(57)【要約】本発明は、（ｉ）配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦ、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）組成物を提供する。また本発明は、Ｎ末端ホスホグルコノイル化またはグルコノイル化を有する改変酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）も提供する。
2016515644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦ、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）組成物。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦ、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせからなる、請求項１に記載のａＦＧＦ組成物。
【請求項３】
次の高速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＩＥＣ）ピークを有し、
【表１】
2016515644.tif 000013
前記ＨＰＩＥＣが：
流速：０.５ｍＬ／分
試料量：１００μＬ
カラム：ＰｒｏＰａｃイオン交換カラム
吸光度：２２０-２８０ｎｍ
溶出プロフィール:
緩衝液Ａ：２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６.０〜８.０
緩衝液Ｂ：２０ｍＭ ＭＥＳ + １Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０〜８.０
【表２】
2016515644.tif 000014
の条件で実施されるものである、請求項１に記載のａＦＧＦ組成物。
【請求項４】
配列番号１のヒトａＦＧＦまたは野生型ヒトａＦＧＦと比較して改善された特異的活性を有する、請求項１に記載のａＦＧＦ組成物。
【請求項５】
Ｎ末端ホスホグルコノイル化またはグルコノイル化を有する、改変酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）。
【請求項６】
前記ａＦＧＦがヒトａＦＧＦである、請求項５に記載の改変ａＦＧＦ。
【請求項７】
前記ａＦＧＦが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の改変ａＦＧＦ。
【請求項８】
配列番号１のヒトａＦＧＦまたは野生型ヒトａＦＧＦと比較して改善された特異的活性を有する、請求項５に記載の改変ａＦＧＦ。
【請求項９】
配列番号２の改変酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）。
【請求項１０】
配列番号３の改変酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスホグルコノイル化またはグルコノイル化での改変酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）に関し、また本発明は、（ｉ）配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦ、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせを含むＦＧＦ組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロで様々な細胞型の増殖と分化に影響を与える酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）は、全脳および視床下部などの神経組織由来の一本鎖タンパク質として最初に分離された。ａＦＧＦは、ヘパリン依存性の有糸分裂促進因子であり、４つすべての型の既知のＦＧＦ受容体及びそのスプライス形態に強固に結合することができる。ａＦＧＦは運動機能および感覚機能と関連のあるニューロンの特定のサブセット内に局在し、成人の脳から精製可能である。精製ａＦＧＦは、神経芽細胞に対する有糸分裂促進因子であり、脊髄ニューロンから伸張する軸索を促進する。さらに、ａＦＧＦは培養において星状膠細胞で神経成長因子の発現を促進することが実証されている。
【０００３】
複数の研究で、ＦＧＦが神経生理学的活性に対して、インビボにおける中枢神経系（ＣＮＳ）内でのそれらのマイトジェン作用とは異なる、広範な影響を有することが報告されている。例えば、脳に投与された場合、ａＦＧＦは脳虚血により誘発された海馬ＣＡ１ニューロンの変性に対して保護的効果を提供した（Sasaki K.et al., Brain Res. Bull. 33:505-511, 1994）。ＦＧＦ１はアルツハイマー病（Guo, Z. and Mattson, M., Cereb. Cortex 10, 50-57, 2000）及びＨＩＶ脳炎（Everall, I. P. et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60, 293-301, 2001）など神経変性疾患の発症に関与する分子神経毒性作用から選択的な神経集団を保護する効果があることが報告されている。
【０００４】
ネイティブヒトａＦＧＦポリペプチドはヒトの脳から分離され、１５４個のアミノ酸から構成される。しかし、ネイティブヒトａＦＧＦのＮ末端の１９個のアミノ酸は、ヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）と同じであると同定された。ＩＬ−１のアミノ酸と共通または類似しているネイティブヒトａＦＧＦのＮ末端からの１９個のアミノ酸は、マクロファージの活性化や調節細胞増殖停止などと同じ内因性免疫応答を引き起こす可能性がある（G. Venkataraman et al., P.N.A.S., 96:3658-63, 1999）。さらに、炎症誘導性サイトカインＩＬ−１及びＦＧＦ−１（ａＦＧＦ）／ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）は、同じ構造スキャフォールドを共有し、チロシンキナーゼドメインの同じ受容体結合部位に競合することが報告されている（A. J. Minter et al., J. Cell Physil., 167:229-37, 1996）。
【０００５】
組換えヒトａＦＧＦの複数のバージョンが市販されており、さまざまなバイオアッセイで広く使用されている。例えば、１４０個のアミノ酸を持つ組換えヒトａＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ、アミノ酸１６−１５５、カタログ番号：２３２−ＦＡ／ＣＦ）、１５４個のアミノ酸を持つ組換えヒトａＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ、アミノ酸２−１５５、カタログ番号：２３１−ＢＣ／ＣＦ）、１４１個のアミノ酸を持つ組換えヒトａＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｎ末端にメチオニン残基が追加された天然配列、カタログ番号：Ｆ５５４２）がある。また、Osakada F et al., Nat Protoc. 2009;4(6):811-24、及び、Christina Krabbe et al., J. Neurochem.(2009)110, 1908-1920 も参照できる。
【０００６】
さらに、米国特許第７９５６０３３号（２０１１年登録）では、ネイティブヒトａＦＧＦのＮ末端から２０個のアミノ酸を欠失することにより短化したネイティブヒトａＦＧＦ、及びこの短化ネイティブａＦＧＦの前に付加されたアラニン（Ａｌａ）を含み、安定性を改善した１３５個のアミノ酸を持つ改変ヒトａＦＧＦが開示されている。
【発明の概要】
【０００７】
一実施態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦ、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦ、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）組成物を提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態において、前記ａＦＧＦ組成物は、次の高速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＩＥＣ）ピークを有し、
【表１】
2016515644.tif 000003
そのうち、前記ＨＰＩＥＣは次の条件で実施される。
流速：０.５ｍＬ／分
試料量：１００μＬ
カラム：ＰｒｏＰａｃイオン交換カラム
吸光度：２２０〜２８０ｎｍ
溶出プロフィール:
緩衝液Ａ：２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６.０〜８.０   
緩衝液Ｂ：２０ｍＭ ＭＥＳ＋１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０〜８.０
【表２】
2016515644.tif 000004
【０００９】
別の一実施態様において、本発明はＮ末端ホスホグルコノイル化またはグルコノイル化を有する改変酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）を提供する。
【００１０】
本発明によれば、前記ａＦＧＦ組成物と前記改変ａＦＧＦは、配列番号１のヒトａＦＧＦ、または野生型ヒトａＦＧＦと比較して改善された特異的活性を示す。
【００１１】
本発明の前述の概要、及び以下の詳細な説明は、添付の図面を併せて参照することでより理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ａＦＧＦ１３５（配列番号１）試料のＨＰＩＥＣプロファイルを示すグラフである。
【図２Ａ】ａＦＧＦ１３５のＨＰＩＥＣプロファイルを示すグラフである。
【図２Ｂ】ａＦＧＦ１４０のＨＰＩＥＣプロファイルを示すグラフである。
【図２Ｃ】ａＦＧＦ１５４のＨＰＩＥＣプロファイルを示すグラフである。
【図３】ａＦＧＦ１３５試料のＨＰＩＥＣプロファイルの５つのピークからの試料における特異的活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
例外が特筆されない限り、ここで使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術における通常の技能を有する者に一般的に理解されているものと同じ意味を持つ。
【００１４】
ここで使用されている単数形は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。したがって、例えば、「試料」には複数の試料及び当業者に既知の等価物が含まれる。
【００１５】
ここで使用されている用語「酸性線維芽細胞増殖因子」または「ａＦＧＦ」は、ヘパリン依存性の有糸分裂促進因子を指し、ネイティブ、野生型または改変ａＦＧＦであり得る、あらゆる型のａＦＧＦ、好ましくはヒトａＦＧＦを含む、４つすべての型の既知のＦＧＦ受容体及びそのスプライス形態に強固に結合することができる。好ましい一実施態様において、前記ａＦＧＦは、参照によりここに組み込まれる米国特許第７９５６０３３号で開示された配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
本発明において、Ｎ末端ホスホグルコノイル化またはグルコノイル化を有する改変ａＦＧＦは、ホスホグルコノイル化及びグルコノイル化のないａＦＧＦ、または野生型ａＦＧＦと比較して、改善された特異的活性を示すことが予期せず発見された。
【００１７】
本発明の一実施態様において、前記ａＦＧＦは配列番号１のアミノ酸を有する。
【００１８】
本発明の好ましい一実施態様において、本発明の前記改変ａＦＧＦは、ａＦＧＦ、好ましくはヒトａＦＧＦ、より好ましくは配列番号１のヒトａＦＧＦへのホスホグルコノイル化またはグルコノイル化の付加によって実施される。本発明において、前記改変ヒトａＦＧＦは優れた特異的活性を有することが予期せず発見された。
【００１９】
ここで使用されている用語「ホスホグルコノイル化」とは、１つ以上の６−ホスホグルコン酸基を添加することによる、分子（タンパク質など）に対する修飾または化学修飾を指す。
【００２０】
ここで使用されている用語「ホスホグルコノイル化」とは１つ以上のホスホグルコン酸基を添加することによる、分子（タンパク質など）に対する修飾または化学修飾を指す。本発明の一実施形態において、前記ａＦＧＦの前記ホスホグルコノイル化は、６−ホスホグルコン酸基をａＦＧＦに添加することにより実施される。
【００２１】
ここで使用されている用語「グルコノイル化」とは、１つ以上のグルコノイル基を添加することによる、分子（タンパク質など）に対する修飾または化学修飾を指す。一部の実施態様において、ａＦＧＦの前記グルコノイル化は６−グルコノイル基をａＦＧＦに添加することで実施される。さらに、本発明によれば、グルコノイル化された前記ａＦＧＦは、ホスホグルコノイル化ａＦＧＦの脱リン酸化に由来することができる。本発明の別の実施態様によれば、ａＦＧＦの前記グルコノイル化は、６−ホスホグルコン酸基をａＦＧＦに添加してから脱リン酸化することにより実施される。本発明によれば、グルコノイル化された改変ヒトａＦＧＦとホスホグルコノイル化された改変ヒトａＦＧＦのどちらも、ホスホグルコノイル化及びグルコノイル化のないａＦＧＦ、または野生型ａＦＧＦと比較して、改善された特異的活性を有する。
【００２２】
タンパク質のホスホグルコノイル化またはグルコノイル化は、ネイティブプロセスまたは合成法などの化学修飾を経て実行することができる。一方で、グルコノイル化またはホスホグルコノイル化（α−Ｎ−６−ホスホグルコノイル化など）は大腸菌（Escherichia coli）（"E. Coli"）で発現したタンパク質への翻訳後修飾として起こることがあるため（Geoghegan, et al., Anal. Biochem. 267:169-184(1999); Kim et al., Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 57:759-762(2001); Yan, et al. Biochemical & Biophysical Research Communications 262:793-800(1999) "Yan et al. I";Yan, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 259:271-282(1999) "Yan et al. II"）、ホスホグルコノイル化またはグルコノイル化されたタンパク質は適切な大腸菌株での発現により産生することができる。
【００２３】
そのような翻訳後修飾は発現したタンパク質の活性、安定性、構造、または免疫原性に悪影響を与える可能性が報告されている。しかし驚くべきことに、本発明ではホスホグルコノイル化またはグルコノイル化されたヒトａＦＧＦがホスホグルコノイル化及びグルコノイル化のないヒトａＦＧＦ、または野生型ヒトａＦＧＦと比較して、改善された特異的活性を示すことがわかった。一実施態様において、前記ヒトａＦＧＦは配列番号１のヒトａＦＧＦである。
【００２４】
ここで使用されている「ａＦＧＦ特異的活性」または「特異的活性」は、試料単位量のバイオアッセイにより測定されたａＦＧＦ活性を指す。
【００２５】
別の一態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１のａＦＧＦと、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦと、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦと、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦと、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）組成物を提供する。
【００２６】
配列番号２のａＦＧＦは、１０１位のアスパラギンをリジンで置換することにより修飾された配列番号１のａＦＧＦである。配列番号３のａＦＧＦは、２位のアスパラギンをリジンで置換することにより修飾された配列番号１のａＦＧＦである。
【００２７】
本発明の一実施形態において、前記ａＦＧＦ組成物は、（ｉ）配列番号１のａＦＧＦと、（ｉｉ）Ｎ末端ホスホグルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦと、（ｉｉｉ）Ｎ末端グルコノイル化を有する配列番号１のａＦＧＦと、（ｉｖ）配列番号２のａＦＧＦと、（ｖ）配列番号３のａＦＧＦ、またはそれらの組み合わせからなる。
【００２８】
本発明の一実施形態において、ａＦＧＦ組成物は次のＨＰＩＥＣピークを有する。
【表３】
2016515644.tif 000005
そのうち、前記ＨＰＩＥＣは次の条件で実施される。
流速：０.５ｍＬ／分
試料量：１００μＬ
カラム：ＰｒｏＰａｃイオン交換カラム
吸光度：２２０〜２８０ｎｍ
溶出プロフィール:
緩衝液Ａ：２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６.０〜８.０
緩衝液Ｂ：２０ｍＭ ＭＥＳ＋１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０〜８.０
【表４】
2016515644.tif 000006
【００２９】
本発明のａＦＧＦ組成物は、配列番号１のヒトａＦＧＦ、または野生型ヒトａＦＧＦと比較して改善された特異的活性を示す。
【００３０】
以下、実施例により本発明についてさらに説明する。これらの実施例は限定のためではなく、例示を目的として示されている。
【実施例１】
【００３１】
修飾された配列番号１のヒトａＦＧＦ（「ａＦＧＦ１３５」）の発現と分離
ａＦＧＦ１３５発現用のベクター、ｐＥＴ３ｃ−ｈａＦＧＦが、米国特許第７９５６０３３号（本出願は、その全ての開示内容が参照によって本願に組み込まれる）で説明されるとおりに作製された。
【００３２】
ｐＥＴ３ｃ−ｈａＦＧＦが増幅された後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen、ドイツ）コンピテントセルに形質転換された。アンピシリン耐性大腸菌コロニーがＬＢ培地で培養され、ＯＤ６００＝０.３まで増幅された後、ＩＰＴＧで誘導された。１６時間（±２時間）のインキュベーション後、細菌が収集され、５０００ｒｐｍで遠心分離されて上清が除去された。細菌が収集され、ＰＢＳで２回洗浄された後、高圧ホモジナイザーで溶解され、続いて孔径０.２２μｍのふるいにかけられた。フィルター後の培地はタンパク質分離の準備が整った。
【００３３】
前記ａＦＧＦ１３５のペプチドが、（１）カチオン交換クロマトグラフィー、（２）アフィニティークロマトグラフィー、（３）サイズ排除クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーカラムによって分離された。これらのカラムに使用された緩衝液はリン酸塩緩衝液（Ｎａ２ＰＯ４：ＮａＨＰＯ３＝５１：４９、０.１％ＥＤＴＡ−Ｎａ、ｐＨ６.０〜８.０）であった。
【実施例２】
【００３４】
発現されたタンパク質のＨＰＩＥＣ（高速液体イオン交換クロマトグラフィー）
実施例１で取得した、分離されたペプチド組成物に対してＨＰＩＥＣ分析が行われた。クロマトグラフィー条件は次のとおりである。移動相：緩衝液Ａ−２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６.０〜８.０、緩衝液Ｂ−２０ｍＭ ＭＥＳ＋１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０〜８.０；カラム：ＰｒｏＰａｃイオン交換カラム；吸光度：２２０〜２８０ｎｍ；試料量：１００μＬ；流速：０.５ｍＬ／分；時間：４５分間；温度：２５℃、グラジエントカーブ：
【表５】
2016515644.tif 000007
【００３５】
Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞増殖に対するバイオアッセイが次のように実施された。良好に成長するＢａｌｂ／３Ｔ３細胞を選択し、細胞濃度を計算した。アッセイには９６ウェルプレートが使用され、そのうち６０ウェル（Ｂ２〜Ｇ１１）にアッセイ試料が入れられ、その他周囲のウェルには滅菌ＰＢＳが入れられた。細胞はプレートでＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種され、３７℃、５％ＣＯ２で２４±２時間培養された。試料希釈用緩衝液ＲＰＭＩ−１６４０倍地＋０.５％ＦＢＳが用意された。実施例１で取得された標準ａＦＧＦ組成物が試料希釈用緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０倍地＋０.５％ＦＢＳ）を使用して１６単位／ｍｌに希釈され、２倍濃度で連続希釈されて少なくとも６つの連続希釈試料を取得した。続いて、９６ウェルプレート中の培地を除去し、１００μＬの試料を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４±２時間培養した。活性測定のため、まずプレートを室温下に１５分間置いた後、１００μＬの発光試薬を各ウェルに加えて３０分間反応させた。最後に、蛍光信号が検出され、活性が平行線定量法で計算された。
【００３６】
結果を図１と下の表１に示す。５つの主要なピークが保持時間（分）約１８.１６５、１８.５０４、１９.１３１、１９.４１９、１９.８８４でそれぞれ観察された。
表１
【表６】
2016515644.tif 000008
【実施例３】
【００３７】
異なるヒトａＦＧＦ間のＨＰＩＥＣプロファイルの比較
この研究では３つの異なるヒトａＦＧＦ、ａＦＧＦ１３５、ａＦＧＦ１４０、ａＦＧＦ１５４を試験した。配列番号１のａＦＧＦ１３５が上述の実施例１のとおり用意された。ａＦＧＦ１４０（１４０個のアミノ酸を有する）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国ＭＮ５５４１３ミネアポリス）より購入されたＲ＆Ｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ａｃｉｄｉｃ ａａ（組換えヒトＦＧＦ酸性アミノ酸）１６−１５５（カタログ番号：２３２−ＦＡ／ＣＦ）である。ａＦＧＦ１５４（１５４個のアミノ酸を有する）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国ＭＮ５５４１３ミネアポリス）より購入されたＲ＆Ｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ａｃｉｄｉｃ ａａ（組換えヒトＦＧＦ酸性アミノ酸）２−１５５（カタログ番号：２３１−ＢＣ／ＣＦ）である。クロマトグラフィー条件は上述の実施例２の説明と同じである。
【００３８】
結果を図２Ａから図２Ｃに示す。図２ＡはａＦＧＦ１３５のＨＰＩＥＣプロファイル、図２ＢはａＦＧＦ１４０のＨＰＩＥＣプロファイル、図２ＣはａＦＧＦ１５４のＨＰＩＥＣプロファイルをそれぞれ示す。図２Ａから図２Ｃに示すように、ａＦＧＦ１３５、ａＦＧＦ１４０、ａＦＧＦ１５４は非常に異なるＨＰＩＥＣプロファイルを有する。
【実施例４】
【００３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるａＦＧＦ１３５のＨＰＩＥＣピークの同定とそれらの特異的活性の比較
１. Ａｒｇ−Ｃ消化：各ピークからの試料がまず３ｋＤａカットオフアミコンウルトラ遠心フィルターで濃縮された。１６すべての試料（１０μｇ、４ロットからのＨＰＩＥＣピーク１、２、４、５）が５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液で１００μＬに希釈された。その後すべてのタンパク質試料が６Ｍ尿素で変性され、１μＬの１Ｍ ＤＴＴ、３７℃で１時間還元された。１０μＬの０.５ Ｍ ＩＡＭを使用して３０分間暗室内にて室温でアルキル化が実施された。得られたｈａＦＧＦタンパク質が５０ｍＭ ＡＢＣ緩衝液で希釈された後、０.５μｇのＡｒｇ−Ｃ（タンパク質：酵素＝２０：１）、３７℃で１７時間消化された。消化後、すべての試料がＺｉｐ Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して脱塩され、ｓｐｅｅｄｖａｃにより乾燥され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に０.１％ＦＡで再溶解された。
【００４０】
２. ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：消化された試料（０.５μｇ）が、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステムと組み合わせたＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計で分析された。Ｃ１８カラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ、７５μｍ×１５０ｍｍ、２μｍ、１００Å）を使用して、次のグラジエントでＬＣ分離が実施された。
【００４１】
【表７】
2016515644.tif 000009
(移動相Ａ：５％ ＡＣＮ／０.１％ ＦＡ；移動相Ｂ：９５％ ＡＣＮ／０.１％ ＦＡ）
【００４２】
ｍ／ｚ３８０〜１８００範囲でフルＭＳスキャンが行われ、ＭＳスキャンからの１０の最も強いイオンがＭＳ／ＭＳスペクトルのため断片化された。生データはＭａｓｃｏｔデータベース検索のためＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １.４によりピークリストに処理された。
【００４３】
３. データベース検索条件：Ｍａｓｃｏｔ ２.４.０でデータベース検索を実行した。使用した条件は次のとおりであった。
データベース：スポンサー提供の配列
消化酵素: Ａｒｇ−Ｃ*
修飾の有無: ホスホグルコノイル化（タンパク質Ｎ末端）；グルコノイル化（タンパク質Ｎ末端）；メチル化（Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｙｓ）
ペプチド質量誤差: ±１０ ｐｐｍ
フラグメント質量誤差: ±０.０２ Ｄａ
最大未切断サイト数：５
質量分析計種類：ＥＳＩ−ＴＲＡＰ
イオンカットオフスコア：３０
Ａｒｇ−Ｃ*：この酵素はアルギニン残基、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ及びＬｙｓ−Ａｒｇ結合のカルボキシル側で切断することが示されている。
【００４４】
３. 結果：
表２：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ結果
【表８】
2016515644.tif 000010
【表９】
2016515644.tif 000011
「位置」は、ｈａＦＧＦの残基数を示す。「実験値」は、測定スキャンで観察されたｍ／ｚ値を示し、「Ｍｒ（実験値）」、「Ｍｒ（理論値）」、「ｐｐｍ」は、実験分子量（ＭＷ）、理論ＭＷ、実験ＭＷと理論ＭＷの差をそれぞれ示す。ＭＣは未切断サイト数（missed cleavage）を表す。スコアはＭａｓｃｏｔデータベース検索エンジンから直接報告されたペプチドイオンスコアである。
【００４５】
ピーク３からの試料はＬＣ−ＭＳを通じて修飾なしのａＦＧＦ１３５であることが示された。
表３：ａＦＧＦの修飾
【表１０】
2016515644.tif 000012
【００４６】
さらに、５つのピークからの試料の特異的活性が比較された。Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞増殖に対するバイオアッセイが上述の実施例２のとおり実施された。図３に示すように、ピーク１と２からの試料は、ピーク３、４、５からの試料よりも高い特異的活性を示した。
【００４７】
本発明が属する分野で通常の知識を有する者が、本発明をここに開示された説明に基づき、更なる例示の必要なくその最大の範囲で利用することが可能であろう。したがって、開示された説明及び請求項は、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するためではなく、例示目的であると理解されるべきである。
【図１】
2016515644.tif 000015
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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