(57)【要約】  試料又は試料のサブコンポーネントの横方向照明のために用いられる試料保持器具であって、前記試料に適合して前記試料を収容するよう構成された試料ウェルを備える支持基板を備え、前記ウェルには、少なくとも一つの壁部に、傾斜した反射面が前記試料ウェルに隣接して設けられ、これは、使用時には光源からの横方向の光線を前記試料ウェル内に収容された試料を通すように向かわせ、そこに収容された試料に実質的に横方向の照明を提供して、単一の対物レンズを用いて前記試料をイメージングさせる、器具である。
2016529519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料又は試料のサブコンポーネントの横方向照明のために用いられる試料保持器具であって、前記試料に適合して前記試料を収容するよう構成された試料ウェルを備える支持基板を備え、前記ウェルには、少なくとも一つの壁部に、傾斜した反射面が前記試料ウェルに隣接して設けられ、これは、使用時には光源からの横方向の光線を前記試料ウェル内に収容された試料を通すように向かわせ、そこに収容された試料に実質的に横方向の照明を提供して、単一の対物レンズを用いて前記試料をイメージングさせる、器具。
【請求項２】
前記ウェルは二つの傾斜した反射面を備え、前記面は、実質的に互いに対向して位置されて前記試料が配置される空間を規定する
請求項１記載の器具。
【請求項３】
前記ウェルは、二つの傾斜した反射面を備えるチャネルであって、前記面は、実質的に互いに対向して位置されて前記試料が配置される空間を規定する
請求項１記載の器具。
【請求項４】
第１及び／又は第２の前記傾斜した反射面の傾きは、２０°〜８０°±５％の間である
請求項１〜３の何れか一項記載の器具。
【請求項５】
前記傾斜した反射面の傾きは、４４°〜４６°±５％の間である
請求項４記載の器具。
【請求項６】
前記傾斜した反射面の傾きは、４５°±５％である
請求項５記載の器具。
【請求項７】
前記反射面は、前記傾斜した面の全部又は一部への金属蒸着で設けられる
請求項１〜６の何れか一項記載の器具。
【請求項８】
前記反射面は金から構成される
請求項７記載の器具。
【請求項９】
前記反射面はクロムから構成される
請求項７記載の器具。
【請求項１０】
前記反射面は蒸着された複数の金属の混合物から構成される
請求項７記載の器具。
【請求項１１】
前記混合物はクロムと金とから構成される
請求項１０記載の器具。
【請求項１２】
前記支持基板は、部分的に又は全体にわたって不透明である
請求項１〜１１の何れか一項記載の器具。
【請求項１３】
前記支持基板は、部分的に又は全体にわたって透明である
請求項１〜１１の何れか一項記載の器具。
【請求項１４】
前記支持基板は、少なくとも第１及び第２ポリマーから構成される少なくとも第１及び第２部分を備える複合体であって、前記第１部分は前記第１ポリマーから構成されて前記支持基板の本体を形成し、前記第２部分は前記第２ポリマーから構成されて試料ウェルを形成する
請求項１〜１３の何れか一項記載の器具。
【請求項１５】
前記第１部分の屈折率は、前記第２部分の屈折率よりも高い
請求項１４記載の器具。
【請求項１６】
前記傾斜した反射面は蒸着された金属反射面を備えておらず、前記光シートは全反射により伝播される
請求項１４又は１５記載の器具。
【請求項１７】
前記第１部分の前記屈折率は、１．４０〜１．５９±５％の間にある
請求項１５又は１６記載の器具。
【請求項１８】
前記第２部分の前記屈折率は、１．３３±５％である
請求項１５〜１７の何れか一項記載の器具。
【請求項１９】
前記試料は、一又は複数の細胞を含む
請求項１〜１８の何れか一項記載の器具。
【請求項２０】
前記一又は複数の細胞は、生きた細胞である
請求項１９記載の器具。
【請求項２１】
前記一又は複数の細胞は、固定細胞である
請求項１９の器具。
【請求項２２】
前記器具は、同様又は同一寸法でアレイ状に配置された複数の試料ウェルを備え、前記複数の試料ウェル内に収容された複数の試料の連続又は同時解析に適合されている
請求項１〜２１の何れか一項記載の器具。
【請求項２３】
前記器具は、紫外線硬化ポリマーから作製される
請求項１〜２２の何れか一項記載の器具。
【請求項２４】
前記器具は、アクリレート系ポリマーから作製される
請求項１〜２２の何れか一項記載の器具。
【請求項２５】
前記アクリレート系ポリマーはポリアクリレートである
請求項２４記載の器具。
【請求項２６】
前記器具は、ポリカーボネート系ポリマーから作製される
請求項１〜２２の何れか一項記載の器具。
【請求項２７】
前記器具は、ポリスチレンポリマーから構成される
請求項１〜２２の何れか一項記載の器具。
【請求項２８】
前記器具は、エラストマー系ポリマーから作製される
請求項１〜２２の何れか一項記載の器具。
【請求項２９】
前記エラストマー系材料は、有機シリコーン系ポリマーである
請求項２８記載の器具。
【請求項３０】
前記有機シリコーン系ポリマーはポリジメチルシロキサンである
請求項２９記載の器具。
【請求項３１】
前記器具は、細胞培地にマッチした屈折率を有する高分子材料から作製されて光学的に透明な器具を提供する
請求項１〜３０の何れか一項記載の器具。
【請求項３２】
前記器具には、前記器具の試料ウェルの開口に接触して使用時に試料を収容するための閉じた試料ウェルを形成する取り外し可能な閉じ部がさらに設けられる
請求項１〜３１の何れか一項記載の器具。
【請求項３３】
前記試料ウェルの高さ、長さ、及び幅は少なくとも１０μｍである
請求項１〜３２の何れか一項記載の器具。
【請求項３４】
前記試料ウェルの前記高さ及び／又は長さ及び／又は幅は、１０μｍ〜２０００μｍの間である
請求項３３記載の器具。
【請求項３５】
前記試料ウェルの前記高さ及び／又は長さ及び／又は幅は、少なくとも５０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１０００μｍの群から選択される
請求項３３又は３４記載の器具。
【請求項３６】
前記試料ウェルの前記高さ及び／又は長さ及び／又は幅は、少なくとも１１００μｍ、１２００μｍ、１３００μｍ、１４００μｍ、１５００μｍ、１６００μｍ、１７００μｍ、１８００μｍ、１９００μｍ、少なくとも２０００μｍの群から選択される
請求項３３又は３５記載の器具。
【請求項３７】
光学顕微鏡法に用いられる請求項１〜３６の何れか一項記載の試料保持器具。
【請求項３８】
蛍光顕微鏡法に用いられる請求項１〜３６の何れか一項記載の試料保持器具。
【請求項３９】
前記器具は、光シート顕微鏡法に用いられる
請求項３７又は３８記載の試料保持器具。
【請求項４０】
前記器具は、選択的平面照明顕微鏡法に用いられる
請求項３７又は３８記載の器具。
【請求項４１】
請求項１〜３６の何れか一項記載の試料保持器具を備える
顕微鏡アセンブリ。
【請求項４２】
前記顕微鏡アセンブリは光学顕微鏡アセンブリである
請求項４１記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項４３】
前記顕微鏡アセンブリは蛍光顕微鏡アセンブリである
請求項４１記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項４４】
前記顕微鏡アセンブリは光シート顕微鏡法に適合されている
請求項４３記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項４５】
前記光シート顕微鏡法は選択的平面照明顕微鏡法である
請求項４３又は４４４記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項４６】
前記アセンブリは、使用時に光シートの焦点を制御する可変焦点レンズを備える
請求項４１〜４５記載の顕微鏡アセンブリ。
【請求項４７】
顕微鏡アセンブリを用いて生体試料を撮像する方法であって、
i）一又は複数の試料を含む請求項１〜３６の何れか一項記載の器具を準備し、
ii）前記器具を顕微鏡アセンブリに組み付け、
iii）対物レンズに向けられた光源により、前記器具の前記傾斜した反射面で光シートを反射して前記試料の一部を通して、前記試料を照明し、
iv）上記iii）の前記対物レンズによって、前記試料によって放射された光を収集し、
v）像を収集して前記試料の画像を形成し、及びオプションとして記憶する
工程を含む方法。
【請求項４８】
前記光源は、ガウシアンビーム（走査する、またはしない）、ガウシアン光シート、ベッセルビーム（走査する、またはしない）からなる群から選択される
請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記方法は、選択的平面照明顕微鏡法である
請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項５０】
選択的平面照明顕微鏡法は、ガウシアン光シート光源を用いる
請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記顕微鏡アセンブリは、前記光源により生成される光シートの焦点を制御する可変焦点レンズを備える
請求項４７〜５０の何れか一項記載の方法。
【請求項５２】
細胞機能の検査薬の効果を観察するためのスクリーニング法であって、
i）一又は複数のウェルを備え、前記ウェルに一又は複数の細胞型を含む請求項１〜３６の何れか一項記載の試料保持器具を準備し、
ii）前記ウェルと検査対象の化学物質とを接触させ、
iii）ii）内の前記細胞を顕微鏡で解析して、処理された前記細胞に対する前記検査薬の効果を判定する
工程を含む方法。
【請求項５３】
前記器具はセルアレイを備え、アレイ読み取り装置で読み取りされるよう構成されている
請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜３６の何れか一項記載の試料保持器具を、病気の診断又は予後に用いる使用方法。
【請求項５５】
病気の診断又は予後のための方法であって、
i）患者から分離した細胞試料を準備して、請求項１〜３６の何れか一項記載の試料保持器具に前記試料を配置し、
ii）上記i）の前記器具を顕微鏡アセンブリに組み付け、
iii）前記細胞試料を顕微鏡で解析し、
iv）上記iii）の前記細胞試料を、標準の対照細胞試料と比較し、
v）病態の尺度として、検査対象の前記試料と前記対照試料との間の構造的及び／又は機能的な差異を判定する
工程を含む方法。
【請求項５６】
生体試料の光学顕微鏡法に用いるための試料保持器具の作成方法であって、
i）試料に適合して前記試料を収容するよう構成された一又は複数の試料ウェルを備える支持基板を備え、前記ウェルには、少なくとも一つの壁部に、傾斜した面が前記試料ウェルに隣接して設けられている試料保持器具を準備し、
ii）前記器具の少なくとも前記傾斜した面に金属を蒸着して反射面を設ける
工程を含む方法。
【請求項５７】
前記器具は、紫外線硬化ポリマーから作製される
請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記器具は、アクリレート系ポリマー、ポリアクリレート、ポリカーボネート系ポリマー、エラストマー系ポリマー、有機シリコーン系ポリマー、ポリジメチルシロキサンからなる群から選択されるポリマーから作製される。
請求項５６又は５７記載の方法。
【請求項５９】
前記金属は、金又はクロムである
請求項５６〜５８の何れか一項記載の方法。
【請求項６０】
前記蒸着される金属は、クロムと金との組み合わせである
請求項５６〜５８の何れか一項記載の方法。
【請求項６１】
前記金属は、熱蒸発により蒸着される
請求項５６〜６０の何れか一項記載の方法。
【請求項６２】
請求項５６〜６１の何れか一項記載の方法により得られた又は得られる試料保持器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、任意の顕微鏡アセンブリに適合し、単一の対物レンズにより一又は複数の試料を横方向に照明するよう構成された、試料を収容するための器具；光学／蛍光顕微鏡法、限定するものではないが特に選択的平面照明顕微鏡法（Selective Plane Illumination Microscopy：SPIM）へのこの器具の使用方法；及びこの器具の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡法は、照明された試料からの光が、レンズセットを通ることで対象の拡大図をもたらすという光の伝播に基づくものである。この基本原理は様々な顕微鏡技術に用いられているが、解像度に限界があったり写像性が低くなるなどの種々の問題がある。光学顕微鏡法の光学的解像は光の回折によるため、２５０ｎｍよりも小さな物体を解像することは難しい。これは特にｚ軸（光軸）方向で顕著であり、この限界値が５００ｎｍ以上にまでなってしまう。多くの細胞組織や細胞成分は、しばしばこの光学解像度の限界よりも小さいが、それでも、タンパク質などの生体分子の機能の解析や細胞過程の解明には、自然な環境下でのそれらの特性を決定づけることが重要である。顕微鏡法は、生命科学や材料科学の分野にますます応用されるようになっており、生理的状態下で小さな物体をイメージングできる方法が望まれている。生きた試料の解像度は、試料の大きさ、組織の散らばり、色素の欠乏、及び細胞成分の動きのために、固定された標本の場合よりも一般に小さくなる。
【０００３】
誘導放出抑制（STimilated Emission Depletion：STED）顕微鏡法や、構造化照明顕微鏡法（Structured Illumination Microscopy：SIM）、一分子に基づく（single-molecule-based：SM）技術（PALM/STORM）などの照明技術が、顕微鏡法の分野に大きな変革をもたらし、いわゆる超高解像が可能となってきた。これらの技術は、従来の照明方法に比べて空間的解像度の点で明らかに有利であるが、これらの画像を生成するには複雑な機器やデータ解析が必要になってしまう。これらの技術は、生きた生体試料の深部イメージングの性能において難がある。
【０００４】
蛍光光シート顕微鏡法（Fluorescence Light-Sheet microscopy）技術がより普及して、生きた細胞のイメージングにより適したものになってきている。光シートに基づく顕微鏡法技術は、検知光学素子の焦点面周りの特定の体積における試料の薄層のみを、観測方向と直交する側方から照明する、というアイデアが背景にある。この技術は強いレーザーを使う必要がなく、したがって、侵襲を最小限に抑え、光退色を低減することができる。
【０００５】
広く用いられている光シート技術、選択的平面照明顕微鏡法（Selective Plane Illumination Microscopy：SPIM）においては、様々な厚さの光のシートを形成するために、円筒状光学素子又はガルバノメトリックミラーによる走査が用いられ、種々の大きさの試料に適用可能となっている。小さな試料（２０−１００μｍ）では、光シートは非常に薄く（〜１μｍ）され、一方大きな試料（１−５ｍｍ）では、シートは厚く（〜５−１０μｍ）され、視野にわたって比較的均一とされる。
【０００６】
試料の照明及び同じ経路に沿った蛍光の収集に一つの対物レンズを用いる落射蛍光顕微鏡法を用いた検出システムとは異なり、ＳＰＩＭは、（１）試料が透明なゲルに埋め込まれ且つ上方から保持されたチャンバ媒体に浸された状態で、水平に調整され且つ液体で満たされたチャンバに浸された検出レンズと、（２）検出レンズの光軸と直交する方向から試料を照明するための励起レンズと、（３）励起レンズを通してチャンバの内部に光シートを形成する一つのシリンドリカルレンズ、又は複数のガルバノメトリックミラーと、を備えている。検出軸に沿って試料を段階的に動かすことで、画像の積層体（stack）が得られる。
【０００７】
蛍光光シート顕微鏡法は、他の技術で直面する制約に原理上対処するものではあるが、複雑な装置及び難解な設定のため、この方法は通常の研究室での実務に適したものではない。上述のように、蛍光光シート顕微鏡法では、２つの対物レンズを、試料の近くで直交させるように配置することが必要であり、加えて、この独特の構造のために特別なサンプルホルダを必要とし、高開口数（NA）の対物レンズや標準のカバースリップが使いにくい。一分子に基づく（SM-based）超解像顕微鏡法により得られる最良のナノメータ解像度で、一つの細胞全体の３次元イメージングの問題に対処可能な最適な解決策がないのは明らかである。
【０００８】
本開示は、任意の顕微鏡アセンブリに適合し、この器具内に収容された一または複数の試料の光シート顕微鏡法を提供するよう構成された、試料を収容するための器具に関する。この器具は、試料ウェル（sample well）を備え、ウェルの一又は複数の側部に、試料を横方向に通るように光シートを反射して、一つの対物レンズで検出可能な蛍光画像を提供するよう構成された、傾斜した反射面が設けられている。光シートと蛍光の収集とは、同じ対物レンズを通して行われる。この器具は、高解像度蛍光顕微鏡法に関する上記の問題に対する、簡単で安価な解を提供する。本開示は、単対物レンズＳＰＩＭ（single objective SPIM：soSPIM）法を提供し、アレイマイクロミラーチップによって標準の倒立顕微鏡でのＳＰＩＭイメージングを可能とする。検出及び励起は、同一のただ一つの対物レンズにより行われる。器具の大きさは、サイズ可変反射面（例えば２０ミクロン〜２ｍｍ）を備え適切な倍率（例えば、１００倍〜１０倍）の対物レンズを用いるように設定することができ、ｓｏＳＰＩＭシステムによって、単一細胞の３次元高及び超解像から有機体全体のレベル（例えば、胚のイメージング）までの３次元ＳＰＩＭが、同じ装置で可能となる。
【０００９】
本開示は、１００倍、６０倍、４０倍、２０倍、及び１０倍の対物レンズを用い、優れた解像度での一分子に基づく（SM-based）超解像顕微鏡法の３次元イメージング性能を実証する。この器具を用いた３次元光学的切断法では、対物レンズ及び光シートのみで、試料を動かす必要がないので、スピニングディスク顕微鏡法（spinning-disc microscopy）などの他のイメージング技術に匹敵する取得スピードが可能であるという利点がある。
【００１０】
また、アレイ状に配置された複数の器具を用いれば、複数の細胞の同時イメージングが可能となる。これにより、複数の単一細胞の同時イメージングが可能となり、大幅に取得時間が短縮され、イメージングのスループットが向上する。アレイ状に配置された複数の器具は、数千の単一細胞ウェルを備えていてもよく、細胞や有機体全体、例えば胚の試料処理を容易にすることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
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【発明の概要】
【００１２】
本発明の一態様において、試料又は試料のサブコンポーネントの横方向照明のために用いられる試料保持器具（sample holding device）が提供される。この器具は、前記試料に適合してこの試料を収容するよう構成された試料ウェルを備える支持基板を備え、前記ウェルには、少なくとも一つの壁部に、傾斜した反射面が前記試料ウェルに隣接して設けられ、これは、使用時には光源からの横方向の光線を前記試料ウェル内に収容された試料を通すように向かわせ、そこに収容された試料に実質的に横方向の照明を提供して、単一の対物レンズを用いて前記試料をイメージングさせる。
【００１３】
「試料又は試料のサブコンポーネント」という表現は、複数の細胞又は複数の細胞の一部分の全体、及び胚などの有機体（又は有機体の一部分の）全体を含む。
【００１４】
本発明の好ましい一形態において、前記ウェルは少なくとも二つの傾斜した反射面を備え、前記面は、実質的に互いに対向して位置されて前記試料が配置される空間を規定する。
【００１５】
本発明の好ましい一形態において、前記ウェルは二つの傾斜した反射面を備えるチャネルであって、前記面は、実質的に互いに対向して位置されて前記試料が配置される空間を規定する。
【００１６】
本発明のさらに好ましい一形態において、第１及び／又は第２の前記傾斜した反射面の傾きは、約２０°〜８０°の間である。
【００１７】
本発明の好ましい一形態において、前記傾斜した反射面の角度は、２５°、３０°、３５°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°±５％からなる群から選択される。
【００１８】
本発明の好ましい一形態において、前記傾斜した反射面の傾きは、約４４°〜４６°±５％の間である。
【００１９】
本発明の好ましい一形態において、前記傾斜した反射面の傾きは、約４５°±５％である。
【００２０】
本発明の好ましい一形態において、前記反射面は、前記傾斜した面の全部又は一部への金属蒸着で設けられる。
【００２１】
本発明の好ましい一形態において、前記反射面は金から構成される。
【００２２】
本発明の別の好ましい一形態において、前記反射面はクロムから構成される。
【００２３】
本発明の好ましい一形態において、前記反射面は蒸着された複数の金属の混合物から構成される。好ましくは、前記混合物はクロムと金とから構成される。
【００２４】
本発明の好ましい一形態において、前記支持基板は、部分的に又は全体にわたって不透明である。
【００２５】
本発明の好ましい一形態において、前記支持基板は、部分的に又は全体にわたって透明である。
【００２６】
本発明の好ましい一形態において、前記支持基板は、少なくとも第１及び第２ポリマーから構成される少なくとも第１及び第２部分を備える複合体であって、前記第１部分は前記第１ポリマーから構成されて前記支持基板の本体を形成し、前記第２部分は前記第２ポリマーから構成されて試料ウェルを形成する。
【００２７】
本発明の好ましい一形態において、前記第１部分の屈折率は、前記第２部分の屈折率よりも高い。
【００２８】
本発明の好ましい一形態において、前記傾斜した反射面は蒸着された金属反射面を備えておらず、前記横方向の光線は全反射により反射される。
【００２９】
本発明の好ましい一形態において、前記第１部分の前記屈折率は、約１．４０〜１．５９±５％の間にある。
【００３０】
好ましくは、前記第２部分の前記屈折率は、約１．３３±５％である。
【００３１】
本発明の好ましい一形態において、前記試料は、一又は複数の細胞を含む。
【００３２】
好ましくは、前記一又は複数の細胞は、生きた細胞である。
【００３３】
本発明の別の好ましい一形態において、前記一又は複数の細胞は、固定細胞である。
【００３４】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、同様又は同一寸法でアレイ状に配置された複数の試料ウェルを備え、前記複数の試料ウェル内に収容された複数の試料の連続又は同時解析に適合されている。
【００３５】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、紫外線硬化ポリマーから作製される。
【００３６】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、アクリレート系ポリマーから作製される。
【００３７】
本発明の好ましい一形態において、前記アクリレート系ポリマーはポリアクリレートである。
【００３８】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、ポリカーボネート系ポリマーから作製される。
【００３９】
本発明の別の好ましい一形態において、前記器具は、ポリスチレンポリマーから構成される。
【００４０】
本発明の別の好ましい一形態において、前記器具は、エラストマー系ポリマーから作製される。
【００４１】
本発明の好ましい一形態において、前記エラストマー系材料は、有機シリコーン系ポリマーである。
【００４２】
本発明の好ましい一形態において、前記有機シリコーン系ポリマーはポリジメチルシロキサンである。
【００４３】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、細胞培地にマッチした屈折率を有する高分子材料から作製されて光学的に透明な器具を提供する。
【００４４】
本発明の好ましい一形態において、前記器具には、前記器具の試料ウェルの開口に接触して使用時に試料を収容するための収容試料ウェルを形成する取り外し可能な蓋がさらに設けられる。
【００４５】
本発明の好ましい一形態において、前記試料ウェルの高さ、長さ、及び幅は少なくとも１０μｍである。
【００４６】
本発明のさらに好ましい一形態において、前記試料ウェルの前記高さ又は長さ又は幅は１０μｍ〜２０００μｍの間である。
【００４７】
本発明の好ましい一形態において、前記試料ウェルの前記高さ及び／又は長さ及び／又は幅は、少なくとも５０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１０００μｍの群から選択される。
【００４８】
或いは、前記試料ウェルの前記高さ及び／又は長さ及び／又は幅は、少なくとも１１００μｍ、１２００μｍ、１３００μｍ、１４００μｍ、１５００μｍ、１６００μｍ、１７００μｍ、１８００μｍ、１９００μｍ、少なくとも２０００μｍの群から選択される。
【００４９】
本発明に係る器具は、本発明にしたがって、反射面を用いたｓｏＳＰＩＭによって撮像され得る単一細胞、又は大きな組織全体又は有機体試料などの試料を入れるよう構成されて作製され得ることは明らかであろう。
【００５０】
本発明の一態様において、光学顕微鏡法に用いられ本発明に係る試料保持器具が提供される。
【００５１】
本発明のさらなる一態様において、蛍光顕微鏡法に用いられる本発明に係る試料保持器具が提供される。
【００５２】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は光シート顕微鏡法に用いられる。
【００５３】
好ましくは、前記器具は選択的平面照明顕微鏡法に用いられる。
【００５４】
本発明のさらなる一態様において、本発明に係る試料保持器具を備えた顕微鏡アセンブリが提供される。
【００５５】
本発明の好ましい一形態において、前記顕微鏡アセンブリは光学顕微鏡アセンブリである。
【００５６】
本発明の別の好ましい一形態において、前記顕微鏡アセンブリは蛍光及び／又は光学顕微鏡アセンブリである。
【００５７】
本発明の好ましい一形態において、前記顕微鏡アセンブリは光シート顕微鏡法に適合されている。
【００５８】
好ましくは、前記光シート顕微鏡法は選択的平面照明顕微鏡法である。
【００５９】
本発明の好ましい一形態において、前記アセンブリは、使用時に光シートの焦点を制御する可変焦点レンズを備える。
【００６０】
本発明のさらなる一態様において、顕微鏡アセンブリを用いて生体試料を撮像する方法が提供される。この方法は、
i）一又は複数の試料を含む本発明に係る器具を準備し、
ii）前記器具を前記顕微鏡アセンブリに組み付け、
iii）前記試料の一部を通して光シートを反射するための前記器具の前記傾斜した反射面に向けられた光源の提供により、前記試料を照明し、
iv）一つの対物レンズによって、前記試料により放射された光を検出し、
v）像を収集して前記試料の画像を形成し、及びオプションとして記憶する
工程を含む。
【００６１】
本発明の好ましい一方法において、前記光源は、ガウシアンビーム、ガウシアン光シート、ベッセルビームからなる群から選択される。
【００６２】
本発明の好ましい一方法において、前記方法は、選択的平面照明顕微鏡法である。
【００６３】
好ましくは、選択的平面照明顕微鏡法は、ガウシアン光シート光源を用いる。
【００６４】
本発明の好ましい一方法において、前記顕微鏡アセンブリは、前記光源により生成される光シートの焦点を制御する可変焦点レンズを備える。
【００６５】
本発明のさらなる一態様において、細胞機能の検査薬の効果を観察するためのスクリーニング法が提供される。この方法は、
i）一又は複数のウェルを備えて前記ウェルに一又は複数の細胞型を含む本発明に係る試料保持器具を準備し、
ii）前記ウェルと検査対象の化学物質とを接触させ、
iii）ii）内の前記細胞を顕微鏡で解析して、処理された前記細胞に対する前記検査薬の効果を判定する
工程を含む。
【００６６】
本発明の好ましい一形態において、前記器具はセルアレイを備え、アレイ読み取り装置で読み取りされるよう構成されている。
【００６７】
遺伝子発現のマーカーを発現している細胞内で起こる、空間的及び時間的変化を撮像してこれに関する情報を抽出する方法は、数多く知られている。さらに、米国特許第５９８９８３５号（これは参照により組み込まれる）は、生物活性の多数の化学物質をスクリーニングするため、細胞内における蛍光レポーター分子の分布又は活性を判定するための光学システムを開示する。上記特許で開示される上記システムでは、生成されたデータの処理、記憶及び表示のためのコンピュータ化された方法も説明されている。多数の化学物質のスクリーニングのためには、細胞を取り扱い化学物質を投与するための細胞のアレイを準備する必要がある。本発明に係る試料保持器具は、オートメーション化されたローディング及びロボット化された取り扱いシステムと互換して用いられることができる。一般的に、高スループットスクリーニングには、転化（converted）又は修飾され（modified）信号を生成する指標化合物と化学物質との均一混合物が用いられる。信号は、適切な手段（例えば、生物発光、光学密度、蛍光放射の検出）により計測され、細胞、化学物質及び指標化合物が収容されたウェルごとに、信号が積算される。
【００６８】
本発明のさらなる一態様において、本発明に係る試料保持器具を、病気の診断又は予後に用いる使用方法が提供される。
【００６９】
本発明のさらなる一態様において、病気の診断又は予後の方法が提供される。この方法は、
i）患者から分離した細胞試料を準備して、本発明に係る試料保持器具に前記試料を配置し、
ii）上記i）の前記器具を顕微鏡アセンブリに組み付け、
iii）前記細胞試料を顕微鏡で解析し、
iv）上記iii）の前記細胞試料を、標準の対照細胞試料と比較し、
v）病態の尺度として、検査対象の前記試料と前記対照試料との間の構造的及び／又は機能的な差異を判定する
工程を含む。
【００７０】
本発明のさらなる一態様において、生体試料の光学顕微鏡法に用いる試料保持器具の作成方法が提供される。この方法は、
i）試料に適合して前記試料を収容するよう構成された一又は複数の試料ウェルを備える支持基板を備え、前記ウェルには、少なくとも一つの壁部に、傾斜した面が前記試料ウェルに隣接して設けられている試料保持器具を準備し、
ii）前記器具の少なくとも前記傾斜した面に金属を蒸着して反射面を設ける
工程を含む。
【００７１】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、紫外線硬化ポリマーから作製される。
【００７２】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、アクリレート系ポリマーから作製される。
【００７３】
本発明の好ましい一形態において、前記アクリレート系ポリマーはポリアクリレートである。
【００７４】
本発明の好ましい一形態において、前記器具は、ポリカーボネート系ポリマーから作製される。
【００７５】
本発明の別の好ましい一形態において、前記器具は、エラストマー系ポリマーから作製される。
【００７６】
本発明の好ましい一形態において、前記エラストマー系ポリマーは有機シリコーン系ポリマーである。
【００７７】
本発明の好ましい一形態において、前記有機シリコーン系ポリマーはポリジメチルシロキサンである。
【００７８】
本発明の好ましい一方法において、前記金属は、金又はクロムである。
【００７９】
本発明の好ましい一形態において、前記蒸着される金属は、クロムと金との組み合わせである。
【００８０】
本発明の好ましい一形態において、前記金属は、熱蒸発により蒸着される。
【００８１】
本発明の一態様において、本発明に係る方法により得られた又は得られる試料保持器具が提供される。
【００８２】
本発明のさらなる一態様において、
i）試料に適合して前記試料を収容するよう構成された一又は複数の試料ウェルを備えた支持基板を備え、前記ウェルには、少なくとも一つの壁部に、傾斜した反射面が前記試料ウェルに隣接して設けられている器具と、
ii）一又は複数の金属と、オプションとして
iii）前記器具の試料ウェルの開口に適合するよう構成された閉じ部と
を備えたキットが提供される。
【００８３】
明細書及び請求項の記載を通して、「〜を備える／〜を含む／〜から構成される（comprise）」「〜を含有する（contain）」という単語、及び、例えば「comprising」及び「comprises」といったその派生語は、「〜を含むが、それに限定されない」ことを意味し、他の一部分、追加物、成分、全体、又は工程を排除することを意図するものではない（そして排除しない）。「本質的に〜からなる（consisting essentially）」は、本質的な成分を有することを意味するが、この本質的な成分の機能を物質的に阻害しない成分を備えていてもよい。
【００８４】
明細書及び請求項の記載を通して、特に文脈において必要でない限り、単数表現は複数を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、文脈において必要でない限り、その使用は単数及び複数のいずれもを予期すると解される。
【００８５】
本発明の特定の態様、形態、又は例に関連して説明される特徴、成分、特性、化合物、化学部分、又は化学基は、特に矛盾がない限り、ここに記載される他の任意の態様、形態、又は例に応用できると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
本発明の実施形態を、単なる一例として、以下の図面を参照して説明する。
【図１】（Ａ）シリコンウェハの異方性ＫＯＨウェットエッチングにより実現される４５°面を呈する微細溝（micro-groove）のＳＥＭ画像である。（Ｂ）二つの異なる大きさのマイクロウェル（micro-well、６０×３００μｍ及び２５×２５μｍ）及び４５°面を呈するシリコンウェハのＳＥＭ画像である。（Ｃ）金属化された４５°面を有し、３０ｍｍのボトムフリーのプラスチックシャーレに封止された、紫外線硬化ポリマーでなる最終的な器具の透過像である。
【図２】最終的なポリマーの器具の作製プロセスを示す。（Ａ−ｉ）紫外線フォトリソグラフィープロセスにより（１００）酸化シリコンウェハに開口窓が規定される。（Ａ−ｉｉ）テキストで報告されるように、（１００）酸化ウェハに、４５°傾斜した（１１０）結晶面で規定される溝が構築される（ａ）。（Ｂ−ｉ）紫外線リソグラフィー及びＲＩＥにより、残った酸化被膜に開口が規定され；（Ｂ−ｉｉ）構築後の酸化被膜をマスクとして用いて、プラズマドライエッチングにより、シリコンにマイクロウェルが刻まれる（ｂ）。（Ｂ−ｉｉｉ）フォトリソグラフィーのレジスト及び酸化層が取り除かれる。（Ｃ−ｉ）ＰＤＭＳエラストマーのキャスティングにより、シリコンモールドが複製され；（Ｃ−ｉｉ，ｉｉｉ）熱硬化後、ＰＤＭＳがカバースライドに貼り付けられることにより形成されるキャビティへの毛細管充填を利用して、ＰＤＭＳレプリカをモールドとしてシート構造体が作製される（ｃ）。（ｃ）で得られたポリマーシート（Ｄ−ｉ）が、金属膜で被覆され（Ｄ−ｉｉ）、中央のマイクロウェルの近くにミラー状の４５°傾斜面が生成される（Ｄ−ｉｉｉ）（ｄ）。（Ｅ−ｉ）器具が、毛細管充填により、好ましくは紫外線硬化ポリマー（ポリアクリレート）でなる保護層で覆われる。（Ｅ−ｉｉ）最後の金属エッチング工程でウェル内部の不均一な金属層が除去される（ｅ）。（Ｅ−ｉｉｉ）器具は、マイクロウェル内に配置される細胞の細胞培養及び３次元ボリュームイメージングの準備が完了している。
【図３】生体試料の作製プロセス及びイメージング手順を示す。（Ａ）エッチングされたシリコンウェハを４５°マイクロミラーとして用いて、対物レンズの光軸と直交して透過される光シートが形成される。まず、異方性ウェットエッチングプロセスにより、シリコンウェハに４５°面が形成される（ｉ）。続いて、撮像対象の生体試料の液滴をのせた清浄なカバースリップにウェハが直接押し付けられて封止される（ｉｉ）。生体試料のイメージングの準備が完了している（ｉｉｉ）。（Ｂ）両側に４５°金属面があるマイクロウェルを呈する紫外線硬化ポリマー系器具の作製プロセスである。異方性エッチングプロセス及びドライエッチングプロセスにより、シリコンウェハ内に４５°面及びマイクロウェルが規定される（ｉ）。このウェハのＰＤＭＳレプリカが形成され（ｉｉ）、これを用いて、紫外線硬化ポリマーの毛細管充填プロセスにより、カバースリップ上にウェハの形が複製される（ｉｉｉ）。高真空下で、ポリマーの面がクロム層で金属化され（ｉｖ）、最後の工程で４５°面が保護されてマイクロウェルに蒸着された金属がエッチングされる（ｖ）。紫外線硬化器具は、細胞培養及びイメージングの準備が完了している（ｉｖ）。
【図４】ｓｏＳＰＩＭの要部を示す。（Ａ）標準のカバースリップ上にある４５°マイクロミラー状の面を呈する微細加工サンプルホルダ、励起光線操舵システム及び光学検出経路で構成され、ミラーの位置合わせ及び蛍光信号検出の可能なｓｏＳＰＩＭの要部の概略図である。（Ｂ）ミラーに沿った励起光線の位置変位（Δｘ）と対物レンズの軸方向の位置合わせ（Δｚ）及び励起光線の焦点ぼかし（δι）との組み合わせにより得られる、光シートの最も薄い部分を生体試料上に維持するための切断性能を示す。（Ｃ）光線操舵システムの概略図である。レーザー（Ｌ１−Ｌ３）からの光は、ｘ軸ガルバノメトリックミラー（ＸＧ）で反射されて、順にリレーレンズ（ＲＬ）を通ってｙ軸ガルバノメトリックミラー（ＹＧ）及び焦点可調レンズ（ＶＬ）に伝達される。光シートを直接形成するために、シリンドリカルレンズ（ＣＬ）を光路内に挿入してもよい。励起光線が常に対物レンズの光軸と平行に放射されるように、（ＸＧ）、（ＹＧ）、（ＶＬ）はすべて対物レンズの後焦点面（back focal plane：BFP）と共役である。テレスコープ（ＴＬ）により、ＢＦＰにおいて光線径が可変とされる。
【図５】光線厚さ及び焦点ぼかしシステムの特性評価を示す。（Ａ）６０倍の水浸対物レンズ（ＮＡ＝１．２）のＢＦＰにおける直径が４ｍｍ（灰色の点）及び２ｍｍ（黒色の点）である励起光線の軸方向の光線プロファイル、及びそれらのガウスビーム伝播方程式でのフィッティング（黒い点線）である。灰色（黒色）の点線は、ＢＦＰにおける直径が４ｍｍ（２ｍｍ）である励起光線のレイリー長の２倍で規定される光シートの視野を示す。（Ｂ）電動の可変焦点レンズ（ＶＬ）の種々の発散強度に対する軸方向の光線プロファイルである。レーザー光線の発散を動的に変化させることで、レーザーシートの幅及び長さを変えることなく焦点の位置が調整可能である。（Ｃ）電動の可変焦点レンズの電流に対する、励起光線の集束位置すなわち光シートの最も薄い部分の位置の、線形従属性である。
【図６】光シートの位置の偏差の補償を示す。（Ａ）上図：蛍光溶液で可視化した、下図の配置で表わされる試料内での異なる二つの深さ（Δｚ）における、対物レンズの軸方向の移動に対する焦点ぼかし補償なし（δι＝０）での励起光線を示す。（Ｂ）対物レンズの軸方向の移動に対する補償なしでの、試料内での種々の深さにおける光シートのプロファイルである。（Ｃ）上図：蛍光溶液で可視化した、下図の配置で表わされる試料内での異なる二つの深さ（Δｚ）における、対物レンズの軸方向の移動に対する焦点ぼかし補償した（δι∝Δｚ）励起光線を示す。（Ｄ）対物レンズの軸方向の移動を補償した後の、試料内での種々の深さにおける光シートのプロファイルである。スケールバーは、光シートの長さ（２２．４μｍ）に対応しており、光シートが最も薄くなっている位置に置かれている。
【図７】ショウジョウバエの胚全体の３次元ボリュームイメージングを示す。（Ａ）ショウジョウバエの胚のように厚い試料のイメージングのための、ミリメートルサイズの微細加工４５°ミラーを備えたｓｏＳＰＩＭの要部の概略図である。異なる発生段階にあるショウジョウバエの胚が、二つの金属化４５°ミラー間において１％低融点寒天ゲルに埋め込まれ、ｓｏＳＰＩＭ顕微鏡で撮像される。（Ｂ）倍率１０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．３）及び厚さ５．２μｍの光シートで撮影された、膜タンパク質CAP43-Venus（上図）、及び核タンパク質Histone-mCherry（下図）を発現しているショウジョウバエの胚の二色ｓｏＳＰＩＭ光学的断面画像である。（Ｃ）倍率２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．５）及び厚さ４．３μｍの光シートで撮影された、ショウジョウバエの胚の二色ｓｏＳＰＩＭ光学的断面画像（上図：CAP43-Venus；下図：Histone-mCherry）である。（Ｄ）倍率４０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．７５）及び厚さ３．１μｍの光シートで撮影された、ショウジョウバエの胚の二色ｓｏＳＰＩＭ光学的断面画像（上図：CAP43-Venus；下図：Histone-mCherry）である。
【図８】ｓｏＳＰＩＭ法の３次元高及び超解像能を示す。（Ａ）膜タンパク質E-Cadherin-GFPを発現しているS180細胞に対する、広視野（widefield）取得と、ｓｏＳＰＩＭ法及びスピニングディスク法の切断性能との比較である。差込図は、切断性能を比較するために赤色のボックス内を走査した平均線を示す。（Ｂ）上図：両側に４５°のミラー状面がある２４×２４μｍ２のマイクロウェル内に配置された、膜タンパク質E-Cadherin-GFPを発現しているS180細胞ダブレット（S180 cell doublet）のｓｏＳＰＩＭ光学的断面画像である。上右図は、ｙ軸方向に沿った最大値投影（Maximum Intensity Projection：MIP）を示す。下図：フォトコンバーティブルタンパク質（photo-convertible protein）dendra2で標識された核タンパク質Fibrilarinを発現しているU2-OS細胞のｓｏＳＰＩＭ光学的断面画像である。下右図は、ｙ軸方向に沿ったＭＩＰを表わす。カバースリップから７μｍ上で１．４４μｍ離れた二つの異なる平面における、核タンパク質Firilarin-dendra2発現U2-OS細胞の核内の高（Ｃ）及び超（Ｄ）解像画像である。差込図は、高及び超解像画像内の白い領域の拡大図を示す。（Ｅ）ＰＡＬＭ連続取得の間に得られた、８０００のフレームの一例であり、カバースリップより７μｍ上であっても低いバックグラウンドノイズで２つの単分子が示されている。これは、ｓｏＳＰＩＭ法の高い切断性能のためである。差込図：白色のボックス内に検出された単分子の拡大図である。（Ｆ）左上図：３００平面の期間、図（Ｅ）の白色のボックス内を記録した時間トレースであり、典型的な単分子の痕跡が示されている。上右図：白色のボックスで囲った（Ｅ）の差込図に示される単分子の一分子強度プロファイル（赤線）と、ＦＷＨＭが２．５１画素（４０２ｎｍ）であるそのガウシアンフィッティング（黒線）である。下図：図（Ｄ）のＰＡＬＭ取得期間において収集された、局在ごと（per localization）の光子数のヒストグラムである。（Ｇ）２４×２４μｍ２ウェル内の固定S180細胞の、カバースリップから８．８μｍ（左図）及び１３．４μｍ（右図）上の異なる二つの平面における、ｓｏＳＰＩＭ高及び超解像画像である。核タンパク質laminを、有機フォトスイッチャブル蛍光色素分子（organic photo-switchable fluorophore）FLIP565で着色している。差込図は、高及び超解像画像内の白色領域の拡大図を示す。スケールバーはすべて５μｍ、差込図内は１μｍである。
【図９】マイクロウェル内の細胞レベルにおける３次元ボリュームイメージングを示す。（Ａ）異なる２４×２４μｍ２のマイクロウェル内にそれぞれ配置された、膜タンパク質E-Cadherin-GFP（上図）、及び皮膚アクチンタンパク質F--Tractin-RFP（中図）を発現している三つのS180細胞の、同時二色ｓｏＳＰＩＭ光学的断面画像である。走査による光シートは、赤いバーで示された範囲内のみを照明し、カメラの読み出し速度は単一ウェルのイメージングの場合と同等である。下図は三つのウェルの位相差画像である。スケールバーは５μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
（材料及び方法）
（器具の作製）
シリコンウェット化学エッチングは、必要な設備が安価であって空間形状の精度に優れた構造物を高スループットで作製することができるため、光マイクロマシン技術（Optical Micro Electro-Mechanical Systems：MEMS）においてよく使われる方法である（非特許文献７０，７１）。Ｓｉのエッチング速度は、種々のパラメータの中でも、化学溶液の組成や温度といったエッチング条件及び結晶方位に強く依存しており、現れる結晶面を選択することが可能である。ウェハの配向、マスク層の開口の形状及びエッチングの化学的性質を選択することにより、多くの異なる構造が実現可能であることが示されている（非特許文献４８，７２，７３）。
【００８８】
本願では、平らな面に対して４５°の角度で傾斜したミラーの形成が必要である。ミラー状の面は、走査するレーザー光線が照射されたときに均一な照明シートを形成可能な程度に滑らかな必要がある。なお、使用される光の波長よりもｒｍｓが十分小さい程度の表面の粗さは、許容可能である。適切なウェットエッチングプロセスを選択することで、これらの条件をともに満たすことができる。以下に（（４５°傾斜ミラーの作製）の欄参照）、可能なプロセスを一つ示し、得られた構造物の例を示す。また、（ポリマーシート構造体の作製）の欄において、これらの構造物をどのようにして最終的な微細構造を有する器具のテンプレートとして用い得るかを示す。
【００８９】
（４５°傾斜ミラーの作製）
一つの側面を研磨し、熱酸化させた（１００）配向のシリコンウェハ（厚さ３００ｎｍ）を商業上の提供者（Bonda Technology PTe Ltd 10 Anson Road，#18-18 International Plaza，シンガポール 079903）から購入した。以下のようにして、光リソグラフィー及び反応性イオンエッチング（Reactive Ion Etching：RIE）により、酸化被膜に開口を規定した。AZ 5214E（MicroChemicals GmbH，Nicolaus-Otto-Str. 39 D-89079 Ulm，ドイツ）レジストを３０００ｒｐｍでスピンコートし、ホットプレート上で１２５℃で１分間ソフトベークし、最終的な厚さを約１．１μｍとした。レジストに、水銀アークランプのｉ線を１００ｍＪ／ｃｍ２のエネルギ線量で照射した。１：４の割合で水で希釈したAZ400現像液に１分間浸し、水ですすぎ、最後に穏やかな窒素ブローで乾燥させることで現像した。続いて、リソグラフィー後のレジスト層をＲＩＥ工程のマスクとして用い；ＣＦ４（２８．５ｓｃｃｍ）と酸素（１．５ｓｃｃｍ）の３×１０−１ｍｂａｒ混合ガスに１５０Ｗの電力を印可することによって１２０Ｖのバイアスで生成するプラズマを５分間印可し、クリアされた領域から酸化被膜を除去した。レジストをはがして、ウェハをＳｉのウェットエッチングする準備が整った。
【００９０】
ウェットエッチングプロセスの間（１１０）面を現せば、（１００）面に対して４５°の傾斜角を有するミラー状の面が得られる。種々の結晶面のエッチング速度（以下、「ｖｈｋｌ」で示す）は、化学物質と配置とを適切に選択することで調整可能である。以下の二つの条件を満たす必要がある：１．酸化マスク層に開けられる溝は、（１００）ウェハの＜１１０＞主平面に対して（面内において）４５°の角度を向くべきである；２．エッチング溶液の化学成分は、アルカリ剤（例えばKOH又はTMAH）に加えて有機界面活性剤を含むべきである。我々は２つの異なる化学物質を用いた、ここでｖ１００＞ｖ１１０＞ｖ１１１である。ウェットエッチングＡは、３ＭのＫＯＨと１ＭのＩＰＡアルコール（水溶液）とで７５℃で行われ；ウェットエッチングＢは、ＴＭＡＨの３０％水溶液と２００ｐｐｍのTriton（商標）界面活性剤とで７５℃で行われた。（１１１）面は常に最もエッチングが遅く、したがって非常に長いエッチング時間において、最終的には、初期構造はすべて（１１１）面（（１００）面に対して５４．７°の角度を形成する）で区切られた矩形溝へとつぶれこむ。図１に、１時間３０分エッチングした場合の典型的な結果を示す。どちらの場合も、ミラー状の面の質は、光学的な応用に十分であった。
【００９１】
（ポリマーシート構造体の作製）
以下に、ポリマーシート構造体の作製プロセスを詳述する。簡単には、ウェットエッチングで製造されたシリコンの器具をマスタとして、ＰＤＭＳ中間モールドの（反転トーン（inverted tone）を有する）複製のために用い、これは再度、毛細管充填と紫外線硬化を利用して最終的なポリマーシートに複製される。この二段階複製プロセスにより、得られる器具の連続的な乗算が可能となり、各複製工程において、一つの「母型（mother mold）」が多くの「娘器具（daughter device）」に反転トーンで再生される。図２は、プロセスの概略である。
【００９２】
上述のように構築されたシリコン（１００）ウェハを、出発基板として用いた（図２Ａ）。ウェットエッチング後に残った酸化被膜を、再度エッチングプロセスのマスク層として用いた。ポジ型のフォトレジスト（上記と同じもの、すなわちAS 5214E）のスピンコート及び紫外線リソグラフィーにより、現像後、二つの連続するミラー間の位置に開口が形成される。ＩＰＣ反応炉内での切換プラズマエッチングプロセス（switched plasma etching process）（非特許文献７５）によって、保護レジスト層のためミラー状の面に影響を及ぼすことなく、シリコンにパターンが転写される：切換プロセス（ボッシュプロセスともいう）は、保護レジスト層に対するシリコンの高選択比の点で最適化されている。レジスト層と酸化皮膜とをともに除去した後、ミラーに囲まれたマイクロウェルを有するシリコンモールド構造体が得られる。この第一世代のモールドから、ＰＤＭＳのキャスティング及び硬化により、第二世代の中間モールドが製造される。ＰＤＭＳレプリカの質及びシリコンモールドの寿命を向上させるため、気相塩類化作用（vapor phase silanization）によって固着防止層（anti-stick layer）がシリコン表面に導入される（非特許文献７６）。一つのシリコンモールドから多くのレプリカを製造することができ、高スループットな作製手順が達成された（2c）。続いて、ＰＤＭＳ中間モールドを用いて、最終的な器具が製造される。ＰＤＭＳモールドがガラスカバースライドに接触されて押され、各溝の開口端からアクセス可能な接続キャビティが規定されるようにモールドとカバースライドとが貼り付けられる。続いて、これらのキャビティが、毛細管現象を利用して紫外線硬化液状ポリマーにより充填される。ポリマーが硬化して、横方向に４５°の傾斜面で囲まれたマイクロウェルを有するポリマーシートが自立できるようになるまで、ガラスカバースライドを通して紫外線が照射される。作製工程の最後において、このシートが金属層で被覆される。ミラー状の面が蒸着源を向くようにして、シートがＵＨＶ金属蒸着装置内に挿入される。最終的に必要な反射率に応じて種々の金属を用いることができるが、プラスチック材料への良好な付着性のため通常Ｃｒが好ましい。熱又はE-gun蒸発によって、３０−５０ｎｍの厚さのＣｒ層が蒸着される（図２Ｄ）。シートの頂面又は底面にはキャッピング壁がないため、Ｃｒはウェルの内部には蒸着しない：なお、通常、ＵＨＶ蒸着チャンバの形状により、垂直な壁部には蒸着はされない。引き続いて、カバースリップ上に器具が実質的に反転されて置かれ、溝の隙間が紫外線硬化レジストで満たされて硬化される。これによりミラーに保護層が設けられる。ウェルは、器具の外部から届かないので空洞のままである。最後に金属エッチング工程により、ウェルの内部にあるかもしれない金属被膜が取り除かれる。使用される金属被膜に応じて、適切な標準エッチング試薬が用いられる。
【００９３】
（ｓｏＳＰＩＭ光線操舵システム）
ｓｏＳＰＩＭ励起光線操舵システム（図４Ａ−４Ｃ）を慣用の倒立顕微鏡（inverted Nikon Ti-E）に適用した。照明レーザー（４０５ｎｍ・２００ｍＷ、４８８ｎｍ・２００ｍＷ、５６１ｎｍ・２００ｍＷ、及び６３５ｎｍ・１７５ｍＷ）がコリメートされ、ダイクロイックビームスプリッタで同一線上に（collinearly）混合されて、空間フィルタリング及び調整容易なように単一モード光ファイバー（single mode optical fiber）に結合された。一又は複数の波長の選択、強度の制御、及びオン／オフ変調のために、音響光学可変波長フィルタ（acousto-optic tunable filter：AOTF）を用いた。すべてのレーザーについて、反射型アクロマティックコリメータ（Thorlabs RC02APC-P01）を用いて、光ファイバーの出口において平行な２ｍｍ幅のレーザー光線を形成した。励起光線の直径、又は開口数を変化させるために、励起光線を２倍に拡大するレーザー光線テレスコピックエキスパンダ（Thorlabs AC254-050-A，焦点距離５０ｍｍ、及びThorlabs AC254-100-A，焦点距離１００ｍｍ）を光路に挿入してもよい。
【００９４】
レーザー光線はｘ軸ガルバノメトリックミラー（ＸＧ）に送られ、リレーレンズ（Thorlabs AC254-050-A、焦点距離は両方とも５０ｍｍ）によって、対となるｙ軸ガルバノメトリックミラー（ＹＧ）に写像される。レーザー光線はさらにリレーレンズ（Thorlabs AC254-050-A，焦点距離は両方とも５０ｍｍ）によって焦点可調レンズ（ＶＬ）（Optotune，Custom EL-30-10，焦点距離−８０ｍｍ〜＋１０００ｍｍ）に写像される。焦点可調レンズは最終的に、第３のテレスコープ（Thorlabs，AC254-150-A、及び顕微鏡の鏡筒レンズ、焦点距離は両方とも１５０ｍｍ）によって、高開口数の顕微鏡対物レンズ（CFI Plan Apochromat VC，６０倍，水浸，開口数１．２０、又はCFI Plan Apochromat VC，１００倍，油浸，開口数１．４０，Nikon）の後焦点面（ＢＦＰ）の中心に写像される。これら一連の共役及びセンタリング工程により、照射面の径方向位置にかかわらず、対物レンズを通して写像されるときに顕微鏡の対物レンズの光軸と同一線上にレーザー光線を得ることができる。
【００９５】
４５°マイクロミラー面を備えて対物レンズの先端に位置するサンプルホルダにより、励起光線を対物レンズの光軸と垂直に反射することができる。励起光線をＹ軸方向に走査することにより、顕微鏡の対物レンズの光軸と垂直に試料を貫く光シートを形成することができる。Ｘ軸方向に沿って励起光線を順に変位させることにより、光シートが試料を貫く位置の深さを変えることができる。サンプルホルダは、軸方向並進ピエゾステージ（Physik Instrument，P-736 PInano−２００μｍ）上に配置され、これにより対物レンズの焦点面を光シートの深さに応じて位置させることが可能となる（図４Ｂ）。
【００９６】
超解像取得のために、励起経路にシリンドリカルレンズ（ＣＬ）（Thorlabs ACY254-150-A，焦点距離１５０ｍｍ）が挿入される。これにより、ミラー上でレーザー光線を走査することなく、一つの方向においてレーザー光線を対物レンズのＢＦＰに集光させて連続照明光シートを形成することができる。必要に応じて、光シートの長軸寸法の方向をミラーの長軸に合わせるために、シリンドリカルレンズは回転マウントに搭載される。
【００９７】
蛍光信号は、高開口数の同一の対物レンズを通って顕微鏡の鏡筒レンズにより集光され、ＥＭＣＣＤカメラ（Evolve 512，Photometrics）により撮影される。超解像取得のために、１００倍の油浸対物レンズを用いた。これにより、結像面での画素サイズを１６０ｎｍに最適化できた。
【００９８】
試料に応じて４５°マイクロミラーを位置決めして撮像するために、視野の大きな、第２のＣＣＤカメラ（Hamamatsu，Orca Flash 2.8）を倍率が０．４５倍のレンズ（Nikon）と組み合わせて用いた（図４Ａ）。このカメラは、ミラーの方向に応じて光シートを形成するために励起光線の走査方向を規定するため、及び、試料内の光シートの最終的な深さを変えるためにミラーと直交する軸に沿った光シートの動きを規定するためにも、用いられた。ＥＭＣＣＤの視野外にマイクロミラーが位置することで、イメージングに利用可能な視野範囲を増加させ、励起光線がマイクロミラーで反射されることで生じるバックグラウンドノイズを減少させることができる。
【００９９】
（光シートの位置決めと同期）
集光されたガウシアンビームを走査すること、又はシリンドリカルレンズを通してガウシアンビームを集光することにより形成される光シートは、励起光線の集束位置の周りで２ω０×２ＺＲ×ｌの体積であるとみなすことができる。ここで、ω０とＺＲはそれぞれ励起光線のウエストとレイリー長であり、ｌは走査特性又はシリンドリカルレンズのいずれかで決まる励起光線の幅である（非特許文献７８）。一般のＳＰＩＭの構成において、光シートは、励起対物レンズの焦点面に位置される。しかしながら、ｓｏＳＰＩＭの構成においては、この場合には光シートが４５°マイクロミラー上の励起光線の反射点に位置されることになる。光シートをマイクロミラーから離して生体試料上に位置させるよう変位させるために、焦点ぼかしシステムが実装されている。これは、電動の高速可調焦点合わせ機構を備えた発散レンズで構成される（Optotune，Custom EL-10-30-C-VIS-LD）。このシステムの焦点範囲は、＋１０００ｍｍ〜−８０ｍｍで対物レンズのＢＦＰと共役である。このシステムにより、光シートの位置をマイクロミラーの位置から２８０／２６０μｍ上、これらは倍率６０倍／１００倍の対物レンズの視野にそれぞれ一致する、にまで変えることができる。このような焦点ぼかしシステムにより、ＥＭＣＣＤカメラの視野内の位置によらず、生体試料上に光シートを位置させることができる。蛍光溶液により励起光線を可視化することによって、マイクロミラー、及び可調レンズの焦点距離に応じて、光シートの位置に関連する光線の精密な校正が可能となった。
【０１００】
さらに、結像面の深さを変えるときの対物レンズの軸方向の移動に起因して生じ得る光シートの位置のずれを補償するために、焦点可調レンズが用いられる。実際、補償なしの場合、光シートの径方向の位置のずれは、対物レンズの軸方向のずれと等しくなる（図５Ａ−５Ｂ）。光シートの最も薄い部分を常に生体試料上に位置させるために、対物レンズの移動に応じて励起光線の焦点を合わせることで、対物レンズのずれを補償した（図５Ｃ−５Ｄ）。この補償により、結像面が０〜４０μｍの範囲で、光シートのずれを５％未満とすることができる。
【０１０１】
（光線の調整及び特性評価）
対物レンズのＢＦＰに応じて、ＸＧ及びＹＧガルバノメータ、並びに焦点可調レンズの、精密な共役及び中央への位置合わせを行った。これは、マイクロミラー上の反射位置によらず、４５°マイクロミラーで反射された後の光シートと顕微鏡の対物レンズの光軸との直交性を確保するために、非常に重要である。顕微鏡の対物レンズに変えて取り付けたシャーリング干渉計（Shear plate SI035，Thorlabs）で、各リレーレンズを通った後のレーザー光線をコリメートすることで、共役を達成した。ＢＦＰと、ＢＦＰにおいて顕微鏡の光軸と垂直に配置された平面鏡で反射された光線の像とを、繰り返しセンタリングすることで、光学素子と対物レンズのＢＦＰの中心とを合わせた。顕微鏡の対物レンズの光軸に対するマイクロミラーの４５°角からの僅かなずれは、ＢＦＰ上のレーザー光線の中心を僅かにずらすことで共役を崩すことなく補償した。
【０１０２】
（微細加工プロセス）
図３に、マイクロウェル及び４５°マイクロミラー状の面を呈するシリコンチップの作製プロセスを示す。アルカリ溶液（KOH又はTMAHなど）の異方性エッチングによって、配向されたシリコンウェハにマイクロミラー状の面が製造される。選択的保護層（非特許文献４８，４９，７９）として機能する界面活性剤を用いて、配向された結晶面の高速エッチングを抑制することで、４５°面が得られる。エッチング条件（すなわち、アルカリ及び界面活性剤の濃度やエッチングバスの温度）を調節することで、面のエッチング速度を、＜１１１＞方向を常に遅くしながら、＜１００＞方向に対するものよりも遅くまで減少させることができる。エッチングが許可されるウェハの開口領域が、ウェハの＜１１０＞基準平面から４５°離れた面上に配向されている場合、露出した＜１１０＞面が維持され＜１００＞面のエッチングが進行して、正確に４５°傾斜した面が両側にあるキャビティが現れる。
【０１０３】
４５°溝を呈するシリコンウェハは、図３Ａに示すように、そのままミラー状の器具として用いられてもよい。この場合、細胞浮遊液の液滴が清浄な＃１．５カバースリップに沈着され、シリコン器具がカバーガラス上に密着して押圧されて一般的なワニスにより封止される。
【０１０４】
より精緻な方法においては、図３Ｂで説明され図３Ｃ−３Ｄに示されるように、両側に４５°マイクロミラーがあるマイクロウェルを備えたポリマーベースの器具が設計される。上述のように４５°面が形成された後、ドライエッチングによってマイクロウェルが形成される（図３Ｂ−ｉ）。続いてシリコンウェハに対してＰＤＭＳ（184 Sylgard，Dow Corning）で複製が行われ、これは、毛細管充填プロセスを行えば、標準のカバースリップ(NOA polymer，Norland product)で覆われた紫外線硬化ポリマーでなるプラスチックの器具を数十回製造することができる（図３Ｂ−ｉｉ，及びｉｉｉ）。プラスチック面の反射率を高めるために、超高真空チャンバ内で熱蒸発によってＣｒ層が蒸着される（図３Ｂ−ｖｉ）。最後に紫外線硬化ポリマーの第２層でマイクロミラーが保護され、マイクロウェル内の金属被覆がウェットエッチングにより除去される（図３Ｂ−ｖ）。器具が超純水で数回洗浄され、表面安定化のため０．２倍のプルロニック溶液（Pluronic solution）（F127，Sigma）で一晩インキュベートされる。最後に、ボトムフリーの３５ｍｍプラスチックシャーレ内にカバースリップが封止されて器具内での細胞培養が容易となる（図１Ｃ）。
【０１０５】
（細胞培養、トランスフェクション、及びイメージング）
E-Cadherin-GFPを安定的に発現しているS180細胞を、Jean-Paul Thiery（Institute of Molecular Cell Biology，A*STAR）から頂いた。U2-OS骨肉腫細胞株（ATCC HTB-96）で、pDendra2-Fibrillarin発現（Evrogen，Cat#FP826-d，dendra2 fused to N-terminus of fibrillarin）クローンU2-OS安定細胞株を樹立した。これを５％ＣＯ２加湿培養器で３７℃に維持した。トランスフェクションの一日前、６つのウェルシャーレに１．２×１０５細胞／シャーレで播種した。jetPRIME DNAトランスフェクション試薬（Polyplus Transfection）を用いて１：２の比率で、細胞をCM-Mc媒体に導入（transfected）した。次の日、導入された細胞を直径１５ｃｍの培養シャーレに移した。G418を０．４ｍｇ／ｍＬ含有するCM-Mc内でクローン選択を行った。トランスフェクションの１０〜１５日後、蛍光顕微鏡下でクローンの選択を行い、蛍光局在の信頼性及び適切性を確保した。選択されたクローンを分離して増殖用の２４のウェルシャーレに移して、１０％DMSO含有培地に凍結した。蛍光性を失わせずに解凍した後、G418でのさらなる選択は省略した。
【０１０６】
１０％FBS（Sigma）、１％GlutaMAX（Sigma）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma）が補充されたHigh-Glucose DMEM（Sigma）内でS180細胞を培養した。１０％FBS（Sigma）、１％GlutaMAX（Sigma）、１％非必須アミノ酸（Life technologies）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma）が補充された、McCoy's 5A媒体で構成されるCM-Mc媒体内で、U2-OS細胞を培養した。
【０１０７】
イメージングの日に密集度が７０％に到達しているように、イメージングの前日、S180細胞を３５ｍｍプラスチックシャーレ内で培養した。細胞を１倍のPBS（Sigma）で二度洗浄し、ＣＯ２非依存細胞培地１ｍＬに浸し、イメージング媒体として用いた。細胞を、培地を数回ピペットで取ることで機械的に脱離させ、１０分間培養器内に載置した。細胞浮遊液の液滴を清浄なカバースリップ上に沈着させ、４５°マイクロミラー面を呈するシリコンマスクを押し付けて、ワニスでカバースリップに封止した。細胞を顕微鏡で直接撮像した。マイクロウェルを用いた実験では、細胞浮遊液の液滴をマイクロウェル内に沈着し、器具を培養器内に１０〜２０分間載置し、マイクロウェルを細胞で満たした。顕微鏡に載置する前に、マイクロウェルをイメージング媒体で一度洗浄し、２ｍＬの新たなイメージング媒体で満たした。
【０１０８】
イメージングの日、U2-OS細胞を−２０℃のメタノールで固定した。０．２倍のトリプシン溶液（Sigma diluted in PBS）により一旦細胞を脱離させ、培養器内で１０分間、完全培地で球形化させた。細胞を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄のためPBSに再懸濁させた。これを再度１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、−２０℃のメタノールに−２０℃で５分間再懸濁させた。細胞を２度PBSで洗浄し、先述のようにイメージングのためPBSに再懸濁させた。
【０１０９】
（画像取得及び超解像イメージング処理）
ｓｏＳＰＩＭ照明に適合する一般的な倒立顕微鏡（Nikon TiE）で画像を取得した。画像はＥＭＣＣＤカメラ（Evolve 512，Photometrics）でストリーミングモードで収集した。MetaMorph software（Molecular Devices）により取得を制御した。MetaMorph内のカスタムソフトウェアを用いて、光線操舵システムはｓｏＳＰＩＭセットアップの欄で説明したように同期されている。４０５ｎｍ光活性化レーザー及び５６１ｎｍ励起レーザーを用い、カスタムデュアルバンドキューブフィルタで対物レンズに向けさせた（Exc: ZET 405/488/561x triple band laser，Dichroique：ZT 405/488/561 rpc triple band laser，Em：ZET 488/561 double band laser tirf，Chroma）。WaveTracer Module（非特許文献２０）及びウェーブレットベースの解析法（非特許文献２１）を用いて、単分子局在及び超解像画像の再構築を行った。
【０１１０】
（実施例１）
この器具を用い、単一の対物レンズにより選択的平面照射を行って、種々の倍率（１０倍、２０倍、４０倍）でショウジョウバエの胚全体を撮像した（図７）。単一の光線の走査、又は水平面内へ操舵された静止したシート光により側方照明を行う。これは４５°反射によって、選択的平面照射による、ウェル内に配置された試料への水平面内照明となる。蛍光信号は、同じ対物レンズを通して収集される。照明光を正しく成形することで、この器具によって標準の顕微鏡をＳＰＩＭ顕微鏡へ転換することができる。特にレーザー光線の動的な焦点ぼかしを制御することが、レーザーシートを対物レンズの光軸に集光するために極めて重要である。その実例は図５に示されている。
【０１１１】
（実施例２）
第２例として、適切な大きさのウェルを用いて単一細胞ダブレットを３次元イメージングする方法を実証する（図８）。特別な光線操舵増設ユニット並びに使い捨てのカバースリップを用いたＳＰＩＭによって、単一の高開口対物レンズを用いて３次元光学的切断画像を生成する方法を実証する。光シートの直径は、細胞のサイズに応じて最も高い光学コントラストが得られるように設定した。
【０１１２】
対物レンズの後焦点面におけるビームサイズを調整することによって、光シートの軸方向励起を修正した（図５Ａ）。この研究では、マイクロミラーからの距離１０〜１００μｍ・６０倍・水浸・開口数１．２の対物レンズで、２３×３０×１．８μｍ（長さ×幅×厚さ）〜１３×３０×１．５μｍの範囲の光シートを用いた。光シートの厚さは、好ましくは単一細胞のＳＰＩＭで得られるものと同程度である（IML-SPIM、非特許文献８：１．８〜４μｍ；Bessel beam、非特許文献９：０．５〜１μｍ；iSPIM、非特許文献１１：１．２μｍ；RSLM、非特許文献１２：１μｍ）。単一細胞又は細胞ダブレットの画像を図８Ａ−８Ｂに示す。切断性能は、解像度及びイメージング速度の点において、スピニングディスク顕微鏡法と同等である。３つの異なるウェルでの３つの細胞の同時イメージングが可能であり、図９にその結果を示す。
【０１１３】
（実施例３）
細胞深くの超解像イメージングを行うための器具性能をさらに実証した（図８Ｃ−８Ｇ）。E-Cadhern-GFPで標識された生きたS180細胞ダブレット、及びFibrilarin-Dendra2安定発現U2-OS細胞を用いた。ＰＡＬＭ（非特許文献７，９）を用いて、カバースリップの３０μｍ上まで、３次元で一分子ベースの超解像顕微鏡法（single-molecule-based super-resolution microscopy）がｓｏＳＰＩＭで可能であることを実証した。このとき、複波長光シートにより、Fibrilarin-Dendra2フォトコンバーティブルタンパク質を４０５ｎｍの光で変換すると同時に５６１ｎｍの光で励起した。
【０１１４】
特定及び限定的な活性化を可能とする垂直照明並びに高開口対物レンズにより、高いＳＮ比で単分子を検出することができた。カバースリップより十ミクロン上での浮遊U2-OS細胞の核小体の超解像強度画像を、再構築できた。図８Ｃは、カバースリップより上の平面（７．２μｍ、及び８．６μｍ）で撮影されたものである。４０ｆｐｓで取得した８０×８０画素の８０００のフレームから抽出された、４４３３（２１３７）の単分子局在から、超解像画像を再構築した（図８Ｅ−８Ｆ）。これにより回折限界未満の、核より小さな構造が明らかになった。バックグラウンドより上の局在事象ごとの光子の中央値の測定値は１４１．３であり、これから導かれる理論的な横方向の解像度は３８．２ｎｍ（非特許文献１５）であった（図８Ｆ）。この解像度は、ＳＰＩＭ（非特許文献１９，７７）などの他の超解像法に匹敵するものであるが、カバースリップ近くでイメージングしたときの従来のＰＡＬＭよりも低いものである。これは主に、試料深部の３次元イメージングに起因する光学収差のためである。照明方法に本質的に起因するものではない。
【０１１５】
ＳＰＩＭ法は、対物レンズの焦点面において、励起及び光変換が軸方向で制限されるというのが大きな利点である。これにより、厚い試料を用いて低いバックグラウンドノイズで単一細胞のイメージングが可能となる。また、単対物レンズＳＰＩＭには、二つの対物レンズを試料の近くにもってくるという機械的な制約がない。これにより、高開口数のものを含め、任意の種類の対物レンズを備える標準の顕微鏡を用いることができる。ただし、この簡素化のため、試料とマイクロミラーの両方を対物レンズの視野内に持ってくる必要がある。１００倍の対物レンズを用いた我々の現在の設定では、４５°反射面から１０〜１００ミクロン離して配置された単一細胞のイメージングが可能である。細胞の位置を拘束する、マイクロミラーに並ぶアレイ状のウェルにより、この制限を弱めている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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