(57)【要約】  本開示は、血管内皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）に指向された抗体、並びに、例えば、ＶＥＧＦの活性及び／又は過剰生成と関連した疾患を治療するためのこのような抗体の使用に関する。
2016505546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項２】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり；
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
ｆ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
ｇ．ＣＦＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧであり、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項３】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹ又はＴであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦ又はＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項４】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＡ又はＱ又はＧであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項５】
ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧである、請求項３又は請求項４に記載のバリアント。
【請求項６】
ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＹである、請求項３又は請求項４に記載のバリアント。
【請求項７】
ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＴである、請求項３又は請求項４に記載のバリアント。
【請求項８】
ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦである、請求項３から７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項９】
ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨである、請求項３から７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１０】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹ又はＴであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹ又はＮであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦ又はＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり、
バリアントは、参照抗体のＣＤＲと比較して、Ｋａｂａｔ  ２８、Ｋａｂａｔ  ３１、Ｋａｂａｔ  ９７及びＫａｂａｔ  １００ａのうちの少なくとも２つにおいてアミノ酸置換を含み、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項１１】
バリアントが、参照抗体のＣＤＲと比較して、Ｋａｂａｔ  ２８、Ｋａｂａｔ  ３１、Ｋａｂａｔ  ９７及びＫａｂａｔ  １００ａのうちの少なくとも２つにおいてアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載のバリアント。
【請求項１２】
バリアントが、参照抗体のＣＤＲと比較して、Ｋａｂａｔ  ２８、Ｋａｂａｔ  ３１、Ｋａｂａｔ  ９７及びＫａｂａｔ  １００ａのうちの少なくとも３つにおいてアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載のバリアント。
【請求項１３】
ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０がＮ、Ｗ又はＴである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１４】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＡである、
請求項１から４及び１０から１３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１５】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦであり；
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１６】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１７】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１８】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１９】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＡである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項２０】
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項２１】
Ｋａｂａｔ  ３０がＴである、請求項１から２０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項２２】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ若しくはＲ若しくはＹであり；及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０はＫ若しくはＮであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＬ若しくはＷ若しくはＹであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＡであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項２３】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり；又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＡ若しくはＱであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項２４】
Ｋａｂａｔ  ２８がＧである、請求項２２又は請求項２３に記載のバリアント。
【請求項２５】
Ｋａｂａｔ  ２８がＲである、請求項２２又は請求項２３に記載のバリアント。
【請求項２６】
Ｋａｂａｔ  ２８がＹである、請求項２２又は請求項２３に記載のバリアント。
【請求項２７】
Ｋａｂａｔ  ３０がＫである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項２８】
Ｋａｂａｔ  ３０がＮである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項２９】
Ｋａｂａｔ  ３０がＲである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３０】
Ｋａｂａｔ  ３０がＷである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３１】
Ｋａｂａｔ  ３１がＨである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３２】
Ｋａｂａｔ  ３１がＬである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３３】
Ｋａｂａｔ  ３１がＷである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３４】
Ｋａｂａｔ  ３１がＹである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３５】
Ｋａｂａｔ  ３１がＦである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３６】
Ｋａｂａｔ  ９７がＡである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３７】
Ｋａｂａｔ  ９７がＤである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３８】
Ｋａｂａｔ  ９７がＥである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項３９】
Ｋａｂａｔ  ９７がＦである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４０】
Ｋａｂａｔ  ９７がＰである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４１】
Ｋａｂａｔ  ９７がＹである、請求項２４から３５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４２】
Ｋａｂａｔ  １００ａがＱである、請求項２４から４１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４３】
Ｋａｂａｔ  １００ａがＴである、請求項２４から４１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４４】
Ｋａｂａｔ  １００ａがＡである、請求項２４から４１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４５】
Ｋａｂａｔ  １００ａがＧである、請求項２４から４１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４６】
ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、請求項１から４５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項４７】
ＤＶＤ−Ｉｇである、請求項４６に記載のバリアント。
【請求項４８】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＦであり、及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ５３はＦであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６４は、Ｓ若しくはＱであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＤ若しくはＥ若しくはＰであり；及び／又は
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９８はＦであり；及び／又は
ｆ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９はＤ若しくはＥであり；及び／又は
ｇ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＧであり；及び／又は
ｈ．ＣＤＲ−Ｌ２におけるＫａｂａｔ  ５１はＡであり； 
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有し； 
バリアントは、ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項４９】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６１はＦ若しくはＥ若しくはＤであり、及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６２はＧ若しくはＬ若しくはＱ若しくはＴ若しくはＫ若しくはＲ若しくはＥ若しくはＨであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６４は、Ｓ若しくはＶ若しくはＱであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６５はＶ若しくはＦ若しくはＨ若しくはＮ若しくはＳ若しくはＱ若しくはＫ若しくはＩであり；及び／又は
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９８はＨであり；
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有し； 
バリアントは、ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項５０】
参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ若しくはＲ若しくはＹであり；及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０はＫ若しくはＮ若しくはＲ若しくはＷであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１は、Ｆ若しくはＨ若しくはＬ若しくはＷ若しくはＹであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＡ若しくはＤ若しくはＥ若しくはＦ若しくはＰ若しくはＹであり；及び／又は
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＡ若しくはＧ若しくはＱ若しくはＴであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有し； 
バリアントは、ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【請求項５１】
ＤＶＤ−Ｉｇである、請求項４８から５０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５２】
バリアント結合ＶＥＧＦ部分において、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＰであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＰであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＥであり；
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＥであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＥであり；
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＥであり；
ｆ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＥであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｇ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｈ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＰであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり；
ｉ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｊ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｋ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ、及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧである、
請求項４８から５１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５３】
第２の結合部分が、ＶＥＧＦ結合部分の外部にある、請求項４６から５２のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５４】
ＶＥＧＦ結合部分が、第２の結合部分の外部にある、請求項４６から５２のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５５】
ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、短いリンカーを介して、場合により、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４２７）又はＧＧＧＧＳＧ（配列番号４３０）を介して連結される、請求項４６から５４のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５６】
ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、中間のリンカーを介して、場合により、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３１）を介して連結される、請求項４６から５４のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５７】
ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、長いリンカーを介して、場合により、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４２９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３２）を介して連結される、請求項４６から５４のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５８】
ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、短いリンカーを介して、場合により、ＴＶＡＡＰ（配列番号４１８）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号４２１）、又はＧＧＳＧＧ（配列番号４２３）を介して連結される、請求項４６から５７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５９】
ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、中間のリンカーを介して、場合により、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号４２４）を介して連結される、請求項４６から５７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６０】
ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、長いリンカーを介して、場合により、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号４２０）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号４２２）、又はＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２５）を介して連結される、請求項４６から５７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６１】
第２の標的がＤＬＬ４である、請求項４６から６０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６２】
第２の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲが、配列番号４１３と配列番号４１４のＤＬＬ４結合部分のＣＤＲのＣＤＲ配列を有する、請求項６１に記載のバリアント。
【請求項６３】
第２の重鎖及び軽鎖可変領域が、配列番号４１３と配列番号４１４のＤＬＬ４結合部分の配列を有する請求項６２に記載のバリアント。
【請求項６４】
６つのＣＤＲが全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１６個、最大１５個、最大１４個、最大１３個、最大１２個、最大１１個、最大１０個、最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個又は最大４個のアミノ酸置換を有する、請求項１から６３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６５】
いずれかの個々のＣＤＲが、参照抗体の対応するＣＤＲ配列と比較して、３個以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６４のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６６】
いずれかの個々のＣＤＲが、参照抗体の対応するＣＤＲ配列と比較して、２個以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６５のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６７】
それぞれ、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片である、請求項１から６６のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６８】
それぞれ、ヒト抗体若しくはヒト化抗体、又はヒト化抗体若しくはヒト化抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片である、請求項１から６７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６９】
ＩｇＧである、請求項１から６８のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７０】
ＩｇＧ１である、請求項６９に記載のバリアント。
【請求項７１】
ＩｇＧ２である、請求項６９に記載のバリアント。
【請求項７２】
ＡＤＣＣ活性を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、請求項１から７１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７３】
フコシル化されていない、請求項１から７２のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７４】
ＦｃγＲへの結合を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、請求項１から７３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７５】
ＦｃＲｎへの結合を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、請求項１から７３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７６】
ヘテロ二量体化を強化する、Ｆｃにおける１つ以上の変異を含む、請求項１から７１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７７】
ＡＤＣＣ活性を減少させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、請求項１から７１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７８】
１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号１のＶＨ配列を有する、請求項１から７７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項７９】
１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号２のＶＬ配列を有する、請求項７８に記載のバリアント。
【請求項８０】
１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する、請求項７８に記載のバリアント。
【請求項８１】
１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号９のＶＨ部分のＶＨ配列を有する、請求項１から７７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項８２】
１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号２のＶＬ配列を有する、請求項８１に記載のバリアント。
【請求項８３】
１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する、請求項８１に記載のバリアント。
【請求項８４】
（ａ）配列番号１のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍又は少なくとも２倍、及び最大２倍、最大３倍又は最大１０倍の親和性を有する、請求項１から８３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項８５】
（ａ）配列番号９のＶＨ部分のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍又は少なくとも２倍、及び最大２倍、最大３倍又は最大１０倍の親和性を有する、請求項１から８３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項８６】
（ａ）配列番号１のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の２から３倍の親和性を有する、請求項８４に記載のバリアント。
【請求項８７】
（ａ）配列番号９のＶＨ部分のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の２から３倍の親和性を有する、請求項８５に記載のバリアント。
【請求項８８】
親和性が、バイオセンサーによって分析されるＫＤの尺度である、請求項８４から８７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項８９】
精製されている、請求項１から８８のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項９０】
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の均質性まで精製されている、請求項８９に記載のバリアント。
【請求項９１】
請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片を含む抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９２】
請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、又は請求項９１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９３】
請求項１から９０のいずれか一項に記載のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９４】
請求項９３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９５】
請求項９４に記載のベクターを用いて形質転換された原核宿主細胞。
【請求項９６】
請求項９４に記載のベクターを用いて形質転換された真核宿主細胞。
【請求項９７】
請求項９３に記載のヌクレオチド配列を発現するように操作された真核宿主細胞。
【請求項９８】
哺乳動物宿主細胞である、請求項９７に記載の真核宿主細胞。
【請求項９９】
（ａ）請求項９７又は請求項９８に記載の真核宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片抗体を回収することを含む、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片を生成する方法。
【請求項１００】
治療有効量の請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、請求項９１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は請求項９２に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項１０１】
癌が、結腸の転移性癌腫、直腸の転移性癌腫、非扁平上皮型非小細胞肺癌又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
癌が、切除不能であり、局所進行性であり、再発性であり又は転移性である非扁平上皮型非小細胞肺癌である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
治療有効量の請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、請求項９１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は請求項９２に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、加齢性黄斑変性症、網膜静脈閉塞後の浮腫及び糖尿病性黄斑浮腫から選択される網膜状態を治療する方法。
【請求項１０４】
網膜状態が、加齢性黄斑変性症である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
網膜状態が、滲出型加齢性黄斑変性症である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
網膜状態が、萎縮型加齢性黄斑変性症である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
網膜状態が、網膜静脈閉塞後の浮腫である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
網膜状態が、糖尿病性黄斑浮腫である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０９】
治療有効量の請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、請求項９１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は請求項９２に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、免疫障害を治療する方法。
【請求項１１０】
免疫障害が、関節リウマチ又はグレーブス病である、請求項１０９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照及び配列表
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、その内容が、全体として参照により本明細書に組み込まれる２０１２年１１月３０日付けで出願された米国仮出願第６０／７３２，２５６号の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、全体として参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年１１月２６日付けで作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、３８１４９３−８０８ＷＯ（１２６２８９）＿ＳＬ．ｔｘｔと名付け、サイズは１６２，２０６バイトである。
【０００３】
２．発明の分野
本開示は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物及びこのような抗体の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
３．背景
血管新生は、腫瘍増殖、増殖網膜症、加齢黄斑変性症、関節リウマチ（ＲＡ）及び乾癬を含む、様々な病態への関与に起因して、魅力的な治療標的であることが明らかになってきた（Ｆｏｌｋｍａｎら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４頁）。特定の分子血管新生因子が最初に注目されたのは、移植された腫瘍によって誘導された強い新生血管応答の観察に基づいた。現在、血管新生は、大部分の原発腫瘍の増殖とその後のこれらの転移に不可欠であることが知られている。依頼、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子−α、アンギオゲニン、インターロイキン（ＩＬ）−８及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ又は血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれる。）を含む多数の分子が血管新生の正の調節に関連付けられている（Ｆｅｒｒａｒａら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：６６９−６７６頁）。
【０００５】
ＶＥＧＦタンパク質は、正常な胚形成期の血管形成（胚循環系の新規形成）と異常な血管新生（既存脈管構造からの血管の増殖）の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である（Ｆｅｒｒａｒａら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２頁；Ｄｖｏｒａｋら、１９９５年，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９頁）。ＶＥＧＦは、固形腫瘍及び血液悪性疾患、眼間新生血管症候群、炎症及び脳浮腫、並びに女性生殖器管の病理学に関係がある（Ｆｅｒｒａｒａら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：６６９−６７６頁）。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、肺、乳房、胃腸管、腎臓、膵臓及び卵巣の腫瘍を含む、多数のヒト腫瘍で過剰発現される（Ｂｅｒｋｍａｎら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１５３−１５９頁）。眼の房水及び硝子体液におけるＶＥＧＦの増加は、各種網膜症に伴う（Ａｉｅｌｌｏら、１９９４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７頁）。高齢者の失明の主因である加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、新生血管形成と血管漏出に起因する。ＡＭＤを患っている患者では脈絡膜新生血管膜にＶＥＧＦの局在が認められている（Ｌｏｐｅｚら、１９９６年、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８頁）。
【０００６】
ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは、原型メンバーであるＶＥＧＦＡ、並びにＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ及び胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を含む。ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子は、７つのイントロンによって分断された８つのエクソンとして構成されている。ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６２、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６を含む少なくとも６種類の異なるアイソフォームが存在し、この場合、下付き文字は、シグナル開裂後に残存するアミノ酸の数を指す。天然のＶＥＧＦは、４５ｋＤａホモ二量体ヘパリン結合糖タンパク質である（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：６６９−６７６頁）。ＶＥＧＦ（具体的には、ＶＥＧＦＡ）は、２種の関連受容体チロシンキナーゼであるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１とも呼ばれる。）とＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１又はキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）又はＣＤ３０９とも呼ばれる。）に結合する。それぞれの受容体は、７つの細胞外領域と１つの膜貫通領域を有する。ＶＥＧＦはまた、ニューロピリンＮＲＰ１（血管内皮細胞成長因子１６５受容体（ＶＥＧＦ１６５Ｒ）又はＣＤ３０４とも呼ばれる。）及びＮＲＰ２（血管内皮細胞成長因子１６５受容体２（ＶＥＧＦ１６５Ｒ２）とも呼ばれる。）に結合する。
【０００７】
血管新生調節におけるその中心的な役割により、ＶＥＧＦは、治療介入の魅力的な標的となる。実際に、ＶＥＧＦ又はその受容体シグナル伝達系の遮断を目的とする様々な治療戦略が新生物疾患の治療用に現在開発中である。抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブは、ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ又はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）とも呼ばれ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより創製及び販売されている組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である（Ｐｒｅｓｔａら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９頁）。ベバシズマブを構築するために、マウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトフレームワーク及びＩｇＧ定常領域に移植された。次に、ＣＤＲ外の更なる変異が分子に導入され、結合を改善し、アミノ酸配列の約９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、配列の約７％がマウス抗体Ａ．４．６．１に由来する抗体を得た。ベバシズマブは、分子量が約１４９，０００ダルトンであり、グリコシル化されている。
【０００８】
ラニビズマブは、ベバシズマブに由来する親和性成熟Ｆａｂ断片である。ラニビズマブは、ＶＥＧＦに対する親和性がより高く、またサイズが小さいため、良好に網膜に浸透し、したがって、ＡＭＤに伴う眼の新生血管形成を治療することができる（Ｌｉｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ、Ｉｎ：Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、２００８年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １８１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  １３１−１５０頁）。ラニビズマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発され、商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で販売されている。
【０００９】
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）を含むレジメンを用いた癌患者の治療は、高血圧、尿蛋白、血栓イベント、出血及び心臓中毒を含む副作用をもたらす場合がある（Ｂｌｏｗｅｒｓ  ＆  Ｈａｌｌ、２００９年、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｒｓ．１８（６）：３５１−６，３５８頁）。また、ヒト化抗体であるにもかかわらず、ベバシズマブは、ヒトに投与した場合に免疫応答を誘発することがある。このような免疫応答は、循環からの抗体又は断片の、免疫複合体を媒介した排出をもたらし、反復投与が治療に不適切になり、それにより、患者への治療的利益が低減し、抗体の再投与が制限され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４頁
【非特許文献２】Ｆｅｒｒａｒａら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：６６９−６７６頁
【非特許文献３】Ｆｅｒｒａｒａら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２頁
【非特許文献４】Ｄｖｏｒａｋら、１９９５年，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９頁
【非特許文献５】Ｂｅｒｋｍａｎら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１５３−１５９頁
【非特許文献６】Ａｉｅｌｌｏら、１９９４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７頁
【非特許文献７】Ｌｏｐｅｚら、１９９６年、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８頁
【非特許文献８】Ｐｒｅｓｔａら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９頁
【非特許文献９】Ｌｉｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ、Ｉｎ：Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、２００８年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １８１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  １３１−１５０頁
【非特許文献１０】Ｂｌｏｗｅｒｓ  ＆  Ｈａｌｌ、２００９年、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｒｓ．１８（６）：３５１−６，３５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、例えば、ベバシズマブよりも親和性が高く、減少させた用量で投与することができるバリアント、又はベバシズマブと比較して、免疫原性及び他の副作用が低減したバリアントを作製することによって、これらの課題の１つ以上を解決する改良された抗ＶＥＧＦ抗体又は断片を提供することが必要である。
【００１２】
本出願の２節又は他の節における任意の参照文献の引用又は特定は、このような参照文献が、本開示に対する先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（要旨）
４．概要
本開示は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、免疫原性の低下及び／又はＶＥＧＦに対する親和性の改善などの、改善された特徴を有する抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブのバリアントに関する。ベバシズマブは、（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって）本明細書で言及されているＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲと、（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって）本明細書で言及されているＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３と呼ばれる３つの軽鎖ＣＤＲを有する。ベバシズマブＣＤＲの配列は、図１Ａ及び１Ｂに示され、それらの番号付けは表１（重鎖ＣＤＲについて）及び表２（軽鎖ＣＤＲについて）に示される。ベバシズマブの親和性成熟によって、関連抗体であるラニビズマブが作製された。ラニビズマブは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｈ２配列がベバシズマブと同一であるが、そのＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ３配列はベバシズマブの配列と相違する。ラニビズマブの重鎖及び軽鎖配列は図１Ｃに示され、ＣＤＲは図１Ｄに示されている。
【００１４】
本開示の抗体は、概して、ベバシズマブ及びラニビズマブと比較して、少なくとも１つのＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＣＤＲを有する。本開示の抗体は、典型的には、結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、親和性定数（ＫＤ）、ＶＥＧＦ受容体１（「ＶＥＧＦＲ１」又は「ＶＥＧＦ−Ｒ１」）へのＶＥＧＦ結合の阻害についてのＥＣ５０、ＶＥＧＦ受容体２（「ＶＥＧＦＲ２」又は「ＶＥＧＦ−Ｒ２」）へのＶＥＧＦ結合の阻害についてのＥＣ５０、及びＶＥＧＦを媒介したＨＵＶＥＣ増殖の阻害についてのＥＣ５０のうちの１つ以上における改善などの、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブＣＤＲ配列と比較して、１つ以上の有利な特徴を付与する重鎖ＣＤＲ配列を有する。いくつかの実施形態において、改善は、単一特異的ＩｇＧ抗体との関連で決定される。さらに他の実施形態において、改善は、表２３のＤＶＤ−Ｉｇ分子などの多重特異的抗体との関連で決定される。様々な実施形態において、これらの特徴の１つ以上は、少なくとも２５％、少なくとも５０％又は少なくとも１００％改善され、場合により、最大１５０％、最大２００％、最大３００％若しくはさらにそれらを超えて改善される。
【００１５】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、典型的には、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブのＣＤＲと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＣＤＲを有する。様々な実施形態において、抗体は、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブのＣＤＲと比較して、２つ、３つ若しくはさらには４つ又はそれらを超える置換を含むＣＤＲを有する。特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブのＣＤＲと比較して、ＣＤＲ−Ｈ１において少なくとも１つのアミノ酸置換及び／又はＣＤＲ−Ｈ３において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。さらに、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブのＶＨ及び／又はＶＬ配列に関連するＶＨ及び／又はＶＬ配列を有することができ、即ち、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブのフレームワーク配列に関連するフレームワーク配列を有することができる。特定の態様において、フレームワーク配列は、各々、最大１つ、最大２つ又は最大３つのアミノ酸置換のそれぞれを有することができる。他の態様において、フレームワーク配列は、ベバシズマブ及び／又はラニビズマブのフレームワーク配列と同一である。したがって、特定の態様において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、最大１７個のＣＤＲ置換（及び特定の実施形態において、最大１０個、最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個又は最大４個のＣＤＲ置換）以外に、（ａ）ベバシズマブのＶＨに対応するＶＨ配列とベバシズマブのＶＬに対応するＶＬ配列；（ｂ）ラニビズマブのＶＨに対応するＶＨ配列とラニビズマブのＶＬに対応するＶＬ配列；（ｃ）ベバシズマブのＶＨに対応するＶＨ配列とラニビズマブのＶＬに対応するＶＬ配列；又は（ｄ）ラニビズマブのＶＨに対応するＶＨ配列とベバシズマブのＶＬに対応するＶＬ配列を有することができる。
【００１６】
特定の態様において、抗体は、場合により、表６、７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９、１３−１６及び２１−２６の１つ以上からの１つ以上の追加のＣＤＲ置換又はＣＤＲ置換の組み合わせを組み合わせて、表２１−２２、２４及び２６のいずれか１つに記載されている少なくとも１つのＣＤＲ置換又はＣＤＲ置換の組み合わせを含む。１つの具体的な実施形態において、表６からの１つ以上の置換が含まれる。
【００１７】
特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＴ又はＧ又はＲ又はＹ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０でＫ又はＮ又はＲ又はＷ；（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＦ又はＨ又はＬ又はＷ又はＹ；（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７でＡ又はＤ又はＥ又はＦ又はＰ又はＹ；及び（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＡ又はＧ又はＱ又はＴ、の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ全てを含む。Ｋａｂａｔの番号付けとＣＤＲ位置間の対応は、重鎖ＣＤＲについては表１に記載され、軽鎖ＣＤＲについては表２に記載されている。
【００１８】
具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＧ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＹ；及び（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＡ、の１つ、２つ又は３つ全てを含む。他の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＧ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＹ；及び（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＱ、の１つ、２つ又は３つ全てを含む。なお他の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＧ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＹ；及び（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＴ、の１つ、２つ又は３つ全てを含む。
【００１９】
他の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＴ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＹ；及び（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＡ、の１つ、２つ又は３つ全てを含む。他の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＴ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＹ；及び（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＱ、の１つ、２つ又は３つ全てを含む。なお他の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８でＴ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１でＹ；及び（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａでＴ、の１つ、２つ又は３つ全てを含む。
【００２０】
他の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、表２４においてＣ１からＣ１３として示されている組み合わせバリアントに存在するアミノ酸置換の少なくとも２つを含む。特定の具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１２若しくはＣ１３に存在する置換の３つ全てを含み、又はＣ１−Ｃ８及びＣ１１のいずれか１つに存在する置換の３つを含む。なお他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｃ５−Ｃ８及びＣ１１のいずれか１つに存在する置換の４つ全てを含み、又はＣ１−Ｃ４のいずれか１つに存在する置換の４つを含む。なお他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｃ１−Ｃ４のいずれか１つに存在する置換の５つ全てを含む。前述の実施形態のそれぞれにおいて、Ｋａｂａｔ  １００ａはＴで置換され得る。
【００２１】
特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、場合により上述のＣＤＲ置換に加えて、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＴ３０Ｋ；ＣＤＲ−Ｈ１におけるＴ３０Ｎ；ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｈ；ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｌ；ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｗ；ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｙ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＱ；及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＴから選択される少なくとも１つの置換を含む。特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、表６、７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９、１３−１６及び２１−２６の１つ以上から選択される変異の１つ以上の追加の変異又は変異の組み合わせを含む。
【００２２】
他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、場合により上述のＣＤＲ置換に加えて、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ；ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ；ＣＤＲ−Ｈ２におけるＹ５３Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ、及びＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む。他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、表８及び９から選択される少なくとも１つの置換を含む。改善された親和性バリアント抗体に組み込むことができる追加の変異は、表６に記載されているものなどの候補脱免疫置換、並びにＶＥＧＦに結合する抗体の能力を破壊しない他の変異、例えば、置換であり得て、限定されないが、表１０及び１１の記載されている変異、又は表１２−１から１２−９及び１３に記載されている変異などの公知の変異が挙げられる。組み込むことができるなお更なる変異には、限定されないが、表１４−１６及び２１−２６に記載されている変異が挙げられる。
【００２３】
具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、場合により上述のＣＤＲ置換に加えて、表７から選択される置換の組み合わせ、及び場合により１つ以上の追加の変異、例えば、表６に記載されているものなどの候補脱免疫置換、並びにＶＥＧＦに結合する抗体の能力を破壊しない他の変異、例えば、置換を含み、限定されないが、表１０及び１１に記載されている変異、又は表１２−１から１２−９及び１３に記載されている変異などの公知の変異が挙げられる。本開示の抗ＶＥＧＦ抗体に組み込むことができるなお更なる変異には、限定されないが、表１４−１６及び２１−２６に記載されている変異が挙げられる。
【００２４】
他の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、場合により上述のＣＤＲ置換に加えて、以下のＣＤＲ置換：Ｋ６４Ｓ（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｋ６４Ｑ（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｙ５３Ｆ及びＫ６４Ｑ（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｈ９７Ｅ及びＹ９８Ｆ（ＣＤＲ−Ｈ３）又はＴ５１Ａ（ＣＤＲ−Ｌ２）の１つ以上を含む。また、抗ＶＥＧＦ抗体は、場合により表６、７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９又は１３−１６及び２１−２６の１つ以上から選択される１つ以上の追加の変異又は変異の組み合わせを含むことができる。
【００２５】
更なるＣＤＲ置換は、Ｎ３１Ｆ（ＣＤＲ−Ｈ１）、Ｈ９７Ｅ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｈ９７Ｄ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｈ９７Ｐ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｙ９９Ｅ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｙ９９Ｄ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｓ１００ａＧ（ＣＤＲ−Ｈ３）を含むことができ、この場合、ＣＤＲ−Ｈ３の３位は、場合により、チロシン、Ｔ２８Ｐ、Ｎ３１Ｆ、Ｎ３１Ｇ及びＮ３１Ｍ（ＣＤＲ−Ｈ１）、Ｈ９７Ａ、Ｈ９７Ｑ、Ｈ９７Ｓ、Ｈ９７Ｔ、Ｓ１００ａＤ、Ｓ１００ａＥ及びＳ１００Ａｖ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｔ３０Ｗ、Ｔ３０Ｒ又はＴ３０Ｑ（ＣＤＲ−Ｈ１）、Ｙ５３Ｆ、Ｔ５８Ｆ、Ａ６１Ｇ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｒ、Ａ６１Ｈ、Ａ６１Ｙ、Ｋ６４Ｇ、Ｋ６４Ｅ、Ｒ６５Ｌ、Ｒ６５Ｔ、Ｒ６５Ａ、Ｒ６５Ｅ及びＲ６５Ｄ（ＣＤＲ−Ｈ２）、並びにＹ９８Ｆ及びＹ１００ｅＦ（ＣＤＲ−Ｈ３）ではない。ＣＤＲは、場合により、表６、７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９、１３及び２１−２６の１つ以上から選択される１つ以上の追加の変異又は変異の組み合わせを含有する。
【００２６】
なお更なる置換は、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｇ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｈ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ；（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｊ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；又は（ｋ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧから選択される置換の組み合わせを含む重鎖ＣＤＲ置換を含むことができる。さらに任意の置換は、表６、７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９、１３及び２１−２６の１つ以上から選択される１つ以上の追加の変異又は変異の組み合わせを含むことができる。
【００２７】
なお更なる重鎖置換は、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｇ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｔ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｋ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｖ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｖ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｎ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｋ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｉ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｈから選択される少なくとも１つの置換を含むことができる。場合により、表７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９、１３及び２１−２６の１つ以上から選択されるような、１つ以上の追加の変異又は変異の組み合わせが含まれ得る。
【００２８】
特定の態様において、本開示の抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性（特定の実施形態において、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性）を有するＶＨ及びＶＬ配列を有し、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、少なくとも１つのＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の態様において、本開示の抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性（特定の実施形態において、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性）を有するＶＨ及びＶＬ配列を有し、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、少なくとも１つのフレームワーク領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態において、ベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列と比較した重鎖及び軽鎖の配列同一性の割合は、独立して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性又は少なくとも９９％の配列同一性から選択される。特定の態様において、本開示の抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及び／又はＶＬ配列に対して、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬ配列を有する。
【００２９】
特定の態様において、本開示の抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、それらのＣＤＲにおいて最大１７個のアミノ酸置換を有する。標的結合能力を維持する、１７個のアミノ酸置換を有するバリアント抗体は、Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１４頁によって生成されている。
【００３０】
具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、独立して、
・ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲと比較して、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個又は最大１０個のＣＤＲ−Ｈ１置換；
・ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲと比較して、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個、最大１１個、最大１２個、最大１３個、最大１４個、最大１５個、最大１６個又は最大１７個のＣＤＲ−Ｈ２置換；
・ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲと比較して、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個、最大１１個、最大１２個、最大１３個又は最大１４個のＣＤＲ−Ｈ３置換；
・ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲと比較して、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個又は最大１１個のＣＤＲ−Ｌ１置換；
・ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲと比較して、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個又は最大７個のＣＤＲ−Ｌ２置換；及び
・ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲと比較して、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個又は最大９個のＣＤＲ−Ｌ３置換
を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、任意の個々の変異は、ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するアミノ酸と比較して、２倍を超えて親和性を減少させず、好ましくは、親和性を維持し又は改善する。
【００３２】
特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ結合部分と（ＶＥＧＦ又は異なる標的とすることができる。）第２の標的結合部分を含む多重特異的抗体である。本開示の多重特異的抗体は、正確な鎖結合を強める変異を有するＦｃ領域を含むことができる。
【００３３】
いくつかの態様において、多重特異的抗体は、ＶＥＧＦ及びＤＬＬ４に対する親和性を有する。
【００３４】
多重特異的抗体の好ましい型は、二重可変ドメイン（「ＤＶＤ」）免疫グロブリン（「ＤＶＤ−Ｉｇ」）である。本明細書に開示されている重鎖置換が組み込まれ得る例示的なＤＶＤ−Ｉｇ重鎖可変領域は、配列番号４１３に記載され、本明細書に開示されている重鎖置換が組み込まれ得る例示的なＤＶＤ−Ｉｇ重鎖は、配列番号４１５に記載されている。本明細書に開示されている軽鎖置換が組み込まれ得る例示的なＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖可変領域は、配列番号４１４及び配列番号４３４に記載され、本明細書に開示されている重鎖置換が組み込まれ得る例示的なＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖は、配列番号４３５及び配列番号４１６に記載されている。一実施形態において、本明細書に開示されているアミノ酸置換が組み込まれ得る抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇは、配列番号４１３の重鎖可変領域と配列番号４１４又は配列番号４３４の軽鎖可変領域を有する免疫グロブリンである。別の実施形態において、本明細書に開示されているアミノ酸置換が組み込まれ得る抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇは、配列番号４１５の重鎖と配列番号４１６又は配列番号４３５の軽鎖を有する免疫グロブリンである。
【００３５】
他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、全長免疫グロブリン分子に基づき、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む、多重特異的抗体のコンポーネントであってもよい。このような構造は、限定されないが、ＩｇＧ−Ｆｖ、ＩｇＧ−（ｓｃＦｖ）２、ＤＶＤ−Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）２−（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ及び（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ−（ｓｃＦｖ）２を含むことができる。他の態様において、その抗ＶＥＧＦ断片は、ＩｇＧの断片又はＤＶＤ又はｓｃＦｖに基づいて、Ｆｃ領域を含まない多重特異的分子のコンポーネントであってもよい。Ｆｃ領域を欠損し、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片が組み込まれ得る例示的な多重特異的分子には、例えば、ｓｃＦｖ二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）及び四量体（テトラボディ）、Ｆａｂ二量体（接着ポリペプチド又はタンパク質ドメインによるコンジュゲート）及びＦａｂ三量体（化学的にコンジュゲートされている。）が挙げられる。
【００３６】
上述された置換は、参考としてベバシズマブＣＤＲ位置を使用しているが、一方、それらの置換は、ラニビズマブが特定の位置のベバシズマブからの配列において異なる場合でさえ、ラニビズマブＣＤＲ配列に組み込まれ得る。例えば、本開示のバリアントは、ＣＤＲ−Ｈ１における「Ｔ２８Ｐ」を含むことができるが、しかしながら、ラニビズマブのＫａｂａｔ  ２８は、Ｔ（ベバシズマブにおける場合）ではなく、Ｄである。それにもかかわらず、プロリン置換はまた、ラニビズマブのＣＤＲ−Ｈ１のＫａｂａｔ  ２８に組み込まれ得る。
【００３７】
上記の特徴の１つ以上を組み込んでいる本開示の例示的な抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の１３節における実施形態１−７２及び８４−１７３に記載されている。
【００３８】
本開示の抗体は、薬剤にコンジュゲートされ、抗体−薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）を形成することができる。例示的なＡＤＣは、１３節における実施形態７３及び１７４に記載され、コンジュゲートされ得る例示的な薬剤は、６．６節に記載されている。
【００３９】
本開示は、さらに、修飾された抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物を提供する。例示的な医薬組成物は、１３節における実施形態７４及び１７５に記載され、例示的な試薬及び製剤は６．９節に記載されている。いくつかの態様において、医薬組成物は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、ＶＥＧＦに対する親和性が増加し及び／又は免疫原性が減少している。
【００４０】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、該核酸を含むベクター（例えば、１３節における例示的な実施形態７６及び１７７を参照されたい。）と同様に、本明細書に提供されている（例えば、１３節における例示的な実施形態７５と１７６を参照されたい。）。さらに、組換え細胞（例えば、１３節における例示的な実施形態７７−８０及び１７８−１８１を参照されたい。）が本明細書に提供されている。このような組換え細胞には、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核及び真核宿主細胞、並びにヌクレオチド配列を発現するように操作された真核（例えば、哺乳動物）宿主細胞が提供される。宿主細胞を培養することによって、抗ＶＥＧＦ抗体を生成する方法もまた提供される（例えば、１３節における例示的な実施形態８１及び１８２を参照されたい。）。
【００４１】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、癌、網膜状態及び免疫障害（例えば、１３節における実施形態８２−８３及び１８３−１９３を参照されたい。）の治療に有用である。例示的な癌としては、限定されないが、結腸癌腫、直腸癌腫、非小細胞肺癌及び乳癌が挙げられる。例示的な網膜状態には、限定されないが、加齢性黄斑変性症（「ＡＭＤ」）、網膜静脈閉塞（「ＲＶＯ」）後の黄斑浮腫及び糖尿病性黄斑浮腫（「ＤＭＥ」）が挙げられる。例示的な免疫障害には、限定されないが、関節リウマチ、乾癬及びグレーブス病が挙げられる。
【００４２】
特定の態様において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、減少させた用量、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の少ない用量で使用することができる。
【００４３】
本出願において共通するように、その内容が他に明示していなければ、不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」並びに定冠詞「その（ｔｈｅ）」は、本出願において、１つ以上を意味するものとして使用されることに留意すべきである。さらに、本出願において共通するように、用語「又は（ｏｒ）」は、本出願において、離接接続詞「又は（ｏｒ）」又は接続詞「及び（ａｎｄ）」を意味するものとして使用される。
【００４４】
本明細書において言及されている全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている書類、行為、材料、デバイス、論文などのいずれかの検討は、本開示の文脈を提示することのみを目的とする。いずれか又は全てのこれらの事項は、従来技術の根拠の一部を形成し、及び本出願の優先日前のどこかに存在していたものとして本開示に関連する分野における共通の一般的知識であると捕らえるべきではない。
【００４５】
本開示の特徴と利点は、その実施形態に関する以下の詳細な説明からさらに明らかになる。
【００４６】
５．表及び図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ベバシズマブの重鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸の番号付けを示す表である。ＣＤＲ１−３は、それぞれ配列番号３−５として開示されている。
【図２】ベバシズマブの軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸の番号付けを示す表である。ＣＤＲ１−３は、それぞれ配列番号６−８として開示されている。
【図３】免疫原性について試験されたベバシズマブＶＬペプチドを示す表である。
【図４】免疫原性について試験されたベバシズマブＶＨペプチドを示す表である
【図５】ベバシズマブにおいて同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域を示す表である。ＣＤＲ領域を下線で示す。
【図６】ベバシズマブの免疫原性を低下させるためのＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３における候補変異を示す表である。表６におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔ番号付けに対応する。
【図７】表面プラズモン共鳴によって分析した場合、ＫＤの改善をもたらすベバシズマブにおける重鎖ＣＤＲアミノ酸置換を示す表である。Δｋｏｎは、ｋｏｎの倍数改善（変異体／ＷＴ）を意味する。Δｋｏｆｆは、ｋｏｆｆの倍数改善（ＷＴ／変異体）を意味する。ΔＫＤは、野生型と比較した変異体におけるＫＤの改善を意味する。表７におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔ番号付けに対応する。
【図８】予備結合試験が、ＶＥＧＦに対する親和性を増加させることを示すベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける変異を示す（データは示さず。）表である。表８におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔ番号付けに対応する。
【図９】予備研究がＶＥＧＦに対する親和性を増加させることを示すベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける変異を示す（データは示さず。）表である。表９におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔ番号付けに対応する。
【図１０】結合に影響を与えずに、本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける変異を示す表である。表１０におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔ番号付けに対応する。
【図１１】結合に影響を与えずに、本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ軽鎖ＣＤＲにおける変異を示す表である。表１１におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ軽鎖におけるＫａｂａｔ番号付けに対応する。
【図１２−１】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−１の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−１において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−１に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−２】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−２の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−２において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−２に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−３】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−３の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−３において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−３に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−４】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−４の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−４において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−４に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−５】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−５の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−５において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−５に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−６】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−６の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−６において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−６に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−７】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−７の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−７において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−７に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−８】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−８の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−８において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−８に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１２−９】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１２−９の各行は、異なる公知のバリアントを含む。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１２−９において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−９に記載される。ＣＤＲ−Ｈ１列は、ＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を与える。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示されない。この部分配列は、配列番号４１１に対応する。ＣＤＲ−Ｈ１における公知の変異は、この部分配列との関連で示されるが、変異は、全長ＣＤＲとの関連で存在することに留意されたい。
【図１３】本開示の抗体に導入され得るベバシズマブ軽鎖ＣＤＲにおける公知の変異を示す表である。表１３の各行は、異なる公知のバリアントを示す。それぞれのバリアントについて、公知のＣＤＲ配列は網かけで示される。表１３において特定されるそれぞれのバリアントの配列識別子は、表２０−１０に記載される。
【図１４】免疫原性について試験されたベバシズマブＣＤＲ２  ＶＨペプチドを示す表であり、この場合、配列番号６２から不変の残基は、空欄によって示される。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果もまた示される。
【図１５】免疫原性について試験されたベバシズマブＣＤＲ３  ＶＨペプチドを示す表であり、この場合、配列番号７４から不変の残基は、空欄によって示される。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果もまた示される。
【図１６】免疫原性について試験されたベバシズマブＣＤＲ２  ＶＬペプチドを示す表であり、この場合、配列番号２５から不変の残基は、空欄によって示される。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果もまた示される。
【図１７】ベバシズマブにおける３つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの選択されたエピトープ修飾を示す表である。
【図１８】単一可変領域変異体とこれらの付随する平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す表である。
【図１９】組み合わせた可変領域変異体とこれらの付随するＥＣ５０を示す表である。
【図２０−１】表１２−１に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−２】表１２−２に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−３】表１２−３に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−４】表１２−４に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−５】表１２−５に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−６】表１２−６に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−７】表１２−７に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−８】表１２−８に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−９】表１２−９に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２０−１０】表１３に列挙されたベバシズマブバリアントのＣＤＲに対応する、知られている場合にその配列番号を示す表である。Ｎ／Ａは、不明のＣＤＲ配列を示す。
【図２１】それぞれが変異ベバシズマブ重鎖ＣＤＲを含む、抗ＶＥＧＦ  ＩｇＧ、ＳＳ  ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＳＬ  ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ免疫グロブリン（Ｉｇ）に関する結合データを示す表である。表２１におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔの番号付けに対応する。
【図２２】変異を含まないＳＳ  ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇと比較して、ＳＳ  ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇと類似した又は減少したＶＥＧＦ親和性をもたらす、ベバシズマブＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３における変異を示す表である。表２２におけるアミノ酸の番号付けは、ベバシズマブ重鎖におけるＫａｂａｔの番号付けに対応する。
【図２３】例示的な重鎖と軽鎖抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖可変領域、及び本明細書に開示されているアミノ酸置換が導入され得る例示的な抗ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖と軽鎖を示す表である。ＣＤＲは太字で示され、リンカー配列は下線で示され、定常領域は斜字体で示されている。例示的な重鎖可変領域は、短いリンカーを有し、配列番号４１３として示されている。例示的な軽鎖可変領域は、短いリンカーと長いリンカーを有し、それぞれ、配列番号４１４と配列番号４３４として示されている。例示的な重鎖は、短いリンカーを有し、配列番号４１５として示されている。例示的な軽鎖は、短いリンカーと長いリンカーを有し、それぞれ、配列番号４３５と配列番号４１６として示される。
【図２４】発現及び親和性データ、並びにベバシズマブＶＨ（表２４中の「ＷＴ」）及びラニビズマブＶＨ（表２４中の「Ｌｕｃ」）と比較して、ＶＥＧＦのその受容体への結合の阻害及びＣ１からＣ１３として示される置換基の組み合わせを有するバリアントに関するＶＥＧＦにより誘導されたＨＵＶＥＣ増殖の阻害における改善を要約する表である。
【図２５】ＩｇＧ及びＤＶＤ−ＩｇフォーマットにおけるベバシズマブＶＨ（表２５中の「ＷＴ」）又はラニビズマブＶＨ（表２５中の「Ｌｕｃ」）に関する比較親和性データを要約する表である。「ＷＴ」と「Ｌｕｃ」対照の両方は、ベバシズマブＶＬ配列（配列番号２）を有した。ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットは、ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇ分子であり、ＶＥＧＦ  ＶＨ配列が内部ドメインに存在し、ＳＬバージョン及びＳＳバージョンがある。
【図２６】ＳＬリンカーを含有するＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇとの関連で、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２及びＣ１３として示される置換の組み合わせを有するバリアントに関する親和性データを要約する表であり、ＶＥＧＦ  ＶＨ配列は内部ドメインに存在した。このアッセイの対照は、ベバシズマブ（表２６中の「ＷＴ」）又はラニビズマブ（表２６中の「Ｌｕｃ」）のＣＤＲ配列を含有するＤＶＤ−Ｉｇ分子であった。空白行によって分けられた２つの異なるアッセイからの結果を示す。
【図２７Ａ】それぞれ、ベバシズマブ重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号１及び配列番号２を示す図であり、ＣＤＲ領域を太字で示す。
【図２７Ｂ】ベバシズマブのＣＤＲ配列及び対応する配列識別子を示す図である。
【図２７Ｃ】それぞれ、定常領域を含有する、ラニビズマブ重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である配列番号９及び配列番号１０を示す図であり、ＣＤＲ領域を太字下線で示す。重鎖可変領域は、配列「ＶＴＶＳＳ」で終了し、重鎖定常領域は、配列「ＡＳＴＫＧＰ」で開始する。軽鎖可変領域は、配列「ＶＥＩＫＰ」で終了し、軽鎖定常領域は、配列「ＴＶＡＡＰＳ」で開始する。
【図２７Ｄ】ラニビズマブのＣＤＲ配列及び対応する配列識別子を示す図である。
【図２８Ａ】ベバシズマブＶＬペプチド応答を示す図である。図２Ａは、刺激指数が２．９５以上である、それぞれのＶＬペプチドに応答したドナーの百分率を示す。Ｎ＝９９人のドナー。
【図２８Ｂ】ベバシズマブＶＬペプチド応答を示す図である。図２Ｂは、ペプチド毎に全９９人のドナーの平均刺激指数±標準誤差を示す。
【図２９Ａ】ベバシズマブＶＨペプチド応答を示す図である。図３Ａは、刺激指数が２．９５以上である、それぞれのＶＨペプチドに応答したドナーの百分率を示す。Ｎ＝９９人のドナー。
【図２９Ｂ】ベバシズマブＶＨペプチド応答を示す図である。図３Ｂは、ペプチド毎に全９９人のドナーの平均刺激指数±標準誤差を示す。
【図３０Ａ】変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す図である。未修飾の親エピトープ配列に対する平均応答は、白抜き記号で示される。大きい丸は、表１７において示される選択された変化を示す。図４Ａは、ＶＨ  ＣＤＲ２ペプチドに指向される。
【図３０Ｂ】変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す図である。未修飾の親エピトープ配列に対する平均応答は、白抜き記号で示される。大きい丸は、表１７において示される選択された変化を示す。図４Ｂは、ＶＨ  ＣＤＲ３ペプチドに指向される。
【図３０Ｃ】変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す図である。未修飾の親エピトープ配列に対する平均応答は、白抜き記号で示される。大きい丸は、表１７において示される選択された変化を示す。図４Ｃは、ＶＬ  ＣＤＲ２ペプチドに指向される。
【図３１】例示的なＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの概略図であり、抗ＤＬＬ４可変ドメインは、分子の外部にあり、抗ＶＥＧＦ可変ドメインは、分子の内部にある。分子間のジスルフィド結合は示されていないが、実際のタンパク質には含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
６．詳細な説明
６．１  抗ＶＥＧＦ抗体
本開示は、抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。特に指定しない限り、用語「抗体」（Ａｂ）は、特定抗原と特異的に結合する又は該抗原に対して免疫反応性の免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作された抗体及び他の修飾型抗体を含み、上記修飾型抗体としては、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重、三重及び四重特異的抗体、ダイアボディ、トリアボディ並びにテトラボディ）、並びに抗体の抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖ断片が挙げられる。さらに、他に特定しない限り、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、インタクトな分子、並びにタンパク質に特異的に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、インタクトな抗体のＦｃ断片を欠損し、動物の循環からより迅速に排出され、インタクトな抗体よりも非特異的組織結合が少なくてもよい（Ｗａｈｌら、１９８３年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６頁）。
【００４９】
用語「ｓｃＦｖ」は、従来の抗体由来の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが連結して１本鎖を形成した１本鎖Ｆｖ抗体を意味する。
【００５０】
「ＶＨ」とは、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はＦａｂの重鎖を含む。「ＶＬ」とは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂの軽鎖を含む。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の標的に対して結合特異性を示すが、一方、免疫グロブリンは、抗体と、標的特異性を欠損している他の抗体様分子の両方を含む。天然の抗体及び免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、多数の定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、カルボキシ末端に定常ドメインを有する。
【００５１】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディであり得る。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、この場合、それぞれのポリペプチド鎖は、リンカーによって接続されたＶＨ及びＶＬドメインを含むが、リンカーは短すぎて、同じ鎖上で２つのドメイン間を対形成することができず、したがって、別のポリペプチド鎖上で相補ドメインを用いて、それぞれのドメインを対形成させる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８頁、及びＰｏｌｊａｋら、１９９４頁、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３頁）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成に起因するダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製するために使用することができる。同様に、トリボディ及びテトラボディは、それぞれ、３つ及び４つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、それぞれ、３つ及び４つの抗原結合部位を形成し、それらは同一である又は異なっていてもよい。
【００５２】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒトＶＥＧＦに結合し、細胞におけるＶＥＧＦ受容体活性を阻害する。
【００５３】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、順に、抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）としても知られている。）及び／又はラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）としても知られている。）のＣＤＲに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００５４】
ＣＤＲは、軽鎖と重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域としても知られている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当該技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を規定するアミノ酸位置／境界は、状況と当該技術分野において公知の様々な定義により異なる場合がある。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ハイブリッド超可変位置とみなすことができ、この場合、これらの位置は、ある基準群下で超可変領域の内側にあるとみなすことができるが、一方、別の基準群下で超可変領域の外側にあるとみなすことができる。これらの位置の１つ以上が、拡張超可変領域に見出される場合もある。本開示は、これらのハイブリッド超可変位置に修飾を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート構造をとる４つのＦＲ領域を３つのＣＤＲで連結して、βシート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。それぞれの鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順でＦＲ領域により極近接してつなぎ合わされ、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．１９８７年参照））。本明細書で使用するとき、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、特に指定しない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基番号付けシステムに従って行われる。
【００５５】
ベバシズマブの重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２によって示される。また、重鎖及び軽鎖可変領域の配列はまた図１Ａに示される。ベバシズマブのＣＤＲの配列及びこれらの対応する識別子は、図１Ｂに示される。配列番号１又は配列番号２をコードする任意のヌクレオチド配列は、本開示の組成物と方法において使用することができる。
【００５６】
ラニビズマブの重鎖及び軽鎖の配列は、それぞれ、配列番号９及び配列番号１０によって示される。重鎖及び軽鎖の配列はまた図１Ｃに示される。重鎖可変領域は、配列「ＶＴＶＳＳ」で終了し、重鎖定常領域は、配列「ＡＳＴＫＧＰ」で開始する。軽鎖可変領域は、配列「ＶＥＩＫＰ」で終了し、軽鎖定常領域は、配列「ＴＶＡＡＰＳ」で開始する。ラニビズマブのＣＤＲの配列及びこれらの対応する識別子は、図１Ｄに示される。配列番号９又は配列番号１０又はこれらの可変領域をコードする任意のヌクレオチド配列は、本開示の組成物及び方法において使用することができる。
【００５７】
本開示は、さらに、ベバシズマブ及びラニビズマブのＣＤＲ配列に関連するＣＤＲ配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体断片を提供する。用語「抗体断片」とは、全長抗体の一部を意味し、概して、標的結合領域又は可変領域を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片が挙げられる。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを非共有的に緊密に結合した二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。この構成において、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に標的結合部位を規定する。多くの場合、６つのＣＤＲが、抗体に対する標的結合特異性を付与する。しかしながら、場合によっては、１つの可変ドメイン（又は標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも標的を認識し、結合する能力を有することができる。「１本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、１つのポリペプチド鎖において、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。概して、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ｓｃＦｖが標的結合に望ましい構造を形成できるようにＶＨドメインとＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含む。「単一ドメイン抗体」は、標的に対して十分な親和性を示す単一のＶＨ又はＶＬドメインで構成される。具体的な実施形態において、単一ドメイン抗体は、ラクダ抗体である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８頁を参照されたい。）。
【００５８】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む、数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されている点がＦａｂ断片と相違する。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の開裂により生成される。抗体断片の追加の化学的カップリングは、当業者に公知である。
【００５９】
特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、モノクローナル抗体である。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用するとき、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核、原核又はファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を意味し、抗体を作製する方法を意味しない。本開示に関連して有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術又はこれらの組み合わせの使用を含む当該技術分野において公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む。
【００６０】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、キメラ抗体であってもよい。用語「キメラ」抗体は、本明細書で使用するとき、ラット又はマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を意味する。キメラ抗体を生成する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０２−７頁；Ｏｉら、１９８６年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２年；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；及び第４，８１６３９７号を参照されたい。
【００６１】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト化抗体であり得る。「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の標的結合サブドメイン）である。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、この場合、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体ヒト化方法は、当該技術分野において公知である。例えば、いずれもが全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７頁；Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；及び第６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９−４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４頁；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３頁；並びに米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。
【００６２】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト抗体であり得る。完全「ヒト」抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト患者の治療処置に望ましいと考えられる。本明細書で使用するとき、「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、及びヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体又は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、ファージディスプレイ法を含む当該技術分野において公知の様々な方法によって作製することができる。それぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；及びＷＯ９１／１０７４１を参照されたい。また、機能的内在性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗体を生成することもできる。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；及び第５，９３９，５９８号を参照されたい。さらに、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの企業に委託し、上記と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供してもらうことができる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を使用して作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用し、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３頁）。
【００６３】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、霊長類化抗体であり得る。用語「霊長類化抗体」は、サル可変領域とヒト定常領域を含む抗体を意味する。霊長類化抗体を生成する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５８，５７０号；第５，６８１，７２２号；及び第５，６９３，７８０号を参照されたい。
【００６４】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、多重特異的抗体、例えば、二重特異的抗体、三重特異的抗体又は四重特異的抗体であってもよい。
【００６５】
特定の態様において、多重特異的抗体は、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ  ４（６）：６５３−６６３頁によって報告されているように、多重特異的抗体における正しい鎖結合を強化するＦｃ変異を含むことができる。
【００６６】
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、多くの場合、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００６７】
特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、全長免疫グロブリン分子に基づき、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む、多重特異的抗体のコンポーネントであり得る。このような構造としては、限定されないが、ＩｇＧ−Ｆｖ、ＩｇＧ−（ｓｃＦｖ）２、ＤＶＤ−Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）２−（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ及び（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ−（ｓｃＦｖ）２が挙げられる。ＩｇＧ−（ｓｃＦｖ）２の場合、ｓｃＦｖは、重鎖又は軽鎖のいずれかのＮ末端又はＣ末端のいずれかに結合され得る。Ｆｃ領域を含み、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片が組み込まれ得る、例示的な多重特異的分子は、それぞれの内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２０１２年、ｍＡｂｓ  ４（２）：１８２−１９７頁、Ｙａｚａｋｉら、２０１３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２６（３）：１８７−１９３頁、及びＧｒｏｔｅら、２０１２年、ｉｎ  Ｐｒｏｅｔｚｅｌ  ＆  Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ（ｅｄｓ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．９０１、ｃｈａｐｔｅｒ  １６：２４７−２６３頁（ＤＯＩ  １０．１００７／９７８−１−６１７７９−９３１−０＿０１６）によって概説されている。他の態様において、それらの抗ＶＥＧＦ断片は、ＩｇＧの断片又はＤＶＤ又はｓｃＦｖに基づいて、Ｆｃ領域を含まない多重特異的分子のコンポーネントであってもよい。Ｆｃ領域を欠損し、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片が組み込まれ得る例示的な多重特異的分子、例えば、ｓｃＦｖ二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）及び四量体（テトラボディ）、Ｆａｂ二量体（接着ポリペプチド又はタンパク質ドメインによるコンジュゲート）及びＦａｂ三量体（化学的にコンジュゲートされている。）は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｒｉａｕ、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：１２９−１３４頁によって報告されている。本開示において、結合特異性の１つは、ＶＥＧＦに指向され得て、他は、任意の他の抗原に指向され、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスによってコードされたエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質又は細菌表面タンパク質などが挙げられる。特定の実施形態において、本開示の抗体は、ＶＥＧＦとＣＤ３の両方に対する結合特異性を有する二重特異的抗体である。別の具体的な実施形態において、本開示の抗体は、ＶＥＧＦとＤＬＬ４の両方に対する結合特異性を有する二重特異的抗体である。
【００６８】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、二重可変ドメイン（「ＤＶＤ」）免疫グロブリン（「ＤＶＤ−Ｉｇ」）であってもよい（全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１頁を参照されたい。）。ＤＶＤ−Ｉｇは、四価の二重標的単一剤を作製するために、リンカーを介した２つのモノクローナル抗体の標的結合可変ドメインを含む。本開示のＤＶＤの軽鎖において使用するための適切なリンカーには、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１頁の３０頁の表２．１において特定されるもの：短いκ鎖リンカーＡＤＡＡＰ（配列番号４１７）（マウス）及びＴＶＡＡＰ（配列番号４１８）（ヒト）；長いκ鎖リンカーＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰ（配列番号４１９）（マウス）及びＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号４２０）（ヒト）；短いλ鎖リンカーＱＰＫＡＡＰ（配列番号４２１）（ヒト）；長いλ鎖リンカーＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号４２２）（ヒト）；ＧＳ−短いリンカーＧＧＳＧＧ（配列番号４２３）、ＧＳ−中間リンカーＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号４２４）及びＧＳ−長いリンカーＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２５）（全てのＧＳリンカーはマウス及びヒトである。）が含まれる。本開示のＤＶＤの重鎖において使用するための適切なリンカーには、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１頁の３０頁の表２．１において特定されるもの：短いリンカーＡＫＴＴＡＰ（配列番号４２６）（マウス）及びＡＳＴＫＧＰ（配列番号４２７）（ヒト）；長いリンカーＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号４２８）（マウス）及びＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４２９）（ヒト）；ＧＳ−短いリンカーＧＧＧＧＳＧ（配列番号４３０）、ＧＳ−中間のリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３１）及びＧＳ−長いリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３２）（全てのＧＳリンカーはマウス及びヒトである。）が含まれる。好ましくは、ヒトリンカーは、ヒト又はヒト化ＤＶＤ−Ｉｇに使用される。本開示のＤＶＤ−Ｉｇ分子において使用され得るリンカーの他の例としては、限定されないが、ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏら、２０１１年、ｍＡｂｓ  ３：４８７−４９４頁において報告されているものが挙げられる。
【００６９】
本開示において、ＤＶＤ−Ｉｇは、ＶＥＧＦ及び第２の標的に指向される。一実施形態において、第２の標的はＤＬＬ４である。抗ＶＥＧＦコンポーネントは、ベバシズマブ又はラニビズマブのＣＤＲと比較して、本明細書に開示されている１つ以上の置換を有するＣＤＲを含む。本開示のＤＶＤ−Ｉｇの設計に有用な抗ＤＬＬ４抗体及び抗体断片は、２０１１年９月８日に公開されたＣｈｅｎらによる、米国特許出願公開第２０１１／０２１７２３７号（全体として参照により本明細書に組み込まれる。）において報告されている。他の実施形態において、第２の標的は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、又は２０１１年２月２４日に公開されたＴａｒｉｑらによる米国特許出願公開第２０１１／０４４９８０号（全体として参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている任意の他の標的である。
【００７０】
ＤＶＤ免疫グロブリンの標的結合ドメインは、典型的には、内部及び外部Ｆｖドメインを形成するために別のものの上部に積層された１つの可変ドメインとともに、タンデムに配列される。ＶＥＧＦ標的可変ドメインは、ＤＶＤ−Ｉｇの内部又は外部Ｆｖドメインとして配列され得る。具体的な実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇは、内部Ｆｖドメインとして配列されたＶＥＧＦ標的可変ドメインと、外部Ｆｖドメインとして配列されたＤＬＬ４標的可変ドメインを有する。図５は、ＶＥＧＦ標的内部ＦｖドメインとＤＬＬ４標的外部Ｆｖドメインを有する、本開示のＤＶＤ−Ｉｇの概略図を示す。
【００７１】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、誘導体化抗体を含む。例えば、限定されないが、誘導体化抗体は、典型的には、グルコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質的開裂、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結（抗体コンジュゲートの検討については、６．６節を参照されたい。）などによって修飾されている。多数の化学修飾の任意のものは、限定されないが、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成を含む公知の技術によって実施することができる。さらに、誘導体は、例えば、ａｍｂｒｘ技術（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ、２００６年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１−２頁を参照されたい。）を使用して、１つ以上の非天然アミノ酸を含むことができる。
【００７２】
本開示のなお別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、対応する野生型配列に対して少なくとも１つの定常領域を媒介した生物学的エフェクター機能を変更するように、配列が修飾されている抗体又は抗体断片であってもよい。
【００７３】
例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、修飾されて、非修飾抗体に対して少なくとも１つの定常領域を媒介した生物学的エフェクター機能を低下させることができ、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合性を低下させることができる。ＦｃγＲ結合性は、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域で抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることによって低下させることができる（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１頁；及びＬｕｎｄら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２頁を参照されたい。）。また、抗体のＦｃγＲ結合能の低下は、オプソニン化、食作用及び抗原依存性細胞傷害作用（「ＡＤＣＣ」）などのＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能も低下させることができる。
【００７４】
他の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、修飾されて、非修飾抗体に対して少なくとも１つの定常領域を媒介した生物学的エフェクター機能を獲得し又は改善することができ、例えば、ＦｃγＲ相互作用を強化することができる（例えば、ＵＳ２００６／０１３４７０９を参照されたい。）。例えば、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、対応する野生型定常領域よりも高い親和性で、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡと結合する定常領域を有することができる。
【００７５】
従って、本開示の抗体は、オプソニン化、食作用又はＡＤＣＣの増加又は減少を生じるように生物学的活性の変更を有することができる。このような変更は、当該技術分野において公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低下させる抗体の修飾は、米国特許第５，８３４，５９７号に記載されている。例示的なＡＤＣＣ低下バリアントは、米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示される「変異体３」に対応し、この場合、残基２３６は欠失され、残基２３４、２３５及び２３７（ＥＵ番号付けを使用している。）はアラニンで置換されている。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、フコース濃度が低い又はフコースを含まない。フコースを欠損している抗体は、特に抗体用量が低い場合に、ＡＤＣＣ活性の増加に相関している。Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３頁を参照されたい。フコース不含抗体を調製する方法としては、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）で増殖させることが挙げられる。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素であるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする、低レベルのＦＵＴ８  ｍＲＮＡを発現する。
【００７７】
なお別の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、例えば、胎児性Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることによって、ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増加又は低下させるように修飾した抗体又は抗体断片であってもよい（例えば、ＷＯ２００５／１２３７８０参照）。特定の実施形態において、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８のうちの少なくとも１つが、単独で又はこれらの任意の組み合わせで、例えば２５０位と４２８位、又は２５０位と３１４位、又は３１４位と４２８位、又は２５０位と３１４位と４２８位で、２５０位と４２８位の特定の組み合わせで置換するように、ＩｇＧクラスの抗ＶＥＧＦ抗体は変異される。２５０位では、置換するアミノ酸残基は、スレオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。３１４位では、置換するアミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。４２８位では、置換するアミノ酸残基は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。適切なアミノ酸置換の特定の組み合わせは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１に記載されており、同表は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。このような変異は、ＦｃＲｎに対する抗体の結合性を増加させ、抗体を分解から保護し、その半減期を延長させる。
【００７８】
Ｆｃ領域は、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ  ４（６）：６５３−６６３頁によって報告されているように、多重特異的抗体における正しい鎖結合を強めるＦｃ変異を含むことができる。
【００７９】
なお他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、Ｊｕｎｇ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０（９）：９５９−９６６頁；Ｙａｚａｋｉら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７（５）：４８１−９頁．Ｅｐｕｂ  ２００４年  Ａｕｇ  １７；及びＵＳ２００７／０２８０９３１に記載されているように、その超可変領域の１つ以上に１つ以上のアミノ酸が挿入されている。
【００８０】
様々な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、異種宿主における発現を増加するように修飾された抗体又は抗体断片であってよい。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、異種宿主細胞における発現及び／又は異種宿主細胞からの分泌を増加するように修飾されている抗体又は抗体断片であってもよい。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、大腸菌などの細菌における発現を増加するように修飾されている。他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、酵母における発現を増加するように修飾されている（Ｋｉｅｋｅら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５６５１−５６５６頁）。なお他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、昆虫細胞における発現を増加するように修飾されている。更なる実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞における発現を増加するように修飾されている。
【００８１】
特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、生成中の抗体の安定性を増加するように修飾されている抗体又は抗体断片であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体又はこれらの断片は、アスパラギン又はグルタミンなどの、非酵素脱アミド化し易い１つ以上のアミノ酸を脱アミド化しないアミノ酸で置換するように修飾することができる（Ｈｕａｎｇら、２００５年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７：１４３２−１４３９頁）。他の実施形態において、抗体又はこれらの断片は、メチオニン、システイン又はトリプトファンなどの酸化し易い１つ以上のアミノ酸を、酸化しにくいアミノ酸で置換するように修飾することができる。さらに他の実施形態において、抗体又はこれらの断片は、アスパラギン又はグルタミン酸などの環化し易い１つ以上のアミノ酸を、環化しにくいアミノ酸で置換するように修飾することができる。
【００８２】
６．２  核酸及び発現系
本開示は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸分子及び宿主細胞を包含する。
【００８３】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子を組換え発現させることによって調製することができる。抗体を組換え発現させるために、宿主細胞は、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１つ以上の組換え発現ベクターでトランスフェクトされ、それにより、軽鎖及び重鎖は宿主細胞で発現され、場合により宿主細胞が培養される培地に分泌させ、その培地から抗体が回収され得る。標準組換えＤＮＡ法は、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を獲得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを宿主細胞に導入するために使用され、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ．、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９８９年）及び米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法が挙げられる。
【００８４】
一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、１つ以上のＣＤＲにおける変化を除き、ベバシズマブ又はラニビズマブと同様である。別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、１つ以上のフレームワーク領域における変化を除き、ベバシズマブ又はラニビズマブと同様である。なお別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、１つ以上のＣＤＲと１つ以上のフレームワーク領域における変化を除き、ベバシズマブ又はラニビズマブと同様である。このような抗体は、本明細書では、「ベバシズマブ関連」又は「ラニビズマブ関連」配列を有すると総称し、単に本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と呼ぶ場合もある。抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を生じさせるために、最初に、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片が得られる。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、軽鎖及び重鎖可変配列をコードする生殖系列ＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅及び修飾によって得ることができる。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、当該技術分野において公知である（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖系列配列データベースを参照されたい；さらに、それぞれの内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６−１９８頁；及びＣｏｘら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁を参照されたい。）。ベバシズマブ又はラニビズマブの重鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片が合成され、突然変異誘発用鋳型として使用され、常法の突然変異誘発技術を使用して、本明細書に記載するようにバリアントを生じさせることもでき；あるいは、該バリアントをコードするＤＮＡ断片は、直接合成することもできる。
【００８５】
抗ＶＥＧＦ  ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、標準組換えＤＮＡ技術によってさらに操作されてもよい。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに維持されるように、２つのＤＮＡ断片が接続されることを意味することが意図される。
【００８６】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び場合によりＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい。）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよいが、特定の実施形態において、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と操作可能に連結することができる。
【００８７】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を参照されたい。）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であってよいが、特定の実施形態において、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＬ領域とＶＨ領域を柔軟なリンカーで接続して、ＶＨ配列とＶＬ配列を連続する１本鎖タンパク質として発現させることができるように、ＶＨをコードするＤＮＡ断片とＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号４１２）をコードする別の断片と操作可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６年；Ｈｕｓｔｏｎ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４頁を参照されたい。）。
【００８８】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体を発現させるために、上記のように得られた部分的又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写制御配列及び翻訳制御配列と操作可能に連結されるように、発現ベクターに挿入される。この文脈で、用語「操作可能に連結される」は、ベクター内の転写制御配列及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するというそれらの意図された機能を発揮するように、抗体遺伝子がベクターにライゲートされることを意味することが意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、又はより典型的には、両方の遺伝子が同一の発現ベクターに挿入される。
【００８９】
抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは、すでに抗体定常領域配列を有してもよい。例えば、抗ＶＥＧＦ  ＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数又は複数）に操作可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に連結されるように、それぞれ、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに挿入することである。さらに又は代用として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子はベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であってもよい。
【００９０】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含することが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０年）に記載されている。当業者には、調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換させるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどの因子に依存してもよいことが認められる。哺乳動物宿主細胞発現に適切な調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルスエレメントが挙げられ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメント及びこれらの配列の更なる説明について、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【００９１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの更なる配列を有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号及び第５，１７９，０１７号を参照されたい。）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。適切な選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いたＤＨＦＲ−宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。軽鎖及び重鎖を発現させるため、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（単数又は複数）は、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な語形は、外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために、一般に使用されている多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど、を包含することが意図される。
【００９２】
原核又は真核宿主細胞のいずれかで本開示の抗体を発現させることができる。特定の実施形態において、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を最適に分泌させるために、抗体の発現は、真核細胞、例えば哺乳動物宿主細胞において行われる。本開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０頁に記載されているＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含み、例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、１９８２年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される。）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞及びＳＰ２／０細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって、宿主細胞を培養することによって生成させる。抗体は、標準タンパク質精製法を用いて、培地から回収することができる。また、宿主細胞は、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などのインタクトな抗体の部分を生成するために使用することができる。上記手順の変形が本開示の範囲に含まれることは理解される。例えば、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。
【００９３】
組換えＤＮＡ技術は、ＶＥＧＦへの結合に不要な軽鎖と重鎖のいずれか又はこれらの両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために使用されてもよい。このような切断型ＤＮＡ分子から発現される分子もまた本開示の抗体に包含される。
【００９４】
さらに、標準化学架橋法によって、本開示の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が本開示の抗体であり、他方の重鎖と軽鎖がＶＥＧＦ以外の抗原に特異的である二機能性抗体を生成させることができる。また、二機能性抗体は、二機能性抗体をコードするように操作された核酸を発現させることによって作製することもできる。
【００９５】
特定の実施形態において、二重特異的抗体、即ち、同一結合部位を用いてＶＥＧＦ及び非関連抗原に結合する抗体は、軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸残基を変異させることによって生成させることができる。様々な実施形態において、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦなどの２つの抗原に結合する二重特異的抗体は、抗原結合部位の周辺のアミノ酸残基を変異させることによって生成させることができる（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１６１４頁）。二機能性抗体は、二重特異的抗体をコードするように操作された核酸を発現させることによって作製することができる。
【００９６】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の組換え発現のために、宿主細胞は、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと、軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つの本開示の発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ得る。典型的には、２つのベクターは、それぞれ、別々の選択マーカーを含有する。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターが使用され得る。
【００９７】
なお他の実施形態において、抗体（多重特異的抗体を含む）及びこれらの断片は、細菌又は哺乳動物の細胞溶解物を用いたインビトロ翻訳、続く、分子シャペロンの添加によって支援されるタンパク質の折り畳み又は集合によって生成され得る。このような方法は、例えば、Ｙｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ、４：２１７−２２５頁によって報告されている。
【００９８】
抗ＶＥＧＦ抗体の１つ以上の部分をコードする核酸が生成されると、更なる変更又は変異が、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下した抗体、又は異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を生成するように、コーディング配列に導入することができる。
【００９９】
また、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、１９８４年  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．に記載されている方法によって）生成させることもできる。バリアント抗体はまた、無細胞プラットフォームを用いて生じさせることもできる（例えば、Ｃｈｕら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  Ｎｏ．２（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を参照されたい。）。
【０１００】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体が組換え発現によって生成されると、免疫グロブリン分子の精製方法として当該技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡ又はプロテインＧ選択後のＶＥＧＦに対するアフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差によって、又は任意の他の標準タンパク質精製技術によって、精製することができる。さらに、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、精製を促進させるために、本明細書に記載されている又は他には当該技術分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合させることができる。
【０１０１】
単離されると、抗ＶＥＧＦ抗体は、所望により、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ、ｅｄｓ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８０年）を参照されたい。）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のゲル濾過クロマトグラフィーによって、更に精製することができる。
【０１０２】
６．３  抗ＶＥＧＦ抗体の生物学的活性
特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦへの結合に関してベバシズマブ又はラニビズマブと競合し、又はＶＥＧＦ活性を中和するなどの特定の生物学的活性を有する。
【０１０３】
したがって、特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦへの結合に関してベバシズマブ又はラニビズマブと競合する。ＶＥＧＦへの結合に関して競合する能力は、競合アッセイを用いて試験することができる。競合アッセイの一例において、ＶＥＧＦは、プレートと（例えば、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ濃度で一晩４℃にて）ＶＥＧＦ溶液を接触させることによって、固体表面、例えば、マイクロウェルプレートに付着される。プレートは、（例えば、ＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で）洗浄され、（例えば、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬで）ブロッキングされる。ＥＬＩＳＡ緩衝液（例えば、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中の、飽和未満量のビオチン化ベバシズマブ（８０ｎｇ／ｍＬ）又は等量のビオチン化ラニビズマブと非標識ベバシズマブ（又は場合によりラニビズマブ）（「参照」抗体）又は競合する抗ＶＥＧＦ抗体（「試験」抗体）抗体の混合物は、（例えば２．８μｇ／ｍＬ、８．３μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬの濃度に）連続希釈されて、ウェルに添加され、プレートは、穏やかに振とうしながら１時間インキュベートされる。プレートは洗浄され、ＥＬＩＳＡ緩衝液で希釈された１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰでコンジュゲートされたストレプトアビジンが、それぞれのウェルに添加され、プレートは１時間インキュベートされる。プレートは洗浄され、結合した抗体は、基質（例えば、ＴＭＢ、Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）の添加によって検出された。反応は、停止緩衝液（例えば、Ｂｉｏ  ＦＸ  Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）の添加によって終了され、マイクロプレートリーダー（例えば、ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、６５０ｎｍで吸光度が測定される。また、この競合アッセイの変形は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体とベバシズマブ又はラニビズマブ間の競合を試験するために使用することもできる。例えば、特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は参照抗体として使用され、ベバシズマブ又はラニビズマブは試験抗体として使用される。さらに、可溶性ＶＥＧＦの代わりに、培養細胞（例えば、哺乳動物細胞）の表面で発現される膜結合型ＶＥＧＦを使用することもできる。競合アッセイの他のフォーマットは、当該技術分野において公知であり、利用することができる。
【０１０４】
様々な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体を０．０８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの濃度又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の濃度（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用する場合、抗ＶＥＧＦ抗体は、標識されたベバシズマブ又はラニビズマブの結合を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の百分率だけ低下させる（例えば、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、標識されたベバシズマブ又はラニビズマブの結合を５０％から７０％低下させる。）。
【０１０５】
他の実施形態において、ベバシズマブ又はラニビズマブを０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬの濃度又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の濃度（例えば２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用する場合、ベバシズマブ又はラニビズマブは、本開示の標識された抗ＶＥＧＦ抗体の結合を少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の百分率だけ低下させる（例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブは、本開示の標識された抗ＶＥＧＦ抗体の結合を５０％から７０％低下させる。）。
【０１０６】
他の態様において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、細胞増殖又は細胞移動などのインビトロアッセイの範囲でＶＥＧＦ活性を阻害（又は中和）する。例えば、一実施形態において、アッセイされるＶＥＧＦ活性は、内皮細胞（「ＥＣ」）増殖の誘導である（例えば、Ｑｉｎら、２００６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：３２５５０−３２５５８頁のプロトコールを参照されたい。）。別の実施形態において、アッセイされるＶＥＧＦ活性は、ＥＣ移動の誘導である（例えば、Ｌｉａｎｇら、２００７年、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：３２９−３３３頁に記載されているインビトロのスクラッチアッセイプロトコールを参照されたい。）。具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦによって刺激される増殖及び細胞移動と、不死化されたウシ網膜内皮細胞におけるＶＥＧＦ１６５によって誘導されるタイトジャンクションタンパク質の脱局在化を反転させる能力について試験される（Ｄｅｉｓｓｌｅｒら、２００８年、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ９２：８３９−８４３頁）。なお別の実施形態において、ＶＥＧＦ活性の中和は、レポーターアッセイを用いてアッセイされる（例えば、Ｙｏｈｎｏら、２００３年，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２６（４）：４１７−２０頁及び米国特許第６，７８７，３２３号を参照されたい。）。
【０１０７】
ＶＥＧＦ中和アッセイの他のフォーマットは当該技術分野において公知であり、使用することができる。
【０１０８】
様々な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体を２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬの濃度、又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の濃度（例えば、１μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用する場合、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦを少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の百分率だけ中和する（例えば、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性を５０％から７０％中和する。）。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦの中和に関してベバシズマブ若しくはラニビズマブの少なくとも０．７倍有効、０．８倍有効、少なくとも０．９倍有効、少なくとも１倍有効、少なくとも１．１倍有効、少なくとも１．２５倍有効、少なくとも１．５倍有効、少なくとも２倍有効、少なくとも５倍有効、少なくとも１０倍有効、少なくとも２０倍有効、少なくとも５０倍有効、少なくとも１００倍有効、少なくとも２００倍有効、少なくとも５００倍有効、少なくとも１０００倍有効であり、又はＶＥＧＦの中和に関してベバシズマブ若しくはラニビズマブに比較して上記数値の任意の組み合わせを両端とする範囲の効力を有する（例えば、ＶＥＧＦの中和に関してベバシズマブ若しくはラニビズマブの０．９倍から５倍有効又はベバシズマブ若しくはラニビズマブの２倍から５０倍有効である。）。
【０１１０】
６．４  抗ＶＥＧＦ抗体の動態特性
特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに対する高い結合親和性を有する。具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、特定の結合速度定数（ｋｏｎ又はｋａ値）、解離速度定数（ｋｏｆｆ又はｋｄ値）、親和性定数（ＫＡ値）、解離定数（ＫＤ値）及び／又はＩＣ５０値を有する。様々な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体とＶＥＧＦ受容体の相互作用の結合定数は、例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−２４０頁に開示されている方法に従って、表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。特定の態様において、このような値は、以下の実施形態から選択される。
【０１１１】
具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のｋｏｎ（例えば５×１０５から５×１０６Ｍ−１ｓ−１、又は１０７から１０８Ｍ−１ｓ−１）でＶＥＧＦに結合する。
【０１１２】
別の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、１０−３ｓ−１以下、５×１０−４ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、５×１０−５ｓ−１以下、１０−５ｓ−１以下、５×１０−６ｓ−１以下、１０−６ｓ−１以下、５×１０−７ｓ−１以下、１０−７ｓ−１以下、５×１０−８ｓ−１以下、１０−８ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度、又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のｋｏｆｆ速度（例えば５×１０−４から１０−６ｓ−１、又は１０−３から５×１０−５ｓ−１）でＶＥＧＦに結合する。
【０１１３】
別の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１のＫＡ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のＫＡ（例えば５×１０９Ｍ−１から１０１１Ｍ−１、又は１０１１Ｍ−１から５×１０１４Ｍ−１）でＶＥＧＦに結合する。
【０１１４】
他の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、５×１０−１４Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、５×１０−１５Ｍ以下、１０−１５Ｍ以下のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）、又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のＫＤ（例えば５×１０−９から５×１０−１２Ｍ又は５×１０−１１Ｍから１０−１３Ｍ）でＶＥＧＦに結合する。
【０１１５】
具体的な実施形態において、ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）値は、当該技術分野において周知である又は本明細書に記載されているアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光偏光アッセイ又は任意の他のバイオセンサー、例えばＢＩＡｃｏｒｅによって決定される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合し、５×１０７ｎＭ未満、１０７ｎＭ未満、５×１０６ｎＭ未満、１０６ｎＭ未満、５×１０５ｎＭ未満、１０５ｎＭ未満、５×１０４ｎＭ未満、１０４ｎＭ未満、５×１０３ｎＭ未満、１０３ｎＭ未満、５×１０２ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６５ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５×１０−１ｎＭ未満、１０−１ｎＭ未満、５×１０−２ｎＭ未満、１０−２ｎＭ未満、５×１０−３ｎＭ未満、１０−３ｎＭ未満、５×１０−４ｎＭ未満、若しくは１０−４ｎＭ未満のＩＣ５０値、又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のＩＣ５０（例えば、５×１０７から５０ｎＭ、又は１５ｎＭから５×１０−３ｎＭ）でＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害する。ＩＣ５０は、当該技術分野において周知の方法又は本明細書に記載されている方法、例えば、ＥＬＩＳＡに従って測定することができる。
【０１１７】
他の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合し、バイオアッセイ（例えば、ＥＣ増殖又は移動）において５×１０７ｎＭ未満、１０７ｎＭ未満、５×１０６ｎＭ未満、１０６ｎＭ未満、５×１０５ｎＭ未満、１０５ｎＭ未満、５×１０４ｎＭ未満、１０４ｎＭ未満、５×１０３ｎＭ未満、１０３ｎＭ未満、５×１０２ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６５ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５×１０−１ｎＭ未満、１０−１ｎＭ未満、５×１０−２ｎＭ未満、１０−２ｎＭ未満、５×１０−３ｎＭ未満、１０−３ｎＭ未満、５×１０−４ｎＭ未満、若しくは１０−４ｎＭ未満のＩＣ５０値、又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のＩＣ５０（例えば、５×１０７から５０ｎＭ、又は１５ｎＭから５×１０−３ｎＭ）でＶＥＧＦ活性を中和する。抗ＶＥＧＦ抗体のＩＣ５０を測定するために使用することができる例示的な中和アッセイは、以下の６．３節に記載されている。
【０１１８】
特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ中和アッセイにおいて約１ｐｍと約１μＭの間のＩＣ５０値でＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１若しくはこれらの両方へのＶＥＧＦの結合を阻害する又はＶＥＧＦ活性を阻害する。具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ中和アッセイにおいて１０ｐＭと１００ｎＭの間、１００ｐＭと１０ｎＭの間、２００ｐＭと５ｎＭの間、３００ｐＭと４ｎＭの間、５００ｐＭと３ｎＭの間、７５０ｐＭと２ｎＭの間、１ｎＭと２０ｎＭの間、５００ｐＭと４０ｎＭの間、５０ｐＭと５０ｎＭの間、２５０ｐＭと１００ｎＭの間及び１００ｎＭと１μＭの間のＩＣ５０値、又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲のＩＣ５０（例えば１０ｐＭから５０ｎＭ、又は７５０ｐＭから２ｎＭ）でＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１若しくはこれらの両方へのＶＥＧＦの結合を阻害する又はＶＥＧＦ活性を阻害する。
【０１１９】
上記実施形態の特定の態様において、ＩＣ５０は、０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１０００μＭ又は上記数値の任意の組み合わせを両端とする任意の範囲（例えば、０．０１から５０μＭ、又は１０μＭから１００μＭ）の濃度のＶＥＧＦの存在下で測定される。
【０１２０】
特定の実施形態において、本開示の抗体の動態特性は、同等のアッセイにおいてベバシズマブ又はラニビズマブと比較して同等である又は改善されている。例えば、特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの約０．５倍から１０００倍の範囲のｋｏｎ速度、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの０．５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの０．７５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの０．９倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１．１倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１．２倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１．３倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１．４倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１．５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１．７５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２．２５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２．５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの３倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの４倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの７．５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１０倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２０倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの５０倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの７５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１００倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの１５０倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２００倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２００倍のｋｏｎ、若しくは上記数値の任意の組合せを両端とする範囲のｋｏｎ、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの２倍−７５倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの５倍−１００倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの０．５倍−１０００倍のｋｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｎの０．７５倍−２００倍のｋｏｎなどでＶＥＧＦに結合する。
【０１２１】
特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．００１倍から３倍の範囲のｋｏｆｆ速度、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．００２倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．００５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．００７５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．０１倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．０２５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．０５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．００７５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．１倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．２５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．７５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．９倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの１倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの１．１倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの１．２５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの１．５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの１．７５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの４倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの３倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの２倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの３倍のｋｏｆｆ、若しくは上記数値の任意の組合せを両端とする範囲のｋｏｆｆ、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．０１倍から１．１倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．０５倍−１．２５倍のｋｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋｏｆｆの０．１倍−０．９倍のｋｏｆｆなどでＶＥＧＦに結合する。
【０１２２】
他の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの０．２５倍から１０００倍の範囲のＫＡ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの０．５倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの０．７５倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの２倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの４倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１５倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの２０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの３０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの４０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの５０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１００倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの２５０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの５００倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの７５０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１０００倍のＫＡ、若しくは上記数値の任意の組合せを両端とする範囲のＫＡ、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの０．７５倍−１０  ５倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１倍−１００倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの１０倍−２０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの４倍−５０倍のＫＡ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＡの２倍−２０倍のＫＡ、若しくは本明細書に開示されているｋｏｎ速度とｋｏｆｆ速度から計算することができる任意の数値又は範囲のＫＡでＶＥＧＦに結合する。
【０１２３】
他の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．００１倍から１０倍の範囲のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．００１倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．００５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．０１倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．０５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．０７５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．１倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．２倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．３倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．４倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．６倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．７倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．８倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．９倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの１倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの１．５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの２倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの４倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの７．５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの１０倍のＫＤ、若しくは上記数値の任意の組合せを両端とする範囲のＫＤ、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．０１倍−２倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．１倍−１．５倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．７倍−４倍のＫＤ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫＤの０．２倍−２倍のＫＤ、若しくは本明細書に開示されているｋｏｎ速度とｋｏｆｆ速度から計算することができる任意の数値又は範囲でＶＥＧＦに結合する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合し、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．００１倍から１０倍の範囲のＩＣ５０値、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．００１倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．００５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．０１倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．０５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．０７５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．１倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．２倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．３倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．４倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．６倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．７倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．８倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．９倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の１倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の１．５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の２倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の４倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の７．５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の１０倍のＩＣ５０、若しくは上記数値の任意の組み合わせを両端とする範囲のＩＣ５０、例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．０１倍から２倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．１倍から１．５倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．７倍から４倍のＩＣ５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ５０の０．２倍から２倍のＩＣ５０でＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１若しくはこれらの両方へのＶＥＧＦの結合を阻害する又はＶＥＧＦの活性を中和する。特定の実施形態において、１つのＣＤＲ置換は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、ＩＣ５０の上記差を生じることができるが、一方で、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、このような置換に加え、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、最大１６カ所の他のＣＤＲ置換を含むことができる。
【０１２５】
６．５  抗ＶＥＧＦ抗体の免疫原性の低下
特定の態様において、本開示は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、免疫原性が低下した抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。本開示は、ベバシズマブのＣＤＲと比較して、それらのＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域に１つ又は複数のアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換がベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、抗体の免疫原性を低下させる抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。特定の実施形態において、免疫原性の低下は、１つ以上のＴ細胞エピトープの消失又は減少をもたらす１つ以上のアミノ酸置換に起因する。
【０１２６】
特定の態様において、免疫原性が低下した本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、生物学的活性、例えば、ＶＥＧＦに対する親和性又はＶＥＧＦ活性の中和が同等である又は改善されている。このような特性は、例えば、上記の６．３節に記載された方法によって試験することができる。
【０１２７】
特定の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の免疫原性は、ベバシズマブ又はラニビズマブ抗体と比較して低下している。このような抗体は、概して、配列番号２５、配列番号６２及び／又は配列番号７４に対応する領域における重鎖及び／又は軽鎖可変領域に対してバリアント配列を有する。該抗体は、概して、配列番号２５、配列番号６２及び配列番号７４に対応する１つ、２つ又は３つ全部の配列において、１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を有するが、本明細書において、１つ、２つ又は３つ全部の領域における、最大４つ又は５つの置換が意図される。
【０１２８】
本開示で使用されるとき、「免疫原性の低下」したバリアントとは、配列番号２５、配列番号６２及び／又は配列番号７４に対応する領域において、それぞれ、配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４のペプチドと比較して、低下した増殖応答を末梢血単核細胞に誘発するバリアント配列を有する抗ＶＥＧＦ抗体を意味する。増殖応答を評価するために使用することができる例示的な増殖アッセイは、以下の７節に記載されている。増殖応答の低下は、レスポンダ−の百分率、刺激指数又はこれらの両方の観点から反映させることができる。
【０１２９】
他の実施形態において、配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４の配列を有するペプチドと比較して、バリアント配列は、少なくとも２５％のレスポンダ−の低下、少なくとも３０％のレスポンダ−の低下、少なくとも３５％のレスポンダ−の低下、少なくとも４０％のレスポンダ−の低下、少なくとも４５％のレスポンダ−の低下、少なくとも５０％のレスポンダ−の低下、少なくとも６０％のレスポンダ−の低下、少なくとも６５％のレスポンダ−の低下、少なくとも７０％のレスポンダ−の低下、少なくとも７５％のレスポンダ−の低下、少なくとも８０％のレスポンダ−の低下、少なくとも８５％のレスポンダ−の低下、少なくとも９０％のレスポンダ−の低下、少なくとも９５％のレスポンダ−の低下、１００％のレスポンダ−の低下、又は上記数値のいずれかを両端とする範囲のレスポンダ−の低下、例えば２５％−７５％のレスポンダ−の低下、５０％−９０％のレスポンダ−の低下、６０％−１００％のレスポンダ−の低下、７０％−９０％のレスポンダ−の低下などをもたらす。
【０１３０】
他の実施形態において、バリアント配列は、それぞれ、配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４のペプチドにより誘発される刺激指数に対して、刺激指数を少なくとも５％低下、少なくとも１０％低下、少なくとも１５％低下、少なくとも２０％低下、少なくとも２５％低下、少なくとも３０％低下、少なくとも３５％低下又は少なくとも４０％低下させるか、若しくは配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４のペプチドに比較して上記数値のいずれかを両端とする範囲の刺激指数の低下、例えば５％−２０％低下、１０％−３０％低下、２５％−３５％低下、３０％−４０％低下などをもたらす。
【０１３１】
ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、免疫原性が低下した候補抗ＶＥＧＦ抗体の例示的な実施形態は、表６に記載されているＣＤＲ置換又は置換の組み合わせの１つ以上を含む。場合により、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、免疫原性が低下した抗ＶＥＧＦ抗体は、単独又は組み合わせて、表７−１３のいずれかにおけるＣＤＲ変異などの１つ以上の追加の置換を含む。
【０１３２】
ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、免疫原性が低下した候補抗ＶＥＧＦ抗体のなおさらに例示的な実施形態は、表１４−１６に記載されているＣＤＲ置換又は置換の組み合わせの１つ以上を含む。ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して、免疫原性が低下した抗ＶＥＧＦ抗体のいくつかの好ましい実施形態は、表１９に提供されている。
【０１３３】
６．６  抗体コンジュゲート
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、共有結合がＶＥＧＦへの結合を妨げないように、任意の型の分子を抗体に共有結合させることによって修飾される抗体コンジュゲートを含む。
【０１３４】
特定の態様において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、エフェクター部分又は標識とコンジュゲートすることができる。用語「エフェクター部分」には、本明細書で使用するとき、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素、生体活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然のポリマー、核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出可能な化合物を包含する。
【０１３５】
一例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、所定の生物学的応答を修飾するように、細胞傷害作用剤、放射性核種又は薬物部分などのエフェクター部分とコンジュゲートすることができる。エフェクター部分は、タンパク質又はポリペプチドであってもよく、限定されないが、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、シグナル伝達分子（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲンアクチベーター）、抗血栓剤若しくは抗血管新生剤（例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン）又はサイトカイン若しくは成長因子などの生物学的応答調節剤（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は神経成長因子（ＮＧＦ））が挙げられる。
【０１３６】
別の例において、エフェクター部分は、細胞毒素又は細胞傷害作用剤であってもよい。細胞毒素及び細胞傷害作用剤の例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシンとこれらの類似体又はホモログが挙げられる。
【０１３７】
また、エフェクター部分としては、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ５並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン））、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
【０１３８】
他のエフェクター部分としては、限定されないが、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２並びにタングステン１８８／レニウム１８８などの放射性核種、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物が挙げられる。
【０１３９】
このようなエフェクター部分を抗体にコンジュゲートするための技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２ｎｄ  Ｅｄ．、６２３−５３頁（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ｅｄｓ．，１９８７年））；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８頁及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３年を参照されたい。）。
【０１４０】
一例において、抗ＶＥＧＦ抗体又はこれらの断片は、抗体のＮ末端若しくはＣ末端を介して又は内部で、共有結合（例えば、ペプチド結合）により別のタンパク質（又はその一部分；例えば、該タンパク質の少なくとも１０個、２０個又は５０個のアミノ酸の部分）のアミノ酸配列に融合される。抗体又はその断片は、抗体の定常領域のＮ末端で他のタンパク質と連結することができる。例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されているように、組換えＤＮＡ法が、このような融合体を作製するために使用され得る。別の例において、エフェクター分子は、半減期をインビボで延長することができ、及び／又は上皮バリアを通した抗体の免疫系への送達を増大させることができる。この型の適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はＷＯ２００５／１１７９８４に記載されているものなどのアルブミン結合化合物が挙げられる。
【０１４１】
特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は小分子毒素にコンジュゲートされる。特定の例示的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ドラスタチン若しくはドロスタチンペプチド類似体又は誘導体、例えば、アウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び第５，７８０，５８８号）にコンジュゲートされる。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物部分は、そのＮ（アミノ）末端、Ｃ（カルボキシル）末端を介して又は内部で抗体に結合することができる（ＷＯ０２／０８８１７２）。例示的なアウリスタチンの実施形態としては、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４９８，２９８号（例えば、リンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製するリンカー及び方法を開示している。）に開示されているような、Ｎ末端に連結されたモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが挙げられる。
【０１４２】
他の例示的な実施形態において、小分子毒素としては、限定されないが、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン及びＣＣ１０６５が挙げられる。本開示の一実施形態において、抗体は、１つ以上のメイタンシン分子（例えば、抗体分子１個あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）にコンジュゲートされる。メイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換されてもよく、これは、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元して、抗体と反応させる（Ｃｈａｒｉら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１頁）と、メイタンシノイド−抗体又はメイタンシノイド−Ｆｃ融合コンジュゲートを生じさせることができる。また、使用することができるカリケアマイシンの構造類似体としては、限定されないが、γ１１、γ３１、Ｎ−アセチル−γ１１、ＰＳＡＧ及びθ１１が挙げられる（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２頁；Ｌｏｄｅら、１９９８年，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８頁；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）。
【０１４３】
本開示の抗体は、標的送達のためにリポソームにコンジュゲートすることもできる（例えば、Ｐａｒｋら、１９９７年、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３９９−４３５頁；Ｍａｒｔｙ  ＆  Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０９：３８９−４０１頁を参照されたい。）。
【０１４４】
一例において、本開示の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合させることができる。１つの特定の例において、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ部分は、利用可能な任意アミノ酸側鎖又は抗体断片に位置する末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合することができる。このようなアミノ酸は、抗体断片に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片内に組み込んでもよい。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。複数部位は、２つ以上のＰＥＧ分子を結合するために使用されてもよい。ＰＥＧ部分は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合することができる。チオール基を結合点として用いる場合、適切に活性化されたエフェクター部分、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。
【０１４５】
１つの具体例において、抗ＶＥＧＦ抗体コンジュゲートは、例えば、ＥＰ０９４８５４４に開示されている方法に従って、ペグ化、即ち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合させた修飾Ｆａｂ’断片である。また、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ．）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ｅｄｓ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、１９９７年）；及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ、ｅｄｓ．、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）；及びＣｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：５３１−５４５頁を参照されたい。ＰＥＧは、ヒンジ領域のシステインに結合することができる。一例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ’断片は、修飾ヒンジ領域の１つのチオール基に共有結合したマレイミド基を有している。リジン残基は、マレイミド基に共有結合することができ、リジン残基上のアミン基のそれぞれに分子量が約２０，０００Ｄａのメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合することができる。したがって、Ｆａｂ’断片に結合されるＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａであり得る。
【０１４６】
用語「標識」は、本明細書で使用する場合、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と直接的又は間接的にコンジュゲートすることができる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体、検出可能（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）であってもよく、又は酵素標識の場合において、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変更を触媒することができる。有用な蛍光部分としては、限定されないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどが挙げられる。有用な酵素標識としては、限定されないが、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
【０１４７】
特に診断目的に有用な追加の抗ＶＥＧＦ抗体コンジュゲートについては、下記６．７節に記載されている。
【０１４８】
６．７  抗ＶＥＧＦ抗体の診断用途
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、ビオチン化、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は任意の他の検出可能な部分（６．６節に記載されているものを含む。）によって修飾されている抗体を含み、診断目的に有利に使用することができる。
【０１４９】
特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、限定されないが、インビトロとインビボの両方の診断法を含み、ＶＥＧＦを精製又は検出するために使用することができる。例えば、抗体は、生体試料中のＶＥＧＦ濃度を定性的及び定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて使用される。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）を参照されたい。
【０１５０】
本開示は、さらに、診断剤にコンジュゲートされた抗体又はこれらの断片を包含する。抗体は、例えば、特定細胞、組織若しくは血清における対象とする標的の発現を検出するために；又は、例えば、所定の治療レジメンの効力を判定するための臨床試験手順の一部として、免疫応答の発生若しくは進行を監視するために、診断的に使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングさせることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当該技術分野において公知の技術を用いて、抗体（又はこれらの断片）に直接的に又は中間体（例えば、当該技術分野において公知のリンカー）を介して間接的に結合又はコンジュゲートすることができる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−カラクトシダーゼ、アセチルコリンステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが挙げられ；発光物質の一例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。
【０１５１】
本開示は、（場合により検出可能な部分にコンジュゲートされた。）本開示の１つ以上の抗ＶＥＧＦ抗体を用いて、生体試料（個体の細胞、組織又は体液）を接触させること、及び、試料がＶＥＧＦ発現に陽性であるか否か、又は試料が対照試料と比較して発現を変化（例えば、減少又は増加）しているか否かを検出することを含む、ＶＥＧＦの発現の検出方法を提供する。
【０１５２】
本方法を用いて診断することができる疾患としては、限定されないが、本明細書に記載されている疾患が挙げられる。特定の実施形態において、組織又は体液は、末梢血、末梢血白血球、生検、例えば、肺又は皮膚生検、及び組織である。
【０１５３】
６．８  抗ＶＥＧＦ抗体を使用する治療方法
６．８．１  臨床的利益
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、病的血管新生によって特徴付けられる様々な新生物又は非新生物病態を治療するために使用することができる。
【０１５４】
本開示の抗体は、癌及び良性腫瘍を含む、血管新生が腫瘍増殖に重要な役割を果たす腫瘍の治療に有用である。本明細書において治療されるべき癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む。）、腹膜癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む。）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）又は腎臓（ｒｅｎａｌ癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な型の頭頸部癌が挙げられ、更にＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む。）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）が挙げられ、更に母斑症に伴う異常血管増殖、浮腫（例えば脳腫瘍に伴うもの）及びメイグス症候群が挙げられる。より具体的には、本開示の抗体によって治療可能な癌としては、乳癌、結腸・直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫及び多発性骨髄腫が挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト患者における結腸直腸癌を治療するために使用される。
【０１５５】
本開示は、腫瘍増殖を支持するための栄養を提供するために必要な腫瘍血管の発生の阻害を目的とする癌治療ストラテジーである抗血管新生治療を包含する。血管新生は、原発腫瘍増殖と転移の両方に関与しているため、本開示によって提供される抗血管新生治療は、原発部位における腫瘍の新生物的増殖を抑制し、並びに二次部位への腫瘍の転移を予防することが可能である。
【０１５６】
本開示の抗体を用いて治療可能な非新生物病態としては、網膜状態（例えば、加齢性黄斑変性症（「ＡＭＤ」）、網膜静脈閉塞（「ＲＶＯ」）後の浮腫及び糖尿病性黄斑浮腫（「ＤＭＥ」））並びに免疫及び炎症性疾患（例えば関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性及び他の増殖網膜症、例えば、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む。）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜液貯留（例えば、心膜炎に伴うもの）及び胸水貯留）が挙げられる。
【０１５７】
したがって、本開示は、上記疾患のいずれかの治療を必要とする患者における該疾患を治療する方法であって、患者に本開示の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む方法を提供する。場合により、上記投与は、例えば、１日後、２日後、３日後、５日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、２カ月後又は３カ月後に反復される。反復投与は、同一用量又は異なる用量で行われ得る。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上で反復することができる。例えば、特定の投薬レジメンに従って、患者は、長期間、例えば、６カ月間、１年間又はそれ以上、抗ＶＥＧＦ治療を受ける。患者に投与される抗ＶＥＧＦ抗体の量は、特定の実施形態において、治療有効量である。本明細書で使用するとき、「治療有効」量のＶＥＧＦ抗体は、単回投薬として又は治療レジメンの経過にわたって、例えば、１週間、２週間、３週間、１カ月、３カ月、６カ月、１年間又はそれ以上にわたって投与することができる。例示的な治療レジメンは、下記の６．１１節に記載されている。
【０１５８】
本開示によると、疾患の治療は、任意の臨床段階若しくは発現期にある疾患の任意の形態を有すると既に診断されている患者の治療；疾患の症状若しくは徴候の発症若しくは進行若しくは増悪若しくは悪化の遅延；並びに／又は疾患の予防及び／若しくは重篤度軽減を包含する。
【０１５９】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体が投与される「対象」又は「患者」は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル又はヒト）などの哺乳動物である。特定の実施形態において、対象又は患者はヒトである。特定の態様において、ヒトは小児患者である。他の態様において、ヒトは成人患者である。
【０１６０】
６．９  医薬組成物及び投与経路
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体及び場合により下記の６．１０節に記載されている併用療法剤などの１つ以上の追加の治療剤を含む組成物が、本明細書に提供される。組成物は、通常、一般に医薬として許容される担体を含む、滅菌医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態であってもよい。
【０１６１】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、局所、髄腔内及び脳室内などの様々な経路によって患者に投与することができる。任意の所定の場合に最適な投与経路は、特定の抗体、対象、疾患の性質と重篤度及び対象の健康状態に依存する。
【０１６２】
網膜疾患以外の適応症の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与又は連続投与により約０．１から約７５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得て、若しくは単回（例えばボーラス）投与、複数回投与又は連続投与により０．０１−５０００μｇ／ｍＬの血清濃度に達するような量であってもよく、若しくは治療する病態、投与経路並びに対象の年齢、体重及び健康状態に応じてその中の任意の有効範囲又は数値であってもよい。特定の実施形態において、例えば、癌の治療について、それぞれの用量は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから約５０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇあたり約３ｍｇから約２５ｍｇの範囲であってもよい。抗体は、水溶液として製剤化され、皮下注射によって投与され得る。
【０１６３】
網膜状態（例えば、加齢性黄斑変性症（「ＡＭＤ」）、網膜静脈閉塞（「ＲＶＯ」）後の浮腫及び糖尿病性黄斑浮腫（「ＤＭＥ」））の治療について、注入後の眼球の抗ＶＥＧＦ抗体の房水濃度が１−５０μｇ／ｍＬとなるような用量が適切である。ＡＭＤの治療について、それぞれの用量は、０．１ｍｇから約１ｍｇ、例えば、約０．２５から約０．５ｍｇであってもよい。抗体は、水溶液として製剤化され、硝子体内注射によって投与され得る。
【０１６４】
医薬組成物は、好都合には、投薬あたり所定量の本開示の抗ＶＥＧＦ抗体を含有する単位用量形態で提示することができる。このような単位としは、限定されないが、例えば、０．１ｍｇから５ｇ、例えば、１ｍｇから１ｇ又は１０から５０ｍｇを含有することができる。本開示で使用する医薬として許容される担体は、例えば、治療する病態又は投与経路に応じて、多種多様な形態をとることができる。
【０１６５】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を場合により当該技術分野において典型的に使用されている医薬として許容される担体、賦形剤又は安定剤（これらの全ては本明細書では「担体」と呼ばれる。）、即ち、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤及び他の各種の添加剤と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存用に調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ、ｅｄ．１９８０年）を参照されたい。このような添加剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに非毒性でなければならない。
【０１６６】
緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近い範囲に維持するのに役立つ。それらは、約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。本開示で使用するのに適切な緩衝剤としては、クエン緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混液、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混液、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混液など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混液、コハク酸−水酸化ナトリウム混液、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混液など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混液、酒石酸−酒石酸カリウム混液、酒石酸−水酸化ナトリウム混液など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混液、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混液、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混液など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混液、グルコン酸−水酸化ナトリウム混液、グルコン酸−グルコン酸カリウム混液など）、蓚酸緩衝液（例えば、蓚酸−蓚酸ナトリウム混液、蓚酸−水酸化ナトリウム混液、蓚酸−蓚酸カリウム混液など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混液、乳酸−水酸化ナトリウム混液、乳酸−乳酸カリウム混液など）及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混液、酢酸−水酸化ナトリウム混液など）などの有機及び無機酸とその塩が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びトリメチルアミン塩、例えば、Ｔｒｉｓが使用され得る。
【０１６７】
保存剤は、微生物増殖を遅らせるために添加することができ、０．２％−１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本開示で使用するのに適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム及びヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。等張化剤は、時として、「安定剤」として公知であり、本開示の液体組成物の等張性を確保するために添加することができ、多価糖アルコール類、例えば、三価以上の糖アルコール類、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。安定剤とは、増量剤から治療剤を可溶化する添加剤又は変性若しくは容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤に至るまでの機能に対応し得る広い分類の賦形剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール類（上記のもの）；アミノ酸類、例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖類又は糖アルコール類、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなどが挙げられ、イノシトール等のシクリトール類も含み；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトース、スクロース、及び三糖類、例えば、ラフィノース；並びに多糖類、例えばデキストランが挙げられる。安定剤は、活性タンパク質１重量部あたり０．１から１０，０００重量部の範囲で存在することができる。
【０１６８】
非イオン性サーファクタント又は界面活性剤（「湿潤剤」としても知られている。）は、治療剤を溶解し易くすると共に、治療用タンパク質を撹拌による凝集から保護し、さらにタンパク質の変性を生じさせずに製剤を表面剪断応力に暴露できるようにするために、添加することができる。適切な非イオン性サーファクタントとしては、ポリソルベート類（２０、８０など）、ポロキサマー類（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール類、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン性サーファクタントは、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば、約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在することができる。
【０１６９】
追加の様々な賦形剤としては、増量剤（例えば、澱粉）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）及び補助溶媒が挙げられる。
【０１７０】
また、本明細書における製剤は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体に加えて、併用療法剤を含有することができる。適切な併用療法剤の例は、下記の６．１０節に挙げられている。
【０１７１】
皮下投与用の投薬スケジュールは、疾患の型、疾患の重篤度及び抗ＶＥＧＦ抗体に対する患者の感受性を含む多数の臨床因子に応じて、６カ月に１回から毎日までと変更することができる。
【０１７２】
本開示の投与される抗ＶＥＧＦ抗体の用量は、特定の抗体、疾患の型（例えば癌、炎症など）、対象、疾患の重篤度、対象の健康状態、治療レジメン（例えば、併用療法剤の使用の有無）及び選択する投与経路に従って異なり；適切な用量は、当業者が容易に決定することができる。
【０１７３】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の個々の投薬の最適量と間隔は、治療する病態の性質と程度、投与形態、投与経路、投与部位、及び治療する特定の対象の年齢と健康状態により決定され、医師が適切な使用投与量を最終的に決定することは、当業者に認識される。この投与は、適切な回数で反復することができる。副作用が生じる場合、通常の臨床診療に従って、投与量及び／又は頻度が変更又は低減されてもよい。
【０１７４】
６．１０  併用療法
以下、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体が利用され得る併用法について記載する。本開示の併用法は、少なくとも２つの薬剤を患者に投与することを伴い、第１の薬剤は本開示の抗ＶＥＧＦ抗体であり、第２の薬剤は併用療法剤である。抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は、同時、連続して又は別々に投与することができる。
【０１７５】
本開示の併用療法の方法は、相加効果を上回る効果が得られ、治療有効量の抗ＶＥＧＦ抗体又は併用療法剤を単独で投与した場合には得られない治療的利益が得られる。
【０１７６】
本方法において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は、同時に又は連続して併用投与することができる。本明細書で使用するとき、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は、同日、例えば、同患者の来院中に、患者に投与される場合、連続して投与されると言われる。連続投与は、１時間おき、２時間おき、３時間おき、４時間おき、５時間おき、６時間おき、７時間おき又は８時間おきに実施することができる。対照的に、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は、別の日に患者に投与される場合、別々に投与されると言われ、例えば、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は、１日おき、２日おき、３日おき、１週間おき、２週間おき又は１カ月おきに投与することができる。本開示の方法において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の投与は、併用療法剤の投与前又は投与後であり得る。
【０１７７】
非限定的な一例として、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は、一定期間併用投与した後に、第２の期間に本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤の投与が変更される。
【０１７８】
本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を投与する潜在的相乗効果のため、一方又は両方の薬剤を単独で投与した場合、治療有効量とならない量でこのような薬剤が投与されてもよい。
【０１７９】
特定の態様において、併用療法剤は、抗血管新生剤、抗リウマチ薬、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、免疫抑制剤又は細胞毒性薬である。
【０１８０】
様々な疾患を治療するために使用される場合、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、同一又は同様の疾患に適した他の治療剤を併用し得ることが意図される。癌を治療するために使用される場合、本開示の抗体は、外科処置、放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせなどの従来の癌治療法を併用してもよい。
【０１８１】
いくつかの他の態様において、本開示の抗体との併用腫瘍療法に有用な他の治療剤としては、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２としても知られている。）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＴＮＦ−αなどの腫瘍増殖に関与する他の因子のアンタゴニスト、例えば、抗体が挙げられる。
【０１８２】
場合により、癌及び免疫疾患の治療について、１つ以上のサイトカインを患者に投与することも有益な場合がある。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ抗体は、増殖抑制剤と同時投与される。
【０１８３】
増殖抑制剤の適切な用量は、現在使用されている用量であり、増殖抑制剤と抗ＶＥＧＦ抗体の併用作用（相乗効果）により用量を減らすことができる。
【０１８４】
癌、免疫疾患及び網膜疾患の治療について、抗炎症剤は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と適切に併用することができる。抗炎症剤としては、限定されないが、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、メペリジン、デキサメタゾン、ペンタサ、メサラジン、アサコール、リン酸コデイン、ベノリラート、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラク及びインドメタシン、アスピリン及びイブプロフェンが挙げられる。
【０１８５】
癌の治療について、化学療法剤は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と適切に併用することができる。化学療法剤としては、限定されないが、放射性分子、細胞毒素又は細胞傷害作用剤とも呼ばれる毒素、例えば、細胞の生存に有害な任意の薬剤、薬剤、及び化学療法用化合物を含有しているリポソーム又は他のビシクルが挙げられる。適切な化学療法剤の例としては、限定されないが、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、抗α５β１インテグリン抗体、アルキル化剤、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アントラマイシン（ＡＭＣ）、有糸分裂阻害剤、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、ジアミノジクロロ白金、アントラサイクリン、抗生物質、代謝拮抗剤、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ生菌（膀胱内）、リン酸ベタメタゾンナトリウム及び酢酸ベタメタゾン、ビカルタミド、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、カリケアマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、結合型エストロゲン、シクロホスファミド、シクロソスファミド、シタラビン、シタラビン、サイトカラシンＢ、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ダウノルビシンＨＣＬ、クエン酸ダウノルビシン、デニロイキンディフティトックス、デクスラゾキサン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ドセタキセル、メシル酸ドラセトロン、ドキソルビシンＨＣＬ、ドロナビノール、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ、ボロシキシマブ、エメチン、エポエチン−α、エルビニアＬ−アスパラギナーゼ、エステル化エストロゲン、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、臭化エチジウム、エチニルエストラジオール、エチドロネート、エトポシドシトロボラム因子、リン酸エトポシド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、ゲムシタビンＨＣＬ、グルココルチコイド、酢酸ゴセレリン、グラミシジンＤ、グラニセトロンＨＣＬ、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣＬ、イホスファミド、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカンＨＣＬ、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミソールＨＣＬ、リドカイン、ロムスチン、メイタンシノイド、メクロレタミンＨＣＬ、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファランＨＣＬ、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルテストステロン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、酢酸オクトレオチド、オンダンセトロンＨＣＬ、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペントスタチン、ピロカルピンＨＣＬ、プリマイシン、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロザン２０、ポルフィマーナトリウム、プロカイン、プロカルバジンＨＣＬ、プロプラノロール、リツキシマブ、サル���ラモスチム、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テノポシド、テストラクトン、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、チオグアニン、チオテパ、トポテカンＨＣＬ、クエン酸トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン及び酒石酸ビノレルビンが挙げられる。
【０１８６】
Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９−２５７に列挙されているものを含む任意の抗血管新生剤は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用することができる。特定の実施形態において、抗血管新生剤は、別のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和性抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤及びこれらの任意の組み合わせである。代用として又は追加として、２つ以上の抗ＶＥＧＦ抗体は、患者に同時投与されてもよい。
【０１８７】
特定の実施形態において、ホルモン療法は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と併用することができる。いくつかの実施形態において、ホルモン療法は、癌細胞増殖の促進からエストロゲン及び／又はプロゲステロンを阻害する１つ以上の薬剤を含み、例えば、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、例えばタモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））又はレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ）、アロマターゼ不活化剤、例えば、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））又はエストロゲン産生を抑制する薬剤、例えば、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ）が挙げられる。他の実施形態において、ホルモン療法は、卵巣からのホルモンの産生を阻害する１つ以上の薬剤である。
【０１８８】
いくつかの態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、小分子タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤と併用することができる。いくつかの実施形態において、ＰＴＫ阻害剤は、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに特異的である。他の実施形態において、ＰＴＫ阻害剤は、チロシンキナーゼのＶＥＧＦ受容体ファミリーの２つ以上（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２）と結合する。他の実施形態において、本発明の組成物と方法に有用なタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤としては、受容体チロシンキナーゼのＶＥＧＦファミリーと選択的に結合せず、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＤＧＦＲ及び／又はＲａｆなどの他のタンパク質ファミリーのチロシンキナーゼドメインとも結合するＰＴＫ阻害剤が挙げられる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、チロシンキナーゼは、受容体チロシンキナーゼであり、即ち、細胞外リガンド結合ドメインを有し、１つ以上のリガンドの結合によって活性化される、大きいタンパク質の細胞内ドメインである。特定の実施形態において、タンパク質チロシンキナーゼは、非受容体チロシンキナーゼである。本開示の方法に使用されるＰＴＫ阻害剤としては、限定されないが、ゲフィニチブ（ＺＤ−１８３９、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、エルロチニブ（ＯＳＩ−１７７４、Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４、Ｚａｃｔｉｍａ（登録商標））、チルホスチンＡＧ−８２５（ＣＡＳ  １４９０９２−５０−２）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＡＧ−４９４（ＣＡＳ  １３３５５０−３５−３）、ＲＧ−１３０２２（ＣＡＳ  １４９２８６−９０−８）、ＲＧ−１４６２０（ＣＡＳ  １３６８３１−４９−７）、ＢＩＢＷ  ２９９２（Ｔｏｖｏｋ）、チルホスチン９（ＣＡＳ  １３６８３１−４９−７）、チルホスチン２３（ＣＡＳ  １１８４０９−５７−７）、チルホスチン２５（ＣＡＳ  １１８４０９−５８−８）、チルホスチン４６（ＣＡＳ  １２２５２０−８５−８）、チルホスチン４７（ＣＡＳ  １２２５２０−８６−９）、チルホスチン５３（ＣＡＳ  １２２５２０−９０−５）、ブテイン（１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペン−１−オン２’，３，４，４’−テトラヒドロキシカルコン；ＣＡＳ  ４８７−５２−５）、クルクミン（（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン；ＣＡＳ  ４５８−３７−７）、Ｎ４−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−Ｎ６，Ｎ６−ジメチルピリド−［３，４−ｄ］−ピリミジン−４，６−ジアミン（２０２２７２−６８−２）、ＡＧ−１４７８、ＡＧ−８７９、シクロプロパンカルボン酸−（３−（６−（３−トリフルオロメチルフェニルアミノ）ピリミジン−４−イルアミノ）フェニル）アミド（ＣＡＳ  ８７９１２７−０７−８）、Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ２−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン、２ＨＣｌ（ＣＡＳ  １９６６１２−９３−８）、４−（４−ベンジルオキシアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＣＡＳ  １７９２４８−６１−４）、Ｎ−（４−（（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）２−ブチンアミド（ＣＡＳ  ８８１００１−１９−０）、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２及びＨＫＩ−３５７が挙られる。
【０１９０】
１つの具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、静脈内５−フルオロウラシル系化学療法と併用される。この併用は、特に結腸又は直腸の転移性癌患者の第１又は第２の選択治療に適している。
【０１９１】
別の具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、カルボプラチン及びパクリタキセルと併用される。この併用は、特に切除不能な局所進行再発性又は転移性非扁平上皮型非小細胞肺癌患者の第１の選択治療に適している。
【０１９２】
なお別の具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、パクリタキセルと併用される。この併用は、特に転移性ＨＥＲ２陰性乳癌の化学療法を受けていない患者の治療に適している。
【０１９３】
網膜疾患の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｅ１００３０、抗血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ペグ化アプタマー；ＡＲＣ１９０５、補体カスケードのＣ５成分を標的とするペグ化アプタマー；及びボロシキシマブ、α５β１インテグリン膜貫通受容体を標的とするモノクローナル抗体；Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）による光線力学療法（ＰＤＴ）；又はＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）、アプタマー（ペガプタニブナトリウム）を併用することができる。
【０１９４】
６．１１  治療レジメン
本開示は、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体の投与を伴う治療レジメンを提供する。治療レジメンは、患者の年齢、体重及び病態により異なる。治療レジメンは、２週間から無期限まで継続することができる。具体的な実施形態において、治療レジメンは、２週間から６カ月間、３カ月間から５年間、６カ月間から１年間又は２年間、８カ月間から１８カ月間などの期間継続する。治療レジメンは、非可変用量レジメンでも、複数可変用量レジメンでもよい。
【０１９５】
下記の例示的な投薬レジメンについて、抗ＶＥＧＦ抗体は、皮下投与用に滅菌した保存剤不含溶液として投与することができる。
【０１９６】
転移性結腸直腸癌の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ボーラス−ＩＦＬ（イリノテカン、５−フルオロウラシル及びロイコボリンレジメン）と併用して、０．５−１５ｍｇ／ｋｇの用量で２週間おきに静脈内投与される。具体的な実施形態において、用量は、ボーラス−ＩＦＬと併用して、２週間おきに１−４ｍｇ／ｋｇ、２−６ｍｇ／ｋｇ、０．５−３ｍｇ／ｋｇ、１−１０ｍｇ／ｋｇ、３−４．８ｍｇ／ｋｇ又は１−４．５ｍｇ／ｋｇである。
【０１９７】
転移性結腸直腸癌の治療のための別の実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＦＯＬＦＯＸ４（オキサリプラチン、ロイコボリン及びフルオロウラシルレジメン）と併用して、１−３０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間おきに静脈内投与される。具体的な実施形態において、用量は、ＦＯＬＦＯＸ４と併用して、２週間おきに２−９ｍｇ／ｋｇ、３−１２ｍｇ／ｋｇ、１−７．５ｍｇ／ｋｇ、２−２０ｍｇ／ｋｇ、６−９．７５ｍｇ／ｋｇ又は４−９．５ｍｇ／ｋｇである。
【０１９８】
非扁平上皮型非小細胞肺癌の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、カルボプラチン／パクリタキセルと併用して、２−４０ｍｇ／ｋｇの用量で３週間おきに静脈内投与される。具体的な実施形態において、用量は、カルボプラチン／パクリタキセルと併用して、３週間おきに５−１４ｍｇ／ｋｇ、４−２０ｍｇ／ｋｇ、１０−１７．５ｍｇ／ｋｇ、７−１４ｍｇ／ｋｇ、１０−３０ｍｇ／ｋｇ又は３−３０ｍｇ／ｋｇである。
【０１９９】
転移性乳癌の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、パクリタキセルと併用して、０．５−２０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間おきに静脈内投与される。具体的な実施形態において、用量は、パクリタキセルと併用して、２週間おきに１−４ｍｇ／ｋｇ、２−６ｍｇ／ｋｇ、０．５−３ｍｇ／ｋｇ、１−１０ｍｇ／ｋｇ、３−４．８ｍｇ／ｋｇ又は１−４．５ｍｇ／ｋｇである。
【０２００】
転移性乳癌の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、単独療法として、０．５−２０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間おきに静脈内投与される。具体的な実施形態において、用量は、単独療法として、２週間おきに１−４ｍｇ／ｋｇ、２−６ｍｇ／ｋｇ、０．５−３ｍｇ／ｋｇ、１−１０ｍｇ／ｋｇ、３−４．８ｍｇ／ｋｇ又は１−４．５ｍｇ／ｋｇである。
【０２０１】
網膜状態（例えば、加齢性黄斑変性症（「ＡＭＤ」）、網膜静脈閉塞（「ＲＶＯ」）後の浮腫又は糖尿病性黄斑浮腫（「ＤＭＥ」））の治療について、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体は、０．１−１ｍｇの用量で１カ月（約２８日）に一回、硝子体内注射によって投与される。具体的な実施形態において、用量は、１カ月（約２８日）に一回、硝子体内注射によって０．１−０．４ｍｇ、０．２−０．６ｍｇ、０．１−０．２５ｍｇ、０．２５−０．５ｍｇ、０．２５−０．７５ｍｇ又は０．３−０．４５ｍｇである。具体的な実施形態において、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体で治療される患者は、滲出型ＡＭＤを有する。別の具体的な実施形態において、患者は、萎縮型ＡＭＤを有する。さらに別の実施形態において、患者は、ＲＶＯを有する。さらに別の実施形態において、患者は、ＤＭＥを有する。
【０２０２】
６．１２  診断及び医薬キット
本開示によって、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む医薬キットが包含される。医薬キットは、（例えば、凍結乾燥形態における又は水溶液としてのいずれか）本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と、
−例えば、上記の６．１０節に記載されている併用療法剤；
−抗ＶＥＧＦ抗体を投与するためのデバイス、例えば、ペン、針及び／又はシリンジ；並びに
−抗体が凍結乾燥形態である場合、抗体を再懸濁するための医薬グレードの水又は緩衝液、の１つ以上を含むパッケージである。
【０２０３】
特定の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体のそれぞれの単位用量は、別々に包装され、キットは、１単位用量以上（例えば、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、８単位用量、１０単位用量又はそれ以上）を含有することができる。１つの具体的な実施形態において、１単位用量以上は、それぞれ、シリンジ又はペンに収容される。
【０２０４】
また、本開示の抗ＶＥＧＦ抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む診断キットは、本明細書に包含される。診断キットは、（例えば、凍結乾燥形態における又は水溶液としてのいずれか）本開示の抗ＶＥＧＦ抗体と、診断アッセイを行うために有用な１つ以上の試薬を含むパッケージである。抗ＶＥＧＦ抗体は酵素で標識される場合、キットは、酵素に必要とされる基質及び補因子（例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体）を含むことができる。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）などの他の添加剤も含めることができる。特定の実施形態において、診断キットに含まれる抗ＶＥＧＦ抗体は、固相表面に固定化する、又は抗体が固定化され得る固相表面（例えば、スライド）がキットに含まれる。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度が得られるように大幅に変化させてもよい。１つの具体的な実施形態において、抗体及び１つ以上の試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含み、乾燥粉末として、通常は凍結乾燥されて（個別に又は組み合わせて）提供され得る。
【実施例】
【０２０５】
７．実施例１：ベバシズマブのＴ細胞エピトープの同定
７．１  材料及び方法
７．１．１  ペプチド
ペプチドは、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ａｄｅｌａｉｄｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって、マルチピンフォーマットを用いて合成された。ベバシズマブの軽鎖及び重鎖Ｖ領域の配列は、合計６９個のペプチドについて、１２個のアミノ酸によりオーバーラップしている１５マーのペプチドとして合成された（表３及び４）。ペプチドは、凍結乾燥状態に達し、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に約１−２ｍｇ／ｍＬで再懸濁された。ストックペプチドは、−２０℃で凍結保持された。
【０２０６】
７．１．２  ヒト末梢血単核細胞
地域ドナーバフィーコート製品は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡから購入された。バフィーコート材料は、カルシウム及びマグネシウムを含有しないＤＰＢＳを用いて１：１  ｖ：ｖに希釈された。希釈されたバフィーコート材料（２５−３５ｍｌ）は、１２．５ｍｌのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ−ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む５０ｍｌの円錐形遠心管（Ｓａｒｓｔｅｄ又はＣｏｓｔａｒ）に重層された。試料は、室温にて３０分間、９００×ｇで遠心分離された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は界面から回収された。ＤＰＢＳは、５０ｍｌの最終体積をもたらすように添加され、細胞は、３５０×ｇで５分間遠心分離された。ペレット化した細胞は、ＤＰＢＳに再懸濁され、計数された。
【０２０７】
７．１．３  樹状細胞
樹状細胞の単離について、Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）は、総体積３０ｍｌのＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１０８個の新鮮に単離されたＰＢＭＣを播種された。過剰のＰＢＭＣは、５×１０７細胞／ｍＬの密度で９０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０％ＤＭＳＯ中で−８０℃にて凍結された。Ｔ７５フラスコは、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートされた。非接着細胞は除去され、接着性単層はＤＰＢＳで洗浄された。単球から樹状細胞を区別するために、８００単位／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び５００単位／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する、３０ｍｌのＡＩＭ  Ｖ培地が添加された。フラスコは、５日間インキュベートされた。５日目に、ＩＬ−１α（Ｅｎｄｏｇｅｎ）及びＴＮＦα（Ｅｎｄｏｇｅｎ）が、５０ｐｇ／ｍＬ及び０．２ｎｇ／ｍＬとなるように添加された。フラスコは、さらに２日間インキュベートされた。７日目に、樹状細胞は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１６．５−３３μｇ／ｍＬマイトマイシンＣの最終濃度について、０．５−１．０ｍｇマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、３ｍｌの１００ｍＭ  ＥＤＴＡの添加によって回収された。フラスコは、さらに１時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。樹状細胞は回収され、ＡＩＭ  Ｖ培地中で２−３回洗浄された。
【０２０８】
７．１．４  細胞培養
７日目に、予め凍結された自家ＰＢＭＣが、３７℃の水浴中で速やかに解凍された。細胞は、ＤＰＢＳ又はＡＩＭ  Ｖ培地中に速やかに希釈され、３５０ｇで５分間遠心分離された。ＣＤ４＋細胞は、磁気ビーズ（Ｅａｓｙ−Ｓｅｐ  ＣＤ４＋キット、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ネガティブ選択によって濃縮された。自家ＣＤ４＋Ｔ細胞及び樹状細胞は、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０７７）のウェルあたり２×１０４個の樹状細胞あたり２×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養された。ペプチドは、約５μｇ／ｍＬで添加された。対照ウェルは、０．２５％ｖ：ｖでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）ビヒクル単独を含有した。陽性対照ウェルは、０．２５％ＤＭＳＯ、及び１μｇ／ｍＬ破傷風毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ又はＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）を含有した。培養物は、５日間インキュベートされた。５日目に、ウェルあたり０．２５μＣｉのトリチウム化チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ又はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が添加された。培養物は、６日目に、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｃｅｌｌハーベスターを用いてフィルターマットに回収された。シンチレーション計数は、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  １４５０シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて行われた。
【０２０９】
７．１．５  データ分析
平均バックグラウンドＣＰＭ値は、６から１２回の反復試験からの個々の結果を平均することによって計算された。４つの陽性対照ウェルのＣＰＭ値が平均された。それぞれのペプチドについての２個又は３個のウェルが平均された。陽性対照及びペプチドのウェルについて刺激指数値は、平均対照値で平均実験ＣＰＭ値を割ることによって計算された。データセットに含まれるには、破傷風毒素陽性対照ウェルにおいて３．０より大きい刺激指数が必要とされた。応答は、２．９５以上の刺激指数をもたらす任意のペプチドについて記録された。ペプチドは、９９人のドナー群から末梢血試料を用いて試験された。全てのペプチドに対する応答が集計された。試験されたそれぞれのペプチドについて、２．９５以上の刺激指数で応答されたドナー群の百分率が計算された。さらに、全てのドナーについての平均刺激指数もまた計算された。
【０２１０】
７．２  結果
７．２．１  ベバシズマブＶＨ及びＶＬ領域におけるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの同定
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープペプチドは、９９人のドナー群内のペプチドに対する応答パーセントの分析によって同定された。平均応答パーセントと標準偏差は、ベバシズマブ重鎖及び軽鎖Ｖ領域を記述する、試験された全てのペプチドについて計算された。平均バックグラウンド応答＋３×標準偏差より大きい又はそれに等しい応答率は、潜在的なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであると考えられた。ベバシズマブ軽鎖Ｖ領域について、３２個のペプチドが試験され（表３）、２．１±２．７％の平均バックグラウンド応答パーセントをもたらした。バックグラウンド上の３×標準偏差は１０．２％であることが決定された。１３位の１つのペプチド（Ｑ４０−Ｔ５４）は、ベバシズマブ軽鎖ペプチドデータセットにおいて、このレベルの応答を示し、応答率は１５．２％であった（図２Ａ）。ベバシズマブ重鎖Ｖ領域について、３７個のペプチドが試験された（表４）。平均バックグラウンド応答パーセントは、２．８±３．１％であった。バックグラウンド上の３×標準偏差は１２．１％であった。ベバシズマブ重鎖データセット内の１つのペプチド＃１８（Ｎ５２−Ｒ５６）は、１６．２％の応答パーセントに達した（図３Ａ）。重鎖データセットにおける＃３０位の第２のペプチドは、９．１％の応答率に達し、増加した刺激指数に起因して、エピトープと考えられた（下記参照）。
【０２１１】
平均刺激指数は、データセットにおける全てのペプチドについて計算された。軽鎖ペプチド１３は、１．８２±０．２４ｓ．ｅ．ｍ．の高い平均刺激指数を有した（図２Ｂ）。重鎖ペプチド＃１８は、２．１６±０．３５ｓ．ｅ．ｍ．の平均刺激指数値を有した（図３Ｂ）。＃３０位のペプチドは、平均刺激指数の上昇と上記の平均応答率に起因して、平均刺激指数を１．４５＋０．１８ｓ．ｅ．ｍ．に戻した（図３Ｂ）。＃３０位のペプチドは、この抗体Ｖ領域のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ含有量を決定する場合に含まれた。これらの刺激指数値は全て、２つのデータセットにおける全てのペプチドについて平均刺激指数よりも有意に高い（全６９個の重鎖及び軽鎖ペプチドについて１．１４±０．０７）。
【０２１２】
これらのデータは、ベバシズマブＶ領域において３つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域が存在することを示す（表５）。ＶＬ領域において、エピトープは、フレームワーク２及びＣＤＲ２由来の２つのアミノ酸を包含するペプチドの１３位で見出される。配列は、ヒト化中に、配列に挿入されるマウス復帰変異（Ｖ４６）を含有する。表５において、ＣＤＲ由来のアミノ酸は、下線で示される。重鎖において、２つのエピトープペプチド領域が同定された。＃１８位のより強いエピトープは、ＣＤＲ２の全てを包含する。第２のエピトープペプチド領域は、フレームワーク３とＣＤＲ３のアミノ酸の両方を含有する。
【０２１３】
７．２．２  ベバシズマブバリアント抗体の免疫原性を低下させたバリアント
ベバシズマブは、突然変異分析に供された（以下の実施例２を参照されたい。）。突然変異分析と併せて実施した抗原結合研究に基づいて、ＶＥＧＦに対する抗体の親和性を有意に低下させないＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３領域内の一連の候補アミノ酸置換が同定された（表６）。これらのアミノ酸置換は、単独及び併用して試験され、野生型抗体と比較して、低下した免疫原性を有するベバシズマブのバリアントを同定した。
【０２１４】
８．実施例２：ＶＥＧＦに対する親和性が増加したベバシズマブバリアントの同定
ベバシズマブ抗体は、ベバシズマブと比較して、ＶＥＧＦに対する親和性が増加した変異体を同定するために、包括的な突然変異分析に供された。ベバシズマブと比較して、ＶＥＧＦに対する候補高親和性変異体の親和性の増加は、それらの結合特性を確認するためにＢＩＡｃｏｒｅによって分析された。
【０２１５】
８．１  材料及び方法
８．１．１  ＢＩＡｃｏｒｅ
１５個のバリアントベバシズマブＶＨ領域構築物は、ヒトＩｇＧ１を含むプラスミドに、修飾されていないＶＬ領域とともにクローンニングされ、一過性トランスフェクションによって２９３Ｔ／１７細胞株において発現させ、抗体はプロテインＡ又はプロテインＧ親和性によって精製された。ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に対する抗体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００及び３０００の表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて測定された。ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）は、最初に、標準的なＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド、ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＨＳ；及びエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて、バイオセンサー表面に固定化され、続いて、５μＬ／分の低流速で、並行な表面上の抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ及びベバシズマブバリアント）によって捕捉された。ＲＬは、ＶＥＧＦの二量体性質によるアビディティを最小限にするために低く維持された。抗体の捕捉は、陰性対照として機能する参照表面上では行われなかった。続いて、ＶＥＧＦは、５０μＬ／分の流速で２分間、全てのフローセルに注入されて、結合を監視し、次に、解離相を監視するためにＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％Ｐ−２０、ＰＨ７．４）を２５分間流した。各サイクルで、ＶＥＧＦは、０ｎＭと５１２ｎＭの範囲で４倍増分させた、ＶＥＧＦの６つの異なる濃度において、表面全体に注入された。表面は、各サイクルの終わりに、２回の短いパルスで１００μＬ／分の流速にて１．５％Ｈ３ＰＯ４を用いて再生された。結合データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアから結合定数を抽出するために、１：１のラングミュアモデルに適合された。二重参照は、それぞれの分析において適用され、参照表面及び緩衝液単独の対照からのバックグラウンド応答を排除した。すべての結合動態データは、少なくとも３回の別々の測定で分析された。
【０２１６】
８．２  結果
結果は、絶対数として、及び野生型に対する倍数改善として表示される。列挙されたバリアントのほとんど全ては、ベバシズマブ又は野生型と比較したとき、結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）が改善されている（表７）。バリアントに対する最終的な親和性値は０．１ｎＭの範囲内であり、配列番号８２に対応するバリアントに対するのと同程度に低い０．０８ｎＭに達した。これらの値は、これらの実験において測定された親和性が１．９ｎＭであるベバシズマブとは対照的である。
【０２１７】
表８及び９は、予備結合研究が示す追加の重鎖バリアントはベバシズマブよりもＶＥＧＦに対して大きな親和性を有することを示す（データは示さず。）。表１０は、予備研究が示す重鎖バリアントがベバシズマブと類似したＶＥＧＦに対する親和性を有することを示す（データは示さず。）。表１１は、予備研究が示す軽鎖バリアントがベバシズマブと類似したＶＥＧＦに対する親和性を有することを示す（データは示さず。）。
【０２１８】
９．実施例３：脱免疫化バリアントペプチドの選択
ベバシズマブの免疫原性領域に対応するバリアントペプチド（実施例１参照）を生じさせた（表１４−１６）。バリアントペプチドは、実施例２に記載されている包括的な突然変異分析に基づいて選択され、ＶＥＧＦに対するベバシズマブの結合親和性を実質的に低下させないＣＤＲ修飾が同定された。
【０２１９】
全７７個のペプチドが合成され、親の１５マーのペプチドのそれぞれの２回の合成を含む、抗原結合研究に基づいて試験された。全９３人のドナーは、７．１節に記載された方法を利用して、親ペプチド及びバリアントペプチドを用いて試験され、結果は、図４Ａ−４Ｃに示される。特に、図４Ａ−４Ｃは、変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。修飾されていない親エピトープ配列に対する平均応答は、白抜きの記号で示されている。大きな丸は、表１７において言及されている選択されたペプチドを示す（下記を参照されたい。）。図４Ａは、ＶＨ  ＣＤＲ２ペプチドを示す；図４Ｂは、ＶＨ  ＣＤＲ３ペプチドを示す；図４Ｃは、ＶＬ  ＣＤＲ２ペプチドを示す。選択されたペプチドについての免疫原性データは表１７に示される。
【０２２０】
重鎖可変領域ＣＤＲ２ペプチドについて、本研究における親ペプチドに対する平均パーセント応答は、５．３８％及び６．４５％であった。３つの変異体ペプチドは、親ペプチドと比較して、低下した全応答率と平均刺激指数を実証した。
【０２２１】
本研究における重鎖可変領域ＣＤＲ３エピトープペプチドの親ペプチド応答率は、７．５３％及び６．４５％であった。親ペプチドと比較して、全応答の低下を実証した単一変異体ペプチド配列が見出された。
【０２２２】
最後に、本研究における軽鎖可変領域ＣＤＲ２ペプチドの親応答率は、２５．８％及び１５％であった。親ペプチドと比較して、全免疫原性の低下を実証した１つの変異体ペプチドが同定された。
【０２２３】
ベバシズマブと比較して、脱免疫変異体がＶＥＧＦに対する親和性を維持することを実証するために、フローサイトメトリーが使用され、修飾されたエピトープペプチド（単一又は二重のアミノ酸修飾及びベバシズマブのいずれかとして）において変異を導入するバリアント抗体の結合特性を比較した。いくつかの脱免疫変異は、ベバシズマブと比較して、同等又は増加したＶＥＧＦに対する親和性を有した。
【０２２４】
一研究において、ベバシズマブ変異体の表面結合形態を発現する一過性に形質転換された２９３ｃ１８細胞は、３ｎＭのＡｌｅｘａ６４７をコンジュゲートしたｒＨｕ  ＶＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃ＰＨＧ０１４３）及び１：４００に希釈したヤギ抗ヒトカッパ−ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃａｔ＃２０６３−０９）で染色された。データは、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＣｙＡｎ  ＡＤＰフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーによって収集され、Ｔｒｅｅｓｔａｒ’ｓ  ＦｌｏＪｏ分析プログラムを用いて分析された。本試験において測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）は表１８に記載されている。
【０２２５】
別の研究において、ＶＥＧＦに結合するベバシズマブとバリアント抗体のＥＣ５０が測定された。抗体力価検定プロットは、ＶＥＧＦを５μＭから０．０１μＭまで２倍に連続希釈しながら、上記のようにＡｌｅｘａ６４７をコンジュゲートしたｒＨｕ  ＶＥＧＦを用いて、ベバシズマブ及びそのバリアントにより生じさせた。ＥＣ５０値を表１９に示す。
【０２２６】
１０．実施例４：ＶＥＧＦに対する親和性が増加したベバシズマブの更なるバリアントの同定
ベバシズマブＶＨに焦点をあてた更なる包括的な変異分析が行われ、得られた有益な置換は、ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ二重可変ドメイン（「ＤＶＤ」）免疫グロブリン（Ｉｇ）に導入された。ＤＶＤ−Ｉｇ免疫グロブリンは、四価の二重標的単一剤を作製するために、リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合可変ドメインを組み合わせる（Ｇｕ  ＆  Ｇｈａｙｕｒ、２０１２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０２：２５−４１参照）。ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇは、ヒト化された抗ＤＬＬ４抗体ｈ１Ａ１１．１の可変領域を含んだ（これは、米国特許出願公開第２０１１／０２１７２３７号の配列番号１８７の重鎖可変領域と米国特許出願公開第２０１１／０２１７２３７号の配列番号１９７の軽鎖可変領域を有する。）。ＤＬＬ４は、腫瘍血管に強く発現されるデルタ様リガンドであり、Ｎｏｔｃｈ経路を介したそのシグナル伝達は、通常の血管発生と腫瘍血管新生に必要とされる。Ｄｌｌ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の遮断は、腫瘍血管新生に特徴的な混沌とした非生産的な血管発芽を増大させることによって、腫瘍増殖を遅らせることが見出された。Ｌｏｂｏｖら、２００７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：３２１９−３２２４頁を参照されたい。
【０２２７】
異なるリンカーを含有するＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇの２つのバージョンを生じさせた。第１の「ＳＬ」バージョンは、抗ＤＬＬ４とベバシズマブ重鎖可変領域を区別する短い重鎖リンカー（アミノ酸配列ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４２７）を有する。）及び抗ＤＬＬ４とベバシズマブ軽鎖可変領域を区別する長い軽鎖リンカー（アミノ酸配列ＴＶＡＡＰＳＶＦＦＰＰ（配列番号４３３）を有する。）を含有した。第２の「ＳＳ」バージョンは、抗ＤＬＬ４とベバシズマブ重鎖可変領域を区別する短い重鎖リンカー（アミノ酸配列ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４２７）を有する。）及び抗ＤＬＬ４とベバシズマブ軽鎖可変領域を区別する短い軽鎖リンカー（アミノ酸配列ＴＶＡＡＰ（配列番号４１８）を有する。）を含有した。両方の場合において、ベバシズマブ可変領域は、抗ＤＬＬ４可変領域の内部にあった（図５を参照されたい。）。
【０２２８】
ＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−Ｉｇは、ＶＥＧＦに対する親和性の増加を示す変異体を同定するために更なる変異分析に供された。ベバシズマブＶＨに焦点をあてた包括的な変異分析は２つの異なる条件で行われた：標的への抗体の１時間の結合、続く洗浄を伴う「１時間アッセイ」、及び標識ＶＥＧＦに対する抗体の１時間の結合と過剰の非標識ＶＥＧＦによる一晩の競合、続く、洗浄を伴う「一晩アッセイ」。１時間アッセイは、より速い結合速度を有するバリアントについて濃縮する可能性が高く、一晩アッセイは、より遅い解離速度を有するそれらの抗体について濃縮することが意図され、これは、結合がコールド競合相手の存在下で一晩生き残る必要があるためである。バリアントは、３つの異なるフォーマット：ＩｇＧ、ＳＬリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇ及びＳＳリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇにおいてスクリーニングされた。ベバシズマブと、ラニビズマブＶＨにおいて使用された４つのアミノ酸置換（Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ及びＳ１００ａＴ；Ｃｈｅｎ、１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１頁）を含有するそのバリアントの結合は、１時間アッセイにおいて区別することができなかったが、一晩アッセイにおいて区別することができた（データは示さず。）。同様に、一晩アッセイは、標準的な１時間アッセイよりも良好により遅い解離速度を有する変異体間の相違を測定する。これは、Ｈ９７Ｙ置換について例示される：結合は、１時間アッセイにおいてＷＴと比較して２．６倍であるが、一晩アッセイにおいて９．３倍として測定された。ベバシズマブなどの遅い解離速度を有する抗体について、１時間アッセイは、結合が非常に短いため、平衡に達することができず、したがって、結果は、より速い結合速度に向けて偏る。一晩のインキュベーションは、大部分のバリアントの結合が平衡に達することができ、したがって、実際の結合親和性に近づける必要がある。ＩｇＧフォーマットにおけるベバシズマブバリアントはまた、１時間アッセイ及び一晩アッセイに加えて、ＢＩＡｃｏｒｅにより分析された。ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットにおける対応するバリアントは、ＢＩＡｃｏｒｅだけによって結合動態について分析された。
【０２２９】
１０．１  材料及び方法
１０．１．１  ＥＬＩＳＡ
抗原への同定されたバリアントの結合を検出するために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅｓ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）は、０．２Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中の１μｇ／ｍＬの非標識ヒトＶＥＧＦを用いて、一晩４℃にて被覆された。次に、プレートは、３０分間、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてブロッキングされ、洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）を用いて洗浄された。全ての洗浄ステップは、３回行われた。１００μＬのＥＬＩＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）中に希釈された、２μＭのベバシズマブバリアントは、ウェルに添加され、１時間又は一晩、３７℃のシェーカーにてインキュベートされた。それぞれのプレートは、各バリアントの結合改善を標準化するために、使用されるべき対照として親のベバシズマブを含有された。プレートは洗浄され、ＥＬＩＳＡ緩衝液中に１：１０００に希釈された１００μＬのヤギ抗ヒトカッパＨＲＰをコンジュゲートした抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）はそれぞれのウェルに添加された。インキュベーションの３０分後、プレートは洗浄され、結合した抗体は、ＴＭＢ１成分ＨＲＰマイクロウェル基質（ＢｉｏＦｘ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）の添加によって検出された。反応は、ＴＭＢマイクロウェル基質に対して、１００μＬ／ウェルの６５０ｎＭ停止試薬を添加することによって停止させ、吸光度は、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて６５０ｎｍで測定された。データは、ソフトウェアＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）により非線形回帰を用いて適合され、ＷＴに対する倍数改善が、ＥＣ５０野生型／ＥＣ５０変異体として報告された。
【０２３０】
１０．１．２  ＢＩＡｃｏｒｅ
ＶＥＧＦ（ヒトＶＥＧＦ−Ａの残基２７−１９１、アクセッション番号ＡＡＶ３８４１２）に対する抗体の結合動態と親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いることによって決定された。カップリング泳動緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｐ−２０、ｐＨ７．４）であった；アッセイ泳動緩衝液は、３００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ７９０６）を含むＨＢＳ−ＥＰ＋であった。ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｒｏｄ＃３１１２５）は、最初に、標準的なＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド、ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＨＳ；及びエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５において、バイオセンサー表面に固定化された。一連のサイクルが行われた結合動態アッセイについて、それぞれのサイクルは、１）ｍＡｂ捕捉、２）Ａｇ又は緩衝液注射、３）解離相及び４）再生からなる。簡単には、抗ＶＥＧＦ抗体は、１０μＬ／分の低流速で並行な表面上に捕捉された。捕捉レベルは、ＶＥＧＦの二量体性に起因して、結合力を最小限にするために低く維持された。抗体は、予備参照のために、陰性対照として機能する参照表面上では捕捉されなかった。その後、ＶＥＧＦ又は緩衝液のみは、結合を監視するために、８０μＬ／分の流速で３分間、全てのフローセルに注入され、次に、解離を監視するために、８０μＬ／分の流速でアッセイ泳動緩衝液を２０−６０分間流した。ＶＥＧＦ注入は、９００ｎＭから１１．１１ｎＭの３点、９倍濃度系列であり、緩衝液のみの注入は、二次参照について機能を果たした。それぞれのサイクルの終了時に、表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を用いて、６０秒及び１０秒のパルスで６０μＬ／分の流速で再生された。結合データは、結合定数を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて、含まれる物質輸送項を有する１：１のラングミュアモデルに適合させた。
【０２３１】
１０．２  結果
改善された親和性のバリアントについての結果を表２１に示す。結合がベバシズマブと同様であり又はそれよりも低いバリアントは表２２において特定されている。親和性改善は、それぞれＢＩＡｃｏｒｅとＥＬＩＳＡ研究について、ＫＤ野生型／ＫＤ変異体及びＥＣ５０野生型／ＥＣ５０変異体として計算された。実施例２においてすでに記載されたものに加えて、ＩｇＧフォーマットにおけるＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅのいずれかによって、改善された親和性を有する全２２個のバリアントが特定された。興味深いことに、ＩｇＧバリアントの特性のすべてが、ＤＶＤ−Ｉｇの内部可変ドメインに移動可能であるわけではない。ＳＬを連結したＤＶＤ−Ｉｇについて、６つのバリアント（ＣＤＲ−Ｈ１におけるＴ３０Ｎ、Ｎ３１Ｆ、Ｎ３１Ｈ、Ｎ３１ＷとＮ３１Ｙ、及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＴ）は、全親和性において、ＫＤについて少なくとも１．５倍の改善が示され、ＳＳを連結したＤＶＤ−Ｉｇについては、たった３つ（ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、Ｎ３１Ｈ及びＮ３１Ｙ）が、ＫＤについて少なくとも１．５倍の改善が示された。解離速度の改善をもたらす置換は、ＩｇＧフォーマットとＳＬリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇフォーマットの両方で同様の効果を有した。また、ＩｇＧフォーマットにおいて減少した解離速度をもたらす置換は、ＩｇＧと比較して頻度が減少しているにもかかわらず、ＳＳリンカーを有する対応するＤＶＤ−Ｉｇバリアントの解離速度の減少をもたらした。ＩｇＧにおけるより速い結合速度を有する１１個のバリアントが同定されたが、Ｈ９７Ｐ置換だけが、ＳＳリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇバリアントの中でより速い結合速度をもたらし、これは、外部ドメインの存在が改善された結合の効果を相殺し得ることを示唆した。ＳＳ連結されたＤＶＤ−Ｉｇについて、内部ドメインの立体障害が、２つのドメインを連結するペプチドの短い距離に起因して、ＳＬ連結されたＤＶＤ−Ｉｇにおいてさらにより大きくなる可能性があった。
【０２３２】
１１．実施例５：ベバシズマブの組み合わせバリアントの特徴付け
１１．１  背景
実施例４において同定された複数の置換を組み込んだベバシズマブの更なるＣＤＲバリアントを生じさせた。ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧの結合を遮断するバリアントの能力、及びＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦにより誘導された増殖を阻害するそれらの能力は、以下に記載されるようにアッセイされた。
【０２３３】
１１．２  ＶＥＧＦ−Ｒ１とＶＥＧＦ−Ｒ２競合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートは、炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中で、一晩４℃にて、２５０ｎｇ／ｍＬの組換えＶＥＧＦ−Ｒ１とＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）のいずれかで被覆された。プレートは洗浄され、３０分間、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてブロッキングされた。ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＥＢ）中のＶＥＧＦ（それぞれＶＥＧＦ−Ｒ１プレートについては４ｎｇ／ｍＬとＶＥＧＦ−Ｒ２プレートについては４００ｎｇ／ｍＬ）と抗体（ＩｇＧフォーマットで）（ＶＥＧＦ−Ｒ１については１：２．５希釈で６７０ｎＭから開始し、ＶＥＧＦ−Ｒ２については１：２希釈で６７ｎＭから開始する。）は、１時間室温にてプレインキュベートされ、次に、洗浄されたプレートに添加された。プレートは、１時間室温にてインキュベートされ、次に、ＥＢ中で１：２，０００に希釈されたビオチン化ヤギ抗ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、０．５ｍｇ／ｍＬ）が洗浄後に添加された。室温で１時間インキュベーション後、プレートは洗浄され、ＥＢ中で１：２，０００に希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ  １ｍｇ／ｍｌ）が添加された。室温で３０分のインキュベーション後、プレートは洗浄され、結合は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＢｉｏＦＸ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）を用いて検出された。反応は、停止溶液（ＢｉｏＦＸ）で終了され、吸光度は、ＶＥＲＳＡマックスマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて６５０ｎｍで測定された。データは、ソフトウェアＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により非線形回帰を用いて適合され、「野生型と比較した倍数改善」としてＥＣ５０野生型／ＥＣ５０変異体として記録された。
【０２３４】
１１．３  ＶＥＧＦにより誘導されたＨＵＶＥＣ増殖の阻害
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、他に記載されているように（Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８年、ＪＢＣ  ２７３：１１１９７頁；Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１７７５４頁）、ＶＥＧＦ分裂促進活性の測定のために使用された。このアッセイにおいて、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ刺激による増殖を阻害する能力について、親抗ＶＥＧＦ  ＩｇＧの効力は、組み合わせ変異を含有するものと比較された。
【０２３５】
ＨＵＶＥＣ細胞は、０．２％ＦＢＳを含むＭ２００ＲＰＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中でウェルあたり６，０００細胞にて９６ウェルプレートに播種され（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｔ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、一晩３７℃でインキュベートされた。１２５μｇ／ｍＬから開始する抗体の連続希釈は、０．２％ＦＢＳを含有する１００／μＬのＭ２００ＲＰＦ中で調製され、氷上で３０分間、１００μＬの５０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦとともにプレインキュベートされた。インキュベーション後、ＶＥＧＦ／抗体混合物は、培地を除去後に個々のウェルに添加され、プレートは４８時間３７℃でインキュベートされた。２０μＬのＡｌａｍａｒブルーが、それぞれのウェルに添加され、一晩インキュベートされ、得られたシグナルは、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＳＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて分光蛍光分析で（励起５５４ｎＭ、発光５９０ｎＭ）読み取った。
【０２３６】
１１．４  結果
Ｃ１からＣ１３として示された組み合わせバリアントについての結果を表２４に示す。ＨＵＶＥＣ増殖におけるＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２結合の阻害の改善は、ＥＣ５０野生型／ＥＣ５０バリアントとして計算された。表２４に示されるように、増殖の阻害を遮断する能力における改善は、ＶＥＧＦに対する改善された親和性と相関する。
【０２３７】
Ｈ９７Ｆ変異のみが２．３倍に結合速度を悪化させながら、６倍を超えて解離速度を改善したため（表２１）、ＩｇＧフォーマットにおける組み合わせバリアントへのＨ９７Ｆの導入は、解離速度を改善させる傾向にあるが、必ずしも、親和性において有意な改善をもたらさない場合がある（表２６におけるＣ５対Ｃ１２；Ｃ６対Ｃ９を対比されたい。）。さらに、Ｈ９７Ｆ置換は、プロテインＡ精製後に収率を低下させる傾向にある（表２６の「発現収率」欄を参照されたい。）。Ｔ３０Ｗ置換の取り込みは、収率をさらに悪化させる。収率におけるこれらに効果は、溶液に暴露された疎水性残基の量の増加によって引き起こされる生成中に折り畳みの変化に起因する場合がある。収率の減少は、ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットにおいて観察されなかった（データは示さず。）。
【０２３８】
１２．実施例６：ＤＶＤフォーマットにおけるベバシツマブバリアントの結合の特徴付け
ＤＶＤ−Ｉｇリンカー設計並びにその長さは、内部ドメインの活性に有意な影響を生じさせることが知られている。それらの標的に対する内部可変ドメインの親和性の損失は、立体障害効果によって大いに引き起こされることが知られている（ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏら、２０１１年、ｍＡｂ  ３：４８７−４９４頁）。
【０２３９】
ＶＥＧＦへの抗ＶＥＧＦ可変ドメインの結合は、異なるフォーマット：ＩｇＧ、及びＳＳリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇ又はＳＬリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇにおいて比較された。ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットにおいて、抗ＶＥＧＦ可変ドメインは内部ドメインとして配置された。結合は、実施例４に記載されている条件を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅによりアッセイされた。
【０２４０】
予想されるように、ＳＳリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇの内部可変ドメインとして抗ＶＥＧＦ可変ドメインを配置することは、親和性の喪失をもたらし、この場合、３２倍であった（ＩｇＧ／ＳＳ  ＫＤ比は０．０３であった。）（表２５参照）。ＳＬリンカーの使用は、なおも親和性の喪失をもたらしたが、ＳＳリンカーを有する場合の親和性の喪失ほど有意ではなかった−この場合、親和性の減少は２．７倍であった（ＩｇＧ／ＳＬ  ＫＤ比は０．３７であった。）。抗ＴＮＦα  ＤＶＤ−Ｉｇについて以前に観察されているように（ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏら、２０１１年、ｍＡｂｓ  ３：４８７−４９４頁）、親和性の喪失は、主により遅い結合速度に起因していた。
【０２４１】
内部可変ドメインにおけるＶＥＧＦの親和性を改善させるために、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））ＶＨ置換が、抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｈ１におけるＴ２８ＤとＮ３１Ｈ、及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７ＹとＳ１００ａＴ）に組み込まれた。ラニビズマブＶＨ置換は、使用されたＢＩＡｃｏｒｅ条件下で、ＩｇＧフォーマットで５．４倍に親和性を改善させた（表２５）。ＤＶＤ−Ｉｇの内部ＶＨドメインに導入した場合、ラニビズマブ置換は、ＳＳリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇについて２．５倍にＶＥＧＦ結合を改善した；しかしながら、これらの置換は、ＳＬリンカーを有するＤＶＤ−Ｉｇの結合を全く改善しなかった（野生型配列と比較したバリアントのＫＤ比は０．８であった。）。ＳＳリンカー単独は親和性に有意な影響を引き起こしたため、ＫＤはほんの７．８６ｎＭであり、これは、ラニビズマブＶＨ置換の寄与があるとしても親抗ＶＥＧＦ抗体より１３倍低い。
【０２４２】
次に、表２４からの選択された組み合わせバリアントは、実施例４に記載されているＤＬＬ４−ＶＥＧＦ  ＤＶＤ−ＩｇのＳＬバージョンとの関連で、ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットに組み込まれた。ＶＥＧＦへのバリアントの結合は、また実施例４に記載されているように、ＢＩＡｃｏｒｅによってアッセイされた。
【０２４３】
結果を表２６に示す。従来のＤＶＤ−Ｉｇ研究において示されているように、ＩｇＧ分子との関連で親和性置換の増加の全てが、ＤＶＤ−Ｉｇの内部抗ＶＥＧＦドメインとの関連で親和性の増加をもたらすというわけではない。表２４のデータと一致して、ＩｇＧとの関連で親和性を数倍に増加させるラニビズマブにおけるアミノ酸置換は、内部ＶＥＧＦドメインの親和性を全く改善させない。Ｃ１０とＣ１２の組み合わせを有する、組み合わせバリアントの少なくとも２つは、そのアッセイとの関連で親和性を約２倍増加させた。これらのバリアントについての解離速度がアッセイの検出限界であったため、親和性改善はさらに大きい可能性がある（表２６においてアスタリスク（＊）で印されている。）。また、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ５、Ｃ９及びＣ１１の組み合わせを組み込んでいるバリアントは、アッセイの検出限界での解離速度を示し、表２６に示されているものよりも良好な親和性を有する可能性がある。
【０２４４】
１３．具体的な実施形態、参照文献の引用
本開示の様々な態様は、以下の番号付けされた段落に記載されている実施形態において記載されている。
【０２４５】
実施形態１．配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）に対応するアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８に対応するアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含む、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、ＣＤＲ−Ｈ１及び／又はＣＤＲ−Ｈ３は、表２１における置換の１つ以上を含み、場合により、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１又は２２の１つ以上から選択される１つ以上の変異又は変異の組み合わせを含み、６つのＣＤＲは全体で、抗体ベバシズマブ又は抗体ラニビズマブのＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２４６】
実施形態２．Ｔ３０Ｋ；Ｔ３０Ｎ、Ｎ３１Ｈ；Ｎ３１Ｌ；Ｎ３１Ｗ；Ｎ３１Ｙ；Ｈ９７Ｆ；Ｈ９７Ｙ；Ｓ１００ａＱ；及びＳ１００ａＴから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２４７】
実施形態３．Ｔ２８Ｇ；Ｔ２８Ｒ；Ｔ２８Ｙ；Ｔ３０Ｒ；及びＳ１００ａＡから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２４８】
実施形態４．Ｎ３１Ｆ；Ｎ３１Ｈ；及びＮ３１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２４９】
実施形態５．Ｔ３０Ｎ；Ｎ３１Ｆ；Ｎ３１Ｈ，Ｎ３１Ｗ及びＮ３１Ｙ；及びＳ１００ａＴから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５０】
実施形態６．置換Ｔ３０Ｋを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５１】
実施形態７．置換Ｔ３０Ｎを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５２】
実施形態８．置換Ｎ３１Ｈを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５３】
実施形態９．置換Ｎ３１Ｌを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５４】
実施形態１０．置換Ｎ３１Ｗを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５５】
実施形態１１．置換Ｎ３１Ｙを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５６】
実施形態１２．置換Ｈ９７Ｆを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５７】
実施形態１３．置換Ｈ９７Ｙを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５８】
実施形態１４．置換Ｓ１００ａＱを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２５９】
実施形態１５．置換Ｓ１００ａＴを含む、実施形態１の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２６０】
実施形態１６．ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含むＤＶＤ−Ｉｇである、実施形態１から１５のいずれかの抗体。
【０２６１】
実施形態１７．（ａ）配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）に対応するアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８に対応するアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含むＶＥＧＦ結合部分であって、ここで、ＶＥＧＦ結合部分のＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ；ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ；ＣＤＲ−Ｈ２におけるＹ５３Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｆ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ；ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；及びＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａから選択される、ベバシズマブ又はラニビズマブと比較して１つ以上の置換を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、場合により、表６、７、８、９、１０、１１、１２−１から１２−９、１３−１６又は２１−２６の１つ以上から選択される１つ以上の追加の変異又は変異の組み合わせを有し、ＶＥＧＦ結合部分の６つのＣＤＲは全体で、抗体ベバシズマブ又は抗体ラニビズマブのＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、ＶＥＧＦ結合部分と、（ｂ）ともに第２の標的に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分を含むＤＶＤ−Ｉｇ。
【０２６２】
実施形態１８．第２の結合部分が、ＶＥＧＦ結合部分の外部にある、実施形態１６又は実施形態１７の抗体。
【０２６３】
実施形態１９．ＶＥＧＦ結合部分が、第２の結合部分の外部にある、実施形態１６又は実施形態１７の抗体。
【０２６４】
実施形態２０．ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、短いリンカーを介して、場合により、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４２７）又はＧＧＧＧＳＧ（配列番号４３０）を介して連結される、実施形態１６から１９のいずれか１つの抗体。
【０２６５】
実施形態２１．ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、中間のリンカーを介して、場合により、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３１）を介して連結される、実施形態１６から１９のいずれか１つの抗体。
【０２６６】
実施形態２２．ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、長いリンカーを介して、場合により、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４２９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３２）を介して連結される、実施形態１６から１９のいずれか１つの抗体。
【０２６７】
実施形態２３．ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、短いリンカーを介して、場合により、ＴＶＡＡＰ（配列番号４１８）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号４２１）、又はＧＧＳＧＧ（配列番号４２３）を介して連結される、実施形態１６から２２のいずれか１つの抗体。
【０２６８】
実施形態２４．ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、中間のリンカーを介して、場合により、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号４２４）を介して連結される、実施形態１６から２２のいずれか１つの抗体。
【０２６９】
実施形態２５．ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、長いリンカーを介して、場合により、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号４２０）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号４２２）、又はＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２５）を介して連結される、実施形態１６から２２のいずれか１つの抗体。
【０２７０】
実施形態２６．第２の標的がＤＬＬ４である、実施形態１６から２５のいずれか１つの抗体。
【０２７１】
実施形態２７．ＣＤＲの第２の重鎖及び軽鎖可変領域が、ＤＬＬ４結合部分のＣＤＲのＣＤＲ配列である配列番号４１３及び配列番号４１４を有する、実施形態２６の抗体。
【０２７２】
実施形態２８．第２の重鎖及び軽鎖可変領域が、配列番号４１３と配列番号４１４のＤＬＬ４結合部分の配列を有する実施形態２７の抗体。
【０２７３】
実施形態２９．ＣＤＲ−Ｈ２が置換Ｋ６４Ｓを含む、実施形態１から２８のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２７４】
実施形態３０．ＣＤＲ−Ｈ２が置換Ｋ６４Ｑを含む、実施形態１から２８のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２７５】
実施形態３１．ＣＤＲ−Ｈ２が置換Ｙ５３Ｆ及びＫ６４Ｑを含む、実施形態１から２８のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２７６】
実施形態３２．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｈ９７Ｅ及びＹ９８Ｆを含む、実施形態１から１２及び１４から３１のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２７７】
実施形態３３．ＣＤＲ−Ｌ２が置換Ｔ５１Ａを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｌ２が、表１３に記載されているＣＤＲ−Ｌ２配列からなるものではない、実施形態１から３２のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２７８】
実施形態３４．ＣＤＲ−Ｈ１が置換Ｎ３１Ｆを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ１が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ１配列からなるものではない、実施形態１から７及び１２から３３のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２７９】
実施形態３５．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｈ９７Ｅを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から１１及び１４から３４のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８０】
実施形態３６．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｈ９７Ｄを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から１１、１４から３１及び３３から３４のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８１】
実施形態３７．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｈ９７Ｐを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から１１、１４から３１及び３３から３４のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８２】
実施形態３８．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｙ９９Ｅを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から３７のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８３】
実施形態３９．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｙ９９Ｄを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から３７のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８４】
実施形態４０．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｓ１００ａＧを含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から１３及び１８から３９のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８５】
実施形態４１．ＣＤＲ−Ｈ３が置換Ｓ１００ａＧを含み、ＶＥＧＦ抗体のＣＤＲ−Ｈ３における３位がチロシンではない、実施形態１から１３及び１８から４０のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８６】
実施形態４２．ＣＤＲ−Ｈ１が、Ｔ２８Ｐ、Ｎ３１Ｆ、Ｎ３１Ｇ及びＮ３１Ｍから選択される少なくとも１つの置換を含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ１が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ１配列からなるものではない、実施形態１から４１のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８７】
実施形態４３．ＣＤＲ−Ｈ３が、Ｈ９７Ａ、Ｈ９７Ｑ、Ｈ９７Ｓ、Ｈ９７Ｔ、Ｓ１００ａＤ、Ｓ１００ａＥ及びＳ１００ａＶから選択される少なくとも１つの置換を含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から４２のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８８】
実施形態４４．ＣＤＲ−Ｈ１が、置換Ｔ３０Ｗ、Ｔ３０Ｒ又はＴ３０Ｑを含み、ＶＥＧＦ抗体が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ１配列からなるものではない、実施形態８から４３のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２８９】
実施形態４５．ＣＤＲ−Ｈ２が、Ｙ５３Ｆ、Ｔ５８Ｆ、Ａ６１Ｇ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｒ、Ａ６１Ｈ、Ａ６１Ｙ、Ｋ６４Ｇ、Ｋ６４Ｅ、Ｒ６５Ｌ、Ｒ６５Ｔ、Ｒ６５Ａ、Ｒ６５Ｅ及びＲ６５Ｄから選択される少なくとも１つの置換を含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ２が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ２配列からなるものではない、実施形態１から４４のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２９０】
実施形態４６．ＣＤＲ−Ｈ３が、Ｙ９８Ｆ及びＹ１００ｅＦから選択される少なくとも１つの置換を含み、ＶＥＧＦ抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３が、表１２−１から１２−９に記載されているＣＤＲ−Ｈ３配列からなるものではない、実施形態１から４５のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２９１】
実施形態４７．重鎖ＣＤＲが、
（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；
（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；
（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；
（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；
（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；
（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；
（ｇ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；
（ｈ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ、及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ；
（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；
（ｊ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；
（ｋ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ
から選択される置換の組み合わせを含む、実施形態１から１８のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２９２】
実施形態４８．６つのＣＤＲが全体で、抗体ベバシズマブ又は抗体ラニビズマブのＣＤＲ配列と比較して、最大１６個、最大１５個、最大１４個、最大１３個、最大１２個、最大１１個、最大１０個、最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個又は最大４個のアミノ酸置換を有する、実施形態１から４７のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２９３】
実施形態４９．いずれかの個々のＣＤＲが、抗体ベバシズマブ又は抗体ラニビズマブの対応するＣＤＲ配列と比較して、３個以下のアミノ酸置換を有する、実施形態１から４６のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２９４】
実施形態５０．いずれかの個々のＣＤＲが、抗体ベバシズマブ又は抗体ラニビズマブの対応するＣＤＲ配列と比較して、２個以下のアミノ酸置換を有する、実施形態１から４６のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２９５】
実施形態５１．それぞれ、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片である、実施形態１から５０のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０２９６】
実施形態５２．それぞれ、ヒト抗体若しくはヒト化抗体、又はヒト化抗体若しくはヒト化抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片である、実施形態１から５１のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２９７】
実施形態５３．ＩｇＧである、実施形態１から５２のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０２９８】
実施形態５４．ＩｇＧ１である、実施形態５３の抗体又は結合断片。
【０２９９】
実施形態５５．ＩｇＧ２である、実施形態５３の抗体又は結合断片。
【０３００】
実施形態５６．二重可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫グロブリンである、実施形態１から５５のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０１】
実施形態５７．抗ＤＬＬ４可変結合ドメインを有する、実施形態５６の抗体又は結合断片。
【０３０２】
実施形態５８．ＡＤＣＣ活性を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態１から５７のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０３】
実施形態５９．フコシル化されていない、実施形態１から５８のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０４】
実施形態６０．ＦｃγＲへの結合を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態１から５９のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０５】
実施形態６１．ＦｃＲｎへの結合を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態１から５９のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０６】
実施形態６２．ＡＤＣＣ活性を減少させるＦｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態１から５４のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０７】
実施形態６３．１つ以上の変異以外に、配列番号１に対応するＶＨ配列と配列番号２に対応するＶＬ配列を有する、実施形態１から６２のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０８】
実施形態６４．１つ以上の変異以外に、配列番号９に対応する重鎖配列と配列番号１０に対応する軽鎖配列を有する、実施形態１から１５、２９から５５及び５８から６３のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３０９】
実施形態６５．配列番号１に対応するＶＨ配列と配列番号２に対応するＶＬ配列を有する抗体の親和性より１．５から５０倍大きい親和性を有する、実施形態１から６３のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３１０】
実施形態６６．配列番号９に対応する重鎖配列と配列番号１０に対応する軽鎖配列を有する抗体の親和性より１．５から５０倍大きい親和性を有する、実施形態１から６３のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３１１】
実施形態６７．配列番号１に対応するＶＨ配列と配列番号２に対応するＶＬ配列を有する抗体の親和性より２から３０倍大きい、実施形態６５の抗体又は結合断片。
【０３１２】
実施形態６８．配列番号９に対応する重鎖配列と配列番号１０に対応する軽鎖配列を有する抗体の親和性より２から３０倍大きい、実施形態６６の抗体又は結合断片。
【０３１３】
実施形態６９．親和性が、バイオセンサーによって分析されるＫＤの尺度である、実施形態６５から６９のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３１４】
実施形態７０．精製されている、実施形態１から６９のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３１５】
実施形態７１．少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の均質性まで精製されている、実施形態７０の抗体又は結合断片。
【０３１６】
実施形態７２．重鎖が、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｇ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｔ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｋ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｖ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｖ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｎ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｋ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｉ及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｈから選択される、少なくとも１つの置換を含む、実施形態１から７１のいずれか１つの抗体又は結合断片。
【０３１７】
実施形態７３．実施形態１−７２のいずれか１つに記載の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片を含む抗体−薬物コンジュゲート。
【０３１８】
実施形態７４．実施形態１から７２のいずれか１つに記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片又は実施形態７３に記載の抗体−薬物コンジュゲート、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【０３１９】
実施形態７５．実施形態１から７２のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【０３２０】
実施形態７６．実施形態７５の核酸を含むベクター。
【０３２１】
実施形態７７．実施形態７６に記載のベクターを用いて形質転換された原核宿主細胞。
【０３２２】
実施形態７８．実施形態７６に記載のベクターを用いて形質転換された真核宿主細胞。
【０３２３】
実施形態７９．実施形態７５のヌクレオチド配列を発現するように操作された真核宿主細胞。
【０３２４】
実施形態８０．哺乳動物宿主細胞である、実施形態７９の真核宿主細胞。
【０３２５】
実施形態８１．（ａ）実施形態７９又は実施形態８０の真核宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片抗体を回収することを含む、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片を生成する方法。
【０３２６】
実施形態８２．治療有効量の実施形態１から７２のいずれか１つに記載の抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片、実施形態７３に記載の抗体−薬物コンジュゲート又は実施形態７４に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【０３２７】
実施形態８３．癌が、結腸の転移性癌腫、直腸の転移性癌腫、非扁平上皮型非小細胞肺癌又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌である、実施形態８２の方法。
【０３２８】
実施形態８４．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３２９】
実施形態８５．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり；
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
ｆ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
ｇ．ＣＦＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧであり、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり；
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３３０】
実施形態８６．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹ又はＴであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦ又はＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３３１】
実施形態８７．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹであり； 
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＡ又はＱ又はＧ又はＴであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３３２】
実施形態８８．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧである、実施形態８６又は実施形態８７のバリアント。
【０３３３】
実施形態８９．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＹである、実施形態８６又は実施形態８７のバリアント。
【０３３４】
実施形態９０．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＴである、実施形態８６又は実施形態８７のバリアント。
【０３３５】
実施形態９１．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦである、実施形態８６から９０のいずれか１つのバリアント。
【０３３６】
実施形態９２．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨである、実施形態８６から９０のいずれか１つのバリアント。
【０３３７】
実施形態９３．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ又はＹ又はＴであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＹ又はＮであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦ又はＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＱ又はＡ又はＧ又はＴであり、
バリアントは、参照抗体のＣＤＲと比較して、Ｋａｂａｔ  ２８、Ｋａｂａｔ  ３１、Ｋａｂａｔ  ９７及びＫａｂａｔ  １００ａのうちの少なくとも２つにおいてアミノ酸置換を含み、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３３８】
実施形態９４．バリアントが、参照抗体のＣＤＲと比較して、Ｋａｂａｔ  ２８、Ｋａｂａｔ  ３１、Ｋａｂａｔ  ９７及びＫａｂａｔ  １００ａのうちの少なくとも２つにおいてアミノ酸置換を含む、実施形態９３のバリアント。
【０３３９】
実施形態９５．バリアントが、参照抗体のＣＤＲと比較して、Ｋａｂａｔ  ２８、Ｋａｂａｔ  ３１、Ｋａｂａｔ  ９７及びＫａｂａｔ  １００ａのうちの少なくとも３つにおいてアミノ酸置換を含む、実施形態９３のバリアント。
【０３４０】
実施形態９６．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０がＮ、Ｗ又はＴである実施形態９３から９５のいずれか１つのバリアント。
【０３４１】
実施形態９７．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＡである、
実施形態８４から８７及び９３から９６のいずれか１つのバリアント。
【０３４２】
９８．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
実施形態８４から９４のいずれか１つのバリアント。
【０３４３】
実施形態９９．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
実施形態８４から９４のいずれか１つのバリアント。
【０３４４】
実施形態１００．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
実施形態８４から９４のいずれか１つのバリアント。
【０３４５】
実施形態１０１．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＹであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＦであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＱである、
実施形態８４から９４のいずれか１つのバリアント。
【０３４６】
実施形態１０２．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＡである、
実施形態８４から９４のいずれか１つのバリアント。
【０３４７】
実施形態１０３．
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８がＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＹであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＨであり； 
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧである、
実施形態８４から９４のいずれか１つのバリアント。
【０３４８】
１０４．Ｋａｂａｔ  ３０がＴである、実施形態８４から１０３のいずれか１つのバリアント。
【０３４９】
実施形態１０５．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ若しくはＲ若しくはＹであり；及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０はＫ若しくはＮであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＬ若しくはＷ若しくはＹであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＡであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３５０】
実施形態１０６．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＦであり；又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＡ若しくはＱであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有する、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３５１】
実施形態１０７．Ｋａｂａｔ  ２８がＧである、実施形態１０５又は実施形態１０６のバリアント。
【０３５２】
実施形態１０８．Ｋａｂａｔ  ２８がＲである、実施形態１０５又は実施形態１０６のバリアント。
【０３５３】
実施形態１０９．Ｋａｂａｔ  ２８がＹである、実施形態１０５又は実施形態１０６のバリアント。
【０３５４】
実施形態１１０．Ｋａｂａｔ  ３０がＫである、実施形態１０７から１０９のいずれか１つのバリアント。
【０３５５】
実施形態１１１．Ｋａｂａｔ  ３０がＮである、実施形態１０７から１０９のいずれか１つのバリアント。
【０３５６】
実施形態１１２．Ｋａｂａｔ  ３０がＲである、実施形態１０７から１０９のいずれか１つのバリアント。
【０３５７】
実施形態１１３．Ｋａｂａｔ  ３０がＷである、実施形態１０７から１０９のいずれか１つのバリアント。
【０３５８】
実施形態１１４．Ｋａｂａｔ  ３１がＨである、実施形態１０７から１１３のいずれか１つのバリアント。
【０３５９】
実施形態１１５．Ｋａｂａｔ  ３１がＬである、実施形態１０７から１１３のいずれか１つのバリアント。
【０３６０】
実施形態１１６．Ｋａｂａｔ  ３１がＷである、実施形態１０７から１１３のいずれか１つのバリアント。
【０３６１】
実施形態１１７．Ｋａｂａｔ  ３１がＹである、実施形態１０７から１１３のいずれか１つのバリアント。
【０３６２】
実施形態１１８．Ｋａｂａｔ  ３１がＦである、実施形態１０７から１１３のいずれか１つのバリアント。
【０３６３】
実施形態１１９．Ｋａｂａｔ  ９７がＡである、実施形態１０７から１１８のいずれか１つのバリアント。
【０３６４】
実施形態１２０．Ｋａｂａｔ  ９７がＤである、実施形態１０７から１１８のいずれか１つのバリアント。
【０３６５】
実施形態１２１．Ｋａｂａｔ  ９７がＥである、実施形態１０７から１１８のいずれか１つのバリアント。
【０３６６】
実施形態１２２．Ｋａｂａｔ  ９７がＦである、実施形態１０７から１１８のいずれか１つのバリアント。
【０３６７】
実施形態１２３．Ｋａｂａｔ  ９７がＰである、実施形態１０７から１１８のいずれか１つのバリアント。
【０３６８】
実施形態１２４．Ｋａｂａｔ  ９７がＹである、実施形態１０７から１１８のいずれか１つのバリアント。
【０３６９】
実施形態１２５．Ｋａｂａｔ  １００ａがＱである、実施形態１０７から１２４のいずれか１つのバリアント。
【０３７０】
実施形態１２６．Ｋａｂａｔ  １００ａがＴである、実施形態１０７から１２４のいずれか１つのバリアント。
【０３７１】
実施形態１２７．Ｋａｂａｔ  １００ａがＡである、実施形態１０７から１２４のいずれか１つのバリアント。
【０３７２】
実施形態１２８．Ｋａｂａｔ  １００ａがＧである、実施形態１０７から１２４のいずれか１つのバリアント。
【０３７３】
実施形態１２９．ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、実施形態８４から１２８のいずれか１つのバリアント。
【０３７４】
実施形態１３０．ＤＶＤ−Ｉｇである、実施形態１２９のバリアント。
【０３７５】
実施形態１３１．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１はＦであり、及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ５３はＦであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６４は、Ｓ若しくはＱであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＤ若しくはＥ若しくはＰであり；及び／又は
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９８はＦであり；及び／又は
ｆ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９はＤ若しくはＥであり；及び／又は
ｇ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＧであり；及び／又は
ｈ．ＣＤＲ−Ｌ２におけるＫａｂａｔ  ５１はＡであり； 
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有し； 
バリアントは、ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３７６】
実施形態１３２．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６１はＦ若しくはＥ若しくはＤであり、及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６２はＧ若しくはＬ若しくはＱ若しくはＴ若しくはＫ若しくはＲ若しくはＥ若しくはＨであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６４は、Ｓ若しくはＶ若しくはＱであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫａｂａｔ  ６５はＶ若しくはＦ若しくはＨ若しくはＮ若しくはＳ若しくはＱ若しくはＫ若しくはＩであり；及び／又は
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９８はＨであり；
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有し； 
バリアントは、ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３７７】
実施形態１３３．参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片であって、
参照抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）及び配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域と、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域を含み、
バリアントにおいて、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ２８はＧ若しくはＲ若しくはＹであり；及び／又は
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３０はＫ若しくはＮ若しくはＲ若しくはＷであり；及び／又は
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１は、Ｆ若しくはＨ若しくはＬ若しくはＷ若しくはＹであり；及び／又は
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７はＡ若しくはＤ若しくはＥ若しくはＦ若しくはＰ若しくはＹであり；及び／又は
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａはＡ若しくはＧ若しくはＱ若しくはＴであり、
バリアントは、場合により、参照抗体のＣＤＲと比較して、表６、７、８、９、１９、１２−１から１２−９、１３−１６、２１、２２及び２４−２６の１つ以上から選択される、１つ以上の追加のＣＤＲ置換又は置換の組み合わせを含み、
バリアントの６つのＣＤＲは全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１７個のアミノ酸置換を有し； 
バリアントは、ＶＥＧＦ重鎖及び軽鎖可変領域が一緒になってＶＥＧＦ結合部分を形成し、第２の標的に一緒に結合する第２の重鎖及び軽鎖可変領域を含む第２の結合部分をさらに含む多重特異的抗体である、参照抗ＶＥＧＦ抗体のバリアント又は参照抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片。
【０３７８】
実施形態１３４．ＤＶＤ−Ｉｇである、実施形態１３１から１３３のいずれか１つのバリアント。
【０３７９】
実施形態１３５．バリアント結合ＶＥＧＦ部分において、
ａ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＰであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＰであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＥであり；
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＥであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＥであり；
ｅ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＥであり；
ｆ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＥであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｇ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｈ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＰであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９９がＤであり；
ｉ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  ９７がＤであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｊ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧであり；
ｋ．ＣＤＲ−Ｈ１におけるＫａｂａｔ  ３１がＦであり、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ、及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＫａｂａｔ  １００ａがＧである、
実施形態１３１から１３４のいずれか１つのバリアント。
【０３８０】
実施形態１３６．第２の結合部分が、ＶＥＧＦ結合部分の外部にある、実施形態１２９から１３５のいずれか１つのバリアント。
【０３８１】
実施形態１３７．ＶＥＧＦ結合部分が、第２の結合部分の外部にある、実施形態１２９から１３５のいずれか１つのバリアント。
【０３８２】
実施形態１３８．ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、短いリンカーを介して、場合により、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４２７）又はＧＧＧＧＳＧ（配列番号４３０）を介して連結される、実施形態１２９から１３７のいずれか１つのバリアント。
【０３８３】
実施形態１３９．ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、中間のリンカーを介して、場合により、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３１）を介して連結される、実施形態１２９から１３７のいずれか１つのバリアント。
【０３８４】
実施形態１４０．ＶＥＧＦ及び第２の重鎖可変領域が、長いリンカーを介して、場合により、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４２９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３２）を介して連結される、実施形態１２９から１３７のいずれか１つのバリアント。
【０３８５】
実施形態１４１．ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、短いリンカーを介して、場合により、ＴＶＡＡＰ（配列番号４１８）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号４２１）、又はＧＧＳＧＧ（配列番号４２３）を介して連結される、実施形態１２９から１４０のいずれか１つのバリアント。
【０３８６】
実施形態１４２．ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、中間のリンカーを介して、場合により、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号４２４）を介して連結される、実施形態１２９から１４０のいずれか１つのバリアント。
【０３８７】
実施形態１４３．ＶＥＧＦ及び第２の軽鎖可変領域が、長いリンカーを介して、場合により、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号４２０）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号４２２）、又はＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２５）を介して連結される、実施形態１２９から１４０のいずれか１つのバリアント。
【０３８８】
実施形態１４４．第２の標的がＤＬＬ４である、実施形態１２９から１４３のいずれか１つのバリアント。
【０３８９】
実施形態１４５．第２の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲが、配列番号４１３と配列番号４１４のＤＬＬ４結合部分のＣＤＲのＣＤＲ配列を有する、実施形態１４４のバリアント。
【０３９０】
実施形態１４６．第２の重鎖及び軽鎖可変領域が、配列番号４１３と配列番号４１４のＤＬＬ４結合部分の配列を有する実施形態１４５のバリアント。
【０３９１】
実施形態１４７．６つのＣＤＲが全体で、参照抗体のＣＤＲ配列と比較して、最大１６個、最大１５個、最大１４個、最大１３個、最大１２個、最大１１個、最大１０個、最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個又は最大４個のアミノ酸置換を有する、実施形態８４から１４６のいずれか１つのバリアント。
【０３９２】
実施形態１４８．いずれかの個々のＣＤＲが、参照抗体の対応するＣＤＲ配列と比較して、３個以下のアミノ酸置換を有する、実施形態８４から１４７のいずれか１つのバリアント。
【０３９３】
実施形態１４９．いずれかの個々のＣＤＲが、参照抗体の対応するＣＤＲ配列と比較して、２個以下のアミノ酸置換を有する、実施形態８４から１４８のいずれか１つのバリアント。
【０３９４】
実施形態１５０．それぞれ、モノクローナル抗体又はモノクローナルの抗ＶＥＧＦ結合断片である、実施形態８４から１４９のいずれか１つのバリアント。
【０３９５】
実施形態１５１．それぞれ、ヒト抗体若しくはヒト化抗体、又はヒト化抗体若しくはヒト化抗体の抗ＶＥＧＦ結合断片である、実施形態８４から１５０のいずれか１つのバリアント。
【０３９６】
実施形態１５２．ＩｇＧである、実施形態８４から１５１のいずれか１つのバリアント。
【０３９７】
実施形態１５３．ＩｇＧ１である、実施形態１５２のバリアント。
【０３９８】
実施形態１５４．ＩｇＧ２である、実施形態１５２のバリアント。
【０３９９】
実施形態１５５．ＡＤＣＣ活性を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態８４から１５４のいずれか１つのバリアント。
【０４００】
実施形態１５６．フコシル化されていない、実施形態８４から１５５のいずれか１つのバリアント。
【０４０１】
実施形態１５７．ＦｃγＲへの結合を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態８４から１５６のいずれか１つのバリアント。
【０４０２】
実施形態１５８．ＦｃＲｎへの結合を増加させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態８４から１５６のいずれか１つのバリアント。
【０４０３】
実施形態１５９．ヘテロ二量体化を強化する、Ｆｃにおける１つ以上の変異を含む、実施形態８４から１５４のいずれか１つのバリアント。
【０４０４】
実施形態１６０．ＡＤＣＣ活性を減少させる、Ｆｃ領域における１つ以上の変異を含む、実施形態８４から１５４のいずれか１つのバリアント。
【０４０５】
実施形態１６１．１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号１のＶＨ配列を有する、実施形態８４から１６０のいずれか１つのバリアント。
【０４０６】
実施形態１６２．１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号２のＶＬ配列を有する、実施形態１６１のバリアント。
【０４０７】
実施形態１６３．１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する、実施形態１６１のバリアント。
【０４０８】
実施形態１６４．１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号９のＶＨ部分のＶＨ配列を有する、実施形態８４から１６０のいずれか１つのバリアント。
【０４０９】
実施形態１６５．１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号２のＶＬ配列を有する、実施形態１６４のバリアント。
【０４１０】
実施形態１６６．１つ以上の特定されたＣＤＲアミノ酸以外に、配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する、実施形態１６４のバリアント。
【０４１１】
実施形態１６７．（ａ）配列番号１のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍又は少なくとも２倍、及び最大２倍、最大３倍又は最大１０倍の親和性を有する、実施形態８４から１６６のいずれか１つのバリアント。
【０４１２】
実施形態１６８．（ａ）配列番号９のＶＨ部分のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍又は少なくとも２倍、及び最大２倍、最大３倍又は最大１０倍の親和性を有する、実施形態８４から１６６のいずれか１つのバリアント。
【０４１３】
実施形態１６９．（ａ）配列番号１のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の２から３倍の親和性を有する、実施形態１６７のバリアント。
【０４１４】
実施形態１７０．（ａ）配列番号９のＶＨ部分のＶＨ配列、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２又は（ｉｉ）配列番号１０のＶＬ部分のＶＬ配列を有する抗体の親和性の２から３倍の親和性を有する、実施形態１６８のバリアント。
【０４１５】
実施形態１７１．親和性が、バイオセンサーによって分析されるＫＤの尺度である、実施形態１６７から１７０のいずれか１つのバリアント。
【０４１６】
実施形態１７２．精製されている、実施形態８４から１７１のいずれか１つのバリアント。
【０４１７】
実施形態１７３．少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の均質性まで精製されている、実施形態１７２のバリアント。
【０４１８】
実施形態１７４．実施形態８４から１７３のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片を含む抗体−薬物コンジュゲート。
【０４１９】
実施形態１７５．実施形態８４から１７３のいずれか１つの抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、又は実施形態１７４に記載の抗体−薬物コンジュゲート、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【０４２０】
実施形態１７６．実施形態８４から１７３のいずれか１つのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【０４２１】
実施形態１７７．実施形態１７６の核酸を含むベクター。
【０４２２】
実施形態１７８．実施形態１７７に記載のベクターを用いて形質転換された原核宿主細胞。
【０４２３】
実施形態１７９．実施形態１７７に記載のベクターを用いて形質転換された真核宿主細胞。
【０４２４】
実施形態１８０．実施形態１７６のヌクレオチド配列を発現するように操作された真核宿主細胞。
【０４２５】
実施形態１８１．哺乳動物宿主細胞である、実施形態１８０の真核宿主細胞。
【０４２６】
実施形態１８２．（ａ）実施形態１８０又は実施形態１８１の真核宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片抗体を回収することを含む、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ結合断片を生成させる方法。
【０４２７】
実施形態１８３．治療有効量の実施形態８４から１７３のいずれか１つに記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、実施形態１７４に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は実施形態１７５に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【０４２８】
実施形態１８４．癌が、結腸の転移性癌腫、直腸の転移性癌腫、非扁平上皮型非小細胞肺癌又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌である、実施形態１８３の方法。
【０４２９】
実施形態１８５．癌が、切除不能であり、局所進行性であり、再発性であり又は転移性である非扁平上皮型非小細胞肺癌である、実施形態１８４の方法。
【０４３０】
実施形態１８６．治療有効量の実施形態８４から１７３のいずれか１つに記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、実施形態１７４に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は実施形態１７５に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、加齢性黄斑変性症、網膜静脈閉塞後の浮腫及び糖尿病性黄斑浮腫から選択される網膜状態を治療する方法。
【０４３１】
実施形態１８７．網膜状態が、加齢性黄斑変性症である、実施形態１８６の方法。
【０４３２】
実施形態１８８．網膜状態が、滲出型加齢性黄斑変性症である、実施形態１８７の方法。
【０４３３】
実施形態１８９．網膜状態が、萎縮型加齢性黄斑変性症である、実施形態１８７の方法。
【０４３４】
実施形態１９０．網膜状態が、網膜静脈閉塞後の浮腫である、実施形態１８６の方法。
【０４３５】
実施形態１９１．網膜状態が、糖尿病性黄斑浮腫である、実施形態１８６の方法。
【０４３６】
実施形態１９２．治療有効量の実施形態８４から１７３のいずれか１つに記載の抗ＶＥＧＦ抗体若しくは抗ＶＥＧＦ結合断片、実施形態１７４に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は実施形態１７５に記載の医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、免疫障害を治療する方法。
【０４３７】
実施形態１９３．免疫障害が、関節リウマチ又はグレーブス病である、実施形態１９２の方法。
【０４３８】
本出願において引用されている全刊行物、特許、特許出願及び他の文献は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献を全目的で参照により組み込むと個別に記載すると同程度まで全目的で全体として参照により本明細書に組み込まれる。様々な具体的な実施形態が例証され、記載されているが、本発明（単数又は複数）の精神及び範囲から逸脱することなしに、種々の変更がなされ得ることが認められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２０−９】
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【図２０−１０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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