(57)【要約】  本発明は、一部には、診断および予後適用に有用な抗ガレクチン−１（Ｇａｌ１）モノクローナル抗体、ならびにその免疫グロブリン、ポリペプチドおよび核酸の発見に基づく。
2016534093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体が、
ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖配列、または
ｂ）表１に列挙した配列からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖配列
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、
ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列、または
ｂ）表１に列挙した配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、
ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖配列、または
ｂ）表１に列挙した配列からなる群から選択される軽鎖配列
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、
ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列、または
ｂ）表１に列挙した配列からなる（consisting）群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
キメラ、ヒト化、複合、マウスまたはヒトである、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／またはＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディ断片からなる群から選択される、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
Ｇａｌ１への市販の抗体の結合を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体が、寄託受託番号ＰＴＡ−１２０４４９にて寄託されたハイブリドーマ８Ａ１２．Ｈ９．Ｈ１０から得ることができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖。
【請求項１０】
ストリンジェントな条件下で、表１に列挙した配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補体とハイブリダイズする、または表１に列挙した配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列である、単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の単離された核酸を含むか、請求項１１に記載のベクターを含むか、請求項１に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を発現するか、または寄託受託番号ＰＴＡ−１２０４４９にて入手できる、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含むデバイスまたはキットであって、少なくとも１種のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片またはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片を含む複合体を検出するための標識を含んでもよいデバイスまたはキット。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を産生する方法であって、（ｉ）請求項１に記載のモノクローナル抗体をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を、前記抗体を発現させるのに適した条件下で培養する工程と、（ｉｉ）発現された抗体を回収する工程とを含む方法。
【請求項１５】
Ｇａｌ１ポリペプチドの存在またはレベルを検出する方法であって、試料を得ることと、請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用により、試料中の前記ポリペプチドを検出することとを含む方法。
【請求項１６】
少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、Ｇａｌ１ポリペプチドと複合体を形成し、複合体が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノ（radioimmune）アッセイ（ＲＩＡ）、免疫化学的にまたは細胞内フローアッセイを用いた形態で検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象における異常Ｇａｌ１発現に関連する障害の進行をモニタリングするための方法であって、
ａ）請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、第１の時点の対象試料において、Ｇａｌ１の発現のレベルを検出することと、
ｂ）その後の時点で工程ａ）を反復することと、
ｃ）工程ａ）およびｂ）において検出された前記Ｇａｌ１の発現のレベルを比較して、対象における障害の進行をモニターすることと
を含む方法。
【請求項１８】
第１の時点およびその後の時点の間に、対象が、障害を寛解するための治療を受けている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
異常Ｇａｌ１に関連する障害を患う対象の臨床成績を予測するための方法であって、
ａ）請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、患者試料におけるＧａｌ１の発現のレベルを決定することと、
ｂ）請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、良好な臨床成績を有する対照対象由来の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルを決定することと、
ｃ）患者試料および対照対象由来の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルを比較することと
を含み、対照対象由来の試料における発現レベルと比較して、患者試料における発現の有意により高いレベルが、患者が不良な臨床成績を有することの徴候である方法。
【請求項２０】
対象における異常Ｇａｌ１に関連する障害のための治療法の有効性を評価する方法であって、
ａ）請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、対象に治療法の少なくとも部分を提供する前に対象から得られる第１の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルと、
ｂ）治療法の部分の提供後に対象から得られる第２の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルと
を比較することを含み、第１の試料と比べて、第２の試料におけるＧａｌ１の発現の有意により低いレベルが、治療法が対象における障害の阻害に効果的であることの徴候である方法。
【請求項２１】
対象における異常Ｇａｌ１に関連する障害を阻害するための被験化合物の有効性を評価する方法であって、
ａ）請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、対象から得られ、被験化合物に曝露された第１の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルと、
ｂ）対象から得られる第２の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルと
を比較することを含み、第２の試料は、被験化合物に曝露されておらず、第２の試料と比べて、Ｇａｌ１の発現の有意により低いレベルが、被験化合物が対象における障害の阻害に効果的であることの徴候である方法。
【請求項２２】
第１および第２の試料が、対象から得られる単一の試料の部分、または対象から得られるプールされた試料の部分である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
障害が、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＭＬＬ再編成ＡＬＬ、ＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、上咽頭癌、カポジ肉腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、メラノーマ、胃腸がん、甲状腺乳頭癌、喉頭扁平上皮癌および皮膚Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１７、１９、２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
試料が、対象から得られる細胞、血清、腫瘍周囲組織および／または腫瘍内組織を含む、請求項１７、１９、２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記有意な増加が、対照対象由来の試料におけるＧａｌ１の発現の正常レベルと比べた、対象試料におけるＧａｌ１の発現のレベル間の少なくとも２倍の増加を含む、請求項１７、１９、２０または２１に記載の方法。
【請求項２６】
対象がヒトである、請求項１７、１９、２０または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
糖結合タンパク質の高度に保存されたファミリーのメンバーであるガレクチン−１（Ｇａｌ１）は、ＮまたはＯ結合型グリカンの分枝におけるＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌ−β１−４−ＮＡｃＧｌｃ）残基の特異的な認識により、免疫応答をモジュレートし、腫瘍免疫回避を促す［Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Rabinovich and Croci (2012) Immunity 36:322-335；Rabinovich and Toscano (2009) Nat. Rev Immunol. 9:338-352；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］。
【背景技術】
【０００２】
Ｇａｌ１は、ＣＤ４５、ＣＤ４３およびＣＤ７等、特異的にシアル酸付加（sialated）された細胞表面糖タンパク質と相互作用することにより、細胞傷害性Ｔ細胞ならびにＴヘルパー（Ｔｈ）１およびＴｈ１７細胞のアポトーシスを選択的に誘導する［Toscano et al. (2007) Nat. Immunol. 8:825-834］。Ｔｈ２細胞および調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、Ｇａｌ１結合糖タンパク質モチーフを欠くため、Ｇａｌ１は、これらの細胞を温存し、免疫抑制性Ｔｈ２／Ｔｒｅｇが濃縮された腫瘍微小環境を促す［Toscano et al. (2007) Nat. Immunol. 8:825-834］。Ｇａｌ１は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大化も促進し［Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Toscano et al. (2007) Nat. Immunol. 8:825-834］、Ｇａｌ１−グリカン相互作用は、低酸素に駆動される腫瘍血管新生を増す［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］。
【０００３】
これらの分子機序が、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の促進におけるＧａｌ１の効果の根底にある。ｃＨＬは、北米および欧州で毎年およそ２０，０００名の新たな患者において診断されるＢ細胞悪性腫瘍である；これらの患者のうち＞９０％が若年成人である。ｃＨＬは、広範なＴｈ２／Ｔｒｅｇの歪んだ炎症性浸潤物内に少数の悪性ホジキンリード−シュテルンベルク（ＨＲＳ）細胞を含む［Kueppers et al. (2002) Ann. Oncol. 13:11-18；Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Kueppers (2009) Nat. Rev. Cancer 9:15-27］。ＨＲＳ細胞は、Ｇａｌ１を過剰発現し、Ｇａｌ１は、Ｔｈ１および細胞傷害性Ｔ細胞を選択的に殺傷し、免疫抑制性Ｔｈ２／Ｔｒｅｇ優勢ＨＬ微小環境を促進する［Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139］。ＨＲＳ細胞は、Ｂ細胞受容体媒介性シグナルを欠き、ＮＦ−κＢおよびアクチベータータンパク質１（ＡＰ１）等、転写因子によって活性化される代替的な生存および増殖経路を利用する［Kueppers et al. (2002) Ann. Oncol. 13:11-18；Mathas et al. (2002) EMBO J. 21:4104-4113；Schwering et al. (2003) Mol. Med. 9:85-95］。ｃＨＬにおいて、腫瘍細胞は、構成的ＡＰ１活性化を示し、高レベルのＡＰ１構成成分、ｃＪｕｎおよびＪｕｎ  Ｂを発現し、ＡＰ１媒介性増殖シグナルに依存する［Mathas et al. (2002) EMBO J. 21:4104-4113；Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3338-3344］。原発性ｃＨＬは、活発な炎症性浸潤を有するが、有効な宿主抗腫瘍免疫応答の証拠は殆どない。反応性Ｔ細胞集団は、免疫応答を直接的に抑制し、免疫攻撃からＨＲＳ細胞を保護する、Ｔｈ２型およびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を優勢に含んだ［Re et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:6379-6386；Marshall et al. (2004) Blood 103:1755-1762；Gandhi et al. (2006) Blood 108:2280-2289］。Ｔｈ１ならびにナチュラルキラーおよび細胞傷害性Ｔ細胞は、著しく提示不足である。
【０００４】
原発性ｃＨＬの免疫組織化学的解析におけるＧａｌ１発現の増加は、より不十分な無再発生存期間に関連する［Kamper et al. (2011) Blood 117:6638-6649］。特に、血清Ｇａｌ１レベルの上昇は、ｃＨＬと新たに診断された患者における腫瘍負荷および有害臨床特色に有意に関連する［Ouyang et al. (2013) Blood 121:3431-3433］。さらに、Ｇａｌ１発現は、ＥＢＶ関連の移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）［Gottschalk et al. (2005) Annu. Rev. Med. 56:29-44；Ouyang et al. (2011) Blood 117:4165-4166 and 4315-4322］、ＭＬＬ再編成ＡＬＬ［Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130］およびカポジ肉腫［Tang et al. (2010) Oncol. Rep. 24:495-500］にも関連する。これらの選択された（select）リンパ系悪性腫瘍およびウイルスにより誘導されるがんに加えて、Ｇａｌ１は、乳がん［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、前立腺がん［Dalotto-Moreno et al. (2013) Cancer Res. 73:1107-1117］、肺がん［Laderach et al. (2013) Cancer Res. 73:86-96］、膵がん［Chung et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:4037-4047］、頭頸部扁平上皮癌［Chung et al. (2008) ANZ J. Surg. 78:245-251；Alves et al. (2011) Pathol. Res. Pract. 207:236-40］、肝細胞癌［Le et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:8932-41］、上咽頭癌［Wu et al. (2012) J. Gastroenterol. Hepatol. 27:1312-1319］およびメラノーマ［Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251；Mathieu et al. (2012) J. Invest. Dermatol. 132:2245-2254］を含む多くの固形腫瘍によっても発現される。Ｇａｌ１発現は、上述の固形腫瘍における有害予後マーカーとして同定された。さらに、Ｇａｌ１サイレンシングは、乳がん［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、前立腺がん［Dalotto-Moreno et al. (2013) Cancer Res. 73:1107-1117］、肺がん［Laderach et al. (2013) Cancer Res. 73:86-96］およびメラノーマ［Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］における抗腫瘍効果に関連する。
【０００５】
Ｇａｌ１の広い免疫抑制活性を考慮すると、これらの結果は、Ｇａｌ１が、多くのがんにおいて標的化された合理的治療法を潜在的にガイドする可能性がある、非常に強力な診断マーカーであることを示唆する。Ｇａｌ１誘導性アポトーシスからＴｈ１および細胞傷害性Ｔ細胞を保護し［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］、Ｇａｌ１関連腫瘍血管新生を抑止し［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、インビボ（in vivo）におけるＧａｌ１＋腫瘍の成長を限定する［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］強力な治療用（即ち、中和）Ｇａｌ１モノクローナル抗体は公知であるが、かかる試薬は、診断および予後目的には最適ではない場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述を鑑みると、本技術分野において依然として、特に、血清に基づくアッセイ等、低侵襲性のシナリオにおいて、Ｇａｌ１を特異的に検出するための組成物および方法の必要があることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、全般的には、異常ガレクチン−１（Ｇａｌ１）発現に関連する障害（例えば、がん）の診断、予後およびモニタリングに有用な、抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体、ならびにその免疫グロブリン、ポリペプチドおよび核酸に関する。
【０００８】
一態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供され、このモノクローナル抗体は、ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖配列、またはｂ）表１に列挙した配列からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖配列を含む。
【０００９】
一実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列、またはｂ）表１に列挙した配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含む。別の実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖配列；またはｂ）表１に列挙した配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む。さらに別の実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ａ）表１に列挙した配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列；またはｂ）表１に列挙した配列からなる（consisting）群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む。また別の実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、複合、マウスまたはヒトである。別の実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／またはＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディ断片からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｇａｌ１への市販の抗体の結合を阻害する。また別の実施形態において、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、寄託受託番号ＰＴＡ−１２０４４９にて寄託されたハイブリドーマ８Ａ１２．Ｈ９．Ｈ１０から得ることができる。
【００１０】
別の態様において、本明細書に記載されているＣＤＲを含むいずれかのモノクローナル抗体、その抗原結合断片またはタンパク質の免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖が提供される。
【００１１】
なお別の態様において、ストリンジェントな条件下で、表１に列挙した配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補体とハイブリダイズする、または表１に列挙した配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列である、単離された核酸分子が提供される。
【００１２】
また別の態様において、かかる単離された核酸を含むベクターが提供される。
【００１３】
別の態様において、かかる単離された核酸を含むか、かかるベクターを含むか、本明細書に記載されているモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片を発現するか、または寄託受託番号ＰＴＡ−１２０４４９にて入手できる宿主細胞が提供される。
【００１４】
なお別の態様において、本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含むデバイスまたはキットが提供され、前記デバイスまたはキットは、少なくとも１種のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、またはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片を含む複合体を検出するための標識を含んでいてもよい。
【００１５】
また別の態様において、本明細書に記載されている（describe）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を産生する方法が提供され、この方法は、（ｉ）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を、前記抗体またはその抗原結合断片を発現させるのに適した条件下で培養する工程と、（ｉｉ）発現された抗体またはその抗原結合断片を回収する工程とを含む。
【００１６】
別の態様において、Ｇａｌ１ポリペプチドの存在またはレベルを検出する方法が提供され、前記方法は、試料を得ることと、本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用により、試料中の前記ポリペプチドを検出することとを含む。一実施形態において、少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｇａｌ１ポリペプチドと複合体を形成し、この複合体は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノ（radioimmune）アッセイ（ＲＩＡ）、免疫化学的に、または細胞内フローアッセイを用いた形態で検出される。
【００１７】
なお別の態様において、対象における異常Ｇａｌ１発現に関連する障害の進行をモニタリングするための方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、第１の時点の対象試料において、Ｇａｌ１の発現のレベルを検出することと、ｂ）その後の時点で工程ａ）を反復することと、ｃ）工程ａ）およびｂ）において検出された前記Ｇａｌ１の発現のレベルを比較して、対象における障害の進行をモニターすることとを含む。一実施形態において、対象は、第１の時点およびその後の時点の間に、障害を寛解するための治療を受けている。
【００１８】
また別の態様において、異常Ｇａｌ１に関連する障害を患う対象の臨床成績を予測するための方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、患者試料におけるＧａｌ１の発現のレベルを決定することと、ｂ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、良好な臨床成績を有する対照対象由来の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルを決定することと、ｃ）患者試料および対照対象由来の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルを比較することとを含み、対照対象由来の試料における発現レベルと比較して、患者試料における発現の有意により高いレベルは、患者が不良な臨床成績を有することの徴候である。
【００１９】
別の態様において、対象における異常Ｇａｌ１に関連する障害のための治療法の有効性を評価する方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、対象に治療法の少なくとも部分を提供する前に対象から得られる第１の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルと、ｂ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を適宜用いて、治療法の部分の提供後に対象から得られる第２の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルとを比較することを含み、第１の試料と比べて、第２の試料におけるＧａｌ１の発現の有意により低いレベルは、治療法が対象における障害の阻害に効果的であることの徴候である。
【００２０】
なお別の態様において、対象における異常Ｇａｌ１に関連する障害を阻害するための被験化合物の有効性を評価する方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、対象から得られ、被験化合物に曝露された第１の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルと、ｂ）本明細書に記載されている少なくとも１種のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を適宜用いて、対象から得られる第２の試料におけるＧａｌ１の発現のレベルとを比較することを含み、第２の試料は、被験化合物に曝露されておらず、第２の試料と比べてＧａｌ１の発現の有意により低いレベルは、被験化合物が、対象における障害の阻害に効果的であることの徴候である。一実施形態において、第１および第２の試料は、対象から得られる単一の試料の部分または対象から得られるプールされた試料の部分である。
【００２１】
本明細書に記載されているいずれかの方法において、障害は、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＭＬＬ再編成ＡＬＬ、ＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、上咽頭癌、カポジ肉腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、メラノーマ、胃腸がん、甲状腺乳頭癌、喉頭扁平上皮癌および皮膚Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択され得る。同様に、一部の実施形態において、試料は、対象から得られる細胞、血清、腫瘍周囲組織および／または腫瘍内組織を含む。他の実施形態において、有意な増加は、対照対象由来の試料におけるＧａｌ１の発現の正常レベルと比べた、対象試料におけるＧａｌ１の発現のレベル間の少なくとも２倍の増加を含む。さらに他の実施形態において、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ウエスタンブロット（ＷＢ）により、内在性ヒトおよびマウスＧａｌ１における抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体、８Ａ１２の交差反応性を示す。ヒトホジキンリンパ腫系統、Ｌ４２８およびマウスメラノーマ系統、Ｂ１６−Ｆ１０に由来する細胞ライセートのＷＢ解析。異なるタイトレーションの８Ａ１２によりライセートを探索したところ、Ｇａｌ１の特異的なバンド（ほぼ１４ｋＤａ）を示した。８Ａ１２は、同様の範囲の力価で内在性ヒトおよびマウスＧａｌ１を認識する。
【図２】図２は、複数の固形および血液悪性腫瘍におけるＧａｌ１発現（転写物存在量）を示す。Ｇａｌ１転写物存在量は、選択（select）リンパ系悪性腫瘍、ウイルスにより誘導されるがんおよび多くの固形腫瘍を含む、複数の腫瘍型において高度に増加される。
【図３】図３は、組換えＧＳＴタグ付きのヒトＧａｌ１および断片の模式図を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、Ｇａｌ１の血清レベルが、正常対照と比べてｃＨＬ試料において有意により高く、ｃＨＬ患者における腫瘍負荷の臨床パラメータに関連することを示す。サンドイッチＥＬＩＳＡによりＧａｌ１血清レベルを評価した。図４Ａは、ｃＨＬ患者および正常健康ドナーにおけるＧａｌ１レベルを示す（９３．０±５６．５ｎｇ／ｍｌ対３６．９±７．８ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜．０００１）。図４Ｂは、リスク適応された臨床治験、ＨＤ１３（初期低リスク）、ＨＤ１４（リスク因子あり初期）またはＨＤ１８（巨大局在化または進行期疾患）における、患者のＧａｌ１レベルを示す。図４Ｃは、Ａｎｎ  ＡｒｂｏｒステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ疾患のｃＨＬ患者におけるＧａｌ１レベルを示す。名目上のｐ値を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｅは、ウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が、十分に特徴付けられた細胞株および組織のセットにおけるＰＤ−Ｌ１の高感度および特異的染色の両方を実証することを示す。図５Ａは、遺伝学的に特徴付けられたびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株（ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ１）およびホジキンリンパ腫細胞株（Ｌ４２８、ＳＵＰ−ＨＤ１、ＨＤＬＭ２）に由来する細胞ライセートのウエスタンブロット解析を示す。ＰＤ−Ｌ１を認識するウサギモノクローナル抗体によりライセートを探索したところ（上パネル）、十分なグリコシル化形態のＰＤ−Ｌ１に予想されるサイズにバンドを示した（ほぼ５５ｋＤａ）。以前に報告された通りの、細胞株毎のＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）遺伝子座、９ｐ２４．１の遺伝子コピー数（ＣＮ）を示す。ＧＡＰＤＨを探索することにより、等量のロードを実証した。ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ホジキン細胞株ＨＤＬＭ２（図５Ｂ）およびＤＬＢＣＬ細胞株ＤＨＬ４（図５Ｃ）のＩＨＣ解析は、ＨＤＬＭ２細胞の膜性染色を示すが、ＤＨＬ４細胞の染色は示さなかった。挿入図は、マウスモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体による同様の染色パターンを示す。図５Ｄは、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色したＦＦＰＥヒト扁桃腺を示し、リンパ系細胞の染色を殆ど示さず、偶発的な（occasional）マクロファージの弱い膜性染色を示す（挿入図、矢印）。図５Ｅは、ウサギＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（本来のロット濃度０．２２ｍｇ／ｍｌ）で染色したヒト胎盤を示し、合胞体栄養細胞の膜染色を実証する。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、ＣＨＬ、ＮＬＰＨＬ、ＰＭＬＢＣＬおよびＴＣＲＬＢＣＬにおけるＰＤ−Ｌ１の免疫組織化学的解析の結果を示す。図６Ａは、リード−シュテルンベルク（ＲＳ）細胞および腫瘍内マクロファージの明確に異なる膜性染色を示す、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色した代表例の結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫（ＮＳＣＨＬ）を示す。挿入図は、ＲＳ細胞（矢印）の細胞膜を強調するＰＤ−Ｌ１による染色、ならびにＰＤ−Ｌ１およびマクロファージマーカーＣＤ６８で二重染色した非悪性細胞およびマクロファージ（矢じり）を示す。図６Ｂは、ＰＤ−Ｌ１が陰性のＬＰ細胞（矢印）を示す、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１で染色した結節性リンパ球優勢型ホジキンリンパ腫（ＮＬＰＨＬ）の代表的症例を示す。図６Ｃは、リンパ腫細胞の優勢な膜性染色を示す、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色した縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）の代表的症例を示す。図６Ｄは、腫瘍細胞または混合腫瘍関連マクロファージのいずれかにおける陰性染色を示す、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色したＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫（ＢＬ）の代表的症例を示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｆは、ウイルス関連リンパ腫および追加的ながんにおけるＰＤ−Ｌ１発現の免疫組織化学的解析の結果を示す。ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１またはマウス抗ＰＤ−Ｌ１（挿入図）で染色したＥＢＶ陽性形質芽球性リンパ腫（ＰＢＬ）（図７Ａ）、ＨＨＶ８陽性原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）（図７Ｂ）、ＥＢＶ陽性節外性ＮＫ／Ｔ−細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＣＬ）（図７Ｃ）、ＥＢＶ陰性移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）（図７Ｄ）、ＥＢＶ陽性上咽頭癌（ＮＰＣ）（図７Ｅ）およびＨＨＶ８陽性カポジ肉腫（ＫＳ）（図７Ｆ）の代表的症例。
【図８】図８Ａ〜図８Ｈは、ウイルス関連リンパ腫および追加的ながんにおけるＧａｌ１発現の免疫組織化学的解析の結果を示す。ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（図８Ａ）、ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫（ＢＬ）（図８Ｂ）、ＥＢＶ陽性節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＣＬ）（図８Ｃ）、ＨＨＶ８陽性原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）（図８Ｄ）、ＥＢＶ陽性形質芽球性リンパ腫（ＰＢＬ）（図８Ｅ）、ＨＨＶ８陽性カポジ肉腫（ＫＳ）（図８Ｆ）、ＥＢＶ陽性上咽頭癌（ＮＰＣ）（図８Ｇ）およびＥＢＶ陰性移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）（図８Ｈ）の代表的症例。
【図９】図９は、組換えＧＳＴタグ付きまたはＨＩＳタグ付きのヒトＧａｌ１（ｈＧａｌ１）および断片の概略図を示す。
【図１０】図１０は、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴにより調製された、２個のラクトース分子とホモ二量体ｈＧａｌ１のリボン図を示す。５ストランド（Ｆ１〜Ｆ５）および６ストランド（Ｓ１〜Ｓ６ａ／Ｓ６ｂ）のβシートにおけるβストランドを文字−数字コードで示す。本図は、Lopez-Lucendo et al. (2004) J. Mol. Biol. 343:957-970から適応させた。
【図１１】図１１は、８Ａ１２  ｍＡｂの微細エピトープマッピングの結果を示す。
【図１２】図１２は、８Ａ１２  ｍＡｂの微細エピトープマッピング結果を要約する概略図を示す。
【図１３】図１３は、８Ａ１２  ｍＡｂのＢＩＡｃｏｒｅ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、一部には、インビトロ（in vitro）検出アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリーその他）において少なくとも予想外に優れた様式で、その機能を中和することなく、ガレクチン１に結合して検出することができる、新たな抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体の発見に基づく。かかる抗体は、Ｇａｌ１、およびＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４その他等の他の免疫阻害性分子のマルチプレックス（例えば、コンビナトリアル）検出に特に有用である。
【００２４】
Ｉ．定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において用いられる場合、この冠詞の文法上の目的語の１個または２個以上（即ち、少なくとも１個）を指すように用いられる。例として、「要素（an element）」は、１個の要素または２個以上の要素を意味する。
【００２５】
マーカーの用語「変更された量」は、対照試料におけるマーカーのそれと比較した、試料におけるマーカーのコピー数の増加もしくは減少および／または特定のマーカー遺伝子（単数または複数）の核酸レベルの増加もしくは減少を指す。マーカーの用語「変更された量」は、正常対照試料におけるマーカーのタンパク質レベルと比較した、試料におけるマーカーのタンパク質レベルの増加または減少も含む。
【００２６】
マーカーの用語「変更された活性」は、正常対照試料におけるマーカーの活性と比較して、例えば生物学的試料における病状が増加または減少されたマーカーの活性を指す。マーカーの変更された活性は、例えば、マーカーの変更された発現、マーカーの変更されたタンパク質レベル、マーカーの変更された構造、または例えば、マーカーと同じもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との変更された相互作用、または転写活性化因子もしくは阻害剤との変更された相互作用の結果であり得る。
【００２７】
マーカーの用語「変更された構造」は、正常または野生型遺伝子またはタンパク質と比較して、マーカー遺伝子またはマーカー（maker）タンパク質内の突然変異またはアレル変異体、例えば、マーカーの発現または活性に影響を与える突然変異の存在を指す。例えば、突然変異として、置換、欠失または付加突然変異が挙げられるがこれらに限定されない。突然変異は、マーカーのコードまたは非コード領域に存在することもできる。
【００２８】
マーカーの用語「変更された細胞下局在化」は、細胞内、例えば、健康および／または野生型細胞内の正常な局在化と比べた、細胞内のマーカーの誤った局在化を指す。マーカーの正常な局在化の徴候は、マーカーポリペプチドが持つ当該分野において公知の細胞下局在化モチーフの解析により、あるいは例えば、正常には細胞外の成熟した機能的Ｇａｌ１の内部移行等、細胞解析により決定することができる。
【００２９】
用語「血管新生」または「新血管新生」は、先在する血管から新たな血管が発生するプロセスを指す［Varner et al. (1999) Angiogen. 3:53-60；Mousa et al. (2000) Angiogen. Stim. Inhib. 35:42-44；Kim et al. (2000) Amer. J. Path. 156:1345-1362；Kim et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:33920-33928；Kumar et al. (2000) Angiogenesis: From Molecular to Integrative Pharm. 169-180］。先在する血管または循環する内皮幹細胞［Takahashi et al. (1995) Nat. Med. 5:434-438；Isner et al. (1999) J. Clin. Invest. 103:1231-1236］由来の内皮細胞は、成長因子もしくはホルモンによる合図または低酸素もしくは虚血状態に応答して、遊走、増殖および管腔を有する構造へと分化するよう活性化され、新たな血管を形成するようになる。がんにおいて生じるような、虚血の際に、酸素負荷および栄養素のデリバリーを増加させる必要は、罹患組織による血管新生因子の分泌を明らかに誘導する；これらの因子は、新たな血管形成を刺激する。いくつかの追加的な用語が、血管新生に関係する。
【００３０】
例えば、用語「血管新生を示す組織」は、先在する血管から新たな血管が発生している組織を指す。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、用語「血管新生の阻害」、「血管新生の縮小」、「血管新生の低下」およびこれらの文法上の均等物は、対応する対照組織における含量の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以下の含量となるような、組織における血管新生のレベルの低下を指し、最も好ましくは、対照組織において観察されるものと同じレベルである。血管新生のレベル低下は、血管新生の絶対的非存在を意味する必要はないが、そうであってもよい。本発明は、血管新生を全面的に排除する方法を必要とせず、これに限定されない。血管新生のレベルは、本技術分野において周知の方法を用いて決定することができ、方法は、本明細書および実施例に記述されている通り、血管の数および／または血管枝分かれ部位の数の計数を限定することなく含む。企図される代替的インビトロアッセイは、細胞レベルでの新たな血管の成長を示す管状コード形成アッセイを含む［D. S. Grant et al., Cell, 58: 933-943 (1989)］。本技術分野に許容される（Art-accepted）インビボアッセイも公知であり、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギその他等、様々な試験動物の使用に関与する。これらのインビボアッセイは、正常および新生物組織の両方における抗血管新生活性の提示に適したニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイを含む［Ausprunk (1975) Amer. J. Path. 79:597-610およびOssonowski and Reich (1980) Cancer Res. 30:2300-2309］。他のインビボアッセイは、ある特定のマウスにおける移植された腫瘍の成長速度を低下させる、またはがんの素因があるもしくは化学的に誘導されたがんを発現するマウスにおける腫瘍もしくは新生物発生前細胞の形成を阻害する化合物の能力を示す、マウス転移アッセイを含む［Humphries et al. (1986) Science 233:467-470およびHumphries et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:782-790］。さらに、一部の実施形態において、血管新生は、本明細書にさらに記載されている通り、周皮細胞成熟化および血管リモデリング等の性状に従って測定することができる。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、用語「低酸素関連の血管新生」または「低酸素誘導性血管新生」は、非新生物疾患状態における病理学的血管新生のプロセスを一般に指し、典型的には、新生物状態への移行を伴うが、必ずしもそうである必要はない。低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ）は、ＨＩＦ−１ｚｌｐｈａ、ＶＥＧＦ、一酸化窒素シンターゼ、ＰＤＦＧ、Ａｎｇ２その他を含む血管新生因子の発現を誘導する。結果として、低酸素関連の血管新生は、かかるプロセスによって特徴付けられる病理学的状態の周知セットを包含する［Pugh et al. (2003) Nat Med 9, 677-684；Fraisl et al. (2009) Dev Cell 16, 167-179；Ferrara et al. (2005) Nature 438, 967-974；Ferrara, N. (2010) Cytokine Growth Factor Rev 21, 21-26］。一部の実施形態において、低酸素関連血管新生病理のセットとして、新生物およびがん、加齢黄斑変性、糖尿病、網膜症、粥状動脈硬化、慢性閉塞性肺疾患ならびに乾癬が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
本明細書に他に特記されていなければ、用語「抗体（単数）」および「抗体（複数）」は、天然起源型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）ならびに単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体および多特異性抗体等の組換え抗体と共に、前述全ての断片および誘導体であって、少なくとも抗原結合部位を有する断片および誘導体を広範に包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質または化学的部分を含むことができる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖またはそれらの抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと省略）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと省略）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名されるより保存された領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。「不活性化抗体」は、補体系を誘導しない抗体を指す。
【００３４】
用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）も含む。用語「抗原結合部分」は、本明細書において用いられる場合、抗原（例えば、Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１種または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能が、全長抗体の断片によって実行され得ることが示された。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片［Ward et al., (1989) Nature 341:544-546］；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらのドメインを、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価ポリペプチドを形成した単一のタンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結することができる［単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；およびOsbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778を参照］。かかる単鎖抗体も、抗体の用語「抗原結合部分」内に包含されることを目的とする。完全ＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的ｓｃＦｖのいかなるＶＨおよびＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結することもできる。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖまたは他の断片の生成において用いることもできる。ダイアボディ等、他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、二価、二重特異性抗体であり、この抗体においては、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖において発現されるが、同じ鎖における該２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を形成する［例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照］。
【００３５】
さらにまた、抗体またはその抗原結合部分は、１種または複数の他のタンパク質またはペプチドと抗体または抗体部分との共有結合または非共有結合による会合によって形成された、より大型の免疫接着ポリペプチドの一部となり得る。かかる免疫接着ポリペプチドの例として、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用［Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101］と、二価およびビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用［Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058］が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片等、抗体部分は、抗体全体のそれぞれパパインまたはペプシン消化等、従来技法を用いて抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載されている通り、標準組換えＤＮＡ技法を用いて得ることができる。
【００３６】
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル；異種間、同種異系間もしくは同系間；またはこれらの修飾型（例えば、ヒト化、キメラ等）であり得る。抗体は、完全にヒトとすることもできる。一実施形態において、本発明の抗体は、Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片に特異的にまたは実質的に特異的に結合する。用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において用いられる場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のうち１種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指す一方、用語「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位のうち複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を表示する。
【００３７】
用語「体液」は、身体から排泄または分泌される流体と共に、正常には排泄または分泌されない流体を指す［例えば、羊水、眼房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳あか、カウパー腺液または尿道球腺液、乳糜、粥状液、糞便、膣液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸水、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙液、尿、膣潤滑、硝子体液、嘔吐物］。
【００３８】
用語「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖障害」は、制御不能な増殖、不死性、転移能、急速成長および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態学的特色等、がん原因細胞に典型的な特徴を保持する細胞の存在を指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、かかる細胞は、動物内に単独で存在することができる、あるいは白血病細胞等、非腫瘍原性がん細胞となることができる。がんとして、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病およびミュー鎖病等の重鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、および免疫細胞アミロイドーシス、メラノーマ、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんその他が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
用語「ＣＤＲ」およびその複数形「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を指し、そのうち３個が軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）、３個が重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体分子の機能活性に寄与し、足場またはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によってそれぞれ離間される。正確な定義的ＣＤＲ境界および長さは、異なる分類およびナンバリング方式に付される。ＣＤＲは、したがって、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触または他のいずれかの境界定義によって参照することができる。異なる境界にもかかわらず、これらの方式はそれぞれ、可変配列内のいわゆる「高頻度可変領域」を構成する部分にある程度の重複を有する。これらの方式に従ったＣＤＲ定義は、したがって、長さおよび隣接フレームワーク領域に関する境界区域が異なる場合がある。例えば、Kabat、Chothiaおよび／またはMacCallum et al.［それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992；Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901；およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732］を参照されたい。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、用語「分類する」は、試料を病状と「関連付ける」または「カテゴリー化する」ことを含む。ある特定の事例において、「分類する」は、統計的証拠、経験的証拠またはその両方に基づく。ある特定の実施形態において、分類する方法およびシステムは、公知の病状を有する試料のいわゆる訓練セットを用いる。確立されると、訓練データセットは、試料の未知の病状を分類するための、未知の試料の特色を比較する基盤、モデルまたはテンプレートとして役立つ。ある特定の事例において、試料の分類は、試料の病状の診断と類似する。ある特定の他の事例において、試料の分類は、別の病状からの試料の病状の区別と類似する。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、用語「コード領域」は、アミノ酸残基へと翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す一方、用語「非コード領域」は、アミノ酸へと翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す（例えば、５’および３’非翻訳領域）。
【００４２】
「相補的」は、２本の核酸ストランドの領域の間のまたは同じ核酸ストランドの２領域の間の配列相補性の広い概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と、この残基がチミンまたはウラシルである場合、特異的水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることが公知である。同様に、第１の核酸ストランドのシトシン残基は、第１のストランドと逆平行である第２の核酸ストランドの残基と、この残基がグアニンである場合、塩基対形成することができることが公知である。第１の領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基が、第２の領域の残基と塩基対形成することができるのであれば、該２領域が逆平行様式で配置されている場合、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。一実施形態において、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１および第２の部分が逆平行様式で配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。別の実施形態において、第１の部分の全ヌクレオチド残基は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、用語「複合抗体」は、２種以上の無関係の可変領域由来の生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を指す。その上、用語「複合ヒト抗体」は、ヒト生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域および２種以上の無関係のヒト可変領域由来のヒト生殖系列または非生殖系列配列を含む可変領域を有する抗体を指す。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように用いられる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０におけるアミノ酸残基からそのカルボキシル末端へと伸びるものと定義される。本発明の抗体における使用のための適したネイティブ配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記載する。好まれるＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好まれるＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲであり（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する［M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照。ＦｃＲはRavetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)に概説がある］。将来的に同定されるＦｃＲを含む他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。
【００４６】
分子の実質的な画分が基質から解離することなく、流体（例えば、標準生理食塩水クエン酸塩、ｐＨ７．４）で基質をリンスできるように、分子が基質に共有結合または非共有結合により会合される場合、分子は、基質に「固定」または「添加」される。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４８】
「機能保存的変異体」は、ポリペプチドの全体的な立体構造および機能を変更することなく、タンパク質または酵素における所定のアミノ酸残基が変化された変異体であり、その例として、同様の性質（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族その他等）を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換え等が挙げられるがこれに限定されない。保存されたと示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、同様の機能のいずれか２種のタンパク質間のパーセントタンパク質またはアミノ酸配列類似性が変動し得るように、タンパク質において異なることができ、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ方法による等、アライメントスキームに従って決定される７０％〜９９％となり得る。「機能保存的変異体」は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％アミノ酸同一性を有し、これが比較されるネイティブまたは親タンパク質と同じまたは実質的に同様の性質または機能を有するポリペプチドも含む。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、用語「異種抗体」は、かかる抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関して定義される。この用語は、該トランスジェニック非ヒト動物からなるものではない生物において見出される配列に対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指し、一般に、該トランスジェニック非ヒト動物の種以外の種に由来する。
【００５０】
「相同」は、本明細書において用いられる場合、同じ核酸ストランドの２領域の間のまたは２種の異なる核酸ストランドの領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域におけるヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基によって占有される場合、該領域同士は該位置において相同である。各領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基の位置が、同じ残基によって占有される場合、第１の領域は、第２の領域と相同である。２領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有される該２領域のヌクレオチド残基の位置の比率の観点から表現される。例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域と、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、該部分のそれぞれのヌクレオチド残基の位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基によって占有される。より好ましくは、該部分のそれぞれの全ヌクレオチド残基の位置は、同じヌクレオチド残基によって占有される。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクター等、本発明の核酸が導入された細胞を指すことを目的とする。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において互換的に用いられる。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の後代または潜在的な後代も指すことを理解されたい。ある特定の修飾が、続く世代において突然変異または環境的影響のいずれかにより生じ得るため、かかる後代は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、依然として、本明細書におけるこの用語の範囲内に含まれる。
【００５２】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書において用いられる場合、ヒト細胞によって作製されるより密接に似ている抗体に変更された、可変および定常領域を有する非ヒト細胞によって作製された抗体を含むことを目的とする。例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列において見出されるアミノ酸を取り込むように非ヒト抗体アミノ酸配列を変更することによる。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異）。用語「ヒト化抗体」は、本明細書において用いられる場合、マウス等、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体も含む。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、用語「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、配列が高頻度可変であるおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６種のＨＶＲを含む；ＶＨにおける３種（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬにおける３種（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ネイティブ抗体において、Ｈ３およびＬ３は、６種のＨＶＲのうち最大の多様性を表示し、Ｈ３は、特に、抗体に対する細密な特異性の付与において特有の役割を果たすと考えられる。例えば、Xu et al. (2000) Immunity 13, 37-45；Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248, 1-25［Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2003)］を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然起源のラクダ科動物抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定的である［例えば、Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448 (1993)およびSheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol. 3, 733-736を参照］。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫細胞」は、免疫応答における役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血性起源のものであり、Ｂ細胞およびＴ細胞等、リンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球等、骨髄系細胞を含む。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫障害」は、免疫疾患、状態およびその素因を含み、ホジキンリンパ腫（例えば、リンパ球リッチ古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型古典的ホジキンリンパ腫、リンパ球枯渇古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫またはＭＬＬ＋プレＢ細胞ＡＬＬを含む）、がん、慢性炎症性疾患および障害（例えば、クローン病、炎症性腸疾患、反応性関節炎およびライム病を含む）、インスリン依存性糖尿病、臓器特異的自己免疫（例えば、多発性硬化症、橋本病甲状腺炎、自己免疫性ぶどう膜炎およびグレーブス病を含む）、接触皮膚炎、乾癬、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、サルコイドーシス、アトピー性状態（例えば、喘息およびアレルギーを含み、アレルギー性鼻炎および食物アレルギー等の胃腸管アレルギー等が挙げられるがこれらに限定されない）、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、寄生虫（例えば、リーシュマニア症を含む）等のある特定の病原体感受性、ならびにある特定のウイルス感染症（例えば、ＨＩＶならびに結核およびらい腫性ハンセン病等の細菌感染症を含む）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞傷害性活性を含む。加えて、用語、免疫応答は、Ｔ細胞活性化によって間接的にもたらされる免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。
【００５７】
本明細書において用いられる場合、用語「阻害」は、例えば、特定の作用、機能または相互作用の減少、限定または遮断を含む。
【００５８】
本明細書において用いられる場合、用語「相互作用」は、２分子間の相互作用を指す場合、分子同士の物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、かかる相互作用は、前記分子の一方または両方の活性をもたらす（生物学的効果を産生する）。活性は、分子の一方または両方の直接的な活性となり得る（例えば、シグナル伝達）。あるいは、相互作用において一方または両方の分子は、そのリガンドとの結合を防ぐことができ、これにより、リガンド結合活性に関して不活性に保持することができる（例えば、そのリガンドに結合して、免疫応答を誘発または阻害）。かかる相互作用を阻害することは、該相互作用に関与する１種または複数の分子の活性の破壊をもたらす。かかる相互作用を増強することは、前記物理的接触の見込みを延長または増加させることであり、前記活性の見込みを延長または増加させることである。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ヒトＧａｌ１に特異的に結合する、Ｇａｌ１に結合しない抗体を実質的に含まない単離された抗体）を指すことを目的とする。しかし、ヒトＧａｌ１のエピトープに特異的に結合する単離された抗体は、それぞれ異なる種に由来する他のＧａｌ１タンパク質に対し交差反応性を有することができる。しかし、一部の実施形態において、抗体は、ヒトＧａｌ１に対しより高い親和性および選択性を維持する。加えて、単離された抗体は、典型的には、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施形態において、ヒトＧａｌ１に対し異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは、十分に定義された組成物において組み合わされる。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるまたは組換えＤＮＡ技法によって産生される場合は、他のタンパク質、細胞材料、分離培地および培養培地、または化学的に合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的活性部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織供給源由来の細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まない、あるいは化学的に合成される場合は化学的前駆物質または他の化学物質が実質的にない。言語「細胞材料を実質的に含まない」は、これが単離されたまたは組換えにより産生された細胞の細胞構成成分からタンパク質が分離された、標的ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）またはその断片の調製物を含む。一実施形態において、言語「細胞材料を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量で）の非標的タンパク質（本明細書において、「混入タンパク質」とも称される）、より好ましくは、約２０％未満の非標的タンパク質、さらにより好ましくは、約１０％未満の非標的タンパク質、最も好ましくは、約５％未満の非標的タンパク質を有する標的タンパク質またはその断片の調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質またはこれらの断片、例えば、これらの生物学的活性断片が、組換えにより産生される場合、これはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない、即ち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、最も好ましくは、約５％未満を表す。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【００６２】
本明細書において用いられる場合、用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことを目的とする。本開示発明の抗体の結合親和性は、標準抗体−抗原アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ等、競合的アッセイ、飽和アッセイまたは標準イムノアッセイによって測定または決定することができる。
【００６３】
本明細書において用いられる場合、「キット」は、少なくとも１種の試薬、例えば、本発明のマーカーの発現を特異的に検出またはモジュレートするためのプローブを含むいずれかの製造物（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を実施するための単位として宣伝、流通または販売することができる。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープに対し単一の結合特異性および親和性を表示する抗体を指す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を表示し、ヒト生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００６５】
「移植後リンパ増殖性障害」、「ＰＴＬＤ」および／または「ウイルス関連ＰＴＬＤ」はそれぞれ、リンパ組織（例えば、リンパ節、脾臓および／または胸腺）において産生される白血球細胞であるリンパ球が、過剰産生されるまたは異常に作用する障害を指し、ウイルスに起因するまたはそれと相関する。リンパ系細胞は、例えば、胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）；骨髄由来リンパ球（Ｂ細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ細胞）を含む。リンパ球は、増殖、活性化および成熟化を含む、多数の異なるステージを進行し、リンパ腫または異常増殖は、各ステージにおいて発生し得る。障害は、ＩＦＮ−．ガンマに関連する悪性新生物を含む、悪性新生物となり得る（高悪性度もしくは低悪性度として、または低、中等度もしくは高グレードとして分類され得る）、あるいはこの障害は、リンパ系細胞の非悪性異常増大化に関与し得る。ＬＰＤは、治療なしでは解決しない、および／または拡張、モノクローナル、ポリクローナルもしくはオリゴクローナル、リンパ系新生物等、過剰な細胞増殖に関与するいずれかのモノクローナルまたはポリクローナルＬＰＤを含む。細胞増殖は、正常よりも急速なものとなることができ、新たな成長終止を惹起した刺激後に続けることができる。新生物は、正常組織との構造的組織化および機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、良性（良性腫瘍）または悪性（がん）のいずれかとなり得る別個の組織塊を形成することができる。
【００６６】
かかるウイルス関連ＰＴＬＤは、例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、ＨＨＶ−８、サイトメガロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（Ｃ型レトロウイルス）および／またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）に起因または関連し得る。ＨＩＶおよび／またはＡＩＤＳ関連がんは、カポジ（Karposi）肉腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＨＴＬＶ−１＋）およびＡＩＤＳ関連リンパ腫等、ＨＩＶ関連ＬＰＤを含む。ＡＩＤＳ患者、臓器移植レシピエントおよび遺伝的免疫障害における等、免疫欠損は、例えば、潜在性ＥＢＶを反応性にし、異常リンパ球の増殖を引き起こし、ＥＢＶ関連ＬＰＤを発症する潜在力をもたらし得る。ＰＴＬＤに関与する細胞等、異常細胞におけるウイルスまたはウイルス感染の存在を検出する方法は、本技術分野において公知である。ウイルス核酸またはポリペプチドは、例えば、異常細胞等、細胞、組織または生物において検出することができる。また、ウイルスに特異的な免疫応答を検出する方法が公知である。トランスビボ（trans vivo）遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイ等、ＤＴＨアッセイを用いて、例えば、調節性Ｔ細胞を検出することができる。かかるアッセイにおいて、ヒトまたは他の哺乳類末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、例えば、ウイルス抗原ありおよびなしの担体対照と混合し、ナイーブマウスの耳介または足蹠等、異種ナイーブレシピエントに注射することができる。ＰＢＭＣのドナーが、負荷抗原に以前に感作された場合、ＤＴＨ様膨張応答が観察される。
【００６７】
「マーカー」は、正常または健康組織または細胞におけるその発現レベルから変更された組織または細胞におけるその発現レベルが、がん等、病状に関連する遺伝子である。「マーカー核酸」は、本発明のマーカーにコードされるまたはこれに対応する核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。かかるマーカー核酸は、配列表に表記されている核酸配列のうちいずれかの全体もしくは部分的配列またはかかる配列の相補体を含むＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を含む。マーカー核酸は、配列表に表記されている核酸配列のうちいずれかの全体もしくは部分的配列またはかかる配列の相補体を含むＲＮＡも含み、この場合、あらゆるチミジン残基は、ウリジン残基に置き換えられている。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカーにコードされるまたはこれに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、配列表に表記されている配列のうちいずれかの全体または部分的配列を含む。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、互換的に用いられる。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、用語「モジュレートする」は、上方調節および下方調節、例えば、応答の増強または阻害を含む。
【００６９】
マーカーの発現の「正常」レベルは、ウイルス関連ＰＴＬＤを患っていない対象、例えば、ヒト患者の細胞におけるマーカーの発現のレベルである。マーカーの「過剰発現」または「有意により高いレベルの発現」は、発現の評価に用いられているアッセイの標準誤差よりも大きい、被験試料における発現レベルを指し、好ましくは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルの少なくとも２倍、より好ましくは、３、４、５または１０倍である。マーカーの「有意により低いレベルの発現」は、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは、３、４、５または１０倍低い、被験試料における発現レベルを指す。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを目的とする。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本明細書において用いられる場合、Ｇａｌ１に結合する抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連した用語「単離された核酸分子」は、該抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡにおける核酸に天然に隣接し得る、Ｇａｌ１以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を指すことを目的とする。
【００７１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性に配置される場合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合、当該配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関して、作動可能に連結とは、連結されているＤＮＡ配列が、連続しており、２種のタンパク質コード領域を連結することが必要とされる場合、読み枠において連続することを意味する。スイッチ配列に関して、作動可能に連結とは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。
【００７２】
マーカーの「過剰発現」または「有意により高いレベルの発現」は、発現の評価に用いられるアッセイの標準誤差よりも大きい、被験試料における発現レベルを指し、好ましくは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍以上高い。マーカーの「有意により低いレベルの発現」は、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍以上低い、被験試料における発現レベルを指す。
【００７３】
用語「ポリペプチド断片」または「断片」は、参照ポリペプチドに関連して用いられる場合、参照ポリペプチドそれ自体と比較してアミノ酸残基が欠失されているが、残るアミノ酸配列が通常、参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。かかる欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端、内部またはカルボキシ末端、あるいはその両方で生じ得る。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０または５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長または少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００以上のアミノ酸長である。これは、例えば、全長ポリペプチドの長さに満たない限り、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、１０００、１０２０、１０４０、１０６０、１０８０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２２０、１２４０、１２６０、１２８０、１３００、１３２０、１３４０以上の長さであるおよび／またはこれを含む。あるいは、これは、全長ポリペプチドの長さに満たない限り、かかる範囲以下および／またはこれを除外することができる。
【００７４】
用語「プローブ」は、特異的に企図された標的分子、例えば、マーカーにコードされるまたはこれに対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することができる、いずれかの分子を指す。プローブは、当業者によって合成されてもよく、適切な生物学的調製物に由来してもよい。標的分子を検出する目的で、プローブは、本明細書に記載されている通り標識されるように特異的に設計することができる。プローブとして利用することができる分子の例として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、用語「再編成された」は、それぞれ本質的に完全ＶＨおよびＶＬドメインをコードする立体構造において、Ｖセグメントが、Ｄ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して配置された、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン遺伝子の遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較により同定することができる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１個の組換えされた七量体／九量体相同性エレメントを有するであろう。
【００７６】
本明細書において用いられる場合、用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを目的とする。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の後代も指すことを目的とすることを理解されたい。ある特定の修飾が、続く世代において突然変異または環境的影響のいずれかにより生じ得るため、かかる後代は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、依然として、本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、用語「組換えヒト抗体」は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子がトランスジェニックもしくは染色体導入された動物（例えば、マウス）、またはそれから調製されたハイブリドーマ（さらに後述する）から単離される抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する他のいずれかの手段によって調製、発現、創製または単離される抗体等、組換え手段によって調製、発現、創製または単離されるあらゆるヒト抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列および／または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態において、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（あるいは、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックの動物が用いられる場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）に付すことができ、これにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関係しながら、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてよい配列となる。
【００７８】
本発明において、「応答」は一般に、例えば、臨床介入の進行、有効性または成績における効果の決定に関係する。一部の実施形態において、応答は、臨床介入（例えば、抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体の投与）開始後の腫瘍量および／または容量の変化に直接的に関係する。例えば、過剰増殖障害応答は、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診によって測定された初期サイズおよび寸法と比較した、全身性介入後の腫瘍のサイズに従って評価することができる。応答は、生検または外科的切除後に、腫瘍のノギス測定または病理学的試験によって評価することもできる。応答は、腫瘍容量のパーセンテージ変化等の定量的様式で、または「病理学的完全応答」（ｐＣＲ）、「臨床完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床安定的疾患」（ｃＳＤ）、「臨床進行性疾患」（ｃＰＤ）もしくは他の定性的判断基準等の定性的様式で記録することができる。評価は、臨床介入開始後早期に、例えば、数時間後、数日間後、数週間後、または好ましくは数ヶ月間後に行うことができる。応答評価のための典型的エンドポイントは、臨床介入の終結、または残渣腫瘍細胞および／または腫瘍床の外科的除去である。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、用語「特異的結合」は、所定の抗原への抗体結合を指す。典型的には、抗体は、分析物としてヒトＧａｌ１およびリガンドとして抗体を用いたＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにより低い等、およそ１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合し、所定の抗原または密接に関係した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０．０倍以上の親和性で所定の抗原に結合する。語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と本明細書において互換的に用いられる。
【００８０】
本明細書において用いられる場合、「対象」は、いずれかの健康な動物、哺乳類もしくはヒト、またはウイルス関連ＰＴＬＤ、例えば、ＥＢＶ関連ＰＴＬＤを患ういずれかの動物、哺乳類もしくはヒトを指す。用語「対象」は、「患者」と互換的である。用語「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等、哺乳類および非哺乳類を含む。
【００８１】
言語「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質から分離されている、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を含む。一実施形態において、言語「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量で）未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、より好ましくは、約２０％未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、さらにより好ましくは、約１０％未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、最も好ましくは、約５％未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を含む。
【００８２】
本明細書において用いられる場合、用語「生存」は、次の全てを含む：全生存としても公知の死亡までの生存（前記死亡は、関係する原因または腫瘍に無関係となり得る）；「無再発生存」（用語、再発は、局在化および遠隔再発の両方を含むであろう）；無転移生存；無疾患生存（用語、疾患は、がんおよびこれに関連する疾患を含むであろう）。前記生存の長さは、定義された出発点（例えば、診断時または治療開始時）およびエンドポイント（例えば、死亡、再発または転移）を参照することにより計算することができる。加えて、治療有効性の判断基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所定の期間内における転移の確率および腫瘍再発の確率を含むように拡張することができる。
【００８３】
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」は、本発明のマーカーの転写およびあるとすればＲＮＡ転写物の正常転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全体または部分と相補的または相同なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはかかるＲＮＡもしくはｃＤＮＡのアナログ）である。
【００８４】
本明細書において用いられる場合、用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。用語、Ｔ細胞は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。用語「抗原提示細胞」は、専門の抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）と共に他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を含む。
【００８５】
本明細書において用いられる場合、Ｖセグメントに関連する用語「非再編成」または「生殖系列立体配置」は、Ｖセグメントが組換えられず、ＤまたはＪセグメントに直接隣接する立体配置を指す。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、用語「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸を指す。ベクターの１種類は、その中に追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、ウイルスゲノム中に追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、これに作動的に連結された遺伝子の発現を方向づけることができる。かかるベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」または単純に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドは、通常用いられる形態のベクターであるため、「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に用いることができる。しかし、本発明は、均等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等、かかる他の形態の発現ベクターを含むことを目的とする。
【００８７】
核酸に関して、用語「実質的相同性」は、２種の核酸またはその指定の配列が、最適に整列および比較された場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失により、ヌクレオチドの少なくとも約８０％において、通常、ヌクレオチドの少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％以上、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９７％、９８％、９９％以上において、同一であることを示す。あるいは、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下でストランドの相補体にハイブリダイズする場合、実質的相同性が存在する。
【００８８】
２配列間のパーセント同一性は、該２配列の最適アライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、該配列によって共有される同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）。２配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、後述する非限定的な例に記載されている通り、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【００８９】
２種のヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウエイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブにて利用できる）におけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基テーブル、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ［CABIOS, 4:11 17 (1989)］のアルゴリズムを用いて決定することもできる。加えて、２種のアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウエイトを用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブにて利用できる）におけるＧＡＰプログラムに取り込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ［J. Mol. Biol. (48):444 453 (1970)］アルゴリズムを用いて決定することができる。
【００９０】
本発明の核酸およびタンパク質配列は、例えば、関係する配列を同定するための公共データベースに対する検索を実行するための、「問い合わせ配列」としてさらに用いることができる。かかる検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２により実行して、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３により実行して、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ入りアライメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389 3402に記載されている通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる（ＮＣＢＩウェブサイトのワールドワイドウェブにて利用できる）。
【００９１】
核酸は、細胞全体、細胞ライセートまたは部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および本技術分野において周知の他の技法［F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照］を含む標準技法によって、他の細胞構成成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製される場合、核酸は、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。
【００９２】
ＩＩ．モノクローナル抗体、免疫グロブリンおよびポリペプチド
本発明は、一部には、Ｇａｌ１に対し作られた単離されたモノクローナル抗体またはその断片に関する。かかる分子は、公知の抗Ｇａｌ１抗体またはＧａｌ１タンパク質機能を中和する抗Ｇａｌ１抗体と比較して、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット、細胞間フロー、ＥＬＩＳＡその他等、診断アッセイにおけるＧａｌ１タンパク質を認識する優れた能力を示すことを特徴とする。
【００９３】
Ｇａｌ１遺伝子および遺伝子産物の配列、構造、ドメイン、生物物理学的特徴および機能は、本技術分野において記載されてきた。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Rabinovich et al. (2002) Trends Immunol. 23:313-320；Liu and Rabinovich (2005) Nature Reviews Cancer 5:29-41；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251；Le et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:8932-8941；Vasta et al. (2004) Curr Opin Struct Biol 14:617-630；Toscano et al. (2007) Cyt. Growth Fact. Rev. 18:57-71；Camby et al. (2006) Glycobiol. 16:137R-157R；米国特許出願公開第２００３−０００４１３２号、同第２００３−０１０９４６４号、同第２００６−０１８９５１４号、同第２００９−０１７６２２３号、同第２００９−０１９１１８２号、同第２０１２−００２８８２５号および同第２０１３−００１１４０９号を参照されたい。代表的ヒトＧａｌ１バイオマーカーの核酸およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＮＭ＿００２３０５．３およびＮＰ＿００２２９６．１において公共に利用できる。ヒト以外の生物におけるＧａｌ１オルソログの核酸およびポリペプチド配列は、周知であり、例えば、サルＧａｌ１（ＮＭ＿００１１６８６２７．１およびＮＰ＿００１１６２０９８．１）、チンパンジーＧａｌ１（ＸＭ＿００３９５３８８２．１およびＸＰ＿００３９５３９３１．１；ＸＭ＿００３９５３８８３．１およびＸＰ＿００３９５３９３２．１；ＸＭ＿００１１６２１０４．３およびＸＰ＿００１１６２１０４．１）、マウスＧａｌ１（ＮＭ＿００８４９５．１およびＮＰ＿０３２５２１．１）、ラットＧａｌ１（ＮＭ＿０１９９０４．１およびＮＰ＿０６３９６９．１）、イヌＧａｌ１（ＮＭ＿００１２０１４８８．１およびＮＰ＿００１１８８４１７．１）、ニワトリＧａｌ１（ＮＭ＿２０６９０５．１およびＮＰ＿９９６７８８．１）およびウシＧａｌ１（ＮＭ＿１７５７８２．１およびＮＰ＿７８６９７６．１）を含む。例えば、検出に有用な関連するＧａｌ１配列は、下に示す配列を含む。
【００９４】
【化１】
2016534093.tif 000003
【００９５】
Ｇａｌ１に対し作られた、単離されたモノクローナル抗体またはその断片が提供される。特に、本発明者らは、２０１３年７月２日に、寄託番号ＰＴＡ−１２０４４９にてブダペスト条約（Budapest Treaty）の条項に従ってアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）に、ハイブリドーマを産生するｍＡｂ  ８Ａ１２Ｈ９Ｈ１０（即ち、８Ａ１２抗体）を寄託した。
【００９６】
８Ａ１２  ｍＡｂの軽鎖および重鎖の可変ドメインを配列決定し、その相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを本明細書の表１に示す。例えば、８Ａ１２軽鎖可変（ｖＫ）ポリペプチド配列を次に示す：
ＭＭＳＰＡＱＦＬＦＬＬＶＬＷＩＱＫＴＮＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＬＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＱＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＦＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
（配列中、ＣＤＲ定義およびタンパク質配列ナンバリングは、Ｋａｂａｔ命名法に従って列挙し、ＣＤＲアミノ酸配列に、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の順序で下線を引く）。よって、軽鎖可変ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）は、ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮであり、ＣＤＲ−Ｌ２は、ＬＬＳＫＬＤＳであり、ＣＤＲ−Ｌ３は、ＷＱＧＴＨＦＰＹＴである。８Ａ１２軽鎖可変（ｖＫ）ポリペプチド配列は、次の核酸配列によってコードされる：
【化２】
2016534093.tif 000004
【００９７】
同様に、８Ａ１２重鎖可変（ｖＨ）ポリペプチド配列を次に示す：
ＭＧＷＳＧＩＦＬＦＬＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＡＹＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＲＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＲＱＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＴＶＷＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（配列中、ＣＤＲ定義およびタンパク質配列ナンバリングは、Ｋａｂａｔ命名法に従って列挙し、ＣＤＲアミノ酸配列に、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の順序で下線を引く）。よって、ＣＤＲ−Ｈ１は、ＲＹＮＭＨであり、ＣＤＲ−Ｈ２は、ＲＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧであり、ＣＤＲ−Ｈ３は、ＷＤＹである。８Ａ１２重鎖可変（ｖＨ）ポリペプチド配列は、次の核酸配列によってコードされる：
【化３】
2016534093.tif 000005
【００９８】
抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことが本技術分野において周知であるため、上に表記されている通りに調製される本発明の組換えモノクローナル抗体は、好ましくは、本発明の可変領域の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３（例えば、表１の配列またはその部分を含む）を含む。本抗体は、本発明の可変領域のＣＤＲ２（例えば、表１の配列またはその部分を含む）をさらに含むことができる。本抗体は、本発明の可変領域のＣＤＲ１（例えば、表１の配列またはその部分を含む）をさらに含むことができる。他の実施形態において、本抗体は、ＣＤＲのいかなる組み合わせを含むこともできる。
【００９９】
上述の遺伝子操作された抗体のＣＤＲ１、２および／または３領域は、本明細書に開示されている本発明の可変領域の配列（例えば、表１の配列またはその部分を含む）として正確なアミノ酸配列（複数可）を含むことができる。しかし、当業者であれば、有効にＧａｌ１に結合する抗体の能力を依然として保持しながら、正確なＣＤＲ配列からのある程度の逸脱が可能となり得ることを認めるであろう（例えば、保存的配列修飾）。したがって、別の実施形態において、遺伝子操作された抗体は、例えば、本発明の１種または複数のＣＤＲ（例えば、表１の配列またはその部分を含む）に対し５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一である、１種または複数のＣＤＲで構成され得る。
【０１００】
公知の非ヒトまたはヒト抗体（例えば、マウス抗ヒトＧａｌ１抗体）の構造的特色を用いて、Ｇａｌ１への結合等、本発明の抗体の少なくとも１種の機能的特性を保持する、構造的に関連するヒト抗ヒトＧａｌ１抗体を創製することができる。別の機能的特性は、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける本来の公知の非ヒトまたはヒト抗体の結合の阻害を含む。
【０１０１】
一部の実施形態において、その可変ドメインが、表１に示す重鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を有する少なくともＣＤＲを含む重鎖を含む、ヒトＧａｌ１に結合することができるモノクローナル抗体が提供される。
【０１０２】
同様に、その可変ドメインが、表１に示す軽鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を有する少なくともＣＤＲを含む軽鎖を含む、ヒトＧａｌ１に結合することができるモノクローナル抗体も提供される。
【０１０３】
その可変ドメインが、表１に示す重鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を有する少なくともＣＤＲを含む重鎖を含み；その可変ドメインが、表１に示す軽鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を有する少なくともＣＤＲを含む軽鎖を含む、ヒトＧａｌ１に結合することができるモノクローナル抗体も提供される。
【０１０４】
当業者であれば、かかるパーセンテージ相同性が、所定のＣＤＲ内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の保存的アミノ酸置換を導入することに等しく、これにより達成することができることを留意するであろう。
【０１０５】
本発明のモノクローナル抗体は、その可変ドメインが、表１に示す重鎖可変ドメインＣＤＲからなる群から選択される配列を有する少なくともＣＤＲを含む重鎖と、その可変ドメインが、表１に示す軽鎖可変ドメインＣＤＲからなる群から選択される配列を有する少なくともＣＤＲを含む軽鎖とを含むことができる。
【０１０６】
かかるモノクローナル抗体は、その可変ドメインが、本明細書に記載されているＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択される配列を有する少なくともＣＤＲを含む軽鎖；および／またはその可変ドメインが、本明細書に記載されているＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなる群から選択される配列を有する少なくともＣＤＲを含む重鎖を含むことができる。一部の実施形態において、ヒトＧａｌ１に結合することができるモノクローナル抗体は、本明細書に記載されているＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むかまたはからなる。
【０１０７】
本発明のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインは、表１に表記されているｖＨアミノ酸配列を含むかまたはからなることができる、および／または本発明のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインは、表１に表記されているｖκアミノ酸配列を含むかまたはからなることができる。
【０１０８】
本発明のモノクローナル抗体は、本技術分野において周知のいずれかの技法によって産生および修飾することができる。例えば、かかるモノクローナル抗体は、２０１３年７月２日にＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−１２０４４９として寄託されたハイブリドーマから得ることができるマウス抗体等、マウス抗体となり得る。同様に、かかるモノクローナル抗体は、キメラ、好ましくは、キメラマウス／ヒト抗体となり得る。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、可変ドメインが、ヒトアクセプターフレームワーク領域と、存在してもよいヒト定常ドメインと、上に定義されているマウスＣＤＲ等の非ヒトドナーＣＤＲとを含むようなヒト化抗体である。
【０１０９】
本発明は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディ；ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない、前記モノクローナル抗体の断片をさらに提供する。例えば、Ｇａｌ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４その他等、多数の免疫阻害性分子は、かかる分子の発現を効率的に特徴付けるために、二特異性または多特異性様式で検出することができる。
【０１１０】
本発明のモノクローナル抗体の他の断片も企図される。例えば、その可変ドメインが、表１に示す少なくともＣＤＲを含む個々の免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖が提供される。一実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、表１に示す重鎖または軽鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を有する少なくともＣＤＲを含む。別の実施形態において、免疫グロブリン軽鎖は、本明細書に記載されている（例えば、表１に示す）軽鎖または重鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を有する少なくともＣＤＲを含み、これもまた提供される。
【０１１１】
一部の実施形態において、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖は、本明細書に記載されているＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２またはＣＤＲ−Ｈ３のうち少なくとも１種を含む可変ドメインを含む。かかる免疫グロブリン重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のうち少なくとも１種を含むかまたはからなることができる。かかる免疫グロブリン軽鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３のうち少なくとも１種を含むかまたはからなることができる。
【０１１２】
他の実施形態において、本発明に係る免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖は、表１に示すそれぞれｖＨまたはｖκ可変ドメイン配列を含むかまたはからなる。
【０１１３】
本発明は、本明細書に記載されているｖＨ可変ドメイン、ｖκ可変ドメイン、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをさらに提供する。
【０１１４】
本発明の抗体、免疫グロブリンおよびポリペプチドは、単離（例えば、精製）された形態で用いることができるか、または膜もしくは脂質小胞（例えば、リポソーム）等、ベクター中に含有され得る。
【０１１５】
ＩＩＩ．核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明のさらに別の目的は、本発明のモノクローナル抗体およびその断片、免疫グロブリンならびにポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明は、ｍＡｂ  ８Ａ１２のｖＨドメインまたはｍＡｂ  ８Ａ１２のｖＨドメインをコードする核酸配列に関する。
【０１１７】
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクター等、いずれか適したベクターに含まれ得るＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【０１１８】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。よって、本発明のさらに別の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【０１１９】
かかるベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターその他等、調節エレメントを含んで、対象への投与後に前記ポリペプチドの発現をもたらすまたは方向づけることができる。動物細胞のための発現ベクターにおいて用いられるプロモーターおよびエンハンサーの例として、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason J O et al. 1985）およびエンハンサー（Gillies S D et al. 1983）その他が挙げられる。
【０１２０】
動物細胞のためのいずれかの発現ベクターを用いることができる。適したベクターの例として、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）その他が挙げられる。プラスミドの他の代表例として、複製起点を含む複製プラスミド、または例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲその他等の組込みプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの代表例として、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。かかる組換えウイルスは、パッケージング細胞の遺伝子導入またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性遺伝子導入等、本技術分野において公知の技法により産生することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ陽性細胞、２９３細胞等が挙げられる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号およびＷＯ９４／１９４７８に見出すことができる。
【０１２１】
本発明のさらに別の目的は、本発明に係る核酸および／またはベクターによって遺伝子導入、感染または形質転換された細胞に関する。用語「形質転換」は、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列にコードされるタンパク質または酵素を産生することができるような、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【０１２２】
本発明の核酸を用いて、適した発現系において本発明の組換えポリペプチドを産生することができる。用語「発現系」は、適した条件下における、例えば、ベクターによって運ばれ宿主細胞へと導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
【０１２３】
一般的な発現系は、Ｅ．コリ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターを含む。宿主細胞の他の例として、原核細胞（細菌等）および真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を限定することなく挙げられる。具体例として、Ｅ．コリ、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）またはサッカロマイセス属（Saccharomyces）酵母、哺乳類細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）と共に、初代または樹立された哺乳類細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生される）が挙げられる。例として、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損したＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称される）その他も挙げられる。この細胞において発現されると、キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が増強されるため、ＹＢ２／０細胞が好まれる。
【０１２４】
本発明は、また、本発明に従って本発明の抗体またはポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を産生する方法であって、（ｉ）インビトロまたはエクスビボ（ex vivo）で、上述の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞に導入することと、（ｉｉ）インビトロまたはエクスビボで、得られた組換え宿主細胞を培養することと、（ｉｉｉ）前記抗体またはポリペプチドを発現および／または分泌する細胞を選択してもよいこととからなる工程を含む方法に関する。かかる組換え宿主細胞は、本発明の抗体およびポリペプチドの産生のために用いることができる。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されているポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。よって、本実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出および／または定量化するために用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託されたライブラリーにおける部分的または全長クローンの同定、単離または増幅に用いることができる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された、あるいはヒトまたは哺乳類核酸ライブラリー由来のｃＤＮＡと相補的なゲノムまたはｃＤＮＡ配列である。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％全長配列、好ましくは、少なくとも８５％または９０％全長配列、より好ましくは、少なくとも９５％全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーは、稀な配列の表示を増加させるよう正規化することができる。低または中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には、但し排他的にではなく、相補的配列と比べて低下した配列同一性を有する配列と共に用いられる。中等度および高ストリンジェンシー条件は、より高い同一性の配列に用いられてもよい。低ストリンジェンシー条件は、約７０％配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガスまたはパラロガス配列の同定に用いることができる。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドにコードされる抗体の少なくとも部分をコードしてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに用いることができる核酸配列を包含する。例えば、それぞれ全体的に参照により本明細書に組み込まれる、Ausubel、上記参照；Colligan、上記参照を参照されたい。
【０１２６】
ＩＶ．抗体を産生する方法
本発明の抗体およびその断片、免疫グロブリンおよびポリペプチドは、単独または組み合わせたいずれかの化学的、生物学的、遺伝的または酵素的技法等が限定することなく挙げられる、本技術分野において公知のいずれかの技法によって産生することができる。
【０１２７】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準技法によって、前記抗体またはポリペプチドを容易に産生することができる。例えば、これは、好ましくは、市販のペプチド合成器具（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製等、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を用いてメーカーの説明書に従った周知の固相方法を用いて合成することができる。あるいは、本発明の抗体および他のポリペプチドは、本技術分野において周知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。例えば、このような断片は、発現ベクターへと所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を取り込み、適した真核生物または原核生物宿主へとかかるベクターを導入し、該宿主は所望のポリペプチドを発現し、後にそこから周知技法を用いて単離した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができる。
【０１２８】
特に、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドを産生する方法であって、（ｉ）前記抗体またはポリペプチドを発現させるのに適した条件下で、本発明に係る形質転換された宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収することとからなる工程を含む方法にさらに関する。
【０１２９】
本発明の抗体および他のポリペプチドは、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー等、従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離される。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために用いることもできる。例えば、それぞれ全体的に参照により本明細書に組み込まれる、Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。
【０１３０】
本発明のキメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ）は、以前に記載されたＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸（nucleic）配列を得て、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにこれを挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞に導入することにより該コード配列を発現させることにより産生することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインは、ＩｇＧクラスまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４等のそのサブクラス等、ヒト免疫グロブリンに属するいずれかの領域となり得る。同様に、ヒトキメラ抗体のＣＬは、カッパークラスまたはラムダクラス等、Ｉｇに属するいずれかの領域となり得る。標準組換えＤＮＡ技法を用いて産生することができる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法によって産生することができ、例えば、Robinson et al.、国際出願（International Patent Publication）ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira et al.、欧州特許出願第１８４，１８７号；Taniguchi, M.、欧州特許出願第１７１，４９６号；Morrison et al.、欧州特許出願第１７３，４９４号；Neuberger et al.、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly et al.、米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly et al.、欧州特許出願第１２５，０２３号；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043；Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526；Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218；Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005；Wood et al. (1985) Nature 314:446-449；Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)；Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207；Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214；Winter、米国特許第５，２２５，５３９号；Jones et al. (1986) Nature 321:552-525；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534；およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用いる。
【０１３１】
加えて、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているプロトコール等、標準プロトコールに従って作製することができる。別の実施形態において、抗体鎖または特異的結合対メンバーは、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，８７１，９０７号または同第５，７３３，７４３号に記載されている本技術分野において公知の技法を用いて、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖および複製可能なジェネリックディスプレイパッケージの構成成分の融合体をコードする核酸分子を含むベクターと、単一の結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含有するベクターと間の組換えにより産生することができる。本発明のヒト化抗体は、以前に記載された通りにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得て、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにこれを挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へと該発現ベクターを導入することによりこの遺伝子を発現させることにより産生することができる。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクターに存在する型か、両方の遺伝子が同じベクターに存在する型（タンデム型）のいずれかとなり得る。
【０１３２】
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子導入技法に基づきヒト化抗体を産生するための方法は、本技術分野において周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988；Neuberger M S. et al. 1985を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）［ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan EA (1991)；Studnicka G M et al. (1994)；Roguska M A. et al. (1994)］および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、本技術分野において公知の種々の技法を用いてヒト化することができる。かかる抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照）。
【０１３３】
同様に、本明細書に記載されている二重特異性または多特異性抗体は、標準手順に従って作製することができる。例えば、トリオーマおよびハイブリッド型ハイブリドーマは、二重特異性または多特異性抗体を分泌することができる細胞株の２例である。ハイブリッド型ハイブリドーマまたはトリオーマによって産生される二重特異性および多特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号に開示されている。かかる抗体は、化学的手段［Staerz et al. (1985) Nature 314:628、およびPerez et al. (1985) Nature 316:354］およびハイブリドーマ技術［Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453、およびStaerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241］によって構築することもできる。あるいは、かかる抗体は、ハイブリドーマまたは異なる抗体を作製する他の細胞を融合し、続いて所望の抗体を産生および共集合するクローンを同定することによりヘテロハイブリドーマを作製することにより生成することもできる。これは、完全免疫グロブリン鎖またはＦａｂおよびＦｖ配列等のその部分の化学的または遺伝的コンジュゲートにより生成することもできる。抗体構成成分は、本明細書に記載されている１種または複数の免疫阻害バイオマーカーを含む、本発明の１種または複数のバイオマーカーのポリペプチドまたはその断片に結合することができる。
【０１３４】
加えて、抗体断片を産生するための方法が周知である。例えば、本発明のＦａｂ断片は、ヒトＧＡＬ１と特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、パパインで処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系または真核生物発現系のためのベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入して、Ｆａｂを発現させることにより産生することができる。
【０１３５】
同様に、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、ＧＡＬ１と特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、ペプシンで処理することにより得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２断片は、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して後述するＦａｂ’を結合させることにより産生することができる。
【０１３６】
本発明のＦａｂ’断片は、ｈＧＡＬ１と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤、ジチオスレイトールで処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂ’断片は、原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入して、その発現を行うことにより産生することができる。
【０１３７】
加えて、本発明のｓｃＦｖは、以前に記載された通りにＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに該ＤＮＡを挿入し、続いて原核生物または真核生物（必要に応じて）に該発現ベクターを導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖ断片を生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知技術を用いることができ、この技術は、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択することと、それを公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖ断片フレームワークに移植することに関与する（例えば、ＷＯ９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ０１７３４９４を参照）。
【０１３８】
Ｖ．抗体、免疫グロブリンおよびポリペプチドの修飾
本明細書に記載されている抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましくなり得る。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲにおいて非ヒト動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬにおけるＣＤＲのみを単純に移植することにより、ヒト化抗体が産生される場合、非ヒト動物に由来する本来の抗体と比較して抗原結合活性が低下することが公知である。ＣＤＲのみならず、同様にＦＲにおける非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの数個のアミノ酸残基が、抗原結合活性と直接的にまたは間接的に関連することが考慮される。したがって、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基によるこれらのアミノ酸残基の置換は、結合活性を低下させ、アミノ酸を非ヒト動物に由来する本来の抗体のアミノ酸残基に置き換えることにより補正され得る。
【０１３９】
本発明の抗体の構造およびこれをコードするＤＮＡ配列に修飾および変化を為すことができ、依然として、望ましい特徴を有する抗体およびポリペプチドをコードする機能的分子を得ることができる。例えば、活性の認識できる損失を伴うことなく、タンパク質構造におけるある特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の相互作用能力および性質は、該タンパク質の生物学的機能活性を定義するため、同様の性質を有するタンパク質を得ながら、タンパク質配列において、また、当然ながら、配列をコードするそのＤＮＡにおいて、ある特定のアミノ酸置換を為すことができる。よって、その生物学的活性の認識できる損失を伴うことなく、本発明の抗体配列または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に様々な変化を為すことができることが企図される。
【０１４０】
一実施形態において、アミノ酸変化は、遺伝暗号の保存に基づき保存的置換をコードするように、ＤＮＡ配列におけるコドンを変化させることにより達成することができる。特に、遺伝暗号（下に示す）によって定義される通り、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、該タンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間には、公知かつ確定的な一致がある。同様に、遺伝暗号によって定義される通り、特定の核酸のヌクレオチド配列と、該核酸にコードされるアミノ酸配列との間には、公知かつ確定的な一致がある。
【０１４１】
遺伝暗号
アラニン（Ａｌａ、Ａ）  ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）  ＡＧＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ
アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）  ＡＡＣ、ＡＡＴ
アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）  ＧＡＣ、ＧＡＴ
システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）  ＴＧＣ、ＴＧＴ
グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）  ＧＡＡ、ＧＡＧ
グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）  ＣＡＡ、ＣＡＧ
グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）  ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ
ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）  ＣＡＣ、ＣＡＴ
イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）  ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＴ
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）  ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ
リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）  ＡＡＡ、ＡＡＧ
メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）  ＡＴＧ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）  ＴＴＣ、ＴＴＴ
プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）  ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ
セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）  ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ
スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）  ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ
トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）  ＴＧＧ
チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）  ＴＡＣ、ＴＡＴ
バリン（Ｖａｌ、Ｖ）  ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ
終結シグナル（終わり）  ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ
【０１４２】
遺伝暗号の重要な周知の特色は、その重複性であり、それによって、タンパク質の作製に用いられる大部分のアミノ酸に対し、２種以上のコードヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上に説明）。したがって、多数の異なるヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列をコードすることができる。かかるヌクレオチド配列は、あらゆる生物において同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ただし、ある特定の生物は、ある配列を他の配列よりも効率的に翻訳することができる）、機能的均等であると考慮される。さらに、時には、所定のヌクレオチド配列においてプリンまたはピリミジンのメチル化変異体を見出すことができる。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンおよび対応するアミノ酸の間のコード関係性に影響を与えない。
【０１４３】
ポリペプチドのアミノ酸（amino）配列に変化を生じさせる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質への相互作用的生物学的機能の付与における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対的疎水性親水性指標特性が、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでこれが、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原その他と該タンパク質との相互作用を規定することが許容される。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいて疎水性親水性指標に割り当てられ、これを次に示す：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（＜ＲＴＩ  ３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１４４】
ある特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換し、依然として、同様の生物学的活性を有するタンパク質をもたらす、即ち、依然として、生物学的機能的に均等なタンパク質を得ることができることが本技術分野において公知である。
【０１４５】
上に概要を述べる通り、したがってアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズその他に基づく。様々な前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、次のもの含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【０１４６】
本発明の抗体のアミノ酸修飾の別の種類は、例えば、安定性を増加させるような、抗体の本来のグリコシル化パターンの変更に有用となり得る。「変更」とは、抗体に見出される１個または複数の糖鎖の欠失および／または抗体に存在しない１個または複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型である。「Ｎ結合型」は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の取り付けを指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素による取り付けのための認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうち１種または複数を含有するように（Ｎ結合型グリコシル化部位のため）、アミノ酸配列を変更することにより簡便に達成される。共有結合修飾の別の種類は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素によるカップリングに関与する。これらの手順は、ＮまたはＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点において有利である。用いられているカップリング機序に応じて、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システイン等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリン等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファン等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に糖（複数可）を取り付けることができる。例えば、かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
【０１４７】
同様に、抗体に存在するいずれかの糖鎖の除去は、化学的にまたは酵素により達成することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物、トリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理は、抗体をインタクトにしたまま、連結する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分または全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Sojahr H. et al. (1987)およびEdge, A S. et al. (1981)によって記載されている。抗体における糖鎖の酵素による切断は、Thotakura, N R. et al. (1987)によって記載されている種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。
【０１４８】
他の修飾は、イムノコンジュゲートの形成に関与し得る。例えば、共有結合修飾の１種類において、抗体またはタンパク質は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に表記されている様式で、種々の非タンパク質性ポリマーの１種、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに共有結合により連結される。
【０１４９】
異種薬剤と本発明の抗体または他のタンパク質とのコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物［ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等］、ビス−ジアゾニウム誘導体［ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等］、ジイソシアネート［トルエン（tolyene）２，６ジイソシアネート等］およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）の二官能性誘導体等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて行うことができる。例えば、炭素標識された１−イソチオシアネートベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジオヌクレオチドのコンジュゲートのための例示的なキレート化剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
【０１５０】
ＶＩ．本発明の使用および方法
本明細書に記載されている本発明の抗Ｇａｌ１抗体、免疫グロブリン、ポリペプチドおよび核酸は、Ｇａｌ１発現の検出に基づく多数の予測医学アッセイ（例えば、診断アッセイ、予後アッセイおよび臨床治験モニタリング）において用いることができる。用語「検出」は、本明細書において用いられる場合、対照の参照ありまたはなしの定性的および／または定量的検出（レベル測定）を含む。本明細書に記載されている通り、本発明のＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片は、次の活性のうち１種または複数を有する：１）その天然の結合パートナー（複数可）への結合および／またはその活性のモジュレート、２）細胞内または細胞間シグナル伝達のモジュレート、３）リンパ球の活性化および／または増殖のモジュレート、４）生物、例えば、マウスまたはヒト等の哺乳類生物の免疫応答のモジュレート、ならびに５）低酸素関連血管新生のモジュレート。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Toscano et al. (2007) Cyt Growth Fact Rev 18:57-71；Camby et al. (2006) Glycobiol 16:137R-157Rを参照されたい。
【０１５１】
よって、本発明の一態様は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞または組織）の文脈においてＧａｌ１ポリペプチド発現を決定して、これにより、試料におけるＧａｌ１ポリペプチドのレベルを決定し、かかるＧａｌ１レベルによって示される障害を個体が患っているかを決定し、かつ／またはかかる障害の状態を決定するための診断アッセイに関する。例えば、本発明の抗体は、異常Ｇａｌ１発現に関連するがん疾患のステージ分類に有用である。
【０１５２】
本発明は、個体がかかる障害を発症するリスクがあるかを決定するための予後（または予測）アッセイも提供する。本発明の別の態様は、臨床治験におけるＧａｌ１の発現または活性における薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響のモニタリングに属する。
【０１５３】
本明細書に記載されているいずれかの方法において、Ｇａｌ１発現は、単独で、または他の分子の発現と組み合わせて検出することができる。実施例に記載されている通り、例えば、Ｇａｌ１は、ＰＤ−Ｌ１等、他の免疫阻害性分子と共に異常に同時発現される。いくつかの分子のコンビナトリアル検出（例えば、逐次的または同時的）は、治療介入の相乗作用および／または障害サブタイプの個別化されたより高分解能の診断に関する有用な情報を提供することができる。一部の実施形態において、Ｇａｌ１は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＩＣＯＳ−Ｌからなる群から選択される１種または複数のマーカーと共にコンビナトリアルに検出される。
【０１５４】
１．診断アッセイ
本発明は、一部には、生物学的試料が、Ｇａｌ１を発現するかおよび／またはＧａｌ１のレベルが、モジュレートされているＧａｌ１である（例えば、上方調節または下方調節されている）かを的確に分類して、これによりがん等、目的の障害の状態を示すための方法、システムおよびコードを提供する。一部の実施形態において、本発明は、Ｇａｌ１に媒介されるがんまたはそのサブタイプと関連するまたはそのリスクがある（Ｇａｌ１試料として公知）、統計的アルゴリズムおよび／または経験的データ（例えば、Ｇａｌ１の存在、非存在またはレベル）を用いて、試料（例えば、対象由来の）を分類するために有用である。
【０１５５】
Ｇａｌ１またはその断片の発現または活性のレベルを検出するため、よって、Ｇａｌ１またはその臨床サブタイプに媒介される疾患または障害と試料が関連するかを分類するのに有用な例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ることと、前記生物学的試料におけるＧａｌ１の発現または活性のレベルが検出されるように、Ｇａｌ１を検出することができる本発明の抗体またはその抗原結合断片と前記生物学的試料を接触させることに関与する。一部の実施形態において、少なくとも１種の抗体またはその抗原結合断片が用いられ、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上のかかる抗体または抗体断片は、組み合わせて（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて）または連続的に用いることができる。ある特定の事例において、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計分類子システムである。例えば、単一の学習統計分類子システムを用いて、Ｇａｌ１の予測または確率値および存在またはレベルに基づきＧａｌ１試料として試料を分類することができる。単一の学習統計分類子システムの使用は、典型的には、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の感度、特異性、陽性適中率、陰性適中率および／または全体的精度によりＧａｌ１試料として試料を分類する。
【０１５６】
他の適した統計的アルゴリズムは、当業者に周知である。例えば、学習統計分類子システムは、複合データセット（例えば、目的とするマーカーのパネル）に適応させることができ、かかるデータセットに基づき決定することができる機械学習アルゴリズム技法を含む。一部の実施形態において、分類木（例えば、ランダムフォレスト）等、単一の学習統計分類子システムが用いられる。他の実施形態において、好ましくは、タンデムに、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の学習統計分類子システムの組み合わせが用いられる。学習統計分類子システムの例として、帰納的学習（例えば、ランダムフォレスト、分類および回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、ブースト木等、決定／分類木）、確率的で近似的に正しい（Probably Approximately Correct）（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習［例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロン等のパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの適用、信念ネットワークにおけるベイジアン学習等］、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習および時間差学習等、公知環境における受動的学習、未知環境における受動的学習、未知環境における能動的学習、学習作用値関数、強化学習の適用等）および遺伝的アルゴリズムおよび進化プログラミングを用いるシステムが挙げられるがこれらに限定されない。他の学習統計分類子システムは、サポートベクターマシン（例えば、Ｋｅｒｎｅｌ方法）、多変量適応回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズム、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎアルゴリズム、ガウス分布の混合物、傾斜降下アルゴリズムおよび学習ベクトル量子化（learning vector quantization）（ＬＶＱ）を含む。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、臨床医、例えば、組織病理学者または腫瘍学者にＧａｌ１試料分類結果を送ることをさらに含む。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明の方法は、個体が、Ｇａｌ１の異常発現または活性に関連する状態または障害を有する確率の形態の診断をさらに提供する。例えば、個体は、この状態または障害を有する約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の確率を有することができる。また別の実施形態において、本発明の方法は、個体における状態または障害の予後をさらに提供する。場合によっては、Ｇａｌ１試料として試料を分類する方法は、さらに、試料が得られた個体の症状（例えば、臨床因子）に基づく。症状または症状の群は、例えば、リンパ球数、白血球数、赤血球（ertythrocyte）沈降速度、下痢、腹痛、筋痙攣、発熱、貧血、体重減少、不安、抑うつおよびこれらの組み合わせとなり得る。一部の実施形態において、Ｇａｌ１の異常発現または活性に関連する状態または障害を有すると個体を診断した後に、該個体への、該状態または障害に関連する１種または複数の症状の治療に有用な治療的有効量の薬物（例えば、化学療法剤）の投与が行われる。
【０１５８】
一実施形態において、本方法は、対照生物学的試料（例えば、Ｇａｌ１に媒介される状態または障害ではない対象由来の生物学的試料）、Ｇａｌ１に媒介される状態もしくは障害の緩解中もしくは発症前の対象由来の生物学的試料、またはＧａｌ１に媒介される状態もしくは障害の発症の治療中の対象由来の生物学的試料を得ることにさらに関与する。
【０１５９】
Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片の存在または非存在を検出するための例示的な方法は、Ｇａｌ１ポリペプチドに結合することができる本発明の抗体またはその断片、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。かかる薬剤は標識され得る。抗体に関する用語「標識される」は、プローブまたは抗体へと検出可能物質をカップリング（即ち、物理的に連結）することによる、プローブまたは抗体の直接標識と共に、直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することを目的とする。間接標識の例として、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出が挙げられる。用語「生物学的試料」は、血清等、対象から単離される組織、細胞および生体液と共に、対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことを目的とする。即ち、本発明の検出方法を用いて、生物学的試料においてインビトロで、およびインビボで、Ｇａｌ１またはその断片を検出することができる。Ｇａｌ１ポリペプチドの検出のためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、細胞内フローサイトメトリーおよび関連する技法、ならびに免疫蛍光法を含む。さらに、Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片の検出のためのインビボ技法は、対象への標識された抗Ｇａｌ１抗体の導入を含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を標準イメージング技法により検出することができる、放射性、発光、蛍光または他の同様のマーカーで標識することができる。
【０１６０】
一実施形態において、生物学的試料は、被験対象由来のポリペプチド分子を含有する。好まれる生物学的試料は、対象から従来の手段によって単離される、血清、腫瘍微小環境、腫瘍周囲または腫瘍内である。
【０１６１】
別の実施形態において、本方法は、対照対象から対照生物学的試料を得ることと、生物学的試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の存在が検出されるように、Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片を検出することができる化合物または薬剤に対照試料を接触させることと、対照試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の存在を、被験試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の存在と比較することとにさらに関与する。
【０１６２】
さらに他の実施形態において、抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにおける抗体の使用のための構成成分またはデバイスに結合させることができる。非限定的な例として、これらのアッセイにおける使用のための固体表面に固定化された抗体が挙げられる（例えば、上述の光または放射線放射に基づく検出可能な標識に連結および／またはコンジュゲートされる）。他の実施形態において、抗体は、「サンドイッチ」または競合的アッセイにおける等、免疫クロマトグラフィーまたは免疫化学的アッセイの使用によるＧａｌ１の検出のためのデバイスまたはストリップに結合している。かかるデバイスまたはストリップの追加的な例は、家庭用検査（home testing）または迅速なポイントオブケア検査用に設計されたデバイスまたはストリップである。さらに別の例として、単一の試料における複数の分析物の同時解析用に設計されたデバイスまたはストリップが挙げられる。例えば、本発明の非標識抗体は、生物学的試料における「捕捉」Ｇａｌ１ポリペプチドに適用することができ、捕捉（または固定化）されたＧａｌ１ポリペプチドは、検出のための本発明の標識型の抗Ｇａｌ１抗体に結合することができる。イムノアッセイの他の標準実施形態は、当業者に周知であり、例えば、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫組織病理診断、免疫組織化学的検査および病理組織診断に基づくアッセイを含む。
【０１６３】
２．予後アッセイ
本明細書に記載されている診断方法をさらに利用して、異常または望まれないＧａｌ１発現レベルに関連する障害であるまたはその発症リスクがある対象を同定することができる。本明細書において用いられる場合、用語「異常」は、野生型または正常Ｇａｌ１発現または活性から逸脱したＧａｌ１発現または活性を含む。異常発現または活性は、発現または活性の増加または減少と共に、発現の野生型発生パターンまたは発現の細胞下パターンに従わない発現または活性を含む。例えば、異常Ｇａｌ１発現または活性は、Ｇａｌ１遺伝子またはその調節配列における突然変異が、Ｇａｌ１遺伝子が過小発現または過剰発現される原因となる事例と、かかる突然変異が、非機能的Ｇａｌ１ポリペプチドまたは野生型様式で機能しないポリペプチド、例えば、Ｇａｌ１結合パートナー（複数可）と相互作用しないポリペプチドまたは非Ｇａｌ１結合パートナー（複数可）と相互作用するポリペプチドをもたらす状況を含むことを目的とする。本明細書において用いられる場合、用語「望まない」は、免疫細胞活性化等、生物学的応答に関与する望まない現象を含む。例えば、用語、望まないは、対象において望ましくないＧａｌ１発現または活性を含む。
【０１６４】
実施例においてさらに説明される通り、異常Ｇａｌ１発現に関連する多くの障害が、当業者に公知である。Ｇａｌ１は、選択リンパ系悪性腫瘍、ウイルスにより誘導されるがんおよび多くの固形腫瘍を含む複数の腫瘍型によって発現される。一部の実施形態において、障害は、ＡＰ−１依存性リンパ系悪性腫瘍［例えば、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）および未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）］およびＭＬＬ再編成ＡＬＬのうち１種または複数等、リンパ系悪性腫瘍サブタイプである。一試験において、あらゆる原発性ＭＬＬ再編成ＡＬＬは、転位置パートナーにかかわらずＧａｌ１陽性であった一方、８１種の生殖系列ＭＬＬ再編成ＡＬＬのうち２種のみが、Ｇａｌ１を発現した［Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130］。他の実施形態において、障害は、ＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性（lymphproliferative）障害（ＰＴＬＤ）、上咽頭癌およびカポジ肉腫のうち１種または複数等、ウイルスにより誘導される悪性腫瘍である。さらに他の（toerh）実施形態において、障害は、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌およびメラノーマのうち１種または複数等、固形腫瘍である。一般に、Ｇａｌ１発現は、これらの固形腫瘍の全てにおける有害予後マーカーである。例えば、Ｇａｌ１のサイレンシングは、乳がん、前立腺がん、肺がんおよびメラノーマにおける抗腫瘍効果に関連する。
【０１６５】
前述の診断アッセイまたは後述のアッセイ等、本明細書に記載されているアッセイを利用して、Ｇａｌ１ポリペプチド発現の誤調節に関連する障害であるまたはその発症リスクがある対象を同定することができる。よって、本発明は、異常または望まないＧａｌ１発現に関連する障害を同定するための方法であって、被験試料が対象から得られ、Ｇａｌ１ポリペプチドが検出され、Ｇａｌ１ポリペプチドの存在が、異常または望まないＧａｌ１発現または活性に関連する障害であるまたはその発症リスクがある対象のために診断される方法を提供する。本明細書において用いられる場合、「被験試料」は、目的とする対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、被験試料は、腫瘍微小環境、腫瘍周囲（perimtural）区域および／または腫瘍内区域の病理組織診断用スライド等、生体液（例えば、脳脊髄液または血清）、細胞試料または組織であり得る。
【０１６６】
さらに、本明細書に記載されている予後アッセイを用いて、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子または他の薬物候補）を対象に投与して、異常または望まないＧａｌ１発現または活性に関連するかかる障害を治療することができるかを決定することができる。例えば、かかる方法を用いて、薬剤の１種または組み合わせで対象を有効に治療することができるかを決定することができる。よって、本発明は、異常または望まないＧａｌ１発現に関連する障害を治療するための１種または複数の薬剤で対象を有効に治療することができるかを決定するための方法であって、被験試料が得られ、Ｇａｌ１ポリペプチドが検出される（例えば、Ｇａｌ１ポリペプチド発現の存在量が、薬剤を投与して異常または望まないＧａｌ１発現に関連する障害を治療することができる対象のために診断される）方法を提供する。
【０１６７】
本明細書に記載されている方法は、例えば、臨床設定で簡便に用いて、Ｇａｌ１に関与する疾患または疾病の症状または家族歴を示す患者を診断することができる本明細書に記載されている少なくとも１種の抗体試薬を含む、例えば、予めパッケージされた診断キットを利用することにより行うことができる。
【０１６８】
さらに、本明細書に記載されている予後アッセイにおいて、Ｇａｌ１が発現されるいずれかの細胞型または組織を利用することができる。
【０１６９】
本発明の別の態様は、関連および／または層別化解析のための本明細書に記載されている組成物および方法の使用であって、異常Ｇａｌ１発現に関連する障害を有する個体由来の生物学的試料におけるＧａｌ１の発現が解析され、情報が、好ましくは同様の年齢および人種の対照（例えば、該障害ではない個体；対照は、「健康」もしくは「正常」個体または所定のタイムラプス試験における初期時点のものとも称され得る）に対し比較される使用を含む。患者および対照の適切な選択は、関連および／または層別化試験の成功に重要である。したがって、十分に特徴付けられた表現型を有する個体のプールが、非常に望ましい。疾患診断、疾患素因スクリーニング、疾患予後、薬物応答性決定（薬理ゲノミクス）、薬物毒性スクリーニング等のための判断基準は、本明細書に記載されている。
【０１７０】
遺伝的関連および／または層別化試験のために異なる試験設計を用いることができる［Modern Epidemiology, Lippincott Williams & Wilkins (1998), 609-622］。患者の応答が干渉されない観察試験が、最も頻繁に行われる。第１の型の観察試験は、疾患の疑われる原因が存在する人物の試料と、疑われる原因が存在しない人物の別の試料を同定し、続いて２種の試料における疾患の発症頻度を比較する。これらの試料採取された集団は、コホートと呼ばれ、試験は、前向き試験である。他の型の観察試験は、症例対照または後向き試験である。典型的症例対照試験において、試料は、結論が導かれるべき集団（標的集団）における、疾患のある特定の徴候等、目的とする表現型を有する個体（症例）および表現型を持たない個体（対照）から収集される。続いて、疾患の可能性のある原因は、後向きに調査される。症例対照試験における試料収集の時間および費用は、前向き試験よりも相当に少ないため、症例対照試験は、少なくとも探索および発見ステージにおいて、遺伝的関連試験においてより一般的に用いられる試験設計である。
【０１７１】
あらゆる関連する表現型および／または遺伝子型情報が得られた後に、統計解析が行われて、個体のアレルまたは遺伝子型の存在と表現型的特徴の間にいずれかの有意な相関が存在するかを決定する。好ましくは、遺伝的関連のための統計検定を行う前に、データ点検およびクリーニングが先ず行われる。試料の疫学的および臨床データは、本技術分野において周知の表およびグラフを含む記述統計学により要約することができる。好ましくは、データ検証が行われて、データ完了、矛盾エントリーおよび外れ値をチェックする。続いて、カイ二乗検定およびｔ検定（分布が正規ではない場合、ウィルコクソン順位和検定）を用いて、それぞれ離散および連続型変数に関する症例および対照の間の有意差をチェックすることができる。
【０１７２】
遺伝的関連検査の性能における重要な決定は、検査のｐ値が該レベルに達する場合有意な関連を明言することができる、有意性レベルの決定である。その後の確証的検査において陽性ヒットが追跡される探索性解析において、未調整のｐ値＜０．２（寛大な解釈の側の有意性レベル）は、例えば、疾患のある特定の表現型的特徴とＧａｌ１発現レベルの有意な関連に関する仮定の作成に用いることができる。ｐ値＜０．０５（本技術分野において伝統的に用いられる有意性レベル）が、疾患との関連を有する考慮されるべきレベルのために達成されることが好まれる。同じ供給源のより多くの試料または異なる供給源由来の異なる試料において、確証的解析においてヒットが追跡される場合、実験的な誤り率を０．０５に維持しながら、過剰な数のヒットの回避に関する複数の検査に対する調整が行われるであろう。複数の検査を調整して異なる種類の誤り率を制御するための異なる方法が存在するが、一般的に用いられるが幾分保存的な方法は、実験的なまたは家族的な誤り率を制御するためのボンフェローニ補正である［Multiple comparisons and multiple tests, Westfall et al, SAS Institute (1999)］。偽発見率ＦＤＲを制御するための並べ替え検定は、より強力なものとなり得る［Benjamini and Hochberg, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 57, 1289-1300, 1995, Resampling-based Multiple Testing, Westfall and Young, Wiley (1993)］。検定が依存性であり、実験的な誤り率の制御とは対照的に偽発見率の制御が十分である場合、多重度を制御するためのかかる方法が好まれるであろう。
【０１７３】
遺伝的または非遺伝的な個体リスク因子が、疾患の素因のために見出されたら、分類／予測スキームをセットアップして、個体が、その表現型および／または遺伝子型ならびに他の非遺伝的リスク因子に依存するカテゴリー（例えば、疾患または非疾患）を予測することができる。別々の形質のロジスティック回帰および連続的形質の線形回帰は、かかる課題のための標準技法である［Applied Regression Analysis, Draper and Smith, Wiley (1998)］。さらに、他の技法は、分類のセットアップに用いることもできる。かかる技法として、異なる方法の性能の比較における使用に適した、ＭＡＲＴ、ＣＡＲＴ、ニューラルネットワークおよび判別解析が挙げられるがこれらに限定されない［The Elements of Statistical Learning, Hastie, Tibshirani & Friedman, Springer (2002)］。
【０１７４】
３．臨床治験における効果のモニタリング
Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片の発現または活性における薬剤（例えば、化合物、薬物または小分子）の影響（例えば、細胞増殖および／または遊走のモジュレーション）のモニタリングは、基礎薬物スクリーニングのみならず、臨床治験においても適用することができる。例えば、Ｇａｌ１遺伝子発現、ポリペプチドレベルを減少させるため、またはＧａｌ１活性を下方調節するための、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の有効性は、Ｇａｌ１遺伝子発現、ポリペプチドレベルの減少またはＧａｌ１活性の下方調節を示す対象の臨床治験においてモニターすることができる。かかる臨床治験において、Ｇａｌ１遺伝子の発現もしくは活性および／または目的とする障害の症状もしくはマーカーは、特定の細胞、組織またはシステムの表現型の「リードアウト」またはマーカーとして用いることができる。
【０１７５】
例えば、但し、これに限定するものとしてではなく、Ｇａｌ１活性をモジュレートする薬剤（例えば、化合物、薬物または小分子）による治療によって細胞においてモジュレートされるＧａｌ１を含む遺伝子（例えば、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにおいて同定される）を同定することができる。よって、例えば臨床治験において異常Ｇａｌ１発現に関連する障害における薬剤の効果を試験するために、細胞を単離し、核酸および／またはタンパク質を調製し、Ｇａｌ１および／または異常Ｇａｌ１発現に関連する障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルを解析することができる。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書に記載されている方法のうち１種によって、産生されるポリペプチドの量を測定することによって、あるいはＧａｌ１または他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって解析される。このようにして、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理的応答を示すマーカーとして役立つことができる。したがって、この応答状態は、薬剤による個体の治療の前およびその間の様々な時点で決定することができる。
【０１７６】
好まれる実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイによって同定される、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子または他の薬物候補）による対象の治療の有効性をモニタリングするための方法であって、（ｉ）薬剤の投与に先立ち対象から投与前試料を得る工程と、（ｉｉ）投与前試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の発現のレベルを検出する工程と、（ｉｉｉ）対象から１種または複数の投与後試料を得る工程と、（ｉｖ）投与後試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の発現のレベルを検出する工程と、（ｖ）投与前試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の発現または活性のレベルを、投与後試料（単数または複数）におけるＧａｌ１ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較する工程と、（ｖｉ）それに従って対象への薬剤の投与を変更する工程とを含む方法を提供する。例えば、薬剤の投与の増加は、検出されるよりも低いレベルとなるようなＧａｌ１の発現または活性の減少に、即ち、薬剤の有効性の増加に望ましくなり得る。かかる実施形態に従って、Ｇａｌ１発現または活性は、観察可能な表現型応答の非存在下であっても、薬剤の有効性の指標として用いることができる。
【０１７７】
ＶＩＩ．キット
加えて、本発明は、生物学的試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の存在を検出するためのキットも包含する。例えば、本キットは、生物学的試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片を検出することができる標識された化合物または薬剤と、試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の量を決定するための手段と、試料におけるＧａｌ１ポリペプチドまたはその断片の量を標準と比較するための手段とを含むことができる。化合物または薬剤は、適した容器内にパッケージすることができる。例えば、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも１種の抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含有するキットは、Ｇａｌ１発現の検出または診断アッセイにおける用途を見出す。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた抗体を含有することができる。
【０１７８】
キットは、キットに設計された特定の適用を容易にするための追加的な構成成分を含むことができる。例えば、インビトロにおける、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおけるＧａｌ１の検出および定量化のための抗体を含有するキットを提供することができる。キットが含有し得る追加的な例示的な薬剤は、標識を検出する手段（例えば、酵素標識の酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウス−ＨＲＰ等、適切な二次標識等）と、対照に必要な試薬（例えば、対照生物学的試料またはＧａｌ１タンパク質標準）とを含む。キットは、本開示発明の方法における使用のために認識されるバッファーおよび他の試薬をその上含むことができる。非限定的な例として、担体タンパク質または洗剤等、非特異的結合を低下させるための薬剤が挙げられる。本発明のキットは、本明細書に提供されている本開示発明の方法における本開示発明のキットまたは抗体の使用を開示または記載する説明用材料を含むこともできる。
【０１７９】
本発明は、限定するものと解釈するべきではない次の実施例によってさらに説明される。本明細書と共に図面を通して引用されているあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１８０】
診断適用に有用な抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体
抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体を生成し、ヒトＧａｌ１およびマウスＧａｌ１の両方と十分に交差反応することを決定した（図１）。エピトープマッピングは、８Ａ１２．Ｈ９．Ｈ１０（即ち、８Ａ１２）抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体が、Ｇａｌ１の以前に記載された糖結合ドメイン（ＣＢＤ）と遠位のドメインを認識し、カッパー軽鎖を包含することを示した。ＧＳＴタグと融合されたＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６と命名された６種の組換えヒトＧａｌ１断片（Ｎ末端、ＣＢＤ、ポストＣＢＤ配列を網羅）および全長タンパク質Ｆ７をＥ．コリ（E. coli）において産生した（図２）。８Ａ１２モノクローナル抗体は、ウエスタンブロット解析によって組換えＧＳＴ−Ｆ５、ＧＳＴ−Ｆ６およびＧＳＴ−Ｆ７を認識することが決定されたが、ＧＳＴ−Ｆ１、ＧＳＴ−Ｆ２、ＧＳＴ−Ｆ３およびＧＳＴ−Ｆ４のうちいずれも、抗体がポストＣＢＤドメインに結合することを示さなかった。
【０１８１】
８Ａ１２抗体を配列決定し、これを下表１に示し、ハイブリドーマから得られる配列の解析を下表１に要約する。加えて、ハイブリドーマ細胞株８Ａ１２をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託し、これは特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure）の規定に従って２０１３年７月２日に寄託番号ＰＴＡ−１２０４４９にて受理された。
【０１８２】
【表１−１】
2016534093.tif 000006
【表１−２】
2016534093.tif 000007
【表１−３】
2016534093.tif 000008
【表１−４】
2016534093.tif 000009
*Kabatに従ったCDR定義およびタンパク質配列ナンバリング。それぞれCDR1、CDR2およびCDR3の順序でCDRアミノ酸配列に下線を引く。
【実施例２】
【０１８３】
古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）におけるＧａｌ１血清レベル
Ａ．患者および試料
後向き試験のために、２９３名の新たに診断された、以前に未治療のｃＨＬ患者由来の凍結した血清試料および臨床データを、施設内審査委員会（Institutional Review Board）が承認したリスク適応ドイツホジキン研究グループ（German Hodgkin Study Group）（ＧＨＳＧ）多施設臨床治験に登録した患者から用いた：ａ）初期疾患（臨床ステージ［ＣＳ］ＩＡ〜ＩＩＢ、リスク因子なし、８０名の患者）のためのＨＤ１３（ＩＳＲＣＴＮ６３４７４３６６）［Diehl et al. (2003) Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ. Program Rev. 2003:225-247；Sieniawski et al. (2007) J. Clin. Oncol. 25:2000-2005］；ｂ）リスク因子のある初期疾患（ＣＳ  Ｉ〜ＩＩＡ、大型の縦隔腫瘤、節外性疾患、上昇赤血球沈降速度（ＥＳＲ）または≧３結節性区域あり、およびＣＳ  ＩＩＢ、上昇ＥＳＲまたは≧３結節性区域あり、８９名の患者）のためのＨＤ１４（ＩＳＲＣＴＮ０４７６１２９６）［Diehl et al. (2003) Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ. Program Rev. 2003:225-247；von Tresckow et al. (2012) J. Clin. Oncol. 30:907-913］；およびｃ）巨大局在化または進行期疾患（ＣＳ  ＩＩＢ、巨大縦隔関与および／または節外性関与あり、およびＣＳ  ＩＩＩまたはＩＶ、１２４名の患者）のためのＨＤ１８（ＮＣＴ００５１５５５４）［Diehl et al. (2003) Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ. Program Rev. 2003:225-247；ホジキンリンパ腫における進行期のための試験、ＨＤ１８を参照、ワールドワイドウェブclinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00515554において利用可］。加えて、凝血した末梢血を２，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより、１５名の健康正常ドナー由来の血清試料を調製した。
【０１８４】
Ｂ．Ｇａｌ１サンドイッチＥＬＩＳＡ
抗Ｇａｌ１ウサギポリクローナル抗体（捕捉抗体）およびビオチンカップルしたマウスモノクローナル抗体、８Ａ１２（検出抗体）を生成し［Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3338-3344；Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］、最適な感度およびシグナル対ノイズ比を有することを決定した。標準サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコールに従って、血清Ｇａｌ１レベルを評価した。簡潔に説明すると、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡマイクロプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を、４μｇ／ｍＬ（１００μｌ／ウェル、０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸塩−炭酸水素塩バッファーに希釈）の捕捉抗体で４℃にて一晩予めコーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による３回の洗浄後に、プレートをブロッキングバッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に溶解した１％ＢＳＡ）で室温（ＲＴ）にて１時間処理した。各ＥＬＩＳＡプレートにおいて、Ｇａｌ１＋ＨＬ系統、Ｌ４２８由来の無血清馴化培地（ＳＦＣＭ）および健康正常ドナー（ＮＤ＃１）由来の血清試料を対照として用いた。全試料を希釈し（血清試料、１：１６；Ｌ４２８  ＳＦＣＭ、１：３２）、２回複製して添加し、ＲＴで２時間インキュベートした。検出抗体、ビオチン化８Ａ１２（１：１，０００）によるＲＴで２時間のインキュベーション後に、１００μｌのストレプトアビジン（strepavidin）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：１５，０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をＲＴで２０分間のインキュベーションのために添加した。５回の洗浄後に、反応液を１００μｌの１工程ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により発色させ、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４により停止した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３吸光度マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）において、４５０および５７０ｎｍにおける吸光度を決定した。１：２段階希釈（合計９ポイント）による８０〜０．３１２ｎｇ／ｍｌの濃度における組換えＨｉｓタグ付きのＧａｌ１（ｒＧａｌ１）の検量線を作成し、ＥＬＩＳＡ毎に４パラメータ非線形回帰曲線を用いて適合させた。検量線を用いた回帰解析により試料濃度を計算した。
【０１８５】
Ｃ．統計解析
ＳＡＳバージョン９．２を用いてデータ解析を行った。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットして、正常対上昇血清Ｇａｌ１のカットオフ値を決定した。スキュー分布のため、群比較のためのウィルコクソン２試料検定またはクラスカル−ワリス検定を用いて、血清Ｇａｌ１値のノンパラメトリック解析を行った。単変量解析は、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒステージ（Ｉ〜ＩＶ）、関与する結節性部位の数（≧３）、Ｂ症状の存在、節外性疾患および上昇ＥＳＲを含み、これら全て、ＨＬ腫瘍負荷の十分に確立されたパラメータである。血清Ｇａｌ１レベルは、性別男性、年齢４５歳以上、ステージＩＶ疾患、低い血清アルブミン、白血球増加症およびリンパ球減少症に関しても解析したが、その理由として、進行期ＨＬのための国際予後スコア（ＩＰＳ）［Hasenclever and Diehl (1998) N. Engl. J. Med. 339:1506-1514；Moccia et al. (2012) J. Clin. Oncol. 30:3383-3388］におけるこれら因子の予後関連性が挙げられる。名目上のｐ値を示す。
【０１８６】
Ｄ．結果
Ｇａｌ１タンパク質発現および転写物存在量は高度に相関し、Ｇａｌ１は、選択リンパ系悪性腫瘍、ウイルスにより誘導されるがんおよび多くの固形腫瘍を含む複数の腫瘍型によって発現される（図３）。よって、Ｇａｌ１ポリペプチドおよびその断片を検出することができる試薬、特に、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）およびＥＬＩＳＡアッセイ等、確立された診断アッセイにおいて十分に機能する試薬の必要がある。よって、精製されたｒＧａｌ１によるサンドイッチＥＬＩＳＡを確立し、そこで用いられる新たに開発されたＧａｌ１抗体（実施例１を参照）を適用して、１５名の健康な正常ドナーおよびＧＨＳＧ由来の２９３名の新たに診断された以前に未治療のｃＨＬ患者における血清Ｇａｌ１のレベルを決定した。このデータは、Ｇａｌ１の血清レベルが、正常対照と比べてｃＨＬ試料において有意により高く、ｃＨＬ患者における腫瘍負荷の臨床パラメータに関連することを実証する。特に、血清Ｇａｌ１レベルは、正常対照と比較してｃＨＬ患者において有意に上昇した（ｐ＜．０００１）（図４Ａ）。ＲＯＣ曲線をプロットすることにより、４９．９ｎｇ／ｍｌのカットオフ値が、１００％特異性および７６．５％特異性で正常ドナーのＧａｌ１血清レベルからｃＨＬ患者のＧａｌ１血清レベルを区別したことが決定された。ＨＤ１３治験（初期低リスク疾患のため）に登録された患者は、ＨＤ１４（追加的なリスク因子を有する初期疾患のため）またはＨＤ１８（巨大局在化または進行期疾患のため）における患者よりも有意に低いＧａｌ１レベルを有した（ＨＤ１３対ＨＤ１４対ＨＤ１８、ｐ＝．０００２）（図４Ｂおよび表２）。
【０１８７】
【表２−１】
2016534093.tif 000010
【表２−２】
2016534093.tif 000011
(A) GHSGリスク適応臨床治験、HD13、HD14およびHD18に登録されたcHL患者由来のGal1血清レベル;
(B) 患者特徴およびGal1血清レベルとの関連。名目上のp値を示す;
*平均±SD;
#示されている単変量解析から未知の値を有する患者を除外した。
【０１８８】
次に、リスク適応した治療法にＨＬ患者を割り当てるための２種の主要な決定要因であるＡｎｎ  ＡｒｂｏｒステージおよびＢ症状［Lister et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7:1630-1636］とＧａｌ１血清レベルとの関連を決定した。Ｇａｌ１レベルは、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒステージ（Ｉ対ＩＩ対ＩＩＩ対ＩＶ、ｐ＝．０１２、図４Ｃおよび表２；Ｉ〜ＩＩ対ＩＩＩ〜ＩＶ、ｐ＝．００６）およびＢ症状（ｐ＝．０４７、表２）と共に増加した。
【０１８９】
ＩＰＳ  ０／１対２〜７の受け入れられたグループ分けを用いたＨＬ  ＩＰＳとＧａｌ１レベルとの関連も決定した［Hasenclever and Diehl (1998) N. Engl. J. Med. 339:1506-1514；Moccia et al. (2012) J. Clin. Oncol. 30:3383-3388］。２〜７のＩＰＳを有する患者は、０または１のＩＰＳを有する患者よりも有意に高いＧａｌ１レベルを有した（ｐ＝．０１９）（表２）。Ｇａｌ１レベルの増加は、７種の個体ＩＰＳリスク因子のうち２種にも関連した［Hasenclever and Diehl (1998) N. Engl. J. Med. 339:1506-1514；Moccia et al. (2012) J. Clin. Oncol. 30:3383-3388］：節外性関与（ステージＩＶ疾患、ｐ＝．０１１）；およびリンパ球数１ｍｍ３当たり＜６００または白血球数の＜８％（ｐ＝．０３６）。Ｇａｌ１レベルは、２種の追加的な有害予後因子を有するｃＨＬ患者においても有意に上昇した［Hsi (2008) Leuk. Lymphoma 49:1668-1680］：≧３個の関与する結節性部位（ｐ＜．０００１）および上昇ＥＳＲ（ｐ＝．００７）（表２）。Ｇａｌ１血清レベルおよび成績の間の関連の直接解析は、進行中のＨＤ１８臨床治験の完了を待つ（ワールドワイドウェブclinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00515554にて利用できる、ホジキンリンパ腫における進行期のための試験、ＨＤ１８を参照）。
【０１９０】
よって、Ｇａｌ１血清レベルが上昇すると、新たに診断されたｃＨＬ患者における腫瘍負荷増加を反映する臨床特色に関連する。腫瘍免疫回避、血管新生および転移におけるＧａｌ１の実証された役割を考慮すると、循環Ｇａｌ１レベルの解析は、ｃＨＬ患者のためのリスク適応された標的化治療戦略を通知することが予想される。
【実施例３】
【０１９１】
Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１は、ＥＢＶおよびＨＨＶ８関連悪性腫瘍によって同時発現される
Ａ．症例選択
Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ；Ｙａｌｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  ＣＴ；ＵＭａｓｓ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡの外科病理学ファイルならびに施設内審査委員会の承認による開業医のコンサルトファイルから症例を検索した。代表的なヘマトキシリンエオシン染色したスライドを再検討した。高齢者ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、ＥＢＶ陽性免疫不全関連ＤＬＢＣＬ、ＢＬ、ＥＮＫＴＣＬ、ＰＢＬ、ＮＰＣ、ＰＥＬ、ＫＳおよびＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ由来の組織全体の切片を評価した。免疫組織化学的検査により、Ｇａｌ１発現に関して総計７７症例を評価した。組織の利用能が限定されていたため、免疫組織化学的検査により、ＰＤ−Ｌ１（５９症例）、ＪｕｎＢ（６６症例）およびリン酸化ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃＪｕｎ；６３症例）発現に関してこれらの症例のサブセットを評価した。ＤＬＢＣＬ、ＮＰＣおよびＢＬの全症例は、インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション試験により、ＥＢＶコードＲＮＡ（ＥＢＥＲ）が陽性であることが以前に示された。１１種のＰＢＬ症例のうち９種および９／１０種のＥＮＫＴＣＬ症例は、ＥＢＥＲが陽性であった。全ＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ症例は、ＥＢＥＲが陰性であった。全ＰＥＬ症例およびＫＳ症例は、免疫組織化学的検査により、ＨＨＶ８が陽性であると以前に示された。Kononen et al. (1998) Nat. Med. 4:844-847において以前に記載された通り、ＤＬＢＣＬ、ＮＯＳの症例を組織マイクロアレイの一部として評価し、各症例を３回複製して並べた。症例は、ＥＢＥＲインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにより、ＥＢＶ陰性であることを確認した。
【０１９２】
Ｂ．免疫組織化学的検査
４μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋した組織切片を用いて、Ｇａｌ１、ｐ−ｃＪｕｎおよびＪｕｎＢの染色を行った。スライドをベーキングし、キシレンにおいて脱パラフィンし、段階的アルコールに通し、続いて蒸気圧調理器具（Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ；ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）において、メーカーの説明書に従って、Ｇａｌ１およびＪｕｎＢは１０ｍＭクエン酸塩バッファー、ｐＨ６．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、またはｐ−ｃＪｕｎは１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかにより抗原を回復（retrieve）させた。さらに別の工程は全て、水分補給されたチャンバーにおいて室温で行った。スライドをＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）で５分間前処理して、内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、続いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４において洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｄａｋｏ）を用いて、メーカーの説明書に従って、スライドをブロッキングし、その後マウス抗Ｇａｌ１（クローン８Ｆ４Ｆ８Ｇ７、１：４００００希釈、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］、ウサギ抗ＪｕｎＢ（クローンＣ３７Ｆ９、１：１０００希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）またはウサギ抗ｐ−ｃＪｕｎ（アミノ酸６３におけるリン酸化セリンに特異的、クローン５４Ｂ３、１：５０希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）モノクローナル抗体と共に希釈液（Ｄａｋｏ）において１時間インキュベートした。次に、スライドをＴｒｉｓバッファーにおいて洗浄し、抗マウスまたは抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ；Ｄａｋｏ）で３０分間処理した。さらに洗浄した後、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原（Ｄａｋｏ）を用いて、免疫ペルオキシダーゼ染色を５分間発色させた。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、段階的アルコールおよびキシレンにおいて脱水し、マウントし、カバーガラスをかけた。
【０１９３】
４μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋した組織切片を用いて、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ自動染色機（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）において、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（クローン１５、最終濃度６．２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を用いた免疫組織化学的検査を行った。ＵｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）をメーカーの説明書に従って用いた。上述と同じプロトコールを用いて、マウス抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ＩｇＧ１、Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎの研究室において生成、クローン３３９．７Ｇ１１、最終濃度６９μｇ／ｍｌ）を用いたＩＨＣを行った。次に、スライドをＩＨＣ後染色のために石鹸水および蒸留水において洗浄し、段階的アルコールおよびキシレンにおいて脱水し、マウントし、カバーガラスをかけた。
【０１９４】
Ｃ．症例評価
免疫組織化学的に染色した切片は、２名の血液病理学者によって同時発生的に評価された。ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１に関する腫瘍細胞の染色の強度は、０（染色なし）、１＋（弱いまたは不確かな染色）、２＋（中等度の染色）または３＋（強い染色）としてスコア化した。腫瘍細胞染色のパーセンテージも評価した。腫瘍細胞の少なくとも２０％が、２＋または３＋染色を示した場合、症例を陽性と考慮した。ＰＤ−Ｌ１を評価する場合、膜性染色のみを考慮した。ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎ染色に関して、腫瘍細胞の少なくとも２０％が、核染色を呈した場合、症例を陽性と考えた。Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１が陽性のマクロファージを症例毎の内部対照とした。適切な外部陰性（扁桃腺）および陽性（ホジキンリンパ腫）対照も各実験に含まれた。
【０１９５】
Ｄ．結果
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１／ＣＤ２７４としても公知）は、抗原提示細胞によって主に発現される同時刺激分子のＢ７ファミリーに属する細胞表面糖タンパク質であり、細胞性免疫応答を調節するように機能する［Zou et al. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8:467-477；Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704］。その同族受容体ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、末梢組織における活性化Ｔ細胞の増殖を阻害し、ＰＤ−１遮断によって反転され得る機能的表現型である「Ｔ細胞消耗」をもたらす［Barber et al. (2006) Nature 439:682-687；Freeman et al. (2000) J Exp Med. 192:1027-1034；Dong et al. (1999) Nat. Med. 5:1365-1369］。肺、卵巣および結腸の癌腫；メラノーマ；未分化大細胞リンパ腫；成人Ｔ細胞リンパ腫；ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫を含む多くのヒト悪性腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現するが、単球、マクロファージおよび胎盤合胞体栄養細胞（synctiotrophoblast）を除く正常ヒト組織は、免疫組織化学的検査によって検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１を発現しない［Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704；Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:793-800；Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-5100；Kozako et al. (2009) Leukemia 23:375-382；Andorsky et al. (2011) Clin. Cancer Res. 17:4232-4244；Kantekure et al. (2012) Am. J. Dermatopathol. 34:126-128；Wilcox et al. (2009) Blood 114:2149-2158；Wilcox et al. (2012) Eur. J. Haematol. 88:465-475］。インビトロおよび前臨床試験は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の破壊が、免疫応答を強め、抗腫瘍活性を促進することを示した［Iwai et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:12293-12297］。ヒト化抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体による近年の第Ｉ相臨床治験は、固体臓器悪性腫瘍、最も著しくは、メラノーマ、非小細胞肺癌および腎細胞癌の患者のサブセットにおいて耐久性のある臨床応答を産生し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の標的化に基づく治療法の有望な方針を示唆する［Brahmer et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28:3167-3175；Brahmer et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2455-2465；Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。
【０１９６】
Ｇａｌ１は、別の免疫調節分子である。Ｇａｌ１が、胃腸管悪性腫瘍、甲状腺乳頭癌、喉頭扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＭＬＬ再編成Ｂリンパ芽球リンパ腫および古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）のリード−シュテルンベルク細胞を含む、種々の固形腫瘍およびリンパ増殖性障害によって発現されることが示された［Cedeno-Laurent et al. (2012) Blood 119:3534-3538；Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130；Saussez et al. (2007) International Journal of Oncology. 30:1109；Danguy et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta. 1572:28528-28529；Yamamoto et al. (2008) Blood 111:3220-3224；Gandhi et al. (2007) Blood 110:1326-1329；Juszczynski et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104:13134-13139；Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277；Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618；Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322；Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res.14:3338-3344］。機能的アンタゴニスト抗体によるＧａｌ１ノックダウンまたは遮断は、メラノーマおよびカポジ肉腫（ＫＳ）の前臨床モデルにおいてＴ細胞依存性様式での腫瘍拒絶反応をもたらし［Rabinovich (2005) Br. J. Cancer. 92:1188-1192；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251；Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、ＰＴＬＤのモデルにおいてＥＢＶ感染ヒトＢ細胞を標的とするＣＤ８＋  Ｔ細胞のＧａｌ１媒介性アポトーシスを予防する［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］。
【０１９７】
ガンマヘルペスウイルスＥＢＶおよびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス［ＫＳＨＶ］としても公知）は、細胞を形質転換する能力を有し、治療選択肢が限定された高悪性度リンパ系および上皮悪性腫瘍の異種性の群のドライバーである。ＥＢＶは、健康個体の９０％超に感染し、ウイルス抗原の発現の限定によって特徴付けられる潜伏状態で持続する。潜伏ＥＢＶ感染および周期的ウイルス再活性化は、免疫適格性患者における活発なウイルス特異的宿主Ｔ細胞応答によって制御される。しかし、造血幹細胞または固形臓器移植、リウマチ学的状態に関連して免疫抑制療法を受けた、または他の理由で、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳにより免疫無防備状態の患者は、ＥＢＶ  ＩＩＩ型潜在性プログラムを再活性化し、ＰＴＬＤ等、悪性腫瘍を発症することができる。ＥＢＶ＋ＰＴＬＤの大部分が、Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１を発現することが示された。これらのタンパク質の発現は、ＪｕｎＢおよびｃＪｕｎを含む活性ＡＰ−１シグナル伝達に依存性であり、遡ってこれらは、ウイルスシグナル伝達分子、ＬＭＰ１および２Ａによって開始される［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322；Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618］。追加的な免疫不全関連悪性腫瘍は、ＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）および形質芽球性リンパ腫（ＰＢＬ）を含む。ＥＢＶ感染は、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＥＮＫＴＣＬ）、上咽頭癌（ＮＰＣ）および地方病バーキットリンパ腫（ＢＬ）にも関連する。これらの腫瘍型による免疫回避のための戦略は、あるとしても、大部分は未知である。
【０１９８】
ＨＨＶ８は、ＥＢＶとは異なり、ガンマヘルペスウイルスであり、数個体（健康個体の５％）のみに感染するが、ＥＢＶと同様に、宿主免疫応答によって制御される潜伏感染を維持する。免疫無防備状態において、溶解性（lytic）複製プログラムの再活性化は、原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）およびＫＳを含むＨＨＶ８関連悪性腫瘍の発症をもたらすことができる［Cesarman (2011) Cancer Lett. 305:163-174；Taylor et al. (2011) Cancer Lett. 305:263-278］。多くのＥＢＶ＋腫瘍に関して、ＨＨＶ８＋腫瘍が、免疫回避のための機序を持つか否かは未知である。
【０１９９】
免疫組織化学的検査のためのＰＤ−Ｌ１抗体の検証
種々の市販の抗体を検査した後に、十分に特徴付けられた細胞株および組織のセットにおけるＰＤ−Ｌ１の高感度および特異的染色の両方を実証する新規ウサギモノクローナル抗体を同定した（図５）。ウエスタンブロット解析により、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、両者共に該抗原を発現することを以前に示したホジキン細胞株、ＨＤＬＭ２およびＬ４２８において、ＰＤ−Ｌ１の予想されるサイズである５５ｋＤａのタンパク質を認識した（図５Ａ）が、ＰＤ−Ｌ１を欠くことを以前に示したびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株、ＳＵ−ＤＨＬ４およびＯＣＩ−Ｌｙ１においては認識しなかった（図５Ａ）［Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277］。同様に、ホルマリン固定パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）細胞株の免疫組織化学的（ＩＨＣ）解析は、膜性および細胞質パターンにおけるＨＤＬＭ２の頑強な染色を明らかにした（図５Ｂ）。対照的に、ＦＦＰＥ細胞株、ＳＵ−ＤＨＬ４の染色は存在しなかった（図５Ｃ）。マウスモノクローナル抗体を用いた染色パターンは同一であった（図５Ｂおよび図５Ｃ挿入図）。遺伝子導入した細胞株の追加的なＩＨＣ解析は、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するがヒトＰＤ−Ｌ２を発現しない細胞株の、ウサギおよびマウスＰＤ−Ｌ１抗体の両方による特異的な染色を示した。このデータは、ウサギおよびマウスモノクローナル抗体の両方を用いたＩＨＣ解析が、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的であることを示す。
【０２００】
ＰＤ−Ｌ１を高レベルで発現することが公知の組織であるヒト胎盤のＩＨＣ解析は、以前の結果［図５Ｅ；Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704］に合致して、シンシチウム（syncitial）トロホブラストの特異的染色を明らかにした。対照的に、Ｂ細胞リッチ二次卵胞およびＴ細胞リッチ卵胞間領域におけるものを含むヒト扁桃腺のリンパ球は、膜性パターンにおける染色が大部分は陰性であった（図５Ｄ）。扁桃腺組織の強拡大検鏡は、扁桃腺上皮組織（図５Ｄ）の明確に異なる膜性染色およびマクロファージと形態学的に一致する散乱した細胞（図５Ｄ、挿入図）の弱い膜性染色を示した。扁桃腺組織において、ＩＨＣに必要とされる抗体の最適最終濃度の達成に必要な希釈に依存して（最終濃度６．２μｇ／ｍｌ；ロット濃度は０．２２〜１．５５ｍｇ／ｍｌに及んだ）、中程度の一般的非特異的バックグラウンド染色が観察された。腫瘍細胞膜染色のみを陽性と考慮した（図５）。
【０２０１】
ｃＨＬおよびＤＬＢＣＬにおけるＰＤ−Ｌ１の発現
ＲＳ細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＪａｋ２を含むゲノム領域である９ｐ２４の増幅にまたはリード−シュテルンベルク（ＲＳ）細胞のＥＢＶ感染に起因し得る、ｃＨＬのＲＳ細胞における増強されたＰＤ−Ｌ１転写物は、以前に実証された［Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277；Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618］。症例のサブセット（１９症例）に関して、明確に異なる抗体を用いたＩＨＣによりＰＤ−Ｌ１の発現を試験した［Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277；Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618］。
【０２０２】
ｃＨＬのＲＳ細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の発生率をより十分に決定するために、改善された抗体を用いて３８症例のｃＨＬを解析したところ、３３症例（８６．８４％）において明確に異なる膜性ＰＤ−Ｌ１発現が検出された。９ｐ２４の増幅の遺伝的確認が得られた選択症例において、圧倒的多数のＲＳ細胞においてＰＤ−Ｌ１の強い膜性染色が観察された（図６Ａ）。しかし、大部分の症例に関して、ＲＳ細胞における９ｐ２４の状態に関する遺伝情報は分かっていなかった。ＥＢＶありまたはなしの両方を含む、結節硬化型（ＮＳ）、混合細胞型（ＭＣ）および他の規定がない（ＮＯＳ）サブタイプとして分類される症例においてＰＤ−Ｌ１発現が観察された（表３）。対照的に、結節性リンパ球優勢型ホジキンリンパ腫は、症例の７％のみにおけるＰＤ−Ｌ１の明確に異なる膜性染色を明らかにした（図６Ｂ；表３）。ｃＨＬとは対照的に、大部分（６６症例のうち７症例、１１％）のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫は、他に規定のない限り（ＤＬＢＣＬ、ＮＯＳ）、ＰＤ−Ｌ１が陰性であった（図６Ｃ）。ＤＬＢＣＬ、ＮＯＳの各症例は、ＥＢＶが陰性であり、免疫抑制または免疫不全の公知の病歴がない患者において生じたことが確認された。
【０２０３】
【表３】
2016534093.tif 000012
＊≧膜性染色；＊＊≧２＋膜性染色および／または細胞質染色；＊＊＊≧陰性としてスコア化；ＮＳＣＨＬ−結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）；ＭＣＣＨＬ−混合細胞型ＣＨＬ；ＮＯＳ−他に規定のない限り；ＮＬＰＨＬ−結節性リンパ球優勢型ホジキンリンパ腫。
【０２０４】
ＥＢＶおよびＨＨＶ８陽性腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１の発現
ＥＢＶおよびＨＨＶ８陽性腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１、Ｇａｌ１、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの免疫組織化学的染色の結果を表４に要約する。全高齢者ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ（５／５、１００％）およびＥＢＶ陽性免疫不全関連ＤＬＢＣＬ（６／６、１００％）に、ＰＤ−Ｌ１の強い膜性染色が観察された。対照的に、ＥＢＶ陽性ＢＬの症例のうち、腫瘍細胞または混合された腫瘍関連マクロファージのいずれかにおいてＰＤ−Ｌ１が陽性のものはなかった（０／７、０％）（図６Ｄ）。
【０２０５】
ＥＮＫＴＣＬ（６／６、１００％）（図７Ｃおよび表４）およびＮＰＣ（９／９、１００％）（図７Ｅおよび表４）の全症例における大部分の腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１の染色を示した。ＰＢＬの７症例のうち２症例（２９％）（図７Ａおよび表４）およびＰＥＬの３症例のうち１症例（３３％）（図７Ｂおよび表４）は、ＰＤ−Ｌ１が陽性であった。ＥＢＶ陰性ＰＴＬＤの７症例のうち３症例（４３％）は、ＰＤ−Ｌ１の強い膜性染色を示し、追加的な３症例は、細胞質ＰＤ−Ｌ１染色を示した（図７Ｄおよび表４）。ＫＳの症例は、膜性ＰＤ−Ｌ１染色を示さなかった（０／９、０％）（図７Ｆ）。ＫＳの１症例は、ＰＤ−Ｌ１の細胞質染色を示した（表４）。
【０２０６】
大部分の高齢者ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ（５／８、６３％）（図８）、ＥＢＶ陽性免疫不全関連ＤＬＢＣＬ（６／８、７５％）（表４）は、Ｇａｌ１が陽性であった。陽性である場合、Ｇａｌ１は、典型的には、大部分の腫瘍細胞において細胞質染色パターンで拡散的に陽性であった（図８Ａ）。対照的に、ＥＢＶ陽性ＢＬの症例は、Ｇａｌ１が陽性ではなかった（表４および図８Ｂ）。ＥＮＫＴＣＬ（８／１０、８０％）、ＰＥＬ（４／４、１００％）、ＰＢＬ（８／１１、７３％）およびＫＳ（７／９、７８％）症例は、強いＧａｌ１染色を示した（図８Ｃ〜図８Ｆおよび表４）。ＮＰＣ（０／９、０％）またはＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ（０／８、０％）の症例は、免疫組織化学的検査によるＧａｌ１の発現を示さなかった（図８Ｇ〜図８Ｈおよび表４）。
【０２０７】
ＥＢＶおよびＨＨＶ８陽性腫瘍におけるＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの発現
ＥＢＶコードタンパク質が、ＡＰ−１シグナル伝達を介して腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１発現を促進することが以前に示された［Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618］。よって、ＡＰ−１転写因子、ＪｕｎＢおよびリン酸（活性）−ｃ−Ｊｕｎの発現および核局在化に関してウイルス関連腫瘍のコホートを解析した。１症例のみがｐ−ｃＪｕｎの発現を示したＢＬ症例を例外として、本試験において試験したＥＢＶおよびＨＨＶ８陽性腫瘍の全クラスが、症例の少なくとも５０％におけるＪｕｎＢおよびｐ−ｃ−Ｊｕｎの核染色を示した（表４）。
【０２０８】
【表４】
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【０２０９】
ＰＢＬに関して、ＰＤ−Ｌ１が陰性であった５症例のうち、２症例は、Ｇａｌ１、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎ染色も陰性であった。全４種のマーカーが陰性であったＰＢＬの１症例は、ＥＢＥＲも陰性であった。
【０２１０】
対照的に、ＰＤ−Ｌ１が陰性であったＰＥＬの２症例は、Ｇａｌ１、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの陽性染色を示した。
【０２１１】
全てＧａｌ１が陰性であったＥＢＶ陰性ＰＴＬＤに関して、ＰＤ−Ｌ１の強い膜性染色を示した３症例のうち、２症例は、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの両方が陽性であり、１症例は、ｐ−ｃＪｕｎが陰性であったが、ＪｕｎＢが陽性であった。ＰＤ−Ｌ１の細胞質染色を示した３症例のうち、１症例は、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの両方が陽性であった一方、２症例は、ＪｕｎＢのみが陽性であった。１症例は、ＰＤ−Ｌ１が陰性であったが、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの陽性染色を示した。
【０２１２】
陰性Ｇａｌ１染色を示した高齢者ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬおよびＥＢＶ陽性免疫不全関連ＤＬＢＣＬの症例は、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎ染色が陽性であった。ＥＢＥＲが陰性であったＥＮＫＴＣＬの１症例は、Ｇａｌ１、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎが陰性であったが、ＰＤ−Ｌ１が陽性であった。Ｇａｌ１が陰性であったＥＮＫＴＣＬの第２の症例は、ＪｕｎＢ、ｐ−ｃＪｕｎおよびＰＤ−Ｌ１が陽性であった。
【０２１３】
Ｇａｌ１が陰性であったがＰＤ−Ｌ１が陽性であったＮＰＣの３症例は、ＪｕｎＢが陽性であったが、ｐ−ｃＪｕｎが陰性とスコア化された。ＰＤ−Ｌ１の細胞質染色を示したＫＳの症例は、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの両方が陽性であった。
【０２１４】
Ｅ．考察
がん療法に対するマルチモーダルおよびコンビナトリアルアプローチは、腫瘍病態形成に関与する複数の機序をますます標的化する。免疫回避は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１等、免疫チェックポイント分子に対して作られたヒト化抗体による臨床治験を含む、いくつかの近年の進歩による魅力的な標的を提示するがんの新たに出現した特質である［Hanahan et al. (2011) Cell 144:646-674およびPardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252-264］。固形腫瘍の患者における抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体による近年の第Ｉ相臨床治験は、治療有効性を改善するために、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍を同定する信頼できる方法の必要を実証する［Brahmer et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28:3167-3175；Brahmer et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2455-2465；およびTopalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。抗ＰＤ−１による治験において、免疫組織化学的検査によっていずれか検出可能な腫瘍関連ＰＤ−Ｌ１を発現した２５症例のうち９症例は、耐久性のある臨床応答を示したが、検出可能なＰＤ−Ｌ１を欠く腫瘍を有する患者における臨床効果は観察されなかった［Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。本明細書に記載されているデータは、高齢者および免疫無防備状態のＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、ＮＰＣならびにＥＮＫＴＣＬ症例の大部分における頑強な膜性ＰＤ−Ｌ１染色を実証する。ＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ、ＥＢＶ陰性ＤＬＢＣＬ、ＰＢＬおよびＰＥＬ症例の少数は、ＰＤ−Ｌ１が陽性であった。
【０２１５】
Ｇａｌ１は、Ｔ細胞のアポトーシスをもたらす新たに出現した免疫調節分子でもあり、Ｇａｌ１遺伝子発現の遮断は、マウスモデルにおける腫瘍拒絶反応を促進する［Liu et al. (2005) Nat. Rev. Cancer 5:29-41およびRubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］。Ｇａｌ１染色は、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、ＥＮＫＴＣＬおよびＰＢＬ、ならびにＨＨＶ８関連腫瘍ＫＳおよびＰＥＬの大部分において見出されると本明細書において決定された。これらのデータは、ウイルスに駆動される悪性腫瘍のクラスは、ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１に対する標的化治療法の恩恵を被ることができ、かかる治療に特異的に応答し得る症例を同定するための信頼できる方法を提供することを示す。
【０２１６】
ＥＢＶ陽性ＰＴＬＤおよびｃＨＬにおけるＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１のＡＰ−１およびＥＢＶ依存性発現を試験する以前の試験と一致して［Juszczynski et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104:13134-13139、Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618、Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322、Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res.14:3338-3344］、Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１発現は、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬおよびＥＮＫＴＣＬにおけるｐ−ｃＪｕｎおよびＪｕｎＢの発現と相関した。大部分のＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ症例は、以前のＥＢＥＲ解析によってＥＢＶが陰性であるにもかかわらず、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの発現を示し、これらの症例のサブセットは、膜性ＰＤ−Ｌ１染色を示した。これらの症例の一部は、細胞質ＰＤ−Ｌ１染色も示し、ＰＤ−Ｌ１の膜発現のみが、腫瘍免疫回避に寄与する可能性があるため、これは不確かな意義のものである。これらの腫瘍は、ＥＢＶ陽性ＰＴＬＤとは対照的に、Ｇａｌ１が均一に陰性でもあった［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］。同様に、ＮＰＣ症例の大部分は、活性化されたＡＰ−１シグナル伝達および強いＰＤ−Ｌ１染色を有したが、Ｇａｌ１が陰性であった。ＰＢＬおよびＰＥＬに関して、ＡＰ−１構成成分の発現は、Ｇａｌ１発現と十分に相関したが、数例の症例は、ＰＤ−Ｌ１が陰性であった。まとめると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１の上方調節の代替的機序を示し、ＡＰ−１活性化またはＥＢＶ陽性は、Ｇａｌ１の発現の駆動に十分ではないことを示す。
【０２１７】
９ｐ２４遺伝子座の増幅は、ｃＨＬに関して示される通り［Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277］、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するが、ＥＢＶまたは活性化ＡＰ−１構成成分が陰性である腫瘍における一般的な知見となり得る。逆に、ＰＤ−Ｌ１発現に対する、グレーゾーンリンパ腫および乳癌［Eberle et al. (2011) Modern Pathology 24:1586-1597およびWu et al. (2012) Oncogene 31:333-341］等、９ｐ２４増幅を持つ腫瘍の照合は、抗ＰＤ−Ｌ１免疫療法の候補をさらに同定するであろう。あるいは、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の結果としてＡＬＫ陽性Ｔ細胞リンパ腫において最初に実証された［Marzec et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:20852-20857］、ＳＴＡＴ３経路を介した異常シグナル伝達は、ＰＤ−Ｌ１発現の別の機序を提供することができる。
【０２１８】
他のＥＢＶ陽性悪性腫瘍の興味深い例外は、実質的にあらゆるＥＢＶ陽性ＢＬ症例におけるＧａｌ１、ＰＤ−Ｌ１およびＪｕｎＢ／ｃＪｕｎ染色の非存在であった。ＢＬにおけるＥＢＶ潜伏期プログラムが、ＤＬＢＣＬとは異なることが公知である［Vereide et al. (2011) Blood 117:1977-1985およびBornkamm (2009) Semin. Cancer Biol. 19:351-365］。特に、より小さいセットのウイルスタンパク質がＢＬにおいて発現され、ＬＭＰ１は発現されない。ＰＴＬＤおよびｃＨＬにおけるＧａｌ１およびＰＤ−Ｌ１のＥＢＶ依存性発現の試験において、Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１発現が、ＬＭＰ１に特に依存性であったことが示された［Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618およびOuyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］。よって、ＢＬ腫瘍細胞におけるＬＭＰ１の欠如は、ＡＰ−１シグナル伝達の活性化不全と、結果的に、検出可能なＧａｌ１およびＰＤ−Ｌ１発現の非存在をもたらし得る。さらに、Ｍｙｃタンパク質が、ＰＤ−Ｌ１の発現を相殺することが示された［Durand-Panteix et al. (2012) J. Immunol. 189:181-190］。よって、ＢＬ腫瘍細胞が、ｍｙｃ転位置／増幅および変更されたＥＢＶ潜伏期プログラムのために、Ｇａｌ１またはＰＤ−Ｌ１に対する標的化治療法の恩恵を被らないことが考えられる。この知見は、いわゆる二重適合ＤＬＢＣＬ等、Ｍｙｃを過剰発現する他の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の下方調節の可能性も生じる［Aukema et al. (2011) Blood 117:2319-2331］。
【０２１９】
ＨＨＶ８陽性（postive）悪性腫瘍ＫＳおよびＰＥＬに関して、症例の大部分は、Ｇａｌ１およびＡＰ−１構成成分が陽性であったが、ＰＥＬの１症例のみは、膜性ＰＤ−Ｌ１染色を示し、ＫＳの１症例のみは、細胞質ＰＤ−Ｌ１染色を示した。内皮細胞もＧａｌ１を染色し、ＫＳの慎重な解釈を要し、これは、内皮由来腫瘍細胞の増殖を表す。ＫＳにおけるＧａｌ１発現の近年の解析は、良性血管増殖の解析を含み、Ｇａｌ１は、ＫＳ試料において上方調節のみが為された［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］。さらに、出願人の以前の試験において用いられた同じ中和抗Ｇａｌ１抗体は、ＫＳのマウスモデルにおいて異常血管新生を減弱し、腫瘍退縮を促進することを示した［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］。
【０２２０】
おそらく矛盾する免疫組織化学的プロトコールおよび他の技術的理由から、予後とヒト腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現との相関は、これまでのところ、矛盾する結果を生じてきた［Hino et al. (2010) Cancer 116:1757-1766、Gadiot et al. (2011) Cancer 117:2192-2201、Hamanishi et al. (2007) PNAS 104:3360-3365、Thompson et al. (2004) PNAS 101:17174-17179、Thompson et al. (2006) Cancer Res. 66:3381-3385、Wu et al. (2006) Acta Histochemica. 108:19-24、Ghebeh et al. (2006) Neoplasia (New York, NY) 8:190、Gao et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:971-979、およびNomi et al. (2007) Clin. Cancer Res. 13:2151-2157］。頑強な染色プロトコールは、本明細書に記載されており、診療において一般的に用いられている自動染色機械によって容易に再現することができる。本明細書に記載されている試験は、陽性染色に対し相当に高い閾値を用いた（強い膜性染色を示す少なくとも２０％腫瘍細胞）一方、以前の試験は、より低いレベルのＰＤ−Ｌ１発現を受け入れていた［Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。
【０２２１】
マクロファージは、おそらく、正常な免疫モジュレーションの結果として、ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１を発現することが以前に観察された。本明細書に記載されている試験において、マクロファージは、ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１染色の両方に対し、一貫した内部陽性対照を提供した。一部の症例において、特に、豊富なマクロファージを有する症例において、細胞形態の慎重な検鏡が、腫瘍細胞における染色の決定に必要とされた。ＰＤ−Ｌ１に関して、おそらく腫瘍不均一性を強調する、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬの一部の症例に、著しい染色不均一性が認められた。免疫モジュレート分子の異種性発現を有する腫瘍が、依然として、これらのシグナルの遮断としての標的化治療法を受け入れることができ、腫瘍全体を標的とする有効な免疫監視の復帰をもたらし得る可能性が高いように思われる。
【０２２２】
ＥＢＶおよびＨＨＶ８に駆動される悪性腫瘍は、珍しいが高悪性度であり、治療選択肢が限られた、多くの場合生命にかかわる新生物である。腫瘍の追加的なクラスの同定および標的化治療法を受け入れることができる特異的な症例を検出する方法は、より効率的かつ有効な免疫療法をもたらすであろう。
【実施例４】
【０２２３】
抗Ｇａｌ１、非中和８Ａ１２  ｍＡｂの微細エピトープマッピングおよび動態解析
図１においてヒトＧａｌ１およびマウスＧａｌ１の両方と十分に交差反応し、図２においてＧａｌ１のポストＣＢＤドメインを認識することが決定された８Ａ１２  ｍＡｂを、微細エピトープマッピング解析にさらに付した。図３に示す、Ｅ．コリにおいて産生される７種のＧＳＴタグ付きのヒトＧａｌ１コンストラクトに加えて、ヒトＧａｌ１ポリペプチドの様々な部分に及ぶ５種の追加的な６×ＨＩＳタグ付きのヒトＧａｌ１コンストラクトを、エピトープマッピング解析における使用のためにＥ．コリにおいて生成した（図９）。図９は、フォールディングされたヒトＧａｌ１ポリペプチドの５−ストランドβ−シート（Ｆ１〜Ｆ５）および６−ストランドβ−シート（Ｓ１〜Ｓ６ａ／Ｓ６ｂ）におけるβ−ストランドに関して、アミノ酸が、各ＧＳＴタグ付きおよびＨＩＳ−タグ付きのコンストラクトマップに包含される仕方をさらに実証する（図１０）。抗Ｇａｌ１、非中和８Ａ１２  ｍＡｂは、ウエスタンブロット解析によって組換えＨＩＳ−Ｆ７およびＨＩＳ−Ｆ５を認識することが決定された（図１１）。これらの結果は、８Ａ１２  ｍＡｂが、アミノ酸残基１１６〜１３５内のＧａｌ１に結合することを示す（図１２）。加えて、非中和８Ａ１２  ｍＡｂは、糖結合ドメインから空間的に遠く隔たるβ−シートＳ２／Ｆ１に結合するため、かかる微細エピトープマッピングデータは、Ｇａｌ１中和の構造的基盤を定義する。
【０２２４】
８Ａ１２  ｍＡｂとＧａｌ１との相互作用の生物物理学的性質［例えば、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（ＫＤ）］をさらに定義するために、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）（ＳＰＲ）解析［生体分子相互作用解析（Biomolecular Interaction Analysis）ＢＩＡｃｏｒｅとも呼ばれる］も行った。２５℃で標準ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰにおいて、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ）にてＳＰＲ実験を行った。簡潔には、抗マウス抗体を先ず、ＣＭ−５センサーチップ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に捕捉した。後に、およそ２５０応答単位（ＲＵ）の抗Ｇａｌ１  ｍＡｂ  ８Ａ１２を固定化し（ｒｍＧａｌ１アッセイのほぼ３５０ＲＵを除いて）、続いて組換えガレクチン［ヒトガレクチン（galetin）−１、２、３、４、７、８、９またはマウスガレクチン−１（ｍＧａｌ１）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製］の様々な希釈を行って、８Ａ１２へのガレクチンの結合を評価した。バッファー単独を充填したチャネルの減算後に、全データを示す。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、単純な１：１（ラングミュア）結合モデルにデータを網羅的に適合させることにより、示されている結合曲線および平衡解離定数（ＫＤ）を得るためのデータ解析を行った。８Ａ１２  ｍＡｂも、ｒｈＧａｌ１およびｒｍＧａｌ１の両方に、ｎＭレベルの親和性を示した（図１３）。加えて、８Ａ１２  ｍＡｂは、Ｇａｌ２、Ｇａｌ３、Ｇａｌ４、Ｇａｌ７、Ｇａｌ８およびＧａｌ９を含むより高い濃度の他の組換えガレクチンへの結合を示さなかったまたは非特異的結合を示した。
【０２２５】
参照による組み込み
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれることが特にかつ個々に示されるように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、本明細書のいずれかの定義を含む本願に従う。
【０２２６】
ゲノム研究所（Institute for Genomic Research）（ＴＩＧＲ）のワールドワイドウェブ、tigr.orgおよび／または国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブ、ncbi.nlm.nih.govによって維持される公共データベース等、公共データベースにおけるエントリーに相関する受託番号を参照するいずれかのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２７】
均等物
当業者であれば、単なるルーチン実験法を用いて、本明細書に記載されている本発明の特異的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することができるであろう。かかる均等物は、次の特許請求の範囲によって包含されることを目的とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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