(57)【要約】  本発明は、（ｉ）標的核酸配列と相補的であり、その発現が前記標的核酸の発現を抑制または低減する核酸と、（ｉｉ）受容体と高い親和性で結合することができる選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合に応答して前記受容体が細胞によって内部移行され得る、選択性薬剤とを含んでなるコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートは、対象とする細胞への核酸の送達に、従って、前記標的核酸によりコードされるタンパク質のダウンレギュレーションを必要とする疾患の治療のための送達に、ならびに診断目的での前記細胞への造影剤の送達に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）受容体に特異的に結合する選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合時に前記受容体が細胞によって内部移行され得る、少なくとも１種の選択性薬剤と、
ｉｉ）前記受容体と同じ細胞で発現される標的分子を特異的に阻害することができる少なくとも１種の核酸
とを含んでなるコンジュゲート。
【請求項２】
前記標的分子がポリペプチドまたはｍＲＮＡである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記標的分子の阻害が、標的ポリペプチドがポリペプチドである場合には、ポリペプチドの活性の阻害であり、または標的ポリペプチドがｍＲＮＡである場合には、ｍＲＮＡのサイレンシングである、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記受容体が表１の左の列に示される受容体ファミリーの１つに属す、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記受容体が表１の右の列に示される受容体からなる群から選択される、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記受容体がＧタンパク質共役受容体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記受容体が中枢神経系の１以上の場所で発現される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記中枢神経系の場所が、視床下部、脳幹、皮質、小脳、線条体、中脳、海馬、グリアおよび髄質からなる群から選択される、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
視床下部で発現される受容体が、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ガラニンＧＡＬ１受容体、カルシトニン受容体様受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、カルシトニンＡＭ１受容体、カルシトニンＡＭＹ１受容体、カルシトニンＣＧＲＰ受容体、カルシトニン受容体、フリッツルドＦＺＤ２受容体、フリッツルドＦＺＤ５受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、オキシトシン受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、バソプレシンＶ２受容体、キスペプチン受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記標的分子が、表３の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記標的分子がＳＯＣＳ３またはＰＴＰ１Ｂであり、かつ、前記選択性薬剤が構造
【化１】
2016503394.tif 000046
［式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、水素もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、またはＲ１およびＲ２は一緒にＣ２−Ｃ５アルキレン基を形成し、
Ｊは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化２】
2016503394.tif 000047
であり、
ｍは、１、２または３であり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
ｐは、１、２または３であり、
Ｇは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化３】
2016503394.tif 000048
であり、
Ｒ４およびＲ５は互いに独立に、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ、
Ｒ６は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、水素である］
を有する化合物またはその薬学上許容される塩である、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
表３の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表３において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項１０または１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
中脳で発現される受容体が、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ボンベシンＢＢ１受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ガラニンＧＡＬ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、ニューロペプチドＳ受容体、オレキシンＯＸ２受容体、５−ＨＴ１Ｄ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ｂ受容体、カルシトニンＡＭ２受容体、カルシトニンＡＭＹ３受容体、フリッツルドＦＺＤ６受容体、キスペプチン受容体、メラトニンＭＴ１受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体およびオピオイドμ受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記標的分子が、表４の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
表４の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表４において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
脳幹で発現される受容体が、５−ＨＴ３受容体、ガラニン受容体１、メラノコルチンＭＣ１受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、カルシトニン受容体様、ＣＲＦ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オピオイドμ受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体およびドーパミンＤ２受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記標的分子が、表５の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記標的分子が５−ＨＴ１Ａであり、かつ、前記選択性薬剤がレリセトロンである、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
表５の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表５において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項１７または１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
皮質で発現される受容体が、５−ＨＴ３受容体、メラノコルチンＭＣ１受容体、ＣＲＦ１受容体、５−ＨＴ２Ａ受容体、α１アドレナリン受容体、ボンベシンＢＢ１受容体、フリッツルドＦＺＤ３受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、ブラジキニンＢ２受容体、カルシトニン受容体様受容体、コレシストキニンＣＣＫ２受容体、ＣＲＦ１受容体、ＣＲＦ２受容体、ガラニンＧＡＬ２受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ５受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、オピオイドκ受容体、オピオイドδ受容体、ソマトスタチンｓｓｔ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ３受容体、ソマトスタチンｓｓｔ４受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、エンドセリンＥＴａ受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、ニューロペプチドＳ  ＮＰＳ受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、キスペプチン受容体、メラトニンＭＴ１受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記標的分子が、表６の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
表６の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表６において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
小脳で発現される受容体が、ＣＲＦ１受容体、５−ＨＴ１Ｂ受容体、フリッツルドＦＺＤ４受容体、フリッツルドＦＺＤ１０受容体、フリッツルドＦＺＤ７受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ２受容体、メラトニンＭＴ２受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ｂ受容体、キスペプチン受容体およびメラトニンＭＴ１受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記標的分子が、表７の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記標的分子がアタキシンＩであり、かつ、前記選択性薬剤が５−ノニルオキシトリプタミンオキサレートである、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
表７の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表７において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項２４または２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
線条体で発現される受容体が、５−ＨＴ２Ａ受容体、コレシストキニンＣＣＫ２受容体、ＣＲＦ１受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、５−ＨＴ６受容体、アデノシンＡ２受容体、アデノシンＡ２Ａ受容体、ドーパミンＤ１受容体、ドーパミンＤ２受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記標的分子が、表８の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記標的分子がグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βであり、かつ、前記選択性薬剤がＬＹ−１６５，１６３である、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
表８の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表８において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項２８または２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
海馬で発現される受容体が、５−ＨＴ３受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ＣＲＦ２受容体、フリッツルドＦＺＤ３受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ５受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、オピオイドδ受容体、ソマトスタチンｓｓｔ３受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、アデノシンＡ１受容体、エンドセリンＥＴａ受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ３受容体、フリッツルドＦＺＤ８受容体、フリッツルドＦＺＤ９受容体、メラトニンＭＴ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体およびバソプレシンＶ１Ｂ受容体からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記標的分子が、表９の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
表９の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表９において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
グリアで発現される受容体が、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ２受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ３受容体およびＴＬＲ７からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
髄質で発現される受容体が、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、オピオイドμ受容体、ＧｌｙＴ１輸送体、ニューロキニンＮＫ１受容体、ニューロキニンＮＫ２受容体、ニューロキニンＮＫ３受容体、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記標的分子が、表１０の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項３５に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
表１０の右の列に示される疾患からなる群から選択される疾患であって、各疾患は表１０において前記疾患と同じ行の左の列に示される標的ポリペプチドに指向されたコンジュゲートで治療される疾患の治療において使用するための、請求項３６に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
少なくとも１種の付加的選択性薬剤をさらに含んでなる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
第１の選択性薬と前記少なくとも１種の付加的選択性薬剤が同じまたは異なる、請求項３８に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
前記少なくとも１種の付加的選択性薬剤と第１の選択性薬剤とが異なる場合に、両選択性薬剤が中枢神経系の同じ場所で発現される受容体に特異的であるか、または中枢神経系の異なる場所で発現される受容体に特異的である、請求項３９に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
前記第１の選択性薬剤と少なくとも１種の付加的選択性薬剤とが結合する中枢神経系の場所が、
（ｉ）中脳と線条体、
（ｉｉ）皮質と海馬、
（ｉｉｉ）脳幹と海馬、
（ｉｖ）皮質と海馬と線条体、
（ｖ）皮質とグリアと海馬、
（ｖｉ）海馬と線条体、
（ｖｉｉ）脳幹と視床下部、
（ｖｉｉｉ）皮質と線条体、
（ｉｘ）グリアと髄質、
（ｘ）脳幹と皮質と中脳、
（ｘｉ）脳幹と中脳と線条体、
（ｘｉｉ）脳幹と皮質と海馬、および
（ｘｉｉｉ）皮質と中脳と線条体
からなる群から選択される、請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
標的分子と同じ細胞で発現され、標的分子に特異的に結合することができる核酸が、ギャップマー、二本鎖ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ活性を有する二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ前駆体、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、リボザイムおよびアプタマーからなる群から選択される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
前記選択性薬剤が核酸の５’末端または核酸の３’末端に結合されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
第１の核酸と相補的な核酸をさらに含んでなる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
前記核酸が干渉ＲＮＡである、請求項４４に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
コンジュゲートが第２の選択性薬剤を含んでなる場合に、
（ｉ）前記核酸が一本鎖ポリヌクレオチドであれば、第２の選択性薬剤は、第１の選択性薬剤が結合されている核酸の反対の末端に結合されるか、または第１の選択性薬剤が結合されている同じ末端に二官能性リンカーによって結合され、あるいは
（ｉｉ）前記核酸が二本鎖ポリヌクレオチドであれば、第２の選択性薬剤は、第１の選択性薬剤が結合されている鎖の反対の末端に、または第１の選択性薬剤が結合されている鎖と相補的な鎖のいずれかの末端に、または第１の選択性薬剤が結合されてない末端と同じ末端に二官能性リンカーを介して結合される、
請求項１〜４２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
少なくとも１種の選択性薬剤が架橋基により核酸に連結されている、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
前記架橋基が構造
−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、式中、
ＡおよびＢは、単糖、Ｃ１−Ｃ５０アルキル鎖および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマー単位を表し；
ａおよびｂは、０〜５０の範囲の整数であり；
ｃは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルスルホネート、カルボニル、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびそれらの混合物からなる群から独立に選択される架橋化合物であり；
ｄは、０または１である、
請求項４７に記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
ｂおよびｄが０であり、ｃが１であり、Ａがアルキル鎖であり、かつ、Ｌ２がホスホジエステル結合である、請求項４８に記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
選択性薬剤と結合されていないポリヌクレオチドの一末端または両末端に結合された保護基をさらに含んでなる、請求項１〜４９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
生体膜を経る輸送を助長する基をさらに含んでなる、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
エンドソーム溶解性ペプチドをさらに含んでなる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
（ｉ）受容体に特異的に結合する選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合時に前記受容体が細胞によって内部移行され得る、少なくとも１種の選択性薬剤と、
（ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子に特異的に結合することができる核酸を含んでなる、リポソームまたはデンドリマーであるナノ輸送体
とを含んでなる、コンジュゲート。
【請求項５４】
前記標的分子がポリペプチドまたはｍＲＮＡである、請求項５３に記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
前記標的分子の阻害が、標的ポリペプチドがポリペプチドである場合には、ポリペプチドの活性の阻害であり、または標的ポリペプチドがｍＲＮＡである場合には、ｍＲＮＡのサイレンシングである、請求項５４に記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
前記受容体が表１の左の列に示される受容体ファミリーの１つに属する、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
前記受容体が表１の右の列に示される受容体からなる群から選択される、請求項５６に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
前記受容体がＧタンパク質共役受容体である、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
前記受容体が中枢神経系の１以上の場所で発現される、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６０】
前記中枢神経系の場所が、視床下部、脳幹、皮質、小脳、線条体、中脳、海馬、グリアおよび髄質からなる群から選択される、請求項５９に記載のコンジュゲート。
【請求項６１】
視床下部で発現される受容体が、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ガラニンＧＡＬ１受容体、カルシトニン受容体様受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、カルシトニンＡＭ１受容体、カルシトニンＡＭＹ１受容体、カルシトニンＣＧＲＰ受容体、カルシトニン受容体、フリッツルドＦＺＤ２受容体、フリッツルドＦＺＤ５受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、オキシトシン受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、バソプレシンＶ２受容体、キスペプチン受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。  
【請求項６２】
前記標的分子が、表３の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項６１に記載のコンジュゲート。
【請求項６３】
前記標的分子がＳＯＣＳ３またはＰＴＰ１Ｂであり、かつ、前記選択性薬剤が構造
【化４】
2016503394.tif 000049
［式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、水素もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、またはＲ１およびＲ２は一緒にＣ２−Ｃ５アルキレン基を形成し、
Ｊは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化５】
2016503394.tif 000050
であり、
ｍは、１、２または３であり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
ｐは、１、２または３であり、
Ｇは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化６】
2016503394.tif 000051
であり、
Ｒ４およびＲ５は互いに独立に、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ、
Ｒ６は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、水素である］
を有する化合物またはその薬学上許容される塩である、請求項６２に記載のコンジュゲート。
【請求項６４】
中脳で発現される受容体が、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ボンベシンＢＢ１受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ガラニンＧＡＬ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、ニューロペプチドＳ受容体、オレキシンＯＸ２受容体、５−ＨＴ１Ｄ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ｂ受容体、カルシトニンＡＭ２受容体、カルシトニンＡＭＹ３受容体、フリッツルドＦＺＤ６受容体、キスペプチン受容体、メラトニンＭＴ１受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体およびオピオイドμ受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
前記標的分子が、表４の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項６４に記載のコンジュゲート。
【請求項６６】
脳幹で発現される受容体が、５−ＨＴ３受容体、ガラニン受容体１、メラノコルチンＭＣ１受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、カルシトニン受容体様、ＣＲＦ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オピオイドμ受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体およびドーパミンＤ２受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６７】
前記標的分子が、表５の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項６６に記載のコンジュゲート。
【請求項６８】
前記標的分子が５−ＨＴ１Ａであり、かつ、前記選択性薬剤がレリセトロンである、請求項６７に記載のコンジュゲート。
【請求項６９】
皮質で発現される受容体が、５−ＨＴ３受容体、メラノコルチンＭＣ１受容体、ＣＲＦ１受容体、５−ＨＴ２Ａ受容体、α１アドレナリン受容体、ボンベシンＢＢ１受容体、フリッツルドＦＺＤ３受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、ブラジキニンＢ２受容体、カルシトニン受容体様受容体、コレシストキニンＣＣＫ２受容体、ＣＲＦ１受容体、ＣＲＦ２受容体、ガラニンＧＡＬ２受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ５受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、オピオイドκ受容体、オピオイドδ受容体、ソマトスタチンｓｓｔ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ３受容体、ソマトスタチンｓｓｔ４受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、エンドセリンＥＴａ受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、ニューロペプチドＳ  ＮＰＳ受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、キスペプチン受容体、メラトニンＭＴ１受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７０】
前記標的分子が、表６の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項６９に記載のコンジュゲート。
【請求項７１】
小脳で発現される受容体が、ＣＲＦ１受容体、５−ＨＴ１Ｂ受容体、フリッツルドＦＺＤ４受容体、フリッツルドＦＺＤ１０受容体、フリッツルドＦＺＤ７受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ２受容体、メラトニンＭＴ２受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ｂ受容体、キスペプチン受容体およびメラトニンＭＴ１受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７２】
前記標的分子が、表７の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項７１に記載のコンジュゲート。
【請求項７３】
前記標的分子がアタキシンＩであり、かつ、前記選択性薬剤が５−ノニルオキシトリプタミンオキサレートである、請求項７２に記載のコンジュゲート。
【請求項７４】
線条体で発現される受容体が、５−ＨＴ２Ａ受容体、コレシストキニンＣＣＫ２受容体、ＣＲＦ１受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、５−ＨＴ６受容体、アデノシンＡ２受容体、アデノシンＡ２Ａ受容体、ドーパミンＤ１受容体、ドーパミンＤ２受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７５】
前記標的分子が、表８の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項７４に記載のコンジュゲート。
【請求項７６】
海馬で発現される受容体が、５−ＨＴ３受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ＣＲＦ２受容体、フリッツルドＦＺＤ３受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ５受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、オピオイドδ受容体、ソマトスタチンｓｓｔ３受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、アデノシンＡ１受容体、エンドセリンＥＴａ受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ３受容体、フリッツルドＦＺＤ８受容体、フリッツルドＦＺＤ９受容体、メラトニンＭＴ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体およびバソプレシンＶ１Ｂ受容体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７７】
前記標的分子が、表９の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項７６に記載のコンジュゲート。
【請求項７８】
前記標的分子がグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βであり、かつ、前記選択性薬剤がＬＹ−１６５，１６３である、請求項７７に記載のコンジュゲート。
【請求項７９】
グリアで発現される受容体が、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ２受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ３受容体およびＴＬＲ７からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８０】
髄質で発現される受容体が、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡＢ１、ＥｐｈＡＢ２、ＥｐｈＡＢ３、オピオイドμ受容体、ＧｌｙＴ１輸送体、ＤＰ１受容体、ニューロキニンＮＫ１受容体、ニューロキニンＮＫ２受容体、ニューロキニンＮＫ３受容体、およびＣＸＣＲ４ケモカイン受容体、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８１】
前記標的分子が、表１０の左の列に定義されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、またはその対応するｍＲＮＡである、請求項８０に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象とする標的に特異的な核酸と、特定の細胞への前記核酸の送達を前記細胞の表面のＧタンパク質共役受容体に対する親和性によって可能とする基とを含んでなるコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の使用は、細胞の状態を変化させるために効果的であることが証明されている。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の細胞への導入は、細胞中の特定の遺伝子の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションし、それにより、１以上の生化学的経路に影響を与えるために使用することができる。細胞生理を変化させるために使用される核酸に基づく技術のうち、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多様な生物体において遺伝子の発現を転写後レベルで調節することに関して与えられた総称である。ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングは、低分子干渉または「ｓｉＲＮＡ」として知られている相同な短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片を使用して達成され得る。長いｄｓＲＮＡが細胞系に導入されると、細胞酵素のダイサーがそれを切断して低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子とする。この低分子干渉ＲＮＡ分子は、現在ガイドＲＮＡと呼ばれている。ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(RNA-Induced-Silencing-Complex)（ＲＩＳＣ）を相同な標的ｍＲＮＡに誘導する。ひと度、それが相同なｍＲＮＡ配列とハイブリッド構造を形成すれば、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。結果として、該ｍＲＮＡにコードされているタンパク質はもはや産生されず、それにより遺伝子のサイレンシングが起こる。ＲＮＡ干渉とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、所与の標的分子に特異的な核酸と、選択的リガンドの結合に応答してエンドサイトーシスを受け得る受容体の選択的リガンドとを含有する核酸構築物を開発した。これらの構築物は、対象とする核酸をその受容体を発現する細胞の内部へ送達するために特に有用であることが示されている。いずれの理論にも拘束されることを望むものではないが、リガンドは、その受容体が発現される細胞の表面の対応する受容体に結合すると考えられる。そしてこれは、受容体媒介エンドサイトーシスによる細胞の内部への核酸−阻害剤複合体の輸送をもたらす。
【０００４】
当業者ならば、本発明がＧＳＨ−Ｒを発現する細胞への送達のためのコンジュゲートに限定されないことを認識するであろう。対照的に、本発明において提供される結果は、表面受容体を介してシグナルを伝達するために細胞が用いている機構が、前記受容体に親和性を示す分子に結合された小分子の細胞への送達を促すための十分な手段であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】タビモレリン構造。強力な経口活性グレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）アゴニスト（ヒト組換えＧＨＳ−Ｒ１ａでＫｉ＝５０ｎＭ）。ラット下垂体細胞からのＧＨ放出をＥＣ５０値２．７ｎＭで刺激する。
【図２】種々の分子で１２日間処置した後の肥満動物の累積体重（ＢＷ）増。Ａ）ビヒクル（ＶＨ）、ＴＡＢ−ＮＳ−ＡＳＯ４（ＮＳ）、ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４（ＳＯＣＳ３）またはＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４（ＰＴＰ１Ｂ）で１２日間処置した動物の累積体重増（ｇ）。ＶＨに対して＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＮＳに対して＋ｐ＜０．０５；＋＋ｐ＜０．０１；＋＋＋ｐ＜０．００１；＋＋＋＋ｐ＜０．０００１。Ｂ）分析の統計学的有意性を示すＡＮＯＶＡ表、ＴＴは処置を意味する。データは平均＋ＥＳＤを表す。
【図３】種々の分子で１２日間処置した後の肥満動物の累積食物摂取（ＦＩ）。Ａ）ビヒクル（ＶＨ）、ＴＡＢ−ＮＳ−ＡＳＯ４（ＮＳ）、ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４（ＳＯＣＳ３）またはＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４（ＰＴＰ１Ｂ）で１２日間処置した動物の累積ＦＩ増（ｇ）。ＶＨに対して＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＮＳに対して＋ｐ＜０．０５；＋＋ｐ＜０．０１；＋＋＋ｐ＜０．００１；＋＋＋＋ｐ＜０．０００１。Ｂ）分析の統計学的有意性を示すＡＮＯＶＡ表、ＴＴは処置を意味する。データは平均＋ＥＳＤを表す。
【図４】肥満の１日体重（ＢＷ）増および食物摂取（ＦＩ）。Ａ）１日ＢＷ増は、１日体重変化の平均とした。群間で有意差は無かったが、ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４（ＳＯＣＳ３）およびＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４（ＰＴＰ１Ｂ）で処置した動物では減少傾向が見られた。Ｂ）１日の食物摂取の平均として測定した１日ＦＩは、ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４（ＳＯＣＳ３）およびＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４（ＰＴＰ１Ｂ）で処理した動物で低下していた。一元配置ＡＮＯＶＡは、処置間の有意差を示した（ｐ＜０．０００１）。ＶＨに対して＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ＮＳに対して＋＋ｐ＜０．０１；＋＋＋ｐ＜０．００１。データは平均＋ＥＳＤを表す。
【図５】アタキシン−１に対するプローブで標識した小脳矢状切片の顕微鏡写真。Ａ）およびＢ）矢印はプルキンエ細胞層、ＭＬ：分子層、ＧＬ：顆粒層を示す。Ａ：ＰＢＳで処置した動物の例、Ｂ：アタキシン−ＩのｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡにコンジュゲートした５−ノニルオキシトリプタミンオキサレート（ＮＰ−１２９７）で処置した動物の例。Ｃ：プルキンエ細胞層における光学密度（ＩｍａｇｅＪ）の任意単位（Ｏ．Ｄ．（ａ．ｕ．））での定量値をＰＢＳに対して正規化したもの、ＮＰ−１２９７で処理した動物において有意な低下（４８％±５ｓ．ｅ．ｍ．）（ｔ検定、＊ｐ＜０．０２）を示す。
【図６】１３１９の５ＨＴ３への結合。３Ｈ−ＧＲ６５６３０（０．５ｎＭ）の排除。データは、１回の実験からのｎ＝４の平均±ＳＤとして表す。ＧＲ６５６３０のＫｄは飽和アッセイから決定した。
【図７】１３０１の５ＨＴ１Ａへの結合。３Ｈ−８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（０．６ｎＭ）の排除。データは、１回の実験からのｎ＝４の平均±ＳＤとして表す。
【発明の具体的説明】
【０００６】
本発明者らは、予期しないことに、受容体に特異的に結合することができる分子に核酸を共有結合させることにより、その受容体を発現する対象細胞に前記核酸を特異的に標的化できることを見出した。さらに、本発明者らはまた、前記核酸が細胞によって内部移行され、それによりその効果を発揮し得ることも見出した。いずれの理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのコンジュゲートは、受容体が選択性薬剤の結合に応答して内部移行される際にその受容体によって内部移行されると考えられる。例えば、本発明の実施例に示されるように、成長ホルモン分泌促進因子受容体のリガンド（タビモレリン）とＳＯＣＳ４またはＰＴＰ１Ｂのいずれかを特異的にサイレンシングすることができる核酸とを含有するコンジュゲートで処置した動物は、対照動物（ＶＨおよびＮＳ）よりも体重増加が有意に低く、食物摂取の低下を示し、それにより、これらの核酸が標的とされる視床下部領域に達するのに効果的であったことを示す。
【０００７】
Ａ．本発明のコンジュゲート
第１の態様において、本発明は、
ｉ）受容体に特異的に結合する選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合時に前記受容体がエンドサイトーシスを受ける、少なくとも１種の選択性薬剤と、
ｉｉ）前記受容体と同じ細胞で発現される標的分子を特異的に阻害することができる少なくとも１種の核酸
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【０００８】
用語「コンジュゲート」は、本明細書で使用する場合、２つ以上の個々の化合物の共有結合から得られるいずれの化合物も意味する。本発明では、コンジュゲートは、共有結合されている核酸と選択性薬剤を含んでなる分子を意味し、前記の結合は直接的または架橋化合物を介したものである。
【０００９】
用語「共有結合(covalent coupling)」または「共有結合(covalent attachment)」は、核酸と選択性薬剤が相互に直接共有結合的に連結されているか、またはリンカー、もしくは架橋、もしくは１もしくは複数のスペーサー部分などの１または複数の介在部分によって相互に間接的に共有結合的に連結されていることを意味する。
【００１０】
Ａ．１．選択性薬剤
「１以上の受容体に特異的に結合する選択性薬剤」という用語は、本明細書で使用する場合、受容体に結合するいずれの物質も意味し、ここで、この受容体は前記選択性薬剤の結合に応答してエンドサイトーシスを受ける。この結合特異性が、前記選択性薬剤に結合された分子の、前記受容体を発現する細胞、組織または器官への送達を可能とする。このように、前記選択性薬剤を担持するコンジュゲートは、動物に投与した場合またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々のタイプの細胞の集団と接触させた場合に、前記細胞に特異的に指向される。
【００１１】
用語「受容体」は、リガンドと呼ばれる生物活性分子と結合する細胞会合型のタンパク質を表す。
【００１２】
本明細書で使用する場合、第１の分子と第２の分子の特異的結合は、第１の分子の、非特異的相互作用とは測定可能に異なる様式で前記第２の分子と結合する能力を意味する。本発明による選択性薬剤は、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍまたはそれを超える標的（受容体）に対するＫｄを示し得る。
【００１３】
本発明の選択性薬剤により標的化され得る受容体としてはまた、限定されるものではないが、５−ヒドロキシトリプタミン受容体、アデノシン受容体、アドレノセプター受容体、アンジオテンシン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カルシトニン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、エフリン受容体、ホルミルペプチド受容体、フリッツルド受容体、ガラニン受容体、成長ホルモン分泌促進因子受容体（グレリン）受容体、キスペプチン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド(opiod)受容体、オレキシン受容体、ペプチドＰ５１８受容体、プロスタノイド受容体、ＳＬＣ６神経伝達物質輸送体ファミリー、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、バソプレシンおよびオキシトシン受容体、ならびにＶＥＧＦ受容体が挙げられる。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、本発明によるコンジュゲートの選択性薬剤により標的化され得る受容体は表１に定義される。
【００１５】
【表１】
2016503394.tif 000002
2016503394.tif 000003
2016503394.tif 000004
【００１６】
好ましい実施形態では、受容体はＧタンパク質共役受容体である。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「Ｇタンパク質共役受容体」（または「ＧＰＣＲ」）は、細胞により発現された際にＧタンパク質（例えば、ＧＴＰを加水分解するタンパク質）と会合する標的受容体を意味する。好ましくは、ＧＰＣＲは、構造上７つの疎水性の膜貫通領域を含んでなるタンパク質を意味する、「７回膜貫通セグメント受容体」（または「７ＴＭＳ受容体」）である。
【００１８】
別の実施形態では、受容体は、中枢神経系の１以上の場所で発現される。さらに別の実施形態では、中枢神経系の前記の場所は、視床下部、脳幹、皮質、小脳、線条体、中脳、海馬、グリアおよび脊髄からなる群から選択される。
【００１９】
好ましい実施形態では、コンジュゲート内の選択的リガンドは、視床下部で発現される受容体に結合する。なおさらに好ましい実施形態では、視床下部で発現される受容体は、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ガラニンＧＡＬ１受容体、カルシトニン受容体様、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、カルシトニンＡＭ１受容体、カルシトニンＡＭＹ１受容体、カルシトニンＣＧＲＰ受容体、カルシトニン受容体、フリッツルドＦＺＤ２受容体、フリッツルドＦＺＤ５受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、オキシトシン受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、バソプレシンＶ２受容体、キスペプチン受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される。
【００２０】
好ましい実施形態では、受容体に結合するリガンドは、表２に示されるリガンドの群から選択される。別の好ましい実施形態では、選択性薬剤はＧＨＳ−Ｒアゴニストである。
【００２１】
なおさらに好ましい実施形態では、ＧＨＳ−Ｒアゴニストは、タビモレリン、または構造（Ｉ）：
【化１】
2016503394.tif 000005
［式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、水素もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、またはＲ１およびＲ２は一緒にＣ２−Ｃ５アルキレン基を形成し、
Ｊは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化２】
2016503394.tif 000006
であり、
ｍは、１、２または３であり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
ｐは、１、２または３であり、
Ｇは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化３】
2016503394.tif 000007
であり、
Ｒ４およびＲ５は互いに独立に、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ、
Ｒ６は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、水素である］
を有するその構造類似体である。
【００２２】
式Ｉの化合物は１以上の不斉中心を有することができ、分割された、純粋なまたは部分的に精製されたその光学異性体またはラセミ混合物の形態のあらゆる光学異性体が式Ｉの範囲内に含まれる。ＥおよびＺ幾何異性体（上記に示す式Ｉの構造の左側へのオレフィン二重結合に関する）も同様に式Ｉの範囲内に含まれる。
【００２３】
一態様において、本発明は、Ｒ１およびＲ２が両方ともアルキル、好ましくは、メチルである式Ｉの化合物を含んでなるコンジュゲートを提供する。一態様において、本発明は、それに加えてまたはその代わりにＪが２−ナフチルである式Ｉの化合物を含んでなるコンジュゲートを提供する。一態様において、それに加えたまたはその代わりにｍは１である。一態様において、Ｒ３はメチルである。別の態様では、ｐは１である。別の態様では、Ｇはフェニルである。
【００２４】
別の態様では、Ｒ４はメチルである。別の態様では、Ｒ５は水素またはメチルである。さらに別の態様では、Ｒ６は水素またはメチルである。
【００２５】
用語「Ｃ１−６アルキル」は、本発明で使用する場合、炭素原子１〜６個の直鎖（線状）、分岐型および環式アルキル基を含むものとする。適切な線状Ｃ１−６アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルである。分岐型Ｃ１−６アルキル基の例は、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルおよびイソヘキシルである。環式基（Ｃ３−６シクロアルキル基）の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。用語「Ｃ１−６アルキル」は、本文脈において同様に、例えば、１〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル置換アルキル基を含み、その例としては、（シクロプロピル）メチル、（シクロプロピル）エチル、（シクロプロピル）プロピル、（シクロブチル）メチル、（シクロブチル）エチルおよび（シクロペンチル）メチルなどの基が挙げられる。特に好適なＣ１−６アルキル基は、多くの場合、Ｃ１−３アルキル基、すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびシクロプロピルの中から選択される。
【００２６】
用語「Ｃ２−５アルキレン基」（すなわち、Ｃ２−５アルカンジイル基）は、本発明で使用する場合、炭素原子２〜５個の直鎖（線状）および分岐型の両方のアルカンジイル基を含むものとする。適切な線状基は、−ＣＨ２−ＣＨ２−；−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−；−ＣＨ２−（ＣＨ２）２−ＣＨ２−；および−ＣＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−である。好適な分岐型基の例としては、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−；−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−；−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−；−ＣＨ２−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−；および−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−が挙げられる。
【００２７】
用語「ハロゲン」は、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒおよびＩを含む。式Ｉに関して特に好適なハロゲンは、ＣｌおよびＦである。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＧＳＨ−Ｒアゴニストは、Ｎ−［（２Ｅ）−５−アミノ−５−メチルヘクス−エノイル］−Ｎ−メチル−３−（２−ナフチル）アラニル−Ｎ，Ｎα−ジメチル−Ｄ−フェニルアラニンアミド（タビモレリン）である。
【化４】
2016503394.tif 000008
【００２９】
別の実施形態では、選択性薬剤は、中脳で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、中脳で発現される受容体は、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ボンベシンＢＢ１受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ガラニンＧＡＬ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、ニューロペプチドＳ受容体、オレキシンＯＸ２受容体、５−ＨＴ１Ｄ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ｂ受容体、カルシトニンＡＭ２受容体、カルシトニンＡＭＹ３受容体、フリッツルドＦＺＤ６受容体、キスペプチン受容体、メラトニンＭＴ１受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体およびオピオイドμ受容体からなる群から選択される。
【００３０】
別の実施形態では、選択性薬剤は、脳幹で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、脳幹で発現される受容体は、５−ＨＴ３受容体、ガラニン受容体１、メラノコルチンＭＣ１受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、カルシトニン受容体様、ＣＲＦ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オピオイドμ受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体およびドーパミンＤ２受容体からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、脳幹で発現される受容体は、５−ＨＴ３受容体である。
【００３１】
好ましい実施形態では、５−ＨＴ３受容体に結合するリガンドは、表２に示されるリガンドの群から選択される。別の好ましい実施形態では、選択性薬剤は、レリセトロン（１−ベンジル−２−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−ベンズイミダゾール）またはレリセトロン−Ｃ６−アシルである。別の実施形態では、選択性薬剤は、皮質で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、皮質で発現される受容体は、５−ＨＴ３受容体、メラノコルチンＭＣ１受容体、ＣＲＦ１受容体、５−ＨＴ２Ａ受容体、α１アドレナリン受容体、ボンベシンＢＢ１受容体、フリッツルドＦＺＤ３受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、ブラジキニンＢ２受容体、カルシトニン受容体様受容体、コレシストキニンＣＣＫ２受容体、ＣＲＦ１受容体、ＣＲＦ２受容体、ガラニンＧＡＬ２受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ５受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、オピオイドκ受容体、オピオイドδ受容体、ソマトスタチンｓｓｔ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ３受容体、ソマトスタチンｓｓｔ４受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、エンドセリンＥＴａ受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、ニューロペプチドＳ  ＮＰＳ受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、キスペプチン受容体、メラトニンＭＴ１受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される。
【００３２】
別の実施形態では、選択性薬剤は、小脳で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、小脳で発現される受容体は、ＣＲＦ１受容体、５−ＨＴ１Ｂ受容体、フリッツルドＦＺＤ４受容体、フリッツルドＦＺＤ１０受容体、フリッツルドＦＺＤ７受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ２受容体、メラトニンＭＴ２受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ａ受容体、アンジオテンシンＡＴ２ｂ受容体、キスペプチン受容体およびメラトニンＭＴ１受容体からなる群から選択される。好ましい実施形態では、小脳で発現される受容体は、５−ＨＴ１Ｂ受容体である。
【００３３】
好ましい実施形態では、５−ＨＴ１Ｂ受容体に結合するリガンドは、表２に示されるリガンドの群から選択される。別の好ましい実施形態では、選択性薬剤は、５−ノニルオキシトリプタミンオキサレートまたは構造
【化５】
2016503394.tif 000009
を有するその構造類似体である。
【００３４】
別の実施形態では、選択性薬剤は、線条体で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、線条体で発現される受容体は、５−ＨＴ２Ａ受容体、コレシストキニンＣＣＫ２受容体、ＣＲＦ１受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、５−ＨＴ６受容体、アデノシンＡ２受容体、アデノシンＡ２Ａ受容体、ドーパミンＤ１受容体、ドーパミンＤ２受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される。
【００３５】
別の実施形態では、選択性薬剤は、海馬で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、海馬で発現される受容体は、５−ＨＴ３受容体、ブラジキニンＢ２受容体、ＣＲＦ２受容体、フリッツルドＦＺＤ３受容体、ガラニンＧＡＬ３受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ５受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ２受容体、オピオイドδ受容体、ソマトスタチンｓｓｔ３受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、５−ＨＴ１Ａ受容体、アデノシンＡ１受容体、エンドセリンＥＴａ受容体、エンドセリンＥＴｂ受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ３受容体、フリッツルドＦＺＤ８受容体、フリッツルドＦＺＤ９受容体、メラトニンＭＴ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体およびバソプレシンＶ１Ｂ受容体からなる群から選択される。好ましい実施形態では、海馬で発現される受容体は、５−ＨＴ１Ａ受容体である。
【００３６】
好ましい実施形態では、５−ＨＴ１Ａ受容体に結合するリガンドは、表２に示されるリガンドの群から選択される。別の好ましい実施形態では、選択性薬剤は、ＬＹ−１６５、ＬＹ−１６５，１６３  Ｃ６−アシル、または８−ＯＨ−ＤＰＡＴである。
【００３７】
別の実施形態では、選択性薬剤は、髄質で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、髄質で発現される受容体は、ＥｐｈＡ１受容体、ＥｐｈＡ２受容体、ＥｐｈＡ３受容体、ＥｐｈＡ４受容体、ＥｐｈＢ１受容体、ＥｐｈＢ２受容体、ＥｐｈＢ３受容体、オピオイド(opiuoid)μ（ミュー）受容体、ＧｌｙＴ１輸送体、ＤＰ１プロスタノイド受容体、タキキニンＮＫ１、ＮＫ２またはＮＫ３受容体、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体およびＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３受容体からなる群から選択される。
【００３８】
別の実施形態では、選択性薬剤は、グリアで発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、グリアで発現される受容体は、ホルミルペプチドＦＰＲ１受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ２受容体、ホルミルペプチドＦＰＲ３受容体およびＴＬＲ７からなる群から選択される。
【００３９】
好ましい実施形態では、受容体に結合する選択性薬剤は、表２に示される通りである。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
Ａ．２．本発明のコンジュゲートの核酸
本発明によるコンジュゲートの第２の成分は、前記受容体と同じ細胞で発現される標的分子に特異的に結合することができる核酸である。一般に、本発明の核酸は、前記標的分子の機能を阻害することができる。従って、標的分子がｍＲＮＡである場合、前記核酸（一般には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸）は、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害して、そのｍＲＮＡによりコードされているタンパク質のレベルの低下をもたらすことにより機能する。標的核酸がタンパク質である場合、前記核酸（一般には、アプタマー）は、そのタンパク質の活性を阻害することにより機能する。
【００４２】
用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、２以上のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体分子ならびに天然核酸に構造上類似するが、天然の核酸とは（例えば、化学修飾によって）１以上の核酸骨格（例えば、天然核酸のリン酸）、核酸の糖（例えば、天然ＤＮＡではデオキシリボース、天然ＲＮＡではリボース）、および核酸の塩基（例えば、天然核酸のアデノシン、シトシン、グアニン、チミジン、またはプリン）が異なる分子を有するポリマーを意味する。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドであってよく、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを含む。二本鎖核酸が使用される場合、これらは標的核酸と相補的な第１のセンス鎖と、そのセンス鎖と相補的な第２のアンチセンス鎖を含んでなり、これにより、第１鎖と第２鎖の間での塩基対形成により二本鎖ＤＮＡの形成が可能である。
【００４４】
用語「アンチセンス鎖」は、標的配列と実質的に相補的な領域を含む二本鎖核酸の鎖を意味する。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２〜７個外側にミスマッチが最も許容される。
【００４５】
用語「センス鎖」は、本明細書で使用する場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を意味する。
【００４６】
用語低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）は、ＲＮＡ干渉経路を誘導する低分子の阻害性ＲＮＡ二重鎖を意味する。これらの分子は様々な長さであってよく（一般に１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖にそれらの標的ｍＲＮＡとの様々な程度の相補性を含む。総てではないが一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に対合しないオーバーハング塩基を有する。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２本の分離した鎖の二重鎖を含む。本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ分子に限定されず、モルホリノなどの、１以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを有する核酸をさらに包含する。
【００４７】
用語「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」は、本明細書で使用する場合、２本の鎖が、一方の鎖の３’末端と対応する他方の鎖の５’末端との間で中断されないヌクレオチド鎖により連結されて二重鎖構造を形成しているｄｓＲＮＡを意味する。
【００４８】
用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、遺伝子発現を調節することができる、一般に約２１〜２３ヌクレオチド長の短い一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉＲＮＡは、合成品（すなわち、組換え型）であっても天然物であってもよい。天然ｍｉＲＮＡは遺伝子によりコードされ、ＤＮＡから転写され、一次転写産物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされて短いステム−ループ構造（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）となり、最終的に成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１以上のｍＲＮＡ分子と部分的に相補的であり、ＲＮＡ干渉に類似したプロセスを介して、またはｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、遺伝子発現のダウンレギュレーションを行う。
【００４９】
「アンチセンス配列」は、本明細書で使用する場合、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含んでなるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを送達する能力は、例えば、Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, (1988)およびvan der Krol et al., BioTechniques 6:958, (1988)に記載されている。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「リボザイム」または「ＲＮＡ酵素」または「触媒ＲＮＡ」は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子を意味する。多くの天然リボザイムが、それらの固有のホスホジエステル結合の１つの加水分解、または他のＲＮＡ内の結合の加水分解を触媒するが、それらはリボソームのアミノトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡリガーゼのリガーゼ活性、および従来のタンパク質酵素により遂行される他のいくつかの化学反応を触媒することも分かっている。
【００５１】
「アプタマー」は、本明細書で使用する場合、結合が「相補的」でない、すなわち、核酸リガンドと標的核酸配列の間の塩基対形成によらない、標的分子上の２以上の部位と結合する核酸リガンドを意味する。アプタマーは、ポリペプチドを含め、想定できるいずれの標的にも結合するものを設計することができる。アプタマーは、慣用の生体分子である抗体のものと競合する分子認識特性を付与するので、生物工学適用および治療適用に有用性を与える。それらの選択的認識に加え、アプタマーは、試験管内で完全に操作することができ、化学合成により容易に生産され、望ましい保存特性を備え、かつ、治療適用において免疫原性をほとんどまたは全く惹起しないことから、抗体に優る利点を提供する。アプタマーは、「ＳＥＬＥＸ」(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Shamah et al, Acc. Chem. Res. 2008, 41 pp. 130-8)として当技術分野の現状で知られている方法論で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパーティション、選択および増幅を何回か繰り返すことによって合成することができる。あるいは、アプタマーは、例えば、段階的固相により合成することができる。
【００５２】
本発明の核酸は、核酸塩基、糖および／またはヌクレオチド間結合に１以上の修飾を含んでもよい。
【００５３】
核酸の１以上の骨格残基に対する修飾は、下記のうちの１以上を含んでなり得る：２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−ＡＩＩｙＩ、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）などの２’糖修飾；４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋を含む４’糖修飾；ロックド核酸(Locked Nucleic Acid)（ＬＮＡ）；ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid)（ＰＮＡ）；インターカレーティング核酸(Intercalating nucleic acid)（ＩＮＡ）；ツイストインターカレーティング核酸(Twisted intercalating nucleic acid)（ＴＩＮＡ）；ヘキシトール核酸(Hexitol nucleic acids)（ＨＮＡ）；アラビノ核酸(arabinonucleic acid)（ＡＮＡ）；シクロヘキサン核酸(cyclohexane nucleic acids)（ＣＮＡ）；シクロヘキセニル核酸(cyclohexenylnucleic acid)（ＣｅＮＡ）；トレオシル核酸(threosyl nucleic acid)（ＴＮＡ）；モルホリノオリゴヌクレオチド；ギャップマー；ミックスマー；インコーポレーションアルギニンリッチペプチド；合成ＲＮＡへの５’−リン酸の付加；ＲＮＡアプタマー((Que-Gewirth NS, Gene Ther. 2007 Feb;14(4):283-91.)；特定のＲＮＡアプタマーの対象に対する解毒薬で調節したＲＮＡアプタマー（Oney S, Oligonucleotides. 2007 Fall;17(3):265-74参照）またはそれらの任意の組合せ。
【００５４】
核酸の１以上のヌクレオシド間結合に対する修飾は、下記のうちの１以上を含んでなり得る：ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエートおよびホスホルアニリダート、またはそれらの任意の組合せ。
【００５５】
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、よく接近不能ＲＮＡとも呼ばれる、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’炭素と４’炭素を連結する付加的な架橋（Ｏ２’，Ｃ４’−メチレンブリッジ）で修飾される。この架橋は、Ａ型のＤＮＡまたはＲＮＡによく見られる、３’エンド構造立体配座でリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、所望により、核酸においてＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と混合することができる。このようなオリゴマーは市販されている。ロックされたリボース立体配座は、塩基のスタッキングおよび骨格の予備構成を増進する。これは、改善されたミスマッチ識別能を備えるだけでなく、熱安定性（融解温度）およびＬＮＡ修飾核酸のハイブリダイゼーション親和性を著しく高める。これらの特性は、それらをアンチセンスに基づく技術に極めて有用とする。さらに、ＬＮＡ抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドは霊長類で試験されており、有望な結果と毒性の低さが示されている。
【００５６】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似する人工的に合成されたポリマーであり、生物学的研究および医学的処置に使用される。ＰＮＡは、自然界に存在することは知られていない。ＤＮＡおよびＲＮＡはそれぞれデオキシリボースおよびリボースの糖骨格を有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合により連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しから構成される。この骨格に、メチレンカルボニル結合により様々なプリンおよびピリミジン塩基が結合される。ＰＮＡは、ペプチドと同様に、最初の（左側）の位置にＮ末端、右側にＣ末端がくるように描かれる。ＰＮＡの骨格は電荷の無いリン酸基を含むので、ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間の結合は、静電反発が無いためにＤＮＡ／ＤＮＡ鎖間よりも強い。混合塩基ＰＮＡ分子は、塩基対認識に関してまさにＤＮＡ分子を模倣するものである。ＰＮＡ／ＰＮＡ結合は、ＰＮＡ／ＤＮＡ結合よりも強い。
【００５７】
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、疎水性の挿入物に共有結合により連結された通常のデオキシリボヌクレオチドからなる、修飾された核酸類似体である。ＩＮＡは、各修飾に関して最大１１度の安定化で、相補的ＤＮＡに高い親和性を有する。ＩＮＡは、通常のＤＮＡよりも、ミスマッチ標的に対する完全マッチ標的への特異性が高い。ＩＮＡがＤＮＡにより高い親和性を持つことを利用すれば、より短いプローブを使用すること、またそれにより特異性をなおさらに増強することが可能となる。さらに、ＩＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡ間のユニークな識別能を備えたＤＮＡ選択的オリゴヌクレオチド類似体である。ＩＮＡが相補的ＤＮＡに高い親和性を持つとしても、相補的ＩＮＡの相補配列に対する親和性は低い。ツイストインターカレーティング核酸は、ＴＩＮＡで表す。
【００５８】
ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）は、天然の核酸塩基とリン酸化された１，５−アンヒドロヘキシトール骨格から構成されるオリゴヌクレオチドである。ＨＮＡとＲＮＡ間の分子会合は、ＨＮＡとＤＮＡ間および天然核酸間（ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ）よりも安定である。他の合成修飾オリゴヌクレオチドは、ＡＮＡ（アラビノ核酸）、ＣＮＡ（シクロヘキサン核酸）、ＣｅＮＡ（シクロヘキセニル核酸）およびＴＮＡ（トレオシル(threosyl)核酸）を含んでなる。
【００５９】
モルホリノは、天然の核酸構造の再設計産物である合成分子である。モルホリノとＤＮＡまたはＲＮＡの間の構造上の違いは、モルホリノも標準的な核酸塩基を有するが、それらの塩基がデオキシリボース／リボース環ではなく６員モルホリン環に結合され、かつ、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合が陰イオン性ホスホジエステル結合に置き換わっていることである。モルホリノは、ＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）とも呼ばれることがある。６員モルホリン間は、化学式Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２）２−ＮＨを有する。
【００６０】
ギャップマーは、ＤＮＡ窓または「ギャップ」が、それ以外の点では通常の、または修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに挿入されたＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドプローブである。この修飾はオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびプローブと標的の相互作用のアビディティを高め、その結果、より短いプローブが効果的に使用できる。
【００６１】
本発明のコンジュゲートの核酸は、神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現される標的分子に特異的に結合することができる。核酸と標的分子の結合は、標的分子が、核酸の配列と相補的な配列を含む核酸である場合に、ワトソン−クリック相互作用を介して起こり得る。あるいは、標的分子がポリペプチドである場合には、本発明のコンジュゲートの核酸は前記分子と相互作用することもでき、この場合、核酸はアプタマーとして働く。
【００６２】
本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸が、標的ｍＲＮＡの核酸配列に相補的である場合、最も適切な核酸を選択するために異なった基準が当業者に利用可能である。例として、コンジュゲートの一部を形成する核酸がｓｉＲＮＡである場合、これは、ＡＡジヌクレオチドに対する標的のｍＲＮＡ配列をスキャンして、ＡＡのすぐ下流の１９個のヌクレオチドを記録することにより選択することができる。他の方法も核酸標的を選択するために使用することができる。一例では、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択は、標的配列がＧＧで始まり、ＢＬＡＳＴ検索により解析した際に他の遺伝子と有意な配列相同性を持たない限り、純粋に経験的に決定される（例えば、Sui G et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20 (2002)参照）。他の例では、ｓｉＲＮＡ標的配列を選択するためにより精巧な方法が使用される。この手順は、内在ｍＲＮＡ中の接近可能な任意の部位が、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド／ＲＮアーゼＨ法による分解の標的となり得る（例えば、Lee NS et a/., Nature Biotechnol. 20:500-05 (2002)参照）という所見を利用する。
【００６３】
あるいは、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現カセットは、標的のセンス鎖と、その後に短いスペーサー、標的のアンチセンス鎖、および転写ターミネーターとして５〜６個のＴを含むように構築される。ｓｉＲＮＡ発現構築物内のセンス鎖およびアンチセンス鎖の順は、ヘアピンｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に影響を及ぼさずに変更することができる。場合によっては、順序の逆転が遺伝子サイレンシング活性の部分的低下をもたらすこともある。
【００６４】
ｓｉＲＮＡ発現カセットのステムとして使用されるヌクレオチド配列の長さは、例えば、１９〜２９の範囲であり得る。ループサイズは３〜２３ヌクレオチドの範囲であり得る。他の長さおよび／またはループサイズも使用可能である。
【００６５】
さらに別の実施形態では、ヘアピンｓｉＲＮＡが遺伝子サイレンシングにおいて機能する限り、ヘアピンｓｉＲＮＡ構築物中の５’オーバーハングを使用することができる。ある特定の例において、５’オーバーハングは約６ヌクレオチド残基を含む。
【００６６】
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉに対する標的配列は２１ｍｅｒの配列断片である。標的配列の５’末端はジヌクレオチド「ＮＡ」を有し、「Ｎ」は任意の塩基であってよく、「Ａ」はアデニンを表す。残りの１９ｍｅｒの配列は３５％〜５５％の間のＧＣ含有率を有する。加えて、残りの１９ｍｅｒの配列には、４つ連続するＡまたはＴ（すなわち、ＡＡＡＡまたはＴＴＴＴ）も、３つ連続するＧまたはＣ（すなわち、ＧＧＧまたはＣＣＣ）も、あるいは７回の「ＧＣ」列もない。
【００６７】
ＲＮＡｉの標的配列を選択するために付加的な基準も使用することができる。例えば、残りの１９ｍｅｒの配列のＧＣ含有率は４５％〜５５％の間に制限することができる。さらに、３つ連続する同一塩基（すなわち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、もしくはＡＡＡ）または５個以上の塩基の回文配列を有するいずれの１９ｍｅｒ配列も排除される。さらに、残りの１９ｍｅｒ配列は、他の遺伝子に対して相同性の低い配列を持つように選択することもできる。ある特定の例では、可能性がある標的配列をＮＣＢＩのヒトＵｎｉＧｅｎｅクラスター配列データベースに対してＢＬＡＳＴＮにより検索する。ヒトＵｎｉＧｅｎｅデータベースには、遺伝子指向クラスターの非冗長セットが含まれる。各ＵｎｉＧｅｎｅクラスターには、一意的な遺伝子を表す配列が含まれる。ＢＬＡＳＴＮ検索で他のヒト遺伝子にヒットしない１９ｍｅｒの配列を選択することができる。検索中に、ｅ値を厳密な値（「１」など）に設定することができる。
【００６８】
ｓｉＲＮＡ配列、ならびに本発明に従って誘導された任意の他のＲＮＡｉ配列の、標的遺伝子のサイレンシング発現における有効性は、当技術分野で公知の種々の方法を使用して評価することができる。
【００６９】
用語「サイレンス」および「の発現を阻害する」、「の発現をダウンレギュレートする」、「の発現を抑制する」などは、それらが標的遺伝子を指す限りにおいて、本明細書においては、標的遺伝子が転写されて標的遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞群から単離することができる標的ｍＲＮＡの量が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して減少することにより示されるような、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制を意味する。阻害の程度は通常以下のように表される：
（対照細胞中のｍＲＮＡ）−（処理細胞中のｍＲＮＡ）＊１００パーセント
（対照細胞中のｍＲＮＡ）
【００７０】
あるいは、阻害の程度は、標的遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量またはある表現型を示す細胞の数の減少に関して示すこともできる。原則として、標的ゲノムサイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作により標的を発現する任意の細胞において、いずれの適当なアッセイによって測定してもよい。しかしながら、所与の核酸がある程度標的遺伝子の発現を阻害するかどうか、従って、本発明に含まれるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合に、下記の実施例で提供されるアッセイおよび当技術分野で公知のアッセイがそのような参照として役立つであろう。例えば、ある例では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子の発現は、少なくとも約５パーセント、１０パーセント、１５パーセント、２０パーセント、２５パーセント、３０パーセント、３５パーセント、４０パーセント、４５パーセント、または５０パーセント抑制される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子は、少なくとも約６０パーセント、７０パーセント、または８０パーセント抑制される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子は、少なくとも約８５パーセント、９０パーセント、または９５パーセント抑制される。
【００７１】
例えば、本発明による核酸配列は、標的遺伝子を発現する細胞中に導入することができる。細胞中の標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットまたは任意の他の標準的方法を使用することにより検出することができる。あるいは、標的ｍＲＮＡによりコードされているポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の免疫学的または非免疫学的方法を使用して測定することができる。ｓｉＲＮＡ配列の導入後の、標的遺伝子によりコードされているｍＲＮＡまたはそのタンパク質の発現レベルの実質的変化は、標的遺伝子の発現の抑制におけるｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。ある特定の例では、他の遺伝子の発現レベルもｓｉＲＮＡ配列の導入前後にモニタリングされる。標的遺伝子発現に対して阻害効果を有するが他の遺伝子の発現には有意に影響しないｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。他の特定の例では、複数のｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を同じ標的細胞に導入することができる。これらのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列は、標的遺伝子発現を特異的に阻害するが、他の遺伝子の発現は阻害しない。さらに別の特定の例では、標的遺伝子および他の１または複数の遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を使用することができる。
【００７２】
当業者ならば、本発明のコンジュゲートに組み込まれる核酸分子の特定の選択がそのコンジュゲートに存在する選択性薬剤のタイプに依存することを認識するであろう。従って、本核酸は、選択性薬剤が特異的に結合する神経伝達物質輸送体を発現する細胞で発現される標的分子に特異的である。このような場合、核酸がアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであれば、その核酸は標的分子と塩基対を形成することにより働き、この場合、標的分子はｍＲＮＡである。核酸がアプタマーであれば、標的分子は前記ｍＲＮＡによりコードされているポリペプチドである。
【００７３】
当業者ならば、標的ｍＲＮＡに対して特異的な本発明の核酸が、上述の方法のいずれかを用いて選択され、相当するｍＲＮＡのレベルに実質的な低下を誘導するその能力に関して試験可能であることを認識するであろう。これらの領域は、異種間で保存性の高い領域またはコード領域内で翻訳複合体との潜在的干渉を避けるための一次転写産物の非コード領域に相当する領域に相当する。
【００７４】
２つの所与の核酸配列を対となるようにアライメントする方法は当業者に広く知られており、ＢＬＡＳＴＮタイプの標準的アルゴリズム[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]により、デフォルトパラメーターを使用して実施することができる。複数の核酸配列のアライメントの方法は、ＣＬＵＳＴＡＬＷタイプの標準的アルゴリズム(Thompson JD et al, Nucleic Acids Res, 1994, 22:4673-4680)を使用し、デフォルトパラメーターを使用して実施することができる。
【００７５】
好ましい実施形態では、選択性薬剤が視床下部で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸はサイトカインシグナル伝達３（ＳＯＣＳ３）、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）、ＣＢ１、インターロイキンβ１（ＩＬ１Ｂ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロペプチドＹ１、ニューロペプチドＹ５およびグレリン受容体サプレッサーのｍＲＮＡに特異的である。
【００７６】
用語「ＳＯＣＳ３」は、リン酸化されたレプチン受容体にそのＳＨ２ドメインを介して結合することによるレプチンによるシグナルの伝達と、偽基質として働くそのＮ末端キナーゼ阻害領域を介したＪａｋチロシンキナーゼ活性の阻害とに関与する、天然型または組換え型のポリペプチド「サイトカインシグナル伝達−３のサプレッサー」を意味する。ＳＯＳＣ３ポリペプチドの種々のオーソログは、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ヒト、マウスおよびラットタンパク質配列に関してそれぞれ受託番号ＮＰ＿００３９４６、ＮＰ＿０３１７３３、およびＮＰ＿４４６０１７として示されている（２０１３年１０月２１日）。ＳＯＣＳ３ポリペプチドの種々のオーソログは、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ヒト、マウス、およびラットポリヌクレオチド配列に関してそれぞれ受託番号ＮＭ＿００３９５５．２、ＮＭ＿００７７０７．２、およびＮＭ＿０５３５６５．１として示されている（２０１３年１０月２１日）。
【００７７】
本発明で使用することができる好適なＳＯＣＳ３特異的ｓｉＲＮＡは、例えば、ＷＯ２０１２０８２７６５に示されているものである。本発明で使用することができる好適なＳＯＣＳ３特異的アンチセンス核酸は、例えば、ＵＳ２０１０１３５９５２、ＵＳ２００４０８７５３０、Raghavendra Rao et al., (J Neurochem., 2002, 83, 1072-1086)、Fox et al., (J. Immunol., 2003, 170, 3679-3687)に示されているものである。
【００７８】
別の好ましい実施形態では、ＳＯＣＳ３に特異的な核酸は、配列ＧＵＧＧＣＧＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＴ（配列番号１）を有するギャップマーであり、ここで、下線のブロックは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドに相当する。
【００７９】
別の好ましい実施形態では、ＳＯＣＳ３に特異的な核酸は、配列ｃｕｕｕｕｃｇｃｕｇｃａｇａｇｕｇａｃＴＴ（配列番号２）のセンス鎖とおよび配列ｇｕｃａｃｕｃｕｇｃａｇｃｇａａａａｇＴＴ（配列番号３）のアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡである。
【００８０】
用語ＰＴＰ１Ｂは、本明細書で使用する場合、インスリン応答の負のレギュレーターとして同定されているタンパク質チロシンホスファターゼｌＢを意味する。単離されたＰＴＰ−１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインスリン受容体を脱リン酸化する(Tonks, N. K., 1988, J. Biol. Chem., 263: 6731-6737)。インスリン受容体の複数のホスホチロシン残基のＰＴＰ−１Ｂ脱リン酸化は順次、受容体自己活性化合物に重要な３つのチロシン残基に特異性を持って進行する(Ramachandran, C. 1992, Biochemistry, 31: 4232-4238)。インスリン受容体の脱リン酸化に加え、ＰＴＰ−１Ｂはまた、インスリン受容体の主要基質であるインスリン関連基質１(insulin related substrate 1)（ＩＲＳ−１）も脱リン酸化する(Lammers, R., 1993, J. Biol. Chem. 268: 22456-22462)。ＰＴＰ−１Ｂポリペプチドのヒトオーソログは、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２８２７として示されている（２０１３年１０月２１日）。
【００８１】
本発明による核酸により標的化され得る好適なＰＴＰ−１Ｂ配列は、ＷＯ２００３０７０８８の表２に示されている。好適なＰＴＰ  １Ｂ特異的ｓｉＲＮＡは、ＷＯ２００３０７０８８の表２に示されている。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、ＰＴＰ−１Ｂに特異的な核酸は、配列ＧＣＵＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＣＵＧＣ（配列番号４）を有するギャップマーであり、ここで、下線のブロックは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドに相当し、太字のブロックはホスホロチオエートにより連結されたヌクレオチドに相当する。
【００８３】
別の好ましい実施形態では、ＰＴＰ−１Ｂに特異的な核酸は、配列ｃｃｇｃａｕｃａｕｇｇａｇａａａｇｇｃＴＴ（配列番号５）のセンス鎖と配列ｇｃｃｕｕｕｃｕｃｃａｕｇａｕｇｃｇｇＴＴ（配列番号６）のアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡであり、大文字の配列は二重鎖ｓｉＲＮＡのオーバーハングに相当する。
【００８４】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が中脳で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、ドーパミンＤ１、Ｄ２もしくはＤ３受容体、ドーパミン輸送体またはα−シヌクレインに特異的である。
【００８５】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が脳幹で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体、セロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体、ＳＥＲＴ（セロトニン輸送体）、α１Ａ−アドレノセプター、アンジオテンシン変換酵素、Ｇタンパク質β３、５−ＨＴ２Ｃ受容体、インターロイキン１β、モノアミンオキシダーゼＡ、カンナビノイドＣＢ１受容体およびα−シヌクレインからなる群から選択されるｍＲＮＡに特異的である。
【００８６】
より好ましい実施形態では、選択性薬剤が脳幹で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸はセロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体のｍＲＮＡに特異的である。
【００８７】
用語「セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体」は、内在性の神経伝達物質セロトニンと結合する５−ＨＴ受容体のサブタイプを意味する。セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体のヒト配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに受託番号Ｐ０８９０８で示されている（２０１３年１０月２１日）。
【００８８】
好ましい実施形態では、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体に特異的な核酸はｓｉＲＮＡである。別の好ましい実施形態では、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体に特異的な核酸は、配列ｇｇｕｇｃｕｃａａｃａａｇｕｇｇａｃｕＴＴ（配列番号１１）のセンス鎖と配列ａｇｕｃｃａｃｕｕｇｕｕｇａｇｃａｃｃＴＴ（配列番号１２）のアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡである。
【００８９】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が皮質で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、アミロイド前駆体タンパク質として２１番染色体にコードされている遺伝子産物、プレセニリン１、プレセニリン２、アポリポタンパク質Ｅ、サイクリン依存性キナーゼ５、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３、微小管親和性調節キナーゼＡ２、ドーパミンＤ４受容体、アセチルコリンエステラーゼ、アデノシンＡ２受容体、ＣＢ１、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ヒスタミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、Ｈ３、５−ＨＴ６、ホスホジエステラーゼ１０Ａ、ホスホジエステラーゼ１Ｂ、ホスホジエステラーゼ１Ｃ、ホスホジエステラーゼ２Ａ、ホスホジエステラーゼ４Ａ、ホスホジエステラーゼ４Ｂ、ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ホスホジエステラーゼ７Ｂ、ホスホジエステラーゼ８Ｂ、ホスホジエステラーゼ９Ｂ、ドーパミン受容体Ｄ１、Ｄ２またはＤ３、未同定タンパク質Ｃ９ｏｒｆ７２、プログラニュリン、タウ、ハンチンチン、α−シヌクレイン、キヌレニンアミノトランスフェラーゼおよびｍｉＲ−１３７からなる群から選択されるｍＲＮＡに特異的である。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が小脳で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、アトロフィン−１、脆弱Ｘ精神遅滞１、Ｇタンパク質共役受容体５５、１ｐ３６、アタキシン１、アタキシン１０、チューブリンキナーゼ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、Ｋｖ３．３チャネル、プロテインキナーゼＣγ、イノシトール受容体、アタキシン１７、インターフェロン関連発生調節遺伝子１、アタキシン１９、アタキシン２、アタキシン２０、アタキシン２１、アタキシン２２、ダイノルフィン、アタキシン２５、アタキシン２６、線維芽細胞増殖因子１４、ミトコンドリアメタロプロテアーゼ複合体、アタキシン２９、アタキシン３、アタキシン３０、チミジンキナーゼ２およびＮＥＤＤ４関連脳発現、アタキシン３２、アタキシン３３、１６ｐ１２．３−ｑ１６．２によりコードされている遺伝子産物、トランスグルタミナーゼ、核タンパク質５６、アタキシン４、アタキシン５、Ｐ／Ｑカルシウムチャネルのα１Ａサブユニット、アタキシン７およびＫｅｌｃｈ様タンパク質１からなる群から選択されるｍＲＮＡに特異的である。
【００９１】
より好ましい実施形態では、選択性薬剤が小脳で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸はアタキシン１のｍＲＮＡに特異的である。
【００９２】
用語「アタキシン１」は、ＣＢＦ１コリプレッサーとして働くことによりＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの不在下でＮｏｔｃｈシグナル伝達を抑制するクロマチン結合因子である脊髄小脳運動失調タイプ１タンパク質を意味する。アタキシン１ポリペプチドの種々のオーソログが、ＮＣＢＩデータベースにヒトおよびマウスに関してそれぞれ受託番号ＮＰ＿０００３２３およびＮＰ＿００１１８６２３３として示されている（２０１３年１０月２１日）。
【００９３】
好ましい実施形態では、アタキシン１に特異的な核酸はｓｉＲＮＡである。別の好ましい実施形態では、アタキシン１に特異的な核酸は、配列ｇａｕｃｕａａｃｇｕｇｇｇｃａａｇｕａＴＴ（配列番号９）のセンス鎖と配列ｕａｃｕｕｇｃｃｃａｃｇｕｕａｇａｕｃＴＴ（配列番号１０）のアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡである。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が線条体で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、ドーパミンＤ１、Ｄ２またはＤ３受容体、セロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体、アデノシンＡ２Ａ受容体、ハンチンチン、およびドーパミン輸送体からなる群から選択されるｍＲＮＡに特異的である。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が海馬で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、２１番染色体にコードされている遺伝子産物、アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン１、プレセニリン２、アポリポタンパク質Ｅ、サイクリン依存性キナーゼ５、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３、微小管親和性調節キナーゼ、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体、アデノシンＡ１受容体、アセチルコリンエステラーゼ、カンナビノイドＣＢ１受容体、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ヒスタミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、Ｈ３、５−ＨＴ６、酸化窒素シンターゼ、ホスホジエステラーゼ１０Ａ、ホスホジエステラーゼ１Ｂ、ホスホジエステラーゼ１Ｃ、ホスホジエステラーゼ２Ａ、ホスホジエステラーゼ４Ａ、ホスホジエステラーゼ４Ｂ、ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ホスホジエステラーゼ７Ａ、ホスホジエステラーゼ７Ｂ、ホスホジエステラーゼ８Ｂおよびホスホジエステラーゼ９Ａからなる群から選択されるｍＲＮＡに特異的である。
【００９６】
より好ましい実施形態では、選択性薬剤が小脳で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βのｍＲＮＡに特異的である。
【００９７】
用語「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β」は、セリンおよびトレオニンアミノ酸残基へのリン酸分子の付加を媒介するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼを意味する。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βのヒト配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに受託番号Ｐ４９８４１で示されている（２０１３年１０月２１日）。
【００９８】
好ましい実施形態では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βに特異的な核酸はｓｉＲＮＡである。別の好ましい実施形態では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βに特異的な核酸は、配列ｇｇｃａｃｃａｇａｇｕｕｇａｕｃｕｕｕｇＴＴ（配列番号１３）のセンス鎖と配列ｃａａａｇａｕｃａａｃｕｃｕｇｇｕｇｃｃＴＴ（配列番号１４）のアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡである。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、選択性薬剤が脊髄で発現される受容体に特異的に結合する場合、核酸は、スーパーオキシドジスムターゼ１、アルシン、推定ヘリカーゼセナタキシン、ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳ、セシクル結合膜タンパク質(cesicle-associated membrane protein)結合タンパク質Ｂ／Ｃ、アンギオゲニン、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３、ポリホスホイノシチドホスファターゼ、オプチニューリン、アタキシン−２、バロシン含有タンパク質、レチキュロン４、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｃａｖ２．２、ＣＯＸ−２、κおよび生存運動ニューロンタンパク質からなる群から選択されるｍＲＮＡに特異的である。
【０１００】
Ａ．３．本発明のコンジュゲートのリンカー領域
核酸および選択性薬剤は、直接結合させてもよい。しかしながら、両部分が連結基によって連結されていることが好ましい。
【０１０１】
用語「連結基」、「リンカー」、「架橋基」およびそれらの文法上同等な語は、化合物の２つの部分を連結する有機部分を意味して本明細書で使用される。選択性薬剤は核酸内のいずれのセンスまたはアンチセンスヌクレオチドにも結合させることができるが、好ましくは、３’末端ヌクレオチドおよび／または５’末端ヌクレオチドを介して結合させることができる。内部コンジュゲートは直接結合させてもよいし、またはリボース基の２’位のヌクレオチドにもしくは別の好適な位置にリンカーを介して間接的に結合させてもよい。
【０１０２】
核酸が二本鎖核酸である場合、コンジュゲートは、センス３’末端ヌクレオチド、センス５’末端ヌクレオチド、アンチセンス３’末端ヌクレオチド、および／またはアンチセンス５’末端ヌクレオチドに結合させることができる。
【０１０３】
定義または慣例によって制限されることを望むものではないが、本出願では、リンカーの長さは、コンジュゲート部分とリンカーを連結する原子と、それを介してリンカーがオリゴヌクレオチドに結合されているオリゴヌクレオチドと会合している末端リン酸部分の酸素原子との間の最短距離に当たる原子数を数えることによって表される。リンカーが１以上の環構造を含んでなる場合、最短経路に当たる環前後の原子を数えることが好ましい。
【０１０４】
本発明において使用するための好適なリンカー基としては、限定されるものではないが、修飾または非修飾ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖、炭水化物、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなどのポリアルキレン、ポリアルコール、ポリプロピレン、エチレンとプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、ポリリジンおよびスペルミジンなどのポリアミン、ポリ（アクリル酸エチル）などのポリエステル、ポリホスホジエステル、脂肪族、およびアルキレンが挙げられる。さらに、ω−アミノ−１，３−ジオール、ω−アミノ−ｌ，２−ジオール、ヒドロキシプロリノール、ω−アミノ−アルカノール、ジエタノールアミン、ω−ヒドロキシ−ｌ，３−ジオール、ω−ヒドロキシ−ｌ，２−ジオール、ω−チオ−ｌ，３−ジオール、ω−チオ−１，２−ジオール、ω−カルボキシ−ｌ，３−ジオール、ω−カルボキシ−１，２−ジオール、コ−ヒドロキシ−アルカノール、ω−チオ−アルカノール、ω−カルボキシ−アルカノール、官能基化オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパルギルアミン、プロパルギルアルコール、およびその他に基づくリンカー／リンカー化学も、適当な長さのリンカーを作製するために本文脈で適用可能である。
【０１０５】
リンカーはまた、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに他の所望の特性、すなわち、高い水溶性、コンジュゲート部分とオリゴヌクレオチド間の分離の最適な距離、柔軟性（またはその欠如）、特定の配向、分岐その他を付与し得る。
【０１０６】
好ましくは、前記連結基は下記の構造
【化６】
2016503394.tif 000017
を有し、ここで、
ｍ、ｎおよびｐは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択され、
ｍ＋ｎ＋ｐの和は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８から選択される整数であり、かつ、
ｋは、０または１である。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ｐは５であり、ｎは２であり、ｋは１であり、かつ、ｍは６であって、リンカーは構造：
【化７】
2016503394.tif 000018
となる。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、ｐは５であり、ｎおよびｋは０であり、かつ、ｍは６であって、リンカーは構造：
【化８】
2016503394.tif 000019
となる。
【０１０９】
特定の実施形態では、リンカーは、選択性薬剤に対して２以上のカップリングを含んでなる。好ましい実施形態では、リンカーは二価または三価のリンカーであり、すなわち、それぞれ２または３分子の選択性薬剤がカップリングすることができる。
【０１１０】
２分子以上の選択性薬剤がリンカーを介して核酸とカップリングしている場合、前記分子は同じ選択性薬剤でも異なる選択性薬剤でもよい。
【０１１１】
特定の実施形態では、二価または三価のリンカーは下式：
【化９】
2016503394.tif 000020
を有し、式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｐ、ｐ’、ｐ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔおよびｕは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から独立に選択され；
ｋ、ｋ’、ｋ’’およびｖは、０および１から独立に選択され；かつ
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）ＯおよびＣ（Ｏ）ＮＨから独立に選択される。
【０１１２】
上記の基の価数に依存して、分岐リンカーは対称的であっても非対称的であってもよい。
【０１１３】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎおよびｎ’が２であり、ｋおよびｋ’が１であり、かつ、ｍおよびｍ’が６である上記に示される二価のリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎ，ｎ’、ｋおよびｋ’が０であり、かつ、ｍおよびｍ’が６である上記に示される二価のリンカーである。
【０１１４】
特定の実施形態では、リンカーは、ｒおよびｒ’が４であり、ｓおよびｓ’が１であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す上記に示される二価のリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣＨ２を表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１５】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎおよびｎ’が２であり、ｋおよびｋ’が１であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒおよびｒ’が４であり、ｓおよびｓ’が１であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１６】
別の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎおよびｎ’が２であり、ｋおよびｋ’が１であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣＨ２を表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１７】
別の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒおよびｒ’が４であり、ｓおよびｓ’が１であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１８】
別の実施形態では、リンカーは、ｐおよびｐ’が５であり、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０であり、ｍおよびｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔおよびｖが０であり、かつ、Ｘ１およびＸ２がＣＨ２を表す上記に示される二価のリンカーである。
【０１１９】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’およびｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’およびｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６である上記に示される三価のリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０であり、かつ、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６である上記に示される三価のリンカーである。
【０１２０】
特定の実施形態では、リンカーは、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２１】
別の実施形態では、リンカーは、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記で示される三価のリンカーである。
【０１２２】
特定の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’およびｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’およびｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２３】
別の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’およびｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’およびｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２４】
別の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２５】
別の実施形態では、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０であり、ｍ、ｍ’およびｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’およびｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’およびｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、かつ、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す上記に示される三価のリンカーである。
【０１２６】
本発明による特に好ましい架橋基は下記の構造：
−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、
ＡおよびＢは、単糖、アルキル鎖および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマー単位を表し；
ａおよびｂは、０〜５０の範囲の整数であり；
ｃは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルスルホネート、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびそれらの混合物からなる群から独立に選択される架橋化合物であり；かつ
ｄは、０または１である。
【０１２７】
特定の実施形態では、架橋基は、構造：
−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、ｂおよびｄは０であり、ｃは１であり、Ａはアルキル鎖であり、かつ、Ｌ２はホスホジエステル結合である。
【０１２８】
Ａ．４．本発明のコンジュゲートのさらなる修飾
本発明のコンジュゲートの別の修飾として、核酸の活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上の部分またはコンジュゲートを、核酸または保護基に化学的に連結することを含む。このような部分としては、限定されるものではないが、コレステロール部分(Letsinger et al, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053-1060)などの脂質部分、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al, EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et a/., Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム ｌ，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート(Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et ai, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)が挙げられる。
【０１２９】
あるいは、細胞分布を増大させることができる部分は、生物障壁中に存在する特定の輸送体を用い、受容体を介するエンドサイトーシスの使用により生物障壁を経て特異的に輸送され得る低分子量化合物またはポリペプチドであってもよい。取り込み受容体および担体の広いアレイは、さらに多数の受容体特異的リガンドとともに、当技術分野で公知である。本発明による使用のための、エンドサイトーシスおよび／またはトランスサイトーシスを媒介する受容体に対する好ましいリガンドとしては、例えば、チアミン輸送体、葉酸受容体、ビタミンＢ１２受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、α（２，３）−シアロ糖タンパク質受容体（例えば、受容体特異的リガンドとしてラマ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなるＦＣ５およびＦＣ４４ナノボディを伴う。）、トランスフェリン−１および−２受容体、スカベンジャー受容体（クラスＡもしくはＢ、タイプＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ、またはＣＤ３６もしくはＣＤ１６３）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体（ＬＲＰｌ、タイプＢ）、ＬＲＰ２受容体（メガリンまたは糖タンパク質３３０としても知られる）、ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ、これはヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の膜結合前駆体である）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、サブスタンスＰ受容体、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体およびマンノース６リン酸受容体に対する、またはそれらに特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１３０】
本発明による使用のための、これらの受容体と結合する好ましいリガンドとしては、例えば、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、α−２−マクログロブリン（α２Ｍ）、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ラクトフェリン、デスモテプラーゼ、組織型およびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ／ｕＰＡ）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ−Ｉ）、ｔＰＡ／ｕＰＡ：ＰＡＩ−ｌ複合体、メラノトランスフェリン（またはＰ９７）、トロンボスポンジン１および２、肝リパーゼ、第Ｖｌｌａ因子／組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、アベタール−４０、アミロイド−β前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ｃｌ阻害剤、補体Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、シュードモナス外毒素Ａ、ＣＲＭ６６、ＨＩＶ−Ｉ Ｔａｔタンパク質、ライノウイルス、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰ）、妊娠帯タンパク質、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補助因子ＩＩ、αｌ−アンチトリプシン、熱ショックタンパク質９６（ＨＳＰ−９６）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪ、またはクラステリン）、ａｐｏＪおよびａｐｏＥに結合したＡＢＥＴＡ、アプロチニン、ａｎｇｉｏ−ｐｅｐｌ、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、トランスフェリン、インスリン、レプチン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、レクチン、ペプチド模倣および／またはヒト化モノクローナル抗体または前記受容体に特異的なペプチド（例えば、ヒトトランスフェリン受容体に結合する配列ＨＡＩＹＰＲＨ（配列番号７）およびＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号８）、または抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）モノクローナル抗体Ａ２４）、ヘモグロビン、ジフテリア毒素ポリペプチド鎖の非毒性部分、ジフテリア毒素Ｂ鎖の全体または一部（ＤＴＢ−Ｈｉｓを含む（Spilsberg  et  al.,2005,Toxicon., 46(8):900-6により記載））、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の非毒性変異体の全体または一部、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ（例えば、ナノ粒子上のポリソーブ−８０コーティングに結合後）、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＡ／レチノール結合タンパク質、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、グルタチオンおよびトランスコバラミン−Ｂ１２からなる群から選択されるリガンドが挙げられる。
【０１３１】
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートの生体膜を経た輸送を促進する基をさらに含んでなる。好ましくは、この基は両親媒性である。例示的薬剤としては、限定されるものではないが、ペネトラチン、アミノ酸４８〜６０を含んでなるＴａｔタンパク質の断片、シグナル配列に基づくペプチド、ＰＶＥＣ、トランスポータン、両親媒性モデルペプチド、Ａｒｇ９、細菌細胞壁透過ペプチド、ＬＬ−３７、セクロピン  Ｐ１、α−デフェンシン、β−デフェンシン、バクテネクチン、ＰＲ−３９およびインドリシジンが挙げられる。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含め、それは修飾が可能である。ヘリックス剤は、好ましくはα−ヘリックス剤であり、好ましくは、親油相および脂質親和相を持つ。
【０１３２】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（本明細書ではオリゴペプチド模倣物とも呼ばれる）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドまたはペプチド模倣物部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る（例えば、表４参照）。
【０１３３】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、エンドソーム溶解性リガンドをさらに含んでなる。エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物もしくはその成分の、エンドソームからその細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解性リガンドは、ｐＨ依存的膜活性および膜融合性を示すポリ陰イオン性のペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。特定の実施形態では、エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームｐＨにおいてその活性立体配座を想定する。「活性立体配座」は、エンドソーム溶解性リガンドがエンドソームの溶解および／または本発明の組成物もしくはその成分の、エンドソームからその細胞の細胞質への輸送を促進する立体配座である。例示的エンドソーム溶解性リガンドとしては、ＧＡＬ４ペプチド(Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972)、ＥＡＬＡペプチド(Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586)、およびそれらの誘導体(Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68)、ＩＮＦ−７ペプチド、Ｉｎｆ  ＨＡ−２ペプチド、ｄｉＩＮＦ−７ペプチド、ｄｉＩＮＦ３ペプチド、ＧＬＦペプチド、ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３ペプチドおよびＩＮＦ−５ペプチドが挙げられる。特定の実施形態では、エンドソーム溶解性成分は、ｐＨの変化に応答して電荷の変化またはプロトン化を受ける化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解性成分は、直鎖であっても分岐型であってもよい。
【０１３４】
Ａ．５．保護基
本発明のコンジュゲートの核酸形成部分は、生体の種々の体液およびコンパートメントを経たそれらの輸送中に、ヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素的消化に耐性を持ち、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびバイオアベイラビリティを改善するように設計される。核酸は、ヌクレアーゼに媒介される分解を防ぐ基の存在により化学的に修飾されることが好ましい。
【０１３５】
本発明の目的では、「キャップ構造」または「保護基」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味すると理解すべきである。５’キャップの限定されない例として、反転した塩基脱落残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオネート架橋基；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転塩基脱落部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転塩基脱落部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオネート；ホスホロジチオネート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。詳細は引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ９７／２６２７０に記載されている。３’キャップとしては、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；ｌ−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド：４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；ｌ，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転塩基脱落部分；５’−ホスホロアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分が挙げられる。Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925もまた参照（この内容は引用することにより本明細書の一部とされる）。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートの核酸配列に結合されたキャップ構造は、以下の一般的構造
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、
ここで、
Ｍは、Ｈ、脂質部分または上記で定義されたターゲティング基であり；
ＡおよびＢは、単糖および（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマー単位を表し；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルホスホネート、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびそれらの混合物からなる群から独立に選択される架橋化合物であり；
ａおよびｂは０〜５０の範囲の整数であり；
ｃは０〜３０の範囲の整数であり；
ｄは少なくとも１の整数である。
【０１３７】
脂質部分は、本明細書中で使用する場合、限定されるものではないが、脂肪、油脂、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホリピド、アミノリピド、クロモリピド（リポクローム）、および脂肪酸を含む、親油性または両親媒性の性質を有する有機化合物を意味する。用語「脂質」は、天然脂質および合成生産脂質の両方を包含する。脂質部分は、通常、オリゴヌクレオチドの親油性を増大させ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるオリゴヌクレオチド構造の細胞内取り込みを助長する。使用され得る好適な脂質として、脂肪酸；脂肪；油；ワックス；コレステロール；ステロール；ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなどの脂溶性ビタミン；モノグリセリド；ジグリセリド、ならびにリン脂質が挙げられる。好ましい脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ドコサン酸（Ｃ２２）、およびリトコール酸とオレイルアミンとのハイブリッド（リトコール−オレイルアミン、Ｃ４３）からなる群から選択されるものである。脂質は、標的組織、標的細胞、投与経路、オリゴヌクレオチドがたどると予想される経路などを考慮に入れることによって状況に応じて当業者が選択できる。
【０１３８】
用語「単糖」は、本明細書で使用する場合、当技術分野において周知であり、ブロックまたは部分を構成するより小さい糖にさらに分解することのできない単一の糖単位からなる糖の単純形態を意味する。このコンジュゲーション基として好ましい糖部分は、フラノース、フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース、修飾単糖、シアル酸およびエリトロースおよびそれらの混合物からなる群から選択される。単糖は、その線状または環状形態（ヘミアセタール環状異性体）にあり得る。フラノースは、Ｄ−リボースまたはフルクトース残基（Ｄ−（−）−フルクトフラノース）などの５員フラン系環を含む任意の単純糖である。単糖の組合せで、複数の糖構造物を得ることができる。フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、二糖類のサッカロースもしくはラクトース、または多糖類のイヌリン、デキストリン、デンプンもしくはグリコーゲンと同様に特に着目される組合せである。
【０１３９】
用語「アルキレングリコール」、「ポリ（アルキレングリコール）」、「アルキレンオキシド」は、本明細書で使用する場合、一般式
−Ｏ−［（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−］ｎ−
を共有するポリエチレンポリマー系列を包含し、
式中、
ｍは各アルキレングリコール単位中に存在するメチレン基の数を表し、ｎは反復単位の数を表し、従って、ポリマーのサイズまたは長さを表す。この用語は、限定されるものではないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジアルキレングリコール（例えば、ジエチレングリコール）、トリアルキレングリコール（例えば、トリエチレングリコール）、および上記のグリコールの対応するモノアルキルエーテルおよびジアルキルエーテルなどのグリコールが挙げられ、ここで、アルキルエーテルは１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルエーテル（例えば、メチル、エチル、プロピルエーテルなど）である。
【０１４０】
他の実施形態では、式（Ｉ）の基は、炭素原子が２〜２０個の任意の線状または分岐型分子であってよい（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールモノマー単位、またはａおよびｂの価に応じて、数個の（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールモノマー単位を有するポリアルキレングリコールポリマーを有する。好ましくは、アルキレングリコール基は、Ｃ１６−Ｃ２０アルキレングリコールから選択される。さらにより好ましくは、アルキレングリコール基はＣ１８アルキレングリコールである
【０１４１】
本発明のコンジュゲートに適切な保護基として、限定されるものではないが、
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
・ＭがＨであり、ｄが０であり、ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａおよびｂがそれぞれ１であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当するＰＥＧ＋糖；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが１であり、ｂが２であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当するＰＥＧ＋（糖）２；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが２であり、ｂが１であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当する（ＰＥＧ）２＋糖；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが３であり、ｂが１であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当する（ＰＥＧ）３＋糖；
・ＡがＰＥＧであり、Ｂが糖であり、ａが５であり、ｂが１であり、ＭがＨであり、ｄが０であり、かつ、Ｌ１およびＬ２がホスホジエステル結合である上式に相当する（ＰＥＧ）５＋糖
が挙げられる。
【０１４２】
用語「ＰＥＧ」および「糖」は、本質的に上記のように使用され、糖としてのフラノースと、Ｃ３、Ｃ９およびＣ１８のスペーサーの群から選択されるＰＥＧとを含む。
【０１４３】
本発明はまた、コンジュゲートが選択性薬剤と結合されてないポリヌクレオチドの一末端または両末端に結合された保護基をさらに含んでなることを企図する。
【０１４４】
Ｂ．本発明のコンジュゲートの構造
本発明によるコンジュゲートの種々の要素は種々の様式で配列することができ、本発明の一部を成す(frorm)。従って、選択性薬剤は核酸の５’末端および／または３’末端にカップリングさせることができる。好ましくは、選択性薬剤は核酸の５’末端にカップリングさせる。さらに、核酸と選択性薬剤とは、直接連結してもよいし、またはリンカーにより接続してもよい。同様に、リンカーも核酸の５’末端および／または３’末端にカップリングさせることができる。好ましくは、リンカーは核酸の５’末端にカップリングさせる。従って、本発明の核酸が単一の核酸鎖を含有する場合、可能な配置は、
・５’末端に結合された選択性薬剤を含んでなる核酸、
・３’末端に結合された選択性薬剤を含んでなる核酸、
・５’末端に結合された選択性薬剤と３’末端に結合された保護基を含んでなる核酸、
・５’末端に結合された保護基と３’末端に結合された選択性薬剤を含んでなる核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、これらの選択性薬剤が、核酸の５’末端および３’末端に接続されている核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、両選択性薬剤が、核酸の５’末端に接続されている二官能性リンカーの２つの末端に接続されている核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、両選択性薬剤が、核酸の３’末端に接続されている二官能性リンカーの２つの末端に接続されている核酸、
・４つの選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、選択性薬剤の２つは核酸の５’末端に接続されている第１の二官能性リンカーの両末端に接続され、選択性薬剤の２つは核酸の３’末端に接続されている第２の二官能性リンカーの両末端に接続されている核酸、
・３つの選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、前記３つの選択性薬剤が三官能性リンカーによって核酸の一末端に接続されている核酸
である。
【０１４５】
それに加えて、本発明のコンジュゲートは、標的分子の発現を調節する２つ以上の核酸鎖を含み得る。例えば、本発明の構築物は、所与の標的分子の異なった領域を標的としたホスホジエステル結合を介して直列に連結された５個までの異なる核酸を含むことができる。
【０１４６】
さらに、核酸が二本鎖核酸であるこれらの場合には、選択性薬剤はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖にカップリングさせてもよく、直接カップリングしてもよいし、またはリンカー基によりカップリングしてもよい。従って、本発明の核酸が単一の核酸鎖を含有する場合、可能な配置は、
・センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端に結合された単一の選択性薬剤を含んでなる核酸、
・センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端に結合された単一の選択性薬剤を含んでなる核酸、
・センス鎖またはアンチセンス鎖の５’に結合された単一の選択性薬剤と反対鎖の５’末端に結合された保護基を含んでなる核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、前記選択性薬剤が核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’および３’末端に接続されている核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、第１の選択性薬剤がセンス鎖の５’末端に接続され、第２の選択性薬剤がアンチセンス鎖の５’末端に接続されている核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、両選択性薬剤がセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の５’末端に、核酸の一方の鎖の５’末端に接続されている二官能性リンカーによって接続されている核酸、
・第１および第２の選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記第１および第２の選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、両選択性薬剤がセンス鎖の３’末端またはアンチセンス鎖の３’末端に、核酸の一方の鎖の３’末端に接続されている二官能性リンカーにより接続されている核酸、
・４つの選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、選択性薬剤の２つがセンス鎖の５’末端に、センス鎖の５’に接続されている第１の二官能性リンカーによって接続され、かつ、選択性薬剤の２つがアンチセンス鎖の５’末端に、アンチセンス鎖の５’に接続されている第２の二官能性リンカーによって接続されている核酸、
・３つの選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、３つの選択性薬剤がセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の５’末端に、三官能性リンカーによって接続されている核酸
・６つの選択性薬剤を含んでなる修飾された核酸であって、前記選択性薬剤は同じであるかまたは異なり、３つの選択性薬剤が三官能性リンカーによってセンス鎖の５’末端に接続され、かつ、３つの選択性薬剤が三官能性リンカーによってアンチセンス鎖の５’末端に接続され、両三官能性リンカーは同じであっても異なっていてもよい、核酸
である。
【０１４７】
コンジュゲートが２以上の選択性薬剤を含有する好ましい実施形態では、種々の選択性薬剤は同じであっても異なっていてもよい。選択性薬剤が異なる場合、それらは同じ受容体に結合しても異なる受容体に結合してもよい。異なる選択性薬剤が異なる受容体に結合する場合、これらの受容体は同じ細胞種または異なる細胞種のいずれで発現されてもよい。受容体が異なる細胞種で発現される場合、これらの受容体は中枢神経系の同じ場所に位置しても異なる場所に位置してもよい。好ましい実施形態では、単一のコンジュゲート内に見られる選択性薬剤は、下記の場所：
（ｉ）中脳および線条体、
（ｉｉ）皮質および海馬、
（ｉｉｉ）脳幹および海馬、
（ｉｖ）皮質、海馬および線条体、
（ｖ）皮質、グリアおよび海馬、
（ｖｉ）海馬および線条体、
（ｖｉｉ）脳幹および視床下部、
（ｖｉｉｉ）皮質および線条体、
（ｉｘ）グリアおよび髄質、
（ｘ）脳幹、皮質および中脳、
（ｘｉ）脳幹、中脳および線条体、
（ｘｉｉ）脳幹、皮質および海馬、ならびに
（ｘｉｉｉ）皮質、中脳および線条体
に結合可能である。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明によるコンジュゲートの選択性薬剤は成長ホルモン分泌促進因子受容体のリガンドであり、核酸は、ＳＯＣＳ３もしくはＰＴＰ  １Ｂ  ｍＲＮＡに、またはその対応するポリペプチドに特異的である。好ましい実施形態では、選択性薬剤はタビモレリンである。別の実施形態では、核酸は一本鎖核酸であり、コンジュゲートは、二官能性リンカーの使用により核酸の５’末端に結合された２つのタビモレリン基を含有する。別の実施形態では、核酸は一本鎖核酸であり、コンジュゲートは、核酸の３’末端に結合された二官能性リンカーの使用により核酸の３’末端に結合された２つのタビモレリン基を含有する。別の実施形態では、核酸は一本鎖核酸であり、コンジュゲートは、核酸の５’末端および３’末端にそれぞれ結合された２つのタビモレリン基を含有する。
【０１４９】
別の実施形態では、核酸は二本鎖核酸であり、コンジュゲートは、二官能性リンカーに使用によりセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の５’末端に結合された２つのタビモレリン基を含有する。別の実施形態では、核酸は二本鎖核酸であり、コンジュゲートは、２つのタビモレリン基を含有し、第１の基がセンス鎖の５’末端に結合され、第２の基がアンチセンス鎖の５’末端に結合されている。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明によるコンジュゲートは、中枢神経系の同じ領域で発現される異なる受容体に標的化された異なる選択性薬剤を含有する。ＳＯＣＳ３またはＰＴＰ−１Ｂに特異的な核酸を含んでなるコンジュゲートの場合、選択性リガンドは、視床下部で発現される異なる受容体に標的化され得る。従って、別の実施形態では、第１および第２の選択性薬剤は、視床下部で発現される、成長ホルモン分泌促進因子受容体、ガラニンＧＡＬ１受容体、カルシトニン受容体様、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ２受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ２受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、ボンベシンＢＢ３受容体、カルシトニンＡＭ１受容体、カルシトニンＡＭＹ１受容体、カルシトニンＣＧＲＰ受容体、カルシトニン受容体、フリッツルドＦＺＤ２受容体、フリッツルドＦＺＤ５受容体、メラノコルチンＭＣ２受容体、メラノコルチンＭＣ３受容体、メラノコルチンＭＣ４受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＦＦ１受容体、ニューロペプチドＹ  Ｙ４受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、オレキシンＯＸ１受容体、オレキシンＯＸ２受容体、ソマトスタチンｓｓｔ１受容体、ソマトスタチンｓｓｔ５受容体、オキシトシン受容体、バソプレシンＶ１Ａ受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、バソプレシンＶ２受容体、キスペプチン受容体、ニューロペプチドＦＦ／Ｂ  ＮＰＢＷ１受容体、ペプチドＰ５１８受容体、タキキニンＮＫ１受容体、タキキニンＮＫ２受容体およびタキキニンＮＫ３受容体からなる群から選択される受容体の組合せ対のいずれかに指向される。
【０１５１】
本発明のコンジュゲートの核酸形成部分は、生体の種々の体液およびコンパートメントを経たそれらの輸送中に、ヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素的消化に耐性を持ち、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびバイオアベイラビリティを改善するように設計される。細胞エキソヌクレアーゼは、標的として遊離型の５’末端を用いる。従って、一本鎖核酸の場合、選択性薬剤は核酸の５’側にカップリングされると安定化部分として働き得る。しかしながら、選択性薬剤が３’末端に連結された二本鎖核酸または一本鎖核酸を含んでなるコンジュゲートの場合、コンジュゲートは、通常はエキソヌクレアーゼの活性による核酸の分解を防ぐ基である安定化部分またはキャップ構造をさらに含み得る。二本鎖核酸の場合、下記の可能な配置が存在する。
【０１５２】
好ましい実施形態では、核酸は、選択性薬剤がアンチセンス鎖の５’末端に連結され、保護基がセンス鎖の５’末端に連結された二本鎖ＲＮＡである。なおさらに好ましい実施形態では、保護基は、構造
Ｍ−Ｌ１ｄ−［（Ａ−Ｌ２）ａ−（Ｂ−Ｌ３）ｂ］ｃ−
を有し、ここで、ＭはＨであり、ｄは０であり、ＡはポリエチレングリコールのＣ１８スペーサーであり、Ｂはフラノースであり、ａは２であり、ｂおよびｃは１であり、かつ、Ｌ２およびＬ３はホスホジエステル結合である。
【０１５３】
本発明のコンジュゲートの核酸形成部分は、生体の種々の体液およびコンパートメントを経たそれらの輸送中に、ヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素的消化に耐性を持ち、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性およびバイオアベイラビリティを改善するように設計される。細胞エキソヌクレアーゼは、標的として遊離型の５’末端を用いる。従って、一本鎖核酸の場合、選択性薬剤は核酸の５’側にカップリングされると安定化部分として働き得る。しかしながら、選択性薬剤が３’末端に連結された二本鎖核酸または一本鎖核酸を含んでなるコンジュゲートの場合、コンジュゲートは、通常はエキソヌクレアーゼの活性による核酸の分解を防ぐ基である安定化部分またはキャップ構造をさらに含み得る。二本鎖核酸の場合、下記の可能な配置が存在する。
【０１５４】
なおさらに好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートは、構造（Ｉ）
【化１０】
2016503394.tif 000021
を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、またはＲ１およびＲ２は一緒にＣ２−Ｃ５アルキレン基を形成し、
Ｊは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化１１】
2016503394.tif 000022
であり、
ｍは、１、２または３であり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
ｐは、１、２または３であり、
ａは、１〜１０であり、
Ｇは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化１２】
2016503394.tif 000023
であり、
Ｒ４およびＲ５は、互いに独立に水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ
Ｒ６は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、水素であり、
かつ、
オリゴヌクレオチドは、ＳＯＣＳ３  ｍＲＮＡまたはＰＴＰ−１Ｂ  ｍＲＮＡに特異的な配列を含んでなる。
【０１５５】
別の実施形態では、コンジュゲートは構造：
【化１３】
2016503394.tif 000024
を有する。
【０１５６】
Ｃ．本発明の医薬組成物
本発明者らは、本発明のコンジュゲートがコンジュゲートの核酸配列により標的とされる核酸の発現を調節する能力を有することを見出した。例えば、ＳＯＣＳ３またはＰＴＰ１Ｂに特異的な核酸と成長ホルモン分泌促進因子受容体に対するリガンドを含んでなるコンジュゲートの場合、その構築物が対象者に投与されると、それは対象者の中脳縫線核内の５ＳＯＣＳ３およびＰＴＰ１Ｂの特異的ノックダウンを効果的に誘導することができる。
【０１５７】
従って、当業者は、本発明のコンジュゲートが、本発明のコンジュゲート中に存在する核酸により標的とされる遺伝子の発現レベルの低下から利益を得る疾患の治療のために適していることを認識するであろう。よって、別の態様において、本発明は医薬に使用するための本発明によるコンジュゲートに関する。加えて、本発明はまた、本発明によるコンジュゲートと薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物にも関する。
【０１５８】
適当な量の本発明のオリゴヌクレオチド構造物は、薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに処方して医薬組成物とすることができる。本発明によるコンジュゲートを含む組成物は、種々の経路により対象者に送達することができる。例示的経路としては、線条体内、脳室内、髄腔内、実質内（例えば、線条体内）、鼻内、および眼内送達が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内、皮下または筋肉注射により全身送達することもでき、それはコンジュゲートの末梢ニューロンへの送達に特に有用である。加えて、本発明のコンジュゲートを鼻内に投与することも可能で、それにより非侵襲的投与様式による全身投与が可能になる。心室内投与も適切な場合がある。好ましい送達経路は脳へ直接、例えば、脳室もしくは脳の視床下部へ、または脳の側方もしくは背側領域への送達である。
【０１５９】
当業者は、Remington's Pharmaceutical Science (第17版, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985)およびGoodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics (第8版, Pergamon Press, Elmsford, N.Y., 1990)（いずれも引用することにより本明細書の一部とされる）などの広く知られ利用可能な資料で論じられている原理および手順に精通している。
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、標準的手順に従ってヒトおよび他の哺乳動物への送達投与に適合した医薬組成物として処方される。通常、静脈内または心室内投与用の組成物は無菌等張緩衝水溶液である。
【０１６１】
必要な場合、組成物は、注射部位における疼痛を緩和するために可溶化剤および局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は、アンプルまたは有効剤の量を示すサシェなどの気密容器中で、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別にまたは単位投与形中に一緒に混合して供給される。組成物を点滴注入により投与すべき場合、製薬等級の無菌水または生理食塩水を含む点滴瓶を用いて投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、成分を投与前に混合することができるように、無菌注射水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１６２】
静脈内投与以外の場合、組成物は少量の加湿剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、ゲル、ポリマー、または徐放性処方物とすることができる。組成物は、当技術分野において公知の従来の結合剤および担体を用いて処方することができる。処方物は、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカライド、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体、医薬の製造における機能性が十分確立されている不活性担体を含むことができる。リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどへのカプセル化を含む種々の送達系が知られており、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。
【０１６３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを含有する治療薬は、中性または塩形態として処方することができる。薬学上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたものなどの遊離アミノ基を伴って形成されたもの、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものなどの遊離カルボキシル基を伴って形成されたものが挙げられる。
【０１６４】
Ｄ．本発明のコンジュゲートの治療的使用
本発明のコンジュゲートで治療することができる臨床病態はコンジュゲートの一部を形成する核酸の特異性に依存すると理解される。従って、本発明のコンジュゲートは、神経伝達物質輸送体を発現する細胞内の対象とする遺伝子をノックダウンすることにより改善することができる任意の疾患の治療のために使用することができる。当業者ならば、コンジュゲートが、細胞中のタンパク質の異常な発現を特徴とする疾患、または標的タンパク質が正常レベルで発現しているが前記標的タンパク質の発現を低下させることにより改善され得る疾患の治療のために有用であることを理解するであろう。よって、別の実施形態では、本発明は、本発明によるコンジュゲートを対象者に投与することを含んでなる、それを必要とする対象者における疾患の治療方法に関し、前記コンジュゲートは、前記疾患に関与する標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる核酸と、前記標的遺伝子が発現される細胞で発現される受容体に特異的なリガンドを含有する。
【０１６５】
選択性薬剤が視床下部で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表３（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表３（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１６６】
【表３】
2016503394.tif 000025
【０１６７】
選択性薬剤が中脳で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表４（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表４（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１６８】
【表４】
2016503394.tif 000026
【０１６９】
選択性薬剤が脳幹で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表５（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表５（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１７０】
【表５】
2016503394.tif 000027
【０１７１】
選択性薬剤が皮質で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表６（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表６（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１７２】
【表６】
2016503394.tif 000028
【０１７３】
選択性薬剤が小脳で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表７（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表７（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１７４】
【表７】
2016503394.tif 000029
2016503394.tif 000030
【０１７５】
選択性薬剤が線条体で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表８（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表８（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１７６】
【表８】
2016503394.tif 000031
【０１７７】
選択性薬剤が海馬で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表９（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表９（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１７８】
【表９】
2016503394.tif 000032
【０１７９】
選択性薬剤が脊髄で発現される受容体に特異的である一実施形態では、本発明は、表１０（右の列）に示される疾患の治療のためのコンジュゲートの使用に関し、その場合、核酸は表１０（左の列）に示される標的ポリペプチドに特異的である。
【０１８０】
【表１０】
2016503394.tif 000033
【０１８１】
特定の障害または病態の治療において有効な本発明のコンジュゲートの量は、その障害または病態の性質によって異なり、治療薬の投与が十分確立された標準的臨床技術により決定することができる。調剤に使用される厳密な用量は、投与経路、および疾患または障害の重症度にもより、医師の判断および患者の必要性に応じて決定されるべきである。脳内投与のための好適な用量範囲は一般に、１〜３０００μｌの１回注射容量で送達されるμｌ当たり約１０３〜１０１５感染単位のウイルスベクターである。μｌ当たりのベクターの感染単位の添加量は一般に、約１０、５０、１００、２００、５００、１０００、または２０００μｌで送達される約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４感染単位のウイルスベクターを含む。効果的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試験系から導かれる用量反応曲線から外挿することができる。
【０１８２】
完治療法のため、本発明のコンジュゲートの脳室内投与の目的で、アクセスポートを有する複数のカテーテルを所与の患者に埋め込むことができる。好ましい実施形態では、脳または脳半球当たり１つのポートとカテーテル系が、おそらく複数ある。神経外科医により埋め込みが実施されれば、患者の神経内科医は、数週間または数ヶ月の期間で繰り返されるコンジュゲートのボーラス注射からなる療法コースを、経時的治療効果をモニタリングしながら行うことができる。フルコースの療法のためには、デバイスを数ヶ月または数年間埋め込んだままにしておくことができる。治療有効性の確認後、アクセスポートを場合により取り出してもよく、またカテーテルを密封して放棄するか、または同様に取り出すこともできる。デバイス材料は、磁気共鳴撮像に干渉してはならず、また、当然のことながら、低分子干渉ＲＮＡ製剤は、アクセスポートおよびカテーテル材料ならびに任意の表面コーティングと適合しなければならない。
【０１８３】
Ｅ．本発明のコンジュゲートの合成
本発明のコンジュゲートは、一般に、有機合成における標準的手順を用いて合成される。当業者ならば、合成の厳密なステップは、合成すべきコンジュゲートの厳密な構造によって異なること認識するであろう。例えば、コンジュゲートが選択性薬剤にその５’末端を介してコンジュゲートされた単一の核酸鎖を含んでなる場合、合成は、通常、以下に説明するように活性化オリゴヌクレオチドと反応性の活性化選択性試薬とを接触させることにより実施される。
【０１８４】
コンジュゲートが二本鎖核酸を含んでなる場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は標準的な分子生物学の手順を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで別々に合成され、アニーリングされる。典型的なコンジュゲートでは、第１の核酸鎖が選択性薬剤を担持し、第２の核酸鎖が保護基を担持する。さらにより好ましい実施形態では、選択性薬剤は第１の核酸鎖の５’末端とカップリングされ、かつ／または保護基は第２の核酸鎖の５’末端に結合されるが、選択性薬剤または保護基の付加は核酸鎖の３’末端に行うこともできる。
【０１８５】
コンジュゲートの合成は、以下のように行うことができる。
【０１８６】
［１］構造：
選択性薬剤−［オリゴヌクレオチド］−３’
を有するコンジュゲートは、一般に下記の工程を用いて合成される。
（ｉ）選択性薬剤を活性化する。好ましくは、選択性薬剤の活性基はスクシンイミド基である。選択性薬剤が第一または第二アミノ基を担持した場合、この基は活性化オリゴヌクレオチドと直接反応し得るので、この工程は必要でない場合がある、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドをその５’末端で活性化する。好ましくは、オリゴヌクレオチドの活性基はアミノ基またはカルボキシル基である、および
（ｉｉｉ）活性化された選択性薬剤と活性化されたオリゴヌクレオチドとを２つの活性基間の反応に適した条件下で接触させる。
【０１８７】
［２］構造：
保護基−［センス鎖］−３’
３’−［アンチセンス鎖］−選択性薬剤
を有するコンジュゲートは、一般に下記の工程を用いて合成される。
（ｉ）選択性薬剤を活性化する。好ましくは、選択性薬剤の活性基はスクシンイミドである。選択性薬剤が第一または第二アミノ基を担持した場合、この基は活性化オリゴヌクレオチドと直接反応し得るので、この工程は必要ない場合がある、
（ｉｉ）センス鎖をその５’末端で活性化する。好ましくは、オリゴヌクレオチドの活性化基はアミノ基である、
（ｉｉｉ）活性化された選択性薬剤と活性化されたセンス鎖を、２つの活性基間の反応に適した条件下で接触させる、
（ｉｖ）固定化したアンチセンス鎖に保護基を付加する。この工程は、好ましくは反応性基がアセチル化またはベンジル化（フラノース基）、２−シアノエチル化（ホスホジエステル結合）およびＦＭＯＣ（環外アミノ基）により封鎖されているオリゴヌクレオチドを用いて行われる、
（ｖ）センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングする。
【０１８８】
Ｅ．１．核酸と５’末端結合された成長ホルモン分泌促進因子に対するリガンドを含んでなるコンジュゲートの合成
本発明のコンジュゲートは、当業者により知られた技術を用いて調製することができる。コンジュゲートの合成は、官能基の選択的保護および脱保護を含み得る。好適な保護基は当業者に周知である。例えば、有機化学における保護基の総説は、Wuts, P.G.M. and Greene T.W. Protecting Groups in Organic Synthesis (第4版 Wiley-Interscience)、およびKocienski P.J. Protecting Groups (第3版 Georg Thieme Verlag)で提供されている。
【０１８９】
本発明に関して、以下の用語は下記で詳細に示す意味を有する。
【０１９０】
用語「Ｃ１−Ｃ６アルキル」は、不飽和を含まず、単結合により分子の残りの部分に連結している１〜６個の、好ましくは１〜３個の（Ｃ１−Ｃ３アルキル）炭素原子を有する炭素原子と水素原子からなる線状または分岐型の炭化水素基を意味する。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルなどのアルキル基が挙げられる。好ましくは、アルキルはメチルを意味する。
【０１９１】
用語「ハロゲン」は、ブロモ、クロロ、ヨードまたはフルオロを意味する。
【０１９２】
用語「ハロアルキル」は、少なくとも１個の水素原子がハロゲンにより置き換えられた上記で定義されるアルキル基を意味する。ハロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＨＦ２、ＣＦ２ＣＦ３が挙げられる。好ましくは、ハロアルキルはＣＦ３を意味する。
【０１９３】
用語「Ｃ６−Ｃ１０アリール」は、例えばフェニル、ナフチルおよびジフェニルを含む、炭素−炭素結合により結合したまたは縮合した１または２個の芳香族核を含んでなる、６〜１０個の間の炭素原子を有する芳香族基を意味する。好ましくは、「アリール」はフェニルを意味する。
【０１９４】
上記の式（Ｉ）により表される本発明の化合物は、キラル中心の存在に応じて立体異性体を含み得る。単一の異性体、鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびそれらの混合物は本発明の範囲内にある。
【０１９５】
特に断りのない限り、本発明において使用する化合物は、１以上の同位体が富化された原子が存在することのみが異なる化合物を含むことが意図される。例えば、水素の重水素もしくはトリチウムによる置換、または炭素の１３Ｃもしくは１４Ｃが富化された炭素による置換、または１５Ｎが富化された窒素による置換を除き、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内にある。
【０１９６】
カルボキシ誘導体化核酸および活性化三重取り込み阻害剤を用いた合成
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、アミノ誘導体化選択性薬剤とカルボキシル誘導体化オリゴヌクレオチドのコンジュゲーションにより得られる。特に、本発明のコンジュゲートは構造（Ｉ）：
【化１４】
2016503394.tif 000034
を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、水素もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであるか、またはＲ１およびＲ２は一緒にＣ２−Ｃ５アルキレン基を形成し、
Ｊは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化１５】
2016503394.tif 000035
であり、
ｍは、１、２または３であり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
ｐは、１、２または３であり、
ａは、１〜１０であり、
Ｇは、１以上のＣ１−Ｃ６アルキルまたはハロゲンで置換されていてもよい基
【化１６】
2016503394.tif 000036
であり、
Ｒ４およびＲ５は互いに独立に、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ
Ｒ６は、水素またはＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、水素であり、
かつ、
オリゴヌクレオチドは、標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、前記標的分子は表３（左の列）に定義されるポリペプチドのｍＲＮＡである。
【０１９７】
（ＩＩＩ）の構造を有するコンジュゲートの合成方法は、（Ｖ）：
【化１７】
2016503394.tif 000037
の構造を有する化合物を式（ＶＩ）：
【化１８】
2016503394.tif 000038
を有するカルボキシ修飾オリゴヌクレオチドと反応させることを含んでなる。
【０１９８】
よって、本発明はまた、オリゴヌクレオチドが標的分子に特異的に結合することができる核酸であり、前記標的分子が表３（左の列）に定義されるポリペプチドのｍＲＮＡである、構造（ＶＩ）を有する化合物に関する。特定の実施形態では、構造（ＶＩ）を有する化合物中のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーである。特に、前記ギャップマーは、５個の２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドのブロックに挟まれた１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。別の実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖である。
【０１９９】
カルボキシルリンカー修飾因子を用いてオリゴヌクレオチドを活性化するための一般手法は一般に、以下のスキームに従う。
【化１９】
2016503394.tif 000039
【０２００】
カルボキシ修飾オリゴヌクレオチドの一般合成法
（ｉ）無水アセトニトリル中に修飾因子分子の溶液を作製し、それを合成装置（Ｙ）の外部リザーバーに入れる、
（ｉｉ）必要なオリゴヌクレオチド配列の合成の開始時に、Ｙ塩基を５’末端に付加する。これによりＹリザーバーからのリンカー／修飾因子分子の、オリゴヌクレオチド配列の末端へのカップリングが可能となる、
（ｉｉｉ）適当なカップリングサイクルを用いて合成を開始する。同じカップリングサイクルを用いて、リンカー／修飾因子分子のカップリングも行う、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド合成の終了時に、支持体を洗浄し、最後に支持体をガスで乾燥させる、
（ｖ）固相支持体をカラムから取り出し、それをねじ口バイアルに移し、２段階の脱保護を完了させる。
【０２０１】
カルボキシ修飾オリゴヌクレオチドは、選択性薬剤とのさらなるコンジュゲーションのために脱保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチド中の残存する保護基を総て次のように除去する。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）および８０％ｖ／ｖの飽和アンモニア溶液（３０〜３２％ｗ／ｖのＮＨ３を含有する）を含有する５００μｌの混合物をオリゴヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ規模）の入ったエッペンドルフ管に加えた。この管を密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順によりヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化またはベンゾイル化およびホスホジエステル結合の２−シアノエチル化）および環外アミノ基の保護基（Ｂｚ、Ａｃ、ＩＢｕ）が排除される。次に、この混合物を冷却し、濾過し、上清を乾燥させた。残留ペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させて保護基をヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’で切断した。最後に、得られた溶液をセファデックスカラムで脱塩すると、カルボキシ修飾５’−オリゴヌクレオチドが残った。
【０２０２】
特定の実施形態では、本発明の方法により合成されたコンジュゲートにより含まれるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーである。特に、ギャップマーは、５個の２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドのブロックに挟まれた１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。
【０２０３】
次に、カルボキシル活性化オリゴヌクレオチドを、上記で定義される式（Ｖ）の選択性薬剤の活性化誘導体と反応させる。上記に示される一般式（Ｉ）を有する化合物が得られる。
【０２０４】
特に、この化合物（Ｉ）は、標的分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドを含んでなり、前記標的分子は表３に定義されるポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。特定の実施形態では、構造（ＩＩＩ）を有する化合物中のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーである。特に、ギャップマーは、５個の２’−Ｏメチル修飾リボヌクレオチドのブロックに挟まれた１０個のデオキシヌクレオチドの中央ブロックを含んでなる。別の実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖である。
【０２０５】
Ｆ．診断用のコンジュゲートおよびそれらの使用
神経伝達物質輸送体に高い親和性で結合することができる選択性薬剤を使用することにより治療用化合物の標的細胞特異的様式での送達を達成し得るということは、診断目的に使用できる化合物の送達にも応用できる。従って、別の実施形態において、本発明は、
（ｉ）受容体に特異的に結合する選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合時に前記受容体が細胞によって内部移行され得る、少なくとも１種の選択性薬剤と、
（ｉｉ）撮像剤
を含んでなるコンジュゲートを提供する。
【０２０６】
用語「選択性薬剤」および「受容体」は上記で詳細に説明されており、本発明の診断用コンジュゲートについても同様に理解することができる。上記の選択性薬剤はいずれも、本発明による撮像法のためのコンジュゲートにおいて使用可能である。
【０２０７】
用語「撮像剤」および「造影剤」は、本明細書において互換的に使用され、その使用により、その像の異なる領域間の「コントラスト」を増強することにより像の異なる部分の区別が容易になる生体適合性化合物を意味する。従って、用語「造影剤」は、そのような薬剤の不在下でも生成可能な像（例えば、ＭＲＩの場合）の品質を向上させるために使用される薬剤、ならびに像の生成に欠くことのできない薬剤（例えば、核撮像の場合）を包含する。好適な造影剤としては、限定されるものではないが、放射性核種撮像用、コンピューター断層撮影用、ラマン分光法用、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）用および光学的撮像用の造影剤が挙げられる。
【０２０８】
放射性核種撮像用の造影剤として、通常、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕおよび６８Ｇａなどの陽電子放射体で標識された放射性薬剤が挙げられる。ＳＰＥＣＴ放射性薬剤は、通常、９４ｍＴｃ、２０１Ｔｌおよび６７Ｇａなどの陽電子放射体で標識される。放射性核種撮像様式（陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）；単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ））は、放射性核種で標識された放射性トレーサーの位置および濃度をマッピングする診断用断面撮像技術である。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴは、代謝活性を測定することにより放射性核種の位置決定および同定を行うために使用することができる。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴは、細胞生存率などの細胞レベルでの情報に属する情報を提供する。ＰＥＴにおいて、患者は、陽電子を放出する微弱な放射性物質を摂取するかまたは注射され、この物質は身体中を移動するのでモニタリングすることができる。一つの一般的な適用では、例えば、患者は陽電子放射体が結合されたグルコースを与えられ、患者が種々の課題を遂行する際の脳がモニタリングされる。脳はそれが働く際にグルコースを使用するので、ＰＥＴ像はどこで脳活性が高いかを示す。本発明のある実施形態では、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏのＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ撮像のためにｅｘ  ｖｉｖｏで標識する。ＰＥＴと密接に関係するのは単光子放射コンピューター断層撮影法、またはＳＰＥＣＴである。この二者の間の主な違いは、ＳＰＥＣＴが、陽電子放出物質の代わりに低エネルギー光子を放出する放射性トレーサーを使用することである。
【０２０９】
ＣＴ撮像用の造影剤は、例えば、ヨウ素化または臭素化造影媒体を含む。これらの薬剤の例としては、イオタラメート、イオヘキシル、ジアトリゾエート、イオパミドール、エチオドールおよびイオパノエートが挙げられる。ガドリニウム剤もＣＴ造影剤として使用されることが報告されている（例えば、Henson et al., 2004参照）。例えば、ガドペンテート剤がＣＴ造影剤として使用されている（Strunk and Schild,2004で論述）。コンピューター断層撮影（ＣＴ）が本発明に関して撮像様式として企図される種々の角度から時には千本を超える一連のＸ線を用い、次にそれらをコンピューターと組み合わせることにより、ＣＴは身体の任意の部分の３次元像を構築することを可能にする。コンピューターは任意の角度からおよび任意の深さで２次元断面を表示するようにプログラムされている。ＣＴにおいて、最初のＣＴスキャンで診断がつかないときには、本明細書に記載したものなどの放射線不透過造影剤の静注が、軟組織体の同定および描写の助けとなり得る。
【０２１０】
光学的撮像用の造影剤としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体の誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーン誘導体、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、テキサスレッド誘導体、マラカイトグリーン，ナノゴールドスルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー色素、ダポキシル色素および本明細書に開示されている種々の他の蛍光化合物が挙げられる。
【０２１１】
好ましい実施形態では、造影剤は、磁気共鳴撮像装置により撮像可能な化合物である。磁気共鳴撮像装置により撮像可能な造影剤は、他の撮像技術で使用されるものと異なる。それらの目的は、同一のシグナル特性を有する組織コンパートメント間を識別するのに役立つこと、および緩和時間を短縮すること（Ｔｌ強調スピンエコーＭＲ像により強いシグナルを、そしてＴ２強調像に低強度のシグナルを生ずることになる）である。ＭＲＩ造影剤の例としては、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、および鉄粒子が挙げられる。特定の一実施形態では、ＭＲＩ造影剤は１９Ｆである。ＣＴおよびＭＲＩは両方とも組織境界を識別するのに役立つ解剖学的情報を提供する。ＣＴに比較したＭＲＩの欠点として、患者の忍容性が低いこと、ペースメーカーおよびある種の他の金属インプラントデバイスの禁忌、ならびに複数の原因（それらの少なからずが運動である）が関係するアーチファクトが挙げられる(Alberico et al., 2004)。他方、ＣＴは迅速で、十分な忍容性があり、かつ容易に利用できるが、ＭＲＩよりコントラスト解像度が低く、ヨウ素化造影剤およびイオン化性放射線が必要になる(Alberico et al., 2004)。ＣＴおよびＭＲＩの両方の欠点は、いずれの撮像様式も細胞レベルにおける機能的情報を提供しないことである。例えば、いずれの様式も細胞生存率に関する情報を提供しない。磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）は、ＣＴより新しく、高強度磁石およびラジオ波周波数シグナルを使用して像を生成する撮像様式である。生物組織中に最も豊富な分子種は水である。撮像検査で最終的にシグナルを生じさせるのは、水のプロトン核の量子力学的「スピン」である。ＭＲＩにおいては、撮像される試料が強い静的磁場（１〜１２テスラ）に置かれ、スピンがラジオ波周波数（ＲＦ）の放射線のパルスで励起されて試料中に正味の磁化を生じさせる。次に、種々の磁場勾配および他のＲＦパルスがスピンに作用して、記録されるシグナル中に空間的情報をコードする。これらのシグナルを収集して解析することにより、ＣＴ像同様に、通常２次元断面で表示される３次元画像を計算することが可能である。
【０２１２】
ＭＲＩ造影剤としては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）からなる群から選択される金属の錯体が挙げられる。好ましい実施形態では、磁気共鳴撮像装置により撮像することができる化合物は、ガドリニウム系化合物である。
【０２１３】
用語「ガドリニウム系化合物」は、本明細書で使用する場合、脳撮像に関して使用される場合には、対象者に投与可能で静脈内増強が生ずる任意のガドリニウム含有物質を意味するものとする。別の実施形態では、ガドリニウム含有造影剤は、ガドリニウム、ガドリニウムペンテート、およびガドジアミドからなる群から選択される。
【０２１４】
ガドリニウム含有造影剤の投与量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの量で可変である。別の実施形態では、第２の磁気共鳴像がガドリニウム含有造影剤を投与した約４５分後に取得される。本発明はまた、工程（ｃ）または工程（ｄ）のいずれかに続いて対象者に生理食塩水（例えば、リンゲル溶液）を腹腔内投与する工程をさらに含んでなる上記の方法も提供する。
【０２１５】
本発明はまた、診断剤として上記に定義されたコンジュゲートの使用および神経伝達物質輸送体をそれらの表面上に発現する細胞の検出方法も提供する。
【０２１６】
本発明はまた、多モードの撮像法も提供する。本発明のある特定の実施形態は、複数のシグナルを測定することを含む複数の撮像様式を使用して対象者または対象者内の部位を撮像する方法に関する。ある特定の実施形態では、細胞上または細胞中の単一の標識から複数のシグナルが生ずる。上記で示されるように、当業者に知られたいずれの撮像様式も、本発明の撮像法のこれらの実施形態で適用可能である。
【０２１７】
撮像様式は、標識された組成物、例えば、標識された細胞の投与中または投与後の任意の時点で実施される。例えば、撮像試験は、本発明の標識された細胞の投与中に、すなわち、特定の位置へ送達を導く補助とするために、またはその後の任意の時点に実施することができる。
【０２１８】
第１の撮像様式と同時に、または第１の撮像様式後の任意の時点で、付加的撮像様式を実施することができる。例えば、付加的撮像様式は、第１の撮像様式の完了の約１秒、約１時間、約１日、もしくはそれより長い任意の時間の後に、またはこれらの示した時間の間の任意の時点で実施することができる。本発明のある特定の実施形態では、複数の撮像様式が並行して実施され、従って、それらは標識された細胞または薬剤の投与に続いて同時に開始される。当業者ならば、本発明によって企図される種々の撮像様式の実行に精通しているであろう。
【０２１９】
本撮像方法のいくつかの実施形態では、同じ撮像デバイスが第１の撮像様式および第２の撮像様式を実施するために使用される。他の実施形態では、異なる撮像デバイスが異なる撮像様式を実施するために使用される。当業者ならば、本明細書に記載の撮像様式を実行するために利用可能な撮像デバイスに精通しているであろう。
【０２２０】
本発明は、１以上の撮像様式を用いて細胞を撮像するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は複数種の撮像剤で標識され、他の態様では、細胞は単一の標識剤で標識される。ある特定の実施形態では、単一の標識剤は多モード検出可能な薬剤である。
【０２２１】
Ｇ．リポソームおよびデンドリマーを含んでなるコンジュゲート
別の実施形態では、本発明は、リポソームと、受容体に特異的に結合する選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合時に前記受容体が細胞によって内部移行されうる選択性薬剤とを含んでなるコンジュゲートを提供する。
【０２２２】
別の実施形態では、本発明は、デンドリマーと、受容体に特異的に結合する選択性薬剤であって、前記選択性薬剤の結合時に前記受容体が細胞によって内部移行され得る選択性薬剤とを含んでなるコンジュゲートを提供する。
【０２２３】
デンドリマーまたはリポソーム内に治療化合物をカプセル化することにより、コンジュゲートは、前記神経伝達物質輸送体を発現する細胞に対する前記化合物の選択的送達が可能となる。
【０２２４】
好ましい実施形態では、選択性薬剤は、表１（左の列）に定義される受容体に特異的である。別の実施形態では、選択性薬剤は、表１（右の列）に定義される受容体に特異的である。別の実施形態では、選択性薬剤は、表２に定義される任意の薬剤である。より好ましい実施形態では、選択性薬剤は、成長ホルモン分泌促進因子受容体である。なおさらに好ましい実施形態では、選択性薬剤は構造：
【化２０】
2016503394.tif 000040
を有し、ここで、ｍ、ｐ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は上記で定義される通りである。
【０２２５】
リポソームおよびナノ粒子は、薬物のカプセル化に慣用されるナノコンテナの例示的形態である。リポソームは好ましくは、２００ナノメートル未満の直径を有する。５０〜１５０ナノメートルの間の直径を有するリポソームが好ましい。特に好ましいのは、約８０ナノメートルの外径を有するリポソームまたは他ナノコンテナである。好適なタイプのリポソームは、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、またはコレステロールなどの天然リン脂質を、リポソーム内のＤＮＡを安定化させるための少量（１パーセント）のジドデシルジメチル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）などの陽イオン脂質とともに用いて製造される。
【０２２６】
リポソームは、ＤＮＡを封入し、かつ、処方物が血液中に留まっているかまたは血液から標的細胞の細胞内コンパートメントに移行中に核酸をヌクレアーゼから保護することができる、直径２００ｎｍ未満のナノ粒子または任意の他の分子ナノコンテナで置き換えることができる。また、ＰＥＧ鎖などのコンジュゲーション剤を使用する代わりに、スフィンゴミエリンなどの１以上の他のポリマー物質をリポソームまたはナノコンテナの表面に結合させて、「輸送可能ペプチド」のコンジュゲーションのため、および処方物の血液からの除去を遅延させて血漿薬物動態を最適化するための足場を提供するという二重の目的を果たすこともできる。さらに、本発明は、特定の標的受容体を有する任意の細胞群または臓器群へのＤＮＡの送達を企図する。リポソームは、肝臓、肺および脾臓などの臓器へＤＮＡを送達するために使用可能である。
【０２２７】
本発明のコンジュゲートの送達のために好適な他のコンテナとして、デンドリマーが含まれる。用語「デンドリマー」は、コアとそのコアから発散する分岐構造の複数のシェルを有する高分子を意味する。樹枝状担体の形状およびサイズは様々であり得る。場合によっては、樹枝状担体はほぼ球状または球形の形状であってもよい。さらに、樹枝状担体は、例えば、約５００ダルトン〜約２００万ダルトンの分子量範囲に相当する、約１５オングストローム（Ａ）〜約２５０Ａの範囲の直径を有し得る。デンドリマーは、種々の供給先（例えば、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、ミッドランド、ミシガン）から商業的に入手可能であり、または当業者に公知の方法により合成することもできる。樹枝状分子は、低分子量種と高分子量種に大別できる。第１のカテゴリーにはデンドリマーおよびデンドロンが含まれ、第２のカテゴリーはデンドロナイズドポリマー、高分岐ポリマー、およびブラシポリマー（ボトルブラシとも呼ばれる）を包含する。デンドリマーおよびデンドロンは、繰り返し分岐した、単分散、かつ、通常は高対称性の化合物である。デンドリマーおよびデンドロンの定義に明白な違いはない。デンドロンは通常、フォーカルポイントと呼ばれる、単一の化学介入可能な基を含む。モル質量分布の欠如のために、高分子質量デンドリマーおよびデンドロンは高分子ではあるがポリマーではない。デンドリマーの特性は、分子表面上の官能基により支配される。樹枝状足場は内部機能と外部機能を分離することから、機能性分子のデンドリマー封入により、生体材料中の活性部位の構造を模倣する構造である活性部位の孤立化が可能となる。例えば、デンドリマーは、その末端基がカルボキシル基などの親水基である場合には水溶性となり得る。
【０２２８】
デンドリマーは一般に下記の特徴によって特性決定が可能である：（ｉ）１以上の反応性部位を有することができ、デンドリマーの最終トポロジーを左右するような点様または有意なサイズであり得る開始コア（Ｉ）；（ｉｉ）開始コアに結合した分岐状の繰り返し単位の１以上の層；（ｉｉｉ）デンドリマーの表面に、場合により架橋基を介して結合された陰イオン基または陽イオン基などの官能性末端基。
【０２２９】
本明細書において企図されるデンドリマーは、リジン、またはリジン類似体構成単位を含んでなり得る。用語「リジン類似体」は、構成単位の前層に結合するための単一の頂点カルボキシル基と、さらなる構成単位、遮断基、リンカーまたはアリール酸基と結合することができる２個または３個の第一アミン基を有する分子を意味する。本明細書において企図される「リジン類似体」の例はＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２に記載され、例えば、グリシル−ｌｙｓである。いくつかの特定の例では、デンドリマーは、構成単位としてリジンのみかまたはリジン類似体の一タイプを含んでなる。
【０２３０】
本明細書において企図される他のデンドリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）またはポリプロピレンイミン構成単位を含んでなるものが含まれる。その特定の例では、デンドリマーは、構成単位としてポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）またはポリプロピレンイミンのみを有する。
【０２３１】
コア部分は、一構成単位に対して結合点を１つだけ含んでもよいし、または２、３もしくはそれを超える結合点を含んでいてもよく、これらは構成単位の結合のためにさらに使用されてもされなくてもよい。一般に、結合点は遊離アミノ基である。コア部分は、構成単位からなり得るか、構成単位を含んでなり得るか、構成単位から誘導され得るか、または構成単位とは異なる分子であり得る。例示的なコア部分は本発明に示され、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２に記載されている。
【０２３２】
リポソームおよびデンドリマーは、静脈内投与に好適な任意の医薬担体と組み合わせることができる。組成物の静脈内投与は、最小の侵襲性であるので好ましい経路である。必要であれば、他の投与経路も可能である。好適な薬学上許容される担体としては、生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファー、リン酸バッファー、または任意の他の水溶液が含まれる。適当な用量は、当業者に周知の手順によって確定することができる。
【０２３３】
本発明を、本明細書において以下の例により説明するが、これらの例は例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２３４】
以下の分子を、成長ホルモン分泌促進因子受容体を発現する脳領域（視床下部）において標的遺伝子をサイレンシングするそれらの能力に関して調べた。
・ＴＡＢ−ＮＳ−Ｃｙ３：３’オーバーハングＴＴを有し、センス鎖が５’末端でＣ１６リンカーを介してタビモレリンとコンジュゲートされ、アンチセンス鎖がＣｙ３で３’標識されている、二重鎖２１ｍｅｒｓｉＲＮＡ、
・２’−ｏ−メチルヌクレオチドの各末端に１０個のＤＮＡヌクレオチドと５個のヌクレオチドのコアを有する（非センス用とＳＯＣＳ３用）２０ｍｅｒのアンチセンス配列、
・２’−ｏ−メトキシエチルｎｔの各末端に１０個のホスホロチオエートｎｔと５ｎｔのコアを有し（ＰＴＰ１Ｂ用）、その５’末端でＣ１０リンカーによってタビモレリンとコンジュゲートされている、２０ｍｅｒのアンチセンス配列。
【０２３５】
実施例１
Ｃｙ３で標識されタビモレリンで視床下部中心に指向されたｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ標的化のバリデーション
タビモレリンにコンジュゲートし、Ｃｙ３（長鎖リンカー）で標識した単回用量３０μｇの非コードｓｉＲＮＡ配列（ＴＡＢ−ＮＳ−Ｃｙ３）で動物を処置した。非コンジュゲート分子を対照として用いた（ＮＳ−Ｃｙ３）。分子を片側の心室に投与した。１時間後に動物を屠殺し、脳を摘出し、蛍光顕微鏡下での可視化のために処理した。
【０２３６】
非コンジュゲート対照（ＮＳ−Ｃｙ３）に比べてコンジュゲート分子（ＴＡＢ−ＮＳ−Ｃｙ３）で処置したマウスにのみ特定の脳領域、すなわち、視床下部領域にＣｙ３標識が検出されたが、このことは、タビモレリンが核酸分子を特定の脳領域に指向され得ることを示している。
【０２３７】
実施例２
高脂肪食肥満モデルにおいてＳＯＣＳ３  ｍＲＮＡまたはＰＴＰ１Ｂ  ｍＲＮＡに指向されたタビモレリンコンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的効果を評価することによるｉｎ  ｖｉｖｏ標的化バリデーション
動物に高脂肪食（ＨＦＤ）（ＴＤ．０６４１４、６０％脂肪、Ｈａｒｌａｎ）または標準食（対照食：２０１４、Ｈａｒｌａｎ）を１２週間与えた。非肥満動物の平均体重に非肥満標準偏差の２倍を加えたものより重い体重の肥満動物を選択した：
肥満ＢＷ＞非肥満ＢＷ平均＋２×非肥満ＳＤ
ここで、
・ＢＷ＝体重
・ＳＤ＝標準偏差
【０２３８】
投与当日に動物を８時間絶食させた。イソフルオラン麻酔下、下記の分子３０μｇを１２日で１０用量鼻腔内投与した（５μｌ／鼻孔）：
・ビヒクル（ＶＨ）（１×ＰＢＳ）
・ＴＡＢ−ＮＳ−ＡＳＯ４（ＮＳ）（タビモレリンで指向された非センス配列）
・ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４（ＳＯＣＳ３）（タビモレリンで指向されたｓｏｃｓ３  ｍＲＮＡに対するアンチセンス配列）
・ＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４（ＰＴＰ１Ｂ）（タビモレリンで指向されたｐｔｐ１ｂ  ｍＲＮＡに対するアンチセンス配列）。
【０２３９】
体重および食物摂取を毎日モニタリングした。最後の投与の４８時間後に動物を屠殺し、さらなる分析のために組織を回収した。
【０２４０】
図２は、処置中の累積体重増を示す。示されているように、ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４またはＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４のいずれかで処置された動物は、対照動物（ＶＨおよびＮＳ）よりも有意に体重増加が小さかった。
【０２４１】
累積食物摂取（ＦＩ）もまた、ＴＡＢ−ＳＯＣＳ３−ＡＳＯ４またはＴＡＢ−ＰＴＰ１Ｂ−ＡＳＯ４で処置した動物において有意に低下した（図３）。これらの結果は、両分子とも標的化された視床下部領域に到達してＢＷおよびＦＩの低下をもたらすのに効果的であったことを示唆した。
【０２４２】
経日変化を分析したところ（図４）、１日当たりのＦＩだけが有意に低下していた。経日ＢＷ変化は統計的に有意ではなかったにもかかわらず、全処置期間でＢＷをモニタリングしたときには小さな経日変化が表れた（図２の累積ＢＷ増）。
【０２４３】
実施例３
小脳のプルキンエ細胞におけるアタキシンＩの標的化（細胞特異性）およびノックダウンのｉｎ  ｖｉｖｏバリデーション
コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの、標的領域に到達して特定の遺伝子をノックダウンする能力を証明するために、本発明者らは、５−ＨＴ１Ｂ受容体に対するリガンドを選択し、この分子をアタキシン−Ｉ  ｍＲＮＡに対応するｓｉＲＮＡにコンジュゲートした。５−ＨＴ１Ｂ受容体は小脳のプルキンエ細胞で発現されるが、本発明者らは、これらの受容体のアゴニストである５−ノニルオキシトリプタミンオキサレートをアタキシン−ＩのｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡにコンジュゲートして用い、プルキンエ細胞でのみこのタンパク質をノックダウンする。
【０２４４】
アタキシン−１−ｓｉＲＮＡ配列(Lee et al.、Nat Neurosci 11、1137-1139 (2008))
【表１１】
2016503394.tif 000041
【０２４５】
このため、５個体のＣ５７／Ｂｌ６野生型マウスの鼻腔内に、コンジュゲート分子を連続４日間、４ｍｇ／ｋｇ／日濃度で投与し、対照として、同系統の５個体の動物をＰＢＳで処置し、最終投与の２４時間後に動物を屠殺し、比色定量検出によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために脳を処理した。両末端（５’および３’）をジゴキシゲニンで標識した４５ヌクレオチド長のマウスアタキシン−Ｉ  ｍＲＮＡ相補的プローブを使用した。脳の矢状凍結切片をこのプローブとともにインキュベートし、ビヒクルで処置した動物に比べてｍＲＮＡレベルが低下したかどうか検出した。アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートされた抗ゴキシゲニン抗体および基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（図５）とともにインキュベートしたところ、比色定量シグナルが得られた。
【０２４６】
実施例４
リガンド、誘導体化リガンドおよびオリゴヌクレオチドを伴った誘導体化リガンドの５−ＨＴ３および５−ＨＴ１Ａに対する結合アッセイ
候補コンジュゲート１３１９を合成した。コンジュゲート１３１９は、以下の配列を有し、５−ＨＴ１Ａに特異的なｓｉＲＮＡにコンジュゲートされたレリセトロン（セロトニン５−ＨＴ３受容体のリガンド）に相当する(Lee et al., Nat Neurosci 11, 1137-1139 (2008))。
【０２４７】
【表１２】
2016503394.tif 000042
【０２４８】
ＨＥＫ−５ＨＴ３において３Ｈ−ＧＲ６５６３０（０．５ｎＭ）を漸増濃度の１３１９（０．１ｎＭ〜１０μＭ）、レリセトロン−Ｃ６−アシルおよび非誘導体化レリセトロン（０．１ｎＭ〜３０μＭ）に置き換えた：１ウェル当たり３μｇのタンパク質を表１１に示す。
【０２４９】
【表１３】
2016503394.tif 000043
【０２５０】
候補コンジュゲート１３０１を合成した。コンジュゲート１３０１は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β  ｓｉＲＮＡ配列にコンジュゲートされたＬＹ−１６５，１６３（セロトニン５ＨＴ１Ａ受容体のリガンド）に相当する(Wang J. et al., J Biol Chem 281, 33842-33848 (2006))。
【０２５１】
【表１４】
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【０２５２】
ヒト５ＨＴ１Ａ受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞において、３Ｈ−８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（０．６ｎＭ）を、漸増濃度の１３０１（０．１ｎＭ〜１０μＭ）、ＬＹ−１６５，１６３−Ｃ６−アシルおよび非誘導体化ＬＹ−１６５，１６３および対照としての８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（０．１ｎＭ〜３０μＭ）に置き換えた：（表１２）。１ウェル当たり１０μｇのタンパク質を室温で、１５分間プレインキュベートし、６０分間インキュベートした。
【０２５３】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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