(57)【要約】【課題】ポリマー層上に形成された薄膜基板に支持される２つのマイクロチャンバを含むＭＥＭＳ式熱量計が提供される。【解決手段】薄膜基板は、２つのマイクロチャンバ間の温度差を測定する熱電センサと、熱的に安定し、かつ、強度に優れたポリマーダイアフラムとを含む。ＭＥＭＳ式熱量計を製造する方法が提供されるとともに、例えば、生体分子などの材料の熱的性質、あるいは、化学反応または物理的相互作用の熱力学的性質を測定するために当該熱量計を用いる方法も提供される。
2016524713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱量測定のためのマイクロデバイスであって、
第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、
第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、
ポリマー層上に形成された薄膜基板と、
を備え、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとは、同一の体積および構成を有し、隣り合って配置され、それぞれが前記薄膜基板に支持されており、
前記薄膜基板は、前記第１および第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバの床面を構成する第１の側と、前記第１の側の反対側の第２の側とを有し、
前記薄膜基板は、さらに
前記第１熱的に隔離されたマイクロチャンバおよび前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバのそれぞれの下に配置され、前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間の温度差を測定する熱電センサと、
１５０℃を超えるガラス転移温度、および、２５０℃を超える熱分解温度を有する材料からなるポリマーダイアフラムと、
を含むことを特徴とするマイクロデバイス。
【請求項２】
前記熱電センサは、少なくとも１つの熱電対を含み、１つの熱電対当たりの熱電感度は、８０μＶ／℃より大きい、請求項１に記載のマイクロデバイス。
【請求項３】
前記熱電センサは、異種材料の複数の細長いセグメントを含む薄層サーモパイルとして構成され、異種材料の隣接するセグメント同士が対向端部で接続されることにより、熱電対の接点を形成する、請求項１に記載のマイクロデバイス。
【請求項４】
前記異種材料は、アンチモンおよびビスマスを含む、請求項３に記載のマイクロデバイス。
【請求項５】
前記ポリマーダイアフラムの材料は、ポリイミド、パリレン、ポリエステル、および、ポリテトラフルオロエチレンから選択される、請求項１に記載のマイクロデバイス。
【請求項６】
前記薄膜基板は、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバの下でそれぞれ位置合わせされる第１のマイクロヒータおよび第１の温度センサと、
前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバの下でそれぞれ位置合わせされる第２のマイクロヒータおよび第２の温度センサと、
をさらに含む、請求項３に記載のマイクロデバイス。
【請求項７】
前記熱電センサの前記熱電対の接点は、前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバおよび前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバのそれぞれの中心付近に位置し、前記第１の温度センサおよび前記第２の温度センサとそれぞれ垂直に位置合わせされる、請求項６に記載のマイクロデバイス。
【請求項８】
サーモパイルは、前記第１および第２のマイクロヒータ、および、前記第１および第２の温度センサのそれぞれから垂直に離れて絶縁されるよう配置される、請求項６に記載のマイクロデバイス。
【請求項９】
前記ポリマー層は、カプトン膜を含む、請求項１に記載のマイクロデバイス。
【請求項１０】
第１の導入チャネルおよび第２の導入チャネルをさらに備え、前記第１の導入チャネルおよび第２の導入チャネルは、前記第１の導入チャネルまたは第２の導入チャネルを流れる溶液を受動カオス的に混合するよう構成される、請求項１に記載のマイクロデバイス。
【請求項１１】
前記第１の導入チャネルおよび第２の導入チャネルのそれぞれは、蛇行形状を有する部分を含む、請求項１０に記載のマイクロデバイス。
【請求項１２】
前記第１の導入チャネルおよび第２の導入チャネルは、前記第１の導入チャネルまたは第２の導入チャネルを流れる前記溶液に乱流を生じさせるのに十分な内部隆起を含む、請求項１０に記載のマイクロデバイス。
【請求項１３】
検体の熱的性質を決定する方法であって、
第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、
第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、
ポリマー層上に形成された薄膜基板と、
を備えるマイクロデバイスを設けるステップと、
前記マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャを設けるステップと、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバ内に、検体を含む試料材料を導入するステップと、
前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバ内に、前記検体を含まない対照材料を導入するステップと、
前記熱エンクロージャを予め決められた温度走査速度で加熱するステップと、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間の測定された温度差に基づき、前記検体の熱的性質を決定するステップと、を含み、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとは、同一の体積および構成を有し、隣り合って配置され、それぞれが前記薄膜基板に支持されており、
前記薄膜基板は、前記第１および第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバの床面を構成する第１の側と、前記第１の側の反対側の第２の側とを有し、
前記薄膜基板は、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバおよび前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバのそれぞれの下に配置され、前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間の温度差を測定する熱電センサと、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバの下でそれぞれ位置合わせされる第１のマイクロヒータおよび第１の温度センサと、
前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバの下でそれぞれ位置合わせされる第２のマイクロヒータおよび第２の温度センサと、
１５０℃を超えるガラス転移温度、および、２５０℃を超える熱分解温度を有する材料からなるポリマーダイアフラムと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記熱エンクロージャを加熱する間に、加熱電力に一時的な周期変化を与えるステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
加熱電力に一時的な周期変化を与えるステップは、前記マイクロデバイスの前記第１および第２のマイクロヒータによって、試料および前記対照材料に対して同様に一時的に変調された加熱を与えることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記熱電センサの出力を、複数の変調周波数に基づき校正するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料チャンバの下で位置合わせされる前記マイクロデバイスの前記第１のマイクロヒータまたは前記第２のマイクロヒータを用いて前記熱電センサの出力を校正することにより、前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間に一定の示差加熱電力を与えるステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
検体の熱的性質を決定する方法であって、
同一の構成を有する熱的に隔離された２つのマイクロチャンバと、
ポリマー層上に形成されて前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバのそれぞれを支持する薄膜基板であって、前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバ間の温度差を測定する熱電センサを含む薄膜基板と、
を備えるマイクロデバイスを設けるステップと、
前記マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャを設けるステップと、
前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバの一方に、検体を含む試料材料を供給するステップと、
前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバの他方に、検体を含まない対照材料を供給するステップと、
前記熱エンクロージャを予め決められた温度走査速度で加熱するステップと、
前記熱エンクロージャを加熱する間に、前記試料材料および前記対照材料に、一時的に変調された加熱を追加で与えるステップと、
前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバ間の測定された温度差に基づき、前記検体の熱的性質を決定するステップと、
を含む方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの物質間の反応にかかる熱を決定する方法であって、
第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、
第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、
ポリマー層上に形成された薄膜基板と、
を備えるマイクロデバイスを設けるステップと、
前記マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャを設けるステップと、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバ内に、第１の物質と第２の物質とを第１の濃度比で混合した混合物を含む試料溶液を供給するステップと、
前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバ内に、前記第１の物質および前記第２の物質の少なくとも１つを含まない対照溶液を供給するステップと、
前記熱エンクロージャを第１の予め決められた一定温度に維持するステップと、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間の測定された温度差に基づき、前記第１の濃度比、および、前記第１の予め決められた一定温度における前記第１の物質と前記第２の物質との間の反応にかかる熱を決定するステップと、
を含み、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとは、同一の体積および構成を有し、隣り合って配置され、それぞれが前記薄膜基板に支持されており、
前記薄膜基板は、前記第１および第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバの床面を構成する第１の側と、前記第１の側の反対側の第２の側とを有し、
前記薄膜基板は、さらに
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバおよび前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバのそれぞれの下に配置され、前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間の温度差を測定する熱電センサと、
１５０℃を超えるガラス転移温度、および、２５０℃を超える熱分解温度を有する材料でできたポリマーダイアフラムと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
少なくとも２つの物質間の反応にかかる熱を決定する方法であって、
同一の構成を有する熱的に隔離された２つのマイクロチャンバである第１のマイクロチャンバおよび第２のマイクロチャンバと、
ポリマー層上に形成されて前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバのそれぞれを支持する薄膜基板であって、前記熱的に隔離された２つのマイクロチャンバ間の温度差を測定する熱電センサを含む薄膜基板と、
を含むマイクロデバイスを設けるステップと、
前記マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャを設けるステップと、
第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバ内に、第１の物質と第２の物質とを混合させて調製した試料溶液を供給するステップと、
第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバ内に、前記第１の物質および前記第２の物質の少なくとも１つを含まない対照溶液を供給するステップと、
前記第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、前記第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバとの間の測定された温度差に基づき、前記第１の物質と、前記第２の物質との間の反応にかかる熱を決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互対照
本出願は、２０１３年６月５日出願の米国仮出願第６１／８３１，４７２号、２０１３年１２月１３日出願の米国仮出願第６１／９１５、９９５号、および、２０１４年６月４日出願の米国仮出願第６２／００７、８０６号の優先権を主張し、それらすべての内容は、参照により本願に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、全米科学財団よって授与されたＤＢＩ−０６５００２０およびＣＢＥＴ−０８５４０３０の下に政府支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明に対して権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）とは、試料の温度が変化するにつれ、熱活性化過程において発生するまたは要求される熱を測定する熱分析の技法である。生化学系に応用された場合、ＤＳＣは、多種多様な生体分子の相互作用および配座転移の熱力学的性質を決定する非標識な方法を提供し得る。しかしながら、ＤＳＣの計器が扱い難く、大量の試料を消費するということが、生体分子の特性評価にＤＳＣを幅広く応用できない理由であろう。
【０００４】
マイクロ・エレクトロ・メカニカル・システム（ＭＥＭＳ）は、微小な機械デバイスにおける電気機械部品を組み合わせた小型集積デバイスまたはシステムである。ＭＥＭＳの技術は、微細化、多様性、および、超小型電子技術を実現し得る製造技術に基づく。現在入手可能なＭＥＭＳ式熱量計には、固相または気相、あるいは、液滴に基づく検出を提供するものもある。しかしながら、現在入手可能なＭＥＭＳ熱量計では、液体試料を明確に定義された環境で適正に取り扱うことは難しいこともある。
【０００５】
フロースルーおよびコンティニュアスフロー型のＭＥＭＳ熱量計は、マイクロ流体チャンバまたはチャネルをバイオリアクタとして一体化している。これらのデバイスは、制御された流体環境を提供でき、生化学的熱力学の研究のために、他のマイクロ流体機能または温度検知構成と容易に一体化できる。しかしながら、依然として大量の試料を必要し、コンティニュアスフロー型であるためにかなりの対流熱漏れが起きるという制約がある。
【０００６】
また、既存のＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの校正は、発熱体と温度検知構造とが一体化していないことにより複雑になり得る。温度変調式熱量測定（交流熱量測定）は、一時的な周期温度変化が小さい熱量測定を含む。このような温度変調は、生体分子の熱緩和を可能にするので、交流熱量測定は、準平衡の条件下で生体分子の相互作用を検出でき、また、広帯域のバックグラウンドノイズにもかかわらず変調周波数の生化学反応信号を取り出すことができる。しかしながら、これらのチップは、液相における生体分子の特性評価には適さない固体薄膜および操作パラメータも含み得る。
【０００７】
等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）は、モル反応比の関数としての生化学反応に対して発生するまたは必要とされる熱を測定でき、新薬発見や生物学的治療の開発などに応用されている。しかしながら、従来のＩＴＣ機器は、複雑な構造設計を有し、熱応答が遅く、大量の試料および試薬を消費してしまう。
【発明の概要】
【０００８】
本開示内容の一側面によれば、マイクロデバイスが提供される。マイクロデバイスは、第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、薄膜基板と、を備える。第１のマイクロチャンバは、試料チャンバであり、第２のマイクロチャンバは、対照チャンバである。第１および第２のチャンバは、同一の体積および構成と有し、隣り合って配置され、それぞれ薄膜基板上で支持されている。薄膜基板は、試料チャンバおよび対照チャンバのそれぞれの下に配置され、試料チャンバと対照チャンバとの間の温度差を測定する熱電センサを含んでよい。薄膜基板は、所望の測定のための温度範囲を上回るガラス転移温度および熱分解温度を有する材料からなるポリマーダイアフラムも含んでよい。例えば、特定の実施形態によれば、当該材料のガラス転移温度は、１５０℃を上回り、熱分解温度は、２５０℃を上回ってよい。例示的な一実施形態では、ダイアフラムの材料は、ポリイミドであってよい。
【０００９】
本発明のマイクロデバイスのいくつかの実施形態において、電熱センサは、８０μＶ／°Ｃを上回る熱電感度を有する熱電対を含む。他の実施形態では、熱センサは、異種材料の複数の細長いセグメントを含む薄層サーモパイルとして構成され、異種材料の隣接するセグメント同士が対向端部で接続されることにより、熱電対の接点が形成される。
例えば、異種熱電材料はＮタイプおよびＰタイプのテルル化ビスマスと、ＮタイプおよびＰタイプのテルル化アンチモンを含んでよい。例示的な一実施形態において、熱電材料は、アンチモン−ビスマス（Ｓｂ−Ｂｉ）である。
【００１０】
薄膜基板のポリマーダイアフラムの材料は、構造的完全性には十分である引張強度およびヤング率を有する。例えば、特定の実施形態では、材料は、５５ＭＰａより高い引張強度、および、５００ＭＰａより高いヤング率を有する。例えば、ポリマーダイアフラムは、ポリイミド、パリレン、ポリエステル、および、ポリテトラフルオロエチレンなどの材料によって製造され得るが、これらの材料に限定されない。一実施形態において、ポリマーダイアフラムは、ポリイミドによって作製される。
【００１１】
特定の実施形態において、マイクロデバイスの薄膜基板は、第１のマイクロヒータおよび第１の温度センサと、第２のマイクロヒータおよび第２の温度センサと、をさらに備え、第１のマイクロヒータと第１の温度センサとは第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバの下で位置合わせされ、第２のマイクロヒータと第２の温度センサとは、第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバの下で位置合わせされてよい。このような実施形態において、熱電センサの熱電対の接点は、第１および第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバそれぞれの中心付近に位置し、第１の温度センサ、および、第２温度センサとそれぞれ垂直に位置合わせされてよい。マイクロヒータ、および、温度センサは、溶着金属／合金の薄層、あるいは、薄膜基板に含浸された金属／合金の薄層の形態をとってよい。マイクロヒータは、マイクロチャンバを均一に加熱するようにパターン化されてよい。
【００１２】
いくつかの実施形態では、マイクロデバイスのチャンバは、ＳＵ−８、パリレン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、あるいは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのポリマーから形成される周囲壁によって画定される。マイクロデバイスの薄膜基板は、周囲壁のポリマーと、ポリマーダイアフラムの材料との混合物からなる最上層を含んでよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、マイクロデバイスは、第１の導入チャネルと、第２の導入チャネルとをさらに含んでよい。第１の導入チャネルおよび第２の導入チャネルは、それぞれの導入チャネルを流れる溶液に、受動カオス的混合をもたらすよう構成されてよい。例えば、第１および／または第２の導入チャネルは、蛇行形状の部分を含み、さらに、第１の導入チャネルまたは第２の導入チャネルを流れる溶液に乱流を生じさせるのに十分な内部隆起を含む。
【００１４】
本開示内容の他の側面によれば、検体の熱的性質を決定する方法が提供される。試料チャンバには、検体を含む試料材料が提供され、対照チャンバには、検体を含まない対照材料が提供される。マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャは、予め決められた温度走査速度で加熱される。検体の熱的性質は、試料チャンバと対照チャンバとの間の測定された温度差に基づき決定されてよい。
【００１５】
方法のいくつかの実施形態では、熱的に隔離するエンクロージャを加熱する間に、加熱電力に一時的な周期変化があってよい。加熱電力に一時的な周期変化をもたらすことは、一時的に変調された加熱のために、マイクロデバイスのマイクロヒータを用いることによりなされてよい。加熱の一時的な変調は、波形発生器によって制御されてよい。
【００１６】
本開示内容の他の側面によれば、少なくとも２つの物質間の反応にかかる熱を決定する方法が開示される。試料チャンバには、第１の物質と第２の物質との混合物を含む試料溶液が提供され、対照チャンバには、対照溶液が提供される。マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャは、一定温度に維持される。第１の物質と第２の物質との反応にかかる所定温度の熱は、試料チャンバと対照チャンバとの間の測定された温度差に基づき決定されてよい。
【００１７】
第１の物質と第２の物質との間の反応は、化学反応、あるいは、例えば、リガンドとタンパク質との結合などの物理的な結合システムであってよい。熱エンクロージャの温度は、反応にかかる熱が異なる温度で決定されるように変化してよい。同様に、２つの物質間の濃度比は、異なる濃度比で測定された温度によって反応の化学量論が決定できるように変化してよい。試料および／または対照溶液は、上記のような、受動的混合をもたらすことができる導入チャネルを介してそれぞれのチャンバに供給されてよい。
【００１８】
例示的な一実施形態では、生体分子相互作用の特性評価のためのＭＥＭＳ式熱量測定デバイスは、第１のマイクロミキサと、第２のマイクロミキサと、熱的に隔離された反応チャンバと、熱的に隔離された対照チャンバと、熱電センサと、を含んでよい。熱的に隔離された反応チャンバは、第１のマイクロミキサと流体接触する。熱的に隔離された対照チャンバは、第２のマイクロミキサと流体接触する。熱電センサは、反応チャンバおよび対照チャンバに関連する少なくとも１つの温度測定基準で測定する。
【００１９】
第１および第２のマイクロミキサは、受動カオス的マイクロミキサであってよい。例えば、第１および第２のマイクロミキサは、天井にヘリンボーン形状の隆起を有する蛇行チャネルによって形成されてよい。デバイスは、第１のマイクロミキサと流体接触する第１および第２の入口と、第２のマイクロミキサと流体接触する第３および第４の入口とをさらに含んでよい。
【００２０】
反応チャンバおよび対照チャンバは、ポリジメチルシロキサンマイクロチャンバのようなポリマー製マイクロチャンバであってよい。反応チャンバおよび対照チャンバは、蛇行形状を有してよい。反応チャンバおよび対照チャンバは、反応チャンバおよび対照チャンバの基部となるポリイミドダイアフラムのようなダイアフラム上に配置されてよい。
【００２１】
本開示内容の例示的な一実施形態によれば、熱電センサは、サーモパイルであってよい。サーモパイルは、例えば、アンチモン−ビスマスサーモパイルであってよい。反応チャンバの第１の側には第１のサーモパイルの接点が配置され、対照チャンバの第１の側には第２のサーモパイルの接点が配置されてよい。
【００２２】
反応チャンバおよび対照チャンバは、空隙によって囲まれてもよい。本開示内容の例示的な一実施形態によれば、空隙は、蛇行チャネルを含んでよい。デバイスは、反応チャンバおよび対照チャンバ用の温度センサおよびヒータをさらに有してよい。
【００２３】
本開示内容の例示的な一実施形態によれば、少なくとも１つの温度測定基準は、反応チャンバと対照チャンバとの間の示差温度であってよい。他の実施形態によれば、少なくとも１つの温度測定基準は、反応チャンバの温度および対照チャンバの温度であってよい。
【００２４】
本開示の内容は、第１の溶液と第２の溶液との間の生体分子相互作用の特性評価を行うための、ＭＥＭＳ式方法をさらに提供する。一実施例では、方法は、第１の溶液と第２の溶液とを混合して反応溶液を生成するステップと、第１の溶液と緩衝溶液とを混合して対照溶液を生成するステップと、反応溶液を含む反応チャンバと、対照溶液を含む対照チャンバとの間の示差温度を測定するステップと、を含む。示差温度は、ＭＥＭＳ式デバイスにおけるサーモパイルのような熱電センサを用いて測定されてよい。
【００２５】
本開示内容の例示的な一実施形態によれば、第１の溶液と第２の溶液とを混合するために、ＭＥＭＳ式デバイスにおけるマイクロミキサ（例えば、受動カオス的なマイクロミキサ）が用いられてよい。
【００２６】
方法は示唆温度に少なくとも一部基づき、示差電力を計算する方法をさらに含んでよい。示差電力に少なくとも一部基づき、少なくとも１つの熱力学的反応パラメータが計算されてよい。熱力学的反応パラメータは、例えば、平衡結合定数、化学量論、または、モルエンタルピー変化であってよい。
【００２７】
反応チャンバと対照チャンバとの間のベースラインの温度差は、反応溶液および対照溶液を導入する前に測定されてよい。そして、エラー補正のために、示差温度からベースラインの温度差が差し引かれてよい。デバイスは、オンチップヒータを用いて校正されてもよい。
【００２８】
本開示の内容は、生体分子反応の特性評価を行うためのＭＥＭＳ式熱量測定デバイスをさらに提供する。一例示的実施形態では、デバイスは、第１の溶液と第２の溶液とを混合する第１の混合手段と、第１の溶液と緩衝溶液とを混合する第２の混合手段と、第１の混合手段と流体接触する熱的に隔離された反応チャンバと、第２の混合手段と流体接触する熱的に隔離された対照チャンバと、反応チャンバと対照チャンバとの間の示差温度を測定する検出手段と、を備える。デバイスは、示差温度に少なくとも一部基づいて、示差電力を計算する計算手段と、示差電力に少なくとも一部基づいて、少なくとも１つの熱力学的反応パラメータを計算する計算手段と、をさらに備えてよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの概略を示す上面図である。
【図１ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの概略を示す等角図である。
【図１ｃ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの概略を示す断面図である。
【図２ａ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの製造手順を示す。
【図２ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの製造手順を示す。
【図２ｃ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの製造手順を示す。
【図２ｄ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの製造手順を示す。
【図２ｅ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの製造手順を示す。
【図３】本開示内容による交流示差走査熱量測定の原理を示す概略図である。
【図４ａ】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定用マイクロデバイスの概略を示す。
【図４ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定用マイクロデバイスの概略を示す。
【図５】（ａ）本開示の一実施例により製造されたマイクロデバイスのＰＤＭＳハウジング構造およびエアギャップを示す。（ｂ）本開示の一実施例により製造されたマイクロデバイスの固体基板を示す。（ｃ）本開示の一実施例により製造されたマイクロデバイスのサーモパイル、一体型マイクロヒータ、および、薄膜基板に埋め込まれた温度センサを示す。（ｄ）本開示の一実施例により製造されたマイクロデバイスのサーモパイルの接点を示す。
【図６ａ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスを用いた熱量測定のためのテスト設定を示す概略図である。
【図６ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態による、熱エンクロージャの概略図と比較した、特注の温度制御された熱エンクロージャの詳細を示す。
【図７】サーモパイルの温冷接点間の一定の温度差に応じた、本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスからのサーモパイルの出力電圧を示す図である。
【図８】マイクロデバイスの２つのチャンバ間の一定の示差電力に応じた、本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスからの（サーモパイルの出力電圧に関する）定常応答を示す図である。
【図９】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの、ステップ状の示差電力に関する過渡応答を示す図である。
【図１０】リゾチームの変性が生じる温度走査における温度の関数としての、本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの出力を示す図である。
【図１１】（ａ）本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスにより測定された際の、リゾチームの変性の間の温度の関数としての比熱容量を示す図である。（ｂ）本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスにより測定された際の、リゾチームの変性の間の温度の関数としてのモルエンタルピーの変化を示す図である。
【図１２】（ａ）本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの出力を示す図である。（ｂ）異なる温度走査速度における、リゾチームが変性する間の温度の関数としてのモルエンタルピーの変化を示す図である。
【図１３】本開示内容のいくつかの実施形態による、交流ＤＳＣ測定のための実験的な設定を示す概略図である。
【図１４】温冷接点間の一定の示差温度に応じた、本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスのサーモパイルの出力電圧を示す図である。
【図１５】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの２つのチャンバの間の一定の示差電力に応じた、該マイクロデバイスからの（サーモパイルの出力電圧に関する）定常応答を示す図である。
【図１６】ステップ状の示差電力に関する、本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの過渡応答を示す図である。
【図１７】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの（ベースラインサブトラクション後の）サーモパイル電圧の周波数依存性を示す図であり、ここでは、試料チャンバは、リゾチーム（２０ｍｇ／ｍＬ）で満たされ、参照チャンバは、０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で満たされている。
【図１８】（ａ）本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスで測定した際の、異なるリゾチーム濃度および交流変調周波数における、リゾチームの変性が生じる間の温度の関数としてのサーモパイル電圧の振幅変化を示す。（ｂ）本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスで測定した際の、異なるリゾチーム濃度および交流変調周波数における、リゾチームの変性が生じる間の温度の関数としてのサーモパイル電圧の相変化を示す。
【図１９】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスで測定した際の、異なるリゾチーム濃度および交流変調周波数における、ゾチームの変性が生じる間の温度の関数としてのリゾチームの比熱容量を示す図である。
【図２０】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスを用いた、リゾチームの変性プロセスの間の該リゾチームの比熱容量に関する直流ＤＳＣ測定と交流ＤＳＣ測定との比較を示す図である。
【図２１ａ】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定のためのマイクロデバイスの特定の構成要素を示す画像である。
【図２１ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定のためのマイクロデバイスの特定の構成要素を示す画像である。
【図２２】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定のための実験的な設定を示す概略図である。
【図２３ａ】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定を実行するためのマイクロデバイスの校正結果を示す図であり、ステップ状の示差電力への過渡応答を示す。
【図２３ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態による、等温滴定型熱量測定を実行するためのマイクロデバイスの校正結果を示す図であり、一定の示差電力への過渡応答を示す。
【図２４】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスにおける、５ｍＭの１８−クラウン−６および４ｍＭの塩化バリウムをそれぞれ０．５μＬ導入した際の時間分解された出力を、脱イオン水で滴定された５ｍＭの１８−クラウン−６の測定と比較して示す（明確にするために４μＶずらして示している）
【図２５ａ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスにおける、一定のモル比で連続注入した５ｍＭの１８−クラウン−６と塩化バリウムとの結合の等温滴定型熱量測定の出力を示す図である。
【図２５ｂ】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスにおける、モル比の関数としての、５ｍＭの１８−クラウン−６と塩化バリウムとの結合の計算された熱を示す図であり、近似曲線は、ワンサイト結合モデルに基づく。
【図２６】本開示内容のいくつかの実施形態によるマイクロデバイスの出力から計算された、２３℃および３５℃におけるモル比の関数としての、１８−クラウン−６と塩化バリウムとの結合における生化学的発熱を示す図である。
【図２７】本開示内容の一実施形態によるマイクロデバイスの概略上面図である。
【図２８】本開示内容の一実施形態によるマイクロデバイスと結合可能な電子回路を示す。
【図２９】本開示内容の一実施形態による、示差温度を測定し、かつ、反応を特徴づける方法を示すフローチャートである。
【図３０】本開示内容の一実施形態による、４ｍＭの塩化バリウムおよび５ｍＭの１８−クラウン−１をそれぞれ０．５μＬ反応チャンバに導入したときの時間分解されたサーモパイル電圧の測定値と、滅菌水および５ｍＭの１８−クラウン−６をそれぞれ０．５μＬ導入したときの信号の測定値との比較を示す。
【図３１】本開示内容の一実施形態による生体分子反応を特徴づけるためのデバイスのベースラインサブトラクション後の出力を示す。
【図３２】本開示内容の一実施形態による出力電圧測定値から計算された反応熱を示す。
【図３３】本開示内容の一実施形態によって得られた反応パラメータと、市販の熱量計を用いて得られた反応パラメータを反映している周知のデータとの第１の比較を示す。
【図３４】本開示内容の一実施形態による、異なるモル比にそれぞれ対応する滴定依存性のスパイクを呈するデバイス出力を示す。
【図３５】本開示内容の一実施形態によって得られた反応パラメータと、市販の熱量計を用いて得られた反応パラメータを反映している周知のデータとの第２の比較を示す。
【図３６】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの概略を示す等角図である。
【図３７ａ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの概略を示す上面図である。
【図３７ｂ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの概略を示す等角図である。
【図３８ａ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの製造工程を示す。
【図３８ｂ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの製造工程を示す。
【図３８ｃ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの製造工程を示す。
【図３８ｄ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの製造工程を示す。
【図３８ｅ】本開示内容の例示的一実施形態によるマイクロデバイスの製造工程を示す。
【図３９】本開示内容の一実施形態により測定された熱容量と温度との間の関係の変化を、計算値と比較して示すグラフである。
【図４０ａ】本開示内容の一実施形態によるマイクロ流体構造内の温度分布を示す。
【図４０ｂ】本開示内容の一実施形態によるマイクロ流体構造内の温度分布を示す。
【図４０ｃ】本開示内容の一実施形態によるマイクロ流体構造内の温度分布を示す。
【図４０ｄ】本開示内容の一実施形態によるマイクロ流体構造内の温度分布を示す。
【図４１】本開示内容の一実施形態によるステップ状の示差電力への過渡応答を示す。
【図４２】本開示内容の一実施形態による、１〜２０ｍｇ／ｍＬの異なる濃度で測定した際の、ベースラインサブトラクションによって補正された温度の関数としてのサーモパイルの差動電圧を示すグラフである。
【図４３】本開示内容の一実施形態による異なるリゾチーム濃度での温度の関数としての、リゾチームの変性の１モル当たりの総エンタルピー変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示内容の一側面によれば、マイクロデバイスが提供される。マイクロデバイスは、第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバと、薄膜基板と、を備える。本願明細書において、第１のマイクロチャンバは、試料チャンバと称し、第２のマイクロチャンバは、対照チャンバと称する。試料チャンバおよび対照チャンバの体積および構成は同一であり、隣り合って配置されてよい。本開示内容の例示的一実施形態によれば、試料チャンバおよび参照チャンバは、環状構造を有している。しかしながら、本開示内容に従う多種多様な幾何学的構造が用いられてよい。試料チャンバおよび対照チャンバは、それぞれ薄膜基板上で支持されてよい。薄膜基板は、試料チャンバおよび対照チャンバのそれぞれの下に配置されて試料チャンバと対照チャンバとの温度差を測定する熱電センサを含んでよい。
【００３１】
図１ａ〜１ｃは、本開示内容によるマイクロデバイスの例示的な一実施形態を示す。本願明細書において、マイクロデバイスは、ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスとも称される。
マイクロデバイス１００は、熱量測定用の試料材料および対照材料を保持し得る２つの同一のマイクロチャンバ１１０および１２０を含む。参照を容易にすべく、本願明細書において、マイクロチャンバは、試料チャンバおよび対照チャンバとも称され、また、まとめて「熱量測定チャンバ」または単に「チャンバ」とも称される。試料チャンバおよび対照チャンバのそれぞれは、マイクロ流体チャネルを介して入口ポート（１１１、１２１）、および、出口ポート（１１２、１２２）に接続される。チャンバのハウジング（１４０）は、微細加工および熱的隔離に適したいかなる材料から製造されてもよい。特定の実施形態では、生体適合性の観点だけでなく、製造およびパッケージングを容易にするため、熱量測定チャンバを製造する材料としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が選択される。しかしながら、微細加工および熱的隔離に適した他の材料も本開示内容の範囲を逸脱せずに用いることができる。例えば、対象となる温度範囲（例えば−１０℃〜９０℃）内で熱的安定性を有し、基板表面と適度な強度で結合し、巨大分子（例えばタンパク質）の吸着を最小限に抑える材料が用いられてよい。マイクロチャンバは、ＳＵ−８、パリレン、ポリカーボネート、および、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）などのポリマーによって形成され得る。
【００３２】
各マイクロチャンバは、熱的に隔離されてよい。例えば、図１ａにおける空隙１３０がチャンバに熱的隔離をもたらす。空隙１３０は、マイクロチャンバを製造するのに用いられる材料と同じ材料から形成されてよい。本開示内容の例示的一実施形態によれば、空隙１３０は、ポリジメチルシロキサンから形成されてよい。しかしながら、従来知られているような他の熱的隔離技法も用いられてよい。例えば、マイクロチャンバは、熱伝導率の低いポリマー材料などで構成される自立構造に配置されることによって熱的に隔離され得る。マイクロチャンバを周囲環境からさらに隔離すべく、マイクロデバイス１００を熱エンクロージャで囲んでよい（例えば、マイクロデバイス１００を真空状態にすることにより、熱エネルギーが周囲環境に放散するのを最低限にとどめることができる）。
【００３３】
図１ｂに示すように、マイクロチャンバ１１０、１２０は、薄膜基板１５０上に支持されている。この薄膜基板１５０と、チャンバを囲む空隙（１３０）とによって、感度の高い熱量測定を可能にする熱的隔離がもたらされる。薄膜基板１５０は、複数のポリマー層またはダイアフラム１５１、１５２、１５３を含んでよい。層１５１、１５２、１５３は、図１ｃに示すように一体化されるが、説明のために、図１ｂでは別々の層として示している。層１５１および１５２はどちらも、繰り返し行われる熱量測定に要求される熱サイクルに耐えうる熱および機械的安定性だけでなく、熱的隔離特性にも優れた材料から形成されてよい。特定の実施形態では、ポリマーダイアフラムは、１５０℃を上回るガラス転移温度と、２５０℃を上回る熱分解温度とを有する材料から形成されてよい。材料は、例えば、ポリイミド、パリレン、ポリエステル、ＳＵ−８、ＰＤＭＳ、および、ポリテトラフルオロエチレン等であってよい。ポリマーダイアフラムは、５５ＭＰａを上回る引張強さ、および／または、５００ＭＰａを上回るヤング率を有してよい。特定の実施形態では、ダイアフラムの材料としては、機械的剛性（ヤング率２．５ＧＰａ）および熱的安定性（ガラス転移温度２８５℃）に優れているという理由から、ポリイミドが選択される。
【００３４】
ハウジング材料と薄膜基板との間の密着性を高めるべく、接着層１５３は、例えば、ポリイミドとＰＤＭＳとの混合物などの、層１５１および／または層１５２の材料の混合物から形成されてよい。薄膜基板は、例えば、シリコンウエハなどの他の固体基板１６０に支持されてもよい。熱的隔離をより確実にすべく、各チャンバの下の薄膜基板の一部が固体基板と接触しないよう（すなわち、最も優れた断熱材だと考えられる空気のみと接触するよう）、各チャンバの断面に対応する薄膜基板の底部側下にある固体基板の領域が取り除かれてよい。
【００３５】
マイクロデバイスは、熱電センサをさらに備えてよい。熱電センサは、薄膜基材上にコーティングされる、薄膜基板に埋め込まれる、あるいは、薄膜基板に含まれてよく、２つのチャンバ間の温度差を測定するよう構成されてよい。例えば、サーモパイル１７０の薄層は、ポリマー層１５２、１５３の間にあってよい。図１ｂおよび１ｃに示すように、サーモパイルは、異種材料の複数の細長いセグメントを含んでよく、異種材料の隣接するセグメント同士が対向端部で接続されることにより、サーモパイルの接点１７１、１７２が形成される。各チャンバの下にあるサーモパイルの接点は、各チャンバの中心軸と位置合わせされてよい。サーモパイルの材料は、例えば、アンチモン−ビスマス（Ｓｂ−Ｂｉ）などの様々な異種金属の対、または、ｎ型およびｐ型テルル化ビスマス、および、ｎ型およびｐ型テルル化アンチモンのような熱電効率の高い他の材料の対を含んでよい。例えば、熱電センサは、熱電対当たり８０μＶ／℃を上回る熱電感度を有してよい。特定の実施形態では、その優れた熱電感度および製造の容易さという理由から、サーモパイルの材料にはアンチモン（ゼーベック係数４３μＶ／Ｋ）およびビスマス（ゼーベック係数−７９μＶ／Ｋ）が選ばれる。サーモパイルの製造には、クロム、ニッケル、ビスマス、アンチモン、テルル化ビスマス、および、テルル化アンチモンを含むさまざまな金属、半導体、および、それらの化合物が用いられてよい。
【００３６】
本開示内容の他の実施形態によれば、熱電センサは、試料チャンバ用熱電センサ、および、対照チャンバ用熱電センサを含んでよく、それぞれのセンサは、それぞれ対応するマイクロチャンバにおける反応の絶対温度を測定してよい。そして、それぞれの熱電センサによって測定された温度の差を計算することにより、示差温度が決定されてよい。薄膜基板は、２つのチャンバ１１０、１２０の下で該チャンバとそれぞれ位置合わせされる２組のマイクロヒータ１８０および温度センサ１９０をさらに含んでよい。例えば、マイクロデバイス１００は、一体化された薄膜抵抗マイクロ温度センサおよびヒータを含んでもよい。温度センサ１９０は、チャンバの温度をリアルタイムでモニタしてよく、マイクロヒータ１８０がチャンバを加熱することにより、熱量測定の校正のための一定の示差電力を生成し得る。校正目的のため、マイクロヒータに電流を流すことにより、ジュール熱が生じ得る。そして、温度と電気抵抗との間の校正された関係に基づき、温度センサによって局部温度が決定されてよい。
【００３７】
マイクロヒータ１８０および温度センサ１９０は、いずれも薄膜基板に埋め込まれ、サーモパイル１７０から垂直方向に離れて隔絶されてよい。例えば、マイクロヒータ１８０および温度センサ１９０は、層１５１と１５２との間に埋め込まれてよい。温度センサ用コンタクトパッド１９５、および、マイクロヒータ用コンタクトパッド１８５は、外部との電気接続のために、チャンバのハウジング構造の外側へと延びてよい。マイクロヒータ１８０および温度センサ１９０は、図１ｂおよび１ｃでは同じ層に存在するように示されているが、異なる層に存在してもよい。特に、デバイスの校正における正確な温度検知のために、サーモパイルの接点１７１、１７２は、温度センサ１９０と位置合わせされてよい。マイクロヒータ１８０は、例えば、チャンバの底部領域の下で蛇行するような、チャンバを均一に加熱するようなパターンに形成されてよい。マイクロヒータの材料は、さまざまな金属または合金（例えばクロムと金の合金（Ｃｒ／Ａｕ）から選ばれてよい。
【００３８】
一実施形態では、図１ａ〜１ｃに示されるマイクロデバイスは、以下に概説する手順によって製造されてよい。シリコンウエハなどの固体基板１６０が設けられる。他の実施形態では、シリコンウエハでなく可撓性層が基板として用いられてよい。可撓性層は、例えば、カプトン膜などのポリマー層であってよい。固体基板には、スピンコーティングなどによって、例えば、ポリイミド薄膜であるポリマーダイアフラム１５１がコーティングされてよい（図２ａ）。例えば、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）を用いて、固体基板の背面の熱量測定チャンバに対応する領域に一対の空胴１６５をエッチングにより形成してよい。ポリマーダイアフラムを硬化させた後、マイクロチャンバ１８０および温度センサ１９０には、金属、または、Ｃｒ／Ａｕなどの合金を熱蒸着によって蒸着してよい。その後、マイクロヒータおよび温度センサの上部に他のポリマーダイアフラム１５２をコーティングする（図２ｂ）。次に、例えば、サーモパイルなどの熱電センサ１７０は、熱蒸着され、標準的なリフトオフプロセスを用いてパターニングされてよく、熱電センサは、例えば、ポリイミドとＰＤＭＳとの混合物を含む層のような他のポリマー層１５３によってさらにコーティングされる（図２ｃ）。チャンバのハウジング構造１４０は、マイクロモールディング技術を用い、例えばＰＤＭＳによって薄膜基板の上部に形成されることにより、熱量測定チャンバが形成され得る（図２ｄ）。チャンバと、入口ポートおよび出口ポート１２１、１２２とを接続するマイクロチャネルなどのマイクロ流体構造も作製されてよい（図２ｅ）。薄膜基板の背面に残るシリコン層が取り除かれる（図２ｅ）ことにより、チャンバのそれぞれの下に独立した薄膜基板の部分が形成されてよい。
【００３９】
図２７を参照すると、本開示内容によるマイクロデバイスの第２の実施形態が示されている。デバイス２７００は、蛇行する対照チャンバ２７０２と、蛇行する試料チャンバ２７０４とを含む。対照チャンバ２７０２と試料チャンバ２７０４とは、空隙２７０６によって熱的に隔離される。マイクロデバイス２７００は、サーモパイル２７０８を含んでもよい。蛇行するマイクロチャンバ２７０２、２７０４を用いることにより、サーモパイルの接点をより多くして、熱的隔離をより確実にすることができる。
【００４０】
マイクロデバイス２７００は、１つ以上のコンタクトパッド２７１０、２０１２を含む。コンタクトパッドは、デバイスと多数の電子回路との間の界面を提供し得る。例えば、コンタクトパッド２７１０は、サーモパイル２７０８と結合されてよい。サーモパイル２７０８の端部とコンタクトパッド２７１０との間の密着性は、粗面処理または化学修飾によって高められ得る。フリップチップボンディング技術により設計された外装も実装されてよい。サーモパイル２７０８の出力は、対照チャンバ２７０２と試料チャンバ２７０４との間の示差温度を示す電圧である。コンタクトパッド２７１０は、出力電圧を測定して分析する電子回路に結合されてよい。本願明細書中で用いられる「結合」という用語は、無線通信を介するような間接結合だけでなく、（例えば、はんだ付けワイヤまたはワニ口クリップを介した）直接的な電気接触などのような直接結合も含む。
【００４１】
本開示内容によるコンタクトパッド２７１０に結合され得る電子回路の例示的一実施形態が図２８に示されている。コンタクトパッド２８０２は、マイクロデバイスと、１つ以上の電子回路２８００との間の界面としての役割を果たす。コンタクトパッドは、電圧計２８０４に結合されてよい。本願明細書中で使用する「電圧計」という用語は、直接的または間接的に電圧を測定するのに用いることができるいずれの計器をも含むことを意図し、マルチメータも含む。電圧計２８０４は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。
【００４２】
電圧計２８０４は、計算装置２８０６に結合されてよい。計算装置２８０６は、１つ以上の電子回路によって形成された１つ以上のプロセッサを含む。計算装置２８０６は、記憶装置２８０８に結合されてよい。
【００４３】
計算装置２８０６およびその構成要素のそれぞれは、従来知られているようなさまざまな方法で実装されてよい。例えば、計算装置の構成要素のそれぞれは、単一の統合プロセッサを用いて実装されてよい。他の実施形態では、構成要素は、それぞれ別々のプロセッサに実装されてもよい。計算装置２８０６の１つ以上の構成要素は、個別の装置であるよりもむしろ電圧計と組み合わされてよい。
【００４４】
少なくとも１つのプロセッサは、１つ以上の電子回路を含んでよい。１つ以上の電子回路は、ハードウェアのみを用いて本開示内容を実施するよう設計されてよい。あるいは、プロセッサは、記憶装置２８０８に記憶されたコンピュータコードで特定される命令を実行するよう設計されてよい。記憶装置は、ハードドライブ、取り外し可能な記憶媒体、あるいは、他のいかなる非一過性の記憶媒体であってよい。このような非一過性記憶媒体は、実行されると、少なくとも１つのプロセッサに、本願明細書に開示される方法を実行させる命令を記憶し得る。
【００４５】
計算装置２８０６は、出力電圧のベースラインに基づき、出力電圧を調整する調整部２８１０と、出力電圧に基づき、熱電力差を決定する熱電力差部２８１２と、熱電力差に基づき、熱力学的反応パラメータを計算する反応特性評価部２８１４と、を含む複数の構成要素を含んでよい。
【００４６】
図２７をさらに参照すると、コンタクトパッド２７１２は、マイクロヒータおよび／または温度センサに結合されてよい。コンタクトパッド２７１２は、本願明細書に開示されるようなインサイチュ温度モニタリングおよびオンチップデバイスの校正を実行するための１つ以上の電子回路にさらに結合されてよい。
【００４７】
図３６を参照すると、本開示内容によるマイクロデバイスの第３の実施形態が示されている。デバイス３６００は、マイクロチャンバを形成する構造３６４０を含む。マイクロチャンバは、例えば、円形または蛇行形状であってよい。構造３６４０は、ＰＤＭＳまたは他のポリマーからなる構造であってよく、薄膜基板３６５０によって支持されてよい。薄膜基板３６５０は、ポリマー層３６５１、３６５２、および、３６５３を含んでよい。ポリマー層３６５２は、サーモパイル３６７０を含んでよい。サーモパイル３６７０は、アンチモン−ビスマスまたは他の熱電接点からなってよい。同様に、ポリマー層３６５１は、マイクロヒータ３６８０と、温度センサ３６９０とを含み得る。
【００４８】
薄膜基板３６５０は、基板３６６０上に形成されてよい。本開示内容によれば、基板は、可撓性材料から形成されてよい。例えば、可撓性材料は、少なくとも約１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、または、２．０の曲げ弾性率を有し得る。
【００４９】
他の実施形態によれば、基板３６６０は、ポリマー材料によって形成されてよい。基板用に適したポリマー材料は、ポリイミド、パリレン、ポリエステル、および、ポリテトラフルオロエチレンを含むがこれらに限定されない。材料は、所望の測定のための温度範囲を上回るガラス転移温度を有するばかりでなく、構造的完全性に十分な引張強度およびヤング率を有してよい。ポリマー基板は、約５〜１０００μｍ、または、約１０〜５００μｍの厚みを有し得る。例えば、本開示内容の実施形態によれば、可撓性基材の厚みは、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、約２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、または、５００μｍであってよい。
【００５０】
シリコン基板などの壊れやすい基板に比べ、ポリマー層などの可撓性層に形成されたマイクロデバイスは、ポリマーの固有応力が低いので、堅固性および製造歩留りを高めることができる。また、ポリマー基板の熱伝導率が低いことは、感度向上のための測定試料の熱的隔離をより確実なものとする。さらに、ポリマー基板は、柔軟であるため、変形することができ、表面が非平面であってもデバイスに対応できる。このように、デバイスは、湾曲を含む形状にも適用できる。ポリマー基板を有するデバイスは、低コストであり、また、使い捨て可能なので、試料間の二次汚染を防ぐことができる。
【００５１】
図３７を参照すると、本開示内容によるマイクロデバイスの第４の実施形態が示されている。デバイス３７００は、マイクロチャンバを形成する構造３７４０を含む。マイクロチャンバは、例えば、円形または蛇行形状であってよい。構造３７４０は、ＰＤＭＳまたは他のポリマーからなる構造であってよく、薄膜基板３７５０によって支持されてよい。薄膜基板３７５０は、層３７５１と、ポリマー層３７５２および３７５３とを含んでよい。ポリマー層３７５２は、マイクロヒータ（図示せず）と温度センサ３７９０とを含んでよい。同様に、層３７５１は、サーモパイル３７７０を含んでよい。サーモパイル３７７０は、アンチモン−ビスマスまたは他の熱電接点からなってよい。層３７５１は、可撓性層、および／または、ポリマー層であってよい。ポリマー層は、上記のポリマー層３６６０と同じ材料および寸法を用いて形成されてよい。
【００５２】
図３８を参照すると、一実施形態において、図３７に示されるマイクロデバイスが以下に概説する手順で製造され得る。図３８ａでは、層３８０２は、シリコンウエハ３８０４と可逆的に結合されてよい。図３８では、可撓性層に関して説明をするが、本開示内容に従うポリマー層が用いられてもよいことが理解されよう。可撓性層３８０２は、例えば、ポリイミド薄膜（例えばカプトン膜）のようなポリマー層であってよい。可撓性層は、約１２．５μｍの厚みを有してよい。可撓性層３８０２は、スピンコートしたＰＤＭＳ層などの接着剤層３８０６によりシリコンウエハ３８０４と可逆的に結合されてよい。接着剤層は、約２０μｍの厚みを有してよい。その後、接着剤層は、硬化されてよい。
【００５３】
図３８ｂでは、可撓性層３８０２上にサーモパイルが形成されてよい。例えば、アンチモンおよびビスマスを基材上に熱蒸着し、標準的なリフトオフプロセスを用いてパターニングすることにより、接点が４００個のサーモパイル３８０８が形成されてよい。一実施形態によれば、アンチモンは、約０．８μｍの厚みを有し、ビスマスは、約１μｍの厚みを有してよい。サーモパイルは、スピンコートされたポリイミド薄層３８１０により保護されてよい。薄層３８１０は、約１．５μｍの厚みを有してよい。
【００５４】
図３８ｃでは、薄層３８１０上に温度センサ３８１２が形成されてよい。例えば、クロムと金との薄膜が蒸着されてパターニングされることにより、オンチップ温度センサ３８１２が形成されてよい。クロムと金との薄膜は、約１００μｍの厚みを有してよい。コンタクトパッド３８１４も同様に形成されてよい。
【００５５】
図３８ｄでは、デバイスは、シリコンウエハ３８０４とは分離されてもよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、まず、薄いＰＤＭＳ層などの他の薄層３８１６で保護されてよい。そして、デバイスは、シリコンウエハ３８０４から機械的に分離されてよい。この工程の間に接着剤層３８０６も取り除かれてよい。本開示内容のいくつかの実施形態によれば、シリコンウエハは、次のマイクロデバイスを製造する際に再使用されてよい。
【００５６】
図３８ｅでは、マイクロチャンバが形成されてよい。マイクロチャンバの形成は、シリコンウエハ３８０４の分離と同時に行われてよい。本開示内容の一実施形態によれば、ソフトリソグラフィによって、蛇行形状のマイクロ流体チャネルがポリマー層３８１８（例えばＰＤＭＳ層）に形成されてよい。ポリマー層３８１８は、例えば、酸素プラズマを用いてマイクロ流体構造に結合されてよい。
【００５７】
本開示内容の他の側面によれば、検体の熱的性質を決定する方法が提供される。方法は、上記のようなマイクロデバイスを設けるステップと、マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャを設けるステップと、検体を含む試料材料を第１のマイクロチャンバに供給するステップと、検体を含まない対照材料を第２のマイクロチャンバに供給するステップと、熱エンクロージャを予め決められた温度走査速度で加熱するステップと、第１のマイクロチャンバと第２のマイクロチャンバとの間の測定された温度差に基づき、検体の熱的性質を決定するステップと、を含む。マイクロデバイス、および、熱量測定のためにマイクロデバイスを用いる方法は、以下の実施例において、互いに関連付けられながらさらに説明される。以下に説明されるいかなる特徴を含むマイクロデバイスも、当該マイクロデバイスを用いる方法で用いることができ、その逆も然りであることを理解されたい。
【００５８】
上記方法のいくつかの実施形態では、図３に示すように、熱エンクロージャの加熱の間に、対照材料および試料材料には一時的な周期変化、または、交流変調加熱が与えられ得る。これによって、広帯域のバックグラウンドノイズにおける変調周波数の生化学反応信号を直ちに取り出すことができるとともに、生体分子の熱緩和を可能にする温度変調をもたらすことができる。温度変調は、マイクロデバイスの薄膜基板に含まれるマイクロヒータを用いることによりなされてよい。当該ヒータは、オンチップ加熱のために異なる周波数、振幅、および、他のパラメータを提供することができる波形発生器によって制御される。
【００５９】
本開示内容の他の側面によれば、少なくとも２つの物質間の反応にかかわる熱を決定する方法が提供される。方法は、上記のようなＭＥＭＳデバイスを設けるステップと、マイクロデバイスを囲む熱エンクロージャを設けるステップと、第１の物質と第２の物質とを混合することにより調製される試料溶液を第１の熱的に隔離されたマイクロチャンバに供給するステップと、第１および第２の物質のうちの少なくとも１つを含まない対照溶液を第２の熱的に隔離されたマイクロチャンバに供給するステップと、試料チャンバと対照チャンバとの間の測定された温度差に基づき、第１の物質と第２の物質との間の反応にかかわる熱を決定するステップと、を含む。測定の間、（マイクロデバイスを囲む）熱エンクロージャの温度は、一定値に維持される。したがって、この方法は、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）とも称される。第１の物質と第２の物質との間の反応は、化学反応または物理結合であり得る。したがって、２つの物質は、互いに反応し合うさまざまな化学物質、生体分子、あるいは、他の分子、受容体リガンド、タンパク質酵素、酸塩基等のいずれであってもよく、２つの物質間の反応は、測定可能な熱を生成または吸収する。
【００６０】
本開示内容の一実施形態による、示差温度を測定し、反応を特徴づける例示的方法が図２９に示されている。方法は、装置を校正するステップと、デバイス出力におけるベースラインを測定するステップと、試料と反応物とを混合するステップと、試料と緩衝剤とを混合するステップと、示差温度を測定するステップと、熱電力を決定するステップと、熱力学的反応パラメータを計算するステップと、を含んでよい。
【００６１】
まず始めに、２９０２において熱量測定デバイスが校正されてよい。例えば、従来知られている校正技術は、「生体分子の熱力学的特性評価のためのＭＥＭＳ示差走査熱量測定センサ」（ビンワンおよびチャオリン．Ｊ、マイクロエレクトロメカニカルシステム２１：５、１１６５〜１１７１、２０１２年１０月）に記載されており、その内容のすべては参照として本願明細書に組み込まれる。
【００６２】
２９０４において、デバイス出力におけるベースラインが測定され得る。例えば、示差温度を測定するためにサーモパイルが用いられる場合、反応がないときのサーモパイルの出力電圧が測定されてよい。これは、試料溶液と緩衝液との混合液をそれぞれのチャンバに導入することにより行われ得る。デバイス出力のベースラインは、後に使用するために図２８に示すような記憶装置２８０８に記憶されてよい。
【００６３】
２９０６において、試料と反応物とが混合されてよい。それとほぼ同時に、２９０８において、試料と緩衝剤とが混合されてよい。混合は、図４ａに示すような受動カオス的ミキサを用いて行われてよい。デバイス４００を用い、試料を入口４３１に導入し、反応物を入口４３２に導入してよい。試料および緩衝剤も対応する入口から導入チャネル４４０へと導入されてよい。試料および反応物は、導入チャネル４３０内で受動的に混合され、試料チャンバ４１０内に送り込まれる。試料および緩衝剤は、導入チャネル４４０内で受動的に混合され、対照チャンバ４２０内に送り込まれる。等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）には、従来知られている滴定技術が用いられてよい。
【００６４】
本開示内容の一実施形態によれば、ＭＥＭＳデバイスにおける滴定は、反応物の特定のモル比をそれぞれ有する一連の別々の反応を用いて行われてよい。反応物を導入するための液体カートリッジセグメントが用いられてよい。例えば、試料が一定の濃度で調製される一方で、結合試薬は別々の濃度で調製されてよい。このように、試料および結合試薬の体積を同一（例えば０．５μＬ）に維持してモル比を変化させ得る。試料および結合試薬は、それぞれ、試薬セグメントの順序に従ってモル比が変化するよう、空気によって連続的に隔てられたアクセスの長いチューブに導入されてよい。アクセスチューブは、マルチポートのシリンジポンプによって駆動されてよい。シリンジポンプは、それぞれのモル比の、熱測定のための正確な量の試料および試薬を反応チャンバに送り、対照チャンバには試料および緩衝剤を送る。チャンバまたはミキサをクリーニングするために、並んだ２つの試薬セグメントの間に緩衝剤セグメントが追加されてよい。
【００６５】
図２９をさらに参照すると、２９１０において反応の示差温度が測定される。測定は、サーモパイルのような熱電センサを用いて行われ得る。サーモパイルは、示差温度を示す電圧を出力してよい。そして、出力された電圧は、２９０４で測定されたデバイス出力におけるベースラインに基づき調整されてよい。
【００６６】
その後、示差温度は、２９１２で反応に関する熱電力を決定するために用いられてよい。熱電力差ΔＰは、以下のように計算されてよい。
【数１】
2016524713.tif 000003
ここでは、ΔＵは、熱電センサからの出力であり、Ｓは、熱電感度、すなわち、単位示差熱電力によって生成される出力電圧である。
【００６７】
そして、示差熱電力は、２９１４において熱力学的反応パラメータを計算するのに用いられてよい。一般に、試料分子Ｍと結合試薬Ｘとの間の生化学反応は、以下のように表されてよい。
【数２】
2016524713.tif 000004
ここでは、反応の結果、エンタルピー変化ΔＨを伴う生成物ＭＸが得られる。ＩＴＣでは、結合試薬Ｘは、滴定される、すなわち、周知の分割量で連続的に試料に加えられ、その一方で反応熱が測定されている。反応熱が測定される。反応熱は、平衡結合定数ＫＢ＝［ＭＸ］／［Ｘ］［Ｍ］（ここでは［  ］は種の平衡濃度を示す）、化学量論Ｎ＝ｎ１／ｎ２、および、モルエンタルピー変化ΔＨを含む反応の熱力学的性質を計算するのに用いられる。特に、反応熱は、示差熱電力に基づき計算されてよい。生化学反応熱は、以下のように表されてよい。
【数３】
2016524713.tif 000005
ここでは、Ｑは、モル比ｒ＝Ｘｔ／Ｍｔで生ずる生化学反応であり、
Ｖ０は、反応の活性化体積であり、Ｍｔは、活性化体積Ｖ０の反応セルにおける、自由な結合した試料の総濃度であり、Ｘｔは、試料溶液に滴定される試薬の総濃度である。
【００６８】
熱力学的反応パラメータを計算すべく、示差熱電力の積分が計算される。結果の値は、生化学反応熱として用いられる。異なるモル比を用いた多数のトライアルからの電圧測定値に基づき、多数のデータポイントが集められてよい。そして、熱力学的反応パラメータを計算すべく、結果のデータを等式（３）にフィッティングしてよい。このフィッティングは、その意図された目的のための従来知られているフィッティング法を用いて行われてよい。
【００６９】
図４は、ＩＴＣに特に適したマイクロデバイスを示す概略分解図である。マイクロデバイス４００は、試料チャンバ４１０と、対照チャンバ４２０とを含む。これらのチャンバはいずれも、サーモパイル４７０を含む薄膜基板４５０に配置され、サーモパイル４７０は、熱走査中に、試料チャンバと対照チャンバとの間の温度差を測定する。第１の物質Ａと第２の物質Ｂとの混合を促進すべく、マイクロデバイスは、試料チャンバ４１０および対照チャンバ４２０のそれぞれのための導入チャネル４３０、４４０をさらに含む。導入チャネルは、それぞれが２つの入口４３１、４３２、および、４４１、４４２を有する。導入チャネルのそれぞれは、チャネルを流れる溶液に受動カオス的混合をもたらすよう構成されてよい。例えば、図４ａおよび４ｂで概略を示すように、導入チャネル４３０、４４０は、蛇行形状の部分を含んでよい。さらに、導入チャネル４３０、４４０は、チャネルを流れる溶液に乱流を起こすのに十分な内部隆起４３４、４４４を有してよい。例えば、図４ａに示すように、導入チャネルは、天井部分にヘリンボーンパターンの隆起を有してよい。以下に、開示されるマイクロデバイス、その製造方法および使用の例をさらに示すが、本開示の内容の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００７０】
実施例１：マイクロデバイスの製造
この例では、図２を参照し、上記の概略手順に実質的に沿ってマイクロデバイスの製造手順を説明する。特に、厚さ６μｍのポリイミド薄膜を（二酸化ケイ素でプレコートした）シリコンウエハにスピンコートした。ウエハの背面の熱量測定チャンバに対応する領域をＴＭＡＨエッチングして残りのウエハ層の厚みを約５０μｍとした。ポリイミドの硬化後、クロム・金薄膜（５／２００μｍ）を熱蒸着によりポリイミド層に蒸着した。マイクロヒータおよび温度センサをポリイミドの第２の層でコーティングした。続いて、アンチモン−ビスマス薄膜（０．５および１．２μｍ）を熱蒸着し、標準的なリフトオフプロセスを用いてパターニングすることにより、接点数５０個のサーモパイルを形成した。サーモパイルは、ポリイミドとＰＤＭＳとの混合物を含む層でさらにコーティングされた。薄膜基板の上部には、ＰＤＭＳからなるチャンバのハウジング構造がマイクロモールディング技術を用いて形成され、それによって、それぞれが円筒形状を有し、体積が１μＬ（直径２．５、高さ２００μｍ）であり、中心間距離が４ｍｍである熱量測定チャンバが形成された。薄膜基板の背面からウエハ基板の残りのシリコン層を除去するために二フッ化キセノン（ＸｅＦ２）気相等方性エッチングが用いられた。集積抵抗マイクロヒータのそれぞれは、４０Ωの公称抵抗値を有し、温度センサのそれぞれは、５５Ωの公称抵抗値を有する。図５は、ＰＤＭＳのハウジング構造および固体熱基板の画像、および、サーモタイルと、薄膜基板に埋め込まれた一体型のマイクロヒータおよび温度センサとの顕微鏡写真の画像である。
【００７１】
実施例２：熱量測定
この実施例では、実施例１によって製造されたマイクロデバイスを校正し、例えば、タンパク質の変性の熱力学など、特定の生体分子の熱力学的特性を測定するために用いた。
【００７２】
Ａ：原理
ＤＳＣは、温度の関数としての示差熱容量、すなわち、試料材料と対照材料との間の熱容量差を測定できる。試料材料と対照材料とに対し同一の温度走査を行った場合、すなわち、それらの温度が対象となる範囲内の特定の速度で変化する場合、試料分子の、熱的に誘導される発熱または吸熱性の活動は、試料材料と対照材料との間にわずかな温度差（すなわち、示差温度）を生じ得る。この温度差は、示差電力を反映するために検出されてよい。
【数４】
2016524713.tif 000006
ここでは、Ｐｓは、試料材料で発生した熱電力であり、Ｐｒは、対照材料で発生した熱電力である。
【数５】
2016524713.tif 000007
ここでは、Ｃｐｓは、試料材料の熱容量であり、Ｃｐｒは、対照材料の熱容量である。したがって、示差熱容量は、以下のように決定されてよい。
【数６】
2016524713.tif 000008
ここでは、
【数７】
2016524713.tif 000009
は、試料材料および対照材料の制御された温度の時間変化率であり、Ｕは、示差温度を検出するために用いられる熱電センサからの出力であり、Ｓは、デバイス感度、すなわち、単位示差熱電力によって生成される出力電圧である。したがって、示差熱容量の解釈は、試料材料の基本的な熱力学的性質を決定づけ得る。
【００７３】
Ｂ．デバイス校正
２つのチャンバ間の温度差を測定するためには、サーモパイルによって生成される電圧を直ちに温度差へと変換できるよう、まずサーモパイルを校正する必要がある。図６ａに示すように、ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスを校正するために、オンチップマイクロヒータを直流電源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅ３６３１Ａ）によって駆動し、熱量測定チャンバ内に一定の示差加熱電力を生じさせる一方で、デジタルマルチメータ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４１０Ａ）で温度センサをインタロゲートすることにより、熱量測定チャンバの温度をモニタした。チャンバ間の示差温度に比例するサーモパイルの出力電圧をナノ電圧計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４２０Ａ）で測定した。ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの温度制御および熱電測定は、パソコンを用い、ＬａｂＶＩＥＷプログラムによって自動化された。
【００７４】
パッケージ化されたＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイス１００は、特注の温度制御された熱エンクロージャ２００内に収容された。熱エンクロージャ２００は、デバイスが配置される金属ステージを取り囲む複数の金属エンクロージャからなる（図６ｂ）。これによって、測定ノイズを最小限にすべく、環境からデバイスパッケージを熱的に隔離させるとともに、試料および対照溶液の温度走査を可能とした。複数のペルチェ素子（Ｍｅｌｃｏｒ  ＵＴ１５−１２−４０−Ｆ２）をデバイスステージの下に配置し、電源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅ３６３１Ａ）によって、デバイスに／から熱を加え／除去した。例えば、比例積分微分（ＰＩＤ）アルゴリズムに基づき、オンチップ温度センサからのフィードバックに従ってペルチェ素子に印加される電圧を調整することにより、試料および対照チャンバの温度を閉ループ制御した。
【００７５】
デバイス校正の間、試料チャンバおよび対照チャンバはいずれも０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で満たされた。これは、後のタンパク質変性測定でも用いる緩衝液である。試料チャンバの下でマイクロヒータを活性化させることにより、周知の一定の示差電力が生じ、その間、対照チャンバの下のマイクロヒータのスイッチは切ったままにした。サーモパイルの温冷接点の温度を測定するために温度センサを用いた。デバイス出力、すなわち、サーモパイルの出力電圧を時間の関数として測定することにより、示差加熱電力に対する定常および過渡応答を得た。
【００７６】
ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスに一体化されたサーモパイルの感度は、（試料チャンバの下のマイクロヒータを用いて）オンチップ加熱により生じた、温冷接点の間の異なる温度差で校正した。サーモパイルの示差電圧と温度差との関係はほぼ直線を示した。（図７では、５０個の接点を有するサーモパイル全体の電感度が６．３ｍＶ／℃であることを示す）。アンチモン−ビスマスの熱電対のそれぞれに対し、１２５μＶ／Ｋのゼーベック係数を得た。さらに、異なる示差電力に対してＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの定常応答を校正し、Ｓ＝４．０ｍＶ／ｍＷのほぼ一定の応答度となるような、ほぼ直線の関係を再び観察した（図８）。デバイス出力に約４０ｎＶの二乗平均平方根（ＲＭＳ）ノイズも観察され、それを示差電力におけるベースラインノイズを決定するために用いた。これは、示差熱電力の測定における約１０ｎＷの検出限界に相当する。
【００７７】
ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの過渡応答を特徴づけるべく、熱量測定チャンバにはまず１３０μＷのステップ状の示差電力が印加され、その後デバイス出力が平衡状態になると印加を停止した。サーモパイルからの対応する出力電圧（図９）は、示差電力の印加に伴い指数関数的に増加し、示差電力の印加停止と同時に指数関数的に減少することがわかった。実験データを一次指数関数的増加および減少関数にフィッティングさせることにより計算される熱時定数は、約２．０ｓであった。
Ｃ．熱量測定
【００７８】
生体分子のＤＳＣ測定は、校正されたマイクロデバイスを用いて実行された。マイクロデバイスの試料チャンバおよび対照チャンバは、生体試料溶液および緩衝液でそれぞれ満たされ、対象となる温度範囲で走査された。熱量測定チャンバの温度をモニタするために温度センサが用いられ、生体分子の熱電力を計算するためにデバイスの出力をリアルタイムで得た。ＤＳＣ測定に先立ち、温度走査の間に、デバイス出力におけるベースライン、すなわち、示差電力の入力がない状態でのサーモパイルの出力電圧を、どちらも緩衝液で満たされた熱測定チャンバを用いて測定した。生体分子試料溶液、および、緩衝液は、構内の真空チャンバによって脱気され、マイクロピペットで計量され、シリンジポンプ（Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＮＥ１０００)によって導入された。
【００７９】
校正されたＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスは、よくあるタイプの生体分子の構造転移であるタンパク質の変性を特徴づけるのに用いられた。このために、熱エンクロージャは、２５Ｗを下回る消費電力で、１０℃から９０℃の温度範囲において６℃／分くらいの時間変化率のＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの温度走査を提供した。説明のために、０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で調製されたリゾチームを用い、リゾチームおよび緩衝液でそれぞれ満たされた試料チャンバおよび対照チャンバの２５℃〜７５℃の温度範囲における走査を５℃／分の一定速度で行いながらデバイス出力をモニタした。
【００８０】
ベースラインサブトラクションにより補正された温度の関数としてのサーモパイル出力電圧を、１〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲の異なるタンパク質濃度で測定した（図１０）。デバイス出力は、タンパク質変性プロセスの吸熱特性を反映し、特定の温度範囲内で濃度に依存した最小値を示すことが観察された。特に、リゾチームの変性は、１ｍｇ／ｍＬで検出可能であり、前に報告されたＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの結果を著しく上回ることを示した。
【００８１】
さらに、チャンバ間の示差熱容量は、校正されたデバイス感度（４．０ｍＶ／ｍＷ）を用いて示差電圧を測定することにより計算され（図１０）、例えば、部分比熱容量（ｃ）（図１１ａ）、モルエンタルピーの総変化（すなわち、リゾチームのモル当たりのエンタルピー）（ΔＨ）、および、融解温度（Ｔｍ、モルエンタルピーの変化がΔＨの５０％に達する温度として定義）（図１１ｂ）などのリゾチームの熱力学的特性を変性プロセス中に得ることを可能にした。異なるタンパク質濃度におけるデバイス出力の振幅差にもかかわらず、それらすべてがタンパク質変性プロセスに関連した熱力学的性質の一定推定値をもたらした。特に、ｃの輪郭形状は、一般的にタンパク質の濃度には影響されず、ΔＨは、約５５℃の対応する融解温度Ｔｍで約４５０ｋＪ／ｍｏｌになるよう一貫して決定された。これらの結果は、一般的に、リゾチームについてはΔＨ＝３７７−４３９ｋＪ／ｍｏｌおよびＴｍ＝５５℃〜５８．９℃の範囲である周知のデータとよく合致しており、実際に関連するタンパク質濃度での試料の消費が著しく減少したことと合わせて、生体分子の特性評価のための本願明細書に開示されるＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの潜在的有用性を実証している。
【００８２】
温度走査速度がもたらすＤＳＣ測定への効果も調べた。例えば、０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で調製された２０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを用いて、リゾチームの変性における温度走査速度を１℃／分から６℃／分まで変化させた。（ベースラインサブトラクションで再度補正した）サーモパイルの出力電圧（図１２ａ）は、温度走査速度に伴い振幅が上昇し、上記したようなタンパク質の変性の温度範囲と同じ温度範囲で一貫した下落を示した。これは、相変態を通じてより高い吸熱力を生じるより大きい熱流束と一致する。
【００８３】
このようなデータをモルエンタルピーの変化を計算するために用いた（図１２ｂ）。温度走査速度が上がるにつれてデバイス出力にわずかなずれが見られる（図１２ａ）ものの、タンパク質の変性プロセスに関連する熱力学的性質は、約５０ｋＪ／モルのΔＨにおける標準偏差（すなわちΔＨの平均値の±５％）、および、１℃未満のＴｍにおける標準偏差と概ね一致していることがわかった（図１２ｂ）。特に、１〜５℃／分の温度走査では、Ｔｍの値はほぼ同じであった。このことは、本開示内容のＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスを用いた測定の一貫性を証明するとともに、リゾチームの変性を測定するには５℃／分くらいの温度走査速度が適切であることを示している。
【００８４】
実施例３：交流ＤＳＣ測定
本実施例では、本願明細書に開示されたマイクロデバイスに基づき、上記のような交流ＤＳＣ測定を実行する方法を例示する。このＭＥＭＳ交流ＤＳＣのアプローチは、少量の生体分子の高精度な測定を潜在的に可能にし、それは、リゾチームの変性の交流ＤＳＣ測定にデバイスを応用することにより実証される。
【００８５】
Ａ．原理
交流ＤＳＣは、示差熱容量、すなわち、試料材料と対照材料との間の熱容量差をモニタできる。これは、温度制御機能を備えた熱的に隔離されたエンクロージャを介し、試料材料および対照材料に適用される同一の交流変調加熱（図３）によって一時的な周期変化が重畳された一定の速度で材料の温度を変化させることにより行われる。示差熱容量は、示差温度、すなわち、試料材料と対照材料との間の温度差を測定することにより得られてよい。
【００８６】
Ｂ．マイクロデバイスの製造、システムの設定および校正
図１に概略を示され、実施例１に記載された手順で製造されたマイクロデバイスを用いて交流ＤＳＣ測定を実行した。チャンバの寸法および体積、ポリイミドダイアフラムの厚み、および、マイクロヒータの特性を含む他のデバイスパラメータは、実施例１のマイクロデバイスとほとんど同じであるが、実施例１で用いられるアンチモン−ビスマスの熱電対は、実施例１の接点５０個より多い１００個の接点を有する。
【００８７】
ＤＳＣ測定システムは、実施例２と同様の構成を有する。マイクロデバイスは、構内の熱エンクロージャに配置された。熱エンクロージャにおける試料ステージの温度は、市販の温度コントローラ（Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ３３１）によって実装される比例積分微分（ＰＩＤ）アルゴリズムによって閉ループ制御された。直流電源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅ３６３１Ａ）により駆動されるオンチップマイクロヒータを用いて一定の示差電力の入力を生じさせる一方で、変調加熱を与えるために、波形発生器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３３２２０Ａ）によって生成された矩形波の交流電圧を印加した（図１３）。デジタルマルチメータ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４１０Ａ）によって各熱力測定チャンバの内部の温度をリアルタイムに検出するために、温度センサが用いられた。デバイス校正の間に、ナノ電圧計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４２０Ａ）によってサーモパイルの出力電圧を測定し、交流ＤＳＣ測定の間に、波形発生器からの同じ交流変調矩形波によって参照されるロックイン増幅器（スタンフォードリサーチシステムズＳＲ８３０）によってサーモパイル電圧の増幅および位相を測定した。交流ＤＳＣ測定は、ＬａｂＶＩＥＷプログラムによって完全に自動化された。
【００８８】
ＭＥＭＳデバイスの直流性能を校正する方法は、実施例２に記載された方法と実質的に同じである。デバイス出力におけるベースライン、すなわち、温度走査の間に示差電力の入力がない状態でのサーモパイル電圧は、緩衝液で満たされた２つのチャンバを用いて測定された。デバイスの変調周波数依存の校正、および、交流ＤＳＣ測定の間、試料チャンバは生体試料溶液によって満たされ、対照チャンバは、緩衝液によって満たされた。生体試料溶液および緩衝液は、構内の真空ポンプによって脱気され、マイクロピペットによってデバイスの熱量測定チャンバへと導入された。
【００８９】
ＭＥＭＳデバイスにおいてまずサーモパイルが校正され、その結果、１００個の接点を有するサーモパイルは、約１３０μＶ／℃のゼーベック係数（アンチモン−ビスマス熱電接点当たり）に対応する１３．０ｍＶ／℃（図１４）の感度を有することが示された。そして、一定の示差電力に対する定常反応が測定され、８．０ｍＶ／ｍＷの直流応答性との関係は、ほぼ直線であることが示された（図１５）。これらの結果は、実施例２における接点５０個のアンチモン−ビスマスのサーモパイルの校正結果と一致する。さらに、デバイスの過渡応答を決定した。熱量測定チャンバのどちらも空気または０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で満たされ、ステップ状の示差電力（０．３２または１．３０ｍＷ）が印加された。これらの測定結果は、図１６に示されている。サーモパイル電圧の時間依存性は、一次指数関数的な増加として表され得る。チャンバが空気で満たされた場合には、０．８ｓの熱時定数が得られ、チャンバが緩衝液で満たされた場合には、２．０ｓの熱時定数が得られた。これらの値は、印加される示差電力とは無関係であり、従来の交流熱量測定値より小さかった。
【００９０】
さらに、印加される示差電力へのデバイス応答の変調周波数依存性を調べた。タンパク質変性プロセスの交流ＤＳＣ測定に応用するためのより正確なシミュレーションを行うべく、試料としての、０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で調製された２０ｍｇ／ｍＬのリゾチームで試料チャンバを満たし、グリシン・塩酸緩衝液で対照チャンバを満たした。その後チャンバは、一定の温度（２５℃、３５℃、または、４５℃）に維持され、交流加熱された（電圧振幅１Ｖ）。図１７は、ベースラインサブトラクションによって補正される変調周波数に対するサーモパイル電圧振幅の依存性を示している。サーモパイルの電圧振幅は、ほとんどすべての変調周波数において温度に伴い増大しており、このことは、タンパク質の熱容量の温度依存性によって説明できることがわかるだろう。また、デバイス出力（および感度）は、０．５〜２０Ｈｚの変調周波数範囲で最高となり（図１７）、変調周波数を選択することで、周囲への熱損失が低下することを示唆している。したがって、この範囲での変調周波数が、以下にさらに説明するタンパク質の変性プロセスの熱量測定に用いられた。
【００９１】
Ｃ．交流ＤＳＣ測定
上記のように校正されたＭＥＭＳ交流ＤＳＣ装置を用いて、タンパク質変性の熱的挙動を測定した。０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で調製された異なる濃度（１０および２０ｍｇ／ｍＬ）のリゾチームを用いる場合、例えば、熱量測定チャンバの温度は、一定周波数（１、５、または、１０Ｈｚ）での３．５Ｖの加熱電圧振幅による交流変調を組み合わせた場合、速度５℃／分では２５℃〜８２℃まで変化した。交流変調加熱により生じた周期的な温度変化は、約０．２℃の振幅を有した。
【００９２】
測定されたサーモパイルの電圧振幅図１８（ａ）は、再びベースラインサブトラクションによって補正され、変性プロセス中は濃度に依存する下落を示した。これは、タンパク質変性の吸熱特性と一致する。さらに、リゾチームの濃度が異なるとサーモパイルの電圧振幅差も異なるにも関わらず、１８（ｂ）に示すサーモパイル電圧の位相は、変性プロセスを通じて同一の変化を示した、これは、２状態のタンパク質変性モデルが採用された場合、本来の状態と変性状態とは変わらないということである。さらに、サーモパイル電圧の振幅および位相はいずれも変調周波数にともなって明らかに変化した。このことは、交流加熱に対するデバイスの非同期な熱的応答に起因しているということもあり得る。しかしながら、タンパク質の濃度が一定である場合、サーモパイル電圧振幅の変化および相変化のプロファイルは、変調周波数が異なっても実質的に同じ形状を示し、これは、ＭＥＭＳ交流ＤＳＣ測定のための周波数の選択が適切であったことを示している。
【００９３】
変性プロセス中のリゾチームの見かけ上の融解温度（Ｔｍ）、すなわち、デバイス出力の相変化がピークに達する温度は、変調周波数に従い、５５℃〜５８℃の範囲にあることがわかった（図１８）。一方、温度の関数としてのタンパク質の比熱容量（ｃ）は、サーモパイルの電圧振幅から計算可能である（図１９）。変調周波数によって誘発される変性プロセスの全体を通じて、ｃはわずかに変化するものの、ｃの輪郭形状は、変調周波数の影響を受けないことがわかった。さらに、各変調周波数において計算されたｃの値は、タンパク質濃度が異なってもそれほど違わなかった（図１９）。これは、交流ＤＳＣ測定が正確であったことを示している。本来の状態のタンパク質と、変性タンパク質との間には比熱容量（Δｃ）に差があるが、それは、変調周波数に関係なく常に３．０ｋＪ／ｍｏｌ?Ｋとなるよう計算された。これらの結果は、直流ＤＳＣ特性評価から得られた結果と一致している。温度変調を用いずに同じＭＥＭＳデバイスで行う直流ＤＳＣ測定（図２０）に比べて、交流ＤＳＣ測定は、ノイズレベルが低く、測定精度が高いので、低濃度での生体分子相互作用の特性評価を実現できる可能性を持っている。
実施例４：ＭＥＭＳ等温滴定型熱量測定
【００９４】
本実施例では、本願明細書に開示されるマイクロデバイスに基づく、上記のような等温滴定型熱量測定を実行する方法を説明する。
【００９５】
Ａ．原理
以下の溶相生体分子反応を考察する。
【数８】
2016524713.tif 000010
ここではＡおよびＢは、反応物（例えば、Ａはリガンド、Ｂは試料）であり、Ｃは生成物である。反応は、エンタルピーΔＨの変化を伴う。ＩＴＣでは、試料にリガンドが滴定されるか、または、周知の分割量で連続的に加えられる一方で、反応熱が測定されてよい。このデータは、平衡結合定数ＫＢ＝［Ｃ］／［Ａ］［Ｂ］（角括弧は、種の平衡濃度を示す）、化学量論Ｎ＝ｎ１／ｎ２、および、エンタルピー変化（ΔＨ）を含む、反応の熱力学的性質を決定するのに用いられてよい。
【００９６】
Ｂ．デバイスの設定および校正
図４に示されたようなＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスを用いた。簡潔に言えば、デバイスは、２つの同一のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロチャンバを統合したものであり、チャンバのそれぞれ（体積１μＬ）は、自立構造のポリイミド薄膜基板上に配置され、熱的隔離のために空隙で囲まれている。チャンバは、アンチモン−ビスマス（Ｓｂ−Ｂｉ）のサーモパイルと一体化され、導入チャネルを介して入口と接続される。導入チャネルは、蛇行するチャネルの背部にヘリンボーンパターンの隆起を有する受動カオス的ミキサを含んでいるため、流入する液体流を混合させるカオス的流動形態が生成される。使用されるＭＥＭＳ−ＩＴＣ装置の特徴のいくつかを図２１に示している。ＩＴＣ測定では、本願明細書において例示目的でリガンドおよび試料と称する２つの反応物がデバイスに導入され、まず導入チャネル内で混合され、その後、試料用熱測定チャンバに入り、そこで反応が完了した。その一方で、試料および（リガンドを含まない）純粋な緩衝液もデバイスに導入され、対照用熱測定チャンバに入る前に混合を始めた。一体化されたサーモパイルを用いてチャンバ間の示差温度を測定し、測定した示差温度は、熱力学的反応パラメータが計算される、反応による熱電力を決定するために用いられた。デバイスは、低ノイズかつ温度制御された熱エンクロージャ（図２２）内に配置され、そこでサーモパイルの出力が測定された。試料およびリガンドは、シリンジポンプを用いて導入された。校正実験は、線形定常状態の熱応答（応答性４．９ｍＶ／ｍＷ）により、デバイスが１．５ｓの熱時定数を有することを示した。
【００９７】
Ｃ．ＩＴＣ測定
デバイスは、１８−クラウン−６および塩化バリウムからなるモデル反応システムのＩＴＣ測定に用いられた。５ｍＭの塩化バリウムおよび４ｍＭの１８−クラウン−６を０．５μＬずつ感知できるほどの遅延なしに導入すると、時間分解されたデバイス出力は、反応に特有のスパイクを呈し（図２４）、これは、反応物が完全に混合していることを示している。塩化バリウム／１８−クラウン−６のモル比を用いて、０．１〜２まで変化する（１回目：０．１、２回目：０．４、３回目：０．８、４回目：１．０、５回目：１．２、６回目：１．６、７回目：２）滴定により、ベースライン補正されたデバイスの出力は、滴定反応と一致するスパイクを示し、結合等温線が得られた（図２５）。温度２３℃および３５℃でＩＴＣ測定が行われ（図２６）、結果としての等温線は、温度に伴い減少するＫＢおよびΔＨを計算するために用いられた（表１を参照）。これらの結果は、開示されたＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスは、体積をほぼ３桁縮小させても、従来の機器が検出可能な試料濃度（およそ１ｍＭ）に匹敵する試料濃度を検出できることを示した。
【表１】
2016524713.tif 000011
【００９８】
実施例５：ＭＥＭＳ等温熱量測定
多層ＳＵ−８モールディングに基づくＰＤＭＳレプリカ技法を用い、カオス的ミキサおよび熱量測定チャンバを単一のシートで作製した。５０個の接点を有するアンチモン−ビスマスサーモパイルと、中心間距離が４ｍであるそれぞれ０．７５μＬの２つの熱量測定チャンバとを微細加工デバイスに集積した。熱量測定チャンバは、高さ１５０μｍ、直径２．５ｍｍの円筒形状を有する。カオス的ミキサは、幅２００μｍ、高さ１５０μｍ、および、長さ約１５ｍｍの蛇行するマイクロチャネルであり、その背部にそれぞれが幅４０μｍおよび高さ５０μｍのヘリンボーンパターンの隆起を有する。それぞれの隆起のチャネルの側壁への傾きは６０℃であり、隣接する隆起同士のエッジ間距離は、３０μｍである。集積された抵抗マイクロヒータの公称抵抗値は、４０Ωであり、温度センサの公称抵抗値は、５５Ωである。
【００９９】
ＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスをテストするために、特注の熱エンクロージャにデバイスを収容することにより、周囲からの熱攪乱を遮断し、デバイスに導入された溶液を温度制御するようにした。改良された熱エンクロージャは、試料ステージを基材から張架することによりさらなる熱的隔離をもたらし、基材を強化してゴムの緩衝層を設けることにより振動を防止し、デバイスに対して複数ポートを有するマイクロ流体フィードスルーを設けている。熱エンクロージャの温度制御は、市販の温度コントローラ（Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ、モデル３３１）によって実行された。デバイスは、熱エンクロージャ内の試料ステージ上に配置される前に、電気配線および流体相互接続チューブと共にパッケージングされた。
【０１００】
デバイスの校正に用いられるオンチップマイクロヒータは、直流電源（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅ３６３１Ａ）によって駆動され、熱力測定チャンバ内で一定の示差加熱電力を生じた。熱量測定チャンバのインサイチュ温度モニタに用いられるオンチップ温度センサは、デジタルマルチメータ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４１０Ａ）によってインタロゲートされた。チャンバ間の示差温度に比例するサーモパイルの出力電圧は、ナノ電圧計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４２０Ａ）によって測定された。熱量測定チャンバの温度モニタ、および、熱電測定は、パソコンを用い、ＬａｂＶＩＥＷのプログラムにより自動化された。生体試料溶液および緩衝液は、構内の真空チャンバにより脱気され、計量されて、マルチインジェクションのシリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＫＤＳ２２０）を用いてＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスに導入された。
【０１０１】
デバイスは、オンチップマイクロヒータにより生成された示差電力への定常および過渡応答を測定することによってまず校正された。ＩＴＣ測定に先立ち、試料溶液および緩衝液を２つの熱量測定チャンバの両方に導入することにより、デバイス出力におけるベースライン、すなわち、反応がない状態でのサーモパイルの出力電圧を測定した。ＩＴＣ測定の間、熱エンクロージャによって制御された反応温度が与えられ、その一方で、示差熱電力を示すサーモパイル出力がリアルタイムで検出され、一体化されたマイクロ温度センサによって熱量測定チャンバの温度がモニタされた。リガンドおよび試料の体積は、各注入において０．５μＬに固定される一方で、モル比は、注入されるリガンドの濃度を変更することによって調整された。デバイス出力におけるベースラインは、生体分子の熱力学的性質を決定するための測定信号から常に差し引かれた。
【０１０２】
ＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスの熱時定数は、９０μＷのステップ状示差電力をまず印加することにより校正され、その後デバイス出力がその平衡状態に達したら印加を停止した。デバイスの出力電圧は、熱時定数が約１．５ｓに決定される示差電力の印加および印加停止の際に、一次指数関数的増加および減少関数にそれぞれ当てはまることがわかった。さらに、異なる差異電力に対してデバイスの定常応答が校正され、Ｓ＝４．９ｍＶ／ｍＷの一定の熱電感度を示す直線関係が観察された。同様に、２０℃〜４５℃の（熱エンクロージャによって提供される）コントローラ温度でデバイスの感度が校正され、デバイスの感度は、相対標準偏差が３％未満でほぼ変わらないことがわかった。
【０１０３】
そして、いずれも滅菌水で調製された１８−クラウン−６と塩化バリウムとの標準的な化学反応を用いて、ベースラインの安定性および検出の特異性がテストされた（すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した）。流量５０μＬ／分で、１秒以内に溶液を熱量測定チャンバ内に注入した。デバイス出力をリアルタイムにモニタするために２ｓ−１のデータ取得速度を用いたところ、注入後には感知できるほどの遅延は認められず、これは、反応物が完全に混合したことを示している。反応チャンバに４ｍＭの塩化バリウムおよび５ｍＭの１８−クラウン−６を０．５μＬずつ導入した際の時間分解されたサーモパイルの電圧と、滅菌水および５ｍＭの１８−クラウン−６を０．５μＬずつ導入した際の信号との比較を図３０に示す。どちらの場合も、対照チャンバには滅菌水および５ｍＭの１８−クラウン−６が注入され、バックグラウンドノイズを低くするための機器構成により、０．２ｓ−１のデータ収集速度が用いられた。デバイスは、測定全体を通して安定したベースラインを示し、１８−クラウン−６と塩化バリウムとの結合の発熱特性に起因する反応に特有のスパイクを示した。約２０〜３０秒のうちに反応は完結し、その間の溶液の注入および混合による妨げはごくわずかであった。
【０１０４】
その後、生体分子の相互作用を特徴づけるためにＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスを用いた。塩化バリウムと１８-クラウン−６との反応を用いてＩＴＣ測定を検証した。塩化バリウムと１８−クラウン−６とのモル質量比を０．１から２まで変化させることにより、ベースライン補正されたデバイス出力は、滴定反応と一致するスパイクを示した。ベースライン補正されたデバイス出力を図３１に示す。市販のＩＴＣ機器で実行されるように、１８−クラウン−６だけからなる試料に塩化バリウムを数回に分けて加えることによって発生する熱を測定するのではなく、０．５〜１０ｍＭの特定濃度の塩化バリウム、および、５ｍＭの特定濃度の１８−クラウン−６を不連続に測定するＩＴＣ実験を行った。各測定は、約５分以内に完結した。
【０１０５】
サーモパイル電圧を用いて、等式１に基づく生物学的熱電力を計算した。そして、プロセスの間に生物学的熱電力を積分することによりこの生物学的熱電力を用いて反応熱を計算した。
【０１０６】
図３２には、近似曲線、および、１８−クラウン−６と塩化バリウムとの反応の結合等温線が示されている。エラーバーは、各モル比での３つの測定の標準偏差を示す。この特定の塩化バリウム・１８−クラウン−６系に対して、デバイスは、従来の機器が検出可能な試料濃度（およそ１ｍＭ）に近い試料濃度を検出することができることに注目されたい。
【０１０７】
ＩＴＣ測定では、１８−クラウン−６と塩化バリウムとの生体反応が２３℃〜３５℃に制御された温度で実行され、結果としての結合等温線を用いて、温度に依存した熱力学的性質Ｎ、ＫＢ、および、ΔＨが計算された。特に、温度が２３℃から３５℃に上昇するにつれ、Ｎは１．００から１．０５へとわずかに増大し、ＫＢは、約６．０×１０−３から２．０×１０−３Ｍ−１へと減少し、ΔＨは、３０．０から２７．８ｋＪ／ｍｏｌまで減少した。このことは、温度に伴い結合がわずかに弱まる傾向を示している。適切な測定によって得られたこれらの特性、および、温度依存性は、図３３に示すような市販の熱量計を用いた周知のデータとかなり一致する。
【０１０８】
ＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスは、２’−シチジル酸（２’ＣＭＰ）とリボヌクレアーゼＡとの実証的な系を用いて、例えば、リガンドとタンパク質の結合などの生体分子相互作用の特性評価にもさらに応用された。２’−シチジル酸は、リボヌクレアーゼＡの活性部位と結合する基質の強力な阻害剤として知られている。どちらの試薬も、５０ｍＭの酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で調製された。同様に、０．１から２までの異なるモル比（２’−シチジル酸／リボヌクレアーゼＡ）では、デバイス出力は、図３４に示すようなモル比に対応する滴定依存スパイクを示した。２’−シチジル酸とリボヌクレアーゼＡとの結合を２３℃および３５℃に制御された温度でＩＴＣ測定した。各モル比における３つの測定のエラーバーが示されている。そして、この生体分子相互作用に関連する温度依存性熱力学的性質は、実験データを等式３のモデルにフィッティングすることにより決定された。結果は、図３５に示すような市販のＩＴＣ機器を用いた周知のデータとまたしてもかなり一致した。２’−シチジル酸とリボヌクレアーゼＡとの相互作用では、リボヌクレアーゼＡの合理的に検出可能な濃度は、２ｍＭくらいであろう。これらの結果は、本開示のＭＥＭＳ−ＩＴＣデバイスは、さまざまな生体分子相互反応の効率的な特性評価に用いられ得ることを実証している。
【０１０９】
実施例６：ポリマーＭＥＭＳ示差走査熱量計
基板として用いたポリイミド薄膜は、デュポン社から購入した（Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）５０ＨＮ、厚さ１２．５μｍ）。まず、スピンコートされたジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）接着層（厚さ２０μｍ）によって基板をシリコンウエハキャリアに可逆的に結合した。このＰＤＭＳ接着層が完全に硬化した後、アンチモン（幅４０μｍ、長さ２ｍｍ、厚さ０．５μｍ）およびビスマス（幅４０μｍ、長さ２ｍｍ、厚さ１μｍ）を基板上に蒸着して標準的なリフトオフプロセスでパターニングすることにより、接点数４００のサーモパイルを形成した。そしてサーモパイルをスピンコートされたポリイミド薄膜（厚さ１．５μｍ）で保護した。続いて、クロム・金薄膜（クロム５ｎｍ、金１５０ｎｍ）を蒸着してパターニングし、オンチップ温度センサを形成した。この温度センサは、５５Ωの公称抵抗値を有し、ＰＤＭＳマイクロ流体構造の接着層としての役目を果たすポリイミドとＰＤＭＳとの混合物からなる他の中間層によって保護された。製造されたデバイスは、基板から機械的に取り外され、ＰＤＭＳ結合層がはがされることにより、シリコンキャリアを再利用のために保存しておくことができる。同時に、蛇行したマイクロ流体チャネル（幅２００μｍ、高さ２００μｍ、長さ２５ｍｍ、体積１μＬ）がソフトリソグラフィによってＰＤＭＳから形成された。取り外された基板は、酸素プラズマによってマイクロ流体構造に結合された。
【０１１０】
パッケージングされたポリマーＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスは、当該デバイスが配置されるアルミニウムステージを取り囲む金属のキャップを構成する特注の熱エンクロージャ内に配置された。熱エンクロージャは、環境ノイズを低減することを目的として、ＤＳＣデバイスを外界温度からさらに熱的隔離するためのものである。さらに、エンクロージャは、デバイス内の試料溶液および対照溶液が、特定の速度で走査されることができるくらい均一な温度である環境をもたらした。複数のペルチェ素子（Ｍｅｌｃｏｒ  ＵＴ１５−１２−４０−Ｆ２）をデバイスステージの下に配置してデバイスに／から熱を加える／除去する一方で、温度コントローラ（Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ  モデル３１１）によって温度を正確に走査した。試料チャネルおよび対照チャネルの温度は、比例・積分・微分アルゴリズムに基づき、金属ステージに取り付けられた温度センサからのフィードバックに従って、ペルチェ素子に印加される電圧を調整することにより、閉ループで制御された。使用前に校正され、デジタルマルチメータ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４１０Ａ）によって測定されたオンチップ温度センサは、インサイチュ温度モニタリングを提供する。サーモパイルの出力電圧は、ナノ電圧計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３４４２０Ａ）によって測定された。ＤＳＣ測定のいかなる時点においても、試料溶液中の生体分子は均一な温度であることができ、そのことは、オンチップ温度センサによって正確に検知された。したがって、この実験の設定におけるＭＥＭＳデバイスは、サーモパイルによる示差電力の決定と共に、生体分子の正確なＤＳＣ測定を実現できよう。
【０１１１】
対象となる試料生体分子として用いられるリゾチーム（凍結乾燥粉末、タンパク質≧９０％）をシグマアルドリッチ社から購入し、０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）中に溶解した。ＤＳＣ測定に先立ち、試料溶液および緩衝液を構内の真空チャンバ内で一晩脱気し、マイクロピペットで計量し、シリンジポンプ（Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＮＥ−１０００）によって導入した。
【０１１２】
ポリマーＤＳＣデバイスをターゲット生体分子の特徴づけに用いる前に、ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスを校正するべく、安定した熱容量を有する液体を選んだ。沸騰温度を比較的高くするために、校正には水およびグリセリンが用いられ、デバイスを熱エンクロージャの内部に配置することにより、環境外乱を最小限にとどめた。熱電測定および抵抗測定は、ＬａｂＶＩＥＷのプログラムにより自動化された。校正後、緩衝液および脱イオン水によりデバイスを完全に洗浄した。
【０１１３】
ＤＳＣ測定に先立ち、２つの熱量測定チャネルをいずれも緩衝液で満たし、対象となる範囲を温度走査する間に、ベースライン、すなわち、示差電力の入力がない状態でのサーモパイルの出力電圧を記録した。その後、生体試料溶液および緩衝液でそれぞれ満たされた熱量測定チャネルによって生体分子の特性評価が行われ、同じ範囲を予め決められた速度で走査した。温度測定チャネルの温度をモニタするために温度センサが用いられ、生体分子の熱電力を計算するためのデバイス出力がリアルタイムに得られた。
【０１１４】
ポリマーＤＳＣデバイスを校正することにより、デバイス出力の応答性が決定された。熱量測定チャネルの体積が不一致であることの影響を説明すべく、空気で満たされた２つの熱量計測チャネルを用いて、まずデバイス温度が走査された。その後、試料チャネルには水およびグリセリンを連続して導入し、対照チャネルはそのまま空気で満たしておいた。すべての材料の熱容量は、文献から得たものである。デバイスの応答性は、以下の等式を用いて決定された。
【数９】
2016524713.tif 000012
ここでは、ΔＵは、測定されたサーモパイル出力電圧、は、試料および対照の温度が対象となる範囲で変化する一定の速度（走査速度）、および、Ｓは、デバイスの校正によって決定されるデバイス応答性、すなわち、単位示差電力当たりのサーモパイル出力電圧である。デバイス応答性は、試料の熱容量を決定するために後で用いられた。すべての校正実験では、文献で報告されている測定値と一致するよう、速度３Ｋ／分で熱走査された。そして、デバイス応答性は、４．７８ｍＶ／ｍＷであると決定された。図３９に示すように、デバイス応答性Ｓ、および、走査速度が等式７に代入された場合、温度の関数としての、実験で決定されたグリセリンと水との間の熱容量変化は、文献に報告されているデータを用いた計算と一致する。また、ＤＳＣ検出システムにおける約１００ｎＶの実験上の出力電圧ノイズレベルも観察された。このノイズレベルは、２１ｎＷの示差電力ノイズと相関する。
【０１１５】
さらに、温度均一性を評価し、デバイスの応答性を検証するために、ポリマーＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスにおける熱伝達の数値解析も行われた。ＣＯＭＳＯＬ（バージョン４．４）を用いての三次元モデルは、水で満たされたポリマー微細構造、サーモパイル接点、カプトン基板、および、その間のすべての保護層を含んでおり、デバイス内部の熱伝導、および、デバイスの外面から周囲への熱対流を明らかにする。このモデルは、低速（５Ｋ／分）で生じる温度ランピングプロセスの間の各温度における定常伝達を想定している。
【０１１６】
マイクロチャネル内部の自然対流は、シミュレーションでは無視される。水中の自然対流は、レイリー数
【数１０】
2016524713.tif 000013
によって特徴づけられてよい。ここでは、Ｈは、チャネルの高さ、αは、熱拡散率、βは、容積熱膨張、ｖは、水の動粘性率、ｇは、重力加速度、ΔＴｍａｘは、外界と注目のデバイス層との間の最大温度差を示す。一定の温度境界が適用される条件では、ＲａＨ＜１７０８の場合、自然対流はごくわずかと考えてよい。デバイスの形状および動作条件（ΔＴｍａｘ７０℃まで）では、ＲａＨ〜１．６Ｅ−０６であると推定される。したがって、自然対流を無視するのは正しいということになる。
【０１１７】
モデルは、以下の境界条件を用いる。基板とその下にあるペルチェヒータとの界面における熱接触抵抗は無視して、カプトン基板の背面をヒータ表面温度に規定した。デバイスの外面から外界への熱対流を表す対流係数ｈは、対流と伝導との相対的有意性を表すヌッセルト数の相関式Ｎｕ＝ｈＬ／ｋを用いて得られる。ここでは、ｋは、空気の熱伝導率であり、Ｌは、代表長さ（ＰＤＭＳの長さ）である。等温平板上の自然対流に対し、相対式
【数１１】
2016524713.tif 000014
によってヌッセルト数が与えられる。Ｒａａｉｒは、空気のレイリー数である。
【０１１８】
実験中の生物学的発熱を表すべく、試料チャネル全体に３ｍＷの発電を適用する。流体の熱伝導率、熱容量、および、質量密度は、温度に依存しており、ＣＯＭＳＯＬシミュレーションで説明される。マイクロ流体構造内の温度分布が図４０に示されている。基板の温度が２９８Ｋ（図４０ａ）、３１８Ｋ（図４０ｂ）、３３８ｋ（図４０ｃ）、３６８Ｋ（図４０ｄ）で規定されるときのデバイスの温度分布は、それぞれ５．１８、９．８９、１１．５７、１３．０６Ｗｍ−２Ｋ−１であると推定される。アンチモン、ビスマス、カプトン、ＰＤＭＳの熱伝導率は、それぞれ所定の公称値２４．４、７．９７、０．１２、０．１５Ｗｍ−１Ｋ−１である。基板の温度が９５℃に規定されている場合、試料チャネルと対照チャネルとの間の最大温度差は、約６℃であり、これは、ポリマーＤＳＣデバイスの優れた熱隔離性を示し得る。
【０１１９】
デバイスの応答性を推定すべく、サーモパイルの温接点と冷接点との平均温度差をまずシミュレーション結果から得た（０．６から１℃まで変化する）。等式７は、４．０９ｍＶ／ｍＷとなるデバイス応答性を得るために用いられる。この値は、一般的にプロセスに依存するセンサ形状および材料特性のばらつきに起因する偏差を考慮すると、実験的に得られた値４．７８ｍＶ／ｍＷと一致する。このデバイスの応答性は、２９８Ｋから３６８Ｋまでの範囲の異なる基板温度において、たった１５％しか違わないことがわかっている。
【０１２０】
ＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの時間応答を特徴づけるべく、デバイス出力が平衡に達するまで、熱量測定チャネルにはまず一定の示差電力が印加された。サーモパイルからの対応する出力電圧（図４１）は、示差電力を印加すると時間に伴い指数関数的に増加することが認められ、示差電圧の印加を停止すると指数関数的に減少することが認められた。実験データを一次指数関数的増加および減少関数にフィッティングすることにより計算された熱時定数は、約２．６ｓであった。
【０１２１】
そして、校正されたポリマーＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスは、タンパク質の変性を特徴づけるために活用された。試料および対照熱量測定チャンバのどちらも０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で満たし、デバイスを５Ｋ／分の一定速度で走査した。走査が完了した後、デバイスは、室温まで冷却され、ベースラインの安定性をテストするための第２の実験が同一条件で行われた。２つのベースライン間にはごくわずかな変動があった。特に、高い温度で勾配が見られ、これは、おそらく対照チャネルと試料チャネルとの間の体積測定の不一致の結果であろう。
【０１２２】
ベースラインの測定に続き、リゾチームを含む０．１Ｍのグリシン・塩酸緩衝液をデバイスの試料チャネルに導入し、対照チャネルは緩衝液だけで満たしておいた。リゾチームの変性の特性評価は、ベースラインを決定する際と同じ実験条件で行われた。ベースラインサブトラクションによって補正された、温度の関数としてのサーモパイル示差電圧は、１〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度で測定された（図４２）。デバイスの出力は、すべてのタンパク質濃度において、２５℃から７５℃までの範囲内の吸熱の熱力学的プロフィールを示した。特に、リゾチームの変性は、１ｍｇ／ｍＬで検出できた。さらに、温度の関数としての示差熱容量、および、校正されたデバイス感度は、等式７によるデバイス電圧出力から計算され得る。温度の関数としての試料の熱容量は、以下の等式によって決定された。
【数１２】
2016524713.tif 000015
ここでは、ｖｓａｍｐｌｅおよびｖｂｕｆｆｅｒは、試料溶液および緩衝液の部分比容をそれぞれ示し、ｍｓａｍｐｌｅは、試料チャネルにおける生体分子の質量を示し、ｃｂｕｆｆｅｒは、緩衝液の部分比容を示す。例えば、この配座転移に関連するリゾチームのモル当たりの総エンタルピー変化（ΔＨ）、および、（エンタルピー変化がΔＨの５０％に達する温度として定義される）融解温度Ｔｍなどの本質的な熱力学的性質が決定され得る。
【０１２３】
エンタルピー変化は、以下の等式により決定された。
【数１３】
2016524713.tif 000016
（サーモパイルの出力における高ノイズに起因するとみられる１ｍｇ／ｍＬ以外のすべてのタンパク質濃度から計算した）。図４３に示すように、対応する融解温度Ｔｍ＝５４．７１ｏＣでは、一貫してΔＨ＝４２１ｋＪ／ｍｏｌとなった。これらの結果は、周知のデータと一致するので、生体分子の相互作用を高感度で検出するポリマーＭＥＭＳ  ＤＳＣデバイスの性能を実証するものとなる。
【０１２４】
本願明細書の記載は、開示内容の原則を例示しているに過ぎない。記載されている実施形態へのさまざまな修正および変更も本願明細書における教示の観点から当業者には明らかであろう。さらに、本願明細書中で用いられる用語は、主に読みやすさおよび教育的な見地から選ばれたものであり、発明の内容を制限するものでないことに留意されたい。したがって、本願明細書の記載は、例示を目的としており、開示内容の範囲を限定するものではない。
【図１ａ】
2016524713.tif 000017
【図１ｂ】
2016524713.tif 000018
【図１ｃ】
2016524713.tif 000019
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７ａ】
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【図３７ｂ】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
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【図３８ｄ】
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【図３８ｅ】
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【図３９】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４０ｃ】
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【図４０ｄ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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