(57)【要約】  本発明は、エンドグルカナーゼを使用するセルロースオリゴマー(セロオリゴマー)の産生のための方法、及び産生されたオリゴマーの各種技術分野における使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロオリゴマーの産生のための方法であって、
a)セルロース(セルロース性出発物質)が、水性反応媒体中で少なくとも1つのエンドグルカナーゼ(EG)(E.C.3.2.1.4)を使用して加水分解的に切断され、
b)1つ以上のセロオリゴマー、すなわちセロオリゴマー画分を含む反応産物が、反応媒体から単離される、方法。
【請求項２】
形成されるセロオリゴマーが、10〜100の範囲の数平均鎖長(数平均重合度DPN)を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形成されるセロオリゴマーが、15〜50の範囲のDPN値を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
EGが、バチルス属、アスペルギルス属若しくはサーモトガ属の微生物、特にバチルス・アミロリケファシエンス種、クロコウジカビ種、若しくはサーモトガ・マリティマ種に由来する、天然の、若しくは組換えによって産生され、場合によって遺伝子改変された酵素、又はこれらの天然若しくは組換え酵素の少なくとも2つの組合せである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
酵素的加水分解が、約3〜8、特に4〜7の範囲のpHで、及び/又は20〜90℃、特に30〜80℃の範囲の温度で、及び/又は0.1〜100時間、特に1〜48時間の間、水性媒体中で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つのEGが約0.01〜100、例えば1〜50又は2〜10U/mlの反応混合物の濃度で適用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
セルロースが、反応混合物の総体積に基づいて0.1〜5%(w/v)の範囲の濃度で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
セルロースが、
a1)セルロースの結晶化度を減少させる前処理段階に供され、
a2)段階1a)のセルロースがEGを使用して酵素的に加水分解される、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
セルロースの結晶化度が、イオン液体、酸、及び/又は力学的エネルギー入力を使用する段階a1)の処理により減少する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
イオン液体が、特に1-エチル-3-メチルイミダゾリウムアセテート(EMIM Ac)及び3-メチル-N-ブチルピリジニウムクロリド([C4mpy]Cl)などの、温度100℃未満で液体である塩から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階a1)において、セルロースがイオン液体中に導入され、場合によって熱作用により、その中で溶解され、次いで水、有機溶媒又はそれらの混合物を添加することにより沈殿され、その沈殿物が分離され、場合によって洗浄され、液体が場合によって除去される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階a1)において、酸処理が濃縮リン酸によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
段階a1)において、力学的処理がボールミルを使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
処理段階、特に段階a1)及びa2)が、反応産物が単離される前に1度以上繰り返される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
食品及び飼料、化粧品又は医薬品の添加物としての、洗剤添加物としての、レオロジー改質剤としての及び有機合成の出発物質としての、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により産生されるセロオリゴマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドグルカナーゼを使用するセルロースオリゴマー(セロオリゴマー)の産生のための方法、及び産生されたオリゴマーの各種技術分野における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは地球上で最も豊富に存在するポリマーであり[Pinkert、Marshら、Chemical Reviews、109(12):6712〜6728ページ、2009]、リグノセルロースの形で植物細胞壁に存在する[Teeri, T. T.、Trends in Biotechnology、15(5):160〜167ページ、1997]。植物の一次及び二次細胞壁は、10〜90%がリグノセルロース繊維からなる[Weiler, E. W.、Allgemeine und molekulare Botanik、Vol. 1. Thieme、Stuttgart、2008]。植物細胞壁において、セルロースはリグニン及びヘミセルロースとともにセルロースフィブリルを形成する。セルロースフィブリル内部には、互いに平行に配置された30〜100個のセルロース分子で構成される結晶コアが存在する。セルロースは植物細胞壁の構造単位であり、安定性及び引張強度だけでなく柔軟性にも関与する。
【０００３】
糖及びデンプンとは対照的に、セルロースはヒトの栄養摂取に関わる食品ではなく、したがって、材料及びエネルギー産生のための、倫理にかなった再生可能原料である。
【０００４】
セロオリゴマーの産生及びそれらの潜在的用途についてはほとんど知られていない。食品及び洗剤への添加が可能であろう。セロオリゴマー中に多数のヒドロキシル基があることにより、セロオリゴマーは様々な点で誘導体化されることが可能であり、それによってセロオリゴマーの特性は目的の方法で改変可能である。再生可能エネルギーの探求がこの分野における研究を推進しているため、近年、セルロースのバイオ燃料への多段階転換について数多くの研究が発表されている[Hahn-Haegerdalら、Trends in Biotechnology、24(12):549〜556ページ、2006、Jorgensenら、2007、Waltz 2008]。
【０００５】
セルロースの加水分解のための、イオン液体中での固体触媒の使用が2008年に報告された[Rinaldiら、Angewandte Chemie-International Edition、47(42):8047〜8050ページ、2008]。しかし、セルロースの脱重合の間、セロオリゴマーの使用に悪影響を及ぼし得るヒドロキシメチルフルフラール、ギ酸及び他の産物などのグルコース分解産物が発生する[Rinaldiら、Chemsuschem、3(2): 266〜276ページ、2010]。糖のイオン液体への良好な溶解性が、糖の抽出及びイオン液体の再利用を困難にする[Rinaldiら、Angewandte Chemie-International Edition、47(42):8047〜8050ページ、2008]。反応を早期に終了させると、DP約30のセロオリゴマーを反応時間1.5時間後に収率90%で調製可能である[Rinaldiら、Angewandte Chemie-International Edition、47(42):8047〜8050ページ、2008]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pinkert、Marshら、Chemical Reviews、109(12):6712〜6728ページ、2009
【非特許文献２】Weiler, E. W.、Allgemeine und molekulare Botanik、Vol. 1. Thieme、Stuttgart、2008
【非特許文献３】Hahn-Haegerdalら、Trends in Biotechnology、24(12):549〜556ページ、2006、
【非特許文献４】Rinaldiら、Angewandte Chemie-International Edition、47(42):8047〜8050ページ、2008
【非特許文献５】Rinaldiら、Chemsuschem、3(2): 266〜276ページ、2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明の目的は、セロオリゴマーをもたらすことが可能であるが既知の調製方法の欠点を有しない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、エンドグルカナーゼを用いた不溶性セロオリゴマーの産生のための、新規の驚くべき有利な処理手順が提供される。本発明による方法は、特に規定された鎖長のオリゴマー及び狭い鎖長分布の不溶性セロオリゴマーが産生され、可溶性の糖の産生が少なく、水中で溶解する限界に近いセロオリゴマー鎖長が得られるという点で利点を示す。
【０００９】
セルロースは、水不溶性で部分結晶性のバイオポリマーであり、そのため水性媒体中で酵素的に加水分解することが困難であるため[Dadiら、Biotechnology and Bioengineering、95(5):904〜10ページ、2006]、例えばイオン液体を用いた追加の、特に好適な前処理が行われ得る。特に、市販の精製エンドグルカナーゼ、特にクロコウジカビ(A. niger)、B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、T.マリティマ(T. maritima)由来のものなどが、セルロース加水分解のために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】a)クロコウジカビ(A. niger)、b)B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、c)T.マリティマ(T. maritima)、d)T.ロンギブラキアタム(T. longibrachiatum)及びe)T.エメルソニ(T. emrsonii)由来のエンドグルカナーゼを用いたAvicelの酵素的加水分解についての、経時的なDPw及びDPnの経過を示す図である。
【図１ｂ】図１ａの続き。
【図１ｃ】図１ａの続き。
【図１ｄ】図１ａの続き。
【図１ｅ】図１ａの続き。
【図２ａ】a)クロコウジカビ(A. niger)、b)B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、c)T.マリティマ(T. maritima)、d)T.ロンギブラキアタム(T. longibrachiatum)及びe)T.エメルソニ(T. emrsonii)由来のエンドグルカナーゼを用いたα-セルロースの酵素的加水分解についての、経時的なDPw及びDPnの経過を示す図である。
【図２ｂ】図２ａの続き。
【図２ｃ】図２ａの続き。
【図２ｄ】図２ａの続き。
【図２ｅ】図２ａの続き。
【図３ａ】a)クロコウジカビ(A. niger)、b)B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、c)T.マリティマ(T. maritima)、d)T.ロンギブラキアタム(T. longibrachiatum)及びe)T.エメルソニ(T. emrsonii)由来のエンドグルカナーゼを用いたSigmacellの酵素的加水分解についての、経時的な重合度DPw及びDPnの経過を示す図である。
【図３ｂ】図３ａの続き。
【図３ｃ】図３ａの続き。
【図３ｄ】図３ａの続き。
【図３ｅ】図３ａの続き。
【図４ａ】イオン液体による中間処理(IL再開)後の、a)クロコウジカビ(A. niger)、b)B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)及びc)T.マリティマ(T. maritima)由来のエンドグルカナーゼを用いたAvicelの2段階酵素的加水分解についての、経時的な重合度DPw及びDPnの経過を示す図である。
【図４ｂ】図４ａの続き。
【図４ｃ】図４ａの続き。
【図５ａ】イオン液体による中間処理(IL再開)後の、a)クロコウジカビ(A. niger)、b)B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)及びc)T.マリティマ(T. maritima)由来のエンドグルカナーゼを用いたα-セルロースの2段階酵素的加水分解についての、経時的な重合度DPw及びDPnの経過を示す図である。
【図５ｂ】図５ａの続き。
【図５ｃ】図５ａの続き。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
1.一般定義
「DPN値」は、オリゴマー又はポリマーの数ベースの重合度又は数平均鎖長を指す。
【００１２】
「DPW値」は、オリゴマー又はポリマーの重量ベースの重合度又は鎖長を指す。
【００１３】
「DPN値」及び「DPW値」は、本発明に従って、特に実験部分でより詳細に記載される標準条件下(移動相、作動温度、流速、カラム材料)で、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を使用して実験的に決定される。
【００１４】
「鎖長分布」及び「モル質量分布」はそれぞれ、GPCにより決定される鎖長及びモル質量の度数分布を指す。数平均モル質量MN及び重量平均モル質量MWは、鎖長又はモル質量分布の範囲を量的に表すために使用され得る。
【００１５】
多分散性はMNに対するMWの割合で定義され、1以上となる。多分散性が低ければ低いほど、モル質量分布は狭くなる。
【００１６】
本発明の文脈において、「セルロース」はパルプから純粋なα-セルロースまで、低リグニンで本質的にヘミセルロースを含まないセルロース性材料の分野において広い意味で理解され得る。純粋産物もセルロース性物質混合物も、ともに酵素反応に実質的な負の効果を及ぼさない限り使用可能である。セルロースは完全に非結晶質(uncrystalline)でも完全に結晶質でもよく、又は既知の決定方法(例えばx線回折)により決定される平均結晶化度(Crl%)を示してもよい。使用されるセルロースの「DPN値」は、例えば約30〜150の範囲であってよい。「DPW値」は例えば120〜150の範囲であってよい。
【００１７】
「セロオリゴマー」は、DPN値が10〜70の範囲であり、β-1,4-グリコシド結合した(β-1,4-glycosidically linked)複数のグルコース単位で構成されるオリゴマーである。
【００１８】
エンドグルカナーゼ(E.C.3.2.1.4)は、セルロース分子内でランダムに切断する酵素である。これらはセルロースの非晶質領域を攻撃する。ランダムな鎖切断により、ほとんどの場合異なる長さの、2本のセルロース鎖が生じる。この結果、DPWの急速な減少、及び還元末端の増加が起こる[Lyndら、Microbiology and Molecular Biology Reviews、66(3):506〜577ページ、2002]。
【００１９】
1エンドグルカナーゼ活性単位は、40℃、pH4.5又は6でカルボキシメチルセルロースから1分あたり1mmolグルコース当量の還元糖が発生するために必要な酵素の量として定義される。
【００２０】
β-グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.21、又はβ-1,6-グルコシダーゼ)は、2つのグルコース又は置換グルコース分子間のβ1-4結合に作用するグルコシダーゼ酵素である。これは、多様なβ-D-グリコシド基質に特異性を有するエキソセルラーゼである。これはβ-D-グルコシドの非還元末端残基の加水分解を触媒し、グルコースを遊離させる。
【００２１】
バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)は1943年にJ. Fukomotoにより発見されたグラム陽性桿菌である[Fukomoto, J.、J. Agric. Chem. SOC. Jpn.、19;487〜503ページ、1943]。これは1987年になって初めて科学者団体によって特徴づけられ、独立した種として公表された[Priestら、International Journal of Systematic Bacteriology、37(1):69〜71ページ、1987]。B.アミロリケファシエンスは土壌から単離され、0.7μm〜0.9μm×1.8μm〜3.0μmの大きさである。細胞は周毛性鞭毛を示し、運動性であり、鎖を形成する。最適温度は30℃〜40℃の間である。15℃を下回ると増殖が停止する[PriestらInternational Journal of Systematic Bacteriology、37(1):69〜71ページ、1987]。B.アミロリケファシエンスから調製されるアミラーゼはデンプンの加水分解のために産業利用される酵素である。American Type Culture Collectionでは、B.アミロリケファシエンスは番号23350を有する。
【００２２】
クロコウジカビ(Aspergillus niger)は好気的に増殖する糸状菌である[Schusterら、Applied Microbiology and Biotechnology、59(4〜5):426〜435ページ、2002]。クロコウジカビは土壌、廃棄物、堆肥及び腐敗した植物性物質中に天然に存在する。クロコウジカビは温度6℃〜47℃、pH範囲1.4〜9.8で増殖する[Reiss, J.ら、Schimmelpilze Lebensweise、Nutzen、Schaden、Bekaempfung. Springer、1986]。これは空中に飛散する黒みがかった分生子を産生する。産業においては、クロコウジカビは主にクエン酸及びグルコン酸の産生に使用される[Roukas, T.、Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology、25 (6):298〜304ページ、2000]。
【００２３】
サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)は遊離の外側細胞膜を有する偏性嫌気性グラム陰性桿菌である。T.マリティマは1986年にイタリア沖の火山でR. Huberにより発見された。この細菌の最適成長は80℃である。55℃を下回ると増殖は起こらない。T.マリティマは長さ1.5μm〜11μm、幅0.6μmである。これは亜極一鞭毛性鞭毛(subpolar monotric flagellation)を示し、ゆえに自由に動くことができる[HuberらArchives of Microbiology、144(4):324〜333ページ、1986]。T.マリティマは、グルコース、スクロース、デンプン、セルロース及びキシランなどの単純及び複合炭水化物で増殖する[Nelson, K. E.ら、Nature、399(6734):323〜329ページ、1999]。
【００２４】
タラロマイセス・エメルソニ(Talaromyces emersonii)は子嚢菌門に属するトリココマ科に属し、1965年にStolkにより発見された[Stolk, A. C.ら、Journal of Microbiology and Serology、31(3):262ページ、1965]。現在の名称はラサムソニア・エメルソニ(Rasamsonia emersonii)である[Houbraken、Spierenburg、Frisvad. Antonie van Leeuwenhoek、101(2):403〜21ページ、2012]。
【００２５】
トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)はボタンタケ科に属する。これは子嚢菌門に属する。T.ロンギブラキアタムは、1969年にRifaiにより発見された[Rifai, M. A.、Mycological Paters No. 116、Commonwealth Mycological Institute、1969]。この種は既に多くの研究の対象となっている[Bissett, J.、Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique、62(5):924〜931ページ、1984、J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique、69(11):2357〜2372ページ、1991、J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique、69(11):2373〜2417ページ、1991、J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique、69(11):2418〜2420ページ、1991]。
【００２６】
2.本発明の特別な実施形態
本発明は、特に以下の実施形態に関する:
1.セロオリゴマーの産生のための方法であって、
a)セルロース又はセルロース性出発物質が、水性反応媒体中で少なくとも1つのエンドグルカナーゼ(EG)(E.C.3.2.1.4)、特に例えば細菌又は真菌由来の微生物EGを使用して加水分解的に切断され、
b)1つ以上のセロオリゴマー、すなわちセロオリゴマー画分を含む反応産物が、反応媒体から単離される、方法。
【００２７】
2.形成されるセロオリゴマーが、10〜100の範囲の数平均鎖長又は数平均重合度DPNを有する、実施形態1に記載の方法。
【００２８】
3.形成されるセロオリゴマーが、15〜50の範囲、例えば20〜45、25〜40又は30〜35の範囲のDPN値を有する、実施形態1又は2のいずれかに記載の方法。
【００２９】
本発明に従って産生されるセロオリゴマーの鎖長分布は、例えば5〜500、10〜4000、15〜300、20〜2000、又は25〜150の範囲であり得るが、これに限定されない。
【００３０】
4.EGが、バチルス属、アスペルギルス属若しくはサーモトガ属の微生物、特にバチルス・アミロリケファシエンス種、クロコウジカビ種、若しくはサーモトガ・マリティマ種に由来する、天然の、若しくは組換えによって産生され、場合によって遺伝子改変された酵素、又はこれらの天然若しくは組換え酵素の少なくとも2つの組合せである、実施形態1から3のいずれかに記載の方法。
【００３１】
5.酵素的加水分解が、約3〜8、特に4〜7若しくは5〜6の範囲のpHで、及び/又は20〜90、特に30〜80若しくは40〜70℃の範囲の温度で、及び/又は0.1〜100時間、特に1〜72若しくは1〜48時間の間、水性媒体中で行われる、実施形態1から4のいずれかに記載の方法。
【００３２】
6.少なくとも1つのEGが約0.01〜100、例えば1〜50、1.5〜30又は2〜10U/mlの反応混合物の濃度で適用される、実施形態1から5のいずれかに記載の方法。
【００３３】
7.セルロースが、反応混合物の総体積に基づいて0.1〜5又は1〜4又は2〜3%(w/v)の範囲の濃度で使用される、実施形態1から6のいずれかに記載の方法。
【００３４】
8.セルロースが、
a1)セルロースの結晶化度を減少させる前処理段階に供され、
a2)段階1a)のセルロースがEGを使用して酵素的に加水分解される、
実施形態1から7のいずれかに記載の方法。
【００３５】
9.セルロースの結晶化度が、イオン液体、酸、及び/又は力学的エネルギー入力を使用する段階a1)の処理により減少する、実施形態8に記載の方法。
【００３６】
10.イオン液体が、特に1-エチル-3-メチルイミダゾリウムアセテート(EMIM Ac)及び3-メチル-N-ブチルピリジニウムクロリド([C4mpy]Cl)などの、温度100℃未満で液体である塩から選択される、実施形態9に記載の方法。
【００３７】
11.段階a1)において、セルロースがイオン液体中に導入され、場合によって例えば20〜80、25〜60、又は30〜50℃の熱作用により、その中で溶解され、次いで水、有機溶媒又はそれらの混合物を添加することにより沈殿され、その沈殿物が分離され、場合によって洗浄され、液体が場合によって除去される、実施形態10に記載の方法。
【００３８】
12.段階a1)において、酸処理が濃縮リン酸によって行われる、実施形態9に記載の方法。
【００３９】
13.段階a1)において、力学的処理が、例えば1mmガラスビーズ及び/又は約200〜600若しくは300〜500若しくは約400Wの範囲のワット数を用いるボールミルを使用して行われる、実施形態9に記載の方法。
【００４０】
14.処理段階、特に段階a1)及びa2)が、反応産物が単離される前に1度以上繰り返される、実施形態1から13のいずれかに記載の方法。
【００４１】
15.反応がβ-グルコシダーゼ存在下でさらに行われる、実施形態1から14のいずれか1つに記載の方法。
【００４２】
16.食品及び飼料、化粧品又は医薬品の添加物としての、洗剤添加物としての、レオロジー改質剤としての及び有機合成の出発物質としての、実施形態1から15のいずれかに記載の方法により産生されるセロオリゴマーの使用。
【００４３】
3.本発明のさらなる形態
3.1  酵素-使用可能なエンドグルカナーゼ
本発明は、具体的に開示又は使用される、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質又は酵素に限定されず、これらの機能的同等物にも及ぶ。
【００４４】
文献から既知である、本発明に従って使用される酵素のアミノ酸配列の非限定的な例を以下に記述する。
【００４５】
サーモトガ・マリティマ:(配列番号:1)
Nelson K.E.ら、「Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima.」Nature 399:323〜329ページ(1999)
Uniprot: Q9X274
2016524899.tif 000002
【００４６】
クロコウジカビ:(配列番号:2)
van Peij N.N.ら、「The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger.」Appl. Environ. Microbiol. 64:3615〜3619ページ(1998)
Uniprot: O74705
2016524899.tif 000003
【００４７】
バチルス・アミロリケファシエンス(配列番号:3)
Zhang G.ら、「Complete Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208, a Strain for Industrial Production of Guanosine and Ribavirin.」J. Bacteriol. 193:3142〜3143ページ(2011)
Uniprot: F4E3N1」
2016524899.tif 000004
【００４８】
本発明に従って具体的に使用される又は本明細書に記載される、酵素の「機能的同等物」又はアナログは、本発明の範囲内でそれらと異なるが、例えばエンドグルカナーゼ活性などの望ましい生物学的活性は保っているポリペプチドである。
【００４９】
したがって、例えば「機能的同等物」は、使用されるエンドグルカナーゼ活性アッセイにおいて、本明細書で定義されるアミノ酸配列を含む酵素の活性を少なくとも10%又は20%、例えば少なくとも50%又は75%又は90%以上又は以下有する酵素という意味で理解される。さらに、機能的同等物は好ましくはpH2〜11の間で安定であり、有利にはpH3〜10の範囲で最適pHを有し、25℃〜95℃又は20℃〜70℃、例えば約45〜60℃又は約50〜55℃の範囲で最適温度を有する。
【００５０】
エンドグルカナーゼ活性は、各種既知のアッセイを用いて検出可能である。何ら制限を課すことなく、40℃、pH4.5又は6の標準条件下で例えばカルボキシメチルセルロースなどの参照基質を使用するアッセイに言及がなされてよい。
【００５１】
本発明によれば、「機能的同等物」は特に、上記の生物学的活性のうち1つを保ちつつ、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置で、具体的に言及されたアミノ酸以外のアミノ酸を有する「突然変異体」という意味でも理解される。したがって、「機能的同等物」は1つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失及び/又は逆位により得られる突然変異体を含み、上記の改変が、本発明による特性プロファイルを有する突然変異体を生じる限り、任意の配列位置で起こり得る。機能的同等物は特に、突然変異体及び非改変ポリペプチド間の反応性パターンが質に関して一致する場合、すなわち同一の基質が異なる速度で転換される場合にも存在する。好適なアミノ酸置換の例を以下の表にまとめる。
【００５２】
2016524899.tif 000005
【００５３】
上記の意味での「機能的同等物」は、記載されたポリペプチドの「前駆物質」並びにポリペプチドの「機能的誘導体」及び「塩」でもある。
【００５４】
この文脈において、「前駆物質」は望ましい生物学的活性の有無に関わらず、ポリペプチドの天然又は合成の前駆物質である。
【００５５】
「塩」という表現は、カルボキシル基の塩だけでなく、本発明によるタンパク質分子のアミノ基の酸付加塩という意味でも理解される。カルボキシル基の塩はそれ自体が既知である方法で調製可能であり、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩などの無機塩、並びに例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどのアミンなどの有機塩基との塩を含む。酸付加塩、例えば塩酸又は硫酸などの鉱酸との塩、及び酢酸又はシュウ酸などの有機酸との塩などは、同様に本発明の主題である。
【００５６】
同様に、既知の技術を用いて、官能性アミノ酸側基又はそれらのN-若しくはC-末端で、本発明によるポリペプチドの「機能的同等物」を調製することが可能である。このような誘導体は例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニア若しくは第一級若しくは第二級アミンとの反応により得られるカルボン酸基のアミド、アシル基との反応により調製される遊離アミノ基のN-アシル誘導体、又はアシル基との反応により調製される遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体などを含む。
【００５７】
当然のことながら、「機能的同等物」は他の生物から入手可能なポリペプチド及び天然に存在する変異体も含む。例えば配列アラインメントを用いて相同配列領域の領域を特定し、本発明の特定の要件に基づく同等の酵素を決定することが可能である。
【００５８】
「機能的同等物」は同様に、例えば望ましい生物学的機能を有する、本発明によるポリペプチドの断片、好ましくは単一のドメイン又は配列モチーフを含む。
【００５９】
「機能的同等物」はさらに、上記ポリペプチド配列又はそれら由来の機能的同等物のうち1つ、及び、さらにそれらとは機能的に異なり、機能的にN-又はC-末端と連結している(すなわち、融合タンパク質の部分の顕著な相互機能障害を有しない)さらなる異種配列の少なくとも1つを含む融合タンパク質である。このような異種配列の非限定的な例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカー又は酵素である。
【００６０】
本発明に従って含まれる「機能的同等物」も、具体的に開示されるタンパク質の相同体である。これらは、特に開示されるアミノ酸配列のうち1つに対して、Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8)、1988、2444〜2448ページのアルゴリズムにより算出される、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、特に少なくとも85%、例えば90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の相同性(同一性)を有する。本発明による相同ポリペプチドの相同性又は同一性の割合は特に、本明細書で具体的に記載されるアミノ酸配列の1つの、全長ベースでのアミノ酸残基の同一性の割合を意味する。
【００６１】
同一性の割合は、BLASTアラインメント、アルゴリズムblastp(protein-protein BLAST)によって、又は以下に記述されるClustal設定を使用することによっても決定可能である。
【００６２】
可能性のあるタンパク質をグリコシル化する場合、本発明による「機能的同等物」は、グリコシル化のパターンを変化させることで得られる、脱グリコシル化又はグリコシル化された形、及び改変された形で先に記述された種類のタンパク質を含む。
【００６３】
本発明によるタンパク質又はポリペプチドの相同体は、突然変異誘発、すなわちタンパク質の点突然変異、伸長又は切断により発生し得る。
【００６４】
本発明によるタンパク質の相同体は、例えば切断型突然変異などの突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより特定可能である。例えば、タンパク質変異体のライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的ライゲーションにより発生させることが可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から、可能性のある相同体のライブラリーを調製するために使用可能な方法が数多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNA合成装置で行うことが可能であり、合成遺伝子はその後好適な発現ベクターにライゲーションされ得る。遺伝子の縮重セットの使用により、可能性のあるタンパク質配列の望ましいセットをコードする全ての配列を混合物中にもたらすことが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者にとって既知である(例えばNarang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3、Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323、Itakuraら(1984) Science 198:1056、Ikeら(1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００６５】
点突然変異又は切断により調製されたコンビナトリアルライブラリーにおいて遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選択された特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、従来技術において既知である。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により発生した、遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適応可能である。ハイスループット解析を受ける膨大な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も一般的に使用される技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られるベクターライブラリーにより好適な細胞を形質転換し、望ましい活性の検出によってその遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおける機能的突然変異の頻度を増大させる技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発(Recursive Ensemble Mutagenesis、REM)が、相同体を特定するためにスクリーニングテストと組み合わせて使用可能である(Arkin及びYourvan (1992) PNAS 89:7811〜7815ページ、Delgraveら(1993) Protein Engineering 6(3):327〜331ページ)。
【００６６】
さらに、当業者は実施例の方法により、本明細書で使用されるエンドグルカナーゼの機能的突然変異体を発生させるための方法を熟知している。
【００６７】
使用される技術によっては、当業者は完全にランダムな又はより標的を絞った突然変異を遺伝子又は(例えば発現を調節するのに重要な)非コード核酸領域に導入し、次いで遺伝子ライブラリーを構築することが可能である。この目的に必要な分子生物学的方法は当業者にとって既知であり、例えばSambrook及びRussell, Molecular Cloning、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
【００６８】
遺伝子を改変する方法、ひいてはそれらによりコードされるタンパク質を改変する方法は当業者にとって古くから既知であり、例えば
- 遺伝子の個々の、又はより多くのヌクレオチドが標的化された方法で置換される、部位特異的突然変異誘発(Trower MK (編) 1996、In vitro mutagenesis protocols. Humana Press、New Jersey)、
- 任意の遺伝子座で、任意のアミノ酸のコドンが置換又は付加され得る飽和突然変異誘発(saturation mutagenesis)(Kegler-Ebo DM、Docktor CM、DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D、Feigenbutz M、Valcarel R、Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)、
- 誤って作用するDNAポリメラーゼによってヌクレオチド配列が突然変異する、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(エラープローンPCR) (Eckert KA、Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739)、
- 好ましい置換がポリメラーゼによって阻害される、SeSaM法(Sequence Saturation Method). Schenkら、Biospektrum、Vol. 3、2006, 277〜279ページ、
- DNA修復機構の欠損のために、例えばヌクレオチド配列の増加した突然変異率が生じる、突然変異誘発株における遺伝子の継代(Greener A、Callahan M、Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (編) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press、New Jersey)、又は
- 密接に関連した遺伝子のプールが形成されて消化され、断片がポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、ここで全長モザイク遺伝子が鎖の分離及び再アニーリングの反復によって最終的に生産される、DNAシャフリング(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389、Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)
などである。
【００６９】
「指向性進化」(特に、Reetz MT及びJaeger K-E (1999)、Topics Curr Chem 200:31、Zhao H、Moore JC、Volkov AA、Arnold FH (1999)、Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution、In: Demain AL、Davies JE (編) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載)を使用して、当業者は選択的な方法で、さらに大規模に機能的突然変異体を作製することもできる。ここで第1の段階では、各タンパク質の遺伝子ライブラリーが初めに産生され、例えば先に示された方法などを使用することが可能である。遺伝子ライブラリーは好適な方法で、例えば細菌又はファージディスプレイシステムなどにより発現される。
【００７０】
望ましい特性にほぼ相当する特性を有する機能性突然変異体を発現する、宿主生物の関連遺伝子は、さらなる突然変異サイクルに供し得る。存在する機能性突然変異体が適切な測定において望ましい特性を有するまで、突然変異、及び選択又はスクリーニングの段階が反復的に繰り返され得る。この反復手順の結果として、限られた数の突然変異、例えば1〜5つの突然変異が段階的に起こり、各酵素の特性に対するそれらの影響について評価、選択され得る。その後、選択された突然変異体が同一の方法でさらなる突然変異段階に供され得る。研究される各突然変異体の数はそれにより顕著に減少し得る。
【００７１】
好適な発現構築物は、特に本発明に従って使用可能であるエンドグルカナーゼの組換え体調製のために使用可能である。
【００７２】
本発明の主題はさらに、調節核酸配列の遺伝的制御下で、本発明による酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物、及びこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターである。
【００７３】
本発明によれば、「発現単位」は発現活性を有し、本明細書で定義されるプロモーターを含み、発現される核酸又は遺伝子に機能的に連結された後にこの核酸又はこの遺伝子の発現、すなわち転写及び翻訳を調節する核酸を意味するものと理解される。こういった理由で、これはこの文脈において「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、さらなる調節因子、例えばエンハンサーなどが存在し得る。
【００７４】
本発明によれば、「発現カセット」又は「発現構築物」は、発現される核酸又は発現される遺伝子に機能的に連結されている発現単位を意味するものと理解される。したがって、発現単位とは対照的に、発現カセットは転写及び翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写及び翻訳の結果、タンパク質として発現される核酸配列も含む。
【００７５】
本発明の文脈内で、「発現」又は「過剰発現」という語は、対応するDNAによりコードされる、微生物における1つ以上の酵素の細胞内活性が生み出されること又は増大することについて記載するものである。この目的のために、例えば生物に遺伝子を導入すること、異なる遺伝子によって現存の遺伝子を置換すること、遺伝子のコピー数を増大させること、強力なプロモーターを使用すること、又は高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、これらの手段を任意で組み合わせることが可能である。
【００７６】
好ましくは、本発明によるこのような構築物は、各コード配列の5'-上流プロモーター及び3'-下流ターミネーター配列、並びにいずれもコード配列に作動可能に(operably)連結されるさらなる通常の調節因子を任意で含む。
【００７７】
本発明によれば、「プロモーター」「プロモーター活性を有する核酸」又は「プロモーター配列」は、転写される核酸との機能的連結においてこの核酸の転写を調節する核酸を意味するものと理解される。
【００７８】
この文脈において、「機能的な」又は「作動可能な」連結は、例えば、プロモーター活性を有する核酸、並びに転写される核酸配列、並びに場合によって、さらなる調節因子、例えば各調節因子が核酸配列の転写に際しその機能を果たし得るように、核酸の転写を確実にする核酸配列、例えばターミネーターのうち1つの連続的配置を意味するものとして理解される。化学的な意味での直接的連結は必ずしもこの目的に必要ではない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列などは、より遠く離れた距離に位置し、又は実際に他のDNA分子から、標的配列に対しそれらの機能を発揮することも可能である。好ましい配置は、2つの配列が互いに共有結合するように、転写される核酸配列がプロモーター配列の後方(すなわち3'末端側)に位置する配置である。この文脈において、プロモーター配列及び組換え的に発現される核酸配列間の距離は200塩基対未満、又は100塩基対未満、又は50塩基対未満であり得る。
【００７９】
プロモーター及びターミネーターに加えて言及され得る調節因子のさらなる例は、標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製開始点などである。好適な調節配列は、例えばGoeddel、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、CA (1990)に記載されている。
【００８０】
本発明による核酸構築物は、特に、遺伝子発現を制御するため、例えば増大させるために、コード配列が有利には作動可能に又は機能的に1つ以上の調節シグナルに連結しているものを含む。
【００８１】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が実際の構造遺伝子の上流になおも存在してもよく、場合によって、自然調節がオフに切り換えられ、遺伝子発現が増大するように遺伝的に改変してもよい。しかし、核酸構築物は構造においてより単純、すなわち追加の調節シグナルがコード配列の上流に挿入されておらず、自然プロモーターがその調節とともに除去されていなくてもよい。代わりに、自然調節配列は、調節がもはや起こらず遺伝子発現が増大するように突然変異している。
【００８２】
好ましい核酸構築物は、有利にはプロモーターに機能的に連結した、1つ以上の既に言及された「エンハンサー」配列も含み、これらにより核酸配列の発現の増大が可能になる。また、DNA配列の3'末端側に、さらなる調節因子又はターミネーターなどの、追加の有利な配列を挿入することが可能である。本発明による核酸は、1つ以上のコピーとして構造中に存在し得る。抗生物質耐性又は栄養要求性(auxotrophism)相補的遺伝子などのさらなるマーカーが、場合によっては構築物上に選択のため構築物においてさらに存在し得る。
【００８３】
好適な調節配列の例は、有利にはグラム陰性細菌において使用される、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP (rhaPBAD)SP6、lambda-PR又はlambda-PLプロモーターなどのプロモーター中に存在する。さらなる有利な調節配列が、例えばグラム陽性プロモーターamy及びSPO2、酵母又は真菌プロモーターADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に存在する。調節のための人工プロモーターも使用可能である。
【００８４】
発現のために、核酸構築物は宿主生物、有利にはベクター、例えば宿主において遺伝子の最適な発現を可能にするプラスミド又はファージなどに挿入される。プラスミド及びファージに加え、ベクターも当業者に既知の他のベクター全て、つまり、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、IS因子、ファスミド、コスミド並びに直鎖又は環状DNAなどを意味するものと理解される。これらのベクターは宿主生物における自律複製、又は染色体複製を受けやすい。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を構成する。
【００８５】
好適なプラスミドは、例えば大腸菌(E. coli)ではpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11又はpBdCI、ストレプトマイセス属ではpIJ101、pIJ364、pIJ702又はpIJ361、バチルス属ではpUB110、pC194又はpBD214、コリネバクテリウム属ではpSA77又はpAJ667、菌類ではpALS1、pIL2又はpBB116、酵母では2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13又はpEMBLYe23、植物ではpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004又はpDH51である。上記のプラスミドは可能性のあるプラスミドを小規模に選択したものである。さらなるプラスミドは当業者に周知であり、例えば書籍Cloning Vector(Eds. Pouwels P. H.ら、Elsevier、Amsterdam-New York-Oxford、1985、ISBN 0 444 904018)などに見られる。
【００８６】
ベクターのさらなる形態において、本発明による核酸構築物又は本発明による核酸を含むベクターは、有利には直鎖DNAの形で微生物に導入され、非相同又は相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。この直鎖DNAはプラスミドなどの線形化ベクター、又は本発明による核酸構築物若しくは核酸のみで構成されていてよい。
【００８７】
生物における異種遺伝子の最適な発現のために、生物において使用される特定の「コドン使用頻度」に従って核酸配列を改変することが有利である。「コドン使用頻度」は問題の生物の他の既知の遺伝子のコンピュータ評価により容易に決定可能である。
【００８８】
本発明による発現カセットは、好適なプロモーターを、好適なコードヌクレオチド配列及びターミネーター又はポリアデニル化シグナルに融合させることにより調製される。この目的のために、例えばT. Maniatis、E.F. Fritsch及びJ. Sambrook、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY (1989)並びにT.J. Silhavy、M.L. Berman及びL.W. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY (1984)並びにAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)などに記載される通常の組換え及びクローニング技術が使用される。
【００８９】
発現のために、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物が好適な宿主生物、有利には宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的なベクターに挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば「Cloning Vectors」(Pouwels P. H.ら編、Elsevier、Amsterdam-New York-Oxford、1985)などに見られる。
【００９０】
本発明によるベクターを用いて、例えば本発明による少なくとも1つのベクターにより形質転換され、本発明に従って使用可能なエンドグルカナーゼの産生のために使用可能である組換え微生物を生み出すことが可能である。有利には、本発明による上記の組換え構築物が好適な宿主系に導入され、発現される。この文脈において、上記の核酸を各発現系で発現させるために、当業者に既知のクローニング及びトランスフェクション方法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを使用することが好ましい。好適な系が、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、F. Ausubelら編、Wiley Interscience、New York 1997、又はSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。
【００９１】
本発明による核酸又は核酸構築物に好適な組換え宿主生物は、原則として全ての原核生物又は真核生物である。細菌、真菌又は酵母などの微生物を宿主生物として使用することが有利である。グラム陽性又はグラム陰性細菌、好ましくは腸内細菌科、シュードモナス科、リゾビウム科、ストレプトマイセス科又はノカルジア科の細菌、特に好ましくはエスケリキア属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、ノカルジア属、バークホルデリア属、サルモネラ属、アグロバクテリウム属、クロストリジウム属、又はロドコッカス属の細菌を使用することが有利である。大腸菌の属及び種が非常に特に好ましい。さらなる有利な細菌がα-プロテオバクテリア、β-プロテオバクテリア又はγ-プロテオバクテリアの群にさらに見られ得る。
【００９２】
この文脈において、本発明による宿主生物は好ましくは、先に定義されたエンドグルカナーゼをコードする核酸配列、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸構築物又はベクターのうち少なくとも1つを含む。
【００９３】
宿主生物によっては、本発明による方法において使用される生物は当業者に既知の方法で増殖又は培養される。一般に、微生物は、通常は糖の形での炭素供給源、酵母抽出物又は硫酸アンモニウムなどの塩などの、通常は有機窒素供給源の形での窒素供給源、鉄、マンガン、マグネシウム塩などの微量元素、及び任意でビタミンを含む液体培地において、酸素を供給しつつ、温度0℃〜100℃の間、好ましくは10℃〜60℃の間で増殖される。この文脈において、液体培地のpHは固定の値に維持されてもよい、すなわち培養中に調節されてもされなくてもよい。培養は回分式、半回分式、又は連続式で行われてよい。栄養は発酵開始時に供給してもよく、半連続的に、又は連続的に供給してもよい。
【００９４】
本発明に従って使用可能なエンドグルカナーゼ、又はそれらの機能的な、生物学的に活性な断片の組換え産生のために、この酵素を産生する微生物が培養され、酵素の発現が任意で誘導され、酵素が培養物から単離される。したがって、ポリペプチドは必要であれば産業規模でも産生され得る。
【００９５】
本発明に従って産生された微生物は、回分法、流加法又は反復流加法により、連続的に又は不連続的に増殖可能である。既知の培養方法の概要がChmielによるテキスト(Bioprozβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag、Stuttgart、1991) [Bioprocess engineering 1. Introduction to bioprocess technology])又はStorhasによるテキスト(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral units] (Vieweg Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、1994))に見られる。
【００９６】
使用される培養培地は問題の株の要求を好適に満たさなければならない。様々な微生物のための培養培地についての記載が、the American Society for Bacteriologyのマニュアル「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D. C.、USA、1981)に見られる。
【００９７】
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常1つ以上の炭素供給源、窒素供給源、無機塩、ビタミン及び/又は微量元素を含む。
【００９８】
好ましい炭素供給源は、単糖、二糖又は多糖などの糖である。非常に良好な炭素供給源の例はグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン又はセルロースである。糖は糖蜜などの複合化合物によって、又は精糖の他の副産物によって培地に添加されてもよい。各種炭素供給源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能性のある炭素供給源は、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナツ脂などの油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸又はリノール酸などの脂肪酸、例えばグリセロール、メタノール又はエタノールなどのアルコール、並びに例えば酢酸又は乳酸などの有機酸である。
【００９９】
窒素供給源は、通常有機若しくは無機窒素化合物、又はこれらの化合物を含む物質である。窒素供給源の例は、アンモニア気体、又は硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、若しくは硝酸アンモニウムなどのアンモニア塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、又はコーンスティープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などの複合窒素供給源を包含する。窒素供給源は個々に又は混合物として使用可能である。
【０１００】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物塩、リン酸塩又は硫酸塩を包含する。
【０１０１】
無機硫黄含有化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物だけでなく、メルカプタン及びチオールなどの有機硫黄化合物なども、硫黄供給源として使用可能である。
【０１０２】
リン酸、リン酸二水素カリウム若しくはリン酸水素二カリウム、又は対応するナトリウム含有塩が、リン供給源として使用可能である。
【０１０３】
溶液中の金属イオンを維持するために、金属イオン封鎖剤が培地に添加されてもよい。特に好適な金属イオン封鎖剤は、カテコール若しくはプロトカテクエートなどのジヒドロキシフェノール、又はクエン酸などの有機酸を包含する。
【０１０４】
通常、本発明に従って使用される発酵培地は、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩及びピリドキシンを含む、ビタミン又は増殖促進剤などの他の増殖因子も含む。増殖因子及び塩は、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分からしばしば得られる。さらに、好適な前駆物質が培養培地に添加されてよい。培地中の化合物の正確な組成は、問題の実験に大いに依存し、個々の場合について個別に決定される。培地の最適化についての情報は、テキスト「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(P.M. Rhodes、P.F. Stanbury編、IRL Press (1997) 53〜73ページ、ISBN 0 19 963577 3)に見られる。増殖培地は、Standard 1 (Merck)又はBHI (brain heart infusion、DIFCO)などの商業的供給源からも入手可能である。
【０１０５】
培地の成分全てが、加熱滅菌(1.5bar及び121℃で20分間)又は濾過滅菌のいずれかを用いて滅菌される。成分は一緒に、又は適切であれば別々に滅菌されてもよい。培地の成分は全て、発酵の開始時に存在していてもよく、必要であれば連続式で、又は回分式で添加されてもよい。
【０１０６】
培養温度は、通常は15℃〜45℃の間、好ましくは25℃〜40℃であり、実験中一定に保つか又は変化させてよい。培地のpHは5〜8.5の範囲、好ましくは約7.0であるべきである。発酵のためのpHは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくはアンモニア水などの塩基化合物、又はリン酸若しくは硫酸などの酸性化合物の添加により、発酵中制御され得る。消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどが泡の形成を制御するために使用可能である。プラスミドの安定性を維持するために、好適な、選択的に作用する物質、例えば抗生物質などが培地に添加されてもよい。好気状態を維持するために、酸素又は酸素含有気体混合物、例えば周囲の空気などが培養物中に通される。培養温度は通常20℃〜45℃である。培養は、望ましい産物の最大量が形成されるまで継続される。この目的は通常、10時間〜160時間以内で実現される。
【０１０７】
その後、発酵ブロスがさらに処理される。必要とされるものによっては、全て又は一部のバイオマスが、例えば遠心処理、濾過、デカンティング又はこれらの方法の組合せなどの分離方法により発酵培養液から除去されるか、前記培養液中に完全に残され得る。
【０１０８】
ポリペプチドが培養培地中に分泌されない場合、細胞を破壊し、通常のタンパク質単離方法により溶解物から産物を得ることも可能である。細胞は任意で、高周波超音波により、例えばフレンチプレッサーセルなどでの高圧により、オスモリシスにより、洗剤、溶菌酵素若しくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、又は上記の方法のうちいくつかの組合せにより破壊され得る。
【０１０９】
ポリペプチドは分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、Q-セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーなどの既知のクロマトグラフィー技術を使用して、また限外濾過、結晶化、塩析、透析及び未変性ゲル電気泳動などの他の一般的な方法を使用しても精製可能である。好適な方法は、例えばCooper, T.G.、Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical working methods]、Verlag Walter de Gruyter、Berlin、New York、又はScopes, R.、Protein Purification、Springer Verlag、New York、Heidelberg、Berlinに記載されている。
【０１１０】
組換えタンパク質を単離するために、ベクター系、又は特定のヌクレオチド配列によりcDNAを伸長し、それによって、例えばより単純な精製の目的などに役立つ、改変されたポリペプチド若しくは融合タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。好適であるこのような改変は、例えばヘキサヒスチジンアンカー、又は抗原として抗体に認識され得るエピトープとして知られる改変など、アンカーとして作用する「タグ」として知られるものなどである(Harlow, E.及びLane, D.、1988、Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載)。これらのアンカーは、タンパク質を固形の担体、例えばクロマトグラフィーカラムなどに充填され得るポリマーマトリクスなどに接着させる、又はタンパク質をマイクロタイタープレート若しくは任意の他の担体に接着させる役割を果たし得る。
【０１１１】
同時に、これらのアンカーは、タンパク質の特定のために使用されてもよい。タンパク質を特定するために、蛍光染色などの通常のマーカー、基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する酵素マーカー、又は放射性マーカーが、さらに単独又はタンパク質の誘導体化のためにアンカーと組み合わせて使用可能である。
【０１１２】
エンドグルカナーゼは遊離又は固定化された形で使用可能である。固定化酵素は、不活性の担体に固定された酵素を意味するものと理解される。好適な担体材料及びその上に固定化された酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1 069 183及びDE-OS 100193773、及びそれらの中で引用されている参考文献より既知である。これらの文献の関連開示を全体として参照されたい。好適な担体材料は、例えば粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換体材料、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール/ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、並びにポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリオレフィンを含む。担持された酵素の産生のために、担体材料は通常微粒子の形で使用され、多孔質の形であることが好ましい。担体材料の粒径は、通常5mm以下、特に2mm以下である(粒径分布曲線)。同様に、全細胞触媒としてエンドグルカナーゼを使用する場合、遊離又は固定化された形が選択され得る。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウム及びカラギーナンなどである。酵素及び細胞は、グルタルアルデヒドと直接架橋(CLEAsへの架橋)していてもよい。対応する、及びさらなる固定化技術が、例えばJ. Lalonde及びA. Margolin「Immobilization of Enzymes」in K. Drauz and H. Waldmann、Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002、Vol. III、991〜1032ページ、Wiley-VCH、Weinheimなどに記載されている。
【０１１３】
3.2セロオリゴマー産生
セロオリゴマーは、エンドグルカナーゼを、場合によってイオン液体及び/又は機械的処理によるセルロースの処理と組み合わせて用いる、単一又は複数の酵素的加水分解により産生される。最適な順序は単純な予備実験により当業者が決定可能である。
【０１１４】
a)イオン液体によるセルロース処理
この目的のために、セルロースを例えば低温のEMIM Ac中で懸濁させる。この目的のために、例えばEMIM Ac 1mlあたり0.02gのセルロースを、液体が透明に変化するまで加熱する。その後セルロースを水により沈殿させる。沈殿したセルロースを、イオン液体及び沈殿のために使用された水から真空濾過により分離する。その後セルロースを水で洗浄する。
【０１１５】
b)機械的セルロース処理
10%(w/w)のセルロースを蒸留水で懸濁させる。ボールミル(例えばBeadbeater、Biospec Products)を取扱説明書の通りに1mmガラスビーズを用いて準備し、セルロース懸濁液で満たしてすり潰す。冷却後、セルロースを再度すり潰す。この工程を氷上で数回繰り返す。その後、溶出水が透明に流れるまで、蒸留水を使用してセルロースをガラスビーズから溶出させる。溶出された懸濁液を集め、その後遠心処理する。前処理されたセルロースから水をデカントし、セルロースを酵素的加水分解に使用する。
【０１１６】
c)酵素的セルロース加水分解
新たに前処理されたセルロースを酵素的加水分解に使用する。好適な緩衝液(酢酸緩衝液、リン酸緩衝液又はトリス緩衝液、0.01〜0.25M、pH4〜7)を加水分解のために、例えば0.1M酢酸Na緩衝液pH4.5及び0.1Mリン酸Na-K緩衝液pH6に調製する。最適緩衝液濃度及びpHは、わずかな予備実験を行うことで確立可能である。
【０１１７】
セルラーゼを望ましい濃度の緩衝液に溶解させる。セルラーゼ溶液を秤量したセルロースに添加し、数秒間ボルテックスミキサーで混合する。他に記述されない限り、2mlエッペンドルフ反応容器中のセルロース約10mg(乾燥重量)をセルラーゼ溶液1mlとともに加水分解に使用し、これらをサーモミキサーにおいて40℃及び800min-1で望ましい時間インキュベートする。反応を終了させるために、試料を卓上遠心機において14000min-1で3分間遠沈させる。いくつかの所定の予備実験後、より大きなバッチでの対応する手順も可能となる。
【０１１８】
c)さらなる酵素的加水分解
不完全に加水分解されたセルロースをさらに分解するために、既に加水分解されたセルロースをイオン液体により再処理し、処理されたセルロースをもう一度酵素的加水分解することが可能である。これは、先に記載されたようにイオン液体により前処理した後、先に記載されたように行われる。
【０１１９】
本発明は、以下の具体的な実施形態を参照して、実験部分においてより詳細に説明されるであろう。
【０１２０】
3.3適用
適用分野は、列挙によりそれらを限定しようとするものではないが、例えば繊維強化材又は表面活性物質若しくは製剤(消泡剤、レオロジー改質剤など)の改変の分野である。
【実施例】
【０１２１】
実験部分
I.材料
セルロース:
本発明に従って、異なる特性プロファイルを有する各種セルロース基質を使用した。セルロース基質は、その重合度又は鎖長分布、及び結晶化度及び有効表面の点で異なる。表1は使用した基質の概要を示す。
【０１２２】
【表１】
2016524899.tif 000006
【０１２３】
セルロース基質の重合度及び鎖長分布をGPCにより決定する。この測定を行うために、試料を現存の方法により誘導体化し、その後GPCにより測定した[Rinaldiら、Angewandte Chemie-International Edition、47(42):8047〜8050ページ、2008、Rinaldiら、Chemsuschem、3(2):266〜276ページ、2010]。本発明に従って分析された試料はもはや代替のGPC法のおかげで、GPC測定のために誘導体化される必要がない[Engelら、2012、Biotechnology for Biofuels 5:77]。表1は、本発明に従って使用されたGPC測定システムにより決定された基質の重合度を示す。
【０１２４】
酵素:
【表２】
2016524899.tif 000007
【０１２５】
II.器材
【表３】
2016524899.tif 000008
【０１２６】
【表４】
2016524899.tif 000009
【０１２７】
【表５】
2016524899.tif 000010
【０１２８】
III.方法
1.イオン液体によるセルロースの前処理
セルロースを低温のEMIN Ac中に懸濁させる。この目的のために、EMIM Ac50mlあたり0.75gのセルロースを、液体が透明に変化するまで少なくとも40分間80℃に加熱する。その後、セルロースを水400mlにより沈殿させる。沈殿したセルロースを、イオン液体及び沈殿のために使用された水から、メッシュサイズ0.2μmのセルロースアセテートフィルターを使用する真空濾過により分離する。その後セルロースを水500mlで3回洗浄する。
【０１２９】
2.機械的セルロース前処理
10%(w/w)のセルロースを蒸留水中に懸濁させる。ボールミル(Beadbeater、Biospec Products)を取扱説明書の通りに1mmガラスビーズを用いて準備し、セルロース懸濁液で満たして3分間すり潰す。その後、セルロースを再度すり潰すことが可能になるまで、ボールミルを3分間冷却しなければならない。この手順を氷上で5回繰り返す。その後、溶出水が透明になるまで、蒸留水によりセルロースをガラスビーズから溶出させる。溶出された懸濁液を集め、その後4000min-1で3分間遠心処理する(Rotina 35R)。前処理されたセルロースから水をデカントし、セルロースを酵素的加水分解に使用する。
【０１３０】
3.酵素的セルロース加水分解
新たに前処理されたセルロースを酵素的加水分解に使用する。セルロースは前処理後に乾燥されていないため、湿重量を乾燥重量に変換しなければならない。この文脈において、前処理されたセルロースの一部を乾燥することにより先に乾燥重量を決定することは、数日かかるために不可能である。したがって、膨潤率を算出するために、前処理の結果として5%のセルロース損失を仮定する。前処理されたセルロースの湿重量を決定し、前処理に使用された重量の95%で割る。決定された膨潤率は次に、前処理された湿ったセルロースの必要量を算出するのに役立つ。湿重量は前処理後に変化し得るため、この倍率は各前処理後に再決定しなければならない。0.1M酢酸Na緩衝液pH4.5及び0.1Mリン酸Na-K緩衝液pH6を加水分解のために調製する。
【０１３１】
クロコウジカビ、T.ロンギブラキアタム及びT.エメルソニエンドグルカナーゼ、並びにクロコウジカビβ-グルコシダーゼを望ましい濃度で酢酸Na緩衝液に溶解させる。T.マリティマ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを望ましい濃度でリン酸Na-K緩衝液に溶解させる。セルラーゼ溶液を秤量したセルロースに添加し、数秒間ボルテックスミキサーで混合する。他に記述されない限り、2mlエッペンドルフ反応容器中のセルロース10mg(乾燥重量)をセルラーゼ溶液1mlとともに加水分解に使用し、これらをサーモミキサーにおいて40℃及び800min-1で望ましい時間インキュベートする。反応を終了させるために、試料を卓上遠心機において14000min-1で3分間遠沈させ、上清を除去し、別のエッペンドルフ反応容器に移し替える。ペレット及び上清を-80℃で凍結させ、後の時点で解析することができる。
【０１３２】
4.イオン液体による新たな前処理後の2回目の酵素的加水分解(IL再開)
セルロースにおける構造特性又は構造変化、例えば結晶化度若しくは再結晶化度による不完全なセルロース加水分解を研究するために、既に加水分解されたセルロースをイオン液体により再処理し、処理されたセルロースを再度酵素的加水分解する。イオン液体により前処理されたセルロースの加水分解後にIL再開を行う。各緩衝液中の10U/mlエンドグルカナーゼ及び3U/mlβ-グルコシダーゼを加水分解の両段階に使用する。
【０１３３】
新たに加水分解されたセルロースがIL再開に使用されるため、加水分解後のセルロース損失が算出される。この目的のために、使用された5種のエンドグルカナーゼによる加水分解後のセルロース損失を先に決定しなければならない(以下を参照のこと)。決定されたセルロース損失は加水分解後のセルロース量(乾燥重量)を算出するために使用される。加水分解後に得られるペレットを80℃で2時間、EMIM Acに溶解させる。セルロース試料中に存在する水分がEMIM Acのセルロース溶解許容量を減少させるため、EMIM Acの必要量はセルロースの量及び水分含有量によって決まる。その後、水を添加することによりセルロースをEMIM Acから沈殿させる。セルロースを水で3回洗浄する。液体を分離するために、セルロースを4000min-1で3分間遠心処理し(Rotina 35R)、次いで液体をデカントする。セルロース試料の湿重量を秤量により決定する。試料の決定された湿重量及び加水分解後の算出された乾燥重量を、試料の膨潤率を決定するために使用する。この方法でセルラーゼにより精製されたセルロースは、その後2回目の加水分解に使用される。セルロースの湿重量を決定するために、先に決定された膨潤率を使用する。
【０１３４】
IV.解析方法
1.有機ゲル浸透クロマトグラフィー
セルロース試料の鎖長分布を決定するために、有機ゲル浸透クロマトグラフィー(GPCO)を使用する。GPCOを行うために、加水分解からのセルロース試料を凍結乾燥し、次いで凍結乾燥物を80℃でDMF/19%(v/v)EMIM Ac中に溶解させる。溶解したセルロースを0.1μm PT-FEフィルターで濾過し、濾液をHPLCガラス容器に移し替える。上記の機器類(表3)を用いるGPCO系を、以下の条件での解析に使用する。
【０１３５】
【表６】
2016524899.tif 000011
【０１３６】
濃度をRI検出器により検出する。セルロース鎖のモル質量を散乱光検出器により決定する。セロオリゴマーの検出限界は重合度約10である。DPW及びDPN両方を、ASTRAソフトウェアを用いて決定する。
【０１３７】
2.水性ゲル浸透クロマトグラフィー
水性加水分解上清における糖の組成を決定するために、水性ゲル浸透クロマトグラフィー(GPCW)を使用する。水性GPCのために、加水分解からの上清を濾過滅菌(0.2μm)し、HPLCガラス容器に移し替える。表4の要素を用いるGPC系を、以下の条件での解析に使用する。
【０１３８】
【表７】
2016524899.tif 000012
【０１３９】
Megazyme(アイルランド)からのグルコース及びセロオリゴマー(セロビオース[C2]〜セロヘキサオース[C6])を較正に使用する。保持時間は27〜31.5分である。分析対象をRI検出器により検出する。
【０１４０】
3.乾燥物決定
加水分解に使用されるセルロースの正確な量を事後決定するために、前処理されたセルロースの乾燥物を決定する。この目的のために、エッペンドルフ反応容器をラベルし、80℃で3日間乾燥する。重量を記録後、エッペンドルフ反応容器を特定の量の湿ったセルロースで満たし、重量を記録する。その後、満たされたエッペンドルフ反応容器を80℃で乾燥する。乾燥後、エッペンドルフ反応容器をもう一度秤量する。膨潤率を空の湿重量、湿重量及び乾燥重量から決定する。新たに前処理されたセルロースを全ての実験に使用するため、決定された膨潤率は、加水分解実験のために算出される値をその後立証するのに役立つのみである。
膨潤率=湿重量/乾燥重量
【０１４１】
4.セルロース損失決定
セルロース損失決定により、可溶性の糖及びセロオリゴマーに分解されたセルロースの量の決定が可能になる。セルロース損失を決定するために、セルロース乾燥物30mgを上記の方法により加水分解する。
【０１４２】
しかし、セルロースは遠心処理により緩衝液から分離されない。ポアサイズ0.2μmのセルロースアセテートフィルターの重量を記録し、加水分解されたセルロース懸濁液をフィルターにより濾過する。フィルターを、加水分解されたセルロースとともに蒸留水10mlで3回洗浄し、80℃で3日間乾燥する。乾燥後、セルロースアセテートフィルターを乾燥されたセルロースとともに秤量し、重量を記録する。セルロース損失は、加水分解に使用されたセルロース及びセルロース乾燥後の重量間の重量差から決定可能である。
【０１４３】
セルロースに吸着された任意のセルラーゼがこの方法により除去されないため、重量はかなり大きく決定される傾向にある。加水分解されていないセルロースの場合、付着している可能性のあるセルラーゼ量は0.8%〜2.3%の間になる。グルコース及び可溶性セロオリゴマーの産生により、セルラーゼの量は不溶性セルロースと関連して加水分解の間増大する。セルロースが70%減少した場合、そこへ付着している可能性のあるセルラーゼ量は最大7.6%に達する。したがって、可溶性の糖及びセロオリゴマーが形成された結果としてのセルロースの実際の損失は、この方法により決定されるよりもわずかに大きい。
【０１４４】
5.高速液体クロマトグラフィー
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、加水分解混合物の水性上清におけるグルコース及びセロビオースの濃度の決定が可能になる。HPLCを行うために、加水分解からの上清を濾過滅菌し、HPLCガラス容器に移し替える。以下の条件でHPLC(表5)を解析に使用する。
【０１４５】
【表８】
2016524899.tif 000013
【０１４６】
6.  4-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドアッセイ
4-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドアッセイ(PAHBAHアッセイ)により、加水分解混合物の水性上清における還元糖のモル濃度の決定が可能になる。可溶性の還元糖はPAHBAH試薬と反応して410nmで光学的に測定可能な黄色色素を生じる。較正目的のために、グルコース較正系列が濃度範囲0.025g〜0.5g/lで、使用された緩衝液により確立される。
【０１４７】
組成を以下の表に列挙する2つの試薬(A及びB)を、PAHBAHアッセイのために調製しなければならない。PAHBAHアッセイを行う前に、作用試薬を試薬A及びB(割合1:10)から調製する。前者は数時間しか持たず、ゆえにPAHBAHアッセイを行う直前に調製しなければならない。アッセイされる試料及び較正液を作用試薬と1:3及び1:5の割合で混合し、100℃で15分間インキュベートする。試料及び標準液を室温まで冷却した後、光度計において410nmで測定する。可溶性の還元糖及びセロオリゴマーの量は、線形回帰により決定される較正線を用いてmol/mlで決定可能である。
【０１４８】
【表９】
2016524899.tif 000014
【０１４９】
7.ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
Life Technologies(California、USA)からのSDSゲル系を用いた、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDSゲル電気泳動)を、使用される酵素の純度を確かめるために使用した。
【０１５０】
転換例
水中での可溶性に近いサイズのセロオリゴマーを調製するために、3つのセルロース基質、Avicel、α-セルロース及びSigmacell、並びに5つのエンドグルカナーゼ及び2つのβ-グルコシダーゼによる実験をまず行った。実験開始前に、使用された酵素を純度について試験し、使用されたセルロースを各反応緩衝液中で膨潤させた後のサイズ分布について試験した。他に記述されない限り、IL前処理をまず行い、その後酵素的加水分解を全ての酵素的加水分解のために行った。3種のセルロースをまず全てのエンドグルカナーゼにより2時間加水分解した。その後、グルコース及び可溶性セロオリゴマー産生が最も小さい3種のエンドグルカナーゼの反応を以下の実験で研究した。
【０１５１】
[実施例1：セルロース基質Avicel、α-セルロース及びSigmacellのGPCO]
酵素的に加水分解されていない3種のセルロース基質Avicel、α-セルロース及びSigmacellのGPCOを行うために、これら3種の基質の試料を40℃で1日間、緩衝液中でインキュベートした。次いで、それらを加水分解試料と同様にGPCOのために調製し、その後GPCOにより解析した。
【０１５２】
Avicelについては、鎖長分布の決定によって酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液について同様の結果を得た。リン酸緩衝液中でインキュベートされたα-セルロース及びSigmacell試料の鎖長分布は、より長い鎖への曲線の比例移行を示す。この観察結果の原因ははっきりしていない。酢酸緩衝液中でインキュベートされた試料は、緩衝液中でインキュベートされなかった試料と比較してより長い鎖へ移動しない。以下では、先に酢酸緩衝液中でインキュベートされ、その後凍結乾燥された基質試料を、酵素的分解を行わないα-セルロース及びSigmacellの鎖長分布を示すための参照として使用する。
【０１５３】
[実施例2：クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス、T.マリティマ、T.ロンギブラキアタム及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解］
クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解をGPCOにより解析した。
【０１５４】
クロコウジカビ
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Avicel、
10U/mlクロコウジカビエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１５５】
結果:エンドグルカナーゼなしでの試料の鎖長分布は、10〜1000グルコース単位の間であり、最大値が250である。クロコウジカビエンドグルカナーゼによる5分間の加水分解後、鎖長分布の上限の、より短い鎖長への700グルコース単位の移行が観察される。この反応時間後の鎖長分布は10〜300グルコース単位の間である。分布の最大値は90グルコース単位である。5分〜24時間の間、鎖長分布の上限がより短い鎖長へ100グルコース単位移行する。24時間後、曲線は10〜200グルコース単位の間となり、70グルコース単位に最大値を有する。
【０１５６】
B.アミロリケファシエンス
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Avicel、
10U/ml B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼ、
3U/mlアグロバクテリウムの種のβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1Mリン酸緩衝液pH6
【０１５７】
結果:エンドグルカナーゼなしでの試料の鎖長分布は10〜700グルコース単位の間であり、最大値が250である。B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解についても、鎖長分布の上限の、より短い鎖への移行が20分後に観察され得る。2時間試料の鎖長分布は、20分間試料と比較してより短い鎖長へ150グルコース単位移行する。2時間及び24時間の間で試料の曲線は一致する。したがって、基質はそれ以上分解されない。24時間の加水分解後、10〜200グルコース単位の間であり、約65グルコース単位に最大値を有する鎖長分布が得られる。
【０１５８】
T.マリティマ
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Avicel、
10U/ml T.マリティマエンドグルカナーゼ、
3U/mlアグロバクテリウムの種のβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1Mリン酸緩衝液pH6
【０１５９】
エンドグルカナーゼなしでの試料のGPCO測定は、10〜700グルコース単位の間の鎖長分布を示す。T.マリティマエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解の初めの5分間、鎖分布の上限の、より短い鎖長への移行が観察される。これはクロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解に類似している。5分間試料は15〜300グルコース単位の間の鎖長分布を示す。24時間後の実験終了まで、鎖長分布の上限はより短い鎖長へ移行し続ける。この反応時間後、鎖長分布は15〜300グルコース単位の間となり、最大値は90グルコース単位となる。
【０１６０】
T.ロンギブラキアタム
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Avicel、
10U/ml T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１６１】
既に言及されたクロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解と比較して、T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解はより遅く進行する。
【０１６２】
5分間の加水分解後の、上記のエンドグルカナーゼについての鎖長分布の上限は300〜400グルコース単位の間となる。T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼの場合は20分後に初めてこうなる。しかし、24時間後の、10〜200グルコース単位、及び最大値60グルコース単位の鎖長は、クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマエンドグルカナーゼの対応する鎖長分布に匹敵する。
【０１６３】
T.エメルソニ
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Avicel、
10U/ml T.エメルソニエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１６４】
エンドグルカナーゼなしでの試料の鎖長分布は10〜700グルコース単位の間であり、最大値が250グルコース単位である。T.エメルソニエンドグルカナーゼによるAvicelの加水分解において、鎖長分布の上限は加水分解の初めの4時間、より短い鎖長へ移行する。4時間後、鎖長分布の曲線は15〜200グルコース単位の間となり、最大値は70グルコース単位となる。
【０１６５】
概要:
使用された5種のエンドグルカナーゼを使用すると、加水分解24時間後、鎖長分布の上限のより短い鎖長への移行を実現することが可能である。鎖長分布の元のコースは加水分解が増大するにつれて狭くなる。全てのエンドグルカナーゼについて、鎖長分布の下限は7〜15グルコース単位の間の範囲である。したがって、全てのエンドグルカナーゼについて内部活性が検出可能である。
【０１６６】
[実施例3：酵素的に加水分解されたAvicelの重合度DPの決定］
(実施例2の)酵素的に加水分解されたAvicelのDPを決定するためにGPC解析を行った。
【０１６７】
試料組成GPCO:
DMF/19% EMIM Ac(v/v)中の2mg/mlセルロース凍結乾燥物
移動相: DMF/10% EMIM Ac(v/v)、50℃
【０１６８】
実験結果は、添付の図1a〜1eにおいてグラフの形で示す。
【０１６９】
セルラーゼが添加される前の試料(0時間試料)のDPW開始値は160〜220の間であり、平均190である。
【０１７０】
以下で述べる割合は全て、開始平均DPW190を参照している。
【０１７１】
クロコウジカビ、T.マリティマ、T.エメルソニ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼによる加水分解実験中、初めの5分間にDPWが37%〜53%減少し、したがって90〜120の間となる。24時間後、クロコウジカビ、T.マリティマ及びT.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼによる加水分解実験において、DPWは開始値からさらに10%〜21%〜50%〜37%減少する。
【０１７２】
20分後のB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼによる加水分解のDPWは、開始値の40%となる。24時間の加水分解後、DPWは開始値からさらに5%〜35%減少する。
【０１７３】
T.エメルソニエンドグルカナーゼの加水分解のDPWは、20分間の加水分解後、開始値から52%低下する。2時間の加水分解後、DPWは開始値の36%である値70に達した。その後、DPWは24時間の反応時間の終了までに120に上昇する。T.エメルソニエンドグルカナーゼによるSigmacellの加水分解においても、DPW及びDPNがともに、3時間の加水分解後に上昇する。したがって、観察された上昇が測定エラーであるとは仮定できない。可能性のある原因は、短い鎖の分解が増大し、それにより現存するより長い鎖が比較においてより際立つことであろう。
【０１７４】
B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼを使用する場合、Avicelのさらなる分解は2時間の加水分解後に観察できない。クロコウジカビ及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼによる加水分解実験においては、DPWのさらなる減少が実験終了まで観察可能である。
【０１７５】
全てのエンドグルカナーゼを使用する場合、DPWは実験の初めの5分間で実験期間の残りと比較して、開始値に対して最も減少する。DPWは初めの1〜2時間で約50%に減少する。他のエンドグルカナーゼと比較してB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用する場合に、値65の最も低いDPWが実現可能である。
【０１７６】
以下の表に列挙する多分散性は、DPW及びDPNから算出した。
【０１７７】
【表１０】
2016524899.tif 000015
多分散性はDPWの減少とともに減少する。したがって、セルロースの多分散性及び分解度の間には相関関係がある。
【０１７８】
[実施例4：Avicelの加水分解の質量バランス］
セルロースの加水分解により、望ましい不溶性のセロオリゴマーだけでなく、可溶性のセロオリゴマー及びグルコースも発生する。この実施例では、可溶性セロオリゴマー及びグルコースが産生された結果としての、使用されたセルロースの損失の定量及び評価を扱う。溶解したセロオリゴマー及びグルコースをHPLC及びPAHBAH試験を用いて定量した。Avicel加水分解試料の水性上清をこれらの研究に使用した。グルコース及びセロビオース濃度をHPLC解析により決定した。これら2種の溶解した糖の濃度は使用された全てのエンドグルカナーゼについて、時間とともに増大する。
【０１７９】
酵素的加水分解後のAvicelの質量分布を以下の表にまとめた。
【０１８０】
【表１１】
2016524899.tif 000016
【０１８１】
未知の可溶性セロオリゴマー11%で、T.エメルソニエンドグルカナーゼが未知の可溶性セロオリゴマーを最も多く産生する。B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼは未知の可溶性セロオリゴマーを6.1%産生する。T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼを使用する場合、未知の可溶性セロオリゴマー2%が発生する。0.5%及び0%で、T.マリティマ及びクロコウジカビエンドグルカナーゼの使用により、非常に少量又は全く測定できない量の未知の可溶性セロオリゴマーが生じる。T.エメルソニ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼが他のエンドグルカナーゼと比較して最も多量の可溶性セロオリゴマーを産生するため、これら2種のエンドグルカナーゼが可溶性セロオリゴマーの産生に使用され得る。
【０１８２】
加水分解後のセルロースが29%で、T.エメルソニエンドグルカナーゼの使用により、主にグルコース、セロビオース(51%)及び可溶性セロオリゴマー(11%)が生じる。加水分解後の不溶性セルロース75%のB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼ、81%のクロコウジカビエンドグルカナーゼ、及び96.6%のT.マリティマエンドグルカナーゼを使用する場合、他のエンドグルカナーゼと比較して最も高いセルロース収率が実現される。したがって、不溶性セルロースが比較的短い鎖のセロオリゴマーの形を取る場合、B.アミロリケファシエンス及びクロコウジカビエンドグルカナーゼが、不溶性セロオリゴマーを産生するための産業工程にとって特に興味深い。
【０１８３】
[実施例5：クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス、T.マリティマ、T.ロンギブラキアタム及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼを用いたα-セルロースの酵素的加水分解］
α-セルロースの加水分解試料の鎖長分布を、GPCOを用いて決定した。
【０１８４】
クロコウジカビ
加水分解混合物の組成:
10mg/mlα-セルロース、
10U/mlクロコウジカビエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１８５】
酵素により処理されていないα-セルロースは以下の特徴的な経過を示す:セルロース鎖濃度は20〜90グルコース単位の範囲で増大する。勾配は90〜200グルコース単位の範囲に降下し、その後200〜450グルコース単位の範囲に再び上昇する。
【０１８６】
クロコウジカビエンドグルカナーゼによる5分間の加水分解後には、肩部分がもはや見えない。鎖長分布の上限は、加水分解されていない試料の経過と比較して、より短い鎖長へ移行する。同様に、分布の最大値がより短い鎖へ移行する。分布は10〜800グルコース単位の間となり、最大値は120となる。19時間まで、鎖長分布は狭くなり続ける。曲線はここで10〜450グルコース単位の間の範囲となり、最大値は75となる。したがって、最大値の80%の減少及び鎖長分布の上限の75%の減少が実現される。
【０１８７】
B.アミロリケファシエンス
加水分解混合物の組成:
10mg/mlα-セルロース、
10U/ml B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼ、
3U/mlアグロバクテリウムの種のβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1Mリン酸緩衝液pH6
【０１８８】
B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解の鎖長分布をGPCOにより決定した。クロコウジカビエンドグルカナーゼによる5分間の加水分解後に、鎖長分布の10〜30グルコース単位の間の下り勾配の浅い部分のみが肩部分の代わりに認められる。20分の反応時間後、この浅い部分はもはや認められないが、代わりにほぼガウス分布の鎖長分布が観察できる。実験終了時には、鎖長分布は10〜400グルコース単位の間となり、最大値は80グルコース単位となる。酵素的加水分解により最大値が80%、上限が75%減少する。
【０１８９】
T.マリティマ
加水分解混合物の組成:
10mg/mlα-セルロース、
10U/ml T.マリティマエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１９０】
T.マリティマエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解の鎖長分布を、GPCOにより決定した。GPCOにより解析された、T.マリティマエンドグルカナーゼを用いたα-セルロースの加水分解由来の5分間試料は、10〜1800グルコース単位の間の鎖長分布を示す。酵素なしの試料と比較して、セロオリゴマーは10〜20グルコース単位の範囲で存在する。5分後、最大値が450から350へ移行した。肩部分はもはやはっきりと分からないが、傾斜のわずかな浅い部分が約120グルコース単位で認められる。10〜30グルコース単位の間の範囲の鎖長分布の傾斜は、30グルコース単位〜最大値の範囲の傾斜と比較してより浅い。鎖長分布の上限及び曲線の最大値は加水分解の間、より短い鎖長へ移行する。19時間の反応時間後、曲線は10〜600の間となり、最大値は150グルコース単位となる。したがって、鎖長分布の最大値は65%、鎖長分布の上限は65%減少する。
【０１９１】
T.ロンギブラキアタム
加水分解混合物の組成:
10mg/mlα-セルロース、
10U/ml T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１９２】
T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解の鎖長分布をGPCOにより決定した。T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解の鎖長分布の上限は、5分間の加水分解時間後により短い鎖長へ移行する。この反応時間後、鎖長分布は10〜1500グルコース単位の間となる。酵素なしの試料と比較して、最大値は450から200グルコース単位へ移行した。同様に、肩部分がより短い鎖長へ移行し、約25グルコース単位にある。19時間の反応時間中、鎖長分布の上限はより短い鎖長へ移行し続ける。同様に、曲線の最大値がより短い鎖へ移行する。鎖長分布が実験の経過中に狭くなるため、実験中の最大値の高さが増大する。19時間後、鎖長分布は10〜400の間となり、最大値は75グルコース単位となる。
【０１９３】
19時間の加水分解時間内で、最大値は80%、鎖長分布の上限は75%減少する。
【０１９４】
T.エメルソニ
加水分解混合物の組成:
10mg/mlα-セルロース、
10U/ml T.エメルソニエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０１９５】
T.エメルソニエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解の鎖長分布をGPCOにより決定した。酵素なしの試料の鎖長分布は20〜1800グルコース単位の間であり、最大値は450グルコース単位である。鎖長分布は90〜200グルコース単位の間により浅い領域(肩部分)を有する。T.エメルソニエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解の鎖長分布の上限は、5分間の加水分解後より短い鎖長へ移行する。この反応時間後、鎖長分布は10〜1500グルコース単位の間となる。酵素なしの試料と比較して、最大値は450から280グルコース単位へ移行した。同様に、肩部分がより短い鎖長へ移行し、約30グルコース単位になる。19時間の反応時間中、鎖長分布の上限はより短い鎖長へ移行し続ける。同様に、曲線の最大値がより短い鎖へ移行する。鎖長分布が実験の経過中に狭くなるため、実験中に最大値の高さが増大する。19時間後、鎖長分布は10〜300の間となり、最大値は70グルコース単位となる。酵素的加水分解により最大値は85%、鎖長分布の上限は80%減少する。
【０１９６】
概要:
提示されたエンドグルカナーゼを比較すると、クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼが最も急速なセルロース分解を示す。T.ロンギブラキアタム及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼはα-セルロースをより遅く分解する。しかし、19時間後の鎖長分布は同じ範囲内である。T.マリティマ由来のエンドグルカナーゼを使用する場合、クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼによる加水分解と比較して、α-セルロースは同様により遅く分解される。しかし、19時間の反応時間後、α-セルロースは他のエンドグルカナーゼを使用する場合と同程度には分解されない。特に、より遅いエンドグルカナーゼについて、最大値がまずより短い鎖へ移行し、10〜30グルコース単位の鎖長を有するセロオリゴマーが形成されることが観察できる。反応時間が進行するにつれて、鎖長分布及びその最大値がより短い鎖長へ移行し続ける。鎖長分布はそのため狭くなり、最大値の高さは増大する。
【０１９７】
[実施例6：酵素的に加水分解されたα-セルロースの重合度DPの決定］
(実施例5の)酵素的に加水分解されたα-セルロースのDPを決定するためにGPC解析を行った。
【０１９８】
試料組成GPCO:
DMF/19% EMIM Ac(v/v)中の2mg/mlセルロース凍結乾燥物
移動相: DMF/10% EMIM Ac(v/v)、50℃
【０１９９】
実験結果は、添付の図2a〜2eにおいて示す。
【０２００】
0時間試料には酵素液を添加せず、セルロース凍結乾燥物をGPCOにより解析した。先に酢酸緩衝液中でインキュベートされ、その後凍結乾燥されたα-セルロース試料を参照として使用した。加水分解されていないα-セルロース試料のDPWは550となる。DPNは230となる。
【０２０１】
5分間の加水分解後、クロコウジカビ試料のDPWは180に減少する。少なくとも50%のDPWの減少がこのように実現する。DPWは連続的に減少し続け、19時間後に110の値、ゆえに開始値の約25%に達する。これは、DPWの減少が時間とともに減速することを示す。5分間の反応時間後、DPNは元の240から140へ減少する。実験が19時間後に終了する際、DPNは50に減少する。
【０２０２】
B.アミロリケファシエンス試料のDPWは5分以内で140に減少する。この反応時間後、DPNは70になる。19時間後、DPWは90になり、DPNは50になる。
【０２０３】
T.エメルソニエンドグルカナーゼを使用する場合、20分間の加水分解後の試料のDPWは150である。T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼを使用する場合、40分後にDPW170に達する。クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼを使用すると、5分後には既にこの領域の値に達している。したがって、T.エメルソニ及びT.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼを使用する場合、クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用する場合よりも遅くDPWの減少が進行する。T.エメルソニエンドグルカナーゼによる19時間の加水分解後には、DPW90及びDPN50に達する。T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼを使用する場合、19時間の加水分解後にDPW90及びDPN40に達する。Avicel及びSigmacellの加水分解においては、T.エメルソニエンドグルカナーゼによる約1時間の加水分解後に、DPW及びDPNが増大する。α-セルロースを使用する場合、DPの増大は観察できない。Avicel及びSigmacellを使用する場合、約70aのDPWでのDPの増大であり、α-セルロースを使用する場合、このDPWは得られない。したがって、DPWに依存する増加が起こる可能性がある。T.マリティマエンドグルカナーゼを使用する場合も、α-セルロースの分解が観察できる。しかし、19時間の加水分解後、DPWは150の値を有し、したがって他のエンドグルカナーゼを使用する場合よりも高い。19時間の加水分解後のDPN値65により、他のエンドグルカナーゼと比較してDPNもより高い。
【０２０４】
使用された5種のエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解を比較すると、19時間の反応時間によりB.アミロリケファシエンス、T.ロンギブラキアタム及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼを使用する場合に、最も低いDPWが得られる。これらの値は90〜93の間である。
【０２０５】
実験終了まで、DPWの減少が全てのエンドグルカナーゼで観察可能である。Avicelに関しては、DPW及びDPNから多分散性を算出した(以下の表を参照)。
【０２０６】
【表１２】
2016524899.tif 000017
【０２０７】
α-セルロースを使用する場合も、DPW及び多分散性の間に相関関係が存在する。
【０２０８】
[実施例7：α-セルロースの加水分解の質量バランス］
結果を以下の表にまとめる。
【０２０９】
【表１３】
2016524899.tif 000018
【０２１０】
T.マリティマ及びクロコウジカビ由来のエンドグルカナーゼを使用すると、加水分解後に87.1%及び94.5%の不溶性セルロースが測定された。したがって、不溶性セルロースが短い鎖のセロオリゴマーの形を取る場合、可溶性セロオリゴマー及びグルコースが産生の目的でない産業工程にとって、これら2種の酵素は、α-セルロースの損失が少ないため、特に興味深い。T.マリティマエンドグルカナーゼを用いた19時間後のDPW150は、同じ加水分解時間後の他のエンドグルカナーゼのDPWを約50単位上回っている。したがって、このエンドグルカナーゼにより副産物はほとんど形成されないが、DPWは他のエンドグルカナーゼが使用される場合と同程度には減少しない。DPW110で、クロコウジカビエンドグルカナーゼの使用により、B.アミロリケファシエンス、T.エメルソニ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼの使用と同範囲のDPWが生じる。他のエンドグルカナーゼと比較して同じ割合でDPWが減少し、グルコース及び可溶性セロオリゴマーの産生が小さいことから、クロコウジカビエンドグルカナーゼがα-セルロースの酵素的加水分解のための格好のエンドグルカナーゼとなる。
【０２１１】
0.7%及び0%で、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼは、実質的に可溶性セロオリゴマーを産生しない、又は全く産生しない。クロコウジカビ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼはそれぞれ2.7%及び3.1%の未知のセロオリゴマーを産生する。他のエンドグルカナーゼと比較して、T.エメルソニエンドグルカナーゼは27.4%で最も多量の未知の可溶性セロオリゴマーを産生する。したがって、T.エメルソニエンドグルカナーゼはセロビオースよりも多くの可溶性セロオリゴマーを産生するのに非常に適している。
【０２１２】
[実施例8：クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス、T.マリティマ、T.ロンギブラキアタム及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼを用いたSigmacellの酵素的加水分解］
α-セルロース及びSigmacellの加水分解試料の鎖長分布を、GPCOを用いて決定した。
【０２１３】
クロコウジカビ
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Sigmacell、
10U/mlクロコウジカビエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２１４】
酵素的分解なしでのSigmacellの鎖長分布は10〜1000グルコース単位の間の範囲内であり、最大値は300〜400グルコース単位であり、10〜50グルコース単位の間の範囲に、50グルコース単位〜最大値の間の範囲よりも浅い傾斜を有する。クロコウジカビエンドグルカナーゼによる5分間の加水分解後、浅い部分は10〜20グルコース単位の間となる。鎖長分布は10〜500グルコース単位の間であり、最大値は100グルコース単位である。6時間の加水分解後、鎖長分布の上限は10〜350グルコース単位の間となり、ゆえに5分間試料の鎖長分布と比較して150グルコース単位短い鎖長へ移行する。6時間加水分解試料においては、曲線の左側部分に浅い部分は認められない。
【０２１５】
B.アミロリケファシエンス
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Sigmacell、
10U/ml B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２１６】
B.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼによるSigmacellの加水分解の5分間試料の鎖長分布は、10〜400グルコース単位の間となる。この反応時間後、15〜50グルコース単位の間に浅い部分は観察できない。20時間後の実験終了まで鎖長分布の上限はより短い鎖へ連続的に移行し続ける。この反応時間後の分布は10〜300グルコース単位の間である。最大値は同様により短い鎖長へ移行し、65グルコース単位になる。
【０２１７】
T.マリティマ
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Sigmacell、
10U/ml T.マリティマエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２１８】
T.マリティマ由来のエンドグルカナーゼによる5分間の加水分解後、鎖長分布は未処理のSigmacellと同範囲となる。鎖長分布の最大値はより短い鎖長へ100グルコース単位移行し、短いセルロース鎖の増大が10〜200グルコース単位の範囲で認められる。20時間の反応時間による実験終了まで、鎖長分布はより短い鎖長へ移行し続け、この時点で10〜400グルコース単位の間である。クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用するSigmacellに対する加水分解実験と比較して、T.マリティマエンドグルカナーゼを使用すると、より遅いSigmacellの分解が観察される。
【０２１９】
T.ロンギブラキアタム
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Sigmacell、
10U/ml T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼ、
3U/mlアグロバクテリウムの種のβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２２０】
T.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼを使用する5分間のSigmacellの加水分解後、鎖長分布は15〜800グルコース単位の間となる。鎖長分布の前方範囲に、浅い部分がこの時点でまだ15〜60グルコース単位の間に認められるが、未処理のSigmacellの場合よりも短い範囲内となる。鎖長分布の上限及び鎖長分布の最大値は実験中、より短い鎖へ移行し続け、浅い部分は実験中、もう認められなくなるまで減少し続ける。20時間後、曲線は10〜300グルコース単位の間となり、最大値は80グルコース単位となる。
【０２２１】
T.エメルソニ
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Sigmacell、
10U/ml T.エメルソニエンドグルカナーゼ、
3U/mlクロコウジカビβ-グルコシダーゼ、
40℃、0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２２２】
20時間試料の鎖長分布は、他の加水分解試料と比較して予想外の経過を示す。SigmacellがT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼを用いて1時間加水分解された後、鎖長分布は10〜300グルコース単位の範囲となり、最大値は70グルコース単位となる。その後、鎖長分布範囲が狭くなり続ける状態で、より長い鎖の増加が観察できる。鎖長分布のより長い鎖長への移行の結果として、曲線の最大値が同様により長い鎖長へ移行する。6時間の加水分解時間後、鎖長分布は10〜250グルコース単位の間となり、最大値は100グルコース単位となる。
【０２２３】
概要:
使用された5種のエンドグルカナーゼを用いたSigmacellの分解を比較すると、クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用すると急速な分解が実現される。T.マリティマ及びT.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼの分解速度はより遅い。クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス、T.マリティマ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼを使用する場合、19時間のSigmacellの加水分解後の鎖長分布の上限は300〜400グルコース単位となる。T.エメルソニエンドグルカナーゼを使用すると、1時間の加水分解時間後により長い鎖の増加が観察できる。Avicel及びT.エメルソニエンドグルカナーゼを使用する場合、2時間の加水分解時間後により長いセルロース鎖の増大が同様に観察され、そのためこの観察が測定エラーであるとみなすことはできない。この観察の原因ははっきりしていない。可能性は、短い鎖の分解が増大することであり、そのため現存のより長い鎖が比較としてより際立つことである。
【０２２４】
[実施例9：酵素的に加水分解されたSigmacellの重合度DPの決定］
(実施例8の)酵素的に加水分解されたSigmacellのDPを決定するためにGPC解析を行った。
【０２２５】
試料組成GPCO:
DMF/19% EMIM Ac(v/v)中の2mg/mlセルロース凍結乾燥物
移動相: DMF/10% EMIM Ac(v/v)、50℃
【０２２６】
実験結果は、添付の図3a〜3eにおいて示す。
【０２２７】
クロコウジカビエンドグルカナーゼを使用する5分間の加水分解後、DPWは130に減少する。DPNは110から60に減少する。したがって、DPW及びDPNはともに少なくとも55%減少する。20分の加水分解時間後、DPWが100、DPNが40に達する。したがって、加水分解はより遅く進行する。DPW120で、1時間及び3時間の試料のDPWはわずかに増大する。DPNは類似の経過を示す。6時間の反応時間後のDPW100及びDPN50は、1時間及び3時間の加水分解時間後のDPW及びDPNの増大が、おそらく同様に測定に対する妨害に基づくという仮定を支持するものである。
【０２２８】
B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用する場合、5分間の加水分解時間後にDPWを開始値の50%に減少させることが可能である。実験終了まで、DPWは80まで減少し続け、その後停滞する。類似の経過がDPNについて観察できる。この値は、同様に5分間の加水分解時間後に半減し、次いで40分後にDPN50で停滞する。分解の終了に至る。T.エメルソニ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼを用いたSigmacellの加水分解は、クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼによる加水分解よりも遅く進行する。5分間の反応時間後、T.エメルソニエンドグルカナーゼを使用する場合のDPWは150となる。1時間の反応時間後、DPWは75まで減少し続ける。この時点で、DPNは40である。3時間の加水分解後、DPWの増大が観察できる。T.エメルソニエンドグルカナーゼによるα-セルロースの加水分解によっても、DPW及びDPNはともに2時間の加水分解後増大する。可能性のある原因は、短い鎖の分解が増大することであり、それにより現存のより長い鎖が比較して際立つことであろう。
【０２２９】
T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼを使用する場合、5分間の反応時間後にDPW200に達する。1時間の反応時間後にDPWは130まで減少し続ける。この時点で、DPNは65である。T.ロンギブラキアタムエンドグルカナーゼを使用する場合、1時間後、セルロースは分解され続け、実験終了後にDPW 80及びDPN50に達する。
【０２３０】
T.マリティマエンドグルカナーゼを使用するSigmacellの加水分解は、クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス、T.エメルソニ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼによるSigmacellの加水分解よりも遅く進行する。20時間の反応時間後、DPW100及びDPN45は、6時間の反応時間後のクロコウジカビエンドグルカナーゼを使用する場合と同範囲となる。
【０２３１】
提示されたエンドグルカナーゼを使用する20時間の加水分解後、DPWは開始値の半分未満まで減少し得る。使用されたエンドグルカナーゼは、それらの反応速度及び実験終了時に達するDPWの点で異なる。最も低いDP値は、B.アミロリケファシエンス及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼを使用すると達成することができる。B.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼを用いると、DPWは80で停滞する。したがって、分解の終了に至る。クロコウジカビ、T.マリティマ及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼを用いると、実験終了までDPWが減少する。したがって、分解の終了には至らない。
【０２３２】
クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンス由来のエンドグルカナーゼの反応速度が他のエンドグルカナーゼと比較してより早いという事実から、これらのエンドグルカナーゼはさらなる実験研究にとって特に興味深い。
【０２３３】
Avicel及びα-セルロースの場合と同様に、Sigmacellについての多分散性も、DPW及びDPNから算出し、以下の表から分かる。
【０２３４】
【表１４】
2016524899.tif 000019
【０２３５】
クロコウジカビ及びT.エメルソニ由来のエンドグルカナーゼを使用する酵素的加水分解のDP及び多分散性の結果は、互いに相関しない。しかし、クロコウジカビエンドグルカナーゼの加水分解試料における測定エラー及びT.エメルソニエンドグルカナーゼの加水分解試料の異常なDP上昇により、これらのエンドグルカナーゼによる1日後のDP結果は使用しなかった。Avicel及びα-セルロースについて既に観察されたように、1日の加水分解時間による他のエンドグルカナーゼのDPW及び多分散性は互いに相関する。
【０２３６】
[実施例10：Sigmacellの加水分解の質量バランス］
読み取り値を以下の表にまとめる:
【０２３７】
【表１５】
2016524899.tif 000020
【０２３８】
クロコウジカビ由来のエンドグルカナーゼを使用すると、加水分解後に87.9%の不溶性セルロースが測定された。T.マリティマエンドグルカナーゼを使用した場合、100%の不溶性セルロースが測定された。Sigmacell損失が少ないため、これら2種の酵素が、可溶性セロオリゴマー及びグルコースが産生の目的ではない産業工程にとって特に興味深い。
【０２３９】
PAHBAH試験を使用して、9.1%の還元糖画分がT.マリティマエンドグルカナーゼを用いたSigmacellの加水分解において決定された。したがって、使用されたセルロースの少なくとも9.1%がグルコース及び可溶性セロオリゴマーに転換されたため、100%の不溶性セルロースの割合はあまりに高い。B.アミロリケファシエンス、T.マリティマ及びクロコウジカビ由来のエンドグルカナーゼを使用する場合、4%未満の未知の可溶性セロオリゴマーが産生される。T.エメルソニ及びT.ロンギブラキアタム由来のエンドグルカナーゼを使用すると、それぞれ12.7%及び25.4%の未知の可溶性セロオリゴマーが産生される。したがってこれらのエンドグルカナーゼは、可溶性セロオリゴマーの産生に好適である。
【０２４０】
[実施例11：イオン液体によるさらなる前処理後の2回目のセルロースの酵素的加水分解:(IL再開)］
IL再開を使用すると、2日間の酵素的加水分解により既に分解されたセルロースがイオン液体中で再溶解され、次いで沈殿する。セルロースはさらなる前処理によりもう一度分解される。この方法を使用すると、基質に起因する分解の終了を研究することが可能である。これらの研究の結果を以下に記載する。
【０２４１】
クロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼを、溶解した糖の産生が少なかったゆえにセロオリゴマーの産生について特に興味深いため、これらの実験に使用した。鎖長依存性が存在するかどうかを研究するために、短い鎖の基質Avicel及び長い鎖の基質α-セルロースを使用してこれらの研究を行った。
【０２４２】
[実施例11a：IL再開後のAvicelの加水分解］
Avicelの加水分解についての追加実験を解析するために、試料をGPCOにより解析した。
【０２４３】
加水分解混合物の組成:
10mg/ml Avicel、
それぞれ10U/mlのクロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼ、
それぞれ3U/mlのクロコウジカビ及びアグロバクテリウムの種由来のβ-グルコシダーゼ、
40℃、それぞれ0.1Mリン酸緩衝液pH6及び0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２４４】
単一の加水分解と比較して、鎖長分布の上限のより短い鎖への移行が、IL再開が行われた試料の鎖長分布について観察できた。2回目の加水分解により発生した鎖長分布は、使用されたエンドグルカナーゼにより異なる。クロコウジカビ及びB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用する場合、18グルコース単位のサイズのセロオリゴマーの増加がIL再開を行った後に認められる。18グルコース単位のサイズのセロオリゴマーの増加により、18グルコース単位でのさらなる最大値が、IL再開を行った後のクロコウジカビエンドグルカナーゼを使用する加水分解において観察される。T.マリティマエンドグルカナーゼを使用すると、15グルコース単位のサイズのセロオリゴマーの増加が、IL再開を行った後に観察できる。
【０２４５】
[実施例11b：IL再開後に酵素的に加水分解されたAvicelの重合度DPの決定］
(実施例11aの)酵素的に加水分解されたAvicelのDPを決定するためにGPC解析を行った。
【０２４６】
試料組成GPCO:
DMF/19% EMIM Ac(v/v)中の2mg/mlセルロース凍結乾燥物
移動相: DMF/10% EMIM Ac(v/v)、50℃
【０２４７】
実験結果は、添付の図4a〜4cにおいて示す。
【０２４８】
クロコウジカビエンドグルカナーゼによる21時間の加水分解後、DPW85に達する。45時間インキュベートされた試料の解析により、セルロースがこれ以上分解されないことが示される。実際に、DPWが95に上昇する。したがって、このエンドグルカナーゼ及びAvicelを使用する場合は、1日の反応時間が十分である。
【０２４９】
IL再開による処理で、DPWが単一の加水分解後の値の半分に減少する。したがって、IL再開法はDPW40のセルロースを産生するための好適な方法である。
【０２５０】
B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用する場合、再開実験の試料以外の試料のDPWは55〜65の間となる。IL再開法を使用する場合、DPW35が得られる。
【０２５１】
T.マリティマエンドグルカナーゼを使用する場合、1日及び2日試料のDPWは80になる。IL再開法はDPW55をもたらす。この方法を使用すると、DPWが単一の加水分解と比較して少なくとも30%減少し得る。
【０２５２】
[実施例11c：IL再開後のα-セルロースの加水分解］
α-セルロースの加水分解についての追加実験を解析するために、試料をGPCにより解析した。
【０２５３】
加水分解混合物の組成:
10mg/mlα-セルロース、
それぞれ10U/mlのクロコウジカビ、B.アミロリケファシエンス及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼ、
それぞれ3U/mlのクロコウジカビ及びアグロバクテリウムの種由来のβ-グルコシダーゼ、
40℃、それぞれ0.1Mリン酸緩衝液pH6及び0.1M酢酸緩衝液pH4.5
【０２５４】
使用された酵素によるα-セルロース加水分解実験の鎖長分布は、Avicelの加水分解と類似のプロファイルを本質的に示す。IL再開実験のみが、分子量の顕著な減少をもたらす。クロコウジカビエンドグルカナーゼを使用する場合、18グルコース単位のサイズのセロオリゴマーの増加がIL再開を行った後に認められる。IL再開を行った後、鎖長分布はより短い鎖へ移行し、10〜200グルコース単位の間となる。α-セルロースを加水分解するためにB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼを使用する場合、IL再開を行った後の鎖長分布の最大値はより短い鎖長へ30グルコース単位移行する。T.マリティマエンドグルカナーゼを使用するIL再開を行った後、鎖長分布の上限又は鎖長分布の最大値のより短い鎖への移行は観察されない。
【０２５５】
[実施例11d：IL再開後に酵素的に加水分解されたα-セルロースの重合度DPの決定］
(実施例11cの)酵素的に加水分解されたα-セルロースのDPを決定するためにGPC解析を行った。
【０２５６】
試料組成GPCO:
DMF/19% EMIM Ac(v/v)中の2mg/mlセルロース凍結乾燥物
移動相: DMF/10% EMIM Ac(v/v)、50℃
【０２５７】
実験結果は、添付の図5a〜cにおいて示す。
【０２５８】
反応時間を2日に延長することで、クロコウジカビ及びT.マリティマ由来のエンドグルカナーゼについてDPWの減少が実現可能である。凍結乾燥の問題により1日加水分解試料が廃棄されたため、これはB.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼについてははっきりしない。
【０２５９】
クロコウジカビエンドグルカナーゼに関しては、単一の加水分解と比較して、IL再開を使用する場合、2日後のDPWが40%減少する。
【０２６０】
B.アミロリケファシエンスエンドグルカナーゼにIL再開法を使用する場合、単一の加水分解と比較して2日後のDPWが36%減少し得る。
【０２６１】
T.マリティマエンドグルカナーゼを使用すると、1日間の加水分解後にDPW140、2日間の加水分解後にDPW120に達する。IL再開を行うことにより、単一の加水分解と比較してさらなる分解は実現不可能である。
【０２６２】
単一の加水分解におけるDPWは2日後の実験終了まで減少し、したがって分解の終了には至らない。
【０２６３】
IL再開法を使用すると、DPW55のα-セルロースが産生可能である。
【０２６４】
実施例で使用されたβ-グルコシダーゼは本発明の任意のさらなる構成である。本発明による研究の範囲内で、前記酵素の使用が強制的ではないことを示すことが可能である。
【０２６５】
セルロース分解産物(特にセロビオース)の存在により、β-グルコシダーゼがエンドグルカナーゼに起因する任意の産物阻害を防ぐことが可能であることが知られている。しかし、この酵素を使用する実際の必要性は、少数の慣習的な予備実験により決定可能である。
【０２６６】
本明細書で引用された文献の開示に対し参照がなされる。
【図１ａ】
2016524899.tif 000021
【図１ｂ】
2016524899.tif 000022
【図１ｃ】
2016524899.tif 000023
【図１ｄ】
2016524899.tif 000024
【図１ｅ】
2016524899.tif 000025
【図２ａ】
2016524899.tif 000026
【図２ｂ】
2016524899.tif 000027
【図２ｃ】
2016524899.tif 000028
【図２ｄ】
2016524899.tif 000029
【図２ｅ】
2016524899.tif 000030
【図３ａ】
2016524899.tif 000031
【図３ｂ】
2016524899.tif 000032
【図３ｃ】
2016524899.tif 000033
【図３ｄ】
2016524899.tif 000034
【図３ｅ】
2016524899.tif 000035
【図４ａ】
2016524899.tif 000036
【図４ｂ】
2016524899.tif 000037
【図４ｃ】
2016524899.tif 000038
【図５ａ】
2016524899.tif 000039
【図５ｂ】
2016524899.tif 000040
【図５ｃ】
2016524899.tif 000041
【配列表】
2016524899000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月14日(2015.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロオリゴマーの産生のための方法であって、
a1)セルロースが、セルロースの結晶化度を減少させる前処理段階に供され、
a2)このように前処理されたセルロースが、水性反応媒体中で少なくとも1つのエンドグルカナーゼ(EG)(E.C.3.2.1.4)を使用して加水分解的に切断され、形成されるセロオリゴマーが10〜100の範囲の数平均重合度(DPN)を有し、かつ
b)1つ以上のセロオリゴマーを含む反応産物が、反応媒体から単離される、方法。
【請求項２】
使用されるセルロースが、セルロースを含む出発物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形成されるセロオリゴマーが、15〜50の範囲のDPN値を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
EGが、バチルス属、アスペルギルス属若しくはサーモトガ属の微生物、特にバチルス・アミロリケファシエンス種、クロコウジカビ種、若しくはサーモトガ・マリティマ種に由来する、天然の、若しくは組換えによって産生され、場合によって遺伝子改変された酵素、又はこれらの天然若しくは組換え酵素の少なくとも2つの組合せである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
酵素的加水分解が、約3〜8、特に4〜7の範囲のpHで、及び/又は20〜90℃、特に30〜80℃の範囲の温度で、及び/又は0.1〜100時間、特に1〜48時間の間、水性媒体中で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つのEGが約0.01〜100、例えば1〜50又は2〜10U/mlの反応混合物の濃度で適用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
セルロースが、反応混合物の総体積に基づいて0.1〜5%(w/v)の範囲の濃度で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
セルロースの結晶化度が、イオン液体及び/又は力学的エネルギー入力を使用する段階a1)の処理により減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
イオン液体が、特に1-エチル-3-メチルイミダゾリウムアセテート(EMIM Ac)及び3-メチル-N-ブチルピリジニウムクロリド([C4mpy]Cl)などの、温度100℃未満で液体である塩から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階a1)において、セルロースがイオン液体中に導入され、場合によって熱作用により、その中で溶解され、次いで水、有機溶媒又はそれらの混合物を添加することにより沈殿され、その沈殿物が分離され、場合によって洗浄され、液体が場合によって除去される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階a1)において、力学的処理がボールミルを使用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
処理段階、特に段階a1)及びa2)が、反応産物が単離される前に1度以上繰り返される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
食品及び飼料、化粧品又は医薬品の添加物としての、洗剤添加物としての、レオロジー改質剤としての及び有機合成の出発物質としての、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により産生される1つ以上のセロオリゴマーの使用。
【国際調査報告】
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2016524899.tif 000043
2016524899.tif 000044
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