(57)【要約】  本発明は、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の２つ以上のアイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療用薬学的組成物に関する。本発明の組成物を使用することにより、筋萎縮性側索硬化症を効果的に予防又は治療することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の２つ以上のアイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＨＧＦの２つ以上のアイソフォームは、全長ＨＧＦ（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＨＧＦ；  ｆｌＨＧＦ）及び欠損型ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ＨＧＦ；  ｄＨＧＦ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記全長ＨＧＦは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記欠損型ＨＧＦは、配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＧＦの２つ以上のアイソフォームは、別途のヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＧＦの２つ以上のアイソフォームは、単一のヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドは、ネイキッドＤＮＡ（ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ）であるか、あるいは、遺伝子運搬体に含まれていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記遺伝子運搬体は、ベクターであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ベクターは、プラスミドであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記プラスミドは、ｐＣＫであることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の２つ以上のアイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療方法。
【請求項１１】
前記ＨＧＦの２つ以上のアイソフォームは、全長ＨＧＦ（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＨＧＦ；  ｆｌＨＧＦ）及び欠損型ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ＨＧＦ；  ｄＨＧＦ）を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記全長ＨＧＦは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記欠損型ＨＧＦは、配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１３年１０月２２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１３−０１２６２１６号及び２０１４年１０月２２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−０１４３３７７号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明は、肝細胞成長因子の２つ以上のアイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ＡＬＳ）は、運動神経原に発生する疾患であって、１８６９年、フランスの医者ジャン−マルタン・シャルコー  （Ｊｅａｎ−Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈａｒｔｃｏｔ）によって最初に報告された。以後、１９３９年米国の有名な野球選手のルー・ゲーリッグ（Ｌｏｕ  Ｇｅｈｒｉｇ）がこの疾患にかかったことで、一般にも知られ、それからルー・ゲーリッグ病（Ｌｏｕ  Ｇｅｈｒｉｇ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれるようになった。
【０００４】
ＡＬＳの予後は、臨床的特徴、電気診断テスト及び症状に係る他の健康状態の排除を土台にする。ＡＬＳに係る種々の遺伝子に係る臨床実験で使用できる分子遺伝子検査は、遺伝的類型診断及び遺伝相談において重要な役割をする。
【０００５】
ＡＬＳは、常染色体優性、常染色体劣性、又はＸ−連関方法によって遺伝されえる。遺伝相談及び危険評価は、特定遺伝子診断の正確な診断による。
【０００６】
ＡＬＳ病の進行を遅延させる薬剤としては、リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）が知られている。リルゾールは、運動神経細胞を破壊する原因の１つとされる過度なるグルタミン酸を抑制させることにより、ＡＬＳの進行速度を緩めることができると知られている。しかし、リルゾールの臨床的効果は、ＡＬＳの症状を改善させることはできず、ＡＬＳ患者が器官切開術を受けずに生存する期間（ｔｒａｃｈｅｏｓｔｏｍｙ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を増やすことにおいても、その結果が明確ではない。このように、ＡＬＳ患者に役に立つと知られたリルゾールの真正の臨床的な効果は、非常に制限的で、明確ではないと報告されている（非特許文献１）。それにもかかわらず、このように臨床的有用性の明確ではないリルゾール以外に、ＡＬＳに対する効果的な予防又は治療剤がない実情であって、ＡＬＳに予防又は治療効果を示す薬物の開発が必要な実情である。
【０００７】
一方、遺伝子治療のための遺伝子伝達体としての発現ベクターが、従来公知されている。本発明の一実施例で使用されたｐＣＫベクターについて、ＰＣＴ／ＫＲ９９／０００８５５に詳細に記載されている。また、ＰＣＴ／ＫＲ０３／０００５４８は、本発明で使用されたｐＣＫ−ＨＧＦＸ７組換えベクターを含む虚血性疾患又は肝疾患治療又は予防用組成物について記載している。ＰＣＴ／ＫＲ９９／０００８５５及びＰＣＴ／ＫＲ０３／０００５４８の内容は、本明細書に参照として取り込まれる。
【０００８】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、筋萎縮性側索硬化症を予防又は治療できる薬物を開発するために鋭意研究した。その結果、２つ以上の肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）アイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む組成物を利用してＡＬＳを治療することができることを究明し、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一様態によると、本発明は、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の２つ以上のアイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本発明者らは、筋萎縮性側索硬化症を予防又は治療できる薬物を開発するために鋭意研究した。その結果、２つ以上の肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）アイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む組成物を利用してＡＬＳを治療することができることを究明した。
【００１６】
本発明の治療戦略は、大きくタンパク質治療と遺伝子治療とに分類される。本発明のタンパク質治療剤戦略によると、ＨＧＦの２種以上のアイソフォームタンパク質を利用する。一方、本発明の遺伝子治療剤戦略によると、ＨＧＦの２種以上のアイソフォームをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を利用する。２種以上のＨＧＦアイソフォーム−暗号化ヌクレオチド配列（ｉｓｏｆｏｒｍｓ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、１つのポリヌクレオチドとして提供されるか、別途のポリヌクレオチドとして提供される。好ましくは、ＨＧＦの２種以上のＨＧＦアイソフォーム−暗号化ヌクレオチド配列は、１つのポリヌクレオチドとして提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のとおりである：
（ａ）本発明は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
（ｂ）本発明は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療方法を提供する。
（ｃ）本発明の組成物又は方法を利用すると、胚神経細胞における神経突起発芽  、成長及び運動神経細胞の成長及び死滅抑制を通じて、筋萎縮性側索硬化症を予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施例によるＥＮＣ細胞の神経突起発芽に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の影響を示す。
【図２】本発明の一実施例によるＥＮＣ細胞の成長に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の影響を示す。
【図３】本発明の一実施例による、ＮＳＣ−３４細胞においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞成長に及ぼす影響を示す。
【図４ａ】本発明の一実施例による、ＮＳＣ−３４細胞においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞死滅に及ぼす影響を示す。
【図４ｂ】本発明の一実施例による、ＮＳＣ−３４細胞においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞死滅に及ぼす影響を示す。
【図５】本発明の一実施例による、酸化的ストレス培養条件でＮＳＣ−３４細胞の生存に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効果を示す。
【図６ａ】本発明の一実施例による、酸化的ストレス培養条件でＮＳＣ−３４細胞の細胞死滅に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効果を示す。
【図６ｂ】本発明の一実施例による、酸化的ストレス培養条件でＮＳＣ−３４細胞の細胞死滅に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効果を示す。
【図７】本発明の一実施例による、Ｇ９３Ａ突然変異型のｈＳＯＤ１を伝達した細胞においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞成長に及ぼす影響を示す。
【図８】本発明の一実施例による、ＡＬＳマウスにおいてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７がマウスの握力に及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に記載する。
【００２０】
本明細書で使用される用語‘ＨＧＦアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）’は、あらゆる対立遺伝子変形体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む、動物において自然に生成される（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ＨＧＦアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有するＨＧＦポリペプチドを意味する。例えば、ＨＧＦアイソフォームは、ＨＧＦの正常型（ｎｏｒｍａｌ  ｆｏｒｍ）又は野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）、そしてＨＧＦの多様な変異体（例えば、スプライシング変異体及び欠損変異体）を全て包括する意味を有する。
【００２１】
本発明の一実施例において、本発明のＨＧＦの２つ以上のアイソフォームは、全長ＨＧＦ（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＨＧＦ；  ｆｌＨＧＦ）と欠損型ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ＨＧＦ；  ｄＨＧＦ）を含む。全長ＨＧＦ及び欠損型ＨＧＦを両方とも含む組成物を利用する場合、ＡＬＳをさらに効果的に予防又は治療することができる。
【００２２】
本明細書で使用される用語‘ｆｌＨＧＦ’は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、ヒトＨＧＦのアミノ酸１−７２８配列を称する。
【００２３】
本明細書で使用される用語‘ｄＨＧＦ’は、動物、好ましくは、哺乳動物においてＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシングにより生成されるＨＧＦタンパク質の欠損型、より好ましくは、全長ＨＧＦ配列からアルファ鎖の一番目クリングルドメインで５個のアミノ酸（Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＳ）が欠損された７２３個のアミノ酸からなるヒトＨＧＦを称する。
【００２４】
本発明の一具体例において、本発明の全長ＨＧＦは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、本発明の欠損型ＨＧＦは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明の一実施例において、本発明のＨＧＦのアイソフォームは、別途のヌクレオチド配列によりコードされるか、又は単一のポリヌクレオチドによりコードされる。本発明の薬学的組成物は、ＨＧＦの相異なる種類のアイソフォームが別途のポリヌクレオチドによりコードされる場合、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、ＨＧＦの相異なる種類のアイソフォームが単一のポリヌクレオチドによりコードされる場合は、前記単一のポリヌクレオチドを含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ＨＧＦアイソフォームの発現を調節する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結できる。
【００２６】
ＨＧＦの２種以上のアイソフォームが別途のポリヌクレオチドによりコードされる場合、２つの方式で発現カセットを構築することができる。その１つの方式によると、アイソフォームのそれぞれに対するＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に発現調節配列を連結して発現カセットを構築する。他の１つの方式によると、‘発現調節配列−第１アイソフォームＣＤＳ−ＩＲＥＳ−第２アイソフォームＣＤＳ−転写終結配列’のような方式で、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）又は２Ａペプチドを利用して発現カセットを構築する。ＩＲＥＳは、遺伝子の翻訳がＩＲＥＳ配列から始まるようにすることにより、２つ以上の関心遺伝子が同一な構造物で発現されるようにする。
【００２７】
ＨＧＦの２種以上のアイソフォームが単一のポリヌクレオチドによりコードされる場合、前記２種以上のアイソフォームを全てコードしているポリヌクレオチドは、単一の発現調節配列に作動可能に連結される。
【００２８】
本発明において、ＨＧＦのアイソフォームは、２つ以上の相異なる種類のアイソフォーム、例えば、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを同時に発現するハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）ＨＧＦ遺伝子によりコードされえる。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によると、前記ハイブリッドＨＧＦ遺伝子は、ヒトＨＧＦのエキソン１乃至１８に当たるｃＤＮＡ、及び前記ｃＤＮＡのエキソン４と５との間に挿入されたヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４又はその断片を含む。
【００３０】
本発明のより好ましい具現例によると、前記ハイブリッドＨＧＦ遺伝子は、配列番号３乃至１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
前記イントロン４を含むハイブリッドＨＧＦ遺伝子は、７１１３ｂｐ長であって、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。前記ハイブリッドＨＧＦ遺伝子は、選択的にＨＧＦ  ｃＤＮＡのエキソン４と５との間にイントロン４の断片を含むことができる。
【００３２】
本発明の好ましい具現例によると、前記エキソン４及び５の間に追加的に挿入される配列は、ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４、配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチド、３９２番目から７２７番目までのヌクレオチド、２２２９番目から５４７１番目までのヌクレオチド、５１１７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、３１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、４１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド又はこれらの組み合わせである。
【００３３】
より好ましくは、本発明で利用される治療学的ヌクレオチド配列のエキソン４と５との間に追加的に挿入される配列は、（ｉ）配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチドと２２２９番目から５４７１番目までのヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチドと５１１７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチドと３１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、（ｉｖ）配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチドと４１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、（ｖ）配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチドと２２２９番目から５４７１番目までのヌクレオチド、（ｖｉ）配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチドと５１１７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、（ｖｉｉ）配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチドと３１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド、又は（ｖｉｉｉ）配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチドと４１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチドである。
【００３４】
前記エキソン４と５との間に追加的に挿入される配列によって、本発明の治療学的ヌクレオチド配列をまとめてみると下記のようである：（ｉ）（エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチド−２２２９番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｉｉ）（エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチド−５１１７番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｉｉｉ）  （エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチド−３１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｉｖ）  （エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から２２４７番目までのヌクレオチド−４１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｖ）（エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチド−２２２９番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｖｉ）（エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチド−５１１７番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｖｉｉ）（エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチド−３１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）；（ｖｉｉｉ）（エキソン１乃至エキソン４）−（配列番号３の３９２番目から７２７番目までのヌクレオチド−４１６７番目から５４７１番目までのヌクレオチド）−（エキソン５乃至１８）。
【００３５】
本明細書において、前記イントロン４の断片を含むハイブリッドＨＧＦ遺伝子は、‘ＨＧＦ−Ｘ’と命名されて、前記ＨＧＦ−Ｘには、配列番号４乃至１０のヌクレオチド配列を有するＨＧＦ−Ｘ２、ＨＧＦ−Ｘ３、ＨＧＦ−Ｘ４、ＨＧＦ−Ｘ５、ＨＧＦ−Ｘ６、ＨＧＦ−Ｘ７及びＨＧＦ−Ｘ８が含まれる。本発明において、好ましくは、ＨＧＦ−Ｘ７が利用される。本発明における‘ＨＧＦアイソフォーム’、‘ＨＧＦ−Ｘ’及び‘ＨＧＦ−Ｘ７’などに関しては、従来ＰＣＴ／ＫＲ０３／０００５４８に報告したことがあり、前記特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれる。
【００３６】
本発明で利用可能なＨＧＦアイソフォームのアミノ酸又はヌクレオチド配列は、野生型ヒトＨＧＦアイソフォームの配列と実質的な同一性を示すアミノ酸又はヌクレオチド配列も含むと解釈される。前記実質的な同一性は、野生型ヒトＨＧＦアイソフォームのアミノ酸又はヌクレオチド配列と任意の他の配列とを最大限に対応するようにアラインして、当業界で通常的に利用されるアルゴリズムを利用し、アラインされて配列を分析した場合、少なくとも８０％の相同性、より好ましくは、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは、少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３  （１９７０）；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：  ３０７−３１  （１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４  （１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３  （１９８９）；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０  （１９８８）；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐｌ．  ＢｉｏＳｃｉ．  ８：１５５−６５  （１９９２）及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１  （１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０  （１９９０））は、ＮＢＣＩ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＳＡＴは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認できる。
【００３７】
本明細書で使用される用語‘予防’は、本発明の組成物の投与によって、筋萎縮性側索硬化症を抑制させるか、進行を遅延させる全ての行為を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される用語‘治療’は、（ａ）筋萎縮性側索硬化症の発展の抑制；（ｂ）筋萎縮性側索硬化症の軽減；又は（ｃ）筋萎縮性側索硬化症の除去を意味する。
【００３９】
本発明の組成物は、神経細胞における神経突起発芽及び成長、そして運動神経細胞の成長及び死滅抑制を通じて、筋萎縮性側索硬化症を予防又は治療することができるようにする。
【００４０】
本発明の組成物は、遺伝子治療分野で通常的に公知された多様な運搬方法を通じて生体内に適用できる。
【００４１】
本発明の一実施例において、本発明のポリヌクレオチドは、ネイキッドＤＮＡ（ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ）であるか、あるいは遺伝子運搬体に含まれている。遺伝子運搬体の例は、プラスミド、ベクター及びウイルスベクターを含む。
【００４２】
（ｉ）プラスミド（ベクター）
本発明のポリヌクレオチドを運搬する運搬体としてプラスミド（ベクター）が利用できる。ベクターに含まれるポリヌクレオチドは、適した発現カセット内に存在することが好ましい。前記発現カセットにおいて、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動的に連結されることが好ましい。
【００４３】
本明細書において、用語‘作動的に結合された’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【００４４】
本発明において、ポリヌクレオチド配列に結合されたプロモーターは、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、人間細胞で作動し、ヌクレオチド配列の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくは、本発明で利用されるプロモーターは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙ）遺伝子由来のプロモーター又はＥＦ１アルファプロモーターであって、最も好ましくは、ｈＣＭＶ  ＩＥ遺伝子のプロモーター／エンハンサー及びエキソン１の全体配列からエキソン２のＡＴＧ開始コドン直前までを含む５’−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）である。
【００４５】
本発明で利用される発現カセットは、ポリアデニル化配列を含むことができ、例えば、牛成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ，  Ｅ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来のポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，  Ｂ．  Ｉ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，  Ｃ．  Ｎ．  ａｎｄ  Ｔ．  Ｐ．  Ｓｔａｃｙ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：２１０４−２１１３（１９８５））、又はポリオマーウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，  Ｄ．  Ｂ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｇ．  Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明の好ましい具現例によると、ポリヌクレオチドの運搬体としてｐＣＫ、ｐＣＰ、ｐＶＡＸ１又はｐＣＹベクターを利用することができ、より好ましくは、ｐＣＫベクターを利用することができる。前記ｐＣＫベクターは、ＷＯ２０００／０４０７３７に詳細に開示されており、前記特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれる。
【００４７】
（ｉｉ）レトロウイルス
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入させて、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染できる細胞のスペクトルが広いため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。
【００４８】
レトロウイルスベクターを構築するために、本発明のポリヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりにレトロウイルスゲノムに挿入されて、複製不能のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）とΨ配列は含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ３３：１５３−１５９（１９８３））。本発明のポリヌクレオチド配列、ＬＴＲ及びΨ配列を含む組換えプラスミドを前記細胞株に移入すると、Ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にして、この転写体は、ウイルスにパッケージングされて、ウイルスは、培地に排出される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  “Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  （ｅｄｓ．），  Ｓｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  ４９４−５１３（１９８８））。組換えレトロウイルスを含有する培地を収集して濃縮し、遺伝子伝達システムに利用する。
【００４９】
２世帯レトロウイルスベクターを利用した遺伝子伝達が発表された。Ｋａｓａｈａｒａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６６：１３７３−１３７６（１９９４））は、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ−ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）の変異体を製造して、ここで、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）配列をエンベロープ部位に挿入して、新しい結合特性を有するキメリック蛋白質（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を生産した。本発明のポリヌクレオチド配列も、このような２世帯レトロウイルスベクターの構築戦略によってレトロウイルスに搭載できる。
【００５０】
（ｉｉｉ）アデノウイルス
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲のターゲット細胞、及び優れた感染性から、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須的なシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節する蛋白質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与する蛋白質をコードする。
【００５１】
現在開発されたアデノウイルスベクターの中で、Ｅ１領域の欠如された複製不能アデノウイルスがよく利用されている。一方、Ｅ３領域は、通常的なアデノウイルスベクターから除去され、外来遺伝子が挿入される座を提供する（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ３１：５４３−５５１（１９８２）；  及びＲｉｏｒｄａｎ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列は、欠失されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域）、又はＥ３領域に挿入されることが好ましい。また、前記ヌクレオチド配列は、欠失されたＥ４領域にも挿入できる。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語、“欠失”は、該当序列が完全に欠失されたものだけではなく、部分的に欠失されたものも含む意味を有する。また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：１７３３−１７３９（１９８７））。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスのゲノムに追加的に結合させることもできる。
【００５２】
アデノウイルスは、４２個の相異なる血清型及びＡ〜Ｆのサブグループを有する。この中、サブグループＣに属するアデノウイルスタイプ５が、本発明のアデノウイルスベクターを得るための最も好ましい出発物質である。アデノウイルスタイプ５に対する生化学的及び遺伝的情報は、よく知られている。アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同一な方式により複製されて、そのため、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、アデノウイルス遺伝子伝達システムを利用した遺伝子治療が安全であると判断される。
【００５３】
（ｉｖ）ＡＡＶベクター
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞を感染させることができて、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているため、本発明の遺伝子伝達システムに好適である。ＡＡＶベクターの製造及び用途に対する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【００５４】
遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに対する研究は、ＬａＦａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｏｌｏｇｙ，  １６２：４８３４８６（１９８８），  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （ＮＹ），  ２１：９２８−９３３（１９９３），  Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９４：１４４０−１４４８（１９９４）、及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２：２９−３７（１９９５）に開示されている。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の治療剤として臨床Ｉを施している。
【００５５】
典型的に、ＡＡＶウイルスは、２つのＡＡＶ末端リピートが両側に位置されている目的の遺伝子配列を含むプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２：１９６３−１９７３（１９８８）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６３：３８２２−３８２８（１９８９））及び末端リピートのない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６５：２９３６−２９４５（  １９９１））を同時形質転換させて製造される。
【００５６】
（ｖ）他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明のポリヌクレオチド配列を生体内に運搬するに利用することができる。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９）；  Ｒｉｄｇｅｗａｙ，  “Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  ｅｄｓ．  Ｓｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  ４６７−４９２（１９８８）；  Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，  “Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ，”  Ｉｎ：  Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，  ｅｄ．  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １１７−１４８（  １９８６）及びＣｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ６８：１−１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、又は単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））由来のベクターも、前記ポリヌクレオチドを細胞内に運搬できる運搬システムとして利用することができる。
【００５７】
（ｖｉ）リポソーム
リポソームは、水相に分散された燐脂質により自然に形成される。外来ＤＮＡ分子をリポソームにより成功的に細胞内に運搬した例は、Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２１：１８５−１９０（１９８２）、及びＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １４９：１５７−１７６（１９８７）に開示されている。本発明のポリヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着又はプラズマ細胞膜との融合などのメカニズムを通じて細胞と相互作用し、細胞内にポリヌクレオチド配列を運搬する。
【００５８】
本発明において、本発明のポリヌクレオチド配列がネーキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子又はプラスミド（ベクター）に搭載された場合は、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｃｅｌｌ，  ２２：４７９（１９８０）；及びＨａｒｌａｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０１：１０９４−１０９９（１９８５））、カルシウムフォスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，  Ｆ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６（１９７３）；及びＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：２７４５−２７５２（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １：８４１（１９８２）；及びＴｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１６−７１８（１９８６））、リポソーム−媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，  Ｔ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １０：８７（１９８０）；  Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２１：１８５−１９０（１９８２）；及びＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １４９：１５７−１７６（１９８７））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７：９５６８−９５７２（１９９０））方法により、ポリヌクレオチド配列を細胞内に移入させることができる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチド配列がウイルスベクターに基づいて制作された場合は、当業界に公知の多様なウイルス感染方法によって、ポリヌクレオチド配列を細胞内に運搬することができる。ウイルスベクターを利用した宿主細胞の感染は、上述の引用文献に記載されている。
【００６０】
本発明の好ましい具現例において、本発明の遺伝子運搬体は、ベクターである。
【００６１】
本発明の一具体例において、本発明のベクターは、プラスミドであり、最も好ましくは、ｐＣＫベクターを利用することができる。ｐＣＫベクターを利用したＨＧＦの２つ以上のアイソフォームを発現する単一ポリヌクレオチドを含む組換えベクターの例は、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が挙げられて、これは、上述のように、ＰＣＴ／ＫＲ９９／０００８５５及びＰＣＴ／ＫＲ０３／０００５４８に詳細に記載されている。
【００６２】
本発明の組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００６３】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、脊髄内投与、脊髄腔内投与、脳室内投与、脳実質内投与、頭蓋腔内投与、筋肉内投与又は局部投与を利用して投与することができる。最も好ましくは、筋肉内、脊髄内、脊髄腔内、脳室内、脳実質内、頭蓋腔内投与することができる。
【００６４】
本発明の薬剤学的組成物は、注射剤として製剤化して投与することができる。本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。
【００６５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のＨＧＦのアイソフォームは、それぞれ１μｇ乃至２５００ｍｇの投与量で投与し、前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ１μｇ乃至２５００ｍｇの投与量で投与する。前記ＨＧＦのアイソフォーム又はこれをコードするポリヌクレオチドの投与が一回を超過して繰り返される時、投与量は、毎回同一であっても、異なってもいてよい。
【００６６】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態で製造するか、又は多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であり、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００６７】
本発明の他の様態によると、本発明は、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の２つ以上のアイソフォーム又は前記アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の予防又は治療方法を提供する。
【００６８】
本発明の一具現例において、本発明のＨＧＦの２つ以上のアイソフォームは、全長ＨＧＦ（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＨＧＦ；  ｆｌＨＧＦ）及び欠損型ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ＨＧＦ；  ｄＨＧＦ）を含む。
【００６９】
本発明の一具体例において、本発明の全長ＨＧＦは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、本発明の欠損型ＨＧＦは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
本発明の筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療方法の場合、本発明の一様態である筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療用薬学的組成物を投与する段階を含む方法であるため、その共通する内容については、本明細書記載の過度なる複雑性を避けるために省く。
【００７１】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【実施例】
【００７２】
実施例１：胚神経細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ，  ＥＮＣ）の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が及ぼす効能の確認
マウスの胚芽（ｅｍｂｒｙｏ）から大脳皮質部分のみを取って単一細胞化した後、Ａｒａ−Ｃ  １０μＭを培養培地に入れて、神経細胞だけ培養した。ＥＮＣの成熟においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が及ぼす影響を確認するために、２×１０４個の細胞を播種し、翌日細胞にｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）から得られたタンパク質１．２５ｎｇ／ｍＬを処理し、細胞の成熟で見られる神経突起発芽（ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）程度を確認した。細胞の神経突起発芽の程度は、神経細胞特異的に発現するチューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）タンパク質のＴＵＪ−１の発現を免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を通じて確認した。
【００７３】
その結果、図１に示されたように、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７処理群が、対照群のｐＣＫ処理群に比べ、有意に神経突起の長さを増加させることを確認した。
【００７４】
実施例２：  ＥＮＣの成熟後、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞成長に及ぼす影響の確認
ＥＮＣの成熟後、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞成長に及ぼす影響を確認した。そのために、５×１０４個のＥＮＣを播種し、６日間成熟過程を進行した。６日後、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｆ細胞から得られたタンパク質１．２５ｎｇ／ｍＬを処理し、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞の成長に及ぼす影響を確認した。ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７を処理した３日後、ＭＴＴアッセイを行って、細胞成長を測定した。
【００７５】
その結果、図２に示されたように、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７処理群が、対照群のｐＣＫ処理群に比べ、約４０％程度細胞成長が増加することを確認した。
【００７６】
実施例３：マウス運動神経細胞（ＮＳＣ−３４）において、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞成長及び細胞死滅に及ぼす影響の確認
３−１．細胞株及び細胞培養
本実験に使用されたＮＳＣ−３４細胞（Ｃｅｌｌｕｔｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  ＣＡ）は、マウス由来の運動神経細胞である。ＮＳＣ−３４細胞は、胚芽期マウスの脊髄神経由来の運動神経細胞と、神経母細胞腫細胞とが混合された細胞株であって、運動神経に係る研究に広く使用される細胞株である。前記細胞は、３７℃，  ５％  ＣＯ２条件で培養し、１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）が含まれたダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ，  Ｓｉｇｍａ）内で培養した。細胞培養媒質、試薬及び血清は、ＧｉｂｃｏとＳｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【００７７】
３−２．ＨＧＦタンパク質を発現する上澄み液の生産及び定量
ＨＧＦタンパク質を発現する上澄み液を生産するために、ＤＮＡトランスフェクション法を利用した。トランスフェクションは、ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤトランスフェクションシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳＡ）を利用して、製造者のプロトコールにしたがって行った。１×１０６個の２９３Ｔ細胞を播種した後、翌日ｐＣＫ、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８（ＰＣＴ／ＫＲ０３／０００５４８のｐＣＫ−ｃＨＧＦ）、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３（ＰＣＴ／ＫＲ０３／０００５４８のｐＣＫ−ｄＨＧＦ）及びｐＣＫ−ＨＧＦＸ７  ＤＮＡ  ３μｇをそれぞれトランスフェクションした。４８時間培養後、それぞれの上澄み液を全部収集して、０．２２μｍフィルターを利用してろ過した。ヒトＨＧＦ免疫分析法を利用し、それぞれの上澄み液に含まれたＨＧＦタンパク質の発現量を測定した。それぞれの上澄み液を再び１μｇ／ｍＬで希釈して、実験に使用した。ヒトＨＧＦ免疫分析法に使用された組換えヒトＨＧＦタンパク質は、Ｒ＆Ｄ社（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）の製品を購入して使用した。
【００７８】
３−３．ＮＳＣ−３４細胞において、ｐＣＫ−ＨＧＦ７が細胞成長に及ぼす影響
ｐＣＫ−ＨＧＦ７が運動神経細胞の成長に及ぼす効果を確認するために、ＮＳＣ−３４細胞にｐＣＫ−ＨＧＦ７を処理した後、細胞の増殖程度を評価した。細胞は、１０％牛胎児血清を含む培養培地で培養した後、実験に使用するために、１％牛胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地を利用して懸濁した。１％の血清を含む培地２ｍＬに３×１０４個の細胞が含まれるように懸濁して、６ウェルプレートに播種した。播種２時間後、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞から得た各上澄み液を、ＨＧＦタンパク質の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように、６ウェルプレートにウェル当たり１００μＬずつそれぞれ添加した。ｐＣＫベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして得た上澄み液を対照群として使用した。４８時間培養後、６ウェルプレートの培地を入れ替えた。それぞれのウェルに１％の牛胎児血清を含む培地２ｍＬを添加した後、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞で得た各上澄み液をＨＧＦタンパク質の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように添加した後、４８時間培養した。ｐＣＫベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして得た上澄み液を対照群として使用した。培養した細胞を収集して細胞を計数した。ｐＣＫベクターを対照群として使用した。
【００７９】
細胞を播種した後、５日間培養した結果、ｐＣＫ、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞で得た各上澄み液を処理した実験群において、ｐＣＫベクターを処理した実験群と比較した時、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８あるいはｐＣＫ−ＨＧＦ７２３を処理した実験群は、約２０％程度の細胞増殖を誘導し、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７を処理した群は、約４８％程度の細胞成長増加が観察された。この結果を通じて、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７は、運動神経細胞の細胞成長を、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８あるいはｐＣＫ−ＨＧＦ７２３に比べ、著しく増加させることを確認することができた（参照：図３）。
【００８０】
３−４．ＮＳＣ−３４細胞において、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞死滅に及ぼす影響
ＮＳＣ−３４細胞を１％牛胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地で３×１０４個で懸濁して、６ウェルプレートに播種した。細胞播種後、２時間細胞を安定化させた後、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞から得た各上澄み液を、ＨＧＦタンパク質の濃度５０ｎｇ／ｍＬとして添加した。ｐＣＫベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして得た上澄み液を対照群として使用した。細胞は、２〜３日間隔で培地と上記の各上澄み液を入れ替え、５日間培養した。
【００８１】
５日間培養した細胞からトリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）を利用してＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡは、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，  ＵＳＡ）を利用してｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、Ｂａｘ遺伝子に対する配列番号１１と１２又はＢｃｌ−２遺伝子に対する配列番号１３と１４のヌクレオチドをプライマーとして使用し、実時間定量重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、鋳型ｃＤＮＡ  １μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬプライマー各１μＬ、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）  １２．５μＬ、滅菌３次蒸留水  ９．５μＬを混合して、２５μＬの混合液を製造した後、５０℃  ２分間、９５℃  １０分間反応した後、９５℃  １５秒、６０℃  １分の条件で４０回繰り返して反応した。この際、各反応値を補正するために、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨに対する配列番号１５と１６のヌクレオチドをプライマーとして使用し、同様にＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。試験結果、ｐＣＫ処理群に比べ、各ＨＧＦ上澄み液を処理したグループにおいて、アポトーシス誘導に係る遺伝子であるＢａｘの遺伝子発現が減少し、特に、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７処理群では、アンチ−アポトーシスに係るＢｃｌ−２の発現が、ｐＣＫ処理群に比べて１．３倍増加した（参照：図４ａ）。この実験を通じて、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が、１％牛胎児血清を含む培地条件で、対照群のｐＣＫ処理群に比べ、約４０％程度細胞死滅を抑制することを確認した（参照：図４ｂ）。
【００８２】
実施例４．酸化的ストレス培養条件で、ＮＳＣ−３４細胞の生存に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効果確認
４−１．酸化的ストレスによるＮＳＣ−３４細胞の細胞死滅を誘導する過酸化水素水の濃度選定
過酸化水素水により誘導されるＮＳＣ−３４細胞の細胞死滅にｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が及ぼす影響を確認する前に、ＮＳＣ−３４細胞の死滅を確認するに適切な細胞の播種濃度及び細胞死滅を誘導する過酸化水素水の濃度を選定した。
【００８３】
１０％牛胎児血清を含む培養培地を利用して培養した細胞を収集し、１％牛胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地で懸濁し、細胞を計数した。計数した細胞は、９６ウェルプレートに１×１０４個の細胞濃度で播種した後、翌日、１０、２０、３０、５０、１００μＭの過酸化水素水を処理した。過酸化水素水を処理しなかったウェルは、リン酸緩衝液を入れて対照群として使用した。２４時間後、ＸＴＴ実験法（Ｒｏｃｈｅ，  ＵＳＡ）を利用して、細胞死滅程度を測定した。対照群に比べ、過酸化水素水を濃度別に処理した実験群で０、１０、３０、７０、８５％の細胞死滅が誘導されることを確認した。このような結果に基づいて、ＮＳＣ−３４細胞の細胞死滅を誘導する過酸化水素水の適切な濃度を３０μＭと選定した。
【００８４】
また、６ウェルプレートで細胞死滅実験を行うために、１％牛胎児血清を含む培地２ｍＬに１．５×１０５、３×１０５、１×１０６個の細胞が含有されるようにして６ウェルプレートに播種した。翌日、ＮＳＣ−３４細胞に過酸化水素水３０μＭを処理した後、１、４、７日目に細胞数を確認した。７日目に細胞数を確認した結果、１．５×１０５個の細胞を播種したウェルの細胞は全て死滅し、実験に選定することができなく、１×１０６個の細胞を播種したウェルは、細胞死滅が誘導されなかった。このような実験結果に基づいて、細胞死滅を誘導する実験に使用する細胞数と過酸化水素水の濃度を３×１０５個と３０μＭと選定した。
【００８５】
４−２．酸化的ストレス培養条件で、ＮＳＣ−３４細胞の生存に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効果確認
ＮＳＣ−３４細胞は、１０％牛胎児血清を含む培養培地で培養した後、細胞死滅抑制実験に使用するために、１％牛胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地を利用して懸濁した。１％の血清を含む培地２ｍＬに３×１０５個の細胞が含まれるように懸濁して、６ウェルプレートに播種した。翌日、以前の実験で選定された過酸化水素水３０μＭを各ウェルに処理した後、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞から得た各上澄み液を、ＨＧＦタンパク質の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように処理した。実験対照群として、ｐＣＫベクターをトランスフェクションして得られた培養培地を利用した。７日間細胞を培養しながら細胞死滅程度を観察した。細胞播種７日後、細胞を収集して細胞を計数した。細胞計数結果、ｐＣＫ、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３を処理した実験群の細胞は、最初播種した細胞数に比べ、約６０〜７０％の細胞のみが生存したが、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７を処理したＮＳＣ−３４細胞は、約９２％程度の生存を示し、他の実験物質処理群に比べ、細胞死滅が抑制されることを確認した。この結果を通じて、ＨＧＦＸ７タンパク質が過酸化水素水による酸化的ストレスで誘導される運動神経の細胞死滅を効果的に抑制することを確認することができた（参照：図５）。
【００８６】
４−３．酸化的ストレス培養条件でＮＳＣ−３４細胞の細胞死滅に及ぼすｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効果確認
ＮＳＣ−３４細胞を１％牛胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地で３×１０５個で懸濁して、６ウェルプレートに播種した。翌日、３０μＭ過酸化水素水を各ウェルに処理した後、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２３、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞から得た各上澄み液を、ＨＧＦタンパク質の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように処理して７日間培養した。実験対照群として、ｐＣＫベクターをトランスフェクションして得られた上澄み液を利用した。
【００８７】
７日間培養した細胞からトリゾール試薬を利用してＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡは、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔを利用してｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型としてＢａｘ遺伝子に対する配列番号１１と１２又はＢｃｌ−２遺伝子に対する配列番号１３と１４のヌクレオチドをプライマーとして使用し、実時間定量重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、鋳型ｃＤＮＡ  １μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬプライマー各１μＬ、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）  １２．５μＬ、滅菌３次蒸留水９．５μＬを混合して、２５μＬの混合液を製造した後、５０℃  ２分間、９５℃  １０分間反応した後、９５℃  １５秒、６０℃  １分の条件で４０回繰り返して反応した。この際、各反応値を補正するために、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨに対する配列番号１５と１６のヌクレオチドをプライマーとして使用し、同様にＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。試験結果、ｐＣＫ処理群に比べ、各ＨＧＦ上澄み液を処理したグループにおいて、アポトーシス誘導に係る遺伝子であるＢａｘの遺伝子発現は減少し、アンチ−アポトーシスに係るＢｃｌ−２の発現は、増加することを確認した。特に、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７処理群の場合、ｐＣＫ処理群に比べ、約７０％程度Ｂａｘ遺伝子の発現を減少させる結果を示して（参照：図６ａ）、Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２の比率（ｒａｔｉｏ）を約７５％程度減少させ、細胞死滅抑制効果に優れていることが確認された（参照：図６ｂ）。
【００８８】
実施例５：  Ｇ９３Ａ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）形態のｈＳＯＤ１を伝達した細胞において、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が細胞成長に及ぼす影響の確認
ＡＬＳの原因の１つと知られたＳＯＤ１（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １）のＧ９３Ａ突然変異型を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験法が多くの研究者によって開発された。特に、運動神経細胞の研究で広く使用するＮＳＣ−３４細胞にｈＳＯＤ１のＧ９３Ａ突然変異型を伝達した時、細胞の死滅を誘導することができるという報告が知られている（Ｃｈｅｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、本試験では、ｈｕｍａｎ  ＳＯＤ１野生型遺伝子（ｗｉｌｄｔｙｐｅ；  ＷＴ）  （ＮＭ＿０００４５４）とｈｕｍａｎ  ＳＯＤ１遺伝子の９３番目アミノ酸配列をグリシンからアラニンに変更した遺伝子をそれぞれｐＣＫベクターのＢａｍＨＩ部位（ｓｉｔｅ）に挿入し、ｐＣＫ−ｈＳＯＤ１−野生型とｐＣＫ−ｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを制作した。制作したプラスミドを利用し、ｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａを伝達したＮＳＣ−３４細胞においてｐＣＫ−ＨＧＦＸ７の効能を確認するために、下記のような実験を進行した。
【００８９】
ＮＳＣ−３４細胞を１０％牛胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地で１×１０４個で懸濁して、９６ウェルプレートに播種した後、翌日、ｐＣＫ、ｐＣＫ−ｈＳＯＤ１−野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ；  ＷＴ）、ｐＣＫ−ｈＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ突然変異（Ｇ９３Ａ）をリポフェクタミンＬＴＸ試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）を利用してトランスフェクションした。トランスフェクション直前にＧ９３Ａトランスフェクション細胞は、ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞から得た各上澄み液を、ＨＧＦタンパク質の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように処理した。実験対照群として、ｐＣＫベクターをトランスフェクションして得られた上澄み液を利用した。
【００９０】
３日間培養した後、ＸＴＴ試薬を処理し、細胞成長を確認した。その結果、野生型ｈＳＯＤ１を伝達した細胞は、ｐＣＫベクターを伝達した細胞と、細胞成長において類似な様相を示すことが確認された。しかし、Ｇ９３Ａ突然変異型のｈＳＯＤ１を伝達した細胞は、ｐＣＫを伝達した細胞に比べ、約８５．８％の細胞成長を示し、野生型ｈＳＯＤ１を伝達した細胞に比べ、細胞成長が低下することを確認した。しかし、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７を処理した実験群は、約９２．９％の細胞成長を示し、Ｇ９３Ａ突然変異型のｈＳＯＤ１の伝達による細胞成長の低下を抑制する効果を示した（参照：図７）。
【００９１】
［遺伝子配列］
配列番号１１：ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴ
配列番号１２：ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＧ
配列番号１３：ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＡ
配列番号１４：ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧ
配列番号１５：ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  Ｃ
配列番号１６：ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ
【００９２】
実施例６．ヒト突然変異ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ  Ｔｇマウス（以下、ＡＬＳマウス）の握力（ｇｒｉｐ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）にｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が及ぼす効能の評価
ＡＬＳの原因の１つとしてＳＯＤ１（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １）の突然変異が明かされたことにより、この遺伝子を利用したＡＬＳマウスモデルが開発されて、現在全世界のＡＬＳ研究者たちがこの動物モデルを利用して多様な研究を行っている（Ｗｅｙｄｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。その中、広く使われるＢ６５ＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ（００２７２６）を選定して実験に使用した。ＡＬＳマウスの制作は、ウジョンＢＳＣ（Ｋｏｒｅａ）に依頼し、ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ過程を経て突然変異型のＳＯＤ１遺伝子を発現するかどうかを確認した後、本実験に使用した。
【００９３】
１０週齢のＡＬＳマウスは、群当たり４匹ずつ分けて、それぞれＴｇ−ｐＣＫ、Ｔｇ−ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８（ＰＣＴ／ＫＲ０３／００５４８のｐＣＫ−ｃＨＧＦ）、Ｔｇ−ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７投与群に分離した。Ｔｇではない個体は、６匹を選んで陰性対照群と設定した（以下、ｎｏｎ−Ｔｇ）。２週間後、陰性対照群を除いた前記三つの実験群のマウスに該当プラスミドを筋肉注射で投与した。この際、投与は、左右の上腕三頭筋、前脛骨筋、大腿直筋、腓腹筋にそれぞれ投与して、容量は、２μｇ／μｌの濃度で５０μｌずつ投与した。投与２週間後（１４週齢）、行動実験を通じて、各マウスの握力を調査した。行動実験の場合、ｍｅｓｈ握力テストを進行した。Ｍｅｓｈ握力テストは、マウスを一定な間隔の格子状の鉄網に乗せて、これをひっくり返した後、マウスが鉄網をつかんで持ち堪える時間を測定して握力を調査する方法である。この方法は、マウスの筋肉能力を評価できる最も代表的な方法の１つである（Ｃｒａｗｌｅｙ  ＪＮ，  ２００８）。
【００９４】
実験結果、ｎｏｎ−Ｔｇマウスの場合、平均９分程度の時間、ひっくり返されたまま持ち堪えた反面、Ｔｇの個体のうち、ｐＣＫを投与したマウスの場合、平均３０秒程度ひっくり返されたまま持ち堪えていた。ｐＣＫ−ＨＧＦ７２８プラスミドを投与した個体の場合は、ｐＣＫ投与群より小幅上昇した平均時間を示し、その時間は、平均４９秒であった。その反面、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７を投与したマウスの場合、ｐＣＫやｐＣＫ−ＨＧＦ７２８を投与したマウスに比べ、さらに長い時間持ち堪えて、その平均時間は、３分であった（参照：図８）。これは、ｐＣＫ−ＨＧＦＸ７が、ｐＣＫ及びｐＣＫ−ＨＧＦ７２８に比べ、ＡＬＳマウスの握力で表される筋肉の機能を著しく向上させたことを示す。
【００９５】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
2016534149.tif 000003
【図２】
2016534149.tif 000004
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
2016534149.tif 000009
【図６ｂ】
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【図７】
2016534149.tif 000011
【図８】
2016534149.tif 000012
【配列表】
2016534149000001.app
【国際調査報告】
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2016534149.tif 000014
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