(57)【要約】  ＨＤＡＣ６特異的阻害剤（すなわち、式ＩまたはＩＩの化合物）は、多嚢胞性疾患と関連する病原性を減少させることを示す。ＨＤＡＣ６特異的阻害剤の投与は、嚢胞形成、嚢胞成長及び胆管細胞増殖を含む多嚢胞肝の症候特徴の多くを減弱した。また、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤での治療は、胆管β−カテニン合成を減少させる一方、胆管アセチル化チューブリン、並びにβ−カテニンリン酸化及び／またはアセチル化の量を増加させた。これらの結果は、ＨＤＡＣ６が嚢胞性胆管細胞において過剰発現すること及びその薬理学的阻害が胆管細胞増殖及び嚢胞成長を減少させることを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多嚢胞性疾患を治療するための方法であって：
式Ｉ：
【化１】
2016534069.tif 000025
のヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩の治療上有効な量、
式中、
環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれはＯＨ、ハロまたはＣ１−６−アルキルによって任意に置換されてもよく；
及び
Ｒは、ＨまたはＣ１−６−アルキルであるか、
または
式ＩＩ：
【化２】
2016534069.tif 000026
のヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩の治療上有効な量、
式中、
Ｘは、ＣまたはＯであり；
Ｒｙは、存在ごとに、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ、ハロ、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ジハロアルキル、−Ｃ１−６トリハロアルキル、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１、−ＣＯ２Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２からなる群から独立して選択される；
または：
同じまたは隣接した炭素原子上の２つのＲｙ基は、共になってＣ３−８−シクロアルキルまたはＣ３−７−ヘテロシクロアルキル環を形成し、そのそれぞれは縮合しても、または分離してもよく；
Ｒｚは、存在ごとに、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ、ハロ、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ジハロアルキル、−Ｃ１−６トリハロアルキル、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２からなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ１は、存在ごとに、Ｈ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ３−８−シクロアルキル、Ｃ３−７−ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６−アルキル−シクロアルキル、Ｃ１−６−アルキル−ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６−アルキル−アリール及びＣ１−６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ２は、存在ごとに、ＨまたはＣ１−６−アルキルからなる群から独立して選択され；
ｍは、０、１、２または３であり；及び
ｎは、０、１、２または３である、
を多嚢胞性疾患をもつ被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、前記被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である、前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記多嚢胞性疾患は、多嚢胞肝である、前記方法。
【請求項４】
請求項２に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記嚢胞は、肝臓に位置する、前記方法。
【請求項５】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記多嚢胞性疾患は、嚢胞性腎疾患である、前記方法。
【請求項６】
請求項５に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記嚢胞性腎疾患は、多発性嚢胞腎である、前記方法。
【請求項７】
請求項２に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記嚢胞は、腎臓に位置する、前記方法。
【請求項８】
請求項５に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記嚢胞性腎疾患は、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）である、前記方法。
【請求項９】
請求項５に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記嚢胞性腎疾患は、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）である、前記方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、嚢胞の前記形成を防ぐのに有効である、前記方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管細胞増殖を阻害するのに有効である、前記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管アセチル化チューブリンの前記量を増加させるのに有効である、前記方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管β−カテニン合成を減少させるのに有効である、前記方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管β−カテニンリン酸化及び／またはアセチル化を増加させるのに有効である、前記方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、式Ｉの前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物は：
【化３】
2016534069.tif 000027
またはその薬学的に許容される塩である、前記方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、前記被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である、前記方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管細胞増殖を阻害するのに有効である、前記方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、式Ｉの前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物は：
【化４】
2016534069.tif 000028
またはその薬学的に許容される塩である、前記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の多嚢胞肝を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、前記被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である、前記方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管細胞増殖を阻害するのに有効である、前記方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、式ＩＩの前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物は：
【化５】
2016534069.tif 000029
またはその薬学的に許容される塩である、前記方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の多嚢胞肝を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、前記被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である、前記方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の多嚢胞性疾患を治療するための前記方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の前記量は、胆管細胞増殖を阻害するのに有効である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連した出願
本出願は、２０１３年１０月２４日に出願のＵ．Ｓ．  Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ６１／８９５，２２３に対する優先権及びそれの利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本開示は、多嚢胞性疾患の治療のためのＨＤＡＣ６阻害剤の投与について報告する。
【０００２】
政府資金提供
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与されるＰ３０ＤＫ０８４５６７、Ｒ２１ＣＡ１６６６３５及びＲ０１  ＤＫ２４０３１の元で政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
リジン残基のアセチル化及び脱アセチルを介するタンパク質の翻訳後修飾は、細胞形状、分化及び増殖の制御を含む、様々な細胞機能を調節することに重要な役割を果たす。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヒストンならびに非ヒストンタンパク質上のリジン残基の脱アセチルを触媒する亜鉛−結合ヒドロラーゼである（Ｈａｂｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００９，  １０，  ３２−４２）。１１個のＺｎ結合ヒトＨＤＡＣｓが、同定された（Ｔａｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，  ２７２，  ４０８−４１１；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ２７２，  ２８００１−２８００７；  Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｄ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９９９，  ９６，  ４８６８−４８７３；  Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０００，  １４，  ５５−６６．  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０００，  ２７５，  １５２５４−１５２６４；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００１，  ９８，  １０５７２−１０５７７；  Ｖｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，  ２９１，  １３０４−１３５１）。これらのメンバーは、４つのファミリーに分類される：クラスＩ（ＨＤＡＣ１、２及び３）、クラスＩＩａ（ＨＤＡＣ４、５、７及び９）、クラスＩＩｂ（ＨＤＡＣ６及び１０）及びクラスＩＶ（ＨＤＡＣ１１）。
【０００４】
クラスＩ  ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ１、２及び３）は、細胞の核中のヒストンタンパク質のＮ−アセチル−リジン残基の脱アセチル及びその他の転写制御因子を介して、遺伝子発現を調節する（Ｈａｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １９９７，  １，  ３００−３０８）。
【０００５】
ＨＤＡＣ６（クラスＩＩｂ  ＨＤＡＣ）は、ヒトにおける亜鉛依存ＨＤＡＣの中で独特である。ＨＤＡＣ６は、細胞質に位置し、そのＣ末端領域に２つの触媒ドメイン及びユビキチン結合ドメインを有する。ＨＤＡＣ６の基質は、ヒストンでなくチューブリン、ペルオキシレドキシン、コルタクチン及び熱ショックタンパク質９０（ｈｓｐ９０）を含む。ＨＤＡＣ６は、細胞移動及び細胞間相互作用を含む微小管動態において重要な役割を果たし、及びそれはユビキチン化タンパク質でのアグリソーム形成に必要とされる。
ＨＤＡＣ６の小分子阻害剤、その医薬組成物及びこれらの化合物を使用して多嚢胞性疾患を治療する方法が、本明細書において提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｂｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００９，  １０，  ３２−４２
【非特許文献２】Ｔａｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，  ２７２，  ４０８−４１１
【非特許文献３】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ２７２，  ２８００１−２８００７
【非特許文献４】Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｄ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９９９，  ９６，  ４８６８−４８７３
【非特許文献５】Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０００，  １４，  ５５−６６
【非特許文献６】Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０００，  ２７５，  １５２５４−１５２６４
【非特許文献７】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００１，  ９８，  １０５７２−１０５７７
【非特許文献８】Ｖｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，  ２９１，  １３０４−１３５１
【非特許文献９】Ｈａｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １９９７，  １，  ３００−３０８
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、式Ｉ：
【化１】
2016534069.tif 000002
のヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を多嚢胞性疾患をもつ被験体に投与することを含む多嚢胞性疾患を治療する方法であって、
式中、環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり、Ｒ１はアリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれはＯＨ、ハロまたはＣ１−６−アルキルによって任意に置換されてもよく、及びＲはＨまたはＣ１−６−アルキルであり、及び式Ｉのヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の量は、被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である、方法を提供する。
【０００８】
また、本開示は、式ＩＩ：
【化２】
2016534069.tif 000003
のヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を多嚢胞性疾患をもつ被験体に投与することを含む多嚢胞性疾患を治療する方法であって、
式中、Ｘは、ＣまたはＯであり；
Ｒｙは、存在ごとに、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ、ハロ、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ジハロアルキル、−Ｃ１−６トリハロアルキル、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１、−ＣＯ２Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２からなる群から独立して選択される；
または：
同じまたは隣接した炭素原子上の２つのＲｙ基は、共になってＣ３−８−シクロアルキルまたはＣ３−７−ヘテロシクロアルキル環を形成し、そのそれぞれは縮合しても、または分離してもよく；
Ｒｚは、存在ごとに、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ、ハロ、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ジハロアルキル、−Ｃ１−６トリハロアルキル、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２からなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ１は、存在ごとに、Ｈ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ３−８−シクロアルキル、Ｃ３−７−ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６−アルキル−シクロアルキル、Ｃ１−６−アルキル−ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６−アルキル−アリール及びＣ１−６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ２は、存在ごとに、ＨまたはＣ１−６−アルキルからなる群から独立して選択され；
ｍは、０、１、２または３であり；及び
ｎは、０、１、２または３であり、
及び式ＩＩのヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物の量は、被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である、方法を提供する。
【０００９】
一定の実施形態において、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物は、被験体における嚢胞の形成を防ぐ。
【００１０】
一定の実施形態において、嚢胞は、肝臓及び／または腎臓に位置し得る。
【００１１】
一定の実施形態において、被験体は、ＰＲＫＣＳＨ（タンパク質キナーゼＣ基質８０Ｋ−Ｈ）及びＳｅｃ６３遺伝子の少なくとも１つにおいて突然変異を有する。
【００１２】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、嚢胞性腎疾患である。
【００１３】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、多発性嚢胞腎である。
【００１４】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）である。被験体は、Ｐｋｄ１及びＰｋｄ２遺伝子の少なくとも１つにおいて突然変異を有し得る。
【００１５】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）である。被験体は、Ｐｋｈｄ１遺伝子において突然変異を有し得る。
【００１６】
一定の実施形態において、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物の量は、胆管細胞増殖及び／または胆管β−カテニン合成を阻害し、及び／または胆管β−カテニンリン酸化及び／またはアセチル化を促進するのに有効である。
【００１７】
一定の実施形態において、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物の量は、胆管アセチル化チューブリンの量を増加させ、及び／または胆管β−カテニン合成を減少させるのに有効である。
【００１８】
一定の実施形態において、式Ｉのヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物は：
【化３】
2016534069.tif 000004
の構造を有する化合物Ａ−１、
またはその薬学的に許容される塩、
または：
【化４】
2016534069.tif 000005
の構造を有する化合物Ｂ−１、
またはその薬学的に許容される塩、である。
【００１９】
一定の実施形態において、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物Ａ−１及びＢ−１の量は、被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である。
【００２０】
一定の実施形態において、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物Ａ−１及びＢ−１の量は、胆管細胞増殖を阻害するのに有効である。
【００２１】
一定の実施形態において、式ＩＩのヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物は：
【化５】
2016534069.tif 000006
の構造を有する化合物Ｃ−２、
またはその薬学的に許容される塩、である。
【００２２】
一定の実施形態において、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物Ｃ−２の量は、被験体における嚢胞成長を減少させるのに有効である。
【００２３】
一定の実施形態において、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）特異的阻害剤化合物Ｃ−２の量は、胆管細胞増殖を阻害するのに有効である。
【００２４】
一定の実施形態において、本開示は、式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物の治療上有効な量を含むキット及び多嚢胞性疾患の治療における使用のための説明書を教示する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】嚢胞性胆管細胞におけるＨＤＡＣ６発現の解析を示す。図１Ａ：正常（ＮＲＣ）及びＰＣＫラット両方の胆管細胞におけるＨＤＡＣ６  ｍＲＮＡ発現を示すＰＣＲ解析。図１Ｂ：ＮＲＣ及びＰＣＫラット胆管細胞におけるＨＤＡＣ６及びアセチル化−α−チューブリン発現についての代表的なウェスタンブロット及びウェスタンブロット結果の濃度測定解析。（＊ｐ＜０．０５、対照については６ｎ＝３、ＰＣＫについてはｎ＝４）。図１Ｃ：ＰＣＫラット（ｎ＝５）、ヒトＡＤＰＫＤ（ｎ＝３）及びＡＲＰＫＤ（ｎ＝３）肝臓並びにそれぞれの対照（ラット及びヒトについてはｎ＝５及び３）における肝臓嚢胞の免疫蛍光共焦点顕微鏡法。ＨＤＡＣ６は緑であり、ＣＫ１９は赤く、及び核は青い（ＤＡＰＩ）。
【図２−１】ＨＤＡＣ６阻害が嚢胞性胆管細胞増殖及び嚢胞性成長を減少させることを示す。細胞を９６ウェルプレート中でインキュベートし、及び増殖をＭＴＳアッセイによって解析した。図２Ａ：異なる用量のツバスタチン−Ａの存在下での時間とともにＰＣＫラット胆管細胞増殖のレベルを示す（＊ｐ＜０．０５）。図２Ｂ：ツバスタチン−Ａ及びツバシンが３日間にわたってＰＣＫラット胆管細胞の増殖を減少させることを示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図２−２】図２Ｃ：ＰＣＫラットから新たに単離した胆嚢嚢胞の代表的な画像を示す。嚢胞をラット尾部コラーゲンマトリックスに包埋し、及び２つの異なるＨＤＡＣ６特異的阻害剤、ツバスタチン−Ａ及びツバシンで処理した。図２Ｄ：時間とともに嚢胞成長の定量的分析を示し、及びその両方の阻害剤（１０μＭ  ツバスタチンＡについてｎ＝１２、２μＭ  ツバシンについてｎ＝４、無治療対照についてｎ＝１６。倍率４０×。＊ｐ＜０．０５）は、嚢胞成長を有意に減少させる。
【図３−１】ＨＤＡＣ６阻害剤がアセチル化α−チューブリンを増加させ、及びβ−カテニンを減少させることを示す。ＰＣＫ胆管細胞を２０μＭツバスタチンＡまたは２μＭツバシンで処理し、及び溶解し、及びウェスタンブロッティングのために使用した。図３Ａ：ＨＤＡＣ６阻害剤での処理が、β−カテニン、サイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃを減少させる一方、アセチル化α−チューブリンレベルを上昇させることを示すウエスタンブロット（ｎ＝３）の代表的な画像を示す。ヒストン−３のアセチル化レベルは、影響を受けないままであった。アクチンを充填対照として使用した。図３Ｂ：ＨＤＡＣ６阻害剤が、充填対照として総β−カテニンを使用して未処理細胞と比較してホスホ−及びアセチル−β−カテニンの量を増加させることを示すウェスタンブロット（ｎ＝３）の代表的な画像を示す。
【図３−２】図３Ｃ：２μＭツバシンでの処理後に時間とともにβ−カテニンタンパク質発現の減少を示す一方で、β−カテニンｍＲＮＡは安定のままであったウェスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ解析を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図４−１】ＨＤＡＣ６阻害剤、化合物Ａ−１がインビボでの嚢胞成長を阻害することを示す。図４Ａ：化合物Ａ−１の異なる用量の存在下でインキュベートした正常（ＮＲＣ）及び嚢胞性胆管細胞（ＰＣＫ）における増殖アッセイを示す。図４Ｂ：媒体（ｎ＝８）または化合物Ａ−１（ｎ＝８）で処理したＰＣＫラットからのピクロシリウス赤で染色した代表的な肝臓及び腎臓切片を示す。バー＝２５００μｍ。
【図４−２】図４Ｃ：総柔組織領域の割合として表した嚢胞性領域の定量化解析。＊ｐ＜０．０５。
【図５】図５Ａ：ＨＤＡＣ６特異的阻害剤、ツバスタチン−Ａ及びツバシンの両方によって誘導される減少した増殖を示すヒトＡＤＰＫＤの３日間増殖アッセイを示す。図５Ｂ：２０μＭツバスタチンＡの効果を示す細胞計数によるＰＣＫ細胞増殖解析を示す。
【図６】図６Ａ：免疫蛍光によって解析し、及び正常な細胞（ＮＲＣ）と比較したＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ａ−１で処理したＰＣＫ胆管細胞及びβ−カテニン発現を示す。図６Ｂ：ＮＲＣと比較して核及び細胞質両方においてＰＣＫ細胞における増加したβ−カテニン発現を示すβ−カテニン蛍光定量化評価を示す。ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ａ−１での処理は、ＰＣＫ細胞におけるβ−カテニン発現を減少させた。
【図７】式Ｉ（化合物Ｂ−１）及び式ＩＩ（化合物Ｃ−２）のＨＤＡＣ６阻害剤で処理した雄のＰＣＫ−１ラットの腎臓における嚢胞の容積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
【００２７】
定義
本発明を記述するのに使用される種々の用語の定義を下に収載する。これらの定義は、個々に、またはより大きな群の部分としてのいずれかに、特定の例において限定されない限り、これらが本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用されるときに、該用語に適用される。
【００２８】
用語「約」は、一般に、値の１０％、５％または１％に過ぎない変化の可能性を示す。たとえば、「約２５ｍｇ／ｋｇ」は、その最も広い意味において、２２．５〜２７．５ｍｇ／ｋｇ、すなわち、２５±２．５ｍｇ／ｋｇの値を一般に示すだろう。
【００２９】
用語「アルキル」は、一定の実施形態において、それぞれ１〜６または１〜８の間の炭素原子を含む飽和した、直鎖または分枝鎖炭化水素部分をいう。Ｃ１−Ｃ６アルキル部分の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分を含むが、限定されない；及びＣ１−Ｃ８アルキル部分の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル及びオクチル部分を含むが、限定されない。
【００３０】
用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニル及び同様のものを含むが、限定されない縮合または非縮合の１つまたは複数の芳香族環を有する単または多環式炭素環式環構造をいう。いくつかの実施形態において、アリール基は、６炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、アリール基は、６〜１０炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、アリール基は、６〜１６炭素原子を有する。
【００３１】
用語「ヘテロアリール」は、環形成原子の１つまたは複数が酸素、硫黄または窒素などのヘテロ原子である場合、少なくとも１つの芳香族環を有する縮合または非縮合の単または多環式（たとえば、二または三環式以上）部分または環構造をいう。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、１〜６炭素原子及びさらなる実施形態において、１〜１５炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、１環原子が酸素、硫黄及び窒素から選択される５〜１６環原子を含み；０、１、２または３環原子は、酸素、硫黄及び窒素から独立して選択されるさらなるヘテロ原子であり；及び残りの環原子は、炭素である。ヘテロアリールは、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニル、アクリジニル及び同様のものを含むが、限定されない。
【００３２】
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲンをいう。
【００３３】
本明細書に使用される用語「被験体」は、哺乳動物をいう。したがって、被験体は、たとえば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、モルモット及び同様のものをいう。好ましくは、被験体は、ヒトである。被験体がヒトであるとき、被験体は、本明細書において患者といわれてもよい。
【００３４】
本明細書に使用される用語「治療すること」、「治療」及び同様のものは、多嚢胞性疾患を少なくとも緩和する、または弱める所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するのに本明細書に使用される。効果は、多嚢胞性疾患またはその徴候もしくは症候を完全にまたは部分的に防ぐことに関して予防的でもよく、及び／または多嚢胞性疾患及び／または多嚢胞性疾患に起因する有害作用のための部分的な、または完全な治癒に関して治療的でもよい。また、「治療すること」は、哺乳動物における多嚢胞性疾患の任意の治療をカバーし、及び：（ａ）多嚢胞性疾患にかかりやすいかもしれないが、それを有するとまだ診断されなかった被験体において多嚢胞性疾患が生じるのを防ぐこと；（ｂ）多嚢胞性疾患を抑制し、すなわち、その発症を抑えること；または（ｃ）多嚢胞性疾患を軽減することまたは寛解させること、たとえば多嚢胞性疾患の退行を引き起こすこと、を含む。本明細書に使用される「治療する」ことは、病理学と関連する症候の全身寛解及び／または症候の発症における遅延を含む。「治療すること」の臨床上及び無症状性証拠は、病理学、個体及び治療で変化するだろう。
【００３５】
一定の実施形態において、用語「治療すること」または「治療」は、胆管細胞増殖、胆管β−カテニン合成または胆管β−カテニンリン酸化及び／またはアセチル化を減少させることをいうことができる。その他の実施形態において、用語「治療すること」または「治療」は、胆管アセチル化チューブリン及び／または胆管β−カテニン合成の量を増加させることをいうことができる。
【００３６】
本明細書に使用される用語「多嚢胞性疾患」は、嚢胞の形成によって特徴づけられる疾患である。多嚢胞性疾患の例は、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）などの嚢胞性腎疾患、多嚢胞肝（ＰＬＤ）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、膵嚢胞またはこれらの組み合わせを含むが、限定されない。
【００３７】
多嚢胞性疾患は、胆管症、胆管細胞、胆管を裏打ちしている上皮が標的細胞である肝臓疾患の群を含むことができる。「胆管症」は、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、ＡＩＤＳ胆管症、胆管消失症候群、アラジール症候群、嚢胞性線維症及び胆道閉鎖症を含むが、限定されない（Ｔｉｅｔｚ  ＰＳ，  Ｌａｒｕｓｓｏ  ＮＦ  （２００６）．  “Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ”．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２２  （３）：  ２７９−８７を参照されたい）。
【００３８】
また、多嚢胞性疾患は、肝臓嚢胞の存在を含む疾患、疾患状態及び障害などの、肝臓または肝機能が塩及び／または水ホメオスタシスまたはバランスにおける機能不全及び／またはアンバランスによって損なわれる肝疾患を含み得る。例示的な肝疾患は、慢性肝臓肝線維症、ＰＬＤ付随ＰＫＤ、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、メッケル・グルーバー症候群、バルデ・ビードル症候群及び同様のものを含むが、限定されない。
【００３９】
式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６阻害剤化合物によって治療され得る多嚢胞肝の臨床症候は、単離された多嚢胞肝または肝臓及び腎臓の場合において、腹部膨満、息切れ、初期の食後充満、腹部不快及び背部不快を生じさせ得る常染色体優性多発性嚢胞腎の場合において、肝腫、肝臓内の複数の大嚢胞を含むが、限定されない。重篤な多嚢胞肝のその他の臨床症候は、門脈圧亢進症、静脈瘤出血、黄疸、腹水及びまれな場合、嚢胞癌並びに肝臓からの静脈排液の妨害物から生じる「疑似」バッド・キアリ症候群を含む。
【００４０】
また、本発明は、本明細書において記述した化合物の薬学的に許容される塩を含む。本明細書に使用される「薬学的に許容される塩」は、親化合物がその塩形態に既存の酸または塩基部分を変えることによって修飾されている、開示された化合物の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例は、ミネラルまたはアミンなどの塩基性残基の有機酸性塩；アルカリまたはカルボン酸などの酸性残基の有機塩；及び同様のものを含むが、限定されない。本発明の薬学的に許容される塩は、たとえば、無毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の無毒性塩を含む。本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、水中または有機溶媒中または２つの混合物において、適切な塩基または酸の化学量論量とこれらの化合物の遊離酸または塩基形態を反応させることによって調整することができる；一般に、非水媒体様エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルが好ましい。適切な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８０  ａｎｄ  １７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８５，  ｂｏｔｈ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  ｐａｇｅ  １４１８  ａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６６，  ２  （１９７７）  から入手でき、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００４１】
本発明の化合物
いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式Ｉの化合物：
【化６】
2016534069.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、そのそれぞれは、ＯＨ、ハロまたはアルキルによって任意に置換されてもよく；
及び
Ｒは、Ｈまたはアルキルである。
【００４２】
式Ｉの代表的化合物は、以下を含むが、限定されない：
【表１】
2016534069.tif 000008
【００４３】
式Ｉに従った選択的なＨＤＡＣ６阻害剤の調整及び特性は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１９８２において提供され、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【００４４】
その他の実施形態において、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤は、式ＩＩの化合物：
【化７】
2016534069.tif 000009
またはその薬学的に許容されるであり、式中、
Ｘは、ＣまたはＯであり；
Ｒｙは、存在ごとに、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ、ハロ、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ジハロアルキル、−Ｃ１−６トリハロアルキル、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１、−ＣＯ２Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２からなる群から独立して選択される；
または：
同じまたは隣接した炭素原子上の２つのＲｙ基は、共になってＣ３−８−シクロアルキルまたはＣ３−７−ヘテロシクロアルキル環を形成し、そのそれぞれは、縮合されても、または分離されてもよく；
Ｒｚは、存在ごとに、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ、ハロ、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ジハロアルキル、−Ｃ１−６トリハロアルキル、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２からなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ１は、存在ごとに、Ｈ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ３−８−シクロアルキル、Ｃ３−７−ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６−アルキル−シクロアルキル、Ｃ１−６−アルキル−ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６−アルキル−アリール及びＣ１−６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ２は、存在ごとに、ＨまたはＣ１−６−アルキルからなる群から独立して選択され；
ｍは、０、１、２または３であり；及び
ｎは、０、１、２または３である。
【００４５】
式ＩＩの化合物の実施形態において、ｎは１または２であり、及びＲｚはハロである。
【００４６】
式ＩＩの化合物のもう一つの実施形態において、ＸはＣであり、及びｍは１または２である。好ましい実施形態において、ＸはＣであり、ｍは１または２であり、及びＲｙはハロまたはＣ１−６−アルコキシである。もう一つの実施形態において、同じまたは隣接した炭素原子上の２つのＲｙ基は、共になってＣ３−８−シクロアルキルまたはＣ３−７−ヘテロシクロアルキル環を形成し、及びＲｙはＣ１−６−アルコキシである。好ましい実施形態において、同じ炭素原子上の２つのＲｙ基は、共になってＣ３−８−シクロアルキルまたはＣ３−７−ヘテロシクロアルキル環を形成する。
【００４７】
式ＩＩの好ましい実施形態は、その薬学的に許容される塩を含み、下の表ＩＩに下に示す。式ＩＩ並びにその薬学的に許容される塩の全ての化合物及び表ＩＩの化合物並びにその薬学的に許容される塩は、「本発明の化合物」であると考慮される。
【表２】
2016534069.tif 000010
【００４８】
本明細書に提供した組成物及び医薬組成物は、被験体の多嚢胞性疾患を治療するのに使用することができる。
【００４９】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、多嚢胞肝である。
【００５０】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、多発性嚢胞腎などの嚢胞性腎疾患である。
【００５１】
一定の実施形態において、本明細書に提供した組成物及び医薬組成物は、胆管細胞増殖及び／または胆管β−カテニン合成を阻害し、及び／または胆管β−カテニンリン酸化及び／またはアセチル化を誘導することができる。
【００５２】
一定の実施形態において、本明細書に提供された組成物及び医薬組成物は、胆管アセチル化チューブリンの量を増加させ、及び／または胆管β−カテニン合成を減少させることができる。
【００５３】
もう一つの本発明の目的は、本明細書における多嚢胞性障害または疾患の治療における使用のための医薬の製造における本明細書において記述した化合物の使用である。もう一つの本発明の目的は、本明細書における多嚢胞性障害または疾患の治療における使用のために本明細書において記述した化合物の使用である。
【００５４】
本発明の方法
本発明の１つの態様において、本明細書において記述したように、その必要のある被験体に式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物の治療上有効な量を投与することを含む多嚢胞性疾患の治療のための方法が提供される。
【００５５】
嚢胞性疾患の影響を治療するまたは寛解するのに十分な式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物の治療上有効な量は、治療される状態の性質、作用が望まれる時間の長さ、並びに患者の年齢及び状態で変化し得るし、及び付き添いの医師によって最終的に決定されてもよい。また、患者に投与してもよい本発明に従った式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物の量または用量は、当該技術分野において公知の様々な要因、たとえば患者の種、性別、年齢、体重、状態、所望の反応、状態の性質、代謝、疾患の重症度、副作用に応じて変化してもよい。所望の用量は、単一用量で、または適切な間隔にて投与される複数の用量として、たとえば１日あたり２、３、４以上の半用量として都合よく投与されてもよい。複数の用量は、たいてい望まれる、または必要とされる。
【００５６】
一定の実施形態において、多嚢胞性疾患は、多嚢胞肝（ＰＬＤ）であり得る。ＰＬＤは、胆管症に含まれ得る遺伝的障害、標的細胞として胆管細胞を有する多様な病因すべての疾患の群である。ＰＬＤは、単独で、または多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）と共に生じる（Ｍａｓｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｉｌｉｏｐａｔｈｉｅｓ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  （２００９）  ２５：２６５−２７１を参照されたい）。
【００５７】
一定の実施形態において、治療されている被験体は、ＰＲＫＣＳＨ（タンパク質キナーゼＣ基質８０Ｋ−Ｈ）及びＳｅｃ６３遺伝子の少なくとも１つにおいて１つまたは複数の突然変異を有する。これらの突然変異は、ポリシスチン−２分解を経て細胞の翻訳後タンパク質修飾機構及び繊毛シグナル伝達に影響を及ぼすことによって、腎臓関与のない多嚢胞肝（ＡＤＰＬＤ）を生じさせる（Ｄｒｅｎｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＰＲＫＣＳＨ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （２００３）  ３３：３４５−３４７  ３；  Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＳＥＣ６３  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  （２００４）  ３６：５７５−５７７  ４；  Ｗｏｏｌｌａｔｔｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｃ６３  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｍａｐ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ６ｑ２１，  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９９），  ７：７７；  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＲＫＣＳＨ／８０Ｋ−Ｈ，  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ−２／ＴＲＰＰ２  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＥＲＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （２０１０）  １９：１６−２４を参照されたい）。
【００５８】
一定の実施形態において、治療される被験体は、繊毛関連タンパク質、ポリシスチン−１（ＰＣ１）及び−２（ＰＣ２）をコードするＰｋｄ１及びＰｋｄ２遺伝子の少なくとも１つにおいて１つまたは複数の突然変異を有し、及びそれは、肝臓及び常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）における腎臓の嚢胞性変性の原因である。
【００５９】
一定の実施形態において、治療されている被験体は、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）と関連するＰｋｈｄ１遺伝子において１つまたは複数の突然変異を有する（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  １  （ＰＫＤ１）  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （１９９５）  １０：１５１−１６０；  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＫＤ２，  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９６）  ２７２：１３３９−１３４２８；  Ｏｎｕｃｈｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＫＨＤ１，  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  １  ｇｅｎｅ，  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−  ｌｉｋｅ  ｐｌｅｘｉｎ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｅｔａ−ｈｅｌｉｘ  １  ｒｅｐｅａｔｓ，  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  （２００２）７０：１３０５−１３１７；  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｌａｒｇｅ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  （２００２）  ３０：２５９−２６９を参照されたい）。
【００６０】
本明細書に使用される用語「嚢胞性腎疾患」は、多発性嚢胞腎（ＰＣＫ）、フォン・ヒッペル・リンダウ病、結節性硬化症、ネフロン癆、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ＡＲＰＫＤ）、後天性嚢胞腎（ＡＣＫＤ）及び常染色体優性多嚢胞肝（ＡＲＰＫＤ）を含む、疾患の大きな群を含むが、限定されない（たとえば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ，  ｉｎ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  （Ａ．  Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒｉｍｏｉｎ，  Ｅｄｓ．）  ｐｐ．  １００２−１０１０，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，  Ｕ．Ｋ．  （１９８３）；  Ｓｔｒｉｋｅｒ  ＆  Ｓｔｒｉｋｅｒ  （１９８６）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ６：１６１−１６４．  Ｅｘｔｒａｒｅｎａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｙｓｔｓ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｇａｂｏｗ  ＆  Ｇｒａｎｔｈａｍ  （１９９７）  Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ｉｎ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＫＩＤＮＥＹ  （Ｒ．  Ｓｃｈｒｉｅｒ  ＆  Ｃ．  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，  Ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ５２１−５６０，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ，  Ｂｏｓｔｏｎ；  Ｗｅｌｌｉｎｇ  ＆  Ｇｒａｎｔｈａｍ  （１９９６）  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ，  ｉｎ  ＲＥＮＡＬ  ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ  （Ｃ．  Ｔｉｓｃｈ  ＆  Ｂ．  Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｅｄｓ．）  ｐｐ：１８２８−１８６３，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい）。
【００６１】
もう一つの態様において、式ＩまたはＩＩの化合物の治療上有効な量は、多嚢胞性疾患をもつ被験体に腹腔内に注射され、式ＩまたはＩＩの化合物は、多嚢胞性疾患を治療する。
【００６２】
一定の実施形態において、式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物は、嚢胞形成を防ぐ。
【００６３】
一定の実施形態において、式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物は、嚢胞成長を阻害する。
【００６４】
一定の実施形態において、式ＩまたはＩＩのＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物は、胆管細胞増殖を阻害する。
【００６５】
式ＩまたはＩＩの化合物でのＨＤＡＣ６阻害は、肝腫を含む多嚢胞肝の多くの特徴及び肝臓または腎臓における嚢胞の成長を減少させることができる。
【００６６】
一定の実施形態において、式ＩまたはＩＩの化合物でのＨＤＡＣ６阻害は、多嚢胞性疾患を獲得する病気に遺伝的にかかりやすい患者における嚢胞の形成を防ぐ。
【００６７】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物Ａ−１であることができる。
【００６８】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物Ｂ−１であることができる。
【００６９】
好ましい実施形態において、式ＩＩの化合物は、化合物Ｃ−２であることができる。
【００７０】
一定の実施形態において、式ＩまたはＩＩの化合物でのＨＤＡＣ６の薬理学的阻害は、β−カテニン機能を阻害すること、たとえばβ−カテニンの発現及びそれの核集積を阻害することによって多嚢胞性疾患を治療する。
【００７１】
本発明の１つの態様において：
【化８】
2016534069.tif 000011
の構造を有する治療上有効な量のＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物（化合物Ａ−１）またはその薬学的に許容される塩を、多嚢胞肝をもつ被験体に投与することを含む多嚢胞肝の治療のための方法であって、
ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ａ−１の量は、嚢胞成長を阻害するのに有効である、方法が提供される。
【００７２】
本発明の１つの態様において：
【化９】
2016534069.tif 000012
の構造を有する治療上有効な量のＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ｂ−１またはその薬学的に許容される塩を、多嚢胞肝をもつ被験体に投与することを含む多嚢胞肝の治療のための方法であって、
ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ｂ−１の量は、嚢胞成長を阻害するのに有効である、方法が提供される。
【００７３】
本発明の１つの態様において：
【化１０】
2016534069.tif 000013
の構造を有する治療上有効な量のＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ｃ−２またはその薬学的に許容される塩を、多嚢胞肝をもつ被験体に投与することを含む多嚢胞肝の治療のための方法であって、
ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ｃ−２の量は、嚢胞成長を阻害するのに有効である、方法が提供される。
【００７４】
医薬組成物
もう一つの態様において、本発明は、式ＩもしくはＩＩの化合物またはそれらの薬学的に許容されるエステル、塩またはプロドラッグを含む医薬組成物を薬学的に許容される担体と共に提供する。この医薬組成物は、多嚢胞性疾患の治療において使用されることができる。
【００７５】
本発明の化合物は、特に経腸的に、たとえば経口的に、たとえば錠剤もしくはカプセルの形態で、または非経口的に、たとえば注射可能な溶液もしくは懸濁液の形態で、局所的に、たとえばローション、ゲル、軟膏もしくはクリームの形態で、または経鼻もしくは坐薬形態で、任意の従来の経路によって医薬組成物として投与されることができる。少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤に結合した遊離型での、または薬学的に許容される塩形態での本発明の化合物を含む医薬組成物は、混合、造粒またはコーティング方法による従来の様式において製造されることができる。たとえば、経口組成物は、ａ）希釈剤、たとえば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、たとえば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩及び／またはポリエチレングリコール；また錠剤のためにｃ）結合剤、たとえば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム及びまたはポリビニルピロリドン；所望の場合ｄ）崩壊剤、たとえば、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または発泡性混合物；及び／またはｅ）吸収剤、着色剤、香味及び甘味料と共に活性成分を含む錠剤またはゼラチンカプセルであることができる。注射可能な組成物は、水性等張液または懸濁液であることができ、坐薬は、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調整することができる。組成物は、滅菌されても、及び／または保存、安定、湿潤もしくは乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩及び／または緩衝液などのアジュバントを含んでいてもよい。加えて、また、これらは、その他の治療的に有益な物質を含んでいてもよい。経皮投与に適切な製剤は、担体を伴う有効量の本発明の化合物を含む。担体は、吸収性薬理学的に許容される溶媒をを含んで、受容者の皮膚を介しての通過を助けることができる。たとえば、経皮装置は、裏当て部材、任意に担体を伴う化合物を含む貯蔵所、任意に、長期の期間にわたって制御された、及び予め決められた速度で受容者の皮膚に化合物を送達するための速度制御バリア及び装置を皮膚に固定する手段を含む包帯の形態である。またマトリックス経皮製剤が、使用されてもよい。たとえば、皮膚及び目に対する局所的投与に適切な製剤は、好ましくは周知の当該技術分野の水性溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。そのようなものは、可溶化剤、安定剤、張性増強剤、緩衝液及び保存剤を含んでいてもよい。
【００７６】
また、本発明の化合物及び医薬組成物が、療法と組み合わせて製剤化され、及び用いることができる、すなわち、化合物及び医薬組成物は、１つまたは複数のその他の所望の治療学または医学的手順と並行して、より前に、またはそれの後に製剤化される、または投与されることができることが、認識されるだろう。組み合わせ投与計画に用いるための療法（治療または手順）の特定の組み合わせは、達成されるべき所望の治療及び／または手順並びに所望の治療効果の適合性を考慮するだろう。また、用いられる療法が、同じ障害に所望の効果を達成し得る（たとえば、本発明の化合物が、もう一つの免疫調節剤、抗癌剤またはＳＬＥなどの自己免疫疾患の治療に有用な薬剤と並行して投与されてもよい）、またはこれらが異なる効果（たとえば、任意の有害作用の制御）を達成し得ることが、認識されるだろう。
【００７７】
一定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる治療的活性成分をさらに含む。本発明のために、用語「緩和剤」は、疾患の症候及び／または治療上の投与計画の副作用の軽減に焦点をおくが、治療的でない治療をいう。たとえば、緩和療法は、鎮痛剤、抗嘔吐薬物、解熱薬及び抗病気薬物を包含する。加えて、化学療法、放射線療法及び外科手術の全ては、緩和的に使用することができる（すなわち、治癒を求めずに症候を減少させるために；たとえば、腫瘍を縮小し、及び癌の圧力、出血、疼痛及びその他の症候を減少させるため）。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と共に製剤化される治療上有効な量の本発明の化合物を含む。
【００７９】
本明細書に使用される用語「薬学的に許容される担体」は、任意のタイプの無毒性、不活性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤を意味する。本発明の医薬組成物は、経口的に、直腸に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（粉末、軟膏または液滴によるように）、口腔内に、または口腔もしくは鼻内噴霧として、ヒト及びその他の動物に投与されることができる。
【００８０】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル及びそれらの混合物などの、たとえば、水またはその他の溶媒、可溶剤及び乳化剤などの当該技術分野において一般に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよい。不活性希釈剤の他に、また、経口組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味料、香味料及び芳香剤などのアジュバントを含むことができる。
【００８１】
注射可能な調合剤、たとえば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散または湿潤剤及び懸濁剤を使用して公知の技術に従って製剤化されてもよい。また、無菌の注射可能な調合剤は、無毒性非経口的に許容される希釈剤または溶媒における無菌の注射可能の溶液、懸濁液またはエマルジョン、たとえば、１，３−ブタンジオールにおける溶液としてでもよい。用いられ得る許容される媒体及び溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ.Ｓ.Ｐ.及び等張食塩水がある。加えて、無菌の、不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来は用いられる。このため、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の刺激性の低い不揮発性油は、用いられることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用される。
【００８２】
本発明の治療の方法によれば、障害は、所望の結果を達成するために必要であるのと同じ量で、及び時間で、本発明の化合物の治療上有効な量を被験体に投与することによって、ヒトまたはその他の動物などの被験体において治療される、または予防される。
【００８３】
本明細書に使用される用語「治療上有効な量」の本発明の化合物は、被験体における多嚢胞肝によって生じる症候の１つまたは複数を減少させるように、十分な量の化合物を意味する。
【００８４】
医学的技術においてかなり理解されているように、本発明の治療上有効な量の化合物は、任意の医学的治療に適用できる妥当な利益／リスク比であるだろう。
【００８５】
一般に、本発明の化合物は、単独で、または１つまたは複数の治療薬と組み合わせてのいずれかで、当該技術分野において公知の通常の、及び許容される容器のいずれかを経て治療上有効な量で投与されるだろう。治療上有効な量は、被験体の疾患の重症度、年齢及び関係する健康、使用される化合物及びその他の因子の効力に応じて広く変化してもよい。一般に、満足な結果は、体重あたり約０．０３〜２．５ｍｇ／ｋｇ（０．０５〜４．５ｍｇ／ｍ２）の１日投与量で全身的に得られることが示される。より大きな哺乳動物、たとえばヒトにおける示された１日投与量は、約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲であり、たとえば、１日４回まで分けられた用量で、または徐放形態で都合よく投与される。経口投与のための適切な単位剤形は、およそ１〜５０ｍｇの活性成分を含む。
【００８６】
一定の実施形態において、本発明の化合物の治療上の量または用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ（約０．１８ｍｇ／ｍ２〜約９００ｍｇ／ｍ２）、あるいは、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ（約１．８〜約９０ｍｇ／ｍ２）の範囲でもよい。一般的に、本発明に従った治療投与計画は、単一の、または複数の用量で１日あたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの本発明の化合物をこのような治療の必要のある患者に投与することを含む。また、治療上の量または用量は、投与経路並びにその他の薬剤との共使用の可能性に応じて変化するだろう。
【００８７】
被験体の状態の改善に応じて、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持量は、必要な場合投与されてもよい。その後、投薬量もしくは投与頻度または両方は、症候が望ましいレベルに緩和されたときに、改善された状態が保持されるレベルまで症候の機能につれて減少させられてもよく、治療はやめるべきである。しかし、被験体は、多嚢胞肝から生じる症候の任意の再発に応じて、長期ベースの断続的な治療を必要とし得る。
【００８８】
しかし、本発明の化合物及び組成物の日々の総使用量が、健全な医学的な判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者のための特定の抑制量は、治療されている障害及び障害の重症度；用いられる特異的化合物の活性；用いられる特異的化合物；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食事；用いられる特異的化合物の投与時間、投与経路及び排出の割合；治療の期間；用いられる特異的化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬物；及び医学的技術分野において周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するだろう。
【００８９】
キット
本明細書における開示は、被験体における多嚢胞性疾患を治療するための式ＩまたはＩＩの異なる用量の化合物を有するパッケージユニットを含むキット形式を提供する。一定の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物Ａ−１または化合物Ｂ−１である。その他の実施形態において、式ＩＩの化合物は、化合物Ｃ−２である。
【００９０】
また、キットは、以下品目の１つまたは複数を含んでいてもよい：処方情報、投薬量情報、貯蔵情報及び同様のもの並びに無菌生理食塩水溶液、針、注射器、カテーテル及び包帯、その他などの応急処置材料を含む使用説明書。キットは、本明細書において記述した方法を行うために適切な比率において共に混合された試薬の容器を含んでいてもよい。試薬容器は、目的の方法を行うときに、測定工程を不必要にする単位量における試薬を好ましくは含む。
【００９１】
パッケージ標識は、たとえば、多嚢胞性疾患の治療のための式ＩまたはＩＩの化合物を摂取するための説明書を含むことができる。もう一つの実施形態において、パッケージ標識は、多嚢胞肝を治療するための説明書を含む。
【００９２】
また式Ｉまたは式ＩＩの化合物の治療上有効な量及び薬学的に許容される担体または希釈剤、並びに多嚢胞肝などの多嚢胞性疾患を治療する方法における説明書を含むパッケージされた組成物が提供される。
【００９３】
本発明の化合物は、溶媒和物（たとえば、水和物）として、本発明の方法の間に都合よく作製され、または形成されることができる。本発明の化合物の水和物は、ジオキサン、テトラヒドロフランまたはメタノールなどの有機溶媒を使用して、水性／有機溶媒混合物から再結晶によって都合よく作製されることができる。
【００９４】
加えて、本発明の化合物のいくつかは、１つまたは複数の二重結合または１つまたは複数の不斉中心を有する。このような化合物は、ラセミ体、ラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオ異性混合物及びシス−もしくはトランス−またはＥ−もしくはＺ−二重異性体、及び絶対立体化学に関して、アミノ酸について（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−として、または（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−として定義され得るその他の立体異性体形態として存在し得る。これらの化合物の全てのこのような異性体形態は、本発明に明白に含まれる。光学異性体は、上記の手順によって、またはラセミ混合物を分割することによって、これらのそれぞれの光学活性前駆体から作製されてもよい。分割は、クロマトグラフィーによって、または繰り返される結晶化によって、または当業者に公知であるこれらの技術のいくつかの組み合わせによって、分割薬剤の存在下で実施することができる。分割に関するさらなる詳細は、Ｊａｃｑｕｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９８１）で見いだすことができる。また、本発明の化合物は、このような例において、複数の互変異性型で表されてもよく、本発明は本明細書において記述した化合物の全ての互変異性型を明白に含む。本明細書において記述した化合物が、オレフィン二重結合または幾何学的非対称のその他の中心を含むとき、及び特に明記しない限り、化合物がＥ及びＺ幾何異性体を含むことが意図されている。同様に、また、全ての互変異性型は、含まれることが意図される。本明細書に見られる任意の炭素−炭素二重結合の配置は、便宜のためにだけ選択され、及びテキストがそのように述べない限り、特定の配置を指定することは意図されない；したがって、トランスとして任意に本明細書に示される炭素−炭素二重結合は、シス、トランスまたは任意の比率における２つの混合物でもよい。このような化合物の全てのこのような異性形態は、本発明において明白に含まれる。本明細書において記述した化合物の全ての結晶形態は、本発明において明白に含まれる。
【００９５】
合成された化合物は、反応混合物から分離され、及びカラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーまたは再結晶などの方法によってさらに精製されることができる。当業者によって認識されることができるように、本明細書における式の化合物を合成するさらなる方法は、当業者に明らかだろう。加えて、種々の合成工程は、代わりの順序または順番で行われて、所望の化合物を与えてもよい。加えて、本明細書において描写した溶媒、温度、反応期間、その他は、説明の目的のみであり、及び当業者は、様々な反応条件が本発明の所望の化合物を生成することができることが認識されるだろう。本明細書において記述した化合物を合成することに有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、当該技術分野において公知であり、及びたとえば、Ｒ．  Ｌａｒｏｃｋ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８９）；  Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｄ．  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９１）；  Ｌ．  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ，  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９４）；  ａｎｄ  Ｌ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  ｅｄ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９５）に記述されるなどのもの、及びその後の版を含む。
【００９６】
本発明の化合物は、選択的生物学的特性を増強するために本明細書において描写される任意の合成手段を経て種々の機能性を追加することによって修飾されてもよい。このような修飾は、当該技術分野において公知であり、及び所与の生物系（たとえば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透を増加させ、経口利用可能性を増加させ、溶解度を増加させて注射による投与を可能にし、代謝を変化させ、及び排出の割合を変化させるものを含む。
【００９７】
本発明の化合物は、これらの化学的構造及び／または化学名によって本明細書において定義される。化合物が化学的構造及び化学名の両方によって呼ばれ、及び化学的構造及び化学名が矛盾する場合、化学的構造が化合物の同一性を決定する。
【００９８】
本明細書において変化するものの任意の定義における化学基のリストの詳述は、収載された基の任意の単一の基または組み合わせとしてその変化するものの定義を含む。本明細書における実施形態の詳述は、任意の単一の実施形態として、または任意のその他の実施形態またはその部分と組み合わせてその実施形態を含む。本明細書における変化するもののための実施形態の詳述は、任意の単一の実施形態として、または任意のその他の実施形態またはその部分と組み合わせてその実施形態を含む。
【００９９】
本明細書において同定される任意の特許、特許出願、公開またはその他の開示材料は、その全体が本明細書において参照により本明細書に援用される。本明細書における参照により援用されると言われるが、既存の定義、記載、または本明細書に記載されるその他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその部分は、矛盾が援用される材料と本開示材料との間に生じない程度まで援用されるのみである。
【実施例】
【０１００】
実施例を図解の目的のため、及び本発明の一定の特定の実施形態を記述するために下に記載した。しかし、請求項の範囲は、本明細書に記載される実施例によって決して限定されるべきでない。開示された実施例に対する種々の変更及び修飾は、当業者にとって明らかだろう、及び本発明の化学構造、置換基、誘導体、製剤及び／または方法に関するものを含むこのような変更及び修飾は、限定されないが、本発明の精神及び添付の請求の範囲の範囲を逸脱しない範囲でなされてもよい。本明細書におけるスキームにおける構造における変数の定義は、本明細書において提示される式において対応する位置のものに相応する。
【０１０１】
実施例１：本発明の化合物の合成
式Ｉの化合物の合成は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１９８２において提供され、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０２】
化合物Ａ−１の合成
【化１１】
2016534069.tif 000014
反応スキーム
【化１２】
2016534069.tif 000015
中間体２の合成
【化１３】
2016534069.tif 000016
ＤＭＦ（１００ｍｌ）中のアニリン（３．７ｇ、４０ｍｍｏｌ）、エチル２−クロロピリミジン−５−カルボキシラート１（７．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１１ｇ、８０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩Ｎ２下で１２０℃でガス抜きし、及び撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、及びＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、次いで飽和塩水（２００ｍｌ×３）で洗浄した。有機層を分離し、及びＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発乾固し、及びシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）によって精製されて白色固体（６．２ｇ、６４％）として所望の生成物を与えた。
【０１０３】
中間体３の合成
【化１４】
2016534069.tif 000017
ＴＥＯＳ（２００ｍｌ）中の化合物２（６．２ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ヨードベンゼン（６．１２ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（９５５ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１６．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の混合物を窒素でガス抜きし、及び除去した。生じる混合物を１４時間１４０℃で撹拌した。室温まで冷却後、残留物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）及び９５％ＥｔＯＨ（２００ｍｌ）で希釈し、シリカゲル上にＮＨ４Ｆ−Ｈ２Ｏ［５０ｇ、シリカゲル（５００ｇ、１００−２００メッシュ）への水（１５００ｍｌ）中のＮＨ４Ｆ（１００ｇ）の添加によってプレ調製した］を添加し、及び生じる混合物を２時間室温で保持し、凝固した材料を濾過し、及びＥｔＯＡｃで洗浄した。ろ液を蒸発乾固して、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）によって精製して黄色固体（３ｇ、３８％）を与えた。
【０１０４】
中間体４の合成
【化１５】
2016534069.tif 000018
２Ｎ  ＮａＯＨ（２００ｍｌ）をＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中の化合物３（３．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を３０分間６０℃にて撹拌した。溶媒の蒸発後、溶液を２Ｎ  ＨＣｌで中和して、白色沈殿物を与えた。懸濁液をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍｌ）で抽出し、及び有機層を水（２×１００ｍｌ）、塩水（２×１００ｍｌ）で分離し、洗浄し、及びＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒の除去は、茶色固体（２．５ｇ、９２％）を与えた。
【０１０５】
中間体６の合成
【化１６】
2016534069.tif 000019
化合物４（２．５ｇ、８．５８ｍｍｏｌ）、アミノヘプタノアート５（２．５２ｇ、１２．８７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３．９１ｇ、１０．３０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４．４３ｇ、３４．３２ｍｍｏｌ）の混合物を一晩室温で撹拌した。反応混合物を濾過した後、ろ液を蒸発乾固して、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝２／１）によって精製して茶色固体の（２ｇ、５４％）を与えた。
【０１０６】
２−（ジフェニルアミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソヘプチル）ピリミジン−５−カルボキサミドの合成
【化１７】
2016534069.tif 000020
ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）及びＤＣＭ（２５ｍｌ）中の化合物６（２．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（２Ｎ、２０ｍＬ）の混合物を１０分間０℃で撹拌した。ヒドロキシルアミン（５０％）（１０ｍｌ）を０℃まで冷却し、及び混合物に添加した。生じる混合物を２０分間室温で撹拌した。溶媒の除去後、混合物を１Ｍ  ＨＣｌで中和して、白色沈殿を与えた。粗生成物をプレＨＰＬＣによって濾過し、及び精製して白色固体（９５０ｍｇ、４８％）を与えた。
【０１０７】
化合物Ｂ−１の合成
【化１８】
2016534069.tif 000021
反応スキーム：
【化１９】
2016534069.tif 000022
中間体２の合成：上の化合物Ａ−１の合成における中間体２の合成を参照されたい。
【０１０８】
中間体３の合成：
ＤＭＳＯ（６９０ｍｌ）中の化合物２（６９．２ｇ、１当量）、１−クロロ−２−ヨードベンゼン（１３５．７ｇ、２当量）、Ｌｉ２ＣＯ３（４２．０４ｇ、２当量）、Ｋ２ＣＯ３（３９．３２ｇ、１当量）、Ｃｕ（１当量４５μｍ）の混合物を窒素でガス抜きし、及び除去した。生じる混合物を１４０℃で撹拌した。反応のワークアップは、９３％収量にて化合物３を与えた。
【０１０９】
中間体４の合成：上の化合物Ａ−１の合成における中間体４の合成を参照されたい。
【０１１０】
中間体６の合成：上の化合物Ａ−１の合成における中間体６の合成を参照されたい。
【０１１１】
２−（（２−クロロフェニル）（フェニル）アミノ）−Ｎ−（７−（ヒドロキシアミノ）−７−オキソヘプチル）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｂ−１）の合成
上の化合物Ａ−１の合成を参照されたい。
【０１１２】
もう一つの実施形態は、本明細書において描写した反応の任意の１つまたはその組み合わせを使用して式Ｉの化合物を作製する方法である。方法は、本明細書において描写した１つまたは複数の中間体または化学的試薬の使用を含むことができる。
【０１１３】
化合物Ｃ−２の合成：
【化２０】
2016534069.tif 000023
工程１：ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の１（２．００ｇ、１２．８１ｍｍｏｌ）及び２（１．５５２ｇ、１２．８１ｍｍｏｌ）の溶液にＴｉ（ＯＥｔ）４（５．４ｍＬ、２５．５６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１６時間室温で撹拌し、及び次いで、０℃で飽和ＮａＨＣＯ３溶液に注いだ。生じる沈殿物を濾過した。生じるろ液をＥＡで抽出した。合わせたＥＡ層を真空中で濃縮し、及び残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝４／１、２／１）によって精製して白色固体（２．６１ｇは、収量：７５％）として３を得た。
【０１１４】
工程２：３（１．００ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、０℃でＰｈＭｇＢｒ（ＴＨＦ中の１Ｍ、１０ｍＬ）の溶液を添加した。それを完全な反応まで０℃〜室温で撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液をｐＨ６〜７に調整するために添加した。生じる混合物をＥＡで抽出した。合わせたＥＡ層を真空中で濃縮し、及び残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝５／１、２／１、１．５／１）によって精製して白色固体（８２３ｍｇ、収量：６０％）として４を得た。
【０１１５】
工程３：ＨＣｌ（水中の２Ｍ、２０ｍＬ）及びＴＨＦ（２０ｍＬ）中の化合物４（８．３ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）の混合物を１６時間５０℃で撹拌した。ＮａＯＨの溶液を混合物に添加して、ｐＨ７〜８に調整した。ＴＨＦを真空中で除去し、及び水性相をＥＡで抽出した。合わせたＥＡ層を真空中で濃縮し、及び残留物をＥＡに溶解した。ＨＣｌ（４Ｍ、１ｍＬ）を添加した。生じる白色固体を濾過によって収集して、所望の生成物５（３９５ｍｇ、収量：５７％）を得た。
【０１１６】
工程４：ＮＭＰ（４ｍＬ）中の化合物５（３５０ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、６（３７６ｍｇ、２．０２ｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．０７ｍＬ、６．４７ｍｍｏｌ）の混合物を５時間１３０℃で撹拌した。混合物を水（２０ｍＬ）に添加し、及びＥＡ（２５ｍＬ×２）で抽出した。有機層を濃縮して残留物を得て、それをシリカゲルクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝４／１）によって精製して７（１７８ｍｇ、収量：３４％）を得た。
【０１１７】
工程５：ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の化合物７（１６８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＤＡＳＴ（３０２μＬ、２．４７ｍｍｏｌ）を添加した。それを室温で３時間及び３５℃で２時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ）でクエンチし、及びＥｔＯＡｃ（２×５ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を真空中で濃縮した。残留物をプレＴＬＣによって精製して、８（７４ｍｇ、収量：４２％）を与えた。
【０１１８】
工程６：ＮＨ２ＯＨ（水中の５０％、３．９ｍＬ）を０℃で８（７４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を含むフラスコに添加した。次いで、ＭｅＯＨ（３．９ｍｌ）中の飽和ＮａＯＨ溶液を０℃で添加した。ＤＣＭ（３．９ｍＬ）を基質が溶解するのを助けるために添加した。混合物を１８時間２５℃で加熱した。濃縮ＨＣｌを、ｐＨを７に合わせるために添加した。それを真空中で濃縮し、及び残留物をプレＨＰＬＣによって精製して白色固体として化合物Ｃ−２（２７ｍｇ、収量：３８％）をもたらした。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ）  δ  １０．９６  （ｓ，  １Ｈ），  ９．００  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．７３  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．２３  −  １．８８  （ｍ，  ６Ｈ）．  ＬＣＭＳ：  ｍ／ｚ  ＝  ３４９  （Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１９】
実施例２：ＨＤＡＣ酵素アッセイ
試験のための化合物を５０倍の終濃度までＤＭＳＯ中に希釈し、及び１０．３倍希釈シリーズを作製した。化合物をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％  ＢＳＡ、２０μＭ  ＴＣＥＰ）中に６倍のこれらの終濃度まで希釈した。ＨＤＡＣ酵素（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）をアッセイ緩衝液中に１．５倍のこれらの終濃度まで希釈した。０．０５μＭ終濃度にてトリペプチド基質及びトリプシンを６倍のこれらの終濃度でアッセイ緩衝液中に希釈した。これらのアッセイにおいて使用される最終酵素濃度は、３．３ｎｇ／ｍｌ（ＨＤＡＣ１）、０．２ｎｇ／ｍｌ（ＨＤＡＣ２）、０．０８ｎｇ／ｍｌ（ＨＤＡＣ３）及び２ｎｇ／ｍｌ（ＨＤＡＣ６）であった。使用される最終基質濃度は、１６μＭ（ＨＤＡＣ１）、１０μＭ（ＨＤＡＣ２）、１７μＭ（ＨＤＡＣ３）及び１４μＭ（ＨＤＡＣ６）であった。
【０１２０】
５μｌの化合物及び２０μｌの酵素を二つ組で黒い、不透明な３８４ウェルプレートのウェルに添加した。酵素及び化合物を１０分間室温で共にインキュベートした。５μｌの基質をそれぞれのウェルに添加し、プレートを６０秒間振盪し、及びＶｉｃｔｏｒ  ２マイクロタイタープレートリーダに置いた。蛍光の発生を６０分間モニターし、及び反応の線形速度を算出した。ＩＣ５０を４つのパラメーター曲線フィットによるＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して決定した。化合物Ｃ−２について得たＩＣ５０値（ｎＭ）は、下で表ＩＩＩに見られる。
【０１２１】
【表３】
2016534069.tif 000024
化合物Ａ−１及びＢ−１について得たＩＣ５０値（ｎＭ）を表Ｉに見ることができる
【０１２２】
実施例３：ＨＤＡＣ６は、嚢胞性胆管細胞において過剰発現する。
ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対照及びＰＣＫラット胆管細胞から単離した。ｃＤＮＡをＦｉｒｓｔ  Ｓｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用して得て、及びＨＤＡＣ６プライマー（フォワードプライマー：５’−ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＧ−３’（配列番号：１）；リバースプライマー：５’−ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＧＡ−３’、配列番号：２）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。β−カテニンｍＲＮＡ発現を製造業者の指導に従ってＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（アッセイＩＤ  Ｒｎ００５８４４３１＿ｇ１）を使用して解析した。試料を１８Ｓ  ｒＲＮＡに規準化した。
【０１２３】
ウェスタンブロット
培養された対照ラット及びＰＣＫラット胆管細胞から単離されるタンパク質を解析した。細胞を破片にし、プロテアーゼ阻害剤、バナジン酸ナトリウム及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）とリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、超音波処理し、試料タンパク質の同等の量をＬａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）及びメルカプトエタノール中に希釈した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をニトロセルロース膜へ移し、ブロックし、及び次いで、以下の一次抗体とインキュベートした：ＨＤＡＣ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ−１１、１：５００）、アセチル化−α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２０００）、β−カテニン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（Ｄ１０Ａ８）ＸＰ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ；  １：１０００）、ホスホ−β−カテニン（Ｓｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１０００）、アセチル−β−カテニン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１０００）、ｃ−ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：５００）、サイクリンＤ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：５００）及びアクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５０００）。膜を４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合された（１：５０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＩＲｄｙｅ  ６８０もしくは８００（１：１５０００、Ｏｄｙｓｓｅｙ）対応二次抗体と室温で１時間インキュベートした。ＥＣＬシステムまたはＯｄｙｓｓｅｙ  Ｌｉｃｏｒ  Ｓｃａｎｎｅｒをタンパク質検出のために使用し、及びＧｅｌ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６.０ソフトウェアをデンシトメトリー解析のために使用した。
【０１２４】
免疫蛍光及び共焦点顕微鏡法。
【０１２５】
対照及びＰＣＫラット、健康なヒト並びにＡＤＰＫＤ及びＡＲＰＫＤ患者のパラフィン包埋した肝臓切片をＨＤＡＣ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ−１１、１：１００）に対する抗体及びアセチル化−α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、マウスモノクローナル１：５００）と一晩４℃でインキュベートし、続いて室温で９０分間の蛍光二次抗体インキュベーションを行った。核をＤＡＰＩ（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。画像をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡で取得した。３人の正常、３人のＡＲＰＫＤ及び３人のＡＤＰＫＤ患者からのパラフィンブロックをＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ａｒｃｈｉｖｅｓから得た。全ての実験手順は、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓ（ＩＲＢ＃：０８−００５６８１）によって承認された。
【０１２６】
統計
データを平均±ＳＥとして表す。統計分析を両側によって行った；スチューデントｔ検定を２つの群を比較するのに使用した。有意性のためのカットオフｐ値は、ｐ＜０．０５にてセットした。
【０１２７】
胆管細胞におけるＨＤＡＣ６  ｍＲＮＡの発現を評価するために、培養されたラット胆管細胞から単離されるｍＲＮＡをＰＣＲを使用して解析した。図１Ａに示したように、ＨＤＡＣ６  ｍＲＮＡは、対照及びＰＣＫラット両方の胆管細胞に存在する。ＰＣＲ産物の同一性をシーケンシングによって確認した。
【０１２８】
図１Ｂは、培養された対照ラット及びＰＣＫラット胆管細胞から単離されるタンパク質におけるウェスタンブロット解析を示す。ＨＤＡＣ６タンパク質は、対照ラット胆管細胞と比較してＰＣＫ胆管細胞において６．５倍に過剰発現し、それはアセチル化−α−チューブリン、主要なＨＤＡＣ６基質の１つの減少したレベルと相関する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｗｏ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （２００６）  ２８１：２４０１−２４０４を参照されたい）。
【０１２９】
また、インビトロにおいて観察されるＨＤＡＣ６の過剰発現を肝臓組織の共焦点免疫蛍光によってインビボにおいて確認した。ＰＣＫラット並びにＡＤＰＫＤ及びＡＲＰＫＤ患者の肝臓組織において、ＨＤＡＣ６の免疫活性は、それぞれ、正常なラット及び健康なヒト対照と比較して肝臓嚢胞において増加する（図１Ｃ）。
【０１３０】
実施例４：ＨＤＡＣ６の阻害は、インビトロにおける胆管細胞増殖及び嚢胞成長を減少させる。
【０１３１】
組織培養
インビトロ実験について、胆管細胞を対照ラット、ＰＣＫラット（ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＡＲＰＫＤ；  Ｖｒｏｍａｎ  Ｂ，  ＬａＲｕｓｓｏ  ＮＦ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６，  ７４：３０３−３１３）、健康なヒト及びＡＤＰＫＤ患者（Ｍａｓｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．    Ｂｉｌｉａｒｙ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｉｌｉａ，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  （２０１０）  ２９９：Ｇ９９０−９９９；  Ｏ’Ｈａｒａｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  Ｎ−Ｒａｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （２０１１）  ２８６：３０３５２−３０３６０；  Ｂａｎａｌｅｓｅｔ  ａｌ．  Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ５０６  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｃｌ（−）／ＨＣＯ（３）  （−）  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  （２０１２）  ５６（２）：６８７−９７）から単離した。
【０１３２】
胆管細胞をＣｏｌｌａｇｅｎ−Ｉ被覆フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ）中で培養した。全ての株化細胞を３７℃、５％  ＣＯ２、１００％湿度にてＮＲＣ  Ｍｅｄｉａ中でインキュベートした。ＮＲＣ  Ｍｅｄｉａは、以下の添加とＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修飾Ｅａｇｌｅ培地／Ｆ１２を含む：０．０１ｍＬ／ｍＬ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）可欠アミノ酸、０．０１ｍＬ／ｍＬ脂質濃縮物、０．０１ｍＬ／ｍＬ  ＭＥＭビタミン溶液、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍＬダイズトリプシン阻害剤、０．０１ｍＬ／ｍＬインスリン／伝達／セレニウム−Ｓ、５％ウシ胎児血清、３０ｇ／ｍＬウシ下垂体抽出物、２５ｎｇ／ｍＬ上皮細胞成長因子、３９３ｎｇ／ｍＬデキサメタゾン、３．４ｇ／ｍＬ  ３，３−，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、４．１１ｇ／ｍＬホルスコリン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン。
【０１３３】
増殖アッセイ法
対照及びＰＣＫラット胆管細胞をＮＲＣ  Ｍｅｄｉａを使用してＣｏｌｌａｇｅｎ−Ｉ被覆フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ）において培養し、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）で剥離させ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉ被覆９６ウェルプレート（１００００細胞／ウェル）へ移し、及び３７℃、５％  ＣＯ２、１００％湿度にてインキュベートした。ＮＲＣ培地中に懸濁される５、１０及び２０μｍｏｌ／ＬツバスタチンＡ（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｔｅｋ）、１−２μｍｏｌ／Ｌツバシン（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｔｅｋ）または２、４及び８μｍｏｌ／Ｌ化合物Ａ−１（Ａｃｅｔｙｌｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ）での治療を２４時間後に始めた。薬物媒体、ＤＭＳＯを対照としてＮＲＣ  Ｍｅｄｉａ中に懸濁した。細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価し、及び／またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏ  Ｔ４  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞を計数した。
【０１３４】
３Ｄ−培養
ＰＣＫラットから新たに単離された胆管をラット尾部Ｉ型Ｃｏｌｌａｇｅｎマトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に包埋し、１０μｍｏｌ／ＬツバスタチンＡ及び２μｍｏｌ／Ｌツバシンの存在または非存在下で成長させた。成長する嚢胞の画像を５日間にわたって毎日撮影し、及び嚢胞サイズをソフトウェア「Ｉｍａｇｅ  Ｊ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）で測定した。それぞれの嚢胞性構造についての周囲領域を前述したように０日目と比較して成長の割合を算出した（Ｍｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＰＣＫ  ｒａｔ，  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００６，  ８６：９４０−９５０；  Ｍａｓｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｙｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  （２００７）  １３２：１１０４−１１１６  ２７；  Ｌｅｅｅｔ  ａｌ．  ＭｉｃｒｏＲＮＡ１５ａ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｃｄｃ２５Ａ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｙｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （２００８）  １１８：３７１４−３７２４  ２８．  Ｇｒａｄｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｐｖ４  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＲＰＫＤ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  （２０１０）  １３９：３０４−３１４  ｅ３０２を参照されたい）。
【０１３５】
ＰＣＫ胆管細胞は、対照ラット胆管細胞より早い速度で増殖する（Ｂａｎａｌｅｓ  ＪＭ，  Ｍａｓｙｕｋ  ＴＶ，  Ｇｒａｄｉｌｏｎｅ  ＳＡ，  Ｍａｓｙｕｋ  ＡＩ，  Ｍｅｄｉｎａ  ＪＦ，  ＬａＲｕｓｓｏ  ＮＦ：  Ｔｈｅ  ｃＡＭＰ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  Ｅｐａｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａ  （ＰＫＡ）  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｙｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ＡＲＰＫＤ），  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００９，  ４９：１６０−１７４を参照されたい）。ＨＤＡＣ６の上方制御が胆管細胞過剰増殖に寄与するかどうか試験するために、ＨＤＡＣ６選択的阻害剤ツバスタチン−Ａを培養された胆管細胞に添加した。
【０１３６】
図２Ａは、ツバスタチン−Ａが、用量及び時間依存的様式においてＰＣＫ胆管細胞増殖を減少させたことを示す。３日目までに、処理されたＰＣＫ胆管細胞の増殖をそれぞれ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭツバスタチンＡについて２．５、３．５、及び４．１５倍まで減少させた。加えて、また、異なるＨＤＡＣ６特異的阻害剤、ツバシンは、２．９４倍までＰＣＫ胆管細胞増殖を減少させた（図２Ｂ）。また、両方の薬物は、それぞれ、８５％及び１６％まで培養されたヒトＡＤＰＫＤ胆管細胞の増殖を減少させた（図５Ａ）。増殖におけるＨＤＡＣ６阻害の効果をさらに確認するために、ＨＤＡＣ６阻害剤ツバスタチン−Ａは、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏ  Ｔ４  Ｃｅｌｌを使用して測定したときに嚢胞性胆管細胞増殖を有意に減少させる（図５Ｂ）。
【０１３７】
ＰＣＫラットから単離し、及び３−Ｄコラーゲンマトリックスにおいて成長した肝臓嚢胞をＨＤＡＣ６阻害剤で処理した（図２Ｃ）。ＰＣＫ嚢胞性構造の周囲領域の解析は、嚢胞成長の有意な阻害を示した。薬物投与の４日後に、ツバスタチン−Ａ及びツバシンは、それぞれ未処置嚢胞と比較して１３１％及び１２５％まで嚢胞成長を減少させた（図２Ｄ）。
【０１３８】
実施例５：  ＨＤＡＣ６の阻害は、β−あて人たんぱく質レベルを低下させる
ＰＣＫ胆管細胞増殖の阻害及び３Ｄ培養における嚢胞成長の原因である機構のより優れた知識のために、培養されたＰＣＫ胆管細胞をツバスタチン−Ａ及びツバシンで処理し、及びアセチル化α−チューブリン及びβ−カテニンの量をウェスタンブロッティングによって決定した。
【０１３９】
ツバスタチン−Ａ及びツバシンで処理されるＰＣＫ胆管細胞は、未処理細胞と比較して、アセチル化α−チューブリンの増加したレベル（１３及び２．３倍）を有した（図３Ａ）。対照的に、β−カテニンのレベルは、それぞれ、ツバスタチンＡ及びツバシンでの処理後、２．２及び５倍まで減少した（図３Ａ）。
【０１４０】
さらに、また、ｂ−カテニン細胞内局在性の免疫蛍光解析は、ＨＤＡＣ６処理が核及び細胞質両方においてｂ−カテニン発現を減少させることを示した（図６）。β−カテニン減少と一致して、また、ＨＤＡＣ６阻害は、β−カテニン遺伝子標的産物、サイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃにおいて減少させる一方、アセチル化されたヒストンＨ３のレベルは、影響を受けないままであった（図３Ａ）。
【０１４１】
また、ＨＤＡＣ６阻害は、ｂ−カテニン不安定化及び分解に対するターゲティングと一致して、β−カテニンアセチル化及びリン酸化を増加させた（図３Ｂ）。β−カテニンタンパク質は、細胞がＨＤＡＣ６阻害剤で処理されたときに、時間とともに減少する一方、β−カテニンメッセンジャーＲＮＡのレベルは安定のままであり、ＨＤＡＣ６阻害がβ−カテニンタンパク質の分解を誘導することを示唆する（図３Ｃ）。
【０１４２】
実施例６：特異的ＨＡＤＣ６阻害剤、化合物Ａ−１は、インビボにおいて嚢胞形成を減少させる。
【０１４３】
ラットＰｌｄモデル
この動物における遺伝子組換えが、ヒトＡＲＰＫＤにおいて見いだされたものにオルソロガスであるので、ＰＣＫラットモデルを使用した。これらの動物は、ヒトＡＤＰＫＤの特徴の多くを発現する（Ｌａｇｅｒ  ＤＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔ  ５９：  １２６−１３６，  ２００１；  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  １１：３０９−３１４，  ２００２）。この突然変異をもつ動物は、腎臓及び肝臓の両方の線維嚢胞性疾患を示し、及びこれらの動物は、長期の治療プロトコルを容易にするのに十分に長く生きる（Ｇａｔｔｏｎｅ  Ｖ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （２００３）  ９：  １３２３−  １３２６；  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｖ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （２００４）  １０：３６３−３６４；  Ｍａｓｙｕｋ  Ｔ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  （２００７）  １３２：１１０４−１１１６，  ２００７）。雌動物は、雄動物より重篤な肝疾患を示す。
【０１４４】
正常及びＰＣＫ胆管細胞をＨＤＡＣ６特異的阻害剤、化合物Ａ−１で処理した。ＰＣＫ細胞増殖を用量依存的様式において、化合物Ａ−１によって阻害し、及び正常細胞の増殖に著しい効果を有しなかった（図４Ａ）。
【０１４５】
次いで、化合物Ａ−１の有効性をＰＣＫラット、多嚢胞肝の動物モデルにおいて試験した。肝臓及び腎臓両方の嚢胞領域を化合物Ａ−１での処理によって有意に減少させた［それぞれ２８．４％及び３９．０％まで（図４Ｂ及び４Ｃを参照されたい）。重要なことには、また肝線維症を３０．５％（ｐ＜０．００１）まで減少させた。
【０１４６】
実施例７：化合物Ｂ−１及びＣ−２の特異的ＨＤＡＣ６阻害剤は、インビボにおいて嚢胞形成を減少させる。
雄ＰＫＣ−１ラット（４週間目、ｎ＝１２）を１２週間化合物の示した用量で１日１回経口経管栄養によって処理した。動物を殺し、及び腎臓を除去し、及びホルマリン中に固定した。腎臓における嚢胞の容積を組織学的解析によって測定した（図７を参照されたい）。比較として、６匹のラットを４週間で殺して、腎嚢胞の開始容積を測定した（対照）。
【０１４７】
結果は、ＨＤＡＣ６特異的阻害剤化合物Ｂ−１及びＣ−２が、インビボでの嚢胞形成を減少させることを示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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