(57)【要約】  本願は、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化された組換え微生物に関し、前記組換え微生物において、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性及びメチオニン流出が強化される。また、本願は、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産を最適化する方法にも関し、前記方法は、c. 組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物において、発酵性炭素源及び硫黄源を含む適切な培地中で、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性及びメチオニン流出が強化される工程、及び、d. メチオニン及び/又はその誘導体を培地から回収する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化された組換え微生物であって、前記組換え微生物において、大腸菌由来のmetHの発現、並びに場合により大腸菌由来のfldA 遺伝子及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子の発現が強化され、大腸菌由来のygaZH遺伝子、若しくはC.グルタミクム由来のbrnFE遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される、組換え微生物。
【請求項２】
前記metH遺伝子、fldA遺伝子、及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子が染色体上で過剰発現される、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択される、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記ygaZH遺伝子若しくはbrnFE遺伝子、又はホモログ遺伝子が誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
さらに、以下の遺伝子：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、S-アデノシルメチオニン及び/若しくはメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA*アレル、thrA、又はスレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードするthrA*アレルの少なくとも一種の発現が増加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記遺伝子の少なくとも一種が誘導性プロモーターの制御下にある、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
さらに、以下の遺伝子：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA、metN、metI、metQ、又はudhAの少なくとも一種の発現が減衰される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
a. 前記metH遺伝子、並びにfldA遺伝子及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子が過剰発現され、
b. 前記ygaZ遺伝子及びygaH遺伝子、若しくはbrnF遺伝子及びbrnE遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するこれらのホモログ遺伝子が過剰発現され、
c. metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG及びpycの遺伝子の発現が強化され、並びに
d. metJ、pykA、pykF、purU、dgsA、metE、及びyncAの遺伝子の発現が減衰される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
a. 組換え微生物を培養する工程であって、前記微生物において、発酵性の炭素源及び硫黄源を含む適切な培地中で、大腸菌由来のmetHの発現、並びに場合により大腸菌由来のfldA遺伝子及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子の発現が強化され、大腸菌由来のygaZH遺伝子、若しくはC.グルタミクム由来のbrnFE遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される工程、並びに
b. 前記培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程
を含む、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産を最適化するための方法。
【請求項１１】
前記ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ygaZHホモログ遺伝子が、シトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換え微生物の生育が、培地中で一種以上の無機性基質、特にリン酸塩及び/又はカリウムの制限又は欠乏を受ける、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記メチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程が、発酵液中のメチオニン及び/又はその誘導体を濃縮する工程を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換え微生物が、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科の中から、好ましくは大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムの中から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え微生物又は請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L-メチオニン及び/又はその誘導体の製造に有用な組換え微生物、並びにL-メチオニンの調製のための方法に関する。本発明の微生物は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性及びL-メチオニン搬出を強化することによりL-メチオニン生産が改善されるような方法で改変されている。特に、metH、fldA、fpr遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子、並びにygaZ及びygaH遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子が微生物中で過剰発現される。
【背景技術】
【０００２】
システイン、ホモシステイン、メチオニン、又はS-アデノシルメチオニン等の含硫化合物は、細胞代謝に非常に重要である。特に、必須アミノ酸であるL-メチオニンは、動物が合成することができないが、多くの身体機能において重要な役割を果たしている。工業的に生産されるメチオニンの大部分が、動物飼料及び食品添加物として広く用いられている。
【０００３】
BSE及び鳥インフルエンザの結果としての動物由来タンパク質の使用の減少に伴い、純粋なメチオニンの需要が増加してきている。一般的に、D,L-メチオニンは、アクロレイン、メチルメルカプタン、及びシアン化水素から化学的に製造される。しかし、ラセミ混合物は純粋なL-メチオニンのようにはうまく機能しない(Saunderson, 1985)。加えて、純粋なL-メチオニンは、例えばN-アセチル-D,L-メチオニンのアシラーゼ処理によってラセミ体のメチオニンから製造することができるが、製造コストが劇的に増加する。したがって、環境問題と相まって、純粋なL-メチオニンの需要の増加によって、メチオニンの微生物生産は魅力的な展望になる。
【０００４】
他の重要なアミノ酸、例えばリジン、スレオニン、及びトリプトファンは、動物飼料用途で発酵により生産されている。したがって、これらのアミノ酸は、グルコース及び他の再生可能な資源を出発物質として用いて製造することができる。L-メチオニンの発酵による生産は未だ成功していないが、技術の発展は進行中である。
【０００５】
微生物におけるL-メチオニン生産の最適化のための種々のアプローチが以前に記述されている(例えば、US7,790,424、US7,611,873、WO2002/10209、WO2005/059093、及びWO2006/008097の特許又は特許出願を参照)。しかし、微生物からのL-メチオニンの工業的生産には更なる改善が必要である。
【０００６】
大腸菌(Escherichia coli)では、2種の異なった酵素がメチオニンのde novo生合成において最終工程を触媒する。活性に必要な補欠分子族を含むコバラミン依存性メチオニンシンターゼ(MetH, EC 2.1.1.13)及びコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ(MetE, EC 2.1.1.14)である(Foster et al., 1961; Gonzalez et al., 1992)。コバラミン依存性メチオニンシンターゼ、MetHは、コバラミン補因子を含むドメイン(Cobドメイン)、メチル-THF基質に結合するドメイン(CH3-THFドメイン)、ホモシステイン基質に結合するドメイン(Hcyドメイン)、及びS-アデノシル-メチオニン(SAM)に結合するドメイン(Adometドメイン)の4つのドメインを有する約136 kDaのタンパク質である(Matthews, 2001)。酸素の存在下で、この酵素は酸化により不活性化される(Banerjee et al., 1990)。この酵素を再活性化するために、還元的メチル化が生じる。この反応には、酵素のAdoMetドメインに結合したSAMによって与えられるメチル基、及び外部の伝達系を介して伝達される2つの電子が関与する。この2つの電子はNADPHによって与えられ、大腸菌においては、FAD-含有フラボドキシンレダクターゼ、FldA、及びFMN-含有フラボドキシンレダクターゼ、Fprから成る、下り勾配ポテンシャルにより駆動する酸化還元鎖を介して伝達される(Fujii & Huennekens, 1974; Wan & Jarrett, 2002)。特許出願WO2009/144270に開示されるように、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)では、FldA及びFprの機能性ホモログが同定されている。これらはそれぞれFdxC、FdxD、又はFdxA、及びFprA1、FprA2、FprA3、又はFldR1である。
【０００７】
タンパク質複合体YgaZ及びYgaHは、L-バリンの搬出を担う分岐鎖アミノ酸エクスポーター(LIV-E)ファミリーのメンバーである。また同様に、YgaZHも、メチオニンの搬出に関与しており、Trotschelのチームによってコリネバクテリウム・グルタミクム由来のYgaZHのホモログであるBrnFEについて示されている(Trotschel et al., 2005)。
【０００８】
L-メチオニンを製造するための、種々の手段によるメチオニンシンターゼ活性の改善について、多数の特許出願が出願された。
・BASFによるWO2007/012078及びWO2007/135188は、数ある改変の中でも、少なくともmetH及び/又はmetEの過剰発現をもたらす遺伝子改変を請求している。
・EvonikによるWO2009/144270は、コブ(I)アラミン(cob(I)alamin)-依存性MetH再活性化系の量及び/又は活性の増加を呈する微生物を用いたメチオニンの製造方法を開示している。
・EvonikによるWO2008/080900は、高濃度のL-メチオニンにより耐性であるはずであるMetHFBR態(フィードバック耐性)を請求している。
【０００９】
同様に、少数の特許は、種々の微生物においてメチオニン排出系をコードする遺伝子の過剰発現を開示している。
・コリネバクテリウム(Corynebacterium)におけるL-メチオニンの取り込みの減少が、特許出願WO2002/097096及びWO2005/085463(Degussa)において記述されており、また、
・L-バリン及びL-メチオニンの搬出を担う分岐鎖アミノ酸エクスポーター(YgaZH)の過剰発現が、特許出願EP1239041(Ajinomoto)及びWO2008/082211(CJ Corporation)に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】US7,790,424
【特許文献２】US7,611,873
【特許文献３】WO2002/10209
【特許文献４】WO2005/059093
【特許文献５】WO2006/008097
【特許文献６】WO2007/012078
【特許文献７】WO2007/135188
【特許文献８】WO2009/144270
【特許文献９】WO2008/080900
【特許文献１０】WO2002/097096
【特許文献１１】WO2005/085463
【特許文献１２】EP1239041
【特許文献１３】WO2008/082211
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Saunderson C.L., 1985, British Journal of Nutrition, 54:621-633
【非特許文献２】Foster M.A., Jones K.M., Woods D.D., 1961, Biochemical Journal, 80:519-531
【非特許文献３】Gonzalez J.C., Banerjee R.V., Huang S., Summer J.S., Matthews R.G., 1992, Biochemistry, 31:6045-6056
【非特許文献４】Matthews R.G., 2001, Accounts of Chemical Research, 34:681-689
【非特許文献５】Banerjee R.V., Harder S.R., Ragsdale S.W., Matthews R.G., 1990, Biochemistry, 29:1129-1135
【非特許文献６】Fujii K. and Huennekens F.M., 1974, Journal of Biological Chemistry, 249 (21):6745-6753
【非特許文献７】Wan J.T. and Jarrett J.T., 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 406:116-126
【非特許文献８】Trotschel C., Deutenberg D., Bathe B., Burkovski A., Kramer R., 2005, Journal of Bacteriology. 187(11):3786-3794
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本願発明者らは、驚くべきことに、そして予想外に、組換えL-メチオニン過剰生産微生物における、L-メチオニン流出の増加及びコバラミン-依存性L-メチオニンシンターゼ活性の強化により、メチオニン生産が改善されることを見出した。
【００１３】
本発明は、メチオニン及び/又はその誘導体の生産を最適化するための組換え微生物及び方法であって、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性及びメチオニン流出が強化されている、組換え微生物及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
組換え微生物において、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性は、大腸菌由来のmetH、並びに場合によりfldA及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子の過剰発現により強化され、一方メチオニン流出は大腸菌由来のygaZH遺伝子若しくはC.グルタミクム由来のbrnFE遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現により強化される。
【００１５】
また、組換え微生物は、他の遺伝子改変、例えば、
・以下の遺伝子：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA*アレル、thrA、又はスレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードするthrA*アレルの少なくとも一種の発現の増加、並びに/又は
・以下の遺伝子：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、udhA、dgsA、metE、metN、metI、metQ又はyncAの一種の発現の減衰
を含んでいてもよい。
【００１６】
特定の実施態様において、本発明は、a) 大腸菌由来のmetH遺伝子、並びに場合によりfldA及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子が過剰発現され、b) 大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子若しくはC.グルタミクム由来のbrnF及びbrnE遺伝子、又はシトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、フレキシネル赤痢菌(Shigella flexneri)、ラオウルテラ・オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)、エンテロバクター(Enterobacter)属の種、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、フォトラブズス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、若しくはシトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)に由来するこれらのホモログ遺伝子が過剰発現され、並びにc) metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG及びpyc遺伝子の発現が強化され、並びにd) metJ、pykA、pykF、purU、yncA、dgsA、及びmetE遺伝子の発現が減衰された、組換え微生物に関する。
【００１７】
好ましくは、組換え微生物は大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願発明を詳細に記述する前に、本発明は具体的に例示された方法に限定されず、当然ながら、変化し得ることが理解されるべきである。また、本願明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためのものであり、限定することを意図せず、限定は添付の特許請求の範囲によってのみされることも、理解されるべきである。
【００１９】
本願明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、上記のものも下記のものも、その全体が参照により本願に組み込まれる。
【００２０】
さらに、本願発明の実施には、別段の指示が無い限り、当該技術分野の範囲内の従来の微生物学的及び分子生物学的技術を用いる。そのような技術は、当業者に周知であり、文献に十分に説明される。
【００２１】
本願明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「一つの」、「ある」、「その」(a、an及びthe)には、文脈において別段の明確な指示がされていない限り、複数への参照が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ある微生物」への参照には、複数のそのような微生物が含まれ、「ある内因性遺伝子」への参照は、一種以上の内因性遺伝子への参照である、などである。別段の規定が無い限り、本願明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本願明細書に記述されるものと類似の又は同等のあらゆる材料及び方法を、本願発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい材料及び方法を以下に記述する。
【００２２】
後に続く特許請求の範囲、及び連続する本願明細書において、表現言語又は必要な含意に起因して文脈により別段要求する場合を除き、語句「含む」、「含有する」、「関わる」若しくは「包含する」、又は「含む」、「含んでいる」、「含有している」、「関わっている」、「包含する」、「包含している」等の変形は、包括的な意味で用いられる、すなわち、記述された特徴を特定するために用いられるが、本発明の様々な実施態様のさらなる特徴の存在又は追加を除外するためには用いられない。
【００２３】
用語「メチオニン」及び「L-メチオニン」は、化学式HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3、及びCAS番号59-51-8、又はその特異的なL-異性体については63-68-3を有する、必須含硫アミノ酸を示す。
【００２４】
「メチオニンの誘導体」は、同一の化学的主鎖を呈するが少なくとも一つの化学基でメチオニンと異なる、メチオニンの分子アナログを指す。本発明において、好ましいメチオニン誘導体は、N-アセチルメチオニン(NAM)、S-アデノシルメチオニン(SAM)、及びヒドロキシ-メチオニン(又はメチオニンヒドロキシアナログ若しくはMHA)である。
【００２５】
本願明細書で用いられる用語「微生物」は、人為的に改変されていない、細菌、酵母、又は真菌を指す。優先的には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトマイセス科(Streptomycetaceae)、及びコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より優先的には、微生物は、エスケリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パントエア属(Pantoea)、サルモネラ属(Salmonella)、又はコリネバクテリウム属の種である。さらにより優先的には、本発明の微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクム種のいずれかである。
【００２６】
本願明細書で用いられる用語「組換え微生物」又は「遺伝子改変された微生物」は、天然には見られず、かつ天然に見られる同等のものと遺伝的に異なっている、細菌、酵母、又は真菌を指す。遺伝的エレメントの導入又は欠失又は修飾によって、改変されていることを意味する。また、特異的変異誘発と特定の選択圧下での進化との組み合わせによる新たな代謝経路の発達及び進化を強制することにより、形質転換することもできる(例えば、WO2004/076659又はWO2007/011939を参照)。
【００２７】
微生物は、宿主微生物内でその遺伝子を発現させる全てのエレメントと共に微生物に導入されるならば、外因性遺伝子を発現するように改変されてもよい。外因性DNAを用いた微生物の改変又は「形質転換」は、当業者の日常的業務である。
【００２８】
微生物は、内因性遺伝子の発現レベルを調節するために改変されてもよい。
【００２９】
用語「内因性遺伝子」は、どの遺伝子改変よりも前からその遺伝子が微生物中に存在していたことを意味する。内因性遺伝子は、内因性の調節エレメントに加えて、若しくはその代わりに異種配列を導入することにより、又は遺伝子の一種以上の補足コピーを染色体若しくはプラスミドに導入することにより、過剰発現されてもよい。また、内因性遺伝子は、その発現及び/又は活性を調節するように改変されてもよい。例えば、コード配列に変異を導入して遺伝子産物を改変してもよく、又は内因性の調節エレメントに加えて、若しくはその代わりに異種配列を導入してもよい。内因性遺伝子の調節は、遺伝子産物の活性の上方制御及び/又は強化をもたらしてもよく、又はその代わりに、内因性遺伝子産物の活性の下方制御及び/又は低減をもたらしてもよい。
【００３０】
これらの発現を調節する別の方法は、遺伝子の内因性プロモーター(例えば野生型プロモーター)を、より強い又はより弱いプロモーターと交換して、その内因性遺伝子の発現を上方又は下方制御することである。これらのプロモーターは、相同性であっても非相同性(異種性)であってもよい。適切なプロモーターを選択することは十分当業者の能力の範囲内である。
【００３１】
反対に、「外因性遺伝子」は、当業者に周知の手段により遺伝子が微生物に導入されたことを意味するが、この遺伝子はその微生物内には天然には存在しない。外因性遺伝子は、宿主の染色体に組み込まれてもよく、又はプラスミド若しくはベクターによって染色体外で発現されてもよい。複製起点及び細胞内でのコピー数に関して異なる様々なプラスミドが、当業者に周知である。これらの遺伝子は相同性であってもよい。
【００３２】
本発明との関係において、用語「ホモログ遺伝子」は、理論的共通遺伝子祖先を有する遺伝子を示すことに限定されず、遺伝的には関連が無いかもしれないが、それにも拘わらず、進化して類似の機能を果たす及び/又は類似の構造を有するタンパク質をコードするようになった遺伝子を含む。したがって、本発明の目的における用語「機能的ホモログ」は、ある酵素活性が、定義されたアミノ酸配列の特定のタンパク質によってのみならず、他の(非)関連微生物由来の類似配列のタンパク質によっても与えられる可能性があるという事実に関する。
【００３３】
既知の遺伝子に関してGenbankに示される参照を用いて、当業者は他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物等における同等の遺伝子を決定することができる。この日常的業務は、有利には他の微生物に由来する遺伝子との配列アライメントを実行することにより決定されるコンセンサス配列を用いて、及び縮重プローブを設計して別の生物における対応する遺伝子をクローニングすることで、行われる。これらの分子生物学の日常的方法は、当業者に周知である。
【００３４】
本願明細書で用いる用語「改善されたメチオニン生産」、「メチオニン生産を改善する」及びこれらの文法的に同意義のものは、メチオニン/炭素源収率(消費された炭素源のグラム/モルあたりの生産されたメチオニンのグラム/モルの比率で、パーセントで表すことができる)の増加及び/又は生産されたメチオニンの純度の改善を指す。本発明において、生産されたメチオニンの純度は、ケトメチル吉草酸及び/又はホモランチオニンの生成を減少させることで向上する可能性がある。消費された炭素源及び生産されたメチオニンの量を決定する方法は、当業者に周知である。組換え微生物において、生産されたメチオニンの収率及び/又は純度は、対応する非改変微生物と比較して高い。
【００３５】
用語「メチオニンの発酵的生産に最適化された微生物」は、進化及び/又は遺伝子改変されて、対応する野生型微生物の内因性生産と比較して改善されたメチオニン生産を示す微生物を指す。メチオニン生産のために「最適化された」そのような微生物は当業者に周知であり、特に、特許出願WO2005/111202、WO2007/077041、WO2009/043803、及びWO2012/098042に開示されている。
【００３６】
本発明によれば、用語「発酵的生産」、「培養」、又は「発酵」は、細菌の生育を示すために用いられる。この生育は、一般的には、使用される微生物に適合し、かつ少なくとも一種の単純炭素源及び必要な場合は補基質を含有する適切な培地を用いた発酵槽中で行われる。
【００３７】
「適切な培地」は、炭素源又は炭素基質、窒素源、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、モルトエキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウム、リン源、例えばリン酸一カリウム若しくはリン酸二カリウム、微量元素(例えば金属塩)、例えばマグネシウム塩、コバルト塩、及び/若しくはマンガン塩、並びにアミノ酸及びビタミン等の成長因子等、細胞の維持及び/又は生育に必須であるか又は有益である栄養素を含む培地(例えば滅菌液体培地)を示す。
【００３８】
本発明による用語「炭素源」又は「炭素基質」又は「炭素の供給源」は、単糖(グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、又はラクトース等)、オリゴ糖、二糖(スクロース、セロビオース、又はマルトース等)、糖蜜、デンプン、又はその誘導体、ヘミセルロース、及びこれらの組み合わせを含む、微生物の通常の生育を補助するために当業者によって用いることができるあらゆる炭素の供給源を示す。特に好ましい単純炭素源は、グルコースである。別の好ましい単純炭素源は、スクロースである。炭素源は、再生可能原料から得ることができる。再生可能原料は、短時間の遅れの範囲内で、かつ十分な量で再生されて所望の製品への変換を可能にする、ある工業的プロセスに必要な原料として定義される。処理されたか又はされていない植物バイオマスは、興味深い再生可能炭素源である。
【００３９】
本発明による用語「硫黄源」は、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィド、及び他のメチルキャッピングされた硫化物又は種々の供給源の組み合わせを指す。より優先的には、培地中の硫黄源は、硫酸塩若しくはチオ硫酸塩、又はこれらの組み合わせである。
【００４０】
用語「窒素源」は、アンモニウム塩又はアンモニアガスのいずれかに相当する。窒素源は、アンモニウム態又はアンモニア態で供給される。
【００４１】
用語「減衰」又は「減衰された発現」は、この関連において、遺伝子の発現又は酵素の生産が非改変微生物と比較して低減されるか又は抑制されることを意味し、これにより非改変微生物と比較したリボ核酸、タンパク質又は酵素の細胞内濃度の減少がもたらされる。当業者は、例えばリボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)の使用、並びに特定のタンパク質の濃度を決定するための特異的抗体の使用を含む、細胞内のリボ核酸濃度又はタンパク質濃度を測定するための種々の手段及び方法を知っている。
【００４２】
酵素生産の減少又は抑制は、該酵素をコードする遺伝子の発現の減衰によって得られる。
【００４３】
遺伝子の減衰は、当業者に周知の手段及び方法によって達成してもよい。一般的に、遺伝子発現の減衰は、
・コーディング領域又はプロモーター領域を変異させる、又は
・遺伝子発現のために必要なプロモーター領域の全て又は一部分を欠失させる、又は
・相同組換えによって遺伝子のコーディング領域の全て又は一部分を欠失させる、又は
・コーディング領域に又はプロモーター領域に外部エレメントを挿入する、又は
・弱いプロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で遺伝子を発現させる
ことによって達成され得る。
【００４４】
当業者は、異なる強度を示す様々なプロモーターを知っており、弱い又は誘導性の遺伝子発現のためにどのプロモーターを使うべきかわかる。
【００４５】
用語、酵素の「活性」は、用語「機能」と互換可能に用いられ、本発明の関連において、酵素によって触媒される反応を示す。当業者は、前記酵素の酵素活性を測定する方法を知っている。
【００４６】
用語、酵素の「活性の減衰」又は「活性の低減」は、アミノ酸配列の変異によって得られるタンパク質の特定の触媒活性の低減、及び/又はヌクレオチド配列の変異によって若しくは遺伝子のコーディング領域の欠失によって得られる細胞内のタンパク質濃度の減少のいずれかを意味する。
【００４７】
用語、酵素の「活性の強化」又は「活性の増加」は、酵素の特定の触媒活性の増加、及び/又は細胞内の酵素の量/アベイラビリティの増加のいずれかを示し、これらは例えば酵素をコードする遺伝子の過剰発現によって得られる。
【００４８】
用語「発現の増加」、「発現の強化」又は「過剰発現」及びこれらの文法的に同意義のものは、文中で互換可能に用いられ、類似の意味を有する。これらの用語は、遺伝子の発現又は酵素の生産が、非改変微生物と比較して増加し、これにより非改変微生物と比較してリボ核酸、タンパク質、又は酵素の細胞内濃度の増加がもたらされることを意味する。当業者は、例えばリボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)の使用、並びに特定のタンパク質の濃度を決定するための特異的抗体の使用を含む、細胞内のリボ核酸濃度又はタンパク質濃度を測定するための種々の手段及び方法を知っている。
【００４９】
酵素生産の増加は、該酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることによって得られる。
【００５０】
遺伝子の発現を増加させるために、当業者は、例えば以下のような種々の技術を知っている。
・微生物内での遺伝子のコピー数を増加させる。遺伝子は染色体上又は染色体外にコードされている。遺伝子が染色体上に位置する場合、(遺伝子置換を含む)専門家に周知の組換え法によって、複数の遺伝子コピーを染色体上に導入することができる。遺伝子が染色体外に位置する場合、複製起点に関して異なっており、それゆえ細胞内でのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドによって保有されてもよい。これらのプラスミドは、プラスミドの性質によって、すなわちタイトな複製を有する低コピー数のプラスミド(例えば大腸菌については、pSC101、RK2)、低コピー数のプラスミド(例えば大腸菌については、pACYC、pRSF1010)、又は高コピー数のプラスミド(例えば大腸菌については、pSK bluescript II)によって、1〜5コピー、又は約20コピー、又は最大500コピーで、微生物中に存在している。
・高レベルの遺伝子発現をもたらすプロモーターを用いる。当業者は、どのプロモーターが最も使いやすいか知っており、例えばPtrc、Ptac、Placプロモーター、又はcIラムダプロモーターが広く用いられる。これらのプロモーターは、特定の化合物によって、又は温度若しくは光等の特定の外部条件によって「誘導性」になることができる。これらのプロモーターは、相同性であっても非相同性(異種性)であってもよい。
・遺伝子に特異的であるか又は非特異的である転写リプレッサーの活性又は発現を減衰させる。
・対応するメッセンジャーRNAを安定化させるエレメント(Carrier and Keasling, 1999)又はタンパク質を安定化させるエレメント(例えばGSTタグ、GE Healthcare)を用いる。
【００５１】
用語「コードする(encoding、coding)」は、そのプロセスにより、ポリヌクレオチドが、転写及び翻訳の機構を介して、アミノ酸配列を作り出すようなプロセスを指す。酵素をコードする遺伝子は外因性でも内因性でもよい。
【００５２】
用語「フィードバック感受性」又は「フィードバック阻害」は、細胞内で特定の物質の生産を触媒する一種以上の酵素が、その物質があるレベルまで蓄積されると、阻害されるか又は活性がより低くなる、細胞機構制御を指す。したがって、用語「フィードバック感受性の低減」又は「フィードバック阻害の低減」は、そのような機構の活性が非改変微生物と比較して減少するか又は抑制されることを意味する。当業者は、この結果を得るための酵素の改変方法を知っている。そのような改変は、特許出願WO2005/111202又は特許US7,611,873に記述されている。
【００５３】
本発明の第一の態様において、組換え微生物は、該微生物におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性を強化することにより、及びメチオニン流出を強化することにより、メチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化される。好ましくは、組換え微生物は、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科の中から選択される。より好ましくは、本発明の組換え微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムの中から選択される。
【００５４】
上述のとおり、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性は、MetH酵素により媒介される。この酵素は、持続的な活性を有するために再活性化系を必要とする。この系は、大腸菌のfldA及びfprという2つの遺伝子によって、並びにC.グルタミクムのfdxC、fdxD、又はfdxAの中から、及びfprA1、fprA2、fprA3、又はfldR1の中から、それぞれ選択される遺伝子によって、コードされる。本願出願において、用語「MetH及びその再活性化系」又は「metH、fldA、fpr」は、大腸菌及びC.グルタミクムの両方におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ及びその再活性化系、又はそれらをコードする大腸菌由来の及びC.グルタミクム由来の両方の遺伝子に関連する。したがって、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性の強化は、好ましくはmetH遺伝子及び加えてfldA及びfpr遺伝子によってコードされるその再活性化系の過剰発現によって行われる。
【００５５】
本発明の一つの実施態様において、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性は、大腸菌由来のmetH、fldA、fpr遺伝子又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子の過剰発現(発現の強化)によって強化される。好ましくは、これらの遺伝子は、その野生型プロモーターとは異なるプロモーター下で過剰発現される。
【００５６】
より好ましくは、metH、fldA、若しくはfpr遺伝子又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子は、染色体上で過剰発現される、すなわちこれらの遺伝子は染色体から過剰発現される。各遺伝子の一つ以上の補足的なコピーが、微生物の染色体上に導入される。これらは、特許出願WO2011/073122に開示されるリストから選択される、異なるローカス(locus)に組み込まれ、これらのローカスの欠失はメチオニン生産に影響を及ぼさない。各遺伝子のコード配列の野生型コピーは保存されているが、これらのプロモーター領域は人工プロモーター及び/又はリボソーム結合部位(RBS)と置換されてもよい。
【００５７】
本発明の特定の実施態様において、
・野生型metH遺伝子は天然のプロモーター及びRBSの置換を有して保存されており、追加の2コピーが染色体上に導入されており、及び
・野生型のfldA及びfpr遺伝子並びにこれらのプロモーター領域は保存されており、各遺伝子の追加の1コピーが染色体に導入されている。
【００５８】
導入された追加の遺伝子コピーは、人工プロモーター及びRBSの制御下で発現される。
【００５９】
アミノ酸生産微生物において、メチオニンは特定の流出トランスポーターによって排出される。とりわけ、大腸菌において、このトランスポーターはYgaZHと呼ばれ、ygaZ及びygaH遺伝子にコードされており、一方でC.グルタミクムにおいては、BrnFEと名付けられ、brnF及びbrnE遺伝子にコードされている。このメチオニン流出系の機能的ホモログが、複数の他の微生物において同定されてきた。本発明において、組換え微生物は、大腸菌由来のygaZH遺伝子又はC.グルタミクム由来のbrnFE遺伝子を過剰発現する。あるいは、本発明の組換え微生物は、YgaZH又はBrnFEトランスポーターの機能的ホモログを過剰発現してもよい。YgaZ及びYgaHホモログタンパク質を、表１及び表２にそれぞれ示す。
【００６０】
【表１】
2016529899.tif 000002
2016529899.tif 000003
2016529899.tif 000004
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【００６１】
【表２】
2016529899.tif 000009
2016529899.tif 000010
2016529899.tif 000011
2016529899.tif 000012
2016529899.tif 000013
2016529899.tif 000014
【００６２】
各ホモログについて表中に開示されたアクセッション番号を用いて、当業者は、例えばNCBIデータベース上で、アミノ酸配列及びそのヌクレオチドコード配列を得ることができる。
【００６３】
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列から、これらのホモログをコードする遺伝子を得ることは、当業者の日常的業務である。アミノ酸配列からの対象のタンパク質をコードする遺伝子の人工合成、又は対応するゲノムDNAからの対象のコーディング領域のPCR増幅のいずれかによって行うことができる。本発明の関連において、これらの遺伝子は、「ygaZ又はygaHのホモログ遺伝子」と呼ばれる。これらのygaZHホモログ遺伝子の配列は、宿主微生物のコドンバイアスに調整してもよい。
【００６４】
本発明の特定の実施態様において、組換え微生物は、配列番号1及び配列番号2にそれぞれ配列が開示されているタンパク質をコードする大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子、若しくはC.グルタミクム由来のbrnF及びbrnE遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子を過剰発現する。好ましくは、ygaZ及びygaHのホモログ遺伝子は、同一の生物に由来し、ygaZのホモログ遺伝子とygaHのホモログ遺伝子とにより成る遺伝子対により構成される。しかし、第一の生物由来のygaZホモログ遺伝子と、第二の生物由来のygaHホモログ遺伝子とのミスマッチ対を使用することができる。好ましくは、ygaZH、brnFE遺伝子又はこれらのホモログ遺伝子は過剰発現される。
【００６５】
YgaZH ホモログ遺伝子は、表１及び表２中にそれぞれ開示されるYgaZ及びYgaHホモログをコードする遺伝子の中から選択される。好ましくは、ygaZHホモログ遺伝子は、シトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のYgaZHホモログをコードする遺伝子の中から選択される。より好ましくは、ygaZHホモログ遺伝子は、シトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する。最も好ましくは、ygaZHホモログ遺伝子は、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー、又はエンテロバクター属の種に由来する。
【００６６】
したがって、ygaZHホモログ遺伝子は、好ましくはシトロバクター・コセリ由来の配列番号3及び配列番号4、フレキシネル赤痢菌由来の配列番号5及び配列番号6、ラオウルテラ・オルニチノリティカ由来の配列番号7及び配列番号8、エンテロバクター属の種(R4-368)由来の配列番号9及び配列番号10、エルシニア・エンテロコリチカ亜種エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica)由来の配列番号11又は12及び配列番号13又は14、フォトラブズス・ルミネセンス亜種ラウモンディイ(Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii)由来の配列番号15及び配列番号16、シトロバクター・ヤンガエ由来の配列番号17及び配列番号18、シトロバクター・フロインディー由来の配列番号19及び配列番号20によってそれぞれ定義される、YgaZホモログとYgaHホモログとの対をコードする遺伝子の中から選択される。
【００６７】
本発明の好ましい態様において、これらのygaZH若しくはbrnFE遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するホモログ遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下で過剰発現される。当業者は、そのような誘導性プロモーターを知っている。例えば、λPR又はλPL等のプロモーターを用いて、ygaZH遺伝子若しくはbrnFE遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するygaZHホモログ遺伝子を本発明の組換え微生物中で過剰発現させてもよい。
【００６８】
本発明の別の目的は、ygaZHホモログ遺伝子を同定すること、及びアミノ酸生産微生物において前記遺伝子を単独で、又は以下に開示する他の遺伝子改変と組み合わせて、過剰発現させることである。
【００６９】
「メチオニン生合成経路の最適化」
本発明による組換え微生物は、メチオニンの生産を改善するために改変される。メチオニン生産に関与する遺伝子は周知であり、メチオニン特異的生合成経路に関与する遺伝子、並びに前駆体提供経路に関与する遺伝子及びメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含む。
【００７０】
効率的なメチオニン生産には、メチオニン特異的経路及び複数の前駆体提供経路の最適化が必要である。メチオニン生産株は、特に特許出願WO2005/111202、WO2007/077041、及びWO2009/043803に既に記述されている。これらの出願は参照として本願出願に組み込まれる。
【００７１】
別段記述されている場合を除いて、メチオニン生合成経路の最適化に関して下記に言及される全ての遺伝子は、大腸菌由来のものを指す。
【００７２】
本発明の特定の実施態様において、組換え微生物は以下に記述するとおり改変される。ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA*アレル、thrA、及びスレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードするthrA*アレルの中から選択される少なくとも一種の発現が増加する。
【００７３】
・ptsGは、特許出願WO2013/001055に記述されるように、PTS酵素IICBGlcをコードし、
・pycは、特許出願WO2013/001055に記述されるように、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする。好ましい実施態様において、pyc遺伝子は異種性であり、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、又はコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種由来のpyc遺伝子から選択される、
・pntABは、特許出願WO2012/055798等に記述されるように、膜結合トランスヒドロゲナーゼをコードし、
・cysPは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、ペリプラズム硫酸塩結合タンパク質をコードし、
・cysUは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、硫酸塩ABCトランスポーターをコードし、
・cysWは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、膜結合硫酸塩輸送タンパク質をコードし、
・cysAは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、硫酸塩パーミアーゼをコードし、
・cysMは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードし、
・cysI及びcysJは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、亜硫酸レダクターゼのα及びβサブユニットをそれぞれコードする。好ましくは、cysI及びcysJは共に過剰発現される、
・cysHは、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、 アデニリル硫酸レダクターゼをコードする。
【００７４】
また、C1代謝の向上も、メチオニン生産の改善をもたらす改変である。GcvTHP、Lpd、MetF、又はMetHの中から選択されるC1代謝に関連する少なくとも一種の酵素の活性の増加に関連する。本発明の好ましい実施態様において、以下の少なくとも一つの発現及び/又は活性を強化することにより、一炭素代謝が向上する。
・特許出願WO 2007/077041に記述される、グリシン開裂複合体をコードする、gcvT、gcvH、gcvP、及びlpd。グリシン開裂複合体(GCV)は、グリシンの酸化を触媒して二酸化炭素、アンモニア、メチレン-THF、及び還元ピリジンヌクレオチドを生じる多酵素複合体である。GCV複合体は、Pタンパク質と言われるグリシンデヒドロゲナーゼ(GcvP)、Hタンパク質と言われるリポイル-GcvH-タンパク質(GcvH)、Tタンパク質と言われるアミノメチルトランスフェラーゼ(GcvT)、及びLタンパク質と言われるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ(GcvL又はLpd)の、4つのタンパク質の構成要素から成る。Pタンパク質は、グリシンからのピリドキサールリン酸依存的なCO2の遊離を触媒し、メチルアミン部分を残す。メチルアミン部分はHタンパク質のリポ酸基に移されるが、Hタンパク質はグリシンの脱炭酸前はPタンパク質に結合している。Tタンパク質はメチルアミン基からのNH3の放出を触媒し、残りのC1ユニットをTHFへ移し、メチレン-THFを形成する。その後、Lタンパク質がHタンパク質のリポ酸成分を酸化し、電子をNAD+に移し、NADHを形成する。
・特許出願WO2007/07704に記述される、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードするMetF。
【００７５】
また、セリン生合成に関与する以下の遺伝子の少なくとも一種の過剰発現によっても、副産物であるイソロイシンの生産が低減される。
・WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserA、
・WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される、ホスホセリンホスファターゼをコードするserB、
・WO2007/077041及びWO2009/043803に記述される、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするserC。
【００７６】
以下の遺伝子の過剰発現は、メチオニンの生産を改善することが既に示されている。
・cysEは、セリンアシルトランスフェラーゼをコードする。WO2007/077041に記述されるように、その過剰発現により、メチオニン生産の増加が起こる。
・metAは、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする。アレルのmetA*は、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素をコードする。優先的には、特許出願WO2005/111202に記述されるmetA*アレルが用いられる。
・thrAは、アスパルトキナーゼ/ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする。アレルのthrA*は、WO2005/111202に記述されるように、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素をコードする。
【００７７】
本発明の特定の実施態様において、前記遺伝子の少なくとも一種が誘導性プロモーターの制御下にある。本発明の好ましい実施態様において、これらの遺伝子の少なくとも一種が、温度誘導性プロモーターの制御下にある。好ましくは、thrA、cysE、metAの遺伝子の少なくとも一種の発現が、直接的に又は間接的に、誘導性プロモーターの制御下にある。より好ましくは、thrA、cysE、及びmetA遺伝子は、直接的に又は間接的に、誘導性プロモーターの制御下にある。本発明の好ましい態様において、thrA遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの直接的な制御下にあり、cysE遺伝子の発現は、thrA遺伝子の誘導的発現の極性効果(polar effect)の下にある。本発明の別の好ましい実施態様において、thrA遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの直接的制御下にあり、cysE及びmetA遺伝子の発現は、thrA遺伝子の誘導的発現の極性効果の下にある。
【００７８】
最も好ましい実施態様において、温度誘導性プロモーターは、PRプロモーターのファミリーに属する。誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子を有するメチオニン生産株は、特許出願WO2011/073122に記述される。
【００７９】
本発明の別の特定の実施態様において、微生物はさらに改変されており、metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA、metN、metI、metQ、又はudhAの遺伝子の少なくとも一種の発現が減衰される。
・metJ遺伝子は、特許出願JP2000/157267に示唆されたように、メチオニンレギュロンの下方制御を担うリプレッサータンパク質MetJ (GenBank 1790373)をコードする。
・pykA及びpykF遺伝子は、「ピルビン酸キナーゼ」酵素をコードする。ピルビン酸キナーゼの少なくとも一つ又は両方の発現の減衰により、ホスホエノールピルビン酸(PEP)の消費が減少する。PEPのアベイラビリティの増加は、WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、ひいてはメチオニンの前駆体となるアスパラギン酸の重要な前駆体である、オキサロ酢酸の生産を増加させる可能性がある。
・purUは、ホルミル-THFデホルミラーゼ反応を触媒する酵素である、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードする。デホルミラーゼ活性の減衰により、ホモシステインのメチル化に必要なメチル-THFの生産が増加する。脱ホルミル化によりC1代謝産物を失うと、メチオニンに変換することができないホモシステインの生産の増加がもたらされる。WO2007/077041及びWO2009/043803に記述されるように、ホモシステインはその後、O-スクシニルホモセリンとホモシステインとの間の反応を触媒することができるシスタチオニンガンマシンターゼ(MetB)酵素の基質になり得、ホモランチオニンの生産をもたらす。
・ybdLは、特許出願WO2012/090021に記述されるように、アミノトランスフェラーゼをコードする。
・yncAは、特許出願WO2010/020681に記述されるように、N-アセチルトランスフェラーゼをコードする。
・metEは、特許出願PCT/IB2012/001336に記述されるように、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼをコードする。
・dgsAは、Mlcとしての方がよく知られているが、特許発明WO2013/001055に記述されるように、ホスホトランスフェラーゼ(PTS)及びホスホエノールピルビン酸(PEP)系の酵素をコードする遺伝子の発現を調節する転写デュアルレギュレーターをコードする。
・metN、metI、metQは、メチオニン取り込み系をコードする。
・udhAは、特許出願WO2012/055798に記述されるように、可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする。
【００８０】
本発明のより好ましい実施態様において、メチオニンの搬入が減衰され、メチオニンの流出が強化されている組換え微生物による、主要な炭素源としてのグルコースからのメチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産は、前記微生物における上述の改変の組み合わせによって達成してもよく、例えば以下のとおりである。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化される。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化され、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素(thrA*)をコードするthrA*アレルの発現が強化される。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化され、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素(thrA*)をコードするthrA*アレルの発現が強化され、cysE遺伝子の発現が強化される。
・metJ遺伝子の発現が減衰され、S-アデノシルメチオニン及び/又はメチオニンへのフィードバック感受性が低減された酵素(MetA*)をコードするmetA*アレルの発現が強化され、スレオニンへのフィードバック阻害が低減された酵素(thrA*)をコードするthrA*アレルの発現が強化され、cysE遺伝子の発現が強化され、metF遺伝子の発現が強化される。
【００８１】
本発明の特定の態様において、組換え微生物は、以下の遺伝子改変を含む。
・大腸菌由来のmetH、及びfldA及びfpr又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される、
・大腸菌由来のygaZ及びygaH遺伝子若しくはC.グルタミクム由来のbrnF及びbrnE遺伝子、又はシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、若しくはシトロバクター・フロインディーに由来するこれらのホモログ遺伝子が過剰発現される、
・metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG、及びpyc遺伝子の発現が強化される、及び、
・metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA、及びyncA遺伝子の発現が減衰される。
【００８２】
本発明の特定の実施態様において、改変される微生物は、腸内細菌科又はコリネバクテリウム科由来である。
【００８３】
優先的には、改変される微生物は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミクムである。
【００８４】
「培養条件」
本発明の第二の態様において、方法はメチオニン及び/又はその誘導体の発酵的生産に最適化される。以下の工程が含まれる。
・組換え微生物を培養する工程であって、発酵性の炭素源及び硫黄源を含む適切な培地中で、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性及びメチオニン流出が、それぞれmetH遺伝子、及び場合により大腸菌由来のfldA及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子、並びに大腸菌由来のygaZH遺伝子、若しくはC.グルタミクム由来のbrnFE遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現により強化される工程、及び、
・培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程。
【００８５】
当業者は、本発明による微生物のための培養条件を規定することができる。特に、細菌は20℃〜55℃の間、優先的には、25℃〜40℃の間、より特定すればC.グルタミクムについては約30℃、大腸菌については約37℃の温度で発酵される。
【００８６】
大腸菌については、培地は、M9培地(Anderson, 1946)、M63培地(Miller, 1992)、又はSchaeferら(1999)等によって規定される培地と同一であるか又は類似の組成とすることができる。
【００８７】
C.グルタミクムについては、培地は、BMCG培地(Liebl et al., 1989)又はRiedelら(2001)等によって記述される培地と同一であるか又は類似の組成とすることができる。
【００８８】
本発明の方法において、組換え微生物中で過剰発現されるygaZHホモログ遺伝子は、好ましくはシトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択され、より好ましくはシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディーに由来する。
【００８９】
本発明の特定の実施態様において、組換え微生物は以下の遺伝子改変を含む。
a. 大腸菌由来のmetH遺伝子、及びfldA及びfpr遺伝子、又はC.グルタミクム由来のこれらのホモログ遺伝子の過剰発現、並びに
b. 大腸菌由来のygaZH遺伝子、若しくはC.グルタミクム由来のbrnFE遺伝子、又はこれらのホモログ遺伝子の過剰発現。
【００９０】
この本発明の特定の実施態様において、前記ygaZHホモログ遺伝子は、好ましくはシトロバクター属の種、赤痢菌属の種、ラオウルテラ属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択され、より好ましくはシトロバクター・コセリ、フレキシネル赤痢菌、ラオウルテラ・オルニチノリティカ、エンテロバクター属の種、エルシニア・エンテロコリチカ、フォトラブズス・ルミネセンス、シトロバクター・ヤンガエ、又はシトロバクター・フロインディー由来のホモログ遺伝子から成る群の中から選択される。
【００９１】
本発明の方法において、組換え微生物中で過剰発現されるygaZHホモログ遺伝子は、最も好ましくはシトロバクター・コセリ、シトロバクター・ヤンガエ、シトロバクター・フロインディー、又はエンテロバクター属の種に由来する。
【００９２】
本発明のある実施態様において、組換え微生物の生育は、培地中で一種以上の無機性基質、特にリン酸塩及び/又はカリウムの制限又は飢餓/欠乏を受ける。これは、微生物の生育が、供給される無機化学物質の量によって管理される条件であって、その量がそれでもなお弱い生育を可能にするものである、条件を指す。そのような微生物生育の制限は、特許出願WO2009/043372に記述されている。本発明の好ましい実施態様において、培養はリン酸塩制限を受ける。
【００９３】
「培地からメチオニン及び/又はその誘導体を回収する」という作業は、L-メチオニン及び/又はその誘導体、特にN-アセチルメチオニン(NAM)及びS-アデノシルメチオニン(SAM)、並びに有用である可能性がある全ての他の誘導体、例えばヒドロキシ-メチオニン(又はメチオニンヒドロキシアナログ若しくはMHA)を回収する作業を示す。生産した化合物の回収及び精製のための方法は、当業者に周知である(特に、WO2005/007862、WO2005/059155を参照)。好ましくは、メチオニン及び/又はその誘導体を回収する工程は、発酵液中のメチオニン及び/又はその誘導体を濃縮する工程を含む。
【００９４】
発酵培地中の生産物の量は、周知の多数の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、又はガスクロマトグラフィー(GC)を用いて決定することができる。例えば、培地中に得られたメチオニンの量は、OPA/Fmoc誘導体化の後に、L-メチオニン(Fluka, Ref 64319)を標準として用いるHPLCによって測定される。NAMの量は、NAM (Sigma, Ref 01310)を標準として用いる屈折率測定法HPLCを用いて決定される。
【実施例】
【００９５】
以下の試験により、大腸菌及びC.グルタミクム等の微生物における、B12依存性メチオニンシンターゼ及びその再活性化系をコードする遺伝子の過剰発現と併せたL-メチオニン排出系をコードする遺伝子の過剰発現により、メチオニン生産を改善する方法を実証する。
【００９６】
下記の実施例において、周知の方法を用いて、大腸菌についてはDatsenko & Wanner(2000)に、C.グルタミクムについては特許WO2007012078に詳細に記述される相同組換えを用いて、複製ベクター並びに/又は様々な染色体上への挿入、欠失、及び置換を含む大腸菌及びC.グルタミクムの株を構築した。
【００９７】
同様に、一種以上の遺伝子を組換え微生物中で発現させる又は過剰発現させるためのプラスミド又はベクターの使用は、当業者に周知である。
【００９８】
適切な大腸菌の発現ベクターの例には、pTrc、pACYC184n pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236等がある。
【００９９】
適切なC.グルタミクム及び大腸菌のシャトルベクターの例は、例えば、pClik5aMCS (WO2005059093)であり、又はEikmannsら(1991)に見出すことができる。
【０１００】
コリネバクテリウム属を操作するための適切なベクターの例は、コリネバクテリウムのハンドブック、Eggeling及びBottin編、2005年、に見出すことができる。
【０１０１】
「プロトコル」
複数のプロトコルを用いて、以下の実施例に記述するメチオニン生産株を構築した。
【０１０２】
本発明で用いられるプロトコル１(相同組換えによる染色体の改変、組換え体の選択、及び抗生物質カセットの除去)及びプロトコル２(P1ファージの形質導入)は、特許出願WO2013/001055に十分に記述されている。
【０１０３】
［プロトコル３：組換えプラスミドの構築］
組換えDNA技術は、詳しく説明されており、当業者に周知である。
【０１０４】
簡潔に言えば、DNA断片を、(当業者であれば設計することができる)オリゴヌクレオチド及びMG1655ゲノムDNAをマトリックスとして用いてPCR増幅する。DNA断片及び選択したプラスミドを適合する制限酵素を用いて消化し、ライゲーションしてその後コンピテントセルを形質転換する。形質転換体を分析して、目的の組換えプラスミドをDNAシーケンシングにより確認する。
【０１０５】
【表３】
2016529899.tif 000015
【０１０６】
「実施例１：L-メチオニン過剰生産大腸菌組換え株におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼの過剰生産［又は］L-メチオニン分泌系の過剰生産 ― 株１、並びに株２、株３、株４、株５、及び株６の構築」
【０１０７】
［株１ ― 参照株］
特許出願WO2013/001055(参照として本願に組み込まれる)に記述されるメチオニン生産株１７は、本願において株１と改名された。思い出すために記述すれば、この株は、内因性のローカスにおいてmetHの前に組み込まれた、人工のプロモーター及びリボソーム結合部位によって、metHを過剰発現した(詳細は、特許出願WO2007/077041を参照)。また、この株は、特許出願WO2013/190343に開示される、metE遺伝子の変異を含んでいる。
【０１０８】
［株５の構築 ― コバラミン依存性メチオニンシンターゼの過剰生産、metH、fldA、及びfprの過剰発現］
大腸菌の、コバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードするmetH遺伝子、並びにMetHの再活性化系をコードするfldA及びfpr遺伝子は、株１の遺伝的背景において全て過剰発現された。
【０１０９】
株１を用いる前に、Datsenko & Wanner, 2000に記述されるように(プロトコル１に従って)、Flpリコンビナーゼを用いて抗生物質カセットをΔdgsA改変から除去した。カナマイシン感受性の形質転換体を選択し、ΔdgsAローカスにおいて抗生物質カセットが存在しないことを、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。確保された株を、株２と命名した。
【０１１０】
metHを過剰発現させるために、特許出願WO2007/077041に記述されたものと同じプロモーター及びリボソーム結合部位に動作可能に連結されたこの遺伝子を、染色体上の2つの異なるローカス、ybeM及びypjC(特許出願WO2011/073122に開示された一覧より選択され、その欠失がメチオニン生産に影響を及ぼさない)に組み込む。
【０１１１】
metHを強力に過剰発現させるために、Datsenko & Wanner, 2000に記述される(プロトコル１による)相同組換え法を用いた。両方の染色体組み込みのために、標的組み込みローカスであるybeM又はypjCと相同性を有するDNA配列を末端に配した、人工プロモーターに連結されたmetH遺伝子及び耐性マーカーを保有する断片を、オーバーラップPCR技術(オーバーラップオリゴヌクレオチド)によりPCR増幅した。ybeM及びypjCへの組換えのための配列は、ybeM及びypjCについてそれぞれ(表３に列挙する)配列番号21及び22、並びに配列番号23及び24と示される。得られたPCR産物「ΔybeM::metH::Km」及び「ΔypjC::metH::Cm」を、次にエレクトロポレーションによってMG1655 metA*11 (pKD46)株に別個に導入した。抗生物質耐性の形質転換体を選択し、標的ローカスへの耐性カセットを伴ったmetH遺伝子の挿入を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。確保された株を、MG1655 metA*11 ΔybeM::metH::Km及びMG1655 metA*11 ΔypjC::metH::Cmと表示した。最後に、ΔybeM::metH::Km及びΔypjC::metH::Cm染色体組み込みを、P1ファージ形質導入によって連続して(プロトコル２により)、MG1655 metA*11 ΔybeM::metH::Km及びMG1655 metA*11 ΔypjC::metHから株２へと移転させた。クロラムフェニコール又はカナマイシン耐性の形質導入体を選択し、ΔybeM::metH::Km及びΔypjC::metH::Cm染色体組み込みの存在を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析により確認した。確保された株を株３と称した。
【０１１２】
Datsenko & Wanner, 2000に記述されるように(プロトコル１に従って)、Flpリコンビナーゼを用いて、株３に対してybeM及びypjCローカスになされた染色体組み込みから抗生物質カセットを除去した。カナマイシン及びクロラムフェニコール感受性の形質転換体を選択し、両ローカスにおいて抗生物質カセットが存在しないことを、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。確保された株を、株４と命名した。
【０１１３】
fldA及びfprを過剰発現させるために、これらの遺伝子を、人工プロモーター及び人工リボソーム結合部位に動作可能に連結し、染色体上のytfAローカス(ybeM及びypjCローカスと同様の選択基準、上記参照)に組み込んだ。人工プロモーターは、fldAについて配列番号25を用い、fprについての特許出願WO2009/043803においてcysPUWAMオペロンの過剰発現について記述されるように、構築した。人工リボソーム結合部位は、特許出願WO2013/001055に開示される株１７においてptsG遺伝子を過剰発現させるために記述されたものと同一である。
【０１１４】
fldA及びfprの過剰発現のコピーを染色体上に加えるために、Datsenko & Wanner, 2000に記述される(プロトコル１による)相同組換え法を用いた。それぞれのプロモーターを伴うfldA及びfpr遺伝子、並びに耐性マーカーを保有し、組み込みローカスであるytfAと相同性を有するDNA配列を両方の末端に配した断片を、オーバーラップPCR技術(オーバーラップオリゴヌクレオチド)によりPCR増幅した。ytfAローカスへの組換えのための配列は、(表３に列挙する)配列番号26及び27として示される。得られたPCR産物「ΔytfA::fldA-fpr::Km」を、次にエレクトロポレーションによってMG1655 metA*11 (pKD46)株に別個に導入した。その後、抗生物質耐性の形質転換体を選択し、ytfAローカスへの耐性カセットを伴ったfldA-fpr遺伝子の挿入を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。確保された株を、MG1655 metA*11 ΔytfA::fldA-fpr::Kmと命名した。最後に、ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体組み込みを、P1ファージ形質導入によって(プロトコル２により)、MG1655 metA*11 ΔytfA::fldA-fpr::Kmから株４へと移転させた。カナマイシン耐性の形質導入体を選択し、ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体組み込みの存在を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析により確認した。確保された株を株５と表示した。
【０１１５】
［株６の構築 ― L-メチオニン分泌系の過剰生産、ygaZHの過剰発現］
メチオニンのエクスポーターをコードする大腸菌のygaZH遺伝子を株１において過剰発現させた。遺伝子を中程度のプラスミドコピー数のpCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)上に、ygaZの天然のプロモーターを用いてクローニングした。このプラスミドを、pME1247と名付けた。最後に、プラスミドpME1247を用いて株１を形質転換し、株６を得た。
【０１１６】
「実施例２：L-メチオニン過剰生産大腸菌株におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼの過剰生産［及び］L-メチオニン分泌系の過剰生産 ― 株７の構築」
メチオニンのエクスポーターをコードする大腸菌のygaZH遺伝子を株５において過剰発現させた。pME1247プラスミドを用いて株５を形質転換し、株７を得た。
【０１１７】
「実施例３：L-メチオニン過剰生産C.グルタミクム組換え株におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ若しくはその再活性化系の過剰生産、又はL-メチオニン分泌系の過剰生産― 株A〜株Fの構築」
C.グルタミクム株ATCC 13032 hom* ask* metH (以下株Aと表示する)は、特許WO2007/012078に記述されている。
【０１１８】
その株A中、hom*及びask*は、Hsdh S393Fタンパク質をコードするホモセリンデヒドロゲナーゼの、及びLysC T311Iとも呼ばれるAsk T311Iタンパク質をコードするアスパラギン酸キナーゼの、それぞれフィードバック耐性アレルに相当する。
【０１１９】
この株Aは、続いて特許WO2007/012078に記述されるように、N-メチル-N'-ニトログアニジンを用いて変異誘発される。株Aの少なくとも2倍のメチオニン力価を示すクローンを単離する。さらなる試験において用いられるそのような1株を、株Bと名付ける。この株BはC.グルタミクムのL-メチオニン生産株である。
【０１２０】
次に、C.グルタミクム株Bを、特許WO2007/012078及びWO2004/050694に記述されるように、改変してhsk* metY metA metF DmcbRを含む株Cを得る。
【０１２１】
ホモセリンキナーゼHsk T190Aをコードする、変異させたアレルhsk*を、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードするmetY、ホモセリンアセチル-トランスフェラーゼをコードするmetA、ホモシステインメチラーゼをコードするmetFと共に過剰発現させ、mcbR遺伝子を欠失させる。
【０１２２】
C.グルタミクムのL-メチオニン生産株Cにおいてコバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性を増加させるために、metHcg (C.グルタミクム由来のmetH遺伝子)を、MetH再酸化タンパク質として働くフェレドキシンレダクターゼをコードするfprA1遺伝子と共に過剰発現させる。これらの改変を、特許WO2009/144270の記述に従って行う。生じた株を株Dと称する。
【０１２３】
C.グルタミクムのL-メチオニン生産株Cにおいてコバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性を増加させる別の方法は、metHEc (大腸菌由来のmetH遺伝子)を、MetH酵素の再活性化に関与するフラボドキシンをコードする大腸菌由来のfldA及びfpr遺伝子と共に過剰発現させることである。これは、特許WO2009/144270に従って行った。生じた株を株Eと称する。
【０１２４】
株CにおいてC.グルタミクム特異的なL-メチオニン排出系を向上させるために、brnFEオペロンを大腸菌-C.グルタミクムシャトル発現ベクターpEC-XT99A (EP1085094)から過剰発現させる。プラスミドを、C.グルタミクム ATCC 13032 DNAを鋳型とするPCRにより作製した断片から大腸菌において構築した。プラスミドを、Trotschelら(2005)によって記述されるようにpEC-XT99A中に構築し、続いて生じたプラスミドpCB1を用いて株Cを形質転換し、株Fを得る。
【０１２５】
「実施例４：C.グルタミクムのL-メチオニン過剰生産株における、コバラミン依存性メチオニンシンターゼの過剰生産［と］L-メチオニン分泌系の過剰生産との組み合わせ ― 株G及び株Hの構築」
C.グルタミクムにおけるMetHCG、FprA1、又はMetHEC、FldA、Fprの過剰生産と、特異的なL-メチオニン排出系BrnFEの過剰生産とを組み合わせるために、上述のプラスミドpCB1をエレクトロポレーションにより株D及び株Eに導入し、それぞれ株G及び株Hを得た。
【０１２６】
株Gは、C.グルタミクムに属する遺伝子のみを保有しているのに対し、株Hは、大腸菌由来のコバラミン依存性メチオニンシンターゼ及びその再活性化系を有している。
【０１２７】
エクスポーターは、全ての場合においてBrnFEである。
【０１２８】
「実施例５：大腸菌株を用いたバイオリアクターでの発酵によるL-メチオニンの生産」
先の実施例で記述した株を、流加培養(fedbatch)法を用いて、2.5 Lのリアクター(Pierre Guerin)内での生産条件下で試験した。
【０１２９】
簡潔に言えば、2.5 g.L-1グルコースを含む10 mLのLB培地中で生育させた24時間培養液を用いて、24時間の最少培地(B1a)での前培養に植菌した。これらの培養は、ロータリーシェーカー(200 RPM)中の、50 mLの最少培地が入った500 mLバッフル付フラスコ内で行った。第一の前培養は30℃の温度で実行し、第二の前培養は34℃の温度で実行した。
【０１３０】
第三の前培養工程は、5 mLの濃縮した前培養液を用いて1.2 g.L-1のバイオマス濃度に植菌した200 mLの最少培地(B1b)を満たしたバイオリアクター(Sixfors)内で行った。前培養の温度を、34℃で一定に維持し、pHは10 % NH4OH溶液を用いて自動的に6.8の値に調節された。吸気及び/又は攪拌により、溶存酸素濃度を飽和空気分圧30 %の値に継続的に調節した。回分(batch)培地中のグルコースが枯渇した後、0.7 mL.h-1の初期流量で流加培養を開始し、その後26時間、0.13 h-1の増殖率で指数関数的に増加させ、約20 g.L-1の最終細胞濃度が得られるようにした。
【０１３１】
【表４】
2016529899.tif 000016
【０１３２】
【表５】
2016529899.tif 000017
【０１３３】
続いて、2.5 Lリアクター(Pierre Guerin)に600 mL又は620 mLの最少培地(B2)を満たし、80〜100 mLの間で変動する前培養液量を用いて3,2 g.L-1のバイオマス濃度に植菌した。
【０１３４】
細胞の生育はリン酸塩により制御される。そのため、回分培地B2中の最終リン酸塩濃度を、異なる濃度のKH2PO4、K2HPO4、及び(NH4)2HPO4を加えることで0〜20 mMの間に含まれる値に調節した。同様に、F2培地の最終リン酸塩濃度を、異なる濃度のKH2PO4、K2HPO4、及び(NH4)2HPO4を加えることで5〜30 mMの間に含まれる値に調節した。流加培地中のチオ硫酸濃度を、培養中のこの化合物の枯渇を防ぐように調節することができる。
【０１３５】
【表６】
2016529899.tif 000018
【表７】
2016529899.tif 000019
【０１３６】
培養温度を、37℃で一定に維持し、pHをNH4OH溶液(10 %及び28 %)の自動添加により作業値(working value) (6.8)に維持した。初期攪拌速度を、回分培養期の間は200 RPMに設定し、流加培養期の間は最大1000 RPMまで上昇させた。初期空気流量を、回分培養期の間は40 NL.h-1に設定し、流加培養期の開始時に100 NL.h-1まで増加させた。溶存酸素濃度を、攪拌を増加させることにより、20〜40%の間、優先的には30%飽和の値に維持した。
【０１３７】
必要な場合、IPTGを終濃度20 μMで回分培地及び流加培地に加えた。必要な場合、抗生物質をスペクチノマイシンについては50 mg.L-1、クロラムフェニコールについては30 mg.L-1、カナマイシンについては50 mg.mL-1、及びアンピシリンについては100 mg.L-1の濃度で加えた。
【０１３８】
細胞質量が5 g.L-1近くの濃度まで達したら、5 mL.h-1の初期流量で流加培養を開始した。流加溶液を、流量の増加を伴うS字形のプロファイル(sigmoid profile)で注入し、25時間後には24 mL.h-1に達した。正確な流加条件は、式：
【０１３９】
【数１】
2016529899.tif 000020
【０１４０】
[式中、Q(t)は流加の流速(mL.h-1)であり、p1 = 1.80、p2 = 22.4、p3 = 0.27、p4 = 6.50である]
によって計算された。この流速を、全培養を通して、10〜50 %、優先的には20〜30 %の間で増加させた。
【０１４１】
25時間の流加培養後、流加溶液ポンプを止め、グルコース枯渇後に培養を終了させた。
【０１４２】
細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連する代謝物を、屈折率検出器を備えたHPLC(有機酸及びグルコース)を用いて、及びシリル化後にGC-MSを用いて分析した。
【０１４３】
大腸菌におけるmetH、fldA、fpr過剰発現とygaZH過剰発現との組み合わせの影響を試験した。結果を表８に示す。
【０１４４】
【表８】
2016529899.tif 000021
【０１４５】
これらの結果により、大腸菌において、ygaZH遺伝子のみの過剰発現はメチオニンの生産にとって何の利益にもならないことが示される(株６)。大腸菌におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ系の過剰発現(株５)は、メチオニンの生産の改善をもたらす。驚くべきことに、発明者らは、ygaZH遺伝子とコバラミン依存性メチオニンシンターゼ系との過剰発現の組み合わせが、メチオニン生産について相乗効果を有しており、メチオニンの生産の予想外の増加をもたらすことを観察する。また、この組み合わせは、ホモランチオニン生産に好ましい影響を与え、より純度の良いメチオニンをもたらす。
【０１４６】
［メチオニン/グルコース収率(Ymet)の決定］
初期液量に、pHを制御するため及び培養に流加するために加えた溶液の量を加えることにより、並びにサンプリングのために使用した液量及び蒸発により失われた液量を減じることにより、リアクター液量を計算した。
【０１４７】
流加培養の液量は、流加ストックを計量することにより継続的に把握した。その後、注入したグルコースを、注入重量、溶液の密度、及びBrix法により決定したグルコース濃度([グルコース])に基づいて計算した。メチオニン収率を以下のとおり表す。
【０１４８】
【数２】
2016529899.tif 000022
【０１４９】
[式中、メチオニン0及びメチオニンtはそれぞれ開始時及び最終のメチオニン濃度であり、V0及びVtは開始時及びt時点の液量である]
【０１５０】
消費されたグルコースは以下のとおり計算される。
【０１５１】
【数３】
2016529899.tif 000023
【０１５２】
注入されたグルコースt = 流加液量t * [グルコース]
消費されたグルコースt = [グルコース]0 * V0 + 注入されたグルコース − [グルコース]残存 * Vt
[式中 [グルコース]0、[グルコース]、[グルコース]残存はそれぞれ開始時、流加された、及び残存するグルコース濃度である]
【０１５３】
［コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性アッセイ］
コバラミン依存性メチオニン活性アッセイは、Drummondら、1995年によって記述されたアッセイを適応させたものである。
【０１５４】
コバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性は、分光光度計を用いて波長350 nm、温度37℃一定で生成物テトラヒドロ葉酸塩(H4葉酸塩)濃度を測定することにより測定した。 
【０１５５】
反応混合物を、80 mMリン酸カリウム(pH7.2)、20 mM DTT、15 μM S-アデノシルメチオニン(SAM)、0.6 mM (6R,S)-5-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸、40μM ヒドロキソコバラミン、0.1mM 塩化亜鉛、及び8μg 粗抽出物、最終液量800μl中で行った。反応混合物を、37℃、10分間インキュベートし、その後ホモシステイン基質を終濃度0.8 mMで加えることにより反応を開始した。37℃、5分間の後、200 μlの酸性誘導体化溶液 (4M HCl、60%ギ酸中)を加えて代謝回転をクエンチし、液量は1mlになり、チューブを80℃で10分間加熱する。この工程は、酵素反応生成物であるテトラヒドロ葉酸塩が酸中で安定でないため、安定化させるために必要である。熱によりメテニルテトラヒドロ葉酸塩の形成がもたらされ、これは350 nmで光を吸収するが、残存基質の5-メチルテトラヒドロ葉酸塩は350 nmでの吸光に寄与しない。反応ブランクは基質のホモシステイン以外の全ての反応混合物の成分を含有した。
【０１５６】
［FldA及びFprタンパク質濃度の定量］
この2つのタンパク質を定量するために、フラボドキシン-1(fldA)及びフラボドキシンレダクターゼ(fpr)に対する抗体(ウサギ由来の抗体、Eurogentec)を作製し、ウエスタンブロット実験に使用した。ウエスタンブロット検出は、ヤギ抗ウサギAPを用いて行った。染色したブロットのFldA及びFprのタンパク質濃度は、市販のイメージングシステム(Epson Expression 1680 professional)を用いて定量化し、本願に記述した種々の株で比較した。
【０１５７】
「実施例６：C.グルタミクム株を用いた発酵によるL-メチオニンの生産」
特許出願WO2009/144270に記述されたものと同条件で株をフラスコ内で培養する。
【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
大腸菌と同様に、C.グルタミクムにおいて、brnFE遺伝子とコバラミン依存性メチオニンシンターゼ系との過剰発現の組み合わせ(大腸菌由来 ― 株H、及びC.グルタミクム由来 ― 株G)は、メチオニン生産について相乗効果を有しており、メチオニンの生産の予想外の増加をもたらす。
【０１６０】
「実施例７：L-メチオニン過剰生産大腸菌株におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼの過剰生産及び相同性L-メチオニン分泌系の過剰生産 ― 株８〜株１７の構築」
シトロバクター属の種、ラオウルテラ属の種、赤痢菌属の種、エンテロバクター属の種、エルシニア属の種、及びフォトラブズス属の種由来のygaZHホモログ遺伝子を、株５の遺伝的背景において過剰発現した。
【０１６１】
株５を用いる前に、Datsenko & Wanner, 2000に記述されるように(プロトコル１に従って)、Flpリコンビナーゼを用いてytfAローカスにおいてなされた染色体組み込みの抗生物質カセットを除去した。カナマイシン感受性の形質転換体を選択し、ytfAローカスにおいて抗生物質カセットが存在しないことを、適切なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。確保された株を、株８と命名した。
【０１６２】
［株９の構築 ― 内因性L-メチオニン分泌系の過剰生産、大腸菌由来のygaZHの過剰発現］
大腸菌由来のygaZHの過剰発現と、同一の遺伝的背景におけるygaZHホモログの過剰発現との効果を比較するために、大腸菌由来のygaZHを保有するプラスミドpME1247を用いて株８を形質転換し、株９を得た。
【０１６３】
［株１０〜株１７の構築 ― 相同性L-メチオニン分泌系の過剰生産、表１０に列挙された属及び種由来のygaZHの過剰発現］
表１０に列挙したygaZHホモログ遺伝子を過剰発現させるために、大腸菌のygaZH遺伝子について上述したとおり、各組の遺伝子を中程度のコピー数のプラスミドpCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)上に、大腸菌由来のygaZ遺伝子の天然のプロモーター及び天然のリボソーム結合部位を用いて、クローニングした。表１１に明記するように、ygaZHホモログ遺伝子は、対応する株のゲノムDNAから増幅したか、又は化学合成し、コドン使用頻度を大腸菌に最適化したか、又はしていない(GeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いたGeneArt(登録商標) Gene Synthesisサービス  ― Lifetechnologiesにより提案されたとおり)。ygaZHホモログ遺伝子を含む、増幅されたDNA断片は、表１１に示す配列番号で開示される。生じたプラスミドを、表１１に言及するとおりに命名した。最後に、各プラスミドを用いて株８を形質転換し、表１１に言及するとおり、株１０〜株１７を得た。
【０１６４】
【表１０】
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2016529899.tif 000026
【表１１】
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【０１６５】
「実施例８：フラスコ試験における培養によるL-メチオニンの生産」
コバラミン依存性メチオニンシンターゼMetH及び様々な微生物由来の種々のL-メチオニン分泌系(大腸菌のYgaZHと相同性である)を過剰生産する組換えL-メチオニン生産菌を、小三角フラスコ中で評価した。
【０１６６】
生産株を小三角フラスコ中で評価した。5.5 mLの前培養液を、30℃で21時間、混合培地(10 % LB培地(Sigma 25 %)、2.5 g.L-1グルコース含有、及び90 % 最少培地PC1)中で増殖させた。これを用いて、50 mL培養に、PC1培地中OD600 0.2まで植菌した。必要な場合は、スペクチノマイシンを50 mg.L-1、及びゲンタマイシンを10 mg.L-1の濃度で加えた。培養の温度は37℃であった。培地がOD600 5〜7に達したら、細胞外アミノ酸をOPA/Fmoc誘導体化後にHPLCを用いて定量し、他の関連する代謝物を、屈折率検出器を備えたHPLC(有機酸及びグルコース)を用いて、及びシリル化後にGC-MSを用いて分析した。
【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
表１３からわかるように、metH、fldA、fpr遺伝子を過剰発現するL-メチオニン生産菌における様々な微生物由来のygaZHホモログ遺伝子の過剰発現は、大腸菌由来のygaZHを過剰発現する株９により得られる成果に相当するか、又はそれよりも良い成果をもたらす。大腸菌以外の他の微生物由来の相同性L-メチオニン分泌系は、細菌の内因性タンパク質と置き替えることができる。
【０１７０】
シトロバクター・コセリ(株１０、Ymet=19,6g/g)、シトロバクター・ヤンガエ(株１６、Ymet=19,6g/g)、シトロバクター・フロインディー(株１７、Ymet=19,6g/g)、及びエンテロバクター属の種(株１３、Ymet=19,4g/g)由来のホモログタンパク質YgaZHは、株９(Ymet=18.7g/g)と比較して最も良いL-メチオニン生産収率を示した。
【０１７１】
メチオニン収率を以下のとおり表した。
【０１７２】
【数４】
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【０１７３】
(参考文献)
【０１７４】
【表１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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