(57)【要約】試料における酵素活性を測定する方法を開示する。本方法は、電気化学発光性官能基を有するジスルフィド含有検出試薬を使用する。本開示は一般に、生物学的試料における酵素の検出および定量的測定のための、検出試薬および電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのアッセイならびに試薬検査キットの開発に関する。特に、本開示は、電気化学発光性官能基を有するジスルフィド含有検出試薬を使用して、試料における酵素活性を検出し測定する方法に関する。
2016508727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断可能なジスルフィド結合を有する分子であって、該ジスルフィド結合の第１の側部に電気化学発光（ＥＣＬ）活性ルテニウムキレートを有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有する分子
を含む検出試薬。
【請求項２】
前記検出試薬の前記ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基で切断され得る、請求項１に記載の検出試薬。
【請求項３】
前記遊離スルフヒドリル基が、反応混合物中の１つまたは複数の成分によって曝露されている、請求項２に記載の検出試薬。
【請求項４】
ジスルフィド結合を有する分子に、該ジスルフィド結合の第１の側部には電気化学発光（ＥＣＬ）活性ルテニウムキレートを結合させ、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部には固定化部分を結合させること
を含む、検出試薬を調製する方法。
【請求項５】
前記検出試薬の前記ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基で切断され得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
電気化学発光性官能基を、ジスルフィド結合を形成できるスルフィド基を有する第１の分子に結合させるステップと、
固定化部分を、ジスルフィド結合を形成できるスルフィド基を有する第２の分子に結合させるステップと、
該第１の分子と該第２の分子との間に切断可能なジスルフィド結合を形成させるステップと
を含む、検出試薬を調製する方法。
【請求項７】
前記検出試薬の前記ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基で切断され得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１の分子と第２の分子との間に切断可能なジスルフィド結合を形成させるステップと、
該第１の分子に電気化学発光性官能基を結合させるステップと、
該第２の分子に固定化部分を結合させるステップと
を含む、検出試薬を調製する方法。
【請求項９】
前記検出試薬の前記ジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基で切断され得る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料中で生成したＮＡＤＰＨを測定する方法であって、
ジスルフィド結合を有する検出試薬と、該試料と、ＮＡＤＰＨ触媒ジスルフィドレダクターゼとを組み合わせて反応混合物を形成するステップであって、該検出試薬の該ジスルフィド結合がＮＡＤＰＨ中の存在下で該レダクターゼによって切断され、
該検出試薬が、該ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを含有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を含有し、
該切断が、該ＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有する第１の切断生成物および該固定化部分を有する第２の切断生成物を生じ、
該レダクターゼによる該切断が該試料中で生成するＮＡＤＰＨの量に比例する、ステップと、
ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが該試料中のＮＡＤＰＨの存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが該試料中のＮＡＤＰＨの非存在を表す、ステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記ＮＡＤＰＨが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ジスルフィド切断レダクターゼが、グルタチオンレダクターゼおよびトリパノチオンレダクターゼから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記固定化部分がビオチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素活性を測定する方法であって、
（ａ）該試料と、ＮＡＤＰ＋と、該試料中の測定される該酵素に特異的な基質とを、ＮＡＤＰＨが還元型ＮＡＤＰ＋から生成するような条件下で、組み合わせて、反応混合物を形成するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の該反応混合物と、グルタチオンレダクターゼおよびグルタチオンジスルフィドとを、グルタチオンジスルフィドを還元してＧＳＨにする条件下で、組み合わせるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の該反応混合物を、ジスルフィド含有検出試薬であって、該ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬と組み合わせるステップであって、該ジスルフィド含有検出試薬が該還元型グルタチオンによって非酵素的に切断され、
該還元型グルタチオンによる該切断が該試料中で生成したＮＡＤＰＨの量と比例しているステップと、
（ｄ）ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが該試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素の存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが該試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素の非存在を表すステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）を、所定の時間にわたっておよび所定の温度で実行する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＡＤＰＨ生成酵素がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記固定化部分がビオチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
試料中のエステラーゼ活性を測定する方法であって、
該試料と、エステラーゼの基質のチオエステル類似体と、ジスルフィド含有検出試薬であって、該ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬とを、該基質の該チオエステル類似体が、反応混合物中のエステラーゼによって脱アシル化されて、該ジスルフィド含有検出試薬の該ジスルフィド結合を切断して該反応混合物中のエステラーゼ活性に比例した検出可能なＥＣＬシグナルの変化を導く、曝露された脱アシル化遊離スルフヒドリル基を有する活性化された基質類似体をもたらすような条件下で、組み合わせて、該反応混合物を形成するステップと、
ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが該試料中のエステラーゼの存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが該試料中のエステラーゼの非存在を表す、ステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記エステラーゼがＬｐ−ＰＬＡ２（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
基質の該チオエステル類似体が、チオ−血小板活性化因子（ＰＡＦ）、リソ−チオ−ＰＡＦ、アセチルチオコリン、プロピオニルチオコリンおよびブチリルチオコリンから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記固定化部分がビオチンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記組み合わせるステップが、洗浄剤を組み合わせることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄剤が、ＣＨＡＰＳ（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）およびＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組み合わせるステップの後で、前記測定するステップの前に、ｐＨを調整するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
試料中のエステラーゼ活性を測定するキットであって、
ジスルフィド含有検出試薬、
エステラーゼの基質のチオエステル類似体、ならびに
エステラーゼ活性を測定するアッセイを実行するための指示であって、
以下：
該試料と、エステラーゼの基質のチオエステル類似体と、ジスルフィド含有検出試薬であって、該ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有すジスルフィド含有検出試薬とを、該基質の該チオエステル類似体が、反応混合物中のエステラーゼによって脱アシル化されて、該ジスルフィド含有検出試薬の該ジスルフィド結合を切断して該反応混合物中の該エステラーゼ活性に比例した検出可能なＥＣＬシグナルの変化を導く、曝露された脱アシル化遊離スルフヒドリル基を有する活性化された基質類似体をもたらすような条件下で、組み合わせて、該反応混合物を形成するステップと、
ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが該試料中のエステラーゼの存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが該試料中のエステラーゼの非存在を表す、ステップと
を含む、指示
を含むキット。
【請求項２６】
前記エステラーゼ活性を測定するアッセイが、リパーゼおよびコリンエステラーゼからなる群から選択されるエステラーゼの活性を測定する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記エステラーゼがリパーゼである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記リパーゼがＬｐ−ＰＬＡ２（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）である、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、２０１３年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／７６９，０４４号、および２０１３年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８４０，８２０号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は一般に、生物学的試料における酵素の検出および定量的測定のための、検出試薬および電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのアッセイならびに試薬検査キットの開発に関する。特に、本開示は、電気化学発光性官能基を有するジスルフィド含有検出試薬を使用して、試料における酵素活性を検出し測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
血液または血漿における酵素活性の測定は、進行する病状および危険因子の有用な検出因子および予測因子となり得る。臨床的状況で実行できる血液および血漿の酵素活性のためのアッセイは、例えば、病理学的酵素過活性の場合にどの患者に阻害剤を施すか、または、それらを組織の損傷、疾患の病理の診断的指標として使用できるかを迅速に判定するため、あるいは、毒性酵素阻害剤の存在を検出するために使用することができる。
【０００４】
標準的な臨床化学アッセイは、臨床的に関連する酵素活性または酵素阻害剤の存在を測定するために存在する。これらのアッセイのいくつかは、直接的にでも、あるいは、標的酵素の活性の測定値をＮＡＤＨ（還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰＨ（還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の変化と結び付ける追加の反応混合物の酵素および基質によっても、反応混合物中のＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの量を変えることによって、標的とする酵素活性を測定することができる。最近では、これらのアッセイは、それらの定量的検出読み出しを得るために、色の変化または他の公知の検出方法を使用する。しかし、検出試薬のジスルフィド結合の切断を、例えばＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨまたは遊離スルフヒドリル基の変化に結び付けて、酵素活性の所望の定量的検出読み出しを提供することによって使用できる、臨床化学的酵素活性の電気化学発光（ＥＣＬ）測定を可能にする検出試薬および方法の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本開示は一般に、切断可能なジスルフィド結合を有する分子であって、該ジスルフィド結合の第１の側部に電気化学発光（ＥＣＬ）活性ルテニウムキレートを有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有する分子、を含む検出試薬に関する。
【０００６】
一部の実施形態では、本開示は、検出試薬のジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基で切断され得る検出試薬に関する。
【０００７】
本開示は一般に、切断可能なジスルフィド結合を有する分子に、該ジスルフィド結合の第１の側部には電気化学発光（ＥＣＬ）活性ルテニウムキレートを、該ジスルフィド結合の第２の側部には固定化部分を結合させるステップを含む、検出試薬を調製する方法に関する。
【０００８】
本開示は一般に、第１の分子と第２の分子との間に切断可能なジスルフィド結合を形成させるステップと、第１の分子に電気化学発光性官能基を結合させるステップと、第２の分子に固定化部分を結合させるステップとを含む、検出試薬を調製する方法に関する。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、検出試薬のジスルフィド結合が、遊離スルフヒドリル基で切断され得る、検出試薬を調製する方法に関する。
【００１０】
本開示は一般に、試料中で生成したＮＡＤＰＨを測定する方法であって、ジスルフィド結合を有する検出試薬と、試料と、ＮＡＤＰＨ触媒ジスルフィドレダクターゼとを組み合わせて反応混合物を形成するステップであって、検出試薬のジスルフィド結合がＮＡＤＰＨの存在下で該レダクターゼによって切断され、検出試薬が、該ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを含有し、かつ該ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を含有し、切断が、ＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有する第１の切断生成物および固定化部分を有する第２の切断生成物を生じ、該レダクターゼによる切断が試料中で生成するＮＡＤＰＨの量に比例する、ステップと、ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが試料中のＮＡＤＰＨの存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが試料中のＮＡＤＰＨの非存在を表す、ステップとを含む方法に関する。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は一般に、ＮＡＤＰＨ生成酵素がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、試料中で生成したＮＡＤＰＨを測定する方法に関する。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は一般に、ジスルフィド切断レダクターゼがグルタチオンレダクターゼおよびトリパノチオンレダクターゼから選択される、試料中で生成したＮＡＤＰＨを測定する方法に関する。
【００１３】
本開示は一般に、試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素活性を測定する方法であって、（ａ）試料と、ＮＡＤＰ＋と、試料中の測定される酵素に特異的な基質とを、ＮＡＤＰＨが生成するような条件下で、組み合わせて、反応混合物を形成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物と、グルタチオンレダクターゼおよびグルタチオンジスルフィドとを、グルタチオンジスルフィドを還元して還元型グルタチオンにする条件下で、組み合わせるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物を、ジスルフィド含有検出試薬であって、ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬と組み合わせるステップであって、ジスルフィド含有検出試薬が還元型グルタチオンによって非酵素的に切断され、還元型グルタチオンによる切断が試料中で生成したＮＡＤＰＨの量と比例しているステップと、（ｄ）ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素の存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素の非存在を表すステップとを含む、方法に関する。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は一般に、ステップ（ａ）が特定の反応に適した所定の時間にわたって所定の温度で実施される、試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素活性を測定する方法に関する。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は一般に、スルフィド切断レダクターゼが、グルタチオンレダクターゼおよびトリパノチオンレダクターゼから選択される、試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素活性を測定する方法に関する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は一般に、ＮＡＤＰＨ生成酵素がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素を測定する方法に関する。
【００１７】
本開示は一般に、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法であって、エステラーゼを有する試料と、エステラーゼの基質のチオエステル類似体と、ジスルフィド含有検出試薬であって、ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬とを含む反応混合物を、基質のチオエステル類似体が、反応混合物中のエステラーゼによって脱アシル化されて、ジスルフィド含有検出試薬のジスルフィド結合を切断して反応混合物中のエステラーゼ活性に比例した検出可能なＥＣＬシグナルの変化を導く、曝露された脱アシル化遊離スルフヒドリル基を有する活性化された基質類似体をもたらすような条件下で、組み合わせるステップと、ＥＣＬシグナルを測定するステップとを含む方法に関する。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は一般に、エステラーゼがＬｐ−ＰＬＡ２（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）である、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は一般に、基質のチオエステル類似体が、チオ−血小板活性化因子（ＰＡＦ）、リソ−チオ−ＰＡＦ（ｌｙｓｏ−ｔｈｉｏ−ＰＡＦ）、アセチルチオコリン、プロピオニルチオコリンおよびブチリルチオコリンから選択される、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は一般に、固定化部分がビオチンである、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は一般に、組み合わせるステップが洗浄剤を組み合わせるステップをさらに含む、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示は一般に、洗浄剤が、ＣＨＡＰＳ（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）およびＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）から選択される、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示は一般に、組み合わせるステップの後および測定するステップの前に、ｐＨを調整するステップをさらに含む、試料中のエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【００２４】
本開示は一般に、本明細書に記載する（ｄｅｓｃｒｅｉｂｅｄ）方法を実施するためのキットに関する。一部の実施形態では、キットは、ジスルフィド含有検出試薬；エステラーゼの基質のチオエステル類似体；ならびに指示であって、エステラーゼを有する試料と、エステラーゼの基質のチオエステル類似体と、ジスルフィド含有検出試薬であって、ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬とを含む反応混合物を、基質のチオエステル類似体が反応混合物中のエステラーゼによって脱アシル化されて、ジスルフィド含有検出試薬のジスルフィド結合を切断して反応混合物中のエステラーゼ活性に比例した検出可能なＥＣＬシグナルの変化を導く、曝露された脱アシル化遊離スルフヒドリル基を有する活性化された基質類似体をもたらすような条件下で、組み合わせるステップと、ＥＣＬシグナルを測定するステップとを含むエステラーゼ活性を測定するアッセイを実施するための指示を含むことができる。
【００２５】
添付の表および図は、本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、基質としてジチオニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を使用する比色分析アッセイの概略図である。
【００２７】
【図１Ｂ】図１Ｂは、検出試薬としてグルタチオンジスルフィド（ＧｓｓＧ）を使用するＥＣＬアッセイの概略図である。
【００２８】
【図２】図２は、酵素濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対するＧｓｓＧ切断（％）  を示す、実施例７に記載したジスルフィド反応から収集したデータのグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
検出試薬
本開示は、酵素活性を検出し測定するためのアッセイおよび方法において有用な検出試薬を提供する。検出試薬は、標準的な電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのアッセイで酵素活性を測定できるようにするものであり、これは、アッセイパネルにおいて、およびケア器具（ｃａｒｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）の関連での使用に有用であり得る。検出試薬は、切断可能なジスルフィド結合、すなわち−Ｓ−Ｓ−のジチオ化学基を有する分子または化合物であってもよい。一部の実施形態では、検出試薬は、ジスルフィド結合の第１の側部に電気化学発光（ＥＣＬ）活性ルテニウムキレートなどの少なくとも１つの電気化学発光性官能基を有することができる。一部の実施形態では、検出試薬は、ジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有することができる。
【００３０】
一部の実施形態では、検出試薬のジスルフィド結合は、反応混合物中の成分の反応によって曝露されている遊離スルフヒドリル基によって切断することができる。反応混合物中の成分は、少なくとも１つの未知の検体、例えば酵素、基質または代謝産物、検出試薬、バッファーおよびアッセイ試薬、ならびに生物学的試料、例えば血液、血漿、血清、赤血球溶解物、唾液、尿および組織抽出物を含むことができる。反応混合物の成分を混合すると、一部の実施形態では、独立に、または反応混合物中の他の成分と一緒に、酵素が作用し、最終的に遊離スルフヒドリル基を曝露させる状態を生み出すことができる。次いで、遊離スルフヒドリル基は、電気化学発光性官能基を有する検出試薬のジスルフィド結合を切断することができる。一部の実施形態では、検出試薬は、試料および／または反応混合物中に存在する酵素の量と比例して切断され得る。
【００３１】
電気化学発光性官能基は、ＥＣＬ反応チャンバー内、例えばフローセル中で、または使い捨て型電極で検出または定量できる検出標識またはタグとして機能を果たすことができる。固定化部分は、検出の間にＥＣＬ反応チャンバーにおいて検出試薬をＥＣＬ電極の近傍に保持する機能を果たすことができる。したがって、例えば、検出試薬のジスルフィド結合が切断されると、電気化学発光性官能基は固定化部分から離れ、それによってアッセイ洗浄ステップで洗い流されて検出されなくなり得る。次いで、これは、ＥＣＬ反応チャンバー中のＥＣＬ活性化電極に電圧を印加することによって発生するＥＣＬシグナルを減少させることができる。電気化学発光性官能基と固定化部分の両方を、ジスルフィド結合に直接結合させるか、または、電気化学発光性官能基もしくは固定化部分をジスルフィド結合と連結するのに使用できる連結中間体（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を介して間接的に結合させることができる。適切な固定化部分は、これらに限定されないが、プレート、ウェル、使い捨て型ＥＣＬ電極、ビオチン、およびアビジンもしくはストレプトアビジンでコーティングすることができるまたは結合親和性を促進するための他の表面官能基をもつ常磁性もしくは磁性ビーズを含む様々な固相媒体であってもよい。適切な連結中間体は、ビオチン、カルボキシレートもしくはアミノ基または他の化学結合を含むことができる。
【００３２】
一部の実施形態では、検出試薬は、ジスルフィド結合を有する分子または化合物に、ジスルフィド結合の第１の側部には少なくとも１つの電気化学発光性官能基、例えば電気化学発光（ＥＣＬ）活性ルテニウムキレートを、ジスルフィド結合の第２の側部には固定化部分を結合させることによって調製することができる。本明細書に記載する連結中間体は、電気化学発光性官能基および固定化部分を、ジスルフィド結合に間接的に連結するために使用することもできる。
【００３３】
一部の実施形態では、他の分子足場を使用して検出試薬を形成することができる。ジスルフィド結合を形成させることができ、かつ電気化学発光性官能基または固定化部分のいずれかと結合させることができるスルフィド基を有する任意の適切な分子部分を使用して、検出試薬を形成することができる。例えば、本明細書で論じるようなグルタチオンジスルフィドは、それがジスルフィド結合を有しており、グルタチオン部分が電気化学発光性官能基および固定化部分と結合して検出試薬を形成することができるので、検出試薬のための適切な分子足場を提供することができる。
【００３４】
したがって、一部の実施形態では、検出試薬は、電気化学発光性官能基を、ジスルフィド結合を形成できるスルフィド基を有する第１の分子と結合させること；固定化部分を、ジスルフィド結合を形成できるスルフィド基を有する第２の分子と結合させること；および第１の分子と第２の分との間にジスルフィド結合を形成させることによって調製することができる。
【００３５】
一部の実施形態では、検出試薬は、第１の分子の第１の部分と第２の分子の第１の部分との間にジスルフィド結合を形成させること；電気化学発光性官能基を第１の分子の第２の部分に結合させること；および固定化部分を第２の分子の第２の部分に結合させることによって調製することができる。これらのステップは、本明細書で提供されている順番で完遂させる必要はなく、例えば固定化部分が最初に分子と結合し、次いでジスルフィド結合が第１の分子および第２の分子との間で形成されるような、異なる順番で実施できることが想定される。さらに、電気化学発光性官能基および固定化部分が第１の分子または第２の分子のいずれかと異なる順番で結合することができることが想定される。検出試薬のジスルフィド結合は、遊離スルフヒドリル基で切断され得る。
【００３６】
電気化学発光（ＥＣＬ）は、それによって、適切な周囲の化学的環境において、「ＥＣＬ標識」などの分子種を電気化学的エネルギーに曝露させると、その種が発光するプロセスである。ＥＣＬは、迅速で高感度の生物分析検出技術であり、これは再生プロセスである。生物学的試料分析における検出方法として、ＥＣＬで達成される利点のいくつかには、簡単でより安価な器具類；安定した危険のない標識；ならびに高いアッセイ性能特性、例えばより低い検出限界、より高いシグナルとノイズの比、およびより低いバックグラウンドレベルが含まれる。ＥＣＬのある特定の用途が開発されており、文献に報告されている。米国特許第５，１４７，８０６号、同第５，０６８，８０８号、同第５，０６１，４４５号、同第５，２９６，１９１号、同第５，２４７，２４３号、同第５，２２１，６０５号、同第５，２３８，８０８号、同第５，３１０，６８７号、同第５，７１４，０８９号、同第６，１６５，７２９号、同第６，３１６，６０７号、同第６，８０８，９３９号、同第６，８８１，５８９号、同第６，８８１，５３６号および同第７，５５３，４４８号（これらの開示を参照により本明細書に組み込む）は、ＥＣＬのある特定の方法、装置、化学部分、発明および付随する利点を詳述している。
【００３７】
電気化学発光シグナルは、電気化学発光性官能基、例えばＥＣＬ活性標識とレドックス基質との間のレドックス反応によって発生するが、これは電極の表面で起こる。ある特定の実施形態では、ＥＣＬ標識はルテニウム（Ｒｕ）含有試薬である。適切な電気化学発光性標識の一例は、トリス（ビピリジン（ｂｙｐｙｒｉｄｉｎｅ））ルテニウム（ＩＩ）（ＴＡＧとも称される［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３］２＋）である。一部の実施形態では、レドックス基質はトリプロピルアミン（ＴＰＡ）である。
【００３８】
一部の実施形態では、通常電極の下に置かれる磁石は、磁性ビーズを引き付け、Ｒｕ標識錯体を電極の近傍に引き下ろすことができる。次いでＲｕを酸化することができる。酸化されたトリプロピルアミン（ＴＰＡ）は酸化されたＲｕと反応し、次いでこれはフォトンを放出することができる。電極近傍の電場においてのみ起こるＲｕとレドックス基質トリプロピルアミン（ＴＰＡ）の間のレドックス反応は、電圧の持続的な印加の間、再生プロセスである可能性があり、これによりがＥＣＬシグナルは経時的に増幅することができる。フォトンは電極表面近傍でしか生成することができないので、磁石によってＲｕが電極に近づけられた場合にだけ電気化学発光が起こり、それによってバックグラウンドレベルは低下する。非特異的ＥＣＬは、生物学的試料のいかなる公知の天然の構成要素によっても誘発されることはなく；したがって、化学発光検出分子の非特異的誘発のため、しばしばバックグラウンドアーチファクトを示す化学発光とは違って、ＥＣＬは低いバックグラウンドレベルを維持する。
【００３９】
酵素活性、方法およびアッセイ
本明細書で開示する検出試薬は、酵素活性を測定、定量および／または検出する様々な形式のアッセイおよび方法において使用することができる。多種多様な酵素を、これらに限定されないが、グルタチオンレダクターゼ、トリパノチオンレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ生成酵素、ＮＡＤＰＨ枯渇酵素、ＮＡＤＨ生成酵素、ＮＡＤＨ枯渇酵素、肝トランスアミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、エステル化酵素、キナーゼ、シンテターゼおよびＡＴＰａｓｅｓを含む検出試薬と一緒に使用することができる。さらに、こうした酵素の基質は、特異的な基質の存在が、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨの生成または利用を導く、または遊離スルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基の生成をもたらす同様の酵素反応混合物で測定することができる。
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書で開示するジスルフィド含有検出試薬は、所期の標的酵素により反応混合物中で生成した遊離スルフヒドリル基によって、生物学的試料中に存在する所期の標的酵素活性の量に比例して切断することができる。目的の酵素の活性または目的の基質の量に比例して、反応混合物において生じた遊離スルフヒドリル基は、検出試薬のジスルフィド結合と平衡し、反応混合物において生じた遊離スルフヒドリル基の量に比例して前記結合を切断する。同様の原理が、反応混合物中の遊離スルフヒドリル基の量の変化に応じて定量可能な色の変化を起こす５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；エルマン試薬）の公知の使用の基礎にある。本明細書で開示する検出試薬は、独特なことに、電気化学発光によって種々様々な酵素活性を測定するための代替の検出方法を可能にする。
【００４１】
ＮＡＤＰＨ生成酵素
本明細書で開示するジスルフィド含有検出試薬は、試料中で生成したＮＡＤＰＨを測定する方法、試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素活性を測定する方法、試料中のＮＡＤＰＨ枯渇酵素活性を測定する方法、および試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性を測定する方法を含む様々な方法において使用することができる。
【００４２】
一部の実施形態では、本明細書で開示するジスルフィド結合含有検出試薬を、生物学的試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性を測定するアッセイにおいて使用することができる。グルコース−６−リン酸のＧ６ＰＤとの反応は、ＮＡＤＰＨに転換される、補因子としてのＮＡＤＰ＋を使用する。Ｇ６ＰＤの遺伝子欠損は比較的よく見られることであり、世界的に約４億の人に影響を及ぼしており、これは、抗マラリア剤を含む一部の治療薬に応答して、また、Ｇ６ＰＤ欠損を有するヒトにおいて溶血を引き起こし得る、空豆などの一部の食品中の作用物質への曝露の後、溶血などの重大な毒性をもたらし得る。したがって、Ｇ６ＰＤ活性を測定するアッセイは、マラリアに罹っている誰かが、特定の系統のマラリアに対してより効果が小さいがＧ６ＰＤ欠損に関連した毒性反応を誘発しない、別の抗マラリア薬に対して例えばプリマキンまたはタフェノキンを受けるべきかどうかを判定するために有用である可能性がある。
【００４３】
一般に、大部分のＧ６ＰＤ活性アッセイでは、ＮＡＤＰ＋の存在下でのグルコース−６−リン酸のＧ６ＰＤとの反応によって生成したＮＡＤＰＨを、レドックス感受性基質、例えばテトラゾリウム塩の色によって定量する。より一般的には、臨床化学分析器における通常の形式は、反応混合物を使用して、レドックス感受性の呈色試薬との反応によって、あるいは単純に、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋と、対応するそれらの還元形態であるそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとの間のＵＶ吸光度の差によって、酵素活性をＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量の変化と結び付けることによって酵素活性を測定する。
【００４４】
本開示の方法において、反応混合物中のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量は、生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量に比例して生成し、次には、定量しようとする酵素の活性に比例する、遊離スルフヒドリル基の量の定量的変化へと置き換えることができる。例えば、ＮＡＤＨ依存性レダクターゼもしくはＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ、例えばグルタチオンレダクターゼもしくはシスチンレダクターゼ（それらの個別の基質と一緒に）、グルタチオンジスルフィドまたはシステインを反応混合物に加え、それらの酵素を、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを生成するかまたは枯渇させる反応混合物中の成分と組み合わせることによって、ジスルフィド結合を形成させるまたは分解させることができ、最終的には、本明細書で開示する検出試薬との相互作用に基づいて、酵素活性を測定するかまたは測定するために使用することができる。アッセイ反応は、生物学的試料における酵素活性（これは一般に、時間当たりの生成産物の量として包含する単位で表される）かまたは未知の基質の量を決定するための妥当なダイナミックレンジを提供するのに十分な、一定の時間および一定の温度で実行される。
【００４５】
一部の実施形態では、反応混合物の生物学的試料中に存在するグルコース−６−リン酸と反応したＧ６ＰＤによって生成されるＮＡＤＰＨが、反応混合物の試薬成分のジスルフィド結合を切断するのに使用される場合、生物学的試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性をＥＣＬアッセイと結び付けることができる。こうしたアッセイのために、酵素グルタチオンレダクターゼと組み合わせて使用されるグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ；酸化型グルタチオン；ジスルフィド架橋を有するグルタチオンダイマー）は、ＮＡＤＰＨを生成するまたは使い果たす酵素を定量するのに適している可能性がある。遊離スルフヒドリル基を有するグルタチオンモノマー（ＧＳＨ；還元型グルタチオン）は、本明細書で開示するＥＣＬ検出試薬中のジスルフィド結合を切断し；したがって、反応混合物中に存在する、またはそこで生成するＮＡＤＰＨの量に比例してＥＣＬシグナルの振幅を変更する。
【００４６】
ＥＣＬベースのアッセイのために、グルタチオンジスルフィドを使用して、反応混合物中でスルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｈｙｄｒｙｌ）基を中間的に生じることなく、Ｇ６ＰＤ（またはＮＡＤＰＨを生成する他の酵素）によるＮＡＤＰＨ生成を、ＥＣＬシグナルの変化に直接関連させることも可能である。一実施形態では、ＧＳＳＧ（またはＧＳＳＧ類似体）の第１のグルタチオン部分と連結されたＥＣＬ官能基および第２のグルタチオン（またはグルタチオン部分）と連結された固定化部分とを含む検出試薬は、こうした切断を触媒することができるＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼによって直接切断される。例えば、トリパノソーマにおいて見出される酵素であるトリパノチオンレダクターゼを、一部の実施形態で使用することができる。トリパノチオンレダクターゼは、トリパノソーマにおけるレドックス調節において使用されるグルタチオン類似体である、トリパノチオンのＮＡＤＰＨ依存性切断を触媒する（Ｍｉｔｔａｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．、２００５年４月；４０巻：２７９〜８６頁；Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、１９９２年１月；５０巻：４７〜５６頁；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９１年１０月；８８巻：８７６９〜８７７３頁）。トリパノチオンレダクターゼは、リンカー基を担持するグルタチオンジスルフィド誘導体に対して活性であり、したがって、ＥＣＬ活性レポーター分子（すなわち、ＥＣＬ官能基）または固定化試薬（すなわち、固定化部分）などの他の部分と連結されたグルタチオンジスルフィド類似体またはトリパノチオン類似体のＮＡＤＰＨ触媒切断に有利である。トリパノチオンレダクターゼを使用するこれらの実施形態では、トリパノチオンレダクターゼのＮＡＤＰＨ触媒活性によるＥＣＬ検出試薬のジスルフィド結合の直接的な切断によって、酵素活性反応混合物に添加されるカップリング試薬としてのグルタチオンおよびグルタチオンレダクターゼの必要性が回避される。
【００４７】
Ｇ６ＰＤ活性が存在し、ＮＡＤＰＨが生成する場合、ＥＣＬ活性ルテニウムキレートと固定化部分の間のジスルフィド結合を分解させることができ、ＥＣＬ活性ルテニウムキレートを洗い流し、存在するＧ６ＰＤ活性の量に比例して、測定されるＥＣＬシグナルの減少をもたらすことができる。Ｇ６ＰＤ活性がない場合、全ＥＣＬシグナルが検出され、ゼロ方向へのＥＣＬシグナルの減少の度合いを使用して、Ｇ６ＰＤの活性を定量することができる。カットオフ値を、プリマキン、またはＧ６ＰＤ欠損を有するヒトに溶血を引き起こす他の薬物の投与の安全性を予測するために確立することができる。
【００４８】
一部の実施形態では、試料中で生成したＮＡＤＰＨを測定するためのアッセイ方法のステップは、ジスルフィド結合を有する検出試薬、試料およびＮＡＤＰＨ触媒ジスルフィドレダクターゼを組み合わせて反応混合物を形成するステップであって、検出試薬のジスルフィド結合がＮＡＤＰＨの存在下でレダクターゼによって切断され、検出試薬が、ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを含み、かつジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を含み、切断によって、ＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有する第１の切断生成物および固定化部分を有する第２の切断生成物を生じ、レダクターゼによる切断が、試料において生成されるＮＡＤＰＨの量と比例しているステップを含むことができる。一部の実施形態では、アッセイ方法のステップはまた、ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが、試料中のＮＡＤＰＨの存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが試料中のＮＡＤＰＨの非存在を表すステップも含むことができる。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ生成酵素はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ジスルフィド切断レダクターゼは、グルタチオンレダクターゼおよびトリパノチオンレダクターゼから選択される。一部の実施形態では、固定化部分はビオチンである。
【００４９】
一部の実施形態では、試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素活性を測定するためのアッセイ方法のステップは、（ａ）試料と、ＮＡＤＰ＋と、試料中の測定される酵素に特異的な基質とを、ＮＡＤＰＨが生成され、この方法のステップが特定の反応に適した所定の時間および所定の温度での反応を可能にするような条件下で、組み合わせて、反応混合物を形成するステップを含むことができる。一部の実施形態では、アッセイ方法のステップは、（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物と、グルタチオンレダクターゼおよびグルタチオンジスルフィドとを、グルタチオンジスルフィドを還元して還元型グルタチオンにする条件下で、組み合わせるステップも含むこともできる。一部の実施形態では、アッセイ方法のステップは、（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物を、ジスルフィド含有検出試薬であって、ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬と組み合わせるステップであって、ジスルフィド含有検出試薬が還元型グルタチオンによって非酵素的に切断され、還元型グルタチオンによる切断が試料中で生成するＮＡＤＰＨの量と比例しているステップを含むこともできる。一部の実施形態では、アッセイ方法のステップは、（ｄ）ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素の存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが試料中のＮＡＤＰＨ生成酵素の非存在を表すステップも含むことができる。一部の実施形態では、ステップ（ａ）を、特定の反応に適した、所定の時間にわたり所定の温度により実施する。一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨ生成酵素はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ジスルフィド切断レダクターゼは、グルタチオンレダクターゼおよびトリパノチオンレダクターゼから選択される。一部の実施形態では、固定化部分はビオチンである。
【００５０】
一部の実施形態では、ＥＣＬ活性ルテニウムキレートなどの電気化学発光性官能基を、アミノ基またはカルボキシレート基などの中間リンカーによって、ＧＳＳＧ中のグルタチオン部分の１つに結合させることができる。固定化部分を、ＧＳＳＧ中の他のグルタチオン部分と連結させることができる。適切な固定化部分は、直接か、あるいはアビジンで誘導体化された磁性ビーズなどの本明細書で論じるような固相と結合できる、ビオチンなどの本明細書で開示するような中間リンカーによって、また、遊離アミノ基もしくはカルボキシレート基によって連結された、磁性ビーズを含むことができる。ＧＳＳＧ検出試薬に対するリンカーの長さは、グルタチオンレダクターゼの接近を可能にしてジスルフィド結合を切断するのに十分でなければならない。
【００５１】
別の実施形態では、グルタチオンレダクターゼのグルタチオンジスルフィドに対するＮＡＤＰＨ触媒作用によって生成したＧＳＨ（還元状態のグルタチオン）は、電気化学発光性官能基、例えばＥＣＬルテニウムキレート化合物、および固定化部分、例えば磁性ビーズまたはビオチンなどの他の適切なＥＣＬアッセイ試薬を有する検出試薬のジスルフィド結合を非酵素的に切断することができる。これは、ＥＣＬ試薬で誘導体化した後、グルタチオンレダクターゼまたはトリパノチオンレダクターゼによって切断され得るグルタチオンジスルフィド類似体を特定する必要性を排除する（例えば、実施例１を参照されたい）。
【００５２】
同様の検出試薬およびＥＣＬ測定システムを使用して、反応混合物からＮＡＤＰＨを生成または枯渇させる他の酵素の活性を関連させて、生物学的試料中の酵素の活性または特異的な基質の量を測定することができる。例えば、生物学的試料中のアンモニアは、試料を、アンモニウムと組み合わせかつ同時にＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に変換させる、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびその基質アルファ−ケトグルタレートを含む反応混合物と組み合わせることによって測定する。そうした反応混合物中のＮＡＤＰＨの変化は、反応混合物中のＮＡＤＰＨの変化によって媒介されるＥＣＬシグナルの変化に基づく検出および定量に関して本明細書で開示する試薬および方法を使用した、血漿または血清などの試料中のアンモニアの測定を可能にする。尿素またはクレアチニンのためのアッセイは、生物学的試料中に存在する尿素またはクレアチニン（または目的の他の特異的な代謝産物）の量に比例してＮＡＤＰＨを生成または枯渇させる、当該技術分野で公知の適切な酵素反応混合物を使用して、同様に形式化される（ｆｏｒｍａｔｔｅｄ）。
【００５３】
ＮＡＤＰＨ生成は、多種多様の酵素の活性、ならびにそれらの基質および生成物の濃度とつながっている可能性があるので、ＥＣＬによりＮＡＤＰＨを測定するシステムは、標準的な臨床化学検体、例えば尿素、クレアチニン、アンモニア、またはアッセイ反応混合物中のＮＡＤＰＨの生成もしくは枯渇に関与する、アッセイに適した当該技術分野で公知の他の検体を含む、多種多様の化合物または酵素を検出または定量するように構成することができる。
【００５４】
ＮＡＤＨ生成酵素
本明細書で開示する検出試薬は、試料中でＮＡＤＨを生成または枯渇させる酵素の活性を測定するためのアッセイにおいて使用することもできる。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する酵素および酵素反応は、本明細書で開示する検出試薬を使用して定量することができる。例えば、一部の実施形態では、検出試薬のジスルフィド結合は、シスチンレダクターゼ、または生物学的試料中のＮＡＤＨの量に比例した量で遊離スルフヒドリル基を生成する他の酵素で切断され得る。シスチンレダクターゼは、システイン（酸化された、アミノ酸システインの二量体形態）を、ＥＣＬ検出試薬のジスルフィド結合を切断することができる遊離ヒドロキシル基を有する還元されたモノマーシステインに変換する。酵素と基質（代謝産物）の両方を含むいくつかの標準的な臨床化学検体は、ＮＡＤＨに応答する呈色試薬による、またはＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの変換、もしくはＮＡＤＨからの変換を示すＵＶ吸光度変化の測定によって検出する、ＮＡＤＨを生成または枯渇させるアッセイ反応混合物に基づく。そうした当該技術分野で公知のアッセイは、本発明の検出試薬および方法を使用してＥＣＬ機器に適合させることができる。
【００５５】
エステラーゼおよびリパーゼ
他のクラスの酵素活性は、それらの天然エステル基質のチオエステル類似体に作用するエステラーゼおよびリパーゼを含む、生物学的試料において測定される特異的な酵素活性に比例して、遊離スルフヒドリル基を直接形成する。したがって、本開示の検出試薬は、エステラーゼおよびリパーゼのようなこうした酵素について、酵素活性を測定する、または酵素活性の存在もしくは非存在を決定する方法において使用することもできる。例えば、選択されるエステラーゼは、使用されている選択されたエステラーゼ酵素によって特異的に切断される、天然エステルのチオエステル類似体または脂肪酸アシル基質を使用することができる。一態様では、上記酵素の基質は、ホスファチジルコリンのｓｎ−２チオエステル類似体、チオ−ＰＡＦ（血小板活性化因子）またはその類似体であってもよい。
【００５６】
リパーゼＬｐ−ＰＬＡ２のための天然の基質は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）と称されるリン脂質である。Ｌｐ−ＰＬＡ２は、ＰＡＦからの酢酸置換基を切断してリソ−ＰＡＦを生成することができる。ＰＡＦについての構造を以下の化合物１として示す。
【化１】
2016508727.tif 000003
【００５７】
一態様では、チオ−ＰＡＦは、Ｌｐ−ＰＬＡ２の活性を測定するための適切なエステラーゼ類似体である。このチオ化合物に対するＬｐ−ＰＬＡ２の脱アセチル化作用により、遊離スルフヒドリル基を有するリソ−ＰＡＦの類似体を生成する。チオ−ＰＡＦについての構造を以下の化合物２として示す。
【化２】
2016508727.tif 000004
【００５８】
一般に、このチオ−ＰＡＦ類似体を使用する比色分析アッセイでは、遊離スルフヒドリル基を、ジチオニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）中のジスルフィド結合の切断によって検出する。例えば、基質としてＤＴＮＢを使用した比色分析（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）アッセイの概略図を示す図１Ａを参照されたい。比色分析アッセイは、すべてのＰＡＦ−ＡＨについて基質としての役目を果たす２−チオ−ＰＡＦを使用することができる。ＰＡＦ−ＡＨによってｓｎ−２位でのアセチルチオエステル結合が加水分解されると、遊離チオールを、５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を使用して検出することができる。ジスルフィド結合の切断によって、分光光度計で定量できる５−チオ−２−ニトロ安息香酸が生成する。標準的なジスルフィド比色分析試薬として、ＤＴＮＢを、有機ホスフェート（コリンエステラーゼ阻害剤）中毒の検出のため、アセチルコリンまたはブチリルコリンのチオエステル類似体を使用する、種々のコリンエステラーゼアッセイにおいて使用することもできる。これは通常、例えば検出波長と重なるヘモグロビンによる光吸収による、いくらかの危険（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）を伴う。
【００５９】
ＥＣＬベースのアッセイに適合させるために、ＤＴＮＢの代わりに、ＥＣＬ検出試薬を使用して、遊離スルフヒドリル基の生成をＥＣＬシグナルの定量的変化に変換することができる（例えば、図１Ｂの、検出試薬としてグルタチオンジスルフィド（ＧｓｓＧ）を使用するＥＣＬアッセイの概略図を参照されたい）。一部の実施形態では、例えば、適切な検出試薬は、電気化学発光性官能基が一方のグルタチオン部分に結合されており、かつ固定化部分が他方のグルタチオン部分に結合されている、グルタチオンジスルフィドの類似体であってもよい。本明細書で論じるように、電気化学発光性官能基は、ルテニウムビス−ピリジル誘導体などのＥＣＬ活性ルテニウム（Ｒｕ）キレートであってもよい。やはり本明細書で論じるように、固定化部分は常磁性ビーズであってもよい。電気化学発光性官能基および固定化部分を、例えばストレプトアビジンコーティングした常磁性ビーズに結合したビオチンなどの本明細書で論じる中間リンカーを含む中間リンカーを使用して、グルタチオン部分に結合させることができる。これらのビーズが、フローセル中などのＥＣＬ反応チャンバー内での磁石の適用によって、ＥＣＬ電極に近接して保持される場合に、検出試薬は、ＥＣＬシグナルを発生させることができる。リソ−チオ−ＰＡＦ上の遊離スルフヒドリル基は、所定の反応時間にわたって生物学的試料中のＬｐ−ＰＬＡ２の活性に比例して生成させることができ、やはり生物学的試料中のＬｐ−ＰＬＡ２の活性に比例して、ＥＣＬ検出試薬で誘導体化したグルタチオンジスルフィド類似体中のジスルフィド結合の切断をもたらすことができる。したがって、記録されるＥＣＬシグナルは、生物学的試料中の活性Ｌｐ−ＰＬＡ２の量に比例して減少し得る。
【００６０】
一部の実施形態では、エステラーゼ活性またはリパーゼ活性の酵素活性などの酵素活性を測定するためのアッセイ方法のステップは、試料と、エステラーゼの基質のチオエステル類似体と、ジスルフィド含有検出試薬であって、ジスルフィド結合の第１の側部にＥＣＬ活性ルテニウムキレートを有し、かつジスルフィド結合の第２の側部に固定化部分を有するジスルフィド含有検出試薬とを、基質のチオエステル類似体が、反応混合物中のエステラーゼによって脱アシル化されて、ジスルフィド含有検出試薬のジスルフィド結合を切断して反応混合物中のエステラーゼ活性に比例した検出可能なＥＣＬシグナルの変化を導く、曝露された脱アシル化遊離スルフヒドリル基を有する活性化された基質類似体をもたらすような条件下で、組み合わせて、反応混合物を形成するステップを含むことができる。このアッセイ方法は、ＥＣＬシグナルの非存在、存在または振幅を測定するステップであって、ＥＣＬシグナルの非存在または低下の度合いが反応混合物中の酵素活性の存在を表し、最大ＥＣＬシグナルが反応混合物中の酵素活性の非存在を表すことができる、ステップを含むこともできる。
【００６１】
一部の実施形態では、酵素はエステラーゼであってもよい。一部の実施形態では、エステラーゼはコリンエステラーゼまたはリパーゼであってもよい。一部の実施形態では、リパーゼはＬｐ−ＰＬＡ２であってもよい。
【００６２】
一部の実施形態では、コリンエステラーゼの適切な基質の例は、これらに限定されないが、アセチルチオコリン、プロピオニルチオコリンまたはブチリルチオコリンを含むエステラーゼ基質アセチルコリンおよびブチリルコリンのチオエステル類似体を含むことができる。これらの基質は、Ｌｐ−ＰＬＡ２でより特異的に切断できるチオ−ＰＡＦ基質と比較して、コリンエステラーゼなどの種々のエステラーゼによって特異的に切断されて、ジスルフィド含有検出試薬を切断できる遊離スルフヒドリル基を曝露させることができる。
【００６３】
一部の実施形態では、組み合わせるステップは、洗浄剤を組み合わせるステップを含むことができる。洗浄剤は、両性イオン洗浄剤、例えば３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）または非イオン性洗浄剤、例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈによるＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）であってもよい。一部の実施形態では、本方法は、測定するステップの前に、組み合わせるステップの組み合わされた成分のｐＨを調整するステップを含むことができる。例えば、ｐＨは、５．０、５．４、５．６、６．０、６．４、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４もしくは８．６またはその間のｐＨ値に調整することができる。
【００６４】
ＥＣＬ活性ルテニウムキレートで誘導体化されたジスルフィドを、ＥＣＬ電極に近接して保持するまたは引き付けるための固定化部分は、ＥＣＬ部分であってもよい。一部の実施形態では、固定化部分は、例えばビオチンであってもよい。
【００６５】
検出試薬キット
本明細書に記載する方法を実行するためのキットも開示する。例えば、酵素活性を検出するのに適した反応混合物を調製するために、キットを使用することができる。キット中に含める材料は、最終的な目的に応じて変えてよい。したがって、キットは、本方法で使用される１つまたは複数の成分を含むことができる。本明細書で開示するキットは以下の成分：検出試薬、酵素の基質、酵素の基質のチオエステル類似体、酵素、グルタチオンジスルフィド、必要なバッファー、標準品および本明細書で開示する方法を実行するための指示ならびに本明細書に記載する方法の他の成分および要素から選択される少なくとも１種の成分を含むことができる。標準品は、アッセイの性能に求められる較正に必要な追加的な化学試薬、または印刷形態または電子的形態のデータ（経験的）であってもよい。
【００６６】
本明細書に記載する本発明の教示を例示するが、それを限定するものではない、本明細書に含めた実施例を参照することによって、本開示をより良く理解することができる。本明細書で開示する記載と以下の実施例はどちらも、例示に過ぎず、限定を意図するものではないことを理解すべきである。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、非限定的なものであり、説明だけを目的とするものである。
【００６８】
本明細書で開示する実施例において参照するある特定の溶液、希釈剤およびバッファーの組成は、以下のものを含むことができる：
【００６９】
（１）希釈剤溶液（０．０２４％リン酸二水素カリウム；０．１４４％リン酸水素二ナトリウム；０．７％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウム；０．３３％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；０．１０４％Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ−ＩＣＰ  ＩＩ）；
【００７０】
（２）ＥＣＬリード溶液（Ｒｅａｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（４．１％リン酸二水素カリウム；２．１４％トリプロピルアミン［ＴＰＡ］；０．８８％塩化ナトリウム；０．０２％ポリドカノール［Ｔｈｅｓｉｔ］；０．１％Ｏｘａｂａｎ−Ａ保存剤）；
【００７１】
（３）ＰＢＳ−１（１０ｍＭリン酸二水素カリウム；１４０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７．８±０．１））；
【００７２】
（４）試料緩衝液（２８ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含有する１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））；
【００７３】
（５）アッセイ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）；および
【００７４】
（６）Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧ（ビオチン−グルタチオンジスルフィド−ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ）。
【００７５】
（実施例１）
低ｍＭのＮＡＤＰＨおよびＧ６ＰＤのＥＣＬ検出および測定
２５ｕＬのＢｉ  Ｇ−ｓ−ｓ−Ｇ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓを、ＧＲ−ＤＢ中で、１：３００に希釈して１Ｕ／ｍＬのＢａｋｅｒ’ｓ  ＧＲおよび５ｍＭ  ＧｓｓＧとした。２５ｕＬのＮＡＤＰＨをＧＲ−ＡＢ中で新規に調製して１０ｍＭ（９．５ｍｇ／ｍＬ）ＧＲ−ＡＢとした。この試薬を３７℃のホットプレート上に置いた。調製物を混合し、室温で３０分間振とうさせた。５ｕｇ／ウェルのビーズを５０ｕＬに加え、さらに１０分間振とうさせた。次いでビーズを１５０ｕＬのＧＲ−ＡＢで１回洗浄し、１５０ｕＬ  ＧＲ−ＡＢに再懸濁させた。以下の表１に、低ｍＭのＮＡＤＰＨの検出を示すデータを提供する。
【表１】
2016508727.tif 000005
【００７６】
以下は、Ｇ６ＰＤが検出されたことを例示する較正曲線（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ｃｕｒｖｅ）を示す、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの追加データである。
具体的に、血液溶解物についてのデータは、１００％血液溶解物のシグナルの減少を示した。
【００７７】
方法は以下の通りである。５０ｕＬのＧ６ＰＤ基質混合物グルタチオンレダクターゼアッセイ緩衝液（Ｂｉ  Ｇ−ｓ−ｓ−ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ（基質）、１０ｍＭのＮＡＤＰ＋、３０ｍＭのＧ６Ｐ、グルタチオンレダクターゼ２Ｕ／ｍＬ、ＧｓｓＧ３０ｍＭ、Ｍｇ＋＋１０ｍＭを含有する）に、２５ｕＬのＧ６ＰＤ（２．０Ｕ／ｍＬから一点希釈）を加えた。混合物を室温で３０分間振とうさせた。２５ｕＬのビーズを各ウェルに加え（４００ｕｇ／ｍＬ）、さらに１０分間振とうさせた。ビーズを１回洗浄し、最後に１５０ｕＬのＧＲ−ＡＢにした。以下の表２Ａおよび表２Ｂに結果を示す。
【表２Ａ】
2016508727.tif 000006
【表２Ｂ】
2016508727.tif 000007
【００７８】
（実施例２）
４つの異なるホモ−および混合−酸化型グルタチオン／グルタチオニルスペルミジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌｓｐｅｒｍａｉｄｉｎｅ）基質の調製
以下は、ビオチンおよびＴＡＧ  Ｐｌｕｓで改変した後の、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｎｏｎｅ）、グルタチオニルスペルミジンまたは混合チオン基質中のジスルフィド結合を、グルタチオンレダクターゼが分解することができなかったことを例示する結果のまとめである。以下のホモ−および混合−酸化型グルタチオン／グルタチオニルスペルミジン基質を調製した：（１）Ｂｉ  Ｇ−ｓ−ｓ−Ｇ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ；（２）Ｂｉ  Ｇｓｐｄ−ｓ−ｓ−Ｇｓｐｄ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ；（３）Ｂｉ  Ｇ−ｓ−ｓ−Ｇｓｐｄ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ；（４）Ｂｉ  Ｇｓｐｄ−ｓ−ｓ−Ｇ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ。
【００７９】
上記の４つすべての基質におけるビオチンとＴＡＧ  Ｐｌｕｓのジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｅａｇｅ）がＤＴＴ還元実験で確認され、検証され、ＤＴＴはＴＡＧ  Ｐｌｕｓの４０％〜＞９０％を取り除くことができた。しかし、パン酵母（Ｂａｋｅｒ'ｓ  Ｙｅａｓｔ）由来およびヒト由来のグルタチオンレダクターゼは、４つの基質のいずれの切断もできなかった。消化はすべて流体相中で実施した。基質を、ＮＡＤＰＨを含む酵素と共に最初にインキュベートし、次いでビーズと共にインキュベートしたところ、基質とビーズの立体障害の問題がないことを確認した。Ｂｉ  Ｇ−ｓ−ｓ−Ｇは、ＮＡＤＰＨの存在下でのグルタチオンレダクターゼによりＧ−ｓ−ｓ−Ｇから生成した還元型グルタチオン（ＧＳＨ）による切断の影響を受けやすく、これは、アッセイ試料に加えられていても、またＧ６ＰＤ活性の結果として形成されていても、ＮＡＤＰＨの定量を可能にした。
【００８０】
（実施例３）
Ｌｐ−ＰＬＡ２の活性についてのＥＣＬアッセイの試験
この実験を行って、遊離スルフヒドリル基の生成をＥＣＬシグナルの定量的変化に変換するのに適したＥＣＬ検出試薬の能力を試験した。ＥＣＬ検出試薬は、一方のグルタチオン部分がルテニウムビス−ピリジル誘導体などのルテニウムキレートで誘導体化されている、グルタチオンジスルフィドの類似体である。他方のグルタチオン部分は、ビオチンをこの第２のグルタチオン基に結合させ、ストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズと混合することによって、常磁性ビーズ上に固定される。
【００８１】
アッセイを以下のステップにしたがって整えた。Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧを、ＰＢＳ−１緩衝液中に１８ｎｍｏｌビオチンおよび１５０ｎｍｏｌ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓを含んで、８１．６ｎｍｏｌの濃度で調製した。基質（２−チオ−ＰＡＦ）を、５４ｐｍｏｌ  Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧ  ＥＣＬ試薬を含むアッセイ緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）中で、２００μＭに調製した。較正曲線を、アッセイ緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）中、ｒｈＬｐ−ＰＬＡ２を、０、６２．５、１２５、５００、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で用いて作成した。アッセイを、適切な場合、管の長さを短くし、フローセル入口の穴径ならびに測定面積および体積を小さくすることによって試料体積について改変した、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの検出分析器（Ｗｅｌｌｓｔａｔ  Ｍ１Ｍ、カタログ番号３１０８０６）で実行した。分析器で使用したソフトウェアは、調整可能なパラメーターを考量した研究用バージョンのソフトウェアである。この研究用ソフトウェアにおける試料体積のために、動作パラメーターのシーケンスも改変した。これらの改変を有する機器をＭｅＭ１と指定した。結果を以下の表３にまとめる。
【表３】
2016508727.tif 000008
【００８２】
（実施例４）
Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧのジスルフィド還元に対するｐＨの影響
一般に、リソ−ＰＡＦは、低いｐＨではジスルフィドを還元するのが遅いということが想定されている。チオールではなくチオレートはジスルフィド結合を攻撃する。したがって、チオール−ジスルフィド交換は、脱プロトン化チオレート形態に対してプロトン化チオール形態が好都合である、低いｐＨ（一般に、８未満）で阻害される。このアッセイを、基本的に実施例３に記載した通り、アッセイ緩衝液のｐＨをｐＨ７．２からｐＨ８．０およびｐＨ８．３に増加させて実施した。データを表４にまとめる。
【表４】
2016508727.tif 000009
【００８３】
（実施例５）
ｐＨ８．０でのタンパク質の表面張力に対する界面活性剤の影響
エステラーゼでの実行に伴って起こり得る複雑さは、チオ−ＰＡＦがミセルを形成する可能性があることである。次いで、ミセルの形成は、親水性のやや嵩高いＧｓｓＧ、または特にＢｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧへのスルフヒドリル基の接近を制限する（または相互作用速度を低下させる）可能性がある。次いで、この影響は界面活性剤試薬の添加によって最少化され得る。そこで、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳおよびジギトニンがミセルの形成を低減させる能力を試験した。したがって、この実験では、表５に挙げた３つの化合物を、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性アッセイにおいてミセル形成を低減させるそれらの能力について試験した。
【表５】
2016508727.tif 000010
【００８４】
ジギトニン、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を酵素に加えて、それぞれ０．０５％、７ｍＭおよび８ｍＭの最終濃度を得た。室温２５±２℃で保持したそれぞれの洗浄剤中のｒｈＬｐ−ＰＬＡ２試料（５００ｎｇ）を、アッセイウェル（２連で）に加え、次いでＢｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧ５０μＬを含有する基質および２５μＬの洗浄したＭ２７０−ＳＡ（ストレプトアビジン）ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号６５３０５）を加えた。アッセイプレートを、Ｆｏｒｍ８  ＆  Ａｍｐ６に設定されたＭｉｃｒｏｍｉｘプレート振とう機（Ｓｅｉｍｅｎｓ／ＤＰＣ）上に置き、プレートカバーで覆い、室温で１０±１分間インキュベートした。アッセイプレートを１５０μＬ／ウェルの希釈剤溶液で１回洗浄した。磁性ビーズ複合体を、アッセイプレートをＬｉｆｅＳｅｐ９６Ｆプレート磁石（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に２±０．５分間置いてペレット化した。アッセイウェル溶液の量（ｖｏｌｕｍｅ）をデカントし、プレートを迅速に逆転させ、これを重ねたペーパータオルに対して軽くたたいて、残液を除去した。ペレット化した磁性ビーズ複合体を再懸濁し、１５０μＬのＥＣＬリード溶液を各ウェルに加え、Ｍｉｃｒｏｍｉｘプレート振とう機上でプレートを２±０．５分間（Ｆｏｒｍ８  ＆  Ａｍｐ６で）撹拌し、上記したようにしてデカントした。磁性ビーズ複合体を洗浄した後、それを１５０μＬ／ウェルの希釈剤溶液で再懸濁し、上記したようにして２±０．５分間撹拌した。アッセイプレートを、単一の緩衝液系（ＥＣＬリード溶液）およびＷａｓａｂｉバージョン２．０２．００３９を使用して、１つのＭｅＭ１分析器で評価した。結果を以下の表６にまとめる。
【表６】
2016508727.tif 000011
【００８５】
結果は、ＣＨＡＰＳおよびＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００が、ミセルの形成を効果的に低減させたことを示しており、これは、基質リソ−チオ−ＰＡＦを、交換されるチオ基に、より接近可能にしており、対照試料（洗浄剤処理なしの酵素）と比較した場合、ＥＣＬシグナルの減少をもたらした。ジギトニンは、ミセル形成を減少させるのに影響を及ぼさなかった。これはおそらく溶液中に含有されるエタノールに起因している（ジギトニンはエタノールにだけ溶解可能である）。
【００８６】
（実施例６）
Ｌｐ−ＰＬＡ２アッセイにおける、ｐＨ８．０でのＣＨＡＰＳおよびＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００のＥＣＬシグナルへの濃度依存効果
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性アッセイにおける、ＣＨＡＰＳおよびＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００のジスルフィドデテクター試薬（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）の改善に対する濃度依存効果を、５００ｎｇのｒｈＬｐ−ＰＬＡ２酵素とともに、７ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭのＣＨＡＰＳならびに８ｍＭ、１５ｍＭおよび３０ｍＭのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を使用して試験した。ＣＨＡＰＳおよびＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００をＤＩ水に溶解し、適切な濃度で試料緩衝液に加えた。基質およびＢｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧも、試料緩衝液に適切な濃度で希釈した。実施例５に記載した通り、アッセイを、５０μＬ体積の酵素試料、Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧを含有する基質５０μＬおよび２５μＬのＭ２７０−ＳＡビーズの組合せで実施した。結果を以下の表７にまとめる。
【表７】
2016508727.tif 000012
【００８７】
結果は、ＣＨＡＰＳは、リパーゼ反応生成物によるＧｓｓＧ切断における濃度依存性の増加を提供し、２０ｍＭのＣＨＡＰＳで最も大きい効果が生じることを示した（表７）。Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００の添加も、ジスルフィドの還元をもたらした。
【００８８】
（実施例７）
ｐＨ８．０での２８ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含有する試料緩衝液を使用したジスルフィド還元
０．１Ｍトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０および２８ｍＭ  ＣＨＡＰＳを含有する試料緩衝液が、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性のアッセイにおいてジスルフィド結合を還元する能力を、５点較正曲線を使用するように修正した、実施例５に記載したアッセイ形式を使用して、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素を２０００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８．０ｎｇ／ｍＬおよび０ｎｇ／ｍＬ、試料緩衝液にスパイクすることによる２連の実験で試験した。
【００８９】
Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧを、８１．６ｎｍｏｌの濃度で調製し、これは１８ｎｍｏｌビオチンおよび１５０ｎｍｏｌ  ＴＡＧ  Ｐｌｕｓ（ルテニウムビス−ピリジル誘導体）を含有した。反応において、試薬の１：１５００希釈を使用した。較正曲線を、試料緩衝液中、ｒｈＬｐ−ＰＬＡ２酵素を、０．０、８．０、８０、８００および２０００ｎｇ／ｍＬの濃度で用いて作成した。基質（２−チオ−ＰＡＦ）を、５４ｐｍｏｌ  Ｂｉ−ＧｓｓＧ−ＴＡＧ試薬を含むアッセイ緩衝液中で、２００μＭに調製した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２７０−ＳＡを洗浄し、アッセイ緩衝液に０．１ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた。アッセイを、実施例６に記載したのと基本的に同様にして実施した。結果を表８にまとめ、図２にデータのグラフ表示を例示する。
【表８】
2016508727.tif 000013
【００９０】
実験による結果は、試料緩衝液中に２８ｍＭのＣＨＡＰＳが存在することにより、それぞれ８．０ｎｇ、８０ｎｇ、８００ｎｇおよび２０００ｎｇ／ｍＬのＬｐ−ＰＬＡ２酵素スパイクについて、Ｌｐ−ＰＬＡ２におけるジスルフィド結合の切断を平均２．９％、８．５％、２３％および３８％増加させることを示していた（表８）。結果は、ビオチン−グルタチオンジスルフィド−ＴＡＧ基質は、遊離スルフヒドリル基の生成をＥＣＬシグナルの定量的変化に変換できるという原理も実証している。
【００９１】
様々な実施形態を記載してきたが、当業者に明らかなように、変更および修正という手段に頼ることができることを理解すべきである。そうした変更および修正は、本明細書に添付する特許請求の範囲の視野および範囲内にあるとみなされるものとする。
【００９２】
本開示は、以下に説明するものなどの多くの他の実施例の特性を含む。本明細書で開示するどの記載も、例に過ぎないことを理解すべきである。これらの実施例は、単なる例示に過ぎず、非限定的なものであるものとする。さらに、本明細書での異なる実施形態の種々の特性および／または特徴を互いに組み合わせることができることを理解すべきである。したがって、例示した実施形態に多くの修正を加えることができること、および、本開示の範囲を逸脱することなく他の構成を工夫することができることを理解すべきである。他の実施形態は、本開示、および本明細書で開示される種々の実施例の実施形態の実践を考慮すれば、当業者に明らかである。本明細書および実施例は例に過ぎないと考えるべきであり、本発明の真の範囲は特許請求の範囲によって示される。
【００９３】
本明細書で使用する「ｔｈｅ」、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味し、明らかに反対のことが示されていない限り、「１つだけ」に限定されるべきでないことも理解すべきである。別段の表示のない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用されるすべての数字は、そう記述されていてもいなくても、すべての場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語で修飾されているものと理解すべきである。本明細書および特許請求の範囲において使用される正確な数値は、本発明の追加的な実施形態を形成し、提供されている例示の範囲および値内の２つの任意の端点に狭めることができる任意の範囲を含むことも理解すべきである。本明細書で開示する数値の精度を確実にするために、努力がなされてきた。しかし、どの測定数値も、そのそれぞれの測定技術において見出される標準偏差から結果として生じるある特定の誤差を本質的に含有し得る。
【００９４】
本明細書で挙げたすべての刊行物、特許および特許出願を、それぞれ個別の刊行物、特許および特許出願があたかも具体的かつ個別的に参照により本明細書に組み込まれているかのように、それらの全体において、同じ程度に参照により本明細書に組み込む。上記刊行物、特許および特許出願のいずれかと一緒に公表されている任意の補足的情報も、参照により組み込む。例えば、一部の学術論文は、通常オンラインで入手可能な補足的情報で公表されている。
【図１Ａ】
2016508727.tif 000014
【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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