(57)【要約】本発明は、血管新生に関与するｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は、生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。本発明はまた、虚血によって引き起こされる心臓疾患を含む心臓疾患を予防又は治療するための該組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生に関与するｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物であって、該阻害剤は、生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている、該組成物。
【請求項２】
該ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）を含むファミリーから選択される、請求項１の組成物。
【請求項３】
該ｍｉＲＮＡが、成熟した：
ａ）配列番号２１、２２若しくは２３からなる群より選択された配列、又は配列番号２１、２２若しくは２３の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−９２ａ；
ｂ）配列番号２４若しくは２５からなる群より選択された配列、又は配列番号２４若しくは２５の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−９２ｂ；
ｃ）配列番号２６若しくは２７からなる群より選択された配列、又は配列番号２６若しくは２７の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１７；
ｄ）配列番号２８若しくは２９からなる群より選択された配列、又は配列番号２８若しくは２９の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−５０３；
ｅ）配列番号３０、３１若しくは３２からなる群より選択された配列、又は配列番号３０、３１若しくは３２の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１６；
ｆ）配列番号３３、３４、３５、３６、３７若しくは３８からなる群より選択された配列、又は配列番号３３、３４、３５、３６、３７若しくは３８の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−３７４；
ｇ）配列番号３９、４０、４１若しくは４２からなる群より選択された配列、又は配列番号３９、４０、４１若しくは４２の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−２４；
ｈ）配列番号４３若しくは４４からなる群より選択された配列、又は配列番号４３若しくは４４の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−４８３；
ｉ）配列番号４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０からなる群より選択された配列、又は配列番号４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−３４；
ｊ）配列番号５１、５２、５３若しくは５４からなる群より選択された配列、又は配列番号５１、５２、５３若しくは５４の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−２０；
ｋ）配列番号５５、５６、５７若しくは５８からなる群より選択された配列、又は配列番号５５、５６、５７若しくは５８の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１５
からなる、請求項１の組成物。
【請求項４】
該ｍｉＲＮＡ前駆体が、
ａ）配列番号１の配列又は配列番号１に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ａ−１；
ｂ）配列番号２の配列又は配列番号２に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ａ−２；
ｃ）配列番号３の配列又は配列番号３に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ｂ；
ｄ）配列番号４の配列又は配列番号４に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１７；
ｅ）配列番号５の配列又は配列番号５に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−５０３；
ｆ）配列番号６の配列又は配列番号６に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１６−１；及び
ｇ）配列番号７の配列又は配列番号７に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１６−２；
ｈ）配列番号８の配列又は配列番号８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ａ；
ｉ）配列番号９の配列又は配列番号９に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ｂ；
ｊ）配列番号１０の配列又は配列番号１０に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ｃ；
ｋ）配列番号１１の配列又は配列番号１１に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２４−１；
ｌ）配列番号１２の配列又は配列番号１２に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２４−２；
ｍ）配列番号１３の配列又は配列番号１３に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−４８３；
ｎ）配列番号１４の配列又は配列番号１４に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ａ；
ｏ）配列番号１５の配列又は配列番号１５に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ｂ；
ｐ）配列番号１６の配列又は配列番号１６に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ｃ；
ｑ）配列番号１７の配列又は配列番号１７に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２０ａ；
ｒ）配列番号１８の配列又は配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２０ｂ；
ｓ）配列番号１９の配列又は配列番号１９に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１５ａ；及び
ｔ）配列番号２０の配列又は配列番号２０に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１５ｂ
からなる、請求項１の組成物。
【請求項５】
該ｍｉＲＮＡ阻害剤が、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に標的化された配列を有する８〜４９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４の組成物。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドが、標的ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の配列に対して少なくとも部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５の組成物。
【請求項７】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、小分子ＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、ＬＮＡ、ＣＤＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノオリゴヌクレオチド、又はその組合せからなる群より選択される、請求項６の組成物。
【請求項８】
該オリゴヌクレオチドがアンタゴｍｉｒからなる、請求項６の組成物。
【請求項９】
該アンタゴｍｉｒが、配列番号１〜５８からなる群より選択された配列のヌクレオチドに対して相補的である少なくとも１６個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項８の組成物。
【請求項１０】
該アンタゴｍｉｒが、配列番号５９又は６０の配列、及びその塩基置換を除く改変物、並びに、配列番号５９又は６０の少なくとも８個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントを含む、請求項９の組成物。
【請求項１１】
該ミクロスフィアが２５μmを超えない直径を提示している、請求項１〜１０の組成物。
【請求項１２】
該ミクロスフィアの少なくとも５０％が、５〜２０μm、優先的には５〜１５μmの直径を提示している、請求項１〜１０の組成物。
【請求項１３】
該ミクロスフィアが１％〜１５％w/wの阻害剤を取り込んでいる、請求項１〜１２の組成物。
【請求項１４】
該ミクロスフィアが１％〜１０％w/wの阻害剤を取り込んでいる、請求項１〜１２の組成物。
【請求項１５】
該ミクロスフィアがポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）からなる高分子でできており、該高分子は１つ以上の他の高分子と場合によりブレンドされている、請求項１〜１４の組成物。
【請求項１６】
該ミクロスフィアがポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）からなる共重合体でできており、該高分子は１つ以上の他の高分子と場合によりブレンドされている、請求項１〜１４の組成物。
【請求項１７】
該ミクロスフィアがポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）及びポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）からなる高分子のブレンドからできている、請求項１〜１４の組成物。
【請求項１８】
ＰＬＧＡ高分子中のラクチド：グリコリドの比が５０：５０から９５：５のモル比である、請求項１６又は１７の組成物。
【請求項１９】
該高分子の固有粘度が０．１〜０．７０dl/gである、請求項１６〜１８の組成物。
【請求項２０】
心筋梗塞の処置に使用するための請求項１〜１９のいずれか一項の組成物。
【請求項２１】
該心筋梗塞が急性心筋梗塞からなる、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
被験者に請求項１〜１９の一項記載の組成物の有効量を投与することを含む、それを必要とする被験者における心室リモデリングを元に戻す又は予防する方法。
【請求項２３】
該投与が、冠内経路による投与からなる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
心筋梗塞の治療又は予防に使用するための生分解性かつ生体適合性のミクロスフィア集団であって、該ミクロスフィアは：
−  ５〜１５μmの平均直径を有し；
−  ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）；ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）又はそのブレンドからできており；
−  心室リモデリングを予防することのできる１％〜１５％w/wの治療剤を取り込んでおり、
該治療剤は、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、より優先的にはｍｉＲ−９２ａ、又はその前駆体からなる群より選択されたｍｉＲＮＡの阻害剤からなる、該ミクロスフィア集団。
【請求項２５】
該阻害剤がアンタゴｍｉｒである、請求項２４のミクロスフィア。
【請求項２６】
少なくともｉ）請求項１〜１９記載の組成物及び／又は請求項２４若しくは２５記載のミクロスフィア、並びにｉｉ）該組成物が配置されたシリンジ又はバイアル又はアンプルを含む、キット。
【請求項２７】
溶媒容器に配置された溶媒をさらに含む、請求項２６のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、虚血性心疾患を含む心臓疾患を予防又は治療することを目的とした医薬製剤の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は、心筋梗塞とも呼ばれ、心臓発作としても一般的に知られているが、世界中の最も工業化された国々における大きな健康リスクであり、依然として世界中における罹患及び死亡の第一原因である。
【０００３】
一般的に、ＡＭＩは、心臓組織への急激かつ持続的な血流の減少によって引き起こされ、これは通常、冠動脈の狭窄又は閉塞の結果である。適切な血液の供給がなければ、組織は虚血となり、心筋細胞（心臓筋肉細胞）及び血管構造は死滅する。
【０００４】
最近数十年間でＡＭＩの処置において主に冠血流再建に関して薬理学的療法と併用して多くの進展が見られた。再灌流療法は、梗塞領域を減少させ、長期及び短期の罹患率及び死亡率を改善することによって、ＡＭＩの自然進行を変化させることに成功した。しかしながら、現在利用可能な２つの再灌流戦略の使用にはかなりの制限がある：線維素溶解により冠動脈の透過度は低くなり、初回血管形成術は、ＡＭＩの発生から最初の数時間の間には頻繁に適用できない。さらに、幾人かのカテーテル挿入患者においては、正常な心外膜流にも関わらず「再流が全く起こらない」現象又は微小血管再灌流の欠如が起こり、これにより有害な機能的転帰がもたらされる。これは、再灌流療法が、コラーゲンによる瘢痕形成の複雑で内因的な修復過程である、有害な心筋のリモデリング（これは心室拡張、収縮不全及びその後の心不全をもたらす）の発生を予防しなかったことを意味する。ＡＭＩの約３０％におけるその発生は、主に、より大きな梗塞サイズ、微小血管閉塞、及び依然として十分に解明されていない好ましくない修復反応に関連している。
【０００５】
修復的線維化及び虚血組織の機能的回復は、酸素を含ませた血液を供給するネットワークの確立に依存しているので、損傷領域から機能的組織へのインサイツでの直接的な変換を達成するために、治癒領域において血管新生を誘導することによって血管床を改善する努力がなされた。
【０００６】
治療的な血管新生の誘導は、この現象の発生を減弱させることができた。それにも関わらず、静脈内血管新生促進因子を用いての数年間の臨床試験の結果は不満足なものであった。理論によって固めたくはないが、この失敗を説明する理由の１つは、静脈内経路は、標的組織に届きかつそこで有効濃度の薬物を維持して、重度に損なわれた心臓容態の下で機能的な血管ネットワークを促進及び維持することができないであろうことであり得ると考えられる。
【０００７】
この問題に対処し、ＡＭＩ後の心不全を予防するために、心筋及び心血管を再生する可能性に関する研究が過去１０年間以内に始まった。多能性前駆細胞を投与し、血管増殖因子を注入する初期の研究は有望な結果を示したが、臨床の場への移行は、これらの療法が、破壊された心筋の回復を可能とするために適切な方法で新生血管を再生することができないことを示した。
【０００８】
今日、細胞療法を用いての損傷された心臓の血管新生及び再増殖、並びに、特定の薬物及び再同期療法は、この現象の進行を減速させ得るが、その発生の予防は依然として心臓医薬にとって懐疑的な課題である。それ故、有害な左心室リモデリングを予防する新規な処置戦略が必要とされる。
【０００９】
発明の要約
本発明は、マイクロＲＮＡの活性又は発現を調節することによって心室リモデリングを元に戻す又は予防する組成物を投与することによる、心疾患、好ましくは虚血性疾患の処置に関する。より特定すると、本発明は、血管新生に関与するマイクロＲＮＡの阻害剤を含む組成物を提供し、該阻害剤は好ましくは、虚血標的組織に局所的に該阻害剤を放出することのできる新規な送達ビヒクルへと取り込まれている。さらに、本発明は、心室リモデリングを元に戻す又は予防する方法、及び、該方法に有用なキットを提供する。
【００１０】
本発明は、血管新生に関与するｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は、生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。
【００１１】
上記の組成物のいくつかの実施態様において、該ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）を含むファミリーから選択される。
【００１２】
上記の組成物のいくつかの実施態様において、該ｍｉＲＮＡ阻害剤は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に標的化された配列を有する８〜４９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の配列に対して少なくとも部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、小分子ＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、ＬＮＡ、ＣＤＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノオリゴヌクレオチド、又はその組合せからなる群より選択され得る。
【００１３】
上記の組成物のいくつかの実施態様において、該ｍｉＲＮＡ阻害剤はアンタゴｍｉｒからなり、好ましくは、本明細書に記載の配列番号１〜５８からなる群より選択された配列のヌクレオチドに対して相補的である少なくとも１６個連続したヌクレオチドを含むクレオチド配列を含むアンタゴｍｉｒからなる。
【００１４】
上記の組成物のいくつかの実施態様において、該ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号５９又は６０の配列、及びその塩基置換を除く改変物、並びに、配列番号５９又は６０の少なくとも８個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントを含む、アンタゴｍｉｒからなる。
【００１５】
上記の組成物のいくつかの実施態様において、該ミクロスフィアは、２５μmを超えない直径を提示し、これは、５〜２０μm、優先的には５〜１５μmの直径を有するミクロスフィアを包含する。
【００１６】
上記の組成物のいくつかの実施態様において、該ミクロスフィアは、ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）からなる高分子から作られ、該高分子は場合により１つ以上の他の高分子とブレンドされている。
【００１７】
本発明はまた、被験者に有効量の前記組成物を投与することを含む、それを必要とする被験者における心室リモデリングを元に戻す又は予防するための方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、心筋梗塞の治療又は予防に使用するための生分解性かつ生体適合性のミクロスフィア集団に関し、該ミクロスフィアは、
−  ５〜２０μm、優先的には５〜１５μmの平均直径を有し；
−  ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）；ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）又はそのブレンドから作られ；
−  心室リモデリングを予防することのできる１％〜１５％w/wの治療剤を取り込んでおり、
該治療剤は、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、より優先的にはｍｉＲ−９２ａ、又はその前駆体からなる群より選択されたｍｉＲＮＡの阻害剤からなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、走査電子顕微鏡によって決定されたアンタゴｍｉｒ-９２ａ−ＰＬＧＡミクロスフィアの形態を示す。
【図２】図２は、レーザー光散乱によって決定されたアンタゴｍｉｒ-９２ａ−ＰＬＧＡミクロスフィアのサイズ分布を示す。
【図３】図３は、１２０mgまでのミクロスフィアの反復注射による血行動態及び左心室収縮力における効果を示す。
【図４】図４は、２４０mgまでのミクロスフィアの反復注射による血行動態及び左心室収縮力における効果を示す。
【図５】図５は、本発明によるミクロスフィアの１回の冠内注射の分子効果の試験のプロトコールを示す。
【図６】図６は、本発明によるミクロスフィアによるｍｉＲ−９２ａ阻害の特異性を示す。
【図７】図７は、カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａが梗塞組織において血管新生を誘導することを示す。血管の総数を全梗塞面積で割って計算された、梗塞帯域における血管密度。Ｎ＝２０。＊Ｐ＜０．０１。
【図８】間接的な測定。カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａ、プラセボ又は食塩水を用いて処置されたミニブタの梗塞関連動脈における、ＡＭＩから１か月後に測定された基礎及び最小微小血管抵抗性指数。（ａ）基礎微小血管抵抗性指数（ＭＲＩ）は、心尖部左冠動脈前下行肢（Ｐｄ）に配置されたプレッシャワイヤを用いて評価された圧力（mmHg）と、左冠動脈前下行肢の遠位区域に配置されたセンサーによって定量された冠動脈流速（ml/分）を乗じることによって計算された。最小微小血管抵抗性指数（ＭＲＩｈｙｐ）は、大腿静脈１２Ｆシースを通して投与された１４０μg/Kg/分のアデノシンの静脈内注入により達成された最大充血において測定されたのと同じパラメーターを用いて計算された。ｎ＝１２。＊ｐ＜０．０１。＊＊ｐ＝０．０５。（ｂ）壊死領域における血管の総数とＭＲＩとの相関。Ｒ２０．４１、ｐ＝０．０２、ｎ＝１２。（ｃ）壊死領域における血管の総数と最小ＭＲＩとの相関。Ｒ２０．２７、ｐ＝０．０８、ｎ＝１２。
【図９】直接的な測定。カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａを用いて処置された又は処置されていないミニブタの梗塞関連動脈におけるＡＭＩから１か月後に測定されたベースライン及び真の微小循環抵抗。（ａ）ベースライン微小循環抵抗（ベースラインＭＲ）は、心尖部左冠動脈前下行肢（Ｐｄ）に配置されたプレッシャワイヤを用いて評価された圧力（mmHg）を、左冠動脈前下行肢の遠位区域に配置されたセンサーによって定量された冠動脈流速（ml/分）で割ることによって計算された。ベースラインＭＲは、対照と比べて処置群において有意により低かった（７．４７±１．３３対１９．６２±２．９８、ｐ＝０．００５）。ｎ＝１３。真の微小循環抵抗（ＴＭＲ（ｈｙｐ））は、大腿静脈１２Ｆシースを通して投与された１４０μg/kg/分のアデノシンの静脈内注入により達成された最大充血中のと同じパラメーターを測定して計算された。有意に低いＴＭＲ（ｈｙｐ）が、対照と比較して処置群において観察された（５．０±１．１５対１４．４９±２．４、ｐ＝０．００６）。ｎ＝１３。（ｂ）全ての壊死領域における血管密度とベースラインＭＲとの相関。Ｒ２＝０．３５、Ｐ＝０．０３３、ｎ＝１３。（ｃ）全ての壊死領域における血管密度とＴＭＲ（ｈｙｐ）との相関。Ｒ２＝０．３１、Ｐ＝０．０４７。ｎ＝１３。
【図１０】ＡＭＩから１か月後、心室中隔心尖部の運動障害の存在が、割り当てられた処置が分からない心エコー検査者によって評価された。処置及び非処置動物における心室中隔心尖部の運動障害を有する動物の比率が示されている（８３．３％対１６．７％、ｐ＝０．０３）。ｎ＝２０。
【図１１】インビトロにおけるｍｉＲ９２ａの発現に対するカプセル化アンタゴｍｉｒ９２ａ及び非カプセル化アンタゴｍｉｒ９２ａの効果の評価。
【図１２】そのそれぞれのｍｉＲＮＡに対するカプセル化アンタゴｍｉｒ１７及び２０ａの効果。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明によって包含される全ての実施態様の記載について関連したいくつかの定義が本明細書において以下に示されている。
【００２１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、生物学的過程の重要な調節因子として出現した小さなノンコーディングＲＮＡである。
【００２２】
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」は、約１８から約２５ヌクレオチド長のノンコーディングＲＮＡを意味する。これらのｍｉＲは、ｍｉＲＮＡをコードする個々の遺伝子を含む複数の起源から、タンパク質をコードする遺伝子のイントロンから、又は複数の密接に関連したマイクロＲＮＡをしばしばコードする多シストロン性転写物から派生し得る。
【００２３】
現在の知識は、ｍｉＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）によって転写され、一般的に数千塩基長である一次ｍｉＲＮＡ転写物（プリｍｉＲＮＡ）と呼ばれる初期転写物から生じることを示す。プリｍｉＲＮＡは、核においてＲＮａｓｅ Ｄｒｏｓｈａによって約７０〜１００ヌクレオチドのヘパリン形の前駆体（プレｍｉＲＮＡ）へとプロセシングされる。細胞質に輸送された後、ヘアピンプレｍｉＲＮＡはさらにダイサーによってプロセシングされて二本鎖マイクロＲＮＡを生成し；鎖の１つ、いわゆる成熟マイクロＲＮＡ（時に両方の鎖が使用され得る）はその後、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、そこでその標的ｍＲＮＡと塩基対相補性によって会合する。ｍｉＲＮＡ塩基がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的と完全に対を形成する比較的稀な場合において、それはｍＲＮＡの分解を促進する。より一般的には、マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二本鎖を形成し、ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすか又はｍＲＮＡの翻訳を阻害する。
【００２４】
「ステムループ配列」は、ヘアピン構造を有し、成熟したマイクロＲＮＡ配列を含有するＲＮＡを意味する。プレｍｉＲＮＡ配列及びステムループ配列は重複していてもよい。ステムループ配列の例は、ｍｉＲＢａｓｅとして知られるマイクロＲＮＡデータベースに見られる。
【００２５】
「マイクロＲＮＡ前駆体」は、ゲノムＤＮＡを起源とし、１つ以上のマイクロＲＮＡ配列を含むノンコーディング構造のＲＮＡを含む転写物を意味する。例えば、特定の実施態様において、マイクロＲＮＡ前駆体はプレｍｉＲＮＡである。特定の実施態様において、マイクロＲＮＡ前駆体はプリｍｉＲＮＡである。
【００２６】
以下の明記は、標準的な命名体系に従い、小文字の「ｍｉｒ−Ｘ」はプレｍｉＲＮＡを指し、大文字の「ｍｉＲ−Ｘ」は成熟形を指す。２つの成熟マイクロＲＮＡが同じプレｍｉＲＮＡの反対のアームを起源とする場合、それらは、−３ｐ又は−５ｐという接尾辞を用いて示される。相対的発現レベルが公知である場合、名称の後のアステリスクは、ヘアピンの反対のアームのマイクロＲＮＡと比較して低いレベルで発現されたマイクロＲＮＡを示す。
【００２７】
以下の明記において、特記しない限り、ｍｉＲ−Ｘという表現の使用は、−３ｐ及び−５ｐ（ある場合）の両方の形態を含む成熟ｍｉＲＮＡを指す。
【００２８】
疑いを避けるために、本明細書において、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲという表現は、同じ産物を示す。
【００２９】
本発明の脈絡において、血管新生に関与するマイクロＲＮＡ上の特定の焦点を結果として用いて、血管新生又は血管新生過程を調節することが目的である。従って、本発明の目的は、血管新生の調節に関与するマイクロＲＮＡファミリーに属する少なくとも１つのマイクロＲＮＡを調節することである。
【００３０】
「マイクロＲＮＡファミリー」という表現によって、血管新生又は血管新生過程の調節からなる関連した機能を有するマイクロＲＮＡ群を意味する。より特定すると、制限されることなく、該マイクロＲＮＡは、抗血管新生活性を提示するマイクロＲＮＡからなる群より選択される。
【００３１】
より特定すると、制限されることなく、このようなマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体からなる群より選択される。当業者には明らかであろうように、血管新生に対する調節特性、優先的にはアンタゴニスト特性を有する任意のｍｉＲＮＡが、このマイクロＲＮＡファミリーの一部と考えられるべきである。
【００３２】
疑いを避けるために、以下の明記におけるマイクロＲＮＡという表現は、特記しない限り、それがその前駆体から切断された後の、成熟又はプロセシングされたＲＮＡを指す。非成熟形では、「前駆体」又は「マイクロＲＮＡ前駆体」という表現が使用される。
【００３３】
以下の表１は、本明細書によって包含されるマイクロＲＮＡ前駆体の種々の配列を再編成する。
【００３４】
【表１】
2016506923.tif 000002
【００３５】
以下の表２は、各マイクロＲＮＡについてのマイクロＲＮＡの配列、及び、対応する前駆体配列中の対応する残基を示す（表１参照）。
【００３６】
【表２】
2016506923.tif 000003
2016506923.tif 000004
【００３７】
特記しない限り、出願書類に言及された前駆体及びマイクロＲＮＡ配列はヒト配列である。それにも関わらず、いくつかの場合において、マイクロＲＮＡヒト配列は、他の種に由来するマイクロＲＮＡ配列に対して相同である。
【００３８】
一例として、ヒトｍｉＲ−９２ａは、他の種に由来するｍｉＲに対して相同であると述べることができる。より特定すると、ヒトｍｉＲ−９２ａは、ｄｍｅ（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、ｍｍｕ（ハツカネズミ（Mus musculus））、ｒｎｏ（ドブネズミ（Rattus norvegicus））、ｄｐｓ（ウスグロショウジョウバエ（Drosophila pseudoobscura））、ａｇａ（ガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae））、ｄｒｅ（ゼブラフィッシュ（Danio rerio））、ｍｍｌ（アカゲザル（Macaca mulatta））、ｘｔｒ（ゼノパス・トロピカリス（Xenopus tropicalis））、ａｍｅ（ミツバチ（Apis mellifera））、ｏｄｉ（ワカレオタマボヤ（Oikopleura dioica））、ｃｉｎ（カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis））、ｃｓａ（ユウレイボヤ（Ciona savignyi））、ｃｆａ（イエイヌ（Canis familiaris））、及びブタ又はｓｓｃ（イノシシ（Sus scrofa））に由来するｍｉＲに対して相同である。
【００３９】
その一般的な知識に基づいて、当業者は、他のヒトマイクロＲＮＡ配列と、他の種に由来するマイクロＲＮＡ配列との間に相同性を容易に見出すだろう。
【００４０】
本明細書に記載の成熟マイクロＲＮＡ及びその対応するステムループ配列のヌクレオチド配列は、オンラインで探索可能なマイクロＲＮＡ配列及びアノテーションのデータベースであるｍｉＲＢａｓｅに見られる配列である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースの項目は、マイクロＲＮＡ転写物の予測されるヘアピン部分（ステムループ）を、成熟マイクロＲＮＡ配列の位置及び配列に関する情報と共に示す。データベース中のマイクロＲＮＡステムループ配列は、厳密には前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）ではなく、いくつかの場合においては、推定される一次転写物からのプレｍｉＲＮＡ及びいくつかのフランキング配列を含み得る。
【００４１】
従って、本発明の目的は、マイクロＲＮＡの阻害剤、又は血管新生の生理機能を支配する種々の反応に関与するいくつかのマイクロＲＮＡ若しくはその前駆体の阻害剤の組合せを含む、ＡＭＩ後の心室リモデリングの治療又は予防のための組成物を提供することである。
【００４２】
しかしながら、大半の公表された研究において、静脈内経路が、動物へのマイクロＲＮＡ阻害剤の投与のために使用される。血管遺伝子発現の調節に関与するマイクロＲＮＡの操作は、虚血疾病における新規な治療標的を示す。生物医学部門では、特定のＲＮＡ配列を阻害するように特に設計されたＲＮＡモジュレーターの投与に関する研究が指数関数的に増加している。
【００４３】
Dimmeler et alは、全身投与された特異的マイクロＲＮＡ阻害剤によるｍｉＲ−９２ａ阻害後の左心室機能の収縮力及び回復における改善を示した。多シストロン性マイクロＲＮＡ１７−９２ａクラスターは腫瘍発生に連関しているので、及びマイクロＲＮＡの細胞型の遍在性のために、ｍｉＲ又は抗ｍｉＲの反復注射による静脈内投与は安全性に関する懸念を生じる。
【００４４】
マイクロＲＮＡは複雑な過程を制御し、様々な細胞経路に存在するという事実のために、それらはまた、有意な副作用をトリガーするという可能性が高い。現在のとりわけ問題は、ｍｉＲＮＡ阻害剤による処置が選択的ではないことである。
【００４５】
さらに、これらの分子の遍在性及び低い臓器特異性から、全身投与により、これらのｍｉＲＮＡが異なる細胞特異的機能を有するか又は通常は発現されていない組織において調節機能を働かせる可能性がある。この間違った調節が副作用をトリガーしそうである。潜在的なリスクの中で、マイクロＲＮＡ操作に関連した腫瘍発生は依然として、この療法をヒト病態に適用する場合の主な懸念の１つである。さらに、標的細胞において適切に持続された濃度を得るために、マイクロＲＮＡ阻害剤は、非常に高い用量で繰り返し注射されなければならない。制御された条件における小動物に対する実験には制約が少ないが、ヒトへの移行には、生物学的安全性に対する障壁だけでなく、実施の障害及び経済学的な障害が前以て推定される。
【００４６】
これらの問題を解決し、この新規な治療アプローチを患者に移行することを可能とするために、マイクロＲＮＡ阻害剤を輸送し、それらを標的臓器に直接放出するための放出ビヒクルを生成することが考えられる。適切なビヒクルは、マイクロＲＮＡ阻害剤をまっすぐに患部組織に指向させ、これにより、投与量の低減を可能とし、よって反復注射投与は回避され、他の臓器に対する起こり得る望ましくない生物学的作用は最小限となるものだろう。
【００４７】
それ故、目的は、マイクロＲＮＡ阻害剤を標的組織のみに放出することにより、選択性を向上させ、これらの処置の副作用を回避することである。この問題は、本発明によると、マイクロＲＮＡ阻害剤を生分解性かつ生体適合性のミクロスフィアにマイクロカプセル化することによって解決される。
【００４８】
従って、本発明の目的は、血管新生の調節に関連したマイクロＲＮＡファミリーに属する少なくとも１つのマイクロカプセル化マイクロＲＮＡ阻害剤を含む、ＡＭＩ後の心室リモデリングの治療又は予防のための組成物を提供することであり、マイクロＲＮＡファミリーは、以下に制限されることなく、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体を含む。
【００４９】
マイクロＲＮＡ阻害剤をミクロスフィアにマイクロカプセル化することによって、経管的血管形成術後の動脈内投与が容易となり、よってミクロスフィアは、傷害領域の微小血管（毛細血管とも呼ばれる）にのみ送達及び保持され；このようにして、カプセル化マイクロＲＮＡ阻害剤は局所的に放出され得る。
【００５０】
ＡＭＩの原因動脈を通しての冠内注射は、冠内微小循環へのミクロスフィアの保持、及び、標的虚血組織への直接的なマイクロＲＮＡ阻害剤の持続的な放出を可能とする。マイクロＲＮＡ阻害剤は血管新生を誘導し、これは、傷害組織の収縮力の機能的回復、並びに、好ましい梗塞後のリモデリングを増強する。
【００５１】
意外なことに、本明細書において、マイクロＲＮＡ阻害剤、特に血管新生の調節に関連したマイクロＲＮＡファミリーに属するマイクロＲＮＡの阻害剤が適切なミクロスフィアにマイクロカプセル化されると、該マイクロＲＮＡは心筋の傷害領域に成功裡に放出され、よって、標的マイクロＲＮＡの生物学的活性を遮断することが示されている。本明細書の実施例において示されているように、選択的な冠内経路による、生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化された所与のマイクロＲＮＡ阻害剤、すなわち、非制限的な例としてのｍｉＲ−９２ａ阻害剤の、心筋梗塞に罹った個体への投与は、心筋機能の回復をもたらす。
【００５２】
それ故、微小循環に保持されたミクロスフィアは、標的虚血組織への直接的なマイクロＲＮＡ阻害剤の持続的な放出を可能とする。標的化マイクロＲＮＡのマイクロＲＮＡ阻害剤の持続作用（ダウンレギュレーションとしても知られる）により、損傷から１か月後に、治癒領域において、有意な血管の増殖及び有害なリモデリングの抑制がもたらされた。
【００５３】
本明細書の実施例に示されているように、有害な心室リモデリングの発生は、梗塞に関連した動脈に投与されたカプセル化された適切なマイクロＲＮＡ阻害剤による血管新生の調節に関連したマイクロＲＮＡファミリーに属するマイクロＲＮＡの局所的かつ持続的な阻害を通して脈管形成を誘導することによって予防され得ることが実証された。これは、急性心筋梗塞を患う患者への次世代の安全な遺伝子調節療法の転換を促進する新規な送達法を示す。
【００５４】
これらの結果は明瞭に、血管新生の調節に関連したマイクロＲＮＡファミリーに属するマイクロＲＮＡ、例えば、本明細書に開示されているようなｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体の阻害剤を含む組成物は、治療有効量かつ治療有効放出速度で該阻害剤の効果的な局所放出を可能とすることを示す。
【００５５】
第一の態様において、本発明は、血管新生に関与するマイクロＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は、生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。
【００５６】
別の態様において、本発明は、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体を含むファミリーから選択されたマイクロＲＮＡの少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は、生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。
【００５７】
本発明のさらに別の態様において、本発明は、ｍｉＲ−９２ａ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。
【００５８】
「ミクロスフィア」という表現によって、１μmから数百μmのサイズの球状粒子と理解されなければならない。「微粒子」という表現は「ミクロスフィア」及び「マイクロカプセル」の両方を含む。本明細書において、「ミクロスフィア」という表現が使用されるが、「マイクロカプセル」という表現による置き換えが当業者によって可能でありかつ関心がある場合には、「ミクロスフィア」及び「マイクロカプセル」の使用は等価であることが理解されなければならない。
【００５９】
「カプセル化」又は「マイクロカプセル化」という表現によって、保護のために又は改変された放出のために粒子に封入又は包埋されていると理解されなければならない。
【００６０】
換言すれば、本発明は、血管新生に関与するマイクロＲＮＡの少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む医薬組成物に関し、該マイクロＲＮＡ阻害剤は、好ましくは、生分解性かつ生体適合性ミクロスフィアにマイクロカプセル化された、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体を含む又は代替的にはからなる群より選択される。
【００６１】
換言すれば、本発明は、生分解性かつ生体適合性ミクロスフィアにマイクロカプセル化された、ｍｉＲ−９２ａ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
「医薬組成物」は、医薬を含む個体への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、ｍｉＲＮＡ阻害剤及び無菌水溶液を含み得る。
【００６３】
本発明の組成物の実施態様において、血管新生に関与するｍｉＲＮＡは成熟ｍｉＲＮＡからなる。
【００６４】
本発明の組成物の実施態様において、該マイクロＲＮＡは成熟した：
ａ）配列番号２１、２２若しくは２３からなる群より選択された配列、又は配列番号２１、２２若しくは２３の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−９２ａ；
ｂ）配列番号２４若しくは２５からなる群より選択された配列、又は配列番号２４若しくは２５の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−９２ｂ；
ｃ）配列番号２６若しくは２７からなる群より選択された配列、又は配列番号２６若しくは２７の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１７；
ｄ）配列番号２８若しくは２９からなる群より選択された配列、又は配列番号２８若しくは２９の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−５０３；
ｅ）配列番号３０、３１若しくは３２からなる群より選択された配列、又は配列番号３０、３１若しくは３２の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１６；
ｆ）配列番号３３、３４、３５、３６、３７若しくは３８からなる群より選択された配列、又は配列番号３３、３４、３５、３６、３７若しくは３８の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−３７４；
ｇ）配列番号３９、４０、４１若しくは４２からなる群より選択された配列、又は配列番号３９、４０、４１若しくは４２の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−２４；
ｈ）配列番号４３若しくは４４からなる群より選択された配列、又は配列番号４３若しくは４４の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−４８３；
ｉ）配列番号４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０からなる群より選択された配列、又は配列番号４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−３４；
ｊ）配列番号５１、５２、５３若しくは５４からなる群より選択された配列、又は配列番号５１、５２、５３若しくは５４の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−２０；
ｋ）配列番号５５、５６、５７若しくは５８からなる群より選択された配列、又は配列番号５５、５６、５７若しくは５８の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１５
からなる。
【００６５】
本発明の組成物の別の実施態様において、該ｍｉＲ−９２ａは、配列番号２１の配列、又は配列番号２１に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、成熟したｍｉＲ−９２ａからなる。
【００６６】
本発明の組成物の別の実施態様において、該ｍｉＲ−９２ａは、配列番号２２の配列、又は配列番号２２に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、成熟したｍｉＲ−９２ａからなる。
【００６７】
本発明の組成物の別の実施態様において、該ｍｉＲ−９２ａは、配列番号２３の配列、又は配列番号２３に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、成熟したｍｉＲ−９２ａからなる。
【００６８】
本発明の意味において、２つの核酸配列間の「同一率」は、最適なアラインメント後に得られた、比較しようとする２つの配列間の同一ヌクレオチド残基の比率を意味し、この比率は純粋に統計学的であり、２つの配列間の差異はその長さに沿って無作為に分布している。２つの核酸配列の比較は、最適に配列をアラインさせた後にそれらを比較することによって伝統的に行なわれ、該比較は、区域によって又は「アラインメントウィンドウ」を使用することによって実施され得る。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業による比較に加えて、Smith及びWaterman（1981）の局所相同性アルゴリズムを用いて、Neddleman及びWunsch（1970）の局所相同性アルゴリズムを用いて、Pearson及びLipman (1988)の相同性探索法を用いて、又はこれらのアルゴリズムを使用したコンピューターソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison、WI、又は比較ソフトウェアBLAST NR若しくはBLAST Pによる）を用いて実施され得る。
【００６９】
２つの核酸配列間の同一率は、２つの最適にアラインさせた配列を比較することによって決定され、２つの配列間の最適なアラインメントのために、比較しようとする核酸配列はリファレンス配列と比較して付加又は欠失を有し得る。同一率は、ヌクレオチド残基が２つの配列間で、好ましくは２つの完全な配列間で同一である位置の数を決定し、同定された位置の数をアラインメントウィンドウの位置の総数で割り、結果に１００を乗じることにより、２つの配列間の同一率を得ることによって計算される。
【００７０】
本明細書に示されているように、リファレンス配列に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列は、該リファレンス配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のヌクレオチド同一性を有するものを包含する。
【００７１】
本発明の組成物の実施態様において、血管新生に関与する該ｍｉＲＮＡは、マイクロＲＮＡの前駆体からなる。
【００７２】
本発明の実施態様において、血管新生に関与する該マイクロＲＮＡ前駆体は、
ａ）配列番号１の配列又は配列番号１に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ａ−１；
ｂ）配列番号２の配列又は配列番号２に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ａ−２；
ｃ）配列番号３の配列又は配列番号３に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ｂ；
ｄ）配列番号４の配列又は配列番号４に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１７；
ｅ）配列番号５の配列又は配列番号５に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−５０３；
ｆ）配列番号６の配列又は配列番号６に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１６−１；
ｇ）配列番号７の配列又は配列番号７に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１６−２；
ｈ）配列番号８の配列又は配列番号８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ａ；
ｉ）配列番号９の配列又は配列番号９に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ｂ；
ｊ）配列番号１０の配列又は配列番号１０に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ｃ；
ｋ）配列番号１１の配列又は配列番号１１に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２４−１；
ｌ）配列番号１２の配列又は配列番号１２に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２４−２；
ｍ）配列番号１３の配列又は配列番号１３に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−４８３；
ｎ）配列番号１４の配列又は配列番号１４に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ａ；
ｏ）配列番号１５の配列又は配列番号１５に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ｂ；
ｐ）配列番号１６の配列又は配列番号１６に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ｃ；
ｑ）配列番号１７の配列又は配列番号１７に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２０ａ；
ｒ）配列番号１８の配列又は配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２０ｂ；
ｓ）配列番号１９の配列又は配列番号１９に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１５ａ；
ｔ）配列番号２０の配列又は配列番号２０に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１５ｂ
からなる。
【００７３】
一般的に言えば、阻害剤は、別の分子が反応に関与するのを抑制又は妨げる分子である。
【００７４】
本明細書において使用される「ｍｉＲ−Ｘ又はｍｉｒ−Ｘの阻害剤」という用語は、ｍｉＲ−Ｘ、又はｍｉｒ−Ｘ、又は少なくとも１つの前駆体の発現及び／又は活性を減少又は低減させる任意の分子又は化合物を指す。この阻害は、結果として、血管新生阻害を妨げ、すなわち、血管新生を促進し、よって、梗塞後の心筋の有害なリモデリングを予防する。
【００７５】
本発明の１つの実施態様において、血管新生に関与する所与の該マイクロＲＮＡ阻害剤は、所与の該マイクロＲＮＡに標的化された配列を有する８〜４９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、該マイクロＲＮＡは、好ましくは、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体を含む群から選択される。
【００７６】
別の実施態様において、該ｍｉＲ−９２ａ阻害剤は、該ｍｉＲ−９２ａに標的化された配列を有する８〜４９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
【００７７】
「に標的化された」という表現は、標的核酸にハイブリダイズして所望の効果を誘導することを可能とするヌクレオチド配列を有することを意味する。特定の実施態様において、所望の効果は、標的核酸の低減及び／又は阻害である。
【００７８】
「ハイブリダイズ」は、「ヌクレオチド相補性」を通して起こる相補的核酸のアニーリングを意味し、すなわち、２つのヌクレオチドが水素結合を介して非共有結合的に対を形成することができることを意味する。
【００７９】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲＮＡ阻害剤のオリゴヌクレオチドは、８〜４９ヌクレオチド長である。
【００８０】
当業者は、これは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８若しくは４９ヌクレオチド長、又はその中の任意の範囲のオリゴヌクレオチドを例示することを理解しているだろう。いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１０〜２０ヌクレオチド長である。当業者は、これは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチド長、又はその中の任意の範囲のオリゴヌクレオチドを例示することを理解しているだろう。
【００８１】
特定の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に対して相補的である配列を有する。
【００８２】
本発明の組成物の１つの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、血管新生に関与する標的ｍｉＲＮＡの配列に対して少なくとも部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該標的ｍｉＲＮＡは、優先的には、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、又はその前駆体から選択される。
【００８３】
本発明の組成物の別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−９２ａの配列に対して少なくとも部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００８４】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という表現は、特定のヌクレオチド配列（センス配列と呼ばれる）に対して相補的であるヌクレオチド配列を有し、センス配列とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを指す。
【００８５】
「相補性」は、第一核酸と第二核酸との間にヌクレオチド対を形成することができることを意味する。
【００８６】
特定の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ又はその前駆体に対して相補的であるヌクレオチド配列を有し、このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ又はその前駆体の相補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、或いは、２つの配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。従って、特定の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、その標的マイクロＲＮＡ又は前駆配列に関して１つ以上のミスマッチした塩基対を有し得、その標的配列にハイブリダイズすることができる。特定の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ又はその前駆体に対して完全に相補的である配列を有し、このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、マイクロＲＮＡ又はその前駆体の相補体に対して１００％同一であることを意味する。
【００８７】
本発明の脈絡において、「相補性」は、ｍｉＲ−９２ａ又はその前駆体のヌクレオチド配列の相補体に対して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９ヌクレオチドの領域におよび、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味するか、或いは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００８８】
「相補率」は、核酸中の相補的ヌクレオチドの数を、核酸の長さで割ったものを意味する。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドの相補率は、標的核酸に対して相補的であるヌクレオチドの数を、オリゴヌクレオチドの長さで割ったものを意味する。
【００８９】
１つの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、血管新生に関与する標的マイクロＲＮＡの配列に対して「完全に相補的」であり、優先的には、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、より優先的にはｍｉＲ−９２ａ、又はその前駆体を含む群から選択され、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、標的マイクロＲＮＡ又はその前駆体における各々の対応する位置のヌクレオチドと対を形成できることを意味する。
【００９０】
特定の実施態様において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）配列番号２１、２２若しくは２３からなる群より選択された配列、又は配列番号２１、２２若しくは２３の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−９２ａ；
ｂ）配列番号２４若しくは２５からなる群より選択された配列、又は配列番号２４若しくは２５の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−９２ｂ；
ｃ）配列番号２６若しくは２７からなる群より選択された配列、又は配列番号２６若しくは２７の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１７；
ｄ）配列番号２８若しくは２９からなる群より選択された配列、又は配列番号２８若しくは２９の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−５０３；
ｅ）配列番号３０、３１若しくは３２からなる群より選択された配列、又は配列番号３０、３１若しくは３２の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１６；
ｆ）配列番号３３、３４、３５、３６、３７若しくは３８からなる群より選択された配列、又は配列番号３３、３４、３５、３６、３７若しくは３８の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−３７４；
ｇ）配列番号３９、４０、４１若しくは４２からなる群より選択された配列、又は配列番号３９、４０、４１若しくは４２の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−２４；
ｈ）配列番号４３若しくは４４からなる群より選択された配列、又は配列番号４３若しくは４４の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−４８３；
ｉ）配列番号４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０からなる群より選択された配列、又は配列番号４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−３４；
ｊ）配列番号５１、５２、５３若しくは５４からなる群より選択された配列、又は配列番号５１、５２、５３若しくは５４の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−２０；
ｋ）配列番号５５、５６、５７若しくは５８からなる群より選択された配列、又は配列番号５５、５６、５７若しくは５８の１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉＲ−１５
の配列に対して部分的に又は完全に相補的である配列を有する。
【００９１】
特定の実施態様において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）配列番号１の配列又は配列番号１に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ａ−１；
ｂ）配列番号２の配列又は配列番号２に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ａ−２；
ｃ）配列番号３の配列又は配列番号３に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−９２ｂ；
ｄ）配列番号４の配列又は配列番号４に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１７；
ｅ）配列番号５の配列又は配列番号５に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−５０３；
ｆ）配列番号６の配列又は配列番号６に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１６−１；
ｇ）配列番号７の配列又は配列番号７に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１６−２；
ｈ）配列番号８の配列又は配列番号８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ａ；
ｉ）配列番号９の配列又は配列番号９に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ｂ；
ｊ）配列番号１０の配列又は配列番号１０に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３７４ｃ；
ｋ）配列番号１１の配列又は配列番号１１に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２４−１；
ｌ）配列番号１２の配列又は配列番号１２に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２４−２；
ｍ）配列番号１３の配列又は配列番号１３に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−４８３；
ｎ）配列番号１４の配列又は配列番号１４に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ａ；
ｏ）配列番号１５の配列又は配列番号１５に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ｂ；
ｐ）配列番号１６の配列又は配列番号１６に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−３４ｃ；
ｑ）配列番号１７の配列又は配列番号１７に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２０ａ；
ｒ）配列番号１８の配列又は配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−２０ｂ；
ｓ）配列番号１９の配列又は配列番号１９に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１５ａ；及び
ｔ）配列番号２０の配列又は配列番号２０に対して少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する配列を含む、ｍｉｒ−１５ｂ
の配列に対して部分的に又は完全に相補的である配列を有する。
【００９２】
特定の実施態様において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｒ−９２ａ−１（配列番号１）の配列に対して部分的に相補的である配列を有する。
【００９３】
特定の実施態様において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｒ−９２ａ−１（配列番号１）の配列に対して完全に相補的である配列を有する。
【００９４】
特定の実施態様において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｒ−９２ａ−２（配列番号２）の配列に対して部分的に相補的である配列を有する。
【００９５】
特定の実施態様において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｒ−９２ａ−２（配列番号２）の配列に対して完全に相補的である配列を有する。
【００９６】
１つの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変された骨格を含む。このような骨格の例は、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、並びにアミド骨格によって提供される。
【００９７】
モルホリノオリゴヌクレオチドは荷電していない骨格を有し、ＤＮＡのデオキシリボース糖は６員環によって置換され、ホスホジエステル結合はホスホロジアミデート結合によって置換されている。モルホリノオリゴヌクレオチドは酵素的分解に対して抵抗性であり、リボヌクレアーゼＨを活性化することではなくむしろ、翻訳を停止することによって、又はプレｍＲＮＡスプライシングに干渉することによって、アンチセンス剤として機能するようである。
【００９８】
改変された骨格は、典型的には、ヌクレアーゼ抵抗性を増加させるために好ましい。改変された骨格はまた、改変されていない骨格と比較して標的配列に対するその変化した親和性のために好ましくあり得る。改変されていない骨格はＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。
【００９９】
別の適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変されたポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡをベースとした分子は、塩基対認識の点で真のＤＮＡ分子模倣体である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結された７Ｖ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、核酸塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結されている。
【０１００】
さらに適切な骨格は、モルホリノヌクレオチド類似体又は等価体を含み、リボース又はデオキシリボース糖は、６員環モルホリノ環によって置換されている。最も好ましいヌクレオチド類似体又は等価体は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、リボース又はデオキシリボース糖は、６員環モルホリノ環によって置換され、隣接するモルホリノ環間の陰イオン性ホスホジエステル結合は、非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置換されている。
【０１０１】
またさらなる実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合における架橋されていない酸素の１つの置換を含む。この改変は僅かに塩基対形成を不安定化させるが、ヌクレアーゼによる分解に対して有意な抵抗性を付与する。
【０１０２】
本発明のさらに適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’、３’及び／又は５’の位置において、−ＯＨ；−Ｆ；１つ以上のヘテロ原子（Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；−アミノキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；及び−ジメチルアミノエトキシエトキシ）によって割り込まれていてもよい、置換又は非置換の鎖状又は分岐状の低級（ＣＩ−ＣＩＯ）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、アリール、又はアラルキルなどで一置換又は二置換された１つ以上の糖部分を含む。
【０１０３】
糖部分は、ピラノース若しくはその誘導体、又はデオキシピラノース若しくはその誘導体、好ましくはリボース若しくはその誘導体、又はデオキシリボース若しくはその誘導体であり得る。このような好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸を含む。
【０１０４】
ＬＮＡは改変されたＲＮＡヌクレオチドであり、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’炭素と４’炭素とを接続する追加の橋を用いて改変されている。これは、塩基スタッキング及び事前構築を増強し、かつ熱に対する安定性を有意に増加させる。この橋は、リボースを３’−エンド構造コンフォメーションに「ロック」し、これはしばしばＡ型のＤＮＡ又はＲＮＡで見られる。本発明に使用されるＬＮＡヌクレオチドは、所望であればいつでもオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ塩基と混合させることができる。
【０１０５】
本発明によると、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、小分子ＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、ＬＮＡ、ＣＤＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノオリゴヌクレオチド、又はその組合せからなる群より選択される。
【０１０６】
別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒからなり得る。
【０１０７】
本発明の組成物の好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドはアンタゴｍｉｒからなる。
【０１０８】
アンタゴｍｉｒは、内因性マイクロＲＮＡをサイレンスさせるために使用される化学的に工学操作されたオリゴヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、切断部位において不対合形成しているか又は切断を阻害するために何等かの塩基の修飾がなされた、特定のマイクロＲＮＡ標的に対して完全に相補的である、小分子合成ＲＮＡ又はＤＮＡである。通常、アンタゴｍｉｒは、分解に対してより抵抗性となり、細胞内部移行を促進させるために何等かの改変を有する。どのようにアンタゴｍｉｒ化が作動するのか（アンタゴｍｉｒがマイクロＲＮＡ活性を阻害する過程）は不明であるが、マイクロＲＮＡと不可逆的に結合することによって阻害すると考えられている。アンタゴｍｉｒは、特定のマイクロＲＮＡの活性を構成的に阻害するために使用される。
【０１０９】
本発明の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、マイクロＲＮＡ又はその前駆体に対して相補的である少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、該マイクロＲＮＡは、配列番号１〜５８からなる群より選択された配列を有する。
【０１１０】
本発明の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、配列番号１、２又は３からなる群より選択された配列のｍｉｒ−９２ａに対して相補的である少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
本発明の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、配列番号２１、２２又は２３からなる群より選択された配列のｍｉＲ−９２ａに対して相補的である少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
別の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、配列番号２１の配列のヌクレオチドに対して相補的である少なくとも１６個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
本発明の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、ＤＮＡ骨格を有する。
【０１１４】
本発明の組成物の該実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、配列番号５９の配列、及びその塩基置換を除く改変物、並びに配列番号５９の少なくとも８個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントを含む。
【０１１５】
本発明の別の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、ＲＮＡ骨格を有する。
【０１１６】
本発明の組成物の該実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、配列番号６０の配列、及びその塩基置換を除く改変物、並びに配列番号６０の少なくとも８個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントを含む。
【０１１７】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも８個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１１８】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも９個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１１９】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも１０個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１２０】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも１１個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１２１】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも１２個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１２２】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも１３個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１２３】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも１４個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１２４】
１つの実施態様において、本発明によるアンタゴｍｉｒは、配列番号５９又は６０の少なくとも１５個連続したそのヌクレオチドの部分配列からなるフラグメントである。
【０１２５】
別の実施態様において、配列番号５９又は６０の配列の該アンタゴｍｉｒは、隣接ヌクレオチド間のホスホチオエート結合（群）による少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個の改変されたヌクレオチド（群）を提示する。
【０１２６】
本発明の他の実施態様において、該アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、コレステロール基、又は任意の類似した若しくは等価な修飾を含み得る。
【０１２７】
一般的に、核酸、ペプチド及びタンパク質を含有する医薬製剤が経口的に又は非経口的に投与されるならば、それは体内の酵素によって分解され、医薬製剤の効力は急速に消失する。この問題を克服するために様々な試みがなされてきた。その１つは、長時間持続放出注射液の製剤化である。
【０１２８】
実際には、マイクロＲＮＡの選択的投与のためのシステムとしてのステントの使用に関する研究が行なわれている。しかしながら、ステントの急速な内皮細胞増殖は、マイクロＲＮＡの持続的な放出に関して、特に長期の遺伝子調節を必要とする生物学的過程についての問題を提起し得る。さらに、リポソーム及びナノ粒子が開発されインビボで使用されているが、重篤な副作用のリスクを伴う循環系への通過は回避されていない。さらに、事前の大動脈クランプを用いることなく経皮的な冠内への投与後に効力及び安全性を実証した研究は全くない。
【０１２９】
本発明の別の態様は、生分解性かつ生体適合性のミクロスフィアの使用に基づく。
【０１３０】
本発明によると、生体適合性で生分解性の高分子を用いて該オリゴヌクレオチドをマイクロカプセル化することに基づいた、心臓領域への該オリゴヌクレオチドの局所放出に適した放出システムが設計及び製造された。本発明は、高いカプセル化効率を有し、分子の改変／分解を伴うことのない、オリゴヌクレオチドが実質的に積載されたミクロスフィアを得ることを可能とする。本発明によると、分子の純度及び品質は、安定化剤又は保持物質のいずれもを加えることなく、使用される製造条件、特に作製されたエマルションの特徴、高分子溶液の濃度、及びマイクロカプセル化過程に関与する相の容量間の関連のお蔭で保たれている。さらに、ミクロスフィアは、動脈塞栓を引き起こすことなく、かつマクロファージの食作用によって破壊されることなく、梗塞領域の微小血管に保持されることを可能とする適切な粒径分布を有する。
【０１３１】
本発明の目的は、短鎖デオキシリボ核酸又は短鎖リボ核酸を安定にカプセル化し、かつ長期間におよび、特定のタンパク質、特にその阻害が疾病に関連するタンパク質の発現の阻害を阻害することのできる、持続放出ミクロスフィアを提供することである。
【０１３２】
一般的に言えば、「生体適合性」は、生きている細胞、組織、臓器、又は系と適合性であり、損傷、毒性、又は免疫系による拒絶のリスクを全く課さないことを意味する。生体適合性ミクロスフィアは、該ミクロスフィア、及びミクロスフィアのあらゆる分解産物が、レシピエントに対して無毒性であり、また、レシピエントの生体に対して有意な有害な又は望ましくない作用、例えば、注射部位における免疫反応を呈さないことを意味する。
【０１３３】
一般的に言えば、「生分解性」は、生物由来物質の作用によって分解され得ることを意味する。
【０１３４】
本明細書において定義される生分解性ミクロスフィアは、ミクロスフィアがインビボにおいて分解又は腐食してより小さな化学種を形成することを意味する。分解は、例えば、酵素的、化学的、及び／又は物理学的過程によってもたらされ得る。
【０１３５】
適切な生体適合性で生分解性の高分子としては、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ酸無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリアセチル、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルの共重合体、生分解性ポリウレタン、そのブレンド及び共重合体が挙げられる。
【０１３６】
微粒子を生成するための多くの技術が先行技術に記載されている。
【０１３７】
微粒子の薬物放出プロファイルは、使用される高分子の物理化学的特性、高分子−薬物−賦形剤間の相互作用、並びに／又は生じた微粒子の形態及び組成を含む、数多くの因子に依存する。
【０１３８】
ミクロスフィアが心筋毛細血管によって保持されるためには、一方でマクロファージによる食作用を通してのその破壊、又は他方では動脈の塞栓化が最小限となるように、それらは非常に特定のサイズ分布を有していなければならず；生分解性で生体適合性の高分子を使用したマイクロカプセル化は、ＡＭＩ後の心室リモデリングが起こる主要な期間である最初の数時間から２〜３週間まで製品の制御された放出を可能とする。
【０１３９】
本発明の脈絡において、冠内経路が好ましいので、これらのミクロスフィアの平均サイズは、心筋毛細血管のサイズを考慮に入れ；これは、心臓領域で保持されるには５〜２０、優先的には５〜１５μmまで変動し、動脈塞栓化を防ぐために２５μmを超える粒子は存在しない。
【０１４０】
本発明の１つの実施態様において、該ミクロスフィアは、２５μmを超えない直径を提示している。
【０１４１】
１つの実施態様において、ミクロスフィアの５０〜１００％が、５〜２５μmの範囲に含まれ、２５μmを超える粒子は存在しない。
【０１４２】
好ましい実施態様において、ミクロスフィアの６０〜１００％が５〜２５μmの範囲に含まれ、２５μmを超える粒子は存在しない。
【０１４３】
別の好ましい実施態様において、ミクロスフィアの７０〜１００％が５〜２５μmの範囲に含まれ、２５μmを超える粒子は存在しない。
【０１４４】
より好ましい実施態様において、ミクロスフィアの８０〜１００％が５〜２５μmの範囲に含まれ、２５μmを超える粒子は存在しない。
【０１４５】
本発明によると、ミクロスフィアの平均直径は、５〜２０μmの範囲内である。
【０１４６】
本発明によると、ミクロスフィアの平均直径は、５〜１５μmの範囲内である。
【０１４７】
代替的な実施態様において、該ミクロスフィアは、８〜１１μmの平均直径を提示している。
【０１４８】
本発明によるミクロスフィアは、梗塞領域に薬物を持続放出するために、生分解性かつ生体適合性の高分子中に多量の該マイクロＲＮＡ阻害剤を積載している。
【０１４９】
積載されているマイクロＲＮＡ阻害剤は、約１〜２０％（w/w）、好ましくは１〜１５％（w/w）、より好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは５〜１０％である。薬物の完全性は保存されている。
【０１５０】
１つの実施態様において、本発明によるミクロスフィアは、１％〜１５％w/wの阻害剤を取り込んでいる。
【０１５１】
別の実施態様において、本発明によるミクロスフィアは、５％〜１５％w/wの阻害剤を取り込んでいる。
【０１５２】
さらに別の実施態様において、本発明によるミクロスフィアは、１％〜１０％、好ましくは５％〜１０％w/wの阻害剤を取り込んでいる。
【０１５３】
本発明の別の特徴は、ミクロスフィアの生成に使用される高分子の性質に関する。
【０１５４】
本発明の実施態様において、該ミクロスフィアは、ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）からなる高分子でできている。１つの実施態様において、該ミクロスフィアは、唯一の高分子としてのＰＬＡでできている。１つの実施態様において、該ミクロスフィアは、１つ以上の他の生体適合性高分子とブレンドされたＰＬＡでできている。
【０１５５】
本発明の別の実施態様において、該ミクロスフィアは、ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）からなる共重合体でできている。１つの実施態様において、該ミクロスフィアは、唯一の高分子としてのＰＬＧＡでできている。１つの実施態様において、該ミクロスフィアは、１つ以上の他の生体適合性高分子とブレンドされたＰＬＧＡでできている。
【０１５６】
さらに別の本発明の実施態様において、該ミクロスフィアは、ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）及びポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）からなる高分子ブレンドでできている。
【０１５７】
「ブレンド」という表現によって、２つ以上の高分子の混合物を同じ有機溶媒に溶解する前に、該混合物が具現されると理解されなければならない。
【０１５８】
当業者は、ＰＬＧＡ共重合体とは対照的に、ＰＬＡ高分子中のラクチド：グリコリドの比は、１００：０のモル比であることを容易に理解するだろう。
【０１５９】
ＰＬＧＡ共重合体に関して、ＰＬＧＡ高分子中のラクチド：グリコリドの比は５０：５０から９５：５のモル比である。
【０１６０】
好ましい実施態様において、ＰＬＧＡ共重合体中のラクチド：グリコリドの比は、５０：５０から９０：１０のモル比、優先的には５０：５０から８０：２０のモル比である。
【０１６１】
本発明の実施態様において、高分子の固有粘度は、０．１〜０．７dl/gである。
【０１６２】
好ましい実施態様において、高分子の固有粘度は０．１５〜０．７dl/g、優先的には０．１５〜０．５dl/gである。
【０１６３】
この態様は、固有粘度が高分子分子量に関連し、それ故、高分子ミクロスフィアからの阻害剤の放出速度に影響を及ぼすという意味において興味深い。
【０１６４】
従って、本発明の目的はまた、全く補助剤を含まず、高分子組成物に関して単一の粒子集団からなる、マイクロカプセル化されたｍｉＲ−９２ａ阻害剤を生成するための方法を提供することである。
【０１６５】
従って、本発明の別の態様は、（ａ）安定化剤を全く含まない精製水中にマイクロＲＮＡ阻害剤を溶解し、（ｂ）高分子を有機溶媒中に溶解し、（ｃ）（ａ）を（ｂ）に加えて第一エマルションを生成し、（ｄ）工程（ｃ）のエマルションを、界面活性剤及び浸透圧剤を含有する水溶液に加えて、第二エマルションを生成し、（ｅ）得られた工程（ｄ）のミクロスフィアを硬化及び収集し、並びに（ｆ）乾燥させることを含む、高分子ミクロスフィア中にマイクロＲＮＡ阻害剤をマイクロカプセル化するための方法である。
【０１６６】
より特定すると、本発明はまた、上記のような組成物を生成するための方法に関し、それは、以下の工程：
ａ）安定化剤を全く含まない精製水中にｍｉＲＮＡ阻害剤を溶解し、
ｂ）高分子を有機溶媒中に溶解し、
ｃ）（ａ）を（ｂ）に加えて第一エマルションを生成し、
ｄ）工程（ｃ）のエマルションを、界面活性剤及び浸透圧剤を含有する水溶液に加えて、第二エマルションを生成し、並びに
ｅ）得られた工程（ｄ）のミクロスフィアを硬化及び収集し、並びに
ｆ）得られたミクロスフィアを乾燥させること
を含むことを特徴とする。
【０１６７】
本発明の別の態様は、心筋梗塞の処置における本発明による組成物の使用に関する。
【０１６８】
換言すれば、本発明は、マイクロＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は、心筋梗塞の処置に使用するために生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。
【０１６９】
好ましい実施態様において、該心筋梗塞は、急性心筋梗塞からなる。
【０１７０】
本発明のさらに別の態様は、被験者に前記のような有効量の組成物を投与することを含む、それを必要とする被験者における心室リモデリングを元に戻す又は予防する方法に関する。
【０１７１】
換言すれば、本発明は、マイクロＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも１つの阻害剤の有効量を含む組成物に関し、該阻害剤は、それを必要とする被験者における心室リモデリングを元に戻す又は予防する方法に使用するための生分解性かつ生体適合性の高分子ミクロスフィアにマイクロカプセル化されている。
【０１７２】
すでに記載されているように、本発明による組成物は、冠内経路による投与に適している。
【０１７３】
冠内経路による投与のために、ミクロスフィアは、静脈内投与のために適切なビヒクルに、界面活性剤を含む又は含まない食塩水溶液（ＰＢＳ）に、又は別の適切なビヒクルに懸濁されなければならない。適切な分散剤としては、例えば、界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、カルボキシメチルセルロース、又は多糖、例えばアルギン酸ナトリウムが挙げられ、等張化剤、例えば塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール又はグルコースを加えることも可能である。冠動脈のサイズを考慮して、血流の変化を制限しかつ動脈塞栓化のリスクを防ぐために、投与媒体中のミクロスフィアの濃度を調整する。この濃度は０．０５％から１％、好ましくは０．１％から０．５％まで変動し得る。投与は単回注射又は反復注射であり得、その後、場合により食塩水を注射し得る。投与は、同じカテーテルを使用して経皮的冠動脈血管形成術後（これに制限されない）に実施され得る。
【０１７４】
本発明の方法は、該投与が冠内経路による投与からなることを特徴とする。
【０１７５】
この態様は、アンタゴｍｉｒのようなオリゴヌクレオチドなどの化合物の直接的な静脈内投与に関するいくつかの予め推定された制約に対処するので特に興味深い。他の予め推定された制約の中には、ｉ）ｍｉＲＮＡの遍在性及び低い臓器特異性に起因する低レベルの生物学的安全性、ｉｉ）マイクロＲＮＡ阻害剤がその効果を生じるための高用量及び反復注射、並びにｉｉｉ）計算された静脈内投与量の理論的に高い費用が言及され得る。
【０１７６】
驚くべきことには、以下の実施例を読んだ後には明らかであろうが、全てのこれらの問題は、本発明によって対処される。
【０１７７】
より特定すると、
ａ）患部組織に供給している動脈にカプセル化アンタゴｍｉｒを選択的に投与することが可能である（実施例５参照）；
ｂ）ミクロスフィアは冠動脈に保持される（実施例６参照）、
ｃ）ミクロスフィアの動脈内投与は腫瘍塞栓化のために使用され、場合により活性な放出物質と組み合わせて恒久的な血流の妨害及び腫瘍進行の阻止を可能とする。これらの要素を考慮して、塞栓化のリスクの存在が考えられた。この理由のために、ミクロスフィアは心筋に全く傷害を引き起こさないか、又は冠動脈流速に有意な変化を全く生じないことを確認する目的で研究が設計された（実施例７参照）、
ｄ）ビヒクル中のマイクロＲＮＡ阻害剤の良好な安定性及びミクロスフィアからの該阻害剤の持続的な放出；これは、それが投与された１０日後までマイクロＲＮＡを阻害するという、その生物学的効果によって実証される（実施例８）、
ｅ）ｍｉＲＮＡ阻害剤を含むミクロスフィアの投与は、傷害組織の収縮力の回復を促進し、かつ有害な梗塞後のリモデリングの発生を予防する（実施例９参照）、
ｆ）ミクロスフィアが局所的に投与されるので、阻害剤の用量は１回の注射に低減させることができ、これにより起こり得る副作用の有意な低減及び費用の明らかな低減が推定されることが実証される。
【０１７８】
本発明によるマイクロＲＮＡ阻害剤の制御された投与、送達及び放出のための適切なビヒクル／システムを入手できることは、以下の利点を有する：
−  処置標的ではない組織及び臓器による薬物の体内分布は制限されるので、増強された生物学的安全性
−  反復静脈内注射の回避は、ｉ）患者の支援の質を増強させることによって、入院及び外来患者の通院を減少させ、ｉｉ）薬物投与のために長期に静脈注射をする必要性、並びに、これから生じる潜在的なリスクを回避し、及びｉｉｉ）製品の静脈内投与に固有のリスク（感染、局所反応など）を最小限にする
−  投与量の減量は、関連した用量依存的な有害作用の低減を可能とする
−  必要とされる投与量並びに反復注射のために必要とされる人員及び装置の低減に因る費用の低減。
【０１７９】
別の実施態様において、本発明は、心筋梗塞後の心室リモデリングの治療又は予防に使用するための生分解性かつ生体適合性のミクロスフィア集団に関し、該ミクロスフィアは、
−  ５〜１５μmの平均直径を有し；
−  ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）；ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）又はそのブレンドから作られ；
−  心室リモデリングを予防することができる１％〜１０％w/wの治療剤を取り込んでおり、
該治療剤は、血管新生に関与するマイクロＲＮＡ、優先的には、ｍｉＲ−９２（ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−２及びｍｉＲ−９２ｂを含む）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１６−２を含む）、ｍｉＲ−３７４（ｍｉＲ−３７４ａ、ｍｉＲ−３７４ｂ及びｍｉＲ−３７４ｃを含む）、ｍｉＲ−２４（ｍｉＲ−２４−１及びｍｉＲ−２４−２を含む）、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃを含む）、ｍｉＲ−２０（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２０ｂを含む）、ｍｉＲ−１５（ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１５ｂを含む）、より優先的にはｍｉＲ−９２ａ、又はその前駆体からなる群より選択されたマイクロＲＮＡの阻害剤からなり、該マイクロＲＮＡ阻害剤は優先的にはアンタゴｍｉｒである。
【０１８０】
本発明はまた、少なくともｉ）本発明による組成物及び／又はミクロスフィア、並びにｉｉ）該組成物が配置されたシリンジ又はバイアル又はアンプルを含む、キットに関する。
【０１８１】
１つの実施態様において、本発明のキットはさらに、溶媒容器に配置された溶媒を含む。溶媒容器は、バイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジであり得る。
【０１８２】
ミクロスフィア及び溶媒は、ダブルコンパートメントのプレフィルドシリンジに配置されていてもよい。
【０１８３】
１つの実施態様において、本発明のキットは、バイアル中にミクロスフィア及び別のバイアル中に溶媒を含んでいてもよい。
【０１８４】
１つの実施態様において、本発明のキットは、バイアル中にミクロスフィア及び別のアンプル中に溶媒を含んでいてもよい。
【０１８５】
１つの実施態様において、本発明のキットは、バイアル中にミクロスフィア及びプレフィルドシリンジ中に溶媒を含んでいてもよい。
【０１８６】
１つの実施態様において、本発明のキットは、プレフィルドシリンジ中にミクロスフィア及び別のバイアル中に溶媒を含んでいてもよい。
【０１８７】
１つの実施態様において、本発明のキットは、プレフィルドシリンジ中にミクロスフィア及び別のアンプル中に溶媒を含んでいてもよい。
【０１８８】
１つの実施態様において、本発明のキットは、ダブルコンパートメントシリンジ中に別々にミクロスフィア及び溶媒を含んでいてもよい。
【０１８９】
本発明は、以下の実施例に関してより良く理解されるだろう。
【０１９０】
実施例１：アンタゴｍｉｒ−９２ａの積載されたミクロスフィアの調製
ミクロスフィアは、遊離カルボキシル末端基を含む、約０．２dL/gの固有粘度の５０：５０のＰＬＧＡ共重合体を使用してw/o/wエマルション／溶媒蒸発法によって調製された。塩化メチレン ３mlを、ＰＬＧＡ ０．６ｇに加えた。精製水中のアンタゴｍｉｒ−９２ａ（Ｉ−Ｓｓｃ−ｍｉＲ−９２ａ；分子量：５３６６g/mol（Ｄａとも称される）；配列：CCGGGACAAGTGCAAT；ＤＮＡ塩基：９；ＬＮＡ塩基：７；製造者：ＩＤＴ（Exiqon））の濃縮溶液（２２２mg/ml）０．３mlをＰＬＧＡ有機溶液に加え、２０秒間の超音波処理によって乳化させた。この一次エマルションを、１％（w/v）ポリビニルアルコール及び１％（w/v）塩化ナトリウムの水溶液からなる外相に加え、約１０３００rpmで６０秒間ホモジナイズした。得られた第二エマルション（w/o/w）を、ある容量の精製水に加え、塩化メチレンを撹拌によって蒸発させた。得られたミクロスフィアを遠心分離によって回収し、精製水で２回洗浄し、その後、凍結乾燥させた。ミクロスフィアの平均直径は９μmであったが（５〜２５μmが８２％、２５μmを超えるのは０％）、カプセル化効率は７４％であった。
【０１９１】
得られたミクロスフィアの写真を図１に提示する。
【０１９２】
図２は、ミクロスフィアのサイズ分布を示す。
【０１９３】
実施例２：ＲＮＡの積載されたミクロスフィアの調製
ミクロスフィアは、遊離カルボキシル末端基を含む、約０．２dL/gの固有粘度の５０：５０のＰＬＧＡ共重合体を使用してw/o/wエマルション／溶媒蒸発法によって調製された。塩化メチレン ３mlを、ＰＬＧＡ ０．６ｇに加えた。リボヌクレアーゼを含まない精製水中のＲＮＡ（RNA Sigma 5000-10000Da）の濃縮溶液（２２２mg/ml）０．３mlをＰＬＧＡ有機溶液に加え、２０秒間の超音波処理によって乳化させた。この一次エマルションを、１％（w/v）ポリビニルアルコール及び５％（w/v）マンニトールのリボヌクレアーゼを含まない水溶液からなる外相に加え、約１０３００rpmで６０秒間ホモジナイズした。得られた第二エマルション（w/o/w）をリボヌクレアーゼを含まないある容量の精製水に加え、塩化メチレンを撹拌によって蒸発させた。得られたミクロスフィアを遠心分離によって回収し、リボヌクレアーゼを含まない精製水で２回洗浄し、その後、凍結乾燥させた。ミクロスフィアの平均直径は１０μmであったが（５〜２５μmが８６％、２５μmを超えるのは０％）、カプセル化効率は７３％であった。
【０１９４】
実施例３：プラセボミクロスフィアの調製
ミクロスフィアは、遊離カルボキシル末端基を含む、約０．２dL/gの固有粘度の５０：５０のＰＬＧＡ共重合体を使用してw/o/wエマルション／溶媒蒸発法によって調製された。塩化メチレン ３mlを、ＰＬＧＡ ０．６ｇに加えた。精製水 ０．３mlをＰＬＧＡ有機溶液に加え、２０秒間の超音波処理によって乳化させた。この一次エマルションを、１％（w/v）ポリビニルアルコール及び１％（w/v）塩化ナトリウムの水溶液からなる外相に加え、約１０３００rpmで６０秒間ホモジナイズした。得られた第二エマルション（w/o/w）をある容量の精製水に加え、塩化メチレンを撹拌によって蒸発させた。得られたミクロスフィアを遠心分離によって回収し、精製水で２回洗浄し、その後、凍結乾燥させた。ミクロスフィアの平均直径は７μmであった（５〜２５μmが８４％、２５μmを超えるのは０％）。
【０１９５】
実施例４：アルブミンフルオレセインイソチオシアネートの積載されたミクロスフィアの調製
ミクロスフィアは、遊離カルボキシル末端基を含む、約０．２dL/gの固有粘度の５０：５０のＰＬＧＡ共重合体を使用してw/o/wエマルション／溶媒蒸発法によって調製された。塩化メチレン １mlを、ＰＬＧＡ ０．２ｇに加えた。アルブミンフルオレセインイソチオシアネート水溶液（２０mg/ml）０．１mlをＰＬＧＡ有機溶液に加え、１５秒間の超音波処理によって乳化させた。この一次エマルションを、１％（w/v）ポリビニルアルコール及び１％（w/v）の水溶液からなる外相に加え、約１０３００rpmで６０秒間ホモジナイズした。得られた第二エマルション（w/o/w）をある容量の精製水に加え、塩化メチレンを撹拌によって蒸発させた。得られたミクロスフィアを遠心分離によって回収し、精製水で２回洗浄し、その後、凍結乾燥させた。ミクロスフィアの平均直径は９μmであった（５〜２５μmが９１％、２５μmを超えるのは０％）。
【０１９６】
実施例５：標的組織に供給している動脈への選択的投与の試験
ラージホワイトブタにおいてＡＭＩをトリガーした後、実施例４に示されているように調製されたフルオレセインアルブミンを含有するミクロスフィア ３０mgを、梗塞領域に供給するＡＭＩに関与する動脈に配置された２．５/１２コアクシャルバルーンを用いて冠内経路によって投与した。ミクロスフィアを、インサイツで、Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する通常の食塩水溶液 １０mlに懸濁し、２回の５mlの連続注射、各々続いて正常食塩水溶液 ５mlの投与が実施された。実験は、カプセル化アンタゴｍｉｒが、患部組織に供給する動脈に選択的に投与され得ることを示した。
【０１９７】
実施例６：血流への流出を許容することなく、患部組織の毛細血管におけるミクロスフィアの保持の試験
ブタモデルにおいて、４回の実験が、前下行枝中間部に配置されたコアクシャルバルーンを通した冠内経路によって、実施例４に従って調製された蛍光ミクロスフィア各 ５mlの２回の注射を投与することによって実施された。４匹の動物を安楽死させ、前下行枝に隣接している組織、及び他の冠動脈によって潅注された対照組織の心筋試料を得た。試料を、光学蛍光顕微鏡を通して観察し、傷害された心筋の毛細血管に保持されたミクロスフィアの存在、並びに、対照組織におけるその不在が実証された。
【０１９８】
全身体内分布を排除するために、以前の２匹の動物において、虚血心筋組織及び対照心筋組織の他に、肺、脾臓及び肝臓から５つの同型試料を得、光Ｂを用いて光学顕微鏡によって可視化した。蛍光は、前壁心筋に排他的に検出された。この分析は、ミクロスフィアが、アンタゴｍｉｒ９２ａの全身的な放出を避けて心臓に保持されることを明らかとした（副作用の低減）。
【０１９９】
実施例７：標的組織それ自体に傷害を及ぼすことなく、患部組織の毛細血管におけるミクロスフィアの保持の試験
潜在的な局所的心毒性及び投与量の治療安全範囲を調べるために実験を実施した。心筋への局所的な虚血傷害を検出するために、虚血を検出するその能力において非常に感度の高い２対のピエゾ・エレクトリック・クリスタルを使用した。心筋組織が虚血に罹れば、残りの組織は運動障害となり肥大し；これは、残りの近接した健康組織によって生じる血圧と共に、微結晶の分離を引き起こし、互いにさらに離れる。開胸術及び心膜切除術を実施した後の２匹のブタにおいて、２対の微結晶を挿入し、１つの対照の対は側面領域に、１つの対は、前下行枝（これを通してミクロスフィアを投与した）によって供給される前側領域にであった。各対の媒体結晶についての、心周期の間の２点におけるそれらの間の距離を測定した：拡張終期（ＥＤＬ）及び収縮末期（ＥＳＬ）。ＥＤＬとＥＳＬとの間の関連は、パラメーターＳＳ（収縮期短縮）：（ＥＤＬ−ＥＳＬ）／ＥＤＬによって表現される。左心室収縮が完全に消失すれば、ＥＤＬ＝ＥＳＬ及びＳＳ＝０である。正常値は０．２±０．１の範囲である。添付されている図解に示されているように、数秒間続く各注射後の最小かつ一過性の周期的変動が、１回目及び２回目の注射に相当する試験投与量を用いて誘導された。さらにかつ驚くべきことに、実施例４に従って調製された蛍光ミクロスフィアの、１４回の試験投与量に達する反復冠内注射により局所的な副作用は全く観察されなかった。限界最大用量には、不可逆的な虚血傷害、血行動態の反動、又は不整脈を全く伴わなかった。
【０２００】
さらに、冠血流の変化を検出するために、フローセンサを、冠血流を測定する左前下行枝の中間部に配置した。冠内注射後に冠血流の有意な変化は全く観察されなかった。
【０２０１】
結果は図３（ミクロスフィア １２０mgを注射した）及び図４（ミクロスフィア ２４０mgを注射した）によって示される。
【０２０２】
実施例８：少量のアンタゴｍｉｒ投与量を含むミクロスフィアの１回の冠内注射の分子効果の試験
少量の投与量のマイクロカプセル化アンタゴｍｉｒが分子応答を生じ得るかを実証するために、虚血組織及び対照組織におけるインビボでのｍｉＲ−９２ａの発現を、カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの冠内投与後に測定した。３匹のブタにおいて、実施例１に従って調製されたアンタゴｍｉｒ−９２ａを含有するミクロスフィア（０．１mg/Kg）６０mgを左冠動脈前下行枝に送達した。動物を、処置から１日目、３日目及び１０日目に安楽死させ、ｍｉＲ−９２ａ及び対照としての内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２３、２０３及び１２６）の発現を、２つの同型梗塞試料及び対照試料において、全ＲＮＡ単離及び特異的プライマーを使用したリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって定量した（図５参照）。
【０２０３】
梗塞組織においては、ｍｉＲ−９２ａの発現は、対照組織と比較して８倍ダウンレギュレートされたが、内因性ｍｉＲの発現は処置によって影響を受けなかった。阻害は、早くも１日目に存在し始め、１０日目にも依然として存在し、対照領域よりも５倍低い発現レベルであった。
【０２０４】
内因性ｍｉＲの有意な調節は検出されなかった。これらの結果は、ビヒクル／システムが、アンタゴｍｉｒ−９２ａの制御された送達及び放出を可能とするに適切な条件を提供し、これにより、１回の冠内投与によりマイクロＲＮＡ−９２ａの持続した阻害が生じることを明らかとする。
【０２０５】
図６に示されたこれらの結果はまた、アンタゴｍｉｒがミクロスフィア製造過程中に分解しないことを確認する。
【０２０６】
実施例９：低い投与量のアンタゴｍｉｒを含有するミクロスフィアの１回の冠内注射の生物学的効果の試験
ミクロスフィアにより輸送されたアンタゴｍｉｒ−９２ａの分子効果が生物学的効果を伴うかどうかを実証するために、前臨床試験が２６匹の成体ミニブタを用いて実施された。この試験の目的は、カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの選択的な冠内投与によるｍｉｒ−９２ａの阻害により、梗塞領域において血管新生の増強がもたらされ、従って、心室リモデリングの発生を予防するかどうかを調べることであった。
【０２０７】
３つの製剤が投与された：
−  食塩水溶液（対照製剤）
−  実施例３に従って調製されたプラセボミクロスフィア
−  １匹のミニブタあたり３mgという１つのアンタゴｍｉｒ用量の、実施例１に従って調製されたアンタゴｍｉｒ−９２ａミクロスフィア。
【０２０８】
処置から４週間後、壊死領域における有意により高い血管密度が、対照と比較して、カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａを受けた動物において検出され、これにより、以前の研究ｉｉ）血管密度（図７参照）において観察されたアンタゴｍｉｒ−９２ａの血管新生促進活性（１６１．５７±５８．７１、対、プラセボ群における６８．４９±２３．５６、対、食塩水群における７３．９１±２４．９７、ｐ＝０．００１）が確認された。
【０２０９】
微小血管は、梗塞帯域及び梗塞周囲の周縁部の両方において増加した。そのような処置された動物における低い微小血管抵抗性指数が一貫して実証され（２００．６７±１０４．４６、対、対照における５１１．７３±２０２．１、ｐ＝０．００７）、それは血管密度と有意に相関していた（Ｒ２０．４１、ｐ＝０．０２）（図８参照）。
【０２１０】
ベースライン微小循環抵抗（ベースラインＭＲ）及び真の微小循環抵抗（ＴＭＲ（ｈｙｐ））は、対照と比較して処置群において有意により低かった（それぞれ７．４７±１．３３対１９．６２±２．９８、ｐ＝０．００５及び５．０±１．１５対１４．４９±２．４、ｐ＝０．００６）。ベースライン及び真の微小循環抵抗は、血管密度と有意に相関していた（それぞれＲ２０．３５、ｐ＝０．０３３及びＲ２０．３１、ｐ＝０．０４７、図９参照）
【０２１１】
これらのデータは、カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａが持続した血管新生をインビボにおいて誘導することを示す。
【０２１２】
増殖血管を見出したので、それ故、ＡＭＩ後に起こる治癒過程におけるその潜在的な利点をさらに調べた。心室リモデリングに対するカプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を決定するために、処置群及び非処置群における、エクスビボにおける磁気共鳴画像法（ＣＭＲ）による形態学的及び構造学的パラメータ、並びに血管内心エコー（ＩＶＥ）によって分析される機能的パラメータを比較した。処置動物と比較して対照においてＩＶＥでは、前側及び心室中隔心尖部運動障害を有する有意により高い比率の動物が存在し（ｐ＝０．０３）（特に図１０参照）、また、エクスビボＣＭＲでは左心室において損傷された心室壁の有意により高度な菲薄化、及び有害なリモデリング形態計測変化が認められた（表３）。
【０２１３】
より特定すると、図１０は、血管内心エコー（ＩＶＥ）による局所壁運動機能障害の分析の結果を示す。ＩＶＥは、Vivid Q超音波造影機器（GE Healthcare, Belford, UK）及び右心室の心尖部に配置されたAcuNav 10F超音波カテーテル（Siemens）を使用することによって実施された。
【０２１４】
試験の結果は、アンタゴｍｉｒ−９２ａミクロスフィアの投与が、急性心筋梗塞後の有害リモデリングの統計学的に有意な減少に関連することを示す。
【０２１５】
【表３】
2016506923.tif 000005
【０２１６】
カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａは、急性心筋梗塞後から１か月後の有害な左心室リモデリングを予防する。各ミニブタにおけるエクスビボＣＭＲの全ての梗塞薄片において計算された種々のリモデリングパラメータが決定された。４匹のミニブタの代表的なＬ２薄片（Ｌ１は心尖部である）が示されている。Ｔ最大梗塞壁＝各薄片における最大梗塞壁厚のΣを罹患薄片の数で割ったものとして計算された最大梗塞壁厚平均値；Ｔ正常な後壁＝各々の罹患薄片における後壁厚のΣを罹患薄片の数で割ったものとして計算された後乳頭筋の挿入にちょうど沿って測定された正常な後壁厚平均値；［１００−（Ｔ最大梗塞壁／Ｔ正常な後壁×１００）］として計算された最小菲薄化の平均比率；Ｔ最小梗塞壁＝各々の罹患薄片における最小梗塞壁厚のΣを罹患薄片の数で割ったものとして計算された最小梗塞壁厚平均値；［１００−（Ｔ最小梗塞壁／Ｔ正常な後壁×１００）］として計算された最大菲薄化の平均比率；ＤＲ：各々の梗塞薄片における梗塞壁間の最大直径のΣを罹患薄片の数で割ったものとして計算された梗塞壁と反対側の正常壁との間の最大直径平均値；ＤＮ：各々の梗塞薄片における正常な壁間の最大直径のΣを罹患薄片の数で割ったものとして計算された、ＤＲと直角を形成し心室腔の中心に最も近く描かれた正常な壁間の最大直径平均値；ＤＲ／ＤＮ：各々の梗塞薄片のＤＲ／ＤＮのΣを罹患薄片の数で割ったものとして計算された真球度指数の平均値。表のデータは、平均値±標準誤差として表現される。
【０２１７】
代表的なＣＭＲの結果は以下を示す：
Ａ：１４匹のミニブタの心臓ＮＭＲ及びＩＶＥ（ＡＭＩ誘発直後の死滅）：ＡＭＩ直後の死滅の発生のために、リモデリング過程がトリガーされる十分な時間がなかった。これは、求心性左心室が全ての区域において類似の寸法を有することが見られた理由である。
Ｂ：ＡＭＩの２０〜３０日後のミニブタの心臓ＮＭＲ及びＩＶＥ：有害な心室リモデリングのエビデンス：ＡＭＩから１か月後、ＣＭＲで前部及び中隔区画に極度のるいそうが観察されだけでなく、ＩＶＥでもＡＭＩ後の有害なリモデリングの典型である運動障害と共に動脈瘤の形成が観察された。
Ｃ：ＡＭＩの２２〜３０日後のミニブタの心臓ＮＭＲ及びＩＶＥ：心室リモデリングは皆無：ＡＭＩから１か月後、前部及び中隔領域における壁側領域の僅かな減少が、ＩＶＥにおいて動脈瘤を形成することなく、運動障害を伴うことなく観察された。これは、ＡＭＩ後の好ましい修復反応の典型的な症例である。
【０２１８】
実施例１０：カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの血管腫瘍誘導又は短期死亡率における効果の試験
全ての動物に対して実施された部検において血管腫瘍は全く観察されず、これにより、遠い場所にある他の臓器におけるマイクロＲＮＡ−９２ａの異所的全身的な抑制は存在しないことが示唆された。試験の死亡率は２３％であった。短期死亡率には差異は全く観察されなかった。カプセル化アンタゴｍｉｒ９２ａに割り当てられた唯１匹のミニブタが死滅した（ｐ＝０．３９）。
【０２１９】
【表４】
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【０２２０】
実施例１１：カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの不整脈誘発プロファイルの試験
カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの不整脈発生能を知るために、手順の最中の全ての不整脈イベントを記録し、Collect 5Sソフトウェア（ＧＥ）によって分析した。さらに、この問題に対処するために、挿入可能なループレコーダーを２６中１０匹の試験ミニブタに無作為に埋め込み、屠殺するまで、梗塞及び処置から１か月後に、起こり得る不整脈の発症を検出した。対照と比較して処置群においては多数の悪性な頻脈性不整脈も徐脈性不整脈も観察されず、このことは、冠内カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａは不整脈誘発作用を発揮しないことを示す。
【０２２１】
【表５】
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【０２２２】
ＰＶＣ：心室性期外収縮、ＮＳＶＴ：非持続性心室頻拍、ＩＶＲ：固有心室調律、ＰＳＶＣ：上室性期外収縮、ＡＭＩ：急性心筋梗塞
【０２２３】
実施例１２：インビトロにおけるｍｉＲ９２ａの発現に対する、カプセル化アンタゴｍｉｒ９２ａ及び非カプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの効果の評価
１２．１：材料及び方法
ａ．  細胞
初代ヒト臍静脈細胞を肺細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９２２（商標））のチオグアニン耐性クローンと融合させることによって確立された、ヒト臍静脈細胞株ＥＡ．ｈｙ９２６を使用した。
【０２２４】
ｂ．  処置
約５０００００個のＥＡ．ｈｙ９２６細胞を６ウェルプレートに播種し、標準的な条件下で（３７℃、５％ＣＯ２）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２mM Ｌ−グルタミン（Sigma, L'Isle d'abeau, France）の補充されたＲＰＭＩ １６４０中でインキュベートした。その後、培地を、それぞれのアンタゴｍｉｒ及びそのそれぞれの対照（ＰＢＳ又はミクロスフィア）を含有する新たな完全ＲＰＭＩ培地と交換した。ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を、１０及び１５０nMのアンタゴｍｉｒ９２ａ（遊離アンタゴｍｉｒ９２ａ及び３つのバッチのアンタゴｍｉｒ９２ａミクロスフィア）、カプセル化アンタゴｍｉｒ１７又はカプセル化アンタゴｍｉｒ２０のいずれかを用いて処置した。細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後、ＲＮＡの抽出のために収集した。全ＲＮＡを抽出し、ｍｉＲＮＡの発現を定量ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。
【０２２５】
ｃ．  ＲＮＡ抽出
ｍｉＲＮＡを、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びミニブタ組織から、Qiagen RNeasy mini-prep（参照番号７４１０６）及びRNeasy+ universal kit（参照番号７３４０４）をそれぞれ使用して製造業者の説明書（Qiagen, Courtaboeuf, France）に従って単離した。抽出されたＲＮＡの量及び純度は、NanoDrop ND 1000分光光度計（Labtech International, Paris, France）を使用して評価された。
【０２２６】
ｄ．  ｍｉＲＮＡの逆転写
ｍｉＲＮＡを、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Life Technologies, ref. 4366596）を使用して、全ＲＮＡ ５ng及び特異的ｍｉＲＮＡプローブを含有する最終容量 １５μl中で逆転写した。試料を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間インキュベートし、逆転写酵素を、８５℃で５分間加熱し、ずっと４℃で冷却することによって不活化させた。
【０２２７】
ｅ．  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
理論的基礎。定量値は、ＰＣＲ産物の指数関数的増殖に関連したシグナルの増加が検出され始める（QuantStudio 6 及び 7 Flexソフトウェアを使用して、製造業者のマニュアルに従って）Ｃｔ数から得られる。出発物質の量の差を制御するために、データを、その発現レベルが処置の関数として変化しないことが経験的に示されている２つの内因性対照（ｍｉＲＮＡ１０３及びｍｉＲＮＡ１９１）の幾何平均に対して標準化した。標的ｍｉＲＮＡの値を続いて、対照における標的ｍｉＲＮＡの数値が１の数値に等しくなるように標準化した。結果は、ΔΔＣｔ計算法（ＲＱ分析ソフトウェア、Applied Biosystems（登録商標））を使用して表現された。
【０２２８】
ＰＣＲ増幅。全てのＰＣＲ反応は、QuantStudio（商標）6 FlexリアルタイムＰＣＲシステム及びＴａｑＭａｎプローブ（Applied Biosystems（登録商標））を使用して実施された。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間の初回変性工程、並びに９５℃で１５秒間及び６５℃で１分間の４５サイクルを含んでいた。サンプルは二重試験とした。
【０２２９】
１２．１：結果
ｍｉＲ−９２ａの発現は、１０nMの遊離アンタゴｍｉｒ−９２ａ及びカプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの両方によって約９０％の低減率で阻害される。
【０２３０】
ｍｉＲ−９２ａの発現は、１５０nMの遊離アンタゴｍｉｒ−９２ａ及びカプセル化アンタゴｍｉｒ−９２ａの両方の後に検出不可能である。
【０２３１】
ｍｉＲ−１７の発現もｍｉＲ−２０ａの発現も、アンタゴｍｉｒ−９２ａによる処置によって有意に減少しなかった。
【０２３２】
これらのデータは図１１に要約されている。
【０２３３】
実施例１３：ｍｉＲのそのそれぞれの発現に対する、３つのカプセル化アンタゴｍｉｒ（アンタゴｍｉｒ１７、２０ａ及び９２ａ）の効果のインビトロにおける評価
１３．１  アンタゴｍｉｒ−１７の積載されたミクロスフィアの調製
ミクロスフィアは、５０：５０ＰＬＧＡ共重合体（固有粘度０．２dL/g）を使用してエマルション／溶媒蒸発法によって調製された。アンタゴｍｉｒ−１７溶液（ＨＳＡ−ｍｉＲ−１７−５ｐ；分子量：５３０５Ｄａ；配列：CTGCACTGTAAGCACT；Exiqon製）をＰＬＧＡ有機溶液中で乳化させた。得られたエマルションを続いて分散性水相に取り込み、ホモジナイズして、所望の粒径を得た。最後に、溶媒蒸発後、得られたミクロスフィアを凍結乾燥させた。ミクロスフィアの平均直径は１０μmであり、アンタゴｍｉｒ−１７含量は７．３％であった。
【０２３４】
１３．２  アンタゴｍｉｒ−２０ａの積載されたミクロスフィアの調製
ミクロスフィアを、５０：５０ＰＬＧＡ共重合体（固有粘度０．２dL/g）を使用してエマルション／溶媒蒸発法によって調製した。アンタゴｍｉｒ−２０ａ溶液（ＨＳＡ−ｍｉＲ−２０ａ；分子量：５２８９Ｄａ；配列：CTGCACTATAAGCACT；Exiqon製）をＰＬＧＡ有機溶液中で乳化させた。得られたエマルションを続いて分散性水相に取り込み、ホモジナイズして、所望の粒径を得た。最後に、溶媒蒸発後、得られたミクロスフィアを凍結乾燥させた。ミクロスフィアの平均直径は１０μmであり、アンタゴｍｉｒ−２０ａ含量は６．８％であった。
【０２３５】
１３．３  結果
材料及び方法は、実施例１２と同じである。
−  ｍｉＲ−１７は、１０nMのカプセル化アンタゴｍｉｒ−１７によって７６％阻害される。ｍｉＲ１７の発現は、１５０nMのカプセル化アンタゴｍｉｒ−１７による処置によって完全に消失する。
−  ｍｉＲ−２０ａは、１０nMのカプセル化アンタゴｍｉｒ−２０ａによる処置によって７％阻害され、１５０nMのカプセル化アンタゴｍｉｒ−２０ａによる処置によって８７％阻害される。結果を図１２に示す。
【０２３６】
実施例１４：積載、サイズ、及びラクチド／グリコリドの比の特徴と共に、３つのバッチのアンタゴｍｉｒ９２ａミクロスフィアのインビトロにおける評価
１４．１  少量のアンタゴｍｉｒ−９２ａの積載されたミクロスフィアの調製（Ｌ１３２５０：ポリマー：ＲＥＳＯＭＥＲ ＲＧ５０２Ｈ）
ミクロスフィアは、実施例１に記載のように５０：５０ＰＬＧＡ共重合体（固有粘度０．２dL/g）を使用して、しかし、より少ない初期量の薬物及びより高い撹拌速度を使用してエマルション／溶媒蒸発法によって調製され、低いアンタゴｍｉｒ−９２ａ含量を有するより小さなミクロスフィアが調製された。ミクロスフィアの平均直径は７μmであり、アンタゴｍｉｒ−９２ａ含量は１．５％であった。
【０２３７】
１４．２  多量のアンタゴｍｉｒ−９２ａの積載されたミクロスフィアの調製（Ｌ１３２６２：ポリマー：ＲＥＳＯＭＥＲ ＲＧ５０２Ｈ）
ミクロスフィアは、実施例１に記載のように５０：５０ＰＬＧＡ共重合体（固有粘度０．２dL/g）を使用して、しかし、より多い初期量の薬物及びより低い撹拌速度を使用してエマルション／溶媒蒸発法によって調製され、高いアンタゴｍｉｒ−９２ａ含量を有するより大きなミクロスフィアが調製された。ミクロスフィアの平均直径は１５．６μmであり、アンタゴｍｉｒ−９２ａ含量は９．８％であった。
【０２３８】
１４．３  長時間持続性ポリマーを使用したアンタゴｍｉｒ−９２ａの積載されたミクロスフィアの調製（Ｌ１３２３０：ポリマー：ＬＡＣＴＥＬ Ｂ６００６）
ミクロスフィアは、実施例１に記載のように、しかし緩徐な薬物放出を目的とした、高い分子量を有する８５：１５のＰＬＧＡ共重合体（固有粘度０．６４dL/g）を使用してエマルション／溶媒蒸発法によって調製された。ミクロスフィアの平均直径は１２μmであり、アンタゴ−ｍｉｒ９２ａ含量は３．１％であった。
【０２３９】
１４．４  結果
３つのバッチのアンタゴｍｉｒ−９２ａミクロスフィアが、積載、サイズ及びラクチド／グリコリドの比の特徴と共に試験された。
【０２４０】
ミクロスフィア含量に従って、Ｌ１３２５０を２及び３０nMで、Ｌ１３２６２を１４及び２１０nMで、Ｌ１３２３０を４及び６６nMで試験した。
【０２４１】
Ｌ１３２５０、Ｌ１３２６２及びＬ１３２３０はｍｉＲ９２ａの発現を完全に消失させた。
【図１】
2016506923.tif 000008
【図２】
2016506923.tif 000009
【図３】
2016506923.tif 000010
【図４】
2016506923.tif 000011
【図５】
2016506923.tif 000012
【図６】
2016506923.tif 000013
【図７】
2016506923.tif 000014
【図８】
2016506923.tif 000015
【図９】
2016506923.tif 000016
【図１０】
2016506923.tif 000017
【図１１】
2016506923.tif 000018
【図１２】
2016506923.tif 000019
【配列表】
2016506923000001.app
【国際調査報告】
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2016506923.tif 000021
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