(57)【要約】新規の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、およびこのようなＡＤＣを使用して増殖性障害を処置する方法が提供される。具体的には、本出願は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）にコンジュゲートさせた１つまたは複数の不対合システイン残基を有する抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性断片を含む新規の化合物、ならびにがんおよびその任意の再発または転移を処置または予防するためのその使用に関する。
2016531914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
の抗体薬物コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩［式中、
ａ）Ａｂは、１つまたは複数の不対合システインを含むＤＬＬ３抗体を含み；
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄは、ＰＢＤを含み；
ｄ）ｎは、約１〜約８の整数である］。
【請求項２】
前記ＤＬＬ３抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３】
前記ＤＬＬ３抗体が、内部移行抗体を含む、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４】
前記ＤＬＬ３抗体が、ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト化抗体を含む、請求項１から３のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５】
前記ＤＬＬ３抗体が、２つの不対合システインを含む、請求項１から４のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項６】
前記ＤＬＬ３抗体が、カッパ軽鎖を含む、請求項１から５のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記ＤＬＬ３抗体が、軽鎖を含み、Ｃ２１４が、不対合システインを含む、請求項６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項８】
ＤＬＬ３抗体が、ＩｇＧ１重鎖を含む、請求項１から７のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項９】
前記ＤＬＬ３抗体が、重鎖を含み、Ｃ２２０が、不対合システインを含む、請求項８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
前記ＤＬＬ３抗体が、ｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６、またはヒトＤＬＬ３への結合について、ｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６のうちのいずれか１つと競合する抗体からなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
前記ＰＢＤが、ＰＢＤ１、ＰＢＤ２、ＰＢＤ３、ＰＢＤ４、およびＰＢＤ５からなる群から選択されるＰＢＤを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
切断型リンカーを含む、請求項１から１１のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
前記切断型リンカーが、ジペプチドを含む、請求項１２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
被験体におけるがんを処置する方法であって、該被験体に請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記がんが、小細胞肺がんを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）不対合システインを含む抗ＤＬＬ３抗体を用意するステップと；
ｂ）該抗ＤＬＬ３抗体を選択的に還元するステップと；
ｃ）該選択的に還元された抗ＤＬＬ３抗体をＰＢＤにコンジュゲートさせるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記抗ＤＬＬ３抗体を選択的に還元する前記ステップが、該抗体を安定化剤と接触させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分取クロマトグラフィーを使用して、前記抗体薬物コンジュゲートを精製するステップをさらに含む、請求項１７から１９のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤＣ３、ＡＤＣ４、およびＡＤＣ５からなる群から選択されるＡＤＣを含む抗体薬物コンジュゲートであって、Ａｂが、操作された抗ＤＬＬ３抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照出願
本出願は、２０１３年８月２８日に出願された米国仮出願第６１／８７１，１７３号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによるＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に援用される。２０１４年８月２８日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、「ｓｃ１６０４ｐｃｔ＿Ｓ６９６９７＿  １２２０ＷＯ＿  ＳＥＱＬ＿  ０８２８１４．ｔｘｔ」という名称で、サイズは６０９ＫＢ（６２４，２７５バイト）である。
【０００３】
本出願は一般に、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）にコンジュゲートさせた１つまたは複数の不対合システイン残基を有する抗ＤＬＬ３抗体またはその免疫反応性断片を含む新規の化合物、ならびにがんおよびその任意の再発または転移を処置または予防するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
一般に用いられる多くのがん治療法は、それらが増殖する腫瘍細胞を選択的に標的化できないことに起因する実質的な毒性を誘導する傾向がある。むしろ、これらの従来の化学療法剤は、非特異的に作用し、正常に増殖する健常組織を、腫瘍細胞と共に損傷するかまたは消失させることが多い。この意図されない細胞傷害作用は、患者が認容しうる投与量またはレジメンを制限し、これにより、薬剤の治療指数を事実上制限することが極めて多い。結果として、細胞傷害性治療剤を腫瘍部位に標的化する多数の試みがなされているが、成功の度合いは様々である。１つの有望な研究領域は、治療的に有効な、局在化された薬物濃度をもたらすように、細胞傷害剤を腫瘍に方向付ける抗体の使用に関係している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに関して、選択された細胞傷害剤にコンジュゲートされた標的化モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）の使用は、正常組織のこれらへの曝露を低減しながら、比較的高レベルのこのような細胞傷害性ペイロードの、腫瘍部位への直接的な送達をもたらすことが以前から認識されている。実験室状況または前臨床状況では、このような抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）の使用が広範に探索されているが、診療所におけるそれらの実際的な使用は、はるかに大きく制限されている。ある特定の場合には、これらの制限は、弱いかまたは効果のない毒素を、十分に選択的でないか、または腫瘍と効果的に会合できなかった腫瘍標的化分子と組み合わせた結果であった。他の場合には、分子構築物は、投与の際に不安定であることが判明し、または血流から余りに早く取り除かれるため、腫瘍部位に治療的に有意な濃度で蓄積されなかった。このような不安定性は、リンカーの選択またはコンジュゲーション手順の結果でありうるが、また、標的化抗体に毒性ペイロードの負荷をかけすぎ（すなわち、薬物対抗体比または「ＤＡＲ」が大きすぎる）、これにより、薬物調製において、不安定なコンジュゲート種が生じることの結果でもありうる。場合によって、構築物の不安定性は、設計に由来する場合であれ、不安定なＤＡＲ種に由来する場合であれ、身体が、標的化されていないペイロードを取り除こうと試みるときに、強力な細胞傷害性ペイロードが、薬物コンジュゲートから早期に浸出し（leached）、注射部位または重要臓器に蓄積されるので、許容不可能な非特異的毒性を結果としてもたらしている。そのため、米国医薬品局（Federal  Drug  Administration）により承認されているＡＤＣは、現在も比較的少数であるが、いくつかのこのような化合物が、現在臨床試験中である。したがって、安定で比較的均質な抗体薬物コンジュゲート調製物であって、好適な治療指数を呈示する調製物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、広義において、ＤＬＬ３関連障害（例えば、増殖性障害または新生物性障害）の処置において使用されうる、新規の方法、化合物、組成物、および製品を対象とする、これらの目的物および他の目的物を提供する。この目的のために、本発明は、腫瘍細胞および／またはがん幹細胞を効果的に標的化し、多種多様な悪性疾患を患う患者を処置するのに使用されうるピロロベンゾジアゼピン（「ＰＢＤ」）ペイロードを含む、新規のデルタ様リガンド３（またはＤＬＬ３）部位特異的コンジュゲートを提供する。下記で詳細に論じられる通り、開示される部位特異的コンジュゲートは、新規の選択的還元技法を使用して、ＰＢＤペイロードに優先的にコンジュゲートさせうる１つまたは複数の不対合システインを有する操作された抗ＤＬＬ３抗体構築物を含む。このような部位特異的コンジュゲート調製物は、従来のコンジュゲート化調製物と比較して比較的安定であり、平均ＤＡＲ分布に関して実質的に均一（homogenous）である。添付の実施例において示される通り、開示される、抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲート調製物の安定性および均一性（平均ＤＡＲ分布およびＰＢＤのポジショニングの両方に関する）は、治療指数の改善に寄与する、好適な毒性プロファイルを提供する。
したがって、一実施形態では、本発明は、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
の抗体薬物コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩［式中、
ａ）Ａｂは、１つまたは複数の不対合システインを含むＤＬＬ３抗体を含み；
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄは、ＰＢＤを含み；
ｄ）ｎは、約１〜約８の整数である］
を含む。
【０００７】
ヒトＤＬＬ３に特異的に結合する、任意の抗ＤＬＬ３抗体を、本明細書で開示される、抗体薬物コンジュゲートの抗体部分であるＡｂとして使用することができる。例えば、本発明の多様な態様では、ＤＬＬ３抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはＣＤＲグラフト化抗体である。本発明の一部の態様では、ＤＬＬ３抗体は、ｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６のうちのいずれか１つ、またはヒトＤＬＬ３への結合について、ｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４、およびｈＳＣ１６．５６のうちのいずれか１つと競合する抗体を含む。抗体薬物コンジュゲートを調製するのに使用されるＤＬＬ３抗体は、例えば、ＩｇＧ１重鎖定常領域および／またはカッパ軽鎖定常領域を含む、任意の適切な定常領域を含みうる。一部の態様では、抗体薬物コンジュゲートを調製するのに使用されるＤＬＬ３抗体は、内部移行抗体としてさらに特徴づけられる。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの不対合システイン残基を含む、抗ＤＬＬ３部位特異的操作コンジュゲートを対象とする。当業者は、不対合鎖間システイン残基は、本明細書の教示に従い、ＡＤＣを生成する薬学的に活性な部分の選択的で制御されたコンジュゲーションのための部位（複数可）をもたらすことを認識する。例えば、薬物の部位特異的コンジュゲーションに有用なＤＬＬ３抗体は、１つまたは複数の不対合システイン、例えば、２つまたはこれを超える不対合システイン、３つまたはこれを超える不対合システイン、４つまたはこれを超える不対合システインなどを含む。不対合システインは、軽鎖に位置してもよく、または重鎖に位置してもよい。一部の実施形態では、不対合システイン残基（複数可）は、重鎖／重鎖間残基と対比される、重鎖／軽鎖間残基を含む。
【０００９】
本発明の特定の態様では、ＤＬＬ３抗体は、Ｃ２１４位において不対合システインを有する軽鎖、および／またはＣ２２０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う番号付け）において不対合システインを有する重鎖を含む。例えば、ＤＬＬ３抗体は、軽鎖のＣ２１４残基を、別の残基で置換するかまたは欠失させた、部位特異的操作ＩｇＧ１アイソタイプ抗体でありうる。関連する実施形態では、前記操作された抗体のＣ２１４残基は、セリンに置換することができる。別の例として、本発明は、ＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ２重鎖のＣ２２０残基を、別の残基で置換するかもしくは欠失させたＤＬＬ３抗体、またはＩｇＧ１重鎖もしくはＩｇＧ２重鎖のＣ２２０残基を、セリンで置換したＤＬＬ３抗体を提供する。
【００１０】
本発明の一部の態様では、抗体薬物コンジュゲートを調製するのに使用される薬物は、本明細書で開示される、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、例えば、ＰＢＤ１、ＰＢＤ２、ＰＢＤ３、ＰＢＤ４およびＰＢＤ５である。他の態様では、本発明は、少なくとも２つの不対合鎖間システイン残基を含む操作された抗体と、少なくとも２つの不対合鎖間システイン残基にコンジュゲートさせたＰＢＤとを含むＡＤＣを提供する。
【００１１】
ＤＬＬ３抗体を薬物と会合させて、抗体薬物コンジュゲートを調製するのに、リンカーを使用してもよく、または使用しなくてもよい。リンカーは、特定の薬物の選択に基づき、必要に応じて、任意選択で使用する。本発明の一部の態様では、リンカーは、例えば、ジペプチドリンカーなどの切断可能なリンカーである。本発明の特定の態様では、切断可能なリンカーを使用して、ＰＢＤ１、ＰＢＤ２、ＰＢＤ３、ＰＢＤ４、またはＰＢＤ５を、ＤＬＬ３抗体と会合させる。本発明の他の態様では、抗体薬物コンジュゲートは、本明細書で記載される、ＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤＣ３、ＡＤＣ４、またはＡＤＣ５を含み、ここで、抗体（Ａｂ）は、操作されたＤＬＬ３抗体である。
【００１２】
上記の抗体薬物コンジュゲートに加えて、本発明は、開示されるＡＤＣを一般に含む医薬組成物、およびこのようなＡＤＣを使用して、患者における、がんを含む障害を診断または処置する方法もさらに提供する。例えば、本発明は、がんを処置する方法であって、被験体に、本発明のＡＤＣを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明の特定の態様では、開示されるＡＤＣは、小細胞肺がんの処置に有用である。
【００１３】
関連する実施形態では、本発明は、腫瘍細胞もしくは腫瘍形成性細胞を死滅させるか、腫瘍細胞もしくは腫瘍形成性細胞の頻度を低減するか、または腫瘍細胞もしくは腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞または腫瘍形成性細胞を、本発明のＡＤＣで処置するステップを含む方法を対象とする。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体薬物コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）不対合システインを含む抗ＤＬＬ３抗体を用意するステップと；
ｂ）抗ＤＬＬ３抗体を選択的に還元するステップと；
ｃ）選択的に還元された抗ＤＬＬ３抗体をＰＢＤにコンジュゲートさせるステップと
を含む方法を含む。
【００１５】
関連する態様では、本発明は、ＡＤＣを調製する方法であって、操作された抗体を発現させる宿主細胞を培養するステップと；前記操作された抗体を、前記培養された宿主細胞または培養培地から回収するステップと；前記操作された抗体を選択的に還元するステップと；ＰＢＤを前記操作された抗体にコンジュゲートさせるステップとを含む方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＡＤＣ；容器；化合物を使用して、少なくとも１つの抗原の発現を特徴とするがんを処置しうることを示す、添付文書または表示を含む製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、鎖内ジスルフィド結合および鎖間ジスルフィド結合を示すヒトＩｇＧ１抗体の構造についての描写である。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、表形式で、開示される抗体薬物コンジュゲートに適合性の、いくつかの例示的なヒト化ＤＬＬ３抗体であって、本明細書の実施例で記載される通りに単離、クローニング、および操作されたヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号３８９〜４０７、奇数）を提示する。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、表形式で、開示される抗体薬物コンジュゲートに適合性の、いくつかの例示的なヒト化ＤＬＬ３抗体であって、本明細書の実施例で記載される通りに単離、クローニング、および操作されたヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号３８９〜４０７、奇数）を提示する。
【００１９】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、本教示に従い生成された、例示的な部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖（配列番号１４〜１９）のアミノ酸配列を提示する。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、本教示に従い生成された、例示的な部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖（配列番号１４〜１９）のアミノ酸配列を提示する。
【００２０】
【図４】図４は、操作された抗体を細胞毒素にコンジュゲートさせるプロセスを描写する概略図である。
【００２１】
【図５】図５は、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して決定される、還元剤を使用してコンジュゲートさせた、部位特異的抗体の軽鎖および重鎖のコンジュゲーション率を示すグラフ表示である。
【００２２】
【図６】図６は、ＨＩＣを使用して決定される、還元剤を使用してコンジュゲートさせた、部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を示すグラフ表示である。
【００２３】
【図７】図７は、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して決定される、安定化剤または還元剤を使用してコンジュゲートさせた、部位特異的抗体の軽鎖および重鎖のコンジュゲーション率を示す。
【００２４】
【図８】図８は、ＨＩＣを使用して決定される、安定化剤または還元剤を使用してコンジュゲートさせた、部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を示すグラフ表示である。
【００２５】
【図９】図９は、ＨＩＣを使用して決定される、安定化剤および／または穏やかな還元剤を使用してコンジュゲートさせた、部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を示す。
【００２６】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＨＩＣを使用して決定される、多様な安定化剤を使用してコンジュゲートさせた、部位特異的抗体構築物のＤＡＲ分布を描写する。
【００２７】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、本明細書で示される通りにコンジュゲートさせ、精製した、部位特異的抗体構築物のコンジュゲーション率およびＤＡＲ分布を描写する。
【００２８】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、本明細書で示される通りに作られた、コンジュゲートさせていない部位特異的構築物およびコンジュゲートさせた部位特異的構築物の結合特性を示す。
【００２９】
【図１３】図１３は、本明細書で示される通りに作られた部位特異的ＡＤＣによりもたらされる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞殺滅率をグラフにより描写する。
【００３０】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、本発明により提供される部位特異的ＡＤＣの安定性の増強を例示する。
【００３１】
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｃは、本発明の部位特異的コンジュゲートによりもたらされる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性をグラフにより実証する。
【図１５−２】図１５Ａ〜１５Ｃは、本発明の部位特異的コンジュゲートによりもたらされる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性をグラフにより実証する。
【００３２】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｄは、本発明の部位特異的コンジュゲートによりもたらされる毒性の低減を例示する。
【図１６−２】図１６Ａ〜１６Ｄは、本発明の部位特異的コンジュゲートによりもたらされる毒性の低減を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
Ｉ．序説
本発明は、多くの異なる形態で実施されうるが、本明細書では、本発明の原理について例示する、その具体的な例示的実施形態が開示される。本発明は、例示される具体的な実施形態に限定されるわけではないことが強調されるべきである。さらに、本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定すると解釈されるべきではない。最後に、本開示の目的では、全ての配列識別受託番号は、そうでないことが注意されない限り、ＮＣＢＩ基準配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース内および／またはＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアーカイブ配列データベース内で見出すことができる。
【００３４】
本発明の部位特異的抗ＤＬＬ３  ＰＢＤコンジュゲートは、それらを、治療用化合物および治療用組成物としての使用に特に適するものとする好適な特徴を呈示することが見出されている。これに関して、コンジュゲートは、決定基である、デルタ様リガンド３すなわちＤＬＬ３であって、多様な増殖性障害と関連することが見出され、良好な治療標的であることが示されているＤＬＬ３と免疫特異的に反応する。加えて、本発明の構築物は、分子操作技法により得られる、天然のジスルフィド結合（複数可）の破壊に由来する、特異的なシステイン位置における、選択的なコンジュゲーションをもたらす。抗体のこの操作は、調節された、化学量論的コンジュゲーションであって、薬物対抗体比（「ＤＡＲ」）を、ＤＡＲが大部分均質な調製物の作製を結果としてもたらす精度で、大部分一定とすることを可能とするコンジュゲーションをもたらす。さらに、開示される、部位特異的構築物は、抗体上のペイロードの位置に関して実質的に均質な調製物をさらにもたらす。本明細書で記載される安定化剤を使用する、操作された構築物の選択的なコンジュゲーションは、所望されるＤＡＲの種の百分率を増加させ、作り出された不対合システイン部位と共に、コンジュゲートに、ＰＢＤの意想外の滲出により引き起こされる、非特異的毒性を低減する、安定性および均質性を付与する。不対合システインの選択的なコンジュゲーションおよび調製物の相対的均一性（コンジュゲーション位置およびＤＡＲの両方における）によりもたらされる、この毒性の低減はまた、腫瘍部位におけるＰＢＤペイロードレベルの上昇を可能とする、治療指数の増強ももたらす。加えて、結果として得られる部位特異的抗ＤＬＬ３  ＰＢＤコンジュゲートは、高度に均一な部位特異的コンジュゲート調製物であって、所望されるＤＡＲ（例えば、ＤＡＲ＝２）の種を、７５％、８０％、８５％、９０％、なおまたは９５％を超えて含む調製物をもたらすように、多様なクロマトグラフィーの方法論を使用して、任意選択で精製することができる。このようなコンジュゲートの均一性は、望ましくない、より高いＤＡＲのコンジュゲート不純物であって、毒性を増加させうる（比較的不安定でありうる）不純物を制限することにより、開示される調製物の治療指数をさらに増加させうる。
【００３５】
開示される操作されたコンジュゲート調製物により呈示される好適な特性は、少なくとも部分的に、コンジュゲーションを特異的に方向付け、作られたコンジュゲートを、コンジュゲーション位置および絶対ＤＡＲの点で大きく制限する能力に立脚することが認識される。従来の大半のＡＤＣ調製物と異なり、本発明は、抗体の部分還元または完全還元に完全に依拠しないで、ランダムなコンジュゲーション部位および比較的制御をかけないＤＡＲ種の作製をもたらす。むしろ、本発明は、ＤＬＬ３標的化抗体を、天然に存在する（すなわち、「天然の」）鎖間ジスルフィド架橋または鎖内ジスルフィド架橋のうちの１つまたは複数を破壊するように操作することにより、１つまたは複数の所定の不対合（または遊離）システイン部位を提供する。したがって、本明細書で使用される「遊離システイン」または「不対合システイン」という用語は、文脈によりそうでないことが記されない限りにおいて、互換的に使用することができ、抗体の任意のシステイン構成要素であって、その天然のジスルフィド架橋パートナーを置換するか、消失させるか、または他の形で変化させて、生理学的条件下における天然に存在するジスルフィド架橋を破壊し、これにより、不対合システインを、部位特異的コンジュゲーションに適するものとしたシステイン構成要素を意味するものとする。コンジュゲーションの前に、遊離システインまたは不対合システインは、系の酸化状態に応じて、同じ抗体上で、チオール（還元システイン）として存在する場合もあり、キャッピングされたシステイン（酸化された）として存在する場合もあり、別の遊離システインとの非天然の分子内ジスルフィド結合（酸化された）として存在する場合もあることが認識される。下記でより詳細に論じられる通り、この抗体構築物の穏やかな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。
【００３６】
より具体的には、次いで、本明細書で開示される新規の技法を使用して、無傷の天然ジスルフィド架橋を実質的に破壊せずに、結果として得られる遊離システインを選択的に還元して、主に選択された部位において、反応性チオールをもたらすことができる。次いで、これらの製造されたチオールを、実質的な非特異的コンジュゲーションを伴わずに、開示されるＰＢＤリンカー化合物との指向性コンジュゲーションにかける。すなわち、本明細書で開示される操作された構築物と、任意選択で、選択的還元技法とは、ＰＢＤペイロードの非特異的でランダムなコンジュゲーションを大部分消失させる。これにより、標的化抗体上のＤＡＲ種の分布およびコンジュゲート位置の両方において実質的に均質な調製物がもたらされることは有意義である。下記で論じる通り、ＤＡＲが比較的高値の夾雑物を消失させることそれ自体により、非特異的毒性が低減され、調製物の治療指数が引き上げられる。さらに、このような選択性により、ペイロードの大部分を、特に有利な所定の位置（軽鎖定常領域の末端領域など）であって、ペイロードが腫瘍に到達するまでは、それは幾分保護されるが、一旦標的に到達したら、適切な形で提示および処理される位置に配置することが可能となる。したがって、また、特異的なペイロードのポジショニングを容易とする操作された抗体の設計も、開示される調製物の非特異的毒性を低減するのに使用することができる。
【００３７】
下記で論じられ、実施例で示される通り、これらの所定の遊離システイン部位の創出は、当技術分野で認知された分子操作技法を使用して、ジスルフィド結合の構成要素であるシステイン残基のうちの１つを除去するか、変化させるか、または置き換えることにより達成することができる。これらの技法を使用して、当業者は、任意の抗体クラスまたはアイソタイプを、本発明に従い、選択的にコンジュゲートさせることが可能な、１つまたは複数の遊離システインを選択的に呈示するように操作しうることを認識する。さらに、選択された抗体を、所望のＤＡＲに応じて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、なおまたは８つの遊離システインを特異的に呈示するように操作することができる。より好ましくは、選択された抗体は、２つまたは４つの遊離システインを含有するように操作され、なおより好ましくは、２つの遊離システインを含有するように操作される。また、遊離システインは、非特異的毒性を低減しながら、選択されたＰＢＤの、標的への送達を容易とするように、操作された抗体内に配置しうることも認識される。これに関して、ＩｇＧ１抗体を含む本発明の選択された実施形態は、ペイロードを、ＣＨ１ドメインに配置し、より好ましくは、ドメインのＣ末端に配置する。他の好ましい実施形態では、構築物は、ペイロードを、軽鎖定常領域に配置し、より好ましくは、定常領域のＣ末端に配置するように操作される。
【００３８】
ペイロードのポジショニングの、操作された遊離システインへの制限はまた、下記に示される新規の安定化剤を使用する、構築物の選択的還元により容易とすることもできる。本明細書で使用される「選択的還元」とは、無傷の天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない、操作された構築物の、遊離システインを還元する還元条件への曝露（これにより、反応性チオールをもたらす）を意味する。一般に、選択的還元は、無傷のジスルフィド結合を破壊せずに、所望のチオールをもたらす、任意の還元剤またはそれらの組合せを使用して実行することができる。ある特定の好ましい実施形態では、かつ、下記の実施例で示される通り、選択的還元は、コンジュゲーションのための操作された構築物を調製するのに、安定化剤および穏やかな還元条件を使用して実行することができる。下記でより詳細に論じられる通り、適合性の安定化剤は一般に、遊離システインの還元を容易とし、所望のコンジュゲーションが、それほど厳密でない還元条件下で進行することを可能とする。これは、天然のジスルフィド結合の実質的大半が、無傷を維持し、非特異的コンジュゲーションの量を顕著に低減し、これにより、望ましくない夾雑物および潜在的な毒性を制限することを可能とする。比較的穏やかな還元条件は、いくつかの系の使用により達しうるが、チオール含有化合物の使用を含むことが好ましい。当業者であれば、本開示の観点で、適合性の還元系をたやすく得ることができる。
【００３９】
ＩＩ．ＤＬＬ３生理学
ＤＬＬ３の表現型決定基は、神経内分泌特徴を呈示する新生物を含む多様な増殖性障害と臨床的に関連しており、ＤＬＬ３タンパク質およびその変異体またはアイソフォームにより、関連疾患の処置において利用されうる、有用な腫瘍マーカーがもたらされることが見出されている。これに関して、本発明は、操作された抗ＤＬＬ３抗体による標的化剤と、ＰＢＤペイロードとを含む、いくつかの部位特異的抗体薬物コンジュゲートを提供する。下記でより詳細に論じられ、添付の実施例で示される通り、開示される、部位特異的抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞を消失させるのに特に有効であり、したがって、ある特定の増殖性障害またはそれらの進行もしくは再発の処置および予防に有用である。加えて、開示された部位特異的ＡＤＣ組成物は、比較的高いＤＡＲ＝２の百分率、および予測外の安定性であって、同じ成分を含む従来のＡＤＣ組成物と比較した場合に、治療指数の改善をもたらしうる安定性を呈示する。
【００４０】
さらに、細胞表面ＤＬＬ３タンパク質などのＤＬＬ３マーカーまたはＤＬＬ３決定基は、がん幹細胞（腫瘍永続細胞としてもまた公知の）と治療的に関連し、これらを消失させるかまたはサイレンシングするのに効果的に利用しうることが見出されている。本明細書で開示される、部位特異的抗ＤＬＬ３コンジュゲートの使用により、がん幹細胞を選択的に低減するかまたは消失させる能力は、このような細胞が、多くの従来の処置に対して一般に抵抗性であることが公知であるという点で驚くべきである。すなわち、従来の標的化された処置法、およびより近年の標的化された処置法の効果は、これらの多様な処置法を前にしてもなお、腫瘍の成長を永続化させることが可能な、抵抗性がん幹細胞の存在および／または出現により制限されることが多い。さらに、がん幹細胞と関連する決定基は、発現が低度であるかまたは一貫しないこと、腫瘍形成性細胞との関連を維持できないこと、または細胞表面に存在できないことに起因して、治療標的として良好ではないことが多い。先行技術の教示とは明らかに対照的に、本明細書で開示される部位特異的ＡＤＣおよび方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服し、このようながん幹細胞を特異的に消失させるか、枯渇させるか、サイレンシングするか、またはそれらの分化を促進し、これにより、基礎をなす腫瘍の成長を維持または再誘導するそれらの能力を失わせる。本明細書で示される通り、開示される、ＤＡＲが比較的均質な調製物により、予測外の安定性がもたらされる。
【００４１】
したがって、本明細書で開示されるＤＬＬ３コンジュゲートなどのＤＬＬ３コンジュゲートは、選択された増殖性（例えば、新生物性）障害またはそれらの進行もしくは再発の処置および／または防止において使用すると有利でありうることに特に注目すべきである。本発明の好ましい実施形態については、特に、特定のドメイン、領域、もしくはエピトープに関して、またはがん幹細胞もしくは神経内分泌特徴を含む腫瘍、およびそれらの、開示される抗体薬物コンジュゲートとの相互作用の文脈で、下記で広範にわたり論じるが、当業者は、本発明の範囲は、このような例示的な実施形態により限定されないことを認識する。むしろ、本発明の最も広範な実施形態および添付の特許請求の範囲は、任意の特定の作用機構、または特異的に標的化される腫瘍、細胞成分、もしくは分子成分に関わらず、開示される抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲート、ならびに新生物性障害または細胞増殖性障害を含む、様々なＤＬＬ３関連障害またはＤＬＬ３媒介性障害の処置および／または防止におけるそれらの使用を広くかつ明白に対象とする。
【００４２】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、１つのＮｏｔｃｈ受容体遺伝子、ならびにＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａとして公知の２つのリガンド遺伝子により主に媒介される（Whartonら、１９８５年；Rebayら、１９９１年）。ヒトでは、４つの公知のＮｏｔｃｈ受容体、および５つのＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ  ＬＡＧ２）リガンド（Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２として公知の、Ｓｅｒｒａｔｅの２つの相同体、ならびにデルタ様リガンド、またはＤＬＬ１、ＤＬＬ３、およびＤＬＬ４と称する、デルタの３つの相同体）が存在する。一般に、シグナル受信細胞の表面上のＮｏｔｃｈ受容体は、反対側のシグナル送信細胞の表面上で発現するリガンドとの相互作用により活性化する（トランス相互作用と称する）。これらのトランス相互作用は、プロテアーゼに媒介される一連のＮｏｔｃｈ受容体の切断をもたらす。結果として、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインは、遊離して、膜から核に移行し、そこで、ＣＳＬファミリーの転写因子（ヒトでは、ＲＢＰＪ）と対合し、それらを、Ｎｏｔｃｈ応答性遺伝子の転写抑制因子から、活性化因子に転換する。
【００４３】
ヒトＮｏｔｃｈリガンドのうちで、ＤＬＬ３は、トランス相互作用を介して、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化させることが不可能であると考えられる点で異なる（Ladiら、２００５年）。Ｎｏｔｃｈリガンドはまた、Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害をもたらす、シスにおける（同じ細胞上の）Ｎｏｔｃｈ受容体とも相互作用しうるが、シス阻害の正確な機構は、不明なままであり、リガンドに応じて変化しうる（例えば、Kleinら、１９９７年；Ladiら、２００５年；Glittenbergら、２００６年を参照されたい）。２つの仮説的な阻害方式は、トランス相互作用を防止することにより、または受容体のプロセシングを攪乱すること、もしくは小胞体内もしくはゴルジ体内の受容体の保持を物理的に引き起こすことを介して、細胞表面上のＮｏｔｃｈ受容体の量を低減することにより、細胞表面におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達をモジュレートすることを含む（Sakamotoら、２００２年；Dunwoodie、２００９年）。しかし、近傍の細胞上のＮｏｔｃｈ受容体およびＮｏｔｃｈリガンドの発現の確率的差異は、転写過程および非転写過程のいずれによっても増幅される可能性があり、シス相互作用とトランス相互作用との微妙なバランスは、Ｎｏｔｃｈにより媒介される、近傍の組織内の多岐にわたる細胞運命の画定の微調整を結果としてもたらしうることが明らかである（Sprinzakら、２０１０年）。
【００４４】
ＤＬＬ３とは、Ｎｏｔｃｈ  ＤＳＬリガンドのデルタ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質のオルソログは、ヒト（受託番号：ＮＰ＿０５８６３７およびＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジー（受託番号：ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受託番号：ＮＰ＿０３１８９２）、およびラット（受託番号：ＮＰ＿４４６１１８）を含むがこれらに限定されない。ヒトでは、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３上で位置決定された、９．５ｋＢｐにわたる８つのエクソンからなる。最後のエクソン内の代替的スプライシングは、２つのプロセシングされた転写物であって、１つは２３８９塩基（受託番号：ＮＭ＿０１６９４１）であり、１つは２０５２塩基（受託番号：ＮＭ＿２０３４８６）である転写物をもたらす。前者の転写物が、６１８アミノ酸のタンパク質（受託番号：ＮＰ＿０５８６３７；配列番号１）をコードするのに対し、後者の転写物は、５８７アミノ酸のタンパク質（受託番号：ＮＰ＿９８２３５３；配列番号２）をコードする。ＤＬＬ３のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメインおよびそれらの膜貫通ドメインにわたる全体で１００％の同一性を共有し、長い方のアイソフォームは、タンパク質のカルボキシ末端において、さらなる３２個の残基を含有する、延伸細胞質テール（extended  cytoplasmic  tail）を含有するという点でだけ異なる。アイソフォームの生物学的関連性は不明であるが、いずれのアイソフォームも、腫瘍細胞内で検出されうる。
【００４５】
ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメイン、単一のＤＳＬドメイン、およびＮ末端ドメインを含む。一般に、ＥＧＦドメインは、ｈＤＬＬ３（配列番号１および２）のアミノ酸残基２１６〜２４９（ドメイン１）、２７４〜３１０（ドメイン２）、３１２〜３５１（ドメイン３）、３５３〜３８９（ドメイン４）、３９１〜４２７（ドメイン５）、および４２９〜４６５（ドメイン６）近傍において生じ、ＤＳＬドメインは、アミノ酸残基１７６〜２１５近傍において生じ、Ｎ末端ドメインは、アミノ酸残基２７〜１７５近傍において生じると認識されている。本明細書でより詳細に論じられ、下記の実施例で示される通り、ＥＧＦ様ドメイン、ＤＳＬドメイン、およびＮ末端ドメインの各々は、識別可能なアミノ酸配列により定義されるような、ＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。本開示の目的では、それぞれのＥＧＦ様ドメインを、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６と称することができ、ＥＧＦ１が、タンパク質のＮ末端部分に最も近いことに注意されたい。タンパク質の構造的組成に関して、本発明の重要な一態様は、選択されたドメイン、モチーフ、またはエピトープと反応するように、開示されるＤＬＬ３モジュレーターを作製し、作り、操作し、選択することができることである。ある特定の場合には、このような部位特異的モジュレーターは、それらの主要な作用様式に応じて、反応性および／または有効性の増強をもたらしうる。特に好ましい実施形態では、部位特異的抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＤＳＬドメインに結合し、なおより好ましい実施形態では、ＤＳＬドメイン内のＧ２０３、Ｒ２０５、Ｐ２０６（配列番号４）を含むエピトープに結合する。
【００４６】
ＩＩＩ．細胞結合剤
１．抗体構造
上記で示唆された通り、本発明の特に好ましい実施形態は、部位特異的抗体またはその免疫反応性断片の形態の細胞結合剤を伴う開示されるＤＬＬ３コンジュゲートであって、ＤＬＬ３タンパク質のアイソフォーム、および、任意選択で、他のＤＬＬファミリーメンバーの１つまたは複数のドメインと優先的に会合するＤＬＬ３コンジュゲートを含む。これに関して、一般に認められた命名法および番号付けシステムを含む、抗体ならびにそれらの部位特異的変異体および部位特異的誘導体については、例えば、Abbasら（２０１０年）、Cellular  and  Molecular  Immunology（６版）、W.B.  Saunders  Company；またはMurpheyら（２０１１年）、Janeway's  Immunobiology（８版）、Garland  Scienceにおいて広範に記載されている。
【００４７】
本出願の目的では、「モジュレーター」および「抗体」という用語は、文脈によりそうでないことが記されない限りにおいて、互換的に使用されうると認識されることに注意されたい。同様に、「抗ＤＬＬ３コンジュゲート」および「ＤＬＬ３コンジュゲート」という用語、または、単に、「コンジュゲート」という用語は全て、本明細書で示される部位特異的コンジュゲートを指し、文脈によりそうでないことが記されない限りにおいて、互換的に使用することができる。
【００４８】
「抗体」または「無傷抗体」は、共有結合的ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用により併せて保持された、２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを含む、Ｙ字型の四量体タンパク質を指すことが典型的である。ヒト軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ここで、定常ドメインは、アミノ酸配列および遺伝子座に基づき、カッパまたはラムダとしてたやすく分類することができる。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および定常領域を含み、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの場合、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と称する３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは、第４のドメインであるＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤクラスでは、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインは、プロリンおよびシステインに富む、可変長（ＩｇＧでは、一般に、約１０〜約６０アミノ酸）のセグメントである、可撓性のヒンジ領域により隔てられている。軽鎖および重鎖の両者における可変ドメインも、約１２またはこれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域により、定常ドメインにつながれており、重鎖はまた、約１０のさらなるアミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対合システイン残基により形成される、鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。
【００４９】
免疫グロブリン分子内には、２種類の天然ジスルフィド架橋または天然ジスルフィド結合：鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合の位置および数は、免疫グロブリンのクラスおよび種によって変化する。本発明は、抗体の任意の特定のクラスまたはサブクラスに限定されるわけではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンを、例示的な目的だけのために使用するものとする。鎖内ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面上に位置決定されており、溶媒に接触可能であり、通例、比較的容易に還元される。ヒトＩｇＧ１アイソタイプでは、各重鎖〜軽鎖間に１つの、および重鎖間に２つの、４つの鎖間ジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合には必要とされない。重鎖のシステインに富むＩｇＧ１ヒンジ領域は一般に、３つの部分：上部ヒンジ（Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ）、コアヒンジ（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ）、および下部ヒンジ（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）からなるように保持されている。当業者は、ＩｇＧ１ヒンジ領域は、Ｆａｂの動きを容易とする構造的可撓性をもたらす、鎖間ジスルフィド結合（２つの重鎖／重鎖、２つの重鎖／軽鎖）を含む  、重鎖内のシステインを含有することを認識する。
【００５０】
ＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上部ヒンジ領域内のＣ２２０との間で形成される（図１）。重鎖間の鎖間ジスルフィド結合は、Ｃ２２６位とＣ２２９位に存在する（全ては、Kabatら、後掲に従うＥＵインデックスによって番号付けされる）。
【００５１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、広義に解釈することができ、それが、ＤＬＬ３決定基との優先的な会合または結合を呈示する限りにおいて、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、組換えにより生成された抗体、イントラボディー、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびそれらの変異体を含む合成抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃ）などの免疫特異性抗体断片；およびＦｃ融合体および他の修飾を含むこれらの誘導体、ならびに他の任意の免疫反応性分子を含む。さらに、文脈上の制約によりそうでないことが指示されない限りにおいて、用語は、抗体の全てのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）、および全てのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）もさらに含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμにより表記されることが典型的である。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに識別可能な種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００５２】
選択された実施形態では、下記でより詳細に論じられる通り、ＣＬドメインは、遊離システインを呈示するカッパＣＬドメインを含みうる。他の実施形態では、供給源抗体は、遊離システインを呈示するラムダＣＬドメインを含みうる。全てのヒトＩｇＧ  ＣＬドメインの配列は周知であるので、当業者は、ラムダ配列およびカッパ配列の両方を、本開示に従い容易に解析し、これらを用いて、適合性の抗体構築物をもたらすことができる。同様に、説明および裏付けの目的で、以下の議論および添付の実施例では主に、ＩｇＧ１型抗体の特徴について述べる。軽鎖定常領域と同様に、異なるアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）、およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に由来する重鎖定常ドメイン配列も周知であり、特徴づけられている。したがって、当業者は、任意のアイソタイプまたはサブクラスを含む抗ＤＬＬ３抗体をたやすく利用し、各々を、本明細書で教示される通りに、開示されるＰＢＤとコンジュゲートさせて、本発明の部位特異的抗体薬物コンジュゲートをもたらすことができる。
【００５３】
抗体の可変ドメインは、抗体によって、アミノ酸組成の大幅な変動を示し、主に、抗原の認識および抗原への結合に関与する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷のＩｇＧ抗体が、２つの結合部位を有する（すなわち、ＩｇＧ抗体は、二価である）ように、抗体結合部位を形成する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、可変性が極めて大きな３つの領域であって、超可変領域、またはより一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知の、４つのそれほど可変的でない領域により枠づけられ、隔てられた領域を含む。ＶＨ領域とＶＬ領域との非共有結合による会合により、抗体の２つの抗原結合部位のうちの１つを含有するＦｖ断片（「可変断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）」を表わして）が形成される。遺伝子操作により得ることができる、ｓｃＦｖ断片（単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）を表わして）は、抗体のＶＨ領域とＶＬ領域とを、単一のポリペプチド鎖内で、ペプチドリンカーで隔てて会合させる。
【００５４】
本明細書で使用される、アミノ酸の、各ドメイン、各フレームワーク領域、および各ＣＤＲへの割当ては、そうでないことが注意されない限り、Kabatら（１９９１年）、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest（５版）、US  Dept.  of  Health  and  Human  Services、PHS、NIH、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号；Chothiaら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Chothiaら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；MacCallumら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはDubel編（２００７年）、Handbook  of  Therapeutic  Antibodies、３版、Wily−VCH  Verlag  GmbH  and  Co.により提示されている番号付けスキームのうちの１つによることができる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＭａｃＣａｌｌｕｍにより定義され、Ａｂｙｓｉｓウェブサイトのデータベース（後掲）から得られるＣＤＲを含むアミノ酸残基を、下記に示す。
【表１】
2016531914.tif 000003
【００５５】
抗体配列内の可変領域およびＣＤＲは、当技術分野で開発された一般的規則（例えば、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムなど、上記で示したもの）に従い同定することもでき、配列を、公知の可変領域のデータベースに関して配列をアラインメントすることにより同定することもできる。これらの領域を同定するための方法については、KontermannおよびDubel編、Antibody  Engineering、Springer、New  York、NY、２００１年およびDinarelloら、Current  Protocols  in  Immunology、John  Wiley  and  Sons  Inc.、Hoboken、NJ、２０００年において記載されている。抗体配列の例示的なデータベースについては、Retterら、Nucl.  Acids  Res.、３３巻（データベース特集号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４頁（２００５年）において記載されている通り、www.bioinf.org.uk/abs（Department  of  Biochemistry  &  Molecular  Biology  University  College  London、London、EnglandのA.C.  Martinにより維持されている）における「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト、およびwww.vbase2.orgにおけるＶＢＡＳＥ２ウェブサイトにおいて記載されており、かつ、これらを介してアクセスすることができる。配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合する、Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析することが好ましい。Dr.  Andrew  C.  R.  Martinによる著書の章であるProtein  Sequence  and  Structure  Analysis  of  Antibody  Variable  Domains、Antibody  Engineering  Lab  Manual（ウェブサイトbioinforg.uk/absでもまた入手可能な、Duebel,  S.およびKontermann,  R.編、Springer-Verlag、Heidelberg、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従い使用されうるＣＤＲを同定するために開発された一般的規則もさらに含む。そうでないことが示されない限りにおいて、本明細書で示される全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従うＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトに従い得られる。
【００５６】
本発明で論じられる重鎖定常領域のアミノ酸位置について、番号付けは、配列決定された最初のヒトＩｇＧ１であることが報告されている、骨髄腫タンパク質であるＥｕのアミノ酸配列について記載する、Edelmanら、１９６９年、Proc,  Natl.  Acad.  Sci.  USA、６３巻（１号）：７８〜８５頁において最初に記載されたＥｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎによるＥｕインデックスはまた、Kabatら、１９９１年（上掲）においても示されている。したがって、重鎖の文脈における「Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」または「Ｋａｂａｔに従うＥＵインデックス」という用語は、Kabatら、１９９１年（上掲）で示される、ＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域のアミノ酸配列に使用される番号付けシステムも、Kabatら、１９９１年において同様に示されている。
【００５７】
本発明に適合性の、例示的なカッパＣＬおよびＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を、添付の配列表内の配列番号５および６として示す。同様に、例示的なラムダＣＬ軽鎖定常領域を、添付の配列表内の配列番号１１として示す。当業者は、不対合システインをもたらすように、本明細書で開示される通りに操作された、このような軽鎖定常領域配列（例えば、配列番号７〜１０、１２、および１３を参照されたい）は、本発明のＤＬＬ３コンジュゲート内に組み込まれうる、全長抗体（配列番号１４〜１９を参照されたい）をもたらすように、標準的な分子生物学技法を使用して、開示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域と結合しうることを認識する。
【００５８】
本発明の部位特異的抗体または免疫グロブリンは、任意のＤＬＬ３決定基を特異的に認識するかまたはこれと会合する、任意の抗体を含むかまたはこれから誘導することができる。本明細書で使用される「決定基」または「標的」とは、特定の細胞、細胞集団、または組織と同定可能な形で会合するか、あるいは特定の細胞内もしくは細胞上、特定の細胞集団内もしくは細胞集団上、または特定の組織内もしくは組織上で特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー、または因子を意味する。決定基または標的は、その性質が形態学的、機能的、または生化学的であってもよく、表現型であることが好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、決定基は、特異的細胞型またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特異点における細胞または特定のニッチにおける細胞）が差次的に発現する（過剰発現または過少発現する）タンパク質である。本発明の目的では、決定基は、異常ながん細胞上で差次的に発現することが好ましく、ＤＬＬ３タンパク質、あるいはそのスプライス変異体、アイソフォームもしくはファミリーメンバー、またはその特異的ドメイン、特異的領域、もしくは特異的エピトープのうちのいずれかを含みうる。「抗原」、「免疫原性決定基」、「抗原決定基」、または「免疫原」とは、免疫応答性動物に導入されると免疫応答を刺激することが可能であり、動物の免疫応答により産生される抗体により認識される、任意のタンパク質（ＤＬＬ３を含む）またはその任意の断片、領域、ドメイン、もしくはエピトープを意味する。本明細書で意図される決定基の存在または非存在を使用して、細胞、細胞亜集団、または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞またはＣＳＣ）を同定することができる。
【００５９】
下記の実施例で示す通り、本発明の選択された実施形態は、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合するマウス抗体であって、「供給源」抗体と考えられうる抗体を含む。他の実施形態では、本発明により意図される抗体は、供給源抗体の定常領域（すなわち、部位特異的抗体をもたらすため）またはエピトープ結合性アミノ酸配列の任意選択の修飾により、このような「供給源」抗体から誘導することができる。一実施形態では、供給源抗体内の選択されたアミノ酸を、欠失、変異、置換、組込み、または組合せにより変化させる場合、抗体は、供給源抗体から「誘導」される。別の実施形態では、「誘導された」抗体は、供給源抗体の断片（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたは全可変領域）を、誘導性抗体（例えば、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはヒト化抗体）をもたらすように、アクセプター抗体配列と組み合わせるか、またはアクセプター抗体配列に組み込んだ抗体である。これらの「誘導した」（例えば、ヒト化またはＣＤＲグラフト化）抗体は、標準的な分子生物学技法を使用して、例えば、決定基に対する親和性を改善するか；細胞培養物中の産生および収率を改善するためか；ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫原性を低減するためか；毒性を低減するためか；活性部分のコンジュゲーションを容易とするためか；または多重特異性抗体を創製するためなど、多様な理由で作製することができる。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはＰＥＧ化）を介して、供給源抗体から誘導することもできる。当然ながら、本明細書で広範に論じられる通り、１つまたは複数の遊離システインを含む、所望の部位特異的抗体をもたらすように、これらの誘導された抗体をさらに操作することもできる。
【００６０】
本発明の文脈では、添付の配列表で示されるマウス可変領域アミノ酸配列から誘導される、開示された軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲのうちのいずれかを、アクセプター抗体と組み合わせるか、または再配列して、本教示に従う、最適化された抗ヒトＤＬＬ３（例えば、ヒト化抗ｈＤＬＬ３またはキメラ抗ｈＤＬＬ３）部位特異的抗体をもたらしうることを認識する。すなわち、添付の配列表で示される連続的な軽鎖可変領域アミノ酸配列から誘導されるかまたは得られたＣＤＲのうちの１つまたは複数（併せて、配列番号２１〜３８７、奇数）を、部位特異的構築物内に組み込むことができ、特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＤＬＬ３アイソフォームと免疫特異的に会合する、部位特異的ＣＤＲグラフト化抗体内または部位特異的ヒト化抗体内に組み込むことができる。このようなヒト化モジュレーターの「誘導された」軽鎖可変領域アミノ酸配列および重鎖可変領域アミノ酸配列についての実施例はまた、図２Ａおよび２Ｂにも示される（配列番号３８９〜４０７、奇数）。
【００６１】
図２Ａおよび２Ｂで注釈を付けたＣＤＲ配列およびフレームワーク配列は、特許権のあるＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔに従って定義する。しかし、本明細書で論じられる通り、当業者であれば、Kabatら、Chothiaら、またはMacCallumらにより定義されるＣＤＲを、添付の配列表で示されるそれぞれの重鎖配列および軽鎖配列の各々について、たやすく定義し、同定し、誘導し、かつ／または列挙しうる。したがって、全てのこのような命名法により定義されるＣＤＲを含む、対象のＣＤＲおよび抗体の各々は、本発明の範囲内に明白に含まれる。より広義では、「可変領域ＣＤＲのアミノ酸残基」またはより単純に「ＣＤＲ」という用語は、上記で示した、任意の配列ベースの方法または構造ベースの方法を使用して同定される、ＣＤＲ内のアミノ酸を含む。この文脈で、図２Ａおよび２Ｂ内の例示的なヒト化抗体についてのＫａｂａｔ  ＣＤＲを、添付の配列表内に、配列番号４０８〜４３７として提示する。
【００６２】
本発明の別の態様は、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９、およびＳＣ１６．１５０；または上記で同定された抗体のうちのいずれか、あるいはそのキメラ形またはヒト化形から得られるかまたは誘導された抗体を組み込むＡＤＣを含む。他の実施形態では、本発明のＡＤＣは、上述のモジュレーターのうちのいずれかに由来する、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを有するＤＬＬ３抗体を含む。注釈を付けた配列表は、上述の抗ＤＬＬ３抗体の各々の重鎖可変領域および軽鎖可変領域について、個別の配列番号を提示する。
【００６３】
２．部位特異的抗体
本開示に基づけば、当業者は、本明細書で記載される操作された構築物をたやすく作ることができる。本明細書で使用される「操作された抗体」、「操作された構築物」、または「部位特異的抗体」とは、重鎖内または軽鎖内の少なくとも１つのアミノ酸を、少なくとも１つの遊離システインをもたらすように、欠失させるか、変化させるか、または置換した（好ましくは別のアミノ酸で）、抗体またはその免疫反応性断片を意味する。同様に、「操作されたコンジュゲート」または「部位特異的コンジュゲート」とは、操作された抗体と、不対合システイン（複数可）にコンジュゲートさせた少なくとも１つのＰＢＤとを含む、抗体薬物コンジュゲートを意味するように理解するものとする。ある特定の実施形態では、不対合システイン残基は、不対合鎖内残基を含む。他の好ましい実施形態では、遊離システイン残基は、不対合鎖間システイン残基を含む。操作された抗体は、多様なアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤであることが可能であり、これらのクラス内で、抗体は、多様なサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４でありうる。このようなＩｇＧ構築物に関して述べると、抗体の軽鎖は、各々が、好ましい実施形態では、ＩｇＧ１重鎖内のＣ２２０残基の欠如に起因して不対合でありうる、各々がＣ２１４を組み込んでいる、カッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプのいずれかを含みうる。
【００６４】
一実施形態では、操作された抗体は、鎖内システイン残基または鎖間システイン残基の、少なくとも１つのアミノ酸の欠失または置換を含む。本明細書で使用される「鎖間システイン残基」が、抗体の軽鎖と重鎖との間、または抗体の２つの重鎖の間のいずれかの、天然のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を意味するのに対し、鎖内システイン残基とは、同じ重鎖内または同じ軽鎖内の別のシステインと自然に対合したシステイン残基である。一実施形態では、欠失させるかまたは置換した鎖間システイン残基は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与する。別の実施形態では、欠失させるかまたは置換したシステイン残基は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合に関与する。典型的な実施形態では、軽鎖が、重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインと対合し、１つの重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが、相補性重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインと対合する、抗体の相補性構造に起因して、軽鎖内または重鎖内のいずれかの単一のシステインが変異または欠失すれば、操作された抗体内に、２つの不対合システイン残基が結果としてもたらされる。
【００６５】
一部の実施形態では、鎖間システイン残基を欠失させる。他の実施形態では、鎖間システインを、別のアミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸）で置換する。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、トレオニン、またはグリシン）残基または親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン）残基による置き換えを結果としてもたらしうる。特に好ましい一実施形態では、鎖間システインを、セリンで置き換える。
【００６６】
本発明により意図される一部の実施形態では、欠失させるかまたは置換したシステイン残基は、軽鎖（カッパまたはラムダのいずれかの）上にあり、したがって、遊離システインを重鎖上に残す。他の実施形態では、欠失させるかまたは置換したシステイン残基は、重鎖上にあり、遊離システインを軽鎖定常領域上に残す。図１は、例示的なＩｇＧ１／カッパ抗体内の鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインを描写する。各場合において既に示した通り、定常領域のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔに従うＥＵインデックスに基づき番号付けする。図４に示される、無傷抗体の軽鎖内または重鎖内のいずれかの単一のシステインの欠失または置換は、２つの不対合システイン残基を有する操作された抗体を結果としてもたらす。
【００６７】
特に好ましい一実施形態では、ＩｇＧ軽鎖（カッパまたはラムダ）の２１４位におけるシステイン（Ｃ２１４）を、欠失させるか置換する。別の好ましい実施形態では、ＩｇＧ重鎖上の２２０位におけるシステイン（Ｃ２２０）を、欠失させるか置換する。さらなる実施形態では、重鎖上の２２６位または２２９位におけるシステインを、欠失させるか置換する。一実施形態では、重鎖上のＣ２２０を、セリンで置換して（Ｃ２２０Ｓ）、所望の遊離システインを、軽鎖内にもたらす。別の実施形態では、軽鎖内のＣ２１４を、セリンで置換して（Ｃ２１４Ｓ）、所望の遊離システインを、重鎖内にもたらす。実施例４により提供されるこのような部位操作構築物を、例示的な抗ＤＬＬ３抗体であるＳＣ１６．５６を使用する図３Ａおよび３Ｂに示す。これらの好ましい構築物の概要を、すぐ下の表２（表中、全ての番号付けは、Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」または変化を伴わない天然の定常領域配列を表す）に示す。言及される配列は、カッパ軽鎖であるが、Ｃ２１４を含む例示的なラムダ軽鎖もまた、本明細書で示される通りに使用しうることに注意されたい。また、本明細書で使用されるデルタ（Δ）も、アミノ酸残基の欠失を指示するものとする（例えば、Ｃ２１４Δとは、２１４位におけるシステインを欠失させたことを示す）。
【表２】
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【００６８】
本明細書で開示される、薬物ローディングの定義された部位および化学量論による抗体−薬物コンジュゲートを作製するための戦略は、抗体の保存された定常ドメインの操作を主に伴うので、他の抗体へも広く適用可能である。抗体の各クラスおよび各サブクラスのアミノ酸配列および天然のジスルフィド架橋については、十分に記載されているので、当業者であれば、過度の実験を伴わずに、多様な抗体の操作された構築物をたやすく作ることができ、したがって、このような構築物は、本発明の範囲内にあるものとして明白に意図される。
【００６９】
３．抗体の作製
ａ．ポリクローナル抗体
当技術分野では、ウサギ、マウス、ラットなどを含む、多様な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生が周知である。一部の実施形態では、ポリクローナル抗ＤＬＬ３抗体含有血清は、動物から採血するか、またはこれを屠殺することにより得る。血清は、研究を目的として、動物から得られた形態で使用することもでき、代替的に、免疫グロブリン画分または均質な抗体調製物をもたらすように、抗ＤＬＬ３抗体を、部分的または完全に精製することもできる。
【００７０】
略述すると、選択された動物は、例えば、選択されたアイソフォーム、ドメイン、および／もしくはペプチド、またはＤＬＬ３もしくはその免疫反応性断片を発現する生細胞もしくは細胞調製物を含みうる、ＤＬＬ３免疫原（例えば、可溶性ＤＬＬ３またはｓＤＬＬ３）で免疫する。接種される種に応じて、免疫応答を増加させるのに使用されうる、当技術分野で公知のアジュバントは、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなど、潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない。このようなアジュバントは、局所的沈着物中に封鎖することにより、抗原を急速な散失から保護する場合もあり、マクロファージおよび免疫系の他の成分に対して走化性の因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有する場合もある。免疫スケジュールは、２回またはこれを超える、選択された免疫原の投与を所定の期間にわたり繰り広げることを伴うことが好ましい。
【００７１】
図１に示される、ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸配列を解析して、抗体を作製するための、ＤＬＬ３タンパク質の特異的領域を選択することができる。例えば、ＤＬＬ３アミノ酸配列の疎水性および親水性解析を使用して、ＤＬＬ３構造内の親水性領域を同定する。免疫原性構造を示すＤＬＬ３タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ解析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ解析、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ解析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ解析、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ解析、またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析など、当技術分野で公知の、他の多様な方法を使用してたやすく同定することができる。平均可撓性プロファイルは、Bhaskaran  R.、Ponnuswamy  P.  K.、１９８８年、Int.  J.  Pept.  Protein  Res.、３２巻：２４２〜２５５頁による方法を使用して作成することができる。ベータターンプロファイルは、Deleage,  G.、Roux  B.、１９８７年、Protein  Engineering、１巻：２８９〜２９４頁による方法を使用して作成することができる。したがって、これらのプログラムまたは方法のうちのいずれかにより同定される、ＤＬＬ３領域、ＤＬＬ３ドメイン、またはＤＬＬ３モチーフの各々は、本発明の範囲内にあり、所望される特性を含むモジュレーターを生じさせる免疫原をもたらすように、単離または操作することができる。ＤＬＬ３抗体を作製するのに好ましい方法は、本明細書に提示される実施例により、さらに例示する。当技術分野では、免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法が周知である。当技術分野ではまた、タンパク質との、ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他の担体タンパク質などの担体との免疫原性コンジュゲートを調製するための方法も周知である。ある状況では、例えば、カルボジイミド試薬を使用する、直接的なコンジュゲーションを使用するが、他の場合には、連結試薬が有効である。ＤＬＬ３免疫原の投与は、当技術分野で理解されている通り、適切な期間にわたり、適切なアジュバントの使用を伴う、注射により実行されることが多い。免疫スケジュール中には、抗体の力価を、下記の実施例で記載されている通りに測定して、抗体の形成が適正であることを決定することができる。
【００７２】
ｂ．モノクローナル抗体
加えて、本発明は、モノクローナル抗体の使用を意図する。当技術分野で公知の「モノクローナル抗体」（またはｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、少量で存在しうる可能な変異（例えば、天然に存在する変異）を除き、集団を構成する個々の抗体は、同一である。ある特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、抗原に結合するか、またはこれと会合するポリペプチド配列を含む抗体であって、抗原結合性ポリペプチド配列が、単一の標的結合性ポリペプチド配列の、複数のポリペプチド配列からの選択を含むプロセスにより得られた抗体を含む。
【００７３】
より一般に、かつ本明細書の実施例で示される通り、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、組換え技法、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらのいくらかの組合せを含む、当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、ならびに当技術分野で認知された生化学技法および遺伝子操作技法であって、それらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、An,  Zhigiang（編）、Therapeutic  Monoclonal  Antibodies:  From  Bench  to  Clinic、John  Wiley  and  Sons、１版、２００９年；Shireら（編）、Current  Trends  in  Monoclonal  Antibody  Development  and  Manufacturing、Springer  Science  +  Business  Media  LLC、１版、２０１０年；Harlowら、Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２版、１９８８年；Hammerlingら、Monoclonal  Antibodies  and  T-Cell  Hybridomas、５６３〜６８１頁（Elsevier、N.Y.、１９８１年）においてより詳細に記載されているような技法を使用して生成することができる。選択された結合性配列をさらに、変化させて、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養においてその産生を改善し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低減させ、多重特異性抗体を創製するなどをすることができること、および、変化させた標的結合性配列を含む抗体もまた、本発明の抗体であることを理解されたい。下記の実施例１で示される通り、本発明に適合性のマウスモノクローナル抗体が提供される。
【００７４】
ｃ．キメラ抗体およびヒト化抗体
別の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる種または抗体クラスに由来する、共有結合的に結合されたタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含みうる。「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内、およびこのような抗体の断片内の対応する配列と同一であるかまたは相同である構築物を対象とする（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Morrisonら、１９８４年、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。
【００７５】
一実施形態では、キメラ抗体は、マウスＶＨアミノ酸配列およびマウスＶＬアミノ酸配列ならびにヒト供給源、例えば、下記で記載されるヒト化抗体から誘導された定常領域を含みうる。一部の実施形態では、抗体は、「ＣＤＲグラフト化」であることが可能であり、この場合、抗体は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属するが、抗体鎖（複数可）の残りの部分は、別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるかまたは相同である、１つまたは複数のＣＤＲを含む。ヒトにおける使用のために、選択された齧歯動物ＣＤＲ、例えば、マウスＣＤＲを、ヒト抗体にグラフト化し、ヒト抗体の天然に存在するＣＤＲのうちの１つまたは複数を置き換えることができる。これらの構築物は一般に、被験体による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、完全強度の抗体機能、例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）をもたらす利点を有する。
【００７６】
ＣＤＲグラフト化と同様に、抗体は、「ヒト化」抗体である。本明細書で使用される、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、１つまたは複数の非ヒト免疫グロブリンから誘導されたアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの１つまたは複数のＣＤＲに由来する残基を、非ヒトの種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物の１つまたは複数のＣＤＲに由来する残基で置き換えた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体またはアクセプター抗体）である。ある特定の好ましい実施形態では、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン内の１つまたは複数のＦＲ内の残基を、ドナー抗体に由来する対応する非ヒト残基で置き換えて、グラフト化されたＣＤＲ（複数可）の適切な三次元立体配置を維持し、これにより、親和性を改善する一助とする。これを、「復帰変異」の導入と称することができる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに精緻化するように、レシピエント抗体内またはドナー抗体内で見出されない残基も含みうる。下記の実施例３では、本発明に適合性のヒト化抗ＤＬＬ３抗体が提供され、結果として得られるヒト化軽鎖アミノ酸配列およびヒト化重鎖アミノ酸配列は、図２Ａおよび２Ｂに示される。図３Ａおよび３Ｂは、例示的な部位特異的ヒト化抗ＤＬＬ３抗体重鎖および軽鎖の、注釈を付けたアミノ酸配列を示す。
【００７７】
多様な供給源を使用して、どのヒト配列をヒト化抗体で使用するのかを決定することができる。このような供給源は、例えば、Tomlinson,  I.  A.ら（１９９２年）、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：７７６〜７９８頁；Cook,  G.  P.ら（１９９５年）、Immunol.  Today、１６巻：２３７〜２４２頁；Chothia,  D.ら（１９９２年）、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：７９９〜８１７頁；およびTomlinsonら（１９９５年）、EMBO  J、１４巻：４６２８〜４６３８頁において開示されている、ヒト生殖細胞系列配列；ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリーを提供している、Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリー（ＶＢＡＳＥ２：Retterら、Nucleic  Acid  Res.、３３巻；６７１〜６７４頁、２００５年）（Tomlinson,  I.  A.ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編纂されている）；または例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４において記載されている、ヒトコンセンサスＦＲを含む。
【００７８】
ＣＤＲグラフティング抗体およびヒト化抗体については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および同５，６９３，７６２において記載されている。さらなる詳細については、例えば、Jonesら、１９８６年、ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および同７，０８７，４０９を参照されたい。
【００７９】
別の方法を、「ヒューマニアリング（humaneering）」と称し、これは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００５／０００８６２５において記載されている。別の実施形態では、非ヒト抗体は、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失またはＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において開示されている方法による「脱免疫」により修飾することができる。
【００８０】
上記で論じた通り、選択された実施形態では、ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト化抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸残基のうちの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％は、レシピエントのヒト配列のアミノ酸残基に対応する。他の実施形態では、ヒト化抗体可変領域残基のうちの少なくとも８３％、８５％、８７％、または９０％は、レシピエントのヒト配列の残基に対応する。さらに好ましい実施形態では、ヒト化抗体可変領域の各々のうちの９５％超は、レシピエントのヒト配列の可変領域に対応する。
【００８１】
ヒト化抗体可変領域の、ヒトアクセプター可変領域に対する配列同一性または配列相同性は、既に論じられた通りに決定することができ、そのため測定される場合、好ましくは、少なくとも６０％または６５％の配列同一性を共有し、より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９３％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を有する、別のアミノ酸残基で置換する置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはこれを超えるアミノ酸配列が、保存的置換で互いと異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似度を、置換の保存的性格について補正するように、上方に調整することができる。
【００８２】
ｄ．ヒト抗体
別の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体を含みる。「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生される抗体、および／またはヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を指す。
【００８３】
ヒト抗体は、当技術分野で公知の多様な技法を使用して生成することができる。１つの技法は、（好ましくはヒト）抗体のライブラリーを、ファージ上で合成し、そのライブラリーを、目的の抗原またはその抗体結合性部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、ここから免疫反応性断片を得ることができるファージディスプレイである。当技術分野では、このようなライブラリーを調製し、スクリーニングするための方法が周知であり、ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、型番：２７−９４００−０１；および、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、型番：２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングする際に使用されうる、他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９１／１７２７１号、同第ＷＯ９２／２０７９１号、同第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ９３／０１２８８号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／０９６９０号；および、Barbasら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照されたい）。
【００８４】
一実施形態では、組換えヒト抗体は、上記の通りに調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。一実施形態では、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ  ｃＤＮＡおよびヒトＶＨ  ｃＤＮＡを使用して作製された、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。
【００８５】
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）により生成された抗体の親和性は、中程度（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）でありうるが、また、当技術分野で記載されている通り、二次ライブラリーから構築および再選択することにより、親和性成熟も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、変異を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ランダムに導入することができる（Leungら、Technique、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）において報告されている）。加えて、親和性成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたりランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを使用して、選択された個々のＦｖクローンにおいて、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させ、高親和性のクローンをスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創製するための方法について記載した。別の有効な手法は、Marksら、Biotechnol.、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、ファージディスプレイにより選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを、免疫されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーで組み換え、複数ラウンドにわたるチェインリシャッフリングにより、より高い親和性についてスクリーニングする手法である。この技法は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍまたはこれ未満の抗体および抗体断片の生成を可能とする。
【００８６】
他の実施形態では、それらの表面に結合対（binding  pairs）を発現する真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリーを使用する、類似の手順を用いることができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態では、ヒト抗体を、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択する（Vaughanら、Nature  Biotechnology、１４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Sheetsら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））。他の実施形態では、ヒト結合対は、酵母など、真核細胞内で作製されたコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離することができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技法は、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能とし、候補配列の比較的容易な操作（例えば、親和性成熟または組換えシャッフリングによる）をもたらすのに有利である。
【００８７】
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化させ、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したマウスに導入することによっても作製することができる。感作すると、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む全ての点で、ヒトにおいて認められるヒト抗体に酷似するヒト抗体の産生が観察された。この手法は、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；同５，５４５，８０６；同５，５６９，８２５；同５，６２５，１２６；同５，６３３，４２５；同５，６６１，０１６、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および同６，１５０，５８４；ならびにLonbergおよびHuszar、Intern.  Rev.  Immunol.、１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）において記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化（このようなＢリンパ球は、新生物性障害を患う個体から回収することもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて免疫することもできる）を介して調製することができる。例えば、Coleら、Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy、Alan  R.  Liss、７７頁（１９８５年）；Boernerら、J.  Immunol、１４７巻（１号）：８６〜９５頁（１９９１年）；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照されたい。
【００８８】
４．組換えによる抗体の産生
部位特異的抗体およびその断片は、抗体産生細胞から得られる遺伝子材料および組換え技術を使用して、産生または改変することができる（例えば、BergerおよびKimmel、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；SambrookおよびRussell（編）（２０００年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版）、NY、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press；Ausubelら（２００２年）、Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley、John  &  Sons,  Inc.（２００６年までの増補）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照されたい）。
【００８９】
より特定すると、本発明の別の態様は、本発明の部位特異的抗体をコードする操作された核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に存在する場合もあり、細胞溶解物中に存在する場合もあり、部分的に精製されるかまたは実質的に純粋な形態で存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸または細胞タンパク質から精製されるとき、「単離」されるか、または「実質的に純粋」とされる。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、イントロン配列を含有する場合もあり、含有しない場合もある。より一般に、本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖であれ、二本鎖であれ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの人工的変異体（例えば、ペプチド核酸）を含む。好ましい実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【００９０】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して得ることができ、操作することができる。ハイブリドーマ（例えば、下記でさらに記載される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）により発現される抗体では、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅技法またはｃＤＮＡクローニング技法により得ることができる（例えば、実施例１を参照されたい）。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）抗体では、抗体をコードする核酸を、ライブラリーから回収することができる。
【００９１】
ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に転換することができる。これらの操作では、ＶＬをコードするＤＮＡ断片またはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体定常領域または可撓性のリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動的に連結する。この文脈で使用される「作動的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片を、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列が、インフレームにとどまるように結合させることを意味するように意図される。
【００９２】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、本明細書で記載される通り、操作される場合もあり、操作されない場合もある、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子に転換することができる。当技術分野では、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Kabat,  E.  A.ら（１９９１年）、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、５版、U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域でありうるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。下記でより詳細に論じられる通り、本明細書の教示に適合性の、例示的なＩｇＧ１定常領域を、添付の配列表内の配列番号６として示し、適合性の操作されたＩｇＧ１定常領域を、配列番号７および８に示す。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することができる。
【００９３】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に転換することができる。当技術分野では、ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Kabat,  E.  A.ら（１９９１年）、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、５版、U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域でありうるが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。これに関して、例示的な適合性のカッパ軽鎖定常領域を、添付の配列表内の配列番号５として示し、適合性のラムダ軽鎖定常領域を、配列番号１１に示す。カッパ軽鎖領域およびラムダ軽鎖領域の、適合性の操作形を、それぞれ、配列番号９〜１０および１２〜１３に示す。
【００９４】
本発明はまた、上記で記載したこのような核酸であって、プロモーター（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４を参照されたい）；および真核生物分泌経路の他の転写調節エレメントおよびプロセシング制御エレメントに作動可能に連結されうる核酸を含むベクターも提供する。本発明はまた、これらのベクターを保有する宿主細胞および宿主発現系も提供する。
【００９５】
本明細書で使用される「宿主発現系」という用語は、本発明の核酸またはポリペプチドおよび抗体のいずれかを作製するように操作されうる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系は、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡで形質転換されるか、またはこれらをトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；組換え酵母発現ベクターをトランスフェクトされた酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）；または哺乳動物細胞またはウイルスのゲノムに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細胞）を含むがこれらに限定されない。宿主細胞には、２つの発現ベクター、例えば、重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクターを共トランスフェクトすることができる。
【００９６】
当技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、同４，９１２，０４０、同４，７４０，４６１、および同４，９５９，４５５を参照されたい。宿主細胞はまた、多様な特徴（例えば、修飾糖形態またはＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）を有する抗原結合性分子の産生を可能とするようにも操作することができる。
【００９７】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定的な発現が好ましい。従って、選択された抗体を安定的に発現する細胞系は、当技術分野で認識された標準的な技法を使用して操作することができ、かつそれは本発明の一部を形成する。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換することができる。当技術分野で周知の選択系のうちのいずれかであって、ある特定の条件下で発現を増強するのに効率的な手法をもたらす、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含む選択系を使用することができる。ＧＳ系は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および同５，８７９，９３６との関連で全体若しくは一部が論じられる。安定的な細胞系を開発するための別の好ましい発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【００９８】
本発明の抗体を、組換え発現または他の開示される技法のうちのいずれかにより生成したら、当技術分野で公知の方法により精製または単離しうるが、これは、本発明の抗体を、同定し、その天然環境から分離および／または回収し、抗体のコンジュゲーションまたは診断的もしくは治療的使用に干渉する夾雑物から分離することを意味する。単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。
【００９９】
これらの単離調製物は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション（diafiltration）、および親和性クロマトグラフィー、特に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーなど、当技術分野で認知された多様な技法を使用して精製することができる。
【０１００】
５．抗体断片および抗体誘導体
ａ．断片
本発明を実施するのにどのような形態の部位特異的抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択するのかに関わらず、部位特異的抗体の免疫反応性断片を、本明細書の教示に従い使用しうることが認識される。「抗体断片」は、無傷抗体の少なくとも一部を含む。本明細書で使用される抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合性断片を含み、「抗原結合性断片」という用語は、少なくとも１つの遊離システインを含む免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片であって、選択された抗原もしくはその免疫原性決定基に免疫特異的に結合するか、もしくはこれと反応するか、または断片が由来する無傷抗体と、特異的抗原結合について競合するポリペプチド断片を指す。
【０１０１】
例示的な部位特異的断片は、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディー、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。加えて、活性な部位特異的断片は、抗原／基質または受容体と相互作用し、それらを、無傷抗体の場合と同様の様式で修飾する（おそらく、いくぶん効率は低いが）その能力を保持する、抗体の一部も含む。
【０１０２】
他の実施形態では、部位特異的抗体断片とは、Ｆｃ領域を含み、無傷抗体に存在する場合のＦｃ領域と通常関連する生物学的機能の少なくとも１つ、例えば、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合を保持する断片である。一実施形態では、部位特異的抗体断片とは、無傷抗体と実質的に同様のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含みうる。
【０１０３】
当業者によりよく認識される通り、断片は、分子的操作により得ることもでき、無傷抗体もしくは無傷抗体鎖または完全抗体もしくは完全抗体鎖の化学的処理または酵素的処理（パパインまたはペプシンなど）を介して得ることもでき、組換え手段により得ることもできる。抗体断片のより詳細な記載については、例えば、Fundamental  Immunology、W.  E.  Paul編、Raven  Press、N.Y.（１９９９年）を参照されたい。
【０１０４】
ｂ．多価抗体
一実施形態では、本発明の部位特異的コンジュゲートは、一価の場合もあり、多価（例えば、二価、三価など）の場合もある。本明細書で使用される「価数」という用語は、抗体に付随する潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子または標的分子上の特異的位置もしくは特異的遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価である場合、分子の各結合部位は、単一の抗原上の位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が、１つを超える標的結合部位を含む（多価）場合、各標的結合部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に特異的に結合する場合もある（例えば、異なるリガンドに結合する場合もあり、異なる抗原に結合する場合もあり、あるいは同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合する場合もある）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照されたい。各場合に、結合部位のうちの少なくとも１つは、ＤＬＬ３アイソフォームと関連するエピトープ、モチーフ、またはドメインを含む。
【０１０５】
一実施形態では、モジュレーターは、Millsteinら、１９８３年、Nature、３０５巻：５３７〜５３９頁において記載されている通り、２つの鎖が異なる特異性を有する、二重特異性抗体である。他の実施形態は、三重特異性抗体など、さらなる特異性を有する抗体を含む。他のより精巧な、適合性の多重特異性構築物およびそれらの製作方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５、ならびにＷＯ９４／０４６９０；Sureshら、１９８６年、Methods  in  Enzymology、１２１巻：２１０頁；ＷＯ９６／２７０１１において示されている。
【０１０６】
上記で言及された通り、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合する場合もあり、標的分子および固体支持材料上の（or）異種ポリペプチドなどの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合する場合もある。抗ＤＬＬ３抗体の好ましい実施形態は、２つの抗原だけに結合する（すなわち、二重特異性抗体である）が、本発明にはまた、三重特異性抗体など、さらなる特異性を有する抗体も包含される。二重特異性抗体はまた、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含む。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体のうちの一方をアビジンにカップリングさせ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞に向けて標的化することが提案されており（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）、ＨＩＶ感染症の処置のためにも提案されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製することができる。当技術分野では、適切な架橋剤が周知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０において、多数の架橋技法と共に開示されている。
【０１０７】
さらに他の実施形態では、当業者に周知の方法を使用して、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインなど、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。
【０１０８】
ｃ．Ｆｃ領域の修飾
遊離システインを作製する部位特異的コンジュゲートを含む、上記で示した、開示される、部位特異的コンジュゲートの可変領域または結合性領域に対する多様な修飾、置換、付加、または欠失に加えて、当業者は、本発明の選択された実施形態はまた、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または修飾も含みうることを認識する。より特定すると、本発明のＤＬＬ３抗体は、とりわけ、薬物動態の変化、血清中半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）または「ＣＤＣ」（補体依存性細胞傷害作用）活性の増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の修飾を含むがこれらに限定されない、好ましい特徴を有する化合物を結果としてもたらす、１種または複数のさらなるアミノ酸残基の置換、変異、および／または修飾を含有しうることが意図される。これに関して、これらのＦｃ変異体は、開示されるモジュレーターの、有効な抗新生物特性を増強するように使用すると有利でありうることが認識される。
【０１０９】
この目的で、本発明のある特定の実施形態は、遊離システインを作製するのに必要とされる置換または修飾のほかに、Ｆｃ領域の置換または修飾、例えば、Ｆｃエフェクター機能が増強されているか、または好ましいＦｃエフェクター機能を有する化合物を生成するための、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、変異、および／または修飾も含みうる。例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ならびにＦｃＲｎ）との間の相互作用に関与するアミノ酸残基の変化は、細胞傷害作用の増加および／または血清中半減期の延長など、薬物動態の変化をもたらしうる（例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、RavetchおよびKinet、Annu.  Rev.  Immunol、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Capelら、Immunomethods、４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；ならびにde  Haasら、J.  Lab.  Clin.  Med.、１２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）を参照されたい）。
【０１１０】
選択された実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期が延長した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を修飾すること（例えば、置換すること、欠失させること、または付加すること）により作製すことができる（例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号；同第ＷＯ０４／０２９２０７号；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照されたい）。このような実施形態に関して述べると、Ｆｃ変異体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける半減期であって、５日間を超える、１０日間を超える、１５日間を超える、好ましくは、２０日間を超える、２５日間を超える、３０日間を超える、３５日間を超える、４０日間を超える、４５日間を超える、２カ月間を超える、３カ月間を超える、４カ月間を超える、または５カ月間を超える半減期をもたらしうる。半減期の延長は、より高い血清中力価を結果としてもたらし、これにより、抗体の投与頻度を低減し、かつ／または投与される抗体の濃度を低減する。ヒトＦｃＲｎへのｉｎ  ｖｉｖｏにおける結合、およびヒトＦｃＲｎへの高親和性の結合性ポリペプチドの血清中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現する、トランスジェニックマウスまたはトランスフェクトされたヒト細胞系においてアッセイすることもでき、または変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長動物においてアッセイすることもできる。ＷＯ２０００／４２０７２では、ＦｃＲｎへの結合が改善されたかまたは減少した抗体変異体について記載されている。例えば、また、Shieldsら、J.  Biol.  Chem.、９巻（２号）：６５９１〜６６０４頁（２００１年）も参照されたい。
【０１１１】
他の実施形態では、Ｆｃの変化は、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の増強または低減をもたらしうる。当技術分野で公知の通り、ＣＤＣとは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣとは、分泌されたＩｇが、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃＲに結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原保有標的細胞に特異的に結合し、続いて、細胞毒素により標的細胞の死滅化を可能とする、細胞傷害作用の一形態を指す。本発明の文脈では、ＦｃＲへの結合親和性を「変化させた」抗体変異体であって、親抗体もしくは非修飾抗体と比較して、または天然配列のＦｃＲを含む抗体と比較して、結合性が増強または減少したかのいずれかの抗体変異体が提供される。結合性の低下を提示するこのような変異体は、感知できる結合性をほとんどまたは全く保有し得ず、例えば、当技術分野で周知の技法により決定されるとおり、ＦｃＲへの結合性は、例えば、天然配列と比較して０〜２０％である。他の実施形態では、変異体は、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して、結合性の増強を呈示する。Ｆｃ変異体のこれらの種類は、開示される抗体の有効な抗新生物特性を増強するように使用すると有利でありうることが認識される。さらに他の実施形態では、このような変化は、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位について）、結合特異性の修飾、食作用の増加；および／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体：ＢＣＲ）の下方調節などをもたらす。
【０１１２】
ｄ．グリコシル化の変化
さらに他の実施形態は、１つまたは複数の操作された糖形態、すなわち、グリコシル化パターンの変化またはタンパク質（例えば、Ｆｃドメインにおいて）に共有結合で結合させた炭水化物組成の変化を含むＤＬＬ３部位特異的抗体を含む。例えば、Shields,  R.  L.ら（２００２年）、J.  Biol.  Chem.、２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁を参照されたい。操作された糖形態は、エフェクター機能を増強もしくは低減すること、標的に対するモジュレーターの親和性を増加させること、またはモジュレーターの生成を容易とすることを含むがこれらに限定されない、様々な目的に有用でありうる。エフェクター機能の低減が所望される、ある特定の実施形態では、その分子を、非グリコシル化形態を発現するように操作することができる。１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の消失を結果としてもたらして、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させうる置換が周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および同６，３５０，８６１を参照されたい）。逆に、１つまたは複数のさらなるグリコシル化部位において操作することにより、エフェクター機能の増強または結合性の改善を、Ｆｃ含有分子に付与することもできる。
【０１１３】
他の実施形態は、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体、または二分枝型ＧｌｃＮＡｃ構造を増加させた抗体など、グリコシル化組成を変化させたＦｃ変異体を含む。このようなグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが実証されている。操作された糖形態は、当業者に公知の任意の方法により作製することができ、例えば、操作された発現株または変異体の発現株を使用することにより作製することもでき、１種または複数の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））との共発現により作製することもでき、多様な生物または多様な生物に由来する細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現させることにより作製することもでき、Ｆｃ領域を含む分子を発現させた後で、炭水化物（複数可）を修飾することにより作製することもできる（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２を参照されたい）。
【０１１４】
ｅ．さらなるプロセシング
部位特異的抗体またはコンジュゲートは、生成の間に、または生成後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結などにより差次的に修飾することができる。多数の化学修飾のうちのいずれかを、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下における代謝的合成などを含むがこれらに限定されない公知の技法により実行することができる。
【０１１５】
本発明に包含される多様な翻訳後修飾は、例えば、Ｎ結合型炭水化物鎖またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、化学部分のアミノ酸主鎖への結合、Ｎ結合型炭水化物鎖またはＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、および原核宿主細胞の発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。さらに、モジュレーターはまた、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素による標識、または親和性標識などの検出標識であって、モジュレーターの検出および単離を可能とする検出標識で修飾することもできる。
【０１１６】
６．部位特異的抗体の特徴
部位特異的コンジュゲートがどのようにして得られるにせよ、部位特異的コンジュゲートが上述の形態のうちのいずれを取るにせよ、開示される抗体の多様な実施形態は、ある特定の特徴を呈示しうる。選択された実施形態では、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニー）を、例えば、頑健な増殖、高い抗体産生、および、下記でより詳細に論じられる通り、所望の部位特異的抗体の特徴を含む好適な特性について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。他の場合には、抗体の特徴は、特定の抗原（例えば、特異的ＤＬＬ３アイソフォーム）または標的抗原の免疫反応性断片を動物への接種のために選択することによって、付与され得るかまたは影響され得る。また他の実施形態では、選択された抗体は、上記に記載した通り、親和性または薬物動態など、免疫化学的特徴を増強または洗練するように操作することができる。
【０１１７】
ａ．中和抗体
ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、「中和」抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。すなわち、本発明は、特異的ドメイン、特異的モチーフ、または特異的エピトープに結合し、ＤＬＬ３の生物学的活性を遮断、低減、または阻害することが可能な抗体分子を含みうる。より一般に、「中和抗体」という用語は、標的分子またはリガンドに結合するかまたはこれらと相互作用し、標的分子の、受容体または基質などの結合パートナーへの結合または会合を防止し、これにより、他の方法でその分子の相互作用から生じる生物学的応答を妨げる抗体を指す。
【０１１８】
当技術分野で公知の競合的結合アッセイを使用して、抗体またはその免疫機能的断片もしくは誘導体の結合性および特異性を評価しうることが認識される。本発明に関して述べると、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体活性により、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける競合的結合アッセイにおいて測定される通り、過剰な抗体により、ＤＬＬ３に結合した結合パートナーの量が、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超えて低減される場合、抗体または断片は、ＤＬＬ３の、結合パートナーまたは基質への結合を阻害または低減すると考えられる。例えば、ＤＬＬ３に対する抗体の場合、中和抗体またはアンタゴニストは、Ｎｏｔｃｈ受容体活性を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超えて変化させることが好ましい。この修飾された活性は、当技術分野で認識された技法を使用して直接測定することもでき、変化した活性が下流に及ぼす影響（例えば、腫瘍形成、細胞の生存、またはＮｏｔｃｈ応答性遺伝子の活性化もしくは抑制）により測定することもできることが認識される。ＤＬＬ３活性を中和する抗体の能力は、ＤＬＬ３のＮｏｔｃｈ受容体への結合の阻害により、またはＤＬＬ３により媒介されるＮｏｔｃｈシグナル伝達の抑制を緩和するその能力を評価することにより評価することが好ましい。
【０１１９】
ｂ．内部移行抗体
発現したＤＬＬ３タンパク質の実質的な部分は、腫瘍形成性細胞表面との会合を維持し、これにより、開示される、部位特異的コンジュゲートの局在化および内部移行を可能とするという証拠が存在する。好ましい実施形態では、このようなモジュレーターを、操作された遊離システイン部位（複数可）を介して、１つまたは複数のＰＢＤと会合させるかまたはそれにコンジュゲートさせるが、これらは、内部移行すると、細胞を死滅させる。特に好ましい実施形態では、部位特異的コンジュゲートは、内部移行ＡＤＣを含む。
【０１２０】
本明細書で使用される「内部移行する」モジュレーターとは、関連する抗原または受容体に結合すると、細胞により取り込まれる（任意のペイロードと共に）モジュレーターである。認識される通り、えり抜きの実施形態では、内部移行抗体断片およびその抗体誘導体、ならびに約２のＤＡＲを含む抗体コンジュゲートを含みうる。内部移行は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる場合もある。治療的適用では、内部移行は、それを必要とする被験体において、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じることが好ましい。内部移行される部位特異的抗体コンジュゲートの数は、抗原発現細胞、とりわけ抗原を発現するがん幹細胞を死滅させるのに十分であるかまたは適正でありうる。場合によって、ペイロードまたは部位特異的抗体コンジュゲート全体としての効力に応じて、単一の操作された抗体分子の細胞への取込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある特定のＰＢＤは、抗体にコンジュゲートさせた少数の毒素分子の内部移行が、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である程度に、高度に強力である。抗体が、哺乳動物細胞に結合すると、内部移行するのかどうかは、当技術分野で認識された多様なアッセイであって、下記の実施例で記載されるアッセイを含むアッセイにより決定することができる。抗体が細胞に内部移行するかどうかを検出する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８において記載されている。
【０１２１】
ｃ．枯渇化抗体
他の実施形態では、部位特異的コンジュゲートは、枯渇化抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。「枯渇化」抗体という用語は、好ましくは、細胞表面上または細胞表面近傍において、抗原に結合するかまたはこれと会合し、細胞の死滅または消失を誘導するか、促進するか、または引き起こす（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞傷害剤の導入によって）抗体を指す。好ましい実施形態では、選択された枯渇化抗体を、ＰＢＤと会合させるかまたはこれにコンジュゲートさせる。
【０１２２】
枯渇化抗体は、定義された細胞集団内のＤＬＬ３発現細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を除去するか、失わせるか、消失させるか、または死滅させうることが好ましい。一部の実施形態では、細胞集団は、富化された、区分された（sectioned）、精製された、または単離された腫瘍永続細胞を含みうる。他の実施形態では、細胞集団は、がん幹細胞を含む、全腫瘍試料を含む場合もあり、不均一な腫瘍抽出物を含む場合もある。当業者は、本明細書の教示に従い、標準的な生化学的技法を使用して、腫瘍形成性細胞または腫瘍永続細胞の枯渇をモニタリングおよび定量しうることを認識する。
【０１２３】
ｄ．ビニングおよびエピトープマッピング
開示される抗ＤＬＬ３部位特異的抗体コンジュゲートは、選択された標的またはその断片により提示される、個別のエピトープまたは免疫原性決定基と会合するかまたはこれに結合することがさらに認識される。ある特定の実施形態では、エピトープまたは免疫原性決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など、化学的に活性の表面基（grouping）を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴、および／または特異的な電荷特徴を有しうる。したがって、本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体への特異的結合、または他の形での分子との相互作用が可能な任意のタンパク質決定基を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合するかまたは反応する）という。好ましい実施形態では、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が、１０−６Ｍ未満であるかもしくはこれと等しいか、または１０−７Ｍ未満であるかもしくはこれと等しい場合に、より好ましくは、平衡解離定数が、１０−８Ｍ未満であるかもしくはこれと等しく、なおより好ましくは、該解離定数が、１０−９Ｍ未満であるかもしくはこれと等しい場合に、抗原に特異的に結合するという。
【０１２４】
より直接的に、「エピトープ」という用語は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体モジュレーターにより認識され、これが特異的に結合することが可能な標的抗原の部分を指す。抗原が、ＤＬＬ３などのポリペプチドである場合、エピトープは一般に、連続アミノ酸およびタンパク質が三次元に折り畳まれて近接した非連続アミノ酸（「コンフォメーションエピトープ」）の両方から形成されうる。このようなコンフォメーションエピトープでは、相互作用点は、線状としては互いから隔てられたタンパク質上のアミノ酸残基にわたり生じる。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（場合によって、「線状」エピトープまたは「連続」エピトープと称する）は、タンパク質が変性しても保持されることが典型的であるのに対し、三次元に折り畳まれて形成されるエピトープは、タンパク質が変性すると失われることが典型的である。いずれにせよ、抗体エピトープは、固有の空間的コンフォメーションにおいて、少なくとも３つ、より通例では、少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を含むことが典型的である。
【０１２５】
これに関して、ある特定の実施形態では、エピトープは、ＤＬＬ３タンパク質の１つまたは複数の領域、ドメイン、またはモチーフ（例えば、アイソフォーム１のアミノ酸１〜６１８）と関連するか、またはこれらの中に存在し得ることが認識される。本明細書でより詳細に論じられる通り、ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、一連の、一般に認識されたドメインであって、６つのＥＧＦ様ドメインおよびＤＳＬドメインを含むドメインを含む。本開示の目的では、「ドメイン」という用語は、その一般に受け入れられた意味に従い使用され、タンパク質内の、同定可能または定義可能である、保存的な構造実体であって、特色のある二次構造内容を呈示する構造実体を指すと考えられる。多くの場合、共通の機能を有する相同的ドメインは通例、配列類似性を示し、多数の異なるタンパク質内で見出される（例えば、ＥＧＦ様ドメインは、少なくとも４７１種の異なるタンパク質内で見出されることが報告されている）。同様に、当技術分野で認識されている「モチーフ」という用語は、その一般的な意味に従い使用され、一般に、短く保存的なタンパク質の領域であって、典型的に、１０〜２０の連続アミノ酸残基である領域を指すものとする。本明細書を通して論じられる通り、選択された実施形態は、ＤＬＬ３の特異的領域内、特異的ドメイン内、または特異的モチーフ内のエピトープと会合するかまたはこれに結合する部位特異的抗体を含む。
【０１２６】
ＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０においてより詳細に論じられている通り、例示的な部位特異的抗体コンジュゲートが結合する、ヒトＤＬＬ３の特に好ましいエピトープを、すぐ下の表３に示す。
【表３】
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【０１２７】
いずれにせよ、抗原上の所望されるエピトープを決定したら、例えば、本発明で記載される技法を使用して、エピトープを含むペプチドで免疫することにより、そのエピトープに対する抗体を作製することが可能である。代替的に、発見プロセスの間、抗体を作製および特徴づけすることにより、特異的ドメイン内または特異的モチーフ内に配置された所望のエピトープについての情報を解明することもできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する抗体、すなわち、抗原への結合について競合する抗体を見出す競合研究を実施することである。それらの交差競合に基づき、抗体をビニングするためのハイスループットプロセスについては、ＷＯ０３／４８７３１において記載されている。当技術分野では、他のビニング法またはドメインレベルの方法またはエピトープマッピング法であって、酵母上での抗体の競合または抗原断片の発現を含む方法が周知である。
【０１２８】
本明細書で用いられる、「ビニング」という用語は、それらの抗原結合の特徴および競合に基づき、抗体を群分けまたは分類するのに使用される方法を指す。ビニング法は、本発明のモジュレーターを定義および類別するのに有用であるが、ビンは、エピトープと常に直接相関するわけではなく、エピトープ結合についてのこのような初期決定は、本明細書で記載される、当技術分野で認識された他の方法により、さらに精緻化および確認することができる。しかし、本明細書で論じられる通り、抗体モジュレーターの、個々のビンへの経験的な割当てにより、開示されるモジュレーターの治療的な潜在的可能性を示しうる情報がもたらされる。
【０１２９】
より具体的に述べると、当技術分野で公知であり、本明細書の実施例で示される方法を使用することにより、選択された基準抗体（またはその断片）が、第２の被験抗体（すなわち、同じビン内にある）が結合するのと同じエピトープに結合するか、またはこれとの結合について第２の被験抗体と交差競合するのかどうかを決定することができる。一実施形態では、基準抗体モジュレーターは、ＤＬＬ３抗原と、飽和条件下で会合し、次いで、ＤＬＬ３に結合する第２の抗体モジュレーターまたは被験抗体モジュレーターの能力を、標準的な免疫化学技法を使用して決定する。被験抗体が、ＤＬＬ３に、基準抗ＤＬＬ３抗体と同時に、実質的に結合することが可能であれば、第２の抗体または被験抗体は、一次抗体または基準抗体とは異なるエピトープに結合する。しかし、被験抗体が、ＤＬＬ３に、同時に、実質的に結合することが可能でないなら、被験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、または一次抗体が結合するエピトープと近接する（少なくとも立体的に）エピトープに結合する。すなわち、被験抗体は、抗原結合について競合し、基準抗体と同じビン内にある。
【０１３０】
開示される抗体の文脈で使用される場合の「競合する」または「競合抗体」という用語は、抗体間の競合であって、被験下にある被験抗体または免疫学的機能的断片が、共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を防止または阻害するアッセイにより決定される競合を意味する。このようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原（例えば、ＤＬＬ３またはそのドメインもしくは断片）またはこれらのいずれかを保有する細胞、標識されていない被験免疫グロブリンおよび標識された基準免疫グロブリンの使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下において、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常は、被験免疫グロブリンを過剰に存在させ、かつ／または最初に結合することを可能にする。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合するエピトープに対して、立体障害が生じるのに十分な程度に近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。本明細書の実施例では、競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細が提示される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、基準抗体の共通抗原への特異的結合は、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害される。場合によって、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはこれを超えて阻害される。
【０１３１】
逆に、基準抗体を結合させる場合、基準抗体は、続いて添加される被験抗体（すなわち、ＤＬＬ３モジュレーター）の結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害することが好ましい。場合によって、被験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはこれを超えて阻害される。
【０１３２】
本発明に関して述べると、かつ、抗ＤＬＬ３抗体のビンに関して本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０で示される通り、ＤＬＬ３の細胞外ドメインは、競合的結合により、本明細書で「ビンＡ」〜「ビンＩ」と称する、少なくとも９つのビンを定義することが決定されている（表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法（bio-layer  interferometry）を介して）。モジュレータービニング技法によりもたらされる解像度を踏まえると、これらの９つのビンは、ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域内に存在するビンの大半を含むと考えられる。
【０１３３】
これに関して、かつ当技術分野で公知の通り、所望のビニングデータまたは競合結合データは、直接的または間接的な固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接的または間接的な固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システム（すなわち、表面プラズモン共鳴：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（すなわち、バイオレイヤー干渉法：ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）、またはフローサイトメトリー法を使用して得ることができる。本明細書で使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの特異的相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。「バイオレイヤー干渉法」という用語は、２つの表面：バイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層、および内部基準層から反射された白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技法を指す。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化により、リアルタイムで測定されうる、干渉パターンのシフトが引き起こされる。特に好ましい実施形態では、解析（表面プラズモン共鳴であれ、バイオレイヤー干渉法であれ、フローサイトメトリーであれ）は、当技術分野で公知の、Ｂｉａｃｏｒｅ測定器またはＦｏｒｔｅＢｉｏ測定器またはフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ）を使用して実施する。
【０１３４】
開示されるＤＬＬ３抗体モジュレーターが会合または結合するエピトープをさらに特徴付けるために、Cochranら（参照により本明細書に組み込まれる、J  Immunol  Methods.、２８７巻（１〜２号）：１４７〜１５８頁（２００４年））により記載されているプロトコールの変法を使用して、ドメインレベルのエピトープマッピングを実施することができる。略述すると、特異的アミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個々のドメインを、酵母の表面上で発現させ、各ＤＬＬ３抗体による結合を、フローサイトメトリーにより決定した。
【０１３５】
他の適合性のエピトープマッピング技法は、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Reineke（２００４年）Methods  Mol  Biol  ２４８巻：４４３〜６３頁）（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）、またはペプチド切断解析を含む。加えて、エピトープの切出し、エピトープの抽出、および抗原の化学修飾などの方法（Tomer（２０００年）Protein  Science  ９巻：４８７〜４９６頁）（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）も用いることができる。他の実施形態では、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Antigen  Structure-based  Antibody  Profiling）（ＡＳＡＰ）としてもまた公知の、修飾支援プロファイリング（Modification-Assisted  Profiling）（ＭＡＰ）により、各抗体の、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する結合プロファイルの類似性に従い、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を類別する方法（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）がもたらされる。各類型は、別の類型により表されるエピトープと明確に異なるか、または部分的に重複する、固有のエピトープを反映しうる。この技術は、特徴づけにより、遺伝子的に識別可能な抗体に焦点を当てうるように、遺伝子的に同一な抗体の迅速なフィルタリングを可能とする。ＭＡＰを使用して、本発明のｈＤＬＬ３抗体モジュレーターを、異なるエピトープに結合する抗体の群へと分取しうることが認識される。
【０１３６】
固定化された抗原の構造を変化させるのに有用な作用物質（agent）は、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼであるＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼであるＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）などの酵素を含む。固定化された抗原の構造を変化させるのに有用な作用物質はまた、化学薬品、たとえば、スクシンイミジルエステルおよびそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジンおよびカルボヒドラジン、遊離アミノ酸などでもありうる。
【０１３７】
抗原タンパク質は、バイオセンサーチップ表面上またはポリスチレンビーズ上に固定化することができる。後者は、例えば、マルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）などのアッセイで処理することができる。最大１００種類の異なるビーズによるマルチプレックス解析を扱うＬＵＭＩＮＥＸの能力のために、ＬＵＭＩＮＥＸは、多様な修飾を伴う、ほとんど無制限の抗原表面を提示する結果として、抗体エピトーププロファイリングにおける、バイオセンサーアッセイを凌駕する解像度の改善をもたらす。
【０１３８】
ｅ．結合親和性
エピトープ特異性のほか、開示される部位特異的抗体は、例えば、結合親和性などの物理的特徴を使用しても特徴づけることができる。これに関して、本発明は、１つまたは複数のＤＬＬ３アイソフォーム、または、パン抗体の場合は、ＤＬＬファミリーの１つを超えるメンバーに対して高結合親和性を有する抗体の使用もさらに包含する。本明細書で使用される、ＩｇＧ抗体についての「高親和性」という用語は、標的抗原に対するＫＤが、１０−８Ｍまたはこれ未満、より好ましくは、１０−９Ｍまたはこれ未満であり、なおより好ましくは、１０−１０Ｍまたはこれ未満である抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての「高親和性」結合とは、ＫＤが、１０−７Ｍまたはこれ未満、より好ましくは、１０−８Ｍまたはこれ未満、なおより好ましくは、１０−９Ｍまたはこれ未満である抗体を指す。
【０１３９】
本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。本発明の抗体は、その解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、≦１０−７Ｍである場合に、その標的抗原に免疫特異的に結合するといわれる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合に、非常に高親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のＫＤは、≦１０−９Ｍであり、オフ速度は、約１×１０−４／秒である。本発明の一実施形態では、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態では、抗体は、ＤＬＬ３に、約１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍの間のＫＤで結合し、さらに別の実施形態では、≦２×１０−１０ＭのＫＤで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、解離定数またはＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、または５×１０−１５Ｍ未満である抗体を含む。
【０１４０】
具体的な実施形態では、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（ＤＬＬ３（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）は、少なくとも１０５Ｍ−１秒−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１秒−１、少なくとも１０６Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１秒−１、少なくとも１０７Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１秒−１、または少なくとも１０８Ｍ−１秒−１である。
【０１４１】
別の実施形態では、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（ＤＬＬ３（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）は、１０−１秒−１未満、５×１０−１秒−１未満、１０−２秒−１未満、５×１０−２秒−１未満、１０−３秒−１未満、５×１０−３秒−１未満、１０−４秒−１未満、５×１０−４秒−１未満、１０−５秒−１未満、５×１０−５秒−１未満、１０−６秒−１未満、５×１０−６秒−１未満、１０−７秒−１未満、５×１０−７秒−１未満、１０−８秒−１未満、５×１０−８秒−１未満、１０−９秒−１未満、５×１０−９秒−１未満、または１０−１０秒−１未満である。
【０１４２】
本発明の他の選択された実施形態では、抗ＤＬＬ３抗体の親和性定数またはＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×１０１５Ｍ−１である。
【０１４３】
上述のモジュレーター特徴のほか、本発明の抗体は、例えば、熱安定性（すなわち、融解温度；Ｔｍ）および等電点を含む、さらなる物理的特徴を使用して、さらに特徴づけることもできる（例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Bjellqvistら、１９９３年、Electrophoresis、１４巻：１０２３頁；Vermeerら、２０００年、Biophys.  J.、７８巻：３９４〜４０４頁；Vermeerら、２０００年、Biophys.  J.、７９巻：２１５０〜２１５４頁を参照されたい）。
【０１４４】
ＩＶ．部位特異的抗体薬物コンジュゲート
本発明の部位特異的抗ＤＬＬ３コンジュゲートは、不対合システインを介して、１つまたは複数のＰＢＤ薬物ペイロード（複数可）に共有結合的に連結された（好ましくは、リンカー部分により）部位特異的抗ＤＬＬ３抗体を含むことが認識される。本明細書で論じられる通り、本発明の部位特異的抗ＤＬＬ３コンジュゲートを使用して、細胞傷害性ＰＢＤを、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞）に施すことができる。これは、結合させた薬物ペイロードを比較的無反応性で非毒性の状態で標的部位に向けてから薬物ペイロードを放出し活性化させる、開示される部位特異的ＡＤＣにより有利に達成される。本明細書で論じられる通り、毒性ペイロードのこの標的化された放出は、大部分、１つまたは複数の遊離システインを介する、ペイロードの安定的な部位特異的コンジュゲーション、および毒性の種の過剰コンジュゲートを最小化するＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物により達成される。腫瘍部位に送達されると、ＰＢＤペイロードを大部分放出するように設計された薬物リンカーによりカップリングされているので、本発明のコンジュゲートは、所望されない非特異的毒性を実質的に低減できる。これは、比較的高レベルの活性ＰＢＤによる細胞毒素を、腫瘍部位に施しながら、標的化されていない細胞および組織の曝露は最小化し、これにより、従来の薬物コンジュゲートと比較した場合、治療指数の増強をもたらすので有利である。
【０１４５】
より具体的に述べると、本明細書の教示に従い、本発明の開示される部位特異的抗体を、作製しおよび／または作り、選択したら、下記で記載される、１つまたは複数のＰＢＤと連結するか、これらに融合させるか、コンジュゲートさせるか、またはこれらと他の形で会合させることができる。本明細書で使用される「コンジュゲート」または「部位特異的コンジュゲート」または「抗体コンジュゲート」という用語は、広義で使用され、会合法に関わらず、不対合システインを介して、開示される部位特異的抗体と会合させた任意のＰＢＤを意味すると考えられる。さらに、上記で示した通り、選択されたコンジュゲートは、操作された抗体と会合させるか、またはこれに連結することができ、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法、および遊離システインの数に少なくとも部分的に応じて、多様な化学量論的モル比を呈示する。
【０１４６】
これに関して、文脈によりそうでないことが記されない限りにおいて、本発明の部位特異的抗ＤＬＬ３コンジュゲートは、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
または薬学的に許容されるその塩［式中、
ａ）Ａｂは、１つまたは複数の不対合システインを含むＤＬＬ３抗体を含み；
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み；
ｃ）Ｄは、ＰＢＤを含み；
ｄ）ｎは、約１〜約８の整数である］
で表しうることが認識される。
【０１４７】
当業者は、上述の式に従う部位特異的コンジュゲートを、いくつかの異なるリンカーおよびＰＢＤを使用して作ることができ、製作またはコンジュゲーション方法論は、成分の選択に応じて変化することを認識する。そのため、部位特異的抗体の反応性システイン（複数可）上のチオールと反応する、任意のＰＢＤまたはＰＢＤ−リンカー化合物は、本明細書の教示に適合性である。同様に、選択されたＰＢＤの、ＤＬＬ３抗体への部位特異的コンジュゲーションを可能とする、任意の反応条件も、本発明の範囲内にある。上記にも拘らず、本発明の特に好ましい実施形態は、本明細書で記載され、下記の実施例で示される、穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用する、ＰＢＤまたはＰＢＤ−リンカーの選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーションおよび夾雑物が少なく、相応に、毒性が低い、より均質な調製物をもたらす傾向がある。
【０１４８】
上式に従う、特に好ましい部位特異的ＡＤＣは、以下：
【化１】
2016531914.tif 000006
【化２】
2016531914.tif 000007
【化３】
2016531914.tif 000008
［式中、Ａｂは、１つまたは複数の遊離システインを含むＤＬＬ３抗体を含み、ｎは、１〜２０の間の整数である］
を含む。
【０１４９】
本明細書で使用される「部位特異的コンジュゲート」または「抗体コンジュゲート」または「ＤＬＬ３コンジュゲート」または「部位特異的ＡＤＣ」という用語は、文脈によりそうでないことが記されない限りにおいて、互換的に使用することができ、ＡＤＣ１、ＡＤＣ２、ＡＤＣ３、ＡＤＣ４、またはＡＤＣ５のうちのいずれかを含むと考えることができる。当技術分野で認識されている技法と共に、本明細書で開示される新規の反応条件を使用して、選択された部位特異的抗体と、ＰＢＤ−リンカーとをコンジュゲートさせて、所望の部位特異的ＡＤＣをもたらしうることが認識される。これに関して、好ましい選択的還元技法を、下記の実施例６〜８に示す。さらに、本明細書で示される選択的還元技法を、特定の部位特異的抗体構築物と組み合わせて使用することにより、高度に均質なＡＤＣ調製物であって、厳格に規定された化学量論比のＤＡＲ値およびペイロードのポジショニングを、比較的低度の非特異的コンジュゲーションと共に呈示するＡＤＣ調製物をもたらすことができる。
【０１５０】
１．ピロロベンゾジアゼピン
本明細書を通して示される通り、本発明の実施形態は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を細胞傷害剤として含む部位特異的コンジュゲート抗ＤＬＬ３抗体を対象とする。ＰＢＤとは、ＤＮＡの副溝に共有結合し、核酸の合成を阻害することにより、抗腫瘍活性を発揮するアルキル化剤であることが認識される。これに関して、ＰＢＤは、最小限の骨髄抑制を呈示しながら、強力な抗腫瘍特性を有することが示されている。本発明に適合性のＰＢＤは、複数の種類のリンカー（例えば、遊離スルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）のうちのいずれか１つを使用して、ＤＬＬ３モジュレーターに連結することができ、ある特定の実施形態では、二量体の形態（すなわち、ＰＢＤ二量体）である。ＰＢＤの一般的構造は、
【化４】
2016531914.tif 000009
である。
【０１５１】
ＰＢＤは、それらの芳香族Ａ環およびピロロＣ環のいずれにおいても、置換基の数、種類、および位置が異なり、Ｃ環の飽和度においても異なる。Ｂ環には、ＤＮＡをアルキル化することに関与する求電子性中心である、Ｎ１０〜Ｃ１１位において、イミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））、またはカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。公知の天然生成物の全ては、キラルのＣ１１ａ位において、（Ｓ）−配置を有し、ＰＢＤに、Ｃ環からＡ環に向かって観察すると右撚りを与える。これにより、ＰＢＤには、Ｂ形式ＤＮＡの副溝との等螺旋性（isohelicity）に適する三次元形状が生じ、結合部位におけるぴったりとした適合がもたらされる（Kohn、Antibiotics  III中、Springer-Verlag、New  York、３〜１１頁（１９７５年）；HurleyおよびNeedham-VanDevanter、Acc.  Chem.  Res.、１９巻、２３０〜２３７頁（１９８６年））。副溝内に付加物を形成するＰＢＤの能力は、それらがＤＮＡのプロセシングに干渉することを可能とし、これにより、それらの細胞傷害剤としての使用を可能とする。上記で言及した通り、それらの効力を増加させるために、ＰＢＤは、本明細書で記載される部位特異的抗ＤＬＬ３抗体にコンジュゲートさせうる、二量体形態で使用されることが多い。開示される部位特異的抗体にコンジュゲートさせうる、適合性のＰＢＤ（および任意選択のリンカー）については、例えば、開示されるＰＢＤに関して、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１号、同７，０４９，３１１号、同７，１８９，７１０号、同７，４２９，６５８号、同７，４０７，９５１号、同７，７４１，３１９号、同７，５５７，０９９号、同８，０３４，８０８号、同８，１６３，７３６号、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７号、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ２０１１／１３０６１３号、同第ＷＯ２０１１／１２８６５０号、同第ＷＯ２０１１／１３０６１６号、および同第ＷＯ２０１４／０５７０７４号において記載されている。
【０１５２】
特に好ましい実施形態では、開示されるモジュレーターにコンジュゲートさせうる、適合性のＰＢＤについては、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７号において記載されている。本開示では、ＰＢＤ二量体、すなわち、２つのＰＢＤ部分を含むＰＢＤ二量体が好ましい場合がある。したがって、本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＡＢ）または（ＡＣ）：
【化５】
2016531914.tif 000010
［式中、
点線は、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間の、任意選択の二重結合の存在を示し；
Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、およびＣＯＲから選択され、任意選択で、ハロまたはジハロからさらに選択され、ここで、ＲＤは独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから選択され；
Ｒ６およびＲ９は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、およびハロから選択され；
Ｒ７は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、およびハロから選択され；
Ｒ１０は、上記に記載した通り、モジュレーターまたはその断片もしくは誘導体に接続させたリンカーであり；
Ｑは独立して、Ｏ、Ｓ、およびＮＨから選択され；
Ｒ１１は、ＨまたはＲであるか、またはＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍ［式中、Ｍは、金属カチオンである］であり；
ＲおよびＲ’は、各々独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基、およびＣ５〜２０アリール基から選択され、任意選択で、基ＮＲＲ’  との関連で、ＲおよびＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意選択で置換された、４員、５員、６員、または７員の複素環式環を形成し、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”、およびＲ１１”は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ、およびＲ１１に従い定義される通りであり、ＲＣは、キャッピング基である］
を有するコンジュゲートである。
【０１５３】
二重結合
一実施形態では、Ｃ１とＣ２との間およびＣ２とＣ３との間に、二重結合が存在しない。
【０１５４】
一実施形態では、点線は、下記：
【化６】
2016531914.tif 000011
で示す通り、Ｃ２とＣ３との間の、任意選択の二重結合の存在を示す。
【０１５５】
一実施形態では、Ｒ２が、Ｃ５〜２０アリール、またはＣ１〜１２アルキルである場合、二重結合は、Ｃ２とＣ３との間に存在する。
【０１５６】
一実施形態では、点線は、下記：
【化７】
2016531914.tif 000012
で示す通り、Ｃ１とＣ２との間の、任意選択の二重結合の存在を示す。
【０１５７】
一実施形態では、Ｒ２が、Ｃ５〜２０アリール、またはＣ１〜１２アルキルである場合、二重結合は、Ｃ１とＣ２との間に存在する。
【０１５８】
Ｒ２
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、およびＣＯＲから選択され、任意選択で、ハロまたはジハロからさらに選択される。
【０１５９】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、およびＣＯＲから選択される。
【０１６０】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ、および＝Ｃ（ＲＤ）２から選択される。
【０１６１】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈである。
【０１６２】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝Ｏである。
【０１６３】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝ＣＨ２である。
【０１６４】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝ＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内で、基＝ＣＨ−ＲＤは、下記：
【化８】
2016531914.tif 000013
に示されるいずれかの立体配置を有しうる。
【０１６５】
一実施形態では、立体配置は、立体配置（Ｉ）である。
【０１６６】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０１６７】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝ＣＦ２である。
【０１６８】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｒである。
【０１６９】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜２０アリールである。
【０１７０】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキルである。
【０１７１】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜２０アリールである。
【０１７２】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜７アリールである。
【０１７３】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ８〜１０アリールである。
【０１７４】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、フェニルである。
【０１７５】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、ナフチルである。
【０１７６】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、ピリジルである。
【０１７７】
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、キノリニルまたはイソキノリニルである。
【０１７８】
一実施形態では、Ｒ２は、１つ〜３つの置換基を保有するが、１つおよび２つの置換基がより好ましく、単一の置換基が最も好ましい。置換基は、任意の位置でありうる。
【０１７９】
Ｒ２が、Ｃ５〜７アリール基である場合、単一の置換基は、化合物の残りの部分への結合に隣接しない環原子であることが好ましく、すなわち、それは、化合物の残りの部分への結合に対して、βまたはγであることが好ましい。したがって、Ｃ５〜７アリール基が、フェニルである場合、置換基は、メタ位またはパラ位にあることが好ましく、パラ位にあることがより好ましい。
【０１８０】
一実施形態では、Ｒ２は、
【化９】
2016531914.tif 000014
［式中、アステリスクは、結合点を示す］
から選択される。
【０１８１】
Ｒ２が、Ｃ８〜１０アリール基、例えば、キノリニルまたはイソキノリニルである場合、それは、キノリン環またはイソキノリン環の任意の位置において、任意の数の置換基を保有しうる。一部の実施形態では、Ｒ２は、１つ、２つ、または３つの置換基を保有し、これらの置換基は、近位環上および遠位環上のいずれかの場合もあり、これらの両方の場合もある（１つを超える置換基の場合）。
【０１８２】
一実施形態では、Ｒ２が、任意選択で置換される場合、置換基は、下記の置換基節で与えられる置換基から選択される。
【０１８３】
Ｒが、任意選択で置換される場合、置換基は、
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ、およびチオエーテル
から選択されることが好ましい。
【０１８４】
一実施形態では、ＲまたはＲ２が、任意選択で置換される場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０１８５】
Ｒ２が、Ｃ１〜１２アルキルである場合、任意選択の置換基は加えて、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基およびＣ５〜２０アリール基も含みうる。
【０１８６】
Ｒ２が、Ｃ３〜２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基は加えて、Ｃ１〜１２アルキル基およびＣ５〜２０アリール基も含みうる。
【０１８７】
Ｒ２が、Ｃ５〜２０アリール基である場合、任意選択の置換基は加えて、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基およびＣ１〜１２アルキル基も含みうる。
【０１８８】
「アルキル」という用語は、サブクラスであるアルケニルおよびアルキニルならびにシクロアルキルを包含することが理解される。したがって、Ｒ２が、任意選択で置換されたＣ１〜１２アルキルである場合、アルキル基は、任意選択で、コンジュゲート系の一部を形成しうる、１つまたは複数の炭素間二重結合または炭素間三重結合を含有することが理解される。一実施形態では、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素間二重結合または炭素間三重結合を含有し、この結合を、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートさせる。一実施形態では、Ｃ１〜１２アルキル基は、飽和Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、Ｃ２〜１２アルキニル、およびＣ３〜１２シクロアルキルから選択される基である。
【０１８９】
Ｒ２上の置換基が、ハロである場合、それは、好ましくは、ＦまたはＣｌであり、より好ましくは、Ｃｌである。
【０１９０】
Ｒ２上の置換基が、エーテルである場合、それは、一部の実施形態では、アルコキシ基、例えば、Ｃ１〜７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）の場合もあり、一部の実施形態では、Ｃ５〜７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）の場合もある。
【０１９１】
Ｒ２上の置換基が、Ｃ１〜７アルキルである場合、それは、好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）でありうる。
【０１９２】
Ｒ２上の置換基が、Ｃ３〜７ヘテロシクリルである場合、それは、一部の実施形態では、Ｃ６窒素を含有するヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルでありうる。これらの基は、窒素原子を介して、ＰＢＤ部分の残りの部分に結合させることができる。これらの基は、例えば、Ｃ１〜４アルキル基により、さらに置換することができる。
【０１９３】
Ｒ２上の置換基が、ビス−オキシ−Ｃ１〜３アルキレンである場合、これは、ビス−オキシ−メチレンまたはビス−オキシ−エチレンであることが好ましい。
【０１９４】
Ｒ２の特に好ましい置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノ、およびメチル−チエニルを含む。
【０１９５】
特に好ましい置換Ｒ２基は、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシフェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル、およびキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル、およびイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル、およびナフチルを含むがこれらに限定されない。
【０１９６】
一実施形態では、Ｒ２は、ハロまたはジハロである。一実施形態では、Ｒ２は、−Ｆまたは−Ｆ２であり、これらの置換基を、下記に、それぞれ、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
【化１０】
2016531914.tif 000015
として例示する。
【０１９７】
ＲＤ
一実施形態では、ＲＤは独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから選択される。
【０１９８】
一実施形態では、ＲＤは独立して、Ｒである。
【０１９９】
一実施形態では、ＲＤは独立して、ハロである。
【０２００】
Ｒ６
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−、およびハロから選択される。
【０２０１】
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、およびハロから選択される。
【０２０２】
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈおよびハロから選択される。
【０２０３】
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈである。
【０２０４】
一実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−［式中、ｐは、１または２である］を形成する。
【０２０５】
Ｒ７
Ｒ７は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、およびハロから選択される。
【０２０６】
一実施形態では、Ｒ７は独立して、ＯＲである。
【０２０７】
一実施形態では、Ｒ７は独立して、ＯＲ７Ａ［式中、Ｒ７Ａは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜６アルキルである］である。
【０２０８】
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、任意選択で置換された、飽和Ｃ１〜６アルキルである。
【０２０９】
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、任意選択で置換された、Ｃ２〜４アルケニルである。
【０２１０】
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、Ｍｅである。
【０２１１】
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、ＣＨ２Ｐｈである。
【０２１２】
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、アリルである。
【０２１３】
一実施形態では、化合物は、二量体［ここで、各単量体のＲ７基は、一緒になって、単量体を連結する、式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成する］である。
【０２１４】
Ｒ８
一実施形態では、化合物は、二量体［ここで、各単量体のＲ８基は、一緒になって、単量体を連結する、式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成する］である。
【０２１５】
一実施形態では、Ｒ８は独立して、ＯＲ８Ａ［式中、Ｒ８Ａは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜４アルキルである］である。
【０２１６】
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、任意選択で置換された、飽和Ｃ１〜６アルキルまたは任意選択で置換された、Ｃ２〜４アルケニルである。
【０２１７】
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、Ｍｅである。
【０２１８】
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、ＣＨ２Ｐｈである。
【０２１９】
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、アリルである。
【０２２０】
一実施形態では、Ｒ８およびＲ７は、一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−［式中、ｐは、１または２である］を形成する。
【０２２１】
一実施形態では、Ｒ８およびＲ９は、一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−［式中、ｐは、１または２である］を形成する。
【０２２２】
Ｒ９
一実施形態では、Ｒ９は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−、およびハロから選択される。
【０２２３】
一実施形態では、Ｒ９は独立して、Ｈである。
【０２２４】
一実施形態では、Ｒ９は独立して、ＲまたはＯＲである。
【０２２５】
ＲおよびＲ’
一実施形態では、Ｒは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基、およびＣ５〜２０アリール基から選択される。これらの基の各々は、下記の置換基節で定義される。
【０２２６】
一実施形態では、Ｒは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキルである。
【０２２７】
一実施形態では、Ｒは独立して、任意選択で置換された、Ｃ３〜２０ヘテロシクリルである。
【０２２８】
一実施形態では、Ｒは独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜２０アリールである。
【０２２９】
一実施形態では、Ｒは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキルである。
【０２３０】
上記では、Ｒ２との関連で、好ましいアルキル基およびアリール基、ならびに任意選択の置換基の識別および数に関する多様な実施形態について記載した。Ｒ２について示された優先事項（preference）は、Ｒにも適用されるので、適切な場合、他の全てのＲ基［ここで、例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９は、Ｒである］にも適用可能である。
【０２３１】
Ｒについての優先事項はまた、Ｒ’にも適用される。
【０２３２】
本発明の一部の実施形態では、置換基−ＮＲＲ’を有する化合物が提供される。一実施形態では、ＲおよびＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意選択で置換された、４員、５員、６員、または７員の複素環式環を形成する。環は、さらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳを含有しうる。
【０２３３】
一実施形態では、複素環式環は、それ自体、Ｒ基で置換されている。さらなるヘテロ原子Ｎが存在する場合には、置換基は、ヘテロ原子Ｎ上に存在しうる。
【０２３４】
Ｒ”
Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であって、ここで、その鎖を、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、および／または芳香族環、例えば、環が任意選択で置換されたベンゼンまたはピリジンで中断させうる、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２３５】
一実施形態では、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であって、ここで、その鎖を、１つまたは複数のヘテロ原子、および／または芳香族環、例えば、ベンゼンまたはピリジンで中断させうる、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２３６】
一実施形態では、アルキレン基は、Ｏ、Ｓ、およびＮＭｅから選択される１つまたは複数のヘテロ原子、ならびに／または、環が任意選択で置換された芳香族環で、任意選択で中断される。
【０２３７】
一実施形態では、芳香族環は、Ｃ５〜２０アリーレン基であり、ここで、アリーレンは、２つの水素原子を、芳香族化合物の２つの芳香族環原子から除去することにより得られる二価部分であって、５〜２０個の環原子を有する部分に関する。
【０２３８】
一実施形態では、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であって、ここで、その鎖を、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、および／または芳香族環、例えば、環が任意選択でＮＨ２により置換されたベンゼンまたはピリジンで中断させうる、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２３９】
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２４０】
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基、Ｃ５アルキレン基、Ｃ７アルキレン基、Ｃ９アルキレン基、およびＣ１１アルキレン基から選択される。
【０２４１】
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基、Ｃ５アルキレン基、およびＣ７アルキレン基から選択される。
【０２４２】
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基およびＣ５アルキレン基から選択される。
【０２４３】
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基である。
【０２４４】
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ５アルキレン基である。
【０２４５】
上記で列挙されたアルキレン基は、１つまたは複数のヘテロ原子、および／または芳香族環、例えば、環が任意選択で置換されたベンゼンまたはピリジンで、任意選択で中断させることができる。
【０２４６】
上記で列挙されたアルキレン基は、１つまたは複数のヘテロ原子、および／または芳香族環、例えば、ベンゼンまたはピリジンで、任意選択で中断させることができる。
【０２４７】
上記で列挙されたアルキレン基は、非置換の直鎖状脂肪族アルキレン基でありうる。
【０２４８】
Ｘ
一実施形態では、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｈ）から選択される。
【０２４９】
Ｘは、Ｏであることが好ましい。
【０２５０】
Ｒ１０
下記で記載される適合性のリンカーなど、適合性のリンカーは、ＤＬＬ３部位特異的抗体を、Ｒ１０位（すなわち、Ｎ１０）における共有結合（複数可）により、ＰＢＤ薬物部分に結合させることが好ましい。
【０２５１】
上述のＰＢＤに加えて、いくつかのＰＢＤは、特に、活性であり、本発明と併せて使用しうることが示されている。この目的で、特に好ましい実施形態では、部位特異的コンジュゲート（すなわち、ＡＤＣ１〜５）は、すぐ下で、ＰＢＤ１〜５として示される、ＰＢＤ化合物を含みうる。薬物−リンカー化合物の成分としてのＰＢＤ１〜５の各々の合成については、このような合成に関して、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０において極めて詳細に提示されている。ＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０を検討すれば、本発明の部位特異的ＡＤＣの好ましいペイロードを含む毒性化合物を、本明細書で示される通りに、たやすく作製し、用いることができる。リンカーが切断されると、ＡＤＣ１〜５から放出されるＰＢＤ化合物を、すぐ下：
【化１１】
2016531914.tif 000016
に示す。
【０２５２】
このような化合物の、腫瘍部位（複数可）における送達および放出は、本開示に従い、増殖性障害を処置または管理するのに、臨床的に有効であることが証明され得る。化合物に関して述べると、開示されるＰＢＤの各々は、各Ｃ環内に２つのｓｐ２中心を有し、これにより、ＤＮＡの副溝において、各Ｃ環内にｓｐ２中心を１つだけ有する化合物より強力な結合性を可能としうる（および、これにより、より大きな毒性を可能としうる）ことが認識される。したがって、本明細書で示されるＤＬＬ３  ＡＤＣに使用される場合、開示されるＰＢＤは、増殖性障害の処置のために特に有効であることが証明され得る。
【０２５３】
上記は、本発明に適合性の、例示的なＰＢＤ化合物を提示するものであり、本明細書の教示に従い、部位特異的抗ＤＬＬ３コンジュゲート内に組み込むことに成功しうる他のＰＢＤに関して限定的であることを意味するものでは決してない。むしろ、本明細書で記載され、下記の実施例で示される、部位特異的抗体にコンジュゲートされうる、任意のＰＢＤは、本発明の境界および範囲を明白に伴う、開示されるコンジュゲートに適合性である。
【０２５４】
２．リンカー化合物
ＰＢＤと同様に、多数のリンカー化合物が本発明に適合性であり、本明細書の教示と組み合わせて使用して、開示される抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲートをもたらすことに成功しうる。広義において、リンカーは、遊離システインおよび選択されたＰＢＤ化合物によりもたらされる、反応性チオールと共有結合しさえすればよい。上記で簡略に言及した通り、選択された実施形態では、選択されたリンカーは、二量体ＰＢＤのＮ１０位に共有結合する。しかし、他の実施形態では、適合性のリンカーは、選択されたＰＢＤに、環または環に付加された置換基のうちの１つの任意の接触可能な部位において、共有結合しうる。したがって、操作された抗体の遊離システイン（複数可）と反応し、本発明の比較的安定な部位特異的コンジュゲートをもたらすのに使用しうる、任意のリンカーが、本明細書の教示に適合性である。
【０２５５】
選択的に還元された遊離システインへの効果的な結合に関して述べると、当技術分野で認識されたいくつかの化合物は、チオールの良好な求核性を利用し、これにより、適合性のリンカーの一部としての使用のために利用可能である。遊離システインによるコンジュゲーション反応は、チオール−マレイミド反応、チオール−ハロゲノ（ハロゲン化アシル）反応、チオール−エン反応、チオール−イン反応、チオール−ビニルスルホン反応、チオール−ビスルホン反応、チオール−チオスルホネート反応、チオール−ピリジルジスルフィド反応、およびチオール−パラフルオロ反応を含むがこれらに限定されない。本明細書でさらに論じられ、下記の実施例で示される通り、チオール−マレイミドによるバイオコンジュゲーションは、その急速な反応速度および穏やかなコンジュゲーション条件に起因して、最も広く使用されている手法のうちの１つである。この手法に関する１つの問題は、レトロマイケル反応、およびマレイミド連結されたペイロードの、抗体または他の標的タンパク質からの喪失、または、例えば、ヒト血清アルブミンなど、血漿中の他のタンパク質への移動の可能性である。しかし、実施例１２で具体的に示される通り、選択的還元の使用および本明細書で示される部位特異的抗体を使用して、コンジュゲートを安定化させ、この所望されない移動を低減することができる。チオール−ハロゲン化アシル反応は、レトロマイケル反応を起こす可能性がなく、したがって、より安定なバイオコンジュゲートをもたらす。しかし、チオール−ハロゲン化物反応は一般に、マレイミドベースのコンジュゲーションと比較して反応速度が緩徐であり、したがって、それほど効率的ではない。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、別の普及したバイオコンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの急速な交換を起こす結果として、混合ジスルフィドおよびピリジン−２−チオンの放出をもたらす。混合ジスルフィドは、還元性の細胞環境内で切断され、ペイロードを放出することが可能である。バイオコンジュゲーションにおいてより大きな関心を集めつつある他の手法は、それらの各々が本明細書の教示に適合性であり、本発明の範囲内に明白に含まれる、チオール−ビニルスルホン反応およびチオール−ビスルホン反応である。
【０２５６】
開示されるＡＤＣに組み込まれる、適合性のリンカー化合物に関して述べると、細胞外において安定であり、ＡＤＣ分子の凝集を防止し、ＡＤＣを、水性媒体中で、自由に可溶性でかつ単量体状態に保つことが好ましい。細胞への輸送または送達の前に、抗体−薬物コンジュゲートは、安定であり、無傷のままである、すなわち、抗体は薬物部分へ連結したままであることが好ましい。リンカーは、標的細胞の外部では、安定であるが、細胞の内部では、ある効率的な速度で切断または分解されるように設計されている。したがって、効果的なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し；（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能とし；（ｉｉｉ）安定および無傷のままである、すなわち、コンジュゲートが、その標的化部位に送達または輸送されるまで、切断または分解されず；（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害効果、細胞殺滅効果、または細胞増殖抑制効果を維持する。添付の実施例でより詳細に論じられる通り、ＡＤＣの安定性は、質量分析、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳによる分離／解析技法など、標準的な解析技法により測定することができる。上記で示した通り、抗体と薬物部分との共有結合による結合は、リンカーが２つの反応性官能基、すなわち、反応的な意味における二価性を有することを要する。ＰＢＤおよび部位特異的抗体など、２つまたはこれを超える機能的部分または生物学的活性部分を結合させるのに有用な、二価のリンカー試薬、は公知であり、それらの結果として得られるコンジュゲートをもたらす方法も記載されている。
【０２５７】
本発明に適合性のリンカーは、切断型リンカーおよび非切断型リンカーとして広く分類することができる。酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断型リンカー、およびジスルフィドリンカーを含みうる、切断型リンカーは、標的細胞による内部移行およびエンドソーム−リソソーム経路による切断を利用する。細胞毒素の放出および活性化は、ヒドラゾン連結またはオキシム連結など、酸不安定性の化学的連結の切断を容易とするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依拠する。リソソーム特異的プロテアーゼ切断部位を、リンカー内に操作する場合、細胞毒素は、それらの細胞内標的の近傍に放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞の還元的環境内では選択的に切断されるが、血流中の酸素に富む環境内では切断されないので、細胞傷害性ペイロードを細胞内に放出させる手法をもたらす。対比を目的として述べると、アミド連結されたポリエチレングリコールまたはアルキルスペーサーを含有する、適合性の非切断型リンカーは、標的細胞内の、リソソームによる、抗体−薬物コンジュゲートの分解の間に、毒性ペイロードを遊離させる。いくつかの点で、リンカーの選択は、部位特異的コンジュゲート内で使用される、特定のＰＢＤに依存する。
【０２５８】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム内環境またはエンドソーム内環境またはカベオラ内環境）内に存在する切断作用物質により切断されるリンカーを含む。リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、細胞内ペプチダーゼ酵素または細胞内プロテアーゼ酵素により切断される、ペプチジルリンカーでありうる。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断作用物質は、それらの各々が、ジペプチドの薬物誘導体を加水分解する結果として、標的細胞の内部で活性薬物の放出をもたらすことが公知である、カテプシンＢおよびカテプシンＤならびにプラスミンを含みうる。カテプシンＢは、がん性組織内で高度に発現することが見出されているので、チオール依存性プロテアーゼであるカテプシンＢにより切断される例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例については、例えば、それらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１２／００７８０２８において記載されている。具体的な好ましい実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断されるペプチジルリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５において記載されているペプチジルリンカーなど、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー、またはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。細胞内のタンパク質分解による治療剤の放出を使用する１つの利点は、コンジュゲートさせると、その薬剤は、典型的に弱められ（attenuated）、コンジュゲートの血清中安定性は典型的に高いことである。
【０２５９】
他の実施形態では、切断型リンカーは、ｐＨ感受性である、すなわち、ある特定のｐＨ値において、加水分解に対して感受性である。ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能であることが典型的である。例えば、リソソーム内で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド（cis-aconitic  amide）、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；同５，８２４，８０５；同５，６２２，９２９を参照されたい）。このようなリンカーは、血液中の中性ｐＨ条件下などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの近似的ｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回ると不安定である。
【０２６０】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。当技術分野では、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成されうる、ジスルフィドリンカーを含む、様々なジスルフィドリンカーが公知である。さらに他の具体的実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Johnsonら、１９９５年、Anticancer  Res.、１５巻：１３８７〜９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lauら、１９９５年、Bioorg-Med-Chem.、３巻（１０号）：１２９９〜１３０４頁）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Lauら、１９９５年、Bioorg-Med-Chem.、３巻（１０号）：１３０５〜１２頁）である。
【０２６１】
特に好ましい実施形態（リンカーに関して、本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７において示される）では、適合性のペプチジルリンカーは、
【化１２】
2016531914.tif 000017
［式中、アステリスクは、細胞傷害性ＰＢＤへの結合点を示し、ＣＢＡは、部位特異的抗体であり、Ｌ１は、リンカーであり、Ａは、Ｌ１を部位特異的抗体上の不対合システインに接続させる接続基であり、Ｌ２は、共有結合であるか、または、−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、自壊型リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は、切断型リンカーである］
を含む。
【０２６２】
Ｌ１は、好ましくは、切断型リンカーであり、リンカーを切断に対して活性化させるためのトリガーと称することができる。
【０２６３】
Ｌ１およびＬ２の性質は、存在する場合、広く変化しうる。これらの基は、コンジュゲートを送達する部位における条件により指定されうる、それらの切断特徴に基づいて選択される。酵素の作用により切断されるこれらのリンカーが好ましいが、また、ｐＨの変化（例えば、酸不安定性または塩基不安定性）、温度の変化、または照射による変化（例えば、光不安定性）により切断可能であるリンカーも使用することができる。本発明ではまた、還元条件下または酸化条件下で切断可能であるリンカーも使用することができる。
【０２６４】
Ｌ１は、連続アミノ酸配列を含みうる。アミノ酸配列は、酵素による切断のための標的基質であることが可能であり、これにより、Ｒ１０の、Ｎ１０位からの放出を可能とする。
【０２６５】
一実施形態では、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態では、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
【０２６６】
一実施形態では、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−［式中、−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す］によって表されうる。ジペプチド内のアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せでありうる。リンカーが、カテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシンにより媒介される切断のための作用部位でありうる。
【０２６７】
加えて、カルボキシル側鎖官能基またはアミノ側鎖官能基を有するこれらのアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕおよびＬｙｓでは、ＣＯおよびＮＨは、この側鎖官能基を表しうる。
一実施形態では、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−［式中、Ｃｉｔは、シトルリンである］
から選択される。
【０２６８】
ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−
から選択されることが好ましい。
【０２６９】
最も好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
【０２７０】
一実施形態では、Ｌ２が存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって、自壊型リンカーを形成する。一実施形態では、Ｌ２は、酵素活性のための基質であり、これにより、Ｒ１０の、Ｎ１０位からの放出を可能とする。
【０２７１】
一実施形態では、Ｌ１が、酵素の作用により切断され、Ｌ２が存在する場合、酵素により、Ｌ１とＬ２との間の結合が切断される。
【０２７２】
Ｌ１とＬ２とは、存在する場合、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
から選択される結合により接続することができる。
【０２７３】
Ｌ２に接続するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来する場合もある。
【０２７４】
Ｌ２に接続するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来する場合もある。
【０２７５】
Ｌ２に接続するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来しうる。
【０２７６】
「アミノ酸側鎖」という用語は、（ｉ）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンなど、天然に存在するアミノ酸；（ｉｉ）オルニチンおよびシトルリンなど、希少なアミノ酸；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、天然に存在するアミノ酸の合成類似体および合成誘導体；ならびに（ｉｖ）全ての光学異性体、ジアステレオマー、異性体富化形態、同位体標識形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護形態、およびこれらのラセミ混合物に見出される基を含む。
【０２７７】
一実施形態では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２とは一緒になって、基：
【化１３】
2016531914.tif 000018
［式中、アステリスクは、薬物位置または細胞傷害剤位置への結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは、０〜３である］を形成する。フェニレン環は、任意選択で、本明細書で記載される、１つ、２つ、または３つの置換基により置換される。一実施形態では、フェニレン基は、任意選択で、ハロ、ＮＯ２、ＲまたはＯＲにより置換される。
【０２７８】
一実施形態では、Ｙは、ＮＨである。
【０２７９】
一実施形態では、ｎは、０または１である。好ましくは、ｎは、０である。
【０２８０】
Ｙが、ＮＨであり、ｎが、０である場合、自壊型リンカーを、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称することができる。
【０２８１】
別の特に好ましい実施形態では、リンカーは、自壊型リンカーを含むことが可能であり、ジペプチドは一緒になって、下記：
【化１４】
2016531914.tif 000019
［式中、アステリスクは、選択されたＰＢＤ細胞傷害部分への結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートさせうる、リンカーの残りの部分（例えば、スペーサー−抗体間結合セグメント）への結合点を示す］
に例示される、−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成する。酵素によりジペプチドが切断されると、自壊型リンカーは、遠隔部位が活性化されて、保護された化合物（すなわち、毒性ＰＢＤ）の完全な放出が可能となり、下記：
【化１５】
2016531914.tif 000020
［式中、Ｌ＊は、切断されたばかりのペプチジル単位を含む、リンカーの残りの部分の活性化形態である］
に示される流れに沿って進行する。ＰＢＤ４およびＰＢＤ５の完全な放出により、所望の毒性活性の維持が確保される。
【０２８２】
一実施形態では、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と細胞結合剤とは、直接的に接続される。例えば、Ｌ１が、連続アミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、遊離システインに直接的に接続されうる。
【０２８３】
別の実施形態では、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と細胞結合剤とは、間接的に接続される。
【０２８４】
Ｌ１とＡとは、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
から選択される結合により接続することができる。
【０２８５】
下記でより詳細に論じられ、下記の実施例５〜８で示される通り、本発明の薬物リンカーは、遊離システイン上の反応性チオール求核試薬に連結される。抗体は、ＤＴＴまたはＴＣＥＰなどの還元剤で処理することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とすることができる。
【０２８６】
リンカーは、モジュレーター上の求核官能基との反応のために、求電子官能基を含有することが好ましい。抗体上の求核基は、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合は、糖ヒドロキシル基または糖アミノ基を含むがこれらに限定されない。アミン基、チオール基、およびヒドロキシル基は、求核基であり、リンカー部分上およびリンカー試薬上の求電子基であって、（ｉ）マレイミド基（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステルなどの活性エステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｖ）ハロアセトアミドなどの、アルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物；ならびに（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルを含み、これらのうちの一部が、以下：
【化１６】
2016531914.tif 000021
の通りに例示される求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能である。
【０２８７】
特に好ましい実施形態では、部位特異的抗体と薬物−リンカー部分との接続は、操作されたＤＬＬ３抗体の遊離システインのチオール残基、およびリンカー上に存在する末端マレイミド基を介する。このような実施形態では、細胞結合剤と薬物−リンカーとの接続は、
【化１７】
2016531914.tif 000022
［式中、アステリスクは、薬物−リンカーの残りの部分への結合点を示し、波線は、操作された抗体の残りの部分への結合点を示す］
である。この実施形態では、Ｓ原子は、ＤＬＬ３抗体に由来することが典型的である。
【０２８８】
上記のＡＤＣ４に関して述べると、結合部分は、活性化チオールと反応して、所望の部位特異的コンジュゲートをもたらしうる、末端ヨードアセトアミドを含む。このリンカーに好ましいコンジュゲーション手順は、他の実施形態で見出され、下記の実施例で示される、選択的還元を含むマレイミド結合基に好ましいコンジュゲーション手順と若干異なる。いずれにせよ、当業者であれば、開示される薬物−リンカー化合物の各々を、本開示の観点で適合性の抗ＤＬＬ３部位特異的抗体とたやすくコンジュゲートさせうる。
３．コンジュゲーション
【０２８９】
上記で論じた通り、本発明により提供されるコンジュゲート調製物は、本明細書で示される、操作された遊離システイン部位（複数可）および／または新規のコンジュゲーション手順の提供に少なくとも部分的に起因して、安定性の増強および実質的な均一性を呈示する。コンジュゲーション部位をもたらすのに、抗体の鎖内または鎖間のジスルフィド結合の各々を完全還元または部分還元する、従来のコンジュゲーション方法論と異なり、本発明は、ある特定の、調製された遊離システイン部位の選択的還元と、薬物−リンカーの遊離システイン部位への方向づけとをもたらす点が有利である。操作された部位および随伴する選択的還元により促進されるコンジュゲーションの特異性により、所望の位置における、高百分率の部位指向性コンジュゲーションが可能となる。軽鎖定常領域の末端領域内に存在するコンジュゲーション部位など、これらのコンジュゲーション部位の一部は、他の遊離システインと交差反応するので、効果的にコンジュゲートするのが典型的に困難であることは重要である。しかし、分子的操作および結果として得られる遊離システインの選択的還元を介して、効率的なコンジュゲーション率を得ることができ、これにより、望ましくない高ＤＡＲ夾雑物および非特異的毒性が大幅に低減される。より一般に、操作された構築物、および開示される、新規の、選択的還元を含むコンジュゲーション法により、明白に、薬物動態および／または薬力学が改善されたＡＤＣ調製物がもたらされ、潜在的には、治療指数の改善がもたらされる。
【０２９０】
これに関して、部位特異的構築物は、遊離システイン（複数可）を提示するが、これは、還元されると、求核基であり、かつ、すぐ上で開示された求電子基など、リンカー部分上の求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能である、チオール基を含む。好ましい本発明の抗体は、鎖間または鎖内の還元可能な不対合システイン、すなわち、このような求核基をもたらすシステインを有する。したがって、ある特定の実施形態では、還元された不対合システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物−リンカー末端のマレイミド基またはハロアセトアミド基との反応は、所望のコンジュゲーションをもたらす。このような場合において、かつ、下記の実施例５で示される通り、抗体の遊離システインは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とすることができる。各遊離システインは、これにより、理論的には、反応性チオール求核試薬を提示する。このような試薬が適合性であるが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に公知の多様な反応、条件、および試薬を使用して実行しうることが認識される。
【０２９１】
逆に言うと、本発明者らは、操作された抗体の遊離システインを選択的に還元して、部位指向性コンジュゲーションの増強、および望ましくない、潜在的に毒性の夾雑物の低減をもたらしうることを発見した。より具体的には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質における分子内相互作用および分子間相互作用をモジュレートすることが見出されており、それを、選択された還元剤（好ましくは、比較的穏やかな）と共に使用して、本明細書で示される通りに、遊離システインを選択的に還元し、部位特異的コンジュゲーションを容易とすることができる。本明細書で使用される「選択的還元」または「選択的に還元すること」という用語は、互換的に使用することができ、操作された抗体内に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊することのない、遊離システイン（複数可）の還元を意味するものとする。選択された実施形態では、これは、ある特定の還元剤により実行することができる。他の好ましい実施形態では、操作された構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。「選択的なコンジュゲーション」という用語は、本明細書で記載されるとおり、選択的に還元された操作された抗体の、ＰＢＤとのコンジュゲーションを意味するものとすることが認識される。これに関して、かつ、実施例６〜８で実証される通り、このような、還元剤と組み合わせた安定化剤の使用により、重鎖抗体上および軽鎖抗体上のコンジュゲーションの程度、ならびに調製物のＤＡＲ分布により決定される、部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善することができる。
【０２９２】
任意の特定の理論により束縛されることを望まないが、このような安定化剤は、所望されるコンジュゲーション部位において、静電的微小環境をモジュレートし、かつ／またはコンフォメーション変化をモジュレートするように作用することが可能であり、これにより、比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）が、所望の遊離システイン部位におけるコンジュゲーションを容易とすることを可能とする。このような作用物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋（水素結合および静電相互作用を介する）を形成することが公知であり、かつ、好適なコンフォメーション変化を引き起こすことも可能であり、かつ／または好適でないタンパク質間相互作用を低減することも可能な、安定化効果を付与するような様式で、タンパク質間相互作用をモジュレートしうる。さらに、このような作用物質は、還元後における、所望されない分子内（および分子間）システイン間結合の形成を阻害し、これにより、操作された部位特異的システインを、ＰＢＤに結合させる（好ましくはリンカーを介して）、所望のコンジュゲーション反応を容易とするようにも作用しうる。反応条件は、無傷の天然のジスルフィド結合の顕著な還元を提供しないので、コンジュゲーション反応は、当然ながら、遊離システイン上の比較的少数の反応性チオール（例えば、好ましくは、２つの遊離チオール）に向けられる。言及される通り、これにより、本明細書で示される通りに作られコンジュゲート調製物中の、非特異的コンジュゲーションおよび対応する不純物のレベルが大幅に低減される。
【０２９３】
選択された実施形態では、本発明に適合性の安定化剤は一般に、塩基性のｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態では、アミン部分は、一級アミンを含むが、他の好ましい実施形態では、アミン部分は、二級アミンを含む。また他の好ましい実施形態では、アミン部分は、三級アミンを含む。他の選択された実施形態では、アミン部分は、アミノ酸を含むが、他の適合性の実施形態では、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態では、アミン部分は、タンパク質構成性アミノ酸を含む。また他の実施形態では、アミン部分は、非タンパク質構成性アミノ酸を含む。特に好ましい実施形態では、適合性の安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリンおよびシステインを含みうる。加えて、適合性の安定化剤は、グアニジンおよび塩基性ｐＫａを有する窒素含有ヘテロ環を含みうる。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、適合性の安定化剤は、約７．５を超えるｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態では、対象のアミン部分は、約８．０を超えるｐＫａを有し、さらに他の実施形態では、アミン部分は、約８．５を超えるｐＫａを有し、また他の実施形態では、安定化剤は、約９．０を超えるｐＫａを有するアミン部分を含む。他の好ましい実施形態は、アミン部分が、約９．５を超えるｐＫａを有する安定化剤を含むが、ある特定の他の実施形態は、約１０．０を超えるｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を呈示する安定化剤を含む。また他の好ましい実施形態では、安定化剤は、約１０．５を超えるｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態では、安定化剤は、約１１．０を超えるｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含むが、また他の実施形態では、安定化剤は、約１１．５を超えるｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態では、安定化剤は、約１２．０を超えるｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含むが、また他の実施形態では、安定化剤は、約１２．５を超えるｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、標準的な技法を使用して、関連するｐＫａをたやすく計算または決定することができ、選択された化合物を、安定化剤として使用する適用可能性を決定するのに使用しうることを理解する。
【０２９５】
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わせると、遊離の部位特異的システインに向けた目標とするコンジュゲーションにおいて特に有効であることが示されている。本発明の目的では、適合性の還元剤は、操作された抗体の天然のジスルフィド結合を顕著に破壊せずに、コンジュゲーションのための、還元された遊離の部位特異的システインをもたらす、任意の化合物を含みうる。選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされるこのような条件下で、活性化薬物リンカーは、大部分、所望の遊離の部位特異的システイン部位へ結合することが制限される。穏やかな条件をもたらすように、比較的低濃度で使用される、比較的穏やかな還元剤または還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される「穏やかな還元剤」または「穏やかな還元条件」という用語は、操作された抗体内に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊せずに、遊離システイン部位（複数可）においてチオールをもたらす還元剤（任意選択で、安定化剤の存在下における）によりもたらされる、任意の作用物質または状態を意味するように理解するものとする。すなわち、穏やかな還元剤または条件は、タンパク質の天然のジスルフィド結合を顕著に破壊せずに、遊離システイン（複数可）を効果的に還元する（チオールをもたらす）ことが可能である。所望の還元条件は、選択的なコンジュゲーションに適切な環境を確立する、いくつかのスルフヒドリルベースの化合物によりもたらすことができる。好ましい実施形態では、穏やかな還元剤は、１つまたは複数の遊離チオールを有する化合物を含みうるが、特に好ましい実施形態では、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明に適合性の還元剤の非限定的な例は、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール、および２−ヒドロキシエタン−１−チオールを含む。
【０２９６】
上記で示した選択的還元プロセスは、遊離システインに向けた目標とするコンジュゲーションにおいて特に有効であることが認識される。これに関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位へのコンジュゲーションの程度（本明細書では、「コンジュゲーション効率」と定義する）は、当技術分野で受け入れられた多様な技法により決定することができる。ＰＢＤの、抗体への、部位特異的コンジュゲーションの効率は、標的コンジュゲーション部位（本発明では、軽鎖のＣ末端上の遊離システイン）上のコンジュゲーションの、他の全てのコンジュゲート部位に対する百分率を評価することにより決定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書の方法は、ＰＢＤの、遊離システインを含む抗体への、効率的なコンジュゲートをもたらす。一部の実施形態では、標的コンジュゲーションの、他の全てのコンジュゲート部位に対する百分率により測定すると、コンジュゲーション効率は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはこれを超える。
【０２９７】
さらに、コンジュゲーションが可能な操作された抗体は、抗体が生成または保存されるときに、ブロックまたはキャッピングされるスルフヒドリル基を含む、遊離システイン残基を含有しうることが認識される。このようなキャップは、スルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲートの形成を防止または阻害する、タンパク質、ペプチド、イオン、および他の材料を含む。場合によって、コンジュゲートさせていない操作された抗体は、同じ抗体上または異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含みうる。実施例で論じられる通り、このような交差反応性は、製作手順の間に、多様な夾雑物をもたらしうる。一部の実施形態では、操作された抗体は、コンジュゲーション反応の前に、キャッピング解除を要する場合がある。具体的な実施形態では、本明細書の抗体は、キャッピング解除され、コンジュゲーションが可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。具体的な実施形態では、本明細書の抗体を、天然に存在するジスルフィド結合を攪乱または再構成しないキャッピング解除反応にかける。大半の場合に、キャッピング解除反応は、通常の還元反応（還元または選択的還元）の間に生じることが認識される。
【０２９８】
４．ＤＡＲ分布および精製
本発明の利点のうちの１つは、厳密に調整されたＤＡＲ分布を含む、比較的均質なコンジュゲート調製物を作製する能力である。これに関して、開示される構築物および／または選択的なコンジュゲーションは、ＰＢＤと操作された抗体との間の化学量論比についての、試料中のＡＤＣ種の均質性をもたらす。上記で簡略に論じた通り、「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」という用語は、ＰＢＤの、部位特異的抗体に対するモル比を指す。一部の実施形態では、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して、実質的に均質でありうるが、これは、調製物中に、特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有する部位特異的ＡＤＣの主要な種であって、ローディング部位（すなわち、遊離システイン上）に関してもまた均質な種が存在することを意味する。本発明のある特定の実施形態では、部位特異的抗体または選択的な組合せの使用により、所望の均質性を達成することが可能である。他の好ましい実施形態では、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた、部位特異的構築物の使用により達成することができる。さらに他の特に好ましい実施形態では、調製物は、解析用クロマトグラフィー技法または分取クロマトグラフィー技法を使用して、さらに精製することができる。これらの実施形態の各々では、ＡＤＣ試料の均質性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）、またはキャピラリー電気泳動を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の多様な技法を使用して解析することができる。
【０２９９】
ＡＤＣ調製物の精製に関して述べると、標準的な医薬調製法を用いて、所望の純度を得ることができることが認識される。下記の実施例で実証される通り、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、混合物中の化合物を、薬物ローディング値により分離しうる。場合によってまた、混合モードクロマトグラフィー（mixed-mode  chromatography）（ＭＭＣ）も、特異的薬物ロードを有する種を単離するのに使用することができる。より一般に、不溶性夾雑物を除去したら、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーなど、標準的な技法を使用して、モジュレーター調製物をさらに精製しうるが、親和性クロマトグラフィーが特に目的の技法である。これに関して、プロテインＡを、ヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖、またはヒトＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するのに使用しうるのに対し、プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に推奨される。また、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのセファロースクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体またはコンジュゲートに応じて利用可能である。
【０３００】
これに関して、開示される、部位特異的コンジュゲートおよびその調製物は、薬物と抗体部分とを、操作された構築物の立体配置と、少なくとも部分的に、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法とに応じて、多様な化学量論的モル比で含みうる。どのくらい多くのならびにどの鎖間ジスルフィド結合および鎖内ジスルフィド結合が破壊されるのかに応じて、理論的な薬物ローディングは、比較的高量でありうるが、遊離システインの交差反応性など、実際的な制限により、凝集物および他の夾雑物に起因して、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の作製は制限される。すなわち、例えば、６超の高薬物ローディングは、ある特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の喪失を引き起こしうる。このような懸案事項に鑑みて、本発明により提供される実際的な薬物ローディングは、操作されたコンジュゲート当たり１つ〜８つの薬物の範囲にわたりうる、すなわち、この場合、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＰＢＤを、各部位特異的抗体に共有結合により結合させる（例えば、ＩｇＧ１であるが、他の抗体は、ジスルフィド結合の数に応じて、異なるローディング容量を有しうる）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、約２、４、または６であり、特に好ましい実施形態では、ＤＡＲは、約２を含む。
【０３０１】
比較的高レベルの均質性にも拘らず、本発明により提供される、開示される組成物は、実際には、１つ〜８つの範囲のＰＢＤ化合物（ＩｇＧ１の場合）を有する操作されたコンジュゲートの混合物を含む。そのため、開示されるＡＤＣ組成物は、構成要素である抗体の大半が、１つまたは複数のＰＢＤ薬物部分に共有結合により連結され、（選択的還元によるコンジュゲート特異性にも拘らず）薬物部分を、抗体に、多様なチオール基により結合させうる、コンジュゲートの混合物を含む。すなわち、コンジュゲーションの後、本発明のＡＤＣ組成物は、異なる薬物ロード（例えば、ＩｇＧ１抗体当たり１つ〜８つの薬物）を様々な濃度で有する抗ＤＬＬ３コンジュゲートの混合物を含む（遊離システインの交差反応性により主に引き起こされるある特定の反応夾雑物と共に）。選択的還元および製作後精製を使用して、コンジュゲート組成物を、それらが大部分、単一の、主要な、所望されるＡＤＣ種（例えば、２の薬物ローディングを有する）を含有し、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物ローディングを有する）は比較的低レベルである程度（point）まで至ることができる。平均ＤＡＲ値は、全体としての組成物（すなわち、纏めると全てのＡＤＣ種）に対する薬物ローディングの加重平均を表す。用いられる定量法における固有の不確定性、および市販の状況における、優勢でないＡＤＣ種を完全に除去することの困難に起因して、許容可能なＤＡＲ値または規格は、平均、範囲、または分布（すなわち、２±０．５の平均ＤＡＲ）として提示されることが多い。好ましくは、測定された平均ＤＡＲを、範囲内（すなわち、１．５〜２．５）に含む組成物であれば、医薬状況で使用される。
【０３０２】
したがって、ある特定の好ましい実施形態では、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８の各々±０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の好ましい実施形態では、本発明は、２、４、６、または８±０．５の平均ＤＡＲを含む。最後に、選択された好ましい実施形態では、本発明は、２±０．５の平均ＤＡＲを含む。ある特定の好ましい実施形態では、範囲または偏差は、０．４未満でありうることが認識される。したがって、他の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７または８の各々±０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６、または８±０．３の平均ＤＡＲ、なおより好ましくは、２または４±０．３の平均ＤＡＲ、なおまたは２±０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態では、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７または８の各々±０．４の平均ＤＡＲと、比較的低レベル（すなわち、３０％未満）の優勢でないＡＤＣ種とを有する組成物を含む。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ組成物は、比較的低レベル（＜３０％）の優勢でないＡＤＣ種を有して、２、４、６、または８の各々±０．４の平均ＤＡＲを含む。特に好ましい実施形態では、ＡＤＣ組成物は、比較的低レベル（＜３０％）の優勢でないＡＤＣ種を有して、２±０．４の平均ＤＡＲを含む。さらに他の実施形態では、主要なＡＤＣ種（例えば、２のＤＡＲ）は、他のＤＡＲ種に対して測定する場合、７０％を超える濃度、７５％を超える濃度、８０％を超える濃度、８５％を超える濃度、９０％を超える濃度、９３％を超える濃度、９５％を超える濃度、なおまたは９７％を超える濃度で存在する。
【０３０３】
下記の実施例で詳述される通り、コンジュゲーション反応に由来するＡＤＣ調製物中の、抗体当たりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡ、および電気泳動など、従来の手段により特徴づけることができる。また、抗体当たりの薬物に関してＡＤＣの定量的分布も決定することができる。ＥＬＩＳＡにより、特定のＡＤＣ調製物中の抗体当たりの薬物の平均値を決定することができる。しかし、抗体当たりの薬物値の分布は、抗体−抗原間結合およびＥＬＩＳＡの検出限界では、識別不可能である。また、抗体−薬物コンジュゲートを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイでは、薬物部分が、抗体、例えば重鎖断片もしくは軽鎖断片または特定のアミノ酸残基にどこで結合しているのかも決定されない。
【０３０４】
Ｖ．医薬調製物および治療的使用
１．製剤および投与経路
選択される部位特異的コンジュゲートの形態、意図される送達方式、処置またはモニタリングされる疾患、および他の多数の変数に応じ、当技術分野で認識された技法を使用して、本発明の組成物を、所望の通りに製剤化することができる。一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできるが、そのほかは、任意選択で、適切な、薬学的に許容される担体であって、当技術分野で周知の賦形剤および補助剤を含む担体を含有するように製剤化することもできる（例えば、Gennaro、Remington：  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy  with  Facts  and  Comparisons：  Drugfacts  Plus、２０版（２００３年）；  Anselら、Pharmaceutical  Dosage  Forms  and  Drug  Delivery  Systems、７版、Lippencott  Williams  and  Wilkins（２００４年）；Kibbeら、Handbook  of  Pharmaceutical  Excipients、３版、Pharamaceutical  Press  （２０００年）を参照されたい）。ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含む、多様な、薬学的に許容される担体は、多数の市販の供給源からたやすく入手可能である。さらにまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、安定化剤、湿潤剤など、薬学的に許容される補助物質一式も入手可能である。ある特定の非限定的な例示的担体は、食塩液、緩衝食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せを含む。
【０３０５】
より特定すると、一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできることが認識される。逆に、本発明の抗ＤＬＬ３部位特異的ＡＤＣは、任意選択で、適切な、薬学的に許容される担体であって、当技術分野で周知であり、コンジュゲートの投与を容易にする比較的不活性な物質であるか、または活性化合物を、作用部位に送達するために薬学的に最適化された調製物へと加工する一助となる、賦形剤および補助剤を含む担体を含有するように製剤化することもできる。例えば、賦形剤は、形態または粘稠性をもたらす場合もあり、ＡＤＣの薬物動態または安定性を改善するための希釈剤として作用する場合もある。適切な賦形剤または添加剤は、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、容量オスモル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透増強剤を含むがこれらに限定されない。ある特定の好ましい実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥形態で提供され、投与前に、例えば、緩衝食塩液中で再構成される場合もある。このような、再構成された組成物は、静脈内投与されることが好ましい。
【０３０６】
全身投与用に開示されるＡＤＣは、経腸投与用、非経口投与用、または局所投与用に製剤化することもできる。実際、３種類の製剤全てを同時に使用して、有効成分の全身投与を達成することができる。非経口および非経口でない薬物送達用の賦形剤ならびに製剤は、Remington,  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、２０版、Mack  Publishing（２０００年）に示されている。非経口投与に適する製剤は、水溶性形態、例えば、水溶性の塩形態にある活性化合物の水溶液を含む。加えて、油性の注射用懸濁液に適するものとしての活性化合物の懸濁液も投与することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば、ヘキシル置換されたポリ（ラクチド）、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質を含有することが可能であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む。任意選択で、懸濁液はまた、安定化剤も含有しうる。リポソームはまた、細胞に送達するための薬剤を封入するのにも使用することができる。
【０３０７】
経腸投与に適する製剤は、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤、丸薬、コーティングされた錠剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤、およびこれらの制御放出形態を含む。
【０３０８】
非経口投与（例えば、注射による）に適する製剤は、水性または非水性で、等張性で、発熱物質非含有で、滅菌の液体（例えば、液剤、懸濁剤）であって、有効成分を、溶解するか、懸濁させるか、または他の形で供給された（例えば、リポソーム内または他の微粒子内に）液体を含む。このような液体は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張性にする溶質など、他の薬学的に許容される成分をさらに含有しうる。賦形剤の例は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などを含む。このような製剤における使用に適する等張性担体の例は、注射用塩化ナトリウム、リンゲル液、または注射用乳酸加リンゲルを含む。
【０３０９】
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合性の製剤は、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌのＡＤＣ濃度を含む。ある特定の選択された実施形態では、ＡＤＣ濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌを含む。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌを含む。
【０３１０】
一般に、抗ＤＬＬ３部位特異的ＡＤＣを含む、本発明の化合物および組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、それを必要とする被験体に、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、室内（intraventricular）、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、および髄腔内（intrathecal）を含むがこれらに限定されない多様な経路によるか、またはこれら以外では、植込みもしくは吸入により投与することができる。対象の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、およびエアゾールを含むがこれらに限定されない、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物に製剤化することができる。適切な製剤および投与経路は、意図される適用および治療レジメンに従い選択することができる。特に好ましい実施形態では、本発明の化合物は、静脈内送達される。
【０３１１】
２．投与量
同様に、ある特定の投与レジメン、すなわち、用量、投与時期、および投与回数は、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的な検討事項に依存する。投与頻度は、治療コースにわたり決定および調整することができ、増殖性細胞または腫瘍形成性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持、新生物性細胞の増殖の低減、または転移の発生の遅延に基づく。他の実施形態では、投与される投与量を調整するかまたは減じて、潜在的な副作用および／または毒性を管理することができる。代替的に、対象の治療用組成物の連続的な徐放製剤も適切でありうる。
【０３１２】
当業者は、コンジュゲート化合物およびコンジュゲート化合物を含む組成物の適切な投与量は、患者によって異なりうることを認識する。最適な投与量の決定は一般に、任意の危険性または有害な副作用に対する、治療的利益のレベルのバランス評価を有する。選択された投与量レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、投与回数、化合物の排出速度、処置の持続期間、組合せで使用される他の薬物、化合物、および／または材料、状態の重症度、ならびに患者の種、性別、年齢、体重、状態、全般的な健康、および既往の病歴を含むがこれらに限定されない、様々な因子に依存する。化合物の量および投与経路は、最終的に、医師、獣医師、または臨床家の熟慮に委ねられるが、一般に、投与量は、作用部位における局所濃度であって、実質的な、危険であるかまたは有害な副作用を引き起こさずに、所望の効果を達成する局所濃度を達成するように選択される。
【０３１３】
一般に、本発明の部位特異的ＡＤＣは、多様な範囲で投与することができる。これらは、投与１回当たり約５μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重；投与１回当たり約５０μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重；投与１回当たり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。他の範囲は、投与１回当たり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、および投与１回当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。ある特定の実施形態では、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３１４】
選択された実施形態では、部位特異的ＡＤＣは、投与１回当たり約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは、静脈内に）投与される。他の実施形態は、投与１回当たり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００μｇ／ｋｇ体重で、ＡＤＣの投与を含む。他の好ましい実施形態では、開示されるコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５  ８、９または１０ｍｇ／ｋｇで投与される。また他の実施形態では、コンジュゲートは、投与１回当たり１２、１４、１６、１８または２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与することができる。さらに他の実施形態では、コンジュゲートは、投与１回当たり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与することができる。本明細書の教示によれば、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察、ならびに標準的な医療法および生化学技法および測定に基づき、多様な部位特異的ＡＤＣに適する投与量をたやすく決定しうる。特に好ましい実施形態では、このようなＤＬＬ３コンジュゲートの投与量は、ある期間にわたり静脈内投与される。さらに、このような投与量は、規定された処置コースにおいて、複数回にわたり投与することができる。
【０３１５】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７において開示されている通り、体表面積（ＢＳＡ）の計算に立脚しうる。周知の通り、ＢＳＡは、患者の身長および体重を使用して計算され、患者の身体の表面積により表される対象のサイズについての尺度をもたらす。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができ、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、または４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができる。また、当技術分野で認識された技法および経験的な技法を使用して、適切な投与量を決定しうることも認識される。
【０３１６】
いずれにせよ、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、それを必要とする被験体に必要に応じて投与することが好ましい。投与頻度の決定は、主治医などの当業者が、処置される状態、処置される被験体の年齢、処置される状態の重症度、処置される被験体の全般的な健康状態などについての検討に基づき下すことができる。一般に、有効用量のＤＬＬ３コンジュゲートを、被験体に、１回または複数回にわたり投与する。より特定すると、有効用量のＡＤＣは、被験体に、１カ月に１回、１カ月に１回を超えて、または１カ月に１回未満投与する。ある特定の実施形態では、有効用量のＤＬＬ３  ＡＤＣを、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、または少なくとも１年間、少なくとも２年間、または数年間を含む期間において、複数回にわたり投与することができる。さらに他の実施形態では、開示されるモジュレーターの投与の間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もあり、なおまたは１年間もしくは数年間が経過する場合もある。
【０３１７】
ある特定の好ましい実施形態では、コンジュゲートモジュレーターを有する処置コースは、選択された医薬品の、数週間または数カ月間における、複数回にわたる投与を含む。より具体的に述べると、本発明のコンジュゲートモジュレーターは、毎日１回、２日ごとに１回、４日ごとに１回、毎週１回、１０日ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、毎月１回、６週間ごとに１回、２カ月ごとに１回、１０週間ごとに１回、または３カ月ごとに１回投与することができる。これに関して、患者の応答および臨床的慣行に基づき、投与量を変化させることもでき、投与間隔を調整することもできることが認識される。
【０３１８】
投与量およびレジメンはまた、開示される治療用組成物について、１回または複数回の投与を施された個体において、経験的に決定することもできる。例えば、個体には、本明細書で記載される通りに生成された治療用組成物を、投与量を漸増させて施すことができる。選択された実施形態では、投与量は、それぞれ、経験的に決定されるかまたは観察される副作用または毒性に基づき、段階的に増加させることもでき、低減するかまたは減じることもできる。選択された組成物の有効性を評価するには、既に記載されている通り、具体的な疾患、障害、または状態についてのマーカーを追跡することができる。がんでは、マーカーは、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定、ｘ線もしくは他のイメージング技法による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡観察により評価される改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）もしくは本明細書で記載される方法に従い同定される、腫瘍形成性抗原の測定；疼痛もしくは麻痺の軽減；腫瘍と関連する発話、視覚、呼吸、もしくは他の身体機能障害の改善；食欲の増進；または受け入れられた検査により測定される生活の質の向上もしくは生存の延長を含む。当業者には、投与量が、個体、新生物性状態の種類、新生物性状態の病期、新生物性状態が個体における他の場所に転移し始めたかどうか、ならびに過去に使用された処置および現在用いられている処置に応じて変化することが明らかである。
【０３１９】
３．組合せ療法
本発明によれば、組合せ療法は、望ましくない新生物性の細胞増殖を減少させるもしくは阻害するか、がんの発生を減少させるか、がんの再発を減少させるかもしくは防止するか、またはがんの拡大もしくは転移を減少させるもしくは防止するのに特に有用でありうる。このような場合、本発明のＡＤＣは、除去しなければ腫瘍塊を支持して永続化させるＣＳＣを除去し、これにより現行の標準治療である減量剤または抗がん剤のより有効な使用を可能とする、増感剤または化学増感剤として機能することが可能である。すなわち、ある特定の実施形態では、開示されるＡＤＣは、投与される別の治療剤の作用様式を強化する、効果の増強（例えば、本質的に相加的または相乗作用的増強）をもたらしうる。本発明の文脈では、「組合せ療法」は、広義に解釈されるものとし、単に抗ＤＬＬ３部位特異的ＡＤＣおよび１種または複数の抗がん剤の投与を指し、その抗がん剤としては、特異的アプローチおよび非特異的アプローチの両方を含む、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗脈管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化された抗がん剤（モノクローナル抗体および低分子実体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、照射療法、および抗転移剤、ならびに免疫療法剤を含むがこれらに限定されない。
【０３２０】
組合せによる結果が、各処置（例えば、ＡＤＣおよび抗がん剤）を個別に実施する場合に観察される効果の相加物となることは要求されていない。少なくとも相加効果が一般的に所望されるが、抗腫瘍効果の任意の増加であって、単剤療法の抗腫瘍効果を上回る増加が有益である。さらに、本発明は、組み合わされた処置が相乗効果を呈示することも要しない。しかし、当業者は、好ましい実施形態を含む、ある特定の選択された組合せにより、相乗作用が観察されうることを認識する。
【０３２１】
組合せ療法を実施するには、ＤＬＬ３コンジュゲートおよび抗がん剤を、被験体に、単一の組成物により同時に投与することもでき、２つまたはこれを超える別個の組成物として、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して、同時に投与することもできる。代替的に、ＡＤＣは、抗がん剤による処置に、例えば、数分間〜数週間の範囲の間隔で先行する場合もあり、後続する場合もある。各送達の間の期間は、抗がん剤とコンジュゲートとが、腫瘍に対して組合せ効果を及ぼしうるような期間である。少なくとも１つの実施形態では、抗がん剤およびＡＤＣの両方を、互いから約５分間〜約２週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、ＤＬＬ３  ＡＤＣの投与と、抗がん剤の投与の間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もある。
【０３２２】
組合せ療法は、１回、２回、または少なくとも状態が処置されるか、緩和されるか、または治癒するまでの期間にわたり投与することができる。一部の実施形態では、組合せ療法は、複数回にわたり、例えば、毎日３回〜６カ月ごとに１回投与される。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日１回、３日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、６カ月ごとに１回などのスケジュールで行うこともでき、ミニポンプを介して持続的に投与することもできる。組合せ療法は、既に言及された任意の経路を介して投与することができる。組合せ療法は、腫瘍部位から遠隔の部位に投与することもできる。
【０３２３】
一実施形態では、部位特異的ＡＤＣを、短い処置サイクルにわたり、１種または複数の抗がん剤と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与する。本発明はまた、非持続的な投与、または毎日の用量の複数回の部分的な投与への分割も意図する。コンジュゲートと抗がん剤とは、隔日または隔週で交互に投与することもでき、一連の抗体処置を施した後で、抗がん剤療法による１回または複数回にわたる処置を施すこともできる。いずれにせよ、当業者により理解される通り、化学療法剤および開示されるコンジュゲートの適切な用量は一般に、ほぼ臨床療法において既に用いられている用量であり、この場合、化学療法剤は、単独でまたは他の化学療法剤と組み合わせて投与される。
【０３２４】
別の好ましい実施形態では、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートを、腫瘍の初期症状後における再発の可能性を低減するかまたは消失させる維持療法において使用することもできる。障害は処置され、初期腫瘍塊を消失させるか、軽減させるか、または他の形で改善され、それにより患者は無症状であるかまたは寛解していることが好ましい。このようなときは、標準的な診断手順を使用して、疾患の徴候がほとんどまたは全くなくてもなお、被験体に、薬学的有効量の、開示されるＤＬＬ３コンジュゲートを、１回または複数回にわたり投与することができる。一部の実施形態では、ＡＤＣは、毎週、隔週、毎月、６週間ごと、２カ月ごと、３カ月ごと、６カ月ごと、または毎年など、ある期間にわたり、定期的なスケジュールで投与される。本明細書の教示を踏まえるなら、当業者は、疾患再発の潜在的可能性を低減する好適な投与量および投与レジメンをたやすく決定しうる。さらに、このような処置は、患者の応答ならびに臨床パラメータおよび診断パラメータに応じて、数週間、数カ月間、数年間の期間にわたり、なおまたは無期限に継続しうる。
【０３２５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣを、減量手順後において、腫瘍転移の可能性を防止または低減するために、予防的に使用することもでき、アジュバント療法として使用することもできる。本開示で使用される「減量手順」とは、広義で定義され、腫瘍または腫瘍の増殖を、消失させるか、低減するか、処置するか、または改善する、任意の手順、技法、または方法を意味するものとする。例示的な減量手順は、手術、照射処置（すなわち、ビーム照射）、化学療法、免疫療法、または切除を含むがこれらに限定されない。腫瘍の転移を低減する臨床手順、診断手順、または治療診断手順により示唆される通り、本開示の観点に照らして当業者によりたやすく決定される適切な時点において、開示されるＡＤＣを投与することができる。コンジュゲートは、標準的な技法を使用して決定される薬学的に有効な投与量で、１回または複数回にわたり投与することができる。投与レジメンは、その改変を可能とする、適切な診断技法またはモニタリング技法を伴うことが好ましい。
【０３２６】
本発明のさらに他の実施形態は、開示されるＤＬＬ３コンジュゲートを、無症状であるが、増殖性障害を発症する危険性がある被験体に投与することを含む。すなわち、本発明のコンジュゲートは、真に防止的な意味で使用することができ、調査または検査され、１つまたは複数の言及された危険因子（例えば、ゲノムによる徴候、家族歴、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検査結果など）を有するが、新生物を発症していない患者へも施すことができる。このような場合、当業者であれば、経験的な観察によるかまたは受け入れられた臨床的慣行により、有効な投与レジメンを決定することが可能である。
【０３２７】
４．抗がん剤
本出願全体を通して議論されるように、本発明の抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲートは、抗がん剤と組み合わせて使用することができる。「抗がん剤」または「抗増殖剤」という用語は、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用しうる任意の薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗脈管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化された抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、照射療法、および抗転移剤、ならびに免疫療法剤を含むがこれらに限定されない。
【０３２８】
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞に対して毒性であり、細胞の機能を減少させるかもしくは阻害し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。ある特定の実施形態では、その物質は、生物に由来する天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例は、細菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、ジフテリア（Diptheria）毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａによる阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓによる阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitegellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、それらの断片および／または変異体を含む、細胞外膵臓ＲＮアーゼなどの細胞傷害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ）を含むがこれらに限定されない。
【０３２９】
本発明の目的では、「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖および／または生存を非特異的に減少させるまたは阻害する化学化合物（例えば、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤）を含む。このような化学薬品は、細胞成長または細胞分裂に必要な細胞内過程を対象とすることが多く、したがって、一般に成長および分裂が急速であるがん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合化し、これにより、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤は、がん性細胞またはがん性となる可能性がある細胞もしくは腫瘍形成性の後代を発生させる可能性がある細胞（例えば、ＴＩＣ）を阻害するかまたは阻害するように設計された、任意の化学薬品を含みうる。このような薬剤は、組合せで、例えば、ＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンで投与されることが多く、最も有効であることが多い。
【０３３０】
本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣと組み合わせて使用されうる抗がん剤の例は、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアミラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン（eleutherobin）、パンクラチスタチン、サルコジクチイン（sarcodictyin）、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ジネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質、エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（cactionomycin）、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシンであるＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖複合体であるＰＳＫ（登録商標）（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ゲムシタビンであるＧＥＭＺＡＲ（登録商標）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビンであるＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤であって、細胞増殖を低減する阻害剤、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むがこれらに限定されない。この定義にはまた、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤であって、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレーター、副腎におけるエストロゲンの産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、ならびに抗アンドロゲン剤などの抗ホルモン剤のほか；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；ワクチン、ｒＩＬ−２であるＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）；トポイソメラーゼ１阻害剤であるＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）；ｒｍＲＨであるＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）；ビノレルビン、およびエスペラミシン、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【０３３１】
特に好ましい抗がん剤は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号：５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号：３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号：１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号：４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ（pentazabicyclo）［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号：８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））など、市販の化合物または臨床で利用可能な化合物を含む。さらなる市販の抗がん剤または、さらなる臨床で利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、��ｆｉｚｅｒ）、チピファルニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有）、アルブミンで操作されたパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ、およびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）；タモキシフェンクエン酸塩、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェンクエン酸塩）ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン（formestanie）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
【０３３２】
他の実施形態では、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートを、現在臨床試験であるか、または市販されている、多数の抗体（または免疫療法剤）のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。この目的で、開示されるＤＬＬ３コンジュゲートは、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ（duligotumab）、デュシギツマブ（dusigitumab）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イマガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（nofetumomabn）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラムシルマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用することができる。
【０３３３】
また他の特に好ましい実施形態は、がん治療について試験中であるかまたは承認された抗体であって、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzumab  ozogamcin）、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンを含むがこれらに限定されない抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合性のさらなる抗がん剤をたやすく同定することが可能である。
【０３３４】
５．放射線療法
本発明はまた、ＤＬＬ３コンジュゲートの、放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡの損傷を誘導する任意の機構であって、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などの機構）との組合せももたらす。また、放射性同位元素の、腫瘍細胞への方向付けられた送達を使用する組合せ療法も意図され、開示されるコンジュゲートを、標的化された抗がん剤または他の標的化手段との関連で使用することができる。放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたり、パルスで投与されることが典型的である。頭頸部がんを有する被験体には、放射線療法を、約６〜７週間にわたり投与することができる。任意選択で、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。
【０３３５】
ＶＩ．適応
本発明のＡＤＣを使用して、任意のＤＬＬ３関連障害の発生または再発を処置、防止、管理、または阻害しうることが認識される。したがって、単独で投与されるのであれ、抗がん剤または放射線療法と組み合わせて投与されるのであれ、本発明のＡＤＣは、患者または被験体における新生物性状態であって、良性腫瘍または悪性疾患（例えば、副腎癌、肝臓（ｌｉｖｅｒ）癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺癌、肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、および子宮癌；肉腫；神経膠芽腫；および多様な頭頸部腫瘍）；白血病およびリンパ系悪性疾患；ニューロンの障害、神経膠障害、星状細胞障害、視床下部障害、ならびに他の腺障害、マクロファージ障害、上皮障害、間質障害、および胞胚腔障害；ならびに炎症性障害、脈管形成性障害、免疫障害、および病原体により引き起こされる障害など、他の障害を含みうる新生物性状態を一般に処置するのに特に有用である。特に、処置の重要な標的は、充実性腫瘍を含む新生物性状態であるが、血液悪性疾患も、本発明の範囲内にある。
【０３３６】
本明細書の、状態を処置する文脈で使用される「処置」という用語は一般に、処置および治療であって、ヒトに対するものであれ、動物（例えば、獣医学的適用における）に対するものであれ、そこにおけるいくらかの所望される治療効果、例えば、進行速度の低減、進行速度の停止、状態の退縮、状態の改善、および状態の治癒を含む、状態の進行の阻害が達成される処置および治療に関する。また、予防的措置（すなわち、予防、防止）としての処置も含まれる。
【０３３７】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは剤形（dosage  from）の量であって、所望される処置レジメンに従い投与されるときに、妥当な有益性／危険性比に見合った、いくらかの所望される治療効果をもたらすのに有効な量に関する。
【０３３８】
同様に、本明細書で使用される「予防有効量」という用語は、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは剤形の量であって、所望される処置レジメンに従い投与されるときに、妥当な有益性／危険性比に見合った、いくらかの所望される予防効果をもたらすのに有効な量に関する。
【０３３９】
より具体的に述べると、本発明に従う処置にかけられる新生物性状態は、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱がん（扁平上皮癌および移行細胞癌）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄腫瘍、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈小体腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（fibrogenesis  imperfecta  ossium）、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頸部がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌など）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫（posterious  unveal  melanoma）、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫（rhabdomysarcoma）、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移がん、および子宮がん（子宮頸癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）を含むがこれらに限定されない群から選択することができる。
【０３４０】
ある特定の好ましい実施形態では、増殖性障害は、副腎腫瘍、肝腫瘍、腎腫瘍、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍、子宮腫瘍、食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍（小細胞腫瘍および非小細胞腫瘍の両方）、甲状腺腫瘍、癌、肉腫、神経膠芽細胞腫、および多様な頭頸部腫瘍を含むがこれらに限定されない、充実性腫瘍を含む。他の好ましい実施形態では、かつ、下記の実施例で示される通り、開示されるＡＤＣは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮性非小細胞肺がんまたは扁平上皮性小細胞肺がん）の処置においてとりわけ有効である。一実施形態では、肺がんは、不応性であるか、再発性であるか、または白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）および／もしくはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、またはカバジタキセル）に対して抵抗性である。
【０３４１】
特に好ましい実施形態では、開示されるＡＤＣを使用して、小細胞肺がんを処置することができる。このような実施形態に関して述べると、コンジュゲートモジュレーターは、限局型病期の疾患を呈示する患者に投与することができる。他の実施形態では、開示されるＡＤＣは、進展型病期の疾患を呈示する患者に投与される。他の好ましい実施形態では、開示されるＡＤＣは、不応性患者（すなわち、初期治療のコースの完了の間において、または初期治療のコースを完了したすぐ後で再発する患者）または再発性小細胞肺がん患者に投与される。また他の実施形態は、開示されるＡＤＣの、感受性の患者（すなわち、再発が一次治療後２〜３カ月間を超える患者）への投与を含む。各場合に、適合性のＡＤＣは、選択された投与レジメンおよび臨床診断に応じて、他の抗がん剤と組み合わせて使用しうることが認識される。
【０３４２】
上記で論じた通り、開示されるＡＤＣはさらに、神経内分泌腫瘍を含む、神経内分泌特徴または表現型を有する腫瘍を防止、処置、または診断するのにも使用することができる。分散した内分泌系（dispersed  endocrine  system）から生じる真性またはカノニカルの神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的まれであり、人口１００，０００人当たりの発生数は２〜５例であるが、高度に侵襲性である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺がん）、および肺（小細胞肺癌および大細胞性神経内分泌癌）において生じる。これらの腫瘍は、セロトニンおよび／またはクロモグラニンＡを含む複数のホルモンであって、カルチノイド症候群として公知の、消耗性の症状を引き起こすことができるホルモンを分泌しうる。このような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしてもまた公知であり、遺伝子記号＝ＥＮＯ２である）、ＣＤ５６（またはＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、およびシナプトフィシン（ＳＹＰ）など、陽性の免疫組織化学マーカーによって表される場合もあり、ＡＳＣＬ１など、発現の上昇を呈示することが公知の遺伝子によって表される場合もある。残念ながら、従来の化学療法は、ＮＥＴを処置するのにそれほど有効でなく、肝転移が一般的な転帰である。
【０３４３】
開示されるＡＤＣは、神経内分泌腫瘍を処置するのに使用すると有利でありうるが、開示されるＡＤＣはまた、遺伝子型または表現型において、カノニカルの神経内分泌腫瘍と共通の形質を模倣するか、これらに酷似するか、またはこれらを呈示する、偽性神経内分泌腫瘍（pseudo  neuroendocrine  tumor）（ｐＮＥＴ）を処置、防止、または診断するのにも使用することができる。偽性神経内分泌腫瘍または神経内分泌特徴を有する腫瘍とは、散在する神経内分泌系の細胞、または発がん性過程において、神経内分泌系の分化カスケードが異常に再活性化した細胞から生じる腫瘍である。このようなｐＮＥＴは一般に、生物学的に活性のアミン、神経伝達物質、およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力を含むある特定の表現型または生化学的特徴を、従来から定義されている神経内分泌腫瘍と共有する。歴史的に述べると、このような腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、稠密につなぎ合わされた小細胞であって、細胞病変が穏やかで最小限の細胞質および円形から楕円形の点状核を有する小細胞を示すことが多い、共通の外見を共有する。本発明の目的では、神経内分泌腫瘍および偽性神経内分泌腫瘍を定義するのに使用されうる、共通して発現する組織学的マーカーまたは遺伝子マーカーは、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を含むがこれらに限定されない。
【０３４４】
したがって、本発明のＡＤＣを使用して、偽性神経内分泌腫瘍およびカノニカルの神経内分泌腫瘍の両方を処置するのに有益である。これに関して、ＡＤＣは、本明細書で記載される通り、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺がん）、および肺（小細胞肺癌および大細胞性神経内分泌癌）において生じる、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴの両方）を処置するのに使用することができる。さらに、本発明のＡＤＣは、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１、およびＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）からなる群から選択される、１種または複数のマーカーを発現する腫瘍を処置するのにも使用することができる。すなわち、本発明は、ＮＳＥ＋であるか、またはＣＤ５６＋であるか、またはＰＧＰ９．５＋であるか、またはＡＳＣＬ１＋であるか、またはＳＹＰ＋であるか、またはＣＨＧＡ＋であるか、またはこれらのいくつかの組合せである腫瘍を患う被験体を処置するのに使用することができる。
【０３４５】
血液悪性疾患に関して述べると、本発明の化合物および方法が、多様なＢ細胞リンパ腫であって、低悪性度ＮＨＬ、濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中等悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性（high  grade  small  non-cleaved  cell）ＮＨＬ、巨大腫瘤病変（bulky  disease）ＮＨＬ、ワルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫（monocytic  B  cell  lymphoma）、血管免疫芽球性リンパ腺症、小リンパ球性リンパ芽球腫、濾胞性リンパ芽球腫、びまん性大細胞リンパ芽球腫、びまん性小型切れ込み核細胞性リンパ芽球腫、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、および非バーキットリンパ腫、大細胞を主とする濾胞性リンパ腫；小型切れ込み核細胞を主とする濾胞性リンパ腫；ならびに小型切れ込み核細胞および大細胞混合型濾胞性リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫を処置するのに特に有効でありうることがさらに認識される。Gaidonoら、「Lymphomas」、CANCER：  PRINCIPLES  &  PRACTICE  OF  ONCOLOGY中、２巻：２１３１〜２１４５頁（DeVitaら編、増補５版、１９９７年）を参照されたい。当業者には、これらのリンパ腫は、分類システムの変化のために異なる名称を有することが多く、異なる名称の下に分類されたリンパ腫を有する患者もまた、本発明の組合せ治療レジメンから利益を得ることが明らかなはずである。
【０３４６】
本発明はまた、良性腫瘍または前がん性腫瘍を提示する被験体の防止的処置または予防的処置ももたらす。ＤＬＬ３関連障害以外の、任意の特定の種類の腫瘍または増殖性障害を、本発明を使用する処置から除外すべきだとは考えられない。しかし、腫瘍細胞の種類は、二次治療剤、特に、化学療法剤および標的化された抗がん剤と組み合わせた本発明の使用と関与性でありうる。
【０３４７】
処置される「被験体」または「患者」は、ヒトであることが好ましいが、本明細書で使用される用語は、全ての哺乳動物を含む任意の種を明白に含むと考えられる。したがって、被験体／患者は、動物、哺乳動物、有胎盤哺乳動物、有袋動物（例えば、カンガルー、ウォンバット）、単孔動物（例えば、カモノハシ）、齧歯動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えば、マウス）、ウサギ目動物（例えば、ウサギ）、鳥類（例えば、トリ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、ブタ（例えば、ブタ）、ヒツジ属動物（例えば、ヒツジ）、ウシ属動物（例えば、ウシ）、霊長動物、真猿類（例えば、サルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒトでありうる。
【０３４８】
ＶＩＩ．製品
また、１つまたは複数の容器を含む医薬パックおよび医薬キットであって、１回または複数回の投与分の抗ＤＬＬ３部位特異的ＡＤＣを含むパックおよびキットもまた提供される。ある特定の実施形態では、１種または複数のさらなる薬剤を有するかまたは伴わずに、例えば、抗ＤＬＬ３コンジュゲートを含む所定量の組成物を含有する、単位投与量が提供される。他の実施形態では、このような単位投与量は、単回使用用の注射用プレフィルドシリンジで供給される。また他の実施形態では、単位投与量中に含有される組成物は、食塩液、スクロースなど、ホスフェートなどの緩衝剤などを含む場合もあり、かつ／または安定で有効なｐＨ範囲内で製剤化される場合もある。代替的に、ある特定の実施形態では、コンジュゲート組成物を、適切な液体、例えば、滅菌水または食塩液を添加すると再構成されうる凍結乾燥粉末として提供することもできる。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、タンパク質の凝集を阻害する１種または複数の物質であって、スクロースおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない物質を含む。容器（複数可）上の任意の表示、または容器（複数可）と関連する任意の表示は、封入されたコンジュゲート組成物が、えり抜きの新生物性疾患状態を処置するのに使用されることを示す。
【０３４９】
本発明はまた、単回投与用投与単位または複数回投与用投与単位のＤＬＬ３コンジュゲート、および、任意選択で、１種または複数の抗がん剤を作製するためのキットも提供する。キットは、容器および容器上にあるかまたは容器と関連する表示または添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができ、薬学的有効量の、開示されるＤＬＬ３コンジュゲートを、コンジュゲート形態または非コンジュゲート形態で含有しうる。他の好ましい実施形態では、容器（複数可）は、滅菌アクセスポートを含む（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ（intravenous  solution  bag）の場合もあり、皮下注射用注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある）。このようなキットは一般に、適切な容器内に、ＤＬＬ３コンジュゲートの、薬学的に許容される製剤と、任意選択で、同じまたは異なる容器内に、１種または複数の抗がん剤とを含有する。キットはまた、診断用または組合せ療法用の、他の薬学的に許容される製剤も含有しうる。例えば、本発明のＤＬＬ３コンジュゲートに加えて、このようなキットは、化学療法薬または放射線療法薬などの、ある範囲の抗がん剤；抗脈管形成剤；抗転移剤；標的化された抗がん剤；細胞傷害剤；および／または他の抗がん剤のうちの任意の１種または複数を含有しうる。
【０３５０】
より具体的に述べると、キットは、さらなる成分を伴うかまたは伴わずに、ＤＬＬ３  ＡＤＣを含有する単一の容器を有する場合もあり、各所望される薬剤のための、別個の容器を有する場合もある。コンジュゲーションのために組み合わされた治療剤を提供する場合、単一の溶液を、モル当量の組合せであらかじめ混合することもでき、１つの成分を他の成分に対して過剰としてあらかじめ混合することもできる。代替的に、キットのＤＬＬ３コンジュゲートおよびいずれか任意選択の抗がん剤は、別個の容器内で個別に維持してから、患者に投与することもできる。キットはまた、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、リンゲル液、およびデキストロース溶液など、滅菌の薬学的に許容される緩衝液または他の希釈剤を含有する第２／第３の格納手段も含みうる。
【０３５１】
キットの構成要素を１種または複数の液体溶液により提供する場合、液体溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液または滅菌食塩液であることが特に好ましい。しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末（複数可）として提供することもできる。試薬または構成要素を乾燥粉末として提供する場合は、適切な溶媒を添加することにより粉末を再構成することができる。溶媒はまた、別の容器で提供されうることも想定される。
【０３５２】
上記で簡略に示された通り、キットはまた、抗体コンジュゲートおよび任意選択の構成要素を動物または患者に投与するための手段、例えば、１つまたは複数の注射針、Ｉ．Ｖ．バッグ、もしくはシリンジ、なおまたは点眼器、ピペット、もしくは他のこのような器具であって、それにより製剤を動物に注入もしくは導入するか、または身体の疾患領域に適用し得る器具も含有しうる。本発明のキットはまた、バイアルなどおよび他の構成要素を、市販のために、例えば、射出成形または吹込み成形されたプラスチック容器であり、所望のバイアルおよび他の器具をそれらの中に入れて保持するプラスチック容器などを密封して閉じ込めて含有するための手段も含むことが典型的である。任意の表示または添付文書により、ＤＬＬ３コンジュゲート組成物が、がん、例えば、小細胞肺がんを処置するのに使用されることが示される。
【０３５３】
他の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、増殖性障害の防止または処置において有用な診断デバイスまたは治療デバイスと共に使用する場合もあり、これらを含む場合もある。例えば、好ましい実施形態では、本発明の化合物および組成物は、増殖性障害の病因または発現に関与する細胞またはマーカー化合物を、検出、モニタリング、定量、またはプロファイリングするのに使用されうる、ある特定の診断デバイスまたは測定器と組み合わせることができる。選択された実施形態では、マーカー化合物は、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、クロモグラニンＡ、およびＰＧＰ９．５を含みうる。
【０３５４】
特に好ましい実施形態では、デバイスを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照されたい）ことができる。また他の好ましい実施形態では、かつ、上記で論じた通り、循環腫瘍細胞は、がん幹細胞を含みうる。
【０３５５】
ＶＩＩＩ．その他
本明細書でそうでないことが規定されない限り、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によりそうでないことが要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。より具体的に述べると、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される通り、文脈によりそうでないことが明確に指定されない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（a  protein）」への言及は、複数のタンパク質を含み、「細胞（a  cell）」への言及は、細胞の混合物を含むなどである。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で提示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を含む。したがって、２．０〜３．０の範囲は、２．０、３．０、および２．０と３．０との間の全ての点を含む。
【０３５６】
一般的に、本明細書で記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される用語法ならびにこれらの技法は、周知の用語法および技法であり、当技術分野で一般に使用されている。そうでないことが示されない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、多様で一般的な参考文献および多様でより特殊な参考文献であって、本明細書を通して引用され、論じられている、参考文献において記載されている、従来の方法に従い実施される。例えば、Abbasら、Cellular  and  Molecular  Immunology、６版、W.B.  Saunders  Company（２０１０年）；Sambrook  J.およびRussell  D.    Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor,  N.Y.（２０００年）；Ausubelら、Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.（２００２年）；HarlowおよびLane、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor,  N.Y.（１９９８年）；およびColiganら、Short  Protocols  in  Protein  Science、Wiley、John  &  Sons,  Inc.（２００３年）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、当技術分野において一般に達成される通り、または本明細書で記載される通り、製造業者の仕様に従い実施する。本明細書で記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および実験技法との関連で使用される用語法は、周知であり、当技術分野で一般に使用される用語法である。さらに、本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するとは解釈されるべきではない。
【０３５７】
本明細書で使用される腫瘍細胞型は、以下：腺癌（Ａｄｅｎｏ）、副腎がん（ＡＤ）、乳がん（ＢＲ）、エストロゲン受容体陽性乳がん（ＢＲ−ＥＲ＋）、エストロゲン受容体陰性乳がん（ＢＲ−ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陽性乳がん（ＢＲ−ＰＲ＋）、プロゲステロン受容体陰性乳がん（ＢＲ−ＰＲ−）、ＥＲｂ２／Ｎｅｕ陽性乳がん（ＢＲ−ＥＲＢ２／Ｎｅｕ＋）、Ｈｅｒ２陽性乳がん（ＢＲ−Ｈｅｒ２＋）、クローディン−低乳がん（ＢＲ−ＣＬＤＮ−ｌｏ）、トリプルネガティブ乳がん（ＢＲ−ＴＮＢＣ）、結腸直腸腫瘍（ＣＲ）、子宮内膜腫瘍（ＥＭ）、胃腫瘍（ＧＡ）、頭頸部腫瘍（ＨＮ）、腎臓腫瘍（ＫＤＹ）、大細胞性神経内分泌腫瘍（ＬＣＮＥＣ）、肝臓腫瘍（ＬＩＶ）、リンパ節腫瘍（ＬＮ）、肺腫瘍（ＬＵ）、肺カルチノイド腫瘍（ＬＵ−ＣＡＲ）、肺紡錘細胞腫瘍（ＬＵ−ＳＰＣ）、黒色腫（ＭＥＬ）、非小細胞肺腫瘍（ＮＳＣＬＣ）、卵巣腫瘍（ＯＶ）、漿液性卵巣腫瘍（ＯＶ−Ｓ）、漿液性乳頭状卵巣腫瘍（ＯＶ−ＰＳ）、卵巣性悪性混合型中胚葉性腫瘍（ＯＶ−ＭＭＭＴ）、粘液性卵巣腫瘍（ＯＶ−ＭＵＣ）、卵巣明細胞腫瘍（ＯＶ−ＣＣ）、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、膵臓腫瘍（ＰＡ）、前立腺腫瘍（ＰＲ）、扁平上皮腫瘍（ＳＣＣ）、小細胞肺腫瘍（ＳＣＬＣ）、および皮膚由来の腫瘍（ＳＫ）の通りに略記される。
【０３５８】
ＩＸ．参考文献
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける、ヌクレオチド配列の寄託、ならびに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列の寄託、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける、注釈を付けたコード領域からの翻訳を含む）についての完全な開示は、特定の参考文献との関連で「参照により組み込まれる」という語句が使用されているのかいないのかに関わらず、参照により組み込まれる。上記の詳細な記載および後続の実施例は、理解の明確さのためだけに与えられる。そこから不要な限定がなされるわけではないものと理解されたい。本発明は、示され、記載される、正確な詳細に限定されるわけではない。特許請求の範囲により定義される本発明には、当業者に明白な変形も含まれる。本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するとは解釈されるべきではない。
【０３５９】
Ｘ．配列表の概要
本出願には、多数の核酸配列およびアミノ酸配列を含む配列表が添付されている。以下の表４は、含まれる配列についての概要を提示する。
【表４−１】
2016531914.tif 000023
【表４−２】
2016531914.tif 000024
【実施例】
【０３６０】
このように一般的に記載された本発明は、例示を目的として提示されるものであり、本発明を限定することを意図されるものではない、以下の実施例を参照することにより、よりたやすく理解される。実施例は、下記の実験が、実施される全ての実験または唯一の実験であることを表すように意図されるものではない。
【０３６１】
（実施例１）
抗ＤＬＬ３抗体の作製
抗ＤＬＬ３マウス抗体は、以下の通りに生成した。第１の免疫戦略では、３匹のマウス（以下の系統：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢの各々から１匹ずつ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはアラムアジュバント（alum  adjuvant）で乳化した、ヒトＤＬＬ３−ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物は、Ａｄｉｐｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（型番ＡＧ−４０Ａ−０１１３）から購入した。初期免疫は、マウス１匹当たりＴｉｔｅｒＭａｘ中の１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃのエマルジョンにより実施した。次いで、マウスには、毎週２回、マウス１匹当たりアラムアジュバント中の５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃを追加投与した。融合前の最後の注射では、マウス１匹当たりＰＢＳ中の５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃを施した。
【０３６２】
第２の免疫戦略では、６匹のマウス（以下の系統：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢの各々２匹ずつ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはアラムアジュバントで乳化した、ヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質は、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現するように操作したＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製した。初期免疫では、マウス１匹当たりＴｉｔｅｒＭａｘ中の１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓのエマルジョンを施した。次いで、マウスには、毎週２回、マウス１匹当たりアラムアジュバント中の５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを追加投与した。最後の注射では、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作した、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞２×１０５個を施した。
【０３６３】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウス血清を、ヒトＤＬＬ３に特異的なマウスＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルは、ＤＬＬ３に特異的な抗体を示した。略述すると、９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、型番６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中０．５μｇ／ｍｌの組換えＤＬＬ３−Ｈｉｓで、一晩にわたりコーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルにより、室温（ＲＴ）で１時間にわたりブロッキングした。マウス血清を用量設定し（１：１００、１：２００、１：４００、および１：８００）、ＤＬＬ３でコーティングされたプレートに、５０μＬ／ウェル添加し、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、３％のＢＳＡ−ＰＢＳまたはＰＢＳ中２％のＦＣＳで１：１０，０００に希釈した、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、５０μＬ／ウェルと共に、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。再度プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３４０２８）４０μＬ／ウェルを、ＲＴで１５分間にわたり添加した。発色させた後、等体積の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させ、プレートを、分光光度計により、ＯＤ４５０で解析した。
【０３６４】
血清陽性免疫マウスを屠殺し、流入領域リンパ節（膝窩、鼠径、および内側腸骨）を切除し、抗体産生細胞のための供給源として使用した。Ｂ細胞（ｈＤＬＬ３−Ｆｃで免疫されたマウスに由来する細胞約２２９×１０６個、およびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓで免疫されたマウスに由来する細胞５１０×１０６個）の細胞懸濁液を、非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と、ＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）モデルを使用するエレクトロセルフュージョンにより、１：１の比で融合させた。細胞を、アザセリン、１５％の胎児クローンＩ血清、１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、および５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地中に再懸濁させ、４つのＴ２２５フラスコ内の、フラスコ当たり１００ｍＬずつの選択培地中で培養した。フラスコを、５％のＣＯ２および９５％の空気を含有する、加湿された３７℃のインキュベーター内に、６〜７日間にわたり入れた。
【０３６５】
融合後６日目または７日目において、ハイブリドーマライブラリー細胞をフラスコから回収し、補充されたハイブリドーマ選択培地（上記で記載された）２００μＬ中にウェル当たりの細胞１個で、６４枚のＦａｌｃｏｎ  ９６ウェルプレートに播種し（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞分取器を使用して）、４８枚の９６ウェルプレートは、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓによる免疫戦略のためのプレートとした。ライブラリーの残りの部分は、液体窒素中で保存した。
【０３６６】
ハイブリドーマは、１０日間にわたり培養し、以下の通りに実施されるフローサイトメトリーを使用して、上清を、ｈＤＬＬ３に対して特異的な抗体についてスクリーニングした。ヒトＤＬＬ３、マウスＤＬＬ３（色素であらかじめ染色された）、またはカニクイザルＤＬＬ３（Ｄｙｌｉｇｈｔ８００であらかじめ染色された）を過剰発現するように操作した、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をウェル当たり１×１０５個、２５μＬのハイブリドーマ上清と共に、３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％のＦＣＳで洗浄し、次いで、試料当たり２５μＬずつの、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：３００に希釈した、ＤｙｅＬｉｇｈｔ  ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分のインキュベーション後に、細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩを伴うＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより、アイソタイプの対照抗体で染色された細胞の蛍光を上回る蛍光について解析した。残りの、使用されなかったハイブリドーマライブラリー細胞は、将来のライブラリー試験およびライブラリースクリーニングのために、液体窒素中で凍結させた。
【０３６７】
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓによる免疫戦略により、約５０のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体がもたらされ、およびｈＤＬＬ３−Ｆｃによる免疫戦略により、約９０のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体がもたらされた。
【０３６８】
（実施例２）
抗ＤＬＬ３抗体の配列決定
上記に基づき、多数の、例示的な、別個のモノクローナル抗体であって、固定化されたヒトＤＬＬ３またはｈ２９３−ｈＤＬＬ３細胞に見かけ上の高親和性で結合するモノクローナル抗体を、配列決定およびさらなる解析のために選択した。選択された、実施例１で作製されたモノクローナル抗体に由来する軽鎖可変領域および重鎖可変領域についての配列解析により、多くの抗体が、新規の相補性決定領域を有し、しばしば、新規のＶＤＪ配置を提示することが確認された。
【０３６９】
所望の抗体を発現する、初期に選択されたハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解させて、抗体をコードするＲＮＡを調製した。１０４〜１０５個の間の細胞を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁させ、２００μＬのクロロホルムを添加した後で強く振とうした。次いで、試料を、４℃で１０分間にわたり遠心分離し、水性相を、新しい微量遠心管に移し、等体積の７０％エタノールを添加した。試料を、２ｍＬの回収用試験管を取り付けた、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉスピンカラムにロードし、製造業者の指示に従い処理した。全ＲＮＡは、スピンカラム膜に対して１００μＬのＲＮａｓｅ非含有水を直接用いて、溶出により抽出した。ＲＮＡ調製物の品質を、１％のアガロースゲル中で３μＬを分画することにより決定してから、使用するまで、−８０℃で保存した。
【０３７０】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な、３’マウスＣγプライマーと組み合わせて、完全なマウスＶＨレパートリーを標的化するように設計された、３２個のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む、５’プライマーミックスを使用して増幅した。同様に、カッパ軽鎖を増幅および配列決定するために、Ｖκマウスファミリーの各々を増幅するように設計された、３２個の５’Ｖκリーダー配列を含有するプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に対して特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用した。ラムダ軽鎖を含有する抗体では、増幅は、３つの５’ＶＬリーダー配列を、マウスラムダ定常領域に対して特異的な１つのリバースプライマーと組み合わせて使用して実施した。ＶＨ転写物およびＶＬ転写物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、以下の通りに、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して増幅した。各ハイブリドーマについて、４回はＶκ軽鎖についてであり、４回はＶγ重鎖についてである、のべ８回にわたるＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖プライマーまたはカッパ軽鎖プライマーのいずれかを０．５μＬ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄａｔａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより特注で合成された）、５倍濃度のＲＴ−ＰＣＲ緩衝液５μＬ、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素ミックス１μＬ、ならびにリボヌクレアーゼ阻害剤であるＲＮａｓｉｎ０．４μＬ（１単位）を含んだ。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間のＲＴステップに続いて、（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間）による３０サイクルであった。次いで、７２℃で１０分間にわたる最終インキュベーションが施された。
【０３７１】
抽出されたＰＣＲ産物は、上記のように、可変領域を増幅するためのプライマーと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。直接的なＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡは、５０μＬの滅菌水を使用して、それらをスピンカラムから溶出させ、次いで、両方の鎖から直接配列決定した（ＭＣＬＡＢ）。
【０３７２】
選択されたヌクレオチド配列は、最高度の配列相同性を有する、生殖細胞系列のＶ遺伝子、Ｄ遺伝子、およびＪ遺伝子のメンバーを同定するのに、ＩＭＧＴ配列解析ツール（http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html）を使用して解析した。これらの得られた配列を、特許権のある（proprietary）抗体配列データベースを使用する、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の、マウス生殖細胞系列データベースに対するアライメントにより、公知の生殖細胞系列のＩｇ  Ｖ領域およびＩｇ  Ｊ領域のＤＮＡ配列と比較した。
【０３７３】
マウス重鎖可変領域およびマウス軽鎖可変領域について得られた配列を、添付の配列表に提示するが、注釈を付けた形式では、このような配列に関して、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１４／１７８１０にも提示されている。
【０３７４】
（実施例３）
ヒト化抗ＤＬＬ３抗体の作製
実施例１の通りに作製された、ある特定のマウス抗体（ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４、およびＳＣ１６．５６と称する）を使用して、ヒトアクセプター抗体へのマウスＣＤＲグラフト化を含む、ヒト化抗体を得た。好ましい実施形態では、下記で記載される通り、本実施例で記載される、ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を、開示される、部位特異的コンジュゲート内に組み込むことができる。
【０３７５】
これに関しては、以下の通りに、特許権のあるコンピュータ支援ＣＤＲグラフティング法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）、および標準的な分子操作技法の補助により、マウス抗体をヒト化した。全ＲＮＡを、ハイブリドーマから抽出し、実施例２で示した通りに増幅した。マウス抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントに関するデータは、得られた核酸配列から得た。ヒトフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列の抗体配列の、フレームワーク配列およびＣＤＲのカノニカル構造と、選択されたマウス抗体のフレームワーク配列およびＣＤＲとの間の最高度の相同性に基づき、選択および／または設計した。解析を目的として、アミノ酸の、ＣＤＲドメインの各々への割当ては、Ｋａｂａｔらによる番号付けに従って行った。ヒト受容体可変領域のフレームワークを選択し、マウスＣＤＲと組み合わせてから、合成により（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、適切な制限部位を含む、統合型の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を作製した。
【０３７６】
次いで、ヒト化可変領域を、操作された全長重鎖および全長軽鎖の構成要素として発現させて、本明細書で記載される、部位特異的抗体をもたらした。より具体的に述べると、ヒト化抗ＤＬＬ３操作抗体は、当技術分野で認識された技法を使用して、以下の通りに作製した。抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のリーダー配列に対して特異的なプライマーセットは、以下の制限部位：ＶＨ断片のためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＶＬ断片のためのＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩを使用して設計した。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、制限酵素であるＶＨ断片のためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＶＬ断片のためのＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。ＶＨおよびＶＬの消化ＰＣＲ産物を精製し、それぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の発現ベクターまたはカッパＣＬヒト軽鎖定常領域の発現ベクターにライゲーションした。下記で詳細に論じられる通り、重鎖および／または軽鎖定常領域は、アセンブルされた抗体上で、部位特異的コンジュゲーション部位を提示するように操作することができる。
【０３７７】
ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの、消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物、ならびに２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡを有する総体積１０μＬ中で、以下の通りに実施した。コンピテントのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物で形質転換し、アンピシリンプレートに、１００μｇ／ｍＬの濃度で播種した。増幅されたライゲーション産物の精製および消化の後、ＶＨ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングするが、ここで、ＨｕＩｇＧ１発現ベクターおよび／またはＨｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクターは、天然の定常領域または操作された定常領域のいずれかを含みうる。
【０３７８】
ヒト化抗体は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターおよびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクターの共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１５０ｍｍプレート内の、１０％の熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の標準的条件下で培養した。一過性トランスフェクションのため、細胞を、８０％のコンフルエンシーまで成長させた。ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１ベクターＤＮＡおよびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−ＫａｐｐａベクターＤＮＡの各々１２．５μｇずつを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクション試薬に添加した。ミックスを、室温で３０分間にわたりインキュベートし、播種した。上清は、トランスフェクションの３〜６日後に採取した。８００×ｇで１０分間にわたる遠心分離により細胞片を除去して、組換えヒト化抗体を含有する培養物上清を、４℃で保存した。組換えヒト化抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。大スケールの抗体発現のためには、ＣＨＯ−Ｓ細胞を、１Ｌの体積中に一過性でトランスフェクトし、１ｍＬ当たりの細胞２．２×１０６個で播種した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、トランスフェクション試薬として使用した。抗体発現の７〜１０日後、遠心分離により細胞片を除去して、組換え抗体を含有する培養物上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性クロマトグラフィーで精製した。
【０３７９】
選択されたヒトアクセプター可変領域についての遺伝子組成を、ヒト化ＤＬＬ３抗体の各々について、すぐ下の表５に示す。表５に表示される配列は、対象クローンについて、図２Ａおよび２Ｂで示された、注釈を付けた重鎖配列および軽鎖配列に対応する。図２Ａおよび２Ｂで示された、相補性決定領域およびフレームワーク領域は、Ａｂｙｓｉｓデータベース（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）の特許権のあるバージョンを使用して、Kabatら（上掲）に従って定義されることに注意されたい。
【０３８０】
より具体的に述べると、下記の表５のエントリーは、配列番号３８９および３９１（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号３９３および３９５（ｈＳＣ１６．１５）、配列番号３９７および３９９（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号４０１および４０３（ｈＳＣ１６．３４）、および配列番号４０５および４０７（ｈＳＣ１６．５６）に示される連続的な可変領域配列に対応する。遺伝子組成のほか、表５は、これらの選択された実施形態では、選択された抗体の好適な結合特性を維持するのに、フレームワークの変化も、復帰変異も必要ではなかったことも示す。当然ながら、他のＣＤＲグラフト化構築物内では、このようなフレームワークの変化または復帰変異が所望される可能性があり、それ自体、本発明の範囲内にあるものとして、明白に意図されることが認識される。
【表５】
2016531914.tif 000025
【０３８１】
フレームワーク領域内では、残基を変化させなかったが、ヒト化クローンのうちの１つ（ｈＳＣ１６．１３）では、安定性の懸案事項に対処するために、変異を、重鎖ＣＤＲ２に導入した。修飾されたＣＤＲを有する抗体の結合親和性を評価して、対応するマウス抗体のいずれとも同等であることを確認した。
【０３８２】
全ての選択された抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化の後、結果として得られる、軽鎖可変領域アミノ酸配列および重鎖可変領域アミノ酸配列について解析して、マウスドナーおよびヒトアクセプターの軽鎖可変領域および重鎖可変領域に関するそれらの相同性を決定した。すぐ下の表６に示される結果により、ヒト化構築物は、一貫して、マウスドナー配列に関する相同性より高度な相同性を、ヒトアクセプター配列に関して呈示したことが明らかにされる。より特定すると、マウス重鎖可変領域およびマウス軽鎖可変領域は、ヒト化抗体とドナーハイブリドーマのタンパク質配列との相同性（７４％〜８３％）と比較して、ヒト生殖細胞系列遺伝子による最も厳密なマッチと同様な、全体的相同性の百分率（８５％〜９３％）を示す。
【表６】
2016531914.tif 000026
【０３８３】
試験により、得られたヒト化構築物の各々は、マウス親抗体により示される結合特徴とほぼ同等な、好適な結合特徴を呈示した。
【０３８４】
（実施例４）
部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の作製
４つの操作されたヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を構築した。４つの操作された抗体のうちの２つは、天然の軽鎖定常領域を含み、重鎖内の変異であって、軽鎖内のシステイン２１４と鎖間ジスルフィド結合を形成する、重鎖の上部ヒンジ領域内のシステイン２２０（Ｃ２２０）を、セリンで置換する（Ｃ２２０Ｓ）か、または除去する（Ｃ２２０Δ）変異を有した。残りの２つの操作された抗体は、天然の重鎖定常領域と、変異させた軽鎖であって、軽鎖のシステイン２１４を、セリンで置換する（Ｃ２１４Ｓ）か、または除去した（Ｃ２１４Δ）軽鎖とを含んだ。アセンブルされると、重鎖と軽鎖とは、治療剤へのコンジュゲーションに適する、２つの遊離システインを含む抗体を形成する。例示的なＳＣ１６．５６構築物の各々について、抗体重鎖および抗体軽鎖のアミノ酸配列は、図３Ａおよび３Ｂに示すが、すぐ下の表７では、変化についてまとめる。図３Ａおよび３Ｂに関して述べると、反応性システインに、重鎖については２２０位において、軽鎖については２１４位において変異させた残基（ｓｓ１内およびｓｓ４内の）と同様に下線を付す。そうでないことが注記されない限りにおいて、定常領域残基の全ての番号付けは、Kabatらにおいて示されるＥＵ番号付けスキームに従う。
【表７】
2016531914.tif 000027
【０３８５】
操作された抗体は、以下の通りに作製した。
【０３８６】
実施例３で示した通りに得られるヒト化抗ＤＬＬ３抗体であるｈＳＣ１６．５６の軽鎖（配列番号１４）または重鎖（配列番号１５）をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅および部位特異的変異誘発のための鋳型として使用した。部位特異的変異誘発は、製造業者の指示に従い、Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
【０３８７】
２つの重鎖変異体については、ｈＳＣ１６．５６の変異体であるＣ２２０Ｓ重鎖またはＣ２２０Δ重鎖をコードするベクターを、ｈＳＣ１６．５６の天然のＩｇＧ１カッパ軽鎖と共に、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトし、哺乳動物一過性発現系を使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体またはＣ２２０Δ変異体を含有する、操作された抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、それぞれ、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（配列番号１６および１４）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ２（配列番号１７および１４）と称した。
【０３８８】
２つの軽鎖変異体については、ｈＳＣ１６．５６の変異体であるＣ２１４Ｓ軽鎖またはＣ２１４Δ軽鎖をコードするベクターを、ｈＳＣ１６．５６の天然のＩｇＧ１重鎖と共に、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共トランスフェクトし、哺乳動物一過性発現系を使用して発現させた。操作された抗体は、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）を使用して精製し、適切な緩衝液中で保存した。Ｃ２１４Ｓ変異体またはＣ２１４Δ変異体を含有する、操作された抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、それぞれ、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３（配列番号１５および１８）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ４（配列番号１５および１９）と称した。
【０３８９】
操作された抗ＤＬＬ３抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴づけて、適正な変異体が作製されたことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の、あらかじめ成型された、１０％のトリス−グリシンミニゲル上で、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）など、還元剤の存在下および非存在下で実行した。電気泳動の後、ゲルを、コロイド状クマシー溶液で染色した。
【０３９０】
２つの重鎖（ＨＣ）変異体である、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（Ｃ２２０Ｓ）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ２（Ｃ２２０Δ）、ならびに２つの軽鎖（ＬＣ）変異体である、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３（Ｃ２１４Ｓ）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ４（Ｃ２１４Δ）のバンドパターンを観察した。還元条件下では、各抗体について、遊離ＬＣおよび遊離ＨＣに対応する２つのバンドが観察された。このパターンは、還元条件下のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下では、４つの操作された抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ｈＳＣ１６．５６ｓｓ４）は、天然のＩｇＧ分子と異なるバンドパターンを呈示したことから、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の非存在が示された。４つの変異体全ては、ＨＣ−ＨＣ二量体に対応する９８ｋＤあたりのバンドを呈示した。ＬＣ上の欠失または変異を有する変異体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３、およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ４）は、遊離ＬＣに対応する２４ｋＤあたりの単一のバンドを呈示した。重鎖上に欠失または変異を含有する操作された抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１、およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ２）は、遊離ＬＣに対応する微弱なバンドと、ＬＣ−ＬＣ二量体に対応する４８ｋＤ近傍における主要なバンドとを有した。ｓｓ１構築物およびｓｓ２構築物については、各軽鎖のＣ末端上の遊離システインに起因して、いくらかの量のＬＣ−ＬＣ種の形成が予測される。
【０３９１】
（実施例５）
部位特異的抗体のコンジュゲーション
部位特異的コンジュゲーションを実証するために、ＰＢＤを含むリンカー−薬物とのコンジュゲーションの前に、上記の実施例４で示した通りに作られた部位特異的抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１）を、ＤＴＴを使用して完全に還元するか、またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を使用して部分還元した。そうでないことが注記されない限りにおいて、以下の全ての実施例では、ＰＢＤ５を使用した。
【０３９２】
プロセスの概略図は、図４で見ることができる。この構築物のための標的コンジュゲーション部位は、各軽鎖定常領域上の不対合システイン（Ｃ２１４）である。コンジュゲーション効率（オンターゲットコンジュゲーションおよびオフターゲットコンジュゲーション）は、軽鎖上のオンターゲットコンジュゲーションを、重鎖上のオフターゲットコンジュゲーションと対比して追跡しうる、逆相（ＲＰ−ＨＰＬＣ）アッセイを使用してモニタリングすることができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）アッセイは、薬物対抗体比（ＤＡＲ）種の分布をモニタリングするのに使用しうる。本実施例では、所望の生成物は、逆相クロマトグラフィーにより決定される通り、軽鎖上に最大限にコンジュゲートさせ（オンターゲット）、過剰コンジュゲート（ＤＡＲ＞２）種を最小化する一方で、ＤＡＲ＝２の種を最大化するＡＤＣである。
【０３９３】
ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１の異なる調製物を、１０ｍＭのＤＴＴの４０モル当量を添加することにより完全に還元するか、または１０ｍＭのＴＣＥＰの２．６モル当量を添加することにより部分還元した。
【０３９４】
１０ｍＭのＤＴＴで還元された試料を、室温で、一晩にわたり（＞１２時間）還元してから、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）、および１０ダイアボリューム（diavolume）に相当する緩衝液交換を使用して、トリスｐＨ７．５緩衝液に緩衝液交換した。次いで、結果として得られる完全還元調製物を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に、１０ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）の４．０モル当量を添加することにより再酸化させた。試料の遊離チオール濃度（エルマン法により測定される、抗体当たりの遊離チオールの数）は、１．９〜２．３の間であり、抗体の遊離システインを、マレイミドリンカーを介して、室温で最小限の３０分間にわたり、ＰＢＤ細胞毒素にコンジュゲートさせた。次いで、水中で調製された１０ｍＭの原液を使用して、１．２モル過剰量のＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応をクエンチした。最小限のクエンチング時間である２０分後、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを、６．０に調整した。次いで、抗体−ＰＢＤの多様なコンジュゲート調製物を、３０ｋＤａの膜を使用するダイアフィルトレーションにより、２０ｍＭのヒスチジンクロリドｐＨ６．０への緩衝液交換を行った。
【０３９５】
１０ｍＭのＴＣＥＰで部分還元された試料を、室温で、最小限の９０分間にわたり還元した。試料の遊離チオール濃度が、１．９〜２．３の間となったら、部分還元された抗体を、ここでもまた、マレイミドリンカーを介して、室温で最小限の３０分間にわたり、ＰＢＤにコンジュゲートさせた。次いで、水中で調製された１０ｍＭの原液による、１．２モル過剰量のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最小限のクエンチング時間である２０分後、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを、６．０に調整した。次いで、コンジュゲート抗体−ＰＢＤ調製物を、３０ｋＤａの膜を使用するダイアフィルトレーションにより、２０ｍＭのヒスチジンクロリド（histidine  chloride）ｐＨ６．０への緩衝液交換を行った。
【０３９６】
オンターゲット軽鎖コンジュゲーションの百分率を決定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、最終の抗体−薬物調製物（ＤＴＴで還元された調製物およびＴＣＥＰで還元された調製物の両方）を解析して、重鎖コンジュゲーション部位を、軽鎖コンジュゲーション部位と対比して定量した（図５）。解析では、移動相Ａとしての、水中０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ、および移動相Ｂとしての９０％ｖ／ｖのアセトニトリル中０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを用いる、Ａｅｒｉｓ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ  ３．６μｍ  Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた。試料は、解析の前に、ＤＴＴで完全還元し、次いで、カラム上に注入し、ここで、３０〜５０％にわたる勾配の移動相Ｂを、１０分間にわたり適用した。２１４ｎｍにおけるＵＶシグナルを収集し、次いで、重鎖および軽鎖のコンジュゲーションの程度を計算するのに使用した。
【０３９７】
より特定すると、ＤＴＴおよびＴＣＥＰを使用してコンジュゲートさせたｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＰＢＤ内の、重鎖と軽鎖との間のペイロードの分布を、図５に示す。重鎖上および軽鎖上のコンジュゲーションパーセントは、既に確立されたピーク（軽鎖、軽鎖＋１つの薬物、重鎖、重鎖＋１つの薬物、重鎖＋２つの薬物など）のＲＰ−ＨＰＬＣ曲線下面積を積分し、コンジュゲート％を各鎖について個別に計算することにより得られた。本明細書を通して論じられる通り、本発明の選択された実施形態は、ペイロードの軽鎖上の配置に好適なコンジュゲーション手順を含む。
【０３９８】
また、同じ調製物について、ＨＩＣを使用しても解析して、ＤＡＲ＝２の種の量を、望ましくないＤＡＲ＞２の種と比べて決定した（図６）。これに関して、ＨＩＣは、移動相Ａとしての、水中１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび２５ｍＭのリン酸カリウム、ならびに移動相Ｂとしての、水中０．２５％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳおよび２５ｍＭのリン酸カリウムを用いるＰｏｌｙＰＲＯＰＹＬ  Ａ  ３  μｍカラム（ＰｏｌｙＬＣ）を使用して実行した。試料は、カラム上に直接注入し、ここで、０〜１００％にわたる勾配の移動相Ｂを、１５分間にわたり適用した。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを収集し、クロマトグラムを、非コンジュゲート抗体および高ＤＡＲ種について解析した。ＤＡＲの計算は、既に確立されたピーク（ＤＡＲ＝０、ＤＡＲ＝１、ＤＡＲ＝２、ＤＡＲ＝４など）のＨＩＣ曲線下面積を積分し、各ピークの％を計算することにより実施した。結果として得られる、ＤＴＴおよびＴＣＥＰを使用してコンジュゲートさせたｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＰＢＤ内のＤＡＲ分布を、図６に示す。
【０３９９】
ｈＳＣ１６部位特異的コンジュゲート調製物についてのＨＩＣにより決定されるＤＡＲ分布は、ＤＴＴ／ＤＨＡＡによる完全還元および再酸化法が、約６０％のＤＡＲ＝２の種を結果としてもたらすのに対し、典型的なＴＣＥＰ部分還元法は、約５０％のＤＡＲ＝２を結果としてもたらすことを示す。完全還元および再酸化法はまた、望ましくない高ＤＡＲ＞２の種（２０〜２５％）も結果としてもたらすのに対し、ＴＣＥＰ部分還元法が結果としてもたらすＤＡＲ＞２の種は１０〜１５％である（図６）。ＴＣＥＰ部分還元は、低レベルのＤＡＲ＞２の種をもたらす一方で、ＤＡＲ＝２の種の百分率は５０％に過ぎないことに注意されたい。ＴＣＥＰ系におけるＤＡＲ＝２の種％を押し上げるなら、望ましくないＤＡＲ＞２の種の対応する増加も結果としてもたらされるであろう。ＤＴＴ／ＤＨＡＡ完全還元試料では、高ＤＡＲ種の増加は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより示される通り、重鎖上の高オフターゲットコンジュゲーションに帰することができ（図５）、これは、還元の駆動力を増加させるときの、ヒンジ領域におけるシステイン残基の非特異的還元に起因する。したがって、開示される、部位特異的構築物が、天然の抗体と比べて、ＤＡＲの改善および望ましくない高ＤＡＲ不純物の減少をもたらすのに対し、従来の還元法は、意図される操作された部位と異なるシステイン残基上に細胞傷害剤を含む、少なくともいくらかの非特異的コンジュゲートを作製する。
【０４００】
（実施例６）
選択的な還元プロセスを使用する、操作された抗体のコンジュゲーション
コンジュゲーションの特異性および最終生成物の均質性をさらに改善するために、実施例４で示した通りに作られた、部位特異的抗体を、ＰＢＤを含むリンカー−薬物とのコンジュゲーションの前に、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含む新規のプロセスを使用して、選択的に還元した。上記で論じた通り、選択的なコンジュゲーションでは、遊離システイン上のＰＢＤを、優先的にコンジュゲートさせるので、非特異的コンジュゲーションは少ない。
【０４０１】
実施例４によれば、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１構築物の標的コンジュゲーション部位は、各軽鎖上の不対合システインである。コンジュゲーションを、これらの操作された部位に指向させるために、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１の調製物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中、室温で最小限の１時間にわたり部分還元した。加えて、対照として、各抗体調製物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の緩衝液中、および２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＧＳＨ、ｐＨ８．２の緩衝液中で、１時間またはこれを超えて、個別にインキュベートした。次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して、全ての調製物を、２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液への緩衝液交換を行った。結果として得られる部分還元調製物（アルギニンおよびグルタチオンを併せた中でインキュベートされた試料について）の遊離チオール濃度は、１．９〜２．３の間であり、次いで、全ての調製物を、マレイミドリンカーを介して、室温で最小限の３０分間にわたり、ＰＢＤにコンジュゲートさせた。次いで、水中で調製された１０ｍＭの原液を使用する、１．２モル過剰量のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最小限のクエンチング時間である２０分後、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを、６．０に調整した。次いで、抗体−ＰＢＤの多様なコンジュゲート調製物を、３０ｋＤａの膜を使用するダイアフィルトレーションにより、２０ｍＭのヒスチジンクロリド、ｐＨ６．０にダイア濾過した。
【０４０２】
オンターゲット軽鎖コンジュゲーションの百分率を決定するために、既に論じた通りに、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、最終の抗体−薬物調製物を解析して、重鎖コンジュゲーション部位を、軽鎖コンジュゲーション部位と対比して定量した（図７）。試料はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用しても解析して、ＤＡＲ＝２の種の量を、望ましくないＤＡＲ＞２の種と比べて決定した（図８）。比較の目的で、ＤＴＴ／ＤＨＡＡおよびＴＣＥＰで還元された試料について、上記の実施例で得られた結果を、図７および８に含める。ＥＤＴＡ／ＧＳＨ対照についてのＨＩＣ解析は、図９に提示するが、ここでは、それらを、選択的に還元された試料の隣に示す。
【０４０３】
図７および８では、選択的還元プロセスを使用して還元された抗体の、ＨＩＣによるＤＡＲ分布およびコンジュゲート軽鎖％について、標準的な完全還元プロセスまたは部分還元プロセス（実施例６で記載した）と比較してまとめる。操作された構築物と組み合わせた選択的なコンジュゲーション法の利益は、たやすく明らかであり、所望の軽鎖コンジュゲーション部位に対する優れた選択性を結果としてもたらし（図７）、６０〜７５％の平均ＤＡＲ＝２レベルをもたらす一方で、望ましくないＤＡＲ＞２の種が１５％を下回るように維持する（図８）。図７および８に示される結果により、選択的還元は、標準的な部分還元手順または完全還元手順よりより高レベルのＤＡＲ＝２と、所望されないＤＡＲ＞２の種の減少をもたらすように、反応を駆動することが実証される。図９に示される対照手順は、穏やかな還元剤（例えば、ＧＳＨ）が、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）の非存在下では、所望のコンジュゲーションをもたらしえなないことを実証する。図９に示される対照手順は、穏やかな還元剤（例えば、ＧＳＨ）が、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）の非存在下では、所望のコンジュゲーションをもたらしえないことを実証する。
【０４０４】
これらのデータは、選択的還元が、従来の部分還元および完全還元によるコンジュゲーション法を凌駕する利点をもたらすことを実証する。これは、新規の選択的還元手順を、不対合（または遊離）システイン残基をもたらすように操作された抗体と共に使用する場合に特に当てはまる。安定化剤と組み合わせた穏やかな還元（すなわち、選択的還元）が、多様なリンカー−薬物にたやすくコンジュゲートする安定的な遊離チオールをもたらすのに対し、ＤＨＡＡによる再酸化は、時間感受性であり、ＴＣＥＰによる還元は、特に、本明細書で記載される操作された構築物では成功しなかった。
【０４０５】
（実施例７）
異なる系による選択的還元
安定化剤と還元剤との多様な組合せを使用する選択的還元の利点をさらに実証するため、コンジュゲーションの前に、異なる安定化剤（例えば、Ｌ−リシン）を、異なる穏やかな還元剤（例えば、Ｎ−アセチル−システインまたはＮＡＣ）と組み合わせて使用して、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１を選択的に還元した。
【０４０６】
ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１の３つの調製物を、３つの異なる緩衝液系：（１）１ＭのＬ−アルギニン／６ｍＭのＧＳＨ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、（２）１ＭのＬ−アルギニン／１０ｍＭのＮＡＣ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、および（３）１ＭのＬ−リシン／５ｍＭのＧＳＨ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を使用して、選択的に還元した。加えて、対照として、抗体調製物を、２０ｍＭのトリス／５ｍＭのＥＤＴＡ／１０ｍＭのＮＡＣ、ｐＨ８．０緩衝液中、および２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＧＳＨ、ｐＨ８．２緩衝液中で、個別にインキュベートした。全ての調製物を、室温で最小限の１時間にわたりインキュベートし、次いで、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用するダイアフィルトレーションにより、２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液への緩衝液交換を行った。次いで、結果として得られる選択的還元調製物であって、遊離チオール濃度が１．７〜２．４の間であることが見出される調製物を、マレイミドリンカーを介して、ＰＢＤにコンジュゲートさせた。コンジュゲーション反応を、室温で最小限の３０分間にわたり進行させた後で、１０ｍＭの原液を使用する、１．２モル過剰のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最小限のクエンチング時間である２０分後、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを、６．０に調整した。次いで、抗体−ＰＢＤの多様なコンジュゲート調製物を、３０ｋＤａの膜を使用するダイアフィルトレーションにより、２０ｍＭのヒスチジンクロリドｐＨ６．０への緩衝液交換を行った。次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、最終の抗体−薬物調製物を解析して、ＤＡＲ分布を決定した（図１０Ａおよび１０Ｂを参照されたい）。
【０４０７】
ＨＩＣにより決定されるＤＡＲ分布は、用いられた３つの異なる選択的還元系（Ａｒｇ／ＧＳＨ、Ｌｙｓ／ＧＳＨ、およびＡｒｇ／ＮＡＣ）について、類似の結果を示す。より特定すると、ＤＡＲ＝２レベルは、異なる調製物について、６０〜６５％であり、高ＤＡＲ種（ＤＡＲ＞２）は、全ての選択的還元系について２０％を下回るように維持され、リンカー−薬物の組合せは、軽鎖の定常領域内の操作されたシステイン残基に対する高い選択性を示した。ここでもまた、実施例６で既に示した通り、穏やかな還元剤単独（例えば、ＧＳＨまたはＮＡＣ）では、十分なコンジュゲーション選択性がもたらされないのに対し、安定化剤を添加する結果として、顕著な改善がもたらされる。
【０４０８】
（実施例８）
高度に均質な抗体−薬物コンジュゲート調製物の生成
さらに、部位特異的抗体−薬物コンジュゲートのＤＡＲの均質性を増加させ、このような均質な調製物では、治療指数および毒性プロファイルが改善されることを実証するために、分取疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、開示されるコンジュゲーション手順により作製された、異なるＤＡＲ種を分離した。
【０４０９】
ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１の調製物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中、室温で最小限の１時間にわたり、選択的に還元した。次いで、３０ｋｄの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して、調製物を、２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液への緩衝液交換を行った。次いで、結果として得られる調製物であって、遊離チオール濃度が２．４と測定される調製物を、マレイミドリンカーを介して、ＰＢＤにコンジュゲートさせた。コンジュゲーションを、室温で最小限の３０分間にわたり進行させてから、１０ｍＭの原液を使用する、１．２モル過剰のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。少なくとも２０分間にわたる反応のクエンチングの後で、０．５Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを、６．０に調整した。次いで、コンジュゲート抗体調製物を、高塩濃度の緩衝液で希釈して、ロード（load）の伝導度を、１００±２０ｍＳ／ｃｍに増加させ、次いで、Ｂｕｔｙｌ  ＨＰ樹脂クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にロードした。次いで、緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸カリウム、１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６）、および緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６）を使用する、降下塩勾配を用いて、疎水性に基づき、異なるＤＡＲ種を分離したところ、ＤＡＲ＝０の種がまず溶出し、続いて、ＤＡＲ＝１、ＤＡＲ＝２が溶出し、次いで、高ＤＡＲ種が溶出した。
【０４１０】
オンターゲット軽鎖コンジュゲーションの百分率を、供給源材料と比較して決定するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、最終の抗体−薬物「ＨＩＣ精製ＤＡＲ＝２」調製物を解析して、重鎖コンジュゲーション部位を、軽鎖コンジュゲーション部位と対比して定量した（図１１Ａ）。試料はまた、ＤＡＲ＝２の種の量を、望ましくないＤＡＲ＞２の種と比べて決定するために、解析用疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用しても解析し、分布もまた、供給源材料と比較した（図１１Ｂ）。
【０４１１】
ＨＩＣ精製プロセスは、９５％を超えるＤＡＲ＝２レベルのほか、９０％を超える軽鎖コンジュゲーションレベルも結果としてもたらしたことから、コンジュゲーションが、軽鎖定常領域のＣ末端上の、所望の遊離システイン残基に実質的に制限された、最終試料中の高度の均質性が示される。この精製プロセスは、複数のスケールで実行して成功し（データは示さない）、ミリグラム〜グラムのスケールで、再現可能な、高いＤＡＲ＝２レベルおよび高い軽鎖コンジュゲーションレベルを達成した。下記の実施例で記載される通り、プロセスは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける毒性研究のための材料を作製するように実行することに成功した。このプロセスは、さらに、スケールアップすることができ、治療用材料を生成するためのＧＭＰプロセスで実行しうることが認識される。
【０４１２】
（実施例９）
部位特異的構築物は、結合特徴を保持する
上記の実施例で示した通りに作られる、部位特異的抗ＤＬＬ３抗体およびＡＤＣを、ＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングして、それらがＤＬＬ３の精製タンパク質に結合するのかどうかを決定した。非操作親抗体を、コンジュゲート形態および非コンジュゲート形態で、対照として使用し、部位特異的抗ＤＬＬ３抗体および抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートと並べて処理した。抗体のＤＬＬ３への結合性は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせた、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるレポーター抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、型番ＳＢ９０５２−０５）であって、ヒトＩｇＧ１分子上に存在するエピトープに結合するレポーター抗体により検出した。ＡＤＣ（部位特異的ＡＤＣまたは従来型ＡＤＣ）の、ＤＬＬ３への結合性は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせたＲ３．５６抗体であって、ＡＤＣ上の薬物リンカーに結合するＲ３．５６抗体により検出した。ＨＲＰは、その基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応する。加水分解されたＴＭＢの量は、ＤＬＬ３に結合した被験物品の量と正比例する。
【０４１３】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの精製ＤＬＬ３でコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。過剰量のタンパク質は、洗浄することにより除去し、ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間にわたりブロッキングした。洗浄後、ＰＢＳＴ中で系列希釈した抗体またはＡＤＣ、１００μＬ／ウェルを、室温で１時間にわたり添加した。プレートを、再度洗浄し、ＰＢＳＴ中０．５ｕｇ／ｍｌの適切なレポーター抗体、１００μＬ／ウェルを、室温で１時間にわたり添加した。さらなる洗浄の後で、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μＬ／ウェルを、室温で１５分間にわたり添加することにより、プレートを発色させた。等体積の２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させた。次いで、分光光度計により、ＯＤ４５０で、試料を解析した。
【０４１４】
ＥＬＩＳＡの結果を、図１２Ａ（抗体）および１２Ｂ（ＡＤＣ）に示す。データの精査により、軽鎖定常領域上に遊離システインをもたらすように重鎖ＣＨ１ドメインを操作しても、抗体の標的抗原への結合性に有害な影響は及ばなかったことが実証される。多様な部位特異的構築物を用いて実行された同様のアッセイ（データは示さない）は、遊離システインをもたらすように、軽鎖定常領域またはＣＨ１領域を操作しても、結果として得られる抗体またはＡＤＣの結合特徴には、ほとんど影響が及ばないことを示す。
【０４１５】
（実施例１０）
部位特異的コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用
部位特異的コンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＤＬＬ３抗原を発現する細胞を効果的に死滅させる能力を実証するアッセイを行った。これに関して、アッセイでは、抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲートが、ヒトＤＬＬ３を発現するように操作したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を死滅させる能力を測定する。このアッセイでは、殺滅は、ＡＤＣ（部位特異的ＡＤＣまたは対照ＡＤＣ）の、細胞表面上のそのＤＬＬ３標的への結合に続く、ＡＤＣの内部移行を要する。内部移行されると、リンカー（上記に記載したＶａｌ−Ａｌａプロテアーゼ切断型リンカー）は、細胞の内部で切断され、ＰＢＤ毒素を放出し、細胞死をもたらす。細胞死は、細胞生存率のサロゲートとしてのＡＴＰ含量を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を使用して測定する。
【０４１６】
具体的には、１０％のウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ完全培地）中に、ウェル当たりの細胞５００個を、抗体薬物コンジュゲートを添加する１日前に、９６ウェル組織培養処理プレートに播種した。播種の２４時間後、細胞を、ＤＭＥＭ完全培地中で系列希釈した、ＳＣ１６．５６−ＰＢＤ対照またはＳＣ１６．５６  ｓｓ１−ＰＢＤで処理した。細胞を、処理後９６時間にわたり培養し、その後、製造業者の指示に従い、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞数を数え上げた。
【０４１７】
図１３に例示する通り、ＳＣ１６．５６−ＰＢＤおよびＳＣ１６．５６ｓｓ１−ＰＢＤのいずれも、１．０ｐＭを下回るＡＤＣ濃度で、細胞を死滅させるのに有効であることが分かった。これらのデータは、従来の抗ＤＬＬ３  ＰＢＤコンジュゲートおよび抗ＤＬＬ３部位特異的ＰＢＤコンジュゲートのいずれも、治療レベルで致死性であることを示す。
【０４１８】
（実施例１１）
血清中の部位特異的コンジュゲートの安定性
本発明の部位特異的コンジュゲートによりもたらされる安定性の改善を実証するために、選択されたコンジュゲートを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト血清に、長時間にわたり曝露した。ＡＤＣの分解を、経時的に測定して、図１４Ａに示されるデータをもたらした。
【０４１９】
より具体的には、各々が同じＰＢＤ細胞毒素を含むＳＣ１６  ＡＤＣおよびＳＣ１６ｓｓ１  ＡＤＣを、商業的に得られるヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）に添加し、５％のＣＯ２、３７℃で、長時間にわたりインキュベートした。試料は、添加の０、２４、４８、９６、および１６８時間後に回収し、総抗体含量およびＡＤＣレベルの両方を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、安定性を測定した。
【０４２０】
総抗体含量の測定に関して述べると、ＥＬＩＳＡは、コンジュゲートＳＣ１６抗体またはコンジュゲートＳＣ１６ｓｓ１抗体および非コンジュゲートＳＣ１６抗体または非コンジュゲートＳＣ１６ｓｓ１抗体の両方を検出するように構成する。このアッセイでは、細胞毒素をコンジュゲートさせるかまたはさせない、ＳＣ１６およびＳＣ１６ｓｓ１を、特異的に捕捉および検出する抗イディオタイプ抗体の対を用いる。アッセイは、感度および直線性を増加させるために電気化学発光を使用する、ＭＳＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を使用して機械的に行う。
【０４２１】
この目的で、ＭＳＤ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  Ｐｌａｔｅを、２ｕｇ／ｍｌの捕捉用抗イディオタイプ（ＩＤ−１６）抗体により、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＰＢＳＴ中に３％のＢＳＡ  １５０ｕＬでブロッキングした。ＡＤＣの検量曲線に加えて、２５ｕＬの血清試料を、プレートに添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後で、プレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、０．５ｕｇ／ｍＬのｓｕｌｆｏタグ付けされた検出用抗イディオタイプ（ＩＤ−３６）抗体２５ｕＬを、各ウェルに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ウェルあたり１５０ｕＬの１倍濃度のＭＳＤリード緩衝液を添加し、ＭＳＤリーダーで読み取った。
【０４２２】
図１４Ａのデータは、ヒト血清に初期に添加した全ＡＤＣについての、グラフ化された百分率である。図１４Ａは、ＳＣ１６およびＳＣ１６ｓｓ１（凡例では、ＳＣ１６  Ａｂ、およびＳＣ１６ｓｓ１  Ａｂ）の抗体レベルが、３７℃で１６８時間の経過にわたり、本質的に安定を維持することを示す。さらに、モニタリングにより、３３６時間後まで、総抗体濃度にほとんど変化がないことが示された（データは示さない）。
【０４２３】
総抗体濃度のモニタリングに加えて、回収された試料についても、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、残留する抗体薬物コンジュゲートのレベルを決定した。すなわち、アッセイでは、全般的に、すぐ上で記載した通りに、ＥＬＩＳＡ方法論を使用して、無傷のＳＣ１６−ＰＢＤおよびＳＣ１６ｓｓ１−ＰＢＤのレベルを測定する。しかし、上記のＥＬＩＳＡアッセイと異なり、このＥＬＩＳＡでは、１個または複数のＰＢＤ分子にコンジュゲートさせたＳＣ１６抗体またはＳＣ１６ｓｓ１抗体を定量するが、検出されたＡＤＣ上に実際存在する、ＰＢＤ分子の数を決定することができない。全抗体アッセイと異なり、このアッセイは、抗イディオタイプｍＡｂと、抗ＰＢＤ特異的ｍＡｂとの組合せを使用するものであり、非コンジュゲートＳＣ１６抗体を検出するものではない。
【０４２４】
このＥＬＩＳＡアッセイでもまた、ＭＳＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して、データを作成する。ＭＳＤ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｎｄ  Ｐｌａｔｅを、４ｕｇ／ｍＬの抗ＰＢＤ特異的ｍＡｂ（Ｒ３．５６）により、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＰＢＳＴ中３％のＢＳＡ  １５０ｕＬでブロッキングした。ＡＤＣの検量曲線に加えて、２５ｕＬの血清試料およびＱＣ試料を、プレートに添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後で、プレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、０．５ｕｇ／ｍＬのｓｕｌｆｏタグ付けされた検出用抗イディオタイプ抗体（ＩＤ−３６）２５ｕＬを、各ウェルに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ウェルあたり１５０ｕＬの１倍濃度のＭＳＤリード緩衝液を添加し、ＭＳＤリーダーで読み取った。試料についての１６８時間後までのデータを、図１４Ａ（凡例では、ＳＣ１６  ＡＤＣおよびＳＣ１６ｓｓ１  ＡＤＣ）に示す。
【０４２５】
図１４Ａのデータは、総抗体レベルと異なり、無傷の従来型ＡＤＣ（ＳＣ１６  ＡＤＣ）の濃度が、無傷の部位特異的ＡＤＣ（ＳＣ１６ｓｓ１  ＡＤＣ）の濃度より顕著に低下することを示す。このような結果は、ランダムなシステイン部位においてコンジュゲートさせたＡＤＣは、本明細書で開示される部位特異的コンジュゲートより急速に分解する傾向があることを示す。既に論じた通り、ＡＤＣの分解は、遊離細胞毒素から生じる非特異的毒性の増加をもたらし得、対応する治療指数を低下させる。
【０４２６】
（実施例１２）
血清中の、部位特異的コンジュゲートの、アルブミンへの移動
従来型ＡＤＣについては、血清中のアルブミンが、コンジュゲートさせた細胞毒素を滲出させ、これにより、非特異的細胞傷害作用を増加させることが注目されている。アルブミンへの移動により媒介される、部位特異的ＡＤＣの分解量を決定するために、ＳＣ１６−ＰＢＤおよびＳＣ１６ｓｓ１−ＰＢＤに曝露された血清中のアルブミン−ＰＢＤ（ｈＡｌｂ−ＰＢＤ）の量を測定するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。このＥＬＩＳＡでは、抗ＰＢＤ特異的ｍＡｂを使用して、ｈＡｌｂ−ＰＢＤを捕捉し、抗ヒトアルブミンｍＡｂを、検出抗体として使用する。遊離ＡＤＣは、ｈＡｌｂ−ＰＢＤと競合するので、試験の前に、血清試料から、ＰＢＤ  ＡＤＣを枯渇させなければならない。定量は、ｈＡｌｂ−ＰＢＤの検量曲線から外挿する。上記の実施例に加えて、このアッセイでも、ＭＳＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して、データを作成し、これを、図１４Ｂに示す。
【０４２７】
まず、血清試料に、ＳＣ１６−ＰＢＤまたはＳＣ１６ｓｓ１−ＰＢＤを、関連の対照と共に、１０μｇの最終濃度まで接種した。上記の実施例と同様に、試料は、添加の０、２４、４８、９６、および１６８時間後に採取した。
【０４２８】
アッセイについて述べると、ＭＳＤ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｎｄ  Ｐｌａｔｅを、４ｕｇ／ｍＬの抗ＰＢＤ特異的ｍＡｂ（Ｒ３．５６）により、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、２５ｕＬのＭＳＤ希釈剤２＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により、室温で３０分間にわたりブロッキングした。血清試料を、ＭＳＤ希釈剤２＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（１０ｕＬの血清＋９０ｕＬの希釈剤）中で１：１０に希釈し、２０ｕＬのＧＥ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂と共に、ボルテックスシェーカー上で、１時間にわたりインキュベートした。無傷のＳＣ１６−ＰＢＤまたはＳＣ１６ｓｓ１−ＰＢＤの、抗イディオタイプ抗体による枯渇の後で、９６ウェル３Ｍフィルタープレートを使用して、試料を、樹脂から分離した。次いで、ｈＡｌｂ−６．５の検量曲線に加えて、枯渇させた血清試料２５ｕＬを、ブロッキングされたプレートに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後で、プレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、ＭＳＤ希釈剤３＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０中で希釈した、１ｕｇ／ｍＬのｓｕｌｆｏタグ付けされた抗ヒトアルブミンｍＡｂ（Ａｂｃａｍ  ａｂ１０２４１）２５ｕＬを添加した。次いで、プレートを、１時間にわたりインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、１５０ｕＬの１倍濃度のＭＳＤリード緩衝液で読み取った。
【０４２９】
図１４Ｂは、回収された全てのＳＣ１６ｓｓ１  ＡＤＣ試料中で、ＳＣ１６をスパイクした試料中より、実質的に少量のｈＡｌｂ−ＰＢＤが検出されたことを示し、これにより、部位特異的コンジュゲートについては、アルブミンへの移動速度がより遅いことが示される。上記の実施例と同様に、このデータは、本発明の部位特異的コンジュゲートが、生理学的環境で、従来型コンジュゲートより安定であり、これにより、標的化されていない細胞毒素（例えば、ｈＡｌｂ−ＰＢＤ）により引き起こされる非特異的毒性の低減に少なくとも部分的に起因して、治療指数の改善を呈示することを意味する。
【０４３０】
（実施例１３）
部位特異的構築物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を実証する
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実行して、実施例１０で実証された、部位特異的構築物の細胞殺滅能を確認した。この目的で、上記の実施例で示した通りに調製された部位特異的ＤＬＬ３  ＡＤＣを、皮下の患者由来異種移植片（ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）（ＰＤＸ）による小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）腫瘍を保有する、免疫不全ＮＯＤＳＣＩＤマウスにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏの治療効果について調べた。より特定すると、抗ＤＬＬ３−ＰＢＤコンジュゲート（ＳＣ１６−ＡＤＣ）、ＨＩＣで精製された抗ＤＬＬ３−ＰＢＤコンジュゲート（ＳＣ１６−ＡＤＣＤ２）、およびＨＩＣで精製された部位特異的抗ＤＬＬ３−ＰＢＤコンジュゲート（ＳＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣＤ２）の各々を、３つの異なるＳＣＬＣモデルにおいて調べた。
【０４３１】
ＳＣＬＣ−ＰＤＸ細胞系である、ＬＵ１２９、ＬＵ６４、およびＬＵ１１７の各々を、解離された細胞接種材料として、乳房脂肪体領域近傍の皮下に注射し、カリパーで毎週測定した（楕円体体積＝ａ×ｂ２／２［式中、ａは、楕円の長径であり、ｂは、楕円の短径である］）。腫瘍が、２００ｍｍ３（範囲：１００〜３００ｍｍ３）の平均サイズまで成長した後で、マウスを、腫瘍体積の平均が等しい処置群（群当たりｎ＝５のマウス）に無作為化した。マウスを、腹腔内注射を介する、ビヒクル（滅菌水中５％のグルコース）、対照ヒトＩｇＧ１  ＡＤＣ（ＩｇＧ−ＡＤＣ；１ｍｇ／ｋｇ）、またはＳＣ１６−ＡＤＣ調製物（０．７５〜１．５ｍｇ／ｋｇ）による単回投与（１００μＬ）で処置し、治療効果は、毎週の腫瘍体積（上記の通りに、カリパーで）および体重測定値により評価した。個々のマウスまたは処置群についての評価項目の基準は、健康の評価（任意の疾病の徴候）、体重の減少（研究開始時から、２０％を超える体重の減少）、および腫瘍負荷（腫瘍体積＞１０００ｍｍ３）を含んだ。有効性は、群が約８００〜１０００ｍｍ３の平均に到達するまで、毎週の腫瘍体積測定値（ｍｍ３）によりモニタリングした。腫瘍体積は、処置群内の全てのマウスについての平均値の標準誤差を伴う平均として計算し、初回処置からの時間（日数）に対してプロットした。処置の結果を、図１５Ａ〜１５Ｃに描写するが、ここでは、処置群当たり５匹のマウスにおける、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を伴う平均腫瘍体積が示される。
【０４３２】
従来型戦略（ＳＣ１６−ＡＤＣまたはＳＣ１６−ＡＤＣＤ２）または部位特異的戦略（ＳＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣＤ２）のいずれかを使用してコンジュゲートさせたＤＬＬ３結合性ＡＤＣであって、ＨＩＣによる、抗体当たり２つの薬物分子を含有する分子種の精製（２つの調製物中の）を伴うＤＬＬ３結合性ＡＤＣについて、ＳＣＬＣ  ＰＤＸ−ＬＵ１２９（図１５Ａ；１．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤＸ−ＬＵ６４（図１５Ｂ；０．７５ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＤＸ−ＬＵ１１７（図１５Ｃ；０．７５ｍｇ／ｋｇ）を保有するマウスにおいて評価したところ、ＤＬＬ３結合性ＡＤＣのＨＩＣによる精製および／または部位特異的コンジュゲーションは、従来型のコンジュゲートＳＣ１６−ＡＤＣと同様の治療効果を有することが実証された。さらに、本実施例で使用される用量レベルなど、適切な用量レベルにより、ＳＣＬＣ  ＰＤＸ保有マウスにおける治癒応答を達成することができる。
【０４３３】
これらのモデルおよび施された用量において、部位特異的ＡＤＣ調製物および従来型ＡＤＣ調製物は、ＳＣＬＣ  ＰＤＸによる３つのマウスモデルで調べたところ、同等のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を有した。ＳＣＬＣ−ＰＤＸ腫瘍を保有するマウスにおける、ＤＬＬ３結合性ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性はまた、未精製ＡＤＣの治療効果を、ＤＡＲ２精製されたＡＤＣの治療効果と比較する場合にも同様であった。まとめると、部位特異的コンジュゲーション戦略およびＤＡＲ２精製法は、従来型の未精製ＡＤＣコンジュゲートと同等の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療有効性もたらす。
【０４３４】
（実施例１４）
部位特異的コンジュゲートは、毒性の低減を実証する
上記の実施例で作成された安定性データおよび有効性データに基づくと、本発明の部位特異的コンジュゲートは、好適な臨床プロファイルを呈示するようである。開示されるコンジュゲート調製物の治療指数を、さらに引き上げるために、それらの毒性プロファイルを記録する研究を行った。すぐ下でより詳細に論じられ、図１６Ａ〜１６Ｄに示される通り、研究は、抗ＤＬＬ３部位特異的コンジュゲートが、天然の抗ＤＬＬ３抗体コンジュゲートまたはＨＩＣで精製されたその調製物より良好に忍容される（例えば、同じ投与回数で死亡が見られないこと、皮膚毒性の発生率の低減、骨髄毒性の低減、リンパ系組織所見による重症度の低減など）ことを強く示唆した。この毒性の低減は、それが、顕著なより高用量投与および腫瘍部位における細胞毒素（例えば、ＰＢＤ）の対応するより高い局在化濃度をもたらすという点で、治療指数を実質的に増加させて有意義である。開示される、部位特異的コンジュゲートに期待される治療指数に基づくと、用量を増加させる（従来型の天然抗体コンジュゲートと比較して）一方で、毒性レベルを低下させるかまたは同様な毒性レベルを維持することが可能でありうる。
【０４３５】
研究に関して述べると、ＤＡＲ２精製された部位特異的ＡＤＣ（ＳＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣＤ２）の毒性を、従来型コンジュゲート（ＳＣ１６−ＡＤＣ）またはそのＤＡＲ２精製形（ＳＣ１６−ＡＤＣＤ２）の毒性と比較した。調製物の各々は、細胞毒素として含む。研究は、試験系として、カニクイザルを使用して実行した。この研究では、臨床徴候、体重、食物摂取、臨床病変（血液学、凝固、臨床化学、および尿検査）、毒性動態、肉眼的剖検所見、臓器重量、および組織病理学検査について、記録および比較した。
【０４３６】
生存曲線を、図１６Ａに、ＳＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣＤ２、ＳＣ１６−ＡＤＣ、およびＳＣ１６−ＡＤＣＤ２のそれぞれを投与された群の各々について示す。図１６Ａの精査により、生存は、同じ用量レベルおよび投与回数（ＡＤＣは、３週間ごとに、１．２５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで投与した）の部位特異的ＡＤＣで延長したことが示される。ＳＣ１６−ＡＤＣでは、瀕死からの安楽死により証拠立てられる通り、３匹中２匹のサルが、単回投与を忍容しなかった。１匹のサルは、従来型ＡＤＣの２回にわたる投与を完了した。ＳＣ１６−ＡＤＣＤ２では、瀕死からの安楽死により証拠立てられる通り、３匹中１匹のサルが、単回投与を忍容しなかった。残りの２匹中１匹のサルは、瀕死からの安楽死により証拠立てられる通り、２回にわたる投与を忍容しなかった。１匹のサルが、従来型ＡＤＣのＤＡＲ２精製形の、２回にわたる投与を完了した。逆に、ＳＣ１６ｓｓ１−ＡＤＣＤ２では、３匹のサル全てが、２回にわたる投与を忍容した。部位特異的ＡＤＣの３回目の投与の後、３匹中１匹のサルを、瀕死から安楽死させた。残りの２匹のサルは、部位特異的ＡＤＣの３回にわたる投与を完了し、研究を完了した。
【０４３７】
部位特異的ＡＤＣについては、図１６Ａに示される生存率に加えて、従来型ＡＤＣまたは従来型ＡＤＣのＤＡＲ２精製形と比較して、皮膚所見の軽減、良好な体重維持（図１６Ｂ）、骨髄毒性の低減（ヘモグロビンおよび好中球のカウントのそれぞれについて、図１６Ｃおよび１６Ｄ）、およびリンパ系組織所見による重症度の低減も見られた。まとめると、図１６Ａ〜１６Ｄに示される結果は、本発明の部位特異的コンジュゲートが呈示する毒性は、従来型のコンジュゲートＡＤＣより弱く、したがって、より良好な治療指数をもたらすことを示す。
【０４３８】
当業者は、本発明を、その精神または中心的な属性から逸脱せずに、他の具体的形態でも実施しうることをさらに認識する。本発明の上記の記載は、その例示的な実施形態だけを開示するという点で、他の変更も、本発明の範囲内にあるものとして意図されることを理解されたい。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載された、特定の実施形態に限定されるわけではない。そうではなくて、添付の特許請求の範囲への言及は、本発明の範囲および内容を示すものとしてなされるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016531914.tif 000049