(57)【要約】  増殖因子受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する第１ドメイン及び軟骨マトリックス成分に特異的に結合する第２ドメインを含む融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含む薬学的組成物が本明細書で提供される。また、本明細書で開示される融合タンパク質及び薬学的組成物を用いて筋骨格疾患を治療する方法が提供される。
2016515587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質中に存在する場合、前記第１ドメインが増殖因子受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、前記第２ドメインが軟骨マトリックス成分に特異的に結合する、前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質が単一のポリペプチド鎖からなる、請求項１に記載の前記融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１結合ドメインがＩＧＦ−１受容体結合ドメインである、請求項１に記載の前記融合タンパク質。
【請求項４】
前記第２結合ドメインがＧＡＧ（グリコサミノグリカン）結合ドメインである、請求項１に記載の前記融合タンパク質。
【請求項５】
前記第２結合ドメインがコラーゲン結合ドメインである、請求項１に記載の前記融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＧＡＧ結合ドメインが、プロリン−アルギニン富化末端ロイシン富化繰り返しタンパク質（ＰＲＥＬＰ）、コンドロアドヘリン、オンコスタチンＭ、コラーゲンＩＸ、ＢＭＰ−４、フィブロネクチン、ＲＡＮＤ１、ＲＡＮＤ２、ＲＡＮＤ３、ＲＡＮＤ４、ＲＡＮＤ５、ＲＡＮＤ６、ＡＫＫ１５、ＲＬＲ２２、Ｒ１Ｑ１７、ＳＥＫ２０、ＡＲＫ２４、ＡＫＫ２４、ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３、ＬＧＴ２５、Ｐｅｐ１８４、Ｐｅｐ１８６、Ｐｅｐ１８５、Ｐｅｐ２３９、Ｐｅｐ２４６、ＡＴＩＩＩ、またはＦｉｂＢｅｔａのＧＡＧ結合ドメインの配列、またはこれに相同もしくは実質的に相同の配列を含む、請求項４に記載の前記融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＧＡＧ結合ドメインが配列番号２〜１３及び５４〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の前記融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＧＡＧ結合ドメインが配列番号２を含む、請求項４に記載の前記融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＩＧＦ−１受容体結合ドメインがヒトＩＧＦ−１のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＩＧＦ−１受容体結合ドメインが配列番号１を含むアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１１】
前記コラーゲン結合ドメインが、ＣＮＡ３５、ＣＮＡ３４４、トロンボスポンジン、マトリリン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質、ＰＲＥＬＰ、軟骨オリゴマータンパク質、コンドロアドヘリン、フィブロモジュリン、デコリン、またはアスポリンのコラーゲン結合ドメインの配列、またはこれらの配列に相同もしくは実質的に相同の配列を含む、請求項５に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１２】
前記コラーゲン結合ドメインが配列番号１４〜１６及び２１〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が配列番号１７〜２０、２８〜５３、及び７１〜８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１４】
前記融合タンパク質中に存在する場合、各結合ドメインが天然の結合活性を示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、４０，０００、３５，０００、３０，０００、２５，０００、２０，０００、１５，０００、１０，０００、７，５００、５，０００、２，５００、１，０００、５００、または２５０個未満のアミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１６】
哺乳類の関節の関節内空間への注入に際して、前記融合タンパク質が、前記第２結合ドメインが前記軟骨マトリックス成分と特異的に結合しない変異体ドメインである点でのみ請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質と異なる融合ムテインより少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍長い期間、前記関節の軟骨組織内に保持される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１７】
前記関節が傷害関節または疾患関節であり、前記軟骨組織内に保持される融合タンパク質の量が組織１ｇ当たり少なくとも約５、約１０、約２０、または約５０ｐｍｏｌである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１８】
前記哺乳類がラットまたはウマであり、前記関節が傷害関節または疾患関節であり、前記注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後に、前記関節が、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の１）前記軟骨組織からのｓＧＡＧ、２）細胞含有量、３）軟骨組織全量、または４）骨の質、の損失と比較した場合、１）、２）、３）、または４）の損失の減少を示す、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項１９】
前記哺乳類がラットまたはウマであり、前記関節が傷害関節または疾患関節であり、前記注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後に、前記軟骨組織が、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧ生成と比較した場合、前記軟骨組織のｓＧＡＧ生成の増大により特徴付けられる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項２０】
前記哺乳類がラットまたはウマであり、前記関節が傷害関節または疾患関節であり、前記注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後に、前記軟骨組織が、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧレベルと比較した場合、前記軟骨組織のｓＧＡＧレベルの増大により特徴付けられる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質。
【請求項２１】
前記組成物がグルココルチコイドをさらに含み、任意選択で前記グルココルチコイドがアルクロメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、シクレソニド、コルチゾール、コルチスポリン、コルチバゾール、デフラザコート、デキサメタゾン、フルドロキシコルチド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルチカゾン、ヘキスアセトンヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、プレグナジエン、プレグナトリエン、プレグネン、プロクトセディル、リメキソロン、テトラヒドロコルチコステロン、トリアムシノロン、及びウロベタゾール、並びにこれらの薬理学的に許容される塩、水和物、及びエステルからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質を含む組成物。
【請求項２２】
前記グルココルチコイドが前記組成物１ｇ当たり１〜１０００μｇの濃度で存在する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項２３】
前記グルココルチコイドが脂肪酸に抱合され、前記脂肪酸への前記抱合が任意選択でエステル結合を介する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項２４】
前記脂肪酸がパルミチン酸を含む、請求項２３に記載の前記組成物。
【請求項２５】
前記グルココルチコイドがミクロ粒子担体中に含有される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項２６】
前記ミクロ粒子担体がリポソームである、請求項２５に記載の前記組成物。
【請求項２７】
前記ミクロ粒子担体が多層状小胞である、請求項２５に記載の前記組成物。
【請求項２８】
前記ミクロ粒子担体が高融点脂質を含む、請求項２６または請求項２７に記載の前記組成物。
【請求項２９】
前記脂質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、またはヒドロソイ（Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ）ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を含む、請求項２８に記載の前記組成物。
【請求項３０】
前記グルココルチコイドが前記ミクロ粒子担体脂質の０．１〜２０モル％の濃度で前記ミクロ粒子担体中に存在する、請求項２６または請求項２７に記載の前記組成物。
【請求項３１】
配列番号１８で示されるアミノ酸配列及びデキサメタゾン２１−パルミチン酸塩を有する融合タンパク質を含む組成物であって、前記デキサメタゾン２１−パルミチン酸塩がＨＳＰＣ含有多層状小胞中に含有される、前記組成物。
【請求項３２】
傷害関節または疾患関節の関節内空間への前記組成物の注入後、軟骨マトリックス合成読み取りまたは軟骨分解読み取りが得られ、前記読み取りが、グルココルチコイドを含まない対応する組成物の対応する注入後に得られた対照の読み取りに優る改善を示す、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項３３】
関節傷害または疾患の治療方法であって、前記方法が、関節の関節内空間に治療的に有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質または請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の前記組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記関節傷害または疾患が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、軟骨分解、急性炎症性関節炎、感染性関節炎、骨粗しょう症、薬物毒性関連軟骨欠損、または外傷性軟骨傷害から選択される、請求項３３に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月２９日出願の米国仮特許出願第６１／８０６，５９９号に対する優先権を主張し、当該出願は参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
外傷性関節傷害（例えば靭帯、腱、及び軟骨の断裂）は、関節組織内で多因子変性カスケードを開始させ、これは慢性的周期の組織修復抑制、細胞外マトリックス異化の上方調節、細胞死、及び関節変性を含む。関節傷害のいくつかの態様は、外科的組織移植手技により修復することができるが、これらのアプローチは、関節の生体力学的安定性を部分的にのみ回復することができる。外科的及び緩和的治療を含む最近の治療アプローチは、関節運動学の恒久的な変更をブロックするのに十分ではない。このような変更は、細胞または組織力学で物理的力の効果及び変化を及ぼし（すなわち、メカノバイオロジー効果）、これは、関節病態生理学に寄与する細胞シグナリングの変更を含む。これらのメカノバイオロジー効果から生ずる変更された細胞シグナリングの結果から関節組織を保護する薬学的治療は存在しない。結果として、関節への外傷性傷害後の数年で、変性関節疾患を発展する危険性が劇的に増大する。
【０００３】
２００３年のＣＤＣによると、関節炎及び他のリウマチ状態のために、米国は、１２７８億ドル（医療費で８０８億ドル及び損失所得で４７０億ドル）、または国内総生産の１．２％を費やした。外傷性関節傷害から生ずる変性関節疾患は、関節炎の全負担の１０％を超える。したがって、外傷性関節傷害から生ずる変性関節疾患のための有効な治療について顕著な未だ対処されていない要求が存在する。以下の開示はこの要求に取り組み、他の利点を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
受け入れられる、有効な治療を提供するような方法で疾患関節または損傷関節に直接的に薬物を送達することは、未だに顕著な困難であり、これは最近の出版物中の以下の説明により例示される。
「関節内治療は、注入された物質が関節空間から速く出るために困難である。この排出は、滑膜毛細管を介して出る小分子、及びリンパ系により排除される巨大分子の両方について真実である。一般的に、可溶性物質は１時間以内しか関節内滞留時間を有しない。」
（Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１４  Ｊａｎ；１０（１）：１１−２２）
この困難に対処するために長く考えられ、かつ未だ対処されていない要求があったことは、８年近く早く出版された別の報告で強調されている同じ問題により例示される。
「将来のＩＡ（関節内）治療で標的化されるべき主な改善は、より長い活性期間であり、これは、投与と関連付けられた不快／痛み、及び感染の危険の可能性のために、１年当たりのＩＡ注入回数を制限することが望ましいからである。」
（Ｇｅｒｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００６  Ｍａｙ  ２０；５８（２）：２２６−４２）
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、受け入れられる、有効な治療を提供するために疾患または損傷に直接的に送達され得る薬学的に活性なタンパク質が本明細書で提供される。これらの薬学的に活性なタンパク質は、増殖因子受容体（例えばＩＧＦ−１受容体）の細胞外ドメインに特異的に結合する第１ドメイン及び軟骨マトリックス成分（例えば硫酸化グリコサミノグリカン及びコラーゲン）に特異的に結合する第２ドメインを含む、融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含む薬学的組成物である。これらの融合タンパク質及び薬学的組成物は、骨関節炎などの変性関節疾患の治療のために特に有用である。また、本明細書で開示される融合タンパク質及び薬学的組成物を用いて筋骨格疾患を治療する方法が提供される。
【０００６】
一態様では、本開示は、第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む融合タンパク質を提供し、第１ドメインは増殖因子受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、第２ドメインは軟骨マトリックス成分に特異的に結合し、この融合タンパク質内で（すなわち、この融合タンパク質内に存在する場合）、各結合ドメインは特異的結合活性を示す。
【０００７】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は単一のポリペプチド鎖からなる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質内で（すなわち、融合タンパク質内に存在する場合）、各結合ドメインは天然の結合活性を示す。
【０００８】
ある特定の実施形態では、第１ドメインはＩＧＦ−１受容体結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１受容体結合ドメインは、ヒトＩＧＦ−１を含むアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１受容体結合ドメインは、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、第２ドメインはｓＧＡＧ（硫酸化グリコサミノグリカン）結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ｓＧＡＧ結合ドメインは、プロリン−アルギニン富化末端ロイシン富化繰り返しタンパク質（ＰＲＥＬＰ）、コンドロアドヘリン（ＣＨＡＤ）、オンコスタチンＭ、コラーゲンＩＸ、ＢＭＰ−４、フィブロネクチン、ＲＡＮＤ１、ＲＡＮＤ２、ＲＡＮＤ３、ＲＡＮＤ４、ＲＡＮＤ５、ＲＡＮＤ６、ＡＫＫ１５、ＲＬＲ２２、Ｒ１Ｑ１７、ＳＥＫ２０、ＡＲＫ２４、ＡＫＫ２４、ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３、ＬＧＴ２５、Ｐｅｐ１８４、Ｐｅｐ１８６、Ｐｅｐ１８５、Ｐｅｐ２３９、Ｐｅｐ２４６、ＡＴＩＩＩ、またはＦｉｂＢｅｔａのｓＧＡＧ結合ドメインの配列、またはこれに相同のもしくは実質的に相同の配列を有する。ある特定の実施形態では、ｓＧＡＧ結合ドメインは、配列番号２〜１３及び５４〜７０（表１を参照のこと）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の一実施形態では、ｓＧＡＧ結合ドメインは配列番号２を含む。特定の一実施形態では、ｓＧＡＧ結合ドメインは配列番号２からなる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、第２ドメインはコラーゲン結合ドメインである。ある特定の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、マトリリン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質、ＰＲＥＬＰ、コンドロアドヘリン、フィブロモジュリン、デコリン、またはアスポリンのコラーゲン結合ドメインの配列、またはこの配列に相同のもしくは実質的に相同の配列を有する。ある特定の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、配列番号１４〜１６及び２１〜２７（表２を参照のこと）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７〜２０、２８〜５３、及び７１〜８７（表３を参照のこと）から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の一実施形態では、融合タンパク質は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。特定の一実施形態では、融合タンパク質は配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質内に存在する場合、各結合ドメインは天然の結合活性を示す。
【００１３】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、４０，０００、３５，０００、３０，０００、２５，０００、２０，０００、１５，０００、１０，０００、７，５００、５，０００、２，５００、１，０００、５００、または２５０未満のアミノ酸を含む。
【００１４】
ある特定の実施形態では、哺乳類の関節の関節内空間への注入に際して、融合タンパク質は、第２結合ドメインが軟骨マトリックス成分に特異的に結合しない変異体ドメインである点でのみこの融合タンパク質と異なる融合ムテインより少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍長い期間、関節の軟骨組織内に保持される。ある特定の実施形態では、関節は傷害関節または疾患関節であり、軟骨組織で保持される融合タンパク質の量は組織１ｇ当たり少なくとも約５、約１０、約２０、または約５０ｐｍｏｌである。ある特定の実施形態では、哺乳類はラットまたはウマであり、関節は傷害関節または疾患関節であり、注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、関節は、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の１）軟骨組織からのｓＧＡＧ、２）細胞含有量、３）全軟骨組織、または４）骨の質、の損失と比較した場合、１）、２）、３）、または４）、の損失の減少を示す。ある特定の実施形態では、哺乳類はラットまたはウマであり、関節は傷害関節または疾患関節であり、注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、軟骨組織は、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧ生成と比較した場合、軟骨組織のｓＧＡＧ生成の増大により特徴付けられる。ある特定の実施形態では、哺乳類はラットまたはウマであり、関節は傷害関節または疾患関節であり、注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、軟骨組織は、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧレベルと比較した場合、軟骨組織のｓＧＡＧレベルの増大により特徴付けられる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、哺乳類の関節の関節内空間への融合タンパク質の注入に際して、融合タンパク質は、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０日間の期間、関節の軟骨組織内に保持される。ある特定の実施形態では、関節は傷害関節であり、軟骨組織内に保持される融合タンパク質の量は、組織１ｇ当たり少なくとも約５、約１０、約２０、または約５０ｐｍｏｌである。ある特定の実施形態では、哺乳類はラットまたはウマであり、関節は疾患または傷害関節であり、注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、関節は、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧ損失と比較した場合、軟骨組織からのｓＧＡＧ損失の減少を示す。ある特定の実施形態では、哺乳類はラットまたはウマであり、関節は傷害関節であり、注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、軟骨組織は、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧ生成と比較した場合、軟骨組織のｓＧＡＧ生成の増大により特徴付けられる。ある特定の実施形態では、哺乳類はラットまたはウマであり、関節は傷害関節であり、注入８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、軟骨組織は、対照タンパク質を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧレベルと比較した場合、軟骨組織のｓＧＡＧレベルの増大により特徴付けられる。
【００１６】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質及びグルココルチコイドのうちの１つ以上を含む組成物を提供する。好適なグルココルチコイドとして、アルクロメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、シクレソニド、コルチゾール、コルチスポリン、コルチバゾール、デフラザコート、デキサメタゾン、フルドロキシコルチド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルチカゾン、ヘキスアセトンヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、プレグナジエン、プレグナトリエン、プレグネン、プロクトセディル、リメキソロン、テトラヒドロコルチコステロン、トリアムシノロン、及びウロベタゾール、並びにこれらの薬理学的に許容される塩、水和物、及びエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、組成物１ｇ当たり１〜１０００μｇの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは脂肪酸に抱合され、脂肪酸への抱合は任意選択でエステル結合を介する。ある特定の実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、グルココルチコイドはミクロ粒子担体中に含有される。ある特定の実施形態では、ミクロ粒子担体はリポソームである。ある特定の実施形態では、ミクロ粒子担体は多層状小胞である。ある特定の実施形態では、ミクロ粒子担体は高融点脂質を含む。ある特定の実施形態では、脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、またはヒドロソイ（Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ）ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を含む。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、ミクロ粒子担体脂質の０．１〜２０モル％の濃度でミクロ粒子担体中に存在する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列及びデキサメタゾン２１−パルミチン酸塩を有する融合タンパク質を含む組成物を提供し、デキサメタゾン２１−パルミチン酸塩はＨＳＰＣ含有多層状小胞中に含有される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、傷害関節または疾患関節の関節内空間への本明細書で開示される融合タンパク質／グルココルチコイド組成物の注入後、軟骨マトリックス合成読み取りまたは軟骨分解読み取りが得られ、これらの読み取りは、グルココルチコイドを伴わない対応する組成物の対応する注入後に得られた対照読み取りに優る改善を示す。
【００２０】
別の態様では、本開示は、関節傷害または疾患の治療方法を提供し、この方法は、関節の関節内空間への、治療的に有効な量の本明細書で開示される融合タンパク質または組成物の投与を含む。ある特定の実施形態では、関節傷害または疾患は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、軟骨分解、急性炎症性関節炎、感染性関節炎、骨粗しょう症、薬物毒性関連軟骨欠損、または外傷性軟骨傷害から選択される。
【００２１】
別の態様では、本開示は、生体適合性ハイドロゲル中に本明細書で開示される融合タンパク質のうちの１つ以上を含む組成物を提供する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、及びヘパリン様ドメインポリマーのうちの１つ以上を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルはメチルセルロースを含む。例えば約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの、任意の分子量のメチルセルロースを使用することができる。任意の量のメチルセルロースをハイドロゲル中で使用することができる。ある特定の実施形態では、メチルセルロースの量はハイドロゲルの約１〜約１０重量％である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルはＨＡ（例えばヒアルロン酸ナトリウム）を含む。例えば約１０ｋＤａ〜約１．８ＭＤａの、任意の分子量のＨＡを使用することができる。任意の量のＨＡをハイドロゲル中で使用することができる。ある特定の実施形態では、ＨＡの量はハイドロゲルの約１〜約１０重量％である。
【００２５】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、硫酸コンドロイチン、硫酸ヘパラン、またはヘパリンを含む、ヘパリン様ドメインポリマーを含む。任意の量のヘパリン様ドメインポリマーをハイドロゲル中で使用することができる。ある特定の実施形態では、ヘパリン様ドメインポリマーの量はハイドロゲルの約０．０５重量％〜２重量％である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、ある特定の温度を超えると（例えば３５℃を超えると）熱硬化性である。ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、ある特定の温度未満で（例えば３５℃未満で）流体またはずり減粘である。
【００２７】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で開示されるハイドロゲル１ｇ当たり約１〜約１０００μｇの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で開示されるハイドロゲル１ｇ当たり約１００〜約１０，０００μｇの濃度で存在する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルはグルココルチコイドをさらに含む。好適なグルココルチコイドとして、アルクロメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、シクレソニド、コルチゾール、コルチスポリン、コルチバゾール、デフラザコート、デキサメタゾン、フルドロキシコルチド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルチカゾン、ヘキスアセトンヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、プレグナジエン、プレグナトリエン、プレグネン、プロクトセディル、リメキソロン、テトラヒドロコルチコステロン、トリアムシノロン、及びウロベタゾール、並びにこれらの薬理学的に許容される塩、水和物、及びエステルが挙げられるが、これらに限定されない。また、修飾グルココルチコイドを使用することができる。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドはエステル結合を介して脂肪酸（例えばパルミチン酸）に抱合される。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、リポソームまたは多層状小胞などの、ミクロ粒子担体中に含有される。リポソームミクロ粒子は、高融点（Ｔm）脂質、例えばＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、またはＨＳＰＣ（水素化大豆ホスファチジルコリン）を含んでよい。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、リポソームミクロ粒子中に含有され、リポソーム脂質の０．１〜２０モル％で存在する。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、リポソームミクロ粒子中に含有され、リポソーム脂質はハイドロゲルの０．０１重量％〜１０重量％である。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、薬学的組成物（例えばハイドロゲル）が関節内に注入された場合、軟骨マトリックス合成を刺激する、もしくは細胞生存を刺激する、または軟骨マトリックス分解を予防する、もしくは細胞死を予防するのに十分な濃度でハイドロゲル中に存在する。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、ハイドロゲル１ｇ当たり１〜１０００μｇの濃度で存在する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、関節の関節内空間への組成物の注入後、関節の軟骨マトリックス合成または分解の読み取りは、融合タンパク質または融合タンパク質とグルココルチコイドとの組み合わせのみの注入後の読み取りに優る改善を示す。
【００３０】
ある特定の実施形態では、関節の関節内空間への組成物の注入後、グルココルチコイドは、少なくとも約８日間（例えば９、１０、１１、または１２日間）の半減期で関節内に存在する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、関節の関節内空間への組成物の注入後、融合タンパク質は、融合タンパク質またはグルココルチコイドのいずれかが単独で注入された場合より長い時間、関節の関節内空間に保持される。
【００３２】
別の態様では、本開示は、関節の関節内空間への治療的に有効な量の本明細書で開示される融合タンパク質のうちの１つ以上の投与を含む、筋骨格疾患の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、筋骨格疾患は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、傷害後軟骨分解、急性炎症性関節炎、感染性関節炎、骨粗しょう症を含むか、または薬物毒性の結果である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本明細書で開示される融合タンパク質の（Ａ）硫酸ヘパラン、及び（Ｂ）硫酸コンドロイチンへの結合のグラフを示し、ＧＦ−Ｆｕｓ３（配列番号１８）の硫酸ヘパラン及び硫酸コンドロイチンへの結合を示すが、ＧＦ−Ｆｕｓ１（配列番号１）またはＧＦ−Ｆｕｓ４（配列番号３３）の結合は示さない。
【図２】本明細書で開示される融合タンパク質のコラーゲンへの結合のグラフを示し、ＧＦ−Ｆｕｓ６（配列番号３５）より高いＧＦ−Ｆｕｓ５（配列番号３４）のコラーゲンへの結合を示す。
【図３】ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ２（配列番号３２）、ＧＦ−Ｆｕｓ３、ＧＦ−Ｆｕｓ４、ＧＦ−Ｆｕｓ５、ＧＦ−Ｆｕｓ６融合タンパク質、及び野生型ＩＧＦによる、ウシ軟骨細胞（Ａ）及びＢＸＰＣ−３細胞（Ｂ）でのＡＫＴリン酸化の刺激を示す２つのグラフを示し、全ての融合タンパク質がｐＡＫＴを野生型ＩＧＦによる上方調節と匹敵するレベルまで上方調節したことを示す。データは平均値±ＳＥＭである。
【図４】時間（日）に対するｓＧＡＧ損失のグラフを示し、ウシ軟骨外植片からのｓＧＡＧ損失がＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ２、及びＧＦ−Ｆｕｓ３により、並びに野生型ＩＧＦにより減少されることを示す。データは平均値±ＳＥＭである。
【図５】ウシ軟骨外植片への35Ｓ−硫酸塩組み込みの２つのグラフを示し、ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ２、ＧＦ−Ｆｕｓ３、及び野生型ＩＧＦを連続的に添加すること（黒色バー）により得られた疾患対照に対する増大を示す。培養培地からの除去４または８日後に（白色バー）、ＧＦ−Ｆｕｓ３はプロテオグリカン生合成で最も大きな増大を刺激した。35Ｓ−硫酸塩組み込みは、８日目（図５Ａ）及び１２日目（図５Ｂ）で終了する培養の最後の４８時間の間に測定した。データは平均値±ＳＥＭである。処理なし対照（健康）の35Ｓ−硫酸塩組み込み速度は、８日目及び１２日目に、それぞれ、１３２．２±３．６及び１４０．３±１１．０（平均値±ＳＥＭ）ｐｍｏｌ／時間／μｇＤＮＡであった。
【図６】時間（日）に対する％ｓＧＡＧ損失のグラフであり、ウシ軟骨外植片からの％ｓＧＡＧ損失が、ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ３、ＧＦ−Ｆｕｓ５、及びＧＦ−Ｆｕｓ６が培地交換毎に供給された場合、これらの融合タンパク質により減少されることを示す。データは平均値±ＳＥＭである。
【図７】時間（日）に対する％ｓＧＡＧ損失のグラフであり、ＧＦ−Ｆｕｓ３が、０〜４日目の間のみ培地に添加された場合、ウシ軟骨外植片からの％ｓＧＡＧ損失を、ＧＦ−Ｆｕｓ１より大きく減少させることを示す。データは平均値±ＳＥＭである。
【図８】ウシ軟骨外植片への35Ｓ−硫酸塩組み込みの２つのグラフを示し、培地交換毎に添加された場合の、ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ３、ＧＦ−Ｆｕｓ５、及びＧＦ−Ｆｕｓ６による疾患対照に対するこのような組み込みの増大を示す。ＧＦ−Ｆｕｓ３は、０〜４日目の間のみ添加された場合、35Ｓ−硫酸塩組み込みの最も大きな増大を刺激した。35Ｓ−硫酸塩組み込みは８日目（図８Ａ）及び１２日目（図８Ｂ）で終了する培養の最後の４８時間の間に測定した。データは平均値±ＳＥＭである。処理なし対照（健康）の35Ｓ−硫酸塩組み込み速度は、８日目及び１２日目で、それぞれ、０．１１７±０．００９９及び０．０８３±０．００４７（平均値±ＳＥＭ）ｎｍｏｌ／時間／μｇＤＮＡであった。
【図９】（Ａ）は、ＧＦ−Ｆｕｓ３及び抗Ｉｎｆｌ−１（デキサメタゾン）単独で及び組み合わせで処理したウシ外植片についての時間（日）に対する％ｓＧＡＧ損失のグラフであり、（Ｂ）は、時間（日）に対する35Ｓ−硫酸塩組み込みのグラフである。疾患対照に対する％ｓＧＡＧ損失の最も大きな減少、及び35Ｓ−硫酸塩組み込みの増大は、ＧＦ−Ｆｕｓ３及び抗Ｉｎｆｌ−２（デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩）の組み合わせで得られた。35Ｓ−硫酸塩組み込みは、８及び１２日目に終了する培養の最後の４８時間の間に測定した（図９Ｂ）。データは平均値±ＳＥＭである。処理なし対照（健康）の35Ｓ−硫酸塩組み込み速度は、８日目及び１２日目で、それぞれ、１５３．５±９．１及び１２３．２±８．８（平均値±ＳＥＭ）ｐｍｏｌ／時間／μｇＤＮＡであった。
【図１０】（Ａ）ゲル４からのＧＦ−Ｆｕｓ２の累積放出、（Ｂ）ゲル３からのＧＦ−Ｆｕｓ２の累積放出、（Ｃ）ゲル４からのＧＦ−Ｆｕｓ２の時点当たりの放出、（Ｄ）ゲル３からのＧＦ−Ｆｕｓ２の時点当たりの放出、（Ｅ）ゲル４からの野生型ＩＧＦの累積放出、（Ｆ）ゲル３からの野生型ＩＧＦの累積放出、（Ｇ）ゲル４からの野生型ＩＧＦの時点当たりの放出、（Ｈ）ゲル３からの野生型ＩＧＦの時点当たりの放出のグラフを示す。ＧＦ−Ｆｕｓ２及び野生型ＩＧＦは、０〜３日目に同様の速度でゲル３及びゲル４の両方から放出され、４日目移行はさらなる放出はなかった。データは平均値±ＳＥＭである。
【図１１】（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、本明細書で開示されるハイドロゲル調合物からの、時間（日）に対する抗Ｉｎｆｌ−２（デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩）の累積放出のグラフであり、Ｘがゲル１及び２について、それぞれ、１または２であり、Ｙがナノ粒子タイプを示す１〜５である、命名規則ゲルＸ−Ｙを用いる。抗Ｉｎｆｌ−２の放出速度は変化し、最も速い（ゲル２−３）放出調合物〜最も遅い（ゲル１−１及び１−３）放出調合物間で９日目の累積放出で４倍の差を達成する。データは平均値±ＳＥＭである。
【図１２】（Ａ）ヒト足首距骨頂部軟骨外植片、（Ｂ）ヒト足首距骨後部軟骨外植片、（Ｃ）ヒト足首の、距骨頭部、及びくるぶし脛骨及び腓骨から集められた、軟骨外植片、並びに（Ｄ）ヒト膝大腿骨−膝蓋骨溝軟骨外植片からの％ｓＧＡＧ損失のグラフを示す。外植片を、サイトカイン（疾患）を伴う１６日間（１６Ｄ）の培養中、ＧＦ−Ｆｕｓ３及び抗Ｉｎｆｌ−１（デキサメタゾン）単独で及び組み合わせで処理した。サイトカインなし対照（健康）。抗Ｉｎｆｌ−１は、単独及びＧＦ−Ｆｕｓ３との組み合わせの両方で、全ての組織について％ｓＧＡＧ損失を減少させた。データは平均値±ＳＥＭである。
【図１３】ＧＦ−Ｆｕｓ３及び抗Ｉｎｆｌ−１（デキサメタゾン）での単独及び組み合わせでの１６日間（１６Ｄ）の処理についての、35Ｓ−硫酸塩組み込みにより決定される硫酸化マトリックス生合成のグラフを示す。組み込みを、（Ａ）ヒト足首距骨頂部軟骨外植片、（Ｂ）ヒト足首距骨後部軟骨外植片、（Ｃ）ヒト足首の、距骨頭部、及びくるぶし脛骨及び腓骨から集められた、軟骨外植片、（Ｄ）ヒト膝大腿骨−膝蓋骨溝軟骨外植片、並びに（Ｅ）ヒト膝コンジル軟骨外植片について、サイトカイン（疾患）を伴う１６日間の培養の最後の４８時間の間に測定した。ＧＦ−Ｆｕｓ３は、単独及び抗Ｉｎｆｌ−１（デキサメタゾン）との組み合わせの両方で疾患対照に対するマトリックス生合成を増大させた。健康な対照の組み込み速度は、１３Ａ〜Ｅの組織について、それぞれ、８９．３±１３．０、８３．１±９．８、７２．６±８．８、８８．８±１３．８、及び８２．２±９．９ｐｍｏｌ／時間／μｇＤＮＡであった。データは平均値±ＳＥＭである。
【図１４】（Ａ）ヒト足首距骨頂部軟骨、（Ｂ）ヒト足首距骨後部軟骨、（Ｃ）ヒト足首の、距骨頭部、及びくるぶし脛骨及び腓骨の軟骨、及び（Ｄ）ヒト膝大腿骨−膝蓋骨溝軟骨についての、35Ｓ−硫酸塩組み込みにより決定される、サイトカインの存在下（疾患）で１６日間の抗Ｉｎｆｌ−１（デキサメタゾン）との組み合わせのＧＦ−Ｆｕｓ１及びＧＦ−Ｆｕｓ３のそれぞれでの８及び１６日間の処理（それぞれ、８Ｄ及び１６Ｄ）についての硫酸化マトリックス生合成のグラフを示す。35Ｓ−硫酸塩組み込みは、サイトカイン（疾患）を伴う１６日間の培養の最後の４８時間の間に測定した。健康対照の組み込み速度は、１４Ａ〜Ｄの組織について、それぞれ、８９．３±１３．０、８３．１±９．８、７２．６±８．８、及び８８．８±１３．８ｐｍｏｌ／時間／μｇＤＮＡであった。ＧＦ−Ｆｕｓ１及びＧＦ−Ｆｕｓ３のそれぞれでの１６日間の処理（黒色バー）は、疾患対照に対する35Ｓ−硫酸塩組み込みを刺激したが、ＧＦ−Ｆｕｓ３のみが、８日間の処理で35Ｓ−硫酸塩組み込みを刺激した（白色バー）。（Ｅ）35Ｓ−硫酸塩組み込みにより決定される、サイトカインの不在下での１６日間の抗Ｉｎｆｌ−１との組み合わせのＧＦ−Ｆｕｓ１及びＧＦ−Ｆｕｓ３のそれぞれでの８及び１６日間の処理についての硫酸化マトリックス生合成。ヒト膝コンジル軟骨外植片組み込みは、１６日間の培養の最後の４８時間の間に測定した。サイトカインなし（健康）、サイトカイン（疾患）、及び抗Ｉｎｆｌ−１単独を対照として含めた。ＧＦ−Ｆｕｓ１及びＧＦ−Ｆｕｓ３のそれぞれでの１６日間の処理（黒色バー）は、疾患対照に対するかつ抗Ｉｎｆｌ−１単独に対する35Ｓ−硫酸塩組み込みを刺激したが、ＧＦ−Ｆｕｓ３のみが、８日間の処理で35Ｓ−硫酸塩組み込みを刺激した（白色バー）。データは平均値±ＳＥＭである。
【図１５】（Ａ）軟骨可溶化物中のデキサメタゾン濃度、（Ｂ）半月板可溶化物中のデキサメタゾン濃度、（Ｃ）靭帯可溶化物中のデキサメタゾン濃度、Ｄ）膝蓋骨及び周囲の滑膜の可溶化物中のデキサメタゾン濃度、（Ｅ）血清中のデキサメタゾン濃度、（Ｆ）洗浄液中のデキサメタゾン濃度、（Ｇ）軟骨可溶化物中のＩＧＦ濃度、（Ｈ）半月板可溶化物中のＩＧＦ濃度、（Ｉ）靭帯可溶化物中のＩＧＦ濃度、（Ｊ）膝蓋骨及び周囲の滑膜の可溶化物中のＩＧＦ濃度、（Ｋ）血清中のＩＧＦ濃度、及び（Ｌ）洗浄液中のＩＧＦ濃度を示す一連のグラフである。即時の時点の試料を０．１時間でプロットする。データは平均値±ＳＥＭである。不在の点は検出限界未満であった。
【図１６】サイトカインの存在下（疾患）でのＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ３−Ｈｉｓ、またはＧＦ−Ｆｕｓ３での４及び１２日間（それぞれ、４Ｄ、白色バー、及び１２Ｄ、黒色バー）の処理についての、35Ｓ−硫酸塩組み込みにより測定された硫酸化マトリックス生合成のグラフである。サイトカイン処理単独（疾患）を対照として含めた。ＧＦ−Ｆｕｓ３は、ＧＦ−Ｆｕｓ３−Ｈｉｓと同等の軟骨マトリックス合成を刺激した。データは平均値±ＳＥＭである。
【図１７】１等級軟骨を有する６３歳女性（１７Ａ）、及び３等級軟骨を有する７６歳女性（１７Ｂ）からの滑液中の融合タンパク質安定性を示す、２つのゲル像を示す。４５ｎｇのＧＦ−Ｆｕｓ３を、３７℃の滑液中での示される時間の間のインキュベーション後、左の５つのレーンにロードした。滑液中でインキュベートしていないストックＧＦ−Ｆｕｓ３標準（ｎｇ）を、右の５つのレーンにロードした。７．５ｋＤａ未満の微かなバンドは、最小限のタンパク質分解を示し、これは１ｎｇ以下であった（すなわち、ロードしたタンパク質のうちの２％未満しか分解されなかった）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、増殖因子受容体（例えばＩＧＦ−１受容体）の細胞外ドメインに特異的に結合する第１ドメイン及び軟骨マトリックス成分（例えばプロテオグリカンサブユニット、例えば硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）、硫酸コンドロイチン、及びコラーゲン）に特異的に結合する第２ドメインを含む、融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。また、本明細書で開示される融合タンパク質及び薬学的組成物を用いて、筋骨格疾患、例えば関節炎（例えば骨関節炎）、外傷性関節傷害、及び関連した状態を治療する方法が提供される。
【００３５】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「Ｌｏｎｇ［Ｒ3］−ＩＧＦ−１」、「ＬＲ３」、「ＩＧＦ（ＬＲ３）」、及び「ＧＦ−Ｆｕｓ１」という用語は同義的に使用され、以下のアミノ酸配列、ＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦＶＮＧＰＲＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号１）を有するＩＧＦ−１変異体ポリペプチドを指す。
【００３６】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は相互変換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小限の長さに限定されない。また、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、ペプチド結合により連結された直線的に配置されたアミノ酸からなり、生物学的に、組換えで、または合成的に生成されようとも、天然または非天然アミノ酸からなろうとも、この定義に含まれる。全長タンパク質及びその断片の両方がこの定義に包含される。また、この用語はポリペプチドの共翻訳及び翻訳後（Ｃ末端ペプチド切断）修飾、例えばジスルフィド結合形成、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化、タンパク質分解切断（例えばフリンまたはメタロプロテアーゼによる切断）などを含む。さらに、本開示の目的のために、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、天然配列に対する欠失、付加、及び置換（一般的に、当業者に既知であるとおり本質的に保存的）などの修飾を有する変異体及び誘導体を、そのタンパク質が所望の活性を維持する限り、含む。これらの修飾は部位特異的変異誘発によるなど故意であってよく、あるいはタンパク質を生成するホストの突然変異またはＰＣＲ増幅もしくは他の組換えＤＮＡ法による誤りによるなど偶発的であってもよい。
【００３７】
「相同性」、「同一性」、及び「類似性」という用語は、２つのペプチド間、または２つの最適に並列された核酸分子間の配列類似性の程度を指す。相同性及び同一性は、それぞれ、比較の目的のために並列され得る各配列中の位置を比較することにより決定することができる。例えば、これは、ＢＬＡＳＴ、ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．１４などの標準の相同性ソフトウェアをデフォルト位置で用いることに基づく。比較される配列中の同等の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、分子はその位置で同一であり、同等の部位が類似のアミノ酸残基により占有される場合（例えば立体的性質及び／または電気的性質が類似する、例えば保存的アミノ酸置換など）、分子はその位置で相同（類似）と言及され得る。相同性／類似性または同一性の割合としての表現は、丁寧に、比較される配列が共有する位置での類似または同一のアミノ酸の数の関数を指す。「非関連」または「非相同」の配列は、本明細書で開示される配列と４０％未満、好ましくは２５％未満しか同一性を共有しない。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウィンドウにわたり同一であること（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチド、または残基と残基に基づいて）を意味する。「配列同一性の割合」という用語は、比較ウィンドウにわたり２つの最適に並列された配列を比較し、両方の配列中に同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）または残基が存在する位置の数を決定して対応する位置の数を得、対応する位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、この結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算される。
【００３９】
「実質的な同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）の位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）の位置のウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を意味し、配列同一性の割合は、参照配列を、比較ウィンドウにわたり、合計が参照配列の２０％以下である欠失または付加を含み得る配列と比較することにより計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであってよい。「類似性」という用語は、ポリペプチドを説明するために使用される場合、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及び保存されたアミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「相同の」または「ホモログ」という用語は相互変換可能に使用され、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを説明するために使用される場合、２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはその指定された配列が、例えばＢＬＡＳＴ、ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．１４を用いて並列のためのデフォルトパラメータ（本明細書を参照のこと）で最適に並列され、比較された場合、適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失、またはアミノ酸挿入もしくは欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも７０％、通常ヌクレオチドの約７５％〜９９％、より好ましくは少なくとも約９８〜９９％で同一であることを示す。また、「ホモログ」または「相同の」という用語は、本明細書で使用される場合、構造及び／または機能についての相同性を指す。配列相同性について、配列は、それらが少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である場合、ホモログである。本発明の遺伝子またはペプチドのホモログの決定は、当業者が容易に確認することができる。
【００４１】
「実質的に相同の」という用語は、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である配列を指す。相同配列は、異なる種における同じ機能の遺伝子であってよい。本発明の遺伝子またはペプチドのホモログの決定は、当業者が容易に確認することができる。
【００４２】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブシーケンス整合が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性の割合を計算する。
【００４３】
比較のための配列の最適並列は、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３（１９７０））の相同性並列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−４８（１９８８））の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または視覚的検査により行うことができる。（一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと）。
【００４４】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性の対での並列を用いて一群の関連配列から多数の配列並列を創作し、配列同一性の割合を示す。また、それはこの並列を創作するために使用されたクラスタリング関係を示すツリーまたは系統樹をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．ＭｏＩ．Ｅｖｏｌ．２５：３５１−６０（１９８７））の進行性の並列法の簡約を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１−５３（１９８９））により説明される方法と同様である。プログラムは、それぞれが最長５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を、最大３００配列、並列することができる。多並列手技は、２つの最も類似する配列の対での並列で始まり、２つの並列された配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターを、次に最も関連する配列または並列された配列のクラスターと並列させる。２つの配列クラスターを、２つの個々の配列の対での並列の単純な拡張により並列させる。最終的な並列は、一連の進行性の対での並列により達成される。プログラムを、配列比較の領域について特異的配列及びそれらのアミノ酸またはヌクレオチド整合を指定することにより、及びプログラムパラメータを指定することにより実行する。例えば、以下のパラメータ、デフォルトギャップ加重値（３．００）、デフォルトギャップ長加重値（０．１０）、及び加重エンドギャップを用いて、参照配列を他の試験配列と比較し、配列同一性関係の割合を決定することができる。
【００４５】
配列同一性及び配列類似性の割合を決定するために好適なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））により説明されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。（また、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：３９８６−９０（１９９８）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎインターネットウェブサイトを通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと並列された場合、整合するまたはいくらかの正の値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、高いスコア付け配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、上記）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するシードとして働く。次いで、ワードヒットを、累積並列スコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方向に拡張させる。各方向へのワードヒットの拡張は、累積並列スコアがその最大達成値から数量Ｘ分落ちた場合、１つ以上の負のスコア付け残基並列の蓄積のために累積スコアが０以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、並列の感受性及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−９（１９９２）を参照のこと）並列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００４６】
配列同一性の割合を計算することに加えて、また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は、最小合計可能性（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の整合が偶然起こり得る可能性の表示を提供する。例えば、アミノ酸配列は、参照アミノ酸に対する試験アミノ酸の比較における最小合計可能性が約０．１未満、より典型的には約０．０１未満、最も典型的には約０．００１未満である場合、参照アミノ酸配列と類似するとみなされる。
【００４７】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸を、類似する構造的特性及び／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、またはトレオニンをセリンで置換することから生ずる。したがって、特定のアミノ酸配列の「保存的置換」は、ポリペプチド活性に重要でないアミノ酸の置換、または重要なアミノ酸の置換であってもペプチドの活性（すなわち、血液脳関門を通るペプチドの能力）を減少させないような、類似の特性（例えば酸性、塩基性、正または負に荷電、極性または非極性など）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、本分野で周知である。例えば、以下の６つの群は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（また、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、また、単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変える、付加する、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加は、その変化がペプチドの活性を減少させない場合、「保存的置換」とみなすことができる。挿入または欠失は、典型的に、約１〜５アミノ酸の範囲内である。保存的アミノ酸の選択は、ペプチド内の置換されるアミノ酸の場所、例えばアミノ酸がペプチドの外側にあり、溶媒に露出されるか、または内側にあり、溶媒に露出されないかに基づいて選択してよい。
【００４８】
ある特定の実施形態では、存在するアミノ酸の場所、すなわち、その溶媒への露出（すなわち、アミノ酸が、溶媒に露出されない内部に局在するアミノ酸と比較して溶媒に露出されるか、またはペプチドもしくはポリペプチドの外側表面に存在するか）に基づいて存在するアミノ酸を置換するであろうアミノ酸を選択することができる。このような保存的アミノ酸置換の選択は、本分野で周知であり、例えばＤｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７，７２１−７３９、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９（１９８６）；２０５−２１８、並びにＳ．Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｅｖｏｌ．１９（１９８３）１７１で開示される。したがって、タンパク質またはペプチドの外側のアミノ酸（すなわち、溶媒に露出されるアミノ酸）に好適な保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば以下の置換を使用することができるが、これらに限定されない。ＹのＦでの、ＴのＳまたはＫでの、ＰのＡでの、ＥのＤまたはＱでの、ＮのＤまたはＧでの、ＲのＫでの、ＧのＮまたはＡでの、ＴのＳまたはＫでの、ＤのＮまたはＥでの、ＩのＬまたはＶでの、ＦのＹでの、ＳのＴまたはＡでの、ＲのＫでの、ＧのＮまたはＡでの、ＫのＲでの、ＡのＳ、Ｋ、またはＰでの置換。
【００４９】
代替の実施形態では、また、タンパク質またはペプチドの内部のアミノ酸に好適な包含される保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、アミノ酸がタンパク質またはペプチドの内部に存在する（すなわち、アミノ酸が溶媒に露出されない）ために好適な保存的置換を使用することができ、例えば以下の保存的置換を使用することができるが、これらに限定されない。ＹがＦで、ＴがＡまたはＳで、ＩがＬまたはＶで、ＷがＹで、ＭがＬで、ＮがＤで、ＧがＡで、ＴがＡまたはＳで、ＤがＮで、ＩがＬまたはＶで、ＦがＹまたはＬで、ＳがＡまたはＴで、及びＡがＳ、Ｇ、Ｔ、またはＶで置換される。いくつかの実施形態では、また、非保存的アミノ酸置換は変異体という用語に包含される。
【００５０】
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばユビキチン化、標識化、ペグ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、脂質付加、糖鎖付加、または他の分子の付加などであるが、これらに限定されない技術により化学的に修飾されたポリペプチドを指す。また、分子は、それが通常はその分子の一部ではない追加の化学基を含有する場合、別の分子の「誘導体」である。このような基は、分子の可溶性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。あるいは、これらの基は、分子の毒性を減少させ、分子の任意の望ましくない副作用を除去し、または減ずることなどを可能にする。このような効果を仲介することができる基は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）で開示され、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５１】
「挿入」または「欠失」という用語は、典型的に、約１〜５アミノ酸の範囲内である。許容される変動は、組換えＤＮＡ技術を用いて配列中のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を系統的に作成しながらペプチドを合成的に生成することにより実験的に決定することができる。
【００５２】
「置換」という用語は、ペプチドについて言及する場合、アミノ酸の、異なる実体、例えば別のアミノ酸またはアミノ酸基への変化を指す。置換は保存的または非保存的置換であってよい。
【００５３】
「共有結合された」により、共有化学結合により直接的または間接的のいずれかで（例えばリンカーを通して）連結されることを意味する。
【００５４】
「融合タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上のタンパク質の組換えタンパク質を指す。融合タンパク質は、例えば１つのタンパク質をコードする核酸配列を別のタンパク質をコードする核酸に連結し、それらが細胞内で全ての意図されるタンパク質を有する単一のポリペプチドに翻訳され得る単一のオープンリーディングフレームを構成するようにすることにより生成することができる。タンパク質の配置の順序は変化してよい。融合タンパク質は、エピトープタグまたは半減期エクステンダを含んでよい。エピトープタグは、ビオチン、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｈｉｓ6、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、緑色蛍光タンパク質、Ｖ５エピトープタグ、ＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＡＵ１、ＡＵ５、及びアビジンを含む。半減期エクステンダは、Ｆｃドメイン及び血清アルブミンを含む。
【００５５】
「対象」及び「個体」及び「患者」という用語は本明細書で相互変換可能に使用され、動物、例えばヒトまたは非ヒト動物（例えば哺乳類）を指し、それらに、本明細書で開示される薬学的組成物での予防処置を含む治療が提供される。「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト及び非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳類」という用語は本明細書で相互変換可能に使用され、全ての脊椎動物、例えば哺乳類、例えば非ヒト霊長類（具体的には高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えばマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、及び非哺乳類、例えばニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は実験動物または疾患モデルとしての動物代替物である。
【００５６】
対象の疾患または状態「を治療すること」、または疾患または状態を有する患者「を治療すること」は、個体を医薬治療、例えば薬物投与に供し、疾患または状態の少なくとも１つの症状を減少させ、安定化させ、または予防するようにすることを指す。
【００５７】
「特異的に結合する」または「特異的結合」により、天然に本発明のポリペプチドを含む試料、例えば生物学的試料中で、所望のポリペプチドを認識し、結合するが、他の分子は実質的に認識せず、結合しない化合物または抗体を意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０-6Ｍ以下の解離定数により特徴付けることができる。他の実施形態では、解離定数は少なくとも約１×１０-7Ｍ、１×１０-8Ｍ、または１×１０-9Ｍである。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、本分野で周知であり、例えば平衡透析、表面プラスモン共鳴などを含む。
【００５８】
「読み取り」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の定性的または定量的測定を指す。ある特定の実施形態では、読み取りは定性的測定である。ある特定の実施形態では、読み取りは定量的測定である。
【００５９】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコル、及び試薬などに限定されず、それ自体変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００６０】
ＩＩ．融合タンパク質
一態様では、本開示は、増殖因子受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する第１ドメイン及び軟骨マトリックス成分に特異的に結合する第２ドメインを含む、融合タンパク質を提供する。
【００６１】
第１ドメインは、任意の所望の受容体（例えば増殖因子受容体）を標的にしてよい。ある特定の実施形態では、第１ドメインは、筋骨格疾患に関与している増殖因子受容体（例えばＩＧＦ−１受容体）を標的にする。第１ドメインは、増殖因子受容体の天然または人工リガンドを含んでよい。第１ドメインは、所望の場合、標的にされた増殖因子受容体の作動薬または拮抗薬であってよい。ある特定の実施形態では、第１ドメインは、ＩＧＦ−１受容体リガンド（例えばヒトＩＧＦ−１受容体リガンド）を含む。特定の一実施形態では、第１ドメインは、ヒトＩＧＦ−１配列を含む。特定の一実施形態では、第１ドメインは、Ｌｏｎｇ［Ｒ3］−ＩＧＦ−１配列（例えば配列番号１で示されるヒトＬｏｎｇ［Ｒ3］−ＩＧＦ−１配列）を含む。特定の一実施形態では、第１ドメインは、配列番号１で示されるヒトＬｏｎｇ［Ｒ3］−ＩＧＦ−１配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性（例えば少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性）を有するポリペプチドを含む。
【００６２】
第２のタイプのドメインは、ｓＧＡＧ（例えば硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸デルマタン、及び硫酸ケラタン）及び／またはコラーゲンもしくはヒアルロン酸を含むが、これらに限定されない任意の軟骨マトリックス成分を標的にしてよい。第２ドメインで使用され得る好適なｓＧＡＧ結合ドメインとして、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、プロリン−アルギニン富化末端ロイシン富化繰り返しタンパク質（ＰＲＥＬＰ）、コンドロアドヘリン、オンコスタチンＭ、コラーゲンＩＸ、ＢＭＰ−４、フィブロネクチン、ＲＡＮＤ１、ＲＡＮＤ２、ＲＡＮＤ３、ＲＡＮＤ４、ＲＡＮＤ５、ＲＡＮＤ６、ＡＫＫ１５、ＲＬＲ２２、Ｒ１Ｑ１７、ＳＥＫ２０、ＡＲＫ２４、ＡＫＫ２４、ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３、ＬＧＴ２５、Ｐｅｐ１８４、Ｐｅｐ１８６、Ｐｅｐ１８５、Ｐｅｐ２３９、Ｐｅｐ２４６、ＡＴＩＩＩ、またはＦｉｂＢｅｔａのｓＧＡＧ結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。第２ドメインで使用され得る好適なコラーゲン結合ドメインとして、トロンボスポンジン、マトリリン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質、ＰＲＥＬＰ、コンドロアドヘリン、フィブロモジュリン、デコリン、またはアスポリンのコラーゲン結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なｓＧＡＧ及びコラーゲン結合ドメインは本明細書の表１及び２で示される。
【００６３】
ある特定の実施形態では、第２ドメインは、第１ドメインのＮ末端に融合される。他の実施形態では、第２ドメインは、第１ドメインのＣ末端に融合される。融合タンパク質は、これらのドメイン間でさらにリンカーを含んでよい。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、軟骨マトリックス成分に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。２つ以上の軟骨マトリックス結合ドメインは、同じ結合ドメインを含んでよく、またはあるいは、それぞれ異なるタイプの軟骨マトリックス結合（すなわち、第２）ドメインを含んでもよい。
【００６４】
ある特定の実施形態では、第２ドメインは、配列番号２〜１３及び５４〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するｓＧＡＧ結合ドメインを含む（表１を参照のこと）。ある特定の実施形態では、第２ドメインは、配列番号２〜１３及び５４〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性（例えば少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性）を有するｓＧＡＧ結合ドメインを含む（表１を参照のこと）。
【００６５】
ある特定の実施形態では、第２ドメインは、配列番号１４〜１６及び２１〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコラーゲン結合ドメインを含む（表２を参照のこと）。ある特定の実施形態では、第２ドメインは、配列番号１４〜１６及び２１〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性（例えば少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性）を有するコラーゲン結合ドメインを含む（表２を参照のこと）。
【００６６】
ある特定の実施形態では、第１結合ドメインは、１０００ｎＭ未満（例えば１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．０００１ｎＭ未満）のＫｄで受容体（例えば増殖因子受容体）に結合する。より低いＫｄはより高い結合アフィニティに対応することに留意せよ。ある特定の実施形態では、第２結合ドメインは、１０００ｎＭ未満（例えば１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．０００１ｎＭ未満）のＫｄで軟骨マトリックス成分（例えばｓＧＡＧまたはコラーゲン）に結合する。
【００６７】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７〜２０、２８〜５３、７１〜８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む（表３を参照のこと）。特定の一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む。特定の一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７〜２０、２８〜５３、７１〜８７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性（例えば少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（表３を参照のこと）。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒスチジンタグを含む。本明細書で使用される場合、ヒスチジンタグまたは６×ヒスチジンタグは、融合タンパク質のｃ末端に融合された配列ＧＧＳＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号８９）を有するペプチドを含む。
【００６８】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、哺乳類の関節の関節内空間（例えば滑液）への注入後少なくとも８日間（例えば８日間、９日間、１０日間、１１日間、または１２日間）の期間、関節の軟骨組織内で保持されるので、上記期間で取られた軟骨組織の生検で検出可能なレベルの融合タンパク質を見ることができる。ある特定の実施形態では、軟骨組織で保持される融合タンパク質の検出可能なレベル（量）は、組織１ｇ当たり少なくとも約５（例えば約１０、２０、３０、４０、または５０）ｐｍｏｌであってよい。
【００６９】
ある特定の実施形態では、関節に投与した場合、本明細書で開示される融合タンパク質は、無害の対照タンパク質（例えば血清アルブミン）を注入した対応する対照関節の軟骨組織のｓＧＡＧ損失と比較した場合、関節軟骨組織からのｓＧＡＧ損失の減少をもたらす。ある特定の実施形態では、傷害関節に投与した場合、本明細書で開示される融合タンパク質は、無害の対照タンパク質を注入した傷害関節の軟骨組織のｓＧＡＧ生成と比較した場合、関節軟骨組織のｓＧＡＧ生成の増大をもたらす。ある特定の実施形態では、関節に投与した場合、本明細書で開示される融合タンパク質は、無害の対照タンパク質を注入した傷害関節の軟骨組織のｓＧＡＧ含有量と比較した場合、軟骨組織のｓＧＡＧ含有量の増大をもたらす。
【００７０】
【表１】
2016515587.tif 000003
【００７１】
「ＲＡＮＤ」は、本明細書で使用される場合、特異的パターンの正電荷を有する配列のランダムな創成を示す。上記タンパク質は、少なくとも例えばＭａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖ３４３，８８５（２０１４）、Ｔｉｌｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．ｖ２８４  Ｎｏ．４２（２００９）、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１，１２１９−１２２６（２００４）、Ｈｉｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２０：１５６−１６７，（１９９８）、及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ｖ８９，３０４０−３０４４（１９９２）で説明される。
【００７２】
【表２−１】
2016515587.tif 000004
【００７３】
【表２−２】
2016515587.tif 000005
【００７４】
【表２−３】
2016515587.tif 000006
【００７５】
【表３−１】
2016515587.tif 000007
【００７６】
【表３−２】
2016515587.tif 000008
【００７７】
【表３−３】
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【００７８】
【表３−４】
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【００７９】
【表３−５】
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【００８０】
【表３−６】
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【００８１】
【表３−７】
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【００８２】
【表３−８】
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【００８３】
【表３−９】
2016515587.tif 000015
【００８４】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つ以上のＤアミノ酸を含む、非天然アミノ酸を含む。Ｄアミノ酸含有ペプチドは、Ｌアミノ酸含有形態と比較してインビトロまたはインビボで安定性の増大を示す。したがって、Ｄアミノ酸を組み込むペプチドの構築は、より大きなインビボ安定性または細胞内安定性が所望され、または必要とされる場合、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄペプチドは内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して抵抗性であり、そのため連結された薬物及び抱合体のより優れた経口経上皮及び経皮送達、膜恒久的複合体（さらなる説明については以下を参照のこと）のバイオアベイラビリティの改善、並びに血管内及び組織内寿命の延長を、これらの特性が望ましい場合、提供する。また、Ｄ異性体ペプチドの使用は、連結された薬物及び他の積荷分子の経皮及び経口経上皮送達を向上させることができる。加えて、ＤペプチドはＴヘルパー細胞に対する主要な組織適合性複合体クラスＩＩ限定提示について効果的にプロセスされることができず、それゆえ生物全体で体液性免疫応答を誘発しにくい。それゆえ、ペプチド抱合体は、例えば細胞貫通ペプチド配列のＤ異性体形態、切断部位のＬ異性体形態、及び治療用ペプチドのＤ異性体形態を用いて構築することができる。
【００８５】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、レトロ−インベルソポリペプチドである。「レトロ−インベルソポリペプチド」は、少なくとも１つの位置でペプチド結合の方向の逆転、すなわち、アミノ酸の側鎖についてアミノ末端及びカルボキシ末端の逆転を有するポリペプチドを指す。したがって、レトロ−インベルソアナログは、逆転した末端及び逆転したペプチド結合方向を有するが、天然ペプチド配列と同様の側鎖のトポロジーをほぼ維持する。レトロ−インベルソペプチドは、Ｌアミノ酸もしくはＤアミノ酸、またはＬアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物であって最大でアミノ酸全てがＤ異性体である混合物を含有してよい。部分的なレトロ−インベルソペプチドアナログは、配列の部分のみが逆転され、エナンチオマーアミノ酸残基で置換されたポリペプチドである。このようなアナログのレトロ反転部分は逆転したアミノ末端及びカルボキシ末端を有するので、レトロ反転部分に隣接するアミノ酸残基は、それぞれ、側鎖に類似したα置換ジェミナル−ジアミノメタン及びマロン酸塩により置換される。細胞貫通ペプチドのレトロ−インベルソ形態は、天然形態と同じ程度に有効に膜を介して転位するように働くことが発見されている。レトロ−インベルソペプチドアナログの合成は、Ｂｏｎｅｌｌｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２４（６）：５５３−６（１９８４）、Ｖｅｒｄｉｎｉ，Ａ  ａｎｄ  Ｖｉｓｃｏｍｉ，Ｇ．Ｃ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１：６９７−７０１（１９８５）、及び米国特許第６，２６１，５６９号で説明され、これらの文献及び特許は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。部分的レトロ−インベルソペプチドアナログの固体相合成のプロセスは、ＥＰ  ９７９９４−Ｂで説明され、当該特許もまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換（例えば保存的アミノ酸置換）を含む。
【００８７】
ＩＩＩ．薬学的組成物
一態様では、本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質のうちの１つ以上及び１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００８８】
薬学的組成物は、従来の薬学的実施に従って調合してよい（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。当該文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本開示に記載される薬学的組成物は、投与に際して即座に、または投与後の任意の所定の時間もしくは期間に活性剤（例えば融合タンパク質）を放出するように調合される。後者のタイプの組成物は、一般的に制御放出調合物として知られ、（ｉ）延長された期間にわたり体内で本発明の剤（複数可）の実質的に一定の濃度を創作する調合物、（ｉｉ）所定のラグタイム後に延長された期間にわたり体内で本発明の剤（複数可）の実質的に一定の濃度を創作する調合物、（ｉｉｉ）体内で剤（複数可）の比較的一定の有効なレベルを維持し、同時に剤（複数可）の血漿レベルでの変動（鋸歯動態パターン）と関連付けられた所望されない副作用を最小化することにより、所定の期間中、剤（複数可）の活性を持続する調合物、（ｉｖ）剤（複数可）の活性を局在化させる調合物、例えば疾患組織または器官に隣接したまたはそれらの中での制御放出組成物の空間的設置、（ｖ）投与の便利、例えば組成物を１週間に１回、または２週間毎に１回投与することを達成する調合物、及び（ｖｉ）治療剤を特定の標的細胞タイプに送達するために担体または化学的誘導体を用いることにより剤（複数可）の活性を標的化する調合物を含む。
【００９０】
いくつかの策のうちのいずれでも、放出速度が問題の融合タンパク質の代謝速度を上回る制御放出を得るために従ってよい。ある特定の実施形態では、制御放出は、例えば様々なタイプの制御放出組成物及びコーティングを含む、様々な調合パラメータ及び成分の適切な選択により得られる。したがって、融合タンパク質は、適切な賦形剤を伴って薬学的組成物に調合され、これは投与に際して、制御された様式で融合タンパク質を放出する。例として、ハイドロゲル、カプセル組成物、油剤、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、分子複合体、ミクロスフィア、ナノ粒子、パッチ、リポソーム、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９１】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、生体適合性ハイドロゲルに調合される。関節に投与され、本明細書で開示される融合タンパク質の所望の放出プロファイルを達成することができる任意のハイドロゲルを使用することができる。ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、及びヘパリン様ドメインポリマーのうちの１つ以上を含む。
【００９２】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルはメチルセルロースを含む。例えば約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの任意の分子量のメチルセルロースを使用してよい。任意の量のメチルセルロースをハイドロゲル中で使用してよい。ある特定の実施形態では、メチルセルロースの量は、ハイドロゲルの約１〜約１０重量％である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルはＨＡ（例えばヒアルロン酸ナトリウム）を含む。例えば約１０ｋＤａ〜約１．８ＭＤａの任意の分子量のＨＡを使用してよい。任意の量のＨＡをハイドロゲル中で使用してよい。ある特定の実施形態では、ＨＡの量は、ハイドロゲルの約１〜約１０重量％である。
【００９４】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、硫酸コンドロイチン、硫酸ヘパラン、またはヘパリンを含む、ヘパリン様ドメインポリマーを含む。任意の量のヘパリン様ドメインポリマーをハイドロゲル中で使用してよい。ある特定の実施形態では、ヘパリン様ドメインポリマーの量は、ハイドロゲルの約０．０５重量％〜２重量％である。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、ある特定の温度を超えて（例えば３５℃を超えて）熱硬化性である。ある特定の実施形態では、ハイドロゲルは、ある特定の温度未満で（例えば３５℃未満で）流体またはずり減粘である。
【００９６】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で開示されるハイドロゲル１ｇ当たり約１〜約１０００μｇの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で開示されるハイドロゲル１ｇ当たり約１００〜約１０，０００μｇの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、ハイドロゲルはグルココルチコイドをさらに含む。
【００９７】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質及びグルココルチコイドを含む、組成物（例えば薬学的組成物）を提供する。好適なグルココルチコイドとして、アルクロメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、シクレソニド、コルチゾール、コルチスポリン、コルチバゾール、デフラザコート、デキサメタゾン、フルドロキシコルチド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルチカゾン、ヘキスアセトンヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、プレグナジエン、プレグナトリエン、プレグネン、プロクトセディル、リメキソロン、テトラヒドロコルチコステロン、トリアムシノロン、及びウロベタゾールが挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物は、このような化合物の任意の及び全ての薬理学的に許容される塩、水和物、及びエステルの形態であってよく、それは酢酸塩（二酢酸塩を含む）、アセトニド（ヘキスアセトニドを含む）、フランカルボン酸塩、リン酸塩、及びプロピオン酸塩（二プロピオン酸塩を含む）。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、エステル結合を介して脂肪酸（例えばパルミチン酸）に抱合される。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、リポソームまたは多層状小胞などの、ミクロ粒子担体中に含有される。リポソームミクロ粒子は高融点（Ｔm）脂質、例えばＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＨＳＰＣを含んでよい。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、リポソームミクロ粒子中に含有され、リポソーム脂質の０．１〜２０モル％で存在する。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドはリポソームミクロ粒子中に含有され、リポソーム脂質はハイドロゲルの０．０１重量％〜１０重量％である。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、薬学的組成物（例えばハイドロゲル）が関節内に注入された場合、軟骨マトリックス合成を刺激する、もしくは細胞生存を刺激する、または軟骨マトリックス分解を予防する、もしくは細胞死を予防するのに十分な濃度でハイドロゲル中に存在する。ある特定の実施形態では、グルココルチコイドは、ハイドロゲル１ｇ当たり１〜１０００μｇの濃度で存在する。
【００９８】
ある特定の実施形態では、関節の関節内空間（例えば滑液）への組成物の注入後、関節の軟骨マトリックス合成または分解の読み取りは、融合タンパク質または融合タンパク質とグルココルチコイド単独との組み合わせの注入後の読み取りに優る改善を示す。
【００９９】
ある特定の実施形態では、関節の関節内空間（例えば滑液）への組成物の注入後、グルココルチコイドは、少なくとも約８日間（例えば９、１０、１１、または１２日間）の半減期で関節内に存在する。
【０１００】
ある特定の実施形態では、関節の関節内空間（例えば滑液）への組成物の注入後、融合タンパク質は、融合タンパク質またはグルココルチコイドのいずれかが単独で注入された場合より長い時間、関節の関節内空間に保持される。
【０１０１】
ＩＶ．治療方法
一態様では、本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質及び薬学的組成物を対象に投与することによる、筋骨格状態（例えば骨関節炎）を治療する方法を提供する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本開示は、治療的に有効な量の本明細書で開示される融合タンパク質またはその薬学的組成物を対象の関節腔に投与することを含む、筋骨格状態の治療方法を提供する。好適な筋骨格状態として、骨関節炎、１つ以上の軟骨欠損、リウマチ性関節炎、傷害後軟骨分解、急性炎症性関節炎、感染性関節炎、骨粗しょう症、または他の薬理的介入からの副作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本明細書で説明される治療方法は、筋骨格状態を患う対象の選択をさらに含む。このような選択は、いくつかの使用可能な方法、例えば本明細書で説明される症状の査定により熟練した実施者により行われる。
【０１０４】
治療の成功は筋骨格状態の１つ以上の症状の寛解により証明される。本明細書で開示される融合タンパク質を必要とする対象に投与することは、筋骨格疾患の発展を予防する、または遅らせると期待される。「予防」という用語は、対象が予防される特定の状態をまだ有しない状況を指すために使用され、この特定の状態が任意の認識できる形態で現れていないことを意味する。予防は、症状の開始及び／または重症度の予防または遅れを包含する（対象が既に別の状態の１つ以上の症状を有する場合を含む）。予防は、一般的に状態の発展または身体的機能障害の危険性のある対象で行われる。このような対象は予防の必要があると言われる。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本明細書で説明される予防方法は、筋骨格状態の危険性のある対象の選択をさらに含み、その後、この対象に融合タンパク質を投与して、これにより筋骨格状態を予防する。このような選択は、いくつかの使用可能な方法により熟練した実施者により行われる。例えば、状態もしくは機能障害を引き起こすことが知られる疾患の危険因子もしくは診断、または状態を引き起こすことが知られる処置または治療の査定。疾患もしくは傷害、または状態に寄与することが知られる関連する家族歴を有する対象は一般的に、危険性が高いと考えられる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」または「治療すること」という用語は、治療的処置及び予防的（すなわち妨害的）測定の両方を指し、目的は疾患の発展を予防する、または遅らせること、例えば筋骨格状態の少なくとも１つの影響または症状を減少させることである。治療は一般的に、その用語が本明細書で定義されるとおり、１つ以上の症状または臨床マーカーが減少された場合、「有効」である。あるいは、治療は、筋骨格状態の進行が減少され、または停止された場合、「有効」である。すなわち、「治療」は症状またはマーカーの改善だけでなく、治療を行わない場合に予想されるであろう症状の進行または悪化の中止、少なくとも遅れも含む。有益なまたは所望の臨床結果として、検出可能か検出不可能かに関わらず、１つ以上の症状（複数可）の軽減、疾患の程度の縮減、疾患の安定化（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または遅れ、疾患状態の寛解または緩和、及び緩解（部分的か全体的かに関わらず）が挙げられるが、これらに限定されない。また、「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較した生存の延長を意味してよい。
【０１０７】
「有効な量」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を減少させる、本明細書で開示される１つ以上の融合タンパク質を含む薬学的組成物の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な薬理的組成物の量に関連する。「治療的に有効な量」という句は、本明細書で使用される場合、任意の医療的治療に適用できる妥当な利益／危険性の割合で障害を治療するのに十分な組成物の量を意味する。「治療的に有効な量」という用語は、それゆえ、筋骨格状態と関連付けられた症状または臨床マーカーの治療的または予防的に顕著な減少に影響するのに十分な、本明細書で開示される組成物の量を指す。
【０１０８】
症状の治療的または予防的に顕著な減少は、対照または非治療対象と比較して測定パラメータにおいて例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％以上である。測定された、または測定可能なパラメータは、臨床的に検出可能な疾患マーカー、例えば生物学的マーカーレベルの上昇または下落、及び疾患または障害の症状またはマーカーの臨床的に許容されるスケールと関連するパラメータを含む。しかしながら、本明細書で開示される組成物及び調合物の全体的な日々の使用は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医により決定されるであろう。必要とされる正確な量は、治療される疾患のタイプなどの要素により変化するであろう。
【０１０９】
筋骨格状態を有する対象の治療について、「治療的に有効な量」という用語は、安全、かつ患者における発展を予防または遅延させ、筋骨格状態をさらに減少させるのに十分な量を指す。したがって、この量は、筋骨格状態の少なくとも１つの症状を治すまたはその減少を引き起こすことができる。疾患の治療のために有効な量は、疾患のタイプ、治療される種、対象の年齢及び一般的状態、投与様式などによる。したがって、正確な「有効な量」を特定することは不可能である。しかしながら、任意の所与の場合について、適切な「有効な量」は、ルーチン実験のみを用いて当業者により決定することができる。治療の有効性は、通常の熟練した実施者が判断してよく、例えば有効性は筋骨格疾患の動物モデルで査定することができる。実験動物モデルを用いる場合、治療の有効性は、治療していない動物に対する筋骨格疾患の症状の減少が示される場合、証明される。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「投与すること」及び「導入すること」という用語は本明細書で相互変換可能に使用され、所望の部位への剤（複数可）の送達をもたらす方法または経路による対象への１つ以上の融合タンパク質などの治療剤の設置を指す。融合タンパク質は、対象で有効な治療をもたらす任意の適切な経路により投与することができる。
【０１１１】
本明細書で開示される１つ以上の融合タンパク質またはその組成物は、本分野で既知のまたは本明細書で説明される任意の経路、例えば経口、非経口（例えば静脈内または筋内）、腹腔内、直腸、皮膚、鼻、膣、吸入、皮膚（パッチ）、または眼により投与してよい。ある特定の実施形態では、融合タンパク質またはその組成物は、直接的な関節内注入により投与される。本明細書で開示される融合タンパク質または組成物は、任意の用量または投与レジメンで投与してよい。
【０１１２】
融合タンパク質または組成物は単一の用量で、または多数の用量で、患者に投与してよい。多数の用量が投与される場合、これらの用量は、例えば１時間、３時間、６時間、８時間、１日間、２日間、１週間、２週間、または１ヶ月間、互いに離れてよい。例えば、本明細書で開示される融合タンパク質または組成物は、例えば２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０週間以上の間、投与してよい。任意の特定の対象について、特異的な投与量レジメンは、個人の要求、及び組成物を投与するまたは組成物の投与を監督する人物の専門的判断に従って、時間にわたり調節されるべきであることを理解されたい。例えば、本明細書で開示される融合タンパク質または組成物の投与量は、より低い用量が十分な治療活性を提供しない場合、増大させてよい。
【０１１３】
最終的には主治医が適切な量及び投与量レジメンを決定するであろうが、融合タンパク質の治療的に有効な量は、０．０００１、０．０１、０．０１、０．１、１、５、１０、２５、５０、１００、５００、または１，０００ｍｇ／ｋｇの用量で提供され得る。有効な用量は、インビトロまたは動物モデルの試験バイオアッセイまたはシステムに由来する用量応答曲線から推定してよい。
【０１１４】
特定の患者または対象のための投与量は、従来の検討を用いて（例えば適切な従来の薬理的プロトコルの手段により）当業者により決定することができる。医師は、例えば最初に比較的低い用量を処方し、続いて適切な応答が得られるまで用量を増大してよい。患者に投与される用量は、適用により、時間にわたり患者で有益な治療応答に影響を与えるのに、または例えば症状を減少させるのに、または他の適切な活性に十分である。用量は特定の調合物の有効性、及び融合タンパク質の活性、安定性、または半減期、及び患者の状態、並びに治療される患者の体重または表面積により決定される。また、用量サイズは、特定の対象での特定のベクター、調合物などの投与に付随する任意の悪い副作用の存在、性質、及び程度により決定される。治療組成物は、任意選択で、本分野で周知の方法に従って、有効性、組織代謝を確認するために、及び投与量を見積もるために、１つ以上の適切なインビトロ及び／またはインビボ動物の疾患モデル、例えば筋骨格疾患のモデルで試験される。具体的には、投与量は最初に、関連するアッセイでの、治療対非治療（例えば治療した細胞または動物モデル対治療していない細胞または動物モデルの比較）の活性、安定性、または他の好適な測定により決定することができる。調合物は、関連する調合物のＬＤ５０、及び／または融合タンパク質の任意の副作用の観察により決定される速度で投与される。投与は単一用量または分割用量で達成してよい。
【０１１５】
疾患の治療または予防で投与される融合タンパク質の有効な量の決定では、医師は循環血漿レベル、調合物毒性、及び疾患の進行を評価する。
【０１１６】
化合物の有効性及び毒性、例えばＥＤ５０（その用量が集団の５０％で有効である）及びＬＤ５０（その用量が集団の５０％で致死的である）は、細胞培養物または実験動物で標準の薬学手技により決定することができる。毒性対治療効果の用量割合は治療指標であり、それは割合、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指標を示す薬学的組成物は好ましい。
【０１１７】
本開示の薬学的組成物の活性成分の実際の投与量レベルは、対象にとって毒性であることなく、特定の対象、組成物、及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化させてよい。
【０１１８】
選択された投与量レベルは、使用される特定の融合タンパク質の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康、及び以前の治療歴、並びに医療分野で周知のこのような要素を含む、様々な要素によるであろう。
【０１１９】
Ｖ．他の実施形態
上記の説明から、本明細書で説明される本発明を様々な使用及び状態に採用するために、変形及び改変が本発明になされ得ることが明らかであろう。また、このような実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【０１２０】
また、本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質を提供するための標識を付された容器である製造物品を企図する。製造物品は、包装材料及びその包装材料内に含有される本明細書で開示される融合タンパク質の薬理剤を含む。
【０１２１】
製造物品中の薬理剤は、本明細書で開示される融合タンパク質を提供するために好適な任意の組成物である。したがって、組成物は、本明細書で開示される１つ以上のポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体、あるいはこのようなペプチドを発現することができるＤＮＡ分子を含んでよい。
【０１２２】
製造物品は、単一の投与量または多数の投与量のいずれかで、本明細書で示される状態の治療での使用に十分な薬理剤の量を含有する。包装材料は、その中に含有される薬理剤の使用を示す標識を含む。
【０１２３】
標識は、市販に必要とされ得るような使用及び関連情報についての教示をさらに含んでよい。包装材料は、薬理剤の保存のための容器（複数可）を含んでよい。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、包装材料という用語は、薬理剤を固定された手段の内部に保持することができるガラス、プラスティック、紙、ホイルなどの材料を指す。したがって、例えば、包装材料は、薬理剤を含有するために使用されるプラスティックまたはガラスバイアル、積層化外皮、及びこのような容器であってよい。
【０１２５】
好ましい実施形態では、包装材料は、製造物品の内容物及びその中に含有される薬理剤の使用を説明する実体表現である標識を含む。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、本開示の範囲を限定するとは解釈されるべきでない。
実施例１：タンパク質発現及び精製の方法
２９３Ｆ細胞で一過性にタンパク質を生成するための方法
所望のタンパク質配列をコードする核酸を標準の組換えＤＮＡ技術を用いてｐＣｅｐ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。クローニングしたベクターを、形質転換したＮＥＢ５−αコンピテント大腸菌（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１ＬのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ中で、アンピシリン選択で一晩、３７℃で、２０００ｒｐｍで振とうしながら増殖させることにより増幅する。細胞を５０００ｇで２０分間スピンさせることにより回収し、ベクターＤＮＡをＱＩＡｆｉｌｔｅｒ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細菌ペレットから抽出する。２９３Ｆ細胞培養培地を２０ｍＬの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（供給源不明）及び１０ｍＬの１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を１ＬのＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に添加することにより調製する。一過性のトランスフェクションのために、１Ｌの２９３Ｆ細胞を３７℃及び５％ＣＯ2で１５０万〜２００万／ｍＬの密度まで増殖させる。１ｍｇの全タンパク質及び２．５ｍＬのポリエチレンイミン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＬの細胞培養培地中で混合し、ボルテックスし、１５分間のインキュベーション後に細胞に添加する。トランスフェクトされた細胞にペプトン（０．２２μｍフィルターを通して滅菌したＦ１７培地中の２０％  ｗ／ｖストック溶液）をトランスフェクト２４及び７２時間後に供給し、０．５％の最終濃度にした。細胞生存率が８０％未満に落ちた（一般的に１週間）後、細胞を４０００ｇで２０分間の遠心分離により回収する。得られる上清を、０．２２μｍフィルターを通してろ過する。
【０１２７】
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯプールからタンパク質を生成する方法
ＤＮＡ２．０で合成される所望のタンパク質配列をコードする核酸を、標準の組換えＤＮＡ技術を用いてｐＭＰ１０Ｋ（社内所有ベクター）にクローニングする。クローニングしたベクターを１０ｍＬ  Ｌｕｒｉａ  ｂｒｏｔｈ中で、アンピシリン選択で一晩、３７℃で、２０００ｒｐｍで振とうしながら増幅させる。ベクターＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細菌から抽出する。懸濁液に適合させたＣＨＯ  Ｋ１細胞を整流振とうフラスコ中のＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ血清非含有培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））中で３７℃、５％ＣＯ2で２００万／ｍＬ以下の密度まで増殖させる。トランスフェクション当日に、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ血清非含有培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））中に再懸濁して８０，０００細胞／ｍＬの密度にし、５００μＬの細胞を２４ウェル組織培養プレート中に分配する（１トランスフェクション当たり１ウェル）。次いで、細胞を、２．７５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて、１０ｎｇの選択可能なｐＮｅｏベクター（ネオマイシン選択マーカーを有する）を含む、１μｇのトータルＤＮＡでトランスフェクトする。トランスフェクト３時間後、１０％ＦＢＳで補完した１ｍＬのＨＡＭＳ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））培地を添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ内で４８時間回復させる。次いで、細胞培地を０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を含むＨＡＭＳ−Ｆ１２で置換し、細胞を選択下で４日間インキュベートする。培地を、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を含むＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯで置換し、細胞を、コロニーが形成し、全ての非トランスフェクト細胞が死滅するまで２〜３週間インキュベートする。次いで、選択されたトランスフェクト細胞を、２５ｍＬの０．３×１０6細胞／ｍＬで１２５ｍＬ振とうフラスコを接種するために十分な細胞が得られるまで、２５ｍＬフラスコに拡張する。細胞拡張を、所望の体積に達するまで０．３×１０6細胞／ｍＬでの接種で続ける。細胞密度が５×１０6細胞／ｍｌを超える密度に達したとき、Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を全体積の１０％で添加する。細胞を、生存率が６０％未満に落ちたとき、６０００ｇでの遠心分離により回収する。上清をＡｃｒｏＰａｋ（商標）１０００  ０．８／０．２μｍ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通してろ過する。
【０１２８】
ニッケル荷電樹脂上でのタンパク質精製
６×ヒスチジンタグ付きタンパク質をＡＫＴＡ（商標）ＦＰＬＣ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製する。５ｍＭイミダゾール及び５００ｍＭのＮａＣｌを、精製するべきタンパク質を含有する、ろ過した上清に添加する。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））ニッケル荷電樹脂の詰めたての２５ｍＬカラム（１．６ｃｍ内径）を、提供される走行緩衝液（ＰＢＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．４）で平衡化する。上清をカラム上に１０ｍＬ／分でロードする。カラムをカラム体積の６倍のＰＢＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄する。結合したタンパク質を３００ｍＭイミダゾールでカラムから溶離する。タンパク質を含有する画分を引き取り、ＰＢＳ中で一晩透析する。
【０１２９】
ＩＧＦ（ＬＲ３）−ＰＲＥＬＰのタンパク質精製
ＩＧＦ（ＬＲ３）−ＰＲＥＬＰを２つのクロマトグラフィーステップ、陽イオン交換及び陰イオン交換を用いて、０．２μＭの、ろ過した上清から精製する。第１のクロマトグラフィーステップでは、ＳＰＦＦ（商標）陽イオン交換カラム（内径１．６ｃｍ、床高１０ｃｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化する。ろ過した上清を蒸留水で、１：１で希釈し、陽イオン交換カラムにロードする。結合した物質を０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、ステップ勾配（１×ＰＢＳ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて溶離する。全てのクロマトグラフィーステップを５００ｃｍ／時間の流速で行う。タンパク質を含有する溶離した画分を集め、１０ｍＳ／ｃｍのコンダクタンスになるまで蒸留水で希釈し、ｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅで８．０に調節する。
【０１３０】
第２のクロマトグラフィーステップでは、ＱＳＦＦ（商標）陰イオン交換カラム（内径１．６ｃｍ、床高１０ｃｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．５×ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で平衡化する。陽イオン交換プール（ｐＨ及びコンダクタンスを調節した）を３００ｃｍ／時間の流速で陰イオン交換カラムにロードする。素通り画分を回収し、濃縮し、２×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析する。
【０１３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
タンパク質を還元状態及び非還元状態で４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））での染色により可視化する。ゲルを水中で１分間、次いで染色液中で２分間電子レンジにかけ、染色プロセスを促進する。ゲルを、水中で２分間電子レンジにかけることにより脱染色する。この方法を、精製タンパク質が正しいサイズであるかどうか、及びそれが純粋であるかどうかを決定するために使用する。
【０１３２】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をタンパク質の純度及びモノマー状態を査定するために使用する。５０μｇのタンパク質を、４５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液中でＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（内径４．６ｍｍ×３０ｃｍ）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に０．３５ｍＬ／分で注入する。全ての測定を、オートサンプラー、二元ポンプ、及びダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ上で行う。データをＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析する。
【０１３３】
実施例２：硫酸ヘパラン及び硫酸コンドロイチンへの融合タンパク質の結合
多糖類硫酸ヘパラン及び硫酸コンドロイチンへの融合タンパク質の結合特異性を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされた多糖類に結合するタンパク質の能力を測定することにより決定してよい。ヘパリン結合プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５０μｌの２〜１０μｇ／ｍＬの濃度の硫酸ヘパランまたは硫酸コンドロイチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））でコーティングし、室温で一晩インキュベートする。プレートをＰＢＳで洗浄し、２５０μｌのＰＢＳ中の０．２％ゼラチンで、３７℃で１時間ブロッキングする。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄し、軽くたたいて乾かす。連続希釈したタンパク質５０μｌをウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートする。タンパク質連続希釈物は１００ｎＭから開始し、ＰＢＳ、０．２％ゼラチン中の１０個の追加の３倍希釈物及び１個のブランク（ＰＢＳ、０．２％ゼラチンのみ）を含む。プレートをＰＢＳ中で洗浄した後、ＰＢＳＴ中で１：２５０の５０μｌの抗ヒトＩＧＦ−１（Ａｂｃａｍ）を添加し、プレートを室温で回転させながら１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴ中の１００μｌの１：１０００抗ウサギ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１００μｌ  ＴＭＢ基質と共に室温で５〜１０分間インキュベートし、反応を１００μｌの停止溶液を添加することにより停止させる。吸収を４５０ｎｍで測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析する。
【０１３４】
上記の方法を２つの融合タンパク質、ＧＦ−Ｆｕｓ３（６×ヒスチジンタグ付き）及びＧＦ−Ｆｕｓ４（６×ヒスチジンタグ付き）の特異性を決定するために使用した。融合した結合ドメインを有しないＧＦ−Ｆｕｓ１（６×ヒスチジンタグ付き）を負の対照として使用した。図１で示されるように、ＧＦ−Ｆｕｓ３は硫酸ヘパラン（図１Ａ）及び硫酸コンドロイチン（図１Ｂ）でコーティングしたプレートに結合したが、一方、ＧＦ−Ｆｕｓ４は結合しなかった。
【０１３５】
実施例３：コラーゲンＩＩへの融合タンパク質の結合
ＩＩ型コラーゲンに対するタンパク質の特異性を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたコラーゲンに結合するタンパク質の能力を測定することにより決定してよい。Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（登録商標）９６ウェルプレートを、１倍の供給された緩衝液で、１００μｌのＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）で、４℃で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、１００μｌのタンパク質非含有ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、室温で１時間ブロッキングする。次いで、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、軽くたたいて乾かす。連続希釈したタンパク質５０μＬをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。タンパク質連続希釈物は１００μＭから開始し、ＰＢＳ中の１０個の追加の３倍希釈物及び１個のブランク（ＰＢＳ）を含む。プレートをＰＢＳ中で洗浄した後、ＰＢＳＴ中で１：２５０の５０μＬの抗ヒトＩＧＦ−１（Ａｂｃａｍ）を添加し、プレートを室温で回転しながら１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴ中の１００μＬの１：１０００抗ウサギ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に室温で１時間置く。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬ  ＴＭＢ基質と共に室温で５〜１０分間インキュベートし、反応を１００μＬの停止溶液を添加することにより停止させる。吸収を４５０ｎｍで測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を用いて分析する。
【０１３６】
２つの予測されたＩＩ型コラーゲン結合融合タンパク質、ＧＦ−Ｆｕｓ５（６×ヒスチジンタグ付き）及びＧＦ−Ｆｕｓ６（６×ヒスチジンタグ付き）の結合を上記で説明するように測定した。図２で示されるように、ＧＦ−Ｆｕｓ５及びＧＦ−Ｆｕｓ６の両方はＩＩ型コラーゲンに結合し、ＧＦ−Ｆｕｓ６はより強く結合した。
【０１３７】
実施例４：高密度培養物中の融合タンパク質で刺激した初代ウシ軟骨細胞によるＡＫＴリン酸化の刺激
ＩＧＦ−１及び軟骨マトリックス結合ドメインを含む融合タンパク質を上記に説明されるように調製した。６種の融合タンパク質、ＧＦ−Ｆｕｓ１（６×ヒスチジンタグ付き）、ＧＦ−Ｆｕｓ２（６×ヒスチジンタグ付き）、ＧＦ−Ｆｕｓ３（６×ヒスチジンタグ付き）、ＧＦ−Ｆｕｓ４（６×ヒスチジンタグ付き）、ＧＦ−Ｆｕｓ５（６×ヒスチジンタグ付き）、及びＧＦ−Ｆｕｓ６（６×ヒスチジンタグ付き）を調製した。融合タンパク質の増殖因子部分が融合タンパク質中で活性であることを確認するために、各構築物を、ＡＫＴリン酸化を刺激するその能力について試験した。野生型ＩＧＦ−１（ｗｔＩＧＦ）を対照として含めた。ウシ軟骨細胞をある範囲の用量の各融合タンパク質で刺激し、ｐＡＫＴレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１３８】
軟骨細胞単離及びリガンド刺激
ウシ軟骨細胞を２〜４週齢の子ウシの大腿骨コンジルから単離する。膝関節を、大腿骨を囲む全ての組織を除去し、骨のこぎりまたは弓のこで大腿骨骨頭を除去し、組織バイス中に締結することにより準備する。関節を無菌的に開放し、膝蓋骨、脛骨、及び腓骨を除去する。メスを用いて、軟骨を大腿骨コンジルからスライスし、ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）（１×、Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）中に入れる。続いて、ＰＢＳを除去し、高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１１９６５−０９２）、ウシ胎児血清（１０％  ｖ／ｖ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１６１４００７１）、ＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ  １５６３０−０８０）、非必須アミノ酸（１×、Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４５）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１×、Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）、プロリン（４００μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ５６０７−２５６）、プロテアーゼＸＩＶタイプ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ５１４７）からなるプロナーゼ溶液（組織５ｇ当たり５０ｍＬ）を撹拌しながら１時間添加する。滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で２回すすいだ後、高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１１９６５−０９２）、ウシ胎児血清（１０％  ｖ／ｖ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１６１４００７１）、ＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ  １５６３０−０８０）、ＮＥＡＡ（１×、Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４５）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１×、Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）、０．２５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１  ２４９  ００２  ００１）からなるコラゲナーゼ溶液（組織５ｇ当たり５０ｍＬ）を撹拌しながら１８時間添加する。細胞を株化し、洗浄し、ウシ胎児血清（１０％  ｖ／ｖ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１６１４００７１）を含む軟骨細胞培養培地（低グルコースＤＭＥＭ（１×  Ｇｉｂｃｏ  １１８８５−０８４）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１×、Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）、非必須アミノ酸（１×、Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４５）、及びＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ  １５６３０−０８０））中に再懸濁する。
【０１３９】
リガンド刺激のために、軟骨細胞を、ウシ胎児血清（１０％  ｖ／ｖ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１６１４００７１）を含む１００μＬの軟骨細胞培養培地を含む９６ウェル組織培養プレートに２００，０００細胞／ウェルで接種した。あるいは、ＢＸＰＣ−３細胞、膵臓腺癌細胞系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６８７（商標））を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１×、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）１５１４０−１２２）、ウシ胎児血清（１０％  ｖ／ｖ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１６１４００７１）を含む１００μＬのＢＸＰＣ−３培地（ＲＰＭＩ−１６４０、例えばＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００１（商標））を含む９６ウェル組織培養プレートに３０，０００細胞／ウェルで接種した。２４時間後、軟骨細胞及びＢＸＰＣ−３細胞の両方を１ウェル当たり１００μＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）ですすぎ、１００μｌの軟骨細胞またはＢＸＰＣ−３培養培地（ウシ胎児血清を含まない）を対応する細胞種に添加した。追加の２４時間後、細胞を、表４に列挙される濃度より５倍高い濃度の２５μＬの融合タンパク質を既にウェル内にある１００μＬの培地に添加することにより、表４に示される用量の融合タンパク質で刺激した。１０分間の刺激後、融合タンパク質を除去し、ウェルを氷冷ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中ですすいだ。５０μＬ／ウェルの細胞抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＦＮＮ００１１）を添加し、４℃で３０分間振とうしながらインキュベートした。次いで、可溶化物を−８０℃で凍結した。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
ＥＬＩＳＡによるｐＡＫＴの定量化
Ｃｏｒｎｉｎｇ高結合３８４ウェル黒色ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号３５７７）を、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中の３０μＬの４μｇ／ｍＬの捕獲抗体（抗−ＡＫＴ１全捕獲抗体、Ｕｐｓｔａｔｅ、カタログ番号０５−５９１ＭＧ）で、室温で１６時間コーティングし、洗浄し、１ウェル当たり５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中の２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３２９４）で、室温で１時間ブロッキングする。２０μＬの融解した可溶化物または組換えｐＡＫＴ標準（４００ｎｇ組換えヒトＡＫＴの１０個の２倍連続希釈物、５０％  ｖ／ｖ細胞抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＦＮＮ００１１）、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３２９４）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で活性（Ｕｐｓｔａｔｅ、カタログ番号１４−２７６））をコーティングしたプレートに適用し、室温で２時間インキュベートする。１００μＬ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した後、結合したホスホ−ＡＫＴを、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（５８７Ｆ１１）−ビオチン標識（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号５１０２）、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹ９９８、部分番号８９０８０３）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  ＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号３７０６９）を用いて、４２５ｎｍでの光放射を検出するためにルミノメータを用いて検出する。
【０１４２】
結果
図３Ａで示されるように、ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ２、及びＧＦ−Ｆｕｓ３は野生型ＩＧＦと同様の程度までＡＫＴのリン酸化を刺激した。得られたＥＣ50値（表５Ａで示される）は、融合タンパク質がこのアッセイで野生型ＩＧＦと機能的に同等であることを示す。図３Ｂで、ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ３、ＧＦ−Ｆｕｓ４、ＧＦ−Ｆｕｓ５、及びＧＦ−Ｆｕｓ６は野生型ＩＧＦと同様の程度までＡＫＴのリン酸化を刺激した。得られたＥＣ50値（表５Ｂで示される）は、融合タンパク質がこのアッセイで野生型ＩＧＦと機能的に同等であることを示す。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
実施例５：ウシ軟骨外植片を用いたインビトロ関節疾患モデル洗い流し実験におけるＧＦ−Ｆｕｓ３及びＧＦ−Ｆｕｓ２の持続される活性
ＰＲＥＬＰからのヘパリン結合ドメインを含有する融合タンパク質のマトリックス結合アーム及び増殖因子アーム両方の活性を、以下に示されるようにウシ軟骨外植片を用いたインビトロ関節疾患モデル洗い流し実験で査定した。
【０１４５】
方法
ウシ軟骨外植片（直径３ｍｍ、厚さ１．２ｍｍ）を２〜４週齢の子ウシの大腿膝蓋骨の溝から回収する。膝関節を、大腿骨を囲む全ての組織を除去し、骨のこぎりまたは弓のこで大腿骨骨頭を除去し、組織バイス中に締結することにより準備する。関節を無菌的に開放し、膝蓋骨、脛骨、及び腓骨を除去する。直径３ｍｍの使い捨て生検パンチを用いて、約８０×直径３ｍｍの全厚みの軟骨コアを大腿膝蓋骨の溝からパンチで取る。滅菌ナイフを用いて、軟骨と骨の接点でこのコアをスライスする。次いで、コアを、厚み１．２ｍｍの滅菌ステンレス鋼プレート中の直径３ｍｍの穴に挿入し、滅菌カミソリ刃を用いてプレートと共に一気にスライスし、超過のコア長を除去し、表面区域の軟骨が無傷の直径３ｍｍ、厚み１．２ｍｍの軟骨外植片を得る。
【０１４６】
外植片を、９６ウェルプレート中で、低グルコースＤＭＥＭ（１×  Ｇｉｂｃｏ  １１８８５−０８４）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１×、Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）、アスコルビン酸（２０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａ４４０３）、プロリン（４００μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ５６０７−２５６）、非必須アミノ酸（１×、Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４５）、及びＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ  １５６３０−０８０）からなる３００μＬの培地中で培養する。３頭の動物からの外植片（動物当たりｎ＝２〜３）を各処理条件で使用し、全部で条件当たり８〜９の外植片の数になる。培地を２日毎に交換する。６及び１０日目に、培地を、５μＣｉ／ｍＬの35Ｓ−硫酸ナトリウム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＸ０４１Ｈ００１ＭＣ、１ｍＣｉ）で補完する。
【０１４７】
８及び１２日目で時点を取る。外植片組織をＰＢＳ中の１ｍＭ非標識硫酸ナトリウム中で４回、各３０分間（全体で２時間）洗浄する。各外植片を湿潤計量し、消化まで−２０℃で凍結する。組織消化をプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号３１１５８７９００１）で行い、各外植片を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１ｍＭ塩化カルシウムｐＨ＝８．０緩衝液中の１ｍＬの１００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ中で、６０℃で一晩消化する。ｓＧＡＧ含有量及びＤＮＡ含有量の測定を、Ｈｏｅｍａｎｎ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．；ｐ．１２７−５２で示されるアッセイ法などの標準のアッセイ法を用いて行う。消化済み軟骨外植片の35Ｓ−硫酸塩含有量を、２０μＬの消化物を２５０μＬのシンチレーション流体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号１２００−４３９）と混合し、ＷＡＬＬＡＣ  １４５０  ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ  ＴＲＩＬＵＸシンチレーションカウンターでカウントすることにより定量した。
【０１４８】
実験設計を本明細書の表６で要約する。処理を以下の濃度、ｗｔＩＧＦ−１  １３．３ｎＭ＝１００ｎｇ／ｍＬ（ＩＧＦ−１  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ２９１−Ｇ１）、ＧＦ−Ｆｕｓ１（６×ヒスチジンタグ付き）１３．３ｎＭ＝１３５ｎｇ／ｍＬ、ＧＦ−Ｆｕｓ２（６×ヒスチジンタグ付き）１３．３ｎＭ＝１４０ｎｇ／ｍＬ、及びＧＦ−Ｆｕｓ３（６×ヒスチジンタグ付き）１３．３ｎＭ＝１８１ｎｇ／ｍＬで与えた。全ての処理はＩＬ−１を含み、４日間または全培養期間のいずれかの間、与えた。測定した結果は、終点のプラグの35Ｓ−硫酸塩組み込み、ＤＮＡ含有量、及びｓＧＡＧ含有量、並びに全ての培地交換についての培地に放出されたｓＧＡＧであった。対照は処理なし（健康）または１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１単独（疾患）のいずれかであった。
【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
図４は、時間（日）に対する培養培地へ失われたｓＧＡＧ全量の累積率により測定される、軟骨マトリックス損失のグラフを示す。損失率は、培養培地中の累積ｓＧＡＧを培養期間にわたり培地中に存在するｓＧＡＧ全量で割り、培養終了時に外植片中に残るｓＧＡＧを足すことにより計算される。軟骨マトリックス損失は、野生型ＩＧＦと同様のレベルで、疾患対照と比較して各ＩＧＦ融合タンパク質により減少された。８日目及び１２日目に終了される培養の最後の４８時間中の新しい軟骨マトリックス合成（すなわち、硫酸化プロテオグリカン合成は35Ｓ−硫酸塩組み込みにより測定される）は、それぞれ、図５Ａ及び５Ｂ中に示される。融合タンパク質が８及び１２日間の全培養期間の間、培地交換毎に供給された場合、軟骨マトリックス合成は、全ての融合タンパク質（ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ２、及びＧＦ−Ｆｕｓ３）及び野生型ＩＧＦにより疾患対照と比較して増大した（黒色バー）。しかしながら、融合タンパク質除去４または８日後の軟骨マトリックス合成の刺激は、ＬＲ３−ＩＧＦへのＰＲＥＬＰヘパリン結合ドメイン融合（ＧＦ−Ｆｕｓ３、図５Ａ及び５Ｂ）について最も高かった。
【０１５１】
実施例６：ウシ軟骨外植片を用いたインビトロ関節疾患モデル洗い流し実験におけるコラーゲン結合増殖因子の活性
ＩＩ型コラーゲンに結合する融合タンパク質（ＧＦ−Ｆｕｓ５、ＧＦ−Ｆｕｓ６）を調製した（両方とも６×ヒスチジンタグ付きであった）。融合タンパク質を、本明細書の実施例５で上記に説明される方法及び結果測定を、表７で要約される処理により改変して用いて特徴付けた。全ての条件は、単一の動物から回収された外植片を使用した。
【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
図６は、時間（日）に対する軟骨マトリックス損失（％ｓＧＡＧ損失）を示し、ここで、ウシ外植片からの軟骨マトリックス損失は、疾患対照と比較して、試験されたＩＧＦ融合タンパク質（ＧＦ−Ｆｕｓ１、３、５、及び６）のそれぞれにより減少した。図７は、時間（日）に対するｓＧＡＧ損失を示し、ここで、ウシ外植片からの軟骨マトリックス損失は、処理なし対照と比較して、試験されたＩＧＦ融合タンパク質のそれぞれでの１２日間の処理により減少した。さらに、ＧＦ−Ｆｕｓ３については、４日間及び１２日間の処理はｓＧＡＧ損失を同等量、減少させた。しかしながら、ＧＦ−Ｆｕｓ１（Ｐｒｅｌｐヘパリン結合ドメインを有しない融合タンパク質）については、４日間の処理は、１２日間の処理より高いｓＧＡＧ損失をもたらした。図８Ａ及び８Ｂは、ウシ軟骨外植片での、それぞれ、８日目及び１２日目の軟骨マトリックス合成（35Ｓ−硫酸塩組み込み）を示す。軟骨マトリックス合成は、疾患対照と比較して、試験されたＩＧＦ融合タンパク質のそれぞれでの８（図８Ａ）及び１２（図８Ｂ）日間両方の処理（黒色バー）により増大する。ＧＦ−Ｆｕｓ３については、４日間及び１２日間の処理は、プロテオグリカン生合成を同等量、増大させ、ＧＦ−Ｆｕｓ３を含まない培地中での８日間の培養の軟骨マトリックス合成の持続された刺激を示す（図８Ｂ）。
【０１５４】
実施例７：外植されたウシ外植片を用いたインビトロ関節疾患モデルにおけるＧＦ−Ｆｕｓ３とデキサメタゾン（抗Ｉｎｆｌ−１）との組み合わせの活性
ＧＦ−Ｆｕｓ３（６×ヒスチジンタグ付き）とデキサメタゾンとの組み合わせを、実施例５で説明される方法を用いて特徴付けた。実験設計を本明細書中の表８で要約する。全ての条件は単一の動物から回収した外植片を使用した。
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
図９Ａは、時間（日）に対する軟骨マトリックス損失（％ｓＧＡＧ損失）を示す。ＧＦ−Ｆｕｓ３とデキサメタゾンとの組み合わせは、単独で投与されたＧＦ−Ｆｕｓ３またはデキサメタゾンいずれかより、ウシ外植片でのＩＬ−１誘発マトリックス損失の阻害でより有効であった。図９Ｂは、８及び１２日目に終了された培養の最後の４８時間中の軟骨マトリックス合成（35Ｓ−硫酸塩組み込み）を示す。ＧＦ−Ｆｕｓ３とデキサメタゾンとの組み合わせは、単独で投与されたＧＦ−Ｆｕｓ３またはデキサメタゾンいずれかより、ウシ外植片での軟骨マトリックス合成の刺激でより有効であった。抗Ｉｎｆｌ−Ｘという用語は、デキサメタゾンの様々な変形を指し、Ｘ＝１はデキサメタゾンであり、Ｘ＝２はデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩であり、Ｘ＝３はリン酸デキサメタゾンである。
【０１５７】
実施例８：ヒアルロン酸を伴うまたは伴わないメチルセルロースハイドロゲルからのＧＦ−Ｆｕｓ２の持続放出
ハイドロゲル調合物からのＧＦ−Ｆｕｓ２及びｗｔ−ＩＧＦのインビトロ持続放出を査定した。メチルセルロースハイドロゲル、ゲル３（ＨＢＳ中の６．１％（ｗ／ｗ）メチルセルロースＡ１５（Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４０））、及びヒアルロナンメチルセルロースハイドロゲル、ゲル４（ＨＢＳ緩衝液中の１．８％（ｗ／ｗ）ヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  ＨＡ１Ｍ）及び６．１％メチルセルロース）を使用した。具体的には、ゲルをフローサイトメトリー管中の総体積５０μＬ中に投じ、各ゲルは１μｇのタンパク質を含有した。ゲルを、人工滑液（ＳＦ）（ｌｇＤＭＥＭ＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋２．５％ウシ血清アルブミン、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉカタログ番号３７５２５）中で、３７℃で撹拌しながら１４日間インキュベートした。人工滑液を３０分後（１条件当たり６回の繰り返し）、その後、１、２、３、４、７、９、１１、１４日目に査定した。タンパク質放出を抗ＩＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。結果は図１０Ａ〜Ｈに示される。ＧＦ−Ｆｕｓ２及び野生型ＩＧＦは、０〜３日目で同様の速度で、ゲル３及びゲル４の両方から放出され、４日目後はさらなる放出はなく、このことは最初の３日間にわたるゲル３及びゲル４からのこれらのタンパク質の持続送達を示す。
【０１５８】
実施例９：埋め込まれた脂質ナノ粒子を伴うハイドロゲルからのデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩（抗Ｉｎｆｌ−２）の放出
脂質ナノ粒子を含有するデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩を埋め込んだハイドロゲルを生成し、これらのナノ粒子からのデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩の放出を測定した。
【０１５９】
メチルセルロースハイドロゲル、ゲル１（ＨＢＳ緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中の９％（ｗ／ｗ）メチルセルロースＡ１５（Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４０））、及びヒアルロナンメチルセルロースハイドロゲル、ゲル２（ＨＢＳ緩衝液中の２％（ｗ／ｗ）ヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  ＨＡ１Ｍ）及び７％メチルセルロース）を使用した。デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩脂質ナノ粒子を表９に示される脂質組成物で生成した。
【０１６０】
【表９】
2016515587.tif 000021
【０１６１】
具体的には、脂質フィルムを、６５℃で１２０ｍｍＨｇでの一晩の乾燥でクロロホルム溶液からロータリー蒸発により形成させた。フィルムを、滅菌ＨＢＳ緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中で、６５℃で、手動で回旋させ、最大スピードで３０秒間ボルテックスしながら、水和させた。デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩ゲルを、得られた多層状小胞（ＭＬＶ）を氷冷１．１倍ゲルストックと混合し、ゲル１ｇ当たり１００μｇのデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩濃度を達成することにより形成した。ただし、１０５１２−４を含むＭＣゲルは、ゲル１ｇ当たり９７．２μｇを含有する。
【０１６２】
ゲルを、エタノール処理したポリエチレン蓋を有する事前に計量しオートクレーブにかけた２ｍｌのポリプロピレン円筒状シェルバイアル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ４０１１−７７Ｐ）に分配し、底に「こぶ」を形成させ、３７℃で２４時間を超えて硬化させた。５倍の約３００ｍｇのゲルをゲル当たり脂質ナノ粒子タイプ当たり、全部で５０ゲル分配した。以下の成分、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０−１２２、２．５％ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３７５２５）、及び１ｇ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１８８５）からなる７００μＬの人工滑液を５０本のバイアルのそれぞれに添加し、ゲルを穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。人工滑液上清を除去し、−８０℃で凍結保存し、７００μｌの新しい人工滑液を１、２、３、４、７、９日目に添加した。
【０１６３】
上清を融解、超音波処理、リパーゼでの消化により分析した。簡潔に記載すると、３２０ｎＭ〜５ｎＭの範囲の、０点を含むデキサメタゾン及びデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩標準曲線を上清と並行して、処理される人工滑液中で創作した。１００μＬのこれらの標準及び各ゲルからの上清を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で処理した。処理した試料及び標準を５０℃のオーブン内に３０分間入れ、次いで室温の超音波発生装置中に５分間入れた。試料及び標準をリパーゼ、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号４３７７０７）で４μｇ／ｍＬで処理した。プレートを密閉し、３７℃で一晩インキュベートした。消化物をＮｅｏｇｅｎからのデキサメタゾンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号１０１５１９）を用いて以下のように分析した。酵素抱合体、洗浄緩衝液、及びＫ−Ｂｌｕｅ基質を教示に従って使用した。デキサメタゾンの新しい標準曲線を上記と同じ範囲内で、人工滑液中で創作し、対照として非処理のままにした。余分の人工滑液を標準に添加して、処理及び非処理標準の総体積を同一にした。試料及び標準をＥＩＡ緩衝液（Ｎｅｏｇｅｎカタログ番号３０１２７７）中に１：２０で希釈したか、または最初の試料を人工滑液中に１：１００で希釈し、次いで試料及び標準をＥＩＡ緩衝液中に１：２０で希釈した。試料及び標準を、酵素抱合体を含むＥＬＩＳＡプレートに室温で４５分間入れた。プレートを１ウェル当たり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、各洗浄後、逆さにし、軽くたたいて乾かした。１００μＬのＫ−ｂｌｕｅ基質を添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。１００μＬ  ＴＭＢ停止溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、カタログ番号５０−８５−０６）を各ウェルに添加し、プレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで、４５０ｎｍで読み取った。１：１００及び１：２０で希釈した両方のサンプルからのデータ、並びに１：２０単独についてのデータを、標準曲線に回帰させた。読み取りが１ｎｇ／ｍＬ未満でない限り、１：１００希釈物からのデータを使用した。
【０１６４】
図１１Ａ、Ｂ、及びＣは、本明細書で開示される脂質ナノ粒子タイプ１、２、３、４、または５を含むハイドロゲル調合物ゲル１またはゲル２からの、時間（日）に対する抗Ｉｎｆｌ−２（デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩）の累積放出のグラフを示し、Ｘがゲル１及び２について、それぞれ、１または２であり、Ｙがナノ粒子タイプを示す１〜５である、名称規定ゲルＸ−Ｙを用いる。これらのハイドロゲルからの抗Ｉｎｆｌ−２の放出速度は、本明細書中の表１０で示される。
【０１６５】
最も遅い放出調合物（ゲル１−１及びゲル１−３）についての抗Ｉｎｆｌ−２の９日目での累積放出は、最も速い放出調合物（ゲル２−３）についての累積放出より約４倍低かった。したがって、ゲルの組成及びナノ粒子タイプを変化させることにより、抗Ｉｎｆｌ−２の放出速度は調節することができる。
【０１６６】
【表１０】
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【０１６７】
実施例１０：125Ｉ−標識ＧＦ−Ｆｕｓ３、ＧＦ−Ｆｕｓ１、及び野生型ＩＧＦのウシ関節軟骨への取り込みがどのようにして決定されるか
ウシ及びヒト関節軟骨中のＧＦ−Ｆｕｓ３、ＧＦ−Ｆｕｓ１、及び野生型ＩＧＦの分配係数、結合アフィニティ、及び結合部位数は、Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４１５（２００３）６９−７９、Ｂｈａｋｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：８（２０００）５８６０−５８６６、Ｂｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４９９（２０１０）３２−３９で以前に説明される方法を用いて評価される。
【０１６８】
簡潔に記載すると、ウシまたはヒト軟骨円盤、直径３ｍｍ×厚み４００〜２０００ｍｍを、皮膚パンチを用いて軟骨スライスから抜く。続いて、これらの円盤を関節の異なる回収部位のうちから平等に群に分配し、新しいＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、プロテアーゼ阻害剤を含有する、Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４  ６９３  １２４  ００１）中に入れる。使用直前に、125Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ（または125Ｉ標識ＧＦ−Ｆｕｓ３もしくはＧＦ−Ｆｕｓ１）を以下のように精製して、分解された断片または遊離の放射活性を除去する。125Ｉ−タンパク質を０．６×３０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラム上にロードし、０．０１Ｍ酢酸１  ０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）からなる緩衝液で溶離して、任意の小分子量放射性標識の除去を確実にする。真正の標識化ＩＧＦ−Ｉまたは融合タンパク質に対応する排除容量画分を集める。
【０１６９】
次いで、一定量の125Ｉ標識タンパク質（平均３３ｐＭ、特異的活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び段階的な量の対応する非標識タンパク質（０〜２００ｎＭ）を、円盤の各群に添加する。３７℃で４８時間のインキュベーション期間後、試料を簡単にすすぎ、次いで残りの緩衝液と共にガンマカウンターで個々にカウントする。各円盤の湿重量及び乾重量を測定して、含水率を決定する。乾燥試料をプロテイナーゼＫで消化して、実施例５で説明されるようにグリコサミノグリカン含有量を査定する。
【０１７０】
実施例１１：ウマ骨関節炎モデル
本明細書で開示される融合タンパク質の疾患調節活性は、ウマの骨関節炎モデルで特徴付けられるであろう。好適なモデルシステムとして、ＭｃＩｌｗｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｒｅｓ  ２０１２；１：２９７−３０９で示されるモデルが挙げられるが、これらに限定されず、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。対象は、関節内での持続保持または即時放出のために調合されたグルココルチコイド注入を伴うまたは伴わないＩＧＦ融合タンパク質の関節内注入により治療されるであろう。注入体積は０．１〜１５ｍＬであり、注入体積中のデキサメタゾンパルミチン酸塩の濃度は約１０ｎＭ〜１０ｍＭであろう。ＩＧＦ融合タンパク質の濃度は１ｎＭ〜１ｍＭであろう。１〜１０回の注入が与えられるであろう。多数回の注入が与えられる場合、注入間の時間は３日間〜６ヶ月間であろう。
【０１７１】
臨床結果を決定するために、０〜５の階級に等級付けされる跛行（０が跛行なし、５が非体重負荷跛行である）、及び０〜４の階級に等級付けされる関節浸出（０が浸出なし、４が最も重症なレベルである）を含む、両方の前肢の臨床検査が隔週で行われるであろう。
【０１７２】
画像法は、放射線学溶解、関節内の骨の増殖、及び骨増殖症を含み得る特徴を観察するためのＸ線写真；橈側手根骨の小柱領域の強膜骨の体積を含み得る変化を観察するためのＣＴ画像法；並びに滑液体積、滑膜増殖、より高い関節包肥厚、関節包浮腫、橈側手根骨浮腫、及び橈側手根骨硬化を含み得る変化を観察するためのＭＲ画像法を含んでよい。
【０１７３】
滑液は、以下の結果：滑液タンパク質のレベル、ＰＧＥ２、ＣＳ８４６、ＣＰＩＩ、ｓＧＡＧ、ＣｏｌＣＥＱ、Ｃ１、２Ｃ、オステオカルシン、及びＣｏｌ−１を査定するために３日毎から毎月に及ぶ頻度で回収されるであろう。また、ＣＳ８４６、ＣＰＩＩ、ｓＧＡＧ、オステオカルシン、Ｃ１、２Ｃ、及びＣｏｌ−１の血清レベルが査定されるであろう。
【０１７４】
実施例１２：ヒト軟骨外植片を用いたインビトロ関節疾患モデル洗い流し実験におけるＧＦ−Ｆｕｓ３の持続活性及びデキサメタゾン（抗Ｉｎｆｌ−１）の抗異化活性
ＧＦ−Ｆｕｓ３（６×ヒスチジンタグ付き）の軟骨結合アーム及び増殖因子アームの両方の活性を、以下に説明されるようにヒト軟骨外植片を用いたインビトロ関節疾患モデル洗い流し実験で査定した。加えて、デキサメタゾンの抗異化活性を、単独、並びにＧＦ−Ｆｕｓ３及び軟骨結合アームを有しないＧＦ−Ｆｕｓ１（６×ヒスチジンタグ付き）の両方との組み合わせの両方で決定した。このヒト軟骨関節疾患モデルは、傷害後または慢性疾患中に起こる炎症性サイトカインにより駆動される関節損傷の異化相を模倣する。また、処理を、炎症が減少または除去された場合の軟骨組織に対するこれらの処理の効果を査定するために炎症性サイトカインの不在化で試験した。
【０１７５】
方法
ヒト軟骨外植片を検死２４時間以内にヒトドナー死体の膝及び足首から回収する。関節は病理学者により無菌的に解剖され、改変されたＣｏｌｌｉｎｓ階級（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｊｏｉｎｔｓ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．２００５；１３（２）：９３−１０３）により軟骨全体の形態を査定され、等級０または１の関節のみが使用される。十分な厚みの膝軟骨表面を、メスを用いて大腿骨−膝蓋骨の溝及びコンジルから回収する。十分な厚みの足首軟骨を、メスを用いて距骨頂部、距骨頂部下の近位領域、距骨頭部、くるぶし脛骨、及びくるぶし腓骨から回収する。直径４ｍｍの使い捨て生検パンチを用いて、十分な厚みの軟骨コアを、表面区域を無傷に保って軟骨表面からパンチで取り、培養で外植片として使用する。
【０１７６】
外植片を、９６ウェルプレート中で、ペニシリン−ストレプトマイシン（１×、Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）、アスコルビン酸（２０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａ４４０３）、プロリン（４００μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ５６０７−２５６）、非必須アミノ酸（１×、Ｓｉｇｍａ  Ｍ７１４５）、及びＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ  １５６３０−０８０）を添加した３００μＬの低グルコースＤＭＥＭ（１×  Ｇｉｂｃｏ  １１８８５−０８４）中で培養する。２〜３体のドナーからの外植片（１ドナー当たり４〜６個の外植片）を各処理条件について使用し、１条件当たり１２〜１８の外植片総数である。ドナーの年齢は、６７歳男性の足首、７１歳男性の足首、７６歳女性の足首、５９歳男性の膝、３４歳男性の膝、及び６３歳女性の膝であった。培地を２日毎に交換する。１４日目に、培地を５μＣｉ／ｍＬの35Ｓ−硫酸ナトリウム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＸ０４１Ｈ００５ＭＣ、５ｍＣｉ）で補完する。
【０１７７】
以下のように、１６日目で時点を取る。外植片組織をＰＢＳ中の１ｍＭ非標識硫酸ナトリウム中で４回、各３０分間（全体で２時間）洗浄する。各外植片を湿潤計量し、消化まで−２０℃で凍結する。組織消化をプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号３１１５８７９００１）で行い、各外植片を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ＝８．０緩衝液中の１ｍＬ  ５００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ中で、６０℃で一晩消化する。ｓＧＡＧ含有量及びＤＮＡ含有量の測定を、Ｈｏｅｍａｎｎ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．；ｐ．１２７−５２中で説明されるアッセイ法などの標準のアッセイ法を用いて行う。消化した軟骨外植片の35Ｓ−硫酸塩含有量を、２０μＬの消化物を２５０μＬのシンチレーション流体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号１２００−４３９）と混合し、Ａ  ＷＡＬＬＡＣ  １４５０  ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ  ＴＲＩＬＵＸシンチレーションカウンターでカウントすることにより定量する。
【０１７８】
結果
処理は、以下の濃度、ＧＦ−Ｆｕｓ１  １３．３ｎＭ＝１３５ｎｇ／ｍＬ、及びＧＦ−Ｆｕｓ３  １３．３ｎＭ＝１８１ｎｇ／ｍＬ、デキサメタゾン１００ｎＭ＝３９．２ｎｇ／ｍＬで与えた。増殖因子及びステロイド処理条件は、サイトカインＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１０−ＴＡ、２５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６−ＩＬ、５０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−６Ｒ  α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２７−ＳＲ、２５０ｎｇ／ｍＬ）を含み、培地交換毎に供給された。ＧＦ−Ｆｕｓ１及びＧＦ−Ｆｕｓ３を、最初の８日間（８Ｄ）または全１６日間の培養期間（１６Ｄ）のいずれかの間、新しい培地に添加し、一方、デキサメタゾンを全ての場合で全１６日間添加した。対照はサイトカインなし（健康）またはサイトカイン単独（疾患）のいずれかであった。１６日目の軟骨外植片から測定した結果は、35Ｓ−硫酸塩組み込み、ＤＮＡ、及びｓＧＡＧ含有量、並びに全ての培地交換について培地に放出されたｓＧＡＧであった。
【０１７９】
図１２Ａ〜Ｄは、デキサメタゾン（抗Ｉｎｆｌ−１）がＧＦ−Ｆｕｓ３の添加あり及びなしの両方で疾患条件と比較してヒト足首及び膝軟骨のマトリックス異化を減少させることを示し、ヒト軟骨分解の高トランスレーショナルモデルでサイトカイン駆動疾患中に損傷から軟骨を保護する可能性を示唆する。加えて、マトリックス損失のこの減少が確かであることは、足首及び膝のある範囲の解剖学的部位（距骨頂部、図１２Ａ、距骨後部、図１２Ｂ、距骨頭部及びくるぶし脛骨及び腓骨、図１２Ｃ、並びに大腿骨−膝蓋骨の溝、図１２Ｄ）から回収した軟骨外植片についての一致する結果により示される。図１３Ａ〜Ｅは、ＧＦ−Ｆｕｓ３がデキサメタゾンの添加あり及びなしの両方で疾患条件と比較して新たに硫酸化された足首及び膝の軟骨マトリックスの合成を上方調節することを示し、機能的荷重負荷マトリックス分子での軟骨修復についての可能性を示唆する。この効果は、足首及び膝のある範囲の解剖学的部位（距骨頂部、図１３Ａ、距骨後部、図１３Ｂ、距骨頭部及びくるぶし脛骨及び腓骨、図１３Ｃ、大腿骨−膝蓋骨の溝、図１３Ｄ、並びに大腿骨コンジル、図１３Ｅ）から回収された軟骨にわたっても確かである。図１４Ａ〜Ｄは、ＧＦ−Ｆｕｓ３のみが各対応するタンパク質を含まない培地中での８日間、ヒト足首及び膝軟骨外植片の軟骨修復活性の可能性を持続し、ＧＦ−Ｆｕｓ１は持続しないことを示す（すなわち、ＧＦ−Ｆｕｓ３条件についての白色バー及び黒色バーの同等性、ＧＦ−Ｆｕｓ１はそうではないこと）。この効果は、距骨頂部（図１４Ａ）、距骨後部（図１４Ｂ）、距骨頭部及びくるぶし脛骨及び腓骨（図１４Ｃ）、並びに大腿骨−膝蓋骨の溝（図１４Ｄ）にわたり確かであり、全ての場合において、疾患＋抗Ｉｎｆｌ１＋ＧＦ−Ｆｕｓ１  ８Ｄは疾患対照と同様であり、一方、疾患＋抗Ｉｎｆｌ＋ＧＦ−Ｆｕｓ３  ８Ｄは連続的に送達されるタンパク質（すなわち、疾患＋抗Ｉｎｆｌ１＋ＧＦ−Ｆｕｓ１  １６Ｄ及び疾患＋抗Ｉｎｆｌ１＋ＧＦ−Ｆｕｓ３  １６Ｄ）と同等のまたはこれらに優る可能性を示した。
【０１８０】
活性疾患または最近の急性傷害がない場合、関節内サイトカインレベルは減少され得る。したがって、単独、並びにＧＦ−Ｆｕｓ１及びＧＦ−Ｆｕｓ３との組み合わせのデキサメタゾンの活性を、ヒト膝コンジル軟骨外植片を用いてサイトカインを含まない設定で査定した。図１４Ｅは、サイトカインの不在下でデキサメタゾンは硫酸化マトリックス生合成を減少させるが、全１６日間の培養についてＧＦ−Ｆｕｓ１またはＧＦ−Ｆｕｓ３のデキサメタゾンとの組み合わせ（黒色バー）は硫酸化マトリックス生合成を健康な対照以上のレベルまで回復させることを示す。さらに、ＧＦ−Ｆｕｓ１（軟骨結合ドメインを有しない）及びＧＦ−Ｆｕｓ３（軟骨結合ドメイン融合を有する）が培養の最後の８日間の間、除去された場合（白色バー）、ＧＦ−Ｆｕｓ３のみが、おそらくヒト軟骨外植片内でのその結合、保持、及び活性の増大のために、（ＧＦ−Ｆｕｓ１とは異なり）連続的な１６日間の処理と同等のレベルで硫酸化マトリックス生合成を持続する。
【０１８１】
実施例１３：ラット膝への関節内注入後の、ＧＦ−Ｆｕｓ３またはｗｔＩＧＦのいずれかと混合した、脂質粒子に封入されたデキサメタゾン、脂質粒子に封入されたデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩、及び即時放出リン酸デキサメタゾンの持続保持
３種のデキサメタゾン誘導体（方法を参照のこと）のラット膝への関節内注入後の保持を測定した。デキサメタゾン及びデキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩を脂質粒子に封入し、デキサメタゾンの最近市販される注入可能な分子構造である非封入、可溶性リン酸デキサメタゾン調合物と比較した。遺伝子工学で作成した軟骨結合ＩＧＦ融合タンパク質（Ｈｉｓタグを有しない）であるＧＦ−Ｆｕｓ３を、脂質粒子の存在がラット膝でＧＦ−Ｆｕｓ３の保持を変化させるかどうかを決定するために、デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩粒子懸濁液及びリン酸デキサメタゾン溶液と混合した。野生型ＩＧＦを、ＧＦ−Ｆｕｓ３の保持と比較するために対照としてデキサメタゾン粒子懸濁液と混合した（表１２）。
【０１８２】
方法
全ての材料の供給源を表１１に列挙する。表１２中の群１、２、及び４の調合物を、１１０μｍ  Ｈｇで一晩乾燥させながら６０℃のクロロホルム溶液からロータリー蒸発により調製した。フィルムを滅菌ＨＢＳ−６．５緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中で、６８℃で、手動で回旋させ、かつ最大スピードで４５〜６０秒間ボルテックスして水和させた。得られた脂質粒子懸濁液を、表１２に列挙される最終濃度の２倍で、２×ＰＢＳ中の適切なタンパク質溶液と１：１で混合した。群３の調合物を、蒸留水中のリン酸デキサメタゾンの滅菌溶液を表１２の濃度の１０倍で作成することにより調製した。これを、ＨＢＳ−６．５と１：４で、続いて２×ＰＢＳ中の適切なタンパク質の２倍溶液と１：１で混合した。
【０１８３】
【表１１】
2016515587.tif 000023
【０１８４】
【表１２】
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【０１８５】
Ｌｅｗｉｓラット（２７５ｇ超）の右膝に関節内注入により５０μＬの表１２の薬物調合物を投与した。１時点当たり１条件当たり６匹のラットに、全部で９６匹のラットに注入した。群１〜３について、動物を注入後即時、並びに注入後１時間、４時間、２４時間、及び９６時間で殺した。群４については、動物を注入後１時間でのみ殺した。動物をイソフルオランで麻酔し、下行大動脈を通してバキュテナーに採血し、血清を回収した。右膝を１００μＬの生理食塩水で洗浄した。軟骨、半月板、十字靭帯、及び周囲の滑膜を伴う膝蓋骨を回収し、急速凍結し、−８０℃で保存した。軟骨、半月板、靭帯、及び周囲の滑膜を伴う膝蓋骨の試料を液体窒素中で冷却した後、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｕｂｅｓ（カタログ番号５２０００１）中でＣｏｖａｒｉｓ  ＣｒｙｏＰｒｅｐ機器を用いて粉砕した。粉砕した試料を組織抽出試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＦＮＮ００７１）（軟骨について５０μＬ、靭帯について１００μＬ、半月板について２００μＬ、及び膝蓋骨について４００μＬ）中に懸濁し、ロータリー振とう器で、４℃で１２〜１８時間混合した。可溶化物を４０００ｇで遠心分離し、清澄上清を除去した。
【０１８６】
各組織タイプについての清澄可溶化物の一定分量、洗浄液、及び血清試料を、実施例９で説明されるように、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及びリパーゼで処理し、製造業者の教示でリパーゼと同時にアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｐ０１１４）を添加した。処理済み可溶化物を組織抽出試薬中に１倍、１０倍、１００倍、１０００倍、及び１０，０００倍で希釈した。処理済み洗浄液及び血清を人工滑液中に１倍、１０倍、１００倍、１０００倍、及び１０，０００倍で希釈した。全ての希釈物を実施例９で説明されるように、デキサメタゾンＥＬＩＳＡ（Ｎｅｏｇｅｎカタログ番号１０１５１９）により分析した。
【０１８７】
清澄可溶化物試料の一定分量を、Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中に１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、及び１００，０００倍（即時時点の洗浄液のみ）で希釈した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７４３４８、全ての希釈物中で最終濃度５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１０％組織抽出試薬）。洗浄液及び血清試料の一定分量を、Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中に１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、及び１００，０００倍（即時時点の洗浄液のみ）で希釈した（全ての希釈物中で最終濃度５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１０％人工滑液）。全ての希釈物を、ヒトＩＧＦ−１  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹ２９１）により分析した。以下の例外を伴って、キットプロトコルに従った。３８４ウェル黒色マイクロプレート及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号３７０６９）を使用し、プレートをルミノメータで、４５０ｎｍで読み取った。
【０１８８】
結果
群１の調合物のデキサメタゾン保持は、軟骨、半月板、靭帯、及び膝蓋骨＋滑膜の可溶化物について群３より即時時点で少なくとも１０倍低かったが、全ての続く時点では１０倍を超えて高かった（図１５Ａ〜Ｄ、図１５Ｂの半月板での４時間の時点を除いて）。群２は、これらの組織で１時間以降の時点で群３より少なくとも１０倍高かった（図１５Ｂの半月板での４時間の時点を除いて）。また、群１は、これらの組織で、即時時点で群２より約１０倍低かったが、全ての続く時点では群２と同じか、またはそれより高かった（図１５Ａ〜Ｄ）。
【０１８９】
群１の調合物は即時時点で、血清中で検出不可能であり、１〜２４時間で群２または群３のいずれかより約１０倍低かった（図１５Ｅ）。滑膜洗浄液では、群１は１時間及び４時間で群２より１０倍高く、滑膜洗浄液で、４時間で群３より１０００倍高かった（図１５Ｆ）。
【０１９０】
これらの結果は、群３の即時放出注入可能調合物と比較して、群１及び２の脂質粒子により送達された場合の、軟骨、半月板、靭帯、及び膝蓋骨＋滑膜でのデキサメタゾンの保持の増大を示す。加えて、群２または３より、即時時点での軟骨、半月板、靭帯、及び膝蓋骨＋滑膜での群１のより低いレベル、並びに血清での群１の検出不可能またはより低いレベルにより示されるように、群１のパルミチン酸塩機能化デキサメタゾンプロドラッグ（デキサメタゾン−２１−パルミチン酸塩）は、非機能化デキサメタゾン群２粒子（デキサメタゾン）及び群３の即時放出調合物（リン酸デキサメタゾン、抗Ｉｎｆｌ−３）の両方と比較して即時時点での突発放出を減少させた。このより低い突発は、１時間及び４時間での滑膜洗浄液での群１のデキサメタゾンレベルの持続保持に寄与するようである。
【０１９１】
ＩＧＦは、群１及び３についてのみ２４及び９６時間で、軟骨組織で検出されたが、ＩＧＦは、６匹の動物のうちの１匹のみで２４時間で群２について検出された（図１５Ｇ）。軟骨で１時間及び４時間で、群１及び３は、それぞれ、群２より約４倍及び１００倍高かった。半月板、靭帯、膝蓋骨＋滑膜、及び滑膜洗浄液では、ＩＧＦは、２４時間で群１及び３について検出されたが、群２は検出されなかった（図１５Ｈ〜Ｊ及び図１５Ｌ）。１時間及び４時間で、群１及び３のＩＧＦレベルは、これらの組織で群２についてより２〜１００倍高かった。血清ＩＧＦレベルは、即時時点で群１及び３についてより群２について約１０倍高く、群２のレベルは１時間及び４時間で検出可能なままであったが、一方、群１及び３は検出限界未満であった（図１５Ｋ）。同様のＩＧＦ保持レベルは、全ての時点での全ての組織で群１及び３について観察された。
【０１９２】
これらの結果は、非結合ＩＧＦである野生型を含有する群２と比較して、遺伝子工学で作成した軟骨結合ＩＧＦ融合タンパク質であるＧＦ−Ｆｕｓ３を含有する群１及び３について、ラットの膝関節内でのＩＧＦの優先的な保持を示す。ＩＧＦは、半月板、靭帯、及び膝蓋骨＋滑膜におけるより群１及び３について軟骨でより長く保持されたが、これはおそらく他の組織と比較してＧＦ−Ｆｕｓ３のヘパリン結合ドメインを優先的に保持する軟骨の劇的により高いＧＡＧ含有量のためである。群１と３との間に差は見られず、脂質粒子の存在はＧＦ−Ｆｕｓ３の保持に影響しないことを示した。
【０１９３】
実施例１４：ウシ軟骨外植片を用いたインビトロ関節疾患モデル洗い流し実験での精製タグを伴うまたは伴わないＧＦ−Ｆｕｓ３の同等の軟骨保持及び同化作用刺激
ＧＦ−Ｆｕｓ３を６×ヒスチジンタグを伴って及び伴わずに調製した（それぞれ、ＧＦ−Ｆｕｓ３−Ｈｉｓ及びＧＦ−Ｆｕｓ３）。実施例５で上記に説明されるように、ウシ軟骨外植片を調製し、培養し、融合タンパク質処理を表１３に記載されるように培地中に含めた。全ての外植片は同じ動物からである。
【０１９４】
【表１３】
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【０１９５】
結果
図１６は、ＧＦ−Ｆｕｓ３−Ｈｉｓからの６×ヒスチジンタグの除去は軟骨マトリックス生合成の刺激を変化させなかったことを示す。加えて、以前の実施例と一致して、ＧＦ−Ｆｕｓ１、ＧＦ−Ｆｕｓ３−Ｈｉｓ、及びＧＦ−Ｆｕｓ３での１２日間の連続処理は、疾患対照と比較して軟骨マトリックス生合成を刺激した。ＧＦ−Ｆｕｓ３−Ｈｉｓ及びＧＦ−Ｆｕｓ３は、非軟骨結合ＧＦ−Ｆｕｓ１より２倍を超えて高く、４日間の処理で疾患対照と比較してマトリックス生合成を刺激した。
【０１９６】
実施例１５：ＧＦ−Ｆｕｓ３は最小限及び重症の軟骨変性を有するドナーからのヒト滑液中で安定である
損傷軟骨の治療活性の持続は、損傷関節の滑膜腔内での軟骨標的化融合タンパク質の安定性を必要とするであろう。それゆえ、軟骨変性を有するドナーからのヒト滑液中でのインキュベーションでのＧＦ−Ｆｕｓ３の安定性を決定した。
【０１９７】
方法
滑液を、死亡２４時間以内に２体のヒトドナー（表１４を参照のこと）から回収し、急速凍結し、−８０℃で保存した。２μＬのＧＦ−Ｆｕｓ３（ＰＢＳ中０．４５ｍｇ／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１００１０−０３１）を、密閉した２００μＬ  ＰＣＲ管中の１８μＬの滑液（最終ＧＦ−Ｆｕｓ３濃度は４５μｇ／ｍＬである）に添加し、３７℃で０、２４、４８、７２、または９６時間インキュベートした。試料をＰＢＳ中に１：１０で希釈し、１０μＬ（４５ｎｇのＧＦ−Ｆｕｓ３）を３．３μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０００７）と混合した。ＧＦ−Ｆｕｓ３標準を１００、２００、４００、８００、及び１６００ｎｇ／ｍＬで調製し、各溶液の１０μＬを３．３μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液と混合した。全ての試料及び標準を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０３２１ＢＯＸ）にロードし、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳ走行緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０００２）中で流した。タンパク質をｉＢｌｏｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＩＢ３０１００１）を用いてニトロセルロース膜に移行させた。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ、カタログ番号９２７−４００００）中で撹拌しながら室温で１時間ブロッキングした。膜を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で２回洗浄し、２μｇ／ｍＬ抗ＩＧＦ−１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０５−１７２）中で、４℃で一晩インキュベートした。膜をＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、１：２０００に希釈したＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲ、カタログ番号８２７−０８３６４）と室温で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ上で画像化した。
【０１９８】
【表１４】
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【０１９９】
結果
等級１（最小限）及び等級３（重症）軟骨変性を有するドナーの両方（それぞれ、図１７Ａ及び１７Ｂ）について、滑液中でＧＦ−Ｆｕｓ３を３７℃で９６時間インキュベートすることは、最小限のタンパク質変性をもたらした。４５μｇのインキュベートされたタンパク質をロードした場合、７．５ｋＤａ未満のかすかなバンドが、図１７Ａ及び１７Ｂの両方で見えたが、両方の場合のこのバンドの強度は１ｎｇ  ＧＦ−Ｆｕｓ３標準以下であり、このことは最初のタンパク質の２％以下しか滑液インキュベーション中に分解されなかったことを示唆する。
【０２００】
均等物
当業者は、ルーチン実験以下のことを用いて、本明細書に記載される本発明（複数可）の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。また、任意の独立請求項及び従属請求項のいずれかに開示される実施形態のうちの１つ以上の任意の組み合わせは、本発明の範囲内であると企図される。
【０２０１】
参照による組み込み
本明細書で参照される各及びどの特許、係属中の特許出願、及び出版物も、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｂ】
2016515587.tif 000033
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2016515587.tif 000044
【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
2016515587.tif 000049
【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
2016515587.tif 000051
【図１５Ｂ】
2016515587.tif 000052
【図１５Ｃ】
2016515587.tif 000053
【図１５Ｄ】
2016515587.tif 000054
【図１５Ｅ】
2016515587.tif 000055
【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
2016515587.tif 000058
【図１５Ｉ】
2016515587.tif 000059
【図１５Ｊ】
2016515587.tif 000060
【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
2016515587.tif 000062
【図１６】
2016515587.tif 000063
【図１Ａ】
2016515587.tif 000064
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2016515587.tif 000069
【図９Ａ】
2016515587.tif 000070
【図１０Ａ】
2016515587.tif 000071
【図１０Ｂ】
2016515587.tif 000072
【図１０Ｃ】
2016515587.tif 000073
【図１０Ｄ】
2016515587.tif 000074
【図１０Ｅ】
2016515587.tif 000075
【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
2016515587.tif 000077
【図１０Ｈ】
2016515587.tif 000078
【図１７Ａ】
2016515587.tif 000079
【図１７Ｂ】
2016515587.tif 000080
【配列表】
2016515587000001.app
【国際調査報告】
2016515587.tif 000081
2016515587.tif 000082
2016515587.tif 000083
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