(57)【要約】本発明は、光増感剤の使用による、微生物病原体によって汚染された水の殺菌に関する。光増感剤は、樹脂、スペーサーおよび該ポルフィリノイドを含む付加物の一部であるポルフィリノイド類である。該付加物が光源によって励起され、水が装置の内部を流れながら殺菌される装置も提供される。該装置およびさらなる要素を含む、水の殺菌のためのシステムもまた、本発明の範囲内である。
2016531908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
R-S-P
[式中、
Rは-(CH2)nCOOH基によってカルボキシル化されるか、または-(CH2)nSO3H基によってスルホン酸化される（ここで、nは、0〜3である）樹脂である；
Sは、一般式：
A-X-B
[式中、
Aは、樹脂に共有結合する部分であり、アミノ基、アルコール基およびチオール基から選択される；
Xは、(CH2)z（ここで、zは、1〜20である）または(O-CH2-CH2)y（ここで、yは、1〜50であるである）または式：[HN-CH(CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-CO]w（ここで、wは、1〜20である）のポリリシンペプチドである；および
Bは、付加物の成分Pの正に荷電した部分とイオン結合を確立する負に荷電した部分である]
で示されるスペーサーである；
Pはポルフィリノイドである；および
ここで、Sは共有結合を介してRに結合し、Sはイオン結合を介してPに結合する]
で示される付加物。
【請求項２】
ポルフィリノイドが、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、ポルフィセン、フタロシアニンおよびナフタロシアニンから選択される、請求項１に記載の付加物。
【請求項３】
スペーサーSの該部分Bが、カルボキシレート、スルホネートおよびフェノレート基から選択される、請求項１〜２のいずれか1つに記載の付加物。
【請求項４】
スペーサーSが、タウリンである、請求項１〜３のいずれか1つに記載の付加物。
【請求項５】
Xが、式：[HN-CH(CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-CO]w（ここで、wは、1〜20である）のポリリシンペプチドであり、任意のリシンユニットが、DまたはL配置でありうる、請求項１〜４のいずれか1つに記載の付加物。
【請求項６】
Pが、一般式(I)：
【化１】
2016531908.tif 000008
(I)
[式中、
Tは、ピリジル、ピペリジルおよびピリミジルから選択される複素環である；
R1=R2=R3は、-CH3である；および
R4は、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和C1-C22炭化水素鎖；C6-C10芳香族、酸素、イオウおよび窒素から選択される1つ以上のヘテロ原子を含むC6-C10ヘテロ芳香族環；および／または混合C1-C22アルキル-C6-C10芳香族部分から選択される]
である、請求項１〜５のいずれか1つに記載の付加物。
【請求項７】
Pが、メソ-テトラ(N,N,N,N-メチル-ピリジル)ポルフィン(C1)、メソ-トリ(N-メチル-ピリジル)、モノ(N-ドデシル-ピリジル)ポルフィン(C12)およびメソ-トリ(N-メチル-ピリジル)、モノ(N-テトラデシル-ピリジル)ポルフィン(C14)から選択される、請求項１〜６のいずれか1つに記載の付加物。
【請求項８】
Pが、Mg(II)、Zn(II)、Al(III)、In(IV)、Ge(IV)、Si(IV)、Sn(IV)、Pd(II)から選択されるキレート金属イオンをさらに含む、請求項１〜７のいずれか1つに記載の付加物。
【請求項９】
ステップ：
a)スペーサーと樹脂との間の共有結合の形成を促進するために過剰のスペーサーを加えることによってスペーサーSを樹脂Rに結合すること；
b)スペーサーSの負電荷とポルフィリノイドPの正電荷との間のイオン結合を形成するために過剰のポルフィリノイドPを加えること；
c)繰り返し洗浄によって未結合のポルフィリノイドPを除去すること；
を含む、請求項１〜８のいずれか1つに記載の付加物の製造方法。
【請求項１０】
水の流入ための入口チャネル(2')（ここで、汚染物質の流入および樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物の流出を防止するための手段(6')は、照射チャンバーの入口チャネル(2')の流入位置に設置される）；水の流出のための出口チャネル(2'')（ここで、粒子状物質の通過を防止するための手段(6'')は、照射チャンバーからの出口チャネル(2'')の流出位置に設置される）；照射チャンバー(1)の内側に位置する少なくとも1つの光源(3)；および該照射チャンバー(1)内の少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物；を含む装置。
【請求項１１】
少なくとも1つの光源(3)が、照射チャンバーの内壁に固定されるか；または透明な管(5)内に包含され、該管が照射チャンバー(1)の内壁に固定される、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
照射チャンバー(1)が、1つ以上のフィルター(4)をさらに含み、樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物が、1つ以上のフィルター(4)に包含される、請求項１０〜１１のいずれか1つに記載の装置。
【請求項１３】
少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物が、親和性結合によって、織物に装着される、請求項１０〜１１のいずれか1つに記載の装置。
【請求項１４】
少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物が、照射チャンバー(1)の内側に分散され、装置が、さらに、空気の流入のためのチャネル(8)を通って照射チャンバー(1)に接続された圧縮空気供給装置(9)；水流に対抗する空気の流入(11)の形成を可能にする、空気排出のための空気出口デバイス(12)；1つ以上のメカニカルスターラー(7)；および照射チャンバー(1)の反対側の内壁に設置された多くの1つ以上の偏向板(10)を含む、請求項１０〜１１のいずれか1つに記載の装置。
【請求項１５】
水が殺菌される請求項１０〜１４のいずれか1つに記載の装置；殺菌された水のコレクター；要素を接続する油圧配管；コントロールパネル；および任意に1つ以上の以下の要素：水が装置に流れ込む前に集められるバッファタンク、圧力計、流量計、油圧弁、遠心ポンプ、遠心分離ポンプおよび周波数インバータ；を含むシステム。
【請求項１６】
微生物種から水を殺菌するための、請求項１０〜１４のいずれか1つに記載装置または請求項１５に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潜在的に危険な微生物病原体の集団によって汚染された水の殺菌に関する。さらに詳しくは、本発明は、不活性樹脂上に固定され、可視光での照明への曝露によって電子的に励起されたポルフィリノイドによる水の殺菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
水は、反応および輸送媒体、温度調節装置および我々が知っている生命過程のための重要なサポートとしての機能を果たすことができるので、多様な役割を実行する。人間集団および人間の活動の数は増加するので、地表および地中の水資源から高品質で純粋な水の供給を提供することが非常に困難になってくる。実際のところ、世界の国々の数、特に発展途上国ならびにいくつかの地中海諸国は、灌漑、産業、および飲料水の利用可能性について、ますます困難な状況に直面している。多くの水源は、ヒトおよびさまざまな動物および植物の生態系にとって有害な化学物質によって、そして、細菌、真菌、カビ、ウイルス、および寄生原虫などの何種類かの病原微生物によって、重度に汚染されている。
【０００３】
したがって、効率的な浄水および殺菌を行う有効かつ環境に安全な技術が強く求められている。
【０００４】
現在、信頼は、主として、塩素、二酸化塩素またはオゾンなどの酸化種による化学処理におかれているが、最も一般的に採用される水殺菌の方法は、物理的方法（たとえば、ろ過、加熱または紫外線(UV)またはX線照射）に基づくものである。
(Tomas C.R.、1990、Wastewater engineering and treatment: problems and solutions. In: Chemical Engineering Techniques in Biotechnology、ed. M.A. Winkler、23-94. Amsterdam: Elsevier)。しかしながら、このような方法は、多くの負の局面、特に化学的殺菌剤と有機物質との間の反応の副産物としてエンドペルオキシドやトリハロメタンの形成、または大規模な微生物叢を特徴とする水の繰り返し処理による多剤耐性菌株の選択などを示すことがしばしばある。さらに、高濃度の食物残留物、有機残骸および排便産物を伴う農場構造物内の高密度の魚が、微生物病原体の大集団の形成をもたらすことが多い水産養殖用水の場合、浄水措置は、マラカイトグリーン、ホルムアルデヒドまたはブロノポールなどの化学物質を養魚タンクへ導入することに基づくが、それらは魚、消費者および環境にとって潜在的に非常に危険である(Magaraggia et al.、2006、Treatment of microbiologically polluted aquaculture waters by a novel photochemical technique of potentially low environmental impact. J. Environ. Monit. 8: 923-931)。
【０００５】
微生物細胞による耐性の進化は、外的侵襲に対する防御方策を増加させるために病原体によって展開されることが見い出されている、非常に多種多様なメカニズムの結果として特に困難な課題を表す：このような耐性として、外壁の肥厚、薬物の貫通を妨げる新たなタンパク質のコード化、外部から加えられた化学物質などの流入を可能にするポーリンチャネルの欠損した突然変異の発現が挙げられる。(Smith、T.L. et al.、1999、Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus: glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus working group. New Engl. J. Med. 340: 493-501)。ヒト病原体またはさまざまな生態系の他の構成要素へのこのような耐性の移転は、公衆衛生への潜在的に深刻な脅威を表す(Cabello、F.C.、2006、Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment. Environ. Microbiol. 8: 1137-1144)。
【０００６】
したがって、水質汚染、特に危険な伝染病の発症を促進しうる生物学的因子によって引き起こされる汚染に対抗するための便利で低価格な方法を開発することが、緊急に必要である。
【０００７】
化学的または微生物学的に汚染された水の処置のための光化学技術の使用は、長年にわたって行われているが、ある限度までの対照的な結果しか得られていない。紫外線の有効性は、350 nmより短い波長では貫通力が低い(＜1 cm)ので限定されることが多い；さらに、核酸によるUV-CおよびUV-B波長の直接吸収は、危険である可能性がある新たな種類の微生物株の選択をもたらす変異原性プロセスの発症の主な原因である(Mitchell、D.L. and D. Kerentz、1993、The induction and repair of DNA photodamage in the environment. In: Environmental UV Photobiology、eds. A.R. Young et al、345-378. New York: Plenum Press)。これらの問題に取り組むために、酸化性が強く細胞傷害性の高い種、主としてOHラジカルおよび過酸化水素の形成を引き起こすUV-Aスペクトル領域の光波長によって電子的に励起されうる半導体(たとえば、TiO2またはZnO)を介する光補助反応の導入などの浄水用の新規な光化学的経路が考案されている。しかしながら、それらの有用性は、主に、UV-Aスペクトル領域の光波長を用いることによって均質に照明されうる水体積が少ないこと、ならびにこの技術の運用に伴う価格が相対的に高いことにより、現在のところ小規模の水処理に限られている。さらに、通常このような光工程に関与する酸化中間体は、大部分のヌクレオチドに対して感知できる反応性を示し、したがって、変異原性効果を促進する確率が高い。
【０００８】
光力学的プロセス、すなわち、可視光波長、酸素および感光色素の組合せ作用によって誘導されたプロセスによる重度に微生物汚染された水の処理によって、新たな見解が開かれている(Magaraggia M. and G. Jori、2012、Photodynamic approaches to water disinfection. In: CRC Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology、eds. A. Griesbeck et al.、1557-1570. Boca Raton: CRC Press)。さまざまな研究(網羅的説明として、Jori G. et al.、2006、Photodynamic therapy in the treatment of microbial infections: basic principles and prospective applications. Lasers Surg. Med. 38: 468-481を参照)が、光力学的増感剤の特に正に荷電した部分に存在する抗微生物特性が、さまざまな起源の水における病原体集団の厳密な管理の達成を可能にすることを一貫して指摘している。該増感剤の主な利点は以下の通りである：
嚢胞期および生長期の両方におけるグラム陽性およびグラム陰性細菌、さまざまな真菌病原体、ウイルスおよび寄生原虫などのさまざまな微生物の集団において、広く適用できることに起因する広範囲の低下を、1回の照射プロトコルによって得ることができる；
光力学的増感剤の作用機序の複数目標的性質は、細菌および真菌細胞の光耐性株が選択される可能性を非常に低くする；
光増感剤と微生物細胞との非常に緊密な関連を達成するために必要なインキュベーション時間が短いので、全光処理時間は通常、短い：実際に、結合は、静電気的、すなわち、光増感剤分子中の正荷電周辺置換基と、多くの微生物細胞の外壁に存在する多数の負荷電官能基との間のリアルタイム相互作用によって促進される。
【０００９】
多数の多環式有機色素は、光力学的増感剤として作用することができ(Boyle R.W. and Dolphin D.、2006、Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitisers、Photochem. Photobiol. 14: 4253-4259)、ポルフィリン、ならびに塩素、ポルフィセン、フタロシアニンおよびナフタロシアニンなどのそのテトラピロール類縁体は、水系などの環境適用のために特に選択される光増感剤として一般に認識されている。本意見は、以下の考察に基づく：
ポルフィリンは、近UV(360-400 nm)〜赤色(600-700 nm)スペクトル領域の範囲のマルチバンド吸収スペクトルを特徴とする。したがって、ポルフィリンは、本質的にすべての可視光波長で非常に効率的に光励起することができ、全スペクトルの可視光または特定の地理的または気候的条件下での日光を放出する本質的に安価なランプ（たとえば、蛍光またはフィラメントタングステンランプ）の使用への道を開く。
ポルフィリンの最も強い吸収帯、いわゆるソーレー帯は、410-430 nmのスペクトル領域においてピークに達する。したがって、ポルフィリン光増感剤と青色光波長との非常に効率的な相互作用があり、太陽スペクトルに存在する波長から天然水への最大貫通力に恵まれる(Baker K.S. and Smith R.C.、1982、Spectral irradiance penetration into natural waters. In: The Role of Solar Radiation in Marine Ecosystems、ed. J. Calkins、233-246. New York: Plenum Press)。
【００１０】
平らな芳香族大環状化合物は、細胞膜の脂質ドメインまたはさまざまなタンパク質とのそれらの安定な関係において、ポルフィリン誘導体のパーティショニングを好む；結果として、外から投与されたポルフィリンは、光増感剤の有意な濃度が遺伝物質に到達する前に特異的細胞内部位によって妨害される確率が高い。これまでに利用可能なすべての証拠は、ポルフィリンによって促進された光プロセスは、非常に低い変異原性潜在力しか有さないことを示す(Jori G. and Spikes J.D.、1994、Photobiochemistry of Proteins. In: Topics in Photomedicine、ed: K.C. Smith、183-319. New York: Plenum Press)。この特徴は、反復的な処置の場合に手順の安全性にとって重要である。
【００１１】
光力学的増感剤としてのポルフィリンを使することのさらなる利点は、ポルフィリン誘導体が得られるさまざまな合成的方策を用いることによって修飾されうることであり、その結果、水溶性、両親媒性、光および暗安定性、吸収スペクトルの微細構造などの物理的および化学的特性を、殺菌される系の特別の特性に合わせて調整することができる
【００１２】
ポルフィリン光増感プロセスを用いる水殺菌のためのいくつかのアプローチが行われている。
【００１３】
たとえば、テトラカチオン性ポルフィリンメソ-(N,N,N,N-テトラメチル-ピリジル)ポリペプチドルフィンおよび可視光の照射または太陽光への直接曝露の組合せ作用を介する廃水中の蠕虫卵および糞便大腸菌群の集団を減少させる可能性が記載された。マイクロモル量のポルフィリンおよび約4時間の全照射時間を用いることによって、大腸菌数は、少なくとも5対数減少した(Alouini Z. and Jemli M.、2001、Destruction of helminth eggs by photosensitised porphyrin. J. Environ. Monit. 3: 548-551)。光増感剤としてのテトラカチオン性ポルフィリンの存在下で系をフルスペクトル可視光で照射した場合、下水処理場から得られた廃水中の糞便大腸菌および糞便腸球菌の死亡率も増加した：マイクロモル量の濃度のポルフィリンの添加および10 mWcm-2未満などの低フルエンス率での廃水サンプル照射により、約2対数の通常非常に耐性の強いグラム陰性糞便大腸菌が不活性化された(L. Costa et al.、2010、Sewage bacteriophage inactivation by cationic porphyrins: influence of light parameters、Photochem. Photobiol. Sci.、9: 1126-1134)。藻類の成長の防止およびそれらの増殖の制御の両方に関し、メソ置換カチオン性ポルフィリンの光増感作用を、殺藻効果を得るために利用することもできる；後者の方法は、いくつかのタイプの廃水において非常に重要である：ナマズ行けから採取された水サンプルから単離されたプランクトンシアノバクテリアであるPlanktothrix perornata (臭気を産生する藍藻)および選択された代表的緑藻類、すなわち、Selenastrum capricornutumの両方が、マイクロモル量のテトラカチオン性メソ置換ポルフィリンの存在下での蛍光電球による96時間の照射により約50%の増殖阻害を受けた(Schrader K.V. et al.、2010、In vitro evaluation of the antimicrobial agent AquaFrin as a bactericide and selective algicide for use in channel catfish aquaculture、North Amer. J. Aquaculture、72: 304-308)。最後に、メソ置換カチオン性ポルフィリンを用いて、マス養殖場において真菌致死的であることが多いSaprolegnia parasitica（水カビ原因菌）感染を治癒または予防する可能性が、フィールドパイロット研究によって実証された(Magaraggia et al.、2006、前記)。
【００１４】
魚養殖場からの廃水および水のポルフィリン光増感殺菌の分野でこれまでに得られた有望な結果にもかかわらず、殺菌される媒体へのポルフィリンの導入には深刻な問題が依然として伴う。
【００１５】
第一に、ポルフィリン自体が、水生生態系の選択された構成要素に結合し、特に長期曝露後に毒性効果を生み出すことができた；さらに、光生成された反応性の高い酸化種は、水性媒体の植物または動物居住者を攻撃することができ、処理された系に、さまざまなタイプの物理的、化学的または生物学的変化を再度引き起こすことができた。F
【００１６】
さらに、ポルフィリンは、最終的に、環境に広がり、汚染または広く拡散したダメージを誘導する。
【００１７】
ポルフィリン光増感水処理の結果を改善するために、共有または親和性結合により水膨潤性マトリックス上に固定されたポルフィリン(またはその類縁体)を、化学合成によって調製し、その抗菌効率をインビトロで試験した。
【００１８】
代表例として、キトサン膜に吸着したメソ置換p-アミノフェニルポルフィンおよび周辺置換Zn(II)フタロシアニンが挙げられる(Bonnett et al.、2006、Water disinfection using photosensitisers immobilized on chitosan、Water Res. 40: 1269-1275)。同じように、セルロースエステル(M. Krouit et  al.、2006、New photoantimicrobial films composed of porphyrinated lipophilic cellulose esters、Bioorg. Med. Chem. Lett.、16:1651-1655)、寒天表面(D. Caminos and E. Durantini、2006、Photodynamic inactivation of Escherichia coli immobilized on agar surfaces by a tricationic porphyrin、Bioorg. Med. Chem. Lett.、14:4253-4259)、綿織物(C. Ringot et al.、2010、Amino porphyrin-grafted cotton fabric using 1,3,5-triazine link -application to antimicrobial phototherapy、 Book of Abstracts International Congress Society of porphyrin and Phthalocyanines、Albuquerque、USA、2010、Abstract S26)またはケイ酸塩マトリックス(S. Artrasky et al.,2006、Immobilization of zinc phthalocyanines in silicate matrices and investigation of their photobactericidal effect on Escherichia coli、Sci. World J.、6: 374-382)などの容易に光増感剤と関連させることができる他の不活性マトリックスが提案されている。
【００１９】
US6107480は、たとえば、廃水処理において光増感剤として用いられるポリマーに共有的に結合したポルフィリン誘導体(メタレートまたは非メタレート)を開示する。ポルフィリンを、エステル官能基によって支持体に結合してもよい。
【００２０】
WO2009006075および WO2012059584は、当技術分野で周知の方法によって支持体上に固定および共有結合されるポルフィリンまたはその誘導体を開示する。特に、WO2009006075には、ポルフィリンを固体支持体に結合させるために官能基が用いられる、官能化された拡張ポルフィリンが開示されている；ポルフィリンは、共有結合を介して固体支持体上に固定され、アクチニドカチオンための分光センサーとして使用される。
【００２１】
CN101940948は、架橋ポリスチレンマイクロスフェアによる担体上へのメタロポルフィリン固定方法を開示する。
【００２２】
WO200138454は、有機汚染物質の重合において触媒として用いられる金属-ポルフィリンを開示する。触媒は、合成樹脂の表面に弱または共有結合によって固定される。
【００２３】
WO2003035553は、微生物学的に汚染された水のための光殺菌剤としてのフタロシアニン塩の使用を開示し、該塩は、不活性マトリックスを伴うことができる。
【００２４】
WO0100322は、イオン交換樹脂上に固定された光触媒的に活性な構成要素を包含する光触媒を開示し、該活性な構成要素は、フタロシアニンおよび／またはテトラフェニルポルフィリン誘導体を含む。
【００２５】
EP984041は、ポリマーマトリックスに共有的に結合するフタロシアニン誘導体を開示する。
【００２６】
WO1997029636は、直接または不活性有機スペーサーによって、固体支持体、樹脂または粒子に共有的に結合するテトラピロール光増感剤を開示する。該有機スペーサーは、たとえば、炭化水素鎖、ポリリシン鎖、ポリエチレングリコール鎖、多糖鎖でありうる。
【００２７】
WO2012046214は、非共有結合でポルフィリンおよび担体を含む光活性化しうる幼虫駆除剤を開示する。
【００２８】
「Ringot C、Sol V、Barriere M、Saad N、Bressollier P、Granet R、Couleaud P、Frochot C、Krausz P. Triazinyl porphyrin-based photoactive cotton fabrics: preparation、characterization、and antibacterial activity. Biomacromolecules. 2011 May 9;12(5):1716-23」は、陰イオン性、中性および陽イオン性ポルフィリンを、結合剤として塩化シアヌル酸を用いてセルロース綿線維上にグラフトすることによって得られる光殺菌綿織物を開示する。
【００２９】
しかしながら、生態系および非標的生物に対するポルフィリンおよび光生成中間体の暗毒性または光毒性、ならびにテトラピロール大員環の上下の芳香族電子雲の間で作動するπ-π相互作用による不活性支持体の隣接位置に結合したポルフィリン分子の凝集傾向などのいくつかの重要な問題が依然として当技術分野で未解決のままである；このことは、光増感活性の大幅な低下をもたらす(Jori and Spikes、1994、op. cit.)。最後に、光励起ポルフィリンは、照射中の分子の不可逆的化学修飾により、ある程度の光退色を受ける(G. Jori and O. Coppellotti、2007、 Inactivation of pathogenic micro-organisms by photodynamic techniques: mechanistic aspects and perspective applications、Anti-infective Agents in Medicinal Chemistry、6: 119-131)。また、ポルフィリンは、アルデヒドまたはキノンなどのカルボニル型化合物の形成などの伸長的修飾を受ける；したがって、その結果としての、生物学的生物と光化学的に修飾されたポルフィリンの間の相互作用は、重大な損傷効果を引き起こすことができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
したがって、不活性マトリックス上にポルフィリンまたはその誘導体が固定され、上記の当技術分野で未解決の問題、特に、光増感剤凝集による光増感効率の低下、ならびにポルフィリン自体によって生成される光毒性および暗毒性、その光分解生成物および光生成反応性酸素種が存在しない、水の殺菌方法およびシステムが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
発明の概要
現在、特異的スペーサーを介してポルフィリノイドが樹脂に結合される付加物が、上述の問題を解決することが見い出されている。
【００３２】
樹脂とポルフィリノイドとの間のスペーサーの使用は、光増感剤凝集による光増感効率の低下の問題を効率的に解決する。したがって、樹脂表面からの既定の適切に選択された距離によりポルフィリン分子に与えられる柔軟性は、高反応性酸素種の収量および細菌および真菌細胞の外表面における負に荷電した基のアレイとの密接な接触を最適化するための、水による光増感剤の溶解および酸素へのそのエネルギー転移を容易にする。
【００３３】
また、本発明の付加物中の樹脂、スペーサーおよびポルフィリノイドの間に確立された特異的結合は、「暗」毒性のリスクを最小化し、同時に、成分の1つが光退色または分解する場合、ポルフィリンの単純で容易な除去および付加物である樹脂-スペーサー-ポルフィリノイドの再構成を可能にする。
【００３４】
したがって、本発明の目的は、一般式：
R-S-P
[式中、Rは樹脂であり、Sはスペーサーであり、Pはポルフィリノイドであり、ここで、Sは共有結合を介してRに結合し、Sはイオン結合を介してPに結合する]
で示される付加物である。
【００３５】
該付加物の個々の成分のさらなる詳細は、本明細書中に後述される。
【００３６】
以下のステップ：
a)スペーサーと樹脂との間の共有結合の形成を促進するために過剰のスペーサーを加えることによってスペーサーSを樹脂Rに結合すること；
b)スペーサーSの負電荷とポルフィリノイドPの正電荷との間のイオン結合を形成するために過剰のポルフィリノイドPを加えること；
c)繰り返し洗浄によって未結合のポルフィリノイドPを除去すること；
を含む該付加物の製造方法も本発明の目的である。
【００３７】
水の流入ための入口チャネル(2')（ここで、粒子状物質の通過を防止するための手段(6')は、照射チャンバーの入口チャネル(2')の流入位置に設置される）および水の流出のための出口チャネル(2'')（ここで、粒子状物質の通過を防止するための手段(6'')は、照射チャンバーからの出口チャネル(2'')の流出位置に設置される）を設けた照射チャンバー(1)；照射チャンバー(1)の内側に位置する少なくとも1つの光源(3)；および該照射チャンバー(1)内の少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物；を含む装置も本発明の目的である。
【００３８】
水中に存在する微生物種を死滅させるための該装置の使用は、本発明のさらなる目的であり、ここで、微生物種は、その生長期と嚢胞期における細菌、真菌、ウイルス、寄生原虫などの微生物および藻類を意図する。
【００３９】
水の殺菌が行われる該装置、殺菌された水のコレクター、異なる要素を接続する油圧配管およびコントロールパネルを含むシステムも本発明の目的である。
【００４０】
微生物種から水を殺菌するための該システムの使用も、本発明の目的である。
【００４１】
発明の記載
定義
本発明の文脈において、「光増感剤」は、電磁放射線、好ましくは可視光を吸収する化合物を意味し、放射線の影響下で三重項酸素からフリーラジカルおよび／または一重項酸素の形成を触媒することができる。本発明の文脈において、ポルフィリノイド化合物は、「光増感剤」とも呼ばれる。
【００４２】
本発明の文脈において、「樹脂」は、共有化学結合を介して、付加物であるスペーサー-ポルフィリノイドに結合した不活性支持体を意味する。本発明の文脈において、樹脂、マトリックスおよび固体支持体は、同義語として用いられる。樹脂は、光増感剤の光化学反応に対して不活性という条件で、任意の性質でありうる。樹脂は、無機または有機樹脂でありうるが、後者は、通常、巨大分子化合物である。
【００４３】
本発明の文脈において、「スペーサー」は、樹脂に結合する第一の部分およびポルフィリノイドに結合する第二の部分を有する分子を意味する。「スペーサー」は、本発明において「リンカー」と同義語として用いられる。そのさらなる特徴は、本明細書中に後述される。
【００４４】
本発明の文脈において、「付加物」は、1つ以上の共有結合または親和力に基づく安定な相互作用の形成を介する、2つ以上の化学物質の間の付加生成物の形成をもたらす化学反応からの生成物を意味する。
【００４５】
本発明の文脈において、「ポルフィリノイド」は、テトラピロール大員環を有する化合物を意味する。ポルフィリノイドとして、たとえば、ポルフィリンおよびその類縁体が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物で充填された多くのプラスチックフィルター(4)を含む、円筒形状の照射チャンバー(1)の例示的な表現である。フィルターを、照射チャンバーの壁に設置された光を円錐形に放射するLED源(3)で照射する。水の流入のための入口チャネル(2')および水の流出のための出口チャネル(2'')も示す。メカニカルフィルターは、照射チャンバーへの水の流入位置(6')および照射チャンバーからの流出位置(6'')に設置される。
【図２】A：照射チャンバー(1)の壁に沿ったLED(3)の分布を上から見た図。B：照射チャンバーの壁に固定されたLED源およびその円錐形発光の側面図。C：照射チャンバー内に配置される可撓管(5)内の光源(3)の配列を示す本発明の実施態様の例。
【図３】樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物の顆粒で充填されたマイクロメーターサイズのプラスチックフィルターの拡大図(ケースA)。ケースBは、樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物を、水に浮いた線維製品の表面に付着させる、本発明の異なる実施態様を表す。
【図４】メカニカルスターラー（簡略化のため図示せず）およびそこから空気がチャンバーを通って流れる水に吹き込まれる空気タンク(9)を備えた円筒形状の照射チャンバーの例示的表現。空気タンク(9)は、チャネル(8)を介してチャンバーに接続される；空気は、照射チャンバーの頂部に位置する出口デバイス(12)を介してチャンバーから出て行く。したがって、水流に対抗する空気の流入が生じる（黒二重矢印11）。
【図５】メカニカルスターラー(7)および照射チャンバーの壁の反対側に交互に設置された多くの偏向板(10)を備えた円筒形状の照射チャンバーの例示的表現。
【図６】本発明の装置(照射チャンバー)およびさらなる要素を含む、微生物的に汚染された水の殺菌用システムの典型的表現。
【図７】PBSに懸濁したCM-セファデックス-C1ポルフィリン付加物の可視吸収スペクトル(a)および1日間のインキュベーション後の遠心分離によって得られた上清(b)。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【図８】PBSに懸濁したCM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物の可視吸収スペクトル(a)および1日間のインキュベーション後の遠心分離によって得られた上清(b)。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【図９】PBSに懸濁したCM-セファデックス-C1ポルフィリン付加物の可視吸収スペクトル(a)および14日間のインキュベーション後の遠心分離によって得られた上清(b)。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【図１０】PBSに懸濁したCM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物の可視吸収スペクトル(a)および14日間のインキュベーション後の遠心分離によって得られた上清(b)。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【図１１】PBSに懸濁したCM-セファデックス-C1ポルフィリン付加物の可視吸収スペクトル(a)および21日間のインキュベーション後の遠心分離によって得られた上清(b)。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【図１２】PBSに懸濁したCM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物の可視吸収スペクトル(a)および21日間のインキュベーション後の遠心分離によって得られた上清(b)。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【図１３】中性水性媒体中で1月間インキュベートされた、サンプルCMセファデックス-C1ポルフィリン(b)およびCMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリン(a)の水性懸濁液の3,000gでの遠心分離によって得られた上清の可視波長幅における可視吸収スペクトル。C1ポルフィリン濃度：0.5 mg/ml。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な記載
樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物
樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物は、本発明の目的である。
該付加物は、上述の従来技術における技術的問題およびの必要性を解決し、また、安価で入手しやすいというさらなる利点を提供する。
付加物の個々の化合物は、さらに詳細に記載される。
【００４８】
樹脂は、水によって容易に溶媒和および/または膨潤されることを特徴とし、水性媒体中で化学的に安定である。
【００４９】
樹脂は、-(CH2)nCOOH基によってカルボキシル化されるか、または-(CH2)nSO3H基によってスルホン酸化される（ここで、nは、0〜3である）。
【００５０】
本発明に適した樹脂は、たとえば、シリカゲル、セルロース、ガラス、ポリアクリルアミドゲルビーズまたはポリスチレン-ポリ(エチレングリコール)グラフトなどのポリマー、コポリマー樹脂および光学繊維から選択される。
【００５１】
樹脂は、平坦な表面、球状に近いビーズおよび細い繊維などの、さまざまな大きさ、形状および幾何配置でありうる。
【００５２】
適当な樹脂を、市販品から得るか、または当技術分野で周知の方法によって合成することができる。
樹脂が、ビーズの形態であるのが好ましい。
【００５３】
樹脂が、ビーズの形態である場合、さまざまな大きさの多孔性でありうる。たとえば、孔の大きさは、セファデックスG-25誘導体では、20〜50 μmおよびセファデックスG-75誘導体では40〜120 μmでありうる。
【００５４】
樹脂が、含水シリカまたはデキストラン多糖から合成的に誘導されるのが好ましい。
樹脂が、セルロース、セファデックス(登録商標)またはセファロース(登録商標)であるのがより好ましい。
【００５５】
セルロースは、すべてのグルコースが、水溶性を増加させるために、隣接する鎖間で水素結合を形成し、鎖をパッキングする、および／または官能基を付加することを可能にする3つの反応性ヒドロキシル基を有する、グルコース約10,000残基からなる分子である。セファデックス(登録商標)は、表面負電荷を生じるように誘導体化された官能性イオン基を有する架橋デキストランゲルの商標である。セファロース(登録商標)は、表面に親水性官能基を有する、海藻から抽出された架橋多糖ポリマーの商標である。
該樹脂は、市販品を入手するか、または当技術分野で周知の方法によって合成されうる。
【００５６】
たとえば、樹脂が、セルロースから作成される場合、カルボキシメチルセルロース(CMC)誘導体が得られる；それは、水溶性を改善し、さらなる官能基(たとえば、アミノ基)のための安定な共有結合による潜在的結合部位を提供する。
【００５７】
付加物において、スペーサーは、樹脂に共有結合する第一の部分およびポルフィリンの正に荷電した部分との安定なイオン結合を確立する負に荷電した第二の部分を含む二座の化合物である。
【００５８】
スペーサーSは、以下の一般式：
A-X-B
[式中、
Aは、樹脂に共有結合する部分であり、アミノ基、アルコール基およびチオール基から選択される；
Xは、(CH2)z（ここで、zは、1〜20である）または(O-CH2-CH2)y（ここで、yは、1〜50であるである）または式：[HN-CH(CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-CO]w（ここで、wは、1〜20である）のポリリシンペプチドである；および
Bは、付加物のポルフィリノイドPの正に荷電した部分とイオン結合を確立する負に荷電した部分である]
を有する。
【００５９】
Aが、アミノ基であるのが好ましい。
Bがカルボキシレート、スルホネートまたはフェノレート基であるのが好ましい。
Xは、末端ポルフィリノイド分子(P)に望ましい走化性および親水性の程度にしたがって選択されうる。
【００６０】
1つの実施態様において、Xは、前記と同意義のポリリシンペプチドであり、任意のリシンユニットは、DまたはL配置でありうる。リシン部分の側鎖におけるアミノ基は、生理的pH値で正に荷電し、ポルフィリン部分(P)の正電荷によってもたらされる付加物と微生物細胞表面に存在する負に荷電した基との間の相互作用を増強する。
【００６１】
好ましい実施態様において、スペーサーは、タウリン(2-アミノ-エタンスルホン酸)であり、ここで、Aはアミノ基、Bはスルホネート基であり、Xは(CH2)2である。スルホネート基は、完全に解離したままであり、したがって、スルホン酸に特有の高レベルの酸強度の結果として、中程度に酸性の水媒体中でさえも負に荷電する。
【００６２】
ポルフィリノイド分子によって獲得された柔軟性、および選択された長さのスペーサーの存在の結果としてのポルフィリンと樹脂との間の決定された距離の存在は、以下の利点を可能にする：
a)水によるポルフィリノイドの溶媒和は、隣接するポルフィリノイド部分間のπ-π引力相互作用の強度を低下させ、凝集ポルフィリンクラスターを生成する傾向を最小化する；
b)ポルフィリノイドのより容易な接近可能性の結果としての電子的に励起した光増感剤から酸素へのエネルギー移動は、それによって高反応性酸素種の収率を最適化する；
c)細菌および真菌細胞の外表面における多数の負に荷電した基との光増感剤の密接な接触は、微生物細胞の成分への光誘起損傷の割合および確率を増加させる。
【００６３】
本発明の付加物の成分Pは、ポルフィリン、還元ポルフィリン、ポルフィリンの異性体、フタロシアニンおよびナフタロシアニンから選択されるポルフィリノイドである。
【００６４】
Pがポルフィリンである場合、以下の一般式(I)：
【化１】
2016531908.tif 000003
(I)
[式中、
Tは、ピリジル、ピペリジルおよびピリミジルから選択される複素環である；
R1=R2=R3は、-CH3である；および
R4は、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和C1-C22炭化水素鎖；C6-C10芳香族、酸素、イオウおよび窒素から選択される1つ以上のヘテロ原子を含むC6-C10ヘテロ芳香族環；および／または混合C1-C22アルキル-C6-C10芳香族部分から選択される]
を有する。
【００６５】
Tが、ピリジルであるのが好ましい。
R4が、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和C1-C22アルキル鎖であるのが好ましい。
R4が、-CH3、-CH2(CH2)4CH3；CH2(CH2)8CH3；-CH2(CH2)10CH3；-CH2(CH2)12CH3；-CH2(CH2)16CH3または-CH2(CH2)20CH3から選択されるのがより好ましい。
R4が、-CH3、-CH2(CH2)10CH3または-CH2(CH2)12CH3であるのが最も好ましい。
【００６６】
本発明は、その範囲内に、式(I)で示される化合物のすべての可能な立体異性体、ZおよびE異性体、光学異性体およびそれらの混合物を包含する。
【００６７】
好ましいポルフィリンは、以下のとおりである：
メソ-テトラ(N,N,N,N-メチル-ピリジル)ポルフィン(C1);
メソ-トリ(N-メチル-ピリジル)、モノ(N-ドデシル-ピリジル)ポルフィン(C12)；および
メソ-トリ(N-メチル-ピリジル)、モノ(N-テトラデシル-ピリジル)ポルフィン(C14)。
【００６８】
一般に、水の殺菌用には、メソ置換ポルフィリンが優先的に採用される。メソ置換ポルフィリンは、テトラピロールコアのメソ位置に1〜4個の四級化窒素を含むポルフィリンであり、ここで、その孤立電子対を介した、窒素原子と1〜20個の炭素原子長の炭化水素鎖との結合によって正電荷が生成される：このようなメソ モノ〜テトラ置換ポルフィリンは、抗生物質耐性菌株などのグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する著しい光毒性活性に恵まれていることがあきらかにされている(E. Reddi et al.、2002、Photophysical properties and antibacterial activity of meso-substituted cationic porphyrins、Photochem. Photobiol. 75：462-470)。微生物細胞における最適な光増感効果は、ピペリジンまたはモルホリンとピリジン環の交換によっても得られているが、メソ-テトラ(N-アルキル-ピリジル)ポルフィンの抗菌性光特性は、詳細に研究されている(Magaraggia et al.、2006、前記；D.A. Caminos et al.、2006、Photodynamic inactivation of Escherichia coli by novel meso-substituted porphyrins、by 4-(3-N,N,N-trimethylammoniumpropoxy)phenyl and 4-(trifluoromethyl)phenyl groups、Photochem. Photobiol. Sci.、5：56-65)。
【００６９】
メソ-トリ(N-メチル-ピリジル)、モノ(N-ドデシル-ピリジル)ポルフィン(C12)およびそのモノ-N-テトラデシル類縁体(C14)が、水殺菌のために特に有効な光増感剤として近年提案されている。(J.C. Bommer and G. Jori、2003、Photodynamic porphyrin antimicrobial agents、US Patent 6,573,258)。これらのポルフィリン分子は、複数の炭素ドデシルまたはテトラデシル鎖が、ポルフィリンを膜自体に係留し、膜透過性の強化という結果をともなって、多くのタイプの微生物細胞に特有の外壁の三次元組織を変更するために、細胞膜の脂質ドメインを貫通するように慎重に設計されている；同時に、4つの正電荷が、微生物細胞の陰イオン性表面と静電的に相互作用する。
【００７０】
本発明で用いるすべての化合物は、化学文献において周知であり、および／または市販されている。たとえば、Kadish、Smith and Guillard (eds)、The Porphyrin Handbook、Academic Pressなどの一般的文献を参照することができる。
【００７１】
Pが還元である場合、クロリンおよびバクテリオクロリンから選択される。ポルフィリンが、ピロール環中の炭素-炭素二重結合の水素添加によって還元される場合、クロリンが生じる；ポルフィリンにおいて2つの隣接するピロール環中の2つの炭素-炭素二重結合が還元される場合、バクテリオクロリンが生じる。クロリンおよびバクテリオクロリンの構造は、当技術分野で周知である。
【００７２】
Pが、ポルフィリンの異性体である場合、ポルフィリンの18π電子異性体であるポルフィセンである。
ポルフィセン
【化２】
2016531908.tif 000004
【００７３】
もう1つの実施態様において、Pは、フタロシアニンまたはナフタロシアニンである。ポルフィリンの4つのピロール環が、ベンゼン環と融合する場合、フタロシアニンが得られる。ポルフィリンの4つのピロール環が、ナフタレン環と融合する場合、ナフタロシアニンが得られる。
フタロシアニン ナフタロシアニン
【化３】
2016531908.tif 000005
【００７４】
成分Pは、キレートされた金属イオンをさらに含むことができるが、金属イオンが、電子的に励起された状態の寿命を短くすることによって光力学的活性を損なうことはない。該金属イオンは、Mg(II)、Zn(II)、Al(III)、In(IV)、Ge(IV)、Si(IV)、Sn(IV)、Pd(II)から選択される。
【００７５】
本発明の付加物と接触した場合に、光増感により微生物種が大幅に不活性化されることは、カチオン性ポルフィリノイドと、たとえば、細菌細胞の外表面に存在する、テイコ酸およびリポテイコ酸由来のカルボキシレート基などの負に荷電した部分のアレイとの緊密な相互作用によって生じた結果である。細胞外壁の緊密な三次元構造を安定させる光励起された光増感剤と感光性標的との間の密接な接近は、このような構造の透過性の増加を引き起こし、その完全性が、細胞の生存にとって重要である細胞内区画への光増感剤の貫通を促進する(T. Maisch、2009、A new strategy to destroy antibiotic resistant microorganisms：antimicrobial photodynamic treatment、Mini-review Med. Chem.、9：947-983)。
【００７６】
本発明の付加物の利点は、スペーサーの強酸性官能基とポルフィリン分子中のカチオン基との間の結合が、樹脂とポルフィリノイドとの間のより弱い直接結合よりも安定であるゆえに、本発明のスペーサーを介する樹脂へのポルフィリノイドの結合が、「暗」毒性のリスクを最小化することである。
【００７７】
本発明の樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物は、水性媒体に懸濁される場合でさえシステムが長期安定性を有すること；およびシステムがフルスペクトル可視光に曝露される場合の光退色が本質的に無視できる程度であること；の結果として水の光殺菌のいくつかの循環のために再利用されうるというさなる利点を有する。
【００７８】
さらに、テトラカチオン性ポルフィリノイドまたはその誘導体と負に荷電したスペーサーとの間に確立された非共有結合は、部分的または広範囲に損傷を受けたポルフィリノイドの速い交換を可能にする；広範囲に損傷を受けたポルフィリノイドは、容易に利用可能な化学的アプローチ（たとえば、塩酸洗浄など）および除去されたポルフィリンの量と化学量論的に等価な新たなポルフィリンの添加によって容易に除去されうる。同じ理由から、もし樹脂またはスペーサーが分解されるならば、付加物からポルフィリノイドを容易に分離し、新しい付加物をすばやく復元することができる。
【００７９】
装置
樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物を装置の一部にすることができる。
装置の機能は、流通反応器の原理に基づき、すなわち、水は、照射チャンバーを通って流れる間に力学的アプローチによって殺菌される。
【００８０】
装置は、水の流入ための入口チャネル(2')（ここで、汚染物質の流入および樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物の流出を防止するための手段(6')は、照射チャンバーの入口チャネル(2')の流入位置に設置される）；水の流出のための出口チャネル(2'')（ここで、粒子状物質の通過を防止するための手段(6'')は、照射チャンバーからの出口チャネル(2'')の流出位置に設置される）；照射チャンバー(1)の内側に位置する少なくとも1つの光源(3)；および該照射チャンバー(1)内の少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物；を含む。
【００８１】
本発明の目的である装置の要素を詳細に記載する。
【００８２】
照射チャンバー(1)は、任意の便利な形状、円錐形、円筒形または長方形であることができ、垂直または水平に進展しうる。
【００８３】
照射チャンバーの大きさは、要求される能力、微生物学的に汚染された水の体積および流量にしたがって設計される。たとえば、もし水の流入と流出の両方が、10リットル/分であり、必要な殺菌レベル(＞3 log)を達成するための時間が10分間であるならば、照射チャンバーを、100リットルの水が入る大きさにする。
【００８４】
照射チャンバー(1)は、一般に、殺菌された水が、用いられることを必要とする場所と接続される。
【００８５】
たとえば、照射チャンバーは、限定的ではないが、養魚タンク、魚卵インキュベーター、工業廃水用器、灌漑や飲料水ためのリザーバー、スイミングプールと接続されうる。
【００８６】
大きいサイズの不純物の通過を防止するための手段(6')、たとえば、メカニカルフィルターは、入口チャネル(2')へのの流入位置に設置される(たとえば、図１を参照)。該手段の役割は、水の濁度を増加させ、ポルフィリン増感剤を励起させるために用いる光線を外し、樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物を損傷させ得る粗い不純物や大きい粒子を止めることである。該手段がメカニカルフィルターである場合、該フィルターの孔の直径は、1〜2 mmであるのが好ましい。
【００８７】
粒子の通過を防止するための手段(6'')、たとえば、メカニカルフィルターもまた、照射チャンバーからの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物の放出を回避するために、照射チャンバーからの出口チャネル(2'')の流出位置に設置される(たとえば、図１を参照)。たとえば、該手段は、メカニカルフィルターであることができ、もし付加物R-S-Pの樹脂がビーズの形態であるならば、該フィルターは、付加物の樹脂ビーズの大きさよりも小さい直径の孔を有する。該メカニカルフィルターは、プラスチック製であるのが好ましい。
【００８８】
少なくとも1つの光源(3)は、照射チャンバー(1)の内側に位置する。
【００８９】
光源が、既定の間隔で、照射チャンバーの内壁に固定され、したがってR-S-P付加物の最大限に均一な照明を得ることができるのが好ましい。
【００９０】
別の実施態様において、図２に概略的に示されるように、光源は、照射チャンバーの内壁に固定された透明な管(5)内に包含される。
照射チャンバーの内側に、1つ以上の光源があるのが好ましい。
光源は、R-S-P付加物のポルフィリノイドを電子的に励起させるために用いられる。
【００９１】
適当な光源を、発光ダイオード(LED)、白熱電球、蛍光灯、高圧キセノンまたは水銀灯から選択することができる。光源が、高圧キセノンまたは水銀灯である場合、紫外線放出は、光路上へのカットオフフィルターの挿入によって遮断される。
光源がLEDであるのが好ましい。
【００９２】
LEDは、制限された波長間隔、すなわち、半発光帯において約20 nmの発光スペクトルを特徴とする。
【００９３】
LEDが、ポルフィリンおよびその類縁体の主要吸収帯である420 nmピークと一致するのが好ましい：このような波長は、100,000 M-1cm-1より大きいモル吸光係数を示すポルフィリンによって強く吸収される。該LEDの使用は、微生物不活性化の所定の閾値に到達するための、より少ないポルフィリン用量の使用を可能にする；さらに、青色光の波長は、水への最大貫通力に恵まれており(the 1/e or 37% value of the incident light intensity is reached at a distance of 20 m from the aqueous surface、see G. Jori、E. Reddi、 1991、Second generation photosensitizers for the photodynamic therapy. In：Doughlas R、et al.、eds. Light in Biology and Medicine、pp 253-266. London：Plenum Press.)、したがって、多量の水体積の均一な照明の獲得を可能にする。
【００９４】
LEDの使用のさらなる利点は、その狭い発光範囲が、入射光の正確な線量測定を保証し、操作の効率性と省エネルギーの両方に関して大きな進歩を有する、殺菌される水性媒体の特性に密接に合わせた照射プロトコルの定義をもたらすことである。LED発光スペクトルに赤外および紫外成分が含まれないことは、操作者、使用者および生態系のための安全対策の必要性を排除し、水を加熱することによって熱的に誘導される望ましくない副作用の確率を最小化する。
【００９５】
最後に、LEDは、低コストのデバイスであり、一般に、長期間(＞1,000 時間)の発光強度を示す。
【００９６】
照射チャンバーの内側に位置する少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物は、フィルター内に包含されるか、薄い織物に充填されるか、または分散されうる。
【００９７】
1つの実施態様において、R-S-P付加物は、フィルター(4)に包含される。すなわち、フィルターは、上位層と下位層を含み、R-S-P付加物は、フィルターの2つの層の間に包含される。該実施態様において、照射チャンバーは、1つ以上のフィルター(4)をさらに含む。たとえば、図１を参照。該フィルターは、可視光に対して透明な材料、好ましくはプラスチック材料で作成される。フィルターは、流れる水によってもたらされる圧力に対する高い機械的抵抗性に恵まれている。フィルターは、孔を有する；樹脂Rがビーズの形態である場合、該孔の寸法は、樹脂ビーズの大きさより小さいが、許容できる圧力で十分に高速な水流を可能にするのに十分な程度に大きい。該孔の直径が、セファデックス、セファロースまたはセルロース樹脂を形成するビーズの大きさ(一般に、それらの湿潤顆粒は、＞150 μmである)よりも小さい10〜20 μmであるのが好ましい。
【００９８】
好ましい実施態様において、フィルター(4)は、照射チャンバーの内壁に固定され、水流の方向に対して直角に、フィルター間で既定の距離を置いて並行に設置される(図１参照)。各フィルターは、樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物の1つ以上の層を含む。フィルターの合計厚みは、5 mm以下であるのが好ましい。フィルターに包含されるR-S-P付加物が、顆粒の形態であるのが好ましい(図３、ケースA)。各フィルターの上面および下面は、2つのフィルターの間に設置されて、円錐形状の発光の結果として各フィルターの内部のポルフィリノイドが均一に照射されるように配向された光源(3)によって照明される。
【００９９】
光源が、照射チャンバーの壁に固定された透明な可撓管(5)に包含される場合(図２ｃに示す)、各フィルターおよび包含されるR-S-P付加物が上下両方から均一かつ同時に照明されるように、該管を2つのフィルターの間に設置することができる。
【０１００】
この実施態様において、水は、ポンプによって押され、入口チャネル(2')を通って底から照射チャンバーに入り、樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物を含むさまざまなフィルター(4)を横切って上向きに流れ、最後に、出口チャネル(2'')を通って照射チャンバー(3)から出る(図１)。水は、フィルターを通って流れるときに、ポルフィリン光励起および微生物細胞不活性化の多くの連続工程を受ける。
【０１０１】
水の流速は、高レベルの水の酸素化に都合がよく、光散乱気泡の形成を最小化するように調節される。
【０１０２】
異なる実施態様において、少なくとも1つの樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物が、親和性結合によって、水が容易に浸透する毛織物などの織物に装着される(図３、ケースB)。該織物は、水に浮き、スペーサー-ポルフィリノイド付加物を浸透させ、ポルフィリノイドと水を汚染している病原細胞との間の効率的相互作用を保証する。
【０１０３】
本発明のもう1つの実施態様において、樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物は、照射チャンバー(1)の内側に分散される。この実施態様において、付加物は、入口チャネル(2')を通って照射チャンバーに入り、チャンバーをすべて横切る水媒体中に自由に浮くことができる。本発明のこの実施態様の略図を図４および５に示す。チャンバーを横切って動く水は、水をさらに攪拌し、同時に、光増感プロセスに関与する主な細胞傷害性作用物質である酸素の安定供給を保障するための空気の流入(11)に曝露される。図４に示すように、空気は、圧縮空気供給装置(9)と照射チャンバーを接続するチャネル(8)を通って照射チャンバー(1)に入る。また、空気出口デバイス(12)は、照射チャンバーの頂部に位置し、空気の排出を可能にする。図５に示すように、水流によってもたらされた圧力の結果としてのチャンバーの特定の部位(たとえば、チャンバーの壁)における付加物の蓄積を回避するために、水流の方向に対抗するメカニカルスターラー(7)を用いて水を連続的に混合する。また、水流の速度を低下させ、照射チャンバー(1)全体に樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物が均一に分布するように、チャンバーの反対側の内壁に、1つ以上の偏向板(10)を配置する(図５に示す)。照射チャンバーの内壁に沿って、光源(3)を設置し、水性媒体の完全な照明を実現する光フルエンス率で運転する。樹脂-スペーサー-ポルフィリノイド付加物が、照射チャンバー(1)の内側に均一に分散されるのが好ましい。
【０１０４】
システム
本発明の装置を、微生物学的に汚染された水の殺菌用システムにおいて用いることができる。
【０１０５】
本発明の1つの目的でもある該システムは、上述の本発明の装置、殺菌された水のコレクター、異なる要素を接続する油圧配管およびコントロールパネルを含む。
【０１０６】
水の殺菌は、装置内で行われる。
【０１０７】
1つの実施態様において、システムは、さらに、水が、装置に流れ込む前に集められるバッファタンクを含む。
【０１０８】
任意に、システムは、また、1つ以上の以下の要素を含むことができる：圧力計、流量計、油圧弁、遠心ポンプ、周波数インバータ。
【０１０９】
水は、殺菌の所望のレベルが達成されるまで、バッファタンクからバッファタンクへ(またはバッファタンクが存在しない場合、装置から装置へ)戻って再利用されうる。
【０１１０】
殺菌の所望のレベルが達成されるとき、殺菌された水は、コレクター内に回収される。
【０１１１】
プロセスの効率のリアルタイム継続的モニタリングのために、たとえば、約5ミリリットルの水サンプルを、コントロールパネルに移動させる；該モニタリングは、生存または死んだ微生物細胞の差動染色およびその後の色強度の分光光度測定に基づく「生/死キット」を介する比色分析を用いる水サンプルの分析を含む(T. Maisch et al.、2004、Antibacterial photodynamic therapy in dermatology. Photochem Photobiol Sci 3：907-917)。
【０１１２】
本発明のシステムの非限定的例を、図６の略図に示す。
【０１１３】
図６の略図に関して、本発明のシステムの機能は以下のとおりである。
【０１１４】
ポンプ(C)の作用の結果として、殺菌される水をバッファタンク(T)から装置/照射チャンバー(F)に押入れる；装置Fの前(P1)および後(P2)に設置された圧力計によって、照射チャンバーの流入口および流出口における水圧をモニターする。同時に、一般に照射チャンバーの後に設置される流量計(Q)によって、水流の速度をコントロールする。次いで、標準的油圧パイプを介して水を最終コレクター(T1)に移動させる。周波数インバータ(INV)を、バッファタンク(T)と照射チャンバー(F)との間に設置された油圧弁(H')に接続し、流量計(Q)によって提供される指示に基づいて水流を調節する。プログラマブル論理制御装置(PLC、またはコントロールパネル)は、圧力計(P)および流量計(Q)などの個々の要素が接続される、電子インターフェースであり、コンピュータ(PC)によってソフトウェアを介して順にコントロールされる；このパネルは、水の殺菌の全プロセスに関与するさまざまなパラメーターを精密に調整するため、ならびに「死/生キット」を介して病原体の不活性化のリアルタイム効率を評価するために、オペレーターによって用いられる。
【０１１５】
パラメーターQおよびPの値、したがって、Fの全体的大きさに基づいて、微生物負荷の減少の満足できる程度を達成するタイミングは、即時〜微生物病原体の集団における少なくとも3対数の減少に対応する時間までの範囲でありうる。
【０１１６】
したがって、パラメーターQおよびPは、所望の水殺菌度を達成するために選択され、ここで、満足できる殺菌度は、微生物病原体の集団において少なくとも3対数の減少に対応する。
【０１１７】
用途
水中に存在する微生物種を死滅させるための本発明の装置の使用は、本発明の目的であり、ここで、微生物種は、その生長期と嚢胞期における細菌、真菌、寄生原虫などの微生物、ウイルスおよび藻類を意図する。
【０１１８】
微生物種から水を殺菌するための本発明のシステムの使用も、本発明の目的である。
【０１１９】
非限定的例を用いて、本発明をさらに記載する。
【実施例１】
【０１２０】
スペーサーの有無条件下でのCM-セファデックス-ポルフィリンシステムによる研究
分光法研究
可視光励起樹脂-スペーサー-ポルフィリンシステムの抗微生物活性についての最初の研究は、CM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物(ここで、C1は、メソ-(N,N,N,N-テトラ-メチル-ピリジル)ポルフィンを示す)を用いることによって行われた。
【０１２１】
C1ポルフィリンを、純度99%の結晶性粉末の形態の、Sigma Chemical Co.からの市販品として得た。 Bommer and Joriの米国特許第6,573,258号 (2003)に記載の手順にしたがって、他のメソ-置換ポルフィリンを化学合成によって調製した。CM-セファデックス樹脂へのカチオン性ポルフィリンの直接結合は、セファデックス中の負に荷電したカルボキシレート部分とポルフィリン分子中の4つの正電荷との間のイオン結合の形成によって得られる。典型的には、pH 8.5に緩衝された水中で、4倍モル過剰のC1とともに室温にてCM-セファデックス(1 g)をインキュベートした。水性懸濁液を3時間緩やかに磁気攪拌した。最後に、洗浄水の蛍光分光分析(420 nmにて励起、660 nmにおける発光を観察)によって除去されるポルフィリンが検出できなくなるまでリン酸緩衝生理食塩水で繰り返し洗浄することによって、未結合のポルフィリンを除去した。平均して、ポルフィリンによるCM-セファデックスの24%装填が起こることが見い出された。CM-セファデックスへのタウリンの共有結合は、活性化されたカルボン酸からアミドを形成するための古典的反応を促進するために、10倍モル過剰のアミノ酸をpH 8.0に緩衝された水性媒体に添加することによって得られた；次いで、タウリンの10倍モル過剰のC1ポルフィリンを加え、得られる懸濁液を室温にて3時間攪拌した。上述のとおり繰り返し洗浄することによって、未結合のポルフィリンを除去した；C1における約60%の装填が得られた。この付加物の分光特性および光増感特性を、スペーサー不含CM-セファデックス-C1ポルフィリン付加物に特有の特性と比較した。
【０１２２】
中性pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の水溶液中の2つのサンプルの懸濁液において、可視光波長帯におけるCM-セファデックス-C1ポルフィリン付加物の吸収スペクトル(図７)は、そのタウリン含有類縁体の吸収スペクトル(図８)と比較して、はっきりと異なる変動を示した。このように、最も強い吸収帯の全光学密度、すなわち、いわゆる422 nmにおけるソーレー帯ピーキングは、散乱による全光学密度への寄与を差し引くための補正を行った後、タウリン不含誘導体について0.11であり、タウリン含有誘導体について0.15であることが見い出された；さらに、吸収スペクトルの半値幅は、それぞれ、タウリン不含誘導体およびタウリン含有誘導体について0.51および0.33 nmであった。タウリンを含む付加物は、520 nmにおける強度の弱いバンド(メソ-置換ポルフィリンに特有)がより明確に分割されたことによっても特徴付けられた。CMセファデックス-C1付加物について観察されるこれらの特徴、すなわち、吸収帯の淡色効果、広がり、および、より不十分な分割は、凝集したポルフィリンに特有であり(J.H. Furhop and K.M. Smith, 1975、Electronic absorption spectra of porphyrins、in：ed. K.M. Smith、Porphyrins and Metalloporphyrins、pp.871-889、Elsevier：Amsterdam)、これは、ポルフィリン分子に隣接するテトラピロール大員環の芳香族電子雲間に確立された強いπ-π相互作用の結果として水性媒体中のポルフィリンにおいて生じることが多い(R.W. Boyle and D. Dolphin、前記)。この傾向は、水によるより大きい分割ならびに樹脂-結合テトラピロール部分間のより長い平均距離を可能にする、ポルフィリンの自由度を増加させるタウリンスペーサーの存在によって弱められる。CM-セファデックス-タウリン系に結合するポルフィリンの、著しくより広範な単量体状態は、光増感効率に関して、最も重要である。定常状態への非放射性分解の確率が増強され、それによって細胞破壊性反応性酸素種を生成する酸素との励起ポルフィリン相互作用の確率が減少することにより、凝集が、ポルフィリンオリゴマーの電子的励起状態の寿命を短くすることは周知である(E. Reddi et al.、前記)。実際に、一重項酸素の生成のための量子収率を、分子プローブ ジナトリウム9,10-アントラセンジプロピオン酸(ADPA)を用いて、2つのサンプルについて測定した：一重項酸素の存在下、ADPAは、そのエンドペルキシドへの変換を介して光退色され、プローブの吸収帯の強度の低下がもたらされる(G. Jori and J.D. Spikes、前記)。量子収率値は、タウリン装填サンプルの0.41から、タウリンを欠いている類縁体の0.29へと減少した。
【０１２３】
それぞれ図９および図１０に示すように、水中(PBS、pH 7.4)での14日間のインキュベーション後に得られたCMセファデックス-C1ポルフィリン付加物とそのタウリン化類縁体の可視吸収スペクトル間の比較は、ソーレー帯の最大値および半値幅におけるポルフィリンの光学密度は、本質的に、第1日に測定された値と同一なので、タウリンの存在は、水性媒体中でのC1ポルフィリンの単量体状態を安定化させるが、一方、タウリンを欠いているサンプルは、380 nm周辺のショルダーの追加の出現とともにソーレー帯の増加した拡大を示し、高次の凝集ポルフィリン種の形成が示唆されることを実証する。2つの異なる帯(C1ポルフィリンの高次および低次オリゴマー)へのソーレー帯の分割は、第21日において得られたCM-セファデックス-C1付加物のスペクトル(図１１)におけるさらなる証拠であり、CMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリンのソーレー帯(図１２)は、使用された濃度が高いことから凝集種を形成すべきであるにもかかわらず、単量体ポルフィリンに特有の特徴を依然として示す。
【０１２４】
吸収スペクトルの分析が、タウリンのアニオン性スルホネート基とC1ポルフィリンの正に荷電した基との間の少なくとも3週間までの中性水中での付加物の継続的インキュベーション中には、強いイオン結合の感知されうる切断がないことを指摘するのは非常に重要である：図８、９および１１は、CMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリンがインキュベートされた水の遠心分離後に得られた上清中に、遊離ポルフィリンの検出可能な存在を示さない；遠心分離は、樹脂および結合したポルフィリンを沈殿させ、ろ去するために行われた。
【０１２５】
両方のサンプルについて、422 nmにピークを有する明確に目に見える吸収帯が、樹脂の懸濁液の遠心分離によって単離された上清のスペクトル中に出現するので、水性媒体へのC1ポルフィリンの放出は、PBS中での１ヶ月間の付加物のインキュベーション後のみに検出可能になる(図１３)。CM-セファデックス-C1ポルフィリン付加物から単離されたポルフィリンについて記録されたピークの強度が、CMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物について記録されたピークの強度よりも約3倍大きいことが明らかである；この観察は、CMセファデックス-タウリン系を結合したポルフィリンの安定性がより大きいことを明確に示す。
【０１２６】
CMセファデックス-C1ポルフィリンおよびCM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物を、工業界で存在する水にしばしば生じる状況をシミュレートする酸性水性媒体(すなわち、1 M HCl)中でのその安定性について試験した場合に、異なる結果が生じることが見い出された。これらの条件下で、CMセファデックスに直接結合したポルフィリンは、純粋に単量体状態で存在することが分光分析によって見い出され、酸性水性媒体中に付加物を懸濁させた後、1日で、樹脂とのその結合は、完全に分離した：したがって、付加物の懸濁液の遠心分離後、すべてのポルフィリンは、上清中で回収された。一方、分光光度分析が示すように、ポルフィリンのかなりの部分(約50%)は、依然として樹脂-タウリン付加物に結合したままなので、タウリンスペーサーの存在下、C1ポルフィリンは、一日間のインキュベーション後、このような過激な酸性環境でさえも部分的にしか放出されなかった。CMセファデックス-タウリン付加物からのポルフィリンの完全な除去は、1 M HClで3日間のインキュベーション後のみに得られた。
【実施例２】
【０１２７】
細菌の光増感不活性化
微生物病原体に対する細胞破壊剤としての光活性化CMセファデックス-C1ポルフィリン(サンプルA)およびCMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリン(サンプルB)の効率を、基質としてグラム陽性菌の1つの典型的な代表、すなわちメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)およびグラム陰性菌の1つの典型的な代表、すなわち大腸菌を用いることによって比較研究した。このような目的で、両方の細菌株の水性懸濁液(108個の細胞/ml)を、0.5 mg/mlのポルフィリン濃度を用い、サンプルAまたはサンプルBのいずれかの存在下、フルスペクトル可視光に曝露させた。照射前に、懸濁液を、緩やかに磁気攪拌しながら、暗室内で室温にて60分間インキュベートした。異なる光曝露時間における細菌細胞の生存を、成長培地での照射された懸濁液のアリコートの連続的10倍希釈、およびCFU/mlを得るためのプレーティングによって決定した。照射時間の関数としての細菌細胞の生存の減少のデータを、表1にまとめる。
【０１２８】
表１
CM-セファデックス-C1ポルフィリン(A)およびCM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン(B)の存在下での照射(400-800 nm、100 mW/cm2)による典型的なグラム陽性およびグラム陰性菌(108個の細胞/ml)の生存の減少（対数目盛り）。中性水性溶液(PBS)中で2つのサンプルを60分間インキュベーションした後に照射を行った。
2016531908.tif 000006
MRSA＝メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
E. coli＝大腸菌
C1濃度＝0.5 mg/ml
【０１２９】
一旦光励起された両方のサンプルが、グラム陽性およびグラム陰性菌株の生存において、数logの減少を誘導することができるのは明らかである。しかしながら、MRSAおよび大腸菌の両方について、細菌光活性化の程度が、セファデックス樹脂とC1ポルフィリンの間にタウリン部分が挿入されているサンプルの方が実質的により大きいことは明らかである。抗菌作用の増強は、細菌細胞を可視光に1分間曝露させた後にすでに明らかであり、30分の照射時間では、約2桁の大きさまたはそれ以上に達した。この効果は、ポルフィリンのかなりの部分が単量体状態であること、CMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリンサンプルについて測定されている一重項酸素生成のより長い安定性およびより多い収率に一致し、スペーサーのかなり肯定的な影響を明確に示す。
【０１３０】
細菌細胞の添加前に水性懸濁液中で1週間保持されたサンプルAおよびBでMRSAおよび大腸菌の光増感不活性化における実験を繰り返した場合、細胞破壊効果の程度の減少は、CMセファデックス-C1ポルフィリン付加物について明らかに検出可能であり、CMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物の存在下で照射されたグラム陽性およびグラム陰性菌についての生存における低下に関するデータは、わずか60分間のインキュベーション後の照射により得られたデータとは僅かにしか異ならなかった（表2）。
【０１３１】
表2
CM-セファデックス-C1ポルフィリン(A)およびCM-セファデックス-タウリン-C1ポルフィリン(B)の存在下での照射(400-800 nm、100 mW/cm2)による典型的なグラム陽性菌およびグラム陰性菌(108個の細胞/ml)の生存の減少（対数目盛り）。中性水性溶液(PBS)中で2つのサンプルを1週間インキュベーションした後に照射を行った。
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MRSA＝メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
E. coli＝大腸菌
C1濃度＝0.5 mg/ml
【０１３２】
したがって、タウリン含有付加物の光活性は、1週間後に有意には減少しないと結論付けるのが合理的である。
【実施例３】
【０１３３】
動的条件下での細菌の光増感不活性化
CMセファデックス-タウリン-C1ポルフィリン付加物の、微生物汚染物質の光増感された死滅を介して水を殺菌する能力についての研究は、最終的に、図１に示すような循環流光反応システムに拡張された。この目的に向けて、106個のMRSA細胞/mlで人工的に汚染された水サンプル50リットルを、付加物で満たされた総数5個の並行ナイロンフィルターを備えた円筒形状の照射チャンバーを通して上方に流した。水が通過する各フィルターの上面および下面を、25 mW/cm2の光強度を用い、発光ピークが420 nmであるLEDで照明した。複合体中のポルフィリン濃度は、10 μMであった。流速は、5リットル/分〜30リットル/分の間で変化させた。照射チャンバーの最下部から頂部への水の全通過時間は、20分であった。6.5 CFU/ml(非照射システム)から3.7 CFU/ml(照射、水の流速 5リットル/分)および4.5 CFU/ml(照射、水の流速 25リットル/分)への細胞コロニーの減少により、流水中の細菌の集団における効率的な低下が達成された。照射期間の終了時に、ポルフィリンの有意な化学的修飾は観察されなかった。
【０１３４】
これらのデータは、上述の照射チャンバーを通って流された汚染された水サンプルをLED源からの420 nm光で照明することによって、スペーサーを介して樹脂に固定されたC1ポルフィリンが、MRSAなどの高病原性細菌の生存の減少を誘導することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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