(57)【要約】  食道腺癌（ＯＡＣ）についての分子診断試験の同定のための方法および組成物が提供される。この試験は、新規ＤＮＡ損傷修復欠損分子サブタイプを定義し、このサブタイプ内の患者の分類を可能にする。本発明を用いて、任意の化学療法の投与前に、ＯＡＣを有する患者が治療レジメンに対して臨床的に応答性であるか、または非応答性であるかを決定することができる。この試験は、現在用いられている多くの標準的な細胞傷害性化学療法剤などの、ＤＮＡ損傷または修復に直接または間接に影響する様々な薬物と共に用いることができる。特に、本発明は、治療レジメンに対する応答性または非応答性とその発現が相関する予測マーカーの、ある特定の組合せの使用を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する、食道腺癌（ＯＡＣ）を有する個体の応答性を予測する方法であって、
ａ．表２Ｂ、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表３および／または表４に列挙されるものから選択される１個または複数個のバイオマーカーの、個体から得られた試験試料における発現レベルを測定すること；
ｂ．発現レベルを捕捉する試験スコアを導出すること；
ｃ．試験スコアと応答性とを相関させる情報を含む閾値スコアを提供すること；ならびに
ｄ．試験スコアと閾値スコアとを比較し、試験スコアが閾値スコアを超える場合、応答性が予測され、および／または試験スコアが閾値スコアを超えない場合、応答性の欠如が予測されること
を含む方法。
【請求項２】
１個または複数個のバイオマーカーが、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群ならびに／またはＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全てのバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発現レベルが、表１Ａ（配列番号１〜２４）、表１Ｂ（配列番号２５〜５０）および／または表３（配列番号５１〜２３０）に記載の標的配列の少なくとも１個に結合するプライマーおよび／またはプローブを用いて測定される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＯＡＣが初期、後期または転移性疾患である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ損傷治療剤が、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復を標的とする療法、ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤およびＤＮＡ合成の阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の物質を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ損傷治療剤が、１つまたは複数の白金含有薬剤、ヌクレオシドアナログ、例えば、ゲムシタビンもしくは５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグ、例えば、カペシタビン、アントラサイクリン、例えば、エピルビシンもしくはドキソルビシン、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、イオン化放射線または放射線と化学療法との組合せ（化学放射線）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ損傷治療剤が白金含有薬剤を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
白金系薬剤がシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらなる療法と一緒にＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する応答性を予測する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
さらなる療法が分裂阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分裂阻害剤がビンカアルカロイドまたはタキサンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ビンカアルカロイドがビノレルビンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タキサンがパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
組合せ療法が、
ａ．シスプラチン／カルボプラチンおよび５−フルオロウラシル
ｂ．シスプラチン／カルボプラチンおよびカペシタビン
ｃ．エピルビシン／ドキソルビシン、シスプラチン／カルボプラチンおよびフルオロウラシル
ｄ．エピルビシン／ドキソルビシン、オキサリプラチンおよびカペシタビン
ｅ．シスプラチン／カルボプラチンおよびパクリタキセル
ｆ．シスプラチン／カルボプラチンおよびイリノテカン
ｇ．シスプラチン／カルボプラチンおよびビノレルビン
から選択される、ＤＮＡ損傷治療剤を含む組合せ療法に対する応答性を予測する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組合せ療法が、パクリタキセルなどのタキサン、イリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ビノレルビンなどのビンカアルカロイドまたは化学放射線のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
処置がネオアジュバント処置および／またはアジュバント処置である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
応答性が予測される場合、個体がＤＮＡ損傷治療剤で処置される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
応答性の欠如が予測される場合、個体がＤＮＡ損傷治療剤で処置されない、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
処置がネオアジュバント白金系療法処置である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
応答性の欠如が予測される場合、個体が分裂阻害剤で処置される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
応答性が、全生存、無進行生存および／または無疾患生存の増加を含むか、または全生存、無進行生存および／または無疾患生存の増加である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ＤＮＡ損傷治療剤を対象に投与することを含む、食道腺癌（ＯＡＣ）を処置する方法であって、表２Ｂ、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表３および／もしくは表４に列挙されるものから選択される１個もしくは複数個のバイオマーカーの、個体から得られた試験試料における発現レベルから導出される試験スコアに基づいて、対象がＤＮＡ損傷治療剤に対して応答性であると予測される、方法；または
（ｂ）食道腺癌（ＯＡＣ）を処置する方法であって、表２Ｂ、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表３および／もしくは表４に列挙されるものから選択される１個もしくは複数個のバイオマーカーの、個体から得られた試験試料における発現レベルから導出される試験スコアに基づいて、対象がＤＮＡ損傷治療剤に対して応答性であると予測される、方法における使用のためのＤＮＡ損傷治療剤。
【請求項２４】
（ａ）分裂阻害剤を対象に投与することを含む食道腺癌（ＯＡＣ）を処置する方法であって、表２Ｂ、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表３および／もしくは表４に列挙されるものから選択される１個もしくは複数個のバイオマーカーの、個体から得られた試験試料における発現レベルから導出される試験スコアに基づいて、対象がＤＮＡ損傷治療剤に対して非応答性であると予測される、方法；または
（ｂ）食道腺癌（ＯＡＣ）を処置する方法であって、表２Ｂ、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表３および／もしくは表４に列挙されるものから選択される１個もしくは複数個のバイオマーカーの、個体から得られた試験試料における発現レベルから導出される試験スコアに基づいて、対象がＤＮＡ損傷治療剤に対して非応答性であると予測される、方法における使用のための分裂阻害剤。
【請求項２５】
試験スコアが請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って導出された、請求項２３または２４に記載の方法または使用。
【請求項２６】
表３に記載の標的配列（配列番号５１〜２３０）の少なくとも１個にハイブリダイズするプライマーまたはプローブを含む、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する、食道腺癌（ＯＡＣ）を有する個体の応答性を予測するためのキット。
【請求項２７】
プライマーまたはプローブが、表３に記載の標的配列の少なくとも１０個にハイブリダイズする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
ＤＮＡ損傷治療剤をさらに含む、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
ＤＮＡ損傷治療剤が、特にＯＡＣの処置のための剤形で提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
処置がネオアジュバントまたはアジュバント処置である、請求項２９に記載のキット
【請求項３１】
ＤＮＡ損傷治療剤が白金系薬剤を含む、請求項２６から３０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ損傷修復欠損サブタイプの使用を含む、特定の処置に対する食道がんの応答性を予測するのに有用な分子診断試験に関する。本発明は、このＤＮＡ損傷修復欠損分子サブタイプを同定するために用いられる４４遺伝子の分類モデルの使用などの、食道がん患者（特に、食道腺癌（ＯＡＣ）患者）におけるこのサブタイプの同定から導出される様々なクラシファイア（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）の作成および使用を含む。１つの適用は、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤およびＤＮＡ修復を標的とする療法を含めた、食道がん治療薬クラスに対する応答の階層化、およびそのための患者の選択である。本発明は、従来の療法選択に関するガイドとなり得る試験を提供し、また新規治療剤を臨床試験で評価する際のエンリッチメント戦略のために、患者群を選択できるようにする。ＤＮＡ修復欠損サブタイプを、例えば、新鮮／凍結（ＦＦ）またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）患者試料から同定することができる。
【背景技術】
【０００２】
製薬業界は、現在投与されている薬物よりも有効で、より特異的であるか、または有害な副作用がより少ない新規薬物処置選択肢を継続的に追求している。ヒト集団は遺伝的に変化に富むため、多くの薬物がその有効性にかなりの差異を生ずる。このため、薬物療法の代替手段が常に開発されている。様々な薬物療法の選択肢が現在利用可能ではあるが、患者が応答しない場合にそなえて、さらなる療法が常に必要とされているのである。
【０００３】
伝統的には、医師により用いられる処置の枠組みは、疾患を処置する上で可能なかぎり最も高い成功率をもたらす第一選択の薬物療法を処方することであった。次いで、第一選択が無効である場合、代替的な薬物療法が処方される。この枠組みは、明らかに、ある特定の疾患については最良の処置方法ではない。例えば、がんなどの疾患においては、最初の処置が最も重要であり、療法の成功のための最良の機会となることが多く、したがって初回の薬物として、その特定の患者の疾患に対して最も有効なはずの薬物を選択する必要性が高い。
【０００４】
食道がん（食道のがん）は高侵攻性疾患であり、世界で１０位の最も一般的ながんであり、英国では過去３０年でより一般的になった。食道がんは、成人では９番目に最も一般的ながんであり、英国では毎年約８，５００の事例が診断されている（ＣＲＵＫ統計）。食道がんは、男性では女性の約２倍多い。腺癌は、腺細胞から始まったがんを意味する。食道がんにおいては、これらが、食道の内壁において粘液を作る細胞である。腺癌の症例数は、ここ２０年で増加している。腺癌は現在、診断される全ての食道がんの半分あまりを占め、残りの症例は扁平上皮癌によるものである。腺癌は主に食道の下側３分の１において見出される。
【０００５】
早期食道腺癌（ＯＡＣ）の処置は、一般には外科手術である。外科的療法は、わずかに約２０％の事例においてであるが、長期生存を提供することが繰り返し示されている唯一の処置である（Mueller JM et al. Br J Surg (1990) 77:845）。外科的切除の結果は、優れたものであり得る。５年生存率は、腫瘍が粘膜に限定される場合、８０％を超え、粘膜下層が含まれる場合、５０％〜８０％である。Bonavina L. Br J Surg (1995) 82:98；Hoelscher AH, et al. Br J Surg (1997) 84:1470。
【０００６】
マイクロアレイおよび分子ゲノミクスの出現は、規定の治療レジメンに対する個々の患者の応答を予測する補助となり得る疾患の診断能力および予後分類に対し、相当なインパクトを与える可能性がある。マイクロアレイは、大量の遺伝的情報の分析を可能にし、それによって個体の遺伝子フィンガープリントが得られる。この技術は究極的には特注の薬物処置レジメンのための必要な手段を提供することになるとして、大変な熱狂ぶりである。
【０００７】
現在、医療専門家は、化学療法剤の恩恵を受けるがん患者を同定するのを助けてくれる手段をほとんど有していない。どの薬物処置が特定のがんの生理にとって最も有効であるかを正確に予測するための方法が利用可能ではないため、最適な第一選択薬の同定は困難であった。この欠陥により、単剤応答率は比較的低く、がんの疾病率および死亡率は増加してしまう。さらに、患者は無効で毒性の高い薬物療法を不必要に受けることが多い。
【０００８】
分子マーカーは、例えば、乳がんにおける適切な処置を選択するために用いられてきた。「トリプルネガティブ」と呼ばれる、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体ならびにＨＥＲ２増殖因子受容体を発現しない乳房腫瘍は、ＰＡＲＰ−１阻害剤療法に応答すると考えられる（Linn, S. C., and Van 't Veer, L., J. Eur J Cancer 45 Suppl 1, 11-26 (2009); O'Shaughnessy, J., et al. N Engl J Med 364, 205-214 (2011)）。最近の研究は、乳房腫瘍のトリプルネガティブ状態はＰＡＲＰ−１阻害剤を含む組合せ療法に対する応答性を示すが、個々のＰＡＲＰ−１阻害剤に対する応答性を十分に示さないことを示している（O'Shaughnessy et al., 2011）。
【０００９】
さらに、化学療法剤の応答性を示す分子サブタイプと関連する遺伝子クラシファイアを同定しようとする他の研究もあった（Farmer et al. Nat Med 15, 68-74 (2009); Konstantinopoulos, P. A., et al., J Clin Oncol 28, 3555-3561 (2010)）。
【００１０】
ＷＯ２０１２／０３７３７８は、４４遺伝子のＤＮＡマイクロアレイアッセイ、ＤＮＡ損傷修復欠損（ＤＤＲＤ）アッセイを記載する。このアッセイは、ＤＮＡ損傷応答ＦＡ／ＢＲＣＡ経路を失ったがんの分子サブグループを同定し、ＤＮＡ損傷化学療法剤に対する感受性をもたらす（Kennedy & D'Andrea Journal of Clinical Oncology (2006) 24:3799, Turner et al Nature Reviews Cancer (2004) 4:814）。
【００１１】
乳がんにおいては、ＤＤＲＤアッセイは、２０３人の乳がん患者においてネオアジュバントＤＮＡ損傷化学療法（５−フルオロウラシル、アントラサイクリンおよびシクロホスファミド）に対する応答を予測することが示された（オッズ比４．０１）（９５％ＣＩ：１．６９〜９．５４）。アジュバント５−フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド処置を用いて処置された１９１人の早期乳がん患者のコホートにおいて、このアッセイは、０．３７のハザード比で５年無再発生存を予測した（９５％ＣＩ：０．１５〜０．８８）。
【発明の概要】
【００１２】
ＯＡＣの多くの例においては、外科手術の後に、通常はシスプラチンとフルオロウラシルの組合せであるネオアジュバント化学療法が行われる。この療法は、腫瘍のサイズを減少させるために用いられる。しかしながら、全ての患者がこの形態の療法に応答するわけではないことが知られており、今までのところ、ネオアジュバント化学療法の恩恵を受けるＯＡＣ患者を同定するための試験は存在しない。結果として、多くの患者は、治療的利益なしに、化学療法、ならびにその関連する副作用および生活の質の低下を受けている。ＤＮＡ損傷応答経路は、食道がんの進行において重要であると示された（He et al (2013) Carginogeneisis 34:139; Motoori et al International Journal of Oncology (2010) 37:1113）。結果として、外科手術より前にネオアジュバント化学療法に関してＯＡＣ患者を階層化するための試験の臨床的必要性は非常に高い。
【００１３】
本発明は、食道がん、特に、ＯＡＣを処置する目的で、白金に基づく療法などのある特定の療法の恩恵をどの患者が受けるかを決定するために、ＤＮＡ損傷修復における欠陥を同定する方法の適用に基づくものである。本発明は、食道がんにおいて発現される遺伝子産物マーカーのコレクションを使用する方法であって、それら転写物のいくつかまたは全てが過剰発現または過少発現される場合、ＤＮＡ損傷修復における欠陥を有する食道がんのサブタイプを同定するような方法を対象とする。本発明はまた、ＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性または耐性を示すための方法も提供する。異なる態様において、この遺伝子一覧または遺伝子産物一覧は、マイクロアレイ、Ｑ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたはｍＲＮＡもしくはタンパク質発現を定量することができる他の技術などの、当技術分野で公知の方法を用いて実現可能な単一パラメータまたは多パラメータの予測試験の基礎を形成し得る。
【００１４】
かくして、本発明の一態様によれば、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する、（特に）食道腺癌（ＯＡＣ）などの食道がんを有する個体の応答性を予測する方法であって、
ａ．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される１個または複数個のバイオマーカー／遺伝子などの、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表２Ｂ、表３および／または表４から選択される１個または複数個のバイオマーカー／遺伝子の、個体から得られた試験試料における発現レベルを測定すること；
ｂ．発現レベルを捕捉する試験スコアを導出すること；
ｃ．試験スコアと応答性を相関させる情報を含む閾値スコアを提供すること；ならびに
ｄ．試験スコアと閾値スコアとを比較し、試験スコアが閾値スコアを超える場合、応答性が予測され、および／または試験スコアが閾値スコアを超えない場合、応答性の欠如が予測されること、
を含む方法が提供される。
【００１５】
この方法を、個体のための好適な処置を選択するための方法として、または試験および処置方法として実施することができる。かくして、ある特定の実施形態においては、試験スコアが閾値スコアを超える場合（応答性が予測される）、その個体はＤＮＡ損傷治療剤で処置される。同様に、試験スコアが閾値スコアを超えない場合（応答性が予測されない）、その個体はＤＮＡ損傷治療剤で処置されない。これらの環境においては、代替処置を企図することができる。ＯＡＣについては、代替処置は、ビンカアルカロイドまたはタキサンなどの分裂阻害剤の投与を含んでもよい。ビンカアルカロイドの例としては、ビノレルビンが挙げられる。タキサンの例としては、パクリタキセルまたはドセタキセルが挙げられる。あるいは、処置は、完全に化学療法を排除してもよい。また、この方法は、いくつかの実施形態においては、応答すると同定された個体のその後の処置を含んでもよい。対応するキットも企図される。この方法は、典型的にはインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実施される。したがって、この方法は、単離された、または予め単離された試料を用いて実施される。いくつかの実施形態においては、この方法は、個体から試験試料を得る工程を包含してもよい。ある特定の実施形態においては、この方法は、表１〜４のいずれかに由来する少なくとも１０個のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを測定することを含む。より具体的には、この方法は、いくつかの実施形態においては、表２Ｂに列挙される少なくとも１０個から４４個全部の異なるバイオマーカーの発現レベルを測定することを含んでもよい。ある特定の実施形態においては、発現レベルは、表１Ａ、表１Ｂまたは表３に記載の標的配列（配列番号１〜２４、配列番号２５〜５０または配列番号５１〜２３０）の少なくとも１個に結合するプライマーまたはプローブを用いて測定される。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、この方法は、試験試料における、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される１個または複数個のバイオマーカーの発現レベルを測定することをさらに含む。ある特定の実施形態においては、試験スコアは、全てのバイオマーカーの発現レベルを捕捉する。いくつかの実施形態においては、試験スコアが０．１、０．２、０．３、０．４または０．５などの約０．１〜０．５の値、例えば、約０．３６８１の閾値スコアを超える場合、応答性を予測することができる。
【００１７】
食道がんは、典型的には、食道腺癌（ＯＡＣ）であり、早期のものであってもよい。あるいは、ＯＡＣは、後期疾患または転移性疾患であってもよい。応答性が予測される処置は、典型的には、ネオアジュバント処置である。しかしながら、それはさらに、またはあるいはアジュバント処置を含んでもよい。
【００１８】
本明細書に記載の発明は、任意の１つのＤＮＡ損傷治療剤に限定されない；それを用いて、ある範囲のＤＮＡ損傷治療剤のいずれか、例えば、ＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接または間接に影響するものに対する応答者または非応答者を同定することができる。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復を標的とする療法、ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤およびＤＮＡ合成の阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の物質を含む。より具体的には、ＤＮＡ損傷治療剤を、１つまたは複数の白金含有薬剤、ヌクレオシドアナログ、例えば、ゲムシタビンもしくは５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグ、例えば、カペシタビン、アントラサイクリン、例えば、エピルビシンもしくはドキソルビシン、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、イオン化放射線または放射線と化学療法との組合せ（化学放射線）から選択することができる。特定の実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤は、白金含有薬剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金に基づく薬剤を含む。例えば、本発明の方法は白金に基づく療法の恩恵を受ける可能性がより高いＯＡＣ患者の応答性を予測する／予後指標として作用することができることが実験的に本明細書に示される。この方法は、さらなる療法または薬物と一緒になって、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する応答性を予測することができる。かくして、この方法は、組合せ療法に対する応答性を予測することができる。かくして、いくつかの実施形態においては、さらなる薬物は分裂阻害剤である。分裂阻害剤は、ビンカアルカロイドまたはタキサンであってもよい。特定の実施形態においては、ビンカアルカロイドはビノレルビンである。他の実施形態においては、タキサンはパクリタキセルまたはドセタキセルである。ある特定の実施形態においては、食道がんの処置における、以下の（組合せ）処置：シスプラチン／カルボプラチンと５−フルオロウラシル（ＣＦ）、シスプラチン／カルボプラチンとカペシタビン（ＣＸ）、エピルビシン／ドキソルビシン、シスプラチン／カルボプラチンとフルオロウラシル（ＥＣＦ）、エピルビシン／ドキソルビシン、オキサリプラチンとカペシタビン（ＥＯＸ）、ならびにパクリタキセル、イリノテカンおよびビノレルビンとの組合せ、タキサンを含む、または含まない放射線または化学放射線に対する応答者が同定される。
【００１９】
本発明は、ＲＥＣＩＳＴにより定義される全生存、無進行生存、無疾患生存、放射線応答、完全な応答、部分的応答、安定な疾患、ならびに限定されるものではないが、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３およびＣＡ１９−９などの血清マーカーなどの、異なる応答分類を用いた、薬物（ＤＮＡ損傷治療剤）に対する応答の予測に関する。本発明の他の実施形態においては、この応答の予測を用いて、単独または標準処置の文脈における、ＤＮＡ損傷組合せ療法により処置された食道がん（ＯＡＣ）の内視鏡超音波、ＣＴ、スパイラルＣＴ、ＦＤＧ−ＰＥＴ、病理学的、組織学的応答を評価することができる。
【００２０】
本発明は、元々は乳がんおよび卵巣がんにおいて同定された、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）分子サブタイプに依拠するものである（ＷＯ２０１２／０３７３７８；参照により本明細書に組み込まれる）。この分子サブタイプは、いくつかの実施形態においては、１つは遺伝子４０個からなり、１つは遺伝子４４個からなる２つの異なる遺伝子クラシファイアの使用により検出することができる。ＤＤＲＤクラシファイアは、最初は、Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｒｒａｙ（ＤＳＡ（商標））上の５３個のプローブセットからなるクラシファイアにより定義された。ＤＮＡ損傷剤含有化学療法レジメンに対する応答を予測する能力に関してこのクラシファイアの機能的妥当性を検証するために、遺伝子レベルでクラシファイアを再定義する必要があった。これにより、Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  ＤＳＡ（登録商標）以外のマイクロアレイプラットフォーム上でプロファイルされた独立データセットに由来するマイクロアレイデータを用いるＤＤＲＤクラシファイアの評価が容易になった。遺伝子レベルでクラシファイアを定義するのを容易にするために、Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  ＤＳＡ（登録商標）プローブセットがマッピングする遺伝子を定義する必要があった。これは、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅなどの公共的に利用可能なゲノムブラウザデータベースの利用を伴った。４４遺伝子のＤＤＲＤクラシファイアモデルは、４０遺伝子のＤＤＲＤクラシファイアモデルに取って代わるものである。本明細書で提示される結果は、４４遺伝子および４０遺伝子のクラシファイアモデルならびに本明細書に開示されるマーカーから導出される関連クラシファイアモデルは、ＯＡＣの文脈においてＤＮＡ損傷治療剤を含有する化学療法レジメンに対する応答の有効かつ有意な予測因子であることを証明する。
【００２１】
４０遺伝子クラシファイアモデル（表２Ａおよび表２Ｂを参照されたい）と４４遺伝子クラシファイアモデルとの両方などの、表１Ａおよび表１Ｂ（または表３および表４）から取られる遺伝子に基づくクラシファイアモデルを用いるＤＤＲＤサブタイプの同定によって、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤およびＤＮＡ修復を標的とする療法を含めた標準的なＯＡＣ治療薬クラスに対する応答を予測する、およびそのための患者を選択することができる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ＰＣＲならびにリアルタイム法および終点法およびｑＰＣＲなどのその全ての変法、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ、ならびに免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどのイムノアッセイを含む、核酸増幅などの上記に列挙された従来の診断的使用のためのキットに関する。そのようなキットは、遺伝子または遺伝子産物の発現をアッセイする、およびｍＲＮＡまたはタンパク質発現を定量するための適切な試薬および指示書を含む。キットは、表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表２Ａおよび／または表２Ｂおよび／または表３および／または表４中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを検出するための好適なプライマーおよび／またはプローブを含んでもよい。キットは、表１Ａ、表１Ｂおよび／または表３に記載の標的配列に結合するプライマーおよび／またはプローブを含有してもよい。標的配列は、配列番号１〜２４、配列番号２５〜５０または配列番号５１〜２３０を含む、本質的にからなる、またはからなっていてもよい。発現がタンパク質レベルで決定される場合、キットは対象のタンパク質に特異的な結合試薬を含有してもよい。結合試薬は、全ての断片およびその誘導体を含む抗体を含んでもよい。本発明の様々な実施形態の文脈においては、用語「抗体」は、関連するタンパク質に対する特異的結合親和性を有する全ての免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子（例えば、限定されるものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、その組合せ、および任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物における免疫応答の間に産生される同様の分子）を含む。本発明の様々な実施形態において有用な特異的免疫グロブリンは、ＩｇＧアイソタイプを含む。本発明の様々な実施形態において有用な抗体は、起源においてモノクローナルまたはポリクローナルであってもよいが、典型的には、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒト抗体、非ヒト抗体、またはヒト化型の非ヒト抗体、またはキメラ抗体であってもよい。抗体のヒト化のための様々な技術はしっかり確立されており、任意の好適な技術を用いることができる。用語「抗体」はまた、抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドも指し、それは関連するタンパク質に特異的に結合する能力を保持する全ての抗体誘導体および断片に拡張される。これらの誘導体および断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆｃ断片などを含んでもよい。用語「抗体」は、重鎖と軽鎖の両方を含む抗体だけでなく、重鎖（のみの）抗体（軟骨魚類またはラクダ科動物の様々な種から誘導することができる）も包含する。特定の実施形態においては、抗体を操作して、１つを超えるタンパク質に特異的に、例えば二重特異性にし、本明細書で同定される２つの異なる標的タンパク質への結合が可能になるようにすることができる（表１〜４を参照されたい）。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、キットはまた、試験が応答性を予測する事象において投与される特異的ＤＮＡ損傷治療剤を含有してもよい。この薬剤を、ＯＡＣ処置に対して特異的に調整される、剤形などの形態で提供することができる。キットを、ＯＡＣ処置レジメンによる投与のための好適な説明書と共に提供することができる。
【００２４】
本発明はまた、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）ヒトＯＡＣ腫瘍を同定するための方法も提供する。本発明を用いて、ＤＮＡを直接損傷する、ＤＮＡを間接的に損傷する、または正常なＤＮＡ損傷シグナリングおよび／もしくは修復プロセスを阻害する薬物などの、ＤＮＡ損傷治療剤に感受性である、および応答する、または耐性である、および応答しない患者を同定することができる可能性がある。
【００２５】
本発明はまた、患者の従来の処置の指導にも関する。本発明はまた、ＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接または間接に影響する薬物クラスなどの、新規ＤＮＡ損傷治療剤がＯＡＣの処置について特異的に試験される臨床試験のための患者の選択にも関する。
【００２６】
本発明および方法は、本発明における全ての転写物のアッセイのための、微細針吸引生検（ＦＮＡ）ならびに新鮮な／凍結された（ＦＦ）組織などの、保管されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された生検材料の使用に適合し、したがって、最も広く利用可能な型の生検材料と適合する。ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）などの溶液中で保存されたＦＦＰＥ組織、新鮮な凍結された組織または新鮮な組織から得られたＲＮＡを用いて、発現レベルを決定することができる。
【００２７】
別途定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である任意の方法、デバイス、および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、デバイスおよび材料をここで説明する。
【００２８】
本出願で引用される全ての刊行物、公開された特許文献、および特許出願は、本出願が関係する当技術分野における技術のレベルを示すものである。本明細書で引用される全ての刊行物、公開された特許文献、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が特異的かつ個別に参照により組み込まれると示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１または１より多い（すなわち、少なくとも１）の冠詞の文法的目的語を指す。例えば、「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、その反対であると明示的に示されない限り、１つのエレメントまたは１より多いエレメントを意味する。
【００３０】
がんにおける現在の研究努力の主な目標は、臨床治療決定に分子パラメータを組み入れることにより、患者における手術前後の全身療法の効能を増加させることである。薬理遺伝学／ゲノミクスは、外来化合物または薬物に対する個体の応答に関与する遺伝子／ゲノム因子に関する研究である。本発明のマーカーの発現に対する刺激効果または阻害効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与して、患者における食道がんを処置する（予防的または治療的に）ことができる。また、そのような処置と共に個体の薬理ゲノミクスを考慮することも理想的である。治療剤の代謝の差異は、薬理活性薬物の用量と血中濃度との関係を変化させることによって重篤な毒性または治療の失敗をもたらす可能性がある。かくして、個体の薬理ゲノミクスの理解により、予防的または治療的処置のための有効な薬剤（例えば、薬物）の選択が可能になる。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な用量および治療レジメンを決定することができる。したがって、個体における本発明のマーカーの発現レベルを決定することによって、個体の治療的または予防的処置のための適切な薬剤を選択することができる。
【００３１】
本発明は、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する応答性を予測するための、ある特定の食道がん組織中で発現される遺伝子または遺伝子産物マーカー（以後、「バイオマーカー」と呼ばれる）のコレクションの適用を対象とする。異なる態様において、このバイオマーカーの一覧は、マイクロアレイ、Ｑ−ＰＣＲ、ＮＧＳ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたはｍＲＮＡもしくはタンパク質発現を定量することができる他の技術などの、当技術分野で公知の方法を用いて送達することができる単一パラメータまたは多パラメータの予測試験の基礎を形成することができる。
【００３２】
本発明はまた、細胞傷害性化学療法後の予後診断または食道がん（特に、ＯＡＣ）のための特定の処置の選択にとって有用であるキットおよび方法に関する。いくつか、または全ての転写物が過剰発現または過少発現される場合、その発現プロファイルがＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性または耐性を示すような方法が提供される。これらのキットおよび方法は、食道腺癌（ＯＡＣ）を有する患者の腫瘍中で差次的に発現される遺伝子または遺伝子産物マーカーを用いる。本発明の一実施形態においては、これらのバイオマーカーの発現プロファイルは、発現プロファイルを１つまたは複数のＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性と相関させるデータベースまたはモデルを作出するための統計方法または相関モデルの下で、保管組織試料における臨床転帰（応答または生存）と相関させる。次いで、予測モデルを用いて、ＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性が不明である患者における応答性を予測することができる。多くの他の実施形態においては、患者集団を、患者の臨床転帰、予後、またはＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性に基づいて少なくとも２つのクラスに分割することができ、バイオマーカーは、これらのクラスの患者間でのクラス区別と実質的に相関する。本明細書に記載の生物学的経路は、ＤＮＡ損傷治療剤を用いるＯＡＣの処置に対する応答性を予測することが示されている。
【００３３】
予測マーカーパネル／発現クラシファイア
食道がん／ＯＡＣを処置するために用いられるＤＮＡ損傷治療剤などの、治療剤に対する応答性または耐性を決定するのに有用である、食道がん／ＯＡＣ組織において発現される遺伝子クラシファイアとしてのバイオマーカーのコレクションが提供される。そのようなコレクションを、「マーカーパネル」、「発現クラシファイア」または「クラシファイア」と呼ぶことができる。コレクションを表１に示す。このコレクションは、表１Ａおよび表１Ｂに示されるバイオマーカーの元のコレクションから得たものであり（ＷＯ２０１２／０３７３７８を参照されたい）、後に、ＯＡＣ関連プラットフォームにマッピングされた（本明細書の実施例を参照されたい）。表２Ｂに示される４４遺伝子クラシファイアなどのクラシファイアの適用により、ＤＮＡ損傷治療剤に対するＯＡＣ患者の応答性を決定することができる。本発明は、これらの遺伝子または標的配列の任意の１個または複数個の発現レベルを決定することを含んでもよい。
【００３４】
かくして、本発明の方法において有用なバイオマーカーは、表１〜表４に同定される。これらのバイオマーカーは、治療剤に対する患者（ＯＡＣを有する）の応答、またはその欠如を決定するための予測値を有すると同定される。それらの発現は、薬剤、より具体的には、ＤＮＡ損傷治療剤に対する応答と相関する。食道腫瘍、特に、腺癌または扁平上皮癌において同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を検査することにより、どの治療剤または薬剤の組合せががんの、いくつかの実施形態においてはＯＡＣ細胞の増殖速度を低下させる可能性が最も高いかを決定することができる。同定された転写物の遺伝子または遺伝子産物マーカーのコレクションを検査することにより、どの治療剤または薬剤の組合せが、がんの増殖速度を低下させる可能性が最も低いかを決定することもできる。したがって、バイオマーカーのコレクションの発現を検査することにより、無効な、または不適切な治療剤を排除することができる。重要なことは、ある特定の実施形態においては、これらの決定を、各患者毎に、または各薬剤毎に行うことができる。かくして、特定の治療レジメンが特定の患者もしくは患者型に恩恵を与える可能性があるかどうか、および／または特定のレジメンを継続するべきであるかどうかを決定することができる。
【００３５】
【表１Ａ−１】
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【表１Ａ−２】
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【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【００３６】
【表１Ｂ−１】
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【表１Ｂ−２】
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【００３７】
表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表３に記載されるバイオマーカーの全部または一部を、予測バイオマーカーパネルにおいて用いることができる。例えば、表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表３中のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーパネルを、本明細書に提供される方法を用いて作成し、これは、表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表３に記載のバイオマーカーの１個から全部およびその間の全ての組合せを含んでもよい（例えば、４個の選択されたバイオマーカー、１６個の選択されたバイオマーカー、７４個の選択されたバイオマーカーなど）。いくつかの実施形態においては、予測バイオマーカーセットは、少なくとも５、１０、２０、４０、６０、１００、１５０、２００、または３００個以上のバイオマーカーを含む。他の実施形態においては、予測バイオマーカーセットは、５、１０、２０、４０、６０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００または７００個以下のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態においては、予測バイオマーカーセットは、表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表３に列挙される複数のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態においては、予測バイオマーカーセットは、表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表３に列挙されるバイオマーカーの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％を含む。選択される予測バイオマーカーセットを、本明細書に記載の方法を用いて提供される予測バイオマーカーおよび当技術分野で公知の類似の方法を用いて集めることができる。一実施形態においては、バイオマーカーパネルは、表１に列挙される全部で５０個のバイオマーカーまたは表３に列挙される全てのバイオマーカーを含有する。別の実施形態においては、バイオマーカーパネルは、表２Ａおよび表２Ｂに記載の４０遺伝子パネルまたは４４遺伝子パネルに対応する。
【００３８】
予測バイオマーカーセットを、様々な大きさの実数値を持つ、対応するスカラー重みとの組み合わせで定義し、これをさらに線形もしくは非線形、代数、三角または相関手段により、代数、統計学習、ベイズ、回帰、または同様のアルゴリズムを介し組み合わせて、単一のスカラー値を得ることができる。この単一のスカラー値は、それに関する数学的に導出された決定関数と共に用いると、試料からの発現プロファイルを、特定の薬物または薬物クラスに対する応答者または非応答者、耐性または非耐性の個別のクラスに分けることができる予測モデルが得られる。バイオマーカーメンバーシップを含むそのような予測モデルは、既知の薬物応答および／もしくは耐性または既知の分子サブタイプ（すなわち、ＤＤＲＤ）分類を有する歴史的患者試料からの代表的な発現プロファイルのセットから、クロス確認、ブートストラップまたは同様のサンプリング技術によって、重みおよびその決定閾値が、感度、特異性、陰性および陽性予測値、ハザード比またはその任意の組合せについて最適化されるように学習させることにより開発される。
【００３９】
一実施形態においては、バイオマーカーを用いて、各々は正でも負でもよい重みを付けた、シグナルの和を得る。得られた和（「決定関数」）を、所定の参照点または値と比較する。参照点または値との比較によって、臨床状態または転帰を診断または予測することができる。
【００４０】
上記のように、当業者であれば、表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表３に提供されるクラシファイアまたは複数のクラシファイアに含まれるバイオマーカーが、治療剤に対する応答性または耐性に関するクラシファイアにおいて、その重みが等しくならないことを理解できる。したがって、わずか１個の配列を用いて、治療剤に対する応答性などの転帰を診断または予測してもよいが、特異性および感度または診断精度もしくは予測精度は、より多くの配列を用いることによって増大させることができる。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語「重み」とは、統計計算における項目の相対的重要性を指す。遺伝子発現クラシファイアにおける各バイオマーカーの重みを、当技術分野で公知の分析方法を用いて患者試料のデータセット上で決定することができる。遺伝子特異的バイアス値を適用することもできる。遺伝子特異的バイアスは、当業者には理解されるように、訓練データセットと比較してクラシファイアにおける各遺伝子を平均中心化（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｒｅ）するのに必要であり得る。特異的バイアス値を、表４に提示し、本発明の方法およびキットに従って適用することができる。
【００４２】
一実施形態においては、バイオマーカーパネルは、例えば、疾患設定に応じて、表に詳述される対応する順位および重みまたは代替的な順位付けおよび重み付けと共に、表２Ａに詳述される４０個のバイオマーカーを対象とする。別の実施形態においては、バイオマーカーパネルは、例えば、疾患設定に応じて、表に詳述される対応する順位および重みまたは代替的な順位付けおよび重み付けと共に、表２Ｂに詳述される４４個のバイオマーカーを対象とする。表２Ａおよび表２Ｂは、クロス確認下で測定される複合決定スコア関数における平均重みの順位として定義される、クラシファイアにおける重みが減少する順序で、バイオマーカーを順位付ける。別の実施形態においては、バイオマーカーパネルは、表４に詳述される対応する順位、重みおよびバイアス、または例えば疾患設定に応じた、代替的な順位付け、重み付けおよびバイアスと共に表４に詳述される４４個のバイオマーカーを対象とする。
【００４３】
【表２Ａ−１】
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【表２Ａ−２】
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【００４４】
【表２Ｂ−１】
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【表２Ｂ−２】
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【００４５】
表３は、表２Ａおよび表２Ｂ中の遺伝子に対応する、Ｘｃｅｌ  Ａｒｒａｙ（Ａｌｍａｃ）に由来するプローブセットを、その配列番号を参照しつつ提示する。
【００４６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【００４７】
【表４】
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【００４８】
異なる実施形態においては、表１Ａおよび／または表１Ｂ、表２Ａおよび／または表２Ｂおよび／または表３および／または表４に列挙されるバイオマーカーのサブセットを、本明細書に記載の方法において用いることができる。これらのサブセットは、限定されるものではないが、表２Ａまたは表２Ｂにおいて１〜２位、１〜３位、１〜４位、１〜５位、１〜１０位、１〜２０位、１〜３０位、１〜４０位、１〜４４位、６〜１０位、１１〜１５位、１６〜２０位、２１〜２５位、２６〜３０位、３１〜３５位、３６〜４０位、３６〜４４位、１１〜２０位、２１〜３０位、３１〜４０位および３１〜４４位のバイオマーカーを含む。
【００４９】
一態様において、治療応答性は、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１およびＭＸ１の少なくとも１個と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーとに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において予測される。本明細書で用いられる場合、用語「バイオマーカー」は、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、または遺伝子発現レベルもしくはタンパク質産生レベルを示す任意の他の核酸配列もしくはポリペプチド配列を指してもよい。いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、またはＡＬ１３７２１８．１のバイオマーカーを言う場合、バイオマーカーは、それぞれ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、またはＡＬ１３７２１８．１のｍＲＮＡを含む。さらなる、または他の実施形態においては、ＭＸ１、ＧＢＰ５、ＩＦ１４４Ｌ、ＢＩＲＣ３、ＩＧＪ、ＩＱＧＡＰ３、ＬＯＣ１００２９４４５９、ＳＩＸ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＴＡＴ１、ＴＯＢ１、ＵＢＤ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ２ｏｒｆ１４、ＥＰＳＴＩ、ＧＡＬＮＴ６、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＫＩＡＡ１２４４、ＬＯＣ１００２８７９２７、ＬＯＣ１００２９１６８２、またはＬＯＣ１００２９３６７９のバイオマーカーを言う場合、バイオマーカーは、それぞれ、ＭＸ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＢＩＲＣ３、ＩＧＪ、ＩＱＧＡＰ３、ＬＯＣ１００２９４４５９、ＳＩＸ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＴＡＴ１、ＴＯＢ１、ＵＢＤ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ２ｏｒｆ１４、ＥＰＳＴＩ、ＧＡＬＮＴ６、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＫＩＡＡ１２４４、ＬＯＣ１００２８７９２７、ＬＯＣ１００２９１６８２、またはＬＯＣ１００２９３６７９のアンチセンス転写物を含む。
【００５０】
さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１およびＭＸ１と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＧＢＰ５と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＣＸＣＬ１０と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＩＤＯ１と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＭＸ−１と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。
【００５１】
さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１およびＩＦ１４４Ｌの少なくとも２個と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーとに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１およびＩＦ１４４Ｌと、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＣＸＣＬ１０と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＭＸ１と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＩＤＯ１と、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。さらなる態様において、個体から得られる試験（生物）試料上でアッセイを行うこと、ならびにそれぞれ、バイオマーカーＩＦ１４４Ｌと、表２Ｂ中のバイオマーカーの一覧から選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーの１個とに対応するバイオマーカー値であって、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に等しい、バイオマーカー値を検出することにより、個体において、治療応答性が予測されるか、またはがん診断が示される。
【００５２】
他の実施形態においては、表１Ａ、表１Ｂおよび／もしくは表３に列挙される標的配列、またはそのサブセットを、本明細書に記載の方法において用いることができる。標的配列を、標的配列にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを設計する目的で用いることができる。一度、標的配列が同定されたら、好適なプライマーおよび／またはプローブの設計は、当業者の能力の範囲内にある。ＮＣＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴツールなどのこのプロセスを支援するための様々なプライマー設計手段が自由に利用可能である。Ye et al, BMC Bioinformatics. 13:134 (2012)を参照されたい。プライマーおよび／またはプローブがストリンジェントな条件下で（本明細書に定義される）標的配列にハイブリダイズするように、それらを設計することができる。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５（またはそれ以上）のヌクレオチド長であってもよい。各サブセットは同じバイオマーカーに対する複数のプライマーおよび／またはプローブを含んでもよいことが理解されるべきである。表は、いくつかの場合、同じ遺伝子全体内の複数の標的配列を示す。そのようなプライマーおよび／またはプローブを、本発明の方法を実施するのに有用なキット中に含有させることができる。キットは、例えば、アレイまたはＰＣＲに基づくキットであってもよく、例えば、ポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰなどの、さらなる試薬を含んでもよい。
【００５３】
クラシファイアモデルを用いる遺伝子発現の測定
様々な方法が、バイオマーカーを同定し、疾患を診断する試みにおいて用いられてきた。タンパク質に基づくマーカーについては、これらのものは２次元電気泳動、質量分析、およびイムノアッセイ法を含む。核酸マーカーについては、これらのものはｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、配列決定、ＦＩＳＨ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、メチル化プロファイル、および大規模遺伝子発現アレイを含む。
【００５４】
バイオマーカーが、個体における異常なプロセスの兆候、疾患または他の状態を示すか、または個体における異常なプロセスの兆候、疾患または他の状態である場合、そのバイオマーカーは一般に、個体における正常なプロセスの兆候、疾患または他の状態の非存在を示すか、または個体における正常なプロセスの兆候、疾患または他の状態の非存在であるバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して、過剰発現または過少発現されると記載される。「上方調節」、「上方調節された」、「過剰発現」、「過剰発現された」およびその任意の変形は、健康または正常な個体からの同様の生物試料において典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）よりも大きい、生物試料におけるバイオマーカーの値またはレベルを指すように互換的に用いられる。この用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）より大きい、生物試料におけるバイオマーカーの値またはレベルを指してもよい。
【００５５】
「下方調節」、「下方調節された」、「過少発現」、「過少発現された」およびその任意の変形は、健康または正常な個体からの同様の生物試料において典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）よりも小さい、生物試料におけるバイオマーカーの値またはレベルを指すように互換的に用いられる。この用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）より小さい、生物試料におけるバイオマーカーの値またはレベルを指してもよい。
【００５６】
さらに、過剰発現されるか、または過少発現されるバイオマーカーを、個体における正常なプロセスの兆候または疾患もしくは他の状態の非存在を示すか、または個体における正常なプロセスの兆候または疾患もしくは他の状態の非存在であるバイオマーカーの「正常な」発現レベルまたは値と比較して「差次的に発現される」または「差次的レベル」もしくは「差次的値」を有すると言うこともできる。かくして、バイオマーカーの「差次的発現」を、バイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変動と言うこともできる。
【００５７】
用語「差次的バイオマーカー発現」と「差次的発現」は、正常な対象におけるその発現と比較して、または特定の療法に差次的に応答するか、もしくは異なる予後を有する患者におけるその発現と比較して、特定の疾患に罹患している対象において発現がより高いか、またはより低いレベルに活性化されるバイオマーカーを指すように互換的に用いられる。この用語はまた、同じ疾患の異なる段階で発現がより高いか、またはより低いレベルに活性化されるバイオマーカーをも含む。また、差次的に発現されるバイオマーカーを、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害されているか、または異なるポリペプチド産物をもたらす選択的スプライシングを受けていることがあることも理解される。そのような差異を、ｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、アンチセンス転写物レベル、またはポリペプチドのタンパク質表面発現、分泌もしくは他の分配などの様々な変化により証明することができる。差次的バイオマーカー発現は、２個以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比較；または２個以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比の比較；またはさらに、正常な対象と疾患に罹患している対象との間；もしくは同じ疾患の様々な段階間で異なる、同じ遺伝子の２個の差次的にプロセッシングされた産物の比較を含んでもよい。差次的発現は、例えば、正常細胞と疾患細胞、または異なる疾患事象もしくは疾患段階を受けた細胞の間での、バイオマーカーの時間的または細胞的発現パターンの、定量的ならびに定性的な差異の両方を含む。
【００５８】
ある特定の実施形態においては、得られる発現プロファイルは、試料における１個または複数個の核酸の量またはレベルが決定されている、ゲノムまたは核酸発現プロファイルである。これらの実施形態においては、診断方法または予後診断方法において用いられる発現プロファイルを作成するため（すなわち、試料における１個または複数個のバイオマーカーの発現レベルを測定するため）にアッセイされる試料は、核酸試料を含む。核酸試料は、分析される細胞または組織の表現型決定バイオマーカーの発現情報を含む核酸の集団を含む。いくつかの実施形態においては、試料が、それが得られる宿主細胞または組織の発現情報を保持する限り、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡなどを含んでもよい。試料を、当技術分野で公知のように、いくつかの異なる方法で、例えば、単離されたｍＲＮＡが、差次的遺伝子発現の分野で公知のように、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどを調製するために単離された、増幅された、または使用されたものとして用いられる、細胞からのｍＲＮＡ単離により調製することができる。したがって、試料におけるｍＲＮＡのレベルの決定は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを調製した後、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを測定することを含む。試料は、典型的には、例えば、標準的なプロトコールを用いる、組織生検により、処置を必要とする対象から収獲された細胞または組織から調製され、そのような核酸を生成することができる細胞型または組織は、限定されるものではないが、疾患細胞または組織、体液などの、決定しようとする表現型の発現パターンが存在する任意の組織を含む。
【００５９】
試験試料における１個または複数個のバイオマーカーの測定される発現レベルを表す発現プロファイルを、任意の都合のよいプロトコールを用いて初期核酸試料から作成することができる。差次的遺伝子発現／バイオマーカー分析の分野で用いられるものなどの、発現プロファイルを作成する様々な異なる様式が公知であるが、発現プロファイルを作成するための１つの代表的かつ都合のよい型のプロトコールは、アレイに基づく遺伝子発現プロファイル作成プロトコールである。そのような適用は、数千もの遺伝子の各々のためのいくつかのプローブが固定されている（ガラス）チップなどの表面が用いられるハイブリダイゼーションアッセイである。これらの表面上に、一般に、分析しようとする各遺伝子内の複数の標的領域、および標的領域あたり複数の（通常は１１〜１００）のプローブが存在する。このように、各遺伝子の発現は、表面上の複数（数十）のプローブへのハイブリダイゼーションにより評価される。これらのアッセイにおいては、標的核酸の試料を、アッセイされる初期核酸試料から最初に調製し、ここで、調製は標識、例えば、シグナル産生システムの要素を用いた標的核酸の標識化を含んでもよい。標的核酸試料調製の後、試料を、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させ、それによって、複合体を、アレイ表面に結合したプローブ配列と相補的である標的核酸間で形成させる。次いで、ハイブリダイズした複合体の存在を、定性的または定量的に検出する。対象方法において用いられる発現プロファイルを作成するために実施することができる特定のハイブリダイゼーション技術は、米国特許第５，１４３，８５４号；第５，２８８，６４４号；第５，３２４，６３３号；第５，４３２，０４９号；第５，４７０，７１０号；第５，４９２，８０６号；第５，５０３，９８０号；第５，５１０，２７０号；第５，５２５，４６４号；第５，５４７，８３９号；第５，５８０，７３２号；第５，６６１，０２８号；第５，８００，９９２号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）；ならびにＷＯ９５／２１２６５；ＷＯ９６／３１６２２；ＷＯ９７／１０３６５；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ３７３２０３；およびＥＰ７８５２８０に記載の技術を含む。これらの方法において、発現をアッセイしようとするバイオマーカーのそれぞれのための１個またはいくつかのプローブを含む「プローブ」核酸のアレイを、上記の標的核酸と接触させる。接触を、ハイブリダイゼーション条件下、例えば、上記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実行した後、未結合の核酸を除去する。ハイブリダイズした核酸の得られるパターンは、プローブ化されたそれぞれのバイオマーカーのための発現に関する情報を提供し、ここで、発現情報は、遺伝子が発現されるかどうか、典型的には、どんなレベルで、発現データ、すなわち、発現プロファイルが定性的および定量的の両方であり得るかに関するものである。前記方法は、アレイ上の他のプローブのサブセットまたは全部に対するハイブリダイゼーションパターンを正規化することを含んでもよい。
【００６０】
バイオマーカー発現クラシファイアの作出
一実施形態においては、がん組織におけるバイオマーカーの相対発現レベルを測定して、遺伝子発現プロファイルを得る。患者組織試料からのバイオマーカーのセットの遺伝子発現プロファイルを、複合決定スコア（または試験スコア）の形態でまとめ、患者データの訓練セットから数学的に導出することができるスコア閾値と比較する。スコア閾値は、それに限定されないが、処置に対する応答性／非応答性などの異なる特徴に基づいて患者群を分離する。患者訓練セットデータは、好ましくは、予後、再発の可能性、長期生存、臨床転帰、処置応答、診断、がん分類、または個別のゲノミクスプロファイルにより特徴付けられたＯＡＣ組織試料に由来する。あるいは、それは分子サブタイプ（ＤＤＲＤ）が明確に定義され、特徴付けられた患者のコホートに由来するデータセットであってもよい。発現プロファイル、および患者試料からの対応する決定スコア（試験スコア）を、数学的に導出されるスコア決定閾値の同じ側にある訓練セットにおける患者試料の特徴と相関させることができる。線形クラシファイアのスカラー出力の閾値を最適化して、訓練データセット内で観察されるクロス確認下での感度および特異性の合計を最大化することができる。あるいは、異なる疾患適応における試験の提唱される臨床有用性に応じて、アッセイの感度および陽性予測値を、特異性および陰性予測値を犠牲にして増大させることができるし、その逆もまた可能である。
【００６１】
所与の試料に関する全体的な発現データを、当業者には公知の方法を用いて正規化して、異なる量の出発材料、変化する抽出および増幅反応の効率などについて補正する。診断または予後判定（例えば、治療剤に対する応答性または耐性）を行うために正規化されたデータ上での線形クラシファイアの使用は、データ空間、すなわち、クラシファイア中の全遺伝子に関する発現値の全ての可能な組合せを、分離超平面によって２つの互いに素な半分に分割することを実際に意味する。この分割は、例えば、治療剤に対する応答性または耐性を示す患者に基づき、大きなセットの訓練例において経験的に導出することができる。当業者であれば、一般性を失うことなく、１個を除く全バイオマーカーに対し、ある特定のセットの値が固定されていたと仮定することができるが、この場合には決定は、例えば、治療剤に対し応答性か耐性かで変化することになり、残りのその１個のバイオマーカーの閾値は自動的に定まる。次いで、この動的閾値を上回る発現値は、治療剤に対する耐性（負の重みを有するバイオマーカーについて）または応答性（正の重みを有するバイオマーカーについて）のいずれかを示す。この閾値の正確な値は、クラシファイア内の他の全てのバイオマーカーの実際に測定される発現プロファイルに依存するが、ある特定のバイオマーカーの大体の傾向は変わらない。すなわち、高い値または「相対的過剰発現」は常に応答性（正の重みを有する遺伝子）または耐性（負の重みを有する遺伝子）のいずれかに寄与する。したがって、全体的な遺伝子発現クラシファイアの文脈においては、相対的発現は、ある特定のバイオマーカーの上方または下方調節が治療剤に対する応答性または耐性を示すかどうかを示し得る。
【００６２】
一実施形態においては、試験試料、例えば、患者組織試料のバイオマーカー発現プロファイルは、線形クラシファイアによって評価される。本明細書で用いられる場合、線形クラシファイアとは、複合決定スコア中での個々のバイオマーカー強度の重み付け和（「決定関数」）を指す。次いで、決定スコアを、感度および特異性に関する特定の設定点に対応する、所定のカットオフスコア閾値と比較し、これによって、試料がスコア閾値を上回る（決定関数陽性）か、または下回る（決定関数陰性）かが示される。
【００６３】
実際には、これは、データ空間、すなわち、バイオマーカー発現値の全ての可能な組合せのセットが、例えば、一方は治療剤に対する応答性に対応し、他方は耐性に対応する、異なる臨床分類または予測に対応する２つの相互排他的な半分に分割されることを意味する。全体的なクラシファイアの文脈においては、ある特定のバイオマーカーの相対的過剰発現は、決定スコア（正の重み）を増加させるか、またはそれを減少させ（負の重み）、かくして、例えば、治療剤に対する応答性または耐性の決定全体に寄与することができる。
【００６４】
用語「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積を指し、両方とも当技術分野で周知である。ＡＵＣ尺度は、完全なデータ範囲にわたってクラシファイアの精度を比較するのに有用である。より高いＡＵＣを有するクラシファイアは、対象の２群（例えば、ＯＡＣがん試料と正常または対照試料）間で未知のものを正確に分類するより高い能力を有する。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば、治療剤に応答する個体と応答しない個体）間を識別する際に特定の特徴（例えば、本明細書に記載の任意のバイオマーカーおよび／またはさらなる生体医学情報の任意の項目）の性能をプロットするのに有用である。典型的には、集団全体にわたる特徴データ（例えば、事例および対照）は、単一の特徴の値に基づいて昇順に選別される。かくして、その特徴の各値について、データに関する真陽性率および偽陽性率が算出される。真陽性率は、その特徴に関する値を上回る事例数を計数した後、それを事例の総数で除算することにより決定される。偽陽性率は、その特徴に関する値を上回る対照数を計数した後、それを対照の総数で除算することにより算出される。この定義は、特徴が対照と比較して事例において高いシナリオを指すが、この定義は、特徴が対照と比較して事例において低いシナリオにも適用される（そのようなシナリオにおいては、その特徴に関する値を下回る試料を計数する）。ＲＯＣ曲線を、単一の特徴について、ならびに他の単一の出力について作成することができ、例えば、２つ以上の特徴の組合せを数学的に組み合わせて（例えば、加算、減算、乗算するなど）、単一の合計値を得、この単一の合計値をＲＯＣ曲線としてプロットすることができる。さらに、複数の特徴からなる、単一の出力値が導出される任意の組合せを、ＲＯＣ曲線としてプロットすることができる。これらの特徴の組合せは、試験を含んでもよい。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１−特異性）に対する試験の真陽性率（感度）のプロットである。
【００６５】
この量、すなわち、治療剤に対するカットオフ閾値応答性または耐性の解釈は、開発フェーズ（「訓練」）において、既知の転帰を有する患者セットから導出される。決定スコアに関する対応する重みおよび応答性／耐性カットオフ閾値は、当業者には公知の方法により訓練データから事前に固定される。本発明の方法の好ましい実施形態においては、部分最小二乗識別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）が、重みを決定するために用いられる（L. Stahle, S. Wold, J. Chemom. 1 (1987) 185-196; D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioinformatics 18 (2002) 39-50）。例えば、食道がん（ＯＡＣ）クラシファイアの転写物に適用される場合、当業者には公知の、分類を実施するための他の方法を、本明細書に記載の方法と共に用いることもできる。
【００６６】
異なる方法を用いて、これらのバイオマーカー上で測定された定量データを予後診断または他の予測的使用に変換することができる。これらの方法としては、限定されるものではないが、パターン認識（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）、機械学習（Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995）、統計学（Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001）、バイオインフォマティクス（Dudoit et al., 2002, J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572）または計量化学（Vandeginste, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998）の分野に由来する方法が挙げられる。
【００６７】
訓練工程においては、応答性／耐性事例の両方に関する患者試料のセットを測定し、訓練セットまたは将来の試料セットを最適に予測するように、この訓練データからの固有の情報を用いて予測方法を最適化する。この訓練工程において、用いられる方法を訓練またはパラメータ化して、特定の強度パターンから特定の予測判定まで予測する。測定されたデータは、予後診断方法またはアルゴリズムにかける前に、好適な変換または前処理工程を施してもよい。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態においては、各転写物に関する前処理された強度値の重み付け和を得た上でこれを、訓練セット上で最適化された閾値と比較する（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）。重みは、それに限定されないが、部分最小二乗法（ＰＬＳ、（Nguyen et al., 2002, Bioinformatics 18 (2002) 39-50））またはサポートベクターマシン（ＳＶＭ、（Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002））などの複数の線形分類法により導出することができる。
【００６９】
本発明の別の実施形態においては、データを非線形的に変換してから、上記の重み付け和を適用する。この非線形変換は、データの次元数を増加させることを含んでもよい。非線形変換および重み付け和を、例えば、カーネル関数の使用により、暗示的に実施することもできる（Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002）。
【００７０】
本発明の別の実施形態においては、新しいデータ試料を、現実に測定される訓練試料または人工的に作出されるプロトタイプのいずれかである、２つ以上のクラス・プロトタイプと比較する。この比較を、好適な類似性尺度、例えば、限定されるものではないが、ユークリッド距離（Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）、相関係数（Van’t Veer, et al. 2002, Nature 415:530）などを用いて実施する。次いで、新しい試料を、最も近いプロトタイプの予後診断群、または近傍にあるプロトタイプの数が最も多い予後診断群に割り当てる。
【００７１】
本発明の別の実施形態においては、決定木（Hastie et al., The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001）またはランダムフォレスト（Breiman, Random Forests, Machine Learning 45:5 2001）を用いて、転写物セットまたはその産物に関する測定された強度データから予後診断判定を作製する。
【００７２】
本発明の別の実施形態においては、ニューラルネットワーク（Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995）を用いて、転写物セットまたはその産物に関する測定された強度データから予後診断判定を作製する。
【００７３】
本発明の別の実施形態においては、限定されるものではないが、線形、対角線形、二次およびロジスティック判別分析を含む判別分析（Duda et al., Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001）を用いて、転写物セットまたはその産物に関する測定された強度データから予後診断判定を作製する。
【００７４】
本発明の別の実施形態においては、マイクロアレイに関する予測分析（ＰＡＭ、（Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572））を用いて、転写物セットまたはその産物に関する測定された強度データから予後診断判定を作製する。
【００７５】
本発明の別の実施形態においては、クラス類似性のソフト独立モデリング（ＳＩＭＣＡ：Ｓｏｆｔ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓ  Ａｎａｌｏｇｙ、（Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139））を用いて、転写物セットまたはその産物に関する測定された強度データから予後診断判定を作製する。
【００７６】
本発明の別の実施形態においては、ｃ指標を用いて、予測能力を定量化する。この指標は、打切り可能な連続応答変数にバイオマーカーを適用する。ｃ指標は、より高い予測生存を示す対象がより長く生存した対象であるように生存時間を順序付けることができる全ての対象対の割合である。両対象が打ち切られる場合、または一方が失敗し、他方の追跡時間が最初の対象の失敗時間より短い場合、２つの対象の生存時間は順序付けることができない。ｃ指標は、予測される生存と観察された生存との間の一致の確率であり、無作為予測についてはｃ＝０．５であり、完全に判別するモデルについてはｃ＝１である（Frank E. Harrell, Jr. Regression Modeling Strategies, 2001）。
【００７７】
治療剤
上記のように、本明細書に記載の方法により、初期のＯＡＣを含む、ＯＡＣに罹患する患者を、異常なＤＮＡ修復を示す腫瘍を標的とする治療剤（本明細書では以後、「ＤＮＡ損傷治療剤」と呼ぶ）に対して応答性または非応答性であると分類することができる。本明細書で用いられる「ＤＮＡ損傷治療剤」は、ＤＮＡを直接損傷することが知られる薬剤、ＤＮＡ損傷修復を防止する薬剤、ＤＮＡ損傷シグナリングを阻害する薬剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止を阻害する薬剤、およびＤＮＡ損傷を間接的にもたらすプロセスを阻害する薬剤を含む。ＯＡＣを処置するために用いられるいくつかの現在のそのような治療剤としては、限定されるものではないが、以下のＤＮＡ損傷治療剤が挙げられる。
【００７８】
１）ＤＮＡ損傷剤：
ａ．アルキル化剤（シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンなどの白金含有剤；シクロホスファミド；ブスルファン）
ｂ．トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン；トポテカン）
ｃ．トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド；ドキソルビシンおよびエピルビシンなどのアントラサイクリン）
ｄ．イオン化放射線。
【００７９】
２）ＤＮＡ修復を標的とする療法：
ａ．非相同末端連結の阻害剤（ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、ＮＵ７０２６）
ｂ．相同組換えの阻害剤
ｃ．ヌクレオチド切出し修復の阻害剤
ｄ．塩基切出し修復の阻害剤（ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ１阻害剤、ＡＰＥＸ２阻害剤、リガーゼＩＩＩ阻害剤）
ｅ．ファンコニ貧血経路の阻害剤。
【００８０】
３）ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤：
ａ．ＡＴＭ阻害剤（ＣＰ４６６７２２）
ｂ．ＣＨＫ１阻害剤（ＸＬ−８４４、ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ００４７７７３６）
ｃ．ＣＨＫ２阻害剤（ＸＬ−８４４、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ００４７７７３６）
ｄ．ＡＴＲ阻害剤（ＡＺ２０）。
【００８１】
４）ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤
ａ．Ｗｅｅｋ１キナーゼ阻害剤
ｂ．ＣＤＣ２５ａ、ｂまたはｃ阻害剤。
【００８２】
５）ＤＮＡ損傷を間接的にもたらすプロセスの阻害剤
ａ．ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
ｂ．熱ショックタンパク質阻害剤（ゲルダナマイシン、ＡＵＹ９２２）。
【００８３】
６）ＤＮＡ合成の阻害剤：
ａ．ピリミジンアナログ（５−ＦＵ、ゲムシタビン）
ｂ．プロドラッグ（カペシタビン）。
【００８４】
上記で考察された通り、応答性が予測される治療剤を、ネオアジュバント設定において適用することができる。しかしながら、それらを、さらに、またはあるいは、アジュバント設定において用いることもできる。
【００８５】
本明細書に記載の発明は、いずれか１つのＤＮＡ損傷治療剤に限定されない；それを用いて、ある範囲のＤＮＡ損傷治療剤のいずれか、例えば、ＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接または間接に影響するものに対する応答者および非応答者を同定することができる。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復を標的とする療法、ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤およびＤＮＡ合成の阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の物質を含む。より具体的には、ＤＮＡ損傷治療剤を、白金含有剤、ヌクレオシドアナログ、例えば、ゲムシタビンもしくは５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグ、例えば、カペシタビン、アントラサイクリン、例えば、エピルビシンまたはドキソルビシン、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、イオン化放射線または（イオン化）放射線と化学療法の組合せ（化学放射線）のうちの１つまたは複数から選択することができる。特定の実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤は、白金含有剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系薬剤を含む。この方法およびキットは、さらなる療法（放射線など）または薬物と一緒のＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する応答性を予測することができる。かくして、この方法およびキットは、組合せ療法に対する応答性を予測することができる。いくつかの実施形態においては、さらなる薬物は、分裂阻害剤である。分裂阻害剤は、ビンカアルカロイドまたはタキサンであってもよい。特定の実施形態においては、ビンカアルカロイドは、ビノレルビンである。他の実施形態においては、タキサンはパクリタキセルまたはドセタキセルである。ある特定の実施形態においては、以下の処置に対する応答者が同定される：ＯＡＣの処置における、シスプラチン／カルボプラチンおよび５−フルオロウラシル（ＣＦ）、シスプラチン／カルボプラチンおよびカペシタビン（ＣＸ）、エピルビシン／ドキソルビシン、シスプラチン／カルボプラチンおよびフルオロウラシル（ＥＣＦ）、エピルビシン／ドキソルビシン、オキサリプラチンおよびカペシタビン（ＥＯＸ）、ならびにパクリタキセル、イリノテカンおよびビノレルビンとの組合せ、タキサンを含む、または含まない放射線または化学放射線。
【００８６】
疾患および組織源
本明細書に記載の予測クラシファイアは、食道がん、特に、ＯＡＣを処置するための治療剤に対する応答性または耐性を決定するのに有用である。食道がんは、典型的には、食道腺癌（ＯＡＣ）であり、早期であってもよい。
【００８７】
一実施形態においては、本明細書に記載の方法は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復を標的とする療法、ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、ＤＮＡ損傷を間接的にもたらすプロセスの阻害およびＤＮＡ合成の阻害のクラスの化学療法剤で処置されるＯＡＣを指すが、これらのクラスに限定されない。これらの化学療法剤はそれぞれ、この用語が本明細書で用いられる「ＤＮＡ損傷治療剤」と考えられる。
【００８８】
「生物試料」、「試料」および「試験試料」は、個体から得られるか、またはそうでなければそれらに由来する任意の材料、生物学的流体、組織、または細胞を指すように互換的に用いられる。これは、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、軟膜、血漿、および血清を含む）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引物、呼気、尿、精液、唾液、髄液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、腹水、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液を含む。これはまた、前記のものの全部の実験的に分離された画分も含む。例えば、血液試料を、血清中または赤色血液細胞もしくは白色血液細胞（白血球）などの特定の型の血液細胞を含有する画分に分画することができる。必要に応じて、試料は、組織と体液試料との組合せなどの、個体に由来する試料の組合せであってもよい。用語「生物試料」はまた、例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検などに由来する、均一化された固体材料を含有する材料も含む。用語「生物試料」はまた、組織培養物または細胞培養物に由来する材料も含む。生物試料を得るための任意の好適な方法を用いることができる；例示的な方法としては、例えば、静脈切開術、スワブ（例えば、口内スワブ）、および微細針吸引生検手順を含む。いくつかの実施形態においては、試料を内視鏡検査により得ることができる。個体から得られるか、または個体に由来する「生物試料」は、個体から得られた後、任意の好適な様式で処理された任意のそのような試料を含む。
【００８９】
そのような場合、標的細胞は、腫瘍細胞、例えば、ＯＡＣ細胞であってもよい。標的細胞は、限定されるものではないが、新しく得られた試料、凍結試料、生検試料、体液の試料、血液試料、パラフィン包埋固定組織試料（すなわち、組織ブロック）などの保存された組織、または細胞培養物などの、ヒトおよび動物の組織を含む任意の組織源に由来する。
【００９０】
いくつかの特定の実施形態においては、試料は、媒体を含むか、または含まなくてもよい。
【００９１】
方法およびキット
遺伝子発現分析のためのキット
本明細書に記載の方法を実施するための試薬、手段、および／または説明書を、キットとして提供することができる。例えば、キットは、食道がん患者のための適切な療法を決定するための試薬、手段、および説明書を含有してもよい。そのようなキットは、生検などにより患者から組織試料を採取するための試薬、および組織を処理するための試薬を含んでもよい。キットはまた、患者の試料におけるバイオマーカーの発現レベルを決定するためのＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、プロテオミック分析、または免疫組織化学分析を含めた、核酸増幅を実施するための試薬などの、バイオマーカー発現分析を実施するための１つまたは複数の試薬を含んでもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマー、ノーザンブロット分析を実施するためのプローブ、および／またはウェスタンブロット、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡ分析などのプロテオミック分析を実施するための抗体を、そのようなキット中に含有させることができる。アッセイのための適切なバッファーを含有させることもできる。これらのアッセイのいずれかにとって必要な検出試薬を含有させることもできる。適切な試薬および方法は、本明細書でさらに詳細に説明される。
【００９２】
ある特定の実施形態においては、表１Ａ（配列番号１〜２４）、表１Ｂ（配列番号２５〜５０）および／もしくは表３（配列番号５１〜２３０）に列挙される標的配列、またはそのサブセットを、本明細書に記載の方法およびキットにおいて用いることができる。標的配列は、標的配列にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを設計する目的で用いることができる。一度、標的配列が同定されたら、好適なプライマーおよび／またはプローブの設計は当業者の能力の範囲内である。ＮＣＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴツールなどの、このプロセスを支援するための様々なプライマー設計ツールが自由に利用可能である。プライマーおよび／またはプローブが、ストリンジェントな条件下で標的配列にハイブリダイズするように、それらを設計することができる。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５（またはそれ以上）ヌクレオチドの長さであってもよい。各サブセットは、同じバイオマーカーに対する複数のプライマーおよび／またはプローブを含んでもよいことが理解されるべきである。これらの表は、いくつかの場合、同じ全遺伝子内の複数の標的配列を示す。そのようなプライマーおよび／またはプローブを、本発明の方法を実施するのに有用なキット中に含有させることができる。キットは、例えば、アレイまたはＰＣＲに基づくキットであってもよく、例えば、ポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰなどのさらなる試薬を含んでもよい。本明細書で特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現を測定するためのアッセイを実施するための方法を記載する説明書を含んでもよい。説明書はまた、参照コホートにおけるバイオマーカーの発現レベルを決定する方法および試験患者との比較のための参照を確立するための発現データを集める方法などの、参照コホートを決定するための方法に関する指示を含んでもよい。説明書は、試験患者におけるバイオマーカー発現をアッセイするため、および発現レベルと、参照コホートにおける発現とを比較した後、試験患者のための適切な化学療法を決定するための指示を含んでもよい。適切な化学療法を決定するための方法は、上記の通りであり、説明書に詳細に記載することができる。
【００９３】
キット中に含まれる情報資料は、本明細書に記載の方法および／または本明細書に記載の方法のための試薬の使用に関する記述資料、指示資料、販売資料またはその他の材料であってもよい。例えば、キットの情報資料は、特に、キットのユーザが特定の治療剤に対する陽性の応答を有するヒトの可能性に適用するため、彼らが遺伝子発現分析を実施し、その結果を解釈することに関する実質的な情報を取得することができる、コンタクト情報、例えば、実際の住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号を含んでもよい。
【００９４】
本明細書で特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現から特定の治療剤に対する陽性の応答を有する患者の可能性を推論するのに必要なソフトウェアを含有してもよい。
【００９５】
キットは、いくつかの実施形態においては、個体が応答性であると予測される事象における投与のためのＤＮＡ損傷治療剤をさらに含有してもよい。ＯＡＣを処置するための本明細書に記載の特定の薬剤のいずれかまたは薬剤の組合せを、キットに組み込むことができる。薬剤または薬剤の組合せを、ＯＡＣ処置に対して特異的に調整される剤形などの形態で提供することができる。キットを、例えば、ネオアジュバント処置および／またはアジュバント処置の文脈における、ＯＡＣ処置レジメンに従う投与のための好適な説明書と共に提供することができる。
【００９６】
ａ）遺伝子発現プロファイリング法
生物試料におけるｍＲＮＡの測定を、生物試料における対応するタンパク質のレベルの検出のための代用として用いることができる。かくして、本明細書に記載の任意のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを、適切なＲＮＡを検出することによって検出することもできる。遺伝子発現プロファイリングの方法としては、限定されるものではないが、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥ、質量分析が挙げられる。
【００９７】
ｍＲＮＡ発現レベルを、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲの後のｑＰＣＲ）により測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作出するために用いられる。ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光が産生されるように、ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイに用いることができる。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、細胞あたりのｍＲＮＡのコピー数などの絶対的な測定値をもたらすことができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲは全て、試料におけるｍＲＮＡの発現レベルを測定するために用いられてきた。Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004を参照されたい。
【００９８】
ｍｉＲＮＡ分子は、非コードであるが、遺伝子発現を調節することができる小さいＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適する任意の方法を、対応するｍｉＲＮＡのために用いることもできる。近年、多くの研究室が疾患のためのバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用を検討している。多くの疾患は幅広い転写調節を含み、ｍｉＲＮＡがバイオマーカーとしての役割を有し得ることは驚くべきことではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾患との関係は、タンパク質レベルと疾患との関係よりもさらに不明確であることが多いが、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの価値は相当なものであり得る。勿論、疾患において差次的に発現されるどのＲＮＡでもそうであるように、インビトロでの診断産物の開発が直面する問題には、ｍｉＲＮＡが疾患細胞中で生存し、分析のために容易に抽出されるという要件、またはｍｉＲＮＡが血液もしくは他のマトリックス中に放出され、そこでそれらが測定されるために十分に生存しなければならないという要件が含まれる。タンパク質バイオマーカーも同様の要件を有するが、多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、パラクリン様式で、疾患中に、病理および機能の部位で意図的に分泌される。多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、これらのタンパク質が内部で合成される細胞の外部で機能するような設計になっている。
【００９９】
遺伝子発現はまた、質量分析法を用いて評価することもできる。様々な構成の質量分析計を用いて、バイオマーカー値を検出することができる。いくつかの型の質量分析計が利用可能であるか、または様々な構成で製造することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素：試料注入口、イオン源、質量分析器、検出器、減圧システム、および装置制御システム、ならびにデータシステムを有する。試料注入口、イオン源、および質量分析器の差異は一般に、装置の型およびその能力を規定する。例えば、注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であってもよく、またはマトリックス支援レーザー脱離において用いられるような直接プローブもしくはステージであってもよい。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーなどの電子スプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器は、四重極マスフィルター、イオントラップ質量分析器および飛行時間質量分析器を含む。さらなる質量分析法は、当技術分野で周知である（Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)）。
【０１００】
タンパク質バイオマーカーおよびバイオマーカー値を、以下のもののいずれか：電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）、タンデム飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、ウルトラフレックスＩＩＩと呼ばれるＴＯＦ／ＴＯＦ、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）．ｓｕｐ．Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）．ｓｕｐ．Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、およびイオントラップ質量分析により検出および測定することができる。
【０１０１】
試料調製戦略は、タンパク質バイオマーカーの質量分析特性評価およびバイオマーカー値の決定の前に試料を標識および濃縮するために用いられる。標識化方法としては、限定されるものではないが、相対的および絶対的定量化のための等圧タグ（ｉＴＲＡＱ）および細胞培養物中でのアミノ酸を用いる安定アイソトープ標識化（ＳＩＬＡＣ）が挙げられる。質量分析の前に候補バイオマーカータンパク質のための試料を選択的に濃縮するために用いられる捕捉試薬としては、限定されるものではないが、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、選択的抗体足場（例えば、ダイアボディなど）、刷り込みポリマー、アビマー、ペプチド模倣物質、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにこれらの改変物および断片が挙げられる。
【０１０２】
前記アッセイは、がん治療剤の応答性を予測するための方法において有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、ここで、該方法は、ＯＡＣに罹患する個体からの生物試料において、表１〜４に提供されるバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出することを含み、バイオマーカー値を用いる、本明細書に詳述されるような分類は、個体が治療剤に応答するかどうかを示す。ある特定の記載される予測バイオマーカーは治療剤に対する応答性を予測するために単独で有用であるが、２個以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれ有用であるバイオマーカーの複数のサブセットのグループ化のための方法も本明細書に記載される。かくして、本出願の様々な実施形態は、Ｎが少なくとも３個のバイオマーカーである、Ｎ個のバイオマーカーを含む組合せを提供する。Ｎは、上記の範囲のいずれかに由来する任意の数、ならびに類似するがより高い次数であると選択することができることが理解される。本明細書に記載の方法のいずれかに従って、バイオマーカー値を個別に検出および分類するか、またはそれらを、例えば、多重アッセイ形式で集合的に検出および分類することができる。
【０１０３】
ｂ）マイクロアレイ法
一実施形態においては、本発明は、「オリゴヌクレオチドアレイ」（本明細書では「マイクロアレイ」とも呼ばれる）を利用する。マイクロアレイを、細胞中でのバイオマーカーの発現を分析するために、特に、がん組織のバイオマーカーの発現を測定するために用いることができる。
【０１０４】
一実施形態においては、バイオマーカーアレイは、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能に標識されたポリヌクレオチド（例えば、全細胞ｍＲＮＡまたは標識されたｃＲＮＡから合成された蛍光標識されたｃＤＮＡ）をマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより製造される。マイクロアレイは、細胞または生物のゲノム中の多くの遺伝子、好ましくはほとんどの、またはほぼ全部の遺伝子の産物のための結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の秩序あるアレイを有する表面である。マイクロアレイを、当技術分野で公知のいくつかの方法で作製することができる。しかしながら、製造されたマイクロアレイは、ある特定の特徴を共有する。アレイは再現性があり、所与のアレイの複数のコピーを製造し、互いに容易に比較することができる。好ましくは、マイクロアレイは小さく、通常は５ｃｍ２より小さく、それらは結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定である材料から作製する。マイクロアレイ中の所与の結合部位または結合部位のユニークなセットは、細胞中の単一の遺伝子の産物に特異的に結合する。特定の実施形態においては、それぞれの位置に既知の配列の添付された核酸を含有する位置的に指定可能なアレイが用いられる。
【０１０５】
細胞のＲＮＡと相補的なｃＤＮＡを作製し、好適なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズさせる場合、任意の特定の遺伝子に対応するアレイ中の部位へのハイブリダイゼーションのレベルは、その遺伝子／バイオマーカーから転写されるｍＲＮＡの細胞中での普及率を反映することが理解される。例えば、全細胞ｍＲＮＡと相補的な検出可能に標識された（例えば、フルオロフォアを用いて）ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズさせる場合、細胞中で転写されない遺伝子に対応する（すなわち、遺伝子産物に特異的に結合することができる）アレイ上の部位は、シグナル（例えば、蛍光シグナル）をほとんど有さないか、または全く有さず、コードされるｍＲＮＡが普及している遺伝子は相対的に強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」、すなわち、プローブが相補的核酸配列を有する配列アレイ部位にハイブリダイズする、二本鎖を形成する、または結合するが、非相補核酸配列を有する部位にはハイブリダイズしないように選択される。本明細書で用いられる場合、短い方のポリヌクレオチドが２５塩基未満またはそれと等しい場合に、標準的な塩基対形成規則を用いてミスマッチがないか、または短い方のポリヌクレオチドが２５塩基よりも長い場合に、５％以下のミスマッチがある時、あるポリヌクレオチド配列は別のものと相補的であると考えられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、完全に相補的である（ミスマッチがない）。特定のハイブリダイゼーション条件は、日常的な実験を用いて陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実行することによって特異的ハイブリダイゼーションをもたらすことを証明することができる。
【０１０６】
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識されたプローブおよび固定されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、オリゴマーか、２００塩基より大きいポリヌクレオチドか）および種類（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）に依存する。核酸のための特異的（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件のための一般的パラメータは、Sambrook et al., supraおよびAusubel et al.,「Current Protocols in Molecular Biology」, Greene Publishing and Wiley-interscience, NY (1987)（あらゆる目的でその全体が組み込まれる）に記載されている。ｃＤＮＡマイクロアレイが用いられる場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、６５℃で４時間の５ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次いで、低ストリンジェンシー洗浄バッファー（１ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）中、２５℃での洗浄、次いで、高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．１ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）中、２５℃で１０分間の洗浄である（Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996)を参照されたい）。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijessen,「Hybridization With Nucleic Acid Probes」, Elsevier Science Publishers B.V. (1993)およびKricka,「Nonisotopic DNA Probe Techniques」, Academic Press, San Diego, Calif. (1992)にも提供されている。
【０１０７】
マイクロアレイプラットフォームとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＡｇｉｌｅｎｔなどの会社により製造されるものが挙げられる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより製造されるマイクロアレイプラットフォームの例としては、Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２アレイ、Ａｌｍａｃが所有するＸｃｅｌ（商標）アレイならびにＢｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（登録商標）およびＬｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（登録商標）などのＡｌｍａｃが所有するＣａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（登録商標）が挙げられる。
【０１０８】
ｃ）イムノアッセイ法
イムノアッセイ法は、抗体の、その対応する標的または分析物との反応に基づくものであり、特異的アッセイ形式に応じて試料における分析物を検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ法の特異性および感度を改善するために、その特異的エピトープ認識のため、モノクローナル抗体が用いられることが多い。モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いため、ポリクローナル抗体も様々なイムノアッセイにおいて上手く用いられてきた。イムノアッセイは、様々な生物試料マトリックスと共に使用するために設計されている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、および定量的な結果を提供するように設計されている。
【０１０９】
定量的結果を、検出しようとする既知の濃度の特異的分析物を用いて作出された標準曲線の使用により作成することができる。未知の試料に由来する応答またはシグナルを標準曲線上にプロットし、未知の試料における標的に対応する量または値を確立する。
【０１１０】
いくつかのイムノアッセイ形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物／バイオマーカーの検出にとって定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の結合に依拠し、標識成分は、直接的または間接的に、酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験を、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出のために形式化することができる。他の方法は、例えば、放射性アイソトープ（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に依拠する。さらなる技術としては、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、その他が挙げられる（ImmunoAssay: A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005 editionを参照されたい）。
【０１１１】
例示的なアッセイ形式としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または時間分解−ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）イムノアッセイが挙げられる。バイオマーカーを検出するための手順の例は、バイオマーカーの免疫沈降、次いで、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなどのサイズおよびペプチドレベルでの識別を可能にする定量方法を含む。
【０１１２】
検出可能な標識またはシグナル生成材料を検出および／または定量するための方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素により触媒される反応の産物（検出可能な標識が酵素である場合；上記を参照されたい）は、限定されるものではないが、蛍光、発光、もしくは放射性であってもよく、またはそれらは可視光もしくは紫外光を吸収してもよい。そのような検出可能な標識を検出するのに好適な検出器の例としては、限定されるものではないが、ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光計、比色計、蛍光計、発光計、および密度計が挙げられる。
【０１１３】
検出のための任意の方法を、反応物の任意の好適な調製、処理、および分析を可能にする任意の形式で実施することができる。これは、例えば、多ウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルもしくは３８４ウェル）中で行うか、または任意の好適なアレイもしくはマイクロアレイを用いてもよい。様々な薬剤のためのストック溶液を、手動で、またはロボット的に作製することができ、その後のピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読取り、データ収集および分析は全て、検出可能な標識を検出することができる商業的に入手可能な分析ソフトウェア、ロボティクス、および検出装置を用いてロボット的に行うことができる。
【０１１４】
臨床使用
いくつかの実施形態においては、治療レジメンに対して応答するＯＡＣ患者を同定および／または選択するための方法が提供される。特に、前記方法は、ＤＮＡを直接的または間接的に損傷する薬剤を投与することを含む治療レジメンに対して応答するがん患者を同定または選択することを目的とする。また、治療レジメンに対して非応答性である患者を同定するための方法も提供される。これらの方法は、典型的には、患者の腫瘍（原発性、転移性、または限定されるものではないが、血液、もしくは血液、尿、唾液および他の体液中の成分などの腫瘍に由来する他の誘導体）中の予測マーカーのコレクションの発現レベルを決定すること、その発現レベルを参照発現レベルと比較すること、および試料における発現が、治療剤に対する応答または非応答に対応する選択された予測バイオマーカーまたはバイオマーカーセットの発現のパターンまたはプロファイルを含むかどうかを同定することを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する、食道腺癌（ＯＡＣ）を有する個体の応答性を予測する方法は、
ａ．表１Ａおよび／または表１Ｂおよび／または表２Ａおよび／または表２Ｂおよび／または表３および／または表４から選択される１個または複数個のバイオマーカーの、個体から得られた試験試料における発現レベルを測定すること；
ｂ．発現レベルを捕捉する試験スコアを導出すること；
ｃ．試験スコアと応答性とを相関させる情報を含む閾値スコアを提供すること；ならびに
ｄ．試験スコアと閾値スコアとを比較し、試験スコアが閾値スコアを超える場合、応答性が予測されること
を含む。
【０１１６】
特定の実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する、食道腺癌（ＯＡＣ）を有する個体の応答性を予測する方法は、個体から試験試料を得る工程；ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される１個または複数個のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを測定する工程；発現レベルを捕捉する試験スコアを導出する工程；試験スコアと応答性とを相関させる情報を含む閾値スコアを提供する工程；ならびに試験スコアと閾値スコアとを比較し、試験スコアが閾値スコアを超える場合、応答性が予測される工程を含む。当業者であれば、実施例１の教示を含む本明細書に提供される教示を用いて、適切な閾値スコア、ならびに適切なバイオマーカー重み付けおよびバイアスを決定することができる。
【０１１７】
他の実施形態においては、ＤＮＡ損傷治療剤を用いる処置に対する、食道腺癌（ＯＡＣ）を有する個体の応答性を予測する方法は、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される１個または複数個のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを測定することを含む。表２Ａおよび表２Ｂは、バイオマーカーが、それぞれ、本明細書に列挙される遺伝子産物の４０個または４４個のからなり、閾値スコアが本明細書に列挙される個々の遺伝子産物の重み付けから導出される、例示的な遺伝子シグナチャー（または遺伝子クラシファイア）を提供する。バイオマーカーが表２Ｂに列挙される４４個の遺伝子産物からなり、バイオマーカーが表２Ｂに提供される重み付けと関連するこれらの実施形態の１つにおいては、０．３６８１の閾値スコアなどの、閾値スコアを超える試験スコアは、個体がＤＮＡ損傷治療剤に応答性である可能性を示す。
【０１１８】
がんは、その増殖速度が、治療剤との接触の非存在下でのその増殖と比較して、治療剤との接触の結果として阻害される場合、治療剤に対して「応答性」である。がんの増殖を、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍型にとって適切な腫瘍マーカーの発現を測定することができる。
【０１１９】
がんは、その増殖速度が、治療剤との接触の非存在下でのその増殖と比較して、治療剤との接触の結果として阻害されないか、または非常に低い程度で阻害される場合、治療剤に対して「非応答性」である。上述の通り、がんの増殖を様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍型にとって適切な腫瘍マーカーの発現を測定することができる。治療剤に対して非応答性であるそのあり方は、非常に変化に富んでおり、異なるがんは異なる条件下で所与の治療剤に対して異なるレベルの「非応答性」を示す。さらに、非応答性の尺度を、患者の生活の質、転移の程度などの、腫瘍の増殖サイズを超えるさらなる基準を用いて評価することができる。
【０１２０】
この試験の適用は、ＲＥＣＩＳＴにより定義される全生存、無進行生存、放射線応答、完全な応答、部分的な応答、安定な疾患、ならびに限定されるものではないが、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３およびＣＡ１９−９などの血清学的マーカーを含むがこれらに限定されない評価項目を予測する。本発明の他の実施形態においては、それを用いて、単独で、または標準処置の文脈において、ＤＮＡ損傷組合せ療法を用いて処置される食道がんにおける、内視鏡超音波、ＣＴ、スパイラルＣＴ、ＦＤＧ−ＰＥＴ、病理学的、組織学的応答を評価することができる。
【０１２１】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、１個もしくは複数個の核酸またはコードされるタンパク質などのその生物学的誘導体の試料内のＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の検出、定量化および定性化のためのアレイまたは非アレイに基づく方法を用いることができる。
【０１２２】
アッセイされる試料から発現プロファイルを得た後、発現プロファイルを参照または対照プロファイルと比較して、試料が得られた細胞または組織、したがって、宿主の療法応答性表現型に関する診断を行う。発現プロファイルに関連して本明細書で用いられる用語「参照」および「対照」は、遺伝子発現もしくは遺伝子産物発現の標準化されたパターンまたは所与の患者の発現クラシファイアを解釈し、予後もしくは予測クラスを割り当てるために用いられるある特定のバイオマーカーの発現レベルを意味する。参照または対照発現プロファイルは、所望の表現型、例えば、応答性表現型を有することが知られる試料から得られるプロファイルであってもよく、したがって、陽性の参照または対照プロファイルであってもよい。さらに、参照プロファイルは、所望の表現型を有しないことが知られる試料に由来するものであってもよく、したがって、陰性の参照プロファイルであってもよい。
【０１２３】
定量的ＰＣＲを、１個または複数個の核酸のレベルを定量する方法として用いる場合、この方法は、二重標識された蛍光性プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブまたは分子ビーコンまたはＦＲＥＴ／Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒプローブ）により放出される蛍光の測定を介してＰＣＲ産物の蓄積を定量することができる。いくつかの方法は、プローブがプライマー中に構築されるＳｃｏｒｐｉｏｎおよびＡｍｐｌｉｆｌｙｏｒシステムなどの別々のプローブを必要としなくてもよい。
【０１２４】
ある特定の実施形態においては、得られる発現プロファイルを、単一の参照プロファイルと比較して、アッセイされる試料の表現型に関する情報を得る。さらに他の実施形態においては、得られる発現プロファイルを、２つ以上の異なる参照プロファイルと比較して、アッセイされる試料の表現型に関するより詳細な情報を得る。例えば、得られる発現プロファイルを陽性および陰性の参照プロファイルと比較して、試料が対象の表現型を有するかどうかに関する確認された情報を得ることができる。
【０１２５】
得られる発現プロファイルと１つまたは複数の参照プロファイルとの比較を、任意の都合のよい方法を用いて実施することができ、例えば、発現プロファイルのデジタル画像を比較することによる、発現データのデータベースを比較することによるなどの様々な方法がアレイ業界の当業者には公知である。発現プロファイルを比較する方法を記載する特許としては、限定されるものではないが、米国特許第６，３０８，１７０号および第６，２２８，５７５号が挙げられ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。発現プロファイルを比較する方法はまた、上記されている。
【０１２６】
比較工程は、得られる発現プロファイルが１つまたは複数の参照プロファイルとどのように類似するか、または類似していないかに関する情報をもたらし、類似性情報は、アッセイされる試料の表現型を決定するために用いられる。例えば、陽性対照との類似性は、アッセイされる試料が応答性参照試料と類似する応答性表現型を有することを示す。同様に、陰性対照との類似性は、アッセイされる試料が非応答性参照試料に対する非応答性表現型を有することを示す。
【０１２７】
バイオマーカーの発現レベルを、異なる参照発現レベルとさらに比較することができる。例えば、参照発現レベルは、バイオマーカーまたはバイオマーカーセットの発現が有益であり、患者が応答性または非応答性であるかどうかを決定するための評価を行うかどうかを評価するための発現の所定の標準参照レベルであってもよい。さらに、バイオマーカーの発現レベルの決定を、患者が応答性または非応答性であるかどうかを決定するための評価を行うためのバイオマーカーとして同時に測定される発現の内部参照マーカーレベルと比較することができる。例えば、本発明のバイオマーカーを含まないが、定常的な発現レベルを示すことが知られる異なるマーカーパネルの発現を、内部参照マーカーレベルとして評価することができ、バイオマーカー発現のレベルを、参照と比較して決定する。代替的な例では、非腫瘍試料である組織試料における選択されたバイオマーカーの発現を、内部参照マーカーレベルとして評価することができる。ある特定の態様においては、バイオマーカーの発現レベルを、発現の増加として決定することができる。他の態様においては、バイオマーカーの発現レベルを、発現の低下として決定することができる。発現レベルを、参照レベルと比較した発現の有益でない変化として決定することができる。さらに他の態様においては、発現レベルを、本明細書に提供される方法により決定されるように所定の標準発現レベルに対して決定する。
【０１２８】
本発明はまた、患者の従来の処置を指導することにも関する。診断試験が、患者がＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接または間接に影響するクラスの薬物に対する応答者であると示す患者に、その療法を投与することができ、患者と腫瘍学者の両方が、患者が恩恵を受けることを確信することができる。診断試験により非応答者であると指定される患者を、それらから恩恵を受ける可能性がより高い代替的な療法について同定することができる。
【０１２９】
本発明はさらに、ＯＡＣを処置するためのＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接または間接に影響するクラスの新規薬物の臨床試験のための患者の選択に関する。潜在的な応答者を含む試験集団のエンリッチメントは、関連する基準の下でのその薬物のより完全な評価を容易にする。
【０１３０】
本発明はさらに、ＤＮＡ損傷応答欠損症（ＤＤＲＤ）と関連するＯＡＣを有するか、またはそれを発症すると疑われる患者を診断する方法に関する。ＤＤＲＤは、患者の細胞または複数の細胞がＤＮＡ損傷を修復する能力が低下し、この能力の低下が腫瘍の発生または増殖における原因である任意の状態と本明細書で定義される。ＤＤＲＤの診断は、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路における突然変異と関連し得る。ＤＤＲＤの診断はまた、腺癌とも関連し得る。食道腺癌（ＯＡＣ）を有する個体を診断する方法は、
ａ．表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表２Ｂ、表３または表４から選択される１個または複数個のバイオマーカーの、個体から得られる試験試料における発現レベルを測定すること；
ｂ．発現レベルを捕捉する試験スコアを導出すること；
ｃ．試験スコアとＯＡＣの診断とを相関させる情報を含む閾値スコアを提供すること；および
ｄ．試験スコアと閾値スコアとを比較し、試験スコアが閾値スコアを超える場合、個体はＯＡＣを有するか、またはＯＡＣを発症することが疑われると決定されること
を含んでもよい。
【０１３１】
診断方法は、個体から試験試料を得る工程；ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される１個または複数個のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを測定する工程；発現レベルを捕捉する試験スコアを導出する工程；試験スコアとＯＡＣの診断とを相関させる情報を含む閾値スコアを提供する工程；ならびに試験スコアと閾値スコアとを比較し、試験スコアが閾値スコアを超える場合、個体はがんを有するか、またはがんを発症することが疑われると決定される工程を含んでもよい。当業者であれば、実施例１の教示を含む本明細書に提供される教示を用いて、適切な閾値スコア、および適切なバイオマーカー重み付けを決定できる。
【０１３２】
他の実施形態においては、ＤＤＲＤと関連するＯＡＣを有するか、または発症すると疑われる患者を診断する方法は、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される１個または複数個のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを測定することを含む。表２Ａおよび表２Ｂは、バイオマーカーが、それぞれ、その中に列挙される遺伝子産物の４０個または４４個からなり、閾値スコアがその中に列挙される個々の遺伝子産物の重み付けから導出される、例示的な遺伝子シグナチャー（または遺伝子クラシファイア）を提供する。バイオマーカーが表２Ｂに列挙される４４個の遺伝子産物からなり、バイオマーカーが表２Ｂに提供される重み付けと関連するこれらの実施形態の１つにおいては、０．３６８１の閾値スコアなどの、閾値スコアを超える試験スコアは、ＯＡＣの診断を示すか、またはＯＡＣを発症することが疑われる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ネオアジュバント化学療法を用いて処置されたＥＡＣ患者における無再発生存（ＲＦＳ）を予測するＤＤＲＤシグナチャーに関するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒプロット。
【図２】ネオアジュバント化学療法を用いて処置されたＥＡＣ患者における全生存（ＰＦＳ）を予測するＤＤＲＤシグナチャーに関するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ。
【図３】ネオアジュバント化学療法を用いて処置されないＥＡＣ患者における生存（ＰＦＳ）を予測するＤＤＲＤシグナチャーに関するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ。
【０１３４】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるものである。
【実施例１】
【０１３５】
食道腺癌（ＯＡＣ）へのＤＤＲＤアッセイの適用および検証
方法
試料
ヒト組織の使用のための適切な倫理審査による承認および同意情報を有する４６個のＦＦＰＥ予備化学療法（白金に基づく；シスプラチン処置）食道内視鏡生検試料を用いて、食道がん（ＯＡＣ）におけるＤＤＲＤアッセイ（表２Ｂに列挙される４４遺伝子に基づく）の予測能力を証明した。試料あたり１つの「印を付けた」ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたスライドと共に、試料あたり５つのＦＦＰＥ組織スライドを得た。Ｈ＆Ｅスライドは、病理サブタイプについて検査し、マクロダイセクション（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）のために印を付けた。
【０１３６】
遺伝子発現プロファイリング
全ての試料を、適切な標準操作手順書（ＳＯＰ）に記載の品質制御環境で処理した。
試料あたり全部で５つの切片をマクロダイセクションし、Ａｍｂｉｏｎ  ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌキットを用いて抽出した。溶解物を２つに分割し、多くの場合、プロファイリングには材料の半分だけで十分であった。２つの事例においては、マクロダイセクションした材料の両アリコートを抽出した。試料を無作為化し、３つのバッチにわたって抽出した。
抽出後、試料の濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  １０００分光計を用いて決定した。ｃＤＮＡ増幅のためのＲＮＡの好適な濃度を得るためには、５つの試料について減圧濃縮が必要であった。
【０１３７】
３６個のＲＮＡ試料は全部、減圧濃縮された元の一次抽出物またはＮＵＧＥＮ  Ｖ３  ＦＦＰＥ増幅キットを用いる増幅に進行させた二次再抽出物であった。４６個の試料を、Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＦＦＰＥ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプロファイリングした。分光計とＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００生物分析装置との両方を用いて、生成されたｃＤＮＡを品質制御した後、試料を断片化し、ＮｕＧＥＮ  Ｅｎｃｏｒｅ  Ｂｉｏｔｉｎモジュールを用いて標識した。断片化ＱＣの後、断片化および標識された産物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上でのハイブリダイゼーションのためのＮｕＧＥＮのガイドラインに従ってＸｃｅｌアレイにハイブリダイズさせた。
【０１３８】
アレイＱＣ
マイクロアレイプロファイリングの後、データの品質制御（ＱＣ）評価を実施した。試料およびアレイの品質を、Ａｌｍａｃが特許権を有するツールボックスを用いて評価した。４６個の試料のうちの１つがマイクロアレイＱＣに失敗した。この試料は、画像分析、陽性判定（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）、倍率および分布に関して失敗した。したがって、４５個の試料をその後の分析において用いた。
【０１３９】
データの調製
試料を、ＲＭＡ設定（バックグラウンド補正；平均に関する中央値を用いる分位点正規化；および中央値分散分析要約（ｍｅｄｉａｎ  ｐｏｌｉｓｈ  ｓｕｍｍａｒｉｓａｔｉｏｎ））でＡｌｍａｃの前処理ツールボックス（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘ）を用いて前処理した。ＤＤＲＤ遺伝子を表すプローブセットのクロスマッピングを用いて、分析のための関連プローブセットを抽出した。
【０１４０】
クラシファイアスコアの算出
クラシファイア中の遺伝子にマッピングされるプローブセットを決定し、アンチセンスプローブセットを排除する（適用可能な場合）。クラシファイア中の各遺伝子に関する全てのプローブセットにわたる強度中央値を算出し、縮小した遺伝子強度マトリックスを得る。その遺伝子に対するプローブセットが、その特定のアレイプラットフォーム上に存在しない場合、訓練データから観察される平均を、代替として用いる。各試料に関する全てのプローブセットの中央値を算出し、縮小した遺伝子強度マトリックスから差し引く。
【０１４１】
試料のクラシファイアスコアを、シグナチャー中の遺伝子の発現の重み付け和として算出する。
【０１４２】
【数１】
2016531579.tif 000018
（式中、ｗｉは各遺伝子に関する重みであり、ｂｉは訓練データと比較して各遺伝子を平均中心化するのに必要とされる遺伝子特異的バイアスであり（表４）、ａｍｅｄｉａｎは、アレイ上の全プローブセットにわたる発現強度の中央値であり、ｇｅｉは観察された遺伝子発現レベルを前処理したものであり、ｋ＝０．３７３８は定数オフセットである）
【０１４３】
クラシファイアスコアを、各試料について算出した後、これを用いて、例えば、応答する可能性が高い患者から応答する可能性が低い患者まで階層化することができる。
【０１４４】
結果
【０１４５】
【表５】
2016531579.tif 000019
【０１４６】
Ｃｏｘ比例ハザード回帰を用いた場合、ＤＤＲＤアッセイは、無再発生存に対し統計的に有意な効果がある。この効果は、他の重要な危険因子がモデルに含まれる場合、統計的に有意である（ハザード比０．０７、９５％ＣＩ（０．００７、０．６４３）、ｐ＝０．０１９）。モデルに含まれる共変量は、臨床的助言によって指示された。
【０１４７】
【表６】
2016531579.tif 000020
【０１４８】
Ｃｏｘ比例ハザード回帰を用いた場合、ＤＤＲＤアッセイは、全生存に対し統計的に有意な効果がある。この効果は、他の重要な危険因子がモデルに含まれる場合、統計的に有意である（ハザード比０．１１、９５％ＣＩ（０．０１４、０．８８５）、ｐ＝０．０３８）。モデルに含まれる共変量は、臨床的助言によって指示された。
【０１４９】
結論
ＤＤＲＤアッセイは、他の重要な共変量について調整すると、食道がんにおける無再発生存（ｐ＝０．０１９）および全生存（ｐ＝０．０３８）の有意な予後因子となることを証明する証拠が提供される。
【実施例２】
【０１５０】
背景
食道がんは、世界で８番目に最も一般的ながんであり、毎年４８０，０００件が診断されている。ＵＫにおいては、男性におけるこの疾患の発生率は、ここ４５年で６８％にまで上昇し、最も一般的な病理学的サブタイプは腺癌である。食道腺癌（ＯＡＣ）におけるこの増加の理由は不明であるが、この腫瘍の発症は前悪性化生性状態であるバレット食道と強く関連する。これは、胃食道逆流疾患によって引き起こされ、肥満、喫煙およびアルコール摂取と共に、ＯＡＣの最も強い危険因子の１つである。バレット食道についてスクリーニングし、潜在的に治癒的な手術の恩恵を受ける可能性があるＯＡＣ患者を術前に選択する努力にも拘らず、生存率は依然として低い。５年生存率は１３％であり、初期の局所領域に限定される疾患においても、この数字が４０％を超えることは稀である。ネオアジュバント療法または周術療法を用いた場合に全生存の有意な改善が示されたが、個々の患者のための最適なアプローチは依然として不明である。医師が最も有益であるネオアジュバント療法に患者を階層化することができる、応答を予測することができるバイオマーカーを同定することが緊急に必要である。
【０１５１】
食道腺癌−患者コホート
ＯＡＣにおける最も活性の高い薬物の１つがＤＮＡ損傷剤シスプラチンであることを考慮して、本発明者らはＯＡＣにおけるＤＤＲＤシグナチャーの効能を調べることにした。本発明者らは、シスプラチンに基づくネオアジュバント化学療法、次いで、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅで２００４年と２０１０年の間に外科的切除で処置された初期ＯＡＣ患者からの６３個のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）予備処置内視鏡生検標本を分析した（表７および表８）。
【０１５２】
本実施例において用いられる６３個の試料は、実施例１に由来する４５個の試料を含む。本発明者らは、さらなる小さい試料をプロファイリングし、この分析のために２つの試料セットを一緒に統合した。したがって、実施例１に記載の方法は、本実施例にも適用可能である。
【０１５３】
マクロダイセクションのために印を付ける前に生検を病理学的サブタイプについて検査し、少なくとも７０％の腺癌組織を含有していた試料を対象とすることにした。マッチした切片標本を、Ｍａｎｄａｒｄ  Ｓｃｏｒｅに従ってスコア化した（＜３＝病理学的応答）。十分な量のＲＮＡを、６３個のＦＦＰＥ生検標本のうちの６２個（９８．４％）から抽出し、保管ＦＦＰＥ組織（Ａｌｍａｃ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のために最適化されたｃＤＮＡマイクロアレイに基づく技術であるＸｃｅｌ（商標）アレイにハイブリダイズさせた。全試料をＤＤＲＤアッセイのためにスコア化した。
【０１５４】
【表７】
2016531579.tif 000021
【表８】
2016531579.tif 000022
【０１５５】
ＤＤＲＤスコアと予後との相関を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析およびＣｏｘ比例ハザード回帰により評価した。合計１３個の試料（２１％）がＤＤＲＤ陽性として特徴付けられ、残りの４９個の試料（７９％）がＤＤＲＤ陰性として特徴付けられた。ＤＤＲＤアッセイにより、無再発生存（ＲＦＳ）との統計的に有意な相関（ＨＲ  ０．３３；９５％ＣＩ  ０．１３〜０．８７；ｐ＝０．０２４）が正であることが示され、ＤＤＲＤ＋ｖｅ患者については６５．２ヶ月対ＤＤＲＤ−ｖｅ患者については３３．９ヶ月の中央ＲＦＳが得られた（図１）。多変量分析の後、ＲＦＳに対するＤＤＲＤアッセイの効果は、他の重要な危険因子がモデル中に含まれていた場合、統計的に有意なままであった（ＨＲ  ０．３１、９５％ＣＩ（０．１１０、０．８７７）、ｐ＝０．０２７）（表９）。中央全生存（ＯＳ）は、ＤＤＲＤ＋ｖｅ患者において有意に高かった（９４．３ヶ月対３２．２ヶ月；ＨＲ  ０．３２；９５％ＣＩ  ０．１２〜０．８２；ｐ＝０．０１７）（図２）。多変量解析の後、ＯＳに対するＤＤＲＤアッセイの効果は、他の重要な危険因子がモデル中に含まれていた場合、統計的に有意なままであった（ＨＲ  ０．３６、９５％ＣＩ（０．１３２、０．９５３）、ｐ＝０．０４０）。これらの結果は、ＤＤＲＤアッセイが初期食道腺癌のためのネオアジュバント化学療法の設定における強力な予後マーカーであることを示している。
【０１５６】
【表９】
2016531579.tif 000023
【０１５７】
【表１０】
2016531579.tif 000024
【０１５８】
ＯＡＣ−化学療法ナイーブにおけるＤＤＲＤ
ＤＤＲＤアッセイが処置とは無関係に予後診断的であったかどうかを決定するために、それを、食道および胃食道接合部腫瘍のための潜在的に治癒的な切除に由来する７５個の新鮮な凍結組織試料のデータセットに適用した。これらの切除は、１９９２と２００の間に実行され、いずれの患者もネオアジュバント化学療法を受けなかった。全試料を、特注のＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  ６０マーオリゴマイクロアレイを用いて分析した。図３に示されるように、ＤＤＲＤ陽性集団と陰性集団との間に生存における差異は見られなかった（ＨＲ０．６４（９５％ＣＩ  ０．１７〜２．４３））。さらに、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘに基づく検証セットは、データセット間で一貫した分析プラットフォームを提供することを求められる。
【０１５９】
結論
・ＤＤＲＤアッセイは処置アプローチを個別化し、初期ＥＡＣ患者に関する転帰を改善することができた。
・第１のアレイに基づくバイオマーカーはＥＡＣにおけるＦＦＰＥ組織から開発される。
・転写プロファイリングは予備処置ＦＦＰＥ内視鏡生検の９８％について成功した。
・ＤＤＲＤアッセイは予後との強い相関を示す。
・陽性のＤＤＲＤアッセイ結果は、アッセイ陰性集団と比較してＲＦＳ（ＨＲ０．３１、９５％ＣＩ（０．１１〜０．８８）、ｐ＝０．０２７）およびＯＳ（ＨＲ０．３６、９５％ＣＩ（０．１３〜０．９５）、ｐ＝０．０４）の増加を予測した。
・ＤＤＲＤ陽性患者は、ＤＤＲＤ陰性患者の１７％と比較して５９％の５年生存率を有する。
・分析の統計力を増大させるためにこの検証セットの拡張が進行中である。
・初期ＥＡＣにおけるＤＤＲＤアッセイの役割は前向き臨床試験において評価される。
【０１６０】
本発明の様々な実施形態は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその範囲を限定されない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な実施形態の様々な改変が、前記の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。さらに、本明細書に記載の全ての実施形態は、広く適用可能であり、必要に応じて、任意かつ全ての他の一致する実施形態と組み合わせることができる。
【０１６１】
様々な刊行物が本明細書に引用され、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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