(57)【要約】  本発明は、共有結合閉鎖ＤＮＡ構築物、医薬組成物およびワクチン、ならびに免疫系の調節のためのそれらの使用に関する。本発明は、特定のＤＮＡ配列を含む、免疫調節のためのＤＮＡ構築物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的にハイブリッド形成する配列番号１のＤＮＡ配列を２つ含んでなる、部分的に一本鎖のダンベル型をした、共有結合により閉じたＤＮＡ残基鎖からなる、免疫調節のためのＤＮＡ構築物。
【請求項２】
一本鎖ループが、３つのＣＧモチーフを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
各ＣＧモチーフの両側に、デオキシチミジンが隣接する、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
一本鎖ループが、少なくとも５０％のピリミジン含量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５】
ピリミジンがデオキシチミジンである、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
少なくとも１つヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基を含む群から選択される官能基で修飾されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項７】
修飾ヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、脂質、ミセル、ベシクル、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子を含む群から選択される化合物、または固相に連結している、請求項５に記載の構築物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物、または請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物。
【請求項９】
化学療法剤をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むワクチン。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ構築物が、アジュバントとして含まれる、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
がんまたは自己免疫疾患の治療のための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載のワクチンの使用。
【請求項１３】
免疫系の調節のための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載のワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共有結合により閉じたＤＮＡ構築物、医薬組成物およびワクチン、ならびに免疫系の調節のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「免疫療法」は、免疫応答を誘導、増強または抑制することによる疾患の処置を定義する。免疫療法の戦略は、がん、感染性疾患、アレルギーおよび喘息などの疾患と闘うことである。
【０００３】
免疫調節物質と呼ばれる、免疫療法にて使用可能な様々な活性薬剤が公知である。特定のＤＮＡ配列が、そのような公知の免疫調節物質に属する。最も公知の免疫調節性短鎖ＤＮＡ配列は、非メチル化シトシングアニンモチーフ（ＣＧモチーフ）を含有し、これはＫｒｉｅｇら（Ｎａｔｕｒｅ  １９９５  ３７４：６５２２  ５４６〜５４９）によって報告されている。非メチル化ＣＧモチーフの発生は、実質的に原核生物またはウイルスと比較して、真核生物のゲノム中で抑制される。したがって、そのようなモチーフを含有するＤＮＡ分子が、天然の「危険シグナル」として発達し、原核生物またはウイルス病原体に対する闘いにおいて免疫系を引き起こす。これは、免疫療法で感染を治療または予防するために、そのような配列を用いて治療的または予防的に使用することができる。
【０００４】
非メチル化ＣＧモチーフを含むＤＮＡ構築物は、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫＴ細胞を含む、自然免疫系のエフェクター細胞を強力に刺激することによって、相当の生理学的効果を引き出すことができる。非メチル化ＣＧモチーフは、自然免疫パターン認識受容体Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９によって検出される。実際の認識機構はまだ完全に理解されてはいないが、内在する経路を解明することにおいて、著しい進展がなされてきた（Ａ．Ｋｒｉｅｇ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．、５：４７１〜４８４、２００６）。
【０００５】
非メチル化ＣＧを含有するＤＮＡ構築物が受容体に結合すると、複数のシグナルカスケードが応答細胞で活性化される。特徴的な表面分子のアップレギュレーションと、サイトカインの分泌によって、優勢Ｔｈ１パターンを有する適応免疫が誘導される。そのような構築物は、例えば抗体、化学療法または放射線療法、ワクチンまたはサイトカインと組み合わせて使用可能である。アレルギー性疾患および喘息は、ほとんどＴｈ２によって媒介される。Ｔｈ１／Ｔｈ２の比を増加することによって、Ｔｈ２媒介応答が弱化され、それによってこれらの種類の疾患が治療または予防される。
【０００６】
ＴＬＲ−９経路によってアップレギュレートされる表面分子としては、細胞型に依存して、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＣＤ１６９が挙げられる。サイトカインの増強された分泌がまた、異なる細胞型に対して特徴的であり、サイトカインとしては、例えば、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＭＩＰ−１β、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＦＮ−γ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１または１０ｋＤａのＩＦＮ−γ−誘導タンパク質（ＩＰ−１０）が挙げられる。
【０００７】
疾患を予防または治療するために、ワクチン接種が非常に効果的な手法であると証明されている。強力で耐久性のある免疫応答を確かにするために、樹状細胞などの抗原提示細胞を刺激可能なアジュバントを通常、抗原と一緒に投与し、その目的のために、ＴＬＲ９アゴニストが、強力な免疫刺激剤として示されてきた。
【０００８】
前臨床および進行中の臨床試験が、免疫調節物質および／またはアジュバントとしてのＴＬＲ−９アゴニストの使用を支持し、体性および細胞性応答両方を増強することによる、それらの抗腫瘍効果を証明する。
【０００９】
非メチル化ＣＧモチーフが免疫応答に影響を与えるまたは調節する内在機構のいかなる説明とも独立に、そのようなモチーフを用いることによる免疫システムの調節のための多くの手法が開発された。国際公開第１９９８／０１８８１０号パンフレットは、非メチル化ＣＧモチーフを含有する免疫刺激配列が、一本鎖の一部分である場合、より効果的であることを開示している。しかしながら、開鎖一本鎖ＤＮＡ分子を投与することは、一本鎖核酸が迅速に分解されるため現実的ではない。結果として、非メチル化ＣＧモチーフを含む一本鎖または二本鎖ＤＮＡ構築物を保護するための様々な方法が開発された。
【００１０】
ＤＮＡヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を達成するために、核酸ポリマーの骨格内のホスホジエステル結合を修飾してホスホロチオエートにすることが多い。そのようなホスホロチオエート保護核酸のいくぶん少ない刺激活性に加えて、昨年の内の臨床試験において、ホスホロチオエート保護の毒性により、そのような核酸を、医薬組成物または医薬品において使用することが除外され、または強く制限されることが示された。
【００１１】
異なる免疫調節プロファイルを有する、公知の活性剤の４つのクラスからの、１つを除くすべてのメンバーが、直鎖ＤＮＡ分子からなる。例外は、欧州特許第１１９６１７８号明細書に開示される。本文献は、全体が天然のＤＮＡからなるＣＧモチーフを含むヌクレオチド残基の、部分的に一本鎖でダンベル型をした、共有結合により閉じた配列を含む短鎖デオキシリボ核酸分子（「ｄＳＬＩＭ」）を開示する。欧州特許第１１９６１７８号明細書の開示によれば、ＣＧモチーフは、開示された分子の二本鎖ステムの両末端での一本鎖ループ内、または二本鎖ステム内に位置する。一本鎖ヘパリンループが、二本鎖ステムを、細胞内または外のＤＮＡヌクレアーゼによる分解から保護する。文献米国特許出願公開第２００９／００５３２５０Ａ１号明細書は、化学療法薬と組み合わせた、そのようなＣＧモチーフを含むダンベル型をした、共有結合により閉じた分子を開示する。米国特許出願公開第２００７／００４９５４６号明細書は、共有結合した１つまたは複数の置換基を有する、ＣＧモチーフを含むダンベル型をした、共有結合により閉じた分子を開示している。刊行物「Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ．ら、２００６、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｇ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＧ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｄｕｍｂｂｅｌｌ  ｓｈａｐｅ」、Ａｌｌｅｒｇｙ、Ｖｏｌ．６１、５６〜６３頁」は、そのような特定のＣＧモチーフを含むダンベル型をした、共有結合により閉じた分子が、アレルギー疾患の治療において有用であろうことを示唆している。
【００１２】
文献国際公開第２０１０／０３９１３７号パンフレットは、免疫刺激モチーフに隣接している配列内、および／または修飾がなければ免疫刺激性であろうオリゴヌクレオチドモチーフ内に、１つまたは複数の化学修飾を有するＴＬＲ媒介疾患に対するアンタゴニストとしての免疫制御オリゴヌクレオチドを開示している。したがって、国際公開第２０１０／０３９１３７号パンフレットに開示されたオリゴヌクレオチドの意図は、ＴＬＲによって引き起こされた免疫応答を抑制することである。
【００１３】
国際公開第２００５／０４２０１８号パンフレットは、新規のいわゆるＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを記述しており、ｃクラスオリゴヌクレチドは、一般に分子の５’末端または３’末端にて、または近くに位置しているＣｐＧ配列と、一般に分子の他の末端にて、または近くに位置しているＧＣリッチパリンドロームモチーフとによって特徴づけられる。本文献は、ｃクラスＤＮＡのパリンドミック配列のバリエーションを開示している。
【００１４】
以上で引用した刊行物「Ａ．Ｋｒｉｅｇ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．、５：４７１〜４８４、２００６」は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの様々なクラスとその効果を開示しているが、ホスホロチオエート修飾を回避したＣＧモチーフを含むダンベル型をした、共有結合により閉じた分子は開示していない。
【００１５】
国際公開第２００４／０００８７３Ａ２号パンフレットは、ホスホロチオエート修飾ＣＧ含有一本鎖ＤＮＡも開示しており、これは、アジュバントとして、融合ペプチドに付加することが可能である。本文献は、ＣＧモチーフを含むダンベル型をした、共有結合により閉じた分子を開示していない。
【００１６】
同様に米国特許出願公開第２００３／００５０２６３号明細書は、ＨＩＶ感染の治療の状況におけるＧＣ含有オリゴヌクレオチドを扱うが、どの配列構成においても、ＣＧモチーフを含むダンベル型をした、共有結合により閉じた分子を扱ってはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
かかる技術水準に対して、真核生物細胞への導入後に安定であり、有害な副作用を回避した、高い免疫調節潜在力を有する、代替免疫調節ＤＮＡ構築物を提供することが、本開示の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、部分的にハイブリッド形成する配列番号１のＤＮＡ配列を２つ含んでなる、部分的に一本鎖のダンベル型をした、共有結合により閉じたＤＮＡ残基鎖からなる、免疫調節のためのＤＮＡ構築物を提供する。
【００１９】
本開示のさらなる実施形態として、一本鎖ループが３つのＣＧモチーフを含む構築物が提供される。
【００２０】
本発明は、各ＣＧモチーフの両側にデオキシチミジンが隣接している、ＤＮＡ構築物をさらに提供する。
【００２１】
本発明による構築物の一本鎖ループが、少なくとも５０％のピリミジン含量を有することがさらに意図される。そのような構築物は、ピリミジンとしてデオキシチミジンを有してよい。
【００２２】
さらなる実施形態として、構築物は、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基を含む群から選択される官能基で修飾されている少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
【００２３】
さらに、修飾ヌクレオチドは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、脂質、ミセル、ベシクル、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子を含む群から選択される化合物、または固相に連結することができる。
【００２４】
本発明の他の目的は、以上で記述したＤＮＡ構築物を含む医薬組成物である。医薬組成物は、化学療法剤をさらに含んでもよい。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、以上で記述したＤＮＡ構築物を含むワクチン、または前記ＤＮＡ構築物を含む医薬組成物である。ワクチンが、アジュバントとして本開示のＤＮＡ構築物を含んでもよいことがさらに想定される。
【００２６】
本発明の他の目的は、がんまたは自己免疫疾患の治療のための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載のワクチンの使用である。
【００２７】
免疫系の調節のための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載のワクチンの使用がまた想定される。
【００２８】
本開示の意味の範囲内で、用語ＤＮＡ構築物は、相当するＤＮＡ配列の長さの制限を示唆しない。ＤＮＡ構築物の単量体ユニットはヌクレオチドである。
【００２９】
ＤＮＡ構築物は、合成的に製造され得るか、部分的または完全に生物学的起源であり、生物学的起源には、ＤＮＡ配列を製造する遺伝子に基づいた方法が含まれる。
【００３０】
本開示による「ステム」は、同一のＤＮＡ分子内（したがって部分的に自己相補的である）、または異なるＤＮＡ分子内（部分的または完全に相補的である）のいずれかにおける塩基対合によって形成されたＤＮＡ二本鎖として理解されるべきである。分子内塩基対合は、同一の分子内の塩基対合を示し、異なるＤＮＡ分子間の塩基対合は、分子間塩基対合と呼ばれる。
【００３１】
本開示の意味の範囲内で「ループ」は、ステム構造内またはその末端いずれかでの、非対合一本鎖領域として理解される。「ヘアピン」は、同一のＤＮＡ分子の２つの自己相補的領域がハイブリッド形成して、非対合ループを有するステムを形成する時に発生する、ステムとループの特徴のある組合せである。ダンベル型は、ステム領域に隣接する両末端でヘアピンを有する直鎖ＤＮＡ構築物を記述する。したがって、本開示の文脈内での「直鎖ＤＮＡ構築物」は、一本および／または二本鎖ＤＮＡを含む直鎖開鎖ＤＮＡ構築物、または二本鎖ＤＮＡステムの両末端で一本鎖ループを含む直鎖ダンベル型ＤＮＡ構築物のいずれかを記述する。
【００３２】
ヌクレオチドが共有または非共有結合する「固相」は、カラム、マトリックス、ビーズ、改質または機能化ガラスを含むガラス、シリカ、またはシリコンおよび変性シリコンを含むシリカ系材料、プラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料のコポリマー、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタンなどを含む）、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、ポリサッカライド、炭素ならびに無機ガラス、金属、ナノ粒子およびプラスチックを指すが、これらに限定されない。したがって、マイクロタイタープレートがまた、本開示による固相の範囲内である。
【００３３】
本開示による免疫調節は、免疫刺激および免疫抑制を指す。免疫刺激は、優先的には、免疫系のエフェクター細胞が、増殖、移動、分化し、または任意の他の形で活性となるために刺激されることを意味する。例えば、通常ヘルパーＴ細胞からの共刺激シグナルを必要とするＢ細胞増殖が、免疫刺激ＤＮＡ分子によって、共刺激シグナルなしに誘導することができる。
【００３４】
一方、免疫抑制は、免疫系の活性化または効果を減少させることと理解されよう。免疫抑制は、例えば、移植された器官の拒絶を防止するため、骨髄移植後の移植片対宿主疾患を処置するため、または例えばリウマチ様関節炎またはクローン病などの自己免疫疾患の処置のために、一般に意図的に誘導される。
【００３５】
本文脈において、免疫調節はまた、まだ発達途上もしくは成熟化した免疫反応に影響を与えること、または確立された免疫反応の特徴を調節することのいずれかによる、免疫反応の性質または特徴への影響を指し得る。
【００３６】
本開示中で使用する用語「ワクチン接種」は、疾患に対して免疫を生じさせるための、抗原性物質（ワクチン）の投与を指す。ワクチンは、ウイルス、真菌、寄生原生動物、細菌などの多くの病原体による感染の、さらには、アレルギー性疾患および喘息の、ならびに腫瘍の効果を防止または緩和することができる。ワクチンは典型的には、免疫応答をブーストするために使用する、１つまたは複数のアジュバント、例えば免疫刺激核酸を含有する。ワクチン接種は一般的に、感染および他の疾患を防止する、最も効果的で費用効果の高い方法であると考えられる。
【００３７】
投与される物質は、例えば、病原体（細菌またはウイルス）の生きているが弱毒化された形態、これらの病原体の死滅もしくは不活化した形態、タンパク質、抗原をコードしている核酸などの精製物質、または腫瘍細胞もしくは樹状細胞などの細胞であり得る。特に、ＤＮＡワクチン接種が最近開発されている。ＤＮＡワクチン接種は、抗原をコードしているＤＮＡの、ヒトまたは動物細胞への挿入（および発現、免疫系認識の誘発）によって働く。発現したタンパク質を認識する免疫系の一部の細胞が、これらのタンパク質およびタンパク質を発現している細胞に対して攻撃を開始することになる。ＤＮＡワクチンの一利点は、製造および保存することが極めて簡単であることである。さらに、ＤＮＡワクチンは、広い範囲の免疫応答型を誘導できることを含め、従来のワクチンに勝るいくつもの利点を有する。
【００３８】
ワクチン接種は、抗原に曝露されると、ワクチン接種した健康な個体において抗原に対する免疫をもたらす予防的手法として使用することができる。あるいは、治療的ワクチン接種は、抗原に対して個体の免疫系を導くことにより、ワクチン接種された、疾患を有する個体の免疫系の改善された応答を引き起こすことができる。予防的および治療的ワクチン接種両方が、ヒトならびに動物に適用することができる。
【００３９】
本開示中で使用される用語「遺伝子治療」は、腫瘍または自己免疫疾患などの疾患を治療するための、個体の細胞および／または生物学的組織の一過性または持続性遺伝子改変（例えば遺伝子の挿入、変更または除去）を指す。遺伝子治療の最も一般的な形は、変異遺伝子を置換するために、機能的遺伝子を不特定のゲノム位置に挿入することを含むが、他の形は、変異を直接修正すること、またはウイルス感染を可能にする正常遺伝子を改変すること、またはさらには細胞内に遺伝子または遺伝子断片を移入してそれを転写させることを含む。
【００４０】
「自家遺伝子治療」は、同一個体の組織または細胞を使用することを指す。単離された細胞または組織を遺伝子治療によって改変し、ドナーに再導入する。反対に「他家遺伝子治療」は、アクセプター個体以外の個体からの遺伝子治療のための細胞を使用することを指す。他家細胞は、遺伝子改変の後、アクセプターに導入する。
【００４１】
用語「エクスビボ遺伝子治療」は、個体からの細胞、例えば造血幹細胞または造血始原細胞を、エクスビボで遺伝的に改変し、続けて処置すべき個体に投入する治療手法を指す。用語「インビボ遺伝子治療」は、個体からの細胞、例えば造血幹細胞または造血始原細胞を、例えば、ウイルスベクターまたは他の発現構築物を用いて、インビボで遺伝的に改変する治療手法を指す。
【００４２】
遺伝子治療は、「生殖細胞系遺伝子治療」と「体細胞遺伝子治療」とに分類することもできる。「生殖細胞系遺伝子治療」の場合、生殖細胞、すなわち精子または卵を遺伝的に改変する。遺伝子変化は通常、それらのゲノム内に統合される。したがって、治療による変化は、遺伝性であり、その後の世代に受け渡されることになる。この手法は、遺伝的障害および遺伝性疾患の治療のために有用である。「体細胞遺伝子治療」の場合において、治療遺伝子を、個体の体性細胞内に移動させる。いずれの改変および効果も、その個体のみに制限され、個体の子孫またはその後の世代に遺伝することはない。
【００４３】
用語「がん」は、これらに限定されないが、乳癌、メラノーマ、皮膚新生物、リンパ腫、白血病；結腸癌、胃癌、膵癌、大腸がん、小腸がんを含む胃腸腫瘍；卵巣癌、子宮頸癌、肺がん、前立腺がん、腎細胞癌および／または肝転移を含む群から選択される、治療または防止されているがん性疾患または腫瘍を含む。
【００４４】
本開示による自己免疫疾患には、リウマチ様関節炎、クローン病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、バセドウ病、重症筋無力症、セリアック病およびアジソン病が含まれる。
【００４５】
本開示は、配列番号１のＤＮＡ配列を２つ含む部分的一本鎖ダンベル型共有結合閉止ＤＮＡ残基鎖からなる、免疫調節のためのＤＮＡ構築物を提供する。配列番号１は、ＣＧモチーフを含み、ＯＤＮ２００６−ループとも呼ばれる。ＯＤＮ２００６−ループの２つのオリゴは部分的にハイブリッド形成して、ダンベル型直鎖ＤＮＡ構築物を生じる。配列番号１の配列は、以下の通りである（図１を比較のこと）。
５’−ＡＧＧＴＧＧＴＡＡＣ  ＣＣＣＴＡＧＧＧＧＴ  ＴＡＣＣＡＣＣＴＴＣ  ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＴ  ＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧ  ＴＣＧＴＴＣＴＴ−３’
【００４６】
ＣＧ含有ＤＮＡ構築物の効果は、ＴＬＲ９との相互作用に依存している。実施例および図面に示すように、ＴＬＲ９アゴニストのクラス間の免疫調節プロファイルの差は、それらの個々のヌクレオチド配列、それぞれＣＧモチーフの状況よりも、それらの立体構造により密接に関連するように思われる。
【００４７】
驚くことに、本開示のダンベル型ＤＮＡ構築物の誘導された刺激パターンは、相当する直鎖ＣＧオリゴヌクレオチドによって、またはさらには欧州特許第１１９６１７８号明細書に開示されたダンベル型ＤＮＡ構築物によって誘導される刺激パターンと異なる。
【００４８】
誘導された刺激パターンはさらに、直鎖ホスホロチオエート保護ＤＮＡオリゴＰｒｏＭｕｎｅ（ＯＤＮ２００６）によって誘導されたパターンと予期しないほど異なる。ＰｒｏＭｕｎｅの配列は、本開示によるＤＮＡ構築物の一本鎖ループの一部であり、ＣＧモチーフ含有ＤＮＡ配列の状況の関連性を強く示唆する。
【００４９】
本開示によれば、１または複数のＣＧモチーフは、構築物の一本鎖および／または二本鎖領域内に局在する。欧州特許第１１９６１７８号明細書に開示されたように、ＣＧモチーフは、分子の一本鎖領域内に含まれようと、二本鎖領域内に含まれようと、免疫応答を誘発可能である。
【００５０】
本開示はさらに、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基を含む群から選択される官能基による、少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾を含む。これにより、ＤＮＡ構築物と、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、脂質、ミセル、ベシクル、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子を含む群から選択される化合物、または固相との、例えば吸着、共有またはイオン結合による結合が可能となる。修飾は、それぞれの目的に応じて具体的に選択することができる。それによって構築物を使用して、例えば他の分子を、組み込まれたＣＧモチーフに応答する特定の細胞に対して出入りさせることができる。加えて、そのような修飾によって、構築物を細胞内に移入するために使用することができるマイクロプロジェクタイルに構築物を結合させることが可能である。構築物はまた、固相、例えばマイクロタイタープレートに結合することもできる。
【００５１】
Ｔｈ１に偏った活性化は、ＮＫ細胞と細胞障害性Ｔ細胞の活性化が関与し、これらの免疫応答は、がん療法に利用可能である。非メチル化ＣＧモチーフを含有するＤＮＡ構築物が、好ましくはＴｈ１活性化をもたらすので、本開示の構築物を使用してがんを治療することができる。がんの治療のためのＴＬＲ９アゴニストが関与する多数の臨床試験が進行中である。そのような分子は、単独で、または例えば放射線療法、手術、化学療法および凍結療法（Ｋｒｉｅｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  １１７：１１８４〜９４）と組み合わせて効果的に投与されてきた。それらの強力な免疫調節、それらの小さなサイズおよびそれらの安定性により、本開示の構築物は、この点で、非常に有利であると考えられる。加えて、本開示の構築物の異なる免疫学的プロファイルは、他の有利性が低いＴＬＲ９リガンドからそれらを区別し、このプロファイルが、がん特異的治療のために利用することができる。
【００５２】
一方、ＴＬＲ９アゴニストがまた、調節性Ｔ細胞の発生に関与し、したがって、自己免疫疾患の治療のために使用することができる。投与経路は、インビボでＣＧモチーフを含有するＤＮＡ構築物の効果を決定する一変数であるように考えられる（Ｋｒｉｅｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  １１７：１１８４〜９４）。
【００５３】
そのようなＣＧモチーフ含有ＤＮＡ分子の免疫刺激効果は、がん治療における化学療法などの標準的治療手法の効果を改善することが示されてきた。したがって、本開示の構築物を含む医薬組成物がさらに提供される。再び、従来技術のＴＬＲ９アゴニストと比較した、本開示の構築物の有利な特徴が、本開示の構築物を、がん、感染性疾患、アレルギーおよび喘息などの疾患の治療のための、前途有望なツールとする。それにより、アレルギーおよび喘息（ほとんどがＴｈ２媒介）の治療は、Ｔｈ１活性化を優先させることが有益である。
【００５４】
ＴＬＲ９アゴニストがワクチンにおける強力なアジュバントとして示されているので、本開示のＤＮＡ構築物を含むワクチンがまた提供される。本開示の構築物は、副作用を引き起こし得る、ＤＮＡを安定化させるための修飾を導入する必要なしに、ＴＬＲ９刺激に対する関連配列を含む。分子のより長い半減期により、効果的な刺激が確保され、よって強力な免疫応答が予測される。
【００５５】
本開示のＤＮＡ構築物の効果を明らかにするために、以下のＤＮＡ構築物を、本明細書で記述された実験のために使用した（表１）。
【表１】
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【００５６】
本開示は、開示された実施形態に限定されずに、実施例および図面によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ＤＮＡ構築物３０Ｌ２０４の配列と構造を表す。
【図２】図２は、ＰＢＭＣにおけるサイトカイン刺激を表す。
【図３】図２は、単球におけるＣＤ８６およびＣＤ１６９、ＮＫ細胞におけるＣＤ６９およびＢ細胞におけるＣＤ８６頻度の刺激を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
図面の詳細な記述
部分的一本鎖ダンベル型共有結合閉鎖ＤＮＡ構築物の製造を記載している、欧州特許第１１９６１７８Ｂ１号明細書を参照する。本発明の構築物はこれに従って作製する。
【００５９】
図１は、本開示によるＤＮＡ構築物の構造と配列を示している。
【００６０】
図２は、上記の表１にて記述したＤＮＡ構築物３μＭによるＰＢＭＣの刺激の結果を示している。
【００６１】
ホスホロチオエート修飾骨格を有するＤＮＡ構築物（ＯＤＮ２００６−２および３０Ｌ２１０）の使用は、ＩＦＦ−αおよびＩＰ−１０の刺激を導かない。驚くべきことに、本開示のＤＮＡ構築物（３０Ｌ２０４）は、欧州特許第１１９６１７８号明細書のすでに公知のダンベル型ＤＮＡ構築物（ｄＳＬＩＭ）と比較して、ＩＦＮ−αおよびＩＰ−１０が顕著に増強されたサイトカイン刺激を導く。
【００６２】
ＩＦＮ−αは、多年間、抗ウイルスサイトカインとして知られている。これは、Ｔｈ１細胞発生を刺激し、したがって、ＣＧ含有ＤＮＡ分子の効果を促進する。ＩＦＮ−αはまた、マウスおよびヒト悪性腫瘍中で抗腫瘍活性を示し、部分的に細胞障害性Ｔ細胞を活性化し、それによって腫瘍細胞の細胞崩壊可能性を増加させることによって、移植された腫瘍細胞の腫瘍原性を低減することができる。ＮＫ細胞とマクロファージの両方の活性がまた、抗腫瘍細胞毒性に対して重要であり、またＩＦＮ−αによって増加する（Ｂｒａｓｓａｒｄら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００２  ７１：５６５〜８１）。したがって、本開示のＤＮＡ構築物での刺激によりＩＦＮ−αの量を増加させることが、がんの治療に対して有益であることが予想される。
【００６３】
ＩＰ−１０は、インビボで強力な血管新生抑制性タンパク質であると最近実証されている。したがって、とりわけ腫瘍疾患の治療におけるＩＰ−１０の誘導も有利であるとみられる。
【００６４】
ＩＦＮ−γの刺激がまた、ｄＳＬＩＭと比較して、本開示のＤＮＡ構築物によって増加される。ＩＦＮ−γ刺激は、３０Ｌ２１０がまたその分泌を刺激するので、配列依存性であるように見られるが、３０Ｌ２１０が、重度の副作用を引き起こし得る、ホスホロチオエート骨格を有することに留意されたい。したがって、本開示のＤＮＡ構築物は、安全性の側面に関して有益である。
【００６５】
ＩＬ−８は、ホスホロチオエート骨格を有するＤＮＡ構築物（ＯＤＮ２００６−２；３０Ｌ２１０）の両方によって刺激される。したがって、観察された効果は、本修飾に対して推定され得る。本開示のＤＮＡ構築物は、ＩＬ−８産出を増加させず、有益である。
【００６６】
ＩＬ−８は、末梢血からの組織への好中球の活性化と移動を媒介すると知られている炎症誘発性サイトカインである。結果として得られる好中球浸潤が、卵巣がんに対して示されてきたように、腫瘍増殖の阻害に部分的に関与し得る（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：２７６９〜７５）。加えて、ＩＬ−８はまた、Ｔ細胞および好塩基球に対して走化性である。したがって、少なくとも一部の腫瘍型の治療または予防のために、ＣＧ含有ＤＮＡ構築物に応答してＩＬ−８を選択的にアップレギュレートすることが有利である。一方、ＩＬ−８が血管新生を誘発し、よってＩＬ−８分泌の誘導は逆効果であることが確立されてきた。したがって、本発明の異なるＤＮＡ分子による異なる程度のＩＬ−８誘導により、所望の治療効果に合わせて分子を作製することが可能になるであろう。
【００６７】
したがって、本開示のＤＮＡ構築物によって誘導された特定のサイトカインパターンは、異なる腫瘍型の治療および予防に有益である。明確に、非メチル化ＧＣモチーフがＤＮＡ構築物の構造を含むＴＬＲ９に包含される特定の事情が、応答している細胞中に誘導された個々それぞれの刺激パターンを決定する。
【００６８】
図３は、表１に列記したＤＮＡ構築物での単球の刺激を示している。本開示のＤＮＡ構築物は、ｄＳＬＩＭと、ホスホロチオエート保護直鎖オリゴＯＤＮ２００６−２と比較して、ＣＤ８６およびＣＤ１６９に関する単球の活性化を改善する。ＣＤ６９の最善の活性化は、ＮＫ細胞内であり、本発明のＤＮＡ構築物によっても達成される。
【００６９】
単球およびＮＫ細胞の活性化は、直鎖ＯＤＮ２００６に対して、おおよそ同等であるが、再び、このオリゴが、重度の副作用を引き起こし得るホスホロチオエート骨格を有することに留意されたい。
【００７０】
Ｂ細胞の活性化は、直鎖ＯＤＮ２００６−２と本開示のダンベル型ＤＮＡ構築物間でおおよそ同等である。２つのダンベル型ＤＮＡ構築物ｄＳＬＩＭと３０Ｌ２０４を比較することで、３０Ｌ２０４が驚くべきことに、ｄＳＬＩＭよりも強力な活性剤であることが示される。
【００７１】
結論として、本実験により、本開示のダンベル型ＤＮＡ構築物は予期せずに、既に公知のダンベル型ＤＮＡ構築物ｄＳＬＩＭと、直鎖オリゴデオキシヌクレオチドＯＤＮ２００６（ＰＲＯＭＵＮＥ（登録商標））よりも良好な免疫細胞の活性剤であることが示された。ホスホロチオエートなしでの、ＯＤＮ２００６のＤＮＡ配列の、ダンベル型直鎖ＤＮＡ構築物の一本鎖ループ内への導入が、免疫調節潜在性の改善を導くことは驚くべきことであった。
【００７２】
ＯＤＮ２００６（ＰｒｏＭｕｎｅ（登録商標））およびｄＳＬＩＭは両方とも、強力な免疫調節物として公知である。ｄＳＬＩＭの一本鎖ループ内へのホスホロチオエートＯＤＮ２００６の導入は、効率的な免疫調節剤をもたらさない（図１のＩＦＮ−αおよびＩＰ−１０を比較のこと）。一本鎖ループ内にホスホジエステル結合を有する、ＯＤＮ２００６の配列を有する本開示のＤＮＡ構築物は、効果を有する新規構築物をもたらし、ＯＤＮ２００６およびｄＳＬＩＭの効果の単なる加算を越えている。したがって、本開示のＤＮＡ構築物は、ＮＫ、ＮＫＴおよび細胞障害性Ｔ細胞応答の鍵となる活性化因子である、中心抗がんサイトカインＩＦＮ−α、強力な血管新生抑制性サイトカインＩＰ−１０、またはＩＦＮ−γのサイトカイン分泌を増加させることによって、がんまたは自己免疫疾患の治療のために使用することができる、新規ＴＬＲ−９アゴニストであると結論付けなければならない。
【００７３】
本開示のＤＮＡ構築物が、ｐＤＣのＣＤ８０、Ｂ細胞のＣＤ８６、単球のＣＤ８６およびＣＤ１６９、ＮＫ、ＮＫＴならびにＴ細胞のＣＤ６９を含むＰＢＭＣの関連細胞亜集団の活性化表面マーカーの強力なアップレギュレーターであるということを示すことも可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月25日(2015.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的にハイブリッド形成する配列番号１のＤＮＡ配列を２つ含んでなる、部分的に一本鎖のダンベル型をした、共有結合により閉じたＤＮＡ残基鎖からなる、免疫調節のためのＤＮＡ構築物。
【請求項２】
一本鎖ループが、４つのＣＧモチーフを含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
各ＣＧモチーフの両側に、デオキシチミジンが隣接する、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
一本鎖ループが、少なくとも５０％のピリミジン含量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５】
ピリミジンがデオキシチミジンを含む、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
少なくとも１つヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基を含む群から選択される官能基で修飾されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項７】
修飾ヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、脂質、ミセル、ベシクル、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子を含む群から選択される化合物、または固相に連結している、請求項５に記載の構築物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む医薬組成物。
【請求項９】
化学療法剤をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むワクチン。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ構築物が、アジュバントとして含まれる、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
がんまたは自己免疫疾患の治療又は予防のための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載のワクチンの使用。
【請求項１３】
免疫系の調節のための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載のワクチンの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月28日(2015.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
本開示によれば、１または複数のＣＧモチーフは、構築物の一本鎖領域内に局在する。欧州特許第１１９６１７８号明細書に開示されたように、ＣＧモチーフは、分子の一本鎖領域内に含まれようと、二本鎖領域内に含まれようと、免疫応答を誘発可能である。
【国際調査報告】
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