(57)【要約】  生物学的サンプルからの希体細胞変異の存在の検出はしばしば、大過剰の野生型ＤＮＡの同時存在のために困難である。本発明は、増幅する野生型ＤＮＡを枯渇することにより、変異ＤＮＡの富化を可能にする新規化合物及び方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからの核酸の混合物中の２つの変異体配列の形態で存在する標的核酸配列の変異体の富化方法であり、ここで前記変異体は単一ヌクレオチド位置で異なり：
前記標的核酸配列を含むサンプルを供給し、ここで富化されるべき変異体は大過剰の他方の変異体のうちで少量においてサンプルに存在し；
前記標的核酸配列の１つの鎖に対しいて相補的であるオリゴヌクレオチドを供給し、ここで前記オリゴヌクレオチドは富化されるべき変異体と単一ヌクレオチド位置でミスマッチを有し、そして他方の変異体と単一ヌクレオチド位置で完全に一致し；
前記オリゴヌクレオチド、及び前記標的核酸配列の何れかの変異体の１つの鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収することを含んで成る方法。
【請求項２】
親和性標識を有する前記ミスマッチインターカレーション化合物が、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、そして前記他方の変異体が野生型対立遺伝子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の変異対立遺伝子の検出方法であって、ここで前記変異対立遺伝子は、単一ヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そして大過剰の野生型対立遺伝子間で少量でサンプルに存在し：
前記サンプル中の前記変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化は、
前記標的核酸配列の１つの鎖に対しいて相補的であるオリゴヌクレオチドを供給し、ここで前記オリゴヌクレオチドは変異対立遺伝子と単一ヌクレオチド位置でミスマッチを有し、そして野生型対立遺伝子と単一ヌクレオチド位置で完全に一致し；
前記オリゴヌクレオチド、及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの１つの鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記富化された変異対立遺伝子を含む溶出された緩衝液を回収することにより実施され；
前記富化された変異対立遺伝子を増幅し；そして
前記富化増幅された変異対立遺伝子の生成物、又は前記富化増幅された変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出することを含んで成る方法。
【請求項６】
親和性標識を有する前記ミスマッチインターカレーション化合物が、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅段階が、対立遺伝子特異的プライマーにより行われる、請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
サンプルからの核酸の混合物中の２つの変異体配列の形態で存在する標的核酸配列の変異体の富化方法であり、ここで前記変異体は単一ヌクレオチド位置で異なり：
前記標的核酸配列を含むサンプルを供給し、ここで富化されるべき変異体は大過剰の他方の変異体のうちで少量においてサンプルに存在し；
前記核酸の混合物が変性されるよう、前記サンプルを加熱し；
前記標的核酸の再アニーリングのために適切な条件を提供し、ここで二本鎖オリゴヌクレオチドが、１つの変異体配列の１つの鎖と、他方の変異体配列の１つの鎖との間で形成され、変異体が異なる単一のヌクレオチド位置でミスマッチが生成され；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収することを含んで成る方法。
【請求項１０】
親和性標識を有する前記ミスマッチインターカレーション化合物が、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、そして前記他方の変異体が野生型対立遺伝子である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の変異対立遺伝子の検出方法であって、ここで前記変異対立遺伝子は、単一ヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そして大過剰の野生型対立遺伝子間で少量でサンプルに存在し：
前記サンプル中の前記変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化は；
前記核酸の混合物が変性されるよう、前記サンプルを加熱し；
前記標的核酸の再アニーリングのために適切な条件を提供し、ここで二本鎖オリゴヌクレオチドが、前記変異対立遺伝子の１つの鎖と、野生型対立遺伝子の１つの鎖との間で形成され、対立遺伝子が異なる単一のヌクレオチド位置でミスマッチが生成され；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収することにより実施され；
前記富化された変異対立遺伝子を増幅し；そして
前記富化増幅された変異対立遺伝子の生成物、又は前記富化増幅された変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出することを含んで成る方法。
【請求項１４】
親和性標識を有する前記ミスマッチインターカレーション化合物が、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅段階が、対立遺伝子特異的プライマーにより行われる、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+である、希対立遺伝子ＤＮＡを富化するための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸化学及び核酸増幅の分野に関する。特に、本発明は、核酸における塩基対ミスマッチを検出することができる化合物及び方法を用いて低量変異標的核酸の富化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどのヒト遺伝性疾患及び癌は、核遺伝子中の突然変異により引起されることが知られている。一般的に、突然変異は、遺伝子座での多型変異体であると思われる。突然変異は、しばしば点突然変異とも呼ばれる単一ヌクレオチドの差異であり得る。細胞及び組織レベルで、特異的遺伝子座での多型性は、有意に変更された細胞挙動性を生ぜしめることができる。しかしながら、比較的小さな細胞又は組織サンプルは特定の遺伝子座を含む数百万又は数十億のＤＮＡ分子を含むことができるので、遺伝子座での多型変異体の範囲及び頻度の表示は、非常に低い頻度で潜在的に存在できる対立遺伝子を検出する必要がある。ほとんどの場合、生物学的サンプルからの希突然変異の存在の検出は、大過剰の野生型ＤＮＡの同時存在のために多大な課題を提示する。
【０００３】
従って、低コピー変異ＤＮＡの存在が増幅反応、例えばＰＣＲの実施に従って検出できるよう、それらの低コピー変異ＤＮＡを選択的且つ正確に富化する方法が当業界において必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、低量対立遺伝子の続く検出を可能にするサンプル中のそのような対立遺伝子（例えば、変異ＤＮＡ）を富化するための方法及び組成物に向けられる。第一の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の２つの変異体配列の形態で存在する標的核酸配列の、単一ヌクレオチド位置で異なる変異体の富化方法に関し、ここで前記方法は、前記標的核酸配列を含むサンプルを供給し、ここで富化されるべき変異体は大過剰の他方の変異体のうちで少量においてサンプルに存在し；前記標的核酸配列の１つの鎖に対しいて相補的であるオリゴヌクレオチドを供給し、ここで前記オリゴヌクレオチドは富化されるべき変異体と単一ヌクレオチド位置でミスマッチを有し、そして他方の変異体と単一ヌクレオチド位置で完全に一致し；前記オリゴヌクレオチド、及び前記標的核酸配列の何れかの変異体の１つの鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し；反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収することを含んで成る。
【０００５】
第二の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の、単一ヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そして大過剰の野生型対立遺伝子間で少量でサンプルに存在する変異対立遺伝子の検出方法に関し、ここで前記方法は、前記サンプル中の前記変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化は、前記標的核酸配列の１つの鎖に対しいて相補的であるオリゴヌクレオチドを供給し、ここで前記オリゴヌクレオチドは変異対立遺伝子と単一ヌクレオチド位置でミスマッチを有し、そして野生型対立遺伝子と単一ヌクレオチド位置で完全に一致し；前記オリゴヌクレオチド、及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの１つの鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し；反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記富化された変異対立遺伝子を含む溶出された緩衝液を回収することにより実施され；前記富化された変異対立遺伝子を増幅し；そして前記富化増幅された変異対立遺伝子の生成物、又は前記富化増幅された変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出することを含んで成る。
【０００６】
第三の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の２つの変異体配列の形態で存在する標的核酸配列の、単一ヌクレオチド位置で異なる変異体の富化方法に関し、ここで前記方法は、前記標的核酸配列を含むサンプルを供給し、ここで富化されるべき変異体は大過剰の他方の変異体のうちで少量においてサンプルに存在し；前記核酸の混合物が変性されるよう、前記サンプルを加熱し；前記標的核酸の再アニーリングのために適切な条件を提供し、ここで二本鎖オリゴヌクレオチドが、１つの変異体配列の１つの鎖と、他方の変異体配列の１つの鎖との間で形成され、変異体が異なる単一のヌクレオチド位置でミスマッチが生成され；反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収することを含んで成る。
【０００７】
第四の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の、単一ヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そして大過剰の野生型対立遺伝子間で少量でサンプルに存在する変異対立遺伝子の検出方法に関し、ここで前記方法は、前記サンプル中の前記変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化は；前記核酸の混合物が変性されるよう、前記サンプルを加熱し；前記標的核酸の再アニーリングのために適切な条件を提供し、ここで二本鎖オリゴヌクレオチドが、前記変異対立遺伝子の１つの鎖と、野生型対立遺伝子の１つの鎖との間で形成され、対立遺伝子が異なる単一のヌクレオチド位置でミスマッチが生成され；反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触し、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、そしてミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができず；前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給し；前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離し；そして前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収することにより実施され；前記富化された変異対立遺伝子を増幅し；そして前記富化増幅された変異対立遺伝子の生成物、又は前記富化増幅された変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出することを含んで成る。
【０００８】
第五の側面によれば、本発明は、図２の化合物である、希対立遺伝子ＤＮＡを富化するための化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ロジウム系インターカレーター、Rh(bpy)2(chrysi)3+ (左側) 及びRh(bpy)2(phzi)3+ (右側)の構造を示す。
【図２】図２は、本発明のビオチン系ロジウムインターカレーター、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+の構造を示す。
【図３】図３は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異部位についての完全に一致した変異二重鎖（Ｍ−ＰＭ）及びＣ：Ａミスマッチ二重鎖に対するRh(bpy)2(phzi)3+ 及び Rh(bpy)2(phzi-CO2H)3+の切断効率のＵＰＬＣ分析を示す。
【図４】図４は、ＵＶ照射時間の関数としてのRh(bpy)2(phzi-CO2H)3+ (Rh(カルボキシル)、Rh(bpy)2(phzi)3+ (Rh(Barton))及び Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+ (Rh(bio))の切断効率のグラフ表示である。
【図５】図５は、各ロジウムキレーターの濃度の関数としての、３０分のＵＶ照射後のRh(bpy)2(phzi)3+ (Rh(Barton))及び３０分又は６０分のＵＶ照射後のRh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+ (Rh(bio))の切断効率のグラフ表示である。
【図６】図６は、[Rh(bpy)2(phzi-CO2H)](Cl)3の合成に関与する化合物の構造を示す（実施例５を参照のこと）。
【図７】図７は、[Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)](Cl)3の合成に関与する化合物の構造を示す（実施例６を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
定義
特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常理解される意味を有する。次の参考文献は、本発明に使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される場合、以下の用語は、特に断らない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００１１】
用語「核酸」（nucleic acid）とは、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、等）のポリマー、及び直鎖状又は分岐鎖状で一緒に共有結合されるヌクレオチドを含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡ接合体、ＰＮＡ−ＲＮＡ接合体、等を含むポリマーを言及する。核酸は典型的には、単鎖又は二本鎖であり、そして一般的に、ホスホジエステル結合を含むが、但しある場合、他の主鎖、例えばホスホラミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 及び 米国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、及びペプチド核酸主鎖及び結合（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895を参照のこと）を有する核酸類似体が包含される。他の類似核酸は、正に荷電された主鎖（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）、非イオン性主鎖（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、及び第4,469,863号）及び非リボース主鎖を有するそれら、例えば米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号に記載されるそれらを包含する。１又は２以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義内に包含され（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176を参照のこと）、そして類似体もまた、例えばRawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35に記載されている。リボース−リン酸主鎖のそれらの修飾は、追加の成分、例えば標識の付加を促進するために、又は生理学的環境下でそのような分子の安定性及び半減期を変更するために実施され得る。
【００１２】
典型的には核酸に見出される天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）の他に、ヌクレオチド類似体はまた、天然に存在しない複素環式塩基、例えばSeela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されるそれらも包含する。ヌクレオチド類似体に使用される一定の塩基が、融解温度（Ｔｍ）モディファイアとして作用する。例えば、それらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ、等）、及び同様のものを包含する。例えば、米国特許第5,990,303号を参照のこと。他の代表的複素環式塩基は、例えばヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２,６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの−アザ誘導体；６−アザシチジン;５−フルオロシチジン;５−クロロシチジン;５−ヨードシチジン;５−ブロモシチジン;５−メチルシチジン;５−プロピニルシチジン;５−ブロモビニルウラシル;５−フルオロウラシル;５−クロロウラシル;５−ヨードウラシル;５−ブロモウラシル;５−トリフルオロメチルウラシル;５−メトキシメチルウラシル;５−エチニルウラシル;５−プロピニルウラシル、及び同様のものを包含する。
【００１３】
「ヌクレオシド」（nucleoside）とは、糖成分（リボース糖又はデオキシリボース糖）に共有結合される塩基又は塩基性基（少なくとも１つの同素環、少なくとも１つの複素環、少なくとも１つのアリール基、及び／又は同様のものを含む）、糖の誘導体又は糖成分の機能的同等物（例えば、炭素環）を含む核酸成分を言及する。例えば、ヌクレオシドが糖成分を含む場合、塩基は典型的には、その糖成分の１′位に結合される。上記に記載されるように、塩基は、天然に存在する塩基であっても、又は天然に存在しない塩基であっても良い。典型的なヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド及び炭素環ヌクレオシドを包含する。
【００１４】
「ヌクレオチド」（nucleotide）とは、ヌクレオシドの糖成分の５′位に共有結合される１，２，３又はそれ以上のリン酸基を有する、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルを言及する。
【００１５】
用語「ポリヌクレオチド」（polynucleotide）及び「オリゴヌクレオチド」（oligonucleotide）とは、交換可能的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを記載するために、時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０−１２個のヌクレオチド、又は指定されるヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約１５−３０個のヌクレオチドから構成され得る。
【００１６】
用語「標的核酸配列の変異体を富化する」（enriching a variant of a target nucleic acid sequence）とは、標的核酸配列の所望する変異体の量を増加すること、及びサンプルにおいて所望しない変異体に対して所望する変異体の比率を高めることを言及する。一般的に、富化される所望する変異体は、所望しない変異体よりも、核酸サンプルにおいてはあまり一般的ではなく、そして標的核酸配列のすべての変異体の合計量の５０％以下を占める。多くの場合、所望する変異体は変
【００１７】
本明細書において使用される場合、用語「野生型」（wild type）とは、１つの遺伝子又は対立遺伝子を言及し、それは、天然に存在する源から単離される場合、その遺伝子又は対立遺伝子の特徴を有する。野生型遺伝子又は野生型対立遺伝子は、最も頻繁には、集団で観察され、そして遺伝子又は対立遺伝子の「通常」又は「野生型」形態として任意には呼ばれるそれらである。
【００１８】
対照的に、用語「変異体」（mutant）又は「変異された」（mutated）とは、野生型遺伝子又は対立遺伝子に比較される場合、配列の修飾を示す遺伝子又は対立遺伝子を意味する。用語「変異」（mutation）とは、通常（未変更）又は野生型配列から分化される場合、変異体の形態をもたらす、通常に保存された核酸配列のヌクレオチドの配列の変化を意味する。変異は一般的に、２つの一般的な種類、すなわち塩基対置換（例えば、単一ヌクレオチド置換）及びフレームシフト変異に分けられ得る。後者は、１〜数個のヌクレオチド対の挿入又は欠失を伴う。
【００１９】
用語「対立遺伝子」（allele）とは、わずか１つ又は少数の塩基により異なる２つの配列を言及する。
【００２０】
用語「ミスマッチ」（mismatch）ＤＮＡ又は「ヘテロ二重鎖］（heteroduplex）ＤＮＡとは、１又は２以上のミスマッチ塩基対を含むＤＮＡを意味する。ミスマッチ塩基対は、ＤＮＡ二重鎖の場合、水素結合された塩基対、すなわちＴとＡ又はＧとＣの１つを形成することができない反対の塩基の特定対を言及する。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、１つの鎖における１又は２以上の塩基が反対の鎖における塩基又は複数塩基を補足するか又は補足しない二本鎖ＤＮＡ、及び何れかの鎖の１又は２以上の塩基が、反対の鎖に比較して、１つの鎖における挿入又は欠失のために、反対の塩基を有するか又は有さない二本鎖ＤＮＡを含む。対照的に、ホモ二重鎖ＤＮＡは、各鎖が他の鎖の完全な相補体であり、そして各塩基が反対の塩と、水素結合された塩基対を形成する二本鎖ＤＮＡを言及する。
【００２１】
用語「分子結合パートナー」（molecular binding partners）及び「特異的結合パートナー」（specific binding partners）とは、特異的結合を示す分子対、典型的には生物分子対を言及する。非制限的例としては、受容体及びリガンド、抗体及び抗原、ビオチン及びアビジン、及びビオチン及びストレプタビジンを挙げることができる。分子結合パートナーはまた、下記に定義されるように、「親和性標識」と「親和性マトリックス」との間で発生する結合によっても表され得る。
【００２２】
「親和性」（affinity）標識は、その分子結合パートナーに対して特異的に結合することができる分子である。結合は、共有又は非共有（例えば、イオン、水素、等）結合を通しであり得る。本明細書において使用される場合、親和性標識、例えばビオチンは、親和性マトリックス、例えばストレプタビジン被覆ビーズ又は粒子に対して選択的に結合することができる。
【００２３】
「親和性マトリックス」（affinity matrix）とは、本明細書において使用される場合、その分子結合パートナーに対して特異的に結合することができる固体支持体又は固体マトリックス（例えば、磁気ラテックス粒子、ガラスビーズ）の表面に結合される分子を言及する。結合は、共有又は非共有結合を通してあり得る。本明細書において使用される場合、親和性マトリックス、例えばストレプタビジン被覆磁気ラテックス粒子は、親和性標識、例えばビオチンに対して選択的に結合することができる。
【００２４】
「ＰＣＲ増幅」（PCR amplification）又は単純に「ＰＣＲ」とは、核酸配列に対する多数の相補体を生成するための鋳型としてのその核酸配列の使用を包含するポリメラーゼ鎖反応を意味する。鋳型は、鋳型配列の一部に対して相補的な配列を有するプライマーにハイブリダイズされ、そしてｄＮＴＰ及びポリメラーゼ酵素を含む適切な反応混合物と接触され得る。プライマーは、オリジナル鋳型に対して相補的な核酸を生成するポリメラーゼ酵素により拡張される。二本鎖核酸分子の両鎖の増幅のためには、２つのプライマーが使用され、各プライマーは、核酸鎖の１つの一部に対して相補的である配列を有することができる。核酸分子の鎖は例えば、加熱することにより変性され、そしてその工程が反復され、そして前の段階の新しく合成された鎖が続く段階において鋳型として作用する。ＰＣＲ増幅プロトコルは、十分な量の標的核酸を生成するために、変性、ハイブリダイゼーション及び拡張反応の少数〜多くのサイクルを包含することができる。
【００２５】
用語「対立遺伝子−特異的プライマー」（allele-specific primer）又は「ＡＳプライマー」（ＡＳ  primer）とは、標的配列の１つ以上の変異体にハイブリダイズするが、しかし変異体の１つによってのみ、プライマーは適切な条件下で核酸ポリメラーゼにより十分に拡張されることで、標的配列の変異体間を区別することができるプライマーを意味する。標的配列の他方の変異体によれば、拡張は効果的ではなく、非効率的であり、又は検出できない。
【００２６】
用語「共通プライマー」（common primer）とは、対立遺伝子−特異的プライマーを含むプライマー対における第二プライマーを意味する。共通プライマーは、対立遺伝子−特異的ではなく、すなわち対立遺伝子−特異的プライマーが識別する、標的配列の変異体間を識別しない。
【００２７】
用語「相補的」（complementary）又は「相補性」（complementarity）は、ワトソン・クリック塩基対規則により関連するポリヌクレオチドの逆平行鎖に関して使用される。用語「完全に相補的」（perfectly complementary）又は「１００％相補的」（100% complementary）とは、逆平行鎖間のすべての塩基のワトソン・クリック対合を有し、すなわちポリヌクレオチド二重鎖における任意の２つの塩基間にミスマッチが存在しない相補的配列を意味する。しかしながら、二重鎖は、完全な相補性の不在下でさえ、逆平行鎖間で形成される。用語「部分的に相補的」（partially complementary）又は「不完全に相補的」（incompletely complementary）とは、１００％、完全ではない（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖に少なくとも１つのミスマッチ又はマッチしない塩基が存在する）、逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の任意のアライメントを意味する。部分的に相補的鎖間の二重鎖は一般的に、完全な相補的鎖間の二重鎖よりも低い安定性である。
【００２８】
用語「サンプル」（sample）とは、核酸を含むか又は含まれると推定される任意の組成物を言及する。これは、個人から単離された組織又は体液、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官及び腫瘍のサンプル、及びまた、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそれらから単離される核酸のサンプルを言及する。
【００２９】
用語「一次配列」（primary sequence）とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列を言及する。ヌクレオチド修飾、例えば窒素含有塩基修飾、糖修飾又は他の主鎖修飾は、一次配列の一部ではない。標識、例えばオリゴヌクレオチドに接合される発色団もまた、一次配列の一部ではない。従って、２つのオリゴヌクレオチドは、同じ一次配列を共有することができないが、しかし修飾及び標識に関しては異なることができる。
【００３０】
用語「プライマー」（primer）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして核酸の相補的鎖に沿って合成の開始点として、そのような合成のために適切な条件下で作用することができるオリゴヌクレオチドを言及する。本明細書において使用される場合、用語「プローブ」（probe）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして通常、検出可能的に標識されるオリゴヌクレオチドを言及する。プローブは、修飾、例えば核酸ポリメラーゼ、及び１又は２以上の発光団によりプローブを非延長性にする３′−末端修飾を有することができる。同じ配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つのアッセイにおいてプライマーとして、及び異なったアッセイにおいてプローブとして作用することができる。
【００３１】
本明細書において使用される場合、用語「標的配列」（target sequence）、「標的核酸」（target nucleic acid）又は「標的物」（target）とは、増幅されるか、検出されるか、又は両者である核酸配列の一部を言及する。
【００３２】
用語「ハイブリダイズされる」（hybridized）及び「ハイブリダイゼーション」（hybridization）とは、二重鎖の形成をもたらす、２つの核酸間の塩基対合相互作用を言及する。２つの核酸は、ハイブリダイゼーションを達成するために、それらの全長にわたって１００％の相補性を有することは必要条件ではない。
【００３３】
用語「選択的ハイブリダイゼーション」（selective hybridization）及び「特異的ハイブリダイゼーション」（specific hybridization）とは、他の核酸もまた存在する複合混合物に存在する特定核酸に対する核酸の主な（ハイブリダイズする分子の５０％又はそれ以上）又はほぼ独占的な（ハイブリダイズする分子の９０％又はそれ以上）ハイブリダイゼーションを言及する。例えば、典型的ＰＣＲ条件下で、プライマーは、溶液にまた存在する非標的核酸を除いて、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズされたプライマーは、標的核酸の増幅を駆動し、少なくとも最も主要な増幅生成物であり、そして好ましくは、ほぼ独占的（例えば、サンプルにおけるすべての増幅生成物の９０％又はそれ以上を表す）増幅生成物である標的核酸の増幅生成物を生成する。好ましくは、非特異的増幅生成物は、検出できないか、又は特異的増幅生成物から容易に区別できるよう少量で検出されるような少量で存在する。同様に、プローブは、反応混合物にも存在する非標的核酸を除いて、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズされたプローブは、少なくとも最も主要なシグナルであり、そして好ましくは、ほぼ独占的（例えば、サンプルにおけるすべての増幅生成物の９０％又はそれ以上を表す）シグナルである検出可能シグナルを生成するために、標的核酸の特異的検出を可能にする。
【００３４】
臨床及び診断用途に直面する主要な懸念は、臨床学的に有意に低いレベルの突然変異及び少数対立遺伝子を検出する能力である。突然変異を検出する能力は、多くの患者領域において重要であるが、しかし特に、組織検体及び体液、例えば血漿又は血清からの初期癌検出のために重要である。希な突然変異又は対立遺伝子の検出が有意である他の領域は、患者の病期分類及び予後のための分子プロファイリング、又は個々の患者への治療の適合化、及び治療結果及び疾患の寛解／再発のモニターリングを包含する。癌関連突然変異の効果的検出は、使用される技法及び方法の選択性を依存する。腫瘍遺伝子及び腫瘍サプレッサー遺伝子の検出及び同定は、種々のタイプのサンプル、例えば前癌又は癌組織、痰、尿、便及び血液中の循環性細胞外ＤＮＡの分析を必要とする。サンプルは典型的には、野生型及び変異ＤＮＡの両者から成り、そして野生型ＤＮＡの量はしばしば、それらの低存在量の変異の検出及び同定を、非常に困難にする，１０1〜１０8又は１０9倍、変異ＤＮＡの量を越える。
【００３５】
多くの方法が、突然変異を検出するために使用されて来た。一組の方法においては、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、検出システムの構成要素である。ＰＣＲは、非常に多くの他の配列（例えば、野生型ＤＮＡ）間に存在する標的核酸配列（例えば、変異ＤＮＡ）を特異的に増幅することができる。対立遺伝子−特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）は、単一のヌクレオチドほど異なる配列間を区別できる方法である。ＰＣＲ及びＡＳ−ＰＣＲの感度及び特異性は、核酸の標的変異体（例えば、変異体）が非常に多量の非標的変異体（例えば、野生型）の存在下でさえ、選択的に増幅され得るようなものである。多くのＡＳ−ＰＣＲアッセイに関しては、変異ＤＮＡは、その変異ＤＮＡ集団よりも１００〜１，０００倍の集団を有する過剰の野生型ＤＮＡ下で検出され得る。しかしながら、この感度レベルは、野生型ＤＮＡに対して１０-3〜１０-6の比率で変異体が存在する非常に低い濃度の変異を正確に検出し、そして同定するためには不十分である。従って、富化方法の使用はしばしば、正確且つ精度の高い検出が達成され得るレベルに、変異体濃度を高めるのに有益であり、又は必要である。
【００３６】
米国特許第６，０３１，０９８号において、Ｂａｒｔｏｎなどは、一対の大きなインターカレディングリガンド、すなわち５，６−クリセンキノンジイミン（chrysi）及び３，４−ベンゾ［ａ］フェナジンキノンジイミン（phzi）に基づいて２つのファミリーのミスマッチ−特異的ロジウム系インターカレーターの合成及び機能を記載している。それらの分子の構造は、図１に示されている。両化合物においては、立体的拡張性リガンドは通常のＢ形ＤＮＡの塩基スタック中に容易にインターカレートするには大き過ぎる。しかしながら、前記化合物は、熱力学的に不安定化されたミスマッチ部位に高い親和性で結合することができる。結合親和性は、Rh(bpy)2(chrysi)3+については１０6Ｍ-1及びRh(bpy)2(phzi)3+については１０8Ｍ-1の順である。親和性は、ミスマッチに関連した不安定化と相関する。親和性とミスマッチ安定化との間の相関関係は、金属錯体が塩基対スタック中に挿入される場合、ミスマッチ塩基を押し出す容易さに基づいて理解され得る。最も不安定化される部位が金属錯体により最も容易に結合される。すべてにおいて、化合物は、すべての可能な配列において、ミスマッチ部位の８０％以上を結合する。それらのロジウム系インターカレーターは、ワトソン・クリック塩基対ＤＮＡ部位上のミスマッチＤＮＡ部位に対して１，０００倍又はそれよりも高い選択性を示す。ミスマッチを、強く且つ選択的に結合する他に、錯体は光活性化に基づいてミスマッチ部位で直接的な鎖切断を促進する。２ｋｂのプラスミド内の単一のミスマッチがそれらのインターカレーター分子により結合され、そして切断され得ることが示された。
【００３７】
本発明は、ロジウム系インターカレーターのミスマッチ結合性質を利用し、そして固体支持体へのその固定化を可能にする、より高い結合親和性化合物、Rh(bpy)2(phzi)3+の新規修飾バージョンの合成を記載している。そのような修飾されたロジウムキレーター化合物の１つの例が、図２上に示されている。低量の変異体ＤＮＡが、単一の塩基ミスマッチを含むヘテロ二重鎖として存在する条件を生成することにより、変異体ＤＮＡはその固定された（phzi）インターカレーターを用いて捕獲され、そしてミスマッチを含まず、そして（phzi）インターカレーターに結合できない過剰量の野生型ＤＮＡから分離され得る。次に、富化された変異体ＤＮＡ集団が、検出のために増幅反応（例えば、対立遺伝子−特異的ＰＣＲ）を受けることができる。
【００３８】
以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。
【実施例】
【００３９】
実施例１：メチル５，６−ジヒドロ−５，６−ジオキソベンゾ［ａ］フェナジン−９−カルボキシレートの合成
２，３−ジクロロナフタレン−１，４−ジオン（４，５ｇ、２０ｍｍｏｌ）、メチル３，４−ジアミノベンゾエート（３，３２ｇ、２０ｍｍｏｌ）及びピリジン１５０ｍｌを、２５０ｍｌの丸底フラスコに添加し、そして還流冷却器に１時間、置いた。溶液は暗赤褐色であるように見えたが、しかし沈殿の兆候を形成しなかった。何れかの沈殿物が室温で形成される場合、溶液を観察のために一晩、放置した。
【００４０】
反応物を一晩、冷却した後、沈殿物が形成し、そして予め計量した焼結ガラス漏斗で濾過し、赤褐色の固形物を生成した。中間体をピリジンによりすすぎ、そして真空デシケ−ターにおいて一晩、乾燥した。漏斗を次のモニターリングのために再び計量し、そして５，７ｇの中間体が単離されたことを示した。次に、この全量を、下記に記載される酸化工程にゆだねた。
【００４１】
酸化工程においては、中間体を２５０ｍｌの丸底フラスコに配置し、そして５０ｍｌの酢酸、３．０ｍｌの脱イオン水及び５ｍｌの濃硝酸を、激しい磁気攪拌下で、順に注意して添加した。次に、その反応混合物を、煮沸槽に配置し、そして還流した。明るい黄色の沈殿物が、加熱に基づいて形成し始めた。重度の沈殿物のために、攪拌棒が動かなくなった。これを軽減するために、さらなる１０ｍｌのアリコートの氷酢酸を添加した。反応混合物を１時間、還流し、そして次に、室温に冷却し、そして濾過し、黄金色の粉末状固形物を得た。この生成物をまた、各２０ｍｌのエタノール及びジエチルエーテルによりすすぎ、そして乾燥のために一晩、放置した。
【００４２】
実施例２：合成：[Rh(bpy)2Cl2]Cl
[Rh(bpy)2Cl2]Clを、Zeglis, B.M. & Barton, J.K. Nat. Protoc. 2007, 2, 122-134に従って調製した。手短に言及すると、ＲｈＣｌ3（０．６４ｇ、２．８ｍｍｏｌ）及びヒドラジン一塩酸塩（５０ｍｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌの丸底フラスコにおいて１２．４ｍｌの脱イオン水に溶解した。２０ｍｌのエタノールに０．８５ｇ（５．６ｍｍｏｌ）の２，２′−ビピリジルを溶解することにより製造された、別々に調整された溶液をまた同じ５０ｍｌの丸底フラスコに添加した。溶解された酸素を、真空の反復した適用、続いてアルゴンガスによる逆充填により除去した。これに続いて、すべての材料が溶解するまで、その反応混合物を還流した。２０分の還流の後、反応は鮮やかなオレンジ色の溶液になり、そして焼結ガラスフィルター漏斗により濾過した。溶液に存在する生成物のみを単離し、そして何れかの不溶性不純物を除去するために、溶液を暖めながら濾過することが重要である。次に、炉液を４℃で一晩、貯蔵し、結晶化を促進した。
【００４３】
冷却された濾液を濾過し、黄色の結晶性固形物を得た。得られる[Rh(bpy)2Cl2]Clの質量は７８０ｍｇであり、そして乾燥チャンバーにおいて周囲温度で貯蔵した。
【００４４】
実施例３：合成：[Rh(bpy)2(OTf)2]OTf
[Rh(bpy)2Cl2]Cl（５００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、１４／２０ジョイントを有する３口丸底フラスコに配置した。２つのゴム製セプタムを、フラスコの左右首端上に配置し、そしてアダプターを、その中央に配置し、塩酸をパージした。フラスコを、含まれる任意の空気を排気し、続いてアルゴンガスを充填することにより脱酸素化した。次に、トリフリック酸を注意して添加、そしてすばやく[Rh(bpy)2Cl2]Clを溶解し、黄色の透明な溶液を得た。文献は反応溶液の１６時間の攪拌を示しているので、それを一晩、放置した。
【００４５】
アセトン／ドライアイス槽を、次の工程のために調製し、ここで３００ｍｌのジエチルエーテルを、乾燥管を備えた、１０００ｍｌの丸底フラスコ中に注ぎ、そしてドライアイス槽下で冷却した。その反応混合物の溶液を、添加管中に注ぎ、そして冷ジエチルエーテル溶液に滴下した。反応混合物は、フラスコの底で沈殿した淡黄色固形物として濁って見えた。その沈殿した生成物を、計量された中位の焼結ガラス漏斗を通して濾過し、そして湿気に対して非常に敏感であることが見出されたので、真空デシケーターに、すぐに配置した。７５０ｍｇの収量のすべての材料を、次の工程のために使用した。
【００４６】
実施例４：[Rh(bpy)2(NH3)2](OTf)3の合成
前の反応で得られたすべての[Rh(bpy)2(OTf)2]OTfを、２５０ｍｌの丸底フラスコに配置した。次に、３０ｍｌの水酸化アンモニウムを、そのフラスコに添加し、そして攪拌した。次に、その混合物を還流し、そしてすべての成分が淡黄色の溶液に見えるまで、約１５分間、煮沸した。次に、過剰水酸化アンモニウムを、回転蒸発により除去し、黄白色の固形物を得た。この生成物（最終収量７２０ｍｇ）を、真空デシケーターにおいて一晩、乾燥した。
【００４７】
実施例５：[Rh(bpy)2(phzi-CO2H)](Cl)3の合成
キノンリガンド
メチル５，６−ジヒドロ５，６−ジオキソベンゾ［ａ］フェナジン−９−カルボキシレート、
メチル５，６−ジヒドロ５，６−ジオキソベンゾ［ａ］フェナジン−１０−カルボキシレート、の混合物
【００４８】
５００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）の[Rh(bpy)2(NH3)2](OTf)3及び図６に記載されるようなキノンリガンド１９８．７５ｍｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）を、周囲温度で２５０ｍｌのアセトニトリルに溶解した。その後まもなく、０．４Ｍの水酸化ナトリウム１０ｍｌを、反応に添加し、そして密封溶液において３時間、攪拌した。色の変化が観察され、これは、反応が起こったことを知らせる。反応混合物のＬＣ−ＭＳ分析は、アルカリ性接合条件下で、所望する化合物が、メチルエステル中間体の現場加水分解により得られたことを示した。次に、反応を、中性ｐＨが達成されるまで、増分量の０．４Ｍの塩酸を添加することにより、ｐＨ７に中和した。反応に含まれるアセトニトリルを、周囲温度での回転蒸発により除去した。
【００４９】
得られる残渣はフラスコを覆い、そして褐色で黄色の外観を有し、次にこれを少量の脱イオン水（〜２５ｍｌ）に溶解した。次に、この溶液を、４℃で一晩、貯蔵した。粗生成物を、次の条件下で半−分取カラムを用いて、逆相ＨＰＬＣにより精製した。
カラム：
Waters Symmetry Shield RP8、5um、7.8x300mm、P/N WAT248000、 L/N M90845D01
緩衝液：
Ａ：１００ｍＭのＴＥＡＡ
Ｂ：アセトニトリル
流速：６ｍｌ／分
【００５０】
カラムを、１００％Ａ緩衝液において平衡化し、そして全サンプル量（５３ｍｌ）を、６ｍｌ／分の流速でポンプを通して注入した。１００％Ａにより５分間、さらに洗浄した後、勾配が開始し、そして３０秒（３ｍｌ）画分を集めた。
【００５１】
画分をＬＣ−ＭＳ分析により分析し、そして最も純粋な画分をプールし、そして凍結乾燥した。ＬＣ−ＭＳ分析は、所望する生成物に関して、７１５のＭ／ｅで予想される親イオンピーク、及び親ロジウム錯体に非常に類似するＵＶスペクトルを示した。
【００５２】
実施例６：[Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)](Cl)3の合成
図７に記載されるように、Rh(bpy)2(phzi-COOH)Cl3（１６０ｍｇ、１９５μモル）を、２５０ｍｌの丸底フラスコにおいて、激しい磁気攪拌下で２０ｍｌのＤＭＦに溶解し、これとは別に、１００ｍｇ（２３９μモル）のEZ-Link Amine-PEG3-ビオチン (Thermo Scientific, 製品# 21347)を、４０ｍｌのアセトニトリルに溶解した。注意：少量の材料が未溶解のまま存続した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ３−ビオチン溶液を、攪拌下で前記フラスコに添加した。それとは別に、ＴＢＴＵ [Ｏ−(ベンゾトリアゾール−１−イル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ‘,Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート] (Alfa Aesar, 在庫番号L13470)の０．５Ｍ溶液を、２ｍｌのアセトニトリルにその３２１ｍｇを溶解することにより、アセトニトリル下で調製し、そしてこれを、攪拌下で反応に添加した。反応を室温で３０分間、進行せしめ、そしてその進行を、アリコートを取出し、そしてＬＣ−ＭＳにより分析することによりモニターした。この分析は、出発材料のすべてが消費され、そして主要反応生成物が所望する標的分子、[Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)](Cl)3（図２）であるように思えたことを明白に示した。さらに、密接に溶出するマイナー副産物もまた観察された。反応を９０分間、攪拌した。いくらかの不溶性物質がこの時点で認められ、そして反応混合物を、ひだ付きフィルター紙を通して濾過した。濾液を、脱イオン水により５００ｍｌに希釈し、そして０．４５ミクロンのフィルターを通して再び濾過した。この物質を、下記のように逆相ＨＰＬＣによる精製のために必要とされるまで、冷蔵庫に貯蔵した。
【００５３】
ＬＣ−ＭＳ分析
上記反応を、Ｃ−８逆相カラム及び２０分間にわたっての１０ｍＭのＴＥＡＡ中、１５−３０％アセトニトリルの直線勾配を用いて、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
精製
分取逆相ＨＰＬＣに基づく方法を、下記のようにして開発した。
カラム：
Waters Symmetry Shield RP8、5um、7.8x300mm、P/N WAT248000、 L/N M90845D01
緩衝液：
Ａ：１００ｍＭのＴＥＡＡ
Ｂ：アセトニトリル
流速：３ｍｌ／分
【００５４】
カラムを、１００％Ａ緩衝液において平衡化し、そして粗生成物の１/５（１００ｍｌ）を、４ｍｌ／分の流速でポンプを通して注入した。１００％Ａにより５分間、さらに洗浄した後、勾配が開始し、そして６０秒（３ｍｌ）画分を集めた。
【００５５】
画分をＬＣ−ＭＳ分析により分析し、そして最も純粋な画分をプールし、そして凍結乾燥した。
【００５６】
実施例７：ロジウムキレーターを用いてのミスマッチＤＮＡの光切断
アッセイを、ミスマッチ部位を含むＤＮＡ二重鎖の光活性化に基づいて、インターカレートし、そして鎖切断を促進する、ロジウムキレーターの能力を試験するために企画した。ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子のＴ７９０Ｍ点突然変異に及び蛍光色素により結合されるオリゴヌクレオチドを、次の特徴により合成した。アミノ酸位置７９０で「Ｃ」対立遺伝子を有する野生型遺伝子のセンス鎖のためのオリゴヌクレオチドを、ＦＡＭ蛍光団（ＷＴ−Ｓ−ＦＡＭ）により結合した。野生型遺伝子（「Ｇ」残基を有する）のアンチセンス鎖のための相補的オリゴヌクレオチドを、ＪＡ２７０蛍光団（ＷＴ−ＡＳ−ＪＡ２７０）により結合した。「Ｔ」対立遺伝子を有するＴ７９０Ｍ変異遺伝子のセンス鎖のためのオリゴヌクレオチドを、ＨＥＸ蛍光団（Ｍ−Ｓ−ＨＥＸ）により結合した。Ｔ７９０Ｍ変異遺伝子（「Ａ」残基を有する）のアンチセンス鎖のための相補的オリゴヌクレオチドを、Ｃｙ５．５蛍光団（Ｍ−ＡＳ−Ｃｙ５．５）により結合した。野生型オリゴヌクレオチドと変異オリゴヌクレオチドとの間で生成される二本鎖は完全にマッチされるが、ところが１つの野生型オリゴヌクレオチドと１つの変異オリゴヌクレオチドとの間で生成される二本鎖は点突然変異の部位でミスマッチを担持する。例えば、ＷＴ−Ｓ−ＦＡＭオリゴヌクレオチドとＭ−ＡＳ−Ｃｙ５．５オリゴヌクレオチドとの間での二本鎖は、ロジウムキレーターにより認識され、そして光活性化に基づいて切断されるＣ：Ａミスマッチを含むであろう。
【００５７】
１０μＭの親ロジウムキレーター、Rh(bpy)2(phzi)3+（図１）又はカルボキシル中間体ロジウムキレーター（実施例５におけるプロトコルに従って合成された）の何れかを、完全にマッチした変異ニ重鎖を生成するためのＭ−Ｓ−ＨＥＸ及びＭ−ＡＳ−Ｃｙ５．５、又はＣ：Ａミスマッチ二重鎖を生成するためのＷＴ−Ｓ−ＦＡＭ及びＭ−ＡＳ−Ｃｙ５．５の何れかから成る、２μＭのオリゴヌクレオチド対と共にインキュベートした。インキュベーションに続いて、その溶液を、UV Stratalinker（登録商標）1800 (Stratagene)を用いて、０〜６０分間、３６５ｎｍの波長で照射し、そして切断の有無について、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣカラム及び蛍光検出器を用いて分析した。実験の結果は、図３に示されている。両ロジウムキレーターは、完全にマッチした変異二本鎖に存在する切断を示さない（Ｍ−ＰＭカラム）。対照的に、効率的な切断が、損なわれていないオリゴヌクレオチドピークの消出、及びＵＶ照射に続いての切断されたオリゴヌクレオチドピークの出現を伴って、Ｃ：Ａミスマッチ二重鎖に観察された。類似する結果が、キレーターが野生型の完全にマッチしたオリゴヌクレオチド二重鎖と共にインキュベートされる場合、観察されたが、ところがカルボキシル中間体ロジウムキレーターは、わずかな量の非特異的切断を示した（データは示されていない）。
【００５８】
実施例８：ロジウムキレーターの比較
実施例７に記載される実験と同じ条件を用いての実験を行い、Ｃ：Ａミスマッチを含むオリゴヌクレオチド二重鎖の切断における、親ロジウムキレーターRh(bpy)2(phzi)3+、カルボキシル中間体キレーターRh(bpy)2(phzi-CO2H)3+及びビオチン結合ロジウムキレーターRh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+の性能を比較した。２μＭのＣ：Ａミスマッチ二重鎖を、１０μＭのロジウムキレーターと共にインキュベートし、続いて、０、１５、３０、４５及び６０分間の光活性化にゆだねた。この実験の結果は、図４上に示される。ビオチン結合ロジウムキレーターは、他の２つのロジウムキレーターにより示される９０−９８％の切断に比較して、ＵＶ照射の６０分後、二重鎖の約６０％の切断を示した。
【００５９】
次に、異なった濃度のキレーターを用いてのビオチン結合ロジウムキレーターの切断活性を、調査し、そして同じ濃度範囲での親ロジウムキレーターの切断活性と比較した。その結果は図５に示されている。５μＭ及び１０μＭの濃度で、親ロジウムキレーターは、ビオチン結合ロジウムキレーターよりも高い切断効率を示した。しかしながら、１５μＭ以上の濃度で、親キレーターは一貫性のない切断効率を示したが、ところがビオチン結合ロジウムキレーターは、６０分のＵＶ照射に続いて、２５μＭの濃度で観察される９０％以上の切断を伴って、それらの高い濃度で効果的切断を示した。
【００６０】
実施例９：Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+を用いて変異ＤＮＡの富化及び検出
核酸、例えばヒトゲノムＤＮＡの混合物が抽出され得るサンプルを提供する。サンプルは、組織、例えば皮膚、器官、及び腫瘍から、又は体液、例えば血液、血漿、血液、尿から、又は核酸を含むか又は含むと思われる任意の組成物からであり得る。核酸のこの混合物から、興味ある標的遺伝子、例えばヒトＥＧＦＲ遺伝子は、一定の変動、例えば非変異体又は野生型遺伝子であろう、大過剰の遺伝子の他方の変異体中で低量で存在する点突然変異を含むことができる。
【００６１】
標的遺伝子の低存在量の変異対立遺伝子を富化するために、標的遺伝子の野生型対立遺伝子の鎖（例えば、センス鎖又は鎖Ｓ）の１つに対して相補的であり、そして完全にマッチする過剰のオリゴヌクレオチド（オリゴＣ）を、抽出されたゲノムＤＮＡを含む溶液に添加する。次に、この溶液を、９０℃又はそれ以上の温度で加熱し、二本鎖ゲノムＤＮＡを変性し、そして次に、一本鎖ＤＮＡの再アニーリングの発生を可能にする温度に徐々に冷却する。アニーリング工程の間、いくらかの鎖Ｓ：オリゴＣ二本鎖が形成することができ、ここで野生型ＤＮＡ−鎖Ｓ：オリゴＣハイブリッドが完全にマッチされるが、しかし変異ＤＮＡ−鎖Ｓ：オリゴＣ二本鎖は点突然変異の位置でミスマッチを有するであろう。
【００６２】
次に、ビオチン結合ロジウムキレーターRh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+を、前記溶液に添加し、そしてキレーターがミスマッチの位置で変異ＤＮＡ−鎖Ｓ：オリゴＣ二本鎖に結合できるようインキュベートする。そのような固体マトリックスの例は、ストレプタビジン被覆磁気粒子、例えばInvitrogenからのストレプタビジン−カップリングされたDynabeads（登録商標）、PromegaからのストレプタビジンMagneSphere（登録商標）Paramagnetic Particles、及びSolulinkからのNanoLink（登録商標）及び MagnaLink（登録商標）ストレプタビジン磁気ビーズである。インキュベーション（例えば、４０℃、１時間）に続いて、磁石を用いて、粒子を分離し、そして野生型ＤＮＡ及び過剰のオリゴＣを含む、前記粒子に結合されていないすべての核酸を洗浄する。次に、結合された変異ＤＮＡ−鎖Ｓを、適切な溶離緩衝液を用いて、磁気粒子から溶離し、そして次に、増幅反応への使用のための鋳型として作用することができる。ＥＧＦＲ遺伝子を例として用いて、種々の変異ＥＧＦＲ対立遺伝子を、米国特許出願番号第１３／３２４，７０５号に開示されるリアルタイムＰＣＲ条件下で対立遺伝子−特異的プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて増幅することができる。
【００６３】
標的遺伝子の低存在量変異対立遺伝子を富化するための別の方法において、サンプルを、核酸の混合物の一本鎖分子への変性のために十分な高温（例えば、９５℃）で加熱した。次に、温度を下げ、各一本鎖のその相補鎖との再アニーリングを可能にする。変異対立遺伝子を担持する、すべて又はほとんどすべての一本鎖を、野生型対立遺伝子を含む相補鎖にアニーリングし、変異体：野生型ミスマッチ二本鎖を形成する。次に、ビオチン結合ロジウムキレーターh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+を、前記溶液に添加し、そしてキレーターがミスマッチ二本鎖に対して特異的に結合できるようインキュベートする。実験の残りを、上記のようにして実施し、検出のために増幅反応に使用され得る変異ＤＮＡの富化された集団をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月15日(2014.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の変異体を富化する方法であって、前記標的核酸は２つの変異体配列の形態で存在し、前記変異体は単一のヌクレオチド位置で異なり、前記方法は：
前記標的核酸配列を含むサンプルを供給する工程であって、ここで富化されるべき変異体は大過剰の他方の変異体の中で少量においてサンプル中に存在する、工程；
前記標的核酸配列の１つの鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを供給する工程であって、ここで前記オリゴヌクレオチドは富化されるべき変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し、そして他方の変異体と単一のヌクレオチド位置で完全に一致する、工程；
前記オリゴヌクレオチド、及び前記標的核酸配列の何れかの変異体の１つの鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供する工程；
前記核酸の混合物が変性されるように前記サンプルを加熱する工程；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触させる工程であって、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、かつミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができない、工程；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給する工程；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離する工程；及び
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収する工程を含み、
ここで前記親和性標識を伴うミスマッチインターカレーション化合物は、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、そして前記他方の変異体が野生型対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の変異対立遺伝子を検出するための方法であって、前記変異対立遺伝子は、単一のヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、かつ大過剰の野生型対立遺伝子の中で少量においてサンプルに存在し、前記方法は：  前記サンプル中の前記変異対立遺伝子を富化する工程であって、ここで前記富化は、
前記標的核酸配列の１つの鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを供給する工程であって、ここで前記オリゴヌクレオチドは変異対立遺伝子と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し、そして野生型対立遺伝子と単一のヌクレオチド位置で完全に一致する工程；
前記核酸の混合物が変性されるよう前記サンプルを加熱する工程；
前記オリゴヌクレオチド、及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの１つの鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供する工程；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触させる工程であって、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、かつミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができない、工程；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給する工程；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離する工程；及び
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記富化された変異対立遺伝子を含む溶出された緩衝液を回収する工程により行われる、工程、
前記富化された変異対立遺伝子を増幅する工程；及び
前記富化増幅された変異対立遺伝子の生成物、又は前記富化増幅された変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出する工程を含み、
ここで前記親和性標識を伴うミスマッチインターカレーション化合物は、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程が、対立遺伝子特異的プライマーにより行われる、請求項４〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の変異体を富化する方法であって、前記標的核酸は２つの変異体配列の形態で存在し、前記変異体は単一のヌクレオチド位置で異なり、前記方法は：
前記標的核酸配列を含むサンプルを供給する工程であって、ここで富化されるべき変異体は大過剰の他方の変異体の中で少量においてサンプルに存在する、工程；
前記核酸の混合物が変性されるように、前記サンプルを加熱する工程；
前記標的核酸の再アニーリングのために適切な条件を提供する工程であって、ここで二本鎖オリゴヌクレオチドが、１つの変異体配列の１つの鎖と、他方の変異体配列の１つの鎖との間で形成され、変異体が異なる単一のヌクレオチド位置でミスマッチが生成される、工程；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触させる工程であって、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、かつミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができない、工程；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給する工程；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離する工程；及び
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収する工程を含み、
ここで前記親和性標識を伴うミスマッチインターカレーション化合物は、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+であることを特徴とする、方法。
【請求項８】
前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、そして前記他方の変異体が野生型対立遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸配列の変異対立遺伝子を検出するための方法であって、ここで前記変異対立遺伝子は、単一のヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そして大過剰の野生型対立遺伝子の中で少量においてサンプルに存在し、前記方法は：
前記サンプル中の前記変異対立遺伝子を富化する工程であって、ここで前記富化は；
前記核酸の混合物が変性されるように、前記サンプルを加熱する工程；
前記標的核酸の再アニーリングのために適切な条件を提供する工程であって、ここで二本鎖オリゴヌクレオチドが、前記変異対立遺伝子の１つの鎖と、野生型対立遺伝子の１つの鎖との間で形成され、対立遺伝子が異なる単一のヌクレオチド位置でミスマッチが生成される、工程；
反応混合物を生成するために、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと、親和性標識により結合されるミスマッチインターカレーション化合物とを接触させる工程であって、ここで前記ミスマッチインターカレーション化合物は、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、かつミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができない、工程；
前記反応混合物を、前記ミスマッチインターカレーション化合物上の親和性標識を認識し、そして結合する親和性マトリックスに供給する工程；
前記反応混合物を洗浄し、そして親和性マトリックスに結合されていないすべての材料から親和性マトリックスを分離する工程；及び
前記親和性マトリックスから核酸を溶出する緩衝液を供給し、そして前記標的核酸配列の富化された変異体を含む溶出された緩衝液を回収する工程により行われる、工程；
前記富化された変異対立遺伝子を増幅する工程；及び
前記富化増幅された変異対立遺伝子の生成物、又は前記富化増幅された変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出する工程を含み、
ここで前記親和性標識を伴うミスマッチインターカレーション化合物は、Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+であることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅工程が、対立遺伝子特異的プライマーにより行われる、請求項１０〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
Rh(bpy)2(phzi)(PEG3-ビオチン)3+である、希対立遺伝子ＤＮＡを富化するための化合物。
【国際調査報告】
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