(57)【要約】Ｔリンパ球では、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、チロシン３２３におけるリン酸化を伴う代替的経路を介して活性化され得る。Ｔ細胞においてチロシン３２３リン酸化ｐ３８に結合しこれを阻害するために必要とされる増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ（Ｇａｄｄ４５α）タンパク質の最小領域の同定が、本明細書で開示される。開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチドは、Ｔ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害し、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害し、炎症促進性サイトカインの産生を阻害し、腫瘍形成および膵臓がんなどの炎症性がんの増殖を低減させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５アミノ酸長以下の単離された増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ（Ｇａｄｄ４５α）ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＬＱＩＨＦＴＬＩＸＡＦＣＣＥＮ（配列番号１）を含み、式中、ＸはＱまたはＲである、ポリペプチド。
【請求項２】
２０アミノ酸長以下である、請求項１に記載の単離されたＧａｄｄ４５αポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）を含む、請求項１に記載の単離されたＧａｄｄ４５αポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）からなる、請求項１に記載の単離されたＧａｄｄ４５αポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のＧａｄｄ４５αポリペプチドおよび異種ペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項６】
前記異種ペプチドが細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＣＰＰがポリアルギニンを含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ポリアルギニンが、１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基を含むまたは１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基からなる、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記Ｇａｄｄ４５αポリペプチドのＮ末端と融合した１１Ｒからなる、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）と融合した１１Ｒからなる、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１２】
Ｔ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害する、またはＴｈ１細胞もしくはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、前記Ｔ細胞を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質と接触させ、それによって前記Ｔ細胞の増殖を阻害するまたは前記Ｔ細胞の分化を阻害するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞が、被験体から単離されており、そして単離された前記Ｔ細胞を、前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質と接触させる、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験体においてＴ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害するため、または被験体においてＴｈ１細胞もしくはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害するための医薬の調製における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質の使用。
【請求項１５】
Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を処置するための医薬の調製における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質の使用。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞媒介性および／または前記ｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害が、多発性硬化症、関節リウマチまたは膵臓がんを含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、静脈内投与、腫瘍内投与または腹腔内投与によって投与される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞媒介性および／または前記ｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害が、膵臓がんを含み、そして前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、腫瘍内注射によって投与される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
被験体において腫瘍血管新生を阻害するための医薬の調製における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質の使用。
【請求項２０】
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、腫瘍内投与によって投与される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、約２０μｇ〜約１００μｇの用量で投与される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、約２０μｇ〜約１００μｇの用量で投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２４】
前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、約２０μｇ〜約１００μｇの用量で投与される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年３月７日に出願された米国仮出願第６１／７７４，０６６号、および２０１２年１１月２０日に出願された米国仮出願第６１／７２８，３６８号（これらの両方は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、Ｔ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路の阻害剤、ならびにｐ３８関連疾患、例えば炎症性がんを含む自己免疫性障害および炎症性障害の処置のためのその使用に関する。特に、本開示は、Ｔ細胞においてｐ３８活性化を阻害することが可能なＧａｄｄ４５αポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、環境ストレス後に放出される炎症促進性サイトカイン受容体の下流のシグナル伝達中間体である。このキナーゼは、関節リウマチおよび多発性硬化症を含む炎症性疾患および自己免疫性疾患において、重要な役割を果たすことが公知である。ｐ３８ＭＡＰＫファミリーには、４種の別々にコードされたメンバー−ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γおよびｐ３８δが含まれる；ｐ３８α、ｐ３８βおよびｐ３８δは、Ｔ細胞において発現されるが、ｐ３８γは、骨格筋において主に発現される（Ｊｉｒｍａｎｏｖａら、Ｂｌｏｏｄ  １１８巻（１２号）：３２８０〜３２８９頁、２０１１年）。ｐ３８キナーゼは、遍在して発現され、スレオニン１８０およびチロシン１８２における二重リン酸化を生じる一連の逐次的リン酸化ステップによって全ての細胞において活性化される。しかし、Ｔ細胞では、その抗原受容体を介したＴ細胞の直接的刺激が、代替的ｐ３８経路の活性化を生じ、チロシン３２３上でのｐ３８αおよびｐ３８βのリン酸化をもたらす（Ｓａｌｖａｄｏｒら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６巻（４号）：３９６〜４０２頁、２００５年）。
【０００４】
残基３２３におけるチロシンからフェニルアラニンへの置換（Ｙ３２３Ｆ）を含有するｐ３８αおよびｐ３８βを発現する遺伝子改変マウスが開発されており、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路の役割をより良く理解するために特徴付けられてきた。このフェニルアラニン置換に起因して、改変形態のｐ３８αおよびｐ３８βは、残基３２３においてリン酸化されることができず、代替的ｐ３８経路の活性化を防止する。この遺伝子改変マウスは、Ｔ細胞増殖、炎症促進性サイトカイン産生における顕著な低減、ならびに多発性硬化症および関節リウマチなどの自己免疫性疾患の動物モデルに対する低減された感受性を示す。これらのマウスの研究により、Ｔ細胞における代替的ｐ３８活性化経路が、Ｔ細胞活性化ならびに自己免疫性疾患および炎症性疾患の発症において重要な役割を果たすことが確立されている（Ｊｉｒｍａｎｏｖａら、Ｂｌｏｏｄ  １１８巻（１２号）：３２８０〜３２８９頁、２０１１年）。
【０００５】
Ｇａｄｄ４５（増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ））は、細胞増殖調節、分化およびアポトーシスにおいて役割を果たすタンパク質のファミリーである。哺乳動物細胞では、３種の異なるＧａｄｄ４５ファミリーメンバーが同定されている−Ｇａｄｄ４５α、Ｇａｄｄ４５βおよびＧａｄｄ４５γ。Ｇａｄｄ４５α欠損マウスを使用して、以前の研究では、Ｇａｄｄ４５αが代替的ｐ３８活性化経路を阻害すること、およびＧａｄｄ４５αの非存在がＴ細胞過剰増殖および自己免疫を生じることが示されている（Ｓａｌｖａｄｏｒら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６巻（４号）：３９６〜４０２頁、２００５年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｉｒｍａｎｏｖａら、Ｂｌｏｏｄ（２０１１年）１１８巻（１２号）：３２８０〜３２８９頁
【非特許文献２】Ｓａｌｖａｄｏｒら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５年）６巻（４号）：３９６〜４０２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｔ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路を阻害することが可能な増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ（Ｇａｄｄ４５α）ポリペプチドが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、このＧａｄｄ４５αポリペプチドは、２５アミノ酸長以下または２０アミノ酸長以下であり、ヒトまたはマウスのＧａｄｄ４５αの残基７１〜８５を含む。一部の場合、これらのＧａｄｄ４５αポリペプチドは、合成または組換えポリペプチド（即ち、天然に存在しないポリペプチド）である。Ｇａｄｄ４５αポリペプチドおよび細胞透過性ペプチドなどの異種ペプチドを含む融合タンパク質もまた提供される。本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチドおよび融合タンパク質を含む組成物がさらに提供される。
【０００８】
Ｔ細胞を、本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させることによって、Ｔ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害するための方法もまた、提供される。Ｔ細胞を、本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させることによって、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害する方法が、さらに提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞が被験体から単離されている、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。他の実施形態では、この方法は、ポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与するステップを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏの方法である。
【０００９】
Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を処置する方法もまた、本開示によって提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を選択するステップ、ならびに治療有効量の本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与するステップを含む。
【００１０】
被験体において腫瘍血管新生を阻害する方法が、本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、この方法は、膵臓腫瘍などの腫瘍を有する被験体を選択するステップ、および治療有効量の本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物をこの被験体に投与するステップを含む。
【００１１】
被験体から取得された腫瘍試料中のチロシン３２３においてリン酸化されたｐ３８（ｐ３８  ｐＹ３２３）について陽性の腫瘍浸潤性Ｔ細胞の百分率を計算し；Ｔ細胞の少なくとも１０％がｐ３８  ｐＹ３２３について陽性の場合にこの被験体が予後不良を有することを決定することによって、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有すると診断された被験体の予後を決定する方法もまた、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この予後不良は、生存時間における減少である。
【００１２】
本開示の上記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、（１１Ｒ）−７１−８５および（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌの細胞取り込みを示すグラフである。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃で２時間、ＦＩＴＣ結合体化（１１Ｒ）−７１−８５もしくは（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで処理したか、または未処理のままにした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ陽性についてフローサイトメトリーによって分析した。
【図２】図２は、（１１Ｒ）−７１−８５によるｐ３８代替的経路活性化の阻害を示す図である。精製されたｐ３８タンパク質を、キナーゼ緩衝液中で活性Ｚａｐ７０と共に１時間インキュベートすることによって活性化した。次いで、（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌを添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、１μｇのＡＴＦ２および１０μＣｉの［３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、３０℃で４５分間インキュベートした。リン酸化産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンに移し、ホスフォイメージャーによって可視化した。
【図３】図３は、（１１Ｒ）−７１−８５に応答したＴ細胞増殖を示すグラフである。Ｔ細胞を脾臓から精製し、異なる濃度の（１１Ｒ）−７１−８５または対照ペプチド（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌで処理した。次いで、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で２日間刺激し、最後に１μＣｉ［３Ｈ］−チミジンでパルスして、１４時間後に回収した。［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｗａｌｌａｃ  １４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて決定した。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、ＣＤ４＋（図４Ａ）およびＣＤ８＋（図４Ｂ）Ｔ細胞による炎症性サイトカイン分泌を示す一連のフローサイトメトリープロットである。Ｔ細胞を脾臓から精製し、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。次いで、細胞を一晩未刺激にし、示された濃度の（１１Ｒ）−７１−８５、対照ペプチド（１１Ｒ）−ＣｔｒｌまたはＤＭＳＯ（ペプチドなし）で処理した。処理後、細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８、またはモネンシンを補充したＰＭＡ＋イオノマイシンのいずれかで再刺激した。サイトカイン発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、ＣＤ４＋（図４Ａ）およびＣＤ８＋（図４Ｂ）Ｔ細胞による炎症性サイトカイン分泌を示す一連のフローサイトメトリープロットである。Ｔ細胞を脾臓から精製し、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。次いで、細胞を一晩未刺激にし、示された濃度の（１１Ｒ）−７１−８５、対照ペプチド（１１Ｒ）−ＣｔｒｌまたはＤＭＳＯ（ペプチドなし）で処理した。処理後、細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８、またはモネンシンを補充したＰＭＡ＋イオノマイシンのいずれかで再刺激した。サイトカイン発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、（１１Ｒ）−７１−８５がＴｈ１分化を阻害することを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで２時間処理し、洗浄後、細胞を、Ｔｈ０条件（中立、図５Ａおよび図５Ｃ）またはＴｈ１極性化条件（図５Ｂおよび図５Ｄ）下で抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。細胞を、再度同じ濃度の培地（第１の列）、（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ（第２の列）または（１１Ｒ）−７１−８５（第３の列）のいずれかで２時間処理し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激した。Ｔ  ｂｅｔおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（炎症促進性応答に典型的なＴｈ１細胞の指標）の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ処理した細胞は、培地で処理した細胞と同様に応答したが、Ｔ−ｂｅｔおよびＩＦＮγの誘導は、（１１Ｒ）−７１−８５による処理によって鈍化された。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、（１１Ｒ）−７１−８５がＴｈ１分化を阻害することを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで２時間処理し、洗浄後、細胞を、Ｔｈ０条件（中立、図５Ａおよび図５Ｃ）またはＴｈ１極性化条件（図５Ｂおよび図５Ｄ）下で抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。細胞を、再度同じ濃度の培地（第１の列）、（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ（第２の列）または（１１Ｒ）−７１−８５（第３の列）のいずれかで２時間処理し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激した。Ｔ  ｂｅｔおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（炎症促進性応答に典型的なＴｈ１細胞の指標）の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ処理した細胞は、培地で処理した細胞と同様に応答したが、Ｔ−ｂｅｔおよびＩＦＮγの誘導は、（１１Ｒ）−７１−８５による処理によって鈍化された。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、（１１Ｒ）−７１−８５がＴｈ１分化を阻害することを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで２時間処理し、洗浄後、細胞を、Ｔｈ０条件（中立、図５Ａおよび図５Ｃ）またはＴｈ１極性化条件（図５Ｂおよび図５Ｄ）下で抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。細胞を、再度同じ濃度の培地（第１の列）、（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ（第２の列）または（１１Ｒ）−７１−８５（第３の列）のいずれかで２時間処理し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激した。Ｔ  ｂｅｔおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（炎症促進性応答に典型的なＴｈ１細胞の指標）の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ処理した細胞は、培地で処理した細胞と同様に応答したが、Ｔ−ｂｅｔおよびＩＦＮγの誘導は、（１１Ｒ）−７１−８５による処理によって鈍化された。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、（１１Ｒ）−７１−８５がＴｈ１分化を阻害することを示す一連のフローサイトメトリープロットである。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで２時間処理し、洗浄後、細胞を、Ｔｈ０条件（中立、図５Ａおよび図５Ｃ）またはＴｈ１極性化条件（図５Ｂおよび図５Ｄ）下で抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。細胞を、再度同じ濃度の培地（第１の列）、（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ（第２の列）または（１１Ｒ）−７１−８５（第３の列）のいずれかで２時間処理し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激した。Ｔ  ｂｅｔおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（炎症促進性応答に典型的なＴｈ１細胞の指標）の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ処理した細胞は、培地で処理した細胞と同様に応答したが、Ｔ−ｂｅｔおよびＩＦＮγの誘導は、（１１Ｒ）−７１−８５による処理によって鈍化された。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、全長Ｇａｄｄ４５αによるＴｈ１７分化の阻害を示す図である。（図６Ａ）ＷＴマウスから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、４μＭのＴＡＴ−Ｃｔｒｌ、ＴＡＴ−Ｇ４５ＦＬまたはＴＡＴ−Ｇ４５Δ１０のいずれかで処理し、プレート被覆した抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、示された転写因子についてブロットした。（図６Ｂ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｈｉ）細胞を、ＷＴマウスから精製し、（Ａ）と同様にＴＡＴ−ＣｔｒｌまたはＴＡＴ−Ｇ４５ＦＬのいずれかで処理し、中立条件（Ｔｈ０）またはＴｈ１７傾斜条件（１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６＋５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β）下で４８時間刺激した。ＲｏｒｃおよびＩｌ１７ａのｍＲＮＡ発現レベルを評価した。≦０．０５のＰ値を、統計的に有意な差異とみなし、アスタリスク（＊）を付した。
【図７】図７は、（１１Ｒ）−７１−８５によるｉｎ  ｖｉｖｏ処理後のインターフェロン調節因子４（Ｉｒｆ４）ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。（１１Ｒ）−７１−８５（４０μｇ）またはビヒクル対照を、野生型マウス中に腹腔内注射した。注射の４時間後、脾細胞を収集し、可溶性抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で２４時間刺激した。Ｉｒｆ４  ｍＲＮＡ発現を、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。
【図８】図８は、（１１Ｒ）−７１−８５の注射後のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＮｆａｔｃ１およびＩｒｆ４の発現における低減を示す一連のグラフである。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇのＤＭＳＯ、（１１Ｒ）−スクランブルまたは（１１Ｒ）−７１−８５をｉ．ｖ．注射し、総Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかを、異なる時点において脾臓から精製した。精製された細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間刺激し、示された転写因子のｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲによって決定した。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、（１１Ｒ）−７１−８５の注射が、樹立されたＰＡＮＣ０２腫瘍の増殖を停止させることを示す図である。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射した。１６日後、マウスに、示された量の（１１Ｒ）−７１−８５またはＤＭＳＯの腫瘍内注射を、１日おきに受けさせた。（図９Ａ）対照マウスおよび４０μｇまたは８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５を注射したマウスにおける、注射開始時（１６日目）から４２日目までの腫瘍体積。４２日目前のマウスの犠牲（ｓａｃ．）が示される。３８日目の対照（左）腫瘍および処置（右）腫瘍の（図９Ｂ）重量および（図９Ｃ）外観。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、（１１Ｒ）−７１−８５の腫瘍内注射が腫瘍浸潤性Ｔ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α分泌を阻害することを実証する一連のフローサイトメトリープロットである。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射した。１６日後、マウスに、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブル（Ｓｃｒ）のいずれかを、１週間にわたり１日おきに注射した。最後の腫瘍内注射の２４時間後、腫瘍浸潤性細胞を回収し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したか、または未刺激のままにした。サイトカイン（ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦα−図１０Ａ；ＩＬ−１０およびＩＦＮγ−図１０Ｂ）の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、（１１Ｒ）−７１−８５の腫瘍内注射が腫瘍浸潤性Ｔ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α分泌を阻害することを実証する一連のフローサイトメトリープロットである。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射した。１６日後、マウスに、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブル（Ｓｃｒ）のいずれかを、１週間にわたり１日おきに注射した。最後の腫瘍内注射の２４時間後、腫瘍浸潤性細胞を回収し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したか、または未刺激のままにした。サイトカイン（ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦα−図１０Ａ；ＩＬ−１０およびＩＦＮγ−図１０Ｂ）の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。
【図１１】図１１は、（１１Ｒ）−７１−８５の腫瘍内注射が腫瘍血管新生を低減させることを示す一対の画像である。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射し、１６日後に、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブルのいずれかを注射した。マウスに、２．５週間にわたり１日おきに腫瘍内注射を受けさせた。最後の注射の２４時間後、腫瘍を収集し、ホルマリン中で固定し、腫瘍血管新生の指標である内皮マーカーＣＤ３１について染色した。
【図１２】図１２は、（１１Ｒ）−７１−８５の腹腔内注射が、ＫＰＣマウス由来の腫瘍浸潤性Ｔ細胞からのＴＮＦ−α分泌を阻害することを示すフローサイトメトリープロットのパネルである。ＫＰＣマウスは、オンコジーン発現およびｐ５３ハプロ不全に起因して膵臓がんを発症するように遺伝子操作されている。ＫＰＣマウスに、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブルのいずれかの腹腔内注射を、１カ月間にわたり１日おきに受けさせた。最後の注射の２４時間後、腫瘍浸潤性細胞を回収し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したか、または未刺激のままにした。細胞内ＴＮＦ−αの発現を、フローサイトメトリーによって決定した。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、（１１Ｒ）−７１−８５がＫＰＣマウスにおいてＰａｎＩＮおよびがん形成を阻害することを示すグラフである。（図１３Ａ）ＫＰＣマウスを、６週齢の時点で致死未満で照射し、１０×１０６の造血性骨髄細胞を詰め、生存をモニタリングした（１群当たりｎ＝５；＊ｐ＜０．０５、ログランク検定）。（図１３Ｂ）（Ａ）と同様に処置したＫＰＣマウスの正常管およびＰａｎＩＮの定量（１群当たりｎ＝６）。（図１３Ｃ）膵臓中の浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞を、（１１Ｒ）７１−８５または（１１Ｒ）Ｓｃｒによる処置の後に、フローサイトメトリーによってＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現について分析した。棒グラフは、示されたサイトカイン分泌細胞の平均百分率を示す（１群当たりｎ＝８；＊ｐ＜０．０５、ＮＳ＝有意でない、対応なし両側スチューデントｔ検定）。（図１３Ｄ）ＫＰＣマウスを、（Ａ）と同様に処置し、異なる腫瘍促進因子の発現を、定量的リアルタイムＰＣＲによって、単離された膵臓上皮細胞において分析した（１群当たりｎ＝６）。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｄは、（１１Ｒ）−７１−８５がＫＰＣマウスにおいてＰａｎＩＮおよびがん形成を阻害することを示すグラフである。（図１３Ａ）ＫＰＣマウスを、６週齢の時点で致死未満で照射し、１０×１０６の造血性骨髄細胞を詰め、生存をモニタリングした（１群当たりｎ＝５；＊ｐ＜０．０５、ログランク検定）。（図１３Ｂ）（Ａ）と同様に処置したＫＰＣマウスの正常管およびＰａｎＩＮの定量（１群当たりｎ＝６）。（図１３Ｃ）膵臓中の浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞を、（１１Ｒ）７１−８５または（１１Ｒ）Ｓｃｒによる処置の後に、フローサイトメトリーによってＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現について分析した。棒グラフは、示されたサイトカイン分泌細胞の平均百分率を示す（１群当たりｎ＝８；＊ｐ＜０．０５、ＮＳ＝有意でない、対応なし両側スチューデントｔ検定）。（図１３Ｄ）ＫＰＣマウスを、（Ａ）と同様に処置し、異なる腫瘍促進因子の発現を、定量的リアルタイムＰＣＲによって、単離された膵臓上皮細胞において分析した（１群当たりｎ＝６）。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｔ細胞中のより高いｐ３８の代替的発現が、ヒトＰＤＡＣにおけるより短い生存および腫瘍新血管形成と関連することを示すグラフである。（図１４Ａ）ヒト膵臓中の、代替的経路によって活性化されたより低い（０〜１０％、ｎ＝１５３）対より高い（≧１０％、ｎ＝４０）レベルの腫瘍浸潤性Ｔ細胞との、患者の生存の相関（ログランク検定）。（図１４Ｂ）ヒトＰＤＡＣ切片を、ＣＤ３について染色し、高倍率視野当たりのＣＤ３＋細胞の絶対数を、ｐ３８で代替的に活性化されたより低い（０〜１０％、ｎ＝１５３）およびより高い（≧１０％、ｎ＝４０）レベルの腫瘍浸潤性Ｔ細胞の全ての試料において分析した（ＮＳ＝有意でない、対応なし両側スチューデントｔ検定）。（図１４Ｃ）ｐ３８代替的経路のより低い（０〜１０％、ｎ＝１０）対より高い（≧１０％、ｎ＝１０）活性化を有する患者の試料の血管密度の検出のための、抗ＣＤ３１抗体による免疫組織化学（＊ｐ＜０．０５、対応なし両側スチューデントｔ検定）。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｔ細胞中のより高いｐ３８の代替的発現が、ヒトＰＤＡＣにおけるより短い生存および腫瘍新血管形成と関連することを示すグラフである。（図１４Ａ）ヒト膵臓中の、代替的経路によって活性化されたより低い（０〜１０％、ｎ＝１５３）対より高い（≧１０％、ｎ＝４０）レベルの腫瘍浸潤性Ｔ細胞との、患者の生存の相関（ログランク検定）。（図１４Ｂ）ヒトＰＤＡＣ切片を、ＣＤ３について染色し、高倍率視野当たりのＣＤ３＋細胞の絶対数を、ｐ３８で代替的に活性化されたより低い（０〜１０％、ｎ＝１５３）およびより高い（≧１０％、ｎ＝４０）レベルの腫瘍浸潤性Ｔ細胞の全ての試料において分析した（ＮＳ＝有意でない、対応なし両側スチューデントｔ検定）。（図１４Ｃ）ｐ３８代替的経路のより低い（０〜１０％、ｎ＝１０）対より高い（≧１０％、ｎ＝１０）活性化を有する患者の試料の血管密度の検出のための、抗ＣＤ３１抗体による免疫組織化学（＊ｐ＜０．０５、対応なし両側スチューデントｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列表
添付の配列表に列挙されたアミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２条に規定されるように、アミノ酸のための標準的な３文字コードを使用して示される。配列表は、本明細書で参照によって組み込まれる、２０１３年１０月２９日に作成された２．６１ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。添付の配列表において：
配列番号１は、Ｇａｄｄ４５αの残基７１〜８５に対応するＧａｄｄ４５αポリペプチドのアミノ酸コンセンサス配列である。
【００１５】
配列番号２は、ヒトＧａｄｄ４５αの残基７１〜８５のアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号３は、マウスＧａｄｄ４５αの残基７１〜８５のアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号４は、ヒトＧａｄｄ４５αタンパク質のアイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９１５）のアミノ酸配列である。
【００１８】
詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＴＦ２          活性化転写因子２
ＣＩＡ            コラーゲン誘導性関節炎
ＣＰＰ            細胞透過性ペプチド
ＥＡＥ            実験的自己免疫性脳脊髄炎
Ｇａｄｄ４５α    増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ
ＩＦＮ            インターフェロン
ＩＬ              インターロイキン
ＩＲＦ            インターフェロン調節因子
ｉ．ｖ．          静脈内
ＬＴ              リンホトキシン
ＭＡＰＫ          マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
ＭＳ              多発性硬化症
ＮＦＡＴｃ１      活性化Ｔ細胞の核因子、細胞質、カルシニューリン依存性１（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  １）
ＰａｎＩＮ        膵臓上皮内新生物前駆病変
ＰＤＡＣ          膵管腺癌
ＲＡ              関節リウマチ
ＴＣＲ            Ｔ細胞受容体
ＴＧＦ            トランスフォーミング増殖因子
Ｔｈ              Ｔヘルパー
ＴＩＬ            腫瘍浸潤性リンパ球
ＴＮＦ            腫瘍壊死因子  。
【００１９】
ＩＩ．用語および方法
特記しない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ刊、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．刊、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．刊、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）において見出すことができる。
【００２０】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される：
投与する：本明細書で使用する場合、被験体に組成物（例えば、ポリペプチド）を投与するとは、組成物を被験体に与える、組成物を被験体に適用する、または組成物を被験体と接触させることを意味する。投与は、例えば、静脈内、髄腔内、外用、経口、皮下、筋内、腹腔内、筋内、または組織中、例えば腫瘍中への直接的注射などのいくつかの経路のいずれかによって達成され得る。
【００２１】
自己免疫性疾患：身体中に通常存在する物質または組織に対して標的化された不適切な免疫応答から生じる疾患の型。自己免疫性疾患には、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病（炎症性腸疾患）、１型糖尿病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスおよび潰瘍性大腸炎が含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
臨床転帰：疾患もしくは障害（例えば膵臓がん）に対する処置後または処置の非存在下での患者の健康状態を指す。臨床転帰には、がんの発生率における減少、死亡までの時間の長さにおける増加、死亡までの時間の長さにおける減少、生存機会における増加、死亡のリスクにおける増加、生存、無病生存期間、慢性疾患、転移、進行疾患または攻撃的疾患、疾患再発、死亡、および治療に対する好ましいまたは不十分な応答が含まれるがこれらに限定されない。
【００２３】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）：共有結合または非共有結合相互作用によって連結された別のタンパク質または分子カーゴの細胞取り込みを促進するペプチド。ＣＰＰは一般に、エンドサイトーシスによって細胞中にカーゴを送達する。多くの場合、ＣＰＰは、荷電アミノ酸、例えばリシンもしくはアルギニンに富んだアミノ酸組成を有するか、または極性／荷電アミノ酸および非極性／疎水性アミノ酸の交互のパターンを含有する配列を有する。
【００２４】
コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデル：関節リウマチの最も一般に使用される自己免疫モデル。このモデルは、疾患病因を研究するためおよび治療剤を検証するために使用され得る。自己免疫性関節炎は、フロイント完全アジュバントおよびＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）のエマルジョンによる免疫化によって、このモデルにおいて誘導される。ＣＩＩの取り扱いおよび調製のためのプロトコール、ならびにマウス系統、適切な免疫化技術の選択、ならびに関節炎の発生率および重症度の評価は、当該分野で公知である（例えば、Ｂｒａｎｄら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２巻（５号）：１２６９〜１２７５頁、２００７年を参照のこと）。典型的には、関節炎の最初の徴候は、免疫化の２１〜２８日後に、このモデルにおいて出現する。ＣＩＡの主な病理学的特徴には、多形核細胞および単核細胞の浸潤を伴う増殖性滑膜炎、パンヌス形成、軟骨分解、骨のびらん、ならびに線維症が含まれる。ヒトにおける関節リウマチと同様、炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βは、ＣＩＡを有するマウスの関節炎関節において豊富に発現され、これらの分子の遮断は、疾患重症度の低減を生じる。
【００２５】
接触させる：直接的な物理的会合状態に置かれること；固体形態および液体形態での両方を含む。
【００２６】
生存における減少：本明細書で使用する場合、「生存における減少」とは、患者の死亡の前の時間の長さにおける減少、または患者にとっての死亡のリスクにおける増加を指す。生存における減少とは、膵臓がんと診断された患者の群などの群における、死亡までの平均時間における減少もまた指し得る。
【００２７】
分化：ある細胞が特定の型の細胞へと発生するプロセスを指す。例えば、Ｔ細胞は、特定のＴ細胞サブタイプ、例えばＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔ調節細胞または細胞傷害性Ｔ細胞へと発生し得る。特定のＴヘルパーサブタイプへのＴ細胞の分化は、サイトカイン環境によって影響される（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ１分化を促進する；ＩＬ−４は、Ｔｈ２分化を促進する；ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３は、Ｔｈ１７分化を促進する）。
【００２８】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）：ＭＳの動物モデル（例えば、Ｇｏｌｄら、Ｂｒａｉｎ  １２９巻：１９５３〜１９７１頁、２００６年を参照のこと）。ＥＡＥ動物は、中枢神経系中に散在する組織傷害の特徴的なプラークを示す。プラークは、脳および脊髄中の神経細胞軸索を取り囲むミエリン鞘の破壊を引き起こす、リンパ球、形質細胞およびマクロファージによる神経組織の浸潤を示す。一部の場合には、ＥＡＥは、ミエリンまたはミエリンの種々の構成要素のいずれかによる、マウス、ラット、モルモットまたは非ヒト霊長類などの感受性動物の免疫化によって誘導される。例えば、ＥＡＥは、ミエリン鞘の構成要素、例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）による免疫化によって誘導され得る。ＥＡＥは、自己免疫性ＣＮＳ組織傷害の機構を研究するため、およびＭＳのための潜在的治療を試験するための、有用かつ広く受容されたモデルである。ＥＡＥには、ドナー動物と同じ様式で誘導される「受動的ＥＡＥ」もまた含まれるが、ドナー動物のリンパ節から回収された活性化Ｔ細胞の、ナイーブレシピエント動物への移入を伴う。
【００２９】
融合タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチド由来のアミノ酸配列を含有するタンパク質。本明細書中の一部の例では、この融合タンパク質は、Ｇａｄｄ４５αの一部分および細胞透過性ペプチドを含む。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸配列から作出された核酸配列の発現によって、生成され得る。融合タンパク質を創出するために、これらの核酸配列は、同じリーディングフレーム中に存在すべきであり、内部終止コドンを含有するべきではない。融合タンパク質、特に短い融合タンパク質は、化学合成によっても生成され得る。
【００３０】
増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ（Ｇａｄｄ４５α）：その転写物レベルがストレスの多い増殖条件およびＤＮＡ損傷剤による処理の後に増加する、一群の遺伝子のメンバー。Ｇａｄｄ４５αタンパク質は、ＭＴＫ１／ＭＥＫＫ４キナーゼを介してｐ３８／ＪＮＫ経路の活性化を媒介することによって、環境ストレスに応答する。Ｇａｄｄ４５αは、Ｔ細胞において代替的ｐ３８活性化経路を阻害することが以前に示されており、Ｇａｄｄ４５αの非存在は、Ｔ細胞過剰増殖および自己免疫を生じる（Ｓａｌｖａｄｏｒら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６巻（４号）：３９６〜４０２頁、２００５年）。Ｇａｄｄ４５αのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースなどにおいて、（例えば、ヒトＧａｄｄ４５αについてＧｅｎｅ  ＩＤ  １６４７の下で）公に入手可能である。ヒトＧａｄｄ４５αについての例示的な配列は、配列番号４として本明細書に示される。
【００３１】
異種：異種タンパク質または異種ポリペプチドとは、異なる供給源または種由来のタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００３２】
炎症性疾患または炎症性障害：炎症（即ち、感染、傷害、組織損傷、刺激作用などから生じる発赤、熱、腫脹および／または疼痛）の存在を特徴とする、任意の疾患、障害または状態。炎症性疾患の例には、自己免疫性疾患（例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチおよびセリアック病）、喘息、血管炎、慢性前立腺炎、骨盤腹膜炎、がん、アテローム動脈硬化症、虚血性心臓疾患、再灌流傷害、移植片拒絶、サルコイドーシス、アレルギー性過敏症および糸球体腎炎が含まれるがこれらに限定されない。
【００３３】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路：増殖、生存および遊走などの細胞プロセスを調節する細胞シグナル伝達経路。哺乳動物は、特異的ＭＡＰＫＫ：ＥＲＫ１／２についてはＭＥＫ１／２、ｐ３８についてはＭＫＫ３／６、ＪＮＫについてはＭＫＫ４／７（ＪＮＫＫ１／２）、およびＥＲＫ５についてはＭＥＫ５、によって活性化される、少なくとも４つの別個に調節されるＭＡＰＫの群、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）−１／２、Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ１／２／３）、ｐ３８タンパク質（ｐ３８アルファ／ベータ／ガンマ／デルタ）およびＥＲＫ５を発現する。各ＭＡＰＫＫは、１種より多いＭＡＰＫＫＫによって活性化され得、これが、ＭＡＰＫシグナル伝達の複雑性および多様性を増加させる。各ＭＡＰＫ経路は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＭＥＫＫまたはＭＫＫＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰ２Ｋ、ＭＥＫまたはＭＫＫ）およびＭＡＰＫを含む３段階のキナーゼカスケードを含有する。この３段階モジュールは、刺激に対する超高感度スイッチ様応答を媒介する。
【００３４】
ＭＡＰＫファミリー：マイトジェン、浸透圧ストレス、熱ショックおよび炎症促進性サイトカインを含む刺激の多様なアレイに対する細胞応答の指向に関与するセリン／スレオニンプロテインキナーゼのファミリー。ＭＡＰＫは、例えば、増殖、遺伝子発現、分化、有糸分裂、細胞生存およびアポトーシスを調節する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫファミリーのメンバーには、ＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２）、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）、ＭＡＰＫ４（ＥＲＫ４）、ＭＡＰＫ６（ＥＲＫ３）、ＭＡＰＫ７（ＥＲＫ５）、ＭＡＰＫ８（ＪＮＫ１）、ＭＡＰＫ９（ＪＮＫ２）、ＭＡＰＫ１０（ＪＮＫ３）、ＭＡＰＫ１１（ｐ３８−β）、ＭＡＰＫ１２（ｐ３８−γ）、ＭＡＰＫ１３（ｐ３８−δ）およびＭＡＰＫ１４（ｐ３８−α）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
転移：がん細胞が、元の腫瘍から身体中の他の部位へ広がることを指す。
【００３６】
多発性硬化症：患者の８０〜８５％において再発寛解型疾病として存在する、時間および空間において散在性の中枢神経系白質障害として古典的に記載される自己免疫性疾患。診断は、脳および脊髄の磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、体性感覚誘発電位の分析、ならびに増加した量の免疫グロブリンまたはオリゴクローナルバンドを検出するための脳脊髄液の分析によって行われ得る。ＭＲＩは、特に高感度の診断ツールである。ＭＳの存在または進行を示すＭＲＩ異常には、Ｔ２強調およびフレアー画像上の高強度白質シグナル、活性病変のガドリニウム増強、低強度「ブラックホール」（グリオーシスおよび軸索病態を示す）、ならびにＴ１強調研究での脳萎縮症が含まれる。連続的ＭＲＩ研究が、疾患の進行を示すために使用され得る。再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）は、発作間に完全回復または部分的回復を有し、疾患進行を有さない、明確に規定された急性発作を特徴とする、ＭＳの臨床経過である。二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）は、最初は再発寛解型であり、次いで、変動する速度で進行型になり、おそらくは時折の再発および軽微な寛解を有する、ＭＳの臨床経過である。一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）は、最初は進行型形態で存在する。
【００３７】
新生物、悪性疾患、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂から生じる組織または細胞の異常な増殖である。新生物性増殖は、腫瘍を生じ得る。個体中の腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周辺組織に浸潤しおよび／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。
【００３８】
ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ：細胞ストレス、例えば、炎症性サイトカイン、紫外線照射、リポポリサッカリド、熱ショック、浸透圧ショックおよび増殖因子に対して応答性のＭＡＰＫのクラス。ｐ３８タンパク質は、細胞分化、アポトーシスおよびオートファジーを含むいくつかの細胞プロセスに関与する。４種のｐ３８  ＭＡＰＫ、ｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８−β（ＭＡＰＫ１１）、ｐ３８−γ（ＭＡＰＫ１２）およびｐ３８−δ（ＭＡＰＫ１３）が同定されており；これらのうち、ｐ３８α、ｐ３８βおよびｐ３８δは、Ｔ細胞において発現される。本明細書で使用する場合、「ｐ３８」とは、これらのｐ３８タンパク質（ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γおよびｐ３８δ）のうちいずれかを指す。特定の実施形態では、「ｐ３８」とは、ｐ３８α、ｐ３８βおよびｐ３８δを含む、Ｔ細胞において発現される任意のｐ３８タンパク質を指す。
【００３９】
膵臓がん：悪性（がん）細胞が膵臓の組織において見出される疾患。外分泌がんとも呼ばれる。
【００４０】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）：最も一般的な型の膵臓悪性疾患。ＰＤＡＣは、米国におけるがん死亡の第４位の原因であり、６カ月未満の平均生存期間を有する。この型のがんは、リンパ系および遠隔臓器への迅速な散在が可能である。ＰＤＡＣは、腫瘍がその周りに構築する生物学的障壁に起因して、他のがんから識別される。その疾患が初期段階において捕捉された患者は、長期生存のより良い機会を有するが、膵臓は、発癌性プロセスが開始したことをシグナル伝達するために、公知の手がかりをほとんど排出しない。従って、現在、初期検出試験は存在しない。
【００４１】
薬学的に許容される担体：本明細書に開示される方法において有用な薬学的に許容される担体は、従来の担体である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）は、ポリペプチドの薬学的送達に適した組成物および製剤を記載している。
【００４２】
一般に、担体の性質は、利用されている投与の特定の様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤形態）のために、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中立の担体に加えて、投与される医薬組成物は、非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤、塩、アミノ酸およびｐＨ緩衝剤など、例えば、塩化ナトリウムもしくはリン酸ナトリウムまたは塩化カリウムもしくはリン酸カリウム、Ｔｗｅｅｎ、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
【００４３】
ポリアルギニンまたはポリリシン：それぞれ、複数のアルギニン残基またはリシン残基のポリマー。本開示の文脈において、「ポリアルギニン」または「ポリリシン」は、それぞれ、約４〜約２０個のアルギニン残基またはリシン残基、例えば約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアルギニン残基またはリシン残基から構成されるペプチドを含む。本明細書の特定の実施形態では、ポリアルギニンペプチドは、６〜１２個のアルギニン残基を含み、またはポリリシンペプチドは、６〜１２個のリシン残基を含む。１つの非限定的な例では、ポリアルギニンペプチドは、１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基からなる。
【００４４】
ポリペプチド：モノマーがアミド結合によって一緒に接合されたアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得る。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、任意のアミノ酸配列を包含するよう意図され、糖タンパク質などの改変配列を含む。用語「ポリペプチド」は、具体的には、天然に存在するタンパク質、ならびに組換えによりまたは合成により産生されるタンパク質を網羅するよう意図される。用語「残基」または「アミノ酸残基」には、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド中に組み込まれたアミノ酸に対する参照が含まれる。
【００４５】
ポリペプチド中の保存的置換は、類似した生化学的特性を有する異なるアミノ酸残基について、タンパク質配列中の１つのアミノ酸残基の置換である。典型的には、保存的置換は、得られたポリペプチドの活性に対して、ほとんど〜全く影響を有さない。例えば、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１、２、３、４または５個以下の置換）を含むタンパク質またはペプチドは、野生型のタンパク質またはペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチドは、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどの標準的手順を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように生成され得る。一例では、かかるバリアントは、抗体の交差反応性または免疫応答を誘導するその能力を試験することによって、容易に選択され得る。保存的置換の例を以下に示す。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
保存的置換は、一般に、（ａ）置換のエリア中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはヘリックスのコンフォメーションとして、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持する。
【００４８】
タンパク質特性における最大の変化、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルの代わりに使用される（または、これらの疎水性残基によって置換される）変化；（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基の代わりに使用される（または、任意の他の残基によって置換される）変化；（ｃ）電気的陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルもしくはヒスタジル（ｈｉｓｔａｄｙｌ）が、電気的陰性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルの代わりに使用される（または、これらの電気的陰性残基によって置換される）変化；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、例えばグリシンの代わりに使用される（または、側鎖を有さない残基によって置換される）変化を生じると一般に予測される置換は、非保存的である。
【００４９】
疾患を予防、処置または改善する：疾患を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患または病理学的状態の徴候または症状を、それが発症し始めた後に改善する治療的介入を指す。「改善する」とは、疾患、例えばＴ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の疾患または障害の徴候または症状の数または重症度における低減を指す。
【００５０】
予後：特定の疾患または障害、例えば膵臓がんに罹患した被験体についての臨床転帰の見込み。がんに関して、予後は、被験体が生存する（例えば、１年間、２年間、３年間、４年間または５年間）および／もしくは抗がん処置に応答する見込み（確率）、ならびに／または腫瘍が転移する見込み（確率）の表示である。一部の実施形態では、「予後不良」は、被験体が、特定の時点（例えば、１年間、２年間、３年間、４年間または５年間）までは生存しない可能性が５０％よりも高いこと、および／または腫瘍が転移する可能性が５０％よりも高いことを示す。いくつかの例では、予後不良は、被験体が生存しない可能性が６０％、７０％、８０％もしくは９０％よりも高いこと、および／または腫瘍が転移する可能性が６０％、７０％、８０％もしくは９０％よりも高いことを示す。逆に、「予後良好」は、被験体が、特定の時点（例えば、１年間、２年間、３年間、４年間または５年間）まで生存する可能性が５０％よりも高いこと、および／または腫瘍が転移しない可能性が５０％よりも高いことを示す。いくつかの例では、予後良好は、被験体が生存する可能性が６０％、７０％、８０％もしくは９０％よりも高いこと、および／または腫瘍が転移しない可能性が６０％、７０％、８０％もしくは９０％よりも高いことを示す。
【００５１】
精製された：用語「精製された」は、絶対的純度を必要としない；むしろ、この用語は、相対的用語として意図される。従って、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、そのペプチドまたはタンパク質が細胞内のその天然の環境にあるときよりも富化されている調製物である。一実施形態では、調製物は、タンパク質またはペプチドが、調製物の総ペプチド含量または総タンパク質含量の少なくとも５０％を表すように、精製される。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞構成要素からの精製を示す。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％純粋である。従って、１つの特定の非限定的な例では、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞構成要素が９０％存在しない。
【００５２】
組換え：組換え核酸またはタンパク質は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の他の方法で分離された２つのセグメントの人工的組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的組合せは、化学的合成によって、または例えば遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、達成される場合が多い。用語組換えは、天然の核酸分子またはタンパク質の一部分の付加、置換または欠失によってもっぱら変更された核酸およびタンパク質を含む。
【００５３】
関節リウマチ：関節の慢性炎症を特徴とする全身性自己免疫性障害。この疾患は、肺、心臓および眼などの身体の他のエリアにおける組織の炎症もまた含み得る。
【００５４】
試料（または生物学的試料）：被験体から取得された、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはそれらの組合せを含有する生物学的検体。例としては、末梢血、尿、唾液、組織生検材料（例えば膵臓組織）、外科的検体および剖検材料が含まれるがこれらに限定されない。一例では、試料には、膵臓腫瘍の生検材料、または膵臓組織などの正常組織（既知の疾患または障害に罹患していない被験体、例えばがんなしの被験体由来）の試料が含まれる。
【００５５】
配列同一性／類似性：２つ以上の核酸配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、これらの配列間の同一性または類似性という観点で表される。配列同一性は、百分率同一性という観点で測定され得る；百分率が高くなるほど、配列はより同一になる。配列類似性は、百分率類似性という観点で測定され得る（これは、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）；百分率が高くなるほど、配列はより類似する。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアラインされる場合に、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。
【００５６】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、以下に記載されている：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻：２３７〜４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５巻：１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６巻：１０８８１〜９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２４巻：３０７〜３１頁、１９９４年。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な検討を示している。
【００５７】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと併せた使用のための、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ、Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４）を含むいくつかの供給源から、インターネット上で入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトにおいて見出すことができる。
【００５８】
ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用されるが、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定されたアウトプットファイルは、アラインされた配列との相同性の領域を示す。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定されたアウトプットファイルは、アラインされた配列を示さない。
【００５９】
被験体：ヒトまたは非ヒト動物。一実施形態では、被験体は、Ｔ細胞媒介性またはｐ３８媒介性の障害を有する。
【００６０】
合成：実験室において人工的手段によって生成されることであり、例えば、合成ポリペプチドは、実験室において化学的に合成され得る。
【００６１】
Ｔ細胞媒介性またはｐ３８媒介性の障害：Ｔ細胞および／またはＴ細胞における代替的ｐ３８活性化経路の異常なまたは病理学的活性化に関連する、任意の疾患、障害または状態。Ｔ細胞媒介性またはｐ３８媒介性の障害には、例えば、自己免疫性障害（例えば、多発性硬化症、関節リウマチおよび炎症性腸疾患であるが、これらに限定されない）および局所炎症性応答に関連する腫瘍（例えば、膵臓がん）を含む炎症性障害が含まれる。
【００６２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）：主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することを担うＴリンパ球の表面上で発現される分子。ＴＣＲは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖のいずれかからなるヘテロダイマーである。哺乳動物では、ＴＣＲは、４つのＣＤ３鎖（γ鎖、δ鎖および２つのε鎖）およびζ鎖との複合体の一部として発現される。
【００６３】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞：他の免疫細胞を活性化または指向させるが、食作用活性の固有の細胞傷害性を有さない、Ｔ細胞の型。Ｔｈ細胞は、Ｂ細胞抗体クラススイッチ、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化および増殖、ならびに食作用細胞の殺菌活性において、重要な役割を果たす。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞は、それぞれマクロファージおよびＢ細胞と主に相互作用するＴｈ細胞のサブセットである。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、リンホトキシン（ＬＴ）−αおよびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βを産生し、マクロファージの殺傷効率および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を最大化するように機能する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３およびＩＬ−２５を産生し、そしてＢ細胞増殖を刺激し、Ｂ細胞クラススイッチを誘導し、中和抗体産生を増加させることによって機能する。Ｔｈ１７細胞は、エフェクターサイトカインＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２を産生するＴヘルパー細胞の別のサブセットである。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞とは発生的に別個であるとみなされる。過剰な数のＴｈ１７細胞は、いくつかの自己免疫性疾患において役割を果たすと考えられている。ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３は、Ｔｈ１７細胞へのＴ細胞の分化と関連している。
【００６４】
治療有効量：疾患の進展を予防するのに十分な、または疾患の退縮を引き起こすのに十分な、または疾患、例えばＴ細胞媒介性もしくはｐ３８媒介性の障害（例えば、自己免疫性疾患、例えば多発性硬化症もしくは関節リウマチ、または炎症性障害、例えばがん）によって引き起こされる症状を低減させることが可能な、用量。
【００６５】
腫瘍血管新生：腫瘍における、新たな血管の形成および／または既存の血管の成長。
【００６６】
特に説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、おおよそであり、記述のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示的であるに過ぎず、限定的である意図はない。
【００６７】
ＩＩＩ．Ｇａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質および組成物
Ｔ細胞においてｐ３８に結合し代替的ｐ３８活性化経路を阻害するために必要とされる増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ（Ｇａｄｄ４５α）タンパク質の最小領域の同定が、本明細書で開示される。特に、本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチドは、チロシン３２３リン酸化ｐ３８の酵素活性を阻害し、ＴＣＲ活性化に応答した（しかし、古典的なｐ３８活性化経路を活性化する刺激に応答したのではない）Ｔ細胞増殖を阻害し、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞へのＴ細胞の傾斜を阻害し、そして炎症促進性サイトカイン産生を低減させることが可能である。さらに、開示されたＧａｄｄ４５αポリペプチドの投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路の活性化を阻害し、炎症性膵臓腫瘍の腫瘍形成および増殖を顕著に低減させる。
【００６８】
Ｔ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路を阻害することが可能なＧａｄｄ４５αポリペプチドが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドは、２５アミノ酸長以下または２０アミノ酸長以下であり、Ｇａｄｄ４５αの残基７１〜８５を含む。一部の実施形態では、このＧａｄｄ４５αは、ヒトまたはマウスのＧａｄｄ４５αである。一部の例では、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドのアミノ酸配列は、ＬＱＩＨＦＴＬＩＸＡＦＣＣＥＮ（配列番号１）を含み、式中、ＸはＱまたはＲである。特定の実施形態では、このＧａｄｄ４５αポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）もしくはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）を含むか、またはこれらからなる。一部の例では、このＧａｄｄ４５αポリペプチドは、ポリペプチド配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）中の１〜５個、例えば、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換を含有する。保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知であり、例示的な置換が本明細書に記載される（例えば、用語および方法を参照のこと）。一部の実施形態では、このＧａｄｄ４５αポリペプチドは、合成または組換え（即ち、天然に存在しない）ポリペプチドである。
【００６９】
Ｇａｄｄ４５αポリペプチドおよび異種タンパク質または異種ペプチドを含む融合タンパク質もまた、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この異種ペプチドは、融合タンパク質の細胞取り込みを促進するペプチド、例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００７０】
ＣＰＰは、受容体非依存的様式で膜を横切るタンパク質、核酸または他の化合物の伝達を促進するポリペプチドのファミリーである（ＷａｄｉａおよびＤｏｗｄｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  ４巻（２号）：９７〜１０４頁、２００３年）。典型的には、ＣＰＰは、細胞のエンドソームに連結された化合物の細胞取り込みを促進し得る短いポリカチオン性配列である。
【００７１】
タンパク質または核酸を細胞中に送達するある特定のペプチドの能力は、膜を横切り転写を開始させることが示された、ＨＩＶがコードするＴａｔタンパク質について元々記載された。次いで、このタンパク質の形質導入に必要とされるＴａｔタンパク質の部分が、Ｔａｔペプチドと称される１１アミノ酸のポリペプチドのみであることが発見された。他のタンパク質と融合した場合、このＴａｔペプチドは、組織培養物中の細胞中へ、１５〜１２０ｋＤａでサイズが変動するこれらのタンパク質を送達することが実証されている（ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、Ｃｅｌｌ  ５５巻（６号）：１１８９〜９３頁、１９８８年；ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３４巻（３号）：８４９〜５５頁、１９８８年；Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２巻（２５号）：１６０１０〜７頁、１９９７年；Ｙｏｏｎら、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２巻（４号）：３２８〜３５頁、２００４年；Ｃａｉら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ２７巻（４号）：３１１〜９頁、２００６年）。
【００７２】
他の公知のＣＰＰには、以下が含まれる：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアホメオボックス（ｈｏｍｅｂｏｘ）遺伝子の３番目のヘリックス由来の１６アミノ酸ペプチド、ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮ（商標）（米国特許第５，８８８，７６２号；Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：１０４４４〜１０４５０頁、１９９４年；Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２１巻：４５〜４８頁、２０００年）；１つのリシンを介して接続された、ニューロペプチドガラニンのＮ末端由来の１２アミノ酸および１４アミノ酸タンパク質マストパランから構成される２７アミノ酸のキメラペプチド、トランスポータン（米国特許第６，８２１，９４８号；Ｐｏｏｇａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １２巻：６７〜７７頁、１９９８年；Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻：８９〜９４頁、１９９９年）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型のＶＰ２２タンパク質由来のペプチド（Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｃｅｌｌ  ８８巻：２２３〜２３３頁、１９９７年）；ＨＳＶ−２のＵＬ−５６タンパク質（米国付与前公開第２００６／００９９６７７号）；およびＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質（米国付与前公開第２００５／０２８７６４８号）。さらに、例えばポリアルギニン、ポリリシンなどの、いくつかの人工的ペプチドもまた、ＣＰＰとして機能することが公知である（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０６１９７号；米国特許出願公開第２００６／００２４３３１号；米国特許出願公開第２００５／０２８７６４８号；および米国特許出願公開第２００３／０１２５２４２号；Ｚｈｉｂａｏら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２巻：３３９〜３４７頁、２０００年；ならびにＬａｕｓら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８巻：１２６９〜１２７２頁、２０００年を参照のこと）。
【００７３】
一部の例では、ＣＰＰは、リシンまたはアルギニンなどの荷電アミノ酸に富んでいる。他の例では、ＣＰＰは、極性／荷電アミノ酸および非極性／疎水性アミノ酸の交互のパターンを含有する。特定の非限定的な例では、ＣＰＰは、ポリアルギニン、例えば、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアルギニン残基を含む。一例では、ポリアルギニンは、１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基を含むまたは１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基からなる。他の非限定的な例では、ＣＰＰは、ポリリシン、例えば、６、７、８、９、１０、１１または１２個のリシン残基を含む。
【００７４】
他の実施形態では、この異種タンパク質またはペプチドは、タンパク質タグ、例えばアフィニティタグ（例えば、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはポリＨｉｓ）、エピトープタグ（例えば、Ｖ５、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡまたはＦＬＡＧ）または蛍光タグ（例えば、ＧＦＰまたは別の周知の蛍光タンパク質）である。
【００７５】
一実施形態では、この融合タンパク質は、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドのＮ末端と融合した１１Ｒを含む。一部の例では、この融合タンパク質は、アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）もしくはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）と融合した１１Ｒを含むか、またはこれらからなる。
【００７６】
本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチドまたはＧａｄｄ４５α融合タンパク質を含む組成物が、本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００７７】
ＩＶ．Ｇａｄｄ４５αポリペプチドの使用
ｐ３８と相互作用する最小領域（Ｇａｄｄ４５αの残基７１〜８５）を含むＧａｄｄ４５αポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路の活性化を阻害することが可能であることが、本明細書に開示される。特に、本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチドは、ＴＣＲ活性化に応答したＴ細胞増殖を阻害し、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞へのＴ細胞の傾斜を阻害し、そして炎症促進性サイトカイン産生を低減させる。開示されたＧａｄｄ４５αポリペプチドの投与は、腫瘍形成および炎症性膵臓腫瘍の増殖を顕著に低減させることもまた、本明細書で実証される。さらに、本明細書に開示されるデータは、チロシン３２３リン酸化（ｐｈｓｏｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）ｐ３８について陽性の腫瘍浸潤性Ｔ細胞の検出が、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有すると診断された患者の予後を決定するために使用され得ることを実証している。
【００７８】
Ｔ細胞の増殖を阻害する方法、例えば、ＴＣＲ刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害する方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞を、本明細書に開示されたＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させ、それによってＴ細胞の増殖を阻害するステップを含む。一部の例では、Ｔ細胞の増殖を阻害する方法は、Ｔ細胞が、被験体から単離されており、この単離されたＴ細胞を、このＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させる、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。他の例では、Ｔ細胞の増殖を阻害する方法は、このＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与するステップを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏの方法である。特定の例では、この被験体は、Ｔ細胞の異常な増殖および／または代替的ｐ３８経路の異常な活性化を示す。例えば、この被験体は、自己免疫性または炎症性の疾患または障害、例えば、多発性硬化症、関節リウマチまたはがん、例えば膵臓がん（例えば、ＰＤＡＣ）に罹患している被験体であり得る。
【００７９】
一部の例では、Ｔ細胞増殖は、対照（例えば、未処理のＴ細胞）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％阻害される。例えば、［３Ｈ］−チミジン組み込みを測定すること、またはＴ細胞特異的マーカーに基づく蛍光活性化細胞選別を使用してＴ細胞集団を測定することを含む、Ｔ細胞の増殖を検出および定量する方法が、当該分野で周知である。
【００８０】
Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害する方法が、さらに提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞を、本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させ、それによってＴ細胞の分化を阻害するステップを含む。一部の例では、Ｔ細胞の分化を阻害する方法は、Ｔ細胞が、被験体から単離されており、この単離されたＴ細胞を、このＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させる、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。他の例では、Ｔ細胞の分化を阻害する方法は、このＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与するステップを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏの方法である。特定の例では、この被験体は、Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害、例えば多発性硬化症、関節リウマチまたはがん（例えば、膵臓がん）を有する被験体である。
【００８１】
一部の例では、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化は、対照（例えば、未処理のＴ細胞）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％阻害される。特定のＴヘルパー（Ｔｈ）サブタイプへのＴ細胞の分化を評価するための方法は、実施例に記載される方法を含め、当該分野で周知である。例えば、Ｔｈサブタイプは、サイトカイン発現プロファイルまたはサブタイプ特異的転写因子発現を評価することによって決定され得る。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＬＴ−αを含むサイトカイン、ならびに転写因子Ｔ−ｂｅｔの発現を特徴とする；Ｔｈ２細胞は、典型的には、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ６およびＩＬ−１３を産生する；ならびにＴｈ１７細胞は、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２を主に発現する（ＺｈｕおよびＰａｕｌ、Ｂｌｏｏｄ  １１２巻（５号）：１５５７〜１５６８頁、２００８年）。
【００８２】
Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を処置する方法もまた、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を選択するステップ、ならびに治療有効量の本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与し、それによってこの被験体を処置するステップを含む。このＴ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害は、Ｔ細胞および／またはＴ細胞における代替的ｐ３８活性化経路の異常なまたは病理学的活性化に関連する、任意の疾患、障害または状態である。一部の実施形態では、このＴ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の障害は、自己免疫性障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病（炎症性腸疾患）、１型糖尿病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスおよび潰瘍性大腸炎であるが、これらに限定されない。他の実施形態では、このＴ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の障害は、炎症性障害、例えば、喘息、血管炎、慢性前立腺炎、骨盤腹膜炎、がん、アテローム動脈硬化症、虚血性心臓疾患、再灌流傷害、移植片拒絶、サルコイドーシス、アレルギー性過敏症および糸球体腎炎であるがこれらに限定されない。一部の例では、このＴ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患または膵臓がん（例えばＰＤＡＣであるがこれに限定されない）を含む。
【００８３】
被験体において腫瘍血管新生を阻害する方法が、本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、この方法は、腫瘍を有する被験体を選択するステップ、および治療有効量の本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物をこの被験体に投与するステップを含む。一部の例では、この腫瘍は、膵臓腫瘍、例えばＰＤＡＣ腫瘍である。一部の例では、投与は、腫瘍内注射を含む。非限定的な例では、腫瘍血管新生は、対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％阻害される。腫瘍血管新生を検出および評価する方法は、当該分野で公知である。例えば、腫瘍血管新生は、内皮マーカー、例えばＣＤ３１またはＣＤ３４について腫瘍細胞を染色することによって評価され得る。
【００８４】
治療タンパク質を投与する方法は、当該分野で周知であり、全身投与および局所投与の両方が含まれる。一部の実施形態では、このＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物は、静脈内投与または腹腔内投与される。被験体が腫瘍を有する一部の例では、このＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物は、腫瘍中に直接投与される。単回または複数回の投与（例えば、２、３、４、５回またはそれより多い投与）は、例えば、処置される疾患の型および重症度、ならびに被験体の全体的な健康に依存して、利用され得る。
【００８５】
被験体に投与されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物の量は、一般に、ｐ３８の活性化を少なくとも部分的に阻害するのに十分な量および／または疾患の１つもしくは複数の徴候もしくは症状を処置もしくは改善するのに十分な量である。治療有効量のＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物は、医師によって決定され得る。一部の実施形態では、治療有効量の本明細書に開示されるＧａｄｄ４５αポリペプチド、融合タンパク質または組成物は、臨床医または他の有資格の観察者によって留意されるような、１つもしくは複数の症状の自覚的軽減、または客観的に同定可能な改善のいずれかを提供する量である。一部の例では、このＧａｄｄ４５αポリペプチドまたは融合タンパク質は、約２０μｇ〜約１００μｇ、例えば、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０または約１００μｇの用量で投与される。
【００８６】
被験体から取得された腫瘍試料中のチロシン３２３リン酸化ｐ３８（ｐ３８  ｐＹ３２３）について陽性の腫瘍浸潤性Ｔ細胞の百分率を計算し；Ｔ細胞の少なくとも１０％がｐ３８  ｐＹ３２３について陽性の場合にこの被験体が予後不良を有することを決定することによって、ＰＤＡＣを有すると診断された被験体の予後を決定する方法もまた、本明細書に提供される。
【００８７】
予後不良とは、任意の陰性の臨床転帰を指す。例えば、一部の実施形態では、予後不良は、生存時間における減少である。一部の実施形態では、予後不良は、がんの転移の見込みにおける増加である。他の実施形態では、予後不良とは、治療、例えば放射線療法または化学療法に応答できないことを指す。特定の実施形態では、この予後不良は、生存時間における減少である。一部の例では、予後不良は、被験体が、１年未満生存する可能性が高いことを示す。
【００８８】
腫瘍試料中のチロシン３２３リン酸化ｐ３８を検出するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、チロシン３２３リン酸化ｐ３８に特異的な抗体を使用した免疫組織化学的検出が含まれる（以下の実施例５を参照のこと）。
【００８９】
Ｖ．さらなる実施形態
１．  ２５アミノ酸長以下の単離された増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性アルファ（Ｇａｄｄ４５α）ポリペプチドであって、このポリペプチドのアミノ酸配列は、ＬＱＩＨＦＴＬＩＸＡＦＣＣＥＮ（配列番号１）を含み、式中、ＸはＱまたはＲである、ポリペプチド。
【００９０】
２．  ２０アミノ酸長以下である、１の単離されたＧａｄｄ４５αポリペプチド。
【００９１】
３．  アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）を含む、１または２の単離されたＧａｄｄ４５αポリペプチド。
【００９２】
４．  アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）からなる、１または２の単離されたＧａｄｄ４５αポリペプチド。
【００９３】
５．  １〜４のいずれか１つのＧａｄｄ４５αポリペプチドおよび異種ペプチドを含む、融合タンパク質。
【００９４】
６．  異種ペプチドが細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、５の融合タンパク質。
【００９５】
７．  ＣＰＰがポリアルギニンを含む、６の融合タンパク質。
【００９６】
８．  ポリアルギニンが、１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基を含むまたは１１個のアルギニン（１１Ｒ）残基からなる、７の融合タンパク質。
【００９７】
９．  Ｇａｄｄ４５αポリペプチドのＮ末端と融合した１１Ｒからなる、８の融合タンパク質。
【００９８】
１０．  アミノ酸配列ＬＱＩＨＦＴＬＩＱＡＦＣＣＥＮ（配列番号２）またはＬＱＩＨＦＴＬＩＲＡＦＣＣＥＮ（配列番号３）と融合した１１Ｒからなる、８の融合タンパク質。
【００９９】
１１．  １〜１０のいずれか１つのポリペプチドまたは融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【０１００】
１２．  Ｔ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害する、またはＴｈ１細胞もしくはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法であって、このＴ細胞を、１〜１１のいずれか１つのポリペプチド、融合タンパク質または組成物と接触させ、それによってＴ細胞の増殖を阻害するステップを含む、方法。
【０１０１】
１３．  Ｔ細胞が、被験体から単離されており、この単離されたＴ細胞を、ポリペプチドまたは融合タンパク質と接触させる、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法である、１２の方法。
【０１０２】
１４．  被験体においてＴ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞の増殖を阻害する方法、または被験体においてＴｈ１細胞もしくはＴｈ１７細胞へのＴ細胞の分化を阻害する方法であって、１〜１１のいずれか１つのポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与するステップを含む、方法。
【０１０３】
１５．  Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を処置する方法であって、Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害を有する被験体を選択するステップ、ならびに治療有効量の１〜１１のいずれか１つのポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与し、それによって被験体を処置するステップを含む、方法。
【０１０４】
１６．  Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害が、多発性硬化症、関節リウマチまたは膵臓がんを含む、１６の方法。
【０１０５】
１７．  投与が静脈内投与、腫瘍内投与または腹腔内投与を含む、１５または１６の方法。
【０１０６】
１８．  Ｔ細胞媒介性および／またはｐ３８媒介性の自己免疫性障害または炎症性障害が、膵臓がんを含み、投与が腫瘍内注射を含む、１７の方法。
【０１０７】
１９．  被験体において腫瘍血管新生を阻害する方法であって、腫瘍を有する被験体を選択するステップ、および治療有効量の１〜１１のいずれか１つのポリペプチド、融合タンパク質または組成物を被験体に投与し、それによって被験体において腫瘍血管新生を阻害するステップを含む、方法。
【０１０８】
２０．  腫瘍が膵臓腫瘍である、１９の方法。
【０１０９】
２１．  投与が腫瘍内投与を含む、１９または２０の方法。
【０１１０】
２２．  ポリペプチドまたは融合タンパク質が、約２０μｇ〜約１００μｇの用量で投与される、１９の方法。
【０１１１】
２３．  ポリペプチドまたは融合タンパク質が、約２０μｇ〜約１００μｇの用量で投与される、１４の方法。
【０１１２】
２４．  ポリペプチドまたは融合タンパク質が、約２０μｇ〜約１００μｇの用量で投与される、１５の方法。
【０１１３】
２５．  膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有すると診断された被験体の予後を決定する方法であって：
被験体から取得された腫瘍試料中のチロシン３２３リン酸化ｐ３８（ｐ３８  ｐＹ３２３）について陽性の腫瘍浸潤性Ｔ細胞の百分率を計算するステップ；および
Ｔ細胞の少なくとも１０％がｐ３８  ｐＹ３２３について陽性の場合にこの被験体が予後不良を有することを決定するステップ
を含む、方法。
【０１１４】
２６．  予後不良が、生存時間における減少である、２５の方法。
【０１１５】
以下の実施例は、ある特定の特別な特徴および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、記載される特定の特徴または実施形態に本開示を限定すると解釈すべきでない。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる代替的ｐ３８活性化経路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
この実施例は、細胞透過性ペプチド（１１Ｒ）と融合したＧａｄｄ４５αの７１〜８５ポリペプチドおよびＴ細胞特異的代替的ｐ３８活性化経路を遮断するその能力を記載する。ｐ３８に結合することが可能なＧａｄｄ４５αの最小領域を、Ｇａｄｄ４５αの種々の短縮された一部分をＧＳＴと融合させ、この産物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換えｐ３８αをプルダウンすることによって同定した。７１〜８５断片は、ｐ３８αならびに全長タンパク質をプルダウンした。さらに、全長Ｇａｄｄ４５αからの７１〜８０の欠失は、ｐ３８αをプルダウンできなくした。
【０１１７】
（１１Ｒ）−７１−８５
Ｇａｄｄ４５αの７１〜８５ペプチドの細胞透過性形態を生成するために、１１個のアルギニン残基をＮ末端に付加して、本明細書で（１１Ｒ）−７１−８５と呼ばれる融合タンパク質を生成した。（１１Ｒ）−７１−８５の細胞透過性を、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して試験した。（１１Ｒ）−７１−８５および１１個のアルギニン残基と融合させた対照ペプチド（（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌと呼ぶ）を、ＦＩＴＣに結合体化した。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃で２時間、ＦＩＴＣ結合体化（１１Ｒ）−７１−８５もしくは（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで処理したか、または未処理のままにした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ陽性についてフローサイトメトリーによって分析した。図１に示すように、両方の１１Ｒ−結合体化ペプチドが、Ｔ細胞によって取り込まれた。
【０１１８】
ｐ３８代替的経路のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
（１１Ｒ）−７１−８５が代替的ｐ３８活性化経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害できるかどうかを試験するために、（１１Ｒ）−７１−８５の存在下および非存在下で、アッセイを実施して、活性化ｐ３８の標的である活性化転写因子２（ＡＴＦ２）のリン酸化を検出した。精製されたｐ３８タンパク質を、キナーゼ緩衝液中で活性Ｚａｐ７０との１時間のインキュベーションによって活性化した。次いで、（１１Ｒ）−７１−８５（０．２、０．５、１．０、２．０または４．０μｇ）または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌ（４．０μｇ）を添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。１μｇのＡＴＦ２および１０μＣｉの［３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、３０℃で４５分間インキュベートした。リン酸化産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンに移し、ホスフォイメージャーによって可視化した。図２に示すように、（１１Ｒ）−７１−８５とのインキュベーションは、ＡＴＦ２のリン酸化における減少をもたらしたが、（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌとのインキュベーションはこれをもたらさなかった。さらに、ＡＴＦ２リン酸化における減少は、（１１Ｒ）−７１−８５の用量に依存した。これらの結果は、（１１Ｒ）−７１−８５が代替的ｐ３８活性化経路を阻害することが可能であることを実証している。
【０１１９】
Ｔ細胞増殖および炎症性サイトカイン産生の阻害
（１１Ｒ）−７１−８５がＴ細胞増殖および炎症性サイトカイン産生を阻害する能力もまた評価した。Ｔ細胞を脾臓から精製し、異なる濃度（０．２、０．５、１．０、２．０または４．０μｇ）の（１１Ｒ）−７１−８５または対照ペプチド（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌで処理した。次いで、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で２日間刺激し、最後に１μＣｉ［３Ｈ］−チミジンでパルスして、１４時間後に回収した。［３Ｈ］−チミジン取り込みを、Ｗａｌｌａｃ  １４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて決定した。図３に示すように、（１１Ｒ）−７１−８５による処理は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に応答したＴ細胞増殖における用量依存的な減少をもたらしたが、（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌによる処理はこれをもたらさなかった。
【０１２０】
サイトカイン産生を評価するために、Ｔ細胞を脾臓から精製し、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。次いで、細胞を一晩未刺激にし、１μＭもしくは２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５もしくは対照ペプチド（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌで、またはＤＭＳＯのみで処理した。処理後、細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（ＴＣＲおよび代替的ｐ３８経路を刺激するため）、またはモネンシンを補充したＰＭＡ＋イオノマイシン（古典的ｐ３８経路を刺激するため）のいずれかで再刺激した。サイトカイン発現を、フローサイトメトリーによって測定した。図４Ａ〜４Ｂに示すように、（１１Ｒ）−７１−８５による処理は、ＴＣＲ刺激に応答したＴＮＦ−αの産生を阻害するが、ＰＭＡ＋イオノマイシンでの刺激に応答したサイトカイン産生に対しては、顕著な影響を有さない。２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５による処理が、１μＭの（１１Ｒ）−７１−８５による処理よりも高い程度まで、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生を阻害するので、（１１Ｒ）−７１−８５の効果は用量依存的である。
【０１２１】
Ｔｈ１およびＴｈ１７分化の阻害
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞分化に対する（１１Ｒ）−７１−８５の影響を評価するために、さらなる研究を実施した。ＩＦＮ−γおよびＴ−ｂｅｔの発現を、炎症促進性応答に典型的なＴｈ１細胞の指標として使用した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、培地または２μＭの（１１Ｒ）−７１−８５もしくは（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで２時間処理し、洗浄後、細胞を、Ｔｈ０条件（中立）またはＴｈ１極性化条件下で抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で３日間刺激した。細胞を、再度同じ濃度の（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌのいずれかで２時間処理し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激した。Ｔ  ｂｅｔおよびＩＦＮγの発現を、フローサイトメトリーによって分析した（図５Ａ〜５Ｄ）。（１１Ｒ）−７１−８５で処理した細胞は、培地または（１１Ｒ）−Ｃｔｒｌで処理した細胞と比較して、ＩＦＮ−γおよびＴ−ｂｅｔの低減された発現を示した。これらの結果は、（１１Ｒ）−７１−８５による処理がＴｈ１分化を阻害することを示している。
【０１２２】
Ｔｈ１７分化に対する全長Ｇａｄｄ４５αの効果もまた評価した。ＷＴマウスから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、４μＭのＴＡＴ−Ｃｔｒｌ、ＴＡＴ−Ｇ４５ＦＬまたはＴＡＴ−Ｇ４５Δ１０のいずれかで処理し、プレート被覆した抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で４８時間刺激し、転写因子ＮＦＡＴｃ１、ＩＲＦ４またはＩＲＦ８についてブロットした（図６Ａ）。全長Ｇａｄｄ４５αによるＣＤ４＋Ｔ細胞の処理は、ＮＦＡＴｃ１およびＩＲＦ４の発現を阻害したが、ＩＲＦ８の発現は阻害しなかった。同様に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｈｉ）細胞を、ＷＴマウスから精製し、ＴＡＴ−ＣｔｒｌまたはＴＡＴ−Ｇ４５ＦＬのいずれかで処理し、中立条件（Ｔｈ０）またはＴｈ１７傾斜条件（１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６＋５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β）下で４８時間刺激した。ＲｏｒｃおよびＩｌ１７ａのｍＲＮＡ発現レベルを評価した（図６Ｂ）。全長Ｇａｄｄ４５αの発現は、Ｔｈ１７傾斜条件下で、ＲｏｒｃおよびＩｌ１７ａの両方の発現を顕著に阻害した。これらの結果は、全長Ｇａｄｄ４５αがＴｈ１７分化を阻害することを示している。
【０１２３】
実施例２：１１Ｒ−７１−８５は、Ｔ細胞活性化マーカーの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する
実施例１に記載した研究は、残基７１〜８５を含むＧａｄｄ４５αポリペプチドが、代替的ｐ３８活性化経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで阻害することが可能であることを実証している。この実施例は、残基７１〜８５を含むＧａｄｄ４５αポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏでも代替的ｐ３８活性化経路を阻害できるという知見を記載する。
【０１２４】
（１１Ｒ）−７１−８５がｐ３８代替的経路をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する能力を、ＴＣＲ刺激後に上方調節される転写因子であるインターフェロン調節因子４（Ｉｒｆ４）ｍＲＮＡの発現を評価することによって評価した。（１１Ｒ）−７１−８５（４０μｇ）またはビヒクル対照を、野生型マウス中に腹腔内注射した。注射の４時間後、脾細胞を収集し、可溶性抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で２４時間刺激した。Ｉｒｆ４  ｍＲＮＡ発現を、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。図７に示すように、（１１Ｒ）−７１−８５による処理は、対照と比較して、Ｉｒｆ４の発現を顕著に阻害した。
【０１２５】
ＴＣＲ刺激の際に活性化される２つの転写因子ＮＦＡＴｃ１およびＩＲＦ４の発現もまた、（１１Ｒ）−７１−８５の静脈内（ｉ．ｖ．）注射の後に評価した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇのＤＭＳＯ、（１１Ｒ）−スクランブルまたは（１１Ｒ）−７１−８５をｉ．ｖ．注射し、総Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかを、異なる時点において脾臓から精製した。精製された細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間刺激し、Ｎｆａｔｃ１およびＩｒｆ４のｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲによって決定した。図８に示すように、（１１Ｒ）−７１−８５による処理は、総Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＴＣＲ刺激後のＮｆａｔ１ｃおよびＩｒｆ４の両方の発現を阻害する。
【０１２６】
実施例３：１１Ｒ−７１−８５の投与は、膵臓腫瘍の増殖および血管新生を阻害し、腫瘍浸潤性Ｔ細胞からのＴＮＦ−α分泌を阻害する
ｐ３８  ＭＡＰＫは、膵臓がんなどの、局所炎症性応答を引き起こす一部の腫瘍の増殖に関与している。従って、（１１Ｒ）−７１−８５を、膵臓腫瘍モデルにおいて試験した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射した。１６日後、マウスに、４０μｇもしくは８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５またはＤＭＳＯの腫瘍内注射を、１日おきに受けさせた。対照マウスおよび（１１Ｒ）−７１−８５またはＤＭＳＯを注射したマウスにおける、注射開始時（１６日目）から４２日目までの腫瘍体積を決定した（図９Ａ）。対照腫瘍および処置腫瘍の重量（図９Ｂ）および外観（図９Ｃ）を、３８日目に評価した。腫瘍体積および腫瘍重量の両方が、対照動物と比較して、（１１Ｒ）−７１−８５で処置したマウスにおいて顕著に減少した。これらの結果は、（１１Ｒ）−７１−８５の注射が、樹立されたＰＡＮＣ０２腫瘍の増殖を停止させることを実証している。
【０１２７】
腫瘍浸潤性Ｔ細胞からのサイトカイン分泌に対する、（１１Ｒ）−７１−８５の腫瘍内注射の効果もまた、膵臓腫瘍を有するマウスにおいて評価した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射し、１６日後、マウスに、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブルの腫瘍内注射を、１週間にわたり１日おきに受けさせた。最後の注射の２４時間後、腫瘍浸潤性細胞を回収し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したか、または未刺激のままにした。ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。図１０Ａに示すように、ＴＮＦ−α分泌は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの状態を示す未刺激の細胞において、（１１Ｒ）−７１−８５注射後に低減された。ＴＮＦ−α分泌においては、ＴＣＲシグナル伝達を迂回し、古典的ＭＡＰＫカスケードを活性化する再刺激後に、差異は存在しなかった。試験した他のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７；図１０Ａ〜１０Ｂ）について、未刺激細胞と再刺激細胞との間に差異は存在しなかった。
【０１２８】
腫瘍血管新生もまた、（１１Ｒ）−７１−８５で処置したＷＴマウスにおいて評価した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、７．５×１０５のＰＡＮＣ０２細胞を注射した。１６日後、マウスに、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブルの腫瘍内注射を、２．５週間にわたり１日おきに受けさせた。最後の注射の２４時間後、腫瘍を収集し、ホルマリン中で固定し、腫瘍血管新生の指標である内皮マーカーＣＤ３１について染色した。図１１に示すように、（１１Ｒ）−７１−８５で処置したマウスは、対照処置マウスと比較して、ＣＤ３１染色における顕著な低減を示し、これは、（１１Ｒ）−７１−８５の投与が腫瘍血管新生を阻害することを示している。
【０１２９】
膵臓がんの第２のマウスモデルを使用して、腫瘍細胞によるサイトカイン分泌に対する（１１Ｒ）−７１−８５の効果を評価した。ＫＰＣマウスは、オンコジーン発現およびｐ５３ハプロ不全に起因して膵臓がんを発症するように遺伝子操作されている。ＫＰＣマウスに、８０μｇの（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブルのいずれかを、腹腔内注射によって１カ月間にわたり１日おきに投与した。最後の注射の２４時間後、腫瘍浸潤性細胞を回収し、ゴルジ阻害剤の存在下で４時間、ＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したか、または未刺激のままにした。細胞内ＴＮＦ−αの発現を、フローサイトメトリーによって決定した（図１２）。これらの結果は、（１１Ｒ）−７１−８５の投与が腫瘍浸潤性Ｔ細胞によるＴＮＦ−α分泌を阻害することを実証している。
【０１３０】
実施例４：（１１Ｒ）−７１−８５は、ＫＰＣマウスにおいてＰａｎＩＮの進行およびがん形成を阻害する
ＫＰＣマウスは、ヒト疾患を密接に模倣するマウス膵臓腫瘍の遺伝的モデルを提供する。ＫＰＣ（ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；ＬＳＬＴｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ）マウスは、膵臓上皮においてＫ−ｒａｓを発現し、ｐ５３についてヘテロ接合性になった場合、およそ８〜１０週齢で開始する自発的腫瘍を発症する（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７巻（５号）：４６９〜４８３頁、２００５年）。これは、膵臓上皮内新生物前駆病変（ＰａｎＩＮ）の形成ならびに周囲の間質および炎症性反応を伴う完全に発達した癌腫への進行を伴う（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７巻（５号）：４６９〜４８３頁、２００５年）。８〜１３週齢のＫＰＣマウス由来の膵臓組織の組織学的試験により、膵管上皮の組織学的変化ならびに周囲の線維炎症性反応の形成、ならびに完全に発達した侵襲性癌腫のエリアによって規定される種々の発達段階にあるＰａｎＩＮが明らかになった。ヒト疾患において見られるように、浸潤性Ｔ細胞は、これらの病変において見出された。特に、Ｔ細胞リッチ領域では、この代替的経路のための明確なリン酸化部位ｐ３８  ｐＹ３２３に特異的な抗体で染色された単核細胞、およびＴ細胞が乏しい領域には存在しなかったＴＮＦαを容易に検出できる。
【０１３１】
Ｔ細胞中のＴＣＲシグナル伝達されたｐ３８活性化が腫瘍発生に関与するかどうかを調べるために、６週齢のＫＰＣマウスを、致死未満で照射し、ＷＴまたはＤＫＩ骨髄で再構築した。前者は侵襲性がんを発症し、３７±９日間の平均生存時間で死亡した（図１３Ａ）。対照的に、ＤＫＩ骨髄を受けたマウスは、８０±１６日間の平均で、かなり長く生存した（図１３Ａ）。従って、ｐ３８代替的経路の遺伝的除去は、オンコジーン媒介性膵臓がんの進行を低減させた。
【０１３２】
これらの知見を考慮して、さらなる実験を実施して、ＫＰＣマウスにおける代替的経路の阻害が疾患進行を変更するかどうかを決定した。ＫＰＣマウスを、９週齢の時点で開始して静脈内（１１Ｒ）−７１−８５または（１１Ｒ）−スクランブルで処置し、膵臓を、３．５週間後に組織学的に評価した。（１１Ｒ）−スクランブルで処置したマウスの３３パーセント（６匹のうち２匹）は、膵臓において侵襲性癌腫を発症した。対照的に、（１１Ｒ）−７１−８５で処置したマウスは、侵襲性の徴候を示さなかった。Ｈ＆Ｅ染色切片の組織学的評価は、（１１Ｒ）−スクランブル処置した腫瘍と比較して、（１１Ｒ）−７１−８５処置した腫瘍において、膵臓内線維炎症性反応の低減を示した。（１１Ｒ）−７１−８５は、侵襲性癌腫の形成を予防しただけでなく、高悪性度ＰａｎＩＮ形成（ＰａｎＩＮ３、上皮内癌）に向かう進行を遅延させもした（図１３Ｂ）。ＰＡＮＣ０２モデルと類似して、（１１Ｒ）−７１−８５で処置したＫＰＣマウス由来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、対照と比較して低減した数のＴＮＦα発現ＣＤ４＋細胞を有したが、ＩＦＮγの発現は僅かに低減された（図１３Ｃ）。ＴＮＦα分泌の低減と合致して、Ｉｒｆ４  ｍＲＮＡ発現は、（１１Ｒ）−７１−８５処置後にＣＤ４＋ＴＩＬにおいて減少した。これと一致して、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５、ＶｅｇｆおよびＴｇｆβの発現もまた、ＫＰＣマウスの膵臓上皮細胞において低減された（図１３Ｄ）。（１１Ｒ）−７１−８５処置マウスにおいて、初期ＰａｎＩＮ形成が存在したが、後の前侵襲性段階が低減されたという事実は、侵襲性癌腫に向かうＰａｎＩＮの進行におけるＴ細胞由来ＴＮＦαの役割を支持する。
【０１３３】
実施例５：ヒトＰＤＡＣ  ＴＩＬにおける高レベルのｐＹ３２３  ｐ３８は、予後不良を示す
マウス膵臓がん、および特にオンコジーン駆動ＫＰＣマウスにおけるｐ３８代替的活性化の重要性は、この経路がヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）にも同様に関与し得るかどうかを扱う研究を促進した。組織学的に検証されたＰＤＡＣを有する１９３人の患者由来の膵臓組織を、浸潤性ｐ３８  ｐＹ３２３陽性細胞について分析した。全ての試料において、ｐ３８  ｐＹ３２３に対する抗体で染色したＴ細胞の顕著な浸潤が存在したが、かかる細胞の数は、患者ごとに変動した。大多数の症例において（ｎ＝１５３、約８０％）、１０％未満のＣＤ３＋腫瘍浸潤性Ｔ細胞が、ｐＹ３２３についても陽性であり、残りは、ｐ３８  ｐＹ３２３を発現する≧１０％のＴ細胞を有した。ｐ３８  ｐＹ３２３陽性Ｔ細胞もまた、逐次的腫瘍切片中で検出されたように、ＴＮＦαを発現した。二重免疫蛍光は、これらの知見を支持し、ｐ３８  ｐＹ３２３陽性Ｔ細胞がＴＮＦαを産生したことを実証している。１０％より多いｐ３８  ｐＹ３２３陽性Ｔ細胞を有する浸潤物を有する患者は、１０％未満のｐ３８  ｐＹ３２３陽性細胞を有する患者（診断後６１３日間の生存期間中央値）と比較して、統計的に有意に短い生存（診断後２９６日間の生存期間中央値）を有した（図１４Ａ）。他の臨床的または病理学的知見（年齢、性別、腫瘍サイズ、ＴＮＭ段階、組織学的段階分け、ＵＩＣＣ段階、腫瘍陽性リンパ節の数）との間には、かかる相関は存在しなかった。２群間のＴ細胞浸潤の量においても差異は存在せず、これは、単に浸潤性Ｔ細胞の存在だけでなく、ｐ３８代替的経路の活性化が、転帰と相関することを示している（図１４Ｂ）。ＣＤ３１陽性腫瘍血管の密度を、高い数のｐ３８  ｐＹ３２３陽性Ｔ細胞を有する１０人のランダムに選択した患者および低い数のｐ３８  ｐＹ３２３陽性Ｔ細胞を有する１０人のランダムに選択した患者において試験した。前者は、血管新生における統計的に有意な増加を有し（図１４Ｃ）、これは、ＴＩＬにおけるｐ３８代替的活性化が、ＰＤＡＣにおける不良な生存の既知の予測因子である腫瘍新血管新生をもたらすことを示している。
【０１３４】
実施例６：多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルにおけるＧａｄｄ４５αポリペプチドの評価
この実施例は、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置の効果を評価するための、多発性硬化症の動物モデルを記載する。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルは、ＣＮＳ関連の脱髄性自己免疫性疾患の認識されたモデルである。ＥＡＥを誘導する方法およびＥＡＥを天然に発症する動物モデルは、当該分野で周知である（例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８巻（１０号）：３４２０〜３４３０頁、２００８年；Ｇｒｅｗａｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４巻：２９１〜３０２頁、２００１年；Ｔｒａｎら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０巻：１４１０〜１４１５頁、２０００年；またはＢｕｔｚｋｅｕｖｅｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８巻：６１３〜６１９頁、２００２年；および米国特許出願公開第２００８／０１６６３１８号を参照のこと）。Ｃ５７ＢＬ／６  ＥＡＥモデルは一般に、慢性および進行性のＭＳを示す。
【０１３５】
ＥＡＥは、マウス１匹当たり４ｍｇ／ｍＬのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有するフロイント完全アジュバント中およそ２００μｇのミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）３５−５５ペプチドによる皮下注射による免疫化によって、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスにおいて誘導される。百日咳毒素を、免疫化後０日目および２日目に、腹腔内投与する。免疫化後の種々の段階で、マウスに、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドまたはビヒクル単独を投与する。
【０１３６】
マウスを、ＥＡＥの徴候について毎日試験する。ＥＡＥは、５ポイントスケール（０、麻痺なし；１、尾の引きずり（ｌｉｍｐ  ｔａｉｌ）；２、後肢不全麻痺および立ち直り自体の困難；３、後肢麻痺；４、後肢および前肢麻痺；ならびに５、瀕死）を使用してスコア付けする。ビヒクル単独と比較した、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置後の平均スコアにおける減少は、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドが、ミエリン化を促進しＭＳを処置するために有効であることを示している。画像化技術もまた、種々の段階でのミエリン化の程度を評価するために使用され得る。
【０１３７】
実施例７：ＭＳ患者におけるＧａｄｄ４５αポリペプチドの評価
この実施例は、ヒトにおけるＧａｄｄ４５αポリペプチドの使用を評価するための方法を記載する。この方法は、網膜神経線維層（ＲＮＦＬ）のミエリン化を研究するための眼コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）の使用を伴う。
【０１３８】
ＭＳの一般的な症状発現である視神経炎は、しばしば、中枢神経系脱髄の初期の症状発現として発生するか、または疾患の経過の間に発症する。ＲＮＦＬは、ミエリン化されていない軸索のみから構成されるので、ＲＮＦＬの厚さを測定することが、ＭＳ患者における軸索喪失をモニタリングする実行可能な方法を示す。ＯＣＴは、乳頭周囲ＲＮＦＬの厚さ、窩および黄斑を定量する、非侵襲性の、非接触性で正確かつ再現性のある技術である。ＲＮＦＬを、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置の前および後に、ＭＳ患者において評価する。Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置の後の軸索の厚さにおける増加は、このＧａｄｄ４５αポリペプチドが、ミエリン化の促進およびＭＳの処置に有効であることを示している。
【０１３９】
実施例８：ＭＳの処置のためのＧａｄｄ４５αポリペプチドの効力の評価
この実施例は、ＭＳの処置のためのＧａｄｄ４５αポリペプチドの効力の評価のための方法を記載する。
【０１４０】
ＭＳを有する被験体を、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドを含む組成物で処置する。当業者は、Ｇａｄｄ４５αポリペプチド組成物の適切な用量および投薬スケジュールを決定することが可能である。被験体を、治療の開始前に、治療期間の間に周期的に、および処置過程の最後に、以下に記載されるＭＳの基準について評価する。
【０１４１】
多発性硬化症を有する被験体におけるＧａｄｄ４５αポリペプチド組成物の効力は、以下の基準によって評価できる。
【０１４２】
１．ＭＲＩ基準、例えば：
Ｔ２病変負荷
Ｔ１低強度の体積
Ｎ−アセチルアスパルテート（ＮＡＡ）レベル
全脳萎縮症  。
【０１４３】
２．臨床的基準、特に：
ＥＤＳＳ（総合障害度評価尺度）における変化
ＳＲＳ（スクリプス神経学的評価尺度）における変化
再発率
９ホールペグテスト  。
【０１４４】
３．免疫学的基準、特に：
Ｔｈ１およびＴｈ２  Ｔ細胞系統のマーカー
種々のＴ細胞マーカーのＦＡＣＳ分析
Ｔ細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏのサイトカイン産生
Ｔ細胞の増殖  。
【０１４５】
Ｔ２病変負荷
Ｔ２病変負荷に対する分析は、以下を含む：
・処置期間の間のＴ２病変の平均体積に対する、処置前期間の間のＴ２病変の平均体積の比較
・処置期間の最後の４週間のＴ２病変の平均体積に対する、処置前期間の間のＴ２病変の平均体積の比較  。
【０１４６】
Ｔ１低強度の体積
Ｔ１低強度の体積に対する分析は、以下を含む：
・処置期間の間のＴ１低強度の平均体積に対する、処置前期間の間のＴ１低強度の平均体積の比較
・処置期間の最後の４週間のＴ１低強度の平均体積に対する、処置前期間の間のＴ１低強度の平均体積の比較  。
【０１４７】
ＥＤＳＳ
ベースラインＥＤＳＳスコアが、処置の開始の前に被験体について決定される。ＥＤＳＳは、処置過程の間に周期的に測定される。ベースラインＥＤＳＳから処置期間の間のＥＤＳＳへの変化が、決定される。また、処置期間の間のＳＲＳおよび９ホールペグテストについてのベースラインスコアからの変化が決定される。
【０１４８】
再発
Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置を受ける前２年間にわたる再発の頻度を、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによって処置されている間の再発の頻度と比較する。
【０１４９】
ＭＳを有する患者における、Ｇａｄｄ４５αポリペプチド組成物の投与を含む治療の有効性は、処置前の期間と比較した、所与の期間（例えば、６、１２、１８または２４カ月間）における被験体当たりのＭＳ増悪の平均数における低減によって実証される。例えばＥＤＳＳスコアによって測定されるような、ある期間（例えば、６、１２、１８または２４カ月間）にわたる被験体の能力障害スコアにおける増加の平均速度における低減、またはさらには能力障害スコアにおける改善もまた、Ｇａｄｄ４５αポリペプチド治療の有効性を実証する。
【０１５０】
実施例９：関節リウマチの動物モデルにおけるＧａｄｄ４５αポリペプチドの評価
この実施例は、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置の効果を評価するための、関節リウマチの動物モデルを記載する。コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルは、関節リウマチを研究するために最も一般的に使用される動物モデルである。このモデルにおいて自己免疫性関節炎を誘導する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｊｉｒｍａｎｏｖａら、Ｂｌｏｏｄ  １１８巻（１２号）：３２８０〜３２８９頁、２０１１年；Ｂｒａｎｄら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２巻（５号）：１２６９〜１２７５頁、２００７年を参照のこと）。
【０１５１】
この実施例では、関節炎は、尾の基部において１０週齢Ｈ−２ｒマウスにフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した１００μｇウシＩＩ型コラーゲンを注射し、２１日後にフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に乳化した１００μｇウシＩＩ型コラーゲンで追加免疫することによって、誘導される。関節炎の誘導後、マウスに、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドまたはビヒクル単独を投与する。各足を、以下のようにスコア付けする：０、紅斑の証拠なし；１、足根に限局された紅斑および軽度の腫脹；２、足首から中足部（ｍｉｄｆｏｏｔ）にかけて広がる紅斑および軽度の腫脹；３、足首から中足骨関節にかけて広がる腫脹；４、足全体の重症腫脹／強直。ビヒクル単独と比較した、Ｇａｄｄ４５αポリペプチドによる処置後の平均スコアにおける減少は、そのＧａｄｄ４５αポリペプチドが、関節リウマチの処置のために有効であることを示す。
【０１５２】
開示された本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、例示された実施形態は、本発明の好ましい実施例にすぎないことを認識すべきであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。従って、本発明者らは、本発明者らの発明が全て、これらの請求項の範囲および精神内に入ると主張する。
【図１４−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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