(57)【要約】【課題】アルデヒド官能化およびケトン官能化タンパク質は、化学修飾されたバイオ医薬品およびタンパク質系材料の開発のための有望な新規基材である。これらの反応性カルボニル基は、典型的には、置換ヒドラジンやアルコキシアミンのようなα効果求核試薬とコンジュゲートして、それぞれヒドラゾンおよびオキシムを生成する。しかし、生じたＣ＝Ｎリンケージは生理的に関連する条件下で加水分解を受けやすく、それによって生物系における有用性が制限される。【解決手段】ここで、我々は、アルデヒドとトリプタミン求核試薬の古典的ピクテ−スペングラー反応に基づくピクテ−スペングラーライゲーションを導入する。このライゲーションは、アルデヒドとアルコキシアミンの生体直交型反応を利用して、中間体オキシイミニウムイオンを形成し、この中間体は、インドール求核試薬により分子内Ｃ−Ｃ結合形成を経て、加水分解に安定なオキサカルボリン生成物を形成する。反応は、治療用モノクローナル抗体ハーセプチンのアルデヒドタグ化変異体を含む、グリオキサール官能化およびホルミルグリシン官能化タンパク質の、部位特異的化学修飾に利用された。アルデヒドのタンパク質への部位特異的な導入技法と共に、ピクテ−スペングラーライゲーションは、医療および材料用途向けの安定なバイオコンジュゲートを生成するための新しい手段をもたらす。【選択図】図１
2016505528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式を有する化合物：
【化１】
2016505528.tif 000037
（式中、
Ａは、存在または非存在であり、存在している場合、置換または非置換アリールまたはヘテロアリール部分であり、Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、アシル、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ６および−ＮＯ２から選択される構成要素であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの２つ以上は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である環系を形成し、
ＲｘおよびＲｙは、Ｈおよび置換または非置換アルキルから選択され、ただし、ＲｘおよびＲｙの少なくとも一方は、
【化２】
2016505528.tif 000038
から選択される式を有し、
式中、
Ｒｏは、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択され、
ｓは、１および２から選択され、
式中、
Ｒ１、ＲｘおよびＲｙから選択される構成要素は次式を有し：
【化３】
2016505528.tif 000039
式中、
Ｌは置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり、
Ｘは、検出可能なラベル、架橋性部分、ポリ（エチレングリコール）およびアフィニティーラベルから選択される）。
【請求項２】
次式を有する、請求項１に記載の化合物。
【化４】
2016505528.tif 000040
【請求項３】
下記から選択される式を有する、請求項１または２に記載の化合物。
【化５】
2016505528.tif 000041
【請求項４】
下記から選択される式を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【化６】
2016505528.tif 000042
【請求項５】
次式を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物：
【化７】
2016505528.tif 000043
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、アシル、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ６および−ＮＯ２から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの２つ以上は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である環系を形成し、
Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される構成要素であり、Ｒ９およびＲ１０は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である５員〜７員環を形成する）。
【請求項６】
Ｌが、置換または非置換の、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を有するアルキルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘが、フルオロフォアおよびビオチンから選択される構成要素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
ＬＸが次式を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物：
【化８】
2016505528.tif 000044
（式中、
Ｒ７は、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択され、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される）。
【請求項９】
Ｒ７が次式を含む、請求項５に記載の化合物：
【化９】
2016505528.tif 000045
（式中、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される）。
【請求項１０】
アルデヒドおよびケトンから選択される構成要素で官能化された生体分子を修飾する方法であって、
（ａ）前記生体分子を請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物と、前記化合物と前記アルデヒドおよび前記ケトンから選択される部分との反応によって環化ピクテ−スペングラー付加体を形成するのに適した反応条件下で接触させる工程であって、それによって前記生体分子を修飾する、工程
を含む方法。
【請求項１１】
前記付加体が下記から選択される式を有する、請求項１０に記載の方法：
【化１０】
2016505528.tif 000046
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、アシル、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ６および−ＮＯ２から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの２つ以上は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である環系を形成し、
Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される構成要素であり、Ｒ９およびＲ１０は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である５員〜７員環を形成する）。
【請求項１２】
前記付加体が下記から選択される式を有する、請求項１０または１１に記載の方法。
【化１１】
2016505528.tif 000047
【請求項１３】
工程（ａ）の前に、前駆体生体分子が、前記アルデヒドおよび前記ケトンから選択される構成要素を含む反応性部分で修飾され、それによってアルデヒドおよびケトンから選択される構成要素で官能化された前記生体分子を形成する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子が、タンパク質、グリカン、核酸、代謝産物、阻害物質、脂質、および補因子から選択される構成要素である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体分子が抗体である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１２年１１月１６日の米国特許仮出願第６１／７２７，５０１号に基づく優先権を主張する。なお、この仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
米国連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の下になされた発明の権利に関する記載
[0002]  本発明は、米国国立衛生研究所により供与された認可番号ＧＭ５９９０７を受けて米国政府の助成でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
序論
[0003]  タンパク質修飾の反応方法は、１０年間盛んな研究領域であった。初期の戦略では天然アミノ酸の全体的な修飾に焦点が絞られ、不均一に修飾された生成物が得られた（Glazer AN（1970）, “Specific Chemical Modification of Proteins,” Annu. Rev. Biochem. 39（1）：101-130）。しかし、種々の用途はタンパク質の部位特異的修飾を要する：レポーター分子の付着部位に関する知識を必要とする生物物理学的研究（Michalet X, Weiss S, & Jager M（2006）, “Single-Molecule Fluorescence Studies of Protein Folding and Conformational Dynamics,” Chem. Rev. 106（5）：1785-1813）、特定の配向で固定化を必要とするタンパク質マイクロアレイおよび機能材料の調製（Wong LS, Khan F, & Micklefield J（2009）, “Selective Covalent Protein Immobilization：Strategies and Applications,” Chem. Rev. 109（9）：4025-4053）、ならびに化学修飾の部位が得られる生物学的物質の薬物動態特性および治療特性に影響を及ぼす、タンパク質薬物とポリ（エチレングリコール）または細胞傷害性分子とのコンジュゲーション（Shen B-Q., et al.（2012）, “Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates,” Nat. Biotechnol. 30（2）：184-189；Cho H, et al.（2011）, “Optimized clinical performance of growth hormone with an expanded genetic code,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（22）：9060-9065）。したがって、近年、この分野では、典型的には生体直行型反応性を示す本来備わっていない官能基の導入を伴う、タンパク質の部位特異的修飾を実現する方法が開発されてきた（Sletten EM & Bertozzi CR（2009）, “Bioorthogonal Chemistry：Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality,” Angew. Chem. Int. Ed. 48（38）：6974-6998；Stephanopoulos N & Francis MB（2011）, “Choosing an effective protein bioconjugation strategy,” Nat. Chem. Biol. 7（12）：876-884）。
【０００４】
[0004]  アルデヒドおよびケトンは、部位特異的タンパク質修飾の化学的手掛かり（chemical handle）として一般的な選択肢である。それらの穏やかな求電子剤としての独特の反応性によって、置換ヒドラジンおよびアルコキシアミンなどのα効果求核剤との選択的コンジュゲーションが可能になり、それぞれヒドラゾンおよびオキシムライゲーション生成物が生じる（Jencks WP（1964）, “Simple Carbonyl Group Reactions,” Prog. Phys. Org. Chem. 2：63-128）。アルデヒドおよびケトンをタンパク質に部位特異的に導入するために、種々の化学的、酵素的、および遺伝子的方法が開発されてきた。これらには、N末端セリンまたはトレオニン残基の過ヨウ素酸酸化（Geoghegan KF & Stroh JG（1992）, “Site-Directed Conjugation of Nonpeptide Groups to Peptides and Proteins Via Periodate-Oxidation of a 2-Amino A1cohol- Application to Modification at N-Terminal Serine,” Bioconjugate Chem. 3（2）：138-146）；α-ケトアミドまたはグリオキサミドを生成するための、ピリドキサールリン酸によって媒介されるN末端アミノ基転移（Gilmore JM, Scheck RA, Esser-Kahn AP, Joshi NS, & Francis MB（2006）, “N-Terminal Protein Modification through a Biomimetic Transamination Reaction,” Angew. Chem. Int. Ed. 45（32）：5307-5311；Scheck RA, Dedeo MT, Iavarone AT, & Francis MB（2008）, “Optimization of a Biomimetic Transamination Reaction,” J. Am. Chem. Soc. 130（35）：11762-11770；Witus LS. et al.（2010）, “Identification of Highly Reactive Sequences For PLP-Mediated Bioconjugation Using a Combinatorial Peptide Library,” J. Am. Chem. Soc. 132（47）：16812-16817； Witus LS & Francis M（2009）, “Site-Specific Protein Bioconjugation via a Pyridoxal 5'-Phosphate-Mediated N-Terminal Transamination Reaction,” Current Protocols in Chemical Biology,（John Wiley & Sons, Inc））；発現タンパク質ライゲーションによって生じたタンパク質C末端チオエステルへのケトンを含む低分子の付加（Esser-Kahn AP & Francis MB（2008）, “Protein-Cross-Linked Polymeric Materials through Site-Selective Bioconjugation,” Angew. Chem. Int. Ed. 47（20）：3751-3754）；アンバー終止コドン抑制によるケトンを含む非天然アミノ酸の遺伝子にコードされた組み込み（Wang L, Zhang Z, Brock A, & Schultz PG（2003）, “Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100（1）：56-61；Hutchins BM. et al.（2011）, “Selective Formation of Covalent Protein Heterodimers with an Unnatural Amino Acid,” Chem. Biol. 18（3）：299-303；Kim CH, et al.（2012）, “Synthesis of Bispecific Antibodies using Genetically Encoded Unnatural Amino Acids,” J. Am. Chem. Soc. 134（24）：9918-9921）；アルデヒドまたはケトンを有する低分子の酵素的ライゲーションを方向づけるペプチドタグの遺伝的コード化（Rashidian M, Song JM, Pricer RE, & Distefano MD（2012）, “Chemoenzymatic Reversible Immobilization and Labeling of Proteins without Prior Purification,” J. Am. Chem. Soc. 134（20）：8455-8467；Chen I, Howarth M, Lin W, & Ting AY（2005）, “Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase,” Nat. Methods 2（2）：99-104）；および本発明者らの実験室で開発された「アルデヒドタグ」法である、ホルミルグリシン生成酵素（FGE）による修飾のための部位の遺伝的コード化（Carrico IS, Carlson BL, & Bertozzi CR（2007）, “Introducing genetically encoded aldehydes into proteins,” Nat. Chem. Biol. 3（6）：321-322；Wu P. et al.（2009）, “Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106：3000-3005；Hudak JE, Yu HH, & Bertozzi CR（2011）, “Protein Glycoengineering Enabled by the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the Genetically Encoded Aldehyde Tag,” J. Am. Chem. Soc. 133（40）：16127-16135）；Hudak JE, et al.（2012）, “Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions Using Copper-Free Click Chemistry and the Aldehyde Tag,” Angew. Chem. Int. Ed. 51（17）：4161-4165；Shi X. et al.（2012）, “Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for singlemolecule imaging,” Nat. Methods 9（5）：499-503；Rabuka D, Rush JS, deHart GW, Wu P, & Bertozzi CR（2012）, “Site-specific chemical protein conjugation using genetically encoded aldehyde tags,” Nat. Protoc. 7（6）：1052-1067）が含まれる。
【０００５】
[0005]  反応性カルボニル基をタンパク質に導入する方法の多様性は、それらの化学修飾のために広範囲で採用されている限定された数の反応とは対照をなす。非常に多くの報告書では、上記のヒドラゾンおよびオキシム形成反応がそれらの生体直交性、操作の簡便さ（すなわち、補助試薬を必要としない）、および穏和な水性条件下における良好な収率のため行われている。しかし、得られるＣ＝Ｎ結合は加水分解を受けやすく（Mueller BM, Wrasidlo WA, & Reisfeld RA（1990）, “Antibody conjugates with morpholinodoxorubicin and acid cleavable linkers,” Bioconjugate Chem. 1（5）：325-330）、長期安定性が必要とされる状況においてそれらの有用性が損なわれる。例えば、α−ＣＤ３３と細胞障害作用を有するカリケアマイシンとの抗体−薬物コンジュゲートであるマイロターグにおけるヒドラゾンリンケージの不安定性が死に至る一因となり、この薬物を米国市場から撤退させたと考えられる（Ducry L & Stump B（2009）, “Antibody-Drug Conjugates：Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies,” Bioconjugate Chem. 21（1）：5-13）。オキシムはＣ＝Ｎリンケージが加水分解に最も安定であると同定されたが、希釈条件下での加水分解に対してはやはり熱力学的に不安定であり、酸触媒プロセスを経て分解する（Kalia J & Raines RT（2008）, “Hydrolytic Stability of Hydrazones and Oximes,” Angew. Chem. Int. Ed. 47（39）：7523-7526）。理想的な保存条件下、すなわち低温、高濃度、および中性または高ｐＨで維持されているオキシムコンジュゲートは動力学的に安定であり、したがって短期の実験室での研究に適していることを多くの研究者が見出した（Hudak JE, Yu HH, & Bertozzi CR（2011）, “Protein Glycoengineering Enabled by the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the Genetically Encoded Aldehyde Tag,” J. Am. Chem. Soc. 133（40）：16127-16135.）；Shi X. et al.（2012）, “Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imaging,” Nat. Methods 9（5）：499-503；Yi L, et al.（2010）, “A Highly Efficient Strategy for Modification of Proteins at the C Terminus,” Angew. Chem. Int. Ed. 49（49）：9417-9421）。しかし、生理的温度および低濃度においてコンジュゲートの持続延長を必要とする生物学的用途では、オキシムが提供する共有結合より著しく安定な共有結合が必要である。
【０００６】
[0006]  理想的なバイオコンジュゲーション反応であれば、タンパク質アルデヒドおよびケトンと安定なＣ−Ｃ結合を形成する。このような反応はいくつか報告されているが、遅い反応速度（Sasaki T, Kodama K, Suzuki H, Fukuzawa S, & Tachibana K（2008）, “N-terminal labeling of proteins by the Pictet-Spengler reaction, “ Bioorg. Med. Chem. Lett. 18（16）：4550-4553）または有機共溶媒の必要性（Alam J, Keller TH, & Loh T-P（2010）, “Functionalization of Peptides and Proteins by Mukaiyama Aldol Reaction, “ J. Am. Chem. Soc. 132（28）：9546-9548；Alam J, Keller TH, & Loh T-P（2011）, “Indium mediated allylation in peptide and protein functionalization,” Chem. Commun. 47（32）：9066-9068）によって制限される。オキシムバイオコンジュゲーションが広く採用されるようにする一般性および操作の簡便さを有するＣ−Ｃ結合形成変換は未だ報告されていない。このような技法であれば、当技術分野における著しい進歩を示すことになる。驚くべきことに、本発明によって、この技法に基づく試薬および方法、ならびにそれらによって形成された生体分子コンジュゲートに立ち入ることが可能になる。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]  様々な実施形態において、本発明は、中間工程におけるオキシム形成の生体直交性を利用するＣ−Ｃ結合形成反応であるピクテ−スペングラーライゲーションに関与することができる化合物を提供する。この新しい反応は、抗体を含む、生体分子との加水分解に安定なコンジュゲート、例えばグリオキサールおよびホルミルグリシン修飾タンパク質を調製するのに有用である。
【０００８】
[0008]  ピクテ−スペングラーライゲーションは、元来伝統的なオキシムおよびヒドラゾンタンパク質コンジュゲーション反応を普及させた選択性、反応速度、および操作の簡便さを有する。しかし、そのオキサカルボリン生成物は、一般にＣ＝Ｎリンケージが損なわれる加水分解が行われる厳しい環境においてバイオコンジュゲートの持続を可能にする。本発明者らは、治療上重要なヒトＩｇＧを含めて、種々のアルデヒド官能化タンパク質を使用する方法の一般性を実証した。モデル反応は、ケトンが同様に潜在的な基材（substrate）であり、バイオコンジュゲーションに関して将来の探索すべき方向であることを示唆する。本発明者らは今回ピクテ−スペングラーライゲーションを精製タンパク質の修飾のために使用することに焦点を絞ったが、用途は反応性カルボニル基による官能化を受け入れられる他の生体分子に及ぶ。ケトン基およびアルデヒド基によるグリカンの代謝的（Mahal LK, Yarema KJ, & Bertozzi CR（1997）, “Engineering Chemical Reactivity on Cell Surfaces Through Oligosaccharide Biosynthesis,” Science 276（5315）：1125-1128；Sadamoto R, et al.（2004）, “Control of Bacteria Adhesion by Cell-Wall Engineering,” J. Am. Chem. Soc. 126（12）：3755-3761；Hang HC & Bertozzi CR（2001）, “Ketone Isosteres of 2-N-Acetamidosugars as Substrates for Metabolic Cell Surface Engineering,” J. Am. Chem. Soc. 123（6）：1242-1243）、酵素的（Tai H-C, Khidekel N, Ficarro SB, Peters EC, & Hsieh-Wilson LC（2004）, “Parallel Identification of O-GlcNAc-Modified Proteins from Cell Lysates,” J. Am. Chem. Soc. 126（34）：10500-10501）、および化学的（O'Shannessy DJ, Voorstad PJ, & Quarles RH（1987）, “Quantitation of glycoproteins on electroblots using the biotin-streptavidin complex,” Anal. Biochem. 163（1）：204-209；Zeng Y, Ramya TNC, Dirksen A, Dawson PE, & Paulson JC（2009）, “High-efficiency labeling of sialylated glycoproteins on living cells,” Nat. Methods 6（3）：207-209）官能化方法は十分に確立しており、グリコシル化タンパク質のプロテオーム解析に使用されている。ピクテ−スペングラーライゲーションは、これらの方法、および生体直行型化学を使用してカルボニル基を検出または操作しようとする他の方法の成果を向上させることができる（Smith CD, et al.（1991）, “Excess brain protein oxidation and enzyme dysfunction in normal aging and in Alzheimer disease,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（23）：10540-10543；Nystrom T（2005）, “Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence,” EMBOJ 24（7）：1311-1317）。
【０００９】
[0009]  例示的実施形態において、本発明は、次式を有する化合物を提供する：
【００１０】
【化１】
2016505528.tif 000003
式中、Ａは、存在または非存在であり、存在している場合、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリール部分であり、Ｒ１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、アシル、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ６および−ＮＯ２から選択される構成要素であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの２つ以上は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である環系を形成する。
【００１１】
[0010]  Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される構成要素であり、Ｒ９およびＲ１０は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である５員〜７員環を形成する。
【００１２】
[0011]  記号Ｒｘ、ＲｙおよびＲｚは、Ｈ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを表し、ただし、ＲｘおよびＲｙの少なくとも一方は、
【００１３】
【化２】
2016505528.tif 000004
から選択される式を有し、
Ｒｏは、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択され、ｓは、１および２から選択される。Ｒ１、Ｒｘ、ＲｙおよびＲｚから選択される構成要素は、次式を有する：
【００１４】
【化３】
2016505528.tif 000005
（式中、Ｌは置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり、Ｘは検出可能なラベル、架橋性部分、ポリアルキレンオキシドおよびアフィニティーラベルから選択される）。
【００１５】
[0012]  別の例示的実施形態において、本発明は、本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物を使用して、生体分子（例えば、抗体）のコンジュゲートを形成する方法を提供する。
【００１６】
[0013]  様々な実施形態において、本発明は、タンパク質と式Ｉの化合物の間の反応によって形成された生体分子コンジュゲートを提供する。
【００１７】
[0014]  例示的実施形態において、本発明は、タンパク質と式Ｉによる化合物の間で形成されたコンジュゲートを利用する、生体分子のアッセイ方法を提供する。本方法は、生体分子と本発明の化合物の間でコンジュゲートを形成する工程と、コンジュゲートを検出する工程を含む。
【００１８】
[0015]  本発明の他の例示的な目的、利点および態様は以下の詳細な説明に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[0016]ピクテ−スペングラーライゲーションの設計および評価を示す図である。（Ａ）ピクテ−スペングラー反応。（B）ピクテ−スペングラーライゲーション。（Ｃ）本研究で使用されるアルデヒド反応性およびケトン反応性インドールの合成。（Ｄ）１００ｍＭ重水素化酢酸（pD≦5.5）またはリン酸（pD≧6.0）緩衝液を含むＤ２Ｏ溶液中における１ａとイソブチルアルデヒドの反応の２次速度定数。エラーバーは少なくとも３回の反復実験の標準偏差を表す。使用している略語：ＴＢＳ、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル；ＤＢＵ、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン；ＴＢＡＦ、フッ化テトラブチルアンモニウム；Ｔｅｏｃ、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル；ＡＤＤＰ、１，１’−（アゾジカルボニル）ジピペリジン；ＰＦＰ、ペンタフルオロフェニル；ＤＩＰＥＡ、ジイソプロピルエチルアミン。
【図２】[0017]典型的なオキシムおよびオキサカルボリンの加水分解安定性を示す図である。（Ａ）５ａおよび５ｂの加水分解を示すスキーム。（Ｂ）室温で２日にわたる１μＭ  ５ａおよび５ｂの加水分解を示す液体クロマトグラフィーのデータ。
【図３】[0018]グリオキサール−Ｍｂのピクテ−スペングラーライゲーションの最適化を示す図である。（Ａ）グリオキサール−Ｍｂのビオチン化の一般スキーム。インドール１ｂは、（Ｂ）濃度依存性、（Ｃ）時間依存性および（Ｄ）ｐＨ依存性の、グリオキサール−Ｍｂのラベリングを示す。さらに、（Ｅ）ビオチン化は、ＢｎＯＮＨ２を用いた共処理によって減少することがある。Ｍｂ（−アルデヒド）またはグリオキサール−Ｍｂ（＋アルデヒド）を、０〜８００μＭ  ＢｎＯＮＨ２の存在下に（Ｂ）０〜２００μＭ  １ｂで３時間、ｐＨ４．０、（Ｃ）２５０μＭ  １ｂで０〜２時間、ｐＨ４．０、（Ｄ）２５０μＭ  １ｂで３時間、ｐＨ４．０〜７５、または（Ｅ）１００μＭ  １ｂで３時間、ｐＨ４５で処理した。反応はすべて、３７℃で行われ、１０μＭベンズアルデヒドを用いてクエンチした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ビオチン化はフルオレセインイソチオシアナート（FITC）とコンジュゲートしたα-ビオチン抗体で評価し、総タンパク質ローディングはポンソーＳで評価した。
【図４】[0019]ピクテ−スペングラーライゲーションによるＦＧｌｙ−ＭＢＰの修飾を示す図である。（Ａ）ＦＧｌｙ−ＭＢＰのピクテ−スペングラーライゲーションと、その後に続くオキサカルボリンを含むＣ末端８量体ペプチドのトロンビン触媒による開裂を示すスキーム。（Ｂ）ピクテ−スペングラーライゲーションのＥＳＩ−ＭＳ分析。ＦＧｌｙ−ＭＢＰおよびＭＢＰ  Ｃ３９０Ａを１ｍＭ  １ａと共にｐＨ５．０、３７℃で１２時間インキュベートした。（Ｃ）ＦＧｌｙ−ＭＢＰコンジュゲートのトロンビン触媒による開裂。ＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲートの蛍光は高［トロンビン］になるほど低減し、Ｃ末端のみにおけるラベリングと一致する。（Ｄ）ＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲート加水分解の蛍光偏光分析；挿入図はトロンビン添加直後の溶液の偏光を示す。トロンビン添加に先立って、１００ｎＭ  ＡＦ４８８コンジュゲートを含む溶液をリン酸緩衝食塩水中（ｐＨ７．２）、３７℃で１週間インキュベートした。
【図５】[0020]ピクテ−スペングラーライゲーションによって修飾されたＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２のキャラクタリゼーションを示す図である。（Ａ）ＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２およびＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２の還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）ヒト抗体で処理されたＳＫＯＶ３およびジャーカット細胞集団の蛍光強度の中央値。細胞をＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２、ＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２またはヒトアイソタイプコントロールで処理し、次いでα−ｈＩｇＧおよびα−ＡＦ４８８抗体で蛍光ラベリングを行った。エラーバーは３回反復実験の標準偏差を表す。
【図６】[0021]１ａと（Ａ）イソブチルアルデヒドおよび（Ｂ）アセトンの反応による粗材料の1HNMR スペクトルを示す図である。
【図７】[0022]５μＭ酢酸ナトリウム中、ｐＨ４．５０、室温における１μＭ  ５ａおよび５ｂの加水分解を示す液体クロマトグラフ（A440）。化合物４を独立に合成し、そのクロマトグラフの強度を任意に計測した。試料は、０．１％トリフルオロ酢酸を含むＨ２Ｏ中アセトニトリル５から９５％までのグラジエントで分析した。
【図８】[0023]種々の条件下におけるオキサカルボリンまたはオキシム形成を経るグリオキサール−Ｍｂのビオチン化。Ｍｂまたはグリオキサール−Ｍｂを１ｂまたは市販のＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ１−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジンで処理した。条件：（Ａ）０〜２００μＭビオチンプローブ、３時間、ｐＨ４．０、（Ｂ）２５０μＭビオチンプローブ、０〜２時間、ｐＨ４．０、（Ｃ）２５０μＭビオチンプローブ、３時間、ｐＨ４．０〜７．５、（Ｄ）０〜８００μＭ  ＢｎＯＮＨ２の存在下に、１００μＭビオチンプローブ、３時間、ｐＨ４．５、または（Ｅ）０〜５０μＭ緩衝アニリンの存在下に、１００μＭ  １ｂ、４時間、ｐＨ４．５、５．５、または６．５。反応はすべて、３７℃で行われ、１０μＭベンズアルデヒドを用いてクエンチした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ビオチン化はＦＩＴＣとコンジュゲートしたα−ビオチン抗体で評価し、総タンパク質ローディングはポンソーＳで評価した。
【図９】[0024]１ａとコンジュゲートしたＦＧｌｙ−ＭＢＰのトリプシン消化物の質量分析を示す図である。（Ａ）修飾ペプチドを示す高分解能ＥＳＩ−ＭＳスペクトル。質量計算値：１０３２．５１１４；質量測定値：１０３２，５２２０。（Ｂ）修飾ペプチドの電子移動解離によるＭＳ／ＭＳ断片化。
【図１０】[0025]ＰＢＳ中のＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲートの紫外−可視スペクトル。
【図１１】[0026]ＰＢＳ中のＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２コンジュゲートの紫外-可視スペクトル。
【図１２】[0027]（Ａ）インドールの調製およびそれらの調製に必要とされる化合物、ならびに（Ｂ）低分子加水分解実験で使用されるフルオレセイン誘導体の調製を示す全合成スキーム。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
I.序論
[0028]  標的タンパク質コンジュゲートを優先的に生成する新規方法を本発明によって提供する。例示的実施形態において、これらのコンジュゲートはタンパク質と検出可能なラベルまたはアフィニティーラベルとの間で形成される。本発明の化合物および方法は、ラベリングされたタンパク質の生成と同定を行うための完全なシステムを示す。例示的実施形態において、タンパク質コンジュゲートは優先的に高分子標的または標的部位に結合する。例示的な標的タンパク質としては、種々の細胞会合分子(cellular associated molecule)および非細胞会合分子が挙げられる。
【００２１】
[0029]  本発明をさらに詳細に説明する前に、本明細書に記載される具体的な実施形態は変わり得るので、本発明はこのような実施形態に限定されないことを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は具体的な実施形態を説明するためのものにすぎず、限定するものではないことも理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学技術用語はすべて、本発明が属する当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。ある範囲の値が記載されている場合、その範囲の上限と下限の間に存在する、文脈上からそうでないことがはっきりしていない限り下限の単位の小数第１位までの各値、およびその記載された範囲における他の任意の記載された値または間に存在する値は本発明の範囲内に包含されることが理解されよう。記載された範囲における具体的に排除された任意の限度を条件として、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、そのより小さい範囲に含めることができ、また本発明の範囲内に包含される。記載された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含められた限度のいずれかまたは両方を排除した範囲も本発明に含まれる。数値の前に「約」という用語が置かれている範囲がいくつか本明細書に提示されている。「約」という用語は、それが先行する正確な数、およびその用語が先行する数に近いまたはおおよそその数である数を文字によって支援するために本明細書で使用される。数が具体的に記載された数に近いかそれともおおよそその数であるかを判定する際に、記載されていない近いまたは近似する数とは、提示されている場面の中で、具体的に記載された数に実質的に等価な数を実現する数とすることができる。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ、具体的にかつ個別に示されて、参照により組み込まれているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、引用された刊行物、特許、または特許出願はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれて、刊行物が引用されている主題を開示および説明する。任意の刊行物の引用は出願日前に開示されたためであり、本明細書に記載される本発明が先行発明を理由としてこのような刊行物に先行する権利を与えられないことを容認するものと解釈されるべきではない。さらに、記載された刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる可能性があり、個別に確認する必要があり得る。
【００２２】
[0030]  特許請求の範囲は、任意選択の構成要素をいずれも排除するように立案できることに留意すべきである。したがって、この記載は、クレーム構成要素の列挙と共に「単独で（solely）」、「のみ（only）」などのような排他的な用語の使用または「消極的」限定の使用のための先行基礎として機能するよう意図されている。本開示を読むと当業者に明らかになるように、本明細書に説明および例示されている個々の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの実施形態の特徴から容易に分離し、またはそれらと容易に組み合わせることができる別々の構成要件および特徴を有する。記載された方法はいずれも、記載された事象の順序または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。本明細書に記載された方法および材料に類似または等価な方法および材料はいずれでも、本発明の実施または試験で使用することができるが、ここで代表的な例示的方法および材料を説明する。
【００２３】
[0031]  本発明を説明する際に、以下の用語を用い、以下に示すように定義する。
【００２４】
II.定義
[0032]  置換基が左側から右側に書かれた通常の化学式で指定されている場合、構造は、その構造を右側から左側に書いた結果生じる化学的に同一の置換基も任意選択により包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−も任意選択により列挙するよう意図されている。
【００２５】
[0033]  「アルキル」という用語はそれ自体でまたは別の置換基の一部分として、別段の記述のない限り、完全飽和、一不飽和、または多不飽和でもよい、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味し、炭素原子の数が指定されている（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）２価、３価および多価基（例えば、アルキレン）を包含することができる。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などの基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１個または複数の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高級同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキル」という用語は、別段の注記のない限り、「ヘテロアルキル」など、以下にさらに詳細に定義されるアルキルの誘導体を任意選択により包含することを意図する。炭化水素基に限定されたアルキル基は「ホモアルキル」と呼ばれる。例示的なアルキル基としては、一不飽和Ｃ９−１０オレオイル鎖または二不飽和Ｃ９−１０，１２−１３リノレイル鎖が挙げられる。
【００２６】
[0034]  「アルキレン」という用語はそれ自体でまたは別の置換基の一部分として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示されるが限定されない、アルカンに由来する２価基を意味し、「ヘテロアルキレン」として後述する基をさらに包含する。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は一般に８個以下の炭素原子を有する、より短鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【００２７】
[0035]  「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は通常の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に結合しているアルキル基を指す。
【００２８】
[0036]  「アリールオキシ」および「ヘテロアリールオキシ」という用語は通常の意味で使用され、酸素原子を介して分子の残部に結合しているアリールまたはヘテロアリール基を指す。
【００２９】
[0037]  「ヘテロアルキル」という用語はそれ自体でまたは別の用語と組み合わせて、別段の記述のない限り、記載された数の炭素原子とＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、窒素および硫黄原子は任意選択により酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意選択により四級化されていてもよい安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味する。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｉはヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残部に結合している位置に配置されてもよい。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２，−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３や−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など２つまでのヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語はそれ自体でまたは別の置換基の一部分として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示されるが限定されない、ヘテロアルキルに由来する２価基を意味する。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は鎖の一端または両端を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンリンキング基の場合、リンキング基の配向はリンキング基の式が書かれている方向によっては示されない。例えば、式−ＣＯ２Ｒ’−は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’と−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’とを表す。
【００３０】
[0038]  「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語はそれ自体でまたは他の用語と組み合わせて、別段の記述のない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式形を表す。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子はヘテロ環が分子の残部に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。別の例示的なシクロアルキル基としては、ステロイド、例えばコレステロールおよびその誘導体が挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
[0039]  「ハロ」または「ハロゲン」という用語はそれ自体でまたは別の置換基の一部分として、別段の記述のない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを包含することを意図する。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを包含することを意図するが、これらに限定されない。
【００３２】
[0040]  「アリール」という用語は、別段の記述のない限り、単環でも、縮合または共役結合している複数の環（好ましくは１〜４個の環）でもよい、多不飽和芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｅ、ＰおよびＢから選択される１〜４つのヘテロ原子を含み、窒素および硫黄原子は任意選択により酸化され、窒素原子は任意選択により四級化されているアリール基（または環）を指す。ヘテロアリール基はヘテロ原子を経て分子の残部に結合することができる。アリールおよびヘテロアリール基は限定されるものではないが、例えばフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系それぞれの置換基は後述の許容できる置換基の群から選択される。
【００３３】
[0041]  簡潔にするため、「アリール」という用語は他の用語と組み合わせて使用される場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記に定義したアリール環とヘテロアリール環とを包含する。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子で置き換えられているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含めて、アルキル基にアリール基が結合している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を包含することを意図する。
【００３４】
[0042]  上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）はそれぞれ、指示された基の置換形と非置換形を任意選択により包含することを意図する。基の各タイプの例示的な置換基を以下に示す。
【００３５】
[0043]  （アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含めて）アルキルおよびヘテロアルキル基の置換基は総称して「アルキル基置換基」と呼ばれ、Ｈ、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’’’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から、０〜（２ｍ’＋１）の数（ここで、ｍ’は、このような基の炭素原子の全数である）で選択される種々の基のうちの１つまたは複数とすることができるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、例えば１〜３つのハロゲンで置換されているアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。例えば、本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’基が１つより多く存在する場合にこれらの基がそれぞれ独立して選択されるように、Ｒ基はそれぞれ独立して選択される。Ｒ’およびＲ”は、同じ窒素原子に結合している場合、窒素原子と共に合わされ、５員、６員、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを包含することを意図するが、これらに限定されない。置換基について上記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、ハロアルキルなど（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）やアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）、水素基を除く基に結合している炭素原子を含む基を包含することを意図することを理解するであろう。これらの用語は、例示的な「置換アルキル」および「置換ヘテロアルキル」部分の成分である、例示的な「アルキル基置換基」とみなされる基を包含する。
【００３６】
[0044]  アルキル基について記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は総称して「アリール基置換基」と呼ばれる。置換基は、例えばＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’’’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、０〜芳香族環系の開いている原子価の全数までの数で選択され、ここでＲ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’は独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択されることが好ましい。例えば、本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’基が１つより多く存在する場合にこれらの基がそれぞれ独立して選択されるように、Ｒ基はそれぞれ独立して選択される。
【００３７】
[0045]  アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で任意選択により置き換えることができ、式中、ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０〜３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で任意選択により置き換えることができ、式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である。こうして形成された新しい環の単結合のうちの１つは、二重結合で任意選択により置き換えることができる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ’’’）ｄ−の置換基で任意選択により置き換えることができ、式中、ｓおよびｄは独立して、整数０〜３であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は独立して、水素または置換もしくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されることが好ましい。これらの用語は、例示的な「置換アリール」および「置換ヘテロアリール」部分の成分である、例示的な「アリール基置換基」とみなされる基を包含する。
【００３８】
[0046]  本明細書では、「アシル」という用語は、カルボニル残基を含む置換基Ｃ（Ｏ）Ｒを表す。Ｒの例示的な種としては、Ｈ、ハロゲン、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルが挙げられる。
【００３９】
[0047]  本明細書では、「縮合環系」は、各環が少なくとも２つの原子を別の環と共有する少なくとも２つの環を意味する。「縮合環系」は芳香族環および非芳香族環を包含することができる。「縮合環系」の例はナフタレン、インドール、キノリン、クロメンなどである。
【００４０】
[0048]  本明細書では、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）およびケイ素（Si）およびホウ素（Ｂ）を包含する。
【００４１】
[0049]  「ポリアルキレンオキシド」は、ポリエーテル主鎖を有する化合物の種類を指す。本発明において有用なポリアルキレンオキシド種としては、例えば直鎖および分枝鎖種が挙げられる。さらに、例示的なポリアルキレンオキシド種は、1つまたは複数の反応性基、活性化可能基(activatable group)、または不活性基で終わることができる。例えば、ポリ（エチレングリコール）は、追加の反応性部分、活性化可能部分もしくは不活性部分をどちらの末端に含むかまたは含まない、反復エチレンオキシドサブユニットからなるポリアルキレンオキシドである。有用なポリアルキレンオキシド種としては、一端が不活性基で「キャッピングされた」種、例えばモノメトキシ-ポリアルキレンオキシドが挙げられる。分子は分枝状種である場合、複数の反応性基、活性化可能基または不活性基をアルキレンオキシド鎖の末端に含むことができ、反応性基は同じでも、異なってもよい。ヘテロ２官能性である直鎖ポリアルキレンオキシド種の誘導体も当技術分野において公知である。
【００４２】
[0050]  「タンパク質」は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒になっているポリペプチドとも呼ばれるポリマーを指す。さらに、非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。核酸によってコードされていないアミノ酸もタンパク質に組み込むことができる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療用部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も本発明で使用することができる。アミノ酸はそのＤ異性体でも、Ｌ異性体でもよい。Ｌ異性体が一般的に好ましい。本明細書では、「タンパク質」はグリコシル化ポリペプチドと非グリコシル化ポリペプチドとを指す。また、タンパク質を発現する系によって不完全グリコシル化されたタンパク質も含まれる。全体的な概説は、Spatola,A.F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins,B.Weinstein,eds., Marcel Dekker, New York,p.267（1983）を参照のこと。
【００４３】
[0051]  本明細書では、「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する完全型免疫グロブリンとすることができ、完全型免疫グロブリンの免疫反応性部分とすることができる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含めて、種々の形で存在することができる（Harlow et al., 1999, Using Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242：423-426）。「抗体」は合成の抗体も包含する。
【００４４】
[0052]  本明細書では、「合成の抗体」という用語は、本明細書において、例えばバクテリオファージによって発現された抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して産生された抗体を意味する。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって産生された抗体も意味すると解釈されるべきであり、ＤＮＡ分子は抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能であり、周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【００４５】
[0053]  記号「Ｒ」は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキル基から選択される置換基を表す一般的略語である。
【００４６】
[0054]  「基材(substrate)」および「前駆体」という用語は同義に使用され、アルデヒドまたはケトンを含む部分で化学修飾することができる生体分子を指す。
【００４７】
[0055]  本明細書に開示される化合物は、このような化合物を構成する原子のうちの１つまたは複数において非天然の割合の原子同位体も含むことができる。例えば、化合物を、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射ラベリングすることができる。本発明の化合物の同位体変種は放射性であろうとなかろうとすべて、本発明の範囲内に包含されるよう意図されている。
【００４８】
[0056]  「アフィニティーラベル」：本明細書では、アフィニティーラベルという用語は、相対するエンティティと特異的に相互作用／結合する基、部分、またはエンティティを指す（例えば、捕捉剤）。アフィニティーラベル／捕捉剤のペアは「アフィニティーペア」と呼ばれることが多い。アフィニティーペアは生化学的なペアであり得る。生化学的なペアは限定されるものではないが、例えば抗体−抗原、酵素−阻害物質(inhibitor)、ホルモン−受容体、糖−レクチン、ビオチン−（ストレプト）アビジンおよび相補的核酸成分などが挙げられる。
【００４９】
[0057]  「と会合している（associated with）」または「と会合する（associated with）」：本明細書において、２つのエンティティが互いに会合しているかまたは会合する場合、直接的もしくは間接的な、共有結合性または非共有結合性の相互作用によってリンクしている。結合は共有結合性であることが好ましい。望ましい非共有結合性相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、磁気的相互作用、静電的相互作用、アフィニティー相互作用またはそれらの組合せなどが挙げられる。
【００５０】
[0058]  「検出可能なラベル」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、本発明における使用に適したラベルとしては、例えば放射性ラベル（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいてよく使用される）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、あるいは、例えば放射ラベルをハプテンもしくはペプチドに組み込むことによって検出可能になったハプテンおよびタンパク質、あるいは、ハプテンもしくはペプチドに特異的に反応する抗体を検出するのに使用されるラベルが挙げられる。
【００５１】
[0059]  タンパク質に結合しているカルボニル部分（例えばアルデヒドおよびケトン）とのピクテ−スペングラーライゲーションを受ける化合物を参照しながら、本発明をさらに説明する。
【００５２】
III.組成物
[0060]  例示的実施形態において、本発明は、次式を有する化合物を提供する：
【００５３】
【化４】
2016505528.tif 000006
式中、Ａは、存在または非存在であり、存在している場合、置換または非置換アリールまたはヘテロアリール部分であり、Ｒ１はＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、アシル、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ６および−ＮＯ２から選択される構成要素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの２つ以上は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である環系を形成する。記号Ｒｘ、ＲｙおよびＲｚは、Ｈ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを表し、ただし、ＲｘおよびＲｙの少なくとも一方は
【００５４】
【化５】
2016505528.tif 000007
から選択される式を有し、Ｒｏは、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択され、ｓは、１および２から選択される。Ｒ１、Ｒｘ、ＲｙおよびＲｚから選択される構成要素は、次式を有する：
【００５５】
【化６】
2016505528.tif 000008
式中、Ｌは、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり、Ｘは、検出可能なラベル、架橋性部分、ポリアルキレンオキシドおよびアフィニティーラベルから選択される。
【００５６】
[0061]  例示的実施形態において、Ｌ−Ｘカセットは環構造の窒素に結合し、次式を有する化合物をもたらす。
【００５７】
【化７】
2016505528.tif 000009
【００５８】
[0062]  様々な実施形態において、本発明の化合物は
【００５９】
【化８】
2016505528.tif 000010
から選択される式を有する。
【００６０】
[0063]  例示的実施形態において、本発明の化合物は
【００６１】
【化９】
2016505528.tif 000011
から選択される式を有する。
【００６２】
[0064]  様々な実施形態において、Ａは置換または非置換フェニルである。
【００６３】
[0065]  様々な実施形態において、本発明の化合物は次式を有する：
【００６４】
【化１０】
2016505528.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、アシル、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ６および−ＮＯ２から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの２つ以上は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である環系を形成する。
【００６５】
[0066]  Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される構成要素であり、Ｒ９およびＲ１０は、それらが結合している原子と共に、任意選択により一緒になって、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される構成要素である５員〜７員環を形成する。
【００６６】
[0067]  本明細書では、「リンカー」という用語は、Ｘを分子の残部と一緒にさせる本発明の化合物の構成要素を指す。スペーサーは親水性（例えば、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコール）とすることができ、または疎水性（例えば、ヘキサン、デカンなど）とすることができ、または親水性と疎水性の両方の領域を含むハイブリッド構造体とすることができる。
【００６７】
[0068]  例示的実施形態において、本発明の化合物は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキルまたはヘテロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキルまたはヘテロアルキル基、ポリオール、ポリエーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール））、ポリアミン、ポリアミノ酸、多糖およびそれらの組合せから選択されるリンカーを含む。様々な実施形態において、リンカーＬは、置換または非置換の、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の炭素原子を有するアルキルである。
【００６８】
[0069]  様々な実施形態において、リンカーは次式を有する：
【００６９】
【化１１】
2016505528.tif 000013
式中、Ｒ７は置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択され、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される。
【００７０】
[0070]  様々な実施形態において、リンカーは、次式を含むポリ（アルキレンオキシド）サブユニットを含む：
【００７１】
【化１２】
2016505528.tif 000014
式中、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。
【００７２】
[0071]  様々な実施形態において、リンカーはポリ（アルキレンオキシド）サブユニットを含む：
【００７３】
【化１３】
2016505528.tif 000015
【００７４】
[0072]  いくつかの実施形態において、本発明の化合物のリンカーによって、Ｘと分子の残部の間の付着に柔軟性および距離が与えられることは有利である。様々な実施形態において、リンカー基を使用して、Ｘの特性および／または化合物全体の特性が調節される。
【００７５】
[0073]  例示的実施形態において、スペーサーは、本発明の化合物を、それが反応することになっている生体分子から隔てる働きをする。このような特徴を有するリンカーには、Ｘと、入ってくる生体分子との間の立体障害の低減を含む、いくつかの用途がある。
【００７６】
[0074]  さらに別の実施形態において、本発明の化合物で使用されるリンカー基には、開裂して、X（および任意選択により部分、例えばアフィニティーラベルに結合している分子）、フルオロフォア、ポリアルキレンオキシドなどをコンジュゲートから遊離することができる基が設けられている。多くの開裂可能基が当技術分野において公知である。例えば、Jung et al.,Biochem.Biophys.Acta,761:152-162(1983);Joshi et al.,J.Biol.Chem.,265:14518-14525(1990);Zarling et al.,J.Immunol.,124:913-920(1980);Bouizar et al.,Eur.J.Biochem.,155:141-147(1986);Park et al.,J.Biol.Chem.,261:205-210(1986);Browning et al.,J.Immunol.,143:1859-1867(1989)を参照のこと。さらに、幅広い開裂可能な２官能性（ホモ２官能性とヘテロ２官能性の両方）スペーサーアームがＰｉｅｒｃｅなどの供給業者から市販され、これらの多くは、本発明の化合物に組み込むのに適している。
【００７７】
[0075]  本発明の化合物の利点の１つは、本発明の化合物を広範囲のエネルギー供与体および／または受容体分子と共に使用して、プローブを構築できることである。ＰＬと共に有用な莫大なフルオロフォアが当業者に公知である。例えば、Cardullo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988);Dexter,D.L.,J.of Chemical Physics 21:836-850(1953);Hochstrasser et al.,Biophysical Chemistry 45:133-141(1992);Selvin,P.,Methods in Enzymology 246:300-334(1995);Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971);Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978);Wang et al.,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990);Wang et al.,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)を参照のこと。
【００７８】
[0076]  本発明のクエンチャーと共に使用することができる例示的なフルオロフォアの非限定的なリストを表1に示す。
【００７９】
【表１−１】
2016505528.tif 000016
【００８０】
【表１−２】
2016505528.tif 000017
【００８１】
[0077]  以下の参考文献によって例示されるように、特定のプローブに適したフルオロフォアを選択するための実際的なガイダンスが文献に非常に多く存在している：Pesce et al.,Eds.,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker, New York, 1971);White et al.,Fluorescence Analysis:A Practical Approach（Marcel Dekker, New York, 1970）など。文献には、蛍光および発色分子ならびにそれらに関連する光学諸特性の網羅的な表を提示する参考文献も含まれる（例えば、Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition（Academic Press, New York, 1971）；Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules（Academic Press, New York, 1976）；Bishop, Ed., Indicators（Pergamon Press, Oxford, 1972）；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes, Eugene, 1992）Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers, New York, 1949）などを参照のこと）。さらに、分子に付加可能で容易に利用可能な反応性基を介して、共有結合のためにレポーター分子およびクエンチャー分子を誘導体化するための包括的なガイダンスが文献に存在している。
【００８２】
[0078]  フルオロフォアを他の分子および表面にコンジュゲートするために利用可能な化学的性質の多様性および有用性は、フルオロフォアで誘導体化された核酸の調製に関する文献の詳細な本文によって例示される。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（上記を参照）；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号を参照のこと。
【００８３】
[0079]  別の例示的実施形態において、Ｘはキレート剤またはキレートである。例示的なキレート剤はアミノカルボキシラート（すなわち、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡなど、およびＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰなどそれらのホスホン酸類似体）である。
【００８４】
[0080]  多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタンドなどが当技術分野において公知であり、本発明の化合物に組み込むことができる。例えば、Pitt et al.,“The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload,"In,Inorganic Chemistry in Biology and Medicine;Martell,Ed.;American Chemical Society,Washington,D.C.,1980,pp.279-312;Lindoy,The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes;Cambridge University Press,Cambridge,1989;Dugas,Bioorganic Chemistry;Springer-Verlag,New York,1989、およびその中に含まれている参考文献を参照のこと。
【００８５】
[0081]  さらに、キレート剤、クラウンエーテルおよびシクロデキストリンの他の分子への付着を可能にする多様な経路が当業者に利用可能である。例えば、Meares et al.,“Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides.”In,Modification of Proteins:Food,Nutritional,and Pharmacological Aspects;”Feeney,et al.,Eds.,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982,pp.370-387;Kasina et al.,Bioconjugate Chem.,9:108-117(1998);Song et al.,Bioconjugate Chem.,8:249-255(1997)を参照のこと。
【００８６】
[0082]  他の実施形態において、Ｘは蛍光増感剤である。例示的な増感剤としては、ローダミン５６０、５７５および５９０フルオレセイン、２−もしくは４−キノロン、２−もしくは４−クマリンまたはそれらの誘導体、例えばクマリン４４５、４５０、４９０、５００および５０３、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジドなど、特にカルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）、クマリン１２０（７−アミノ−４−メチル−２−クマリン）、クマリン１２４（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−クマリン）、アミノメチルトリメチルプソラーレン、ナフタレンなどが挙げられる。
【００８７】
[0083]  例示的実施形態において、増感剤はナフチル部分を含む部分である。
【００８８】
[0084]  別の実施形態において、Ｘはアフィニティー部分である。例示的なアフィニティー部分は、広範囲の生物活性低分子（例えば、薬物、殺虫剤、毒素など）、有機官能基（例えば、アミン、カルボニル、カルボキシラートなど）、生体分子、金属、金属キレートおよび有機金属化合物から選択される。
【００８９】
[0085]  オリゴマーアフィニティーラベル分子を生成し、それらのオリゴマーアフィニティーラベル分子を高分子標的に優先的に共有結合させる方法および組成物であって、標的は複合混合物の一構成要素、すなわち血清、血液、脳脊髄液などであり、および／または高分子標的の複数の結合部位のうちの１つもしくは限定数における優先結合がある、方法および組成物が提供される。本明細書に記載された方法は、コンビナトリアルライブラリーから高分子標的または標的部位に優先的に結合するアフィニティーラベル分子の生成と同定を行い、生体外または生体内でアフィニティーラベルを目的の高分子に優先的に結合させるための完全なシステムを示す。
【００９０】
[0086]  本発明で有用な例示的アフィニティーラベル分子はオリゴマーであり、リンカー部分Ｌの反応性官能基の反応性と相補的な反応性を有する、利用可能な反応性官能基を有する。例示的なアフィニティーラベル分子には、複合混合物における目的の高分子標的または標的部位と特異的に相互作用する能力がある。高分子標的または標的部位との特異的相互作用とは、アフィニティーラベル分子と高分子標的が組み合わされる環境において、アフィニティーラベルが他の成分に比べて高分子標的に若干の優先結合を発現することである。優先度は通常、オリゴマーの非存在下におけるランダム結合の少なくとも約１．５倍、好ましくは少なくとも約２倍となる。
【００９１】
[0087]  例示的実施形態において、アフィニティーラベルはオリゴマーアフィニティーラベルである。オリゴマーアフィニティーラベルは、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、それらの組合せなどとすることができる。
【００９２】
[0088]  一般に、各オリゴマーアフィニティーラベルにおけるモノマー単位の数は４〜１２、さらに普通は４〜８、好ましくは５〜８である。オリゴマーアフィニティーラベルを含むモノマー単位は天然でも、合成でもよく、一般に約２〜３０個の炭素原子、普通約２〜１８個の炭素原子、好ましくは約２〜１２個の炭素原子である。
【００９３】
[0089]  様々な実施形態において、アフィニティーラベルはオリゴペプチドであり、アミノ酸モノマーは天然でも、合成でもよい。好都合には、天然のＬ−α−アミノ酸を使用するが、Ｄ−鏡像異性体を使用してもよい。
【００９４】
[0090]  様々な実施形態において、アフィニティーラベルはオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド、天然または合成のヌクレオチドモノマーが容易に用いられる。
【００９５】
[0091]  特に、合成ヌクレオチドでは、リン酸基または糖基は修飾することができ、ホスファートの酸素原子を硫黄または窒素で置き換えることによってホスファートを置換することができ、リン酸基はスルホナート、アミドなどで置き換えることができ、リボースまたはデオキシリボースはアラビノース、フルクトース、グルコースなど炭素原子５〜６個の糖で置き換えることができ、プリンおよびピリミジンは窒素上でのアルキルまたはアシルによる置換によって修飾することができ、異なる環構造を使用することができ、窒素を酸素で置き換えるまたはその逆をすることなどができる。
【００９６】
[0092]  様々な実施形態において、アフィニティーラベルはオリゴ糖である。例示的なオリゴ糖は、炭素原子５〜８個の糖からなる直鎖状でも、分枝状でもよいモノマー単位を普通4〜6個有する。特にレクチンまたは接着分子に結合することに興味がある場合、公知オリゴ糖の様々な修飾を用いることができる。
【００９７】
[0093]  別の例示的実施形態において、Ｘは薬物部分である。薬物部分は、臨床使用のためにすでに許容されている作用剤とすることができ、あるいはその使用が実験的であり、またはその活性もしくは作用機序が調査中である薬物とすることができる。薬物部分は所与の病状において証明された作用を有することができ、または所与の病状において望ましい作用を示すと仮定することのみできる。別の例示的実施形態において、薬物部分は選択される検体と相互作用可能かをスクリーニングされる化合物である。本発明におけるＸとして有用な薬物部分は、種々の薬理活性を有する幅広い範囲の薬物クラスに由来する薬物を含む。
【００９８】
[0094]  さらに別の例示的実施形態において、Ｘはタンパク質、核酸、ペプチドまたは抗体などの生体分子である。本発明を実施するのに有用である生体分子はいずれの供給源に由来するものでもよい。生体分子は天然供給源から単離することができ、または合成方法により生成することができる。タンパク質は、天然タンパク質または変異型タンパク質とすることができる。突然変異は、化学変異誘発、指定部位突然変異誘発または当業者に公知の突然変異を誘発する他の手段によって行うことができる。本発明を実施するのに有用であるタンパク質としては、例えば酵素、抗原、抗体および受容体が挙げられる。抗体はポリクローナルでも、モノクローナルでもよい。ペプチドおよび核酸は天然供給源から単離することができ、または起源が完全合成でも、部分合成でもよい。
【００９９】
[0095]  Ｘがタンパク質または抗体である実施形態において、タンパク質はタンパク質の表面に存在している任意の反応性ペプチド残基を介して分子の残部と一緒になった。好ましい実施形態において、反応性基はアミンまたはカルボキシラートである。例示的実施形態において、反応性基はリシン残基のε−アミン基である。
【０１００】
[0096]  他の例示的なアフィニティー部分としては、制限されないが、マイナーグルーブ結合剤、および挿入剤が挙げられる。
【０１０１】
ＩＶ．方法
[0097]  本発明は、生体分子と本発明の化合物の間のコンジュゲートを調製する方法も提供する。例示的実施形態において、アルデヒドおよびケトンから選択される構成要素で官能化された生体分子を修飾する方法であって、この方法は（ａ）この生体分子を前記請求項のいずれかに記載の化合物と、化合物とアルデヒドおよびケトンから選択される部分との反応によって環化ピクテ−スペングラー付加体を形成するのに適した反応条件下で接触させ、それによってこの生体分子を修飾する工程を含む方法を提供する。
【０１０２】
[0098]  例示的実施形態において、本発明は、本発明の化合物との反応のために生体分子前駆体を活性化する方法を提供する。したがって、工程（ａ）より前に、前駆体生体分子を前記アルデヒドおよび前記ケトンから選択される構成要素を含む反応性部分で修飾し、それによってアルデヒドおよびケトンから選択される構成要素で官能化された生体分子を形成する。
【０１０３】
Ｖ.コンジュゲート
[0099]  本発明は、本発明の化合物と生体分子の間で形成されたコンジュゲートも提供する。本発明のコンジュゲートの例示的な生体分子成分としては、タンパク質、グリカン、核酸、代謝産物、阻害物質、脂質、および補因子が挙げられる。
【０１０４】
[00100]  例示的実施形態において、コンジュゲートは
【０１０５】
【化１４】
2016505528.tif 000018
から選択される式を有し、式中、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６は上述の通りである。
【０１０６】
[00101]  様々な実施形態において、コンジュゲートは
【０１０７】
【化１５】
2016505528.tif 000019
から選択される構成要素である式を有する。
【０１０８】
[00102]  以下の実施例は本発明の実施形態を説明するものであって、本発明の組成物またはそれらが使用される方法の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例1
材料と方法
Ａ.一般合成方法
【０１１０】
[00103]  すべての試薬は、Sigma Aldrich、AcrosおよびTCIから入手し、さらに精製を行うことなく使用した。密封したビンで購入し、モレキュラーシーブで貯蔵したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを除いて、無水溶媒はアルミナおよびＱ−５（1）のカラムに通して精製することによって乾燥および脱酸素した。重水素化溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。溶媒は、Ｗｅｌｃｈ  ２０２６自浄式ドライ真空ポンプまたはＥｄｗａｒｄｓ  ＲＶ３真空ポンプを装備したＢｕｃｈｉ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−１１４で除去した。
【０１１１】
[00104]  薄層クロマトグラフィーは、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ６０Åシリカゲル平板を用いて行い、ＵＶ照明またはＩ２染色で分析した。フラッシュクロマトグラフィーは、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ６０Å  ２３０〜４００メッシュシリカゲルを用いて行った。高圧液体クロマトグラフィーは、２１０および２５４ｎｍにて作動するＵＶ吸収検出器を備えたＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ装置で行った。分取スケールＨＰＬＣは、１００Å  Ｃ１８逆相カラム（250×21.4mm）を用いて溶媒流速２０ｍＬ／分、またはＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ３００−５  Ｃ４逆相カラム（250×4.6mm）を用いて溶媒流速１ｍＬ／分で行った。
【０１１２】
[00105]  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＱ−４００、ＡＶＢ−４００、ＤＲＸ−５００、ＡＶ−５００、またはＡＶ−６００分光計を用いて得られた。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、残留ＣＨＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）、ＣＤ２ＨＣＮ（１．９４ｐｐｍ）、またはＣＤ２ＨＯＤ（３．３１ｐｐｍ）を基準とした。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．１６ｐｐｍ）、ＣＤ３ＣＮ（１．３２ｐｐｍ）、またはＣＤ３ＯＤ（４９．００ｐｐｍ）を基準とした。ＮＭＲスペクトルは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ（Mestrelab Research S.L.）を使用して処理した。低分子の高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ  ＦａｃｉｌｉｔｙでＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を用いて得られた。
【０１１３】
Ｂ．新規化合物の合成
【０１１４】
【化１６】
2016505528.tif 000020
[0100]  ２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−１Ｈ−インドール（６）：オーブンで乾燥したフラスコに、インドール−２−メタノール（１．５８１ｇ、１０．７４ｍｍｏｌ）、ＴＢＳＣｌ（１７８９ｇ、１１．８７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、およびイミダゾール（２．１９７ｇ、３２．２７ｍｍｏｌ、３．００当量）を加え、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ、無水）に懸濁した。１６時間後、反応混合物を橙色残渣になるまで濃縮した。粗混合物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解し、ＡｃＯＨ水溶液（５％（ｖ/ｖ）、３回×５０ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで脱水し、結晶性固体（２．７８９ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ、９９％）になるまで濃縮し、さらに精製を行うことなく使用した。９：１  ヘキサン類：ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．５。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．２９（ｓ，１Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，０．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．１９〜７．１４（ｍ，１Ｈ）、７．１２〜７．０７（ｍ，１Ｈ）、６．３２（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．８９（ｓ，２Ｈ）、０．９５（ｓ，９Ｈ）、０．１２（ｓ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３８．３、１３６．０、１２８．６、１２１．７、１２０．５、１１９．８、１１０．９、９９．０、５９．４、２６．１、１８．５、−５．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１５Ｈ２４ＮＯＳｉ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２６２．１６２７；実測値：２６２．１６２５。
【０１１５】
【化１７】
2016505528.tif 000021
【０１１６】
[0101]  メチル３−（２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパノエート（７）：６（２．７８９ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（25mL）溶液に、メチルアクリラート（４．８０ｍＬ、５３．３ｍｍｏｌ、５．００当量）と、続いて１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ；８００μＬ、５．３５ｍｍｏｌ、０．５０当量）を添加し、得られた混合物を還流した。１８時間後、溶液を冷却し、橙色油になるまで濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（９：１  ヘキサン類：ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４）で精製して、無色油（３．５４３ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ、９６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．３４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．２３〜７．１８（ｍ，１Ｈ）、７．１２〜７．０７（ｍ，１Ｈ）、６．３８（ｓ，１Ｈ）、４．８４（ｓ，２Ｈ）、４．５４〜４．４９（ｍ，２Ｈ）、２．８９〜２．８４（ｍ，２Ｈ）、０．９１（ｓ，９Ｈ）、０．１０（ｓ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７２．０、１３８．５、１３７．１、１２７．７、１２２．０、１２１．０、１１９．８、１０９．３、１０１．８、５８．２、５１．９、３９．５、３４．６、２６．０、１８．４、−５．２。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１９Ｈ３０ＮＯ３Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３４８．１９９５；実測値：３４８．１９９６。
【０１１７】
【化１８】
2016505528.tif 000022
【０１１８】
[0102]  メチル３−（２−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパノエート（2）：０℃の７（１．２８３ｇ、３．６９２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中１．０Ｍ、３．９０ｍＬ、３．９０ｍｍｏｌ、１．０６当量）を添加した。１５分後、反応混合物をジエチルエーテル（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（飽和水溶液、３回×２０ｍＬ）で洗浄し、淡緑色油になるまで濃縮した。油をシリカゲルクロマトグラフィー（２：１  ヘキサン類：ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．２５）で精製して、白色結晶固体（８２２ｍｇ、３．５２４ｍｍｏｌ、９５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．３４（ｄｄ，Ｊ＝８．２，０．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．２７〜７．２３（ｍ，１Ｈ）、７．１６〜７．１１（ｍ，１Ｈ）、６．４４（ｓ，１Ｈ）、４．７７（ｓ，２Ｈ）、４．４９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、３．６６（ｓ，３Ｈ）、２．８７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．６４（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７２．３、１３８．５、１３７．０、１２７．６、１２２．２、１２１．１、１１９．９、１０９．３、１０２．３、５７．１、５２．０、３９．１、３４．３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３Ｈ１５ＮＮａＯ３［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：２５６．０９５０；実測値：２５６．０９４６。
【０１１９】
【化１９】
2016505528.tif 000023
【０１２０】
[0103]  ２−（トリメチルシリル）エチルヒドロキシ（メチル）カルバマート（8）：Ｎ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２４９ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ、１．０５当量）に、ＫＯＨ（０．１Ｍ  ＭｅＯＨ溶液、３０．０ｍＬ、３．００ｍｍｏｌ、１．０６当量）を添加すると、白色沈殿物が形成された。５分後、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミド（７３６ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ）を添加した。４時間後、溶液を濃縮し、残渣を酢酸エチル（３０ｍＬ）に懸濁した。有機溶液を炭酸水素ナトリウム（飽和水溶液、３回×１５ｍＬ）および食塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、次いで無色油（４６６ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ、８６％）になるまで濃縮し、それは後の使用に十分な純度を有するものであった。４：１  ヘキサン類：ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．２。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．２４〜４．１９（ｍ，２Ｈ）、３．２０（ｓ，３Ｈ）、１．０４〜０．９８（ｍ，２Ｈ）、０．０４（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５８．６、６５．０、３８．０、１７．９、−１．４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ７Ｈ１７ＮＮａＯ３Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：２１４．０８７５；実測値：２１４．０８７０。
【０１２１】
【化２０】
2016505528.tif 000024
【０１２２】
[0104]  Ｎ−メチル３−（２−（３，８，８−トリメチル−４−オキソ−２，５−ジオキサ−３−アザ−８−シラノニル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパノエート（9）：オーブンで乾燥し、２（１９５ｍｇ、０．８３６ｍｍｏｌ）、ＴｅｏｃＮ（Ｍｅ）ＯＨ（２０１ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．２６当量）、およびトリブチルホスフィン（２５１μＬ、１．０５ｍｍｏｌ、１．２６当量）を加えたフラスコに、トルエン（２４ｍＬ、無水）と、続いて１，１’−（アゾジカルボニル）ジピペリジン（２６３ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１．２５当量）を添加した。濃い白色沈殿物が次の１時間にわたって形成され、その後ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を添加し、溶液をセライトで濾過した。残渣を黄色油になるまで濃縮し、次いでシリカゲルクロマトグラフィー（４：１  ヘキサン類：ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．３）で精製して、無色油（２９９ｍｇ、７３６μｍｏｌ、８８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．２８〜７．２２（ｍ，１Ｈ）、７．１４〜７．０９（ｍ，１Ｈ）、６．５７（ｓ，１Ｈ）、５．０５（ｓ，２Ｈ）、４．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．２５〜４．１９（ｍ，２Ｈ）、３．６７（ｓ，３Ｈ）、３．０９（ｓ，３Ｈ）、２．８８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．０２〜０．９６（ｍ，２Ｈ）、０．０５（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７１．９、１５８．０、１３７．３、１３３．３、１２７．５、１２２．８、１２１．４、１２０．０、１０９．６、１０５．４、６８．０、６４．８、５１．９、３９．３、３７．０、３４．７、１７．９、−１．４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２ＮａＯ５Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：４２９．１８２２；実測値：４２９．１８１６。
【０１２３】
【化２１】
2016505528.tif 000025
【０１２４】
[0105]  ３−（２−（３，８，８−トリメチル−４−オキソ−２，５−ジオキサ−３−アザ−８−シラノニル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパン酸（3）：９（３６６ｍｇ、９００μｍｏｌ）のジオキサン（７ｍＬ）溶液に、ＬｉＯＨ（０．５Ｍ水溶液、３．６０ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加した。２時間後、反応をＡｃＯＨ（５％（ｖ/ｖ）水溶液、１０ｍＬ）でクエンチして、ｐＨ４にすると、白色沈殿物が形成された。溶液をＥｔＯＡｃ（３回×１０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を黄色油になるまで濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（２：１  ヘキサン類：ＥｔＯＡｃ＋２％  ＡｃＯＨ、Ｒｆ＝０．４）で精製し、黄褐色固体（２９２ｍｇ、７４４μｍｏｌ、８３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．９５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、７．６１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．２８〜７．２３（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．１０（ｍ，１Ｈ）、６．５８（ｓ，１Ｈ）、５．０４（ｓ，２Ｈ）、４．６７〜４．５９（ｍ，２Ｈ）、４．２５〜４．１９（ｍ，２Ｈ）、３．１１（ｓ，３Ｈ）、２．９８〜２．９０（ｍ，２Ｈ）、１．０４〜０．９４（ｍ，２Ｈ）、０．０４（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７６．４、１５８．０、１３７．２、１３３．１、１２７．５、１２２．９、１２１．５、１２０．２、１０９．５、１０５．５、６８．０、６５．０、３９．１、３７．０、３４．８、１７．９、−１．４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２ＮａＯ５Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：４１５．１６６５；実測値：４１５．１６６６。
【０１２５】
【化２２】
2016505528.tif 000026
【０１２６】
[0106]  ３−（２−（（（メチルアミノ）オキシ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパン酸（1a）：３（１０７ｍｇ、２７３μｍｏｌ）およびＣｓＦ（２４１ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ、５．８１当量）の混合物に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ、無水）を添加した。２０時間後、Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）を添加すると、気体が発生した。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＡｃＯＨ、３％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４５）で精製し、白色固体（６９ｍｇ、２７４μｍｏｌ、１００％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．５１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．１９〜７．１４（ｍ，１Ｈ）、７．０５〜７．００（ｍ，１Ｈ）、６．４７（ｓ，１Ｈ）、４．８９（ｓ，２Ｈ）、４．５４〜４．５０（ｍ，２Ｈ）、２．８３〜２．７５（ｍ，２Ｈ）、２．６６（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７５．１、１３８．５、１３６．２、１２９．０、１２３．１、１２１．８、１２０．６、１１０．４、１０４．７、６８．０、４０．４、３８．９、３５．６。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３Ｈ１７Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２４９．１２３９；実測値：２４９．１２３２。
【０１２７】
【化２３】
2016505528.tif 000027
【０１２８】
[0107]  ３−（１−イソプロピル−２−メチル−１，２−ジヒドロ−［１，２］オキサジノ［５，４−ｂ］インドール−５（４Ｈ）−イル）プロパン酸（10）：１ａ（６．０ｍｇ、２４μｍｏｌ）の１：１  ＮＨ４ＯＡｃ水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ４．５０）：ＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に、イソブチルアルデヒド（６．６μＬ、７２μｍｏｌ、３当量）を添加した。１時間後、反応混合物を淡桃色固体（７．０ｍｇ、２３μｍｏｌ、９６％）になるまで濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＡｃＯＨ、３％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．３２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．２０〜７．１５（ｍ，１Ｈ）、７．１２〜７．０７（ｍ，１Ｈ）、５．００（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．７８（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．３２〜４．１８（ｍ，２Ｈ）、３．５５（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．７６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．６７（ｓ，３Ｈ）、２．２７〜２．１８（ｍ，１Ｈ）、１．０８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、１．０２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７５．２、１３６．２、１３０．４、１２７．８、１２１．５、１１９．６、１１９．６、１０９．２、１０７．０、６６．８、５８．３、４１．６、３９．３、３４．５、３３．２、２０．６、２０．６。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１７Ｈ２３Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３０３．１７０９；実測値：３０３．１７０１。
【０１２９】
【化２４】
2016505528.tif 000028
【０１３０】
[0108]  ３−（１，１，２−トリメチル−１，２−ジヒドロ−［１，２］オキサジノ［５，４−ｂ］インドール−５（４Ｈ）−イル）プロパン酸（11）：１ａ（５．８ｍｇ、２３μｍｏｌ）の１：１  ＮＨ４ＯＡｃ水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ４．５０）：ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に、アセトン（５．１μＬ、６９μｍｏｌ、３当量）を添加した。１時間後、反応混合物を無色油（６．８ｍｇ、２４μｍｏｌ、１００％）になるまで濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２中５％  ＡｃＯＨ、３％  ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ７．６０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．３９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．１５〜７．１０（ｍ，１Ｈ）、７．０７〜７．０３（ｍ，１Ｈ）、４．９２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、４．２２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）、２．７０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．６６（ｓ，３Ｈ）、１．４５（ｓ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ１７３．０、１３７．２、１３４．１、１２５．７、１２１．４、１２０．０、１１９．８、１１６．９、１１０．６、６５．８、６０．０、４０．０、３７．１、３４．６９、３４．６６。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１６Ｈ２１Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２８９．１５５２；実測値：２８９．１５４４。
【０１３１】
【化２５】
2016505528.tif 000029
【０１３２】
[0109]  ２−（トリメチルシリル）エチルメチル（（１−（３−オキソ−３−（（３−（３−（２−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）アセトアミド）プロポキシ）プロピル）アミノ）プロピル）−１Ｈ−インドール−２−イル）メトキシ）カルバマート（12）：オーブンで乾燥し、０℃でＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、無水）中３（６．５ｍｇ、１７μｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（９．０μＬ、５１μｍｏｌ、３．０当量）を加えたフラスコに、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセタート（３．０μＬ、１７μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。溶液を次の３０分間にわたって室温まで加温し、その後０．５ｃｍ３のシリカプラグで濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３回×０．５ｍＬ、無水）に溶解し、次いでビオチン−ＰＥＧ３−ＮＨ２（７．７ｍｇ、１７μｍｏｌ、１．０当量）およびジイソプロピルエチルアミン（９．０μｌ、５１μｍｏｌ、３．０当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ、無水）溶液に添加した。２４時間後、溶液を濃縮し、次いでシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中８％  ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．１）で精製し、白色固体（１０．２ｍｇ、１２．４μｍｏｌ、７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．４３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．２４〜７．１９（ｍ，１Ｈ）、７．１０〜７．０５（ｍ，１Ｈ）、６．８２（ｓ，１Ｈ）、６．５９〜６．５４（ｍ，２Ｈ）、６．００（ｓ，１Ｈ）、５．１９（ｓ，１Ｈ）、５．０３（ｓ，２Ｈ）、４．６０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、４．４６〜４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．２６〜４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｄｄ，Ｊ＝９．５，７．７Ｈｚ，２Ｈ）、３．５８〜３．４９（ｍ，８Ｈ）、３．４５（ｍ，２Ｈ）、３．３４（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．３０（ｄｄ，Ｊ＝１２．１，６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．２３（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．１３（ｓ，３Ｈ）、３．１２〜３．０７（ｍ，１Ｈ）、２．８６（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，５．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．７２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．６８（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．７４〜１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６７〜１．６０（ｍ，６Ｈ）、１．４５〜１．３７（ｍ，２Ｈ）、１．０３〜０．９５（ｍ，２Ｈ）、０．０４（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７３．１、１７０．８、１６３．６、１５７．８、１３７．４、１３３．１、１２７．３、１２２．７、１２１．１、１１９．９、１１０．１、１０５．３、７０．５２、７０．４５、７０．２、７０．１、６９．９、６９．２、６７．７、６４．９、６１．９、６０．２、５５．６、４０．６４、４０．５７、３８．０、３７．７、３７．３、３６．９、３６．０、２９．８、２９．０、２８．２、２８．２、２５．７、１７．９、−１．４。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３９Ｈ６４Ｎ６ＮａＯ９ＳＳｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：８４３．４１２２；実測値：８４３．４１２５。
【０１３３】
【化２６】
2016505528.tif 000030
【０１３４】
[0110]  ３−（２−（（（メチルアミノ）オキシ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）−Ｎ−（３−（３−（２−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）アセトアミド）プロポキシ）プロピル）プロパンアミド（1b）：オーブンで乾燥し、１２（２．２ｍｇ、２．７μｍｏｌ）およびＣｓＦ（６．５ｍｇ、４３μｍｏｌ、１６当量）を加えたフラスコに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ、無水）を添加した。２時間後、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、反応混合物を白色残渣になるまで濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（６５：２０：２０：２．５：２．５  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＮＨ４ＯＨ、Ｒｆ＝０．２５）、無色油（１．８ｍｇ、２．７μｍｏｌ、９９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．２１〜７．１７（ｍ，１Ｈ）、７．１０〜７．０４（ｍ，１Ｈ）、６．６５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、６．５０（ｓ，１Ｈ）、６．４９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、５．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．８８（ｓ，２Ｈ）、４．８３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．５５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．４２〜４．３７（ｍ，１Ｈ）、４．２４〜４．１９（ｍ，１Ｈ）、３．５８〜３．４８（ｍ，８Ｈ）、３．４７〜３．４３（ｍ，２Ｈ）、３．３６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）、３．３２〜３．２８（ｍ，２Ｈ）、３．２６〜３．２１（ｍ，２Ｈ）、２．８５（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，５．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．６７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．６２（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．１５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．７２〜１．６９（ｍ，２Ｈ）、１．６８〜１．５９（ｍ，６Ｈ）、１．４４〜１．３８（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７３．０、１７０．９、１６３．４、１３７．３、１３５．５、１２７．６、１２２．２、１２１．０、１１９．８、１１０．０、１０３．７、７０．５、７０．４、７０．０、６９．８、６９．４、６７．３、６１．９、６０．１、５５．６、４０．７、４０．３、３９．４、３８．２、３７．５、３７．３、３６．０、２９．９、２８．９、２８．７、２８．２、２８．１、２５．７。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３３Ｈ５３Ｎ６Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：６７７．３６９６；実測値：６７７．３６９１。
【０１３５】
【化２７】
2016505528.tif 000031
【０１３６】
[0111]  ６−アミノ−９−（２−カルボキシ−４−（（５−（３−（２−（３，８，８−トリメチル−４−オキソ−２，５−ジオキサ−３−アザ−８−シラノニル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパンアミド）ペンチル）カルバモイル）フェニル）−３−イミニオ−３Ｈ−キサンテン−４，５−ジスルホン酸ナトリウムおよび６−アミノ−９−（２−カルボキシ−５−（（５−（３−（２−（３，８，８−トリメチル−４−オキソ−２，５−ジオキサ−３−アザ−８−シラノニル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパンアミド）ペンチル）カルバモイル）フェニル）−３−イミニオ−３Ｈ−キサンテン−４，５−ジスルホン酸ナトリウム（13）：オーブンで乾燥し、０℃でＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、無水）中３（９．８ｍｇ、２５μｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ、７５μｍｏｌ、３．０当量）を加えたフラスコに、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセタート（４．５μｌ、２６μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。溶液を次の４５分間にわたって室温まで加温し、その後０．５ｃｍ３のシリカプラグで濾過し、ＣＨ２Ｃ１２（２ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ、無水）に溶解した。この溶液２００μｌに、ジイソプロピルエチルアミン（４．５μＬ、２６μｍｏｌ、１７当量）およびＡＦ４８８カダベリン（１．０ｍｇ、１．６μｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ、無水）溶液を添加した。２１時間後、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、反応混合物を赤色残渣になるまで濃縮し、Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣ（時間（分）、アセトニトリル（％）／Ｈ２Ｏ：０，１０；５，１０；３５，１００）で精製した。赤色粉末の生成物を単離した（１．１７ｍｇ、１．１５μｍｏｌ、７４％）。Ｃ４５Ｈ５ＩＮ６Ｎａ２Ｏ１４Ｓ２Ｓｉ［Ｍ＋Ｎａ］＋のＨＲＭＳ（ESI）計算値：１０３７．２４６９；測定値：１０３７．２４８８。
【０１３７】
【化２８】
2016505528.tif 000032
【０１３８】
[0112]  ６−アミノ−９−（２−カルボキシ−４−（（５−（３−（２−（（（メチルアミノ）オキシ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパンアミド）ペンチル）カルバモイル）フェニル）−３−イミニオ−３Ｈ−キサンテン−４，５−ジスルホン酸ナトリウムおよび６−アミノ−９−（２−カルボキシ−５−（（５−（３−（２−（（（メチルアミノ）オキシ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパンアミド）ペンチル）カルバモイル）フェニル）−３−イミニオ−３Ｈ−キサンテン−４，５−ジスルホン酸ナトリウム（1c）：オーブンで乾燥し、１３（１．１６６ｍｇ、１．１４９μｍｏｌ）およびＣｓＦ（３１ｍｇ、２０４μｍｏｌ、１７８当量）を加えたフラスコに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（無水、０．５ｍＬ）を添加した。６時間後、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）を添加し、反応混合物を暗赤色残渣になるまで濃縮し、Ｃ４カラムによるＨＰＬＣ（時間（分）、アセトニトリル（％）／Ｈ２Ｏ：０，５；５，５；１０，１０）で精製した。得られた生成物を９：１  ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（３回×０．５ｍＬ）に溶解し、濾過して、残留ＣｓＦを除去すると、赤色固体（８７１μｇ、１．００μｍｏｌ、８７％）が得られた。６：２：２：２  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、Ｒｆ＝０．２０。Ｃ３９Ｈ３９Ｎ６Ｏ１２Ｓ２［Ｍ−Ｎａ］−のＨＲＭＳ（ESI）計算値：８４７．２０６７；測定値：８４７．２０７８。
【０１３９】
【化２９】
2016505528.tif 000033
【０１４０】
[0113]  ５−（（３，３−ジエトキシプロピル）カルバモイル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（14）：５−カルボキシフルオレセイン（３０ｍｇ、８０μｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（３１ｍｇ、１６２μｍｏｌ、２．０当量）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２０重量％Ｈ２Ｏ、５５ｍｇ、３２６μｍｏｌ）の混合物に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）と、続いてトリエチルアミン（２２．２μＬ、１５９μｍｏｌ、２．０当量）および３−アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（１３μＬ、８０μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。暗所で２６時間撹拌した後、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、溶液を橙色油になるまで濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃ１２中８％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３５）およびＣ１８カラムによるＨＰＬＣ（時間（分）、ＭｅＣＮ（％）／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ：（０，４５；３，４５；１５，５５）で精製した。明橙色粉末の生成物を得た（１３ｍｇ、２６μｍｏｌ、３２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ８．４１（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ）、８．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．６８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ）、６．６１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）、６．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３Ｈｚ，２Ｈ）、４．６５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．７５〜３．６７（ｍ，２Ｈ）、３．５９〜３．５３（ｍ，２Ｈ）、３．５１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．９５（ｄｔ，Ｊ＝８．６，４．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．２０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  １７０．７、１６８．３、１６２．４、１５５．５、１５４．４、１３７．９、１３５．０、１３０．３、１２９．５、１２６．１、１２５．０、１１４．２、１１１．２、１０３．７、１０３．０、９８．２、６３．０、３７．３、３４．５、１５．７。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２８Ｈ２８ＮＯ８［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：５０６．１８１５；実測値：５０６．１８２３。
【０１４１】
【化３０】
2016505528.tif 000034
【０１４２】
[0114]  ２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（３−オキソプロピル）カルバモイル）安息香酸（Shen B-Q. et al.（2012）, “Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates,” Nat. Biotechnol. 30（2）：184-189）：化合物１４（１３ｍｇ、２６μｍｏｌ）を１２：１２：１  ＣＨ２Ｃ１２：トリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解し、密封したバイアル中で４２℃に加熱した。１８時間後、反応をＨ２Ｏ（２ｍＬ）でクエンチし、溶液を橙色油になるまで濃縮した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃ１２中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２）で精製すると、橙色固体（８．８ｍｇ、２０μｍｏｌ、７９％；９７％  ｂｒｓｍ）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ  ８．４６（ｓ，１Ｈ）、８．２０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．８１〜６．５８（ｍ，６Ｈ）、４．６７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．５３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、１．９３（ｄｔ，Ｊ＝１４．２，７．１Ｈｚ，２Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２４Ｈ１６ＮＯ７［Ｍ−Ｈ］−の計算値：４３０．０９２７；実測値：４３０．０９１７。
【０１４３】
【化３１】
2016505528.tif 000035
【０１４４】
[0115]  ５−（（３−（（ベンジルオキシ）イミノ）プロピル）カルバモイル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（5a）：４（３．２ｍｇ、７．４μｍｏｌ）およびＯ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．３ｍｇ、８．１μｍｏｌ、１．１当量）の混合物を１：１酢酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５０）：ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した。２．５時間後、得られた懸濁液を橙色固体になるまで濃縮し、Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣ（時間（分）、ＭｅＣＮ（％）／Ｈ２Ｏ：０，４０；５，４０；１５，５５）で精製し、橙色固体（３．２ｍｇ、６．０μｍｏｌ、８１％）を得た。生成物をｓｙｎ：ａｎｔｉ異性体比の９：１１の混合物として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ８．４０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．１６〜８．０８（ｍ，１Ｈ）、７．５４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．６Ｈ，ａｎｔｉ−Ｃ（Ｈ）ＮＯ）、７．３２〜７．１５（ｍ，６Ｈ）、６．８７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，０．４Ｈ，ｓｙｎ−Ｃ（Ｈ）ＮＯ）、６．６９（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ）、６．６８〜６．６２（ｍ，２Ｈ）、６．５６（ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．５４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．０８（ｓ，ｓｙｎ−ＣＨ２Ｏ，０．９Ｈ）、５．０１（ｓ，ａｎｔｉ−ＣＨ２Ｏ，１．１Ｈ）、３．６１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．７５（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ｓｙｎ−ＣＨ２Ｃ（Ｈ）Ｎ，０．９Ｈ）、２．５３（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ａｎｔｉ−ＣＨ２Ｃ（Ｈ）Ｎ，１．１Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３１Ｈ２５Ｎ２Ｏ７［Ｍ＋１−１］＋の計算値：５３７．１６６２；実測値：５３７．１６７０。
【０１４５】
【化３２】
2016505528.tif 000036
【０１４６】
[0116]  ５−（（２−（５−（２−カルボキシエチル）−２−メチル−１，２，４，５−テトラヒドロ−［１，２］オキサジノ［５，４−ｂ］インドール−１−イル）エチル）カルバモイル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（5b）：４（３．２ｍｇ、７．４μｍｏｌ）および１ａ（２．０ｍｇ、８．１μｍｏｌ、１．１当量）の混合物を１：２酢酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５０）：ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）に溶解した。２．５時間後、反応混合物を橙色固体になるまで濃縮し、Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣ（時間（分）、ＭｅＣＮ（％）／Ｈ２Ｏ：０，４０；５，４０；１５，５５）で精製し、橙色固体（３．７ｍｇ、５．６μｍｏｌ、７６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．０７（ｓ，１Ｈ）、７．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．１７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．０８〜７．０３（ｍ，１Ｈ）、７．０３〜６．９８（ｍ，１Ｈ）、６．６８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，２Ｈ）、６．６２〜６．５２（ｍ，４Ｈ）、５．１２（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．０５（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．３７〜４．２７（ｍ，２Ｈ）、４．１１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．５９（ｄｔ，Ｊ＝１３．２，６．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．５０（ｄｔ，Ｊ＝１３．７，６．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．８８（ｓ，３Ｈ）、２．７５〜２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．５２（ｍ，１Ｈ）、２．２９（ｍ，１Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３７Ｈ３２Ｎ３Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：６６２．２１３８；実測値：６６２．２１５４。
【０１４７】
Ｃ.低分子実験
[0117]  １Ｈ  ＮＭＲキネティクス：重水素化酢酸ナトリウム緩衝液は、Ｄ２Ｏ中ＮａＯＤの添加により酢酸−ｄ４のＤ２Ｏ溶液を適当なｐＤ（ｐＤ＝ｐＨ計示度＋０．４１）（2）まで塩基性にし、それらをＤ２Ｏで希釈して１００ｍＭ［アセタート−ｄ３］にすることによって調製した。重水素化リン酸ナトリウム緩衝液は、１００ｍＭリン酸−ｄ３のＤ２Ｏ溶液と１００ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４のＤ２Ｏ溶液を組み合わせて、適当なｐＤにすることによって調製した。反応速度式における各反応物質の順序を決定するために、１ａ（１．５ｍＭまたは３．０ｍＭ）またはイソブチルアルデヒド（１．５ｍＭまたは３．０ｍＭ）の重水素化緩衝溶液を含むストック溶液をＮＭＲ取得の直前に１：１の比で組み合わせた。速度定数を決定するために、１ａ（１ｍＭ）またはイソブチルアルデヒド（１ｍＭ）の重水素化緩衝溶液を含むストック溶液を、ＮＭＲ取得の直前に１：１の比で組み合わせた（１．５ｍＭの各反応物質を含むストック溶液をｐＤ  ７．０で使用した）。キネティックデータはすべて、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−５００またはＡＶ−６００分光計でプローブ温度を２９５Ｋに維持して取得した。８組のスペクトルスキャンを３０秒ごとに取得し、反応をすべて、少なくとも一半減期追跡した。Ｎ−ＣＨ２共鳴の消失を経時的に追跡し、生成物のメチル共鳴を積分して、溶液状態の材料の全量を決定した。データはＭｅｓｔＲｅＮｏｖａおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで解析した。
【０１４８】
[0118]  低分子加水分解：加水分解溶液は、１μＭ  ５ａまたは５ｂ、内部標準として２５μＭフェニルアラニン、および５ｍＭ酢酸ナトリウムを適当なｐＨで含むものであった。溶液を室温でインキュベートし、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００装置でＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８逆相カラム（4.6×50mm）を用いて、溶媒流速０．４ｍＬ／分で液体クロマトグラフィーにより５０μＬずつ繰り返し分析した。以下のグラジエントを用いた（時間（分）、ＭｅＣＮ（％）／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ）：０，５；１０，９５；１２，９５；１４，５；１９，５。各溶液の最初の注入時刻をｔ＝０と指定した。５ａおよび５ｂの４４０ｎｍにおける吸収ピークの積分を各注入のフェニルアラニンピークに対して正規化した。
【０１４９】
Ｄ.グリオキサール−Ｍｂのビオチン化
[0119]  グリオキサール−Ｍｂの調製：ウマ心臓ミオグロビン（Sigma-Aldrich）のアミノ基転移を改変された文献プロトコル（3）に従って行った。ミオグロビン（５０μＭ）のリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．５０）およびピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ、２００ｍＭ）のリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．５０に調整）のストック溶液を調製した。ミオグロビン溶液を等体積のＰＬＰストック溶液またはビヒクル（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５０）と組み合わせ、暗所にて３７℃で１時間インキュベートした。次いで、溶液を１０倍希釈し、遠心濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．５０）に５回交換し、次いでリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．５０）に対して透析を行って、残留ピリドキサールリン酸を除去した。
【０１５０】
[0120]  時間依存的なラベリング：グリオキサール−ＭｂまたはＭｂ（３μｇ）および１ｂまたはＮ−（アミノオキシアセチル）−Ｎ’−（Ｄ−ビオチノイル）ヒドラジン（アミノオキシ−ビオチン）（２５０μＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．００）中、４μｌの反応体積で３７℃にて０〜１２０分化合し、次いでベンズアルデヒド（１０ｍＭ）でクエンチした。
【０１５１】
[0121]  濃度依存的なラベリング：グリオキサール−ＭｂまたはＭｂ（３μｇ）および１ｂまたはアミノオキシ−ビオチン（０〜２００μＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．００）中、４μＬ反応体積で３７℃にて３時間化合し、次いでベンズアルデヒド（１０ｍＭ）でクエンチした。
【０１５２】
[0122]  ｐＨ依存的なラベリング：グリオキサール−ＭｂまたはＭｂ（１．７μｇ）および１ｂまたはアミノオキシ−ビオチン（２５０μＭ）を酢酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ４．００〜５．５０）またはリン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ６．００〜７．５０）緩衝液中、４μＬの反応体積で３７℃にて３時間化合し、次いでベンズアルデヒド（１０ｍＭ）でクエンチした。
【０１５３】
[0123]  ＢｎＯＮＨ２を用いた共処理：グリオキサール−ＭｂまたはＭｂ（１．７μｇ）、１ｂ（１００μＭ）、およびＢｎＯＮＨ３Ｃ１（０〜８００μＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５０）中、５μＬの反応体積で３７℃にて３時間化合し、次いでベンズアルデヒド（１０ｍＭ）でクエンチした。
【０１５４】
[0124]  アニリンを用いた共処理：グリオキサール−ＭｂまたはＭｂ（１．７μｇ）、１ｂ（１００μＭ）、およびアニリニウムアセタート（０〜５０ｍＭ、ｐＨ４．５０または５．５０）またはアニリニウムホスファート（０〜５０ｍＭ、ｐＨ６．５０）緩衝液を酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５０または５．５０）またはリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５０）中、  μＬの反応体積で３７℃にて４時間化合し、次いでベンズアルデヒド（１０ｍＭ）でクエンチした。
【０１５５】
[0125]  ウェスタンブロットの一般手順：ベンズアルデヒドを添加した後、反応混合物を室温で５分間インキュベートし、次いでβ−メルカプトエタノールを含む３３％（ｖ/ｖ）４ｘ  ＳＤＳローディングバッファーと化合し、２６ウェルＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ  ４〜１２％ビス−トリスゲル（４５分、１７５Ｖ）でＸＴ  ＭＥＳ緩衝液中実行した。次いで、ゲルの内容物は、２０％  ＭｅＯＨを含むトリス−グリシン緩衝液中でニトロセルロース膜にウェット式転写し（６０分、１００Ｖ）、総タンパク質ローディングは、ポンソーＳ染色（５％（ｖ/ｖ）酢酸中０．１％（ｗ/ｖ））でイメージングした。次いで、ブロットをウシ血清アルブミン（4%（ｗ/ｖ））を含有する０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝食塩水中、４℃で終夜ブロッキングした。次いで、ブロッキング液中のブロットをマウスα−ビオチンＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１/１００００）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ（３回×１０分）で洗浄し、イメージングした。ウェスタンブロットをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０画像装置でスキャンし、データをＩｍａｇｅＪで解析した。
【０１５６】
Ｅ．ＦＧｌｙ−ＭＢＰコンジュゲートの調製および評価
[0126]  ＦＧｌｙ−ＭＢＰおよびＭＢＰ  Ｃ３９０Ａを既に説明したように調製した（Shen B-Q., et al.（2012）, “Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates,” Nat. Biotechnol. 30（2）：184-189）。
【０１５７】
[0127]  全長タンパク質コンジュゲートのＥＳＩ−ＭＳ：質量分析用のＭＢＰと１ａとのコンジュゲーション反応は、ＦＧｌｙ−ＭＢＰまたはＭＢＰ  Ｃ３９０Ａ（６．８μｇ）と１ａ（１ｍＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）中、８μＬの反応体積で３７℃にて１２時間化合することによって調製した。次いで、リン酸水素ナトリウム（１００ｍＭ、９２μＬ）の添加により、反応をクエンチして、ｐＨを７．９にし、ＥＳＩ−ＭＳによる分析に先立って４℃で１時間未満貯蔵した。
【０１５８】
[0128]  トリプトシン消化物：リン酸ナトリウム緩衝液（６５ｍＭ、ｐＨ７．２）中ＦＧｌｙ−ＭＢＰと１ａ（５．７μｇ）のコンジュゲートを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、２．５４ｍＭ、６０ｎｍｏｌ）と共に５６℃で３０分間、ヨードアセトアミド（５．９８ｍＭ、１５０ｎｍｏｌ）と共に暗所にて室温で１時間、次いでＤＴＴ（２．３３ｍＭ、６０ｎｍｏｌ）と共に室温で５分間インキュベートした（システイン残基はＦＧｌｙ−ＭＢＰ中に存在していないが、ＤＴＴおよびヨードアセトアミドを添加して、オキサカルボリン部分がタンパク質消化において使用される標準還元およびアルキル化手順と適合性があることを示した）。得られた試料をトリプシン（０．１１５μｇ、２重量％）で３７℃にて１８時間処理した。次いで、溶液をギ酸で酸性化して、最終濃度１％にし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８樹脂で精製し、７０％ＭｅＣＮおよび１％ギ酸のＨ２Ｏ溶液で溶離した。溶離液を遠心蒸発で濃縮し、得られた残渣を水に再懸濁した後、ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ＨＨＭＩ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ＬａｂにてフローインジェクションによりＢｒｕｋｅｒ  Ａｐｅｘ−Ｑｅ  ＥＳＩ−Ｑ−ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計（９．４Ｔ）で分析を行った。Ｃ４５Ｈ７０Ｎ１３Ｏ１５［Ｍ＋Ｈ］＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値：１０３２．５１１４；測定値：１０３２．５２２０。
【０１５９】
[0129]  トロンビン開裂：ＦＧｌｙ−ＭＢＰ（４４μｇ）の溶液を酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）中ＡＦ４８８  Ｃ５−アミノオキシアセトアミドまたは１ｃ（２００μＭ）で、２０μＬの反応体積で３７℃にて１７時間ラベリングした。溶液を１０倍希釈し、遠心濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、３０  ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、ＰＢＳに５回交換した。得られたＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲート（０．６μｇ）のＰＢＳ溶液をトロンビン（０〜１．２Ｕ）と共に、６μＬの反応体積で３７℃にて１時間インキュベートし、次いで還元性ＳＤＳローディングバッファーの添加により、クエンチし、５分間沸騰させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分割を行った。ゲルをイメージングし、次いでコロイダルブルー（Life Technologies）で染色した。
【０１６０】
[0130]  蛍光偏光法(fluorescence polarization)：オキシムおよびオキサカルボリン結合(-linked)ＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲートを上述のように調製した。アミド結合(-linked)ＡＦ４８８−ＭＢＰは、ＦＧｌｙ−ＭＢＰ（４４μｇ）をＡＦ４８８  ５−ＳＤＰエステル（５００μＭ）で炭酸水素ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）中、１５μＬの反応体積で３７℃にて４５分間処理することによって調製した。次いで、溶液を１０倍希釈し、遠心濃縮機（Amicon Ultra、30 kDa MWCO）を使用して、ＰＢＳに５回交換した。コンジュゲーション効率をＵＶ−ｖｉｓで評価した後、１００  ｎＭ  ＡＦ４８８を含む各コンジュゲートの溶液をＰＢＳ（１００μＬ）で３回繰り返して調製した。溶液を密封した黒色９６ウェルプレート（Costar）にて３７℃でインキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダーを使用して、蛍光偏光データを定期的に取得した。ほぼ１週間後、プレートリーダーを３７℃に平衡化させ、トロンビン（12U）を各ウェルに添加し、偏光を１２分間隔でモニターした。遊離フルオロフォア（１００ｎＭ）の溶液は偏光値４０±１．３ｍＰ（ＡＦ４８８  Ｃ５−アミノオキシアセトアミド）および１０４±０．３ｍＰ（1c）を示し、トロンビン開裂生成物の偏光値と矛盾することがなく、誤差は、ペプチド−ＡＦ４８８コンジュゲートと遊離フルオロフォアの混合物が存在していること、ならびに３７℃で１週間にわたってＰＢＳが蒸発したためＡＦ４８８コンジュゲート溶液の濃度がわずかに上昇したことに起因すると考えられる。
【０１６１】
Ｆ．ＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２の調製および評価
[0131]  ＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２は既に記載のように調製し、ＣｙｓからＦＧｌｙへの変換は９７％完了していた（Cho H, et al.（2011）, “Optimized clinical performance of growth hormone with an expanded genetic code,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（22）：9060-9065））。
【０１６２】
[0132]  ＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２の調製：ＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２（７６μｇ）を１ｃ（１ｍＭ）と共に酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５０）中、１００μＬの反応体積で３７℃にて１２時間インキュベートした。次いで、溶液を１０倍希釈し、遠心濃縮機（Amicon Ultra、30 kDa MWCO）を使用して、ＰＢＳに６回交換した。コンジュゲーション効率は、Ｔｈｅｒｍｏ  ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計で、ＦＧ１ｙ−α−ＨＥＲ２の場合ε２８０＝２１００００Ｍ−１  ｃｍ−１、ＡＦ４８８の場合ε４９４＝７１０００Ｍ−１  ｃｍ−１を使用し、２８０ｎｍにおけるＡＦ４８８の吸収を説明する補正係数（ε280=ε494*0.11）を適用して決定した。
【０１６３】
[0133]  細胞培養：ＳＫＯＶ３およびジャーカット(Jurkat)Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから入手し、加湿した５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にてグルタミン、１０％ウシ胎仔血清、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させた。細胞密度は１×１０５〜２×１０６細胞／ｍＬの間で維持した。
【０１６４】
[0134]  ＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２による生細胞ラベリング：培地中の細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％ウシ胎仔血清）で洗浄し、９６ウェルＶ−底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において１００μＬずつのＦＡＣＳ緩衝液に１０６／ｍＬで再懸濁し、次いで４℃に冷却した（その後の操作はすべて４℃で行った）。ラベリング実験を３回繰り返して行った。抗体インキュベーションはすべて、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬ中で実施し、洗浄工程はすべて、３００  ｘ  ｇでの遠心およびＦＡＣＳ緩衝液２００μＬでの洗浄３回を伴うものであった。細胞をｈＩｇＧ（１０ｎＭ）と共に３０分間インキュベートし、洗浄し、ウサギα−ＡＦ４８８（Life Technologies、1/2000）またはビヒクルと共に３０分インキュベートし、洗浄し、次いでヤギα−ｈＩｇＧ  ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９（Jackson ImmunoResearch、1/2000）およびロバα−ウサギＦＩＴＣ（Jackson ImmunoResearch、1/2000）またはビヒクルと共に３０分インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液３００μＬに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで行い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ（Tree Star）で行った。中央蛍光強度は、図１３に示すようにゲーテッド集団(populations gated)に関して算出した。
【０１６５】
結果および考察
[0135]  ピクテ−スペングラーライゲーション試薬の設計および合成。ここ１世紀にわたって、ピクテ−スペングラー反応はインドールアルカロイド天然物の合成において重要な役割を果たしてきた（Stockigt J, Antonchick AP, Wu F, & Waldmann H（2011）, “The Pictet-Spengler Reaction in Nature and in Organic Chemistry,” Angew. Chem. Int. Ed. 50（37）：8538-8564）。本発明者らは、トリプタミンとアルデヒドまたはケトンの間にＣ−Ｃ結合を形成する変換（図１Ａ）は非可逆的バイオコンジュゲーションに適応できると仮定した。標準形のピクテ−スペングラー反応は既にこの場面において使用されてきた（Sasaki T, Kodama K, Suzuki H, Fukuzawa S, & Tachibana K（2008）, “N-terminal labeling of proteins by the Pictet-Spengler reaction, “Bioorg. Med. Chem. Lett. 18（16）：4550-4553）；しかし、反応はタンパク質相溶性条件下で遅く、ｐＨ４〜５において２次速度定数約１０−４Ｍ−１ｓ−１で進行する（Maresh JJ, et al.（2007）, “Strictosidine Synthase：Mechanism of a Pictet-Spengler Catalyzing Enzyme,” J. Am. Chem. Soc. 130（2）：710-723）。これらの遅い反応キネティクスは、修飾タンパク質の優れた収率を実現するのに高濃度（例えば、５０ｍＭ）の誘導体化試薬を必要とし、試薬コスト、オフターゲットの反応性、得られたコンジュゲートの精製、およびタンパク質ラベリングを生細胞に適用する場合の毒性の観点から問題となる恐れがある。
【０１６６】
[0136]  ピクテ−スペングラーライゲーション（図１Ｂ）の本発明者らの設計において、アミノオキシ置換基をインドールの２位に移動させることによって反応速度を上昇させ、より求核性の高い３位が求電子置換に関与することが可能になる。２位において脂肪族アミンで置換されているインドールは「ｉｓｏ−ピクテ−スペングラー」反応に有機溶媒中で関与することが公知である（Molina P, Alca'ntara Jn, & Lo'pez-Leonardo C（1996）, “Regiospecific preparation of γ-carbolines and pyrimido[3, 4-a]indole derivatives by intramolecular ring-closure of heterocumulene-substituted indoles,” Tetrahedron 52（16）：5833-5844；Lee Y, Klausen RS, & Jacobsen EN（2011）, “Thiourea-Catalyzed Enantioselective Iso-PictetSpengler Reactions,” Org. Lett. 13（20）：5564-5567）。最後に、本発明者らはアミノオキシ官能基をメチル化して、反応性オキシイミニウムイオン中間体を形成し、分子内求電子置換を介した急速なＣ−Ｃ結合形成を容易にした。Ｎ−アルコキシトリプタミンのピクテ−スペングラー反応を行って、環外アミノオキシ官能基を有する生成物が得られることは公知である（Plate R, Van Hout RHM, Behm H, & Ottenheijm HCJ（1987）, “Synthesis of 2-hydroxy-3-（ethoxycarbonyl）-1 ,2,3,4-tetrahydro-β-carbolines from N-hydroxytryptophans.  An approach to the eudistomin series,” J. Org. Chem. 52（4）：555-560）；Hermkens PHH, et al.（1990）, “Syntheses of 1,3-disubstituted N-oxy-β-carbolines by the PictetSpengler reactions of N-oxy-tryptophan and -tryptamine derivatives,” Tetrahedron 46（3）：833-846）；Kirkup MP, Shankar BB, McCombie S, Ganguly AK, & McPhail AT（1989）, “A concise route to the oxathiazepine containing eudistomin skeleton and some carba-analogs,” Tetrahedron Lett. 30（49）：6809-6812）が、本発明者らの知る限りでは、それらの水性媒体中におけるキネティクスも挙動も研究されていない。これらの前例によって、本発明者らはアミノオキシ官能化インドール１は高速ピクテ−スペングラー型反応（図１Ｂ）に関与すると予想した。
【０１６７】
[0137]  本発明者らは、モデルインドール１ａを簡潔で高収率の合成法（図１Ｃ）で調製した。まず、インドール−２−メタノールのＴＢＳＣｌによる保護と、その後に続くＤＢＵ触媒によるメチルアクリラートへのアザ−Ｍｉｃｈａｅｌ付加によって、マスクされた官能化ハンドルとしてエステルを取り付けた。（Yeom C-E, Kim MJ, 8：Kim BM（2007）, “1,8-Diazabicylo[5.4.0]undec-7-ene（DBU）-promoted efficient and versatile aza-Mchael addition,” Tetrahedron 63（4）：904-909）。ヒドロキシル基の脱保護を行って、インドール２を得た後、改良光延条件下におけるＴｅｏｃ保護Ｎメチルヒドロキシルアミンとの反応によりアミノオキシ部分を取り付けた（Ishikawa T, et al.（2001）, Novel [2-3]-Sigmatropic Rearrangement for Carbon-Nitrogen Bond Formation J. Am. Chem. Soc. 123（31）：7734-7735；Tsunoda T, Yamamiya Y, & Ito S（1993）, 1,1’-（azodicarbonyl）dipiperidine-tributylphosphine, a new reagent system for mitsunobu reaction, Tetrahedron Lett. 34（10）：1639-1642）。得られた生成物を鹸化すると、化合物３が生成され、ＣｓＦで正確に脱保護して、インドール１ａを６工程にわたる収率６６％で得た。
【０１６８】
[0138]  モデルインドール１ａの反応性および生成物の加水分解安定性。ピクテ−スペングラーライゲーションを検証するために、本発明者らはインドール１ａを酢酸アンモニウムメタノール溶液中ｐＨ４．５にてイソブチルアルデヒドまたはアセトンで処理した。両反応共、非常に正確に１時間未満で進行して、所望のトリヒドロ−β−オキサ−γ−カルボリン（以降、オキサカルボリンと呼ぶ）生成物（図６）が生成された。１Ｈ  ＮＭＲ分光法による１ａとイソブチルアルデヒドとのＤ２Ｏ中における反応速度の分析によって、ｐＤ７．０での、１ａとイソブチルアルデヒドとの濃度において１次である速度則（表Ｓ１）、ならびにアミノオキシ化合物の酸性条件におけるｐＤ−速度定数プロファイル特性（図１Ｄ）が明らかになった（Jencks WP（1959）Studies on the Mechanism of Oxime and Semicarbazone Formation J. Am. Chem. Soc. 81（2）：475-481）。これらの結果から、本発明者らの速度向上戦略は、ピクテ−スペングラーライゲーションが水性媒体中において標準形のピクテ−スペングラー反応より４〜５桁速いので、成果をあげたことが明らかである。
【０１６９】
[0139]  次に、ピクテ−スペングラーライゲーションによって生成したオキサカルボリンの加水分解安定性とモデルオキシムの加水分解安定性を比較した。本発明者らは、アルデヒド誘導体化フルオレセイン（４、図２Ａ）をベンジルアルコキシアミンまたは１ａで処理して、それぞれコンジュゲート５ａおよび５ｂを生成した。１μＭ  ５ａまたは５ｂを含むｐＨ４．５または５．０の緩衝液を室温でインキュベートし、液体クロマトグラフィーで分析した。２日間にわたって、オキシム５ａの大部分は加水分解したが、一方９０％を超えるオキサカルボリン５ｂは未変化のままであった（図２Ｂ）。他の生成物は検出されなかった（図７）。先の研究によって、オキシムの加水分解は、反応をコンジュゲートの加水分解に向けて推進するトラップとして使用される過剰のホルムアルデヒドの存在下で、同様の時間尺度で起こることが明らかになった。（Kalia J & Raines RT（2008）, “Hydrolytic Stability of Hydrazones and Oximes,” Angew. Chem. Int. Ed. 47（39）：7523-7526）。特に、本発明者らの結果は、オキシムの加水分解が水溶液中で、トラップの非存在下でもはっきりと認識できる程度に起き得ることを示しており、非可逆的バイオコンジュゲーション反応の必要性を強調するものである。これらのモデル実験は、ピクテ−スペングラーライゲーションが酸性条件下で急速に進行して、加水分解に安定な生成物を生成することを確証する。
【０１７０】
[0140]  モデルタンパク質に対する反応の範囲。本発明者らは、次にピクテ−スペングラーライゲーションを、アルデヒドを有するタンパク質をラベリングする手段として評価した。ラベリングされたタンパク質の検出および操作を容易にするために、本発明者らは、３とアミノ−ポリ（エチレングリコール）官能化ビオチンをカップリングし、続いてＣｓＦでＴｅｏｃ基を脱保護することによって、ビオチン化インドール１ｂを調製した。１ｂとの反応のためのタンパク質基材として、本発明者らは、ピリドキサールリン酸によって媒介されるアミノ基転移により、Ｎ末端グリオキサール部分（グリオキサール−Ｍｂ）を有するウマ心臓ミオグロビンを生成した（図３Ａ）（Gilmore JM, Scheck RA, Esser-Kahn AP, Joshi NS, & Francis MB（2006）, “N-Terminal Protein Modification through a Biomimetic Transamination Reaction,” Angew. Chem. Int. Ed. 45（32）：5307-5311）。グリオキサール−Ｍｂラベリング実験において、コンジュゲートした生成物を、過剰のラベリング試薬をベンズアルデヒドでクエンチした後、ＦＩＴＣとコンジュゲートしたα−ビオチン抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法で検出した。まず、本発明者らは、ラベリングは濃度依存的および時間依存的に行われることを確証した（それぞれ図３Ｂおよび３Ｃ）。重要なことに、アルデヒド官能化が行われていなかったＭｂの対照試料のラベリングは無視できるほどであった。本発明者らは、次に反応のｐＨ依存性を研究し、インドール１ａのキネティックの研究においても認められたように、ビオチン化の程度がより酸性のｐＨにおいて上昇していることが認められた（図３Ｄ）。最後に、本発明者らは、アルデヒド捕捉剤であるベンジルアルコキシアミンとの共処理によって、ビオチン化が低減したことを見出した（図３Ｅ）。市販のアミノオキシ−ビオチンをラベリング試薬として使用した同様の一連の実験から、ラベリングにおいて同じ定性的な傾向が明らかになった（図８）。まとめると、これらの結果は、インドール１ｂがアミノ基転移ミオグロビンにおけるアルデヒド官能基を特異的
にラベリングし、さらに一般的には典型的なアミノオキシ試薬のように挙動することを確証する（本発明者らはピクテ−スペングラーライゲーションがアニリン触媒作用によって加速化され得るかどうかも調査した（see Dirksen A, Hackeng TM, & Dawson PE（2006）, “Nucleophilic Catalysis of Oxime Ligation,” Angew. Chem. Int. Ed. 45（45）：7581-7584）。アニリンはＩｂとグリオキサール−ＭｂとのｐＨ４．５における反応速度を上昇させず、より高いｐＨ（５．５または６．５）で、アニリンは反応を阻害した。
【０１７１】
[0141]  （図８Ｅ）は先の観察結果と矛盾しないことがわかった（Hudak JE, et al.（2012）, “Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions Using Copper-Free Click Chemistry and the Aldehyde Tag,” Angew. Chem. Int. Ed. 51（17）：4161-4165；Shi X. et al.（2012）, “Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for singlemolecule imaging,” Nat. Methods 9（5）：499-503））。
【０１７２】
[0142]  本発明者らは、次に１ａと、遺伝子にコードされたアルデヒドタグ方法（図４Ａ）を使用して調製されたホルミルグリシン官能化マルトース結合タンパク質（ＦＧｌｙ−ＭＢＰ）との反応を研究した（Rabuka D, Rush JS, deHart GW, Wu P, & Bertozzi CR（2012）, “Site-specific chemical protein conjugation using genetically encoded aldehyde tags,” Nat. Protoc. 7（6）：1052-1067）。簡潔に言えば、組換えタンパク質における残基３８９〜３９４を構成する６−残基ペプチド配列ＬＣＴＰＳＲをＭＢＰのＣ末端において操作した。本発明者らは、アルデヒドタグ配列へのトロンビン開裂部位Ｎ末端も含めた。大腸菌（E. coli）における結核菌（M. tuberculosis）ＦＧＥと一緒にタンパク質が共発現することによって、Ｃｙｓ３９０のＦＧｌｙへの酸化が起こる（Carrico IS, Carlson BL, & Bertozzi CR（2007）, “Introducing genetically encoded aldehydes into proteins,” Nat. Chem. Biol. 3（6）：321-322）。対照として、本発明者らは、ＦＧＥの基材ではなく、ＦＧｌｙアルデヒドを欠くＣ３９０Ａ変異体も発現させた。ＦＧｌｙ−ＭＢＰを１ｍＭインドール１ａと共に３７℃で１２時間インキュベーションすると、ＥＳＩ−ＭＳで判断して、所望の単一修飾付加体に定量的に変換するが、Ｃ３９０Ａ変異体は反応を示さなかった（図４Ｂ）。さらに、１ａのＦＧｌｙ−ＭＢＰコンジュゲートをトリプシンで消化したとき、本発明者らは、高分解能ＥＳＩ−ＭＳによって所望の付加体を含むＣ末端８−残基トリプシンペプチドを同定することができた。トリプシンペプチドの電子移動解離によるＭＳ／ＭＳ断片化によって、ＦＧｌｙ残基の修飾についての直接証拠が得られた（図９Ｂ）。
【０１７３】
[0143]  ラベリングがＦＧｌｙ残基においてのみ行われたことを確認するために、本発明者らは、アルデヒドタグ配列の上流に直接操作されたトロンビン開裂部位を利用した。まず、本発明者らは、３とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）カダベリンをカップリングさせて、続いてＣｓＦで脱保護することによって、インドール１ｃを調製した。次に、本発明者らは、１ｃまたはＡＦ４８８ヒドロキシルアミンとの処理によってＦＧｌｙ−ＭＢＰのオキサカルボリン結合またはオキシム結合ＡＦ４８８コンジュゲートを調製し、コンジュゲートを様々な量のトロンビンと共に１時間インキュベートし、次いで生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＦＧｌｙ−ＭＢＰ帯に由来するインゲル蛍光の強度は、トロンビン濃度が上昇するほど低下し、開裂したＣ末端８−残基ペプチド内で排他的に行われるラベリングと矛盾しない（図４Ｃ）。特に、オキシム結合およびオキサカルボリン結合ＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲートは定性的に同様の挙動を示し、オキシムに比べて、大きいオキサカルボリン部分はタンパク質がトロンビンの基材として機能する能力を阻害しなかったことが示唆された。これらの実験は、ピクテ−スペングラーライゲーションがアルデヒドタグ付きタンパク質上のＦＧｌｙ残基を排他的にラベリングすることを確証する。
【０１７４】
[0144]  タンパク質上のオキサカルボリンリンケージの加水分解安定性。次に、本発明者らは、ＦＧｌｙ−ＭＢＰ上のオキサカルボリンリンケージの加水分解安定性をアッセイした。蛍光偏光法は溶液状態のフルオロフォアの回転率に関する情報を得る技法である：高分子とコンジュゲートしたフルオロフォアはゆっくりと回転し、高い偏光値を示すが、低分子フルオロフォアは低い偏光値を示す。したがって、蛍光偏光法はタンパク質フルオロフォアコンジュゲートの開裂をモニターするのに適していることが理想的である（Jameson DM & Ross JA（2010）, “Fluorescence Polarization/Anisotropy in Diagnostics and Imaging,” Chem. Rev. 110（5）：2685-2708）。ＦＧｌｙ−ＭＢＰの溶液を１ｃ、ＡＦ４８８ヒドロキシルアミン、またはリシン反応性ＡＦ４８８−スルホジクロロフェノールエステルで処理して、オキサカルボリン結合、オキシム結合、またはアミド結合ＡＦ４８８−ＭＢＰコンジュゲートを作製した（図１０）。次いで、試料をＡＦ４８８コンジュゲート中で１００ｎＭまで希釈し、３７℃でインキュベートした。蛍光偏光を１週間モニターした（図４Ｄ）。オキシムコンジュゲートは偏光が一様に低下し、７日にわたるコンジュゲートの加水分解がほぼ完全であることが示唆された。逆に、オキサカルボリンおよびアミドコンジュゲートは、偏光において最小の変化しか示さなかった。オキサカルボリン結合ＡＦ４８８コンジュゲートが１週間後も未変化であったことを確認するために、本発明者らがトロンビンを試料に添加すると、フルオロフォアを含むＣ末端ペプチドがタンパク質の残部から開裂されたときすぐに偏光の低下が起こった。アミド結合ＡＦ４８８コンジュゲートからの信号は安定なままであり（リシン残基はトロンビン開裂部位の下流には存在しない）、偏光の低下が人為的なトロンビン添加の結果でないことが示唆された。
【０１７５】
[0145]  モノクローナル抗体の部位特異的修飾へのピクテ−スペングラーライゲーションの適用。抗体コンジュゲートの調製におけるピクテ−スペングラーライゲーションの有用性を披露するために、本発明者らは、２本の重鎖のぞれぞれのＣ末端においてアルデヒドタグ配列で修飾されたα−ＨＥＲ２ヒトＩｇＧを使用した（ＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２と略す）。親抗体は、臨床使用が認可された薬物ハーセプチン（Herceptin）（Menard S, Pupa SM, Campiglio M, & Tagliabue E（2003）, “Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer,” Oncogene 22（42）：6570-6578）および臨床評価の後期段階にある、ハーセプチン（Herceptin）に基づいた抗体−薬物コンジュゲートであるＴ−ＤＭ１（Krop IE, et al.（2012）, “A Phase II Study of Trastuzumab Emtansine in Patients With Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 -Positive Metastatic Breast Cancer Who Were Previously Treated With Trastuzumab, Lapatinib, an Anthracyc1ine, a Taxane, and Capecitabine,” Journal of Clinical Oncology）の変異体である。ＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２を先に記載したように調製し（Hudak JE, et al.（2012）, “Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions Using Copper-Free Click Chemistry and the Aldehyde Tag,” Angew. Chem. Int. Ed. 51（17）：4161-4165）、次いでインドール１ｃでｐＨ４．５において１２時間ラベリングした。得られたコンジュゲート（AF488-α-HER2）は重鎖において正確に修飾され（図５Ａ）、ｈＩｇＧ１つ当たり平均１．０±０．１３のフルオロフォアを有するものであった（図１１）。本発明者らは、次にこの抗体コンジュゲートの、ＨＥＲ２を過剰発現する卵巣腺癌細胞系ＳＫＯＶ３への結合をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＳＫＯＶ３細胞をＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２またはＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２で処理し、続いてＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９とコンジュゲートしたα−ｈＩｇＧ２次抗体で処理して、全ｈＩｇＧ結合を測定した。本発明者らは、ＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２とＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２の間に結合の差を見出さなかった（図５Ｂ）。これは、ピクテ−スペングラーライゲーション反応条件もオキサカルボリン部分の存在も抗体のＨＥＲ２に対するアフィニティーには悪影響を及ぼさないことを示唆する。ラベリングした細胞をウサギα−ＡＦ４８８２次抗体と共にインキュベートし、続いてＦＩＴＣとコンジュゲートしたα−ウサギ３次抗体と共にインキュベートすると、ＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２で処理したがＦＧｌｙ−α−ＨＥＲ２では処理していない細胞における蛍光が増大した（図５Ｂ）。この結果によって、ＡＦ４８８カーゴをＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２によって細胞表面に送達することに成功したことが確認された。予想される通り、アイソタイプ対照ｈＩｇＧは、ＳＫＯＶ３細胞への顕著な結合を示さなかった。さらに、ＡＦ４８８−α−ＨＥＲ２コンジュゲートは、ＨＥＲ２を発現しないジャーカットＴ細胞へのアフィニティーを示さなかった。全体的に、これらの実験から、ピクテ−スペングラーライゲーションを使用して、結合活性を損なうことなく、部位特異的にラベリングされたモノクローナル抗体を調製できることが明らかである。
【０１７６】
[0146]  本発明の特定の実施形態の前述の説明は、例示および説明のために提示されたものである。これらは、包括的なものでも、本発明を開示された正確な形に限定するものでもなく、上記の教示を考慮に入れて、明らかに多くの修正形態および変形形態があり得る。本発明の原理およびその実際の適用を最もよく説明し、それによって、当業者が本発明および考えられた特定の使用に適している様々な修正を含む様々な実施形態を最もよく利用できるようにするために、実施形態を選択し、説明した。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義されるよう意図される。
【０１７７】
[0147]  本明細書に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的で参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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