(57)【要約】試料（２）の高解像度画像（Ｉｆ）を生成するための顕微鏡検査方法が、ａ）試料（２）に、励起後に統計学的に明滅しながら特定の蛍光放射を放出する物質を付与するか、またはそのような物質を含有する試料（２）を使用する工程、ｂ）試料（２）に照明放射（１０）を照射し、これにより、蛍光放射を放出させるために試料（２）を励起する工程、ｃ）蛍光放射を放出する試料（２）を、光軸（ＯＡ）に沿って、位置分解能をもつ検出器（５）に結像することを繰り返し、これにより一連の画像（Ｉｎ）を得る工程、ｄ）一連の画像（Ｉｎ）において明滅によって引き起こされた強度ゆらぎを評価するキュムラント関数により一連の画像（Ｉｎ）を加工し、これにより、試料（２）中の物質の局所的な分布の画像（Ｉｆ）であって、結像の光学解像度を超えて上昇した位置解像度を有する画像（Ｉｆ）を生成する工程を有しており、その際、ｅ）照明放射（１０）の照射は、照明放射（１０）が試料（２）を光軸（ＯＡ）に沿って限定的な深さ範囲内でのみ、蛍光放射を放出させるために励起するように行われる。
2016534395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（２）の高解像度画像（Ｉｆ）を生成するための顕微鏡検査方法であって、
ａ）該試料（２）に、励起後に統計学的に明滅しながら特定の蛍光放射を放出する物質を付与するか、またはそのような物質を含有する試料（２）を使用する工程、
ｂ）該試料（２）に照明放射（１０）を照射し、これにより、該蛍光放射を放出させるために該試料（２）を励起する工程、
ｃ）該蛍光放射を放出する該試料（２）を、光軸（ＯＡ）に沿って、位置分解能をもつ検出器（５）に結像することを繰り返し、これにより一連の画像（Ｉｎ）を得る工程、
ｄ）該一連の画像（Ｉｎ）において該明滅によって引き起こされた強度ゆらぎを評価するキュムラント関数により該一連の画像（Ｉｎ）を加工し、これにより、該試料（２）中の該物質の局所的な分布の画像（Ｉｆ）であって、結像の光学解像度を超えて上昇した位置解像度を有する画像（Ｉｆ）を生成する工程
を有する顕微鏡検査方法において、
ｅ）該照明放射（１０）の該照射が、該照明放射（１０）が該試料（２）を該光軸（ＯＡ）に沿って限定的な深さの範囲内でのみ、該蛍光放射を放出させるために励起するように行われることを特徴とする顕微鏡検査方法。
【請求項２】
前記照明放射（１０）の前記照射が、テンポラル合焦（１２〜１４）により、前記限定的な深さの範囲に制限されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項３】
前記照明放射のために、或るパルス長を有するパルス状の原ビームが供給され、かつ前記試料（２）内にある画像面（１５）内に光学系（１３、１４、３）によって結像される平面内にある散乱要素（１２）へと方向づけられ、これにより、前記試料（２）内では、該画像面（１５）内でのみ、前記照明放射が最小のパルス長を有しており、かつ該画像面（１５）と該散乱要素（１２）の間では、該最小のパルス長および該原ビームの該パルス長より大きいパルス長を有することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項４】
前記照明放射（１０）が、前記光軸（６）を横切って存在するシート光（１６）のみを照射し、したがって前記限定的な深さの範囲に制限されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項５】
前記物質が、光学的な切替え用放射の照射により第１の状態と第２の状態を切替え可能であり、その際、前記物質が、該第１の状態では前記蛍光放射を放出させるために励起可能でなく、かつ該第２の状態では前記蛍光放射を放出させるために励起可能であること、および工程ｂ）では、前記照明放射の前記照射が、該光学的な切替え用放射（１０）の照射を含み、該光学的な切替え用放射（１０）が、前記特定の蛍光放射の明滅パラメータを調整することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項６】
前記光学的な切替え用放射（１０）が、２光子効果による前記物質の切替えをもたらし、かつ前記試料（２）が、前記光学的な切替え用放射（１０）により走査され、その際、前記試料（２）内の焦点面であって、深さ範囲を規定する焦点面が走査されることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項７】
光学的な切替え用放射（１０）の照射が、テンポラル合焦により、前記限定的な深さ範囲に制限されることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項８】
光学的な切替え用放射（１０）のために、或るパルス長を有するパルス状の原ビームが供給され、かつ前記試料（２）内にある画像面（１５）内に光学系（１３、１４、３）によって結像される散乱面（１５）内にある散乱要素（１２）へと方向づけられ、これにより、前記試料（２）内では、該画像面（１５）内でのみ、前記光学的な切替え用放射（１０）が再び該原ビームの該パルス長を有することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項９】
前記光学的な切替え用放射（１０）が、前記光軸（６）を横切って存在するシート光（１６）のみを照射し、したがって前記限定的な深さ範囲に制限されることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１０】
明滅パラメータが、暗時間、明滅の暗状態と明状態の間の移行確率、および明滅の明／暗の時間比率のうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項５乃至９のいずれか１項に記載の顕微鏡検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、深さ方向においても蛍光を発する試料の高解像度の画像を生成するための顕微鏡検査方法または顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡検査による試料の調査は、多種多様な技術的解決策が存在する広大な技術分野である。古典的な光学顕微鏡検査から出発して非常に様々な顕微鏡検査方法が開発された。
生物標本を調査するための光学顕微鏡検査の古典的な適用分野は蛍光顕微鏡検査である。この場合、試料、例えば細胞の一部を特異的に標識するために、特定の色素（いわゆる蛍光体）が使用される。試料は、言及したように励起用放射によって照明され、これにより励起された蛍光放射が適切な検出器で捕捉される。通常はこのために光学顕微鏡内に、蛍光放射を励起用放射から分離して別々の観察を可能にするブロックフィルタを組み合わせたダイクロイックビームスプリッタが設けられている。こうすることにより、光学顕微鏡において、様々に着色された個々の細胞部分を表示することが可能である。もちろん、標本の複数の部分を、標本の異なる構造に特異的に蓄積する様々な色素によって同時に着色することもできる。この方法はマルチルミネセンスと呼ばれる。それ自体がルミネセンスを発する、つまり標識物質を添加しなくてもルミネセンスを発する試料も測定することができる。
【０００３】
最近では、物理的な法則によって生じる回折限界を超える解像度用に様々な手法が開発された。これらの顕微鏡検査方法は、古典的な顕微鏡に比べてより高い横方向の光学解像度を利用者に提供することを特色とする。本明細書ではそのような顕微鏡検査方法を高解像度顕微鏡検査方法と呼ぶ。なぜなら、この方法は光学的な回折限界を超える解像度を達成するからである。これに対し、回折によって制限された顕微鏡を古典的な顕微鏡と呼ぶ。
【０００４】
出版物（非特許文献１）および（非特許文献２）ならびに（非特許文献３）からは、広視野顕微鏡検査の高解像度の方法が知られている。この方法は蛍光体の明滅特性を利用している。試料の蛍光体が統計学的に互いに独立して明滅する場合、試料の結像は、いわゆるキュムラント関数を用いた適切なフィルタリングにより、物理的に設定される光学解像限界を超えて、解像度をかなり上昇させることができる。高解像度画像を生成するには、試料を広視野で励起および結像する。その際、一連の単一画像を撮影し、その後、キュムラント関数により１つの単一画像へと統合し、この場合の単一画像はより高い解像度を有している。この方法は、概念「超解像光ゆらぎイメージング（Ｓｕｐｅｒ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ）」を略してＳＯＦＩ方法と呼ばれている。
【０００５】
ＳＯＦＩ方法では、事後的に試料に付加されるかまたは内在的に試料中に存在する蛍光体のできるだけ様々な明滅状態を含む一連の画像が必要である。同時にカメラは、この明滅を時間的に捕捉すると同時に高い位置解像度を提供できなければならない。ＳＯＦＩ原理の実現に関しては、単一画像の撮影中にその蛍光状態を交代させる蛍光体ができるだけ少なく、かつ単一画像から単一画像への個々の蛍光体のゆらぎ（つまり蛍光状態の交代）が検出可能でなければならない。したがって、ＳＯＦＩ方法はこれまでは、特に、蛍光を発する材料に関しては結像の光軸に沿った深さ方向の距離がないも同然の薄い試料に対して適用されてきた。これにより、相前後して存在する蛍光体がその蛍光状態を単一画像の撮影中に交代させないことを保証するため、試料のＴＩＲＦ照明を実施することが想起され得た。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ティー．デルティンガー他（Ｔ．  Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「高速で背景のない３Ｄ超解像光ゆらぎイメージング（ＳＯＦＩ）（Ｆａｓｔ，ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ−ｆｒｅｅ，３Ｄ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ（ＳＯＦＩ））」、ＰＮＡＳ（２００９）、２２２８７−２２２９２頁
【非特許文献２】「超解像光ゆらぎイメージング（ＳＯＦＩ）による解像度上昇とピクセル増加の達成（Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｅ  ｐｉｘｅｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＳＯＦＩ））」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ、３０．０８．２０１０、１８（１８）：１８８７５−８５，ｄｏｉ：１０．１３６４／ＩＥ．１８．０１８８７５
【非特許文献３】エス．ガイスビューラー他（Ｓ．Ｇｅｉｓｓｂｕｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「ＳＯＦＩとＳＴＯＲＭの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＳＯＦＩ  ａｎｄ  ＳＴＯＲＭ）」、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２、４０８−４２０（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の基礎となる課題は、厚い試料も分析することができる、つまり試料の可能性に関する制限が撤廃されている、ＳＯＦＩ原理に従う高解像度顕微鏡検査方法を提示することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は、本発明により、試料の高解像度画像を生成するための顕微鏡検査方法によって解決され、この方法は以下の工程、すなわち
ａ）試料に、励起後に統計学的に明滅しながら特定の蛍光放射を放出する物質を付与するか、またはそのような物質を含有する試料を使用する工程、
ｂ）試料に照明放射を照射し、これにより、蛍光放射を放出させるために試料を励起する工程、
ｃ）蛍光放射を放出する試料を、光軸に沿って、位置分解能をもつ検出器に結像することを繰り返し、これにより一連の画像を得る工程、
ｄ）一連の画像において明滅によって引き起こされた強度ゆらぎを評価するキュムラント関数により一連の画像を加工し、これにより、試料中の物質の局所的な分布の画像であって、結像の光学解像度を超えて上昇した位置解像度を有する画像を生成する工程
を有しており、その際、
ｅ）照明放射の照射は、照明放射が試料を光軸に沿って限定的な深さ範囲内でのみ、蛍光放射を放出させるために励起するように行われる。
【０００９】
本発明によれば、試料の深さ方向においても蛍光を発する高解像度の結像を達成するため、ＳＯＦＩ原理を光切断法と組み合わせる。これにより、画像生成の際の焦点外の背景寄与も、まったく結像されない深さ区域での蛍光励起による試料の負荷も、回避される。
【００１０】
光切断は様々なやり方で行うことができる。一実施形態では、例えば本出願人の独国特許出願公開第１０２００９０６０７９３号明細書で説明されているようないわゆるテンポラル合焦が使用される。他の１つの実施形態では、結像の光軸を横切って存在するシート光を照射する。
【００１１】
さらなる一実施形態は、試料における明滅状態を生成するために多光子方法を使用する。この方法を使用するのは、直接的な多光子励起がポイントスキャナを必要とし、ポイントスキャナは、ＳＯＦＩ原理には使用できないと推測される、という点で意外である。なぜなら、このＳＯＦＩ原理は、走査型の画像構造を必要とするであろうからである。しかしＳＯＦＩ原理は、様々な明滅状態において試料全体を同時に結像することを強いており、走査型の画像構造とは相いれない。それにもかかわらず、光学的な切替え用放射を照射することで第１の状態と第２の状態が切り替わり得る物質を使用することにより、多光子効果をＳＯＦＩ原理のための光切断に用いることができる。この物質は、第２の状態でのみ、蛍光放射を放出させるために励起可能である。これにより、完全に選択された深さ範囲のみがその後の蛍光励起工程で明滅し得るように、走査型の切替えを用いて試料を準備することができる。その後、試料は平面的に、ただし予め走査された多光子作用によって選択された深さ範囲内でのみ蛍光を発する。切替え用放射は、好ましくは多光子方法により走査型で施される。なぜなら多光子方法が特に狭く限定した深さ範囲を規定できるからである。もちろん、多光子励起を走査型のスキャンなしで深さ方向に選択して行うため、テンポラル合焦によって切替え用放射を施してもよい。
【００１２】
切替え用放射により試料を深さ方向に選択して準備した場合、試料のその後の励起は、さらなる構造化なしで行われる。なぜなら試料は予め準備された深さ範囲内でのみ切り替えられており、したがって、そこでしかＳＯＦＩ原理に必要な明滅挙動を示し得ないからである。
【００１３】
切替え用放射による前述の試料の準備により、選択された深さ範囲のみが特定の明滅挙動を示し、この明滅挙動はその後、ＳＯＦＩ方法で評価される。その際、明滅パラメータとして、以下の量、すなわち暗時間、明滅の暗状態と明状態の間の移行確率、明滅の明／暗の時間比率のうちの１つまたは複数が考慮される。
【００１４】
ＳＯＦＩ原理に関しては、蛍光体の明滅の暗時間および明時間ならびに明滅確率からの比率を最適化することを目標としなければならない。蛍光体の明と暗の比率は１：１が最適である。なぜなら、この場合に、平均すると各々の単一画像ですべての蛍光体の半分が光っているからである。これを達成する場合に、必要な単一画像の数が最小限に抑えられる。
【００１５】
したがって、できるだけ高速の画像撮影に関して好ましいのは、切替え用放射の適切な調整により明滅の明／暗の時間比率を調整することであり、また好ましくはこの比率を検出器の単一画像撮影速度に適合させることである。さらに、前述の照明パラメータにより、標識または試料の明滅パラメータを適合させることができ、この明滅パラメータは、暗時間および明滅の暗状態と明状態の間の移行確率のうちの少なくとも一方に影響を及ぼし、すなわち両方に、１：１の最適比率を達成するかまたはその比率に近づけるための影響を及ぼす。
【００１６】
照明放射によって影響を及ぼすことに加えて、当該分子の持続時間であって、蛍光放射を放出する（明状態）持続時間または蛍光放射を放出しない（暗状態）持続時間を化学的に制御することにより物質を操作することもできる。この場合、明状態と暗状態が同じ持続時間の際に明と暗の間の移行確率０．５を達成する状態の占有数を目標とする。
【００１７】
以下では、例えば本発明の本質をなす特徴も開示している添付図面に基づいて本発明をさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】深さ方向においても高解像度の画像を生成するための顕微鏡検査方法の１実施形態のブロック図。
【図２】図１の方法を実施するための顕微鏡の概略図。
【図３】本方法を実施するためのさらなる顕微鏡の概略図。
【図４】図２または図３の顕微鏡の構造方式を変形することで実施可能な本方法のさらなる１実施形態のための図１に類似のブロック図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１は、深さ方向においても高解像度の画像を生成するための顕微鏡検査方法の第１の実施形態のブロック図として示している。
工程Ｓ１では、試料に標識を付与し、この標識は、励起後に統計学的に明滅しながら特定の蛍光放射を放出する冒頭に挙げた物質である。その代わりに、この物質を既に含有する試料を選択する。
【００２０】
続く工程Ｓ２では、照明放射を試料に照射し、こうして、試料中の物質からの特定の蛍光放射の放出を励起する。その際、照明放射は光切断方法により、後の結像の光軸に沿って限定的な深さ範囲内でのみ、蛍光放射を放出させるために試料を励起するように照射される。この限定的な深さ範囲が、深さ方向での解像度を規定する。
【００２１】
続いて工程Ｓ３では、試料の結像を繰り返し、この場合、明滅挙動に基づき、各々の結像には試料の別の明滅状態が存在する。したがって、結像の繰り返しが一連の画像Ｉｎを生成する。続く工程Ｓ４では、この一連の画像Ｉｎをキュムラント関数によって加工し、このキュムラント関数は、一連の画像において明滅によって引き起こされた強度ゆらぎを評価する。これにより、結像の光学解像度を超えて上昇した位置解像度を有する画像Ｉｆが生成される。工程Ｓ３およびＳ４の方法は、例えば冒頭で言及したデルティンガー他（Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）の出版物による既知のＳＯＦＩ原理に対応している。ただし、工程Ｓ２の形態により試料が狭く限定された深さの範囲内でのみ明滅しながら蛍光放射を放出することに違いがある。これにより画像Ｉｆは、試料を専らこの深さ範囲内へ再現する。
【００２２】
図２は、図１の方法を実施するために使用可能な顕微鏡１を示している。図２には、この場合、この顕微鏡検査方法のための２つの異なる実施形態が記入されている。これに関し図２の図中の要素１７〜１９および点で描かれたビーム経路は、図１による方法の実施形態には関係していない。したがって図２のこの構成要素は、後になって初めて説明されるものであり、さしあたって重要ではない。
【００２３】
試料２は、詳しくは表示されていないカバーガラスの下にある。試料は、顕微鏡１により、対物レンズ３および結像レンズ４を介して検出器５に結像される。この点に関しては既知の顕微鏡構造に対応している。結像のビーム経路内にはビームスプリッタ７が存在しており、このビームスプリッタを介して照明用ビーム経路８がカップリングされており、この照明用ビーム経路は、顕微鏡３を介して試料２に放射を施すビーム成形機構１１を備えている。
【００２４】
照明用ビーム経路８は、照明放射１０を放出する照明源９を含んでいる。照明放射１０はパルス状であり、かつテンポラル合焦により、限定的な深さ範囲内でのみ特定のパルス状の時間挙動を有するように照射される。試料の限定的な深さ範囲内でのみ、パルス幅が最小限に抑えられる。このようなテンポラル合焦は、例えば本出願人の独国特許出願公開第１０２００９０６００７９３号明細書から知られている。原理は、例えばオロン他（Ｏｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １３、１４６８（２００５）またはヴァジリら（Ｖａｚｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）ＰＮＡＳ  １０５−２０２２１（２００８）といった出版物から知られている。したがって、照明用ビーム経路８の要素の機能原理および形態に関しては、明示的にこれらの刊行物の参照を指示し、かつその開示内容を全面的に本願明細書に援用する。
【００２５】
照明源９はパルス状の照明放射１０を放出する。この照明放射は、図２で示した実施形態では格子１２として形成された散乱要素を介して偏向される。格子１２の代わりに別の散乱要素、例えばＤＭＤ、ＬＤＣフィルタ、ＬＣｏＳ、または分散要素を使用してもよい。放射は光学系１３および１４により、ならびにビームスプリッタ７および対物レンズ３を介し、パルス状の放射が画像面１５内で初めて、照明源から放出されたときのパルス長を再び有するように結像される。画像面１５内で厳密に同じパルス長が再び存在するのは理想的な場合である。散乱要素後のビーム経路内の分散要素により、画像面１５内では現実には少し長いパルス長が存在している。それでもなお画像面１５内では散乱要素後のビーム経路内での最短のパルス長が存在する。つまり、照明源９はパルス状の原ビームを放出し、この原ビームは、試料２内にある画像面１５内でようやく再び散乱要素後の最小のパルス長が生じるように、散乱要素および光学系を介して修正される。画像面１５の上側および下側では、パルス長はより大きい。
【００２６】
図２では、照明用ビーム経路８のビーム経路は実線で記入されている。格子１２の要素からの放射は破線で描かれている。見えているように、格子１２の格子要素に当たる放射はスペクトル的に分光される。放射のスペクトル成分は、画像面１５に対してのみ同じ継続時間を有しており、したがって、画像面１５内でのみ、照明源９から来るような原ビームのパルスが、最小のパルス長のパルスへと再構成される。これは、実線の照明用ビーム経路が示すように、画像面１５全体に適用される。ＳＯＦＩに有用に明滅する蛍光放射を放出させるため、原ビームのパルス長のパルス状放射によってのみ励起される物質を選択することで、図２の顕微鏡により、照明放射１０を照射した際に所望の深さの選択を実現することができる。これは、実線で描かれたビーム経路が明らかにしているように広視野で行われる。
【００２７】
図３は、概略的に示した顕微鏡１の形態において、図１の方法のさらなる一実施形態を示している。説明を繰り返さないために、機能的または構造的に図２の要素に対応する要素には同じ符号を付している。
【００２８】
図３にも、要素１７〜１９および点で描かれたビーム経路により、後になって初めて図４に基づいて説明される一変形形態が記入されている。図３の顕微鏡１は、図２の顕微鏡とは実質的に照明用ビーム経路８によって異なっている。ここでも照明源９は、ビーム成形機構１１によって修正される光線を放出する。図２でビーム成形機構１１が、まずはテンポラル合焦による光切断のために格子１２ならびに光学系１３および１４によって形成されていた場合、図３のビーム成形機構１１は、顕微鏡１の光軸６を横切るシート光１６の形態での照明放射を照射させる。これにより、試料２はシート光１６の範囲内でのみ照らされ、したがって、このシート光が深さ面を規定する。
【００２９】
図４は、顕微鏡検査方法のさらなる一実施形態を概略的に示している。この顕微鏡検査方法は、工程Ｓ３およびＳ４に関しては図１の方法に対応しており、したがって、これらの工程の説明の繰り返しを省くことができる。違いは工程Ｓ２の形態にあり、図４の実施形態では工程Ｓ２が２つの部分に分かれて形成されている。工程Ｓ２は２つの工程Ｓ２ａおよびＳ２ｂから成っている。工程Ｓ１も工程Ｓ１’に変形されている。工程Ｓ１’では試料が準備され、この試料の物質は、多光子効果により蛍光状態に切り替えられ、蛍光状態ではこの物質はＳＯＦＩに有用な蛍光放射を統計学的な明滅挙動で放出する。言い換えると、切替え用放射の照射後に初めて、試料（つまり試料の蛍光を発する分子）を励起することができる。切替え用放射が照射されなかった範囲では、試料はたとえ励起用放射が照射されても、ＳＯＦＩに有用な蛍光挙動を示すことはなく、理想的な場合には蛍光をまったく発しない。したがって工程Ｓ１’は、切替え用放射により、その後の励起用放射の照射によって蛍光放射を放出させるために試料を励起可能な状態に移し得る物質で試料を標識するか、または内在的に適切な物質を含有する試料を選択することを含んでいる。
【００３０】
図１の実施形態の工程Ｓ２で照射された照明放射は、つまり図４の実施形態では２つの成分、切替え用放射および励起用放射を含んでいる。これに対応して工程Ｓ２は２つの工程Ｓ２ａおよびＳ２ｂに分かれている。工程Ｓ２ａでは切替え用放射を照射する。これは、それにより所望の深さの範囲が選択されるように行われる。その後、工程Ｓ２ｂでは励起用放射を試料に照射する。この場合、試料は予め工程Ｓ２ａでの照明により切り替えられた範囲内でのみ蛍光放射を放出し得るので、深さの選択はもう行わなくてよい。
【００３１】
照明放射の供給が２つの部分に分かれていることに本質的な利点がある。切替え用放射を施すために走査型またはスキャン型の方法を用いることができる。走査型またはスキャン型の手法は、それ自体ではＳＯＦＩ原理とは相いれない。なぜならＳＯＦＩ原理では、一連の画像Ｉｎにおいて異なる明滅状態を存在させるために、試料全体を同時に結像しなければならないからである。したがって、画像の様々な範囲を次々と捕捉する走査型の画像撮影は考慮の対象にならない。それにもかかわらず図４の方法では切替え用放射を、走査しながら、つまり個々の試料区域を次々と走査しながら施すことができる。なぜなら蛍光放射の励起が後になって工程Ｓ２ｂで初めて行われるからであり、そこでは、もちろん広視野で行われ、結像（工程Ｓ３）も広視野で行われる。
【００３２】
つまり工程Ｓ１’で、多光子効果を介して切り替えられる相応の物質を使用した場合に、試料が走査される。
その代わりに、工程Ｓ２ａでは例えばテンポラル合焦が考慮される。したがって本方法の代替的な一実施形態に関しては図２の顕微鏡はこれまで説明した構造とは異なり、照明源９が切替え用放射をパルス状に供給するような構造になっている。多光子方法のために必要なパルス長、つまり強度は、画像面１５内でのみ存在する。つまり工程Ｓ２ａは、照明用ビーム経路８および照明源９の相応の動作によって実現される。工程Ｓ２ｂを実施するために追加的にビームスプリッタ１７が設けられており、このビームスプリッタは、この場合は励起用放射１９として機能するビーム源からの光を顕微鏡１のビーム経路内にカップリングし、その際、試料は広視野で照明される。その後、画像面１５内の予め準備された範囲だけが、統計学的に明滅する蛍光放射を放出する。つまり変形された構造方式では、照明放射は照明用ビーム経路８と（要素１７〜１９によって実現された）励起用ビーム経路とから成る組合せによって実現されている。この実施形態では、テンポラル合焦が既に深さの選択を実現しているので、切替え用放射のスキャンは必ずしも必要ではない。
【００３３】
図３は、図４による方法の実施形態に関して、この場合は多光子方法によるスキャン型の試料準備のための顕微鏡を示している。この実施形態では要素９〜１１が、励起用放射による試料２の広視野照明をもたらすように変形されている（図示されていない）。この励起は、光軸６を横切って行うことができるが、その代わりに光軸６に沿って行うこともできる。追加的にビームスプリッタ２０が設けられており、このビームスプリッタには、切替え用ビーム源２２からの原ビームをスキャン偏向するスキャナ２１からの放射が供給される。したがって、試料２の表面に沿って走査する切替え用ビーム２３が存在している。この切替え用ビームは、多光子効果により物質試料２を、後に励起用放射が物質試料２を励起し得る状態に切り替える。多光子方法に基づき、物質の切替えに必要な強度は、試料２の狭く限定された深さ範囲内にのみ存在する。したがって工程Ｓ２ａは、スキャナ２１および切替え用ビーム源２２の適切な制御により実施され、工程Ｓ２ｂはビーム源９の適切な制御により実施される。
【００３４】
これらの顕微鏡のすべての実施形態では、制御機器（描き込まれていない）が設けられており、この制御機器が、図１または図４の方法を実施するために顕微鏡のコンポーネントを適切に制御する。
【００３５】
単一画像から成る一連の画像Ｉｎは、ＳＯＦＩ処理Ｓ４において高解像度画像Ｉｆに変換される。その際、例えばデルティンガー他（Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）によって説明された原理が使用される。同様に、この原理に対してデルティンガー他（Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）によって改良された、国際公開第２０１０／１４１６０８号によるコンセプトも使用することができる。この刊行物も、この観点において全面的に本願明細書に援用することになる。
【００３６】
ＳＯＦＩ原理のために必要な蛍光体の明滅は、第１の蛍光を発する状態から第２の蛍光を発しない状態への移行によって定義される。この蛍光を発しない状態とは、画像のために評価される蛍光放射が放出されないあらゆる状態のことである。したがって蛍光を発しない状態とは、蛍光体が別の蛍光スペクトル領域内で光っている状態であっていっこうにかまわない。
【００３７】
第１の状態から第２の状態への移行確率は、例えばハイレマン他（Ｈｅｉｌｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  １２１、７０３６頁、２００９といった出版物から知られているように、例えば化学的な影響、温度の影響、または照明の影響によって修正することができる。
【００３８】
ＳＯＦＩ原理は、それぞれの画像撮影速度または画像積分時間に対し、光っている蛍光体と光っていない蛍光体の割合が１：１である場合が特に効率的である。この両方の状態が同じ持続時間の場合、第１の状態から第２の状態および第２の状態から第１の状態の移行確率は、理想的には０．５であることが望ましい。これは、化学的な作用、温度の作用、または照明の作用を用いて試料を相応に操作することによって達成できる。その際、照射するスペクトル分布を最適化することにより、前述の最適比率１：１を達成するために移行確率を最適化することができる。したがってＳＯＦＩ原理は、別の顕微鏡検査方法とは著しく異なる移行確率を必要とする。例えばＰＡＬＭ原理（ｄＳＴＯＲＭとも言う）は、蛍光体の圧倒的な割合が暗状態にある状態を必要とする。
【００３９】
できるだけ蛍光体の半分が明状態にあることを達成するには、移行確率だけでなく、暗時間も考慮しなければならない。明から暗への移行確率が０．５であっても、暗状態の持続時間がはるかに長い場合には１：１の最適比率にはなっていないであろう。したがって、移行確率および暗持続時間（もしくは明持続時間）のうちの少なくとも一方を最適に調整し、かつ画像撮影速度または画像積分時間に適合させることにより、光っている蛍光体と光っていない蛍光体の比率を、最適値１：１を目指して最適化するために、現況技術で用いられている移行確率および暗時間を修正するための手段を用いることが特に好ましい（また試料エリアより小さいかもしれない画像エリアの結像にまったく依存しない）。逆に、撮影速度を持続時間に適合させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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