(57)【要約】  放射性核種に結合した単離ポリペプチドの使用方法であって、単離ポリペプチドが、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する使用方法が記載されている。方法は、ＨＳＰ９０阻害に対する反応をモニタリングするための方法であって、１８Ｆに結合した単離ポリペプチドを使用することを含む。本願はまた、その取り込みをモニタリングしてＨＳＰ９０阻害を測定するためのイメージング剤としての、１８Ｆに結合した単離ポリペプチドの使用であって、単離ポリペプチドが、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ９０阻害に対する反応をモニタリングするための方法であって、
（ａ）１８Ｆに結合した単離ポリペプチドを被験体に投与する工程であって、単離ポリペプチドが、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する工程と、
（ｂ）被験体をイメージングする工程と、
（ｃ）イメージング剤組成物の取り込みをモニタリングしてＨＳＰ９０阻害を測定する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
単離ポリペプチドが、その配列が配列表に記載されているＨＥＲ２結合１８Ｆ放射性標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子ＺＨＥＲ２：２８９１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
その取り込みをモニタリングしてＨＳＰ９０阻害を測定するためのイメージング剤としての、１８Ｆに結合した単離ポリペプチドの使用であって、単離ポリペプチドが、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、使用。
【請求項４】
その取り込みをモニタリングしてＨＳＰ９０阻害を測定するためのイメージング剤を製剤化するための、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＨＳＰ９０阻害に対する癌患者（乳房腫瘍、胃腫瘍及び他のＨＥＲ２発現腫瘍）の反応をモニタリングするために、その配列が配列表に記載されている１８Ｆ放射性標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子ＺＨＥＲ２：２８９１を使用する、請求項３又は請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種に結合した単離ポリペプチドの使用方法であって、単離ポリペプチドが、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２。上皮成長因子受容体ファミリーに属するＨＥＲ２／ｎｅｕ又はＥｒｂＢ−２とも称される）は、１８５ｋＤａの膜貫通受容体である（１）。ＨＥＲ２遺伝子の増幅及びタンパク質の過剰発現は、多くの種類の癌の病因及び進行において重要な役割を果たしている。ＨＥＲ２は、乳癌の２５〜３０％、胃癌の１５〜３５％及び卵巣癌の７〜３８％で過剰発現しており、低い生存率と相関している（２〜５）。このため、このタンパク質は、癌治療の重要な予測バイオマーカー及び標的として近年出現した（６）。そのファミリーの他のメンバーとのホモ二量体化又はヘテロ二量体化は、細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化を促進し、ＭＡＰＫ及びＡｋｔシグナル伝達経路によって媒介される細胞の生存及び増殖をトリガーする（７、８）。
【０００３】
診療所で利用可能なＨＥＲ２ターゲティング療法は、受容体の二量体化を防止する抗体（例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、抗体−薬物コンジュゲート（例えば、Ｔ−ＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、又はチロシンキナーゼドメインをターゲティングする小分子阻害剤（例えば、ラパチニブ、Ｔｙｖｅｒｂ，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；二重ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ阻害剤）を含む。細胞外ドメインのタンパク質分解脱落、又は限定的な場合では選択的スプライシングは、抗ＨＥＲ２治療に対する最も顕著な耐性機構の１つをもたらす切断型シグナリングレムナントｐ９５ＨＥＲ２ドメインを生成し得る（９）。トラスツズマブは、抗ＨＥＲ２ターゲティング療法の中心であるが、ＨＥＲ２タンパク質発現を逆転させるものではない。したがって、これとの関連では、ＨＥＲ２プロテアソーム分解を引き起こす分子シャペロンＨＳＰ９０の阻害剤が現在調査中である。このような阻害剤の１つであるＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、第ＩＩ相臨床試験中である。
【０００４】
ターゲティング療法、特にトラスツズマブ又はペルツズマブから最も利益を得ることができる個体を特定するためには、ＨＥＲ２の状態を正確に検査することが重要である。しかしながら、ＨＥＲ２発現は、原発性疾患から局所再発及び遠隔再発の二次疾患への進行を通じて変化し得るので、これは難題であり得、生検に適さないことが多い（１０）。さらに、最近の研究では、誤った評価の潜在的な情報源として空間的不均一性が強調されている（１１）。ＦＤＡ承認の診断薬の大部分は、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に基づくものである。ＩＨＣは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍生検におけるＨＥＲ２タンパク質の発現を決定し、ＦＩＳＨは、ＨＥＲ２遺伝子の増幅（一般に、ＨＥＲ２過剰発現はコピー数の変化によって引き起こされるので、これは合理的な代替と考えられている（１２））を検出する。可溶性細胞外ドメインを検出することによる、血清ベースの代替方法の有用性も調査中である（１３）。
【０００５】
放射性標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子（これは、非免疫グロブリン由来の親和性タンパク質である）を使用する腫瘍マーカーターゲティング分子イメージングは、ＨＥＲ２分子診断の正確かつ非侵襲的な代替方法を提供し得る。Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺタンパク質の３本のヘリックスバンドルとして設計されている（１４）。それらは、結合親和性がナノモル〜ピコモルであること、抗体又は抗体断片（約２０〜１５０ｋＤａ）と比較してサイズが小さいこと（約６．５ｋＤａ）、血漿滞留時間が短いので迅速かつ均一な組織分布を可能にすることを特徴とする。その結果、最初の１時間又は２回の投与以内に、高コントラストな画像を得ることができる（１５、１６）。さらに、これらの分子は、全長ＩｇＧ抗体と比較して、短命の放射性同位体で放射性標識するのに非常に適切である。
【０００６】
癌患者のＨＥＲ２の状態を正確に評価することは依然として臨床的な課題であり、患者の最大２０％は、治療を中止するか、又は無用な毒性に曝露される可能性がある。特に、生検に適さない局所再発及び遠隔再発の状況では、非侵襲的イメージングは、現在の方法の実行可能な代替方法と広く考えられているが、トレーサーが肝臓及び腎臓中に長時間保持されて、隣接転移の検出が妨害されることが、陽電子放射断層撮影法による臨床的成功を妨げている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２０８７９０８号
【発明の概要】
【０００８】
ＨＥＲ２ターゲティングＡｆｆｉｂｏｄｙ［18Ｆ］ＧＥ−２２６は、系統、及びトラスツズマブによる前処理にかかわらず、注射後１時間以内に、差次的なＨＥＲ２発現を決定するための実行可能な戦略を提供することが今回見出された。全長ＨＥＲ２対ｐ９５ＨＥＲ２でトランスフェクトした細胞と、ＨＥＲ２を分解するためのｓｉＲＮＡ  ＨＥＲ２（対照として）又はＨＳＰ９０阻害剤処理とを使用して、ＡｆｆｉｂｏｄｙとＨＥＲ２との相互作用の動態特性に関する知見が本明細書で提供される。
【０００９】
下記のように、本発明は、ＨＥＲ２結合体を使用して、ＨＳＰ９０阻害に対する反応をモニタリングする方法を提供する。
【００１０】
本発明は、ＨＳＰ９０阻害に対する反応をモニタリングするための方法であって、
（ａ）１８Ｆに結合した単離ポリペプチドを被験体に投与する工程であって、単離ポリペプチドが、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する工程と、
（ｂ）被験体をイメージングする工程と、
（ｃ）イメージング剤組成物の取り込みをモニタリングしてＨＳＰ９０阻害を測定する工程と
を含む方法を提供する。本発明はまた、イメージング剤としてのポリペプチドの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
単離ポリペプチドは、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する任意のポリペプチドであって、診断イメージングに適切な放射性同位体に結合したか、又は放射性同位体で標識されているポリペプチドであり得る。限定されないが、適切な単離ポリペプチド及びその放射性標識誘導体並びにその製造方法の例は、国際公開第２０１２／０９６７６０号、国際公開第２０１２／０８７９０８号及び国際公開第２０１２／０８７９１２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。好ましくは、単離ポリペプチドは、国際公開第２０１２／０９６７６０号、国際公開第２０１２／０８７９０８号及び国際公開第２０１２／０８７９１２号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む。より好ましくは、単離ポリペプチドは、本明細書では［１８Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］と称され、添付の配列表に記載されているＨＥＲ２結合１８Ｆ放射性標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子ＺＨＥＲ２：２８９１［配列番号２］である。
【実施例】
【００１２】
実験計画：薬物処理の有無の下、細胞及び異種移植片において、細胞固有の［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］取り込み、及びトレーサーの腫瘍特異的結合を評価した。蛍光標識類似体の腫瘍局在性をＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）と比較することによって、特異性をさらに決定した。
【００１３】
結果：［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］取り込みは、インビトロでは、系統にかかわらず、１０種のＨＥＲ２陽性細胞株では、ＨＥＲ２陰性細胞株と対比して１１〜６７倍多かった。ＨＥＲ２陽性異種移植片における取り込みは迅速であり、正味の不可逆的結合反応速度により、１時間以内に、ＨＥＲ２陰性腫瘍（ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２：ＮＵＶ60（％ＩＤ／ｍＬ）６．１±０．７；Ｋi（ｍＬ／ｃｍ3／分）０．００６９±０．００１４）と、ＨＥＲ２陽性腫瘍（ＮＵＶ60及びＫi：ＭＣＦ７−ＨＥＲ２、１０．９±１．５及び０．０１５±０．００３５；ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、１８．２±３．４及び０．０２５±０．００５２；ＳＫＯＶ−３、１８．７±２．４及び０．０３６±０．００６５）とを区別することが可能であった。腫瘍取り込みは、ＥＬＩＳＡによって決定したＨＥＲ２発現と相関しており（ｒ2＝０．７８）、細胞レベルのＨＥＲ２発現と共局在していた。差次的なエピトープ結合と一致して、トレーサー取り込みは、トラスツズマブによる短期的又は持続的な処理によって影響を受けなかったが、ＳＫＯＶ−３異種移植片では、短期的なＮＶＰ−ＡＵＹ９２２処理によるＨＥＲ２分解を反映していた（それぞれビヒクル又は薬物について、ＮＵＶ60：１３．５±２．１対９．０±０．９％ＩＤ／ｍＬ）。
【００１４】
結論：［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、細胞系統にかかわらず、高い特異性でＨＥＲ２に結合する。このトレーサーは、トラスツズマブによる前処理にかかわらず、ＨＥＲ２を検出し、ＨＳＰ９０阻害に対する反応をモニタリングするのに有用である。
【００１５】
結果
固有のＨＥＲ２親和性（ＫD＝７６ｐＭ）の結果、［18Ｆ］ＧＥ−２２６取り込みは、インビトロでは、系統にかかわらず、１０種のＨＥＲ２陽性細胞株では、ＨＥＲ２陰性細胞株と対比して１１〜６７倍多かった。取り込みは、ＨＥＲ２タンパク質発現と相関していたが、ＥＧＦＲのような他の標的の存在とは無関係であった。［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］及びＨＥＲ２  ｓｉＲＮＡ処理で遮断すると、取り込みがそれぞれ９６．８±２．６％及び８１．７±９．２％減少した。ＨＥＲ２陽性異種移植片における取り込みは迅速であり、定常状態の正味の不可逆的結合反応速度により、１時間以内に、ＨＥＲ２陰性腫瘍（ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２：ＮＵＶ60（％ＩＤ／ｍＬ）６．１±０．７；Ｋi（ｍＬ／ｃｍ3／分）０．００６９±０．００１４）と、ＨＥＲ２陽性腫瘍（ＮＵＶ60及びＫi：ＭＣＦ７−ＨＥＲ２、１０．９±１．５及び０．０１５±０．００３５；ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、１８．２±３．４及び０．０２５±０．００５２；ＳＫＯＶ−３、１８．７±２．４及び０．０３６±０．００６５）とを区別することが可能であった。腫瘍取り込みは、ＥＬＩＳＡによって決定したＨＥＲ２発現と相関していた（変数がＮＵＶ60又はＫiである場合、ｒ2≧０．７４）。差次的なエピトープ結合と一致して、トレーサー取り込みは、トラスツズマブによる短期的又は持続的な処理によって影響を受けなかったが、ＳＫＯＶ−３異種移植片では、短期的なＮＶＰ−ＡＵＹ９２２処理によるＨＥＲ２分解を反映していた（それぞれビヒクル又は薬物について、ＮＵＶ60：１３．５±２．１対９．０±０．９％ＩＤ／ｍＬ）。蛍光標識トレーサー類似体の腫瘍局在性をＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）と比較することによって、特異性をさらに決定した。Ａｆｆｉｂｏｄｙの腫瘍シグナルは、空間の不均一性にかかわらず、細胞レベルのＨＥＲ２発現と共局在していた。差次的なエピトープ結合と一致して、ＳＫＯＶ−３異種移植片では、トレーサー結合は、トラスツズマブへの短期的又は持続的な曝露（合計７日間にわたって５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラスと、それに続く２５ｍｇ／ｋｇの２回の腹腔内投与）によって影響を受けなかった。ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２によるシャペロンＨＳＰ９０（この中では、ＨＥＲ２はクライアントタンパク質である）の阻害は、用量依存的なＨＥＲ２分解を引き起こし、その結果、インビトではＳＫＯＶ−３細胞において、及びインビボでは、５０ｍｇ／ｋｇのＮＶＰ−ＡＵＹ９２２を１日３回投与した後のＳＫＯＶ−３異種移植片において、トレーサー取り込みが減少した（それぞれビヒクル及び薬物について、ＡＵＣ0-60：６１８．４±９０．１対４４６．７±４２．８％ＩＤ／ｍＬ＊分；Ｐ＝０．０４３）。
【００１６】
材料及び方法
化学及び放射化学
ＦＡＳＴｌａｂおける自動製造に最適化されたフルオロベンズアルデヒド（ＦＢＡ）戦略を使用して、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］を標識した。簡潔に言えば、この放射化学は、［18Ｆ］フルオロベンズアルデヒドシントンに結合したマレイミド−アミノオキシアセチルＡｆｆｉｂｏｄｙ分子前駆体を使用し、続いて、固相抽出（ＳＰＥ）生成物を精製する。減衰補正されていない典型的な最終合成収率は２５％であり、放射化学的純度は９５％であった。
【００１７】
表面プラズモン共鳴
ＨＥＲ２タンパク質に対する［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の親和性を特性評価するために、表面プラズモン共鳴研究を行った。ヒト、アカゲザル及びラットのＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ（ＳＩＮＯ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，Ｃａｔ．Ｎｒ：１０００４−Ｈ０２Ｈ、９００２０−Ｋ０２Ｈ及び８００７９−Ｒ０２Ｈ）並びにヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ−６ＸＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ．Ｎｒ：１１２９−ＥＲ）及びｐ９５ＨＥＲ２  ＥＣＤ−Ｆｃ−６ＸＨｉｓ（Ｓｙｎｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）カップリング緩衝液）で希釈して、最終濃度を１０μｇ／ｍＬにした。機器のマニュアル（Ｓｙｎｇｅｎｅ）のアミンカップリングプロトコールにしたがって、ＢｉａｃｏｒｅセンサーチップＣＭ５（Ｃａｔ．Ｎｒ：ＢＲ−１００５−３０）に対する抗原のカップリングを行った。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｃａｔ．Ｎｒ：ＢＲ−１００６−６９）をランニング緩衝液として使用し、物質の溶媒として使用した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、親和性研究を実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で［19Ｆ］ＧＥ−２２６を５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．７８ｎＭ、０．３９ｎＭ、０．１９５ｎＭ、０．０９７ｎＭ、０．０４９ｎＭ及び０ｎＭに希釈した。第１のチップのフローセルは、ブランク、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ−６ＸＨｉｓ、ｐ９５ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ−６ＸＨｉｓバッチＩ及びｐ９５ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ−６ＸＨｉｓバッチＩＩから構成されていた。第２のチップのフローセルは、ブランク、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、アカゲザルＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ及びラットＨＥＲ２  ＥＣＤ−Ｆｃを含んでいた。プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ．Ｎｒ：Ｐ６０３１）及び抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｒ：ＮＥＦ８０３００１ＥＡ）を用いて、タンパク質の固定化を可視化した。［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］を無作為の順序で６０秒間にわたって流速５０μＬ／分でセルに対して２回反復でポンピングし、続いて、ＨＢＳ−ＥＰを１２０秒間にわたってポンピングして、解離をモニタリングした。この後、５０ｍＭ水酸化ナトリウムを流速３０μＬ／分で３０秒間、続いてＨＢＳ−ＥＰを６０秒間ランしてチップを再生し、表面を安定化した。ラングミュア１：１結合モデル並びに会合相及び解離相の同時計算を使用して、速度計算を実施した。
【００１８】
細胞及び治療
ＭＣＦ７−ベクター（ｐｉＲＥＳ）、ＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２細胞は、Ｊｏｓｅ  Ｂａｓｅｌｇａ研究室の厚意により提供されたものである（１７）。ＭＣＦ７クローン、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳＫＢＲ−３（ＡＴＣＣ）及びＳＫＯＶ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）細胞は、ＤＭＥＭ中で維持した。ＡＧＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＨＧＣ−２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ）及びＯＥ−３３（ＡＴＣＣ）細胞は、ＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。Ａ４３１細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＭＥＭイーグル培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。１０％ＦＣＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、グルタミン及び抗生物質（両方とも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を成長培地に補充した。１％非必須アミノ酸をＡ４３１細胞にさらに補充した。５％ＣＯ2を含有する加湿雰囲気中で、すべての細胞を３７℃で培養した。
【００１９】
ｓｉＲＮＡによるＨＥＲ２ノックダウンでは、製造業者の説明書にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリバースウェットトランスフェクションによって、２５ｎＭスクランブル対照（ＳＣＲ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｏｏｌ，Ｃａｔ．Ｎｒ：Ｄ−００１８１０−１０−０５）又はＨＥＲ２ターゲティングｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＥＲＢＢ２  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ；Ｃａｔ．Ｎｒ：４４５７２９８）でＳＫＯＶ−３細胞をトランスフェクトした。取り込み実験の４８時間前に、３×１０5個の細胞を１２ウェルプレートに播種した。並行してトランスフェクトした細胞のウエスタンブロッティングによって、標的のノックダウンを確認した。
【００２０】
薬物処理に対する反応のすべての取り込み研究において、取り込み実験の４８時間前に、２．５×１０5個のＳＫＯＶ−３細胞を完全培地に播種した。細胞を、示されている用量のＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）と共に２４時間インキュベートし、１０μｇ／ｍＬのトラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に１時間又は２４時間インキュベートしてから、放射性トレーサーを追加した。
【００２１】
インビトロ取り込みアッセイ
ＨＥＲ２陽性系統又はＨＥＲ２陰性系統におけるベースライン取り込みでは、３×１０5個の細胞を、１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ  ＭＡ）中の完全培地に播種し、一晩回復させた。無血清培地で細胞を２回洗浄し、５００μＬの無血清培地中、３７０ＫＢｑで１時間パルスした。遮断研究では、細胞を、トレーサー及び０．５ｍｇ／ｍＬのコールド非標識［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］と共にコインキュベートした。
【００２２】
ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシン処理し、完全培地で中和し、遠心分離した。ＰＢＳでペレットを３回洗浄し、１２０μＬのＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  ＩＩガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって、１００μＬの溶解物の放射能をカウントした。適用した放射能及びタンパク質含量に対して放射能を正規化し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって各サンプルについて決定した。
【００２３】
ウエスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を含有するＲＩＰＡ緩衝液に細胞を溶解した。等量のタンパク質（２０μｇ）を４−１５％ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋｓ，Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。０．１％ｖ／ｖ  ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を含有する５％ミルクトリス緩衝生理食塩水で膜を１時間ブロッキングし、ＨＥＲ２（ｐ９５ＨＥＲ２及び全長ＨＥＲ２のバンドを可視化する場合にはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，Ｃａｔ．Ｎｒ：２１６５、並びに全長ＨＥＲ２バンドのみが示されるブロットの場合にはＣａｔ．Ｎｒ：４２９０）、ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，Ｃａｔ．Ｎｒ：４２６７）又はβ−アクチン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｃａｔ．Ｎｒ：ａｂ６２７６）に対する抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰ標識マウス及びウサギ二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）を室温で１時間アプライした。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒ−ｆｉｌｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、シグナルを可視化した。
【００２４】
ＰＥＴ用の小動物実験モデル
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ２０１２にしたがって、及び公開されているｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｗｅｌｆａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（１８）の範囲内において、有資格の調査員がすべての動物実験を行った。６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で、インビボ実験モデルを確立した。ＳＫＯＶ−３異種移植片以外のすべてについては、細胞接種の約２日前に０．７２ｍｇ／６０日のエストラジオール放出ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。１００μＬのＭＣＦ７−ベクター、ＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２細胞（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡと１：１で混合した１．５×１０7個の細胞のＰＢＳ溶液）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と１：１で混合した５×１０6個の細胞のＰＢＳ溶液）又はＳＫＯＶ−３細胞（５×１０6個の細胞のＰＢＳ溶液）をマウスの背部に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、異種移植片を確立した。キャリパー測定によって腫瘍の大きさを頻繁に測定し、以下の方程式によって腫瘍体積を計算した：体積ｍｍ3＝（π／６）×ａ×ｂ×ｃ（式中、ａ、ｂ及びｃは、腫瘍の３つの直交軸を表す）。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ3に達したら（注射の約４週間後のＭＣＦ７モデル、注射の約３週間後のＭＤＡ−ＭＢ−３６１異種移植片、及び注射の約６週間後のＳＫＯＶ−３異種移植片）、マウスを生体内分布研究又はＰＥＴイメージング研究に使用した。
【００２５】
遮断研究では、放射性トレーサーの投与の２０分前に、５００μｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）のコールド［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］をＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスに尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。放射性トレーサーとトラスツズマブとの相互作用を評価するために、スキャンの２時間前に、５０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブでＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。動物を回復させ、２５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブで２回以上腹腔内（ｉ．ｐ．）処理し初回投与の７日後に再スキャンした。ＨＳＰ９０阻害に対する反応を調査するために、５０ｍｇ／ｋｇのＮＶＰ−ＡＵＹ９２２又は等量のビヒクル（約５μＬ／ｇ体重；１０％ＤＭＳＯ及び５％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液）でＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスを３日間にわたって１日１回（ｑ．ｄ．）腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。最終処理の２４時間後に、動物をＰＥＴイメージングに使用した。
【００２６】
ＰＥＴ−ＣＴイメージング
イソフルラン吸入によってマウスを麻酔し、専用の小動物ＰＥＴ−ＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  Ｉｎｖｅｏｎ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でスキャンした。ＰＥＴ減衰補正のために低線量ＣＴスキャン（８０ｋＶｐ、０．５ｍＡ、回転度２２０、６００ミリ秒／曝露時間、再構成ピクセルサイズ８０μｍ）を最初に取得して、解剖学的基本面を得た。約３．７ＭＢｑの［18Ｆ］ＧＥ−２２６を尾静脈にボーラス静脈内（ｉ．ｖ．）注射した後に、ＰＥＴ画像を取得した。６０分間かけてリストモード形式で、動的発光スキャンを取得した。画像再構成のために、フィルタ逆投影（４×１５秒間及び４×６０秒間、続いて１１×３００秒間）によって、取得したデータを０．５ｍｍのサイノグラムビン及び１９のタイムフレームに分類した。放射性トレーサー取り込みの可視化のために、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｖｅｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｐｌａｃｅソフトウェアを使用した。動的データの３０〜６０分の累積画像を用いて、三次元（３Ｄ）関心領域（ＲＯＩ）を規定した。０．２５〜２分の累積画像を使用してＲＯＩを心腔の中央に対して描写することによって動脈入力関数を推定した。各時点のすべてのＲＯＩについて、カウント密度を平均して、時間放射能曲線（ＴＡＣ）を得た。ＶＤＣ−３０４投与量較正器（Ｖｅｅｎｓｔｒａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって測定した注射用量に対して腫瘍ＴＡＣを正規化し、正規化した取り込みを、組織１ｍＬ当たりの注射用量の割合（ＮＵＶ；％ＩＤ／ｍＬ）として表した。６０分の時点の放射性トレーサーの正規化した取り込み（ＮＵＶ60）を比較に使用した。定性的な画像の可視化のために、動的データの累積画像（３０〜６０分）も繰り返し再構成した（ＯＳＥＭ３Ｄ）。
【００２７】
生体内分布
約３．７ＭＢｑの［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］を腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。放血によって、様々な時点でマウスを屠殺した。組織を切除し、計量し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  ＩＩガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して放射能をカウントし、減衰補正した。データを、組織１グラム当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【００２８】
代謝安定性
３．７ＭＢｑの［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］をマウスに尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。注射の１０分後、３０分後及び６０分後に、心臓穿刺によってマウスを放血させ、遠心分離のために採血した。ＨＰＬＣによる放射性代謝産物の分析のために、血漿を得て氷上で維持した。
【００２９】
蛍光ＧＥ−２２６実験用の小動物モデル
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と１：１で混合したＡ４３１細胞（１×１０7個の細胞）及びＮＣＩ−Ｎ８７細胞（２×１０6個の細胞）のＰＢＳ溶液１００μＬを４〜６週齢の雄性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の下脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、両側Ａ４３１／ＮＣＩ−Ｎ８７モデルを確立した。上記のように、腫瘍体積を頻繁にモニタリングし、それらが５０〜１００ｍｍ3（約３〜４週間）に達したら、ヘキスト（約２０ｍｇ／ｋｇ）及びフルオレセインコンジュゲートＧＥ２２６［配列番号２］（約１５ｍｇ／ｋｇ）の混合ＰＢＳ溶液１００μＬをマウスに尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。注射の１２０分後に腫瘍を切除し、直ぐにホルマリン固定し、パラフィン包埋した。切片をスライスし、−８０℃で暗所に保存した。免疫蛍光画像を倍率４００倍で取得した。ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）を用いて、隣接する腫瘍切片を免疫組織化学的に染色した。
【００３０】
免疫組織化学
製造業者の説明書にしたがってＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ，Ｅｌｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｃａｔ．Ｎｒ：Ｋ５２０４）を使用して、切除した腫瘍におけるＨＥＲ２タンパク質発現を評価した。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ
ＰｒｅＣｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザー及びＣＫ１４ビーズ含有チューブを用いて、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、摘出及び急速凍結した腫瘍組織サンプルをホモジナイズした（６５００ｒｐｍで２５秒間を２サイクル）。製造業者の説明書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃ−ＥｒｂＢ２／ｃ−Ｎｅｕ  Ｒａｐｉｄ  Ｆｏｒｍａｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉ，Ｃａｔ．Ｎｒ：ＱＩＡ１０−１ＥＡ）によって、ＨＥＲ２発現を決定した。
【００３２】
速度論モデリング
Ｋ1（ｍＬ／ｃｍ3／分）、ｋ2、（１／分）及びｋ3（１／分）並びに血液血管成分Ｖb（ｍＬ血液／ｍＬ組織；無単位）を推定するために、標準的な二組織不可逆的コンパートメントモデルを適用して、各腫瘍ＴＡＣを、対応する画像から得られた血漿ＴＡＣ（入力関数（ＩＦ）として）に一致させることによって、ＰＥＴデータの動態分析を実施した。不可逆的取り込み速度Ｋi（ｍＬ／ｃｍ3／分）をＫ1×ｋ3／（ｋ2＋ｋ3）として計算した。動態パラメータを推定するために、測定した腫瘍ＴＡＣを以下のようにモデリングした。
【００３３】
【数１】
2016526556.tif 000002
ほとんどの場合において、明確な不可逆的取り込みが示された腫瘍ＴＡＣの視覚的評価の後に、二組織不可逆的モデルを選択した。さらに、二組織可逆的コンパートメントモデルを使用した場合、高分散を特徴とするパラメータの非生理的な推定値が得られた。
【００３４】
統計分析
データを平均±平均の標準偏差（ＳＤ）又は標準誤差（ＳＥＭ）として表した。対応のない両側スチューデントｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．１）を使用して、２つのデータセット間の比較の有意性を決定し、Ｐ＜０．０５を有意であると定義した。
Ａｆｆｉｂｏｄｙ−ＨＥＲ２結合特性
フッ素化補欠分子族がＡｆｆｉｂｏｄｙの結合反応速度に悪影響を与えないことを確実にするために、表面プラズモン共鳴を使用して、19Ｆ−Ａｆｆｉｂｏｄｙ類似体の受容体相互作用を測定し、これを、ヒト全長及び切断型ｐ９５ＨＥＲ２並びにアカゲザル及びラット全長ＨＥＲ２の結合と比較した。トレーサーは、ヒト（ＫD＝７６ｐＭ）及びアカゲザルＨＥＲ２（ＫD＝６７ｐＭ）に対して非常に強い結合を示したが、ｐ９５ＨＥＲ２及びラットＨＥＲ２と相互作用しなかった（表１、図６）。
【００３５】
［18Ｆ］ＧＥ−２２６は、系統非依存性の特異的ＨＥＲ２結合を示す
乳癌、上部消化管癌及び卵巣癌に由来する１０種の細胞株（これらの半分はＨＥＲ２陰性であり、もう半分はＨＥＲ２陽性であった）において、トレーサー保持を試験した。パネルには、空ベクター（ＭＣＦ７−ベクター）、ｐ９５ＨＥＲ２（ＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２）又は全長ＨＥＲ２（ＭＣＦ７−ＨＥＲ２）でトランスフェクトしたＨＥＲ２陰性ＭＣＦ７細胞から構成される同系モデルが含まれていた。ＨＥＲ２陰性細胞株及びｐ９５ＨＥＲ２トランスフェクト細胞株はすべて、ごくわずかなバックグラウンド取り込みであったが（すべての株を通して、タンパク質１ｍｇ当たり１．２±０．５％の適用放射能）、ＨＥＲ２陽性細胞株はすべて、高レベルのトレーサーを保持しており（タンパク質１ｍｇ当たり１３．６±３．４〜７９．９±１２．１％の適用放射能）、内因性ＨＥＲ２発現とよく一致していた。しかしながら、トレーサー結合は、別のＥＧＦＲ表皮成長因子受容体ファミリーメンバー（ＥＧＦＲ）の発現とは無関係であった。図１Ａは、取り込みが比放射能に強く依存していたことを明らかにした最初の実験として、代表的な取り込み実験の１つを示す。インキュベーションを７０分後及び１４０分後に開始した場合、新たに調製した［18Ｆ］ＧＥ−２２６と比較して、同じ放射性トレーサーの調製は、３９．５±８．５及び２４．９±３．８％のトレーサー取り込みをもたらした（図７）。
【００３６】
シグナルの特異性をさらに調査するために、ＳＫＯＶ−３細胞を、トレーサー及び過剰のその非放射性19Ｆ類似体と共にコインキュベートした（図１Ｂ）。これは、取り込みを、対照細胞と比較して３．１±２．６％に減少させた（１００±１２％；Ｐ＜０．０００１）。さらに、ｓｉＲＮＡによるＨＥＲ２の一過性ノックダウンは、トレーサー取り込みを、非ターゲティングスクランブル対照と比較して減少させた（図１Ｃ、１００±１２％対１８±９％、Ｐ＜０．０００１）。ウエスタンブロットによって、標的のノックダウンを確認した。
【００３７】
［18Ｆ］ＧＥ−２２６は、トラスツズマブと異なる結合部位を示し、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２によるＨＥＲ２分解の検出を予測する
ＨＥＲ２をターゲティングするイメージングプローブを開発する場合、トラスツズマブ治療の可能性にかかわらず、トレーサーが患者のＨＥＲ２の状態を正確に決定することができるかが重要な問題である。しかしながら、１０μｇ／ｍＬのトラスツズマブでＳＫＯＶ−３細胞を１時間前処理することによって、トレーサー結合は変化せず、取り込み実験前に２４時間インキュベートすると、薬物未投与の対照と比較して、トレーサー結合が３２±１１％減少した（図２Ａ；Ｐ＜０．０００１）。
【００３８】
ＨＳＰ９０阻害の結果として起こるＨＥＲ２分解は（ＨＥＲ２は、ＨＳＰ９０のクライアントタンパク質である（２０））、トレーサー取り込みの検出可能な変化をもたらすと仮説される。ＨＳＰ９０阻害剤ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２は、未処理細胞と比較して、ＨＥＲ２タンパク質発現の用量依存的な減少を引き起こし、その結果としてトレーサー取り込みが減少したが、これは、その特異性をさらに裏付けている（図２Ｂ；試験したすべての濃度について、対照と比較して、Ｐ＜０．０００１）。
【００３９】
［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、インビボにおける差次的なＨＥＲ２発現を区別する
インビトロデータに基づいて、様々な程度のＨＥＲ２発現を区別するトレーサーの能力を、インビボにおける複雑な腫瘍環境で精査することが望まれた。図３Ａは、ＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスの代表的な小動物［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］ＰＥＴ画像を示す。多い腫瘍取り込みは、体内の少ない非特異的保持と対照をなす。トレーサーは代謝的に安定であり、主に腎臓経路を介して迅速に排泄された（図８及び表２）。異なる腫瘍モデル間で、トレーサーは、ＨＥＲ２陽性異種移植片とＨＥＲ２陰性異種移植片とを十分に区別した。これらの差異は、腫瘍特異的な分布及び保持動態の両方によって説明された。ＨＥＲ２陰性ＭＣＦ７−ベクター及びＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２異種移植片は、初回送達後に、少ない腫瘍保持及び定常状態の組織放射能を示したが、ＨＥＲ２陽性異種移植片は、取り込みが増加しており、正味の不可逆的結合パターンに従っていた（図３Ｂ）。したがって、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］ＰＥＴは、ＨＥＲ２陰性異種移植片（ＭＣＦ７−ベクター及びＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２）を、ＨＥＲ２低発現異種移植片（ＭＣＦ７−ＨＥＲ２）及びＨＥＲ２中発現異種移植片（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）と区別することができた。しかしながら、簡単な取り込み測定をＰＥＴ分析に用いた場合には、組織放射能は、中度及び高度（ＳＫＯＶ−３）のＨＥＲ２発現を有する腫瘍と同程度であった。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡによって決定したところ、放射性トレーサー取り込みは、ＨＥＲ２タンパク質発現とよく相関していた（ｒ2＝０．７８；図３Ｃ及び図９）。
【００４０】
組織取り込みのみとは対照的に、血漿と比べた組織取り込みを説明する速度論モデリングは、様々なＨＥＲ２群を区別するのに役立ち得ると仮説した。二組織不可逆的コンパートメントモデルを用いて、正味の不可逆的取り込み速度定数Ｋiを求めた（図３Ｄ）。このモデルを用いて、本発明者らは、すべての群を区別することができ、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１異種移植片をＳＫＯＶ−３異種移植片とさえ区別することができた（図３Ｄ）。予想通り、すべての群で、Ｋiは、ＮＵＶ60と非常に相関していた（ｒ2＝０．８２；Ｐ＝０．００８；図３Ｅ）。
【００４１】
Ａｆｆｉｂｏｄｙの特異性をさらに裏付けるために、本発明者らは、ＰＥＴスキャンの２０分前に、３０ｍｇ／ｋｇの［19Ｆ］ＧＥ−２２６を静脈内（ｉ．ｖ．）注射することによって、遮断研究を行った（約１０００倍の放射性標識トレーサー）。コールドリガンドは、特定の結合部位を遮断することによって、トレーサー取り込み（対照腫瘍及び遮断腫瘍では、ＮＵＶ60１８．７±２．４対７．１±１．６、Ｐ＝０．０００３）及びＫiの有意な減少をもたらした（図３Ｆ〜Ｈ）。対照サンプルと遮断サンプルとの間では、後者がＨＥＲ２陰性腫瘍の特徴を共有するという点において、トレーサー取り込みの速度が区別可能に異なっていたことは注目に値する。
【００４２】
蛍光ＧＥ−２２６の局在性及び強度は、ＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）と相関する
細胞内局在性を調べるために、フルオレセインでＧＥ−２２６［配列番号２］を標識し、腫瘍切片における局在性及び蛍光強度を、ＦＤＡ承認のＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）と比較した。ＰＥＴ実験とは対照的に、注射用量に対する正規化は、蛍光化合物では不可能である。被験体間の変動を排除するために、両側腫瘍担持マウスにおいて、実験を実施した。図３に記載されているＨＥＲ２陽性異種移植片及びＨＥＲ２陰性異種移植片は、成長速度が大きく異なっており、差次的なホルモン処理を必要とするので、本発明者らは、Ａ４３１（ＨＥＲ２陰性）異種移植片及びＮＣＩ−Ｎ８７（ＨＥＲ２陽性）異種移植片を用いた。２０ｍｇ／ｋｇのヘキスト及び１５ｍｇ／ｋｇのフルオレセイン−ＧＥ−２２６の混合ＰＢＳ溶液を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）染色又は蛍光顕微鏡検査のために、注射の２時間後に、腫瘍を切除し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、隣接する腫瘍切片を調製した。図４は、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍では、蛍光染色がＨＥＲ２陽性領域と共局在しており、Ａ４３１腫瘍では、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）染色及び蛍光染色が両方ともごくわずかであったことを示している。
【００４３】
［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、トラスツズマブによる前処理にかかわらず、ＨＥＲ２の状態を正確に評価することができ、インビボにおけるＮＶＰ−ＡＵＹ９２２に対する反応を予想する
トラスツズマブを３回投与することによって、ＳＫＯＶ−３腫瘍担持マウスを処理し、初回投与の２時間後にイメージングし、最終処理の４８時間後（すなわち、初回スキャンの７日後）に再イメージングした。７日間の連続処理により、動脈入力関数の上昇及び腎排泄の変化の結果として、Ｋiが２４％（Ｐ＝０．０２５）減少したにもかかわらず（図５Ｂ、図１０）、両処理は、腫瘍のトレーサー保持に悪影響を与えなかった（図５Ａ）。これにより、Ａｆｆｉｂｏｄｙが、トラスツズマブと異なる結合部位を有することが確認された。最後に、インビボにおいて、ＨＳＰ９０阻害の治療バイオマーカーに対する反応としても［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］を利用することができるかを評価するために、５０ｍｇ／ｋｇのＮＶＰ−ＡＵＹ９２２又はビヒクルを３回投与することによって、ＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスを処理した。これはＨＥＲ２発現の減少をもたらし、その結果、トレーサー取り込みが減少した（図５Ｃ〜Ｄ、図１１）。
【００４４】
考察
速度論モデリングを用いて、本発明者らは、ＺHER2:2891Ａｆｆｉｂｏｄｙ、すなわち［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］が、系統、及びトラスツズマブによる前処理にかかわらず、１時間以内に、ＨＥＲ２陰性腫瘍とＨＥＲ２陽性腫瘍とを定量的に区別することを実証する。大きな（１５０ｋＤａ）抗体の欠点を克服するために、Ａｆｆｉｂｏｄｙ放射性トレーサーを開発した。これまでに、放射性標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子に関して文献で報告された研究のほとんどは、放射性金属又は放射性ハロゲンで標識されたＺHER2:342の類似体が用いられていた（１６、２１〜２６）。最近、Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈ及び共同研究者らがこのＡｆｆｉｂｏｄｙを再設計して（２７）、Ａｆｆｉｂｏｄｙの非結合面に１１個のアミノ酸置換を含有し、元のプロテインＡドメインとの類似性が除かれた最適な骨格（ＺHER2:2891）を作製した。ＨＥＲ２イメージング剤への広範な臨床的アクセスを可能にする、ＦＡＳＴｌａｂにおける部位特異的ＧＭＰグレードの自動製造の可能性に加えて、ＺHER2:2891は、脱アミド化を防ぐことによって熱安定性及び化学安定性が改善しているだけではなく、非結合面の親水性が増加している；これは、ペプチド合成及びインビボ薬物動態のそれぞれに有利な特質である。後者の特性は、放射性トレーサーの注射後１〜２時間以内に、イメージング研究の実施を可能にするために望ましいものである。しかしながら、この早期の期間内では、非特異的な取り込みが組織シグナルに寄与する可能性がある。ＨＥＲ２陰性腫瘍とＨＥＲ２陽性腫瘍とを定量的に区別するために、早期のイメージング（１時間）では、固有の細胞取り込み及びインビボ動的イメージングの両方を使用して、18Ｆ放射性標識ＺHER2:2891Ａｆｆｉｂｏｄｙ、すなわち［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の特異性を評価した。
【００４５】
コントラストの最適化は、イメージング剤の開発の成功に極めて重要である。高コントラストは主に、放射性トレーサーの高い親和性及び迅速な薬物動態から得られる。他の分子イメージングプローブと比較して、Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は、短い血液循環時間及び高い標的親和性から恩恵を受け、その結果、注射後比較的短時間で高コントラストな画像が得られ、インターナリゼーション速度が遅くなる（２３、２８、２９）。これは、より広く利用可能な短命の放射性同位体、例えば18Ｆ及び68Ｇａを利用して、患者の線量測定を最小限に抑えることを可能にする。ナノボディと比較して、Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は、ＫDが低く、ｋonが高く、ｋoff速度が遅いため優れている（３０）。親和性に関して、コールド非標識［19Ｆ］−ＧＥ−２２６［配列番号２］を用いた表面プラズモン共鳴実験により、ヒト及びアカゲザルＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに高い親和性で結合し、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ（７６ｐＭ（２７））に対する親ＺHER2:2891Ａｆｆｉｂｏｄｙの結合と同程度であることが明らかになった。対照的に、［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、ラットＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ及びヒトｐ９５ＨＥＲ２と相互作用しなかったが、これは、ＥＣＤ含有ヒトタンパク質に対する特異性を実証している。ＨＥＲ２陽性（約１１〜６７倍高い）対陰性ヒト乳癌、上部消化管癌及び卵巣癌細胞株における高特異的な細胞固有の取り込みによって実証されているように、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］を生成するための放射性フッ素化は、いずれの放射性トレーサーの親和性にも影響を与えなかった。特に、観察された系統の非依存性はまた、ＥＧＦＲのような他の標的と対比した放射性トレーサーのＨＥＲ２特異性、及び乳房以外の癌における潜在的有用性を裏付けている。ＤＯＴＡコンジュゲートを介して111Ｉｎで標識されたＺHER2:2891を用いた前臨床イメージングは、ＳＫＯＶ−３異種移植片における優れた腫瘍ターゲティングを示す（２８）。125Ｉなどの大きな放射性ハロゲンは、111Ｉｎと比較してＡｆｆｉｂｏｄｙ分子の腫瘍ターゲティングに影響を与えると報告されているが、インビボでは、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］のかなり多い取り込みが観察された。実際、１時間という早期の時点では、ＨＥＲ２高発現ＳＫＯＶ−３腫瘍における［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の取り込み（約６０の腫瘍／筋肉比）は、［111Ｉｎ］−ＤＯＴＡ−ＺHER2:2891について報告されたもの（約５０の腫瘍／筋肉比）と同程度であった。ＰＥＴの感度、解像度及び定量は、単一光子計算放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ；111Ｉｎ放射性同位体のイメージングに使用される（２８））と比較して優れているので、早期の時点では、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、類似の［111Ｉｎ］−ＤＯＴＡ−ＺHER2:2891ベースのＳＰＥＣＴと比較して優れたコントラストを提供すると予想される。一方、遅発的なイメージング（例えば、４時間）は、適切な場合には、ＳＰＥＣＴ放射性トレーサーのコントラストの大幅な増加につながり得る。ＳＫＯＶ−３異種移植片における研究では、２時間の時点において、腫瘍のトレーサー取り込みはより高かったが、その増加は、さらなる評価のために、この時点の選択を正当化するには十分では��かったことが示された。トレーサーの全身体内動態に関しては、近位尿細管における再吸収のため、多い腎臓蓄積が放射性金属トレーサーの特徴である（３１）。これとの関連では、111Ｉｎで標識された先のＡｆｆｉｂｏｄｙ分子は、腫瘍で見られたものよりも約１０倍多い十分な腎臓局在性を示したが（２８、２９）、これは、腎臓周辺の領域における腫瘍のイメージングを妨げるだけではなく、線量測定に影響を与えた。対照的に、腎臓における大量のトレーサー蓄積を伴わずに、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の迅速な腎クリアランスが実証された；腎臓の放射能レベルは、６０分の時点の腫瘍におけるレベルと同程度であった（表２）。肝臓を含む他の臓器における取り込みはごくわずかであり、臨床状況において他のＡｆｆｉｂｏｄｙ分子に関して以前に検出された肝臓取り込みが、Ａｆｆｉｂｏｄｙの体内動態又は標識戦略に寄与するかは依然として分かりにくかった；旧世代のＡｆｆｉｂｏｄｙ分子の臨床的進歩は、多い腎臓及び肝臓保持によって妨害されており、隣接転移に対する展望が妨げられていた（３２）。この効果は、少なくとも部分的には、腎臓における放射性金属の喪失及び放射性イオンの保持に起因する可能性があり、腎臓の放射能が、７２時間にわたって腫瘍取り込みよりも１５倍超高かった前臨床モデルにおいても観察されている（３３）。Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子とアルブミン又は18Ｆ放射性標識とのバイオコンジュゲーションは、尿細管再吸収を防ぎ、迅速な糸球体ろ過を可能にする別のアプローチとして提案されている（２３、３４、３５）。本発明者らの知見は、インビボでＡｆｆｉｂｏｄｙ分子の有利な薬物動態特性を維持するための手段として、18Ｆを用いる放射性ハロゲン戦略を支持している。
【００４６】
インビトロ及びインビボにおいて、ＨＥＲ２の結合特異性を評価した。数種類の証拠により、ＨＥＲ２に対する［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の結合は、高特異的であることが示された：ａ）インビトロ及びインビボにおいて、このトレーサーは、ＨＥＲ２陽性細胞及び腫瘍とＨＥＲ２陰性細胞及び腫瘍とを区別し（同系ベクター対照細胞と比較して、ＨＥＲ２受容体（１７）の細胞外ドメインを欠く突然変異体ｐ９５ＨＥＲ２タンパク質を発現する細胞に対する結合の欠如又は減少を含む）、ｂ）細胞におけるＨＥＲ２タンパク質のｓｉＲＮＡノックダウンは、トレーサー取り込みを減少させ、ｃ）コールド非標識［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］による細胞又はマウスの前処理は、取り込みの有意な減少をもたらし、ｄ）ＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）によって決定したところ、蛍光標識ＧＥ−２２６の腫瘍分布は、ＨＥＲ２タンパク質と共局在していた。後者はまた、研究した異種腫瘍モデルでは、Ａｆｆｉｂｏｄｙの腫瘍分布が非限定的であったことを実証した。本発明者らは、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の上記望ましい親和性及び薬物動態特性が、そのＨＥＲ２特異性と共に、本研究で観察された［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の非常に高コントラストなＰＥＴ画像をもたらしたことを示唆する。本発明者らは、本研究における高コントラストな画像がおそらくは、齧歯類ＨＥＲ２に対するトレーサー結合の欠如に部分的に起因すると認識しているが（図６）、それにもかかわらず、Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子に関する齧歯類のデータとして、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の低い非特異的結合は、ヒトのイメージングプロファイルに十分に転換されることが示された。
【００４７】
ＰＥＴイメージングにより、ＨＥＲ２陽性異種移植片における迅速なトレーサー取り込みが実証された。取り込みの動態は、経時的な正味の不可逆的結合反応速度に従っていたので、二組織不可逆的コンパートメントモデルを選択して腫瘍データをフィットした；トレーサーはインビボにおいて安定であったので、代謝産物の補正は必要なかった（図８Ａ）。（イメージング期間にわたる）不可逆的取り込みは、１時間以内に、ＨＥＲ２陰性腫瘍（ＮＵＶ60、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２：６．１±０．７％ＩＤ／ｍＬ）とＨＥＲ２陽性腫瘍（ＮＵＶ60ＭＣＦ７−ＨＥＲ２：１０．９±１．５；ＭＤＡ−ＭＢ−３６１：１８．２±３．４；ＳＫＯＶ−３：１８．７±２．４％ＩＤ／ｍＬ）とを区別することを可能にした。トレーサー注射後の早期の時点では、ＡｆｆｉｂｏｄｙのＰＥＴデータの詳細な動態分析が不足している。時間放射能曲線により、ＨＥＲ２陰性異種移植片における定常状態（限定的なウォッシュアウト）のバックグラウンド取り込みが明らかになったが、これは、文献におけるこれらのペプチド種の正規分布動態と一致していた（２３、３３、３６）。この現象をさらに調査するために、速度論モデリングを用いたところ、トレーサー−ＨＥＲ２相互作用の興味深い生物学的特徴が示された。ＨＥＲ２陰性異種移植片（例えば、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７  ｐ９５ＨＥＲ２）では、取り込みは迅速であり、６０分間のスキャン期間にわたって安定であり続けた。ウォッシュアウト機構は、サイズによって主に決定されるので、Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子の組織保持は、小分子よりも長いが、全長免疫グロブリンほどではない。したがって、ＨＥＲ２陰性腫瘍で観察された取り込みは、非特異的なバックグラウンドの組織分布に起因し得る。対照的に、ＨＥＲ２陽性モデルはすべて、画像取得時間枠全体にわたって連続的な取り込みの増加を示した。本発明者らは、腫瘍におけるトレーサーの正味の不可逆的な捕捉が、トレーサー送達（Ｋ1）及び血液量（Ｖb）の差異ではなく、特異的取り込み（ｋ3；図９Ｂ）によるものであったことを確認した。ＥＬＩＳＡによって決定したところ、腫瘍の取り込みは、ＨＥＲ２発現と相関していた（変数がそれぞれＮＵＶ60又は正味の不可逆的結合定数Ｋiである場合、ｒ2＝０．７８及び０．８２）。本発明者らは、この相関関係が、特異的なＡｆｆｉｂｏｄｙ−ＨＥＲ２相互作用、及びおそらくはいくらかの受容体のインターナリゼーションに起因すると考える（２３、２８、２９）；本研究では、受容体のインターナリゼーションを評価しなかったが、インビボにおける蛍光標識Ａｆｆｉｂｏｄｙの局在性は、本研究の時間枠内のインターナリゼーションが大量であることを示唆していなかった。重要なことに、速度論モデリングは、ＨＥＲ２陽性の閾値を規定することを可能にする（又は、より正確には、ＨＥＲ２陽性腫瘍における不可逆的取り込みを決定する）。
【００４８】
トラスツズマブが最も重要なＨＥＲ２ターゲティング療法であることを考慮して、本発明者らは、トレーサー及び抗体が、同じ細胞外エピトープに対して競合しなかったことを確認したかった。本発明者らは、インビトロ及びインビボの両方において、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の取り込みが、トラスツズマブの存在によって妨げられなかったことを確認した。差次的なエピトープ結合と一致して、トレーサー取り込みは、トラスツズマブによる短期的又は持続的な処理によって影響を受けなかった。インビトロにおけるトラスツズマブによる前処理の２４時間後のわずかであるが有意な取り込みの減少は、高濃度を使用したことによって、受容体のインターナリゼーション又は他の動態が変化したことに関係する可能性が高い（３７、３８）。
【００４９】
最後に、本発明者らは、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］が、ＨＳＰ９０阻害の薬力学的マーカーとして適切であることを確認した。これらの化合物のうちの最も有望なＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（３９）は、現在、第ＩＩ相臨床試験中であり、ＨＥＲ２発現をダウンレギュレートすることが以前に示されている（４０）（これは、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］ＰＥＴによってインビトロ及びインビボで正確に確認された）。これは、ＨＳＰ９０阻害剤１７−アリルアミノゲルダナマイシンがＨＥＲ２を分解して、トラスツズマブの［68Ｇａ］標識Ｆ（ａｂ’）2断片の取り込みの減少をもたらすことを同様に実証したＳｍｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ及び共同研究者らによる報告と一致している（３６）。
【００５０】
結論として、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］ＰＥＴイメージングは、腫瘍の不均一性、細胞株の年齢、又はトラスツズマブによる前処理にかかわらず、ＨＥＲ２受容体発現の正確な区別を可能にする。本発明者らは、トレーサーが、その低い非特異的結合、短命の放射性標識の使用、及びその有利な薬物動態特性により、優れた安全性及び線量測定プロファイルを有すると予想する。これらのデータは、計画されている癌患者におけるこのトレーサーの臨床開発を支持している。
表
【００５１】
【表１】
2016526556.tif 000003
【００５２】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、ＨＥＲ２に高選択的かつ高感度で結合する。（Ａ）差次的なＨＥＲ２の状態の多様な系統の細胞株を［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］に６０分間曝露し、保持放射能（適用放射能の割合として測定）を全タンパク質に対して正規化した（ｎ＝１（５〜６回反復）の平均±ＳＤ）。上記パネルの同じ細胞株について、ウエスタンブロットによって決定した全長ＨＥＲ２タンパク質及び切断型ｐ９５  ＨＥＲ２タンパク質の発現を示す。（Ｂ）遮断用量０．５ｍｇ／ｍＬの［19Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の存在下又は非存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞を［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］と共に６０分間インキュベートし、細胞結合活性を測定した（Ｐ＜０．０００１；ｎ＝３（異なる３日間で３回反復）の平均±ＳＤ）。（Ｃ）ｓｉＲＮＡによってＨＥＲ２発現を一時的に抑制し、６０分後のトレーサー保持を非ターゲティングスクランブル対照と比較した（Ｐ＜０．０００１；ｎ＝３（異なる３日間で３回反復）の平均±ＳＤ）；ウエスタンブロットによって、ノックダウンを確認した。
【図２】［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］は、トラスツズマブと異なる結合部位を有し、ＨＳＰ９０阻害によるＨＥＲ２分解を検出する。（Ａ）１０μｇ／ｍＬのトラスツズマブでＳＫＯＶ−３細胞を１時間又は２４時間処理し、［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］と共にさらなる時間インキュベートし、保持放射能を未処理対照と比較した（＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎ＝５（異なる５日間で３回反復）の平均±ＳＤ）。ＨＥＲ２タンパク質発現に対する効果を以下のパネルに示す。（Ｂ）ＨＥＲ２発現に対するＨＳＰ９０阻害剤ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２の効果及びその結果として生じるトレーサー取り込みに対する影響（対照と比較したすべての濃度について、Ｐ＜０．０００１；ｎ＝３（異なる３日間で３回反復）の平均±ＳＤ）。
【図３】ＨＥＲ２を差次的に発現する異種移植片モデルにおける［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］の腫瘍プロファイル。（Ａ）ＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスのＯＳＥＭ３Ｄ再構成した代表的なＰＥＴ−ＣＴ画像。白色の矢印は腫瘍を示し、オレンジ色の矢印は腎臓を示す。（Ｂ）示されている異種移植片モデルにおける腫瘍の時間放射能曲線の比較（ｎ＝６の平均±ＳＥＭ。ＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２については、ｎ＝３の平均±ＳＥＭ）。（Ｃ）腫瘍溶解物においてＥＬＩＳＡによって決定した、ＮＵＶ60とＨＥＲ２発現との間の相関関係。（Ｄ）Ｋi（腫瘍中のトレーサーの正味の不可逆的保持に関する速度定数）を求めるために単一入力二組織３Ｋモデルを使用した組織薬物動態分析。（Ｅ）ＮＵＶ60とＫi（Ｅ）との間の相関関係。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｆ）ＰＥＴスキャンの２０分前に、３０ｍｇ／ｋｇ［19Ｆ］ＧＥ−２２６のＰＢＳ溶液でＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスを静脈内（ｉ．ｖ．）処理し、未処理対照と比較した。グラフは、１群当たりｎ＝６の腫瘍の時間放射能曲線の平均±ＳＥＭを示す。Ｐ＝０．０００２。（Ｇ）（Ｆ）に記載されている遮断用量で処理した又は処理しなかったマウスの代表的なＰＥＴ−ＣＴ画像、及び遮断実験の動態分析。
【図４】特殊な不均一性を有する腫瘍では、ＧＥ−２２６［配列番号２］は、ＨＥＲ２タンパク質発現と共局在する。フルオレセインでＧＥ−２２６［配列番号２］を標識し、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＡ４３１（これらはそれぞれ、高レベル及び低レベルのＨＥＲ２を発現する）の両方を担持するマウスに注射した。腫瘍を切片化し、隣接するスライドを、ＤＡＫＯ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）を用いて染色したか、又は免疫蛍光顕微鏡検査に使用した。
【図５】［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］結合は、トラスツズマブ処理に干渉せず、ＨＳＰ９０阻害に対する反応を予測することができる。（Ａ）スキャンの２時間前に、５０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブでＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。動物を回復させ、２５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブでさらに２回処理し、初回スキャンの７日後に再イメージングした（ｎ＝６±ＳＥＭ）。早期スキャン及び後期スキャンの両方において、トレーサー取り込みが少ない外れ値であった１匹のマウスは、別個に示されている。（Ｂ）Ａの薬物動態分析（Ｐ＝０．０２５）。（Ｃ）ＳＫＯＶ−３異種移植片モデルにおけるＮＶＰ−ＡＵＹ９２２処理（ｎ＝５±ＳＥＭ）とビヒクル処理対照（ｎ＝４±ＳＥＭ）との比較、及び（Ｄ）阻害定数の動態分析（Ｐ＝０．０１１）。
【図６】表面プラズモン共鳴によって決定したところ、ＧＥ−２２６［配列番号２］は、高い親和性でヒト（Ａ）及びアカゲザル（Ｂ）ＨＥＲ２に結合するが、ヒトｐ９５ＨＥＲ２（Ｃ）及びラットＨＥＲ２（Ｄ）に結合しない。
【図７】トレーサー取り込みは、比放射能に依存する。トレーサーの投与時（ｔ0）、最初のインキュベーションの７０分後（ｔ70）又は１４０分後（ｔ140）直ぐに、２０μＣｉ／ｍＬの［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］でＳＫＯＶ−３細胞をパルスし、細胞結合放射能を測定した。少なくとも２回反復でＮ＝１。誤差：ＳＤ。
【図８】Ａ、３．７ＭＢｑの［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］をマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、注射の１０分後３０分後及び６０分後に、ラジオＨＰＬＣによって代謝産物を定量した。親ピーク（保持時間（ＲＴ）約１０．６分間）を代謝産物（ＲＴ約２９分間）と比較することによって、代謝安定性を評価し、放射化学的純度（ＲＣＰ）の割合として表す。Ｂ、ＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウス（ｎ＝６）の心臓、腫瘍及び腎臓における取り込みに関する、ＰＥＴデータから求めた時間放射能曲線。
【図９】Ａ、ＥＬＩＳＡによって決定した様々な異種移植片モデルにおけるＨＥＲ２発現。Ｂ、これらの異種移植片における［18Ｆ］ＧＥ−２２６［配列番号２］結合の動態パラメータ。
【図１０】薬物未投与のＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウス、又はトラスツズマブで処理したＳＫＯＶ−３異種移植片担持マウスの心臓（Ａ、Ｂ）及び腎臓（Ｃ、Ｄ）における取り込みのＴＡＣ及びＡＵＣ0-60（＊＊＊Ｐ＝０．０００４）。
【図１１】ビヒクル（１０％ＤＭＳＯ及び５％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液）と比較した、５０ｍｇ／ｋｇのＮＶＰ−ＡＵＹ９２２で３回投与することによって処理した後のＳＫＯＶ−３腫瘍におけるＨＥＲ２発現。
【００５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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