(57)【要約】  ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドが提供される。そのような結合により、単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒト可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）になることが妨げられる。単離された抗体またはリガンドの内の１種または複数種を含有する医薬組成物が更に提供される。抗体の組み合わせを使用して、ヒトＴＮＦにより媒介される疾患（例えば、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、メタボリックシンドローム、アルツハイマー病、ＨＩＶ、ＩＩ型糖尿病）を有する対象を処置する方法が更に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドであって、前記結合により、前記単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられる、抗体またはリガンド。
【請求項２】
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープは、配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨを有する、請求項１に記載の抗体またはリガンド。
【請求項３】
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープは、配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する、請求項１に記載の抗体またはリガンド。
【請求項４】
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープは、配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有する、請求項１に記載の抗体またはリガンド。
【請求項５】
膜貫通型ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）に結合しないおよびｔｍＴＮＦの構造または生物学的活性に影響を及ぼさない請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはリガンド。
【請求項６】
インタクトで生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦに結合しない請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはリガンド。
【請求項７】
ポリクローナルのアフィニティ精製抗体またはこのフラグメント、モノクローナル抗体またはこのフラグメント、抗体の単離された一本鎖、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、高親和性抗体もしくはリガンドまたはこれらのフラグメントである請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはリガンド。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸８〜１５位または８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープ、および配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有するＴＮＦ単量体特異的エピトープと反応する二重特異性抗体である請求項７に記載の抗体またはリガンド。
【請求項９】
前記抗体フラグメントは、ｓｃ−Ｆｖ構築物、Ｆａｂ構築物、Ｆａｂ2構築物または軽鎖可変配列もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列である、請求項７に記載の抗体またはリガンド。
【請求項１０】
前記抗体またはフラグメントはポリエチレングリコール分子を更に含む、請求項７に記載の抗体またはリガンド。
【請求項１１】
ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドであって、前記結合により、前記単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられる、抗体またはリガンドと、薬学的に許容される基剤または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗体またはリガンドは、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはリガンドである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたは配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープに特異的に結合する抗体またはリガンド、および
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有する
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープに特異的に結合する抗体またはリガンド
から選択される１種または複数種の抗体またはリガンドを含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸８〜１５位または８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープ、および配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有するＴＮＦ単量体特異的エピトープと反応する二重特異性抗体を含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトＴＮＦにより媒介される疾患を有する対象を処置する方法であって、
ｓＴＮＦの解離単量体がインビボで集合してまたは再集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることを妨げることによりまたは低減させることにより、ｔｍＴＮＦの量、濃度または生物学的活性に影響を及ぼすことなく、前記疾患を有する対象の血液中における生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの量または濃度を低減させること
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたまたは合成の抗体またはリガンドを、前記抗体またはリガンドを必要とする対象に投与することを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象の血流中における生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの量または濃度の低減を長時間にわたり維持することを更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象の細胞内病原体による感染に対するまたは悪性腫瘍に対する感受性が処置により増加しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記感染は結核、細菌性敗血症、侵襲性真菌症もしくはヒストプラスマ症である、または前記悪性腫瘍はリンパ腫もしくは肝脾Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体またはリガンドは、薬学的に許容される基剤または希釈剤により医薬組成物中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物を静脈内投与する、または皮下投与する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与を定期的に繰り返す、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、肥満、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症、随伴性心血管疾患、アルツハイマー病または神経変性疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患は、炎症中にまたは炎症性障害の経過中に産生される生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの病原性の結果である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＩＶ−１に感染している対象を処置する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたもしくは合成の抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を、前記抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を必要とする前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２６】
ＩＩ型糖尿病を有する対象を処置する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に
記載の単離されたもしくは合成の抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を、前記抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を必要とする対象に定期的に投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記対象をその他の糖尿病の薬剤で同時に処置している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与を、前記対象がその他の糖尿病の薬剤による処置を中止した後に定期的に繰り返す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトＴＮＦにより媒介される疾患を有する対象を処置するために、ｓＴＮＦの解離単量体がインビボで集合してまたは再集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることを妨げることによりまたは低減させることにより、ｔｍＴＮＦの量、濃度または生物学的活性に影響を及ぼすことなく対象の血液中における生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの量または濃度を低減させる組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたまたは合成の抗体またはリガンドを含む請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＨＩＶ−１に感染しているまたはＩＩ型糖尿病を有する対象を処置するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたもしくは合成の抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子様式で提出した資料の参照による援用
本出願人は、本明細書と共に電子様式で提出した配列表資料を参照により援用する。このファイルはＧＧＰ１１ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられており、２０１４年１月２３日に作成されて２ＫＢのサイズである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、以前は腫瘍壊死因子−αと呼ばれていた）は、関節リウマチ、ならびに強直性脊椎炎、若年性関節リウマチおよび乾癬性関節炎等の関連する炎症性疾患の病理において主要な役割を果たす炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍａｔｏｒｙ）サイトカインである。ヒトプロフォームの膜貫通結合ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）は、非共有結合的に会合している３つの単量体を含む２６−ｋＤａのホモ三量体であり、各単量体は、細胞膜に埋め込まれているＮ末端配列を有する。ｔｍＴＮＦの各単量体は、２３３個のアミノ酸の配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録受入番号Ｐ０１３７５）を有する。可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）は、プロフォームｔｍＴＮＦの酵素的開裂により形成されるホモ三量体である。ｓＴＮＦ三量体の各単量体は１５７個のアミノ酸の配列（配列番号１）を有しており、この配列は、公開された受入番号Ｐ０１３７４のアミノ酸７７〜２３３位と同じ配列である。
【０００３】
両方の型の活性なＴＮＦ（ｔｍＴＮＦおよびｓＴＮＦ）はホモ三量体として存在しており10〜13、構築されたホモ三量体におけるＴＮＦ単量体間の溝中の受容体結合部位を認識する三量体受容体とかみ合う。単量体間の溝は、２つの隣接する単量体由来のアミノ酸配列を含む14、15。両方の型のＴＮＦの受容体結合部位は同一である。
【０００４】
三量体の完全性は生物学的機能に必須である。ｔｍＴＮＦの場合、三量体の構造はｔｍＴＮＦの細胞膜への挿入前に細胞内で確立されており16、膜、更には膜境界でパルミトイル化アミノ酸側鎖により固着している脂質を通過するタンパク質のステムの固着により、ｔｍＴＮＦ中に維持される17。対照的に、ｓＴＮＦの活性な三量体は、不活性な単量体配列番号１と、３種の型間での定常状態均衡で活性なｓＴＮＦホモ三量体として再び生じる二量体とに自由に解離する18。
【０００５】
抗ＴＮＦ生物製剤は、抗ＴＮＦモノクローナル抗体ＲＥＭＩＣＡＤＥ（インフリキシマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）およびＨＵＭＩＲＡ（アダリムマブ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ならびに広く使用されている、Ｆｃに融合したキメラ可溶化ＴＮＦ受容体、即ちＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト、Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）による上述の炎症性疾患の管理に大きな進歩をもたらしている1、2。この治療上のおよびマーケティング上の成功は、重度の感染および悪性腫瘍のまれではあるが統計学的に有意な発生により損なわれており3、4、免疫防御を損なうｔｍＴＮＦ5、6の機能の随伴性の阻害とおそらく関連している。この有害な発生は、細胞内病原体、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）ならびに特定の型の癌に主に起因する、結核、全身性の真菌感染ならびにその他の細胞内感染の発症を含んでいる。この結果は驚くほどのことではなかった。なぜならば、これらの薬剤は炎症誘発性のｓＴＮＦを阻害するがｔｍＴＮＦも阻害しており、ｔｍＴＮＦは、そのような細胞内感染および悪性腫瘍の接触分泌による細胞コントールに必須だから
である3、7、9。
【０００６】
両方の型のＴＮＦの受容体結合領域は同一であることから、他方に対して一方の型の受容体のかみ合いを選択的に阻害する新規のモノクローナル抗体の開発の望みはほとんどない。ＴＮＦの短配列に対する抗体は有用な治療法につながっていない。例えば、１９８７年にＳｏｃｈｅｒら26は、ＴＮＦの完全なまたは部分的な合成配列に対する抗体の調査において、ＴＮＦの生物学的活性および受容体結合を阻害すると思われるＴＮＦフラグメント１〜１５に対する高ポリクローナル抗体反応を観測した。しかしながら、この１６年経過した観測は更なる治療用薬剤の開発にはつながっていない。なぜならばおそらく、ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦアミノ酸１〜１５位と会合していない不連続な表面領域であるからだろう。その後の研究者らは２００１年に、パピローマウイルス様粒子にコンジュゲートしたＴＮＦアミノ酸４〜２３位をカップリングさせ、ポリクローナル抗体の誘発と実験的な関節炎の減弱とを観測した27。その他の研究者らは２００７年に、ウイルス様粒子をベースとする組成物にカップリングさせた同じフラグメントＴＮＦアミノ酸４〜２３位を使用し、実験的な関節炎を減弱させる抗体を誘発した。完全長ＴＮＦの免疫化とは対照的に、感染に対する耐性の抑制は生じなかった28。これらのＴＮＦフラグメントはＴＮＦの受容体結合領域を対象としていなかったことから、これらの刊行物は、結果として生じるポリクローナル抗体の治療的使用の更なる教示または示唆を示さず、それ以降、更なる研究は発表されていない。
【０００７】
先天性免疫に必要なｔｍＴＮＦ機能を保持しつつｓＴＮＦの炎症誘発活性を選択的に抑制しようとするもう一つの最近の試みは、不活性である三量体を形成する合成の優性ネガティブＴＮＦ単量体多様体の設計を含んでいた19。感染に対する先天性免疫を抑制することなく実験的な関節炎を減弱することが示されており20、関節炎の原因におけるｓＴＮＦの主要な役割が強調された。別の試みは、単量体間の接触領域と相互作用する小分子薬剤の探索である。ある分子、即ちＳＰ３０４は、そのような接触領域にμＭの親和性で結合し、インビトロでの三量体の破壊をもたらした21、22。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
様々な炎症性疾患の抗ＴＮＦ処置の分野における過多な文献にもかかわらず、当該技術分野には、細胞性免疫の抑制に起因する有害な副作用を生じさせない、これらの疾患用の新規で有用な組成物と治療用のまたは予防用の免疫原性組成物を生成する方法との必要性がまだある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載しているように、本発明者は、選択された抗ＴＮＦ単量体に特異的な生物学的組成物、およびこの生物学的組成物の、ｔｍＴＮＦの構造もしくは生物学的活性に影響を及ぼさないまたは処置した対象の細胞内病原体による感染に対する感受性を増加させない様々な使用方法を提供している。
【００１０】
一態様では、ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドが提供される。この抗体またはリガンドの単量体への結合により、単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられる、または阻止される。一実施形態では、この抗体またはリガンドは、配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたは配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶの単量体特異的エピトープＡ２に特異的に結合する。更に別の実施形態では、この抗体またはリガンドは、配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦの単量体特異的エピトープＦに特異的に結合する。一実施形態では、この抗体は、エピトープＡ２およびＦを対象とする二重特異性抗体である。
【００１１】
別の態様では、医薬組成物は、ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する１種または複数種の単離されたまたは合成の抗体またはリガンドであって、この結合により、単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられるまたは阻止される、抗体またはリガンドと、薬学的に許容される基剤または希釈剤とを含む。ある実施形態では、この組成物は、上記の抗体の内の１種または２種を含有する。
【００１２】
更なる態様では、ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドを調製するまたは生成する方法が提供される。
【００１３】
更に別の態様では、可溶性ヒトＴＮＦ（ｓＴＮＦ）により媒介される疾患を有する対象を処置する方法は、ｔｍＴＮＦの量、濃度または生物学的活性に影響を及ぼすことなく、この疾患を有する対象の血液中におけるｓＴＮＦの量、濃度または生物学的活性を低減させることを含む。このことは、ｔｍＴＮＦの量、濃度または生物学的活性に影響を及ぼすことなく、ＴＮＦの解離単量体がインビボで集合してまたは再集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることを妨げることにより、阻止することによりまたは低減させることにより達成される。ある実施形態では、この方法は、上記のおよび本明細書に記載の単量体特異的抗体、二重特異性抗体、リガンドおよび組成物を用いる。一実施形態では、疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬性関節炎または乾癬である。
【００１４】
更に別の態様では、ｓＴＮＦの上昇はまた、最初のＨＩＶ感染ならびに潜伏ＨＩＶ感染およびＩＩ型糖尿病の再発にも関与する。従って、更に別の態様では、ＨＩＶ−１に感染しており、抗レトロウイルス剤で処置されている対象が新たな感染（または潜伏ＨＩＶに起因する反跳性感染）を発症することを予防する方法は、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）で処置されている対象に、ＡＲＴの中断後に本明細書に記載の単離されたまたは合成の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を投与することを含む。
【００１５】
更に別の態様では、ＩＩ型糖尿病を有する対象を処置する方法は、上記の単離されたまたは合成の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を、既知の抗糖尿病療法と任意選択的に併用して、この抗体またはリガンドまたは医薬組成物を必要とする対象に定期的に投与することを含む。
【００１６】
その他の態様では、本明細書に記載のＴＮＦ単量体特異的抗体、リガンド、二重特異性抗体または組成物は、本明細書で特定したあらゆる疾患を含む、可溶性ヒトＴＮＦにより媒介される疾患または障害の処置で使用するために提供される。その他の態様では、本明細書で特定したあらゆる疾患を含む、可溶性ヒトＴＮＦにより媒介される疾患または障害の処置用の医薬品の調製における本明細書に記載の抗体、リガンドまたは組成物の使用が提供される。
【００１７】
これらの方法および組成物のその他の態様および利点を、以下の詳細な説明において更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＴＮＦ界面ＡおよびＴＮＦ界面Ｆに関する免疫源およびエピトープの検出用配列を説明する図であり、これらの配列を、本明細書に記載の３つの単量体特異的ＴＮＦエピトープＡ１、Ａ２およびＦの配列および縁を特定するために、ならびに生成した抗ＴＮＦ単量体特異的抗体の単量体特異的ＴＮＦエピトープＡ１、Ａ２およびＦへの結合活性を特定するために使用した。これらの配列を以下の実施例１で論じる。
【図２Ａ】ｓＴＮＦアミノ酸１〜２３位でラットを免疫化することによりＴＮＦ単量体特異的エピトープを説明する棒グラフである。組換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）で、単量体、二量体および三量体の混合物で、ならびに指定の末端短縮ＴＮＦペプチドを用いる合成ペプチドで抗体結合反応を測定した。合成の検出用ペプチドには以下が含まれた：配列番号１のＴＮＦアミノ酸１〜１０位、結合を全く示さなかった；配列番号１のＴＮＦアミノ酸５〜１２位、最小の結合から結合なし；配列番号１のＴＮＦアミノ酸４〜１２位であるＡ１エピトープＳＳＲＴＰＳＤＫＰ；配列番号１のＴＮＦアミノ酸４〜１１位ＳＳＲＴＰＳＤＫ；配列番号１のＴＮＦアミノ酸９〜１５位ＳＤＫＰＶＡＨ；配列番号１のアミノ酸８〜１５位のＡ２エピトープ配列；配列番号１のＴＮＦアミノ酸８〜１４位ＰＳＤＫＰＶＡ；および配列番号１のＴＮＦアミノ酸１６〜２３位ＶＶＡＮＰＱＡＥ、結合を示さなかった。ＴＮＦアミノ酸１〜２３位に対しては、ラットの抗血清により、２つの重複するエピトープのみが検出されたのは明らかであり、これらの重複するエピトープは、ＴＮＦアミノ酸４〜１２位であるエピトープＡ１およびＴＮＦアミノ酸８〜１５位であるエピトープＡ２であった。
【図２Ｂ】合成ペプチドにより、図２Ａの記載と同じ方法を使用してマウスの血清中で検出したＡ２エピトープＰＳＤＫＰＶＡＨＶの縁を説明する棒グラフである。合成の検出用ペプチドには以下が含まれた：配列番号１のＴＮＦアミノ酸１０〜１７位ＤＫＰＶＡＨＶ、最小の結合を示した；ＴＮＦアミノ酸９〜１６位、最小の結合；配列番号１のＴＮＦアミノ酸８〜１６位であるＡ２エピトープＰＳＤＫＰＶＡＨＶ；配列番号１のＴＮＦアミノ酸８〜１５位ＰＳＤＫＰＶＡＨ；および配列番号１のＴＮＦアミノ酸８〜１４位ＰＳＤＫＰＶＡ、結合なし。ラットのおよびウサギの血清を使用した場合、エピトープＡ２の境界は配列番号１のアミノ酸８〜１５位である。グラフに示すように、マウスの免疫系はＴＮＦアミノ酸８〜１６位のみを認識し、ＴＮＦアミノ酸８〜１５位には結合しない。
【図２Ｃ】
【化１】
2016508485.tif 000002
（界面領域に下線を引き、Ｆエピトープはボールド体である）である配列番号１のｓ
ＴＮＦアミノ酸１１２〜１２８位によってラットまたはマウスを免疫化することによ
る、単量体特異的ＴＮＦエピトープの縁の特定の結果を説明する棒グラフである。組
換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）で、単量体、二量体および三量体の混合物で、ならびに指定
の４種の末端短縮ＴＮＦペプチドを用いる合成ペプチドで抗体結合反応を測定した。
合成ペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１８〜１２４位であるＩＹＬＧＧＶＦ、配
列番号１のアミノ酸１１７〜１２４位であるＰＩＹＬＧＧＶＦ、配列番号１のアミノ
酸１１６〜１２４位であるＥＰＩＹＬＧＧＶＦ（エピトープＦ）および配列番号１の
アミノ酸１１６〜１２３位であるＥＰＩＹＬＧＧＶであった。最大の結合はアミノ酸
１１６〜１２４位のペプチドに対するものであり、これにより、エピトープ（エピト
ープＦと称する）の縁が示された。
【図３Ａ】以下の実施例２に記載するように、２００ｎｇ／ｍＬのｓＴＮＦ、ビオチン標識化抗体および非ビオチン標識化抗体を使用するサンドイッチアッセイからのデータを説明するグラフである。結合曲線は、市販のＲＥＭＩＣＡＤＥ抗ＴＮＦ抗体が、ビオチンで標識化してｓＴＮＦ（三量体、二量体および単量体）と混合した場合にＴＮＦの多量体型に結合することを示す。混合物中におけるビオチン化抗体−ＴＮＦは、未標識のプレート化（ｐｌａｔｅｄ）ＲＥＭＩＣＡＤＥ抗体（●）に結合してこの抗体とサンドイッチを形成することができる利用可能なＴＮＦ三量体エピトープを依然として有する。対照的に、配列番号１のＴＮＦアミノ酸１〜２３位で免疫化したラットからプロテインＡ／プロテインＧ精製ＩｇＧ（○）を得た。この精製ＩｇＧは、エピトープＡ１に選択的に結合する単量体特異的抗ＴＮＦとエピトープＡ２に選択的に結合する単量体特異的抗ＴＮＦとの混合物を含有する。このアッセイでは精製ＩｇＧ（○）はサンドイッチを形成しない。なぜならば、この抗体がＴＮＦ混合物中のＴＮＦ単量体に結合すると、標識化した単量体特異的抗体−ＴＮＦ複合体は、プレート上の未標識のプレート化単量体特異的抗体に結合するための利用可能な単量体特異的エピトープを有しないからである。結合していないプレートから、標識化ＴＮＦ単量体特異的抗体−単量体複合体を簡単に洗浄する。このアッセイでは、陽性コントロールとして三量体ＴＮＦに結合するＲＥＭＩＣＡＤＥ抗体を使用した。結果として、抗Ａ１抗体も抗Ａ２抗体もｓＴＮＦの三量体型に結合しない。
【図３Ｂ】試薬として以下のものを使用する、図３Ａのサンドイッチアッセイと同様のサンドイッチアッセイからのデータを説明するグラフである：市販のＲＥＭＩＣＡＤＥ抗ＴＮＦ抗体（●）；エピトープＦ：ＥＰＩＹＬＧＧＶＦのみに選択的に結合する、ＴＮＦエピトープＦに対する単量体特異的抗血清由来のアフィニティ精製ＩｇＧ（×）およびエピトープＦ：ＥＰＩＹＬＧＧＶＦのみに選択的に結合する、ＴＮＦエピトープＦに対する単量体特異的抗血清由来のプロテインＡ／Ｇ精製ＩｇＧ（□）。結果として、市販のＲＥＭＩＣＡＤＥ抗ＴＮＦ抗体とは対照的に、抗Ｆ抗体はｓＴＮＦの三量体型に結合しない。
【図４Ａ】単量体特異的エピトープＰＳＤＫＰＶＡＨおよびＳＳＲＴＰＳＤＫＰ（それぞれエピトープＡ２およびエピトープＡ１）に選択的に結合する抗体を含有する、ＴＮＦアミノ酸１〜２３位に対して生成された抗血清を使用する、標的細胞におけるｓＴＮＦ誘発細胞傷害性の抗体抑制のアッセイの結果を説明するグラフである。棒線の下に、１×１０6、２．５×１０5、１×１０5、２．５×１０4、１×１０4および２．５×１０3からの、全てのウェルにおける２００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦを有する抗血清の力価を示す。最後の棒線は５０％ＮＲＳ中のｓＴＮＦである。
【図４Ｂ】ＴＮＦエピトープＦに対する抗血清による実施例２に記載のアッセイでの、アクチノマイシン処理したＷＥＨＩ細胞におけるｓＴＮＦ細胞傷害性の機能的阻害を説明するグラフである。ラットにおいて配列番号１のアミノ酸１１２〜１２８位である免疫源ＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫ（ＴＮＦのＦベータシート界面配列）に対して生成された単量体特異的抗血清の指定の希釈液（５０％、１６．７％、５．６％、１．８５％、０．４８％）を、２００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦおよび５０％ＮＲＳ（正常なラット血清）によるｓＴＮＦの生物学的活性を抑制する能力に関して比較した。この図に示されているように、０．４８％〜５０％に希釈した抗血清を使用すると、ＴＮＦ細胞傷害性の抑制が示された。結果として、エピトープＦに対する単量体特異的抗血清は、抗血清の存在下での細胞の複製の増加により明らかなように、細胞へのｓＴＮＦの細胞傷害作用を抑制する能力を示した。一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔ検定による後検定によって、統計学的有意性を測定した。このアッセイでは、陽性コントロールとして、三量体ＴＮＦに結合するＲＥＭＩＣＡＤＥ抗体を使用した。
【図５】ＴＮＦエピトープＡ１またはＡ２に対して生成されたモノクローナル抗体による、ＷＥＨＩ細胞におけるｓＴＮＦ細胞傷害性の抑制を示す棒グラフである。ＴＮＦの非存在下で増殖させたＷＥＨＩ細胞において細胞複製（ＯＤ）を測定し、このＷＥＨＩ細胞では良好な複製が示された。０．２ｎｇ／ｍＬの配列番号１の完全長ＴＮＦ１〜１５７位の存在下で増殖させたＷＥＨＩ細胞では、ＴＮＦが複製を抑制したことが実証された。市販のＲＥＭＩＣＡＤＥ抗ＴＮＦ抗体を１μｇ／ｍＬ加えたＴＮＦ中で増殖させた細胞では、抗体が、ＴＮＦの非存在下で示されたのと同じレベルまで複製を戻したことが実証された。ＴＮＦエピトープＡ１（配列番号１のアミノ酸４〜１２位）に対する本発明者のモノクローナルの単量体特異的抗体Ａ１−４Ｈ６を１０μｇ／ｍＬ加えたＴＮＦは、ＷＥＨＩ細胞の複製の抑制に失敗し、ＴＮＦのみに曝した細胞のレベルで維持した。ＴＮＦエピトープＡ２（配列番号１のアミノ酸８〜１６位）に対する本発明者の単量体特異的モノクローナル抗体Ａ２−８Ｄ１２を１０μｇ／ｍＬ加えたＴＮＦの存在下で、およびＴＮＦエピトープＡ２（配列番号１のアミノ酸８〜１６位）に対する本発明者の単量体特異的モノクローナル抗体Ａ２−１０Ｈ１０を０．２５μｇ／ｍＬ加えたＴＮＦの存在下で、ＷＥＨＩ細胞を培養した。これらの後者の２種の単量体特異的モノクローナル抗体からのデータは、ｓＴＮＦ細胞傷害性のより高い統計的有意性の抑制（即ち、細胞死滅の低減）を示した。２番目の単量体特異的モノクローナル抗体Ａ２−１０Ｈ１０は、その他の単量体特異的抗Ａ２抗体Ａ２−８Ｄ１２と比べて、このアッセイにおいて効力の４０倍の増加という高い感受性を示した。これらの結果から、単量体特異的抗Ａ２モノクローナル抗体がｓＴＮＦを抑制すること、および１種のそのような抗体Ａ２−１０Ｈ１０は、４０倍低い用量により実証されるように、その他に比べて高親和性を示すことが実証される。単量体特異的抗Ａ１モノクローナル抗体により、高い用量でも抑制されないことが実証された。これらのデータから、ＴＮＦアミノ酸１〜２３位のポリクローナル抗血清の作用は単量体特異的抗Ａ２抗体のみに起因したことが実証された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者は、選択された抗ＴＮＦ単量体に特異的な生物学的組成物、ならびに一部または全体がＴＮＦ遊離単量体の内界面接触領域内である選択されたエピトープを対象とする抗体および／またはその他のリガンドが、ＴＮＦ遊離単量体とその他の単量体との会合を阻害し、生物学的に活性なｓＴＮＦ三量体の形成を継続的に妨げるという結論に基づく様々な使用方法を提供している。関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎（ＡＳ）および乾癬性関節炎（ＰＡ）、乾癬ならびにその他の炎症性疾患の処置のために、ｓＴＮＦの活性を選択的に阻害するがｔｍＴＮＦを阻害しない抗体またはリガンド、例えばモノクローナル抗体または二重特異性抗体を有することが利点である。
【００２０】
Ｉ．抗体／リガンド
そのため、本発明は、ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドであって、この結合により、単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられるまたは阻止される、抗体またはリガンドを提供する。
【００２１】
本発明者は、一部または全体が遊離ＴＮＦ単量体の内界面接触領域内である特定のエピトープを対象とする抗体が、遊離ＴＮＦ単量体とその他の単量体との会合を阻害し、三量体の形成を継続的に妨げることができたと結論付けた。ＴＮＦに関する既知の刊行物とは対照的に、本発明者は、配列番号１のアミノ酸１〜１５位のＴＮＦ配列中に２つの重複するエピトープが存在すると結論付けた。配列番号１のアミノ酸４〜１２位に及ぶ一方のエピトープＡ１は、単量体に特異的であったが三量体の形成を妨げなかった。配列番号１のアミノ酸８〜１５位または８〜１６位に及ぶ他方のエピトープＡ２は、単量体に特異的であり三量体の形成を妨げた。さらに、本発明者は、ＴＮＦのＦβシート中において配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である新規で未確認のエピトープＦを特定しており、このエピトープは、単量体に特異的であり三量体の形成を妨げた。これらのエピトープに特異的に結合する抗体またはリガンドの発見および新規の使用を、以下においておよび実施例において詳細に論じる。
【００２２】
初期のＸ線結晶学研究により、１５７個のアミノ酸（配列番号１）のｓＴＮＦ単量体が「「ジェリーロール」トポロジーを有する細長い逆平行βプリーツシートサンドイッチ」を形成することが証明された。密接しているが非共有結合的な会合である３つの単量体が活性三量体を構成した11。５つのストレッチのアミノ酸配列が、以下の界面βシート接触面を形成した：Ａ、配列番号１のアミノ酸１１〜１８位；Ａ’、配列番号１のアミノ酸３５〜３９位；Ｃ、配列番号１のアミノ酸５４〜６７位；Ｆ、配列番号１のアミノ酸１１４〜１２６位およびＨ、配列番号１のアミノ酸１４９〜１５７位、ここで、Ａ、Ａ’、Ｃ、ＦおよびＨは、βシート命名規則を指す11。本発明者は、潜在的なＢ細胞エピトープに関する５つ全ての領域を調査し、一部が界面領域内である２つのエピトープ（Ａβシート）と全体が界面領域内である１つのエピトープ（Ｆβシート）とに対する抗体を検出してマッピングしており、これらのエピトープは全て、ＴＮＦの受容体結合部位の既知の領域外であった12,13,15。以下の実施例１を参照されたい。
【００２３】
一実施形態では、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドは、配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたは配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶのエピトープＡ２に結合する。別の実施形態では、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドは、配列番号１のアミノ酸４〜１２位である配列ＳＳＲＴＰＳＤＫＰのＡ１エピトープに結合する。別の実施形態では、ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドは、配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦのＦエピトープに結合する。
【００２４】
以下に記載するように、Ａ１エピトープに対する抗体は、ＴＮＦ単量体に特異的であるものの、単独で使用した場合にＴＮＦ機能の阻害において不活性であることが分かっている。これらのＡ２エピトープおよびＦエピトープに対する抗体は、ＴＮＦ単量体に特異的に結合するが三量体には結合せず、ｓＴＮＦ三量体の構築を妨げ、インビトロでｓＴＮＦ機能を抑制する。これらの単量体に特異的な抗Ａ２エピトープおよび抗Ｆエピトープの抗体またはリガンドは、膜貫通型ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）には結合せず、ｔｍＴＮＦの構造または生物学的活性に影響を及ぼさない。加えて、これらの抗体またはリガンドは、インタクトで生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦには結合しない。Ａ２エピトープおよびＦエピトープに対するモノクローナル抗体は、ｓＴＮＦに関連する病理を有する関節リウマチおよび関連する炎症性疾患用のより安全でｓＴＮＦ選択的な抗ＴＮＦ生物製剤としての治療的使用に有用である。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、２本の軽鎖および２本の重鎖を有するインタクトな免疫グロブリンを指す。用語「抗体フラグメント」はインタクトな抗体の構造未満を指し、抗体フラグメントとして、単離された単一の抗体鎖、ｓｃ−Ｆｖ構築物、Ｆａｂ構築物、Ｆａｂ2構築物または軽鎖可変配列もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列等が挙げられるがこれらに限定されない。用語「二重特異性」抗体は、あるエピトープ、例えばＡ２エピトープに結合する１本の重鎖および／または１本の軽鎖と、別のエピトープ、例えばＦエピトープに結合する１本の重鎖および／または１本の軽鎖とを含有する、合成的にまたは組換えにより生成された抗体を指す。用語「リガンド」を、指定のエピトープに結合するように設計することができるその他の合成の分子または配列を指すために使用する。
【００２６】
「高親和性」とは、問題となっている抗体またはリガンドのＴＮＦ単量体特異的エピトープＡ２またはＦに対する結合の強さのことである。一実施形態では、Ａ２またはＦに対する抗体／リガンドは、１０ナノモル（ｎＭ）未満の親和性で結合する。別の実施形態では、Ａ２またはＦに対する抗体／リガンドは、１ナノモル（ｎＭ）未満の親和性で結合する。別の実施形態では、Ａ２またはＦに対する抗体／リガンドは、１００ピコモル（ｐＭ）未満の親和性で結合する。別の実施形態では、Ａ２またはＦに対する抗体／リガンドは、１０ｐＭ未満の親和性で結合する。
【００２７】
そのため、一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはリガンドは、ポリクローナルのアフィニティ精製されたもしくは高親和性の抗体またはこのフラグメントであることができる。一実施形態では、抗体またはリガンドは、モノクローナル抗体またはこのフラグメントである。別の実施形態では、抗体またはリガンドは、抗体の単離された一本鎖である。抗体の更にその他の形態、例えば合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはこれらのフラグメントを、上記のエピトープの内の１つを対象とするリガンドまたは抗体として用いることができる。そのような抗体の適切なフラグメントも用いることができる。更に別の実施形態では、抗体もしくはリガンドまたはこれらのフラグメントは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を更に含む。抗体もしくはリガンドまたはフラグメントを、既知の従来の方法によりＰＥＧと会合させることができる、またはＰＥＧと融合させることができる30、31。
【００２８】
選択されたエピトープの内の１つに特異的に結合する抗体またはリガンドの産生では、従来の技法を用いることができる。例えば、特定のエピトープを含有するペプチド／ポリペプチド組成物で、選択された動物、例えば霊長動物、齧歯動物またはヒトを免疫化することにより、ポリクローナル抗体組成物が概して産生される。例えば、図２Ａ〜２Ｃに記載の抗血清についての説明を参照されたい。高力価で高親和性のポリクローナル抗体の選別を、標準的な技法により、例えば酵素結合免疫吸着アッセイおよび表面プラズマ共鳴でモニタリングすることができる。必要に応じて、ポリクローナル抗体分子を哺乳動物から、例えば全血から、血漿からまたは血清から単離することができ、従来の技法により免疫化動物の血漿または血清から更に精製することができる。従来の回収技法として、特に血漿交換、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィーを挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体組成物それ自体を、本発明の医薬組成物として用いることができる。
【００２９】
また、モノクローナル抗体を、免疫化哺乳動物から得た抗体産生細胞を使用して、現時点で従来の技法により、エピトープの内のいずれか１つに対して生成することができる、および非ＩｇＧ産生骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを形成することができる、またはモノクローナル抗体は、既知の分子生物学的技法による抽出を有する活性化免疫Ｂ細胞からの選別由来であることができる。このモノクローナル抗体をその他の形態の抗体およびリガンド、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体の調製に使用することができる。ファージディスプレイライブラリ、抗体フラグメントおよびこれらの混合物のスクリーニングにより、その他の抗体フラグメントまたはリガンドを産生することができる。このタイプの抗体およびリガンドの生成技法は当該技術分野で公知であり、上記で特定したエピトープの開示したアミノ酸配列を使用して、リガンドそれ自体を生成することができる32、35〜39。
【００３０】
既知の技法を使用して、キメラ抗体を同様に開発することができる。キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種由来である分子のことである。本発明に従って産生されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の可変部分を使用して、例えば米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載のおよび米国特許第４，７０４，６９２号明細書に記載の従来の方法により、一本鎖抗体を調製することもできる。本明細書に記載の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドの生成において、抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメントおよびｓｃＦｖフラグメント、ならびにこれらのライブラリを用いることもできる。
【００３１】
選択されたエピトープの内の２つ以上に特異的に結合する二重特異性の抗体またはリガンドの産生では、従来の技法を用いることができる。複数のエピトープに結合する二重特異性抗体を開発することは当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｈｏｒｎｉｇ  Ｎ，Ｆａｅｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ  Ａ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ．”，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，９０７：７１３−２７；Ｓｐｅｉｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，”Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１３年７月７日，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１：７５３−７５８；およびＪｏｎａｔｈａｎ  Ｓ  Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｅｎｐｉｎｇ  Ｚｈｕ，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，２００５  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，２６：６４９−６５８を参照されたい。一実施形態では、エピトープＡ２およびエピトープＦに結合することができるまたはこれらのエピトープと反応することができる二重特異性抗体を開発する。そ
のような二重特異性抗体、例えばＡ２およびＦと反応する抗体は、単一の抗Ａ２のまたは抗Ｆの抗体またはリガンドのみと比べて結合活性を増強する、および効力を高める。
【００３２】
上記で特定したＴＮＦ単量体特異的エピトープの内の１つを有する組換えコンビナトリアル免疫グロブリンｓｃＦｖライブラリ（例えばファージディスプレイ）をスクリーニングして、ＴＮＦ単量体に結合する免疫グロブリンライブラリのメンバーを単離することにより、その他の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドを開発することができる。例えば、当該技術分野で公知のその他のテキストもある中で、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ編Ｋａｙ，ＢＫ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ．（１９９６）を参照されたい。ファージディスプレイライブラリを作成するためのおよびスクリーニングするためのキットは市販されており、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙキット等である。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、国際公開第９２／０９６９０号パンフレット、国際公開第９０／０２８０９号パンフレット等を参照されたい。
【００３３】
ＩＩ．医薬組成物
別の態様では、医薬組成物は、ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗体またはリガンドであって、この結合により、単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられるまたは阻止される、抗体またはリガンドを含む。
【００３４】
この医薬組成物は、上記の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドの内の１種または複数種を、適切な基剤または希釈剤と共に含有する。そのため、一実施形態では、この医薬組成物は、配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたは配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有するＡ２エピトープに特異的に結合する抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドを含有する。更に別の実施形態では、この医薬組成物は、配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有するＦエピトープに特異的に結合する、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドを含有する。
【００３５】
別の実施形態では、医薬組成物は、２種の抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドを含む。一実施形態では、この組成物は、配列番号１のアミノ酸８〜１５位であるＡ２エピトープＰＳＤＫＰＶＡＨまたは配列番号１のアミノ酸８〜１６位であるＡ２エピトープＰＳＤＫＶＰＡＨＶに特異的に結合する抗体またはリガンドと、配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有するＦエピトープに特異的に結合する抗体またはリガンドとを含む。
【００３６】
更に別の実施形態では、Ａ２エピトープとＦエピトープとに特異的に結合する二重特異性抗体を含有する医薬組成物は、可溶性ＴＮＦ三量体の形成の阻害でも有用である。当該技術分野で既知であるマルチリガンド構築物のその他の形態は、Ａ２エピトープおよび／またはＦエピトープへの結合を利用して三量体の破壊をもたらすこともできる。また、ｓＴＮＦにより媒介される様々な疾患を処置するために従来使用されるその他の治療レジメンまたは医薬レジメンと同時にまたは連続して本発明の抗ＴＮＦ単量体特異的組成物を使用することができる。
【００３７】
本明細書に記載のこの医薬組成物はまた、１種または複数種の薬学的に許容される基剤または希釈剤も含有する。本明細書で定義するように、本発明の免疫原性のタンパク様組成物での使用に適する薬学的に許容される基剤は当業者に公知である。そのような基剤として、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸塩緩衝液、アルコール／水溶液、乳濁液
または懸濁液が挙げられるがこれらに限定されない。その他の従来用いられる希釈液、アジュバントおよび賦形剤を、従来の技法に従って添加することができる。そのような基剤として、エタノール、ポリオールおよびこれらの適切な混合液、植物油ならびに注射用有機エステルを挙げることができる。緩衝剤およびｐＨ調整剤も用いることができる。緩衝剤として、有機酸または有機塩基から調製された塩が挙げられるがこれらに限定されない。代表的な緩衝剤として、有機酸塩、例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸もしくはフタル酸の塩等のクエン酸塩、Ｔｒｉｓ、トリメタンミン塩酸塩（ｔｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）またはリン酸塩緩衝剤が挙げられるがこれらに限定されない。非経口基剤として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル油または固定油を挙げることができる。静脈注射用基剤として、液体および栄養素補充液、電解質補充液、例えばリンゲルブドウ糖に基づくもの等を挙げることができる。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等も薬学的な基剤で用いることができる。本発明は、基剤の選択によって限定されない。上記の成分からの、適切なｐＨ等張性、安定性およびその他の従来の特徴を有するこの薬学的に許容される組成物の調製は当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｕｂｌ．，２０１２；およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第７版，編者Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２等のテキストを参照されたい。
【００３８】
ＩＩＩ．使用方法
Ａ．特定の炎症状態の処置
可溶性ヒトＴＮＦ（ｓＴＮＦ）により媒介される疾患を有する哺乳動物対象、好ましくはヒト対象を処置する方法は、ｔｍＴＮＦの量、濃度または生物学的活性に影響を及ぼすことなく、この疾患を有する対象の血液中におけるｓＴＮＦの量、濃度または生物学的活性を低減させることを含む。この低減は、ＴＮＦの解離単量体がインビボで集合してまたは再集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられることにより、阻止されることによりまたは低減されることにより起こる。そのため、一実施形態では、この方法は、ＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する、単離されたまたは合成の抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドを、この抗体またはリガンドを必要とする対象に投与することを含む。この選択された抗体またはリガンドは、インタクトで生物学的に活性なｓＴＮＦ三量体には結合しない。この選択された抗体またはリガンドは膜貫通型ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）には結合せず、ｔｍＴＮＦの構造または生物学的活性に影響を及ぼさない。
【００３９】
一実施形態では、この方法は関節リウマチの処置に有用である。別の実施形態では、この方法は強直性脊椎炎の処置に有用である。別の実施形態では、この方法は若年性関節リウマチの処置に有用である。更に別の実施形態では、この方法は乾癬性関節炎の処置に有用である。更に別の実施形態では、この方法は乾癬の処置に有用である。別の実施形態では、この方法は、炎症中にまたは炎症性障害の経過中に産生される生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの病原性の結果の処置に有用である。本発明の方法の更に追加の実施形態は、低レベルでまたは慢性的なレベルでｓＴＮＦおよび／または炎症が役割を果たすその他の疾患の処置に関わる。一実施形態では、そのような疾患はＨＩＶ−１である。別の実施形態では、この方法は２型糖尿病の処置に有用である。更にその他の実施形態では、治療用の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドは、肥満の病理における炎症を処置する方法で有用である。別の実施形態では、この方法は、メタボリックシンドロームの処置に有用である。別の実施形態では、この方法は、アテローム性動脈硬化症および随伴性心血管疾患の処置に有用である。別の実施形態では、この方法は、アルツハイマー病の
病理に関与する炎症の処置に有用である。別の実施形態では、この方法は、神経変性疾患の病理に関与する炎症の処置に有用である。更にその他の炎症性疾患40を本明細書に記載の組成物および方法で処置することができる。そのような処置は、非選択の薬剤に関連する免疫抑制および罹患率および死亡率に悩まされない。
【００４０】
従って、一実施形態では、この方法に有用な抗体／リガンドは、Ａ２エピトープ配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶに結合する。この方法の別の実施形態では、この方法に有用な抗体／リガンドは、ＦエピトープＥＰＩＹＬＧＧＶＦに結合する。これらの選択されたエピトープへの抗体／リガンドの結合により、単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられる、または阻止される。この方法の更なる実施形態では、これらの選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンドの内の２種を対象に投与する。更にその他の実施形態では、医薬組成物は、上記で論じた二重特異性抗体を含むことができる。
【００４１】
この方法の別の態様は、対象の血流における生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの量または濃度の低減を長時間にわたり維持することを含む。そのような維持は、上述の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体、リガンド、モノクローナル抗体、二重特異性抗体またはこれを含有する医薬組成物の内の１種または複数種の投与の繰り返しを含むことができる。これらの方法の使用によって、対象の細胞内病原体による感染、例えば結核、細菌性敗血症、侵襲性真菌症もしくはヒストプラスマ症に対するまたは悪性腫瘍、例えばリンパ腫もしくは肝脾Ｔ細胞リンパ腫に対する感受性は処置により増加しない。
【００４２】
これらの治療方法によれば、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドは、薬学的に許容される基剤また希釈剤により医薬組成物中に存在する。例えば、この抗体／リガンドの内の１種または２種を含有し、非ｓＴＮＦ免疫源を対象とする抗体も場合により含有する上記の医薬組成物のいずれかを用いることができる。
【００４３】
上記の各方法では、本発明のこれらの組成物を適切な経路で、例えば皮下経路で、粘膜経路で、静脈内経路で、腹腔内経路で、筋肉内経路で、経鼻経路でまたは吸入経路で投与する。投与の現在好ましい経路は、皮下、静脈内または筋肉内である。
【００４４】
各用量中に存在する、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体、リガンド、モノクローナル抗体もしくは二重特異性抗体または上記の構築物の量は、その他の免疫源に対するその他の抗体またはリガンドの有無にかかわらず、患者の年齢、体重、性別、全身の健康状態および処置する具体的な疾患についての検討を考慮して選択される。著しく有害な副作用をもたらすことなく患者に外因性効果をもたらすのに必要な抗体の量は、用いる医薬組成物に応じて変化する。ｓＴＮＦにより媒介される疾患を有する患者では、一般的に、各用量は、無菌溶液中における選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体の約５〜４００ｍｇ／ｍＬの注射液を含むことができる。抗体の別の投与量は約２００ｍｇ／ｍＬである。抗体の更に別の投与量は約１００ｍｇ／ｍＬである。更に別の実施形態では、抗体の投与量は約５０ｍｇ／ｍＬである。更なる実施形態では、抗体の投与量は約１０ｍｇ／ｍＬである。一緒に使用する場合、２つの単量体特異的ＴＮＦエピトープの内の異なる１つに対する各抗ＴＮＦ単量体特異的抗体の投与量は同一であることができる。別の実施形態では、２種の組み合わされた、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体間の相乗作用に起因して、組み合わせの投与量は、各抗体のみの付加的な単一投与量に比べて低い。Ａ２およびＦを対象とする二重特異性抗体の投与量は、これらのエピトープの内の１つのみに対する抗体の投与量に比べて低くなることができる。ｓＴＮＦエピトープ以外を対象とする抗体との更なる組み合わせにより、抗ＴＮＦ単量体特異的抗体の投与量を変更することができる。
【００４５】
一実施形態では、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンドの投与を疾患の経過
中に定期的に繰り返す。選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体の内の２種を処置の経過中に投与する様々な実施形態では、薬学的に許容される基剤中の各抗体／リガンドを、別々に、組み合わせてまたは任意の順序で連続的に投与する。
【００４６】
投与の頻度は、毎週から毎月または隔月の幅およびより少ない頻度であることができ、抗体の半減期および具体的な疾患の経過に依存することができる。一実施形態では、投与量を週に１回投与する。別の実施形態では、投与量を２週に１回投与する。別の実施形態では、投与量を月に１回投与する。別の実施形態では、投与量の投与の頻度は２ヶ月または３ヶ月に１回である。当業者は、その他の投与の幅を検討することもでき、特に抗体組成物の投与が疾患のその他の処置と併用されているまたは連続しているその他の投与の幅を検討することもできる。
【００４７】
Ｂ．ＨＩＶ−１感染の処置
更に別の態様では、対象を処置して、抗レトロウイルス剤で処置された対象における潜伏ＨＩＶ−１による再感染または反跳性感染を低減するまたは予防する方法が提供される。この方法によれば、ＡＲＴが投与されている対象に、エピトープＡ２またはＦに対する単離されたまたは合成の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体もしくはリガンド、モノクローナル抗体もしくは二重特異性抗体、またはこの抗体もしくはリガンド、モノクローナル抗体もしくは二重特異性抗体を含有する医薬組成物を投与する。一実施形態では、Ａ２エピトープまたはＦエピトープに結合する抗ＴＮＦ単量体特異的抗体を、抗レトロウイルス療法を受けている対象に投与する。別の実施形態では、Ａ２エピトープまたはＦエピトープに結合する抗ＴＮＦ単量体特異的抗体またはリガンドまたは組成物を、ＡＲＴを中断した直後から対象に投与する。更に別の実施形態では、抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンド／組成物を、ＡＲＴ処置を中断する前のおよびＡＲＴ処置の中断から長期の後の両方の対象に慢性的に投与する。この処置方法の目的は、ＡＲＴが最初のＨＩＶ感染のコントロールに成功した後の、異なる潜伏株またはＨＩＶの多様体による対象の再感染または反跳性感染を予防することである。
【００４８】
更にその他の実施形態では、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンドを、その他の抗ＨＩＶ組成物（例えば米国特許第７，９４３，１４０号明細書を参照されたい）と共に使用することができる。
【００４９】
上記方法のいずれかによれば、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンドを、薬学的に許容される基剤により、別々に、組み合わせてまたは任意の順序で連続的に投与する。組成物、投与量、投与の経路および投与の頻度は、記載されている通りであると予測される。しかしながら、本出願の教示を前提として、当業者は、その他の適切な投与量および投与の経路を用いることができる。特にＨＩＶの場合、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンド／組成物の投与は、不定期間にわたり定期的に繰り返されると予想される。
【００５０】
Ｃ．疾患の処置
更に別の態様では、ｓＴＮＦの上昇はまた、ＩＩ型糖尿病にも関与する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体および医薬組成物を利用して実行され得る疾患を処置する方法を含む。一実施形態では、ＩＩ型糖尿病を有するヒト対象を処置するこの方法は、単離されたまたは合成の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体もしくはリガンドまたは医薬組成物を、これを必要とする対象に定期的に投与することを含む。この抗体、リガンドまたは医薬組成物は、上記に具体的に記載したものの内のいずれかであることができる。一実施形態では、対象を、その他の糖尿病の薬剤で同時に処置する。更に別の実施形態では、選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンドまたは組成物の投与を、対象がその他の糖尿病の薬剤による処置、例えばインスリンま
たはメトホルミン等の経口薬による処置を中止した後に定期的に繰り返す。
【実施例】
【００５１】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、上記で論じた組成物および方法の特定の実施形態を説明する。これらの実施例は、特許請求の範囲および本明細書の開示を限定するものではない。
【００５２】
実施例１−ＴＮＦエピトープのマッピング
１５７個のアミノ酸ＴＮＦ単量体配列番号１は、細長い逆平行βプリーツシート構造を有する。３つの単量体が非共有結合性の三量体に会合する場合、生物学的に活性なｓＴＮＦが形成される。以下の５つのストレッチのアミノ酸配列が、界面βシート接触面を形成する：
Ａ  −  ＫＰＶＡＨＶＶＡ、配列番号１のアミノ酸１１〜１８位、
Ａ’−  ＡＬＬＡＮ、配列番号１のアミノ酸３５〜３９位、
Ｃ  −  ＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱ、配列番号１のアミノ酸５４〜６７位、
Ｆ  −  ＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬ、配列番号１のアミノ酸１１４〜１２６位、および
Ｈ  −  ＱＶＹＦＧＩＩＡＬ、配列番号１のアミノ酸１４９〜１５７位、
ここで、Ａ、Ａ’、Ｃ、ＦおよびＨは、βシート命名規則を指す11。
【００５３】
三量体の免疫学的な破壊を実現するために、本発明者は、隣接する単量体間の接触領域（いわゆる内部領域または界面領域）内に全体がまたは一部が存在するエピトープ配列に結合する抗体は、ｓＴＮＦまたはｔｍＴＮＦであるインタクトな三量体には結合せずＴＮＦの遊離単量体に結合するだけであろうという説を立てた。遊離単量体のみへの結合では、この抗体は、単量体が再会合して活性な三量体を形成する能力を妨げるまたは阻止するだろう。
【００５４】
従って、本発明者は、潜在的なＢ細胞エピトープに関する５つ全ての領域を調査し、一部が界面領域内である２つのエピトープ（Ａ界面βシート接触面）と全体が界面領域内である１つのエピトープ（Ｆ界面βシート接触面）とに対する抗体を検出してマッピングした。上記で特定したＴＮＦの５つの既知の界面領域由来の直鎖状配列に由来する合成ペプチドでラットまたはマウスを免疫化した5。これらの合成ペプチド配列をＫＬＨとコンジュゲートさせ、アジュバント、例えばＦｒｅｕｎｄｓ  ＣｏｍｐｌｅｔｅアジュバントまたはＦｒｅｕｎｄｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅアジュバントを使用した。また、合成ペプチ配列は、ＨＩＶ  Ｔａｔ構築物用に説明されているもの等の自己アジュバント性構築物に取り込まれている33。従来のＥＬＩＳＡを使用して、各合成ペプチド配列で免疫化したラットから単離したポリクローナル抗体をｒＴＮＦについて評価し、合成ＴＮＦペプチドについても評価した。例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＭＡＢ６１０，ｃｌｏｎｅｓ  ２８４０１，１および２頁（２００５年６月７日）に抗ヒトＴＮＦ／ＴＮＦＳＦ１Ａ抗体用に記載されているプロトコルを参照されたい。
【００５５】
より大きいペプチド免疫源由来の短縮配列への結合を使用して、エピトープの縁を描写した。ＴＮＦのある領域に対する抗体を検出した場合、短縮ペプチド配列を使用して、上記で定義したエピトープの縁を特定した。各特異的エピトープ配列の内の１つに排他的に結合した抗体を、本発明の選択された抗ＴＮＦ単量体特異的抗体と称した。例えば図１を参照されたい。
【００５６】
表１は、界面領域、試験した免疫源およびエピトープ調査で検出したエピトープを示す。
【００５７】
【表１】
2016508485.tif 000003
【００５８】
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、エピトープの縁の特定を説明する。
【００５９】
３つ全てのエピトープ配列は、ＴＮＦの受容体結合部位の既知の領域外である12、13、15。界面接触領域Ａに重複する合成ペプチド配列中で検出した２つの重複するＢ細胞エピトープは以下の通りである：
配列番号１のアミノ酸８〜１５位である
【化２】
2016508485.tif 000004
および配列番号１のアミノ酸８〜１６位である
【化３】
2016508485.tif 000005
、ならびに
配列番号１のアミノ酸４〜１２位である
【化４】
2016508485.tif 000006
。
【００６０】
そのため、配列番号１のｓＴＮＦアミノ酸１〜２３位の配列は、２つのＢ細胞エピトープのみを含有し、各エピトープは、抗体結合に必須の界面アミノ酸を含有するが、エピトープＡ２のみは三量体の形成および生物学的機能に必須のアミノ酸を含有する。
【００６１】
配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である第３のエピトープ
【化５】
2016508485.tif 000007
（Ｆシート）の全配列は界面接触領域Ｆ内であった。このエピトープのアミノ酸の内の２つ、即ちＴｒｙ119およびＧｌｙ122は、三量体の形成および生物学的活性に重要である13、24。
【００６２】
上記に示す３種のエピトープでは、ボールド体のアミノ酸は内界面領域内に存在する。イタリック体のアミノ酸は、点変異により三量体の形成失敗および生物学的活性の喪失が誘発される箇所である。
【００６３】
３つの単量体特異的エピトープＡ１：ＳＳＲＴＰＳＤＫＰ、Ａ２：ＰＳＤＫＰＶＡＨ／ＰＳＤＫＶＰＡＨＶおよびＦ：ＥＰＩＹＬＧＧＶＦそれぞれに対する抗体は、従来のＥＬＩＳＡアッセイにおいて合成ｒＴＮＦ（三量体型、二量体型および単量体型を含む）に結合する。Ａ１ＳＳＲＴＰＳＤＫＰに対する抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方）は、抗体のエピトープへの結合に必須である２つの界面アミノ酸（Ｌｙｓ11およびＰｒｏ12）のみに結合した。これらのアミノ酸はどちらも、三量体の形成およびｓＴＮＦの生物学的活性に重要ではないことが分かっている。Ａ２ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶに対する抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方）はまた、三量体の形成およびｓＴＮＦ分子の生物学的活性に重要であるＨｉｓ15をマスクした13、23。
【００６４】
Ｆ単量体界面領域内では、その他の単量体特異的抗体１種のみを検出した。ＦエピトープはＴＮＦアミノ酸１１６〜１２４位に及んでおり、単量体特異的であるポリクローナル抗体を誘発した。この抗体は、両方とも三量体の形成およびｓＴＮＦ分子の生物学的活性に重要であるＴｙｒ119およびＧｌｙ122をマスクした。
【００６５】
実施例２−選択的結合活性
天然のまたは合成のｓＴＮＦは、不活性なＴＮＦ単量体、不活性なＴＮＦ二量体および生物学的に活性なＴＮＦ三量体の混合物からなる。アッセイで使用した各抗体および市販の抗ＴＮＦ抗体（例えばＲＥＭＩＣＡＤＥ）または市販のＴＮＦ受容体キメラ（例えばＥＮＢＲＥＬ）は、実施例１で実施した従来のＥＬＩＳＡのように、プレート上にコーティングされた合成ＴＮＦに結合する。しかしながら、ｓＴＮＦの単量体型、二量体型または三量体型に対する抗体／リガンドの特異的結合の検出には、適切な選択的アッセイが必要である。実施例１で特定した単量体に基づく３つのエピトープのみに結合する抗体またはリガンドの選択的結合活性を実証するために、以下のアッセイを実施した。
【００６６】
Ａ．サンドイッチアッセイ
一実施形態では、サンドイッチアッセイは、試料中のｓＴＮＦに結合し、続いてプレート上にコーティングされた非ビオチン化の同じ抗体で検出されるビオチン化抗ＴＮＦ抗体を用いる25。未標識抗体（例えば、本発明者のエピトープ結合抗体の内の１種または市販の抗体、例えばＲＥＭＩＣＡＤＥ抗体）をプレート化する。合成ｓＴＮＦとビオチン化されている同じ抗ＴＮＦ抗体との混合物を含有する試料を調製し、次いでプレートに導入した。次いで、プレートを洗浄し、検出可能なシグナルを発生させるために適切な検出用システム、例えばストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して、未標識の結合抗体と標識された検出用抗体とでサンドイッチされた、結合したあらゆるｓＴＮＦを測定する。
【００６７】
捕獲用／検出用抗体として使用した抗体が、ｓＴＮＦの三量体型に結合する抗体である場合、サンドイッチ効果を検出することができる。このアッセイでは、プレートに結合した抗体とビオチン化抗体との両方に同時に結合する能力を有するｓＴＮＦ三量体のみが結合を示すことができる。このことは、混合物中において、三量体上の全ての結合部位が結合され得るわけではなく、その結果、捕捉される余分な結合部位がプレート上に残るからである。例えば、市販のＲＥＭＩＣＡＤＥ抗体は、このアッセイでは三量体結合を示す。
【００６８】
対照的に、ｓＴＮＦ単量体に基づく単一のエピトープに特異的に結合する本発明者の抗
体は、このアッセイでは結合を示さない。各単量体が混合物中の標識化抗体と結合すると、混合物をプレートに加えた場合に、このエピトープはもはや、プレート上の同じ未標識抗体に結合することができない。サンドイッチは生じることができない。
【００６９】
従って、このアッセイを使用して、Ａ２またはＦに選択的に結合するおよびｓＴＮＦ単量体のみに結合する抗ＴＮＦ単量体特異的抗体／リガンドと、ｔｍＴＮＦおよび三量体ｓＴＮＦの両方の三量体に結合する、これらの非選択的な市販のおよび既知の抗ＴＮＦ抗体とを区別することができる。
【００７０】
このアッセイで用いた場合、本発明者は、エピトープＡ１、Ａ２またはＦに対する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルの両方）がｓＴＮＦ単量体のみに結合することができたと結論付けた。このアッセイの実施の結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。
【００７１】
Ｂ．機能アッセイ
機能アッセイは、アクチノマイシン処理したＷＥＨＩ細胞等のＴＮＦ結合細胞への抗体の効果を示すものである。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＭＡＢ６１０，ｃｌｏｎｅｓ  ２８４０１，１および２頁（２００５年６月１７日）に抗ヒトＴＮＦ／ＴＮＦＳＦ１Ａ抗体用に記載されている「Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ」に関するプロトコルを参照されたい。図４Ｂおよび５のデータの作成のため、細胞Ｌ９２９の代わりにＷＥＨＩ細胞を使用する。このアッセイでは、選択された試験抗体によるＴＮＦ活性の抑制が示された。このアッセイでは、本明細書に記載の単量体に基づく３つのエピトープの内の１つに結合する抗体を評価し、この抗体が、ｓＴＮＦの生物学的に活性な三量体の形成を妨げ、その結果、用量反応曲線においてｓＴＮＦの活性を抑制する能力を有するかどうかを確認する。この機能アッセイの性能および結果を図４Ｂおよび５に示す。
【００７２】
Ｃ．結果
上記のサンドイッチアッセイでは、ｓＴＮＦ単量体に基づく３つのエピトープ：Ａ１：ＳＳＲＴＰＳＤＫＰ、Ａ２：ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶおよびＦ：ＥＰＩＹＬＧＧＶＦの内の１つに結合した、選択された抗体は、ｓＴＮＦの単量体型のみに結合した。上に記載したように、エピトープＡ１、Ａ２またはＦの内の１つに結合する、選択されたビオチン化抗ＴＮＦ抗体は、ｓＴＮＦとサンドイッチを形成して同じ選択された非ビオチン化抗ＴＮＦ単量体特異的抗体をコーティングしたプレートによる結合を引き起こさないであろう。例えば図３Ａおよび３Ｂを参照されたい。抗Ａ２のおよび抗Ｆの抗体／リガンドに関する結果とは対照的に、市販の抗ＴＮＦ  ＲＥＭＩＣＡＤＥ抗体は、サンドイッチアッセイにおいて結合を示し（例えば図３を参照されたい）、三量体ＴＮＦに対する結合を示した。加えて、界面領域に進入しているＴＮＦペプチドに対する全てのポリクローナル抗体は、サンドイッチアッセイにおいて陰性であり、三量体への結合の欠如を示し、結合が単量体に限定されたことを示した。
【００７３】
しかしながら、３つのエピトープ、即ちＡ１：ＳＳＲＴＰＳＤＫＰ、Ａ２：ＰＳＤＫＰＶＡＨおよびＦ：ＥＰＩＹＬＧＧＶＦの内の１つに対する選択的結合を示した抗体の内のわずか２つで、機能アッセイでのアクチノマイシン処理したＷＥＨＩ細胞における細胞複製のＴＮＦ抑制の抑止であるＴＮＦの用量応答性抑制が生じた。例えば図４Ａ、４Ｂおよび５を参照されたい。Ａ２およびＦに対する抗体は、三量体の形成を妨げることができ、ＴＮＦ受容体へのｓＴＮＦ結合の抑制およびアクチノマイシン処理したＷＥＨＩ細胞へのｓＴＮＦの細胞傷害性の抑制と関連した。これらのアッセイの発見から、エピトープＡ２およびＦに対する単量体特異的抗体は、単量体間の結合に必須である特異的アミノ酸側鎖をブロックすることにより三量体の構築を妨げるという証拠が提供される。
【００７４】
驚くことに、Ａ１エピトープに対する抗体は単量体特異的であるが、ＴＮＦ機能の阻害においては不活性であった。
【００７５】
本明細書全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的にではなく包括的に解釈すべきである。単語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」およびこの単語の変化形を、包括的にではなく排他的に解釈すべきである。様々な状況下で、本明細書における様々な実施形態を用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用して示しているが、関連する実施形態が用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を使用して説明されることも理解しなければならない。用語「ａ」または「ａｎ」は単数または複数を指しており、例えば「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意すべきである。従って、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書において互換的に使用される。
【００７６】
本明細書において別に定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によりおよび公開されたテキストへの参照により一般に理解されるのと同じ意味を有しており、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。米国仮特許出願第６１／７６８０４４号明細書および米国仮特許出願第６１／７５６５７１号明細書を含む、本明細書において列挙したまたは言及した全ての文献、ならびに添付したまたは電子的な配列表は、参照により本明細書に援用される。
【００７７】
本明細書に記載の教示を前提として、当業者は、従来の方法により、エピトープＡ２またはＦの内の１つまたは複数に特異的に結合する高親和性ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体およびヒト化抗体、モノクローナル抗体ならびに二重特異性抗体を含む、抗体またはその他の抗体フラグメントを生成することができる。そのような抗体およびリガンドは容易に得られ、本明細書で開示した方法で有用である。更なる説明なしに、当業者は、前述の説明を使用して、および以下の例示的実施例を使用して、本発明の組成物を製造するおよび利用するならびに特許請求の範囲の方法を実行することができると考えられる。本発明は、様々な特定の物質、方法および実施例への言及により本明細書において説明されているおよび例示されているが、本発明は、その目的のために選択される物質および方法の特定の組み合わせに限定されないことが理解される。上記で説明した実施形態の多くの修正形態または変更形態が本明細書に含まれており、当業者に自明であることが予想される。本明細書に記載の組成物およびプロセスに対するそのような修正形態および改変形態は、本明細書に添付した特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【００７８】
参考文献
１．Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｃ．＆Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ｓｔｉｌｌ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ  ｆｏｒ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ５，５７８−５８２（２００９）．
２．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．＆Ｍａｉｎｉ，Ｒ．Ｎ．Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｆｒｏｍ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  ｃａｒｅ：ｗｈａｔ
ｌｅｓｓｏｎｓ  ｈａｓ  ｉｔ  ｔａｕｇｈｔ  ｕｓ？  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，７９１−７９４（２０１０）．
３．Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ３８，１２６１−１２６５（２００４）．
４．Ｂｏｎｇａｒｔｚ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｓｅｒｉｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ
ｒａｒｅ  ｈａｒｍｆｕｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌｓ．ＪＡＭＡ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２９５，２２７５−２２８５（２００６）．
５．Ｓｃａｌｌｏｎ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃＡ２  ｂｉｎｄｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
７，２５１−２５９（１９９５）．
６．Ｍｉｔｏｍａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｏｕｔｓｉｄｅ−ｔｏ−ｉｎｓｉｄｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８，３７６−３９２（２００５）．
７．Ｏｌｌｅｒｏｓ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＮＦ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ
ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＴＮＦ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ａｌｐｈａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８，３３９４−３４０１（２００２）．
８．Ｌｉ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ５５，１４７０−１４７９（２００６）．
９．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＮＦ
ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３６，２７６８−２７８０（２００６）．
１０．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．＆Ｂａｇｌｉｏｎｉ，Ｃ．Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ
ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｔｒｉｍｅｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６２，６９５１−６９５４（１９８７）．
１１．Ｅｃｋ，Ｍ．Ｊ．＆Ｓｐｒａｎｇ，Ｓ．Ｒ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｔ  ２．６  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４，１７５９５−１７６０５（１９８９）．
１２．Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ
ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＮＦ）ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ  
ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  １０，８２７−８３６（１９９１）．
１３．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７，２４０６９−２４０７５（１９９２）．
１４．Ｙａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＴＮＦａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ＭＨＣ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＴＮＦ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，１１８９−１１９１（２００９）．
１５．Ｍｕｋａｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ−ＴＮＦＲ２  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ３，ｒａ８３（２０１０）．
１６．Ｔａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，８２１６−８２２５（１９９６）．
１７．Ｕｔｓｕｍｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＮＦ（ｐｒｏ−ＴＮＦ）ｉｓ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｅｄ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５００，１−６（２００１）．
１８．Ｃｏｒｔｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｌｏｗｌｙ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍｓ  ａｔ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２８４（Ｐｔ  ３），９０５−９１０（１９９２）．
１９．Ｓｔｅｅｄ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＮＦ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１８９５−１８９８（２００３）．
２０．Ｚａｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９，１８７２−１８８３（２００７）．
２１．Ｈｅ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１０２２−１０２５（２００５）．
２２．Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．＆  ＭｃＣｌｅｎｄｏｎ，Ｃ．Ｌ．Ｒｅａｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｈａｎｇｉｎｇ  ｆｒｕｉｔ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５０，１００１−１００９（２００７）．
２３．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−１５：ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２，５５３−５５８（１９８９）．
２４．Ｄｏｕｎｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ＲＡＮＫＬ  Ｇ２７８Ｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｃａｕｓｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒｉｍｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  ＲＡＮＫＬ  ａｎｄ  ＴＮＦ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１，７８４−７９８（２０１２）．
２５．Ｎａｇａｈｉｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６，１３５−１４１（１９９５）．
２６．Ｓｏｃｈｅｒ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  １−１５  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｌｏｃｋ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８４，８８２９−８８３３（１９８７）．
２７．Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ
ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０８，４１５−４２３（２００１）．
２８．Ｓｐｏｈｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，７４５０−７４５７（２００７）．
３０．Ｆｅｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇｓ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，Ｅｄ．Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：Ｂａｓｅｌ，１１３−１２５（２００９）．
３１．Ｆｅｅ，Ｃ．Ｊ．；ａｎｄ  Ｄａｍｏｄａｒａｎ，Ｖ．Ｂ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ（２０１２）．
３２．Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
３３．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈｉｃｃａ，ＪＪ，Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ａｎｔｉ−ＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：１００８−１０１４（Ｄｅｃ．２００９）．
３４．Ｓｔａｃｙ，ＡＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｔｒｉｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｃａｓｃａｄｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  Ｐｅａｋ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｔｏ  Ｍｏｒｅ  Ｍｏｄｅｓｔ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（８）：３７１９−３７３３（Ａｐｒｉｌ  ２００９）
３５．米国特許第７，２２７，００３号明細書
３６．米国特許第７，２２３，３９４号明細書
３７．米国特許第７，０７０，７７５号明細書
３８．米国特許第５，９１９，４５２号明細書
３９．米国特許第５，６９８，４１９号明細書
４０．Ｔａｂａｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｇｌａｓｓ，ＣＫ，Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３９：１６６（Ｊａｎ．２０１３）
４１．Ｈｏｒｎｉｇ  Ｎ，Ｆａｅｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ  Ａ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ．”，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，９０７：７１３−２７
４２．Ｓｐｅｉｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，”Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｕｌ  ７，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１：７５３−７５８
４３．Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｓ  Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｅｎｐｉｎｇ  Ｚｈｕ，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，２００５  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，２６：６４９−６５８
【図１】
2016508485.tif 000008
【図２Ａ】
2016508485.tif 000009
【図２Ｂ】
2016508485.tif 000010
【図２Ｃ】
2016508485.tif 000011
【図３Ａ】
2016508485.tif 000012
【図３Ｂ】
2016508485.tif 000013
【図４Ａ】
2016508485.tif 000014
【図４Ｂ】
2016508485.tif 000015
【図５】
2016508485.tif 000016
【配列表】
2016508485000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月15日(2015.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦの解離単量体のエピトープに特異的に結合する抗体またはリガンドを含んで成る組成物であって、前記結合により、前記単量体が集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられる、組成物。
【請求項２】
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープは、配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープは、配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープは、配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
膜貫通型ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）に結合せず、およびｔｍＴＮＦの構造または生物学的活性に影響を及ぼさず、およびインタクトで生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦに結合しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
抗体が、ポリクローナルのアフィニティ精製抗体またはこのフラグメント、モノクローナル抗体またはこのフラグメント、抗体の単離された一本鎖、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、高親和性抗体もしくはリガンドまたはこれらのフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
抗体が、配列番号１のアミノ酸８〜１５位または８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープと反応し、および配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有するＴＮＦ単量体特異的エピトープと反応する、二重特異性抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体フラグメントは、ｓｃ−Ｆｖ構築物、Ｆａｂ構築物、Ｆａｂ2構築物または重鎖若しくは軽鎖可変配列または相補性決定領域（ＣＤＲ）配列である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される基剤または希釈剤を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１のアミノ酸８〜１５位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたは配列番号１のアミノ酸８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープに特異的に結合する抗体またはリガンド、および
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープに特異的に結合する抗体またはリガンド
から選択される１種または複数種の抗体またはリガンドを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
抗体が、配列番号１のアミノ酸８〜１５位または８〜１６位である配列ＰＳＤＫＰＶＡＨまたはＰＳＤＫＰＶＡＨＶを有する前記ＴＮＦ単量体特異的エピトープ、および配列番号１のアミノ酸１１６〜１２４位である配列ＥＰＩＹＬＧＧＶＦを有するＴＮＦ単量体特異的エピトープと反応する二重特異性抗体を含む、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ヒトＴＮＦに媒介される疾患を処置するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項１３】
ｔｍＴＮＦの量、濃度または生物学的活性に影響を及ぼすことなく、前記疾患を有する対象の血液中における生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの量または濃度が低減され、且つｓＴＮＦの解離単量体がインビボで集合してまたは再集合して生物学的に活性な三量体ヒトｓＴＮＦになることが妨げられまたは低減されることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
を含む方法。
【請求項１４】
前記対象の血流中における生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの量または濃度の低減が長時間にわたり維持される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記対象の細胞内病原体による感染に対するまたは悪性腫瘍に対する感受性が処置により増加しない、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記感染が、結核、細菌性敗血症、侵襲性真菌症もしくはヒストプラスマ症である、または前記悪性腫瘍はリンパ腫もしくは肝脾Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、肥満、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症、随伴性心血管疾患、アルツハイマー病、神経変性疾患、炎症中にまたは炎症性障害の経過中に産生される生物学的に活性な三量体ｓＴＮＦの病原性の結果、ＨＩＶ−１またはＩＩ型糖尿病である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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