(57)【要約】本発明は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの新規な医薬用途に関する。前記化合物を活性成分として含有する、免疫反応を抑制し、及び／又は未分化Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖を促進するための医薬組成物に関するものである。
2016515571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、免疫反応を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
皮膚、血液、角膜、肝臓、肺、腸、膵臓、心臓、腎臓、骨髄、幹細胞又は前駆細胞の移植に対する免疫拒絶反応を抑制するためのものである、請求項１に記載の免疫反応を抑制するための医薬組成物。
【請求項３】
移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患又は炎症疾患の治療及び予防に使用されるものである、請求項１に記載の免疫反応を抑制するための医薬組成物。
【請求項４】
（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖を促進するための組成物。
【請求項５】
抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びＴＧＦ−βを更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
レチノイン酸（ＲＡ）又はレチナールを更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記調節性Ｔ細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋及びＦｏｘｐ３＋の表現型を有するものである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
未熟Ｔ細胞を、生体外において請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物で処理する工程を含む、調節性Ｔ細胞への分化を誘導する方法。
【請求項９】
未熟Ｔ細胞を、生体外において請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物で処理する工程を含む、調節性Ｔ細胞の増殖を促進する方法。
【請求項１０】
未熟Ｔ細胞を、生体外において請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物で処理する工程を含む、調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び調節性Ｔ細胞の増殖を促進することにより調節性Ｔ細胞を取得する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により取得された調節性Ｔ細胞を含む、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患のような免疫疾患の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの新規な医薬用途に関する。特に、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの調節性Ｔ細胞の分化誘導及び増殖促進作用、活性化された調節性Ｔ細胞の免疫調節作用などによる、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）をはじめとする各種免疫疾患を予防し、又は治療するための方法、このような方法に使用するための医薬組成物、及び該医薬組成物を用いて免疫疾患の予防又は治療に使用するための調節性Ｔ細胞の取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫とは、体内に存在する外部抗原物質を認識し、そして除去し、外部物質から自己を保護する作用をいう。免疫反応は、大きく細胞性免疫反応と体液性免疫反応とに分けられており、体液性免疫反応では、Ｂ細胞から分泌された抗体は、外部抗原を認識し、それらを中和し、非自己と認識された他の細胞の表面に結合することによってマクロファージ細胞の食作用を補助し、あるいは補体系を活性化することによって特定の免疫反応を増大させる。細胞性免疫反応では、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞）が外部抗原を直接不活性化し、あるいはＩＬ−２およびＩＦＮ−γのようなサイトカインを分泌することによってマクロファージ細胞を活性化する。このように、免疫反応では、自己と非自己抗原を識別する能力は、体内防御体系のために絶対的に重要である。
【０００３】
しかしながら、同種又は異種の細胞、組織又は器官の移植という特定の状況においては、有益な外部移植片の拒絶を防ぐために、免疫反応を抑制することが必要である。例えば、白血病、骨髄腫、リンパ腫及び再生不良性貧血のような血液癌を治療するために、同種の骨髄移植又は造血幹細胞移植は、効果的な治療法として用いられている。しかしながら、宿主組織を非自己抗原として認識することによる免疫拒絶反応の場合、ドナーに由来する移植片は、レシピエントの組織、皮膚、臓器などに対して損傷を引き起こし、最悪の場合には、死亡することさえもある。このように、移植片が免疫拒絶反応を生じることによって宿主組織を損傷する疾患は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）と呼ばれている。例えば、幹細胞移植の場合、骨髄に移植された新しい細胞（移植片）が患者（宿主）の組織を異種として認識し、その結果、同種のドナーの骨髄細胞がレシピエントの組織、皮膚、消化器管、または肝臓などの臓器を損傷することをいう。移植片対宿主疾患の発病過程において、患者の抗原提示細胞は、移植された骨髄細胞中のＴ細胞を活性化してＴｈ１細胞に分化させ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのサイトカインの分泌を増加させ、それにより細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞などが活性化し、これらの細胞が患者の臓器を攻撃して移植片対宿主疾患が引き起こされる。移植片対宿主疾患の主な原因は、同種の骨髄移植又は造血幹細胞の移植である。特に、移植片対宿主疾患は、造血幹細胞移植によって生じ、患者の１５〜３０％が死亡することが報告されている。それゆえ、移植片対宿主疾患の発症を予防し、移植片が長期間生着するためには、外部抗原を認識するレシピエントの免疫系が回避されるか、あるいは免疫反応が抑制されなければならない。
【０００４】
また、アレルギー反応のような免疫過敏反応において、対象の免疫学的反応が侵入する外部物質より大きな損傷を引き起こす場合、免疫反応を抑制することが必要である。このようなアレルギー性疾患の例には、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー皮膚炎などが挙げられる。また、自己免疫疾患は、免疫系が対照自身の身体の一部に感受性を有し、その結果、自己を非自己から区分する能力が欠落して、自らの身体を破壊する疾患を意味する。自己免疫疾患もまた、免疫反応を抑制するための治療が必要である。このような自己免疫疾患の例には、リウマチ性関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、ループス、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、多発性筋肉炎、皮膚筋炎、自己免疫血球減少症、脈管炎症候群、全身紅斑性狼瘡などが挙げられる。世界全体において、免疫過敏反応によって引き起こされる疾患が増加しているが、このような疾患の根本的な原因は、十分に解明されていない。従って、免疫反応の抑制は、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの免疫疾患に罹っている患者の治療に有用な治療法として広く使われている。現在、免疫反応を抑制するための多くの化合物免疫抑制剤が開発され、シクロスポリンＡは、最も優れた臨床効果を示し、移植片対宿主疾患を含む自己免疫疾患、移植拒絶反応及び様々な炎症疾患に広く用いられている。シクロスポリンＡは、高用量で用いられる場合、Ｔ細胞の活性化を完全に抑制して疾患を治療するが、腎臓毒性を含む大きな副作用を示す短所を有する。それゆえ、低用量で用いることが推奨されている。さらに、低用量の使用による薬効の減少を補うために、２または３種類の他の免疫抑制剤との併用投与が行われている。しかしながら、併用投与のためには、２つの物質の作用機序と毒性部位が相違しなければならない前提条件がある。従って、従来の免疫抑制剤に代わってより効果的な免疫抑制剤の開発が必要とされている。
【０００５】
一方で、免疫系で中心的な役割を果たす細胞群の１つであるＴ細胞は、胸腺で成熟し、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）とＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に分類される。一連の分化過程を経て、ヘルパーＴ細胞は、固有の特性を有するＴ細胞、Ｔｈ１（Ｔヘルパータイプ１）、Ｔｈ２（Ｔヘルパータイプ２）、Ｔｈ１７（Ｔヘルパータイプ１７）、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）などに分化する。調節性Ｔ細胞は、異常に活性化された免疫細胞の機能を抑制することによって炎症反応を制御する特性を有し、免疫疾患は、調節性Ｔ細胞の活性を増加させる作用によって治療することができることが知られている。調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋をマーカーとして使用し、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する。免疫寛容および自己免疫疾患における調節性Ｔ細胞の重要性は、Ｆｏｘｐ３に変異を有するｓｃｕｒｆｙマウスで明らかである。Ｆｏｘｐ３に変異を有するｓｃｕｒｆｙマウスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の過剰な活性および炎症性サイトカインの過剰な生成により、わずか生後１ヶ月で死亡し（非特許文献１）、ヒトにおいても、Ｆｏｘｐ３遺伝子変異の遺伝疾患であるＩＰＥＸ（X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群）の原因であり、これは、１型糖尿病、アレルギー性疾患、炎症性腸疾患などの多くの自己免疫疾患を引き起こす（非特許文献２）。それゆえ、自己免疫疾患および慢性炎症疾患を含む各種免疫疾患は、調節性Ｔ細胞を活性化するか、あるいは調節性Ｔ細胞を有効成分として含む薬剤を投与することによって治療できるものと期待されうる。しかしながら、調節性Ｔ細胞は、胸腺より産生される他のＴリンパ球と比較して免疫抑制機能を有する分化された細胞であり、胸腺における自己抗原によってすでに活性化されている。調節性Ｔ細胞は、約５％の胸腺Ｔリンパ球から構成され、約１０〜１５％のＣＤ４＋Ｔリンパ球が末梢器官に存在する。その結果として、治療上有効な量の調節性Ｔ細胞を得ることは非常に困難であり、多量の調節性Ｔ細胞を效果的に取得する方法が必要とされている。
【０００６】
一方、特許文献１は、細胞ネクローシスを阻害する活性を有する新規なインドール又はインダゾール化合物、およびこれを含むネクローシス関連疾患の治療剤を提供する。しかしながら、前記特許文献１は、細胞ネクローシスの阻害における前記インドール又はインダゾール化合物の活性、および肝臓疾患、神経変性疾患などのネクローシス関連疾患との関連性のみを開示し、前記化合物の調節性Ｔ細胞との関連性、免疫反応の抑制における有効性、免疫過敏反応関連疾患の治療における使用可能性については全く言及していない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、従来の免疫抑制剤に代替し、又は補助することができる優れた免疫抑制効果を有する化合物を提供するために研究した。その結果、本発明者らは、細胞ネクローシス阻害剤として知られる特許文献２の化合物、特に、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンが、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化及び増殖を促進し、優れた免疫抑制効果を示し、それにより移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの治療に幅広く適用できることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許公開第１０−２００９−００１８５９３号
【特許文献２】韓国特許公開第１０−２００９−００１８５９３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sakaguchi S．et al, Cell 2008, 133:775-787
【非特許文献２】Itoh M．et al, J Immunol 1999, 162:5317-5326
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、免疫反応を抑制するための医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患などの免疫疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる別の目的は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖を促進するための組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる別の目的は、未熟Ｔ細胞を、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む組成物で処理する工程を含む、調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、次いで増殖を促進することにより調節性Ｔ細胞を取得する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる別の目的は、未熟Ｔ細胞を、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む組成物で処理することによって取得された調節性Ｔ細胞を含む、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患などの免疫疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び／又は増殖を促進することによって調節性Ｔ細胞の活性化による免疫反応の抑制に使用するための医薬組成物を提供する。
【００１６】
一態様として、本発明は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、免疫反応を抑制するための医薬組成物を提供する。
【００１７】
別の態様として、本発明は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、調節性Ｔ細胞の活性化による免疫反応の抑制によって、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患などの免疫疾患を予防し、又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１８】
さらなる別の態様として、本発明は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。
【００１９】
さらなる別の態様として、本発明は、未熟Ｔ細胞を、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む組成物で処理する工程を含む、調節性Ｔ細胞への分化誘導及び増殖促進による調節性Ｔ細胞の取得方法を提供する。
【００２０】
さらなる別の態様として、本発明は、未熟Ｔ細胞を、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む組成物で処理することによって取得された調節性Ｔ細胞を含む、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患などの免疫疾患を予防し、及び治療するための医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを製造する方法は、特許文献１に開示の方法を参考にすることができ、前記特許文献１は、出典明示によりその全体が本明細書内に取り込まれるものとする。
【００２２】
本発明に係る化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、薬学的に許容しうる塩を形成していてもよい。このような「薬学的に許容しうる塩」は、薬学的に許容しうるアニオンを含有する無毒性酸付加塩、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのような無機酸との塩；酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などのような有機カルボン酸との塩；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸のようなスルホン酸との塩が含まれる。また、薬学的に許容しうる塩基付加塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩との塩；リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸との塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン、トリエチルアミンなどのアミノ酸との塩なども含まれる。本発明に係る化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、従来の方法のいずれかによってその塩に変換されてもよく、塩の形成は、さらに説明することなく当業者によって容易に行うことができる。
【００２３】
本明細書における用語「異性体」は、同一の化学式又は分子式を有するが、光学的又は立体的に異なる化合物又はその塩を意味する。本発明に係る化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、構造中に不斉炭素中心を有していてもよく、光学異性体（Ｒ又はＳ異性体）、ラセミ体、ジアステレオマー混合物、個々のジアステレオマーなどの形態で存在していてもよい。全ての異性体及びそれらの混合物もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
以下では、特に説明がない限り、本発明に係る化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンには、その薬学的に許容しうる塩及び異性体が含まれる。
【００２５】
本発明は、免疫反応の抑制に使用するための、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む組成物を提供することを特徴とする。
【００２６】
本明細書において、用語「免疫抑制」又は「免疫反応の抑制」とは、外部又は自己抗原によって引き起こされる体に対する不利益な免疫反応を抑制することを意味する。
【００２７】
本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、全ての細胞、組織及び器官の移植で生じうる免疫拒絶反応の抑制に使用することができる。例えば、皮膚、血液、角膜、肝臓、肺、腸、膵臓、心臓、腎臓、骨髄、幹細胞及び前駆細胞などの移植時に免疫拒絶反応を抑制するために使用することができ、好ましくは、皮膚移植、骨髄移植、幹細胞移植、輸血及び臓器移植時に生じうる免疫拒絶反応を抑制するために使用することができる。
【００２８】
よって、本発明の医薬組成物は、移植された臓器、組織又は細胞に対する免疫反応を抑制することによって移植拒絶反応及び／又は移植片対宿主疾患の治療及び予防に有用である。
【００２９】
本明細書において、用語「治療」とは、疾患の症状の発症を示す対象に適用される場合に疾患の進行を妨げ、又は遅延させることを意味し、用語「予防」とは、疾患の症状の発症を示さないが、そのリスクが高い対象に適用される場合に疾患の発症の症状を妨げ、又は遅延させることを意味する。
【００３０】
また、本発明の医薬組成物は、免疫過敏反応によって引き起こされる様々な免疫過敏性疾患、好ましくは、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患の治療及び予防に有用である。前記アレルギー性疾患の例には、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー皮膚炎などが挙げられる。また、自己免疫疾患の例には、リウマチ性関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、ループス、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、多発性筋肉炎、皮膚筋炎、自己免疫血球減少症、脈管炎症候群、全身紅斑性狼瘡などが挙げられる。
【００３１】
本発明の具体的な実施例において、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの免疫反応抑制効果を調べるために、同種免疫反応モデルマウスを、ドナーマウスの骨髄及び脾臓細胞を放射線照射したレシピエントマウスに移植することによって作製し、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを投与して、免疫移植拒絶反応の可否を測定した。その結果、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンで処理した群の生存率が、未処理の群と比較して著しく増加し、体重と移植片対宿主反応の評価でも著しい結果が見られた（図１及び２）。組織学的所見でも、大腸組織のＨ＆Ｅ染色の結果として、大腸の絨毛及び粘膜の破壊が本発明の化合物で処理しなかった疾患モデルマウスで見られるのに対して、本発明の化合物で処理した群では、正常な大腸と同様であることが観察された（図３）。
【００３２】
また、同種免疫反応モデルマウスにおける酸化ストレスによる免疫反応を観察した結果、本発明の化合物で処理した群が未処理の群と比較して、細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の生成度が用量及び時間依存的に有意に抑制され（図４）、免疫調節機能のマーカーである高移動性群タンパク質Ｂ１（以下、ＨＭＧＢ１という）の発現が優位に抑制されることが観察された（図５）。
【００３３】
このように、同種免疫反応モデルマウスにおいて、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、免疫移植拒絶反応を減少させ、ＲＯＳ及びＨＭＧＢ１生成抑制、そして組織内の細胞ネクローシスを抑制することが確認された。さらに、細胞レベルで免疫反応を調節する可能性を調べた結果、本発明の化合物で処理した群では、未処理の群と比較して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋免疫調節細胞（調節性Ｔ細胞）が６倍またはそれ以上に増加し、ＣＤ４＋ＩＬ−４細胞が増加したが、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γは半分以上減少する結果を確認した（図６）。ＩＦＮ−γは、移植されたドナーＴ細胞から分泌される代表的な移植片対宿主疾患で誘発されるサイトカインであり、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンが調節性Ｔ細胞とＩＬ−４を上方調節することによって移植されたＴ細胞の活性化を抑制することが分かる。
【００３４】
このような実験結果から、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、調節性Ｔ細胞を増加させ、増加した調節性Ｔ細胞の免疫抑制作用によって移植されたＴ細胞の活性化を抑制し、炎症反応を制御し、次いで細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）及びＨＭＧＢ１の発現を減少させることによって免疫反応の抑制に効能を有することを確認することができる。従って、本発明の化合物は、免疫反応を抑制するための医薬組成物として有効に使用することができ、さらに、免疫反応の抑制を必要とする移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患などの免疫疾患治療に幅広く適用することができる。
【００３５】
本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−  
（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを含む免疫抑制のための医薬組成物は、他の公知の免疫抑制剤と組み合わせて用いられてもよい。併用可能な他の免疫抑制剤の例には、以下に限定されないが、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、タクロリムス、サクロリムス（sacrolimus）、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、又は各種ステロイド製剤などが挙げられる。
【００３６】
本発明のさらなる別の態様として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン、その薬学的に許容しうる塩又は異性体を含む、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化誘導及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖促進のための医薬組成物が提供される。
【００３７】
本明細書において、用語「調節性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞反応を調節することができる細胞を意味し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋をマーカーとして使用し、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する細胞である。前記調節性Ｔ細胞は、異常に活性化された免疫細胞の機能を抑制することによって炎症反応を制御する特性を有し、慢性炎症反応を抑制することによって、免疫寛容および自己免疫疾患に対する治療効果を示すことができる。特に、Ｆｏｘｐ３因子が調節性Ｔ細胞の分化および活性に重要な役割を果たすことが知られている。
【００３８】
従って、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによって誘導される調節性Ｔ細胞は、全ての細胞、組織及び器官の移植で生じうる免疫拒絶反応を抑制するために使用することができる。例えば、皮膚、血液、角膜、肝臓、肺、腸、膵臓、心臓、腎臓、骨髄、幹細胞及び前駆細胞などの移植時の免疫拒絶反応を抑制するために使用することができ、好ましくは、皮膚移植、骨髄移植、幹細胞移植、輸血及び臓器の移植時に生じうる免疫拒絶反応を抑制するために使用することができる。従って、本発明の化合物によって誘導される調節性Ｔ細胞は、移植された臓器、組織又は細胞に対する免疫反応を抑制させることによって移植拒絶反応又は移植片対宿主疾患の治療及び予防に有用である。また、本発明の化合物によって誘導される調節性Ｔ細胞は、免疫過敏反応によって引き起こされる様々な免疫過敏性関連疾患、好ましくは、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患の治療及び予防に有用である。自己免疫疾患の例には、リウマチ性関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、ループス、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、多発性筋肉炎、皮膚筋炎、自己免疫血球減少症、脈管炎症候群、全身紅斑性狼瘡などが挙げられる。
【００３９】
本発明の具体的な実施例において、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、マウスの脾臓細胞から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を促進することを確認し（図７及び図８）、このような効果は、従来の分化誘導剤として知られたレチナール（retinal）又はレチノイン酸と同様に優れた効果である。さらに、本発明の化合物をレチナール又はレチノイン酸と組み合わせて処理した場合、調節性Ｔ細胞への分化を促進する効果が更に亢進されることを確認した（図９及び図１０）。また、インビトロ実験では、本発明の化合物で処理することによって誘導された調節性Ｔ細胞が、Ｔ細胞及び同種免疫反応細胞の増殖を抑制する効果が示され、インビボでの移植片対宿主疾患モデルマウスでは、調節性Ｔ細胞の免疫調節機能におけるその効果が確認された（図１１〜図１４）。
【００４０】
従って、本発明の化合物又はこれを含む組成物は、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を誘導し、及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖を促進することによって免疫疾患及び慢性炎症疾患の治療のための治療上有効な量の調節性Ｔ細胞を大規模での生成及び濃縮に有益に用いることができる。
【００４１】
好ましくは、本発明の化合物を含む、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化誘導及び／又は調節性Ｔ細胞の増殖促進のための医薬組成物は、調節性Ｔ細胞への分化のために、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びＴＧＦ−βを更に含んでいてもよく、分化及び増殖を促進する効果を更に向上させるために、従来の分化誘導剤であるレチノイン酸又はレチナールを更に含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の化合物によって分化された調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋及びＦｏｘｐ３＋の表現型を示し、同種免疫反応細胞及びＧＶＨＤマウスにおける免疫反応を調節し、及び抑制する機能を有する。
【００４３】
さらに、本発明は、未熟Ｔ細胞を、本発明の化合物又はこれを含む組成物で処理することによって取得された調節性Ｔ細胞を含む、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び炎症疾患などの免疫疾患の治療のための組成物を提供する。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、必要に応じて、本発明の化合物と共に、薬学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせを含んでいてもよい。医薬組成物は、生体内への化合物の投与を容易にする。化合物を投与する様々な技術が存在し、以下に限定されないが、経口、注射、エアゾール、非経口及び局所投与などが挙げられる。
【００４５】
本明細書において、薬学的に許容しうる担体は、生体をあまり刺激することなく、投与される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。また、前記添加剤は、製剤の製造、圧縮性、外観及び味を向上させうる。例えば、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、可溶化剤、緩衝液、甘味料、基剤、吸着剤、矯味剤、結合剤、懸濁化剤、硬化剤、抗酸化剤、光沢剤、着香剤、香味剤、顔料、コーティング剤、湿潤剤、湿潤調整剤、充填剤、消泡剤、清涼化剤、咀嚼剤、静電防止剤、着色剤、糖衣剤、等張化剤、軟化剤、乳化剤、粘着剤、粘増剤、発泡剤、ｐＨ調整剤、賦形剤、分散剤、崩壊剤、防水剤、防腐剤、保存剤、溶解補助剤、溶剤、流動化剤などが、適宜添加されてもよい。
【００４６】
本発明の医薬組成物に含まれる化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの用量は、患者の体重、性別、年齢、健康状態、食生活、疾患の特殊な性質、薬剤の投与時間、投与方法、薬剤混合及び疾患の重症度などのような要因により医師の処方に依存する。しかしながら、成人の治療に必要とされる用量は、投与強度および頻度に応じて、典型的に、１日にあたり約１．０ｍｇ〜２，０００ｍｇである。成人に筋肉内又は静脈内に投与される場合、より高い１日用量が望ましい場合は別として、１回用量で別々に投与される場合、合計用量は、典型的に、１日にあたり約１．０ｍｇ〜３００ｍｇの範囲で十分である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明の医薬組成物は、免疫反応を抑制するための医薬組成物として有益に使用することができ、さらに、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの治療に幅広く適用することができる。また、未熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化及び増殖を促進させることによって、免疫疾患及び慢性炎症疾患の治療に必要とされる治療上有効な量の調節性Ｔ細胞を大規模で取得するのに有益に使用することができ、本発明によって取得された調節性Ｔ細胞は、免疫反応の抑制を必要とする移植拒絶反応、移植片対宿主疾患のような自己免疫疾患、及び慢性炎症疾患などの治療に幅広く適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン（以下、「化合物Ａ」と表示）で処理していないＧＶＨＤマウス及び化合物Ａで処理したＧＶＨＤマウスの写真である。
【図２】ドナーマウスの骨髄及び脾臓細胞をレシピエントマウスに移植したＧＶＨＤモデルマウスの移植経過日数に伴うＧＶＨＤの臨床スコア（Ａ）、生存率（Ｂ）及び体重（Ｃ）を示す図である。■は、骨髄及び脾臓細胞の移植によって作製したＧＶＨＤマウスを示し、●は、脾臓細胞でない骨髄移植でＧＶＨＤが誘導されないマウスを示し、△は、０．３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを投与するＧＶＨＤモデルマウスを示し、▼は、１ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを投与するＧＶＨＤモデルマウスを示す。
【図３】化合物Ａで未処理のＧＶＨＤマウス及び化合物Ａで処理したＧＶＨＤマウスの各大腸組織のＨ＆Ｅ染色の結果を示す。
【図４】化合物Ａで未処理のＧＶＨＤマウス及び化合物Ａで用量ごとに処理したＧＶＨＤマウスの処理７日後（Ａ）及び１４日後（Ｂ）における活性酸素種（ＲＯＳ）生成度を示す。
【図５】化合物Ａで未処理のＧＶＨＤマウス及び化合物Ａで用量ごとに処理したＧＶＨＤマウスの処理７日後（Ａ）及び１４日後（Ｂ）におけるＨＭＧＢ１の相対的な発現を示す。
【図６】化合物Ａで未処理のＧＶＨＤマウス及び化合物Ａで処理したＧＶＨＤマウスから単離した脾臓の調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）及びＣＤ４＋ＩＦＮ−γ細胞についてのフローサイトメトリー分析の結果である。
【図７】抗ＣＤ３（ａＣＤ３）及び抗−ＣＤ２８（ａＣＤ２８）で処理した場合、これにＴＧＦ−βでさらに処理した場合、及びこれに４０μＭ又は８０μＭの化合物Ａでさらに処理した場合のマウス脾臓細胞から単離したＣＤ４＋細胞の調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）への分化の程度を示す図である。
【図８】抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で処理した場合、これにＴＧＦ−βでさらに処理した場合、及びこれに４０μＭ又は８０μＭの化合物Ａでさらに処理した場合のマウス脾臓細胞から単離したＣＤ４＋細胞である分化した細胞のＦｏｘｐ３＋発現の程度についてのフローサイトメトリー分析の結果である。
【図９】各群における調節性Ｔ細胞への分化の効果についてのフローサイトメトリー分析の結果である。マウス脾臓細胞から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で処理し、またはこれらにＴＧＦ−βでさらに処理することによる調節性Ｔ細胞への分化の誘導過程において、４０μＭの化合物Ａ処理群、８０μＭの化合物Ａ処理群、０．１μＭのレチノイン酸（以下、「ＲＡ」と表示）処理群、１μＭのレチナール処理群、０．１μＭのＲＡ及び４０μＭの化合物Ａ処理群、０．１μＭのＲＡ及び８０μＭの化合物Ａ処理群、１μＭのレチナール及び４０μＭの化合物Ａ処理群、ならびに１μＭのレチナール及び８０μＭの化合物Ａ処理群に分ける。
【図１０】調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）への分化の程度を示す図である。マウス脾臓細胞から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及びＴＧＦ−βで処理することによる調節性Ｔ細胞への分化の誘導過程において、化合物Ａ単独処理群、レチナール単独処理群、ＲＡ単独処理群、化合物Ａ及びレチナール併用処理群、及び化合物Ａ及びＲＡ併用処理群に分ける。
【図１１】ａＣＤ３及びａＣＤ２８の添加で誘導された調節性Ｔ細胞、ａＣＤ３、ａＣＤ２８及びＴＧＦ−βの添加で誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「ＴＧＦ−β Ｔｒｅｇ」と表示）、ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及びＲＡの添加で誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「ＲＡ Ｔｒｅｇ」と表示）、ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及び４０μＭの化合物Ａの添加で誘導された調節性Ｔ細胞、ならびにａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及び８０μＭの化合物Ａの添加で誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「化合物Ａ Ｔｒｅｇ」と表示）についての［３Ｈ］チミジン分析によるＴ細胞増殖の抑制効果の結果を示す図である。
【図１２】ａＣＤ３及びａＣＤ２８の添加で誘導された調節性Ｔ細胞、ａＣＤ３、ａＣＤ２８及びＴＧＦ−βの添加で誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「ＴＧＦ−β Ｔｒｅｇ」と表示）、ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及びＲＡの添加で誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「ＲＡ Ｔｒｅｇ」と表示）、ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及び４０μＭの化合物Ａの添加で誘導された調節性Ｔ細胞、ならびにａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及び８０μＭの化合物Ａの添加で誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「化合物Ａ Ｔｒｅｇ」と表示）についての［３Ｈ］チミジン分析による同種免疫反応細胞増殖の抑制効果の結果を示す図である。
【図１３】同種免疫細胞における化合物Ａの濃度による調節性Ｔ細胞への分化誘導効果についての比較分析の結果を示す図である。
【図１４】移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）モデルマウスにおける化合物Ａの濃度による調節性Ｔ細胞への分化促進効果についての比較分析の結果を示す図である。
【００４９】
以下、本発明を実施例で詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明が下記実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
実施例１．同種免疫反応モデルマウスの樹立
互いに異なるＭＨＣクラスを有する６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋｂ）およびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｋｄ）マウスをオリエントバイオ社から購入した。カトリック大学校の実験動物研究室管理委員会の規定を通過し、前記マウスを同委員会の管理下で使用した。レシピエントマウスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｋｄ）は、８００ｃＧｙで放射線を全身に照射した（放射線供給源：Ｘ−ｒａｙ Ｍｅｖａｔｒｏｎ ＭＸＥ−２）。２４時間以内に、ドナーマウスのＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋｂ）から単離した骨髄の５×１０６細胞および脾臓の５×１０６細胞を、同種レシピエントマウスに静脈内から移植して、移植片対宿主拒絶反応モデルを作製した。前記骨髄移植マウスを観察し、下記の点について評価した：各２点ずつ合計１０点の評価基準で体重、姿勢、活動性、毛状態、皮膚密度（１週間に２回ずつ）（表１）。
【表１】
2016515571.tif 000003
【実施例２】
【００５１】
実施例２．フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）
マウスを、試験群として（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン（韓国のＬＧ生命科学社、以下、「化合物Ａ」という）で処理したＧＶＨＤ群、および対照群として化合物Ａで処理していないＧＶＨＤ群に分けた。各群の脾臓を単離し、次いで単一細胞を単離した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（調節性Ｔ細胞の表現型）の発現、ならびにＣＤ４＋ＩＦＮ−γ細胞及びＣＤ４＋ＩＬ−４細胞を、蛍光モノクローナル抗体およびフローサイトメーターを用いて分析した。
【実施例３】
【００５２】
実施例３．活性酸素種（ＲＯＳ）の測定
各群のマウスを屠殺し、これらの脾臓を単離した。単一細胞を単離し、得られた細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した。３μＭのカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ試薬を用いて３７℃で１０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーターを用いて５４０ｎｍで分析した。
【実施例４】
【００５３】
実施例４．ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて前記細胞から抽出した。１μｇのＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素およびランダムヘキサマーと４５℃で１時間反応させて、ｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲを、鋳型として１μｇのｃＤＮＡ、プライマーＳ、プライマーＡＳ、および蒸留水を混合した混合物、ならびにＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて行った。前記ＰＣＲは、ＨＭＧＢ１（５'−ＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＣＴＡＡＧ−３'と５'−ＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＧＧＧ−３'）を用いて、９５℃で１５秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルの条件で行った。蛍光データは、Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。
【実施例５】
【００５４】
実施例５．免疫組織化学
４μｍの連続切片をパラフィンに包埋した組織から得て、キシレンで３回処理してパラフィンを除去し、次いで９５％、９０％、７０％のエタノールで段階的に含水した。内在性ペルオキシダーゼを０．５％過酸化水素中で除去し、前記試料を通常のヤギ血清で３０分間処理し、続いて製造業者の指示に従ってＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で希釈した一次抗体と１時間反応させた。前記実験で発現の差を示す遺伝子に対する発現タンパク質への一次抗体を反応させた後、前記試料をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、３％のＢＳＡで希釈した５μｇ／ｍＬのビオチン化抗マウス／抗ウサギＩｇＧと３０分間反応させ、ＴＢＳで３回洗浄した。該試料を３μｇ／ｍＬのセイヨウワサビのペルオキシダーゼストレプトアビジン中で３０分間保ち、ＤＡＢおよび過酸化水素で発色させ、マイヤーのヘマトキシリンまたは１％のメチルグリーンで対照染色させた。
【００５５】
結果
１．本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによるモデルマウスでの免疫移植拒絶の抑制
本発明では、ＧＶＨＤモデルマウスにおける本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによる免疫拒絶反応の抑制効果を調べた。実験結果として、本発明の化合物で処理した群の生存率が、未処理の群のものと比較して大きく増加し、体重および移植片対宿主反応の評価で顕著な結果が観察できた（図１及び２）。組織学的所見において、大腸のＨ＆Ｅ染色の結果として、本発明の化合物で処理していないＧＶＨＤ群では、大腸の絨毛及び粘膜が破壊されていることが観察されたが、本発明の化合物で処理した群では、正常な大腸組織と同様であることが観察された（図３）。
【００５６】
２．化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによる酸化ストレスの調節
ＲＯＳは、体内の細胞機能の調節において非常に重要な役割を果たしており、免疫系における免疫細胞の防御作用に関連している。ネクローシス細胞では、ＲＯＳはミトコンドリアにより生成され、これによりＨＭＧＢ１が酸化される。そして、免疫寛容が酸化されたＨＭＧＢ１によって生じる。
【００５７】
よって、本発明者らは、ＧＶＨＤモデルマウスにおける酸化ストレスによる免疫反応を観察した。その結果、本発明の化合物で処理した群において、対照群と比較して、細胞内活性酸素の生成度が用量及び時間依存的に有意に抑制されていることを観察した（図４）。
【００５８】
３．（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによるＨＭＧＢ１生成の抑制
ＨＭＧＢ１の放出は、炎症及び免疫を調節する機能を有しうることが広く知られてきた。それゆえ、本研究では、ＧＶＨＤモデルマウスにおいて本発明の化合物で処理した実験群と対照群で動物を屠殺し、脾臓細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＨＭＧＢ１の発現をリアルタイムＰＣＲで比較実験を行った。その結果、本発明の化合物で処理した群におけるＨＭＧＢ１の放出が、対照群と比較して時間依存的に顕著に抑制されることが確認された（図５）。
【００５９】
４．化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによる免疫機能調節
本発明者らは、ＧＶＨＤモデルマウスにおいて、本発明の化合物により、免疫移植拒絶反応が減少され、ＲＯＳ及びＨＭＧＢ１の生成抑制、組織内の細胞ネクローシスが抑制されることを見出し、免疫疾患動物モデルにおける免疫反応を調節する可能性を見ようとした。よって、本発明の化合物で処理した実験群および対照群のマウスを屠殺し、それらの脾臓を単離し、単一細胞を単離し、次いで免疫調節機能をフローサイトメトリー分析により調べた。その結果、本発明の化合物で処理した群は、対照群と比較して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋免疫調節細胞（調節Ｔ）が６倍またはそれ以上に増加された。さらに、ＣＤ４＋ＩＬ−４細胞が増加し、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ細胞が半分以上減少した（図６）。ＧＶＨＤモデルマウスにおいて、高用量の放射線で照射し、ドナーの移植されたＴ細胞が、宿主の抗原提示細胞により活性化され、増殖し、代表的なＧＶＨＤ誘発サイトカインとして知らされたＩＦＮ−γを分泌する。前記実験結果により、本発明の化合物が、調節性Ｔ細胞およびＩＬ−４の上方調節によってＩＦＮ−γを抑制したことが示された。従って、本発明の化合物は、移植されたＴ細胞の活性化を抑制することによって免疫反応を抑制できることが分かった。
【実施例６】
【００６０】
実施例６．インビトロ実験における（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンによる調節性Ｔ細胞への分化誘導効果についての確認
リンパ球Ｔｈ細胞分化における本発明の化合物の効果を調べるために実験した。マウス脾臓細胞から単離した５×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ａＣＤ３）でコーティング処理した２４ウェルプレートに分注し、次いで１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８（ａＣＤ２８）および５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで処理して、調節性Ｔ細胞への分化を３日間誘導した。調節性Ｔ細胞への分化前に、本発明の化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン（以下、「化合物Ａ」という）（ＬＧ生命科学社、韓国）で４０μＭおよび８０μＭの濃度にて処理した。フローサイトメトリー分析のために、これらに抗マウスＣＤ４ ＰｅｒＣＰ、ＣＤ２５ ＡＰＣおよびＦｏｘＰ３ＰＥ蛍光で標識した抗体を加え、４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標））で測定した。
【００６１】
このように、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ａＣＤ３、ａＣＤ２８、及びＴＧＦ−βで刺激することによって調節性Ｔ細胞の分化環境を作出し、化合物Ａで処理した結果、化合物Ａで処理していない対照群と比較して、Ｆｏｘｐ３＋の発現は、調節性Ｔ細胞への分化を促進することによって約２倍近く高められ、調節性Ｔ細胞への分化は、化合物Ａの濃度に依存的に増加した。特に、化合物Ａは、ＴＧＦ−βシグナルを調節することによってＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進することが分かった（図７及び図８）。
【実施例７】
【００６２】
実施例７．従来の分化誘導剤レチナール／レチノイン酸および化合物Ａによる調節性Ｔ細胞の増殖の比較及びインビトロ実験における併用治療の効果についての確認
ＲＡは、ＴＧＦ−βの存在下でＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇへの分化を増加させることが知られている。実施例６の実験結果から、化合物Ａは、特にＦｏｘｐ３＋の発現を強力に亢進させることが確認されたので、化合物Ａを一般的に公知のＲＡの効果と比較する実験を行った。
【００６３】
マウス脾臓細胞から単離した５×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ａＣＤ３）でコーティング処理した２４ウェルプレートに分注し、次いで１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８（ａＣＤ２８）および５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで処理して、調節性Ｔ細胞への分化を３日間誘導する過程において、（１）４０μＭ又は８０μＭの化合物Ａを単独で処理する群、（２）０．１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）を単独で処理する群、（３）１μＭのレチナールで処理する群、（４）０．１μＭのＲＡ及び４０μＭ又は８０μＭの化合物Ａで処理する群、及び（５）１μＭのレチナール及び４０μＭ又は８０μＭの化合物Ａで処理する群に分け、次いで各群の調節性Ｔ細胞への分化の効果を比較した。
【００６４】
上記のように、ＣＤ４＋細胞を、各化合物単独で、またはａＣＤ３、ａＣＤ２８及びＴＧＦ−βの存在下で併用して処理した結果として、化合物Ａを単独で処理した場合、Ｆｏｘｐ３＋の発現は、レチナール又はＲＡで処理した群と同程度に増加した。また、化合物ＡをＲＡまたはレチナールと併用して処理した場合、Ｆｏｘｐ３＋の発現は、各化合物を単独で処理した群と比較して増加した。これらの結果により、化合物Ａは、Ｔｈ細胞の分化における調節性Ｔ細胞への分化を促進することが確認された（図９及び図１０）。
【実施例８】
【００６５】
実施例８．化合物Ａによって誘導された調節性Ｔ細胞の同種免疫反応細胞の増殖を抑制する効果の確認
化合物Ａによって誘導された調節性Ｔ細胞（以下、「ｉＴｒｅｇ」という）の機能を確認するために、ｉＴｒｅｇ細胞が、Ｔ細胞の増殖（ａＣＤ３＋ａＣＤ２８＋刺激）及び同種免疫反応細胞の活性（Ｂ６ ＣＤ４＋および２０００ｃＧｙ Ｂ／ｃ ＡＰＣの同種反応）を抑制できるかどうかを評価した。このために、（１）ａＣＤ３及びａＣＤ２８の添加によって誘導されたＴｒｅｇ細胞、（２）ａＣＤ３、ａＣＤ２８及びＴＧＦ−βの添加によって誘導されたＴｒｅｇ細胞（以下、「ＴＧＦ−β Ｔｒｅｇ」という）、（３）ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及びＲＡの添加によって誘導されたＴｒｅｇ細胞（以下、「ＲＡ Ｔｒｅｇ」という）、（４）ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及び４０μＭの化合物Ａの添加によって誘導されたＴｒｅｇ細胞（以下、「化合物Ａ Ｔｒｅｇ」という）、並びに（５）ａＣＤ３、ａＣＤ２８、ＴＧＦ−β及び８０μＭの化合物Ａの添加によって誘導されたＴｒｅｇ細胞（以下、「化合物Ａ Ｔｒｅｇ」という）を準備し、比較分析を白血球混合培養法により行った。
【００６６】
まず、Ｔ細胞の増殖についての分析を行った。１×１０５個のマウスＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬのａＣＤ３でコーティング処理した９６ウェル丸底プレートに分注し、次いで１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８（ａＣＤ２８）で刺激して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のための環境を作った。
【００６７】
次に、１×１０５個のドナー脾臓細胞および１×１０５個のレシピエント脾臓細胞（２０Ｇｙの放射線で照射した）を共にインキュベートすることにより、ドナー脾臓細胞による同種免疫反応をレシピエント脾臓細胞で誘導させた。
【００６８】
５つの群のインビトロで誘導させた１×１０５個の調節性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して１:１の割合で加え、３７℃で３〜４日間インキュベートした。次いで、そこに［３Ｈ]チミジンを加え、８〜１４時間インキュベートし、回収した。Ｔｏｍｔｅｃ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅによるろ過によって得た細胞の放射能を、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００６９】
実験結果から、化合物Ａによって誘導されたＴｒｅｇは、ＴＧＦ−β ＴｒｅｇおよびＲＡ Ｔｒｅｇと比較して、Ｔ細胞の増殖及び同種免疫反応によるＴ細胞の活性をより効率的に抑制することが確認された（図１１及び図１２）。
【実施例９】
【００７０】
実施例９．インビトロ実験における化合物Ａによる調節性Ｔ細胞の分化効果についての確認
Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓細胞から単離した１×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞および２０Ｇｙで照射したＢＡＬＢｃ抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、４８ウェルプレートに加え、３７℃で５日間インキュベートした。脾臓細胞に対して抗原提示細胞による同種免疫反応が誘導される条件下でインキュベートし、比較分析のためにインキュベーション前に化合物Ａを様々な濃度で処理した。細胞を５日のインキュベーション後に回収し、フローサイトメトリー分析のために、そこに、抗マウスＣＤ４ ＰｅｒＣＰ、ＣＤ２５ ＡＰＣとＦｏｘＰ３ ＰＥ蛍光標識抗体を加え、４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標））で測定した。
【００７１】
その結果、調節性Ｔ細胞は、化合物Ａの濃度に依存して増加することが確認された（図１３）。
【実施例１０】
【００７２】
実施例１０．インビボの移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）モデルマウスにおける化合物Ａによる調節性Ｔ細胞の増加効果についての確認
互いに異なるＭＨＣクラスを有する６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋｂ）マウスおよびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｋｄ）マウスを使用した。レシピエントマウスＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｋｄ）は、８Ｇｙで全身放射線を照射した。２４時間以内に、ドナーマウスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋｂ）から単離した５×１０６個の骨髄細胞および５×１０６個の脾臓細胞をレシピエントマウスに静脈内から移植して、移植片対宿主拒絶反応モデル（ＧＶＨＤモデル）を作製した。化合物Ａは、このようなＧＶＨＤモデルに２週間にわたり１週間に４回ずつ静脈内から注入した。マウスを屠殺し、単一細胞を単離し、脾臓における免疫調節機能をフローサイトメトリー分析により調べた。その結果、化合物Ａを投与した群では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が増加することが確認された（図１４）。
【図１】
2016515571.tif 000004
【図２】
2016515571.tif 000005
【図３】
2016515571.tif 000006
【図４】
2016515571.tif 000007
【図５】
2016515571.tif 000008
【図６】
2016515571.tif 000009
【図７】
2016515571.tif 000010
【図８】
2016515571.tif 000011
【図９】
2016515571.tif 000012
【図１０】
2016515571.tif 000013
【図１１】
2016515571.tif 000014
【図１２】
2016515571.tif 000015
【図１３】
2016515571.tif 000016
【図１４】
2016515571.tif 000017
【国際調査報告】
2016515571.tif 000018
2016515571.tif 000019
2016515571.tif 000020
2016515571.tif 000021
2016515571.tif 000022
2016515571.tif 000023