(57)【要約】移植された臓器の生存を延長する方法、および移植された臓器の拒絶反応を予防または減弱する方法が提供される。これらの方法は、その臓器を、補体活性の阻害剤（例えば７０ｋＤａの最大分子量、および／または１０日間より短い半減期を有する補体阻害剤、例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質、または１本鎖抗Ｃ５抗体）と、移植の前に接触させることを含む。その方法はまた、同種移植レシピエントに、１つまたはそれより多くの免疫抑制剤と共に補体活性の阻害剤を投与することを含む。第二補体経路阻害剤による前処置は、移植片の生存の改善、および動物における虚血−再灌流傷害の減少に有効であることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー哺乳類からレシピエント哺乳類へ移植された臓器の生存を延長する方法であって、該方法は、補体阻害剤を移植の前に該臓器へ投与することを包含し、ここで該補体阻害剤が、７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日未満の半減期を有する、方法。
【請求項２】
ドナー哺乳類からレシピエント哺乳類へ移植された臓器の生存を延長する方法であって、該方法は、補体阻害剤を移植の前に該臓器へ投与することを包含し、ここで該補体阻害剤が、配列番号３を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質、または配列番号２７もしくは配列番号２９を含む１本鎖抗体である、方法。
【請求項３】
レシピエント哺乳類において移植された臓器の拒絶反応を予防または減弱する方法であって、該方法は、補体阻害剤を移植の前に該臓器へ投与することを包含し、ここで該補体阻害剤が、７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日未満の半減期を有する、方法。
【請求項４】
レシピエント哺乳類において移植された臓器の拒絶反応を予防または減弱する方法であって、該方法は、補体阻害剤を移植の前に該臓器へ投与することを包含し、ここで該補体阻害剤が、配列番号３を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質、または配列番号２７もしくは配列番号２９を含む１本鎖抗体である、方法。
【請求項５】
前記拒絶反応が、超急性拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）または慢性拒絶反応である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記補体阻害剤が、約２６ｋＤａの分子量を有する、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記補体阻害剤が、約６５ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記レシピエント哺乳類が、移植の前にワクチン接種されていない、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記レシピエント哺乳類が、移植の前に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓに対してワクチン接種されていない、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記補体阻害剤が、前記レシピエント哺乳類への移植の前に、前記臓器から実質的に除去されている、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記補体阻害剤が、配列番号３を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１２】
前記補体阻害剤が、１本鎖抗体である、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記補体阻害剤が、１本鎖抗Ｃ５抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補体阻害剤が、配列番号２７もしくは配列番号２９を含む１本鎖抗Ｃ５抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記臓器が、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、脈管組織、眼、角膜、レンズ、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、膵島、軟骨、肝細胞、および造血細胞からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記補体阻害剤が、ドナー哺乳類から前記臓器を取り出した後でかつレシピエント動物への該臓器の移植前に、該臓器へ投与される、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記補体阻害剤が、臓器調達センターで投与される、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記補体阻害剤が、移植の直前に投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ドナー哺乳類およびレシピエント哺乳類がヒトである、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記レシピエントが、移植後に補体阻害剤で処置されない、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記補体阻害剤を前記臓器へ投与することが、前記補体阻害剤を含む溶液で、該臓器を灌流することを含む、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記補体阻害剤を前記臓器へ投与することが、前記補体阻害剤を含む溶液中に該臓器を浸漬することを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記臓器が、０．５から６０時間にわたって灌流または浸漬される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記臓器が、１から３０時間にわたって灌流または浸漬される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記臓器が、２８時間にわたって灌流または浸漬される、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
臓器移植は、慢性臓器不全を有するほとんどの患者にとって好ましい処置である。腎臓、肝臓、肺、および心臓移植は、レシピエントがより普通の生活様式に復帰するので優れた社会復帰の機会を提供するが、潜在的なレシピエントの医学的／外科的適合性、ドナー不足の深刻化、および移植された臓器機能の早期不全によって、その適用は限られる。
【０００２】
細胞、組織、および臓器の移植は一般的なものになり、そして多くの場合命を救う手法である。臓器移植は、慢性の臓器不全を有するほとんどの患者にとって好ましい処置である。拒絶反応を阻害する処置における大きな改善にも関わらず、拒絶反応は、臓器移植の成功に対する単一の最も大きな障害であり続けている。拒絶反応は、急性拒絶反応だけでなく、慢性拒絶反応も含む。移植腎の１年生存率は、死体腎移植で平均８８．３％、そして生体腎移植で平均９４．４％である。移植腎の対応する５年生存率は、６３．３％および７６．５％である（ＯＰＴＮ／ＳＲＴＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ、２００２）。死体肝移植および生体肝移植の１年生存率は、８０．２％および７６．５％である。対応する肝移植片５年生存率は、６３．５％および７３．０％である（ＯＰＴＮ／ＳＲＴＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ、２００２）。免疫抑制剤、特にシクロスポリンＡ、およびより最近ではタクロリムスの使用は、特に急性拒絶反応を予防することによって、臓器移植の成功率を劇的に改善した。上記の数字が示すように、短期および長期両方の、移植の成功率を改善する必要性が依然として存在する。腎臓および肝臓移植に関して上記の数字から分かるように、これらの移植臓器の５年生着不全率（ｆｉｖｅ−ｙｅａｒ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｒａｔｅ）は、２５〜３５％程度である。２００１年単独で、２３，０００人を超える患者が臓器移植を受け、そのうち約１９，０００人が腎臓または肝臓移植を受けた（ＯＰＴＮ／ＳＲＴＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ、２００２）。現在の技術に基づいて、これらの移植された腎臓および肝臓のうち約５，０００〜６，０００が、５年以内に生着不全となる（ｆａｉｌ）と推定される。これらの数は、骨髄のなど、他の移植臓器および移植組織もしくは細胞を含まない。
【０００３】
複数の移植の型が存在する。これらは例えば、Ａｂｂａｓら、２０００において記載されている。１つの個体から同じ個体へ移植された移植片は、自己移植片または自家移植片と呼ばれる。２つの遺伝的に同一のまたは同系の個体間で移植された移植片は、同族移植片と呼ばれる。同じ種の２つの遺伝的に異なる個体間で移植された移植片は、同種異系移植片または同種移植片と呼ばれる。異なる種の個体間で移植された移植片は、異種移植片（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｇｒａｆｔ）または異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）と呼ばれる。同種移植片において外来性であると認識される分子は同種抗原と呼ばれ、そして異種移植片においては異種抗原と呼ばれる。同種抗原または異種抗原と反応するリンパ球または抗体は、それぞれ同種反応性、または異種反応性であると記載される。
【０００４】
現在、米国において毎年４０，０００件を超える腎臓、心臓、肺、肝臓、および膵臓移植が行われている（Ａｂｂａｓら、２０００）。他の可能性のある移植は、脈管組織、眼、角膜、レンズ、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、膵島、軟骨、肝細胞、および造血細胞を含むがこれに限らない。不幸なことに、ドナーよりも多くの移植候補者が存在する。この不足を克服するために、どのように異種移植片を用いるかを学ぶ大きな努力がなされている。この分野において進歩があったが、ほとんどの移植は同種移植片である。同種異系移植は、現在異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）よりも成功する可能性が高いが、成功するために多くの障害を克服しなければならない。ドナー臓器に対してレシピエントが行ういくつかの型の免疫学的攻撃が存在し、それは同種移植片の拒絶反応をもたらし得る。これらは、超急性拒絶反応、急性血管拒絶反応（促進型液性拒絶反応およびデノボ急性液性拒絶反応を含む）、および慢性拒絶反応を含む。拒絶反応は、通常Ｔ細胞媒介の攻撃、または液性抗体攻撃の結果であるが、補体およびサイトカインの影響などの、さらなる２次的因子を含み得る。
【０００５】
臓器移植を必要とする患者の数および利用可能なドナー臓器の数の間のますます広がるギャップは、世界中で大きな問題となっている（Ｐａｒｋら、２００３）。抗ＨＬＡ抗体を生じた個人は、免疫された、または感作されたと言われる（Ｇｌｏｏｒら、２００５）。重症の抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）の発症のために、ＨＬＡ感作は、臨床移植における生体ドナーからの臓器の最適な利用の大きな障壁である（Ｗａｒｒｅｎら、２００４）。例えば、腎移植を待つ全ての個人の５０％超が、前感作された患者であり（Ｇｌｏｔｚら、２００２）、複数回の輸血、以前の同種移植の失敗、または妊娠に起因する、高レベルの広く反応性の同種抗体を有する（Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉ、１９９６）。ＡＢＭＲの研究は、この型の拒絶反応は同種移植片の機能の急性または慢性のいずれかの喪失をもたらし得るという認識のために、現在移植において最も活動的な分野の１つである（Ｍｅｈｒａら、２００３）。超急性拒絶反応（ＨＡＲ）または促進型液性拒絶反応（ＡＣＨＲ）を含むＡＢＭＲの多くの症例が報告されており、それは強力な抗Ｔ細胞療法に対して抵抗性の急性同種移植片傷害、循環ドナー特異的抗体の検出、および移植片における補体成分の沈着によって特徴付けられる。循環同種抗体の増加および補体活性化を伴うＡＢＭＲは、急性拒絶反応症例の２０〜３０％において起こり、そして細胞性拒絶反応を有する患者と比較してより悪い予後を患者にもたらす（Ｍａｕｉｙｙｅｄｉら、２００２）。
【０００６】
高レベルの同種抗体を示す、高度に前感作された患者は通常、即時および攻撃的なＨＡＲを患う。診療において、多大な努力および技術の著しい進歩のために、移植前のリンパ球毒性クロスマッチを得て、ドナーＨＬＡ抗原に特異的な抗体を有する感作患者を同定することによって、ＨＡＲを回避し得る。しかし、ドナーＨＬＡまたは他の非ＭＨＣ内皮抗原に対する循環抗体はまた、遅延した形式の急性液性拒絶反応に関与し得、それは移植片の喪失の発生の増加と関連する（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９９）。従って、臨床実践場面におけるＡＢＭＲを模倣する、新規前感作動物モデルの開発が、そのメカニズムの研究に、および前感作宿主における同種移植片拒絶反応の管理における非常に必要な進歩へ向けた努力に有用である。
【０００７】
高度に前感作された患者のいくらかは、抗ドナー抗体を一時的に除去するためにデザインおよび実行される、免疫吸着（Ｐａｌｍｅｒら、１９８９；Ｒｏｓｓら、１９９３；Ｋｒｉａａら、１９９５）、プラスマフェレーシス、または静脈内免疫グロブリン（Ｓｏｎｎｅｎｄａｙら、２００２；Ｒｏｃｈａら、２００３）を含むものなどの介入プログラムから利益を得ることができる。しかし、その利点に加えて、前述の療法は、その効果に感受性の低い患者が存在し（Ｋｒｉａａら、１９９５；Ｈａｋｉｍら、１９９０；Ｇｌｏｔｚら、１９９３；Ｔｙａｎら、１９９４）、そしてそれらは非常に高価であり、時間がかかり、そしてリスクが高い（Ｓａｌａｍａら、２００１）という多くの欠点を有する。さらに、これらのプロトコールの一過性および変動する効果が、その影響を限定する（Ｇｌｏｔｚら、２００２；Ｋｕｐｉｎら、１９９１；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、２０００）。従って、ＡＢＭＲの予防におけるリスクおよびコストを抑制するための新規戦略を開発することは、移植片（例えば同種移植片）を受け取る前感作レシピエントにとって有用である。
【０００８】
補体経路は、臓器移植における虚血−再灌流傷害において重要な役割を果たすことが公知である。移植における補体についての概説は、例えばＢａｌｄｗｉｎら、２００３、およびＣｈｏｗｄｂｕｒｙら、２００３を参照のこと。移植片の生存を改善するために、補体活性化を阻害することが提案されたが、移植の前にレシピエントを補体阻害剤で処置する必要がある、および／または古典的補体経路および補体第二経路両方の阻害、または最終補体成分（例えばＭＡＣ複合体）の阻害が必要であると考えられている。古典的補体経路および第二補体経路の両方に拮抗する補体阻害剤による虚血−再灌流傷害の処置における例は、例えばＷａｄａら、２００１およびｄｅＶｒｉｅｓら、２００３を参照のこと。移植された臓器に対する複数の内因性の拒絶反応メカニズムのために、その移植における全体的な治療効果を確認するために、補体阻害処置についてのより多くの研究が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】OPTN/SRTR  Annual  Report  (2002).    Chapter  1  of  the  Annual  Report  produced  by  the  Scientific  Registry  of  Transplant  Recipients  (SRTR)  in  collaboration  with  the  Organ  Procurement  and  Transplantation  Network  (OPTN).
【非特許文献２】Abbas  AK,  et  al.  (2000).    Cellular  and  Molecular  Immunology  (4th  edition),  p.  363-383  (W.B.  Saunders  Company,  New  York).
【非特許文献３】Park  WD  et  al.  (2003).    Am.  J.  Transplant  3:952-960.
【非特許文献４】Gloor  (2005).    Contrib.  Nephrol.  146:11-21.
【非特許文献５】Warren  et  al.  (2004).    Am.  J.  Transplant.  4:561-568.
【非特許文献６】Glotz  D,  et  al.  (2002).    Am.  J.  Transplant.  2:758-760.
【非特許文献７】Kupiec-Weglinski  (1996).    Ann.  Transplant.  1:34-40.
【非特許文献８】Mehra  et  al.  (2003).    Curr.  Opin.  Cardiol.  18:153-158.
【非特許文献９】Mauiyyedi  et  al.  (2002).    Curr.  Opin.  Nephrol.  Hypertens.  11:609-618.
【非特許文献１０】Collins  et  al.  (1999).    J.  Am.  Soc.  Nephrol.  10:2208-2214.
【非特許文献１１】Palmer  et  al.  (1989).    Lancet  1:10-12.
【非特許文献１２】Ross  et  al.  (1993).    Transplantation  55:785-789.
【非特許文献１３】Kriaa  et  al.  (1995).    Nephrol.  Dial.  Transplant.  10  Suppl.  6:108-110.
【非特許文献１４】Sonnenday  et  al.  (2002).    Transplant.  Proc.  34:1614-1616.
【非特許文献１５】Rocha  et  al.  (2003).    Transplantation  75:1490-1495.
【非特許文献１６】Hakim  et  al.  (1990).    Am.  J.  Kidney  Dis.  16:423-431.
【非特許文献１７】Glotz  et  al.  (1993).    Transplantation  56:335-337.
【非特許文献１８】Tyan  et  al.  (1994).    Transplantation  57:553-562.
【非特許文献１９】Salama  et  al.  (2001).    Am.  J.  Transplant.  1:260-269.
【非特許文献２０】Kupin  et  al.  (1991).    Transplantation  51:324-329.
【非特許文献２１】Schweitzer  et  al.  (2000).    Transplantation  70:1531-1536.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
哺乳類において移植片（例えば同種移植片）の生存を延長するための方法および組成物が提供される。
【００１１】
よって、１つの局面において、本発明は、ドナー哺乳類からレシピエント哺乳類へ移植された臓器の生存を延長する方法、およびレシピエント哺乳類において移植された臓器の拒絶反応（例えば超急性拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応、または慢性拒絶反応）を予防または減弱する方法を提供し、それは補体阻害剤を移植の前に臓器へ投与することを含み、ここでその補体阻害剤は、７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日未満の半減期を有する。そのような阻害剤は、古典的補体経路または第二補体経路のいずれか、または両方の経路を介して作用し得る。本発明において使用するための特定の補体阻害剤は、例えばＴＴ３０、ＴＴ３２、またはパキセリズマブ、またはエクリズマブの１本鎖バージョンなどの１本鎖抗Ｃ５抗体、またはエクリズマブのＦａｂを含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類からレシピエント哺乳類へ移植され得る臓器の生存を延長する方法を提供し、それは移植の前に第二補体経路阻害剤をその臓器に投与することを含む。その臓器を、ドナー哺乳類から取り出した後であるが移植の前に、補体または終末補体の阻害剤を含む溶液と接触させ得る。１つの実施態様において、その臓器を、０．５から６０時間、例えば１〜３０時間または２８時間、その溶液で灌流またはそれに浸漬する。１つの実施態様、別の実施態様において、その溶液を除去し得、そして続いてその臓器を、補体または終末補体の阻害剤を含まない２番目の溶液で再灌流またはそれに浸漬し得る。特定の実施態様において、２番目の液体による再灌流の時間は、０．２５から３時間、例えば２時間または０．５時間であり得る。灌流または再灌流を含む上記の実施態様のいずれかにおいて、その灌流または再灌流は、冷虚血の時間であり得る。
【００１３】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類の生存を延長する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類における臓器機能を改善する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類において、虚血−再灌流傷害を予防または減弱する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００１６】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類において、超急性拒絶反応を予防または減弱する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類において、急性移植片傷害を予防または減弱する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類において、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）を予防または減弱する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類において、抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）を予防または減弱する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、ドナー哺乳類から臓器移植を受けた後のレシピエント哺乳類において、慢性拒絶反応を予防または減弱する方法を提供し、ここでその方法は、移植の前に、第二補体経路阻害剤を臓器に投与することを含む。
【００２１】
本発明の方法において使用し得る代表的な臓器は、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、脈管組織、眼、角膜、レンズ、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、膵島、軟骨、肝細胞、および造血細胞を含むがこれに限らない。１つの実施態様において、その臓器は腎臓である。
【００２２】
上記の実施態様のいずれかにおいて、臓器をドナー哺乳類から取り出した後、およびその臓器の保存前に、第二補体経路阻害剤をその臓器に投与し得る。別の実施態様において、その第二補体経路阻害剤を、その臓器の保存中に投与する。これらの実施態様において、その臓器の保存は、臓器の冷虚血をもたらす。ある実施態様において、臓器の保存後、そして移植前に、その第二補体経路阻害剤をその臓器に投与し得る。上記の実施態様のいずれかにおいて、その第二補体経路阻害剤を、少なくとも１つの免疫抑制剤（例えば１つまたはそれより多くの免疫抑制剤）とともに投与し得る。１つの実施態様において、その免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ＯＫＴ３、コルチコステロイド、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、抗Ｔ細胞抗体、シクロホスファミド、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎａｍｉｄｅ）、ブレキナル、ＡＴＧ、ＡＬＧ、１５−デオキシスパガリン、ＬＦ１５−０１９５、およびブレディニンおよびその組み合わせからなる群から選択される。他の実施態様において、その第二補体経路阻害剤を、少なくとも１つの古典的補体経路、第二補体経路、またはレクチン補体経路のさらなる阻害剤とともに投与する。
【００２３】
上記の実施態様のいずれかにおいて、そのドナー哺乳類またはレシピエント哺乳類は、ヒトである。
【００２４】
上記の実施態様のいずれかにおいて、その第二補体経路阻害剤は、具体的には、Ｈ因子、補体Ｈ因子関連タンパク質（ＣＦＨＲ）、Ｉ因子、補体受容体１（ＣＲ１）、補体受容体２（ＣＲ２）、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ４６、Ｃｒｒｙ、およびＣ４結合タンパク質の安定性または機能を増加させる。特定の実施態様において、その補体阻害剤は、Ｈ因子融合タンパク質であり得る。さらにより特定の実施態様において、そのＨ因子融合タンパク質は、ＣＲ２−ＦＨ分子であり得る。ある実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分、およびＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分を含み、その結果、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２リガンドに結合することができる。そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み得る。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。ある実施態様において、そのＦＨ部分は、ＦＨの少なくとも最初の４つのＳＣＲドメイン、またはＦＨの少なくとも最初の５つのＳＣＲドメインを含む。特定の実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、２つまたはそれより多くのＦＨ部分を含み得る。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、そしてそのＦＨ部分は、ＦＨの最初の４つのＳＣＲドメインを含み、一方他のものにおいては、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、そしてそのＦＨ部分は、ＦＨの最初の５つのＳＣＲドメインを含む。他の実施態様において、そのＣＲ２部分は、配列番号１のアミノ酸２３から２７１を含み、そしてそのＦＨ部分は、配列番号２のアミノ酸２１から３２０を含む。
【００２５】
またさらなる局面において、本発明は、ドナー哺乳類からレシピエント哺乳類に移植される臓器の生存を延長する方法、およびレシピエント哺乳類における移植された臓器の拒絶反応（例えば超急性拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応、または慢性拒絶反応）を予防または減弱する方法を含み、それは移植の前に、補体阻害剤を臓器に投与することを含み、ここでその補体阻害剤は、７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日未満の半減期を有する。そのような阻害剤は、古典的または第二補体経路のいずれか、または両方の経路を通じて作用し得る。本発明において使用するための特定の補体阻害剤は、例えばＴＴ３０、ＴＴ３２、または１本鎖抗Ｃ５抗体、例えばパキセリズマブまたはエクリズマブの１本鎖バージョン、またはエクリズマブのＦａｂを含む。
【００２６】
適当な補体阻害剤は、典型的には７０ｋＤａ未満、６９ｋＤａ未満、６８ｋＤａ未満、６７ｋＤａ未満、６６ｋＤａ未満、６５ｋＤａ未満、６４ｋＤａ未満、６３ｋＤａ未満、６２ｋＤａ未満、６１ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５９ｋＤａ未満、５８ｋＤａ未満、５７ｋＤａ未満、５６ｋＤａ未満、５５ｋＤａ未満、５４ｋＤａ未満、５３ｋＤａ未満、５２ｋＤａ未満、５１ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４９ｋＤａ未満、４８ｋＤａ未満、４７ｋＤａ未満、４６ｋＤａ未満、４５ｋＤａ未満、４３ｋＤａ未満、４２ｋＤａ未満、４１ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３９ｋＤａ未満、３８ｋＤａ未満、３７ｋＤａ未満、３６ｋＤａ未満、３５ｋＤａ未満、３４ｋＤａ未満、３３ｋＤａ未満、３２ｋＤａ未満、３１ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２９ｋＤａ未満、２８ｋＤａ未満、２７ｋＤａ未満、２６ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２４ｋＤａ未満、２３ｋＤａ未満、２２ｋＤａ未満、２１ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、または１９ｋＤａ未満の分子量を有する。１つの実施態様において、その補体阻害剤は、約６４〜６６ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約６５ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約２６〜２７ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約２６ｋＤａの分子量を有する。特定の実施態様において、その補体阻害剤は、約２６．２８ｋＤａまたは２６．２５ｋＤａの分子量を有する。
【００２７】
さらに、適当な補体阻害剤は、１０日、９．５日、９日、８．５日、８日、７．５日、７日、６．５日、６日、５．５日、５日、４．５日、４日、３．５日、または３日未満の半減期を有し得る。１つの実施態様において、その補体阻害剤は、短い半減期（例えば１０日未満）を有し、そしてレシピエント哺乳類への移植の前に、実質的に臓器から除去される。
【００２８】
特定の実施態様において、その補体阻害剤は、７０ｋＤａの最大分子量および１０日より短い半減期の両方を有する。
【００２９】
７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日未満の半減期を有する補体阻害剤は、その臓器により容易に浸透し、そしてドナー臓器における補体の活性化を遮断し得るので、有利である。しかし、その低分子量および／または短い半減期のために、それらは実質的に移植の前に臓器から除去され、それによってレシピエントの感染に対する（ａｇａｉｎ）自然免疫反応への影響を最小限にする。移植レシピエントは、典型的には移植後に免疫抑制的な処置を受け、そして従って感染のリスクがあるので、これは特に重要である。ドナー臓器からの補体阻害剤の除去はさらに、レシピエントが、ドナー臓器を受け取る前に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ）のワクチン接種を前もって受ける必要がないので、有利である。
【００３０】
１つの実施態様において、その補体阻害剤は、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）の補体阻害ドメインに連結した補体受容体２（ＣＲ２）断片を含む融合タンパク質である。別の実施態様において、その補体阻害剤は、配列番号３を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である。特定の実施態様において、その補体阻害剤は、ＴＴ３０（ＡＬＸＮ１１０２としても公知である）である。
【００３１】
別の実施態様において、その補体阻害剤は、１本鎖抗体、例えば１本鎖抗Ｃ５抗体である。１つの実施態様において、その１本鎖抗Ｃ５は、配列番号２７を含む。別の実施態様において、その１本鎖抗Ｃ５は、配列番号２９を含む。特定の実施態様において、その１本鎖抗Ｃ５抗体は、エクリズマブの１本鎖バージョンである。別の特定の実施態様において、その１本鎖抗Ｃ５抗体は、パキセリズマブである。
【００３２】
別の実施態様において、その補体阻害剤は、抗Ｃ５抗体エクリズマブの重鎖のＶＨ１−ＣＨ１（配列番号３０）および軽鎖のＶＬ−ＣＬ（配列番号３１）を含むＦａｂである。
【００３３】
１つの実施態様において、その抗Ｃ５抗体は、エクリズマブの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）または可変領域（ＶＲ）を含む。別の実施態様において、その抗Ｃ５抗体は、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施態様において、その抗Ｃ５抗体は、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施態様において、その抗Ｃ５抗体は、それぞれ配列番号１および２で記載されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む。
【００３４】
その補体阻害剤を、移植の前に（例えばその臓器をドナー哺乳類から取り出した後、およびその臓器をレシピエント哺乳類へ移植する前に）、その臓器へ投与する。１つの実施態様において、その補体阻害剤を、臓器調達センターで投与する。別の実施態様において、その補体阻害剤を、移植の直前に、例えば移植前の数時間または数分以内に、「バックテーブル（ｂａｃｋ  ｔａｂｌｅ）」での手技において投与する。
【００３５】
その補体阻害剤を、あらゆる適当な技術によって臓器に投与し得る。１つの実施態様において、その補体阻害剤を含む溶液で臓器を灌流することによって、その補体阻害剤を臓器に投与する。別の実施態様において、その臓器を、補体阻害剤を含む溶液中に浸す。１つの実施態様において、その臓器を、補体阻害剤を含む溶液で、０．５から６０時間、または１時間から３０時間（例えば３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間、１０時間、１０．５時間、１１時間、１１．５時間、１２時間、１２．５時間、１３時間、１３．５時間、１４時間、１４．５時間、１５時間、１５．５時間、１６時間、１６．５時間、１７時間、１７．５時間、１８時間、１８．５時間、１９時間、１９．５時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、または３０時間）、灌流またはそれに浸漬する。
【００３６】
１つの実施態様において、レシピエント哺乳類は、移植の前にワクチン接種（例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）に対して）しない。別の実施態様において、そのレシピエントを、移植後に補体阻害剤で処置しない。
【００３７】
本発明の方法で使用し得る代表的な臓器は、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、脈管組織、眼、角膜、レンズ、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、膵島、軟骨、肝細胞、および造血細胞を含むがこれに限らない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、代表的なＣＲ２−ＦＨ発現プラスミドおよびＣＲ２−ＦＨタンパク質の概略図を提供する。ＣＲ２−ＦＨ発現プラスミドに関して、ｋはＫｏｚａｋ配列を指し、５はＣＤ５シグナルペプチドを指し、ｌは任意選択のリンカーを指し、ｓは終止コドンおよびポリＡシグナルを指す。ＣＲ２−ＦＨタンパク質（シグナルペプチド有りまたは無し）に関して、５はＣＤ５シグナルペプチドを指し、ｌは任意選択のリンカーを指す。
【図２】図２は、ヒトＣＲ２のアミノ酸配列（配列番号１）およびヒトＨ因子のアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。
【図３】図３は、代表的なヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）およびヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする代表的なポリヌクレオチド配列（配列番号４）を提供する。
【図４】図４〜６は、本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子の代表的なアミノ酸配列（配列番号５〜１０）を提供する。「ｎｎｎ」は、任意選択のリンカーを示す。
【図５】図４〜６は、本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子の代表的なアミノ酸配列（配列番号５〜１０）を提供する。「ｎｎｎ」は、任意選択のリンカーを示す。
【図６】図４〜６は、本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子の代表的なアミノ酸配列（配列番号５〜１０）を提供する。「ｎｎｎ」は、任意選択のリンカーを示す。
【図７】図７は、本明細書中で記載されるシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の代表的なアミノ酸配列（配列番号１１、１３、および２５）、およびそのシグナルペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列（配列番号１２、１４、および２６）を提供する。
【図８】図８は、マウスＣＲ２のアミノ酸配列（配列番号１５）およびマウスＨ因子のアミノ酸配列（配列番号１６）を提供する。
【図９】図９は、代表的なマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）およびマウスＣＲ２−ＦＨおよびシグナルペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列（配列番号１８）を提供する。
【図１０】図１０は、ＣＲ２ＮＬＦＨＦＨ、リンカー配列無しにＣＲ２部分および２つのＦＨ部分を含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の代表的なＤＮＡ配列（配列番号１９）を提供する。
【図１１】図１１は、ＣＲ２ＬＦＨＦＨ、リンカー配列を介して２つのＦＨ部分と連結したＣＲ２部分を含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の代表的なＤＮＡ配列（配列番号２０）を提供する。
【図１２】図１２は、代表的なヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ヒトＣＲ２−ｆＨまたはＣＲ２ｆＨと呼ばれる）のアミノ酸配列（配列番号２１）、およびヒトＣＲ２−ｆＨおよびシグナルペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列（配列番号２２）を提供する。シグナルペプチドをコードする配列に下線を引く。
【図１３】図１３は、２つのＦＨ部分を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ヒトＣＲ２−ＦＨ２またはヒトＣＲ２ｆＨ２と呼ばれる）の代表的なアミノ酸配列（配列番号２３）、およびヒトＣＲ２−ＦＨ２およびシグナルペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列（配列番号２４）を提供する。シグナルペプチドをコードする配列に下線を引く。
【図１４】図１４は、インビトロ赤血球溶血アッセイにおける、抗ラットＣ５モノクローナル抗体（１８Ａ１０）による古典的補体経路の阻害、およびｈＴＴ３０（ヒトＣＲ２−ＦＨ）による第二補体経路の阻害を示す。
【図１５】図１５は、ラット腎移植の代表的な方法を提供する。補体阻害剤（例えば抗Ｃ５  ｍＡｂまたはｈＴＴ３０）またはコントロールを使用して、移植の前に腎臓を処置した。
【図１６】図１６は、補体阻害剤の前処置（抗Ｃ５  ｍＡｂまたはｈＴＴ３０のいずれか）ありまたはなしの腎移植後の動物の生存パーセンテージを示す。
【図１７Ａ】図１７は、補体阻害剤の前処置（抗Ｃ５  ｍＡｂまたはｈＴＴ３０のいずれか）ありまたはなしの、移植後３日目における、レシピエント動物の血中クレアチニン（１７Ｂ）およびＢＵＮ（１７Ａ）レベルを示す。
【図１７Ｂ】図１７は、補体阻害剤の前処置（抗Ｃ５  ｍＡｂまたはｈＴＴ３０のいずれか）ありまたはなしの、移植後３日目における、レシピエント動物の血中クレアチニン（１７Ｂ）およびＢＵＮ（１７Ａ）レベルを示す。
【図１８】図１８は、正常動物および補体阻害剤前処置（抗Ｃ５  ｍＡｂまたはｈＴＴ３０のいずれか）動物の、移植後３日目または２１日目における移植腎臓の組織学的画像を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、実験手順、すなわち移植直前のＴＴ３０による臓器灌流を示す概略図である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＴＴ３０または１８Ａ１０を、移植前に臓器に投与した場合のレシピエントマウスの生存パーセントを示すグラフである。
【図２０】図２０は、ドナー臓器をＴＴ３０で２回灌流した場合の、ラット腎臓ライセートのＣ３濃度を示すグラフである。
【図２１】図２１は、１本鎖パキセリズマブの配列を示す概略図である。図２１に示すように、１本鎖エクリズマブおよび１本鎖パキセリズマブは、位置３８で異なる（すなわち、１本鎖エクリズマブは位置３８にグルタミン残基を有し、一方パキセリズマブは位置３８にアルギニン残基を有する）。
【図２２】図２２は、１本鎖エクリズマブの配列を示す概略図である。図２１に示すように、１本鎖エクリズマブおよび１本鎖パキセリズマブは、位置３８で異なる（すなわち、１本鎖エクリズマブは位置３８にグルタミン残基を有し、一方パキセリズマブは位置３８にアルギニン残基を有する）。
【図２３】図２３は、ＣＲ２部分およびＨ因子部分を区別する、ＴＴ３０の配列を示す概略図である。
【図２４】図２４は、Ｈ因子（白）およびＣＲ２（黒）と関連した、ＴＴ３０のＳＣＲドメインの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「臓器」という用語は、移植のためのあらゆる細胞、組織、または臓器を指す。代表的な臓器は、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、脈管組織、眼、角膜、レンズ、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、膵島、軟骨、肝細胞、および造血細胞を含むがこれに限らない。特定の実施態様において、その臓器は腎臓である。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「移植」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物レシピエントにおける臓器の置き換えを指す。置き換えの目的は、宿主の病気の臓器または組織を取り除き、そしてそれをドナー由来の健常臓器または組織で置き換えることである。ドナーおよびレシピエントが同じ種である場合、その移植は同種移植として公知である。ドナーおよびレシピエントが異なる種である場合、その移植は異種移植として公知である。移植のために必要な技術は様々であり、そして大部分移植される臓器の性質に依存する。治療様式としての移植の成功は、多くの可能性のある生理学的アウトカムに依存する。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「灌流」という用語は、特定の臓器または体の領域に流体を通過させることを指す。言い換えると、灌流または「灌流する」ことは、流体を血管または他の天然の経路を通じて循環させることによって、臓器、組織に流体を供給することを指す。臓器および組織を灌流する技術は当該分野で周知であり、そして国際特許出願ＷＯ２０１１／００２９２６、および米国特許第５，７２３，２８２号および同第５，６９９，７９３号において開示され、それらはどちらも本明細書中でその全体が参考文献に組み込まれる。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「溶液」という用語は、補体阻害剤を含み得るあらゆる流体を指す。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「減弱する」および「予防する」という用語は、統計学的に有意な量での減少を指す。例えば、１つの実施態様において、減弱することまたは予防することは、拒絶反応を部分的にまたは完全に阻害することのいずれかを指す。１つの実施態様において、「減弱する」は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％減少すること、例えば参照サンプルと比較して少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または１００％までおよび１００％の減少を含む減少、または参照レベルと比較して１０〜１００％の間のあらゆる減少を意味する。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、「延長する」という用語は、統計学的に有意な量での増加を指す。例えば、１つの実施態様において、移植片の生存の延長は、移植片の生存を、例えば参照レベルと比較して少なくとも１０％増加すること、例えば参照サンプルと比較して少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または１００％までおよび１００％の増加を含む減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、または参照レベルと比較して１０〜１００％の間のあらゆる増加を指す。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、疾患または障害を「処置」または「処置すること」という用語は、疾患または障害、または疾患または障害の症状を緩和する、改善する、安定化する、逆転する、遅くする、遅延させる、予防する、減じる、または除去するために、または疾患または障害の進行、または疾患または障害の症状を遅らせる、または止めるために、１つまたはそれより多くの補体阻害剤を、他の治療薬ありまたは無しで投与することと定義される。「有効な量」は、上記で定義したように、疾患または障害を処置するために十分な量である。
【００４６】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットを含むがこれに限らない。いくつかの実施態様において、その個体はヒトである。いくつかの実施態様において、その個体は、ヒト以外の個体である。いくつかの実施態様において、その個体は、第二補体経路が関係する疾患の研究のための動物モデルである。処置を受けることができる個体は、現在無症候性であるが、後に症候性黄斑変性関連障害を発症するリスクのある個体を含む。例えば、ヒト個体は、そのような疾患を経験したことがある近親者を有する個体、および遺伝的または生化学的マーカーの分析によって、生化学的方法によって、またはＴ細胞増殖アッセイなどの他のアッセイによって、そのリスクが決定された個体を含む。いくつかの実施態様において、その個体は、第二補体経路が関係する疾患（例えば加齢黄斑変性）を発症しやすいことを示す、ＦＨ遺伝子の変異または多形を有する人である。いくつかの実施態様において、その個体は、ＦＨの野生型ハプロタイプまたは保護ハプロタイプを有する。ＦＨの異なる多形が、米国特許公開第２００７００２０６４７号において開示されており、それは本明細書中でその全体が組み込まれる。
【００４７】
拒絶反応
本明細書中で使用する場合、「拒絶反応」という用語は、臓器の正常な機能を損傷または破壊するのに十分な、臓器移植レシピエントの免疫反応が、移植された臓器、細胞または組織に対して惹起する過程または複数の過程を指す。その免疫系の反応は、特異的（抗体およびＴ細胞依存性）または非特異的（食作用性、補体依存性等）メカニズム、または両方が関与し得る。
【００４８】
「超急性拒絶反応」は、移植後数分から数時間以内に起こり、そしてそれは移植された組織抗原に対して前もって作られ抗体のために起こる。それは移植片脈管構造の出血および血栓性閉塞によって特徴付けられる。抗体の内皮への結合は補体を活性化し、そして抗体および補体は移植片内皮に多くの変化を誘導して、それが血管内血栓症を促進し、そして血管の閉塞をもたらし、結果として移植された臓器は不可逆的な虚血性の損傷を受ける（Ａｂｂａｓら、２０００）。超急性拒絶反応は多くの場合、既存のＩｇＭ同種抗体、例えば赤血球に発現するＡＢＯ血液型抗原に対する抗体によって媒介される。天然の抗体によって媒介されるこの型の拒絶反応は、異種移植の拒絶反応の主な理由である。同種移植は通常ドナーおよびレシピエントのＡＢＯ型を一致させるように選択するので、天然のＩｇＭ抗体による超急性拒絶反応は、同種移植片ではもはや大きな問題ではない。通常外来性ＭＨＣ分子などのタンパク質同種抗原に対して、または血管内皮細胞に発現する同種抗原に対するＩｇＧ抗体によって媒介される、ＡＢＯ一致同種移植片の超急性拒絶反応は依然として起こり得る。そのような抗体は、輸血、以前の移植、または複数回の妊娠による、同種抗原への以前の曝露の結果として生じ得る（この以前の曝露を、「前感作」と呼ぶ、Ａｂｂａｓら、２０００）。
【００４９】
「急性拒絶反応」は、通常移植の最初の週の後に始まる、Ｔ細胞、マクロファージ、および抗体によって媒介される血管および実質の傷害の過程である（Ａｂｂａｓら、２００１）。血管内皮細胞および実質細胞に存在する、ＭＨＣ分子を含む同種抗原に反応することによって、急性拒絶反応においてＴリンパ球が中心的な役割を果たす。活性化Ｔ細胞が、移植片細胞の直接的な溶解を引き起こす、または壊死を引き起こす炎症性細胞をリクルートおよび活性化するサイトカインを産生する。ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の両方が、急性拒絶反応に寄与し得る。移植片における同種細胞の破壊は高度に特異的であり、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球による殺滅の特徴である（Ａｂｂａｓら、２０００）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカインを分泌し、そして移植片における遅延型過敏様の反応を誘導することによって、急性移植片拒絶反応の媒介において重要であり得、ＣＤ４＋Ｔ細胞が急性拒絶反応を媒介するために十分であることを示すいくつかの証拠が入手可能である（Ａｂｂａｓら、２０００）。抗体はまた、移植片レシピエントが血管壁抗原に対する液性免疫反応を開始した後も急性拒絶反応を媒介し得、そして産生された抗体は血管壁に結合し、そして補体を活性化する（Ａｂｂａｓら、２０００）。
【００５０】
「臓器移植後臓器機能障害」は、移植後の乏尿症、同種移植片の免疫原性および急性拒絶反応エピソードのリスクの増加、および長期の生存の低下を引き起こす急性移植不全の１つの形態である。ドナー、移植片、およびレシピエントに関連する因子が、この状況に寄与し得る。臓器移植後臓器機能障害の概説に関しては、例えばＰｅｒｉｃｏら、２００４、Ｌａｎｃｅｔ、３６４：１８１４−２７を参照のこと。
【００５１】
「慢性拒絶反応」は、長期にわたって起こる、正常な臓器構造の喪失を伴う線維症によって特徴付けられる。慢性拒絶反応の病因は、急性拒絶反応の病因より理解されていない。内膜の平滑筋細胞の増殖の結果として、移植片の動脈閉塞が起こり得る（Ａｂｂａｓら、２０００）。その過程は、促進性または移植片動脈硬化と呼ばれ、そして移植後６ヶ月から１年以内に、あらゆる血管化臓器移植において発症し得る。
【００５２】
「抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）」は、別の型の拒絶反応であり、そして高度に感作された患者の腎移植において主な障害のままである。
【００５３】
移植を成功させるために、いくつかの様式の拒絶反応を克服しなければならない。拒絶反応を予防するために複数のアプローチを利用する。これは、免疫抑制剤（下記でさらに詳しく考察する）の投与、多くの場合様々な様式の攻撃を予防するために（例えば、Ｔ細胞攻撃、抗体、およびサイトカインおよび補体効果の阻害）いくつかの型の投与を必要とし得る。ドナーをレシピエントとマッチさせるプレスクリーニングも、拒絶反応の予防において、特に超急性拒絶反応の予防において、大きな因子である。移植前の抗ＨＬＡ抗体の免疫吸着は、超急性拒絶反応を低減し得る。移植の前に、レシピエントまたは宿主に抗Ｔ細胞薬、例えばモノクローナル抗体ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、シクロスポリンＡ、またはタクロリムス（ＦＫ５０６）を投与し得る。さらに、グルココルチコイドおよび／またはアザチオプリンを、移植の前に宿主に投与し得る。移植拒絶反応の予防を補助するために使用される薬剤は、ＡＴＧまたはＡＬＧ、ＯＫＴ３、ダクリズマブ、バシリキシマブ、コルチコステロイド、１５−デオキシスパガリン、ＬＦ１５−０１９５、シクロスポリン、タクロリムス、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、６−メルカプトプリン、ブレディニン、ブレキナル、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎａｍｉｄｅ）、シクロホスファミド、シロリムス、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体、抗ＣＤ２モノクローナル抗体、および抗ＣＤ４５を含むがこれに限らない。臓器移植における拒絶反応または損傷のさらなる考察に関しては、ＷＯ２００５１１０４８１を参照のこと、これは本明細書中でその全体が参考文献に組み込まれる。
【００５４】
補体および移植／移植片拒絶反応
補体システムは、米国特許第６，３５５，２４５号において詳細に記載されている。補体システムは、細胞性およびウイルス病原体の侵入に対して防御するために体の他の免疫学的システムとともに作用する。少なくとも２５個の補体タンパク質が存在し、それらは血漿タンパク質および膜補助因子の複合体の集合（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）として見出される。その血漿タンパク質は、脊椎動物の血清において、グロブリンの約１０％を占める。補体成分は、一連の複雑な、しかし正確な酵素的切断イベントおよび膜結合イベントにおいて相互作用することによって、その免疫防御機能を達成する。得られる補体カスケードは、オプソニン機能、免疫調節機能、および溶解機能を有する産物の産生をもたらす。
【００５５】
補体カスケードは、古典的経路または第二経路を介して進行する。これらの経路は多くの成分を共有し、そして最初のステップは異なるが、それらは収束し、そして活性化および標的細胞の破壊の原因となる同じ「終末補体」成分（Ｃ５からＣ９）を共有する。
【００５６】
古典的補体経路は、典型的には標的細胞の抗原性部位の抗体認識および結合によって開始する。第二経路は通常、抗体非依存性であり、そして病原体表面のある特定の分子によって開始し得る。両方の経路は、補体成分Ｃ３が活性プロテアーゼ（それぞれの経路で異なる）によって切断されてＣ３ａおよびＣ３ｂを生じる点に収束する。補体の攻撃を活性化する他の経路は、一連のイベントにおいて後に作用して、補体機能の様々な局面をもたらし得る。
【００５７】
補体阻害剤
低分子量および／または１０日未満の半減期を有するあらゆる適当な補体阻害剤を、本発明の方法において使用し得る。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「分子量」という語句は、分子中に含まれる原子の原子量の合計を指す。例えば、その補体阻害剤は、７０ｋＤａ未満、６９ｋＤａ未満、６８ｋＤａ未満、６７ｋＤａ未満、６６ｋＤａ未満、６５ｋＤａ未満、６４ｋＤａ未満、６３ｋＤａ未満、６２ｋＤａ未満、６１ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５９ｋＤａ未満、５８ｋＤａ未満、５７ｋＤａ未満、５６ｋＤａ未満、５５ｋＤａ未満、５４ｋＤａ未満、５３ｋＤａ未満、５２ｋＤａ未満、５１ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４９ｋＤａ未満、４８ｋＤａ未満、４７ｋＤａ未満、４６ｋＤａ未満、４５ｋＤａ未満、４３ｋＤａ未満、４２ｋＤａ未満、４１ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３９ｋＤａ未満、３８ｋＤａ未満、３７ｋＤａ未満、３６ｋＤａ未満、３５ｋＤａ未満、３４ｋＤａ未満、３３ｋＤａ未満、３２ｋＤａ未満、３１ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２９ｋＤａ未満、２８ｋＤａ未満、２７ｋＤａ未満、２６ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２４ｋＤａ未満、２３ｋＤａ未満、２２ｋＤａ未満、２１ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、または１９ｋＤａ未満の分子量を有し得る。１つの実施態様において、その補体阻害剤は、約６４〜６６ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約６５ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約２６〜２７ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約２６ｋＤａの分子量を有する。別の実施態様において、その補体阻害剤は、約２６．２８ｋＤａまたは２６．２５ｋＤａの分子量を有する。またさらなる実施態様において、その補体阻害剤は、エクリズマブの分子量未満の分子量を有する（すなわち約１４８ｋＤａ未満）。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、「半減期」という語句は、補体阻害剤の血漿中濃度が、その元の濃度の半分になるのにかかる時間を指す。１つの実施態様において、その補体阻害剤は、１０日未満の半減期を有する。例えば、その補体阻害剤は、１０日、９．５日、９日、８．５日、８日、７．５日、７日、６．５日、６日、５．５日、５日、４．５日、４日、３．５日、または３日未満の半減期を有し得る。１つの実施態様において、その補体阻害剤は、短い半減期（例えば１０日未満）を有し、そしてレシピエント哺乳類への移植前に臓器から実質的に除去される。別の実施態様において、その補体阻害剤は、エクリズマブより短い半減期を有する（すなわち、約２９１時間またはおよそ１２．１日未満）。
【００６０】
１つの実施態様において、その補体阻害剤を、移植レシピエントに使用するために臓器を新しい場所へ輸送する場合に、臓器を保存するための溶液の成分として使用する。この場合、「半減期」は、補体阻害剤の溶液中濃度が、その元の濃度の半分になるのにかかる時間を指す。
【００６１】
その補体阻害剤は、７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日より短い半減期の両方を有し得る。
【００６２】
上記で記載した阻害剤は、臓器に容易に浸透し得、そしてドナー臓器において補体の活性化を遮断し得るので、有利である。しかし、その低分子量および／または短い半減期のために、それらは移植の前に臓器から実質的に除去され、それによって感染に対する（ａｇａｉｎ）レシピエントの自然免疫反応への影響を最小限にする。移植レシピエントは、典型的には移植後免疫抑制的な処置を受け、そして従って感染のリスクがあるので、これは特に重要である。
【００６３】
１本鎖抗体
本明細書中で使用する場合、「１本鎖抗体」（１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）としても公知である）という語句は、短いリンカーペプチドで連結した、免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の融合体を指す。
【００６４】
１つの実施態様において、その補体阻害剤は、１本鎖抗体、例えば１本鎖抗Ｃ５抗体である。１つの実施態様において、１本鎖抗Ｃ５は、配列番号２７を含む。別の実態態様において、その１本鎖抗Ｃ５は、配列番号２９を含む。特定の実施態様において、その１本鎖抗Ｃ５抗体は、エクリズマブの１本鎖バージョンである。１本鎖エクリズマブの配列を、図２２に示す。別の特定の実施態様において、その１本鎖抗Ｃ５抗体は、パキセリズマブである。１本鎖パキセリズマブの配列を、図２１に示す。
【００６５】
Ｆａｂ断片
別の実施態様において、その補体阻害剤は、抗Ｃ５抗体エクリズマブの、重鎖のＶＨ−ＣＨ１（配列番号３０）および軽鎖のＶＬ−ＣＬ（配列番号３１）を含むＦａｂである。
【００６６】
ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質
１つの実施態様において、その補体阻害剤は、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）の補体阻害ドメインに連結した補体受容体２（ＣＲ２）断片を含む融合タンパク質である。別の実施態様において、その補体阻害剤は、配列番号３を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である。特定の実施態様において、その補体阻害剤は、ＴＴ３０（ＡＬＸＮ１１０２としても公知である）である。図２３〜２４は、ＴＴ３０の配列を示し、そしてＣＲ２部分およびＨ因子部分を区別する。
【００６７】
Ｈ因子分子は第二補体経路の活性化を阻害し得る
Ｈ因子は、第二補体経路の公知の阻害剤である。本発明は、Ｈ因子分子、Ｈ因子分子を含む組成物（例えば医薬組成物）、および移植片の生存を改善し、虚血−再灌流傷害または移植臓器に対する他の内因性超急性拒絶反応、急性拒絶反応、または慢性拒絶反応を減少させる方法を提供する。この適用におけるＨ因子分子は、Ｈ因子の野生型形態、変異形態、または他の改変された形態を含む。１つの実施態様において、そのＨ因子分子は、Ｈ因子融合タンパク質である。１つの実施態様において、そのＨ因子融合タンパク質は、細胞または病原体表面のＣ３ｂ活性化部位に対する標的化部分に融合したＨ因子を含む。特定の実施態様において、そのような融合タンパク質は、補体受容体２（ＣＲ２）−Ｈ因子融合タンパク質を含む。
【００６８】
ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２部分およびＦＨ部分を含む。ＣＲ２部分は、その分子の補体活性化部位への標的化送達に関与し、そしてＦＨ部分は、第二経路の補体活性化を特異的に阻害することに関与する。予備的な研究が、ＣＲ２−ＦＨ分子、特にＣＲ２タンパク質の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインおよびＨ因子タンパク質の最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＴＴ３０とも呼ばれる）は、インビトロで標的化活性および補体阻害活性の両方を有することを示した。この分子は、ＣＲ２部分を欠くＨ因子分子よりも有意により有効であり、ＦＨを補体活性化部位へ標的化することは、黄斑変性（例えば加齢黄斑変性）などの、第二補体経路が関与する疾患を処置する有効な治療手段であることを示唆する。血漿中のＦＨの比較的高い濃度、および血漿と直接接触している細胞は既にＦＨで完全に覆われているという、長い間信じられてきた考えのために、この観察は驚くべきことである。Ｊｏｚｓｉら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．（２００４）１９：２５１−２５８。
【００６９】
本明細書中で使用する「ＣＲ２−ＦＨ分子」は、ＣＲ２またはその断片（「ＣＲ２部分」）、およびＦＨまたはその断片（「ＦＨ部分」）を含む、天然に存在しない分子を指す。ＣＲ２部分は、ＣＲ２の１つまたはそれより多くの天然リガンドに結合し得、そして従って補体活性化部位への分子の標的化送達に関与する。ＦＨ部分は、第二補体経路の補体活性化を特異的に阻害することに関与する。ＣＲ２−ＦＨ分子のＣＲ２部分およびＦＨ部分を、２つの部分の望ましい機能性が維持される限り、当該分野で公知のあらゆる方法によって一緒に連結し得る。ＣＲ２部分および／またはＦＨ部分は、その機能に干渉しない、または実際に改善する、当該分野で公知のあらゆる改変を任意選択で有する、哺乳類または他の種由来のＣＲ２タンパク質またはＦＨタンパク質、そのホモログ、オルソログ、パラログを含み得る。その哺乳類または他の種は、少なくともヒト、マウス、ラット、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ウシ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、または当該分野で公知である、および／または実施において使用される他の動物を含み得る。
【００７０】
本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子は、従って一般的にＣＲ２リガンドへの結合および第二経路の補体活性化の阻害という２つの機能を有する。「ＣＲ２リガンド」は、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ、およびＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合断片を含むがこれに限らない、天然に存在するＣＲ２タンパク質に結合するあらゆる分子を指す。ＣＲ２−ＦＨ分子は、例えば、ＣＲ２タンパク質の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかの結合親和性で、ＣＲ２リガンドに結合し得る。結合親和性を、例えば表面プラズモン共鳴法、滴定型熱量測定法、ＥＬＩＳＡ、およびフローサイトメトリーを含む、当該分野で公知のあらゆる方法によって決定し得る。いくつかの実施態様において、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２の１つまたはそれより多くの以下の性質を有する：（１）Ｃ３ｄへの結合、（２）ｉＣ３ｂへの結合、（３）Ｃ３ｄｇへの結合、（４）Ｃ３ｄへの結合、および（５）ＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合断片（複数可）への結合。
【００７１】
本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子は一般的に、第二経路の補体活性化を阻害し得る。そのＣＲ２−ＦＨ分子は、天然に存在するＦＨタンパク質よりも強力な補体阻害剤であり得る。例えば、いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、ＦＨタンパク質の補体阻害活性の約１．５、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０倍のいずれか、またはそれ超の補体阻害活性を有する。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、約１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、または１０ｎＭ未満のいずれかのＥＣ５０を有する。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、例えば８〜５０ｎＭ、８〜２０ｎＭ、１０〜４０ｎＭ、および２０〜３０ｎＭのいずれかを含む、約５〜６０ｎＭのＥＣ５０を有する。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、ＦＨタンパク質の補体阻害活性の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかの補体阻害活性を有する。
【００７２】
補体の阻害を、例えば、インビトロザイモサンアッセイ、赤血球溶血アッセイ、免疫複合体活性化アッセイ、およびマンナン活性化アッセイを含む、当該分野で公知のあらゆる方法に基づいて評価し得る。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨは、１つまたはそれより多くの以下のＦＨの性質を有する：（１）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）への結合、（２）Ｃ３ｂへの結合、（３）ヘパリンへの結合、（４）シアル酸への結合、（５）内皮細胞表面への結合、（６）細胞インテグリン受容体への結合、（７）病原体への結合、（８）Ｃ３ｂ補助因子活性、（９）Ｃ３ｂ崩壊促進活性（ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、および（１０）第二補体経路の阻害。
【００７３】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、融合タンパク質である。本明細書中で使用される「融合タンパク質」は、お互いに操作可能に連結された、２つまたはそれより多くのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。いくつかの実施態様において、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、お互いに直接融合している。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分およびＦＨ部分は、アミノ酸リンカー配列によって連結している。リンカー配列の例は、当該分野で公知であり、そして例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（ＳｅｒＧｌｙ４）、（ＳｅｒＧｌｙ４）２、（ＳｅｒＧｌｙ４）３、および（ＳｅｒＧｌｙ４）４を含む。連結配列はまた、補体因子の異なるドメイン間に見出される「天然」連結配列を含み得る。例えば、ヒトＣＲ２の最初の２つのＮ末端のショートコンセンサスリピートドメイン間の連結配列である、ＶＳＶＦＰＬＥを使用し得る。いくつかの実施態様において、ヒトＣＲ２の４番目および５番目のＮ末端のショートコンセンサスリピートドメイン間の連結配列（ＥＥＩＦ）を使用する。融合タンパク質におけるＣＲ２部分およびＦＨ部分の順序は変動し得る。例えば、いくつかの実施態様において、ＣＲ２部分のＣ末端が、分子のＦＨ部分のＮ末端に融合している（直接的または間接的に）。いくつかの実施態様において、ＣＲ２部分のＮ末端が、分子のＦＨ部分のＣ末端に融合している（直接的または間接的に）。
【００７４】
いくつかの実施態様において、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかの、少なくとも約４００、４５０、５００、５５０またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む。１つの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質は、ＴＴ３０である。
【００７５】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号５〜１０のいずれかのアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号５〜１０のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号５〜１０のいずれかの、少なくとも約４００、４５０、５００、５５０またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む。
【００７６】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００７７】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、化学的架橋剤によって連結したＣＲ２部分およびＦＨ部分を含む。２つの部分の連結は、２つの部分に存在する反応基で起こり得る。架橋剤を用いて標的化し得る反応基は、第一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物、およびカルボン酸、またはタンパク質に付加し得る活性基を含む。化学的リンカーの例は、当該分野で周知であり、ビスマレイミドヘキサン、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ＳＰＤＰなどのＮＨＳ−エステル−マレイミド架橋剤、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ＭＢＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＴＢＰ、ＥＤＣ、およびＤＴＭＥなどのイミドエステル架橋剤を含むがこれに限らない。
【００７８】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分およびＦＨ部分は、非共有結合で連結している。例えば、その２つの部分を、ＣＲ２部分またはＦＨ部分にそれぞれ連結した、２つの相互作用する橋架けタンパク質（ビオチンおよびストレプトアビジンなどの）によって結合し得る。
【００７９】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、本明細書中で記載される２つまたはそれより多くの（同じまたは異なる）ＣＲ２部分を含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、本明細書中で記載される２つまたはそれより多くの（同じまたは異なる）ＦＨ部分を含む。これらの２つまたはそれより多くのＣＲ２（またはＦＨ）部分は、お互い直列に連結（例えば融合）し得る。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、ＣＲ２部分および２つまたはそれより多くの（例えば３、４、５、またはそれより多くの）ＦＨ部分を含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、ＦＨ部分および２つまたはそれより多くの（例えば３、４、５、またはそれより多くの）ＣＲ２部分を含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、２つまたはそれより多くのＣＲ２部分、および２つまたはそれより多くのＦＨ部分を含む。
【００８０】
いくつかの実施態様において、単離されたＣＲ２−ＦＨ分子が提供される。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、２量体または多量体を形成する。
【００８１】
その分子中のＣＲ２部分およびＦＨ部分は、同じ種（例えばヒトまたはマウス）由来、または異なる種由来であり得る。
【００８２】
ＣＲ２部分
本明細書中で記載されるＣＲ２部分は、ＣＲ２またはその断片を含む。ＣＲ２は、主に成熟Ｂ細胞および濾胞性樹状細胞に発現する膜貫通タンパク質である。ＣＲ２は、Ｃ３結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ＣＲ２の天然リガンドは、例えば、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、およびＣ３ｄ、およびＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合分解断片を含む。Ｃ３の切断は、最初にＣ３ｂの産生、およびこのＣ３ｂの活性化細胞表面への共有結合を生じる。そのＣ３ｂ断片は、補体カスケードを増幅する酵素複合体の産生に関与する。細胞表面において、特に補体活性化の制御因子を含む宿主表面（すなわちほとんどの宿主組織）に沈着した場合、Ｃ３ｂは急速に不活性なｉＣ３ｂに変換される。膜結合補体制御因子の非存在下においても、かなりのレベルのｉＣ３ｂが形成される。ｉＣ３ｂは次に、血清プロテアーゼによって、膜結合断片Ｃ３ｄｇ、そして次いでＣ３ｄに消化されるが、この過程は比較的遅い。従って、ＣＲ２のＣ３リガンドは、一旦産生されれば比較的長く生存し、そして補体活性化の部位において高い濃度で存在する。従って、ＣＲ２は、分子を補体活性化の部位へ持ってくる強力な標的化ビヒクルとして作用し得る。
【００８３】
ＣＲ２は、ショートコンセンサスリピートとして公知である、１５または１６個の反復ユニット（ＳＣＲドメイン）を有する細胞外部分を含む。ＳＣＲドメインは、４つのシステイン、２つのプロリン、１つのトリプトファン、およびいくつかの他の部分的に保存されたグリシンおよび疎水性残基を含む、高度に保存された残基の典型的なフレームワークを有する。配列番号１は、全長ヒトＣＲ２タンパク質配列を示す。アミノ酸１〜２０はリーダーペプチドを含み、アミノ酸２３〜８２はＳＣＲ１を含み、アミノ酸９１〜１４６はＳＣＲ２を含み、アミノ酸１５４〜２１０はＳＣＲ３を含み、アミノ酸２１５〜２７１はＳＣＲ４を含む。活性部位（Ｃ３ｄ結合部位）は、ＳＣＲ１−２（最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメイン）に存在する。これらのＳＣＲドメインは、スペーサーとして作用する、様々な長さの短い配列によって分けられている。全長マウスＣＲ２タンパク質配列は、本明細書中で配列番号１５によって示される。マウスＣＲ２タンパク質のＳＣＲ１ドメインおよびＳＣＲ２ドメインは、マウスＣＲ２アミノ酸配列で、配列番号１５の位置１４〜７３（ＳＣＲ１）、および配列番号１５の位置８２〜１３８（ＳＣＲ２）に存在する。ヒトおよびマウスＣＲ２は、配列番号１および配列番号１５によって示される全長アミノ酸配列にわたって約６６％同一であり、そして配列番号１および配列番号１５のＳＣＲ１−ＳＣＲ２領域にわたって約６１％同一である。マウスおよびヒトＣＲ２はどちらも、Ｃ３に結合する（Ｃ３ｄ領域において）。開示されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関して、種および系統のバリエーションが存在すること、および本明細書中で記載されるＣＲ２またはその断片は、全ての種および系統バリエーションを包含することが理解される。
【００８４】
本明細書中で開示されるＣＲ２部分は、ＣＲ２タンパク質のリガンド結合部位のいくらかまたは全てを含むポリペプチドを指し、全長ＣＲ２タンパク質（例えば配列番号１で示すようなヒトＣＲ２、または配列番号１５で示すようなマウスＣＲ２）、可溶性ＣＲ２タンパク質（例えばＣＲ２の細胞外ドメインを含むＣＲ２断片）、ＣＲ２の他の生物学的に活性な断片、ＳＣＲ１およびＳＣＲ２を含むＣＲ２断片、または下記で詳細に説明するような、天然に存在するＣＲ２またはその断片のあらゆるホモログを含むがこれに限らない。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の以下の性質の１つを有する：（１）Ｃ３ｄへの結合、（２）ｉＣ３ｂへの結合、（３）Ｃ３ｄｇへの結合、（４）Ｃ３ｄへの結合、および（５）ＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合断片（複数可）への結合。
【００８５】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の３つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分はＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、例えばＣＲ２の少なくとも最初の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のＳＣＲドメインのいずれかを含む、少なくともＣＲ２の最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む（およびいくつかの実施態様において、それらから成る、または実質的にそれらから成る）。
【００８６】
ＣＲ２タンパク質またはその断片のホモログは、少なくとも１つまたは少数のアミノ酸が欠失（例えばタンパク質の短縮バージョン、例えばペプチドまたは断片）、挿入、反転、置換、および／または誘導体化（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加によって）しているという点で、天然に存在するＣＲ２（またはＣＲ２断片）とは異なるタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、ＣＲ２ホモログは、天然に存在するＣＲ２のアミノ酸配列（例えば配列番号１、または配列番号１５）と少なくとも約７０％同一、例えば天然に存在するＣＲ２のアミノ酸配列（例えば配列番号１、または配列番号１５）と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。ＣＲ２ホモログまたはその断片は、好ましくはＣＲ２の天然に存在するリガンド（例えばＣ３ｄまたはＣＲ２結合能を有する他のＣ３断片）への結合能を保持する。例えば、そのＣＲ２ホモログ（またはその断片）は、ＣＲ２（またはその断片）の結合親和性の、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるＣ３ｄに対する結合親和性を有し得る。
【００８７】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ヒトＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、例えば少なくともヒトＣＲ２（配列番号１）のアミノ酸２３から１４６を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ヒトＣＲ２（配列番号１）のアミノ酸２３から１４６と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有する、ヒトＣＲ２の少なくとも最初の２つのＳＣＲドメインを含む。
【００８８】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ヒトＣＲ２の少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、例えば少なくともヒトＣＲ２（配列番号１）のアミノ酸２３から２７１を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ヒトＣＲ２（配列番号１）のアミノ酸２３から２７１と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有する、ヒトＣＲ２の少なくとも最初の４つのＳＣＲドメインを含む。
【００８９】
参照配列（例えば配列番号１）と、例えば少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列が参照配列の各１００アミノ酸あたり５点までの変化を含み得る以外は、参照配列と同一であることが意図される。これらの５点までの変化は、欠失、置換、付加であり得、そして配列のどこでも起こり得、参照配列のアミノ酸中に個々に、または参照配列内の１つまたはそれより多くの連続的な群のいずれかで点在する。
【００９０】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２タンパク質のリガンド結合部位の一部または全てを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分はさらに、結合部位の３次元構造を維持するために必要な配列を含む。ＣＲ２のリガンド結合部位を、ＣＲ２の結晶構造、例えば米国特許出願公開第２００４／０００５５３８号において開示されるヒトおよびマウスＣＲ２結晶構造に基づいて、容易に決定し得る。例えば、いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、ＣＲ２のＳＣＲ２のＢ鎖およびＢ−Ｃループを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、配列番号１に関して、セグメントＧ９８−Ｇ９９−Ｙ１００−Ｋ１０１−Ｉ１０２−Ｒ１０３−Ｇ１０４−Ｓ１０５−Ｔ１０６−Ｐ１０７−Ｙ１０８を含むＣＲ２  ＳＣＲのＢ鎖およびＢ−Ｃループ上の部位を含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、配列番号１に関して位置Ｋ１１９を含むＣＲ２  ＳＣＲ２のＢ鎖上の部位を含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、配列番号１に関して、Ｖ１４９−Ｆ１５０−Ｐ１５１−Ｌ１５２を含むセグメントを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、Ｔ１２０−Ｎ１２１−Ｆ１２２を含むＣＲ２  ＳＣＲ２のセグメントを含む。いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、２つまたはそれより多くのこれらの部位を有する。例えば、いくつかの実施態様において、そのＣＲ２部分は、配列番号１に関して、Ｇ９８−Ｇ９９−Ｙ１００−Ｋ１０１−Ｉ１０２−Ｒ１０３−Ｇ１０４−Ｓ１０５−Ｔ１０６−Ｐ１０７−Ｙ１０８およびＫ１１９を含む部分を含む。これらの部位の他の組み合わせも企図される。
【００９１】
Ｈ因子部分
本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子のＦＨ部分は、ＦＨまたはその断片を含む。
【００９２】
補体因子Ｈ（ＦＨ）は、１本鎖ポリペプチドの血漿糖タンパク質である。そのタンパク質は、一連の２０個のビーズのように連続的様式で配置された、約６０アミノ酸の２０個の反復ＳＣＲドメインから成る。Ｈ因子はＣ３ｂに結合し、第二経路Ｃ３−コンバターゼ（Ｃ３Ｂｂ）の崩壊を加速し、そしてＣ３ｂのタンパク質分解性の不活性化の補助因子として作用する。Ｈ因子の存在下で、Ｃ３ｂのタンパク質分解は、Ｃ３ｂの切断を生じる。Ｈ因子は、少なくとも３つの別々のＣ３ｂに対する結合ドメインを有し、それらはＳＣＲ１〜４、ＳＣＲ５〜８、およびＳＣＲ１９〜２０内に位置する。Ｈ因子の各部位が、Ｃ３ｂタンパク質内の別々の領域に結合する：そのＮ末端部位は天然のＣ３ｂに結合する；Ｈ因子の中間領域に位置する２番目の部位は、Ｃ３ｃ断片に結合する、そしてＳＣＲ１９および２０内に位置する部位はＣ３ｄ領域に結合する。それに加えて、Ｈ因子はまた、ヘパリンに対する結合部位を含み、それらはＨ因子のＳＣＲ７、ＳＣＲ５〜１２、およびＳＣＲ２０内に位置し、そしてＣ３ｂ結合部位のそれと重複する。構造的および機能的分析は、ＦＨの補体阻害活性のためのドメインは、最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメイン内に位置することを示している。
【００９３】
配列番号２は、全長ヒトＦＨタンパク質配列を示す。アミノ酸１〜１８はリーダーペプチドに対応し、アミノ酸２１〜８０はＳＣＲ１に対応し、アミノ酸８５〜１４１はＳＣＲ２に対応し、アミノ酸１４６〜２０５はＳＣＲ３に対応し、アミノ酸２１０〜２６２はＳＣＲ４に対応し、アミノ酸２６７〜３２０はＳＣＲ５に対応する。全長マウスＦＨタンパク質配列は、本明細書中で配列番号１６によって示される。マウスＦＨタンパク質のＳＣＲ１ドメインおよびＳＣＲ２ドメインは、マウスＦＨアミノ酸配列で配列番号１６の位置２１〜２７（ＳＣＲ１）、および配列番号１６の位置８２〜１３８（ＳＣＲ２）に位置する。ヒトおよびマウスのＦＨは、配列番号２および配列番号１６によって示される全長アミノ酸配列にわたって、約６１％同一である。開示されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関して、種および系統バリエーションが存在すること、およびＦＨまたはその断片は、全ての種および系統バリエーションを包含することが理解される。
【００９４】
本明細書中で記載されるＦＨ部分は、ＦＨタンパク質の補体阻害活性のいくらか、または全てを有するＦＨタンパク質のあらゆる部分を指し、そして全長ＦＨタンパク質、ＦＨタンパク質の生物学的に活性な断片、ＳＣＲ１〜４を含むＦＨ断片、または下記で詳細に記載するような、天然に存在するＦＨまたはその断片のあらゆるホモログを含むがこれに限らない。いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、１つまたはそれより多くの以下の性質を有する：（１）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）への結合、（２）Ｃ３ｂへの結合、（３）ヘパリンへの結合、（４）シアル酸への結合、（５）内皮細胞表面への結合、（６）細胞インテグリン受容体への結合、（７）病原体への結合、（８）Ｃ３ｂ補助因子活性、（９）Ｃ３ｂ崩壊促進活性、および（１０）第２補体経路の阻害。
【００９５】
いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、ＦＨの最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。いくつかの実施態様において、その構築物は、ＦＨの最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。いくつかの実施態様において、その構築物は、ＦＨの最初の６個のＮ末端ＳＣＲドメインを含む。いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、例えば少なくともＦＨの最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれより多くのＮ末端ＳＣＲドメインのいずれかを含む、少なくともＦＨの最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む（そしていくつかの実施態様においてそれらから成る、または実質的にそれらから成る）。
【００９６】
いくつかの実施態様において、そのＦＨは野生型ＦＨである。いくつかの実施態様において、そのＦＨはＦＨの保護的変異体である。
【００９７】
いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、ヘパリン結合部位を欠く。これは、例えば、ＦＨ上のヘパリン結合部位の変異によって、またはヘパリン結合部位を含まないＦＨ断片を選択することによって達成し得る。いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、加齢黄斑変性に対して保護的な多形を有するＦＨまたはその断片を含む。Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（２０）：７２２７。そのような配列を含むＣＲ２−ＦＨ分子の１つの例を、図４において提供する（配列番号６）。
【００９８】
ＦＨタンパク質またはその断片のホモログは、少なくとも１つまたは少数の、しかし１つまたは少数に限らない、アミノ酸が欠失（例えば、ペプチドまたは断片などの、タンパク質の短縮バージョン）、挿入、反転、置換および／または誘導体化（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加によって）しているという点で、天然に存在するＦＨ（またはＦＨ断片）と異なるタンパク質を含む。例えば、ＦＨホモログは、天然に存在するＦＨのアミノ酸配列（例えば配列番号２、または配列番号１６）と少なくとも約７０％同一である、例えば天然に存在するＦＨのアミノ酸配列（例えば配列番号２、または配列番号１６）と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、ＦＨ（またはその断片）のホモログは、ＦＨ（またはその断片）の補体阻害活性をすべて保持する。いくつかの実施態様において、そのＦＨ（またはその断片）のホモログは、ＦＨ（またはその断片）の補体阻害活性の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかを保持する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、ヒトＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、例えば少なくともヒトＦＨ（配列番号２）のアミノ酸２１から２６２を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、ヒトＦＨ（配列番号２）のアミノ酸２１から２６２と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有する、ヒトＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。
【０１００】
いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、ヒトＦＨの少なくとも最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、例えば少なくともヒトＦＨ（配列番号２）のアミノ酸２１から３２０を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、ヒトＦＨ（配列番号２）のアミノ酸２１から３２０と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有する、ヒトＦＨの少なくとも最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、そのＦＨ部分は、Ｈ因子遺伝子の選択的スプライシングされた転写物によってコードされるタンパク質である、Ｈ因子様１分子（ＦＨＬ−１）の全長または断片を含む。成熟ＦＨＬ−１は、４３１アミノ酸を含む。最初の４２７アミノ酸は、７つのＳＣＲドメインを構築し、そしてＦＨのＮ末端ＳＣＲドメインを同一である。Ｃ末端の残りの４つのアミノ酸残基Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（ＳＦＴＬ）は、ＦＨＬ−１に特異的である。ＦＨＬ−１は、機能的に特徴付けられ、そしてＨ因子補体調節活性を有することが示されている。「ＦＨ部分」という用語はまた、ＦＨＲ１遺伝子、ＦＨＲ２遺伝子、ＦＨＲ３遺伝子、ＦＨＲ４遺伝子、ＦＨＲ５遺伝子によってコードされるタンパク質を含むがこれに限らない、Ｈ因子関連分子の全長または断片を包含する。これらのＨ因子関連タンパク質は、例えばＣｏｒｄｏｂａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００４、４１：３５５−３６７において開示される。
【０１０２】
ＣＲ２−ＦＨ分子の変異体
ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）の変異体も、本発明の方法および組成物に包含される。本明細書中で記載されるＣＲ２−ＦＨ分子の変異体は、（ｉ）ＣＲ２部分および／またはＦＨ部分の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されている変異体であって、そのような置換アミノ残残基が、遺伝コードによってコードされているものであっても、そうでなくてもよい、変異体；または（ｉｉ）ＣＲ２部分および／またはＦＨ部分の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、置換基を含む変異体、または（ｉｉｉ）ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）が、別の化合物、例えばＣＲ２−ＦＨ分子の半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合している変異体、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸、例えばリーダー配列または分泌配列、またはＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）の精製のために用いられる配列が、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）に融合している変異体、または（ｖ）ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）が、効果の持続時間を増加させるために、より大きなポリペプチド、すなわちヒトアルブミン、抗体またはＦｃに融合している変異体であり得る。そのような変異体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、ＣＲ２−ＦＨ分子の変異体は、１つまたはそれより多くの予測された、好ましくは非必須アミノ酸残基でなされた保存的アミノ酸置換（下記でさらに規定する）を含む。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく、タンパク質の野生型配列から変え得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【０１０４】
ＣＲ２−ＦＨ分子のＣＲ２部分またはＦＨ部分におけるアミノ酸置換を、その分子の機能性を改善するために導入し得る。例えば、ＣＲ２部分のそのリガンド（複数可）への結合親和性を増加させるために、ＣＲ２部分のそのリガンド（複数可）への結合特異性を増加させるために、ＣＲ２−ＦＨ分子の望ましい部位への標的化を改善するために、ＣＲ２−ＦＨ分子の二量体化または多量体化を増加させるために、およびＣＲ２−ＦＨ分子の薬物動態を改善するために、分子のＣＲ２部分にアミノ酸置換を導入し得る。同様に、ＣＲ２−ＦＨ分子の機能性を増加させるために、およびＣＲ２−ＦＨ分子の薬物動態を改善するために、分子のＦＨ部分にアミノ酸置換を導入し得る。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる、および／またはポリペプチドの潜在的な免疫原性を低減する化合物（例えばポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」）に融合する。融合タンパク質に、水溶性、大きさ、低い腎クリアランス速度、および低い免疫原性を与えるために、ＰＥＧを使用し得る。例えば、米国特許第６，２１４，９６６号を参照のこと。ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）の場合において、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）のＰＥＧへの融合を、当業者に公知であるあらゆる手段によって達成し得る。例えば、まずシステイン変異をＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質に導入し、続いてＰＥＧ−マレイミドによる部位特異的誘導体化によって、ペグ化を達成し得る。ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のＣ末端にシステインを付加し得る。例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１５）：８５４８−８５５３を参照のこと。ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）に行い得る別の改変は、ビオチン化を含む。ある特定の例において、ストレプトアビジンと容易に反応し得るように、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）をビオチン化することが有用であり得る。タンパク質のビオチン化方法は、当該分野で周知である。さらに、コンドロイチン硫酸を、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えばＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）に結合させ得る。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２−ＦＨ分子の標的化効率をさらに増加させる、別の標的化分子または標的化部分に融合している。例えば、そのＣＲ２−ＦＨ分子を、血管の内皮細胞に結合する、または他の方法で接着する能力を有するリガンド（「血管内皮標的化アミノ酸リガンド」と呼ばれる）（例えばアミノ酸配列）に融合し得る。代表的な血管内皮標的化リガンドは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、インテグリン、フィブロネクチン、Ｉ−ＣＡＭ、ＰＤＧＦ、または血管内皮細胞の表面に発現する分子に対する抗体を含むがこれに限らない。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、そのＣＲ２−ＦＨ分子は、細胞間接着分子のリガンドにコンジュゲート（例えば融合）している。例えば、そのＣＲ２−ＦＨ分子を、細胞間接着分子に結合する１つまたはそれより多くの炭水化物部分にコンジュゲートし得る。その炭水化物部分は、傷害部位へのＣＲ２−ＦＨ分子の局在化を促進する。その炭水化物部分を、化学的または酵素的結合などの、細胞外の手段によってＣＲ２−ＦＨ分子へ結合し得る、または適当な酵素の発現によって達成される細胞内プロセシングの結果であり得る。いくつかの実施態様において、その炭水化物部分は、インテグリンまたはＥ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、またはＰセレクチンを含むセレクチンなどの、特定の種類の接着分子に結合する。いくつかの実施態様において、その炭水化物部分は、Ｎ結合炭水化物、例えばフコシル化炭水化物およびシアル酸付加炭水化物を含む、複合体型を含む。いくつかの実施態様において、その炭水化物部分は、ルイスＸ抗原、例えばシアル酸付加ルイスＸ抗原（ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ａｎｔｉｇｅｎ）に関連する。
【０１０８】
ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のさらなる説明に関しては、ＷＯ２００７／１４９５６７を参照のこと、それは本明細書中でその全体が参考文献に組み込まれる。
【０１０９】
免疫抑制剤
移植片拒絶反応を遅らせるために（すなわち、その生存を延長するために）利用される多くの薬剤は、様々な方法で働く。免疫抑制剤は、広く使用されている。いくつかの免疫抑制剤の作用メカニズムの概説に関しては、Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ、２０００を参照のこと。シクロスポリンＡは、移植片拒絶反応を阻害するために最も広く使用されている免疫抑制剤の１つである。それはインターロイキン−２またはＩＬ−２の阻害剤である（それは、インターロイキン−２のｍＲＮＡ転写を妨げる）。より直接的には、シクロスポリンは、通常Ｔ細胞受容体刺激の際に起こるカルシニューリンの活性化を阻害する。カルシニューリンは、ＮＦＡＴ（Ｔ細胞活性化の核内因子）を脱リン酸して、それが核に入り、そしてインターロイキン−２プロモーターに結合することを可能にする。この過程を遮断することによって、シクロスポリンＡは、それがなければ起こる、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、およびその結果起こるイベントのカスケードを阻害する。タクロリムスは、インターロイキン−２の産生を阻害することによって作用する、別の免疫抑制剤である。
【０１１０】
ラパマイシン（シロリムス）、ＳＤＺ  ＲＡＤ、およびインターロイキン−２受容体ブロッカーは、インターロイキン−２の作用を阻害し、そして従って上記で記載されたイベントのカスケードを妨げる薬剤である。
【０１１１】
プリンまたはピリミジン生合成の阻害剤も、移植片拒絶反応を阻害するために使用される。これらはＤＮＡ合成を妨げ、そしてそれによって、Ｔ細胞が分裂する能力を含む、細胞分裂を阻害する。その結果は、新しいＴ細胞の形成を防止することによる、Ｔ細胞活性の阻害である。プリン合成の阻害剤は、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、およびミゾリビン（ブレディニン）を含む。ピリミジン合成の阻害剤は、ブレキナルナトリウム、レフルノミド、およびテリフルノミドを含む。シクロホスファミドは、プリンおよびピリミジン合成両方の阻害剤である。
【０１１２】
Ｔ細胞活性化を阻害する、さらに別の方法は、レシピエントを、Ｔ細胞に対する抗体で処置することである。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞受容体の一部である、ＣＤ３に対するマウスモノクローナル抗体である。この抗体は、Ｔ細胞受容体を阻害し、そしてＴ細胞の活性化を抑制する。
【０１１３】
同種移植拒絶反応を遅延するための多くの他の薬剤および方法が当業者に公知であり、そして使用されている。１つのアプローチは、例えば照射によって、Ｔ細胞を枯渇させることであった。これは多くの場合骨髄移植において、特に主要ＨＬＡの部分的なミスマッチがある場合使用された。ＣＤ４０リガンド−ＣＤ４０相互作用の阻害剤（ブロッカー）、および／またはＣＤ２８−Ｂ７相互作用のブロッカーのレシピエントへの投与が使用された（米国特許第６，２８０，９５７号）。公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／３７８６０は、Ｔｈ１免疫反応を阻害するための抗ＣＤ３モノクローナル抗体およびＩＬ−５の投与を教示する。公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ００／２７４２１は、腫瘍壊死因子−αアンタゴニストを投与することによって、角膜の移植拒絶反応を予防または処置する方法を教示する。Ｇｌｏｔｚら（２００２）は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）の投与は、抗ＨＬＡ抗体の力価の著明な、そして持続する減少を誘導し得、それによってＨＬＡミスマッチの臓器の移植を可能にすることを示す。同様のプロトコールは、血漿交換（Ｔａｕｂｅら、１９８４）、または免疫抑制剤と組み合わせた免疫吸着技術（Ｈｉｅｓｓｅら、１９９２）、またはこれらの組み合わせ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、２０００）を含んでいた。Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎら（２００３）は、共通ガンマ鎖（γｃ）を使用するサイトカイン受容体（インターロイキン−２、−４、−７、−９、−１５、−２１）の適切なシグナル伝達のために必要な酵素である、ヤヌスキナーゼ３（ＪＡＫ３）の経口阻害剤によって免疫抑制が引き起こされるモデルを教示し、その結果はＴ細胞活性化の阻害である。心臓同種移植の研究において、ＩＣＡＭ−１に対するアンチセンス核酸を、単独で、または白血球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）に特異的なモノクローナル抗体と組み合わせて使用した（Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ、２０００）。同様に、心臓同種移植を処置するために、抗ＩＣＡＭ−１抗体を、抗ＬＦＡ−１抗体と組み合わせて使用した（Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ、２０００）。アンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに、ラット心臓または腎臓同種移植モデルにおいて、シクロスポリンとともに使用し、移植片の生存を延長させる相乗効果をもたらした（Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ、２０００）。慢性移植片拒絶反応を、分化、増殖、およびアポトーシスに関与するサイトカインである、ＴＧＦ−βのアンタゴニストを投与することによって処置した（米国特許出願公開ＵＳ２００３／０１８０３０１）。
【０１１４】
上記で記載された１つまたはそれより多くの免疫抑制剤を、本発明の方法において使用し得る。
【０１１５】
方法および使用
本明細書中で開示される方法を、ドナーからレシピエントに移植された臓器の移植片の生存を延長するために使用する。本明細書中で開示される方法をまた、移植臓器の拒絶反応を予防または減弱するために、および移植のレシピエントにおける虚血−再灌流傷害（ＩＲＩ）を処置、減少、または軽減するために使用する。その方法は一般的に、任意選択で１つまたはそれより多くの免疫抑制剤、および／または１つまたはそれより多くのさらなる補体阻害剤と組み合わせて、補体活性の阻害剤を投与することを含む。
【０１１６】
ドナー哺乳類からレシピエント哺乳類へ移植された臓器の生存を延長する方法、およびレシピエント哺乳類において移植された臓器の拒絶反応（例えば超急性拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応、または慢性拒絶反応）を予防または減弱する方法も提供され、それは移植の前に、補体阻害剤を臓器へ投与することを含み、ここでその補体阻害剤は、特定の阻害剤（例えばＴＴ３０または１本鎖抗Ｃ５抗体、例えばパキセリズマブまたはエクリズマブの１本鎖バージョン）である、または７０ｋＤａの最大分子量および／または１０日未満の半減期を有する。
【０１１７】
本明細書中で記載される方法を、異なる臓器移植のシナリオにおいて、例えば自己移植片または自家移植片、同系移植片または同族移植片、同種異系移植片または同種移植片、および異種移植片（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｇｒａｆｔ）または異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）において使用し得る。本明細書中で記載される方法は、超急性拒絶反応、急性拒絶反応、臓器移植後臓器機能障害、または慢性拒絶反応を処置するために有効であり得る。特定の実施態様において、補体阻害剤を、移植後に臓器レシピエントに投与しない。
【０１１８】
その補体阻害剤を、移植の前（例えば、ドナー哺乳類からの臓器の取り出し後、そしてその臓器のレシピエント哺乳類への移植前）に臓器に投与する。１つの実施態様において、その補体阻害剤を、臓器調達センターで投与する。別の実施態様において、その補体阻害剤を、移植の直前に、例えば移植前数時間または数分以内に、「バックテーブル」での手技において投与する。１つの実施態様において、補体阻害剤を、ドナー哺乳類からの回収または除去後であるが、臓器の保存前に投与する。別の実施態様において、その補体阻害剤を、保存中に臓器に投与する。別の実施態様において、その補体阻害剤を、保存後であるが、移植の前に投与する。他の実施態様において、その補体阻害剤を、上記で列挙した複数の段階で投与する。さらに、いずれの投与も、特定の時間枠内で複数回繰り返し得る。例えば、その投与は、２回またはそれより多くの灌流または浸漬を含み得る。別の実施態様において、単一の補体阻害剤を投与し得る、２つまたはそれより多くの補体阻害剤を投与し得る、または複数の補体阻害剤を投与し得る。
【０１１９】
その補体阻害剤を、あらゆる適当な技術によって臓器に投与し得る。１つの実施態様において、補体阻害剤を含む溶液で臓器を灌流することによって、その補体阻害剤をその臓器に投与する。別の実施態様において、その臓器を、補体阻害剤を含む溶液に漬ける。１つの実施態様において、その臓器を、補体阻害剤を含む溶液で、０．５時間から６０時間、または１時間から３０時間（例えば３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間、１０時間、１０．５時間、１１時間、１１．５時間、１２時間、１２．５時間、１３時間、１３．５時間、１４時間、１４．５時間、１５時間、１５．５時間、１６時間、１６．５時間、１７時間、１７．５時間、１８時間、１８．５時間、１９時間、１９．５時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、または３０時間）、灌流する、またはそれに漬ける。
【０１２０】
１つの実施態様において、そのレシピエント哺乳類は、移植前にワクチン接種しない（例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）に対して）。別の実施態様において、そのレシピエントを、移植後に補体阻害剤で処置しない。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、臓器保存溶液中に存在するＣＲ２−ＦＨの量は、例えば１リットルあたり約１０μｇから約５０μｇ、約５０μｇから約１００μｇ、約１００μｇから約２００μｇ、約２００μｇから約３００μｇ、約３００μｇから約５００μｇ、約５００μｇから約１ｍｇ、約１ｍｇから約１０ｍｇ、約１０ｍｇから約５０ｍｇ、約５０ｍｇから約１００ｍｇ、約１００ｍｇから約２００ｍｇ、約２００ｍｇから約３００ｍｇ、約３００ｍｇから約４００ｍｇ、または約４００ｍｇから約５００ｍｇのいずれかを含む、１リットルあたり約１０μｇから約５００ｍｇである。いくつかの実施態様において、ＣＲ２−ＦＨ（ＴＴ３０）の量は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００μｇ／ｍＬ、またはそれより多い量を含む。いくつかの実施態様において、ＣＲ２−ＦＨ（ＴＴ３０）の量は、約１３０μｇ／ｍＬを含む。
【０１２２】
ＣＲ２−ＦＨ組成物を、単独で、または組織修復および再生および／または炎症を阻害することが可能な分子を含む、有益な効果を有することが公知である他の分子と組み合わせて使用し得る。有用な補助因子の例は、抗ＶＥＧＦ剤（例えばＶＥＧＦに対する抗体）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アキソカイン（ＣＮＴＦのムテイン）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子ＩＩ、プロスタグランジンＥ２、３０ｋＤ生存因子、タウリン、およびビタミンＡを含む。他の有用な補助因子は、消毒薬、抗生物質、抗ウイルス薬、および抗真菌薬、および鎮痛薬および麻酔薬を含む、症状軽減補助因子を含む。
【０１２３】
「凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」は、目的の薬剤（例えば抗体またはその抗原結合断片、またはＨ因子融合タンパク質）と組み合わせた場合に、凍結乾燥および続く保存の際に、その薬剤（例えば抗体またはその抗原結合断片）の化学的および／または物理的不安定性を、有意に防止または軽減する分子である。代表的な凍結乾燥保護剤は、ショ糖またはトレハロースなどの糖；グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどのリオトロピック塩；三価または価数がより多い（ｔｒｉｈｙｄｒｉｃ  ｏｒ  ｈｉｇｈｅｒ）糖アルコールなどのポリオール、例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；およびその組み合わせを含む。好ましい凍結乾燥保護剤は、トレハロースまたはショ糖などの非還元糖である。本明細書中で記載される方法および組成物は、凍結乾燥保護剤の使用または添加を含み得る。
【０１２４】
その凍結乾燥保護剤は、「凍結乾燥保護量」でその薬剤処方物に添加されるが、そのことは凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤の存在下で、薬剤（例えば抗体またはその抗原結合断片またはＨ因子融合タンパク質）の凍結乾燥後に、その薬剤（例えば抗体またはその抗原結合断片、またはＨ因子融合タンパク質）が、凍結乾燥および保存の際にその物理的および化学的安定性および完全性を実質的に保持することを意味する。
【０１２５】
本方法および使用を、以下の実施例に関して記載し、それらは例証のために提示され、そしていかなる方法においてもその開示を制限することを意図しない。当該分野で周知である標準的な技術、または下記で具体的に記載した技術を利用する。本明細書中で以下の略語を使用する：ＡＢＭＲ、抗体媒介性拒絶反応；ＡＣＨＲ、促進型液性拒絶反応；ＡＣＲ、急性細胞性拒絶反応；ＡＶＲ、急性血管性拒絶反応；ＣｓＡ、シクロスポリン；ＣｙＰ、シクロホスファミド；ＨＡＲ、超急性拒絶反応；ＭＣＰ−１、単球走化性タンパク質１；ＭＳＴ、平均生存時間；ＰＯＤ、術後日数。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：方法
【０１２７】
動物および免疫抑制剤
体重２５〜３０ｇのオス成体Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）マウスおよびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）を、それぞれドナーおよびレシピエントとして選択した。免疫抑制剤を投与する群において、レシピエントにＣｓＡ（１５ｍｇ／ｋｇ／日、ｓ．ｃ．、０日目からエンドポイントの拒絶反応まで、または１００日目まで毎日）、またはＣｙＰ（４０ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．、０日目および１日目）、または抗Ｃ５  ｍＡｂ（クローンＢＢ５．１、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を注射した。
【０１２８】
ニワトリ細胞を用いた標準的な溶血アッセイ
例えば、Ｗａｎｇら（２００７）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｇｒａｆｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  Ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７９：４４５１−４４６３中の、当該分野において公知の常識である多くの方法で、血球溶血アッセイを行い得る。代表的な方法を、下記のとおり提供する：
【０１２９】
試薬：
ＧＶＢＳ緩衝液（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む）を、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ；ｃａｔ＃Ｂ１００）から得た。ニワトリ赤血球を、Ｌａｍｐｉｒｅ（Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ；ｃａｔ＃７２０１４０３）からオルシーバー液（Ａｌｓｅｖｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で得た。抗ニワトリＩｇＧ（感作抗体）を、Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｐｅｗｅｌｌ、ＮＪ）から得た。正常マウス血清および正常ヒト血清を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から得た。
【０１３０】
方法：
試験サンプル（すなわち、ｍＡｂ、Ｆａｂ、融合タンパク質）および血清（すなわちヒト血清）を、望ましい最終濃度の２倍の濃度まで、ＧＶＢＳ中で個々に用量設定した。ＧＶＢＳ中のサンプル（すなわちｍＡｂ）を用量設定すること（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）による、５０マイクロリットルのそのようなサンプル溶液を、９６穴Ｕ底ＮｕｎｃＴＭプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の各ウェルに入れた。それにより、５０μＬ／ウェルの望ましい最終濃度の２倍の溶液が得られる。５０マイクロリットルのそのような血清溶液を、各サンプルウェルに加えた。これで、１倍の各成分（血清およびサンプル）を有する１００μＬの全量になる。並行して以下のものを含むアッセイコントロールを他のウェルに加えた：ネガティブコントロールとして１００μＬのＧＶＢＳ、ポジティブコントロールとして１００μＬのＧＶＢＳプラス２μＬのＮＰ４０、参照ブランク／バックグラウンドとして阻害剤を含まない血清（１０ｍＭのＥＤＴＡを含む）、および１００％の血清溶解のポジティブコントロールとして、阻害剤を含まない血清。
【０１３１】
４００マイクロリットルのニワトリ血液細胞（約１×１０９細胞／ｍｌ）を、１ｍＬのＧＶＢＳで洗浄し、そして４℃、約３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって回収した。細胞を再懸濁し、そして４回洗浄した。最後の洗浄後、細胞のペレットを、約３００μＬのＧＶＢＳを加えることによって約４００μＬに再懸濁した。その懸濁液から、２１０μＬのニワトリ血液細胞を、６ｍＬの最終的な体積でＧＶＢＳと混合して、５×１０７細胞／ｍｌの最終濃度にした。６マイクロリットルの抗ニワトリＩｇＧ（０．１％ｖ／ｖ）をその溶液に加え、そしてできた混合物を反転させて混合し、そして氷上で１５分間インキュベートした。次いでその混合物を４℃、３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。できた上清を吸引によって除去し、そしてペレットを、６ｍｌの体積までＧＶＢＳに再懸濁した。その懸濁液を再び遠心し、そしてできたペレットを、３．６ｍＬの最終体積まで再懸濁した。それらの中で３０μＬの細胞（約２．５×１０６細胞）を、試験サンプル（またはコントロール）を含むサンプルプレートの各ウェルに加えた。各ウェルを接着性のプレートシーラーで覆ってから軽くたたいて混合し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを遠心した後、４１５ｎｍのＯＤを測定するために、８５μＬの上清を、細胞ペレットを乱さずに、９６穴平底ＮｕｎｃＴＭプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。試験サンプルおよび参照ブランクの間のＯＤ測定の差を、１００％の血清溶解コントロールおよび参照ブランクの間の測定差で割ること、すなわち（サンプルＡ４１５−参照ブランク４１５）／（１００％血清最大４１５−参照ブランク４１５）によって、溶解％を計算した。
【０１３２】
第二経路活性のウサギ赤血球アッセイ
１．細胞調製方法
【０１３３】
ウサギ血液（Ｌａｍｐｉｒｅ、ｃａｔ＃７２０６４０３、オルシーバー液中）中の赤血球の濃度を、約１０９細胞／ｍＬと決定した。その決定方法は、１００μＬのウサギ血液および２．９ｍＬの水の混合物に関して、４１２ｎｍにおけるＯＤを測定することを含む。ＯＤの測定値および細胞濃度の間の相関は、０．２９のＯＤ４１２＝１×１０８細胞／ｍＬである。４００マイクロリットルのウサギ血液を、１ｍＬのＧＶＢＳ（２ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＥＧＴＡを含む）で４回洗浄した。最後に洗浄した後、ウサギ赤血球のペレットを、３００μＬのＧＶＢＳを加えることによって、４００μＬに戻して再懸濁した。その中から、５０μＬの懸濁細胞を取り出して、ＧＶＢＳで１ｍＬに希釈した。３０マイクロリットルのそのような希釈溶液を、９６穴プレートのウェルにおいて、１００μＬの調製したサンプルと混合した（これで約１．５×１０６細胞／ウェルになる）。そのプレートを、３７℃で３０分間インキュベートしてから、４１５ｎｍでのＯＤを測定するために、各ウェルの上清８５μＬを、９６穴平底ＮｕｎｃＴＭプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。
【０１３４】
ドナー臓器の灌流および保存
１．ドナー臓器を採取した直後、ＵＷ溶液によるドナー臓器の１回目の灌流；
２．ドナー臓器をＵＷ溶液中、４℃で２８時間保存；
３．移植の３０〜４５分前にドナー臓器の２回目の灌流（レシピエントのみの処置群（群１から４、６〜７）の溶液はＵＷであり；ドナー臓器およびレシピエント処置群（群５）の溶液は、１３０μｇ／ｍｌのｈＴＴ３０を含むＵＷであり、さらに洗い流さなかった；
４．２回目の灌流後、ドナー臓器を、移植前３０〜４５分間、２回目の灌流のときのものと同じ溶液と共に、氷で覆った容器中で保存した。
【０１３５】
上記のドナー臓器灌流の条件は以下の通りであった：
１．全体積：２．５ｍｌ
２．時間：２０〜３０秒
３．シリンジサイズ：３ｃｃ
４．手動で操作、圧力：低
【０１３６】
実施例２：ＴＴ３０は、ラット血清において補体第二経路を有効に阻害する
抗Ｃ５モノクローナル抗体１８Ａ１０（抗ラットＣ５抗体）およびヒトＴＴ３０（ＣＲ２−ＦＨ）を、健常ラット血清とインキュベートして、それぞれ古典的（ＣＣＰ）補体経路および第二（ＣＡＰ）補体経路を阻害する能力を評価した。抗Ｃ５モノクローナル抗体の効力を、感作したニワトリ赤血球（ＲＢＣ）を用いることによって、そして５０％Ｌｅｗｉｓラット血清における３７℃で３０分間の溶解に関して、ＣＣＰの阻害として測定した。ｈＴＴ３０の効力を、ウサギＲＢＣを用いることによって、２０％Ｌｅｗｉｓラット血清における３７℃で３０分間の溶解に関して、ＣＡＰの阻害として測定した。ｈＴＴ３０を、異なる濃度で（５００ｎＭまで）単独で、または過剰な抗ｈｕＣＲ２モノクローナル抗体の存在下で、ラット血清に加えた（抗ＣＲ２対ｈＴＴ３０の比は２：１）。データは平均値±ＳＥＭを示す。図１４に示すように、抗Ｃ５抗体およびｈＴＴ３０は、それぞれＣＣＰおよびＣＡＰを有効に阻害する。抗ＣＲ２抗体の共処置は、ｈＴＴ３０による細胞溶解の阻害を無効にしなかった。
【０１３７】
実施例３：移植前にＴＴ３０で腎臓を処置することによる補体第二経路の阻害は、移植片の生存を改善する
【０１３８】
ＬｅｗｉｓからＬｅｗｉｓへのラット同所性（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ）腎臓移植を、抗ラットＣ５モノクローナル抗体またはｈＴＴ３０の処置ありまたはなしで行った。ラット腎臓を、処置薬（抗Ｃ５：２００μｇ／ｍＬ；ｈＴＴ３０：１３０μｇ／ｍＬ、またはアイソタイプがマッチした抗体：２００μｇ／ｍＬ）を含む、または含まない、氷冷Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液（ＵＷ）で灌流した。一定の圧力でシリンジを用いて灌流を行った。次いでその腎臓を切除し、そして４℃で２８時間の冷虚血の期間、氷冷灌流溶液（同じ濃度の治療薬を含むまたは含まないＵＷ溶液）中に入れた。その腎臓を、同系レシピエントへの移植の前に、氷冷ＵＷ溶液で２回目の灌流をした。
結果：
【０１３９】
コントロール群から臓器を受けたラットの生存中央値は移植後３日であったが、ｈＴＴ３０または抗Ｃ５  ｍＡｂで処置した臓器を受けた動物は、中央値で２１日間生存した。移植片の生存能を、屠殺のとき（２１日目）まで記録し、そして処置群あたりの移植した動物の数を、カッコ内に含める（図１６を参照のこと、ＵＷ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１、対数順位検定）。図１６に示すように、臓器をｈＴＴ３０で前処置することにより、明らかに移植片の生存を改善した。コントロール処置下の、移植後約２から３日目の突然の移植不全と比較して、ｈＴＴ３０による前処置は、移植片の生存を実質的に増加させ、そしてこの増加を屠殺のときまで維持した。ｈＴＴ３０前処置の効果は、抗Ｃ５モノクローナル抗体前処置の効果の少なくとも５０〜６０％超であり、それは第二補体経路のみを阻害することが、移植片の生存を有意に増加させるのに十分であることを意味する。ｈＴＴ３０および抗Ｃ５抗体の間の効果の差は、古典的補体経路および第二補体経路を両方阻害することは、移植片の生存をさらに改善し得ることを示し得る。しかし、それはまたｈＴＴ３０の最も有効な濃度または投与レジメがこの研究で使用されなかったからかもしれない。ｈＴＴ３０前処置を最適化するためにさらなる実験を行う。
【０１４０】
移植後の腎機能も試験した。移植後３日目の生存動物のクレアチニンレベルおよびＢＵＮレベルを測定および比較した。図１７に示すように、ｈＴＴ３０および抗Ｃ５モノクローナル抗体前処置はどちらも、血液クレアチニンレベルおよびＢＵＮレベルを有意に減少させた。ｈＴＴ３０前処置は、この研究において、抗Ｃ５抗体よりさらに有効であった。従って、ｈＴＴ３０前処置は、移植後の腎機能を改善する有効な方法である。データは平均値±ＳＥＭ（各群でｎ＝７から９）であり、そしてｔ検定によって有意に異なる（ＵＷ群と比較して＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０１４１】
ラット腎同系移植片における虚血−再灌流傷害に対する補体阻害の効果をさらに例証するために、ヘマトキシリンエオジン染色組織学的切片（２０×）を作成した。図１８に示すように、正常腎と比較して、尿細管の拡張、膨張および壊死、および重度の白血球の浸潤などの典型的なＩＲＩの組織学的特徴が、移植後３日目に取り出した、ＵＷ溶液で処置した同系移植片に関して観察された。しかし、移植後３日目の、抗Ｃ５モノクローナル抗体およびｈＴＴ３０処置同系移植片の両方が、細胞浸潤の低減、より少ない尿細管の傷害、および比較的正常な糸球体の形態を示した。２１日目、両方の補体阻害剤処置同系移植片の組織像は正常に近く、尿細管上皮細胞および糸球体細胞において損傷が少なかった。対照的に、ＵＷ処置コントロール群の動物は、２１日目まで生存しなかった。これらの組織学的比較は、ラットにおいて、ＴＴ３０の前処置は、初期の組織虚血−再灌流傷害を有意に低減し、そして腎の生存を改善することを明らかに示す。特に、この研究におけるｈＴＴ３０の前処置は、抗Ｃ５抗体処置に匹敵する治癒効果を有していた。
結論：
【０１４２】
データは、ＤＧＦについてのラット腎移植モデルにおいて、虚血−再灌流傷害の予防における補体第二経路の治療的阻害の重要な役割を示唆する。ドナー臓器をｈＴＴ３０で処置することにより、ＩＲＩ関連急性腎傷害を低減して、移植片の生存を可能にした。観察に基づいて、ｈＴＴ３０の使用は、初期の移植後合併症の臨床経過を改善し得、潜在的に長期の移植片機能および生存に影響を与え得る。
【０１４３】
実施例４：移植前に終末補体経路および第二補体経路の両方を阻害することは、移植片の生存を改善する
【０１４４】
ドナー臓器を移植直前に補体阻害剤で処置した後の、移植片の生存の増加およびＩＲＩの低減を測定するために、以下の研究を行った。ドナー腎を、補体阻害剤の非存在下で、ＵＷ溶液で灌流および保存した。４℃で２８時間冷保存した後、ドナー腎をＴＴ３０（１３０μｇ／ｍＬ）または抗ラットＣ５  ｍＡｂ  １８Ａ１０（２００μｇ／ｍＬ）いずれかの存在下の、新鮮なＵＷ溶液で再灌流した。コントロールとしてＵＷ溶液単独を用いた。補体阻害剤が移植の間臓器に留まるように、ドナー腎を、移植の前に４℃で４５分間、さらに洗い流すことなく灌流液中で保存した。
【０１４５】
図８に示すように、ＴＴ３０または１８Ａ１０処置腎を移植された動物は、コントロール処置腎を移植された動物と比較して、移植片の生存が有意に増加した（ＴＴ３０は６６．７％（６匹のうち４匹）、および１８Ａ１０は６６．７％（６匹のうち４匹）対ＵＷ溶液単独は０％（６匹のうち０匹）；Ｐ＜０．０１）。これらのデータは、移植前のドナー臓器の第二経路阻害剤または終末経路阻害剤のいずれか、特に低分子量阻害剤（例えば７０ｋＤａまたはそれより小さい）および／または短い半減期を示す（例えば１０日未満）阻害剤、例えばＴＴ３０および１８Ａ１０（１本鎖抗体）による処置は、ＩＲＩを低減し、そして移植片の生存を延長し得ることを明らかに示す。
【０１４６】
実施例５：ドナー臓器における第二補体経路の阻害は、腎臓における補体Ｃ３レベルを低減する
【０１４７】
ドナー臓器の第二経路阻害剤処置が、臓器における補体活性化を阻害するかどうかを試験するために、以下の研究を行った。ＴＴ３０（ＵＷ溶液中１３０μｇ／ｍＬ）を、調達灌流（最初の灌流）および２８時間の保存、または虚血後灌流（２８時間の冷虚血後の灌流、すなわち２回目の灌流）および４５分の保存のいずれかで、ドナー臓器に適用した。腎臓をホモジナイズして、そしてライセートをＥＬＩＳＡによる補体Ｃ３の測定のために使用した。
【０１４８】
図１０に示すように、調達灌流および２８時間の保存におけるＴＴ３０処置は、ＵＷ溶液単独と比較して、Ｃ３レベルを有意に低減した。虚血後灌流および４５分間の保存におけるＴＴ３０処置の使用は、ＵＷ溶液コントロールと比較して、Ｃ３レベルの低減に有意な効果を達成しなかった。これらの結果は、特に低分子量阻害剤（例えば７０ｋＤａまたはそれより小さい）および／または短い半減期（例えば１０日未満）を示す阻害剤、例えばＴＴ３０および１８Ａ１０を用いた、ドナー臓器における補体活性化の第二経路の阻害は、臓器における補体活性化を有効に予防し得ることを明らかに示した。
【０１４９】
上記の実施例は単なる例証であり、そしていかなる方法においても本開示の範囲を制限すると解釈すべきではない。
【０１５０】
本出願を通じて引用された全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋの登録、特許および公開された特許出願は、本明細書中で明確に参考文献に組み込まれる。
参考文献のリスト
【０１５１】
本開示の背景を明らかにするために本明細書中で使用される出版物および他の文献は、そして特に、実施に関するさらなる詳細を提供するための事例は、本明細書中でその全体が参考文献に組み込まれ、そして便宜上、本文中で著者および日付によって参照し、そして以下の参考文献のリストにそれぞれグループ分けする。
【０１５２】
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【０１５３】
本明細書中で引用された全ての参考文献の内容は、その全体が参考文献に組み込まれる。
配列のまとめ
【表１−１】
2016531910.tif 000002
【表１−２】
2016531910.tif 000003
【表１−３】
2016531910.tif 000004
【表１−４】
2016531910.tif 000005
【表１−５】
2016531910.tif 000006
【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
2016531910.tif 000009
【表１−９】
2016531910.tif 000010
【表１−１０】
2016531910.tif 000011
【表１−１１】
2016531910.tif 000012
【図１】
2016531910.tif 000013
【図２】
2016531910.tif 000014
【図３】
2016531910.tif 000015
【図４】
2016531910.tif 000016
【図５】
2016531910.tif 000017
【図６】
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【図７】
2016531910.tif 000019
【図８】
2016531910.tif 000020
【図９】
2016531910.tif 000021
【図１０】
2016531910.tif 000022
【図１１】
2016531910.tif 000023
【図１２】
2016531910.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
2016531910.tif 000026
【図１５】
2016531910.tif 000027
【図１６】
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【図１７Ａ】
2016531910.tif 000029
【図１７Ｂ】
2016531910.tif 000030
【図１８】
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【図１９Ａ】
2016531910.tif 000032
【図１９Ｂ】
2016531910.tif 000033
【図２０】
2016531910.tif 000034
【図２１】
2016531910.tif 000035
【図２２】
2016531910.tif 000036
【図２３】
2016531910.tif 000037
【図２４】
2016531910.tif 000038
【配列表】
2016531910000001.app
【国際調査報告】
2016531910.tif 000039
2016531910.tif 000040
2016531910.tif 000041
2016531910.tif 000042
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