(57)【要約】疎水性薬剤用の準安定リポソーム製剤が、発症している膀胱の組織または組織ルーメンへデリバリーされる。これらは直径が少なくとも１ミクロンであり、脂質中に疎水性治療、予防または診断用薬剤を閉じ込めている１つ以上の脂質で形成されている。これらのリポソームの安定性が増し、閉じ込めた薬剤の隣接組織への移動が向上すると、特に組織によく浸透しないタクロリムスなどの疎水性薬剤のデリバリーが良くなる。準安定リポソームによる製剤は、局所的に、好ましくは点滴によって、または局所的に、例えば、治療が必要な膀胱などの組織または組織ルーメンにスプレーまたは塗布することによって投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームを形成している脂質内に閉じ込められた１つ以上の疎水性治療、予防または診断用薬剤を含む、直径が少なくとも１ミクロンである準安定リポソームの投与製剤。
【請求項２】
さらに前記リポソーム内に封入された１つ以上の治療、予防または診断用薬剤を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
質量濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、準安定リポソームによる疎水性薬剤を形成するために、形態が再構成用の用量単位容器中の乾燥粉末である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記リポソームが組織または組織ルーメンへの直接投与に好適なゲルまたは溶液中に懸濁している、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記疎水性薬剤が、膀胱疾患または障害の治療用である、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記疎水性薬剤がタクロリムスである、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記リポソームがスフィンゴミエリン、またはその誘導体を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記リポソームの直径が１〜１００ミクロンである、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
リポソームを形成している脂質内に閉じ込められた１つ以上の疎水性治療、予防または診断用薬剤を含む、直径が少なくとも１ミクロンである準安定リポソームの投与製剤を、組織または組織ルーメンに投与することを含む、治療が必要な個体を治療する方法。
【請求項１０】
前記リポソームがさらに前記リポソーム内に封入された１つ以上の治療、予防または診断用薬剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記製剤が、質量濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、準安定リポソームによる疎水性薬剤を形成するために、再構成用の用量単位容器中の乾燥粉末の形態であり、無菌水溶液で前記製剤を再構成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
さらに組織または組織ルーメンへの直接投与に好適なゲルまたは溶液中に前記リポソームを懸濁させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記製剤が、スプレー器具、ガーゼ、ローラー、及びスポンジからなる群から選択されるアプリケーターを含む膀胱鏡を介して投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソームがスフィンゴミエリン、またはその誘導体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポソームの直径が１〜１００ミクロンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
気道、消化管、尿生殖路、及び生殖路のルーメンからなる群から選択されるルーメンに前記リポソームを投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎水性薬剤がタクロリムスまたは毒素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記疎水性薬剤が膀胱疾患または障害の治療用であり、膀胱疾患または障害がある個体に有効量の前記リポソームを投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記疎水性薬剤が膀胱疾患または障害の治療用であり、膀胱疾患または障害がある個体に有効量の前記リポソームを投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記障害が出血性膀胱炎、間質性膀胱炎/有痛性膀胱症候群及び癌からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、膀胱、特に出血性膀胱炎、癌、及び間質性膀胱炎/有痛性膀胱症候群などの状態の治療のための薬剤の製剤のための準安定リポソームの分野にある。
【背景技術】
【０００２】
世界中の何百万という人々が、出血性膀胱炎、間質性膀胱炎/有痛性膀胱症候群(ＩＣ/ＰＢＳ)、及び癌を含む膀胱の状態に苦しんでいる。出血性膀胱炎は、反復性血尿、尿意切迫、及び恥骨上部痛を特徴とする。ＩＣ/ＰＢＳは、アメリカだけで約七十万人から百万人が苦しんでいる慢性及び有痛性炎症性状態であり、このうちの９０パーセントが女性である。
【０００３】
膀胱癌は、男性では診断される頻度が４番目に多い癌であり、女性では診断される頻度が９番目に多い癌である。膀胱癌と新たに診断される症例は、毎年約５６，０００である。膀胱癌を原因とする死亡例は、毎年１２，０００である。
【０００４】
長年にわたって膀胱内治療が膀胱治療の中心である(Ｐａｒｋｉｎ,ｅｔ  ａｌ.,Ｕｒｏｌ,４９,１０５-１０７(１９９７))。リポソームは、自然または合成リン脂質から形成される生分解性、非中毒性、一枚膜または多重膜ベシクルである。リポソームには、その水性(親水性薬剤)または脂質(疎水性)相に、幅広い治療薬剤を閉じ込め、保持する能力がある(Ｓｅｎｉｏｒ,Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｔｈｅｒ.Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ.,３,１２３-１９３(１９８７);Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ,Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ａｎａｌ,３３,３３７-３６２(１９８８);Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ,Ｓｕｂｃｅｌｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１４,３６３-３７８(１９８９);Ｒｅｉｍｅｒ,ｅｔ  ａｌ.,Ｄｅｒｍａｔｏｌ,１９５:９３(１９９７))。リポソームが、代謝障害(Ｇｒｅｇｏｒｉｄｉｓ,ｅｔ  ａｌ.,Ｐｒｏｇ.Ｃｌｉｎ.Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ.,９５,６８１-７０１(１９８２)、伝染病(Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ,Ｊ.  Ｃｌｉｎ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.,２９,８７３-８８４(１９８３)、全身真菌感染(Ｇｒａｎｔ,ｅｔ  ａｌ.,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ,９８４,１１-２０(１９８９)の治療のため及び化学療法薬剤の有害作用を減らすために(Ｏｗｅｎ,ｅｔ  ａｌ.,Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ,３,１０１-１０７(１９９２);Ｇａｂｉｚｏｎ,ｅｔ  ａｌ.,Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ.,３３,７７９-７８６(１９９４))、臨床的実践に用いられている。ＣｈａｎｃｅｌｌｏｒらによってＵ．Ｓ．特許第７，０６３，８６０号及び８，１１０，２１７号に、膀胱機能障害の治療のためにカプサイシンまたはボツリヌス毒素それぞれの尿路細胞へのリポソームによるデリバリーが開示されている。１２のリポソームによる治療薬製剤が米国連邦医薬品局によって承認され、さらに２２のリポソームによる治療薬製剤が臨床試験されている(Ｃｈａｎｇ,ｅｔ  ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐ.,１,１９５(２０１２))。
【０００５】
治療薬剤を含有するリポソームは、主に全リポソームのエンドサイトーシスまたはファゴサイトーシス及びリポソーム膜の標的細胞膜との直接融合によって標的細胞にデリバリーされる。現在のリポソームによる治療は、構成するリポソーム粒子（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の小さく(ミクロン以下)、熱力学的に安定した球形構造のためエンドサイトーシス経路を主に利用している。
【０００６】
現在のリポソームによる製剤にはリポソームの小さく安定した構造のためいくつかの不利点があり、特に疎水性薬剤のデリバリーに不利点がある。小さなリポソームは、曲率半径が小さいため膨張圧が大きく、膜結合エネルギーが高い。このため、小さなリポソームはエントロピー的に好ましくないが、熱力学的に安定した、球形コンフォメーションとなっている。小さなリポソームは、標的細胞の膜と反応する可能性が限定される。現在のリポソームによる治療は、疎水性薬剤のデリバリーを内包するデリバリーのために、直接膜融合ではなく主にエンドサイトーシスに依存している。
疎水性化合物が交換機構によってリポソームの脂質二重層から急速に(数分内で)枯渇することが多く、全身循環内の他の脂質構造体(リポタンパク質、赤血球膜等)の中で均衡する(Ｆａｔｏｕｒｏｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｍｉｓｉａｒｉｓ,Ｊ.  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ,９,６１-７４(２００１);Ｆａｈｒ  ａｎｄ  Ｓｅｅｌｉｇ,Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｔｈｅｒ.Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ.,１８,１４１  -１７２(２００１);Ａｒｄｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ.,Ｊ.  Ｂｉｏｍｏｌ,  Ｓｔｒｕｃｔ.Ｄｙｎ.,１７,３３-４０(１９９９))。脂質構造体も局所環境に存在しているため、リポソームの急速除去は、リポソーム製剤の局所デリバリーによって完全に免れない。標的細胞膜との直接融合と比較してエンドサイトーシスによる摂取は比較的遅い。それゆえ、現在のリポソームによる製剤が、リポソームによる製剤がより多くの直接経路を用いた場合より、エンドサイトーシスを受けている環境でも、多くの疎水性薬剤を失う可能性がある。このため、リポソーム製剤による疎水性治療薬剤のデリバリー方法を改善する必要がある。
例えば、出血性膀胱炎、ＩＣ／ＰＢＳ、癌及び他の障害の治療のために膀胱などの組織または組織ルーメンに直接適用することによって、疎水性治療薬剤のデリバリーを改善する準安定リポソームを提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，０６３，８６０号明細書
【特許文献２】米国特許第８，１１０，２１７号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐａｒｋｉｎ,ｅｔ  ａｌ.,Ｕｒｏｌ,４９,１０５-１０７(１９９７)
【非特許文献２】Ｓｅｎｉｏｒ,Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｔｈｅｒ.Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ.,３,１２３-１９３(１９８７)
【非特許文献３】Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ,Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ａｎａｌ,３３,３３７-３６２(１９８８)
【非特許文献４】Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ,Ｓｕｂｃｅｌｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１４,３６３-３７８(１９８９)
【非特許文献５】Ｒｅｉｍｅｒ,ｅｔ  ａｌ.,Ｄｅｒｍａｔｏｌ,１９５:９３(１９９７)
【非特許文献６】Ｇｒｅｇｏｒｉｄｉｓ,ｅｔ  ａｌ.,Ｐｒｏｇ.Ｃｌｉｎ.Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ.,９５,６８１-７０１(１９８２)
【非特許文献７】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ,Ｊ.  Ｃｌｉｎ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.,２９,８７３-８８４(１９８３)
【非特許文献８】Ｇｒａｎｔ,ｅｔ  ａｌ.,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ,９８４,１１-２０(１９８９)
【非特許文献９】Ｏｗｅｎ,ｅｔ  ａｌ.,Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ,３,１０１-１０７(１９９２)
【非特許文献１０】Ｇａｂｉｚｏｎ,ｅｔ  ａｌ.,Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ.,３３,７７９-７８６(１９９４)
【非特許文献１１】Ｃｈａｎｇ,ｅｔ  ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐ.,１,１９５(２０１２)
【非特許文献１２】Ｆａｔｏｕｒｏｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｍｉｓｉａｒｉｓ,Ｊ.  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ,９,６１-７４(２００１)
【非特許文献１３】Ｆａｈｒ  ａｎｄ  Ｓｅｅｌｉｇ,Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｔｈｅｒ.Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ.,１８,１４１  -１７２(２００１)
【非特許文献１４】Ａｒｄｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ.,Ｊ.  Ｂｉｏｍｏｌ,  Ｓｔｒｕｃｔ.Ｄｙｎ.,１７,３３-４０(１９９９)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
準安定リポソームによる製剤が開発されている。これらは膀胱などの組織または組織ルーメンへの疎水性薬剤のデリバリーに有利である。これらは直径が少なくとも１ミクロンであり、脂質中に疎水性治療、予防または診断用薬剤を閉じ込めている１つ以上の脂質で形成されている。これらのリポソームの安定性が増し、閉じ込めた薬剤の隣接組織への移動が向上すると、特に組織によく浸透しないタクロリムスなどの疎水性薬剤のデリバリーが良くなる。
【００１０】
準安定リポソームによる製剤は、局所的に、好ましくは点滴によって、または局所的に、例えば、治療が必要な膀胱などの組織または組織ルーメンにスプレーまたは塗布することによって投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、リポソームのコンフォメーションのミクロ状態及び関連した結合有効性の確率及び縮退を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、リポソームのコンフォメーションのミクロ状態及び関連した結合有効性の確率及び縮退を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、リポソームのコンフォメーションのミクロ状態及び関連した結合有効性の確率及び縮退を示す。
【図２】図２は、リポソームのアンサンブルの平衡結合有効性の確率分布である。
【図３】図３は、粒子直径に基づく準安定リポソーム製剤の全容積の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、単一成長空隙の空隙容積に対して結合有効性を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ.定義
【００１３】
「活性薬剤」は、本明細書に用いる場合、身体の局所的に及び/または全身に作用する生理学的または薬理学的活性物質を指す。活性薬剤は、疾患または障害の治療(例えば、治療薬剤)、予防(例えば、予防薬剤)、または診断(例えば、診断用薬剤)のために患者に投与される物質である。
【００１４】
「疎水性」は、本明細書に用いる場合、水分子とエネルギー的に好ましい相互作用を生じることができず、そのため水に溶解しない非極性分子または分子の一部を指す。
【００１５】
「親水性」は、本明細書に用いる場合、水分子とエネルギー的に好ましい相互作用を十分に生じ、水に容易に溶解する極性分子または分子の一部を示す。
【００１６】
「両親媒性」は、本明細書に用いる場合、リン脂質または洗剤分子中のような疎水性及び親水性領域をともに有する分子を示す。
【００１７】
「有効量」または「好適量」は、本明細書に用いる場合、症状または特定の状態または障害の計測可能な改善または予防をもたらすために、平均余命の計測可能な延長をもたらすために、または一般に患者の生活の質を改善するために少なくとも必要な最少濃度である。このため、有効量は、特異的生物学的活性分子及び治療される特異的状態または障害に依存している。単クローン抗体(ｍＡｂ)などの多くのタンパク質の有効量が、当該技術分野でよく知られている。以下で発見した、または、ｍＡｂなどの公知のタンパク質で特異的障害を治療するため、さらに障害を治療するために臨床的に適用されるタンパク質の有効量は、医師などの当業者の技術内で望ましい標準的技術によって決定される。
【００１８】
「製剤的に許容可能な」は、本明細書に用いる場合、正常な医学的判断の範囲内で、合理的利益／リスク比に見合って、過剰毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症のないヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに好適である、化合物、物質、組成物、および/または投与形態を指す。
【００１９】
「固定のシェルマクロ構造」は、本明細書に用いる場合、多数のシェル層の配置が一定のトポロジーを維持するという要件を指す。
【００２０】
「断続的」は、本明細書に用いる場合、縮退関数に関連して、空隙内部と分類される座標の間にギャップがない数学的関数を指す。この意味では、断続的は、非離散と同義である。
【００２１】
「溶媒」は、本明細書に用いる場合、他の物質を溶解可能な液体物質を指す。
【００２２】
「対象」は、本明細書に用いる場合、有体物(溶媒の一部を含むことができる)、または有体物が占めることができる空間の一部を指す。
【００２３】
「シェル」は、本明細書に用いる場合、一定の表面面積を維持するが、変形中、必ずしも一定の空隙容積を維持しない、三次元的対象の変形可能境界を指す。
【００２４】
「空隙」は、本明細書に用いる場合、シェル内の三次元的空間を指す。
【００２５】
「容積」は、本明細書に用いる場合、対象が占める三次元的空間の量を指す。
【００２６】
「空隙容積」は、本明細書に用いる場合、シェルと相関している空隙の容積を指す。
【００２７】
「シェルの結合有効性」は、本明細書に用いる場合、シェルと同じ表面面積を有する球の容積によって割ったシェルの空隙容積を指す。
【００２８】
「シェルのコンフォメーション」は、本明細書に用いる場合、シェルの形状を指す。
【００２９】
「シェルの識別可能なコンフォメーション」は、本明細書に用いる場合、一致しないシェルのコンフォメーションを指す。
【００３０】
「シェルのコンフォメーション縮退」は、本明細書に用いる場合、シェルの表面面積及びシェルの結合有効性がともに変化しないようにシェルが変形した場合、シェルが有することができる識別可能なコンフォメーションの数を指す。
【００３１】
「シェルの最もエントロピー的に好ましい結合有効性」は、本明細書に用いる場合、コンフォメーション縮退が最も高いシェルの結合有効性を指す。
【００３２】
「リン脂質シェル」は、本明細書に用いる場合、リン脂質及び水性(または極性)溶媒の相互作用により生ずるシェルの形態中のリン脂質のコレクションを指す。
【００３３】
「リポソーム」は、本明細書に用いる場合、１つ以上の結合し、及び/または同心性リン脂質シェルからなる粒子を指す。
【００３４】
「リポソームの平面投影」は、本明細書に用いる場合、リポソームの点をその対応投影点に接続する全線が互いに平行であり、投影平面に垂直であるようなリポソームの全点の二次元平面上の対応点への線型写像を指す。
【００３５】
「リポソームの投影直径」は、本明細書に用いる場合、リポソームの可能な平面投影のすべての面積の平均と等しい面積となるようなサイズの円の直径を指す。
【００３６】
「リポソームのコンフォメーション平衡」は、本明細書に用いる場合、リポソームが、リポソームのリン脂質シェルのコレクションの最もエントロピー的に好ましい結合有効性に対応するコンフォメーションセット中にあるコンフォメーションにあることを指す。
【００３７】
「リポソームの相対的直径」は、本明細書に用いる場合、リポソームがコンフォメーションの平衡の状態にあった場合、リポソームが有するリポソームの投影直径の投影直径に対する割合を指す。
【００３８】
「膜結合に関係する膨張圧」は、本明細書に用いる場合、膜結合によって生じた膜内の内部圧力を指し、曲がった膜を曲率の半径が比較的大きなコンフォメーションに向けて押す。
【００３９】
「準安定リポソーム」は、本明細書に用いる場合、ａ)相対的直径が１と異なり、ｂ)膜結合に関係する膨張圧が、リポソームがコンフォメーションの平衡に向かう傾向に打ち勝つのに十分強くないほど十分に大きいリポソームを指す。
【００４０】
「デカルト座標を有するユークリッド空間の１単位」は、本明細書に用いる場合、当該空間のいずれかの主方向での離散化の最小要素に対応する座標距離を指す。
【００４１】
「デカルト座標を有するユークリッド空間内の隣接座標」は、本明細書に用いる場合、それぞれ主デカルト軸に沿い、対象の座標から１単位の距離にある６つの座標を指す。
【００４２】
「自然数」は、本明細書に記載する場合、負ではない整数を指す。
【００４３】
「コンフォメーション縮退の計算可能性」は、本明細書に用いる場合、縮退内のコンフォメーションが自然数と１対１対応にあるような縮退の状態を指す。
【００４４】
「膜関連薬剤」は、本明細書に用いる場合、膜の周囲の水性溶媒に対して生物学的膜内または隣接して優先的に分断する薬剤を指す。
【００４５】
「リポソームのトポロジー」は、本明細書に用いる場合、リポソーム構成成分を配列する方法を指す。
【００４６】
ＩＩ.準安定リポソーム製剤
【００４７】
直径が少なくとも１ミクロンである準安定リポソームが、デリバリーの部位で安定性が増すためデリバリーの向上をもたらす。デリバリーがさらに向上すると、リポソームを形成している脂質内で疎水性の治療、予防または診断用薬剤を閉じ込めることができる。このリポソームが疎水性活性薬剤を標的細胞にデリバリーするエンドサイトーシスに必ずしも依存していないと考えられる。一方、大きく、準安定リポソームは、疎水性活性薬剤を含有するリポソームの一部を標的細胞、好ましくは尿路上細胞の細胞膜から分離させ、直接融合させることによって、タクロリムスなどの疎水性活性薬剤をデリバリーする。
【００４８】
リポソームは、１つ以上の賦形剤と製剤化することができる。製剤は、局所適用のために液体またはゲル、好ましくは液体の形態とすることができる。
【００４９】
Ａ.準安定リポソーム
【００５０】
コンフォメーション縮退がより大きなリン脂質シェルからなるリポソームでは、同じトポロジーからなるが、そのリン脂質シェルはコンフォメーション縮退がより小さいリポソームよりエントロピーが大きい。図１に示したとおり、外部または内部の力の存在を除外すると、最大到達可能エントロピーを有するリポソームが平衡にある。外部または内部の力の存在を無視すると、リポソームは、それが平衡コンフィギュレーションにある場合、安定している。
【００５１】
リポソームは、１つ以上の結合し、及び/または同心性リン脂質シェルからなる(Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｉｇ,Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ,Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ(２００３))。固定の表面面積を有するリン脂質シェルの空隙容積は、変えることができる。このため、固定の表面面積を有するシェルの最大空隙容積は、シェルが球のコンフォメーションにある場合の空隙容積に一致する。同様に、固定の空隙容積を含有する最少シェル表面面積(シェルによって結合した非圧縮性流体の場合と同様に)も、球のコンフォメーションにあるシェルに相関する。
【００５２】
こうして、シェルの結合有効性、ｅが
【数１】
2016534087.tif 000002
として計算され、式中、Ｖがシェル空隙容積であり、Ａがシェル表面面積である。
【００５３】
シェルの結合有効性は、その最大値が１．００と等しくなるように正規化され、正で、単位のない量である。最大結合有効性は、球形のシェルの結合有効性に一致する。このため、固定の表面面積のシェルで、空隙容積が最大である場合、結合有効性は１.００に等しい。シェル表面面積が最小であり、空隙容積が一定である場合も、結合有効性は１．００に等しい。
【００５４】
図１に示したとおり、外部のポテンシャル(膜結合エネルギーなど)の影響がなければ、結合有効性は最大コンフォメーション縮退(このため最大エントロピーである)に相関し、平衡結合有効性である。シェルの結合有効性が平衡結合有効性と異なる場合、リン脂質シェルは熱力学的に準安定している。リン脂質シェルの結合有効性が増すと、その構成要素であるリポソームの相対的直径を増加させることができる。準安定と考えられるリポソームの相対的直径の好ましい増加は、１％超である。相対的直径が大きくなると、リポソームは反応性を増すことができる。結合有効性がその平衡結合有効性より大きなリポソームに相関するエネルギーは、リポソームをエントロピー的に好ましくなく、縮退が少ない構造的コンフォメーションに膨張させるのに必要な仕事の量に等しい。
【００５５】
投影直径が１ミクロン未満であるリポソーム(小リポソーム)は、準安定状態となることができない。このリポソームは、その曲率の半径が小さいため、膜結合エネルギーが高く、エントロピー作用を支配する。典型的な小さな一枚膜リポソームは、結合有効性が１.００であり、膜結合圧力の直接的結果としてコンフォメーション縮退が少ない球形コンフォメーションである。膜結合圧力の支配的な作用がリポソームコンフォメーションを制御するため、小リポソームは準安定状態となることができない。そのため、小リポソームは、エントロピー平衡でなくても、常に熱力学的に(準安定ではなく)安定している。
【００５６】
これに反して、直径が１ミクロン超のリポソームは、曲率の半径が大きく、このため小リポソームより膨張圧が小さくなる。こうして、大きなリポソームは、膜結合圧力ではなくエントロピー力によって支配することができる。そのため、大きなリポソームは、準安定状態となることができる。
【００５７】
アンサンブルのマクロ特性の確率分布は、対象のマクロ特性に関係するミクロ状態の縮退関数に等しい(Ｔｏｌｍａｎ,Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ,Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ,(１９３８))。ここでは、対象のマクロ特性は、結合有効性の確率分布である。このため、リン脂質シェルの結合有効性の確率分布は、その許容コンフォメーションの縮退関数に等しい。
【００５８】
アンサンブルの縮退関数は、ボルツマンの式Ｓ＝ｋｂ  ｌｏｇ  ｇを介してエントロピーに関係しており、式中、Ｓが、従来の熱力学的エントロピーであり、ｋｂが、ボルツマン定数であり、ｇが、コンフォメーション縮退である。エネルギー及びエントロピーの間の関係Ｕは、対象の固定の数の系Ｎに対して、温度Ｔの物理学的定義の中心をなし、
【数２】
2016534087.tif 000003
である。
【００５９】
温度のこの定義は、２つの系の有効なミクロ状態の縮退が結合して最大化される場合に平衡が生じると仮定して、熱接触で平衡にある２つの系に対して等しい量と同義である(Ｋｉｔｔｅｌ,Ｃ.Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ.Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ.  (１９６９))。系が一定温度の無限リザーバーとの熱接触にある場合、周囲温度（例えば、室温)で非分離系の場合のように、縮退の結合は、本質的に無限リザーバーの温度である。そのため系のエネルギーレベルの得られる確率分布ε１は、分配関数によって決定され、
【数３】
2016534087.tif 000004
であり、
式中、
【数４】
2016534087.tif 000005
であり、
【数５】
2016534087.tif 000006
は、
ミクロ状態ｌで系を発見する確率であり、当該エネルギー、ε１、を有し、
Ｚが分配関数である。
【００６０】
このため、当該系についての温度及び平均エネルギーの間の関係は、
【数６】
2016534087.tif 000007
であり、
これらのそれぞれの確率によって加重したエネルギー状態を統合することによって得られる。
【００６１】
最大コンフォメーション縮退(このため最大エントロピーである)に相関する結合有効性は、当該系の平衡結合有効性である。結合有効性がその平衡結合有効性より大きな系(すなわち、リポソーム)に相関するエネルギーは、圧力Ｐに対してリポソームを膨張させるのに必要な仕事Ｗの量に等しく、コンフォメーション縮退の膨張的な減少及びエントロピーの対応する減少に相関する。エネルギーの増加は、エントロピー的に好ましい平衡コンフィギュレーションから当該系を移動するために必要である。必要な仕事の量はＷ=ＰΔＶであり、式中、ΔＶが容積の増加であり、結合有効性の変化に一致する。
【００６２】
コンフォメーション縮退の膨張的な減少に相関する圧力Ｐは、
【数７】
2016534087.tif 000008
を用いる温度の物理学的定義の微分に類似させて導出することができる。
圧力は容積の関数であるため、
【数８】
2016534087.tif 000009
であり、ｄＵ=０である場合、よく知られた熱力学の恒等式となる。
【００６３】
仮定上のリン脂質シェルのアンサンブルに相関する縮退関数の例示的な計算が、実施例１に記載されている。
【００６４】
リポソームのコンフォメーション(例えば、膜結合圧力)に影響を及ぼす非エントロピー力がないと仮定して、シェルのコレクションの結合有効性の確率分布が、図２に示されている。これに反して、平衡での分布と有意に異なるシェルのアンサンブル結合有効性の確率分布は、平衡ではない。例えば、平衡分布より平均結合有効性が大きなシェルのコレクション(その空隙内容物一時的に浸透しない)が、その膜が浸透性である場合より多くの容積を含み、その結果としてその構成膜の不浸透性状態が継続する限り、準安定であるシェルの例である。実践的意味から準安定を考えると、容積の増加は、少なくとも１％とすることができる。不浸透性膜などの非持続因子によって平衡結合有効性分布への到達を妨げたリン脂質シェルのコレクションが、準安定である。
【００６５】
大きなリポソームは、その曲率の半径が大きいため、膜結合ポテンシャルが比較的小さく、その結果、エントロピー力によって制御される。有意に平衡での結合有効性確率分布から逸脱する結合有効性の確率分布を有する大きなリポソームのコレクションが準安定である。
【００６６】
Ｂ.リポソーム
【００６７】
リポソームは、水性コンパートメントから分離した同心性リン脂質二重層からなる球形ベシクルである。リポソームは、細胞表面に接着し、分子膜を形成することができる。構造的には、リポソームは、水性の内部を含む同心性リン脂質二重層からなる脂質ベシクルである(Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ,ｅｔ  ａｌ.,Ｉｎｔ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.,３００,１２５-３０  ２００５;Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ａｎｄ  Ｒｙｍａｎ,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ,１２４,５８Ｐ(１９７１))。疎水性化合物は脂質相と関係があり、親水性化合物は水性相と関係がある。
【００６８】
リポソームは１つ以上の脂質から形成され、生理的ｐＨで中性、陰イオン性、または陽イオン性とすることができる。好適な中性及び陰イオン性脂質としては、ステロール及びコレステロール、リン脂質、リソリピド、リソリン脂質、スフィンゴ脂質またはペグ化脂質などの脂質が挙げられるが、これらに限定されない。中性及び陰イオン性脂質としては、１，２-ジアシル-グリセロ-３-ホスホコリン;ホスファチジルセリン(ＰＳ)、ホスファチジングリセロ−ル、ホスファチジルイノシトール(ＰＩ);糖脂質;スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質及びセラミドガラクトピラノシドなどのスフィンゴ糖脂質(１-ｃｅｒａｒｎｉｄｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅとしても知られる)、ガングリオシド及びセレブロシド;カルボン酸基を含有する脂肪酸、ステロール、例えば、コレステロール;これらに限定されないが、１，２-ジオレオイルホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、１，２-ジヘキサデシルホスホエタノールアミン(ＤＨＰＥ)、１，２-ジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、１，２-ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、及び１，２-ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)を含む、１，２-ジアシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン、を含むが、これらに限定されない、ホスファチジルコリン(ＰＣ)(卵ＰＣ、大豆ＰＣなど)が挙げられるが、これらに限定されない。当該脂質は、脂質のさまざまな天然(例えば、Ｌ-α-ホスファチジル:卵黄、心臓、脳、肝臓、大豆由来の組織)及び/または合成(例えば、飽和及び不飽和１，２-ジアシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン、１-アシル-２-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン、１，２-ジヘプタノイル-ＳＮ-グリセロ-３-ホスホコリン)誘導体も含むことができる。好ましい実施形態では、リポソームがホスファチジルコリン(ＰＣ)先頭基、好ましくはスフィンゴミエリンを含有する。もうひとつの実施形態では、リポソームがＤＰＰＣを含有する。さらにひとつの実施形態では、リポソームが中性脂質、好ましくは１，２-ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)を含有する。
【００６９】
特定の実施形態では、リポソームが一種類のリン脂質から生成される。このような実施形態では、好ましくはリン脂質がホスファチジルコリン先頭基を有し、最も好ましくはスフィンゴミエリンである。リポソームがスフィンゴミエリン代謝生成物を含むことができる。リポソームを製剤化するために用いられるスフィンゴミエリン代謝生成物としては、セラミド、スフィンゴシン、またはスフィンゴシン１-リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを製剤化するために用いられる脂質に含まれるスフィンゴミエリン代謝生成物の濃度は、約０．１モル％〜約１０モル％の範囲とすることができる。好ましくは約２．０モル％〜約５．０モル％、さらに好ましくは約１．０モル％の濃度とすることができる。
【００７０】
リポソーム中の好適な陽イオン性脂質しては、これらに限定されないが、Ｎ-[１-(２，３-ジオレイルオキシ)プロピル]-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアンモニウム塩が挙げられ、ＴＡＰ脂質としても言及され、例えば、硫酸メチル塩である。好適なＴＡＰ脂質としては、ＤＯＴＡＰ(ジオレイル-)、ＤＭＴＡＰ(ジミリストイル-)、ＤＰＴＡＰ(ジパルミトイル-)、及びＤＳＴＡＰ(ジステアロイル-)が挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム中の好適な陽イオン性脂質としては、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(ＤＤＡＢ)、１，２-ジアシルオキシ-３-トリメチルアンモニウムプロパン、Ｎ-[１-(２，３-ジオロイルオキシ)プロピル]-Ｎ，Ｎ-ジメチルアミン(ＤＯＤＡＰ)、１，２-ジアシルオキシ-３-ジメチルアンモニウムプロパン、Ｎ-[１-(２，３-ジオレオイルオキシ)プロピル]-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、１，２-ジアルキルオキシ-３-ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、３-[Ｎ-(Ｎ'，Ｎ'-ジメチルアミノ-エタン)カルバモイル]コレステロール(ＤＣ-Ｃｈｏｌ);２，３-ジオレイルオキシ-Ｎ-(２-(スペルミネカルボキシアミド)-エチル)-Ｎ，Ｎ-ジメチル-１-プロパナミニウムトリフルオロ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ)-アセテート(ＤＯＳＰＡ)、β-アラニルコレステロール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(ＣＴＡＢ)、ジＣ１４-アミジン、Ｎ-ｆｅｒｆ-ブチル-Ｎ'-テトラデシル-３-テトラデシルアミノ-プロピオンアミジン、Ｎ-(α-トリメチルアンモニオアセチル)ジドデシル-Ｄ-グルタメートクロリド(ＴＭＡＧ)、ジテトラデカノイル-Ｎ-(トリメチルアンモニオ-アセチル)ジエタノールアミンクロリド、１，３-ジオレイルオキシ-２-(６-カルボキシ-スペルミル)-プロピルアミド(ＤＯＳＰＥＲ)、及びＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'-テトラメチル-、Ｎ'-ビス(２-ヒドロキシルエチル)-２，３-ジオレイルオキシ-１，４-ブタンジアンモニウムヨージドが挙げられるが、これらに限定されない。ひとつの実施形態では、陽イオン性脂質は、１-[２-(アシルオキシ)エチル]２-アルキル(アルケニル)-３-(２-ヒドロキシエチル)-イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば、１-[２-(９(Ｚ)-オクタデセノイルオキシ)エチル]-２-(８(Ｚ)-ヘプタデセニル-３-(２-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(ＤＯＴＩＭ)、及び１-[２-(ヘキサデカノイルオキシ)エチル]-２-ペンタデシル-３-(２-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(ＤＰＴＩＭ)とすることができる。ひとつの実施形態では、陽イオン性脂質は、第４級アミンにヒドロキシアルキル部分を含有する、２，３-ジアルキルオキシプロピル第４級アンモニウム化合物誘導体とすることができ、例えば、１，２-ジオレイル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(ＤＯＲＩ)、１，２-ジオレオイルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(ＤＯＲＩＥ)、１，２-ジオレオイルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド(ＤＯＲＩＥ-ＨＰ)、１，２-ジオレオイル-オキシ-プロピル-３-ジメチル-ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド(ＤＯＲＩＥ-ＨＢ)、１，２-ジオレイルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシペンチルアンモニウムブロミド(ＤＯＲＩＥ-Ｈｐｅ)、１，２-ジ��リステルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシルエチルアンモニウムブロミド(ＤＭＲＩＥ)、１，２-ジパルミチルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(ＤＰＲＩＥ)、及び１，２-ジステリルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(ＤＳＲＩＥ)である。
【００７１】
当該脂質は、１つ以上の脂質の組み合わせから形成することができ、例えば、荷電脂質を生理的ｐＨで非イオン性または荷電していない脂質と組み合わせることができる。非イオン性脂質としては、これらに限定されないが、コレステロール及びＤＯＰＥ(１，２-ジオレオイルグリセリルホスファチジルエタノールアミン)が挙げられ、コレステロールが最も好ましい。スフィンゴミエリンなどの第１のリン脂質の第２の脂質に対するモル比は、約５：１〜約１:１または３:１〜約１:１、さらに好ましくは約１．５:１〜約１:１の範囲とすることができ、最も好ましくは、モル比が約１:１である。
【００７２】
当該リポソームは、典型的には水性コアを有する。当該水性コアは、水または水及びアルコールの混合物を含有することができる。好適なアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール(イソプロパノールなど)、ブタノール(ｎ-ブタノール、イソブテン、ｓｅｃ-ブタノール、ｔａｒｔ-ブタノールなど）、ペンタン(アミルアルコール、イソブチルカルビノールなど)、ヘキサノール(１-ヘキサノール、２-ヘキサノール、３-ヘキサノールなど)、ヘプタノール(１-ヘプタノール、２-ヘプタノール、３-ヘプタノール及び４-ヘプタノールなど)またはオクタノール(１-オクタノールなど)またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
当該リポソームは、１つ(一枚膜)またはいくつかの(多重膜)リン脂質二重層によって輪郭がつくられた１つまたはいくつかの水性コンパートメントを有する(Ｓａｐｒａ,ｅｔ  ａｌ.,Ｃｕｒｒ.Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ.,２,３６９-８１(２００５))。好ましくは、当該リポソームは多重膜である。多重膜リポソームは、関係する疎水性治療薬剤のためにより多くの脂質二重層を有する。このため、標的細胞に到達するリポソーム内でより多くの量の治療薬剤を用いることができる可能性がある。好ましくは、リポソーム製剤が、製剤中にリポソーム集団の１〜１００％の範囲で多くのリポソームを含有する。いくつかの実施形態では、多くのリポソームとは製剤中にリポソーム集団の約５０％以上を示す。
【００７４】
Ｃ．治療、予防及び診断用薬剤
【００７５】
準安定リポソーム製剤を介してデリバリーすることができる薬剤としては、リポソーム内に封入することができる治療、栄養、予防、及び診断用薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、疎水性である小分子、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、脂質、リポタンパク質、タンパク質ペプチドとすることができる。
【００７６】
活性薬剤と脂質との割合(脂質１ｍｇ当たりの活性薬剤の国際単位または重量、マイクログラムまたはミリグラム）は、活性薬剤の有効性を調節するために制御することができる。好適な活性薬剤と脂質との割合としては、１:１、１:０．９、１:０．８、１:０．７、１:０．６、１:０．５、１:０．４、１:０．３、１:０．２、または１:０．１(脂質１ｍｇ当たりの活性薬剤の活性単位または重量)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
特定の実施形態では、準安定リポソームが１つ以上の化学療法薬剤を含有する。好ましくは、化学療法薬は膀胱癌の治療に有効な疎水性化学療法薬剤である。
【００７８】
当該薬剤は、これらに限定されないが、ケモカインをコード化する核酸に特異的なリボザイム、三重鎖形成オリゴヌクレオチド(ＴＦＯ)、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍｉｃｒｏＲＮＡを含む抑制性核酸とすることができる。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には長さが少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含み、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドである。抑制性核酸及びこれを生成する方法が当該技術分野でよく知られている。ｓｉＲＮＡ設計ソフトウエアを利用することができ、例えば、ｈｔｔｐ://ｉ．ｃｓ．ｈｋｕ．ｈｋ/〜ｓｉｒｎａ/ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｓｉｒｎａ．ｐｈｐである。核酸の合成は、よく知られており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｄｓ.３ｒｄ  ｅｄ.)  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ(２００１)を参照。用語「ｓｉＲＮＡ」は、毒性のない短鎖二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡを意味する。一般に、毒性を示さない限り、ｓｉＲＮＡの長さは特に限定されない。「ｓｉＲＮＡ」は、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、さらに好ましくは２１〜３０ｂｐ長とすることができる。あるいは、発現するｓｉＲＮＡの最終転写生成物の二本鎖ＲＮＡ部は、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、さらに好ましくは２１〜３０ｂｐ長とすることができる。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡが少なくとも１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。２つのＲＮＡ鎖が対になっているｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ部分は、完全に対になったものに限られず、ミスマッチ(対応するヌクレオチドが相補的ではない)、またはバルジ(１つの鎖上に対応する相補的ヌクレオチドを欠いている)のため、対ではない部分を含有する可能性がある。対ではない部分は、ｓｉＲＮＡ形成を干渉しない程度まで含有することができる。「バルジ」は、好ましくは１〜２の対ではないヌクレオチドを含み、２つのＲＮＡ鎖が対になっているｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域が、好ましくは１〜７、さらに好ましくは１〜５のバルジを含有する。また、本明細書に用いられる「ミスマッチ」は、２つのＲＮＡ鎖が対になっているｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域に、好ましくは１〜７、さらに好ましくは１〜５の数で含有される。好ましいミスマッチでは、ヌクレオチドのうちの１つがグアニンであり、他はウラジルである。このようなミスマッチは、センスＲＮＡのためにコード化するＤＮＡ中のＣからＴへ、ＧからＡへの変異、またはこれらの混合物によるものであるが、これらに特に限定されるものではない。さらに、２つのＲＮＡ鎖が対になっているｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、バルジ及びミスマッチをともに含有することができ、その数が合計で好ましくは１〜７、さらに好ましくは１〜５である。
【００７９】
ｓｉＲＮＡの末端構造は、ｓｉＲＮＡがそのＲＮＡｉ作用のため標的遺伝子の発現を抑える、減らす、または妨げることができる限り、平滑または付着(オーバーハング)末端とすることができる。付着(オーバーハング)末端構造は、３'オーバーハングだけに限定されず、ＲＮＡｉ作用を誘発することができる限り、５'オーバーハング構造を含むことができる。また、オーバーハングヌクレオチドの数は、すでに報告した２または３に限定されず、オーバーハングがＲＮＡｉ作用を誘発することができる限り、任意の数とすることができる。例えば、オーバーハングが１〜８、好ましくは２〜４ヌクレオチドからなる。本明細書では、付着末端構造を有するｓｉＲＮＡの全長は、対となっている二本鎖部分の長さ及び両末端にオーバーハング一本鎖を含む対の長さの合計として発現する。例えば、両末端に４ヌクレオチドオーバーハングを有する１９ｂｐ二本鎖ＲＮＡ部分の場合では、全長が、２３ｂｐとして発現する。さらに、このオーバーハング配列が標的遺伝子に対して特異性が少ないため、標的遺伝子配列と必ずしも相補的(アンチセンス)ではなく、または一致(センス)しない。さらに、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子上でその遺伝子抑制作用を維持することができる限り、ｓｉＲＮＡは、例えば、その１つの末端のオーバーハング部分に低分子量ＲＮＡ(ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡなどの天然ＲＮＡ分子、または人工ＲＮＡ分子とすることができる)を含有することができる。また、ｓｉＲＮＡの末端構造は、前に記載したとおり両末端とも必ずしもカットオフ構造ではなく、二本鎖ＲＮＡの１つの側鎖の末端がリンカーＲＮＡによって結合されるステムループ構造を有することができる。二本鎖ＲＮＡ領域(ステムループ部分)の長さは、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、さらに好ましくは２１〜３０ｂｐ長とすることができる。あるいは、発現するｓｉＲＮＡの最終転写生成物である二本鎖ＲＮＡ領域の長さは、例えば、１５〜４９ｂｐ、好ましくは１５〜３５ｂｐ、さらに好ましくは２１〜３０ｂｐ長である。さらに、ステム部分が対となるのを妨げないような長さである限り、リンカーの長さは、特に制限されない。ｍｉＲＮＡｓがＤｉｃｅｒ様酵素による短ステムループ前駆物質の開裂によって生成される;一方、ｓｉＲＮＡは長二本鎖ＲＮＡ分子の開裂によって生成される。ｍｉＲＮＡは一本鎖であり、一方、ｓｉＲＮＡは二本鎖である。ｍｉＲＮＡを生成する方法が当該技術分野に知られている。ＣＣＬ２(ＭＣＰ-１)、ＣＣＬ４(ＭＩＰ-１β)、ＣＣＬ１１(エオタキシン)、ＣＸＣＬ１(ＧＲＯ-α)、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ-１２ｐ７０/ｐ４０、ＩＬ-５、ｓＩＬ-２Ｒα、ＩＬ-６、ＩＬ-１０、ＩＬ-８、及びＥＧＦの配列が知られるため、当業者であれば公的に入手可能な情報を用いてこのケモカインの発現を抑制するｍｉＲＮＡを容易に生成することができる。
【００８０】
泌尿器障害に関連がある成長因子の生物学的活性を増加させることは、特定の泌尿器障害、特に、間質性膀胱炎/有痛性膀胱症候群及び過活動膀胱症候群を治療するのに有効である。過活動膀胱症候群患者の尿のＥＧＦレベル上昇がみられると、組織修復及び繊維症が示唆される。泌尿器障害の症状の重症度または数を減少させる有効量の１つ以上の成長因子が、泌尿器障害の１つ以上の症状がある対象に投与される。好ましい成長因子としては、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、骨誘導タンパク質(ＢＭＰ)、形質転換成長因子(ＴＧＦ)などの形質転換成長因子、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、表皮成長因子(ＥＧＦ)、神経成長因子(ＮＧＦ)、インスリン様成長因子(例えば、インスリン様成長因子Ｉ)、分散因子/肝細胞成長因子(ＨＧＦ)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭＣＳＦ)、グリア成長因子(ＧＧＦ)、及び内皮細胞成長因子(ＦＧＦ)が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい成長因子はＥＧＦである。
【００８１】
過活動膀胱などの膀胱疾患の治療のための好ましい実施形態では、準安定リポソームを用いて、ボツリヌス毒素などの毒素を投与することができる。ボツリヌス神経毒素(ＢｏＮＴ)は、ボツリヌス血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びスネアタンパク質への遮断作用がある、これらの毒素の全改変、置換またはフラグメント変型を指す。これらは、天然生成毒素または合成生成毒素の少なくとも１つのアミノ酸の置換または改変を含む。これらの改変は、遺伝子組換え技術で実施することができる。結合ドメイン及び/または転座ドメインの除去または置換による毒素も含まれる。ＢｏＮＴ血清型Ａ〜Ｇのこれらのいくつかの変型が、米国特許第７，４９１，７９９号に記載され、Ｂｌａｎｄらによって記載されている(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ.Ｐｕｒｉｆ.,７１(ｌ):６２-７３(２０１０))。
【００８２】
ボツリヌス毒素は、クロストリジウムボツリヌスによって生成され、公知の最も強力な生物学的毒素と考えられている(Ｓｍｉｔｈ＆Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ,Ｊ.  Ｕｒｏｌ.,１７１:２１２８(２００４))。ＢｏＮＴは、筋肉収縮過剰によるさまざまな状態を治療するために効果的に用いられている。ＢｏＮＴ-Ａが７つの免疫学的異なる神経毒素(血清型Ａ〜Ｇ)のうちで臨床的に最もよく用いられるボツリヌス毒素である。ＢｏＮＴ-Ａ及びＢｏＮＴ-Ｂが用いられ、複数の部位にＢｏＮＴ-Ａを膀胱壁内注入して、神経性膀胱過剰活動の脊髄損傷患者の治療に成功している。
【００８３】
ＢｏＮＴは、神経筋接続部ならびに自律神経伝達部でアセチルコリン(「ＡＣｈ」)の放出を抑制することによって作用を及ぼすことが知られている。ＢｏＮＴの筋肉内注入後、骨格筋ならびに平滑筋で一時的な化学的除神経及び筋弛緩を得ることができる(Ｃｈｕａｎｇ＆Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ,Ｊ.  Ｕｒｏｌ.,１７６(６  Ｐｔ  ｌ):２３７５-８２(２００６))。Ｓｍｉｔｈら(Ｊ.Ｕｒｏｌ.、１６９:１８９６(２００３))が、ラットの近位尿道括約筋ＢｏＮＴを注入すると高いが、低くない電場刺激で標識ノルエピネフリンが明白に減少することを発見した。これは、ＢｏＮＴが自律神経末端でのノルエピネフリン放出を抑制することを示している。
【００８４】
ひとつの実施形態では、ＢｏＮＴは、ＢｏＮＴＡ-Ｇ、好ましくはＢｏＮＴＡ、ＣまたはＥ、さらに好ましくはＢｏＮＴＡとすることができる。
【００８５】
製剤またはリポソームは、任意でＢｏＮＴの代わりにまたは加えて１つ以上の薬剤を含有する。これらは、バクテリア、真菌類、またはウイルス、鎮痛剤、抗炎症剤、抗潰瘍薬、鎮痙薬、または胃の状態を治療するために用いられる他の薬剤によって生じた感染を治療するための薬剤などの抗感染薬を含むことができる。
【００８６】
ＢｏＮＴと脂質との割合(脂質１ｍｇ当たりのＢｏＮＴの単位)は、ＢｏＮＴの有効性を調節するために制御することができる好適なＢｏＮＴと脂質との割合としては、１:１、１:０．９、１:０．８、１:０．７、１:０．６、１:０．５、１:０．４、１:０．３、１:０．２または１:０．１(脂質１ｍｇ当たりのＢｏＮＴの単位)が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、ＢｏＮＴと脂質との割合が１:０．５である。
【００８７】
例示的な診断用薬剤としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、放射能物質、及びＸ線造影剤、及びＭＲＩ造影剤が挙げられる。
【００８８】
好ましい代表的な化合物としては、抗炎症剤、脈管形成抑制剤、及びタクロリムスなどの化学療法薬剤が挙げられる。
【００８９】
タクロリムス(ＦＫ-５０６またはｆｕｊｉｍｙｃｉｎ)は、強力な免役抑制剤である。これは、カルシニューリンを抑制することによって先天性免疫系、特にＴ-細胞で作用する、その結果Ｔリンパ球シグナル伝達及びインターロイキン-２(ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ-２)転写がともに減少する(Ｍｉｇｉｔａ  ａｎｄ  Ｅｇｕｃｈｉ,Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ.,３３,２２９２(２００１))。タクロリムスは、強力な免疫調整剤であるが、腎毒性及び高血圧を含む重度の有害作用の発生率が高いため、その全身投与は制限される(Ｎａｅｓｅｎｓ,ｅｔ  ａｌ.,Ｃｌｉｎ.Ｊ.  Ａｍ.Ｓｏｃ.Ｎｅｐｈｒｏｌ.,４,４８１(２００９);Ａｋａｒ,ｅｔ  ａｌ.,Ｃｌｉｎ.Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ.,３３,５３(２００５))。従来より、疎水性分子であるタクロリムスの膀胱へのデリバリーは、その水溶性の低さのため、妨げられてきた。最新の研究では、タクロリムスの局所的なリポソームによるデリバリーにより、全身の有害作用を減少させながら疎水性に関連した問題を克服することができることが示唆されている(Ｃｈｕａｎｇ,ｅｔ  ａｌ.,Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌｏ.Ｕｒｏｄｙｎａｍ.,３０,４２１-４２７(２０１１);Ｎｉｒｍａｌ,ｅｔ  ａｌ.,Ｊ.  Ｕｒｏｌ.,１８９,１５５３-１５５８(２０１３))。
【００９０】
特定の実施形態では、１つの活性薬剤だけが準安定リポソーム粒子に組み入れられる。好ましくは、実施例に示したとおり、活性薬剤は疎水性である。他の実施形態では、２つ以上の活性薬剤が準安定リポソーム粒子に組み入れられる。
【００９１】
Ｄ.キャリア及び賦形剤
【００９２】
リポソームは、組織または組織ルーメンへの投与のため製剤的に許容可能なキャリア及び/または賦形剤とともに製剤化することができる。好適なキャリアとしては、水、生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水などの無菌液体、及びポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、及びヒアルロン酸などの水性または水溶性ゲルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
当該製剤は、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。
【００９４】
一般に、リポソームは、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサッシャなどの気密封止容器中の乾燥凍結粉末または水を含まない濃縮物として、単位剤形中に、別々にまたはともに混合されて供給される。製剤が点滴によって投与される場合、無菌製薬等級純水または生理食塩水を含有する点滴びんで小分けすることができる。
【００９５】
ＩＩＩ.製造方法
【００９６】
リポソームの製造方法が、前記載の文献に示され、よく知られている。これら方法は、臨床効果を得るために好適な化学的及び物理的安定性を有するリポソームを生成しようとしている(Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ,Ａｄｖ.Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ.Ｒｅｖ.,５８,１５３２-５５(２００６))。このため、リポソームによる治療ためのリポソームの典型的な製造方法では、室温で安定している大きな準安定リポソームとなる。
【００９７】
好ましい実施形態では、脱水準安定リポソームが、ｔｅｒｔ-ブチルアルコール(ＴＢＡ)/水補助溶媒系中のリン脂質、好ましくはスフィンゴミエリンの均質な分散液から、スフィンゴミエリン１ｍｇとＴＢＡ/水１ｍＬの割合が２:１で、調製される。リポソームの等方性単相溶液を凍結乾燥して、無菌バイアル中に脱水リポソーム粉末を生成する。凍結乾燥ステップにより、バイアルから水及びＴＢＡをともに除去した後の空き脂質ベシクルまたは脱水リポソームが残る。水、生理的生理食塩水またはＰＢＳなどの製剤的に許容可能なキャリアを添加すると、凍結生成物から自然に大きな準安定リポソーム分散液が形成される(実施例３を参照)。脂質とＴＢＡの割合は、得られたリポソーム調製物の大きさ及び多分散性に影響を及ぼす重要な要素である。
【００９８】
ひとつの実施形態では、準安定リポソームによるタクロリムスが、脱水-再水化方法によって調製される。
【００９９】
ＩＶ.大きな準安定製剤による治療
【０１００】
疎水性薬剤を大きな準安定リポソームの脂質成分に組み入れると、点滴中の利用可能性が増す。局所デリバリーには、全身デリバリーに関係する重度の有害作用を減らす利点がある。小さく熱力学的に安定したリポソームではなく大きな準安定リポソームを用いるひとつの利点は、大きな準安定リポソームでは、標的細胞の膜との反応性が増し、このためエンドサイトーシスではなく膜融合経路を介して活性薬剤をデリバリーすることになることである。さらに、本明細書に記載した大きな準安定リポソームの利点は、室温で安定しているが、標的細胞と接触すると現在の安定したリポソーム製剤より反応性が増すことである。
【０１０１】
当該製剤は、直接組織に投与される、または組織ルーメンに点滴される。代表的な組織ルーメンとしては、気道、消化管及び尿生殖路の組織ルーメンが挙げられる。これらには、鼻、肺、食道、直腸、膀胱、腟、尿道、及び子宮の腔などの腔が含まれる。ひとつの実施形態では、リポソームが、組織に適用されるゲルに製剤化される。もうひとつの実施形態では、リポソームが液体中に懸濁し、有効な時間、典型的には３０〜６０分間、組織にスプレーまたは塗布される、またはルーメンに点滴される。当該製剤は、膀胱鏡及びこれらに限定されないが、スプレー器具、ガーゼ、ローラーまたはスポンジを含む製剤を投与するのに好適なアプリケーターによってデリバリーすることもできる。当該製剤は、スプレー、塗布、ローラーまたはスポンジ、好ましくは、スプレー器具を用いたスプレーによって投与することができる。
【０１０２】
リポソームが封入された活性薬剤は、好ましくは膀胱に点滴することによって投与される。点滴の方法が知られている(Ｌａｗｒｅｎｃｉａ,ｅｔ  ａｌ.,Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ.,８:７６０-８(２００１);Ｎｏｇａｗａ,ｅｔ  ａｌ.,Ｊ.  Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.,１１５:９７８-８５(２００５);Ｎｇ,ｅｔ  ａｌ.,Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ.,３９１:３０４-１３(２００５);Ｔｙａｇｉ,ｅｔ  ａｌ.,Ｊ.Ｕｒｏｌ.  ,１７１:４８３-９(２００４).(Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ,ｅｔ  ａｌ.,Ｊ.  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.Ｅｘｐ.Ｔｈｅｒ.,３０９:１１６７-７３(２００４);Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ,ｅｔ  ａｌ.,Ｎａｔ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ,５:５４６-５１(２００２))。
【０１０３】
選択される用量は、所望の治療効果、投与の経路及び所望の治療の持続時間に依存している。一般に、１日当たり０．００１〜１０ｍｇ/ｋｇ体重の用量レベルが、哺乳動物に投与される。一般に、静脈内注入またはインフュージョンでは、用量は、少なくすることができる。
【０１０４】
特定の組成物は、経口、非経口(筋肉内、腹腔内、静脈内(ＩＶ)または皮下注入)、経皮(受動的に、またはイオントフォレーシスもしくはエレクトロポレーションを用いて)、または経粘膜(鼻、腟、直腸、または舌下)投与経路によって投与することもでき、各投与経路に好適な剤形に製剤化することができる。
【０１０５】
準安定リポソーム活性薬剤を含有する製剤は、膀胱鏡、内視鏡、または他の好適な観察器具を用いて、液体、粘性液体またはゲル状物質をスプレー、ローラー、塗布またはスポンジすることによって、膀胱中の所望の部位、他の体腔、または皮膚に投与することができる。観察器具を用いると、製剤を投与する前に投与の領域を特定することができる。観察器具は、製剤を含有し、これらに限定されないが、スプレー器具、ガーゼ、ローラーまたはスポンジを含む製剤のためのアプリケーターを含むことができる。アプリケーターは、製剤が偶発的に望ましくない領域に適用されないように製剤が投与されるまで好適なカバーを用いて保護することができる。アプリケーターは、観察器具の末端に取り付けると、高精度での投与が可能になる。観察器具のための液体スプレーツールが、当該技術分野で知られており、例えば、このようなツールは、Ｙａｍａｍｏｔｏ及びＫｉｄｏｏｋａによりＵ．Ｓ．特許第７，５８８，１７２号及び６，３５４，５１９号に記載されている。
【０１０６】
準安定リポソームの疎水性活性薬剤を含有する製剤は、治療が必要な膀胱中の部位、他の体腔、または皮膚に好適な量及び濃度でスプレーすることができる。準安定リポソームの疎水性活性薬剤を含有する製剤は、表面を製剤で被覆するために部位の表面に塗布することができる。塗布に関係する投与の技術のためには、好ましくは製剤が、粘性製剤またはゲル状製剤である。
【０１０７】
準安定リポソームによるタクロリムスまたは他の疎水性活性薬剤のデリバリーによる１つの利点は、同じ治療効果を得ながら、未封入製剤、または同等の安定したリポソーム製剤を投与する場合に必要な用量に比べて、用量を減少させることができることである。大きな準安定リポソームにより、タクロリムスまたは他の疎水性活性薬剤のデリバリーが向上し、その結果、少ない用量で有効となる(実施例５を参照)。
【０１０８】
さまざまな用量単位の準安定リポソーム製剤を用いることができる。脱水準安定リポソームによるタクロリムスまたは他の疎水性活性薬剤の乾燥粉末を含有する用量単位は、製剤的に許容可能なキャリアを有する容器中で液体に戻すことができる。好ましくは、製剤的に許容可能なキャリアは、水性キャリアである。好適な量としては、０．１〜１ｍｇ、１〜３ｍｇ、３〜１０ｍｇ、１０〜２０ｍｇ及び２０〜５０ｍｇが挙げられるが、これらに限定されない。好適な濃度としては、０．０５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．０５ｍｇｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ、さらに好ましくは０．０５ｍｇ/ｍｌ〜２．５ｍｇｍｌが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
膀胱障害またはこのうちの１つ以上の症状の軽減は、現在の治療と比べて長期間、低下しないで、製剤の投与後、１週間、数週間、１、２または３ヶ月以上、好ましくは６ヶ月超となる可能性がある。当該製剤は、１つ以上の膀胱障害または膀胱障害に関係する症状の軽減に有効性をもたらすような規則性で投与することができる。
【０１１０】
準安定リポソームによるタクロリムスまたは他の活性薬剤は、膀胱障害または膀胱障害の１つ以上の症状を軽減するために十分な用量で１つ以上の膀胱障害がある患者に投与される。タクロリムスまたは他の疎水性活性薬剤の投与のために大きな準安定リポソーム製剤を用いると、膀胱障害の治療の有効性が改善する。リポソームは、典型的には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水などの製剤的に許容可能なキャリア中で、膀胱にシンチレートすることによって投与される。当該製剤で治療することができる代表的な膀胱障害としては、出血性膀胱炎、ＩＣ/ＰＢＳ、及び癌が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、障害が出血性膀胱炎である。これらの準安定リポソーム製剤を用いて、これらに限定されないが、膣、消化管(上部及び下部)、口、気道、食道、鼻腔、耳道、及び皮膚を含む身体の他の部位の障害を治療することができる。
【０１１１】
準安定リポソームによる疎水性活性薬剤治療による治療によって軽減することができる症状としては、血尿、尿意切迫、恥骨上部痛、炎症、及び尿停滞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
準安定リポソーム製剤の投与の代表的な部位としては、膀胱、膣、消化管(上部及び下部)、口、気道、食道、鼻腔、耳道及び皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。準安定リポソーム製剤は、特に前記の身体部位の上皮層の治療に非常に適している。好ましい実施形態では、準安定リポソーム製剤で治療される部位が膀胱、特に上皮細胞である。
【０１１３】
本発明は、さらに以下の非限定の実施例を参照することによって理解される。
【０１１４】
実施例
【０１１５】
実施例１:リン脂質シェルのコレクションの最もエントロピー的に好ましい結合有効性の測定
【０１１６】
単一リン脂質シェルからなるコレクションの各メンバーを有するリポソームのコレクションを検討する。結合有効性の関数としてのコンフォメーション縮退の分布は、計算で測定することができる。関数ドメインの結合有効性が低い領域及び高い領域とも、比較的低いコンフォメーション縮退に対応しており、最大縮退は、結合有効性の中間レベルに対応している。図１を参照。結合有効性が最も高いのは、特異的単一構造的コンフォメーション(球)に対応していると予測され、このため単一の縮退を有する。ドメインの他の末端では、結合有効性が最も低いのは、面積を含まないようにしっかりと「折りたたまれた」曲線に対応する。この曲線のセットは、限定された面積を含む曲線のセットよりコンフォメーション縮退が少ない。最大コンフォメーション縮退は、構造的コンフォメーション縮退の中間値で生じると予測される。
【０１１７】
縮退関数は、計算で推定することができる。この推定は、デカルト座標で示された等方性三次元的ユークリッド空間を想定することで始まる。理論では、ユークリッド空間は、連続的と考えることができるが、計算目的では、ユークリッド空間は離散化される。連続的ケースは、離散化の細かさが増している漸近限界である。ユークリッド空間の各離散的デカルト座標は２つの状態:空隙の内部または空隙の外部のうちの１つに分類することができる。シェルに含まれている空隙の容積は、空隙の内部と分類される離散的座標の数として計算で定義される。空隙を含むシェルの表面面積は、空隙内と分類される座標に隣接しているが、中でない座標の数として計算で定義される。
【０１１８】
シェル(及び空隙)と定義されるユークリッド空間を離散化するとコンフォメーション縮退の計算可能性がもたらされる。連続的ケースでは、異なり、縮退は、数で定義するのは困難であり、このため、とりわけ有用ではない。この状況は、計算結果が連続的ケースの近似(または代表)であるという文脈で解釈される場合の離散的確率分布と連続的確率分布の対比に類似している。
【０１１９】
縮退関数の計算による推定のためにシェル表面の面積及び空隙容積の定義はともに、一組の座標の要素の計算であり、本質的に単位がないとすると、次元に関する２つの間の違いをもたらすことが必要である。表面面積の計算は、単位距離を２乗し、容積の計算は、単位距離を３乗する。
【０１２０】
縮退関数を作成するために用いられるアルゴリズムは、多くの３次元形状のランダム生成に関係しており、離散化により形成される各形状は、隣接し、各形状の容積は同じである(すなわち、空隙の内部と分類される座標の数が同じ)。各形状は、空間の任意の点に１つの座標を有する空隙から、構成することができる。各ケースの任意の点が、始まりである。次に、シェルが空隙のまわりに生成され、続いてランダムに選択したシェル座標を空隙に加える。ランダムに選択したシェル座標を空隙に加えるプロセスは、その後、繰り返される。繰り返す数は、所望の空隙の大きさによって定められる。
【０１２１】
この方法を用いると、単純に結合した空隙及び単純に結合していない空隙をともに生成することができる。この方法によって生成された全空隙は、隣接する。生成された空隙の容積の大きさの増加は、デカルト離散化の細かさの増加に似ている。そのため、空隙のセットの統計的なパラメトリック特性は、パラメーターが「平衡」または漸近値に到達する程度まで空隙の大きさを増加させる関数として検討することができる。このプロセスにより結果について離散化の作用を考える必要性をなくすことができる。
【０１２２】
成長する空隙に関する対象のパラメトリック特性が結合有効性となる。図４が単一で成長する空隙の結合有効性を示している。横軸は、ボクセルによって測定される容積によって空隙容積を示している。縦軸は、計算された結合有効性を示し、単位がない。図４と同じ軸を用いてランダムに生成した空隙のサンプル１００をグラフ化すると、２０未満の座標で空隙と容積の縮退関数の有意なオーバーラップがある。離散化した空間中の所与の空隙容積の可能性のある状態が許容される状態に量子化されるため、オーバーラップが存在し、モデルの量子性は、小さな空隙容積で明白である。また、このプロットは、空隙のアンサンブルについて予測される結合有効性の可能性のある範囲が一般に空隙容積に依存していないことを示している。ランダムに生成した空隙のサンプル集合１００では、得られた結合有効性１００が、８０パーセントの信頼区間でおよそ正規分布しており、結合有効性が０．２５〜０．３６の範囲にあり、中央値が０．２９である。ランダムに生成した空隙のサンプル集合１００の結合有効性分布は、パラメーターとして平均０．３００、標準偏差０．０４４、及び歪度０．５３７と示される。
【０１２３】
実施例２:リポソームのコレクションの最もエントロピー的に好ましい結合有効性の測定
【０１２４】
リポソームの結合有効性は、実験によって直接、測定することが困難である。そのため、リポソーム製剤が準安定している程度を測定するために、製剤内に含有されるリポソームの相対的直径が検討される。
【０１２５】
相対的直径を測定する能力に関して、リポソームのコレクションに相関するリポソーム投影直径の分布の変化の得られた測定係数が、図３に示したとおり、人為現象的に実際のリポソーム投影直径の分布よりおよそ４パーセント大きくなり、可能性のあるリポソーム平面投影の大きなサンプル集合の分布(その平均が「投影直径」の定義である)が、およそ４パーセントの変化の係数を有することを示している。測定したリポソーム投影直径分布と実際のリポソーム投影直径分布のこの差は、不規則な形状のリポソームが観察方向の向きの点で有する可能性があるばらつきによるものである。このため、本来の結合有効性の変化(または安定したコンフォメーションからの逸脱)に相関するリポソーム投影直径の分布の変化を推測すると、純粋に測定プロセスの人為的なものである測定した直径分布の広がりが原因に違いない。
【０１２６】
準安定リポソーム(またはリポソーム製剤)が平衡していない程度は、その相対的直径によって特徴づけられる。準安定リポソームの相対的直径を測定するために、準安定リポソームがコンフォメーションの平衡に到達する前及びその後に、準安定リポソームの投影直径が測定される。その後、平衡前の投影直径と平衡後の投影直径の割合(相対的直径)が測定される。
【０１２７】
最もエントロピー的に好ましい結合有効性を有するコンフォメーションのリポソーム粒子では、相対的直径が１．００である。リポソーム上または内で作用する他の力がないと、これがリポソームのコンフォメーションの平衡コンフィギュレーションであり、その最も可能性のある構造的コンフォメーションである。相対的直径が１．００以上である準安定リポソームでは、平衡コンフォメーションに到達することが可能になると、その空隙容積の部分を放出する傾向がある。これは、典型的には、リポソームのリン脂質シェルがその空隙容積の内容物への浸透性を増加させることによってもたらせる。
【０１２８】
実施例３:大きな準安定スフィンゴミエリンリポソームの調製
【０１２９】
方法:
【０１３０】
２:３(容積比)の水と第三級ブチルアルコール(ＴＢＡ)の混合物４０ｍＬに純粋スフィンゴミエリン(ＳＭ)８０ｍｇを溶解した。以下のパラメーター(第１に-４０℃で３０分間凍結させ、その後、１０℃で２０時間２００ミクロンの真空下で第１の乾燥を行い、続いて２０℃で４．５時間第２の乾燥を行う)で、この溶液を凍結させ、真空密封バイアル中に維持した。その後、純水４０ｍｇで室温(２５℃)で凍結乾燥物を再水化した。得られたリポソームの分散液の光学顕微鏡の結果が図５に示されている。その後、５５℃までこの分散液を加熱し、リポソームのリン脂質シェルのスフィンゴミエリン内容物がゲル-液体相転移を越えた(Ｑｕｉｎｎ,Ｌａｎｇｍｕｉｒ,２９,９４４７-９４５６(２０１３))。この相転移により、リポソームのリン脂質シェルのまわりに水が拡散し、その結果、より小さなリポソームがそのリン脂質シェルのエントロピー的に好ましい結合有効性を得た。２５℃まで分散液を冷却した。
【０１３１】
結果
【０１３２】
再水化時に、準安定スフィンゴミエリンリポソームの平均直径が３９．７０ミクロンであることが光学顕微鏡検査により明らかになった。リポソームは、その中心が比較的半透明である不規則な形状の粒子として光学顕微鏡に現れ、各リポソーム内部の領域の膜(必然的に光学)密度が小さいことを示している。５５℃まで加熱後、スフィンゴミエリンリポソームの平均直径が２２．８６ミクロンまで減少した。全リポソームの大きさが減少したわけではないが、リポソームのうちの十分な数、およそ９０パーセントで、投影直径が減少したことを示し、罹患した各リポソームが結果的に単一の相対的直径を有していた。これらの投影直径が減少したリポソームは、その内部の光学密度が減少していない。この結果は、リポソーム内部で折りたたんでいるリン脂質シェル膜の量が増加した結果である。実施例２に記載した計算に基づくと、もとの準安定分布に相関する相対的直径は１．７４である。加熱前、熱力学的に安定したスフィンゴミエリンリポソーム分散液の平衡相対的直径(１．００)から変化し、このため準安定．であった実験のスフィンゴミエリンリポソーム分散液は、相対的直径(１．７４)であった。２５℃までの冷却時に、加熱前の大きさに再拡張しなかったことにより明白であるとおり、２５℃まで冷却後、水が再懸濁スフィンゴミエリン粒子に拡散しなかった。これは温度に関係した相対的直径の減少が不可逆であったことを示している。このため、得られたスフィンゴミエリン分散液は、その時、リポソームの相対的直径に関して平衡であり、結果としてリポソームのリン脂質シェルの最もエントロピー的に好ましい結合有効性であった。
【０１３３】
実施例４:近赤外(ＮＩＲ)染料を保持する大きな準安定スフィンゴミエリンリポソームの調製
【０１３４】
方法
【０１３５】
２:３(容積比)の水と第三級-ブチルアルコールの混合物４０ｍＬ中に純粋スフィンゴミエリン８０ｍｇ及び０．５％(ｗｔ/ｗｔ)の膜関連ＮＩＲ蛍光染料、ＤＩＲ(１，１'-ジオクタデシル-３，３，３'，３'-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド)を溶解した。以下のパラメーター(第１に-４０℃で３０分間凍結させ、その後、１０℃で２０時間２００ミクロンの真空下で第１の乾燥を行い、続いて２０℃で４．５時間第２の乾燥を行う)を用いて、得られた溶液を凍結させ、真空密封バイアル中に維持した。その後、純水４０ｍｇにより室温(２５℃)で凍結乾燥物を再水化した。５５℃まで５分間、再懸濁液のアリコットを加熱した。その後、２５℃まで加熱したアリコットを冷却した。得られた非加熱及び加熱再懸濁液を２０倍に希釈し、光学顕微鏡を用いて観察し、得られたスフィンゴミエリン-ＮＩＲ染料リポソームのコンフォメーションを測定した。
【０１３６】
結果
【０１３７】
膜関連ＮＩＲ染料で調製したスフィンゴミエリン分散液は、実施例３で調製した粒子と同じ特性を示した。非加熱、準安定染料-リポソームの平均直径は、３９．７±３．０ミクロンであった。加熱、安定染料-リポソームの平均直径は、２２．９±１．９ミクロンであった。
【０１３８】
実施例５:ラット膀胱中の準安定リポソームを介した近赤外(ＮＩＲ)染料デリバリーの向上
【０１３９】
方法
【０１４０】
尿道にカテーテルを挿入し、尿管を閉鎖して、麻酔をかけたスプレーグドーリーラットの膀胱に、大きな準安定粒子による膜関連薬剤デリバリーの有効性を測定するため、膀胱を空にした後、実施例３で調製した各(非加熱または加熱)分散液０．５ｍＬを点滴した。膜関連治療薬剤の代用マーカーとして、スフィンゴミエリンリポソームと混合した膜関連染料を用いた。膀胱中で６０分間、懸濁液をインキュベートした。インキュベーション後、膀胱を採取し、開口し、生理的生理食塩水で洗浄した。ＮＩＲロングパスフィルター及びフィルター範囲の外部に励起源を備えたカメラを用いて管腔表面を画像に表示した。陰性対照として腹腔内組織を用い、染料付着がないことを示した。
【０１４１】
結果
【０１４２】
陰性対照に対する、膀胱の管腔表面の画像強度の増加の比較では、準安定(非加熱)リポソーム製剤に暴露した膀胱の方が安定した(加熱)リポソーム製剤より有意に明るいことを示していた。このように、準安定リポソーム製剤は、安定したリポソーム製剤より多くの膜関連染料を尿路上皮にデリバリーしていた。
【０１４３】
実施例６:膀胱の状態の治療のための大きな準安定リポソームの調製
【０１４４】
実施例３または４に記載したとおり、大きな準安定リポソーム製剤を調製することができる。しかし、０．５％(ｗ/ｗ)の親油性ＮＩＲ染料の代わりに、治療に好適な量(０．５％〜１０％ｗ/ｗなど)のタクロリムスまたは他の所望の膜関連治療薬剤をスフィンゴミエリンまたは他の好適なリン脂質と混合する。その後、得られた準安定治療薬剤は、有効な時間、典型的には３０〜６０分間、患者の膀胱に点滴される。
【図１Ａ】
2016534087.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2016534087.tif 000016
2016534087.tif 000017
2016534087.tif 000018