(57)【要約】  本発明は、第一の免疫賦活剤が非メチル化シチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）でありおよび第二の免疫賦活剤が３´，５´‐サイクリックジグアニル酸（ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ）である、少なくとも二つの免疫賦活剤の免疫刺激量、ならびに薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導のための該医薬組成物の使用に関する。また本発明は、イン・サイチュでの腫瘍破壊治療におけるその使用ならびに癌に罹患している哺乳動物の治療における使用のための該医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の免疫賦活剤が非メチル化シチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）および第二の免疫賦活剤が３’，５’‐サイクリックジグアニル酸（ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ）である、少なくとも二つの免疫賦活剤の免疫刺激量、ならびに薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
腫瘍破壊および前記の医薬組成物の投与のステップを含むイン・サイチュでの腫瘍破壊治療における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項４】
前記のステップが以下の順番：
ｃ．腫瘍の破壊ならびに
ｄ．前記の医薬組成物の投与
であることを特徴とする、請求項３の医薬組成物。
【請求項５】
前記の医薬組成物の投与のステップが腫瘍破壊後の２４時間内に引き続いて起きることを特徴とする、請求項４の医薬組成物。
【請求項６】
前記の医薬組成物の投与のステップが腫瘍破壊後の１２時間内に引き続いて起きることを特徴とする、請求項５の医薬組成物。
【請求項７】
前記の医薬組成物の投与のステップが腫瘍破壊後の６時間内に引き続いて起きることを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
【請求項８】
前記のステップが以下の順番：
ａ．前記の医薬組成物の周術期投与ならびに
ｂ．腫瘍の破壊
であることを特徴とする、請求項３の医薬組成物。
【請求項９】
該医薬組成物の投与方式が、好ましさが増す順番に、静脈内、新生物塊の排出領域における皮下内、腫瘍周囲または腫瘍内である、請求項３〜８のいずれかの医薬組成物。
【請求項１０】
癌に罹患している哺乳動物における癌の治療における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物が既に腫瘍破壊を受けている、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍破壊を受ける予定であるかまたは既に受けている、癌に罹患している哺乳動物における癌の治療における周術期投与における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１の医薬組成物の投与のステップを含むことを特徴とする、癌に罹患している哺乳動物の治療方法。
【請求項１４】
治療方法が以下のステップを以下の順番：
ａ．イン・サイチュでの腫瘍の破壊ならびに
ｂ．請求項１の医薬組成物の投与
で含むことを特徴とする、癌に罹患している哺乳動物の治療方法。
【請求項１５】
治療方法が以下のステップを以下の順番：
ａ）請求項１の医薬組成物の周術期投与
ｂ）イン・サイチュでの腫瘍の破壊
で含むことを特徴とする、癌に罹患している哺乳動物の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも二つの免疫賦活剤の免疫刺激量を含む医薬組成物、腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導のためのそれらの使用、イン・サイチュでの腫瘍破壊治療におけるそれらの使用ならびに癌に罹患している哺乳動物の治療における使用のための該医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、新生物性成長（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ）を記述するために使用される一般的な用語である。新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）は、一般に正常よりも高速度で増殖する組織の異常な、通常は脱分化型の形態と考えられている。ほとんどの場合、新生細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ）は周辺組織に浸潤し、さらに転移して身体の他の場所で成長し続ける。
【０００３】
例えば、外科的処置等の、新生物塊（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｍａｓｓ）すなわち腫瘍の局所および局部治療は、起こり得る転移に作用しない。従って追加の治療、例えば、細胞障害性薬剤による治療等が必要である。このような治療は一般に化学療法として知られている。
【０００４】
他のアプローチは、腫瘍特異抗原に対する液性免疫応答の誘導であり、しばしば癌免疫療法と称される。腫瘍特異抗原に対するこのような免疫応答の良好な誘導の優位性は、それがしばらくの間持続し、局所腫瘍の治療が可能でない、身体の他の場所での腫瘍局在を排除することである。腫瘍抗原に対する液性免疫応答に関する系統的な総説は、Ｒｅｕｓｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｍ．らによってＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５８：１５３５‐１５４４（２００９）に掲載されている。時々、一または複数の自己腫瘍抗原に対する自発的な液性免疫応答が報告される。別の場合、液性免疫応答は、例えば、腫瘍細胞を単離し、インビトロでこれらの細胞を増殖ならびに引き続いて死滅させ、その後に免疫賦活剤の存在下で患者へ注入することによって、計画的に誘導される。
【０００５】
局所治療は、もちろん固形腫瘍治療における第一のステップである。これは、伝統的に腫瘍切除によって行われる。別のアプローチは、イン・サイチュでの腫瘍破壊である。イン・サイチュでの腫瘍破壊の特徴は、腫瘍が除去されず壊死されることである。原則として、放射線治療がイン・サイチュでの腫瘍破壊の方式であるが、腫瘍破壊の多数の他の方法が開発されている。一般的な方法は、例えば、光増感性化合物とその後のレーザーによるそれらの活性化の組み合せ、レーザー光、マイクロ波、電流、超音波、高密度焦点式超音波による、またはラジオ波によるイン・サイチュでの加熱、または凍結治療：凍結により組織を壊死させることである。
【０００６】
イン・サイチュでの腫瘍破壊は、破壊された腫瘍塊を身体内に存在したまま残す。これは、イン・サイチュで破壊された腫瘍における腫瘍特異抗原に対する免疫応答を試行し構築すること（癌免疫療法）を可能とする。腫瘍特異抗原に対するこのような免疫応答誘導の優位性は、腫瘍由来の物質を単離し、インビトロでの増殖および患者への再注入をしなくても良いことである。
【０００７】
非自己抗原に基づくワクチン開発からの知見に反して、免疫応答を誘導する方法にかかわらず、腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導は決して容易ではない。基本的に腫瘍抗原は、大部分は身体の正常成分：自己抗原である。従って免疫系それ自体としては、自己指向性免疫応答を下方制御し、自己抗原に対して寛容状態をもたらす。
【０００８】
従って癌免疫療法の開発は、免疫賦活に基づく極めて特別なアプローチを必要とする。免疫賦活とは、免疫応答の発生の速度および／または範囲を増加することによる、および／またはその持続期間を延長することによる、免疫応答の強化に対する一般用語である。
【０００９】
現在、非メチル化シチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）が、腫瘍特異自己抗原に対する免疫応答を誘導することのできる、最も好ましい特効のある免疫賦活化合物の群であると考えられている。
【００１０】
これらのシチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストとして作用する。ＣｐＧモチーフは、それらのＴｈ１応答および腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の優先的な誘導のために優れている。ＴＬＲ９は主として、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）によって発現され、これらの細胞は、ＣｐＧモチーフを内部移行し、これに直接応答する。ＴＬＲ９のトリガーに際して、ＤＣは成熟し排泄リンパ節に移行し、そこでＤＣはＴおよびＢリンパ球に対し抗原を提示する。重要なことにこれらのＤＣは、ＭＨＣクラスＩ分子に捕捉された抗原を提示する独自の能力を獲得し、それは交差提示として知られるプロセスであり、腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）の効率的なプライミング（準備刺激）にとって極めて重要である。それ自体、ＣｐＧ  ＯＤＮ投与は、予防的環境において腫瘍増殖を防止することが報告されており、マウスにおける定着腫瘍を根絶することもできた。Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：５３９０‐５３９６（２００８）およびＲｏｕｘ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ．５７：１２９１‐１３００（２００８））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ただし、たとえこれらの腫瘍増殖の防止および定着腫瘍の根絶は意義深いとしても、それは処置されたすべての動物において認められるわけではない。
【００１２】
それ故に、ＣｐＧ  ＯＤＮの効果レベルをさらに高めるための方法に対する継続的な探索が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＣｐＧ  ＯＤＮの効果レベルを高めるための手段を提供する。
【００１４】
ＣｐＧ  ＯＤＮが３’，５’‐サイクリックジグアニル酸（しばしばサイクリックジ‐ＧＭＰまたは単にｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰと称される）と組み合されるとき、これら二つの成分の驚くほど高い免疫賦活効果が認められ、著明な生存率の改善をもたらすことが、驚くべきことに今や見出だされた。腫瘍特異抗原に対する免疫応答誘導におけるＴＬＲ９およびそのアゴニストの重要な役割を考えると、ＴＬＲ９機構と全く関係がないｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰが、それにもかかわらずＣｐＧ  ＯＤＮと組み合されるときに、腫瘍特異自己抗原に対する免疫応答を誘導するために極めて適していると分かったことは本当に驚くべきことである。
【００１５】
サイクリックｄｉ‐ＧＭＰは、多様な細菌種に存在する細胞内シグナル伝達分子である（Ａｍｉｋａｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：６６４９‐６６５５（１９８９），Ｒｏｓｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２７９‐２８１（１９８７）およびＤ’Ａｒｇｅｎｉｏ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２４９７‐２５０４（２００４）。
【００１６】
サイクリックｄｉ‐ＧＭＰは、種々の細菌感染に対する哺乳動物における増強された防御的な自然免疫を刺激することができる（Ｏｇｕｎｎｉｙｉ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：４６７６‐４６８５（２００８）およびＫａｒａｏｌｉｓ  Ｄ．Ｋ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．７５：４９４２‐４９５０（２００７））。
【００１７】
ワクチン用免疫賦活剤としてのｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰの使用が、とりわけ近年Ｇｒａｙ，Ｐ．Ｍ．らによって記載された（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７８：１１３‐１１９（２０１２））。この発表においては、ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰならびに他の既知のワクチン免疫賦活剤であるＬＰＳ、ＣｐＧ  ＯＤＮおよび従来のアルミニウム塩に基づく免疫賦活剤との間で比較が行われた。
【００１８】
しかしながらｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰの使用は、当該技術分野において典型的な非自己ワクチン化との関連で：細菌病原体を含むワクチンにおける免疫賦活剤として主に知られている。インビトロでの基底癌細胞およびＧＦ‐刺激ヒト結腸癌細胞に関するｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰの阻害効果を記載する論文が発表されている。（Ｋａｒａｏｌｉｓ，Ｄ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ３２９：４０‐４５（２００５））。しかしながらｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰは、恐らく上記の理由のために、ＣｐＧ  ＯＤＮとの組み合せでの自己指向性免疫応答における使用のための免疫賦活剤としてこれまで示唆されたことはなかった。免疫刺激における使用のためのＣｐＧ  ＯＤＮは、１９９４年以来記載されている（米国特許ＵＳ６４２９１９９）。ＣｐＧモチーフは、基本的に５’‐Ｘ１‐Ｃ‐ｐＧ‐Ｘ２‐３’の構造を有する。ＣｐＧモチーフ５’‐Ｐｕ‐Ｐｕ‐ＣｐＧ‐Ｐｙｒ‐Ｐｙｒが、中でも最も免疫賦活性であることが知られている（Ｓｃｈｅｕｌｅ，Ｒ．Ｋ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４４：１１９‐１３４（２０００））。基本的にＣｐＧ  ＯＤＮの長さは８から８０塩基であり、ＣｐＧ  ＯＤＮは少なくとも一つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【００１９】
異なる動物種における効果のわずかな違いが頻繁に認められる。単に一例として；ヒトＴＬＲ９は、ＣｐＧモチーフＧ‐Ｔ‐ＣｐＧ‐Ｔ‐Ｔによって最適にトリガーされ、一方でマウスＴＬＲ９は、Ｇ‐Ａ‐ＣｐＧ‐Ｔ‐Ｔによってさらに最適にトリガーされる（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：８３１‐８３５（２００３）。
【００２０】
７つの家畜種および３つの実験室種に対する最適なＣｐＧモチーフが、Ｒａｎｋｉｎ，Ｒ．らによってＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１：３３３‐３４０（２００１）において記載されている。イヌおよびネコの免疫細胞増殖を効率的に刺激するＣｐＧモチーフが、Ｗｅｒｎｅｔｔｅ，Ｃ．Ｍ．らによってＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．８４：２２３‐２３６（２００２）において記載されている。家禽におけるＣｐＧモチーフの適用が、とりわけＡｍｅｉｓｓ，Ｋ．Ａ．らによってＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１１０：２５７‐２６７（２００６）において記載されている。
【００２１】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、さらにＷＯ２０１２／０８９８００、ＷＯ２０１２／１６０１８３およびＷＯ２０１２／１６０１８４に記載されている。異なるＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ  ＯＤＮは、容易に市販品として入手可能であり、望むならばＣｐＧ  ＯＤＮは簡単に合成される。ＣｐＧ  ＯＤＮの適量は、とりわけ上記の刊行物および実施例の欄において見出し得る。
【００２２】
従って本発明の第一の実施形態は、第一の免疫賦活剤がＣｐＧ  ＯＤＮであり、第二の免疫賦活剤が３’，５’‐サイクリックジグアニル酸（ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ）である、少なくとも二つの免疫賦活剤の免疫刺激量、ならびに薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧ  ＯＤＮの適量の決定に関しては、以下の通りである。
【００２４】
ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰに関して非常に適した量は、体重ｋｇ当たり１００μｇおよび体重ｋｇ当たり５０ｍｇの間の範囲である。さらに一層適した量は、５００μｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。単に一例として：マウスにおける使用に関しては、３０μｇ量のｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ／マウス（５０ｇ）が極めて適した量である。ヒトにおける使用に関しては、同等に適した量はヒト当たり４５ｍｇのｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰである。
【００２５】
ＣｐＧ  ＯＤＮに関してマイクログラムでの適した量は、とりわけＣｐＧ  ＯＤＮの長さに依存する。いずれのＣｐＧ  ＯＤＮの分子量もおおむね３０３×ｎと関係し、ここでｎはＣｐＧ  ＯＤＮ内のヌクレオチド数である。単に一例として：２０‐ｍｅｒのＣｐＧ  ＯＤＮの１ｍＭは約６μｇである。
【００２６】
もちろんＣｐＧ  ＯＤＮの適量はまた、ＣｐＧの処方に依存する。極めて強い免疫賦活性ＣｐＧ  ＯＤＮは、より弱いＣｐＧ  ＯＤＮよりもより低い量で投与され得る。
【００２７】
単に指標として：当該技術分野において周知のＣｐＧ１６６８（‘５‐ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ‐３’）等の平均的な免疫賦活性の２０‐ｍｅｒのＣｐＧ  ＯＤＮの適量は、体重ｋｇ当たり２０μｇおよび体重ｋｇ当たり５０ｍｇの間の範囲である。より適した量は５００μｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００２８】
相当する４０‐ｍｅｒのＣｐＧ  ＯＤＮに関して、これは１０００μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを意味する。
【００２９】
ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧ  ＯＤＮは通常、薬剤的に許容可能な担体の中で投与される。担体は、好ましくはｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧ  ＤＯＮが容易に溶解する液体である。極めて適した担体は水および生理食塩水（ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水））である。
【００３０】
従って、単に一例として：本発明によるおよびヒトの治療に適した医薬組成物は、例えば、１００μｌのＰＢＳ中に４５ｍｇのｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよび７５ｍｇのＣｐＧ  ＯＤＮを含み得る。
【００３１】
実施例において、ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧ  ＯＤＮの適量についての情報をさらに提供する。引用する参考文献は、種々の状況下での適量のさらなる例を提供する。
【００３２】
ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧ  ＯＤＮの双方の免疫刺激量を含むこのような医薬組成物は、腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導のために多数の方法において使用され得る。これは例えば、上記のインビトロで培養した腫瘍細胞との組合せでの使用、または上記の腫瘍破壊法との組み合せでの使用であり得る。
【００３３】
従って本発明の第二の実施形態は、腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
【００３４】
腫瘍破壊のときまたはその前後における、腫瘍内またはその周辺へのｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧ  ＯＤＮの併用投与は、イン・サイチュでの腫瘍破壊後の腫瘍特異抗原に対する極めて著明な免疫応答を誘導することが見出だされた。この免疫応答は持続性であり、かつ個々の免疫賦活剤によって誘導される免疫応答よりも顕著に強力である。従ってそれは、たとえ転移細胞が潜在的に身体内に存在しているとしても、該細胞を除去するために極めて適している。
【００３５】
さらにこの免疫応答は、たとえ治療の数週間後に同じ種類の腫瘍細胞が計画的に相当量で投与されるとしても、これらの増殖を防止するのに十分なほど強力であると思われた。
【００３６】
従って本発明のこの実施形態の好ましい形態は、腫瘍破壊および本発明の医薬組成物の投与のステップを含む、イン・サイチュでの腫瘍破壊療法における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
【００３７】
言うまでもないことであるが本発明は、ヒト向けおよび動物向け医薬の分野においてどちらにも適用可能である。
【００３８】
用語「免疫賦活剤の免疫刺激量」は、広い意味で解釈されるべきである。このような量の免疫賦活剤は、免疫系を刺激することが可能である。この刺激は、例えば（必ずしも必要ではないが）、実施例の欄で示される通り、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）およびインターロイキン１２（ＩＬ１２）等のサイトカイン産生の増加に反映され得る。
【００３９】
さらに上記の通り、言うまでもないことであるが本発明は、ヒト向けおよび動物向け医薬の分野においてどちらにも適用可能であるが、しかし動物種に対し使用されるＣｐＧモチーフを、本発明が使用される動物種に適合させるのが（強制ではないが）賢明である。これは、上で要約する刊行物に基づいて容易になし得る。
【００４０】
原則的に、本発明の腫瘍破壊および医薬組成物の投与のステップは、異なる時点または同時に行い得る。理論的にはしかしながら、腫瘍破壊の適用の数日前またはより良好には１週間前または２週間以上前に、免疫系を「プライミング」する目的で、医薬組成物により腫瘍を条件づけることが、好ましい経路であると予想される。
【００４１】
しかしながら驚いたことに、医薬組成物の投与が腫瘍破壊の後、腫瘍破壊後の数日以内、好ましくは一日以内、より好ましくは１２時間以内、さらに一層好ましくは６時間以内、よりさらに一層好ましくは腫瘍破壊後の２時間以内に実施されると、免疫刺激のレベルは、これらのステップの順番が逆であるときよりもより良好であることが見出だされた（Ｎｉｅｒｋｅｎｓ  Ｓ，ｄｅｎ  Ｂｒｏｋ  ＭＨ，Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ  ＲＰ，Ｇｒａｕｅｒ  ＯＭ，Ｂｅｎｎｉｎｋ  Ｅ，Ｍｏｒｇａｎ  ＭＥ，Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ，Ｒｕｅｒｓ  ＴＪ，Ａｄｅｍａ  ＧＪ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  Ｊｕｌ  １；６８（１３）：５３９０‐６）。
【００４２】
また、医薬組成物の投与が腫瘍破壊の約二時間前と破壊時の間に実施されるとき、極めて良好な結果が得られる。これは破壊後、破壊により誘導された新生物塊の構造における変化のために、新生物塊に接近または侵入することが、より難く成り得るからである。
【００４３】
腫瘍破壊の二時間前と二時間後との間における医薬組成物の投与は、周術期投与と称される。
【００４４】
従って、この実施形態の一つの好ましい形態は、腫瘍破壊および本発明の医薬組成物の投与のステップを含む、イン・サイチュでの腫瘍破壊療法における使用のための医薬組成物に関し、ここで前記のステップが以下の順番：
ａ．腫瘍の破壊ならびに
ｂ．本発明の医薬組成物の投与
であることを特徴とする。
【００４５】
この実施形態のより好ましい形態は、上記の順番でのステップに関し、ここでその順番で好ましさが増す、腫瘍破壊後の２４時間、１２時間または６時間以内に医薬組成物の投与が引き続いて起きる。
【００４６】
この実施形態の他の好ましい形態は、腫瘍破壊および本発明の医薬組成物の投与のステップを含む、イン・サイチュでの腫瘍破壊療法における使用のための医薬組成物に関し、ここで前記のステップが以下の順番：
ａ．本発明の医薬組成物の周術期投与ならびに
ｂ．腫瘍の破壊
であることを特徴とする。
【００４７】
医薬組成物の投与部位に関しては、以下の考慮がなされるべきである：
好ましくは、医薬組成物は新生物塊の中に直接投与される。若干好ましくないが、医薬組成物が新生物塊周囲の一以上の部位に投与される、腫瘍周囲への投与もまた可能である。腫瘍周囲への投与とは、腫瘍の周囲、好ましくは腫瘍表面から１センチメートル以下の距離以内での投与である。最も好ましい腫瘍周囲への投与は、腫瘍表面で行われる。腫瘍の一つの面での投与は適当であるが、好ましくは本発明の医薬組成物は、腫瘍周囲の二つ以上の面で投与される。
【００４８】
あまり好ましくないが他の投与は、新生物塊の排出領域への皮下投与である。最後に、好ましくは新生物塊の場所近くでの静脈内投与が可能である。
【００４９】
従って前記の医薬組成物の投与は、好ましさが増す順番に、静脈内投与、新生物塊の排出領域における皮下投与、腫瘍周囲への投与または腫瘍内への投与により行われる。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物の癌治療における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
【００５１】
この実施形態の好ましい形態は、本発明の使用のための医薬組成物に関し、ここで哺乳動物は既に腫瘍破壊されている。
【００５２】
本発明のさらなる他の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物の癌治療における周術期投与における使用のための本発明の医薬組成物に関し、ここで該哺乳動物は腫瘍破壊を受ける予定であるかまたは既に受けている。
【００５３】
本発明の他の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物の治療方法に関し、前記の治療方法が本発明の医薬組成物の投与のステップを含むことを特徴とする。
【００５４】
さらに本発明の他の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物の治療方法に関し、前記の治療が以下の順で以下のステップ：  
ａ．イン・サイチュでの腫瘍の破壊ならびに
ｂ．本発明の医薬組成物の投与
を含むことを特徴とする。
【００５５】
本発明のさらなる他の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物の治療方法に関し、前記の治療が以下の順で以下のステップ：
ａ．本発明の医薬組成物の周術期投与ならびに
ｂ．イン・サイチュでの腫瘍の破壊
を含むことを特徴とする。
【００５６】
実施例
実施例１
マウスおよび腫瘍細胞
Ｃ５７Ｌ／６ｎマウス（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｉｇａ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｉｊｍｅｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において、特別な病原体フリーのバリア条件下で飼育した。飲料水および標準実験用試料ペレットを自由に与え、特定の処理群への無作為割り当ての前に、マウスを少なくとも１週間飼育した。実験は、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ動物実験委員会の動物飼育ガイドラインに従って行った。
【００５７】
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ）を完全培地中で培養した（ＭＥＭ、５％ウシ胎児血清（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ‐ｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅ）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３、ＭＥＭビタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（すべてＧｉｂｃｏ製）、２０μＭ  β‐メルカプトエタノール（β‐ＭＥ））。
【００５８】
腫瘍モデルおよび凍結手術
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（２：１）の混合液に懸濁し、総容量５０μｌ中の０．５＊１０６個の細胞を右大腿に皮下注射した。腫瘍直径が６〜８ｍｍとなったときに（一般に９〜１０日）、それらを処理群にランダムに割り当てた。イソフルラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ麻酔下で、その先端を循環液体窒素の連続流動によって冷却する液体窒素冷凍アブレーションシステム（ＣＳ７６，Ｆｒｉｇｉｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）を使用して、冷凍アブレーション（クライオ（Ｃｒｙｏ））を実施した。凍結と解凍の２回の処理サイクルの間に、腫瘍は巨視的に凍結されたが、一方で周囲の健常組織は無傷のままであった。持続性の腫瘍防御の誘導をモニターするために、冷凍アブレーション４０日後に１５＊１０３個のＢ１６Ｆ１０細胞によりマウスを再負荷した。再負荷は、１００μｌのＰＢＳで右側腹部に皮下注射した。腫瘍容積が１０００ｍｍ３を超えたとき、または腫瘍が皮膚バリアーを突破したときにマウスを屠殺した。
【００５９】
免疫賦活剤の注入
完全ホスホロチオエート修飾主鎖を有するＣｐＧ  １６６８（‘５‐ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ‐３’）をＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ）から購入した。Ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰを、Ｓｐｅｈｒ  Ｖ，Ｗａｒｒａｓｓ  Ｒ，Ｈｏｅｃｈｅｒ  Ｋ，Ｉｌｇ  Ｔ．によってＡｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｏｃｔ；１６５（３‐４）：７６１‐７５において記載された通りに合成した。ＣｐＧおよび／またはＣ‐ｄｉ‐ＧＭＰを、ＰＢＳ中で腫瘍周囲に注入した（ｐ．ｔ．、アブレーションされた腫瘍一面を覆う二回以上の２０μｌの注入に分割された３０μｇ）。すべての注入は、アブレーション後３０分以内に行った。
【００６０】
サイトカイン測定
マウス骨髄系樹状細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）と共に培養し、培養７日目に収集した。１．２×１０５個の細胞を一晩のインキュベーションの間、以下の免疫賦活剤に暴露した：ＣｐＧ  １６６８  １μｇ／ｍｌ、ｃ‐ＧＭＰ  １０  μｇ／ｍｌ、ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ  １０  μｇ／ｍｌ。次に上清を注意深く収集し、ＩＬ１２またはＩ型ＩＦＮ産生を定量した。ＩＬ１２に関しては、製造者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の指示に従ってＥＬＩＳＡ法を使用した。Ｉ型ＩＦＮは、Ｌ９２９  ＩＳＲＥリポーター細胞を使用する標準バイオアッセイによって定量した。
【００６１】
統計解析
カプランマイヤー生存曲線を、ログランク検定を使用して解析した。サイトカインデータは、分散分析を使用してポストホックボンフェローニテストにより解析した。
【００６２】
結果：
図１のグラフから明らかな通り、腫瘍破壊および免疫賦活剤としてのＣｐＧ  ＯＤＮまたはｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ投与の組み合せは、アブレーション単独に比較して増加した６０日後の生存率（約５０％）をもたらす（図１）。しかしながら、腫瘍破壊並びに免疫賦活剤としてのＣｐＧおよびｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰの双方の投与との組み合せは、＞７５％といった優れた６０日後の生存率をもたらし、双方の個々の免疫賦活剤単独により得られる生存率よりも強力である。
【００６３】
ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよび／またはＣｐＧとＤＣのインキュベーションの後で産生されるサイトカインの分析は、これらの免疫賦活剤の組み合せがＩ型ＩＦＮおよびＩＬ１２の相乗的な産生をもたらすことを明らかにした。
【００６４】
Ｉ型ＩＦＮは、抗腫瘍環境において、樹状細胞および他の細胞における効率的な交差提示に必須であることが知られている（Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０８：１９８９‐２００３（２０１１））。
【００６５】
インターロイキンＩＬ１２は、一般的にＴｈ１応答に向けて免疫系を活発にすることが知られているサイトカインであり、それは一般に抗腫瘍免疫にとって好ましい。
【００６６】
図２から明らかなように、培地、対照のｃ‐ＧＭＰまたはＣｐＧが使用されたとき、ＩＦＮはまったく、またはわずかな量しか産生されなかった。本実験で使用した量のｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ（１０μｇ／ｍｌ）だけが＜５０Ｕ／ｍｌのＩＦＮの産生をもたらした。しかしながらＣｐＧがｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰと組み合されたとき、＞２００Ｕ／ｍｌという強い相乗的なＩＦＮの産生が認められた。
【００６７】
図３は、培地、対照のｃ‐ＧＭＰまたはｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰが単独で免疫賦活剤として使用されたとき、ＤＣがＩＬ１２を産生しないことを示す。ＣｐＧ単独では、濃度依存的にわずかなレベルのＩＬ１２産生をもたらした。しかしながらＣｐＧがｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰと組み合されたとき、相乗的なＩＬ１２の産生が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】Ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧと組み合わせたアブレーション後の抗腫瘍メモリ応答。右大腿の皮下に増殖するＢ１６Ｆ１０細胞の定着腫瘍を、冷凍アブレーション単独で、または表示した免疫賦活剤と組み合わせて処理した。免疫賦活剤（３０μｇ）を、アブレーション後の腫瘍周囲領域にＰＢＳ４０μｌ中で注入した。４０日後に、ナイーブおよび腫瘍フリーのマウスを、１５．０００個のＢ１６Ｆ１０細胞で脇腹への皮下注射によって再負荷した。この再負荷の成長をカプランマイヤー生存曲線として描いており、ＣｐＧまたはｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰとの組み合せのアブレーション後の腫瘍成長の強化された保護、およびＣｐＧがｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰと組み合されるときのより優れた保護を示している。クライオ／ＣｐＧ／ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰと比較するクライオ／ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰについてｐ＜０．０５である。
【図２】ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧによる併用治療の際のＤＣによる相乗的Ｉ型ＩＦＮの産生。マウス骨髄系樹状細胞をＧＭ‐ＣＳＦと共に培養し、培養７日目に収集した。１．２×１０５個の細胞を一晩のインキュベーションの間、表示した免疫賦活剤または免疫賦活剤の組み合せ：ＣｐＧ  １μｇ／ｍｌ、ｃ‐ＧＭＰ  １０μｇ／ｍｌ、ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ  １０μｇ／ｍｌに暴露した。次に上清を収集し、Ｉ型ＩＦＮ産生をＬ９２９  ＩＳＲＥ細胞を使用して標準的なバイオアッセイによって定量した。結果は、標準誤差付きの平均で示され、すべての他のバーに対し＊＝Ｐ＜０．００１である。同様の結果を三つの独立した実験において得た。
【図３】ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰおよびＣｐＧによる併用治療の際のＤＣによる相乗的ＩＬ１２の産生。マウス骨髄樹状細胞をＧＭ‐ＣＳＦと共に培養し、培養７日目に収集した。１．２×１０５個の細胞を一晩のインキュベーションの間、表示した免疫賦活剤：ＣｐＧ  １μｇ／ｍｌ、ｃ‐ＧＭＰ  １０μｇ／ｍｌ、ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ  １０μｇ／ｍｌに暴露した。次に上清を収集し、ＩＬ１２産生を標準的なＥＬＩＳＡ法によって定量した。結果は、標準誤差付きの平均で示され、＊＝Ｐ＜０．００１である。同様の結果を三つの独立した実験において得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月12日(2016.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の免疫賦活剤が非メチル化シチジルグアノシルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）および第二の免疫賦活剤が３’，５’‐サイクリックジグアニル酸（ｃ‐ｄｉ‐ＧＭＰ）である、少なくとも二つの免疫賦活剤の免疫刺激量、ならびに薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
腫瘍特異抗原に対する免疫応答の誘導における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
腫瘍破壊および前記の医薬組成物の投与のステップを含むイン・サイチュでの腫瘍破壊治療における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項４】
前記のステップが以下の順番：
ｃ．腫瘍の破壊ならびに
ｄ．前記の医薬組成物の投与
であることを特徴とする、請求項３の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
前記の医薬組成物の投与のステップが腫瘍破壊後の２４時間内に引き続いて起きることを特徴とする、請求項４の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記の医薬組成物の投与のステップが腫瘍破壊後の１２時間内に引き続いて起きることを特徴とする、請求項５の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
前記の医薬組成物の投与のステップが腫瘍破壊後の６時間内に引き続いて起きることを特徴とする、請求項６の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
前記のステップが以下の順番：
ａ．前記の医薬組成物の周術期投与ならびに
ｂ．腫瘍の破壊
であることを特徴とする、請求項３の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
該医薬組成物の投与方式が、好ましさが増す順番に、静脈内、新生物塊の排出領域における皮下、腫瘍周囲または腫瘍内である、請求項３〜８のいずれかの使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
癌に罹患している哺乳動物における癌の治療における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物が既に腫瘍破壊を受けている、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍破壊を受ける予定であるかまたは既に受けている、癌に罹患している哺乳動物における癌の治療における周術期投与における使用のための、請求項１の医薬組成物。
【国際調査報告】
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