(57)【要約】ナノスケールのテクスチャー加工表面上に未分化多能性細胞を整列させることにより、心筋細胞集団を調製するデバイスおよび方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹状のマイクロテクスチャー加工表面上に幹細胞を整列させることにより調製される、心筋細胞の単離集団。
【請求項２】
心室心筋細胞を含む、請求項１に記載の単離集団。
【請求項３】
心室心筋細胞および心室線維芽細胞を含む、請求項１に記載の単離集団。
【請求項４】
心室心筋細胞および心室線維芽細胞を、１：０、１：１、２：１、および１：２からなる群から選択される比で含む、請求項３に記載の単離集団。
【請求項５】
前記凹状の表面が、バルーンの内部表面である、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項６】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項７】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項５に記載の単離集団。
【請求項８】
前記集団が、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項９】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項５に記載の単離集団。
【請求項１０】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項６に記載の単離集団。
【請求項１１】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項１２】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項５に記載の単離集団。
【請求項１３】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項６に記載の単離集団。
【請求項１４】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項７に記載の単離集団。
【請求項１５】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項８に記載の単離集団。
【請求項１６】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項９に記載の単離集団。
【請求項１７】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項１０に記載の単離集団。
【請求項１８】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項１９】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞のうちの１種または複数である、請求項５に記載の単離集団。
【請求項２０】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項６に記載の単離集団。
【請求項２１】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項７に記載の単離集団。
【請求項２２】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項８に記載の単離集団。
【請求項２３】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項９に記載の単離集団。
【請求項２４】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１０に記載の単離集団。
【請求項２５】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１１に記載の単離集団。
【請求項２６】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１２に記載の単離集団。
【請求項２７】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１３に記載の単離集団。
【請求項２８】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１４に記載の単離集団。
【請求項２９】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１５に記載の単離集団。
【請求項３０】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１６に記載の単離集団。
【請求項３１】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１７に記載の単離集団。
【請求項３２】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項５に記載の単離集団。
【請求項３４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項６に記載の単離集団。
【請求項３５】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項７に記載の単離集団。
【請求項３６】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項８に記載の単離集団。
【請求項３７】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項９に記載の単離集団。
【請求項３８】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１０に記載の単離集団。
【請求項３９】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１１に記載の単離集団。
【請求項４０】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１２に記載の単離集団。
【請求項４１】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１３に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１４に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１５に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１６に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１７に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１８に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１９に記載の単離集団。
【請求項３４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項２０に記載の単離集団。
【請求項３５】
複数の整列した心筋細胞を調製する方法であって、幹細胞を、凹状のマイクロテクスチャー加工表面上で、該幹細胞が心筋細胞へと分化するのに適する条件下で培養するステップと、これにより複数の整列した心筋細胞を調製するステップとを含む、方法。
【請求項３６】
前記幹細胞を前記テクスチャー加工表面上で培養するステップの前に、熱可塑性材料をプラズマで処理するステップと、処理された熱可塑性材料を収縮させて、テクスチャー加工表面を得るステップと、ソフトリソグラフィーを使用して足場に該テクスチャー加工表面を複製して、該足場上にテクスチャー加工表面を作製するステップと、該足場に圧力をかけて該表面を凹状にするステップとを含む方法により、前記テクスチャー加工表面を調製するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記熱可塑性材料を、前記プラズマで５分間処理する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記熱可塑性材料の一方の面だけを、前記プラズマで処理する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記プラズマが、酸素プラズマである、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記整列した心筋細胞が、心室心筋細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記整列した心筋細胞が、心室心筋細胞である、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記整列した心室心筋細胞が、異方性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記整列した心室心筋細胞が、異方性である、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記整列した心室心筋細胞が、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記整列した心室心筋細胞が、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記整列した心室心筋細胞の平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記凹状の表面が、バルーンの内部表面である、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記凹状の表面が、バルーンの内部表面である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる２０１３年１月２３日出願の米国仮出願第６１／７５５，８７１号に対する利益を主張する。
【０００２】
連邦政府による支援を受けた研究または開発についての記載
本発明は、米国国立保健研究所のＦａｃｕｌｔｙ  Ｃｏｒｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｎｔ  Ｃｏｕｎｃｉｌによる政府支援である助成金ＧＲＦ１０３５４４およびＴＢＲＳ  Ｔ２３−７０６／１１によってなされた。したがって、米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
心室細動（ＶＦ：ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）は、成人における突然死の最も一般的な原因であり、心不全患者は特にＶＦを起こしやすい。ＶＦの発生は、細胞内誘因（例えば、活動電位の延長、早期後脱分極および遅延後脱分極）と多細胞のリエントリー事象（ｍｕｌｔｉ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｅｎｔｒａｎｔ  ｅｖｅｎｔ）（例えば、スパイラルウェーブリエントリー）の両方を必要とする。ｈＥＳＣなどのヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、高効率で心臓細胞系に誘導できることから、細胞ベースの心筋修復のための将来性のある無制限の心筋細胞（ＣＭ）供給源をもたらす。
【０００４】
しかし、それらの機能的な有効性および安全性は、それらの催不整脈性に関して十分に評価されていない。実際、ｈＥＳＣ−ＣＭは、単一細胞レベルでは機能的に未成熟であることが公知であることから、それ自体、多細胞調製物中で不整脈基質として用いられる可能性がある。
【０００５】
天然の心臓において、心室（Ｖ）ＣＭは、協調的で指向性の電気活動および収縮活動のために電気シグナルの伝導が異方性（すなわち、非対称性であり、横方向の速度と縦方向の速度とが異なる）となるように高度に組織化された様式で並んでいる。これに対し、胚様体（ＥＢ）形成または分化誘導を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化させたｈＥＳＣ−ＣＭクラスターは、組織化がランダムであり、等方性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、より異方性の電気シグナルを発生させ、より協調的で指向性の電気活動および収縮活動を有するＣＭへと分化させる技術を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、収縮フィルムのマイクログルーブ技術を使用して、整列したｈＥＳＣ−ＶＣＭ調製物のシートを作製し、それに続き高分解能光学マッピング記録を作成して、それらの活動電位（ＡＰ：ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）特性および伝導速度（ＣＶ：ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）特性を詳細に検討しうることを裏付けるデータを提供する。これらの結果は、優れた機能的有効性および安全性を有するＰＳＣ由来移植片をデザインすること、および疾患のモデル化および催不整脈性のスクリーニングのために、正確なヒト心臓アッセイをデザインすることの基盤となる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を心筋細胞に増殖および／または分化させるための方法であって、細胞を物理的に整列させ、機能的な異方性をもたらし、リエントリー性不整脈に対する感受性を小さくする方法を提供する。重要なことは、このような調製物が、天然の心臓の組織化をより良好に模倣し、これにより、より正確なモデルとして用いられることである。細胞集団の異種性は最小限であり、例えば、細胞型の異種性は５０％未満である。集団は、テクスチャー加工表面を有する基板上の幹細胞またはその派生体により調製され、この場合、テクスチャー加工表面は、本明細書で記載される方法により調製される。一態様では、細胞を培養する前に、テクスチャー加工表面を、細胞外マトリックスで処理する。一態様では、方法は、細胞を基板から取り外すステップをさらに含む。さらには、基板上の方法により作製される細胞集団、またはその代わりに、基板から取り外された細胞集団も提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、複数の整列した心筋細胞を調製する方法であって、該方法は、幹細胞を、テクスチャー加工表面上で、幹細胞が心筋細胞へと分化するのに適する条件下で培養するステップと、これにより複数の整列した心筋細胞を調製するステップとを含み、ここで熱可塑性材料をプラズマで処理するステップと、処理された熱可塑性材料を収縮させて、テクスチャー加工表面を得るステップと、ソフトリソグラフィーを使用して足場にテクスチャー加工表面を複製して、足場上にテクスチャー加工表面を作製するステップとを含む調製法により、テクスチャー加工表面を調製する方法が提供される。
【００１０】
一態様では、方法は、幹細胞をテクスチャー加工表面上で培養するステップの前に、テクスチャー加工表面を、調製法により調製するステップをさらに含む。一態様では、熱可塑性材料を、約３および１５分間の間、または約４分間および１０分間の間、約４分間および８分間の間、もしくは約５分間にわたりプラズマで処理する。
【００１１】
一態様では、熱可塑性材料の一方の面だけを、プラズマで処理する一方、他方の面はプラズマで処理しない。一態様では、プラズマは、酸素プラズマである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、凹状のマイクロテクスチャー加工（ｍｉｃｒｏ−ｔｅｘｔｕｒｅｄ）表面上に幹細胞を整列させることにより調製される、心筋細胞の単離集団が提供される。いくつかの態様では、集団は、心室心筋細胞（ＶＣＭ）を含む。いくつかの態様では、集団は、心室心筋細胞および心室線維芽細胞を含む。一態様では、集団は、ＶＣＭ：線維芽細胞を、１：０、１：１、２：１、および１：２から選択される群の比で含む。
【００１３】
いくつかの態様では、テクスチャー加工表面は凹状であり、例えばチャンバーまたはバルーンの内部などである。このような三次元構造は、マイクロテクスチャーに加えて、例えば心室心筋細胞などへの幹細胞の所望の分化をさらに改善することが観察されている。いくつかの態様では、凹状のテクスチャー加工表面は、水平方向にフラットな縁辺部を有する。いくつかの態様では、縁辺部は、丸型または卵型である。いくつかの態様では、凹状のテクスチャー加工表面は、球面のうちの少なくとも約１０％、または球面のうちの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％を含む。いくつかの態様では、凹状の表面は、チャンバーまたはバルーンの一部である。いくつかの態様では、凹部の半径は、少なくとも約１ｃｍ、または２ｃｍ、５ｃｍ、１０ｃｍ、または約１００ｃｍ、５０ｃｍ、２０ｃｍ、１０ｃｍ、もしくは５ｃｍ以下である。
【００１４】
一態様では、微細加工されたデバイスは、チャンバー作製時の接触ガイドキュー（ｃｏｎｔａｃｔ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｃｕｅｓ）を設置するために、プラズマ処理でマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される。
【００１５】
一態様では、複数の細胞が、マイクロテクスチャー加工表面から取り外される。
【００１６】
一態様では、整列した心筋細胞または細胞集団は、心室心筋細胞である。一態様では、整列した心室心筋細胞は、異方性である。
【００１７】
一態様では、整列した細胞または細胞集団は、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒もしくは約２．５〜約３．５ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒もしくは約２〜約７ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する。一態様では、整列した細胞または細胞集団の平均異方性比（ＡＲ）は、約０．５〜１．５である。
【００１８】
一態様では、本発明で使用されるプラズマは、酸素プラズマ、ヘリウムプラズマ、または水素プラズマのうちの１種または複数である。
【００１９】
方法で使用される供給源細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。一態様では、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。さらなる態様では、ｈＥＳＣは、ＨＥＳ２幹細胞系（ＮＩＨコード：ＥＳ０２）などの幹細胞系に由来する。細胞は、テクスチャー加工表面上で、フィーダー細胞不使用で、例えばフィーダー非含有で培養し、培養物が６５％を超える、またはその代わりに７０％を超える、またはその代わりに７５％を超える、またはその代わりに８０％を超える、またはその代わりに８５％を超える、またはその代わりに９０％を超える集密度に達したら継代培養する。培養培地は、少なくとも２日ごとに、またはその代わりに少なくとも毎日（１日間は約２２〜２６時間を含むことから、毎日とは、２２〜２６時間ごと、またはその代わりに少なくとも約２４時間ごとを意図する）交換する。次いで、細胞を、少量の培養物（細胞約５０〜１００個ずつ）へと分散させ、心筋細胞への分化を支持する分化培地中で培養する。このような分化培地の非限定的な例は、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（本明細書で記載される）であり、一態様では、本明細書で記載される通りに補充する。分化培地は、初期培養または分化培地の使用から計算される通り、約１８〜２０日目まで、２日ごとに、またはその代わりに少なくとも毎日（１日間は、約２２〜２６時間を含み、したがって、毎日は、２２〜２６時間ごと、またはその代わりに少なくとも約２４時間ごとを意図する）置きかえる。次いで、分化させた細胞は、解離させ、対照ポリエチレン基板上または整列した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングされたポリエチレン基板上に、少なくとも５日間、またはその代わりに少なくとも６日間、またはその代わりに少なくとも７日間、またはその代わりに少なくとも８日間、またはその代わりに少なくとも９日間にわたり播種して、細胞間の電気接点を確立する。
【００２０】
一態様では、細胞を培養し、分化させる前に、表面を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で処理する。複数のＥＣＭが当業界公知であり、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌとは、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞により分泌され、Ｃｕｌｔｒｅｘ  ＢＭＥの製品名の下に、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＴｒｅｖｉｇｅｎ  Ｉｎｃにより市販されている、ゼラチン状タンパク質混合物の商標名である。この混合物は、多くの組織中に見出される複雑な細胞外環境に酷似しており、細胞生物学者により、細胞培養基質として使用されている。実験室手順は、少量の冷却（４℃）したＭａｔｒｉｇｅｌを、プラスチック製の組織培養実験器具へと分散させる手順である。Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は、３７℃（体温）でインキュベートすると自己集合して、実験器具の表面を覆う薄膜を生成する。代替物は、ＰａｔｈＣｌｅａｒ（登録商標）Ｇｒａｄｅ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔの商標名の下に、ＡＭＳＢＩＯにより販売されている。また、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈもＥＣＭゲルを販売している。
【００２１】
任意の適切な方法を使用して、例えば、温度を（３２℃より低く）低下させることにより、細胞を解離させることができる。細胞は、温度の作用を受けると、無傷の膜タンパク質と共に放出される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６６７０号を参照されたい。
【００２２】
一態様では、細胞は、幹細胞由来心筋細胞、または胚性幹細胞、多能性細胞、ｉＰＳＣ、もしくは胚様体など、幹細胞または幹細胞由来細胞もしくは幹細胞から分化した細胞である。したがって、例えば心筋細胞に分化できる単離細胞を培養することによりテクスチャー加工表面上に細胞を整列させて調製された単層内中の、心筋細胞などの複数の派生細胞も提供される。一態様では、心筋細胞は、活動電位を保有する機能性を含むか、または有する。このような心筋細胞は、心筋細胞またはそれらが由来する幹細胞を特徴づけるのに有用な、それらの活動電位および伝導特性について測定することができる。
【００２３】
さらには、本明細書で記載される任意の方法により基板上で調製された、またはその代わりにそこから取り外された心筋細胞などの細胞の単層も提供される。細胞は、実質的に同種の場合もあり、異種の場合もある。好ましい異種集団は、約１：０、１：１、２：１、または１：２のｈＥＳＣ−ＶＣＭ：線維芽細胞の群である。
【００２４】
開示される方法は、生理学的機能性を改善するために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のアラインメントおよびｈＥＳＣ由来幹細胞、例えばｈＥＳＣ由来心筋細胞（ｈＥＳＣ−ＣＭ）のアライメントを誘導するのに有効な、十分に制御されたマルチスケールの（ナノまたはマイクロ）グルーブを作製する。
【００２５】
方法は、細胞を成長させる任意の特定の方法または基質の構成に限定されない。加えて、最適化されたパラメータまたは特定のパラメータを、例えば、ランダムな構造的アライメントを有するベースラインの等方性オルガノイドと比較してそれらの電気機械的機能を検討するために、３Ｄシステム（異方性オルガノイドまたは「小型心室」を作製する、細胞アライメントおよびマトリックスアライメント）へと変換することもできる。オルガノイドの形状条件および境界条件を制御することにより、ランダムな（等方性の）細胞配向性および整列した（異方性の）細胞配向性をもたらすことができる。最適なｈＥＳＣ−ＶＣＭの成熟に、異方性レベルのより微細な制御が必要な場合、チャンバー制作時の接触ガイドキューを設置するために、グルーブ付き表面特徴を有する新規開発のテクスチャー加工されたバルーンを使用して、細胞およびコラーゲンマトリックスのアライメントを調節することも可能な場合がある。二次元構造および三次元構造を、広範囲の虚血状態（５％のＯ２環境内で培養することによる）または他の実験条件（生理学的条件または病理学的条件を模倣する）に晒した後、結果生じる機能的な変化を検討することもできる。それらの不整脈に対する感受性の変化には、特に注意を払うことができる。
【００２６】
例を目的として述べると、プレストレスを加えたポリエチレン（ＰＥ）を単軸収縮させて、自己相似整列グルーブまたは「リンクル」を作製する。
【００２７】
プラズマ処理の前に、材料にプレストレスを加えることができる。材料にプレストレスを加えると、応力を除去することにより、収縮を達成することができる。別の態様では、材料にプレストレスを加えた場合でもそうでない場合でも、材料を加熱することにより収縮が達成される。さらなる態様では、プラズマ処理の後で収縮を実施する。
【００２８】
いくつかの態様では、収縮は、単軸収縮または二軸収縮である。いくつかの態様では、少なくとも６０％以上材料を収縮させる。
【００２９】
本技術を実施するのに適する熱可塑性材料としては、これらに限定されないが、高分子量ポリマー、ポリオレフィン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、アクリル、セルロイド、酢酸セルロース、エチレン−酢酸ビニル（ＥＶＡ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、フッ素プラスチック（ＰＴＦＥ；ＦＥＰ、ＰＦＡ、ＣＴＦＥ、ＥＣＴＦＥ、ＥＴＦＥを含む）、イオノマーであるカイデックス（ｋｙｄｅｘ）、商標登録されたアクリル／ＰＶＣ合金、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリアセタール（ＰＯＭまたはアセタール）、ポリアクリレート（アクリル）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮまたはアクリロニトリル）、ポリアミド（ＰＡまたはナイロン）、ポリアミド−イミド（ＰＡＩ）、ポリアリールエーテルケトン（ＰＡＥＫまたはケトン）、ポリブタジエン（ＰＢＤ）、ポリブチレン（ＰＢ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート（ＰＣＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリケトン（ＰＫ）、ポリエステルポリエチレン（ＰＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホンポリエチレンクロリネート（ＰＥＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリフタルアミド（ＰＰＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）またはスペクトラロンが挙げられる。一態様では、熱可塑性材料は、ポリオレフィンを含む。別の態様では、熱可塑性材料は、ポリエチレンを含む。
【００３０】
プラズマで処理された熱可塑性の収縮材料は、「マスター」鋳型をもたらし、次いで、これを使用して、マイクロテクスチャー加工された細胞培養プレート、表面、またはデバイスをもたらし、細胞を培養する。
【００３１】
テクスチャー加工されたマイクロ表面は、グルーブ間距離とそれぞれ個別のグルーブ深度を有する実質的に整列したリンクルまたはグルーブを有しており、ここで上記グルーブ深度は、それぞれ独立して、約０．１、または１．０もしくは１０．０ｍｍ（ならびにこれらの間の範囲、例えば、約０．１〜約１０．０ｍｍ、または約０．５〜約５．０、または約０．７〜約１．３、または約０．１〜約１．０、または約１．０〜約１０．０ｍｍ、およびこれらの間の０．１ｍｍの増分）である。基板の剛性は、約０．５〜約１５０ｋＰａ、または約１．０〜約１００ｋＰａ、または約５０〜約１００ｋＰａ；または約１．０〜約１０ｋＰＡ；または約１．０ｋＰａ、または約１０ｋＰａまたは約１００ｋＰａである。
【００３２】
方法および構成を使用して、候補薬剤を基板上に整列した細胞と接触させ、細胞に対する薬剤の効果（存在する場合）をモニタリングすることにより、幹細胞の分化を調節し、実行するそれらの能力について候補薬剤をスクリーニングすることができる。本明細書では、細胞を成長させ、スクリーニングを実施するキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ−Ｈ】ｈＥＳＣの心室特異化およびリンクルを付けた基板の特徴付けを示す図である。Ａ）心室表現型を指し示す、代表的なＡＰ波形である。ＬＶ−ＭＬＣ２ｖ−ＧＦＰの形質導入後における、Ｂ）ＭＬＣ２ｖ発現およびＣ）ＧＦＰ発現による陽性染色を示す図である。Ｄ）フローサイトメトリーにより、派生細胞のうちの約９５％がＴｎＴ陽性であったことを指し示す図である。ＥおよびＦ）心室様ＡＰ表現型、心房様ＡＰ表現型、およびペースメーカー様ＡＰ表現型の百分率分布を示す円グラフである。Ｇ）収縮フィルム加工のために、プレストレスを加えたポリエチレンフィルムを、例えば、５分間にわたり酸素プラズマで処理する。次いで、プラズマで処理されたフィルムの裏面を拘束し、１５０℃で３．５分間にわたり収縮させることを示す図である。Ｈ）０、２、５、１０、および１５分間にわたりプラズマで処理された対照基板およびリンクル付けた基板（それぞれ、Ｐ０〜Ｐ１５）についてのＳＥＭ画像（１，０００倍）およびＡＦＭ画像（３０×３０μｍ２）を示す図である。また、平均リンクル高さおよび波長も示される。
【図２Ａ−Ｄ】非整列対照基板上の、ｈＥＳＣ−ＶＣＭの活動電位および伝導特性を示す図である。Ａ）１Ｈｚでのペーシング時の、２つの異なる部位における、代表的なＡＰを示す図である。Ｂ）優先的な指向性がなく点刺激（白丸）したときの、光学的にマッピングされた膜電位の円形伝播パターンを示す、１２ミリ秒間隔の典型的な等時線図である。Ｃ）ＡＰの速度適応を示す図である。Ｄ）ペーシング周期への伝導速度の依存性を示す図である。データは、６つの試料の６０カ所の部位から回収した。＊ｐ＜０．０１。
【図３Ａ−Ｅ】細胞アライメントの効果を示す図である。Ａ）多様な整列基板（Ｐ２、Ｐ５、Ｐ１０、およびＰ１５）についての、典型的な１６ミリ秒間隔の等時線図である。両端矢印は、リンクル付けた基板の主軸の縦方向を指し示す。異なる基板の横方向伝導速度（Ｂ）または縦方向伝導速度（Ｃ）とＡＰＤ９０（Ｄ）との積により、横方向波長および縦方向波長（Ｅ）がもたらされる。＊ｐ＜０．０１、縦方向対横方向。
【図４Ａ−Ｅ】アライメントにより異方性が再現され、リエントリー性不整脈の発生率が低減されることを示す図である。Ａ）被験基板の異方性比を示す図であり、Ｂ）自発性（白）リエントリー性不整脈およびＰＥＳ誘導性（黒）リエントリー性不整脈の発生率を示す図であり、Ｃ）代表的なＭＡＰを示す図であり、Ｄ）ＡＰ持続時間回復曲線を示す図であり、Ｅ）対照ｈＥＳＣ−ＶＣＭおよびＰ５  ｈＥＳＣ−ＶＣＭについての、ＡＰＤＲの最大傾きを示す図である。＊ｐ＜０．０１。
【図５Ａ−Ｂ】リエントリー性不整脈を示す画像を含む図である。Ａ）定常状態ペーシング時において、またはＢ）ＰＥＳにより誘導されたペーシング時において、自発的に生じた、スパイラルウェーブの形態の、持続的な機能的リエントリーについての代表的な等時線図である。キラリティーは、赤色（＋：時計回り）の矢印および黄色（−：反時計回り）の矢印により示す。
【図６Ａ−Ｇ】イソプロテレノールの、対照ｈＥＳＣ−ＶＣＭ（Ａ〜Ｃ）およびＰ５整列ｈＥＳＣ−ＶＣＭ（Ｄ、Ｅ）に対する効果を示す図である。イソプロテレノールは、ＣＶ（Ｇ）および脱分極（立ち上がり）速度を増大させながら、ＡＰ持続時間（Ｆ）を短縮する。対照単層（Ａ）に対する時空異質性は、０．５μＭのイソプロテレノール（Ｂ）により大きく増進される。対照基板（Ｃ）上では、０．５μＭのイソプロテレノールによりリエントリー性不整脈が誘導された。等時線図（Ｄ〜Ｅ）上で示される伝導速度の増大にもかかわらず、イソプロテレノールにより誘導される時空異質性の増進は、整列基板により大きく低減される。白丸は、刺激部位を指し示す。データは、平均±ＳＤとして示し、＊は、表示されたバーの間の有意差を表示する（ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本明細書で用いられるある種の用語は、以下の定義された意味を有しうる。
【００３５】
明細書および請求の範囲において使用される通り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によりそうでないことが指示されない限り、複数形の指示を含む。
【００３６】
本明細書で用いられる「含む」という用語は、組成物および方法は列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するものとする。組成物および方法を規定する場合に使用される「から本質的になる」は、意図される目的に使用される場合の組合せに対して、任意の本質的な意義を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で規定される要素から本質的になる組成物は、微量の汚染物質または不活性の担体を除外しないと予想される。「〜からなる」は、他の成分による微量を超える要素および意図されたデバイスを調製するための他の実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これら各々の移行句により規定される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３７】
範囲を含む全ての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、０．１の増分で（＋）または（−）に変化する近似値である。常に明示的に言明されるわけではないが、全ての数値表示には、「約」という用語を先行させることを理解されたい。常に明示的に言明されるわけではないがまた、本明細書で記載される試薬は、例示的に過ぎないものであり、このような試薬の同等物が当業界公知であることも理解されたい。
【００３８】
当業者により理解される通り、ありとあらゆる目的に関して、特に書面による説明を提供するという観点で、本明細書で開示される全ての範囲は、ありとあらゆる可能な部分範囲とその部分範囲の組合せも包含する。任意の列挙された範囲は、その同じ範囲が少なくとも均等な２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分割されることを十分に述べており、そのようなことが可能であると容易に認識することができる。非限定的な例としては、本明細書で論じられる各範囲は、下位の３分の１の範囲、中位の３分の１の範囲、および上位の３分の１の範囲等へとたやすく分割することができる。また、当業者により理解される通り、「最大で」、「少なくとも」、「〜を超える」、「〜未満」など、全ての言い回しは、列挙された数を含み、続いて上記で論じた部分範囲に分割されうる範囲を指す。
【００３９】
「熱可塑性材料」は、加熱時、または延伸により生じる応力などのプレストレスの解除時に収縮する可塑性材料を意味することが意図される。一態様では、熱可塑性材料とは、歪みを起こさずに一様に収縮する材料である。収縮は、二軸収縮（等方性）または単軸収縮（異方性）のいずれかであり得る。本発明の方法に組み入れるのに適する熱可塑性材料としては、例えば、ポリオレフィン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、アクリル、セルロイド、酢酸セルロース、エチレン−酢酸ビニル（ＥＶＡ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、フッ素プラスチック（ＰＴＦＥ；ＦＥＰ、ＰＦＡ、ＣＴＦＥ、ＥＣＴＦＥ、ＥＴＦＥを含む）、イオノマーであるカイデックス、商標登録されたアクリル／ＰＶＣ合金、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリアセタール（ＰＯＭまたはアセタール）、ポリアクリレート（アクリル）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮまたはアクリロニトリル）、ポリアミド（ＰＡまたはナイロン）、ポリアミド−イミド（ＰＡＩ）、ポリアリールエーテルケトン（ＰＡＥＫまたはケトン）、ポリブタジエン（ＰＢＤ）、ポリブチレン（ＰＢ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート（ＰＣＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリケトン（ＰＫ）、ポリエステルポリエチレン（ＰＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホンポリエチレンクロリネート（ＰＥＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリフタルアミド（ＰＰＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、およびスペクトラロンなどの高分子量ポリマーが挙げられる。
【００４０】
いくつかの態様では、熱可塑性材料は、ポリオレフィンを包含する。ポリオレフィンとは、単量体としての単純なオレフィン（アルケンとも呼ばれる）から作製されたポリマーである。例えば、ポリエチレンとは、オレフィンであるエチレンを重合化することにより作製されるポリオレフィンである。ポリプロピレンとは、オレフィンであるプロピレンから作製される、別の一般的なポリオレフィンである。
【００４１】
いくつかの態様では、熱可塑性材料は、形状記憶ポリマー（ＳＭＰ）を包含する。ＳＭＰとは、温度変化などの外部の刺激（誘因）により誘導されて、変形状態（一時的形状）から、それらの元の（恒久的）形状へと戻る能力を有する、高分子スマート材料である。
【００４２】
市販の熱可塑性材料としては、これらに限定されないが、「Ｓｈｒｉｎｋｙ−Ｄｉｎｋ」およびＳｏｌｕｐｏｒｅ（登録商標）などの多孔性フィルムが挙げられる。Ｓｈｒｉｎｋｙ−Ｄｉｎｋとは、小児用玩具に使用されている、市販の熱可塑性物質である。Ｓｏｌｕｐｏｒｅ（登録商標）は、Ｌｙｄａｌｌ，Ｉｎｃ．、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔから市販されている。
【００４３】
「ソフトリソグラフィー」は、当業界において一般に公知の技法を指すことが意図される。ソフトリソグラフィーでは、明確に規定されたパターンを含む転写表面を有する、スタンプ、鋳型、またはマスクなどのパターニングデバイスを、転写されるパターンを受容する受容材料または整合性材料と共に使用する。基板とパターニングデバイスの転写表面とを分子スケールで適合的に接触させることを含む材料加工により、マイクロサイズ構造およびナノサイズ構造が形成される。
【００４４】
「受容材料」という用語は、転写されるパターンを受容することが可能な材料を指すことが意図される。ある種の実施形態では、受容材料とは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのエラストマー材料で構成される、ソフトリソグラフィーで典型的に使用される整合性材料などの整合性材料である。熱可塑性の受容材料または熱可塑性材料は、例えばエッチング可能なことから受容材料でもある。
【００４５】
「インプリントリソグラフィー」は、当業界で一般に公知の技法を指すことが意図される。「インプリントリソグラフィー」は、典型的には、スタンプ、鋳型、またはマスクなどのパターニングデバイスを活用する三次元パターニング法を指す。
【００４６】
「鋳型」は、インプリントリソグラフィーの鋳型を意味することが意図される。
【００４７】
クローンとは、元の細胞、この場合は幹細胞と、遺伝子的に同一な細胞系である。「クローン増殖」は、１つの細胞が２つの同一な娘細胞および／または同一細胞集団に連続的に分裂することによる細胞集団の成長を指す。
【００４８】
「増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）」という用語は、細胞もしくは細胞集団を成長させたり、またはその表現型を変化させたりすることを意味する。「成長（ｇｒｏｗｉｎｇ）」という用語は、所望数の細胞または細胞型を得るのに必要な、支持培地、栄養物、成長因子、支持細胞、または任意の化学的または生物学的化合物の存在下で細胞が繁殖することを指す。一実施形態では、細胞の成長は、胚様体の再生をもたらす。いくつかの態様では、「成長」はまた、多能性細胞または幹細胞の、規定された系列の細胞への分化も意味する。
【００４９】
「培養」という用語は、細胞または生物の、多様な種類の培地上または培地中における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖を指す。培養物中で成長した細胞の子孫細胞は、親細胞と完全に同一（すなわち、形態的に、遺伝子的に、または表現型的に）ではない場合もあることが理解される。「増大させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」は、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる細胞の「系列」は、細胞、すなわち、その前駆細胞および子孫細胞の遺伝的形質を規定する。細胞の系列は、発生および分化の遺伝スキーム内で細胞を位置付ける。
【００５１】
「胚様体またはＥＢ」は、その後の分化を容易にする培養中に形成される胚性幹細胞の三次元（３Ｄ）凝集体である。ＥＳ細胞は、懸濁培養物中で成長させると、近位内胚葉の外層で取り囲まれた小型の細胞凝集体を形成する。ＥＢは、成長して分化すると、流体で満たされた空隙および外胚葉様細胞の内層を有する嚢胞性胚様体へと発生する。
【００５２】
細胞または細胞集団の派生体とは、単離細胞または細胞集団の娘細胞である。派生体は、増大させたクローン細胞、または単離された幹細胞または幹細胞集団から培養し、増殖した分化細胞を含む。派生体はまた、胚性幹細胞に由来する胚様体など、既に派生させた幹細胞または幹細胞集団も含む。
【００５３】
「分化」は、未分化細胞が心臓細胞、肝細胞、または筋細胞などの分化細胞の特色を獲得する過程を述べたものである。「分化誘導」は、分化を特定の細胞型へと誘導する、幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化」は、細胞が、細胞系列内のあまり分化が確定していない位置に戻ることを規定する。本明細書で用いられる「分化する、または分化した」という用語は、細胞系列内のより分化が確定した（「分化した」）位置に到達した細胞を規定する。本明細書で用いられる「中胚葉（または外胚葉もしくは内胚葉）系列へと分化する細胞」は、それぞれ、特異的な中胚葉系列、外胚葉系列、または内胚葉系列への分化が確定し始めている細胞を規定する。中胚葉系列へと分化するか、または特異的な中胚葉細胞をもたらす細胞の例は、脂質生成細胞、平滑筋原細胞、軟骨形成細胞、心臓形成細胞、皮膚形成細胞、造血細胞、血管形成細胞、筋原細胞、腎形成細胞、泌尿生殖器形成細胞、骨形成細胞、心膜形成細胞、または間質細胞である細胞を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
「実質的に同種」は、細胞の約５０％超、またはその代わりに約６０％超、またはその代わりに７０％超、またはその代わりに７５％超、またはその代わりに８０％超、またはその代わりに８５％超、またはその代わりに９０％超、またはその代わりに９５％超が同じまたは類似の表現型を有する細胞集団について記載する。表現型は、あらかじめ選択された細胞表面マーカーまたは他のマーカー、例えば、ミオシンもしくはアクチンにより決定することもでき、遺伝子もしくはタンパク質、例えば、カルシウム処理タンパク質、ｔ管タンパク質、またはその代わりに、カルシウムポンプタンパク質の発現により決定することもできる。別の態様では、実質的に同種の集団の発現は、野生型の対応する細胞または組織より減少している（例えば、発現の正常レベルの約９５％未満、またはその代わりに約９０％未満、またはその代わりに約８０％未満、またはその代わりに約７５％未満、またはその代わりに約７０％未満、またはその代わりに約６５％未満、またはその代わりに約６０％未満、またはその代わりに約５５％未満、またはその代わりに約５０％未満）。
【００５５】
細胞を成長させるための表面を調製するための方法
本明細書で記載される細胞を分化させるための方法では、テクスチャー加工された、すなわち生体適合性の表面を使用しており、本方法は、熱可塑性材料を収縮させるステップと、これにより材料上でテクスチャー加工表面を調製するステップとを含む、またはその代わりにこれから本質的になる、またはさらにはこれからなり、ここで該材料は、収縮の前または後にプラズマで処理される。このような方法が当業界公知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６６７０号；同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４６１２号；および同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４６１３号で記載されている。本明細書では、熱可塑性材料の例を開示する。
【００５６】
プラズマは、当業界公知の方法により準備でき、供給源の利用可能性に応じて変更できる。一実施形態では、プラズマは、酸素プラズマ、ヘリウムプラズマ、または水素プラズマのうちの１種または複数である。特定の実施形態では、プラズマは、酸素プラズマである。
【００５７】
プラズマ処理の持続時間は変更でき、例えば、テクスチャーおよび／または熱可塑性材料の所望されるスケールに依存しうる。一態様では、プラズマ処理には、約１０秒間超、またはその代わりに約２０秒間、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約７分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、または約３０分間超かかる。別の態様では、プラズマ処理には、約６０分間未満、またはその代わりに約４５分間、約３０分間、約２５分間、約２０分間、約１５分間、約１０分間、約７分間、約５分間、約４分間、約３分間、約２分間、約１分間、約３０秒間、または約２０秒間未満かかる。別の態様では、プラズマ処理は、約０．５分間〜最大３０分間の間の間隔、またはこの間の０．５分間隔（例えば、１．５分間、または２．０分間、または２．５分間）でなされる。いくつかの態様では、処理は、締め切られた室内で実行される。いくつかの態様では、処理は、携帯用のコロナ放電器内で実行する。
【００５８】
熱可塑性材料は、プラズマ処理の前または後に、プレストレスを加えることができる。このような場合には、応力を除去することにより、収縮を達成することができる。このような応力は単純に、単軸的または二軸的な引延ばしでありうる。
【００５９】
その代わりに、材料を加熱することにより収縮を達成することもできる。一態様では、プラズマで処理されたフィルムの両側を固定し、適切な温度（例えば、約１５０℃）で２分間、またはその代わりに約３分間、またはその代わりに約３．５分間、またはその代わりに約４．０分間、またはその代わりに約４．５分間、またはその代わりに約６分間以上にわたり収縮させる。テクスチャーの材料および所望されるスケールに応じて、温度を変更してもよい。一態様では、加熱は、少なくとも約１００℃、または少なくとも約１２５℃、または少なくとも約１５０℃、または少なくとも約１７５℃、または少なくとも約２００℃である。一態様では、加熱は、約１００〜約２００℃、またはその代わりに約１２５〜約１７５℃、または約１５０℃である。
【００６０】
材料の収縮は、単軸収縮または二軸収縮であってもよい。材料を単軸収縮させる場合、テクスチャーは一次元でありうる。材料を二軸収縮させる場合、テクスチャーは二次元でありうる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、材料を、その元のサイズから少なくとも約６０％、またはその代わりに少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％単軸収縮または二軸収縮させる。
【００６２】
ポリマー材料を処理し、収縮させた後、第２の高分子形状適合性材料（ｆｏｒｍ  ｃｏｎｆｏｒｍｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）のための鋳型として使用する。また「形状適合性材料」という用語は、転写されるパターンを受容することが可能な材料を指すことが意図され、これは「受容材料」と称される場合もある。ある種の実施形態では、このような材料としては、例えばソフトリソグラフィーで典型的に使用されるようなものが挙げられ、したがって、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ゼラチン、アガロース、ポリエチレングリコール、硝酸セルロース、ポリアクリルアミド、またはキトサンなどのエラストマー材料を含む。
【００６３】
形状適合性材料を使用して、鋳型からデバイスを作製するのに、ソフトリソグラフィーまたはインプリントリソグラフィーを使用することができる。鋳型成形またはリソグラフィーは、ソフトリソグラフィーまたはインプリントリソグラフィーなどの過程を含む、またはその代わりにこれから本質的になる、またはさらにはこれからなる。これらの方法は当業界公知であり、米国特許公開第２０１２／００６４６２７号；同第２０１１／０１２２４０６号；および同第２０１２／０１２９２０９号において開示されている。
【００６４】
形状適合性材料の例としては、これらに限定されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ゼラチン、アガロース、ポリエチレングリコール、硝酸セルロース、ポリアクリルアミド、およびキトサンのうちの１種または複数を含む材料が挙げられる。
【００６５】
一態様では、リソグラフィーは、熱可塑性材料を使用する。
【００６６】
一態様では、ＰＤＭＳなどのリソグラフィーにおいて使用される材料は、典型的なソフトリソグラフィーの場合と同様に鋳型として機能するプラズマ処理表面に注ぎ込まれ、摂氏１１０度で１０分間にわたり硬化させる。次いで、硬化させたＰＤＭＳデバイスを、鋳型から剥離させ、携帯用のコロナ放電器を使用して接着する（Ｈａｕｂｅｒｔ  Ｋ．ら（２００６）、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ、６：１５４８〜１５４９）。デバイスデザインの構想からデバイスの加工までの全過程は、数分間以内で完了させることができる。
【００６７】
一態様では、細胞を培養し、分化させる前に、表面を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で処理する。複数のＥＣＭが当業界公知であり、例えばＭａｔｒｉｇｅｌは、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞により分泌されたゼラチン状タンパク質混合物の商標名であり、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＴｒｅｖｉｇｅｎ  ＩｎｃからＣｕｌｔｒｅｘ  ＢＭＥという製品名で市販されている。この混合物は、多くの組織中に見出される複雑な細胞外環境と類似しており、細胞生物学者によって細胞培養基質として使用されている。一般的な実験室手順は、プラスチック製の組織培養実験器具に少量の冷却（４℃）したＭａｔｒｉｇｅｌを分配することである。Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は、３７℃（体温）でインキュベートすると自己集合して、実験器具の表面を覆う薄膜を生成する。代替物は、ＡＭＳＢＩＯによりＰａｔｈＣｌｅａｒ（登録商標）Ｇｒａｄｅ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔという商標名で販売されている。また、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈもＥＣＭゲルを販売している。
【００６８】
テクスチャー加工されたマイクロ表面は、グルーブ間距離とそれぞれ個別のグルーブ深度を有する実質的に整列したリンクルまたはグルーブを有しており、ここで上記グルーブ深度は、それぞれ独立して、約０．１、または１．０もしくは１０．０ｍｍ（ならびにこれらの間の範囲、例えば、約０．１〜約１０．０ｍｍ、または約０．５〜約５．０、または約０．７〜約１．３、または約０．１〜約１．０、または約１．０〜約１０．０ｍｍ、およびこれらの間の０．１ｍｍの増分）である。基板の剛性は、約０．５〜約１５０ｋＰａ、または約１．０〜約１００ｋＰａ、または約５０〜約１００ｋＰａ；または約１．０〜約１０ｋＰＡ；または約１．０ｋＰａ、または約１０ｋＰａまたは約１００ｋＰａである。
【００６９】
幹細胞または心筋細胞の整列および整列した細胞
本技術により調製されたテクスチャー加工表面は、細胞、特に幹細胞を整列させるのに使用でき、さらに胚性幹細胞を分化させるのに使用できる。一態様では、細胞は、ヒト胚性幹細胞、ｉＰＳＣ、または幹細胞由来心筋細胞である。したがってまた、テクスチャー加工表面上で細胞を整列させることにより調製された単層など、複数の心筋細胞も提供される。一態様では、複数の細胞は、実質的に同種である。
【００７０】
幹細胞は、フィーダー非含有条件下で培養することができ、培養物が例えば、約８０％の集密度に達したら継代培養する。幹細胞の培養培地は、毎日交換する。心室を特異化するために、幹細胞コロニーをディスパーゼ（例えば、１ｍｇ／ｍｌ）により小さなクラスター（細胞５０〜１００個）に解離させた後、分化培地中で培養することができる。分化培地は、例えば、サイトカインおよびＷｎｔ阻害剤が以下：１日目：ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）およびブレビスタチン（５μＭ）；２〜４．５日目：ヒト組換えＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）およびヒト組換えアクチビンＡ（５ｎｇ／ｍｌ）；４．５〜７日目：ＩＷＲ−１（１μＭ）のように補充された、約５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および約２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを含んでいてもよい。
【００７１】
分化培地は、１８〜２０日目まで毎日補給してもよく、その１８〜２０日目の時点で整列した細胞を解離させ、対照表面上またはテクスチャー加工表面上に７日間置き、電気記録の前に細胞間の電気的な接点を確立させる。
【００７２】
本明細書において、細胞を成長させる方法が説明され、さらに薬物スクリーニングのための該方法の使用も本明細書で説明される。
【００７３】
キット
本開示はまた、マイクロテクスチャー加工表面上に整列した細胞を培養するキットであって、熱可塑性材料と、形状適合性材料と、プラズマなどの関連材料と、細胞培養培地と、マイクロテクスチャー加工表面を作製し、細胞を培養し、分化させ、細胞を本明細書で提供される表面から取り外すための指示書とを含むキットも提供する。
【実施例】
【００７４】
実施例１
不整脈に対する安全性を増強するための物理的アライメントによる、ヒト胚性幹細胞由来心室心筋細胞の操作された異方性
本実施例は、マルチスケールのトポグラフィーによりｈＥＳＣ−ＶＣＭの物理的アライメントが可能になり、それによって機能的な異方性が再現されることを実証する。整列した異方性ｈＥＳＣ−ＶＣＭは、不整脈に対する感受性が小さく、有効性と安全性が改善された将来の移植可能なプロトタイプ、加えて催不整脈性スクリーニングのためのより正確なモデルをもたらす可能性がある。
【００７５】
材料および方法
ＨＥＳＣ培養物および心室の特異化
電気生理学的異質性は、持続的なリエントリーおよび不整脈に対する公知の寄与因子である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける心臓分化に由来する心室特異的亜型の混合に起因する不応性の分散を回避するため、本実施例では、改変心室特異化プロトコール（Ｋａｒａｋｉｋｅｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．、３（１）：１８〜３１、２０１４））を採用した。
【００７６】
改定プロトコールは、ＭＬＣ２ｖ−プロモーターによる転写制御下において、ＡＰ記録、トロポニンＴ（ＴｎＴ）陽性免疫染色、およびＧＦＰ発現で測定した場合、＞９５％のｈＥＳＣ−ＶＣＭを発生させる（図１Ａ〜Ｄ）。簡単に言えば、未分化ｈＥＳＣ（ＨＥＳ２系、ＮＩＨコード番号ＥＳ０２）を、フィーダー非含有条件下で培養し、培養物が約８０％の集密度に達したら継代培養した。幹細胞の培養培地（ｍＴｅＳＲ１；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を毎日交換した。心室を特異化するために、ｈＥＳＣコロニーをディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）により小さなクラスター（細胞５０〜１００個）に解離させた後、サイトカインおよびＷｎｔ阻害剤が以下：１日目：ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）およびブレビスタチン（５μＭ）；２〜４．５日目：ヒト組換えＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）およびヒト組換えアクチビンＡ（５ｎｇ／ｍｌ）；４．５〜７日目：ＩＷＲ−１（１μＭ）のように補充された分化培地（５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを含むＳｔｅｍＰｒｏ３４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。
【００７７】
分化培地を１８〜２０日目まで毎日補給し、その１８〜２０日目の時点でｈＥＳＣ−ＶＣＭを解離させ、対照基板上または整列したＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたポリエチレン基板上に７日間置き、電気記録の前に細胞間の電気的な接点を確立させた。構造的欠陥または形状的欠陥のない無傷の調製物だけを実験に使用した。
【００７８】
リンクル基板の製作および特徴付け
加工法は既に説明されている（Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．、２０１１、２３（４８）：５７８５〜９１）。簡単に言えば、プレストレスを加えたポリエチレン収縮フィルムを、酸素プラズマ（Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｅｐ  ＩＩ、ＳＰＩ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）で、２、５、１０、または１５分間処理して、Ｐ２基板、Ｐ５基板、Ｐ１０基板、およびＰ１５基板を作製した。次いで、プラズマで処理されたフィルムの両側を固定し、１５０℃で３分間にわたり収縮させて、マイクロリンクル付けたマスターを作製し、次いで、これを、ＰＤＭＳによるソフトリソグラフィーを使用して複製して、細胞アライメントを誘導するための基板をもたらした（図１Ｇ）。
【００７９】
走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）の両方を実施して、リンクルを特徴付けた（図１Ｈ）。ＳＥＭのために、リンクルを、４ｎｍの金でスパッターコーティングし（Ｐｏｌａｒｏｎ  ＳＣ７６２０）、１，０００倍の倍率で画像を得た（ＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ３Ｄ  ＦＥＧ）。自社製ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）高速フーリエ変換コードを使用してＳＥＭ画像を解析することにより、リンクルの波長を得た。ＡＦＭは、ＭＦＰ−３Ｄ倒立光学顕微鏡（Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）上で実施した。画像のトポグラフィーは、約７５ｋＨｚの先端部共鳴周波数および３Ｎ／ｍの力定数を用いたタッピングモードで撮影した。データの収集および解析は、ＩＧＯＲ  Ｐｒｏ  ６．０（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）により実施した。
【００８０】
光学マッピング
１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳからなる、ｐＨ７．４のタイロード液中、室温で２０分間にわたり、ＨＥＳＣ−ＶＣＭ調製物に、４μＭのジ−４−ＡＮＥＰＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）をロードし、次いで、２回にわたり洗浄してから、５１５±３５ｎｍのバンドパス励起光フィルターおよび５９０ｎｍのハイパス発光フィルターによりフィルタリングされたハロゲンライトを使用して、蛍光イメージングを行った。１０×１０ｍｍ２の視野をもたらすように、１倍の対物レンズおよび１倍の集光レンズを備えたＭｉＣａｍ  Ｕｌｔｉｍａ（ＳｃｉＭｅｄｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＡＰおよび伝導特性についての高分解能光学マッピングを実施した。特注の熱版を導入して、潅流されるタイロード液を、３７℃で維持した。データは、２００Ｈｚのサンプリング速度で回収し、ＢＶ＿Ａｎａソフトウェア（ＳｃｉＭｅｄｉａ）を使用して解析した。イソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＮＹ、ＵＳＡ）は、表示される濃度の潅流により適用した。
【００８１】
電気生理学
電気生理学プロトコールは、調製物表面に対して垂直に設置された単極点刺激電極を介して刺激（閾値の１．５倍で、持続時間を１０ミリ秒とする）を送達する、プログラム刺激装置（Ｍａｓｔｅｒ８；ＡＭＰＩ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用して作成した。定常状態ペーシングは、１．５〜２．０Ｈｚの周波数を賦与して、内因性調律に対する正の変時効果をオーバードライブする、イソプロテレノールの存在下を除き、０．５Ｈｚの速度で開始した。５秒間の休止を含んで毎分０．１Ｈｚずつの増分で周波数を増大させた。
【００８２】
マッピングは、各周波数の最後の５〜１０秒間に実施した。比を１：１とする単層が刺激を捕捉しない場合は、ペーシングを中止した。プログラム電気刺激：標準的な（Ｓ１−Ｓ２）プログラム電気刺激（ＰＥＳ：ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）プロトコールを導入して、ｈＥＳＣ−ＶＣＭの電気回復曲線（ＥＲＣ：ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｒｅｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を研究した。早期期外刺激（Ｓ２）は、８回にわたる一連のＳ１刺激の後で、基本サイクル長（ＢＣＬ）を６５０ミリ秒として送達した。Ｓ１−Ｓ２間隔は、６００ミリ秒で開始して、捕捉できなくなるまで、２０ミリ秒の段階で連続的に短縮した。次いで、Ｓ１−Ｓ２間隔を、１８ミリ秒ずつ増大させた後、その後、ＡＰの伝搬をもたらさない最大のＳ１−Ｓ２間隔として規定される有効不応期（ＥＲＰ）が達成されるまで、２ミリ秒増分で増大させた。各Ｓ２の後で、１０秒間にわたり休止した。刺激プロトコールの全体は、ジ−４−ＡＮＥＰＰＳによる染色後３０分間以内に実施した。
【００８３】
活動電位持続時間（ＡＰＤ：ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）および伝導速度など、標準的なパラメータについては、既に記載されている（Ｘｕｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００５、１１１（１）：１１〜２０；Ｔｓｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６、１１４（１０）：１０００〜１１）通りに解析した。ＡＰＤ回復（ＡＰＤＲ）曲線は、Ｓ１−Ｓ２間隔からＳ１の最後のＡＰＤ９０を差し引くことによって決定されるＳ２のＡＰＤ９０を、前述の拡張期（ＤＩ）に対してプロットすることにより作成した。回復曲線には、以下の単一指数関数式：
ｙ（ＡＰＤ９０）＝ｙ０＋Ａ１（１−ｅ（−ＤＩ／γ１））
［式中、Ａ１およびγ１は、当てはめのパラメータである］を当てはめた。ＥＲＣの最大傾き（Ｓｌｏｐｅｍａｘ）は、以下の式：
【数１】
2016505276.tif 000003
で規定される最小ＤＩ（ＤＩｍｉｎ）の関数である。
【００８４】
データは、平均値±ＳＤとして示した。スチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡ検定を採用し、Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【００８５】
結果
ｈＥＳＣ−ＶＣＭの２Ｄ調製物についての電気生理学
伝導および他の多細胞型特性について研究するため、単一のｈＥＳＣ−ＶＣＭを再凝集させ、高分解能光学マッピングのための２次元調製物（単層）を形成させた。図２Ａは、１Ｈｚで点刺激したときの、ｈＥＳＣ−ＶＣＭの典型的な２Ｄ調製物上で光学的にマッピングされたＡＰを示す。単極ペーシング電極に対して遠位の２つの部位（白丸）からマッピングされた、代表的なＡＰ波形は、同種の集団から予期される通り、それらの形態が互いに酷似することを示したが、系統的な時間的遅延（１８５ミリ秒／ｃｍ）が一貫して観察された。
【００８６】
図２Ｂは、同じ調製物についての伝導等時線図（間隔を１２ミリ秒とする）であって、平均伝導速度を５．０±１．４ｃｍ／秒（ｎ＝１６）とする、電極からの脱分極波面の遠心的伝搬（ｄＦ／ｄｔ）を実証する伝導等時線図を示す。しかし、伝播は、円形かつ等方性であり、任意選択の横方向（Ｔ−）および縦方向（Ｌ−）の伝導速度（ＣＶ）の測定により、１．０±０．２（ｎ＝１６）の異方性比（ＡＲ：ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ｒａｔｉｏ）が一貫してもたらされた。定常状態ペーシングの周波数を連続的に大きくすると、ＡＰＤ９０は短縮されることから（１．０Ｈｚ、１．２５Ｈｚ、１．５Ｈｚ、および２Ｈｚのとき、それぞれ、３７４±１６．８ミリ秒、３６２±２４．２ミリ秒、３３７±３９．３ミリ秒、および２６６±１７．０ミリ秒；図２Ｃ）、速度適応が指し示される。
【００８７】
同様に、ＣＶのサイクル長（すなわち、速度または周波数の逆数）に対する速度依存性も観察された（図２Ｄ）。ＣＶとＡＰＤとの積として計算された波長（ＷＬ）は、１．０Ｈｚで１．８±０．５ｃｍであった。
【００８８】
ｈＥＳＣ−ＶＣＭの物理的アライメントは、異方性特性をもたらす
次に、本実施例では、物理的に整列させたｈＥＳＣ−ＶＣＭの機能的帰結について検討した。対照調製物による円形の伝導パターンと異なり、Ｐ５整列調製物によるＡＰの伝搬は、１Ｈｚのときの、横方向（３．１±０．６ｃｍ／秒、ｎ＝１４）の伝導速度と縦方向（５．４±１．４ｃｍ／秒、ｎ＝１４）の伝導速度とが異なる楕円形状を表し、１．８のＡＲをもたらした（図３Ａ〜Ｃ）。このアライメント誘導性ＡＲは、天然の心室のＡＲと同等であった。
【００８９】
したがって、後続の実験では、Ｐ５調製物に焦点を当てた。Ｐ２整列調製物、Ｐ１０整列調製物、およびＰ１５整列調製物についても、同様の卵型の異方性パターンが観察された。ＡＲは、グルーブの形状に依存していた。本実施例では、Ｐ１０およびＰ１５においてこの効果のプラトーが観察された（図４Ａ）。また、被験周波数のうちのいずれにおいても、対照（Ｐ０）調製物および全ての整列した調製物（すなわち、Ｐ２、Ｐ５、およびＰ１０）の間で、ＡＰＤ９０の統計学的差違は観察されなかった（図３Ｄ）。対照と比較して、Ｐ５整列基板上、Ｐ１０整列基板上、およびＰ１５整列基板上の横方向に沿って伝搬するＷＬは、有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図３Ｅ）。
【００９０】
整列した異方性ｈＥＳＣ−ＶＣＭは、リエントリー性不整脈の発生率の低減を表した
１．５〜２．０Ｈｚでの定常状態ペーシング時において、１６例の対照調製物のうちの６例（すなわち、３７．５％）が、回転持続時間を９３８±１８４ミリ秒（ｎ＝１０）とし、速度を１．１±０．２Ｈｚとする細動の単位事象または根源事象であるスパイラルウェーブ形態（図５Ａ）の自発性で持続的な機能的リエントリー（図４Ｂ、白色バー）を表した。自発性リエントリー性不整脈を示さなかった調製物は、標準的（Ｓ１−Ｓ２）ＰＥＳプロトコールを使用して、それらの不整脈の誘導可能性についてさらに調べた（図５Ｂ）。残りの１０例の対照のうち、４例（すなわち、全体のうちの２５％；図４Ｂ、黒色バー）で、機能的リエントリーを誘導することに成功することが可能であった。したがって、全ての対照調製物のうちの６２．５％は、自発性リエントリー性不整脈または誘導性リエントリー性不整脈に対して感受性であった。持続的なリエントリーを呈示しなかった５例の対照調製物について、ＡＰ波面は、その伝搬経路に沿って、複数（２つ以上）の個別の波面に分割されたが、持続的なスパイラルウェーブを伴わなかった。
【００９１】
２．０〜２．５Ｈｚでは、細胞アライメントは、自発性リエントリーの発生率を実質的に低減するか（Ｐ２＝３３．３％、合計で９例の調製物；Ｐ５＝２１．４％、合計で１４例の調製物）、または消失させたが（Ｐ１０＝０％、合計で６例の調製物；Ｐ１５＝０％、合計で６例の調製物）、整列した調製物はまた、ＰＥＳ誘導性不整脈に対する感受性も小さかった（Ｐ２＝２２．２％、Ｐ５＝２１．４％、Ｐ１０＝１６．７％、Ｐ１５＝１６．７％）（図４Ｂ）。したがって、自発性リエントリー性不整脈および誘導性リエントリー性不整脈の全発生率は、実質的に低減された。
【００９２】
代表的な線図を、図５Ａ〜Ｂに示す。自発性スパイラルウェーブまたは誘導性スパイラルウェーブの回転持続時間および速度は、アライメントの程度に依存しないと考えられた（表１）ことから、基板の持続的なリエントリーに対する閾値だけが変化したことが示唆される。スパイラルウェーブには、異なるキラリティー（対照、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ１０、およびＰ１５について、それぞれ、時計回り（＋）／反時計回り（−）＝６／４、３／２、１／３、１／０、および０／１）が観察された。しかし、回転とアライメント方向との間に明白な相関は認められなかった。
【００９３】
【表１】
2016505276.tif 000004
【００９４】
図４Ｃは、基本サイクル長（ＢＣＬ）を６５０ミリ秒とし、Ｓ１−Ｓ２カップリング間隔を徐々に短縮したときに記録される、対照単層の単相活動電位（ＭＡＰ：ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の代表例について表示する。刺激すると、典型的なＭＡＰは、急速に上昇し初め、この直後にその最大の振幅の約５〜１０％で素早く再分極し、続いて２００〜２５０ミリ秒にわたり持続する「プラトー」期（ショルダー）になり、その後、静止膜電位（ＲＭＰ：ｒｅｓｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）に戻る。Ｓ１−Ｓ２カップリング間隔が５５０ミリ秒から３３０ミリ秒に短縮されると、ＡＰＤ９０およびＭＡＰの振幅は短縮され（３０５ミリ秒から１０８ミリ秒に）、減衰する。ＢＣＬで測定されたＭＡＰの振幅は、Ｓ１−Ｓ２間隔を３３０ミリ秒とするときの振幅の２．４倍であった。Ｓ１−Ｓ２をさらに短縮したところ、２５８±３８ミリ秒の有効不応期（ＥＲＰ）に達した。
【００９５】
図４Ｄは、ＡＰＤ９０（４例の独立の調製物の各々の１０カ所の部位から平均した）を、拡張期に対してプロットした（ＤＩ；Ｓ１の最後のＡＰＤ９０とＳ１−Ｓ２カップリング間隔との間の差違）ところ、１．６の最大傾きをもたらした、対照についての代表的なＡＰＤ回復曲線を示す。他方、Ｐ５整列基板についてのＡＰＤＲ曲線は、最大傾きを１．４とする、ややフラットな傾きの曲線を示した。しかし、差違は、統計学的に有意ではなかった。
【００９６】
アライメント誘導性の異方性は、イソプロテレノールにより促進される空間分散および催不整脈作用を低減する
次に、本実施例は、β−アドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノールの、対照調製物および整列した調製物に対する作用について研究した。自発性持続的リエントリー性不整脈も誘導性持続的リエントリー性不整脈も表さない単層を、実験のために選択した。１Ｈｚで、イソプロテレノールを０．１、０．５、および１．０μＭとする定常状態ペーシングは、対照調製物のＣＶを、それぞれ、６．３±１．４ｃｍ／秒、７．６±１．１ｃｍ／秒、および８．１±０．６ｃｍ／秒へと有意に増大させた（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。伝導等時線図は、イソプロテレノールが、等時線の不規則性および隔たりにより表示される通り、イソプロテレノール非含有のベースライン条件下で観察される典型的な円形のパターンと比較して、ＣＶの空間分散を増進することを明らかにした（図６Ａ〜Ｂ）。このような分散が、３例の対照調製物中の２例（すなわち、６６％）において自発性スパイラルウェーブをもたらすことにより、持続的な機能的リエントリー性不整脈に対する感受性を増大させたことは（図６Ｃ）、催不整脈作用と符合した。これに対し、Ｐ５誘導性アライメントは、Ｔ−ＣＶおよびＬ−ＣＶの増大（それぞれ、２．８９ｃｍ／秒および４．９８ｃｍ／秒から、４．９１ｃｍ／秒および７．７６ｃｍ／秒への増大；ｎ＝３）にも関わらず、０．５μＭのイソプロテレノールによるＣＶの分散を緩和した（図６Ｄ〜Ｅ）。イソプロテレノール適用の前および後におけるＡＲは、同一（１．８３および１．７６；ｎ＝２）であった。０．５μＭでは、持続的な機能的リエントリー性不整脈は、観察することができなかった（ｎ＝２）。
【００９７】
心臓組織は、秩序だった異方性の組織化を呈示し、電気的イベントおよび機械的イベントが、有効な血液の駆出のために、協調的な様式で生じることを可能とする。本実施例は、収縮フィルムの微細加工により、ｈＥＳＣ−ＶＣＭの物理的アライメントが可能となり、これにより、機能的な異方性が再現され、重要なことに、整列した異方性ｈＥＳＣ−ＶＣＭのリエントリー性不整脈に対する感受性は小さいと考えられることを実証する。
【００９８】
病理学的状態（例えば、虚血、梗塞、および心不全）では、異方性の変化を含む、構造的かつ機能的なリモデリングが生じ、不整脈原性に寄与する。細胞内誘因に加えて、細胞電気生理学の異質性も、持続的なリエントリーおよび不整脈に対する主要な寄与因子である。異質性は、静的な場合もあり、動的な場合もある。例えば、多様な機能的特性を有する混合細胞集団が存在すれば、不応性の空間分散および時間分散に寄与しうるであろう。これらの実験では、ｈＥＳＣ−ＶＣＭを発生させる心室特異化プロトコールを採用して、表現型の異質性を最小化した。
【００９９】
また、ｈＥＳＣ−ＶＣＭの対照調製物と整列した調製物との間の内部比較も行って、物理的アライメントの機能的帰結も確認した。動的異質性を導入する手段として、本実施例では、プログラム電気刺激を実施して、砕波を作製するための大きな早期刺激を導入したが、この砕波は、ＶＦへの遷移およびその後におけるＶＦの維持において役割を果たすことが公知の電気回復特性に依存する。実際、ＡＰＤ回復の急勾配は、スパイラルウェーブの安定性にとって不可欠なカルシウム依存性パラメータである。
【０１００】
しかし、これらのデータにおいて示される通り、物理的な細胞アライメントは、ＡＰＤ回復を変化させなかった。したがって、ＡＰＤ９０などの細胞特性が、対照調製物と整列した調製物との間で異なっていなかったという観察を総合すると、ＡＲおよび伝導特性の差違、加えて自発性不整脈および誘導性不整脈の発生率の低減は、物理的アライメントそれ自体に起因する可能性がある。
【０１０１】
ＰＳＣ−ＶＣＭは、心不全（ＨＦ）などの状態を有する患者に有益な、細胞ベースの心筋修復のための有望な選択肢をもたらす。本結果は、分散をさらに増大させ、したがって、不整脈に対する感受性をさらに増大させる可能性が高い、顕著な異質性が既に存在する（例えば、ＨＦを有する）患者への移植の前に、リエントリー性不整脈の可能性を低下させるための、細胞アライメントにより増強されうる、ＰＳＣ由来移植片の動的安定性について評価する必要があるという興味深い可能性を提起する。
【０１０２】
したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特色により具体的に開示されたが、本明細書で開示され具体化された開示の改変、改善、および変更が当業者によって行われてもよく、このような改変、改善、および変更は、本開示の範囲内にあると考えられることが理解されるものとする。本明細書で示される材料、方法、および例は、好ましい実施形態を表し、例示的なものであるが、本開示の範囲への限定と意図されるないものとする。
【０１０３】
本開示は、本明細書において広くかつ一般的に説明されている。全体の開示の範囲内に含まれるより狭義の種および亜属の群の各々も本開示の一部を形成する。これは、除外された材料が本明細書で具体的に列挙されているのかどうかに関わらず、属から任意の対象物を除去するという条件または否定的限定を伴う本開示の全体の記述を含む。
【０１０４】
加えて、本開示の特色または態様がマーカッシュ群の観点で記載される場合、当業者は、本開示はマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群の観点でも説明されることを認識するであろう。
【０１０５】
本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個別に組み込まれた場合と同程度に、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含めて本明細書を優先させる。
【図１Ａ−Ｈ】
2016505276.tif 000005
【図２Ａ−Ｄ】
2016505276.tif 000006
【図３Ａ−Ｅ】
2016505276.tif 000007
【図４Ａ−Ｅ】
2016505276.tif 000008
【図５Ａ−Ｂ】
2016505276.tif 000009
【図６Ａ−Ｇ】
2016505276.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月24日(2015.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹状のマイクロテクスチャー加工表面上に幹細胞を整列させることにより調製される、心筋細胞の単離集団。
【請求項２】
心室心筋細胞を含む、請求項１に記載の単離集団。
【請求項３】
心室心筋細胞および心室線維芽細胞を含む、請求項１に記載の単離集団。
【請求項４】
心室心筋細胞および心室線維芽細胞を、１：０、１：１、２：１、および１：２からなる群から選択される比で含む、請求項３に記載の単離集団。
【請求項５】
前記凹状の表面が、バルーンの内部表面である、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離集団。
【請求項６】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離集団。
【請求項７】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項５に記載の単離集団。
【請求項８】
前記集団が、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離集団。
【請求項９】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項５に記載の単離集団。
【請求項１０】
前記表面が、チャンバー作製時の接触ガイドキューを設置するために、プラズマ処理によりマイクロテクスチャー加工されたマスターまたはグルーブ付き表面特徴を有するテクスチャー加工されたバルーンのソフトリソグラフィーを含む方法により調製される、請求項６に記載の単離集団。
【請求項１１】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離集団。
【請求項１２】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項５に記載の単離集団。
【請求項１３】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項６に記載の単離集団。
【請求項１４】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項７に記載の単離集団。
【請求項１５】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項８に記載の単離集団。
【請求項１６】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項９に記載の単離集団。
【請求項１７】
平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項１０に記載の単離集団。
【請求項１８】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離集団。
【請求項１９】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞のうちの１種または複数である、請求項５に記載の単離集団。
【請求項２０】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項６に記載の単離集団。
【請求項２１】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項７に記載の単離集団。
【請求項２２】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項８に記載の単離集団。
【請求項２３】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項９に記載の単離集団。
【請求項２４】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１０に記載の単離集団。
【請求項２５】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１１に記載の単離集団。
【請求項２６】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１２に記載の単離集団。
【請求項２７】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１３に記載の単離集団。
【請求項２８】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１４に記載の単離集団。
【請求項２９】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１５に記載の単離集団。
【請求項３０】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１６に記載の単離集団。
【請求項３１】
前記幹細胞が、哺乳動物幹細胞またはヒト幹細胞である、請求項１７に記載の単離集団。
【請求項３２】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離集団。
【請求項３３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項５に記載の単離集団。
【請求項３４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項６に記載の単離集団。
【請求項３５】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項７に記載の単離集団。
【請求項３６】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項８に記載の単離集団。
【請求項３７】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項９に記載の単離集団。
【請求項３８】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１０に記載の単離集団。
【請求項３９】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１１に記載の単離集団。
【請求項４０】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１２に記載の単離集団。
【請求項４１】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１３に記載の単離集団。
【請求項４２】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１４に記載の単離集団。
【請求項４３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１５に記載の単離集団。
【請求項４４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１６に記載の単離集団。
【請求項４５】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１７に記載の単離集団。
【請求項４６】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１８に記載の単離集団。
【請求項４７】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項１９に記載の単離集団。
【請求項４８】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および成体幹細胞のうちの１種または複数を含む組成物を分化させることにより調製される、請求項２０に記載の単離集団。
【請求項４９】
複数の整列した心筋細胞を調製する方法であって、幹細胞を、凹状のマイクロテクスチャー加工表面上で、該幹細胞が心筋細胞へと分化するのに適する条件下で培養するステップと、これにより複数の整列した心筋細胞を調製するステップとを含む、方法。
【請求項５０】
前記幹細胞を前記テクスチャー加工表面上で培養するステップの前に、熱可塑性材料をプラズマで処理するステップと、処理された熱可塑性材料を収縮させて、テクスチャー加工表面を得るステップと、ソフトリソグラフィーを使用して足場に該テクスチャー加工表面を複製して、該足場上にテクスチャー加工表面を作製するステップと、該足場に圧力をかけて該表面を凹状にするステップとを含む方法により、前記テクスチャー加工表面を調製するステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記熱可塑性材料を、前記プラズマで５分間処理する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記熱可塑性材料の一方の面だけを、前記プラズマで処理する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記プラズマが、酸素プラズマである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記整列した心筋細胞が、心室心筋細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記整列した心筋細胞が、心室心筋細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記整列した心室心筋細胞が、異方性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記整列した心室心筋細胞が、異方性である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記整列した心室心筋細胞が、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記整列した心室心筋細胞が、１Ｈｚで約２〜約４ｃｍ／秒の横方向伝導速度または１Ｈｚで約３〜約８ｃｍ／秒の縦方向伝導速度のうちの少なくとも１つを有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記整列した心室心筋細胞の平均異方性比（ＡＲ）が約０．５〜１．５である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記凹状の表面が、バルーンの内部表面である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記凹状の表面が、バルーンの内部表面である、請求項５０に記載の方法。
【国際調査報告】
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