(57)【要約】  本発明の実施形態は、内部空胴を有する脂質二重層と、細胞におけるＷＡＳｐの発現又は分解を変更するように構成された内部空胴内の治療物質と、細胞の細胞外ドメインを標的化するように構成された脂質二重層の外部の標的化部分とを含むリポソームに関する。本発明の実施形態は、リポソームを投与することを含む、疾患を治療する方法に関する。新規の医薬組成物も開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームであって、
内部空胴を有する脂質二重層と、
細胞におけるＷＡＳｐの発現又は分解を変更するように構成された、前記内部空胴内の治療物質と、
細胞の細胞外ドメインを標的化するように構成された、前記脂質二重層の外部の標的化部分と、
を含む、リポソーム。
【請求項２】
前記標的化部分が抗体を含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記標的化部分が、造血細胞の表面上に優先的に又は独自に発現された分子に結合する作用物質を含む、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記造血細胞がリンパ球である、請求項２又は３に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記造血細胞の表面上の分子が細胞接着分子及びインテグリンからなる群から選択される、請求項３に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記インテグリンがリンパ球機能関連抗原−１の高親和性コンフォメーションである、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記治療物質が小分子、ペプチド又はオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記治療物質がＷＡＳｐに結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記治療物質がＷＡＳｐを発現する細胞と接触した場合に、該細胞におけるＷＡＳｐの発現を低減する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記治療物質がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の配列を有するオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドに結合した相補鎖を含む、請求項１０に記載のリポソーム。
【請求項１２】
前記標的化部分が白血球、造血細胞、巨核球又は血小板の表面上に独自に又は優先的に発現された分子に結合する作用物質を含む、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記分子が細胞接着分子及びインテグリンからなる群から選択される、請求項１２に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記インテグリンがその低活性コンフォメーションにある、請求項１３に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記標的化部分がαＩＩｂβ３インテグリンに結合する作用物質を含む、請求項１３又は１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記治療物質が分子、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１７】
前記治療物質がＷＡＳタンパク質に結合する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１８】
前記治療物質がＷＡＳｐと接触した場合に、ユビキチン化部位に結合する、請求項１７に記載のリポソーム。
【請求項１９】
前記ユビキチン化部位がリシン残基７６又は８１である、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２０】
前記治療物質がＷＡＳｐを発現する細胞と接触した場合に、該細胞におけるＷＡＳｐの分解を低減する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２１】
前記治療物質がＷＡＳｐを発現する細胞と接触した場合に、カルパインシステイン−プロテアーゼによるＷＡＳｐのタンパク質分解を低減する、請求項１６又は１７に記載のリポソーム。
【請求項２２】
前記脂質二重層がリン脂質を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２３】
前記リン脂質がホスファチジルコリン又は１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を含む、請求項２２に記載のリポソーム。
【請求項２４】
前記脂質二重層がステロールを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２５】
前記ステロールがコレステロールである、請求項２４に記載のリポソーム。
【請求項２６】
前記脂質二重層がホスファチジルコリン、ＤＰＰＥ及びコレステロールを含む、請求項２５に記載のリポソーム。
【請求項２７】
前記脂質二重層におけるホスファチジルコリン、ＤＰＰＥ及びコレステロールの比率が約６：２：２である、請求項２６に記載のリポソーム。
【請求項２８】
前記リポソームの平均径が約１００ナノメートル〜約１７０ナノメートルである、複数の請求項１〜２７のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項２９】
リンカーを更に含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項３０】
前記リンカーがグリコサミノグリカンを含む、請求項２９に記載のリポソーム。
【請求項３１】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロナンを含む、請求項２０に記載のリポソーム。
【請求項３２】
前記抗体が配列番号８を含むエピトープに結合する、請求項２に記載のリポソーム。
【請求項３３】
前記抗体がｍＡｂ２４（ＨＭ２１８３）、ＫＩＭ１２７及びＡＬ−５７からなる群から選択される、請求項２に記載のリポソーム。
【請求項３４】
前記治療物質が、
４−［１−（｛６−［３−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］ピリジン−３−イル｝カルボニル）ピペリジン−４−イル］モルホリン、
Ｎ−［（２Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−６−（１−メチル−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−５−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アセトアミド、
３，５−ジメチル−１−（１−｛［５−（フェノキシメチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］カルボニル｝ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール、
４−｛３−［（３−イソプロピル−１，４，６，７−テトラヒドロ−５Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）カルボニル］フェニル｝−２−メチルブタ−３−イン−２−オール、
８−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル）−１−イソブチル−３−（４−メトキシベンジル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン、及び、
２’−メトキシ−Ｎ−（１−メチル−２−ピリジン−２−イルエチル）ビフェニル−３−カルボキサミドからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項３５】
前記治療物質が、
１−（３−メチルフェニル）−２−（３−ピリジニルメチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン、
Ｎ−［シクロプロピル（４−メチルピリジン−２−イル）メチル］−３−メチル−１−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、
Ｎ−（１，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−｛［（２Ｓ）−２−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］メチル｝ベンズアミド、
１−［（２Ｅ）−３−フェニル−２−プロペン−１−イル］−４−［２−（３−ピロリジニル）ベンゾイル］ピペラジン、
４−（５−メチルピリジン−２−イル）−１−［（５−メチル−１−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］ピペリジン−４−オール、
Ｎ−（３−メチルベンジル）−Ｎ’−｛［１−（ピリジン−２−イルメチル）ピロリジン−３−イル］メチル｝尿素、
５−アセチル−Ｎ−（２−メチルベンジル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボキサミド、及び、
３−［（２，２−ジメチルプロパノイル）アミノ］−２−メチル−Ｎ−［（１−メチルピペリジン−３−イル）メチル］ベンズアミドからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項３６】
患者において疾患を治療する方法であって、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のリポソームを、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記患者が悪性疾患を患っている、請求項１に記載の治療方法。
【請求項３８】
前記悪性疾患が造血器悪性疾患である、請求項３７に記載の治療方法。
【請求項３９】
前記造血器悪性疾患がＢ前駆細胞型若しくはＴ前駆細胞型急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項３８に記載の治療方法。
【請求項４０】
前記患者がウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症を患っている、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
薬学的に許容可能な担体と、
４−［１−（｛６−［３−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］ピリジン−３−イル｝カルボニル）ピペリジン−４−イル］モルホリン、
Ｎ−［（２Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−６−（１−メチル−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−５−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アセトアミド、
３，５−ジメチル−１−（１−｛［５−（フェノキシメチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］カルボニル｝ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール、
４−｛３−［（３−イソプロピル−１，４，６，７−テトラヒドロ−５Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）カルボニル］フェニル｝−２−メチルブタ−３−イン−２−オール、
８−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル）−１−イソブチル−３−（４−メトキシベンジル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン、及び、
２’−メトキシ−Ｎ−（１−メチル−２−ピリジン−２−イルエチル）ビフェニル−３−カルボキサミドからなる群から選択される化合物と、
を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
薬学的に許容可能な担体と、
１−（３−メチルフェニル）−２−（３−ピリジニルメチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン、
Ｎ−［シクロプロピル（４−メチルピリジン−２−イル）メチル］−３−メチル−１−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、
Ｎ−（１，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−｛［（２Ｓ）−２−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］メチル｝ベンズアミド、
１−［（２Ｅ）−３−フェニル−２−プロペン−１−イル］−４−［２−（３−ピロリジニル）ベンゾイル］ピペラジン、
４−（５−メチルピリジン−２−イル）−１−［（５−メチル−１−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］ピペリジン−４−オール、
Ｎ−（３−メチルベンジル）−Ｎ’−｛［１−（ピリジン−２−イルメチル）ピロリジン−３−イル］メチル｝尿素、
５−アセチル−Ｎ−（２−メチルベンジル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボキサミド、及び、
３−［（２，２−ジメチルプロパノイル）アミノ］−２−メチル−Ｎ−［（１−メチルピペリジン−３−イル）メチル］ベンズアミドからなる群から選択される化合物と、
を含む、医薬組成物。
【請求項４３】
患者において疾患を治療する方法であって、請求項４１又は４２に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記疾患が悪性疾患、ウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
薬学的に許容可能な担体と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７、及び該オリゴヌクレオチドに結合した相補鎖からなる群から選択される化合物とを含む医薬組成物。
【請求項４６】
患者において疾患を治療する方法であって、請求項４５に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記疾患が悪性疾患、ウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ヒトＷＩＰと少なくとも９０％の類似性を有するペプチドであって、リシン残基７６又は８１でＷＡＳｐに結合し、それによりＷＡＳｐをユビキチン化及びその後の分解から保護する、ペプチド。
【請求項４９】
配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５を含む、請求項４８に記載のペプチド。
【請求項５０】
患者において疾患を治療する方法であって、請求項４８又は４９に記載のペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項５１】
前記疾患が悪性疾患、ウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記治療物質がヒトＷＩＰと少なくとも９０％の類似性を有するペプチドを含み、該ペプチドがリシン残基７６又は８１でＷＡＳｐに結合する、請求項１〜９又は１２〜３３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項５３】
前記ペプチドが配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５を含む、請求項５２に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は２０１３年６月３日付けで出願された米国仮出願第６１／８３０，１７８号（その開示が引用することにより本明細書の一部をなす）の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の実施の形態は、リポソーム及びそれを用いて疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）は、血液成分の形成に関わる細胞である造血細胞において発現されるタンパク質である。ＷＡＳｐファミリータンパク質は細胞の増殖、運動性、浸潤及び転移に関わるプロセスであるアクチン重合に関与する細胞骨格タンパク質である。ＷＡＳｐは、同様のドメイン構造を有し、アクチン重合に関与するウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）ファミリーのタンパク質の基本メンバーである。
【０００４】
ＷＡＳｐに加えて、ＷＡＳｐ相互作用タンパク質（ＷＩＰ）として知られるヒトタンパク質も造血細胞において発現する。ＷＩＰはＷＡＳｐに結合し、アクチン重合に関与する。適切に機能するＷＡＳｐタンパク質の発現レベルの低下をもたらすウィスコットアルドリッチ症候群遺伝子における突然変異又は欠失は、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を引き起こし得る。ＷＡＳは主に男性に見られる稀な遺伝性疾患であり、患者は免疫不全、湿疹、自己免疫及び悪性疾患を患う可能性がある。
【０００５】
ＷＡＳｐに関連し、ＷＡＳと同様の症状を呈する別のより重症度の低い遺伝障害は、低い血小板数、下痢及び制御不能な出血を特徴とするＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）である。現在、ＷＡＳ及びＸＬＴの治療はＷＡＳｐの発現及び機能を変更するのではなく、疾患の症状を治療することに重点を置いている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、突然変異した造血細胞と関連する造血器悪性疾患においてＷＡＳｐ及びＷＩＰが過剰発現していることを見出した。ＷＡＳｐの過剰発現が検出された造血細胞、特にリンパ球は、ＷＡＳｐが過剰発現していない正常リンパ球と比較して細胞移動、細胞浸潤性及び細胞外基質（ＥＣＭ）分解の増大を示した。
【０００７】
Ｂ前駆細胞型又はＴ前駆細胞型急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等の造血細胞と関連する悪性疾患では、悪性細胞は細胞浸潤、細胞移動及び細胞増殖のための浸潤突起等の膜構造を形成する傾向があり、それにより悪性疾患が様々な器官に伝播及び転移することが可能になる。造血器悪性疾患と関連する転移は、疾患の致命的転帰につながる可能性のある予後不良の指標となる。
【０００８】
本発明の一実施の形態の態様では、造血細胞と関連する悪性疾患を患う患者においてＷＡＳｐを過剰発現するリンパ球を標的化する方法が提供される。ＷＡＳｐを過剰発現するリンパ球は、活性化リンパ球上で優先的に又は独自に発現される分子に対する抗体を含む造血細胞を標的化するリポソーム（以下、「造血細胞標的化リポソーム（Hematopoietic cell Targeting Liposome；ＨＴＬ）」を、それを必要とする患者に投与することによって標的化することができる。本発明の一実施の形態では、分子は細胞接着分子（ＣＡＭ）の細胞外ドメインである。ＣＡＭはインテグリンであり得る。インテグリンはリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）の高親和性コンフォメーションであり得る。抗体はＨＴＬの外表面に存在し得る。抗体は任意に抗原結合領域、例えばＦａｂフラグメントを含む抗体部分であってもよい。
【０００９】
ＨＴＬは、ＷＡＳｐ遺伝子発現を減少させることが可能なオリゴヌクレオチドを更に含み得る。オリゴヌクレオチドはＨＴＬの内部空胴内に存在し得る。ＨＴＬは造血器悪性疾患を患う患者に投与することができる。ＨＴＬは悪性造血細胞に誘引されて融合することにより、該細胞にＷＡＳｐ遺伝子発現を減少させることが可能なオリゴヌクレオチドを導入し、それにより悪性造血細胞の悪性疾患を軽減させることで造血器悪性疾患を治療することができる。
【００１０】
ＨＴＬは、ＷＡＳｐ分解を増大する作用物質（以下、ＷＡＳｐ分解物質）を含み得る。ＷＡＳｐ分解物質は小分子、ペプチド又はオリゴヌクレオチド等の分子であり得る。ＷＡＳｐ分解物質はＨＴＬの内部空胴内に存在し得る。ＨＴＬは造血細胞と関連する悪性疾患を患う患者に投与することができる。ＨＴＬは悪性造血細胞に誘引されて融合することにより、該細胞にＷＡＳｐ分解を増大するＷＡＳｐ分解物質を導入し、それにより悪性造血細胞の悪性疾患を軽減させることで造血器悪性疾患を治療することができる。
【００１１】
本発明の一実施の形態によると、本発明者らはＷＡＳ及び／又はＸＬＴの治療のためのリポソームを用いた細胞の標的化を更に提案する。不適切なＷＡＳｐ発現又は不十分なＷＡＳｐ発現を有する細胞は、リポソーム（以下、ＷＡＳ細胞標的化リポソーム又はＷＴＬとして知られる）を、それを必要とする患者に投与することによって標的化することができる。ＷＴＬは、不適切又は不十分なＷＡＳｐ発現を有する細胞に対する抗体等の標的化部分を含み得る。抗体はＷＴＬの外表面に存在し得る。ＷＴＬは、ＷＡＳｐの分解を防止又は低減することが可能な小分子、オリゴヌクレオチド又はペプチド等の分子であり得るＷＡＳｐ分解防止物質を更に含んでいてもよい。ＷＡＳｐ分解防止物質はＷＴＬの内部空胴内に存在し得る。本発明の一実施の形態によると、ＷＡＳｐ分解防止物質はＷＡＳｐ分解部位でＷＡＳｐに結合する。
【００１２】
本発明の一実施の形態によると、不適切なＷＡＳｐ発現を有する細胞は白血球又は別の造血細胞である。本発明の一実施の形態によると、不適切又は不十分なＷＡＳｐ発現を有する細胞はリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、単球、顆粒球、巨核球又は血小板である。
【００１３】
ＷＴＬ上に存在する抗体は、白血球、造血細胞、リンパ球、樹状細胞、マクロファージ、単球、顆粒球、巨核球又は血小板上で優先的に又は独自に発現される分子に対するものであり得る。抗体は表面分子又はＣＡＭの細胞外ドメインに対するものであり得る。ＣＡＭはインテグリンであり得る。抗体は低活性コンフォメーションの表面分子又はインテグリンに対するものであり得る。本発明の一実施の形態では、抗体はＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ６１、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２又はαＩＩｂβ３インテグリンに対するものである。
【００１４】
本論考において他に明記しない限り、本発明の一実施の形態の特徴（単数又は複数）に特徴的な条件又は関係を修飾する「略」及び「約」等の形容詞は、その条件又は特徴が意図される用途の実施の形態の操作に許容可能な許容範囲内であると規定されることを意味するものと理解される。特に指定のない限り、本明細書及び特許請求の範囲における「又は」という単語は、排他的な「又は」ではなく包括的な「又は」とみなされ、それが接続する項目の少なくとも１つ又は任意の組合せを示す。
【００１５】
この発明の概要は、下記の発明を実施するための形態で更に説明される簡略化した形態での概念の選択を取り入れるために提示される。この発明の概要は、特許請求される主題の重要な特徴又は本質的特徴を特定することを意図するものでも、特許請求される主題の範囲を限定するために用いられることを意図するものでもない。
【００１６】
本発明の実施形態の非限定的な例を、本段落の後に挙げる添付の図面を参照して下記に説明する。２つ以上の図面に見られる同一の構造、要素又は部品には概して、それらが見られる全ての図面で同じ符番を付けている。図面に示す構成要素及び特徴部の寸法は便宜及び表示の明確さで選ばれ、必ずしも縮尺通りに示される訳ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態によるリポソームの概略図である。
【図２】本発明の実施形態によるｓｉＲＮＡの投与時の相対ＷＡＳｐ発現を示す棒グラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
上記の発明の概要で言及したように、ＨＴＬ及びＷＴＬはどちらも細胞を標的化し、疾患を治療するために変更されたリポソームである。本発明の一実施形態によるリポソーム１０を図１に概略的に示す。リポソームは脂質二重層２０を含む略球形のベシクルである。リポソーム１０は治療物質３０、リンカー４０及び標的化分子５０を更に含む。
【００１９】
本発明の一実施形態によると、脂質二重層２０はリン脂質、好ましくは中性リン脂質を含む。本発明の一実施形態によると、リン脂質はホスファチジルコリンである。本発明の一実施形態によると、リン脂質はダイズホスファチジルコリンである。本発明の一実施形態によると、リン脂質は１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）である。
【００２０】
他の使用可能な中性リン脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、及び１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）からなる群から選択される。
【００２１】
本発明の一実施形態によると、脂質二重層は２つ以上の脂質の混合物を含む。本発明の一実施形態によると、脂質二重層はステロール、好ましくはコレステロールを含む。本発明の一実施形態によると、脂質二重層はホスファチジルコリン、ＤＰＰＥ及びコレステロールから構成される。本発明の一実施形態によると、ホスファチジルコリン、ＤＰＰＥ及びコレステロールの比率は６：２：２である。本発明の一実施形態によると、リポソーム１０は単層ベシクルである。
【００２２】
本発明の一実施形態によると、リポソーム１０の平均径は約８０ナノメートル〜２００ナノメートル（ｎｍ）である。本発明の一実施形態によると、標的化部分に結合していないＨＴＬ及びＷＴＬのリポソームの平均径は約９０ｎｍ〜約１４０ｎｍである。本発明の一実施形態によると、標的化部分への結合後のＨＴＬ及びＷＴＬのリポソームの平均径は約１００ｎｍ〜約１７０ｎｍである。
【００２３】
治療物質３０は小分子、ペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチド等の分子であり得る。治療物質３０は天然のペプチド、タンパク質若しくはヌクレオチドに由来するものであっても、又は合成したものであってもよい。治療物質３０は天然若しくは非天然アミノ酸、又はそれらの組合せを含むペプチドであり得る。
【００２４】
リポソーム１０がＨＴＬである本発明の一実施形態によると、治療物質３０はＷＡＳｐの発現を低減するオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、ＷＡＳｐの発現を低減する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。付加的又は代替的には、治療物質３０はプラスミドベクターに埋め込まれた短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。本発明の一実施形態によると、ｓｉＲＮＡは表１の配列と少なくとも９０％の類似性を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２５】
【表１】
2016524621.tif 000003
【００２６】
本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号１とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号２とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号３とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号４とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号５とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号６とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。本発明の一実施形態によると、オリゴヌクレオチドは配列番号７とその相補配列との二重鎖を含むｓｉＲＮＡであり得る。
【００２７】
上述のように、ＷＡＳｐ及びＷＩＰは造血細胞において発現され、アクチン重合に関与する細胞骨格タンパク質である。正常に機能する細胞では、ＷＡＳｐはＷＡＳｐの分解をもたらすリシン残基７６及び８１でのユビキチン化によって分解される。ＷＩＰはＷＡＳｐに結合し、ＷＡＳｐをユビキチン化から保護することにより分解から保護する。ＷＡＳ患者においては、突然変異ＷＡＳｐの産生のためにＷＩＰがＷＡＳｐと適切に結合せず、結果としてＷＡＳｐが適切に発現される個体よりも急速にＷＡＳｐ分解が生じる。
【００２８】
リポソーム１０がＷＴＬである本発明の一実施形態によると、治療物質３０はＷＡＳｐに結合して、ＷＡＳｐの分解を防止又は減少させる作用物質ペプチドであり得る。本発明の一実施形態によると、作用物質は小分子、オリゴヌクレオチド又はペプチド等の分子である。作用物質はＷＡＳｐに結合し、リシン残基７６又はリシン残基８１でのユビキチン化を防止する。
【００２９】
本発明の一実施形態によると、ペプチドはＷＡＳｐに結合し、カルパインシステイン−プロテアーゼによるＷＡＳｐのタンパク質分解を防止する。ＷＡＳｐはカルパインシステイン−プロテアーゼに感受性の７つの潜在的部位を有し、そのうち４つがＷＡＳｐのＮ末端ＷＨ１ドメインに位置する。
【００３０】
本発明の一実施形態によると、およそ１０００〜１００００のオリゴヌクレオチド分子が各リポソーム１０中に治療物質３０として存在する。本発明の一実施形態によると、およそ３４００〜５２００のオリゴヌクレオチド分子が各リポソーム１０中に治療物質３０として存在する。
【００３１】
リンカー４０は脂質二重層２０及び標的化分子５０と連結することができる。リンカー４０はポリエチレングリコールを含み得る。リンカー４０はグリコサミノグリカンを含み得る。グリコサミノグリカンはヒアルロナンであり得る。ヒアルロナンの分子量は約７００キロダルトン（ｋＤａ）以上であり得る。グリコサミノグリカンと脂質二重層との体積比は約１：１であり得る。ヒアルロナン等のグリコサミノグリカンは、リポソームの構造に影響を与えることなくリポソームを凍結乾燥（フリーズドライ）及び再水和に供することを可能にする安定化効果を有する。
【００３２】
本発明の一実施形態によると、標的化分子５０は抗体であり得る。抗体はモノクローナル抗体であってもよい。抗体は特定の細胞型で独自に発現される分子に対するものであり得る。特定の細胞型で「独自に発現される」分子とは、主に特定のタイプの細胞の表面上に存在し、概して生物の他の細胞型では存在しないか、又は比較的低いレベルで存在する分子を指す。細胞型はリンパ球、活性化リンパ球、白血球、造血細胞、巨核球又は血小板であり得る。抗体は細胞表面分子又は細胞接着分子（ＣＡＭ）の細胞外ドメインに対するものであってもよい。ＣＡＭは細胞の表面上に位置するタンパク質であり、別の細胞又は細胞外マトリックスとの結合に関与する。ＣＡＭはインテグリンであり得る。インテグリンはαサブユニット及びβサブユニットとして知られる２つのサブユニットから構成される。複数のタイプのαユニット及びβユニットがヒトに存在することが知られている。インテグリンは不活性（低親和性）、活性（高親和性）、及びインテグリンがリガンドに結合したリガンド占有（ligand occupied）という３つの主なコンフォメーション状態をとることが知られている。インテグリンは、「開放（opening up）」によって低親和性状態から高親和性状態へと変換されることでコンフォメーション変化を受け、リガンドのより容易な結合が可能となる。
【００３３】
本発明の一実施形態によると、リポソーム１０毎に約２０〜７０の抗体分子が標的化分子として存在する。
【００３４】
リポソーム１０がＨＴＬである本発明の一実施形態によると、標的化分子５０はリンパ球、好ましくは活性化リンパ球上で独自に発現される分子に対する抗体であり得る。分子は主にリンパ球によって発現されるＣＡＭであり得る。抗体はリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）に対するものであり得る。抗体はリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）の高親和性コンフォメーションに対するものであってもよい。抗体はβサブユニット又はαサブユニット、好ましくはβ２−Ｉサブユニット又はαＬ−Ｉサブユニットに対するものであってもよい。抗体はＣＰＮＫＥＫＥＣ配列（以下、配列番号８）、特にＧｌｕ１７３及びＧｌｕ１７５アミノ酸を含むエピトープに結合し得る。抗体はｍＡｂ２４（ＨＭ２１８３）、ＫＩＭ１２７又はＡＬ−５７であってもよい。
【００３５】
リポソーム１０がＷＴＬである本発明の一実施形態によると、標的化分子５０はリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、単球、顆粒球、巨核球又は血小板によって独自に発現される分子に対する抗体であり得る。抗体はＣＡＭ、好ましくは細胞接着分子の細胞外ドメインに対するものであり得る。細胞接着分子はインテグリンであり得る。抗体は低親和性コンフォメーションのインテグリンに対するものであってもよい。本発明の一実施形態では、抗体はαＩＩｂβ３インテグリンに対するものである。
【００３６】
本発明の一実施形態によると、リポソーム１０は超音波処理及び押出を用いて製造される。リンカー４０は、アミド結合を形成する１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）等のカップリング剤を用いてリポソーム１０にコンジュゲートすることができる。治療物質３０はリポソーム１０にプロタミンとの任意の組合せ及び混合によって導入され得る。標的化分子５０は、任意に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）等のカップリング剤を用いたアミンカップリングによってリンカー４０にコンジュゲートすることができる。
【００３７】
本発明の更なる実施形態は、ＨＴＬ又はＷＴＬリポソームを、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を治療する方法に関する。ＨＴＬリポソームは、限定されるものではないが造血器悪性疾患を含む悪性疾患を治療するために投与することができる。治療される悪性疾患としては、Ｂ前駆細胞型又はＴ前駆細胞型急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を挙げることができる。ＷＴＬリポソームは、ＷＡＳ及び／又はＸＬＴを患う患者を治療するために投与することができる。
【００３８】
本発明の一実施形態では、リポソームを少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成する。本発明の一実施形態では、医薬組成物は経口投与、直腸投与、膣内投与、局所投与、経鼻投与、点眼投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は静脈内投与によるヒト又は動物への使用に適している。
【００３９】
本発明の一実施形態による医薬組成物は単位剤形で好都合に与えることができ、製薬分野で既知の方法のいずれかによって調製される。本発明の一実施形態では、単位剤形は錠剤、カプセル、トローチ剤、カシェ剤、パッチ、アンプル、バイアル又はプレフィルドシリンジの形態である。
【００４０】
本発明の実施形態による医薬組成物は概して、少なくとも１つの活性成分を薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とともに含む医薬組成物の形態で投与される。
【００４１】
経口投与については、医薬組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末等の形態をとることができる。クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム及びリン酸カルシウム等の様々な賦形剤を含有する錠剤がデンプン、好ましくはジャガイモ又はタピオカデンプン及び幾つかの複合ケイ酸塩等の様々な崩壊剤と、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン及びアラビアゴム等の結合剤とともに用いられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク等の潤滑剤が錠剤化目的で非常に有用であることが多い。同様のタイプの固体組成物も軟ゼラチンカプセル及び硬ゼラチンカプセルに充填剤として用いられる。この関連で好ましい材料としては、ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールも挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシルが経口投与に望まれる場合、本発明の成分を様々な甘味剤、着香料、着色料、乳化剤及び／又は懸濁化剤、並びに水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及び同様の様々なその組合せ等の希釈剤と組み合わせることができる。
【００４２】
本発明の実施形態による組成物は、徐放性又は速放性配合物等の制御放出配合物で投与することもできる。かかる制御放出投薬組成物は当業者に既知の方法を用いて調製することができる。
【００４３】
非経口投与を目的として、ゴマ油若しくはラッカセイ油又は水性プロピレングリコール中の溶液、及び対応する水溶性塩の滅菌水溶液を用いることができる。かかる水溶液を必要に応じて適切に緩衝化し、液体希釈剤を初めに十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にしてもよい。これらの水溶液は静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射及び腹腔内注射目的で特に好適である。
【００４４】
本発明の実施形態による医薬組成物は０．１％〜９５％、好ましくは１％〜７０％のリポソームという活性量を含有し得る。
【００４５】
本発明の一実施形態では、リポソームの投与量は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。この投与量を毎日、週３回又は週１回投与することができる。
【００４６】
本発明の一実施形態によると、リポソームはそれを必要とする患者に付加的な抗癌剤と組み合わせて投与される。本発明の一実施形態では、抗癌剤はドキソルビシン、アスパラギナーゼ、メトトレキサート、シタラビン、デニロイキンジフチトクス、リツキシマブ、ダウノルビシン、０、シクロホスファミド、ビンクリスチン、フルダラビン及びデキサメサゾンからなる群から選択される。
【００４７】
本発明の実施形態を下記実施例において更に説明する。
【実施例】
【００４８】
実施例１Ａ：悪性造血細胞におけるＷＡＳｐ及びＷＩＰの過剰発現。
ＷＡＳｐ及びＷＩＰの発現における分子変化を、ヒト癌性細胞でのＷＡＳｐ及びＷＩＰの発現を正常末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に対して比較することによって検査した。悪性細胞株は造血器悪性疾患に由来するものとした。ＰＢＬを健常ドナーの全血からフィコール勾配を用いて単離した後、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びインターロイキン−２を用いてリンパ球を増加させた。トリス含有溶解緩衝液を用いて細胞を溶解した。タンパク質溶解物をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、適切な一次抗体（マウス抗ＷＡＳｐ又はウサギ抗ＷＩＰ又はマウス抗ＧＡＰＤＨ）を用いて免疫ブロットした。免疫反応性タンパク質を抗マウス又は抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて検出した後、増強化学発光による検出を行った。ＡＬＬ、ＣＬＬ及びＮＨＬを含む様々な悪性造血細胞に由来する細胞抽出物で２倍〜６倍のＷＡＳｐ及びＷＩＰの過剰発現が検出された。特に、両タンパク質の過剰発現は強く相関する。これらの結果から、ＷＡＳｐ及びＷＩＰ発現が増大したリンパ球の標的化並びにＷＡＳｐ及びＷＩＰ過剰発現の妨害が造血器悪性疾患の有用な療法であり得ることが示される。
【００４９】
実施例１Ｂ：ＷＡＳｐ過剰発現は造血細胞浸潤を上方調節する。
細胞浸潤に対するＷＡＳｐの影響をゼラチナーゼベースのアッセイを用いて試験した。ＷＡＳｐをコードするプラスミドをトランスフェクトしたリンパ球は、ＷＡＳｐ発現レベルが倍増しなかった対照プラスミドをトランスフェクトした細胞とは対照的に２倍のレベルのＷＡＳｐを発現し、ゼラチナーゼ活性の増大を示した。ゼラチナーゼ活性は、典型的には細胞浸潤を伴うＥＣＭ分解を表す。ＥＣＭ分解はファロイジン染色によって示されるようにＦ−アクチンの蓄積と共局在化していた。これらの結果から、ＷＡＳｐ過剰発現が細胞浸潤能の増大に関連することが示される。悪性細胞におけるＷＡＳｐ発現を減少させることにより細胞の浸潤能力を減少させ、悪性転移を低減することができる。
【００５０】
実施例１Ｃ：ＷＡＳｐ蓄積はリンパ球移動を増進する。
活性化黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ＷＡＳｐ発現細胞のリアルタイムイメージングを行い、野性型ＷＡＳｐ発現細胞とＮ末端が切断された蓄積非分解性突然変異型ＷＡＳｐを発現する細胞とを比較した。細胞を適切なレーザー、フィルター及び検出器を備える共焦点顕微鏡を用いてモニタリングした。突然変異型ＷＡＳｐを発現する細胞は正常に伝播せず、代わりに連続的にローリングし（rolled）、移動した。これらの細胞は平膜構造（膜状仮足）を形成せず、代わりに移動性癌性細胞の特徴であるスパイク状の膜突出（糸状仮足）を生じた。これらの結果から、細胞中のＷＡＳｐ蓄積が該細胞における癌性細胞構造の存在と関連し得ることが更に示される。ＨＴＬを用いてＷＡＳｐ発現を制御することで、悪性特徴を低減することができる。
【００５１】
実施例１Ｄ：ＷＡＳｐ蓄積はリンパ球活性化を増進する。
実施例１Ｃに記載のリンパ球を使用し、細胞内カルシウム濃度及び転写因子である活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）の活性（それぞれリンパ球の活性化及び増殖の指標である）を測定することによってリンパ球活性化に対するＷＡＳｐ蓄積の影響を評価した。カルシウムレベルは、カルシウム感受性Ｆｌｕｏ−３フルオロフォアを使用する分光蛍光分析を用い、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポータープラスミドとの共トランスフェクションによって決定した。突然変異型ＹＦＰ−ＷＡＳｐが発現され、蓄積した細胞において細胞内カルシウム濃度及びＮＦＡＴレベルの両方の顕著な増大が示された。この結果から、リンパ球におけるＷＡＳｐ蓄積がリンパ球の活性化及び増殖を増大し得ることが示される。
【００５２】
実施例１Ｅ：ＷＡＳｐ発現は、特定のＷＡＳｐ  ｓｉＲＮＡによる処理後に効率的に遺伝子サイレンシングされる。
先の実施例に示されるように、ＷＡＳｐは悪性細胞において過剰発現する。ｓｉＲＮＡを用いたＷＡＳｐ発現の遺伝子サイレンシングを試験した。ＷＡＳｐを、市販のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いてサイレンシングした。各々その対応する配列との二本鎖ｓｉＲＮＡの二重鎖の形態である以下のオリゴヌクレオチドの混合物５００ピコモル量を、１×１０７個の細胞に導入した：５’−ＧＣＣＧＡＧＡＣＣＵＣＵＡＡＡＣＵＵＡ−３’（配列番号４）、５’−ＵＧＡＣＵＧＡＧＵＧＧＣＵＧＡＧＵＵＡ−３’（配列番号１）、５’−ＧＡＡＵＧＧＡＵＵＵＧＡＣＧＵＧＡＡＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＡＣＣＵＡＧＣＣＣＡＧＣＵＧＡＵＡＡ−３’（配列番号２）。これらの実験はＴ細胞型白血病細胞において行った。非特異的（Ｎ．Ｓ）ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して、トランスフェクションの４８時間後に約９０％のサイレンシング効率が達成された。
【００５３】
本実施例から、ｓｉＲＮＡが悪性造血細胞に導入した場合にＷＡＳｐ発現の低減に効果的であり、悪性疾患の伝播及び転移の予防に有用であり得ることが示される。本発明の実施形態によるＨＴＬを使用して悪性造血細胞を標的化し、ｓｉＲＮＡを悪性造血細胞に導入することができる。
【００５４】
実施例２Ａ：本発明の実施形態によるリポソームの製造。
ＨＴＬ又はＷＴＬとして使用される抗体をコーティングしたリポソームは、以下のように作製することができる。最初の工程では、６：２：２（又は代替的には検出のためにローダミンフルオロフォアで標識した０．１％ＤＰＰＥを添加して６：２：１．９）のモル比のホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）から構成される多層ベシクル（ＭＬＶ）を調製する。脂質混合物を、６０セルシウス度（℃）で３５分（minutes (min)）〜４０分間撹拌することによってクロロホルムに２ミリグラム毎ミリリットル（ｍｇ／ｍｌ）の最終濃度まで溶解する。その後、６５℃で３０分間の真空回転蒸発を行う。脂質混合物を真空デシケーターで更に一晩乾燥させる。得られる乾燥脂質薄膜をｐＨ７．４の希釈リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で水和させ、十分にボルテックスした後、オービタルシェーカーを用いて２００回転毎分（ｒｐｍ）、３７℃で２時間混合し、ＭＬＶを生成する。
【００５５】
次いで、ＭＬＶを液体窒素及び６５℃に設定したサーモブロックを用いた７サイクルの急速凍結融解に供した後、手動押出デバイスを用いて６５℃で押出し、直径約１００ナノメートル（ｎｍ）の最終サイズを有する単層ベシクル（ＵＬＶ）を得る。押出は、細孔径を０．２マイクロメートルから０．１マイクロメートル（μｍ）まで徐々に減少させたポリカーボネート膜を使用して１つの細孔径につき１０サイクルの２工程で行い、ＵＬＶを形成する。
【００５６】
リンカー（ヒアルロナンを含む）を、１ｍｇのヒアルロナン（ＨＡ；分子量７００ｋＤａ）を撹拌（３７℃で３０分間）により０．１モル（Ｍ）酢酸ナトリウム緩衝液に溶解することによってＵＬＶにコンジュゲートする。次いで、ＨＡを２０ｍｇのカップリング剤１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、ｐＨ＝４．０）を用いて３７℃で２時間撹拌することによって予め活性化する。次いで、押出ＵＬＶ懸濁液を１時間〜３時間超遠心分離した後、ペレットを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．６）に再懸濁する。ＵＬＶ懸濁液及び活性化ＨＡを１：１の体積比で合わせ、穏やかに撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートする。遊離ＨＡを、ＨＡ−ＵＬＶから超遠心分離機（１０５ｇ、４℃、各洗浄につき１時間）を用いる３回の洗浄によって分離する。
【００５７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＨＡコーティングリポソームとのカップリングを、（アミンカップリング法を用いて）以下のようにして行う。５０マイクロリットル（μｌ）のＨＡコーティングリポソームを、穏やかに撹拌しながら室温で２０分間の２００μｌの４００ｍＭ  ＥＤＡＣ及び２００μＬの１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とのインキュベーションによって活性化する。ＮＨＳ−ＥＤＡＣ活性化ＨＡ−リポソームを５０μｌ（約２５μｇ）の所望のｍＡｂ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４）と混合した後、穏やかに撹拌しながら室温で一晩のインキュベーションを行う。ＨＴＬに使用することができる例示的な抗体としては、ＫＩＭ１２７又はｍＡｂ２４（ＨＭ２１８３）が挙げられる。ＫＩＭ１２７は以下の参考文献（引用することにより本明細書の一部をなす）で以前に記載されている：Stephens P, Romer JT, Spitali M, Shock A, Ortlepp S, Figdor CG, Robinson MK. KIM127, an antibody that promotes adhesion, maps to a region of CD18 that includes cysteine-rich repeats. Cell Adhes Commun. 1995 Dec;3(5):375-84. PubMed PMID: 8640375；Lu C, Ferzly M, Takagi J, Springer TA. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin beta 2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. J Immunol. 2001 May 1;166(9):5629-37. PubMed PMID: 11313403。ＷＴＬについては、ＬＦＡ−１に対する抗体（リンパ球に関するもの）又は巨核球及び血小板に特異的なαＩＩｂβ３インテグリン（ＣＤ４１）を認識する抗体を使用することができる。反応性残基を２０μｌのエタノールアミンＨＣｌ（１Ｍ；ｐＨ＝８．５）でブロックする。
【００５８】
得られるリポソームを、セファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO）を充填し、ＨＥＰＥＳ系緩衝溶液（ＨＢＳ、ｐＨ＝７．４）で平衡化したサイズ排除カラムを用いて精製し、非結合ｍＡｂを除去する。
【００５９】
精製したリポソーム懸濁液を、１００％エタノール及びドライアイスの混合物中２００μｌアリコートで約２０分〜３０分間急速凍結した後、−８０℃で２時間〜４時間凍結する。次いで、凍結乾燥デバイスを用いて凍結アリコートを４８時間凍結乾燥する。凍結乾燥リポソームを更に使用するまで−８０℃で保管する。
【００６０】
粒度分布及びゼータ電位の測定：抗体コーティングリポソーム及び対照の非コーティングリポソームの粒度分布及び平均径を、ゼータ電位及び動的光散乱計器を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定する。全ての測定をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中、室温で行う。
【００６１】
上記の方法に従って形成されるリポソームのサイズは、抗体を含まずに直径１０３．０３±０．９２ｎｍ、抗体を含んで直径１３８．２９±０．２７ｎｍであった。リポソームのゼータ電位は抗体を含まず、ＨＡを含まない場合に−８．１±０．５１ミリボルト（ｍＶ）、抗体を含まず、ＨＡを含む場合に−１７．８±１．２ｍＶ、抗体を含み、ＨＡを含む場合に−２４．１±２．９ｍＶであった。
【００６２】
治療物質（ペプチド、小分子又はオリゴヌクレオチド）封入及び取り込み効率の定量化は以下のようにして行う。凍結乾燥リポソーム（全脂質１０μｇ〜１００μｇ）を、ｓｉＲＮＡ（５０ピコモル〜７５０ピコモル）を含むか又は含まない２００μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水で水和させる。ｓｉＲＮＡを完全長組み換えプロタミン（ｓｉＲＮＡ：プロタミンのモル比  １：５）とヌクレアーゼ無含有水中で混合した後、室温で２０分間のインキュベーションを行い、複合体を形成する。リポソームを室温で３０分間穏やかに振盪する。封入されていないｓｉＲＮＡを超高速遠心分離（６．４×ｇ、４℃、２０分間）によって除去した後、懸濁液を細胞に添加する。ｓｉＲＮＡ封入効率をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡアッセイ（Invitrogen）により製造業者の取扱説明書に従って決定する。取り込み効率を、リポソーム中のＲＮＡ結合色素ＲｉｂｏＧｒｅｅｎの蛍光を、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下及び非存在下で比較することによって決定する。界面活性剤の非存在下では、アクセス可能な（取り込まれていない）ｓｉＲＮＡのみからの蛍光が測定される。一方、界面活性剤の存在下では全ｓｉＲＮＡからの蛍光が測定される。封入％は方程式：ｓｉＲＮＡ封入％＝［１−（（遊離ｓｉＲＮＡ濃度）／（全ｓｉＲＮＡ濃度））］×１００によって算出する。封入率は約６０％〜９５％の封入である。
【００６３】
ペプチド負荷については、凍結乾燥リポソーム（全脂質１０μｇ〜１００μｇ）を、４０℃で１時間反復ボルテックスによってペプチド（２５０：１のリン脂質：ペプチドモル比）を含有する２００μｌのＰＢＳで水和させる。ペプチド負荷は蛍光標識ペプチド（Ｃｙ３、Ｐｅｐ（Ｃｙ３）で標識）を用いて定量化し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ  ７５カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって分離を行う。Ｐｅｐ（Ｃｙ３）は、リポソームとともに単一バンドとして溶出する（リポソーム結合ペプチド）。比較すると、対照として使用される遊離Ｐｅｐ（Ｃｙ３）は単一バンドを示さず、カラムに沿って広がる（smear）。リポソーム結合画分を回収し、分離していない（全）Ｐｅｐ（Ｃｙ３）を含有するサンプルと比較して分光蛍光計を使用して定量化する。封入％は方程式：ペプチド封入％＝［（リポソーム結合Ｃｙ３強度（正：intensity））／（全Ｃｙ３強度）］×１００によって算出する。
【００６４】
実施例２Ｂ：ＷＡＳｐ発現を変調する化合物
化合物はChemBridge Corporation（San Diego，CA，USA）から入手した。得られる化合物のうち１４個が、ＷＡＳｐに結合するその能力によってＷＡＳｐ発現を変調する潜在的作用物質とみなされた。この１４個の化合物を２９３Ｔ細胞において以下の手順を用いて試験した。
【００６５】
化合物をＤＭＳＯに個別に溶解して２０ミリモル（ｍＭ）のストック溶液を作製し、−２０℃で保管しておいた。２９３Ｔ細胞を対数期中期、約６０％〜８０％コンフルエンスまで調製し、この細胞に１５μｇの黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ−ＷＡＳｐプラスミド（６０２３）を、リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコルを用いてトランスフェクトした。細胞を回収して計数した。６ウェル内のサンプル当たり１〜２×１０６細胞に、２ｍｌ〜４ｍｌの完全（１０％ＦＣＳ）ＤＭＥＭ培地（０．５×１０６細胞／ｍｌ）を添加した。細胞を６ウェルにプレーティングし（０．５×１０６細胞／ｍｌ×サンプル数）、３７℃、５％ＣＯ２で（細胞を接着させるために）少なくとも４時間プレインキュベートした。細胞を成長させた培地を１ｍｌ取り、化合物（１０μＭ〜８０μＭ）に添加した。化合物を含む培地をプレート内の細胞に滴加して戻した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ウエスタンブロット分析を用いて、化合物で処理した細胞におけるＹＦＰ−ＷＡＳｐ発現の濃度測定分析を行った。ＤＭＳＯ溶媒対照に曝露した細胞に対して１．５倍の発現の相対変化（増大又は減少）を有する化合物を下記表２に挙げる。表２に、対照に対するＷＡＳｐの相対発現に応じたＷＡＳｐ発現レベルの化合物の変調を挙げる。
【００６６】
【表２】
2016524621.tif 000004
2016524621.tif 000005
【００６７】
【表３】
2016524621.tif 000006
【００６８】
本実施例から化合物４、６及び７が細胞におけるＷＡＳｐ発現を増大することが示される。これらの化合物及び／又はこれらの化合物を含むＷＴＬをＷＡＳ又は他の疾患の治療に使用することができる。
【００６９】
本実施例から化合物１０、１３及び１４が細胞におけるＷＡＳｐ発現を効果的に減少させることも示される。これらの化合物及び／又はこれらの化合物を含むＷＴＬを悪性疾患の治療に使用することができる。
【００７０】
使用することができる付加的な化合物には表４に挙げる化合物が含まれる。
【００７１】
【表４】
2016524621.tif 000007
2016524621.tif 000008
【００７２】
実施例２Ｃ：ＷＡＳｐの発現を低減するｓｉＲＮＡ。
多数のｓｉＲＮＡ二重鎖を実施例１Ｅと同様に細胞中で試験した。以下の二本鎖ｓｉＲＮＡ配列を使用した：配列番号１及びその相補配列；配列番号２及びその相補配列；配列番号３及びその相補配列；配列番号１及びその相補配列（１〜４と表す）。５００ピコモルの各二本鎖ｓｉＲＮＡを使用した。加えて、ナンセンスｓｉＲＮＡ配列（「Ｎ．Ｓ．ｓｉＲＮＡ」と表す）を対照として使用した。対照Ｎ．Ｓ．ｓｉＲＮＡは表５中の各々のｓｉＲＮＡ分子の１２５個の二重鎖から作製した。
【００７３】
【表５】
2016524621.tif 000009
【００７４】
加えて、各々１２５ピコモルの配列番号１〜４を含むｓｉＲＮＡの混合物（「ミックス」と表す）も使用した。ウエスタンブロット分析により、全ｓｉＲＮＡ二重鎖がＷＡＳｐの下方調節に効果的であり、配列番号１のｓｉＲＮＡが最も効果的に使用される単一ｓｉＲＮＡであることが示された。Ｎ．Ｓ．ｓｉＲＮＡはＷＡＳｐの下方調節に効果的ではなかった。対照（非処理）細胞に対するＷＡＳｐの相対発現の詳細を示す棒グラフを図２に示す。
【００７５】
実施例２Ｄ：ＷＩＰ様ペプチド
本発明の実施形態によると、ＷＩＰ様ペプチドを作製することができる。ＷＩＰ様ペプチドは、天然のＷＩＰペプチドの一部分と同様であるが潜在的修飾を有するペプチドである。本発明の一実施形態によると、ＷＩＰ様ペプチドは天然のＷＩＰの対応する部分と９０％の類似性を有する。本発明の一実施形態によると、ＷＩＰ様ペプチドは、ＷＡＳｐのユビキチン化部位であることが観察されているリシン残基７６及び８１でＷＡＳｐに結合する。理論に束縛されるものではないが、ＷＩＰ様ペプチドはＷＡＳｐのこれらのリシン残基に結合し、それによりＷＡＳｐをユビキチン化及びその後の分解から保護することが示唆される。
【００７６】
ＷＩＰ様ペプチドは以下の方法を用いて作製される。精製用のＨｉｓ６タグ及びタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位を含有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合構築物を、ＷＩＰ様ペプチドを効率的に発現するために用いた。ＭＢＰ−Ｈｉｓ−Ｔｅｖ−ペプチドコード配列を大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞中で増幅させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）発現細胞に形質転換した。ＷＩＰ様ペプチドをＭ９最小培地中で標準プロトコルを用いて発現させた。細胞を３７℃で約０．８〜１．０のＯＤ６００が達成されるまで成長させた。次いで、イソプロピル−チオ−ガラクトース（ＩＰＴＧ）を１．０ｍＭの最終濃度まで添加し、２７℃で一晩誘導を進行させた。細胞を遠心分離し、溶解緩衝液（１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭベンザミジン及び１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を均質化（Ｃ５ホモジナイザー、Avestin）によって溶解させた後、５ｍＭベンザミジンの第２のアリコートの添加を行い、１ｍＭ  ＰＭＳＦを添加し、溶解物を遠心分離によって清澄化した。溶解物をＮｉ２＋を充填したＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（GE Healthcare, Inc.）にアプライし、溶解緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液中でタンパク質を溶出させた。溶解緩衝液に対する一晩の透析により、３０℃で３時間のＴＥＶプロテアーゼ切断（１：４０（ｗ／ｗ）で添加）を行った。切断の直後に反応物を再度カラムにロードし、フロースルー中のタンパク質を回収し、これを続いて室温で一晩２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に対して透析した。最後に、タンパク質を２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した陽イオン交換カラムにアプライした。カラムを２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中で洗浄し、ＮａＣｌ濃度を１２５ｍＭまで上昇させながら溶出させた。１Ｍギ酸緩衝液を最終濃度５０ｍＭまで用いてペプチド含有画分のｐＨを３．０まで低下させ、タンパク質を遠心濃縮チューブ（ＭＷＣＯ  ３ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ）内で０．５ｍＬの最終容量まで安全に濃縮した。５ｍＭギ酸塩（ｐＨ３．０）によるタンパク質の段階希釈及び濃縮を用いて、リン酸塩及びＮａＣｌを緩衝液から除去した。次いで、ｐＨをｐＨ５．８〜７．０に調整し、得られる精製ペプチドを凍結乾燥し、貯蔵のために−８０℃で凍結した。
【００７７】
以下の表６中のペプチドを本発明の実施形態に従って合成することができる。
【００７８】
【表６】
2016524621.tif 000010
【００７９】
これらのペプチドがＷＡＳｐのリシン残基７６及び／又は８１に結合し、それによりＷＡＳｐをユビキチン化及びその後の分解から保護し得ることが示唆される。
【００８０】
実施例３Ａ：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＷＡＳの治療におけるＷＴＬの使用。
ＷＡＳノックアウトマウスを用いる。野生型（ＷＴ）同腹子を対照として用いる。マウスを病原体除去条件下で飼育する。ＷＡＳｐ分解部位でＷＡＳｐに結合し、ユビキチン化又はカルパイン媒介タンパク質分解によるＷＡＳｐの分解を防止するペプチドを含むリポソームの懸濁液（２００μｌ）を超音波洗浄器（bath sonicator）内で５分間超音波処理し、即座に尾静脈から静脈注射する。体重及び臨床症状を毎日モニタリングする。マウスを９日目に屠殺し、脾臓を摘出する。リンパ球及び巨核球細胞系列を精製し、ＷＡＳｐ発現レベルについて分析する。
【００８１】
ＷＴＬによる処理は、ＷＡＳノックアウトマウスにおいて適切に発現されるＷＡＳｐの量を増大し得る。臨床症状は、対照マウスと比べてＷＴＬで処理したマウスにおいて改善し得る。
【００８２】
実施例３Ｂ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの悪性疾患の治療におけるＨＴＬの使用。
５週齢〜６週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）マウスを購入し、病原体除去環境下で飼育する。接種日に、マウスに２５０センチグレイ（centigeiger）（ｃＧｙ）の全身照射を平行対向４ＭＶ  ｘ線によって３２５ｃＧｙ／分の線量率で行う。接種の直前にマウスを赤外線ランプで温めた後、尾静脈注射によって２．５〜１０×１０６個の白血病細胞を１００ｍＬ  ＰＢＳの最大容量で接種する。尾静脈から採取したおよそ５０ｍＬの末梢血を抗ＣＤ４５（白血球共通抗原、Ｌｙ−５）抗体、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ネズミ及びＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５で染色することによって、マウスを１４日毎に白血病生着についてモニタリングする。赤血球を塩化アンモニウムで溶解した後、サンプルをフローサイトメトリーによって分析する。ヒトに対するネズミＣＤ４５細胞の割合を算出する。このパラメーターは全白血病負荷を正確に反映することが示されている。この方法ではネズミ末梢血中１％のヒトＣＤ４５細胞が検出されるはずである。
【００８３】
上に記載した通りに生着マウスの脾臓からヒト白血病細胞を採取することによって持続的異種移植片を確立する。Ｔ−ＡＬＬ細胞の調製物を使用して、マウス脾臓から通常脾臓１つ当たり純度８５％超の３×１０８個を超える細胞からなる持続的小児ＡＬＬ異種移植片を確立する。二次又は三次受容マウスへの接種の前に、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で細胞を急速解凍する。
【００８４】
二次及び三次生着速度と一次生着速度との比較のために、いずれの場合にも同数のヒト白血病細胞を接種する。ＨＴＬの投与は全白血病負荷の改善を示し得る。
【００８５】
本発明の一実施形態によると、内部空胴を有する脂質二重層と、細胞におけるＷＡＳｐの発現又は分解を変更するように構成された、前記内部空胴内の治療物質と、細胞の細胞外ドメインを標的化するように構成された、前記脂質二重層の外部の標的化部分とを含む、リポソームが更に提供される。任意に、前記標的化部分が抗体を含む。任意に、前記標的化部分が、造血細胞の表面上に優先的に又は独自に発現された分子に結合する作用物質を含む。任意に、前記造血細胞がリンパ球である。任意に、前記造血細胞の表面上の分子が細胞接着分子及びインテグリンからなる群から選択される。任意に、前記インテグリンがリンパ球機能関連抗原−１の高親和性コンフォメーションである。任意に、前記治療物質が小分子、ペプチド又はオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。任意に、前記治療物質がＷＡＳｐに結合する。任意に、前記治療物質がＷＡＳｐを発現する細胞と接触した場合に、該細胞におけるＷＡＳｐの発現を低減する。任意に、前記治療物質がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含む。任意に、前記ｓｉＲＮＡが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の配列を有するオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドに結合した相補鎖を含む。任意に、前記標的化部分が白血球、造血細胞、巨核球又は血小板の表面上に独自に又は優先的に発現された分子に結合する作用物質を含む。任意に、前記分子が細胞接着分子及びインテグリンからなる群から選択される。任意に、前記インテグリンがその低活性コンフォメーションにある。任意に、前記標的化部分がαＩＩｂβ３インテグリンに結合する作用物質を含む。任意に、前記治療物質が分子、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。任意に、前記治療物質がＷＡＳタンパク質に結合する。任意に、前記治療物質がＷＡＳｐと接触した場合に、ユビキチン化部位に結合する。任意に、前記ユビキチン化部位がリシン残基７６又は８１である。任意に、前記治療物質がＷＡＳｐを発現する細胞と接触した場合に、該細胞におけるＷＡＳｐの分解を低減する。任意に、前記治療物質がＷＡＳｐを発現する細胞と接触した場合に、カルパインシステイン−プロテアーゼによるＷＡＳｐのタンパク質分解を低減する。任意に、前記脂質二重層がリン脂質を含む。任意に、前記リン脂質がホスファチジルコリン又は１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を含む。任意に、前記脂質二重層がステロールを含む。任意に、前記ステロールがコレステロールである。任意に、前記脂質二重層がホスファチジルコリン、ＤＰＰＥ及びコレステロールを含む。任意に、前記脂質二重層におけるホスファチジルコリン、ＤＰＰＥ及びコレステロールの比率が約６：２：２である。任意に、複数のリポソームにおける前記リポソームの平均径が約１００ナノメートル〜約１７０ナノメートルである。任意に、前記リポソームがリンカーを更に含む。任意に、前記リンカーがグリコサミノグリカンを含む。任意に、前記グリコサミノグリカンがヒアルロナンを含む。任意に、前記抗体が配列番号８を含むエピトープに結合する。任意に、前記抗体がｍＡｂ��４（ＨＭ２１８３）、ＫＩＭ１２７及びＡＬ−５７からなる群から選択される。任意に、前記治療物質が、
４−［１−（｛６−［３−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］ピリジン−３−イル｝カルボニル）ピペリジン−４−イル］モルホリン、
Ｎ−［（２Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−６−（１−メチル−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−５−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アセトアミド、
３，５−ジメチル−１−（１−｛［５−（フェノキシメチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］カルボニル｝ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール、
４−｛３−［（３−イソプロピル−１，４，６，７−テトラヒドロ−５Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）カルボニル］フェニル｝−２−メチルブタ−３−イン−２−オール、
８−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル）−１−イソブチル−３−（４−メトキシベンジル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン、及び、
２’−メトキシ−Ｎ−（１−メチル−２−ピリジン−２−イルエチル）ビフェニル−３−カルボキサミドからなる群から選択される。任意に、前記治療物質が、
１−（３−メチルフェニル）−２−（３−ピリジニルメチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン、
Ｎ−［シクロプロピル（４−メチルピリジン−２−イル）メチル］−３−メチル−１−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、
Ｎ−（１，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−｛［（２Ｓ）−２−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］メチル｝ベンズアミド、
１−［（２Ｅ）−３−フェニル−２−プロペン−１−イル］−４−［２−（３−ピロリジニル）ベンゾイル］ピペラジン、
４−（５−メチルピリジン−２−イル）−１−［（５−メチル−１−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］ピペリジン−４−オール、
Ｎ−（３−メチルベンジル）−Ｎ’−｛［１−（ピリジン−２−イルメチル）ピロリジン−３−イル］メチル｝尿素、
５−アセチル−Ｎ−（２−メチルベンジル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボキサミド、及び、
３−［（２，２−ジメチルプロパノイル）アミノ］−２−メチル−Ｎ−［（１−メチルピペリジン−３−イル）メチル］ベンズアミドからなる群から選択される。任意に、前記治療物質がヒトＷＩＰと少なくとも９０％の類似性を有するペプチドを含み、該ペプチドがリシン残基７６又は８１でＷＡＳｐに結合する。任意に、前記ペプチドが配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５を含む。
【００８６】
本発明の一実施形態によると、患者において疾患を治療する方法であって、上述の請求項のいずれか一項に記載のリポソームを、それを必要とする患者に投与することを含む、方法が更に提供される。任意に、前記患者が悪性疾患を患っている。任意に、前記悪性疾患が造血器悪性疾患である。任意に、前記造血器悪性疾患がＢ前駆細胞型若しくはＴ前駆細胞型急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。任意に、前記患者がウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症を患っている。
【００８７】
本発明の一実施形態によると、薬学的に許容可能な担体と、
４−［１−（｛６−［３−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］ピリジン−３−イル｝カルボニル）ピペリジン−４−イル］モルホリン、
Ｎ−［（２Ｒ，４Ｒ，６Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−６−（１−メチル−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−５−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］アセトアミド、
３，５−ジメチル−１−（１−｛［５−（フェノキシメチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］カルボニル｝ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール、
４−｛３−［（３−イソプロピル−１，４，６，７−テトラヒドロ−５Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）カルボニル］フェニル｝−２−メチルブタ−３−イン−２−オール、
８−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル）−１−イソブチル−３−（４−メトキシベンジル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン、及び、
２’−メトキシ−Ｎ−（１−メチル−２−ピリジン−２−イルエチル）ビフェニル−３−カルボキサミドからなる群から選択される化合物と、
を含む、医薬組成物が更に提供される。
【００８８】
本発明の一実施形態によると、学的に許容可能な担体と、
１−（３−メチルフェニル）−２−（３−ピリジニルメチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン、
Ｎ−［シクロプロピル（４−メチルピリジン−２−イル）メチル］−３−メチル−１−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド、
Ｎ−（１，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−｛［（２Ｓ）−２−（メトキシメチル）ピロリジン−１−イル］メチル｝ベンズアミド、
１−［（２Ｅ）−３−フェニル−２−プロペン−１−イル］−４−［２−（３−ピロリジニル）ベンゾイル］ピペラジン、
４−（５−メチルピリジン−２−イル）−１−［（５−メチル−１−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］ピペリジン−４−オール、
Ｎ−（３−メチルベンジル）−Ｎ’−｛［１−（ピリジン−２−イルメチル）ピロリジン−３−イル］メチル｝尿素、
５−アセチル−Ｎ−（２−メチルベンジル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボキサミド、及び、
３−［（２，２−ジメチルプロパノイル）アミノ］−２−メチル−Ｎ−［（１−メチルピペリジン−３−イル）メチル］ベンズアミドからなる群から選択される化合物と、
を含む、医薬組成物が更に提供される。
【００８９】
本発明の一実施形態によると、薬学的に許容可能な担体と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７、及び該オリゴヌクレオチドに結合した相補鎖からなる群から選択される化合物とを含む医薬組成物が更に提供される。
【００９０】
本発明の一実施形態によると、上記で開示される医薬組成物を投与することを含む、疾患を患う個体を治療する方法が更に提供される。任意に、前記疾患が悪性疾患、ウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症である。
【００９１】
本発明の一実施形態によると、ヒトＷＩＰと少なくとも９０％の類似性を有するペプチドであって、リシン残基７６又は８１でＷＡＳｐに結合し、それによりＷＡＳｐをユビキチン化及びその後の分解から保護する、ペプチドが更に提供される。任意に、前記ペプチドが配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５を含む。
【００９２】
本発明の一実施形態によると、患者において疾患を治療する方法であって、上記で開示されるペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法が更に提供される。任意に、前記疾患が悪性疾患、ウィスコットアルドリッチ症候群又はＸ連鎖性血小板減少症である。
【００９３】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprise）」、「含む（include）」及び「有する（have）」という動詞並びにその活用形（conjugates）はそれぞれ、動詞の目的語（単数又は複数）が必ずしも動詞の主語（単数又は複数）の成分、要素又は部品の完全な列挙ではないことを示すために用いられる。
【００９４】
本願における本発明の実施形態の説明は例として提示され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。記載の実施形態は様々な特徴を有し、その特徴全てが本発明の全ての実施形態に必要とされるわけではない。幾つかの実施形態では幾つかの特徴又は特徴の考え得る組合せのみが用いられる。当業者であれば、記載の本発明の実施形態及び記載の実施形態で述べられる様々な特徴の組合せを有する本発明の実施形態の変形形態に想到するであろう。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2016524621.tif 000011
【図２】
2016524621.tif 000012
【配列表】
2016524621000001.app
【国際調査報告】
2016524621.tif 000013
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