(57)【要約】  本発明は、腫瘍関連ΜＵＣ１−シアログリコトープであるＣＡ６のｉｎ  ｖｉｖｏでの検出および定量化の診断ツールとして使用される、ヒト化モノクローナル抗体であるＤＳ６に基づくコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質に関する。
2016515093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、該抗体様結合タンパク質は、以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
によって表される構造を有する２つのポリペプチドを含み、
式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成し；
ここで、該抗体様タンパク質はキレート剤をさらに含む、
前記抗体様結合タンパク質。
【請求項２】
Ｌ１がＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）である、請求項１に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項３】
Ｌ２がＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）である、請求項１または２に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項４】
Ｌ１およびＬ２が同一である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項５】
ＶＬ１およびＶＬ２が同一である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項６】
ＶＨ１およびＶＨ２が同一である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項７】
式［Ｉ］のポリペプチドが配列番号１を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項８】
式［ＩＩ］のポリペプチドが配列番号７を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項９】
キレート剤がハード酸カチオンキレート剤である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１０】
ハード酸カチオンキレート剤が、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＴＰＡ（１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）である、請求項９に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１１】
ハード酸カチオンキレート剤がＤＯＴＡである、請求項１０に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１２】
ハード酸キレート剤が共有結合している、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗体様タンパク質。
【請求項１３】
１から５コピーの間のハード酸キレート剤が共有結合している、請求項１２に記載の抗体様タンパク質。
【請求項１４】
さらにタグを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１５】
タグが、６ｘ−ヒスチジン、ビオチン、ＭＹＣ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＭＢＰまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはＨＡである、請求項１４に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１６】
タグが６ｘ−ヒスチジンタグである、請求項１５に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１７】
少なくとも１つの放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１８】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、または８３Ｓｒである、請求項１７に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項１９】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が６４Ｃｕである、請求項１８に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項２０】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングのための１つまたはそれ以上の薬剤を含む、請求項１７に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項２１】
医薬的に許容可能な担体と、ＣＡ６発現組織をイメージングするのに有効な量の、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質とを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を作製する方法であって：
（ａ）以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
（式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する）
によって表される構造を有するポリペプチドをコードする、１つまたはそれ以上の核酸分子を細胞で発現させること；ならびに
（ｂ）抗体様結合タンパク質をキレート剤に結合させること
を含む、前記方法。
【請求項２３】
Ｌ１がＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｌ２がＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌ１およびＬ２が同一である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＶＬ１およびＶＬ２が同一である、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＶＨ１およびＶＨ２が同一である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
式［Ｉ］のポリペプチドが配列番号１を含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
式［ＩＩ］のポリペプチドが配列番号７を含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
キレート剤がハード酸カチオンキレート剤である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ハード酸カチオンキレート剤が、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＴＰＡ（１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ハード酸カチオンキレート剤がＤＯＴＡである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ハード酸キレート剤が共有結合している、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
１から５コピーのハード酸キレート剤が共有結合している、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
患者におけるＣＡ６を発現している疾患組織を処置する方法であって：
（ａ）ＣＡ６に特異的に結合し、キレート剤およびイメージング剤をさらに含む抗体様結合タンパク質を患者に投与すること；
（ｂ）陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングによって、患者におけるＣＡ６を発現している疾患組織を特定すること；ならびに
（ｃ）疾患組織におけるＣＡ６の発現が参照基準におけるＣＡ６の発現の１０％以上である場合に、患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であることを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項３６】
患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であると決定される場合に、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４を投与することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の抗体様結合タンパク質を使用して、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４に対する対象の応答をモニタリングすることをさらに含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体様結合タンパク質が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
患者におけるＣＡ６陽性の癌を処置する方法であって：
（ａ）患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；および
（ｂ）患者におけるＣＡ６の発現レベルが参照基準におけるＣＡ６の発現の１０％以上の場合に、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４を患者に投与する工程
を含む、前記方法。
【請求項４０】
患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報が、ＣＡ６に特異的に結合し、キレート剤およびイメージング剤を含む抗体様タンパク質を投与すること、ならびにバイオイメージング法を使用して、患者におけるイメージング剤の局在を検出することによって取得される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体様結合タンパク質が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＡ６陽性の癌が、漿液性卵巣癌腫、類内膜卵巣癌腫、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、陰門の新生物、乳癌腫、膵臓腫瘍および尿路上皮の腫瘍である、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングによって取得される、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
キレート剤がハード酸カチオンキレート剤である、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ハード酸カチオンキレート剤が、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＴＰＡ（１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ハード酸カチオンキレート剤がＤＯＴＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
抗体様結合タンパク質が、さらにタグを含む、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
タグが６ｘ−ヒスチジンタグである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
抗体様結合タンパク質が、少なくとも１つの放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤をさらに含む、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、または８３Ｓｒである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が６４Ｃｕである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングのための１つまたはそれ以上の薬剤を含む、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であるかどうかを決定する方法であって：
（ａ）患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；および
（ｂ）患者におけるＣＡ６の発現レベルが参照基準におけるＣＡ６の発現の１０％以上の場合に、患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であることを決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項５４】
患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報が、ＣＡ６に特異的に結合し、キレート剤およびイメージング剤を含む抗体様タンパク質を投与すること、ならびにバイオイメージング法を使用して、患者におけるイメージング剤の局在を検出することによって取得される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体様結合タンパク質が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングによって取得される、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
キレート剤がハード酸カチオンキレート剤である、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
ハード酸カチオンキレート剤が、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＴＰＡ（１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ハード酸カチオンキレート剤がＤＯＴＡである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
抗体様結合タンパク質が、さらにタグを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
タグが６ｘ−ヒスチジンタグである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
抗体様結合タンパク質が、少なくとも１つの放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、または８３Ｓｒである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が６４Ｃｕである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングのための１つまたはそれ以上の薬剤を含む、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置に対する癌患者の応答をモニタリングする方法であって：
（ａ）ｈｕＤＳ６−ＤＭ４の投与の後に、患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；および
（ｂ）患者におけるＣＡ６の発現レベルが、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４で処置する前のＣＡ６の発現レベルと比較して低下した場合に、処置を続けるべきである旨の指示を与える工程を含む、前記方法。
【請求項６７】
患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報が：
所定の期間にわたって、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４によって患者を処置すること；
ＣＡ６に特異的に結合し、キレート剤およびイメージング剤を含む抗体様タンパク質を投与すること；ならびに
バイオイメージング法を使用して、患者におけるイメージング剤の局在を検出することによって取得される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質が請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングによって取得される、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
キレート剤がハード酸カチオンキレート剤である、請求項６７〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
ハード酸カチオンキレート剤が、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＴＰＡ（１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ハード酸カチオンキレート剤がＤＯＴＡである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
抗体様結合タンパク質が、さらにタグを含む、請求項６７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
タグが６ｘ−ヒスチジンタグである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
抗体様結合タンパク質が、少なくとも１つの放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤をさらに含む、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、または８３Ｓｒである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が６４Ｃｕである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージングのための１つまたはそれ以上の薬剤を含む、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者集団での治療的使用のための薬物開発において、いくつかの課題が存在する。いくつもの理由（例えば、患者集団における臨床的有用性の不足または安全性の証明不足）により、初期の薬剤の多くは、市場に届いていない。有効かつ安全な薬物の開発に関するいくつかの重要な論点は：（１）患者集団において、その目的とする分子標的との薬物相互作用を確証すること；（２）同じ患者集団において、特異的標的が特定の疾患を処置することに関係があることを確証すること；および（３）同じ患者集団において、標的に対する薬物の効果に基づいて生物学的に最適な用量を特定することである。特定の薬物に対する適切なコンパニオン診断の開発は、臨床患者集団において使用するための薬物の開発で大いに役立つ。
【０００３】
分子イメージングを連結したコンパニオン診断は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、分子標的および薬物分子とのその相互作用に関する強力な非侵襲性の四次元評価を提供する。イメージングプラットフォームのいくつかの例としては、以下が挙げられる：磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子エミッション断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線または光音響イメージング。イメージングコントラストの選択は、特定の分子プローブおよび固有の組織特性を考慮する。コンパニオン診断と分子イメージングを連結することによって、患者において、特定の薬物の、その分子標的との相互作用をより良く理解することが可能になり、これは、特定の薬物に対する潜在的応答者を特定するのに役立ち得、薬物（およびその最適な投薬）の感受性および耐性の機構に関する理解および決定を援助し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒト化モノクローナル抗体であるＤＳ６に基づくコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）バイオイメージングなどのイメージング法によって腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープ（ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）であるＣＡ６をｉｎ  ｖｉｖｏで検出および定量化するための診断ツールとして使用するために開発された。この抗体様結合タンパク質は、患者の層別化、および細胞傷害性マイタンシノイドであるＤＭ４にコンジュゲートした、腫瘍関連ΜＵＣ１−シアログリコトープであるＣＡ６に対するヒト化モノクローナル抗体からなる、ヒト化ＤＳ６抗体−薬物免疫複合体、すなわちｈｕＤＳ６−ＤＭ４の治療的効能の初期評価を容易にする。
【０００５】
コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ＣＡ６の発現が高い組織（例えば腫瘍組織）を標的にする薬物、例えばＣＡ６エピトープを標的にする抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）による処置に優先的に応答し得る、ＣＡ６の発現が高い患者および患者の亜集団を特定するのに使用することができる。ＡＤＣは、例えば、細胞傷害剤、例えばＤＭ１もしくはＤＭ４などのマイタンシン誘導体または国際公開第ＷＯ２００５／００９３６９号に記載されているような別の薬剤に結合した、ｈｕＤＳ６分子であり得る。例えば、対象がＡＤＣによる処置に応答する見込みがあるかどうかを決定するために、コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質をＡＤＣの投与の前に投与することができる。
【０００６】
コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、バイオイメージング法、例えば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡ６の検出に使用することができ、曝露時間を短くし、４８〜２４時間以内またはそれ以下のような高速イメージングを可能にする。コンパニオン診断薬は、適切なクリアランス動態を有する非常に特異的なバインダーである。
【０００７】
本明細書で開示される本発明は、キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を提供する。この抗体様結合タンパク質は、ＰＥＴなどのバイオイメージング法による、ヒトＣＡ６腫瘍抗原のｉｎ  ｖｉｖｏでの検出および定量化のための診断ツールとして使用することができ、ここでは、抗体様結合タンパク質は、バイオイメージングトレーサーにカップリングするための適切なキレート剤にコンジュゲートしている。
【０００８】
本明細書で開示される本発明は、キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質をさらに提供する。この抗体様結合タンパク質は、ＣＡ６腫瘍抗原を発現している組織に関するイメージング剤または検出剤として使用することができ、ここでは、抗体様結合タンパク質は、薬剤にカップリングするための適切なキレート剤にコンジュゲートしている。
【０００９】
本明細書で開示される本発明は、タンデムに配置され、リンカー配列によって分離された、ヒト化ＤＳ６抗体由来のそれぞれのＶＬおよびＶＨのＤＮＡ配列を含むＤＳ６抗体様結合タンパク質を作製する方法をさらに提供する。ＤＳ６ＶＬ−リンカー−ＤＳ６ＶＬおよびＤＳ６ＶＨ−リンカー−ＤＳ６ＶＨコンストラクトは、以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
に従って、ＤＮＡレベルで、３’末端においてヒト定常ドメイン配列に融合され、
式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ＶＬ１およびＶＬ２のポリペプチドは、同じまたは異なるＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１およびＶＨ２のポリペプチドは、同じまたは異なるＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する。ＣＬおよびＣＨ１ドメインは、ジスルフィド結合などで結合され得る。さらに、式Ｉおよび式ＩＩのポリペプチドは、任意選択のタグ（例えば、ポリヒスチジンまたは６×−Ｈｉｓタグ）を含むことができる。
【００１０】
本明細書で開示される本発明は、患者の癌などの障害を処置する方法であって、患者におけるＣＡ６の発現レベルを得る工程であって、キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を患者に投与する工程、および組織がＣＡ６を発現しているかどうかに関して決定する工程；ならびに患者が、参照組織でのＣＡ６の発現レベルより少なくとも１０％大きい、例えば、参照組織でのＣＡ６の発現より１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上大きいＣＡ６の発現レベルを有している場合に、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４を患者に投与する工程を含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明で注目する抗体様結合タンパク質は、腫瘍組織、例えば漿液性卵巣癌腫、類内膜卵巣癌腫、子宮頸部の新生物、子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｓ）の新生物、陰門の新生物、乳癌腫、膵臓腫瘍および尿路上皮の腫瘍において、ＣＡ６の発現レベルを決定するのに使用される。
【００１１】
本明細書で開示される本発明は、癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であるかどうかを決定する方法であって、患者におけるＣＡ６の発現レベルを得る工程であって、キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を患者に投与する工程、およびＣＡ６の発現レベルが参照組織でのＣＡ６の発現レベルより少なくとも１０％大きい、例えば、参照組織でのＣＡ６の発現より１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上大きいかどうかに関して決定する工程；ならびに決定が肯定的に行われる場合に、癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補である旨の指示を与える工程を含む方法をさらに提供する。
【００１２】
本明細書で開示される本発明は、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置に対する癌患者の応答をモニタリングする方法であって、患者におけるＣＡ６の発現レベルを得る工程、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の前およびその処置の間に、キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を患者に投与する工程、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の結果として、ＣＡ６の発現レベルが増大する、同じである、または低下するかどうかに関して決定する工程；ならびに患者におけるＣＡ６の発現レベルが、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４で処置する前のＣＡ６の発現レベルと比較して低下した場合に、処置を続けるべきである旨の指示を与える工程を含む方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、抗体様結合タンパク質が、以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
によって表される構造を有する２つのポリペプチドを含み、
式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成し；
抗体様タンパク質はキレート剤をさらに含む、
抗体様結合タンパク質を提供する。
【００１４】
本発明は、キレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を作製する方法であって：
（ａ）以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
（式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する）
によって表される構造を有するポリペプチドをコードする、１つまたはそれ以上の核酸分子を細胞で発現させること
；ならびに
（ｂ）抗体様結合タンパク質をキレート剤に結合させること
を含む、方法も提供する。
【００１５】
本発明は、患者におけるＣＡ６を発現している疾患組織を処置する方法であって、ＣＡ６に特異的に結合し、キレート剤およびイメージング剤をさらに含む抗体様結合タンパク質を患者に投与すること；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングによって、患者におけるＣＡ６を発現している疾患組織を特定すること；ならびに疾患組織におけるＣＡ６の発現が参照基準におけるＣＡ６の発現の１０％以上である場合に、患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であることを決定することを含む方法をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、患者のＣＡ６陽性の癌を処置する方法であって、患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；および患者におけるＣＡ６の発現レベルが参照基準におけるＣＡ６の発現の１０％以上の場合に、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４を患者に投与する工程を含む方法をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であるかどうかを決定する方法であって、患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；および患者におけるＣＡ６の発現レベルが参照基準におけるＣＡ６の発現の１０％以上の場合に、患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置の候補であることを決定する工程を含む方法をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置に対する癌患者の応答をモニタリングする方法であって、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４の投与の後に、患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；およびｈｕＤＳ６−ＤＭ４で処置する前のＣＡ６の発現レベルと比較して、患者におけるＣＡ６の発現レベルが低下した場合に、処置を続けるべきである旨の指示を与える工程を含む方法をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、抗体様結合タンパク質が、以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
によって表される構造を有する２つのポリペプチドを含み、
式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する、
抗体様結合タンパク質を提供する。
【００２０】
本発明は、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を作製する方法であって、以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
によって表される構造を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の核酸分子を細胞で発現させることを含み、
式中：
ＶＬ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する、
方法も提供する。
【００２１】
本発明の特定の実施形態は、以下の特定の実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】二価の改変抗体様結合タンパク質である二価の単一特異性タンデム免疫グロブリンフラグメント（Ｂ−Ｆａｂ）の概略図である。Ｂ−Ｆａｂタンパク質の例としては、以下が挙げられる：Ｇ４ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号３）およびＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂ、Ｇ４ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号３）を有し、Ｃ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを有さないＢ−Ｆａｂ、およびＧ４ＳリンカーおよびＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂ。
【図２−１】ゲル電気泳動（図２Ａ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図２Ｂ）および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）（図２Ｃおよび図２Ｄ）による、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）２）リンカー（配列番号３）およびＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを有する、Ｂ−Ｆａｂ  ＤＳ６ベース改変抗体の評価を示す図である。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図３−１】ゲル電気泳動（図３Ａ）、ＳＥＣ（図３Ｂ）およびＦＡＣＳ（図３Ｃおよび図３Ｄ）による、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを有するＢ−Ｆａｂ  ＤＳ６ベース改変抗体の評価を示す図である。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図４−１】ゲル電気泳動（図４Ａ）、ＳＥＣ（図４Ｂ）およびＦＡＣＳ（図４Ｃおよび図４Ｄ）による、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカーおよびＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂ  ＤＳ６ベース改変抗体の評価を示す図である。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図５】ＤＯＴＡなしのＡ２７８０細胞（図５Ａ）、ＤＯＴＡなしのＷＩＳＨ細胞（図５Ｂ）およびＤＯＴＡありのＷＩＳＨ細胞（図５Ｃ）を使用するＦＡＣＳによる、Ｂ−Ｆａｂ  ＤＳ６ベース改変抗体の評価を示す図である。ＤＯＴＡコンジュゲーションがＤＳ６結合を変化させないことを示す。
【図６Ａ】６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の評価が、６４Ｃｕでの放射標識およびＤＯＴＡコンジュゲーションが理想的な放射化学（図６Ａ）を可能にすることを実証することを示す図である。
【図６Ｂ】６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の評価が、６４Ｃｕでの放射標識およびＤＯＴＡコンジュゲーションが血清安定性（図６Ｂ）を可能にすることを実証することを示す図である。
【図７】ダイアボディスキャフォールドを有する抗体様結合タンパク質（図７Ａ）とＢ−Ｆａｂスキャフォールドを有する抗体様結合タンパク質（図７Ｂ）の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で開示される本発明は、ＰＥＴバイオイメージングによってヒトＣＡ６腫瘍抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで検出および定量化するための診断ツールとして使用される、ヒト化モノクローナル抗体であるＤＳ６に基づくコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質に関する。このコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、患者の層別化、および細胞傷害性マイタンシノイドであるＤＭ４にコンジュゲートした、腫瘍関連ΜＵＣ１−シアログリコトープであるＣＡ６に対するヒト化モノクローナル抗体からなる、ＤＳ６抗体−薬物免疫複合体ｈｕＤＳ６−ＤＭ４の治療的効能の初期評価を容易にする。抗体−薬物免疫複合体であるｈｕＤＳ６−ＤＭ４は、例えば、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第ＷＯ２００５／００９３６９号に記載されている。ＤＳ６抗体およびＣＡ６腫瘍抗原は、例えば、参照によって本明細書に組み入れるＫｅａｒｓｅら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０００  Ｄｅｃ  １５；８８（６）：８６６〜７２）に記載されている。
【００２４】
ＨｕＤＳ６−ＤＭ４は、細胞傷害性マイタンシノイドであるＤＭ４にコンジュゲートした、腫瘍関連ΜＵＣ１−シアログリコトープであるＣＡ６に対するヒト化モノクローナル抗体（ｈｕＤＳ６）からなる、ファースト・イン・クラスの抗体−薬物免疫複合体である。ムチンタンパク質は、上皮表面での保護的な粘膜バリアの形成において重要な役割を果たし、肺、乳房、卵巣、胃および膵臓を含めた多くの異なる組織の粘膜表面を覆う上皮細胞の先端面で発現している。ΜＵＣ１（ムチン−１）は、いくつかの上皮癌で過剰発現していると知られており、ＣＡ６の過剰発現は、ヒトの癌における侵襲性の挙動および患者の悪い転帰に関連している。ＣＡ６は、正常な成体組織の中での分布が限られており、したがって、ＤＳ６抗体はＣＡ６陽性の腫瘍（例えば、卵巣、子宮、膵臓、乳房または肺の腫瘍）の選択的処置に対する有望な薬剤となる。抗体／抗原結合および内部移行の際に、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４免疫複合体はＤＭ４を放出し、ＤＭ４がチューブリンに結合し、微小管の集合／解体ダイナミクスを乱し、ＣＡ６過剰発現腫瘍細胞の有糸分裂停止をもたらす。ＨｕＤＳ６−ＤＭ４は、ＣＡ６抗原陽性の固形腫瘍と診断された患者において、第Ｉ相臨床試験を現在受けている。
【００２５】
腫瘍においてＣＡ６の発現を示し、それ故、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置に応答する可能性がある患者を同定するために、高親和性でＣＡ６に結合するコンパニオン診断ツールを開発した。さらに、このコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４療法に対する患者の応答（すなわち、腫瘍の縮小と相関があるＣＡ６シグナルの低下または不十分な効能とつながった標的のダウンレギュレーション）を非侵襲的にモニターし、それによって、臨床試験または臨床的処置における患者の層別化を容易にするための補助ツールを提供する、初期効能マーカーとして働く。そうしたコンパニオン診断薬は消耗を低減することができ、患者へ有効な医薬をより速く送達するのに役立ち得る。本明細書で開示されるコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質はまた、ＰＥＴバイオイメージングによるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡ６の検出に使用することもできる。高い腫瘍対血液シグナルを用いて、例えば、４８〜２４時間以内またはそれ以下での短い曝露時間および高速イメージングを可能にするために、適切なクリアランス動態を有する非常に特異的なバインダーが必要とされた。
【００２６】
ＰＥＴイメージングに必要とされる仕様（例えば、より良い腫瘍浸透、より速いクリアランス動態および優れた腫瘍対血液比）を満たすために、ＤＳ６抗体配列に由来する様々な新規抗体様結合タンパク質を、適切なキレート剤および放射標識とともに開発した。予め決定したメリット（ｍｅｒｉｔ）（ＩＦＯＭ）のイメージング図に基づいて、特異性評価および最終的な臨床解釈のために、約７０ｋＤａの抗体フラグメント（二価の単一特異性タンデム免疫グロブリン、Ｂ−Ｆａｂと呼ばれる）を選んだ。Ｂ−Ｆａｂ型式は、以下の利点をもたらした：（１）熱ストレス（４２℃で１週間のインキュベーション）に対する高い安定性；（２）ヒト血清（３７℃で２４時間のインキュベーション）中での高い安定性；および（３）一過的な細胞培養での妥当な産生能（約２ｍｇ／Ｌ）。全長抗体（約１５０ｋＤａ）と比較して、抗体フラグメント（約５０〜７５ｋＤａ）は、より速い腎臓排出速度および血液クリアランスを示し、これによって、ＰＥＴバイオイメージング間のより高いシグナル対ノイズ比がもたらされる。
【００２７】
Ｂ−Ｆａｂ  ＤＳ６抗体様結合タンパク質は、ＤＳ６ヒト化モノクローナル抗体のＣＡ６抗原認識部位に基づく２つのＣＡ６抗原認識部位を含み、ＣＡ６抗原に対して高い結合親和性を示す。キレート剤（例えば、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＥＴＡまたはＤｆ）とのコンジュゲーション後に、ＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂを放射標識して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＥＴバイオイメージング実験に使用した。
【００２８】
標準的な組換えＤＮＡ法を使用して、（ＤＳ６抗体に基づく）本発明のコンパニオン診断用抗体を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、こうしたポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、そうしたベクターを宿主細胞に導入した。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版）を参照されたい。酵素反応および精製法は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造者の仕様書に従って実施することができる。特定の定義が与えられない限り、本明細書に記載の分析化学、有機合成化学ならびに医化学および薬化学に関して利用される命名法、ならびにそれらの実験法および技法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。同様に、従来の技法を、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、送達および患者の処置に使用することができる。
【００２９】
１．一般的定義
本開示によって利用される場合、別段指示がない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解されたい。文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを指す。ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。そうした修飾としては、ブロモウリジン（ｂｒｏｍｕｒｉｄｉｎｅ）などの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【００３１】
「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのある組み合わせであり、その起源によって、単離ポリヌクレオチドは：（１）単離ポリヌクレオチドが天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と結合していない、（２）天然では結合しないポリヌクレオチドに連結している。または（３）大きな配列の一部として天然では存在しない。
【００３２】
「単離ポリペプチド」は：（１）通常は見出されると思われる少なくともいくつかの他のポリペプチドを含んでいないもの、（２）同じ供給源からの、例えば同じ種からの他のポリペプチドを本質的に含んでいないもの、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるもの、（４）少なくとも約５０パーセントの天然では結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物もしくは他の物質から分離されたもの、（５）「単離ポリペプチド」が天然では結合しているポリペプチドの部分と（共有結合性または非共有結合性相互作用によって）結合していないもの、（６）天然では結合していないポリペプチドと（共有結合性または非共有結合性相互作用によって）作動可能に結合しているもの、または（７）天然では存在しないものである。そうした単離ポリペプチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡまたはそれらの任意の組み合わせによってコードされ得る。好ましくは、単離ポリペプチドは、その天然環境で見られ、その使用（治療、診断、予防、研究など）を妨げると思われるポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体およびマウス抗体を包含する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、これらに限定されないが、マウスおよびラットなどのげっ歯類ならびにウサギなどのウサギ類を含めた、ヒト以外の哺乳動物で産生される。他の実施形態では、ヒト抗体はハイブリドーマ細胞で産生される。さらに他の実施形態では、ヒト抗体は組換えで産生される。
【００３５】
天然起源の抗体は、一般的に四量体を含む。そうした四量体のそれぞれは、一般的にポリペプチド鎖の２つの同一対から構成され、各対は、１つの全長「軽」鎖（一般的に、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重」鎖（一般的に約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。本明細書で使用する場合、用語「重鎖」および「軽鎖」は、標的抗原に対して特異性を与えるのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。軽鎖および重鎖のそれぞれのアミノ末端部分は、一般的に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを一般的に含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、一般的に、エフェクター機能に関与する定常ドメインを規定する。したがって、天然起源の抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシ
ル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインはカルボキシル末端にある。
【００３６】
哺乳類の軽鎖、特にヒトの軽鎖は、一般的にκ軽鎖およびλ軽鎖に分類され、ヒトの重鎖は、一般的にμ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして規定する。ＩｇＧには、これらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めたいくつかのサブクラスがある。ＩｇＭには、これらに限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含めたサブクラスがある。同様に、ＩｇＡは、これらに限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含めたサブクラスに細分される。全長の軽鎖および重鎖内で、可変および定常ドメインは、一般的に、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合し、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、すべての目的のために参照によってその全体を組み入れる、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ，Ｗ．ら、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、第二版、１９８９）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、一般的に、抗原結合部位を形成する。天然起源の抗体の可変ドメインは、一般的に、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの高頻度可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、一般的に、フレームワーク領域によって整列され、これによって、特異的エピトープへの結合が可能になり得る。アミノ末端からカルボキシル末端まで、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、一般的に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「天然Ｆｃ」は、単量体形態であろうと多量体形態であろうと、抗体の消化から得られるまたは他の方法によって生成される非抗原結合性フラグメントの配列を含む分子を指し、ヒンジ領域を含むことができる。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源のものであり、免疫グロブリンのいずれかであり得るが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ分子は、共有結合性会合（すなわちジスルフィド結合）および非共有結合性会合によって二量体または多量体形態に連結され得る、単量体ポリペプチドで構成されている。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１およびＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４に及ぶ。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られる、ジスルフィド結合した二量体である。本明細書で使用する場合、用語「天然Ｆｃ」は、単量体、二量体および多量体形態に対する総称である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す。例示的なＦｃ変異体およびサルベージ受容体とのその相互作用は当技術分野で既知である。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからのヒト化の分子または配列を含むことができる。さらに、天然Ｆｃは、除去可能な領域を含み、なぜらば、これが、本発明の抗体様結合タンパク質について必要とされない構造的特色または生物活性を与えるからである。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、以下のこと：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞で発現させる際のＮ末端の異種性、（４）糖鎖付加、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすもしくは関与する、１つもしくはそれ以上の天然Ｆｃ部位もしくは残基を欠く、またはこうした１つもしくはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が改変された、分子または配列を含む。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃドメイン」は、天然ＦｃおよびＦｃ変異体ならびに上記で定義された配列を包含する。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃ分子と同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化されたものであろうと、他の方法で生成されたものであろうと、単量体または多量体形態の分子を含む。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「抗体様結合タンパク質」は、少なくとも１つの標的抗原に特異的に結合する非天然起源（または組換え）改変分子を指す。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびダイアボディを包含する。
【００４１】
ある種の態様では、「抗体様結合タンパク質」は、タンデムに配置され、短いアミノ酸リンカー配列によって分離された、抗体由来のそれぞれのＶＬおよびＶＨのＤＮＡ配列を、以下の式［Ｉ］および［ＩＩ］：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ  ［Ｉ］
ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ１  ［ＩＩ］
に従って含み、
式中：
ＶＬ１は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり；
ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント（二価の単一特異性タンデム免疫グロブリンフラグメント）を形成する。
【００４２】
ある種の態様では、ＶＬ１およびＶＬ２は同一のポリペプチドであり、ある種の態様では、ＶＨ１およびＶＨ２は同一のポリペプチドである。
【００４３】
ある種の態様では、Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸の長さである。
【００４４】
ある種の態様では、または一般的に、ＣＬおよびＣＨ１ドメインはジスルフィド結合によって連結される。
【００４５】
ある種の態様では、Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、ＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）のいずれかである。
【００４６】
ある種の態様では、式［Ｉ］のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む。
【００４７】
ある種の態様では、式［ＩＩ］のポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む。
【００４８】
ある種の態様では、前記抗体様結合タンパク質は、少なくとも１つの放射標識、イメージング剤、治療剤または診断剤をさらに含む。
【００４９】
ある種の態様では、前記抗体様結合タンパク質は、少なくとも１、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５Ｃｉ／μモルの比活性を有する。
【００５０】
ある種の態様では、前記抗体様結合タンパク質は、例えば遊離抗体様結合タンパク質を用いて、ＦＡＣＳによって結合を測定する場合に、最大で８、７、６、５または４ｎＭの見かけのＫｄを有し得る。
【００５１】
ある種の態様では、前記抗体様結合タンパク質は、熱ストレスに対して高い安定性を示す。より詳細には、可溶性抗体様結合タンパク質の２５、２０、１５、１０または５％未満が、４２℃で１週間のインキュベーション後に失われる可能性がある。
【００５２】
ある種の態様では、前記抗体様結合タンパク質は、ヒト血清中で高い安定性を示す。より詳細には、抗体様結合タンパク質の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５％が、ヒト血清中での３７℃で２４時間のインキュベーション後に単量体であり得る。
【００５３】
「単離」抗体様結合タンパク質は、その天然環境の成分から同定および分離ならびに／または回収された抗体様結合タンパク質である。その天然環境の混入成分は、抗体様結合タンパク質の診断的または治療的使用を妨げると思われる物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれる。好ましい実施形態では、抗体様結合タンパク質は：（１）ローリー法で測定した際に抗体の９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシーケネーターの使用によって、少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分である程度まで、または（３）クマシーブルー、好ましくは銀染色を使用する還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離抗体様結合タンパク質は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体様結合タンパク質を含み、これは、抗体様結合タンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に純粋」または「実質的に精製された」は、存在する主な化学種である化合物または化学種（すなわち、これは、モル基準で組成物中のいかなる他の個々の化学種よりも豊富である）を指す。いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は組成物であり、ここで化学種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を占める。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在するすべての高分子種（ｍａｃｒｏｍｏｌａｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％より多くを占める。さらに他の実施形態では、化学種は本質的に均一になるまで精製され（混入種は、従来の検出方法によって組成物中に検出され得ない）、この場合、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」または「標的抗原」は、抗体または抗体様結合タンパク質に結合することができ、さらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために動物で使用することができる、分子または分子の一部を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有し得る。抗体様結合タンパク質によって認識される各標的抗原に対して、抗体様結合タンパク質は、標的抗原を認識するインタクトな抗体と競合することができる。「多特異性」または「多機能性」抗体様結合タンパク質以外の「二価」抗体様結合タンパク質は、同一の抗原特異性を有する抗原結合部位を含むと理解されている。
【００５６】
二重特異性または二機能性抗体は、一般的に、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位またはエピトープを有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、これらに限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）フラグメントの連結を含めた様々な方法によって、生成することができる。
【００５７】
Ｆａｂとも称されるＦ（ａｂ）フラグメントは、一般的に、１つの軽鎖ならびに重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、Ｆ（ａｂ）フラグメントのＶＨ−ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成しない。本明細書で使用する場合、Ｆ（ａｂ）フラグメントは、アミノ酸リンカーで分離された２つの可変ドメインを含む１つの軽鎖ならびにアミノ酸リンカーで分離された２つの可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む１つの重鎖を含むこともできる。Ｆ（ａｂ）フラグメントは、ＣＬおよびＣＨ１の間にジスルフィド結合を含むこともできる。
【００５８】
Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、一般的に、１つの軽鎖およびより多くの定常領域を（ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に）含む１つの重鎖の一部を含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成され得る。
【００５９】
「ダイアボディ」は、一般的に、一緒にフォールドするには２つの可変領域にとって短すぎ、ｓｃＦｖを二量体化させる低分子ペプチドリンカーによって結合した重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域からそれぞれなる、２つの単鎖の可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の二量体である。
【００６０】
本発明の抗体様結合タンパク質に関連して、フレーズ「生物学的特徴」、「生物学的特性」および用語「活性」は、本明細書で互換的に使用され、これらには、限定されないが、エピトープ親和性および特異性、抗原標的（または標的ポリペプチド）の活性をアンタゴナイズする能力、抗体様結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性、ならびに抗体様結合タンパク質の免疫原性的特徴が含まれる。抗体様結合タンパク質の他の特定可能な生物学的特徴または特性としては、例えば、交差反応性（すなわち、一般に、抗原標的の非ヒト相同体とのまたは他の抗原標的もしくは組織との交差反応性）および哺乳動物細胞で高いタンパク質発現レベルを保持する能力が挙げられる。これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴解析、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの中和アッセイならびにヒト、霊長類または必要に応じて任意の他の供給源を含めた様々な供給源からの組織切片を用いる免疫組織化学的検査を含めた、当技術分野で認識される技法を使用して、前述の特徴または特性を観察または測定することができる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント」は、ポリペプチドフラグメントが得られた免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のＣＤＲを少なくとも含むポリペプチドフラグメントを指す。免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、標的抗原に結合することができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「中和」抗体様結合タンパク質は、それが結合する標的抗原のエフェクター機能をブロックするまたは実質的に低減することができる分子を指す。本明細書で使用する場合、「実質的に低減する」は、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より一層好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の、標的抗原のエフェクター機能の低減を意味する。
【００６３】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ−細胞受容体に特異的に結合することができる、任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。ある種の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面基を含み、ある種の実施形態では、特定の三次元構造特性および／または特定の荷電特性を有し得る。エピトープは、抗体または抗体様結合タンパク質が結合する抗原領域である。ある種の実施形態では、抗体様結合タンパク質は、それが、タンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。好ましい実施形態では、抗体様結合タンパク質は、平衡解離定数が≦１０−８Ｍ、より好ましくは平衡解離定数が≦１０−９Ｍ、最も好ましくは解離定数が≦１０−１０Ｍの場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００６４】
抗体様結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば表面プラズモン共鳴法によって決定することができる。一般に、表面プラズモン共鳴解析は、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物（溶液中の抗体様結合タンパク質）の間のリアルタイムの結合相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定する。表面プラズモン解析は、分析物（バイオセンサーマトリックス上の抗体様結合タンパク質）を固定化し、リガンド（標的抗原）を提示することによって実施することもできる。本明細書で使用する場合、用語「ＫＤ」は、特定の抗体様結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」は、抗体様結合タンパク質またはその抗原結合性フラグメントが、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍもしくはそれ以上のＫｄでエピトープを含む抗原に結合する能力および／または非特異的な抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性でエピトープに結合する能力を指す。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、免疫グロブリンドメインの間に挿入されて、交差した二重可変領域免疫グロブリンにフォールドするように軽鎖および重鎖のドメインに対して十分な可動性を与える、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。非限定例としては、グリシン／セリンリンカー、例えばＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）、およびグリシン／アラニンリンカーが挙げられる。リンカーは、可変ドメイン間のまたは可変ドメインと定常ドメインの間の移行部に、それぞれ配列レベルで挿入される。免疫グロブリンドメインのほぼ正確なサイズがよく理解されているので、ドメイン間の移行部を特定することができる。ドメイン移行部の正確な位置は、実験データで示されるような、またはモデリングまたは二次構造予測の技法によって想定され得るような二次構造的要素、例えばβシートまたはαヘリックスなどを形成しないペプチドストレッチの位置を突き止めることによって決定することができる。リンカーは独立しているが、場合によっては、同じ配列および／または長さを有してもよい。例示的なアミノ酸リンカーは当技術分野で既知であり、本明細書に記載の使用に適する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「タグ」は、ポリペプチドまたは抗体様結合タンパク質の任意の位置（一般的にＮ末端またはＣ末端）に通常インフレームで融合した、任意の連結分子または親和性ベースの配列を指す。適切なタグの存在は、抗体様タンパク質の検出、精製または他の特性を向上させる働きをし得る。適切な親和性ベースのタグとしては、別の部分に特異的に結合することができる任意の配列が挙げられる（非限定例としては、ポリヒスチジン、６ｘ−ヒスチジン、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ビオチン、ＨＡ、ＧＳＴまたはＭＢＰが挙げられる）。場合によっては、連結分子は、ポリペプチドの存在を報告することができる任意のドメインを含み得る発光性レポーターでもよい。適切な発光性レポータードメインとしては、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質またはそれらの発光変異体が挙げられる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、コード化情報を宿主細胞に伝達するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指す。用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントを挿入することができる、環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に挿入することができる。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌性複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それに作動可能に連結される遺伝子の発現を導くことができる。そうしたベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書で言及する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形であることが多い。用語「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般に使用されるベクター形態であるので、本明細書で互換的に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むことが意図される。
【００６９】
用語「作動可能に連結される」は、隣接配列の配置を指すために本明細書で使用され、そのように記載される隣接配列は、その通常の機能を果たすように構成または構築される。したがって、コード配列に作動可能に連結される隣接配列は、コード配列の複製、転写、および／または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、プロモーターがそのコード配列の転写を導くことができる場合は、コード配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、それが正確に機能する限り、コード配列と近接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在性配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結される」と依然として考えることができる。
【００７０】
本明細書で使用する場合、フレーズ「組換え宿主細胞」（または「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、そうした細胞の子孫も言及することが意図される。変異または環境上の影響のいずれかが原因で、ある種の改変が後代に生じる可能性があるので、そうした子孫は、実際は親細胞と同一でない可能性があるが、それでもそうした細胞は、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類の発現システム（ならびにファージディスプレイ発現システム）を含めた多種多様の宿主細胞発現システムを、本発明の抗体様結合タンパク質を発現させるのに使用することができる。適切な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ１９である。抗体様結合タンパク質を組換えで発現させるために、ポリペプチド鎖が宿主細胞で発現され、好ましくは宿主細胞が培養される培地中に分泌され、その培地から抗体様結合タンパク質を回収できるように、宿主細胞を、抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターで形質転換または形質移入する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「形質転換」は、細胞の遺伝的特性の変更を指し、細胞が新しいＤＮＡを含むように改変された場合に、細胞は形質転換されている。例えば、細胞は、その天然の状態から遺伝子改変される場合に、形質転換される。形質転換に続いて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによって細胞のＤＮＡと組換えることができ、または複製されることなしにエピソームの要素として一過的に維持することができ、またはプラスミドとして独立に複製することができる。形質転換ＤＮＡが細胞分裂とともに複製される場合に、細胞は、安定して形質転換されたと考えられる。本明細書で使用する場合、用語「形質移入」は、細胞による外来性または外因性のＤＮＡの取り込みを指し、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に、細胞は「形質移入」されている。いくつかの形質移入技法が当技術分野で周知である。そうした技法は、１つまたはそれ以上の外因性ＤＮＡ分子を適切な宿主細胞に導入するのに使用することができる。
【００７２】
本明細書で使用され、物体に適用される用語「天然起源」は、物体が天然に見出され得、かつ人間によって操作されていないことを指す。例えば、天然供給源から単離することができ、かつ人間によって意図的に改変されていない、（ウイルスを含めた）生物体に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然起源である。同様に、本明細書で使用する場合、「非天然起源」は、天然に見られない、または構造的に改変された、または人間によって合成された物体を指す。
【００７３】
本明細書で使用する場合、２０種の従来のアミノ酸およびそれらの省略形は、従来の用法に従う。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）；非天然アミノ酸、例えばα−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型のアミノ酸も、本発明の抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖に対する適切な成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表示法では、標準的な用法および慣例に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル末端方向である。
【００７４】
天然起源の残基は、共通の側鎖の特徴に基づいて以下のクラスに分けることができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
【００７５】
保存的アミノ酸置換は、こうしたクラスのうちの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。保存的アミノ酸置換は、非天然起源のアミノ酸残基を包含することができ、これは、一般的に、生物学的システムでの合成よりもむしろ化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらは、ペプチド模倣薬およびアミノ酸残基の他の逆転または反転形態を含む。非保存的置換は、こうしたクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。
【００７６】
当業者は、周知の技法を使用して、本発明の抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖の適切な変異体を決定することができる。例えば当業者は、活性に重要でないと考えられる領域を標的にすることによって、活性を損なうことなしに変化させることができる、ポリペプチド鎖の適切な領域を特定することができる。あるいは当業者は、同様のポリペプチドの間で保存された分子の残基および部分を特定することができる。さらに、生物活性または構造に重要であり得る領域でさえ、生物活性を損なうことなしに、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなしに、保存的アミノ酸置換を受けることができる。
【００７７】
用語「キレート剤」は、少なくとも２つの非金属イオンに配位した金属を含むことができる複素環形態の化学化合物である。抗体様結合タンパク質上にハード酸カチオンキレート部分が存在することは、コンパニオン診断薬の迅速なｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスを確実にするのに役立つ。
【００７８】
キレート剤は、バイオコンジュゲーションの標準的な方法を使用して、抗体または抗体様結合タンパク質に共有結合される。抗体のアミン含有残基（例えば、リジンまたはＮ末端）は、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を含むキレート剤とのアミド結合形成を受ける。硫黄含有残基（例えば、システイン）は、活性化エステルまたはマレイミド部分を含むキレート剤とのコンジュゲーションを受ける。あるいは、バイオコンジュゲートは、抗体の活性化カルボン酸残基が、それぞれキレート剤上で、アミンまたはチオール基とのアミドまたはチオエステル形成を受ける場合に形成される。二機能性リンカー、例えば、ＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ−Ｍａｌ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などは、必要に応じて使用される。
【００７９】
キレート剤はその金属結合特徴で選ばれ、随意に変更することができる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＤＴＰＡ（１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）およびＤｆ（デスフェリオキサミンＢ）などのキレート剤は、様々な放射標識、放射性核種、放射性同位体、金属および放射性金属とともに有用である。配位子がカルボキシレートまたはアミン基などのハード塩基のキレート官能基を含むＤＯＴＡ型キレート剤は、ハード酸カチオン、特にＩＩａ族およびＩＩＩａ族の金属カチオンをキレート化するのに最も有効である。そうした金属キレート錯体は、環のサイズを目的の金属に合わせることにより、非常に安定化させることができる。また、１種を超えるキレート剤を、標的化可能なコンストラクトにコンジュゲートして、複数の金属イオン、例えば、診断用放射性核種および／または治療用放射性核種を結合することができる。
【００８０】
抗体または改変抗体様結合タンパク質のキレート剤に結合させることができる、特に有用な診断用放射標識、放射性核種または放射性同位体としては、これらに限定されないが、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のγ放射体、β放射体もしくは陽電子放出体が挙げられる。診断用放射標識は、２５〜１０，０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは２５〜４，０００ｋｅＶの範囲、さらにより好ましくは２０〜１，０００ｋｅＶの範囲、さらにより好ましくは７０〜７００ｋｅＶ範囲の崩壊エネルギーを含む。有用な陽電子放出放射性核種の全崩壊エネルギーは、好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出を利用する診断剤として有用な放射標識としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７およびＴ１−２０１。有用なγ線放出放射標識の崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「患者」には、これらに限定されないが、ヒトおよび動物対象が含まれる。
【００８２】
「障害」は、本発明の抗体または改変抗体様結合タンパク質を使用する処置の利益を享受すると思われる任意の状態である。「障害」および「状態」は本明細書で互換的に使用され、問題になっている障害に患者を罹りやすくする病態を含めた、慢性および急性の障害または疾患を含む。ある種の態様では、障害は固形腫瘍癌などの癌である。ある種の特定の態様では、癌は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、腎臓癌、リンパ系の癌、ＣＡ６が発現している肉腫もしくは癌腫、またはＣＡ６グリコトープが優勢に発現している、まだ確定されていない他の癌である。癌は、例えば、漿液性卵巣癌腫、類内膜卵巣癌腫、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、陰門の新生物、乳癌腫、膵臓腫瘍および尿路上皮の腫瘍でもよい。
【００８３】
選択された細胞集団を死滅させることによって処置することができるいかなる障害も、本明細書に記載の抗体様結合タンパク質を用いて使用するのに適し、例えば、癌、自己免疫疾患、例えば、全身紅はん性、関節リウマチおよび多発性硬化症；移植片拒絶反応、例えば腎臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応および骨髄移植拒絶反応；移植片対宿主疾患；ウイルス感染、例えばｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなど；および寄生虫感染、例えばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症、ならびに当業者によって決定される他のものである。
【００８４】
参照発現レベルは、例えば、患者の（例えば、腫瘍を含む組織と同じ組織型からの）非疾患組織におけるＣＡ６の発現レベルでもよく、または参照基準は、例えば、当技術分野で認められた標準、例えば個体集団からの非疾患組織の発現レベルに由来するものから決定することができる。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「処置」または「処置する」は、治療的処置および予防的または防止的対策の両方を指す。処置を必要としているものは、障害を有するもの、および障害を有する傾向があるもの、または障害が防止されるべきものを含む。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」または「治療用組成物」は、患者に正しく投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能な担体」または「生理学的に許容可能な担体」は、抗体または改変抗体様結合タンパク質の送達を達成または増強するのに適した、１つまたはそれ以上の製剤化材料を指す。
【００８８】
１つまたはそれ以上の抗体または改変抗体様結合タンパク質を含む医薬組成物に関連して使用する場合、用語「有効量」および「治療有効量」は、所望の治療結果をもたらすのに十分である量または投薬量を指す。より詳細には、治療有効量は、ある期間にわたって、処置を受ける状態と関係がある臨床的に定義された病的過程の１つまたはそれ以上を阻害するのに十分な、抗体または改変抗体様結合タンパク質の量である。本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、ＣＡ６発現組織、例えば腫瘍組織を可視化するのに有効な抗体様タンパク質の量も指す。有効量は、使用されている特定の抗体または改変抗体様結合タンパク質に依存して変わる可能性があり、処置を受ける患者および障害の重症度に関する様々な因子および状態にも依存する。例えば、抗体または改変抗体様結合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、患者の年齢、体重および健康状態ならびに前臨床動物研究で得られる用量反応曲線および毒性データなどの因子が、考慮される因子の１つであろう。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「取得する」または「取得すること」は、物理的実体または値を「直接的に取得すること」または「間接的に取得すること」によって、物理的実体または値、例えば数値の所持を得ることを指す。「直接的に取得すること」は、物理的実体または値を得るために、方法を実施する（例えば、合成法または分析法を実施する）ことを意味する。「間接的に取得すること」は、別の団体または供給源（例えば、物理的実体または値を直接的に取得した第三者の研究室）から物理的実体または値を受け取ることを指す。物理的実体を直接的に取得することは、物理的物質、例えば出発材料における物理的変化を含む方法を実施することを含む。例示的変化としては、２つまたはそれ以上の出発材料から物理的実体を作製すること、物質を剪断またはフラグメント化すること、物質を分離または精製すること、２つまたはそれ以上の分離した実体を混合物中で合わせること、共有結合または非共有結合を破壊または形成することを含む化学反応を実施することが挙げられる。値を直接的に取得することは、サンプルまたは別の物質における物理的変化を含む方法を実施すること、例えば、物質、例えば、サンプル、分析物または試薬における物理的変化を含む分析方法を実施すること（「物理的解析」と本明細書で言及することもある）を含む。
【００９０】
間接的に取得した情報は、例えば、オンラインデータベースまたはアプリケーション（「Ａｐｐ」）などから紙または電子形態で与えられるレポートの形で提供され得る。レポートまたは情報は、例えば、医療機関、例えば病院またはクリニック；または医療提供者、例えば医師または看護師によって提供され得る。
【００９１】
本発明の一実施形態は、医薬的に許容可能な担体および治療有効量の抗体または改変抗体様結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００９２】
２．抗体様結合タンパク質の使用
本発明の抗体または改変抗体様結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量化のための任意の既知のアッセイ法、例えば競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイで用いることができる。抗体または改変抗体様結合タンパク質は、用いられるアッセイ法に適切な親和性で、１つまたはそれ以上の標的抗原に結合する。
【００９３】
診断的適用に関して、ある種の実施形態では、改変抗体様結合タンパク質を、検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを発生することができる、いかなるものでもよい。例えば、検出可能な部分は、放射標識、放射性同位体、放射性核種、イメージング剤、治療剤または診断剤、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、１１Ｃ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、１２４Ｉもしくは６７Ｇａ；蛍光性または化学発光性化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン；または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼでもよい。
【００９４】
適切なレポーター部分は、特定のイメージング法（例えば、ＰＥＴイメージングのための１８Ｆ／１１Ｃ／６８Ｇａ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ／１２４Ｉ放射標識レポーター、ＳＰＥＣＴイメージングのための９９ｍＴｃ／１１１Ｉｎ標識レポーター、光学イメージングのための蛍光色素標識レポーターまたはＭＲＩのための常磁性体標識レポーター）によって検出することができる。適切な適合（ｍａｔｃｈ）は、抗体または抗体様結合タンパク質の生物学的半減期と放射標識の物理的な半減期（表１を参照されたい）の間が推奨される。
【００９５】
【表１】
2016515093.tif 000003
【００９６】
イメージングコンパニオン診断プローブまたは抗体様結合タンパク質の開発は、創薬と類似しているプロセス（例えば、標的プローブをはじめとして、放射線量測定、医薬品の安全性試験の実施に関する基準の毒性試験、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準の生産、前臨床評価、標的プローブの前臨床検証、ならびに臨床評価）を本質的に必要とする。評価すべきさらなるパラメーターは：トレーサー投与に対するイメージングの最適なタイミング、ｅｘ  ｖｉｖｏ解析との相関、トレーサーの生体内分布および標的特異性（放射標識された無関係のフラグメントで試験される）である。一度完全に開発されれば、分子イメージングプローブは、特定の薬物または薬剤に対する分子イメージングコンパニオン診断薬として使用することができる。
【００９７】
本発明の改変抗体様結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにも有用である。検出可能な部分で標識された抗体様結合タンパク質は、動物に、好ましくは血流に投与することができ、宿主中の標識抗体の存在および位置をアッセイする。抗体様結合タンパク質は、核磁気共鳴によろうと、陽電子放出断層撮影によろうと、または当技術分野で既知の他の検出手段によろうと、動物で検出可能な任意の部分で標識することができる。
【００９８】
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング法は、組織中のＣＡ６グリコトープの発現レベルを評価するために、腫瘍組織などの組織をイメージングするのに使用することができる。組織中のＣＡ６の発現レベルの決定は、例えば、癌患者などの患者がＣＡ６グリコトープを標的にする薬物による処置の良い候補であるかどうかを決定するのに有用である。例えば、抗体様結合タンパク質は、ｈｕＤＭ６−ＤＭ４細胞傷害剤に対するコンパニオン診断薬として有用である。
【００９９】
一実施形態では、患者は、ｈｕＤＭ６−ＤＭ４などのＣＡ６標的化分子による治療に関して評価される。患者は、例えば、腫瘍組織などの疾患組織（例えば組織生検）中のＣＡ６の発現レベルに関して情報を取得することによって評価され、ＣＡ６の発現レベルが参照発現レベルの１０％を超える（例えば、参照レベルより１０％、２０％、３０％、４０％以上またはそれ以上）と決定された場合、次いで患者は、ＣＡ６標的化分子による処置に関して良い候補であると決定される。ＣＡ６標的化分子による処置に関して良い候補である患者は、この分子による処置に陽性に応答すると予想される。適切なＣＡ６の発現レベルを有さない、例えば参照基準と比較して１０％未満のＣＡ６発現の患者は、ＣＡ６標的化分子による処置に関して良い候補でないと決定される。
【０１００】
参照発現レベルは、例えば、患者の（例えば腫瘍を含む組織と同じ組織型からの）非疾患組織におけるＣＡ６の発現レベルでもよく、または参照基準は、例えば、当技術分野で認められた標準、例えば個体集団からの非疾患組織の発現レベルに由来するものから決定することができる。
【０１０１】
一実施形態では、対象の組織中のＣＡ６の発現レベルは、例えばサービスプロバイダーから、例えば医療機関から、例えば病院またはクリニックまたは医院から、または医師もしくは看護師などの医療専門家から、または保険業者から、またはデータベースから間接的に取得される。別の実施形態では、ＣＡ６の発現レベルは、本発明で注目する抗体様結合タンパク質を対象に投与し、バイオイメージング法によってＣＡ６の発現レベルを決定するなど、直接的に決定される。
【０１０２】
ＣＡ６標的化分子による処置に関して良い候補であると決定された患者は、場合により、ＣＡ６標的化分子をさらに投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡ６標的化分子によって処置される患者は、ＣＡ６標的化分子による処置後にＣＡ６の発現レベルが変化している（例えば、低下している）かどうかを決定するために、ＣＡ６標的化分子の投与後（例えば、毎週、隔週、毎月、隔月）の間隔でモニターされる。ある時間後、または患者が有害事象を提示後に、疾患組織中のＣＡ６の発現レベルが未変化のままである場合は、ＣＡ６標的化分子による処置を中止するまたは続ける決定を行うことができる。
【０１０３】
一実施形態では、患者はｈｕＤＭ６−ＤＭ４などのＣＡ６標的化分子による処置の間、モニターされる。患者は、例えば、ＣＡ６標的化分子の投与またはｈｕＤＭ６−ＤＭ４などのＣＡ６標的化分子による処置の後に、腫瘍組織などの疾患組織中のＣＡ６の発現レベルに関して情報を取得することによってモニターされ、ＣＡ６の発現レベルが参照発現レベルの１０％を超える（例えば、参照レベルより１０％、２０％、３０％、４０％以上またはそれ以上）であると決定される場合、患者は、ＣＡ６標的化分子による継続的な処置に関して良い候補であると決定される。ＣＡ６の発現レベルが、ｈｕＤＭ６−ＤＭ４などのＣＡ６標的化分子による処置の間に低下したと決定される場合、患者は、この分子による処置に陽性に応答し、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４による処置を続けるべきであると決定される。適切なＣＡ６の発現レベルを有さない、例えば、参照基準と比較して１０％未満のＣＡ６発現の患者、またはＣＡ６の発現レベルが増大した患者は、ＣＡ６標的化分子による継続的な処置に関して良い候補でないと決定される。
【０１０４】
本明細書で開示される本発明は、抗体様結合タンパク質および生物学的サンプル中の標的抗原レベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットにも関する。そうした試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性の対照サンプルならびに検出試薬を含むことができる。
【０１０５】
４．改変抗体様結合タンパク質組成物およびその投与
改変抗体様結合タンパク質を含む組成物は本発明の範囲内である。そうした診断的、治療的または医薬的組成物は、診断的または治療的有効量の抗体様結合タンパク質または抗体様結合タンパク質−薬物コンジュゲートを、投与様式と適合するように選択される医薬的にまたは生理学的に許容可能な製剤化薬剤と混合物して、含むことができる。
【０１０６】
許容可能な製剤化材料は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度において、受容者に対して非毒性である。
【０１０７】
診断的または医薬的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を改変する、維持するまたは保持するための製剤化材料を含むことができる。適切な製剤化材料としては、これらに限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えば、ボレート、炭酸水素、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、シトレート、ホスフェートもしくは他の有機酸）、充填剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、フィラー、単糖類、二糖類および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）、着色剤、着香料および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えばポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールもしくはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定増強剤（例えば、ショ糖もしくはソルビトール）、張性増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属−好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム−またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤ならびに／または医薬的補助剤が挙げられる（いかなる目的のためにも、参照によって本明細書に組み入れる、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）およびこれのその後の版を参照されたい）。
【０１０８】
最適な診断的または医薬的組成物は、例えば、所期の投与経路、送達型式および所望の投薬量に応じて、当業者によって決められる。そうした組成物は、抗体様結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出速度およびｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響する可能性がある。
【０１０９】
診断的または医薬的組成物の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に、水性でもよいし非水性でもよい。例えば、注射用の適切なビヒクルまたは担体は、場合によっては非経口投与用組成物によく見られる他の材料で補充されている、水、生理食塩水または人工の脳脊髄液でもよい。血清アルブミンと混合した中性の緩衝食塩水または生理食塩水は、さらなる例示的ビヒクルである。他の例示的医薬組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これは、ソルビトールまたは適切な代替物をさらに含むことができる。本発明の一実施形態では、改変抗体様結合タンパク質組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤化薬剤と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形で、保管用に製造することができる。さらに、抗体様結合タンパク質は、ショ糖などの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０１１０】
本発明の診断的または医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入または経口のような消化管を介した送達用に選択することができる。そうした医薬的に許容可能な組成物の製造は、当技術分野の範囲内である。
【０１１１】
製剤成分は、投与部位にとって許容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨで、一般的に約５〜約８のｐＨ範囲内で組成物を維持するのに使用される。
【０１１２】
非経口投与が意図される場合は、本発明で使用するための診断的または治療用組成物は、医薬的に許容可能なビヒクルに所望の抗体様結合タンパク質を含む、発熱物質を含有しない非経口的に許容可能な水溶液の形でもよい。非経口注射に特に適したビヒクルは、抗体様結合タンパク質が、適切に保存された滅菌等張液として製剤化される滅菌蒸留水である。さらに別の製造物は、薬剤、例えば、蓄積注射を介して送達され得る生成物の制御または持続性放出を提供する、注射可能なマイクロスフェア、生体分解可能な粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームとともに、所望の分子の製剤を含み得る。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、循環における持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子を導入するための他の適切な手段としては、埋め込み式の薬物送達装置が挙げられる。
【０１１３】
一実施形態では、診断的または医薬的組成物は、吸入用に製剤化することができる。例えば、抗体または改変抗体様結合タンパク質は、吸入用の乾燥散剤として製剤化することができる。抗体様結合タンパク質の吸入液剤も、エアロゾル送達のための噴射剤を用いて製剤化することができる。さらに別の実施形態では、液剤を噴霧することができる。
【０１１４】
ある種の製剤を経口的に投与し得ることも意図される。本発明の一実施形態では、この様式で投与される抗体様結合タンパク質は、錠剤およびカプセル剤などの固形剤形の配合に習慣的に使用される担体の有無にかかわらず、製剤化することができる。例えば、カプセル剤は、生物学的利用能が最大になり、前全身性分解が最小になる、消化管のあるポイントで、製剤の活性部分を放出するように設計することができる。抗体様結合タンパク質の吸収を容易にするために、さらなる薬剤を含むことができる。希釈剤、着香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤も用いることができる。
【０１１５】
別の診断的または医薬的組成物は、錠剤の製造に適した無毒性の賦形剤との混合物中に、有効量の抗体様結合タンパク質を含むことができる。滅菌水または別の適切なビヒクルに錠剤を溶解させることによって、単位剤形で液剤を製造することができる。適切な賦形剤としては、これらに限定されないが、不活性な希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素、ラクトース、もしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴム；または平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクが挙げられる。
【０１１６】
持続または制御送達製剤での、抗体様結合タンパク質を含む製剤を含めた、さらなる本発明の診断的または医薬組成物は、当業者に明らかである。様々な他の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体分解可能な微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射を製剤化する技法も、当業者に知られている。持続性放出製造物のさらなる例としては、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続性放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニルアセテートまたはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含むことができる。持続性放出組成物は、リポソームを含むこともでき、これは、当技術分野で既知のいくつかの方法のうちのいずれかによって製造することができる。
【０１１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される本発明の診断的または医薬組成物は、一般的に、滅菌される必要がある。これには、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥されている場合は、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成より前にまたは後に行うことができる。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保管することができる。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌された出入り口を有する容器、例えば、皮下注射針で穴をあけることができるストッパーを有する静脈輸液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１１８】
一度診断的または医薬的組成物が製剤化されると、それを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固形物として、または乾燥または凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保管することができる。そうした製剤は、使用準備済形態または投与より前に再構成を要する形態（例えば凍結乾燥化）のいずれかで保管することができる。
【０１１９】
本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットも包含する。キットは、それぞれ、乾燥したタンパク質を有する第一の容器および水性製剤を有する第二の容器の両方を含むことができる。単一のチャンバーおよび複数のチャンバーを有する、予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットも、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２０】
所望の分子が吸収されたまたはカプセル化された膜、スポンジまたは他の適切な材料の埋め込みによって、組成物を、局所的に投与することもできる。埋め込み装置を使用する場合は、装置を任意の適切な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラスまたは連続的投与を介することができる。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびそれらの様々な使用の例示である。これらは、説明目的のためのみに記述され、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【実施例１】
【０１２２】
ヒト化ＤＳ６モノクローナル抗体およびＤＳ６−ＤＭ４の放射標識およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特性評価
臨床的に有用な分子イメージング剤は、投与後の妥当な時間内で高コントラストイメージをもたらし、腫瘍浸透を示し、より速いクリアランス動態を有し、優れた腫瘍対血液比を示す。バイオイメージングでインタクトな天然抗体を使用することの注意は、腫瘍取り込みおよび血液クリアランスの動態が本質的に遅いことであり；これらはまた、高いバックグラウンドを有し、明瞭な腫瘍のイメージを得るために長時間（数時間〜数日）を必要とする傾向がある。
【０１２３】
バイオイメージングと組み合わせた放射標識トレーサーが、前臨床腫瘍モデルから臨床状況へ移すことができることが以前に示された（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２３（６）：７９７；Ｌｉｕら、（２００９）Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ  １２：５３０）。本発明者らは、さらに、放射標識されたＤＳ６抗体およびＤＳ６−ＤＭ４が、マウスのＷＩＳＨ異種移植腫瘍を効果的に標的にすることを示した。これらの結果に基づいて、イメージングベースのコンパニオン診断薬として、薬物動態の最適化を目的に、３種の改変抗体様結合タンパク質を開発した。
【実施例２】
【０１２４】
ＤＳ６改変Ｂ−Ｆａｂの発現
対応するコンストラクトの軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを、大腸菌ＤＨ５α細胞で増殖させた。形質移入に使用するプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドメガキットを使用して大腸菌から調製した（Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質に関するポリペプチド配列およびＤＮＡ配列を表２に示す）。
【０１２５】
ＤＳ６抗体様結合タンパク質Ｂ−Ｆａｂを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、ＨＥＫ２９３細胞の一過的形質移入によって産生した。形質移入してから７日後に、上清を収集し、遠心分離および０．２μｍの濾過にかけて、粒子を除去した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で捕獲することによって、精製した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムに結合させた後、カラムをＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ＦＰ１２０１６）で洗浄し、続いて０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９で中和した。精製の仕上げ工程は、ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ＦＰ１２０１６）を用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーからなっていた。仕上げ工程に続いて、限外濾過によって精製産物を濃縮し、最後に、０．２２μｍの膜を使用してＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂを濾過滅菌した。
【０１２６】
タンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって各バッチを分析して、純度ならびに各サブユニットおよび単量体の分子量を決定した。精製したＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂの品質を、以下に記載の分析法によって確認した。
【０１２７】
【表２】
2016515093.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2016515093.tif 000005
【０１２９】
【表４】
2016515093.tif 000006
【実施例３】
【０１３０】
ＤＳ６抗体に基づく改変抗体様結合タンパク質の開発
ｈｕＤＳ６−ＤＭ４に対するイメージングベースのコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質を開発するために、ヒト化ＤＳ６モノクローナル抗体のＣＡ６結合配列に基づく、３種の改変抗体様結合タンパク質（Ｂ−Ｆａｂ、図１を参照されたい）を作出した。３種の改変抗体様結合タンパク質をそれぞれ精製し、以下に記載のように試験し；結果を表３に示す。望ましい特性には、ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる＞９５％の純度、約１０ｍｇ／ｍＬの濃度、安定的なペプチド、ＤＳ６抗体と類似した結合およびポリヒスチジン（６ｘ−Ｈｉｓ）タグの存在がＰＥＴトレーサーに影響を及ぼすかどうかを決定することが含まれる。さらなる選択基準としては、以下が挙げられる：＞５％ＩＤ／ｇの腫瘍シグナル；３：１の腫瘍対筋肉比；効率的な腎臓クリアランス；およびブロックされていない取り込みとブロックされた取り込みの間の統計的有意差（ｐ＜０．０５）（放射標識されたキレート化Ｂ−Ｆａｂに対する品質基準の概要について、表４を参照されたい）。
【０１３１】
【表５】
2016515093.tif 000007
【０１３２】
【表６】
2016515093.tif 000008
【０１３３】
（Ｇ４Ｓ）２リンカーを含むＢ−Ｆａｂ抗体は、６ｘ−Ｈｉｓタグの有無にかかわらず、対照の、ＣＡ６結合配列のベースになったＤＳ６モノクローナル抗体と類似した結合効率を維持することが明らかになった。精製した抗体様結合タンパク質のそれぞれの品質を、以下の分析法によって確認した：
【０１３４】
ａ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）およびＴＳＫゲルＳＷＸＬガードカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＡＫＴＡエクスプローラー１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、分析的ＳＥＣを実施した。分析は、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｎａ−ホスフェートｐＨ６．７を用いて、１ｍＬ／ｍｉｎで流し、２８０ｎｍで検出した。３０マイクロリットルのタンパク質サンプル（０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）をカラムにアプライした。分子サイズの推定のために、ゲル濾過標準混合物（ＭＷＧＦ−１０００、ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してカラムを較正した。データ評価は、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアｖ５．１１を使用して実施した。
【０１３５】
ｂ）ＬＣ−ＭＳによるインタクト質量分析
各サンプルを０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いでＤＴＴ（最終的に１０ｍＭ）を加えて還元した。分離に先立って、２％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を用いる一体式トラップカラムにより２０μＬ／ｍｉｎでサンプルを２０分間トラップし、脱塩してから、１５％の溶出液Ａ（Ｈ２Ｏ／０．０５％ＴＦＡ）から５０％の溶出液Ｂ（アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ）に及ぶ勾配で溶出した。
【０１３６】
３７℃で、一体式カラム（ＰＳＤＶＢ；１００μｍ  Ｉ．Ｄ．×５ｃｍ）によってナノフロー（３００ｎＬ／ｍｉｎ）で操作して、各サンプルを分離した。各サンプルの導入は、外径が３６５μｍ、内径が７５μｍおよび先端径が１５μｍである、ｎｅｗ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅのエレクトロスプレー針とシースガスを使用して行った。ＱＳｔａｒ  ＸＬによって取得した後、スペクトルを対応する時間範囲にわたってまとめ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳｃｉｅｘからＢｉｏＡｎａｌｙｓｔとともに供給されるタンパク質再構築ツールを使用して、デコンヴォルーションした。
【０１３７】
ｃ）ＬＣ−ＭＳを使用するペプチドマスフィンガープリント分析によるタンパク質の同定
目的のレーンをパンチアウトし、カルバミドメチル化し、エンドプロテイナーゼのトリプシンで消化した。続いてこのサンプルを、ＯｒｂｉＴｒａｐ  ＸＬ質量分析計を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。得られたスペクトルを、所与のコンストラクトが加えられたユーザー定義データベースのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＰＰおよび全種のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースと比較した。
【０１３８】
３種の改変ＤＳ６ベース抗体様結合タンパク質のそれぞれを特性評価するために、３種の改変ＤＳ６ベース抗体様結合タンパク質のそれぞれをハード酸カチオンキレート剤ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）に化学的にコンジュゲートし、６４Ｃｕで放射標識し、前臨床の腫瘍モデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＥＴバイオイメージング実験およびＩｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞結合アッセイに使用した。各改変抗体に関する活性および実験のデータの概要は、表５および図２〜４で見ることができる。
【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
上記の抗体様結合タンパク質のすべておよびそれらの対応するＤＯＴＡコンジュゲート（１．５〜２．５ＤＯＴＡ／フラグメント）は、ＣＡ６陽性細胞（ＷＩＳＨ細胞系）に対して高親和性（Ｋｄ＝４〜２０ｎＭ）であり、これは、ＤＯＴＡ誘導体化が抗原に対する親和性に悪影響を及ぼさないことを示唆する。このフラグメントはＣＡ６陰性細胞（Ａ２７８０細胞系）に対して低親和性であった。ヒト血清安定性研究ならびにＷＩＳＨまたはＡ２７８０皮下腫瘍のいずれかを有するヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏイメージングおよび２４時間生体内分布研究によって、６４Ｃｕ標識薬剤を評価した。６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−Ｂ−Ｆａｂは高い収率（ＲＣＹ−８０％、ＳＡ−５５ＧＢｑ／μモル、＞９９％純度）で合成され、２４時間の血清安定性（９４±５％、ｎ＝３）試験において、良好な結果をもたらした。異種移植腫瘍を有するマウスにおけるＩｎ−ｖｉｖｏ生体内分布実験（表６を参照されたい）は、高い腫瘍／筋肉（８．７：１）、腫瘍／血（３．６：１）および陽性腫瘍／陰性腫瘍（１．８、ｐ＜０．０５、ｎ＝７）比と合わせて、比較的高いＷＩＳＨ腫瘍取り込み（７．６±０．８７％ＩＤ／ｇ、ｎ＝４、２０〜２０６ｍｇ）および低いＡ２７８０腫瘍取り込み（５．１±０．９２％ＩＤ／ｇ、ｎ＝３、５０〜２７０ｍｇ）を示した。腫瘍取り込みは、腎臓（６２±４％ＩＤ／ｇ）および肝臓（１０±０．７５％ＩＤ／ｇ）によってのみ、上回ることができた。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−Ｂ−Ｆａｂを、ｉｎ  ｖｉｖｏでのブロッキング研究によって、ＷＩＳＨを有する腫瘍動物において、特異性についてさらに評価した。ブロッキングは、Ｂ−Ｆａｂ（２ｍｇ、ｎ＝５）またはＤＳ６（１ｍｇ、ｎ＝４）をそれぞれ、放射標識された薬剤を投与する２．５または２５時間前に投与することのいずれかにより実施した。Ｂ−ＦａｂブロッキングはＷＩＳＨ腫瘍取り込みを２３％（ｐ＜０．０５、ｎ＝８）低下させたが、ＤＳ６ブロッキングは、２６％（ｐ＜０．０５、ｎ＝７）低下させた。対照の腫瘍（ｎ＝３）は、この研究においてブロックされなかった。これらの前臨床研究は、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−Ｂ−Ｆａｂが、患者において、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４に対する適切なコンパニオン診断薬であることを示唆する。
【実施例４】
【０１４３】
前臨床の腫瘍モデルにおける、開発した改変抗体のＩｎ  ｖｉｖｏでのＰＥＴ研究
ａ）Ｂ−Ｆａｂ（Ｇ４Ｓ）２リンカーおよびＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグ
Ｂ−Ｆａｂ１１５１は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）２）（配列番号３）としてのＬ１およびＬ２リンカーの両方を含み、発現されるＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを含む、ＤＳ６ベース改変抗体様結合タンパク質である。このタンパク質をＩＭＡＣおよびＳＥＣによって精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合溶液を、ＰＢＳ中に１．８ｍｇ／ｍｌで調製し、ＷＩＳＨ  ＣＡ６＋細胞系においてフローサイトメトリーを使用して、結合親和性を特性評価した（図２Ｃおよび図２Ｄ）。
【０１４４】
ｂ）Ｂ−Ｆａｂ（Ｇ４Ｓ）２リンカー
Ｂ−Ｆａｂ１１５３は、（Ｇ４Ｓ）２としてのＬ１およびＬ２リンカーの両方を含み、Ｃ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグを含まない、ＤＳ６ベース改変抗体様結合タンパク質である。このタンパク質はＨｉｓタグを欠いていたので、ＩＭＡＣ、Ｋａｐｐａ−ｓｅｌｅｃｔおよびＳＥＣによってこのタンパク質を精製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合溶液を、ＰＢＳ中に１．６ｍｇ／ｍｌで調製し、結合親和性をＷＩＳＨ  ＣＡ６＋細胞系において、フローサイトメトリーを使用して特性評価した（図３Ｃおよび図３Ｄ）。
【０１４５】
ｃ）Ｂ−Ｆａｂ  Ｇ４ＳリンカーおよびＣ末端の６ｘ−Ｈｉｓタグ
Ｂ−Ｆａｂ１１５２は、単一コピーのＧ４ＳとしてのＬ１およびＬ２リンカーの両方を含み、Ｃ末端の６×−Ｈｉｓタグを含む、ＤＳ６ベース改変抗体様結合タンパク質である。このタンパク質をＩＭＡＣおよびＳＥＣによって精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合溶液を、ＰＢＳ中に１．８ｍｇ／ｍｌで調製し、結合親和性をＷＩＳＨ  ＣＡ６＋細胞系において、フローサイトメトリーを使用して特性評価した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。
【実施例５】
【０１４６】
ＤＯＴＡを有するまたは有さないＤＳ６に関するＩｎ  ｖｉｔｒｏ結合の結果
ＤＯＴＡコンジュゲーションがＤＳ６活性を変化させないことを示すために、ＤＳ６抗体様結合タンパク質とＤＯＴＡ−ＤＳ６コンジュゲート抗体の結合を、ＣＡ６陽性のＷＩＳＨ細胞系およびＡ２７８０  ＣＡ６陰性細胞系でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。蛍光活性化セルソーティング実験により、ＤＯＴＡコンジュゲーションはＣＡ６陽性のＷＩＳＨ細胞においてＤＳ６結合を変化させないことが確認された（図５を参照されたい）。
【実施例６】
【０１４７】
６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の放射標識および安定性
銅６４で標識されたＤＯＴＡコンジュゲートＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂを使用して、ＣＡ６陽性（ＷＩＳＨ）またはＣＡ６陰性（Ａ２７８０）皮下腫瘍のいずれかを有するヌードマウスにおいて、ヒト血清安定性研究および２４時間生体内分布研究を実施した。放射化学研究は、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂ改変抗体様結合タンパク質は、約３０％の放射化学的収率、＞９５％の放射化学的純度および１．９Ｃｉ／μモルの比活性を有することを示す（図６Ａを参照されたい）。６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６  Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の血清安定性実験を３７℃のヒト血清中で２４時間実施し、これは、０時間時点で９７．２％の活性および２４時間時点で９６．３％の活性を示し、２４時間後に有意な活性低下がないことを実証する（図６Ｂを参照されたい）。
【実施例７】
【０１４８】
異なるスキャフォールドを有する抗体様結合タンパク質の比較
どのスキャフォールドがイメージングコンパニオン診断薬として使用するのに最も適するかを評価するために、上記のＢ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の特徴を、ＣＡ６に特異的に結合するダイアボディの特徴と比較した。ホモ二量体を形成する抗ＣＡ６ダイアボディのアミノ酸配列を配列番号１２として示す（表７）。いくつかの実験では、そのホモ二量体ダイアボディは、ＧＧＣタグ、配列番号１３のタグおよび配列番号１４のタグからなる群から選択されるＣ末端タグをさらに含んでいた。
【０１４９】
図７で示すように、このダイアボディは、Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質のスキャフォールドと異なるスキャフォールドを有する。例えば、これは、いかなるＣＬドメインまたはいかなるＣＨ１ドメインも含まない。
【０１５０】
【表９】
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【０１５１】
以下の表８Ａ〜８Ｃに結果を示す。これらの結果は、配列番号１４のタグに融合した配列番号１２のダイアボディをＢ−Ｆａｂ１１５３（これは（Ｇ４Ｓ）２リンカーを含むが、Ｈｉｓ−タグを含まない）と比較することによって得た。
【０１５２】
【表１０】
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【０１５３】
【表１１】
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【０１５４】
これらの結果から、コンパニオン診断薬としての使用に関して、Ｂ−Ｆａｂはダイアボディより優れていると結論することができる。例えば、ダイアボディは血漿安定性アッセイおよび温度ストレスアッセイにおいて分解を呈したが、Ｂ−Ｆａｂは両アッセイにおいて安定であった。
【０１５５】
本発明を様々な実施形態に関して記載してきたが、変形形態および修正形態を当業者なら思いつくことが理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求される本発明の範囲内に入るそのようなすべての等価な変形形態を包含することが意図される。さらに、本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけであり、記載される主題を制限するものとして解釈されるべきでない。
【０１５６】
本明細書で記載される各実施形態は、そうでないと明示されない限り、任意の他の実施形態（複数可）と組み合わせることができる。特に、そうでないと明示されない限り、好ましいまたは有利であると示される任意の特色または実施形態を、好ましいまたは有利であると示される任意の他の特色（複数可）または実施形態（複数可）と組み合わせることができる。
【０１５７】
本出願で引用するすべての参考文献は、参照によって本明細書に明確に組み入れる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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