ｄ）、コントロール（白色バー）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ処置（灰色バー）およびｒＩＮＧＡＰ処置（黒色バー）細胞からの２０分後の様々なプロテインキナーゼ活性化についてのＯＤの統計的棒グラフ、ユーロ、各々（図３５Ａ〜Ｄ）において数で示したプロテインキナーゼの略名および対応する倍率変化。有意な変化だけを提示した。少なくとも２５％のＯＤにおける変化は有意と見なした。
【図３５Ｂ】図３５は、Ｋｉｎｅｔｗｏｒｋｓ（商標）Ｂｒｏａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｃｒｅｅｎを使用してＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞中でのプロテインキナーゼ活性化に及ぼす作用を示す図である（ＫＰＰＳ  １．３、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社）。（図３５Ａ〜Ｃ）、ＰＢＳ（コントロール）、８３５ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐおよび１ｎＭのｒＩＮＧＡＰ各々を用いて２０分間処置したＨＰＤＥ細胞からの様々なホスホプロテインキナーゼのＫｉｎｅｔｗｏｒｋｓウエスタンブロット結果、（図３５Ｄ）、コントロール（白色バー）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ処置（灰色バー）およびｒＩＮＧＡＰ処置（黒色バー）細胞からの２０分後の様々なプロテインキナーゼ活性化についてのＯＤの統計的棒グラフ、ユーロ、各々（図３５Ａ〜Ｄ）において数で示したプロテインキナーゼの略名および対応する倍率変化。有意な変化だけを提示した。少なくとも２５％のＯＤにおける変化は有意と見なした。
【図３５Ｃ】図３５は、Ｋｉｎｅｔｗｏｒｋｓ（商標）Ｂｒｏａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｃｒｅｅｎを使用してＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞中でのプロテインキナーゼ活性化に及ぼす作用を示す図である（ＫＰＰＳ  １．３、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社）。（図３５Ａ〜Ｃ）、ＰＢＳ（コントロール）、８３５ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐおよび１ｎＭのｒＩＮＧＡＰ各々を用いて２０分間処置したＨＰＤＥ細胞からの様々なホスホプロテインキナーゼのＫｉｎｅｔｗｏｒｋｓウエスタンブロット結果、（図３５Ｄ）、コントロール（白色バー）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ処置（灰色バー）およびｒＩＮＧＡＰ処置（黒色バー）細胞からの２０分後の様々なプロテインキナーゼ活性化についてのＯＤの統計的棒グラフ、ユーロ、各々（図３５Ａ〜Ｄ）において数で示したプロテインキナーゼの略名および対応する倍率変化。有意な変化だけを提示した。少なくとも２５％のＯＤにおける変化は有意と見なした。
【図３５Ｄ】図３５は、Ｋｉｎｅｔｗｏｒｋｓ（商標）Ｂｒｏａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｃｒｅｅｎを使用してＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞中でのプロテインキナーゼ活性化に及ぼす作用を示す図である（ＫＰＰＳ  １．３、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社）。（図３５Ａ〜Ｃ）、ＰＢＳ（コントロール）、８３５ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐおよび１ｎＭのｒＩＮＧＡＰ各々を用いて２０分間処置したＨＰＤＥ細胞からの様々なホスホプロテインキナーゼのＫｉｎｅｔｗｏｒｋｓウエスタンブロット結果、（図３５Ｄ）、コントロール（白色バー）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ処置（灰色バー）およびｒＩＮＧＡＰ処置（黒色バー）細胞からの２０分後の様々なプロテインキナーゼ活性化についてのＯＤの統計的棒グラフ、ユーロ、各々（図３５Ａ〜Ｄ）において数で示したプロテインキナーゼの略名および対応する倍率変化。有意な変化だけを提示した。少なくとも２５％のＯＤにおける変化は有意と見なした。
【図３５Ｅ】図３５は、Ｋｉｎｅｔｗｏｒｋｓ（商標）Ｂｒｏａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｃｒｅｅｎを使用してＩＮＧＡＰがＨＰＤＥ細胞中でのプロテインキナーゼ活性化に及ぼす作用を示す図である（ＫＰＰＳ  １．３、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社）。（図３５Ａ〜Ｃ）、ＰＢＳ（コントロール）、８３５ｎＭのＩＮＧＡＰ−Ｐおよび１ｎＭのｒＩＮＧＡＰ各々を用いて２０分間処置したＨＰＤＥ細胞からの様々なホスホプロテインキナーゼのＫｉｎｅｔｗｏｒｋｓウエスタンブロット結果、（図３５Ｄ）、コントロール（白色バー）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ処置（灰色バー）およびｒＩＮＧＡＰ処置（黒色バー）細胞からの２０分後の様々なプロテインキナーゼ活性化についてのＯＤの統計的棒グラフ、ユーロ、各々（図３５Ａ〜Ｄ）において数で示したプロテインキナーゼの略名および対応する倍率変化。有意な変化だけを提示した。少なくとも２５％のＯＤにおける変化は有意と見なした。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下の詳細な説明から本発明の他の特徴および利点が明白になるであろう。しかし詳細な説明および本発明の特定の実施形態を示す特定の実施例は、例示する目的でのみ提示されることを理解されたい。本開示の精神および範囲内の様々な変化および改変は、当業者にはこの詳細な説明から明白になるであろう。
【００３９】
膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）は、部分的に管が閉塞したハムスター膵臓内で新規な管関連膵島形成を誘導する因子として発見された。本発明者らは、以前に、ＩＮＧＡＰの生物活性部分であるＩＮＧＡＰ１０４−１１８ペプチド（本明細書では「ＩＮＧＡＰ−Ｐ」、「１５−ｍｅｒ」もしくは配列番号１とも呼ぶ）がβ細胞新生活性およびインスリン強化活性を有することを証明している。近年の第２相臨床試験は、ＩＮＧＡＰ−Ｐが１型および２型両方の糖尿病患者において改良されたグルコース恒常性を生成することを証明したので、そこで糖尿病のための薬物療法としてのＩＮＧＡＰの潜在能力を支持している。しかし、不良な安定性および／または短い血漿半減期は、治療薬としてのＩＮＧＡＰ−Ｐを開発する能力を妨害した。
【００４０】
本発明者らは本明細書で、糖尿病を治療もしくは予防するための医薬品としてのＩＮＧＡＰ−Ｐの有効性を改良するため、およびその作用機序を理解するために、本発明者らが全長ＩＮＧＡＰタンパク質（「ｒＩＮＧＡＰ」および「ｒ−ＩＮＧＡＰ」とも呼ばれる）における手がかりを探索したことを報告する。本発明者らは、ｒＩＮＧＡＰをクローニングし、ｒＩＮＧＡＰを使用してＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞中でのこのタンパク質およびＩＮＧＡＰ−Ｐペプチドによって誘導されたシグナル伝達事象を調査した。ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞は、ＩＮＧＡＰに増殖の増加で応答するラットインスリノーマ細胞系である。全長組み換えタンパク質（ｒ−ＩＮＧＡＰ）は１５−ｍｅｒペプチドよりはるかに（細胞培養中で５日間まで）安定性であり、６Ｈｉｓタグ付けされる。データは、ｒＩＮＧＡＰがラットインスリノーマＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞の増殖を刺激することにモルベースでＩＮＧＡＰ−Ｐよりも少なくとも１００倍効率的であること、およびそれらがどちらもＲａｓ−Ｒａｆ−Ｅｒｋ経路の活性化を介してシグナル伝達するにもかかわらず、上流シグナル伝達事象は異なる可能性があることを示した。本発明者らはさらに、蛍光標識ｒＩＮＧＡＰの結合は細胞表面に限定され、受容体結合および集団化と一致する方法で細胞表面上にパッチを形成するが、他方ＩＮＧＡＰ−Ｐは急速に内在化されることも示している。ＩＮＧＡＰ誘導性Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰＫ４２／４４）活性化はｒＩＮＧＡＰおよび１５−ｍｅｒ両方について百日咳毒素（Ｐｔｘ）によって有意に低下するが、これはｒＩＮＧＡＰおよびこのペプチドがどちらもＧタンパク質共役受容体によって作用することを示唆している。そこで、データは、ｒＩＮＧＡＰはインビトロおよびインビボのどちらにおいてもＩＮＧＡＰ−Ｐに比較してはるかに大きな安定性（細胞培養中では５日間まで）および膵島再生において少なくとも１００倍高いモル効率を有することを証明した（図２３、２４を参照）。
【００４１】
Ｘ線結晶解析法を使用して、ｒＩＮＧＡＰの三次元再構築体を生成した。この再構成物は、生理活性１５−ｍｅｒペプチドであるＩＮＧＡＰ−Ｐが分子のコアから外へ伸びるループの一部であることを証明した（図１７Ｂ）。１５−ｍｅｒのＩＮＧＡＰ−Ｐが小さな線形化ペプチドであることは、注目すべきことである。本発明者らは、ｒＩＮＧＡＰタンパク質内のループがこのタンパク質とその標的細胞／受容体との相互作用を促進できる、およびこのためループ構造を保存することがＩＮＧＡＰペプチドの生物活性および安定性にとって極めて重要であるという仮説を立てた。タンパク質配列の解析（図１７Ａ）は、ＩＮＧＡＰ−Ｐがタンパク質コアを形成する高度に疎水性のアミノ酸配列に隣接されることを証明した。注目すべきことに、ＩＮＧＡＰ−Ｐ（アミノ酸１０３、１２０および１２２）のすぐ隣に位置する三個のトリプトファン残基（Ｗ）（図ｌ７Ｃ）およびグリシン１１９（Ｇ）は、ヒトを含む種を越えてＲｅｇ３タンパク質内で高度に保存されている。
【００４２】
このため本発明者らは、このペプチドのいずれかの片側または両側に保存アミノ酸を含む、ＩＮＧＡＰ−Ｐの三つの拡張アナログを設計および生成した（表１、図１８を参照）。溶解性を侵害しないように、拡張は１９−ｍｅｒペプチドを生じさせる４アミノ酸に限定した。拡張ＩＮＧＡＰペプチドは、ＩＮＧＡＰの天然三次元ループ構造を保存する可能性がある。理論によって拘束されることを望まなくても、１９−ｍｅｒのいずれかの末端にある二つの疎水性トリプトファン残基はこのペプチドのループ構造を安定化させられると考えられる。そこで１９−ｍｅｒペプチドは、ｒＩＮＧＡＰタンパク質の生物活性を保持し（おそらく強化された活性さえ示す）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ  １５−ｍｅｒに比較して増加した安定性および／または血漿半減期を有する。
【００４３】
１９−ｍｅｒペプチドの構造は表１に示した。拡張１９−ｍｅｒＩＮＧＡＰペプチドを生成するために、ＩＮＧＡＰタンパク質配列中のＩＮＧＡＰ−Ｐ  １５−ｍｅｒペプチドに隣接する４アミノ酸を、表１に示したようにＩＮＧＡＰ−Ｐ  １５−ｍｅｒに加えた（１５−ｍｅｒに加えられた隣接アミノ酸には下線を付した。さらに図１７、１８も参照されたい）。
【００４４】
【表１】
2016508509.tif 000003
【００４５】
ＩＮＧＡＰ−Ｐ  １５‐ｍｅｒおよびｒＩＮＧＡＰと比較した１９‐ｍｅｒの生物活性について調査した。本明細書に示したように、培養ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞内のＩＮＧＡＰ１０２−１２０誘導性Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰＫ４２／４４）活性化は、ＩＮＧＡＰ１０４−１１８により生成された活性化より３倍超およびｒＩＮＧＡＰにより生成された活性化のおよそ２倍であった（図１８）。さらに、本発明者らは、蛍光標識１９‐ｍｅｒ（ＩＮＧＡＰ１０２−１２０）の結合が細胞表面に限定され、ｒＩＮＧＡＰについて視認された方法に類似する方法での受容体集団化に似ているが、細胞表面に結合するとは思われないＩＮＧＡＰ１０４−１１８（図１９）とは顕著に異なることを証明する。
【００４６】
ＦＢＳ中での比較ペプチド安定性の分析は、ＩＮＧＡＰ−Ｐに比したＩＮＧＡＰ−１９の利点を証明しなかったが、これはどちらのペプチドも類似速度で分解したためである（図２０）。
【００４７】
ＩＮＧＡＰ−１９の効率がその安定性を増加させることによってさらに増大させられるかどうかを研究するために、環化（ジスルフィド、末端システインの添加による頭−尾）を選択したが、それは環化がペプチド安定性を増加させるために広範に使用されるアプローチであるからである（Ａｄｅｓｓｉ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓｏｔｏ，Ｃ，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００２，９：９６３−９７８）。ＩＮＧＡＰ−Ｐを同様に環化させ、新規アナログをＩＮＧＡＰ−１９ＣおよびＩＮＧＡＰ−ＰＣ（環化についての「Ｃ」）と名付けた。
【００４８】
ＩＮＧＡＰ−Ｐ、ＩＮＧＡＰ−ＰＣ、ＩＮＧＡＰ−１９およびＩＮＧＡＰ−１９Ｃの安定性をＦＢＳ中でのインビトロインキュベーションにおける時間経過試験において比較した。データは、ＩＮＧＡＰ−１９Ｃが直鎖１５‐ｍｅｒ（ＩＮＧＡＰ−Ｐ）ペプチドまたは１９‐ｍｅｒ（ＩＮＧＡＰ−１９）ペプチドより安定性であると思われることを示した（図２０、２１）。重要なことに、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞内でのＥｒｋ１／２活性化の試験に基づくと、ＩＮＧＡＰ−１９Ｃは直鎖１９‐ｍｅｒ（ＩＮＧＡＰ−１９）とは効力が同等であったが、ＩＮＧＡＰ−Ｐ（図２２）より高モル有効性を有していた。さらに、本発明者らは、環化単独ではＩＮＧＡＰ−Ｐの活性を増加させないことを証明した（図２２Ａ）。
【００４９】
そこで、これらの結果は、１９‐ｍｅｒのｒＩＮＧＡＰ、ＩＮＧＡＰ１０２−１２０（配列番号４）および環化された１９‐ｍｅｒのｒＩＮＧＡＰ、環化ＩＮＧＡＰ１０２−１２０は、ＩＮＧＡＰ−Ｐ  １５‐ｍｅｒより生物活性が高かった。環化ＩＮＧＡＰ１０２−１２０は、ＩＮＧＡＰ−Ｐより大きな安定性を示す。
【００５０】
したがって、本明細書ではＩＮＧＡＰの１９‐ｍｅｒペプチド、ＩＮＧＡＰ１０２−１２０（本明細書では、「ＩＮＧＡＰ−１９」、「１９‐ｍｅｒ」、「１９‐ｍｅｒ  ｓｅｑ３」および配列番号４と呼ばれる）が提供される。さらに本明細書ではＩＮＧＡＰの環化１９‐ｍｅｒペプチド、ＩＮＧＡＰ１０２−１２０（本明細書では、「ＩＮＧＡＰ−１９Ｃ」および配列番号６と呼ばれる）が提供される。本明細書では、１９‐ｍｅｒペプチドがＩＮＧＡＰのβ細胞新生活性およびインスリン増強活性および／または改良された安定性を、ＩＮＧＡＰ−Ｐとの比較で、有することが証明され、１９‐ｍｅｒのＩＮＧＡＰペプチドが糖尿病にとって強力な新規治療薬であることを示している。
【００５１】
本明細書の一つの実施形態では、配列番号４または配列番号６に規定した配列を含むＩＮＧＡＰペプチドが提供される。本明細書のまた別の実施形態では、配列番号４または配列番号６に規定した配列からなるＩＮＧＡＰペプチドが提供される。組成物およびその使用方法もまた提供される。
【００５２】
本明細書で使用する用語「β細胞」は、膵臓内のランゲルハンス島の完全に分化したインスリン産生β細胞を意味する。膵臓β細胞は、それらのインスリン分泌および典型的には膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の細胞表面発現を特徴とする。
【００５３】
さらに、ＩＮＧＡＰの生物活性を保持する本発明の１９‐ｍｅｒ１５−ｍｅｒペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメントおよび変異体が本発明のペプチドにより包含されることも理解すべきである。一つの実施形態では、配列番号４および配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列番号４および配列番号６の変異体が提供される。また別の実施形態では、変異体は、配列番号４および配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有し、ＩＮＧＡＰの１０３位および１２０位でトリプトファン残基を保持する（言い換えると、ＩＮＧＡＰの１０３位および１２０位でのトリプトファン残基は除去されない、置換されない、または変化させられない）。さらに他の実施形態では、変異体は、トリプトファン残基の１０３位および１２０位の少なくとも一つまたは両方のトリプトファン残基を保持する。
【００５４】
本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓の状態または疾患を治療または予防するために使用できる。そのような状態もしくは疾患の非限定的例には、代謝障害、または状態、例えば１型および２型真性糖尿病、糖尿病の合併症（例えば、網膜症、腎症もしくは神経障害、糖尿病足、糖尿病性潰瘍、糖尿病性大血管障害）、代謝性アシドーシスもしくはケトーシス、反応性低血糖、高インスリン血症、グルコース代謝障害、インスリン耐性、代謝症候群、様々な起源の脂質異常症、アテローム硬化症および関連疾患、肥満症、高血圧、慢性心不全、水腫および高尿酸血症が含まれる。
【００５５】
β細胞質量の拡大は、既存膵島細胞の増殖、管関連前駆体からの新生または分化エンドクリン細胞からの膵島細胞の再生を含むいくつかのプロセスを含む可能性がある。本発明者らは、本明細書において、ＩＮＧＡＰ−Ｐが、（１）正常ヒト膵臓管細胞（ＨＰＤＥ）の増殖およびエンドクリン分化（図２５〜２９、３４）、（２）脱分化ヒト膵島由来管様構造からの機能的膵島様構造（ＤＬＳ）の再生（図２３、３０〜３３）、および（３）インスリン産生ラット細胞系であるＲＩＮｍ５Ｆ細胞の増殖（図１、８、１８、２２）を誘導することを証明する。動物モデルにおいては、ＩＮＧＡＰ−Ｐが膵島細胞の数の有意な増加およびより多くのインスリンの産生を導くことができる（米国特許出願公開第２００４／０１３２６４４号明細書）ことも証明されている。新規に形成されたβ細胞は膵管の壁内に出現し、膵管から出芽すると思われた。これらのインスリン陽性細胞は管上皮細胞分化および膵島細胞増殖から生じ、それらの出現はＩＮＧＡＰ−Ｐを用いた処置の用量および期間に比例していた。長い治療期間にわたって、これらの細胞は管から離れて移動し、膵臓の実質内で膵島を形成した。ＩＮＧＡＰ−Ｐの連続１０日間の投与後、膵島数の３０％増加が生じ、３０日後には、組織内の膵島数の倍増が生じた。本明細書に開示したペプチドについても類似の作用が予想される。
【００５６】
したがって、一つの実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、β細胞新生を促進、強化または誘導する。例えば、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓細胞の機能性を改良もしくは回復させる、および／または膵臓β細胞の数もしくは大きさを増加させることができる。また別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓β細胞の再生を促進、強化または誘導する。また別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓β細胞の増殖を促進、強化または誘導する。さらにまた別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、インスリン強化活性を有する。さらに別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、１型もしくは２型糖尿病を有する被験者におけるグルコース恒常性を改良する。
【００５７】
本明細書で使用する「インスリン強化活性」および「インスリン強化」は、インスリンが本発明のペプチドおよび組成物と組み合わせて投与されると、インスリン単独の投与と比較して、低用量のインスリンで治療成績を達成できる能力を意味する。これを言い換えると、インスリンが本発明のペプチドおよび組成物と組み合わせて投与されると、所定の治療成績を達成するために必要とされる外部から提供されるインスリン量が少なくなる。本発明のペプチドおよび組成物の存在下では、より高用量のインスリン単独を用いた場合と類似の治療成績が低用量のインスリンで達成される。
【００５８】
また別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、例えば、膵臓β細胞のアポトーシスもしくはネクローシスによるβ細胞死を予防する、脱分化成体膵島に由来する始原管様構造（ＤＬＳ）からの新規な機能的膵島の分化を誘導する、エンドクリン分化を増強する、管上皮と関連する細胞からの膵島細胞再生を誘導して新規の膵島形成をもたらす、および／または高血糖症の反転をもたらす。特定の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓管細胞の分化を誘導する、および／またはそのような細胞がアポトーシス経路を回避することを可能にする。
【００５９】
さらにまた別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＩＮＧＡＰ−Ｐ  １５−ｍｅｒペプチドに比較して、より優れたインビトロ安定性、循環中でのより優れた安定性および／またはインビボでのより長い半減期を有する。
【００６０】
一つの実施形態では、β細胞関連障害は、本発明のペプチドおよび組成物によって治療または予防される。特定の実施形態では、糖尿病、特に１型糖尿病、２型糖尿病、発症前１型糖尿病および／または糖尿病合併症が本発明のペプチドおよび組成物によって治療または予防される。
【００６１】
そこで、一つの態様では、本明細書ではそれを必要とする被験者において代謝障害を治療または予防するための方法であって、被験者に治療有効量の本発明のペプチドおよび組成物を投与する工程を含む方法が提供される。また別の態様では、本明細書ではそれを必要とする被験者において糖尿病を治療または予防するための方法であって、被験者に治療有効量の本発明のペプチドもしくは組成物、例えば配列番号４を投与する工程を含む方法が提供される。
【００６２】
さらにまた別の態様では、それを必要とする被験者における膵臓β細胞の変性を予防するため、および／または膵臓β細胞の機能性を改良および／または回復させるための方法であって、被験者に治療有効量の本発明のペプチドおよび組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一つの態様では、膵臓細胞、例えばβ細胞の数もしくはサイズが被験者において増加させられる、および／または血漿中インスリンレベルが被験者において増加させられる、および／または被験者においてグルコース恒常性が回復もしくは改良させられる。
【００６３】
また別の態様では、インビトロおよび／またはインビボでの糖尿病誘発物質から膵島細胞を保護する方法であって、真核細胞を本発明のペプチドおよび組成物と接触させる工程、または被験者に投与する工程を含む方法が提供される。一つの実施形態では本発明のペプチドおよび組成物の投与後には、被験者において膵島生存能が改良される、および／または膵島機能不全が遮断される、および／またはβ細胞質量が維持される。
【００６４】
本発明のまた別の実施形態によると、β細胞前駆体の分化を誘導する方法であって、上記β細胞前駆体の分化を誘導するために、β細胞前駆体を含む膵臓管細胞の培養を本発明のペプチドの調製物と接触させる工程を含む方法が提供される。一つの実施形態では、膵臓エンドクリン不全を備える哺乳動物の膵臓管細胞は、身体から除去してインビトロで処置することができる。管細胞は、典型的にはβ細胞前駆体を含む。そこで本発明のペプチドの調製物を用いる治療は、β細胞前駆体の分化を誘導するであろう。本発明のペプチドを用いて処置した細胞は、次にそれらが由来する哺乳動物の体内への自己移植片として使用することができる。そのような自己治療は、移植片に含まれる有害な宿主対移植片拒絶反応を最小限に抑える。
【００６５】
一つの実施形態では、被験者は、齧歯類、イヌ、ブタ、霊長類またはヒトであってよい。本発明の方法は任意の哺乳動物において使用できるが、被験者は、好ましくはヒトである。
【００６６】
用語「ホモログ」は、ホモログ配列が元の配列と実質的に同一方法で機能するように、本明細書に記載のペプチドの配列からわずかな、もしくは取るに足らない配列変化を有するアミノ酸もしくは核酸配列を意味するために使用される。配列変化は、局所的突然変異もしくは構造的改変に帰せることができる。実質的な配列同一性を有する配列には、本明細書に提供したようなペプチドをコードする配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列、または本明細書に提供するペプチドと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば配列番号４もしくは配列番号６）が含まれる。配列同一性は、当分野において公知の方法によって計算できる。核酸配列同一性は、最も好ましくはＢＬＡＳＴバージョン２．１の詳細検索のアルゴリズムによって評価される。一連のプログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴから入手できる。
【００６７】
用語「アナログ」は、本明細書に記載したペプチドの配列と比較して改変されているアミノ酸もしくは核酸配列であって、この改変が本明細書に記載した配列（例えば、膵臓β細胞新生の誘導、膵臓β細胞再生の誘導、グルコース恒常性の改良または高血糖症の反転）の生物活性を変化させないアミノ酸もしくは核酸配列を意味するために使用される。改変された配列もしくはアナログは、本明細書に記載したペプチド、例えば配列番号４もしくは配列番号６に比較して改良された特性を有していてよい。
【００６８】
さらに包含されるのは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、および配列番号４または配列番号６の生物活性、例えばβ細胞新生活性、インビボ安定性などを維持するペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする配列である。用語「ハイブリダイズする配列」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列にハイブリダイズできる核酸配列を意味する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者には公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６の中に見いだすことができる。本明細書で使用する用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の二つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部分に発生する場合がある。ハイブリダイズする部分は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の１つに対して長さが少なくとも５０％である。これに関連して、核酸二本鎖、もしくはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有バッファー中でナトリウムイオン濃度、標識核酸のＧ／Ｃ含量、核酸プローブ（１）および温度の関数であるＴｍによって決定される（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｌ）。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似であるが同一ではない分子を同定するためには、１％ミスマッチはＴｍの約１℃減少を生じさせると推定することができ、例えば９５％超の同一性を有する核酸分子が追求される場合は、最終洗浄は５℃低下させられる。これらの考察に基づいて、一つの実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、−５℃のＴｍ（上記の方程式に基づいて）での５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液／１．０％のＳＤＳでのハイブリダイゼーション、その後に６０℃での０．２×のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの洗浄であると規定される。
【００６９】
ペプチドは、ペプチドの生物活性を変化させないアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含有するように改変されてよい。保存的アミノ酸置換は、ペプチドの一つ以上のアミノ酸を類似の電荷、サイズおよび／または親水性特徴を備えるアミノ酸と置換することを含んでいる。保存的置換だけが行われる場合は、結果として生じるアナログは未置換ペプチドと機能的に同等であろうと予想される。非保存的アミノ酸置換は、ペプチドの一つ以上のアミノ酸を異なる電荷、サイズおよび／または親水性特徴を有する一つ以上のアミノ酸と置換することを含んでいる。
【００７０】
ペプチドは、ペプチドを治療的により有効に、またはより適切に、例えばより安定性にするために改変されてよい。例えば、本発明のペプチドは、無機酸、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などと、または有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸およびトルエンスルホン酸と反応させることによって医薬上許容される塩に変換させられてよい。医薬上許容される塩は当分野において周知であり、ペプチドおよびそれらのアナログ、ホモログ、フラグメントおよび変異体の医薬上許容される塩は本明細書に包含される。
【００７１】
さらに、ペプチドは、例えばペプチドの循環中半減期を増加させるためにポリマーへの共有結合によって化学的に改変されてよい。典型的なポリマーおよびポリマーをペプチドに付着させる方法は、米国特許第４７６６１０６号明細書、同第４１７９３３７号明細書、同第４４９５２８５号明細書および同第４６０９５４６号明細書に示されている。ポリマーの非限定的例は、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒ（式中、Ｒは水素、または例えばアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であってよい）を有する。一つの実施形態では、保護基は、一〜八個の炭素を有する、またはメチルである。記号ｎは、正の整数、例えば１〜１，０００または２〜５００である。一つの実施形態では、ＰＥＧは、１，０００〜４０，０００、２０００〜２０，０００または３，０００〜１２，０００の平均分子量を有する。ＰＥＧは、少なくとも一個のヒドロキシ基または一個の末端ヒドロキシ基を有していてよい。このヒドロキシ基は、インヒビターにおける遊離アミノ基と反応するために活性化されてよい。
【００７２】
本発明はさらに、本発明のペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００７３】
可能性のある発現ベクターには、ベクターが使用される宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクターもしくは改変ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）が含まれるがそれらに限定されない。発現ベクターは「宿主細胞を変換させるために適合する」が、これは発現ベクターが、本発明の核酸分子および本発明の核酸分子に機能的に連結している発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される調節配列を含有することを意味する。「機能的に連結した」は、核酸が核酸の発現を可能にする方法で調節配列に連結していることを意味することが意図されている。
【００７４】
本明細書では、本発明の核酸分子、またはそのフラグメントもしくはアナログを含有する組み換え発現ベクターならびに挿入されたペプチドをコードする配列の転写および翻訳のために必要な調節配列が提供される。
【００７５】
適切な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物もしくは昆虫の遺伝子を含む様々な起源から引き出すことができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載された調節配列を参照されたい。適切な調節配列の選択は宿主細胞に依存しており、当業者であれば容易に実施することができる。そのような調節配列の例には、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、例えば複製起源、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、ならびに転写の誘導能力を付与する配列、などの他の配列を発現ベクター内に組み込むことができる。
【００７６】
本発明の組み換え発現ベクターは、さらに本開示のペプチドを用いて形質転換もしくは形質導入された宿主細胞の選択を促進する選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。選択可能なマーカー遺伝子の例は、所定の薬物に対する耐性を付与する例えばＧ４１８およびハイグロマイシンなどのタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたは免疫グロブリンもしくはその部分、例えば免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、のＦｃ部分をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度における変化によって監視される。選択可能なマーカー遺伝子が例えばネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合は、Ｇ４１８を備える形質転換細胞を選択できる。選択可能なマーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生残するであろうが、他の細胞は死滅する。これは、本開示の組み換え発現ベクターの発現について視認およびアッセイすることを、および特に突然変異が発現および表現型に及ぼす作用を決定することを可能にする。選択的マーカーは、対象の核酸からの別個のベクター上に導入できることは理解されるであろう。
【００７７】
本明細書に提供した組み換え発現ベクターは、さらにまたペプチドの発現増加、組み換えペプチドの可溶性の向上を供する成分をコードする、および／または親和性精製におけるリガンドとして作用することによって標的組み換えペプチドの精製に役立つ遺伝子を含有していてよい。例えば、タンパク質分解性開裂部位は、融合タンパク質の精製に引き続いて融合成分から組み換えタンパク質の分離を可能にするために標的組み換えペプチドに添加されてよい。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質もしくはプロテインＡを各々組み換えペプチドに融合させるｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．社、オーストラリア国メルボルン）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州ビバリー）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。
【００７８】
組み換え発現ベクターは、形質転換宿主細胞を生成するために宿主細胞内へ導入できる。用語「形質転換宿主細胞」は、本発明の組み換え発現ベクターを用いて形質転換または形質導入できる細胞を含むことが企図されている。用語「変換された」、「〜を用いて形質転換された」、「〜を用いて形質導入された」、「形質転換」および「形質導入」は、当分野において公知の多数の可能な技術の一つによって細胞内への核酸（例えば、ベクターまたは裸のＲＮＡもしくはＤＮＡ）の導入を含むことが企図されている。原核細胞は、核酸を用いて、例えばエレクトロポレーションもしくは塩化カルシウム媒介形質転換によって転換させることができる。例えば、核酸は、哺乳動物細胞内へ従来型技術、例えばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質導入、リポフェクチン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＲＮＡ移入、ＤＮＡ移入、人工染色体、ウイルスベクターおよび任意の新生遺伝子移入テクノロジーによって導入することができる。宿主細胞を形質転換および形質導入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））およびその他の実験テキストの中に見いだすことができる。
【００７９】
適切な宿主細胞には、極めて様々な真核宿主細胞および原核細胞が含まれる。例えば、本開示のペプチドは、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現することができる。その他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９１）の中に見いだすことができる。さらに、本開示のペプチドは、原核細胞内、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で発現させることができる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３（５６５６）：３７１−３（２００４））。
【００８０】
本明細書に記載した方法において使用するために適切な哺乳動物細胞には、特に、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０もしくは１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）ならびにＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）および３Ｔ３マウス線維芽細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）が含まれる。
【００８１】
哺乳動物細胞における発現を指令するために適切な発現ベクターには、一般にプロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０などのウイルス物質に由来する）ならびに他の転写および翻訳制御配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターの例には、制限なくｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０（１９８７））、ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７））およびｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州）が含まれる。
【００８２】
または、本発明のペプチドは、さらに非ヒトトランスジェニック動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジおよびブタにおいて発現させることもできる（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０−６８３（１９８５）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９−８１４（１９８３）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２（１９８５）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４１：３４３−３４５（１９８５）および米国特許第４７３６８６６号明細書）。本発明は、さらにそのような動物に由来する、またはそのような動物から単離された組織および細胞も包含する。
【００８３】
上述したアナログおよびホモログに加えて、所定の実施形態では、本発明のペプチドは、さらに異種ポリペプチドにＮ末端もしくはＣ末端で組み換え融合させられてよい、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）させられてよい。例えば、ペプチドは、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、及び、例えば異種ポリペプチド、ヒスチジン（ＨＩＳ）タグ、薬物、放射性核種もしくは毒素などのエフェクター分子に組み換えにより融合もしくは結合させられてよい。例えば、国際公開第９２／０８４９５号パンフレット、国際公開第９１／１４４３８号パンフレット、国際公開第８９／１２６２４号パンフレット、米国特許第５３１４９９５号明細書、および欧州特許第３９６３８７号明細書を参照されたい。あらゆるタイプの分子は、その分子が本発明のペプチドの生物活性を阻害しない限り、本発明のペプチドに共有結合させられてよい。例えば、しかし決して限定することなく、ペプチド誘導体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合によって改変されているペプチドが含まれる。極めて多数のあらゆる化学的改変は、特異的化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがそれらに限定されない公知の技術によって実施されてよい。
【００８４】
ペプチドが融合させられる異種ポリペプチドは、例えばペプチドのインビボ半減期を増加させるため、または当分野において公知の方法を使用してイムノアッセイにおいて使用するために有用な可能性がある。本発明のペプチドは、精製または検出を促進するために例えばポリペプチドなどのマーカー配列に融合させることができる。一般に、本発明のペプチドは非結合形態で使用されてよい、または例えば分子の治療特性を改良するため、分子の薬理学的特性を改良するなどのために、様々な分子の少なくとも一つに結合させられてよい。
【００８５】
所定の実施形態では、本発明のペプチドは、追加のアミノ酸配列または一つ以上の成分を含む。以下では、典型的な改変についてより詳細に説明する。例えば、ペプチドは、追加の機能的成分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、画像撮影剤もしくは標識）を加えるために改変されてよい。
【００８６】
さらに、「非必須アミノ酸領域」で保存的置換もしくは変化をもたらすヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が実施されてよい。例えば、ペプチドは、一つ以上の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を除いて、出発配列と同一であってよく、例えば一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つまたは十以上の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失が作成されてよい。他の実施形態では、出発ペプチドに由来するペプチドは、出発配列と、一つ、二つ以下、三つ以下、四つ以下、五つ以下、六つ以下、七つ以下、八つ以下、九つ以下または十以下の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を除いて同一であってよい。所定の実施形態では、出発ペプチドに由来するペプチドは、出発配列と比較して、一つ、二つ、三つ、一つから二つ、一つから三つ、一つから五つまたは一つ〜十の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を有する。特定の実施形態では、配列番号４の第２位および第１９位でのトリプトファン残基の少なくとも一つもしくは両方は誘導体ペプチド内で維持される、つまり第２位および第１９位でのトリプトファン残基の少なくとも一つもしくは両方で維持される。
【００８７】
さらに本発明には、本明細書に記載したペプチドのフラグメント、誘導体、改変体もしくは変異体ならびに上述したアナログおよびホモログさらにそれらにいずれかの組み合わせが包含される。本発明のペプチドに関する場合の用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、「改変体」、「ホモログ」および「アナログ」には、対応する出発ペプチド配列の生物活性の少なくとも一部を維持するあらゆるポリペプチドが含まれる。用語「変異体」、「誘導体」および「改変体」は、本明細書では互換的に使用される。
【００８８】
本発明のペプチドの変異体には、本明細書に記載したアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入および本明細書に記載した改変に起因する変化したアミノ酸配列を備えるポリペプチドであるフラグメントが含まれる。変異体ポリペプチドは、本明細書に記載した保存的もしくは非保存的アミノ酸の置換、欠失もしくは付加を含んでいてよい。変異体はさらに、官能性側鎖基の反応によって化学的誘導された一つ以上の残基を有していてよい。さらに変異体として含まれるのは、２０個の標準アミノ酸の一つ以上の天然発生のアミノ酸誘導体を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロピンは、プロリンと置換されてよい、５−ヒドロキシリシンはリシンと置換されてよい、３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよい、ホモセリンはセリンと置換されてよい、およびオルニチンはリシンと置換されてよい。さらに、変異体は一つ以上の非古典的アミノ酸を含有していてよい。
【００８９】
そこで一つの実施形態では、本明細書に開示したペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は本発明に包含される。一つの実施形態では、アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は、出発ペプチドの一つ以上の生物活性、例えば、β細胞新生活性、インスリン強化活性、被験者におけるグルコース恒常性を回復もしくは改良する能力、細胞受容体に結合して高血糖症を反転する能力、安定性などを維持する。ペプチドの一つ以上の生物活性は、アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体によって維持されてよい。一つの実施形態では、アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は、出発ペプチドの少なくとも一つの生物活性もしくは特性を維持する。
【００９０】
一つの実施形態では、本発明のペプチドは、精製される、または実質的に純粋である。また別の実施形態では、本発明のペプチドは、化学的に合成される。
【００９１】
医薬組成物および投与方法
本発明のペプチドを包含する医薬組成物は、本明細書に包含される。本発明のペプチドは、被験者に本発明のペプチドを公知の技術にしたがって従来型医薬上許容される担体もしくは希釈剤と組み合わせることによって調製された従来型投与形で投与することができる。当業者であれば、医薬上許容される担体もしくは希釈剤の形態および特性は、それが結び付けられる有効成分の量、投与経路および他の周知の変量によって決定付けられることを認識できるであろう。
【００９２】
ペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体を調製および被験者に投与する方法は、当分野において周知である、または当業者によって容易に決定される。本発明のペプチドおよび組成物の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入もしくは局所であってよい。本明細書で使用する用語「非経口」には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸もしくは経膣投与が含まれる。特定の実施形態では、本発明のペプチドもしくは組成物は、注射によって投与される。一つの実施形態では、投与経路は静脈内である。また別の実施形態では、本発明のペプチドもしくは組成物は、経口で、例えば一日一回、一日二回または一日三回投与される。
【００９３】
通常は、注射のために適切な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸もしくはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）および場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）を含んでいてよい。非経口投与のための製剤には、無菌の水性もしくは非水性液剤、懸濁剤およびエマルジョン剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、食塩液および緩衝媒質を含むエマルジョンもしくは懸濁液が含まれる。本発明では、医薬上許容される担体には、０．０１〜０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液もしくは０．８％食塩液が含まれる。他の一般的な非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液もしくは不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補給剤および栄養補給剤、例えばリンゲルデキストロースをベースとする電解質補給剤などが含まれる。保存料および他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた存在してよい。
【００９４】
より特別には、注射に使用するために適切な医薬組成物には、無菌注射用溶液もしくは分散液の即時調製物のための無菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液および無菌粉末が含まれる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度まで流体でなければならない。組成物は、製造および保存条件下で安定性でなければならず、好ましくは、例えば細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であってよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。本明細書に開示した治療方法において使用するために適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【００９５】
微生物の作用の防止は、様々な抗菌性および抗真菌性物質、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールもしくは塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射用組成物の長期間吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによって引き起こすことができる。
【００９６】
あらゆる場合に、無菌注射用溶液は、本発明のペプチド（単独で、または他の活性物質と組み合わせて）を、必要に応じて一つの成分もしくは成分の組み合わせを備える適切な溶媒中において、当業者によって容易に決定することができる必要とされる量で組み込むことによって調製し、その後にろ過殺菌することによって調製できる。一般に、分散液は活性化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分の粉末に以前に殺菌ろ過されたその溶液からの任意の追加の望ましい成分の粉末を産生する、真空乾燥法およびフリーズドライ法である。注射用調製物は、加工処理され、例えばアンブル、バッグ、ボトル、シリンジもしくはバイアルなどの容器に充填され、当分野において公知の方法にしたがって無菌条件下で密封される。
【００９７】
液体医薬組成物が調製された後、液体医薬組成物は、分解を防止するため、および無菌性を失わないようにするために凍結乾燥されてよい。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者には公知である。使用直前に、組成物は追加の成分を含むことができる無菌希釈剤（例えば、リンゲル液、蒸留水または無菌食塩液）を用いて再構成することができる。再構成すると、組成物は、当業者には公知のそれらの方法を使用して被験者に投与される。
【００９８】
さらに、調製物は、キットの形態に包装して販売されてよい。そのような製造品は、好ましくは使用取扱説明書を提供するラベルもしくは包装添付文書を有し、調製物を使用するために必要とされる追加の成分を有することができる。
【００９９】
当業者であれば、例えば糖尿病を予防または治療するための有効量の本発明のペプチドおよび組成物は、投与の手段、被験者の特徴もしくは生理学的状態（例えば健康状態）、投与される他の医薬品、治療が診断的、予後的、予防的または治療的などのいずれであるかを含む多数の様々な因子に依存して変動することを理解できるであろう。用量は、安全性および有効性を最適化するために当業者には公知のルーチン方法を使用して決定されてよい。
【０１００】
明白に、投与すべき融合ペプチドの量もまた、それが投与される被験者に依存するであろう。被験者がヒトである場合には、投与されるペプチドの量は、患者の年齢、状態の重症度および患者の過去の病歴を含む多数の因子に依存し、常に投与する医師の堅実な裁量の範囲内に含まれる。一般に、ヒトまたは他の哺乳動物に単回用量もしくは分割用量で投与される本発明のペプチドの総一日量は、例えば、単回もしくは複数回用量で、０．１ｍｇ／Ｋｇ／日〜３０ｍｇ／Ｋｇ／日のペプチド、０．１ｍｇ／Ｋｇ／日〜２０ｍｇ／Ｋｇ／日のペプチド、または２ｍｇ／Ｋｇ／日〜１０ｍｇ／Ｋｇ／日のペプチドの量にあってよい。単回用量組成物は、そのような量または一日量を作り上げるためのその約数を含有していてよい。一つの実施形態では、一日に５ｍｇ／ｋｇが腹腔内（ＩＰ）投与される。
【０１０１】
ＩＮＧＡＰペプチドの用法・用量および製剤は記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３２６４４号明細書を参照されたい）。
【０１０２】
一つの実施形態では、本発明のペプチドは、医薬上許容される塩の形態で調製される、または使用される。特定の実施形態では、医薬上許容される塩は酢酸塩である。
【０１０３】
一つの実施形態では、本発明のペプチドは、精製される、または実質的に純粋である。
【０１０４】
安定性は、当分野において公知の方法を使用して決定されてよい。例えば、ペプチドの安定性は、純度、不純物の総パーセンテージ、個別不純物のパーセンテージ（ＨＰＬＣまたは他の適切な定量的方法によって決定される）、サンプルの外観および含水量を含むがそれらに限定されない様々なパラメーターを比較することによって決定される。ＨＰＬＣ法を使用すると、治療用ペプチドのレベルに比較して分解生成物のレベルにおける何らかの増加を決定することができる。
【０１０５】
ペプチドサンプルは、溶液中であろうと凍結乾燥粉末であろうと、様々な温度で、水分の存在下もしくは非存在下で、および明色もしくは暗色のバイアル中に保存することができる。様々な保管条件中の分解は、不純物の増加および治療用ペプチド含量の減少をもたらすことがある。一部の実施形態では、サンプル調製物は、８０％超純粋、９０％超純粋、９５％超純粋または９７％超純粋である。
【０１０６】
本発明のペプチドは、さらにまた医薬的に投与可能な組成物の成分として投与されてもよい。言い換えると、ペプチドは、それを必要とする被験者に投与するための製剤中に存在してよい。本発明のペプチドは、例えば、糖尿病を治療するための単独有効成分であってよい。または、組成物は、さらに一つ以上の追加の化合物、例えば同一状態もしくは関連状態を治療するために使用されてよい第二薬を含有していてよい。
【０１０７】
本発明のペプチドは、場合により、治療を必要とする障害もしくは状態を治療する際に有効である他の物質と組み合わせて投与できることを理解されたい。本開示の範囲と調和して、本発明のペプチドおよび組成物は、他の治療薬もしくは予防薬とともに使用されてよい。本発明のペプチドは、第二薬と同時に、または連続して投与されてよい。１型糖尿病もしくは２型糖尿病または関連障害のための任意の治療薬は、本発明のペプチドと組み合わせて使用するために企図されていることを理解されたい。そのような治療薬もしくは予防薬の例には、制限なく、抗糖尿病薬、例えばメトホルミン、スルホニルウレア（例えば、グリベンクラミド、トルブタミド、グリメピリド）、ナテグリニド、レパグリニド、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、ＰＰＡＲ−γ−アゴニスト（例えば、ＧＩ２６２５７０）およびアンタゴニスト、ＰＰＡＲ−γ／αモジュレーター（例えば、ＫＲＰ２９７）、α−グルコシダーゼインヒビター（例えば、アカルボース、ボグリボース）、ＤＰＰＩＶインヒビター（例えば、ＬＡＦ２３７、ＭＫ−４３１）、α２−アンタゴニスト、血糖値を下げるための薬剤、コレステロール吸収インヒビター、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼインヒビター（例えば、スタチン）、インスリンおよびインスリンアナログ、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アナログ（例えば、エキセンジン−４）および／またはアミリンが含まれる。一つの実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、関節リウマチの治療のために承認されているが糖尿病における有効性の確証を有するＩＬ−１インヒビターである免疫モジュレーターのアナキンラと組み合わせて使用される。
【０１０８】
一つの実施形態では、第二治療薬は、例えば、細胞死もしくはβ細胞のアポトーシスを遮断する、ＩＬ−１、例えばＩＬ−１βの有害作用から膵島を保護する、例えば糖尿病原性薬から保護する、および／またはさもなければ膵島生育能力および／または機能を保護もしくは改良することによってβ細胞質量を維持する薬物である。第二治療藥は、インスリン耐性を反転させる、腸管グルコース吸収を制御する、肝グルコース産生を正常化する、および／またはβ細胞のグルコース感知およびインスリン分泌を改善することもできる。一つの実施形態では、第二治療薬は、転写因子ＮＦ−κΒのインヒビター、または転写因子ＮＦ−κΒのサイトカイン誘導性活性化のインヒビターであってよい。一つの実施形態では、第二治療薬はアナキンラである。他の実施形態では、第二治療薬は、インスリン、インスリンアナログ、ＳＧＬＴ２インヒビター、新規の膵島形成誘発剤、幹細胞療法薬、Ｔリンパ球インヒビター、ＩＬ１２活性化因子、ＳＴＡＴ４アクチベーター、免疫モジュレーター、膵島インプラント、抗炎症薬、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および／またはインターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニストである。
【実施例】
【０１０９】
本発明は、本発明を具体的に示すために提供され、決して本発明の範囲を限定すると見なすべきではない下記の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【０１１０】
（実施例１）
ＩＮＧＡＰ−Ｐおよびｒ−ＩＮＧＡＰはＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞の増殖を用量依存性で増加させる。
膵臓管細胞はＩＮＧＡＰの特定標的であると理解されてきたが（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７：３３４−３４１；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐａｎｃｒｅａｓ，３４：１０３−１１１）、臨床試験の結果を含む多数の試験は、β細胞もまたＩＮＧＡＰ刺激に応答性であると提言している。ＩＮＧＡＰがβ細胞に及ぼす作用について試験するために、本発明者らはラットインスリノーマ細胞系であり、一般にインビトロでのβ細胞の代理として使用されるＲＩＮ−ｍ５Ｆを使用した（Ｃｏｚａｒ−Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５７：３０５６−３０６８）。本発明者らの実験ではインスリン発現への有意な作用は観察されなかったが、データはＩＮＧＡＰ−Ｐおよびｒ−ＩＮＧＡＰがどちらも用量依存性で２４時間後にＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞内へのＢｒｄＵ組み込みを誘導し（図１Ａ）、最も効果的な濃度はｒ−ＩＮＧＡＰについては１ｎＭ（ＰＢＳ（１に等しい）を用いた処置であった陰性コントロールに比較して１．５倍の増加）であり、ＩＮＧＡＰ−Ｐについては８３５ｎＭ（陰性コントロールに比較して１．８倍の増加）であることを証明した。これらをまとめると、この倍率変化はハムスター管外植片およびＡＲＩＰ細胞に関する以前のデータと一致していた（Ｒａｆａｅｌｏｆｆ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，９９：２１００−２１０９）。類似の有糸分裂促進作用は、陽性コントロールとして使用されたＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、１．４９倍の増加）およびエキセンジン４（１０μΜ、１．５６倍の増加）を用いた場合に観察された（図１Ａ）。
【０１１１】
ＢｒｄＵ取り込みの増加は、ｒ−ＩＮＧＡＰもしくはＩＮＧＡＰ−Ｐいずれかの添加１〜１５分後に観察されたＥｒｋ１／２の急速な一時的活性化と一致していた（図１Ｂ、Ｃ）。注目すべきことに、ＥＧＦおよびＥｘ−４は、より長時間持続するＥｒｋ１／２活性化を生成すると思われたが（図１Ｃ）、これはこれらの因子とＩＮＧＡＰにより活性化されるシグナル伝達経路に差があることを示唆している。これらの結果は、タンパク質およびペプチドが類似の方法で作用するが、モル効率には差（少なくとも１６７倍の差）があることを証明した。効率における類似の差は、分化した膵島由来管様構造から機能的ヒト膵島のインビトロ再生のモデルを使用した１５−ｍｅｒペプチドとｒＩＮＧＡＰタンパク質との間（Ａｓｓｏｕｌｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，６９：１−８）およびＨＰＤＥ細胞内（Ｂｅａｔｒｉｃｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ａｓｓｏｕｌｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．Ｒ．，Ｉｓｌｅｔ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＮＧＡＰ）  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．７０ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．２００９）で観察されたことに留意されたい。この現象についての最も可能性の高い説明は、ＩＮＧＡＰタンパク質およびＩＮＧＡＰ−Ｐは細胞表面と様々に相互作用する、および／または異なるシグナル伝達経路を活性化することにある。
【０１１２】
ＩＮＧＡＰ−１９およびＩＮＧＡＰ−１９ＣペプチドもまたＲＩＮｍ５Ｆ細胞内でのＥｒｋ１／２活性化を誘導することが証明されており、どちらもＩＮＧＡＰ−ＰもしくはＩＮＧＡＰ−ＰＣより有効であった（図２３）。
【０１１３】
（実施例２）
ｒ−ＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ１０２−１２０結合ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞は細胞表面上でクラスター様複合体を形成するが、他方ＩＮＧＡＰ１０４−１１８は細胞質内へ急速に内在化する。
ＩＮＧＡＰがどのようにしてＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞に結合してその中に内在化するのかを決定するために、本発明者らは蛍光反応性色素であるＤｙＬｉｇｈｔ４８８（緑色）および−５９４（赤色）ならびに５−ＦＡＭ標識ＩＮＧＡＰ−Ｐで標識したｒ−ＩＮＧＡＰを使用した。図１０に示したように、５０ｎＭのＤｙＬｉｇｈｔ４８８  ｒ−ＩＮＧＡＰはＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞の細胞表面に数分間以内に結合し、細胞表面上で小さなクラスターおよびパッチを形成したが、これは他のリガンドについて記載された膜多重タンパク質複合体の架橋結合に似ている。これは３７℃および氷上の両方で観察され、高親和性受容体結合を示唆している。これは、カベオリンおよびクラスリン媒介エンドサイトーシスについての陽性マーカーとして使用されたコレラ毒素（ＣＴＢ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４）およびトランスフェリン（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって示された相同染色とは異なる（図２（Ａ）、（Ｂ））。内在化の第１徴候は１５分後に観察されたが（図１０、１１）、このタンパク質は、１時間以内に内在化するトランスフェリンおよびＣＴＢとは異なり（図２（Ｃ）、（Ｄ））、数時間にわたり細胞表面上でクラスター化したままで留まると思われた（図２（Ｃ）〜（Ｅ）、図１１）。５時間のインキュベーション後、蛍光標識の大部分は細胞の内側で見られ（図２（Ｅ））、部分的にリソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄ）と共在していた。２４時間後、全標識ｒＩＮＧＡＰは内在化して部分的ではあるがリソソームと結び付くと思われ、細胞表面へのそれ以上の結合を示さなかった（図２（Ｆ））。結果は、ＩＮＧＡＰ１０２−１２０についても類似であった（図１９）。
【０１１４】
興味深いことに、追跡実験では、細胞を１時間だけＤｙＬｉｇｈｔ４８８  ｒＩＮＧＡＰに曝露させ、続いて洗浄し、５もしくは２４時間にわたりｒＩＮＧＡＰを伴わずに培養を実施すると、内在化ｒＩＮＧＡＰの量は連続インキュベーション後より有意に低くはなかった（図１２）。これは、大多数のＩＮＧＡＰ受容体は１時間以内にむしろ急速にリガンド結合すること、および受容体代謝回転時間はおそらく２４時間を越えることを示唆した。
【０１１５】
ｒＩＮＧＡＰとＣＴＢもしくはトランスフェリンとの間の共遊走の欠如は、ｒＩＮＧＡＰがクラスリン媒介もしくはカベオリン媒介経路のいずれによっても内在化されないことを示唆している。これは、ｒＩＮＧＡＰとの共局在を示していない（図１１）、クラスリンおよびカベオリンについての免疫染色の結果と一致している。本発明者らは、これらのデータをｒＩＮＧＡＰ内在化より迅速に発生するクラスリン媒介（クロルプロマジン、ダンシルカダベリン）もしくはカベオリン媒介エンドサイトーシス（フィリピン、およびβ−メチルシクロデキストリン）ならびにダイナソア（Ｄｙｎａｓｏｒｅ）（ダイナミンインヒビター）について観察された細胞毒性に起因するこれらの薬物の特定インヒビターを用いてこれらのデータを検証することはできなかった。しかし本発明者らは、ｒＩＮＧＡＰ内在化はウォルトマンニン（液相ピノサイトーシスおよびＰＩ３Ｋ）およびサイトカラシンＤ（アクチン重合のインヒビター）によって阻害されたことを証明しており、これはマクロピノサイトーシスがｒＩＮＧＡＰエンドサイトーシスにとっての主要機序であることを示唆している。
【０１１６】
ｒ−ＩＮＧＡＰおよびＩＮＧＡＰ１０２−１２０とは対照的に、ＦＡＭ標識ＩＮＧＡＰ１０４−１１８の蓄積もしくはクラスター化は細胞表面上で観察されなかった（図４）。これらの結果は、１５−ｍｅｒペプチドは細胞膜に結合するとすぐに内在化されることを示した。標識ペプチドは、ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞の細胞質内で５分間のインキュベーション後に視認でき、３０分後にはプラトーに到達した（図４）。図４（Ｃ）から明らかなように、ＩＮＧＡＰ−Ｐは３０分後に早期エンドソームと共局在し、その後は徐々にリソソーム区画内に移動し、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄと共局在すると思われる（図４（Ｄ）、（Ｆ））。
【０１１７】
細胞結合および内在化の動力学における差とは別に、タンパク質とペプチドと間の幾つかの他の差が観察されている。例えば、内在化ＩＮＧＡＰ−Ｐは、連続的および「追いかけ」インキュベーションを行う２４時間実験において証明されたように、迅速に分解すると思われる（図１３）。さらに、ＩＮＧＡＰ−Ｐの内在化は、氷上で、またはカベオラインヒビターフィリピンとのプレインキュベーションによって阻害されたが（図１４）、これはこのプロセスがカベオラ／脂質ラフトエンドサイトーシスによって媒介される可能性があることを示唆している。クラスリン依存性エンドサイトーシスのインヒビター（クロルプロマジン、ダンシルカダベリン）は有意な作用を有していなかった（図示していない）。他方、ＩＮＧＡＰ−Ｐ内在化はサイトカラシンＤとの１５分間のプレインキュベーションによって阻害され、結果として細胞表面上の小クラスターの形成を生じさせた（図５（Ｃ））。これは、アクチン線維がＩＮＧＡＰ−Ｐ内在化のプロセスに包含されることを示唆している。しかし、ウォルトマンニンはこのプロセスに阻害作用を有するとは思われなかったので、これはマクロピノサイトーシスである可能性は低い（図５（Ｄ））。
【０１１８】
ｒＩＮＧＡＰ、ＩＮＧＡＰ１０２−１２０およびＩＮＧＡＰ１０４−１１８が同一受容体を介して作用するかどうかを調査するために、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８−ｒＩＮＧＡＰおよびＦＡＭ−ＩＮＧＡＰ１０２−１２０もしくはＩＮＧＡＰ１０４−１１８を２０倍モル過剰の非標識タンパク質もしくはペプチドを用いた競合実験において使用した。結果は、タンパク質の内在化が未標識タンパク質によって部分的に阻害され、ペプチドの内在化は未標識ペプチドによって部分的に阻害されたが、それらは試験した濃度では相互に阻害するとは思われなかった（図６）。この結果は、タンパク質およびペプチドが同一受容体に結合できないことを示唆している。
【０１１９】
（実施例３）
Ｅｒｋ１／２の活性化
１９−ｍｅｒの拡張ペプチド（１９−ｍｅｒのｓｅｑ（配列番号）１、ｓｅｑ２およびｓｅｑ３、表１を参照）および１５−ｍｅｒのＩＮＧＡＰ−Ｐペプチド（表１を参照）の効力を比較するために、Ｅｒｋ１／２活性化をＲＩＮｍ５Ｆ細胞において測定した。結果は図１８に示した。図１８に提示したデータは、１９−ｍｅｒのｓｅｑ３は、同一濃度で試験した場合に、１５−ｍｅｒのＩＮＧＡＰ−Ｐペプチドおよび二つの他の１９−ｍｅｒ配列に比較して、ＲＩＮ細胞内でＥｒｋ１／２活性化において３倍以上強力であったことを示している。１９−ｍｅｒのｓｅｑ３は１０倍濃度での１５−ｍｅｒペプチドより１倍濃度で２．５倍以上強力であったが、これは１９−ｍｅｒのｓｅｑ３ペプチドがより高い効率を有することを示唆した。
【０１２０】
Ｅｒｋ１／２の活性化は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）または様々なクラスのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によって細胞膜レベルで開始された多数のシグナル伝達カスケードによって媒介される可能性がある。これらのシグナル伝達カスケードには、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＰＩ３ＫもしくはＲａｓ／Ｒａｆ依存性経路が含まれる。ＩＮＧＡＰ受容体の性質は知られていないが、本発明者らは、ＲＴＫおよびＧＰＣＲ開始シグナル伝達事象についてホスホ特異的抗体および上述の経路の薬理学的インヒビターを用いてスクリーニングした。比較のために、本発明者らは、指示した濃度でＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞に対して有糸分裂促進性であると見いだされたＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＥｘ−４（１０ｎΜ）を使用した（図１Ａ）。ＥＧＦは古典的ＲＴＫ経路を通してシグナル伝達し、Ｅｘ−４はＧタンパク質共役ＧＬＰ−１受容体のアゴニストであるので、そのような比較はＩＮＧＡＰがどのように機能するのかについての重要な手掛かりを提供する可能性がある。
【０１２１】
低分子量ＲａｓファミリーＧＴＰａｓｅｓの活性化は、例えばＥＧＦＲなどのＲＴＫを通してのシグナル伝達における最初の重要な事象である。しかし、ＧＰＣＲによるＭＡＰキナーゼ活性化の機序はさらにＧＰＣＲとＲＴＫとの間のクロストーク、例えばＧＬＰ−１を含む数種のＧＰＣＲリガンドについて証明されたＥＧＦＲトランス活性化によるＲａｓ活性化も含む可能性がある。この考えと一致して、本発明者らの結果は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫ経路と関係しているＥｒｋ１／２リン酸化（図１Ｂ、Ｃ）およびｃ−Ｒａｆ（図７Ｂ）のタイムラインと一致して、ＩＮＧＡＰ−ＰおよびｒＩＮＧＡＰ両方による迅速なＲａｓ活性化を証明している（図７Ａ）。
【０１２２】
Ｒａｓ活性化に加えて、本発明者らは、Ｅｒｋ１／２の活性化に比較して遅延した、ＩＮＧＡＰ−Ｐを用いた処置３０分後のＡｋｔリン酸化の増加を観察した（図１５）。これは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の活性化は匹敵するがＩＮＧＡＰ−ＰによるＥｒｋ１／２リン酸化の原因ではないことを示唆した。ｒＩＮＧＡＰもまたＡｋｔリン酸化をわずかに上昇させると思われたが、この変化は有意ではなかった。図１５に示したように、Ａｋｔの最強の活性化はＥｘ−４によって誘導されたが、これは早期の時点に観察され、また別のラットインスリノーマ細胞系におけるＧＬＰ−１シグナル伝達に関するデータと一致していた（Ｂｕｔｅａｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４２，８５６−８６４）。Ａｋｔの早期の活性化もまたＥＧＦ処置後に観察されたが、明白な二次ピークは３時間後であった。まとめると、これらの結果は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−Ｅｒｋ活性化の上流のシグナル伝達事象はＩＮＧＡＰ−ＰとｒＩＮＧＡＰとの間で変動する可能性があり、Ｅｘ−４およびＥＧＦによって誘導されるシグナル伝達事象とは異なる可能性が高いことを示す。注目すべきことに、本発明者らは、タンパク質もしくはペプチドいずれかによるｐ３８  ＭＡＰＫ（ウエスタンブロット）、またはＰＫＡ（ＥＬＩＳＡ）、またはＰＫＣ（ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ）いずれの有意な活性化も観察しなかった（図示していない）。
【０１２３】
ＩＮＧＡＰ誘導性増殖に関係するシグナル伝達事象を調査するために、本発明者らは、Ｒａｆ（Ｒａｆインヒビター１）、ＰＩ３Ｋ（ウォルトマンニン）、ＰＫＣ（Ｂｉｓ）、ＰＫＡ（Ｈ８９、ＰＫｉ）、アデニル酸シクラーゼ（ＳＱ２２５３６）、Ｓｒｃ（ＰＰ２）およびＥＧＦＲ（ＡＧ１４７８）の特異的薬理学的インヒビターを使用した。さらに、百日咳毒素（Ｐｔｘ）を使用して、ＩＮＧＡＰ作用がＧＰＣＲによって媒介されたのかどうかを試験した。これらのインヒビターの有効性は、ＩＮＧＡＰもしくはＥＧＦもしくはＥｘ−４を用いた処置１０分後のＥｒｋ１／２リン酸化および２４時間後のＢｒｄＵ組み込みによって判定した。
【０１２４】
図８Ａに示したように、Ｅｒｋ１／２のＩＮＧＡＰ誘導性活性化はＰｔｘへの２４時間の曝露後に４０％まで阻害されたが、ＡＧ１４７８による影響は受けなかった（図８Ｂ）。これは、ＩＮＧＡＰがおそらくＧＰＣＲを通してシグナル伝達するが、ＧＬＰ−１について以前に証明されているように、このシグナル伝達がＥＧＦ受容体を包含していないことを示唆している（Ｂｕｔｅａｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２，１２４−１３２）。ＰｔｘもまたＩＮＧＡＰもしくはＥＧＦもしくはＥｘ４により誘導される早期Ｒａｓ活性化を阻害したが（図９）、これはさらにＩＮＧＡＰがＧＰＣＲ−Ｒａｓ経路を介してシグナル伝達するという見解を支持する。Ｒａｓ−Ｒａｆシグナル伝達の以前の密接な関係付けと一致して、Ｒａｆキナーゼインヒビター１を用いた前処置は１０分後のＥｒｋ１／２活性化（図８Ｂ）および試験した全成長因子によって誘導された２４時間後のＢｒｄＵ取り込み（図１６）のどちらも減少させた。興味深いことに、ＳｒｃインヒビターＰＰ２は、ｒ−ＩＮＧＡＰによって刺激されたがＩＮＧＡＰ−Ｐによっては刺激されなかったＥｒｋ１／２リン酸化（図８Ｂ）および増殖（図１６）の両方を阻害したが、これはさらにタンパク質とペプチドとの間のシグナル伝達における差を強調している。
【０１２５】
Ｅｒｋ１／２の予想された阻害およびＰＤ９８０５９によるＢｒｄＵの取り込みとは別に、試験した他のインヒビター（ＰＫＣ、ＰＩ３ＫまたはＰＫＡ）はいずれもＥｒｋ１／２リン酸化を有意に減少させなかった。以下で考察する２４時間後にｒＩＮＧＡＰ処置細胞におけるＢｒｄＵ組み込みにおける減少を誘発するＨ８９（ＰＫＡインヒビター）を除いて、他の群では増殖の阻害は観察されなかった（図１６）。本発明者らの早期のデータは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達をヒト脱分化管様構造からのＩＮＧＡＰ−Ｐ誘導性膵島新生に明白に関係付けている（Ｊａｍａｌ．，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，１２，７０２−７１２）。この経路は、ラット新生児膵島にＩＮＧＡＰ−Ｐが及ぼす作用も媒介すると思われる（Ｂａｒｂｏｓａ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９９，２９９−３０６）。さらに、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達はＲｅｇタンパク質にとって最も一般的な経路であると思われる（Ｔａｋａｓａｗａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５８０，５８５−５９１；Ｂｉｓｈｎｕｐｕｒｉ，Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３０，１３７−１４９）。これに関連して、ＩＮＧＡＰ−ＰもしくはｒＩＮＧＡＰいずれかの有糸分裂促進作用におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の関与を全く示していない本発明者らのデータは、驚くべきことであるように見える。しかし本発明者らは、３０分間にわたりＩＮＧＡＰ−Ｐを用いて処置した細胞内での１〜１５分間後のＲａｓ−Ｒａｆ−Ｅｒｋ活性化におけるピークを追跡するＡｋｔリン酸化を観察した。
【０１２６】
Ｅｒｋ１／２データとは対照的に、ＰＫＡ（Ｈ８９）のインヒビターはｒＩＮＧＡＰ処置細胞内へのＢｒｄＵ取り込みを減少させた（図１６）。ＧＰＣＲシグナル伝達におけるｃＡＭＰ依存性ＰＫＡが果たす公知の役割およびＩＮＧＡＰ−Ｐが後根神経節における神経突起成長に及ぼす刺激作用にこの経路を関係付けた以前の結果（Ｔａｍ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１７，１８９−１９３）を前提に、本発明者らは、ＩＮＧＡＰ誘導性増殖におけるこの経路の潜在的関係を試験するために追加の実験を実施した。本発明者らはさらに、より特異的なＰＫＡインヒビターであるＰＫｉ（Ｍｕｒｒａｙ，Ａ．Ｉ，２００８，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．，１，ｒｅ４）およびアデニル酸シクラーゼの特異的インヒビターであるＳＱ２２５３６がＥｒｋ１／２リン酸化に及ぼす作用を試験した。図８Ａに示したように、ＰＫｉ（１００μΜ）は作用を有さず、ＳＱ２２５３６（２００ｎＭ）はＩＮＧＡＰ−ＰもしくはｒＩＮＧＡＰいずれかによって誘導されたＥｒｋ１／２リン酸化を減少させなかっただけではなく、わずかにそれを増加させさえした。
【０１２７】
本発明者らの結果は、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路がＩＮＧＡＰシグナル伝達に関係していないことを示唆している。これに関連して、ＩＮＧＡＰが実際にＧＰＣＲを通してシグナル伝達する場合は、この受容体は、アデニル酸シクラーゼを阻害する能力を有するＧｉタンパク質に結合する可能性が高い（Ｌｕｔｔｒｅｌｌ，Ｌ．Ｍ．，２００２，Ｃａｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，８０，３７５−３８２）。
【０１２８】
これらをまとめると、本明細書に提示した結果は、ＩＮＧＡＰ−ＰおよびｒＩＮＧＡＰの両方がＲａｓ−Ｒａｆ−Ｅｒｋ経路を活性化することによりＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞内での増殖を刺激することを証明している。ＩＮＧＡＰ−ＰおよびｒＩＮＧＡＰはどちらも、ｃＡＭＰの活性化を誘導しないＧｉタンパク質共役受容体を介して作用する可能性が高い。
【０１２９】
（実施例４）
ＩＮＧＡＰペプチドの安定性試験
血清の存在下でのＩＮＧＡＰ−ＰおよびＩＮＧＡＰ−１９ペプチドの分解プロファイルを決定した（図２０）。５０μΜのペプチドは、指示した時間にわたり、２５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをＨＰＬＣによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、ＨＰＬＣプロファイルを図示したようにスーパーインポーズした。
【０１３０】
ＦＢＳ中のＩＮＧＡＰ−ＰＣおよびＩＮＧＡＰ−１９Ｃペプチドのインビトロインキュベーションの時間的経過試験も実施した（図２１）。５０μΜのＩＮＧＡＰ−ＰＣおよびＩＮＧＡＰ−１９Ｃは、指示した時間にわたり、２５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをＨＰＬＣによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、図示したようにＨＰＬＣプロファイルをスーパーインポーズした。血清の存在下では４８時間にわたりＩＮＧＡＰ−１９Ｃについては分解が観察されないことを見て取ることができる（図２１Ｂ）。試験したＩＮＧＡＰペプチド中、ＩＮＧＡＰ−１９Ｃは最高安定性を示した。
【０１３１】
実験方法
組み換えＩＮＧＡＰタンパク質およびＩＮＧＡＰペプチド
ＩＮＧＡＰタンパク質の１５アミノ酸フラグメント（アミノ酸１０４〜１１８）およびＩＮＧＡＰタンパク質の１９アミノ酸フラグメント（アミノ酸１０２〜１２０）を合成し、Ｓｈｅｌｄｏｎバイオテクノロジーセンター（ＭｃＧｉｌｌ大学、モントリオール）でＨＰＬＣ精製した。Ｃ末端６−Ｈｉｓタグ（分子量１７．６ｋＤａ）を含有する全長組み換えＩＮＧＡＰ（ｒ−ＩＮＧＡＰ）は、ハムスター膵臓組織から、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴおよびＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のディレクショナルクローニングによってｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内へクローニングした。この構築体をレンチウイルスベクター内への再クローニングに使用し、Ｈ２９３細胞内で（Ａｓｓｏｕｌｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，６９：１−８に記載されているように）発現させた。ｒ−ＩＮＧＡＰの精製はコバルト樹脂（ＢＤ  ＴＡＬＯＮ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｍ）、Ｍｅｒｃｋ社）を使用して、（Ａｓｓｏｕｌｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，６９：１−８）に記載されたように実施した。
【０１３２】
細胞培養
ＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞（第１８継代）はＡＴＣＣから購入し、２５ｍＭのグルコース、１０％のＦＢＳ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）および抗生物質／抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、３７℃／５％ＣＯ２で維持した。実験は第２５〜３１継代からの細胞上で実施した。細胞は６０ｍｍ組織培養皿中に蒔種し（１×１０６細胞／培養皿）、２４〜４８時間増殖させ、その後にＩＮＧＡＰタンパク質もしくはペプチドを用いた処置に先立って、２４時間にわたり血清を除去した。ＩＮＧＡＰ−Ｐ（１５−ｍｅｒペプチド）、ＩＮＧＡＰ−Ｐ２（１９−ｍｅｒペプチド）、ｒＩＮＧＡＰおよびＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社）を指示した時間にわたり血清無含有培地中に投与した。
【０１３３】
ＢｒｄＵ免疫染色による細胞増殖の評価
８ウエルもしくは４ウエルのチャンバースライド（５×１０４もしくは１×１０５細胞／ウエル）内に蒔種した細胞を２４時間にわたりＩＮＧＡＰ、ＥＧＦもしくはＥｘ４を用いて上述したように処置し、５０μΜのＢｒｄＵを処置の最後の３時間の間7に加えた。細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃のメタノール中で１０分間固定した。ＢｒｄＵについての免疫染色は製造業者のプロトコールにしたがってマウス抗ＢｒｄＵ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して実施した。これに続いて二次ＨＲＰ結合抗体（広域スペクトル、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ（商標）−Ｐｌｕｓ）およびＡＥＣ色原体（どちらもＺｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて検出を実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。ＢｒｄＵ陽性核および陰性核を計数し（全２００個／ウエル）ＢｒｄＵ陽性核のパーセンテージを計算した（図３６）。
【０１３４】
ウエスタンブロット分析
処置後、細胞を氷上に置き、ＰＢＳで洗浄し、２．５ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４および完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠（Ｒｏｃｈｅ社）を含有する溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、マサチューセッツ州ビバリー）中に溶解させた。同等量のタンパク質（２０〜５０μｇ、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて測定）を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解させ、その後にニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）上に９０分間かけて２５０ｍＡでトランスファーさせ、様々な抗体を用いて分析した。抗Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰＫ４４／４２）および抗ホスホＥｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から購入した。一次抗体インキュベーション後、ブロットを洗浄し、次に二次抗マウスもしくは抗ウサギＨＲＰ共役抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）中でインキュベートし、洗浄し、ＥＣＬシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して展開させた。同一プロット上での数種のタンパク質の発現を分析するために、膜を最初はホスホ抗体とともにインキュベートし、次にストリッピングし（０．２Ｍグリシン、０．１％のＳＤＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ２．２）その後に対応する非ホスホ一次抗体を用いてプロービングした。
【０１３５】
蛍光ｒＩＮＧＡＰ、ＩＮＧＡＰ１０２−１２０およびＩＮＧＡＰ１０４−１１８の視認
１００μｇのｒＩＮＧＡＰを取扱説明書に規定されたようにＤｙＬｉｇｈｔ４８８またはＤｙＬｉｇｈｔ５９４（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて標識した。ＩＮＧＡＰ１０２−１２０およびＩＮＧＡＰ１０４−１１８は、Ｓｈｅｌｄｏｎバイオテクノロジーセンター（ＭｃＧｉｌｌ大学、モントリオール）またはＣａｎｐｅｐｔｉｄｅ社（ケベック州ポイント・クレア）での合成中に５−ＦＡＭまたはＦＩＴＣのいずれかを用いて標識した。蛍光ｒＩＮＧＡＰ（５０ｎＭ）もしくはＩＮＧＡＰ１０２−１２０およびＩＮＧＡＰ１０４−１１８（８．３５〜１６．７μΜ）をガラス製チャンバースライド内で増殖させたＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞に加え（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社またはＬａｂ−Ｔｅｋ社）、その後に様々な間隔でＰＢＳを用いて洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。スライドは、核の対比染色のためにＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ培地（Ｖｅｃｔｏｒ社）またはＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄを使用してマウントし、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０またはＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０ｉ下で試験した。ライブ共焦点イメージングのために細胞はＮｕｎｃ（商標）チャンバーカバーグラススライド（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）内で増殖させた。核は、ＩＮＧＡＰとのインキュベーション前に０．０１％のＤＡＰＩを用いて染色し、その後に洗浄した。ライブ画像撮影は３７℃および５％のＣＯ２で実施した。
【０１３６】
統計的分析
実験は、少なくとも三回繰り返した。結果は、平均値±ＳＥＭとして表示した。統計的分析は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて実施した。＜０．０５のｐ値を有意と見なした。
【０１３７】
（実施例５）
１５Ｌ  ＩＮＧＡＰと１５Ｃ  ＩＮＧＡＰの比較
方法：細胞の蒔種および処置
全ＦＢＳ含有培地をＲＩＮｍ５Ｆ細胞のプレートから吸引し、培地を洗い流すために、１０ｍＬのＰＢＳをピペットでプレート内に注入する。ＰＢＳを吸引し、６００μＬのトリプシンをプレート内にピペットで注入する。トリプシンが全てを被覆するのを保証するためにプレートを傾ける。８ｍＬのＦＢＳ含有培地をプレートに加え、次に培地と細胞の混合物を１５ｍＬ試験管内に収集する。細胞密度を決定するために、顕微鏡下で血球計を使用して細胞とトリパンブルーの１：１希釈液を使用して細胞を計数する。５×１０５細胞／プレートの所望の細胞密度を得るために各プレート内で所望とされる細胞量を計算し、細胞を１６〜３５ｍｍプレート内に蒔種する。細胞を３日間にわたり３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートする。処置前２４時間にわたり細胞を血清飢餓にさせるために培地を血清含有培地からＦＢＳ無含有培地へ切り換える。十六枚のプレートを処置する。
ａ．  １５Ｃ  ＩＮＧＡＰを備える四枚のプレート
ｂ．  １５Ｌ  ＩＮＧＡＰを備える四枚のプレート
ｃ．  ＦＢＳを備える四枚のプレート
ｄ．  Ｈ２Ｏを備える四枚のプレート
プレートを４８時間インキュベートし、細胞を各プレートからトリプシン処理により収集し、各サンプルを固有のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ内に入れる。
【０１３８】
細胞生存性アッセイ
細胞生存性アッセイは、１サンプルからの５μＬの細胞を１０ｍＬの細胞計数機の塩溶液とバイアル内で混合することによって実施した。バイアルをプローブの内側に配置する。細胞計数機は、生細胞の数を計数する。他の細胞サンプル全部を用いて細胞計数を繰り返し、１サンプル当たり二回の個別計数を実施する。細胞計数を全タンパク質に正規化するために、以下に示すようなＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを実施する。結果は下記の表１Ａ〜Ｃに示した。
【０１３９】
【表１Ａ】
2016508509.tif 000004
【０１４０】
【表１Ｂ】
2016508509.tif 000005
【０１４１】
【表１Ｃ】
2016508509.tif 000006
【０１４２】
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ
細胞計数を全タンパク質に正規化するために、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを実施した。サンプルを遠心分離し、培地を吸引し、試験管１本当たり１ｍＬのＰＢＳを用いて繰り返し、再度遠心した。ＰＢＳを吸引し、２００μＬのＲＩＰＡ溶解バッファーと置換した。遠心分離を４℃の室内で繰り返した。ＲＩＰＡ溶解バッファー中に溶解させた５μＬの８種の「標準」濃度のＢＳＡをピペットで９６ウエルの第１の三本のカラム内に注入したが（各濃度について三回ずつ）、最終濃度は溶解バッファーだけを含有するブランクであった。これらを後に計数目的に使用する。各タンパク質サンプル二本を遠心分離した。約２ｍＬのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットからの２ｍＬの溶液Ａおよび同様にこのキットからの４０μＬ溶液Ｓと一緒に混合することによって調製した。２５μＬのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬をピペットによって各ウエル内に入れた。キットからの２００μＬの溶液Ｂを各ウエル内に入れた。これらの溶液を一緒に混合する（確実に気泡が存在しないようにする）ためにプレートを１０分間撹拌し、各サンプルの吸光度を計算するためにリーダー内に入れる。結果として生じる数値をスプレッドシートに入力した。標準曲線は、既に公知の標準物質の濃度（ｘ値）およびそれらの吸光度値（ｙ値）を使用して作成した。最も適合する線の式を使用して、それらの吸光度値を当てはめることによってサンプルの濃度を代数的に計算した。
【０１４３】
ＢｒｄＵ免疫染色による細胞増殖の評価
細胞を三枚の８ウエルチャンバースライド（１×１０５細胞／ウエル）内に蒔種し、１５Ｃ  ＩＮＧＡＰ、１５Ｌ  ＩＮＧＡＰ、水またはＦＢＳを用いて処置し、一晩インキュベートし、５０μΜのＢｒｄＵを処置の最後の３時間の間に加えた。細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃で１０分間、メタノール中で固定した。ＢｒｄＵについての免疫染色は製造業者のプロトコールにしたがってマウス抗ＢｒｄＵ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して実施した。これに続いて二次ＨＲＰ共役抗体（広域スペクトル、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ（商標）−Ｐｌｕｓ）およびＡＥＣ色原体（どちらもＺｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて検出を実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。ＢｒｄＵ陽性核および陰性核を計数し（ウエルあたり総計２００個）、ＢｒｄＵ陽性核のパーセンテージを計算した。結果は下記の表２Ａ〜Ｃに示した。
【０１４４】
【表２Ａ】
2016508509.tif 000007
【０１４５】
【表２Ｂ】
2016508509.tif 000008
【０１４６】
【表２Ｃ】
2016508509.tif 000009
【０１４７】
ウエスタンブロット分析
ホスホ−ＥＲＫついてのウエスタンブロット、続き
細胞の蒔種および処置工程後に、十六枚のプレートを様々な処置で様々な時間にわたり処置した。
ａ．  二枚のプレートの１０×１５Ｃ  ＩＮＧＡＰを５分間放置する。
ｂ．  二枚のプレートの１０×１５Ｃ  ＩＮＧＡＰを１０分間放置する。
ｃ．  二枚のプレートの１０×１５Ｃ  ＩＮＧＡＰを３０分間放置する。
ｄ．  二枚のプレートの１０×１５Ｃ  ＩＮＧＡＰを６０分間放置する。
ｅ．  二枚のプレートの１０×１５Ｌ  ＩＮＧＡＰを５分間放置する。
ｆ．  二枚のプレートの１０×１５Ｌ  ＩＮＧＡＰを１０分間放置する。
ｇ．  二枚のプレートの１０×１５Ｌ  ＩＮＧＡＰを３０分間放置する。
ｈ．  二枚のプレートの１０×１５Ｌ  ＩＮＧＡＰを６０分間放置する。
【０１４８】
インキュベーション後、プレートから全てのＩＮＧＡＰ処置が確実に除去されるように、低温ＰＢＳを用いてプレートを２回洗浄した。細胞は、２００μＬのＲＩＰＡ溶解バッファーを各プレートに加えることによって溶解させ、確実に完全溶解させるためにおよそ２０分間にわたり振とう機上に置いた。タンパク質サンプルは、ピペットを使用してエッペンドルフチューブ内に収集し、４℃の室内で２０分間、１６．１×１，０００ｒｐｍで遠心した。結果生じた上清を新しい試験管に移し、各サンプル中のタンパク質の濃度を決定するためにＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを実施した。各ウエルのゲル内に計１５μｇをローディングする場合に必要とされる量のタンパク質を溶解させる。サンプルをローディングバッファーと組み合わせ、１００℃で５分間で加熱し、ラダーに沿って１０ウエルを２〜１０％アクリルアミドゲル内に入れ、５０分間、または青色タンパク質の最前部が底部から突出するまで２００Ｖでランする。二重トランスファーサンドイッチを使用して、１時間にわたり０．３Ａでトランスファーを実行することによってタンパク質をゲルから陽荷電ニトロセルロース膜上にトランスファーさせた。これは既にランしたタンパク質をゲル物質から膜上へトランスファーさせる。膜を透明容器に置き、５％のＢＳＡ  ＴＢＳＴバッファー中に１時間浸漬することにより非特異的タンパク質をブロッキングし、この時間Ｔ中はそれを振とう機上に配置した。
【０１４９】
ブロッキング溶液を除去し、膜は一次抗体溶液（１０ｍＬの５％のＢＳＡ  ＴＢＳＴ中のリン酸化ＥＲＫに結合する１０μＬのウサギ抗ホスホーＥＲＫ抗体）中に残留させ、４℃の室内で一晩攪拌し続けた。一次抗体を除去し、膜を〜１０ｍＬの１×ＴＢＳＴバッファーを用いて洗浄し、１０分間にわたり振とう機上に配置した。洗浄を三回繰り返した。膜は次に、室温の振とう機上で１時間、二次抗体溶液（１：１，０００の希釈係数を生じさせる、１０ｍＬの５％のＢＳＡ  ＴＢＳＴ中で一次抗体に共役する１０μＬのヤギ抗ウサギ抗体）中に置いた。これはタンパク質が化学発光を発光することを誘発するので、機械を使用すると可視化できる。膜は、二次抗体を用いて二回処理した。膜を５分間にわたり１ｍＬのＥＣＬ溶液で被覆し、リン酸化ＥＲＫを視認できるｃｈｅｍｉ−ｄｏｃ機内へ配置した。コンピュータープログラムＩｍａｇｅ  Ｌａｂを使用して、ゲル上のホスホ−ＥＲＫのバンドを定量した。
【０１５０】
ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＥＲＫの定量後、ＥＣＬ溶液を除去するためにＴＢＳＴを用いて膜を洗浄し、抗体プロセスはウサギ抗ホスホ−ＥＲＫの代わりに一次抗体としてウサギ抗ＥＲＫを用いて、ホスホ−ＥＲＫの代わりに全ＥＲＫを定量することを目標に繰り返し、全三回のウエスタンブロット試験を実施した。結果は下記の表３Ａ〜Ｃに示した。
【０１５１】
【表３Ａ】
2016508509.tif 000010
【０１５２】
【表３Ｂ】
2016508509.tif 000011
【０１５３】
【表３Ｃ】
2016508509.tif 000012
【０１５４】
本開示を特定実施形態と結び付けて記載してきたが、さらに改変することが可能であり、本出願は、本開示が関係する当該分野内の公知もしくは慣習的実践の範囲内に含まれ、本明細書の上記に規定した必須の特徴に適用できるように、および添付の特許請求の範囲内に含まれるように、一般に本開示の原理にしたがっている、本開示からの逸脱を含む本開示のあらゆる変化、使用または適応を含むことが意図されていることは理解されるであろう。
【０１５５】
他に規定されない限り、または状況が明白に他のことを指令しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者であれば一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と類似もしくは同等のあらゆる方法および材料が本発明の実践もしくは試験において使用できることを理解されたい。
【０１５６】
本明細書で言及した全ての文献および参考文献の内容は、これにより全体として参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
2016508509.tif 000013
【図１Ｂ】
2016508509.tif 000014
【図１Ｃ】
2016508509.tif 000015
【図２】
2016508509.tif 000016
【図３Ａ】
2016508509.tif 000017
【図３Ｂ】
2016508509.tif 000018
【図３Ｃ】
2016508509.tif 000019
【図３Ｄ】
2016508509.tif 000020
【図４】
2016508509.tif 000021
【図５Ａ】
2016508509.tif 000022
【図５Ｂ】
2016508509.tif 000023
【図５Ｃ】
2016508509.tif 000024
【図５Ｄ】
2016508509.tif 000025
【図６Ａ】
2016508509.tif 000026
【図６Ｂ】
2016508509.tif 000027
【図６Ｃ】
2016508509.tif 000028
【図６Ｄ】
2016508509.tif 000029
【図６Ｅ】
2016508509.tif 000030
【図６Ｆ】
2016508509.tif 000031
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2016508509.tif 000090
2016508509.tif 000091