(57)【要約】  本発明は、移植患者または移植を必要とする患者が共刺激遮断抵抗性拒絶を起こしやすいかどうかを決定するためにCD4+CD57+ T細胞レベルの変化を利用する方法を提供する。これらの方法は、移植片移植に関連する免疫障害を処置しかつ/または移植物を維持するための効果的な投薬レジメンを同定するのに役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、
（a）共刺激遮断療法を受ける人から血液試料を取得すること、
（b）CD4+CD57+ T細胞の量を定量すること、および
（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンスのCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較すること
を含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスより高い、前記方法。
【請求項２】
患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、
（a）移植を必要とする人から末梢血試料を取得すること、
（b）CD4+CD57+ T細胞の量を定量すること、および
（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンスのCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較すること
を含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスより高い、前記方法。
【請求項３】
CD4+CD57+ T細胞のパーセンテージが、リファレンスにおけるCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較して、少なくとも2倍上昇している、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
リファレンスが正常健常対照または安定移植患者からの血液であるか、何人かの代表的正常健常対照または安定移植患者から決定されたリファレンス値である、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項５】
共刺激遮断療法が、
（a）図4の27位のメチオニンで始まり+357位のリジンまたは+356位のグリシンで終わるアミノ酸配列、または
（b）図4の26位のアラニンで始まり+357位のリジンまたは+356位のグリシンで終わるアミノ酸配列
を含むL104EA29YIgである、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項６】
L104EA29YIg分子投与レジメンが初期相レジメンを含み、初期相レジメンは移植後最初の3ヶ月から6ヶ月の範囲に及ぶことができ、最初は月に1回より頻繁な投与を伴う、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
初期相投与レジメンが、1日目、2週目来院時、4週目来院時、8週目来院時および12週目来院時におけるL104EA29YIg分子の投与を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
初期相投与レジメンが5日目におけるL104EA29YIg分子の投与を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
初期相投与レジメンが、6週目来院時、10週目来院時、4ヶ月目来院時、5ヶ月目来院時および6ヶ月目来院時におけるL104EA29YIg分子の投与を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
投与レジメンがさらに維持相レジメンを含み、維持相レジメンは初期相レジメンが終了した後に始まって、L104EA29YIg分子の投与が月に1回以下の頻度である、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
初期相中のL104EA29YIg分子の有効量が対象の体重に基づいて約10mg/kgである、請求項6に記載の方法。
【請求項１２】
維持相中のL104EA29YIgの有効量が約5mg/kg体重である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
L104EA29YIg分子の有効量が対象の体重に基づいて約10mg/kgであり、かつ投与レジメンが1日目、15日目、29日目、57日目、85日目の投与を含み、その後は月に1回、5mg/kgである、請求項5に記載の方法。
【請求項１４】
L104EA29YIg分子の有効量が対象の体重に基づいて約10mg/kgであり、かつ投与レジメンが1日目、5日目、15日目、29日目、57日目、85日目の投与を含み、その後は月に1回、5mg/kgである、請求項5に記載の方法。
【請求項１５】
L104EA29YIg分子の有効量が対象の体重に基づいて約10mg/kgであり、かつ投与レジメンが1日目、5日目、15日目、29日目、43日目、57日目、71日目、85日目、113日目、141日目、169日目の投与を含み、その後は月に1回、5mg/kgである、請求項5に記載の方法。
【請求項１６】
移植拒絶が、固形臓器移植拒絶、組織移植拒絶および/または細胞移植拒絶を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１７】
移植拒絶が、皮膚移植拒絶、島細胞移植拒絶、筋移植拒絶、肝細胞移植拒絶、ニューロン移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肺移植拒絶、付属器移植拒絶、肢移植拒絶、鼻移植拒絶、耳移植拒絶または顔面移植拒絶である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
移植拒絶が腎臓移植拒絶である、請求項16に記載の方法。 
【請求項１９】
共刺激遮断療法が、約3μg/ml〜約30μg/mlの目標トラフ血清中濃度が維持されるように投与されるL104EA29YIgである、請求項1または請求項2に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2013年3月28日に出願された米国仮特許出願第61/806,206号に基づく優先権を主張し、その内容は全て引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本願ではさまざまな刊行物に言及する。これら刊行物の開示は、本発明が関与する技術分野の現状をより詳しく説明するために、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、移植患者が共刺激遮断抵抗性拒絶を起こしやすいかどうかを決定するための方法に関する。これらの方法は、移植片移植に関連する免疫障害を処置しかつ/または移植物を維持するための効果的な投薬レジメンを同定するのに役立つ。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
移植拒絶ではT細胞が中心的役割を果たすことから、現在の免疫抑制療法に共通する目標は、T細胞の活性化と機能を遮断することである（Sayegh, M.H. et al., N. Engl. J. Med., 338(25):1813-1821 (1998)）。T細胞が完全に活性化するには抗原特異的シグナル（シグナル1）と共刺激シグナル（シグナル2）の両方が必要である（Lenschow, D.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996)）。最もよく特徴がわかっている共刺激経路の一つには、CD28-CD80/86（B7-1/2）相互作用が関与する（Linsley, P.S. et al., Annu. Rev. Immunol., 11:191-212 (1993)）。細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）はCD28より高いアビディティでCD80/86に結合し、T細胞の活性化に続いてT細胞上に一過性に発現することで、CD28とCD80/86の間の相互作用を中断する（Oosterwegel, M.A. et al., Curr. Opin. Immunol., 11(3):294-300 (1999)）。これがT細胞活性化に関する負のフィードバックシグナルを生じる。
【０００５】
機能的に異なるT細胞集団は特異的細胞表面抗原の発現によって定義づけることができる。数多くの研究がT細胞の表面表現型と機能との間の関連について述べている（Appay, V. et al., Nat. Med., 8:379-385 (2002)）。T細胞およびNK細胞上に発現する表面分子CD57は、機能的関連を持つマーカーである。CD57は、一般に、細胞老化（細胞が永続的に細胞周期停止している状態）の外部マーカーであると記載されてきた。CD57を発現するCD4+ T細胞の増殖は、結核、マラリア、関節リウマチ、およびHIV-1感染などといったいくつかの慢性病態と関連付けられている（Maeda, T. et al., Arthritis Rheum., 46:379-384 (2002)；Imberti, L. et al., Blood, 89:2822-2832 (1997)）。
【０００６】
ベラタセプト（L104EA29YIg）は一次維持免疫抑制用に承認された最初の生物学的薬剤であり、CD28共刺激経路を選択的に遮断してT細胞活性化を防止する（Larsen, C.P. et al., Am. J. Transplant., 5:443-453 (2005)）。ベラタセプトとコルチコステロイドおよびミコフェノール酸との併用は、腎移植を受けた成人の移植片拒絶の予防に適応を持つ。ベラタセプトは長期移植片機能ならびに患者生存および移植片生着の改善に関連付けられているが、この共刺激遮断分子で処置された患者は、初期急性拒絶を起こす傾向があった。
【０００７】
さらに、ドナー臓器不足を緩和するために拡大基準ドナーからの腎臓の導入が必要になっているが、レシピエントが合併症および移植片喪失を起こすリスクは、生体ドナー腎または標準基準死体ドナー腎のレシピエントより高い（Tullius, S.G. et al., Eur. Renal Dis., 1:51-54 (2007)）。
【０００８】
共刺激遮断分子およびリスクの高い拡大基準ドナー臓器の使用は増加しているので、共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがある患者を前もって同定する必要があることは明らかである。本発明者らは、共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクと強く相関するCD4+ T細胞表現型を同定した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがある患者を同定するための予測的アッセイは今のところ存在しない。したがって、当技術分野では、ある患者が共刺激遮断分子による処置に適格であるかそれとも急性拒絶のリスクがあるかを決定することができる診断アッセイが必要とされている。本発明はそのような新規アッセイを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
一態様において、本発明は、移植患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、（a）共刺激遮断療法を受ける人から血液試料を取得すること、（b）CD+CD57+ T細胞のパーセントを定量すること、および（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンス中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較することを含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスと比較して上昇している、前記方法を提供する。
【００１１】
もう一つの態様において、本発明は、移植を必要とする患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、（a）移植前の人から末梢血試料を取得すること、（b）CD+CD57+ T細胞のパーセントを定量すること、および（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンス中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較することを含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスと比較して上昇している、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ベラタセプト処置患者からのPBMCを老化のマーカー（CD57）および消耗のマーカー（PD1）について調べたグラフである。ACRを起こした患者は、CD4+コンパートメントにおけるCD57+PD1-細胞のパーセンテージが有意に高かったが、CD8+コンパートメントではそうではなかった。これらの相違はCD4+ T細胞の各メモリーサブセットにおいて有意であったが、CD8+ T細胞ではそうではなかった。
【図２】タクロリムス処置患者からのPBMCを老化のマーカー（CD57）および消耗のマーカー（PD1）について調べたグラフである。CD4+ T細胞でもCD8+ T細胞でもCD57+PD1-コンパートメントに、アウトカムとの有意な相関関係は見いだされなかった。
【図３】CD28- T細胞が急性細胞性拒絶アウトカムを予測しないことを示す図である。ベラタセプト処置患者およびタクロリムス処置患者からのPBMCを、共刺激マーカーCD28およびCD27の表面発現について調べた。拒絶を起こしたベラ処置（belatreated）患者ではCD28陰性CD4 T細胞の出現率（prevalence）に増加傾向が存在したが、これは統計的有意には及ばなかった。CD8細胞でのCD28発現とアウトカムとの間に相関関係は認められなかった。
【図４】実施例1において利用したフェノフロー（phenoflow）パネルである。*CD3抗体は使用前に1:8希釈し、CD45RA抗体は使用前に1:10希釈した。
【図５】（配列番号1および配列番号2）シグナルペプチド、+1位のメチオニンで始まり+124位のアスパラギン酸で終わるか-1位のアラニンで始まり+124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含む、CTLA4変異体分子L104EA29YIgのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。配列番号1および配列番号2は、シグナルペプチド、+27位のメチオニンで始まり+150位のアスパラギン酸で終わるか+26位のアラニンで始まり+150位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含むCTLA4変異体分子L104EA29YIgの、それぞれヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本願において使用する科学用語および技術用語は、別段の指定がある場合を除き、いずれも当技術分野において一般に使用される意味を有する。本願において使用する以下の単語または表現は、指定した意味を有する。
【００１４】
本明細書にいう「リガンド」は、もう一つの分子を特異的に認識してその分子に結合する分子を指し、例えばCTLA4のリガンドはB7分子である。
【００１５】
「L104EA29YIg」、「ベラタセプト」および「LEA29YIg」は、本明細書では可換的に使用され、アミノ酸変化A29Y（29位のアラニンがチロシンアミノ酸残基で置換されている）とL104E（+104位のロイシンがグルタミン酸アミノ酸残基で置換されている）とを含む野生型CTLA4の細胞外ドメインを含む可溶性CTLA4変異体分子がIgテールに接合されている融合タンパク質を指す（図4の配列番号1および配列番号2に含まれている；L104EA29YIgをコードするDNAは2000年6月20日にATCC（登録商標）番号PTA-2104として寄託された）。ベラタセプトはIV製剤NULOJIX（登録商標）（Bristol-Myers Squibb Company）として市販されている。ベラタセプトは、抗原提示細胞上の表面リガンド（CD80およびCD86）に結合することによって選択的共刺激遮断薬として作用する融合タンパク質である。抗原認識において、T細胞受容体がMHCアロ抗原と出会った時（シグナル1）の効率のよいT細胞活性化には、CD80およびCD86へのT細胞上の共刺激受容体（CD28）の結合（シグナル2）が必要である。
【００１６】
本明細書にいう「B7」は、B7分子ファミリーを指し、CTLA4および/またはCD28を認識してそれらに結合しうるB7-1（CD80）、B7-2（CD86）およびB7-3を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００１７】
本明細書において使用する用語「CD4」は、Tヘルパー細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞の表面に発現する糖タンパク質である「分化抗原群（cluster of differentiation）4」を指す。
【００１８】
本明細書にいう「CD57+ T細胞」は、CD57分子が細胞表面に発現しているT細胞である。
【００１９】
本明細書において、受容体、シグナルまたは分子を「遮断する」または「阻害する」とは、その受容体、シグナルまたは分子の活性化を妨害することを意味し、それらは当該技術分野において認識されている試験によって検出される。遮断または阻害は部分的であっても完全であってもよい。例えば、細胞媒介性免疫応答の遮断は、腎移植後の血清中クレアチニン濃度などといった移植物の機能性を決定することによって検出することができる。
【００２０】
本明細書にいう「共刺激遮断抵抗性拒絶」および「急性拒絶」は本明細書では可換的に使用され、レシピエントと適合しない同種移植片組織または異種移植片組織に対する反応を指し、これは、典型的には、移植の2〜60日後に起こる。
【００２１】
本明細書において、障害または疾患を「処置する」または「処置すること」とは、薬物療法または他の治療法によって疾患または障害を管理することを意味する。疾患または障害の処置は、疾患に関連する免疫媒介イベントを抑制し、疾患または障害の症状を改善し、疾患または障害の重症度を軽減し、疾患または障害の進行の経過を改変し、かつ/または基礎にある疾患または障害の問題を改善しもしくは治癒させうる。例えば移植片移植に関連する免疫障害の処置は、免疫応答を調節することによって、例えばCTLA4陽性および/またはCD28陽性細胞とB7陽性細胞との機能的な相互作用を調節することによって、達成しうる。例えば腎移植拒絶の処置には、糸球体濾過量（GFR）によって測定される腎移植拒絶の阻害が含まれる。例えば移植片移植に関連する免疫障害の処置には、L104EA29YIgの投与による臓器拒絶の予防が含まれる。さらに、移植片移植に関連する免疫障害の処置は、宿主の生存および移植された臓器の生着を延ばしうる。
【００２２】
本明細書にいう「移植片移植に関連する免疫障害」とは、T細胞とB7陽性細胞との相互作用によって媒介される任意の移植関連疾患を意味し、例えば移植片移植拒絶に関連する免疫障害、移植片関連障害、移植片対宿主病（GVHD）（例えば骨髄移植に起因しうるもの、または寛容の誘導をもたらしうるもの）、移植片または移植物の急性拒絶および移植片または移植物の慢性拒絶を含む移植片または移植物の拒絶を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
本明細書にいう「移植片」または「移植物」は、固形臓器の同種移植片または異種移植片、組織または細胞の同種移植片または異種移植片、あるいは外部構造の同種移植片または異種移植片であることができ、例えば皮膚、島細胞（島とも呼ばれる）、筋、肝細胞、ニューロン、心臓、肝臓、腎臓、肺、付属器、肢、鼻、耳または顔面を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
ベラタセプトなどの共刺激遮断免疫抑制時に、一部の患者では、初期共刺激遮断抵抗性拒絶が見られている。共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがある患者をT細胞表現型によって前もって同定することができるかもしれないという仮説の下に、T細胞老化のマーカーであるCD57を発現する最終分化メモリー細胞を特異的に定量し、この発現を臨床アウトカムと関係づけることにより、共刺激遮断を受ける移植患者を研究した（実施例1参照）。
【００２５】
実施例1において考察するように、薬物投与に先だって腎臓移植患者から末梢血試料を得て、マルチパラメータフローサイトメトリーで解析することにより、記憶、分化、活性化、消耗および老化のマーカーについて、試料を特異的に解析した。最終的に急性拒絶を起こした患者は、拒絶がない患者と比較して、移植の時点で、CD4+CD57+PD1- T細胞のパーセンテージが著しく高かった（p＝0.0055）（図1）。CD4+ T細胞でのCD57発現は、典型的には老化のマーカーと見なされているが、これには増殖マーカーKi67の発現と逆説的な相関関係があり（p＝0.0087）、テロメア長の短縮とは関連しなかった（p＝0.7424）。これらの関係はCD4コンパートメントに限定された。CD8+CD57+ T細胞は急性拒絶患者の方が高い傾向がわずかにあったが（p＝0.2358、図1）、CD8+ T細胞でのCD57発現は、Ki67発現の低減やテロメア長の短縮を含む、より伝統的な老化の指標と関連した。
【００２６】
一態様において、本発明は、移植患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、（a）共刺激遮断療法を受ける人から血液試料を取得すること、（b）CD+CD57+ T細胞のパーセントを定量すること、および（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンス中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較することを含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスと比較して上昇している、前記方法を提供する。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明は、移植を必要とする患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、（a）移植前の人から末梢血試料を取得すること、（b）CD+CD57+ T細胞のパーセントを定量すること、および（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンス中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較することを含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスと比較して上昇している、前記方法を提供する。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、腎臓移植患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、（a）共刺激遮断療法を受ける人から血液試料を取得すること、（b）CD+CD57+ T細胞のパーセントを定量すること、および（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンス中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較することを含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスと比較して上昇している、前記方法を提供する。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、腎臓移植の必要がある患者に共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがあるかどうかを予測する方法であって、（a）移植前の人から末梢血試料を取得すること、（b）CD+CD57+ T細胞のパーセントを定量すること、および（c）試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージをリファレンス中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較することを含み、試験試料中のCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージがリファレンスと比較して上昇している、前記方法を提供する。
【００３０】
一実施形態において、リファレンスは、正常健常対照または安定移植患者からの血液であるか、または何人かの代表的正常健常対照または安定移植患者から決定されたリファレンス値であることができる。
【００３１】
もう一つの実施形態では、CD4+CD57+ T細胞のパーセンテージが、リファレンスにおけるCD4+CD57+ T細胞のパーセンテージと比較して、少なくとも2倍、2〜25倍、2〜20倍、2〜15倍、2〜10倍、2〜5倍、上昇している。
【００３２】
もう一つの実施形態では、血液試料のCD4+CD57+ T細胞含有量が、フローサイトメトリーによって測定される。フローサイトメトリーは免疫表現型検査のために臨床検査室で日常的に使用されることが増えている。フローサイトメトリーの利点として、速さ、感度、正確さ、および客観性が挙げられる。フローサイトメーターの構成要素と操作は当業者にはよく知られており、ここでは詳述しない。それらの説明のために、1996年10月22日発行の米国特許第5,567,627号を挙げ、この文献は引用によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。フローサイトメトリーの構成要素と方法論を使用すれば試料のいくつかのパラメータについて特異的情報が得られることを示せば足りる。例えば、試料内の異なるサイズの構成要素について情報を得ることができ、それと同時に、試料内の異なる構成要素から受け取った異なる波長のシグナルについて情報を得ることができる。したがって、試料がさまざまなサイズの構成要素を含み、かつ異なる波長の光を放出するラベルを持つ構成要素も含んでいる場合、得られたフローサイトメトリーデータは、ユーザーに多次元の情報を提供することができる。本発明は、異なるタイプの標識抗体ならびに既知の抗原を発現する標識細胞および非標識細胞を用意することによって、この技術を利用する。それらに試料をばく露した後、それらをフローサイトメーター内で解析することにより、血液に関する大量の情報を迅速かつ効率よく得ることができる。
【００３３】
マルチパラメータフローサイトメトリーは、免疫表現型検査が望まれる場合には、最適な方法である。なぜなら、分化関連抗原に対する抗体と活性化関連抗原に対する抗体とを同時に使用することで、特定の細胞集団がどんな機能を果たしているかが明らかになるので、より少ない細胞から、より多くの情報を客観的に得ることができるからである。例えば、患者および正常健常対照から末梢血試料を得ることで、全血ライジング試薬キット（Whole Blood Lysing Reagent Kit）（Beckman Coulter、カリフォルニア州フラートン）を使った溶血により、マルチカラー蛍光励起セルソーター解析を行うことができる。末梢血白血球の細胞表面抗原は、FACS（登録商標）CaliburフローサイトメーターをCELLQuestプログラム（Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンビュー）と一緒に使用することで検出することができる。細胞表面抗原および細胞内サイトカインは蛍光標識モノクローナル抗体（典型的にはBecton Dickinsonから入手可能）を使って検出することができる。
【００３４】
細胞内サイトカイン解析のための細胞刺激と染色は製造者の説明書（PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）に従って行うことができる。簡単に述べると、末梢血白血球を酢酸ミリスチン酸ホルボールおよびカルシウムイオノフォアで4時間刺激する。刺激の最後の3時間は、細胞内サイトカインを蓄積させるために、細胞内輸送阻害剤モネンシン（nomensin）（GOLGISTOP（登録商標））を添加する。その後、所望の抗原に特異的な蛍光標識モノクローナル抗体で細胞表面抗原を染色する。CYTOFIX（登録商標）/CYTOPERM（登録商標）溶液を添加して細胞を固定し透過処理してから、細胞内サイトカインを蛍光標識モノクローナル抗体で染色し、マルチカラー蛍光励起セルソーター（FACS）解析を行う。
【００３５】
さらなる一実施形態では、共刺激遮断療法が、抗原提示細胞上の表面リガンド（CD80およびCD86）に結合することによって選択的共刺激遮断薬として作用する融合タンパク質である変異体CTLA4Ig分子L104EA29YIg（ベラタセプト）を投与することを含む。
【００３６】
本発明において例示する典型的なベラタセプト医薬組成物は、以下に記載する静脈内（i.v.）製剤である。
【００３７】
凍結乾燥L104EA29YIg 100mg/バイアル医薬品の組成
【表１】
2016515706.tif 000002
a各バイアルは、再構成溶液のバイアル、針およびシリンジ残留液用に10％の過剰充填分を含有する。
【００３８】
凍結乾燥された薬物は、典型的には、10mlの滅菌注射用水USP（SWFI）または0.9％塩化ナトリウム注射液USPで約25mg/mlに再構成される。再構成された溶液はさらに、0.9％塩化ナトリウム注射液USPで1〜10mg/mlの医薬品濃度に希釈される。希釈された注射用医薬品は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。
【００３９】
L104EA29Yは、典型的には、移植に続く初期相高リスク期には患者の体重に基づいて10mg/kgで投与し、維持投薬量は患者の体重に基づいて5mg/kgに減らす。
【００４０】
L104EA29Yの典型的な目標トラフ血清中濃度は、移植後最初の3〜6ヶ月間は、同種移植片の機能を維持するのに十分な約3μg/mL〜約30μg/mL、好ましくは約5μg/mL〜約20μg/mLである。典型的には、維持相におけるL104EA29Yの目標トラフ血清中濃度は約0.2μg/mL〜約3μg/mL、好ましくは約0.25μg/mL〜約2.5μg/mLである。
【００４１】
典型的な投与レジメンは、初期相と、それに続く維持相を含み、初期相では用量を高くし、免疫学的リスクが最大である期間中は投与頻度も増やす。初期相レジメンは移植後最初の3ヶ月から6ヶ月の範囲に及ぶことができ、初期相レジメンでは、最初は月に1回より高い頻度、好ましくは免疫学的リスクおよび/または目標トラフ血清中濃度に依存して毎日、毎週または2週間ごとの頻度で投与が行われる。維持相は初期相が終わると始まり、月に1回を越えない頻度で投与が行われ、必要なだけ長く、典型的には患者が移植物を保持している限り続けられる。本明細書にいう1日目（day 1）は、移植の日またはL104EA29Yもしくはその医薬組成物による処置の初日と定義される。
【００４２】
初期相におけるL104EA29Yの投薬量は、患者の体重に基づいて約8〜約12mg/kg、好ましくは約10mg/kgである。維持相における本発明のL104EA29YIgの投薬量は、患者の体重に基づいて約3〜約7mg/kg、好ましくは約5mg/kgである。
【００４３】
初期相は移植後最初の3ヶ月から6ヶ月に及びうる。初期相中の投与レジメンはレシピエントおよび/または移植片の状況に依存して変化しうる。例えば、集中度の高い初期相レジメンでは、高用量の本発明の分子または医薬組成物を1日目、5日目、2週目来院時（例えば13〜17日目）に投与した後、最初の3ヶ月間は2週間ごとに（例えば4週目来院時、6週目来院時、8週目来院時、10週目来院時、および12週目来院時）に投与し、続いて6ヶ月目来院時までは月に1回（例えば4ヶ月目来院時、5ヶ月目来院時、および6ヶ月目来院時に）投与するであろう。典型的な高集中度初期相レジメンの一例は、1日目、5日目、15日目、29日目、43日目、57日目、71日目、85日目、113日目、141日目および169日目における、患者の体重に基づいて10mg/kgのL104EA29YIgの投与である。集中度の低いレジメンでは、例えば、本発明の分子または医薬組成物を1日目、2週目来院時、4週目来院時に投与した後、3ヶ月目来院時までは月に1回、投与するであろう。典型的な低集中度初期相レジメンの一例は、1日目、15日目、29日目、57日目および85日目における、患者の体重に基づいて10mg/kgのL104EA29YIgの投与である。
【００４４】
典型的には、初期相の後に維持相が続き、ここでは、用量を減らした本発明の分子または医薬組成物が、1〜2ヶ月間隔で、必要なだけ長く、典型的には患者が移植物を保持している限り投与される。上述の高集中度レジメンの場合、維持相の一例として、7ヶ月目来院時から開始される、患者の体重に基づいて5mg/kgのL104EA29YIgの月に1回の投与が挙げられる。一方、上記低集中度レジメンの場合、維持層の一例として、4ヶ月来院時から開始される、患者の体重に基づいて5mg/kgのL104EA29YIgの月に1回の投与が挙げられる。
【００４５】
あるいは、当業者は、患者のリスク状況および/または移植後治療に対する応答に応じて、投与レジメンに変更を加えることができるであろう。例えば、上述の低集中度レジメンの初期相には、レジメンに5日目の投与を追加することによって免疫学的リスクが最も高い期間中の投与頻度を増加させる変更を加えることができるであろう。
【００４６】
本明細書にいう「4週間」、「月（month）」、「ヶ月（months）」、「月に1回（monthly）」は、28±5日の期間を指す。本明細書にいう「2週間」は14±3日の期間を指す。
【００４７】
L104EA29Yの目標トラフ値プロファイルを維持しつつ、移植レシピエントの生活における投与スケジューリングを容易にするには、投与レジメンに融通性が必要である。投薬に関して許容される時間枠は次のとおりとすることができる:
【表２】
2016515706.tif 000003
【００４８】
目標日は、前回の実際の来院日に、所望する期間を加えた結果である。2週目の来院の場合、所望する期間は10日である。前回の来院から2週間後に予定された来院、例えば4週目の来院の後の6週目の来院の場合、所望する期間は14日である。前回の来院から1ヶ月後または4週間後に予定された来院、例えば3ヶ月目の来院の後の4ヶ月目の来院の場合、所望する期間は28日である。前回の来院から2ヶ月後に予定された来院、例えば6ヶ月目の来院の後の8ヶ月目の来院の場合、所望する期間は56日である。例えば15日目の実際の来院日＋14日で、29日目という4週目の目標日になる。上記来院時間枠に基づいて、投与は29日目±3日に行うことができる。投与が26日目に行われたとすれば、その日が、次の目標日の計算に利用される実際の来院日になる。
【００４９】
急性拒絶のリスクが低いレシピエントには、典型的には、生体血縁ドナーおよび十分に適合したレシピエント/ドナーから移植を受ける人々が含まれる。急性拒絶のリスクが高いレシピエントには、典型的には、マージナルドナーからの移植または再移植を受ける人々、高いパネル反応性抗体を有する人々、またはアフリカ系アメリカ人である人々が含まれる。
【００５０】
本発明が関係する技術分野の当業者には明白であるだろうが、本発明は、本発明の本旨または本質的特徴から逸脱することなく、上に具体的に開示した形態以外の形態で体現することができる。それゆえに、上述した本発明の特定実施形態は例示であって限定ではないと見なすべきである。本発明の範囲は、上記の説明で挙げた例に限定されるのではなく、本願請求項に記載されるとおりである。
【実施例１】
【００５１】
ベラタセプトに基づく免疫抑制時に、一部の患者では、初期共刺激遮断抵抗性拒絶が見られている。共刺激遮断抵抗性拒絶のリスクがある患者をT細胞表現型によって前もって同定することができるかもしれないという仮説の下に、T細胞老化のマーカーであるCD57を発現する最終分化メモリー細胞を特異的に定量し、この発現を臨床アウトカムと関係づけることにより、ベラタセプトに基づく共刺激遮断を受ける患者を研究した。
【００５２】
方法：ベラタセプトに基づく免疫抑制を受ける腎同種移植レシピエントからの試料を、IRBの承認を受けた組織取得プロトコールから選択した。
【００５３】
研究対象集団：
エモリー大学病院（Emory University Hospital）/エモリー移植センター（Emory Transplant Center）（エモリー）またはアトランタ小児病院（Children's Healthcare of Atlanta）（CHOA）において評価されている臓器移植レシピエント、臓器移植の候補、およびその臓器ドナーを、研究対象として検討した。
【００５４】
組み入れ基準：
・エモリーまたはCHOAにおいて評価されている臓器移植のレシピエントもしくは候補またはレシピエントのための臓器ドナー。
・既知の末期臓器疾患を何も持たず免疫抑制薬物治療を何も受けていない個体と、免疫抑制を必要とする状態（例えば皮膚疾患）にあって移植療法を必要としない個体とを組み入れるための正常ボランティア。
【００５５】
除外基準：
・エモリーまたはCHOAの医師による移植または移植後追跡調査の基準に合致しえない患者。
・担当医師の意見として、参加することで患者を過度の危険にさらすことになる、何らかの状態。具体的状態として、瀉血を許さない貧血、凝固障害もしくは臨床使用のための生検時に十分な組織の取得を妨げるであろう技術的問題、または同意したプロセスの適時な施行を妨げる医学的緊急性が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５６】
登録
以下のシナリオのそれぞれについてボランティアをリクルートした。
・グループ1：潜在的に免疫性である病因または派生結果を伴う臨床的に認識される合併症の発生。例として、日和見感染、拒絶、悪性腫瘍、自己抗体形成、または免疫抑制薬毒性が挙げられる。
・グループ2：明白な合併症を伴わない安定な移植片機能を特徴とする免疫安定性の維持。これらの患者は、シナリオ1の下で具体的合併症を持つ個体のための比較対照とした。これらの個体は、グループ1で同定された各同定済み合併症について、患者背景が一致する20人までのコホートを設定するために登録した。
・グループ3：移植前状況。腎臓、膵臓、肝臓または肺移植のレシピエント候補を登録して、待機期間、移植時および移植後を通して追跡した。これらの個体は、急速に発生する合併症の予期的な無症状段階での検出に有用である可能性を持つアッセイの遡及評価を容易にするために、免疫合併症の臨床症状に先だって、前もって免疫合併症を捕捉するのに役だった。
・グループ4：上記3つのシナリオの1つの基準に合致する個体のためのドナー。免疫関連合併症の多くは、ドナー抗原に特異的な免疫応答が引き金を引くか、またはそのような免疫応答が関与するので、ドナー特異的免疫の評価にはドナー組織が必要である。腎臓移植レシピエントは生体ドナーから臓器を受け入れたので、機序解析用の標的末梢血リンパ球を得るために、彼らのドナーを登録した。
・グループ5：臓器不全の発生につながりうる肝臓疾患、腎臓疾患または肺疾患を有する個体。これらの個体を含めることによって、移植後に再発しうる疾患の機序の研究が可能になり、再発のリスクが増加しているのはどの患者かを予測しやすくなる。さらにまた、このグループは、移植後の経過に影響を及ぼしうる疾患合併症の研究も可能にした。
・グループ6：患者試料用のリファレンス比較対照として役立つように、正常ボランティア、および移植を受けない病状のために免疫抑制剤の投与を受けている人々をリクルートした。
【００５７】
女性および十分なサービスを受けていない少数民族出身者の組み入れには注意を払って患者をリクルートした。登録は、評価対象である疾患プロセスに応じた年齢、性別、および民族性を持つ個体からの試料のコレクションをもたらす患者背景を対象とした。
【００５８】
手順
登録後にボランティアは試料を提供することができた。一般に、この研究のために提供される血液の体積は、各時点について50mLまたは3mL/kgのうちのどちらか少ない方とした。個別のアッセイの必要上、これより多量の試料が要求される状況（例えばリンパ球枯渇患者、または多重に計画されたアッセイ）では、血液量を増やして1回の瀉血セッションにつき最大150mLまでを収集したが、血液量が3mL/kgを越えることはなかった。採取した血液の総量は、最新のNIHガイドラインに沿って、どの6週間をとっても、450mLまたは7mL/kgのうちのどちらか少ない方を越えることはなかった。生検組織およびBAL液は、この手順を監督する医師が決定した臨床診断の需要に要求されるものを上回る組織または液に限定した。尿は、診断試験に差し障ることなく提供されうるものに限定し、典型的には、正常ボランティアおよび腎臓ドナーまたは腎臓レシピエントからのみ収集した。提供スケジュールはグループによって異なった。一般に、記録された合併症を持つ患者（グループ1）は、合併症が診断された時、合併症の消散（または慢性状態の場合は持続）の1ヶ月後および6ヶ月後に、登録、研究が行われた。
【００５９】
試料はエモリー移植バイオレポジトリー（Emory Transplant Biorepository）に送られ、そこで研究または貯蔵のために加工された。一般に、血液試料は、末梢血単核球（PBMC）、血清、血漿、PBMC由来DNA、およびcDNAに変換されたPBMC由来RNAの形で分離し、貯蔵した。生検組織は液体窒素中で急速凍結し、DNA、RNA、およびcDNAに変換した。BAL液は細胞液と単核球とに分離し、細胞を貯蔵するか、またはDNA、RNA、およびcDNAに変換した。尿は遠心して、細胞上清と細胞ペレットとに分離した。ペレットを貯蔵し、かつ/またはRNAおよびcDNAに変換した。試料は新鮮な状態で研究するか、余剰分として廃棄した場合もある。
【００６０】
この集団の多様性を保証するために、年齢、性別、および人種を含む患者背景データを記録した。臨床情報は各試料収集の時に収集され、移植を必要とする原疾患、移植の日、試料提供の日、移植時の薬物用量、免疫抑制薬の直近のレベル、提供時のクレアチニン、ベースラインクレアチニンなどの情報を含んだ。被験者に血液の提供を依頼した時はその度に、彼らの健康状態が精査されることになる。治験来院の結果として明らかになる臨床関連情報（例えば瀉血後の過度の紫斑形成、肉眼的血尿など）は、措置がなされるように患者の担当医師に申し送りした。
【００６１】
アッセイ
薬物投与に先だって末梢血試料を得て、記憶、分化、活性化、消耗および老化のマーカーについて試料を特異的に解析するマルチパラメータフローサイトメトリーによって解析した。
【００６２】
PBMC試料を融解し、5×105細胞/50μl/チューブの濃度で再懸濁した。チューブ1本につき1μlのLIVE/DEAD固定アクア死細胞染料（live/dead fixable aqua dead cell stain）を加えた。次にチューブを暗所室温で30分間インキュベートしてから、1mlの1×PBSで2回洗浄し、50μlのPBSに再懸濁した。
【００６３】
抗体：フルオレセインイソチオシアネート（FITC）にコンジュゲートされた抗体には、CD2（BD Pharmingen #555326）、CD11a（BioLegend #301206）、CD39（Miltenyi Biotec #130-093-502）、CD57（BD Pharmingen #555619）、CD103（Beckman Coulter #IM1856U）、IgD（BD Pharmingen #555778）、Ki67（BD Pharmingen #556026）、およびパーフォリン（BD Pharmingen #556577）が含まれた。
【００６４】
フィコエリトリン（PE）にコンジュゲートされた抗体には、CD25（Miltenyi Biotec #130-091-024）、CD28（BD Pharmingen #555729）、CD31（Miltenyi Biotec #130-092-653）、CD38（BD Pharmingen #555460）、BCL2（BD Pharmingen #556535）、IgM（BD Pharmingen #555783）、PD1（CD279）（BioLegend #329906）およびグランザイムB（Invitrogen #MHGB04）が含まれた。
【００６５】
PE-Cy7は、488nm光で励起されてエネルギー供与体として働くR-フィコエリトリン（PE）が、エネルギー受容体として作用して780nmに極大を持つ蛍光を発するシアニン色素Cy7（Cy7）と共役してなるタンデム蛍光色素である。PE-Cy7タンデム蛍光色素にコンジュゲートされた抗体には、CD19（BD Pharmingen #341093）、CD127（eBioscience #25-1278-42）、およびCCR7（CD197）（BD Pharmingen #557648）が含まれた。
【００６６】
アロフィコシアニン（APC）にコンジュゲートされた抗体には、CD27（BioLegend #302810）、HLADR（BD Pharmingen #340549）、CCR5（CD195）（R&D #FAB1802A）、およびIgG（BD Pharmingen #550931）が含まれた。CD127（BD Pharmingen #558598）はALEXA FLUOR（登録商標）647にコンジュゲートした。ALEXA FLUOR（登録商標）647蛍光色素の発光はAPCと同じ装置設定で収集される。
【００６７】
ALEXA FLUOR（登録商標）700にコンジュゲートされた抗体には、CD3（BD Pharmingen #557943）、およびCD27（eBioscience #50-168-83）が含まれた。
【００６８】
APC-eFluor 780にコンジュゲートされた抗体には、CD8（eBioscience #47-0088-42）およびCD24（eBioscience #47-0247-42）が含まれた。
【００６９】
V450にコンジュゲートされた抗体には、CD4（BD Horizon #560345）およびCD5（BD Horizon #644487）が含まれた。
【００７０】
パシフィックオレンジ（Pacific Orange）（PacOrange）にコンジュゲートされた抗体には、CD3（Invitrogen #CD0330TR）、CD14（Invitrogen #MHCD1430）およびCD20（Invitrogen #MHCD2030）が含まれた。
【００７１】
QDOT（登録商標）655ナノクリスタルコンジュゲート（QDOT（登録商標）655）にコンジュゲートされた抗体には、CD45RA（Invitrogen #Q10069）が含まれた。CD38（eBioscience #95-0388-42）はeFluor650NCにコンジュゲートされた。eFluor650NC蛍光色素の発光は、QDOT（登録商標）655と同じ装置設定で収集される。
【００７２】
細胞外染色：図4に列挙する抗体の必要量を適当なチューブに加え、暗所氷上で30分間インキュベートしてから、1mlの1×PBSで2回洗浄し、200μlのPBSに再懸濁した。
【００７３】
細胞内染色：300μlのBD CYTOFIX（登録商標）/CYTOPERM（登録商標）をチューブ7およびチューブ8に加え、暗所氷上で30分間インキュベートしてから、1mlの1×BD Perm/Washバッファーで2回洗浄した。図4に示すICS抗体を適当なチューブに加え、暗所室温で30分間インキュベートしてから、1mlの1×BD Perm/Washバッファーで2回洗浄し、200μlのPBSに再懸濁した。
【００７４】
製造者の説明書に従って試料をBD LSRFortessa（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）にかけた。
【００７５】
QuantStudio（Life Technologies）でiTaq SYBR（登録商標）（Bio-Rad）を使って老化に関連するパラメータであるテロメア長のPCR解析も行い、5人の正常健常対照からのリファレンス試料と比較した。移植から7ヶ月以内に、9人の患者が急性細胞性拒絶を起こし、5人には拒絶がなかった。
【００７６】
結果：最終的に急性細胞性拒絶を起こした患者は、拒絶がなかった患者と比較して、移植の時点で、CD4+CD57+PD1- T細胞のパーセンテージが著しく高かった（p＝0.0055）（図1）。CD4+ T細胞でのCD57発現は、典型的には老化のマーカーと見なされているが、これには増殖マーカーKi67の発現と逆説的な相関関係があり（p＝0.0087）、テロメア長の短縮とは関連しなかった（p＝0.7424）。これらの関係はCD4コンパートメントに限定された。CD8+CD57+ T細胞は急性拒絶患者の方が高い傾向がわずかにあったが（p＝0.2358、図1）、CD8+ T細胞でのCD57発現は、Ki67発現の低減やテロメア長の短縮を含む、より伝統的な老化の指標と関連した。
【００７７】
考察：この研究では、ベラタセプト抵抗性拒絶のリスクと強く相関するCD4+ T細胞表現型が同定された。CD57は、一般に、細胞老化（細胞が永続的に細胞周期停止している状態）の外部マーカーであると記載されてきた。しかし、非老化（Ki67+、正常テロメア長）表現型がCD57と関連することと、それがCD4+ T細胞に限定されることから、この状況では、これは活性化T濾胞ヘルパー（TFH）細胞のフラグ（ＦＬＡＧ（登録商標））であることが示唆される。TFH細胞は、一定の免疫応答にとって不可欠であることが知られている抗原曝露歴のある細胞であり、CD154およびCD28ホモログICOSを含む代替的共刺激経路によって駆動される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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