(57)【要約】本発明は、変異チオエステラーゼ、及び植物における、例えば酵素活性を増加させ且つ中鎖長脂肪酸（例えば、８〜１４炭素）の及び所望の比での生成の増加を促進するためのその使用に関する。さらに本明細書には、新規トリグリセリド油を製造し、続いてその油を化学修飾することによる、再生可能化学品の製造方法が開示される。Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２又はＣ１４の脂肪酸鎖長を含む油もまた開示され、これは、本明細書に記載される方法における供給原料として有用である。
2016508717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端触媒ドメインとＮ末端疎水性ドメイン及び特異性ドメインとを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする核酸分子であって、前記疎水性ドメイン及び／又は前記特異性ドメインの１つ以上が前記触媒ドメインにとって異種である核酸。
【請求項２】
ｉ）Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉ）Ｃ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉｉ）Ｃ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｖ）Ｃ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；又は
ｖ）Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン
を含む変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４５のアミノ酸残基１５２〜１９０；配列番号４６のアミノ酸残基１３９〜１７７；配列番号４７のアミノ酸残基１１７〜１５５；配列番号６０のアミノ酸残基１５８〜１９６；及び配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥのアミノ酸残基；
ｂ）アミノ酸配列
【化１０１】
2016508717.tif 000106
を含むモチーフ及び／又は
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４５のアミノ酸残基１５２〜１９０；配列番号４６のアミノ酸残基１３９〜１７７；配列番号４７のアミノ酸残基１１７〜１５５；配列番号６０のアミノ酸残基１５８〜１９６；及び配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性
を含む特異性ドメインをコードする、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
改変された脂肪酸プロファイルを有するトリグリセリドの生成を促進し、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化１０２】
2016508717.tif 000107
を含むモチーフ；及び／又は
ｂ）配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜２０３との少なくとも６０％の配列同一性（１６６位のアミノ酸残基がグルタミンであり；１７５位のアミノ酸残基がスレオニンであり；１７７位のアミノ酸残基がイソロイシンであり；１７９位のアミノ酸残基がロイシンであり；１８６位のアミノ酸残基がロイシンであり；１９０位のアミノ酸残基がリジンであり；１９８位のアミノ酸がイソロイシンであり、且つ２０３位のアミノ酸がリジンである）；及び／又は
ｃ）配列番号６１
を含む特異性ドメインをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
Ｃ１２：０脂肪酸の生成を促進し、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化１０３】
2016508717.tif 000108
を含むモチーフ；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性（１２７位のアミノ酸残基がロイシンであり、１３３位のアミノ酸残基がメチオニンであり、１３７位のアミノ酸残基がスレオニンであり、及び１６３位のアミノ酸残基がメチオニンである）；及び／又は
ｃ）配列番号４３
を含む特異性ドメインをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
Ｃ１４：０脂肪酸の生成を促進し、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化１０４】
2016508717.tif 000109
を含むモチーフ；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性（１２７位のアミノ酸残基がバリンであり、１３３位のアミノ酸残基がロイシンであり、１３７位のアミノ酸残基がアラニンであり、及び１６３位のアミノ酸残基がイソロイシンである）；及び／又は
ｃ）配列番号４４
を含む特異性ドメインをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
Ｃ８：０〜Ｃ：１０脂肪酸の生成を促進し、増加させ及び／又は優先し、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化１０５】
2016508717.tif 000110
を含むモチーフ；
ｂ）アミノ酸残基１５６〜１９３配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性（１６３位のアミノ酸残基がチロシンであり、及び／又は１８６位のアミノ酸残基がプロリンである）；
ｃ）アミノ酸残基１５６〜１９３配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性（１６３位のアミノ酸残基がチロシンであり、及び１８６位のアミノ酸残基がプロリンである）；及び／又は
ｄ）配列番号８４
を含む特異性ドメインをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
配列番号４３のアミノ酸残基９１〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基９１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を含む特異性ドメインであって、且つ９１位のアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位のアミノ酸がプロリンであり、及びアミノ酸１０２位がプロリンである特異性ドメインをコードする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
配列番号４３のアミノ酸残基９１〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基９１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を含む特異性ドメインであって、且つ９１位のアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位のアミノ酸がプロリンであり、アミノ酸１０２位がプロリンであり、１２７位のアミノ酸残基がバリンであり、１３３位のアミノ酸残基がロイシンであり、１３７位のアミノ酸残基がアラニンであり、及び１６３位のアミノ酸残基がイソロイシンである特異性ドメインをコードする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号４３のアミノ酸残基９１〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基９１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を含む特異性ドメインであって、且つ９１位のアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位のアミノ酸がプロリンであり、アミノ酸１０２位がプロリンであり、１２７位のアミノ酸残基がロイシンであり、１３３位のアミノ酸残基がメチオニンであり、１３７位のアミノ酸残基がスレオニンであり、及び１６３位のアミノ酸残基がメチオニンである特異性ドメインをコードする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；及び配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥのアミノ酸残基；
ｂ）アミノ酸配列
【化１０６】
2016508717.tif 000111
を含むモチーフ；
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；及び配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性；及び／又は
ｄ）配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；又は配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６
を含む疎水性ドメインをコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
Ｎ末端ロイシン残基を含む疎水性ドメインをコードする、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
プラスチドトランジットペプチドをコードするＮ末端配列をさらにコードする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１４】
前記プラスチドトランジットペプチドが、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）タンパク質由来のトランジットペプチド部分配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記プラスチドトランジットペプチドが、
【化１０７】
2016508717.tif 000112
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３又は１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記疎水性ドメインに対してＮ末端側に位置するリンカードメインをさらにコードする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１７】
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択される残基に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から伸長する少なくとも５アミノ酸残基；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を含むアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から伸長する少なくとも５アミノ酸残基；
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択されるアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から伸長する少なくとも５アミノ酸残基；及び／又は
ｄ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含むリンカードメインをコードする、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥが、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５；配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０、配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号４９、配列番号５１；配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
藻類宿主細胞における発現を向上させるコドンバイアスを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸を含む発現カセット。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸及び／又は請求項２０に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸によりコードされる変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸、請求項２０に記載の発現カセット、請求項２１に記載のベクター、及び／又は請求項２２に記載の変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥを含む宿主細胞。
【請求項２４】
油産生細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
植物細胞、藻類細胞及び微細藻類細胞から選択される、請求項２３又は２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記藻類細胞がプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の藻類細胞であるか、又は配列番号６２〜７０の１つ以上と少なくとも７０％の核酸配列同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細胞である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記藻類細胞が、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プロトテカ・クルガニ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）及びプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）からなる群から選択される、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する活性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
非形質転換宿主細胞又は野生型アシル−ＡＣＰ  ＴＥで形質転換した宿主細胞と比較して少なくとも１％上昇したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０又はＣ１４：０脂肪酸を有する油を生成する、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ８：０脂肪酸を含む油を生成する、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ１０：０脂肪酸を含む油を生成する、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上であるＣ８：０／Ｃ１０：０比を含む油を生成する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸、請求項２０に記載の発現カセット、請求項２１に記載のベクター、及び／又は請求項２２に記載の変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥを含む植物、藻類又は微細藻類。
【請求項３４】
プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の藻類である、請求項３３に記載の藻類。
【請求項３５】
プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プロトテカ・クルガニ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）及びプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）からなる群から選択される、請求項３３又は３４に記載の藻類。
【請求項３６】
、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の植物、藻類若しくは微細藻類によって生成される油生成物、又は前記油から生成される化学品、材料、若しくは食品。
【請求項３７】
所望の脂肪酸プロファイルを有する油を生成する植物、藻類又は微細藻類を作製する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸配列で前記植物、藻類又は微細藻類を形質転換するステップと、前記油を生成させるため前記植物、藻類又は微細藻類を培養するステップとを含む方法。
【請求項３８】
前記植物、藻類又は微細藻類が、非形質転換植物、藻類若しくは微細藻類又は野生型アシル−ＡＣＰ  ＴＥで形質転換した植物、藻類若しくは微細藻類と比較して少なくとも１％上昇したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０又はＣ１４：０脂肪酸を生成する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物、藻類又は微細藻類が、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ８：０脂肪酸を含む油を生成する、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物、藻類又は微細藻類が、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ１０：０脂肪酸を含む油を生成する、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物、藻類又は微細藻類が、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上であるＣ８：０／Ｃ１０：０比を含む油を生成する、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
油の生成方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子で前記植物、藻類又は微細藻類を形質転換するステップと、脂肪酸を生成させるため前記変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥを発現させるステップと、前記脂肪酸を含む前記植物、藻類又は微細藻類によって生成された前記油を回収するステップとを含む方法。
【請求項４３】
油の生成方法であって、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の植物、藻類又は微細藻類を培養するステップと、脂肪酸を生成させるため前記変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥを発現させるステップと、前記脂肪酸を含む前記植物、藻類又は微細藻類によって生成された前記油を回収するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき２０１３年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，２２３号明細書の利益を主張するものであって、且つ２０１３年３月１２日に出願された米国特許出願第１３／７９７，７３３号明細書の一部継続出願であり、これらの出願は両方ともに、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及び油生成細胞における、例えば、特定のアシル−ＡＣＰ基質に対する酵素活性を増加させ、且つ所望の脂肪酸プロファイルを有する油の生成増加を促進するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、脂肪及び脂肪酸は主として植物源及び動物源に由来し、粉ミルク及び栄養補助食品に使用される微生物発酵によるオメガ３脂肪酸の商業生産は顕著な例外である。しかしながら、組換え微細藻類を使用した調整油の商業生産に向けて進展がなされつつある。国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／２３６９６号明細書を参照のこと。
油産生生物において所望の脂肪酸プロファイルを生じさせる一つの方法は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼトランス遺伝子；例えば、所望の脂肪酸を生成する植物由来のトランス遺伝子を導入することである。
アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）は、脂肪酸生合成を終了させることによって脂肪酸最終産物の長さ及びアイデンティティを機能的に決定する（Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４０３：２５−３４）。アミノ酸配列アラインメントに基づけば、植物ＴＥは２つのファミリー、即ち、１８：１−ＡＣＰに対する顕著な優先性を示すが１８：０−及び１６：０−ＡＣＰに対する活性は僅かであるＦａｔＡと；８〜１６炭素の間の種々の鎖長を有する飽和アシル−ＡＣＰを主として加水分解するＦａｔＢとに分かれることが示されている（Ｖｏｅｌｋｅｒ，Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｓｅｔｌｏｗ  ＪＫ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；１９９６：１１１−１３３；Ｇｉｎａｌｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００３）３１：３２９１−３２９２；及びＪｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：３５９−３７１）。ＦａｔＢ  ＴＥは、保存された疎水性１８アミノ酸ドメイン（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｙｕａｎ（１９９８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １００：１６７−１７２）と、Ｃ末端触媒ドメインにおける保存されたＡｓｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ触媒三残基と（Ｂｌａｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２）７（９）：ｅ４２９４９．ｄｏｉ：１０．１３７１及びＭａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７：１−１１）を有する。Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７：１−１１は、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ触媒三残基を包含するＣ末端ホットドッグフォールドによって特徴付けられるＣ末端の保存されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ触媒ドメインを同定している。この保存されたアシル−ＡＣＰ  ＴＥ触媒ドメインは十分に特徴付けられており、保存ドメイン受託番号ｐｆａｍ０１６４３が割り当てられている。ホットドッグフォールドもまた十分に特徴付けられて保存ドメイン受託番号ｃｄ０３４４０が割り当てられており、保存ドメイン受託番号ｃｌ００５０９が割り当てられるホットドッグスーパーファミリーの一部である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５１１４９号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０６０３２号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１５０４１０号
【特許文献４】国際公開第２０１１／１５０４１１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４０３：２５−３４
【非特許文献２】Ｖｏｅｌｋｅｒ，Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｓｅｔｌｏｗ  ＪＫ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；１９９６：１１１−１３３
【非特許文献３】Ｇｉｎａｌｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００３）３１：３２９１−３２９２
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：３５９−３７１
【非特許文献５】Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｙｕａｎ（１９９８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １００：１６７−１７２
【非特許文献６】Ｂｌａｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２）７（９）：ｅ４２９４９．ｄｏｉ：１０．１３７１
【非特許文献７】Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７：１−１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、Ｃ末端触媒ドメインとＮ末端疎水性ドメイン及び特異性ドメインとを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする核酸分子であって、疎水性ドメイン及び／又は特異性ドメインの１つ以上が触媒ドメインにとって異種である核酸分子が提供される。概して、５’から３’方向に読んで、Ｎ末端疎水性ドメイン、特異性ドメイン及び触媒ドメインは作動可能に連結されている。様々な実施形態において、ドメインの１つ以上が互いに隣接していてもよい。
【０００７】
一部の実施形態では、核酸分子は、
ｉ）Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉ）Ｃ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉｉ）Ｃ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｖ）Ｃ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｖ）Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；及び／又は
ｖｉ）Ｃ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン
を含む変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）をコードする。
【０００８】
一部の実施形態では、核酸は、
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４５のアミノ酸残基１５２〜１９０；配列番号４６のアミノ酸残基１３９〜１７７；配列番号４７のアミノ酸残基１１７〜１５５；配列番号６０のアミノ酸残基１５８〜１９６；及び配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥのアミノ酸残基；
ｂ）アミノ酸配列
【化１】
2016508717.tif 000003
を含むモチーフ；及び／又は
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４５のアミノ酸残基１５２〜１９０；配列番号４６のアミノ酸残基１３９〜１７７；配列番号４７のアミノ酸残基１１７〜１５５；配列番号６０のアミノ酸残基１５８〜１９６；及び配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性
を含む特異性ドメインをコードする。
【０００９】
一部の実施形態では、核酸は、改変された脂肪酸プロファイルを有するトリグリセリドの生成を促進し、増加させ及び／又は優先する特異性ドメインであって、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化２】
2016508717.tif 000004
を含むモチーフ；
ｂ）配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜２０３との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性（ここでは１６６位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がグルタミンであり；１７５位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がスレオニンであり；１７７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がイソロイシンであり；１７９位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり；１８６位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり；１９０位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がリジンであり；１９８位にある又はそれに対応するアミノ酸がイソロイシンであり及び２０３位にある又はそれに対応するアミノ酸がリジンである）；及び／又は
ｃ）配列番号６１
を含む特異性ドメインをコードする。
【００１０】
一部の実施形態では、核酸は、Ｃ１２：０脂肪酸の生成を促進し、増加させ及び／又は優先する特異性ドメインであって、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化３】
2016508717.tif 000005
を含むモチーフ；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性（ここでは１２７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり、１３３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がメチオニンであり、１３７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がスレオニンであり、及び１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がメチオニンである）；及び／又は
ｃ）配列番号４３
を含む特異性ドメインをコードする。
【００１１】
一部の実施形態では、核酸は、Ｃ１４：０脂肪酸の生成を促進し、増加させ及び／又は優先する特異性ドメインであって、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化４】
2016508717.tif 000006
を含むモチーフ；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性（ここでは１２７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がバリンであり、１３３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり、１３７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、及び１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がイソロイシンである）；及び／又は
ｃ）配列番号４４
を含む特異性ドメインをコードする。
【００１２】
一部の実施形態では、核酸は、Ｃ８：０〜Ｃ：１０脂肪酸の生成を促進し、増加させ及び／又は優先する特異性ドメインであって、且つ
ａ）アミノ酸配列
【化５】
2016508717.tif 000007
を含むモチーフ；
ｂ）アミノ酸残基１５６〜１９３配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性（ここでは１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がチロシンであり、又は１８６位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がプロリンである）；及び／又は
ｃ）配列番号８４
を含む特異性ドメインをコードする。
【００１３】
一部の実施形態では、核酸は、配列番号４３のアミノ酸残基９１〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基９１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメインをコードし、ここでは９１位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位にある又はそれに対応するアミノ酸がプロリンであり、及びアミノ酸１０２位がプロリンである。
【００１４】
一部の実施形態では、核酸は、配列番号４３のアミノ酸残基９１〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基９１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメインをコードし、ここでは９１位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位にある又はそれに対応するアミノ酸がプロリンであり、アミノ酸１０２位がプロリンであり、１２７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がバリンであり、１３３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり、１３７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、及び１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がイソロイシンである。
【００１５】
一部の実施形態では、核酸は、配列番号４３のアミノ酸残基９１〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基９１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメインをコードし、ここでは９１位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位にある又はそれに対応するアミノ酸がプロリンであり、アミノ酸１０２位がプロリンであり、１２７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり、１３３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がメチオニンであり、１３７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がスレオニンであり、及び１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がメチオニンである。
【００１６】
一部の実施形態では、核酸は、以下を含む疎水性ドメインをコードする：
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；及び配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥのアミノ酸残基；
ｂ）アミノ酸配列
【化６】
2016508717.tif 000008
を含むモチーフ；
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；及び配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性；及び／又は
ｄ）配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；及び／又は配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６。一部の実施形態では、核酸は、Ｎ末端ロイシン残基を含む疎水性ドメインをコードする。
【００１７】
一部の実施形態では、核酸は、プラスチドトランジットペプチドをコードするＮ末端配列をさらにコードする。一部の実施形態では、プラスチドトランジットペプチドは、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）タンパク質由来のトランジットペプチド部分配列を含む。一部の実施形態では、プラスチドトランジットペプチドは、
【化７】
2016508717.tif 000009
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、プラスチドトランジットペプチドは、
【化８】
2016508717.tif 000010
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、核酸は、疎水性ドメインに対してＮ末端側に位置するリンカードメインをさらにコードする。
【００１９】
一部の実施形態では、核酸は、以下を含むリンカードメインをコードする：
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択される残基に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から伸長する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０残基；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含むアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から伸長する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０残基；
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択されるアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から伸長する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０残基；及び／又は
ｄ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列。
【００２０】
一部の実施形態では、核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５；配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０、配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号４９、配列番号５１；配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥをコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５；配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０、配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号４９、配列番号５１；配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥをコードする。
【００２１】
様々な実施形態において、核酸配列は、藻類宿主細胞における発現を向上させるコドンバイアスを含む。
【００２２】
さらなる態様において、上記及び本明細書に記載するとおりの核酸を含む発現カセットが提供される。
【００２３】
別の態様において、上記及び本明細書に記載するとおりの核酸（例えば、ポリヌクレオチド）及び／又は発現カセットを含むベクターが提供される。
【００２４】
別の態様において、上記及び本明細書に記載するとおりの核酸によりコードされる変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）が提供される。
【００２５】
さらなる態様において、上記及び本明細書に記載するとおりの核酸、発現カセット、及び／又は変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥを含む宿主細胞が提供される。様々な実施形態において、宿主細胞は油産生細胞（例えば、植物細胞、藻類細胞、微細藻類細胞）である。一部の実施形態では、藻類細胞はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の細胞であり、又は配列番号６２〜７０の１つ以上と少なくとも７０％の核酸配列同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細胞である。一部の実施形態では、藻類細胞は、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プロトテカ・クルガニ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）及びプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する活性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、宿主細胞は、非形質転換宿主細胞又は野生型アシル−ＡＣＰ  ＴＥで形質転換した宿主細胞と比較して少なくとも１％上昇したレベル、例えば、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５〜８５％、７０〜９０％、９０〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、又は５００％超上昇したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０又はＣ１４：０脂肪酸を有する油を生成する。
【００２６】
さらなる態様において、上記及び本明細書に記載するとおりの核酸、発現カセット、ベクター、及び／又は変異アシル−ＡＣＰ−ＴＥを含む油産生細胞又は生物（例えば、植物、藻類、微細藻類）が提供される。一部の実施形態では、藻類はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の藻類である。一部の実施形態では、藻類は、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プロトテカ・クルガニ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）及びプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）からなる群から選択される。別の態様において、植物、藻類又は微細藻類によって生成される油生成物、又は当該の油から作製される化学品、材料、又は食品が提供される。
【００２７】
別の態様において、所望の脂肪酸プロファイルを有する油を生成する植物、藻類又は微細藻類を作製する方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、植物、藻類又は微細藻類を上記及び本明細書に記載するとおりの核酸配列で形質転換するステップと、油を生成させるため、その植物、藻類又は微細藻類を培養するステップとを含む。一部の実施形態では、植物、藻類又は微細藻類は、非形質転換植物、藻類若しくは微細藻類又は野生型アシル−ＡＣＰ  ＴＥで形質転換した植物、藻類若しくは微細藻類と比較して少なくとも約１％上昇したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０及び／又はＣ１４：０脂肪酸、例えば、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５〜８５％、７０〜９０％、９０〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、又は５００％超上昇したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０及び／又はＣ１４：０脂肪酸を生成する。
【００２８】
別の態様において、油の生成方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、植物、藻類又は微細藻類を、上記及び本明細書に記載するとおりの変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥをコードする核酸分子で形質転換するステップと、脂肪酸を生成させるため変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥを発現させるステップと、脂肪酸を含む植物、藻類又は微細藻類によって生成された油を回収するステップとを含む。
【００２９】
別の態様において、油の生成方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、上記及び本明細書に記載するとおりの変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥをコードする核酸分子を含む植物、藻類又は微細藻類を培養するステップと、脂肪酸を生成させるため変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥを発現させるステップと、脂肪酸を含む植物、藻類又は微細藻類によって生成された油を回収するステップとを含む。
【００３０】
定義
「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」又は「アシル−ＡＣＰ  ＴＥ」は、同義的に、脂質合成中にアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）からの脂肪酸の切断を触媒する酵素を指す。アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）がアシル−ＡＣＰチオエステル結合を加水分解すると、遊離脂肪酸及びＡＣＰが放出される。ＴＥは、脂肪酸生合成を終了させることにより、脂肪酸最終産物の長さ及びアイデンティティを機能的に決定する。Ｓａｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ（２００２）４０３：２５−３４を参照のこと。
【００３１】
用語「触媒ドメイン」は、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ触媒三残基を含むアシル−ＡＣＰ  ＴＥのＣ末端部分であって、脂肪酸上のアシル基の加水分解反応を触媒するものを指す。アシル−ＡＣＰ  ＴＥ触媒ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば、Ｂｌａｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２）７（９）：ｅ４２９４９及びＭａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７：１−１１に記載されている。
【００３２】
用語「疎水性ドメイン」は、アシル−ＡＣＰ  ＴＥ中の保存された疎水性１８アミノ酸ドメイン又はその部分配列を指す。疎水性ドメインは当該技術分野で記載がなされており、ＦａｔＢアシル−ＡＣＰ  ＴＥをプラスチド膜に係留すると考えられている。例えば、Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｙｕａｎ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ（１９９８）１００：１６７−１７２；Ｂｌａｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２）７（９）：ｅ４２９４９；及びＭａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７：１−１１を参照のこと。
【００３３】
用語「リンカードメイン」は、疎水性ドメインに対してＮ末端側に位置するアシル−ＡＣＰ  ＴＥのアミノ酸部分配列を指し、疎水性ドメインをトランジットペプチドに結合させることができる。野生型ＦａｔＢアシル−ＡＣＰ  ＴＥはリンカードメインを含む。
【００３４】
アシル−ＡＣＰ  ＴＥのＮ末端及びＮ末端ドメイン（例えば、トランジットペプチド、リンカードメイン、疎水性ドメイン、特異性ドメイン）に関連して用語「異種」は、アシル−ＡＣＰ  ＴＥ  Ｃ末端及び／又は触媒ドメインをコードする天然に存在する遺伝子によってはコードされないアミノ酸部分配列を指す。アシル−ＡＣＰ  ＴＥのＣ末端領域及び／又は触媒ドメインに関して、アシル−ＡＣＰ  ＴＥの異種Ｎ末端領域は、アシル−ＡＣＰ  ＴＥ  Ｃ末端及び／又はＣ末端触媒ドメインをコードする天然に存在する遺伝子によってはコードされないＮ末端領域でアシル−ＡＣＰ  ＴＥのＮ末端領域を交換又は改変することにより生じ得る。これは、例えば、改変された及び／又は天然に存在しないドメインとの個々のドメインのスワッピング、点突然変異の導入、改変された又は天然に存在しない部分配列の導入、又は単一アミノ酸残基、部分配列及び／又はドメインの欠失を含めた当該技術分野において公知の任意の方法で達成することができる。
【００３５】
用語「アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ」は、ＴＥの脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質特異性を指す。アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥは、アシル−ＡＣＰ基質から特定の脂肪酸を優先的に遊離させる。例えば、アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥは、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、及びＣ１８：２脂肪酸の集合中のある所与の脂肪酸を、他の全ての脂肪酸と比べて優先的に遊離させることができる。アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥの優先性は、他の優先されない脂肪酸−ＡＣＰ基質と比較して高いＶｍａｘ（高いｋｃａｔ、又は高いＶ／Ｋ）として検出することができる。精製タンパク質を使用する動態学的アッセイがない場合、優先性は、アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥを過剰発現するように遺伝子操作された細胞の脂肪酸プロファイルの、アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥを過剰発現しない対照細胞と比べた変化から推測することができる。
【００３６】
任意の所与のポリマー成分（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、総称的に「残基」とも称される）の位置が、その所与のポリマーにおける成分の実際の数値的位置ではなく、ある選択されたアミノ酸又は核酸ポリマーの同じ位置又は等価な位置を（例えば、最適アラインメント又はコンセンサス配列に基づき）参照して指示されるとき、所与のアミノ酸ポリマー又は核酸ポリマーの付番は、その選択されたアミノ酸ポリマー又は核酸ポリマーの付番「に対応する」か又はそれ「と比べた」ものである。
【００３７】
「変異体」は、親ポリペプチド配列と１つ以上のアミノ酸位置が（例えば、置換、欠失、又は挿入により）異なる配列を含むポリペプチドである。変異体は、親ポリペプチド配列の総残基数の最大４０％、例えば親ポリペプチド配列の総残基数の最大４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％  ２％又は１％が親ポリペプチド配列と異なる配列を含み得る。例えば、４００アミノ酸ポリペプチド配列の変異体は、親ポリペプチド配列の総残基数の最大４０％、即ち４００アミノ酸ポリペプチド配列内の最大１６０箇所のアミノ酸位置（参照配列（例えば、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５；配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０、配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号４９、配列番号５１；配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７及び配列番号５９）内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、又は１６０箇所のアミノ酸位置などが異なる配列を含む。
【００３８】
「天然に存在する」は、組成物に適用されるとき、人によって人為的に作り出されるのとは別様に自然中に見出され得ることである。例えば、自然中の供給源から単離することができ、且つ人によって実験室で意図的に修飾されていない、生物（ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物又は哺乳類組織を含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドは、天然に存在する。「天然に存在しない」（「合成の」又は「人工の」とも称される）は、物体に適用されるとき、その物体が天然に存在しない−即ち、その物体を、人によって人為的に作り出されるのとは別様に自然中に見出すことができないことを意味する。
【００３９】
「天然油」又は「天然脂肪」は、生物から得られる大部分がトリグリセリドの油を指し、この油は、トリグリセリドの脂肪酸プロファイルを実質的に変化させるための、別の天然油又は合成油とのブレンド、又は分画、又は他のプロセスを受けていない。特定の位置特異性のトリグリセリドを含む油に関連して、天然油又は天然脂肪は、当該の位置特異的トリグリセリドプロファイルを得るためにエステル交換又は他の合成プロセスに供されておらず、むしろ位置特異性は細胞又は細胞集団によって自然に生じる。天然油又は天然脂肪に関連して、及び概して本開示全体を通して使用されるとき、油及び脂肪という用語は、特に注記される場合を除き同義的に使用される。従って、「油」又は「脂肪」は、物質の構成及び他の条件に応じて室温で液体、固体、又は部分的に固体であり得る。ここで、用語「分画」は、如何に達成されるにしろ、その生物により生成されるプロファイルと比べて油の脂肪酸プロファイルを変化させる形で油から材料を取り出すことを意味する。天然油は、生物から得られるかかる油を包含し、ここで油は、精製、漂白及び／又は脱ガムを含めた、そのトリグリセリドプロファイルを実質的に変化させることのない最小限の処理を受けている。天然油はまた「非エステル交換天然油」であってもよく、これは、脂肪酸においてグリセロールに対するアシル結合が再分布するプロセスを天然油が受けておらず、生物から回収されたときと本質的に同じ配置のままであることを意味する。
【００４０】
「脂肪酸プロファイル」は、細胞中又は細胞に由来する油中の脂肪酸の、鎖長及び／又は飽和パターンに関する分布を指す。これに関連して飽和パターンは、飽和酸と不飽和酸との比較測定、又は細胞、詳細には細胞トリグリセリドの様々な脂肪酸における二重結合の位置の分布のより詳細な分析を含み得る。細胞又は油トリグリセリドの脂肪酸プロファイルにおける「脂肪酸」は、その細胞又は油トリグリセリドの脂肪酸アシル基を指す。
【００４１】
油に関連して、「プロファイル」は、油中の特定の種又はトリグリセリド又は脂肪酸アシル基の分布である。「脂肪酸プロファイル」は、油のトリグリセリド中の脂肪酸アシル基の分布であって、グリセロール骨格との結合は考慮しない。「ｓｎ−２プロファイル」は、油中のトリアシルグリセリドのｓｎ−２位に見られる脂肪酸の分布である。「位置特異的プロファイル」は、グリセロール骨格とのアシル基結合の位置を考慮し、立体特異性は考慮しないトリグリセリドの分布である。換言すれば、位置特異的プロファイルは、ｓｎ−１／３と、対するｓｎ−２とにおけるアシル基結合を表す。従って、位置特異的プロファイルでは、ＰＯＳとＳＯＰとが同じものとして取り扱われる。「立体特異的プロファイル」は、ｓｎ−１、ｓｎ−２及びｓｎ−３におけるアシル基の結合を表す。特に指示されない限り、ＳＯＰ及びＰＯＳなどのトリグリセリドは等価と見なされる。「ＴＡＧプロファイル」は、グリセロール骨格との結合を考慮した、しかしそれらの結合の位置特異的性質は考慮しない、トリグリセリドに見られる脂肪酸の分布を指す。従って、ＴＡＧプロファイルでは、油中のＳＳＯ率はＳＳＯとＳＯＳとの合計であり、一方、位置特異的プロファイルでは、ＳＳＯ率は油中のＳＯＳ種を含めずに計算される。
【００４２】
「微細藻類」は、葉緑体又はプラスチドを含有し且つ場合により光合成を行う能力を有する微生物生命体、又は光合成を行う能力を有する原核微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光独立栄養生物、並びに固定炭素源のみで生きることのできる従属栄養生物が含まれる。微細藻類には、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）などの、細胞分裂直後に姉妹細胞から分離する単細胞生物、並びに、例えばボルボックス属（Ｖｏｌｖｏｘ）などの、２つの別個の細胞型の単純な多細胞光合成微生物である微生物が含まれる。微細藻類には、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、及びプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）などの細胞が含まれる。微細藻類にはまた、アグメネルム属（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、及びピロボトリス属（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの、細胞間接着を呈する他の微生物光合成生物も含まれる。微細藻類にはまた、ある種の渦鞭毛藻類種及びプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種など、光合成を行う能力を失った偏性従属栄養微生物も含まれる。
【００４３】
「油産生」細胞は、天然に、又は組換えによる若しくは古典的な株改良により、乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％の脂質を生成する能力を有する非ヒト細胞である。「油産生微生物（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｂｅ）」又は「油産生微生物（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、油産生性の微生物、例えば微細藻である。
【００４４】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関連して用いられるとき、用語「単離された」は、典型的にそのポリペプチド又はポリヌクレオチドと共に存在する少なくとも１つの他の構成要素から分離されているポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。従って、天然に存在するポリペプチドは、それが精製されて、天然でそのポリペプチド又はポリヌクレオチドと共に存在する少なくとも１つの他の構成要素から離れている場合、単離されている。組換えポリペプチド又はポリヌクレオチドは、それが精製されて、そのポリペプチド又はポリヌクレオチドが産生されるときに存在する少なくとも１つの他の構成要素から離れている場合、単離されている。
【００４５】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書ではアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用され、特に限定されない限り、天然に存在するアミノ酸と同じように機能することができる異型アミノ酸を含む。
【００４６】
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、特に具体的に指示しない限り、天然に存在するＬ−アミノ酸又は残基を含む。本明細書では、一般的に用いられるアミノ酸の一文字及び三文字略号を使用する（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７１−９２，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．）。用語「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」は、Ｄ−アミノ酸並びに化学修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似体、通常はタンパク質に組み込まれない天然に存在するアミノ酸、及びアミノ酸の特徴的な特性を有する化学合成化合物（まとめて「異型」アミノ酸）を含む。例えば、ペプチド化合物の立体配置上の制約を天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じにすることが可能なフェニルアラニン又はプロリンの類似体又は模倣体は、「アミノ酸」の定義の範囲内に含まれる。
【００４７】
例示的異型アミノ酸としては、例えば、国際公開第９０／０１９４０号パンフレットに記載されるもの、並びにＧｌｕ及びＡｓｐに代えて置換されてもよい２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐに代えて、２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸に代えて、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸に代えて、２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙに代えて、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅに代えて、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓに代えて、ホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓに代えて、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａに代えてＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ及びＧｌｎに代えて、Ｎ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓに代えて、ヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓに代えて、アロヒドロキシルリジン（Ａｈｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒに代えて、３−（及び４−）ヒドキシプロリン（ｈｙｄｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌに代えて、アロイソロイシン（Ａｉｌｅ）；Ａｌａに代えて、アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａに代えて、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；Ｉｌｅに代えて、Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸に代えて、ノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸に代えて、ノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓに代えて、オルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎに代えてシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｐｈｅに代えて、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、及びトリフルオリルフェニルアラニンが挙げられる。
【００４８】
用語「配列」は、ポリペプチド又は核酸ポリマーに関連して使用されるとき、当該の配列を有するポリマー又はサブポリマー若しくは断片を構成する単量体の順序を指す。
【００４９】
アミノ酸又はヌクレオチド配列の「部分配列」は、より大きい配列の一部分であるか、又はそのより大きい配列の一部分によって特徴付けられるペプチド又は核酸サブポリマー又は断片である。
【００５０】
用語「同一」又は「パーセント同一性」は、２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの一つを用いて又は目視検査により測定して最大限一致するように比較し及びアラインメントしたとき、同じであるか又は特定の割合の同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【００５１】
パーセントヌクレオチド又はアミノ酸同一性を決定するための配列比較には、典型的には１つの配列が参照配列として働き、それと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムの使用に際しては、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する１つ又は複数の試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメータに設定したＢＬＡＳＴを使用して行うことができる。
【００５２】
ポリペプチドに関連して使用されるとき、用語「野生型」は、その分子の供給源に関わらず、天然に存在する生物のポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指す；即ち、用語「野生型」は、その分子が天然の供給源から精製されるか；組換えによって発現し、続いて精製されるか；又は合成されるかに関わらず、配列特徴を指す。
【００５３】
用語「突然変異」は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを改変することにより（その改変が如何に達成されるにしろ）生じるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド配列又は部分配列の変化を意味するものとする。例えば、突然変異は、無作為に、ＰＣＲ突然変異により、遺伝子全体の合成により、又は任意の他の方法で生じさせることができる。
【００５４】
用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書では、機能的に等価なアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを指して用いられる。機能的に等価なアミノ酸は、概してそれが置き換えるアミノ酸とサイズ及び／又は性質（例えば、電荷又は疎水性）が類似している。同様の性質のアミノ酸は、以下のとおりまとめることができる：
（１）疎水性：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ；
（２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）極性：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（４）酸性／負電荷：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（５）電荷：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ；
（６）塩基性／正電荷：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ；
（７）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（９）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【００５５】
以下の表は、例示的な及び好ましい保存的アミノ酸置換を示す。
【００５６】
【表１】
2016508717.tif 000011
【００５７】
用語「ベクター」は、本明細書では、ポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトを表して使用される。かかるベクターは、宿主細胞において安定的に又は一過性に増殖し得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、又は単に潜在能力を有するゲノムインサートであり得る。好適な宿主に導入されると、ベクターは複製し、宿主ゲノムと独立して機能し得るか、又は場合によっては宿主ゲノムに組み込まれる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」は、組換えにより又は合成的に生じさせた、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸断片の一部であってもよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された転写される核酸を含む。
【００５９】
「外来遺伝子」は、細胞に形質転換される核酸を指す。外来遺伝子は、形質転換される細胞と比べて異なる種由来（従って異種）であってもよく、又は同じ種由来（従って同種）であってもよい。同種遺伝子の場合、それは、遺伝子の内在性コピーと比べて細胞のゲノム中の異なる位置を占有する。外来遺伝子は、細胞において２つ以上のコピーで存在し得る。外来遺伝子はゲノムへの挿入として、又はエピソーム分子として細胞中に維持され得る。
【００６０】
「外因的に提供された」は、細胞培養物の培養培地に提供される分子を表す。
【００６１】
「誘導性プロモーター」は、作動可能に連結された遺伝子の転写を特定の刺激に応答して媒介するものである。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、語句「作動可能な連結状態にある」は、２つの配列、即ち制御配列（典型的にはプロモーター）と連結配列との間の機能的連結を指す。プロモーターは、それが遺伝子の転写を媒介する場合に、外来遺伝子と作動可能な連結状態にある。
【００６３】
「プロモーター」は、核酸の転写を指図する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用されるとき、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡエレメントの場合のように、転写開始部位近傍にある必要不可欠な核酸配列を含む。プロモーターにはまた、場合により遠位のエンハンサー又はリプレッサーエレメントも含まれ、これらは転写開始部位から数千塩基対も離れたところに位置し得る。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え」は、例えば細胞、又は核酸、タンパク質、若しくはベクターに関連して使用されるとき、その細胞、核酸、タンパク質又はベクターが外来核酸若しくはタンパク質の導入又は天然核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されていること、又はその細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞中には見られない遺伝子を発現するか、又は本来異常発現、過剰発現、過小発現するか若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。「組換え核酸」は、本明細書で使用されるとき、初めに実験室的方法を使用して合成され、それにより通常天然に見出されない核酸配列が生じる核酸分子を指す。実験室的方法を使用することにより、異なる配列（例えば、プロモーター、ターゲティング配列等）と作動可能な連結状態にある組換え核酸分子が実現される。従って、単離核酸（線状形態）、又は通常はつながっていないＤＮＡ分子をライゲートすることによりインビトロで形成される発現ベクターは、本発明の目的上いずれも組換えと見なされる。組換え核酸が作製され、宿主細胞又は生物に再び導入されると、組換え核酸は非組換え的に、即ちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製し得ることが理解される；しかしながら、かかる核酸は、組換え産生されると、続いて非組換え的に複製するにも関わらず、なおも本発明の目的上組換えと見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、即ち上述したとおりの組換え核酸の発現を経て作製されるタンパク質である。
【００６５】
「トランジットペプチド」は、シグナル配列に融合したポリペプチドの輸送を指図するアミノ酸配列である。ポリペプチドを発現するプラスチド細胞に関連して、トランジットペプチドはプラスチドへのポリペプチドの輸送を指図し得る。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、ゲノムＤＮＡ；ｍＲＮＡのＤＮＡ表現であり、通常メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅によって得られる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成的に又は増幅によって産生されるＤＮＡ分子；及びｍＲＮＡを含め、任意の形態のＤＮＡ又はＲＮＡを指す。用語「ポリヌクレオチド」は、二本鎖核酸分子、並びに一本鎖分子を包含する。二本鎖ポリヌクレオチドでは、ポリヌクレオチド鎖は同延である必要はない（即ち、二本鎖ポリヌクレオチドが両鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない）。
【００６７】
用語「宿主細胞」は、ベクターを一過性に、或いは安定的に維持する能力を有する細胞を指す。宿主細胞としては、限定なしに、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻類細胞（例えば、微細藻類細胞）、植物細胞及び哺乳類細胞が挙げられる。当該技術分野において公知の、又は公知になる他の宿主細胞もまた、本発明での使用に好適である。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「相補的」は、２つのヌクレオチド間の正確な対合能力を指す。例えば、核酸分子の所与の位置にあるヌクレオチドが別の核酸分子のヌクレオチドとのハイブリダイズ能を有する場合、それらの２つの核酸分子は当該の位置で互いに相補的であると見なされる。用語「実質的に相補的」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のハイブリダイゼーションを実現するのに互いに十分に相補的な配列を表す。
【００６９】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、概して、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度を指す。多くの配列の特定のハイブリダイゼーションを実現するのに好適な例示的ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０で少なくとも約６０℃の温度及び約０．２モルの塩濃度である。
【００７０】
「セルロース系材料」は、セルロースの消化産物、例えば、グルコース及びキシロース、並びに場合によりさらなる化合物、例えば二糖類、オリゴ糖類、リグニン、フルフラール及び他の化合物を意味する。セルロース系材料の供給源の非限定的な例としては、サトウキビバガス、サトウダイコンパルプ、コーンストーバー、木材チップ、おがくず及びスイッチグラスが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】Ｃ末端にＦＬＡＧエピトープタグを有するＵｃ  ＴＥ（Ｆ）又はＣｃ  ＴＥ（Ｅ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現するように操作したＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）株の全細胞溶解物のウエスタンブロッティングを示す。
【図２】ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（Ｕｃ）ＴＥ、シナモマム・カンフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）（Ｃｃ）ＴＥ及びキメラ発現コンストラクトの略画を示す。全てのコンストラクトが同じＣ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチド、ＡｓｃＩリンカー及びＣ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含んだ。
【図３Ａ】図３Ａ−Ｃは、プラスミドｐＳＺ２０３７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）並びにＣ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが大文字の囲み文字で示され、一方、Ｃ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来配列がそれぞれ下線を引いた斜体及び太字体の大文字で示される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが再び小文字により示され、続いてＡ  ６Ｓゲノム領域が太字体の小文字により示される。
【図３Ｂ】図３Ａ−Ｃは、プラスミドｐＳＺ２０３７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）並びにＣ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが大文字の囲み文字で示され、一方、Ｃ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来配列がそれぞれ下線を引いた斜体及び太字体の大文字で示される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが再び小文字により示され、続いてＡ  ６Ｓゲノム領域が太字体の小文字により示される。
【図３Ｃ】図３Ａ−Ｃは、プラスミドｐＳＺ２０３７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）並びにＣ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが大文字の囲み文字で示され、一方、Ｃ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来配列がそれぞれ下線を引いた斜体及び太字体の大文字で示される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが再び小文字により示され、続いてＡ  ６Ｓゲノム領域が太字体の小文字により示される。
【図４】プラスミドｐＳＺ２０３８に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０２３［ｐＳＺ２０３８］を使用して、Ｕｃ−Ｃｃ  ＴＥキメラをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｃｃ  ＴＥ由来配列が下線を引いた斜体で表記され、一方、Ｕｃ  ＴＥ由来配列が太字体の大文字で表記される。
【図５】プラスミドｐＳＺ２２３１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１２１０［ｐＳＺ２２３１］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＢをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｃｃ  ＴＥ由来配列が下線を引いた斜体で表記され、一方、Ｕｃ  ＴＥ由来配列が太字体の大文字で表記される。
【図６】プラスミドｐＳＺ２２３２に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１２１１［ｐＳＺ２２３２］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＣをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｃｃ  ＴＥ由来配列が下線を引いた斜体で表記され、一方、Ｕｃ  ＴＥ由来配列が太字体の大文字で表記される。
【図７】プラスミドｐＳＺ２２３３に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１２１２［ｐＳＺ２２３３］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＤをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｃｃ  ＴＥ由来配列が下線を引いた斜体で表記され、一方、Ｕｃ  ＴＥ由来配列が太字体の大文字で表記される。
【図８】プラスミドｐＳＺ２２３４に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１２１３［ｐＳＺ２２３４］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＥをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｃｃ  ＴＥ由来配列が下線を引いた斜体で表記され、一方、Ｕｃ  ＴＥ由来配列が太字体の大文字で表記される。
【図９】株Ａ、株Ｅ及び株Ｆ並びにｐＳＺ２０３７（Ｄ１０２２、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＡ）及びｐＳＺ２０３８（Ｄ１０２３、Ｕｃ−Ｃｃ  ＴＥキメラ）ＤＮＡで形質転換した代表的な誘導トランスジェニック系統を比較するウエスタンブロットを示す。
【図１０】株Ａ、株Ｅ及び株Ｆ並びにｐＳＺ２２３１（Ｄ１２１０、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＢ）又はｐＳＺ２２３２（Ｄ１２１１、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＣ）ＤＮＡで形質転換した代表的な誘導トランスジェニック系統を比較するウエスタンブロットを示す。
【図１１】株Ａ、株Ｅ及び株Ｆ並びにｐＳＺ２２３３（Ｄ１２１２、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＤ）又はｐＳＺ２２３４（Ｄ１２１３、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＥ）ＤＮＡで形質転換した代表的な誘導トランスジェニック系統を比較するウエスタンブロットを示す。
【図１２】Ｃｃ  ＴＥとＵｃ  ＴＥとの間のキメラ融合物から新生タンパク質の効率的な成熟に必要であることが同定されたアミノ酸（Ａｓｎ９１、Ｐｒｏ９２及びＰｒｏ１０２）並びにＵｃ  ＴＥ骨格のコンテクストに挿入されるとき新規１：１比のＣ１２：０対Ｃ１４：０を付与する４つのＣｃ  ＴＥ特異的アミノ酸（Ｖａｌ１２７、Ｌｅｕ１３３、Ａｌａ１３７、及びＩｌｅ１６３）を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ−Ｂは、ＦＡＴＡ及びＦＡＴＢチオエステラーゼタンパク質の配列アラインメントを示す。ＦＡＴＢのＮ末端は高度な配列保存を呈する。トランジットペプチド、プロリンリッチドメイン及び疎水性パッチの概略領域を枠で囲む。Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の効率的なプロセシングに重要であることが示された３個のアミノ酸（例えば、Ｎ９１、Ｐ９２及びＰ１０２）が行１４の下にアンダースコアで示され、疎水性パッチとコア酵素ドメインの始端との間に位置する。
【図１３Ｂ】図１３Ａ−Ｂは、ＦＡＴＡ及びＦＡＴＢチオエステラーゼタンパク質の配列アラインメントを示す。ＦＡＴＢのＮ末端は高度な配列保存を呈する。トランジットペプチド、プロリンリッチドメイン及び疎水性パッチの概略領域を枠で囲む。Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の効率的なプロセシングに重要であることが示された３個のアミノ酸（例えば、Ｎ９１、Ｐ９２及びＰ１０２）が行１４の下にアンダースコアで示され、疎水性パッチとコア酵素ドメインの始端との間に位置する。
【図１４Ａ】図１４Ａ−Ｃは、コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］のヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドを含むＵｃ  ＴＥをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、一方、Ｕ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＦＡＴＢ２由来配列が太字体の大文字で表記される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが再び小文字により示され、続いてＡ  ６Ｓゲノム領域が太字体の小文字により示される。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−Ｃは、コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］のヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドを含むＵｃ  ＴＥをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、一方、Ｕ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＦＡＴＢ２由来配列が太字体の大文字で表記される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが再び小文字により示され、続いてＡ  ６Ｓゲノム領域が太字体の小文字により示される。
【図１４Ｃ】図１４Ａ−Ｃは、コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］のヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドを含むＵｃ  ＴＥをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、一方、Ｕ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＦＡＴＢ２由来配列が太字体の大文字で表記される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’ＵＴＲが再び小文字により示され、続いてＡ  ６Ｓゲノム領域が太字体の小文字により示される。
【図１５】プラスミドｐＳＺ２０８５に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０５７［ｐＳＺ２０８５］を使用して、Ｕｃ  ＦＡＴＢ２ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｕｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、ｐＳＺ２０８４に見られる残りのＵｃ  ＦＡＴＢ２配列が太字体の大文字で表記される。
【図１６】プラスミドｐＳＺ２０８６に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１０５８［ｐＳＺ２０８６］を使用して、Ｕｃ  ＦＡＴＢ２ＥｘｔＢをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｕｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、ｐＳＺ２０８４に見られる残りのＵｃ  ＦＡＴＢ２配列が太字体の大文字で表記される。
【図１７Ａ】図１７Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼＵｃ  ＦＡＴＢ２のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ４４８、Ｄ１０５６、Ｄ１０５７及びＤ１０５８の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの４つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１０５７及びＤ１０５８は、Ｄ４４８及びＤ１０５６と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株の脂肪酸プロファイル（株Ｂ及び株Ａ）が指示される。
【図１７Ｂ】図１７Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼＵｃ  ＦＡＴＢ２のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ４４８、Ｄ１０５６、Ｄ１０５７及びＤ１０５８の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの４つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１０５７及びＤ１０５８は、Ｄ４４８及びＤ１０５６と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株の脂肪酸プロファイル（株Ｂ及び株Ａ）が指示される。
【図１８】プラスミドｐＳＺ２４５０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１４３１［ｐＳＺ２４５０］を使用して、Ｃｃ  ＦＡＴＢ１ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。Ｃｃ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＣｃ  ＦＡＴＢ１配列が太字体の大文字で表記される。
【図１９】プラスミドｐＳＺ２４５１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１４３２［ｐＳＺ２４５１］を使用して、Ｃｃ  ＦＡＴＢ１ＥｘｔＢをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。Ｃｃ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＣｃ  ＦＡＴＢ１配列が太字体の大文字で表記される。
【図２０Ａ】図２０Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼＣｃ  ＦＡＴＢ１のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ５３４、Ｄ１４３１、Ｄ１４３２の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの３つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４３１及びＤ１４３２は、Ｄ５３４と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株Ｃの脂肪酸プロファイルが指示される。
【図２０Ｂ】図２０Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼＣｃ  ＦＡＴＢ１のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ５３４、Ｄ１４３１、Ｄ１４３２の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの３つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４３１及びＤ１４３２は、Ｄ５３４と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株Ｃの脂肪酸プロファイルが指示される。
【図２１】プラスミドｐＳＺ２４７９に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１４８１［ｐＳＺ２４７９］を使用して、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ）ＦＡＴＢ２  ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列が太字体の大文字で表記され、及びＦＬＡＧエピトープ（ｐＳＺ２４８０）が小文字で表記される。
【図２２】プラスミドｐＳＺ２４８０に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１４８２［ｐＳＺ２４８０］を使用して、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含むＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２  ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列が太字体の大文字で表記され、及びＦＬＡＧエピトープ（ｐＳＺ２４８０）が小文字で表記される。
【図２３Ａ】図２３Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ２８０、Ｄ１４８１及びＤ１４８２の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの３つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４８１及びＤ１４８２は約３３％の平均Ｃ１４値を示す。野生型株Ｃ及びＣｃ  ＦＡＴＢ２発現株（株Ｋ）の脂肪酸プロファイルを矢印で示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ２８０、Ｄ１４８１及びＤ１４８２の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの３つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４８１及びＤ１４８２は約３３％の平均Ｃ１４値を示す。野生型株Ｃ及びＣｃ  ＦＡＴＢ２発現株（株Ｋ）の脂肪酸プロファイルを矢印で示す。
【図２４】プラスミドｐＳＺ２４７７に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１４７９［ｐＳＺ２４７７］を使用して、ウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（Ｕａ）ＦＡＴＢ１  ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。Ｕａ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ配列伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＵａ  ＦＡＴＢ１配列が太字体の大文字で表記される。ｐＳＺ２４７８中のＦＬＡＧエピトープが小文字で表記される。
【図２５】プラスミドｐＳＺ２４７８に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１４８０［ｐＳＺ２４７８］を使用して、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含むＵａ  ＦＡＴＢ１  ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。Ｕａ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ配列伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＵａ  ＦＡＴＢ１配列が太字体の大文字で表記される。ｐＳＺ２４７８中のＦＬＡＧエピトープが小文字で表記される。
【図２６Ａ】図２６Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１０：０−１４：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼＵａ  ＦＡＴＢ１のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ４４９、Ｄ１４７９、Ｄ１４８０の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの３つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４７９及びＤ１４８０は、Ｄ４４９と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株Ｂ及び株Ｃの脂肪酸プロファイルが指示される。
【図２６Ｂ】図２６Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１０：０−１４：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼＵａ  ＦＡＴＢ１のＮ末端が酵素活性に影響を及ぼすことを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ４４９、Ｄ１４７９、Ｄ１４８０の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの３つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４７９及びＤ１４８０は、Ｄ４４９と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株Ｂ及び株Ｃの脂肪酸プロファイルが指示される。
【図２７】プラスミドｐＳＺ２２３１に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。コンストラクトＤ１２１０［ｐＳＺ２２３１］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２キメラＢをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。Ｃｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ配列が太字体の大文字により示される；トリミング型又は伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、及びＤ１４２９内のＵｃ  ＦＡＴＢ２伸長部が下線を引いた小文字の斜体で表記される。
【図２８】プラスミドｐＳＺ２４４８に含まれる形質転換ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチド及び天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２配列に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２  ＥｘｔＡをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させるのに使用したコンストラクトＤ１４２９［ｐＳＺ２４４８］。Ｃｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ配列が太字体の大文字により示される；トリミング型又は伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、及びＤ１４２９内のＵｃ  ＦＡＴＢ２伸長部が下線を引いた小文字の斜体で表記される。
【図２９】図２９Ａ−Ｂは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼＵｃ  ＦＡＴＢ２のＮ末端がＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２キメラＢの酵素活性を向上させることを示す。パネルＡは、天然タンパク質と比べたＤ１２１０及びＤ１４２９の間の配列の違いを示す。パネルＢは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換したときの２つのコンストラクト間の脂肪酸プロファイルを比較する。Ｄ１４２９は、Ｄ１２１０と比べて約２倍の平均Ｃ１２脂肪酸プロファイルの増加を示す。野生型株Ａ及び株Ｃの脂肪酸プロファイルが指示される。これらのキメラＴＥの中での相対Ｃ１２：Ｃ１４活性は著しく低下し、天然ＵｃＴＥ酵素と比べてＣ１４：０活性の大幅な増加を伴う（例えば図１８のＤ４４８系統を図３０のＤ１２１０及びＤ１４２９系統と比較する）。
【図３０Ａ】図３０Ａ−Ｂは、Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２及びＵａＦＡＴＢ１の伸長部を示す。Ａ．ＡＨＰＫ±ＦＬＡＧタグまで伸長したＣｐａｌＦＡＴＢ２（Ｃ１４）（ｐｓＺ２４７９（Ｄ１４８１）及びｐｓＺ２４８０（Ｄ１４８２））。Ｂ．ＰＰＫＬ±ＦＬＡＧタグまで伸長したＵａＦＡＴＢ１（Ｃ１０−Ｃ１６）（ｐｓＺ２４７７（Ｄ１４７９）及びｐｓＺ２４７８（Ｄ１４８０））。
【図３０Ｂ】図３０Ａ−Ｂは、Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２及びＵａＦＡＴＢ１の伸長部を示す。Ａ．ＡＨＰＫ±ＦＬＡＧタグまで伸長したＣｐａｌＦＡＴＢ２（Ｃ１４）（ｐｓＺ２４７９（Ｄ１４８１）及びｐｓＺ２４８０（Ｄ１４８２））。Ｂ．ＰＰＫＬ±ＦＬＡＧタグまで伸長したＵａＦＡＴＢ１（Ｃ１０−Ｃ１６）（ｐｓＺ２４７７（Ｄ１４７９）及びｐｓＺ２４７８（Ｄ１４８０））。
【図３１】ｐＳＺ２６０９（Ｄ１５５８）クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）（Ｃｈｏｏｋ）及びクフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＡの核酸配列を示す。ＣｗＦＡＴＢトランジットペプチド（下線を引いた文字）、ＡｓｃＩリンカー（小文字）、ＣｗＦＡＴＢ配列（斜体）、Ｃｈｏｏｋ  ＦＡＴＢ配列（太字）、ＦＬＡＧエピトープタグ（下線を引いた小文字）。
【図３２】ｐＳＺ２６１０（Ｄ１５５９）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＢの核酸配列を示す。ＣｗＦＡＴＢトランジットペプチド（下線を引いた文字）、ＡｓｃＩリンカー（小文字）、ＣｗＦＡＴＢ配列（斜体）、Ｃｈｏｏｋ  ＦＡＴＢ配列（太字）、ＦＬＡＧエピトープタグ（下線を引いた小文字）。
【図３３】ｐＳＺ２６１１（Ｄ１５６０）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＣの核酸配列を示す。ＣｗＦＡＴＢトランジットペプチド（下線を引いた文字）、ＡｓｃＩリンカー（小文字）、ＣｗＦＡＴＢ配列（斜体）、Ｃｈｏｏｋ  ＦＡＴＢ配列（太字）、ＦＬＡＧエピトープタグ（下線を引いた小文字）。
【図３４】ｐＳＺ２６１２（Ｄ１５６１）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＤの核酸配列を示す。ＣｗＦＡＴＢトランジットペプチド（下線を引いた文字）、ＡｓｃＩリンカー（小文字）、ＣｗＦＡＴＢ配列（斜体）、Ｃｈｏｏｋ  ＦＡＴＢ配列（太字）、ＦＬＡＧエピトープタグ（下線を引いた小文字）。
【図３５】ｐＳＺ２６１３（Ｄ１５６２）ＣｈｏｏｋＦＡＴＢの核酸配列を示す。ＣｗＦＡＴＢトランジットペプチド（下線を引いた文字）、ＡｓｃＩリンカー（小文字）、Ｃｈｏｏｋ  ＦＡＴＢ配列（太字）、ＦＬＡＧエピトープタグ（下線を引いた小文字）。
【図３６】ｐＳＺ１９５４（Ｄ９６５）ＣｗＦＡＴＢの核酸配列を示す。ＣｗＦＡＴＢトランジットペプチド（下線を引いた文字）、ＡｓｃＩリンカー（小文字）、ＣｗＦＡＴＢ配列（斜体）、ＦＬＡＧエピトープタグ（下線を引いた小文字）。
【図３７】クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）（Ｃｈｏｏｋ）及びクフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）のアシル−ＡＣＰ  ＴＥ  ＦＡＴＢキメラ（「Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラ」）を示す。
【図３８Ａ】図３８Ａ−Ｂは、Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラの主要な脂質プロファイルを示す。
【図３８Ｂ】図３８Ａ−Ｂは、Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラの主要な脂質プロファイルを示す。
【図３９Ａ】図３９Ａ−Ｂは、Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラの発現のウエスタン分析及び脂肪酸プロファイルの概要を示す。
【図３９Ｂ】図３９Ａ−Ｂは、Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラの発現のウエスタン分析及び脂肪酸プロファイルの概要を示す。
【図４０】ＴＥの脂肪酸−ＡＣＰ基質特異性に影響を及ぼすＣｈｏｏｋＦＡＴＢ２、ＣｗＦＡＴＢ１、ＵｃＦＡＴＢ２及びＣｃＦＡＴＢの特異性ドメイン内の残基を示す。ＣｈｏｏｋＦＡＴＢ２の脂肪酸−ＡＣＰ基質特異性に影響を及ぼす残基としては、例えば、Ｅ１６６、Ｔ１７５、Ｉ１７７、Ｌ１７９、Ｌ１８６、Ｋ１９０、Ｉ１９８及びＫ２０３（残基の付番は配列番号６１を参照する）が挙げられる。ＵｃＦＡＴＢ２及びＣｃＦＡＴＢの脂肪酸−ＡＣＰ基質特異性に影響を及ぼす残基としては、例えば、Ｌ／Ｖ１２７、Ｍ／Ｌ１３３、Ｔ／Ａ１３７、Ｍ／Ｉ１６３及び（残基の付番は配列番号４３及び配列番号４４を参照する）が挙げられる。
【図４１Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（Ｕｃ  ＦａｔＢ２  受託番号Ｍ９４１５９；Ｄ１０５８）、シナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）ＦＡＴＢ１（Ｃｃ  ＦＡＴＢ２、受託番号Ｕ３１８１３；Ｄ１４３２）及びＵｃ  ＦＡＴＢ２キメラＦ（Ｄ１７７７）に由来する前述のＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｕｃ  ＦＡＴＢ２キメラＦを生じさせるためＵｃ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された４個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４１Ｂ】Ｄ１０５８のＣ１２：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ１４３２のＣ１４：０脂肪酸プロファイル及びＤ１７７７の新規ハイブリッドＣ１２：０−Ｃ１４：０プロファイルを示す。
【図４１Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ１７７７をもたらした４個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）も示される。
【図４２Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２、クフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ  ＦＡＴＢ２、受託番号Ｕ５６１０３）、クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）（Ｃｐａｕ  ＦＡＴＢ１）、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ１、受託番号ＡＡＣ４９１７９）、クフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａ  ｉｇｎｅａ）（Ｃｉｇｎｅａ  ＦＡＴＢ１）、クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａ  ａｖｉｇｅｒａ）（Ｃａ  ＦＡＴＢ１）、及びシナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）（Ｃｃ  ＦＡＴＢ４）の間の配列アラインメント。Ｎ末端特異性ドメインが、トランジットペプチド、触媒三残基及びＣ末端ＦＬＡＧエピトープタグに対して強調される。
【図４２Ｂ】野生型Ｃｈ  ＦＡＴＢ２及び６つのＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラに由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。野生型Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）同一の残基は点で表記され、一方、改変はアミノ酸文字で表記される。置換をもたらす元となったＦＡＴＢ遺伝子は以下である：Ｄ３１２６  Ｃｗ  ＦＡＴＢ２；Ｄ３１２７  Ｃｐａｕ  ＦＡＴＢ１；Ｄ３１２８  Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ１；Ｄ３１２９  Ｃｉｇｎｅａ  ＦＡＴＢ１；Ｄ３１３０  Ｃａ  ＦＡＴＢ１；及びＤ３１３１  Ｃｃ  ＦＡＴＢ４。
【図４３Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、Ｃｗ  ＦＡＴＢ２（Ｄ９６５）及びＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン１（Ｄ３１２６）に由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン１を生じさせるためＣｈ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された６個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４３Ｂ】Ｄ９６５のＣ１２：０−Ｃ１４：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ３０４２のＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸プロファイル及びＤ３１２６を発現する株におけるほぼ検出不能のＣ１０：０蓄積を示す。
【図４３Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ３１２６を生じさせた６個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）も示される。
【図４４Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、Ｃｐａｕ  ＦＡＴＢ１（Ｄ２５０６）及びＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン２（Ｄ３１２７）に由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン２を生じさせるためＣｈ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された７個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４４Ｂ】Ｄ２５０６のＣ１０：０−Ｃ１４：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ３０４２のＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸プロファイル及びＤ３１２７を発現する株における全ての検出可能なＣ８：０−Ｃ１０：０蓄積の消失を示す。
【図４４Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ３１２７を生じさせた７個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）も示される。
【図４５Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、Ｃｐａ１  ＦＡＴＢ１（Ｄ２８３９）及びＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン３（Ｄ３１２８）に由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン３を生じさせるためＣｈ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された８個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４５Ｂ】Ｄ２８３９のＣ８：０−Ｃ１０：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ３０４２のＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸プロファイル及びＤ３１２８を発現する株における全ての検出可能なＣ８：０−Ｃ１０：０蓄積の消失を示す。
【図４５Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ３１２８を生じさせた８個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）も示される。
【図４６Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、Ｃｉｇｎｅａ  ＦＡＴＢ１（Ｄ２６７６）及びＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン４（Ｄ３１２９）に由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン４を生じさせるためＣｈ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された３個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４６Ｂ】Ｄ２６７６のＣ１０：０−Ｃ１４：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ３０４２のＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸プロファイル及びＤ３１２９を発現する株におけるほぼ検出不能のＣ１０：０蓄積を示す。
【図４６Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ３１２９を生じさせた３個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）も示される。
【図４７Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、Ｃａ  ＦＡＴＢ１（Ｄ２８００）及びＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン５（Ｄ３１３０）に由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン５を生じさせるためＣｈ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された２個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４７Ｂ】Ｄ２８００のＣ８：０−Ｃ１２：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ３０４２のＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸プロファイル及びＤ３１３０を発現する株におけるロバストなＣ８：０−Ｃ１０：０蓄積を示す。
【図４７Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ３１３０を生じさせた２個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）並びにＣｐａｌ  ＦＡＴＢ１の酵素活性を増強することが示されている既発表のＭ２３０Ｉ置換も示される。
【図４８Ａ】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２）、Ｃｃ  ＦＡＴＢ４（Ｄ１８４５）及びＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン６（Ｄ３１３１）に由来するＮ末端特異性ドメインの配列アラインメント。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラバージョン６を生じさせるためＣｈ  ＦＡＴＢ２のＮ末端特異性ドメイン内で改変された１３個のアミノ酸を枠で囲んで強調する。
【図４８Ｂ】Ｄ１８４５のＣ１２：０−Ｃ１４：０優先性脂肪酸プロファイル、Ｄ３０４２のＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸プロファイル及びＤ３１３１を発現する株における検出可能なＣ１０：０蓄積の欠如を示す。
【図４８Ｃ】天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２の相同性モデル上で、Ｄ３１３１を生じさせた１３個のアミノ酸改変を強調する。また、酵素コアを含む触媒三残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｓｎ）も示される。
【図４９】Ｃｈ  ＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２；ｐＳＺ４２４３）のアミノ酸配列を示す。Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の藻類トランジットペプチドが小文字で表記され、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた大文字で強調される。Ｃｈ  ＦＡＴＢ２が太字体の大文字で表され、Ｎ末端特異性ドメインが枠で囲まれる。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
Ｉ．序論
脂質生成生物においてより正確に定義付けられた脂肪酸プロファイルを達成するため、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ基質特異性のより精緻な制御を可能にする変異チオエステラーゼが提供される。
【００７３】
特定の実施形態は、植物由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのＮ末端疎水性ドメインがチオエステラーゼの成熟及び細胞活性に重要であるという発見に基づく。この領域を含めることにより活性が増加することが分かっており、植物チオエステラーゼ間でのドメインのスワッピングを用いて低活性のチオエステラーゼにおける活性を増加させることができる。従って、特定の実施形態は、より高活性の疎水性ドメインをチオエステラーゼに組み込んで細胞におけるその活性を増加させ、それにより細胞の脂肪酸プロファイルを改変する融合タンパク質を含む。また、ＦＡＴＢチオエステラーゼでは、ある種のアミノ酸がＴＥ触媒活性の増加において役割を果たすことも分かっている。詳細には、配列番号４３又は配列番号４４のＡｓｎ９１、Ｐｒｏ９２及びＰｒｏ１０２に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含めると、チオエステラーゼ活性を増加させることができる。
【００７４】
一部の実施形態では、疎水性ドメインはリンカードメインを使用してトランジットペプチドに結合させることができる。リンカードメインの選択は、有利にはプロリン残基を含めることを含め、以下に記載する。
【００７５】
加えて、ＦＡＴＢの触媒ドメインのＮ末端側に特定のアミノ酸置換を含めると、ＦＡＴＢ酵素の脂肪酸優先性を改変し、それによりそれらのアミノ酸置換を有する遺伝子を発現する細胞の脂肪酸プロファイルをシフトさせることができる。詳細には、配列番号４３又は配列番号４４のＶａｌ１２７、Ｌｅｕ１３３、Ａｌａ１３７、及びＩｌｅ１６３に対応する１つ以上のアミノ酸残基を含めると、ＦＡＴＢチオエステラーゼの脂肪酸優先性をシフトさせることができる。
【００７６】
これらの発見を組み合わせて、疎水性ドメインのドメインスワッピング及び／又は突然変異と、また新規に発見された特異性改変位置における組込み突然変異との両方に起因する活性の増加を有する変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを作り出し得る。場合により、本明細書に開示される変異疎水性ドメイン及び新規変異特異性突然変異の一方又は両方を有する変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに、変異リンカードメインが含められる。その結果、活性が向上した又は特異性が改変されたチオエステラーゼとなる。
【００７７】
油産生細胞（例えば、油糧種子植物、藻類（例えば、微細藻類）のもの）に組み込まれると、この変異チオエステラーゼは、新規の又はより経済的で高価値の市販用製品が生成されるように細胞の脂肪酸プロファイルを改変させることができる。
【００７８】
実施形態はまた、油抽出後のかかる細胞からの残渣バイオマス、この油から作られる油脂化学品、燃料及び食品、並びに細胞の培養方法も包含する。様々な実施形態において、細胞は、従属栄養細胞又は偏性従属栄養細胞、及び緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、トレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、クロレラ目（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ）、クロレラ科（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｃｅａｅ）、又は緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）に分類される細胞を含めた微細藻類細胞である。これらの細胞はまた、植物細胞又は大型藻類の細胞であってもよい。ＩＩ型脂肪酸合成経路を有する宿主細胞が好ましい。以下に提供する例はトレボウクシア藻植物のプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を宿主細胞として使用するが、開示される遺伝子、コンストラクト及び方法はまた、油糧種子作物にも利用が見出され得る。これらの遺伝子をかかる作物に導入する方法は当該技術分野において公知である；例えば、米国特許第６３３１６６４号明細書、同第５５１２４８２号明細書、同第５４５５１６７号明細書、同第５６６７９９７号明細書を参照のこと。
【００７９】
ＩＩ．変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
１つ以上の外来遺伝子を有する遺伝子コンストラクト及び遺伝子操作された油産生細胞（例えば、植物、藻類、微細藻類）において変異ＴＥを使用することにより、脂肪酸、アシルグリセリド、又はそれらの誘導体を作製することができる。例えば、天然で又は遺伝子修飾によって高度な脂質を生成し得る微細藻類又は油糧種子作物を操作する（又はさらに操作する）ことにより、脂肪酸合成中にアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）からの脂肪酸の切断を促進し得る外因性変異脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現させることができる。合成された脂肪酸は、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ、トリグリセリド）を含めたアシルグリセリドに組み込まれ得る。ＴＡＧは回収され得るか、又は細胞内若しくはインビトロでのさらなる酵素処理によって、他の有用な化合物を産生し得る。
【００８０】
ある実施形態では、変異脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、特定の炭素鎖長を有する（脂肪酸合成中の）成長している脂肪酸アシル基に対する所望の特異性に基づき設計される。特異性ドメインが、特定の脂肪酸アシルＡＣＰ基質に対するその優先性に基づき、及び／又は所望の炭素鎖長の脂肪酸の生成に影響を及ぼし、それを増加させ及び／又はそれを促進するその能力に関して選択される。概して、変異脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは中鎖ＡＣＰ−脂肪酸アシル基質に対して優先的な基質特異性を有する（例えば、それによりＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、及び／又はＣ１４脂肪酸を遊離させる）。様々な実施形態において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのＮ末端の特異性ドメインは、Ｃ末端触媒ドメインにとって（例えば、点突然変異及び／又はドメインスワッピングに起因して）異種である。特定の実施形態では、特異性ドメイン及び触媒ドメインの脂肪酸鎖長基質特異性及び／又は優先性は同じであり、又は１〜２炭素の範囲内である。例えば、様々な実施形態において、変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）は以下を含む：
ｉ）Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉ）Ｃ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉｉ）Ｃ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｖ）Ｃ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｖ）Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；及び／又は
ｖｉ）Ｃ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン。
【００８１】
様々な実施形態において、変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）は以下を含む：
ｉ）Ｃ．フッケリアナ（Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）アシル−ＡＣＰ  ＴＥ由来の特異性ドメイン及びＣ．ライティイ（Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ）アシル−ＡＣＰ  ＴＥ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｉｉ）シナモマム・カンフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）アシル−ＡＣＰ  ＴＥ由来の特異性ドメイン及びウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；及び／又は
ｉｉｉ）ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の特異性ドメイン及びシナモマム・カンフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）アシル−ＡＣＰ  ＴＥ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン。
【００８２】
様々な実施形態において、特異性ドメインは、アシル−ＡＣＰ  ＴＥのＮ末端ホットドッグフォールドドメイン内に、例えば、配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３；配列番号４５のアミノ酸残基１５２〜１９０；配列番号４６のアミノ酸残基１３９〜１７７；配列番号４７のアミノ酸残基１１７〜１５５；配列番号６０のアミノ酸残基１５８〜１９６；又は配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜１９４に対応するアミノ酸部分配列を包含する。様々な実施形態において、特異性ドメインは、アミノ酸配列
【化９】
2016508717.tif 000012
を含むモチーフを含む。
【００８３】
様々な実施形態において、変異アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（ＴＥ）は以下を含む：
ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメイン（ここでは１２７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がバリンであり、１３３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり、１３７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、及び１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がイソロイシンである）、及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来又はＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；
ｖ）配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメイン（ここでは１２７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり、１３３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がメチオニンであり、１３７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がスレオニンであり、及び１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がメチオニンである）、及びＣ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来又はＣ１４：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン；及び／又は
ｖｉ）配列番号６１のアミノ酸残基１５６〜２０３と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメイン（ここでは１６６位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がグルタミンであり；１７５位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がスレオニンであり；１７７位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がイソロイシンであり；１７９位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり；１８６位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がロイシンであり；１９０位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がリジンであり；１９８位にある又はそれに対応するアミノ酸がイソロイシンであり、及び２０３位にある又はそれに対応するアミノ酸がリジンである）、及びＣ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来又はＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン。
ｖｉｉ）アミノ酸残基１５６〜１９３配列番号６１と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む特異性ドメイン（ここで１６３位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がチロシンであり、又は１８６位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がプロリンである）；及びＣ８：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来、Ｃ１０：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来又はＣ１２：０アシル−ＡＣＰ優先性ＴＥ由来の触媒ドメイン。
【００８４】
特異性ドメインが、配列番号４３のアミノ酸残基１２５〜１６３及び配列番号４４のアミノ酸残基１２５〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む実施形態において、９１位にある又はそれに対応するアミノ酸残基がアスパラギンであり、９２位にある又はそれに対応するアミノ酸がプロリンであり、及びアミノ酸１０２位がプロリンであるとき、成熟型の変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼへの切断を増加させ、促進し及び／又は亢進させることができる。
【００８５】
それに代えて、又は加えて、宿主細胞における変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現レベルを増加させ及び／又は酵素活性を増加させるため、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを、特異性ドメインに対してＮ末端側に位置する疎水性ドメインと共に発現させることができる。様々な実施形態において、疎水性ドメインのＮ末端アミノ酸残基はロイシンである。様々な実施形態において、疎水性ドメインのＮ末端アミノ酸残基はプロリンである。一実施形態において、疎水性ドメインを含む部分配列は、適宜１５、１６、１７、又は１８アミノ酸長であり得る。様々な実施形態において、疎水性ドメインは、配列番号４３のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４４のアミノ酸残基６１〜７７；配列番号４５のアミノ酸残基８５〜１０１；配列番号４６のアミノ酸残基７８〜９５；配列番号４７のアミノ酸残基５０〜６６；配列番号６０のアミノ酸残基９１〜１０７；又は配列番号６１のアミノ酸残基９０〜１０６に対応するアシル−ＡＣＰ  ＴＥのＮ末端側半分の範囲内にあるアミノ酸部分配列である。様々な実施形態において、疎水性ドメインは、アミノ酸配列
【化１０】
2016508717.tif 000013
を含むモチーフを含む。本明細書において説明及び実証するとおり、疎水性ドメインは、必須ではないが、Ｎ末端ロイシン残基を含み得る。
【００８６】
さらに別の方法は、宿主細胞の脂肪酸プロファイルに対するチオエステラーゼの影響を増加させることが分かっている。変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを、疎水性ドメインに対してＮ末端側に位置するリンカードメインと共に発現させることができる。リンカードメインはプロリンリッチであり得る。リンカードメインは単独で、又は変異疎水性ドメイン及び上記で考察した特異性を付与する変種の一方又は両方との組み合わせで使用することができる。変異アシル−ＡＣＰがトランジットペプチド又はシグナルペプチド、例えばプラスチドトランジットペプチドを含む実施形態では、リンカードメインはトランジットペプチドに対してＣ末端側に位置する（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、リンカードメインがトランジットペプチド（存在する場合）と疎水性ドメインとの間に位置する）。様々な実施形態において、アシル−ＡＣＰリンカードメインはプロリンリッチであり、３、４、５、６個又はそれ以上のプロリン残基を含む。様々な実施形態において、リンカードメインは、アシル−ＡＣＰ  ＴＥのＮ末端側半分の範囲内にある、アシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端からＮ末端側に延在し、且つ配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択される残基に対応する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３，３４、３５又は３６残基に対応するアミノ酸部分配列を包含する。
【００８７】
様々な実施形態において、リンカードメインを含む部分配列は以下を含む：
ａ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択される残基に対応するアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から延在する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０残基；
ｂ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含むアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から延在する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０残基；
ｃ）配列番号４３のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４４のアミノ酸残基４３〜５９；配列番号４５のアミノ酸残基４９〜８３；配列番号４６のアミノ酸残基５３〜７７；配列番号４７のアミノ酸残基１５〜４８；配列番号６０のアミノ酸残基５７〜８９；及び配列番号６１のアミノ酸残基５６〜８８からなる群から選択されるアシル−ＡＣＰ−ＴＥ部分配列由来のＣ末端から延在する少なくとも５アミノ酸残基、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０残基；及び／又は
ｄ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列。
【００８８】
様々な実施形態において、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼはシグナルペプチド又はトランジットペプチドをさらに含み得る。様々な実施形態において、トランジットペプチドは変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをプラスチド、例えば葉緑体に誘導する。様々な実施形態において、プラスチドトランジットペプチドは、
【化１１】
2016508717.tif 000014
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他のプラスチドトランジット配列は当該技術分野において公知であり、以下にさらに詳細に記載する。
【００８９】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｃ末端領域にとって又は触媒ドメインにとって異種であるＮ末端領域を有する変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼであって、且つウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ４９００１、Ｑ４１６３５、Ｍ９４１５９）、シナモマム・カンフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ３９４７３；Ｕ３１８１３）、ニクズク（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ７１７２９、ＡＡＢ７１７３０、ＡＡＢ７１７２９１．１）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ８３９３９、ＡＡＤ４２２２０、ＡＡＬ１５６４５）、ポプルス・トメントサ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＣ４７３１１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１７２３２７、ＣＡＡ８５３８７、ＣＡＡ８５３８８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ０１９８２、Ｑ９ＳＱＩ３）、クフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５６１０３、Ｑ３９６６３）、クフェア・ランケオラータ（Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ５４０６０、ＣＡＢ６０８３０、ＣＡＣ１９９３３）、クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ７２８８２、Ｕ３９８３４、Ｑ３９５１３、Ｑ３９５１４、ＡＡＣ４９２６９）、クフェア・カロフィラ亜種メソステモン（Ｃｕｐｈｅａ  ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ  ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｏｓｔｅｍｏｎ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＢ７１５８１）、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ４９１８０；ＡＡＣ４９１７９）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＮ８１８１９）、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５１５２５）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステ��ーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＩ１８９８６）、マフア（Ｍａｄｈｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＸ５１６３７）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＨ１１７１０；ＣＡＡ５２０７０．１）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（インディカ栽培品種群）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＹ８６８７７）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（ジャポニカ栽培品種群）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０６８４００）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（インディカ栽培品種群）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＹ９９６１７）、ウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ７１７３１、Ｏ２４４２０）、ドイツアヤメ（Ｉｒｉｓ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＧ４３８５８、ＡＡＧ４３８５８．１）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＳ３０４２２．１）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＬ７９３６１．１）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＸ８２７９９．３）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）オレオイル−アシルキャリアータンパク質チオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＧ４００８９．１）、及びヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ５６００３４．１）からなる群から選択されるアシル−ＡＣＰ  ＴＥ由来の疎水性ドメイン及び／又は特異性ドメインを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。
【００９０】
詳細な実施形態において、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５；配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０、配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号４９、配列番号５１；配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
詳細な実施形態において、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４；配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９、配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号４８、配列番号５０；配列番号５２；配列番号５４；配列番号５６及び配列番号５８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【００９２】
ＩＩＩ．微生物操作−発現カセット及びベクター
プロモーター、ｃＤＮＡ、及び３’ＵＴＲ、並びにベクターの他のエレメントは、天然の供給源から単離された断片を使用するクローン技術によって生じさせることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；及び米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照のこと）。或いは、エレメントは公知の方法を用いて合成により生じさせてもよい（例えばＧｅｎｅ．１９９５  Ｏｃｔ．１６；１６４（１）：４９−５３を参照のこと）。
【００９３】
Ａ．発現のコドン最適化
微生物で発現させるポリペプチド、例えば変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び選択可能マーカーをコードするＤＮＡは、コドン最適化されたｃＤＮＡであってもよい。微細藻類における発現用に遺伝子を再コード化する方法が、米国特許第７，１３５，２９０号明細書に記載される。コドン最適化に関するさらなる情報が、例えば、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／のコドン使用頻度データベースにおいて利用可能である。プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）に好ましいコドン使用頻度の表もまた、米国特許出願公開第２０１２／０２８３４６０号明細書（本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される）に提供される。
【００９４】
Ｂ．プロモーター
多くのプロモーターが、形質転換される微細藻類にとって内因性のプロモーター、並びに形質転換される藻類にとって内因性でないプロモーター（即ち、他の藻類由来のプロモーター、高等植物由来のプロモーター、及び植物ウイルス又は藻類ウイルス由来のプロモーター）を含め、微細藻類において活性を示す。微細藻類において活性を示す外来性及び／又は内因性プロモーター、及び微細藻類において機能する抗生物質耐性遺伝子が、例えば、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３５（６）：３５６−６２（クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎｕａｒｙ；４（１）：６３−７３（クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ））；Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ．１６；２５２（５）：５７２−９（フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６  Ａｐｒｉｌ；３１（１）：１−１２（ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ））；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９４  Ｎｏｖ．２２；９１（２４）：１１５６２−６（ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ））；Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  Ａ，Ｃａｓｏｔｔｉ  Ｒ，Ｌｅｂｌａｎｃ  Ｃ，Ａｂｒｅｓｃｉａ  Ｃ，Ｂｏｗｌｅｒ  Ｃ，ＰＭＩＤ：１０３８３９９８，１９９９  Ｍａｙ；１（３）：２３９−２５１（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｚｉｏｎｅ  Ｚｏｏｌｏｇｉｃａ，ＶＩＩＩａ  Ｃｏｍｕｎａｌｅ，Ｉ−８０１２１  Ｎａｐｌｅｓ，Ｉｔａｌｙ）（フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）及びタラシオシラ・ワイスフロッギー（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ））；Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２  Ｍａｙ；１２９（１）：７−１２（ポルフィリディウム属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．））；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｊａｎ．２１；１００（２）：４３８−４２（クラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；８７（３）：１２２８−３２（クラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｊｕｎ．２５；２０（１２）：２９５９−６５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎｕａｒｙ；４（１）：６３−７３（クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ））；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．１９９５  Ａｕｇｕｓｔ；３６（５）：１０２５−３５（クラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））；Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇｕｓｔ；４３（４）：３６１−５（ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ））；Ｙｉ  Ｃｈｕａｎ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．２００５  Ａｐｒｉｌ；３２（４）：４２４−３３（ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ））；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （ＮＹ）．１９９９  Ｍａｙ；１（３）：２３９−２５１（タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）及びフェオダクチラム属（Ｐｈａｅｄａｃｔｙｌｕｍ））；Ｋｏｋｓｈａｒｏｖａ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；５８（２）：１２３−３７（様々な種）；Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００４  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２７１（１）：５０−９（サーモシネココッカス・エロンガテス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ））；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２０００），１８２，２１１−２１５；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ａｐｒ．２５；２２１（２）：１５５−９；Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４  Ｊｕｎｅ；１０５（２）：６３５−４１；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２９（５）：８９７−９０７（シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ＰＣＣ  ７９４２）；Ｍａｒ  Ｐｏｌｌｕｔ  Ｂｕｌｌ．２００２；４５（１−１２）：１６３−７（アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）ＰＣＣ  ７１２０）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４  Ｍａｒｃｈ；８１（５）：１５６１−５（アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）（様々な株））；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１  Ｍａｒ．２７；９８（７）：４２４３−８（シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ））；Ｗｉｒｔｈ，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９８９  Ｍａｒｃｈ；２１６（１）：１７５−７（様々な種）；Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２  Ｊｕｎｅ；４４（６）：１５１７−３１及びＰｌａｓｍｉｄ，１９９３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３０（２）：９０−１０５（フレミエラ・ジプロシフォン（Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ  ｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎ））；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２４：７５−８１（クラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））；Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏ．２２：１５−２０；Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９：３１７−３２２（クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ））により記載されており；さらなるプロモーターに関しては、米国特許第６，０２７，９００号明細書の表１も参照されたい）。
【００９５】
外来遺伝子を発現させるために使用されるプロモーターは、当該の遺伝子と天然に連結しているプロモーターであってもよく、又は異種遺伝子であってもよい。一部のプロモーターは微細藻類の２つ以上の種で活性を示す。別のプロモーターは種特異的である。例示的なプロモーターとしては、クラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のＲＢＣＳ２などのプロモーター並びにカリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスなどのウイルスプロモーターが挙げられ、これらは微細藻類の複数の種において活性を有することが示されている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２００５  Ｍａｒｃｈ；２３（１０−１１）：７２７−３５；Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇｕｓｔ；４３（４）：３６１−５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎｕａｒｙ；４（１）：６３−７３を参照のこと）。他の実施形態では、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター、又はクラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）ＲＢＣＳ２プロモーターを使用することができる。場合により、プロモーターを含むこれらの配列の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ヌクレオチド又はそれ以上が使用される。様々な実施形態において、発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の種にとって内因性である。
【００９６】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）における外来遺伝子の発現に有用なプロモーターとしては、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ＨＵＰ  １遺伝子のプロモーター及びクロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）硝酸レダクターゼプロモーターが挙げられ、米国特許第６，３９５，９６５号明細書に記載されるクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスプロモーターもまた、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）において遺伝子を発現させるために使用することができる。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）で活性を示すさらなるプロモーターについては、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４  Ｏｃｔ．１４；２０４（１）：１８７−９４；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔｏｂｅｒ；２６（１）：８５−９３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ａｕｇ．１５；３２６（１）：１５０−９；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊａｎ．５；３１８（１）：２１４−２３を参照することができる。
【００９７】
Ｃ．選択可能マーカー
微細藻類の形質転換に有用なトランス遺伝子コンストラクトにおいては、多種多様な選択可能マーカーの任意のものを用い得る。好適な選択可能マーカーの例としては、ショ糖インベルターゼ遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及びフレオマイシンに対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子が挙げられる。抗生物質に対する微細藻類の感受性を決定する方法は周知されている。例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｏｃｔ．１６；２５２（５）：５７２−９。以下の例は、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の株における選択可能マーカーとしてのショ糖インベルターゼの使用を例示する。
【００９８】
Ｄ．誘導性発現
本発明はまた、目的の遺伝子を発現させるための誘導性プロモーターの使用も提供する。詳細には、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現に誘導性プロモーターを使用すると、微生物の成長後に条件が調整された時点で変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成することが可能となる。
【００９９】
有用な誘導性プロモーターとしては、外因的に提供される小分子（例えば、グルコース）、温度（加熱又は冷却）、光等の刺激に応答して、作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介するものが挙げられる。好適なプロモーターは、本質的にサイレントな遺伝子の転写を活性化させ、又は例えば、実質的に、転写レベルが低い作動可能に連結された遺伝子の転写を上方制御することができる。後者の場合に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの転写レベルが、それを発現する微生物の成長を大幅に妨げることはない。
【０１００】
Ｅ．２つ以上の外来遺伝子の発現
さらに、遺伝子操作された微生物、例えば微細藻類は、２つ以上の外来遺伝子、例えば、変異脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする遺伝子とを含み、それらを発現し得る。一方又は両方の遺伝子を、誘導性プロモーターを使用して発現させることができ、誘導性プロモーターは、脂質収率及び脂肪酸エステルへの変換が増強されるようにこれらの遺伝子の相対的な発現タイミングを制御することが可能である。２つ以上の外来遺伝子の発現が同じ誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、又は異なる誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。後者の状況では、第１の外来遺伝子の発現を第１の期間に誘導することができ（その間に第２の外来遺伝子の発現が誘導されても又は誘導されなくてもよい）、且つ第２の外来遺伝子の発現を第２の期間に誘導することができる（その間に第１の外来遺伝子の発現が誘導されても又は誘導されなくてもよい）。本明細書には、脂質生成微生物をショ糖を代謝するように操作するためのベクター及び方法が提供され、これは、操作された細胞がサトウキビ原料を脂質に変換することが可能になるため、有利な形質である。
【０１０１】
本発明での使用に好適なさらなる修飾の例としては、２つ以上の外来遺伝子（１つが固定炭素源（ショ糖など）のトランスポーターをコードするもの、２つ目がショ糖インベルターゼ酵素をコードするもの）を発現するように微細藻類株を遺伝子操作することが挙げられる。得られる発酵性生物は、これまでに公知の生物学的炭化水素生成方法で達成可能となっているものより低い製造コストで炭化水素を生成する。上記に記載される２つの外来遺伝子の挿入を、定方向及び／又はランダム突然変異誘発による多糖生合成の中断と組み合わせることができ、これは炭化水素生成に益々多くの炭素フラックスを導く。個々に、及び組み合わせで、栄養変換、炭化水素生成を改変する操作及び外因性酵素による処理が、微生物により生成される炭化水素組成を改変する。この改変は、炭化水素の生成量、他の炭化水素と比べた１つ以上の炭化水素種の生成量、及び／又は微生物で生成される炭化水素種のタイプの変化であってもよい。例えば、微細藻類は、より多量の及び／又はより高い割合のＴＡＧを産生するように操作することができる。
【０１０２】
Ｆ．コンパートメント発現（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
本発明はまた、目的の遺伝子のコンパートメント発現も提供する。一部の実施形態では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を１つ以上の細胞内コンパートメントに標的化することが望ましい場合がある。標的にする例示的な細胞小器官は、脂肪体、プラスチド（葉緑体を含む）、ミトコンドリア、及び小胞体である。
【０１０３】
１．発現及びプラスチドへの標的化
プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の核ゲノムで発現するタンパク質は、プラスチド標的化シグナルを使用してプラスチドに標的化することができる。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）にとって内因性のプラスチド標的化配列は、プラスチドに標的化されるタンパク質をコードするクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）核ゲノム中の遺伝子など、公知である；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４を参照されたく、一実施形態では、本発明のベクターにおいてかかる制御配列が使用され、タンパク質の発現がプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）プラスチドに標的化される。
【０１０４】
以下の実施例は、藻類プラスチド標的化配列を使用して異種タンパク質を正しいコンパートメントに標的化することについて記載する。プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）及びクロレラ・プロトテコディエス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｄｉｅｓ）細胞を使用してｃＤＮＡライブラリを作成しており、これは米国特許出願公開第２０１２／０２８３４６０号明細書及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号明細書の実施例に記載されている。組換え発現させる変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのプラスチド標的化有用ｃＤＮＡライブラリから同定された藻類プラスチド標的化配列のアミノ酸配列が、米国特許出願公開第２０１２／０２８３４６０号明細書及び本明細書に提供される。様々な実施形態において、プラスチドトランジットペプチドは、
【化１２】
2016508717.tif 000015
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
本発明の一実施形態において、微生物におけるポリペプチドの発現は葉緑体に標的化される。異種遺伝子の発現を葉緑体に標的化する方法は公知であり、本発明に用いられ得る。遺伝子産物を葉緑体に標的化する方法が、Ｓｈｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：２５  ３２に記載されている。核遺伝子産物を葉緑体に移行させるためのトランジットペプチドの使用に関しては、Ｔｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：１５１０４  １５１０９及び米国特許第４，９４０，８３５号明細書もまた参照されたい。タンパク質の輸送を葉緑体に指向させる方法もまた、Ｋｅｎａｕｆ  ＴＩＢＴＥＣＨ（１９８７）５：４０  ４７にレビューされている。葉緑体に標的化されるタンパク質をコードするクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）核ゲノム中の遺伝子など、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）にとって内因性の葉緑体標的化配列は公知である；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４を参照のこと。
【０１０６】
Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  ＵＲ−Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌがＩＭＰＡＣＴＶＥＣＴＯＲ１．４ベクターを販売しており、これはイエギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）小サブユニットタンパク質の分泌シグナルを使用して異種タンパク質を葉緑体ストロマ（細胞質）環境中へと、二重膜系を越えてシャトル輸送して送達する。シグナルペプチドの適切なプロセシングを可能にするため、タンパク質が成熟ルビスコタンパク質の最初の１１アミノ酸と融合される（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：８１−９３（１９９２））。シグナルペプチドはＲｂｃＳ遺伝子由来の天然イントロンを含む。
【０１０７】
別の手法では、葉緑体ゲノムが異種タンパク質を発現するように遺伝子操作される。外来ＤＮＡでコーティングされた高速タングステンマイクロプロジェクタイルによるレシピエント細胞のボンバードメントを使用したクラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（緑藻）の葉緑体の安定的な形質転換が記載されている。例えば、Ｂｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１５３４  １５３８；Ｂｌｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１２３  １３２及びＤｅｂｕｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８９）８：２８０３  ２８０９を参照のこと。タングステンマイクロプロジェクタイルを使用した形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９８７）７：７０  ７３により記載される。植物及び微細藻類の両方に関する他の葉緑体形質転換方法が公知である。例えば、米国特許第５，６９３，５０７号明細書；同第６，６８０，４２６号明細書；並びにＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２  Ｍａｙ；１２９（１）：７−１２；及びＰｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２００７  Ｍａｙ；５（３）：４０２−１２を参照のこと。
【０１０８】
米国特許第６，３２０，１０１号明細書（２００１年１１月２０日にＫａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．に付与された；参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、細胞は、細胞当たりの葉緑体数を約１に減らすように化学的に処理することができる。次に、少なくとも１つの異種核酸分子を葉緑体に導入することを目的として、異種核酸をパーティクルボンバードメントによって細胞に導入することができる。異種核酸は、葉緑体に固有の酵素により容易に達成される相同組換えによって葉緑体のゲノムに組込み可能であるように選択される。そのため、異種核酸は、目的の遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。加えて、異種核酸は典型的には選択可能マーカーを含む。この技術に関するさらなる詳細については、米国特許第４，９４５，０５０号明細書及び同第５，６９３，５０７号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）が参照される。このようにポリペプチドは、葉緑体のタンパク質発現系により生成され得る。
【０１０９】
米国特許第７，１３５，６２０号明細書（２００６年１１月１４日にＤａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に付与された；参照により本明細書に援用される）は、葉緑体発現ベクター及び関連方法を記載している。典型的な発現カセットは以下の構成要素を含む：微生物遺伝子又は葉緑体遺伝子、例えばｐｓｂＡ由来の５’非翻訳領域、これは葉緑体で目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写及び翻訳をもたらし得る；目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；並びに翻訳及び転写終結領域、例えば葉緑体遺伝子の３’逆方向反復領域、これは、導入遺伝子のＲＮＡを安定させて、それにより外来遺伝子発現を増強することができる。カセットは、場合により抗生物質耐性遺伝子を含み得る。
【０１１０】
典型的には、発現カセットには、適切なゲノムへの挿入に好都合な制限部位が隣接する。発現カセットに葉緑体ＤＮＡ由来のＤＮＡ配列が隣接して、葉緑体ゲノムへの特に相同組換えによる発現カセットの安定した組込みを促進してもよい。或いは、発現カセットは組み込まれないままであってもよく、その場合、発現カセットは典型的には、葉緑体における異種ＤＮＡの複製を提供する能力を有する葉緑体複製起点を含む。
【０１１１】
発現カセットは、概して、葉緑体における発現能を有する遺伝子由来のプロモーター領域を含む。プロモーター領域には、ホウレンソウ又はエンドウマメ由来のｐｓｂＡ遺伝子などの葉緑体遺伝子から得ることが可能なプロモーター、又はトウモロコシ由来のｒｂｃＬ及びａｔｐＢプロモーター領域及びＲｍａプロモーターが含まれ得る。プロモーターの例は、Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｕａ，ＴＩＢＳ（１９８７）１２：６７  ７０；Ｍｕｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ．（１９８５）４：３９  ５４；Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ（１９８６）ＰｈＤ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｋｒｅｂｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８２）１０：４９８５  ５００２；Ｚｕｒａｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８１）９：３２５１  ３２７０；及びＺｕｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８２）７９：７６９９  ７７０３に記載される。他のプロモーターを同定し、そのように同定されたプロモーターの相対強度を、目的のプロモーターをプロモーターレスマーカー遺伝子の５’側に置き、且つその有効性を、例えば比較的強力な葉緑体プロモーターであるｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーターにより達成される転写と比べて観察することにより評価し得る。ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ遺伝子発現の効率はさらに、種々の技術のいずれかによって増強することができる。それらには、異種ｇｅｎｔｅの５’側にタンデムに挿入される複数のプロモーター、例えば二重ｐｓｂＡプロモーターの使用、エンハンサー配列の付加などが含まれる。
【０１１２】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）葉緑体における外来遺伝子の発現には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１８６５（クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）葉緑体、完全ゲノム）に見られるものなど、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）葉緑体で活性を示す多数のプロモーターを使用することができる、
【０１１３】
異種遺伝子の誘導性発現をもたらすことが望ましい場合、誘導性プロモーター及び／又は（３’末端における）転写及び／又は翻訳レベルでの調節をもたらす配列を含む５’非翻訳領域を発現カセットに含めてもよい。例えば、５’非翻訳領域は、発現を光によって調節可能な遺伝子由来であってもよい。同様に、３’逆方向反復領域を使用して異種遺伝子のＲＮＡを安定化させることもできる。誘導性遺伝子は、特定の目的の刺激に応答した発現の亢進、及びその刺激の非存在下における低発現又は発現の欠如により同定され得る。例えば、光誘導性遺伝子は、光の照射中に発現の亢進が起こる一方、微光又は無光下では発現の実質的な低下が起こるか又は発現が起こらない場合に同定することができる。微細緑藻類由来の光調節プロモーターが公知である（例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２７４（６）：６２５−３６を参照のこと）。
【０１１４】
終結領域は葉緑体及び細菌間で比較的互換性が高いと見られるため、用いられる終結領域は主に好都合なものとなり得る。終結領域は転写開始領域にとって天然であってもよく、目的のＤＮＡ配列にとって天然であってもよく、又は別の供給源から得ることのできるものであってもよい。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：８４１１を参照のこと。
【０１１５】
発現カセットは、多くの方法のいずれかによって目的の植物細胞に形質転換され得る。これらの方法には、例えば、微粒子銃法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６：２９９  ３０２、米国特許第４，９４５，０５０号明細書を参照のこと；電気穿孔（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：５８２４  ５８２８）；レーザービームの使用、マイクロインジェクション又はＤＮＡを葉緑体に導入することが可能な任意の他の方法が含まれる。
【０１１６】
微細藻類などの微生物における使用に好適な葉緑体発現ベクターのさらなる説明は、米国特許第７，０８１，５６７号明細書（２００６年７月２５日にＸｕｅ  ｅｔ  ａｌ．に付与された）；同第６，６８０，４２６号明細書（２００４年１月２０日にＤａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に付与された）；及び同第５，６９３，５０７号明細書（１９９７年１２月２日にＤａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．付与された）が参照される。
【０１１７】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の核ゲノムで発現するタンパク質は、葉緑体標的化シグナルを使用して葉緑体に標的化することができる。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）にとって内因性の葉緑体標的化配列は、葉緑体に標的化されるタンパク質をコードするクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）核ゲノム中の遺伝子など、公知である；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４を参照のこと。タンパク質はまた、遺伝子を葉緑体ゲノムに直接挿入することによってもクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）葉緑体で発現させることができる。葉緑体形質転換は典型的には相同組換えによって行われ、ターゲティングベクターを作成するための葉緑体ゲノム配列が既知であれば実施することができる（例えば、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）葉緑体の完全ゲノム配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１８６５を参照のこと）。
【０１１８】
Ｇ．形質転換
細胞は、例えば、微粒子銃、電気穿孔、ガラスビーズ形質転換及びシリコンカーバイドウィスカー形質転換を含めた任意の好適な技術によって形質転換することができる。
【０１１９】
本発明における微生物の形質転換用ベクターは、当業者が精通している公知の技術によって調製することができる。一実施形態において、微細藻類などの微生物におけるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現用の例示的ベクター設計は、微細藻類において活性なプロモーターと作動可能な連結状態にあるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を含む。或いは、ベクターが目的の遺伝子と作動可能な連結状態にあるプロモーターを含まない場合、遺伝子は、ベクターの組込み箇所でそれが内因性プロモーターに作動可能に連結された状態となるように細胞に形質転換することができる。プロモーターレスの形質転換方法が微細藻類で機能することが分かっている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：４，（１９９８），ｐｐ．４４１−４４７を参照のこと）。ベクターはまた、例えば抗生物質又は除草剤に対する耐性を付与するタンパク質、即ち選択可能マーカーをコードする第２の遺伝子も含み得る。場合により、一方又は両方の遺伝子の後に、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳配列が続く。これらの２つの遺伝子をコードする発現カセットは、ベクター中で物理的に連結されてもよく又は別個のベクター上にあってもよい。微細藻類の同時形質転換もまた用いることができ、ここでは個別のベクター分子を同時に使用して細胞を形質転換する（例えば、Ｐｒｏｔｉｓｔ  ２００４  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１５５（４）：３８１−９３を参照のこと）。形質転換細胞は、場合によりその耐性カセットを欠く細胞が成長しない条件下において抗生物質又は他の選択可能マーカーの存在下で成長する能力に基づき選択することができる。
【０１２０】
ＩＶ．宿主細胞−油又は脂質を生成する微生物
好適な脂質及び／又は炭化水素を生成する任意の生物種を使用することができ、しかしながら天然で高レベルの好適な脂質及び／又は炭化水素を生成する微生物が好ましい。微生物による炭化水素の生成については、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ  Ｌｏｏｋ  Ｂａｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ，ＮＲＥＵＴＰ−５８０−２４１９０，Ｊｏｈｎ  Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｔｅｒｒｉ  Ｄｕｎａｈａｙ，Ｊｏｈｎ  Ｂｅｎｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）によりがレビューされている。
【０１２１】
微生物を選択する際の考慮点としては、油、燃料、及び油脂化学品の生産に好適な脂質又は炭化水素の生成に加え、以下が挙げられる：（１）細胞重量に対する割合として高い脂質含量；（２）成長の容易さ；（３）遺伝子操作の容易さ；及び（４）バイオマス処理の容易さ。詳細な実施形態において、野生型微生物又は遺伝子操作された微生物は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％又はそれ以上が脂質である細胞を生じる。好ましい生物は（光の非存在下において糖類上で）従属栄養的に成長するか、又はそのように成長するように、例えば本明細書に開示される方法を用いて操作することができる。形質転換の容易さ、並びに微生物において機能する選択可能マーカー及び構成的又は誘導性プロモーターを利用可能であることが、遺伝子操作の容易さに影響を及ぼす。処理上の考慮点には、例えば、有効な細胞溶解手段を利用可能であることが含まれ得る。
【０１２２】
Ａ．藻類
本発明の一実施形態において、微生物は微細藻類である。変異アシル−ＡＣＰｔｈｉｏｅｓｔｅｓｔｅｒａｓｅの発現に用いることのできる微細藻類の非限定的な例としては、例えば、アクナンテス・オリエンタリス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アグメネルム属（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ）、アンフィプロラ・ヒアリネ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ）、アンフォラ・コフェイフォルミス（Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ）、アンフォラ・コフェイフォルミス・リネア（Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｉｎｅａ）、アンフォラ・コフェイフォルミス・プンクタタ（Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、アンフォラ・コフェイフォルミス・タイロリ（Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｔａｙｌｏｒｉ）、アンフォラ・コフェイフォルミス・テヌイス（Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ）、アンフォラ・デリカチッシマ（Ａｍｐｈｏｒａ  ｄｅｌｉｃａｔｉｓｓｉｍａ）、アンフォラ・デリカチッシマ・カピタタ（Ａｍｐｈｏｒａ  ｄｅｌｉｃａｔｉｓｓｉｍａ  ｃａｐｉｔａｔａ）、アンフォラ属種（Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アンキストロデスムス・ファルカツス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｆａｌｃａｔｕｓ）、ベケロビア・フーグランディイ（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ  ｈｏｏｇｌａｎｄｉｉ）、ボロディネラ属種（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、ボトリオコッカス・スデチクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）、Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｎｏｒ、Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｅｄｉｏｎｕｃｌｅａｔｕｓ、カルテリア属（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、キートケロス・グラシリス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、キートケロス・ムエレリ（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、キートケロス・ムエレリ・サブサルスム（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ｓｕｂｓａｌｓｕｍ）、キートケロス属種（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．）、クロレラ・アニトラタ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｎｉｔｒａｔａ）、クロレラ・アンタルクチカ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、クロレラ・アウレオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・カンジダ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃａｎｄｉｄａ）、クロレラ・カプスラテ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、クロレラ・デシクカテ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｅｓｉｃｃａｔｅ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・エメルソニイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、クロレラ・フスカ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）、クロレラ・フスカ変種バクオラタ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ  ｖａｒ．ｖａｃｕｏｌａｔａ）、クロレラ・グルコトロファ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｇｌｕｃｏｔｒｏｐｈａ）、クロレラ・インフシオヌム（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ）、クロレラ・���ンフシオヌム変種アクトフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ  ｖａｒ．ａｃｔｏｐｈｉｌａ）、クロレラ・インフシオヌム変種アウクセノフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ  ｖａｒ．ａｕｘｅｎｏｐｈｉｌａ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ロボフォラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｏｂｏｐｈｏｒａ）（株ＳＡＧ３７．８８）、クロレラ・ルテオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ルテオビリディス変種アウレオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ｖａｒ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ルテオビリディス変種ルテセンス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ｖａｒ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）、クロレラ・ミニアタ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｉａｔａ）、クロレラ・ミヌチッシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ・ムタビリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｕｔａｂｉｌｉｓ）、クロレラ・ノクツルナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｎｏｃｔｕｒｎａ）、クロレラ・オバリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｏｖａｌｉｓ）、クロレラ・パルバ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐａｒｖａ）、クロレラ・フォトフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｈｏｔｏｐｈｉｌａ）、クロレラ・プリングスヘイミイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉｉ）、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（ＵＴＥＸ株１８０６、４１１、２６４、２５６、２５５、２５０、２４９、３１、２９、２５のうちの任意のものを含む）、クロレラ・プロトテコイデス変種アシディコラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｖａｒ．ａｃｉｄｉｃｏｌａ）、クロレラ・レグラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、クロレラ・レグラリス変種ミニマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ｖａｒ．ｍｉｎｉｍａ）、クロレラ・レグラリス変種ウンブリカタ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ｖａｒ．ｕｍｂｒｉｃａｔａ）、クロレラ・レイシグリイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ）、クロレラ・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、クロレラ・サッカロフィラ変種エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ  ｖａｒ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・サリナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）、クロレラ・シンプレックス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ属種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、クロレラ・スフェリカ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｈａｅｒｉｃａ）、クロレラ・スチグマトフォラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｏｒａ）、クロレラ・バンニエリイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｎｎｉｅｌｌｉｉ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ブルガリス品種テルチア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆ．ｔｅｒｔｉａ）、クロレラ・ブルガリス変種アウトトロフィカ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ａｕｔｏｔｒｏｐ��ｉｃａ）、クロレラ・ブルガリス変種ビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ブルガリス変種ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ブルガリス変種ブルガリス品種テルチア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆ．ｔｅｒｔｉａ）、クロレラ・ブルガリス変種ブルガリス品種ビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・キサンテラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｘａｎｔｈｅｌｌａ）、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、クロレラ・トレボウクシオイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロロコックム・インフシオヌム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ）、クロロコックム属種（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．）、クロロゴニウム属（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロオモナス属種（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、クリソスファエラ属種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．）、クリコスファエラ属種（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．）、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、クリプトモナス属種（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、キクロテラ・クリプチカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）、キクロテラ・メネギニアナ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｍｅｎｅｇｈｉｎｉａｎａ）、キクロテラ属種（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、ドナリエラ属種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、ドナリエラ・バーダウィル（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄａｗｉｌ）、ドナリエラ・ビオクラタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂｉｏｃｕｌａｔａ）、ドナリエラ・グラヌラテ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌａｔｅ）、ドナリエラ・マリチメ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）、ドナリエラ・ミヌタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔａ）、ドナリエラ・パルバ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐａｒｖａ）、ドナリエラ・ペイルケイ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｅｉｒｃｅｉ）、ドナリエラ・プリモレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ）、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）、ドナリエラ・テリコラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、ドナリエラ・ビリディス（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、エレモスフェラ・ビリディス（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、エレモスフェラ属種（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．）、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ  ｓｐ．、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、フランケイア属種（Ｆｒａｎｃｅｉａ  ｓｐ．）、フラギラリア・クロトネンシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ  ｃｒｏｔｏｎｅｎｓｉｓ）、オビケイソウ属種（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ  ｓｐ．）、グレオカプサ属種（Ｇｌｅｏｃａｐｓａ  ｓｐ．��、グレオタムニオン属種（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ  ｓｐ．）、ヒメノモナス属種（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、イソクリシス類縁ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ａｆｆ．ｇａｌｂａｎａ）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、レポキンクリス属（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム属（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、ミクラクチニウム属（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）（ＵＴＥＸ  ＬＢ  ２６１４）、モノラフィディウム・ミヌツム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）、モノラフィディウム属種（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、ナンノクロリス属種（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．）、ナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ）、ナンノクロロプシス属種（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ナビクラ・アクセプタタ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ａｃｃｅｐｔａｔａ）、ナビクラ・ビスカンテレ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｂｉｓｋａｎｔｅｒａｅ）、ナビクラ・シュードテネロイデス（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｓｅｕｄｏｔｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）、ナビクラ・サプロフィラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ）、フナガタケイソウ属種（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓｐ．）、ネフロクロリス属種（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．）、ネフロセルミス属種（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．）、Ｎｉｔｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、ニッチア・アレクサンドリナ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ａｌｅｘａｎｄｒｉｎａ）、ニッチア・コミュニス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ニッチア・ディシパタ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｄｉｓｓｉｐａｔａ）、ニッチア・フルスツルム（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）、ニッチア・ハンチアナ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｈａｎｔｚｓｃｈｉａｎａ）、ニッチア・インコンスピクア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ）、
ニッチア・インテルメディア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ニッチア・ミクロケファラ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌａ）、ニッチア・プシラ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ）、ニッチア・プシラ・エリプチカ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ  ｅｌｌｉｐｔｉｃａ）、ニッチア・プシラ・モノエンシス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ  ｍｏｎｏｅｎｓｉｓ）、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｑｕａｄｒａｎｇｕｌａｒ、ニッチア属種（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）、オクロモナス属種（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、オオキスティス・パルバ（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖａ）、オオキスティス・プシラ（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）、オオキスティス属種（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、オシラトリア・リムネチカ（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｉｍｎｅｔｉｃａ）、オシラトリア属種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、オシラトリア・サブブレビス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｕｂｂｒｅｖｉｓ）、パラクロレラ・ケスレリ（ＰａｒａＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、パスケリア・アキドフィラ（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、パブロバ属種（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐ．）、ファグス属（Ｐｈａｇｕｓ）、フォルミジウム属（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）、プラチモナス属種（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プレウロクリシス・カルテレ（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ）、プレウロクリシス・デンタテ（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｄｅｎｔａｔｅ）、プレウロクリシス属種（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．）、プロトテカ・ウィケルハミイ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）、プロトテカ・ポルトリケンシス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ）、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）、シュードクロレラ・アクアチカ（ＰｓｅｕｄｏＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｃａ）、ピラミモナス属種（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ピロボトリス属（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、サルキノイド・クリソフィテ（Ｓａｒｃｉｎｏｉｄ  ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅ）、セネデスムス・アルマツス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、アオミドロ属（Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ）、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、スチココッカス属種（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、シネココッカス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、テトラエドロン属（Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ）、テトラセルミス属種（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．）、テトラセルミス・スエキカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ）、タラシオシラ・ワイスフロッギー（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）、及びビリディエラ・フリデリキアナ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ  ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａｎａ）が挙げられる。
【０１２３】
例示的な宿主細胞は、改変された脂肪酸プロファイル及び／又はグリセロ脂質における脂肪酸の改変された位置特異的分布を生じる油産生細胞、その細胞から生成される産物を特徴とする。油産生細胞の例としては、油産生藻類のものなどのプラスチド油産生細胞を含め、ＩＩ型脂質生合成経路を有する微生物細胞が挙げられる。細胞の具体的な例としては、Ｃｈｌｏｒｐｏｐｈｙａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ、クロレラ目（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ）、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅの従属栄養又は偏性ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｈｉｃ微細藻類が挙げられる。油産生微細藻類の例は、偏性従属栄養生物を含む属であるクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及びプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種を含め、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットに提供される。油産生細胞は、例えば、細胞重量基準で２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、又は約９０％の油（±５％）を生成する能力を有し得る。上述の公開公報はまた、かかる細胞を培養し及び特に微細藻類細胞から油を抽出する方法も開示している；かかる方法は本明細書に開示される細胞に適用することができる。本明細書に記載される任意の実施形態において、細胞は、細胞によるショ糖原料からの油の生成を可能にするための外来性インベルターゼ遺伝子を含む従属栄養細胞であり得る。
【０１２４】
１．プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）
一実施形態において、微生物はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の微生物である。天然に存在する及び組換えのプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の株は、脂質の生成に利用が見出される。
【０１２５】
プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）は、高度な脂質、特に燃料及び油脂化学品の生産に好適な脂質を生成することができるため、脂質の生成に用いる注目すべき微生物である。プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）によって生成される脂質は、他の微細藻類によって生成される脂質と比べてより短い鎖長及びより高い飽和度の炭化水素鎖を有する。さらに、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の脂質は色素を略含まず（低い乃至検出不能なレベルのクロロフィル及び特定のカロテノイド）、いずれにしても他の微細藻類からの脂質と比べて含まれる色素がはるかに少ない。さらに、本発明により提供される組換えプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞を使用すると、他の微生物からの脂質生成と比べてより高い収率及び効率で、且つコストを抑えて脂質を生成することができる。加えて、この微細藻類は従属栄養成長し、プロトテカ・ウィケルハミイ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）（ＵＴＥＸ  ３２７を含む）、プロトテカ・ポルトリケンシス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ）、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ株１４４１、１４３５を含む）、及びプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）のように遺伝子操作を受けることができる。プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種は偏性従属栄養生物である。
【０１２６】
本発明において使用されるプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種は、ゲノムの特定の標的領域を増幅することにより同定され得る。例えば、具体的なプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種又は株の同定は、例えばＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．（２００１）４２：１１５−１２１「リボソームＤＮＡ配列を使用したクロレラ属種分離株の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」に記載される方法を用いた、ゲノムの任意の領域を使用するプライマー及び方法論を用いた核及び／又は葉緑体ＤＮＡの増幅及び配列決定により実現することができる。十分に確立された系統発生解析方法、例えばリボソーム内部転写スペーサー（ＩＴＳ１及びＩＴＳ２  ｒＤＮＡ）、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、及び他の保存されたゲノム領域の増幅及び配列決定を当業者が使用して、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種のみならず、同様の脂質プロファイル及び生成能力を有する他の炭化水素及び脂質生成生物も同定することができる。藻類の同定及び分類方法の例については、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５  Ａｕｇｕｓｔ；１７０（４）：１６０１−１０及びＲＮＡ，２００５  Ａｐｒｉｌ；１１（４）：３６１−４もまた参照のこと。
【０１２７】
従って、ゲノムＤＮＡ比較を用いて、本発明で使用する好適な微細藻類種を同定することができる。限定はされないが、２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡなどの保存されたゲノムＤＮＡの領域を微細藻類種から増幅し、コンセンサス配列と比較して、本発明で使用される好ましい微細藻類と分類学的に近縁の微細藻類種をスクリーニングすることができる。プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の範囲内の種に関するかかるＤＮＡ配列比較の例を以下に示す。ゲノムＤＮＡ比較は、菌株コレクションで誤同定されている微細藻類種の同定にも有用であり得る。多くの場合に、菌株コレクションは微細藻類の種を表現型及び形態の特徴に基づき同定し得る。これらの特徴を用いると、微細藻類の種又は属が誤って分類されることが起こり得る。ゲノムＤＮＡ比較の使用は、微細藻類種をその系統発生関係に基づき分類する優れた方法であり得る。
【０１２８】
本発明で使用される微細藻類は、典型的には、配列番号６２〜７０に列挙される配列の少なくとも１つと少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は少なくとも８５％のヌクレオチド同一性を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列を有する。
【０１２９】
２．クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）
一実施形態において、微生物はクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微生物、例えば、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・ミヌチッシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、又はクロレラ・エメルソニイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）である。
【０１３０】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）は、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）に属する単細胞緑藻類の属である。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）は直径約２〜１０μｍの球形で、鞭毛を持たない。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の一部の種は天然で従属栄養性である。
【０１３１】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、特にクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）は、その高度な脂質組成、特にバイオディーゼルに好適な長鎖脂質により、変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現に使用される一つの微生物である。加えて、この微細藻類は従属栄養成長し、且つ遺伝子操作を受けることができる。
【０１３２】
一実施形態において、トランス遺伝子の発現に使用される微生物はクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の微生物、好ましくは、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ミヌチッシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、又はクロレラ・エメルソニイ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）である。トランス遺伝子の、例えばクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）における発現の例については、文献を参照することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３５（１９９７），ｐｐ．３５６−３６２；Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．２０００  Ｊｕｌｙ；１６（４）：４４３−６；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９），ｐｐ．３３５−３４１；Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００６）７２：１９７−２０５；Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４，６３−７３，２００２；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：５，３６５−３７０（２００１）；Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １８：９，７７８−７８０，（１９９９）；Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ  ４２（２）：２０９−２１６，（１９９９）；Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｊ  ２１（１）：１３−２０，（２００５）を参照のこと）。原核生物微細藻類を含む他の脂質生成微細藻類も同様に操作することができる（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５２，Ｎｕｍｂｅｒ  ４／Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９９を参照のこと）。
【０１３３】
３．クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）種の同定
変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現に使用されるクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の種は、ゲノムの特定の標的領域を増幅することにより同定され得る。例えば、具体的なクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の種又は株の同定は、例えばＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．（２００１）４２：１１５−１２１「リボソームＤＮＡ配列を使用したクロレラ属種分離株の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」に記載される方法を用いた、ゲノムの任意の領域を使用するプライマー及び方法論を用いた核及び／又は葉緑体ＤＮＡの増幅及び配列決定により実現することができる。十分に確立された系統発生解析方法、例えばリボソーム内部転写スペーサー（ＩＴＳ１及びＩＴＳ２  ｒＤＮＡ）、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、及び他の保存ゲノム領域の増幅及び配列決定を当業者が使用して、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の種のみならず、本明細書に開示される方法を用いることが可能な他の炭化水素及び脂質生成生物も同定することができる。藻類の同定及び分類方法の例については、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５  Ａｕｇｕｓｔ；１７０（４）：１６０１−１０  ａｎｄ  ＲＮＡ，２００５  Ａｐｒｉｌ；１１（４）：３６１−４も参照のこと。
【０１３４】
宿主細胞の例示的な実施形態としては、脂肪酸生合成酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を発現する組換え油産生細胞が挙げられる。結果として、一部の実施形態は、これまで天然油では得ることのできなかった天然油を特徴とする。ある場合には、この天然油は、非植物又は非種子油から得ることができなかったか、又は全く得ることができなかったものである。
【０１３５】
油産生細胞は貯蔵油を生成し、これは細胞の貯蔵小胞に貯蔵され得る。原料油は細胞から、細胞を破壊し及び油を単離することにより得られ得る。生成された油は、当該技術分野において公知のとおり、又は国際公開第２０１０／１２０９３９号パンフレットに記載されるとおり、精製、漂白及び脱臭（ＲＢＤ）され得る。原料油又はＲＢＤ油は、種々の食品、化学品、及び工業製品又は工業プロセスにおいて用いられ得る。油の回収後、有用な残渣バイオマスが残る。残渣バイオマスの使用には、紙、プラスチック、吸収剤、吸着剤の製造、動物用飼料として、人間の栄養用、又は肥料用が含まれる。
【０１３６】
トリグリセリド細胞油の脂肪酸プロファイルが提供される場合、それは、リン脂質が除去された条件下又はリン脂質の脂肪酸に実質的に非感受性の分析方法で（例えばクロマトグラフィー及び質量分析法を使用して）分析される細胞からの抽出された貯蔵油の非分画サンプルを指すことは理解されるであろう。細胞は油産生性であるため、ある場合には貯蔵油は、細胞中の全ＴＡＧのバルクを成し得る。
【０１３７】
様々な実施形態において、宿主細胞はプラスチド細胞、例えば、Ｃｈｌｏｒｐｏｐｈｙａ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｔａｅ、クロレラ目（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｌｅｓ）、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａｃａｅの従属栄養微細藻類である。様々な実施形態において、細胞は油産生性であり、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％の油を蓄積する能力を有する。細胞は偏性従属栄養生物、例えば、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）又はプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）を含めたプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種であってもよい。本明細書に記載される変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥをコードする核酸は、独立栄養藻類又は植物においても発現し得る。場合により、細胞はショ糖を使用して油を生成する能力を有し、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレット、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／２３６９６号明細書に記載されるとおり、組換えインベルターゼ遺伝子を導入してショ糖の代謝を可能にしてもよい。インベルターゼは、ここに言及する全ての遺伝子と同様に、コドン最適化され、及び細胞の染色体に組み込まれ得る。目的とする種々の藻類種及び植物種のコドン使用頻度は当該技術分野において公知であり、例えば、インターネット上のｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にあるコドン使用頻度データベースを参照することができる。
【０１３８】
本明細書に記載される変異アシル−ＡＣＰ  ＴＥをコードするポリヌクレオチドは、さらに、多種多様な植物宿主細胞で発現させることができる。特に、例えば温帯油糧種子作物を含め、食用及び工業的用途の植物油の生産に関わる植物の植物細胞が興味深い。目的の植物としては、限定はされないが、ブドウ種子（キャノーラ及び高エルカ酸品種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、クフェア、ダイズ、ピーナッツ、ココナツ及び油ヤシ、及びトウモロコシが挙げられる。
【０１３９】
Ｖ．微生物の培養方法
微生物は、遺伝子操作の実施と、続く炭化水素（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカン）の生成との両方の目的で培養される。前者のタイプの培養は、小規模で、且つ最初は少なくとも出発微生物が成長することのできる条件下において実施される。例えば、出発微生物が光独立栄養生物である場合、最初の培養は光の存在下で実施される。微生物が光とは独立して成長するように進化するか又はそのように操作された場合には、培養条件が変更され得る。炭化水素生成を目的とする培養は、通常大規模に実施される。好ましくは固定炭素源が存在する。この培養物もまた随時又は常時光に曝露され得る。
【０１４０】
微細藻類は液体培地中で培養することができる。培養物はバイオリアクター内に入れることができる。場合により、バイオリアクターは光を侵入させない。或いは、微細藻類は、固定炭素源が入った、且つ光が細胞に当たることを許容する光バイオリアクターで培養することもできる。それでもなお、微細藻類細胞の光への曝露は、細胞が輸送し且つ利用する固定炭素源の存在下（即ち、混合栄養成長）であっても、暗所での細胞培養と比較して成長が加速する。培養条件パラメータを操作して炭化水素総生成量、生成される炭化水素種の組み合わせ、及び／又は炭化水素種の生成を最適化することができる。場合によっては、例えば、培養物に光を当たらせない極めて大型の（例えば、１０，０００Ｌ、４０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、５００，０００Ｌ、又はそれ以上のバイオリアクター）発酵槽を使用するときなど、細胞は暗所で培養することが好ましい。
【０１４１】
微細藻類培養培地は、典型的には、固定窒素源、微量元素、場合によりｐＨ維持用の緩衝液、及びリン酸塩などの成分を含有する。他の成分としては、酢酸塩又はグルコースなどの固定炭素源、及び塩化ナトリウムなどの、特に海水微細藻類用の塩を挙げることができる。微量元素の例としては、例えば、ＺｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ及び（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏのそれぞれの形態の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、及びモリブデンが挙げられる。
【０１４２】
固定炭素源上で成長することが可能な生物に関して、固定炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、ガラクトース、キシロース、マンノース、ラムノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グリセロール、フロリドシド、及び／又はグルクロン酸であり得る。１つ以上の炭素源は、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、及び少なくとも約５００ｍＭの濃度の１つ以上の外因的に提供される固定炭素源で供給され得る。一部の微細藻類種は、光の非存在下でグルコース又は酢酸塩などの固定炭素源を利用することにより成長し得る。かかる成長は従属栄養成長として知られている。例えば、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）については、従属栄養成長は高生成量のバイオマス及び細胞中における高脂質含量の蓄積をもたらす。
【０１４３】
一部の微生物は、都市廃棄物、二次処理下水、廃水などの不均一化合物供給源である固定炭素源、及び他の固定炭素源並びに他の栄養素、例えば硫酸、リン酸、及び硝酸で天然で成長するか、又はそこで成長するように操作することができる。下水成分は炭化水素の生成における栄養素源として働き、この培養は安価な炭化水素供給源を提供する。
【０１４４】
培養培地のｐＨ、微量元素のアイデンティティ及び濃度並びに他の培地構成物質など、他の培養パラメータもまた操作することができる。
【０１４５】
Ａ．光合成成長
特定の微細藻類は光の存在下で成長することができる。微細藻類細胞の培養物に当たる光子の数を、波長スペクトル及び１日の明暗時間比などの他のパラメータとともに操作することができる。微細藻類はまた、自然光下で、並びに自然光と人工光とを同時に及び／又は交互に組み合わせて培養することもできる。例えば、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の特定の微細藻類種は、日中は自然光下で及び夜間は人工光下で培養することができる。
【０１４６】
微細藻類などの微生物を成長させる光バイオリアクターのガス含有量を操作することができる。光バイオリアクターの容積の一部は、液体ではなくガスを含み得る。ガス注入口を使用して光バイオリアクターにガスをポンピングすることができる。空気、空気／ＣＯ２混合物、アルゴンなどの希ガス等を含め、任意のガスを光バイオリアクターにポンピングし得る。ガスが光バイオリアクターに入る速度もまた操作することができる。光バイオリアクターへのガスフローを増加させると、微細藻類の培養物の濁度が増加する。ガスを光バイオリアクターへと搬送するポートの配置もまた、所与のガスフロー速度における培養物の濁度に影響を及ぼし得る。空気／ＣＯ２混合物を調節して、特定の生物による最大の成長に最適な量のＣＯ２を生じさせることができる。微細藻類は明所において、例えば３％ＣＯ２／９７％空気下では、１００％空気中と比べて著しく速く成長する。３％ＣＯ２／９７％空気のＣＯ２は、空気中に存在するＣＯ２より約１００倍多い。例えば、バイオリアクター又は光バイオリアクターには、約９９．７５％空気：０．２５％ＣＯ２、約９９．５％空気：０．５％ＣＯ２、約９９．０％空気：１．００％ＣＯ２、約９８．０％空気：２．０％ＣＯ２、約９７．０％空気：３．０％ＣＯ２、約９６．０％空気：４．０％ＣＯ２、及び約９５．００％空気：５．０％ＣＯ２の空気：ＣＯ２混合物を注入することができる。
【０１４７】
微細藻類培養物は、回転ブレード及びインペラなどの装置、培養物の揺動、撹拌子、加圧ガスの注入、及び他の器具を使用して混合に供することもできる。
【０１４８】
光バイオリアクターは、微細藻類が入ったチャンバに気体、固体、半固体及び液体を流入させるポートを有し得る。ポートは、通常、管類又は他の物質の搬送手段に取り付けられる。例えばガスポートは培養物へとガスを搬送する。光バイオリアクターへのガスのポンピングは、細胞にＣＯ２及び他のガスを供給し、且つ培養物を曝気して、従って濁度を生じさせる働きをし得る。培養物の濁度の大きさは、ガスポートの数及び位置を変えると変化する。例えば、ガスポートは、円筒形のポリエチレンバッグの底に沿って配置され得る。空気にＣＯ２が加えられ、光バイオリアクター中で泡立つと、微細藻類の成長が速まる。例えば、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）細胞が入った光バイオリアクターに、５％ＣＯ２：９５％空気の混合物が注入される（例えば、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｊｕｎ．２８；５４（１３）：４５９３−９；Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．１９９９；８７（６）：８１１−５；及びＪ  Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００３  Ｊｕｎｅ；６６（６）：７７２−８を参照のこと）。
【０１４９】
光バイオリアクターは１つ以上の光源に曝露され、光バイオリアクターの表面に当てられる光によるエネルギー源として微細藻類に光を提供し得る。好ましくは光源は、細胞が成長するのに十分な、しかし酸化損傷を引き起こしたり、又は光阻害反応を引き起こしたりする程は強くない強度を提供する。場合によっては光源は、太陽の波長範囲を模倣する又はほぼ模倣する波長範囲を有する。他の場合には、別の波長範囲が用いられる。光バイオリアクターは、屋外又は温室内又は太陽光が表面に当たることが可能な他の施設に置かれ得る。ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）の種に好ましい光子強度は２５〜５００μＥｍ−２ｓ−１である（例えば、Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ  Ｒｅｓ．２００５  Ｊｕｎｅ；８４（１−３）：２１−７を参照のこと）。
【０１５０】
光バイオリアクターは好ましくは、培地を流入させる１つ以上のポートを有する。必ずしも一つの物質のみがポートを出入りする必要はない。例えば、ポートを使用して培養培地を光バイオリアクターに流し込んでもよく、次に後にサンプリング、ガス流入、ガス流出、又は他の目的に使用することができる。場合によっては、光バイオリアクターは培養開始時に培養培地で満たされ、培養物が接種された後はそれ以上成長培地は注入されない。換言すれば、微細藻類バイオマスがある期間水性媒体中で培養され、その間に微細藻類は増殖し、数が増加する；しかしながらその全期間を通じて水性培養培地の分量が光バイオリアクターを通って流れることはない。従って一部の実施形態では、水性培養培地が接種後に光バイオリアクターを通って流れることはない。
【０１５１】
他の場合には、微細藻類が増殖し、数が増加する全期間を通じて培養培地は光バイオリアクターを通って流れることができる。一部の実施形態では、接種後、但し細胞が所望の密度に達する前まで、光バイオリアクターに培地が注入される。換言すれば、前記微細藻類の数の所望の増加が達成されるまで微細藻類の増殖のためにガス流入及び培地流入の乱流レジームが維持されることはない。
【０１５２】
光バイオリアクターは好ましくは、ガスを流入させる１つ以上のポートを有する。ガスは、ＣＯ２などの栄養素の供給並びに培養培地における乱流の提供の両方の役割を果たし得る。乱流は、ガス流入ポートを水性培養培地の液面より下側に、光バイオリアクターに流入するガスが培養物の表面まで泡立つように配置することにより実現し得る。１つ以上のガス流出ポートがガスを逃がし、従って光バイオリアクターの圧力上昇を防止する。好ましくはガス流出ポートは「一方向」バルブにつながり、このバルブが光バイオリアクターへの汚染微生物の流入を防止する。場合によっては、細胞は光バイオリアクターである期間培養され、その間に微細藻類は増殖し、数が増加するが、しかしながら培養培地のほぼ全体にわたる乱流渦がガス流入により引き起こされる乱流レジームがその全期間を通じて維持されるわけではない。他の場合には、培養培地のほぼ全体にわたる乱流渦がガス流入により引き起こされる乱流レジームは、微細藻類が増殖し、数が増加する期間全てにわたり維持され得る。場合によっては、微細藻類が増殖し、数が増加する期間は、光バイオリアクターの規模と渦の規模との間の所定範囲の比が維持されない。他の場合には、かかる範囲が維持され得る。
【０１５３】
光バイオリアクターは好ましくは、培養物のサンプリングに用いることのできる少なくとも１つのポートを有する。好ましくはサンプリングポートは、培養物の純培養性を変化させ、損なうことなしに、繰り返し使用することができる。サンプリングポートは、サンプルフローの停止及び開始を可能にするバルブ又は他の装置を伴い構成され得る。或いは、サンプリングポートは連続サンプリングを可能にしてもよい。光バイオリアクターは好ましくは、培養物の接種を可能にする少なくとも１つのポートを有する。かかるポートはまた、培地又はガスの流入など、他の目的にも用いることができる。
【０１５４】
Ｂ．従属栄養成長
上記に記載したとおりの微生物の光合成成長に代わるものとして、一部の微生物は、固定炭素源が成長及び脂質蓄積のエネルギーを供給する従属栄養成長条件下で培養することができる。
【０１５５】
本発明における一つの従属栄養培養方法では、バイオディーゼルの生産コスト、脂質エステル転移反応の副産物として生成される粗製の、部分的に精製された、又は精製されたグリセロールを、発酵原料、例えば脂質生成微生物の培養物として用いることができる。従って、本発明は、第１の微生物培養物において微生物（例えば、微細藻類）を培養するステップと；培養物から微生物脂質を回収するステップと；上記に記載したとおり、１つ又は複数の脂肪酸エステル及びグリセロールを生成するため微生物脂質をエステル転移反応に供するステップと；原料としてグリセロールを第２の微生物培養物に加えるステップとを含む。第１及び第２の微生物培養物は、必須ではないが、同じ微生物の培養物であってもよい。必要に応じて連続的なシステムが考案されてもよく、従って培養物から回収された脂質から生成されるグリセロールが同じ培養物に再び供給され得る。
【０１５６】
本発明は、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、及びスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）の微生物を含めた、真核微生物及び原核微生物の両方の複数の属の発酵に対するグリセロールの使用を取り入れて、大幅に向上した培養パラメータを提供する。実施例で実証されるとおり、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、及びスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）を含めた極めて多岐にわたる進化系統の微生物、並びに複数の個別的なプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）及び／又はクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の種及び株の培養物は、精製試薬グレードのグリセロールのみならず、バイオディーゼルエステル転移反応からの酸性及び非酸性グリセロール副産物上でもまた非常に良好に成長する。場合によっては、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）株などの微細藻類は、グルコースの存在下と比べてグリセロールの存在下でより速い細胞分裂を起こす。これらの例では、細胞が初めにグリセロールを供給されて細胞密度を急速に増加させ、次にグルコースを供給されて脂質を蓄積する２段階成長プロセスが、脂質の生成効率を改善し得る。エステル転移反応プロセスのグリセロール副産物の使用は、生成プロセスに戻される場合、顕著な経済的利点をもたらす。グリセロールとグルコースとの混合物など、他の供給方法も同様に提供される。かかる混合物の供給によってもまた、同じ利益が得られる。加えて、本発明は、グリセロールとの様々な組み合わせでショ糖などの代替的な糖類を微細藻類に供給する方法を提供する。本発明により提供されるこれらの利益は、本明細書において、原核生物及び真核生物の両方を含む極めて多岐にわたる進化系統の微生物に関して実証されており、微生物発酵に対する本発明の有用性を実証している。
【０１５７】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）を成長及び増殖させる標準方法は公知である（例えば、Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１１：８５−９３及びＭｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６を参照のこと）。加えて、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の複数の種及び種内の複数の株が、バイオディーゼルエステル転移反応からのグリセロール副産物を含め、グリセロールの存在下で成長することができる。
【０１５８】
炭化水素の生成については、本明細書に記載される組換え細胞を含め、細胞が、好ましくは多量に培養又は発酵される。培養は大容積の液体中での培養、例として浮遊培養などであってもよい。他の例としては、細胞の小さい培養物で出発し、それを細胞成長及び増殖並びに炭化水素生成との組み合わせで拡大して大きいバイオマスにすることが挙げられる。バイオリアクター又は鋼製発酵槽を使用して大容積培養物を収容し得る。ビール及び／又はワインの製造に使用されるものと同様の発酵槽が、エタノールの製造で使用される超大型発酵槽と同様に好適である。
【０１５９】
発酵槽における培養に適切な栄養源が提供される。それらとしては、以下の１つ以上などの原材料が挙げられる：固定炭素源、例えば、グルコース、コーンスターチ、解重合セルロース系材料、ショ糖、サトウキビ、サトウダイコン、ラクトース、乳清、又は糖蜜；脂肪源、例えば、脂肪又は植物油；窒素源、例えば、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、アンモニア（純粋又は塩形態）、硝酸又は硝酸塩、又は窒素分子；及びリン源、例えばリン酸塩。加えて、発酵槽は、温度、ｐＨ、酸素分圧、及び二酸化炭素レベルなどの培養条件の制御が可能である。場合により、酸素又は窒素などの気体成分は、液体培養物中で泡立たせることができる。コムギ、ジャガイモ、コメ、及びモロコシなどの他のデンプン（重合グルコース）源。他の炭素源には、工業グレードグリセロール、黒液、酢酸などの有機酸、及び糖蜜などのプロセス流が含まれる。炭素源はまた、ショ糖と解重合サトウダイコンパルプとの混合物など、混合物として提供されてもよい。
【０１６０】
発酵槽を使用して、細胞にその成長周期の様々な段階を経させることができる。例として、炭化水素生成細胞の接種材料が培地に導入され、その後に遅延期間（誘導期）が続いた後、細胞が成長し始め得る。この誘導期間の後、成長速度は徐々に増加し、対数期、即ち指数増殖期に入る。次には指数増殖期の後に、栄養素の減少及び／又は毒物の増加に起因して成長の減速が続く。この減速の後、成長が止まり、細胞は、細胞に提供される特定の環境に応じて静止期又は定常状態に入る。
【０１６１】
本明細書に開示される細胞による炭化水素生成は、対数期又はその後、例えば、栄養素が補給されるか又はなおも利用可能であって、細胞分裂がない中で炭化水素生成を継続することが可能な静止期に生じ得る。
【０１６２】
様々な実施形態において、本明細書に記載される条件を用いて成長した微生物は、及び少なくとも約２０重量％の脂質、好ましくは少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、及びより好ましくは少なくとも約６０重量％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％又は８５重量％を含む。
【０１６３】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の複数の種、及び種内の複数の株は、等価な量の試薬グレードのグリセロール中と比べてエステル転移反応からのグリセロール副産物の存在下でより良好に機能する。エステル転移反応からのグリセロール副産物は、通常、グリセロールに加えて残留メタノール及び他の夾雑物を含む。例えば、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）種の株は、純粋試薬グレードグリセロール上で成長させる場合と比べて、脂質エステル転移反応からの酸性及び非酸性グリセロール副産物上でより良好な生産性を呈し得る。セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）及びフナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）微細藻類などの他の微生物もまた、等価な量の試薬グレードのグリセロールと比べて、エステル転移反応からのグリセロール副産物の存在下でより良好に機能し得る。様々な実施形態において、乾燥細胞重量は、純粋なグリセロール上と比べてバイオディーゼルグリセロール副産物上でより高い。例えば、１リットルのセネデスムス・アルマツス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ）及びナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）当たりの乾燥細胞重量は、純粋試薬グレードグリセロール上と比べて酸性及び非酸性バイオディーゼル副産物グリセロール上でより高い。さらに、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の複数の種及びクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種内の複数の株について、１リットル当たりの脂質レベルは、細胞がバイオディーゼルグリセロール副産物の存在下で培養される場合に、等価な濃度の純粋試薬グレードグリセロールの存在下で培養した場合と比べてより高い。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の複数の種及びクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種内の複数の株、並びにスピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）及びセネデスムス・アルマツス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ）は、バイオディーゼルグリセロール副産物の存在下で培養される場合に、等価な濃度の純粋試薬グレードグリセロールの存在下で培養した場合と比べて乾燥細胞重量のより高い割合を脂質として蓄積する。
【０１６４】
別の意外な結果は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）などの微細藻類を含めた微生物の複数の種及びクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の種内の複数の株、並びにセネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、及びスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）などの他の微細藻類が、グルコースのみの存在下と比べて、グリセロールとグルコースとの混合物の存在下でバイオディーゼル産生株としてより良好な特性を呈することである。
【０１６５】
微生物脂質生成における生産性の３つの異なるマーカー（１リットル当たりの乾燥細胞重量、脂質の１リットル当たりのグラム数、及び脂質としての乾燥細胞重量の割合）が、バイオディーゼル副産物と炭素源の一時的分離とを使用することにより改善する。従って本発明は、原核生物及び真核生物の双方を含め、系統樹の極めて多岐にわたる範囲の微生物の複数の種において単位時間当たりにより多量の脂質を産生する新規方法を提供する。グリセロールを使用した本明細書に開示される脂質及び炭化水素の製造方法は、微細藻類に限られず、グリセロールをエネルギー源として利用する能力を有する任意の微生物で用いられ得る。
【０１６６】
本発明における代替的な従属栄養成長法では、解重合セルロース系バイオマスを供給原料として使用して微生物を培養することができる。セルロース系バイオマス（例えば、コーンストーバーなどのストーバー）は安価であり、容易に入手し得る；しかしながら、この材料を酵母用の供給原料として使用する試みは失敗している。詳細には、かかる供給原料は酵母の成長に対して阻害性であり、酵母はセルロース系材料から生成された五炭糖（例えば、ヘミセルロース由来のキシロース）を利用できないことが分かっている。対照的に、微細藻類は加工されたセルロース系材料で成長することができる。従って、本発明は、セルロース系材料及び／又は五炭糖の存在下で微細藻類を培養する方法を提供する。セルロース系材料は、概して成分のパーセント乾燥重量として４０〜６０％のセルロース、２０〜４０％のヘミセルロース、及び１０〜３０％のリグニンを含む。
【０１６７】
好適なセルロース系材料としては、草本及び木質エネルギー作物、並びに農作物の残渣、即ち、一次的な食物又は繊維産物と共に耕作地から取り去られることのない植物部位、主として茎及び葉が挙げられる。例としては、農業廃棄物、例えば、サトウキビバガス、もみ殻、トウモロコシ繊維（茎、葉、皮、及び穂軸を含む）、小麦わら、稲わら、サトウダイコンパルプ、柑橘パルプ、柑橘果皮；林業廃棄物、例えば、堅木及び軟木間伐材、並びに材木作業からの堅木及び軟木廃材；木材廃棄物、例えば製材廃棄物（木材チップ、おがくず）及びパルプ工業廃棄物；都市廃棄物、例えば都市固形廃棄物の紙破砕物、都市木材廃棄物及び都市の植物性廃棄物、例えば自治体の芝生の刈り屑；及び木造建築廃棄物が挙げられる。さらなるセルロース系材料としては、専用のセルロース作物、例えば、スイッチグラス、雑種ポプラ材、及び茅、繊維トウ、及び繊維モロコシが挙げられる。かかる材料から生成される五炭糖としては、キシロースが挙げられる。
【０１６８】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の一部の種は、本明細書において、グルコースとキシロースとの組み合わせで培養されると、グルコース又はキシロースのいずれか単独で培養される場合と比べてより高い生産性を呈することが示されている。この相乗効果は、セルロース系材料などの、キシロースとグルコースとの組み合わせでのクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の培養を実現する点で、顕著な利点をもたらす。
【０１６９】
それ自体が場合により上記に記載する方法と組み合わせて用いられ得るなおも別の代替的従属栄養成長法では、例としてサトウキビ又はサトウダイコンから生成されるショ糖が、供給原料として使用される。以下の「微生物操作」と題される節にさらに詳細に記載されるとおり、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）などの微生物をショ糖を炭素源として利用するように操作することにより、脂質生成を促進し、又はより効率的にすることができる。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼの発現により、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）がショ糖を培養培地から細胞へと輸送し、且つショ糖を加水分解してグルコース及びフルクトースを産生することが可能になる。場合により、フルクトースのリン酸化を最大化するには内因性ヘキソキナーセ活性が不十分な例では、フルクトキナーゼも同様に発現させることができる。好適なショ糖トランスポーターの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＤ９１３３４、ＣＡＢ９２３０７、及びＣＡＡ５３３９０である。好適なショ糖インベルターゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＢ９５０１０、ＮＰ０１２１０４及びＣＡＡ０６８３９である。好適なフルクトキナーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２６９８４、Ｐ２６４２０及びＣＡＡ４３３２２である。かかる遺伝子の１つ以上をコードするクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）を含めた微細藻類の形質転換用ベクターは、本明細書に記載されるとおり設計することができる。
【０１７０】
ショ糖インベルターゼの分泌により、ショ糖を細胞に輸送することのできるトランスポーターの発現が不要となり得る。これは、分泌されたインベルターゼがショ糖分子からグルコース分子及びフルクトース分子（このいずれもが本明細書に開示される微生物によって輸送され及び利用され得る）への変換を触媒するためである。例えば、分泌シグナルと共にショ糖インベルターゼが発現すると、細胞外部にインベルターゼ活性が生じる。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）で活性の分泌シグナルの例については、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９），ｐｐ．３３５−３４１を参照のこと。本明細書に開示される遺伝子操作方法によって可能になるとおりの、かかるタンパク質の発現により、既に細胞外グルコースをエネルギー源として利用可能な細胞がショ糖を細胞外エネルギー源として利用することが可能になる。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞は、細胞外フルクトース及び細胞外グルコースの両方をエネルギー源として使用することができ、インベルターゼの分泌が、効率的で安価なエネルギー源としてのショ糖の使用に必要な唯一の触媒活性をもたらし得る。
【０１７１】
例えば、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞は、３つのプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣＭＶ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスプロモーター（ＣＶ）、又はクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ＨＵＰ１プロモーター（ＨＵＰ  １））のうちの一つの調節制御下にあるショ糖インベルターゼ遺伝子で操作することができる。この例で使用されるショ糖インベルターゼ遺伝子は、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）のコドン使用頻度に最適化するためのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子の修飾を含む。本明細書に記載されるものなどの、分泌性ショ糖インベルターゼの発現は、細胞発酵に対する糖蜜、サトウキビ汁、及び他のショ糖含有供給原料の使用を可能にする。
【０１７２】
外因性の分泌性ショ糖インベルターゼを発現する微生物の成長能は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の培養培地にインベルターゼを添加することにより示される。クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞は、純粋試薬グレードグルコース上で成長し得るのと同様に、サトウキビ加工からの廃糖蜜上でも成長することができる；この低価値のサトウキビ加工廃棄物を使用することにより、炭化水素及び他の油の生産に大幅なコスト削減がもたらされ得る。糖蜜は、リグニン及びその他の、多くの微生物を毒し且つその成長を遅らせるセルロース廃棄物を含有するが、しかしながらクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞はかかる毒物の存在下でも良く育つことが発見された。
【０１７３】
或いは、ショ糖インベルターゼは、ショ糖トランスポーターを発現する細胞内、並びにショ糖が細胞に侵入することを可能にする任意の糖質トランスポーターを発現する細胞内で細胞内発現させてもよい。
【０１７４】
バイオリアクターは従属栄養成長法での使用に用いられ得る。理解されるであろうとおり、本明細書に記載される従属栄養成長法で固定炭素源を使用する場合、光合成成長法において細胞が光を利用できるようにするために提供されるものは不要である。
【０１７５】
本明細書に記載されるプロセス条件及び従属栄養成長法の具体的な例は、微生物成長及び／又は脂質産生の効率を向上させる任意の好適な方法で組み合わせることができる。加えて、本発明は、上述の方法での使用にさらに一層好適な微生物を作製するための微生物、例えば微細藻類の選択及び／又は遺伝子操作を含む。例えば、増殖及び／又は脂質（例えば、脂肪酸）生成を増加させるため上述の供給原料のいずれかのさらに高い利用能を有する微生物は、本発明の範囲内である。
【０１７６】
Ｃ．混合栄養成長
混合栄養成長は、エネルギー源として光と１つ又は複数の固定炭素源との両方を使用した細胞の成長及び炭化水素生成である。混合栄養成長は光バイオリアクターで実施することができる。微細藻類は、様々な種類の透明又は半透明材料製の閉鎖型光バイオリアクターで成長させ及び維持することができる。かかる材料には、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（商標）エンクロージャ、ガラスエンクロージャ、ポリエチレンなどの材料製のバッグ、透明又は半透明パイプ、及び他の材料が含まれ得る。微細藻類は、レースウェイポンド、沈殿池、及び他の非密閉型容器などの開放型光バイオリアクターで成長させ及び維持することができる。
【０１７７】
Ｄ．成長培地
本発明の方法において有用な微生物は、世界中の様々な場所及び環境に見出される。他の種からのその分離及びもたらされるその進化的分岐の結果として、最適成長並びに脂質及び／又は炭化水素構成成分の産生のための特定の成長培地を予測することは困難であり得る。ある場合には、微生物のある種の株が、何らかの阻害成分の存在又は微生物の特定の株が要求する何らかの必須栄養要件の欠如が原因となって、特定の成長培地で成長できないこともある。
【０１７８】
固体及び液体成長培地は、概して、多種多様な供給源から利用可能であり、微生物の多種多様な株に好適な特定の培地の調製に関する説明については、例えば、テキサス大学オースティン校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ）が藻類のそのカルチャーコレクションを管理しているサイト（ＵＴＥＸ）であるオンライン上のｕｔｅｘ．ｏｒｇ／を参照することができる。例えば、様々な淡水及び海水培地が、米国特許出願公開第２０１２／０２８８９３０号明細書（本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される）に提供される。
【０１７９】
特定の例において、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞の培養に好適な培地には、プロテオース培地が含まれる。この培地は純粋培養に好適であり、１リットルのブリストル培地に１ｇのプロテオースペプトンを添加することにより１Ｌ容積の培地（ｐＨ約６．８）を調製することができる。ブリストル培地は、水溶液中に２．９４ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１７ｍＭ  ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、０．４３ｍＭ、１．２９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、及び１．４３ｍＭ  ＮａＣｌを含む。１．５％寒天培地については、１Ｌのこの溶液に１５ｇの寒天を添加することができる。溶液は覆われてオートクレーブされ、次に使用時まで冷蔵温度で保管される。
【０１８０】
本明細書に記載される方法で使用される他の好適な培地は、上記に特定したＵＲＬを参考にするか、又は微生物培養株を管理する他の機関、例えば、ＳＡＧ、ＣＣＡＰ、又はＣＣＡＬＡなどに情報を求めることにより容易に同定することができる。ＳＡＧは、ゲッティンゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、独国）の藻類カルチャーコレクションを指し、ＣＣＡＰは、スコットランド海洋科学協会（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｓｃｏｔｌａｎｄ、英国）が管理する藻類及び原生動物のカルチャーコレクションを指し、及びＣＣＡＬＡは、植物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ）（Ｔ｛（ｒ）の上にハチェック｝ｅｂｏ｛（ｎ）の上にハチェック｝、チェコ共和国）の藻類研究所のカルチャーコレクションを指す。
【０１８１】
Ｅ．脂質収率の増加
プロセス条件を調整することにより、特定の用途に好適な脂質の収率を増加させ及び／又は生産コストを削減することができる。例えば、特定の実施形態では、油産生細胞（例えば、植物、藻類、微細藻類）が制限濃度の１つ以上の栄養素、例えば、炭素及び／又は窒素、亜リン酸、又は硫黄などの存在下で、過剰の固定炭素エネルギー、例えばグルコースを供給しながら培養される。窒素制限は、窒素が過剰に供給される培養物の微生物脂質収率と比べて微生物脂質収率を増加させる傾向がある。詳細な実施形態において、脂質収率の増加は少なくとも約：１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、又は５００％である。油産生細胞（例えば、植物細胞、藻類細胞、微細藻類細胞）は、全培養期間の一部又は期間全体にわたり制限量の栄養素の存在下で培養することができる。詳細な実施形態において、栄養素濃度は、制限濃度と非制限濃度とが全培養期間中に少なくとも２回繰り返される。
【０１８２】
脂質収率を増加させるため、脂質を生成する油産生細胞又は生物（例えば、植物、藻類、微細藻類）の供給原料に酢酸を用いることができる。酢酸は、脂肪酸合成を開始する代謝ポイント（即ち、アセチル−ＣｏＡ）に直接供給され；従って培養物中に酢酸が提供されると、脂肪酸産生が増加し得る。概して、油産生細胞又は生物は、微生物脂質収率、及び／又は微生物脂肪酸収率を、具体的には酢酸の非存在下における微生物脂質（例えば、脂肪酸）収率と比べて増加させるのに十分な量の酢酸の存在下で培養される。
【０１８３】
別の実施形態では、脂質を生成する油産生細胞又は生物（例えば、植物、藻類、微細藻類）を、脂質経路酵素（例えば、脂肪酸合成酵素）に対する１つ以上の補因子の存在下で培養することにより脂質収率を増加させる。概して、１つ又は複数の補因子の濃度は、その１つ又は複数の補因子の非存在下における微生物脂質収率と比べて微生物脂質（例えば、脂肪酸）収率を増加させるのに十分である。詳細な実施形態において、１つ又は複数の補因子は、その１つ又は複数の補因子をコードする外来遺伝子を含有する油産生細胞（例えば、植物細胞、藻類細胞、微細藻類細胞）を培養物に含めることにより培養物に提供される。或いは、１つ又は複数の補因子は、その補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する油産生細胞（例えば、植物、藻類、微細藻類）を含めることにより培養物に提供されてもよい。特定の実施形態では、好適な補因子には、脂質経路酵素が要求する任意のビタミン、例えば：ビオチン、パントテン酸などが含まれる。本発明での使用に好適な補因子をコードするか、又はかかる補因子の合成に関与する遺伝子は周知されており、上記及び本明細書に記載されるものなどのコンストラクト及び技法を使用して油産生細胞（例えば、植物細胞、藻類細胞、微細藻類細胞）に導入することができる。
【０１８４】
様々な実施形態において、細胞は、１つ以上の脂肪酸タイプに関して完全に栄養要求性又は部分的に栄養要求性（即ち、合成罹病性（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｃｋｎｅｓｓ）又は合成致死性）であり得る。細胞は１つ又は複数の脂肪酸の補給を伴い培養され、それにより細胞数が増加し、次に細胞が油を（例えば、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０％まで）蓄積することが可能となる。或いは、細胞は、環境条件に基づき活性を切り換えることのできる調節可能な脂肪酸合成遺伝子を含み、第１の細胞分裂期間中の環境条件は脂肪酸の産生に好ましく、且つ第２の油蓄積期間中の環境条件は脂肪酸の生成に好ましくない。
【０１８５】
これらの補給又は調節方法のいずれかを適用する結果として、最適な細胞増殖に必須の１つ以上の脂肪酸を少量有する細胞から細胞油を得ることができる。得られ得る油の具体的な例としては、ステアリン酸、リノール酸及び／又はリノレン酸が少ないものが挙げられる。場合により、細胞は油産生プラスチド微生物、例えばＣｈｌｏｒｐｈｙｔａのものである。
【０１８６】
従って、一部の実施形態では、油又は脂肪の生成方法が提供される。この方法は、増殖期において、ある脂肪酸の存在に起因して細胞数が増加するよう細胞分裂に許容的な第１の条件セットの下で組換え油産生細胞を培養するステップと、油生成期において、細胞分裂に制限的であるが、その脂肪酸が枯渇した油の生成には許容的な第２の条件セットの下で細胞を培養するステップと、細胞から油を抽出するステップとを含み、ここで細胞は、脂肪酸合成酵素の活性を抑える働きをする突然変異又は外来核酸を有し、この酵素は場合により、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、Δ１２脂肪酸デサチュラーゼ、又はケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。脂肪酸は油中で少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０枯渇し得る。細胞は従属栄養培養され得る。
【０１８７】
様々な実施形態において、細胞は微細藻類細胞であってもよく、乾燥細胞重量基準で少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の油を生成し得る。
【０１８８】
ＶＩ．脂質及び炭化水素の回収方法
本明細書に記載される細胞により生成される炭化水素（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカン）は、任意の好都合な手段により採収され、又は他の形で収集され得る。例えば、細胞から分泌される炭化水素を遠心することにより、水層中の夾雑物から、及び場合により遠心後の沈殿物としての任意の固形材料から、疎水性層中の炭化水素を分離することができる。遠心前又は遠心後に、細胞又は細胞画分を含有する材料をプロテアーゼで処理して夾雑タンパク質を分解することができる。場合によっては夾雑タンパク質は、炭化水素又はタンパク質が取り除かれたときに炭化水素を形成する炭化水素前駆体と、場合により共有結合的に会合する。他の場合には、炭化水素分子は、同様にタンパク質を含有する調製物中にある。タンパク質を含有する炭化水素調製物にプロテアーゼを添加してタンパク質を分解することができる（例えば、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のプロテアーゼを使用することができる（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ５１４７）。消化後、炭化水素は好ましくは残留タンパク質、ペプチド断片、及びアミノ酸から精製される。この精製は、例えば、遠心及びろ過などの上記に挙げた方法により達成することができる。
【０１８９】
細胞外炭化水素はまた、本来無菌である環境において非毒性抽出溶媒に細胞を曝露し、続いて生細胞と抽出溶媒及び炭化水素の疎水性画分とを分離することにより生きている微細藻類細胞からインビボで抽出し、次にそれをバイオリアクターに戻すことができ、ここで分離された生細胞は、次にステンレス鋼発酵槽又は光バイオリアクターなどの培養容器に戻される（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００４  Ｄｅｃ．５；８８（５）：５９３−６００及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００４  Ｍａｒ．５；８５（５）：４７５−８１を参照のこと）。
【０１９０】
炭化水素はまた、全細胞抽出により単離することもできる。初めに細胞が、「細胞の溶解」と題される節に記載されるとおり破壊され、次に細胞内の及び細胞膜／細胞壁に会合した炭化水素並びに細胞外炭化水素が、上記に記載したとおり遠心の使用によるなどして全細胞集団から収集され得る。
【０１９１】
炭化水素及び脂質と上記の方法によって生成された細胞溶解物との分離には、様々な方法が利用可能である。例えば、炭化水素をヘキサンなどの疎水性溶媒で抽出することができる（Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：７１７を参照のこと）。炭化水素はまた、液化（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４を参照のこと）；油の液化（例えば、Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照のこと）；及び超臨界ＣＯ２抽出（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４を参照のこと）を用いて抽出することもできる。
【０１９２】
Ａ．細胞の溶解
微生物中で生成される細胞内脂質及び炭化水素は、一部の実施形態では、微生物の細胞を溶解した後に抽出される。抽出後、脂質又は炭化水素をさらに精製して油、燃料、又は油脂化学品を生成することができる。
【０１９３】
培養の完了後、微生物を発酵ブロスから分離することができる。場合により、この分離は遠心によって行われ、濃縮ペーストを生じる。遠心は微生物から細胞内の水をほとんど除去せず、乾燥ステップではない。次にバイオマスを洗浄溶液（例えば、ＤＩ水）で洗浄して発酵ブロス及び残屑を取り除くことができる。場合により、洗浄された微生物バイオマスはまた、細胞破壊前に乾燥（オーブン乾燥、凍結乾燥等）させてもよい。或いは、細胞は、発酵の完了時に発酵ブロスの一部又は全てから分離することなく溶解させてもよい。例えば、細胞は、細胞の溶解時における細胞と細胞外液体との比が１：１ｖ：ｖ未満であってもよい。
【０１９４】
脂質及び／又は炭化水素を含有する微生物を溶解させて溶解物を生成することができる。本明細書に詳述されるとおり、微生物を溶解するステップ（細胞溶菌とも称される）は、熱誘導溶菌、塩基の添加、酸の添加、プロテアーゼ及び多糖類分解酵素、例えばアミラーゼなどの酵素の使用、超音波の使用、機械的溶菌、浸透圧ショックの使用、溶菌性ウイルスによる感染、及び／又は１つ以上の溶菌性遺伝子の発現を含め、任意の好都合な手段によって実現し得る。溶菌は、微生物によって生成された細胞内分子を放出するように実施される。微生物を溶解させるためのこれらの方法の各々は、単一の方法として、又は同時に若しくは逐次的に組み合わせて用いることができる。
【０１９５】
細胞破壊の程度は顕微鏡分析によって観察することができる。本明細書に記載される方法の１つ以上を用いると、典型的には７０％より高い細胞破壊率が観察される。好ましくは、細胞破壊率は８０％より高く、より好ましくは９０％より高く、及び最も好ましくは約１００％である。
【０１９６】
詳細な実施形態において、微生物は成長後に溶解され、例えばそれにより、抽出又はさらなる処理のための細胞脂質及び／又は炭化水素の露出を増加させる。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現（例えば、誘導性プロモーターによる）又は細胞溶菌のタイミングは、脂質及び／又は炭化水素の収率が最適化されるように調整することができる。以下にいくつかの溶菌技法を記載する。これらの技法は個々に又は組み合わせて使用することができる。
【０１９７】
１．熱誘導溶菌
一部の実施形態では、微生物を溶解するステップは、微生物を含有する細胞懸濁液を加熱することを含む。この実施形態において、微生物を含有する発酵ブロス（又は発酵ブロスから単離された微生物の懸濁液）は、微生物、即ち微生物の細胞壁及び膜が分解し又は破壊されるまで加熱される。典型的には、適用温度は少なくとも５０℃である。より効率的な細胞溶菌には、より高い温度、例えば、少なくとも３０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、少なくとも１２０℃、少なくとも１３０℃又はそれ以上が用いられる。
【０１９８】
熱処理による細胞の溶解は、微生物を煮沸することにより実施されてもよい。或いは、熱処理（煮沸なし）はオートクレーブで実施されてもよい。熱処理された溶解物はさらなる処理のため冷却され得る。
【０１９９】
細胞破壊はまた、蒸気処理により、即ち加圧蒸気を加えることによって実施されてもよい。細胞破壊のための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号明細書に記載されている。
【０２００】
２．塩基を使用した溶菌
一部の実施形態では、微生物を溶解するステップは、微生物を含有する細胞懸濁液に塩基を添加することを含む。
【０２０１】
塩基は、使用される微生物のタンパク質性化合物の少なくとも一部を加水分解するのに十分な強さでなければならない。タンパク質を可溶化するのに有用な塩基は、化学分野において公知である。本発明の方法において有用な例示的塩基としては、限定はされないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムの水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。好ましい塩基はＫＯＨである。細胞破壊のための微細藻類の塩基処理については、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号明細書に記載される。
【０２０２】
３．酸溶菌
一部の実施形態では、微生物を溶解するステップは、微生物を含有する細胞懸濁液に酸を添加することを含む。酸溶菌は、１０〜５００ｎＭ又は好ましくは４０〜１６０ｎＭの濃度の酸を使用して行うことができる。酸溶菌は、好ましくは室温より高い温度で（例えば４０〜１６０℃、好ましくは５０〜１３０℃の温度で実施される。中程度の温度（例えば、室温乃至１００℃、特に室温乃至６５℃に関しては、酸処理を音波処理又は他の細胞破壊方法と有効に組み合わせることができる。
【０２０３】
４．酵素を使用した細胞の溶解
一部の実施形態では、微生物を溶解するステップは、酵素の使用により微生物を溶解させることを含む。微生物を溶解させるのに好ましい酵素は、プロテアーゼ及び多糖類分解酵素、例えばヘミセルラーゼ（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のヘミセルラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；＃Ｈ２１２５）、ペクチナーゼ（例えば、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）由来のペクチナーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；＃Ｐ２４０１）、Ｍａｎｎａｗａｙ  ４．０Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、セルラーゼ（例えば、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルロース；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；＃Ｃ９４２２）、及びドリセラーゼ（例えば、担子菌網種（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐ．）由来のドリセラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；＃Ｄ９５１５である。
【０２０４】
ａ）セルラーゼ
本発明の実施形態において、微生物を溶解させるためのセルラーゼは、場合によりクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）由来の多糖類分解酵素又はクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）及び／又はプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）ウイルスである。
【０２０５】
ｂ）プロテアーゼ
プロテアーゼ、例えば、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）プロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，Ｏｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００，ｐｐ．２９−３２（４）に列挙されるプロテアーゼ、及び他のプロテアーゼを使用して微生物を溶解することができる。使用することのできる他のプロテアーゼには、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４  ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）及びＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １００  Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）が含まれる。
【０２０６】
ｃ）組み合わせ
前述のプロテアーゼ及び多糖類分解酵素の任意の組み合わせを含め、プロテアーゼ及び多糖類分解酵素の任意の組み合わせもまた使用することができる。
【０２０７】
５．超音波を使用した細胞の溶解
本発明の別の実施形態において、微生物を溶解するステップは、超音波、即ち音波処理を用いることにより実施される。従って、細胞はまた、高周波音波によっても溶解させることができる。この音波は電子的に生じさせ、金属先端から適切に濃縮された細胞懸濁液に伝導させることができる。この音波処理（又は超音波処理）は、細胞懸濁液中に空洞を作り出すことに基づき細胞の完全性を破壊する。
【０２０８】
６．機械的溶菌
本発明の別の実施形態において、微生物を溶解するステップは機械的溶菌により実施される。細胞を機械的に溶解させて、場合によりホモジナイズすることにより、炭化水素（例えば、脂質）収集が促進され得る。例えば、圧力式の破壊装置を使用して細胞含有スラリーをポンピングし、制限オリフィスバルブに通すことができる。高圧（最大１５００バール）が加えられると、続いて出口ノズルを通じて瞬間的膨張が起こる。細胞破壊は３つの異なる機構：バルブとの衝突、オリフィスにおける高液体せん断、及び吐出時の急激な圧力降下により、細胞の破裂が引き起こされることで達成される。この方法では細胞内分子が放出される。
【０２０９】
或いは、ボールミルが用いられてもよい。ボールミルでは、細胞が懸濁液中にビーズなどの微粉研磨材と共に撹拌される。せん断力、ビーズ間での粉砕、及びビーズとの衝突により細胞が壊れる。ビーズが細胞を破壊すると、細胞の内容物が放出される。細胞はまた、ブレンディング（例として高速又はワーリングブレンダーによるなど）、フレンチプレス、又はさらには弱い細胞壁の場合には遠心の使用によって細胞を破壊するなど、せん断力によっても破壊することができる。
【０２１０】
Ｂ．脂質及び炭化水素の抽出
本発明の微生物により産生された脂質及び炭化水素は、有機溶媒で抽出することにより回収し得る。ある場合には、好ましい有機溶媒はヘキサンである。典型的には、有機溶媒は、溶解物成分を予め分離することなしに溶解物に直接添加される。一実施形態において、上記に記載する方法の１つ以上によって生じる溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成するのに十分な期間にわたり有機溶媒と接触させる。ある場合には、次にこの溶液をさらに精製して特定の所望の脂質及び／又は炭化水素成分を回収し得る。ヘキサン抽出方法は当該技術分野において周知されている。
【０２１１】
上記の方法により生成された細胞溶解物から脂質を分離するには、様々な方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及びアルカンなどの炭化水素は、ヘキサンなどの疎水性溶媒で抽出することができる（Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：７１７を参照のこと）。脂質及び脂質誘導体はまた、液化（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４を参照のこと）；油の液化（例えば、Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照のこと）；及び超臨界ＣＯ２抽出（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４を参照のこと）を用いて抽出することもできる。Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｏｃｏｉｄｅｓの培養物からの微細藻類脂質の回収プロトコルを記載しており、ここでは細胞が遠心により採収され、蒸留水で洗浄され、凍結乾燥により乾燥された。得られた粉末状細胞が乳鉢において微粉砕され、次にｎ−ヘキサンで抽出された。Ｍｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６。
【０２１２】
従って、本発明の微生物により産生された脂質、脂質誘導体及び炭化水素は、有機溶媒で抽出することにより回収し得る。ある場合には、好ましい有機溶媒はヘキサンである。典型的には、有機溶媒は、溶解物成分を予め分離することなしに溶解物に直接添加される。一実施形態において、上記に記載する方法の１つ以上によって生じる溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成するのに十分な期間にわたり有機溶媒と接触させる。ある場合には、次にこの溶液をさらに精製して特定の所望の脂質及び／又は炭化水素成分を回収し得る。ヘキサン抽出方法は当該技術分野において周知されている。
【０２１３】
本明細書に記載されるとおり細胞によって生成される脂質並びに脂質誘導体、例えば脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及びアルカンなどの炭化水素は、上記に記載したとおり、リパーゼを含む１つ以上の酵素を使用して修飾することができる。炭化水素が細胞の細胞外環境にあるとき、１つ以上の酵素は、その酵素が炭化水素を修飾し又は炭化水素前駆体からのその合成を完了させる条件下で当該の環境に加えることができる。或いは、炭化水素は、酵素などの１つ以上の触媒を加える前に細胞材料から部分的に又は完全に単離されてもよい。かかる触媒は外因的に加えられ、その活性は細胞外又はインビトロで生じる。
【０２１４】
従って、本明細書に記載されるとおり細胞によってインビボで生成されるか、又はインビトロで酵素的に修飾された脂質及び炭化水素は、場合により従来手段によってさらに処理することができる。処理には、「クラッキング」して炭化水素分子のサイズを減じ、ひいては水素：炭素比を増加させることが含まれ得る。炭化水素及びトリグリセリド油処理では、通常、触媒クラッキング法及び熱クラッキング法が用いられる。触媒方法には、固体酸触媒などの触媒の使用が関わる。触媒はシリカアルミナ又はゼオライトであってもよく、それにより炭素−炭素結合のヘテロリシスな、即ち非対称な切断がもたらされ、カルボカチオン及びヒドリドアニオンが生じる。こうした反応中間体は、次に別の炭化水素との転位又はヒドリド移動を起こす。従ってこの反応により中間体が再生し、自己伝播連鎖機構がもたらされ得る。炭化水素はまた、場合によりそこにある炭素−炭素二重結合、又は三重結合の数がゼロまで減るように処理されてもよい。炭化水素はまた、そこにある環構造又は環状構造が除去され又は消失するように処理されてもよい。炭化水素はまた、水素：炭素比が増加するように処理されてもよい。これには、水素の添加（「水素化」）及び／又は炭化水素の「クラッキング」により炭化水素を小さくすることが含まれ得る。
【０２１５】
熱的方法には、高温高圧を用いた炭化水素サイズの低減が関わる。約８００℃の高温、及び約７００ｋＰａの高圧を使用することができる。これらの条件により、時に（光子フラックスにより区別されるとおりの）水素リッチな炭化水素分子を指して使用されることもある用語「軽質」が生じる一方、凝縮により、比較的水素が枯渇したより重い炭化水素分子が生じる。この方法論により、ホモリシスな、即ち対称な切断がもたらされてアルケンが生じ、このアルケンは場合により上記に記載したとおり酵素的に飽和していてもよい。
【０２１６】
触媒方法及び熱的方法は、植物においては炭化水素処理及び油精製の標準的な方法である。従って、本明細書に記載されるとおり細胞によって生成される炭化水素は、従来手段で収集して処理し又は精製することができる。微細藻類により生成される炭化水素のハイドロクラッキングに関する報告は、Ｈｉｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＸＸＩＶ：１９３−２０５（１９８２））を参照のこと。代替的実施形態において、この画分が、有機化合物、熱、及び／又は無機化合物などの別の触媒で処理される。脂質をバイオディーゼルにするための処理には、エステル転移反応が用いられる。
【０２１７】
本発明の方法により生成された炭化水素は、種々の工業用途において有用である。例えば、ほぼ全てのタイプの洗剤及び洗浄製品に使用される陰イオン界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）の生成は、１０〜１４個の炭素原子の鎖を略含む炭化水素を利用する。例えば、米国特許第６，９４６，４３０号明細書；同第５，５０６，２０１号明細書；同第６，６９２，７３０号明細書；同第６，２６８，５１７号明細書；同第６，０２０，５０９号明細書；同第６，１４０，３０２号明細書；同第５，０８０，８４８号明細書；及び同第５，５６７，３５９号明細書を参照のこと。ＬＡＳなどの界面活性剤は、米国特許第５，９４２，４７９号明細書；同第６，０８６，９０３号明細書；同第５，８３３，９９９号明細書；同第６，４６８，９５５号明細書；及び同第６，４０７，０４４号明細書に記載されるものなど、パーソナルケア組成物及び洗剤の製造に用いられ得る。
【０２１８】
ＶＩＩ．天然に存在しない脂肪酸プロファイルを有する油
本明細書に開示される油は、パーム油、パーム核油、及びヤシ油などの、中鎖脂肪酸が高い他の天然に存在する油とは異なる。例えば、カロテノイドなどの夾雑物のレベルが、本明細書に記載される油と比べてパーム油及びパーム核油でははるかに高い。パーム油及びパーム核油は、詳細には、本明細書に記載される油と比べてα及びβカロチン並びにリコペンを多量に含有する。加えて、パーム油及びパーム核油には２０種を上回る異なるカロテノイドが見られるが、本実施例では、本明細書に記載される油に含有されるカロテノイド種が極めて少数で、且つ極めて低レベルであることが実証される。加えて、パーム油、パーム核、及びヤシ油では、本明細書に記載される油と比べてトコトリエノールなどのビタミンＥ化合物のレベルがはるかに高い。
【０２１９】
概して、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）株は、鎖長Ｃ８〜Ｃ１４の脂肪酸をほとんど又は全く有しない。例えば、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）株のプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５）、プロトテカ・クルガニ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ）（ＵＴＥＸ  ３２９）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）（ＵＴＥＸ  １４４２）及びプロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）（ＵＴＥＸ  １４３８）は、Ｃ８脂肪酸を全く（又は検出不能な量しか）生成せず、０〜０．０１％のＣ１０脂肪酸、０．０３〜２．１％のＣ１２脂肪酸及び１．０〜１．７％のＣ１４脂肪酸を生成する。
【０２２０】
ある場合には、変異脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含有する油産生細胞（例えば、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）株）は、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、又は９０〜９９％のＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、又はＣ１４脂肪酸によって特徴付けられる脂肪酸プロファイルを有する。他の場合には、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含有するプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）株は、鎖長Ｃ１２及びＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して活性を有し、鎖長Ｃ１２及び鎖長Ｃ１４の脂肪酸を１：１±２０％の比で生成する。
【０２２１】
場合によっては、トランスジェニックプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）株を一定の高い選択圧下に置いて外来遺伝子を保持することが、所望される特定の鎖長の脂肪酸が増加するため有利である。高レベルの外来遺伝子の保持はまた、本明細書に開示される相同組換えベクター及び方法を使用して外来遺伝子を細胞の核染色体に挿入することによっても実現し得る。核染色体に組み込まれた外来遺伝子を含む組換え細胞もまた企図される。
【０２２２】
微細藻類油はまた、微細藻類により生成されるか、又は培養培地から微細藻類油に取り込まれる他の構成要素も含み得る。これらの他の構成要素は、微細藻類の培養に使用される培養条件、微細藻類の種、バイオマスから微細藻類油を回収するために用いられる抽出方法及び微細藻類油組成に影響を及ぼし得る他の要因に応じて種々の量で存在し得る。かかる構成要素の非限定的な例としては、０．１〜０．４マイクログラム／ｍｌ存在するカロテノイド、０〜０．０２ミリグラム／油キログラム存在するクロロフィル、０．４〜０．６ミリグラム／油１００グラム存在するγトコフェロール、及び０．２〜０．５ミリグラム／油グラム存在する全トコトリエノールが挙げられる。
【０２２３】
他の構成要素としては、限定なしに、リン脂質、トコフェロール、トコトリエノール、カロテノイド（例えば、α−カロチン、β−カロチン、リコペン等）、キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α−クリプトキサンチン及びβ−ｃｒｙｔｏｘａｎｔｈｉｎ）、及び様々な有機又は無機化合物を挙げることができる。
【０２２４】
ある場合には、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）種から抽出された油は、０．０２ｍｇ／ｋｇ以下のクロロフィルを含む。ある場合には、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）種から抽出された油は、０．４ｍｃｇ／ｍｌ以下の全カロテノイドを含む。ある場合には、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）油は、油１００グラム当たり０．４０〜０．６０ミリグラムのγトコフェロールを含む。他の場合には、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）油は、油１グラム当たり０．２〜０．５ミリグラムの全トコトリエノールを含む。
【０２２５】
変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞から生成される油は、それを、例えば他の供給源からのブレンド油と区別する同位体プロファイルを有し得る。安定炭素同位体値δ１３Ｃは、標準（例えばＰＤＢ、サウスカロライナ州Ｐｅｅｄｅｅ累層産のベレムナイト・アメリカーナ（Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）の化石骨格のカーボナイト）に対する１３Ｃ／１２Ｃ比の表現である。油の安定炭素同位体値δ１３Ｃ（‰）は、使用される供給原料のδ１３Ｃ値に関係し得る。一部の実施形態では、油は、トウモロコシ又はサトウキビなどのＣ４植物に由来する糖上で従属栄養成長させた油産生生物から得られる。一部の実施形態では、油のδ１３Ｃ（‰）は１０〜−１７‰又は１３〜−１６‰である。
【０２２６】
様々な実施形態において、Ｃ１０優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）由来の特異性ドメインの全ての残基又は特異性決定残基と、Ｃ１２優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、クフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）又はウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）由来の触媒ドメインとを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞が、少なくとも約１０％のＣ１２：０脂肪酸、及び少なくとも約１０％のＣ１４：０脂肪酸を含む油を生成する。
【０２２７】
様々な実施形態において、Ｈｉｓ１６３→Ｔｙｒ又はＬｅｕ１８６→Ｐｒｏの（又は配列番号６１のＨｉｓ１６３→Ｔｙｒ又はＬｅｕ１８６→Ｐｒｏに対応する位置にある）置換の一方又は両方を有する第１のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの修飾された特異性ドメインの全ての残基又は特異性決定残基と、第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒ドメインとを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞が、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ８：０脂肪酸又は少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ１０：０脂肪酸又は少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上であるＣ８：０／Ｃ１０：０比を含む油を生成する。適宜、特異性ドメインはＣ８：０優先性、Ｃ１０：０優先性又はＣ１２：０優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼから得られてもよく、独立して触媒ドメインはＣ８：０優先性、Ｃ１０：０優先性又はＣ１２：０優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼから得られてもよい。特異性ドメインと触媒ドメインとは、同じ又は異なるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ由来であってよい。様々な実施形態において、Ｃ１０優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、Ｈｉｓ１６３→Ｔｙｒ又はＬｅｕ１８６→Ｐｒｏの置換の一方又は両方を有するクフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）由来の修飾された特異性ドメインの全ての残基又は特異性決定残基と、Ｃ１０優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）由来の触媒ドメインとを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞が、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ８：０脂肪酸又は少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上のＣ１０：０脂肪酸又は少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、又はそれ以上であるＣ８：０／Ｃ１０：０比を含む油を生成する。
【０２２８】
様々な実施形態において、Ｃ１４優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、シナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）由来の特異性ドメインの全ての残基又は特異性決定残基と、Ｃ１２優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（例えば、クフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）又はウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）由来の触媒ドメインとを含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞が、約１：１比；例えば、１：１±２０％の比でＣ１２：０脂肪酸及びＣ１４：０脂肪酸を含む油を生成する。
【０２２９】
さらに、疎水性ドメインに対してＮ末端側に位置するリンカードメインのＣ末端から伸長する５個又はそれ以上のアミノ酸残基を含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞は、そのリンカードメインを含まない同じアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞と比較して比較的高い中鎖長脂肪酸（例えば、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０）を含む油を生成する。様々な実施形態において、疎水性ドメインに対してＮ末端側に位置するリンカードメインのＣ末端から伸長する５個又はそれ以上のアミノ酸残基を含む変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞は、リンカードメインを含まない同じアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、又はそれ以上増加した中鎖長脂肪酸を含む油を生成する。
【０２３０】
具体的な実施形態において、組換え細胞は、ＡＣＰからの中鎖脂肪酸の切断を触媒する活性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする変異アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ外来遺伝子をコードする外来遺伝子の産物を発現するように働き得る核酸を含む。結果として、一実施形態において、生成される油は、組換え核酸が発現する結果としてＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２、及び／又はＣ１４脂肪酸が上昇し、且つＣ１６、Ｃ１８、及びＣ１８：１脂肪酸が減少した脂肪酸プロファイルによって特徴付けられ得る。様々な実施形態において、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、及び／又はＣ１４脂肪酸の増加は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％より大きく、７５〜８５％、７０〜９０％、９０〜２００％、２００〜３００％、３００〜４００％、４００〜５００％、又は５００％より大きい。
【０２３１】
一部の実施形態では、細胞中又は細胞の油中の中鎖脂肪酸レベルを増加させるためのさらなる遺伝子修飾には、置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する活性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が含まれる。具体的な関連する実施形態では、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＬＰＡＡＴの両方が、細胞において安定に発現する。油産生細胞中に（及び特にプラスチド微生物細胞中に）組換え核酸を導入する結果として、外因性中鎖特異的チオエステラーゼ及び置換アシルグリセロエステルのｓｎ−２位への中鎖脂肪酸アシル基の転移を触媒する外因性ＬＰＡＡＴ、細胞は、それが生成するトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）中の特定の中鎖脂肪酸の割合を、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍、又はそれ以上増加させることができるようになり得る。外因性ＬＰＡＡＴの導入により、外因性中鎖優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ単独の導入と比較してｓｎ−２位の中鎖脂肪酸が１、２、３、４倍又はそれ以上増加し得る。ある実施形態では、中鎖脂肪酸は、細胞によって生成されるＴＡＧ脂肪酸の３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％超である。様々な実施形態において、中鎖脂肪酸は、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、及び／又はパルミチン酸である。
【０２３２】
様々な実施形態において、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＥ８５７８３）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＱ４２８６２）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＭ９２３３４）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＢ０９１３８）、クラミドモナス・ラインハルティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＤＰ０２３００）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ４９１１９）、リムナンテス・アルバ（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ａｌｂａ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＤＰ０２３００）、リムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（推定）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ８８６２０）、リムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）アシル−ＣｏＡ：ｓｎ−１−アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ６２７５１）、リムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）１−アシルグリセロール−３−リン酸Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ５８２３９）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＥＦ３９３７７）からなる群から選択される。
【０２３３】
外因性ＬＰＡＡＴの発現に代えて、又はそれに加えて、細胞は、外因性ＫＡＳＩ又はＫＡＳＩＶ酵素を発現し、且つ場合によりＫＡＳＩＩの活性を低下又は消失させる働きをし得る組換え核酸を含んでもよく、これは中鎖優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現させる場合に特に有利である。中鎖優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼと併せてＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＶ酵素を過剰発現するようにプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）細胞を操作すると、Ｃ１０〜Ｃ１２脂肪酸の生成が全脂肪酸の少なくとも約４０％、例えば、全脂肪酸の少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％又はそれ以上である株を作成することができる。中鎖生成はまた、ＫＡＳＩ及び／又はＫＡＳＩＩの活性を（例えば、ノックアウト又はノックダウンを用いて）抑えることによっても増加させることができる。中鎖優先性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの過剰発現と併せたプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５）ＫＡＳＩの種々の対立遺伝子の染色体ノックアウトにより、少なくとも約６０％のＣ１０〜Ｃ１４脂肪酸、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又はそれ以上のＣ１０〜Ｃ１４脂肪酸である脂肪酸プロファイルを実現することができる。高度の中鎖脂肪酸はまた、ＫＡＳＩ  ＲＮＡヘアピンポリヌクレオチドが発現する結果としても実現することができる。これらのうちの任意の修飾に加えて、ＳＡＤ又はＦＡＤ酵素の（例えば、ノックアウト又はノックダウンにより）不飽和又は多価不飽和脂肪酸生成を抑制することができる。
【０２３４】
ある実施形態では、上述の高度中鎖生成細胞の一つが、１つ以上の脂肪酸アシルデサチュラーゼをノックアウト又はノックダウンすることにより低多価不飽和油を生成するようにさらに操作される。従って、生成される油は高い安定性を有する。
【０２３５】
これらの油の加水分解から得られる高度中鎖油又は脂肪酸は、潤滑剤及び界面活性剤の生成を含めた、食品、燃料及び油脂化学品用途において特に有用であり得る。例えば、この細胞から得られる脂肪酸は、エステル化され、クラッキングされ、アルデヒド又はアルコールに還元され、アミノ化され、硫酸化され、スルホン化され、又は当該技術分野において公知の他の化学的プロセスに供され得る。
【０２３６】
ＶＩＩＩ．燃料及び化学品生成
化石燃料由来の出発物質に取って代わり得る再生可能な生物学的出発原料が利用可能であり、且つその使用が望ましいことに伴い、燃料、例えば、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料における生物学的起源の炭化水素成分の使用に対する関心が高まっている。本発明は、本明細書に記載される方法により産生される脂質をバイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料を生成するための生物学的材料として使用したバイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料の生成方法を提供する。
【０２３７】
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素を豊富に含む石油蒸留物である。その沸点範囲は３７０°Ｆ〜７８０°Ｆと広く、ディーゼルエンジン車両などの圧縮点火機関での燃焼に好適である。米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：ＡＳＴＭ）が、セタン価、雲り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄分、水分、灰分、銅板腐食、及び残留炭素などの他の燃料特性の許容範囲と併せて沸点範囲に従いディーゼルの等級を規定している。技術的には、バイオマスに由来する任意の炭化水素蒸留材料又はその他適切なＡＳＴＭ規格に適合するものを、ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５）として、又はそれが脂肪酸メチルエステルである場合にはバイオディーゼル（ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１）として定義することができる。
【０２３８】
抽出後、本明細書に記載される微生物バイオマスから回収された脂質及び／又は炭化水素成分を化学的処理に供し、ディーゼル車両及びジェットエンジンで使用される燃料を製造することができる。
【０２３９】
バイオディーゼルは液体であり、製造原料に応じて色が異なる（琥珀色乃至暗褐色）。バイオディーゼルは水に対して実質的に不混和性であり、沸点が高く、且つ蒸気圧が低い。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車両で使用されるディーゼルと同等の処理燃料を指す。バイオディーゼルは生分解性且つ非毒性である。従来のディーゼル燃料と比べたバイオディーゼルのさらなる利点は、エンジン摩耗の低さである。典型的には、バイオディーゼルはＣ１４〜Ｃ１８アルキルエステルを含む。バイオマス又は本明細書に記載されるとおり生成及び単離された脂質が、種々のプロセスによってディーゼル燃料に変換される。バイオディーゼルの好ましい生成方法は、本明細書に記載されるとおりの脂質のエステル転移反応による。バイオディーゼルとしての使用に好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
【０２４０】
本明細書に記載される方法によって生成されるバイオディーゼルは、単独で用いられ得るか、又はほとんどの現代のディーゼルエンジン車両において従来のディーゼル燃料と任意の濃度でブレンドされ得る。バイオディーゼルは、従来のディーゼル燃料（石油ディーゼル）とブレンドされる場合、約０．１％〜約９９．９％存在し得る。世界の大部分で、任意の燃料混合物中のバイオディーゼルの量を記述するため、「Ｂ」ファクターとして知られる方式が用いられている。例えば、２０％のバイオディーゼルを含有する燃料はＢ２０と表示される。純粋なバイオディーゼルはＢ１００と称される。
【０２４１】
バイオディーゼルはまた、家庭用及び商業用ボイラーにおける暖房用燃料としても使用され得る。既存の油ボイラーはゴム部品を含む場合があり、バイオディーゼルで動かすには改造が必要となり得る。この改造プロセスは通常は比較的単純であり、バイオディーゼルが強溶媒であるためゴム部品を合成部品に交換することを伴う。その強溶媒の力に起因して、バイオディーゼルを燃焼させるとボイラーの効率が増加し得る。バイオディーゼルをディーゼル配合中の添加剤として使用して純粋な超低硫黄ディーゼル（ＵＬＳＤ）燃料の潤滑性を増加させることができ、ＵＬＳＤは事実上硫黄分を有しないため、これは有利である。バイオディーゼルは石油ディーゼルと比べて良好な溶媒であり、これまで石油ディーゼルで作動していた車両の燃料系統における残渣の堆積物を破壊するために使用することができる。
【０２４２】
バイオディーゼルは、油リッチなバイオマスに含まれるトリグリセリドのエステル転移反応によって生成され得る。従って、本発明の別の態様では、バイオディーゼルの生成方法が提供される。好ましい実施形態では、このバイオディーゼルの生成方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養するステップと、（ｂ）脂質含有微生物を溶解して溶解物を生成するステップと、（ｃ）溶解した微生物から脂質を分離するステップと、（ｄ）脂質組成物をエステル転移反応させるステップとを含み、これによりバイオディーゼルが生成される。微生物を成長させる方法、微生物を溶解して溶解物を生成する方法、有機溶媒を含む培地で溶解物を処理することにより不均一混合物を形成する方法、及び処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は上記に記載しており、バイオディーゼルの生成方法においても用いられ得る。
【０２４３】
バイオディーゼルの脂質プロファイルは、通常、原料油の脂質プロファイルと極めて類似している。本明細書に記載される方法及び組成物により提供される他の油をエステル転移反応に供することにより、（ａ）少なくとも４％のＣ８〜Ｃ１４；（ｂ）少なくとも０．３％のＣ８；（ｃ）少なくとも２％のＣ１０；（ｄ）少なくとも２％のＣ１２；及び（３）少なくとも３０％のＣ８〜Ｃ１４を含む脂質プロファイルを有するバイオディーゼルを産生し得る。
【０２４４】
脂質組成物をエステル転移反応に供し、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを産生することができる。好ましいエステル転移反応は以下に概説し、それには塩基触媒エステル転移反応及び組換えリパーゼを使用したエステル転移反応が含まれる。塩基触媒エステル転移反応プロセスでは、アルカリ触媒、典型的には水酸化カリウムの存在下で、トリアシルグリセリドをアルコール、例えばメタノール又はエタノールと反応させる。この反応により、メチル又はエチルエステル及び副産物としてのグリセリン（グリセロール）が形成される。
【０２４５】
動物油及び植物油は、典型的には、遊離脂肪酸と三価アルコールのグリセロールとのエステルであるトリグリセリドで作られている。エステル転移反応では、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）中のグリセロールがメタノール又はエタノールなどの短鎖アルコールに置き換えられる。
【０２４６】
この反応においては、アルコールが塩基で脱プロトン化されて強い求核剤となる。一般に、エタノール又はメタノールは大幅に過剰量で（最大５０倍）使用される。通常、この反応は極めて低速で進行するか又は全く進行しない。熱、並びに酸又は塩基の使用は、反応をより速く進行させる助けとなり得る。酸又は塩基はエステル転移反応によっては消費されないため、これらは反応物ではなく、触媒である。塩基触媒法は低い温度及び圧力しか必要とせず、且つ９８％を超える変換収率を生み出すため（但し出発油は水分及び遊離脂肪酸が少ないことを条件とする）、ほぼ全てのバイオディーゼルが塩基触媒法を用いて生成されている。
【０２４７】
エステル転移反応はまた、上記に考察したとおり、塩基の代わりにリパーゼなどの酵素を使用しても実施されている。リパーゼ触媒エステル転移反応は、例えば、室温乃至８０℃の温度、及び１：１より大きく、好ましくは約３：１のＴＡＧ対低級アルコールのモル比で実施することができる。エステル転移反応における使用に好適なリパーゼとしては、限定はされないが、表７に掲載されるものが挙げられる。エステル転移反応に有用なリパーゼの他の例については、例えば、米国特許第４，７９８，７９３号明細書；同第４，９４０，８４５号明細書  同第５，１５６，９６３号明細書；同第５，３４２，７６８号明細書；同第５，７７６，７４１号明細書及び国際公開第８９／０１０３２号パンフレットが参照される。かかるリパーゼとしては、限定はされないが、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、及びフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の微生物によって生成されるリパーゼ並びに膵リパーゼが挙げられる。
【０２４８】
エステル転移反応における使用に好適なリパーゼとしては、限定はされないが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）リパーゼＡＢＧ７３６１４、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ノボザイム−４３５（ｎｏｖｏｚｙｍ−４３５））ＣＡＡ８３１２２、カンジダ・キリンドラケア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）リパーゼＡＡＲ２４０９０、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リパーゼ（リパーゼＬ；天野製薬株式会社（Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ（例えば、リパーゼＯＦ；名糖産業株式会社（Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（リポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）ＩＭ  ２０）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼＡＡＡ２５８８２、リゾプス・ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ）リパーゼ（リリパーゼ（Ｌｉｌｉｐａｓｅ）Ａ−１０ＦＧ）Ｑ７Ｍ４Ｕ７＿１、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼＢ３４９５９、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ（リパーゼＦ）ＡＡＦ３２４０８、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ（ＳＭ酵素）ＡＢＩ１３５２１、サーモミセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼＣＡＢ５８５０９、リパーゼＰ（ナガセケムテックス株式会社（Ｎａｇａｓｅ  ＣｈｅｍｔｅＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、及びリパーゼＱＬＭ（名糖産業株式会社（Ｍｅｉｔｏ  Ｓａｎｇｙｏ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）、名古屋、日本）が挙げられる。
【０２４９】
バイオディーゼルに好適な脂肪酸エステルの生成にリパーゼを使用することの課題の一つは、強塩基法で用いられる水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の価格と比べてリパーゼの価格が著しく高いことである。この課題は、固定化リパーゼを使用することにより対処されており、固定化リパーゼは再利用することができる。しかしながら、リパーゼベースの方法が生産コストの点で強塩基法と競合し得るようにするには、最小限のサイクル数にわたり再利用後の固定化リパーゼの活性を維持しなければならない。固定化リパーゼは、エステル転移反応で典型的に用いられる低級アルコールの毒作用を受ける。米国特許第６，３９８，７０７号明細書（２００２年６月４日にＷｕ  ｅｔ  ａｌ．に付与された）は、固定化リパーゼの活性を増強し及び活性が低下した固定化リパーゼを再生する方法を記載している。いくつかの好適な方法には、３以上の炭素原子数を有するアルコール中に固定化リパーゼをある期間、好ましくは０．５〜４８時間、及びより好ましくは０．５〜１．５時間浸漬することが含まれる。好適な方法はまた、不活性化した固定化リパーゼを、炭素原子数が３以上のアルコールで洗浄し、次に不活性化した固定化リパーゼを植物油中に０．５〜４８時間浸漬することも含む。
【０２５０】
詳細な実施形態において、組換えリパーゼは、リパーゼの作用を受ける脂質を生成する同じ微生物で発現する。好適な組換えリパーゼとしては、上記に列挙するもの及び／又は上記に列挙するＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有するもの、又は上記に列挙するリパーゼのうちの一つと少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有し且つリパーゼ活性を呈するポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態において、酵素活性は、上述の配列（これらは全て、完全に記載されたものとして本明細書によって参照により援用される）のうちの一つと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する配列に存在する。リパーゼ及び選択可能マーカーをコードするＤＮＡは、好ましくはコドン最適化ｃＤＮＡである。微細藻類における発現用に遺伝子を再コードする方法は、米国特許第７，１３５，２９０号明細書に記載される。
【０２５１】
バイオディーゼルの共通の国際規格はＥＮ  １４２１４である。ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１は、米国及びカナダで参照される最も一般的なバイオディーゼル規格である。ドイツはＤＩＮ  ＥＮ  １４２１４を使用し、イギリスはＢＳ  ＥＮ  １４２１４への準拠を求めている。製品がこれらの規格に適合するかどうかを決定する基本的な工業試験としては、典型的には、ガスクロマトグラフィー及びＨＰＬＣなどが挙げられる。品質規格を満たすバイオディーゼルはほとんど毒性を示さず、毒性評価（ＬＤ５０）が５０ｍＬ／ｋｇを上回る。
【０２５２】
ＡＳＴＭ規格を満たすバイオディーゼルは非毒性でなければならないが、夾雑物が存在することもあり、夾雑物は結晶化し及び／又は溶液から堆積物として沈殿及び沈降する傾向がある。堆積物の形成は、バイオディーゼルが低温で使用される場合に特に問題である。堆積物又は沈殿物は、燃料流量の低下、燃料系統の詰まり、フィルタの目詰まり等の問題を引き起こし得る。より高品質の製品を生成するためバイオディーゼル中のこれらの夾雑物及び堆積物の除去に具体的に対処するプロセスは、当該技術分野において周知されている。かかるプロセスの例としては、限定はされないが、夾雑物、例えばリン脂質及び遊離脂肪酸を除去する油の前処理（例えば、脱ガム、苛性処理による精製及びシリカ吸着剤によるろ過）及び低温ろ過が挙げられる。低温ろ過は、生成後のバイオディーゼル中に存在するあらゆる粒子状物質及び堆積物を除去するために特別に開発されたプロセスである。このプロセスは、バイオディーゼルを冷却し、低温での燃料の使用時に形成され得るあらゆる堆積物又は沈殿物をろ去する。かかるプロセスは当該技術分野において周知されており、米国特許出願公開第２００７−０１７５０９１号明細書に記載されている。好適な方法としては、バイオディーゼルを約３８℃未満の温度に冷却して不純物及び夾雑物をバイオディーゼル液体中の粒子状物質として沈殿させることが挙げられる。次に、冷却したバイオディーゼルに珪藻土又は他のろ過材を加えてスラリーを形成してもよく、次にこれを圧力リーフ又は他のタイプのフィルタでろ過して粒子状物質を除去し得る。次にろ過されたバイオディーゼルを仕上げフィルタに通して残りのあらゆる堆積物及び珪藻土を除去してもよく、これにより最終バイオディーゼル生成物が生成される。
【０２５３】
米国特許出願公開第２０１２／０２８３４６０号明細書、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）からのトリグリセリド油を使用したバイオディーゼルの生成。生成されたバイオディーゼルのＡＳＴＭ  Ｄ６７５１  Ａ１方法による低温浸透ろ過性（Ｃｏｌｄ  Ｓｏａｋ  Ｆｉｌｔｅｒａｂｉｌｉｔｙ）は、３００ｍｌの容積について１２０秒であった。この試験には３００ｍｌのＢ１００のろ過が関わり、Ｂ１００は４０°Ｆに１６時間冷却され、室温に放置して加温され、ステンレス鋼製の支持体を備えた０．７ミクロンガラス繊維フィルタを使用して真空下でろ過される。本明細書に記載される油はエステル転移により、１２０秒未満、１００秒未満、及び９０秒未満の低温浸透時間のバイオディーゼルを生じ得る。
【０２５４】
バイオディーゼルが特に低い温度で使用される場合には、後続のプロセスもまた用いられ得る。かかるプロセスには脱蝋及び分画が含まれる。両プロセスとも、雲り点（バイオディーゼルが結晶化し始める温度）を低下させることにより燃料の低温流動性及び冬期性能を改善するように設計される。バイオディーゼルの脱蝋手法はいくつかある。一つの手法は、バイオディーゼルを石油ディーゼルとブレンドすることである。別の手法は、バイオディーゼルの雲り点を低下させることのできる添加剤を使用することである。別の手法は、添加剤に混合して飽和物を結晶化させた後、結晶をろ去することにより、飽和メチルエステルを手当たり次第に除去することである。分画はメチルエステルを個々の成分又は画分に選択的に分離し、特定のメチルエステルの除去又は含有を可能にする。分画方法としては、尿素分画、溶媒分画及び熱蒸留が挙げられる。
【０２５５】
本発明の方法により提供される別の有用な燃料は再生可能ディーゼルであり、これはアルカン、例えばＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０を含み、従ってバイオディーゼルと区別可能である。高品質の再生可能ディーゼルはＡＳＴＭ  Ｄ９７５規格に適合する。本発明の方法によって生成される脂質は、再生可能ディーゼルを生成するための供給原料として働き得る。従って、本発明の別の態様では、再生可能ディーゼルの生成方法が提供される。再生可能ディーゼルは少なくとも３つのプロセス、即ち、熱水処理（水素処理）；水素化処理；及び間接液化により生成され得る。これらのプロセスにより非エステル蒸留物が得られる。これらのプロセスの間、本明細書に記載されるとおり生成され及び単離されるトリアシルグリセリドがアルカンに変換される。
【０２５６】
一実施形態において、再生可能ディーゼルの生成方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養するステップと、（ｂ）微生物を溶解して溶解物を生成するステップと、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離するステップと、（ｄ）脂質を脱酸素及び水素処理してアルカンを生成するステップとを含み、これにより再生可能ディーゼルが生成される。再生可能ディーゼルの製造に好適な脂質は、微生物バイオマスからヘキサンなどの有機溶媒を使用して抽出することによるか、又は米国特許第５，９２８，６９６号明細書に記載されるものなど、他の方法によって得ることができる。一部の好適な方法には、機械的な圧搾及び遠心が含まれ得る。
【０２５７】
一部の方法では、微生物脂質は、初めにクラッキングを水素処理と併せて行うことにより、それぞれ炭素鎖長及び飽和二重結合を減少させる。次にこの材料を異性化し、これもまた水素処理と併用する。次にナフサ画分を留去し、続いてさらに蒸留することにより、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５規格に適合するためにディーゼル燃料中に求められる成分を気化させて蒸留し、一方で、Ｄ９７５規格に適合するために求められる成分より重い成分は残すことができる。トリグリセリド油を含めた、化学修飾された油の水素処理、ハイドロクラッキング、脱酸素及び異性化方法は、当該技術分野において周知されている。例えば、欧州特許出願公開第１７４１７６８（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７４１７６７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８２４６６（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６４０４３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１６８１３３７（Ａ１）号明細書；欧州特許出願公開第１７９５５７６（Ａ１）号明細書；及び米国特許第７，２３８，２７７号明細書；同第６，６３０，０６６号明細書；同第６，５９６，１５５号明細書；同第６，９７７，３２２号明細書；同第７，０４１，８６６号明細書；同第６，２１７，７４６号明細書；同第５，８８５，４４０号明細書；同第６，８８１，８７３号明細書を参照のこと。
【０２５８】
再生可能ディーゼルの生成方法の一実施形態において、脂質を処理してアルカンを生成するステップは、脂質組成物を水素処理することにより実施される。熱水処理では、典型的には、バイオマスを高温及び高圧の水中で反応させて油及び残留固形物を形成する。変換温度は典型的には３００°Ｆ〜６６０°Ｆであり、圧力は、水を主に液体として保つのに十分な１００〜１７０標準大気圧（ａｔｍ）である。反応時間は１５〜３０分程度である。反応完了後、水から有機物を分離する。それによりディーゼルに好適な蒸留物が生成される。
【０２５９】
再生可能ディーゼルを作製する一部の方法では、トリグリセリドを処理する初めのステップは、二重結合を飽和させる水素化処理であり、次に水素及び触媒の存在下における高温での脱酸素が続く。一部の方法では、水素化及び脱酸素は同じ反応で起こる。他の方法では、脱酸素は水素化より前に起こる。次に、場合により、同様に水素及び触媒の存在下で異性化が実施される。ナフサ成分が好ましくは留去される。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
【０２６０】
トリグリセリドを水素化するための一つの好適な方法には、銅、亜鉛、マグネシウム及びランタンの塩の水溶液、並びにアルカリ金属又は好ましくは炭酸アンモニウムの別の溶液の調製が含まれる。これらの２つの溶液を約２０℃〜約８５℃の温度に加熱し、沈殿容器のｐＨが５．５〜７．５に維持されるような速度で沈殿容器に共に計量することにより、触媒が形成され得る。追加の水を最初に沈殿容器に使用してもよく、又は塩溶液及び沈殿溶液と同時に加えてもよい。次に得られた沈殿物を十分に洗浄し、乾燥させ、約３００℃で焼成して、水素下約１００℃〜約４００℃の範囲の温度で活性化させ得る。次に反応槽において上述の触媒の存在下で１つ以上のトリグリセリドを水素と接触させ、反応させ得る。反応槽は、トリクルベッド反応槽、固定床気体−固体反応槽、充填気泡塔反応槽、連続撹拌型タンク反応槽、スラリー相反応槽、又は当該技術分野において周知されている任意の他の好適な反応槽タイプであってよい。このプロセスはバッチ式で行われてもよく、或いは連続方式で行われてもよい。反応温度は典型的には約１７０℃〜約２５０℃の範囲である一方、反応圧力は典型的には約３００ｐｓｉｇ〜約２０００ｐｓｉｇの範囲である。さらに、本発明のプロセスにおける水素対トリグリセリドのモル比は、典型的には約２０：１〜約７００：１の範囲である。このプロセスは、典型的には約０．１時間−１〜約５時間−１の範囲の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）で実施される。当業者は、用いられる温度、水素とトリグリセリドとのモル比、及び水素の分圧によって、反応に要する時間が異なり得ることを認識するであろう。かかる水素化プロセスによって生成される生成物には、脂肪アルコール、グリセロール、微量のパラフィン及び未反応のトリグリセリドが含まれる。これらの生成物は、典型的には従来手段、例えば、蒸留、抽出、ろ過、結晶化などによって分離される。
【０２６１】
石油精製装置は、原材料を水素で処理することにより、水素化処理を使用して不純物を除去する。水素化処理の変換温度は、典型的には３００°Ｆ〜７００°Ｆである。圧力は、典型的には４０〜１００ａｔｍである。反応時間は、典型的には１０〜６０分程度である。固体触媒を用いると、特定の反応速度が増加し、特定の生成物に対する選択性が向上し、且つ水素消費が最適化される。
【０２６２】
油の脱酸素に好適な方法には、油を約３５０°Ｆ〜約５５０°Ｆの範囲の温度に加熱し、加熱した油を少なくともほぼ大気圧乃至それを上回る範囲の圧力下で少なくとも約５分間窒素と連続的に接触させることが含まれる。
【０２６３】
好適な異性化方法には、アルカリ異性化及び当該技術分野で周知されている他の油異性化を用いることが含まれる。
【０２６４】
水素処理及び水素化処理は、最終的にトリグリセリド供給原料の分子量の低減をもたらす。トリグリセリド分子は、水素化処理条件下で４つの炭化水素分子、即ちプロパン分子と、３つのより重い、典型的にはＣ８〜Ｃ１８範囲の炭化水素分子とに低減される。
【０２６５】
従って、一実施形態において、本明細書に記載される脂質組成物に対して行われる１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５再生可能ディーゼルを含むアルカン混合物である。微生物による炭化水素の生成については、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ  Ｌｏｏｋ  Ｂａｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０，Ｊｏｈｎ  Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｔｅｒｒｉ  Ｄｕｎａｈａｙ，Ｊｏｈｎ  Ｂｅｎｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）により概説されている。
【０２６６】
ディーゼル燃料の蒸留特性は、Ｔ１０−Ｔ９０（それぞれ１０％及び９０％の容積が蒸留されたときの温度）の点から記載される。プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）トリグリセリド油から再生可能ディーゼルを生成した。実施例１４で生成された材料のＴ１０−Ｔ９０は、５７．９℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的修飾の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（低温ろ過など）の方法を用いることにより、本明細書に開示される方法に従い生成されるトリグリセリド油を使用して、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０及び６５℃など、他のＴ１０−Ｔ９０範囲の再生可能ディーゼル組成物を生じさせることができる。
【０２６７】
生成された材料のＴ１０は２４２．１℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的修飾の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（低温ろ過など）の方法を用いることにより、１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、及び少なくとも２９０のＴ１０など、他のＴ１０値の再生可能ディーゼル組成物を生じさせることができる。
【０２６８】
生成された材料のＴ９０は３００℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的修飾の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、及び少なくとも２９０のＴ９０など、他のＴ９０値の再生可能ディーゼル組成物を生じさせることができる。
【０２６９】
生成された材料のＦＢＰは３００℃であった。本明細書に開示される油の水素処理、異性化、及び他の共有結合的修飾の方法、並びに本明細書に開示される蒸留及び分画（冷温ろ過など）の方法を用いることにより、２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、及び少なくとも３００のＦＢＰなど、他のＦＢＰ値の再生可能ディーゼル組成物を生じさせることができる。
【０２７０】
本明細書に記載される方法及び組成物によって提供される他の油は、（ａ）少なくとも４％のＣ８〜Ｃ１４；（ｂ）少なくとも０．３％のＣ８；（ｃ）少なくとも２％のＣ１０；（ｄ）少なくとも２％のＣ１２；及び（３）少なくとも３０％のＣ８〜Ｃ１４を含む脂質プロファイルの油を含め、水素処理、異性化、及び他の共有結合的修飾の組み合わせに供することができる。
【０２７１】
従来の超低硫黄ディーゼルは、任意の形態のバイオマスから二段階プロセスで生成され得る。第一に、バイオマスが、水素及び一酸化炭素がリッチなガス状混合物であるシンガスに変換される。次に、このシンガスが液体に触媒変換される。典型的には、液体の生成は、フィッシャー・トロプシュ（ＦＴ）合成を用いて達成される。この技術は石炭、天然ガス、及び重油に応用されている。従って、再生可能ディーゼルの生成方法のさらに別の好ましい実施形態において、脂質組成物を処理することによりアルカンを生成するステップは、脂質組成物の間接液化によって行われる。
【０２７２】
本発明はまた、ジェット燃料の生成方法も提供する。ジェット燃料は、透明乃至淡黄色である。最も一般的な燃料は、航空機用Ａ−１（Ａｅｒｏｐｌａｎｅ  Ａ−１）に分類される無鉛／パラフィン油系燃料であり、これは国際的に標準化された一連の規格に合わせて生成される。ジェット燃料は、１千種以上にも上る可能性がある多数の異なる炭化水素の混合物である。そのサイズ（分子量又は炭素数）の範囲は、生成物の要件、例えば凝固点又は発煙点によって制限される。ケロシン系の航空機用燃料（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ａ−１を含む）は、約８〜１６炭素数の炭素数分布を有する。ワイドカット系又はナフサ系航空機用燃料（Ｊｅｔ  Ｂを含む）は、典型的には約５〜１５炭素の炭素数分布を有する。
【０２７３】
両方の航空機とも（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ｂ）、複数の添加剤を含有し得る。有用な添加剤としては、限定はされないが、抗酸化剤、帯電防止剤、腐食防止剤、及び燃料系着氷防止剤（ＦＳＩＩ）が挙げられる。抗酸化剤、例えば、ＡＯ−３０、ＡＯ−３１、又はＡＯ−３７は、ゴム状化を防止し、通常はアルキル化フェノールをベースとする。帯電防止剤は静電気を消散させて火花の発生を防止する。ジノニルナフチルスルホン酸（ＤＩＮＮＳＡ）を有効成分として含むスタディス４５０（Ｓｔａｄｉｓ  ４５０）が、一例である。腐食防止剤、例えばＤＣＩ−４Ａは民生用及び軍用燃料に使用され、及びＤＣＩ−６Ａは軍用燃料に使用される。ＦＳＩＩ剤には、例えばＤｉ−ＥＧＭＥが含まれる。
【０２７４】
一部の実施形態では、藻類燃料を既存のジェット燃料とブレンドすることによりジェット燃料が生成される。本発明の方法によって生成される脂質は、ジェット燃料を生成するための供給原料となり得る。従って、本発明の別の態様において、ジェット燃料の生成方法が提供される。本明細書によって、本発明の方法により生成される脂質からジェット燃料を生成する２つの方法、即ち流動触媒クラッキング（ＦＣＣ）及び水素化脱酸素（ＨＤＯ）が提供される。
【０２７５】
流動触媒クラッキング（ＦＣＣ）は、重質粗油画分からのオレフィン、特にプロピレンの生成に用いられる一つの方法である。本発明の方法によって生成される脂質はオレフィンに変換することができる。このプロセスには、生成された脂質をＦＣＣゾーンに流し、ジェット燃料として有用なオレフィンを含む生成物流を収集することが含まれる。生成された脂質がクラッキング条件でクラッキング触媒と接触することにより、ジェット燃料として有用なオレフィン及び炭化水素を含む生成物流が提供される。
【０２７６】
一実施形態において、ジェット燃料の生成方法は、（ａ）本明細書に開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養するステップと、（ｂ）脂質含有微生物を溶解することにより溶解物を生成するステップと、（ｃ）溶解物から脂質を単離するステップと、（ｄ）脂質組成物を処理するステップとを含み、これによりジェット燃料が生成される。ジェット燃料の生成方法の一実施形態では、脂質組成物を流動触媒クラッキングゾーン中に流すことができ、これは、一実施形態では、脂質組成物をクラッキング条件でクラッキング触媒と接触させることにより、Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを含む生成物流を提供することを含み得る。
【０２７７】
この方法の特定の実施形態では、脂質組成物中に存在し得るいかなる夾雑物も除去することが望ましいとされ得る。従って、脂質組成物を流動触媒クラッキングゾーンに流す前に、脂質組成物が前処理される。前処理には、脂質組成物をイオン交換樹脂と接触させることが含まれ得る。イオン交換樹脂は酸性イオン交換樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）−１５であり、脂質組成物が上向流又は下向流のいずれかで流れる反応槽中の床層として使用することができる。他の前処理には、硫酸、酢酸、硝酸、又は塩酸などの酸に脂質組成物を接触させることによる弱酸洗浄が含まれ得る。接触は、通常は周囲温度及び大気圧下において、希釈酸性溶液で行われる。
【０２７８】
場合により前処理された脂質組成物はＦＣＣゾーンに流れ、そこで炭化水素系成分がオレフィンへとクラッキングされる。触媒クラッキングは、反応ゾーンにおいて、微粉化された粒子状物質で構成される触媒に脂質組成物を接触させることにより達成される。ハイドロクラッキングとは対照的に、この反応は触媒クラッキングであり、水素の添加又は水素の消費なしに行われる。クラッキング反応が進むに従い、触媒に相当量のコークスが堆積する。この触媒は、再生ゾーンで触媒からコークスを燃焼させることにより高温で再生される。コークスを含有する触媒は、本明細書では「コークス化触媒」と称され、反応ゾーンから再生ゾーンへと連続的に輸送されて再生され、再生ゾーンからの本質的にコークスを含まない再生触媒に置き換わる。様々なガス流による触媒粒子の流動化が、反応ゾーンと再生ゾーンとの間の触媒の輸送を可能にする。流動化された触媒流中における、本明細書に記載される脂質組成物のものなど、炭化水素のクラッキング方法、反応ゾーンと再生ゾーンとの間での触媒の輸送方法、及び再生器におけるコークスの燃焼方法は、ＦＣＣプロセスの当業者には周知されている。例示的なＦＣＣ適用及びＣ２〜Ｃ５オレフィンを生成するための脂質組成物のクラッキングに有用な触媒が、米国特許第６，５３８，１６９号明細書、同第７，２８８，６８５号明細書（これらは全体として参照により援用される）に記載される。
【０２７９】
好適なＦＣＣ触媒は、概して、同じマトリックス上にあっても又はなくてもよい少なくとも２つの成分を含む。一部の実施形態では、２つの成分は両方とも反応槽全体にわたって循環し得る。第１の成分は、概して、活性非晶質粘土タイプの触媒及び／又は高活性結晶性分子篩など、流動化触媒クラッキングの技術分野で使用される周知の触媒のいずれかを含む。分子篩触媒は所望の生成物に対する選択性が大幅に向上しているため、非晶質触媒と比べて好ましい場合がある。一部の好ましい実施形態では、ＦＣＣプロセスにおける分子篩としてゼオライトが使用される。好ましくは、第１の触媒成分が、大孔ゼオライト、例えばＹ型ゼオライト、活性アルミナ材料、バインダー材料（シリカ又はアルミナのいずれかを含むもの）及びカオリンなどの不活性充填剤を含む。
【０２８０】
一実施形態において、本発明の脂質組成物のクラッキングは、ＦＣＣゾーンのライザー部、或いはリフト部で行われる。脂質組成物はノズルによってライザーに導入され、脂質組成物の急速蒸発が生じる。触媒との接触前、脂質組成物の温度は通常約１４９℃〜約３１６℃（３００°Ｆ〜６００°Ｆ）であり得る。触媒がブレンド容器からライザーに流れ、そこで触媒がａｂｏｒｔ２秒以下の間にわたり脂質組成物と接触する。
【０２８１】
ブレンドされた触媒及び反応脂質組成物の蒸気は、次にライザーの上から出口を通って吐き出され、オレフィンを含むクラッキング後の生成物蒸気流と、相当量のコークスで被覆された、概して「コークス化触媒」と称される一群の触媒粒子とに分けられる。脂質組成物と触媒との接触時間を最小限に抑えるため（接触は所望の生成物から望ましくない他の生成物へのさらなる変換を促進し得る）、旋回アーム装置などの任意のセパレータ装置を使用して、生成物流からコークス化触媒を速やかに除去することができる。セパレータ、例えば旋回アームセパレータはチャンバの上部に位置し、ストリッピングゾーンがチャンバの下部にある。旋回アーム装置により分離された触媒はストリッピングゾーンに降下する。軽質オレフィンを含むクラッキング後の炭化水素と一部の触媒とを含むクラッキング後の生成物蒸気流が、導管を通ってチャンバを出て、この導管はサイクロンと連通している。サイクロンによって生成物蒸気流から残りの触媒粒子が除去され、粒子濃度が極めて低いレベルに低下する。次に生成物蒸気流が分離容器の上から出る。サイクロンによって分離された触媒は分離容器に戻され、次にストリッピングゾーンに戻される。ストリッピングゾーンは、蒸気との向流接触によって触媒の表面から吸着炭化水素を除去する。
【０２８２】
低い炭化水素分圧は、軽質オレフィンの生成に有利に働く。従って、ライザー圧力は約１７２〜２４１ｋＰａ（２５〜３５ｐｓｉａ）に設定され、炭化水素分圧は約３５〜１７２ｋＰａ（５〜２５ｐｓｉａ）であり、好ましい炭化水素分圧は約６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉａ）である。炭化水素のこの比較的低い分圧は、希釈剤が脂質組成物の１０〜５５ｗｔ％、好ましくは脂質組成物の約１５ｗｔ％である範囲で蒸気を希釈剤として使用することにより実現される。乾性ガスなどの他の希釈剤を使用して、同等の炭化水素分圧を達成することができる。
【０２８３】
ライザー出口のクラッキング流の温度は約５１０℃〜６２１℃（９５０°Ｆ〜１１５０°Ｆ）となる。しかしながら、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を上回ると、ガスが一層乾燥し、オレフィンが増す。一方、ライザー出口温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）を下回ると、エチレン及びプロピレンが減る。従って、ＦＣＣプロセスは、約５６６℃〜約６３０℃の好ましい温度、約１３８ｋＰａ〜約２４０ｋＰａ（２０〜３５ｐｓｉａ）の好ましい圧力で実施することが好ましい。別のプロセス条件は触媒の対脂質組成物比であり、これは約５から約２０、好ましくは約１０から約１５まで異なり得る。
【０２８４】
ジェット燃料の生成方法の一実施形態では、脂質組成物がＦＣＣ反応槽のリフト部に導入される。リフト部の温度は極めて高く、約７００℃（１２９２°Ｆ）〜約７６０℃（１４００°Ｆ）の範囲となり、触媒の対脂質組成物比は約１００〜約１５０である。脂質組成物をリフト部に導入すると、多量のプロピレン及びエチレンが生じることが予想される。
【０２８５】
本明細書に記載されるとおり生成された脂質組成物又は脂質を使用したジェット燃料の生成方法の別の実施形態では、脂質組成物又は脂質の構造が、水素化脱酸素（ｈｙｄｒｏｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ：ＨＤＯ）と称されるプロセスによって破壊される。ＨＤＯは、水素を用いた酸素の除去を意味し、即ち、材料の構造を破壊しながら酸素が除去される。オレフィン二重結合が水素化され、任意の硫黄及び窒素化合物が除去される。硫黄の除去は水素化脱硫（ｈｙｄｒｏｄｅｓｕｌｐｈｕｒｉｚａｔｉｏｎ：ＨＤＳ）と呼ばれる。原材料（脂質組成物又は脂質）の前処理及び純度が、触媒の有効寿命に寄与する。
【０２８６】
一般に、ＨＤＯ／ＨＤＳステップでは、水素が供給原料（脂質組成物又は脂質）と混合され、次に混合物が並流として、単相或いは二相供給原料として触媒床に通される。ＨＤＯ／ＭＤＳステップの後、生成物画分が分離され、別個のｉｓｏｍｅｒｚａｔｉｏｎ反応槽に送られる。生物学的出発物質用の異性化反応槽については、文献（ＦＩ  １００  ２４８）に並流反応槽として記載されている。
【０２８７】
供給炭化水素、例えば本明細書では脂質組成物又は脂質を水素化することによる燃料の生成方法はまた、脂質組成物又は脂質を水素ガスと共に並流として第１の水素化ゾーンに通して実施することもでき、その後、水素ガスを第２の水素化ゾーンに、流出する炭化水素に対する向流として通すことにより、流出する炭化水素が第２の水素化ゾーンでさらに水素化される。例示的なＨＤＯ適用及びＣ２〜Ｃ５オレフィンを生成するための脂質組成物のクラッキングに有用な触媒が、米国特許第７，２３２，９３５号明細書（全体として参照により援用される）に記載されている。
【０２８８】
典型的には、水素化脱酸素ステップでは、本明細書における脂質組成物又は脂質などの生物学的成分の構造が分解され、酸素、窒素、リン及び硫黄化合物、並びにガスとしての軽質炭化水素が除去され、且つオレフィン結合が水素化される。このプロセスの第２のステップでは、即ちいわゆる異性化ステップでは、炭化水素鎖の分枝及び低温でのパラフィン性能の向上のため、ｉｓｏｍｅｒｚａｔｉｏｎが実施される。
【０２８９】
クラッキングプロセスの第１のステップ、即ちＨＤＯステップでは、水素ガス及び水素化される本明細書の脂質組成物又は脂質が、並流又は向流のいずれかとしてＨＤＯ触媒床システムに送り込まれ、前記触媒床システムは１つ以上の触媒床、好ましくは１〜３つの触媒床を含む。ＨＤＯステップは、典型的には並流方式で動作する。２つ以上の触媒床を含むＨＤＯ触媒床システムの場合、床のうち１つ以上を向流原理を用いて動作させてもよい。ＨＤＯステップでは、圧力は２０〜１５０バールの間、好ましくは５０〜１００バールの間で様々であり、温度は２００〜５００℃の間、好ましくは３００〜４００℃の範囲で様々である。ＨＤＯステップでは、周期律表第ＶＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有する周知の水素化触媒が使用され得る。好ましくは、水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ及び／又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。典型的には、ＮｉＭｏ／Ａｌ２Ｏ３及びＣｏＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒が使用される。
【０２９０】
ＨＤＯステップの前に、場合により本明細書の脂質組成物又は脂質は、より穏和な条件下で、従って二重結合の副反応を回避して予備的に水素化処理され得る。かかる予備水素化は、予備水素化触媒の存在下、５０〜４００℃の温度及び１〜２００バールの水素圧、好ましくは１５０〜２５０℃の温度及び１０〜１００バールの水素圧で実施される。触媒は、周期律表第ＶＩＩＩ族及び／又は第ＶＩＢ族の金属を含有し得る。好ましくは、予備水素化触媒は担持Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ及び／又はＣｏＭｏ触媒であり、担体はアルミナ及び／又はシリカである。
【０２９１】
水素を含有するＨＤＯステップのガス流が冷却され、次にそれから一酸化炭素、二酸化炭素、窒素、リン及び硫黄化合物、ガス状軽質炭化水素及び他の不純物が除去される。圧縮後、精製水素又は再生水素が第１の触媒床及び／又は触媒床の間に戻され、抜き取られたガス流を補う。濃縮液体から水が除去される。この液体は第１の触媒床及び／又は触媒床間に送り込まれる。
【０２９２】
ＨＤＯステップの後、生成物は異性化ステップに供される。このプロセスには、炭化水素を異性化触媒と接触させる前に可能な限り完全に不純物を除去することが重要である。異性化ステップは任意選択のストリッピングステップを含み、ここではＨＤＯステップからの反応生成物が、水蒸気又は好適なガス、例えば、軽質炭化水素、窒素又は水素によるストリッピングによって精製され得る。任意選択のストリッピングステップは、異性化触媒の上流のユニットにおいて向流方式で実施されるか（ここではガスと液体とが互いに接触する）、又は実際の異性化反応槽の前に、別個のストリッピングユニットにおいて向流原理を利用して実施される。
【０２９３】
ストリッピングステップの後、水素ガス及び本明細書の水素化された脂質組成物又は脂質、及び場合によりｎ−パラフィン混合物が、１つ又はいくつかの触媒床を含む反応異性化ユニットに送り込まれる。異性化ステップの触媒床は並流方式又は向流方式のいずれで動作してもよい。
【０２９４】
このプロセスに関して、異性化ステップで向流原理が適用されることが重要である。異性化ステップでは、これは任意選択のストリッピングステップ又は異性化反応ステップの一方又は両方を向流方式で実施することにより行われる。ｉｓｏｍｅｒｚａｔｉｏｎステップでは、圧力は２０〜１５０バールの範囲、好ましくは２０〜１００バールの範囲で様々であり、温度は２００〜５００℃、好ましくは３００〜４００℃である。異性化ステップでは、当該技術分野において公知の異性化触媒が使用され得る。好適な異性化触媒は、分子篩又は第ＶＩＩ族金属及び／又は担体を含有する。好ましくは、異性化触媒は、ＳＡＰＯ−１１若しくはＳＡＰＯ４１又はＺＳＭ−２２若しくはＺＳＭ−２３及び／又はフェリエライト及びＰｔ、Ｐｄ又はＮｉ及びＡｌ２Ｏ３及び／又はＳｉＯ２を含有する。典型的な異性化触媒は、例えば、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２２／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２３／Ａｌ２Ｏ３及びＰｔ／ＳＡＰＯ−１１／ＳｉＯ２である。異性化ステップとＨＤＯステップとは、同じ圧力容器で、又は別個の圧力容器で実施されてもよい。任意選択の予備水素化は、ＨＤＯステップ及び異性化ステップと別個の圧力容器で、又は同じ圧力容器で実施されてもよい。
【０２９５】
従って、一実施形態において、１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５ジェット燃料を含むアルカン混合物である。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、１０ｐｐｍ未満の硫黄分を有する。他の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２０５℃未満の蒸留曲線のＴ１０値を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、３００℃未満の終沸点（ＦＢＰ）を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも３８℃の引火点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、７７５Ｋ／Ｍ３〜８４０Ｋ／Ｍ３の密度を有する。さらに別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、−４７℃未満の凝固点を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも４２．８ＭＪ／Ｋの真燃焼熱を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、少なくとも１３．４質量％の水素分を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、２６０℃で定量的重量分析ＪＦＴＯＴによって試験したとき、３ｍｍＨｇ未満である熱安定性を有する。別の実施形態において、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料規格に適合する組成物は、７ｍｇ／ｄｌ未満の実在ガムを有する。
【０２９６】
従って、本発明は、微細藻類脂質の化学的修飾を行うことにより様々な工業用途及び他の用途で有用な生成物を産生する様々な方法を開示する。本明細書に開示される方法によって生成される油の修飾方法の例としては、限定はされないが、油の加水分解、油の水素化処理、及び油のエステル化が挙げられる。微細藻類油の修飾により基礎油脂化学品が生成され、これをさらに、所望の機能のための選択された誘導油脂化学品となるよう修飾することができる。上記に燃料生成方法に関連して記載したのと同様の方法で、本明細書に記載される微生物培養物から生成された油に対してもこれらの化学的修飾を実施することができる。基礎油脂化学品の例としては、限定はされないが、石鹸、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル、及びグリセロールが挙げられる。誘導油脂化学品の例としては、限定はされないが、脂肪ニトリル、エステル、ダイマー酸、第四級アンモニウム化合物（ｑｕａｔｓ）、界面活性剤、脂肪アルカノールアミド、脂肪アルコールスルフェート、樹脂、乳化剤、脂肪アルコール、オレフィン、及び高級アルカンが挙げられる。
【０２９７】
本明細書に記載される方法によって生成されるグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の加水分解により、他の有用な化学品を生成するため誘導体化することのできる遊離脂肪酸が産生される。加水分解は、水と、酸又は塩基のいずれかであってよい触媒との存在下で起こる。放出された遊離脂肪酸を誘導体化することにより、以下に報告されるとおり様々な生成物を産生することができる：米国特許第５，３０４，６６４号明細書（高度に硫酸化された脂肪酸）；同第７，２６２，１５８号明細書（クレンジング組成物）；同第７，１１５，１７３号明細書（織物柔軟剤組成物）；同第６，３４２，２０８号明細書（皮膚処置用のエマルション）；同第７，２６４，８８６号明細書（撥水組成物）；同第６，９２４，３３３（ペンキ添加剤）；同第６，５９６，７６８号明細書（脂質リッチの反芻動物飼料）；同第６，３８０，４１０号明細書（洗浄剤及びクリーナー用の界面活性剤）。
【０２９８】
加水分解に関して、一部の実施形態では、トリグリセリド油は場合により、初めに水又は水酸化ナトリウムなどの液体培地中で加水分解され、それによりグリセロール及び石鹸が得られる。様々な好適なトリグリセリド加水分解方法があり、限定はされないが、鹸化、酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素加水分解（本明細書ではスプリッティングと称される）、及び熱圧縮水を使用した加水分解が挙げられる。当業者は、油脂化学品を生成するためにトリグリセリド油が加水分解される必要はなく；むしろ、油は、他の公知のプロセスによって所望の油脂化学品に直接変換されてもよいことを認識するであろう。例えば、トリグリセリド油がエステル化を介してメチルエステル脂肪酸に直接変換されてもよい。
【０２９９】
一部の実施形態では、油がグリセロールと脂肪酸とにスプリッティングされることにより、本明細書に開示される方法により生成された油の触媒的加水分解が起こる。上記で考察したとおり、次に脂肪酸を他のいくつかの修飾によってさらに処理することにより、誘導体油脂化学品が得られ得る。例えば、一実施形態では、脂肪酸がアミノ化反応を受けて脂肪族窒素化合物が生成され得る。別の実施形態では、脂肪酸がオゾン分解を受けて１塩基酸及び２塩基酸が生成され得る。
【０３００】
他の実施形態では、本明細書で生成される油のスプリッティングによって加水分解が起こり、油脂化学品が作り出され得る。一部の実施形態では、トリグリセリド油が、他の処理を行う前にスプリッティングされ得る。当業者は、限定はされないが、酵素的スプリッティング及び圧力スプリッティングを含め、多くの好適なトリグリセリドスプリッティング方法があることを認識するであろう。
【０３０１】
概して、酵素的油スプリッティング方法は、水／油混合物に作用する生体触媒として酵素リパーゼを使用する。次に酵素的スプリッティングによりそれぞれ油又は脂肪がグリセロール及び遊離脂肪酸にスプリッティングされる。次にグリセロールが水相中に移動する一方、有機相は遊離脂肪酸が高濃度化し得る。
【０３０２】
酵素的スプリッティング反応は、概して有機相と水相との相境界で起こり、ここで酵素は相境界にのみ存在する。次に相境界に達するトリグリセリドがスプリッティング反応に寄与し又は関与する。反応が進むにつれ、なおもグリセリドとして化学的に結合している脂肪酸の占有密度又は濃度は遊離脂肪酸と比較して相境界で低下し、そのため反応が減速する。特定の実施形態では、酵素的スプリッティングは室温で起こり得る。当業者には、油を所望の脂肪酸にスプリッティングするために好適な条件は公知であろう。
【０３０３】
例として、界面境界面を増加させることにより反応速度を加速させることができる。反応が完了すると、次に酵素から遊離した有機相から遊離脂肪酸が分離され、グリセリドとして化学的に結合した脂肪酸をなおも含有する残渣が送り戻され又は再循環されて、スプリッティングに供される新鮮な油又は脂肪と混合される。このように、再循環されたグリセリドが、次にさらなる酵素的スプリッティングプロセスに供される。一部の実施形態では、遊離脂肪酸は、かかる方法で部分的にスプリッティングされた油又は脂肪から抽出される。このようにして、化学的に結合した脂肪酸（トリグリセリド）がスプリッティングプロセスに返され又は送り戻される場合、酵素消費を大幅に削減することができる。
【０３０４】
スプリッティングの程度は、測定された酸価を、所与の油又は脂肪について計算することのできる理論的に可能な酸価で除した比として決定される。好ましくは、酸価は、標準的な一般方法に従い滴定を用いて測定される。或いは、グリセロール水相の密度がスプリッティングの程度の尺度として取られてもよい。
【０３０５】
一実施形態において、本明細書に記載されるとおりのスプリッティングプロセスはまた、生成された油のアルカリ精製プロセスからのいわゆるソーダ油滓に含まれるモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドのスプリッティングにも好適である。このように、ソーダ油滓は、中性油を予め鹸化して脂肪酸にすることなく定量的に変換することができる。この目的上、石鹸中の化学的に結合している脂肪酸が、好ましくはスプリッティング前に、酸を添加することにより放出される。特定の実施形態では、スプリッティングプロセスのため、水及び酵素に加えて緩衝溶液が使用される。
【０３０６】
一実施形態において、本明細書に記載される方法において生成される油はまた、加水分解方法として鹸化に供されてもよい。動物油及び植物油は、典型的にはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）で作られており、ＴＡＧは脂肪酸との三価アルコールのグリセロールとのエステルである。アルカリ加水分解反応では、ＴＡＧ中のグリセロールが除去され、ナトリウム又はカリウムなどのアルカリ金属カチオンと会合して脂肪酸塩を生成し得る３つのカルボン酸アニオンが残る。このスキームにおいては、カルボン酸要素がグリセロール部分から切断され、ヒドロキシル基に置き換えられる。反応で使用される塩基（例えば、ＫＯＨ）の量は、所望の鹸化程度によって決定される。例えば、目標が、ＴＡＧ組成物中に当初存在する油の一部を含む石鹸製品を製造することである場合、ＴＡＧの全てを脂肪酸塩に変換するには不十分な量の塩基が反応混合物中に導入される。通常、この反応は水溶液中で実施され、緩徐に進行するが、熱を加えることにより進行を速めてもよい。脂肪酸塩の沈殿は、反応混合物に水溶性アルカリ金属ハロゲン化物（例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌ）などの塩を添加することにより促進し得る。好ましくは、塩基は、ＮａＯＨ又はＫＯＨなどのアルカリ金属水酸化物である。或いは、アルカノールアミンなどの他の塩基、例えばトリエタノールアミン及びアミノメチルプロパノールをこの反応スキームにおいて使用することができる。ある場合には、清澄な石鹸製品を製造するため、これらの代替方法が好ましい場合がある。
【０３０７】
一部の方法では、化学修飾の第１のステップは、水素化処理により二重結合を飽和させ、続いて水素及び触媒の存在下において高温で脱酸素することであり得る。他の方法では、水素化と脱酸素とを同じ反応で行ってもよい。さらに他の方法では、脱酸素は水素化前に行われる。次に場合により異性化が、同様に水素及び触媒の存在下で実施されてもよい。最後に、必要に応じてガス及びナフサ成分が除去され得る。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号明細書（トリグリセリドの水素化）；同第５，０９１，１１６号明細書（脱酸素、水素化及びガス除去）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化）；及び同第５，８８８，９４７号明細書（異性化）を参照のこと。
【０３０８】
一部の実施形態では、トリグリセリド油は部分的に又は完全に脱酸素される。脱酸素反応により、限定はされないが、脂肪酸、脂肪アルコール、ポリオール、ケトン、及びアルデヒドを含めた所望の生成物が形成される。一般に、いかなる特定の理論によっても制限されないが、脱酸素反応は、限定なしに水素化分解、水素化、連続水素化−水素化分解、連続水素化分解−水素化、及び併用される水素化−水素化分解反応を含めた、様々な異なる反応経路の組み合わせを含み、脂肪酸又は脂肪酸エステルからの酸素の少なくとも部分的な除去を生じさせることにより、さらなる処理によって所望の化学品に容易に変換することのできる反応生成物、例えば脂肪アルコールを生成する。例えば、一実施形態において、脂肪アルコールがＦＣＣ反応によってオレフィンに変換されてもよく、又は縮合反応によって高級アルカンに変換されてもよい。
【０３０９】
かかる化学修飾の一つは水素化であり、これは、グリセロ脂質又は遊離脂肪酸の脂肪酸構成要素の二重結合に水素を添加するものである。水素化プロセスは、特定の用途に一層好適であり得る半固体又は固体脂肪への液体油の転換を可能にする。
【０３１０】
本明細書に記載される方法により生成される油の水素化は、以下に報告されるとおり、本明細書に提供される方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施することができる：米国特許第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第５，３４６，７２４号明細書（潤滑製品）；同第５，４７５，１６０号明細書（脂肪アルコール）；同第５，０９１，１１６号明細書（食用油）；同第６，８０８，７３７号明細書（マーガリン及びスプレッド用構造脂肪）；同第５，２９８，６３７号明細書（低カロリー脂肪代用物）；同第６，３９１，８１５号明細書（水素化触媒及び硫黄吸着剤）；同第５，２３３，０９９号明細書及び同第５，２３３，１００号明細書（脂肪アルコール）；同第４，５８４，１３９号明細書（水素化触媒）；同第６，０５７，３７５号明細書（泡止め剤）；同第７，１１８，７７３号明細書（食用エマルションスプレッド）。
【０３１１】
当業者は、様々なプロセスを用いて炭水化物を水素化し得ることを認識するであろう。一つの好適な方法としては、水素化反応槽において水素化生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び触媒と接触させることが挙げられる。水素化触媒は、概して、Ｃｕ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｉｒ、及びそれらの合金又は任意の組み合わせを、単独で、或いはＷ、Ｍｏ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂ、Ｐ、Ｂｉ、及びそれらの合金又は任意の組み合わせなどの助触媒と共に含むことができる。他の有効な水素化触媒材料としては、担持ニッケルか、或いはレニウムで修飾されたルテニウムが挙げられる。ある実施形態では、水素化触媒はまた、触媒の所望の機能性に応じた担体のうちのいずれか一つも含む。水素化触媒は、当業者に公知の方法によって調製され得る。
【０３１２】
一部の実施形態では、水素化触媒には、担持第ＶＩＩＩ族金属触媒及び金属スポンジ材料（例えばスポンジニッケル触媒）が含まれる。ラネーニッケルは、この発明での使用に好適な活性スポンジニッケル触媒の例を提供する。他の実施形態では、本発明における水素化反応は、ニッケル−レニウム触媒又はタングステン修飾ニッケル触媒を含む触媒を使用して実施される。水素化反応に好適な触媒の一例は、炭素担持ニッケル−レニウム触媒である。
【０３１３】
ある実施形態では、重量単位でほぼ等量のニッケル及びアルミニウムの合金を、約２５重量％の水酸化ナトリウムを例えば含有するアルカリ水溶液で処理することにより、好適なラネーニッケル触媒が調製され得る。アルミニウムはアルカリ水溶液によって選択的に溶解され、大部分がニッケルで少量のアルミニウムを含むスポンジ型材料が生じる。初期合金は、形成されたスポンジニッケル触媒中に約１〜２重量％が残るような量の助触媒金属（即ちモリブデン又はクロム）を含む。別の実施形態では、水素化触媒は、水中のトリニトラトニトロシルルテニウム（ＩＩＩ）、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）の溶液を使用し、好適な担体材料を含浸させて調製される。次に溶液を乾燥させ、含水量が約１重量％未満の固体を形成する。次に固体を回転式ボール炉において４時間、大気圧下３００℃（焼成なし）又は４００℃（焼成あり）の水素流中で還元してもよい。冷却し、且つ窒素で触媒を不活性化した後、窒素中５容積％の酸素が触媒に２時間送られる。
【０３１４】
特定の実施形態において、記載される触媒は触媒担体を含む。触媒担体は触媒を安定化させ、担持する。使用される触媒担体の種類は、選択した触媒及び反応条件に依存する。本発明に好適な担体としては、限定はされないが、炭素、シリカ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、チタニア、セリア、バナジア、窒化物、窒化ホウ素、ヘテロポリ酸、ヒドロキシアパタイト、酸化亜鉛、クロミア、ゼオライト、カーボンナノチューブ、炭素フラーレン及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３１５】
この発明で使用される触媒は、当業者に公知の従来方法を用いて調製することができる。好適な方法としては、限定はされないが、初期湿潤、蒸発含浸、化学蒸着、洗浄−コーティング、マグネトロンスパッタリング技術などを挙げることができる。
【０３１６】
水素化反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、適切な反応条件を認識するであろう。一般に、水素化反応は８０℃〜２５０℃の温度で、好ましくは９０℃〜２００℃で、最も好ましくは１００℃〜１５０℃で行われる。一部の実施形態では、水素化反応は５００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａの圧力で行われる。
【０３１７】
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、その場で発生する水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語「外部水素」は、バイオマス反応それ自体から生じるのではなく、むしろ別の供給源からその系に添加される水素を指す。
【０３１８】
一部の実施形態では、出発炭水化物をより小さい分子に変換し、所望の高級炭化水素への変換を容易にすることが望ましい。この変換に好適な一つの方法は、水素化分解反応によるものである。炭水化物の水素化分解の実施については、様々なプロセスが知られている。一つの好適な方法としては、水素化分解反応槽においてより小さい分子又はポリオールを含む反応生成物が形成されるのに十分な条件下で炭水化物を水素又は好適なガスと混合された水素及び水素化分解触媒と接触させることが挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「より小さい分子又はポリオール」は、より低い分子量を有する任意の分子を含み、これは出発炭水化物より少ない炭素原子数又は酸素原子数を含み得る。ある実施形態では、反応生成物は、ポリオール及びアルコールを含むより小さい分子を含む。一部の当業者は、水素化分解反応の実施に適切な方法を選択することが可能であろう。
【０３１９】
一部の実施形態では、五炭糖及び／又は六炭糖又は糖アルコールを、水素化分解触媒を使用してプロピレングリコール、エチレングリコール、及びグリセロールに変換してもよい。水素化分解触媒は、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、及びそれらの合金又は任意の組み合わせを、単独で、或いはＡｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂｉ、Ｂ、Ｏ、及びそれらの合金又は任意の組み合わせなどの助触媒と共に含み得る。水素化分解触媒はまた、遷移金属（例えば、クロム、モリブデン、タングステン、レニウム、マンガン、銅、カドミウム）又は第ＶＩＩＩ族金属（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、及びオスミウム）を含有する炭素質パイロポリマー触媒も含み得る。特定の実施形態において、水素化分解触媒は、アルカリ土類金属酸化物と組み合わせるか、又は触媒活性担体に付着した上記の金属のいずれかを含み得る。特定の実施形態において、水素化分解反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。
【０３２０】
水素化分解反応を実施するための条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。一般に、水素化分解反応は１１０℃〜３００℃の温度、好ましくは１７０℃〜２２０℃、最も好ましくは２００℃〜２２５℃で行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は塩基性条件下、好ましくは８〜１３のｐＨ、さらにより好ましくは１０〜１２のｐＨで行われる。一部の実施形態では、水素化分解反応は、６０ＫＰａ〜１６５００ＫＰａの範囲、好ましくは１７００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａ、さらにより好ましくは４８００ＫＰａ〜１１０００ＫＰａの範囲の圧力で行われる。
【０３２１】
本発明の水素化分解反応で使用される水素には、外部水素、再生水素、その場で発生する水素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【０３２２】
一部の実施形態では、上記で考察する反応生成物は、縮合反応槽（縮合反応槽１１０として図１に概略的に図示される）において縮合反応によって高級炭化水素に変換されてもよい。かかる実施形態において、反応生成物の縮合は、高級炭化水素を形成することが可能な触媒の存在下で起こる。理論によって制限されることを意図するものではないが、高級炭化水素の生成は、炭素−炭素結合、又は炭素−酸素結合の形成を含め、段階的な付加反応によって進むものと考えられる。得られる反応生成物は、以下にさらに詳細に記載するとおり、これらの部分を含有する任意の数の化合物を含む。
【０３２３】
特定の実施形態において、好適な縮合触媒には、酸触媒、塩基触媒、又は酸／塩基触媒が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「酸／塩基触媒」は、酸及び塩基の両方の官能基を有する触媒を指す。一部の実施形態では、縮合触媒として、限定なしに、ゼオライト、カーバイド、窒化物、ジルコニア、アルミナ、シリカ、アルミノケイ酸塩、リン酸塩、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バナジウム、酸化ランタン、酸化イットリウム、酸化スカンジウム、酸化マグネシウム、酸化セリウム、酸化バリウム、酸化カルシウム、水酸化物、ヘテロポリ酸、無機酸、酸修飾樹脂、塩基修飾樹脂、及びそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、修飾剤も含まれ得る。好適な修飾剤としては、Ｌａ、Ｙ、Ｓｃ、Ｐ、Ｂ、Ｂｉ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、縮合触媒にはまた、金属も含まれ得る。好適な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｓｎ、Ｏｓ、それらの合金、及び任意の組み合わせが挙げられる。
【０３２４】
特定の実施形態において、縮合反応において記載される触媒には、水素化反応について上記に記載したとおりの触媒担体が含まれ得る。特定の実施形態において、縮合触媒は自己担持型である。本明細書で使用されるとき、用語「自己担持型」は、その触媒が担体として機能する別の材料を必要としないことを意味する。他の実施形態では、縮合触媒は、触媒を懸濁するのに好適な別個の担体と併せて使用される。ある実施形態では、縮合触媒担体はシリカである。
【０３２５】
縮合反応が起こる条件は、出発物質の種類及び所望の生成物に基づき異なり得る。当業者は、本開示の利益をもって、反応の実施に用いるのに適切な条件を認識するであろう。一部の実施形態では、縮合反応は、提案されている反応の熱力学が有利となる温度で実施される。縮合反応の温度は、具体的な出発ポリオール又はアルコールに応じて異なり得る。一部の実施形態では、縮合反応の温度は８０℃〜５００℃、好ましくは１２５℃〜４５０℃、最も好ましくは１２５℃〜２５０℃の範囲である。一部の実施形態では、縮合反応は、０ＫＰａ〜９０００ＫＰａの範囲、好ましくは０ＫＰａ〜７０００ＫＰａ、さらにより好ましくは０ＫＰａ〜５０００ＫＰａの範囲の圧力で実施される。
【０３２６】
本発明により形成される高級アルカンとしては、限定はされないが、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルカン、４〜３０個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルケン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルカン、５〜３０個の炭素原子を有するシクロアルケン、アリール、縮合アリール、アルコール、及びケトンが挙げられる。好適なアルカンとしては、限定はされないが、ブタン、ペンタン、ペンテン、２−メチルブタン、ヘキサン、ヘキセン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２，−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプテン、オクタン、オクテン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルヘキサン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、ノナン、ノネン、デカン、デセン、ウンデカン、ウンデセン、ドデカン、ドデセン、トリデカン、トリデセン、テトラデカン、テトラデセン、ペンタデカン、ペンタデセン、ノニルデカン、ノニルデセン、エイコサン、エイコセン、ウンエイコサン、ウンエイコセン、ドエイコサン、ドエイコセン、トリエイコサン、トリエイコセン、テトラエイコサン、テトラエイコセン、及びそれらの異性体が挙げられる。これらの生成物の一部は燃料としての使用に好適であり得る。
【０３２７】
一部の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは非置換である。他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは一置換である。さらに他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは多置換である。置換シクロアルカン及びシクロアルケンを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。好適なシクロアルカン及びシクロアルケンとしては、限定はされないが、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、メチル−シクロペンタン、メチル−シクロペンテン、エチル−シクロペンタン、エチル−シクロペンテン、エチル−シクロヘキサン、エチル−シクロヘキセン、それらの異性体及び任意の組み合わせが挙げられる。
【０３２８】
一部の実施形態では、形成されるアリールは非置換である。別の実施形態において、形成されるアリールは一置換である。置換アリールを含む実施形態において、置換基には、限定なしに、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキル、１〜１２個の炭素原子を有する分枝又は直鎖アルキレン、フェニル、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。本発明に好適なアリールとしては、限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、パラキシレン、メタキシレン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３２９】
本発明において生成されるアルコールは、４〜３０個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アルコールは環式である。他の実施形態では、アルコールは分枝状である。別の実施形態では、アルコールは直鎖状である。本発明に好適なアルコールとしては、限定はされないが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプチルデカノール、オクチルデカノール、ノニルデカノール、エイコサノール、ウンエイコサノール、ドエイコサノール、トリエイコサノール、テトラエイコサノール、及びそれらの異性体が挙げられる。
【０３３０】
本発明において生成されるケトンは、４〜３０個の炭素原子を有する。ある実施形態では、ケトンは環式である。別の実施形態では、ケトンは分枝状である。別の実施形態において、ケトンは直鎖状である。本発明に好適なケトンとしては、限定はされないが、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ウンデカノン、ドデカノン、トリデカノン、テトラデカノン、ペンタデカノン、ヘキサデカノン、ヘプチルデカノン、オクチルデカノン、ノニルデカノン、エイコサノン、ウンエイコサノン、ドエイコサノン、トリエイコサノン、テトラエイコサノン、及びそれらの異性体が挙げられる。
【０３３１】
別のかかる化学修飾は、エステル交換である。天然で産生されるグリセロ脂質は、脂肪酸構成要素の分布が均一でない。油との関連において、エステル交換は、異なるグリセロ脂質の２つのエステル間でのアシル基の交換を指す。エステル交換プロセスは、グリセロ脂質の混合物の脂肪酸構成要素を転位させて分布パターンを修飾し得る機構を提供する。エステル交換は周知の化学的プロセスであり、概して、油の混合物をある時間にわたり（例えば３０分間）、アルカリ金属又はアルキル化アルカリ金属（例えばナトリウムメトキシド）などの触媒の存在下で（約２００℃に）加熱することを含む。このプロセスを用いて油混合物の脂肪酸構成要素の分布パターンをランダム化することができ、又は所望の分布パターンを生成するように仕向けることができる。脂質を化学的に修飾するこの方法は、脂質としての乾燥細胞重量に対する割合が少なくとも２０％である微生物バイオマスなどの、本明細書に提供される材料に対して実施することができる。
【０３３２】
存在し得る一部のＴＡＧの融点未満の温度に油混合物を維持することにより、指向性エステル交換を実施することができ、ここでは脂肪酸の特定の分布パターンが求められる。これによりそれらのＴＡＧの選択的な結晶化がもたらされ、このようなＴＡＧは結晶化に伴い反応混合物から効果的に除去される。このプロセスは、例えば、油中の脂肪酸の大部分が沈殿し終えるまで続けることができる。指向性エステル交換プロセスを使用すると、例えば、より長鎖の脂肪酸をより短鎖のカウンターパートによって置換することで、より低いカロリー含有量の生成物を生成することができる。指向性エステル交換はまた、不要なトランス異性体を生じ得る水素化に頼ることなしに、食品添加剤又は生成物（例えばマーガリン）において求められる所望の融解特性及び構造的特徴を提供できる脂肪の混合物を含む生成物の生成にも用いられる。
【０３３３】
本明細書に記載される方法により生成される油のエステル交換は、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：米国特許第６，０８０，８５３号明細書（非可消化性脂肪代用物）；同第４，２８８，３７８号明細書（ピーナッツバター安定化剤）；同第５，３９１，３８３号明細書（食用スプレー油）；同第６，０２２，５７７号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，４３４，２７８号明細書（食品用の食用脂肪）；同第５，２６８，１９２号明細書（低カロリーナッツ製品）；同第５，２５８，１９７号明細書（低カロリー食用組成物）；同第４，３３５，１５６号明細書（食用脂肪生成物）；同第７，２８８，２７８号明細書（食品添加剤又は薬剤）；同第７，１１５，７６０号明細書（分画プロセス）；同第６，８０８，７３７号明細書（構造脂肪）；同第５，８８８，９４７号明細書（エンジン潤滑剤）；同第５，６８６，１３１号明細書（食用油混合物）；及び同第４，６０３，１８８号明細書（硬化性ウレタン組成物）。
【０３３４】
本発明における一実施形態では、上記に記載したとおりの油のエステル転移反応の後に、米国特許第６，４６５，６４２号明細書に報告されるとおり、エステル転移反応した生成物とポリオールとの反応が続き、ポリオール脂肪酸ポリエステルが生成される。かかるエステル化及び分離プロセスは、以下のとおりのステップを含み得る：石鹸の存在下で低級アルキルエステルをポリオールと反応させるステップ；生成物混合物から残留石鹸を除去するステップ；生成物混合物を水洗及び乾燥することにより不純物を除去するステップ；精製のため生成物混合物を漂白するステップ；生成物混合物中のポリオール脂肪酸ポリエステルから未反応低級アルキルエステルの少なくとも一部を分離するステップ；及び分離した未反応低級アルキルエステルを再循環させるステップ。
【０３３５】
エステル転移反応はまた、米国特許第６，２７８，００６号明細書に報告されるとおり、短鎖脂肪酸エステルを含む微生物バイオマスに対して実施することもできる。一般に、エステル転移反応は、好適な触媒の存在下で油に短鎖脂肪酸エステルを添加し、混合物を加熱することによって実施され得る。一部の実施形態では、油は、重量単位で反応混合物の約５％〜約９０％を含む。一部の実施形態では、短鎖脂肪酸エステルは、重量単位で反応混合物の約１０％〜約５０％であってもよい。触媒の非限定的な例としては、塩基触媒、ナトリウムメトキシド、酸触媒、例えば、硫酸及び酸性粘土などの無機酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸、並びにＡｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５などの酸性樹脂が挙げられる。ナトリウム及びマグネシウムなどの金属、及び金属水素化物もまた、有用な触媒である。
【０３３６】
別のかかる化学修飾はヒドロキシル化であり、これには、二重結合への水の付加によってもたらされる飽和及びヒドロキシル部分の取り込みが関わる。ヒドロキシル化プロセスは、グリセロ脂質の１つ以上の脂肪酸構成要素からヒドロキシ脂肪酸への変換機構を提供する。ヒドロキシル化は、例えば米国特許第５，５７６，０２７号明細書に報告される方法を用いて実施することができる。ヒマシ油及びその誘導体を含むヒドロキシル化脂肪酸は、食品添加剤、界面活性剤、色素湿潤剤、消泡剤、防水添加剤、可塑剤、化粧品用乳化剤及び／又は脱臭剤を含めたいくつかの工業用途、並びにエレクトロニクス、医薬品、ペンキ、インク、接着剤、及び潤滑剤における成分として有用である。グリセリドのヒドロキシル化がどのように実施され得るかについての一例は、以下のとおりである：脂肪を、ヘプタンと組み合わせて好ましくは約３０〜５０℃に加熱し、３０分間以上温度を維持し得る；次に混合物に酢酸を添加した後、硫酸水溶液を添加し、続いて過酸化水素水溶液を添加することができ、これは少量ずつ増加させながら１時間かけて混合物に添加される；過酸化水素水の後、次に温度を少なくとも約６０℃に上昇させ、少なくとも６時間撹拌し得る；撹拌後、混合物を沈殿させ、反応により形成された下層の水層を取り出すと同時に、反応により形成された上層のヘプタン層を約６０℃の温度の熱水で洗浄し得る；次に洗浄したヘプタン層を水酸化カリウム水溶液でｐＨ約５〜７に中和し、次に真空留去し得る；次に反応生成物を１００℃で真空乾燥させ、乾燥した生成物を真空条件下で蒸気脱臭し、珪藻土を使用して約５０°〜６０℃でろ過する。
【０３３７】
本明細書に記載される方法によって生成される微生物油のヒドロキシル化は、以下に報告されるような方法及び／又は材料の１つ以上と併せて実施するか、又はそのような生成物を生成するため実施することができる：米国特許第６，５９０，１１３号明細書（油性コーティング及びインク）；同第４，０４９，７２４号明細書（ヒドロキシル化プロセス）；同第６，１１３，９７１号明細書（オリーブ油バター）；同第４，９９２，１８９号明細書（潤滑剤及び潤滑添加剤）；同第５，５７６，０２７号明細書（ヒドロキシル化乳）；同第６，８６９，５９７号明細書（化粧品）。
【０３３８】
ヒドロキシル化したグリセロ脂質は、エストライドに変換することができる。エストライドはグリセロ脂質からなり、ここではヒドロキシル化脂肪酸構成要素が別の脂肪酸分子とエステル化されている。ヒドロキシル化グリセロ脂質からエストライドへの変換は、Ｉｓｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＯＣＳ  ７１（２）：１６９−１７４（１９９４）により記載されるとおり、グリセロ脂質と脂肪酸との混合物を加温し、混合物を鉱酸に接触させることによって行われ得る。エストライドは、限定なしに以下に報告されるものを含めた、様々な用途において有用である：米国特許第７，１９６，１２４号明細書（エラストマー材料及び床仕上げ材）；同第５，４５８，７９５号明細書（高温用途の濃化油）；同第５，４５１，３３２号明細書（工業用途の流体）；同第５，４２７，７０４号明細書（燃料添加剤）；同第５，３８０，８９４号明細書（潤滑剤、グリース、可塑剤、及び印刷インク）。
【０３３９】
微生物油に対して実施することのできる他の化学反応としては、米国特許第６，０５１，５３９号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールをシクロプロパン化剤と反応させることにより流動性及び／又は酸化安定性を増進させること；米国特許第６，７７０，１０４号明細書に報告されるとおり、トリアシルグリセロールからワックスを製造すること；及び「エポキシ化トリアシルグリセロールのアクリル化速度論に及ぼす脂肪酸組成の影響（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，７９：１，５９−６３，（２００１）及びＦｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７：１，１０４−１１４（２００４）に報告されるとおり、トリアシルグリセロールのエポキシ化が挙げられる。
【０３４０】
上記に記載したとおりの燃料及び化学製品用の油含有微生物バイオマスの産生は、脱脂バイオマスミールの生成をもたらす。脱脂ミールは、藻類油の調製の副産物であり、家畜、例えば、反芻動物、家禽、ブタ及び水産養殖の動物用飼料として有用である。得られるミールは、含油量が低いものの、高品質タンパク質、炭水化物、繊維、灰分、残留油及び動物用飼料に適切な他の栄養素をなお含有する。細胞は主に油分離過程で溶解されるため、脱脂ミールはかかる動物によって容易に消化可能である。脱脂ミールは場合により、動物用飼料中で穀物などの他の成分と組み合わされ得る。脱脂ミールは粉末状の稠度を有するため、エクストルーダ又はエキスパンダー又は市販の別のタイプの機械を使用してペレットに圧縮することができる。
【０３４１】
本発明を上記に詳細に記載しているが、本発明は以下の例に例示され、これらの例は、特許請求される発明を説明するために提供され、それを限定するために提供されるものではない。
【実施例】
【０３４２】
以下の例は、特許請求される発明を説明するために提供され、それを限定するために提供されるものではない。
【０３４３】
実施例１
１２：０−アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼの特異性の改変
本例は、宿主としてプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）を使用した、１２：０−アシルＡＣＰチオエステラーゼ（ＴＥ）の特異性の改変を実証する。
【０３４４】
本例では、本発明者らは、カリフォルニア月桂樹（ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、「Ｕｃ」）由来の１２：０−アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼ（Ｕｃ  ＦａｔＢ２／Ｕｃ  ＴＥ、受託番号Ｍ９４１５９）の基質特異性を改変し並びに成熟を増強する能力を実証する。これは、Ｕｃ  ＴＥのＮ末端部分を、楠（シナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）、「Ｃｃ」）由来の近縁の１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）の対応する領域で置換することにより実現した。
【０３４５】
Ｕｃ  ＴＥ及びＣｃ  ＴＥはいずれも核コードタンパク質であり、微細藻類においてそのそれぞれの活性を発揮するには、プラスチドに輸送されなければならない。この輸送は、新生チオエステラーゼのＮ末端に位置するトランジットペプチドがプラスチドトランスポーター複合体により認識されることによって起こる。プラスチドの中に入ると、トランジットペプチドは切断され、成熟チオエステラーゼが遊離する。新生タンパク質と成熟タンパク質との間には移動度に識別可能な差異があるため、この成熟過程は全細胞溶解物のウエスタンブロッティングにより追跡することができる。図１に示すとおり、本発明者らは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）内でＵｃ  ＴＥとＣｃ  ＴＥとの間に全体的な成熟効率の有意な差があることを認めた。両方のタンパク質ともクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）タンパク質由来の同じ異種トランジットペプチドを含み、且つ成熟タンパク質間で９０％超のアミノ酸同一性を呈するため、この知見は意外である。
【０３４６】
次に本発明者らは、Ｃｃ  ＴＥのＮ末端内にある９個の非重複アミノ酸のうちの１つ以上が（アラインメントされる対応するＵｃ  ＴＥ配列と比較したとき）このチオエステラーゼについて観察された効率的な成熟に決定的に重要であったかどうかを調べた。従って、本発明者らは、Ｕｃ  ＴＥのＮ末端をＣｃ  ＴＥ由来の対応する領域に置換する影響を試験することに決定した。Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９９５）９２（２３）：１０６３９−４３）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で評価したとき、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ特異性がＵｃ  ＴＥ又はＣｃ  ＴＥのＮ末端１７８アミノ酸の影響を受けなかったと結論付けた。Ｙｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．では、Ｌｅｕ８４が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現する成熟タンパク質の始端であった。対照的に、本Ｃｃ  ＴＥ及びＵｃ  ＴＥ発現コンストラクトは、Ｐｒｏ６１がＣ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤトランジットペプチド後の最初の残基である。Ｙｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．のＵｃ  ＴＥ及びＣｃ  ＴＥチオエステラーゼキメラでは、Ｔｒｐ１７９が融合点であった。
【０３４７】
本発明者らは、６つのＣｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラを構築するための融合点としてＴｒｐ１７９を使用し、ここではＣｃ  ＴＥ遺伝子の種々のセグメントを使用してＵｃ  ＴＥの対応する領域を置換した（図３）。これらのコンストラクトを、本発明者らが株Ａと呼ぶプロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）株ＵＴＥＸ  １４３５の古典的に突然変異誘発した誘導体に形質転換した。形質転換、細胞培養、脂質生成及び定量化は全て、例えば、国際公開第２００８／１５１１４９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６０３２号パンフレット、国際公開第２０１１／１５０４１０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１５０４１１号パンフレットに以前記載されているとおり実施した。各キメラチオエステラーゼの成熟に対する影響を、全細胞溶解物のウエスタンブロッティングによって野生型Ｃｃ  ＴＥ及びＵｃ  ＴＥと比較した。
【０３４８】
以下に記載するとおり、本発明者らは、Ｃｃ  ＴＥにユニークな３つのアミノ酸（Ａｓｎ９１、Ｐｒｏ９２及びＰｒｏ１０２）が、Ｕｃ  ＴＥにグラフトしたとき効率的な成熟を実現したことを見出した。より効率的な成熟は、それらの位置に変異アミノ酸を有する外因性アシル−ＡＣＰ  ＴＥを発現する細胞が生成する油の脂肪酸プロファイルのより大きいシフトを可能にし得る。さらに、本発明者らは、４つのＣｃ  ＴＥ特異的アミノ酸（Ｖａｌ１２７、Ｌｅｕ１３３、Ａｌａ１３７、及びＩｌｅ１６３）が、Ｕｃ  ＴＥにグラフトされると新規の二重１２：０及び１４：０ＡＣＰ活性を付与することを見出した。これらのアミノ酸位置におけるアシル−ＡＣＰ  ＴＥ変異体が油産生細胞で発現すると、細胞は、望ましい又はさらには新規の脂肪酸プロファイルを有するトリグリセリドを生成し得る。
【０３４９】
実施例２
Ｃｃ−Ｕｃチオエステラーゼキメラコンストラクト
Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内でＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ  ＴＥキメラＡを発現させるために使用されるコンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］
この例では、ショ糖インベルターゼ（ショ糖含有培地での選択及び成長を可能にする）と、Ｃｃ  ＴＥとＵｃ  ＴＥとの間のキメラ融合物とを発現するコンストラクトｐＳＺ２０３７で形質転換したＡ株を作成した。株Ａで発現させるために導入したコンストラクトｐＳＺ２０３７は、６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ｙＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｕｃ（ＴＥ２）−キメラＡ−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢと書くことができる。
【０３５０】
形質転換ＤＮＡの配列を図４に提供する。コンストラクト中の関連する制限部位が下線を引いた小文字で示され、５’−３’に、それぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位は形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を画定する。太字体小文字配列は、相同組換えによる６Ｓ遺伝子座への標的組込みを可能にするＡからのゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’−ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）並びにＣ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが大文字の囲み文字で示され、一方、Ｃ．カンフォルム（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来配列がそれぞれ下線を引いた斜体及び太字体の大文字で示される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’−ＵＴＲが再び小文字により示され、その後ろに太字体の小文字により示されるＡ  ６Ｓゲノム領域が続く。最終的なコンストラクトを配列決定して正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にした。
【０３５１】
ＡにおけるＵｃ−Ｃｃ  ＴＥキメラ及び４つのさらなるＣｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラ（キメラＢ〜Ｅ）の発現に使用されるコンストラクト
Ｃｃ−ＵＣ  ＴＥキメラＡに加え、５つのさらなるキメラチオエステラーゼ発現コンストラクトを設計した。これらのコンストラクトは以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ２０３８−６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｕｃ（ＴＥ２）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢ
ｐＳＺ２２３１−６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ｙＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｕｃ（ＴＥ２）−キメラＢ−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢ
ｐＳＺ２２３２−６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ｙＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｕｃ（ＴＥ２）−キメラＣ−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢ
ｐＳＺ２２３３−６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ｙＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｕｃ（ＴＥ２）−キメラＤ−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢ
ｐＳＺ２２３４−６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ｙＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｕｃ（ＴＥ２）−キメラＥ−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢ
【０３５２】
これらのコンストラクトは全てｐＳＺ２０３７と同じベクター骨格；選択可能マーカー、プロモーター、プラスチドトランジットペプチド、ＦＬＡＧエピトープタグ及び３’−ＵＴＲを有し、それぞれのＣｃ−Ｕｃキメラチオエステラーゼのみが異なる。これらのコンストラクト中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ２０３７と同じである。図５〜図９は適切なキメラチオエステラーゼ配列を示し、ここではＣｃ  ＴＥ由来配列が下線を引いた斜体で表記され、一方、Ｕｃ  ＴＥ由来配列が太字体の大文字で表記される。
【０３５３】
Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）における異種チオエステラーゼ変異体の発現により、目的のユニークな特異的脂肪酸プロファイルがもたらされた。クフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）チオエステラーゼ（受託番号Ｕ５６１０３）をその内因性プラスチドトランジットペプチドと共に発現する株Ｄでは、約１：６：３の比（Ｃ１０：Ｃ１２：Ｃ１４）でＣ１０：０、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸レベルの上昇が得られた。クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤトランジットペプチドと共に株ＥにおいてＣｃ  ＴＥ（受託番号Ｕ３１８１３）を発現させると、１：１０のＣ１２：Ｃ１４比でＣ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の上昇がもたらされた。クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤトランジットペプチドもまた含む株ＦにおけるＵｃ  ＴＥ（受託番号Ｍ９４１５９）の発現により、７：１のＣ１２：Ｃ１４比でＣ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の上昇がもたらされた。株Ａは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）の基本となる株に相当する。データは、各株について生物学的レプリケート（Ａ及びＢ）で表１に示される。
【０３５４】
【表２】
2016508717.tif 000016
【０３５５】
表２及び図１０は、ｐＳＺ２０３７（Ｄ１０２２、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＡ）及びｐＳＺ２０３８（Ｄ１０２３、Ｕｃ−Ｃｃ  ＴＥキメラ）ＤＮＡで形質転換した代表的な誘導トランスジェニック系（図３を参照のこと）の脂肪酸（ＦＡ）プロファイルの比較、及び参照として、株Ａにおける発現を示す。Ｕｃ  ＴＥのＮ末端をＣｃ  ＴＥ（ｐＳＺ２０３７；Ｄ１０２２）由来の対応する領域に置換すると、約１：１比でＣ１２：０及びＣ１４：０の上昇を呈する新規ＦＡプロファイルがもたらされた。さらに、これらの株は、野生型Ｕｃ  ＴＥ（株Ｆに代表される）と比較したとき成熟タンパク質の定常状態レベルの増加を呈する。対照的に、Ｃｃ  ＴＥのＮ末端をＵｃ  ＴＥ（ｐＳＺ２０３８；Ｄ１０２３）由来の対応する領域に置換すると、低発現及び新生タンパク質から成熟型への限られたプロセシングがもたらされた。
【０３５６】
【表３】
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【０３５７】
表３及び図１１は、ｐＳＺ２２３１（Ｄ１２１０、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＢ）又はｐＳＺ２２３２（Ｄ１２１１、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＣ）ＤＮＡで形質転換した代表的な誘導トランスジェニック系と比べた株Ａにおける発現についてのＦＡプロファイルの比較を示す。Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＢ（ｐＳＺ２２３１；Ｄ１２１０）を発現する株が約１：１比のＣ１２：０及びＣ１４：０レベルのＦＡプロファイルを呈した一方；Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＣ（ｐＳＺ２２３２；Ｄ１２１１）は約４：１のＣ１２：０対Ｃ１４：０比をもたらした。
【０３５８】
【表４】
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【０３５９】
重要なことには、いずれのコンストラクトを発現する株も、野生型Ｕｃ  ＴＥ（株Ｆに代表される）と比較したとき成熟タンパク質の定常状態レベルの増加を呈した。
【０３６０】
表４及び図１２は、ｐＳＺ２２３３（Ｄ１２１２、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＤ）又はｐＳＺ２２３４（Ｄ１２１３、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＥ）ＤＮＡで形質転換した代表的な誘導トランスジェニック系と比べた株Ａにおける発現についてのＦＡプロファイルの比較を示す（図３を参照のこと）。Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＤ（ｐＳＺ２２３３；Ｄ１２１２）を発現する株は、天然Ｕｃ  ＴＥ酵素と同様の約４：１比のＣ１２：０及びＣ１４：０レベルのＦＡプロファイルを呈した。対照的に、Ｃｃ−Ｕｃ  ＴＥキメラＥ（ｐＳＺ２２３４；Ｄ１２１３）を発現する株は、約１：１のＣ１２：０対Ｃ１４：０比のＦＡプロファイルを呈した。さらに、いずれのコンストラクトを発現する株も、野生型Ｕｃ  ＴＥ（株Ｆに代表される）と比較したとき成熟タンパク質の定常状態レベルの中程度の増加を呈した。
【０３６１】
【表５】
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【０３６２】
Ｃｃ  ＴＥとＵｃ  ＴＥとの間のキメラ融合物から新生タンパク質の効率的な成熟に必要であることが同定されたアミノ酸（Ａｓｎ９１、Ｐｒｏ９２及びＰｒｏ１０２）並びにＵｃ  ＴＥ骨格のコンテクストに挿入されるとき新規１：１比のＣ１２：０対Ｃ１４：０を付与する４つのＣｃ  ＴＥ特異的アミノ酸（Ｖａｌ１２７、Ｌｅｕ１３３、Ａｌａ１３７、及びＩｌｅ１６３）を図１３に示す。従って、１つ以上又はＡｓｎ９１、Ｐｒｏ９２及びＰｒｏ１０２を有するようにＦＡＴＢ２遺伝子を突然変異させると、油産生細胞、特に２型脂肪酸合成経路を有する微細藻類細胞又は植物細胞で発現させるとき、遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性を増加させることができる。同様に、１つ以上又はＶａｌ１２７、Ｌｅｕ１３３、Ａｌａ１３７、及びＩｌｅ１６３を有するようにＦＡＴＢ２遺伝子を突然変異させると、油産生細胞、特に２型脂肪酸合成経路を有する微細藻類又は植物細胞で発現させるとき、遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性を増加させることができる。
【０３６３】
実施例３
予測プラスチドトランジットペプチドの直ちに下流の保存ドメインは、ＦＡＴＢチオエステラーゼの活性を増強する
本例では、本発明者らは、予測プラスチドトランジットペプチドの直ちに下流の保存ドメインを含めることによりＦＡＴＢチオエステラーゼの活性を増強する能力を実証する。これらのドメインの機能はこれまで不明であったため、単に酵素とそのプラスチドトランジットペプチドとの間のリンカーに過ぎないと考えられてきた可能性もある。本発明者らは、天然又は異種トランジットペプチドと共にこれらのドメインを含めると、シフトした脂肪酸プロファイルに明らかにされるとおり、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で過剰発現するＦＡＴＢアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの全体的な酵素活性が大幅に向上することを示す。さらに、本発明者らは、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）由来（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０）又はクフェア・ライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）由来（Ｃｗ  ＦＡＴＢ２、受託番号Ｕ５６１０３）の１４：０−アシル−アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼなどの高活性チオエステラーゼからこの領域を融合すると、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来のＦＡＴＢ２タンパク質（Ｕｃ  ＦａｔＢ２／Ｕｃ  ＴＥ、受託番号Ｍ９４１５９）などの機能性が低いチオエステラーゼの活性が増強されたことを決定した。
【０３６４】
本発明者らは、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）で発現させるとき、いくつかのＦＡＴＢタンパク質が一貫して比活性の上昇を呈したことを観察した。この違いの理由を決定する一環として、本発明者らは、ＦＡＴＢチオエステラーゼのＮ末端領域が酵素活性に寄与したかどうかを調べた。植物チオエステラーゼの配列アラインメントは、ＦＡＴＢタンパク質の最も端にあるＮ末端に著しい保存程度を示す（図１４）。この領域は予測プラスチドトランジットペプチドと重複し、プロリンリッチドメイン及び疎水性パッチを含む。このＮ末端領域の主要な機能が、プラスチドに対する新生タンパク質の正確なターゲティングを提供することであったという仮定に基づき、チオエステラーゼのこの部分を、概して、Ｐ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）内で発現させるため異種トランジットペプチドによって置換した。
【０３６５】
意外にも、本発明者らは、活性程度が最も高いＦＡＴＢチオエステラーゼ発現コンストラクトが天然Ｎ末端のほとんど又は全てを含むこと、及び疎水性パッチ又はプロリンリッチドメインを変化させることにより活性を向上させ得ることを認めた。以下に記載するとおり、本発明者らは、いくつかのチオエステラーゼ（例えば、Ｕｃ  ＦＡＴＢ２、受託番号Ｍ９４１５９；シナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）ＦＡＴＢ１、受託番号Ｕ３１８１３；Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０；ウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）ＦＡＴＢ１、受託番号Ｏ２４４２０及び本明細書に記載されるＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢキメラＢ（コンストラクトＤ１２１０））の比活性を、疎水性パッチ並びにプロリンリッチドメインの全て又は一部を含むようそれらのＮ末端を伸長することにより向上させた。これらの結果は、最大限のＦＡＴＢチオエステラーゼ活性にＮ末端領域が重要であることを実証している。さらに、これらの結果は、パフォーマンスの低いＦＡＴＢチオエステラーゼの活性を、そのＮ末端を高活性チオエステラーゼのＮ末端で置換することにより改善可能であることを実証している。
【０３６６】
コンストラクトＤ１０５６
コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドを含むＵｃ  ＦＡＴＢ２をＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ａ）内で発現させた。
【０３６７】
ショ糖インベルターゼ（ショ糖含有培地での選択及び成長を可能にする）と、ｐＳＺ１１１８に由来するＵｃ  ＦＡＴＢ２発現コンストラクト（Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の異種トランジットペプチドがＳＡＤ１トランジットペプチド由来の１５個のさらなるアミノ酸及びフランキング領域を含むように伸長されている）とを発現するコンストラクトｐＳＺ２０８４で形質転換したＡ株を作成した。株Ａで発現させるために導入したコンストラクトｐＳＺ２０８４は、６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＵｃＦＡＴＢ２−ＣｖＮＲ：：６ＳＢと書くことができる。
【０３６８】
形質転換ＤＮＡの配列を図１５Ａ〜図１５Ｃに提供する。コンストラクト中の関連する制限部位が下線を引いた小文字で示され、５’−３’に、それぞれ、ＢｓｐＱＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｐＱＩである。ＢｓｐＱＩ部位は形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を画定する。太字体小文字配列は、相同組換えによる６Ｓ遺伝子座への標的組込みを可能にするＡからのゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＣ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それにより株がショ糖上で成長することを可能にする）の発現を駆動するＣ．ラインハルティイ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）β−チューブリンプロモーターが、小文字の囲み文字により示される。ＳＵＣ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡが大文字の斜体により示され、一方、コード領域が小文字の斜体で示される。クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子３’−ＵＴＲが小文字により示され、その後ろにスペーサーセグメント（点線の下線を引いた小文字）及びＵ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラ融合チオエステラーゼの発現を駆動するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＭＴ３プロモーター（斜体の囲み文字により示される）が続く。伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、一方、Ｕ．カリフォルニカ（Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＦＡＴＢ２由来配列が太字体の大文字で表記される。Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグが下線を引いた小文字で表記される。Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）硝酸レダクターゼ３’−ＵＴＲが再び小文字により示され、その後ろに太字体の小文字により示されるＡ  ６Ｓゲノム領域が続く。最終的なコンストラクトを配列決定して正しいリーディングフレーム及びターゲティング配列を確実にした。
【０３６９】
コンストラクトＤ１０５７及びＤ１０５８
株Ａにおいて５又は１５アミノ酸Ｎ末端伸長部を有するＵｃ  ＦＡＴＢ２（それぞれＵｃ  ＦＡＴＢ２  Ｅｘｔ  Ａ及びＵｃ  ＦＡＴＢ２  Ｅｘｔ  Ｂ）の発現に、コンストラクトＤ１０５７及びＤ１０５８を使用した。
【０３７０】
ｐＳＺ２０８４に加えて、２つのさらなるＵｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ発現コンストラクトを設計した。これらのコンストラクトは以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ２０８５−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＵｃＦＡＴＢ２ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
ｐＳＺ２０８６−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＵｃＦＡＴＢ２ＥｘｔＢ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
【０３７１】
これらのコンストラクトはｐＳＺ２０８４と同じベクター骨格；選択可能マーカー、プロモーター、プラスチドトランジットペプチド、ＦＬＡＧエピトープタグ及び３’−ＵＴＲを有し、それぞれのＵｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼコード配列のみが異なる。これらのコンストラクト中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ２０８４と同じである。図１６〜図１７は適切な伸長型Ｕｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ配列を示し、ここでは伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、ｐＳＺ２０８４に見られる残りのＵｃ  ＦＡＴＢ２配列が太字体の大文字で表記される。
【０３７２】
コンストラクトＤ１４３１及びＤ１４３２
コンストラクトＤ１４３１及びＤ１４３２［ｐＳＺ２４５０及びｐＳＺ２４５１］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチド及びＵｃ  ＦＡＴＢ２又はＣｃ  ＦＡＴＢ１（それぞれＤ１４３１又はＤ１４３２）に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含む１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、シナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）をＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。これらのコンストラクトは以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ２４５０−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｃＦＡＴＢ１ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
ｐＳＺ２４５１−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｃＦＡＴＢ１ＥｘｔＢ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
【０３７３】
これらのコンストラクトは両方ともｐＳＺ２０８４と同じベクター骨格；選択可能マーカー、プロモーター、プラスチドトランジットペプチド、ＦＬＡＧエピトープタグ及び３’−ＵＴＲを有し、それぞれのＣｃ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼコード配列のみが異なる。これらのコンストラクト中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ２０８４と同じである。図１９〜図２０は適切な伸長型Ｃｃ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ配列を示し、ここでは伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＣｃ  ＦＡＴＢ１配列が太字体の大文字で表記される。
【０３７４】
コンストラクトＤ１４８１及びＤ１４８２
コンストラクトＤ１４８１及びＤ１４８２［ｐＳＺ２４７９及びｐＳＺ２４８０］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチド及び天然Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列に由来する４１アミノ酸Ｎ末端伸長部を含む１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０）をＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。これらのコンストラクトは以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ２４７９−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
ｐＳＺ２４８０−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｐａｌＦＡＴＢ２ＥｘｔＡ３ｘＦＬＡＧ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
【０３７５】
これらのコンストラクトは両方ともｐＳＺ２０８４と同じベクター骨格；選択可能マーカー、プロモーター、プラスチドトランジットペプチド、及び３’ＵＴＲを有し、それぞれのＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼコード配列及びＦＬＡＧエピトープタグの存在又は非存在のみが異なる。これらのコンストラクト中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ２０８４と同じである。図２２〜図２３は適切な伸長型Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ配列を示し、ここでは伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＣｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列が太字体の大文字で表記され、及びＦＬＡＧエピトープ（ｐＳＺ２４８０）が小文字で表記される。
【０３７６】
コンストラクトＤ１４７９及びＤ１４８０
コンストラクトＤ１４７９及びＤ１４８０［ｐＳＺ２４７７及びｐＳＺ２４７８］を使用して、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチド及び天然Ｕａ  ＦＡＴＢ１配列に由来する３４アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）１０：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕａ  ＦＡＴＢ１、受託番号Ｏ２４４２０）をＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。これらのコンストラクトは以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ２４７７−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＵａＦＡＴＢ１ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
ｐＳＺ２４７８−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＵａＦＡＴＢ１ＥｘｔＡ３ｘＦＬＡＧ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
【０３７７】
これらのコンストラクトは両方ともｐＳＺ２０８４と同じベクター骨格；選択可能マーカー、プロモーター、プラスチドトランジットペプチド、及び３’ＵＴＲを有し、それぞれのＵａ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ及びＣ末端ＦＬＡＧエピトープタグの存在又は非存在のみが異なる。これらのコンストラクト中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ２０８４と同じである。図２５〜図２６は適切な伸長型Ｕａ  ＦＡＴＢ１チオエステラーゼ配列を示し、ここでは伸長部が下線を引いた斜体で表記され、一方、残りのＵａ  ＦＡＴＢ１配列が太字体の大文字で表記される。ｐＳＺ２４７８中のＦＬＡＧエピトープが小文字で表記される。
【０３７８】
コンストラクトＤ１２１０及びＤ１４２９
コンストラクトＤ１２１０及びＤ１４２９［ｐＳＺ２２３１及びｐＳＺ２４４８］を使用して、Ｃｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢキメラＢ１２：０−１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼをＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）（ＵＴＥＸ  １４３５株Ｃ）内で発現させた。ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（Ｕｃ  ＦａｔＢ２／Ｕｃ  ＴＥ、受託番号Ｍ９４１５９）のＮ末端部分を近縁の１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、シナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）由来の対応する領域に置換することにより、Ｃｃ−ＵｃキメラＢ（コンストラクトＤ１２１０、前出）を作成した。コンストラクトＤ１４２９は、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチド及び天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２配列に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含んだ。これらのコンストラクトは以下のとおり記載することができる：
ｐＳＺ２２３１−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐ−ＣｃＦＡＴＢ１−ＵｃＦＡＴＢ２−キメラＢ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
ｐＳＺ２４４８−６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＣｃＦＡＴＢ１−ＵｃＦＡＴＢ２−キメラＢ−ＥｘｔＡ−ＣｖＮＲ：：６ＳＢ
【０３７９】
これらのコンストラクトは両方ともｐＳＺ２０８４と同じベクター骨格；選択可能マーカー、プロモーター、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープ及び３’ＵＴＲを有し、それぞれのＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２キメラチオエステラーゼ及びプラスチドトランジットペプチドのみが異なる。これらのコンストラクト中の関連する制限部位もまた、ｐＳＺ２０８４と同じである。図２８〜図２９は適切なＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼ配列（太字体の大文字）を示し、ここではトリミング型又は伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドが下線を引いた大文字で示され、及びＤ１４２９内のＵｃ  ＦＡＴＢ２伸長部が下線を引いた小文字の斜体で表記される。
【０３８０】
実施例４
クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）ＦＡＴＢチオエステラーゼの活性及び特異性の修飾
この例において、本発明者らは、クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）ＦＡＴＢチオエステラーゼ（Ｃｈ  ＦＡＴＢ２、受託番号Ｕ３９８３４）の活性及び特異性を特定のアミノ酸の突然変異誘発によって修飾する能力を実証する。ある変異ＦＡＴＢが、酵素の脂肪酸特異性に影響を及ぼすものとして本発明者らが上記に記載したＮ末端特異性ドメインで修飾される（図４１）。これらの突然変異のあるものは、Ｃ８又はＣ１０脂肪酸に富む（例えば少なくとも１０％のＣ８、１０％のＣ１０、又は１０％のＣ８／Ｃ１０を含む脂肪酸プロファイルを有する）天然油の産生において有用である。例えば、このような変異体の使用により、細胞集団によって産生される天然油中のＣ８、Ｃ１０パーセンテージ又はＣ８／Ｃ１０比が野生型ＦＡＴＢと比較して少なくとも倍増し得る。
【０３８１】
Ｎ末端特異性ドメインの突然変異誘発によって新規Ｃ１２：０−Ｃ１４：０チオエステラーゼを産生する能力に基づき、同様の手法に従いＣ８：０−Ｃ１０  Ｃｈ  ＦＡＴＢ２チオエステラーゼの活性を変化させた。変異ＦＡＴＢ遺伝子を、前出の例に記載したとおり相同組換えによってＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）にクローニングした。図４２Ａは、Ｃｈ  ＦＡＴＢ２に対する６つのユニークなＦＡＴＢチオエステラーゼの配列アラインメントを示す。６つのキメラＦＡＴＢが作成され、ここではＣｈ  ＦＡＴＢ２の強調されるＮ末端特異性ドメインを、６つの代替的なＦＡＴＢ配列の各々からの同じ領域と一致するように突然変異させた。これにより、僅か２個程の乃至１３個もの数のアミノ酸置換を有するＣｈ  ＦＡＴＢ２キメラがもたらされた（図４２Ｂ）。各Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラの活性を、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）内での発現により試験した。各キメラの脂肪酸プロファイルを野生型ＦＡＴＢチオエステラーゼの発現と比較した（図４３〜図４８）。
【０３８２】
興味深いことに、Ｄ３１２６〜Ｄ３１２９、又はＤ３１３１を発現するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）株は、非形質転換株を上回るＣ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸蓄積をほとんど又は全く有しない。しかしながら、Ｄ３１３０を発現するＰ．モリフォルミス（Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）株は、Ｃ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸の顕著な蓄積を呈した。実際、Ｄ３１３０キメラに関するＣ８：０−Ｃ１０：０の蓄積程度は、野生型Ｄ３０４２  Ｃｈ  ＦＡＴＢ２を発現する株で観察されたものと比べて高かった（それぞれ１９．６％対９．７％のＣ８：０〜Ｃ１０：０合計）。さらに、Ｄ３１３０株内でのＣ８：０−Ｃ１０：０の比が、野生型Ｄ３０４２  Ｃｈ  ＦＡＴＢ２株で観察されたものと比べて高かった（それぞれ０．４９対０．２６のＣ８：０／Ｃ１０：０）。これらの結果は、Ｄ３１３０  Ｃｈ  ＦＡＴＢ２キメラが野生型Ｄ３０４２  Ｃｈ  ＦＡＴＢ２と比べて向上した酵素活性並びに改変された特異性を呈することを示唆している。
【０３８３】
Ｄ３１３０キメラは、野生型Ｄ３０４２  Ｃｈ  ＦＡＴＢ２と比べて２つのアミノ酸置換を含む。両方のアミノ酸置換とも、モデル構造中ではヘリックスに位置する。Ｈｉｓ１６３−Ｔｙｒ置換が、Ｄ１７７７  Ｕｃ  ＦＡＴＢ２キメラＦに存在する４個中３個のアミノ酸置換を含んだ同じヘリックス内に見られる。Ｌｅｕ１８６−Ｐｒｏ置換は、Ｃ．パルストリス（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＦＡＴＢ１の酵素活性を向上させる既発表のＭｅｔ２３０−Ｉｓｏ置換と真逆であるように思われる。従って、Ｈｉｓ１６３−Ｔｙｒ置換がＣ８：０−Ｃ１０比の改変に関与している一方で、Ｌｅｕ１８６−Ｐｒｏ置換が全Ｃ８：０−Ｃ１０：０脂肪酸の蓄積を向上させる可能性がある。これらの変化は相乗的に用いることができる。例えば、Ｈ１６３Ｙ及びＬ１８６Ｐの両方の変化を有する株ではＣ８が１．８％から６．５％に増加し、Ｃ１０が７．４４％から１３．１１％に増加し、及びＣ８／Ｃ１０比が０．２３から０．５１に増加した。
【０３８４】
本明細書に記載される例及び実施形態は例示目的に過ぎず、それらを踏まえた様々な改良又は変更が当業者に提案され得るとともに、本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるものとされることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願が、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。
【０３８５】
非公式配列表
配列番号１−コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］、また６ＳＡ：：Ｃｒ（ｂｔｕｂ）−ｓｙｎ（ｙＩＮＶ）−Ｃｖ（ｎｒ）：Ｐｍ（ａｍｔ０３）−Ｃｐ（ＳＡＤ１ｔｐ）−Ｃｃ（ＴＥ２）−Ｕｃ（ＴＥ２）−キメラＡ−Ｃｖ（ｎｒ）：：６ｓＢとも書かれる。
【化１３】
2016508717.tif 000020
【化１４】
2016508717.tif 000021
配列番号２−コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］中のＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドと、続くＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼの核酸配列。
【化１５】
2016508717.tif 000022
配列番号３−コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］によりコードされるＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドと、続くＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼのアミノ酸配列。
【化１６】
2016508717.tif 000023
配列番号４−コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］中のＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼの核酸配列。
【化１７】
2016508717.tif 000024
配列番号５−コンストラクトＤ１０２２［ｐＳＺ２０３７］によりコードされるＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼのアミノ酸配列。
【化１８】
2016508717.tif 000025
配列番号６−コンストラクトＤ１０２３［ｐＳＺ２０３８］中のＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼの核酸配列
【化１９】
2016508717.tif 000026
配列番号７−コンストラクトＤ１０２３［ｐＳＺ２０３８］によりコードされるＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼのアミノ酸配列
【化２０】
2016508717.tif 000027
配列番号８−コンストラクトＤ１２１０［ｐＳＺ２２３１］中のＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＢの核酸配列
【化２１】
2016508717.tif 000028
配列番号９−コンストラクトＤ１２１０［ｐＳＺ２２３１］によりコードされるＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＢのアミノ酸配列
【化２２】
2016508717.tif 000029
配列番号１０−コンストラクトＤ１２１１［ｐＳＺ２２３２］中のＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＣの核酸配列
【化２３】
2016508717.tif 000030
配列番号１１−コンストラクトＤ１２１１［ｐＳＺ２２３２］によりコードされるＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＣのアミノ酸配列
【化２４】
2016508717.tif 000031
配列番号１２−コンストラクトＤ１２１２［ｐＳＺ２２３３］中のＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＤの核酸配列
【化２５】
2016508717.tif 000032
配列番号１３−コンストラクトＤ１２１２［ｐＳＺ２２３３］によりコードされるＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＤのアミノ酸配列
【化２６】
2016508717.tif 000033
配列番号１４−コンストラクトＤ１２１３［ｐＳＺ２２３４］中のＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＥの核酸配列
【化２７】
2016508717.tif 000034
配列番号１５−コンストラクトＤ１２１３［ｐＳＺ２２３４］によりコードされるＣ．カンフォルム（Ｃ．  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）及びＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）キメラチオエステラーゼＥのアミノ酸配列
【化２８】
2016508717.tif 000035
配列番号１６−コンストラクトｐＳＺ２０８４、また６ＳＡ：：ＣｒＴＵＢ２−ＳｃＳＵＣ２−ＣｖＮＲ：ＰｍＡＭＴ３−ＣｐＳＡＤ１ｔｐＥｘｔ−ＵｃＦＡＴＢ２−ＣｖＮＲ：：６ＳＢとも書かれ、ＳＡＤ１トランジットペプチド由来の１５個のさらなるアミノ酸とフランキング領域とを含むように伸長されたＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドを含む
【化２９】
2016508717.tif 000036
【化３０】
2016508717.tif 000037
配列番号１７−コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］中のＵ．カリフ
ォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＦＡＴＢ２由来配列と融合した伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドの核酸配列。
【化３１】
2016508717.tif 000038
配列番号１８−コンストラクトＤ１０５６［ｐＳＺ２０８４］によりコードされるＵ．カリフォルニカ（Ｃ．  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＦＡＴＢ２由来配列と融合した伸長型Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＳＡＤ１トランジットペプチドのアミノ酸配列。
【化３２】
2016508717.tif 000039
配列番号１９−コンストラクトＤ１０５７［ｐＳＺ２０８５］中の５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むＵｃ  ＦＡＴＢ２をコードする核酸配列
【化３３】
2016508717.tif 000040
配列番号２０−コンストラクトＤ１０５７［ｐＳＺ２０８５］によりコードされる５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むＵｃ  ＦＡＴＢ２のアミノ酸配列
【化３４】
2016508717.tif 000041
配列番号２１−コンストラクトＤ１０５８［ｐＳＺ２０８６］中の１５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むＵｃ  ＦＡＴＢ２をコードする核酸配列
【化３５】
2016508717.tif 000042
配列番号２２−コンストラクトＤ１０５８［ｐＳＺ２０８６］によりコードされる１５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むＵｃ  ＦＡＴＢ２のアミノ酸配列
【化３６】
2016508717.tif 000043
配列番号２３−コンストラクトＤ１４３１［ｐＳＺ２４５０］中のＵｃ  ＦＡＴＢ２に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むシナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）の核酸配列
【化３７】
2016508717.tif 000044
配列番号２４−コンストラクトＤ１４３１［ｐＳＺ２４５０］によりコードされるＵｃ  ＦＡＴＢ２に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むシナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）のアミノ酸配列
【化３８】
2016508717.tif 000045
配列番号２５−コンストラクトＤ１４３２［ｐＳＺ２４５１］中のＣｃ  ＦＡＴＢ１に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むシナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）の核酸配列
【化３９】
2016508717.tif 000046
配列番号２６−コンストラクトＤ１４３２［ｐＳＺ２４５１］によりコードされるＣｃ  ＦＡＴＢ１に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部を含むシナモマム・カンフォルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｃ  ＦＡＴＢ１／Ｃｃ  ＴＥ、受託番号Ｕ３１８１３）のアミノ酸配列
【化４０】
2016508717.tif 000047
配列番号２７−コンストラクトＤ１４８１［ｐＳＺ２４７９］中のＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと天然Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列に由来する４１アミノ酸Ｎ末端伸長部とを含む１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０）をコードする核酸配列
【化４１】
2016508717.tif 000048
配列番号２８−コンストラクトＤ１４８１［ｐＳＺ２４７９］によりコードされるＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと天然Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列に由来する４１アミノ酸Ｎ末端伸長部とを含む１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０）のアミノ酸配列
【化４２】
2016508717.tif 000049
配列番号２９−コンストラクトＤ１４８２［ｐＳＺ２４８０］中のＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと、天然Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列に由来する４１アミノ酸Ｎ末端伸長部と、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグとを含む１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０）をコードする核酸配列
【化４３】
2016508717.tif 000050
配列番号３０−コンストラクトＤ１４８２［ｐＳＺ２４８０］によりコードされるＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと、天然Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列に由来する４１アミノ酸Ｎ末端伸長部と、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグとを含む１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２、受託番号ＡＡＣ４９１８０）のアミノ酸配列
【化４４】
2016508717.tif 000051
配列番号３１−コンストラクトＤ１４７９［ｐＳＺ２４７７］中のＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと天然Ｕａ  ＦＡＴＢ１配列に由来する３４アミノ酸Ｎ末端伸長部とを含むウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）１０：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕａ  ＦＡＴＢ１、受託番号Ｏ２４４２０）をコードする核酸配列
【化４５】
2016508717.tif 000052
配列番号３２−コンストラクトＤ１４７９［ｐＳＺ２４７７］によりコードされるＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと天然Ｕａ  ＦＡＴＢ１配列に由来する３４アミノ酸Ｎ末端伸長部とを含むウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）１０：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕａ  ＦＡＴＢ１、受託番号Ｏ２４４２０）のアミノ酸配列
【化４６】
2016508717.tif 000053
配列番号３３−コンストラクトＤ１４８０［ｐＳＺ２４７８］中のＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと、天然Ｕａ  ＦＡＴＢ１配列に由来する３４アミノ酸Ｎ末端伸長部と、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグとを含むウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）１０：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕａ  ＦＡＴＢ１、受託番号Ｏ２４４２０）をコードする核酸配列
【化４７】
2016508717.tif 000054
配列番号３４−コンストラクトＤ１４８０［ｐＳＺ２４７８］によりコードされるＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと、天然Ｕａ  ＦＡＴＢ１配列に由来する３４アミノ酸Ｎ末端伸長部と、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグとを含むウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）１０：０−１６：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕａ  ＦＡＴＢ１、受託番号Ｏ２４４２０）のアミノ酸配列
【化４８】
2016508717.tif 000055
配列番号３５−コンストラクトＤ１４２９［ｐＳＺ２４４８］中のＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと、天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２配列に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部とを含むＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢキメラＢ  １２：０−１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする核酸配列
【化４９】
2016508717.tif 000056
配列番号３６−コンストラクトＤ１４２９［ｐＳＺ２４４８］によりコードされるＣ．プロトテコイデス（Ｃ．  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）由来の伸長型異種トランジットペプチドと、天然Ｕｃ  ＦＡＴＢ２配列に由来する５アミノ酸Ｎ末端伸長部とを含むＣｃ−Ｕｃ  ＦＡＴＢキメラＢ  １２：０−１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列
【化５０】
2016508717.tif 000057
配列番号３７−５アミノ酸Ｕｃ／Ｃｃ  ＦＡＴＢ  Ｎ末端伸長部
【化５１】
2016508717.tif 000058
配列番号３８−１５アミノ酸Ｕｃ／Ｃｃ  ＦＡＴＢ  Ｎ末端伸長部
【化５２】
2016508717.tif 000059
配列番号３９−天然Ｃｐａｌ  ＦＡＴＢ２配列に由来するＮ末端伸長部
【化５３】
2016508717.tif 000060
配列番号４０−天然Ｕａ  ＦＡＴＢ１配列に由来するＮ末端伸長部
【化５４】
2016508717.tif 000061
配列番号４１−天然Ｃｗ  ＦＡＴＢ１配列に由来するＮ末端伸長部
【化５５】
2016508717.tif 000062
配列番号４２−天然Ｃｗ  ＦＡＴＢ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ３９６６３）に由来するＮ末端伸長部
【化５６】
2016508717.tif 000063
配列番号４３−野生型カリフォルニア月桂樹（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂａｙ  Ｔｒｅｅ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９４１５９．１）
【化５７】
2016508717.tif 000064
配列番号４４−野生型シナモマム・カンフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３１８１３．１）
【化５８】
2016508717.tif 000065
配列番号４５−野生型クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）（Ｃｐａｌ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ４９１８０）
【化５９】
2016508717.tif 000066
配列番号４６−野生型クフェア・ライチイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦＡＴＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５６１０３）
【化６０】
2016508717.tif 000067
配列番号４７−野生型ウルムス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｏ２４４２０）
【化６１】
2016508717.tif 000068
配列番号４８−ｐＳＺ２６０９（Ｄ１５５８）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＡの核酸配列
【化６２】
2016508717.tif 000069
配列番号４９−ｐＳＺ２６０９（Ｄ１５５８）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＡによりコードされるアミノ酸配列
【化６３】
2016508717.tif 000070
配列番号５０−ｐＳＺ２６１０（Ｄ１５５９）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＢの核酸配列
【化６４】
2016508717.tif 000071
配列番号５１−ｐＳＺ２６１０（Ｄ１５５９）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＢによりコードされるアミノ酸配列
【化６５】
2016508717.tif 000072
配列番号５２−ｐＳＺ２６１１（Ｄ１５６０）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＣの核酸配列
【化６６】
2016508717.tif 000073
配列番号５３−ｐＳＺ２６１１（Ｄ１５６０）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＣによりコードされるアミノ酸配列
【化６７】
2016508717.tif 000074
配列番号５４−ｐＳＺ２６１２（Ｄ１５６１）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＤの核酸配列
【化６８】
2016508717.tif 000075
配列番号５５−ｐＳＺ２６１２（Ｄ１５６１）Ｃｈｏｏｋ−ＣｗＦＡＴＢキメラＤによりコードされるアミノ酸配列
【化６９】
2016508717.tif 000076
配列番号５６−ｐＳＺ２６１３（Ｄ１５６２）ＣｈｏｏｋＦＡＴＢの核酸配列
【化７０】
2016508717.tif 000077
配列番号５７−ｐＳＺ２６１３（Ｄ１５６２）ＣｈｏｏｋＦＡＴＢをコードするアミノ酸配列
【化７１】
2016508717.tif 000078
配列番号５８−ｐＳＺ１９５４（Ｄ９６５）ＣｗＦＡＴＢの核酸配列
【化７２】
2016508717.tif 000079
配列番号５９−ｐＳＺ１９５４（Ｄ９６５）ＣｗＦＡＴＢによりコードされるアミノ酸配列
【化７３】
2016508717.tif 000080
配列番号６０−野生型クフェア・ライチイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）（Ｃｗ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦＡＴＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５６１０４．１（ＲＮＡ）；Ｑ３９６６３（タンパク質））
【化７４】
2016508717.tif 000081
配列番号６１−野生型クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）（Ｃｈｏｏｋ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３９８３４．１（ＲＮＡ）；Ｑ３９５１４（タンパク質））
【化７５】
2016508717.tif 000082
配列番号６２−プロトテカ・クルエガニ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｅｇａｎｉ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化７６】
2016508717.tif 000083
配列番号６３−プロトテカ・ウィケルハミイ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化７７】
2016508717.tif 000084
配列番号６４−プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化７８】
2016508717.tif 000085
配列番号６５−プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化７９】
2016508717.tif 000086
配列番号６６−プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化８０】
2016508717.tif 000087
配列番号６７−プロトテカ・ウィケルハミイ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化８１】
2016508717.tif 000088
配列番号６８−プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化８２】
2016508717.tif 000089
配列番号６９−プロトテカ・ゾフィー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ
【化８３】
2016508717.tif 000090
配列番号７０−プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）ｒＲＮＡ
【化８４】
2016508717.tif 000091
配列番号７１−Ｄ３０４２（ｐＳＺ４２４３）（野生型）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表される
【化８５】
2016508717.tif 000092
配列番号７２−Ｄ３０４２；ｐＳＺ４２４３（野生型）のアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表される
【化８６】
2016508717.tif 000093
配列番号７３−Ｄ３１２６（ｐＳＺ４３３１）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化８７】
2016508717.tif 000094
配列番号７４−Ｄ３１２６（ｐＳＺ４３３１）ののアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化８８】
2016508717.tif 000095
配列番号７５−Ｄ３１２７（ｐＳＺ４３３２）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化８９】
2016508717.tif 000096
配列番号７６−Ｄ３１２７（ｐＳＺ４３３２）のアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９０】
2016508717.tif 000097
配列番号７７−Ｄ３１２８（ｐＳＺ４３３３）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９１】
2016508717.tif 000098
配列番号７８−Ｄ３１２８（ｐＳＺ４３３３）のアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９２】
2016508717.tif 000099
配列番号７９−Ｄ３１２９（ｐＳＺ４３３４）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９３】
2016508717.tif 000100
配列番号８０−Ｄ３１２９（ｐＳＺ４３３４）のアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９４】
2016508717.tif 000101
配列番号８１−Ｄ３１３０（ｐＳＺ４３３５）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９５】
2016508717.tif 000102
配列番号８２−Ｄ３１３０（ｐＳＺ４３３５）の核酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９６】
2016508717.tif 000103
配列番号８３−Ｄ３１３１（ｐＳＺ４３３６）のアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９７】
2016508717.tif 000104
配列番号８４−Ｄ３１３１（ｐＳＺ４３３６）のアミノ酸配列；藻類トランジットペプチドが小文字で表され、ＦＬＡＧエピトープタグが下線で表され、及び野生型ＣｈＦＡＴＢ２（Ｄ３０４２、ｐＳＺ４２４３）と比べて突然変異したＮ末端特異性ドメインの一部分が太字で強調される
【化９８】
2016508717.tif 000105
【図１】
2016508717.tif 000113
【図２】
2016508717.tif 000114
【図３Ａ】
2016508717.tif 000115
【図３Ｂ】
2016508717.tif 000116
【図３Ｃ】
2016508717.tif 000117
【図４】
2016508717.tif 000118
【図５】
2016508717.tif 000119
【図６】
2016508717.tif 000120
【図７】
2016508717.tif 000121
【図８】
2016508717.tif 000122
【図９】
2016508717.tif 000123
【図１０】
2016508717.tif 000124
【図１１】
2016508717.tif 000125
【図１２】
2016508717.tif 000126
【図１３Ａ】
2016508717.tif 000127
【図１３Ｂ】
2016508717.tif 000128
【図１４Ａ】
2016508717.tif 000129
【図１４Ｂ】
2016508717.tif 000130
【図１４Ｃ】
2016508717.tif 000131
【図１５】
2016508717.tif 000132
【図１６】
2016508717.tif 000133
【図１７Ａ】
2016508717.tif 000134
【図１７Ｂ】
2016508717.tif 000135
【図１８】
2016508717.tif 000136
【図１９】
2016508717.tif 000137
【図２０Ａ】
2016508717.tif 000138
【図２０Ｂ】
2016508717.tif 000139
【図２１】
2016508717.tif 000140
【図２２】
2016508717.tif 000141
【図２３Ａ】
2016508717.tif 000142
【図２３Ｂ】
2016508717.tif 000143
【図２４】
2016508717.tif 000144
【図２５】
2016508717.tif 000145
【図２６Ａ】
2016508717.tif 000146
【図２６Ｂ】
2016508717.tif 000147
【図２７】
2016508717.tif 000148
【図２８】
2016508717.tif 000149
【図２９】
2016508717.tif 000150
【図３０Ａ】
2016508717.tif 000151
【図３０Ｂ】
2016508717.tif 000152
【図３１】
2016508717.tif 000153
【図３２】
2016508717.tif 000154
【図３３】
2016508717.tif 000155
【図３４】
2016508717.tif 000156
【図３５】
2016508717.tif 000157
【図３６】
2016508717.tif 000158
【図３７】
2016508717.tif 000159
【図３８Ａ】
2016508717.tif 000160
【図３８Ｂ】
2016508717.tif 000161
【図３９Ａ】
2016508717.tif 000162
【図３９Ｂ】
2016508717.tif 000163
【図４０】
2016508717.tif 000164
【図４１Ａ】
2016508717.tif 000165
【図４１Ｂ】
2016508717.tif 000166
【図４１Ｃ】
2016508717.tif 000167
【図４２Ａ】
2016508717.tif 000168
【図４２Ｂ】
2016508717.tif 000169
【図４３Ａ】
2016508717.tif 000170
【図４３Ｂ】
2016508717.tif 000171
【図４３Ｃ】
2016508717.tif 000172
【図４４Ａ】
2016508717.tif 000173
【図４４Ｂ】
2016508717.tif 000174
【図４４Ｃ】
2016508717.tif 000175
【図４５Ａ】
2016508717.tif 000176
【図４５Ｂ】
2016508717.tif 000177
【図４５Ｃ】
2016508717.tif 000178
【図４６Ａ】
2016508717.tif 000179
【図４６Ｂ】
2016508717.tif 000180
【図４６Ｃ】
2016508717.tif 000181
【図４７Ａ】
2016508717.tif 000182
【図４７Ｂ】
2016508717.tif 000183
【図４７Ｃ】
2016508717.tif 000184
【図４８Ａ】
2016508717.tif 000185
【図４８Ｂ】
2016508717.tif 000186
【図４８Ｃ】
2016508717.tif 000187
【図４９】
2016508717.tif 000188
【配列表】
2016508717000001.app
【国際調査報告】
2016508717.tif 000189
2016508717.tif 000190
2016508717.tif 000191
2016508717.tif 000192