(57)【要約】  本発明は、概して、１つまたは複数の樹状細胞（ＤＣ）応答、例えば、樹状細胞成熟、１つまたは複数の樹状細胞抗ウイルス応答および／または１つまたは複数の樹状細胞炎症応答をモジュレートし、制御しまたは他の形でそれに影響を与える調節ネットワークを同定するための組成物および方法、さらに、１つまたは複数の樹状細胞応答をモジュレートし、制御しまたは他の形でそれに影響を与える調節ネットワークを種々の治療および／または診断指標において利用するための組成物および方法に関する。
2016515383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートする方法であって、樹状細胞または樹状細胞の集団を、モジュレート剤の非存在下の前記樹状細胞または樹状細胞の集団の１つ以上の応答と比較したとき前記１つ以上の樹状細胞応答を改変するのに十分な量のモジュレート剤と接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記モジュレート剤が、表１〜表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子を調節する１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所望の遺伝子または標的遺伝子の組み合わせが、１つ以上の樹状細胞応答の正の調節因子または１つ以上の樹状細胞応答の負の調節因子として選択および同定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記モジュレート剤が、樹状細胞成熟を調節する１つ以上の遺伝子をモジュレートすること；樹状細胞の免疫応答を調節する１つ以上の遺伝子をモジュレートすること；樹状細胞の抗ウイルス免疫応答を調節する１つ以上の遺伝子をモジュレートすること；および樹状細胞の炎症性免疫応答を調節する１つ以上の遺伝子をモジュレートすることからなる群から選択される１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートするのに十分な量である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記モジュレート剤が、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記モジュレート剤が、キナーゼ、膜貫通受容体、化学的薬物、生物学的薬物、キナーゼをモジュレートする薬剤、膜貫通受容体をモジュレートする薬剤、化学的薬物をモジュレートする薬剤、および生物学的薬物をモジュレートする薬剤から選択される１つ以上の薬剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
樹状細胞応答に関連するシグネチャー遺伝子、遺伝子シグネチャーまたは他の遺伝子エレメントを同定する方法であって、
ａ）樹状細胞を樹状細胞応答の阻害薬または樹状細胞応答を向上させる薬剤に接触させること；および
ｂ）ステップ（ａ）により発現がモジュレートされたシグネチャー遺伝子、遺伝子シグネチャーまたは他の遺伝子エレメントを同定すること
を含む方法。
【請求項１１】
ｃ）樹状細胞応答の阻害薬または樹状細胞応答を向上させる薬剤に接触させた樹状細胞における、ステップ（ｂ）で同定された前記シグネチャー遺伝子、遺伝子シグネチャーまたは遺伝子エレメントの発現を摂動させること；および
ｄ）ステップ（ｃ）により発現がモジュレートされた標的遺伝子を同定すること
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記樹状細胞応答の前記阻害薬が、表１〜表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子を調節する標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記樹状細胞応答を向上させる前記薬剤が、表１〜表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子を調節する標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能を向上させる薬剤である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド拮抗薬、ペプチド拮抗薬、核酸拮抗薬、核酸リガンド、または小分子拮抗薬である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象における免疫応答を診断する方法であって、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを検出すること、ならびに前記検出レベルを、シグネチャー遺伝子または遺伝子産物発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することを含み、前記検出レベルと前記対照レベルとの間の差が、前記対象における免疫応答の存在を示す方法。
【請求項１６】
前記免疫応答が、自己免疫応答である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫応答が、炎症応答である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象における免疫応答をモニタリングする方法であって、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の第１のレベルを、第１の時点において検出すること、前記表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の第２のレベルを、第２の時点において検出すること、ならびに前記第１の検出された発現、活性および／または機能レベルを前記第２の検出された発現、活性および／または機能レベルと比較することを含み、前記第１および第２の検出レベルの変化が、前記対象における免疫応答の変化を示す方法。
【請求項１９】
前記免疫応答が自己免疫応答である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫応答が炎症応答である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対象における異常な樹状細胞応答を診断する方法であって、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能レベルを検出すること、ならびに前記検出レベルを、シグネチャー遺伝子または遺伝子産物の発現、活性および／または機能レベルの対照と比較することを含み、前記検出レベルと前記対照レベルとの差が、前記対象における異常な樹状細胞応答の存在を示す方法。
【請求項２２】
前記異常な樹状細胞応答が自己免疫応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫応答が炎症応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
対象における異常な樹状細胞応答をモニタリングする方法であって、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の第１のレベルを、第１の時点において検出すること、前記表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の第２のレベルを、第２の時点において検出すること、ならびに前記第１の検出された発現、活性および／または機能レベルを前記第２の検出された発現、活性および／または機能レベルと比較することを含み、前記第１および第２の検出レベルの変化が前記対象における前記樹状細胞応答の変化を示す方法。
【請求項２５】
前記異常樹状細胞応答が、自己免疫応答である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記異常樹状細胞応答が、炎症応答である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８７，３７８号明細書の利益を主張し、この仮特許出願は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、以下の助成：国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から交付されたパイオニア助成（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｇｒａｎｔ）ＤＰ１ＯＤ００３９５８−０１；国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から交付されたパイオニア助成（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｇｒａｎｔ）５ＤＰ１ＯＤ００３８９３−０３；国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から交付されたゲノミクス科学中核的研究拠点助成（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｒａｎｔ）１Ｐ５０ＨＧ００６１９３−０１；国立ヒトゲノム研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から交付された助成１Ｐ０１ＨＧ００５０６２−０１；および国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から交付された助成１Ｆ３２ＨＤ０７５５４１−０１に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、１つまたは複数の樹状細胞（ＤＣ）応答、例えば、樹状細胞成熟、１つまたは複数の樹状細胞抗ウイルス応答および／または１つまたは複数の樹状細胞炎症応答をモジュレートし、制御しまたは他の形でそれに影響を与える調節ネットワークを同定するための組成物および方法、さらに、１つまたは複数の樹状細胞応答をモジュレートし、制御しまたは他の形でそれに影響を与える調節ネットワークを種々の治療および／または診断指標において利用するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
その重要性にも関わらず、抗ウイルス応答、炎症応答、成熟、Ｔ細胞およびＢ細胞の動員を含めた樹状細胞応答を制御する分子回路については、依然として解明または精緻化がほとんどなされていない。樹状細胞の調節ネットワークを再構築した最近の研究は、細胞集団にわたる測定に焦点を置いたが、これは集団全体にわたってシグナルを検出できないこともあり、および／または特定の一部の細胞においてのみ発現する１つまたは複数のシグナル間を区別できないこともある。従って、樹状細胞応答をモジュレートし、制御し、または他の形でそれに影響を与えるネットワークのさらなる理解ならびに種々の治療および診断方法でこのネットワークを利用するための手段が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／７８７，３７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートするための組成物および方法を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「モジュレートする」は、１つ以上の遺伝子の発現の上方調節、または他の形でそれを増加させること；１つ以上の遺伝子の発現の下方調節、または他の形でそれを低下させること；１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／または機能を阻害しまたは他の形で低下させること；１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／または機能を中和しまたは他の形で不活性化すること；および／または１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／または機能を向上させまたは他の形で増加させることを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で使用されるとき、用語「樹状細胞の応答をモジュレートする」は、種々の樹状細胞機能および／または活性のいずれかのモジュレーション、例えば、非限定的な例として、樹状細胞成熟を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の免疫応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の抗ウイルス免疫応答、例えば、コア抗ウイルス応答および／または二次抗ウイルス応答を含む樹状細胞の抗ウイルス免疫応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の炎症性免疫応答、例えば誘導性炎症応答および／または急激化ピーク炎症応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；Ｔ細胞およびＢ細胞動員を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；１つまたは複数のＴＨ１細胞応答のＤＣによる促進を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；１つまたは複数のＴＨ２細胞応答のＤＣによる誘導を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；ＤＣの下流にある任意の細胞に対するＤＣの誘導、影響または他の効果を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７細胞、記憶Ｔ細胞および他のＴ細胞を含むＴ細胞のＤＣによる誘導を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；ＤＣ表現型における、例えば成熟表現型と未熟表現型との間および／またはＤＣのサブセット間のシフトを調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の少なくとも１つの機能または生物学的活性を操作しまたは他の形でそれに影響を与えること；病原体の駆動によるＴ細胞極性化の樹状細胞制御を操作しまたは他の形でそれに影響を与えること；および／またはＤＣにより分泌されるサイトカイン、ケモカインおよび他の分子の産生を操作しまたは他の形でそれに影響を与えることを含む。
【０００８】
本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートするモジュレート剤を提供する。好適なモジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。
【０００９】
本発明は、「コア抗ウイルス」遺伝子シグネチャー、「二次抗ウイルス」遺伝子シグネチャー、「成熟」遺伝子シグネチャー、「誘導性炎症」遺伝子シグネチャー、および「急ピーク型炎症」遺伝子シグネチャーを含む一連の遺伝子シグネチャーを提供する。これらのシグネチャーは、単一細胞、例えばコヒーレントな単一細胞群にわたり遺伝子発現値をクラスタリングすることにより同定される。一部の実施形態では、これらのシグネチャーは既に同定されたシグネチャーを大幅に精緻化し、改良する。一部の実施形態では、これらのシグネチャーは、細胞集団測定では存在しないか、または容易に検出し得ないシグナルを生成する。
【００１０】
「コア抗ウイルス」遺伝子シグネチャーは、応答樹状細胞の中で最も初期に誘導される。「成熟」遺伝子シグネチャーは、集団レベルでは「誘導性炎症」遺伝子シグネチャーと似ているように見えるが、単一細胞解析を用いることで、「成熟」遺伝子シグネチャーは一部の細胞のみで発現していることが確立された。「成熟」遺伝子シグネチャーは、樹状細胞によるＴ細胞およびＢ細胞の動員を可能にし、従って自然免疫系と適応免疫系との間の橋渡しをすることに関与する。
【００１１】
これらの遺伝子は、いくつかの適応で用いられる標的、例えば、免疫応答の治療および／または診断、免疫応答、例えば炎症のモニタリング、移植および他の治療適応、および／またはワクチン開発の標的である。
【００１２】
一部の実施形態では、１つ以上のシグネチャー遺伝子は、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａ（すなわち、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａ）に列記されるものから選択される。
【００１３】
所望の標的遺伝子または標的遺伝子の組み合わせが選択され、かつ選択した１つまたは複数の標的遺伝子が樹状細胞応答の間に過剰発現するか、それとも過小発現するかを決定した後、所望の成熟および／または機能結果に応じて好適な拮抗薬または作動薬が使用される。好適な拮抗薬および／または作動薬には、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が含まれる。
【００１４】
モジュレート剤を使用して、樹状細胞に関連する摂動に応答する遺伝子として同定された１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現をモジュレートする。これらの標的遺伝子は、例えば、樹状細胞をモジュレート剤に接触させ、かつ存在する場合には、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現に対する効果をモニタリングすることにより同定される。一部の実施形態では、１つ以上のシグネチャー遺伝子は、表１〜表５Ａに列記されるものから選択される。モジュレート剤は１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現に直接作用することができ、および／またはモジュレート剤は、１つまたは複数の標的遺伝子に関連することが知られる遺伝子または遺伝子の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートすることによって１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現に間接的に作用することができる。
【００１５】
一部の実施形態では、標的遺伝子は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＴＮＦＲの発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、ＴＮＦＲに関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、表６に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。
【００１６】
一部の実施形態では、標的遺伝子はＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＴＩＲＡＰの発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、ＴＩＲＡＰに関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、表７に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。
【００１７】
一部の実施形態では、標的遺伝子はＳｔａｔ１である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＳｔａｔ１の発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、Ｓｔａｔ１に関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、表８に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。
【００１８】
一部の実施形態では、標的遺伝子はインターフェロン産生調節因子（ＩＦＮＲ）である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＩＦＮＲの発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、ＩＦＮＲに関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、表９に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。
【００１９】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、以下の表１０、表１１または表１２に列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子である。一部の実施形態では、モジュレート剤は、１つまたは複数の標的遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明は、樹状細胞応答に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法を提供し、この方法は、ａ）樹状細胞を樹状細胞応答の阻害薬または樹状細胞応答を向上させる薬剤に接触させること；およびｂ）ステップ（ａ）により発現がモジュレートされた遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む。一部の実施形態では、この方法はまた、ｃ）樹状細胞応答の阻害薬または樹状細胞応答を向上させる薬剤に接触させた樹状細胞における、ステップｂ）で同定された遺伝子または遺伝子エレメントの発現を摂動させること、およびｄ）ステップｃ）により発現がモジュレートされた遺伝子を同定することを含む。一部の実施形態では、拮抗薬および／または作動薬は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド拮抗薬、ペプチド拮抗薬、核酸拮抗薬、核酸リガンド、または小分子拮抗薬である。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートする方法を提供し、この方法は、樹状細胞を、表１または表１Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子または１つ以上の遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤に接触させることを含む。一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートする方法を提供し、この方法は、樹状細胞を、表２または表２Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子または１つ以上の遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤に接触させることを含む。一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートする方法を提供し、この方法は、樹状細胞を、表３または表３Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子または１つ以上の遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤に接触させることを含む。一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートする方法を提供し、この方法は、樹状細胞を、表４または表４Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子または１つ以上の遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤に接触させることを含む。一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートする方法を提供し、この方法は、樹状細胞を、表５または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上の遺伝子または１つ以上の遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤に接触させることを含む。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答を診断する方法であって、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを検出すること、ならびに検出レベルを、シグネチャー遺伝子または遺伝子産物発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することを含み、検出レベルと対照レベルとの間の差が、対象における免疫応答の存在を示す方法を提供する。一部の実施形態において、免疫応答は、自己免疫である。一部の実施形態において、免疫応答は、炎症応答、例として、自己免疫応答に伴う炎症応答および／または感染性疾患もしくは他の病原体関連障害に伴う炎症応答である。
【００２３】
一部の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答をモニタリングする方法であって、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物、例えば、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現、活性および／または機能のレベルを、第１の時点において検出すること、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物、例えば、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現、活性および／または機能のレベルを、第２の時点において検出すること、ならびに発現、活性および／または機能の第１の検出レベルと、発現、活性および／または機能の第２の検出レベルとを比較することを含み、第１および第２の検出レベルとの間の変化が、対象における免疫応答の変化を示す方法を提供する。一部の実施形態において、免疫応答は、自己免疫応答である。一部の実施形態において、免疫応答は、炎症応答である。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明は、対象における異常な樹状細胞応答を診断する方法を提供し、この方法は、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能レベルを検出すること、ならびに検出レベルを、シグネチャー遺伝子または遺伝子産物発現、活性および／または機能レベルの対照と比較することを含み、ここで検出レベルと対照レベルとの差が、対象における異常な樹状細胞応答の存在を示す。一部の実施形態では、異常な樹状細胞応答は自己免疫応答である。一部の実施形態では、異常な樹状細胞応答は、自己免疫応答に関連する１つまたは複数の炎症応答および／または感染症または他の病原体に起因する障害に関連する１つまたは複数の炎症応答を含めた炎症応答である。一部の実施形態では、異常な樹状細胞応答は、樹状細胞がＴ細胞およびＢ細胞を動員する能力の変化である。一部の実施形態では、異常な樹状細胞応答は、応答がないことである。一部の実施形態では、異常な樹状細胞応答は、樹状細胞応答の低下である。一部の実施形態では、異常な樹状細胞応答は、樹状細胞応答の亢進である。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明は、対象における異常な樹状細胞応答をモニタリングする方法を提供し、この方法は、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物、例えば、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現、活性および／または機能レベルを、第１の時点で検出すること、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物、例えば、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現、活性および／または機能レベルを、第２の時点で検出すること、ならびに第１の検出された発現、活性および／または機能レベルを第２の検出された発現、活性および／または機能レベルと比較することを含み、ここで第１の検出されたレベルと第２の検出されたレベルとの間の変化が、対象における樹状細胞応答の変化を示す。一部の実施形態では、樹状細胞応答は自己免疫応答である。一部の実施形態では、樹状細胞応答は炎症応答である。一部の実施形態では、樹状細胞応答は、樹状細胞がＴ細胞およびＢ細胞を動員する能力である。
【００２６】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれかにおいて使用される好適なモジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。
【００２７】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「コア抗ウイルス」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表１および表１Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「コア抗ウイルスモジュレート剤」と称される。
【００２８】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤はキナーゼ、例えば非限定的な例として、ＭＡＰＫ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＴＢＫ１、ＰＬＫ４、ＩＫＢＫＥ、ＰＬＫ２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＣＨＵＫ、ＪＡＫ１、ＣＲＫＬ、ＭＫＮＫ２、ＴＹＫ２、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＩＫＢＫＢ、ＭＫＮＫ１、ＮＥＫ７、ＰＩＫ３Ｒ２、ＩＫＢＫＧ、ＲＩＰＫ２、ＭＡＰ２Ｋ６、ＭＥＴ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＭＡＲＫ２、ＤＧＫＡ、およびＢＵＢ１Ｂからなる群から選択されるキナーゼである。
【００２９】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤は膜貫通受容体、哺乳類内因性化学的薬物、化学的薬物、例えば、化学的キナーゼ阻害薬物または他の化学的薬物、例えば化学的試薬、毒物または他の化学的薬物、生物学的薬物またはそれらの任意の組み合わせである。好適なコア抗ウイルスモジュレート剤としては、本明細書に記載される任意のものが挙げられる。
【００３０】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「二次抗ウイルス」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表２および表２Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「第２抗ウイルスモジュレート剤」と称される。
【００３１】
例えば、一部の実施形態では、二次抗ウイルスモジュレート剤はキナーゼ、膜貫通受容体、非哺乳類内因性化学的薬物、化学的薬物、例えば、化学的キナーゼ阻害薬物または別の化学的薬物、例えば化学的試薬、毒物または他の化学的薬物、またはそれらの任意の組み合わせである。好適な二次抗ウイルスモジュレート剤としては、本明細書に記載される任意のものが挙げられる。
【００３２】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「成熟」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表３および表３Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「成熟モジュレート剤」と称される。
【００３３】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤はキナーゼ、膜貫通受容体、哺乳類内因性化学的薬物、非哺乳類内因性化学的薬物、化学的薬物、例えば、化学的キナーゼ阻害薬物または別の化学的薬物、例えば化学的試薬、化学的毒物もしくは他の化学的薬物、生物学的薬物、またはそれらの任意の組み合わせである。好適な成熟モジュレート剤としては、本明細書に記載される任意のものが挙げられる。
【００３４】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「ピーク型炎症」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表４および表４Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「ピーク型炎症モジュレート剤」と称される。
【００３５】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は、キナーゼ、例えば非限定的な例として、キナーゼ、膜貫通受容体、哺乳類内因性化学的薬物、非哺乳類内因性化学的薬物、化学的薬物、例えば、化学的キナーゼ阻害薬または別の化学的薬物、例えば化学的試薬、毒物または他の化学的薬物、生物学的薬物、または他のモジュレート剤、またはそれらの任意の組み合わせである。好適なピーク型炎症モジュレート剤としては、本明細書に記載される任意のものが挙げられる。
【００３６】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「誘導性炎症」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表５および表５Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「誘導性炎症モジュレート剤」と称される。
【００３７】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は、キナーゼ、膜貫通受容体、哺乳類内因性化学的薬物であり、非哺乳類内因性化学的薬物、化学的薬物、例えば化学的キナーゼ阻害薬または別の化学的薬物、例えば非限定的な例として、化学的試薬、化学的毒物または他の化学的薬物、生物学的薬物、またはそれらの任意の組み合わせである。好適なピーク型炎症モジュレート剤としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。
【００３８】
当業者は、モジュレート剤が種々の使用を有することを認識する。例えば、モジュレート剤は、本明細書に記載の治療剤として使用される。モジュレート剤は、スクリーニングアッセイ、診断キットにおける試薬として、もしくは診断ツールとして使用することができ、またはそれらのモジュレート剤は、治療試薬を生成するための競合アッセイにおいて使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ−Ｃ】図１Ａ〜図１Ｈは、ＬＰＳ刺激ＢＭＤＣの単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑがトランスクリプトームの広範な不均質性を明らかにしたことを示す一連のグラフおよび図である。これらの図のカラー版は、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，「単一細胞トランスクリプトミクスは免疫細胞の発現およびスプライシングの二峰性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４９８（７４５３）：２３６−４０（２０１３）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２１７２に見ることができる。図１ａ〜図１ｃは、２つの１０，０００細胞集団レプリケート間（図１ａ）、２つの単一細胞間（図１ｂ）、および「平均」単一細胞測定値と集団測定値との間（図１ｃ）の転写物発現レベル（ｘ軸およびｙ軸：対数目盛ＴＰＭ＋１）の相関を示す。ピアソン相関係数（ｒ）を左上角に記載する。
【図１Ｄ】図１ｄ、図１ｅは、例示的な転写物を示す。３つの非変動遺伝子（図１ｄ）および４つの変動遺伝子（図１ｅ）についての各単一細胞（ｙ軸上の「１」）および３つの集団レプリケート（ｙ軸上の「１０，０００」）におけるＲＮＡ−Ｓｅｑリード密度を示す。
【図１Ｈ】図１ｆ〜図１ｈは、代表的な転写物のＲＮＡ−ＦＩＳＨを示す。低変動遺伝子Ｉｌ６（上段パネル、ｎ＝３１９３細胞）および高変動遺伝子Ｃｘｃｌ１（下段パネル、ｎ＝３１９３細胞）についてのＲＮＡ−ＦＩＳＨ染色からの顕微鏡写真（ｌｏｇフィルタ処理後（図１ｆ、図１ｇ））および発現レベルの分布（図１ｈ）が示される。細胞境界が薄い灰色の輪郭線により表される。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、単一細胞にわたる発現レベルの二峰性変動を示す一連のグラフおよび図である。これらの図のカラー版は、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，「単一細胞トランスクリプトミクスは免疫細胞の発現およびスプライシングの二峰性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４９８（７４５３）：２３６−４０（２０１３）に見ることができる。図２ａは、幅広い発現レベルにおける細胞間変動を示す。単一細胞発現平均値（μ、Ｘ軸）と単一細胞変動性（標準偏差、σ、Ｙ軸）との間の関係が示される。青色の破線（すなわち、上側の線）は、平均発現レベルの理論上の最大標準偏差を示す（実施例１）；灰色の破線（すなわち、下側の線）は、一定のファノ因子（σ／μ＝０．２５）を示す。免疫応答遺伝子およびハウスキーピング遺伝子は、それぞれマゼンタ色および緑色で示す；水色の網掛け領域は単一細胞平均ＴＰＭ＜２５０を表す。特に、高い平均発現レベルであっても、ＢＭＤＣ応答要素は実質的な変動性を示し（左）、一方、ｈＥＳＣ（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））（右）は示さない。
【図２Ｂ−Ｃ】図２ｂは、５２２個の最も高発現の遺伝子の細胞間変動を示す。各遺伝子（行、ファノ因子によって低（上）から高（下）にソートした）および各発現レベルビン（列）について、ビンが定義するレベルでその遺伝子を発現する細胞の数が示される（濃い黄色：１８個の細胞；黒色：０個の細胞）。遺伝子はその平均単一細胞発現レベル（ＴＰＭ＞２５０、（図２ａ）の白色の範囲）に基づき選択される。灰色の破線は、（図２ａ）に強調表示される一定のファノ因子（０．２５）を示す。図２ｃは、２８１個の低変動性遺伝子（上）および２４１個の高変動性遺伝子（下）の平均発現確率密度分布を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｄは、単一細胞間のアイソフォーム使用の変動を示す一連のグラフおよび図である。これらの図のカラー版は、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，「単一細胞トランスクリプトミクスは免疫細胞の発現およびスプライシングの二峰性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４９８（７４５３）：２３６−４０（２０１３）に見ることができる。図３ａは、個々の細胞間で有意なスプライシングの差を有する遺伝子の例を示す。各々が２つの異なるアイソフォームを有する２つの例示的な遺伝子座（下）に関する１８個の単一細胞（１、青色）および３個の集団レプリケート（１０Ｋ、灰色）の各々についてのＲＮＡ−Ｓｅｑリード密度が示される。
【図３Ｂ】図３ｂは、個々の細胞（青色ヒストグラム、上）および集団（灰色ヒストグラム、下）における高発現遺伝子（単一細胞ＴＰＭ＞２５０）の選択的にスプライスされたエクソンに関するエクソンインクルージョンの分布（スプライスイン率（ＰＳＩ）スコア、Ｘ軸）を示す。単一細胞は、ある特定のアイソフォームの発現に向かう強いバイアスを呈する。
【図３Ｃ】図３ｃは、Ｉｒｆ７におけるスプライシング変動のＲＮＡ−ＦＩＳＨ検証を示す。左：ＲＮＡ−Ｓｅｑリード密度（転写物が発現する細胞のみを示す）。色付きの囲みは、ＲＮＡ−ＦＩＳＨにより分析したエクソンを示す。右：転写物の２つの構成的（「構成的」または「Ｃｏｎ」）領域（構成的領域Ａ：シアン（Ｃ）；構成的領域Ｂ：マゼンタ色（Ｍ））および１つの選択的にスプライスされたエクソン（「特異的」：橙色（Ｏ））に対するプローブとの同時ハイブリダイゼーションからのＲＮＡ−ＦＩＳＨ画像。白色の矢印は、Ｉｒｆ７について同様に高い発現レベルを有するが、選択的にスプライスされたエクソンについては逆の優先性を有する２つの細胞を強調表示する。ヒストグラム：２つの構成的領域（右上および右下パネル）は同程度のレベルで検出された（下のヒストグラム、０．５からの偏差は予想どおりプローブ設計に起因する）が、一方、選択的エクソン（右中央のパネル）は、個々の細胞においてインクルージョンまたはエクスクルージョンに向かうバイアスを示す（上のヒストグラム）。図３ｄは、遺伝子Ａｃｐｐの相互排他的な最後のエクソンの選択的調節について同様の結果が得られたことを実証している。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｆは、単一細胞ｍＲＮＡ発現レベルの共変動分析がどのように個別的な成熟状態および抗ウイルス細胞回路を明らかにするかを示す一連のグラフおよび図である。これらの図のカラー版は、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，「単一細胞トランスクリプトミクスは免疫細胞の発現およびスプライシングの二峰性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４９８（７４５３）：２３６−４０（２０１３）に見ることができる。図４ａは、６３２個のＬＰＳ誘導性遺伝子のＰＣＡを示す。２つの第１主成分に対する各細胞（ポイント）の寄与が示される。ＰＣ１（Ｘ軸）は３個の「半成熟」細胞（四角）を１５個の「成熟」細胞（三角）と判別する。薄い灰色の三角形は、最も成熟した細胞を示す。
【図４Ｂ】図４ｂは、誘導性遺伝子のクラスタ相関行列を示す。左：６３２個のＬＰＳ誘導性遺伝子の各対（行、列）の単一細胞発現プロファイル間のピアソン相関係数が示される（ｒ、紫色：負の相関；黄色：正の相関）。３つの強調表示されるクラスタが、いくつかの代表的な遺伝子座と共に左側に示される。右：ＰＣ１（左）およびＰＣ２（右）に対する各遺伝子（行）についての射影スコア（緑色：高；青色：低）。ＰＣ１は半成熟ＢＭＤＣを成熟ＢＭＤＣと識別する；ＰＣ２は抗ウイルス遺伝子のクラスタにマッピングされる。
【図４Ｃ】図４ｃは、ＲＮＡ−ＦＩＳＨによる相関の確認を示す。各対のメンバーを同時に染色するときのＲＮＡ−ＦＩＳＨに基づく２つの遺伝子対（Ｉｒｆ７−Ｓｔａｔ２、Ｉｒｆ７−Ｉｆｉｔ１）の間の関係が示される。ピアソン相関係数の二乗（ｒ２）および測定した細胞の数を左上角に示す。
【図４Ｄ−Ｆ】図４ｄ〜図４ｆは、Ｉｒｆ７がインターフェロンフィードバック回路においてどのように変動性を伝播するかを示す。ＬＰＳで４時間刺激した野生型（ＷＴ）（ｎ＝３６）（図４ｄ）、Ｉｒｆ７−／−（ｎ＝４７）（図４ｅ）、およびＩｆｎｒ−／−（ｎ＝１８）（図４ｆ）ＢＭＤＣにおいて単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した各単一未熟ＢＭＤＣ（列）の抗ウイルスクラスタ（「抗ウイルス」行）からの８個の遺伝子の各々の発現レベルが、８個の非変動免疫応答遺伝子（「非変動応答」行）と共に示される。
【図５】図５は、単一ＬＰＳ刺激性ＢＭＤＣの間のｍＲＮＡ発現の大域的相関を示すグラフである。１８個の個々の細胞の各々、単一細胞平均、および各１０，０００細胞の３つの集団（行、列）の大域的発現プロファイル間のピアソン相関係数が示される。相関は全て、対数目盛発現プロファイルで計算した。単一細胞（Ｓ）１２、１３、および１６は半成熟であり、一方９および１６は、図４ａの薄い灰色の三角形に対応する最も成熟したものである。
【図６】図６は、２５個の異なる転写物の単一細胞ＲＮＡ−ＳｅｑとＲＮＡ−ＦＩＳＨとの間の一致を示す一連のグラフである。１８個の細胞の単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（左、青色）および平均１６００個の細胞の単一細胞ＲＮＡ−ＦＩＳＨ（右、赤色）における２５個の転写物の各々に関する遺伝子発現レベルの分布が示される。
【図７】図７は、全細胞にわたるロバストなＬＰＳ応答を示すグラフである。各単一細胞（青色）および集団平均（灰色）における主要な応答遺伝子（列、遺伝子名は最下部）のレベルに関する統合ゲノミクス・ビューワ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ）からのＲＮＡ−Ｓｅｑリードのトラックが示される。遺伝子は、主要なケモカインおよびケモカイン受容体（Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｒｌ２）、サイトカイン（Ｃｘｃｌ２）、およびＬＰＳ応答の他の重要な成分（Ｔａｎｋ、Ｃｆｌａｒ）を含む。
【図８】図８は、他の細胞型における単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑからの遺伝子発現の変動を示す一連のグラフである。マウス胚性幹細胞（左）およびマウス胚線維芽細胞（右）における単一細胞発現平均値（μ、Ｘ軸）と単一細胞変動性（標準偏差、σ、Ｙ軸）との間の関係が示される。これらの図は、既発表の単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの再分析を示す（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆  Ｙａｎａｉ，Ｉ．「ＣＥＬ−Ｓｅｑ：多重線形増幅による単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＣＥＬ−Ｓｅｑ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．００３）。ハウスキーピング遺伝子は緑色である。いずれの場合にもＬＰＳ刺激性ＢＭＤＣ（図２ａ）と比較して単一細胞遺伝子発現の変動性が実質的に低いことが認められた。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜図９Ｄは、３つの単一細胞におけるユニークなｍＲＮＡ分子の定量化を示す一連のグラフおよび図である。図９ａは改良プロトコルを示す。逆転写の間にランダムな４個のヌクレオチドバーコードを各ｍＲＮＡ分子に導入してＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａオリゴを改変した。改変したオリゴの構造が示される（バーコードはＮＮＮＮによって表される）。このバーコードはＰＣＲ増幅およびライブラリ調製を通して保持される。図９ｂは、３つのバーコード付加単一細胞ｃＤＮＡライブラリ（青色）ならびに３つの１０，０００細胞レプリケート実験（灰色）に関するある遺伝子座のリード密度を示すＩＧＶスクリーンショットを示す。２つの単一細胞は、２つのアイソフォームのうち一方のみを発現する。
【図９Ｃ】図９ｃは、転写物の５’末端に位置するリードの詳細な調査を示す。８１個のリードが２３個のユニークなバーコードを表し、観察されたスプライシング結果が単に１個または数個の分子の確率論的増幅によるわけでないことが確認された。
【図９Ｄ】図９ｄは、３つのバーコード付加単一細胞ライブラリに関する単一細胞ＴＰＭ（Ｘ軸、対数目盛）とユニークに同定されたバーコード（Ｙ軸、対数目盛）との間の関係を示す。少なくとも１つのユニークなバーコードで表される遺伝子のみをプロットする。水色の網掛け部分は、本研究全体を通して使用した閾値である単一細胞ＴＰＭ＜２５０を表す。単一細胞遺伝子発現の２つの代替の定量化は全体的に良好に相関し（０．８２＜Ｒ＜０．８６）、高発現遺伝子（ＴＰＭ＞２５０）について厳密な直線関係を呈する。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、３つのバーコード付加単一細胞ライブラリに基づく単一細胞間のアイソフォーム発現の変動を示す一連のグラフおよび表である。図１０ａは、６個の選択的にスプライスされた遺伝子のリード密度を示すＩＧＶスクリーンショットを示す。各遺伝子について、選択的にスプライスされたエクソンは橙色で囲む。
【図１０Ｂ−Ｃ】図１０ｂは、図１０ａに示す各転写物についてカウントされたユニークな分子バーコードの数を示す表である。図１０ｃは、単一細胞（青色ヒストグラム、上）および集団（灰色のヒストグラム、下）における少なくとも１５個のバーコードで表される遺伝子中の選択的にスプライスされたエクソンについてのエクソンインクルージョン（ＰＳＩスコア、Ｘ軸）の分布を示す。結果は、１８個の細胞（単一細胞ＴＰＭ＞２５０；図３）にわたる高発現遺伝子のスプライシング解析と極めて類似している。単一細胞はいずれか一方のアイソフォームの方に向かって強い非対称を呈する。
【図１１】図１１は、単一細胞におけるＩｒｆ７のスプライシング変動のＲＮＡ−ＦＩＳＨ検証を示すグラフである。短い構成的プローブ（マゼンタ色、図３ｃ）に対するアイソフォーム特異的Ｉｒｆ７プローブ（橙色、図３ｃ）を呈するＩｒｆ７転写物の比の細胞にわたる分布が示される。分布は、長い構成的プローブ（図３ｃ）に対する特異的プローブの比を計算するときに得られるものと同様に二峰性である。
【図１２】図１２は、半成熟細胞と成熟細胞との間の分離を呈するＩＧＶスクリーンショットを示すグラフである。これらの遺伝子は、ＰＣ１について極めて高いか（正の）または低いか（負の）のいずれかの射影スコアを有する。右側の黒色の縦のバーは、成熟および成熟マーカーの両方を発現する２つの細胞を強調表示し、事実上、それらが成熟細胞のうち最も成熟していることが示唆される。
【図１３Ａ−Ｃ】１３Ａ〜図１３Ｅは、ＲＮＡ−ＦＩＳＨによる共変動パターンの確認を示す一連のグラフである。ＲＮＡ−ＦＩＳＨにより同時に測定した転写物の対について発現レベル（ｌｏｇ（カウント＋１））の関係が示される。図１３ａは、Ｃｃｒ７（成熟細胞でより多く発現する）とＩｌ１ｂ（半成熟細胞でより多く発現する）との発現レベルが強い相関を有しなかった（ピアソンｒ２＝０．１２、ｎ＝８１２）ことを示す。図１３ｂは、Ｓｔａｔ４（半成熟細胞でより多く発現する）とセルピンｂ９（半成熟細胞でより多く発現する）との発現レベルがより強く相関した（ピアソンｒ２＝０．２８、ｎ＝５７３）ことを示す。図１３ｃは、Ｃｘｃｌ１０とＴｎｆと（両方とも成熟細胞でより多く発現する）の発現レベルが軽度の相関を有した（ピアソンｒ２＝０．１８、ｎ＝５１１）ことを示す。
【図１３Ｄ−Ｅ】図１３ｄは、Ｃｃｌ２２とＩｒｆ８と（両方とも半成熟細胞で発現する）が中程度の相関（ピアソンｒ２＝０．２６、ｎ＝１１１０）を示したことを示す。図１３ｅは、Ｓｔａｔ１（抗ウイルス、いずれにも特異的でない）とＣｘｃｌ１と（炎症、いずれにも特異的でない）が極めて弱い相関であったことを示す（ピアソンｒ２＝０．０７、ｎ＝６３１）ことを示す。
【図１４】図１４は、個々のＬＰＳ刺激性ＢＭＤＣが単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲによって２つの個別的な集団にクラスタを形成することを示すグラフである。４６個の個々の細胞（列）の各々における５０個の遺伝子（行）に関する単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）からの正規化発現レベル（赤色：高い；青色：低い、目盛は上部）が示される。細胞は、それらの発現プロファイルに基づき階層的凝集クラスタリングによってクラスタリングした（デンドログラム、上）とともに、２つの主クラスタ（半成熟および成熟、下）を形成する。
【図１５】図１５は、種々の半成熟および成熟細胞表面マーカーが陽性および陰性であるサブ集団間での主要マーカーの発現レベルの差を示すグラフである。マーカー毎に陽性および陰性にソートした細胞（Ｘ軸）間のｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した１０個のマーカー遺伝子（バー、色凡例は右）の各々の示差的発現レベル（Ｙ軸）が示される。マーカーは、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータ中の「成熟」（赤色）および「半成熟」（青色）サブ集団を判別するそれらの能力に基づき選択した。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＬＰＳ応答の時間経過に沿った１３個の遺伝子のシグネチャーに関する単一細胞ｑＰＣＲ発現プロファイリングを示す一連のグラフである。図１６ａは、非刺激ＢＭＤＣおよびＬＰＳ刺激後２時間、４時間、および６時間の各細胞（列）における各遺伝子（行）の発現レベルを示す。遺伝子シグネチャーは、９個の抗ウイルスクラスタ遺伝子、２個の一様に誘導された遺伝子、および２個のハウスキーピング対照からなる。
【図１６Ｂ】図１６ｂは、各時点（列）における各遺伝子（行）を発現する細胞のパーセンテージを示す。細胞は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋで遺伝子の発現が２３のＣｔより高かった場合に、その遺伝子について陽性としてスコアリングした。一部の免疫応答遺伝子、Ｃｘｃｌ１０およびＣｌｅｃ４ｅは、全ての細胞で一様に誘導され、全時点にわたり持続したが、抗ウイルスクラスタ遺伝子を発現する細胞のパーセンテージは時間依存的に増加した。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ＲＮＡ−ＦＩＳＨおよび免疫蛍光共染色を示す一連の写真およびグラフである。図１７ａは、Ｓｔａｔ１タンパク質（緑色）、Ｓｔａｔ１  ｍＲＮＡ（マゼンタ色）、およびＩｆｉｔ１  ｍＲＮＡ（白色）の共染色像の例を示す。
【図１７Ｂ】図１７ｂは、０時間（上）、２時間（中央）または４時間（下）にわたるＬＰＳへの曝露後のＩｆｉｔ１  ｍＲＮＡ（黒色）およびＳｔａｔ１（赤色）、ｐＳｔａｔ１（灰色）、およびＳｔａｔ２（緑色）タンパク質のレベルの分布を示す（総蛍光レベル、左のヒストグラム；平均蛍光レベル、中央；およびパーセント核移行、右）。全体的なタンパク質レベルはいずれの場合にも全時間経過にわたり増加したが、Ｓｔａｔ１、ｐＳｔａｔ１、およびＳｔａｔ２の誘導に実質的なばらつきが認められた。Ｓｔａｔ１レベルは徐々に上昇したが、ｐＳｔａｔ１のシフトは早期に最も顕著であった。一方、Ｓｔａｔ２は、２時間までに強力な核移行を示し、続いて２〜４時間で強力な誘導を示した。４時間までに、タンパク質レベルはより均質になり、核転座ははっきりとしなくなった。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、Ｓｔａｔタンパク質とＩｆｉｔ１  ｍＲＮＡ発現との間の相関を示す一連のグラフである。図１８ａは、４時間のＬＰＳ刺激後のＳｔａｔタンパク質（Ｙ軸）とＩｆｉｔ  ｍＲＮＡレベル（Ｘ軸）との間の相関を示す代表的な散布図を示す。上段：Ｓｔａｔ１、中央段：ｐＳｔａｔ１；下段：Ｓｔａｔ  ２。左列：総タンパク質蛍光；中央列：平均タンパク質蛍光；右列：核タンパク質のパーセント。
【図１８Ｂ】図１８ｂは、ＬＰＳに０時間（上）、２時間（中央）、または４時間（下）にわたり曝露した後の種々の測定パラメータ間の相関（ｒ２；青色＝０；赤色＝１）を示すヒートマップを示す。
【図１９】図１９は、同定された抗ウイルス回路の単純モデルを示す図である。Ｘは摂動点を表す。ＩｆｎフィードバックがＩｒｆ７およびＳｔａｔ２の発現を駆動する。Ｉｒｆ７の発現の変動性は、Ｉｆｉｔ１など、抗ウイルス遺伝子の発現の変動性に伝播する。Ｓｔａｔ２もまた関係し、しかしながらＩｒｆ７とのその関連は現在の実験によっては確立できない。
【図２０】図２０は、スプライシング因子Ｓｒｓｆ３およびＳｒｓｆ７の「毒」カセットエクソンについてのスプライシングパターンを示すグラフである。スプライシング因子Ｓｒｓｆ３およびＳｒｓｆ７（これらは各々、選択的にスプライスされた毒カセットエクソン（破線の囲み）を有することが知られる）をコードする２個の遺伝子に関する各個々の細胞（「１」、青色）および集団平均（「１０，０００」、灰色）におけるＲＮＡ−Ｓｅｑリード密度が示される。各遺伝子について既知のアノテートされたアイソフォームを下部に示す。上部に橙色で強調表示される一つの細胞、Ｓ１３は、「毒性」エクソンを含むＳｒｓｆ３およびＳｒｓｆ７アイソフォームのみを発現した。各遺伝子について、１１個の細胞は専ら選択的アイソフォームを発現した。
【図２１】図２１は、長鎖非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡの発現変動を示すグラフである。３個の既にアノテーションされているｌｎｃＲＮＡ遺伝子について各個々の細胞（「１」、青色）および集団平均（「１０，０００」、灰色）におけるＲＮＡ−Ｓｅｑリード密度が示される。集団レベルで比較的高発現のｌｎｃＲＮＡ（Ｇａｓ５、左）は、単一細胞レベルで二峰性に発現する。集団で低発現であるかまたは検出不能な２つのｌｎｃＲＮＡ（Ｇｍ８７７３、２８１００２５Ｍ１５Ｒｉｋ）は、事実上、個々の細胞の一部で顕著に発現する。
【図２２】図２２は、３’バイアスのクオリティコントロールを示す一連のグラフである。６個の単一細胞（上２段）および全３個の１０，０００集団（下段）に関する５’（左）から３’（右）までの各々正規化した転写物位置における正規化したＲＮＡ−Ｓｅｑカバレッジのプロットが示される。単一細胞および集団のいずれも３’バイアスをほとんど示さない。
【図２３】図２３は、ＬＰＳ刺激の非存在下（左）およびＬＰＳ刺激の４時間後（右）における免疫応答遺伝子Ｃｘｃｌ１（上）およびＣｘｃｌ１０（下）のＲＮＡ−ＦＩＳＨを示す一連の写真である。Ｃｘｃｌ１０およびＣｘｃｌ１は、刺激前の発現は無視し得るレベルであるが、ＬＰＳによって強力に誘導される。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜図２４Ｅは、病原体成分で刺激した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の、マイクロフルイディクスで可能となる単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑを示す一連のグラフおよび図である。図２４ａは、ＢＭＤＣの走査型電子顕微鏡写真（スケールバー：２５μｍ）を示す。図２４ｂは、ＴＬＲ２によるＰＡＭ３ＣＳＫ（ＰＡＭ、グラム陽性菌由来）、ＴＬＲ４によるリポ多糖（ＬＰＳ、グラム陰性菌由来）、およびＴＬＲ３によるポリイノシン：ポリシチジン酸（ＰＩＣ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ウイルスＲＮＡの合成模倣薬）の検知に関するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ネットワークの簡略図を示す。
【図２４Ｄ】図２４ｃは、Ｃ１チップ上（ＣＡＤ図、下）における単一ＢＭＤＣのマイクロ流体捕捉（上、細胞を紫色の丸で囲む）を示す。図２４ｄは、ＬＰＳ刺激細胞に関して３つの刺激および時間点の全てからの試料を共に計算した主成分（ＰＣ）分析（左）、および最初の３つのＰＣに関するＬＰＳ刺激細胞スコアの分布（右）を示す。
【図２４Ｅ】図２４ｅは、ＢＭＤＣ集団（左列）および個々のＢＭＤＣ（右列）の中でのＰＡＭ（緑色）、ＬＰＳ（黒色）、およびＰＩＣ（マゼンタ色）による刺激後０時間、１時間、２時間、４時間、および６時間におけるＢＭＤＣ中の誘導性遺伝子（行）の経時的発現プロファイルを示す。右端は、最初の３つの主成分（ＰＣ）（ＰＣ１、ＰＣ２、およびＰＣ３、列）に対する遺伝子射影スコアであり；下部は、最初の３つのＰＣ（ＰＣ１、ＰＣ２、およびＰＣ３、行）に対する各細胞（列）の寄与である。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜図２５Ｄは、単一細胞の時間依存的挙動を示す一連のグラフである。図２５ａは、ＰＡＭ（上、緑色）、ＬＰＳ（中央、黒色）、およびＰＩＣ（下、マゼンタ色）による刺激後の各時点（上部に示す）で３つの遺伝子（図２４ｅの３つのクラスタの各々から１つずつ）に見られる例示的な単一細胞発現分布を示す。分布は同じ最大高さを有するように縮尺を調整する。個々の細胞を各分布の下側にバーとしてプロットする。
【図２５Ｂ−Ｃ】図２５ｂ〜図２５ｄは、３つのモジュールの各々（表示される、上）について、ＬＰＳ（上）、ＰＩＣ（「コア」抗ウイルスクラスタＩｄについて、（図２５ｂ））またはＰＡＭ（「ピーク型」炎症クラスタ（図２５ｃ）および「持続型」炎症（図２５ｄ）クラスタについて）で刺激したＢＭＤＣにおける２時間目（左）および６時間目（右）のその全構成遺伝子のウェーブプロット（ｗａｖｅ  ｐｌｏｔ）を示す。Ｘ軸：発現レベル、ｌｎ（ＴＰＭ＋１）；Ｙ軸：遺伝子；Ｚ軸：単一細胞発現密度。遺伝子は、２時間（「ピーク型」炎症）または６時間（「コア」抗ウイルス、「持続型」炎症）のＬＰＳ時点における平均発現値の最小から最大へと並べる。
【図２５Ｄ】図２５ｂ〜図２５ｄは、３つのモジュールの各々（表示される、上）について、ＬＰＳ（上）、ＰＩＣ（「コア」抗ウイルスクラスタＩｄについて、（図２５ｂ））またはＰＡＭ（「ピーク型」炎症クラスタ（図２５ｃ）および「持続型」炎症（図２５ｄ）クラスタについて）で刺激したＢＭＤＣにおける２時間目（左）および６時間目（右）のその全構成遺伝子のウェーブプロット（ｗａｖｅ  ｐｌｏｔ）を示す。Ｘ軸：発現レベル、ｌｎ（ＴＰＭ＋１）；Ｙ軸：遺伝子；Ｚ軸：単一細胞発現密度。遺伝子は、２時間（「ピーク型」炎症）または６時間（「コア」抗ウイルス、「持続型」炎症）のＬＰＳ時点における平均発現値の最小から最大へと並べる。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜図２６Ｌは、刺激中の変動の動的変化を示す一連のグラフである。図２６ａは、単一細胞発現分布を記述するために用いる３つのパラメータの概略的レンダリングを提供し、左から右に：μ、検出可能な発現レベルを有する細胞の平均ＲＮＡ存在量レベル；σ、検出可能な発現を有する細胞の発現のばらつき；およびα、全ての（ｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞１で）検出可能な発現を有する細胞の割合。
【図２６Ｂ】図２６ｂは、ＬＰＳ刺激後の種々の時点で測定されたＴＮＦ発現分布（黒色）のフィット（灰色）の例を示す。
【図２６Ｃ】図２６ｃは、各時点（Ｘ軸）におけるＴＮＦについて推定したμ、σ２、およびα（Ｙ軸、左から右に）の値の変化を示す。μおよびσ２の単位はｌｎ（ＴＰＭ＋１）である。
【図２６Ｄ】図２６ｄは最尤推定量αである。ＬＰＳ刺激後の種々の時点におけるＴＮＦの発現分布（黒色、左）、および発現が対数正規の形で分布しかつ任意の偏差が技術的検出限界に起因する帰無モデルを考えるときの、αＭＬＥ（緑色、右）の決定に用いられるマッチング尤度関数（青色の点線）が示される。
【図２６Ｅ−Ｆ】図２６ｅおよび図２６ｆは、発現とＨ３Ｋ２７ａｃ結合との間の関係がαに依存し、μには依存しないことを示す。プロットは、集団発現（Ｙ軸）の１０分位ビンの各々およびα（図２６ｅ、Ｘ軸）またはμ（図２６ｆ、Ｘ軸）の１０分位ビンの各々に対応するＨ３Ｋ２７ａｃ（ＬＰＳ２時間、上）、Ｈ３Ｋ２７ａｃ（非刺激、中央）、およびＨ３Ｋ４ｍｅ３（２時間ＬＰＳ、下）遺伝子の平均プロモーターリード密度（強度；黒色  高；白色  低；スケールバー、下）を示す。発現とＨ３Ｋ２７ａｃ（図２５ｅ、上、中央）との間の集団全体の相関は、検出可能な発現レベルを有する単一細胞（α；図２５ｅ、中央）のパーセンテージの制御後に大部分が消失するが、この依存性はＨ３Ｋ４Ｍｅ３レベル（図２６ｅ、下）については残る。対照的に、μの制御（図２６ｆ）によっては発現レベルとＫ２７ａｃとの間の依存性はなくならず、なぜならμの単一の範囲内で（縦縞）、集団発現レベルとＫ２７ａｃとの間の相関が維持されるためであり、μそれ自体はこの関係の根底にある決定因子ではないことが示唆される。
【図２６Ｇ】図２６ｇは、そのまま（赤色）あるいはμ（青色）またはα（緑色）を制御したときの免疫応答遺伝子のみに関する平均発現レベルとＫ２７ａｃとの間の相関のｐ値を示す棒グラフを示す。
【図２６Ｈ】図２６ｈは、各モジュールにおけるαおよびμの動的変化を示す。各モジュール（上：コア抗ウイルス；中央：ピーク型炎症；下：持続型炎症）について、種々の条件（上部に示す）で各推移において（Ｘ軸）αのみ（尤度比検定による、Ｐ＜０．０１、青色）、μのみ（ウィルコクソン検定、Ｐ＜０．０１、緑色）、または両方（独立に各検定、水色）に有意な変化を有する遺伝子の割合（Ｙ軸）を示す棒グラフ。各モジュールおよび条件において、応答時間の経過の中で少なくとも１時点で有意に二峰性（尤度比検定による）であり、かつ両方の条件において少なくとも１０細胞で発現するモジュール内の遺伝子の総数から比率を計算する。この数は、各バーの上部に示す。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜図２７Ｆは、ＩＦＮ−βフィードバックが「コア」抗ウイルス標的の発現の不均質性を駆動することを示す一連のグラフおよび図である。図２７ａは、ＬＰＳ（左、黒色）またはＩＦＮ−β（右、赤色）で２時間刺激した後のＲｓａｄ（上）およびＳｔａｔ２（下）の単一細胞発現分布を示す。
【図２７Ｂ】図２７ｂは、ＬＰＳ（左）またはＩＦＮ−β（右）で２時間刺激したときの「コア」抗ウイルスクラスタの遺伝子（Ｙ軸；図２５ｂと同じように並べた）の各々の発現の分布を示すウェーブプロットを示す。ＬＰＳで２時間ではほとんどの遺伝子の発現が二峰性であったが、ＩＦＮ−βで２時間ではほとんどが単峰性の発現（図２５ｂにおける４時間ＬＰＳの時点と同種の）であった。
【図２７Ｃ】図２７ｃは、各ＬＰＳ刺激細胞（０時間、１時間、２時間、４時間、および６時間）およびＩＦＮ−βで２時間刺激した（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）細胞（右端）の「コア」抗ウイルススコア（Ｙ軸）を示す。２つの「早熟」細胞（黄色の星印）は、１時間のＬＰＳで異常に高い抗ウイルススコアを有する。
【図２７Ｄ】（ｄ）１時間ＬＰＳでの「コア」（クラスタＩｄ、左）および二次（クラスタＩｃ、右）抗ウイルスクラスタからの遺伝子の発現の正規分位点プロット。２つの「早熟」細胞（黄色の星印）は、異常に高いレベルの「コア」抗ウイルス遺伝子（左）を発現するが、二次遺伝子（右）ではそれはない。図２７ｅは、ＲＮＡ−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＦＩＳＨ）により、Ｉｆｎｂ１（マゼンタ）およびＩｆｉｔ１（シアン）の両方について陽性の、まれな早期応答細胞（矢印；黄色の星印）の存在が確認されたことを示す。灰色：細胞輪郭。スケールバー：２５μｍ。図２７ｆは、１時間のＬＰＳ刺激後におけるＲＮＡ−ＦＩＳＨによるＩｆｎｂ１（マゼンタ）およびＩｆｉｔ１（シアン）の両方の検出（＞５コピー）の一致を示すベン図を提供する（Ｐ＜１０〜２５、等比率の検定）。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜図２８Ｅは、細胞間シグナリングのマイクロ流体遮断が抗ウイルスモジュールおよび炎症モジュールにおける応答の不均質性に影響を与えることを示す一連の図およびグラフである。図２８Ａは、細胞間連絡の実験的遮断を示す。左：Ｃ１チップ；右：オンチップ刺激と、続くマイクロ流体バルブ（赤色のバー）の作動が、個々のチャンバに細胞を密閉し、細胞間シグナリングを阻止する。図２７ｂは、オンチップ刺激（左；細胞間シグナリングなし）およびインチューブ刺激（右）からの単一細胞（列）における「コア」抗ウイルスモジュール（Ｉｄ、上段）および「ピーク型」炎症モジュール（ＩＩＩｃ、下段）の遺伝子（行）の発現を示す。色がスケール化した発現値（ｚ−スコア）を表す。
【図２８Ｃ】図２８ｃは、オンチップ（左、青色；パラ分泌シグナリングなし）またはインチューブ（右；黒色）での４時間ＬＰＳ刺激における「コア」抗ウイルスクラスタ（上）および「ピーク型」炎症クラスタ（下）からの個々の代表的な遺伝子の遺伝子発現分布を示す。
【図２８Ｄ】図２８ｄは、（左から右に）：ＬＰＳ０時間、ＬＰＳ１時間、ＬＰＳ２時間、ＬＰＳ４時間、ＬＰＳ６時間、「オンチップ」非刺激、「オンチップ」ＬＰＳ４時間、ＬＰＳ４時間で０時間目にＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）を添加、ＬＰＳ４時間で１時間目にＧｏｌｇｉＰｌｕｇを添加、ＬＰＳ４時間で２時間目にＧｏｌｇｉＰｌｕｇを添加、Ｉｆｎａｒ−／−  ＢＭＤＣでＬＰＳ４時間、およびＳｔａｔ１−／−  ＢＭＤＣでＬＰＳ４時間からの個々の細胞に関する「コア」抗ウイルススコア（上パネル、Ｙ軸）、「ピーク型」炎症スコア（中央パネル、Ｙ軸）、および「持続型」炎症スコア（下パネル、Ｙ軸）のバイオリンプロットを示す。１時間ＬＰＳで異常に高い抗ウイルススコアを有する２つの「早熟」細胞（図２７）を黄色の星印で示す。
【図２９Ａ】図２９Ａおよび図２９Ｂは、集団レベルのパラ分泌シグナリングが「コア」抗ウイルス応答を向上かつ協調させる一方で、「ピーク型」炎症応答を弱めて脱同期化させることを示す一連の図およびグラフである。図２９ａは、正のＩＦＮ−βシグナリングがどのように抗ウイルス応答を誘導し、その不均質性を低下させると同時に、場合によりＩＬ−１０を含め、「ピーク型」炎症クラスタを弱めかつその不均質性を増加させる負のパラクリンフィードバックループを活性化したかを示す遺伝子ネットワークモデルである。
【図２９Ｂ】図２９ｂは、正および負のパラクリンフィードバックがどのように細胞間の抗ウイルス遺伝子（マゼンタ色）および炎症遺伝子（緑色）の発現変動性を変化させたかを示す細胞集団モデルである。灰色は発現がないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、概して、コア抗ウイルス応答、二次抗ウイルス応答、成熟、誘導性炎症応答および急ピーク型炎症応答を含む樹状細胞応答を制御する調節ネットワークを同定するための組成物および方法、ならびに樹状細胞応答を制御する１つまたは複数の調節ネットワークを種々の治療および／または診断指標において利用するための組成物および方法に関する。
【００４１】
本明細書に提供される研究では、単一細胞核酸分析、具体的には単一細胞ＲＮＡ  Ｓｅｑを使用して、様々な病原性成分に応答する個々の樹状細胞（ＤＣ）のｍＲＮＡをプロファイリングした。単一細胞ＲＮＡ  Ｓｅｑプロファイリング方法の使用は、非限定的な例として、よりクリーンなシグネチャー、成熟回路からの抗ウイルス回路の分離、および細胞集団中に同定されたシグネチャーの精緻化など、多くの利点を提供する。
【００４２】
単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑは、一見したところ同一の細胞の間にある遺伝子発現変動の範囲、基礎、および機能を理解するための偏りのない手法を提供する。しかしながら、この可能性を実現するには、種々の実験条件にわたり多数の細胞をプロファイリングし、および分析するための、ハイスループットのワークフローが必要である。本開示は、３つの病原性成分で刺激した１，７００個を超える初代マウス樹状細胞（ＤＣ）から単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリを調製するマイクロ流体ベースの手法を提供する。同じ刺激に曝露された個々の細胞間で、所与のｍＲＮＡ転写物を検出可能なレベルで発現する細胞の割合と、これらの発現細胞内での転写物のレベルとの両方に実質的な変動があることが認められた。個別的な遺伝子モジュールは、異なる経時的不均質性のプロファイルによって特徴付けられる。詳細には、抗ウイルス遺伝子の「コア」モジュールは、少数の「早熟」細胞によって前初期に発現され、次に後の時点で全ての細胞で活性になる。密閉したマイクロ流体チャンバで細胞を個々に刺激し、ノックアウトマウスのＤＣを分析し、および分泌および細胞外シグナリングをモジュレートすることにより、この応答がインターフェロン媒介性パラ分泌シグナリングを介して伝播し、協調する。意外にも、細胞間連絡を妨げると、ピーク型早期誘導性炎症モジュールの発現の変動性もまた実質的に低下し、パラ分泌シグナリングがさらに炎症プログラムの一部分を抑制することが示唆される。本明細書に提供される組成物および方法は、細胞の不均質性の制御における細胞間連絡の重要性を強調し、多細胞集団が複雑な動的応答を確立するために用いる一般的な戦略を明らかにする。
【００４３】
史上初めてこの解析の使用によって、本明細書で「コア抗ウイルス」遺伝子シグネチャー、「二次抗ウイルス」遺伝子シグネチャー、「成熟」遺伝子シグネチャー、「炎症誘導性」遺伝子シグネチャー、および「炎症急ピーク型」遺伝子シグネチャーと称される種々の応答要素に関する一連の精緻化された遺伝子シグネチャーが明らかにされた。これらのシグネチャーは、コヒーレントな単一細胞群で発現する遺伝子である。これらの遺伝子シグネチャーの各々は、以下の表１〜表５に提供する。
【００４４】
「コア抗ウイルス」遺伝子シグネチャーは、応答樹状細胞の最も初期に誘導される。「成熟」遺伝子シグネチャーは、集団レベルでは「誘導性炎症」遺伝子シグネチャーと似ているように見えるが、単一細胞解析を用いることで、「成熟」遺伝子シグネチャーは一部の細胞のみで発現していることが確立された。「成熟」遺伝子シグネチャーは、樹状細胞によるＴ細胞およびＢ細胞の動員を可能にし、従って自然免疫系と適応免疫系との間の橋渡しをすることに関与する。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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【００４９】
【表５】
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【００５０】
【表６】
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【００５１】
【表７】
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【００５２】
【表８】
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【００５３】
【表９】
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【００５４】
【表１０】
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【００５５】
所望の標的遺伝子または標的遺伝子の組み合わせが選択され、かつ選択した１つまたは複数の標的遺伝子が樹状細胞応答の間に過剰発現するか、それとも過小発現するかを決定した後、所望の成熟および／または機能結果に応じて好適な拮抗薬または作動薬が使用される。好適な拮抗薬および／または作動薬には、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が含まれる。
【００５６】
モジュレート剤を使用して、樹状細胞に関連する摂動に応答する遺伝子として同定された１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現をモジュレートする。これらの標的遺伝子は、例えば、樹状細胞をモジュレート剤に接触させ、かつ存在する場合には、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現に対する効果をモニタリングすることにより同定される。一部の実施形態では、１つ以上のシグネチャー遺伝子は、表１〜表５Ａに列記されるものから選択される。モジュレート剤は１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現に直接作用することができ、および／またはモジュレート剤は、１つまたは複数の標的遺伝子に関連することが知られる遺伝子または遺伝子の産物の発現、活性および／または機能をモジュレートすることによって１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現に間接的に作用することができる。
【００５７】
一部の実施形態では、標的遺伝子は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＴＮＦＲの発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、ＴＮＦＲに関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、以下の表６に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。表６の下線を引いた遺伝子は、ＴＮＦＲが存在しないとき、例えばノックアウトされているときに上方調節される遺伝子であり、下線が引かれていない遺伝子は、ＴＮＦＲが存在しないとき、例えばノックアウトされているときに下方調節される遺伝子である。
【００５８】
【表１１】
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【００５９】
【表１２】
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【００６０】
一部の実施形態では、標的遺伝子はＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＴＩＲＡＰの発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、ＴＩＲＡＰに関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、以下の表７に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。表７の下線を引いた遺伝子は、ＴＩＲＡＰが存在しないとき、例えばノックアウトされているときに上方調節される遺伝子であり、下線が引かれていない遺伝子は、ＴＩＲＡＰが存在しないとき、例えばノックアウトされているときに下方調節される遺伝子である。
【００６１】
【表１３】
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【００６２】
【表１４】
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【００６３】
【表１５】
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【００６４】
一部の実施形態では、標的遺伝子はＳｔａｔ１である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＳｔａｔ１の発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、Ｓｔａｔ１に関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、以下の表８に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。表８の下線を引いた遺伝子は、Ｓｔａｔ１が存在しないとき、例えばノックアウトされているときに上方調節される遺伝子であり、下線が引かれていない遺伝子は、Ｓｔａｔ１が存在しないとき、例えばノックアウトされているときに下方調節される遺伝子である。
【００６５】
【表１６】
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【００６６】
【表１７】
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【００６７】
【表１８】
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【００６８】
一部の実施形態では、標的遺伝子はインターフェロン産生調節因子（ＩＦＮＲ）である。一部の実施形態では、モジュレート剤はＩＦＮＲの発現、活性および／または機能を変化させる。一部の実施形態では、モジュレート剤は、ＩＦＮＲに関連する遺伝子、例えば非限定的な例として、以下の表９に示されるものに含まれる遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。表９の下線を引いた遺伝子は、ＩＦＮＲが存在しないとき、例えばノックアウトされているときに上方調節される遺伝子であり、下線が引かれていない遺伝子は、ＩＦＮＲが存在しないとき、例えばノックアウトされているときに下方調節される遺伝子である。
【００６９】
【表１９】
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【００７０】
【表２０】
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【００７１】
【表２１】
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【００７２】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、以下の表１０、表１１または表１２に列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子である。一部の実施形態では、モジュレート剤は、１つまたは複数の標的遺伝子の発現、活性および／または機能を変化させる。表１０、表１１および／または表１２の下線を引いた遺伝子は、標的遺伝子が存在しないとき、例えばノックアウトされているときに上方調節される遺伝子であり、下線が引かれていない遺伝子は、標的遺伝子が存在しないとき、例えばノックアウトされているときに下方調節される遺伝子である。
【００７３】
【表２２】
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【００７４】
【表２３】
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【００７５】
【表２４】
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【００７６】
【表２５】
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【００７７】
【表２６】
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【００７８】
【表２７】
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【００７９】
【表２８】
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【００８０】
【表２９】
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【００８１】
本明細書に提供される技術の感度は、細胞の近縁のサブ集団の検出および定義を可能にする。これらの技術は、細胞の個別的なサブセットにおいて選択的に誘導される遺伝子応答モジュール、例えばシグネチャーの同定を可能にする。単一細胞間の相関解析が、細胞回路の再構築およびこれらのモジュールの調節因子の同定において有用である。
【００８２】
最近の分子研究が明らかにしているところによれば、「均質な」集団から得られた場合であっても、個々の細胞は遺伝子発現、タンパク質レベル、および表現型出力について有意な差を呈し（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９）；Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「非遺伝的細胞間変動性および薬理学に及ぼす影響（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，５５６−５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０９．０１５（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤耐性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，６９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｋ．Ｅ．＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｓ．「癌細胞は抗有糸分裂薬への長期曝露後に大きい系統内および系統間変動を呈する（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １４，１１１−１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０７．００２（２００８）、重大な機能的影響が伴う（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤��性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，６９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｋ．Ｅ．＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｓ．「癌細胞は抗有糸分裂薬への長期曝露後に大きい系統内および系統間変動を呈する（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １４，１１１−１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０７．００２（２００８）；Ｆｅｉｎｅｒｍａｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「エフェクター細胞および調節性Ｔ細胞によるＩＬ−２応答の単一細胞定量化が免疫応答における決定的な可塑性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，１−１６、ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１０．９０（２０１０））。しかしながら、細胞の不均質性に関する既存の研究では、典型的には少数の予め選択されたＲＮＡのみを測定しているか（Ｙｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「膵臓循環腫瘍細胞のＲＮＡシーケンシングはＷＮＴシグナリングを転移と関係付ける（ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ＷＮＴ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，５１０−５１３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１２１７（２０１２）；Ｒａｊ，Ａ．，Ｒｉｆｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．＆  Ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．「遺伝子発現の変動性が不完全浸透の根底にある（Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，９１３−９１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８７８１（２０１０））または同時にタンパク質を測定しており（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９）；Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答におけ���個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「非遺伝的細胞間変動性および薬理学に及ぼす影響（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，５５６−５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０９．０１５（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤耐性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，６９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｋ．Ｅ．＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｓ．「癌細胞は抗有糸分裂薬への長期曝露後に大きい系統内および系統間変動を呈する（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １４，１１１−１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０７．００２（２００８）；Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト結腸腫瘍における転写不均質性の単一細胞分析（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，１１２０−１１２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２０３８（２０１１）；Ｂｅｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｃ．＆  Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．「ヒト造血連続体にわたる示差的免疫および薬物応答の単一細胞マスサイトメトリー（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３２，６７７−６７８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０６３５１（２０１１）、なぜならゲノムプロファイリング法（Ｂｅｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｃ．＆  Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．「ヒト造血連続体にわたる示差的免疫および薬物応答の単一細胞マスサイトメトリー（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）��．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３２，６７７−６７８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０６３５１（２０１１）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．「細胞の不均質性：違いが違いを作り出すか？（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：Ｄｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？）」  Ｃｅｌｌ  １４１，５５９−５６３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０４．０３３（２０１０）；Ｋａｌｉｓｋｙ，Ｔ．，Ｂｌａｉｎｅｙ，Ｐ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「単一細胞レベルでのゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｖｅｌ）」．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５，４３１−４４５，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｇｅｎｅｔ−１０２２０９−１６３６０７（２０１１）；Ｋａｌｉｓｋｙ，Ｔ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「単一細胞ゲノミクス（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，３１１−３１４（２０１１））は、ごく最近まで単一細胞には適用できなかったためである（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「高度多重化ＲＮＡ−ｓｅｑによる単一細胞転写ランドスケープの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＮＡ−ｓｅｑ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１０１／ｇｒ．１１０８８２．１１０（２０１１）；Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞のトランスクリプトームランドスケープを捕捉するためのＲＮＡ−Ｓｅｑ解析（ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５，５１６−５３５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２３６（２０１０）；Ｔａｎ
ｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞のｍＲＮＡ−Ｓｅｑ全トランスクリプトーム解析（ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｗｈｏｌｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３７７−３８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１５（２００９）；Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２）；Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆  Ｙａｎａｉ，Ｉ．「ＣＥＬ−Ｓｅｑ：多重線形増幅による単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＣＥＬ−Ｓｅｑ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．００３）。ここで、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したモデル哺乳類系、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の応答の不均質性を調べた。これまで観察されたことのない広範な二峰性変動がＲＮＡ転写物の存在量およびスプライシングパターンの両方に見出され、これらは選択された転写物のＲＮＡ−蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによって独立して検証された。詳細には、数百個の主要な免疫遺伝子が、意外にも集団平均で極めて高発現の遺伝子であっても、個々の細胞にわたり二峰性に発現する。さらに、単一細胞にわたるスプライシングパターンが、これまで観察されたことのないレベルの不均質性を実証し：集団レベルで複数のスプライスアイソフォームを有する遺伝子について、個々の細胞はある特定のアイソフォームの優勢な発現に向かうバイアスを呈する。本明細書に提供される実施例により示されるとおり、これらの細胞間の差異は、細胞状態および細胞回路使用の両方の不均質性によって駆動される。一部の二峰性は、近似した、しかし個別的な既知の成熟度状態のＢＭＤＣの存在を反映するが、同じ成熟度状態の細胞内であっても、他の部分では同一である細胞の間の主要な調節回路の使用の違いを反映して、他の二峰性パターンが存在する。例えば、１３７個の極めて変動的な、しかし共調節される抗ウイルス応答遺伝子のモジュールが同定された。本明細書に提供する本研究は、ノックアウトマウス由来のＢＭＤＣを使用して、この抗ウイルスモジュールにおける二峰性が、主要な抗ウイルス転写調節因子Ｓｔａｔ２およびＩｒｆ７が関わるインターフェロン回路を通じて伝播し得ることを実証する。この研究は、細胞間の広範な機能的多様性を明らかにする際の、かつ細胞状態および回路を読み解く際の偏りのない単一細胞ゲノミクスの力および可能性を実証する。
【００８３】
上記の分析は、同じ条件および全体的状態の単一細胞にわたる転写物間の共変動が、どのようにして使用の違いによって有意な細胞の不均質性が促進される調節回路を同定および構築する助けとなり得るかを示す概念実証を提供する。具体的には、変動性回路（図１９）では、インターフェロンシグナリングがＳｔａｔ２およびＩｒｆ７の誘導に必要とされ、次にはそれらが、変動性抗ウイルスクラスタ遺伝子を誘導する働きをする。しかしながら、これらの実験は、回路のどの成分が観察される不均質性それ自体を引き起こすのかを断定するものではない。一つの説得力のある可能性は、上流のノイズがインターフェロン−シグナリング経路から初めにＳｔａｔ２およびＩｒｆ７に、次に標的遺伝子に伝播するというものである。この仮説は、Ｓｔａｔタンパク質レベルおよび核移行に観察された変動により裏付けられる。また、最近の研究によっても裏付けられ（Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｐｈａｔｎａｎｉ，Ｈ．，Ｓｃｈｅｕ，Ｓ．＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「インターフェロン−？遺伝子の確率論的発現（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−？  Ｇｅｎｅ）」．ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，ｅ１００１２４９（２０１２）；Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ，Ｅ．＆  Ｔｈａｎｏｓ，Ｄ「．ウイルス感染は、単一対立遺伝子のＩＦＮ−β遺伝子発現を媒介するＮＦ−κＢ依存性染色体間の関連性を誘導する（Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ  ＩＦＮ−ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．Ｃｅｌｌ  １３４，８５−９６（２００８）；Ｒａｎｄ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．「多層的確率性およびパラクリンシグナル伝播がＩ型インターフェロン応答を形作る（Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｓｈａｐｅ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ−Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１２．１７（２０１２））、それらの研究は、哺乳類細胞においてウイルス複製中のＩｒｆ７の過剰発現がＩｆｎ−β産生の不均質性を低減すること、およびＩｒｆ７転座がウイルス刺激下でのＩｆｎ−β産生と相関を有することを実証している。特に、Ｉｒｆ７およびＳｔａｔ２のレベルと強く相関したインターフェロン刺激性遺伝子（例えば、Ｉｓｇ１５）およびインターフェロン誘導性タンパク質の発現の変動性もまた観察された。これは、一様なＩｆｎ−β刺激による先行研究では観察されなかったもので（Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｐｈａｔｎａｎｉ，Ｈ．，Ｓｃｈｅｕ，Ｓ．＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「インターフェロン−β遺伝子の確率論的発現（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  Ｇｅｎｅ）」．ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，ｅ１００１２４９（２０１２））、インターフェロンフィードバックの変動性が下流の不均質性を駆動するという仮���を裏付ける。
【００８４】
スプライシングにおける二峰性の影響の探索にも同様の戦略を用い得る可能性がある。たった１８個の細胞を調べるだけでも、アイソフォームが個別の機能的影響を有する遺伝子について、二峰性スプライシングパターンの興味深い例が観察された。例えば、スプライシング調節因子Ｓｒｓｆ３およびＳｒｓｆ７は、各々「毒カセットエクソン」を含むことが知られており、これが含まれると、ＲＮＡがナンセンス変異依存分解機構による分解の標的となる（Ａｎｋｏ，Ｍ．−Ｌ．ｅｔ  ａｌ．「２つのＳＲタンパク質のＲＮＡ結合ランドスケープがユニークな機能および多様なＲＮＡクラスに対する結合を明らかにする（Ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ＳＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ＲＮＡ  ｃｌａｓｓｅｓ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２０１２−１３−３−ｒ１７（２０１２））。これらのエクソンは集団レベルでは発現が極めて弱いが、単一細胞のうちの１つ（細胞Ｓ１３、図２０）は、もっぱらこれらの毒を含むアイソフォームを高レベルで発現した（Ｓｒｓｆ３およびＳｒｓｆ７の両方について、１１細胞はもっぱら他のアイソフォームを発現した）。Ｓｒｓｆ３それ自体は負のフィードバックループにおいてそれ自体の毒カセットエクソンのインクルージョンの増加に関与するため（Ａｎｋｏ，Ｍ．−Ｌ．ｅｔ  ａｌ．「２つのＳＲタンパク質のＲＮＡ結合ランドスケープがユニークな機能および多様なＲＮＡクラスに対する結合を明らかにする（Ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ＳＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ＲＮＡ  ｃｌａｓｓｅｓ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２０１２−１３−３−ｒ１７（２０１２））、Ｓ１３が事実上最も高いレベルのＳｒｓｆ３活性に相当し得る。多数の細胞を用意するとき、相関分析を用いてＳｒｓｆ３の標的候補を同定することができた。一方、他の調節遺伝子におけるスプライシングの差異が、発現の多様性をさらに向上させ得る：例えば、Ｉｒｆ７の種々のアイソフォームによりコードされる−細胞において二峰性にスプライスされる（図３ｃ）−タンパク質は、インターフェロン応答性遺伝子をインビトロで別様に活性化させる（Ｎｉｎｇ，Ｓ．，Ｈｕｙｅ，Ｌ．Ｅ．＆  Ｐａｇａｎｏ，Ｊ．Ｓ．「インターフェロンシグナリングと独立した経路によるＩＲＦ７プロモーターの転写活性の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＲＦ７  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ａ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８０，１２２６２−１２２７０（２００５））。これらの例は、スプライシングの不均質性が、別の潜在的な応答コード層に相当し得ることを示唆している。
【００８５】
本明細書に提供される研究は、遺伝子発現、選択的スプライシング、および調節回路活性に反映されるＬＰＳ刺激に対するＢＭＤＣの転写応答に広範な二峰性を見出す。遺伝子発現では、集団平均で高発現のものを含め、主要な免疫タンパク質をコードする数百もの二峰性に発現した転写物が認められた。一部の遺伝子の変動は異なる成熟状態にある少数のサブ集団に起因するが、他のものは抗ウイルス調節回路の二峰性の活性を反映する。単一細胞にわたる共変動は、集団規模の測定では区別不能であり得る精緻化された機能遺伝子モジュールを分析する助けとなり得る。詳細には、最近の集団規模の研究では（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））、ＳＴＡＴタンパク質によって制御される成熟遺伝子および抗ウイルス遺伝子がエンリッチされた８０８個の「後期誘導型」ＬＰＳ遺伝子の大きいクラスタが同定された。これらの２つのサブセットは、集団レベルデータ単独に基づいては別個に試験することができなかったが、単一の時点からの単一細胞データは、異なる単一細胞で発現するとおりそれらを明らかに区別する。同様に、単一細胞間で選択的スプライシングに見出された予想外のかつ高頻度に見られる非対称が、このプロセスの分子的見解を修正する。両方の現象とも、細胞回路を再構築するための「摂動系」としての各細胞の治療を可能にする（Ａｎｇｅｌｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「僧帽細胞におけるネットワークアフィリエーションおよび感覚処理の生物物理学的シグネチャー（Ａ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｔｒａｌ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，３７５−３７８，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１２９１（２０１２）；Ｓａｃｈｓ，Ｋ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｏ．，Ｐｅ’ｅｒ，Ｄ．＆  ａｌ，ｅ．「多パラメータ単一細胞データに由来する因果的タンパク質シグナリングネットワーク（Ｃａｕｓａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄａｔａ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）（２００５））。実際、たった１８個の単一細胞からの、かつ誘導性遺伝子に焦点を置くデータであっても、本明細書の研究は、「概念実証」として、どのように種々の調節因子を、続いてノックアウトモデルで検証したインターフェロン駆動性抗ウイルス回路内のそれらの共変動する標的に因果的に関係付けることができたかを実証した。最後に、分析の多くが、可能性のある増幅ノイズの影響を取り除くため���発現遺伝子に焦点を置いたが、データはまた、大型非コードＲＮＡなどの、発現がより抑えられた転写物の間での有意な二峰性も明らかにする（図２１）。この観察は、集団におけるこれらの転写物の発現レベルが低い程（Ｃａｂｉｌｉ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト大型遺伝子間非コードＲＮＡの統合的アノテーションが大域的特性および特異的サブクラスを明らかにする（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ）」．Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２５，１９１５−１９２７（２０１１））、細胞の全てがそれらを低度に発現するよりむしろ、少数の細胞がそれらを高度に発現する結果になり得るという興味深い可能性を示唆しており、しかしながらこれらの２つの仮説を解きほぐすにはさらなる技術的改良が必要である（図９）。従って、単一細胞測定は、これらの転写物の発見、アノテーション、および分析を促進する助けとなるはずである。
【００８６】
これらの結果を他の単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータセットと比較すると、分析した組織の供給源（インビトロ対エキソビボ）、個々の細胞の生物学的条件（定常状態に対し、動的応答）、および細胞内微小環境の不均質性の全てが、任意の個々の系内での単一細胞の不均質性の程度に影響を与えている可能性があることが示される。複雑な組織−未分類の骨髄、種々のステージの発生中の胚、不均質腫瘍、およびまれな臨床試料などに適用されるとき（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９）；Ｔｏｄｄ，Ｒ．＆  Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｄ．Ｈ．「単一細胞診断法の課題：遺伝子発現の分析（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８，２５４−２５７（２００２））−単一細胞ゲノミクスを通じて見られる変動性は、新しい細胞分類スキームを決定し、移行状態を同定し、これまでに認識されていない生物学的違いを見出し、かつそれらを識別するマーカーをマッピングする助けとなり得る。この可能性を実現するには、単一細胞ゲノミクスに固有の高レベルのノイズ−入力材料が微量であることに起因する技術的ノイズ、および例えばＲＮＡ転写の短いバーストに起因する生物学的ノイズの両方−（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞における単一分子感度による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームおよびトランスクリプトームの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３３−５３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８３０８（２０１０）；Ｃａｉ，Ｌ．，Ｄａｌａｌ，Ｃ．Ｋ．＆  Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．「頻度をモジュレートした核移行バーストが遺伝子調節を協調させる（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｒｓｔｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，４８５−４９０，ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０７２９２  ［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７２９２（２００８））に対処するための新規戦略が必要となり得る。実験的調製における技術的進歩を新規の計算論的アプローチと組み合わせるさらなる研究により、数百個または数千個の単一細胞に基づく分析によって細胞内回路を再構築し、細胞状態およびタイプを列挙および再定義し、およびゲノム規模での細胞の意思決定に関する理解を根本的に転換することが可能となり得る。
【００８７】
本明細書に提供される研究はまた、マイクロ流体システムを使用して、２，０００個を超えるＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））単一細胞骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリの作成および分析も行う。ＢＭＤＣは、初代で、有糸分裂後で、かつ、病原性成分に応答し、集団レベルで十分に特徴付けられた炎症性および抗ウイルス性サイトカインに対するロバストな生理学的に関連性のある転写プログラムを誘発するため、単一細胞応答の研究に魅力的なシステムである（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１）；Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．＆  Ａｋｉｒａ，Ｓ．「パターン認識受容体および炎症（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  １４０，８０５−８２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０１．０２２（２０１０）；Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「ナノワイヤ媒介性送達が初代免疫細胞の機能的インテロゲーションを可能にする：慢性リンパ性白血病の分析への応用（Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ��ｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）」．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１２（１２）：６４９８−５０４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ３０４２９１７（２０１２））。最初に、刺激前ならびにＬＰＳ、ＰＡＭ３ＣＳＫ、およびポリＩ：Ｃ（それぞれグラム陰性菌、グラム陽性菌およびウイルスＲＮＡの合成模倣薬由来）による刺激後の４つの時点（１時間、２時間、４時間、６時間）でＢＭＤＣをプロファイリングした。これらの個別的なスナップショットから、単一細胞ノイズの経時的および応答特異的構造を調べた。刺激および時間点にわたる単一細胞変動の変化を評価するため、新規入れ子型統計モデルを開発し、それを使用して各遺伝子の単一細胞発現分布をパラメータ化した。集団レベルでは各病原体成分が個別の経時的プログラムを活性化する一方、個々の応答細胞は各応答内でも著しく変動的な挙動を示す。炎症回路では、２つの時間的に個別の発現不均質性パターンが認められた：一部の回路は初期に強力に同期し、時間とともに位相がずれるが、他の回路はノイズを伴い誘導される。一方、抗ウイルス遺伝子回路はノイズを伴い始まり、時間とともに厳密に同期するようになる。
【００８８】
詳細には、本明細書に提供される研究は、集団測定では隠れている早熟の「初期抗ウイルス応答細胞」のまれな集団を発見したとともに、それらの応答が集団全体を通じてパラ分泌シグナリングにより増幅されるという仮説を立てる。この仮説を検証するため、密閉したマイクロ流体チャンバ内で各細胞を個々に刺激し、ほとんどの細胞が主要な抗ウイルス応答遺伝子を誘導しなかったことが分かった。しかしながら、意外にも、炎症応答はこれらの隔離細胞で変動性が小さく、細胞内連絡が様々な回路のノイズを制限すると同時に増加させ得ることを実証している。インターフェロン受容体を欠損したＤＣを分析すると、これらの知見の多くが再現され、インターフェロンフィードバックが抗ウイルス応答の協調ならびに炎症応答における交差阻害およびノイズに必須であることを示している。最後に、モデルによって指名された主要な細胞内調節因子を欠失させたＤＣを試験して、このプロセスを制御する主要な回路成分を確かめた。この研究は、単一細胞間の変動性を細胞間および細胞内回路の再構築ならびにゲノム規模での細胞の意思決定の理解にどのように役立てればよいかを実証する。
【００８９】
本開示の組成物および方法はマイクロ流体ベースの手法の使用を用いることにより、種々の病原体成分および関連する摂動に対するＢＭＤＣの動的応答をサンプリングして、１，７００個を超えるＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリを調製する（例えば、Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２）を参照のこと。個別的な遺伝子モジュールは、所与のｍＲＮＡ転写物を検出可能なレベルで発現する細胞の割合およびそれらの検出可能に発現する細胞内におけるｍＲＮＡレベルの両方の変化によって生じる種々の経時的変動性プロファイルによって特徴付けられる。ＢＭＤＣ集団の平均経時的応答は、単一細胞レベルでの根底にある非同期性の、しかし連続的なプロセスから生じる：サンプリングした各時点で、かつ各モジュールについて、一部の細胞は、時間的連続上で他と比べてより「進んでいる」。詳細には、集団測定では隠れている、初期にインターフェロンを産生しかつコア抗ウイルスモジュールを活性化する数個の「早熟」細胞が見出された。理論によって拘束されることを意図するものではないが、これらの早熟細胞は、インターフェロン媒介性パラ分泌シグナリングを介した集団における抗ウイルス応答の駆動に関与すると考えられる。
【００９０】
集団応答の協調におけるパラ分泌シグナリングの役割を理解するため、本明細書に提供される研究は、密閉したマイクロ流体チャンバで細胞間連絡を阻止して細胞を個々に刺激する新規実験手法を開発した。これは後の時点における抗ウイルス応答の広がりおよび協調を遮断し、これらの「早熟」細胞が天然の集団応答の惹起および協調において重要な役割を果たすことが示唆される。さらに、インターフェロン受容体が欠損したＢＭＤＣ、または分泌阻害薬（ブレフェルジンＡ、「ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ」）またはタンパク質合成阻害薬（シクロヘキシミド）で処理したＢＭＤＣは、ＬＰＳで刺激されたとき「コア」抗ウイルス応答遺伝子を誘導しなかったことが分かった。意外にも、パラ分泌シグナリングの阻害は、または単にインターフェロンシグナリングだけの阻害もまた、初期の急ピーク型の誘導パターンを伴う炎症応答遺伝子モジュールを発現する細胞の割合の有意な増加をもたらしており、これは動的な集団レベルの正および負のパラクリンフィードバックループがどのように免疫応答の変動の促進および制限の両方を行い得るのかを強調する。
【００９１】
ＢＭＤＣ集団内での個々の細胞の挙動は、免疫応答の間に極めて動的であり、デジタルおよびアナログの両方の変動が、様々な時点、刺激およびモジュールにわたり変化する。これらのパターン−集団レベルの測定では隠れている−は、細胞集団がどのように細胞内および細胞間の両方の制御戦略を用いて複雑な動的応答を協調させることができるのかに関する原理を明らかにする。ここに提供される、種々の時点および刺激で得られた単一細胞プロファイリングデータセット、および関連する統計的分析、ならびに物理学的、遺伝学的および生化学的摂動は、必須の入力およびこれらの細胞内および細胞間制御戦略の分析手法を提供する。
【００９２】
最初に、単一細胞発現分布の統計的分析により、動的応答の間、特定の転写物を検出可能なレベルで発現する細胞の割合ならびに発現細胞内のｍＲＮＡレベルの両方が変化することが明らかとなる。これらの２つの機能の相互作用が、時間的応答プロファイルの豊かな多様性をコードし得る。例えば、後期誘導型「コア」抗ウイルス遺伝子は、初期の時点では極めて弱い平均発現を呈するが、数個の「早熟」細胞では高発現である。対照的に、「ピーク型」炎症遺伝子の漸進的な減退は、全ての細胞における発現が一様に徐々に低下するというよりむしろ、それらの転写物を発現する細胞の割合の変化を反映する。この挙動の遍在性は、暗黙のうちに集団発現プロファイルの変化を細胞内イベントのみに帰する傾向のある従来の計算論的な回路再構築手法にとって課題となる。むしろ、これらの観察は、細胞集団が、全ての細胞に共通する入り組んだ細胞内回路を通じるのみならず、不均質な単一細胞間の細胞間フィードバック機構を通じてもまた複雑な平均応答を生じ得ることを示唆している。複数の応答プログラムを特徴付ける二峰性の初期変化（図２６ｆ）は、迅速な免疫応答を生じる最も効率的な方法が、任意の細胞に所与の作業をさらに効率的に行うよう頼むのではなく、むしろより多くの細胞にそれを行うよう頼むことであることを示唆し得る。
【００９３】
かかる細胞間制御戦略の重要性の一例は、パラ分泌シグナリングが単一細胞挙動のいくつかの個別的な時間パターンを確立するにおいて重要な役割を果たすという知見である。詳細には、本明細書の研究は、少数の「早熟」細胞がＩｆｎｂ１および「コア」抗ウイルス遺伝子をＬＰＳ刺激後１時間という初期に発現し、およびＩＦＮ−βの分泌を介して他の細胞における「コア」抗ウイルス遺伝子の活性化を助け、集団応答を協調させることを明らかにしている。これらの細胞は、「コア」抗ウイルスモジュールにおける約１００個の遺伝子の発現を除き、集団の残りの細胞と区別できないことが注記される。
【００９４】
本明細書に提供される実験データは、実に、観察される「早熟」細胞が、効率的で時宜を得た集団応答を可能にするのに決定的に重要なプライミングされたイニシエーターである可能性が高いことを示唆している。第一に、ＬＰＳを加えた後の種々の時点における分泌を阻害するブレフェルジンＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）実験は、「コア」抗ウイルス応答に作用する主要なパラクリンシグナルが初期に約１時間で分泌されることを示唆している。さらに重要なことには、「オンチップ」隔離実験は、これらの「早熟」細胞からのパラ分泌シグナリングがない場合、４時間のインキュベーション後であっても、ごく一部（２０％）の細胞のみがＬＰＳに対する低下した「コア」抗ウイルス応答を独力で開始できるに過ぎないことを示している。従ってこれらのデータは、「早熟」細胞が、ＬＰＳに１時間程の初期に応答してＩｆｎｂ１を発現するようにプライミングされる特別な、恐らくは確率論的に定義された後成的状態の細胞に相当し得ることを示唆している。パラ分泌シグナリングはまた、インターフェロン媒介性連絡を含め、後の時点で一部の誘導性遺伝子（「ピーク型」炎症性）を抑える働きもする。まとめると、これらの観察は、「オンチップ」、ノックアウトおよび化学的モジュレート実験で観察された、抗ウイルス経路と炎症経路との間の交差阻害に関するモデル（図２９）を示唆している。このモデルでは、少数の細胞からの抗ウイルスフィードバックが一部の細胞からの抗炎症性サイトカインの発現および分泌を誘導し、次にはそれが隣接細胞の炎症応答を減弱させる。重要なことには、このモデルはまた、一様な過剰の細胞外シグナリング分子（例えば、ＩＦＮ−β）を提供するのではなく、むしろ個別的な応答サブセット間のバランスを標的にするという代替的治療戦略も示唆している（例えば、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．＆  Ｐａｓｃｕａｌ，Ｖ．「全身性エリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患におけるＩ型インターフェロン（Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，３８３−３９２，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００６．０８．０１０（２００６）；Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｃ．＆  Ｒｏｓｅｎ，Ａ．「Ｉ型インターフェロン：自己免疫における疾患拡大の重要な関与因子（Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ｃｒｕｃｉａｌ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ６，４０−４９，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｒｒｈｅｕｍ．２００９．２３７（２０１０）を参照のこと）。
【００９５】
シグネチャー遺伝子の選択のための自動化手順
本発明はまた、種々の治療および／または診断指標において有用な遺伝子シグネチャーを決定する方法を提供する。これらの方法の目的は、目的プロセスに関して情報を与える遺伝子の小さいシグネチャーを選択することである。基本概念は、異なるタイプの情報は、ゲノム全体（＞２０ｋの遺伝子）の「スペース」の、関連遺伝子のサブセットへの異なる分類を伴い得ることである。この方針は、シグネチャーサイズに対する制約を考慮し、これらの分類の最良のカバレッジを有するように設計される。例えば、この方針の一部の実施形態において、２つのタイプの情報：（ｉ）時間的発現プロファイル；および（ｉｉ）機能的アノテーションが存在する。第１の情報源は、遺伝子を、共発現される遺伝子のセットに分類する。情報源は、遺伝子を、共機能的遺伝子のセットに分類する。次いで、遺伝子の小さいセットを、それぞれのセットからの所望の数の代表物、例えば、それぞれの共発現セットからの少なくとも１０個の代表物およびそれぞれの共機能的セットからの少なくとも１０個の代表物が存在するように選択する。複数の情報源を用いる作業（ひいては、複数の分類を「被覆」する目的）の問題は、コンピュータ科学の理論において集合被覆として公知である。この問題は最適性に対して解決することができない一方（そのＮＰ困難性に起因）、それは、小倍数内で近似させることができる。一部の実施形態において、それぞれのセットからの代表物の所望数は、１つ以上、少なくとも２つ、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上である。
【００９６】
このアプローチの重要な特性は、シグネチャーのサイズ（次いで、それがこの制約下であり得る最良のカバレッジを見出す）；またはカバレッジの所望のサイズ（次いで、カバレッジ要求を満たし得る最小のシグネチャーサイズを選択する）を与えることができることである。
【００９７】
この手順の例示的実施形態は、表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに提供される様々な遺伝子シグネチャーの選択である。
【００９８】
シグネチャー遺伝子の使用
本発明は、種々の診断および／または治療指標において使用される樹状細胞関連遺伝子シグネチャー、治療用分子をスクリーニングするまたはそうでなければ同定するための様々な方法を提供する。本発明に関する「シグネチャー」は、限定されるものではないが、核酸と、その多型、突然変異物、変異体、改変物、サブユニット、断片、および他の分析物または試料由来計測物を包含する。
【００９９】
例示的なシグネチャーを表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに示し、本明細書において、とりわけ、「樹状細胞関連遺伝子」、「樹状細胞関連核酸」、「シグネチャー遺伝子」、または「シグネチャー核酸」と集合的に称する。
【０１００】
これらのシグネチャーは、を表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の第１レベルを検出し、検出レベルをシグネチャー遺伝子または遺伝子産物発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することにより、対象における免疫応答および／または異常樹状細胞応答を診断し、予後診断し、および／または病期分類し、検出レベルおよび対照レベルの差が、対象における免疫応答および／または異常樹状細胞応答の存在を示す方法において有用である。
【０１０１】
これらのシグネチャーは、を表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを第１の時点において検出し、を表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを第２の時点において検出し、発現、活性および／または機能の第１の検出レベルと、発現、活性および／または機能の第２の検出レベルとを比較することにより、対象における免疫応答および／または異常樹状細胞応答をモニタリングし、第１および第２の検出レベルの変化が、対象における免疫応答および／または異常樹状細胞応答の変化を示す方法において有用である。
【０１０２】
これらのシグネチャーは、を表１、表１Ａ、表２、表２Ａ、表３、表３Ａ、表４、表４Ａ、表５および／または表５Ａに列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の検出レベルに基づき、免疫応答、例えば、異常免疫応答、自己免疫応答、および／または炎症応答、および／または異常樹状細胞応答のリスクがあり、またはそれを罹患する患者集団を同定する方法において有用である。これらのシグネチャーは、治療または治療法の有効性を決定するための、異常免疫応答および／または異常樹状細胞応答のための治療および治療法を受ける対象のモニタリングにも有用である。これらのシグネチャーは、患者が治療または治療法に対して応答性であるか否かを決定するための、異常免疫応答および／または異常樹状細胞応答のための治療および治療法を受ける対象のモニタリングにおいても有用である。これらのシグネチャーは、異常免疫応答および／または異常樹状細胞応答の症状の治療、その進行の遅延、またはそうでなければその改善において有効である治療法および治療の選択または改変にも有用である。本明細書に提供されるシグネチャーは、治療の選択を容易にする精度での、規定状態の疾患における患者の群の選択に有用である。
【０１０３】
これらのシグネチャー遺伝子はまた、療法、ワクチン、移植または他の治療介入に対する患者の反応をモニタリングする方法にも有用である。例えば、１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現レベルを投与前および投与後の種々の時点で検出することができ、それらのレベルを本明細書に提供される単一細胞方法を用いて分析することができる。専門家は、コホートまたは他のコヒーレント群でどの遺伝子が発現しているか、および／または細胞のどのサブ集団がもっぱらこれらの遺伝子を発現しているかを決定することにより、どのコホートおよび／またはどの経路が免疫応答および／または異常な樹状細胞応答の発生に関与しているかを決定できることになる。
【０１０４】
本発明は、１つ以上のシグネチャー核酸に結合する検出試薬を有するキットも含む。本発明により、１つ以上のシグネチャー核酸に結合し得る検出試薬、例えば、オリゴヌクレオチドのアレイも提供される。好適な検出試薬としては、キットの形態で一緒に包装されるシグネチャー核酸の一部に相補的な相同核酸配列、例えば、オリゴヌクレオチド配列を有することにより、１つ以上のシグネチャー核酸を特異的に同定する核酸が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、シグネチャー遺伝子の断片であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、２００、１５０、１００、５０、２５、１０以下のヌクレオチド長であり得る。キットは、別個の容器中に、またはそれらをマトリックスに結合させるための試薬とともに別個に包装され）、対照配合物（陽性および／または陰性）、および／または検出標識、例えば、とりわけ、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、ルシフェラーゼ、放射性標識を含有し得る。アッセイを実施するための説明書（例えば、印刷物、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を、キット中に含めることができる。アッセイは、例えば、ノザンハイブリダイゼーションまたは当分野において公知のサンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。キットには、例えば、ＰＣＲ、核酸シーケンシング等を含め、本明細書に記載される方法のいずれかを実施するための試薬および説明書が含まれ得る。あるいは、キットは、１つ以上の核酸配列を含む核酸基質アレイを含む。
【０１０５】
樹状細胞およびその使用
樹状細胞（ＤＣ）は、感染抵抗性および自己に対するモジュレート耐性を含みおよび／またはそれに寄与する多くの免疫応答に関与する。ＤＣは、Ｔ細胞の認識および／または応答性を制御する能力を有する。
【０１０６】
ＤＣは、種々の病原体、例えば微生物成分に応答して個別的な方法で成熟するに伴い、感染抵抗性を誘導することが知られており、従って種々の宿主免疫応答を惹起することができる（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＆  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ．「医学に樹状細胞を取り入れる（Ｔａｋｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４９：４１９−４２６（２００７）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６１７５を参照のこと）。本明細書に提供されるモジュレート剤を使用して、これらの免疫応答を破壊することができる。例えば、モジュレート剤は、表１〜表５Ａの１つ以上の遺伝子の発現、活性、および／または機能をモジュレートする。一部の実施形態では、これらのモジュレート剤はＤＣ成熟を遮断しまたは他の形で阻害する。一部の実施形態では、これらのモジュレート剤はＤＣの１つ以上の機能を変化させまたは他の形でそれに影響を与え、それにより、例えば防御性ＴＨ１表現型から非防御性ＴＨ２表現型に、Ｔ細胞応答をモジュレートする。
【０１０７】
ＤＣはまた、免疫発生を向上させることにより感染症を治療しおよび予防する種々のワクチン適応の設計および作成にも有用である。これらの適応では、ワクチンは１つ以上のモジュレート剤を含み得る。例えば、一部の実施形態では、ワクチンは、樹状細胞成熟を制御しまたは他の形でそれに影響を与えるモジュレート剤を送達する。一部の実施形態では、ワクチンは、１つ以上のＴ細胞応答、例えば防御性ＴＨ１表現型の誘導を変化させ、または他の形でそれに影響を与えるモジュレート剤を送達する。
【０１０８】
ＤＣはまた、Ｔ細胞免疫を調節するその能力により、癌に対する種々の治療ワクチンの設計および作成にも有用である（例えば、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ＆  Ｐａｌｕｃｋａ．「癌に対する治療ワクチンとしての樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ）」．Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５：２９６−３０６（２００５）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉｌ５９２を参照のこと）；また、Ｐａｌｕｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．「癌ワクチンの改良のための樹状細胞サブセットに基づく構築（Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」．Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２：２５８−６３（２０１０）；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｉ．２０１０．０２．０１０も参照のこと）。
【０１０９】
例えば、ＤＣは、ワクチンのアジュバントとして使用される。未熟ＤＣが耐性を誘導する一方、成熟ＤＣは免疫を誘導することが知られている。未熟ＤＣが主に抗原捕捉細胞として機能する一方、成熟ＤＣは主に抗原提示細胞として機能する。従って、モジュレート剤を使用してＤＣまたはＤＣの集団の成熟度をモジュレートし、例えばそれにより、所望の結果に基づき成熟ＤＣと未熟ＤＣとの間のバランスをシフトさせることができる。例えば、耐性が所望される場合には、モジュレート剤を使用して未熟ＤＣ表現型の方にシフトさせることができ、および免疫が所望される適応では、モジュレート剤を使用して成熟ＤＣ表現型の方にシフトさせることができる。一部の実施形態では、モジュレート剤を使用してＤＣまたはＤＣの集団の可塑性をモジュレートする。例えば、モジュレート剤を使用してＤＣまたはＤＣの集団をＤＣの特定のサブセットの方に、例えばランゲルハンス細胞、間質ＤＣおよび形質細胞様ＤＣの方またはそれから離れる方に；またはＤＣ分化の特定の経路の方に、例えば、骨髄経路の方またはそれから離れる方におよび／またはリンパ系経路の方またはそれから離れる方にシフトさせることができる。
【０１１０】
本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートするための組成物および方法を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「モジュレートする」は、１つ以上の遺伝子の発現の上方調節、または他の形でそれを増加させること、１つ以上の遺伝子の発現の下方調節、または他の形でそれを低下させること、１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／または機能を阻害しまたは他の形で低下させること、および／または１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／または機能を向上させまたは他の形で増加させることを含む。
【０１１１】
本明細書で使用されるとき、用語「樹状細胞の応答をモジュレートする」は、種々の樹状細胞機能および／または活性のいずれかのモジュレーション、例えば、非限定的な例として、樹状細胞成熟を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の免疫応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の抗ウイルス免疫応答、例えば、コア抗ウイルス応答および／または二次抗ウイルス応答を含む樹状細胞の抗ウイルス免疫応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の炎症性免疫応答、例えば誘導性炎症応答および／または急激化ピーク炎症応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；Ｔ細胞およびＢ細胞動員を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；１つまたは複数のＴＨ１細胞応答のＤＣによる促進を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；１つまたは複数のＴＨ２細胞応答のＤＣによる誘導を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；ＤＣの下流にある任意の細胞に対するＤＣの誘導、影響または他の効果を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７細胞、記憶Ｔ細胞および他のＴ細胞を含むＴ細胞のＤＣによる誘導を調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；ＤＣ表現型における、例えば成熟表現型と未熟表現型との間および／またはＤＣのサブセット間のシフトを調節するネットワークを制御しまたは他の形でそれに影響を与えること；樹状細胞の少なくとも１つの機能または生物学的活性を操作しまたは他の形でそれに影響を与えること；病原体の駆動によるＴ細胞極性化の樹状細胞制御を操作しまたは他の形でそれに影響を与えること；および／またはＤＣにより分泌されるサイトカイン、ケモカインおよび他の分子の産生を操作しまたは他の形でそれに影響を与えることを含む。
【０１１２】
本発明は、１つ以上の樹状細胞応答をモジュレートするモジュレート剤を提供する。好適なモジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。
【０１１３】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「コア抗ウイルス」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表１および表１Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「コア抗ウイルスモジュレート剤」と称される。
【０１１４】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤はキナーゼ、例えば非限定的な例として、ＭＡＰＫ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＴＢＫ１、ＰＬＫ４、ＩＫＢＫＥ、ＰＬＫ２、ＭＡＰ３Ｋ７、ＣＨＵＫ、ＪＡＫ１、ＣＲＫＬ、ＭＫＮＫ２、ＴＹＫ２、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＩＫＢＫＢ、ＭＫＮＫ１、ＮＥＫ７、ＰＩＫ３Ｒ２、ＩＫＢＫＧ、ＲＩＰＫ２、ＭＡＰ２Ｋ６、ＭＥＴ、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＭＡＲＫ２、ＤＧＫＡ、およびＢＵＢ１Ｂからなる群から選択されるキナーゼである。
【０１１５】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤は膜貫通受容体、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される膜貫通受容体である：ＩＦＮＡＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＩＬ２８ＲＡ、ＴＬＲ９、ＩＦＮＡＲ２、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ３、ＭＳＲ１、ＦＣＥＲ１Ｇ、およびＫＩＲ２ＤＳ４．
【０１１６】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤は哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、トレチノイン、または非哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される非哺乳類内因性化学的薬物である：サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５リポ多糖類、メゼレイン、３−デオキシ−２−オクツロソン酸（２）−リピドＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ５リポ多糖、およびバフィロマイシンＡ１。
【０１１７】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤は化学的薬物、例えば非限定的な例として、ＳＢ２０３５８０またはＨ−７などの化学的キナーゼ阻害薬物、または別の化学的薬物、例えば化学的試薬、毒物、または以下からなる群から選択される他の化学的薬物である：リポ多糖、ポリｒＩ：ｒＣ−ＲＮＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ４リポ多糖、スタリマイシン、ブロモデオキシウリジン、２−アミノプリン、リバビリン、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８、プリスタン、イミキモド、デシタビン、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型アボルツス・エキ（ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ）リポ多糖、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６、コンカナマイシンＡ、ポリｄＡ−ｄＴ、イオノマイシン、フコイダン、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２２１６、ＡＬ  １０８、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、没食子酸エピガロカテキン、クロロキン、３Ｍ−０１１、カルビマゾール、３Ｍ−００１、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ、ロシグリタゾン、およびリピドＡ。
【０１１８】
例えば、一部の実施形態では、コア抗ウイルスモジュレート剤は生物学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される生物学的薬物である：ペグイントロン（ｐｅｇｉｎｔｒｏｎ）、フォントリズマブおよびインターフェロンβ−１ａ。
【０１１９】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「二次抗ウイルス」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表２および表２Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「第２抗ウイルスモジュレート剤」と称される。
【０１２０】
例えば、一部の実施形態では、二次抗ウイルスモジュレート剤はキナーゼ、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択されるキナーゼである：ＭＡＰＫ９、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＣＲＫＬ、ＭＥＴ、ＴＢＫ１、ＭＡＰ３Ｋ７、およびＪＡＫ１。
【０１２１】
例えば、一部の実施形態では、二次抗ウイルスモジュレート剤は膜貫通受容体、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される膜貫通受容体である：ＴＬＲ４、ＴＬＲ３、およびＩＦＮＡＲ２。
【０１２２】
例えば、一部の実施形態では、二次抗ウイルスモジュレート剤は非哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５リポ多糖類である。
【０１２３】
例えば、一部の実施形態では、二次抗ウイルスモジュレート剤は化学的薬物、例えば非限定的な例として、ＬＦＭ−Ａ１３などの化学的キナーゼ阻害薬物、または別の化学的薬物、例えば化学的試薬、毒物または以下からなる群から選択される他の化学的薬物である：ポリｒＩ：ｒＣ−ＲＮＡ、リポ多糖、およびＲ−ＷＩＮ  ５５，２１２。
【０１２４】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「成熟」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表３および表３Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「成熟モジュレート剤」と称される。
【０１２５】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤はキナーゼ、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択されるキナーゼである：ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＰＲＫＣＤ、ＭＴＯＲ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＰＲＫＣＢ、ＬＹＮ、ＭＡＰＫ１４、ＤＤＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＲＫＣＡ、ＡＫＴ１、ＲＡＦ１、ＳＨＣ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＲＡＫ４、ＰＲＫＣＱ、ＳＰＨＫ１、ＭＡＰ４Ｋ１、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＧＳＫ３Ｂ、ＦＥＳ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＲＣ、ＣＨＵＫ、ＰＴＫ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＭＡＰＫ９、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＭＡＰＫ８、ＢＴＫ、ＥＧＦＲ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＤＰＫ１、ＰＲＫＧ１、ＦＬＴ３、ＴＹＫ２、ＣＤＫ９、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＣＤＫ１０、ＭＡＳＴ２、ＭＡＰＫ１１、ＦＧＦＲ３、ＰＩＭ１、ＡＣＶＲＬ１、ＦＧＦＲ２、ＭＡＲＫ２、ＰＢＫ、ＰＬＫ３、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＮＭＥ１、ＨＩＰＫ２、およびＥＲＢＢ２。
【０１２６】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤は膜貫通受容体、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される膜貫通受容体である：ＣＤ４０、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＦＡＳ、ＴＬＲ７、ＣＤ５、ＩＬ２７ＲＡ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＣＤ２８、ＩＣＡＭ１、ＬＴＢＲ、ＴＬＲ８、ＦＣＧＲ２Ａ、ＴＹＲＯＢＰ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＬＲ５、ＴＲＥＭ２、ＩＧＨＭ、ＣＤ２、ＴＮＦＲＳＦ８、ＩＬ６Ｒ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＨＲＮＡ１、ＩＴＧＢ３、ＡＧＥＲ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＬＲ６、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＲＡ＠（ＴＲＡ、Ｔ細胞受容体α遺伝子座としても知られる）、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＮＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＩＬ１ＲＬ２、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ８６、およびＭＳ４Ａ２。
【０１２７】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤は哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、プロスタグランジンＥ２、ヒアルロン酸、ＡＴＰ、トレチノイン、エタノール、過酸化水素、酪酸、アラキドン酸、尿酸、コンドロイチン硫酸Ａ、アデノシン、ヘパリン、Ｃａ２＋、ヒスタミン、Ｌ−メチオニン、一酸化炭素、サイクリックＡＭＰ、ラウリン酸、エピネフリン、１１，１２−エポキシエイコサトリエン酸、β−エストラジオール、リポキシンＡ４、Ｌ−グルタミン酸、ジヒドロテストステロン、プロゲステロン、キヌレン酸、メバロン酸、５，６−エポキシエイコサトリエン酸、Ｌ−オルニチン、マロン酸、エライジン酸、Ｎ（ω）−ヒドロキシアルギニン、ジメチルグリシン、１７−エピエストリオール、Ｄ−ガラクトサミン、ヒドロコルチゾン、葉酸、ヘミン、グルコサミン、血小板活性化因子、グリコシルホスファチジルイノシトール、パルミトレイン酸、およびグルタチオンからなる群から選択される哺乳類内因性化学的薬物である。
【０１２８】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤は非哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖、リポタイコ酸、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ５リポ多糖、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ザイモサンＡ、１５−デオキシ−デルタ−１２，１４−ＰＧＪ  ２、ペプチドグリカン、ウルソル酸、ガングリオシドＧＤ３、ザイモサン、ヘモゾイン、プロスタグランジンＡ１、メゼレイン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型０１２７Ｂ８リポ多糖、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５リポ多糖類、リシノール酸、ツニカマイシン、およびアピゲニンからなる群から選択される非哺乳類内因性化学的薬物である。
【０１２９】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤は化学的薬物、例えば非限定的な例として、化学的キナーゼ阻害薬物、例えば、ＳＢ２０３５８０、ワートマニン、ＰＤ９８０５９、ＳＰ６００１２５、Ｓｂ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＬＹ２９４００２、ＡＧ４９０、ＫＮ  ９３、ビスインドリルマレイミドＩ、Ｒｏ３１−８２２０、スタウロスポリン、Ｂａｙ  １１−７０８２、Ｈ８９、Ｇｏ  ６９７６、チルホスチンＡＧ  １４７８、ＰＤ  １６９３１６、ＰＰ１、８−ブロモグアノシン３’，５’−環状一リン酸、１−ｏ−ヘキサデシル−２−ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロール、ミリストイル化ＰＫＣゼータ偽基質ペプチド阻害薬、ＫＴ  ５９２６、および８−クロロフェニルチオ−アデノシン３’，５’−環状一リン酸である。
【０１３０】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤は化学的薬物、例えば非限定的な例として、別の化学的薬物、例えば化学的試薬、化学的毒物または以下からなる群から選択される他の化学的薬物である：リポ多糖、ｓｓＲＮＡ４０、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル、カフェ酸フェネチルエステル、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｗ７、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ４リポ多糖、ホルボールミリステートアセテート、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６、ポリｒＩ：ｒＣ−ＲＮＡ、ＡＴＰ−ガンマ−Ｓ、シンバスタチン、ＥＧＴＡ、ナイスタチン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、３Ｍ−００１、トラニラスト、タプシガルギン、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４、ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯエート、レシキモド、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型アボルツス・エキ（ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ）リポ多糖、３−メチルアデニン、ムラブチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、Ｒ５０２０、ロバスタチン、シロリムス、ブクラデシン、没食子酸エピガロカテキン、メルファラン、３Ｍ−０１１、イマチニブ、ｚＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ、アスピリン、ブレオマイシン、デキサメタゾン、サングリフェリンＡ、メトキサレン、ボルテゾミブ、カンプトテシン、モノホスホリルリピドＡ、３Ｍ−００２、パクリタキセル、ピロリジンジチオカルバメート、ニッケル、トリコスタチンＡ、ドコサヘキサエン酸、クルクミン、硫酸デキストラン、レスベラトロール、フォルスコリン、スラミン、プリスタン、７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン、Ｎｉ２＋、トロバフロキサシン、フェナントリジン、ブリオスタチン１、ＵＣＮ−０１、ビンブラスチン、エトポシド、シクロヘキシミド、オキサリプラチン、［Ｌｙｓ１５，Ａｒｇ１６，Ｌｅｕ２７］ＶＩＰ（１−７）ＧＲＦ（８−２７）、フルバスタチン、シグリタゾン、ニコチン、エイコサペンタエン酸、ロシグリタゾン、イオノマイシン、ペントキシフィリン、ニフルミン酸、［Ａｃ−Ｈｉｓ１，Ｄ−Ｐｈｅ２，Ｌｙｓ１５，Ａｒｇ１６，Ｌｅｕ２７］ＶＩＰ−（３−７）−ＧＲＦ−（８−２７）、ミフェプリストン、グリオトキシン、フラボピリドール、タネスピマイシン、ロテノン、ＧＣＳ−１００、ミダゾラム、１−α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、デシタビン、３，３’−ジインドリルメタン、Ａ２３１８７、エンチノスタット、ジドブジン、シチジリル−３’−５’−グアノシン、テトランドリン、バルプロ酸、シスプラチン、トレミフェン、キナクリン、ビタミンＥ、ボリノスタット、ＧＷ３９６５、イソブチルメチルキサンチン、フルベストラント、Ｓｎ５０ペプチド、プロピオン酸クロベタゾール、Ｄ６０９、ベンゼン、エポチロンＢ、スペルミン一酸化窒素複合体、メチルセレニン酸、デフェロキサミン、トログリタゾン、１’−アセトキシカビコールアセテート、パリカルシトール、ヒ素、イミキモド、ＧＬＰ−１−（７−３４）−アミド、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−システイン−ＧＤＰＫＨＰＫＳＦ、９−シス−レチノイン酸、カドミウム、スリンダク硫化物、ロットレリン、１３−シス−レチノイン酸、ニトロフラントイン、Ｎ−Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシナール、ダシノスタット、Ｒｏ４１−５２５３、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン、ラロキシフェン、セリバスタチン、パノビノスタット、フィセチン、トリニトロベンゼンスルホン酸、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２２１６、オクラトキシンＡ、アゾキシメタン、没食子酸エピカテキン、ホルボールエステル、ＭＡＬＰ−２ｓ、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン、ロリプラム、ラクタシスチン、活性酸素種、四塩化炭素、ホルボール１２，１３−ジデカノエート、ポリエチレングリコール、ジイソプロパノールニトロソアミン、Ｎ（１）−グアニル−１，７−ジアミノヘプタン、アルデスロイキン、４−ヒドロキシタモキシフェン、サリドマイド、ドキソルビシン、スルフォラファン、メチルニトロニトロソグアニジン、ＳＵ６６５６、ＣＧＳ  ２１６８０、ダウノルビシン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、リンシドミン、ファスジル、５−フルオロウラシル、ジエチルスチルベストロール、モルヒネ、マイトマイシンＣ、リバビリン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、オルトバナジウム酸ナトリウム、Ａｍ  ５８０、プレドニゾロン、クロロキン、ガラクトシルセラミド−α、ゲムシタビン、９，１０−ジメチル−１，２−ベンズアントラセン、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、メチルプレドニゾロン、インドメタシン、ＣＰ−５５９４０、ドセタキセル、メマンチン、アルブチン、モクセストロール、２，２，２−トリクロロエタノール、ダヌセルチブ、アナストロゾール、ペリホシン、ビスホスホネート、メフェナム酸、グルタチオンエチルエステル、ビンフルニン、ポリイノシン酸、スパルホス酸、レチノイド、ビンクリスチン、フェナセチン、リピドＡ、ジメチルニトロソアミン、ゲニステイン、２−デオキシグルコース、ピオグリタゾン、Ｏ６−ベンジルグアニン、硫酸ベリリウム、ベンゾ（ａ）ピレン７，８−ジヒドロジオール、メチルアムホテリシンＢ、リオシグアト、Ｏ−（クロロアセチルカルバモイル）フマギロール、デホスタチン、アトラセンタン、ティピファニブ、ボンクレキン酸、ナタマイシン、１０−デカルバモイルマイトマイシンＣ、フェノクソディオール、シアン化カリウム、３，４−メチレンジオキシアンフェタミン、（−）−没食子酸ガロカテキン、１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１７−α−エチニルエストラジオール、サリチル酸、３−デアザネプラノシン、およびドキシサイクリン。
【０１３１】
例えば、一部の実施形態では、成熟モジュレート剤は生物学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される生物学的薬物である：シクロスポリンＡ、ヘモシアニン、エタネルセプト、エンテロトキシンＢ、ロミデプシン、アダリムマブ、インターフェロンβ−１ｂ、アトシバン、およびデフィブロチド。
【０１３２】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「ピーク型炎症」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表４および表４Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「ピーク型炎症モジュレート剤」と称される。
【０１３３】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤はキナーゼ、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択されるキナーゼである：ＩＲＡＫ４、ＣＨＵＫ、ＩＫＢＫＧ、ＩＫＢＫＢ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＲＫ２、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＴＢＫ１、ＩＲＡＫ３、ＴＧＦＢＲ２、ＬＹＮ、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＭＡＰＫ８、ＫＩＴ、ＲＩＰＫ２、ＰＲＫＣＡ、ＣＤＫ９、ＳＰＨＫ１、ＰＲＫＣＤ、ＥＧＦＲ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＴＸＫ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＭＡＰＫ１０、ＩＲＡＫ２、ＩＫＢＫＥ、ＲＡＦ１、ＪＡＫ２、ＡＤＲＢＫ１、ＴＥＫ、ＭＡＰＫ９、ＭＥＴ、ＭＡＰＫ１４、ＩＴＫ、ＢＭＰＲ２、ＦＬＴ３、ＰＲＫＤ１、ＴＹＫ２、ＰＲＫＣＱ、ＭＥＲＴＫ、ＭＡＰＫ１、ＡＫＴ２、ＭＡＰＫＡＰＫ５、ＪＡＫ１、およびＰＩＫ３ＣＧ。
【０１３４】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は膜貫通受容体、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される膜貫通受容体である：ＴＬＲ４、ＩＬ２８ＲＡ、ＩＦＮＡＲ１、ＦＡＳ、ＴＬＲ７、ＣＤ１４、ＴＬＲ３、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＬＲ５、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ１、ＴＬＲ９、ＳＩＧＩＲＲ、ＭＳＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＩＬ２７ＲＡ、ＴＬＲ２、ＣＤ２８、ＰＬＡＵＲ、ＭＡＲＣＯ、ＵＮＣ５Ｂ、ＴＨＢＤ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ１０ＲＢ、ＣＤ８６、ＩＬ１Ｒ１、ＦＣＧＲ１Ａ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ６Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＡＲＲＥＳ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＥＰＯＲ、ＴＲＡ＠、ＩＬ１７ＲＡ、ＴＲＢ＠（ＴＲＢ、Ｔ細胞受容体β遺伝子座としても知られる）、およびＣＤ３００Ｃ。
【０１３５】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、ヒアルロン酸、β−エストラジオール、プロスタグランジンＥ２、尿酸、ニューロプロテクチンＤ１、血小板活性化因子、ステアリン酸、トレチノイン、パルミチン酸、プロゲステロン、Ｄ−スフィンゴシン、スペルミン、過酸化水素、ロイコトリエンＤ４、ヒドロコルチゾン、ラウリン酸、脂肪酸、１１，１２−エポキシエイコサトリエン酸、ケノデオキシコール酸、リノレン酸、ＡＴＰ、リトコール酸、脂質、アラキドン酸、アルデヒド、パルミチン酸メチル、Ｌ−シスチン、Ｌ−酒石酸、アルギニン、酪酸、Ｄ−グルコース、Ｌ−オルニチン、１，４−グルカン、タウロリトコール酸、グロボトリアオシルセラミド、セロチン酸、Ｄ−エリスロ−Ｃ１６−セラミド、ジメチルグリシン、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、Ｌ−トリヨードチロニン、メバロン酸、アルコール、βカロチン、およびＤ−ガラクトサミンからなる群から選択される哺乳類内因性化学的薬物である。
【０１３６】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は非哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される非哺乳類内因性化学的薬物である：サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５リポ多糖類、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ５リポ多糖、ザイモサン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型０１２７Ｂ８リポ多糖、リポタイコ酸、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖、ペプチドグリカン、メゼレイン、マンナン、カラギーナン、ユビキノン９、ブレフェルジンＡ、ポリアミン、マンノシル化リポアラビノマンナン、イソケルシトリン、シクロマルトデキストリン、シクロピアゾン酸、２−メルカプトアセテート、バフィロマイシンＡ１、ヘモゾイン、リポアラビノマンナン、ＭＡＬＰ−２Ｒ、マリアアザミ（Ｓｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ）抽出物、多糖、１５−デオキシ−デルタ−１２，１４−ＰＧＪ  ２、ホルボール１２，１３−ジブチラート、シリンギン、イソブチルアミン、およびグルクロノキシロマンナン。
【０１３７】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は化学的薬物、例えば非限定的な例として、ＳＰ６００１２５、Ｕ０１２６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２、ＰＤ９８０５９、ＰＰ１、ワートマニン、Ｂａｙ  １１−７０８２、Ｇｏ  ６９７６、ＰＳ−１１４５、ＪＡＫ阻害薬Ｉ、メルクＣ（ｍｅｒｃｋ  Ｃ）、ビスインドリルマレイミドＩ、およびチルホスチンＢ５６からなる群から選択される化学的キナーゼ阻害薬である。
【０１３８】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は別の化学的薬物、例えば化学的試薬、毒物または以下からなる群から選択される他の化学的薬物である：リポ多糖、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型アボルツス・エキ（ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ）リポ多糖、トロバフロキサシン、レシキモド、デキサメタゾン、シクロヘキシミド、トリニトロベンゼンスルホン酸、ＭＡＬＰ−２ｓ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ４リポ多糖、ポリｒＩ：ｒＣ−ＲＮＡ、カンプトテシン、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、シンバスタチン、パクリタキセル、ゲニステイン、ホルボールミリステートアセテート、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル、トリアムシノロンアセトニド、タプシガルギン、塩化ピクリル、１−α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、５−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、ピロリジンジチオカルバメート、セルレチド、硫酸マグネシウム、ＧＷ３９６５、酢酸コルチゾン、ラニチジン、ロフルミラスト、３−メチルアデニン、Ｎｉ２＋、硫酸デキストラン、グルココルチコイド、没食子酸エピガロカテキン、オゾン、ゲムフィブロジル、トリシリビン、ファモチジン、トラネキサム酸、グレパフロキサシン、アセトアミノフェン、ダイゼイン、ベパファント、ＩＤＮ−６５５６、ＺＦＡ−ｆｍｋ、ＢＱ  １２３、ペントキシフィリン、亜鉛、クロロキン、α−トコフェロール、トリアムシノロンヘキサセトニド、エダラボン、ラベプラゾール、オカダ酸、ＣＰ−５５９４０、イオノマイシン、カフェ酸フェネチルエステル、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、ポリミキシンＢ、パルミトイル−Ｃｙｓ（（ＲＳ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＨ、シチジリル−３’−５’−グアノシン、ＢＱ−７８８、メルファラン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、スタリマイシン、２５−ヒドロキシコレステロール、ブクラデシン、Ａ２３１８７、スニチニブ、ラクタシスチン、アクチノマイシンＤ、メチルプレドニゾロン、ドコサヘキサエン酸、ＳＲ  １４４５２８、ビタミンＥ、クラリスロマイシン、サルメテロール、メバスタチン、ブロモデオキシウリジン、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６、モノホスホリルリピドＡ、２，４−ジニトロフルオロベンゼン、ボリノスタット、ＴＯ−９０１３１７、エリスロマイシン、ミソプロストール、ＰＤ１８４３５２、ジエチルマレエート、塩化アンモニウム、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、ブレオマイシン、アレンドロン酸、パルテノライド、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン、ニフェジピン、ロシグリタゾン、デシプラミン、イロマスタット、ニコチン、１３−シス−レチノイン酸、トリコスタチンＡ、シス−ウロカニン酸、ロスバスタチン、ミコフェノール酸、シクロホスファミド、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、エイコサペンタエン酸、エストロゲン、オレオイル−エストロン、８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン、カルテオロール、Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ＮＳＣ  ２７００１２、ダルセトラピブ、ＭＫ２２０６、ＧＳＫ２１１８４��６、デキサメタゾン／トブラマイシン、デオキシスパガリン、ＲＰ  ４８７４０、ホスホマイシン、ＮＳＣ  ９５３９７、バシトラシン、チロフィバン、デキサナビノール、ロリプラム、クルクミン、ジクロフェナク、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、活性酸素種、ω−Ｎ−メチルアルギニン、タクロリムス、ピリニクス酸、バルプロ酸、チオアセトアミド、シスプラチン、プロピルチオウラシル、５−アザシチジン、ガラクトシルセラミド−α、ジホスホリルリピドＡ、ゲンタマイシンＣ１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、ＰＦ−２５１８０２、ＰＦ−４３０８５１５、ＧＴＳ  ２１、コンパウンド４８／８０、ベスナリノン、グリオキサール、２，４−ジニトロチオシアナトベンゼン、エナラプリラト、トレハロースジミコレート、ビス−ｐｏｍ−ｐｍｅａ、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、レスベラトロール、Ｓ−ニトロソグルタチオン、ロバスタチン、およびクロロプロマジン。
【０１３９】
例えば、一部の実施形態では、ピーク型炎症モジュレート剤は生物学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される生物学的薬物である：シクロスポリンＡ、エンテロトキシンＢ、リシノプリル、アブシキシマブ、およびエプチフィバチド。
【０１４０】
一部の実施形態では、モジュレート剤を使用して、「誘導性炎症」遺伝子シグネチャーの１つ以上の遺伝子、例えば、表５および表５Ａに列記されるものに含まれる１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートする。これらのモジュレート剤は、本明細書では「誘導性炎症モジュレート剤」と称される。
【０１４１】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤はキナーゼ、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択されるキナーゼである：ＣＨＵＫ、ＩＫＢＫＢ、ＴＢＫ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ１、ＬＹＮ、ＩＫＢＫＧ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＩＫＢＫＥ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＮＥＫ７、ＡＫＴ１、ＧＳＫ３Ｂ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＩＮＳＲ、ＬＲＲＫ２、ＰＲＫＣＢ、ＪＡＫ２、ＣＡＲＤ１１、ＭＥＴ、ＭＡＰＫ９、ＩＲＡＫ４、ＭＡＰＫ１４、ＥＧＦＲ、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＲＥＴ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＰＩＫ３Ｒ１、ＲＩＰＫ２、ＰＲＫＣＥ、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰ２Ｋ６、ＥＲＢＢ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＰＬＫ４、ＰＬＫ２、ＰＲＫＣＤ、ＳＰＨＫ１、ＭＡＰＫ１１、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＥＲＴＫ、ＳＹＫ、ＫＤＲ、ＭＡＲＫ２、ＪＡＫ１，およびＲＡＦ１。
【０１４２】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は膜貫通受容体、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される膜貫通受容体である：ＴＬＲ４、ＴＬＲ３、ＩＦＮＡＲ１、ＴＬＲ９、ＣＤ４０、ＩＬ２８ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＬＲ２、ＣＤ１４、ＭＲＣ１、ＣＤ２４４、ＮＣＲ１、ＫＬＲＣ４−ＫＬＲＫ１／ＫＬＲＫ１、ＦＡＳ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＩＬ１Ｒ１、ＬＥＰＲ、ＰＧＲＭＣ１、ＭＳＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、Ｋｌｒａ４（他を含む）、ＩＴＧＢ３、ＩＬ４Ｒ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＥＭ２、ＮＣＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＩＣＡＭ１、ＴＬＲ８、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＣＥＲ２、ＩＬ６Ｒ、ＡＧＥＲ、ＣＤ２８、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＴＧＢ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＴＹＲＯＢＰ、およびＧＦＲＡ１。
【０１４３】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される哺乳類内因性化学的薬物である：ＡＴＰ、プロスタグランジンＥ２、プロゲステロン、ヒアルロン酸、β−エストラジオール、スーパーオキシド、ラウリン酸、尿酸、パルミチン酸、過酸化水素、トレチノイン、ヒスタミン、ベンジルアミン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）、エタノール、オレイン酸、グルタチオン、一酸化炭素、コレステロール、スフィンゴシン−１−リン酸、アルギニン、Ｎ−アセチルグルコサミン、テストステロン、ホスファチジン酸、ナイアシンアミド、ＵＤＰ、一酸化窒素、ガングリオシドＧＤ１ａ、γ−リノレン酸、８−オキソ−７−ヒドロデオキシグアノシン（ｈｙｄｒｏｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、メラトニン、アルコール、Ｄ−ガラクトサミン、ガングリオシド、鉄、ロイコトリエンＤ４、ロイコトリエンＣ４、５’−メチルチオアデノシン、グリコケノデオキシコール酸、リノール酸、ニューロプロテクチンＤ１、ヒドロコルチゾン、塩化ナトリウム、ヘパリン、プロスタグランジンＥ１、４−フェニル酪酸、サイクリックＡＭＰ、脂肪酸、ケノデオキシコール酸、ＵＴＰ、コレカルシフェロール、リポキシンＡ４、トロンボキサンＡ２、アシル補酵素Ａ、ゲラニルゲラニルピロリン酸、アラキドン酸、ホルムアルデヒド、タウリン、プロスタグランジンＤ２、Ｌ−グルタミン酸、アナンダミド、２−メトキシエストラジオール、終末糖化産物、Ｄ−グルコース、セピアプテリン、バニリン酸、Ｄ−エリスロ−Ｃ１６−セラミド、シトルリン、メバロン酸、およびβカロチン。
【０１４４】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は非哺乳類内因性化学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される非哺乳類内因性化学的薬物である：ペプチドグリカン、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５リポ多糖類、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型０１２７Ｂ８リポ多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖、ザイモサン、リン脂質、バフィロマイシンＡ１、ルテオリン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ５リポ多糖、カラギーナン、ウルソル酸、アピゲニン、２−シクロヘキセン−１−オン、リポタイコ酸、ゲルダナマイシン、マンガン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、イソリキリチゲニン、シクロマルトデキストリン、ベンジルイソチオシアネート、ピセタノール、ナリンゲニン、ヘモゾイン、プロスタグランジンＡ１、ホオノキオール、プレグナ−４，１７−ジエン−３，１６−ジオン、リポアラビノマンナン、Ｄ−システイン、８−プレニルケンペロール、シナピン酸、（Ｓ）−ノルコクラウリン、フマギリン、１５−デオキシ−デルタ−１２，１４−ＰＧＪ  ２、胆汁酸、プロスタグランジンＪ２、イソロイシン、およびジンセノサイド  Ｒｇ１。
【０１４５】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は化学的薬物、例えば非限定的な例として、Ｂａｙ  １１−７０８２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２、ＪＡＫ阻害薬Ｉ、１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−カイロイノシトール２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカーボネート、チルホスチンＡＧ  １２９６、ワートマニン、Ｒｏ３１−８２２０、ＳＣ６８３７６、ＰＳ−１１４５、ＳＰ６００１２５、ＰＰ２／ＡＧ１８７９チロシンキナーゼ阻害薬、ＡＧ４９０、ＰＰ１、ビスインドリルマレイミドＩ、チルホスチンＡＧ  １２７、ハービマイシン、Ｇｏ  ６９７６、Ｓｂ２０２１９０、Ｈ８９、カルホスチンＣ、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ、Ｔｐｌ２キナーゼ阻害薬、ＣＧＰ７７６７５、Ｒｏ  ３１−７５４９、チルホスチンＡＧ  １２８８、８−ブロモグアノシン３’，５’−環状一リン酸、ＳＢ  ２２００２５、ＡＲ−１２、エルブスタチン、ＫＴ  ５９２６、チルホスチン４７、およびスタウロスポリンからなる群から選択される化学的キナーゼ阻害薬である。
【０１４６】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は別の化学的薬物、例えば非限定的な例として、化学的試薬、化学的毒物または以下からなる群から選択される他の化学的薬物である：リポ多糖、ポリｒＩ：ｒＣ−ＲＮＡ、レシキモド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ４リポ多糖、リピドＡ、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４、デキサメタゾン、ＣＥＰ−１３４７、ホルボールミリステートアセテート、ロシグリタゾン、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型アボルツス・エキ（ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ）リポ多糖、シグリタゾン、ＭＡＬＰ−２ｓ、トリニトロベンゼンスルホン酸、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８、ＣＧＳ  ２１６８０、メチル２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８−オエート、シクロヘキシミド、ピロリジンジチオカルバメート、ロナファーニブ、硫酸第一鉄、リゾホスファチジルコリン、Ｐａｍ３−Ｃｙｓ、ピコリン酸、タクロリムス、アスピリン、硫酸デキストラン、四塩化炭素、レスベラトロール、２−アミノプリン、クルクミン、ブレオマイシン、３−メチルアデニン、ＧＷ３９６５、カンプトテシン、メトトレキサート、ボルテゾミブ、セレコキシブ、トリブチリン、シガレットスモーク、アラキドニルトリフルオロメタン、シンバスタチン、チオアセトアミド、没食子酸エピガロカテキン、リポオリゴ糖、アムホテリシンＢ、トリアムシノロンアセトニド、ピオグリタゾン、ナイスタチン、３Ｍ−００２、パーオキシナイトライト、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）−システイン−ＧＤＰＫＨＰＫＳＦ、魚油、インドメタシン、サリチル酸、亜ヒ酸塩、ピリニクス酸、ケルセチン、パルテノライド、フェンレチニド、パクリタキセル、Ａ２３１８７、テモゾロミド、テトラクロロジベンゾジオキシン、アトルバスタチン、ドコサヘキサエン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ランソプラゾール、ルチン、リモナバン、セレン、イソプロテレノール、アクチノマイシンＤ、ＡＴＰ−ガンマ−Ｓ、ビンブラスチン、ブクラデシン、シンナムアルデヒド、テンポール、サリドマイド、トポテカン、ジエチルスチルベストロール、フルバスタチン、１３−シス−レチノイン酸、プロテアソーム阻害薬ＰＳＩ、鉄ニトリロ三酢酸、Ｎ−Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシナール、エトポシド、ミコフェノール酸、クロロキン、タンニン酸、ラベプラゾール、３Ｍ−０１１、フォルスコリン、オカダ酸、ドキソルビシン、ＳＢ  ２１６７６３、２’，３’−ジアルデヒドＡＴＰ、ＮＣＸ−４０４０、カプサゼピン、５−アミノサリチル酸、ヘキサメトキシフラボン、トシルリジンクロロメチルケトン、コルチコステロイド、３Ｍ−００１、サイトカラシンＤ、シスプラチン、クリプトタンシノン、メチレンブルー、Ｌ−Ｎ６−（１−イミノエチル）−リジン、ニトロプルシド、Ｎ−アセチルスフィンゴシン、ミフェプリストン、５−アザシチジン、テルミサルタン、エブセレン、プロスタグランジン、カプサイシン、ドキシサイクリン、ＳＲ  １４４５２８、ピペリン、プラバスタチン、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン、ピルビン酸エチル、クレンブテロール、オーラノフィン、タモキシフェン、ミノサイクリン、ＴＧＡＬコポリマー、カンナビジオール、Ｓｎ５０ペプチド、ベンゾ（ａ）ピレン、シリビニン、１’−アセトキシカビコールアセテート、ニメスリド、ロフェコキシブ、イソブチルメチルキサンチン、ジエチルマレエート、トラニラスト、ジピリダモール、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、フルベストラント、イミキモド、１７−α−エチニルエストラジオール、トリフルサル、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン、カプトプリル、フルチカゾン、フィセチン、ニコチン、ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕアルデヒド、シス−ウロカニン酸、フコイダン、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル、ゲニステイン、アゾキシメタン、没食子酸エピカテキン、イオノマイシン、トログリタゾン、ＮＳ−３９８、セリバスタチン、アロプリノール、８−クロロアデノシン、ＡＺＤ８０５５、クロルフェニラミン、ジエチルチオカルバメート、ＬＹ３１１７２７、ＢＮ  ５０７３０、１−（１−グリセロ）ドデカ−１，３，５，７，９−ペンタエン、ビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナデート、エチルバニリン、ベンズニダゾール、ＣＥ−２０７２、硫酸メタプロテレノール、ｎ−６ドコサペンタエン酸、ＡＧＮ１９４２０４、コリンフェノフィブラート、エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ロサルタンカリウム、バンコマイシン、ブリオスタチン１、ウレタン、エストロゲン、メチルプレドニゾロン、Ｕ７３１２２、メトホルミン、ベザフィブラート、ジクロフェナク、クロシドライト石綿、アセトバニロン、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、活性酸素種、ＳＵ６６５６、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８−オイック酸、セマキシニブ、ストレプトゾシン、緑茶ポリフェノール、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、５−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、ラクタシスチン、Ｎ−（３−（アミノメチル）ベンジル）アセトアミジン、ペントキシフィリン、タネスピマイシン、酢酸メドロキシプロゲステロン、スルフォラファン、プロプラノロール、α−トコフェロール、アルブチン、トランス−シンナムアルデヒド、ヘスペリジン、シタグリプチン、デスＡｒｇ（１０）−カリジン、クロニキシン酸リジン、バフィロマイシンＡ、大豆イソフラボン、ヒドロキシルラジカル、マリマスタット、ジロートン、ブメタニド、オキサゼパム、メタスタット、フェロジピン、γトコフェロール、ピリラミン、ミクロシスチン、エポキシエイコサトリエン酸、レミフェンタニル、ラミナラン、フルニソリド、イブプロフェン、９，１０−ジメチル−１，２−ベンズアントラセン、モルヒネ、ピマゲジン、ｚＶＡＤ−ＦＭＫ、およびＳ−ニトロソグルタチオン。
【０１４７】
例えば、一部の実施形態では、誘導性炎症モジュレート剤は生物学的薬物、例えば非限定的な例として、以下からなる群から選択される生物学的薬物である：シクロスポリンＡ、インフリキシマブ、インターフェロンβ−１ａ、ＮＦ−κＢデコイ、エンテロトキシンＢ、フォントリズマブ、アナキンラ、ヘモシアニン、グレープシード抽出物、およびエタネルセプト。
【０１４８】
モジュレート剤の使用
本発明による治療実体の投与を、改善された移動、送達、忍容性などを提供するために配合物中に取り込まれる好適な担体、賦形剤、および他の薬剤とともの施すことが認識される。複数の適切な配合物を、全ての製薬化学者に公知の処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ  ｅｄ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、その中のＢｌａｕｇ、ＳｅｙｍｏｕｒによるＣｈａｐｔｅｒ  ８７。これらの配合物としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオンまたはアニオン）含有ベシクル（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル剤、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。上記混合物のいずれも、本発明による治療および治療法において適切であり得るが、配合物中の活性成分が配合物により不活性化されず、配合物が投与経路について生理学的に適合性および忍容性であることを条件とする。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）および製薬化学者に周知の配合物、賦形剤および担体に関連する追加の情報についてのそれらの引用も参照。
【０１４９】
モジュレート剤を含む本発明の治療配合物は、免疫関連障害または異常免疫応答に伴う症状を治療または緩和するために使用される。本発明はまた、免疫関連障害、異常免疫応答、および／または腫瘍性疾患、例えば癌に伴う症状を治療または緩和する方法を提供する。治療レジメンは、免疫関連障害または異常免疫応答を罹患する（またはそれらを発症するリスクがある）対象、例えば、ヒト患者を、標準的方法を使用して同定することにより実施される。例えば、モジュレート剤は、自己免疫疾患および／または炎症障害の治療における有用な治療ツールである。ある実施形態において、モジュレート剤の使用は、例えば、ある病原体および他の感染性疾患に対して企図される。モジュレート剤は、例えば、移植片拒絶を予防し、遅延させ、もしくはそうでなければ軽減させ、および／または移植片の生存を延長させるための種々の移植指標における有用な治療ツールでもある。モジュレート剤はまた、異常な樹状細胞応答を呈する遺伝的欠陥を有する患者にも有用である。
【０１５０】
モジュレート剤は、自己免疫障害、炎症疾患、癌を含む増殖性障害などに対するワクチンにおいて、および／またはワクチンアジュバントとしても有用である。これらのタイプの障害の治療のためのアジュバントの組合せは、標的化される自己抗原、すなわち、自己免疫に関与する自己抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質；炎症自己抗原、例えば、アミロイドペプチドタンパク質、または移植抗原、例えば、アロ抗原からの広範な抗原との組合せにおける使用に好適である。抗原は、タンパク質に由来するペプチドまたはポリペプチド、ならびに以下のもの：糖、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植抗原、アレルゲン、または他の巨大分子要素のいずれかの断片を含み得る。一部の例において、２つ以上の抗原を抗原組成物中に含める。
【０１５１】
自己免疫疾患としては、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫要素によるウイルス疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症脱髄多発性神経障害（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても公知）、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１５２】
一部の実施形態において、モジュレート剤は、対象における炎症要素を有する自己免疫疾患、例えば、異常免疫応答の症状の治療、その進行の遅延、またはそうでなければその改善において有用である。一部の実施形態において、モジュレート剤は、異常Ｔｈ１７応答、例えば、異常樹状細胞に伴うことが公知の自己免疫疾患に有用である。
【０１５３】
炎症障害としては、例えば、慢性および急性炎症障害が挙げられる。炎症障害の例としては、アルツハイマー病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発性肺損傷が挙げられる。
【０１５４】
これらの免疫関連障害に伴う症状としては、例えば、炎症、発熱、全身倦怠感、発熱、疼痛（炎症部位に局在することが多い）、頻脈、関節疼痛または疼き（関節痛）、呼吸促迫または他の異常呼吸パターン、悪寒、錯乱、見当識障害、興奮、眩暈、咳嗽、呼吸困難、肺感染、心不全、呼吸器不全、浮腫、体重増加、粘液膿性の再発、悪液質、喘鳴、頭痛、および腹部症状、例えば、腹痛、下痢または便秘などが挙げられる。
【０１５５】
治療の有効性は、特定の免疫関連障害を診断または治療する任意の公知の方法に関連して決定する。免疫関連障害の１つ以上の症状の緩和は、モジュレート剤が臨床的利益を付与することを示す。
【０１５６】
免疫関連障害または異常免疫応答を罹患する患者へのモジュレート剤の投与は、種々の実験室または臨床的目的のいずれかが達成される場合、良好とみなされる。例えば、患者へのモジュレート剤の投与は、免疫関連障害または異常免疫応答に伴う症状の１つ以上が緩和、低減、阻害され、またはさらなる、すなわち、悪化状態に進行しない場合、良好とみなされる。患者へのモジュレート剤の投与は、免疫関連障害または異常免疫応答が寛解に入り、またはさらなる、すなわち、悪化状態に進行しない場合、良好とみなされる。
【０１５７】
モジュレート剤の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関連する。投与すべき要求量は、さらに、モジュレート剤のその特異的標的の特異性に依存し、投与されるモジュレート剤が、それが投与される他の対象から自由体積で枯渇される速度にも依存する。
【０１５８】
モジュレート剤は、医薬組成物の形態で、種々の疾患および障害の治療のために投与することができる。このような組成物の調製に関与する原理および考慮、ならびに要素の選択における指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９ｔｈ  ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供される。
【０１５９】
ポリペプチドベースのモジュレート剤を使用する場合、標的に特異的に結合し、治療機能を保持する最小断片が好ましい。このような断片は、化学合成し、および／または組換えＤＮＡ技術により産生することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）参照）。配合物は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものも含有し得る。あるいは、またはさらに、組成物は、その機能を向上させる薬剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤などを含み得る。このような分子は、好適には、意図される目的に有効な量の組合せで存在する。
【０１６０】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許文献は、それぞれのこのような刊行物または文献が参照により本明細書に組み込まれることを個別具体的に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、任意のものが関連する先行技術であるという自白としてでなく、その内容または日付に関するいかなる自白も構成もしないものとして意図される。本発明を目下詳細な説明として記載したが、当業者は、本発明を種々の実施形態において実施することができること、ならびに上記説明および以下の実施例が説明の目的のためであり、以下の特許請求の範囲を限定するものではないことを認識する。
【実施例】
【０１６１】
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例を、説明の目的のためにのみ提供し、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【０１６２】
実施例１：材料および方法
細胞培養、ソーティング、および溶解：６〜８週齢雌性Ｂ６マウス由来の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の培養物を、以前に記載のとおり（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））調製した。インビトロ培養９日目、細胞を以前に記載のとおり（前掲）リポ多糖（ＬＰＳ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で４時間刺激し、細胞を氷上の１５ｍＬコニカルチューブに移し、５μＭカルセインＡＭおよび５μＭエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、次に１％２−メルカプトエタノール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を補足した５μｌ  ＴＣＬ緩衝液を各々含む９６ウェルプレートの個々のウェルに単一のカルセイン陽性ＥｔｈＤ−１陰性細胞をソートした。遠心後、プレートを直ちに−８０℃で凍結した。インキュベーターから取り出して溶解するまでの間の総経過時間は１５分未満であった。ｃＤＮＡ合成直前に細胞を氷上で解凍し、それらを最終的な溶出なしに２．２×ＲＮＡＣｌｅａｎ  ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）で精製した。捕捉されたＲＮＡを有するビーズを風乾し、直ちにｃＤＮＡ合成用に処理した。細胞を含まないウェルもまた陰性対照として調製し、集団試料として１０，０００細胞の集合から全ＲＮＡを抽出した（下記参照）。
【０１６３】
ｃＤＮＡ合成および増幅：ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して増幅ｃＤＮＡを調製した。１μｌの１２μＭ  ３’ＳＭＡＲＴプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴ（３０）Ｎ−１Ｎ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ；Ｎ−１＝Ａ、Ｇ、またはＣ）、配列番号２７３）、１μｌのＨ２Ｏ、および２．５μｌの反応緩衝液をＲＮＡ捕捉ビーズに添加した。ピペッティングによりビーズを十分に混合した。混合物を７２℃で３分間加熱し、次に氷上に置いた。第１鎖ｃＤＮＡをこのＲＮＡプライマーミックスと、２μｌの５×第１鎖緩衝液、０．２５μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの１２μＭ  ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａオリゴ（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ（Ｘ＝有標のＳＭＡＲＴｅｒオリゴ配列中の非公表塩基）、配列番号２７４）、１００Ｕ  ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ  ＲＴ、および１０Ｕ  ＲＮアーゼ阻害薬を合計１０μｌで添加してかつ４２℃で９０分間、続いて７０℃で１０分間インキュベートすることにより合成した。２５μｌの室温ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を添加し、ピペッティングで十分に混合し、室温で８分間インキュベートすることにより、第１鎖ｃＤＮＡを精製した。良好な分離が確立した後、ビーズから上清を取り除いた。上記のステップは全て、ＰＣＲ産物フリーのクリーンルームで行った。ｃＤＮＡを、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ緩衝液、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの１２μＭ  ＩＳ  ＰＣＲプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ、配列番号２７５）、２μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス、および３９μｌ  Ｈ２Ｏを合計５０μｌで添加することにより増幅した。ＰＣＲは、９５℃で１分間、続いて９５℃で１５秒、６５℃で３０秒および６８℃で６分を２１サイクル、続いてさらに７２℃で１０分の最終伸長で実施した。増幅ｃＤＮＡを、９０μｌのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズを添加してかつ８０％エタノールで洗浄することにより精製した。分子カウントのため（Ｋｉｖｉｏｊａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「ユニークな分子識別子を使用して分子の絶対数をカウントする（Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，７２−７４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１７７８（２０１１）を参照のこと（図９および図１０にあるとおり）、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａオリゴを、４つのランダムな塩基を含むカスタムのＲＮＡオリゴヌクレオチドに置き換えた（バーコード付加ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａオリゴ：５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＮＮＮＮｒＧｒＧｒＧ−３’、配列番号２７６）。
【０１６４】
ｃＤＮＡせん断およびライブラリ構築：精製緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を増幅ｃＤＮＡに添加して総容積７６μｌを作成した。ｃＤＮＡを、１００μｌチューブにおいて１０％デューティサイクル、５％強度および２００サイクル／バーストで５分間、周波数掃引モード（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２機、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）でせん断した。せん断したｃＤＮＡを２．２容積のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズで精製した。
【０１６５】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用のインデックス付きペアエンドライブラリを、以下の変更を伴い記載のとおり調製した（Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．「鎖特異的ＲＮＡシーケンシング方法の包括的比較分析（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，７０９−７１５（２０１０）を参照のこと。第一に、各ライブラリに異なるインデックス付与アダプター（８塩基バーコードを含む）を使用した。第二に、ライゲーション産物を、２ラウンドの０．７容積のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズクリーンアップ（第１ラウンドは１００μｌの容積で出発した）を用いることによりサイズ選択した。第三に、ＰＣＲはＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼでＧＣ緩衝液および２Ｍベタインを伴い実施した。第四に、ユニバーサルインデックス付与プライマー（フォワードプライマー５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣ（配列番号２７７）、リバースプライマー５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号２７８））によるＰＣＲにおけるアニーリング温度として、５５℃を使用した。第五に、１２サイクルのＰＣＲを実施した。第六に、２ラウンドの１．０容積のＡＭＰｕｒｅビーズを使用してＰＣＲプライマーを取り除いた。
【０１６６】
集団対照および陰性対照：陽性（集団）対照については、ＰｒｅｐＥａｓｅ  ＲＮＡ  Ｓｐｉｎキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して１０，０００個の細胞からＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって測定するとき１３．８ｎｇの全ＲＮＡを単離した。上記のプロセスにおいて１ｎｇの全ＲＮＡを使用し、但しｃＤＮＡ増幅ステップには１２サイクルのみを用いた。陰性対照については、ＴＣＬ緩衝液が入ったウェルにおいてゼロ個のソート細胞で出発し、上記のプロセスを全て実行した。Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ構築の最終ＰＣＲにおける１８サイクルを用いた。
【０１６７】
リードタイミングおよびマッピング：逆転写中、ＳＭＡＲＴポリメラーゼにより、転写物の５’末端および３’末端に由来する断片について第２のリードの始端にそれぞれショートアダプター（ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａオリゴ）およびロングアダプター（ＳＭＡＲＴプライマーオリゴ）が付加される。リードをマッピングする前に、Ｂｔｒｉｍ６４を使用して、コマンドライン引数−ｌ  １  −ｅ  １００  −ｖ  １  −ｂ  ２８  −ａ  −１００でこれらのアダプター配列を取り除いた。第２のリードの約３分の１からアダプター配列がトリムされた。トリムしたリードを、Ｔｏｐｈａｔ  ｖ１．４．１（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．＆  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．「ＴｏｐＨａｔ：ＲＮＡ−Ｓｅｑによりスプライスジャンクションを発見する（ＴｏｐＨａｔ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１１０５−１１１１，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ１２０（２００９））をデフォルトパラメータで使用して、ｍｍ９バージョンのマウスゲノムにマッピングした。統合ゲノム・ビューワ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「統合ゲノミクス・ビューワ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｉｅｗｅｒ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，２４−２６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１７５４（２０１１））でゲノムマッピングを使用してデータを可視化し、以下に記載するとおり、一組のライブラリクオリティメトリクスを計算した。
【０１６８】
ショートアダプター（５’末端）をトリムしたリードを、トリムされていないリードに対してほぼ等しい比率でマッピングした。しかしながら、ロングアダプター（３’末端）をトリムしたリードペアは多くの場合にトリミング後であってもポリＡストレッチを含み、極端に低率（＜１％）でマッピングされた。これらのリードは転写物の３’末端に由来するはずであるため、この低いマッピング率により転写物の３’末端からのリードが欠乏する。この欠乏が、ＳＭＡＲＴプロトコル（下記参照）の副産物である３’カバレッジバイアスを相殺し得る（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））。
【０１６９】
ユニークｍＲＮＡ分子の定量化：４ヌクレオチドランダムバーコード配列を含むようにＳＭＡＲＴｅｒオリゴを改変した３つの単一細胞ライブラリを処理する場合、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａオリゴを含むリードを上記に記載したとおり単離し、トリムした。次に４つのさらなる塩基（バーコードに対応する）をトリムし、後に処理するため維持した。トリムしたリードを上記に記載したとおりマウスｍｍ９ゲノムにマッピングした。各遺伝子について、正しいストランド上のエクソン配列にマッピングされたこれらのリードのサブセットを次に同定し、それらの元の４ヌクレオチドバーコードを取り出した。各遺伝子についてユニークな数のバーコードをカウントし、単一細胞遺伝子発現の代替的な定量として使用した。３つの細胞全てについて、ユニークな分子バーコードカウントおよびＴＰＭ推定値の両方が提供された。
【０１７０】
ライブラリクオリティメトリクス：ゲノムマッピング率、各転写物のカバレッジの変動係数、各ライブラリ中のリボソームＲＮＡの割合、および位置カバレッジバイアスを含めたライブラリクオリティメトリクスを、ＰｉｃａｒｄＴｏｏｌｓバージョン１．４２（ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用して計算した。このデータには、先行の報告（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））と比べて少ない３’バイアスが観察され、これは上記に指摘したライブラリ構成の違いに起因した可能性が高い（図２２）。
【０１７１】
発現レベル計算：Ｂｏｗｔｉｅインデックス（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．＆  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．「ヒトゲノムに対する低分子ＤＮＡ配列の超高速かつメモリ効率の良いアラインメント（Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２００９−１０−３−ｒ２５（２００９））をＵＣＳＣ  ｋｎｏｗｎＧｅｎｅトランスクリプトーム（Ｆｕｊｉｔａ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「ＵＣＳＣゲノムブラウザデータベース：最新情報２０１１（Ｔｈｅ  ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１１）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ９６３（２０１０））に基づき作成し、ペアエンドリードを、Ｂｏｗｔｉｅ  ｖ  ０．１２．７を使用して、コマンドラインオプション−ｑ  −−ｐｈｒｅｄ３３−ｑｕａｌｓ  −ｎ  ２  −ｅ  ９９９９９９９９  −ｌ  ２５  −Ｉ  １  −Ｘ  １０００  −ａ  −ｍ  ２００でこのインデックスに直接アラインした。次に、ＲＳＥＭ  ｖ１．１１（Ｌｉ，Ｂ．＆  Ｄｅｗｅｙ，Ｃ．「ＲＳＥＭ：参照ゲノムを伴うまたは伴わないＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの正確な転写物定量化（ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−１２−３２３（２０１１））をこれらのアラインメントに対してデフォルトパラメータで実行し、発現レベルを推定した。各遺伝子について、ＲＳＥＭの遺伝子レベル発現推定値（τ）に１，０００，０００を乗じて転写物百万分率（ＴＰＭ）推定値を求めた。発現レベルを対数空間に変換するため、ｌｎ（ＴＰＭ＋１）を取った。「平均」単一細胞発現レベルを計算するときは、初めに１８個の単一細胞の各々からのＴＰＭレベルを平均し、次にこの平均推定値を対数空間に変換した。
【０１７２】
同じ手順を、ＢＭＤＣのＬＰＳ刺激後のＲＮＡ−Ｓｅｑ経時変化からなる既発表のデータセット（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））に適用した。このデータセットを使用して、刺激前と比較してＬＰＳ刺激後４時間目に集団で少なくとも２倍誘導された６３２個の遺伝子のセットを同定した。これらの遺伝子を図２ａ、図２ｄ、および図４ｂにおいて分析した。
【０１７３】
ＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）：２５個の異なるｍＲＮＡ転写物について、発現レベルをインサイチューでＲＮＡ−ＦＩＳＨプローブ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して測定した。簡潔に言えば、インビトロで８日目にＢＭＤＣをＣｄ１１ｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でソートし、ポリ−ｌ−リジンコートカバーガラスにプレーティングした。翌朝、一部の細胞を以前に記載のとおり（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））ＬＰＳで刺激した。固定の１０分前に細胞培養培地をＨＢＳＳ中１：５００希釈のＡｌｅｘａ−３５０コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。続いて、製造者の推奨に従い細胞を固定して染色した。一晩硬化させた後、Ｓｌｏｗｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をマウントしたカバーガラスを、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを備えた落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、ｘ、ｙ、およびｚに６０×倍率でラスター走査した（１．４２ＮＡ、油浸）。各試料につき平均１００個の個々の三次元スタックを撮った。全ての試料について４色イメージングを実施し、以下の情報を得た：励起（ｅｘ）４０５ｎｍ−ＷＧＡおよびＤＡＰＩ染色；ｅｘ  ４８８ｎｍ、ｅｘ  ５４６ｎｍ、ｅｘ  ６４７ｎｍ−それぞれプローブ１、２、および３。
【０１７４】
得られた画像を二段階で処理した。第一に、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ：細胞表現型の同定および定量化のための画像解析ソフトウェア（ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ：ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２００６−７−１０−ｒ１００（２００６））を使用して、ＵＶフィルタセット（ｅｘ４０５ｎｍ）を使用して撮った画像スタック毎の細胞数および位置を決定した。明るく染色された核領域（ＤＡＰＩ）を使用して個々の核を同定し、次に、ぼやけた膜輪郭（ＷＧＡ）から各細胞の延在範囲を決定するためのシードとして使用した。次にソフトウェアを使用してイメージング位置毎に個々の細胞の位置および延在範囲を抽出した。次に、各カラーチャンネルについて個々のｍＲＮＡを同定し、以前記載された解析パッケージを使用してＭａｔｌａｂでカウントした（Ｒａｊ，Ａ．，Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｇａａｒｄ，Ｐ．，Ｒｉｆｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．＆  Ｔｙａｇｉ，Ｓ．「複数の単一標識プローブを使用して個々のｍＲＮＡ分子をイメージングする（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｎｇｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，８７７−８７９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１２５３（２００８））。次にＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒの出力を用いて、同定されたｍＲＮＡを個々の細胞に割り当てた。最終的な分析およびプロットもまたＭａｔｌａｂを使用して実施した。表示されたＲＮＡ−ＦＩＳＨ画像を着色し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用してオーバーレイした。
【０１７５】
全てのＲＮＡ  ＦＩＳＨヒストグラムについて、Ｍａｔｌａｂでカウントをビニングし（ｎ＝５０）、５ビンのウィンドウで平滑化した。対照として、ＬＰＳで刺激しなかったＢＭＤＣもまた解析し、誘導された遺伝子のＲＮＡ−ＦＩＳＨプローブの特異性を確実にした（図２３）。
【０１７６】
スプライシング解析については、Ｉｒｆ７またはＡｃｐｐのいずれかに対してカスタムのＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を以下のとおり設計した：
【０１７７】
【表３０】
2016515383.tif 000032
【０１７８】
２つの構成的Ｉｒｆ７プローブの間のｂＤＮＡ数の差により、構成的プローブＢについてやや良好な結合、ひいてはより高いカウントがもたらされた。結果として、メトリック、プローブＡカウント／（プローブＡカウント＋プローブＢカウント）（図３ｃのヒストグラムにおいて使用される）は、通常、平均が約０．４５で（約０．５ではなく）分布する。構成的プローブＢに対してアイソフォーム特異的プローブをプロットすると、同様の曲線が得られた（図３ｃを図１５と比較）。細胞は、構成的プローブ（Ｉｒｆ７）についてカウントされたｍＲＮＡの数が少なくとも５であるか、または選択的エクソン（ａｌｔｅｒａｔｉｖｅ  ｅｘｏｎ）カウントの合計が少なくとも５であった場合に限り含めた。Ａｃｐｐはｎ＝６１５細胞；Ｉｒｆ７はｎ＝４９０。
【０１７９】
免疫蛍光（ＩＦ）測定：ＲＮＡ−ＦＩＳＨ染色の直後に、ＩＦ共染色を以前に記載のとおり実施した（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  ｖｉｒａｌ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１）；Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「初代免疫細胞におけるナノワイヤ媒介性遺伝子サイレンシング：慢性リンパ性白血病における患者特異的応答の同定（Ｎａｎｏｗｉｒｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）」．Ｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗ（２０１２））。全て１：２００で使用した、Ｓｔａｔ１、ｐＳｔａｔ１、およびＳｔａｔ２抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。平均および総蛍光レベル、ならびに核に局在する蛍光のパーセンテージを落射蛍光像から、上記のとおりの個々の細胞およびそれらの核の位置および延在範囲を用いて定量化した（図１７および図１８）。全てのタンパク質ヒストグラムについて、カウントはＭａｔｌａｂでビニングし（ｎ＝１００）、５ビンのウィンドウで平滑化した。単一平面および三次元スキャンによっても同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１８０】
単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を少し変更して用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲ用の単一ＢＭＤＣを調製した。すなわち、個々のＢＭＤＣを推奨される溶解緩衝液容積の４分の１となるように分取し、全ての後続のステップを対応してスケール調整した。特異的な標的増幅の後、０．５μＬエキソヌクレアーゼＩ、０．２５μＬエキソヌクレアーゼＩ反応緩衝液、および１．７５μＬ水を各試料に添加し、ボルテックスし、遠心し、および３７℃に３０分間加熱することにより、エキソヌクレアーゼＩ消化（ＮＥＢ）を実施した。１５分間の８０℃加熱不活性化の後、試料を緩衝液ＴＥ中１：５希釈した。９６×９６遺伝子発現チップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ）を使用して、単一細胞、陰性対照、および集団対照（抽出した全ＲＮＡを使用して等しく調製した）を分析した（Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト結腸腫瘍における転写不均質性の単一細胞分析（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，１１２０−１１２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２０３８（２０１１））。
【０１８１】
ファノ因子計算：ファノ因子（正規化標準偏差）を、単一細胞間での遺伝子発現値（対数空間）の標準偏差と平均単一細胞発現レベル（対数空間、上記を参照）との比として計算した。図２ａ、図２ｂの灰色の破線は、０．２５の一定のファノ因子を表し、以下の表Ｓ３に示すとおり、高発現遺伝子を変動遺伝子と非変動遺伝子との２つのグループに大まかに分ける。これらの２つの遺伝子セットの機能エンリッチメント解析（下記参照）は、使用したファノ因子閾値（０．２〜０．３）の小さい変化に対して極めてロバストであった。
【０１８２】
【表３１】
2016515383.tif 000033
【０１８３】
【表３２】
2016515383.tif 000034
【０１８４】
【表３３】
2016515383.tif 000035
【０１８５】
図２ａの青色破線は、その単一細胞平均を所与とした１８個の単一細胞の理論上の最大標準偏差を表す。この理論上の最大値は、細胞が（μ＋ｌｏｇ（２））／２の値に関して完全に二峰性に分布し、かつ関係：σｍａｘ＝ｓｑｒｔ（１８／１７）＊（μ＋ｌｏｇ（２））／２）によって表されるときに現れる。
【０１８６】
変動性／非変動遺伝子セットの機能エンリッチメント：ＤＡＶＩＤ  ｖ６．７を使用して非変動性高発現遺伝子セットの機能エンリッチメント（ＧＯアノテーション）を実施した（Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｔ．＆  Ｌｅｍｐｉｃｋｉ，Ｒ．Ａ．「バイオインフォマティクスエンリッチメントツール：大規模遺伝子リストの包括的機能解析への道（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｔｏｏｌｓ：ｐａｔｈｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｅ  ｌｉｓｔｓ）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７，１−１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ９２３（２００９）；Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｔ．＆  Ｌｅｍｐｉｃｋｉ，Ｒ．Ａ．「ＤＡＶＩＤバイオインフォマティクスリソースを使用した大規模遺伝子リストの系統的および統合的解析（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｅ  ｌｉｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＡＶＩＤ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４，４４−５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００８．２１１（２００９））。バックグラウンドセットとして５２２個の高発現遺伝子の完全なリストを使用した。図２ａおよび表Ｓ３について、２つのリストを組み合わせてハウスキーピング遺伝子のセットを形成した。第１のリストは、ＧＯアノテーションに定義されたリボソームサブユニットタンパク質のセットであり（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００９）、第２のリストは、Ｑｉａｇｅｎウェブサイトからダウンロードした一般的に用いられるマウスハウスキーピング遺伝子の表から取った。
【０１８７】
相関行列および主成分分析（ＰＣＡ）：６３２個の誘導性遺伝子のＰＣＡをＲでｐｒｃｏｍｐ関数を使用して実施した。各遺伝子の発現値を、単一細胞間でゼロ平均および単位分散を有するように変換し、集団における全体的存在量が様々である遺伝子間の変動性パターンを適切に比較した。
【０１８８】
対数目盛の（しかし変換していない）遺伝子発現推定値に基づき相関行列を計算し、その行列をｋ平均法を用いてクラスタリングした。「エルボ（ｅｌｂｏｗ）法」（Ｄｉｄａｙ，Ｅ．「分類およびデータ解析の新規手法（Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４））に基づく５つのクラスタのパラメータ（データは示さず）を選択し、しかし強くエンリッチされた抗ウイルスクラスタの同定（およびＰＣ２とのその高度の重複）は、パラメータ選択またはｋ平均法の確率性に対し極めてロバストであった。
【０１８９】
６３２個の遺伝子のセットにおいて、先行研究からの抗ウイルス遺伝子標的のセット（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９））をアノテートした。Ｓｔａｔ２標的を、同じように刺激した（４時間目の）ＢＭＤＣのセットに関する以前に定義された「プロモーターＣｈＩＰピーク」セットから（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））アノテートした。６３２個の誘導性遺伝子の完全なセットをバックグラウンドセットとして使用して、Ｒの超幾何検定を用いてクラスタ特異的エンリッチメント解析を実施した。
【０１９０】
集団蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析および定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：ＢＭＤＣをＬＰＳで４時間刺激した。ソートの１５分前、半成熟細胞（Ｓ）または成熟細胞（Ｍ）を定義したＢｉｏｌｅｇｅｎｄからの１１個の抗体の各々で細胞を染色した：Ｃｄ８３（Ｓ）、Ｃｄ２７３（Ｓ）、Ｃｃｒ７（Ｓ）、Ｃｄ４０（Ｓ）、Ｃｄ２０１（Ｓ）、Ｃｄ１３７（Ｓ）、Ｃｄ６８（Ｍ）、Ｃｄ１２０ｂ（Ｍ）、Ｃｄ５３（Ｍ）、Ｃｄ８８（Ｍ）、およびＣｄ１６／３２（Ｍ）。１％２−メルカプトエタノールを補足した１００μＬの緩衝液ＴＣＬ中において、試験表面マーカーの各々に関して陽性あるいは陰性の１，０００個の細胞の群を３群ソートした。次に、以前に記載のとおり、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２０個の試料の各々から全ＲＮＡを抽出し、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを調製した（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「生体分子を生細胞に送達するためのユニバーサルプラットフォームとしての垂直シリコンナノワイヤ（Ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｎａｎｏｗｉｒｅｓ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，１８７０−１８７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０９３５０１０７（２０１０））。次に、以前に記載のとおり、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用してＧＡＰＤＨに対する種々の転写物の集団全体の発現レベルを分析した（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「生体分子を生細胞に送達するためのユニバーサルプラットフォームとしての垂直シリコンナノワイヤ（Ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｎａｎｏｗｉｒｅｓ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，１８７０−１８７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０９３５０１０７（２０１０））（図１５）。ｑＲＴ−ＰＣＲのプライマーを以下の表Ｓ６に提供する。
【０１９１】
【表３４】
2016515383.tif 000036
【０１９２】
【表３５】
2016515383.tif 000037
【０１９３】
【表３６】
2016515383.tif 000038
【０１９４】
【表３７】
2016515383.tif 000039
【０１９５】
スプライシング解析：約６７，０００個の予めアノテーション済みの選択的にスプライシングされるイベント（スキップされたエクソン、相互排他的スプライスイベント）のセットをダウンロードした（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト組織トランスクリプトームにおける交互アイソフォーム調節（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５６，４７０−４７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７５０９（２００８））。ＭＩＳＯ（Ｋａｔｚ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｔ．，Ａｉｒｏｌｄｉ，Ｅ．Ｍ．＆  Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．Ｂ．「アイソフォーム調節を同定するためのＲＮＡシーケンシング実験の解析および設計（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，１００９−１０１５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１５２８（２０１０））をデフォルトパラメータで実行し、単一細胞および集団レプリケートの各々において全てのイベントについてスプライスイン率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｉｎ：ＰＳＩ）を推定した。大多数のイベントは、試料のいずれにおいてもＭＩＳＯによる解析に十分な深さで発現しなかった。残りの４，３３８個のイベントについては、１０，０００細胞レプリケートから得られたＰＳＩ推定値が厳密に相関したことが指摘された（平均ｒ＝０．９１）。３つの集団レプリケートのＰＳＩ値を平均し、残りの分析の焦点を３２２個の遺伝子における３５２個の「選択的にスプライスされる」イベントに置いた（２０％＜集団ＰＳＩ平均＜８０％）（２８個の遺伝子は少なくとも２個の選択的スプライシングイベントを有した）。
【０１９６】
次に、単一細胞間でのこれらの３５２個の選択的スプライシングイベントのＰＳＩ分布を調べた（図３ｂ）。高発現転写物からの高信頼のスプライシングイベントのみが調べられたことを確実にするため、選択的にスプライスされる遺伝子が当該の単一細胞の範囲内で高度に（単一細胞ＴＰＭ＞２５０）発現する単一細胞／スプライスイベント対のＰＳＩ推定値のみを考慮した。これにより、７９個の遺伝子から８９個のユニークな選択的スプライスイベントがもたらされた。このフィルタを適用した後、単一細胞にわたるＰＳＩ推定値のヒストグラム（図３ｂ、上）をプロットした。図３ｂ（下）は、図３ｂ（上）からの同じ８９個のスプライスイベントに関する第１の１０，０００細胞レプリケートからのＰＳＩ推定値のヒストグラムを示す。
【０１９７】
マウス：本明細書に提供されるハイスループットの実施例のため、６〜８週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｗｔ）、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ−／−×Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ−／−（Ｔｎｆｒ、Ｉｒｆ１−／−、Ｔｉｒａｐ−／−、Ｉｌ１ｒｎ−／−、Ｉｋｂｋｅ−／−、Ｃｘｃｒ２−／−、Ｅｇｒ１−／−、Ｆａｓ−／−、ＮＺＢＷＦ１／ＪおよびＩｆｎβ１−ｅＹＦＰレポーターマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手した。Ｓｔａｔ１−／−および１２９／Ｓｖ対照マウスはＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）から購入した。Ｉｒｆ７−／−骨髄（ＢＭ）はマサチューセッツ大学メディカル・スクール（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）のＫａｔｅ  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから供与された。Ｉｆｎｒ−／−ＢＭは、マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のＮｉｒ  Ｈａｃｏｈｅｎにより供与された。ＺＦＰ３６−／−（ＴＴＰ−／−）および対照ＢＭはＮＩＨ／ＮＩＥＨＳのＰｅｒｒｙ  Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒにより供与された。Ｉｆｎａｒ１−／−（Ｉｆｎｒ  ＫＯ）骨髄、Ｎｉｒ  Ｈａｃｏｈｅｎ（マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））；Ｉｌ２７−／−（Ｉｌ２７ｒ  ＫＯ）骨髄、Ｖｉｊａｙ  Ｋｕｃｈｒｏｏ（ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））による供与。
【０１９８】
動物は全て、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡにあるＭＩＴの従来の無菌施設で飼育および管理した（ＩＵＣＡＣプロトコル：０６０９−０５８０１５）。実験は全て、ＭＩＴ動物管理委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）により概説されるガイドラインに従い実施した。
【０１９９】
細胞培養、ソーティング、および溶解：本明細書に提供されるハイスループットの実施例のため、６〜８週齢雌性Ｂ６マウス由来の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の培養物を以前記載されたものを少し変更して調製した（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））。すなわち、単離した骨髄を１０％ＤＭＳＯを補足した純粋ウシ胎仔血清中５００万（Ｍ）細胞毎ｍＬで凍結した。ラン毎に単一のバイアルを解凍し、以前に記載のとおり（前掲）培養した。インビトロ培養９日目、細胞を抗Ｃｄ１１ｃ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識し、フローソーティングし、陽性細胞の上位１０％を残した。続いて細胞をスピンダウンし、１５ｍＬコニカルチューブにおいて、関連性のある刺激を補足した培地中２×１０５細胞毎ｍＬの濃度で再懸濁し、キャップを少し開いてインキュベーターに置いた。刺激薬−ＰＡＭ３ＣＳＫ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）［ＰＩＣ］（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、１００ｎｇ／ｍＬ）、およびインターフェロン−β（Ｉｆｎ−β）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０００単位／ｍＬ）−を、以前に記載のとおり（前掲）使用した。特定の時点の４５分前に細胞をスピンダウンし、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造者の推奨に従う）を補足した完全培地１ｍＬ当たり３×１０５Ｍ細胞の濃度で再懸濁し、７：３でＣ１懸濁液試薬（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）と混合し、Ｃ１マイクロ流体チップにロードした。ロード後、Ｃ１マイクロ流体チップの捕捉ポートの各々を細胞の存在について光学的に調べた。核の数をカウントすることにより、各チャンバに存在する細胞の数を決定した。平均単一細胞捕捉率はチップ当たり７２（平均）±１３（標準偏差）であった。２つ以上の細胞を含んだチャンバ数の平均は、８±７であった。まれな複数の捕捉イベントは本解析においてフィルタリングで自動的に（すなわち、コンピュータ解析によって）除去されなかったが、手動で調べることにより任意の特別な知見（例えば、「早熟細胞」）を確認し、細胞ダブレットまたは他の細胞捕捉上の考慮事項が関与しないことを確実にした。同様に、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０の添加が本明細書に提供されるシステムにおける遺伝子発現を変えないことが明確に確認された。
【０２００】
全トランスクリプトーム増幅：細胞単離後、細胞を溶解し、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑを行った（Ｒａｍｓｋｏｌｄ、２０１１を参照のこと）。全トランスクリプトーム増幅産物（ＷＴＡ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）用のＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡキットをｍＲＮＡ−Ｓｅｑプロトコルと併せて使用して調製し、以下の変更を伴いＣ１上で実行した：
【０２０１】
【表３８】
2016515383.tif 000040
【０２０２】
【表３９】
2016515383.tif 000041
【０２０３】
【表４０】
2016515383.tif 000042
【０２０４】
ライブラリ調製およびＲＮＡ−Ｓｅｑ：Ｃ１チップからＷＴＡ産物を回収し、ｃＤＮＡライブラリをＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、製造者の推奨を少し変更したものに従い調製した。すなわち、推奨容積の４分の１で反応を実行し、タグメンテーションステップを１０分に延長した。ＰＣＲステップ後、ライブラリの標準化なしに９６試料全てをプールし、０．９×ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で２回洗浄し、緩衝液ＴＥに溶出した。最後に、プールしたライブラリを、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  ＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量化し、高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して検査し、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実行した。最後に、ＨｉＳｅｑ  ２０００またはＨｉＳｅｑ  ２５００のいずれかを使用して試料をディープシーケンシングした。
【０２０５】
集団対照のＲＮＡ−Ｓｅｑ：ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨に従い使用して全ＲＮＡを抽出することにより、集団対照を作成した。続いて、水中１μＬのＲＮＡを２μＬの溶解反応混合物に添加し、サイクル条件Ｉ（上記のとおり）を用いて熱サイクル処理にかけた。次に、４μＬのＲＴ反応混合物を添加し、その混合物を、サイクル条件ＩＩ（上記のとおり）を用いて熱サイクル処理にかけた。最後に、１μＬの全ＲＴ反応物を９μＬのＰＣＲ混合物に添加し、当該の混合物を、サイクル条件ＩＩＩ（上記のとおり）を用いて熱サイクル処理にかけた。産物を定量化し、０．１２５ｎｇ／μＬに希釈し、ライブラリを調製し、洗浄し、上記のとおり試験した。
【０２０６】
ＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−Ｆｉｓｈ）：Ｉｆｉｔ１、Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｂ２ｍ、およびＩｆｎｂ１に対するＲＮＡ−ＦＩＳＨ（図２７）を、以前に記載のとおりＰａｎｏｍｉｃｓのプローブを使用して実施した（例えば、Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞トランスクリプトミクスが免疫細胞における発現およびスプライシングの二峰性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４９８，２３６−２４０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２１７２（２０１３）を参照のこと）。
【０２０７】
オンチップ細胞隔離およびシミュレーション：細胞間連絡を遮断するため、捕捉後、Ｃ１チップにおいて個々のＢＭＤＣを刺激した。初めに、細胞をロードする前、Ｃ１チップをＣ１ブロッキング試薬、次に完全培養培地で２時間予めブロックした。次に、非刺激ＢＭＤＣをロードし、次に適切な刺激を補足した完全培地で洗浄した。刺激を添加した完全培地の導入後、特異的アッセイ時点の３０分前まで（すなわち、４時間目の刺激時点に対して３．５時間）チップはＣ１システム内で３７℃に維持した。次に細胞をチップ上においてＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地で洗浄し、Ｃ１システムからチップを取り出し、イメージングし、４時間目に上記のとおり実行した。室温でのこの３０分の間隔（本発明者らの「インチューブ」試料をロードするタイミングに相当）を占めるのは、溶解前の細胞の洗浄（１５分）、イメージング（５分）、および試薬ローディング（１０分）である。最後に、細胞を上記のとおりロードし、次に上記のとおりＬＰＳ不含の完全培地を導入することにより、モック「オンチップ」実験を実施した。
【０２０８】
サイトカイン添加、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、およびシクロヘキシミド実験：組換えＩＬ−４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＩＬ−６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−１２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＩＬ−１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＩＬ−２７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−３５（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）を記載のとおり２００ｎｇ／ｍＬで添加した。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を様々な時点において１：１，０００希釈で添加した。最後に、シクロヘキシミドを刺激時点で、または標準的な４時間ＬＰＳ制御の間に、５００×エタノールストックから１００μｇ／ｍＬで添加した。
【０２０９】
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの処理：未加工のシーケンシングデータを以前に記載のとおり（Ｓｈａｌｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３）処理し、但しＮｅｘｔｅｒａライブラリ調製のため、ＳＭＡＲＴｅｒショートおよびロングアダプター配列をトリムする必要はなかった（例えば、Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２）を参照のこと。ショートシーケンシングリードをＵＣＳＣ  ｍｍ９トランスクリプトームにアラインした（例えば、Ｆｕｊｉｔａ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「ＵＣＳＣゲノムブラウザデータベース：最新情報２０１１（Ｔｈｅ  ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１１）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ９６３（２０１０）を参照のこと。これらのアラインメントを使用してトランスクリプトームアラインメント率を推定し、また、ＲＳＥＭ  ｖ  １．１２の入力としても使用することにより（Ｌｉ，Ｂ．＆  Ｄｅｗｅｙ，Ｃ．「ＲＳＥＭ：参照ゲノムを伴うまたは伴わないＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの正確な転写物定量化（ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−１２−３２３（２０１１））、全試料中の全てのＵＣＳＣ  ｍｍ９遺伝子の遺伝子発現レベル（転写物百万分率；ＴＰＭ）を定量化した。Ｔｏｐｈａｔ  ｖ．１．４１でゲノムマッピングを実施し（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．＆  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．「ＴｏｐＨａｔ：ＲＮＡ−Ｓｅｑによりスプライスジャンクションを発見する（ＴｏｐＨａｔ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１１０５−１１１１，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ１２０（２００９））、得られたアラインメントを使用してゲノムマッピング率、ｒＲＮＡコンタミネーション、および３’および５’位置バイアス（ＰｉｃａｒｄＴｏｏｌｓ）を計算した。全単一細胞の少なくとも１％において認め得るレベル（ｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞１）で発現しなかった全ての遺伝子を破棄し、全てのさらなる解析に１０，３１３個の遺伝子が残った。
【０２１０】
クラスタと主成分（ＰＣ）との間の統計的に有意な関連性を決定する：ＰＣにより定義されるとおりのデータ中の一次変動性源と有意に関連したのはどのモジュールかを決定するため、近年開発された統計学的リサンプリング手法（Ｃｈｕｎｇ，Ｎ．Ｃ．＆  Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．「系統的変動を駆動する変量の統計的有意性（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」．ａｒＸｉｖ，ｄｏｉ：ｕｕｉｄ／２２Ｂ６ＤＡ４１−Ｅ０２Ｄ−４２３Ｆ−８７ＢＣ−２１１０９１２３５Ａ５１（２０１３））を用いて最初の３つのＰＣに関連した遺伝子を決定した。簡潔に言えば、最初の３つのＰＣに対する各遺伝子の寄与を独立してゼロアウトし、かつ変更されたＰＣによって説明される分散の変化を調べることにより、各免疫応答遺伝子についてＦ統計量を計算した。次に、行列中の少数のランダム行（ｎ＝５）を並べ替え、これらの合成ゼロ変数についてＦ統計量を計算した。この手順を１，０００回繰り返し、ゼロ統計量のセットを作成した。各モジュールの統計的有意性を評価するため、片側マン−ホイットニー検定を実施した。
【０２１１】
遺伝子発現変動のパラメトリックモデルのフィッティング：各条件における各遺伝子について、一連の入れ子型統計モデルをその発現分布にフィッティングすることにより、ノミナルパラメータα、σ２、およびμを推定した（図２６ａ、図２６ｂ）。表示は全てＬＰＳ応答に焦点を置き、ここではほとんどのモジュールの遺伝子が誘導される。第一に、免疫応答遺伝子の単一細胞発現分布が、これまで文献で遺伝子発現の単一細胞分布を記述するために用いられているとおりの（例えば、Ｒａｊ，Ａ．，Ｐｅｓｋｉｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｔｒａｎｃｈｉｎａ，Ｄ．，Ｖａｒｇａｓ，Ｄ．Ｙ．＆  Ｔｙａｇｉ，Ｓ．ｉｎ  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．４  ｅ３０９（２００６）を参照のこと）、（μ、σ２）単峰性対数正規分布に適合するかどうかを調べた。各条件における各遺伝子について、全てのｌｏｇ（ＴＰＭ＋１）値の平均および分散を計算し、適合度検定を用いてこれらのパラメータを有する対数正規分布を試験した。主として本発明者らの単一細胞データにおけるゼロ値のインフレーションに起因して、２−パラメータモデルで良好に記述されたのは極めてごく少数（２．５％）の分布のみであった。
【０２１２】
次に、α、σ２、およびμの値を推定することにより、各単一細胞遺伝子発現分布をパラメータ化した。各分布は、所与の条件における所与の遺伝子について単一細胞にわたって観察された発現値に対応する。範囲０＜ｌｎ（ＴＰＭ＋１）＜１の発現レベルは、典型的にはエクソン配列にマッピングされた極めて少数のリードを反映したことが観察され、これらは少量のコンタミネーションを示すものと思われたため、発現閾値はｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞１に設定した。従ってレベル（ｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞１）で転写物発現が検出された細胞の割合としてα値を推定した。次に平均（μ）および分散（σ２）を、ｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞１の全ての発現値の対数空間で計算した。この３パラメータモデルのフィットを、さらなる適合度検定を用いて評価した。分布の大多数（９２％）が３パラメータ（μ、σ２、α）モデルで良好に記述されたことが分かった（ｐ＜０．０１、適合度検定）。
【０２１３】
実施例２．リポ多糖（ＬＰＳ）による骨髄由来樹状細胞（ＢＭＣＤ）の刺激
ゲノム規模での発現変動性の程度を特徴付け、その調節および機能上の意味を読み解くため、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用してＬＰＳ刺激に対するＢＭＤＣの応答の不均質性を調べた。ＢＭＤＣはいくつかの理由で単一細胞解析に魅力的なモデル系である。第一に、グラム陰性菌の成分でありかつＴｏｌｌ様受容体４のリガンドであるＬＰＳは、細胞応答を同期しかつ時間的位相のずれを軽減する生理学的に関連性のある一様な刺激である（Ｔａｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞ＮＦ−κＢダイナミクスがデジタル活性化およびアナログ情報処理を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＮＦ−κＢ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，２６７−２７１，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９１４５（２０１０））。第二に、ＬＰＳによる活性化によって、炎症性および抗ウイルス性サイトカインのロバストな転写プログラムが誘起され、かつこの応答を制御する成分の多くが「ポピュレーションワイド」の研究から知られている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．＆  Ａｋｉｒａ，Ｓ．「パターン認識受容体および炎症（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  １４０，８０５−８２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０１．０２２（２０１０））。第三に、ＬＰＳ刺激は、誘導性遺伝子についてのｍＲＮＡとタンパク質レベルとの間の同期を増加させるはずであり、単一細胞解析を潜在的に混乱させる因子を低減する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞における単一分子感度による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームおよびトランスクリプトームの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３３−５３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８３０８（２０１０）、Ｌｉ，Ｇ．−Ｗ．＆  Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．「生細胞における単一分子レベルでのセントラルドグマ（Ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｇｍａ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４７５，３０８−３１５（２０１１））。最後に、骨髄培養物由来の分化ＤＣは、有糸分裂後の、細胞周期の効果が大部分取り除かれたものである（Ｋａｌｉｓｋｙ，Ｔ．，Ｂｌａｉｎｅｙ，Ｐ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「単一細胞レベルでのゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｖｅｌ）」．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５，４３１−４４５，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｇｅｎｅｔ−１０２２０９−１６３６０７（２０１１）；Ｒａｍｏｓ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「単一造血幹細胞の転写プロファイルにおける多様性のエビ���ンス（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２，ｅ１５９，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００２０１５９．ｓｔ００８（２００６））。
【０２１４】
ＬＰＳでＢＭＤＣを刺激して４時間後に単一細胞を回収した（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））（実施例１）。ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑを使用して（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））、１８個の単一ＢＭＤＣ（Ｓ１〜Ｓ１８）、１０，０００個の細胞の３つのレプリケート集団、および２つの陰性対照（空のウェル）から得られるｃＤＮＡライブラリを構築した。これらのライブラリの各々を試料当たり２７００万リードペアの平均深さまでシーケンシングした。予想どおり、陰性対照ライブラリのリードは０．２５％未満がマウスゲノムとアラインし、これらの試料は、以降のあらゆる解析から除外した。ライブラリクオリティメトリクス（Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．「鎖特異的ＲＮＡシーケンシング方法の包括的比較分析（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，７０９−７１５（２０１０））、例えばゲノムに対するアラインメント率、リボソームＲＮＡコンタミネーション、および３’または５’カバレッジバイアスは、全ての単一細胞ライブラリおよび１０，０００細胞レプリケートにわたり同程度であった。各試料について、ＵＣＳＣがアノテートした全ての遺伝子の発現レベルを（Ｈｓｕ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「ＵＣＳＣ既知遺伝子（Ｔｈｅ  ＵＣＳＣ  Ｋｎｏｗｎ  Ｇｅｎｅｓ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，英国）２２，１０３６−１０４６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｌ０４８（２００６））ＲＳＥＭ（Ｌｉ，Ｂ．＆  Ｄｅｗｅｙ，Ｃ．Ｎ．「ＲＳＥＭ：参照ゲノムを伴うまたは伴わないＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの正確な転写物定量化（ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉ���ａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，３２３−３２３（２０１１））を使用して計算し（実施例１）、少なくとも３個の個々の細胞において認め得るレベル（転写物百万分率（ＴＰＭ）＞１）で発現しなかった遺伝子は全て破棄し、さらなる解析に６，３１３個の遺伝子が残った。
【０２１５】
集団レプリケートの遺伝子発現レベルは互いに厳密に相関したが（ピアソンｒ＞０．９８、対数目盛、図１ａ）、個々の細胞間では遺伝子発現プロファイルに実質的な変動があった（０．２９＜ｒ＜０．６２、平均値：０．４８、図１ｂ、図５）。この広範な細胞間変動にも関わらず、「平均」単一細胞の発現レベル（全１８個の単一細胞にわたり転写物発現レベルを平均することにより得られる）は集団試料と良好な相関を示した（０．７９＜ｒ＜０．８１）（図１ｃ、図５）。この観察から、単一細胞間で観察される有意な遺伝子発現の差が、実に併せて平均することで集団プロファイルを形成することが確認される。
【０２１６】
増幅が不要な単一分子イメージング技術であるＲＮＡ−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｙｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「膵臓循環腫瘍細胞のＲＮＡシーケンシングはＷＮＴシグナリングを転移と関係付ける（ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ＷＮＴ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，５１０−５１３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１２１７（２０１２）；Ｒａｊ，Ａ．，Ｒｉｆｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．＆  Ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．「遺伝子発現の変動性が不完全浸透の根底にある（Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，９１３−９１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８７８１（２０１０））を使用して、単一細胞発現の不均質性が、少量の細胞ＲＮＡの増幅に関連する技術的ノイズではなく、むしろ真の生物学的差異を反映していることを検証した。広範囲の発現レベルを網羅するように選択した２５個の遺伝子について、ＲＮＡ−ＦＩＳＨにより検出される遺伝子発現レベルの変動は、シーケンシングデータに観察される不均質性（図１ｄ〜図１ｈ、図６）を綿密に映し出した。例えば、古典的ハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン（Ａｃｔｂ）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２ｍ））の発現は、単一細胞ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＲＮＡ−ＦＩＳＨの両方の測定とも対数正規分布に一致し、これは先行研究と整合する（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｍ．「膵臓ランゲルハンス島由来の単一細胞における遺伝子発現プロファイリングはｍＲＮＡレベルの対数正規分布を明らかにする（Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｌｏｇｎｏｒｍａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５，１３８８−１３９２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１０１／ｇｒ．３８２０８０５（２００５））。対照的に、ＬＰＳに対するＢＭＤＣ応答に関与するが、しかしながら平均して高発現である多くの遺伝子が、対数正規分布にフィットしない有意に高いレベルの不均質性を呈した。極端な場合には、これらの遺伝子の発現レベルは個々の細胞間で最大約１，０００倍異なった（図１ｅ〜図１ｈ）。より一般的には、単一細胞遺伝子発現の高度な変動性は広範囲の集団発現レベルにわたり持続することが分かった（図２ａ）。
【０２１７】
詳細には、５２２個中２８１個の最も高発現の遺伝子（単一細胞平均ＴＰＭ＞２５０、表Ｓ３）は低い変動性を呈し、それらの発現レベルは単一細胞にわたり対数正規分布によって良好に記述された（ＲＮＡ−Ｓｅｑ：図２ｂ、図２ｃ上、ＲＮＡ−ＦＩＳＨ（Ａｃｔｂ、Ｂ２ｍ）：図６）。これらの２８１個の遺伝子は、リボソームタンパク質および他の構造タンパク質をコードするハウスキーピング遺伝子がエンリッチされている（ボンフェローニ補正後ｐ＝１．５×１０−６）。これは、酵母（Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｓ．＆  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．「システム生物学：１つから多くのこと（Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｍａｎｙ  ｔｈｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，５６１−５６２（２００６）；Ｂａｒ−Ｅｖｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「天然タンパク質存在量によるタンパク質発現規模におけるノイズ（Ｎｏｉｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｃａｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８，６３６−６４３（２００６））およびヒト（Ｒａｍ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト細胞におけるゲノムワイドな位置解析によって明らかになるクロマチン調節因子のコンビナトリアルパターニング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  Ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，１６２８−１６３９（２０１１））細胞における、高発現のハウスキーピングおよび「成長」遺伝子は細胞間の変動が小さいという先行研究の観察と整合する。
【０２１８】
しかしながら、意外にも、他の高発現遺伝子の多くは二峰性発現パターンを呈した（２４１個中１８５個の高度に変動的な遺伝子、図２ｂ、図２ｃ下）：これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは細胞の多くで高かったが、少なくとも３つの細胞において単一細胞平均より少なくとも一桁低く、多くの場合に存在量が極めて低いかまたは検出不能であった。この変動をＲＮＡ−ＦＩＳＨにより独立して検証し（例えば、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ１０、Ｉｆｉｔ１など：図６）、それが技術的ノイズの結果ではないことを確認した。この変動性セットは、ＬＰＳ刺激時に集団レベルで少なくとも２倍誘導された遺伝子が高度にエンリッチされ（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））（ｐ＝２．７×１０−７；超幾何検定）、抗ウイルスおよび炎症の両方の応答要素を含んだことから、高発現遺伝子間におけるかかる広範な変動性が免疫応答の特徴であり得ることが示唆される。二峰性発現パターンは多くの免疫応答転写物を特徴付けるが、一部の免疫応答遺伝子はあらゆる細胞で高発現であり（図７）、全ての細胞がＬＰＳにロバストに応答したことが実証された。これらには、主要なケモカインおよびケモカイン受容体（Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｒｌ２）、サイトカイン（Ｃｘｃｌ２）、およびＬＰＳ応答の他の重要な成分（Ｔａｎｋ）が含まれる。
【０２１９】
高発現転写物のこの変動度は先行研究では観察されていない（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「高度多重化ＲＮＡ−ｓｅｑによる単一細胞転写ランドスケープの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＮＡ−ｓｅｑ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１０１／ｇｒ．１１０８８２．１１０（２０１１）；Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞のトランスクリプトームランドスケープを捕捉するためのＲＮＡ−Ｓｅｑ解析（ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５，５１６−５３５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２３６（２０１０）；Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞のｍＲＮＡ−Ｓｅｑ全トランスクリプトーム解析（ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｗｈｏｌｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３７７−３８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１５（２００９）；Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２）；Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆  Ｙａｎａｉ，Ｉ．「ＣＥＬ−Ｓｅｑ：多重線形増幅による単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＣＥＬ−Ｓｅｑ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．００３）。例えば、８個のヒト胚性幹細胞の既発表のＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑデータセットにおいて（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））（図２ａ）、または高分化型マウス胚線維芽細胞およびマウス胚性幹細胞由来の単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータセットにおいて（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆  Ｙａｎａｉ，Ｉ．「ＣＥＬ−Ｓｅｑ：多重線形増幅による単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＣＥＬ−Ｓｅｑ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．００３）（図８）、高度に豊富な（集団平均）遺伝子の発現に極めて低い不均質性が認められた。加えて、（平均して）高発現の遺伝子におけるかかる二峰性は、対数期中期酵母細胞および分裂ヒト細胞系におけるタンパク質発現の変動に関するゲノム規模の研究では観察されなかった（Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｓ．＆  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．「システム生物学：１つから多くのこと（Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｍａｎｙ  ｔｈｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，５６１−５６２（２００６）；Ｂａｒ−Ｅｖｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「天然タンパク質存在量によるタンパク質発現規模におけるノイズ（Ｎｏｉｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｃａｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８，６３６−６４３（２００６）；Ｓｉｇａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト細胞におけるタンパク質レベルの変動性および記憶（Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，６４３−６４６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５３１６（２００６））。従って、観察された二峰性が、刺激されたＢＭＤＣ集団における機能的に重要な違いを反映したものであり得るという仮説を立てた。
【０２２０】
さらに、単一細胞間のスプライシングパターンもまた、これまで観察されたことのないレベルの不均質性を示す：集団レベルで複数のスプライスアイソフォームを有する遺伝子について、個々の細胞は主に、ある特定のアイソフォームを発現する。試料の各々における既にアノテート済みのスプライシングイベントの頻度（スプライスイン率、ＰＳＩ）を、アイソフォーム比を計算するためのベイジアンフレームワークであるＭＩＳＯを使用して計算した（Ｋａｔｚ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｔ．，Ａｉｒｏｌｄｉ，Ｅ．Ｍ．＆  Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．Ｂ．「アイソフォーム調節を同定するためのＲＮＡシーケンシング実験の解析および設計（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，１００９−１０１５（２０１０））。意外にも、集団から得られた推定量は高度な再現性を有したが、単一細胞はエクソンインクルージョン頻度の有意な変動性を呈した（図３ａ、図３ｂ）。
【０２２１】
ＰＣＲ増幅ステップ（ライブラリ調製プロセスに固有）が、特に低発現転写物に関して、「ジャックポット効果（ｊａｃｋｐｏｔ  ｅｆｆｅｃｔ）」（Ｓｈｉｒｏｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｊｉａ，Ｔ．Ｚ．，Ｓｉｍｓ，Ｐ．Ａ．＆  Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．「デジタルＲＮＡシーケンシングは配列依存性バイアスおよび増幅ノイズを最小限に抑え、単一分子バーコードを最適化する（Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉａｓ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｉｓｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂａｒｃｏｄｅｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０９，１３４７−１３５２（２０１２））に起因して潜在的にアイソフォーム調節変動性の過大評価をもたらす可能性を、慎重に検討した。しかしながら、単一細胞内で極めて高発現であった（単一細胞ＴＰＭ＞２５０）８９個の選択的にスプライスされたエクソン（０．２＜集団ＰＳＩ＜０．８）に解析を限定した場合であっても、個々の細胞間におけるスプライシングパターンの同じ二峰性がなおも観察され、スプライス変異体は、両方が同等レベルで同時に発現するというよりむしろ、いずれか一方が極めて非対称に発現したことが分かった（図３ｂ）。
【０２２２】
数個の分子の確率論的に過大な増幅がスプライシング解析を混乱させ得た可能性をさらに制御するため、３つのさらなる単一細胞ｃＤＮＡライブラリを、少し変更したＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑプロトコル（実施例１）を用いて逆転写中に各ＲＮＡ分子に４個のヌクレオチドバーコードを導入して作成した。このバーコードはＰＣＲ増幅およびライブラリ調製全体を通じて維持されたため、シーケンシングライブラリに表されるユニークなＲＮＡ転写物の数を定量化することが可能であった（図９および実施例１）。スプライシング解析を、少なくとも１５個のユニークなバーコードで表される遺伝子に限定する場合であっても、集団平均と比較して単一細胞ではアイソフォーム発現の強いバイアスが観察された（図１０）。
【０２２３】
現在まで、スプライシングパターンの単一細胞変動は単一遺伝子でさえほとんど研究されておらず、ゲノム規模で解析されたことは一度もない。ある最近の報告は（Ｗａｋｓ，Ｚ．，Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｍ．＆  Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．「選択的ＲＮＡスプライシングの細胞間変動性（Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，１−１２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１１．３２（２０１１））、ＲＮＡ−ＦＩＳＨを用いて２つの遺伝子の選択的アイソフォームにおける変動を調べ、単一細胞間でより低いレベルのアイソフォーム変動性を観察した（不均質性のレベルは細胞型によって異なった）。蛍光レポーターを使用して単一細胞エクソンインクルージョンレベルを定量化した別の研究では、一つの遺伝子に高度に変動的な二峰性のスプライシングパターンが観察された（Ｇｕｒｓｋａｙａ，Ｎ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．「２つの蛍光タンパク質を用いた単一細胞レベルにおけるカセットエクソンの選択的スプライシングの解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｘｏｎｓ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１３１４（２０１２））。
【０２２４】
細胞間におけるアイソフォーム比の広範な違いを独立して検証するため、２つの遺伝子（Ｉｒｆ７およびＡｃｐｐ、図３ｃ、図３ｄ）における構成的かつアイソフォーム特異的エクソンを標的化するＲＮＡ−ＦＩＳＨプローブ（Ｗａｋｓ，Ｚ．，Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｍ．＆  Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．「選択的ＲＮＡスプライシングの細胞間変動性（Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，１−１２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１１．３２（２０１１））を設計した。個々の細胞間に全体的Ｉｒｆ７レベルの実質的な発現変動性が認められ（「構成的」プローブに反映されるとおり、図３ｃ、下および上パネル）、単一細胞シーケンシング結果に酷似していた（および以下でさらに調査した）。加えて、各Ｉｒｆ７発現細胞内では、特定のエクソンのインクルージョンまたはエクスクルージョンのいずれかに向かうバイアス（図３ｃ、図１１、中央パネル、例えば、「高」および「低」と示された細胞を比較のこと）が観察された。Ａｃｐｐの相互排他的な選択的最終エクソンを検出するように設計された２つのプローブを使用して、同様の結果が観察された（図３ｄ）。従って、これらの研究は、スプライシングの不均質性が単一細胞間の共通の変動モードであり、多くの場合に集団研究で観察される選択的アイソフォームの「同時発現」によって隠されている現象であることを実証している。
【０２２５】
実施例３．観察される二峰性の原因および意味
本明細書に記載される研究は、観察される二峰性の原因および機能的意味を探索するように設計した。高度に（平均して）、しかし二峰性に発現する遺伝子間での免疫応答遺伝子のエンリッチメントは、シグナリング回路の活性化における（Ｔａｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞ＮＦ−κＢダイナミクスがデジタル活性化およびアナログ情報処理を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＮＦ−κＢ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，２６７−２７１，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９１４５（２０１０））、プロモーターイベントにおける（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｈ．Ｇ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．＆  Ｋｏｎｄｅｖ，Ｊ．「プロモーター構成が遺伝子発現の細胞間変動性に及ぼす効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−ｔｏ−Ｃｅｌｌ  Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ７，ｅ１００１１００−ｅ１００１１００（２０１１））、または応答タイミングにおける（Ｎａｃｈｍａｎ，Ｉ．，Ｒｅｇｅｖ，Ａ．＆  Ｒａｍａｎａｔｈａｎ，Ｓ．「酵母減数分裂のタイミング変動性を分析する（Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｉｍｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｍｅｉｏｓｉｓ）」．Ｃｅｌｌ  １３１，５４４−５５６（２００７））個別的な機能状態（例えば、細胞サブタイプ）または確率論的差異のいずれかを反映したものであり得る。初めに、少なくとも一部の変動はインビトロ分化ＢＭＤＣにおける個別的な細胞状態を反映したものであり得ると仮定した。詳細には、以前、ＢＭＤＣが、適応免疫系をプライミングするため抗原捕捉細胞から抗原提示細胞に切り換わる発生過程を通じて個別的な成熟状態を獲得し得ることが報告されている（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「樹状細胞の免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８，７６７−８１１（２０００））。成熟は、ＬＰＳなどの病原体由来のリガンドに応答して起こるか、あるいは培養下ＤＣのクラスタを破壊する結果として起こり（Ｊｉａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「Ｅ−カドヘリン媒介性接着の破壊は機能的に個別の樹状細胞成熟経路を誘導する（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，６１０−６２４，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０８．０１５（２００７））、いずれも特定の細胞表面マーカーの上方調節をもたらし得る。ＬＰＳに応答して起こるサイトカインの誘導は、ＢＭＤＣのさらに成熟した状態を表す。
【０２２６】
存在する場合、免疫応答遺伝子における転写変動のうちどの程度が個別的な成熟度状態に起因するのかを試験するため、ＬＰＳに対する集団全体の応答において少なくとも２倍誘導された６３２個の遺伝子に焦点を置き、単一細胞発現プロファイルに関して不偏主成分分析（ＰＣＡ、図４ａ）を実施した（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））。データセット内には、第１主成分（ＰＣ１、全変動の１５％、図４ａ）によって明らかに区別可能な少なくとも２つの個別的な細胞サブ集団が認められた。１５細胞の一方の群は抗ウイルス性および炎症性の両方のサイトカインのセット（Ｔｎｆ、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、およびＣｘｃｌ１０を含む）を極めて高いレベルで発現し（ＴＰＭ＞１，０００）、一方、３細胞の第２の群は、これらの遺伝子の各々を、検出可能ではあるがはるかに低いレベルで発現した（ＴＰＭ＜５０）。他のマーカー、例えばＣｃｒ７、Ｃｄ８３、セルピンｂ９、およびＣｃｌ２２は、逆の発現パターンを示した（図４ｂ、図１２）。これらの２つの群を区別する遺伝子の多くが、これまでにＢＭＤＣ成熟のマーカーとして同定されている細胞表面タンパク質（例えば、Ｃｄ８３、Ｃｄ８６、およびＣｃｒ７）をコードする。これらの観察は、１５細胞および３細胞の２つのサブ集団が個別のＤＣ成熟状態に相当することを示唆している：Ｃｄ８３、Ｃｄ８６およびＣｃｒ７が高発現でサイトカインが低発現の細胞は、「半成熟ＤＣ」またはクラスタが破壊されたＤＣに似ており（Ｊｉａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「Ｅ−カドヘリン媒介性接着の破壊は機能的に個別の樹状細胞成熟経路を誘導する（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，６１０−６２４，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０８．０１５（２００７）；Ｌｕｔｚ，Ｍ．Ｂ．「耐性誘導のための半成熟樹状細胞の治療可能性（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）」．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３，１２３，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１２．００１２３（２０１２））、一方、サイトカインが高発現の細胞は「成熟（ｍａｔｕｒｉｎｇ）または成熟（ｍａｔｕｒｅ）ＤＣ」に相当する。加えて、１５個中２個の成熟細胞���図１２）が、サイトカインおよび表面マーカーの両方をコードする転写物をより高いレベルで発現し、これらの細胞が最も成熟したＤＣであることが示唆される（図５）。
【０２２７】
単一細胞における半成熟および成熟ＢＭＤＣの存在を、いくつかの方法で検証した。第一に、同じ半成熟／成熟の分類をＲＮＡ−ＦＩＳＨで検証し（図１３）、また、種々の発現レベルおよび最初の２つの主成分の各々を網羅するように選択した９６個の遺伝子のシグネチャーを使用した単一細胞定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ：Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  ＨＤ）によっても検証した（図１１、表Ｓ６）（Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト結腸腫瘍における転写不均質性の単一細胞分析（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，１１２０−１１２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２０３８（２０１１））。第二に、Ｃｄ１１ｃ＋  ＢＭＤＣのサブセットを、単一細胞ＲＮＡ−ＳｅｑにおけるそのｍＲＮＡレベルが成熟群と半成熟群との間を判別する１１個の細胞表面マーカーの各々の存在または非存在に基づき選別した。次にｑＲＴ−ＰＣＲを、選別した集団の各対において使用して、同様にシーケンシングデータにおける２つの群、例えば、ＴｎｆとＣｘｃｌ１０（成熟サブ集団において高発現）およびＣｃｌ２２とセルピンｂ９（半成熟サブ集団において高発現）を判別する１０個のマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。実際、１１個中８個の細胞表面マーカーにより選別された集団のペアについて、マーカー発現レベルの予想された差異が検出され、シーケンシングベースの分類が確認された（図１５）。これらの結果は単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑの感度をさらに検証し、同じ細胞型内であっても、近縁の、しかし個別的な成熟度状態の間をそれが如何に効果的に区別し得るかを実証している。
【０２２８】
実施例４．同じ細胞状態の細胞間における調節回路の変動の役割
個別的な成熟度状態は、観察された不均質性および二峰性のごく一部のみを説明するため、「同じ」細胞状態（例えば、１５個の成熟細胞）の細胞間における調節回路の変動の役割を次に調べた。かかる変動性回路が存在する場合、転写因子のｍＲＮＡレベルとその標的の発現との間の単一細胞間にわたる共変動が潜在的な調節相互作用を表し、さらには、調節因子の発現の変動がその標的の変動性の根底にあることを示唆し得るとすることが妥当であった。かかる相関的手法は、種々の条件で測定した集団レベルの転写プロファイルから調節関係を同定することに成功している（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｎａｃｈｍａｎ，Ｉ．，Ｒｅｇｅｖ，Ａ．＆  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．２０  ｉ２４８（２００４））。ここで、同じ条件でそれを複数の単一細胞に適用するように研究を設計した。
【０２２９】
この目的上、全単一細胞にわたるあらゆる誘導性遺伝子対の間の発現プロファイルの相関を計算し、細胞間で相関がある形で変動する１３７個の遺伝子のクラスタを同定した（図４ｂ）。これらのクラスタの遺伝子では、抗ウイルス応答のメンバーが高度にエンリッチされ（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９））（１３７個中６０個の遺伝子、ｐ＝２．５×１０−３、超幾何検定）、抗ウイルス応答の２つの既知の主調節因子であるＳｔａｔ２およびＩｒｆ７をコードする転写物が含まれた。これらのクラスタではまた、ＬＰＳで刺激したＤＣにおいてＣｈＩＰ−Ｓｅｑによって以前決定されたとおり（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））、Ｓｔａｔ２標的もエンリッチされた（７３／１３７個の遺伝子、ｐ＝４．５×１０−５、超幾何検定）。この「抗ウイルスクラスタ」の遺伝子は、ＰＣＡの第２主成分（ＰＣ２、変動の８％、図４ａ、図４ｂ）によって強く判別された。これらの抗ウイルス遺伝子の間の相関を、単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記と同じ９６個の遺伝子シグネチャー）およびＲＮＡ−ＦＩＳＨ（図４ｃ、図４ｄ）の両方を用いて検証した。特に、ほとんど（１００／１３７個）のクラスタの遺伝子が、細胞にわたり二峰性発現を呈し（図２ｃ、下）、集団レベルで強力に発現した（１３個の遺伝子ＴＰＭ＞２５０；５３個の遺伝子ＴＰＭ＞５０）。
【０２３０】
抗ウイルス回路の変動が応答中にどのように変化し得るかをさらに特徴付けるため、非刺激ＢＭＤＣならびにＬＰＳ刺激後２時間目、４時間目、および６時間目における１３個の遺伝子（９個の抗ウイルスクラスタ遺伝子、２個の一様に誘導された遺伝子、および２個のハウスキーピング対照）のシグネチャーについて単一細胞ｑＰＣＲ発現プロファイリングを実施した（図１６）。抗ウイルスクラスタ遺伝子を発現する細胞のパーセンテージは時間依存的に増加し（図１６）、抗ウイルス主要調節因子に関して高いｍＲＮＡレベルを呈する細胞の割合の変化とよく似ていた。対照的に、一様に誘導された遺伝子（Ｃｘｃｌ１０、Ｃｌｅｃ４ｅ）は、２時間後に全ての細胞でロバストに誘導された。重要なことには、主調節因子をコードする転写物の発現レベルと下流標的遺伝子との間の定量的相関が、４時間および６時間の両時点に存在した。
【０２３１】
実施例５．Ｓｔａｔ２とＩｒｆ７とのレベルの差
この抗ウイルス応答回路の使用が同じ成熟度状態のＢＭＤＣの間で極めて変動的であることが観察されたため、クラスタの遺伝子の発現の二峰性変動がＳｔａｔ２とＩｒｆ７とのレベルの差に関係し得ると仮定された。この場合、ＢＭＤＣにおけるこれらの主調節因子を摂動させると、それらの標的の発現低下および変動がもたらされることが予想され得た。この仮説を検証するため、Ｉｒｆ７ノックアウト（Ｉｒｆ７−／−）マウス由来の、ＬＰＳで刺激した細胞において、単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてシグネチャー遺伝子の発現を測定した。予想どおり、この摂動により、変動性抗ウイルスクラスタのほとんどのシグネチャー遺伝子の転写が消失した一方、抗ウイルス応答の構成的エレメントは比較的影響を受けないままであった（図４ｅ）。しかしながら、Ｓｔａｔ２発現および変動性レベルはＩｒｆ７ノックアウトの影響を受けなかったことから、応答中にＳｔａｔ２がＩｒｆ７の上流で、あるいはそれと並行して作用し得ることが示唆される（Ｎｉｎｇ，Ｓ．，Ｈｕｙｅ，Ｌ．Ｅ．＆  Ｐａｇａｎｏ，Ｊ．Ｓ．「インターフェロンシグナリングと独立した経路によるＩＲＦ７プロモーターの転写活性の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＲＦ７  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ａ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８０，１２２６２−１２２７０（２００５）；Ｏｕｓｍａｎ，Ｓ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｌ．「ウイルス感染中の中枢神経系におけるインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）−７およびＩＲＦ−９遺伝子発現の示差的調節（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＲＦ）−７  ａｎｄ  ＩＲＦ−９  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９，７５１４−７５２７（２００５））。Ｓｔａｔ２およびＩｒｆ７は両方ともにインターフェロン−シグナリング経路の標的であるため、インターフェロンフィードバックがＳｔａｔ２、Ｉｒｆ７およびクラスタ遺伝子の発現および変動に及ぼす効果を次に調べた。実際、インターフェロン受容体ノックアウト（Ｉｆｎｒ−／−）マウス由来のＢＭＤＣ（Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．，Ｋｅｒｒ，Ｉ．Ｍ．＆  Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．「ＩＦＮおよび他の細胞外シグナリングタンパク質に応答したＪａｋ−ＳＴＡＴ経路および転写活性化（Ｊａｋ−ＳＴＡＴ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＦＮｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）２６４，１４１５−１４２１（１９９４）；Ｇｏｕｇｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「ＳＴＡＴ１の調節性発現を介したＩ型およびＩＩ型インターフェロンの間の機能的クロストーク（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＴ１）」．ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，ｅ１０００３６１−ｅ１０００３６１（２０１０））が刺激されたとき、Ｓｔａｔ２およびＩｒｆ７の両方、ならびに他の全てのクラスタ遺伝子について発現の大幅な低下が観察された（図４ｆ）。
【０２３２】
一つの可能性は、Ｓｔａｔ２レベルの初期変動が、Ｓｔａｔ２転写物それ自体を含めた（自己調節による（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２）））、４時間目の抗ウイルスクラスタにおける広範な変動の根底にあることである。例えば、免疫応答遺伝子の大多数（例えば、Ｉｆｉｔ１）が非刺激細胞では発現しなかったが、Ｓｔａｔ２転写物はＬＰＳ刺激前であっても変動的に発現する（図１６）。刺激前に高いレベルのＳｔａｔ２を有する細胞は、４時間の時間で抗ウイルスクラスタを発現する可能性が最も高いものであり得る。
【０２３３】
この関連付けをさらに調べるため、細胞をＩｆｉｔ１、Ｓｔａｔ１、およびＳｔａｔ２  ｍＲＮＡならびにＳｔａｔ１、ｐＳｔａｔ１、およびＳｔａｔ２タンパク質について共染色し（実施例１、図１７および図１８）、ＬＰＳで０、２、および４時間刺激した（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）ＢＭＤＣにおけるそれらのｍＲＮＡ／タンパク質レベルおよびタンパク質局在を定量化した。全体的なタンパク質レベルはいずれの場合にも時間経過全体を通じて増加したが、Ｓｔａｔ１、ｐＳｔａｔ１、およびＳｔａｔ２の誘導に実質的な不均質性が認められた（図１７）。２時間目、３つ全てのタンパク質が、それらの発現および核転座の両方に不均質性を示した。４時間までにはタンパク質レベルはより均質になり、核転座がそれほど顕著でなくなった。Ｉｆｉｔ１  ｍＲＮＡ分布は極めて類似したパターンを示し、初期の時点でより二峰性の発現を呈し、それが４時間までにより一様になった。しかしながら、個々の細胞内のＳｔａｔタンパク質およびＩｆｉｔ１  ｍＲＮＡレベルは初期には相関せず（０．００＜ｒ２＜０．１２）、４時間目に極めて弱い相関を示すのみであった（０．００＜ｒ２＜０．２８）。これは、標的のｍＲＮＡ蓄積が転写調節因子の一体となった時空間活性を反映し、これは単一の時間的スナップショットによっては十分に表されないことがあるという事実に起因し得る（Ｃａｉ，Ｌ．，Ｄａｌａｌ，Ｃ．Ｋ．＆  Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．「頻度をモジュレートした核移行バーストが遺伝子調節を協調させる（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｒｓｔｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，４８５−４９０，ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０７２９２  ［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７２９２（２００８））。従って、高いＩｆｉｔ１  ｍＲＮＡレベルを有する細胞では、Ｓｔａｔタンパク質は既に核を離れていることがあり得る。かかる仮説の検証には、タンパク質および複数の転写物を同時にリアルタイムでトラッキングすることが必要であり（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８））、これは、内因性蛍光タグを初代免疫細胞において（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「ナノワイヤ媒介性送達が初代免疫細胞の機能検査を可能にする：慢性リンパ性白血病の分析への応用（Ｎａｎｏｗｉｒｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）」．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２，６４９８−６５０４，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ｎｌ３０４２９１７（２０１２）���、および特にＳｔａｔタンパク質に対して（Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．，Ｂｅｇｉｔｔ，Ａ．＆  Ｖｉｎｋｅｍｅｉｅｒ，Ｕ．「緑色蛍光タンパク質タグ付加は、特に非リン酸化ＳＴＡＴ１の核細胞質間輸送を低下させる（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔａｇｇｉｎｇ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｏｆ  ｕｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＳＴＡＴ１）」．ＧＦＰ−ｔａｇｇｉｎｇ  ｏｆ  ＳＴＡＴ１  ２７４，８１５−８２６，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１１１／ｊ．１７４２−４６５８．２００６．０５６２６．ｘ（２００７））付加するという難題によって著しく複雑化する作業である。逆に、４時間目であっても、Ｉｆｉｔ１  ｍＲＮＡレベルはそれらのタンパク質レベルと比べてＳｔａｔ１およびＳｔａｔ２  ｍＲＮＡとより良好に相関した（図１８）。Ｓｔａｔタンパク質はそれ自体の遺伝子発現を自己調節するため（Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））、これは先の調節イベントの仮説と整合している。
【０２３４】
実施例６．ハイスループットマイクロ流体で可能となる単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ
複雑な真核生物における何兆個もの細胞は組織および臓器にカノニカルにグループ化され、さらに、分子、構造および機能を共有するタイプに細分される。しかしながら、近年、機能的に「同一」の細胞であっても、それらの成分分子は著しく異なり得ること（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞における単一分子感度による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームおよびトランスクリプトームの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３３−５３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８３０８（２０１０）；Ｔａｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞ＮＦ−κＢダイナミクスがデジタル活性化およびアナログ情報処理を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＮＦ−κＢ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，２６７−２７１，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９１４５（２０１０）；Ｒａｊ，Ａ．＆  Ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．「確率論的遺伝子発現のための単一分子手法（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３８，２５５−２７０，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｐｈｙｓ．３７．０３２８０７．１２５９２８（２００９）；Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．「細胞の不均質性：違いが違いを作り出すか？（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：Ｄｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？）」  Ｃｅｌｌ  １４１，５５９−５６３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０４．０３３（２０１０）；Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．，Ｂｒｙｄｅｒ，Ｄ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「デジタルＲＴ−ＰＣＲによる個々の造血前駆細胞の転写因子プロファイリング（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，１７８０７−１７８１２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０８５１２１０３（２００６）；Ｐ���ｓｚｅｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．「細胞の不均質性により生じる集団ロバスト性（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ  ａｒｉｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０７，１１６４４−１１６４９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９１３７９８１０７（２０１０）；Ｓｌａｃｋ，Ｍ．Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｅ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．「摂動に対する不均質な細胞応答を特徴付ける（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，１９３０６−１９３１１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０７０３８１０５（２００８）；Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「非遺伝的細胞間変動性および薬理学に及ぼす影響（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，５５６−５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０９．０１５（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤耐性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，６９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｋ．Ｅ．＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｓ．「癌細胞は抗有糸分裂薬への長期曝露後に大きい系統内および系統間変動を呈する（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １４，１１１−１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０７．００２（２００８）、およびこの不均質性が外部刺激に対する実質的に異なる応答をもたらし得ること（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「非遺伝的細胞間変動性および薬理学に及ぼす影響（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，５５６−５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０９．０１５（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤耐性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，６９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｋ．Ｅ．＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｓ．「癌細胞は抗有糸分裂薬への長期曝露後に大きい系統内および系統間変動を呈する（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １４，１１１−１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０７．００２（２００８）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９））が次第に明らかになりつつある。かかる変動性は治療介入の場合に不利益であると分かり得るが（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．「細胞の不均質性：違いが違いを作り出すか？（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：Ｄｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？）」  Ｃｅｌｌ  １４１，５５９−５６３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０４．０３３（２０１０）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ��Ｐ．Ｋ．「単一細胞におけるアポトーシスの測定およびモデル化（Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４４，９２６−９３９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０３．００２（２０１１））、潜在的な集団レベル応答の多様性を増加させることにより重要な機能的役割を果たしている可能性がある（Ｆｅｉｎｅｒｍａｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「エフェクター細胞および調節性Ｔ細胞によるＩＬ−２応答の単一細胞定量化が免疫応答における決定的な可塑性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，１−１６、ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１０．９０（２０１０）；Ｖｅｅｎｉｎｇ，Ｊ．−Ｗ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｗ．Ｋ．＆  Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｏ．Ｐ．「細菌における双安定性、エピジェネティクス、および両賭け戦略（Ｂｉｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ｂｅｔ−Ｈｅｄｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）」．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６２，１９３−２１０，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１４６／  ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉｃｒｏ．６２．０８１３０７．１６３００２（２００８）；Ｌｏｃｋｅ，Ｊ．Ｃ．＆  Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．「動画を使用した単一細胞における遺伝子回路ダイナミクスの分析（Ｕｓｉｎｇ  ｍｏｖｉｅｓ  ｔｏ  ａｎａｌｙｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７，３８３−３９２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２０５６（２００９）；Ｔｈａｔｔａｉ，Ｍ．＆  ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．「変動環境における確率論的
遺伝子発現（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ）」．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６７，５２３（２００４）；Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｇａｌｌｉｅ，Ｊ．，Ｋｏｓｔ，Ｃ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｇ．Ｃ．＆  Ｒａｉｎｅｙ，Ｐ．Ｂ．「両賭け戦略の実験的展開（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔ  ｈｅｄｇｉｎｇ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，９０−９３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８５０４（２００９）；Ｃｈａｌａｎｃｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．「遺伝子発現ノイズと調節ネットワーク構成との間の相互作用（Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｎｏｉｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）」．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ  ２８，２２１−２３２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｇ．２０１２．０１．００６（２０１２））。
【０２３５】
免疫系は、これの十分に確立された例である：免疫細胞はそのタイプおよび機能が不均質なことで有名であるが（Ｂｅｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｃ．＆  Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．「ヒト造血連続体にわたる示差的免疫および薬物応答の単一細胞マスサイトメトリー（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３２，６７７−６７８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０６３５１（２０１１）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．＆  Ｍｅｒａｄ，Ｍ．「インビボでの樹状細胞およびマクロファージの不均質性（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ）」．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５，３２３−３３５，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１１．０９．００７（２０１１））、免疫細胞は共同で病原体に対する適切な応答を生じなければならない。集団レベルの挙動をコードするために用いられる戦略、ならびにそれらの戦略がどのようなときに失敗し、および何を犠牲にするかを理解することは、実質的な臨床的関連を有する基礎的な生物学的問題である。最近の分子研究は、十分なサンプリングで、通常技術的および生物学的ノイズに隠されている情報提供機構が、単一細胞手法によって明らかになる可能性を実証している（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．「細胞の不均質性：違いが違いを作り出すか？（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：Ｄｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？）」  Ｃｅｌｌ  １４１，５５９−５６３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０４．０３３（２０１０）；Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「非遺伝的細胞間変動性および薬理学に及ぼす影響（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，５５６−５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０９．０１５（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤耐性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，��９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｇａｕｄｅｔ，Ｓ．，Ａｌｂｅｃｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスにおける細胞間変動性の非遺伝的起源（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＴＲＡＩＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４２８−４３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８０１２（２００９）；Ｆｅｉｎｅｒｍａｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「エフェクター細胞および調節性Ｔ細胞によるＩＬ−２応答の単一細胞定量化が免疫応答における決定的な可塑性を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，１−１６，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１０．９０（２０１０）；Ｂｅｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｃ．＆  Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．「ヒト造血連続体にわたる示差的免疫および薬物応答の単一細胞マスサイトメトリー（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３２，６７７−６７８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０６３５１（２０１１）））。それにも関わらず、これらの研究の大多数は、利用可能な試薬および既知の役割が十分に特徴付けられたマーカーに−必然的に−焦点を置いており、免疫応答の決定因子の偏りのない発見が妨げられている。
【０２３６】
単一細胞ゲノミクス方法の出現により、現在、単一細胞の挙動を前例のない詳細さでプロファイリングするシーケンシングベースの手法を用いる可能性が開かれている（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「高度多重化ＲＮＡ−ｓｅｑによる単一細胞転写ランドスケープの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＮＡ−ｓｅｑ）」．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１０１／ｇｒ．１１０８８２．１１０（２０１１）；Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞のトランスクリプトームランドスケープを捕捉するためのＲＮＡ−Ｓｅｑ解析（ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５，５１６−５３５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２３６（２０１０）；Ｔａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞のｍＲＮＡ−Ｓｅｑ全トランスクリプトーム解析（ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｗｈｏｌｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３７７−３８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１５（２００９）；Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２）；Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆  Ｙａｎａｉ，Ｉ．「ＣＥＬ−Ｓｅｑ：多重線形増幅による単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＣＥＬ−Ｓｅｑ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．００３）。原則的に、ゲノムワイドな単一細胞手法は、新規細胞分類スキーム、移行状態、認識されていない生物学的差異、分子回路などをアブイニシオに決定する助けとなり得る。この可能性を実現するには、単一細胞測定に固有の高レベルのノイズ（Ｃｈａｌａｎｃｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．「遺伝子発現ノイズと調節ネットワーク構成との間の相互作用（Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｎｏｉｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）」．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ  ２８，２２１−２３２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｇ．２０１２．０１．００６（２０１２）；Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４４１  ８４０−８４６（２００６）；Ｍｕｎｓｋｙ，Ｂ．，Ｎｅｕｅｒｔ，Ｇ．＆  ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．「遺伝子発現ノイズを用いた遺伝子調節の理解（Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｉｓｅ  ｔｏ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３６，１８３−１８７，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１６３７９（２０１２）；Ｂａｌａｚｓｉ，Ｇ．，Ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．＆  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．「細胞の意志決定および生物学的ノイズ：微生物から哺乳動物まで（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｉｓｅ：Ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４４，９１０−９２５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０１．０３０（２０１１））−入力材料が微量であることに起因する技術的ノイズ、およびＲＮＡ転写のバーストに起因する生物学的ノイズの両方（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞における単一分子感度による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームおよびトランスクリプトームの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３３−５３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８３０８（２０１０）；Ｃａｉ，Ｌ．，Ｄａｌａｌ，Ｃ．Ｋ．＆  Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．「頻度をモジュレートした核移行バーストが遺伝子調節を協調させる（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｒｓｔｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，４８５−４９０，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７２９２（２００８））に対処するために必要な規模を達成するための新規実験戦略の開発が求められる。
【０２３７】
集積マイクロ流体回路は、この障害を克服するためのエレガントな解決法を提供する。実際、細胞捕捉、イメージング、溶解、逆転写、および増幅（ＰＣＲ）を含め、マイクロ流体デバイス内での単一細胞全トランスクリプトーム（ＷＴＡ）増幅プロトコルに関わるステップの各々を実施するための方法論的先例が存在する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞における単一分子感度による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームおよびトランスクリプトームの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３３−５３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８３０８（２０１０）；Ｔａｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞ＮＦ−κＢダイナミクスがデジタル活性化およびアナログ情報処理を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＮＦ−κＢ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，２６７−２７１，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９１４５（２０１０）；Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｕｄｅｒ，Ｖ．，Ｈａｎｇ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「並列アーキテクチャのナノリットル規模の核酸プロセッサ（Ａ  ｎａｎｏｌｉｔｅｒ−ｓｃａｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ２２，４３５−４３９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９５１（２００４）；Ｈｕａｎｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞において低コピー数タンパク質をカウントする（Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｌｏｗ−Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３１５，８１−８４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１３３９９２（２００７）；Ｍａｒｃｕｓ，Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．「マイクロ流体単一細胞ｍＲＮＡ単離および分析（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，３０８４−３０８９（２００６）；Ｍｅｌｉｎ，Ｊ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「マイクロ流体大規模統合：生物学的オートメーションのための設計基準の進展（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）」．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３６，２１３−２３１，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｐｈｙｓ．３６．０４０３０６．１３２６４６（２００７）；Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ��「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９））。本研究では、市販のマイクロ流体システム（Ｃ１  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を単一細胞ＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ  ｍＲＮＡトランスクリプトームライブラリの調製に適合させた。このシステムは最大９６個の個々の細胞を単離し、各単離細胞に多段階分子生物学プロトコルを適用し、次にチップ担体上のＳＢＳフォーマットウェルに反応産物を出力する。各細胞から生じたＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２））二本鎖ｃＤＮＡは、次にＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリに変換される。
【０２３８】
数千個の骨髄樹状細胞の単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイリング：Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを、ハイスループットｃＤＮＡライブラリ構築プロトコルと組み合わせて利用することにより、合計２０００〜３０００個の単一骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）からＲＮＡ−Ｓｅｑ準備完了ライブラリを作成した（Ｔｏｒｉｅｌｌｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞遺伝子発現解析のための集積マイクロ流体バイオプロセッサ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，２０１７３（２００８）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１）；Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））。ＢＭＤＣは、初代であり、集団レベルで十分に特徴付けられており、有糸分裂後であり、かつ強力な病原性刺激を加えて同期させることができるため、単一細胞応答の研究に好ましいモデル系に相当する（ｏｒｉｅｌｌｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞遺伝子発現解析のための集積マイクロ流体バイオプロセッサ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，２０１７３（２００８））。１８個の「均質な」刺激を受けた単一ＢＭＤＣの間の応答変動性を調べる前出の実施例によっては、ノイズおよびその分子的決定因子の進展を調べることはできなかった。さらに、１つの刺激に焦点を置いたことにより、種々の刺激にわたる回路活性化および不均質性のプロファイリングおよび対比が妨げられた。
【０２３９】
本明細書に記載される研究は、これらの疑問に答えるように設計した。第一に、ＢＭＤＣ  Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナリングを３つの個別的な病原性刺激（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））−リポ多糖（ＬＰＳ；グラム陰性菌の成分およびＴＬＲ４作動薬）、ポリイノシン：ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＰＩＣ；ウイルス様二本鎖ＲＮＡおよびＴＬＲ３作動薬）、およびＰＡＭ３ＣＳＫ（ＰＡＭ；細菌リポペプチドの合成模倣薬およびＴＬＲ２作動薬）で活性化した後、ゲノムワイドなｍＲＮＡ発現応答を５つの時点（０、１、２、４、および６時間）でプロファイリングした。各条件について、最大９６個の細胞（平均８５個±１０％）を捕捉する単一Ｃ１  ＩＦＣのランを行い、１０，０００個の細胞からライブラリもまた作成した（集団対照）。全体で、３１１個、２１２個、および１４６個の細胞がそれぞれＬＰＳ、ＰＩＣ、およびＰＡＭに対して応答し、ならびに約４０００個のさらなる細胞（以下に記載する）をプロファイリングした。
【０２４０】
これらの試料の各々を１０００万リードペアの平均深さまでシーケンシングし、ＵＣＳＣがアノテートした全ての遺伝子について使用して発現推定量（転写物百万分率；ＴＰＭ）を計算した（Ｌｉ，Ｂ．＆  Ｄｅｗｅｙ，Ｃ．Ｎ．「ＲＳＥＭ：参照ゲノムを伴うまたは伴わないＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの正確な転写物定量化（ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，３２３−３２３（２０１１））。得られたライブラリは一貫して高いクオリティであり、既発表のＳＭＡＲＴデータと同等であった（Ｒａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞レベルのＲＮＡおよび個々の循環腫瘍細胞からの完全長ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２２８２（２０１２）；Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「ナノワイヤ媒介性送達が初代免疫細胞の機能的インテロゲーションを可能にする：慢性リンパ性白血病の分析への応用（Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）」．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１２（１２）：６４９８−５０４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ３０４２９１７（２０１２））。トランスクリプトームマッピング率中央値は約５０〜６０％であり、一方、ゲノムマッピング率中央値は約７０〜８０％であった。トリムできない混入アダプター配列に起因して有意な割合のリード（約１０％）がマッピングできなかったことから、ｃＤＮＡライブラリは、トランスクリプトームマッピング率によって見られるものと比べてさらに高いクオリティであることが示唆される。一方、３’バイアスレベルは、これまでに観察されているものより高かったが、Ｎｅｘｔｅｒａデータ（Ｉｌｌｕｍｉｎａウェブサイトで利用可能）からの既発表のものと極めて類似していた。
【０２４１】
発現の点では、単一細胞測定値は、凝集させ、同様のプロトコルを使用して作成した細胞集団からのデータと比較したとき厳密に一致した。インシリコ単一細胞平均ＲＮＡ−Ｓｅｑデータと集団測定値との間の相関は高かった（Ｒ＝約０．９、図２４ａ）。これは、同じバルク集団試料のレプリケートに関する２つの異なるライブラリ構築方法の間の比較について観察された相関の改善を表す（Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．「鎖特異的ＲＮＡシーケンシング方法の包括的比較分析（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７，７０９−７１５（２０１０））。この相関度は発現スペクトルにわたりロバストであった。相関は、他のインシリコ単一細胞平均に約３０細胞が含まれた後はプラトーに達する傾向があった。
【０２４２】
集団レベル試料内でこれらの３つの刺激に対するそれらの示差的経時的応答に基づき遺伝子をクラスタリングした（図２４ｂ）。集団ベースの測定値は、以前実行されたマイクロアレイベースの実験（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））と厳密に一致し、精緻化した（以下に記載する）。詳細には、分析では、ＮＦ−ｋＢの標的が高度にエンリッチされた、以前見出されたいくつかのクラスタ（炎症プログラム、クラスタＶＩ、ＶＩＩ）が、インターフェロン応答性遺伝子が高度にエンリッチされた個別的なクラスタ（クラスタＩ、ＩＩ）とともに再現された（図２４ｂ）。概して、抗ウイルス遺伝子は集団レベルおよび単一細胞レベルの両方で典型的には「後期誘導型」であった一方、ほとんどの炎症応答遺伝子は初期に（１〜２時間で）急ピークを生じた。それでもなお、後にピークを生じる後期誘導型炎症遺伝子（クラスタＶＩ）のセットがあった。
【０２４３】
実施例７．免疫応答中の細胞間の変動
単一細胞データからの細胞回路の精緻化：集団レベルの経路のこの広義の定義から、遺伝子を単一細胞におけるその発現値に基づきサブクラスタリングすることにより、より高い分解能の構造を調べた（黒色の線、図２４ｂ）。クラスタ分析と連携して、経時的データセットの約８００個全ての単一細胞に関して不偏主成分分析（ＰＣＡ）もまた実施した。
【０２４４】
高分解能データにより、集団レベルでは区別され得なかった精緻化した回路セットに遺伝子を割り当てることが可能になったことが見出された。例えば、全ての抗ウイルス遺伝子は、ＬＰＳおよびＰＩＣに曝露した後、遅い時点で集団レベルの誘導を呈したが、その全体的な誘導レベルに基づくのみならず、単一細胞のサブセット内におけるコヒーレントな発現からも区別された１０２個の遺伝子のクラスタ（クラスタ１Ｄ）が観察された（補図）。このモジュールの遺伝子は抗ウイルスおよびインターフェロン応答遺伝子の著しいエンリッチメントを呈するが、クラスタ１Ａ〜１Ｃの遺伝子は同様の機能パターンを呈しない。クラスタ１Ｄの遺伝子はまた、ＰＣＡ分析の第１主成分（ＰＣ１）に対するその寄与によっても強力に区別される。従って、クラスタ１Ｄは、ＢＭＤＣの「コア」抗ウイルス応答に相当すると称された。特に、コア抗ウイルス遺伝子と非コア抗ウイルス遺伝子との分離は、集団レベル測定からは容易に明らかなものではなく、先行のＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）またはマイクロアレイ（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））のいずれの実験においても観察されなかった。
【０２４５】
同様に、概して第２主成分（ＰＣ２）の高い射影スコアにより示される炎症プログラムを複数の個別的な回路に分け得ることが観察された。多くのカノニカルな炎症マーカー（すなわち、ＴＮＦ、ＩＬ１Ａ、ＣＸＣＬ２）は、ＬＰＳに対して「急ピーク型」の応答を呈する（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．＆  Ａｋｉｒａ，Ｓ．「パターン認識受容体および炎症（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  １４０，８０５−８２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０１．０２２（２０１０）、クラスタ３ｃ）−これらの遺伝子は初期に急激に誘導され、かつ応答における後の時点で下方調節される。対照的に、他のクラスタはＬＰＳとＰＡＭとの間で共有され（クラスタ３ｂ、３ｄ）、全時間経過を通じた誘導レベルの上昇を呈する。これらの２つのクラスタは集団レベル測定値と極めて類似しているように見えるが、クラスタ３ｂ遺伝子は第３主成分（ＰＣ３）の強力な射影スコアにより特徴付けられ、樹状細胞成熟のマーカー、詳細には細胞表面マーカー、受容体およびトランスポーター（ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＣＲ７）ならびにＴ細胞との適切な連絡およびＴ細胞の活性化に不可欠なサイトカイン（ＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２）が高度にエンリッチされる。これらの遺伝子はＬＰＳに応答して、しかし細胞の個別的なサブセットにおいてのみ高度に誘導される。
【０２４６】
精緻化された単一細胞回路により、免疫応答において中心的な役割を果たし得る新規分子調節因子の同定が可能となる。例えば、「成熟」クラスタ（ＰＣ３の高い射影スコアによって示される）は多くの周知のＢＭＤＣ成熟マーカーを含むが、このシグネチャーにおける残りの遺伝子は、既知の成熟度マーカーとのその強い単一細胞相関が適応免疫系の活性化におけるその役割を意味付ける転写因子、Ｇタンパク質共役受容体、ｌｉｎｃＲＮＡ、および膜貫通タンパク質のリッチリストを損なう。これらの遺伝子の多くはＢＭＤＣ成熟において、または免疫応答の調節においてさえも、特徴付けられた役割を有しない。
【０２４７】
他のもの、例えば転写因子ＩＲＦ８および膜貫通タンパク質ＴＭＥＭ３９Ａは、未知の分子機構を通じた自己免疫疾患と有意に関連付けられている。同様に、「コア」抗ウイルスモジュールの精緻化は、核ドット関連タンパク質（例えばＳｐ１００およびＳｐ１４０）、クロマチン調節因子（例えばＰｈｆ１１）、推定転写調節因子（例えばＺｎｆｘ１）およびユビキチンリガーゼ（例えばＤｔｘ３ｌ）を含め、これまで特徴付けられていない調節因子の潜在的な役割を浮かび上がらせる。
【０２４８】
経時的および発生的不均質性は連続スペクトルにより定義される：主成分分析は、複数の個別的なサブグループ化に分けるというよりむしろ、樹状細胞が細胞変動の連続的なランドスケープ上の個々の点を表すことを示す。例えば、第１主成分は単一細胞をそれらの刺激時点に基づき大まかに分けるが、所与のデータセットの範囲内にある細胞のＰＣ１負荷量の間には大きい幅がある（図２４ｄ）。
【０２４９】
これは応答の初期（１時間および２時間）に特に当てはまり、細胞が刺激４時間後にそれらのコア抗ウイルス応答を同期し始めるため、この初期は後の時点と明確に分けられる。しかしながら、抗ウイルス応答と対照的に、ＬＰＳ時間経過の中で単一細胞間の成熟度状態の多様性は着実に増加することが見られる。同定された回路はサブセット細胞においてのみ誘導されるが、高度に変動的なレベルの誘導が連続的な中間状態の範囲をもたらす（図２４ｆ）。これらの研究では、３つの刺激時間経過の各々に関して、またはさらには個々の時点の各々に関して別途ＰＣＡ分析を実施した後にも、明確に定義付けられた個別のサブ集団を同定することはできなかったことから、この系で観察される単一細胞ノイズの連続的な性質が強調される。これは恐らくは、実験系が、均質な、有糸分裂後の、および同期した免疫細胞集団として予め選択されていることの反映である。
【０２５０】
単一細胞データのパラメータ化：１８個の個々のＢＭＤＣトランスクリプトームに関する先の分析において、単一細胞間で個々の遺伝子発現レベルに広範な二峰性が観察され、ＲＮＡ−ＳｅｑまたはＲＮＡ−ＦＩＳＨのいずれによっても、あらゆる細胞でほとんどの転写物が検出されなかったことが観察された。しかしながら、現在の実験の規模は、単一条件から単一細胞データをモデル化およびパラメータ化し始めるのに十分な規模を提供する。従って、本研究はここで一連の入れ子型統計モデルを各単一細胞分布にフィットさせることを試み、初めにＬＰＳ応答遺伝子に取り組むことに集中した。低い割合（約５％）の転写物が単峰性対数正規分布によって良好に記述された一方（平均値μ、および標準偏差σによりパラメータ化した）、残りは、無視できないレベル（ｌｎ（ＴＰＭ）＞１）で転写物を発現する細胞の割合を定義する第３のパラメータ（α）を導入することが統計的に有利であった（尤度比検定、Ｐ＜０．０１）。単一細胞データを二峰性分布としてこのように明確にパラメータ化することにより、単一細胞の不均質性を２つの成分に分割することが可能となる：１つの変動性レベルは、転写物を発現する細胞の割合によって表され（本明細書において参照されるときαによりパラメータ化される、これはデジタルノイズである）、第２の層は、発現細胞間にわたるＲＮＡレベルの散布度を反映する（σによりパラメータ化され、これは本明細書ではアナログノイズと称される）。
【０２５１】
大多数（約８０〜９０％、適合度検定、ＳＭ）の単一細胞分布が、この３パラメータの、明確に二峰性の分布により良好に記述されたことから、この新規パラメータ化を広範に適用して単一細胞ノイズの変化を系統的に分析し得ることが示唆される。興味深いことに、１つのＬＰＳ時点で３パラメータ分布がフィットしなかった多数（７０〜８０％）の転写物は正規分布の混合モデルによって良好に記述され、また別の時点でも適合度検定に失敗したことから、これらの遺伝子に関する複数の調節された「バースト発生状態」の存在が示唆される。
【０２５２】
定量的クロマチンレベルは単一細胞ノイズパラメータと一致する：ｍＲＮＡレベルとクロマチン状態との間の強い相関は良好に記述されているが（例えば、Ｒａｍ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「ヒト細胞におけるゲノムワイドな位置解析によって明らかになるクロマチン調節因子のコンビナトリアルパターニング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  Ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，１６２８−１６３９（２０１１）；Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「ハイスループットクロマチン免疫沈降手法が哺乳動物における動的遺伝子調節の原理を明らかにする（Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４７，８１０−８２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２）を参照）、ここで単一細胞データにより、この関係を新しいレベルで再分析することが可能となる。多くの場合にＣｈＩＰ−ｓｅｑでアッセイされるヒストンマークの集団マップは幅広い定量範囲を呈する。クロマチンマークはＤＮＡ分子に存在しているか、または存在していないかのいずれかであるため、プロモーターにおける活性マークの定量的クロマチン測定が全体的な集団発現レベルよりむしろ、遺伝子のデジタルノイズレベル、すなわち転写物を発現する細胞の割合と相関するはずであるとすることは妥当であった。実際、ある遺伝子に関する単一細胞分布のαパラメータとその遺伝子のプロモーターに存在するＫ２７の集団レベルとの間には、集団発現レベルの制御後であっても強い関係が観察された。全く対照的に、転写物を発現する細胞の割合を制御した後の集団レベルｍＲＮＡ発現と定量的クロマチンレベルとの間には、関係は観察されなかった。これらの関係は、活性クロマチンマークＫ２７ａｃならびにＲＮＡ  ＰｏｌＩＩレベルについてロバストであったが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３についてはロバストでなく、Ｋ２７ａｃが活性転写とより緊密に相関するという先の観察と一致する。
【０２５３】
免疫応答回路の個別的な不均質性プロファイル：単一細胞分布のパラメータ化を適用して、実験条件にわたる免疫応答回路の単一細胞不均質性の変化を分析した。この研究は、典型的には集団研究から「後期誘導型」として分類されるコア抗ウイルスプログラムの構造を調べ（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９））、先行研究における応答のスナップショットの間の実質的な二峰性を同定することから開始した（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「ＴＬＲシグナリング成分の系統的発見がウイルス検知回路を描写する（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））。抗ウイルス応答において最も顕著な単一細胞パターンは、主要な抗ウイルス遺伝子が単一細胞間でその発現パターンを二峰性から単峰性にシフトさせたとおり、２時間〜４時間の間の時点に現れた。しかしながら、デジタルノイズにおけるこのシフトはアナログノイズの大幅な低下を伴う−この場合もまた、全てのパラメータにおいて最も劇的なシフトは２〜４時間の間に現れる（σシフト中央値＝０．６〜０．９、ｐ値＝３．５×１０＾−５）。従って、単一細胞は観察時間経過の中でそれらの抗ウイルス応答を緊密に同期し、これは後の時点におけるコア抗ウイルス遺伝子のロバストなかつ緊密に調節された発現によって示される。
【０２５４】
炎症プログラムに関与する遺伝子は、その抗ウイルス対応物と比較して、完全に逆の経時的不均質性プロファイルを示す傾向がある。詳細には、急ピーク型の応答（クラスタＩＩＩｃ）を呈する遺伝子（Ｉｌ１ａおよびＴＮＦ−αなどのカノニカルな抗炎症性サイトカインを含む）は、初期の時点で急激に誘導され、しかし応答において後に下方調節される。この時間的な位相のずれの正確な原因は分かっていないが、交差阻害性のフィードバックループおよびＲＮＡ分解因子がピーク型応答の発生に関与している可能性もある。顕著なことに、これらのバルク発現推定量のダイナミクスはほぼ全面的にデジタルノイズの変化に起因することが観察された。これらの転写物を発現する細胞の割合は全ての時間推移の間で有意な変化を呈したが、発現細胞の分布を表すパラメータは、刺激していない時点での応答の誘導全体を通して統計的に変化はなかった。
【０２５５】
炎症性遺伝子の個別的なクラスタ（クラスタＩＩＩｄ）は時間経過にわたり絶えず誘導され、コア抗ウイルスクラスタと同様のデジタルノイズのパターンを呈する−この場合もまた、最も顕著なシフトは２〜４時間の間に現れる。しかしながら、抗ウイルスの同期とは対照的に、この回路のアナログノイズに変化は観察されなかった。従って、後期誘導型抗ウイルス遺伝子および炎症遺伝子はＬＰＳにおける集団レベルで同様の時間的プロファイルを示すが、これらの２つの応答は４時間の時点で異なる不均質性プロファイルを呈し、前者は緊密に調節される回路に似ている一方、後者はノイズの多い誘導を呈する。まとめると、これらの分析は、機能的に個別のＬＰＳ応答モジュールの大きく異なる経時的不均質性パターンを強調し、かつ緊密に調節される回路およびノイズの多い回路の両方を区別する単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑの能力を例証している。
【０２５６】
刺激間の単一細胞ノイズの変化：ＰＩＣおよびＰＡＭはそれぞれ抗ウイルス経路および炎症経路の特異的な拮抗薬であるが、ＬＰＳはＢＭＤＣ集団において両方の防御プログラムを活性化する能力を有することが既に指摘されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．＆  Ａｋｉｒａ，Ｓ．「パターン認識受容体および炎症（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」．Ｃｅｌｌ  １４０，８０５−８２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０１．０２２（２０１０））。ＴＬＲ４シグナリングの非特異的な性質を所与とすれば、より直接的な刺激に対する応答において免疫応答回路が別様に挙動し得ると仮定された。
【０２５７】
例えば、ＰＩＣに対する曝露は抗ウイルスクラスタにおける単一細胞の不均質性を低下させ得ると仮定された。しかしながら、抗ウイルスの経時的不均質性パターンはＬＰＳと比較してＰＩＣ時間経過において僅かに遅延したことが観察された。詳細には、コア遺伝子は４〜６時間の時点間で二峰性発現から単峰性発現に移行し、抗ウイルス同期における遅延から、ＰＩＣが事実上より弱い刺激として働いたことが示された。これらの観察は以前の報告と一致する。
【０２５８】
しかしながら、炎症回路の経時的変動性パターンは、ＰＡＭに対する曝露後、大きく異なった。ＬＰＳ応答と同様、急ピーク型応答遺伝子は初期の時点で発現細胞の割合の急激な誘導を呈した。しかしながら、これらの遺伝子は、２時間の時点で「ピーク」でなく、「プラトー」となる傾向があり、後の時点で脱同期化しなかった（デジタルノイズまたはアナログノイズのいずれにも統計的に有意な変化なし）。同様に、炎症回路が、ＬＰＳ応答中の抗ウイルスコア回路と同様、後の時点でその応答を同期し始めたことが見出された（Ｔ＝２時間〜４時間の間にアナログノイズの有意な減少、ｐ値＝０．００１４）。個別の刺激に対する曝露後に変化するこれらの回路の経時的ノイズパターンは、単一細胞不均質性が純粋に制約のない転写の確率論的帰結であるわけではなく、代わりに、免疫応答中に調節される制御された現象であることを強く主張するものである。従って次の研究は、単一細胞変動性の駆動における細胞内および細胞間の両方の決定因子の役割をさらに調査した。
【０２５９】
実施例８．経時的ノイズの環境決定因子
内部要素の変動性レベルが応答表現型の違いを駆動し得る一方（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞における単一分子感度による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームおよびトランスクリプトームの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３３−５３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８３０８（２０１０）；Ｔａｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．「単一細胞ＮＦ−κＢダイナミクスがデジタル活性化およびアナログ情報処理を明らかにする（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＮＦ−κＢ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」．Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，２６７−２７１，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９１４５（２０１０）；Ｒａｊ，Ａ．＆  Ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．「確率論的遺伝子発現のための単一分子手法（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３８，２５５−２７０，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｐｈｙｓ．３７．０３２８０７．１２５９２８（２００９）；Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．「薬物に対する応答における個々の癌細胞の動的プロテオミクス（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｄｒｕｇ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１５１１−１５１６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０１６５（２００８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．「細胞の不均質性：違いが違いを作り出すか？（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：Ｄｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？）」  Ｃｅｌｌ  １４１，５５９−５６３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０４．０３３（２０１０）；Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．，Ｂｒｙｄｅｒ，Ｄ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「デジタルＲＴ−ＰＣＲによる個々の造血前駆細胞の転写因子プロファイリング（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，１７８０７−１７８１２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０８５１２１０３（２００６）；Ｐａｓｚｅｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．「細胞の不均質性により生じる集団ロバスト性（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ  ａｒｉｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ���ｔｙ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０７，１１６４４−１１６４９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９１３７９８１０７（２０１０）；Ｓｌａｃｋ，Ｍ．Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｅ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｌ．Ｆ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．「摂動に対する不均質な細胞応答を特徴付ける（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，１９３０６−１９３１１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０７０３８１０５（２００８）；Ｎｉｅｐｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｌ．＆  Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．「非遺伝的細胞間変動性および薬理学に及ぼす影響（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，５５６−５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．０９．０１５（２００９）；Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「癌細胞サブ集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬剤耐性状態（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」．Ｃｅｌｌ  １４１，６９−８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０２．０２７（２０１０）；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｋ．Ｅ．＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｓ．「癌細胞は抗有糸分裂薬への長期曝露後に大きい系統内および系統間変動を呈する（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｉｎｔｒａ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ）」．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １４，１１１−１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０７．００２（２００８））、細胞内微小環境の局所的な違いが不均質性の外部交絡要因をもたらし得る（Ｆａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．「マイクロリットル量の血液におけるタンパク質の迅速多重解析のための集積バーコードチップ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｃｈｉｐｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，１３７３−１３７８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１５０７（２００８）；Ｇｏｍｅｚ−Ｓｊｏｅｂｅｒｇ，Ｒ．，Ｌｅｙｒａｔ，Ａ．，Ｐｉｒｏｎｅ，Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．「多目的完全自動化マイクロ流体細胞培養システム（Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ，ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｅｌｌ  ��ｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９，８５５７−８５６３（２００７）；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．「発生における細胞の非遺伝的不均質性：単なるノイズではない（Ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｊｕｓｔ  ｎｏｉｓｅ）」．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６，３８５３−３８６２，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１２４２／ｄｅｖ．０３５１３９（２００９）；Ｋａｌｉｓｋｙ，Ｔ．，Ｂｌａｉｎｅｙ，Ｐ．＆  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．「単一細胞レベルでのゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｖｅｌ）」．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５，４３１−４４５，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｇｅｎｅｔ−１０２２０９−１６３６０７（２０１１）；Ｌｅｃａｕｌｔ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「マイクロ流体細胞培養アレイにおける単一造血幹細胞増殖のハイスループット解析（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｒｒａｙｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，５８１−５８６，ｄｏｉ：ｐａｐｅｒｓ２：／／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１６１４（２０１１）；Ｌｏｅｗｅｒ，Ａ．＆  Ｌａｈａｖ，Ｇ．「我々は皆個別的である：哺乳類細胞における非遺伝的不均質性の原因および帰結（Ｗｅ  ａｒｅ  ａｌｌ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ：ｃａｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆ａｍｐ；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２１，７５３−７５８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｄｅ．２０１１．０９．０１０（２０１１）；Ｍｉｌｌｅｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｗｅｅｄｌｅｒ，Ｊ．Ｖ．，Ｎｕｚｚｏ，Ｒ．Ｇ．＆  Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ｕ．「初代哺乳類ニューロンを低密度で培養するためのマイクロ流体デバイス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｔ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）」．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ７，９８７，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ７０５２６６ａ（２００７）；Ｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．「真核生物遺伝子発現における確率性の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３０４，１８１１−１８１４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０９８６４１（２００４））。各ＢＭＤＣの応答は、サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡの発現が優勢で、次にはそれらがさらなる細胞内シグナリング経路を活性化し得��。従って、不均質な細胞間シグナリングは、遅い拡散と相まって、環境条件の豊かな局所的多様性を容易に生じさせ、各細胞に、異なる制約下におけるその応答を計算するよう強いることができる。
【０２６０】
一様なインターフェロン刺激は抗ウイルス応答から二峰性を取り除く：以前、インターフェロン（ＩＦＮ）シグナリングの第二波の変動性が、抗ウイルス応答において４時間の時点で観察された広範な二峰性に関与したという仮説が立てられた（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「ナノワイヤ媒介性送達が初代免疫細胞の機能的インテロゲーションを可能にする：慢性リンパ性白血病の分析への応用（Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）」．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１２（１２）：６４９８−５０４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ３０４２９１７（２０１２））。これをさらに調べるため、ＢＭＤＣをＩＦＮ−βで直接刺激し、この抗ウイルスフィードバックへの等しいアクセスを全ての細胞に提供した。刺激後２時間目に（ＩＦＮ−βはＬＰＳ下２時間でピークに達するため４時間ＬＰＳ刺激と同等（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）））、抗ウイルスクラスタのデジタルノイズに劇的なシフトが観察され、主要な遺伝子がＬＰＳにおける二峰性発現分布からＩＦＮ−β下の単峰性発現分布にシフトした。この知見は、抗ウイルス遺伝子の発現における初期の不均質性が細胞内でのタイミングの差により生じるのでなく（Ｎａｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「酵母減数分裂におけるタイミング変動性を分析する（Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｉｍｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｍｅｉｏｓｉｓ）」，Ｃｅｌｌ  １３１，５４４−５５６（２００７））、むしろＩＦＮ−β曝露の差により生じる可能性があることを示唆している。これは、選択の細胞セットにおいてＬＰＳ刺激下０〜２時間に見られるＩｆｎｂ１  ｍＲＮＡ発現の初期の上昇と併せて、一部の細胞が、事実上、インターフェロンシグナリングの一次波の生成に関与している可能性があることを示唆し、これは最終的に、ＩＦＮ−βが集団全体を覆うことに伴い抗ウイルス応答を同期する。かかる場合、ＩＦＮ−βを産生した細胞およびその最近接細胞がオートクリンおよびパラ分泌シグナリングに起因して初期抗ウイルス誘導を呈すると予想され得る。
【０２６１】
細胞のまれな集団は、初期の時点で後期誘導型抗ウイルス遺伝子を早熟に発現する：この仮説を裏付けて、ＬＰＳ刺激の僅か１時間後に抗ウイルス応答遺伝子の早熟発現を呈した３つの細胞が興味深いことに発見された。これらの細胞は、Ｉｆｉｔ１を含めた抗ウイルスシグネチャーのロバストな発現ならびに第２主成分にわたるその射影によって明らかに区別される。この集団を存在を検証するため、ＲＮＡ−ＦＩＳＨを実施し、Ｉｆｉｔ１およびＩｆｎｂ１の発現について細胞を共染色した。従って、この集団は存在し、しかしまれな集団である。
【０２６２】
パラ分泌シグナリングの除去は細胞の不均質性を劇的に変化させる：極めて示唆的ながら、「初期応答細胞」サブ集団の発見は、集団において抗ウイルス同期に細胞内シグナリングが必須であることを確定的に示すものではない。この仮説を検証するには、細胞を個々に単離してそれらを培養する方法が必要である。パラ分泌シグナリングがない場合、前者の仮説は、デジタル抗ウイルスノイズにおけるシフトを示唆し得る。
【０２６３】
これを達成するため、非刺激ＢＭＤＣをＣ１  ＩＦＣ上にロードして単離し、続いて密閉したマイクロ流体チャンバの内部で各細胞をＬＰＳで個々に刺激した。標準的な刺激プロトコルを厳密に反映するため、ＩＦＣ洗浄ポートの１つからＬＰＳ添加培地が送達されるようにＣ１システムをプログラムし、次に細胞を３７℃で４時間インキュベートした後、通常のイメージング、溶解、およびｃＤＮＡ合成および増幅を行った。重要なことには、このオンチップ刺激の細胞密度（４．５ｎＬ当たり１細胞）は通常のインチューブ刺激（５ｎＬ当たり１細胞）と緊密に一致し、この実験を既存のＬＰＳデータと直接比較することが可能であった。当初仮定したとおり、パラ分泌シグナリングが存在しない場合、抗ウイルス応答が強力に脱同期化された。抗ウイルス遺伝子分布が単峰性（バルクＬＰＳ刺激）から二峰性（オンチップ刺激）にシフトすることに伴いデジタルノイズの劇的な増加が観察された。特に、一部の細胞（同定された初期応答細胞に類似しているように思われる）は、実にコア抗ウイルス応答のロバストな活性化を呈した。同様に、パラ分泌シグナリングの除去により、全てのＢＭＤＣについて成熟プロセスが重度に制限され、全ての細胞において成熟マーカーの発現が消失した。これは、ＢＭＤＣにおいて成熟を駆動することが知られるＴＮＦ媒介性シグナリングが無くなったことに起因する可能性が高い。それでもなお、パラ分泌シグナリングの非存在下で全ての誘導性遺伝子が別様に挙動したわけではない：多くの後期誘導型炎症遺伝子は影響を受けず、単離細胞がマイクロ流体チャンバ内でＬＰＳに対する自然応答を起こす能力を有したことを実証している。
【０２６４】
これを調べるため、個々のＢＭＤＣを単離し、次にＣ１  ＩＦＣ内部で４時間刺激することにより、パラ分泌シグナリングを除去した。通常の活性化条件と一致させるため、ＩＦＣ洗浄ポートの１つからＬＰＳ添加培地が送達されるようにＣ１システムをプログラムし、次に刺激する間にわたり細胞を３７℃でインキュベートした後、イメージングおよび溶解を通常どおり行った。重要なことには、チップ刺激の細胞密度（４．５ｎＬ当たり１細胞）は通常のインチューブ刺激（５ｎＬ当たり１細胞）と緊密に一致し、これら２つを直接比較することが可能であった。当初仮定したとおり、パラ分泌シグナリングが存在しない場合、抗ウイルス応答が強力に脱同期化された。ごく一部の細胞における主要な抗ウイルスマーカーの限られたコヒーレントな誘導により抗ウイルス遺伝子分布が単峰性から二峰性にシフトすることに伴いデジタルノイズの劇的な増加が観察された。重要なことには、パラ分泌シグナリングの非存在下で全ての誘導性遺伝子が別様に挙動したわけではない：多くの後期誘導型炎症遺伝子は影響を受けず、単離細胞がマイクロ流体チャンバ内でＬＰＳに対する自然応答を起こす能力を有したことを実証している。
【０２６５】
パラ分泌シグナリングの存在は抗ウイルス同期に必須であるが、細胞内連絡は他の免疫応答回路に対して逆の効果を有する。意外にも、パラ分泌シグナリングの除去はＬＰＳ刺激４時間後のデジタルノイズおよびアナログノイズの両方を劇的に低減した。ＴＮＦ、Ｉｌ１ａ、およびＩＮＨＢＡなどのカノニカルな炎症性マーカーは、全てパラクリン除去時に二峰性分布から単峰性分布にシフトした−２時間の時点におけるその一様な発現に似ている。従って、これらの結果は、この脱同期化の上流決定因子としてのパラ分泌シグナリングを強く指し示しており、抗ウイルス経路および炎症経路の両方における不均質性の駆動において細胞間連絡が果たす広範な−かつ時には逆の−役割を強調している。
【０２６６】
インターフェロンフィードバックは炎症の不均質性を増加させる：オンチップ単離実験は全てのパラ分泌シグナリングを直ちに無くすため、上記で観察された結果に関与するパラクリンシグナルの個々、またはその組み合わせを識別することはできない。個々のシグナリング経路の役割にさらに具体的に対処するため、本研究は、特定の受容体分子が欠損したノックアウトマウスのプロファイリングに取り掛かった。上流の炎症ノイズ源を詳しく理解するため、本研究は、ＴＮＦ受容体欠損マウス由来のＢＭＤＣのプロファイリングから開始した。先行する知見および仮説と一致して、ＴＮＦＲ−／−ＢＭＤＣは成熟マーカーの誘導を呈しなかった。しかしながら、多くの急ピーク型応答遺伝子は、野生型ＢＭＤＣおよびＴＮＦＲ−／−ＢＭＤＣの両方において４時間の時点で極めて類似した分布を呈した。ＩＬ１受容体欠損ＢＭＤＣをプロファイリングするとき、同様の結果が見られた；ＢＭＤＣは成熟できなかったが、急ピーク型応答遺伝子の間でコヒーレントな変化は観察されなかった。
【０２６７】
次に、インターフェロン受容体ノックアウト（Ｉｆｎａｒ１−／−）マウス由来のＢＭＤＣをプロファイリングした。予想どおり、および先行の知見と一致して（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「ナノワイヤ媒介性送達が初代免疫細胞の機能的インテロゲーションを可能にする：慢性リンパ性白血病の分析への応用（Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）」．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１２（１２）：６４９８−５０４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ３０４２９１７（２０１２））、インターフェロンシグナリングの阻害が抗ウイルス遺伝子の発現を完全に遮断した。抗ウイルス経路の除去は本質的に完全であり、抗ウイルス応答を呈する細胞はなかったことから、「初期応答細胞」であっても、その抗ウイルス応答を活性化させるためにはＩｆｎＢのオートクリンシグナリングが必要であり得ることが示唆される。しかしながら、再び炎症「急ピーク型」遺伝子は、これらのノックアウト細胞で著しく低下したレベルのデジタルおよびアナログの両方の変動性を示した。Ｉｆｎａｒ１−／−はオンチップ刺激からの細胞と近接してクラスタリングされ、ＬＰＳと比較したノイズのシフトは両実験間で有意に相関した。抗ウイルス経路の誘導におけるインターフェロンシグナリングの既知の役割を所与とすれば、これらの知見は、炎症応答脱同期の一次上流機構としての広範な抗ウイルス交差阻害を一体となって指し示している。
【０２６８】
実施例９．「クラスタ破壊」細胞の除去
上記の実施例において、ＢＭＤＣは、個別の成熟度状態に対応する２つの個別のサブ集団に分類されたことが特定された。ＢＭＤＣ成熟は、ＢＭＤＣが適応免疫系をプライミングするため抗原捕捉細胞から抗原提示細胞に切り換わる発生過程である（例えば、Ｊｉａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．「Ｅ−カドヘリン媒介性接着の破壊は機能的に個別の樹状細胞成熟経路を誘導する（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，６１０−６２４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０８．０１５（２００７）を参照のこと）。成熟は、病原体由来のリガンド、例えばＬＰＳに応答して起こるか、あるいは培養下ＢＭＤＣのクラスタを破壊する結果として起こり（前掲）、その両方が特定の細胞間マーカーの上方調節をもたらし得る。病原体依存性の成熟は病原体曝露後長い期間に起こり、データセットにおいて細胞は発生の連続に沿って含まれる（図２４ｄ、図２４ｅ）。
【０２６９】
しかしながら、「クラスタ破壊」とも称される病原体非依存性の成熟は培養プロセスの公知のアーチファクトであり、刺激前に起こり、個別的な細胞状態を表す。従って、「均質な」集団由来の遺伝子発現変動の変化を適切に測定するため、本明細書に提供される研究は、以降のあらゆる分析からクラスタ破壊細胞を全て取り除くことを試みた。
【０２７０】
１８個の細胞に関するＰＣＡを実施した前出の実施例では、第１主成分（ＰＣ１）がこれらの２つの細胞集団を判別したことが分かった。高いＰＣ１負荷量の多くの遺伝子が、細胞表面受容体Ｃｃｒ７、Ｃｄ８３、およびＣｄ８６などの、既知のＢＭＤＣ成熟マーカーであった（Ｊｉａｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００７）。これらの遺伝子は、病原体依存性および病原体非依存性の両方の成熟経路において上方調節され、従って全てがＬＰＳ時間経過において集団レベルで誘導される（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．「病原体応答を媒介する哺乳類転写ネットワークの偏りのない再構築（Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｓｈａｌｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３）。ＰＣ１遺伝子の中では、Ｌｙｚ１が最も高い負荷量を有し、クラスタ破壊細胞の最良の判別因子であった。Ｌｙｚ１は１５個の成熟（非クラスタ破壊）細胞では（ｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞９）であったが、３個のクラスタ破壊細胞には全く存在しなかった（ＴＰＭ＝０）。さらに、Ｌｙｚ１は、病原体依存性成熟を起こす２個の細胞において異なる形では調節されず、これはＬＰＳ時間経過全体を通じてその単一細胞レベルまたは集団平均レベルで認め得るほどに変化しなかった。同様に、相補的マーカー（セルピンｂ６ｂ）を同定し、このマーカーはクラスタ破壊細胞においてのみ高発現であるが、他のいずれにも存在しないことが分かり、しかしＬＰＳ時間経過中にその全体的な発現を認め得るほどに変化させることはなかった。従って、これらのマーカーが病原体依存性成熟を起こす細胞において異なる形で調節される可能性は低く、これらのマーカー転写物の発現パターンがクラスタ破壊細胞の同定方法を提供したというのは妥当であった。２つのマーカーを独立して確認するため、刺激前にＣＤ８３（成熟マーカー）発現に関して予め選別した細胞に対してさらなるｑＲＴＰＣＲ解析を実施し、次にそれらの２つの選別したサブ集団（ＣＤ８３＋、ＣＤ８３−）をＬＰＳで４時間刺激した。刺激前および刺激後の両方について２つのサブ集団における２つのｍＲＮＡのレベルを測定した。これらの研究から、これらのマーカーが病原体応答に関して２つのサブ集団間をきれいに区別することが成功裏に検証された。
【０２７１】
【表４１】
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【０２７２】
従って、全ての潜在的クラスタ破壊細胞を厳密に取り除くため、Ｌｙｚ１についてｌｎ（ＴＰＭ＋１）＜６またはセルピンｂ６ｂについてｌｎ（ＴＰＭ＋１）＞４である全てのライブラリを以降の分析から除外した。これは、実験毎に例外なく行った。
【０２７３】
クラスタ破壊が「コア」抗ウイルスモジュールの初期活性化と関係しなかったことを確かめるため、１時間ＬＰＳ刺激および４時間ＬＰＳ「オンチップ」刺激の両方の実験について、クラスタ破壊マーカーの発現と「コア」抗ウイルスモジュールの活性化との間に相関がなかったことを確認した。
【０２７４】
本発明を詳細な説明および実施例として目下記載してきたが、当業者は、本発明を種々の実施形態で実施することができることおよび上記の説明および実施例が説明の目的のためであり、以下の特許請求の範囲を限定するものでないことを認識する。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ−Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３Ｄ−Ｅ】
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【図１５】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2016515383.tif 000075
【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
2016515383.tif 000077
【図２６Ａ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
2016515383.tif 000080
【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
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【図２７Ａ】
2016515383.tif 000083
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ−Ｆ】
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【図５】
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【図１４】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ｂ−Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｅ−Ｆ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
2016515383000001.app
【国際調査報告】
2016515383.tif 000113
2016515383.tif 000114