(57)【要約】  本発明は、アジュバントと組み合わせられている、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうち少なくとの一方の組成物を含んでいる、哺乳動物の対象種のメスのレシピエントのための避妊ワクチンを提供し；ここで、当該細胞は、当該メスのレシピエントと同一でない少なくとも１個体の当該対象種のメスのドナーから得られた細胞の組織試料から増殖してなる。さらに本発明は、上記避妊ワクチンを製造する方法、ならびに上記避妊ワクチンを用いてメスのレシピエントを処置して妊娠を阻止する方法を提供する。
2016515578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の対象種のメスのレシピエントのための避妊ワクチンであって、
アジュバントと組み合わせられている、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうち少なくとも一方を含んでいる組成物を含み、
前記の細胞は、メスの前記レシピエントと同一でない少なくとも１個体の前記対象種のメスのドナーから得られた細胞の組織試料から増殖してなる、避妊ワクチン。
【請求項２】
前記対象種が、霊長目、食肉目、カンガルー目、ウサギ目、およびげっ歯目の少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の避妊ワクチン。
【請求項３】
前記食肉目から選択された対象種が、イヌ属およびネコ属の少なくとも１つから選択される、請求項２に記載の避妊ワクチン。
【請求項４】
前記カンガルー目から選択された対象種が、オポッサム科から選択される、請求項２に記載の避妊ワクチン。
【請求項５】
前記ウサギ目から選択された対象種が、ウサギ科から選択される、請求項２に記載の避妊ワクチン。
【請求項６】
前記げっ歯目から選択された対象種が、クマネズミ属から選択される、請求項２に記載の避妊ワクチン。
【請求項７】
前記霊長目から選択された対象種が、ヒトである、請求項２に記載の避妊ワクチン。
【請求項８】
前記アジュバントが、アルミニウム塩ベースのアジュバント、イーストベースのアジュバント、微小球体ベースのアジュバント、フロイントベースのアジュバント、油ベースのアジュバント、ビロソームベースのアジュバントおよび微粒子ベースのアジュバントから成る群から選択される、請求項１に記載の避妊ワクチン。
【請求項９】
前記アジュバントが、前記対象種および前記メスのレシピエントへの投与の方法に基づき選択される、請求項１に記載の避妊ワクチン。
【請求項１０】
哺乳動物の対象種のメスのレシピエントのための避妊ワクチンを製造する方法であって：
メスの前記レシピエントと同一でない少なくとも１個体の前記対象種のメスのドナーから、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうち少なくとも一方を含んでいる組織試料を得ること；
前記組織試料から前記細胞を増殖させて、増殖した細胞の供給源を作製すること；
前記増殖した細胞の部分を採取すること；および
採取された前記増殖した細胞の部分をアジュバントと組み合わせて、前記メスのレシピエントのための前記避妊ワクチンを形成すること、を含んでいる、方法。
【請求項１１】
前記組織試料を得る工程は、外科的切除技術および生検技術の少なくとも１つを用いて、前記メスのドナーの少なくとも１つの卵巣から前記組織試料を取り出すことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記増殖した細胞の部分を採取する工程は、トリプシンおよびＥＤＴＡを用いて当該部分を消化することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物の対象種の少なくとも１個体のメスのレシピエントを、妊娠を阻止するために処置する方法であって、
投与の方法を用いて前記対象種のメスのレシピエントに避妊ワクチンを導入することを含み、
前記避妊ワクチンは、前記対象種および前記メスのレシピエントへの投与の方法に基づき選択されたアジュバントと組み合わせられている、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうちの少なくとも一方の組成物を含み、
前記細胞は、前記メスのレシピエントと異なる個体である前記対象種の少なくとも１個体のメスのドナーから得られた前記細胞の組織試料から増殖してなる、方法。
【請求項１４】
前記投与の方法には、経口投与、経鼻投与、眼内投与、膣内投与、皮下注射、および筋肉注射のうち少なくとも１つが含まれている、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［連邦政府委託研究または開発に関する記述］
適用外。
【０００２】
［発明の背景］
本発明は、概して哺乳動物の対象種のための避妊ワクチン、ならびにそのような避妊ワクチンを製造するための方法に関する。ワクチンは、ネコおよびイヌを含むがそれらに限定されない、広範囲の対象種へ適用が可能である。
【０００３】
種々の哺乳類のグループにおいて、卵胞形成、卵成熟、排卵、およびその後の受精の検査および説明が、数多くの研究で行われてきた。歴史的に、正常な受精の説明および生殖の結果を最大化するために受精をどのように利用することが可能かということに、研究上の注目は集中していた。しかし過去５０年の間、生殖機能の中断（すなわち避妊）を目的として生殖周期の操作をする方法論の開発に、多大な努力が払われている。このような努力は、ホルモン療法の使用を通じて正常な生殖周期を中断するための方法、および最近は、受精を阻止するために抗体を増加させる方法論に集中している。
【０００４】
避妊薬または避妊ワクチンの発見を求める現在の研究は、哺乳類の卵の外部被膜である透明帯に対する抗体を産出することに注目している。特に、透明帯ワクチンは、ブタの卵から開発されてきた。これらのワクチンは、例えばウマ、バッファロー、ゾウ、クマ、ヘラジカおよびヒツジを含んでいる多数の動物種において用いられてきた。これらの種のうちいくつか、すなわちウマ、クマ、ゾウおよびヘラジカにおいて、このワクチンは妊娠の防止において非常に優れた結果を示したが、一方他においては良い結果を示さず、イヌおよびネコにおいては特に悲惨な結果を示した。透明帯ワクチンに対して、なぜ動物種がこれほど異なる反応を示すのかということに、大きな関心が存在する。
【０００５】
本発明者らは、透明帯ワクチンは受精の阻害の機序に完全に作用せず（元来仮定されていたように）、しかしまた卵胞形成、卵成熟、および排卵の阻止において直接的な役割を有することを確信する。本発明者らは、顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞に対する透明帯抗体の免疫交差反応が、卵の成熟の間に起こることを確信する。現在製造されている透明帯ワクチンは、顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞に対して低免疫交差反応を発生させ、少数の（１つまたは２つ）排卵された卵母細胞の受精の阻止、ならびに卵胞形成および卵巣機能を部分的に妨げることが可能であることを、本発明者らは主張する。透明帯ワクチンの注射を２回または３回施された雌馬は可逆性不妊を示し、一方雌馬における透明帯ワクチンの複数回および繰り返しの注射は、持続した抗体産出および半永久的な不妊を導くことを研究は示した（Kirkpatrick, JF, Liu, IKM, Turner, JW, Jr., Naugle R, Keiper R, Long-term effects of porcine zona pellucida immunocontraception on ovarian function in feral horses (Equus caballus). J Rerod Fertil 1992(94): 437-444）。これは、透明帯ワクチンが卵巣それ自体において効果を有するという結論を導く。これが事実であるということについてのさらなる支持としては、透明帯を避妊ワクチンとして試験した場合、イヌおよびマウスなど多産の種において、卵巣炎および異常周期性が首尾一貫して見られるということが挙げられる。透明帯ワクチンの低免疫原性は、多産ではない種（例えばウマ、バッファロー、ヒツジ、ゾウおよびクマ）における受精阻止の成功と、多産の種（例えばイヌおよびネコ）における卵巣機能、卵胞形成および受精阻止における不十分な成功とによって、証明されている。
【０００６】
従って、ほとんどの、仮に全てでないとしても、ネコおよびイヌを含んでいる胎盤を持つ哺乳動物のために有効となる、非外科的な不妊剤または避妊ワクチンの開発をすることが望ましい。
【０００７】
［発明の簡単な概要］
本発明は、哺乳動物の対象種のメスのレシピエントのための避妊ワクチンの一態様を供する。ワクチンは、アジュバントと組み合わせられている、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうちの少なくとも一方を含んでいる組成物を含み、当該細胞は、当該メスのレシピエントと同一の個体ではない当該対象種の少なくとも１個体のメスのドナーから得た細胞の組織試料から増殖させたものである。
【０００８】
発明の実施形態において、対象種は、霊長目、食肉目、カンガルー目、ウサギ目、およびげっ歯目の少なくとも１つから選択される。このような第一の実施形態において、食肉目から選択された対象種は、イヌ属（genus Cains）およびネコ属（genus Felis）の少なくとも１つから選択される。このような第二の実施形態において、カンガルー目から選択された対象種は、オポッサム科から選択される。このような第三の実施形態において、カンガルー目から選択された対象種は、ウサギ科（family Leporidae）から選択される。このような第四の実施形態において、げっ歯目から選択された対象種は、クマネズミ属（genus Rattus）から選択される。このような第五の実施形態において、霊長目から選択された対象種は、ヒト（Homo sapiens）である。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、アジュバントは、アルミニウム塩ベースのアジュバント、イーストベースのアジュバント、微小球体ベースのアジュバント、フロイントベースのアジュバント、油ベースのアジュバント、ビロソームベースのアジュバントおよび微粒子ベースのアジュバントから成る群から選択される。さらに別の実施形態において、アジュバントは、対象種とメスのレシピエントへの投与の方法とに基づき選択される。
【００１０】
別の態様において、本発明は、哺乳動物の対象種のメスのレシピエントのための避妊ワクチンを製造する方法を供する。この方法は、メスの上記レシピエントと同一の個体ではない上記対象種の少なくとも１個体のメスのドナーから、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうちの少なくとも一方を含んでいる組織試料を得る工程と；上記組織試料から上記細胞を増殖させて、増殖した細胞の供給源を作製する工程と；上記増殖した細胞の部分を採取する工程と；採取された上記増殖した細胞の部分をアジュバントと組み合わせて、上記メスのレシピエントのための上記避妊ワクチンを形成する工程と、を含む。
【００１１】
１つの実施形態において、上記組織試料を得る工程は、外科的切除技術および生検技術の少なくとも１つを用いて、上記メスのドナーの少なくとも１つの卵巣から組織試料を取り出すことを含む。別の実施形態において、上記増殖した細胞の部分を採取する工程は、トリプシンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて当該部分を消化することを含む。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の対象種の少なくとも１個体のメスのレシピエントを、妊娠を防ぐために処置する方法を供する。この方法は、投与の方法を用いて上記対象種のメスのレシピエントに避妊ワクチンを導入する工程を含み；上記避妊ワクチンは、上記対象種および上記投与に基づき選択されたアジュバントと組み合わせられている、複数の顆粒膜細胞および複数の卵巣間質細胞のうちの少なくとも一方の組成物を含み；上記細胞は、上記メスのレシピエントと異なる個体である上記対象種の少なくとも１個体のメスのドナーから得られた細胞の組織試料から増殖したものである。１つの実施形態において、上記方法は、経口投与、経鼻投与、眼内投与、膣内投与、皮下注射、および筋肉注射のうち少なくとも１つを含む上記投与の方法を含んでいる。
【００１３】
［図面のいくつかの見解の簡単な説明］
本発明のさらなる特徴は、添付図面の参考に従って実施例としてのみ与えられた、以下の実施形態の説明から明らかになるであろう：
図１は、本発明の一実施形態に係る組成物を示し；
図２は、本発明の一実施形態に係る、哺乳動物の対象種のための避妊ワクチンを製造する方法の工程を示し；
図３は、本発明の一実施形態に係る避妊ワクチンのための細胞を増殖する工程を示す。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
この出願請求項は、２０１３年３月２１日に提出された先願たるアメリカ合衆国仮出願番号６１／８０３，９６７に対する優先権を主張し、これによって仮出願番号６１／８０３，９６７の全体の開示を参照によって組み入れる。
【００１５】
本発明は、一つの態様において、哺乳動物の対象種のメスのレシピエントのための避妊ワクチンを提供する。当該ワクチンは、アジュバントと組み合わせられている、複数の顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞のうちの少なくとも一方の組成物を含む。当該顆粒膜細胞および卵巣間質細胞は、当該対象種のメスのドナーであって、当該対象種のメスのレシピエントと同一の個体ではないものから得た組織試料から増殖する。当該ワクチン組成物は、当該メスのレシピエントにおいて、高いが安全な免疫原性について選択されたアジュバントを含んでいる非外科的な不妊剤である。驚くべきことに、対象種およびメスのレシピエントへの投与の方法に応じて選択されたアジュバントと組み合わせられた、研究室において増殖した顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞どちらかの組み合わせを含んでいる組成物の投与は、メスのレシピエントの生殖系を構成する様々な器官、組織、血管および／または管を含む生殖器系に対する、メスの免疫系を刺激することが発見された。メスのレシピエントの免疫系は、ワクチン組成物を異質のものとして認識し、ワクチンの投与の結果として妊娠の可能性を排除する。図１は、本発明のこの態様の１つの実施形態を示し、ここでワクチン組成物１０は、メスのドナーラットと異なる個体であるメスのレシピエントラットに対する、ラットベイトを介した経口投与のための微小球体アジュバントと組み合わせられる形で、メスのドナーラットから得られた組織試料から増殖した卵巣間質細胞を含む。
【００１６】
ワクチンは、最も多産な種において妊娠の防止に効果的である。ワクチンは、対象種のメスのレシピエントにおいて、少なくとも１年間、好ましくは少なくとも３年間、より好ましくは少なくとも５年間、最も好ましくは終身の間妊娠を防止することが可能である。少なくとも１回、好ましくは１回から１０回、より好ましくは１回から５回、最も好ましくは１回から３回の繰り返しの注射が、不妊を達成するために必要とされる。効果的な不妊のためのワクチンの回数、ならびにワクチン接種の時間間隔は、当業者によって用いられる方法に従って、ワクチンについて選択された対象種および投与の方法に基づき選択される。
【００１７】
対象種は、全ての哺乳動物を含み得る。好ましくは、対象種は、霊長目、食肉目、カンガルー目、ウサギ目、およびげっ歯目の哺乳動物を含む。霊長目の哺乳動物は、より好ましくはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）を対象種として含み、ここで不妊は、例えば女性が多発性嚢胞腎（ＰＯＤ）を患っている場合等であることが望ましいものであり得る。食肉目の哺乳動物は、イヌ属（イヌ）およびネコ属（ネコ）から選択された対象種を、より好ましくは含む。カンガルー目の哺乳動物は、例えばオポッサム等のオポッサム科から選択された対象種を、より好ましくは含む。ウサギ目の哺乳動物は、例えばウサギ等の、ウサギ科から選択された対象種を、より好ましくは含む。げっ歯目の哺乳動物は、クマネズミ属（ラット）から選択される対象種をより好ましくは含む。
【００１８】
図２は、本発明の避妊ワクチンを製造するための、方法２０の工程を示している例示的な実施形態を提供する。工程１２において示されている細胞を増殖させるために得る組織試料の量は、組織回収の間における組織の損傷を最小化しつつ、関連のワクチンのために必要とされる細胞の供給源を増殖させるために十分な量の組織を得ることに即したものである。同様に、組織試料を得る方法は、同様の基準において選択される。１つの実施形態において、顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞の組織試料は、当業者において知られている外科的切除技術または生検技術のどちらかを用いることによって、メスのドナーの卵巣から得る。
【００１９】
広範な細胞増殖および細胞産出を導く分裂（有糸分裂）状態に顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞を置く細胞培養を用いて、図２の工程１６において示されたように細胞を増殖する。
【００２０】
採取した組織試料は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のために、例えば１２℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２４℃、より好ましくは２２℃等の環境温度において研究室へ移される。試料は、タンパク質（例えばウシ胎児血清５〜１９％）を含む培地へ移されるべきである。得られた組織試料は、例えば、培養フラスコ等の培養容器を備えているユニークな培養系に置かれる。１つの実施形態において、図３の工程２２において示されているように、細胞の増殖を向上させるために組織試料を組織断片へと破砕する。組織断片化は、当業者において知られている任意の適切な技術（切開、化学的消化、および物理的消化が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて達成される。１つの実施形態において、例えばＥＤＴＡ等のカルシウム安定剤と組み合わせたトリプシン等のタンパク質分解酵素を用いて、組織間の結合を破砕し組織断片を形成する。
【００２１】
水分および栄養のために、培地が培養系へ補充される。好ましい実施形態において、図３の工程２４において示されているように、栄養欠乏期の間、組織断片の湿った状態は保つが培地との物理的な接触を奪うために、培地を初めのうちは組織断片から分離しておく。水分は、組織断片を、培養容器へ付着、結合および／または“固着”するように誘導する。培養容器への付着、結合および／または“固着”は、細胞が増殖および分裂するために必要である。組織断片は初めのうち培地から分離されているため、当該組織断片は、栄養欠乏の期間または段階を経る。栄養欠乏期は、細胞が所望のストレス状態へと進むまで、１２時間〜７６時間、好ましくは２４時間から６０時間、より好ましくは３６時間から４８時間、最も好ましくは約４８時間継続し得る。
【００２２】
１つの実施形態において、組織断片を、修正した“懸滴”培養系に置き、ここで断片は懸濁せず、組織断片を湿った状態に保つために十分なだけの培地と共に培養フラスコ内に置く。そしてフラスコを逆（または傾けた状態）にし、組織断片を加湿し続けるために少量の培地を底に添加する。フラスコが反対にされたことで、断片は重力によってストレスを受けるが、培地からの水分によりフラスコ表面との接触を保つ傾向がある。
【００２３】
図３の工程２６において示されているように、細胞死の前に、組織断片を含んでいる組織試料は、栄養添加期の間細胞に栄養を供給するために培地と物理的に接触する。培地は、当業者において知られた方法を通じて、組織断片に接触および／または添加する。ストレスを受けた細胞は、初めにプレ有糸分裂状態となることによって、培地において栄養の導入に反応し、最終的に有糸分裂状態となり分裂する。培地は、当業者において知られた時期、例えば１〜４日の間隔、およびより好ましくは２〜３日の間隔でリフレッシュする。例えば、培養系に添加した培地のタイプおよび量、ならびに栄養添加期の長さを含む、細胞の増殖のための条件は、組織試料の初めの量、増殖の対象となる細胞のタイプ（顆粒膜または卵巣間質細胞）に応じて設定される所望の細胞増殖量および対象種に依存する。プレ有糸分裂状態は、通常８〜１０日間継続し得る。有糸分裂状態は、通常３２〜４８時間継続し得る。
【００２４】
培養系を、前もって選択した期間の経過後、所定の量の細胞が増殖するまで維持する。しかし、正常な非癌性の細胞の間での接触が、増殖を阻害する。細胞が６０〜９０％コンフルエント、好ましくは７０〜８０％コンフルエントである場合、細胞を引き離し、別の培養系に再懸濁および播種し、有糸分裂状態における細胞分裂を維持する。この工程は、図３の工程２８において培養拡大期として示されている。
【００２５】
適切な回数の細胞分裂周期が終了した後、増殖した細胞を含んでいる試料を採取する。好ましくは、増殖した細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡインキュベーション技術を用いた培養系から採取し、リン酸緩衝食塩水を用いて洗浄する。典型的には、消化過程において引き離された細胞は、４８時間まで離れた状態のままである。そして顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡインキュベーション技術等、当業者において知られている任意の適切な技術を用いて採取する。数百万の顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞を、これらの方法論を用いて産出することが可能である。
【００２６】
増殖した細胞の懸濁液を含んでいる試料を遠心分離し、遠心分離された増殖した細胞を、環境温度で、図２の工程１８において示されているようにアジュバントと組み合わせ、ワクチンを形成する組成物を産出する。アジュバントを、対象種におけるアジュバント免疫原性および投与の経路に基づき選択する。レシピエントの免疫系が異種タンパク質を認識し、当該免疫系が全般的な領域よりも局地的な領域において刺激される一方、同時にレシピエントにおける安全性の懸念をワクチンが引き起こすことを避けることができるように、免疫系反応を高めるアジュバントを選択する。本発明において、様々なアジュバントが用いられ得る。可能なアジュバントとしては、アルミニウム塩ベースのアジュバント、イーストベースのアジュバント、微小球体ベースのアジュバント、フロイントベースのアジュバント、油ベースのアジュバント、ビロソームベースのアジュバントおよび微粒子ベースのアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。限定されない例については、アルミニウム塩ベースのアジュバントがヒト、ネコおよびイヌにおいて使用可能であり；イーストベースのアジュバントがウマ、およびおそらくヒトにおいて使用可能であり；フロイントベースのアジュバントがウマ等の種々の種において使用可能である。例えば、カンガルー目、ウサギ目、およびげっ歯目等の哺乳動物のために、ベイトを介した経口投与用に調剤されたワクチンのためのアジュバントは、該哺乳動物の腸内分解に耐える能力、ならびに血液内の腸内バリアを通過する能力において選択される。
【００２７】
避妊ワクチンは、当業者に知られた方法に従って、ホルマリンまたは他の防腐剤を用いて、２年間、好ましくは１８か月間、より好ましくは１２か月間、最も好ましくは６か月間、保存することが可能である。あるいは、ワクチンを、当業者に知られた方法に従って凍結乾燥することが可能である。凍結乾燥したワクチンは、４〜５℃の温度で長期保存が可能であり、適用に際し評価されるタンパク質が保護され、当該タンパク質の免疫原性が維持されている限り、６か月間、好ましくは１年間、好ましくは３年間、最も好ましくは５年間、長期保存が可能である。
【００２８】
限定されない例として、経口投与、経鼻投与、眼内投与、膣内投与、皮下注射、および筋肉注射を含む、当業者に知られたタンパク質の投与のための技術を用いて、ワクチンを適用または投与することが可能である。
【００２９】
対象種において妊娠を阻止することができるワクチンを製造するために必要な増殖顆粒膜細胞および／または卵巣間質細胞の数は、対象種、およびメスのレシピエントにワクチンを導入するために用いる投与または用途の方法または技術に依存する。ワクチンは、対象種の組織試料において初めに得た細胞の数よりも、はるかに多い（桁分の）細胞の数を含むことが可能である。０．５〜１ｍｌのアジュバントを含んでいるワクチンにおいて、１０００〜１億個の任意の数の細胞を用いることが可能である。
【００３０】
前述の実施例および詳細な説明は、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明を制限するとみなされるものではない。本発明は、本業者にとって明らかな変更を包含すると解される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る組成物を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る、哺乳動物の対象種のための避妊ワクチンを製造する方法の工程を示す。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る避妊ワクチンのための細胞を増殖する工程を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2016515578.tif 000007
2016515578.tif 000008
2016515578.tif 000009