(57)【要約】  本発明はポリエチレンおよびラッカーゼを含む組成物を提供し、ここで、ラッカーゼは、６０℃〜１００℃の温度および／またはキシランの存在下で最適比活性を有する。さらに、発明は、６０℃〜１００℃の温度で最適比活性を有するラッカーゼをプラスチックと接触させる、または６０℃〜１００℃の温度で最適比活性を有するラッカーゼを発現する微生物をプラスチックと接触させることにより、プラスチックを生分解／分解するための方法を含む。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレンおよびラッカーゼを含み、前記ラッカーゼは、６０℃〜１００℃の温度で最適比活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記組成物は６０℃〜１００℃の温度で維持される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ラッカーゼはブレビバチルス・ボルステレンシスラッカーゼまたはブレビバチルス・アグリラッカーゼから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ラッカーゼは細胞外ラッカーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
さらにＣｕ２＋、キシランまたは両方を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
７．５〜８．５のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ポリエチレン、ラッカーゼおよびキシランを含む組成物。
【請求項９】
ロドコッカス・ルーバー株Ｃ２０８を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリエチレンは熱酸化される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリエチレンを、６０℃〜１００℃の温度で最適比活性を有するラッカーゼと接触させる工程を含む、ポリエチレンを分解するための方法。
【請求項１２】
さらに前記ポリエチレンおよび前記ラッカーゼを６０℃〜１００℃の温度で維持することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに前記ポリエチレンおよび前記ラッカーゼ７．５〜８．５のｐＨで維持することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラッカーゼはブレビバチルス・ボルステレンシスラッカーゼまたはブレビバチルス・アグリラッカーゼから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラッカーゼは細胞外ラッカーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、Ｃｕ２＋およびキシランから選択される少なくとも１つの添加物を前記ラッカーゼに添加することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ポリエチレンをＢ．ボルステレンシス、Ｂ．アグリ、またはＢ．ボルステレンシスおよびＢ．アグリの組み合わせと接触させる工程を含み、前記ポリエチレンは前記細菌のための唯一の炭素源である、ポリエチレンを分解するための方法。
【請求項１９】
さらに、前記ポリエチレンおよび前記Ｂ．ボルステレンシス、Ｂ．アグリ、またはＢ．ボルステレンシスおよびＢ．アグリの組み合わせを３５℃〜５０℃の温度で維持することことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記ポリエチレンおよび前記Ｂ．ボルステレンシス、Ｂ．アグリ、またはＢ．ボルステレンシスおよびＢ．アグリの組み合わせを７．５〜８．５のｐＨで維持することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、Ｃｕ２＋およびキシランから選択される少なくとも１つの添加物を前記ブレビバチルス・アグリに添加することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ポリエチレンおよびキシランを含む組成物をロドコッカス・ルーバー株Ｃ２０８と接触させる工程を含む、ポリエチレンを分解するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、とりわけ、好熱性ラッカーゼに基づく組成物およびプラスチックを分解／生分解するために好熱性ラッカーゼまたはそれを発現する微生物を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの産業活動は必然的に産業廃棄物を生成させる。これらの産業廃棄物は、主として、工場、農業、漁業および食品加工産業により排出される無機および有機廃棄物から構成される。これらの廃棄物を生分解するまたは取り扱う高いコストはこれらの産業が負担している。これらのコストが、これらのおよび他の関連ビジネスに対する市場拡大を妨害している。
【０００３】
現在のところ、有機廃棄物発酵および処理システムが廃棄物を利用するために開発されている。これらのシステムを使用して、現在のところ、生物活性物質、例えば土壌改良剤および堆肥を生成することができる。
【０００４】
プラスチックは多くの利益を提供し、というのも、それは一般により軽く、より強く、より耐久性があり、水に対してより耐性があるからである。しかしながら、従来のプラスチックを多くの用途のための理想の材料とする同じ特性がまた、これらの材料の耐用年数の終わりに環境問題を引き起こす傾向があり、というのも、これらの材料の本来の強度および耐久性により、それらは、環境において生分解せずに存続し続けることができるからである。
【０００５】
消費者使用後、プラスチック袋は、環境においてまたは埋め立て地においてしばしば最終的にはごみとなる。従来のプラスチックは生分解性ではないので、廃棄されたプラスチックは、どちらかの場所で著しい環境問題を表す。ごみとして、プラスチックは目に見え、まん延した汚染物質であり、動物および海洋種、およびヒトの健康にとって脅威となる。埋め立て地において、プラスチック袋は埋め立て体積を増大させ、埋め立て圧縮を妨害し、その中にトラップされた廃棄有機材料の生分解を遅延させ、よって、メタン、有害な温室効果ガスの形成を助長する。
【０００６】
地球環境保護を考慮すると、最近の最も重要な問題は、維持し、続けることができる循環社会システムを構築することである。そのような社会的状況では、プラスチック廃棄物のためのリサイクル技術を開発するためにも多くの努力がなされている。プラスチック廃棄物のためのリサイクル技術は２つの主な型に分けられる：物理的アプローチ（熱リサイクル、材料リサイクル）および化学的アプローチ（化学的リサイクル）。それらの中で、前の物理的処理はすでに、商業ベースのＰＥＴまたは他の樹脂に対し実用化されており、というのも、それは比較的簡単で、コスト効率が良いからである。しかしながら、このアプローチは反復使用のために品質低下を避けることができず、よって得られたリサイクル製品は用途が限られている。
【０００７】
他方、化学的リサイクルの場合、プラスチック廃棄材料は、モノマまたはオリゴマに断片化され、それらはその後収集され、新しいプラスチックの再合成のための原材料として使用される。このアプローチにより、一次製品に完全に匹敵するプラスチック製品の生成が可能になり、品質低下が引き起こされない。これらの事実を考慮すると、化学的リサイクルを考慮した製品が近年開発され、それらの一部がすでに市場に出ている。
【０００８】
将来、生分解性プラスチックはプラスチックの総生産量のほぼ半分を占めるであろうし、将来におけるそれらのリサイクルのための効率的な技術の開発に注意が与えられることも予測される。現在のところ流通している生分解性プラスチックは、ほぼ例外なくポリエステル系プラスチックである。これは、これらのプラスチックに対しては、モノマリサイクルは非常に容易に達成することができることを意味し、というのも、それらのモノマ成分、例えば有機酸および多価アルコールは加水分解の影響を受けるエステル結合を介して結合されているからである。
【０００９】
しかしながら、実際にリサイクルしようとすると、大きな問題が起こる。というのも、廃棄物は複数の型の材料を混合して含むからである。廃棄物の分別収集が強く求められているが、廃棄物を廃棄する人々の認識ならびに分別収集に要求される時間および努力を考慮すると、実際には、分別収集を完全に達成することは不可能であろう。特に、プラスチック製品は一般に、複数の異なるプラスチックを組み合わせて使用し、現在のところ使用される技術では、プラスチック型に従い、全てのプラスチック廃棄物を分離することはできない。この理由のために、現状では、リサイクルは、リサイクル技術に関係なく、分離および収集が容易な廃棄物に制限される。
【００１０】
この問題を克服するために、新しいプロセスが提案されており、この場合、酵素がプラスチックの化学的分解のために使用される。酵素の使用から得られる利点として、酵素の基質特異性は優れた特徴となり得るが、反応が常温で、標準圧下で実施することができ、よってエネルギーコストが節約され、環境汚染の一因となる有機溶媒が必要とされないことも重要である。一般に、酵素は基質特異性を有し、明確にそれらの標的基質を選択する。よって、酵素の組み合わせ（各々がある特定のプラスチックのみに対して反応する）により、高純度モノマの混合物形態のプラスチック廃棄物からの効率的な抽出が可能になり、いずれの分離プロセスも必要とされない。一般に、バイオプロセスは高いコストを必要とし、よって、この点において何の疑いもなく不利であるが、分離なしで高純度モノマの抽出を達成することは大きな利点である。特に、生分解性プラスチックが自然界の微生物により分泌される酵素の作用により分解されるという事実をも考慮すると、そのような生分解細菌に由来する酵素を使用するプロセスを開発することが予期され得る。
【００１１】
酵素的リサイクルを確立するために、前提となるのは、高い基質特異性を有する強いプラスチック生分解酵素の存在である。特に、プラスチック廃棄物は、実際には固体形態、例えばチップおよび／またはブロックで廃棄されるので、固体を分解する細菌が特に重要である。
【００１２】
非天然プラスチック生分解細菌に由来する酵素として知られている例は、エステル系ポリウレタンを生分解することができるものである。そのような酵素はコマモナス・アシドボランスに由来し、エステル系固体ポリウレタン中のエステル結合を開裂し、水溶性モノマを生成させる［Ａｋｕｔｓｕ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ，  Ｔ．，  Ｎｏｍｕｒａ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｎａｋａｈａｒａ，  Ｔ．：  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  Ｃ．  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＴＢ−３５．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６４，  ６２−６７  （１９９８）；および’’Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｓｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ’’と題するＪＰ０９−２２４６６４Ａ号（出願人：Ｓｕｚｕｋｉ  Ｍｏｔｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；発明者：Ｔｏｓｈｉａｋｉ  Ｎａｋａｊｉｍａら）］。
【００１３】
これらの生分解性プラスチックのための生分解細菌の多くの報告が存在するが、これらの報告のほとんどが、乳化または粉末プラスチックまたはミクロンオーダーの薄膜の分解に関した（Ｋｉｍ，  Ｄ．  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｒｈｅｅ，  Ｙ．  Ｈ．：  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  ｆｕｎｇｉ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ６１，  ３００−３０８  （２００３））。Ｕｃｈｉｄａらは、アシドボラックス・デラフィールデイ（Ａｃｉｄｏｖｏｌａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ）株ＢＳ−３を単離し、これはＰＢＳＡペレットを唯一の炭素源として同化する［’’Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ’’と題するＪＰ１１−２２５７５５Ａ号（出願人：Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；発明者：Ｔｏｓｈｉａｋｉ  Ｎａｋａｊｉｍａら）；Ｎ．，  Ｔｏｋｉｗａ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｎａｋａｈａｒａ，  Ｔ．：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｇｒａｄｅｓ  ｓｏｌｉｄ  ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）−ｃｏ−ａｄｉｐａｔｅ，  ａ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｌａｓｔｉｃ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １８９，  ２５−２９，  （２０００）］が、固体ペレットを生分解することができる細菌についての他の報告はない。
【００１４】
前記を考慮すると、フィルムまたはペレット形態のプラスチックを生分解することができる微生物に関する報告は数が限られており、さらにそれらの酵素はよく知られていない。酵素的リサイクルを確立するために、固体プラスチックを迅速に生分解することができる酵素に対する強い要求がある。
【発明の概要】
【００１５】
１つの実施形態では、本発明は、ポリエチレンおよびラッカーゼを含む組成物を提供し、ここで、ラッカーゼは、６０℃〜１００℃の温度で最適比活性を有する。別の実施形態では、ラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ラッカーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ラッカーゼはＢ．ボルステレンシスラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼはＢ．アグリラッカーゼである。
【００１６】
別の実施形態では、本発明はさらに、ポリエチレンを分解／生分解するための方法を提供し、これはポリエチレンを、６０℃〜１００℃の温度で最適比活性を有するラッカーゼと接触させる工程を含む。別の実施形態では、方法は反応温度を６０℃〜１００℃で維持することを含む。
【００１７】
別の実施形態では、本発明はさらに、ポリエチレンを分解するための方法を提供し、これは、ポリエチレンをブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・アグリ、またはＢ．ボルステレンシスおよびＢ．アグリの組み合わせと接触させる工程を含み、ここで、ポリエチレンは細菌のための唯一の炭素源である。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびブレビバチルス細菌を３５℃〜５０℃の温度で維持することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ブレビバチルス・ボルステレンシスおよびブレビバチルス・アグリに対する最適温度増殖条件を示すグラフである。
【図２】ブレビバチルス・ボルステレンシスおよびブレビバチルス・アグリに対する最適ｐＨ増殖条件を示すグラフである。
【図３】ブレビバチルス・ボルステレンシスから単離されたラッカーゼの活性およびブレビバチルス・アグリから単離されたラッカーゼの活性に対する最適温度条件を示すグラフである。
【図４】Ｂ．ボルステレンシスにおけるラッカーゼ比活性に対する銅濃度の効果を示す棒グラフである。
【図５】Ｂ．ボルステレンシスにおけるラッカーゼ濃度に対する銅濃度の効果を示す棒グラフである。
【図６】Ｂ．アグリにおけるラッカーゼ比活性に対する銅濃度の効果を示す棒グラフである。
【図７】Ｂ．アグリにおけるラッカーゼ濃度に対する銅濃度の効果を示す棒グラフである。
【図８】Ｂ．アグリが、ブレビバチルス・ボルステレンシスに比べて、より良好なポリエチレン生分解能力を有したことを示す棒グラフである。
【図９】ラッカーゼ生分解されたポリエチレン（Ａ）および対照（Ｂ）を示すＳＥＭ顕微鏡写真（×１０，０００）である。
【図１０】７日インキュベーション後の、ロドコッカス・ルーバー細菌のラッカーゼのポリエチレン消化効率に対するキシランおよび／または銅の効果を示す棒グラフである。対照は銅、キシランおよびポリエチレンを、ラッカーゼまたはこれを含む細菌なしで含んだ。
【図１１】１６ＳｒＲｎａ配列ブレビバチルス・アグリを示す。
【図１２】それらの１６ＳｒＲＮＡ配列に基づく両方の株の系統樹を外部株としてのロドコッカス・ルーバーと共に示す。
【図１３】ブレビバチルス・アグリの４０℃における細菌増殖曲線を示す。
【図１４】００：００時間での細菌細胞外培地へのラッカーゼ排出を示す
【図１５】１９：４０時間での細菌細胞外培地へのラッカーゼ排出を示す。
【図１６】異なる測定時間における排出されたラッカーゼ活性を示す。
【図１７】異なる温度におけるラッカーゼ相対活性を示す。全ての実験は同じ酵素濃度を用いて実施された。
【図１８】３０および９０分後の異なる温度におけるラッカーゼ活性を示す。
【図１９】ＡＢＴＳのラッカーゼ誘導に対する効果を示す。
【図２０】ＡＢＴＳのラッカーゼ比活性に対する効果を示す。
【図２１】キシランの（Ａ）ラッカーゼ誘導、および（Ｂ）ラッカーゼ比活性に対する効果を示す。
【図２２】キシランおよび銅の相乗作用の（Ａ）ラッカーゼ誘導、および（Ｂ）ラッカーゼ比活性に対する効果、１００μｇ／ｍＬのキシラン濃度を示す。
【図２３】コバルトの（Ａ）ラッカーゼ誘導、および（Ｂ）ラッカーゼ比活性に対する効果を示す。
【図２４】ニッケルの（Ａ）ラッカーゼ誘導、および（Ｂ）ラッカーゼ比活性に対する効果を示す。
【図２５】異なる添加物のラッカーゼ活性に対する効果間の比較を示す。
【図２６】異なる添加物の存在下での３０日生分解実験後の、ＰＥ試料のＦＴＩＲ分析を示す。（Ａ）ＦＴＩＲスペクトル、（Ｂ）各処理に対するカルボニルインデックス。
【図２７】異なる添加物の存在下での３０日生分解実験後のＰＥ試料のＤＳＣ分析、（Ａ）ＤＳＣ曲線、（Ｂ）ＤＳＣ分析から得られたパラメータを示す。
【図２８】７日間のラッカーゼ酵素とのプレインキュベーション後に実施された、異なる添加物の存在下での３０日生分解実験後のＰＥ試料のＦＴＩＲ分析を示す。（Ａ）ＦＴＩＲスペクトル、（Ｂ）各処理に対するカルボニルインデックス。
【図２９】７日間のラッカーゼ酵素とのプレインキュベーション後に実施された、異なる添加物の存在下での３０日生分解実験後のＰＥ試料のＤＳＣ分析を示す。（Ａ）ＤＳＣ曲線、（Ｂ）ＤＳＣ分析から得られたパラメータ。
【図３０】ラッカーゼとのプレインキュベーションありおよびなしのＤＳＣ曲線の比較を示す。（Ａ）ＤＳＣ曲線（Ｂ）ＤＳＣ分析から得られたパラメータ。
【図３１】異なる期間中ラッカーゼと共にインキュベートしたＰＥのＦＴＩＲ分析（Ａ）ＦＴＩＲスペクトル、（Ｂ）各処理に対するカルボニルインデックスを示す。
【図３２】ラッカーゼとの異なるインキュベーション時間後のＰＥ試料のＤＳＣ曲線の比較を示す。（Ａ）ＤＳＣ曲線（Ｂ）ＤＳＣ分析から得られたパラメータ。
【図３３】ＰＥ試料のＳＥＭ画像を示す。（Ａ）処理なしのＰＥ試料（Ｂ）酵素なしでの７日のインキュベーション後のＰＥ試料（Ｃ）ラッカーゼとの７日のインキュベーション後のＰＥ試料。
【図３４】ブレビバチルス・アグリ由来のマルチ銅オキシダーゼ配列を示す。
【図３５】増幅遺伝子のＰＣＲ産物を用いた、１％アガロースゲルを示す。
【図３６】コロニーＰＣＲ由来のＰＣＲ産物を用いた、１％アガロースゲルを示す。
【図３７】誘導産物を用いた、１０％ＳＤＳ  ｐａｇｅを示す。
【図３８】異なる温度における酵素誘導を示す。
【図３９】細菌誘導培地中の銅濃度のラッカーゼ活性に対する効果を示す。
【図４０】洗浄および溶出緩衝液中の銅濃度の精製ラッカーゼ活性に対する効果を示す。
【図４１】異なる銅濃度を含む溶出緩衝液で洗浄された、精製タンパク質試料を用いた１０％ＳＤＳ  ｐａｇｅを示す。
【図４２】ｍｏｎｏＱフラクションを用いた１０％ＳＤＳ  ｐａｇｅを示す。
【図４３】ＡＢＴＳ濃度のラッカーゼ活性に対する効果を示す（タンパク質ストック濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）。
【図４４】反応温度のラッカーゼ活性に対する効果を示す（タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）。
【図４５】温度のラッカーゼ生存に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１つの実施形態では、本発明は、ポリエチレンおよびラッカーゼを含む組成物を提供する。別の実施形態では、ラッカーゼはオキシダーゼ酵素である。別の実施形態では、ラッカーゼは銅を含むオキシダーゼ酵素である。別の実施形態では、ラッカーゼはオキシダーゼ酵素であり、これは、フェノールおよび同様の分子上で作用し、一電子酸化を実施する。別の実施形態では、ラッカーゼは細菌ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは植物ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは真菌ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは好熱性ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは好熱性細菌ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは好気性細菌ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは細菌単離ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは細菌精製ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼはブレビバチルス・ボルステレンシスラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼはブレビバチルス・アグリラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼは細胞外細菌ラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼはロドコッカス・ルーバーラッカーゼである。別の実施形態では、ラッカーゼはロドコッカス・ルーバーＣ２０８ラッカーゼである。
【００２０】
別の実施形態では、発明の組成物は、５０℃〜１００℃の温度で維持される。別の実施形態では、発明の組成物は、６０℃〜１００℃の範囲の温度で維持される。別の実施形態では、発明の組成物は、７０℃〜９０℃の範囲の温度で維持される。別の実施形態では、発明の組成物は７５°〜８５℃の範囲の温度で維持される。別の実施形態では、発明の組成物は、７７℃〜８３℃の範囲の温度で維持される。
【００２１】
別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、５０℃〜１００℃の範囲の温度で最適比活性を有する。別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、６０℃〜１００℃の温度範囲で最適比活性を有する。別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、７０℃〜９０℃の温度範囲で最適比活性を有する。別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、７５℃〜８５℃の温度範囲で最適比活性を有する。別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、７７℃〜８３℃の温度で最適比活性を有する。
【００２２】
別の実施形態では、本明細書で記載されるラッカーゼは下記アミノ酸配列を含む：ｍｒｅｐｆｖｌｅｇｅｋｓｉｌａｌａｄｗｑａｈｆｐｇｌｖａｇｆｔｖｒｌｇｇｅｓｅｅｐｙｇｓｆｎｍｇｌｈｖｇｄｄｐａｈｖｉａｎｒｋｋｌａｅｑｖｇｍｐｆｅａｗｔｃａｄｑｖｈｇｎｒｖｃｑｖｔａｇｇａｇｋｅｓｌｇｄｖｉａａｔｄｇｌｆｔｑｑｋｇｖｌｌｔｓｆｙａｄｃｖｐｌｙｆｌｄｐａｓｇａｉｇｌａｈａｇｗｋｇｔｖｇｒｉａｅｅｍｖｋａｌｑｔｈｙｋａｋｐｇｄｉｒｉａｉｇｐｓｉｇｇｃｃｙｅｖｄｅｒｉｍｔｑｖｒｔｓａｅｎｗｋｔａｖｓａｓｔｅｇｋｙｍｌｄｌｒｑｌｎｔｅｉｌｒｅａｇｉｓｒａｎｍｌｖｔｄｗｃｔｓｃｒｔｄｌｆｆｓｈｒｋｅａｇｐｇｋｍｔｇｒｍａｓｙｉｇｗｋｅｔｅｇｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。別の実施形態では、本明細書で記載されるラッカーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の実施形態では、本明細書で記載されるラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の活性フラグメントを含む。別の実施形態では、ラッカーゼの活性フラグメントはラッカーゼ活性を含む。別の実施形態では、ラッカーゼの活性フラグメントは、ポリエチレン生分解および／または分解活性を含む。別の実施形態では、ラッカーゼの活性フラグメントは、６０℃〜１００℃の範囲またはラッカーゼに対して上記で提供される任意の他の範囲の温度で最適ポリエチレン生分解および／または分解活性を含む。
【００２４】
別の実施形態では、ラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼのバリアントであり、これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼとは、１−５の保存的アミノ酸置換により異なる。別の実施形態では、本発明のラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼまたはそのペプチドに少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼに少なくとも７５％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼに少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼに少なくとも８５％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼに少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のラッカーゼに少なくとも９５％相同である。
【００２５】
別の実施形態では、ラッカーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼのバリアントであり、これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼとは、１−５の保存的アミノ酸置換により異なる。別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼまたはそのペプチドに少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼに少なくとも７５％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼに少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼに少なくとも８５％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼに少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のラッカーゼに少なくとも９５％相同である。
【００２６】
別の実施形態では、本発明のラッカーゼは、下記ＤＮＡ配列によりコードされる:ＡＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＣＣＧＡＧＣＡＡＧＣＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＡＡＡＧＣＧＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＧＡＴＧＡＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＴＡＣＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣＧＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴＴＴＣＣＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＡＡＡＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＧＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＣＴＣＧＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＡＴＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＴＣＴＴＴＴＣＣＧＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＡＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＧＧＧＴＡＴＴＴＧＴＣＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＧＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＡＴＣＧＣＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＡＴＣＧＴＣＴＡＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＴＣＧＧＧＴＣＡＡＣＴＣＣＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＣＧＣＧＡＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＡＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＧＴＴＣＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＧＡＣ��ＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＣＧＧＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＣＴＡＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＡＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＡＴＡＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＴＣＣＧＡＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧＴＡＡ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２)。
【００２７】
別の実施形態では、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列と少なくとも７５％同一である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列と少なくとも８５％同一である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一である。
【００２８】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物は水性組成物である。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はゲルの形態である。
【００２９】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらにＣｕ２＋を含む。別の実施形態では、特にブレビバチルス・アグリラクターゼを含む組成物に関しては、組成物は、少なくとも５μΜ、少なくとも１０μΜ、少なくとも１５μΜ、少なくとも２０μΜ、少なくとも２５μΜまたは少なくとも３０μΜのＣｕ２＋を含む。別の実施形態では、組成物は、２５μΜ−３５μΜのＣｕ２＋、好ましくは約３０μΜのＣｕ２＋を含む。
【００３０】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、キシランを含む。別の実施形態では、特にブレビバチルス・アグリラクターゼを含む組成物に関しては、組成物は少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも７５μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬ、少なくとも９０μｇ／ｍＬ、少なくとも９５μｇ／ｍＬまたは少なくとも１００μｇ／ｍＬのキシランを含む。さらに別の実施形態では、組成物は、最大でも５００μｇ／ｍＬ、最大でも４００μｇ／ｍＬ、最大でも３００μｇ／ｍＬ、最大でも２００μｇ／ｍＬ、最大でも１５０μｇ／ｍＬ、最大でも１４０μｇ／ｍＬ、最大でも１３０μｇ／ｍＬ、最大でも１２０μｇ／ｍＬ、最大でも１１０μｇ／ｍＬまたは最大でも１００μｇ／ｍＬのキシランを含む。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、Ｃｕ２＋およびキシランを含む。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、３０−１００μΜのＣｕ２＋および５０−１５０μｇ／ｍＬのキシラン、４５−７５μΜのＣｕ２＋および７５−１２５μｇ／ｍＬのキシラン、または約６０μΜのＣｕ２＋および約１００μｇ／ｍＬのキシランを含む。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、キシランを含み、Ｃｕ２＋を欠いている。
【００３１】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））を含む。別の実施形態では、特にブレビバチルス・アグリラクターゼを含む組成物に関しては、組成物は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．ｌ％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）〜約０．０５％（ｖ／ｖ）または約０．０１％（ｖ／ｖ）のＡＢＴＳを含む。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、二価金属を含む。二価金属は当業者に知られていることが認識されるべきである。別の実施形態では、二価金属はコバルト（Ｃｏ２＋）である。別の実施形態では、二価金属はニッケル（Ｎｉ２＋）である。別の実施形態では、特にブレビバチルス・アグリラクターゼを含む組成物に関しては、組成物は、少なくとも５μΜ、少なくとも１０μΜ、少なくとも１５μΜまたは少なくとも２０μΜの二価金属を含む。
【００３３】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、６．５〜９．５のｐＨを有する。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、７〜９のｐＨを有する。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、７．５〜８．５のｐＨを有する。別の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、７．８〜８．２のｐＨを有する。
【００３４】
別の実施形態では、本明細書で記載される組成物はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを接触させたままとする界面活性剤を含む。別の実施形態では、界面活性剤はプラスチック−結合因子である。別の実施形態では、界面活性剤は生物系界面活性剤である。
【００３５】
別の実施形態では、界面活性剤は、当業者に知られている任意の物質である。別の実施形態では、界面活性剤はプラスチック−結合タンパク質である。別の実施形態では、界面活性剤は糖脂質である。別の実施形態では、界面活性剤は、糖脂質エステル、例えばマンノシルエリスリトール脂質およびラムノリピド；シクロリプブペプチド（ｃｙｃｌｏｌｉｐｂｐｅｐｔｉｄｅ）；シクロポリペプチド；および両親媒性タンパク質、例えばサーフェクチン（ｓｕｒｆｅｃｔｉｎ）である。別の実施形態では、界面活性剤は、プラスチック−結合タンパク質、例えば限定はされないがヒドロホビンおよびその相同体である。
【００３６】
別の実施形態では、「ポリエチレン」および「プラスチック」という用語は同じ意味で使用される。別の実施形態では、プラスチックはポリエステル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリスチレン、デンプン、およびそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態では、ポリスチレンはポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチルスクシネートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、脂肪族ポリエステル、ポリカプロラクトンおよびそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、プラスチックは生分解性プラスチックである。別の実施形態では、生分解性プラスチックは、使用状態中その機能を維持し、発明の組成物の作用により、より簡単な分子レベル分解されるプラスチックである。別の実施形態では、分解されるプラスチックは、分解反応の型によって任意の形態、例えばエマルジョンおよび固体ペレットをとることができる。別の実施形態では、ポリエチレンは、熱酸化により処理される。別の実施形態では、ポリエチレンは、酸化により処理される。別の実施形態では、ポリエチレンは、熱酸化および酸化の両方により処理される。
【００３７】
別の実施形態では、組成物は、Ｂ．ボルステレンシスの生物学的に純粋な培養物およびプラスチックを含む。別の実施形態では、組成物は、Ｂ．アグリの生物学的に純粋な培養物およびプラスチックを含む。別の実施形態では、組成物は、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシスの生物学的に純粋な培養物、およびプラスチックの混合物を含む。別の実施形態では、組成物は、ブレビバチルス・アグリまたはＢ．ボルステレンシス由来の変異体を含み、これは、そのプラスチック生分解活性を約６０℃〜約１００℃の温度で維持する。
【００３８】
特許請求される発明において記載される微生物の有効な、生分解量の決定は、当業者の知識の範囲内である。対象となる廃棄物を効果的に分解するのに必要とされる細菌の量を決定することができる、様々な方法が存在する。
【００３９】
方法
別の実施形態では、ラッカーゼによるポリエチレン生分解は２つの工程を含む：最初に酵素がポリエチレン基質に付着し、その後、水（ｈｙｄｒｏｌｉｃ）開裂を触媒する。別の実施形態では、ラッカーゼは、ポリエチレンを短鎖のオリゴマ、二量体、およびモノマに崩壊させる。別の実施形態では、ラッカーゼはポリエチレンを短鎖のオリゴマ、二量体、およびモノマに崩壊させ、これは、発明の細菌に対し、炭素およびエネルギーの唯一の源として機能する。別の実施形態では、生分解中、モノマはさらにミネラル化される。別の実施形態では、発明の生分解プロセスは脱重合プロセスである。
【００４０】
別の実施形態では、発明の生分解プロセスにより、最終生成物が得られる：二酸化炭素（ＣＯ２）、水（Ｈ２Ｏ）および／またはメタン（ＣＨ４）。別の実施形態では、生分解プロセスは、ポリエチレンを酵素的に分解する能力を有する微生物から始まる。別の実施形態では、生分解プロセスは、精製酵素から始まる。別の実施形態では、プロセスは、ラッカーゼのプラスチック表面への付着を含む。別の実施形態では、ラッカーゼは、プラスチックのポリマ鎖を開裂し、プラスチック表面の侵食、すなわち、生分解が起こり、最終生成物ＣＯ２、Ｈ２ＯおよびＣＨ４が生成される。別の実施形態では、ラッカーゼは、ポリエチレンの炭化水素バックボーンを酸化する。別の実施形態では、本明細書で記載されるプロセスは環境に優しい。
【００４１】
酵素
別の実施形態では、発明は、ポリエチレンを分解するための方法を提供し、これはポリエチレンをラッカーゼと接触させる工程を含む。別の実施形態では、発明はポリエチレンを分解するための方法を提供し、これは、ポリエチレンを、６０℃〜１００℃の温度範囲で最適比活性を有するラッカーゼと接触させる工程を含む。別の実施形態では、方法はさらに、ラッカーゼをＣｕ２＋と接触させることを含む。
【００４２】
別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを５０℃〜１００℃の温度範囲で維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを６０℃〜１００℃の温度範囲で維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７０℃〜９０℃の温度範囲で維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７５℃〜８５℃の温度範囲で維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７７℃〜８３℃の温度範囲で維持することを含む。
【００４３】
別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７〜１０のｐＨで維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７〜９のｐＨで維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７．５〜８．５のｐＨで維持することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、ポリエチレンおよびラッカーゼを７．８〜８．２のｐＨで維持することを含む。
【００４４】
別の実施形態では、発明の方法はさらに、生分解反応前に前記ラッカーゼの前記ポリエチレンとのインキュベーションを含む。当業者に認識され得るように、インキュベーション期間は、反応で使用される特定のラッカーゼに依存し得る。別の実施形態では、前記インキュベーションは少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日または少なくとも１４日である。
【００４５】
細菌
別の実施形態では、発明は、ポリエチレンを分解するための方法を提供し、これは、ポリエチレンをブレビバチルス・ボルステレンシス、Ｂ．アグリ、またはブレビバチルス・ボルステレンシスおよびブレビバチルス・アグリの組み合わせと接触させる工程を含み、ここで、ポリエチレンは細菌のための唯一の炭素源である。別の実施形態では、方法はさらに、細菌をＣｕ２＋と接触させることを含む。別の実施形態では、方法はさらに、細菌を、キシランと接触させることを含む。別の実施形態では、方法はさらに、細菌を、Ｃｕ２＋およびキシランと接触させることを含む。
【００４６】
別の実施形態では、発明は、ポリエチレンを分解するための方法を提供し、これは、ポリエチレンを本発明のラッカーゼを発現する細菌と接触させる工程を含む。別の実施形態では、細菌は菌株からなる。別の実施形態では、細菌は単離菌株からなる。
【００４７】
別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は３０℃〜５５℃の温度範囲で実施される。別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は３５℃〜５０℃の温度で実施される。別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は３５℃〜４５℃の温度で実施される。別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は３７℃〜４３℃の温度で実施される。
【００４８】
別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は、７〜９．５のｐＨで実施される。別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は７〜９のｐＨで実施される。別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は７．５〜８．５のｐＨで実施される。別の実施形態では、発明の方法の細菌反応は７．８〜８．８のｐＨで実施される。
【００４９】
生分解反応
別の実施形態では、本発明による生分解反応は、その目的および規模によって、当業者に知られている任意の反応系（例えば、水溶液または固体系）および任意の条件で実施される。
【００５０】
別の実施形態では、生分解反応は、プラスチックに効果的に付着し、本発明の利点を得るために、界面活性剤とプラスチックの間の強化された疎水性相互作用を含む。別の実施形態では、本方法は、界面活性剤およびプラスチックを低水分活性条件において混合する工程、およびプラスチックを、プラスチック生分解酵素／細菌を使用して、高水分活性条件において生分解する工程を含む。
【００５１】
別の実施形態では、「水分活性」という句は、当業者によく知られた因子であり、溶質を含む溶液の蒸気圧と純粋なもののそれとの間の比として規定される。別の実施形態では、「低水分活性条件」は、界面活性剤がプラスチックの疎水性表面に著しく付着することができる条件である。
【００５２】
別の実施形態では、反応は、界面活性剤およびフィルムまたはペレット形態のプラスチックを低水分活性条件において混合する工程を含み、よって、有効量の界面活性剤がプラスチックに付着し、水分活性が増加し、プラスチックのプラスチック生分解酵素／細菌による生分解が促進される。
【００５３】
別の実施形態では、反応は低塩濃度（４％未満）条件において実施される。
【００５４】
この発明は下記実験の詳細セクションで説明される。これらのセクションは発明の理解を助けるために明記されるが、その後に続く特許請求の範囲で明記される発明を決して制限することを意図せず、制限すると解釈されるべきではない。
【００５５】
本明細書では、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別記されない限り、複数の形態を含む。よって、例えば、「１つの治療薬」への言及は、１を超える治療薬への言及を含む。
【００５６】
特定的に述べられておらず、文脈から明らかでない限り、本明細書では、「または」という用語は、包含的であると理解される。
【００５７】
「含む」という用語は本明細書では、「含むが、限定はされない」という句を意味するために使用され、これと同じ意味で使用される。
【００５８】
本明細書では、「含む」「含んでいる」「含有している」「有する」などという用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、「包含する」「包含している」などを意味することができ；「本質的に、から構成される」または「本質的に、からなる」は同様に、米国特許法で帰する意味を有し、その用語は制約がなく、列挙されているその基本または新規の特性が、列挙されているものを超えた存在により変化されない限り、列挙されているものを超えた存在を可能にするが、先行技術実施形態を排除する。別の実施形態では、「含む」という用語は、「からなる」という用語を包含する。
【００５９】
特定的に述べられておらず、文脈から明らかでない限り、本明細書では、「約」という用語は、当技術分野における一般公差の範囲内、例えば、平均の２つの標準偏差内として理解される。約は、表示された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。文脈から別に明確にならない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語により修飾される。
【００６０】
本発明の追加の目的、利点、および新規特徴は、制限することを意図しない下記実施例の検査により当業者に明らかになるであろう。加えて、以上で詳述され、以下の特許請求の範囲セクションで特許請求される本発明の様々な実施形態および態様の各々は、下記実施例において実験的支持を見出す。
【００６１】
実施例
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明において使用される実験室手順は分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、下記を参照されたい：’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ’’  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）；  ’’Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’’  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’’，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  ’’Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ’’，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ’’，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  ’’Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ’’，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；４，６８３，２０２号；４，８０１，５３１号；５，１９２，６５９号および５，２７２，０５７号で明記される方法；  ’’Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ’’，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  ’’Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ’’  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９９４），  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；  ’’Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  ’’Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  ’’Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ’’  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）；これらは全て参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、この文書を通して提供される。
【００６２】
実施例１
土壌細菌から新たに単離したラッカーゼによるポリエチレンの生分解
この研究は、プラスチック生分解に関与することが見出された細菌ラッカーゼの活性の誘導および最適化に焦点を当てた。
【００６３】
２つの土壌細菌が好ましいポリエチレン生分解能力を示したことが見出された。どちらの細菌も、それらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子により配列決定され、ブレビバチルス・ボルステレンシスおよびブレビバチルス・アグリと同定された。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が図１１に示される。図１２はそれらの１６ＳｒＲＮＡ配列に基づく両方の株の系統樹を、外部株としてのロドコッカス・ルーバーと共に示す。
【００６４】
２つの株のキャラクタリゼーションから、それらが好熱性であり、最適増殖温度はブレビバチルス・ボルステレンシスでは４０℃、およびブレビバチルス・アグリでは４５℃であることが明らかになった（図１）。最適ｐＨ増殖条件はｐＨ＝６．５〜ｐＨ＝７の間であることもまた、見出された（図２）。
【００６５】
さらなる証拠から、どちらの株も細胞外ラッカーゼ酵素を生成することが示され、これは８０℃で最適活性を示した（図３および図１７）。最適温度は細菌の最適増殖温度に比べ比較的高く、それは、その酵素を使用した細菌の超好熱祖先の進化上の残りに由来することが可能である。
【００６６】
高温でのインキュベーションの酵素に対する効果を知るために、異なる温度におけるラッカーゼ酵素の生存を調べた（図１８）。この試験中、ラッカーゼを異なる温度において３０または９０分間インキュベートし、その後、活性試験を実施した。ブレビバチルス・アグリにおいて酵素が最も良好に生存した温度は８０℃であることが見出され、この温度では、酵素はその活性において４％の減少を示した。
【００６７】
細菌をポリエチレンと共にインキュベートした場合、Ｂ．アグリがＢ．ボルステレンシスに比べ良好な生分解能力を有したことに注目した（図８）。
【００６８】
ポリエチレンの生分解は、対照に比べ、ＳＥＭ顕微鏡法を使用して１０，０００倍に拡大すると、明確に目で確認できるようになった（図９）。
【００６９】
ブレビバチルス・アグリの細菌増殖を特徴付けた。図１３に示されるように、細菌は、３００分後に定常期に入った。さらに、活性分析に対する最適増殖時間を実施すると、ブレビバチルス・アグリに対する最適分析時間は２日であることが見出された（図１６）。
【００７０】
実施例２
細胞外ラッカーゼ排出
細胞外ラッカーゼの排出を２，６−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）の存在下で調べ、生分解プロセスに関与することを見出した。この基質の酵素による酸化により、溶液の色の黄色−褐色がかった色への変化が起こった。細胞外酵素の３０ｍＭのＤＭＰとの室温における１９時間のインキュベーション後、ブランクと比較すると（図１４）、褐色がかった色となった（図１５）。これは、ラッカーゼ酵素の細胞外培地への排出を示した。
【００７１】
実施例３
異なる添加物のラッカーゼ活性への効果
酵素活性を改善するために、細菌増殖培地への異なる添加物添加の効果を調べた。ラッカーゼ誘導および活性の両方に対する効果を調べた。下記添加物を調べた：銅（Ｃｕ２＋）、ＡＢＴＳ、キシラン、銅およびキシラン相乗作用、コバルトならびにニッケル。
【００７２】
両方の細菌におけるラッカーゼの誘導および活性に対する増殖培地へのＣｕ２＋添加の効果を評価した。Ｂ．ボルステレンシスでは、Ｃｕ２＋の添加濃度を増大させると、ラッカーゼの誘導が低下するが、比活性が高くなることが見出された（図４および５）。
【００７３】
Ｂ．アグリでは、Ｃｕ２＋の添加濃度を増大させると、ラッカーゼの誘導および比活性が改善されることが見出された（図６）。さらに、Ｂ．アグリにおける、Ｃｕ濃度のラッカーゼ濃度における効果をモニタした（図７）。銅の酵素誘導および活性に対する陽性効果は、銅が酵素触媒部位の一部を構成するという事実により説明することができる。よって、銅のレベルを増加させるとより活性な酵素が生成される。
【００７４】
２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）としても知られているＡＢＴＳは公知の基質およびラッカーゼメディエーターである。ＡＢＴＳの効果を分析すると、その反応培地への添加は酵素活性を改善することが仮定された。０．１％（ｖ／ｖ）のＡＢＴＳ濃度により、ブレビバチルス・アグリにおいて最適ラッカーゼ誘導が得られた（図１９）。０．０１％（ｖ／ｖ）のＡＢＴＳ濃度により、ブレビバチルス・アグリにおいて最適ラッカーゼ比活性が得られた（図２０）。
【００７５】
キシランの効果を調べると、キシラン濃度を増加させると、ブレビバチルス・アグリにおいてラッカーゼ誘導が増加することが見出された（図２１Ａ）。１００μｇ／ｍＬのキシラン濃度により、最適ラッカーゼ比活性が得られる（図２１Ｂ）。
【００７６】
キシランおよび銅の相乗作用の効果を分析すると、銅濃度を増加させると、ブレビバチルス・アグリにおいてラッカーゼ誘導および比活性の両方が増加したことが見出された（図２２Ａ−Ｂ）。これらの結果を、銅添加で得られたものと比較すると−誘導レベルは、銅およびキシラン誘導において実際に高いことが指摘されるべきである。
【００７７】
二価金属のラッカーゼ誘導および活性に対する効果もまた調べた。選択した金属はコバルト（触媒部位で銅にとって代わることができることが見出されている）、およびニッケル、酸化能力を有する公知の二価金属とした。
【００７８】
コバルト濃度のラッカーゼ誘導および活性に対する効果を調べると、ブレビバチルス・アグリにおいて、２０μΜのコバルト濃度により、最適ラッカーゼ誘導が得られ（図２３Ａ）、１０μΜの濃度により、最適ラッカーゼ比活性が得られたことが見出された（図２３Ｂ）。
【００７９】
ニッケル濃度のラッカーゼ誘導および活性に対する効果を分析すると、ブレビバチルス・アグリにおいて、２０μΜのニッケル濃度により、最適ラッカーゼ誘導が得られ（図２４Ａ）、１０μΜのニッケル濃度により、最適ラッカーゼ比活性が得られたことが見出された（図２４Ｂ）。
【００８０】
異なる添加物のラッカーゼ活性に対する効果を比較すると（図２５）、最適添加物は３０μΜのＣｕ２＋または１００μｇ／ｍＬキシラン＋６０μΜのＣｕ２＋であることが見出された。
【００８１】
異なる添加物、銅ならびに銅およびキシラン相乗作用の効果、およびポリエチレン（ＰＥ）との、生分解前のラッカーゼとの７日インキュベーションをさらに調べた。（フーリエ変換赤外分光法）ＦＴＩＲ分析（図２６Ａ−Ｂ）によると、ＰＥが生分解実験前にラッカーゼとインキュベートされなかった場合、１００μｇ／ｍＬのキシランおよび６０μΜ銅の存在下での生分解実験により、最高カルボニルインデックスが得られたことがわかり、これは、より良好な生分解プロセスが起きたことを示す。
【００８２】
（示差走査熱量計）ＤＳＣ分析によれば（図２７Ａ−Ｂ）、試料結晶化度間で有意な差は得られなかった。生分解実験の初めに、ＰＥの生分解はＰＥ中のアモルファス領域から始まり、ＰＥの結晶化パーセントが増加することが仮定され得る。その後、生分解プロセスはポリマの結晶領域において続き、ＰＥの結晶領域における立体妨害がこの領域の酸化の原因として起こり、結晶化パーセントが減少する。
【００８３】
ＰＥを生分解実験前にラッカーゼとインキュベートさせると、ＦＴＩＲ分析におけるより高いカルボニルインデックス値が全ての試料に対して得られた（図２８Ａ）。ここで、対照と比べて、より高いカルボニルインデックスが、全ての試料において得られた（図２８Ｂ）が、とりわけ、銅添加の効果を、細菌増殖培養物への銅およびキシラン添加と比較すると、異なる処理間で有意な差はない。
【００８４】
ＰＥを生分解実験前にラッカーゼとインキュベートさせると、ポリマのより高い結晶化度および融解温度も得られ（図２９）、これは、ポリマのアモルファス部分は破壊され、より安定なポリマが得られたことを示す可能性がある。両方の実験において、７１２株と共にインキュベートした試料の結晶化度レベルは、他の実験よりも高くなり、生分解はポリマのアモルファス部分から始まり、結晶化度が増加し、その後、いくつかの点では、結晶領域の生分解が始まり、結晶化度が減少するという理論とつながりがある可能性がある
【００８５】
生分解実験前の酵素とのインキュベーションの効果を分析すると、インキュベーションにより、異なる熱特性、例えば融解温度を有するＰＥが形成されるが、ポリマ結晶化度においては大きな差はないことが明らかである。この融解温度の変化により、より安定なポリマが得られることが示される（図３０）。
【００８６】
実施例４
キシランおよび／または銅との７日インキュベーション後のロドコッカス・ルーバー細菌のラッカーゼによるポリエチレンの生分解
前の実施例と同様に、この研究は、プラスチック生分解に関与することが見出された細菌ラッカーゼの活性の誘導および最適化に焦点を当てた。
【００８７】
この研究では、ロドコッカス・ルーバー（Ｃ２０８）細菌は好ましいポリエチレン生分解能力を示したことが見出された。
【００８８】
Ｃ２０８ポリエチレン生分解活性の初期最適化により、キシランはこのＣ２０８、ラッカーゼ、ポリエチレン生分解活性に良い影響を与えることが明らかになった。特定的には、図１０の結果は、銅ではなくキシランがＣ２０８ラッカーゼ活性を誘導することを示す。
【００８９】
実施例５
ラッカーゼ酵素によるＰＥ酸化に対するインキュベーション時間の効果
ＰＥのラッカーゼとのインキュベーション時間の効果をＦＴＩＲ分析を用いて分析すると、ＰＥのラッカーゼとのインキュベーション時間が長いほど、より高いカルボニルインデックス値が得られたことが明らかである。ここで、最高カルボニルインデックスはＰＥ試料をラッカーゼと１４日間インキュベートした時に得られた（図３１）。
【００９０】
同じ結果をＤＳＣ分析を用いて分析すると、得られた結果は、ＦＴＩＲ結果と一致した。ＤＳＣ結果では、ＰＥ試料が元の試料と比べて変化を受けたことが明らかである。１４日インキュベーション試料では、融解温度ならびに結晶化度は変化した（図３２）。
【００９１】
ＰＥの表面に変化があったかどうか見るために、前の結果の試料を走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を用いて分析した。図３３では、ラッカーゼとの１４日インキュベーション後のＰＥ（図３３Ｃ）を対照（図３３Ｂ）および元のＰＥ（図３３Ａ）と比較すると、ＰＥ表面の表面でかなりの変化が得られたことを見ることができる。対照および元の未処理ＰＥの表面はかなり滑らかに見えるが、ラッカーゼとのインキュベーション後、膨張して見え、またはさらに壊れて見える。この現象に対する可能な説明は、ラッカーゼ酵素がＰＥの表面を酸化したというものであり、これは以上で記載されるＦＴＩＲ分析により支持される。
【００９２】
実施例６
大腸菌における７１２菌株由来の酵素の発現
ＮＣＢＩウェブサイトに基づき、ブレビバチルス・アグリ株におけるマルチ銅オキシダーゼ遺伝子（受入ＥＬＫ４２５２６）を配列決定した。このプロセスにおいて使用したプライマーは：Ｌａｃ−ａｇｒｉＦ、Ｌａｃ−ａｇｒｉＲ、Ｌａｃ−Ｆ３’、Ｌａｃ−Ｆ５’である。
Ｌａｃ−ａｇｒｉＦ：５’ＡＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＧＡＡＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
Ｌａｃ−ａｇｒｉＲ：５’ＴＴＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＧＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
Ｌａｃ−Ｆ３’：５’ＴＣＡＴＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＴＧＴＴＣＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
Ｌａｃ−Ｆ５’：５’ＡＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＣＴＡＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
【００９３】
得られた配列を図３４に示す。この配列に基づいて、ｐＥＴ４１ａ、ｐＥＴ２８、およびｐＥＴ４１−ｍｂｐに対するプライマーを設計した。プライマーをＧｅｎｅｉｏｕｓプログラムおよびＮＥＢカッターウェブサイトを使用して設計した。
【００９４】
ｐＥＴ４１ａおよびｐＥＴ４１−ｍｂｐを切断するために、下記プライマーを使用した：
Ｆｒ−Ｌａｃ−ＭｆｅＩ−ｐＥＴ４１（ＭｆｅＩ制限部位）：
５’−ＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＧＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
Ｆｒ−Ｌａｃ−ＳｐｅＩ−ｐＥｔ４１（Ｓｐｅｌ制限部位）：
５’−ＴＡＧＣＴＡＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＧＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
Ｒｅｖ−Ｌａｃ−ＮｏｔＩ−ｐＥＴ４１（Ｎｏｔｌ制限部位）：
５’−ＡＴＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＧＧＴＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
【００９５】
ｐＥＴ２８ａを切断するために、下記プライマーを使用した：
Ｆｒ−Ｌａｃ−Ｎｄｅ−ｐＥＴ２８（Ｎｄｅ制限部位）：
５’−ＡＴＣＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＧＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
Ｒｅｖ−Ｌａｃ−Ｘｈｏ−ｐＥＴ２８（Ｘｈｏ制限部位）：
５’−ＡＴＧＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＧＧＴＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
【００９６】
マルチ銅オキシダーゼ遺伝子の以上で言及したプライマーを用いた増幅＼ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルを用いて分析した（図３５）。ゲルは明らかに、プライマーを用いた遺伝子の良好な増幅を示した。
【００９７】
切断し、連結させた後、プラスミドを、コンピテント大腸菌細菌Ｃｌｏｏｎｉ株にトランスフォームさせ、コロニー−ＰＣＲを実施した。１％アガロースゲルを使用したＰＣＲ産物の分析（図２６）は、コロニー１、２、８、９、１０、１１、１２およびコロニー１５が、陽性対照（ブレビバチルス・アグリから増幅させた遺伝子）と比べて、その遺伝子に対して陽性であることが疑われることを示した。元の細菌（ブレビバチルス・アグリ）から増幅させたラッカーゼ酵素遺伝子は陽性対照として機能した。陰性対照では、修飾プラスミドを分析するのに使用された同じプラスミドを使用する、無修飾プラスミドの増幅が使用された。
【００９８】
全ての陽性コロニー（コロニー番号１、２、８、９、１０、１１、１２、１５）のプラスミドを浄化し、配列決定し、コロニー番号１、２、１０および１５は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓプログラムで作成された配列比較により真陽性であった（図示せず）。陽性プラスミドを、コンピテント大腸菌細菌（ＢＬ２１株）にトランスフォームさせ、それらの細菌による酵素発現を１０％ＳＤＳ電気泳動ｐａｇｅで分析した（図３７）。プラスミド４１ａ、２８ａおよび４１ｍｂｐを陰性対照として使用し、細菌にトランスフォームさせた。タンパク質がコロニー１５において最もよく発現されたので、この点から、我々はコロニー１５を使用するべきであることを決定した。
【００９９】
次に、酵素誘導に対する最適温度を調べた。異なる温度における酵素誘導実験からのライセートタンパク質組成物間で比較すると、３７℃においては、組換えタンパク質のかなりの誘導は得られなかったが、２０℃および３０℃の両方において、酵素のかなりの誘導が得られた（図３８）ことが明らかである。実験の各々において−対照は、４１ｍｂｐプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１菌株由来のライセートとした。
【０１００】
誘導培地中の銅濃度：異なる銅濃度の存在下で誘導を行った時に、生成したタンパク質活性の分析を実施した（図３９）。実験の各々において−対照は、４１ｍｂｐプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１菌株由来のライセートとした。最も良好なライセート活性は２ｍＭの銅濃度において得られた。今後は、この濃度を用いて研究することを決定した。全ての処理において酵素が得られた（図３９）。
【０１０１】
実施例７
アミロースビーズカラム上でのタンパク質精製プロセスにおいて使用される洗浄および溶出緩衝液中の銅濃度
精製プロセスの結合および溶出緩衝液中の銅濃度の効果を調べた（図４０および４１）。３００μΜ銅の銅濃度がタンパク質精製プロセスにとって最適であることが明らかに示された。全てのストックが１ｍｇ／ｍＬ酵素のタンパク質濃度を含んだ。
【０１０２】
組換え酵素をアミロースビーズ上で浄化し、トロンビン酵素を用いて切断した。その後、ｍｏｎｏ  Ｑカラム（強アニオン交換体）を使用して精製した。２つの明らかなピークが２８０ｎｍ波長において得られたので、精製プロセスは効率的であった。追加のピークが３３０ｎｍの波長において得られ、この場合、最大吸光度がマルチ銅オキシダーゼ触媒部位におけるＩＩＩ型銅により得られ、酵素の溶出が示される。異なるタンパク質フラクションを、１０％ＳＤＳ  ｐａｇｅを用いて分析し、実際に、純粋なタンパク質がＡ１４、Ａ１５およびＢ１フラクション（約６０ＫＤａ）において得られ、ｍｂｐタンパク質（約４０ＫＤａ）がＡ１において得られた（図４２）。
【０１０３】
実施例８
ＡＢＴＳ最適濃度：
比色反応に対する最適ＡＢＴＳ濃度を試験した（図４３）。最適濃度は８０ｍＭのＡＢＴＳであることが見出され、ミカエリスメンテン曲線を描いた。ミカエリスメンテン曲線により、酵素Ｋｍは４０ｍＭのＡＢＴＳであり、そのＶｍａｘは２２０ｍｏｌ／分であることが示される。
【０１０４】
実施例９
精製酵素活性に対する温度の効果：
８０ｍＭのＡＢＴＳの存在下での精製酵素活性を異なる温度において、同じ酵素濃度の存在下で分析した（図４４）。６５℃が酵素活性に対して最適温度であると結論づけた。
【０１０５】
酵素の生存能力もまた調べた（図４５）。結果により、その検査前での、異なる温度における酵素のプレインキュベーションにより、その活性が減少したことが示された。異なる温度における酵素の３０分プレインキュベーションの効果を比較すると、５０℃における酵素のプレインキュベーションでは、酵素活性の減少が最小であった（１１％）。生存能力および最適活性温度の両方が元の酵素よりも低いことが指摘されるべきである。おそらく、酵素を生成した細菌のためである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ−３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【国際調査報告】
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2016515833.tif 000049
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