(57)【要約】本発明は、広範囲の体液および組織におけるバイオマーカーの、高い特異性および効率を有するインビボおよび／またはインビトロでの検出を可能にする診断デバイスを提供する。診断デバイスは、体液中に存在するバイオマーカーに特異的に結合する、金属性担体、半導体担体またはポリマー担体を含む基体にリンカー化合物または層により連結させた結合剤から構成される。本発明はさらに、バイオマーカーの検出のために該デバイスを使用する方法、ならびに該デバイスおよび体液中のバイオマーカーの検出に適した成分を含むキットを提供する。さらに本発明は、特定の疾患関連標的構造の検出に適した、インビボおよびインビトロでの該結合剤の適用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式I：
A-L-B
を有する組成物を含み、
式中、
Aが、バイオマーカーに特異的に結合する結合剤であり、かつ酵素阻害剤であり；
Lがリンカーであり；かつ
Bが、金属性担体、半導体担体、またはポリマー担体を含む基体である、
流体または組織中のバイオマーカーのインビボおよび／またはインビトロでの検出のための診断デバイス。
【請求項２】
バイオマーカーが、体液中の循環腫瘍細胞(CTC)に存在する標的構造を有する、請求項1記載の診断デバイス。
【請求項３】
標的構造が、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIである、請求項1または2記載の診断デバイス。
【請求項４】
Aが疾患に関連した標的構造を有する、請求項1から3のいずれか一項記載の診断デバイス。
【請求項５】
疾患が癌または感染である、請求項4記載の診断デバイス。
【請求項６】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIの酵素活性の阻害が可逆的である、請求項3記載の診断デバイス。
【請求項７】
Aが以下の構造式II：
2016531297.tif 000015
を有し、
式中、
Xが結合、NHまたはOであり、
R1、R2、R3、R4およびR5が、水素  アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、炭酸エステル、カルボキシラート、カルボキシル、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、オルト炭酸エステル、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、4°アンモニウムイオン、第一級ケタミン、第二級ケタミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ(ジイミド)、シアナート、イソシアナート、ニトラート、ニトリル、イソニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、スルフヒドリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフィニル、スフホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアナート、イソチオシアナート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスファート、ボロノ、ボロナート、ボリノ、およびボリナートからなる群より独立して選択される、
請求項1から6のいずれか一項記載の診断デバイス。
【請求項８】
R1またはR2が、Lに共有結合または非共有結合される基である、請求項7記載の診断デバイス。
【請求項９】
Aが以下の構造式III：
2016531297.tif 000016
を有する、請求項7または8記載の診断デバイス。
【請求項１０】
Lが、ポリマー、タンパク質、好ましくは、アルギナートまたはヒドロゲルである、請求項1から9のいずれか一項記載の診断デバイス。
【請求項１１】
Aが、検出可能なマーカーまたは薬物にコンジュゲートされている、請求項1から10のいずれか一項記載の診断デバイス。
【請求項１２】
検出可能なマーカーまたは薬物が、蛍光色素、化学発光色素、放射性トレーサまたは抗癌薬である、請求項1から11のいずれか一項記載の診断デバイス。
【請求項１３】
(a)式IIもしくはIIIの結合剤または請求項1から12のいずれか一項記載の診断デバイスを、体液試料または組織と接触させる段階と；
(b)Aを該体液または組織中のバイオマーカーに結合させる段階と；
(c)Aの存在を検出する段階と
を含む、流体または組織中のバイオマーカーを検出するための方法。
【請求項１４】
(a)請求項1から12のいずれか一項記載の診断デバイスと、
(b)その使用のための説明書と
を含む、流体または組織中の疾患関連バイオマーカーを検出するためのキット。
【請求項１５】
特定の疾患関連標的構造の検出のための、式IIもしくはIIIの結合剤または請求項1から12のいずれか一項記載の診断デバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーに特異的に結合する結合剤と、リンカー化合物と、金属性担体、半導体担体またはポリマー担体から構成される基体とを含む、流体または組織中のバイオマーカーのインビボおよび／またはインビトロでの検出のための診断デバイスに関し、該結合剤は酵素阻害剤である。本発明はさらに、本発明の診断デバイスを用いる流体または組織中のバイオマーカーを検出するための方法、ならびに本発明の診断デバイスを含む疾患関連バイオマーカー検出用キットにも関する。本発明はさらに、特定の疾患関連標的構造の検出のための前記結合剤の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
特定の細胞型、小分子、細菌およびウイルスなどの多くのバイオマーカーが、ヒト体液中に存在する。しかしながら、その濃度の低さのため、それらは公知の濃縮法の使用により効率的に検出することができず、そのため、それらは、臨床化学、病理学および細胞診断学において確立された検出方法など従来の診断方法に使用することができない。
【０００３】
バイオマーカー、例えば、血液試料中に存在する循環腫瘍細胞は、免疫細胞化学的なアプローチを用いる市販の方法によりインビトロで検出される。CKまたはEpCAMなどの上皮抗原に特異的な抗体は一般に、擬陽性および偽陰性染色の比率の変わりやすさにもかかわらず、上皮腫瘍細胞検出で最も広く用いられているマーカーである。例えば、正常な対照におけるCK陽性細胞の割合は、非腫瘍細胞の非特異的結合の事例または循環上皮細胞への特異的結合の事例において0から20％の範囲であり、それらは体内の外傷または炎症が原因で存在する。非特異的結合のために、特異性は限定され、バイオマーカーの検出のために必要な試料量は非常に多くなる。さらに、抗体に基づく技術は、検出に必要な抗体を調製するのに高いコストを伴う。
【０００４】
抗体に基づく技術のさらなる欠点は、細胞に極めて有害な厳しい条件(高い塩条件、熱、pH値に関して)下でのみ抗体は抗原から除去できることである。これに対して、本発明の結合剤は、通常の条件下で高い濃度で容易に分離され、それによって、リンカーに結合した結合剤が放出されうる。そのために、これらの技術は、バイオマーカーのインビトロでの検出にはあまり適していない。
【０００５】
したがって、当技術分野において公知の検出デバイスおよび方法の欠点を有さない代替の診断デバイスが必要である。
【０００６】
本発明の目的は、体液中の希少なバイオマーカーを検出するだけでなく、感染または癌などの疾患に特異的な様々な標的構造の診断に適した、基体上でのバイオマーカーの結合および／または濃縮の効率的な手段も提供する検出デバイスを提供することである。
【０００７】
抗体に基づく検出方法と比較して、有機合成により調製された結合剤を含む本発明の診断デバイスのコストはより低くなることが想定される。具体的には、本発明の結合剤は、産業規模でより効率的に調製できる。さらに、本発明のシステムの特異性は、リンカーにより提供される結合部位はたった一つであることに起因して向上する。阻害剤などの小分子は、免疫系により検出されず、そのために、体内に投与されるときに副作用の危険性はより低い。
【発明の概要】
【０００８】
下記および添付の特許請求の範囲において特徴づけられた態様により、上記技術的課題に対する解決方法が達成される。
【０００９】
第1の態様において、本発明は、下記式：
A-L-B
を有する組成物を含む、流体または組織中のバイオマーカーのインビボまたはインビトロでの検出のための診断デバイスに関し、
式中、Aは該バイオマーカーに特異的に結合する結合剤であり；Lはリンカーであり；およびBは金属性担体、半導体担体、またはポリマー担体を含む基体である。好ましい態様において、Aは、本明細書において以下に定義されるような酵素阻害剤である。
【００１０】
別の態様において、本明細書に記載のバイオマーカーは、タンパク質、クオラムセンシング分子、毒素、脂質、炭水化物、核酸、小分子、薬物、細菌、ウイルスまたは真核細胞に存在する標的構造を有しうる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーが体液中の循環腫瘍細胞(CTC)に存在する標的構造を有している、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００１２】
別の態様において、標的構造はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIである。
【００１３】
本発明はさらに、結合剤Aが疾患に関連した標的構造を有する、本明細書に記載の診断デバイスを対象とする。好ましくは、疾患は癌または感染である。
【００１４】
本発明の診断デバイスのさらなる態様において、Aはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIの酵素活性の阻害剤である。好ましくは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIの酵素活性の阻害は可逆的である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、Aが以下の構造式II：
2016531297.tif 000002
を有する、本明細書に記載の診断デバイスに関し、
式中、Xは結合、NHまたはOであり、
R1、R2、R3、R4およびR5は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、炭酸エステル、カルボキシラート、カルボキシル、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、オルト炭酸エステル、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、4°アンモニウムイオン、第一級ケタミン、第二級ケタミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ(ジイミド)、シアナート、イソシアナート、ニトラート、ニトリル、イソニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、スルフヒドリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフィニル、スフホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアナート、イソチオシアナート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスファート、ボロノ、ボロナート、ボリノ、およびボリナートからなる群より独立して選択される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、本明細書に定義されているR1またはR2がLに共有結合または非共有結合した基である、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００１７】
本発明の好ましい態様は、Aが以下の構造式III：
2016531297.tif 000003
を有する、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明の診断デバイスのリンカー化合物Lは、ポリマー、タンパク質、好ましくは、アルギナートまたはヒドロゲルである。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、結合剤Aは、検出可能なマーカー、好ましくは蛍光色素または化学発光色素もしくは放射性トレーサにコンジュゲートされるか；または結合剤Aは薬物にコンジュゲートされる。好ましくは、薬物は抗癌薬である。
【００２０】
別の態様において、本発明の診断デバイスは、金属性担体を含む基体(本明細書においてBと表記)を含む。好ましくは、金属性担体はステンレス鋼から構成される。
【００２１】
さらなる態様において、本発明の診断デバイスは、基体B上に構築された中間層を含む。好ましくは、中間層は、金、プラチナまたは銀のような貴金属から構成される。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、(a)式IIもしくはIIIの結合剤または本発明の診断デバイスを体液試料または組織と接触させる段階；(b)Aを該体液または組織中のバイオマーカーに結合させる段階；および(c)Aの存在を検出する段階を含む、流体または組織中のバイオマーカーを検出するための方法に関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、(a)本発明の診断デバイス、および(b)その使用のための説明書を含む、流体または組織中の疾患関連バイオマーカーを検出するためのキットに関する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、特定の疾患関連標的構造の検出のための、式IIもしくはIIIの結合剤または本発明の診断デバイスの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】競合阻害による阻害剤候補の酵素との相互作用の略図を示す。
【図２】例示的阻害剤の合成プロトコールの概略を示す。
【図３】フルオレセインイソチオシアナート(FITC)に連結させた結合剤の例を示す。
【図４】本発明の診断デバイスの略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
第1の態様において、本発明は、下記式I：
A-L-B
を有する組成物を含む、流体または組織中のバイオマーカーのインビボおよび／またはインビトロでの検出のための診断デバイスに関し、
式中、Aは該バイオマーカーに特異的に結合する結合剤であり、該結合剤は酵素阻害剤であり；Lはリンカーであり；およびBは金属性担体、半導体担体、またはポリマー担体を含む基体である。
【００２７】
本明細書で用いられる「診断デバイス」という用語は、例えば、臨床化学、病理学および細胞診断学における、バイオマーカーの診断または検出のために用いられるデバイスを指す。例えば、本発明の診断デバイスは、臨床分析器、携帯型バッテリー式計量器、自己実施アッセイデバイス、ポイントオブケア分析器、ポイントオブケア計量器、ポイントオブプレゼント(point of present)分析器、ポイントオブプレゼント計量器等を含み、初期危険評価(前兆および早期疾患の同定)、予後、治療選択、疾患または状態のモニタリングおよび管理、集団遺伝学のスクリーニングおよびモニタリング、薬理ゲノミクス診断学、疫学的調査およびモニタリング、臨床試験モニタリング、ならびに症候群のサーベイランスのために用いられうる。
【００２８】
本明細書で用いられる「バイオマーカー」という用語は、標的構造を有する物質、好ましくは、生体分子または患者の体液中に存在する物質を指す。バイオマーカーの例は、ペプチド、タンパク質、クオラムセンシング分子、毒素、脂質、炭水化物、核酸、小分子、薬物、細菌、ウイルス、真核細胞である。
【００２９】
本明細書で用いられる「標的構造」という用語は、本発明の診断デバイスに付着させた結合剤に結合することが望ましい、例えば患者の体液中の、顕微鏡的な構造または超顕微鏡的な構造を指す。本明細書で用いられる「標的構造」という用語は、細胞全体を表す可能性があるが、より具体的には、生体細胞内、細胞膜上、細胞間隙中、または血液またはリンパ液などの体液中に位置する、細胞の構造、すなわち、タンパク質、ヌクレオチド鎖、炭水化物または脂質などの有機分子を意味する。「細胞構造」という用語はまた、細胞またはウイルスなどのより大きな構造も同時に意味する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、バイオマーカーが、ペプチド、タンパク質、クオラムセンシング分子、毒素、脂質、炭水化物、核酸、小分子、薬物、細菌、ウイルスまたは真核生物；例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、上皮成長因子受容体(EGFR)、前立腺特異抗原(PSA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、大腸菌(Escherichia coli)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、シュードモナス属種(Pseudomonas spec.)、パピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ホモセリンラクトン、テトラヒドロカンナビノール(THC)、循環腫瘍細胞(CTC)に存在する標的構造を有する、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーが体液中の循環腫瘍細胞(CTC)上に存在する標的構造を有する、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００３２】
本明細書で用いられる「循環腫瘍細胞またはCTC」という用語は、対象から得られた試料中に認められる任意の循環癌細胞を指す。典型的には、CTCは、固形腫瘍からはがれ落ちている。したがって、CTCは多くの場合、進行癌を有する患者の循環中に非常に低い濃度で認められる、固形癌からはがれ落ちた上皮細胞である。CTCはまた、肉腫由来の中皮細胞またはメラノーマ由来のメラニン細胞である場合もある。
【００３３】
本明細書で用いられる「体液」という用語は、唾液、痰、血清、血漿、血液、尿、粘液、胃液、膵液、精液、乳汁分泌もしくは月経の産物、涙、またはリンパ液など動物またはヒトから天然に生じる液体を意味することが意図される。
【００３４】
本明細書で用いられる「標的構造」は、標的モチーフのフォールディングによって形成される三次元構造に基づき配列が選択される、合理的に選択された任意の配列または配列の組み合わせを指す。当技術分野において公知の多種多様な標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフには、これらに限定されないが、酵素活性部位およびシグナル配列が含まれる。核酸標的モチーフには、これらに限定されないが、プロモーター配列、シスエレメント、ヘアピン構造および誘導性発現因子(タンパク質結合配列)が含まれる。
【００３５】
別の態様において、標的構造は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIまたはその断片である。好ましくは、標的構造は、EC 3.4.17.21-グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIまたはその断片である。EC 3.4.17.21-グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をSEQ ID NO:1および2として示す。
【００３６】
本発明はさらに、結合剤Aが疾患に関連した標的構造を有する、本明細書に記載の診断デバイスを対象とする。好ましい態様において、疾患は癌または感染である。
【００３７】
本明細書で用いられる「癌」という用語は、対象における転移性および／または非転移性の癌、特に固形腫瘍癌を指し、原発性癌および続発性癌を含む。癌への言及には癌細胞への言及が含まれる。本明細書で用いられる「固形腫瘍癌」という用語は、癌細胞で構成される1つまたは複数の固形腫瘍をもたらす癌を指し、例えば、肺癌、脳(神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫)、肝臓、甲状腺、骨、副腎、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵臓、結腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、および食道を含む。
【００３８】
本明細書で用いられる「感染」という用語は、対象の侵襲を指す。この用語は、対象の体内またはその上に通常存在する微生物の過剰な増殖を包含する。より一般的には、微生物感染は、微生物集団の存在が宿主生物(対象)にダメージを与えている任意の状況でありうる。よって、過剰数の微生物集団が生物の体の中もしくはその上に存在するとき、または微生物集団の存在の影響が生物の細胞もしくは他の組織にダメージを与えるときに、生物は微生物感染を「患って」いる。
【００３９】
本明細書で用いられる「対象」は、予測的および早期疾患の同定などの診断が意図される個体である。本明細書において対象となる対象には、植物、動物またはヒト；好ましくはヒトが含まれる。
【００４０】
別の態様において、本発明の結合剤Aは阻害剤、好ましくは酵素阻害剤である。本明細書で用いられる「阻害剤」は、バイオマーカーの内部またはその表面上の活性部位またはその他の部位に結合し、それによってその活性を遮断する化合物を指す。
【００４１】
本明細書で用いられる「酵素阻害剤」という用語は、酵素への結合を通じて酵素活性を低下させる分子を指す。酵素阻害剤は、酵素の内部またはその表面上の活性部位またはその他の部位に結合し、それによって、酵素の基質との相互作用を遮断する。酵素阻害剤は、可逆的にまたは不可逆的に酵素に結合しうる。好ましくは、本発明の阻害剤は可逆的に結合する。
【００４２】
本明細書で用いられる「可逆的」という用語は、元の(「結合していない」)状態に戻ることができることを意味する。本明細書で用いられる「可逆的阻害」という用語は、標的分子(バイオマーカー)の活性を阻害する能力を結合剤が維持する阻害作用を意味する。
2016531297.tif 000004
【００４３】
図1は、E＝酵素、I＝阻害剤、S＝天然の基質であり、それぞれ競合阻害(左)、アロステリック阻害(右)による、酵素に対する実現可能な阻害剤の結合可能性を簡略化したものである。
【００４４】
本発明の結合剤Aは、以下に定義する酵素活性のいかなる種類の可逆的または不可逆的な阻害剤であってもよい。好ましくは、本発明の結合剤は、可逆的に酵素の活性を阻害する。
【００４５】
可逆的阻害剤の種類
可逆的阻害剤は、水素結合、疎水性相互作用およびイオン結合などの非共有相互作用によって酵素に結合する。阻害剤と活性部位との間の複数の弱い結合が組み合わされて、強く特異的な結合を生じる。基質および不可逆的阻害剤とは対照的に、可逆的阻害剤は概して、酵素に結合しているときに化学反応の影響を受けず、希釈または透析により容易に除去することができる。
【００４６】
4種類の可逆的阻害剤が存在する。それらは、阻害剤に対する酵素の基質の濃度を変化させることの影響によって分類される。
a. 競合阻害では、図の左側に示すように、基質および阻害剤は同時に酵素に結合することはできない。これは通常、基質も結合する酵素の活性部位に対して親和性を有する阻害剤によって生じ；基質および阻害剤は酵素の活性部位へのアクセスについて競合する。この種類の阻害は、十分に高い濃度の基質(Vmaxが一定である)により、すなわち、阻害剤を上回ることにより克服することができる。しかしながら、それはKm値、すなわちVmaxの半分に達するためにより高い濃度の基質を要することから、見かけのKmは上昇する。競合的阻害剤は多くの場合、実際の基質に構造が類似する(以下の実施例を参照)。
b. 不競合阻害では、阻害剤は、基質-酵素複合体にのみ結合し、非競合的阻害剤と混同されるべきではない。この種類の阻害は、Vmaxの低下(最大反応速度は活性化された複合体の除去の結果として低下する)、およびKmの低下(ルシャトリエの原理およびES複合体の効果的な排除の結果としてのより優れた結合効率のためにKmが低下し、これはより高い結合親和性を示す)をもたらす。
c. 混合型阻害では、阻害剤は、酵素の基質と同時に酵素に結合できる。しかしながら、阻害剤の結合は、基質の結合に影響を与え、その逆もまた同様である。この種類の阻害は、基質の濃度の上昇により減少させることができるが、克服はできない。混合型阻害剤は、活性部位に結合することが可能だが、この種類の阻害は概して、阻害剤が酵素上の異なる部位に結合するアロステリック効果に起因する。このアロステリック部位に結合する阻害剤は、酵素の立体構造(すなわち、三次構造または三次元の形状)を変化させ、活性部位に対する基質の親和性を低下させる。
d. 非競合阻害は、阻害剤の酵素への結合がその活性を低下させるが、基質の結合に影響しない混合阻害の一形態である。結果として、阻害の程度は、阻害剤の濃度にのみ依存する。実際の基質の結合は当然のことながら、依然として適正に機能していることから、  Vmaxは反応が効率的に進行できないために減少するが、Kmは同じままである。
【００４７】
不可逆的阻害の種類
不可逆的阻害剤は通常、酵素を共有結合的に改変し、そのために、阻害は元に戻すことができない。不可逆的阻害剤は多くの場合、ナイトロジェンマスタード、アルデヒド、ハロアルカン、アルケン、マイケル供与体、スルホン酸フェニル、またはフルオロホスホン酸などの反応性官能基を含有する。これらの求電子基は、アミノ酸側鎖と反応し、共有結合付加体を形成する。この改変された残基は、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基などの求核基を含有する側鎖を有する残基であり；これらには、アミノ酸セリン、システイン、スレオニンまたはチロシンが含まれる。
【００４８】
不可逆的阻害は、不可逆的な酵素不活性化とは異なっている。不可逆的阻害剤は一般に、1つのクラスの酵素に特異的であり、全てのタンパク質を不活性化するわけではなく；タンパク質構造を破壊することではなく、それらの標的の活性部位を特異的に変化させることにより機能する。例えば、極端なpHまたは温度は通常、全てのタンパク質構造の変性をもたらすが、これは非特異的作用である。同様に、一部の非特異的化学処理はタンパク質構造を破壊する；例えば、濃塩酸中での加熱は、ペプチド結合を保持するタンパク質を加水分解すると共に、遊離アミノ酸を放出する。
【００４９】
不可逆的阻害剤は時間依存的な阻害を示し、そのために、その効力はIC50値により特徴づけることができない。これは、不可逆的阻害剤の所与の濃度における活性な酵素の量は、阻害剤が酵素とプレインキュベートされる長さによって異なるためである。
【００５０】
阻害剤の例を以下の表1に示す。
【００５１】
【表１】
2016531297.tif 000005
【００５２】
半数阻害濃度(IC50)は、生物活性を阻害する際の化合物の有効度を測定するために用いられる。可逆的阻害の可能性を評価するために、阻害剤候補からIC50値を得て、当技術分野において周知の競合結合アッセイを行う。IC50値は本質的に、いかなるインキュベーション時間でも同じはずである。
【００５３】
本発明の診断デバイスのさらなる態様において、結合剤Aは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIの酵素活性の阻害剤である。好ましくは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼIIの酵素活性の阻害は可逆的である。
【００５４】
別の態様において、本発明は、Aが以下の構造式II：
2016531297.tif 000006
を有する、本明細書中に記載の診断デバイスに関し、
式中、Xは結合、NHまたはOであり、
R1, R2, R3, R4およびR5は、水素 アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、炭酸エステル、カルボキシラート、カルボキシル、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、オルト炭酸エステル、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、4° アンモニウムイオン、第一級ケタミン、第二級ケタミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ(ジイミド)、シアナート、イソシアナート、ニトラート、ニトリル、イソニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、スルフヒドリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフィニル、スフホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアナート、イソチオシアナート、カルボノチオイル、ホスフィン、ホスホノ、ホスファート、ボロノ、ボロナート、ボリノ、およびボリナートからなる群より独立して選択される。
【００５５】
R1, R2, R3, R4およびR5は、阻害活性に対して負の影響を有していない限り、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはハロなどの1つまたは複数の化学基で置換されなくても置換されてもよい。
【００５６】
好ましくは、式II中のR1および／またはR2は、リンカー分子Lにより置換されるかまたはそれに結合する。
【００５７】
本明細書で用いられる「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、その範囲内に直鎖、分岐鎖および環状部分を含む。「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、1つまたは複数の不飽和結合を含むことが意図される。好ましくは、「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」は、「C1-6-アルキル」基、「C2-6-アルケニル」基および「C2-6-アルキニル」基である。
【００５８】
別の態様において、本発明は、本明細書で定義されるR1またはR2がLに共有結合的にまたは非共有結合的に結合された基である、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００５９】
本発明の好ましい態様は、Aが以下の構造式III：
2016531297.tif 000007
を有する、本明細書に記載の診断デバイスに関する。
【００６０】
本明細書に記載の結合剤Aは、種々の戦略を用いるリンカー技術により直接的にまたは間接的に基体に結合されうる。好ましくは、式III中の窒素が結合した水素は、リンカー分子Lにより置換されるかそれに結合する。
【００６１】
結合剤Aは、接着、静電的相互作用、化学的結合、共有結合または非共有結合により基体に結合されうる。これらの戦略には、標準的なストレプトアビジン-ビオチン相互作用が含まれる。それには、接着または静電的相互作用を介する、IgG のような(モノクローナル)抗体またはその断片の基体への直接結合も含まれる。加えて、酵素、抗体もしくはその断片、核酸、ペプチドまたは糖ペプチドのような標的特異的分子構造の共有結合は、以下に詳述するリンカー技術を用いて行うことができる。最近の技術によって、標的構造の基体への正確な結合が可能になり、ナノメートルスケールでの空間分解能がもたらされ、それにより、濃度および空間分布に関する正確なリアルタイムの情報が提供される。
【００６２】
好ましくは、Aは、リンカー技術により、例えば、アルギナート、ヒドロゲル(例えば、Xantecヒドロゲル)、またはビオチン／ストレプトアビジンなどのポリマー構造またはタンパク質構造を介して、基体に間接的に結合する。
【００６３】
さらなる態様において、本発明の診断デバイスのリンカー化合物Lは、ポリマー、タンパク質、好ましくは、アルギナートまたはヒドロゲルである。
【００６４】
本発明のさらなる態様によると、結合剤Aは、検出可能なマーカー、好ましくは、蛍光色素もしくは化学発光色素もしくは放射性トレーサにコンジュゲートされるか、または結合剤Aは薬物にコンジュゲートされる。好ましくは、薬物は抗癌薬である。
【００６５】
本明細書で用いられる「検出可能なマーカー」という用語には、これらに限定されないが、発色団、酵素、その切断産物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物、ならびにこれらのマーカーの誘導体および／または組み合わせが含まれる。提供した実施例では、ビオチン-アビジンを用いた。任意のマーカーによる標識は、最適な検出および結合剤の結合を得るための条件下で行われる。
【００６６】
結合剤は、シグナル伝達物質に連結させることができる。
【００６７】
シグナル伝達物質の例は、フルオロフォアのグループに由来しうる。フルオロフォア分子は、単独で利用されるか、または機能システムの蛍光モチーフとして機能することができる。分子の複雑度および合成方法に基づき、フルオロフォア分子は概して、4種類のカテゴリー：タンパク質およびペプチド、小有機化合物、合成オリゴマーおよびポリマー、ならびに多成分系に分類することができる。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、YFP(黄色蛍光タンパク質)およびRFP(赤色蛍光タンパク質)でありうる。非タンパク質有機フルオロフォアは、以下の主要な化学ファミリーに属する：フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、およびテキサスレッドのようなキサンテン誘導体；シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、およびメロシアニンのようなシアニン誘導体；ナフタレン誘導体(ダンシル誘導体およびプロダン誘導体)；クマリン誘導体；ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾールのようなオキサジアゾール誘導体；カスケードブルー等のようなピレン誘導体；ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン170等のようなオキサジン誘導体；プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー等のようなアクリジン誘導体；オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンのようなアリールメチン(Arylmethine)誘導体；ポルフィン、フタロシアニンおよびビリルビンのようなテトラピロール誘導体。さらなるシグナル伝達物質は、量子ドットのような半導体のグループに由来しうる。
【００６８】
他のシグナル伝達物質は、磁気共鳴画像法(MRI)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)およびポジトロン放出断層撮影法(PET)などの非侵襲的分子画像技術のためのものでありうる、放射性トレーサまたは高ペイロードMRI造影剤でありうる。典型的な同位元素には、11C、13N、15O、18F、64Cu、62Cu、124I、76Br、82Rb、68Ga、99mTc、111In、123Iおよび201Tlが含まれる。
【００６９】
さらに、結合剤に連結させた西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)のような酵素もシグナル伝達物質として用いることができる。
【００７０】
別の態様において、本発明の診断デバイスは、金属性担体を含む基体(本明細書においてBと表記)を含む。好ましくは、金属性担体はステンレス鋼から構成される。本発明のデバイスの基体は、ステンレス鋼などの金属、シリコンもしくは生体適合性ポリマーなどのポリマー、またはガラスで作られた平面状または非平面状の基体であってもよく、一般に、透明、不透明、導電性、半導性、または非導電性であることができる。基体は、センサーのインビボでの適用のために生体適合性であることができる。
【００７１】
さらなる態様において、本発明の診断デバイスは、基体B上に構築された中間層を含む。好ましくは、中間層は、金、プラチナまたは銀のような貴金属で構成される。好ましくは、基体は、金属、好ましくは元素周期表の第10属または第11属の金属、国際公開公報第WO 2006/131400 A1号に記載された好ましい金属で構成された中間層を含む。一方で、基体は、ポリマー層などさらなる層を含んでもよい。
【００７２】
したがって、診断デバイスは、以下の特性を有する基体B上に構築された第2層をさらに含んでもよい。第2層は、ポリマー層として形成され、好ましくはヒドロゲルで構成される。第2層は、結合剤、例えば、式IIまたはIIIで定義された阻害剤の結合を促進する。ポリマー層は、表面積の増大により、標的分子または細胞の濃縮を促進する。第2層は、本明細書の上記で定義した検出可能な化合物など、結合剤の共有結合のための官能基をさらに含有してもよい。第2層は、標的分子または細胞の定量的検出および産生を促進するために切断産物を検出することができる酵素反応性化合物をさらに含有してもよい。第2層は、非特異細胞の結合および体液との望ましくない相互作用を妨げるマトリックスとして機能してもよい。結合剤、例えば、式IIまたはIIIで定義された阻害剤は、該中間層に共有結合してもよい。
【００７３】
診断デバイスの効率を改善するために、特定の表面構造を用いることにより、機能性表面積(結合剤への効率的な結合のために機能化される)または基体それ自体の表面積を増大させてもよい。表面構造には、隆線、くぼみ、隆起部、エッジまたは溝が含まれてもよく、また、円筒形、球形、円錐形、またはピラミッド形のものであってもよい。
【００７４】
さらなる例示的基体およびこれと同じのものを作製するための方法は、国際公開公報第WO 2010/145824 A1号、同第WO 2011/113584 A1号、および欧州特許第EP 1811302 B1号において見いだすことができる。本発明のデバイスを調製する例示的アプローチを以下の実施例のセクションにおいて示す。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、(a)式IIもしくはIIIの結合剤または該結合剤を含む本発明の診断デバイスを体液試料と接触させる段階；(b)Aを体液中のバイオマーカーに結合させる段階；および(c)Aの存在を検出し、それによってAに結合した結合バイオマーカーに直接的にまたは間接的に結合するバイオマーカーを検出する段階を含む、流体または組織中のバイオマーカーを検出するための方法に関する。例えば、PSMAは、結合剤(A)として機能する阻害剤に結合する。PSMAが細胞の一部であるという事実を踏まえると、PSMAではない細胞の他の部分もまた、検出されうる。本発明の基体を調製するためのインビボでの適用およびインビトロでの適用のための例示的アプローチを以下の実施例のセクションにおいて示す。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、(a)本発明の診断デバイス、および(b)その使用のための説明書を含む、流体または組織中の疾患関連バイオマーカーを検出または捕捉するためのキットに関する。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、特定の疾患関連標的構造の検出のための結合剤を含む、式IIもしくはIIIの結合剤または本発明の診断デバイスの使用に関する。別の態様において、本発明は、特定の疾患関連標的構造の単離のための式IIまたはIIIの結合剤の使用に関する。
【実施例】
【００７８】
本発明を実施する最良の形態
実施例1：診断デバイスの作製
診断デバイスの作製は、別々だが相互に関連する4つの手順により行われる。第1段階は結合剤の作製であり、第2段階は基体の作製であり、第3段階は、リンカー技術により基体に直接的または間接的に結合させる本発明の結合剤を用いて、基体を機能化する段階であり、任意で、結合剤に結合したバイオ分子は取り除かれる。例えば、基体は、平面状、非平面状、透明または不透明な表面上にナノパターン化された金属、半導体および/または磁気島のようなナノ構造を堆積させることにより作製され、ここで、ナノ構造は表面上に分布し、続いて、結合剤がナノ構造に結合し、図1に図式的に示されるようなデバイスを提供する。
【００７９】
A. 結合剤の作製
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図2 合成プロトコールの概略図
【００８０】
生成物1（C20H20O4; 324.36 g/mol）
2016531297.tif 000009
20 gのベンジルアクリル酸(0.12 mol)をアルゴン雰囲気下で熱引きしたフラスコ内に置き、次いで、100℃に加熱した。熱源を取り除き、0.4 g(0.45 ml；2.14 mmol)トリス(ジメチルアミノ)ホスフィンを溶液に滴下し、それによって、反応混合物を115℃に加熱した。結果として生じた黄色の溶液を室温に冷却した。続いて、75 mlのシリカゲルパルプ(ヘキサン：酢酸エチル 5：1)を添加した。混合物を乾燥シリカゲル上に置き、ヘキサン／エタール アセタート 1:1で洗った。エバポレーターの使用により溶液を取り除き、減少した無色の液体を凍結乾燥により一晩乾燥させた。生成物1の生成物収量は、82％の収率に相当する、15.97 g(0.049 mol)であった。
(合成は、P.F. Jackson et al, Design and pharmacological activity of phosphinic acid based NAALADase inhibitors, J. Med. Chem. 2001, 44, 4170-4175と同様であった。)
【００８１】
生成物2（C20H23O6P; 390.29 g/mol）
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加熱したフラスコ中で、次亜リン酸アンモニウム(12.86 g、0.155 mol)の懸濁液をジクロロメタン(245 ml)中で調製した。この懸濁液にトリメチルシリルジロリド(44.54 g；0.41 mol；51.8 ml)およびトリエチルアミン(37.64 g；0.37 mol；51.6 ml)を添加し、それによって、温度を10℃未満に留めた。この混合物を3〜9℃で30分間撹拌した。その後、生成物2(10 g；0.031 mol、10.2 ml DCMで溶解)を10℃未満の温度で加えた。溶液を室温に温め、20.5 時間撹拌した。次に、3 N HCl(112 ml)を注意深く添加し、それによって温度を25℃未満に維持することにより、反応を停止させた。有機相を3 N HCl(55 ml毎)で4回およびH2O(55 ml毎)で4回洗った。溶媒をロータリーエバポレーターから取り除き、混合物を凍結乾燥システムで一晩乾燥させた。結果は、81％の収率に相当する、9.866 g(0.0253 mol)の濁った無色かつ粘性の液体であった。
(合成は次に従う：D. Vitharana et al, Synthesis and biological evaluation of (R)- and (S)-2-(phosphonomethyl) pentanedioic acids as inhibitors of glutamate carboxypeptidase II, Tetrahedron Assymetry 2002, 13, 1609-1614。)
【００８２】
生成物3（C23H31O5N2P; 446.41 g/mol）
2016531297.tif 000011
生成物2(4.64 g、11.9 mmol)をDMF(23.8 ml (2 ml/mmol))で溶解し、アルゴン雰囲気下の氷浴中で30分間、ジアミノプロパン(1.99 ml、23.8 mmol)と共に撹拌した。その後、DMAP(0.279 g、2.38 mmol)およびDCC(2.27 g、11.9 mmol)を溶液に添加し、アルゴン雰囲気下の室温で2.5時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターから取り除いた。次に、9/1の比率のDCM/MeOHによるカラムクロマトグラフィー処理を行った。最終段階において、生成物3を凍結乾燥した。ここで、結果は、84％の収率に相当する、4.562 g(0.010 mol)の黄色固形油であった。
【００８３】
生成物4（C23H31O6N2P; 462.47 g/mol）
2016531297.tif 000012
生成物3(4.562 g、9.62 mmol)を水/アセトニトリル溶媒(1:1、60 ml)で溶解した。その後、赤褐色になるまで、0.1モル酸化溶液(THF/水/ピリミジン 7:2:1中に0.1 Mヨウ素)をゆっくり滴下した。次に、溶液を乾くまで蒸発させ、DCM中に吸収させた。有機相を、NaHSO4の5％溶液および飽和NaCl溶液で複数回振盪した。水相をDCMで抽出した。収集した有機相をNaSO4で乾燥させ、ろ過して取り除いた。生じた溶液をロータリーエバポレーターから取り除き、凍結乾燥システムで乾燥させた。結果は、58.5％の収率に相当する、2.6 g(5.63 mmol)の茶色がかった泡状物質であった。
(合成は次に従う：D. Vitharana et al, Synthesis and biological evaluation of (R)- and (S)-2-(phosphonomethyl) pentanedioic acids as inhibitors of glutamate carboxypeptidase II, Tetrahedron Assymetry 2002, 13, 1609-1614。) 
【００８４】
生成物5（C9H19O6N2P; 282.23 g/mol）
2016531297.tif 000013
生成物4(1 g、2.04 mmol)を水素ガス(6バルーン)下で500 mg Pd/C触媒の水/アセトニトリル溶液(18 ml/7 ml)と共に20時間撹拌した。その後、触媒をろ過して除去し、濾液を共蒸発させた。生成物(educt)の浄化はHPLCの使用により行った(バッファーA：5％MeCN、バッファーB：30％MeCN)。
(合成は次に従う：D. Vitharana et al, Synthesis and biological evaluation of (R)- and (S)-2-(phosphonomethyl) pentanedioic acids as inhibitors of glutamate carboxypeptidase II, Tetrahedron Assymetry 2002, 13, 1609-1614。)
【００８５】
B. 基体の作製
基体として、検出カテーテルを用いた。参照により本明細書に組み入れられるWO 2010/145824に開示されたプロトコールにしたがって、検出カテーテルを調製した。
【００８６】
C. 基体の機能化
上記ナノ粒子基体に機能を持たせるために、様々な戦略を用いて、結合分子、例えば、式IIIの阻害剤を表面に結合させる。これらの戦略には、標準的なストレプトアビジン-ビオチン相互作用が含まれる。それにはまた、接着または静電的相互作用を介する、IgGのような(モノクローナル)抗体またはその断片のアレイ表面への直接結合が含まれてもよい。加えて、抗体もしくはその断片のような標的特異的分子構造、核酸で作られたオリゴマー、またはペプチドもしくは糖ペプチドの共有結合は、以下の詳細な実施例に記載されているようなリンカー技術を用いて行うことができる。本発明の診断デバイスは、医学的適用、生物学的および生化学的研究、ならびに環境モニタリングおよび環境保護および食の安全に適している。医学的適用を考慮して、診断デバイスはインビボおよびインビトロでの使用のためのデバイスとして構築される。
【００８７】
D. さらなる使用のための結合剤の回収
バイオマーカーが本発明の結合剤Aにより特定された後に、高濃度で本発明の結合剤を添加することにより、またはリンカー分子の酵素的切断により、バイオマーカーを結合剤Aから取り除くことができ、よって、インビトロでのバイオマーカーの決定が可能になる。
【００８８】
実施例2：インビボでの検出
診断デバイスを使用するインビボでの検出のために、デバイスは通常、分子または細胞選択カテーテルをもたらすバネ線担体上に構築されて、循環または体から希少な分子成分または細胞成分を直接的に得る。インビボ適用のためのデバイスとして、例えば、バネ線上に構築されたデバイスは、種々の適用、例えば、癌診断、および癌、代謝性疾患、感染性疾患、アレルギー性疾患および炎症性疾患のような慢性疾患のモニタリングに有用な細胞または分子選択カテーテルを提供する。このデバイスは、例えば、中空針を使用することにより、血管(静脈または動脈)を穿刺し、中空針または標準的な静脈ラインを通ってデバイスを血管内に入れることにより、適用される。適切なインキュベーション時間(5から60分)の後、さらなる処置のために、デバイスを付着した細胞および／または分子と共に交換する。
【００８９】
細胞選択カテーテルとして、本発明による診断デバイスは、例えば循環腫瘍細胞(CTC)または細菌など、末梢血からの希少細胞の単離に適している。
【００９０】
CTCは、癌を有するヒトまたは動物の血液中のみに現れる細胞である。細胞性または可溶性PSMAに対して作られた結合剤を備えた細胞選択カテーテルは、PSMA陽性細胞上のPSMAタンパク質または血中の可溶性PSMAに特異的に結合する。細胞選択カテーテルに結合した細胞の数は、血液循環中での保持期間および実際の細胞濃度に依拠する。治療前もしくは治療中、ならびに／または癌薬物療法の過程および／もしくは染色体異常および／もしくは他の遺伝的欠陥の診断を終えた後の患者をモニタリングするのに適切な数のPSMA陽性細胞は、インビボで5〜60分の保持期間後に収集することができる。カテーテルを交換した後、付着細胞を有するカテーテルの先端を、専門研究所に輸送するために収集管内に入れる。
【００９１】
実施例3：インビトロでの検出
結合剤は、種々のリンカーおよび表面に結合させることができ、この文脈において、種々のインビトロ適用において用いることができる。
【００９２】
インビトロでの使用のための「診断デバイス」は、平面状かつ透明の支持体上に構築されて、ナノ構造表面上のプラズモン共鳴波長またはナノスフェアリソグラフィーを用いて支持体の上に堆積させた物質に依存する発光特性もしくは磁気特性を測定することにより標的の定量的かつ定性的決定を可能にする「ラボオンチップ」を提供する。インビトロでの適用のためのデバイスとして、「診断デバイス」は、以下に記載のように用いられるはずである「現場での(on scene)」診断手法(例えば、ベッドサイド、手術室、救急車または戦場で)のためのものである。量子サイズ閉じ込め効果により、ナノサイズ金属粒子は、サイズに応じて異なる光吸収スペクトルを示す。表面プラズモンバンドは、粒子の表面の周りの集団電子振動によるものである。例えば、Ag(銀)ナノ粒子は390 nm付近にプラズモンバンドを有するが、Auナノ粒子は520 nm付近にプラズモンバンドを有する。表面プラズモン吸収のピックポジション、強度およびバンド幅は、粒子のサイズ、形態(形状)、および表面機能性と直接関係する。アビジンにより金ナノ粒子の2次元集合体を覆うことにより、そのプラズモンピークはより長波長へとシフトし、容易に検出できる。本発明は、以下の実施例によりさらに例証されうる。
【００９３】
結合剤は、シグナル伝達物質に連結され、バイオマーカーを検出するために用いられうる。例えば、それはフルオレセイン イソチオシアナート(FITC)に連結されうる。結合された結合剤はこの例において、480 nm付近の波長を有する光を用いてFITCを励起させ、525 nm付近の波長を検出できる適切なフィルターを用いて検出することにより検出することができる。
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図3 フルオレセイン イソチオシアナート(FITC)に連結させた結合剤の例
【００９４】
結合剤は、尿または血液などの液体試料からバイオマーカーを単離するために、表面に連結させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2016531297.tif 000021
2016531297.tif 000022
2016531297.tif 000023