(57)【要約】本発明は、水稲遺伝子コードに最適化されたＯｓｒｂＦＧＦ遺伝子、関連のベクター及びそれらを用いてＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を作製する方法、並びにＯｓｒｂＦＧＦの単離・精製方法を提供する。水稲胚乳細胞においてＯｓｒｂＦＧＦを特異的に発現する発現ベクターを用いてＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を作製し、該子実からＯｓｒｂＦＧＦを単離・精製することで、得られたＯｓｒｂＦＧＦの純度が９５％に達すると共に、インビトロにおいてＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖、及びインビボにおいて創傷癒合を促進する活性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水稲遺伝子コードに最適化され、且つＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．１に示されるヌクレオチド配列で構成されることを特徴とする、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現する遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現する遺伝子を含んでなることを特徴とする、組換え発現ベクター。
【請求項３】
前記組換え発現ベクターが、水稲胚乳細胞特異的な発現ベクターであることを特徴とする、請求項２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記組換え発現ベクターが、図３に示される構造を有することを特徴とする、請求項３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
トランスジェニック水稲の子実において、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現させることを特徴とする、請求項２〜４の何れか１項に記載の組換え発現ベクターのトランスジェニック水稲子実の作製における用途。
【請求項６】
請求項１に記載の水稲遺伝子コードに最適化され、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現する遺伝子のトランスジェニック水稲子実の作製における用途。
【請求項７】
１）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．１に示される配列を有し、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現するＯｓｒｂＦＧＦ遺伝子を構築し、
２）水稲胚乳細胞特異的に発現するＯｓｒｂＦＧＦ発現ベクター、及び選択標識遺伝子ベクターを構築し、
３）ステップ２）で得られるベクターを水稲品種の癒合再生組織に同時導入し、
（４）前記癒合再生組織を培養し、スクリーニングと誘導を経てヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現するＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲株を取得し、及び
５）ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲株を培養し、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現するＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を取得する
ステップを含むことを特徴とする、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現するトランスジェニック水稲の子実を作製する方法。
【請求項８】
前記ＯｓｒｂＦＧＦ発現ベクターが、図３に示される構造を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記選択標識遺伝子ベクターが、図４に示される構造を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
１）ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を原料としてＯｓｒｂＦＧＦ抽出液を調製し、
２）加圧フィルターを用いてＯｓｒｂＦＧＦ抽出液をろ過し、ＯｓｒｂＦＧＦろ液を取得し、
３）Ｈｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗカラムでＯｓｒｂＦＧＦろ液を単離・精製し、二段洗浄法によってＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦろ液中の不純タンパク質を除去し、及び
４）ＯｓｒｂＦＧＦ溶出液を用いてＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦを溶離させ、高純度のＯｓｒｂＦＧＦを取得する
ステップを含むことを特徴とする、ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実からヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を単離・精製する方法。
【請求項１１】
１）ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を原料とし、５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオン、及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む抽出バッファーを以ってＯｓｒｂＦＧＦ抽出液を調製し、
２）それぞれ３μｍ及び０．２２μｍの加圧フィルターを用いてＯｓｒｂＦＧＦ抽出液をろ過し、ＯｓｒｂＦＧＦろ液を取得し、
３）Ｈｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いてＯｓｒｂＦＧＦろ液を単離・精製し、且つ２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及びＩｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）で平衡化し、二段洗浄法によってＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦろ液中の不純タンパク質を除去し、そのうち、洗浄バッファーＩは、５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、６００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含み、洗浄バッファーＩＩは、５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、９００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含み、及び
４）ＯｓｒｂＦＧＦ溶出液を用いてＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦを溶離させ、高純度のヒト塩基性線維芽細胞増殖因子タンパク質を取得し、前記ＯｓｒｂＦＧＦ溶出バッファーは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．７ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含む
ステップを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の水稲遺伝子コードに最適化され、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現する遺伝子を含んでなる、トランスジェニック水稲。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の技術分野に属し、具体的には、遺伝子組換え技術を用いて植物からヒト細胞増殖因子を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ヘパリンと高い親和性を示し且つ似たような生物活性を有するタンパク質ファミリーであり、現在まで既に２３種類の異なる線維芽細胞増殖因子が単離、同定されている。線維芽細胞増殖因子のプロトタイプである塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ又はＦＧＦ−２）は、２０世紀７０年代頃に下垂体と脳で初めて発見され、１つの一本鎖で構成される分子量が１７ｋＤａ、等電点が９．６のタンパク質である。塩基性線維芽細胞増殖因子は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖を促進すると共に幹細胞の分化を抑制することができ、人体の気道平滑筋細胞の増殖と移動を促進させ、並びにインビトロでその収縮表現型を変化させて気道リモデリングの減衰を引き起こすこともできるため、喘息治療において重要な役割を果たす可能性があると期待されている。その後、塩基性線維芽細胞増殖因子がマウス乳房上皮細胞の生長を促進できることも実証され、なお、塩基性線維芽細胞増殖因子が創傷癒合の速度を著しく加速することができるため、火傷治療及び創傷癒合の臨床応用に広く使われるようになっている。また、塩基性線維芽細胞増殖因子を傷口炎症、傷口腫れ及び熱傷癒合の治療に用いる場合、単なる手術治療よりさらに効果的であり、皮膚表面の硬度が比較的に小さいため、心血管疾患及び神経変性疾患の組織修復と創傷癒合にも塩基性線維芽細胞増殖因子がよく使われる。
【０００３】
塩基性線維芽細胞増殖因子は、脳と下垂体から初めて単離され、その原料源にかなり制限があり、体内外の塩基性線維芽細胞増殖因子の応用における大量の需要に対応できていない。過去数十年に亘り、研究者によって様々な努力が重ねられ、それぞれ大腸菌、ピキア酵母、大豆種子及びカイコにおいて組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現することに成功したが、収益が比較的低く、製造プロセスが煩雑であり、水不溶性等の問題も存在した。そのため、市場の需要に対応することができず、特に、細胞治療及びトランスレーショナル医療分野のヒト塩基性線維芽細胞増殖因子に対する日増しに増加する応用の需要にも対応できていない。
【０００４】
最近、水稲胚乳を用いてヒトラクトフェリン、ヒトリゾチーム、ｒｈＩＧＦ−１融合タンパク質、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及びヒト血清アルブミン等を含む各種の薬用組換えタンパク質を発現したことが報告されている。これらの結果から、水稲胚乳発現系がコスト面で有利であり、安全性が高く、製造スケールを拡大しやすく、且つ動物及び他の植物細胞発現系を用いる製造プロセスに比べてより簡便である等といった長所があることが実証された。その結果水稲胚乳が薬用タンパク質の大量製造に適した発現プラットホームとして次第に認められ、学術研究や工業応用にとって何れも相当魅力的なものとなっている。
【０００５】
ところで、水稲胚乳系を利用して塩基性線維芽細胞増殖因子を発現することに関しては未だに報告がない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、水稲胚乳発現系において効果的に発現できるヒトｂＦＧＦ遺伝子、該ヒトｂＦＧＦ遺伝子を含んでなる水稲胚乳細胞の特異的発現ベクター、ヒトｂＦＧＦトランスジェニック水稲、及び該トランスジェニック水稲の子実からヒトｂＦＧＦタンパク質を単離・精製する方法を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の１つの目的として、水稲の遺伝子コードに最適化された、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を発現する遺伝子（以下、ＯｓｒｂＦＧＦ遺伝子と称する場合がある）を提供し、前記遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．１に示される配列を有する。
【０００８】
本発明は、更に、前記ＯｓｒｂＦＧＦ遺伝子を含んでなるベクター、好ましくは水稲胚乳細胞の特異的発現ベクター、より好ましくは図３に示される構造を有するベクターを提供する。
【０００９】
本発明の別の１つの目的として、前記ＯｓｒｂＦＧＦ遺伝子を含むベクターの、ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実の製造における用途を提供する。
【００１０】
本発明の別の１つの目的として、ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を製造する方法を提供し、該方法は、以下のステップを含む。
【００１１】
１）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．１に示される配列を有するＯｓｒｂＦＧＦ遺伝子を作製し、
２）水稲胚乳細胞特異的に発現するＯｓｒｂＦＧＦ発現ベクター、及び選択標識遺伝子ベクターを構築し、
３）ステップ２）で得られるベクターを水稲品種の癒合再生組織に同時導入し、
４）前記癒合再生組織を培養した後、スクリーニングと誘導を経てＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲株を取得し、
５）ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲株を培養し、ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を取得する。
【００１２】
更に、上記方法におけるＯｓｒｂＦＧＦ発現ベクターは、図３に示される構造を有する。
【００１３】
更に、上記方法における選択標識遺伝子ベクターは、図４に示される構造を有する。
【００１４】
また、本発明の別の１つの目的は、ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実からＯｓｒｂＦＧＦタンパク質を単離・精製する方法を提供するものであり、該方法は、以下のステップを含む。
【００１５】
１）ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を原料としてＯｓｒｂＦＧＦ抽出液を調製し、
２）加圧フィルターを用いてＯｓｒｂＦＧＦ抽出液をろ過し、ＯｓｒｂＦＧＦろ液を取得し、
３）Ｈｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗカラムでＯｓｒｂＦＧＦろ液を単離・精製し、二段洗浄法によってＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦろ液中の不純タンパク質を除去し、
４）ＯｓｒｂＦＧＦ溶出液を用いてＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦを溶離させ、高純度のＯｓｒｂＦＧＦを取得する。
【００１６】
具体的には、上記方法は、以下のステップを含む。
【００１７】
１）ＯｓｒｂＦＧＦトランスジェニック水稲の子実を原料とし、５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む抽出バッファーを以ってＯｓｒｂＦＧＦ抽出液を調製し、
２）それぞれ３μｍ及び０．２２μｍの加圧フィルターを用いてＯｓｒｂＦＧＦ抽出液をろ過し、ＯｓｒｂＦＧＦろ液を取得し、
３）Ｈｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いてＯｓｒｂＦＧＦろ液を単離・精製し、且つ２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及びＩｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）で平衡化し、二段洗浄法によってＯｓｒｂＦＧＦろ液中の不純タンパク質を除去し、そのうち、洗浄バッファーＩは、５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、６００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含み、洗浄バッファーＩＩは、５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、９００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含み、
４）ＯｓｒｂＦＧＦ溶出液を用いてＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦを溶離させ、高純度のＯｓｒｂＦＧＦを取得し、前記ＯｓｒｂＦＧＦ溶出バッファーは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．７ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、水稲胚乳において効果的に発現するヒトｂＦＧＦ遺伝子を構築し、更に、該遺伝子を水稲で発現させてＯｓｒｂＦＧＦタンパク質を製造、単離及び精製することに成功した。本発明によって得られるＯｓｒｂＦＧＦタンパク質は、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の活性を示し、植物遺伝子工学の技術を利用してヒト細胞増殖因子タンパク質を製造する産業応用に基盤を築いた。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プラスミドｐＯｓＰＭＰ２の構造を示す模式図である。
【図２】プラスミドｐＯｓＰＭＰ２７６の構造を示す模式図である。
【図３】プラスミドｐＯｓＰＭＰ２７７の構造を示す模式図である。
【図４】プラスミドｐＯｓＰＭＰ０５の構造を示す模式図である。
【図５】ＰＣＲ増幅によって陽性形質転換株を同定する結果を示す図であり、そのうち、左側から右側まで順に１レーン目〜８レーン目は陽性形質転換株であり、Ｎｃは陰性対照として非遺伝子導入ＴＰ３０９イネのゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｐｃは陽性対照としてｐＯｓＰＭＰ２７６プラスミドを鋳型としている。
【図６】ウェスタンブロット法を用いてトランスジェニック水稲のＯｓｒｂＦＧＦ発現を解析する結果を示す図であり、そのうち、左側から右側まで順に１レーン目〜８レーン目は陽性形質転換株であり、Ｎｃは非遺伝子導入ＴＰ３０９水稲の子実の抽出液であり、ＰｃはｂＦＧＦ標準品である。
【図７】ＯｓｒｂＦＧＦの発現レベルを示す図である。
【図８】トランスジェニック水稲の子実からＯｓｒｂＦＧＦを単離・精製する結果を示す図であり、そのうち、ａはＯｓｒｂＦＧＦの収率を示し、ｂは精製プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果を示し、ｃは精製プロセスのウェスタンブロット解析結果を示す。そのうち、図ｂとｃにおいて、左側から右側まで順にレーンＭは分子量マーカー、ＵＦ−５は５ｋＤａ限外ろ過による濃縮及び脱塩処理のサンプル、Ｅｌｕは親和溶出のサンプル、Ｗ２は２回目洗浄のサンプル、Ｗ１は１回目洗浄のサンプル、ＥｘｔｒａはｂＦＧＦ粗抽出液である。
【図９】ＯｓｒｂＦＧＦのインビトロ及びインビボ活性の分析結果を示す図であり、そのうち、ａはＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖に対するＯｓｒｂＦＧＦの影響を示し、ｂはＯｓｒｂＦＧＦで創傷を処理した後の２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目及び１４日目の癒合率を示し、ｃとｅはそれぞれＯｓｒｂＦＧＦで創傷を処理した後の３日目、７日目及び１４日目のＣＤ６８とＰＣＮＡの陽性数を示し、ｄとｆはそれぞれＣＤ６８とＰＣＮＡの免疫放射線自動撮影結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面を以って本発明の特徴と長所を詳細に説明する。以下に取り挙げる実施例は、本発明に係る方法を例示したに過ぎず、本発明の構成がこれらの実施例に制限されるものではない。
【００２１】
実施例で使用する各試薬及び装置は、特に説明がない限り、全て通常の市販のものである。
【００２２】
実施例１：水稲特異的発現の組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子ベクターの構築、及びトランスジェニック水稲株の作製
ヒトｂＦＧＦ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ００２００６）は、Ｈｅｒｏｎ  Ｂｌｕｅバイオテック社が合成し、且つ水稲において使用頻度の高い遺伝子コードに基づき、ｂＦＧＦ遺伝子の６１．５４％の遺伝子コードを最適化することでｂＦＧＦ遺伝子の２１．６５％のヌクレオチを変更させた。最適化されたヒトｂＦＧＦ遺伝子の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．ｌに示されるとおりで、コード最適化前後のアミノ酸配列に変化がなかった。本実施例において、水稲胚乳細胞における組換えヒトｂＦＧＦ遺伝子の発現を誘発するため、水稲特異的プロモーターＧｔｌ１３ａ及びそのシグナルペプチドを用い、図１に示されるプラスミドｐＯｓＰＭＰ２を用いて水稲胚乳特異的の発現カセットを構築した。前記合成のコード最適化済みのヒトｂＦＧＦ遺伝子をＳｃｈＩとＸｈｏＩで消化した後、図２に示すように、ｐＯｓＰＭＰ２に挿入してプラスミドｐＯｓＰＭＰ２７６を構築した。次に、アグロバクテリウム法による形質転換用のプラスミドを構築するため、ＨｉｎｄｌｌｌとＥｃｏＲＩでｐＯｓＰＭＰ２７６を消化し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０．２に示される長さ１９８３ｂｐの、Ｇｔｌ１３ａプロモーター及びそのシグナルペプチド配列以外、コード最適化済みのｂＦＧＦ遺伝子及びＮｏｓターミネーターを更に含む発現カセット全体をバイナリー発現ベクターＪＨ２６００に挿入し、得られたバイナリープラスミドをｐＯｓＰＭＰ２７７と名づけ、具体的には図３に示したとおりである。バイナリープラスミドｐＯｓＰＭＰ２７７をアグロバクテリウム菌株ＥＨＡ１０５（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、アグロバクテリウム菌による同時導入法を利用して前記ｐＯｓＰＭＰ２７７プラスミド、及び図４に示されるｐＯｓＰＭＰ０５プラスミドを水稲品種ＴＰ３０９の癒合再生組織に同時導入した。具体的な方法については、Ｄａｌｅｙ，  Ｍ．，  Ｋｎａｕｆ，  Ｖ．  Ｃ．，  Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ，  Ｋ．  Ｒ．，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｊ．Ｃ．  Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｗｏ  ｂｉｎａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｓ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  １９９８，  １７，  ４８９−４９６を参照することができる。培養、スクリーニング及び誘導を経てから完全な植物株を形成させ、合計５８株の独立の形質転換株を得た。その後、ＰＣＲ増幅によって陽性形質転換株を同定するため、Ｇｔｌ１３ａシグナルペプチドから始まるフォワードプライマー（５’−ＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＴ−３’）及びＮｏｓターミネーターから始まるリバースプライマー配列（５’−ＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣ−３’）を用いてＰＣＲ増幅を行い、結果を図５に示す。
【００２３】
実施例２：ＯｓｒｂＦＧＦの解析と同定
本実施例において、ウェスタンブロット法を用いて得られたトランスジェニック水稲で発現するｂＦＧＦ（本発明において、ＯｓｒｂＦＧＦと称する場合がある）が水稲胚乳細胞に凝集するか否かを検出した。具体的には、ＰＣＲ解析で陽性結果を示すトランスジェニック水稲株のＴ１子実それぞれｌＯＯｍｇを取って抽出バッファー（５０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍＬに入れ、４℃下において６０分間研磨した後、１０６２０ｘｇの条件下で１０分間遠心することでタンパク質粗抽出液を得た。１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質の粗抽出液４０μＬ及びＥ．ｃｏｌｉ由来の組換えｂＦＧＦ３５０ｎｇを分離させ、その後、ゲルをニトロセルロース膜に転写させた。塩基性線維芽細胞増殖因子のウサギポリクローナル抗体（英国Ａｂｃａｍ社製）及びアルカリフォスファターゼ標識のヤギ抗ウサギＩｇＧ（中国ＺＳＧＢ−ＢＩＯ社製）を用い、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）和５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ、中国ＢＩＯＳＨＡＲＰ社製）を基質として標的タンパク質の検出を行った。図６に示されるように、結果として３５株のトランスジェニック水稲において発現したＯｓｒｂＦＧＦが水稲胚乳に凝集しているのが確認できた。Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトを用いて最終のウェスタンブロット結果を解析したところ、ＯｓｒｂＦＧＦの発現レベルとして、図７に示されるように、玄米１Ｋｇ当たりのＯｓｒｂＦＧＦ発現量が９９．１１〜１８５．６６ｍｇであった。
【００２４】
なお、本実施例において、更にサザンブロット法を用いてトランスジェニック水稲株を同定した。具体的には、トランスジェニック水稲の若葉２００ｍｇを取って液体窒素において研磨し、ファスト植物ゲノムＤＮＡ抽出システム（中国天根バイオテック社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、若しくはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃、オーバーナイトで前記ゲノムＤＮＡを消化した後、０．８％のアガロースゲルで分離させ、ゲルをＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＮＹ＋膜に転写させた後、以下のプライマー（５’−ＧＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＧＣＣＣＣＡＴＡＧ−３’、及び５’−ＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣ−３’）を用いてｂＦＧＦコーディング領域由来の長さ８２４ｂｐのプローブを増幅し、ロシュ社のＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  Ｉのマニュアルに従ってハイブリッドを行った。結果から、制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合、何れもシングル断片を検出でき、該結果と遺伝子解析の結果が一致するのが確認できた。また、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでダブルダイジェストして得られたシングルバンドを発現カセット全体と比較した場合、前記アグロバクテリウム菌株のバイナリーベクターが発現カセット全体に存在しているのが確認できた。
【００２５】
実施例３：ＯｓｒｂＦＧＦの単離と精製
室温下において、抽出バッファー（５０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて研磨を行い、1時間かけてトランスジェニック水稲の子実について抽出を施し、得られた抽出液をそれぞれ３μｍ及び０．２２μｍの加圧フィルターに通過させてろ過することによって清澄なろ液を得た後、ろ液をＨｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）に注入し、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及びＩｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ  ＰＢで平衡化し、二段洗浄法を利用して不純タンパク質を除去してＯｓｒｂＦＧＦの収率を高めた。そのうち、洗浄バッファーＩが５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンであり、洗浄バッファーＩＩが５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．５）、９００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンである。不純物を洗い流した後、Ｈｅｐａｒｉｎ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに吸着したＯｓｒｂＦＧＦを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  Ｌ−還元型グルタチオンからなる溶出バッファーで溶離させて高純度のＯｓｒｂＦＧＦタンパク質を取得し、ＯｓｒｂＦＧＦの収率を図８ａに示す。各溶出ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果及びウェスタンブロット解析結果を、それぞれ８ｂと８ｃに示す。凍結乾燥の前処理として、先ずＯｓｒｂＦＧＦ溶出液を濃縮させてからＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）５ｋＤ限外ろ過フィルターで部分的に脱塩処理を施し、その後、Ｖｉｖａ  Ｆｌｏｗ  ５０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）１００ｋＤ限外ろ過フィルターを用いてエンドトキシンを除去した。得られたＯｓｒｂＦＧＦの最終純度が９５％以上であり、且つエンドトキシン含有量が１ＥＵ／ｇ以下であった。最後に、ＯｓｒｂＦＧＦをＯｓｒＨＳＡの保護下で凍結乾燥させた（１：５０、ｗ／ｗ）。
【００２６】
実施例４：ＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖に対するＯｓｒｂＦＧＦの影響
ＤＭＥＭ培地を含み且つ１．５％ＦＢＳ、及び１％ペニシリンとストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加した９６ウェルプレートにおいて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培養し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の初期濃度がｌ×１０５〜５×ｌ０５個／ｍＬであり、３７℃、５％Ｃ０２の条件下で２４時間インキュベートした。その後、培地を吸取ってからＰＢＳで細胞を洗浄し、３７℃下において０．２５％のトリプシンで３分間処理した。処理済みの細胞をＤＭＥＭ培地に再懸濁させ、１．５％ＦＢＳ及び１％ペニシリンとストレプトマイシンを補充した後に８００ｒｐｍ下で３分間遠心した。上澄液を捨て、細胞を１．５％ＦＢＳ及び１％ペニシリンとストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。４０００個／ｍＬの濃度になるようにＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに蒔き、３７℃、５％Ｃ０２下において２４時間インキュベートした。その後、０．７５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄し、３７℃、５％Ｃ０２下において更に２４時間インキュベートした。最後に、細胞をＯｓｒｂＦＧＦ濃度の異なる（２００μＬ／ウェル）ＤＭＥＭ培地に入れて４８時間インキュベートし、２０μＬのＭＴＴ（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド）溶液を加えて更に３７℃で４時間インキュベートした。微量定量プレートをＶｅｒｓａＭａｘ（米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）に設置させて４９０ｎｍにおいて測定を行った。全部データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトで解析し、且つ全ての実験を何れも３回繰返して行った。図９ａに示されるように、ＯｓｒｂＦＧＦ濃度が６ｐｇ〜５ｎｇ／ｍＬの範囲において、濃度依存性のＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖作用が示され、１．１５×１０６ＩＵ／ｍｇに達しているのが確認できた。これらの結果から、ＯｓｒｂＦＧＦがインビトロにおいてＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖を促進する活性があると確認でき、本発明に係るＯｓｒｂＦＧＦが市販のｒｂＦＧＦと同様の生物活性があることが実証された。
【００２７】
実施例５：創傷癒合に対するＯｓｒｂＦＧＦの影響
体重が２００〜２５０ｇの雌性ＳＤラット（上海スラック実験動物会社製）をランダムに４組に分けて切創副木のモデルを作製し、具体的な方法については、Ｇａｌｉａｎｏ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｍｉｃｈａｅｌｓ，  Ｖ．，  Ｄｏｂｒｙａｎｓｋｙ，  Ｍ．，  Ｌｅｖｉｎｅ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｇｕｒｔｎｅｒ，  Ｇ．Ｃ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．２００４，  ７２，  ４８５〜４９２を参照することができる。上述のランダムに組分けした４組のモデルを、ＯｓｒｂＦＧＦ投与組として２０００ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝１５）、５００ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝１５）及び１２５ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝１５）の３組、及び陰性対照組として１組の生理塩水投与組（ｎ＝１５）に分けてそれぞれ処理し、創傷の癒合率を測定した。それぞれ０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目及び１４日目において創傷の閉合状況を観察し、Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｌ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｔｒｅｄｇｅｔ，  Ｅ．Ｅ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７，  ２５，  ２６４８〜２６５９に記載の方法に従って創傷癒合率［（原創傷面−実創傷面）／原創傷面×１００］の評価、病理学と免疫組織化学の観察を行った。図９ｂに示されるように、創傷癒合率がＯｓｒｂＦＧＦに対して用量依存性を示し、そのうち、治療開始から最初の８日間において、低投与量が、例えば５００ｎｇ及び２０００ｎｇの高投与量に比べて効果がより顕著であるのが確認できた。通常、損傷皮膚が回復する際に上皮形成、ＣＤ６８の発現、及び細胞核抗原ＰＣＮＡの増殖を促すことができる。したがって、本実施例において、更に治療開始から３日目、７日目及び１４日目におけるＰＣＮＡとＣＤ６８の発現を測定した。図９ｃ〜９ｆに示されるように、陰性対照組に比べ、治療開始から３日目及び７日目にＯｓｒｂＦＧＦ投与組のＰＣＮＡとＣＤ６８の発現が著しく増加し、治療開始から１４日目にＯｓｒｂＦＧＦ投与組のＰＣＮＡとＣＤ６８の発現レベルが逆に陰性対照組より低くなっているのが確認できた。その理由として、治療の初期段階において、ＯｓｒｂＦＧＦが細胞増殖を刺激することによりＣＤ６８とＰＣＮＡの発現を促進させて創傷癒合を加速させ、その後、細胞増殖、ＣＤ６８とＰＣＮＡの発現を低下させることで治療の後期段階で瘢痕が生じたり、創傷閉合時の細胞増殖を防ぐといったことが考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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