(57)【要約】  本発明は、ジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒアルロン酸またはその一つの塩およびエンバク抽出物を含む組合せに関し、有利には、傷の治療および皮膚病変の修復用の組合せに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒアルロン酸またはその一つの塩およびエンバク抽出物を含む、組合せ。
【請求項２】
ヒアルロン酸がヒアルロン酸ナトリウムの断片の形態である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
ヒアルロン酸塩の断片の分子量が５０，０００〜７５０，０００Ｄａの間である、請求項２に記載の組合せ。
【請求項４】
エンバク抽出物がエンバクの苗から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項５】
ヒアルロン酸／エンバクの苗の抽出物／Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの重量比が、それぞれ２／１／３〜２／１／５の間である、請求項４に記載の組合せ。
【請求項６】
ヒアルロン酸／エンバクの苗の抽出物／Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの比率が、それぞれ、２／１／４の重量比である、請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
有利なケラチノサイト遊走用の局所使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項８】
皮膚病変の処置用の局所使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項９】
皮膚の治療および回復の改善用の局所使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１０】
活性成分として、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せを、皮膚科学的または化粧的に許容可能な賦形剤と共に含む、皮膚科学組成物または化粧組成物。
【請求項１１】
切り傷、縫合、かすり傷、引っ掻き傷、擦り傷、手術後の傷跡または美容皮膚科学的処置の後、表面的な火傷、日焼けの処置における使用のための、請求項１０の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、ジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒアルロン酸またはその一つの塩およびエンバク（oat）抽出物を含む相乗的組合せ、有利には、傷の治療および皮膚病変の修復用の組合せに関する。
【０００２】
背景技術
治癒は一連の局所的な防御現象であり、これは侵襲（外傷、火傷、皮膚科学的作用、外科的処置）後に生じる。血液および組織からの多数の活性産物がこれらの現象中に放出される（酵素、各種のタンパク質、ヒスタミン等）。治癒は幾つかの工程を含み、その最初は出血を止める血液の凝固である。血液からの白血球が死細胞を除去する。次いで、生存細胞が増殖し、新たな組織を生じさせ、その外観は病変部位に依存する。
【０００３】
治癒は幾つかの因子（特に、栄養、代謝、内分泌または薬剤治療）に依存し、栄養失調者または高齢者において、あるいはコルチコイドの長期摂取の場合において、治癒の遅れが観察される。加齢に伴い、実際に皮膚病変の治療および回復を改善するプロセスの効果は低くなり、当該プロセスはさらに遅くなる。
【発明の概要】
【０００４】
迅速かつ美的な皮膚病変の修復用の新規組成物の提案の必要性が、今もなお存在する。
【０００５】
文献に記載されている経口経路によって投与されるジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの薬理的特性は多数存在する。
【０００６】
中でも、ジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンは、スポーツする人々の運動(effort)後の回復を促進するためや、外科的処置後の入院期間を短縮するための栄養補助剤として経口的に使用されている。
【０００７】
当該ジペプチドは、グルタミン摂取を必要とする蘇生患者に対する非経口栄養に使用されるアミノ酸または他の混合物の標準溶液への補完として、非経口栄養においても推奨されている。
【０００８】
本発明において、本発明者らは、局所経路で使用されるジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンが、その修復特性（ケラチノサイトの遊走に対する作用）に基づき、皮膚に対する生物学的活性を有するという驚くべき態様を明らかにした。
【０００９】
さらに、本発明者らは当該ジペプチドを、エンバク抽出物およびヒアルロン酸と組合せた場合に当該活性が大幅に増強されることも明らかにした。
【００１０】
特に、本発明者らは、ケラチノサイトの遊走に対して、エンバク抽出物（より具体的にはエンバクの苗の抽出物）、ヒアルロン酸またはその一つの塩およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの３成分間に相乗作用が存在することを示した。当該活性は組織の修復および皮膚病変の治療において特に興味深い。
【００１１】
実際に、上皮細胞の遊走は、胚形成および治癒のような、組織修復の進行およびプロセスの重要な工程である。
【００１２】
細胞移動の開始、協調および停止の機構は完全に解明されていないが、細胞遊走の極めて重要な役割は十分に確立されている。当該細胞プロセスを刺激する能力のある幾つかの薬剤は、特定の材料または細胞質タンパク質のように特徴づけられてきた(SANTORO MM.,GAUDINO G.「Cellular and molecular facets of keratinocyte reepithelization during wound healing.」EXP.CELL.RES.304(1):274-286,2005)(WERNER S.,GROSE R.「Regulation of wound healing by growth factors and cytokines.」PHYSIOL.REV.83(3):835-870,2003)(STEFFENSEN B.,AKKINEN L.,LARIAVA H.「Proteolytic events of wound healing-coordinated interactions among matrix metallopteinases(MMPs),integrins,and extracellular matrix molecules.」CRIT.REV.ORAL BIOL.MED.12(5):373-398,2001)。
【００１３】
皮膚の治癒および慢性的な皮膚の炎症性疾患の間に、ケラチノサイトは遊走プロセスを開始するために「活性化」される。次いで、細胞は、一方では細胞外マトリックスとの相互作用によって、他方では細胞−細胞間相互作用によって、影響されるそれらの表現型を示す(MCMILLAN J.R.,AKIYAMA M.,SHIMIZU H.「Epidermal basement membrane zone component:ultrastructural distribution and molecular interactions.」J DERM SC.31:169-177,2003)。傷のバンク(bank)の基底層のケラチノサイトは創傷上に遊走し、それを覆う。実際に、ケラチノサイトは、基底層のフィブロネクチン、間質皮膚コラーゲン（１型）、４型コラーゲンおよびラミニン５と接触して活性化する。それらはまた、特定のポリペプチド成長因子（ＴＧＦβ、ＴＧＦαおよびＥＧＦ等）によって調節される。また、ケラチノサイトの活性化に続いて、サイトカイン（ＩＬ１、ＴＮＦα）およびケモカイン（ランテスおよびＩＬ８）もまた、創傷の再上皮化の速度を向上させるのに寄与する(SZABO I.,WETZEL M.A.,ROGERS TJ.「Cell-Density-Regulated Chemotactic Responsiveness of Keratinocytes In Vitro.」J INVEST DERMATOL 117:1083-1090,2001)。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】添付図面の一つは、ケラチノサイトの遊走に対するエンバクの苗の抽出物／ヒアルロン酸およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ならびにそれらの組合せの効果を図示する。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本発明の主題は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒアルロン酸またはその一つの塩およびエンバク抽出物を含む組合せである。
【００１６】
用語「Ｌ−アラニン」は、（Ｓ）−２−アミノプロパン酸を意味し、α−アミノプロピオン酸とも言う。Ｌ−アラニンは、わずかな非極性および疎水性の天然アミノ酸である。
【００１７】
用語「Ｌ−グルタミン」は２−アミノグルタラミン酸を意味する。Ｌ−グルタミンは、準必須の、極性非荷電および親水性のアミノ酸である。
【００１８】
本発明の具体的な実施態様において、組合せは、高分子量のヒアルロン酸またはその一つの塩を含む。好ましくは、分子量は５０，０００〜７５０，０００Ｄａの間、好ましくは２５０，０００〜４５０，０００Ｄａの間であろう。
【００１９】
ヒアルロン酸塩は、優先的にはヒアルロン酸ナトリウムであろう。
【００２０】
本発明の実施の形態によれば、ヒアルロン酸塩は、５０，０００〜７５０，０００Ｄａの間、好ましくは２５０，０００〜４５０，０００Ｄａの間の分子量を有するであろう。
【００２１】
本発明の実施態様において、エンバク抽出物は、エンバクの苗から、優先的にはＷＯ２０１０／０５４８７９に記載のようにして得られる。
【００２２】
「エンバクの苗(oat seedling)」とは、出穂前のエンバクという本発明の意味の範囲内であることを意味すると解釈され、これは、発芽後（発芽後、約２週〜２カ月）の段階であって、茎成長から出穂の段階を含まないことを言う。「茎成長」とは、開花前の、茎の成長および穂の形成中の膨らみに相当する成長期を示す。二次代謝産物は、エンバクの苗の抽出物の成分として特許出願ＷＯ２０１０／０５４８７９に記載されている（フラボノイドおよびアベナコシド型のサポニン）。前記抽出物は、２〜１５％のフラボノイドならびに０．２〜２％のアベナコシドＡおよびＢの存在によって特徴づけられる。
【００２３】
エンバク抽出物の調製方法は、次の通りであってよい：
・エンバク、好ましくはエンバクの苗の一部を乾燥し、粉砕する、
・ケトン類、エステル類、Ｃ１〜Ｃ４アルコール類およびこれら溶媒の任意の混和比率の混合物から構成される群から選択される有機溶媒で抽出、ならびに
・遠心分離またはろ過。
【００２４】
有利には、本発明の方法の有機溶媒は、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、Ｃ１〜Ｃ４アルコールおよびこれら溶媒の任意の混和比率の混合物から構成される群から選択される。
【００２５】
次いで、抽出工程によって得られる搾りかすを遠心分離またはろ過によって抽出液から分離し、溶液を、乾燥抽出物が得られるまで、おおよそ濃縮してよい。
【００２６】
本発明の実施の形態によれば、支持体を、乾燥工程中に、抽出乾燥物質に対する重量割合が１〜７５％まで変化し得るように添加してよい。支持体は、マルトデキストリン、乳糖のような糖類、シリカ、または任意の他の化粧品学的に許容可能な支持体であってよい。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、溶液は、６０〜８０％の乾燥物質、好ましくは７０％の乾燥物質を含む麦汁を得るために濃縮される。
【００２８】
具体的な実施態様において、本発明の組合せは、ヒアルロン酸／エンバク抽出物／Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの重量比が、それぞれ２／１／３〜２／１／５の間であることを特徴とする。
【００２９】
実施の別の形態において、ヒアルロン酸、エンバクの苗の抽出物およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの比率は、重量比でそれぞれ２／１／４である。
【００３０】
別の好ましい実施態様において、本発明の組成物は、ヒアルロン酸／エンバクの苗の抽出物／Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを、それぞれ２／１／４の比率で含む。
【００３１】
本発明の別の主題は、皮膚の完全性および質を回復するための皮膚修復の促進を目的とする新規な皮膚科学組成物または化粧組成物に関する。
【００３２】
本発明の組成物は、ヒアルロン酸、エンバク抽出物およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの前述の組合せを皮膚科学または化粧活性成分として含み、さらに少なくとも一つの皮膚科学的または化粧的に許容可能な賦形剤を含む。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様において、組成物は局所適用を目的とする。
【００３４】
皮膚科学的（薬学的）または化粧的に適合する賦形剤は、ミルク、クリーム、バーム、オイル、ローション、ゲル、フォーム状ゲル、軟膏、スプレー等の形態の局所適用組成物を得る観点から当業者に公知のものの中の任意の賦形剤であってよい。
【００３５】
好ましい実施態様において、組成物は、クリーム、軟膏の形態であろう。
【００３６】
実施態様において、本発明の組成物は少なくとも一つの他の活性成分を含む。
【００３７】
本発明の「活性成分」とは、皮膚科学または化粧品特性を有する任意の物質を意味するものと解釈される。
【００３８】
当該他の活性成分は、特に、治療剤、無痛化剤、痒み止め剤、抗老化剤、抗しわ剤、抗ラジカル剤、抗紫外線剤、皮膚高分子合成またはエネルギー代謝の刺激剤、保湿剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤を含む群から選択できる。
【００３９】
優先的には、治療剤および／または無痛化剤が使用されるだろう。
【００４０】
最後に、本発明の別の主題は、皮膚病変の処置および治療用の、ヒアルロン酸、エンバク抽出物およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの組合せに基づく組成物の使用に関する。
【００４１】
本発明は、さらに、有利なケラチノサイト遊走を目的とする組成物の調製のための、本発明のヒアルロン酸、エンバクの苗の抽出物およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの組合せに関する。
【００４２】
本発明の組成物は損傷を受けた皮膚のケアを目的とする：
・次の侵襲的な行為／処置：縫合を伴うまたは伴わない外科的行為（切除、剃毛）、凍結療法、レーザー切除、中程度または重度の剥皮、メソセラピー、掻爬
・表面の切り傷または火傷の外傷後
・皮膚の回復を促進する治療製品を必要とする次の表面的（非侵襲的）行為、これは長期間（完全に皮膚が修復されるまで）使用できる
・次のわずかな外観の変化：表面のかすり傷、日焼け
【００４３】
本発明の皮膚および粘膜の病変の処置は、特に、切り傷、縫合、かすり傷、引っ掻き傷、擦り傷、手術後の傷跡または美容皮膚科学的処置後、表面的な火傷、日焼けの処置を含み得る。
【００４４】
本発明は、さらに、皮膚の治療および修復の改善を目的とする、本発明の化粧組成物の使用に関する。
【００４５】
本発明は、その範囲を限定することなく示される以下の結果を読むことによって、より理解されるだろう。
【実施例】
【００４６】
ケラチノサイトの遊走に対する薬理学的評価
当該試験の目的は、Ｏｒｉｓ細胞遊走アッセイキット（プラティパス・テクノロジーズ）を使用して、ケラチノサイト遊走に対するヒアルロン酸、エンバクの苗の抽出物、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンおよびそれらの組合せの効果を評価することであった。
【００４７】
生物材料
文献中で参照モデルとして頻繁に引用される自然に不死化したＨａＣａＴヒトケラチノサイト系を使用した。
【００４８】
細胞遊走プロトコル
細胞遊走の検討で使用したプロトコルは、当該細胞プロセスの小型化および定量化を可能にする、９６ウェルキットのＯｒｉｓ細胞遊走アッセイ（プラティパス・テクノロジーズ−ＴＥＢＵ）の使用に基づく。
【００４９】
当該試験の原理は、９６ウェルプレートのウェルの中心に向かう細胞遊走を検討することからなる。直径２ｍｍの検出ゾーンを設けるために、ウェル中にストッパーを置くことからなる。次いで、細胞がその周辺の表面に適切に付着したらストッパーを取り除き、それにより細胞は検出ゾーンに向けて遊走が可能になる。ストッパーを取り除き活性成分を含むプレートを３７℃２４時間、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で培養する。ストッパーが存在していたゾーンに位置する細胞の量は細胞遊走の評価に従って解析された。マスクにより、当該ゾーンに位置する細胞の可視化かつ一意的な計数が可能になる。各条件について６〜８ウェルから平均を決定する。
細胞をＦＣＳ−フリー培地中で培養した。
【００５０】
試験製品
・ＥＧＦ：３３ｎｇ／ｍｌ
・エンバクの苗の抽出物：１０または３０μｇ／ｍｌ
［抽出物の調製：１００ｍｌのアセトン／水（８０／２０）（ｖ／ｖ）抽出溶媒で、１０ｇの粉砕された苗を抽出する；ろ過し、搾りかすを抽出溶媒でリンスする；アセトンを留去し、水相を取り出す；ろ過する；乾燥抽出物が得られるまで乾燥によって濃縮する］
・ヒアルロン酸ナトリウム（分子量２５０〜４５０ｋＤａ）：２０または６０μｇ／ｍｌ
・Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン：４０または９０μｇ／ｍｌ
【００５１】
結果の解析
結果を示す：
・遊走した細胞量に比例する蛍光強度（ＦＩ）
・対照（０％ＦＣＳ）と比較した活性の割合
【００５２】
【数１】
2016515642.tif 000002
【００５３】
統計解析
ダネット検定による統計解析を遊走の生データで行った。そして、当該検定は異なる条件で得られた結果の有意差を特徴付ける値である「ｐ値」を与える。有意水準を定めた：
ｐ＜０．０５（＊  有意差あり）
Ｐ＜０．０１（＊＊  かなり有意差あり）
Ｐ＜０．００１（＊＊＊  高い有意差あり）
Ｐ＞０．０５（有意差なし）
【００５４】
結果
ケラチノサイトの遊走に対する、エンバクの苗の抽出物、ヒアルロン酸およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの単独または組合せの効果について異なる濃度での結果を表１および２に記載し、また図１に表す。当該曲線で表される蛍光強度の値は、３つの独立した操作の代表的実験中に行われた６〜８の測定の平均に相当する。
【００５５】
ＤＭＥＭおよび０％ＦＣＳの存在中で、陽性対照であるＥＧＦの実験でケラチノサイトの遊走を実際に誘導する。これらの実験条件において、エンバクの苗の抽出物（１０または３０μｇ／ｍｌ）単独およびヒアルロン酸塩（２０または６０μｇ／ｍｌ）単独はいずれもケラチノサイトの遊走に対する顕著な効果は有さなかった。一方、これらの組合せは、遊走の増加傾向を示しているように見える：試験濃度に応じた対照と比較して＋４５％または＋２７％（表１および２）。
【００５６】
Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン単独は、濃度依存的にケラチノサイトの遊走を誘導する。これらの誘導はＥＧＦ陽性対照よりもさらに重要である。３つの活性成分（エンバクの苗の抽出物、ヒアルロン酸およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン）の組合せは、非常に重要かつ統計学的に有意にケラチノサイトの遊走を誘導する。表１および２ならびに図１は、これらの誘導が対照と比較して統計学的に有意であることを示すが、それは、エンバクの苗の抽出物およびヒアルロン酸単独またはそれらの組合せと比較しても統計学的に有意でもある。
【００５７】
添付の図１は、エンバクの苗の乾燥抽出物（ＥＳ）、ヒアルロン酸（ＡＨ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｕ）およびそれらの組合せのケラチノサイトの遊走に対する効果を示す。パーセンテージは、対照と比較した相加的な活性の割合に相当する。
【００５８】
【表１】
2016515642.tif 000003
【００５９】
【表２】
2016515642.tif 000004
【００６０】
結果的に、エンバクの苗の抽出物、ヒアルロン酸またはその一つの塩およびＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの組合せは、ケラチノサイトの遊走を相乗的に増加させる。これらの結果は、皮膚科学的または化粧的な治療組成物において、当該組合せの使用への興味を確認する。
【００６１】
【表３】
2016515642.tif 000005
【図１】
2016515642.tif 000006
【国際調査報告】
2016515642.tif 000007
2016515642.tif 000008
2016515642.tif 000009
2016515642.tif 000010