(57)【要約】  本発明は、配列番号１の配列に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、いわゆる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含む、単離された細菌であって、以下からなる群より選択される細菌に関する：  −  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号１−４４６７の下、登録された細菌、及びＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された前記細菌の変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１の配列に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、単離された細菌であって、以下からなる群：
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された細菌、及び
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される細菌。
【請求項２】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のものであることを特徴とする、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
配列番号４に相同なＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ｐｏｌＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】
配列番号５に相同なジャイレース（ｇｙｒＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の細菌。
【請求項５】
配列番号６に相同なリコンビナーゼ（ＲｅｃＡ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の細菌。
【請求項６】
配列番号７に相同なトリプトファンシンターゼのβサブユニット（ｔｒｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の細菌。
【請求項７】
配列番号８に相同なＡＴＰシンターゼのβサブユニット（ＡｔｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から６の何れかに記載の細菌。
【請求項８】
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒａｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、ファエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、ファエモニエラ・アエロフィルム（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ａｅｌｏｐｈｉｌｕｍ）、エウティパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）、フォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）及びボトリオスフェリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）からなる群より選択される、標的微生物と呼ばれる少なくとも１つの微生物の増殖を遅らせる能力をもつことを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の細菌。
【請求項９】
請求項１から８の何れか一項に記載の少なくとも１つの細菌を含む組成物。
【請求項１０】
請求項１から８の何れか一項に記載の細菌を液体培地中に含む液体組成物であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
栄養増殖期の細菌を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
胞子の形態にある細菌を含むことを特徴とする、請求項９から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
固体であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
−  請求項１から８の何れか一項に記載の少なくとも１つの細菌を、細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、２４時間より長い期間、１２℃から３７℃の温度で培養し、次いで；
−  無細胞性組成物を形成するように、培養培地から細菌を抽出するか、細菌を不活性化する
方法によって得ることができる無細胞組成物。
【請求項１５】
配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナルと２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナルを含む、水中２０％から９５％のアセトニトリル勾配により０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速で２５ｃｍ／４．６ｍｍ／５μｍのサイズのＸｂｒｉｄｇｅカラムにより行われるＨＰＬＣのクロマトグラムを示すことを特徴とする、細菌の培養培地から形成される請求項１４又は１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属から単離された新規細菌、少なくとも１つのそのような細菌を含む組成物、及び少なくとも１つのそのような細菌を培養することにより得ることができる無細胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、世界的な食糧需要を満たすために、集約的な農業植物耕作地の開発が必要とされている。これらの集約的な耕作地は、農業での関心のある植物の栄養を最適化するため、それらの成長を促進するため、及び望ましくない植物の成長及び／又は病原性因子の増殖を最小化するために、薬剤の使用を必要とする。特に、植物の栄養を最適化することを目的とした薬剤、並びに病原性生物に対する、特に植物病原性細菌及び／又は植物の最適な成長に影響を与える可能性のある真菌に対する植物保護剤が用いられている。
【０００３】
化学肥料は、しばしば固体の形態を呈し、土壌中でほとんど溶けず、これらの肥料製品が植物の最適な成長のために必要とされる的確な時期に大量に与えられる必要がある。土壌に施され、植物に摂取されないこれらの固体肥料製品の余剰は、一時的に土壌中に留まり、雨水や灌漑水によって徐々に溶解され、河川や地下水面の汚染を導く。
【０００４】
したがって、完全に植物の成長を促進すると共に、環境、特に地下水面を汚染することなく、土壌肥沃化の効率を改善するための解決法が求められている。
【発明の概要】
【０００５】
よって、本発明は、この課題に対する解決策を提供することを目的としている。
【０００６】
また、多くの植物病原性因子が、植物耕作地において増殖して、その損害のために、作物生産の生産率と品質が低下する可能性がある。これらの植物病原性因子の中には、例えば、ジャガイモの栽培に損害を与える可能性があるストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）などの、非常に多くの細菌が見られる。また、例えば、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、特に灰色腐敗の原因となる灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒａｅ）、又はフィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、さらに又はブドウの病気の原因となるファエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、ファエモニエラ・アエロフィルム（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ａｌｅｏｐｈｉｌｕｍ）、エウティパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）、若しくはフォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）などの多くの植物病原性真菌も見られる。
【０００７】
本発明はまた、植物病原性の特定の生物−細菌及び／又は真菌−に対する植物の保護のための解決策をもたらすことも目的としている。
【０００８】
これを行うために、本発明は、配列番号１の配列に１００％相同である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、いわゆる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含む単離された細菌に関し、前記単離された細菌は、以下の群：
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された細菌、及び
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される。
【０００９】
配列番号１の配列を以下に記載する：
2016531589.tif 000002
【００１０】
上記の配列番号１の配列において、配列番号１の配列の第１０３６位と第１０４９位における記号「ｎ」は、ＩＵＰＡＣ（「国際純正・応用化学連合」）に従い、ａ、ｔ、ｃ又はｇの４つのヌクレオチドのうちの任意の１つを示す。したがって、第１０３６位のヌクレオチドｎは、ヌクレオチド「ａ」、ヌクレオチド「ｔ」、ヌクレオチド「ｇ」、及びヌクレオチド「ｃ」からなる群より選択され、第１０４９位のヌクレオチドｎは、第１０３６位のヌクレオチドとは独立にヌクレオチド「ａ」、ヌクレオチド「ｔ」、ヌクレオチド「ｇ」、及びヌクレオチド「ｃ」からなる群より選択される。
【００１１】
したがって、本発明は、配列番号１で同定される１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を含む単離された細菌であって、以下の群：
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された細菌、及び
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される単離された細菌に関する。
【００１２】
本発明に係る細菌は、ストレプトマイセス属のものである。
【００１３】
本発明の第１の変形形態に係る細菌の株は、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関の地位を有するパスツール研究所（その住所は７５７２４パリ市ドクタールー通り２５セデックス番号１５である）ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）に対して、２０１１年４月７日付けで申請者により寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された。本発明に係る細菌は、したがって、ＣＮＣＭに寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された。
【００１４】
本発明の第１の変形形態に係る細菌は、任意の自然環境から単離される、すなわち、任意の原産自然環境からの単離により得られる細菌である。細菌は、それが存在していた原産自然環境から単離された。
【００１５】
第２の変形形態では、本発明は、番号Ｉ−４４６７の下でＣＮＣＭに対して寄託された本発明の第１の変形形態に係る細菌の変異体細菌、すなわち、本発明の第１の変形形態に係る細菌の変異により得られる細菌に関する。本発明に係る変異体細菌はまた、配列番号１の配列と相同である１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列も含む。
【００１６】
突然変異誘発の任意の方法、特に、ランダムな突然変異誘発法及び部位特異的突然変異誘発法からなる群より選択される方法によって、本発明の第１の変形形態に係る細菌を処理することにより、このような変異体細菌が得られる。
【００１７】
本発明の第１の変形形態に係る細菌を、物理的変異原−特に、例えば、本発明に係る細菌を紫外線又は電離放射線に曝露する−及び化学的変異誘発物質からなる群より選択される少なくとも１つの変異誘発剤にゆだねる、ランダム突然変異誘発による処理が行われる。
【００１８】
変異体細菌は、番号Ｉ−４４６７の下でＣＮＣＭに対して寄託された本発明の第１の変形形態に係る細菌と比べてＤＮＡ配列に相違を有する。これらのＤＮＡ配列の相違は、本発明に係る細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列とは別のＤＮＡ配列に影響を与え得る。
【００１９】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号４に相同なＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ｐｏｌＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ｐｏｌＢ）をコードする配列として、配列番号４の配列を有する。
【００２０】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は配列番号５に相同なジャイレース（ｇｙｒＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、ジャイレース（ｇｙｒＢ）をコードする配列として、配列番号５の配列を有する。有利には、本発明によれば、単離された細菌は配列番号６に相同なリコンビナーゼ（ＲｅｃＡ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、リコンビナーゼ（ＲｅｃＡ）をコードする配列として、配列番号６の配列を有する。
【００２１】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号７に相同なトリプトファンシンターゼのβサブユニット（ｔｒｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、トリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＢ）をコードする配列として、配列番号７の配列を有する。
【００２２】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号８に相同なＡＴＰシンターゼのβサブユニット（ＡｔｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有する。したがって、単離された細菌は、ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（ＡｔｐＢ）をコードする配列として、配列番号８の配列を有する。
【００２３】
有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列の少なくとも１つを有する。有利には、本発明によれば、単離された細菌は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列をそれぞれ有する。
【００２４】
有利には、本発明に係る細菌は、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、灰色かび病菌、フザリウム・クルモルム、フィチウム・ウルチムム、ファエモニエラ・クラミドスポラ、ファエモニエラ・アエロフィルム、エウティパ・ラタ、フォミチポリア・メジテラネア及びボトリオスフェリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）からなる群より選択される、標的微生物と呼ばれる少なくとも１つの微生物の増殖を遅らせる能力をもつ。
【００２５】
本発明に係る細菌は、以下の特徴の全て又は一部により特徴付けられる：
−  ヒトに対して非病原性（無害）である；
−  グラム陽性細菌である；
−  腐生菌、つまり、土壌の有機物を分解する能力をもつ菌である。
【００２６】
本発明は、本発明の第１の変形形態に係る細菌から技術的方法によって作製され、配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含む任意の細菌に及ぶ。「技術的方法」とは、あらゆる細菌の培養方法、細菌の選択方法、単離方法、クローン化方法、及び／又は細菌の遺伝物質の改変方法−特に突然変異誘発−を意味する。
【００２７】
本発明はまた、本発明に係る少なくとも１つの細菌を含む細菌株にも及ぶ。
【００２８】
本発明に係る細菌株は、以下の特徴の全て又は一部により特徴付けられる：
−  ＩＳＰ−２培地又はベネット固形培地で培養された場合、固形培地の組成に応じて黄−褐色から灰−褐色に変化する色の、固形培地の奥で増殖した分枝した菌糸体、いわゆる基中菌糸を有する；
−  ＩＳＰ−２培地又はベネット固形培地で培養された場合、白色の空気／固体界面で増殖する空中菌糸を有する；
−  １２℃から３７℃、好ましくは２８℃から３０℃の至適増殖温度を有する；
−  ６から８を含む至適増殖ｐＨを有する；
−  炭素源として、Ｄ−グルコース、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトース及びデキストリンを利用する能力をもつ；
−  唯一の炭素源として、優先的にガラクトース、イノシトール、ソルボース、フルクトース、アラビノース、ラフィノース、ラムノース、セルロースを使用する能力をもたない；
−  窒素源として、アミノ酸、硝酸塩及びアンモニウム塩を使用する能力をもつ；
−  硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力をもち、アデニン、ｔｗｅｅｎ２０及び酢酸ナトリウムを分解できる；
−  デンプンを加水分解する能力をもたず、その加水分解産物を利用できない。
【００２９】
本発明はまた、本発明に係る少なくとも１つの細菌を含む組成物も対象としている。したがって、本発明は、配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含む、少なくとも１つの細菌を含む組成物を対象とする。本発明に係る組成物は、本発明に係る細菌とは異なる細菌を含むことも、含まないこともできる。本発明に係る組成物は、番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに寄託されたもののような株の少なくとも１つの細菌、及び／又は配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含む、ＣＮＣＭに寄託されたこの株の少なくとも１つの変異体細菌を含む。
【００３０】
本発明に係る組成物は、本発明に係る細菌を含むことができ、本発明に係る前記細菌は生菌（つまり、適応した栄養培地において成長し、増殖する能力をもつ）であっても、又は死菌（つまり、不活性で成長及び増殖できない菌）であってもよい。このような死菌は、当業者に既知の任意の微生物不活化処置、特に、本発明に係る細菌のタンパク質の変性の熱処理（例えば、９０℃の温度で１５分間の本発明に係る細胞の加熱）によって得られる。
【００３１】
有利には、本発明に係る組成物は、配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含むヌクレオチドを含む。
【００３２】
有利には、本発明に係る組成物は、生菌と死菌を同時に含むことができる。
【００３３】
有利には、本発明によれば、組成物は、それが含む細菌の保持及び増殖に適した少なくとも１つの培地を含む。
【００３４】
本発明に係る組成物は、本発明に係る細菌を液体培地中に含む液体組成物であり得る。有利には、液体培地は水性培地である。
【００３５】
本発明の第１の変形形態に係る液体組成物は、以下の特徴の全て又は一部により特徴付けられる：
−  液体組成物は栄養増殖期の細菌、つまり、活性な代謝を呈している、及び／又は細胞分裂により増殖している細菌を含む。生菌は、したがって、栄養増殖期又は定常期にある。
−  前記液体培地は水性培養培地、特に、本発明に係る細菌の増殖に必要な全ての無機成分と有機前駆体、特に、炭素源、窒素源、リン源、ビタミン及び痕跡元素を含む完全培地及び富栄養培地からなる群より選択される水性培養培地である。
−  前記液体培地は、Ｄ−グルコース、酵母抽出物、リン酸二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、及びグリセリンを含む。
【００３６】
上述の変形形態と組み合わされ得る、本発明の第２の変形形態に係る液体組成物は、以下の特徴の全て又は一部により特徴付けられる：
−  液体組成物は、胞子の形態にある本発明に係る細菌を含む。本発明に係る細菌−例えば、番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに対して寄託された本発明の第１の変形形態に係る細菌、又は本発明の第２の変形形態に係る細菌、番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに寄託され、登録された前記細菌の変異体−が、空気／固体界面で増殖して一次菌糸体を形成し、空中増殖を開始するとき、胞子の形成が観察される。分岐していない空中のフィラメント又は「菌糸」は、そのとき、一次菌糸体から発生し、その端部に胞子前駆体の区画化構造を有する。これは、したがって、胞子の形態にある生菌である；
−  配列番号１の配列に１００％相同であるＤＮＡ配列を含む前記胞子；
−  胞子は滑らかで、「Ｓ」型の螺旋状につながれており、これらの滑らかな胞子鎖は平均１０から５０個の胞子を有する；
−  前記液体培地はストレス誘発因子として、Ｄ−グルコース、酵母抽出物、ペプトン、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む。
【００３７】
細菌のストレスを生じることができる培養培地、特に、炭素及び／又は窒素及び／又はリン及び／又はビタミン及び／又は痕跡元素が制限された、又は欠乏した液体培養培地中における本発明に係る細菌の培養により、本発明に係る細菌−例えば、番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに対して寄託された本発明の第１の変形形態に係る細菌、又は本発明の第２の変形形態に係る、番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに対して寄託され、登録された前記細菌の変異体−の胞子の産生が促進される。
【００３８】
有利には、このような胞子は、栄養培地中に置かれて、再水和の対象となり、栄養期にある本発明に係る細菌の集団を形成することができる。
【００３９】
本発明に係る液体組成物は、本発明に係る栄養期にある細菌及び本発明に係る胞子の形態にある細菌を含み得る。何れの場合も、本発明に係る増殖型及び胞子は、配列番号１の配列に１００％相同な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する。
【００４０】
本発明に係る組成物は、少なくとも１つの本発明に係る細菌を含む固体状態の組成物であり得る。
【００４１】
第１の変形形態では、本発明に係る固形組成物は、少なくとも１つの本発明に係る細菌と、固形培養培地−特に一定割合の寒天−寒天（Ｅ４０６）−を含む固形培地−を含む。
【００４２】
第２の変形形態では、本発明に係る固形組成物は、−２０℃よりも低い温度−特に約−８０℃又は液体窒素の温度に近い温度−において、細菌の保存培地中に少なくとも１つの本発明に係る細菌を含む。本発明は、したがって、本発明に係る少なくとも１つの細菌を含む保存培地−特にグリセロール及び／又はポリエチレングリコールを含む保存培地−を対象としている。
【００４３】
また、本発明は、以下の方法により得ることができる無細胞性組成物も対象としている：
−  本発明に係る少なくとも１つの細菌を、前記細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、２４時間より長い期間、１２℃から３７℃の温度で培養し、それから；
−  無細胞性組成物を形成するように、培養培地から細胞を抽出するか、細菌を不活化する。
【００４４】
また、本発明は、配列番号１の配列に１００％相同であるＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、無細胞性組成物も対象としている。そのような無細胞性組成物は特に、本発明に係る細菌の増殖が可能であったが、前記細菌を実質的に含まない培養培地である。そのような無細胞性組成物は、配列番号１の配列に１００％相同な配列を含むＤＮＡを有することも、呈さないこともできる。
【００４５】
本発明に係る株の培養の２４時間後に得られる、本発明に係るそのような無細胞性組成物は、逆相カラムＨＰＬＣ分析により、以下の表１に列挙された保持時間（ｔｉ）を有する複数のピーク（Ｐ２４，ｉ）を呈し得る。
2016531589.tif 000003
【００４６】
本発明に係る株の培養の３日（７２時間）後に得られる本発明に係る無細胞性組成物は、逆相カラムＨＰＬＣ分析により、以下の表２に列挙された保持時間（ｔｉ）と、相対値で表されたピーク（Ｐ７２，ｉ）下面積（Ａ７２，ｉ）を有する、複数のピーク（Ｐ７２，ｉ）を呈し得る。
2016531589.tif 000004
【００４７】
酢酸エチルによる本発明に係る株の培養培地の抽出、酢酸エチル溶液の乾燥、及びメタノールにおける抽出物の可溶化によって得られる抽出物をＨＰＬＣによって分析する。ＨＰＬＣクロマトグラフィーは２５ｃｍ／４．６ｍｍ／５μｍのサイズのＸｂｒｉｄｇｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｇｕｙａｎｃｏｕｒｔ  Ｆｒａｎｃｅ）により行われる。溶離は、水中２０％から９５％のアセトニトリル勾配により０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速で行われる。検出は２５４ｎｍの波長で行われる。
【００４８】
有利には、本発明によれば、無細胞性組成物は細菌の培養培地から形成され、水中２０％から９５％のアセトニトリル勾配により０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速で２５ｃｍ／４．６ｍｍ／５μｍのサイズのＸｂｒｉｄｇｅカラムで行われ、１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナル及び２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナルを含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する。
【００４９】
上記の抽出及び分析の条件において、有利には、本発明によれば、本発明に係る株の培養から３日（７２時間後）に得られる無細胞性組成物は、１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナル（Ｐ７２，６）及び２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナル（Ｐ７２，１４）を含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する。
【００５０】
上記の分析条件において、有利には、本発明によれば、本発明に係る株の培養から３日（７２時間）後に得られる無細胞性組成物は、マイナーシグナルと呼ばれるシグナルを３．９３分、５．３０分、６．５９分、８．８３分、９．６３分、１２．３９分、１２．８７分、１３．７６分、１３．７６分、１５．９３分、１６．２７分、１８．４１分及び１９．３８分の保持時間で含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する。
【００５１】
本発明は、１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナルと２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナルを含むＨＰＬＣのクロマトグラムを有する細菌の培養培地から形成される組成物も対象としている。有利には、ＨＰＬＣのクロマトグラムは、マイナーシグナルと呼ばれるシグナルを３．９３分、５．３０分、６．５９分、８．８３分、９．６３分、１２．３９分、１２．８７分、１３．７６分、１３．７６分、１５．９３分、１６．２７分、１８．４１分及び１９．３８分の保持時間に有する。
【００５２】
本発明者らは、本発明に係る少なくとも１つの細菌との接触により得られるが本発明に係る細菌を実質的に含まない、並びに／又は配列番号１の配列に１００％相同な配列を含むＤＮＡを含まない若しくは含み得る、そのような無細胞性組成物が、ヒマワリ、トウモロコシ、ナタネ、コムギ及びトマトなどの栽培中の植物の成長への刺激効果を有し、また、ブドウの葉における抗真菌活性−特に灰色かび病菌に対する活性−も有することを明らかにした。
【００５３】
また、本発明は、細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地において、２４時間より長い期間、本発明に係る少なくとも１つの細菌を培養する方法により得ることができる無細胞性組成物にも及ぶ。
【００５４】
有利には、本発明によれば、細菌を少なくとも実質的に含まない無細胞性組成物を形成するように、培養培地から細菌を取り除く。
【００５５】
有利には、本発明によれば、無細胞性組成物の配列番号１の配列に１００％相同な配列を含むＤＮＡを例えば、ヌクレアーゼによる無細胞性組成物の処理によって取り除く。
【００５６】
変形形態としては、有利には、本発明によれば、培養培地から細菌を取り除かない。
【００５７】
変形形態としては、有利には、本発明によれば、配列番号１の配列に１００％相同な配列を含むＤＮＡを無細胞性組成物から取り除かない。
【００５８】
有利には、本発明に係る細菌をその増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、十分な期間、すなわち、１日から１０日の期間、１２℃から３７℃、好ましくは２８℃から３０℃、特におよそ３０℃の温度で培養し、それから、無細胞性組成物を形成するように、例えば培養培地の遠心によって、培養培地から細胞を抽出するか、細菌を不活化する。したがって、このような無細胞性組成物は、細菌の増殖に適した条件で培養培地において本発明に係る細胞を接触させ、培養することにより得られた、もはや本発明に係る細菌を含まない培養培地であるか、又は、死滅した細菌を含む培養培地である。本発明に係るこのような無細胞性組成物は、本発明に係る細菌の特性−特に抗真菌性−に近い特性か、そうでなければ等価な特性−特に抗真菌性−を有する。
【００５９】
また、本発明は、本発明に係る細菌、又は細菌の株、又は組成物−液体若しくは固体の組成物−のあらゆる使用−特に農業における使用−にも関する。
【００６０】
また、本発明は、配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含む植物処置組成物の農業における使用にも関する。
【００６１】
特に、有利には、本発明によれば、以下からなる群より選択される少なくとも１つの生物学的物質を含む処置組成物を植物に接触させる：
−  本発明に係る細菌；
−  本発明に係る液体組成物；
−  本発明に係る固形組成物；
−  本発明に係る無細胞性組成物。
【００６２】
本発明は同様に、上記又は下記の特徴の全て又は一部の組み合わせを特徴とする、細菌、細菌の株、細菌組成物（液体又は固体）及び無細胞性組成物にも関する。
【００６３】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明、非限定的にのみ与えられている例示的な実施例、及び以下の添付の図面を読むことで明らかになるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、本発明に係る処置組成物による処置の灰色かび病菌に対する保護／治療効果を示しているブドウの葉の対比写真を再現したものである（１ａ及び１ｂ）。
【図２】図２は、本発明に係る細菌による、ファエモニエラ・クラミドスポラの増殖の阻害を示しているペトリ皿の写真を再現したものである。
【図３】図３は、本発明に係る細菌によるリン酸カルシウムの可溶化の例示的な写真を再現したものである。
【図４】図４は、本発明に係る液体組成物によるヒマワリの種の処置による、ヒマワリの苗の成長の刺激の例示的な写真を再現したものである。
【図５】図５は、本発明に係る液体組成物によるトウモロコシの種子の処置による、トウモロコシの苗の成長の刺激の例示的な写真を再現したものである。
【図６ａ−６ｂ】図６ａ及び図６ｂは、本発明に係る細菌を含む液体組成物による、ナタネの実生の根の成長の刺激の例示的な写真を再現したものである。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明に係る細菌の株は、ブドウの株の根圏の試料及び深部の根から単離された。この根圏の試料は、採取の表面部を除いて、土壌表面の下１０ｃｍから５０ｃｍの深さから採取され、それから、密封した滅菌小袋に入れられ、ストレプトマイセスの株の単離に先立ち、＋４℃で保存された。
【００６６】
採取された試料は、３０分間、毎分２００回転の速度で磁気撹拌しながら、水３６ｍＬに試料４ｇの割合で、滅菌蒸留水中に懸濁させられる。得られた懸濁液は次に、１０分間、５０℃の温度に置かれ、それから、滅菌蒸留水で希釈（×１０７）される。この希釈液０．１ｍＬは、抗生物質としてナリジクス酸（１０ｍｇ／Ｌ）若しくはノボビオシン（２５ｍｇ／Ｌ）、並びに／又は抗真菌剤のシクロヘキシミド（４０ｍｇ／Ｌ）を補充した固形寒天培地ＳＥＡ（「土壌抽出液寒天」）を含むペトリ皿に塗布される。ペトリ皿はその後、２１日間、３０℃のインキュベーター中に置かれる。
【００６７】
塗布、光学顕微鏡による観察、及びその形態学的特徴の認識により、放線菌株を単離する。このようにして単離された純粋な放線菌株は、クローニングのためにベネット培地上に移される。単離されたコロニーは２カ月間、４℃で維持され、採取され、２０％の滅菌グリセロール中に懸濁され、その後、−２０℃に置かれ、保存される。
【００６８】
本発明に係る細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡのシークエンシング
当業者に公知の方法により、細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を解析する。このために、本発明に係る細菌を液体培地中で培養し、それから、そのゲノムＤＮＡを抽出し、以下を用いたＰＣＲ（「ポリメラーゼ連鎖反応」）によって、１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を選択的に増幅させる：
−  以下の配列番号２の配列のユニバーサルプライマー「２７ｆ」、
「ａｇａｇｔｔｔｇａｔ  ｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ」、及び；
−  以下の配列番号３の配列のユニバーサルプライマー「１４９２ｒ」、
「ｇｇｔｔａｃｃｔｔｇ  ｔｔａｃｇａｃｔｔ」。
【００６９】
これを行うには、本発明に係る細菌を３０℃で５日間、１００ｍＬの液体ＩＳＰ−２培地（「ＩＳＰ培地２、国際ストレプトマイセスプロジェクト酵母麦芽エキス寒天」）中で撹拌培養する。得られた菌糸体と培養培地を遠心によって分離し、再蒸留水で２回洗浄する。菌糸体の溶解は環境温度で１０分間、５００μｌの溶解バッファー（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ、ｐＨ８．０）中で行う。次に、６０ｍＬの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍＬの氷酢酸及び２８．５の蒸留水の混合により得られる溶液（ｐＨ４．８）１５０μＬを溶解液に加え、強く撹拌する。得られた溶解液を１００００ｇで１分間、遠心する。再度１００００ｇ、１分間の遠心工程を行い、上清を回収する。上清を回収し、これに等量のイソプロパノールを加える。撹拌後、１００００ｇで２分間、遠心する。沈殿したＤＮＡは、３００μＬの７０％エタノールで洗浄し、遠心し、その後、風乾し、５０μＬの滅菌再蒸留水に溶解させる。
【００７０】
キット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、以下の熱プロファイルに従い、ＰＣＲを行う（「テクネタッチジーンＰＣＲサーマルサイクラー」）：
−  ９８℃で３分間、変性；
−  「Ｔａｑポリメラーゼ」の添加；
−  以下を含む３０サイクルの増幅：
■  ９４℃で１分間の加熱段階、続いて；
■  ５２℃で１分間の加熱段階、続いて；
■  ７２℃で２分間の加熱段階、続いて；
−  ７２℃で１０分間の伸長段階。
【００７１】
ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって分析され、紫外光下で臭化エチジウムによって回収される。「ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ」ソフトウェアを使用した本発明に係る細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列番号１の配列とゲノムデータベース中の参照配列との比較は、配列番号１の配列に９９％より高い相同性を有する配列をゲノムデータベース中に１つも見つけない。
【実施例】
【００７２】
実施例１  −  本発明に係る細菌の生産
番号Ｉ−４４６７の下、ＣＮＣＭに寄託されたもののような本発明に係る細菌の一定量の種菌を２０倍量の富栄養培地に播種する。バイオマスの生産のための、そのような富栄養培地は例えば、ｐＨ７．２でＤ−グルコース、酵母抽出物、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）及びグリセロールを含む。培養を５日間、３０℃の温度に維持する。
【００７３】
変形形態としては、本発明に係る細菌を少なくとも実質的に含まない本発明に係る無細胞性組成物を形成するように、本発明に係る細菌と培養培地とを分離することができる。
【００７４】
実施例２  −  本発明に係る胞子の生産
本発明に係る細菌の一定量の種菌を２０倍量の胞子形成培地に播種する。例えば、胞子形成液体培地は、ｐＨ７．２でＤ−グルコース、酵母抽出物、ペプトン、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）及び蒸留水から形成される。
【００７５】
培養を６日間、３０℃の温度に維持する。本発明に係る胞子を含む、本発明に係る組成物が得られる。次いで、例えば遠心又は濾過による、液体／固体の任意の分離方法によって、本発明に係る主に胞子の形態にある細菌と培養培地とを分離することができる。
【００７６】
実施例３  −  病原体に対する保護
本発明に係る細菌を含む液体組成物は、例えば、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌及びストレプトマイセス・スカビエスなどの特定の細菌の増殖の阻害能を有する。
【００７７】
ブドウの葉に対する本発明に係る胞子のあらかじめの適用は、ブドウの葉に対して後で適用された真菌の灰色かび病菌の胞子の発芽と、その増殖を阻害できる。また、そのような適用は、前処理したブドウの葉において、真菌である灰色かび病菌の症状（図１ｂで灰色の模様（１）によって表されている、葉の茶色の斑点）の出現を予防／排除することもできる。本発明に係る細菌の胞子の組成物で前処理し、灰色かび病菌に感染させたブドウの葉（図１ａ）、及び前処理せずに感染させたブドウの葉（図１ｂ）の写真を再現したものが図１に示されている。図１ａの葉は、灰色かび病菌による感染の症状を呈しておらず、したがって、本発明に係る細菌の胞子によって灰色かび病菌に対して保護されている。
【００７８】
実施例４  −  標的微生物の増殖の阻止
ＣＮＣＭに寄託された株の細菌を固形寒天ベネット培地に播種し、固体処理組成物を形成するように、この播種した培地を５日間、３０℃に置く円筒法（Bauer等, 1996）により、標的微生物の増殖の阻止活性を測定し、定量する。固体処理組成物の円筒形の断片、例えば、直径６ｍｍの円筒形の断片を採取し、標的微生物、例えば、植物病原性の標的微生物を播種した培養培地の表面に、この円筒形の断片を置く。標的微生物の培養培地は、例えば、植物病原性真菌用のＰＤＡ（「ポテトデキストロース寒天」）培地又は植物病原性細菌用のベネット培地であり得る。標的微生物を播種した培地における本発明に係る細菌の培養培地の化合物の拡散を可能とするように、標的微生物を播種した培養培地の表面に４℃で４時間、円筒形の断片を維持する。
【００７９】
標的微生物を播種した培地を４８時間、３０℃に置き、それから、標的微生物の増殖阻害区域の直径を測定する。
【００８０】
本発明に係る細菌は、細菌及び／又は真菌の増殖の阻害活性を有する。微生物の増殖に対する本発明に係る細菌の活性スペクトルを以下の表３に示すが、ここで、記号（−）は阻止活性がないことに対応し、記号（＋）は１０ｍｍから１５ｍｍの阻止直径に対応し、記号（＋＋）は１５ｍｍから２０ｍｍの阻止直径に対応し、そして、記号（＋＋＋）は２０ｍｍより大きい阻止直径に対応している。
2016531589.tif 000005
【００８１】
これらの条件において、本発明に係る株による、灰色かび病菌株の菌糸増殖の阻止直径は２８ｍｍであり、フザリウム・クルモルム株の菌糸増殖の阻止直径は３０ｍｍであり、フィチウム・ウルチムム株の菌糸増殖の阻止直径は２６ｍｍである。
【００８２】
本発明に係る細菌は、有利には、例えば、ファエモニエラ・クラミドスポラ、ファエモニエラ・アエロフィルム、エウティパ・ラタ、フォミチポリア・メジテラネア及びボトリオスフェリア・オブツサのようなブドウの植物病原性因子の増殖の阻止能を有する。
【００８３】
図２には、本発明に係る株の細菌２による、ブドウの木の病原因子として選択されたファエモニエラ・クラミドスポラ真菌の菌糸８の増殖の阻害距離が大きいことが、本発明に係る株とは別のコレクション株３、４及び５による病原性因子の菌糸８の増殖の阻害との比較で視覚化されている。株７及び８が、病原性因子の菌糸８の増殖を阻止しないことは注目に値する。本発明に係る細菌は、細菌性又は真菌性の植物病原性因子の増殖を制限することができる。
【００８４】
実施例５  −  施肥
本発明に係る細菌は、培養培地の固形栄養素−特にリン−の可溶化を促進する。本発明者らは、リン酸カルシウム粉末によって不透明化された固形寒天培地（９）において、本発明に係る細菌のコロニー（２）を取り囲む半透明の光輪（１０）の形成を観察した（図３）が、これは、細菌によるリン酸カルシウムの可溶化を証明している。本発明に係る細菌は、植物により吸収されない固形施肥製品の−植物の根圏における−溶解を増大させ、植物の栄養を改善することができる。
【００８５】
実施例６  −  ヒマワリ及びトウモロコシの成長の刺激
本発明に係る細菌の栄養型の細胞と胞子を含む、本発明に係る液体組成物を調製し、ヒマワリの種子とトウモロコシの種子に対して薄膜コーティングによって適用する。液体組成物は、組成物１リットル当たり１から２ｇの細菌を含むが、ここで細菌の質量は、細菌の湿重量である。並行して、本発明に係る組成物によって処置していない対照として、ヒマワリ（図４ａ）及びトウモロコシ（図５ｃ）の種まきと苗の栽培を行う。また、本発明者らは、ヒマワリの苗（図４ｂ）及びトウモロコシの苗（図５ｄ）の初期の成長の刺激も観察した。種子に対して適用した本発明に係る細菌は、ヒマワリやトウモロコシのような植物の成長−特に植物の地上部の成長−を刺激することができる。
【００８６】
実施例７  −  ナタネの実生の根の成長の刺激
ＣＮＣＭに寄託された株の前培養１体積を６０体積の水に懸濁させることにより、本発明に係る細菌の栄養型細胞と胞子を含む本発明に係る液体組成物を調製する。前培養は、定常増殖期にある培養であり、前培養液１リットル当たり約１０ｇ（湿重量）の細菌を含む。１６．４グラムのナタネと４９０μｌの液体組成物（つまり、３０リットルの液体組成物中に約１トンのナタネ種子）を混合して均質化することによって、ナタネの種子上に本発明に係る液体組成物の膜を形成するように、本発明に係る液体組成物を種子に適用する。液体組成物は、組成物１リットル当たり１から２ｇの細菌を含むが、ここで細菌の質量は、細菌の湿重量である。「Ｐｉｋａｗ」培養培地上に、本発明に係る組成物でコーティングされたナタネの種子の種まきを行う。実生の成長の８日後、本発明に係る組成物で処置した種子から得られた実生の根の部分１２を回収し、秤量する。本発明の組成物で処置した種子から得られたナタネ実生の根部の質量は８５ｍｇであり、コントロールとして本発明に係る細菌を含まない組成物で処置した種子から得られたナタネ実生の根部１２の質量（５９ｍｇ）を上回っている。図６ａ及び図６ｂにそれぞれ示されている処置及び未処置のナタネ実生の写真を再現したものは、コントロールとして本発明に係る細菌を含まない組成物で処置したナタネ実生の根部１１に比べて増大した、本発明に係る組成物で処置したナタネ実生の根部１２の成長を示している。ＣＮＣＭに寄託されたもののような本発明に係る細菌を含む液体組成物は、ナタネの発芽と実生の成長を刺激する。
【００８７】
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【図１ａ】
2016531589.tif 000013
【図１ｂ】
2016531589.tif 000014
【図２】
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【図３】
2016531589.tif 000016
【図４】
2016531589.tif 000017
【図５】
2016531589.tif 000018
【図６ａ】
2016531589.tif 000019
【図６ｂ】
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【配列表】
2016531589000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月27日(2015.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６Ｓ  ｒＤＮＡと呼ばれる配列番号１の配列と同一である細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の単離された細菌であって、以下からなる群：
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された細菌、及び
−  ＣＮＣＭに対して寄託され、番号Ｉ−４４６７の下、登録された前記細菌の変異体
より選択される細菌。
【請求項２】
配列番号４に相同なＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ｐｏｌＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
配列番号５に相同なジャイレース（ｇｙｒＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】
配列番号６に相同なリコンビナーゼ（ＲｅｃＡ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の細菌。
【請求項５】
配列番号７に相同なトリプトファンシンターゼのβサブユニット（ｔｒｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の細菌。
【請求項６】
配列番号８に相同なＡＴＰシンターゼのβサブユニット（ＡｔｐＢ）をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１から５の何れかに記載の細菌。
【請求項７】
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒａｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、ファエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、ファエモニエラ・アエロフィルム（Ｐｈａｅｏｍｏｎｉｅｌｌａ  ａｅｌｏｐｈｉｌｕｍ）、エウティパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）、フォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）及びボトリオスフェリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）からなる群より選択される、標的微生物と呼ばれる少なくとも１つの微生物の増殖を遅らせる能力をもつことを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の細菌。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載の少なくとも１つの細菌を含む組成物。
【請求項９】
請求項１から７の何れか一項に記載の細菌を液体培地中に含む液体組成物であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
栄養増殖期の細菌を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
胞子の形態にある細菌を含むことを特徴とする、請求項９又は１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
固体であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
−  請求項１から７の何れか一項に記載の少なくとも１つの細菌を、細菌の増殖を可能とするのに適した培養培地に播種し、２４時間より長い期間、１２℃から３７℃の温度で培養し、次いで；
−  無細胞性組成物を形成するように、培養培地から細菌を抽出するか、細菌を不活性化する
方法によって得ることができる無細胞組成物。
【請求項１４】
配列番号１の配列に１００％相同なＤＮＡ配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
１１．９２５分の保持時間における第１の主要なシグナルと２０．０４分の保持時間における第２の主要なシグナルを含む、水中２０％から９５％のアセトニトリル勾配により０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速で２５ｃｍ／４．６ｍｍ／５μｍのサイズのＸｂｒｉｄｇｅカラムにより行われるＨＰＬＣのクロマトグラムを示すことを特徴とする、細菌の培養培地から形成される請求項１３又は１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2016531589.tif 000023
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2016531589.tif 000028
2016531589.tif 000029
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