(57)【要約】  本発明は、医薬として使用するための、特に萎縮疾患又は症状を治療または予防するための、又はサルコペニア、悪液質、ジストロフィー、発育不全、低血圧、又は筋肉喪失の患者の細胞増殖を増加させるための、並びに細胞培養増殖に適したインビトロ方法、及び医薬組成物に使用するための、ＳＥＲＦ２、前記ＳＥＲＦ２をコードする核酸、又はＳＥＲＦ２を発現する細胞を提供する。
2016508123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、ＳＥＲＦ２、該ＳＥＲＦ２をコードする核酸、又はＳＥＲＦ２を発現する細胞。
【請求項２】
萎縮性疾患又は症状を治療又は予防するのに使用するための、又は細胞再生治療のための、ＳＥＲＦ２、該ＳＥＲＦ２をコードする核酸、又はＳＥＲＦ２を発現する細胞。
【請求項３】
該萎縮が、細胞のアポトーシス上昇又は再生の低下に関連している、請求項２に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項４】
該萎縮が、筋細胞、特に心筋細胞又は骨格筋細胞又は平滑筋細胞、結合組織細胞、特に筋肉周囲の結合組織の細胞、上皮細胞、特に血管細胞、及び衛星細胞、又は骨細胞からなる群から選択される細胞の減少である、請求項２に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項５】
該疾患又は症状が、サルコペニア、悪液質、ジストロフィー、特に筋ジストロフィー、発育不全、低血圧、特に手術後の低血圧、多発性筋炎、線維筋痛症、筋細管ミオパシー、筋肉系の代謝性疾患、パーキンソン病、重症筋無力症、心筋症、心筋細胞の収縮不全、皮膚の老化から選択されるか、又は本発明の治療が、医療用ギプス又は他の固定、又はこれらの任意の組み合わせで、ある期間後の筋肉喪失又は筋ジストロフィーを防止するためである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項６】
ＳＥＲＦ２が患者に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項７】
患者の細胞が生体外でＳＥＲＦ２により処理され、該細胞が該患者に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項８】
幹細胞又は前駆細胞が該患者に投与される、請求項７に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項９】
該疾患又は症状が慢性又は急性である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の使用のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項１０】
幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、特に表皮細胞、間葉細胞、特に心筋細胞、衛星細胞、骨格筋細胞、造血細胞、特に造血幹細胞又は前駆細胞の増殖を増加させるか、又は該細胞のアポトーシス速度を低下させるインビトロ方法であって、ＳＥＲＦ２又はＳＥＲＦ２をコードする核酸を該細胞に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
該細胞が、筋細胞、特に心筋細胞又は骨格筋細胞又は平滑筋細胞、結合組織細胞、特に筋肉周囲の結合組織の細胞、及び幹細胞、前駆細胞、特に衛星細胞、造血細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、特に表皮細胞、又は骨細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＥＲＦ２が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むか又はこれからなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用又は方法のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項１３】
投与されるＳＥＲＦ２濃度が、０．５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ、特に好ましくは２．５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは４μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用又は方法のためのＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項１４】
酸化的ストレスを受けている細胞が処理される、請求項１〜１３いずれか１項に記載のＳＥＲＦ２、核酸、又は細胞。
【請求項１５】
ＳＥＲＦ２又はＳＥＲＦ２をコードする核酸、及び医薬的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、安定剤、及び／又は補助剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、再生治療、特に筋細胞の再生のための、及び種々の起源のヒト細胞におけるプログラム細胞死の軽減のための、医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞再生の欠如又は脱制御されたアポトーシスを特徴とする主な疾患は、サルコペニアと悪液質である。サルコペニアの病因は多くの要因があり、まだ充分理解されていないが、この現象の後遺症、すなわち独立性の喪失及び代謝合併症は主要な保健上の問題である。高齢者における筋肉減少の最も明白な代謝的説明は、タンパク質合成と分解速度との不均衡であるが、他の原因、例えばプログラム細胞死（アポトーシス）の過度の上昇速度、神経変性プロセス、インスリン、成長ホルモン、及び性ホルモンなどの同化ホルモン産生又は感受性の低下、サイトカイン分泌の調節不全、炎症事象に対する応答の変化、不十分な栄養摂取、及び座りがちな生活も関与している。栄養、運動、ホルモン、特定の同化薬を組み合わせた多モードアプローチは、加齢よるサルコペニアの進展を制限するための治療計画であり得る。しかし、すべての治療アプローチは深刻な欠点を有し、例えばホルモン及び同化薬剤は、しばしば重篤な副作用を持っている。サルコペニアの合意されている定義は、von Haehling et al. , J Cachexia Sarcopenia Muscle (2010) 1:129-133に開示されている。
【０００３】
サルコペニアと身体活動の欠如は関連している。しかし、身体活動だけでは完全にサルコペニアを防ぐことはできない。サルコペニアの治療戦略は満足できるものではない。最も一般的な治療法は、テストステロンなどの筋肉の成長と相互作用するホルモンの適用である。残念ながら、テストステロンを用いた治療は、心血管疾患又は癌などの種々の副作用を誘導し得ることが示されている。
【０００４】
サルコペニアは通常高齢者に見られるが、、認知症のように若年成人でも観察されることがある。６０〜７０歳の老人のサルコペニアの有病率は５〜１１％であり、８０歳以上の人では１１〜５０％である。また、今後３０年間にわたって２億人ががこの症候群に悩まされると推定されている（Cruz-Jentoft A., Age and Ageing 2010, 39）。
【０００５】
年齢に関連するサルコペニアを持つ人のみが影響を受けるのではなく、腫瘍を有する寝たきりの患者、又は身体活動の無い患者も、筋組織の著しい減少を有する。
高齢者の急速な増加や同時に年齢関連サルコペニアの増加とをこれらの患者と組合せた医療システムに対する莫大なコストは、サルコペニアの効率的な治療を必要としている。
【０００６】
悪液質は、疾患によって引き起こされる筋肉量と体重の減少を有する身体的消耗として定義される。これは、悪液質を発現する疾患を有する高齢者に一般的である。さらに、筋肉量の減少は、衰弱（frailty）とサルコペニアの症状の特徴である。身体的衰弱は、体力低下、歩行速度の低下、身体活動の低下、体重減少、及び極度の疲労から生じる症状である。サルコペニアと衰弱は、筋肉量の減少に関連しているため、悪液質症状として分類できるであろう。
【０００７】
アポトーシスはいわゆるプログラム細胞死を意味し、これは、細胞が破壊される活性プロセスである。この破壊は、クロマチン凝縮、細胞収縮、膜小疱形成、及びアポトーシス体の形成のようないくつかの特徴的な形態学的変化を受ける。成人の体内の細胞では、細胞分裂と制御された細胞死とが完全にバランスされていることは、知られている。例えば、ヒト胚の発生における手足の指の形成において、又は細胞が変性しているか、非機能的であるか、及び／又は潜在的に動物に危険である場合などのように、アポトーシスが発生する異なる事象がある。
【０００８】
アポトーシスは、事象の制御された連続を特徴とする。最初の兆候は、クロマチンの凝縮、ＤＮＡ断片化、タンパク質分解酵素の発現、及び最終的に細胞破壊である。これらの生化学的及び形態学的変化は、様々な方法で測定することができ、これらのいくつかは、単に一般的な細胞死を検出するのみであるため、アポトーシスと壊死とを区別することができる検査方法を選択することが非常に重要である。
【０００９】
利用可能な証拠は、筋核アポトーシスを標的化することが、サルコペニアと戦うために新規かつ有効な治療手段を提供することを示唆する（Marzetti E. et al. (2012) Gerontology 58/2:99-106）。筋細胞量の減少は高齢者にとって深刻な問題であるため、これらの患者の筋力を回復する治療法を提供することは非常に重要であろう。筋細胞の減少もまた、サルコペニアとして知られている。現在この疾患の満足のいく治療法は存在せず、筋細胞増殖の誘導はサルコペニアのための新しい革新的な治療法につながる可能性がある。筋細胞の減少は、細胞分裂と制御された細胞死（アポトーシス）との不均衡から生じる。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、種々の消耗性疾患の治療のための、細胞増殖を刺激し及び／又はアポトーシスを低下させる、適切な薬剤及び方法を見つけることである。
【００１１】
本発明は、かかる治療用の新規薬剤としてＳＥＲＦ２を提供する。第１の態様において本発明は、医薬として使用するための、ＳＥＲＦ２、ＳＥＲＦ２をコードする核酸、又はＳＥＲＦ２を発現する細胞を提供する。関連する態様において本発明は、萎縮性疾患又は症状を治療又は予防するのに使用するための、又は細胞再生治療のための、又は患者の細胞増殖を増加させるための、ＳＥＲＦ２、ＳＥＲＦ２をコードする核酸、又はＳＥＲＦ２を発現する細胞を提供する。
【００１２】
また、幹細胞又は前駆細胞への、ＳＥＲＦ２又はＳＥＲＦ２をコードする核酸の投与を含む、これらの細胞の増殖を増加させるか又はそのアポトーシス速度を低下させるインビボ又はインビトロ方法が提供される。
【００１３】
第４の態様において本発明は、ＳＥＲＦ２又はＳＥＲＦ２をコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、医薬的に許容される担体又は安定剤を含むことができる。
【００１４】
明らかなように、これらの態様の全ては互いに関連しており、等価であり、全ての好適な実施態様は、同様にこれらの態様のそれぞれに関連している。本発明の主題はまた、特許請求の範囲でさらに定義される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第２の精製工程（ＨＩＣカラム）後のＳＥＲＦ２の分析。画分１〜９の等量をＳＤＳゲル上にのせ、ウェスタンブロット分析に供した。ＳＥＲＦ２（矢印）は約１３ｋＤａで出現し、ＨＩＣカラムで遅れは無いが、不純物が保持される。より大きい見かけの分子量は、ＳＥＲＦ２の溶出挙動を変化させる多量の正電荷（１９残基）のためである。
【図２】ラットの骨格筋細胞（Ｌ６）の増殖に対するＳＥＲＦ２の作用。１×１０4のＬ６細胞を、１００μｌの増殖培地を含有するウェルに接種した。細胞を、＋３７℃、５％ｖ／ｖのＣＯ2、及び加湿雰囲気中で一晩インキュベートした。アッセイを行う前に、細胞の生存率を顕微鏡で確認した。細胞を、ウェルあたり１００μｌのＤＰＢＳで３回洗浄した。ＳＥＲＦ２をＤＭＥＭで希釈し、細胞に１００μｌ／ウェルを加えた。最後に、細胞を様々な時点について＋３７℃でインキュベートした。次に、１０μｌ／ウェルのAlamaBLue（登録商標）試薬（Invitrogen）を加えた。プレートを＋３７℃で１時間インキュベートした。蛍光（励起：５７０ｎｍ、発光：５８５ｎｍ）を、Varioskan Flash マルチプレートリーダー（Thermo Scientific）を使用して測定した。得られたデータをマイクロソフトエクセル（Microsoft Excel）及びグラフパッドプリズム（Graph Pad Prism）Ｖ４を用いて評価した。
【図３】Ｈ９ｃ２細胞の増殖に対するＳＥＲＦ２の作用は用量依存性である。増殖アッセイを基本的に図２のように行った。インキュベーション時間は２４時間であり、加えたＳＥＲＦ２濃度は２０〜１．２５μｇ／ｍｌの範囲であった。
【図４】マウス衛生細胞（ＭｕＭａ２３／Ｐ１３）の増殖に対するＳＥＲＦ２の作用。増殖アッセイを基本的に図２のように行った。インキュベーション時間は２４時間であり、加えたＳＥＲＦ２濃度はそれぞれ２０及び４μｇ／ｍｌであった。
【図５】ラット心筋細胞（Ｈ９ｃ２）の増殖に対するＳＥＲＦ２の作用の動力学。ＳＥＲＦ２で刺激した細胞（緑の線）は増殖して応答し、６日後に最大増殖速度に達した。増殖アッセイを基本的に図２のように行った。インキュベーション時間は２４、４８、７２、及び１４４時間であり、加えたＳＥＲＦ２濃度は５μｇ／ｍｌであった。
【図６】ラット骨格筋細胞（Ｌ６）の増殖に対するＳＥＲＦ２の作用の動力学。ＳＥＲＦ２で刺激した細胞（緑の線）は増殖して応答し、６日後に最大増殖速度に達した。増殖アッセイを基本的に図２のように行った。インキュベーション時間は２４、４８、７２、及び１４４時間であり、加えたＳＥＲＦ２濃度は５μｇ／ｍｌであった。
【図７】ＳＥＲＦ２は、Ｈ2０2誘導性アポトーシスからヒト上皮細胞株（Ａ４３１）を防御する。実験は、ウェル当たり５ｍｌの細胞培養培地（無血清）を含有する６ウェルプレートで行い、１×１０6細胞／ウェルの細胞密度で接種し、一晩培養した。翌日、２００ｍＭのＨ2０2又は２００ｍＭのＨ2０2とＳＥＲＦ２（５μｇ／ｍｌ）を培養物に加えた。６時間インキュベーション後、接着細胞を採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、死滅細胞をトリパンブルー染色して光学顕微鏡を使用して検出した。死滅細胞のパーセントが示されている。
【図８】ＳＥＲＦ２は、Ｈ2０2誘導性アポトーシスからヒト上皮細胞株（ＭＣＦ−７）を防御する。実験は、ウェル当たり５ｍｌの細胞培養培地（無血清）を含有する６ウェルプレートで行い、１×１０6細胞／ウェルの細胞密度で接種し、一晩培養した。翌日、２００ｍＭのＨ2０2又は２００ｍＭのＨ2０2とＳＥＲＦ２（５μｇ／ｍｌ）を培養物に加えた。６時間インキュベーション後、接着細胞を採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、死滅細胞をトリパンブルー染色して光学顕微鏡を使用して検出した。死滅細胞のパーセントが示されている。
【図９】ＳＥＲＦ２は、Ｈ2０2誘導性アポトーシスからヒトＴ細胞株（Jurkat）を防御する。実験は、ウェル当たり５ｍｌの細胞培養培地（無血清）を含有する６ウェルプレートで行い、１×１０6細胞／ウェルの細胞密度で接種し、一晩培養した。翌日、２００ｍＭのＨ2０2又は２００ｍＭのＨ2０2とＳＥＲＦ２（緑の棒；５μｇ／ｍｌ）を培養物に加えた。６時間インキュベーション後、接着細胞を採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、死滅細胞をトリパンブルー染色して光学顕微鏡を使用して検出した。死滅細胞のパーセントが示されている。
【図１０】ＳＥＲＦ２は、FＣＳを補い、増殖因子依存性ヒト骨髄性細胞におけるアポトーシスを緩和する。ＴＦ−１細胞を、異なる培養条件下でインキュベートした：ＦＣＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ（濃い青）、無血清培地＋ＧＭ−ＣＳＦ（５μｇ／ｍｌ、淡い青）、無血清培地＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＳＥＲＦ２（５μｇ／ｍｌ、ライム色）、無血清培地＋ＳＥＲＦ２（緑）、無血清培地のみ（赤）。９．５時間後、培養上清を、カスパーゼ３の発現レベルについてＥＬＩＳＡ技術により分析した。結果は、ｐＮＡ（ｐｍｏｌ／μｌ）として表現される。
【図１１】ＳＥＲＦ２は、ヒトＢ細胞株におけるアポトーシスを緩和する。７１１−３細胞を、異なる培養条件［無血清培地（濃い青）、無血清培地＋ＳＥＲＦ２（５μｇ／ｍｌ、ライム色）、無血清培地＋ＳＥＲＦ２＋Ｈ2０2（緑）、及び無血清培地＋Ｈ2０2（赤）］下でインキュベートした。９．５時間後、培養上清を、カスパーゼ３の発現レベルについてＥＬＩＳＡ技術により分析した。結果は、ｐＮＡ（ｐｍｏｌ／μｌ）として表現される。
【図１２】ＣＡＭアッセイにおけるＳＥＲＦ２の血管新生促進作用。ＳＥＲＦ２のプロ血管新生特性を評価するために、３μｇのＡ：ＰＢＳ、及びＣ：ＳＥＲＦ２をＣＡＭ毎に適用した。Ｂ：ＶＥＧＦ−Ａ（０．５μｇ／ＣＡＭ）を陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照として使用した。新しい血管は、ＶＥＧＦとＳＥＲＦ２処理したＣＡＭにおいて同定された。処理は、胎児齢６，７日に行った。血管新生応答を顕微鏡で評価した。示された写真は、６日目に記録のために撮られた。
【図１３】ａ：異なる用量のＳＥＲＦ２とインキュベートした７ｄｐｆ齢のゼブラフィッシュの心臓の大きさの変化。ｂ：異なる濃度のＳＥＲＦ２及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）中でインキュベートした７ｄｐｆ齢のゼブラフィッシュの心臓容積の変化。対照動物との有意差は、星印で示される。
【図１４】異なる用量のＳＥＲＦ２でインキュベートしたゼブラフィッシュ中の血液細胞濃度の変化。平均値（血液細胞／ｎｌ）とＳＥＭが示されている。星印は対照動物に対する有意差を示す。
【図１５】異なる用量のＳＥＲＦ２又はＥＰＯとインキュベートした７ｄｐｆ又は１５ｄｐｆ齢のゼブラフィッシュ中の尾びれの内皮細胞の増殖の変化。星印は対照動物との有意差を示す。
【図１６】７ｄｐｆゼブラフィッシュ中の尾の血管のイメージング（上の画像＝対照、下の画像＝ＳＥＲＦ２処理された）。赤紫色の矢印は背動脈を示し、青の矢印は節間血管を示す。
【図１７】７ｄｐｆゼブラフィッシュ中の血液細胞（緑の矢印）の検出（上の画像＝対照、下の画像＝ＳＥＲＦ２処理された）。血液細胞の濃度を決定するために、検出された細胞の数を容器容積で割った。
【図１８】えら、骨格筋、及び尾部のＴＵＮＥＬ技術によって検出されたアポトーシス細胞。これらの実験から、ＳＥＲＦ２処理動物中の特異的に染色された細胞の数が、未処理動物と比較して、種々の領域で少ないことが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
ＳＥＲＦ２（小ＥＤＲＫリッチ因子２）は、公知の配列を有するタンパク質である。例えば、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）データベースＰ８４１０１（ヒト），Ｐ８４１０２（マウス）、又はＮＣＢＩデータベースＮＰ＿００１０１８１１８（ヒトタンパク質），ＮＰ＿０３５４８４（マウスタンパク質），ＮＭ＿００１０１８１０８（ヒトヌクレオチド），ＮＭ＿０１１３５４（マウスヌクレオチド）を参照されたい。アイソフォームが、データベース受け入れ番号ＮＰ＿００１０１８１１８．１，ＮＰ＿００１１８６８０４．１，ＮＰ＿００１１８６８０５．１，ＮＰ＿００１１８６８０６．１、及びＮＰ＿００１１８６８０７．１で寄託されている。これまで、これはＨ４Ｆ５ｒｅｌとも呼ばれてきた（Ｈ４Ｆ５関連−ＳＥＲＦ２は、Ｈ４Ｆ５と６９％の配列同一性を共有する、Scharf et al. nature genetics 20, 1998: 83- 86）。ＳＥＲＦ２はさらに、ＵＳ２００７／０４２３９２Ａｌ（配列番号１１４３として，ＥＢＩデータベース受け入れ番号ＡＧＩ３２１８９）、及びＷＯ２０００／５５３５１Ａｌ（配列番号１０５４として，ＥＢＩデータベース受け入れ番号ＡＡＢ５３５１４）に開示されており，これらはいずれも、参照することにより本明細書に組み込まれる。ＳＥＲＦ２はさらに、Van Ham Tjakko J et al. , Cell, Vol. 142, No. 4 (2010), 601-612、及びＮＣＢＩデータベース受け入れ番号ＡＡＣ６３５１６に開示されている。
【００１７】
過去には、ＳＥＲＦホモログタンパク質の機能的能力について結果が異なっている。一部の論文は、アミロイド形成性タンパク質の凝集を介する毒性の役割を報告（例えばvan Ham et al. Cell 142, 2010: 601-612）し、他の論文は、封入体中の毒性タンパク質の沈着を介する保護的役割を記載している。van Ham et al.により記載された凝集し易いタンパク質の線維状凝集体が、神経変性疾患のみの特徴であることを理解することが重要である。
【００１８】
いくつかの神経変性疾患は、遺伝子中の拡張したトリヌクレオチド配列ＣＡＧに関連している。ＣＡＧはアミノ酸であるグルタミンをコードするため、これらの疾患はまとめてポリグルタミン疾患として知られている。異なるポリグルタミン疾患に関与する遺伝子（及びタンパク質）はほとんど共通点を持たないが、これらが引き起こす疾患は、驚くほどよく似た経過をたどる：拡張部の長さが３５〜４０の臨界値を超えた場合、タンパク質中のグルタミン繰り返しの数が多いほど、疾患は早期に発症しやすく、症状はより重篤となる。この事実は、異常に長いグルタミン片がこれらの宿主タンパク質を神経細胞に対して毒性にすることを示唆し、及びすべてのポリグルタミン疾患が、共通の分子機構を介して進行すると仮定される。細胞死の１つの可能な機構は、宿主タンパク質がその適切な形に折り畳まれることをグルタミンの異常に長い配列が妨害する、形状を取ることである。ポリグルタミン（ポリＱ）疾患は、アルツハイマー病やパーキンソン病のように、コンフォメーション性神経変性疾患に分類され、これらは異常に拡張されたポリＱを有するタンパク質ストレッチにより引き起こされる。
【００１９】
ポリグルタミンのコンピュータモデルを使用して、ポリグルタミン反復配列の長さが、疾患で見られる臨界値より長い場合に限り、これはβらせんと呼ばれる特定の形状を取ることが示された。グルタミン片が長いほど、βらせんを形成する傾向が大きい。タンパク質中のポリグルタミン片（ｐｏｌｙＱ）の拡張は、タンパク質凝集を引き起こし、神経変性疾患における細胞死と関連している。発症年齢は、３５〜４０のグルタミンの臨界値以上のポリＱ挿入体の長さと相関している。インビトロの単離されたポリＱペプチドの凝集速度論は、同様の同様の臨界長依存性を示す。単離されたポリＱペプチドのコンピュータシミュレーションを用いることにより、凝集機構が、単一のポリＱペプチド鎖におけるランダムコイルから平行βヘリックスへのコンホメーション転移であることが示された。この転移は、３７グルタミンより長いペプチドに選択的に発生する。見かけの毒性分子種（可溶性オリゴマー）、及び神経損傷を引き起こすこれらのその後の能力は、膜内タンパク質分解性切断の精度に依存する。いくつかのオリゴマー種は小さく、脳実質中を容易に拡散するのに充分に可溶性であり、シナプス構造と機能、及び最終的にはニューロンの生存に影響を与える。
【００２０】
一連の実験において、van Ham et al.（上記）は、シー・エレガンス（C. elegans）中の年齢関連タンパク質毒性の制御物質として、凝集の修飾物質（ＭＯＡＧ−４／ＳＥＲＦ）を同定しようと試みた。著者らは、グルタミン残基の数（＜４０残基）に応じて、タンパク質凝集を検出することができ、これらが、ＭＯＡＧ−４中に点突然変異を導入した時は、低下していることを見いだした。しかし、これらの生物において寿命は影響を受けなかった。ＳＥＲＦタンパク質ファミリーのメンバーは、ＭＯＡＧ−４と同様の機能を有しているようである。さらに、ＳＥＲＦ１／２の過剰発現は、マウス繊維芽細胞中の変異体ハンチントンタンパク質の凝集と細胞死滅とを増加させた。
【００２１】
これらの興味深い知見にもかかわらず、この論文の結果は多くの問題を提起している：
１．シー・エレガンス（C. elegans）中の機能試験は、ヒト又は哺乳動物における状態を反映しないことが多く、例えば最近の結果は、コリプレッサー相互作用よりもコアクチベーター相互作用について、ＴＣＦタンパク質間の高度の種特異性を明らかにしており、シー・エレガンス（C. elegans）とヒトのＴＣＦ４定常状態核レベルの基本的差異を証明している。他の例は、一方では、神経系において重症の欠陥を引き起こす、シー・エレガンス（C. elegans）及びディー・メラノガスター（D. melanogaster）のｕｎｃ−７６変異体と、他方では、形態学的及び強い行動的表現型を示さない、マウスＦＥＺ１−／−ノックアウトマウスとの間の劇的な差異である。
【００２２】
２．ＳＥＲＦタンパク質ファミリーについて、毒性的役割ではなく防御的役割を記載する文献報告がある。
【００２３】
３．ＭＯＡＧ４とＳＥＲＦタンパク質とのアミノ酸配列には顕著な差（約５０％）があり、従って、機能的差異はタンパク質配列の差異に帰因するかも知れない。
【００２４】
４．最も重要なことは、高度に人工的なシステムが使用されることである。７４個のｐｏｌｙＱ反復配列でトランスフェクトされた細胞（自然には決して達成されない状態）でのみ凝集が起きる。さらに、凝集はアミロイド形成性タンパク質でのみ見られる。従って、外因性タンパク質の非存在下で、ＭＯＡＧ４／ＳＥＲＦの天然の機能があるかどうかはいまだに不明である。
【００２５】
にもかかわらず、本発明のある実施態様では、治療すべき疾患又は症状は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及びポリグルタミン疾患でもなく、アミロイド線維又はアミロイド形成タンパク質の凝集に起因する任意の疾患又は症状の、１つ以上の疾患ではない。具体的な態様において、この疾患又は症状は、神経系の疾患又は症状ではない。
【００２６】
本発明の結果は、種々の哺乳動物細胞型におけるＳＥＲＦ２の防御的及び増殖支持的役割を明白に示している。いくつかの実験において、ＳＥＲＦ２が種々のヒト細胞株において増殖を誘導することが示されている。これは、間葉系起源の細胞以外に、特に造血系細胞及び筋細胞に対する作用も有する。
【００２７】
本明細書においてＳＥＲＦ２は、任意のＳＥＲＦ２アイソフォーム又は変化型に関する。好適な実施態様においてＳＥＲＦ２は、配列番号１に示したアミノ酸配列、又は配列番号１に示した配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる。
【００２８】
用語「配列同一性」は、通常アミノ酸配列である２つの配列間の同一性を意味し、これは、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）又はＣｌｕｓｔａｌＷ（WWW.ebi.ac.uk/CLUSTALW/）のような配列整列プログラムによって決定することができる。これらのアルゴリズムは、選択された配列のための最適な一致を計算し、これらを整列させて、同一性、類似性、及び相違点を見ることができるようにする。配列番号１に対する配列同一性は、配列番号１の全配列に対して計算される。
【００２９】
本発明の好適な実施態様において、本発明のＳＥＲＦ２は、配列番号１に示した配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はさらに１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又はこれからなる。
【００３０】
ＳＥＲＦ２は、組換えＳＥＲＦ２でもよい。さらに好ましくは、これは患者と同じ起源であるが、他の動物からのＳＥＲＦ２変化型でもよい。好ましくは、患者は哺乳動物、特にヒト又は非ヒト動物、特に家畜動物、例えばブタ、げっ歯類、又は霊長類である。好ましくＳＥＲＦ２は、特に特に家畜動物、例えばブタ、げっ歯類、又は霊長類のＳＥＲＦ２である。
【００３１】
本明細書において「含む」は、開かれた意味で使用され、すなわち本発明のＳＥＲＦ２は、アミノ酸又はタンパク質成分をさらに有することができる。これは、融合タンパク質であってもよい。このような拡張ＳＥＲＦ２タンパク質は、好適な実施態様において限定された大きさを有することができ、例えば最大２０００アミノ酸、最大１８００アミノ酸、最大１６００アミノ酸、最大１４００アミノ酸、最大１２００アミノ酸、最大１０００アミノ酸、最大８００アミノ酸、最大６００アミノ酸、最大４００アミノ酸、最大３００アミノ酸、最大２００アミノ酸、又は最大１６０アミノ酸を有することができる。もちろん本発明はまた、上記実施態様に含まれる前記配列のいずれか１つから成るＳＥＲＦ２タンパク質にも関する。
【００３２】
「からなる」は、閉じられた、順序が限定された意味で使用される。
【００３３】
ＳＥＲＦ２タンパク質を使用する代わりに（又はこれと組合せて）、上記ＳＥＲＦ２タンパク質とその変化型とをコードする核酸を使用することも可能である。このような配列は、例えば配列番号１をコードする配列番号２に示される。
【００３４】
細胞中でＳＥＲＦ２の産生を誘導するために、核酸を使用することができる。核酸送達のための好適な処方は、制御送達のためのリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、又は小胞である。次に、細胞はＳＥＲＦ２を産生し分泌して、治療薬の連続的産生を提供する。
【００３５】
また、本発明の用途のためにＳＥＲＦ２を発現する細胞が提供される。このような細胞は、好ましくはＳＥＲＦ２を連続的に分泌して治療効果を提供する。このような細胞は、任意の細胞である。好適な実施態様において、細胞は患者に対して免疫原性ではなく、例えばこれは、ＳＥＲＦ２を組換え発現するように遺伝子操作されている、患者から得られた細胞である。細胞の修飾は、インビトロ又はインビボで行うことができる。
【００３６】
特に、核酸又は細胞の直接活性のある治療薬は発現されたＳＥＲＦ２であるため、前記の及び以後のさらに詳細な説明は、ＳＥＲＦ２タンパク質、核酸、及び細胞に等しく関連する。これらの実施態様のすべては、本明細書において等しく 「ＳＥＲＦ２」と呼ばれ、ここでＳＥＲＦ２タンパク質は、直接活性のある薬剤であるため好適である。
【００３７】
本発明は、特に、萎縮性疾患又は症状の治療又は予防に又は細胞再生治療に使用するためのＳＥＲＦ２を提供する。
【００３８】
本明細書において「予防すること」は、患者が疾患又は症状を決して発症しないことを要求するものではなく、これは、疾患又は症状を発症するリスクが低下することに関連する。これは予防的治療である。疾患又は症状の発症後、例えば治療の必要な患者が特定された後に、他の形態の治療が発生する。「治療すること」は、疾患又は症状が完全に治癒されることを意味するものではない。これはまた、症状の改善又は寛解を指すこともある。
【００３９】
萎縮は、細胞レベルでのアポトーシスを含む、組織の再吸収と分解の全身的な生理学的プロセスである。これはまた、身体の一部の部分的な喪失とも呼ばれる。これは疾患により引き起こされるか、又は、老化中のような正常な身体の変化の一部でもある。特別な実施態様では、萎縮は筋萎縮であるが、他の組織も影響を受け、本発明により同様に治療される。ＳＥＲＦ２は、晩年の筋肉量と機能を維持するのに有効な筋核アポトーシスのダウンレギュレーションを達成し、さらに細胞増殖と発達とを刺激する。
【００４０】
これは、アポトーシスと増殖の再生との間の平衡を、基本的に増殖と再生に向けてシフトさせる。ＳＥＲＦ２はアポトーシスを低下させ、増殖を増加させる。すなわち、これは、アポトーシスが増加しているか、及び／又は細胞の増殖又は再生が低下している細胞又は疾患を治療するために使用することができる。すなわち好適な実施態様において、本発明に従って治療される萎縮は、細胞のアポトーシスの増加又は再生の低下に関連する。萎縮は、特定の組織の量の減少でもよい。このような組織は、筋肉（例えばサルコペニアにおける）、皮膚（例えば、薬物治療又は年齢による皮膚の菲薄化における）、骨、又は肝臓などの内臓、造血系の組織、例えば骨髄、脾臓、扁桃、リンパ節でもよい。
【００４１】
萎縮の治療に加えて、本発明は、特定の細胞型の不足がない場合でも、細胞の量を増加させるのに使用することができる。これは、特定の組織量を増加させるために、時間制限又は拡張療法として使用することができる。このような組織は、例えば、上記したように筋肉（例えばボディービル用）、皮膚、骨、肝臓などの内臓、及び造血系の組織でもよい。
【００４２】
好適な実施態様において、治療される萎縮は、筋細胞、特に心筋細胞又は骨格筋細胞又は平滑筋細胞、結合組織細胞、特に筋肉又は骨細胞周囲の結合組織の細胞、上皮細胞、特に血管細胞、及び衛星細胞、又は骨細胞（例えば骨芽細胞又は破骨細胞）からなる群から選択される細胞の減少である。
【００４３】
治療又は予防される疾患又は症状は、特別な実施態様では、サルコペニア、悪液質、筋ジストロフィー、特に筋ジストロフィー、発育不全、低血圧、特に手術後の低血圧、多発性筋炎、線維筋痛症、筋細管ミオパシー、筋肉系の代謝性疾患、パーキンソン病、重症筋無力症、心筋症、心筋細胞の収縮不全、皮膚の老化から選択することができる。本発明の治療は、医療用ギプス又は他の固定、又はこれらの任意の組み合わせにおけるある時間後の、筋肉喪失又は筋ジストロフィーを防止するためであることができる。治療される疾患又は症状は、不十分な血管新生に関連することがある。不十分な血管新生に関連する疾患は、特定の組織（特に、好適な実施態様で治療される上記した組織の一つ）への血液循環の喪失及び不十分な酸素供給により特徴付けられる。不十分な血管新生を伴う疾患は、例えば虚血性心疾患、及び抗血管新生治療（血管新生を低下させるか又は妨害する抗体による治療、例えば黄斑変性症の治療、又は癌の治療において）により生じる症状である。治療されるさらなる疾患又は症状は、好中球減少症、特に化学療法誘発性好中球減少症であることができ、これは、本発明により、造血系の細胞の増殖を増加させるか又はそのアポトーシスを低下させることにより治療することができる。好ましくは、造血幹細胞がインビボ又は生体外で拡張され、血液細胞の減少をもたらす癌治療における症状を改善するために使用される。もちろん、他の幹細胞、例えば上記の組織のいずれかの幹細胞を、本発明のＳＥＲＦ２を使用して拡張することができる。
【００４４】
体細胞は限られた寿命と再生能力の両方を有し、これは老化の間に特に明らかである。サルコペニアは、高齢者における骨格筋及び筋力の変性喪失として定義される。筋肉の喪失は、日常生活の中で高齢者に大きな障害を発生させ、医療費の莫大な増加につながる。転倒と骨折の危険性が上昇し、独立性と生活の質の喪失が明らかになる。筋肉喪失の理由は、特にタンパク質分解、タンパク質合成の喪失と筋肉脂肪含有量である。筋細胞量の喪失の機構は、骨格筋における衛星細胞の減少である。衛星細胞は、筋肉の基底膜に位置する特殊化した細胞であり、筋肉再生及び筋肉組織の成長のために重要である。衛星細胞の数は年齢とともに減少し、これがサルコペニアの理由である。
【００４５】
背景技術の項で述べた理由により、筋細胞内でアポトーシスを防止するための及び新たな筋肉組織の形成を誘導するための新しい治療法は、細胞の喪失に関連するサルコペニアや他の疾患を治療するために、大きな需要がある。
【００４６】
筋肉及び衛星細胞に対するＳＥＲＦ２の有益な作用に加えて、これは、他の種々の細胞型のために使用することができるであろう。造血細胞（ＨＣ）に対するＳＥＲＦ２の作用が最も重要である。これは、ＧＦを奪われた細胞死からこれらの細胞型を保護し、生存期間の延長につながる。これは、絶対に必要な細胞の数が少ししか残っていない疾患（例えば、化学療法中）、又は幹細胞などの希少な細胞型を拡張する必要がある疾患で、特に重要である。これらの作用に関連して、ＳＥＲＦ２は、例えば対象の造血細胞又は血液細胞の量、例えば血液細胞濃度を増加させるために、インビボ又はインビトロで使用することができる。これは、治療的又は非治療的使用であってもよい。すなわち本発明はまた、血液細胞の増加を必要とする被験体の血液細胞の欠乏を治療するための治療法にも関する。血液細胞は、赤血球（赤血球）、ＰＢＭＣ、白血球、Ｔ細胞、顆粒球、及びマクロファージ又は単球から選択することができる。
【００４７】
ＳＥＲＦ２が上皮細胞に対して増殖及び寿命向上作用を示すという本明細書に提示された新しい結果を考えると、ＳＥＲＦ２は皮膚の老化を防止するための薬剤として適している。その比較的小さい分子量のために、これはリポソーム中にパッケージすることができ、医療用化粧品における効率的な添加剤として使用できるであろう。すなわちＳＥＲＦ２はまた、老化作用を防止又は低減するために、皮膚の治療において化粧品又は治療用途に使用することもできる。
【００４８】
上皮細胞の作用は、特に血管新生中に明らかになる。本明細書に示されるように、血管新生は、ＳＥＲＦ２を投与することによってインビボ又はインビトロで刺激することができる。すなわち本発明はまた、血管新生を刺激するためのＳＥＲＦ２の使用を提供する。動脈供給が不十分な組織を有する患者を治療することができる。患者は、本発明により治療される無酸素組織を有していてもよい。動脈供給が不充分な組織はまた、例えば急性又は慢性であってもよく、例えば、少なくとも１４日間、好ましくは少なくとも１８日間、特に好ましくは少なくとも２２日間、さらにより好ましくは少なくとも２８日間、少なくとも３４日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、又はさらには少なくとも６０日間、この状態でもよい。すなわち本発明は、特にこのような治療を必要とする組織における、ＳＥＲＦ２による血管新生の誘導を必要とする患者の治療に関する。好ましくは、治療は局所的である。
【００４９】
ＳＥＲＦ２は、例えば患者に投与することができ、例えばＳＥＲＦ２タンパク質又は核酸は、適切な手段によって患者のシステム又は特定の組織へ直接投与される。
【００５０】
あるいは、患者の細胞は生体外でＳＥＲＦ２で処理され、この細胞が患者に投与される。ＳＥＲＦ２処理された細胞は増殖のために活性化され、インビボで必要な再生機能を実行することができる。再投与は好ましくは局所的であり、細胞の起源の組織（例えば、筋細胞/筋肉幹細胞又は前駆細胞、例えば衛生細胞を筋肉に再適用）に投与される。生体外で処理され再投与される好適な細胞は、任意の種類の幹細胞又は前駆細胞であり、これらは、一般に増殖及び組織再生の可能性が上昇している。
【００５１】
本発明に従って治療されるべき疾患又は症状は、慢性又は急性であってもよい。好適な実施態様において「慢性」は、少なくとも１４日間、少なくとも１８日間、少なくとも２２日間、少なくとも２８日間、少なくとも３４日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、又はさらには少なくとも６０日間存在する疾患又は症状に関する。
【００５２】
本発明はさらに、幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、特に表皮細胞、間葉細胞、特に心筋細胞、衛星細胞、骨格筋細胞、造血細胞、特に造血幹細胞又は前駆細胞に、ＳＥＲＦ２又はＳＥＲＦ２をコードする核酸を投与することを含む、前記細胞の増殖を増加させるか、又は前記細胞のアポトーシス速度を低下させる、インビトロ又はインビボ方法に関する。
【００５３】
造血細胞は、例えば骨髄、脾臓、扁桃、又はリンパ節の、細胞、幹細胞、又は前駆細胞でもよい。このようなインビボ方法は、上記治療法の１つのために適切であり得る。インビトロ方法は、細胞培養物を増殖させるために、又は細胞を増殖させるための生体外工程で使用することができ、これらは次に、治療の過程で患者に再挿入することができる。
【００５４】
このような細胞は、好ましくは、筋細胞、特に心筋細胞又は骨格筋細胞又は平滑筋細胞、結合組織細胞、特に筋肉周囲の結合組織の細胞、及び幹細胞、前駆細胞、特に衛星細胞、造血細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、特に表皮細胞からなる群から選択される。本発明のＳＥＲＦ２は、任意の組織中のこれらの細胞の量を増加させるために使用することができ、心臓の量又は容積を増加させるために使用することができる。この増加は、このような細胞の機能不全を伴う疾患、例えば筋力低下、特に心筋力低下を治療するために、又は同化理由のために使用することができる。特に好適な実施態様は、人工皮膚のための皮膚細胞のインビトロ調製に関し、これらの細胞又は皮膚は皮膚の修復に使用することができる。
【００５５】
ＳＥＲＦ２（従来通り、タンパク質、核酸又は細胞を含む）は、当技術分野で公知の任意の方法で投与することができる。特に好適な投与形態は、局所投与である。好適な局所投与手段は、経皮パッチ又はミニポンプによるものであり、これは、その必要のある部位又は組織にＳＥＲＦ２を連続的に提供することができる、もちろん、全身投与も可能であり、全体に上昇した増殖活性を提供する。全身投与の場合には、しかし局所投与形態でも、選択された種類の組織に特異的な表面受容体のリガンドなどの組織ホーミング分子に、ＳＥＲＦ２を連結、例えば融合することができる。このような組織は、上記、例えば筋肉（心筋、骨格筋、又は平滑筋）細胞、内皮細胞などから選択することができる。このようなホーミング分子は、あらゆる種類の投与でＳＥＲＦ２の組織特異的作用を可能にする。
【００５６】
好適な実施態様において、投与されるＳＥＲＦ２濃度は、０．５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ、特に好ましくは２．５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは４μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。これらの範囲は、本発明の治療に特に有効であることがわかった。
【００５７】
実施例に示すように、ＳＥＲＦ２は、例えば酸化的ストレスなどのストレス下にある細胞の、増殖を増加させるか及び／又はアポトーシスを低下させることができる。すなわち好適な実施態様において、本発明で治療される細胞は、ストレス、特に・ＯＨを含む反応性酸素種により誘導されるストレスなどの酸化的ストレスを受けている。
【００５８】
本発明はさらに、ＳＥＲＦ２タンパク質又はＳＥＲＦ２をコードする核酸又はＳＥＲＦ２を発現する細胞を含む医薬組成物に関する（３つのすべての実施態様は等しく「ＳＥＲＦ２」、好ましくＳＥＲＦ２タンパク質と呼ばれる）。治療的使用のための医薬組成物又は製剤は、医薬的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、安定剤、及び／又は補助剤を含んでよい。本発明はまた、治療有効量のＳＥＲＦ２を含む医薬組成物を提供する。用語「治療有効量」は、特定の症状及び投与経路について治療効果を提供する量を意味する。組成物は、液体型又は凍結乾燥型でもよく、種々のｐＨ値とイオン強度とを有する希釈剤（トリス、酢酸塩、又はリン酸緩衝液、塩化ナトリウム）、可溶化剤、例えば、ツイーン又はポリソルベート、担体、例えばヒト血清アルブミン又はゼラチン、保存剤、例えばチメロサール又はベンジルアルコールを含む。特定の組成物の選択は、治療される症状、投与経路、及び所望の薬物動態パラメータを含む多くの要因に依存する。
【００５９】
好適な製剤は、局所投与のための製剤である。特に好適なものは、ハイドロゲル、パッチ、特に経皮パッチ、及び外科的に挿入された送達手段、例えばミニポンプである。また、溶解性、安定性、血漿半減期、及び生物学的利用能を増加させるために、水溶性ポリマーで修飾されたＳＥＲＦ２を含む組成物も包含される。組成物はまた、長期間にわたる制御された送達のための、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、微粒子、又は小胞へ、ＳＥＲＦ２の取り込みを含むこともできる。
【００６０】
特殊な実施態様において、ＳＥＲＦ２に担体が提供される。担体は、好ましくは、ゲル、好ましくはゲル、好ましくはヒドロゲル、又はＳＥＲＦ２を含有する溶液を任意に含浸させた創傷包帯又はやスワブから選択される。さらに担体は、より長期に効果的な適用として、活性剤組合せを遅延させより遅く放出させる遅延放出のための担体を含む。対応する担体を有するこのような製剤は、局所投与及び迅速投与に特に適している。
【００６１】
特に本発明は、医薬として使用するための又はＳＥＲＦ２の上記使用の任意の１つのための医薬組成物を提供する。
【００６２】
本発明はさらに、以下の図面及び実施例により、本発明のこれらの具体的な態様に限定されることなく説明される。
【実施例】
【００６３】
実施例１：材料と方法
１．１  ＳＥＲＦ２−クローニング、発現、及び精製
ＳＥＲＦ２は、ＡＢ４ｃＤＮＡライブラリーを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより同定された。ＳＥＲＦ２のコード配列は１８０ｂｐであり、成熟タンパク質の長さは５９アミノ酸、分子量は６８９９、ｐＩは１０．４４である。
【００６４】
配列番号２: atgacccgcggtaaccagcgtgagctcgcccgccagaagaatatgaaaaag
配列番号１:  M  T  R  G  N  Q  R  E  L  A  R  Q  K  N  M  K  K
cagagcgactcggttaagggaaagcgccgagatgacgggctttctgctgccgcccgcaagcag
Q  S  D  S  V  K  G  K  R  R  D  D  G  L  S  A  A  A  R  K  Q
agggactcggagatcatgcagcagaagcagaaaaaggcaaacgagaagaaggaggaacccaag
R  D  S  E  I  M  Q  Q  K  Q  K  K  A  N  E  K  K  E  E  P  K
tag
-
【００６５】
ＳＥＲＦ２を、タグなしでｐＥＴ２８ベクター（カナマイシン耐性を妨害する）に、５’ＮｃｏＩと３’ＸｈｏＩ部位で、コドン最適化してクローニングした。ＳＥＲＦ２は、ＢＬ２１大腸菌で発現させた。
【００６６】
一晩前培養物を、選択Ｍ９ＺＢ培地中のグリセロールストックから調製し、２２０ｒｐｍで振盪して３７℃でインキュベートした。翌日、一晩前培養物をＯＤ600＝０．１に希釈し、ＯＤ600＝０．５になるまで、２２０ｒｐｍで振盪して３７℃でインキュベートした。次に、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した。次に、培養物を３０℃で４時間インキュベートし、次に、２２０ｒｐｍで振とうして、室温で一晩インキュベートした。２５００ｇで２時間遠心分離して、細菌を採取した。
【００６７】
１．２  ＳＥＲＦ２の精製
細胞を、破砕のために溶解緩衝液［７５ｍｌ／ｌ培養容積；５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％トリトンＸ−１００］に再懸濁し、−８０℃で３回の凍結／融解サイクルに供した。３回目の融解後、３０μｇ／ｌのＤＮＡｓｅＩを添加し、溶解した細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。２５００ｇで２時間遠心分離して、上清を回収した。
【００６８】
精製のために、濾過した溶解物（０．２２μｍ）を１４ｍｌ／分の流速で２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中でＳＰ−セファロースカラム（７０ｍｌ  ＣＶ）にのせた。画分を、２０ｍＭトリス／１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の直線勾配により、２１４ｎｍでタンパク質を記録して溶出した。銀染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルとウエスタンブロット法を介して、それぞれ関連する画分を単離した後、硫酸アンモニウムを３０％の最終飽和になるように、ゆっくり一晩攪拌して加えた。次に、塩に富むＳＥＲＦ２を限外濾過（０．２２μｍ）し、及び７ｍ／分の流速でハイトラップオクチル−セファロースＦＦ（Hi Trap Octyl-Sepharose FF）カラム（２５ｍ  ＣＶ）を介して第２の精製に供した。関連する画分を銀染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルとウエスタンブロッティング（図１）を介して同定し、プールし、２０ｍＭのリン酸Ｎａ塩、ｐＨ７．４に対して透析した。
【００６９】
１．３  細胞培養
ラット由来の胚性心筋細胞Ｈ９ｃ２（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１４４６）及び胚骨格筋細胞Ｌ６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１４５８）を、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＣＳ  ＰＡＡ）と１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）をと含有するダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（ＤＭＥＭ、Sigma Aldrich）中で培養した。細胞を、８０ｃｍ２の細胞培養フラスコ（NUNC）中で１５ｍｌの増殖培地を使用して増殖させた。両方の細胞株を、＋３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2の加湿雰囲気下でインキュベートした。約９０％の集密度に達した時、細胞を分割した。通常、１：５又は１：１０の分割比を適用した。この目的のために、上清を除去し、細胞を１０ｍｌダルベッコーのリン酸緩衝化生理食塩水（DPBS、Gibco）を用いて洗浄した。３ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco）を添加し、次に＋３７℃で５〜１０分間インキュベーションして、細胞を回収した。細胞の剥離に成功したかどうかを、顕微鏡（IMT-2、Olympus）下で確認し、７ｍｌの増殖培地を添加した。細胞数及び生存率を、自動細胞アナライザー（CEDEX、Innovatis）を用いてトリパンブルー排除によって測定した。このために、９５０μｌのＤＰＢＳ及び５０μｌの細胞懸濁液を混合し、分析のために使用した。
【００７０】
初代マウス衛星細胞の単離：雄のＩＣＲマウスから筋肉組織を採取し、ハサミとメスを用いて刻んだ。プロテアーゼ溶液（Sigma, St. Lois）で３７℃で１時間インキュベーション後、激しくピペッティングして残りの組織塊を分離し、パーコール（Pharmacia）勾配（７５％、５０％、３０％）にのせた。１２５０ｘｇで２０分間遠心分離した後、細胞を２回目の中間期（９９％衛星細胞）から回収し、洗浄し、６ウェルプレート中で１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度で培養した。Danoviz ewt al . Methods Mol Biol. 2012 ; 798: 21-52も参照されたい。
【００７１】
哺乳動物細胞培養：
接着細胞：Ａ４３１は類表皮癌細胞であり、ＭＣＦ−７細胞は上皮細胞であり、ＥＣＶ−３０４は膀胱癌細胞由来である。
懸濁細胞：ＴＦ−１細胞は、重度の汎血球減少症患者の骨髄に由来する。この細胞は、５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補足した培地を必要とし、マクロファージ様細胞に分化する。Jurkat細胞株は、急性Ｔ細胞白血病（ＡＴＣＣ）を有する１４歳の少年の血液kから得られた。７１１−３は、ヒトのリンパ芽球様Ｂ細胞株である。
【００７２】
１．４  AlamarBlue（登録商標）アッセイ
増殖は、AlamarBlue（登録商標）アッセイを用いて製造業者のプロトコルに従って測定した。簡単に述べると、１００μｌの増殖培地を含有するウェル当たり１×１０4細胞を接種した。細胞を＋３７℃、５％ｖ／ｖのＣＯ2及び加湿雰囲気中で一晩インキュベートした。アッセイを行う前に、細胞の生存率を顕微鏡で確認した。通常、細胞は６０％の集密度に達した。細胞を、ウェルあたり１００μｌのＤＰＢＳで３回洗浄した。ペプチドをＤＭＥＭ中で必要に応じて希釈（５０〜２０μｇ／ｍｌの範囲）し、１００μｌ／ウェルを細胞に添加した。最後に、実験の種類に応じて種々の時点について、細胞を＋３７℃でインキュベートした。次に１０μｌ／ウェルのAlamarBlue（登録商標）試薬（Invitrogen）を加えた。プレートを＋３７℃で１時間インキュベートした。蛍光（励起：５７０ｎｍ、発光：５８５ｎｍ）は、Varioskan Flashマルチプレートリーダー（Thermo Scientific）を用いて測定した。データは、マイクロソフトエクセルとグラフパッドプリズムＶ４を用いて評価した。
【００７３】
１．５  鶏卵テスト− 漿尿膜（HET-CAM）アッセイ
特定病原体不含受精卵（白色レグホン）を、胎児齢５日（Ｅ５）にBAXTER Biosciences (Vienna, Austria) から入手した。Microzid (Schulke, Austria) に浸したタオルを使用して、卵の表面を消毒した。小さな穴を開け、１８Ｇ針を備えた注射器を用いて、３ｍｌの卵白を除去した。次に、穴をパラフィンで被覆した。卵を開くために、別の穴を上部に開けた。ピンセットを使用して、この部分の卵の殻を除去した。下層の膜を取り除いて、漿尿膜（ＣＡＭ）にアクセスしやすくなった。この操作窓を、最終的に無菌アルミ箔で覆った。卵は、＋３７℃、５％ｖ／ｖＣＯ2及び加湿雰囲気でインキュベートした。胎児齢６日（Ｅ６）に、プラスチックホイル（外径１２ｍｍ、内径３ｍｍ）を、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで３回、及び滅菌Locke（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣ１、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＮａＨＣＯ3）バッファで３回洗浄した。最後に、プラスチック箔をＣＡＭ上に置いた。選択されたペプチドを希釈し、プラスチックホイルの真ん中にこれらをピペッティングすることにより、Ｅ６のＣＡＭ上に塗布した。実験の種類に応じて、卵はＥ８又はＥ１１まで＋３７℃でインキュベートした。所定の時点で、デジタルカメラ（Coolpix990, Nikon, Japan）を備えた実体顕微鏡（StemiSVll, Zeiss, Germany）を使用して、ＣＡＭの写真を撮影した。試験したペプチドの血管新生能は、実験の終了時に顕微鏡で評価した。
【００７４】
１．６  染色方法
トリパンブルー染色は、光学顕微鏡を使用して細胞生存率を測定するための最も一般的に使用される方法の１つである。トリパンブルーは、その膜が損傷されている場合にのみ細胞を染色することができる。生きた細胞はこの色素を取り込まない。
【００７５】
１．７  カスパーゼ３特異的ＥＬＩＳＡ
カスパーゼ３は、システイン、アスパラギン酸特異的プロテアーゼファミリーのメンバーであり、アポトーシスの早期イベントのマーカーである。カスパーゼ３の発現を市販のキットを用いて測定した。簡単に説明すると、種々の処理後のアポトーシスを起こした細胞の培養上清を採取し、ｐ−ニトロアニリン（ＰＮＡ）（これは、カスパーゼ３によって切断されると黄色を生成する）で標識した基質と共にインキュベートした。生成された黄色の量はカスパーゼ−３活性に比例し、これは、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Promega）により測定することができる。このアッセイは、基本的に製造業者が記載（CaspACE（登録商標）Assay Systemの取扱説明書、Promega）するように実施した。
【００７６】
実施例２：結果
組換えＳＥＲＦ２タンパク質をクローニングし、形質細胞様樹状細胞に似ているヒト細胞株から発現させた。ＳＥＲＦ２は、ラット筋細胞の増殖の刺激と、血管新生の促進の両方を行うことが示されている。従って、ＳＥＲＦ２が種々のヒト細胞に影響を与えることは明らかである。最初の実験は、ＳＥＲＦ２が筋細胞及び衛星細胞の増殖を刺激することができるどうかを調べるために設定した。
【００７７】
２．１  ＳＥＲＦ２は、骨格筋細胞、心筋細胞、及び初代衛星細胞の増殖を支持する
これらの実験の目的は、ラットの胚心筋芽細胞株Ｈ９ｃ２に対するＳＥＲＦ２の増殖作用を決定することであった。処理は２４時間行われ、AlamarBlue（登録商標）アッセイは方法の欄で説明したように行われた。得られた結果は図３に示される。マウス衛星細胞ＭｕＭａ２３／ＰＩについて、同様セットの実験を行った。得られた結果は図４に示される。両方のセットの実験において、ヒトＳＥＲＦ２による治療は、用量依存的に増殖作用をもたらした。この観察は、Ｌ６ラット骨格筋細胞を用いた実験（図２）と同様である。これらの実験では、両方の細胞株（Ｌ６とＨ９ｃ２９）は、ＳＥＲＦ２で一回処理された。AlamarBlue（登録商標）アッセイは、インキュベーションの６日目まで毎日行われた。この実験の結果はそれぞれ図５と図６に示される。
【００７８】
ＳＥＲＦ２は、用量及び時間依存的にＬ６ラットの骨格筋細胞に対して増殖作用を示した。最大の作用は、インキュベーションの３〜６日後に観察された。心筋芽細胞（Ｈ９ｃ２）をＳＥＲＦ２で処理した場合、同様の結果が得られた。増殖作用は、５μｇ／ｍｌ  ＳＥＲＦ２でピークに達することが観察された。
【００７９】
２．２  ＳＥＲＦ２は、ニワトリＣＡＭアッセイで血管新生作用を示す
ＨＥＴ−ＣＡＭアッセイは、基質又は細胞の血管新生能の評価を可能にする。適切なＶＥＧＦ濃度を決定し、これは陽性対照として使用することができる。これを達成するために、２つの卵のＣＡＭにＶＥＧＦ−Ａを１回塗布した（１００ｎｇ／ＣＡＭａｂｓ．）。２つの卵を未処理のままとし、陰性対照とした。処理は胎児齢６日（Ｅ６）に行った。血管新生応答は、光学顕微鏡でＥ１１に測定した。この実験の写真は、図１２に示される。
【００８０】
ＳＥＲＦ２の血管新生促進特性を評価するために、このタンパク質をＨＥＴ−ＣＡＭアッセイに供した。３μｇ量のＰＢＳ及びＳＥＲＦ２ペプチドをＣＡＭ毎に適用した。ＶＥＧＦ−Ａ（０．５μｇの／ＣＡＭ）を陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照とした。処理は、胎児齢６日と７日に行った。その間、全ての希釈物を＋４℃で保存し、塗布前に室温で平衡化させた。Ｅ７及びＥ８に、血管新生応答を顕微鏡で評価した。各処理は三重測定で行った。これらの２日間の記録のために写真を撮った（図１２を参照）。新たに形成された血管の手動カウントによって決定されるように、ＳＥＲＦ２はＨＥＴ−ＣＡＭアッセイにおいて血管新生促進応答を示した。
【００８１】
２．３  ＳＥＲＦ２はヒト細胞におけるアポトーシスを防ぐ
増殖因子由来アポトーシス又はストレス誘導性アポトーシスに対して、ＳＥＲＦ２が効果を有するかどうかという質問をした。実験プロトコルは、２００μΜ未満の用量で、細胞ストレスとその後のアポトーシス死とを引き起こすことが知られている過酸化水素（Ｈ2０2）の添加を含んでいた（Cox A., Carcinogenesis. 2007, Vol. 28, 10）。さらに、ＴＦ−１細胞の培養物中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の欠乏によって、アポトーシスを誘導した。これらの細胞は、ＴＦ−１細胞の増殖と分化のために絶対に必要である増殖因子の存在に依存している。
【００８２】
結果は、図７（Ａ４３１細胞−Ｈ2Ｏ2アッセイ）、図８（（ＭＣＦ−７細胞−Ｈ2０2アッセイ）、図９（Jurkat細胞−Ｈ2０2アッセイ）、図１０（ＴＦ−１細胞−増殖因子アッセイ）、及び図１１（７１１−３細胞−Ｈ2０2アッセイ）に示される。
【００８３】
すべての実験計画において、細胞培養物中のＳＥＲＦ２の存在はアポトーシスを顕著に低下させた。この作用が、種々の起源の細胞、すなわち上皮細胞又は骨髄系又はリンパ系の細胞に見られたことは注目に値する。
【００８４】
２．４  ゼブラフィッシュにおけるＳＥＲＦ２のインビボ作用
ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生、生理学、及びヒト疾患を研究するための重要なモデルとなっている。循環系に関しては、ゼブラフィッシュは、哺乳動物と比較して造血、脈管新生、及び血管新生を支配する高度に保存された経路を有するだけでなく、これらとすべての主要な血液細胞型を共有する。従ってゼブラフィッシュは、脊椎動物の心臓血管の発生を研究するための優れたモデル生物である。大規模なフォワード遺伝子スクリーニングにより、遺伝性の血液疾患、悪性血液疾患、発達血液学、ならびに心臓発達と心機能の変化のモデルとなる多くのゼブラフィッシュ変異体が同定されている。ゼブラフィッシュモデルの別の利点は、発生の最初の１０日間に、単純な拡散により胚に酸素が供給されることである。すなわち胚は、この期間に心拍又は循環血液無しで生存して正常に発生することができ、これは、循環器系の発生の研究を促進する。
【００８５】
その幼虫のサイズが小さいため、心臓血管性能、血管新生プロセス、運動ニューロンの筋機能との完全性を計算するためのいくつかの方法が、過去１０年間に開発された。我々は２つの適用経路を用いるＳＥＲＦ２のインビボ性状解析のためにゼブラフィッシュを使用した：１）受精後（ｄｐｆ）３日目の動物の卵黄嚢への天然のタンパク質の天然タンパク質の注入、又は２）拡散を介して天然のタンパク質を供給するための長期インキュベーション。両方の投与経路によるタンパク質の効率的な取り込みは、心臓筋肉の成長、血管新生、及びアポトーシスに及ぼす作用を調べることを可能にした。
【００８６】
方法。ＳＥＲＦ２は、ａ）種々のタンパク質濃度で、又は拡散を介して天然のタンパク質を供給するための長期インキュベーションで、受精後（ｄｐｆ）３日目の動物の卵黄嚢と新たな受精卵（２〜８細胞期）への天然のタンパク質の注入により投与された。血管新生作用の詳細な分析のために、ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）標識した内皮細胞を有するｆｌｋ−１トランスジェニック動物が使用された。他のすべての実験では、野生型（ｗｄｔ）動物が使用された。
【００８７】
Schwerte et al.により記載されたように、心臓の大きさは、拡張末期寸法の測定と拡張末期容積を計算することにより決定した（Schwerte et al. The Journal of Experimental Biology. 2003;206(Pt 8):1299-1307）。
【００８８】
脈管新生指数。既に記載されている（Schwerte et al.、前出 ）ように、後続の差分画像のいくつかの赤血球の移動シフトベクトルを蓄積することにより、血管床の形を得た。これと平行して、緑色蛍光を発する内皮細胞を示すｆｌｋ−１トランスジェニック動物を画像化した。
【００８９】
アポトーシス細胞のインサイチュ染色のＴＵＮＥＬアッセイ。インサイチュー細胞死検出キット、Fluorescein（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）を使用して製造業者の説明書に従って、アポトーシス細胞を検出した。
【００９０】
統計解析。取得したデータを両側スチューデントｔ検定（マイクロソフトエクセル）を使用して解析し、ｐ＜０．０５の場合に有意差を受け入れた。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示されている。
【００９１】
結論。ＳＥＲＦ２によるゼブラフィッシュの処理は、動物の心臓容積の有意な増加をもたらした（図１３ａ及び１３ｂを参照）。最も顕著な知見の１つは、対照と比較した血液細胞濃度の５０〜１００％という高く有意な増加であった（図１４）。以前の研究から、酸素送達が必要とされる生理的な状況に対してこのパラメータがより敏感であることが知られていることを考慮すると、これは、既に示されている（Schwerte et al.、前出）よりも、ゼブラフィッシュの発生の後期に血管増殖が上昇していることのヒントであるかも知れない。脊椎動物では、血管と血液細胞が共通の幹細胞（いわゆる血管芽細胞）を有している。低酸素症に対する最初の応答が、新しい血管が成長する前の血液細胞の濃度の増加であることが、文献（Schwerte et al.、前出）から知られている。全体の酸素運搬能力の上昇が、新たに成長した血管に比べてより高速な応答を提供し、これが次に新しい血液及び血液細胞により充填されなければならないため、生理学的観点から、これは意味がある。血液細胞の濃度は、酸素運搬能力の調整における中心的パラメータである。以前の研究で、血管の増殖に比較して酸素送達の上昇が必要である生理的状況に対して、このパラメータがより敏感であることが示された。１つの処理群以外の７ｄｐｆすべては、大幅に増加した血液細胞濃度を示す。この増加は全ての薬物送達経路に見出され、ＳＥＲＦ２が、インキュベーションと皮膚上の取り込み、及び注入と腸管上の取り込み、の両方により送達可能であることの証拠を与えている（図１５〜１７）。
【００９２】
ＳＥＲＦ２処理した動物におけるアポトーシス細胞数の減少は、ＳＥＲＦ２のインビボの明らかな抗アポトーシス効果を証明している（図１８）。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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