(57)【要約】  本発明は、あらかじめ従属栄養条件において暗所で発酵によって調製された、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のタンパク質富化微細藻類バイオマスの後処理過程を最適化する方法であって、１）バイオマスの乾燥重量を基準にして５０％を超えるタンパク質を含むバイオマスを提供するステップと、次に、低温において、２）発酵終了時にバイオマスを回収するステップと、３）バイオマスを洗浄及び濃縮するステップと、４）任意選択的に、バイオマスを溶解するステップと、次に、低温の制約なしに、５）任意選択的に、バイオマススラリーを濃縮するステップと、６）加熱処理を適用するステップと、７）製品を得るために、このようにして得られたバイオマスを乾燥するステップとを含み、ｐＨを７に調節するステップが、加熱処理ステップ６）の前又は後に適用される方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ従属栄養条件において暗所で発酵によって調製された、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のタンパク質富化バイオマスの後処理過程を最適化する方法であって、
１）バイオマスの乾燥重量を基準にして５０％を超えるタンパク質を含むバイオマスを提供するステップと、
次に、低温において、
２）発酵終了時に前記バイオマスを回収するステップと、
３）前記バイオマスを洗浄及び濃縮するステップと、
４）任意選択的に、前記バイオマスを溶解するステップと、
次に、低温の制約なしに、
５）任意選択的に、前記バイオマス懸濁液を濃縮するステップと、
６）加熱処理を適用するステップと、
７）前記得られたバイオマスを乾燥させて製品を得るステップと
を含み、
ｐＨを７に調節するステップが、ステップ６）の加熱処理の前又は後に適用される方法。
【請求項２】
前記バイオマスが、乾燥重量を基準にして、６０％を超える、好ましくは６５％又は７０％を超えるタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱処理が、１００℃より低い温度における３０秒間〜５分間にわたる高温／短時間（ＨＴＳＴ）加熱処理であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱処理が、１００℃〜１５０℃の温度で５〜３０秒間にわたる超高温度（ＵＨＴ）加熱処理であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマスが、１容量のバイオマスあたり最大で６容積の水、好ましくは最大で３容積の水で洗浄されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマス懸濁液が、ＫＯＨ又はＮａＯＨを添加することによりｐＨ７に中和されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマスの細胞が、ミル粉砕、好ましくはビーズミル粉砕によって溶解されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマスが、遠心分離又は蒸発によって濃縮されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
以下のパラメータ：
−前記バイオマス中の乾燥細胞重量を測定すること、
−糖含有量を測定すること、
−タンパク質の量を判定すること、
−揮発性有機化合物を分析すること、
−酵素活性、具体的には、リポキシゲナーゼ活性を測定すること、
−呈色又は色素含有量を測定すること、
−金属、具体的には、鉄、銅又はニッケル含有量を測定すること、
−酸化度を判定すること
の１つ又は複数によって、製品の質に対する、微細藻類バイオマスの処理ステップの影響もまた評価されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、及びクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、より具体的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質富化微細藻類バイオマスの生産効率、官能特性、及び経時的安定性を最適化する方法に関し、前記微細藻類は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、より具体的には、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）又はクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【背景技術】
【０００２】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）は、タンパク質及びその他の必須栄養素に富むため、潜在的な食料源であることは当業者によく知られている。
【０００３】
それらは、具体的には、４５％のタンパク質、２０％の脂肪、２０％の炭水化物、５％の繊維質、及び１０％のミネラル及びビタミンを含有する。
【０００４】
（食料農業機関（ＦＡＯ）によって報告されるような）動物性タンパク質の増大する世界的な需要を満たすための代替供給源の探求において、食糧としての微細藻類（及び主にそれらのタンパク質）の使用が、ますます検討されている。
【０００５】
さらに、欧州連合（ＥＵ）は、多年にわたり植物タンパク質の構造的不足に悩まされ続けており、最近では、２０００万トンを上回る大豆同等物が南米から輸入されている。
【０００６】
したがって特定のタンパク質富化微細藻類の大量生産が、この「タンパク質不足」を低下させる可能な方法であることが想定される。
【０００７】
大規模な分析及び栄養調査は、これらの藻類タンパク質が、従来の植物タンパク質と同等であり、又はより高品質でさえあることを示した。
【０００８】
それでもなお、高い生産コストと、感覚受容的に許容できる食品調製品に微細藻類由来材料を組み込むことの技術的困難さのために、微細藻類タンパク質の広範な流通は、まだ始まったばかりである。
【０００９】
高い割合のタンパク質を有する様々な生物種からの微細藻類バイオマスが、報告されている（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ（２００７），２５：２０７−２１０の表１を参照されたい）。
【００１０】
それに加えて、国際公開第２０１０／０４５３６８号パンフレットなどの先行技術におけるいくつかの特許出願は、微細藻類バイオマスのタンパク質含有量をさらに増大させるように培養条件を調節することが、可能であることを教示する。
【００１１】
好ましくは、この能力を有する微細藻類では、培養は、暗所において同化可能な炭素源存在下で、従属栄養的に実施される。
【００１２】
これらの従属栄養培養経路によって、微細藻類を大量生産すること、そして微細藻類含有食品中の顕著な緑茶風味の原因であるクロロフィルを微細藻類が合成するのを阻害して官能特性を改善することの、双方が可能になる。
【００１３】
タンパク質含有量を高めるために、微細藻類は、グルコースなどの豊富な炭素源の存在下において、窒素富化培地中で培養される。この場合、窒素が、有機又は無機供給源によって提供されているかどうかは重要でない。
【００１４】
このようにして生産された微細藻類バイオマスは、乾燥細胞重量基準で、典型的に少なくとも４０％、又は最大５０〜６０％にさえ至るタンパク質を含有する。
【００１５】
しかし、タンパク質富化バイオマスを生産する上流プロセスについて実施される研究、特に適切な発酵条件の研究と同様に、前記バイオマスを関心のある食品調製品に組み込む後処理過程から、その他の困難さが生じるという意味では、何も保証の限りでない。
【００１６】
慣例的に、後処理過程は、
−増殖培地から分離された微細藻類を収集するステップと、
−低温殺菌及び洗浄するステップと、
−任意選択的に細胞を破壊して関心のある分子を放出するステップと、
−乾燥するステップと
のいくつかのステップを含む。
【００１７】
最初の細胞収集ステップは、１つ又は複数の固体／液体分離ステップを使用して実施される。
【００１８】
バイオマスは、通常は、沈殿、遠心分離又は濾過によって収集され、時に追加的な軟凝集ステップが必要なこともある。
【００１９】
バイオマスの５０〜２００倍の濃縮を可能にしてもよいこの第１のステップに続いて、微細藻類懸濁液は迅速な処理を要し、さもなければそれは迅速に分解する。
【００２０】
第１の操作は、前記懸濁液を低温殺菌することにあり、すなわち微生物負荷（汚染細菌の増殖）を制限又は阻害するのみならず、望ましくない臭気又は風味（「異臭」）を引き起こしがちである特定の酵素を不活性化するように、それを加熱する。
【００２１】
この操作は、慣例的に高温で短時間実施される（これは「高温／短時間」（ＨＴＳＴ）又は超高温（ＵＨＴ）法と称される）。
【００２２】
第２の操作は、（大量の蒸留水又は脱イオン水による）洗浄であり、無処理細胞で推奨されて、可溶性不純物が除去される。
【００２３】
細胞を破壊し又は破裂させるステップが想定される場合、いくつかの手段が可能である。機械的（ホモジナイザー、ビーズミル粉砕、超音波ミル粉砕）又は非機械的（アルカリ性手段、凍結／解凍サイクル、有機溶媒又は浸透圧衝撃）。
【００２４】
方法は、破壊される微細藻類細胞壁の性質、そして単離される生成物の性質に応じて選択される。
【００２５】
最後の下流処理ステップは、前記懸濁液（無処理細胞又は溶解細胞）を脱水することにある。クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、及びスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属の微細藻類を乾燥するために、いくつかの方法が用いられている。最も常套的なのは、噴霧乾燥、乾燥ドラム上の乾燥、及び凍結乾燥である。噴霧乾燥は、工業規模で最も頻繁に使用される方法である。
【００２６】
しかし、特定のバイオマスの酸化感受性のために、抗酸化剤の添加が必要になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
微細藻類に適する方法及び併用法におけるこの多様性にもかかわらず、依然として当業者によって、満足な解決を見ていない６つの主な困難さ（下のａ）〜ｆ）に列挙される）が残されており、具体的には、次のようである：
ａ）後処理過程におけるタンパク質収率の損失、
ｂ）バイオマスの加熱不活性化ステップ後のタンパク質含有量の残念な損失（これは最大２５％の損失をもたらすこともある）、
ｃ）推奨される洗浄ステップにもかかわらず、無制御な望ましくない風味又は臭気（悪臭）の発生、
ｄ）なおも説明のつかない、生産されたバッチの経時的安定性の不在と、いくつかのバッチが安定している一方で、その他はそうでないという安定性再現性の不在、
ｅ）最終製品の微生物汚染のリスク、及び
ｆ）バイオマス濃縮係数の芳しくない管理に基づく、精製工程の全体的なエネルギー効率の低下。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
これらの欠点を克服するために、出願人は、適切な加工段階を実装するための研究を行うこととし、その有効性は、
ａ）生成したバイオマスのタンパク質含有量及び収率及び／又は乾燥バイオマス含有量を計算することにより、そしてまた
ｂ）官能分析法により、及び／又は
ｃ）出願人によって開発された非常にユニークな加速老化法によって、生成したバッチの経時的安定性を測定することにより、測定し得る。
【００２９】
本発明は、あらかじめ従属栄養条件において暗所で発酵によって調製された、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のタンパク質富化バイオマスの後処理過程を最適化する方法であって、
１）バイオマスの乾燥重量を基準にして５０％を超えるタンパク質を含むバイオマスを提供するステップと、
次に、低温において、
２）発酵終了時にバイオマスを回収するステップと、
３）バイオマスを洗浄及び濃縮するステップと、
４）任意選択的に、バイオマスを溶解するステップと、
次に、低温の制約なしに、
５）任意選択的に、バイオマス懸濁液を濃縮するステップと、
６）加熱処理を適用するステップと、
７）得られたバイオマスを乾燥させて製品を得るステップと
を含み、
ｐＨを７に調節するステップは、ステップ６）の加熱処理の前又は後に適用される方法に関する。
【００３０】
好ましくは、バイオマスは、乾燥重量を基準にして５０％を超える、好ましくは５５％を超える、なおもより好適には６０、６５又は７０％を超える、タンパク質を含む。
【００３１】
ステップが低温で実施される場合、温度は、８℃より低く、好ましくは４℃より低く保たれる。好ましくは、この低温は、本発明による方法のステップ２）〜４）全体を通じて適用される。
【００３２】
好ましくは、加熱処理は、１００℃より低い温度で３０秒間〜５分間にわたる高温／短時間（ＨＴＳＴ）加熱処理である。
【００３３】
代案としては、加熱処理は、１００℃〜１５０℃の温度で５〜３０秒間にわたる超高温（ＵＨＴ）加熱処理である。
【００３４】
好ましくは、バイオマスは、１容量のバイオマスあたり最大で６容積の水で、好ましくは最大で３容積の水で洗浄される。
【００３５】
好ましくは、バイオマス懸濁液は、ＫＯＨ又はＮａＯＨを添加することにより、好ましくはＫＯＨを添加することにより、ｐＨ７に中和される。
【００３６】
好ましくは、バイオマスの細胞は、ミル粉砕、好ましくはビーズミル粉砕によって溶解される。
【００３７】
好ましくは、バイオマスは、遠心分離又は蒸発によって濃縮される。
【００３８】
任意選択的に、生成物の質に対する微細藻類バイオマス処理ステップの効果は、以下のパラメータ：
−バイオマス中の乾燥細胞重量を測定すること、
−糖含有量を測定すること、
−タンパク質の量を判定すること、
−揮発性有機化合物を分析すること、
−酵素活性、具体的には、リポキシゲナーゼ活性を測定すること、
−呈色又は色素含有量を測定すること、
−金属、具体的には、鉄、銅又はニッケル含有量を測定すること、
−酸化度を判定すること
の１つ又は複数によって判定してもよい。
【００３９】
具体的には、生成物の質に対する、いくつかのバイオマス処理操作の効果が比較され、最良の結果をもたらす処理操作が選択される。
【００４０】
特定の実施形態では、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、及びクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、より具体的には、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００４１】
この方法の目的は、特に、高収率でタンパク質富化微細藻類バイオマスを生産する、最適化された方法を開発することであり；前記バイオマスは、望ましくない風味又は臭気を有さず、経時的に安定している。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、より具体的には、バイオマスのタンパク質生産効率の観点から、官能特性の観点から、及び経時的安定性の観点から、タンパク質富化微細藻類バイオマスの生産に特異的な全ての要件を満たせるようにする、最適化された方法に関する。
【００４３】
したがって本発明は、あらかじめ従属栄養条件において暗所で発酵によって調製された
、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類のタンパク質富化バイオマスの後処理過程を最適化する方法であって、
１）バイオマスの乾燥重量を基準にして５０％を超えるタンパク質を含むバイオマスを提供するステップと、
次に、低温において、
２）発酵終了時にバイオマスを回収するステップと、
３）バイオマスを洗浄及び濃縮するステップと、
４）任意選択的に、バイオマスを溶解するステップと、
次に、低温の制約なしに、
５）任意選択的に、バイオマス懸濁液を濃縮するステップと、
６）加熱処理を適用するステップと、
７）得られたバイオマスを乾燥させて製品を得るステップと
を含み、
ｐＨを７に調節するステップは、ステップ６）の加熱処理の前又は後に適用される方法に関する。
【００４４】
本発明による方法のステップ１）に従って、バイオマスは、乾燥重量を基準にして少なくとも５０％のタンパク質を含む。なおもより好ましくは、それは、乾燥重量を基準にして、少なくとも５５、６０、６５又は７０％のタンパク質を含む。
【００４５】
本発明の好ましい微細藻類は、従属栄養条件下（炭素源としての糖、及び暗所で）で成長することができる。出願人は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のタンパク質富化微細藻類を選択することを推奨する。使用される微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の一種、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ルテオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・レイシグリィ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、パラクロレラ・ベイエリンキイ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）、及びプロトセカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）から選択し得るが、これらに限定されるものではない。本発明で使用される微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）に属するものであることが好ましい。
【００４６】
特定の実施形態では、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）株は、テキサス大学オースティン校（米国）の藻類カルチャーコレクション（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）からのＵＴＥＸ１６６３株である。特定の実施形態では、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）株は、藻類及び原生動物カルチャーコレクション（スコットランド、英国）（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ
Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）からのＣＣＡＰ２１１／８Ｄ株である。微細藻類は液体培地中で培養されて、適切なバイオマスが生成する。本発明によれば、微細藻類は、暗所で炭素源及び窒素源を含有する培地中で培養される（従属栄養条件）。固体及び液体増殖培地は、一般に文献で入手することができ、非常に多様な微生物株に適し
た、特定の培地調製用として推奨されるものは、例えば、テキサス大学オースティン校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ）が、その藻類カルチャーコレクション（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｇａｅ）（ＵＴＥＸ）について運営しているウェブサイトｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／から、オンラインで見出すことができる。バイオマスの生産は、発酵槽（又はバイオリアクター）内で実施される。
【００４７】
バイオリアクター、培養条件、及び従属栄養培養及び増殖方法の特定の例を任意の適切なやり方で組み合わせて、微細藻類増殖の効率とタンパク質含有量を改善してもよい。このようなバイオマスの生産方法は、当業者によく知られている。
【００４８】
本発明による方法のステップ２〜４は、低温、すなわち８℃より低く、好ましくは４℃より低く、保たれる温度で実施される。この低温によって、細胞代謝、そしてまた微生物汚染物質の発生が、停止／低下できるようになる。
【００４９】
さらに、出願人が記述するように、これらのステップを低温で実施する別の利点は、冷却、そしてまた限定的酸素添加が、「悪臭」を引き起こして最終生成物の不安定性の原因でもある酸化現象の制限を促進することである。
【００５０】
より具体的には、
−本発明による方法のステップ２）では、バイオマスは発酵終了時に回収される。有利には、バイオマスは、残留栄養源（特に残留グルコース）が使用され尽くしたら、すぐに回収される。これらの条件によって、生成されるバイオマスの生産効率が最適化され、洗浄ステップ中に除去される残留可溶性物質濃度が制限できるようになる。
【００５１】
−本発明による方法のステップ３）では、バイオマスは洗浄及び濃縮される。バイオマスは発酵終了時に水洗されて、残留可溶性物質（塩、非代謝糖類など）が除去される。バイオマスは、１容積のバイオマスあたり最大で６容積の水、好ましくは１容積のバイオマスあたり最大で３容積の水、特定の実施形態では１容積のバイオマスあたり１容積前後の水で洗浄される。この操作によって、細胞純度が顕著に改善できる（発酵終了時に、非細胞構成要素に由来する固体画分が低下する）。このようにして、バイオマスの感覚特性劣化の潜在的原因である、この可溶性物質の負荷が低下される。この操作は、有利には低温条件で実施される。次にバイオマスは、１５〜４０％固形分、好ましくは２０〜３０％固形分に濃縮される。それは、例えば、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＦＥＵＸ５１０遠心分離機を使用して、遠心分離によって濃縮されてもよい。
【００５２】
−ステップ４）では、得られたバイオマスが、任意選択的に溶解される。細胞壁及び細胞内成分は、粉砕又はサイズ低下される。溶解を実施するために、ミクロビーズミル粉砕及び高圧均質化技術などの様々な技術が利用できる。好ましい様式は、ミクロビーズミル粉砕、特にビーズミルを使用したミクロビーズミル粉砕である。慣例的に、０．５ｍｍ直径のケイ酸ジルコニウムビーズと共に、ＮＥＴＺＳＣＨ  Ｌａｂｓｔａｒビーズミルが使用される。溶解程度は、変動してもよい。例えば、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％の細胞溶解程度が想定されてもよい。
【００５３】
本発明による方法の最後の３つのステップは、低温制約なしに実施される。
【００５４】
−ステップ５）では、得られたバイオマス懸濁液が、任意選択的に濃縮される。バイオマスは、蒸発によって濃縮される。例えば、回転蒸発器、強制流式蒸発器、流下薄膜式蒸発器又は拭き取り膜式蒸発器などの任意のタイプの蒸発器を使用してもよい。蒸発による濃縮は、方法のエネルギー性能を最適化することで、乾燥前の濃縮係数の改善に寄与する
。この濃縮によって、最終生成物の感覚特性に潜在的に有害である、任意の揮発性生成物の除去もまた可能になる。
【００５５】
−ステップ６）では、加熱処理が適用される。この加熱処理は、最終生成物に対する任意の微生物学的リスクに対抗する、安全対策の機能を果たす。慣例的に、それは、ＨＴＳＴ又はＵＨＴ処理からなる。さらに、この加熱処理は、最終生成物の感覚特性の改善に寄与する。具体的には、２つの異なるタイプの加熱処理が想定される。第１のタイプは、例えば１００℃より低い温度で３０秒間〜５分間にわたる、バイオマスの高温／短時間（ＨＴＳＴ）加熱処理である。第２のタイプは、ＵＨＴ（超高温）加熱処理である。好ましくは、ＵＨＴ加熱処理は、１００〜１５０℃の温度で５〜３０秒間、好ましくは１２０〜１４０℃の温度で５〜１５秒間にわたり、実施される。
【００５６】
−ステップ７）では、得られたバイオマスを乾燥させて製品を得る。好ましくは、乾燥は、噴霧乾燥によって実施される。噴霧乾燥は噴霧乾燥機内で実施され、液体懸濁液は加熱空気流中に微細な小滴分散体の形態で噴霧されて、搬送される物質は、迅速に乾燥させて乾燥粉末が形成する。脂質に富む化合物を噴霧乾燥するための多数の装置が、先行技術にある。提案される装置及び技術の例証は、例えば、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌによって１９９１に出版され１９９４年に再版された、Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｂｙ  Ｋ．Ｍａｓｔｅｒｓ、特にその第５版（大英図書館又は米国議会図書館でＩＳＢＮ０−４７０−２１７４３−Ｘの下に利用可能）、又はＢＥＴＥ（登録商標）Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２００５（ウェブサイトｗｗｗ．ｂｅｔｅ．ｃｏｍでアクセスされる）などの文献中に容易に見ることができる。例えば、噴霧乾燥は、サイクロンによって、Ｎｉｒｏ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｍｉｎｏｒ単一効用噴霧乾燥塔上で、又はＦｉｌｔｅｒｍａｔ  ＦＭＤ１２５上で、実施されてもよい。
【００５７】
最後の重要な段階は、ステップ６）の加熱処理の前又は後に、（溶解又は未溶解）バイオマス懸濁液のｐＨを７に中和することにある。
【００５８】
この中和はＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくはＫＯＨの添加によって、ｐＨを７に調節することにより実施されてもよい。濃水酸化カリウムによるこの中和は、下流ｐＨにおける、そして製造バッチ間の、あらゆる可能なゆらぎの抑制を可能にし、感覚特性もまた改善する。
【００５９】
１つ又は複数の抗酸化剤の添加もまた、（ｐＨ７への中和ステップの前又は後に）選択されてもよい。
【００６０】
有利なことに、アスコルビン酸及び／又はトコフェロール混合物、好ましくはアスコルビン酸とトコフェロールの組み合わせの選択が可能である。
【００６１】
慣例的に、使用される比率は、１５０ｐｐｍ／乾燥のアスコルビン酸及び５００ｐｐｍ／乾燥のトコフェロール混合物である（ｘｐｐｍ／乾燥とは、乾燥バイオマス１ｋｇあたりｘｍｇを意味する）。
【００６２】
抗酸化剤の性質は、安定化させる基材の特性に左右されることが明確に理解される。それらは、酸化変性のリスクに関して、最終生成物の安定性を改善しなくてはならず、それによって安定した物理化学的及び官能プロフィールの保持により、最終生成物の保存が改善される。
【００６３】
生成物の質に対する微細藻類バイオマスの処理ステップの効果は、以下によってさらに
評価されてもよい。
○収率の損失を測定する、具体的には、加熱処理中の「溶解」と、下流で実施される場合は洗浄時のそれらの除去から起こる、細胞固形分の損失、そしてまたタンパク質含有量の損失も分析する。
この固形分損失は、大部分がタンパク質画分からなることが示されている（これは上で同定された困難さａ）及びｂ）に対処できるようにする）；
○生産されたバッチの官能的品質を判定する、具体的には、様々なバッチの感覚特性を評価するために編成された官能パネルによって判定する（困難さｃ）に対処する）；
○経時的安定性を測定する、具体的には、最初のサンプルと、気密条件下で１０日間にわたり６０℃のオーブンに入れた同一サンプルとの比較官能分析からなる、加速老化試験によって測定する（困難さｄ）に対処する）。
官能分析は、記載される試験に従って実施される。この分析は、任意の酸化記述語を強調することを可能にし、それによってこの酸化分解に関して、サンプル安定性が評価できるようにする。
○方法の様々な段階における経時的な微生物負荷の変化の測定（困難さｅ）に対処する）；
○この一連の操作にわたる固形物（濃縮係数）の変化を分析する（困難さｆ）に対処する）。
【００６４】
品質を評価する上で不可欠な３つの特性は、出願人によって定義されている：
−製品の乾燥バイオマス及び／又はタンパク質の含有量；
−製品の官能特性；及び
−製品の経時的安定性。
【００６５】
さらに、製品の品質を評価するために、具体的には、以下のようなその他のパラメータもまた考慮に入れてもよい。
−バイオマス中の乾燥細胞重量を測定すること、
−糖含有量を測定すること、
−タンパク質の量を判定すること、
−揮発性有機化合物を分析すること、
−酵素活性、具体的には、リポキシゲナーゼ活性を測定すること、
−呈色又は色素含有量を測定すること、
−金属、具体的には、鉄、銅又はニッケル含有量を測定すること、
−酸化度を判定すること。
【００６６】
本発明は、非限定的及び例証的であることが意図される以下の実施例によって、よりよく理解されるであろう。
【実施例】
【００６７】
従属栄養条件及び暗所における発酵によって調製されたクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）バイオマスの後処理過程によって、いくつかのバッチが生産された。使用された株は、参照ＵＴＥＸ２５０のクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００６８】
以下に定義する、様々なステップが実施された。
【００６９】
ＨＴＳＴ処理：１００℃より低い温度で３０秒間〜５分間にわたる、具体的には、７５℃で１分間にわたる、バイオマスの高温／短時間（ＨＴＳＴ）加熱処理。
【００７０】
洗浄：１容量のバイオマスあたり最大で６容積の水による。
【００７１】
抗酸化剤の添加：好ましくは１５０ｐｐｍ／乾燥のアスコルビン酸及び５００ｐｐｍ／乾燥のトコフェロール混合物の比率での、アスコルビン酸及びトコフェロール混合物の添加。
【００７２】
噴霧乾燥：サイクロンによる、Ｎｉｒｏ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｍｉｎｏｒ単一効用噴霧乾燥塔上又はＦｉｌｔｅｒｍａｔ  ＦＭＤ１２５上の噴霧乾燥。
【００７３】
ミル粉砕：ビーズミルを使用したビーズミル粉砕。慣例的に、０．５ｍｍ直径のケイ酸ジルコニウムビーズと共に、ＮＥＴＺＳＣＨ  Ｌａｂｓｔａｒビーズミルが使用される。
【００７４】
濃縮：回転蒸発器（実験室規模）、又は任意のその他のタイプのより大規模な蒸発器（強制流式、流下薄膜式、拭き取り膜式など）による、２０〜３０％固形分の濃縮／蒸発。
【００７５】
ＵＨＴ処理：１００〜１５０℃の温度で５〜３０秒間、好ましくは１２０〜１４０℃の温度で５〜１５秒間にわたる。
【００７６】
得られたバッチの品質は、次のようにして試験される。以下のパラメータの１つ又は複数が、評価又は測定された。
【００７７】
官能的品質：生産されたバッチの官能的品質は、一連の感覚性の記述語について、およそ１８人の官能パネルによって評価される。専門家パネルは、順位強度尺度（ＮＦ  Ｖ  ０９−０１５：１９８５）で、水中の３％及び５５℃でバッチの嗅覚特性を評価する（サンプルは閉じたガラスジャー内で提示される）。
【００７８】
経時的安定性：これは、出願人によって開発された加速老化試験で測定され、それは、最初のサンプルと、６０℃で１０日間にわたり気密条件下でオーブンに入れた同一サンプルとの比較官能分析からなる。官能分析によって、任意の酸化記述語を強調することが可能になり、それによってこの酸化分解に関して、サンプルの安定性が評価できるようになる。
【００７９】
収率損失の測定：
−乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の測定及び／又は
−乾燥バイオマスの測定及び／又は
−タンパク質含有量。
さらに、追加的なパラメータもまた評価してもよい。
【００８０】
糖含有量：糖（グルコース、マルトース、フルクトース、スクロース）含有量は、液体クロマトグラフィーによって判定される。イオン交換クロマトグラフィーによる分離に続いて、電流測定分析によって様々な化学種が検出される。
【００８１】
揮発性有機化合物：揮発性有機化合物の含有量は、ＳＰＭＥ／ＧＣによって評価される。
【００８２】
加熱処理の分析：観察による、光学的顕微鏡検査による、細胞形態学にもたらされた変化。
【００８３】
呈色測定：分光比色計の手段による測定、Ｄ６５又はＣ光源下の４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長における、ＣＩＥ  １９３１  ２°観察者による反射率測定。指標「Ｌ」、「ａ」、及び「ｂ」が評価され、「Ｌ」は明るさ、「ａ」は緑色〜赤色尺度、「ｂ」は青色〜
黄色尺度に相当する。
【００８４】
色素含有量：細胞破壊後、９０％アセトンで色素を抽出する。次に分光光度法によって、抽出物を分析する。色素は、様々な波長で記録された吸光度に基づく計算によって定量化される。
【００８５】
金属分析：スルホ硝酸混合物を使用した無機質化による有機材料の破壊と、後続の適切な希釈に続く発光分析による測定。
【００８６】
酸化度の判定：イソオクタン中の希釈後、２３２ｎｍにおける吸光度の測定値。
【国際調査報告】
2016524922.tif 000002
2016524922.tif 000003
2016524922.tif 000004
2016524922.tif 000005