(57)【要約】  動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液である。該方法は、動物組織材料を金属過酸化物と洗浄剤とを含むアルカリ性浸漬溶液に入れて揺らすことと、中性洗浄液を用いて浸漬過程で放出した微生物と動物組織細胞の有機成分を洗浄することと、弱酸性洗浄液を用いて組織基質を洗浄することと、中性溶液で組織基質を低温保存又は凍結乾燥保存することと、を含む。動物組織浸漬溶液は０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含む。該方法で前処理した動物組織は、組織の保存、更なる脱細胞処理による完全な組織基質支持骨格材料の製造に役立つ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織材料を金属過酸化物と洗浄剤とを含むアルカリ性浸漬溶液に入れて揺らすステップ（１）と、
中性洗浄液を用いて浸漬過程で放出された微生物と動物組織細胞の有機成分を洗浄するステップ（２）と、
弱酸性洗浄液を用いて組織基質を洗浄するステップ（３）と、
中性溶液において組織基質を低温保存又は凍結乾燥保存するステップ（４）と、を含む動物組織材料の消毒・滅菌方法。
【請求項２】
ステップ（１）での動物組織浸漬溶液は０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含み、溶液のｐＨ値は９．０〜１２．０の間であり、金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムが好ましく、洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムが好ましく、溶液のｐＨ値は９．５〜１１．５の間にあることが好ましい請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（１）での具体的な方法は１ｋｇあたりの動物組織材料を５〜４２℃で２〜８Ｌの浸漬溶液に６〜４８時間浸漬し、浸漬しながら揺らすことである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（２）での中性洗浄液は無菌濾過した純水又は生理的食塩水である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（２）での組織材料を中性洗浄液で２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間である請求項１又は４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（３）での弱酸性洗浄液は酢酸、酢酸ナトリウム又は塩酸でｐＨ値を５．０〜６．０の間に調整して無菌濾過した生理的食塩水又は２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（３）での組織材料を弱酸性洗浄液で２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間である請求項１又は６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（４）に記載の中性保存溶液は２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液又は他の生物学的相溶性緩衝液であり、ｐＨ値は７．０〜８．０の間にある請求項１に記載の方法。
【請求項９】
０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含み、ｐＨ値は９．０〜１２．０の間にある、動物組織材料を消毒・滅菌するための動物組織浸漬溶液。
【請求項１０】
金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムであり、過酸化カルシウムであることが好ましく、洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムであり、溶液のｐＨ値は９．５〜１１．５の間にある請求項９に記載の動物組織浸漬溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物組織処理と組織基質材料製造の技術分野に関し、具体的に、動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱細胞組織器官基質は、人体組織の修復、各種の組織工学試験及び再生医学研究に適用されている。人体と多くの動物との組織と器官の細胞外基質の類似性と相同性は非常に高い。同種異系又は異種異系の組織器官を脱細胞した生物基質材料は、人体組織の臨床修理と修復に成功に用いられている。良好な組織器官基質を宿主に移植した後、基質支持骨格材料は初期の生体力学的支持を提供し、宿主細胞と相互作用することによって細胞の挙動（例えば粘着、移動、増殖及び分化）を調整し、宿主細胞の内部成長に伴って、組織器官基質自体は徐々に新組織に形質転換する。
【０００３】
動物組織器官の既存の細胞成分を除去した後、インビトロで人体細胞と組み合わせて、従来の三次元フレーム構造の組織器官基質を再び細胞化して機能化し、人体に移植可能な組織及び器官を生産することができる。
【０００４】
組織器官基質は、各種の複雑な構造タンパク質と機能性タンパク質からなる三次元フレームであり、且つ多くの他の活性複合体を含む。主成分として、コラーゲン繊維、糖タンパク質、ムコタンパク質等を含み、他の成分として、アミノデキストラン（ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン）等の糖類、一部の脂質及び成長因子を含む。組織器官基質を製造するための生物学的プロセスフローは非常に複雑であり、組織器官の収集、保存、洗浄、消毒、脱細胞、抗原性低減化、ウイルス不活性化及び最終滅菌等の工程を含む。なお、動物組織の消毒・滅菌処理は、組織器官基質を大幅に損ない、細菌とウイルスを不活性化すると同時に、組織器官基質の生化学的組成成分を深刻に変えて、三次元フレームの超微細構造を損ない、生体力学的特性を低下させてしまう。これらの変化は、移植基質材料に対する宿主の反応に影響し、組織基質製品の臨床効果を劣化させて、人体組織の修復要件に達しにくい可能性がある。
【０００５】
動物組織材料の消毒、滅菌及びウイルス不活性化方法は、組織基質支持骨格の製造過程での各プロセスステップに用いられる。従来から用いられている方法として、主に、リンスして希釈することで細菌数と真菌数を低減させ、無菌環境下で操作して再感染を防止する物理方法と、溶液の製造において微生物成長阻害剤と抗生物質を添加することと、製造プロセスフローにおいて滅菌ステップを追加し、細菌量を制御することと、製品の最終滅菌処理とを含む。製造プロセスフローの滅菌方法は、化学的酸化剤（過酢酸、次亜塩素酸ナトリウム、オキシドール又はヨウ素溶液等）、又はアルコール、又は酸とアルカリ（酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム）を用いて処理することである。実験結果から明らかなように、これらの一般的な消毒・滅菌処理方法は、いずれも組織基質を様々な程度で損なってしまう。どのように細胞外組織基質の既存の基本構造を損なわずに、主な生化学成分と生体力学的特性を変えずに、効果的に消毒し、滅菌し、ウイルスを不活性化するかは、組織工学科学と生体材料科学分野で更に研究すべき課題となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、従来技術における上記欠陥に対して、
動物組織材料を金属過酸化物と洗浄剤とを含むアルカリ性浸漬溶液に入れて揺らすステップ１と、
中性洗浄液を用いて浸漬過程で放出した微生物と動物組織細胞の有機成分を洗浄するステップ２と、
弱酸性洗浄液を用いて組織基質を洗浄するステップ３と、
中性溶液で組織基質を低温保存又は凍結乾燥保存するステップ４と、を含む動物組織材料の消毒・滅菌方法を提供する。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（１）の動物組織浸漬溶液は０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含み、溶液のｐＨ値は９．０〜１２．０の間にある。金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムが好ましく、洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムが好ましい。
【０００８】
過酸化カルシウムは二酸化カルシウムとも呼ばれ、農業で種子と穀物の無毒性消毒剤として用いられ、食品、化粧品等の製造で添加剤として用いられ、薬物の製造で高温酸化剤又は酸素生産剤として用いられる。このため、本発明のより好ましい実施形態において、金属過酸化物として、低濃度又は過飽和度の過酸化カルシウムのアルカリ性水溶液が用いられ、一般的に含有量が０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の間にある。過酸化カルシウムの含有量は、実際の適用において、溶液体積と動物の元の組織器官材料との比率に応じて調整でき、例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％。ュ。ュ、０．２％までの範囲内のいずれかの濃度である。また、本発明に使用される金属過酸化物として、過酸化ナトリウム、過酸化マグネシウム、過酸化バリウム等の過酸化カルシウム以外の金属過酸化物を含んでもよい。
【０００９】
本発明に使用される過酸化カルシウム又は他の金属過酸化物水溶液の初期ｐＨ値は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、酢酸、塩酸等の溶液を用いて８．５〜１２．５の間、好ましくは９．０〜１２．０の間、より好ましくは９．５〜１１．５の間に調整できる。最終的な炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの含有量は０．０１〜２．０％の間にあってもよく、水酸化ナトリウムの含有量は１．０〜１００ｍＭの間にあってもよい。好ましくは、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの含有量は０．５〜１．０％の間にあり、水酸化ナトリウムの含有量は５〜１０ｍＭの間にある。各成分の含有量は、実際の適用において、溶液体積と動物の元の組織器官材料との比率に応じて調整できる。
【００１０】
本発明における金属過酸化物は、組織基質タンパク質の変性を引き起こすことない低濃度の洗浄剤又は汚染除去剤と組み合わせて使用できる。この適用目的のために好適な洗浄剤又は汚染除去剤は種類が多く、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を含む。一般的に、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、脂肪酸ナトリウム塩、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート、及びポリエチレングリコール等が用いられる。ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムが好ましい。溶液において、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルの濃度は０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよく、デオキシコール酸ナトリウムの濃度は０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよく、ドデシルスルホン酸ナトリウムの濃度は０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよい。
【００１１】
本発明の消毒・滅菌処理溶液において、細胞分解後に放出したプロテアーゼによる組織基質材料の破壊を防止するために、必要に応じて、例えば、ベンジルスルホニルフルオリド、Ｎ−エチルマレイミド等のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ１で動物組織器官材料を前処理する際に、５〜４２℃で行え、組織材料を処理溶液に浸漬し、且つ揺らす。使用される溶液の体積は、一般的に組織材料の重量の１〜１０倍である。前処理時間は、一般的に６〜４８時間である。同時に、処理温度、組織材料の種類、細菌数及び体積重量比率等に応じて、適当に調整できる。
【００１３】
本発明の消毒・滅菌方法は、更に消毒・滅菌・浸漬後、組織材料を徹底的に洗浄することを含む。好ましい実施形態において、ステップ２は中性洗浄液を用いて行える。中性洗浄液は、無菌濾過した純水、生理的食塩水、又は１０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸等の生物学的緩衝液である。具体的な方法は、組織材料を純水、生理的食塩水及び生物学的緩衝液で２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間であることである。
【００１４】
本発明の消毒・滅菌方法は、徹底的に洗浄した後、弱酸性洗浄液を用いて組織材料を洗浄する必要がある。ステップ３での弱酸性洗浄液は、酢酸、酢酸ナトリウム又は塩酸でｐＨ値を５．０〜６．０の間に調整して無菌濾過した生理的食塩水又は２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液である。具体的な方法は、弱酸性処理液を用いて組織材料を２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間であることである。
【００１５】
本発明の洗浄した後の組織材料を中性保存溶液に入れて低温保存又は凍結乾燥保存する。ステップ４での中性保存溶液は、ｐＨ値が７．０〜８．０の間にある２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液又は他の生物学的相溶性緩衝液である。
【００１６】
本発明の方法を実施する際に、組織浸漬溶液除去後、最終的な洗浄溶液に適当な抗生物質を添加してもよく、例えば、１Ｌあたりに１００ｍｇのゲンタマイシンを含む。組織材料は、抗生物質を添加した溶液において、５〜１０℃で一時的に保存できる。
【００１７】
本発明は、更に０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含む、動物組織材料を消毒・滅菌するための動物組織浸漬溶液に関する。溶液のｐＨ値は、９．０〜１２．０の間にあることが好ましく、９．５〜１１．５の間にあることがより好ましい。金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムが好ましく、洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムが好ましい。
【００１８】
本発明は、従来の各種の製造技術における原料の消毒、滅菌及びウイルス不活性化に存在する問題に対して、動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液を提供する。該方法と該溶液を用いることで、製造される動物組織材料の細菌数を少なくとも１０6減少させることができ、同時に動物細胞外基質材料の既存の組織の基本支持骨格構造、主な生化学成分及び生体力学的特性を損なわない。同時に、本発明は、タンパク質の変性を引き起こすことない低濃度の洗浄剤と組み合わせて使用して、動物細胞を分解させ、破砕し、細胞内の有機成分を放出し、それにより浸漬と洗浄過程で組織中の一部の動物細胞成分を除去する。また、本発明の消毒・滅菌方法は、安全で環境にやさしく、有毒な化学物質を使用せず、組織基質支持骨格にも化学残留物質が残らない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は０．１％の過酸化カルシウム溶液で豚皮を消毒・滅菌する効果図である。  左図は対照である。  右図は過酸化カルシウム溶液で２４時間処理した後の材料を検出した結果、細菌の存在が観察されていないことである。
【図２】図２は０．１％の過酸化カルシウム溶液（初期ｐＨ値は１１．６である）処理による豚真皮基質の示差走査熱量計分析グラフである。
【図３】図３は豚皮真皮材料のｐＨ値の異なる溶液中での膨潤（図Ａ）及び消毒・滅菌液のｐＨ値による組織基質の示差走査熱量計分析グラフ（図Ｂ）である。
【図４】図４は高ｐＨ値（１２．２）溶液の消毒・滅菌前処理による豚の脱細胞真皮組織基質構造の組織切片ＨＥ染色図である。  Ａは未処理の豚真皮組織である。  Ｂは消毒・滅菌と脱細胞処理後の組織基質材料である。
【図５】図５は複数種の消毒・滅菌方法による組織基質支持骨格損傷の示差走査熱量計分析グラフである。
【図６】図６は複数種の消毒・滅菌方法による組織基質構造変化の走査型電子顕微鏡写真である。  Ａはリン酸緩衝液対照である。  Ｂは１Ｎ水酸化ナトリウム（１時間）である。  Ｃは０．２％の過酢酸（２時間）である。  Ｄは３．０％のオキシドール（２時間）である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、実施例により、本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。なお、当業者にとって、本発明の原理から逸脱せずに、本発明を改良して修飾してもよく、これらの改良と修飾も同様に本発明の保護範囲にある。
【００２１】
実施例１：動物組織材料の消毒・滅菌及びその脱細胞への影響
４匹の九ヶ月齢の一般的な生きた豚を屠殺した後、まず毛を除去した。各豚の体から１〜２ｍｍ厚の新鮮な豚皮（皮下脂肪なし）を収集した。豚真皮を約３ｃｍ×３ｃｍの小塊に切り、２５０ｍＬのプラスチックボトルに入れた。豚毎に４本ボトル、ボトル毎に２０ｇの豚真皮材料となる。そのうちの２本ボトルにそれぞれ１２５ｍＬのリン酸緩衝液（初期ｐＨ値は７．５である）を対照として加えて、一本ボトルに１２５ｍＬの０．１％の過酸化カルシウム溶液（初期ｐＨ値は１１．６である）を加えて、他の一本ボトルに１２５ｍＬの０．１％の過酸化カルシウムと０．１％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル溶液（初期ｐＨ値は１１．６である）を加えた。揺らしながら１時間浸漬した後、一本ボトルのリン酸緩衝液対照を初期生菌数の測定に用いた。１００μＬを異なる希釈倍数の溶液（１０倍、１０００倍及び１００００００倍）で濾過して洗浄した後、栄養寒天／普通肉汁寒天培地で２４時間（３７℃）培養した後に生菌数を計算した。すべての試験ボトルをオービタルシェーカーで揺らして洗浄し（５０回転／分）一晩２４時間浸漬した。生菌数を測定することで、組織原料の消毒と滅菌効果を評価した。結果から明らかなように、ボトル中の初期生菌数は平均的に１０8.7（±０．１、Ｎ＝４）であり、対照としてのリン酸緩衝液において、２４時間後の生菌数は２４５倍増加し、平均的に１０11.1（±０．１、Ｎ＝４）であり、過酸化カルシウム溶液において、生菌が検出されず、具体的には図１を参照する。
【００２２】
０．１％の過酸化カルシウムと０．１％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル溶液で前処理した豚皮組織を、更に脱細胞処理し、消毒と滅菌前処理による後続加工への影響の評価に用いた。豚皮組織を無菌生理的食塩水（０．９％の塩化ナトリウム）で２回洗浄した後、１００ｍＬの０．５％のデオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｐＨ値が８．０である）を加えた。２２時間脱細胞浸漬後、無菌生理的食塩水で５回洗浄し、毎回２時間である。示差走査熱量計を用いて消毒と滅菌前処理による組織基質への影響を分析した。示差走査熱量計による分析はリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）で行い、昇温速度が２℃／分となるように２℃から１２５℃まで昇温した。未処理の新鮮な豚皮組織基質は、変性開始温度が６０．５±０．３℃であり、エンタルピーが６５．２±１．４Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であり、前処理後の組織基質は、変性開始温度が６１．９±０．２℃であり、エンタルピーが６２．３±１．１Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であった。測定結果から明らかなように、新鮮な豚真皮に比べて、本発明の消毒と滅菌前処理は、真皮組織基質を損なわず、具体的には図２を参照する。
【００２３】
実施例２：動物組織材料の消毒・滅菌
六ヶ月齢の一般的な生きた豚を屠殺した後、表面を洗浄し、毛を除去した。新鮮な豚皮を切り取り、且つ皮下脂肪（２〜３ｍｍ厚）を除去した。収集された豚皮原料を５〜１０℃の環境中に一時的に冷蔵した。豚真皮を約３０ｃｍ×３０ｃｍの大塊に切り、４００ｇあたりの豚皮原料に１Ｌの溶液を用いるように、２％の炭酸ナトリウム＋０．２％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（飽和過酸化カルシウム濃縮液で初期ｐＨ値を１２．０〜１２．２に調整する）の溶液に入れた。オービタルシェーカーで揺らして洗浄し（９０回転／分）一晩浸漬した（１６〜２４時間）。浸漬溶液を除去した後、無菌環境中で１Ｌあたりに１００ｍｇのゲンタマイシンを含む純水で洗浄した後、１Ｎ塩酸でｐＨ値を５．０〜６．０の間に低く調整し、更に２回洗浄する。更に１Ｎ塩酸でｐＨ値を７．０〜８．０の間に高く調整し、更に２回洗浄し、組織原料の消毒と滅菌前処理を完了した。
【００２４】
実施例３：動物組織材料の消毒・滅菌及びその組織基質への影響
六ヶ月齢の一般的な生きた豚を屠殺した後、表面を洗浄し、毛を除去した。新鮮な豚皮を切り取り、且つ皮下脂肪を除去した。収集された豚皮原料を５〜１０℃の環境中に一時的に冷蔵した。豚真皮を約３０ｃｍ×３０ｃｍの大塊に切り、１００ｇあたりの豚皮原料に１Ｌの溶液を用いるように、０．５％の炭酸ナトリウム＋０．１％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（飽和過酸化カルシウム濃縮液で初期ｐＨ値を１１．０に調整する）の溶液に入れた。オービタルシェーカーで揺らして洗浄し（６０回転／分）一晩浸漬した（１６〜２４時間）。浸漬溶液を除去した後、１Ｌあたりに１００ｍｇのゲンタマイシンを含む純水で洗浄し、更に０．２Ｍ酢酸でｐＨ値を７．０〜８．０の間に調整し、組織原料の消毒・滅菌前処理を完了した。示差走査熱量計を用いて前処理による組織基質への影響を分析した。示差走査熱量計による分析はリン酸緩衝液（ｐＨ値は７．５である）で行い、昇温速度が２℃／分間となるように２℃から１２５℃まで昇温した。未処理の新鮮な豚皮組織基質は、変性開始温度が６０．５±０．３℃であり、エンタルピーが６５．２±１．４Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であり、前処理後の組織基質は、変性開始温度が６１．９±０．４℃であり、エンタルピーが６６．７±１．５Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であった。測定結果から明らかなように、新鮮な豚真皮に比べて、本発明の消毒と滅菌前処理は真皮組織基質を損なわない。
【００２５】
実施例４：消毒・滅菌時の動物組織浸漬溶液の適宜のｐＨ値の確定
消毒・滅菌溶液と豚皮原料が反応するため、新鮮な豚皮材料を加えた後、ｐＨ値は有意に低下した。本実施例は適宜の過酸化カルシウム溶液のｐＨ値を確定した。試験において１〜２ｍｍ厚の新鮮な豚皮を、予め水酸化ナトリウムで多様なｐＨ値に調整した炭酸水素ナトリウム（１％）と過酸化カルシウム（０．１％）溶液に入れて、原料の膨潤により組織の前処理における変化を評価した。前処理後の豚皮組織を無菌生理的食塩水（０．９％の塩化ナトリウム）で洗浄した後、更に０．５％のデオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｐＨ値は８．０である）を加えて一晩脱細胞浸漬処理した。脱細胞組織基質を無菌生理的食塩水で５回洗浄し、毎回２時間である。示差走査熱量計の分析結果から明らかなように、ｐＨ値が１１．５より大きい場合に、豚皮の膨潤が有意に向上し、組織基質が不可逆変化し、組織基質が不安定になり、具体的には図３を参照する。組織切片の研究により、ｐＨ値が１１．５より大きい場合に、組織基質の構造が損なわれたことも示され、具体的には図４を参照する。
【００２６】
実施例５：従来の消毒・滅菌方法による組織基質材料への損傷
従来の消毒・滅菌方法による組織基質材料への損傷と比較するために、本実施例は、試験において約１ｍｍ厚の新鮮な豚皮を、０．２％の次亜塩素酸ナトリウム（２時間）、０．２％の過酢酸（２時間）、３．０％のオキシドール（２時間）、７．５％のヨウ素溶液（２時間）、１Ｎ水酸化ナトリウム（１時間）及びリン酸緩衝液対照（ｐＨ値は７．５である）を含む複数種の溶液に入れた。これらの溶液において処理した後、豚皮組織をリン酸緩衝液で徹底的に洗浄した（５回、毎回２時間）。示差走査熱量計の分析結果から明らかなように、これらの一般的な消毒・滅菌処理方法は、いずれも組織基質を多様な程度で損ない、特に水酸化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム及びヨウ素溶液であり、具体的には図５を参照する。走査型電子顕微鏡写真から組織基質構造のいくつかの変化が明瞭に見えて、具体的には図６を参照する。しかし、これらの従来の消毒・滅菌方法と異なり、本発明は金属酸化物水和物又は過酸化物と低濃度の脱細胞洗浄剤を組み合わせて使用して、適宜のｐＨ値（１０．０〜１１．５）で、動物細胞外基質材料の既存の組織の基本支持骨格構造、主な生化学成分及び生体力学的特性を損なうことがない。
【図１】
2016534118.tif 000003
【図２】
2016534118.tif 000004
【図３】
2016534118.tif 000005
【図４】
2016534118.tif 000006
【図５】
2016534118.tif 000007
【図６】
2016534118.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月26日(2016.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は生物組織処理と組織基質材料製造の技術分野に関するがこれに限られなく、具体的に、動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液に関するがこれに限られない。
【背景技術】
【０００２】
脱細胞組織器官基質は、人体組織の修復、各種の組織工学試験及び再生医学研究に適用されている。人体と多くの動物との組織と器官の細胞外基質の類似性と相同性は非常に高い。同種異系又は異種異系の組織器官を脱細胞した生物基質材料は、人体組織の臨床修理と修復に成功に用いられている。良好な組織器官基質を宿主に移植した後、基質支持骨格材料は初期の生体力学的支持を提供し、宿主細胞と相互作用することによって細胞の挙動（例えば粘着、移動、増殖及び分化）を調整し、宿主細胞の内部成長に伴って、組織器官基質自体は徐々に新組織に形質転換する。
【０００３】
動物組織器官の既存の細胞成分を除去した後、インビトロで人体細胞と組み合わせて、従来の三次元フレーム構造の組織器官基質を再び細胞化して機能化し、人体に移植可能な組織及び器官を生産することができる。
【０００４】
組織器官基質は、各種の複雑な構造タンパク質と機能性タンパク質からなる三次元フレームであり、且つ多くの他の活性複合体を含む。主成分として、コラーゲン繊維、糖タンパク質、ムコタンパク質等を含み、他の成分として、アミノデキストラン（ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン）等の糖類、一部の脂質及び成長因子を含む。組織器官基質を製造するための生物学的プロセスフローは非常に複雑であり、組織器官の収集、保存、洗浄、消毒、脱細胞、抗原性低減化、ウイルス不活性化及び最終滅菌等の工程を含む。なお、動物組織の消毒・滅菌処理は、組織器官基質を大幅に損ない、細菌とウイルスを不活性化すると同時に、組織器官基質の生化学的組成成分を深刻に変えて、三次元フレームの超微細構造を損ない、生体力学的特性を低下させてしまう。これらの変化は、移植基質材料に対する宿主の反応に影響し、組織基質製品の臨床効果を劣化させて、人体組織の修復要件に達しにくい可能性がある。
【０００５】
動物組織材料の消毒、滅菌及びウイルス不活性化方法は、組織基質支持骨格の製造過程での各プロセスステップに用いられる。従来から用いられている方法として、主に、リンスして希釈することで細菌数と真菌数を低減させ、無菌環境下で操作して再感染を防止する物理方法と、溶液の製造において微生物成長阻害剤と抗生物質を添加することと、製造プロセスフローにおいて滅菌ステップを追加し、細菌量を制御することと、製品の最終滅菌処理とを含む。製造プロセスフローの滅菌方法は、化学的酸化剤（過酢酸、次亜塩素酸ナトリウム、オキシドール又はヨウ素溶液等）、又はアルコール、又は酸とアルカリ（酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム）を用いて処理することである。実験結果から明らかなように、これらの一般的な消毒・滅菌処理方法は、いずれも組織基質を様々な程度で損なってしまう。どのように細胞外組織基質の既存の基本構造を損なわずに、主な生化学成分と生体力学的特性を変えずに、効果的に消毒し、滅菌し、ウイルスを不活性化するかは、組織工学科学と生体材料科学分野で更に研究すべき課題となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
次は本文詳細に記載する主題に対する概説であるが、該概説は請求の範囲を制限するものではない。
第一の態様において、本発明の実施形態は、
動物組織材料を金属過酸化物と洗浄剤とを含むアルカリ性浸漬溶液に入れて揺らすステップ（１）と、
中性洗浄液を用いてステップ（１）で得られた動物組織材料を洗浄して、浸漬過程で放出した微生物と動物組織細胞の有機成分を取り除くステップ（２）と、
弱酸性洗浄液を用いてステップ（２）で得られた組織基質を洗浄するステップ（３）と、
中性溶液でステップ（３）で得られた組織基質を低温保存又は凍結乾燥保存するステップ（４）と、を含む動物組織材料の消毒・滅菌方法を提供する。
【０００７】
ある実施形態において、ステップ（１）の動物組織浸漬溶液は０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含み、溶液のｐＨ値は９．０〜１２．０の間にある。金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択され、洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択される。
【０００８】
過酸化カルシウムは二酸化カルシウムとも呼ばれ、農業で種子と穀物の無毒性消毒剤として用いられ、食品、化粧品等の製造で添加剤として用いられ、薬物の製造で高温酸化剤又は酸素生産剤として用いられる。このため、本発明のより好ましい実施形態において、金属過酸化物として、低濃度又は過飽和度の過酸化カルシウムのアルカリ性水溶液が用いられ、一般的に含有量が０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）（１００ＭＬ溶液に０．０１〜０．２gの過酸化カルシウムを含むことに相当し、以下「ｗ／ｖ」の意味は同じである」）の間にある。過酸化カルシウムの含有量は、実際の適用において、溶液体積と動物の元の組織器官材料との比率に応じて調整でき、例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％。ュ。ュ、０．２％（ｗ／ｖ）までの範囲内のいずれかの濃度である。また、本発明に使用される金属過酸化物として、過酸化ナトリウム、過酸化マグネシウム、過酸化バリウム等の過酸化カルシウム以外の金属過酸化物を含んでもよいがこれに限られない。
【０００９】
本発明の一つの実施形態において、過酸化カルシウム又は他の金属過酸化物水溶液を使用する過程において、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、酢酸、塩酸等の溶液を用いて浸漬溶液の初期ｐＨ値を、８．５〜１２．５の間、好ましくは９．０〜１２．０の間、より好ましくは９．５〜１１．５の間に調整できる。最終的な炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの含有量は０．０１〜２．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよく、水酸化ナトリウムの含有量は１．０〜１００ｍＭの間にあってもよい。好ましくは、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの含有量は０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあり、水酸化ナトリウムの含有量は５〜１０ｍＭの間にある。各成分の含有量は、実際の適用において、溶液体積と動物の元の組織器官材料との比率に応じて調整できる。
【００１０】
本発明の一つの実施形態において、金属過酸化物は、組織基質タンパク質の変性を引き起こすことない低濃度の洗浄剤又は汚染除去剤と組み合わせて使用できる。この適用目的のために好適な洗浄剤又は汚染除去剤は種類が多く、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を含む。一般的に、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、脂肪酸ナトリウム塩、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート、及びポリエチレングリコール等が用いられる。ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム及びドデシルスルホン酸ナトリウムの中の一種又は複数種が好ましい。溶液において、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルの濃度は０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよく、デオキシコール酸ナトリウムの濃度は０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよく、ドデシルスルホン酸ナトリウムの濃度は０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の間にあってもよい。
【００１１】
本発明の一つの実施形態の浸漬溶液において、細胞分解後に放出したプロテアーゼによる組織基質材料の破壊を防止するために、必要に応じて、例えば、ベンジルスルホニルフルオリド及び/又はＮ−エチルマレイミド等のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。
【００１２】
本発明のある実施形態において、ステップ（１）で動物組織器官材料を前処理する際に、５〜４２℃で行え、組織材料を浸漬溶液に浸漬し、且つ揺らす。使用される溶液の体積は、一般的に組織材料の重量の１〜１０倍である。前処理時間は、一般的に６〜４８時間である。同時に、処理温度、組織材料の種類、細菌数及び体積重量比率等に応じて、適当に調整できる。
【００１３】
本発明の一つの実施形態において、消毒・滅菌方法は、更に消毒・滅菌・浸漬後、組織材料を徹底的に洗浄することを含む。ある実施形態において、ステップ（２）は中性洗浄液を用いて行える。中性洗浄液は、無菌濾過した純水、生理的食塩水、又は１０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸等の生物学的緩衝液である。具体的な方法は、組織材料を純水、生理的食塩水又は生物学的緩衝液で２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間であることである。
【００１４】
本発明の一つの実施形態において、消毒・滅菌方法は、中性洗浄液を用いて徹底的に洗浄した後、弱酸性洗浄液を用いて組織材料を洗浄する必要がある。ステップ（３）での弱酸性洗浄液は、酢酸、酢酸ナトリウム又は塩酸でｐＨ値を５．０〜６．０の間に調整して無菌濾過した生理的食塩水又は２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液である。具体的な方法は、弱酸性洗浄液を用いて組織材料を２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間であることである。
【００１５】
本発明の一つの実施形態において、洗浄した後の基質材料を中性保存溶液に入れて低温保存又は凍結乾燥保存する。ステップ（４）での中性溶液は、ｐＨ値が７．０〜８．０の間にある２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液又は他の生物学的相溶性緩衝液である。
【００１６】
本発明の一つの実施形態において、方法を実施する際に、組織材料の浸漬溶液除去後、後続の洗浄溶液に適当な抗生物質を添加してもよく、例えば、１Ｌあたりに１００ｍｇのゲンタマイシンを含む。組織材料は、抗生物質を添加した溶液において、５〜１０℃で一時的に保存できる。
【００１７】
第二の態様において、本発明の実施形態は、更に０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含む、動物組織材料を消毒・滅菌するための動物組織浸漬溶液を提供する。溶液のｐＨ値は、９．０〜１２．０の間にあることが好ましく、９．５〜１１．５の間にあることがより好ましい。金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択され、洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択される。
【００１８】
第三の態様において、本発明の実施形態は、更に動物組織材料を、上記の方法で消毒・滅菌した後得られる動物組織基質を提供する。
本発明の一つの実施形態において、従来の各種の製造技術における原料の消毒、滅菌及びウイルス不活性化に存在する問題に対して、動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液及び該方法で得られる動物組織基質を提供する。該方法と該溶液を用いることで、製造される動物組織材料の細菌数を少なくとも１０6減少させることができ、同時に動物細胞外基質材料の既存の組織の基本支持骨格構造、主な生化学成分及び生体力学的特性を損なわない。同時に、本発明の一つの実施形態においては、タンパク質の変性を引き起こすことない低濃度の洗浄剤と組み合わせて使用して、動物細胞を分解させ、破砕し、細胞内の有機成分を放出し、それにより浸漬と洗浄過程で組織中の一部の動物細胞成分を除去する。また、本発明の一つの実施形態において、消毒・滅菌方法は、安全で環境にやさしく、有毒な化学物質を使用せず、組織基質支持骨格にも化学残留物質が残らない。
他の態様は、図面及び詳細な説明で明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は０．１％の過酸化カルシウム溶液で豚皮を消毒・滅菌する効果図である。  左図は対照である。  右図は過酸化カルシウム溶液で２４時間処理した後の材料を検出した結果、細菌の存在が観察されていないことである。
【図２】図２は０．１％の過酸化カルシウム溶液（初期ｐＨ値は１１．６である）処理による豚真皮基質の示差走査熱量計分析グラフである。
【図３】図３は豚皮真皮材料のｐＨ値の異なる溶液中での膨潤（図Ａ）及び異なるｐＨ値の消毒・滅菌液による組織基質処理後の示差走査熱量計分析グラフ（図Ｂ）である。
【図４】図４は高ｐＨ値（１２．２）溶液の消毒・滅菌前処理による豚の脱細胞真皮組織基質構造の組織切片ＨＥ染色図である。  Ａは未処理の豚真皮組織である。  Ｂは消毒・滅菌と脱細胞処理後の組織基質材料である。
【図５】図５は複数種の消毒・滅菌方法による組織基質支持骨格損傷の示差走査熱量計分析グラフである。
【図６】図６は複数種の消毒・滅菌方法による組織基質構造変化の走査型電子顕微鏡写真である。  Ａはリン酸緩衝液対照である。  Ｂは１Ｎ水酸化ナトリウム（１時間）である。  Ｃは０．２％の過酢酸（２時間）である。  Ｄは３．０％のオキシドール（２時間）である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、実施例により、本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。なお、当業者にとって、本発明の原理から逸脱せずに、本発明を改良して修飾してもよく、これらの改良と修飾も同様に本発明の保護範囲にある。
【００２１】
実施例１：動物組織材料の消毒・滅菌及びその脱細胞への影響
４匹の九ヶ月齢の一般的な生きた豚を屠殺した後、まず毛を除去した。各豚の体から１〜２ｍｍ厚の新鮮な豚皮（皮下脂肪なし）を収集した。豚真皮を約３ｃｍ×３ｃｍの小塊に切り、２５０ｍＬのプラスチックボトルに入れた。豚毎に４本ボトル用意し、ボトル毎に２０ｇの豚真皮材料を入れる。そのうちの２本ボトルにそれぞれ１２５ｍＬのリン酸緩衝液（初期ｐＨ値は７．５である）を対照として加えて、一本ボトルに１２５ｍＬの０．１％の過酸化カルシウム溶液（初期ｐＨ値は１１．６である）を加えて、他の一本ボトルに１２５ｍＬの０．１％の過酸化カルシウムと０．１％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル溶液（初期ｐＨ値は１１．６である）を加えた。揺らしながら１時間浸漬した後、一本ボトルのリン酸緩衝液対照を初期生菌数の測定に用いた。テスト液を異なる希釈倍数の溶液（１０倍、１０００倍及び１００００００倍）で希釈した後、それぞれ１００μＬ異なる希釈倍数の溶液をとって濾過して洗浄した後、栄養寒天／肉汁培地で２４時間（３７℃）培養した後に生菌数を計算した。すべての試験ボトルをオービタルシェーカーで揺らして洗浄し（５０回転／分）一晩２４時間浸漬した。生菌数を測定することで、組織原料の消毒と滅菌効果を評価した。結果から明らかなように、ボトル中の初期生菌数は平均的に１０8.7（±０．１、Ｎ＝４）であり、対照としてのリン酸緩衝液において、２４時間後の生菌数は２４５倍増加し、平均的に１０11.1（±０．１、Ｎ＝４）であり、過酸化カルシウム溶液において、生菌が検出されず、具体的には図１を参照する。
【００２２】
０．１％の過酸化カルシウムと０．１％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル溶液で前処理した豚皮組織を、更に脱細胞処理し、消毒と滅菌前処理による後続加工への影響の評価に用いた。豚皮組織を無菌生理的食塩水（０．９％の塩化ナトリウム）で２回洗浄した後、１００ｍＬの０．５％のデオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｐＨ値が８．０である）を加えた。２２時間脱細胞浸漬後、無菌生理的食塩水で５回洗浄し、毎回２時間である。示差走査熱量計を用いて消毒と滅菌前処理による組織基質への影響を分析した。示差走査熱量計による分析はリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）で行い、昇温速度が２℃／分となるように２℃から１２５℃まで昇温した。未処理の新鮮な豚皮組織基質は、変性開始温度が６０．５±０．３℃であり、エンタルピーが６５．２±１．４Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であり、前処理後の組織基質は、変性開始温度が６１．９±０．２℃であり、エンタルピーが６２．３±１．１Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であった。測定結果から明らかなように、新鮮な豚真皮に比べて、本発明実施例の消毒と滅菌前処理は、真皮組織基質を損なわず、具体的には図２を参照する。
【００２３】
実施例２：動物組織材料の消毒・滅菌
六ヶ月齢の一般的な生きた豚を屠殺した後、表面を洗浄し、毛を除去した。新鮮な豚皮を切り取り、且つ皮下脂肪（２〜３ｍｍ厚）を除去した。収集された豚皮原料を５〜１０℃の環境中に一時的に冷蔵した。豚真皮を約３０ｃｍ×３０ｃｍの大塊に切り、４００ｇあたりの豚皮原料に１Ｌの溶液を用いるように、２％の炭酸ナトリウム＋０．２％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（飽和過酸化カルシウム濃縮液で初期ｐＨ値を１２．０〜１２．２に調整する）の溶液に入れた。オービタルシェーカーで揺らして洗浄し（９０回転／分）一晩浸漬した（１６〜２４時間）。浸漬溶液を除去した後、無菌環境中で１Ｌあたりに１００ｍｇのゲンタマイシンを含む純水で洗浄した後、１Ｎ塩酸でｐＨ値を５．０〜６．０の間に低く調整し、更に２回洗浄する。更に１Ｎ塩酸でｐＨ値を７．０〜８．０の間に高く調整し、更に２回洗浄し、組織原料の消毒と滅菌前処理を完了した。
【００２４】
実施例３：動物組織材料の消毒・滅菌及びその組織基質への影響
六ヶ月齢の一般的な生きた豚を屠殺した後、表面を洗浄し、毛を除去した。新鮮な豚皮を切り取り、且つ皮下脂肪を除去した。収集された豚皮原料を５〜１０℃の環境中に一時的に冷蔵した。豚真皮を約３０ｃｍ×３０ｃｍの大塊に切り、１００ｇあたりの豚皮原料に１Ｌの溶液を用いるように、０．５％の炭酸ナトリウム＋０．１％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（飽和過酸化カルシウム溶液で初期ｐＨ値を１１．０に調整する）の溶液に入れた。オービタルシェーカーで揺らして洗浄し（６０回転／分）一晩浸漬した（１６〜２４時間）。浸漬溶液を除去した後、１Ｌあたりに１００ｍｇのゲンタマイシンを含む純水で洗浄し、更に０．２Ｍ酢酸でｐＨ値を７．０〜８．０の間に調整し、組織原料の消毒・滅菌前処理を完了した。示差走査熱量計を用いて前処理による組織基質への影響を分析した。示差走査熱量計による分析はリン酸緩衝液（ｐＨ値は７．５である）で行い、昇温速度が２℃／分間となるように２℃から１２５℃まで昇温した。未処理の新鮮な豚皮組織基質は、変性開始温度が６０．５±０．３℃であり、エンタルピーが６５．２±１．４Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であり、前処理後の組織基質は、変性開始温度が６１．９±０．４℃であり、エンタルピーが６６．７±１．５Ｊ／ｇ（Ｎ＝３）であった。測定結果から明らかなように、新鮮な豚真皮に比べて、本発明実施例の消毒と滅菌前処理は真皮組織基質を損なわない。
【００２５】
実施例４：消毒・滅菌時の動物組織浸漬溶液の適宜のｐＨ値の確定
消毒・滅菌溶液と豚皮原料が反応するため、新鮮な豚皮材料を加えた後、ｐＨ値は有意に低下した。本実施例は適宜の過酸化カルシウム溶液のｐＨ値を確定した。試験において１〜２ｍｍ厚の新鮮な豚皮を、予め水酸化ナトリウムで多様なｐＨ値に調整した炭酸水素ナトリウム（１％）と過酸化カルシウム（０．１％）溶液に入れて、原料の膨潤により組織の前処理における変化を評価した。前処理後の豚皮組織を無菌生理的食塩水（０．９％の塩化ナトリウム）で洗浄した後、更に０．５％のデオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液に溶解し、ｐＨ値は８．０である）を加えて一晩脱細胞浸漬処理した。脱細胞組織基質を無菌生理的食塩水で５回洗浄し、毎回２時間である。示差走査熱量計の分析結果から明らかなように、ｐＨ値が１１．５より大きい場合に、豚皮の膨潤が有意に向上し、組織基質が不可逆変化し、組織基質が不安定になり、具体的には図３を参照する。組織切片の研究により、ｐＨ値が１１．５より大きい場合に、組織基質の構造が損なわれたことも示され、具体的には図４を参照する。また、実際の応用過程において、溶液のｐＨ値が組織基質に不可逆の変化を招かれるかどうかは処理時間及び組織基質と溶液の体積比例などの要素にもよる。
【００２６】
実施例５：従来の消毒・滅菌方法による組織基質材料への損傷
従来の消毒・滅菌方法による組織基質材料への損傷と比較するために、本実施例は、試験において約１ｍｍ厚の新鮮な豚皮を、０．２％の次亜塩素酸ナトリウム（２時間）、０．２％の過酢酸（２時間）、３．０％のオキシドール（２時間）、７．５％のヨウ素溶液（２時間）、１Ｎ水酸化ナトリウム（１時間）及びリン酸緩衝液対照（ｐＨ値は７．５である）を含む複数種の溶液に入れた。これらの溶液において処理した後、豚皮組織をリン酸緩衝液で徹底的に洗浄した（５回、毎回２時間）。示差走査熱量計の分析結果から明らかなように、これらの一般的な消毒・滅菌処理方法は、いずれも組織基質を多様な程度で損ない、特に水酸化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム及びヨウ素溶液であり、具体的には図５を参照する。走査型電子顕微鏡写真から組織基質構造のいくつかの変化が明瞭に見えて、具体的には図６を参照する。しかし、これらの従来の消毒・滅菌方法と異なり、本発明実施例は金属酸化物水和物又は過酸化物と低濃度の洗浄剤を組み合わせて使用して、適宜のｐＨ値（例えば８．５〜１２．５、選択的に１０．０〜１１．５）で、動物細胞外基質材料の既存の組織の基本支持骨格構造、主な生化学成分及び生体力学的特性を損なうことがない。
【００２７】
なお、本発明の好適な実施形態を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で、上記実施形態とは異なる種々の態様で実施することができる。本発明の精神と原則にある限り、行ったいずれの修正、等価置き換え、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織材料を金属過酸化物と洗浄剤とを含むアルカリ性浸漬溶液に入れて揺らすステップ（１）と、
中性洗浄液を用いてステップ（１）で得られた動物組織材料を洗浄して、浸漬過程で放出された微生物と動物組織細胞の有機成分を取り除くステップ（２）と、
弱酸性洗浄液を用いてステップ（２）で得られた組織基質を洗浄するステップ（３）と、
中性溶液においてステップ（３）で得られた組織基質を低温保存又は凍結乾燥保存するステップ（４）と、を含む動物組織材料の消毒・滅菌方法。
【請求項２】
ステップ（１）での浸漬溶液は０．０１〜０．２％ｗ／ｖの金属過酸化物と０．０５〜１．０％ｗ／ｖの洗浄剤とを含み、溶液のｐＨ値は８．５〜１２．５の間であり、選択的に９．０〜１２．０の間であり、さらに選択的に９．５〜１１．５の間であり、前記金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択され、前記洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記浸漬溶液は、ベンジルスルホニルフルオリド及び/またはＮ−エチルマレイミドから選択されるプロテアーゼ阻害剤をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（１）での具体的な方法は１ｋｇあたりの動物組織材料を５〜４２℃で２〜８Ｌの浸漬溶液に６〜４８時間浸漬し、浸漬しながら揺らすことである請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（２）での前記中性洗浄液は無菌濾過した純水、生理的食塩水又は生物学緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（２）において、動物組織材料を中性洗浄液で２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間である請求項１又は５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（３）での前記弱酸性洗浄液は酢酸、酢酸ナトリウム又は塩酸でｐＨ値を５．０〜６．０の間に調整して無菌濾過した生理的食塩水又は２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（３）において、組織基質を弱酸性洗浄液で２〜５回洗浄し、毎回１〜３時間である請求項１又は７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（４）における前記中性溶液はｐＨ値が７．０〜８．０の間である２〜２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジニルエタンスルホン酸緩衝液又は他の生物学的相溶性緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属過酸化物と０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）の洗浄剤とを含み、ｐＨ値は８．５〜１２．５の間にあり、選択的に９．０〜１２．０の間にある、動物組織材料を消毒・滅菌するための動物組織浸漬溶液。
【請求項１１】
前記金属過酸化物は過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化ナトリウム又は過酸化バリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択され、選択的に過酸化カルシウムであり、前記洗浄剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム又はドデシルスルホン酸ナトリウムからなるグループの中の一種又は複数種から選択され、溶液のｐＨ値は９．５〜１１．５の間にある請求項１０に記載の動物組織浸漬溶液。
【請求項１２】
動物組織材料を、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法で消毒・滅菌した後得られる動物組織基質。
【国際調査報告】
2016534118.tif 000009
2016534118.tif 000010
2016534118.tif 000011
2016534118.tif 000012