(57)【要約】  1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、c-myc発現を減少させる、デスモプラキン発現を増加させる、及び転移を阻害する組成物及び方法が本明細書に開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する方法であって、
下式の化合物:
【化１】
2016529257.tif 000060
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することが、前記対象の冒された組織における該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、該対象の冒されていない組織における該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することが、該1種以上のプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記投与する工程の前に、前記1種以上の遺伝子プロモーターが過剰メチル化されている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記投与する工程の後で、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態の変化がある、請求項１記載の方法。
【請求項７】
メチル化状態の前記変化が、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記所望のメチル化状態が達成されない場合、有効量の前記組成物の投与を繰り返すことをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記所望のメチル化状態が、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
投与することが腹腔内投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
投与することが経口投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
投与することが静脈内投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)遺伝子プロモーター、c-myc遺伝子プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、mutLホモログ1プロモーター、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、転写因子21(TCF21)プロモーター、又は血管内皮細胞成長因子-A(VEGF-A)プロモーターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記1種以上の遺伝子プロモーターが、エストロゲン受容体遺伝子(ER)プロモーター、乳癌1遺伝子(BRCA1)プロモーター、上皮カドヘリン遺伝子(E-cad)プロモーター、TMS1遺伝子プロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質7遺伝子(IGFBP7)プロモーター、p16プロモーター、レンチオイン酸受容体遺伝子(RARβ2)プロモーター、又はRas関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1遺伝子(RASSF1A)プロモーターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が不健康である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が癌を有する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が乳癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターがデスモプラキン(DSP)プロモーターを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記癌がメラノーマであり、前記1種以上の遺伝子プロモーターがデスモプラキン(DSP)プロモーターを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が子宮頸癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)プロモーター又はc-Mycプロモーターを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が肺癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、mutLホモログ1、結腸癌、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、又は転写因子21(TCF21)プロモーターを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
1種以上の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
対象における1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する方法であって、
1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することにより治療を必要とする対象を特定すること;及び
下式の化合物:
【化２】
2016529257.tif 000061
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することが、前記対象の冒された組織における該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、該対象の冒されていない組織における該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することが、該1種以上のプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記投与する工程の前に、前記1種以上の遺伝子プロモーターが過剰メチル化されている、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記投与する工程の後で、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態の変化がある、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
メチル化状態の前記変化が、前記1種以上のプロモーターのメチル化パーセントの減少である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記所望のメチル化状態が達成されない場合、有効量の前記組成物の投与を繰り返すことをさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が不健康である、請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が癌を有する、請求項２７記載の方法。
【請求項３７】
前記冒された組織が腫瘍又は癌であり、前記冒されていない組織が腫瘍でも癌でもない、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、請求項２７記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害する、請求項２７記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が1種以上のプロピルヒドロキシラーゼの発現を阻害する、請求項２７記載の方法。
【請求項４１】
投与することが腹腔内投与を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４２】
投与することが経口投与を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４３】
投与することが静脈内投与を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４４】
前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)遺伝子プロモーター、c-myc遺伝子プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、mutLホモログ1、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター;分泌型フリズルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、転写因子21(TCF21)プロモーター、又は血管内皮細胞成長因子-A(VEGF-A)プロモーターを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４５】
前記1種以上の遺伝子プロモーターが、エストロゲン受容体遺伝子(ER)プロモーター、乳癌1遺伝子(BRCA1)プロモーター、上皮カドヘリン遺伝子(E-cad)プロモーター、TMS1遺伝子プロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質7遺伝子(IGFBP7)プロモーター、p16プロモーター、レンチオイン酸受容体遺伝子(RARβ2)プロモーター、又はRas関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1遺伝子(RASSF1A)プロモーターを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が乳癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターがデスモプラキン(DSP)プロモーターを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４７】
前記癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記癌がメラノーマであり、前記1種以上の遺伝子プロモーターがデスモプラキン(DSP)プロモーターを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が子宮頸癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)プロモーター又はc-Mycプロモーターを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が肺癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、mutLホモログ1、結腸癌、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、又は転写因子21(TCF21)プロモーターを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項５１】
1種以上の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項５２】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害であると診断されたか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する方法であって、
下式の化合物:
【化３】
2016529257.tif 000062
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することが、該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントを測定することを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することが、前記対象の冒された組織における該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、該対象の冒されていない組織における該1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記投与する工程の前に、前記1種以上の遺伝子プロモーターが過剰メチル化されている、請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
前記投与する工程の後で、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態の変化がある、請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
メチル化状態の前記変化が、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含む、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記所望のメチル化状態が達成されない場合、有効量の前記組成物の投与を繰り返すことをさらに含む、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記所望のメチル化状態が、前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物が1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、請求項５２記載の方法。
【請求項６３】
前記組成物が1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害する、請求項５２記載の方法。
【請求項６４】
前記組成物が1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害する、請求項５２記載の方法。
【請求項６５】
投与することが腹腔内投与を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項６６】
投与することが経口投与を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項６７】
投与することが静脈内投与を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項６８】
DNA過剰メチル化を特徴とする前記疾患又は障害が癌ではない、請求項５２記載の方法。
【請求項６９】
前記対象が不健康である、請求項５２記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が癌を有する、請求項５２記載の方法。
【請求項７１】
前記癌が乳癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターがデスモプラキン(DSP)プロモーターを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記癌がメラノーマであり、前記1種以上の遺伝子プロモーターがデスモプラキン(DSP)プロモーターを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
前記癌が子宮頸癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)プロモーター又はc-Mycプロモーターを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
前記癌が肺癌であり、前記1種以上の遺伝子プロモーターが、デスモプラキン(DSP)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、mutLホモログ1、結腸癌、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、又は転写因子21(TCF21)プロモーターを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７６】
1種以上の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７７】
対象におけるc-myc発現を減少させる方法であって、
下式の化合物:
【化４】
2016529257.tif 000063
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
前記c-mycプロモーターのメチル化状態を変更することをさらに含む、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
前記c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することが、該c-mycプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含む、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記投与する工程の前に、前記c-mycプロモーターが過剰メチル化されている、請求項７７記載の方法。
【請求項８２】
前記投与する工程の後で、前記c-mycプロモーターのメチル化状態の変化がある、請求項７７記載の方法。
【請求項８３】
前記c-mycプロモーターのメチル化状態の前記変化が、該c-mycプロモーターのメチル化パーセントの減少を含む、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が不健康である、請求項７７記載の方法。
【請求項８５】
前記対象が癌を有する、請求項７７記載の方法。
【請求項８６】
前記癌が子宮頸癌である、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
c-myc発現の減少が、前記対象における転移を阻害する、請求項７７記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物が1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害する、請求項７７記載の方法。
【請求項８９】
前記組成物が1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害する、請求項７７記載の方法。
【請求項９０】
前記組成物が1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害する、請求項７７記載の方法。
【請求項９１】
対象におけるデスモプラキン発現を増加させる方法であって、
下式の化合物:
【化５】
2016529257.tif 000064
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項９２】
デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を変更することをさらに含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することをさらに含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
前記デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することが、該デスモプラキンプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含む、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
デスモプラキンの前記遺伝子発現が増加している、請求項９１記載の方法。
【請求項９６】
デスモプラキンの前記タンパク質発現が増加している、請求項９１記載の方法。
【請求項９７】
前記対象が不健康である、請求項９１記載の方法。
【請求項９８】
前記対象が癌を有する、請求項９１記載の方法。
【請求項９９】
前記癌が乳癌である、請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
前記癌がメラノーマである、請求項９７記載の方法。
【請求項１０２】
前記癌が子宮頸癌である、請求項９７記載の方法。
【請求項１０３】
前記癌が肺癌である、請求項９７記載の方法。
【請求項１０４】
1種以上の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１０５】
投与することが腹腔内投与を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項１０６】
投与することが経口投与を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項１０７】
投与することが静脈内投与を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項１０８】
デスモプラキン発現の増加が前記対象における転移を阻害する、請求項９１記載の方法。
【請求項１０９】
対象における転移を阻害する方法であって、
下式の化合物:
【化６】
2016529257.tif 000065
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与すること;及び
1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化状態を調節することを含む、前記方法。
【請求項１１０】
1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化状態を調節することが、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を変化させることを含む、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
前記1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化を変化させることが、該1種以上のプロモーターのメチル化パーセントを減少させることを含む、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
前記1種以上の遺伝子がデスモプラキン遺伝子を含む、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１３】
デスモプラキンの遺伝子発現が増加している、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１４】
デスモプラキンのタンパク質発現が増加している、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象が不健康である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が癌を有する、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１７】
前記癌が乳癌である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１８】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１１７記載の方法。
【請求項１１９】
前記癌がメラノーマである、請求項１１５記載の方法。
【請求項１２０】
前記癌が子宮頸癌である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１２１】
前記癌が肺癌である、請求項１１５記載の方法。
【請求項１２２】
1種以上の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１１５記載の方法。
【請求項１２３】
有効量の下式の化合物:
【化７】
2016529257.tif 000066
又はその医薬として許容し得る塩;及び1種以上の化学療法剤を含む、癌を治療する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、本明細書に全体として組み込まれた2013年8月16日に出願された米国仮特許出願第61/867,000号の優先権及びその出願日の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
(背景）
DNAメチル化は、一般的に遺伝子発現を止めるプロセスを説明する。いくつかの遺伝子のプロモーター中にC(シトシン)及びG(グアニン)の長い広がり(「CpGアイランド」と呼ばれる)があり、これらの領域はDNAメチル化を受けやすいが、これはCの5'位にメチル基が付加されるプロセスである。Cにメチル基が存在すると、遺伝子発現に必要な転写装置が阻害される。
【０００３】
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)及びヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は、メチル化プロセスを制御する。正常な生理機能において、DNAメチル化は一過性の事象であり、これは、DNMT及びHDACがメチル基をCに加えるように作用する一方で、DNAメチラーゼ(DNM)及びヒストンメチルトランスフェラーゼ(HAT)がそれらを除去するように作用することを意味する。正常な細胞において、DNAメチル化は、主に、サテライトDNA及び寄生因子(長鎖散在反復配列(LINES)、短鎖散在性反復配列(SINES)、及び内在性レトロウイルスなど)を含む反復ゲノム領域で起こる(Yoderらの文献(1997))。CpGアイランド、特にプロモーターと関連するCpGアイランドは、一般的にメチル化されていない。DNAメチル化は、特異的転写因子の結合を阻害することにより直接的に、並びにメチル-CpG-結合タンパク質及びそれらの関連する抑制性クロマチン再構成活性をリクルートすることにより間接的に、転写を抑制する。
【０００４】
適切に確立され維持されているDNAメチル化パターンは、哺乳類の発生に、成体生物の正常機能に、並びに老化に必須である。DNAメチル化は、膨大な量の反復DNAを考慮すると、遺伝子発現をサイレンシングし、ゲノム安定性を維持する強力な機構であり、そうでないと非正統的組換え事象を媒介し、付近の遺伝子の転写制御不全を起こし得る。
【０００５】
DNAメチル化を効果的に調節できる組成物及び方法が、まだ欠乏している。これらの需要及び他の需要は本発明により満たされる。
【発明の概要】
【０００６】
（概要）
1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化１】
2016529257.tif 000002
又はその医薬として許容し得る塩を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【０００７】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化２】
2016529257.tif 000003
又はその医薬として許容し得る塩を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【０００８】
c-Myc発現を減少させる組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化３】
2016529257.tif 000004
又はその医薬として許容し得る塩を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【０００９】
デスモプラキンを増加させる組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化４】
2016529257.tif 000005
又はその医薬として許容し得る塩を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【００１０】
転移を阻害する組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化５】
2016529257.tif 000006
又はその医薬として許容し得る塩を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【００１１】
癌を治療する組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化６】
2016529257.tif 000007
又はその医薬として許容し得る塩;及び1種以上の化学療法剤を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【００１２】
癌を治療する組成物であって、有効量の下式の化合物:
【化７】
2016529257.tif 000008
その医薬として許容し得る塩;及び1種以上の抗癌剤を含む、前記組成物が本明細書に開示される。
【００１３】
対象における1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する方法であって、下式の化合物:
【化８】
2016529257.tif 000009
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法が本明細書に開示される。
【００１４】
対象における1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する方法であって、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することにより治療を必要とする対象を特定すること;及び下式の化合物:
【化９】
2016529257.tif 000010
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法が本明細書に開示される。
【００１５】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する方法であって、下式の化合物:
【化１０】
2016529257.tif 000011
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法が本明細書に開示される。
【００１６】
対象におけるc-myc発現を減少させる方法であって、下式の化合物:
【化１１】
2016529257.tif 000012
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法が本明細書に開示される。
【００１７】
対象におけるデスモプラキン発現を増加させる方法であって、下式の化合物:
【化１２】
2016529257.tif 000013
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記方法が本明細書に開示される。
【００１８】
対象における転移を阻害する方法であって、下式の化合物:
【化１３】
2016529257.tif 000014
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与すること;及び1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化状態を調節することを含む、前記方法が本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
（図面の簡単な説明）
添付される図面は、本明細書に組み込まれその一部を構成するが、本発明のいくつかの態様を表し、説明と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００２０】
【図１】図1A〜1Eは、インビトロ及びインビボのDNAメチルトランスフェラーゼmRNA発現を示す。図1Aは、DMSOと比べて、AKB-6899が、(i)10μMでDNMT-1を有意に阻害し、(ii)25μMでDNMT-1及びDNMT-3aを有意に阻害し、且つ(iii)50μMでDNMT-1及びDNMT-3aを有意に阻害したことを示す。PyMT腫瘍細胞は、処理されないままにされ、DMSOにより処理され、又はAKB-6899(10、25、又は50μM)により24時間処理された。該細胞はトリゾール抽出に付され、全RNAが回収された。DNMT-1及びDNMT-3a mRNA発現のRT-PCRのために、cDNAが合成された。図1Bは、DMSOと比べて、AKB-6899(25μM)が、DNMT-1とDNMT-3aの両方の発現を有意に減少させたことを示す。ヒトMDA-MB-231腫瘍細胞は、処理されないままにされ、DMSOにより処理され、又はAKB-6899(25μM)により24時間処理された。RT-PCRのために全RNAが単離された。図1C(DNMT-1)、図1D(DNMT-3a)、及び図1E(DNMT-3b)は、マウスに移植され、非処置(UTX)、DMSOで処置、5-AZAで処置、又はAKB-6899(17.5 mg/kg)で処置されたヒト子宮頸部腫瘍におけるRT-PCRにより推定されたAKB-6899の効果を、5-アザ-2'デオキシシチジン(5-AZA)の効果と比較するものである。
【００２１】
【図２】図2A〜2Dは、インビトロ及びインビボのHDAC発現を示す。図2A(HDACにより分類)と図2B(処置により分類)はどちらもヒト子宮頸癌細胞株(HeLa)におけるHDAC 1〜HDAC10の発現を示す。細胞は、処理されないままにされ、DMSOにより処理され、AKB-6899(5又は50μM)により処理され、又はフェニルブチレート(PBA)により処理されたが、これはHDAC阻害剤の「黄金律（ゴールドスタンダード）」と考えられてきた。図2Cは、DMSO、5-アザ-2'デオキシシチジン(デシタビン)、又はAKB-6899による処置後のマウスのヒト子宮頸部腫瘍中のHDAC1発現を示す。図2Dは、DMSO、5-AZA、又はAKB-6899(17.5mg/kgマウス体重)による処置後のヒト子宮頸部腫瘍におけるHDAC3発現を示す。
【００２２】
【図３】図3A〜3Eは、PyMT乳癌細胞(3A)、ヒトMDA-MB-231トリプルネガティブ乳癌細胞(3B)、ヒトC8161.9メラノーマ細胞(3C)、及びヒトMCF-7乳癌細胞(3D)におけるデスモプラキン(DSP)遺伝子プロモーターのメチル化に対するAKB-6899(25μM)の作用を示す。図3Aにおいて、DSPプロモーターは100%メチル化されなかった(AKB-6899)のに対して、99.99%メチル化された(ビヒクル)。図3Bにおいて、DSPプロモーターは、99.89%(ビヒクル)に対して、99.62%メチル化されなかった(AKB-6899)。図3Cにおいて、DSPプロモーターは、42.04%(ビヒクル)に対して、99.90%メチル化されなかった(AKB-6899)。図3Dにおいて、DSPプロモーターは、98.48%(ビヒクル)に対して、92.48%メチル化されなかった(AKB-6899)。図3Eにおいて、ビヒクル(DMSO)と比べると、PyMT細胞のAKB-6899による処理は、DSP発現を増加させた。
【００２３】
【図４】図4A〜4Bは、インビトロ及びインビボのデスモプラキンmRNA発現を示す。図4Aは、DMSO又はAKB-6899(10μM)による処理後の培養されたPyMT細胞を示す。DMSOに比べて、AKB-6899は、デスモプラキンmRNA発現を有意に増加させた。図4Bは、PyMT腫瘍からのデスモプラキン発現を示す(インビボ)。ビヒクルに比べると、AKB-6899は、デスモプラキン発現を有意に増加させた。
【００２４】
【図５】図5A〜5Bは、AKB-6899処理後のデスモプラキンタンパク質発現を示す。図5Aにおいて、培養されたPyMT腫瘍細胞は、DMSO又はAKB-6899(10μM)により24時間処理された。AKB-6899は、デスモプラキンタンパク質発現を増加させた。図5Bにおいて、デスモプラキンタンパク質発現はヒトMDA-MB-231細胞中で測定されたが、それはデスモプラキンを発現しない。
【００２５】
【図６】図6A〜6Bは、図6Aにおいて種々の処理後のc-MycプロモーターのCpGメチル化のパーセントを、図6BにおいてDSPプロモーターのCpGメチル化のパーセントを示す。HeLa子宮頸癌細胞は、処理されないままにされ、DMSOにより処理され、5-AZAにより処理され、AKB-6899(5又は25μM)により処理され、又はPBA(2 mM)により処理された。DMSO及びPBAに比べると、AKB-6899は、これら2つのプロモーターの脱メチル化の増加を引き起こした。
【００２６】
【図７】図7A〜7Bは、種々のインビボ処置の後のc-MycプロモーターのDNAメチル化パーセントを7Aに、c-Mycプロモーターの相対コピー数を7Bに示す。ヒト子宮頸部腫瘍の動物モデルは、処置されず、DMSOにより処置され、5-AZAにより処置され、又はAKB-6899(17.5 mg/kg)により処置された。AKB-6899は、c-Mycプロモーターを完全に脱メチル化し、c-Myc発現を阻害したようである。
【００２７】
【図８】図8A〜8Bは、AKB-6899の細胞傷害性を示す。図8Aにおいて、HeLa細胞は、種々の濃度のAKB-6899、ドセタキセル、又はAKB-6899とドセタキセルの組み合わせにより処理された。XTTアッセイを利用して、生存率パーセントが決定された。図8Bにおいて、MDA-MB-231細胞は、種々の濃度のAKB-6899、ドセタキセル、又はAKB-6899とドセタキセルの組み合わせにより処理された。XTTアッセイを利用して、生存率パーセントが決定された。
【００２８】
【図９】図9は、SCIDマウスに移植されたヒトA375メラノーマ細胞に対する種々の処置の効果を示す。処置の間、腫瘍成長が測定された。動物は、以下の組み合わせのうちいずれかにより処置された:ビヒクル/ビヒクル、ビヒクル/AKB-6899(17.5 mg/kg)、ドセタキセル(30 mg/kg)/ビヒクル、又はドセタキセル/AKB-6899。触知可能な腫瘍形成の19日後、ビヒクル/AKB-6899組み合わせを受けたマウス中の腫瘍は、対照のサイズの74%である腫瘍を有した。ドセタキセル/ビヒクル組み合わせを受けたマウス中の腫瘍は、対照のサイズの49%である腫瘍を有した。ドセタキセル/AKB-6899組み合わせを受けたマウス中の腫瘍は、対照のサイズの13%である腫瘍を有した。
【００２９】
【図１０】図10A〜10Bは、AKB-6899が用量依存的にDNMT転写を阻害したことを示す。図10Aにおいて、AKB-6899は、ヒト扁平上皮癌肺癌細胞(H1703)においてインビトロで、DNMT-1、DNMT-3a、及びDNMT-3b転写を用量依存的に阻害した。DMSOにより処理されたDNMT mRNAは1.0を超え、発現のレベルがハウスキーピング対照遺伝子、CAP1より高いことを意味する。図10Bにおいて、AKB-6899は、ヒト腺癌肺癌細胞(A549)においてDNMT-3a及びDNMT-3b転写を阻害した。DMSOにより処理されたDNMT mRNAは1.0未満であり、発現のレベルがハウスキーピング対照遺伝子、CAP1より低いことを意味する。
【００３０】
【図１１】図11A〜11Dは、2種のヒト肺癌細胞における23の異なる遺伝子プロモーターのメチル化のパーセントを示す。図11A及び11BはH1703扁平上皮癌を対象とし、図11C及び図11DはA549腺癌を対象とする。DMSOはビヒクルとして使用され、対照として使用された。DMSOにより処理された対照群に比べて、AKB-6899(10μM及び50μM)は、DNAメチル化のパーセントを用量反応的に減少させた。Dec/PBA条件は、5μMデシタビン(5-アザ- 2'デオキシシチジン(5-AZA)、脱メチル化剤である)と2 mMホスホ酪酸(PBA、HDAC阻害剤)の組み合わせを表す。試験された全プロモーターで、両タイプの肺癌において、AKB-6899は、AKB-6899処理の後のDNAメチル化%のレベルが、DMSO処理対照細胞(DMSO)のDNAメチル化%のレベルより低くなるように、遺伝子プロモーターを脱メチル化した。
【００３１】
【図１２】図12A〜12Dは、2種のヒト肺癌細胞における、14の通常の腫瘍抑制遺伝子の一団のmRNA発現のレベルを示す(すなわち、図12AにおいてH1703扁平上皮癌及び図12BにおいてA549腺癌)。AKB-6899及びDec/PBAは、A549腺癌においてより、H1703扁平上皮癌においてmRNA発現を誘起するのに効果的であった。腫瘍抑制因子mRNAの全てがAKB-6899に反応して増大したが、1つは例外であり、A549腺癌細胞中のCDKN1C遺伝子は、発現レベルが、1.0に標準化されたDMSOに比べて0.1(AKB10)及び0.9(AKB50)であった。図12A〜12Bにおいて、下記が適用される:「1」=DMSO、「2」=AKB-6899(10μM)、「3」=AKB-6899(50μM)、及び「4」=デシタビン(5μM)/PBA(2 mM)の組み合わせ。図12C及び12Dは、これら14の遺伝子のmRNA発現の生の値である。
【００３２】
【図１３】図13A〜13Bは、AKB-6899の増加する投与量に反応した正常な肺上皮細胞(BEAS-2B)及び肺癌細胞(H1703扁平上皮癌及びA549腺癌)のXTT細胞生存率アッセイを示す。図13Aにおいて、最高の投与量ですら、BEAS-2B細胞の生存率の著しい減少は全く検出されなかった。図13Bにおいて、AKB-6899の投与量増加の後、2種の肺癌細胞の顕著な毒性があった。
【００３３】
【図１４】図14A〜14Cは、AKB-6899の全身投与の効果を示す。マウスは、腹腔内AKB-6899か腹腔内DMSOのいずれかにより、週に3回、3週間処置された。肺が除去され、検査されて、DNMT mRNA発現、CpGメチル化パーセント、及びmRNAの倍率変化が決定された。データは、AKB-6899がDNMTの発現を下方制御し、DNAメチル化を減少させたことを示す。図14Aは、DMSO処置に比較すると、AKB-6899(17.5 mg/kg)が、正常なマウスの肺でDNMT-1、DNMT-3a、及びDNMT-3bの発現を阻害したことを示す。図14Bは、AKB-6899が、これらのマウスの肺でDSP及びRASSF1プロモーターを脱メチル化したことを示す。図14Cは、図14Bに記載された脱メチル化の結果として、DSP及びRASSF1 mRNA発現のレベルが増加したことを示す。データは、それぞれの遺伝子発現のDMSOレベルにより1.0に標準化された(条件ごとにn=4肺)。
【００３４】
【図１５】図15は、(DMSO処理MDA-MB-231癌細胞に比べた）MDA-MB-231癌細胞へのAKB-6899の投与後のRNAseqデータを示す。
【００３５】
本発明の追加の利点は、一部は以下の説明に述べられており、一部は説明から明らかであるか、又は本発明の実施により知ることができる。上記の全般的な説明と以下の詳細な説明は両方とも例示的であり請求項記載の本発明を限定しないことを理解されたい。
【発明の詳細な説明】
【００３６】
（説明）
本発明は、本発明の以下の詳細な説明及び本発明に含まれる実施例を参照してより容易に理解できる。
【００３７】
本発明の化合物、組成物、物品、システム、装置、及び/又は方法が開示され、説明される前に、それらが、特記されない限り特定の合成方法に限定されず、又は特記されない限り特定の試薬に限定されず、その理由が、合成方法及び試薬がもちろん変わり得るからであることを理解されたい。本明細書で使用される術語が特定の態様を説明する目的のみのものであり、限定的でないものとすることも理解されたい。本明細書に記載されるものに類似又は等価なあらゆる方法及び物質が本発明の実施又は試験に使用できるが、例としての方法及び物質がここで説明される。
【００３８】
本明細書に言及される全刊行物は引用により本明細書に組み込まれて、該刊行物が関連して引用される方法及び/又は物質が開示及び説明される。本明細書において議論される刊行物は、本願の出願日に先立つそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のどのようなことも、本発明が先の発明に基づいてそのような刊行物に先んじる資格がないことの承認であると解釈されるべきではない。
【００３９】
（A.定義）
本明細書及び添付される特許請求の範囲で使用される通り、単数形「a(1つの）」、「an（1つの）」、及び「the（その）」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００４０】
範囲は、本明細書において、「約」ある特定の値から、及び/又は「約」別な特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表される場合、さらなる態様は、一方の特定の値から、及び/又はもう一方の特定の値までを含む。同様に、先行する言葉「約」の使用により値が近似値として表される場合、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるだろう。範囲のそれぞれの終点が、もう一方の終点との関連においてともう一方の終点とは独立の両方において、重要であることがさらに理解されるだろう。本明細書に開示される数がいくつかあり、各値が、その値自体に加えて「約」その特定の値としても本明細書に開示されることも理解されるだろう。例えば、値「10」が開示されると、「約10」も開示される。2つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解される。例えば、10及び15が開示される場合、11、12、13、及び14も開示される。
【００４１】
明細書及び結びの請求項における、組成物中の特定の要素又は成分の重量部への言及は、重量部が表されている組成物又は物品中のその要素又は成分と任意の他の要素又は成分との間の重量の関係を示す。そのため、2重量部の成分X及び5重量部の成分Yを含む化合物において、X及びYは重量比2:5で存在し、追加の成分がその化合物に含まれるか否かにかかわらずそのような比で存在する。
【００４２】
本明細書で使用される通り、用語「任意の」又は「任意に」は、その後に記載される事象又は状況が起こることも起こらないこともあり、説明が、前記事象又は状況が起こる場合及びそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、一態様において、例えば、AKB-6899など開示される組成物を含む開示される組成物は、任意に1種以上の他の薬剤、例えば、抗癌剤又は抗増殖剤又は抗メチル化剤又は化学療法剤を含み得る。
【００４３】
本明細書で使用される通り、用語「アナログ」は、親化合物(例えば、本明細書に開示される化合物)の構造から誘導された構造を有し、その構造が本明細書に開示されるものに充分に類似しており、その類似性に基づいて、請求項記載の化合物と同じ又は類似の活性及び有用性を示し、前駆体として、例えば、ABK-6899などの開示される化合物と同じ又は類似の活性及び有用性を誘起すると当業者により予測されるだろう化合物を指す。
【００４４】
本明細書で使用される通り、「ホモログ(homolog)」又は「ホモログ(homologue)」は、特定の公知の配列に対する相同性を有するポリペプチド又は核酸を指す。述べられた又は公知の配列に対して、少なくとも40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセント相同性を有する、本明細書に開示される核酸及びポリペプチドの多様体が具体的に開示される。一態様において、具体的に開示される核酸及びポリペプチドには下記がある: APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-A。一態様において、具体的に開示される核酸及びポリペプチドには下記がある: HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7。当業者は、2つのタンパク質又は核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、2つの配列を、相同性が最高レベルであるように並べた後で計算できる。本明細書の開示される遺伝子及びタンパク質の多様体、修飾体、又は誘導体を定義する一方法が、特定の公知の配列に対する相同性の点で該多様体、修飾体、及び誘導体を定義することによることが理解される。
【００４５】
本明細書で使用される通り、用語「対象」は、投与の標的、例えば、動物を指す。用語「対象」は、飼育動物(例えば、ネコ、イヌなど)、家畜(例えば、畜牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど)、及び実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど)も含む。そのため、本明細書に開示される方法の対象は、哺乳動物、魚、鳥、爬虫類、又は両生類などの脊椎動物であり得る。或いは、本明細書に開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ネコ、モルモット、又は齧歯動物であり得る。該用語は、特定の年齢又は性別を意味しない。そのため、雄雌は関係なく、成体及び新生の対象並びに胎児が網羅されるものとする。
【００４６】
対象は、不健康な対象であり得る。言い換えると、対象は健康でないことがある。例えば、対象は、1つ以上の疾患又は障害を患っていることもある。疾患又は障害は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする疾患又は障害であり得る。一態様において、疾患又は障害は、癌又は腫瘍又は異常な細胞成長であり得る。一態様において、腫瘍は固形腫瘍であり得る。一態様において、腫瘍は固形腫瘍でないことがある。開示される方法の一態様において、対象は、投与工程の前に、1つ以上の上述の疾患又は障害の治療の必要性を診断され得る。開示される方法の一態様において、対象は、例えば、悪性癌細胞などの悪性細胞のアポトーシスを誘起する必要性を診断され得る。開示される方法の一態様において、対象は、1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する必要性を診断され得る。開示される方法の一態様において、対象は、例えば、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントを減少させることによるなど、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を変更する必要性を診断され得る。一態様において、対象は、血管漏出でない疾患又は障害を有し得る。一態様において、対象は、網膜症でない疾患又は障害を有し得る。一態様において、対象は、重症下肢虚血(CLI)でない疾患又は障害を有し得る。
【００４７】
本明細書で使用される通り、「患者」は例えば、ヒト対象などの対象であり得る。
【００４８】
本明細書で使用される通り、用語「治療」は、疾患、病理学的状態、又は障害(例えば、1種以上の遺伝子プロモーターのDNA過剰メチル化を特徴とする疾患又は障害)を治癒し、寛解させ、安定化させ、又は予防する目的での患者の医療管理を指す。この用語は、積極的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、又は障害の改善に具体的に向けた治療を含み、原因治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、又は障害の原因の除去に向けた治療も含む。さらに、この用語は、待期療法、すなわち、疾患、病理学的状態、又は障害の治癒よりも症状の軽減のために設計された治療;予防的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、又は障害の発生を最小限にするか、又は部分的若しくは完全に妨げることに向けた治療;及び支持的治療、すなわち、関連する疾患若しくは障害、病理学的状態、又は疾患の改善に向けた別な特異療法を補うために利用される治療を含む。種々の態様において、該用語は、哺乳動物(例えば、ヒト)を含む対象のあらゆる治療を網羅し、(i)疾患若しくは障害にかかりやすいが疾患若しくは障害を有すると診断されたことがまだない対象において、該疾患若しくは障害が起こるのを防ぐこと;(ii)疾患若しくは障害を抑えること、すなわちその発生を阻止すること;又は(iii)疾患若しくは障害を軽減すること、すなわち、疾患若しくは障害の後退を起こすか、若しくは疾患若しくは障害と関連する症状を軽減することを含む。
【００４９】
本明細書で使用される通り、用語「予防する」又は「予防すること」は、特に事前の行動により、何かが起こることを妨げること、避けること、取り除くこと、先んじること、止めること、又は邪魔することを指す。減少させる、阻害する、又は予防するが本明細書で使用される場合、具体的に他に示されない限り、他の2つの言葉の使用も明白に開示されることが理解される。一態様において、悪性細胞の成長の予防が意図される。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントを阻害すること、減らすこと、又は減少させることが開示される。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を変更又は調節することが開示される。
【００５０】
本明細書で使用される通り、用語「診断された」は、技能者（person of skill）、例えば、医師による身体診察にかけられ、本明細書に開示される化合物、組成物、又は方法により診断又は治療できる病態を有すると見いだされることを意味する。例えば、「癌と診断される」及び「癌を有する」は、技能者、例えば、医師による身体診察にかけられ、悪性細胞の成長を予防若しくは阻害でき、且つ/又は癌細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞集団中でアポトーシスを誘導できる化合物若しくは組成物により診断でき、若しくは治療できる病態を有すると見いだされたことを意味する。さらなる例として、「過剰メチル化を特徴とする疾患又は障害と診断される」は、技能者、例えば、医師による身体診察にかけられ、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を調節又は変更することが対象にとって有益であろう1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする病態を有すると見いだされたことを意味する。一態様において、該対象は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントを減少させることにより、利益を得る。
【００５１】
本明細書で使用される通り、句「その治療を必要とすることが特定された」などは、疾患又は障害又は疾病又は病態の治療の必要性に基づく対象の選択を指す。特定された対象は不健康な対象であり得る。例えば、対象は、技能者による先の診断に基づいて疾患又は障害(例えば、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする疾患又は障害)の治療の必要性を有すると特定され、その後、その疾患又は障害の治療に付され得る。例えば、対象は、技能者による先の診断に基づいて疾患(例えば、癌又は固形腫瘍又は非固形腫瘍又は悪性細胞成長に関連する他の障害又は細胞の集団のアポトーシスを必要とする疾患)の治療の必要性を有すると特定され、その後、その疾患の治療に付され得る。特定が、一態様において、診断を下した人とは異なる人により実施され得ることが企図される。さらなる態様において、診察又は評価を実施した人により投与が実施され得ることも企図される。
【００５２】
本明細書で使用される通り、「異常な」DNAメチル化は、過剰メチル化、低メチル化、又は両方を指す。一態様において、異常なDNAメチル化は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を指し得る。当業者に知られている通り、過剰メチル化は、遺伝子プロモーターが、正常な細胞又は組織(すなわち、冒されていない細胞又は組織)におけるメチル化パーセントに対して、細胞又は組織(すなわち、冒された細胞又は組織)においてより高度にメチル化されている場合を指し得る。一態様において、異常なDNAメチル化は、以下の遺伝子プロモーターの1つ以上をもたらし得る: APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-A。一態様において、異常なDNAメチル化は、以下の遺伝子プロモーターの１つ以上をもたらし得る: HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7。
表1. DNA過剰メチル化が関与する癌のリスト
【表１】
2016529257.tif 000015
2016529257.tif 000016
2016529257.tif 000017
表2. DNA低メチル化が関与する癌のリスト
【表２】
2016529257.tif 000018
表3. DNA過剰メチル化が関与し得る癌のリスト
【表３】
2016529257.tif 000019
【００５３】
「メチル化特異的PCR」又は「MSP」は、亜硫酸水素ナトリウムによる最初のDNAの修飾、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシン全てをウラシルに転化すること、及び、非メチル化DNAに対してメチル化DNAに特異的なプライマーによるその後の増幅を伴うアッセイを指し得る。MSPは、CpGアイランド内のCpG部位の実質的にあらゆる基のDNAメチル化状態を分析するための簡単で、迅速な、費用効率の高い方法であることが当技術分野に知られている。該技法は2部を含む:(1)メチル化シトシンが変化しないままでいる条件下での非メチル化シトシンのウラシルへの亜硫酸水素ナトリウム転化及び(2)非メチル化DNAとメチル化DNAの両方に特異的なプライマーセットを使用するPCRによる亜硫酸水素塩誘発性の配列の差異の検出。MSPは少量のDNAしか必要とせず、所与のCpGアイランド座の0.1%メチル化対立遺伝子に対して敏感であり、パラフィン包埋試料から抽出したDNAに実施できる。MSPは、示差的な(differential）制限酵素切断に依存してメチル化DNAを非メチル化DNAから区別する、以前のPCR系手法に固有な偽陽性結果をなくす(MCPに関するさらなる情報については、Hermanらの文献(1996）及びDerksらの文献(2004)参照)。
【００５４】
本明細書で使用される通り、用語「投与すること」及び「投与」は、開示される組成物又は医薬調合物を対象に与えるあらゆる方法を指す。そのような方法は当業者に周知であり、下記があるがこれらに限定されない:経口投与、経皮投与、吸入による投与、鼻腔内投与、局所投与、膣内投与、点眼、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与、並びに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与などの注射剤を含む非経口投与。投与は、連続的でも、間欠的でもよい。種々の態様において、調合物は、治療的に投与でき、すなわち、既存の疾患又は病態を治療するために投与できる。さらに種々の態様において、調合物は、予防的に投与でき、すなわち、疾患又は病態の予防のために投与できる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「接触させること」は、開示される組成物又は化合物(例えば、AKB-6899を含む組成物)が、直接的(すなわち、標的自体との相互作用により)か間接的(例えば、上流遺伝子などの別な遺伝子、分子、酵素(例えば、HDAC、又はPHD、又はDNMT)、補因子、因子、又は標的の活性が依存しているタンパク質との相互作用により)のいずれかで、意図される標的(例えば、遺伝子プロモーター、DNAメチル化に関与する酵素、受容体、転写因子、細胞、細胞集団など)の活性に影響を与え得るように、開示される組成物又は化合物を意図される標的(例えば、遺伝子プロモーター、DNAメチル化に関与する酵素、細胞若しくは細胞集団、受容体、抗原、又は他の生物学的存在)と合わせることを指す。一態様において、開示される組成物又は化合物は、例えば、癌細胞又は腫瘍細胞などの細胞又は細胞集団と接触させることができる。
【００５６】
本明細書で使用される通り、用語「決定すること」は、活性又は事象又は数量又は量又は発現及び/若しくは活性レベル若しくは罹患率及び/若しくは発生率の変化を測定又は確認することを指し得る。例えば、決定することは、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を測定又は確認することを指し得る。決定することは、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントを測定又は確認することを指し得る。一態様において、決定することは、単一の対象から得た試料を利用すること(対象内決定)を含み得るか、又は複数の対象から得た試料を利用すること(対象間決定)を含み得る。DNAメチル化を測定又は確認する方法は当技術分野に公知である。
【００５７】
一態様において、本明細書で使用される通り、決定することは、アポトーシスの数量又は量を測定又は確認することを指し得る。決定することは、関心のある遺伝子又はタンパク質、例えば、PHD、DNMT、HDAC、HIFなどの活性又は発現の数量又は量を測定又は確認することも指し得る。一態様において、決定することは、マイクロRNA又はsnoRNAの数量又は量を測定又は確認することも指し得る。本明細書で使用される活性又は事象又は数量又は量又は発現及び/若しくは活性レベル若しくは罹患率及び/若しくは発生率の変化を決定するのに利用される方法及び技法は、当業者がいくつかの定量可能な値を測定又は確認するためにとるであろう工程を指し得る。当技術分野は、活性又は事象又は数量又は量又は発現及び/若しくは活性レベル若しくは罹患率及び/若しくは発生率の変化を測定する方法を熟知している。一態様において、決定することは、APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-Aを含む1種以上のプロモーターの遺伝子発現又はタンパク質発現を測定することを指し得る。一態様において、決定することは、HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7を含む1種以上のプロモーターの遺伝子発現又はタンパク質発現を測定することを指し得る。一態様において、決定することは、事象の前、又は事象の後、又は事象(投与する工程など)の前後に起こり得る。
【００５８】
本明細書で使用される通り、用語「有効量」又は「有効な量」は、所望の結果を達成するか、又は望ましくない状態に対する作用を有するのに充分な量を指す。例えば、「治療上有効な量」は、所望の治療結果を達成するか、又は望ましくない症状に作用を有するのに充分であるが、一般的に有害な副作用を起こすには不充分な量を指す。例えば、一態様において、開示される組成物又は化合物の有効量は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を調節するのに有効な量である。一態様において、開示される組成物の有効量は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントを減少させるか、又は最小にするのに有効な量である。一態様において、開示される組成物又は化合物の有効量は、例えば、1種以上の遺伝子プロモーターの異常なDNAメチル化を有する細胞など、所望の細胞又は細胞集団においてアポトーシスを誘導するのに有効な量である。
【００５９】
任意の特定の患者のための具体的な治療上有効な投与量レベルは、治療される障害及び該障害の重症度;利用される具体的な組成物;患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事;投与の時間;投与経路;利用される具体的な化合物の排泄速度;治療期間;利用される具体的な化合物と組み合わせて、又は同時に使用される薬物、並びに医学分野に周知である同様な因子を含む種々の因子によるだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに要するレベルより低いレベルで、開示される組成物又は化合物の投与量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることは、充分に当技術分野の技量内にある。望まれる場合、有効な一日量は、投与の目的で複数の投与量に分割できる。その結果、単一の投与量組成物は、一日量を構成する量又はその約数を含み得る。万一禁忌の場合には、用量は個々の医師により調整され得る。用量は変わることがあり、1日又は数日間、1つ以上の用量投与(dose administration)で毎日投与され得る。一態様において、調合物は、「予防上有効な量」、すなわち、疾患又は病態の予防に有効な量で投与され得る。
【００６０】
用語「医薬として許容し得る」は、生物学的に、又は他の面で望ましくなくない、すなわち、許容し得ないレベルの望ましくない生物学的作用を起こさず、有害な方法で相互作用しない物質を説明する。本明細書で使用される通り、用語「医薬として許容し得る担体」は、滅菌の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液、又は乳液、並びに使用直前に滅菌された注射液又は分散液に再構成するための滅菌された粉末を指す。好適な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、カルボキシメチルセルロース、及びその好適な混合物、植物油(オリーブ油など)、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤も含み得る。微生物の作用の予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含ませて確実にできる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことも望ましくなり得る。注射用医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅くするモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの作用物質を含ませてもたらすことができる。注射用デポ形態は、ポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ(オルトエステル)、及びポリ(無水物)などの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作られる。薬物とポリマーの比率及び使用される特定のポリマーの性質により、薬物放出の速度を制御できる。デポ注射用製剤は、また、体組織と適合性のあるリポソーム又はマイクロエマルション中に薬物を捕捉することにより製造される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルター(bacterial-retaining filter)に通して濾過することにより、又は使用直前に滅菌水若しくは他の滅菌された注射用媒体に溶解若しくは分散できる滅菌された固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより滅菌できる。好適な不活性な担体は、ラクトースなどの糖類を含み得る。
【００６１】
本明細書で使用される通り、「干渉RNA」又は「RNA干渉」(RNAi)は、当技術分野に公知である。RNAiは、RNAとその標的mRNAとの相補性に基づいて、標的の破壊をもたらす。インビボで、長く伸びたdsRNAはDICERエンドリボヌクレアーゼと相互作用して、3'オーバーハングを有する短い(21〜23 nt)dsRNAに切断され得る。次いで、内在性又は合成の短いdsRNAが、マルチヌクレアーゼ(multinuclease)含有RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に入り、これらの酵素が相補的な標的の特異的な切断をもたらす。RNAの短い(＜23nt)セグメントが一般的に遺伝子サイレンシングに最適と考えられているが、より長い(＜30 nt)配列が、効率的で恐らくより強力な遺伝子サイレンシングをもたらし得ることも示された。当業者は、通常使用されるRNAiのいくつかの異なる種類:短鎖干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)を熟知しており、これらは全て標的遺伝子産物の発現を阻害できる。siRNA及びshRNA(一般的に長さが20〜22ntであるが、最高30 ntになり得る)は、免疫系刺激の問題及びより長いRNA配列がRNAiに使用されていた場合に観察された完全な翻訳停止を克服し、サイレンシング効果を最適にするように設計された。
【００６２】
「マイクロRNA」又は「miRNA」は、配列特異的に遺伝子発現を制御する約19〜約27塩基対の一本鎖ノンコーディングRNA分子を指すRNAi誘導剤である。miRNAは、標的メッセンジャーRNA転写物(mRNA)上の相補的配列と結合して、通常、翻訳抑制又は標的分解及び遺伝子サイレンシングをもたらす転写後制御因子である。一態様において、マイクロRNAは、DNMT及びHDACなどのメチル化制御因子を標的にできる。一態様において、AKB-6899を含む開示される組成物は、マイクロRNAの発現を増加させることできる。一態様において、開示される組成物は、マイクロRNAの発現を制御できる。一態様において、マイクロRNAは、DNMT、HDAC、及び/又は腫瘍抑制遺伝子などの他の遺伝子の示差的なメチル化を起こすことができる。一態様において、マイクロRNA配列は、ポリAテールプライマーを使用して特定できる。一態様において、ポリAテールが付加されたRNAはタンパク質に翻訳され得る。
【００６３】
「短鎖干渉RNA」又は「siRNA」は、低分子干渉RNAとしても知られているが、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘起して、遺伝子発現を減少させることができる二本鎖のRNAである。siRNAは、その機能を維持する限り種々の長さでよい。いくつかの例において、siRNA分子は、長さが、少なくとも21ヌクレオチド、及び例えば少なくとも23ヌクレオチドなど約19〜23ヌクレオチドである。一例において、siRNAは、siRNAと標的RNAとの間の配列同一性領域内で、mRNAなどの相同なRNA分子の特異的分解を引き起こす。一例において、siRNAは、3'のオーバーハングしている末端と塩基対を形成する場合、標的mRNAの配列特異的分解を起こし得る。dsRNAプロセシングの方向が、センス標的RNAとアンチセンス標的RNAのどちらが、産生されたsiRNAエンドヌクレアーゼ複合体により切断され得るかを決める。siRNAは、例えば、Invitrogen社のBLOCK-IT(商標)RNAi Designer(rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress)を使用して、発生させることができる。さらに、いったんsiRNA分子のヌクレオチド組成が決定されると、公的にアクセスできるオンライン配列「スクランブラー」を使用して、ヒトmRNAとの標的外結合を確実に最小限にできる(すなわち、sirnawizard.com/scrambled.phpのウェブページ)。さらに、公的にアクセスできるオンライン配列分析ソフトウェアを利用して、自己相補性を確実に最小限にできる(すなわちbasic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.htmlのウェブページ)。
【００６４】
一態様において、siRNAを使用して、例えば、HIF、DNMT-1、DNMT-3a、DNMT-3b、PHD1、PHD2、PHD3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7などの開示されている1つ以上の遺伝子の発現を、例えば減少させることにより、転写又は翻訳が調節され得る。一態様において、siRNAを使用して、例えば、APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-Aなどの開示されている1つ以上の遺伝子の発現を、例えば減少させることにより、転写又は翻訳が調節され得る。
【００６５】
shRNA(ショートヘアピンRNA)は、発現ベクター中にクローニングされて、RNAi干渉試験のためのsiRNA(典型的には19〜29 nt RNA二本鎖)を発現できるDNA分子である。shRNAは、以下の構造的特徴を有する:標的遺伝子から誘導された約19〜29ヌクレオチドの範囲の短いヌクレオチド配列と、それに続く約4〜15ヌクレオチドの短いスペーサー(すなわちループ)、及び最初の標的配列の逆相補配列である約19〜29ヌクレオチド配列。
【００６６】
一般的に、用語「アンチセンス」は、いくらかの配列相補性によりRNA配列(mRNAなど)の一部にハイブリダイズできる核酸分子を指す。本明細書に開示されるアンチセンス核酸は、二本鎖又は一本鎖のオリゴヌクレオチド、RNA若しくはDNA、又はその修飾体若しくは誘導体であり得るが、直接細胞に投与でき(例えば、アンチセンス分子を対象に投与することにより)、又は外因性の導入された配列の転写により細胞内に産生することができる(例えば、プロモーターの制御下にあるアンチセンス分子を含むベクターを対象に投与することにより)。当技術分野では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは熟知されている。アンチセンスのオリゴヌクレオチド又は分子は、正規か非正規のいずれかの塩基対合により標的核酸分子(すなわち、開示される遺伝子プロモーター)と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、RNAseH媒介性RNA-DNAハイブリッド分解により、標的分子の破壊を促進するように設計されている。或いは、アンチセンス分子は、通常ならば標的分子上で起こるであろう、転写又は複製などのプロセシング機能を中断するように設計されている。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計できる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を見つけることによる、アンチセンス効率の最適化の方法が数多く存在する。例示的な方法は、インビトロ選択実験並びにDMS及びDEPCを使用するDNA修飾試験だろう。アンチセンス分子が標的分子と、10-6、10-8、10-10、又は10-12以下の解離定数(kd)で結合するのが好ましい。アンチセンス核酸はポリヌクレオチドであり、例えば、長さが、6〜100ヌクレオチドなど、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチドである核酸分子である。しかし、アンチセンス分子ははるかに長くなり得る。特定の例において、ヌクレオチドは、1つ以上の塩基部分、糖部分、又はホスフェート骨格(又はこれらの組み合わせ)で修飾されており、ペプチドなどの他の懸垂基（appending groups）、又は細胞膜若しくは血液脳関門を越えた輸送を促進する作用物質、ハイブリダイゼーション誘起性の切断剤、又は挿入剤を含み得る。
【００６７】
一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘起性の架橋剤、輸送剤、又はハイブリダイゼーション誘起性の切断剤などの別な分子にコンジュゲートされ得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞による分子の取込みを増大させる標的部分を含み得る。標的部分は、宿主細胞の表面に存在する分子を認識する抗体又はその断片などの特異的結合分子であり得る。アンチセンス分子は、idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx/で利用可能なIntegrated DNA Technologies社のAntisense Design algorithmを利用して発生させることができる。
【００６８】
本明細書で使用される通り、「トリプルネガティブ乳癌」又は「TNBC」は、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、及びHER2/neu受容体の欠如を特徴とする癌を指し得る。TNBCの標準治療は、手術、補助化学療法、及び放射線療法である。
【００６９】
本明細書で使用される通り、「CpGアイランド」は、高G-C含量を有し、CpGジヌクレオチドに富み、通常低メチル化されている〜1 kBのゲノム領域を指す。
【００７０】
「アポトーシス」及びアポトーシスを確認する方法は当技術分野に公知であり、下記があるがこれらに限定されない:カスパーゼ-3活性を測定すること、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼdUTPニック末端標識を測定すること。一態様において、アポトーシスを確認することは、下記の1つを含み得る:カスパーゼ-3活性を測定すること、アネキシンV /ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼdUTPニック末端標識を測定すること。
【００７１】
本明細書で使用される「メチル化状態」は、遺伝子プロモーターのメチル化の程度又はレベルを指す。一態様において、遺伝子プロモーターのメチル化の程度又はレベルは正常であり得る。一態様において、遺伝子プロモーターのメチル化の程度又はレベルは異常であり得る。一態様において、遺伝子プロモーターの異常なメチル化状態は、該遺伝子プロモーターが過剰メチル化されていることを示し得る。一態様において、遺伝子プロモーターの異常なメチル化状態は、該遺伝子プロモーターが低メチル化されていることを示し得る。上述の通り、メチル化状態はメチル化特異的PCRにより測定することができるが、それは2部を含む:(1)メチル化シトシンが変化しないままでいる条件下での非メチル化シトシンのウラシルへの亜硫酸水素ナトリウム転化及び(2)非メチル化DNAとメチル化DNAの両方に特異的なプライマーセットを使用するPCRによる亜硫酸水素塩誘発性の配列の差異の検出(MCPに関するさらなる情報に関しては、Hermanらの文献(1996)及びDerksらの文献(2004)参照)。
【００７２】
「メチル化パーセント」は、遺伝子プロモーターのメチル化の定量可能な量を指し得る。定量可能な量は、冒された組織での遺伝子プロモーターのメチル化の量を測定し、それを、冒されてない組織での同じ遺伝子プロモーターのメチル化の量と比較することにより、得ることができる。一態様において、定量可能な量は、対象(例えば、癌を有する対象、又は1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害であると診断されたか、若しくは1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象)における遺伝子プロモーターのメチル化の量を測定し、それを、1つ以上の他の対象(例えば、癌を有さない1つ以上の他の対象、又は1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害であると診断されていないか、若しくは1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われていない対象)における同じ遺伝子プロモーターのメチル化の量と比較することにより、得ることができる。
【００７３】
（B.組成物）
有効量の下式の化合物:
【化１４】
2016529257.tif 000020
又はその医薬として許容し得る塩を含む、1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する組成物が本明細書に開示される。
【００７４】
有効量の下式の化合物:
【化１５】
2016529257.tif 000021
又はその医薬として許容し得る塩を含む、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する組成物が本明細書に開示される。一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される組成物は、1種以上の抗癌剤又は1種以上の化学療法剤を含み得る。
【００７５】
有効量の下式の化合物:
【化１６】
2016529257.tif 000022
又はその医薬として許容し得る塩を含む、c-Myc発現を減少させる組成物が本明細書に開示される。
有効量の下式の化合物:
【化１７】
2016529257.tif 000023
又はその医薬として許容し得る塩を含む、デスモプラキン発現を増加させる組成物が本明細書に開示される。
【００７６】
有効量の下式の化合物:
【化１８】
2016529257.tif 000024
又はその医薬として許容し得る塩を含む、癌を治療する組成物が本明細書に開示される。一態様において、メチス(metises)を阻害する、開示される組成物は、1種以上の抗癌剤又は1種以上の化学療法剤を含み得る。
【００７７】
有効量の下式の化合物:
【化１９】
2016529257.tif 000025
又はその医薬として許容し得る塩;及び1種以上の化学療法剤を含む、癌を治療する組成物が本明細書に開示される。
【００７８】
有効量の下式の化合物:
【化２０】
2016529257.tif 000026
その医薬として許容し得る塩;及び1種以上の抗癌剤を含む、癌を治療する組成物が本明細書に開示される。
【００７９】
有効量の下式の化合物:
【化２１】
2016529257.tif 000027
又はその医薬として許容し得る塩を含む、開示される組成物を含む医薬組成物が本明細書に開示される。
【００８０】
一態様において、開示される組成物は、1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むDNAメチルトランスフェラーゼ(DNA MT)は、当技術分野に公知である。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、ヒトDNAメチルトランスフェラーゼを含み得る。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、DNMT-1、DNMT-3A、又はDNMT-3Bを含み得る。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Aの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Bの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1、DNMT-3A、及びDNMT-3Bの発現を阻害できる。
【００８１】
一態様において、開示される組成物は、1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むヒストンデアセチラーゼは、当技術分野に公知である。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、ヒトヒストンデアセチラーゼを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、例えば、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、又はHDAC11などのあらゆる公知のHDACを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、又はSIRT7を含み得る。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の1つ以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11のそれぞれの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の1つ以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、1種以上のHDACの発現を阻害でき、且つ1種以上のSIRTの発現を阻害できる。
【００８２】
一態様において、開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むプロリルヒドロキシラーゼは、当技術分野に公知である。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、ヒトプロリルヒドロキシラーゼを含み得る。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、例えば、PHD1、PHD2、及びPHD3などのあらゆる公知のプロリルヒドロキシラーゼを含み得る。一態様において、開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD2の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD3の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3のそれぞれの発現を阻害できる。
【００８３】
一態様において、開示される組成物は、開示される方法において、開示されるDNMT、HDAC、SIRT、又はPHDの1つ以上を阻害できる。
【００８４】
有効成分としての開示される組成物及び化合物(その医薬として許容し得る塩(複数可)を含む)、医薬として許容し得る担体、並びに任意に、他の治療用成分又は補助剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。利用される医薬担体は、例えば、固体、液体、又は気体であり得る。固体担体の例には、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸がある。液体担体の例は、液糖、落花生油、オリーブ油、及び水である。気体担体の例には、二酸化炭素及び窒素がある。経口剤形用の組成物を製造する際に、任意の簡便な医薬媒体を利用できる。例えば、水、グリコール、油類、アルコール類、着香剤、保存剤、着色剤などを使用して、懸濁剤、エリキシル剤、及び液剤などの経口液体調合物を形成できる一方で、スターチ、糖類、微結晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を使用して、散剤、カプセル剤、錠剤などの経口固体調合物を形成できる。錠剤及びカプセル剤は、固体医薬担体が使用される好ましい経口用量単位である。任意に、錠剤は、標準的な水性又は非水性の技法により被覆され得る。本明細書に開示される組成物又は化合物を含む錠剤は、任意に1種以上の副成分又は補助剤と共に、圧縮又は成形により製造され得る。打錠剤は、好適な機械中で、粉末又は顆粒などの自由流動形態にある、開示される組成物又は開示される化合物を、任意に、結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、表面活性剤、又は分散剤と混合して圧縮することにより製造できる。成形錠剤は、好適な機械中で、不活性な液体希釈剤により濡らされた粉末化された化合物の混合物を成形することにより製造できる。
【００８５】
開示される組成物が開示される化合物から製造できることが理解される。開示される組成物が開示される使用方法に利用できることも理解される。
【００８６】
（C.方法）
（i)DNAメチル化を調節する方法）
下式の化合物:
【化２２】
2016529257.tif 000028
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する方法が本明細書に開示される。一態様において、DNAメチル化を調節する、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【００８７】
1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することにより、治療を必要とする対象を特定すること;及び下式の化合物:
【化２３】
2016529257.tif 000029
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化を調節する方法が本明細書に開示される。
【００８８】
1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を測定又は確認する方法は当技術分野に公知である。例えば、メチル化特異的PCRは、当技術分野に公知であり、使用することができる。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することは、対象の冒された組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、対象の冒されていない組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含み得る。一態様において、冒された組織は腫瘍又は癌であり得るが、冒されていない組織は腫瘍又は癌以外のものであり得る。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することは、1種以上のプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含み得る。
【００８９】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、対象は不健康な対象であり得る。一態様において、不健康な対象は、疾患、病態、障害、若しくは疾病に冒されているか、又は患っている対象であり得る。
【００９０】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、投与する工程の前に、1種以上の遺伝子プロモーターは過剰メチル化されている。言い換えると、検討している1種以上の遺伝子プロモーターは、より高いレベルのメチル化パーセントを有する。メチル化パーセントのレベルは、2つの対象、例えば、特定の疾患若しくは障害であると診断されたか、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われる対象と、特定の疾患若しくは障害であると診断されていないか、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われていない対象などとの間で比較され得る。メチル化パーセントのレベルは、対象内、例えば、冒された組織又は器官又は細胞と、冒されていない組織又は器官又は細胞などとの間で比較され得る。一態様において、冒された組織又は器官又は細胞は、癌性又は腫瘍状の組織又は器官又は細胞であり得る。
【００９１】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、該方法は、投与する工程の前に、それを必要とする対象を特定することを含み得る。
【００９２】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態の変化があり得る。例えば、一態様において、メチル化状態の変化は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含み得る。投与する工程の後で、所望のメチル化状態が達成されない場合、該方法は、有効量の組成物の投与を繰り返すことを含み得る。一態様において、所望のメチル化状態は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少であり得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定される前後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定された後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、例えば2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、又はそれ以上の回数など、1回以上繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、対象の人生の1時間ごと、3時間ごと、6時間ごと、12時間ごと、18時間ごと、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、2年ごと、5年ごと、又は10年ごとに起こり得る。一態様において、開示される方法は、単一の投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、DNAメチル化を調節する、開示される方法は、いくつかの投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、開示される方法は、全ての投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【００９３】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化２４】
2016529257.tif 000030
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むDNAメチルトランスフェラーゼ(DNA MT)は、当技術分野に公知である。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、ヒトDNAメチルトランスフェラーゼを含み得る。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、DNMT-1、DNMT-3A、又はDNMT-3Bを含み得る。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Aの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Bの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1、DNMT-3A、及びDNMT-3Bの発現を阻害できる。
【００９４】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化２５】
2016529257.tif 000031
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むヒストンデアセチラーゼは、当技術分野に公知である。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、ヒトヒストンデアセチラーゼを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、あらゆる公知のHDAC、例えば、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、又はHDAC11などを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、又はSIRT7を含み得る。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の1つ以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11のそれぞれの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の1種以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、1種以上のHDACの発現を阻害でき、且つ1種以上のSIRTの発現を阻害できる。
【００９５】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化２６】
2016529257.tif 000032
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むプロリルヒドロキシラーゼは、当技術分野に公知である。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、ヒトプロリルヒドロキシラーゼを含み得る。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、あらゆる公知のプロリルヒドロキシラーゼ、例えば、PHD1、PHD2、及びPHD3などを含み得る。一態様において、開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD2の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD3の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3の組み合わせの発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3のそれぞれの発現及び/又は活性を阻害できる。
【００９６】
DNAメチル化を調節する、開示される方法の投与する工程は、当技術分野に公知であるあらゆる投与経路を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は腹腔内投与を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は経口投与を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は静脈内投与を含み得る。
【００９７】
DNAメチル化を調節する、開示される方法において、遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)遺伝子プロモーター、c-myc遺伝子プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失(deleted in liver cancer)1(DLC1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PR domain containing 2、with ZNF domain)(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、mutLホモログ1プロモーター、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、転写因子21(TCF21)プロモーター、又は血管内皮細胞成長因子-A(VEGF-A)プロモーターを含み得る。
【００９８】
DNAメチル化を調節する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1つ以上を含み得る: DSP、C-MYC、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CYP1B1、DLC1、CDH1、FHIT、CDH13、MGMT、OPCML、PAX5、PRDM2、RASSF1、APC、APBA1、CADM1、CXCL12、MTHFR、MLH1、RASSF2、SFRP1、TCF21、及びVEGF-A。
【００９９】
一態様において、DNAメチル化を調節する、開示された方法は、当技術分野に公知である1種以上の腫瘍抑制遺伝子(TSG)の1種以上の遺伝子プロモーターを含み得る。
【０１００】
DNAメチル化を調節する、開示される方法において、遺伝子プロモーターは、エストロゲン受容体遺伝子(ER)プロモーター、乳癌1遺伝子(BRCA1)プロモーター、上皮カドヘリン遺伝子(E-cad)プロモーター、TMS1遺伝子プロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質7遺伝子(IGFBP7)プロモーター、p16プロモーター、レチノイン酸受容体遺伝子(RARβ2)プロモーター、又はRas関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1遺伝子(RASSF1A)プロモーターを含み得る。
【０１０１】
DNAメチル化を調節する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: ER、BRCA1、E-cad、TMS1、IGFBP7、RARβ2、及びRASSF1A。
【０１０２】
DNAメチル化を調節する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-A。
【０１０３】
DNAメチル化を調節する、開示される方法において、対象は、血管漏出ではない疾患又は障害を有し得る。DNAメチル化を調節する、開示される方法において、対象は、網膜症ではない疾患又は障害を有し得る。DNAメチル化を調節する、開示される方法において、対象は、重症下肢虚血(CLI)ではない疾患又は障害を有し得る。
【０１０４】
DNAメチル化を調節する、開示される方法において、対象は癌を有し得る。一態様において、癌は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化により起こる癌であり得る。例えば、癌は、表1に特定されるいずれの癌でもあり得る。一態様において、開示される方法は、1種以上の抗癌剤を対象に投与することを含み得る。一態様において、対象は乳癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターはデスモプラキン(DSP)プロモーターを含み得る。一態様において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌であり得る。一態様において、対象はメラノーマを有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターはデスモプラキン(DSP)プロモーターを含み得る。開示される方法の一態様において、対象は子宮頸癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーター又はc-Mycプロモーターを含み得る。一態様において、対象は肺癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、mutLホモログ1、結腸癌、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、又は転写因子21(TCF21)プロモーターを含み得る。
【０１０５】
一態様において、DNAメチル化を調節する、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターの異常なDNAメチル化、例えば、過剰メチル化などと関連する1つ以上の症状を改善することを含み得る。
【０１０６】
（（ii)DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する方法）
下式の化合物:
【化２７】
2016529257.tif 000033
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する方法が本明細書に開示される。
【０１０７】
一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を測定又は確認する方法は、当技術分野に公知であり、先に議論されている。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することは、対象の冒された組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、対象の冒されていない組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含み得る。一態様において、冒された組織は腫瘍又は癌であり得るが、冒されていない組織は、腫瘍又は癌以外のものであり得る(すなわち、非癌性組織又は細胞又は試料)。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することは、1種以上のプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含み得る。
【０１０８】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する方法の一態様において、対象は不健康な対象であり得る。一態様において、不健康な対象は、疾患、病態、障害、又は疾病、例えば、DNA過剰メチル化を特徴とするものなどに冒されているか、又は患っている対象であり得る。
【０１０９】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の一態様において、投与する工程の前に、1種以上の遺伝子プロモーターは過剰メチル化されている。言い換えると、検討している1種以上の遺伝子プロモーターは、より高いレベルのメチル化パーセントを有する。メチル化パーセントのレベルは、2つの対象、例えば、DNA過剰メチル化を特徴とする特定の疾患若しくは障害であると診断されたか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする特定の疾患若しくは障害を有すると疑われる対象と、DNA過剰メチル化を特徴とする特定の疾患若しくは障害であると診断されていないか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする特定の疾患若しくは障害を有すると疑われていない対象などとの間で比較され得る。メチル化パーセントのレベルは、対象内、例えば、冒された組織又は器官又は細胞と、冒されていない組織又は器官又は細胞などとの間で比較され得る。一態様において、冒された組織又は器官又は細胞は、癌性又は腫瘍状の組織又は器官又は細胞であり得る。
【０１１０】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の一態様において、該方法は、投与する工程の前に、それを必要とする対象を特定することを含み得る。
【０１１１】
一態様において、DNA過剰メチル化により制御され得る疾患は下記であり得る:ベックウィズ・ヴィーデマン症候群(すなわち、CDKN1C及び/又はH19遺伝子の過剰メチル化);プラダー・ウィリー症候群(すなわち、MKRN3、MAGEL2、NDN、SNURF/SNRPN、及び/又はIPW遺伝子の過剰メチル化);アンジェルマン症候群(すなわち、UBE3A及び/又はATPC10C遺伝子の過剰メチル化);脆弱X症候群(すなわち、FMR1遺伝子の過剰メチル化);筋強直性ジストロフィー(すなわち、DMPK、SIX5、及び/又は他の遺伝子の過剰メチル化); ATRX症候群(すなわち、ATRX遺伝子の過剰メチル化);成長(development)(すなわち、成長を制御する1種以上の遺伝子の過剰メチル化);敗血症(すなわち、DNMT-1、DNMT-3A、及び/又はDNMT-3B遺伝子の過剰メチル化);及び老化プロセスに関与する1種以上の遺伝子。
【０１１２】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の一態様において、投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態の変化があり得る。例えば、一態様において、メチル化状態の変化は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含み得る。投与する工程の後で、所望のメチル化状態が達成されない場合、該方法は、有効量の組成物の投与を繰り返すことを含み得る。一態様において、所望のメチル化状態は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少であり得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定される前後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定された後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、又はそれ以上の回数など、1回以上繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、対象の人生の1時間ごと、3時間ごと、6時間ごと、12時間ごと、18時間ごと、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、2年ごと、5年ごと、又は10年ごとに起こり得る。一態様において、開示される方法は、単一の投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、開示される方法は、いくつかの投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、開示される方法は、全ての投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【０１１３】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化２８】
2016529257.tif 000034
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害できる。DNAメチルトランスフェラーゼは、当技術分野に公知であり、先に議論されている。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、ヒトDNAメチルトランスフェラーゼを含み得る。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、DNMT-1、DNMT-3A、又はDNMT-3Bを含み得る。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Aの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Bの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1、DNMT-3A、及びDNMT-3Bの発現を阻害できる。
【０１１４】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化２９】
2016529257.tif 000035
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害できる。ヒストンデアセチラーゼは、当技術分野に公知であり、先に議論されている。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、ヒトヒストンデアセチラーゼを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、あらゆる公知のHDAC、例えば、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、又はHDAC11などを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、又はSIRT7を含み得る。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の1種以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11のそれぞれの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の1種以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、1種以上のHDACの発現を阻害でき、且つ1種以上のSIRTの発現を阻害できる。
【０１１５】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化３０】
2016529257.tif 000036
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むプロリルヒドロキシラーゼは、当技術分野に公知であり、先に議論されている。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、ヒトプロリルヒドロキシラーゼを含み得る。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、あらゆる公知のプロリルヒドロキシラーゼ、例えば、PHD1、PHD2、及びPHD3などを含み得る。一態様において、開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD2の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD3の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3の組み合わせの発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3のそれぞれの発現及び/又は活性を阻害できる。
【０１１６】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法の投与する工程は、当技術分野に公知であるあらゆる投与経路を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は腹腔内投与を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は経口投与を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は静脈内投与を含み得る。一態様において、対象は、血管漏出、網膜症、又は重症下肢虚血(CLI)を有さない。
【０１１７】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法において、遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)遺伝子プロモーター、c-myc遺伝子プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、mutLホモログ1 プロモーター、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、転写因子21(TCF21)プロモーター、又は血管内皮細胞成長因子-A(VEGF-A)プロモーターを含み得る。
【０１１８】
一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: DSP、C-MYC、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CYP1B1、DLC1、CDH1、FHIT、CDH13、MGMT、OPCML、PAX5、PRDM2、RASSF1、APC、APBA1、CADM1、CXCL12、MTHFR、MLH1、RASSF2、SFRP1、TCF21、及びVEGF-A。
【０１１９】
一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法は、当技術分野に公知である1種以上の腫瘍抑制遺伝子(TSG)の1種以上の遺伝子プロモーターを含み得る。
【０１２０】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法において、遺伝子プロモーターは、エストロゲン受容体遺伝子(ER)プロモーター、乳癌1遺伝子(BRCA1)プロモーター、上皮カドヘリン遺伝子(E-cad)プロモーター、TMS1遺伝子プロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質7遺伝子(IGFBP7)プロモーター、p16プロモーター、レチノイン酸受容体遺伝子(RARβ2)プロモーター、又はRas関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1遺伝子(RASSF1A)プロモーターを含み得る。
【０１２１】
一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: ER、BRCA1、E-cad、TMS1、IGFBP7、RARβ2、及びRASSF1A。
【０１２２】
一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-A。
【０１２３】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患又は障害は、癌以外のものであり得る。
【０１２４】
DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法において、対象は癌を有し得る。一態様において、癌は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化により起こる癌であり得る。例えば、癌は、表1に特定されるいずれの癌でもあり得る。一態様において、開示される方法は、1種以上の抗癌剤を対象に投与することを含み得る。一態様において、対象は乳癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターはデスモプラキン(DSP)プロモーターを含み得る。一態様において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌であり得る。一態様において、対象はメラノーマを有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターはデスモプラキン(DSP)プロモーターを含み得る。一態様において、対象は子宮頸癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーター又はc-Mycプロモーターを含み得る。一態様において、対象は肺癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、mutLホモログ1、結腸癌、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、又は転写因子21(TCF21)プロモーターを含み得る。
【０１２５】
一態様において、DNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害と診断されるか、又はDNA過剰メチル化を特徴とする疾患若しくは障害を有すると疑われる対象を治療する、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターのDNA過剰メチル化と関連する1つ以上の症状を改善させることを含み得る。
【０１２６】
（iii)C-MYC発現を減少させる方法）
下式の化合物:
【化３１】
2016529257.tif 000037
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象におけるc-myc発現を減少させる方法が本明細書に開示される。一態様において、c-myc発現を減少させる、開示される方法は、c-mycプロモーターのメチル化状態を変更することを含み得る。一態様において、c-myc発現を減少させる、開示される方法は、c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。c-mycプロモーターなどのプロモーターのメチル化状態を測定又は確認する方法は、当技術分野に公知であり、先に議論されている。一態様において、c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することは、対象の冒された組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、対象の冒されていない組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含み得る。一態様において、冒された組織は腫瘍又は癌であり得て、冒されていない組織は、腫瘍又は癌以外のものであり得る(すなわち、非癌性組織又は細胞又は試料)。一態様において、c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することは、c-mycプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含み得る。
【０１２７】
対象におけるc-myc発現を減少させる方法の一態様において、対象は不健康な対象であり得る。一態様において、不健康な対象は、疾患、病態、障害、又は疾病に冒されているか、又は患っている対象であり得る。
【０１２８】
c-myc発現を減少させる、開示される方法において、対象は、血管漏出ではない疾患又は障害を有し得る。c-myc発現を減少させる、開示される方法において、対象は、網膜症ではない疾患又は障害を有し得る。c-myc発現を減少させる、開示される方法において、対象は、重症下肢虚血(CLI)ではない疾患又は障害を有し得る。
【０１２９】
対象におけるc-myc発現を減少させる、開示される方法の一態様において、該方法は、投与する工程の前に、それを必要とする対象を特定することを含み得る。
【０１３０】
c-myc発現を減少させる、開示される方法の一態様において、投与する工程の前に、c-mycプロモーターは過剰メチル化されている。言い換えると、c-mycプロモーターは、より高いレベルのメチル化パーセントを有する。メチル化パーセントのレベルは、2つの対象、例えば、特定の疾患若しくは障害であると診断されたか、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われる対象と、特定の疾患若しくは障害であると診断されておらず、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われていない対象などとの間で比較され得る。メチル化パーセントのレベルは、対象内、例えば、冒された組織又は器官又は細胞と、冒されていない組織又は器官又は細胞などとの間で比較され得る。一態様において、冒された組織又は器官又は細胞は、癌性又は腫瘍状の組織又は器官又は細胞であり得る。
【０１３１】
c-myc発現を減少させる、開示される方法の一態様において、投与する工程の後で、c-mycプロモーターのメチル化状態の変化があり得る。例えば、一態様において、メチル化状態の変化は、c-mycプロモーターのメチル化パーセントの減少を含み得る。投与する工程の後で、c-mycプロモーターの所望のメチル化状態が達成されない場合、該方法は、有効量の組成物の投与を繰り返すことを含み得る。一態様において、所望のメチル化状態は、c-mycプロモーターのメチル化パーセントの減少であり得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定される前後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定された後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、又はそれ以上の回数など、1回以上繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、対象の人生の1時間ごと、3時間ごと、6時間ごと、12時間ごと、18時間ごと、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、2年ごと、5年ごと、又は10年ごとに起こり得る。一態様において、開示される方法は、単一の投与する工程の後で、c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、DNAメチル化を調節する、開示される方法は、いくつかの投与する工程の後で、c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、開示される方法は、全ての投与する工程の後で、c-mycプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【０１３２】
c-myc発現を減少させる、開示される方法において、対象は癌を有し得る。一態様において、癌は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化により起こる癌であり得る。例えば、癌は、表1に特定されるいずれの癌でもあり得る.一態様において、c-myc発現の減少は、対象における転移を阻害できる。一態様において、c-myc発現を減少させる、開示される方法は、1種以上の抗癌剤を対象に投与することを含み得る。
【０１３３】
c-myc発現を減少させる、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化３２】
2016529257.tif 000038
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むDNAメチルトランスフェラーゼ(DNA MT)は当技術分野に公知である。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、ヒトDNAメチルトランスフェラーゼを含み得る。一態様において、DNAメチルトランスフェラーゼは、DNMT-1、DNMT-3A、又はDNMT-3Bを含み得る。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Aの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-3Bの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、DNMT-1、DNMT-3A、及びDNMT-3Bの発現を阻害できる。
【０１３４】
c-myc発現を減少させる、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化３３】
2016529257.tif 000039
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のヒストンデアセチラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むヒストンデアセチラーゼは、当技術分野に公知である。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、ヒトヒストンデアセチラーゼを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、あらゆる公知のHDAC、例えば、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、又はHDAC11などを含み得る。一態様において、ヒストンデアセチラーゼは、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、又はSIRT7を含み得る。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の1種以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、及びHDAC11のそれぞれの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の1種以上の発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、及びSIRT7の組み合わせの発現を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、1種以上のHDACの発現を阻害でき、且つ1種以上のSIRTの発現を阻害できる。
【０１３５】
c-myc発現を減少させる、開示される方法の一態様において、下式の化合物:
【化３４】
2016529257.tif 000040
又はその医薬として許容し得る塩を含む開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現を阻害できる。非哺乳類のホモログを含むプロリルヒドロキシラーゼは、当技術分野に公知である。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、ヒトプロリルヒドロキシラーゼを含み得る。一態様において、プロリルヒドロキシラーゼは、あらゆる公知のプロリルヒドロキシラーゼ、例えば、PHD1、PHD2、及びPHD3などを含み得る。一態様において、開示される組成物は、1種以上のプロリルヒドロキシラーゼの発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD2の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD3の発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3の組み合わせの発現及び/又は活性を阻害できる。一態様において、開示される組成物は、PHD1、PHD2、及びPHD3のそれぞれの発現及び/又は活性を阻害できる。
【０１３６】
c-myc発現を減少させる、開示される方法の投与する工程は、当技術分野に公知であるあらゆる投与経路を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は腹腔内投与を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は経口投与を含み得る。例えば、一態様において、投与する工程は静脈内投与を含み得る。
【０１３７】
一態様において、c-myc発現を減少させる、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターの異常なDNAメチル化、例えば、過剰メチル化などと関連する1つ以上の症状を改善させることを含み得る。
【０１３８】
（iv)デスモプラキン発現を増加させる方法）
下式の化合物:
【化３５】
2016529257.tif 000041
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象におけるデスモプラキン発現を増加させる方法が本明細書に開示される。一態様において、デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法は、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を変更することを含み得る。一態様において、デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法は、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。デスモプラキンプロモーターなどのプロモーターのメチル化状態を測定又は確認する方法は、当技術分野に公知であり、先に議論されている。一態様において、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することは、対象の冒された組織におけるデスモプラキンプロモーターのメチル化状態を、対象の冒されていない組織におけるデスモプラキンプロモーターのメチル化状態と比較することを含み得る。一態様において、冒された組織は腫瘍又は癌であり得て、冒されていない組織は腫瘍又は癌以外のものであり得る(すなわち、非癌性の組織又は細胞又は試料)。一態様において、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することは、デスモプラキンプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含み得る。
【０１３９】
対象におけるデスモプラキン発現を増加させる方法の一態様において、対象は不健康な対象であり得る。一態様において、不健康な対象は、疾患、病態、障害、又は疾病に冒されているか、又は患っている対象であり得る。
【０１４０】
デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、対象は、血管漏出ではない疾患又は障害を有し得る。デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、対象は、網膜症ではない疾患又は障害を有し得る。デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、対象は、重症下肢虚血(CLI)ではない疾患又は障害を有し得る。
【０１４１】
対象におけるデスモプラキン発現を増加させる、開示される方法の一態様において、該方法は、投与する工程の前に、それを必要とする対象を特定することを含み得る。
【０１４２】
デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法の一態様において、投与する工程の前に、デスモプラキンプロモーターは過剰メチル化されている。言い換えると、c-mycプロモーターは、より高いレベルのメチル化パーセントを有する。メチル化パーセントのレベルは、2つの対象、例えば、特定の疾患若しくは障害であると診断されたか、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われる対象と、特定の疾患若しくは障害であると診断されておらず、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われていない対象などの間に比較され得る。メチル化パーセントのレベルは、対象内、例えば、冒された組織又は器官又は細胞と、冒されていない組織又は器官又は細胞などとの間で比較され得る。一態様において、冒された組織又は器官又は細胞は、癌性又は腫瘍状の組織又は器官又は細胞であり得る。
【０１４３】
デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法の一態様において、投与する工程の後で、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態の変化があり得る。例えば、一態様において、メチル化状態の変化は、デスモプラキンプロモーターのメチル化パーセントの減少であり得る。投与する工程の後で、デスモプラキンプロモーターの所望のメチル化状態が達成されない場合、該方法は、有効量の組成物の投与を繰り返すことを含み得る。一態様において、所望のメチル化状態は、デスモプラキンプロモーターのメチル化パーセントの減少であり得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定される前後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定された後で繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、又はそれ以上の回数など、1回以上繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、対象の人生の1時間ごと、3時間ごと、6時間ごと、12時間ごと、18時間ごと、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、2年ごと、5年ごと、又は10年ごとに起こり得る。一態様において、開示される方法は、単一の投与する工程の後で、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法は、いくつかの投与する工程の後で、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、開示される方法は、全ての投与する工程の後で、デスモプラキンプロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【０１４４】
デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、対象は癌を有し得る。一態様において、癌は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化により起こる癌であり得る。例えば、癌は、表1に特定されるいずれの癌でもあり得る。一態様において、対象は、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、メラノーマ、子宮頸癌、又は肺癌を有し得る。一態様において、対象は、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、メラノーマ、子宮頸癌、及び肺癌の1つ以上を有し得る。一態様において、デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法は、1種以上の抗癌剤を対象に投与することを含み得る。
【０１４５】
デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、デスモプラキン遺伝子発現は増加され得る。デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、デスモプラキンタンパク質発現は増加され得る。デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、デスモプラキン遺伝子発現及びデスモプラキンタンパク質発現は増加され得る。デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法において、デスモプラキン遺伝子及び/又はタンパク質発現の増加は、例えば、対象における転移を阻害できる。
【０１４６】
一態様において、デスモプラキン発現を増加させる、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターの異常なDNAメチル化、例えば、過剰メチル化などと関連する1つ以上の症状を改善させることを含み得る。
【０１４７】
（v)転移を阻害する方法）
下式の化合物:
【化３６】
2016529257.tif 000042
又はその医薬として許容し得る塩を含む有効量の組成物を対象に投与すること;及び1種以上の遺伝子プロモーターのDNAメチル化状態を調節することを含む、対象における転移を阻害する方法が本明細書に開示される。転移を阻害することの一態様において、1種以上の遺伝子のDNAメチル化状態を調節することは、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を変化させることを含み得る。転移を阻害することの一態様において、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【０１４８】
対象における転移を阻害する方法の一態様において、対象は不健康な対象であり得る。一態様において、不健康な対象は、疾患、病態、障害、又は疾病に冒されているか、又は患っている対象であり得る。
【０１４９】
転移を阻害する、開示される方法において、対象は、血管漏出ではない疾患又は障害を有し得る。転移を阻害する、開示される方法において、対象は、網膜症ではない疾患又は障害を有し得る。転移を阻害する、開示される方法において、対象は、重症下肢虚血(CLI)ではない疾患又は障害を有し得る。
【０１５０】
1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を測定又は確認する方法は、当技術分野に公知である。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することは、対象の冒された組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を、対象の冒されていない組織における1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態と比較することを含み得る。一態様において、冒された組織は腫瘍又は癌であり得て、冒されていない組織は、腫瘍又は癌以外のものであり得る(すなわち、非癌性組織又は細胞又は試料)。一態様において、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することは、1種以上のプロモーターのメチル化パーセントを測定することを含み得る。
【０１５１】
対象における転移を阻害する、開示される方法の一態様において、投与する工程の前に、1種以上の遺伝子プロモーターは過剰メチル化されている。言い換えると、検討している1種以上の遺伝子プロモーターは、より高いレベルのメチル化パーセントを有する。メチル化パーセントのレベルは、2つの対象、例えば、特定の疾患若しくは障害であると診断されたか、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われる対象と、特定の疾患若しくは障害であると診断されておらず、又は特定の疾患若しくは障害を有すると疑われていない対象などとの間で比較され得る。メチル化パーセントのレベルは、対象内、例えば、冒された組織又は器官又は細胞と、冒されていない組織又は器官又は細胞などとの間で比較され得る。一態様において、冒された組織又は器官又は細胞は、癌性又は腫瘍状の組織又は器官又は細胞であり得る。
【０１５２】
対象における転移を阻害する、開示される方法の一態様において、該方法は、投与する工程の前に、それを必要とする対象を特定することを含み得る。
【０１５３】
対象における転移を阻害する、開示される方法の一態様において、投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態の変化があり得る。例えば、一態様において、メチル化状態の変化は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含み得る。投与する工程の後で、所望のメチル化状態が達成されない場合、該方法は、有効量の組成物の投与を繰り返すことを含み得る。一態様において、所望のメチル化状態は、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化パーセントの減少を含み得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定される前後に繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、メチル化状態が決定された後で繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、又はそれ以上の回数など、1回以上繰り返され得る。一態様において、投与する工程は、対象の人生の1時間ごと、3時間ごと、6時間ごと、12時間ごと、18時間ごと、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年、2年ごと、5年ごと、又は10年ごとに起こり得る。一態様において、開示される方法は、単一の投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、DNAメチル化を調節する、開示される方法は、いくつかの投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。一態様において、開示される方法は、全ての投与する工程の後で、1種以上の遺伝子プロモーターのメチル化状態を決定することを含み得る。
【０１５４】
対象における転移を阻害する、開示される方法において、遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)遺伝子プロモーター、c-myc遺伝子プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、mutLホモログ1プロモーター、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、転写因子21(TCF21)プロモーター、又は血管内皮細胞成長因子-A(VEGF-A)プロモーターを含み得る。
【０１５５】
対象における転移を阻害する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: DSP、C-MYC、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CYP1B1、DLC1、CDH1、FHIT、CDH13、MGMT、OPCML、PAX5、PRDM2、RASSF1、APC、APBA1、CADM1、CXCL12、MTHFR、MLH1、RASSF2、SFRP1、TCF21、及びVEGF-A。
【０１５６】
一態様において、転移を阻害する、開示される方法は、当技術分野に公知である1種以上の腫瘍抑制遺伝子(TSG)の1種以上の遺伝子プロモーターを含み得る。
【０１５７】
対象における転移を阻害する、開示される方法において、遺伝子プロモーターは、エストロゲン受容体遺伝子(ER)プロモーター、乳癌1遺伝子(BRCA1)プロモーター、上皮カドヘリン遺伝子(E-cad)プロモーター、TMS1遺伝子プロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質7遺伝子(IGFBP7)プロモーター、p16プロモーター、レンチオイン酸（rentioic acid）受容体遺伝子(RARβ2)プロモーター、又はRas関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1遺伝子(RASSF1A)プロモーターを含み得る。
【０１５８】
対象における転移を阻害する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: ER、BRCA1、E-cad、TMS1、IGFBP7、RARβ2、及びRASSF1A。
【０１５９】
DNAメチル化を調節する、開示される方法は、以下の遺伝子プロモーターの1種以上を含み得る: APBA1、APC、BRCA1、CADM1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、C-MYC、CXCL12、CYP1B1、DLC1、DSP、E-CAD、ER、FHIT、IGFBP7、MGMT、MLH1、MTHFR、OPCML、PAX5、PRDM2、RARβ2、RASSF1、RASSF1A、RASSF2、SFRP1、TCF21、TMS1、及びVEGF-A。
【０１６０】
転移を阻害する、開示される方法において、対象は癌を有し得る。一態様において、癌は、1種以上の遺伝子プロモーターの過剰メチル化により起こる癌であり得る。例えば、癌は、表1に特定されるいずれの癌でもあり得る。一態様において、開示される方法は、1種以上の抗癌剤を対象に投与することを含み得る。一態様において、対象は乳癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーターを含み得る。一態様において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌であり得る。一態様において、対象はメラノーマを有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーターであり得る。開示される方法の一態様において、対象は子宮頸癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーター又はc-Mycプロモーターを含み得る。一態様において、対象は肺癌を有し得て、1種以上の遺伝子プロモーターは、デスモプラキン(DSP)プロモーター、腺腫様多発結腸ポリープ(APC)プロモーター、アミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー1(APBA1)プロモーター、細胞接着分子1(CADM1)プロモーター、E-カドヘリン(CDH1)プロモーター、H-カドヘリン(CDH13)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1C(CDKN1C)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A(CDKN2A)プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B(CDKN2B)プロモーター、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(CXCL12)プロモーター、チトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1(CYP1B1)プロモーター、肝臓癌中欠失1(DLC1)プロモーター、脆弱ヒスチジントライアド(FHIT)プロモーター、O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)プロモーター、mutLホモログ1、結腸癌、非ポリポーシスタイプ2(MLH1)プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NAD(P)H)(MTHFR)プロモーター、オピオイド結合タンパク質/細胞接着分子様(OPCML)プロモーター、ペアードボックス5(PAX5)プロモーター、PRドメイン含有2、ZNFドメインを有する(PRDM2)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー1(RASSF1)プロモーター、Ras関連(RalGDS/AF-6)ドメインファミリーメンバー2(RASSF2)プロモーター、分泌型フリッツルド関連タンパク質1(SFRP1)プロモーター、又は転写因子21(TCF21)プロモーターを含み得る。
【０１６１】
一態様において、転移を阻害する、開示される方法は、1種以上の遺伝子プロモーターの異常なDNAメチル化、例えば、過剰メチル化などと関連する1つ以上の症状を改善させることを含み得る。
【０１６２】
（vi)開示される化合物を合成する方法）
AKB-6899とも称され得る開示される化合物、6、及びエステルプロドラッグ、例えば、化合物5は、スキームIに概説され、以下の実施例1にさらに説明されるプロセスにより製造できる。
【０１６３】
スキームI
【化３７】
2016529257.tif 000043
試薬及び条件:(a)H2: Pd/C、EtOH、室温、16時間。
【０１６４】
【化３８】
2016529257.tif 000044
試薬及び条件:(b)(CF3O2S)2O、Et3N、CH2Cl2;室温、16時間。
【０１６５】
【化３９】
2016529257.tif 000045
試薬及び条件:(c)Et3N、Na2CO3、EtOH、室温、16時間。
【０１６６】
【化４０】
2016529257.tif 000046
試薬及び条件:(d)Pd(dppf)Cl2、K3PO4、H2O、ジオキサン; 85℃、16時間。
【０１６７】
【化４１】
2016529257.tif 000047
試薬及び条件:(e)(i)NaOH、THF; 30分。(ii)HCl、THF、H2O; 85℃、16時間。
【実施例】
【０１６８】
（a.実施例1）
AKB-699とも称され得る、{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}酢酸(6)。
【０１６９】
以下に説明される反応において、特記されない限り、温度をセルシウス度(℃)で与え;操作は、室温又は周囲温度、「室温」、「rt」、又は「RT」で実施し(典型的には、約18℃〜約25℃の範囲;溶媒の蒸発は、ロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で(典型的には、4.5〜30 mm Hg)で、水浴温度最高60℃で実施し;反応の過程は、典型的には、薄層クロマトグラフィー(TLC)により追跡し;生成物は、満足できる1H NMR、HPLC、及び/又はLC-MS(GC-MS)データを示し;以下の従来の略語も使用する: L(リットル（複数可）)、mL(ミリリットル)、mmol(ミリモル)、g(グラム)、及びmg(ミリグラム)。特記されない限り、溶媒及び試薬は全て供給業者から購入し、さらに精製せずに使用した。反応は、特記されない限り、窒素ブランケット下で実施した。化合物を、UVランプ(254 nm)下で可視化した。1H NMRスペクトルを300 MHz NMRで記録した。
【０１７０】
[(3,5-ジヒドロキシピリジン-2-カルボニル)-アミノ]-酢酸エチルエステル(2)の製造: 20 L丸底フラスコに、窒素及びパラジウムカーボン(10% Pd/C)(100 g、60%湿潤ペースト)、及びエタノール(12L)を入れ、それに続いて[(3,5-ビス-ベンジルオキシピリジン-2-カルボニル)-アミノ]-酢酸エチルエステル、1、(1000g、2.378mol)を加えた。生じた混合物を、真空-窒素パージサイクルに3回、真空-水素パージサイクルに3回かけた。水素雰囲気を導入し、該反応混合物を、TLC分析による反応の完了まで、1〜25℃で撹拌した。反応は、典型的には2〜3時間続き、反応を完了させるために激しい撹拌が重要であった。次いで、該反応系を、真空-窒素パージサイクルにかけて、系から水素を除いた。該反応混合物を濾過し、フィルターケーキをエタノール(2L)で洗浄した。合わせた濾液を、ロータリーエバポレーターで、45℃までの水浴温度で一定重量に濃縮すると、558g(97.7%収率)の所望の生成物を灰白色の固体として与えた。MP: 138-140℃; MS(ESI+): m/z 241(M+1);
【化４２】
2016529257.tif 000048
【０１７１】
N-フェニルビス(トリフルオルメタン(trifluormethane)-スルフィンイミド)(3)の製造: 10Lのファウンド（found）底フラスコに、アニリン(232.5g、2.5mol)、トリエチルアミン(505g、5mol)、及びジクロロメタン(5L)を入れた。生じた混合物を、氷浴により冷却した。ジクロロルメタン(dichlolormethane)(1L)中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物(1410g、5mol)を滴加した。該反応混合物を放置して室温に温め、一晩撹拌した。次いで、該反応物を、砕いた氷(4kg)に撹拌しながら加えた。生じた二相の混合物を分離した。有機層をブライン(2L×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、粗製の固体生成物を形成した。粗製の固体をエタノールで洗浄すると、767g(86%収率)の所望の生成物が白色の固体として生じた。MP: 96-98℃;
【化４３】
2016529257.tif 000049
【０１７２】
[(3-ヒドロキシ-5-トリフルオロメタンスルホニルオキシピリジン-2-カルボニル)-アミノ]-酢酸エチルエステルナトリウム塩(4)の製造: 20L丸底フラスコに、[(3,5-ジヒドロキシ-ピリジン-2-カルボニル)-アミノ]-酢酸エチルエステル、2、(860g、3.58mol)及びエタノール(11L)を入れた。該混合物を撹拌すると、10〜20℃で溶液が形成した。トリエチルアミン(602 mL、4.3mol)を加えた。生じた混合物を0〜5℃に冷却し、N-フェニルビス(トリフルオルメタン-スルフィンイミド)、3、(1406g、3.94mol)を加えた。添加後、反応混合物を35〜40℃に温め、一晩撹拌した。TLC分析により、反応が完了したことが示された。次いで、該反応混合物を、40℃までの水浴温度でロータリーエバポレーションにより濃縮した。残渣（油状の固体)をトルエン(4.5L)で処理し、およそ4.5Lに濃縮した。トルエン溶媒交換を、残留エタノールレベルが1H NMR分析により0.5%未満になるまで繰り返した。該トルエン溶液を10% w/w Na2CO3水溶液(5.5L、1.3当量)で処理した。生じたスラリーを濾過し、フィルターケーキを水(2×2L)で洗浄し、次いで、トルエン/TBME(1:2)の混合物(2×2L)で洗浄した。固体生成物を乾燥させると、1156g(82%収率)の所望の生成物を白色の固体として与えた。MS(ESI+): m/z 373(M+1);
【化４４】
2016529257.tif 000050
【０１７３】
{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}酢酸エチルエステル(5)の製造: 5L丸底フラスコに、[(3-ヒドロキシ-5-トリフルオロメタンスルホニルオキシピリジン-2-カルボニル)-アミノ]-酢酸エチルエステルナトリウム塩、4、(310g、0.78mol)、1,4-ジオキサン(3L)、及び水(150 mL)を入れた。該溶液を、真空-窒素パージサイクルにかけ、それに続いて、リン酸カリウム(50g、0.234mol)及び3-フルオロフェニルボロン酸(163g、1.17mol)を加えた。添加後、真空-窒素パージサイクルを1回繰り返した。次いで、1,1-ビス(ジフェニル-ホスフィノ)フェロセンパラジウム(II)クロリドCH2Cl2錯体(72g、0.088mol、0.11当量)を加えた。もう1回の真空-窒素パージサイクルの後、次いで、該反応混合物を75〜85℃に加熱した。反応の進行を、TLCによりモニターした。該反応は、14〜16時間後に完了した。該反応物を15〜25℃に冷却し、ロータリーエバポレーションにより45℃までの水浴温度で、溶媒回収が終わるまで濃縮した。残渣を、HCl水溶液(1M、1.5L)及び酢酸エチル(1.5L)で処理し、30分間室温で撹拌した。次いで、層を分離した。有機層を 水(1.5L)、ブライン(1.5L)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル/酢酸: 3:1:0.01（体積比）)により精製すると、226g(90%収率)の所望の生成物を与えた。MS(ESI+): m/z 319(M+1);
【化４５】
2016529257.tif 000051
【０１７４】
{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}酢酸(6)の製造: {[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}酢酸エチルエステル、5、(226g、0.71mol)の室温のTHF(1L)中のスラリーに、水酸化ナトリウムの水溶液(1 M、2L)を、内部反応温度を25℃未満に維持しながら、加えた。反応の進行をTLCによりモニターした。20〜30分後、該反応は完了した。内部温度を25℃未満に維持しながら、反応溶液のpHを、濃HClを使用して5〜5.5に調整した。該反応混合物を濾過して不溶物を除き、濾液を、ロータリーエバポレーションにより40℃までの水浴温度で、THFが全て除去されるまで濃縮した。生じた固体を真空濾過により回収し、水(1L)で洗浄した。次いで、固体を、水(1.5L)とTHF(1.5L)の混合物に室温で溶解させた。pHを、濃HClにより、およそ5からおよそ2〜2.25に調整した。生じた混合物を30分間撹拌し、その後pHを、2〜2.5の範囲であると確認した。二相の混合物を、ロータリーエバポレーションにより、40℃までの水浴温度で、THFの除去が終わるまで濃縮した。生じた固体を濾過し、水(2×1L)で洗浄し、乾燥させると、115g(55.8%収率)の所望の生成物を白色の固体として与えた。MP: 182-184℃; MS(ESI-): m/z 289(M-1);
【化４６】
2016529257.tif 000052
【０１７５】
開示されるHIF-2α安定剤のアミドプロドラッグは、スキームIIに概説され、以下の実施例2にさらに説明されるプロセスにより製造できる。
【０１７６】
スキームII
【化４７】
2016529257.tif 000053
試薬及び条件:(a)CH3NH2 HCl、EDCI、HOBt、DIPEA、DMF; 0℃から室温、2日
【０１７７】
（b.実施例2）
5-(3-フルオロフェニル)-N-(2-メチルアミノ-2-オキソエチル)-3-ヒドロキシピリジン-2-イルアミド(7)
【０１７８】
5-(3-フルオロフェニル)-N-(2-メチルアミノ-2-オキソエチル)-3-ヒドロキシピリジン-2-イルアミド(7)の製造: {[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]-アミノ}酢酸、6、(2.9g、10 mmol)のN2下の室温のDMF(50 mL)溶液に、1-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-3-エチルカルボジイミド(EDCI)(2.33g、14.4mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1.35g、10 mmol)、及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(15.65mL、30 mmol)を加える。該反応物を、5分間撹拌し、次いでメチルアミン塩酸塩(0.9g、130 mmol)を加える。2日間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をCH2Cl2とH2Oの間で分配する。有機層を分離し、飽和NaClで洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、減圧下で濃縮する。粗生成物をシリカ(MeOH:CH2Cl2 1:99)で精製すると、所望の化合物を与える。
【０１７９】
下記は、開示されるHIF-2α安定剤及びそのプロドラッグを製造するさらなるプロセスを説明する。スキームIIIでは、エステルプロドラッグの例を製造するプロセスを概説し、実施例3に説明する。
【０１８０】
スキームIII
【化４８】
2016529257.tif 000054
試薬及び条件:(a)K2CO3、PdCl2(dppf)、DMF、H2O; 45℃、18時間。
【０１８１】
【化４９】
2016529257.tif 000055
試薬及び条件:(b)NaOCH3、CH3OH;還流、20時間。
【０１８２】
【化５０】
2016529257.tif 000056
試薬及び条件:(c)48% HBr;還流、20時間。
【０１８３】
【化５１】
2016529257.tif 000057
試薬及び条件:(d)CDI、DIPEA、DMSO;室温、2.5時間。
【０１８４】
（c.実施例3）
メチル{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}アセタート(11)
【０１８５】
5-(3-フルオロフェニル)-3-クロロ-2-シアノピリジン(8)の製造:磁気撹拌のために改造し窒素入口を備えた100 mL丸底フラスコに、(3-フルオロフェニル)ボロン酸(4.48g、32 mmol)、3,5-ジクロロ-2-シアノピリジン(5.8g、34 mmol)、K2CO3(5.5g、40 mmol)、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロ-パラジウム(II)[PdCl2(dppf)](0.1g、0.13 mmol)、ジメチルホルムアミド(50 mL)、及び水(5mL)を入れる。該反応溶液を激しく撹拌し、45℃に加熱し、その温度で18時間保ち、その後、酢酸エチル/メタノール(4:1)を移動相として使用し、UV 435 nmを使用して残存出発物質を可視化するTLCにより、出発物質3,5-ジクロロ-2-シアノピリジンが無いことにより、反応の完全さを確認できる。次いで、該反応溶液を室温に冷却し、内容物を、酢酸エチル(250 mL)と飽和NaCl水溶液(100 mL)との間で分配する。有機相を単離し、飽和NaCl水溶液(100 mL)で2回目の洗浄をする。有機相を、MgSO4で4時間乾燥させ、MgSO4を濾過により除去し、溶媒を減圧下で除去する。次いで、残った残渣を、メタノール(50 mL)中に、室温で20時間スラリー化する。生じた固体を濾過により回収し、冷メタノール(50 mL)で、次いでヘキサン(60 mL)で洗浄し、乾燥させると、所望の生成物を与える。
【０１８６】
5-(3-フルオロフェニル)-3-メトキシ-2-シアノピリジン(9)の製造:磁気撹拌のために改造し還流冷却器及び窒素入口を備えた500 mL丸底フラスコに、5-(3-フルオロフェニル)-3-クロロ-2-シアノピリジン、8、(9.28g、40 mmol)、ナトリウムメトキシド(13.8 mL、60 mmol)、及びメタノール(200 mL)を入れる。撹拌しながら、該反応溶液を20時間還流に加熱する。ヘキサン/酢酸エチル(6:3)を移動相として使用しUV 435 nmを利用して反応成分を可視化するTLC分析により測定して、5-(3-フルオロフェニル)-3-クロロ-2-シアノピリジンの消失により、該反応を完了したと決定できる。該反応混合物を室温に冷却し、水(500 mL)と合わせる。該混合物を0℃〜5℃に冷却し、3時間撹拌する。生じた固体を濾過により回収し、水で洗浄し、次いでヘキサンで洗浄する。次いで、生じたケーキを、真空中で、40℃で乾燥させると、所望の生成物を与える。
【０１８７】
5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボン酸(10)の製造:磁気撹拌のために改造し還流冷却器を備えた50 mL丸底フラスコに、5-(3-フルオロフェニル)-3-メトキシ-2-シアノピリジン、9、(0.912g、4 mmol)及び48% HBr水溶液(10 mL)を入れる。撹拌しながら、該反応溶液を20時間還流に加熱する。ヘキサン/酢酸エチル(6:3)を移動相として使用しUV 435 nmを使用して反応成分を可視化するTLC分析により測定して、5-(3-フルオロフェニル)-3-メトキシ-2-シアノピリジンの消失により、該反応が完了したと決定できる。次いで、該反応物を撹拌しながら0℃〜5℃に冷却し、50% NaOH水溶液をゆっくり添加してpHをおよそ2に調整する。次いで、撹拌を0℃〜5℃で3時間続ける。生じた固体を濾過により回収し、水で洗浄し、次いでヘキサンで洗浄する。生じたケーキを、真空中で40℃で乾燥させると、所望の生成物を与える。
【０１８８】
メチル{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}-アセタート(11)の製造:磁気撹拌のために改造し窒素流入チューブを備えた50 mL丸底フラスコに、5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボン酸、10、(0.932gm、4 mmol)、N,N'-カルボニルジイミダゾール(CDI)(0.97g、6 mmol)、及びジメチルスルホキシド(5 mL)を入れる。該反応混合物を、45℃で約1時間撹拌し、次いで室温に冷却する。グリシンメチルエステル塩酸塩(1.15g、12 mmol)を加え、それに続いてジイソプロピルエチルアミン(3.2 mL、19 mmol)を滴加する。次いで、該混合物を室温で2.5時間撹拌し、その後水(70 mL)を加える。反応フラスコの内容物を0℃〜5℃に冷却し、溶液pHがおよそ2になるまで1N HClを加える。該溶液をジクロロメタン(100 mL)で抽出し、有機層をMgSO4で16時間乾燥させる。シリカゲル(3g)を加え、次いで溶液を2時間スラリー化し、その後固体を濾過により除く。濾液を減圧下で濃縮乾固させ、生じた残渣をメタノール(10 mL)中で2時間スラリー化する。生じた固体を濾過により回収し、冷メタノール(20 mL)で洗浄し、次いでヘキサンで洗浄し、生じたケーキを乾燥させると所望の生成物を与える。
【０１８９】
エステルプロドラッグ、メチル{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-イル]アミノ}アセタート、11は、スキームI工程(e)に概説され、実施例1に説明された手順により、開示されるHIF-2α安定剤、{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}酢酸、6に転化できる。
【０１９０】
以下のスキームIVは、開示されるHIF-2α安定剤のアミドプロドラッグの手順を概説し、実施例4はそのさらなる非限定的な例を説明する。
【０１９１】
スキームIV
【化５２】
2016529257.tif 000058
試薬及び条件:(a)EDCI、HOBt、DIPEA、DMF;室温。
【０１９２】
（d.実施例4）
5-(3-フルオロフェニル)-N-(2-アミノ-2-オキソエチル)-3-ヒドロキシルピリジン-2-イルアミド(12)
【０１９３】
5-(3-フルオロフェニル)-N-(2-アミノ-2-オキソエチル)-3-ヒドロキシルピリジン-2-イルアミド(6)の製造: 5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボン酸、10、(699 mg、3 mmol)の室温のN2下のDMF(20 mL)溶液に、1-(3-ジメチル-アミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド(EDCI)(0.925g、5.97 mmol)及び1-ヒドロキシベンゾ-トリアゾール(HOBt)(0.806g、5.97 mmol)を加える。生じた溶液を15分間撹拌し、次いで2-アミノアセトアミド塩酸塩(0.66g、5.97 mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(1.56 ml、8.96 mmol)を加える。該反応をTLCによりモニターし、反応が完了したら、反応混合物を減圧下で濃縮し、H2Oを加える。通常の後処理により所望の生成物を単離できる。
【０１９４】
本開示は、開示される安定剤の医薬として許容し得る塩も含む。下記は、スキームVに描かれる医薬として許容し得る塩の製造の非限定的な例である。
【０１９５】
スキームV
【化５３】
2016529257.tif 000059
（e.実施例5）
ナトリウム{[5-(3-フルオロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ}アセタート(13)。
【０１９６】
NaHCO3(41.09 mg)を含むバイアルに、{[5-(3-フルオロ-フェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]-アミノ}酢酸(6)のアセトン溶液(5.12 mL中に400 mg試料の0.64 mL)を加える。該溶液を撹拌し、所望の生成物を、真空中での濃縮により単離する。
【０１９７】
（D.実験）
以下の実施例は、当業者に、本明細書の請求項記載の化合物、組成物、物品、装置、及び/又は方法が製造及び評価される方法の完全な開示及び説明を与えるために述べるが、単に本発明を説明するものであり、発明者らがその発明と考えるものの範囲を限定しないものとする。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、開示されている具体的な実施態様になされ得るが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることを認識するはずである。数(例えば、量、温度など)に関して正確度を確保するように努力したが、いくらかの誤差及び偏差を見込まなくてはならない。
【０１９８】
（i)デスモプラキン発現及びデスモソーム機能に対するAKB-6899の作用）
これらの実験で、AKB-6899処理により起こるPHD3の阻害が、MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞において(インビトロ)、デスモプラキンmRNA及びタンパク質発現を増加させるか否かを評価する。さらに、AKB-6899処理により起こるPHD3の阻害が、デスモソーム機能に影響するか否かを評価する。
【０１９９】
対照動物(すなわち、DMSOを受け取る)に比べて、AKB-6899(17.5 mg/kg)で処置されたPyMT乳癌坦癌マウスは、DSP mRNA発現の有意な増加を有した(すなわち、AKB-6899処置動物において〜118倍増加)(図4B)。デスモプラキン(DSP)は、上皮細胞の内膜に位置するデスモソームの主なタンパク質成分であり、それがデスモソームカドヘリンに結合して細胞対細胞接着を維持する。DSPは、ER/PR発現により制御されている(Maynadierらの文献(2012）; Ahmedらの文献(1995); Pangらの文献(2004))。臨床的には、DSPの発現は、正常な乳腺上皮でより高い。DSPの喪失は、低分化の乳房腫瘍及びリンパ節転移の増加に関係する。DSPの喪失は、ki-67染色と著しく逆相関する(Daviesらの文献（1999))。デスモソームに組み込まれた機能性のデスモプラキンは、セリン165/166でリン酸化されていない。プロテインキナーゼC(PKC)によるser165/166でのリン酸化は、デスモプラキンをデスモソームから取り外す。デスモソーム機能の喪失及び接着結合の減少は、この移行が治療の有効性をなくし、臨床成績不良の可能性を増加させるので、腫瘍の病期分類、予後、及び治療計画を知らせることができるマーカーである(Dusekらの文献(2011))。さらに、DSPの喪失は、それが接着タンパク質に結合し、核に移行し、Wnt/β-カテニン経路を活性化するので、上皮間葉転換(EMT)プロセスのマーカーである(Yangらの文献(2012))。
【０２００】
DSPはER/PR発現により制御され、末期PyMT腫瘍はER/PR陽性を失い、リンパ節及び肺に大量に転移するので(Linらの文献(2003))、遺伝子発現を制御するより包括的な事象に対するAKB-6899の作用を評価した。培養中のPyMT腫瘍細胞を、DMSO又はAKB-6899により処理した。デスモプラキンプロモーター中のCpGアイランドのメチル化特異的PCRを実施した。データにより、未処理の細胞(Utx又はUTX)及びDMSO処理(ビヒクル)細胞におけるDSPプロモーターのほぼ完全なメチル化が示される。逆に、AKB-6899で処理した細胞は完全に非メチル化されていた(図3A)。トリパンブルーにより、対照細胞と比べてAKB-6899処理細胞における細胞死が全くないことを確認した。実験を繰り返し、RNAを細胞から単離した。RT-PCRを実施し、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)の制御を評価した。DNMT-3bのmRNAレベルには差が全くなかったが、DNMT-1及びDNMT-3a(すなわち、メチル化を制御する主要なDNMT)のmRNAレベルの有意な減少を記録した(図1A)。DNMT-1及びDNMT-3aのmRNAレベルの減少は、DSPのmRNAレベルを増加させ(図4A)、デスモプラキンタンパク質発現を増加させた(図5A)。
【０２０１】
DNMT発現の減少及びDSP発現の増加がヒト癌に関連するか否かを決定するために、MDA-MB- 231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞におけるデスモプラキン発現のレベルを決定した。ウェスタンブロット分析により、MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞は、ER/PRも欠くが、該タンパク質を発現しなかったことが明らかになった(図5B)。MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞をDNAメチル化に関して評価し、これらの細胞がDSP CpGアイランドで著しく過剰メチル化されていることを確認した。AKB-6899は、DSP CpGアイランドのほとんど完全な脱メチル化を誘発した(図3B)。PyMT腫瘍細胞と同様に、AKB-6899は、MDA-MB-231ヒト腫瘍細胞中のDNMT-1及びDNMT-3aのmRNAレベルを有意に減少させた(図1B)。
【０２０２】
次に、AKB-6899が、ヒト乳癌細胞におけるデスモプラキンのmRNAレベル及びタンパク質を増加させるか否かを評価する。MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌(TNBC)細胞を培養し、(i)プロリルヒドロキシラーゼ-3(PHD3)を標的とするヒトsiRNA又は(ii)スクランブルされた対照siRNAにより24時間トランスフェクトする(siRNA戦略については、Eubankらの文献(2011）参照)。トランスフェクトされた細胞を処理しないままにするか(Utx)、又はAKB-6899(1μM、10μM、及び25μM)若しくはDMSO(ビヒクル)で処理する。処理は24、48、又は72時間続く。毒性効果(例えば、細胞死)を、トリパンブルー排除試験を利用して評価し、必要な場合、処理濃度を調整する。第一の試料を使用して、細胞をDNA単離用にペレット化し、それに続いて、デスモプラキンプロモーターを標的とするプライマーによるメチル化特異的PCRを実施する。例えば、本明細書に開示される実験は、QIAGEN EpiTect Methyl Signature PCR Kitsを利用した。第二の試料を使用して、細胞を、トリゾール均質化、全RNA精製、cDNA合成、及びRT-PCRに付す。DSPI及びDSPII mRNAのmRNAレベルを測定する。siPHD3によるノックダウンの後のPHD3のmRNAレベルを評価する。第三の試料を使用して、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液により溶解させる。ライセートを、ウェスタンブロット分析用にデスモプラキンI/II抗体及びPHD3抗体により免疫染色し、デスモプラキンの発現を決定する。PHD3タンパク質の発現の減少を確認する。処理細胞と未処理細胞の両方で、PHD3 mRNAの有無を、(i)デスモプラキンCpGアイランドのDNAメチル化パーセント、(ii)デスモプラキンmRNA発現、及び(iii)デスモプラキンタンパク質発現と比較する。
【０２０３】
AKB-6899がトリプルネガティブ乳癌中でデスモソーム機能を増大させるか否かを評価する。MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞を培養する一方で、細胞の一部に処理を行わない。他の細胞をDMSO(ビヒクル)により処理し、又はAKB-6899(1μM、10μM、及び25μM)で処理する(濃度の最適化の議論に関しては、Rodaらの文献(2012)参照)。処理は、24、48、又は72時間続く。第一の試料を使用して、処理前に、コラーゲン-1の重合層に細胞を播種することにより、コラーゲン浸潤試験(CIA)を実施する(例えば、Tselepsisらの文献(1998)参照)。第二の試料を使用して、カルセイン-AM色素輸送アッセイ(FRAP)を実施する(例えば、Liらの文献(2010)参照)。第三の試料を使用して、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液により細胞を溶解させ、ウェスタンブロット分析用にDSP I/II抗体により免疫染色する。処理細胞と未処理細胞の両方で、コラーゲンを浸潤した腫瘍細胞の数を決定する。カルセイン-AMを輸送できる腫瘍細胞のパーセンテージも決定する。これらの測定値を、処理の関数として、デスモプラキンタンパク質の発現と比較する。
【０２０４】
（ii)デスモプラキン制御及び転移の阻害に対するAKB-6899の作用）
この一連の実験において、MDA-MB-231ヒトTNBC担癌SCIDマウスにおけるDNAメチル化に対するAKB-6899の作用を評価する。さらに、DNMT-1及びDNMT-3aの発現に対するAKB-6899の作用並びにデスモプラキンの発現に対するAKB-6899の作用も決定する。単独又はドセタキセルと組み合わせたAKB-6899の作用も、血液、リンパ節、及び肺における腫瘍転移に対して評価する。
【０２０５】
AKB-6899とドセタキセルのような標準化学療法の組み合わせが、A375担癌SCIDマウスにおいて、ヒトメラノーマ腫瘍成長をドセタキセル単独よりも良好に減少させるかを決定する。図9は、化学療法及びAKB-6899が、ヒト腫瘍を有するSCIDマウスに首尾よく投与できることを示す。図9は、インビボのドセタキセルとAKB-6899の両方の有効投与量の最適化(マウスに対する毒性が全く観察されなかった)も示す。
【０２０６】
次に、AKB-6899処置が、SCIDマウス中のヒト乳癌において、DSPのmRNAレベルを増加させ、DSPタンパク質発現を増加させるか否かを、決定する。同年齢の雌のSCIDマウスに、1×106 MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞を第4乳腺脂肪体に同所性移植する。腫瘍が触知可能になると(約8日)、マウスを、無作為に以下の処置群に分ける:(i)非処置(UTX又はUtx);(ii)ビヒクル(DMSO);及び(iii)AKB-6899(17.5 mg/kg週3回与える)。各処置を、腹腔内注射により、100μL総体積で投与する。処置は、およそ10週間、又はマウス若しくは腫瘍が除去基準に達するまで続く。そのような基準の1つは、腫瘍寸法が2 cmに達することである。毎日、腫瘍測定値を、カリパスを使用して盲目的に(blindly)記録する。腫瘍体積(すなわち、長さ×幅×高さ)及びマウス体重を毎週記録する。各処置セッションの間、罹患率を推定する。10週後、マウスを、安楽死させ(例えば、CO2及び頚椎脱臼)、腫瘍を回収する。腫瘍をいくつかの試料に分ける。第一の試料を固定し、総デスモプラキン発現のためのヒトDSP I/II抗体を使用する免疫組織化学用に薄片にする。第二の試料を、DNA単離及びDSPプロモーターのためのその後のメチル化特異的PCRのために直ちに凍結する。第三の試料を使用して、DSPのmRNAレベルの決定のためのRNAを単離する。
【０２０７】
単独又はドセタキセルと組み合わせたAKB-6899が、ドセタキセル単独よりも良好に、腫瘍転移を効果的に減少させるか否かを評価する。ドセタキセルは、トリプルネガティブ乳癌の標準治療と考えられている。同年齢の雌のSCIDマウスに、1×106 MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞を第4乳腺脂肪体に同所性移植する。腫瘍が触知可能になると(約8日)、マウスを無作為に以下の処置群に分ける:(i)非処置(Utx);(ii)ビヒクル1(AKB-6899のためのDMSO)又はビヒクル2(ドセタキセルのためのPBS);(iii)ドセタキセル単独(30 mg/kg週1回);(iv)AKB-6899単独(17.5 mg/kg週3回);及び(v)ドセタキセル(30 mg/kg週1回)とAKB-6899(17.5 mg/kg週3回)との組み合わせ。各処置を、腹腔内注射により、100μLの総体積で投与する。処置は、およそ10週間、又はマウス若しくは腫瘍が除去基準に達するまで続く。そのような基準の1つは、腫瘍寸法が2 cmに達することである。毎日、腫瘍測定値を、カリパスを使用して盲目的に記録する。腫瘍体積(すなわち、長さ×幅×高さ)及びマウス体重を毎週記録する。各処置セッションの間、罹患率を推定する。10週後、マウスを、安楽死させ(例えば、CO2及び頚椎脱臼)、腫瘍、心房血液、リンパ節、及び肺を回収する。腫瘍をいくつかの試料に分ける。第一の試料を固定し、総DSP発現の決定のためのヒトDSP I/II抗体を使用する免疫組織化学用に薄片にする。腫瘍細胞の血管周囲浸潤を、ヘマトキシリン・エオシン染色により評価し、病理学者の評価に付す。第二の試料を、DNA単離及びデスモプラキンプロモーターのためのメチル化特異的PCRのために直ちに凍結する。第三の試料を使用して、デスモプラキンmRNA発現のためのRNAを単離する。全RNAを、全血から単離し、cDNAを合成し、MDA-MB-231ヒト腫瘍細胞中のヒトERVK6A mRNAの存在に関してRT-PCRを実施する。肺の半分を液体窒素中で急速冷凍し、全RNA単離、cDNA合成、及びERVK6A mRNAのためのRT-PCR用にホモジナイズする。腫瘍転移の発生率を定量化するために、肺のもう半分を縛り、PBSを吹き付け、ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンで染色し、明視野(bright light)顕微鏡法に付す。
【０２０８】
血液、リンパ節、及び肺中のヒトERVK6A mRNAのレベルを、RT-PCR、腫瘍細胞血管周囲浸潤の病理学者スコアリング、及び5つの処置群のそれぞれ(すなわち、(i)非処置マウス、(ii)DMSO又はPBS処置マウス(ビヒクル)、(iii)AKB-6899のみ、(iv)ドセタキセルのみ、及び(v)AKB-6899とドセタキセルの組み合わせ処置マウス）から得た肺における腫瘍発生率により評価する。DNA低メチル化を確認するために、いくつかの実験を実施する:(i)腫瘍中のデスモプラキンmRNA及びタンパク質発現を決定する、(ii)デスモプラキンプロモーターのメチル化特異的PCRを実施する、(iii)デスモプラキンmRNAのRT-PCRを実施する、且つ(iv)DSP I/IIタンパク質の免疫染色を利用する。
【０２０９】
統計分析を実施する。例えば、ホルムの手順を利用して、多重性に対して調整する。データをSAS 9.3(SAS社製、Cary、NC)で分析する。各処置下でのsiRNAとその対照との間のDSPプロモーターメチル化のレベルを比較する。各条件でn=3反復実験を使用すると、2倍の差をCV=20%及びa=0.025(片側)で検出するのに80%検定力を生じる。n=5反復実験/条件(2つのエンドポイント及び4つの対比でa=0.025/8)を要する、処置のDSPタンパク質発現及びデスモソーム機能のレベルをDMSOと比較する。分散分析(ANOVA)を仮説検定に使用する。非処置マウスの転移と、DMSO処置マウスの転移と、AKB-6899処置マウスの転移とを比較する。群あたりn=10マウスでは、CV=50%及びa=0.025/10(5つのエンドポイント及び2つの対比)で2.5倍の差を検出するのに80%の検定力を生じる。線形混合効果モデルを利用して、反復された腫瘍サイズデータを分析し、分散分析を他のエンドポイントに利用する。転移を、非処置と、DMSO処置又はPBS処置(ビヒクル)と、AKB-6899単独と、ドセタキセル単独と、AKB-6899+ドセタキセルの組み合わせとの間で比較する。群あたりn=10マウスでは、CV=50%及びa=0.025/10(5つのエンドポイント及び2つの対比)で2.5倍の差を検出するのに80%の検出力を生じる。線形混合効果モデルを利用して、反復された腫瘍サイズデータを分析し、分散分析を他のエンドポイントに利用する。
【０２１０】
（iii)AKB-6899がDNAメチル化の逆転を起こす機構の決定）
AKB-6899は、プロリルヒドロキシラーゼ-3(PHD3)の特異的な小分子阻害剤であり、HIF-2αを選択的に安定化させる(HIF-1αは安定化させない)。間欠的な低酸素(IH)に曝される腫瘍細胞はHIF-2αを失うが、HIF-1αを保持する(Nanduriらの文献(2009))。したがって、Bl6F10坦癌マウスをIHプロトコルに曝露させた。IHに曝露されたこれらのマウスは、間欠的な空気に曝露されたものに比べ、増加した腫瘍転移を有した(p=0.013)。DNAメチル化が、酸素利用可能性に関連する恒常性機構を正常化する遺伝子の発現及び/又は抑制により低酸素事象を制御するか否かを調査する。
【０２１１】
PyMTマウス乳癌細胞及びMDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞(それぞれ、通常、99.96%及び99.86%過剰メチル化されている)のAKB-6899による処理は、デスモプラキンプロモーターを、それぞれ0.0%及び0.38%に低メチル化した。したがって、本明細書に記載される実験は、(i)AKB-6899誘発性の低メチル化の機構の決定、(ii)MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞におけるDSP発現の増加、(iii)PHD3及びHIF-2α特異的安定化の役割の推定、(iv)これらの経路がDNMTを制御する方法の決定、並びに(v)デスモソーム機能に対する、増加したDSP発現の効果の調査を意図している。
【０２１２】
さらに、本明細書に記載される実験において、AKB-6899によるHIF-2α安定化の有効性を調査する。具体的には、AKB-6899により処置されたMDA-MB-231ヒト担癌SCIDマウスの腫瘍を、(i)ドセタキセル単独、及び(ii)AKB-6899とドセタキセルの組み合わせにより処置されたマウスの腫瘍と比較することにより、腫瘍転移を評価する。同じ処置群を使用して、腫瘍中のデスモプラキン発現のレベルも推定する。(i)AKB-6899単独、(ii)ドセタキセル単独、(iii)デシタビン単独、又は(iv)AKB-6899を含む種々の組み合わせで処置された腫瘍の間のグローバルDNAメチル化の変化をプロファイルするために、MethylCap-Seq Experimental QCを発生させる。メチル化プロファイルを、種々の処置群に対して決定する。
【０２１３】
ビヒクルかAKB-6899のいずれかで処置されたPyMT乳癌坦癌マウスの腫瘍の遺伝子発現シグネチャーも評価した。AKB-6899で処置されたマウスは、ビヒクル処置マウスに比べて、デスモプラキン遺伝子発現の有意な増加を経験した(すなわち、ビヒクル動物に対してAKB-6899動物における118.5倍の増加)(図4A)。デスモプラキンプロモーターに対するメチル化特異的PCRを実施した。低メチル化のレベルは完全に近かった(図3A(マウスPyMT乳癌細胞)、図3B(ヒトMDA-MB-231トリプルネガティブ乳癌細胞)、図3C(ヒトC8161.9メラノーマ腫瘍細胞)、及び図3D(ヒトMCF-7乳房癌細胞)。PyMT腫瘍細胞においてAKB-6899がデスモプラキン遺伝子発現を増加させたか否かを決定するために、PyMT腫瘍細胞を培養中にAKB-6899により処理した。デスモプラキンタンパク質の発現の上向き調節が観察された(図5A)。MDA-MB-231によるDSP発現の欠如を確認した(図5B)。DNMT-1及びDNMT-3aのRT-PCRを、PyMT腫瘍細胞とMDA-MB-231ヒト腫瘍細胞の両方で実施した。AKB-6899は、PyMT腫瘍細胞とMDA-MB-231ヒト腫瘍細胞の両方で、DNMT mRNA発現を下向き調節した(図1A(PyMT)及び図1B(MDA-MB-231))。
【０２１４】
次に、PHD3阻害及びHIF-2α安定化が、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞におけるデスモプラキンプロモーターのDNAメチル化を阻害するか否かを評価する。MDA-MB- 231ヒトトリプルネガティブ乳癌(TNBC)腫瘍細胞を培養し、(i)プロリルヒドロキシラーゼ-3(PHD3)を標的とするヒトsiRNA、(ii)HIF- 2αを標的とするヒトsiRNA、又は(iii)スクランブルされた対照siRNAによりトランスフェクトする。トランスフェクションは24時間起こる(Eubankらの文献(2011))。処理群は以下の通りである: 0.5% O2又は21% O2のいずれかで、又は21% O2でCoCl2単独で、(i)AKB-6899(0.25μM、2.5μM、及び25μM)、(ii)DMSO(ビヒクル)、又は(iii)5-アザ-2'-デオキシシチジン(デシタビン)(0.5μM、1μM、及び2μM)。処理は、24、48、又は72時間続く。トリパンブルー排除試験を利用して毒性を評価する。必要な場合(例えば、処理が毒性の徴候を示す場合)、処理濃度を調整する。第一の試料を、トリゾール均質化、全RNA精製、cDNA合成、及びRT-PCRに付して、siRNAサイレンシングを確認する(すなわち、siPHD3をsiスクランブルされた対照とPHD3に関して比較し、siHIF-2aをsiスクランブルされた対照とHIF-2αに関して比較することにより決定されたmRNAノックダウン)。それぞれのタンパク質の減少を確認するために、第二の試料を、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液により溶解させ、ライセートを、ウェスタンブロット分析のために、PHD3又はHIF-2a抗体により免疫染色する。第三の試料を、DNA単離を単離するためにペレット化し、それに続いて、デスモプラキンプロモーターを標的とするプライマーによるメチル化特異的PCRを実施する。
【０２１５】
HIF-2α安定化誘発性のDNMT転写の減少が、デスモプラキンプロモーターのDNA低メチル化を起こすか否かを調査する。MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌腫瘍細胞を培養し、(i)ヒトDNMT-1を標的とするsiRNA、(ii)ヒトDNMT-3aを標的とするsiRNA、(iii)ヒトDNMT-3bを標的とするsiRNA、(iv)ヒトDNMT-1と、DNMT-3aと、DNMT-3bとの組み合わせを標的とするsiRNA、又は(iv)スクランブルされた対照siRNAにより24時間トランスフェクトする。2種以上のDNMTを標的とする複数のsiRNAを、CP70ヒト卵巣癌細胞中にトランスフェクトする組み合わせの手法が示された(Leuらの文献(2003))。トランスフェクション後、腫瘍細胞を処理せず(すなわち、未処理)又は以下の処置群の1つに付す: 0.5% O2か21% O2のいずれか、又は21% O2でCoCl2単独で、(i)AKB-6899(0.25μM、2.5μM、及び25μM)、(ii)DMSO(ビヒクル)、又は(iii)デシタビン(0.5μM、1μM、及び2μM)。処理は、24、48、又は72時間続く。第一の試料を、トリゾール均質化、全RNA精製、cDNA合成、及びRT-PCRに付して、siRNAサイレンシングを確認する。ノックダウン後のmRNAレベルを決定するために、siDNMT-1、siDNMT-3a、siDNMT-3b、又は複数のDNMTを標的とするsiRNAの組み合わせによりトランスフェクトされた腫瘍細胞のmRNAレベルを、適切なsiスクランブルされた対照のmRNAレベルと比較する。それぞれのタンパク質のレベルの減少を確認するために、第二の試料を、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液により溶解させ、ライセートを、ウェスタンブロット分析のためにDNMT抗体及びDSP抗体により免疫染色する。第三の試料をDNA単離のためにペレット化し、それに続いて、デスモプラキンプロモーターを標的とするプライマーによりメチル化特異的PCRを実施する。各DNMT及び全DNMTのmRNAの存在及び/又は非存在を、処理条件に対するデスモプラキンプロモーターのDNAメチル化パーセントと比較する。
【０２１６】
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞において、HIF-2α安定化がデスモプラキンタンパク質発現を増加させ、デスモソーム機能を向上させるか否かを、次に調査する。MDA-MB- 231ヒトトリプルネガティブ乳癌腫瘍細胞を培養する。24時間又は48時間、0.5% O2か21% O2のいずれか、又は21% O2でCoCl2単独で、培養した細胞を処理しないままにするか(Utx)、DMSO(ビヒクル)、AKB-6899(0.25μM、2.5μM、及び25μM)、又はデシタビン(0.5μM、1μM、及び2μM)により処理する。第一の試料を、コラーゲン浸潤アッセイ(CIA)に付すが、処理の前に細胞をコラーゲン-1の重合層に播種する(Tselepisらの文献(1998))。第二の試料を、カルセイン-AM色素輸送アッセイ(FRAP)に付すが、これはLiらの文献(2010）に記載の通り実施する。第三の試料を、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液により溶解させ、ライセートを、ウェスタンブロット分析のためにデスモプラキンI/II抗体により免疫染色する。コラーゲンを浸潤する腫瘍細胞の数並びにカルセイン-AMを輸送できる腫瘍細胞のパーセンテージを決定し、特定の処理の関数としてデスモプラキンタンパク質の発現と比較する。
【０２１７】
（iv)デスモプラキンの制御及び転移の阻害に対するAKB-6899の有効性の決定）
AKB-6899により起こる、MDA-MB-231ヒトTNBC担癌SCIDマウス中のHIF-2α安定化の有効性を決定する。AKB-6899、ドセタキセル、及びAKB-6899とドセタキセルとの組み合わせの、血液及び肺中の腫瘍転移に対する作用を評価する。AKB-6899、ドセタキセル、デシタビン、及びこれらの組み合わせにより処理された腫瘍の間のグローバルDNAメチル化の変化をプロファイルするために、MethylCap-Seq Experimental QCを発生させる。遺伝子発現のマイクロアレイを使用して、これらのメチル化プロファイルを確認する。
【０２１８】
AKB-6899とドセタキセルのような標準化学療法との組み合わせが、A375担癌SCIDマウスにおいて、ドセタキセル単独よりも良好に、ヒトメラノーマ腫瘍成長を減少させるか否かを研究する。図9は、SCIDマウス中のヒト腫瘍モデルにおいて、化学療法及びAKB-6899を投与する実行可能性を確認する。図9は、インビボのドセタキセルとAKB-6899の両方の有効投与量の最適化も表している(すなわち、マウスに対する毒性効果が全く観察されなかった)。
【０２１９】
AKB-6899とドセタキセルのような標準化学療法との組み合わせが、ドセタキセル単独よりも、腫瘍転移を良好に減少させるか否かを研究する。同年齢の雌のSCIDに、1×106 MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞を、マウスの第4乳腺脂肪体に同所性移植する。腫瘍が触知可能になると(約8日)、マウスを無作為に以下の処置群に分ける:(i)ビヒクル(すなわち、ドセタキセル用にはPBS、デシタビン用にはPBS、及びAKB-6899用には鉱油);(ii)ドセタキセル単独(30 mg/kg週1回);(iii)AKB-6899単独(17.5 mg/kg週3回);(iv)デシタビン単独(0.156 mg/kg週2回);(v)ドセタキセル(30 mg/kg週1回)とAKB-6899(17.5 mg/kg週3回)の組み合わせ;及び(vi)ドセタキセルとデシタビンの組み合わせ。
【０２２０】
処置は、およそ10週間、又はマウス若しくは腫瘍が除去基準に達するまで続く。そのような基準の1つは、腫瘍の寸法が2 cmに達することである。毎日、腫瘍寸法を、カリパスを使用して盲目的に記録する。腫瘍体積(すなわち、長さ×幅×高さ)及びマウス体重を毎週記録する。各処置セッションの間に、罹患率を推定する。10週後、マウスを安楽死させ(例えば、CO2及び頚椎脱臼)、腫瘍、心房血液(Rodaらの文献(2012))、及び肺(Eubankらの文献(2009))を回収する。腫瘍をいくつかの試料に分ける。第一の試料を固定し、(i)総デスモプラキン発現用のヒトデスモプラキンI/II抗体、(ii)腫瘍細胞増殖用のki-67抗体、及び(iii)腫瘍細胞アポトーシス用のカスパーゼ-3抗体を使用する免疫組織化学用に薄片にする。腫瘍細胞の血管周囲浸潤をヘマトキシリン・エオシン染色により評価し、病理学者の評価に付す。第二の試料を、DNA単離及びその後のDSPプロモーターのメチル化特異的PCRのために直ちに凍結する。第三の試料を使用して、全RNAを全血から単離するが、次いでそれをcDNA合成し、RT-PCRに使用して、MDA-MB-231ヒト腫瘍細胞からのヒトERVK6A mRNAの存在を決定する。肺の半分を液体窒素中で急速冷凍し、全RNA単離、cDNA合成、及びERVK6A mRNA発現のためのRT-PCRのためにホモジナイズする。腫瘍転移の発生率を定量化するために、肺のもう半分を縛り、PBSを吹き付け、ホルマリン中に固定し、ヘマトキシリンで染色し、明視野顕微鏡法に付す。
【０２２１】
種々の処置の後、血液及び肺中のヒトERVK6A mRNAの発現を、RT-PCR、腫瘍細胞血管周囲浸潤の病理学者のスコアリング、及び肺の腫瘍発生率により評価する。腫瘍中のcDNA低メチル化及びデスモプラキンタンパク質発現は、デスモプラキンプロモーターのメチル化特異的PCR及びデスモプラキンタンパク質の免疫染色を利用して確認する。
【０２２２】
SCIDマウスにおけるトリプルネガティブ乳房腫瘍のAKB-6899誘発性のDNA低メチル化を、次に、デシタビン誘発性のDNA低メチル化と比較する。(i)AKB-6899、(ii)AKB-6899とドセタキセルの組み合わせ及びデシタビン単独、並びに(iii)AKB-6899とドセタキセルの組み合わせによる処置を受けたMDA-MB-231ヒト乳癌担癌SCIDマウス由来の腫瘍DNA及びRNA。Methylcap-seq及びヒトマイクロアレイ遺伝子発現アッセイを、記載される通りに(Rodriguezらの文献(2012))実施する。DNAメチル化データを、Rodriguezらの文献(2012)に記載される通りに分析する。処置群の間のDNAメチル化シグネチャーを、ヒトマイクロアレイ遺伝子発現用の同じ腫瘍試料を使用して確認し、DNA過剰メチル化又は低メチル化を機能性遺伝子の活性と比較する。
【０２２３】
これらの実験において、ホルムの手順を使用して、多様性に対して調整する。データをSAS 9.3(SAS社製、Cary、NC)で分析する。各処置下でのsiRNAとその対照との間のDSPプロモーターメチル化を比較する。各条件でn=3反復実験では、2倍の差をCV=20%及びa=0.025(片側)で検出するのに80%検定力を生じる。処置のDSPタンパク質発現及びデスモソーム機能を、n=5反復実験/条件(2つのエンドポイント及び4つの対比でa=0.025/8)を利用して、DMSOと比較する。分散分析(ANOVA)を仮説検定に利用する。種々の処置(例えば、(i)AKB-6899、(ii)AKB-6899とドセタキセルの組み合わせによる処置、及び(iii)ドセタキセルによる処置）の間の転移を評価する。この評価において、群あたりn=10匹のマウスでは、CV=50%及びa=0.025/10(5つのエンドポイント及び2つの対比)で2.5倍の差を検出する80%の検出力を生じる。線形混合効果モデルを使用して反復された腫瘍サイズデータを分析し、分散分析を他のエンドポイントに使用する。AKB-6899とデシタビンの間の遺伝子メチル化又は発現のレベルを、線形効果モデルを使用して比較する。n=10匹のマウス/群は、2つの群の標準偏差が0.4でFDR=0.01であることを仮定すると、各遺伝子について2倍の差の検出を可能にする(Jungらの文献(2005))。回帰モデルを使用して、メチル化と遺伝子発現の間の関連を調査する。
【０２２４】
（v)マイクロRNA及びsnoRNA発現に対するAKB-6899の効果）
種々のマイクロRNA及びsnoRNAの発現を、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞へのAKB-6899の投与後に評価した。データを図15に表す。これらの癌細胞において、AKB-6899はいくつかのマイクロRNAの発現を増加させ、その一部はDNMTなどのメチル化制御因子を標的としている。AKB-6899は、約20のsnoRNAも制御したが、その一部はメチル化を導くことが知られている。最後に、分析は、AKB-6899処理癌細胞中の60を超えるRNA転写物を特定したが、その転写はまだアノテーションされていない。AKB-6899処理乳癌細胞をDMSO処理癌細胞と比較した。
【０２２５】
（E.参考文献）
Ahmed A, et al. Colocalization of vascular endothelial growth factor and its  flt-1 receptor in human placenta. Growth Factors. 2005; 12(3):235-243.
【０２２６】
Barekati Z, et al. Methylation signature of lymph node metastases in breast  cancer patients. BMC Cancer. 2012; 12:244-2407-12-244.
【０２２７】
Chen D, et al. Hypoxia inducible factors-mediated inhibition of cancer by GM-CSF: A mathematical model. Bull Math Biol. 2012; 74(11):2752-2777.
【０２２８】
Chimonidou M, et al. DNA methylation of tumor suppressor and metastasis suppressor genes in circulating tumor cells. Clin Chem. 2011; 57:1169-1177.
【０２２９】
Clevers H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 2006; 127(3):469-480.
【０２３０】
Davies EL, et al. The immunohistochemical expression of desmoplakin and its role in vivo in the progression and metastasis of breast cancer. Eur J Cancer. 1999; 35:902-907.
【０２３１】
Derks S, et al. Methylation-specific PCR unraveled. Cell Oncol. 2004; 26(5-6):291-299.
【０２３２】
Dusek  RL,  et  al.  Desmosomes:  New  perpetrators  in  tumour  suppression.  Nat  Rev Cancer. 2011; 11:317-323.
【０２３３】
Eubank TD, et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor  inhibits  breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 2009;69: 2133-2140.
【０２３４】
Eubank TD, et al. Opposing roles for HIF-1alpha and HIF-2alpha in the regulation of angiogenesis by mononuclear phagocytes. Blood. 2011; 117:323-332.
【０２３５】
Herman J, et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (DNA methylation/tumor suppressor genes/pl6/p15). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93:9821-9826.
【０２３６】
Leu YW, et al. Double RNA interference of DNMT-3b and DNMT-1 enhances DNA demethylation and gene reactivation. Cancer Res. 2003; 63:6110-6115.
【０２３７】
Li MW, et al. Connexin 43 is critical to maintain the homeostasis of the blood testis barrier via its effects on tight junction reassembly. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107:17998- 18003.
【０２３８】
Lin EY, et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 2003; 163(5):2113-2126.
【０２３９】
Matsumoto S, et al. Imaging cycling tumor hypoxia. Cancer Res. 2010; 70(24):10019- 10023.
【０２４０】
Maynadier M, et al. Estrogens promote cell-cell adhesion of normal and malignant mammary cells through increased desmosome formation. Mol Cell Endocrinol. 2012; 364:126- 133.
【０２４１】
Naldini A, et al. Downregulation of hypoxia-related responses by  novel  antitumor histone deacetylase inhibitors in MDAMB231 breast cancer cells. Anticancer  Agents  Med Chem. 2012; 12:407-413.
【０２４２】
Nanduri J, et al. Intermittent hypoxia degrades HIF-2alpha via calpains resulting in oxidative stress: Implications for recurrent apnea-induced morbidities. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106:1199-1204.
【０２４３】
OjalvoLS, et al. Gene expression analysis of macrophages that facilitate tumor invasion supports a role for wnt-signaling in mediating their activity in  primary  mammary  tumors. Journal of Immunology. 2010; 184(2):702-712.
【０２４４】
Pang H, et al. Epidermal growth factor suppresses induction by progestin of the adhesion protein desmoplakin in T47D breast cancer cells. Breast Cancer Res. 2004; 6:R239-R245.
【０２４５】
Roda  JM,  et  al.  Hypoxia-inducible  factor-2  alpha  regulates  GM-CSF-derived  soluble vascular endothelial growth factor receptor 1 production from macrophages and inhibits tumor growth and angiogenesis. Journal of Immunology. 2011; 187(4): 1970-1976.
【０２４６】
Roda JM, et al. Stabilization of HIF-2alpha induces sVEGFR-1 production from tumor- associated macrophages and decreases tumor growth in a murine melanoma model. J Immunol. 2012; 189:3168-3177.
【０２４７】
Rodriguez BA, et al. Methods for high-throughput MethylCap-seq data analysis BMC Genomics. 2012; 13 Suppl 6: S14-2164-13-S6-S14.
【０２４８】
Szyf M. DNA methylation signatures for breast cancer classification and prognosis. Genome Med. 2012; 4:26.
【０２４９】
Tselepis C, et al. Desmosomal adhesion inhibits invasive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95:8064-8069.
【０２５０】
Watson JA, et al. Epigenetics, the epicenter of the hypoxic response. Epigenetics. 2010; 5:293-296.
【０２５１】
YangL, et al. Desmoplakin acts as a tumor suppressor by inhibition of the Wnt/beta- catenin signaling pathway in human lung cancer. Carcinogenesis. 2012; 33:1863-1870.
【図１Ａ−１Ｂ】
2016529257.tif 000067
【図１Ｃ−１Ｄ】
2016529257.tif 000068
【図１Ｅ】
2016529257.tif 000069
【図２Ａ】
2016529257.tif 000070
【図２Ｂ】
2016529257.tif 000071
【図２Ｃ−２Ｄ】
2016529257.tif 000072
【図３Ａ−３Ｄ】
2016529257.tif 000073
【図３Ｅ】
2016529257.tif 000074
【図４Ａ−４Ｂ】
2016529257.tif 000075
【図５Ａ−５Ｂ】
2016529257.tif 000076
【図６Ａ−６Ｂ】
2016529257.tif 000077
【図７Ａ−７Ｂ】
2016529257.tif 000078
【図８Ａ−８Ｂ】
2016529257.tif 000079
【図９】
2016529257.tif 000080
【図１０Ａ−１０Ｂ】
2016529257.tif 000081
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2016529257.tif 000082
【図１１Ｃ−１１Ｄ】
2016529257.tif 000083
【図１２Ａ】
2016529257.tif 000084
【図１２Ｂ】
2016529257.tif 000085
【図１２Ｃ−１２Ｄ】
2016529257.tif 000086
【図１３Ａ−１３Ｂ】
2016529257.tif 000087
【図１４Ａ−１４Ｃ】
2016529257.tif 000088
【図１５】
2016529257.tif 000089
【国際調査報告】
2016529257.tif 000090
2016529257.tif 000091
2016529257.tif 000092