(57)【要約】本発明は、シュガーエンドの発生率がより低く、ゼブラチップ病原体の感染による退色が少ない、チップスおよびフレンチフライ等、ジャガイモ製品を生産するための簡便な方法を提供する。例えば、ジャガイモ塊茎または前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるシュガーエンドの頻度を最小にする方法であって、前記ジャガイモ塊茎における液胞インベルターゼ酵素活性を破壊することを含み、前記ジャガイモ塊茎におけるシュガーエンドの頻度が、対照ジャガイモ塊茎と比較して低下する方法が提供される。
2016503297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャガイモ塊茎または前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるシュガーエンドの頻度を最小にする方法であって、前記ジャガイモ塊茎における液胞インベルターゼ酵素活性を破壊することを含み、前記ジャガイモ塊茎におけるシュガーエンドの頻度が、対照ジャガイモ塊茎と比較して低下する方法。
【請求項２】
ジャガイモ塊茎または前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるゼブラチップの症状を最小にする方法であって、前記ジャガイモ塊茎における液胞インベルターゼ酵素活性を破壊することを含み、前記ジャガイモ塊茎におけるゼブラチップの症状が、対照ジャガイモ塊茎と比較して減少する方法。
【請求項３】
前記液胞インベルターゼ酵素活性が、前記液胞インベルターゼ酵素をコードする液胞インベルターゼ遺伝子の１個またはそれより多くのヌクレオチド変化を前記ジャガイモ塊茎に導入することにより破壊される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記液胞インベルターゼ酵素活性が、阻害性ヌクレオチド配列を導入することにより破壊される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害性ヌクレオチド配列が、アンチセンスＲＮＡ配列、ｄｓＲＮＡｉ配列および逆方向反復からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害性ヌクレオチドが、植物プロモーターに作動可能に連結している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記植物プロモーターが、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組織特異的プロモーターが、塊茎特異的プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記塊茎特異的プロモーターが、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子に関連するプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記塊茎特異的プロモーターが、配列番号６の核酸配列またはその任意の機能的バリアントもしくはその機能的断片を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害性ヌクレオチド配列が、逆方向反復配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記逆方向反復が、配列番号５から誘導される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記逆方向反復が、配列番号５の＋５３〜＋７３３に対応するセンス配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記逆方向反復が、配列番号５の＋５５２〜＋４９に対応するアンチセンス配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記逆方向反復が、配列番号３、１５、１６および１８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むセンス配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記逆方向反復が、配列番号４、１３、１４、１７および２１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むアンチセンス配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、ジャガイモ植物体において遺伝子サイレンシングカセットを発現させることを含み、前記カセットが、逆方向反復として配向されたセンス配列およびアンチセンス配列を含み、前記センス配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号５にハイブリダイズすることができ、前記アンチセンス配列が、前記センス配列の全長または部分的な逆向きの相補体配列である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記センス配列および前記アンチセンス配列が、スペーサーにより離間されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現カセットが、塊茎特異的プロモーターを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記塊茎特異的プロモーターが、前記センス配列および前記アンチセンス配列に作動可能に連結している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
カセットの発現が、少なくとも１種の内在性インベルターゼ遺伝子の発現を下方調節し、これにより、ジャガイモ塊茎もしくは前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるシュガーエンドの頻度を最小にし、かつ／またはジャガイモ塊茎もしくは前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるゼブラチップの症状を最小にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記センス配列が、全長または部分的な配列番号５に対し１００％同一である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンス配列が、前記センス配列の前記逆向きの相補体配列に対し１００％同一である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記アンチセンス配列が、前記センス配列の前記逆向きの相補体配列に対し１００％同一ではないが、これと部分的に重複する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年１１月９日に出願した米国仮出願第６１／７２４，６３２号および２０１３年３月１４日に出願した米国仮出願第６１／７８３，３９０号に対する優先権を主張する。これらの出願のそれぞれは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、シュガーエンド（ｓｕｇａｒ  ｅｎｄ）の発生率がより低く、かつ／またはゼブラチップ（ｚｅｂｒａ  ｃｈｉｐ）病原体の感染による退色が少ない、チップスおよびフレンチフライを含むジャガイモ製品を生産するための簡便な方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）は、世界中で３番目に重要な食用作物である。これは、ヒトによる消費、動物飼料ならびにデンプンおよびアルコールの原料として使用されている。世界での生産の３分の２超は、直接人間によって食されており、残りの多くは、動物に与えられるか、デンプン生産に使用されている。２１世紀の最初の１０年間における世界の平均的な市民の１年の食事は、約３３ｋｇ（または７３ｌｂ）のジャガイモを含んだ。
【０００４】
生育期毎に、ジャガイモ植物体は、植物体の健康、収量および最終塊茎品質に影響を与える様々な生物的ストレスおよび非生物的ストレスに曝される。圃場における環境実践および栽培実践の効果の組合せによる低い塊茎品質は、フレンチフライまたはポテトチップス等、最終製品において可視化され得る。最適に及ばない生育年および不十分な栽培実践は、褐色斑点病、空胴病、内部壊死、維管束変色、ゼブラチップおよびシュガーエンド等、内部塊茎病害の明らかな増加をもたらす。これらの病害を有する完成したフライ製品は、廃棄しなければならず、製造加工業者に対する経済的損失を構成する。経済的負担の一部は、契約違約金の形で栽培者へと転嫁される、または製品のより高い価格の形で消費者へと転嫁される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、ジャガイモ塊茎品質の改善が引き続き必要であり、本発明は、これに取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ジャガイモ塊茎または前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるシュガーエンドの頻度を最小にする方法であって、前記ジャガイモ塊茎におけるシュガーエンドの頻度が、対照ジャガイモ塊茎と比較して低下する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、前記ジャガイモ塊茎における液胞インベルターゼ酵素活性を破壊することを含む。
【０００７】
本発明は、また、ジャガイモ塊茎または前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるゼブラチップの症状を最小にする方法であって、前記ジャガイモ塊茎におけるゼブラチップの症状が、対照ジャガイモ塊茎と比較して減少する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、前記ジャガイモ塊茎における液胞インベルターゼ酵素活性を破壊することを含む。
【０００８】
液胞インベルターゼ酵素活性は、いずれかの適した方法により破壊することができる。一部の実施形態では、液胞インベルターゼ酵素活性は、液胞インベルターゼ酵素をコードする液胞インベルターゼ遺伝子の１個またはより多くのヌクレオチド変化をジャガイモ塊茎に導入することにより破壊される。一部の実施形態では、ヌクレオチド変化は、自然に起こる、または任意の適した方法により人為的に作製される。一部の実施形態では、液胞インベルターゼ酵素活性は、１種またはより多くの阻害性ヌクレオチド配列を導入することにより破壊される。一部の実施形態では、阻害性ヌクレオチド配列は、アンチセンスＲＮＡ配列、ｄｓＲＮＡｉ配列および逆方向反復からなる群から選択される。
【０００９】
一部の実施形態では、阻害性ヌクレオチドは、植物プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、植物プロモーターは、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される。
【００１０】
一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、塊茎特異的プロモーターである。一部の実施形態では、塊茎特異的プロモーターは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子に関連するプロモーターである。一部の実施形態では、塊茎特異的プロモーターは、配列番号６の核酸配列またはその任意の機能的バリアントもしくはその機能的断片を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、阻害性ヌクレオチド配列は、逆方向反復配列である。一部の実施形態では、逆方向反復は、配列番号５に由来する。一部の実施形態では、逆方向反復は、配列番号５の特定の部分（単数または複数）またはその逆向きの相補配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはより高い類似性を共有する、少なくとも１種のセンス配列および少なくとも１種のアンチセンス配列を含む。一部の実施形態では、逆方向反復は、配列番号５またはその逆向きの相補配列とハイブリダイズすることができる、少なくとも１種のセンス配列および少なくとも１種のアンチセンス配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、逆方向反復は、配列番号５の＋５３〜＋７３３に対応するセンス配列を含む。一部の実施形態では、逆方向反復は、配列番号５の＋５５２〜＋４９に対応するアンチセンス配列を含む。
【００１３】
本発明は、また、通常ではシュガーエンドの誘導をもたらす圃場条件下でシュガーエンドを有する塊茎を産生しないトランスジェニック植物体を産生するための方法と、インベルターゼサイレンシングを使用して、ゼブラチップの症状を最小にしまたはシュガーエンドの頻度を低減させる方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ジャガイモ植物体において遺伝子サイレンシングカセットを発現させることを含む。一部の実施形態では、カセットは、逆方向反復として配向されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む。一部の実施形態では、センス配列は、配列番号５に対して１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、アンチセンス配列は、センス配列の全長または部分的な逆向きの相補体配列である。一部の実施形態では、センス配列およびアンチセンス配列は、スペーサーにより離間されている。一部の実施形態では、発現カセットは、塊茎特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、塊茎特異的プロモーターは、センス配列およびアンチセンス配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、カセットの発現は、少なくとも１種の内在性インベルターゼ遺伝子の発現を下方調節し、これにより、ジャガイモ塊茎もしくは前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるシュガーエンドの頻度を最小にし、かつ／またはジャガイモ塊茎もしくは前記ジャガイモ塊茎から製造された製品におけるゼブラチップの症状を最小にする。一部の実施形態では、センス配列は、配列番号５の全長または部分配列に対して１００％同一である。一部の実施形態では、アンチセンス配列は、センス配列の逆向きの相補体配列に対して１００％同一である。例えば、センス配列は、配列番号３であり得、アンチセンス配列は、配列番号２１であり得る。一部の実施形態では、アンチセンス配列は、センス配列の逆向きの相補体配列に対して１００％同一というわけではないが、これと部分的に重複し、例えば、センス配列は、配列番号３であり得、アンチセンス配列は、配列番号４であり得る。
【００１５】
この遺伝子の有効性は、以前に低温誘導に厳密に関連付けされていたため、本発明の方法は予想外であった（Klannら、Plant Physiol １９９３年；BethkeおよびJiang、Plant Physiol ２０１０年；Yeら、J. Agric Food Chem ２０１０年）。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】シュガーエンド（ＳＥ）が、「Ｒａｎｇｅｒ」（Ａ）および空ベクター（Ｂ）対照フライのほとんど半分において明らかである。系統１６３２−１（Ｃ）および１６３２−４（Ｄ）は、インベルターゼがサイレンシングされており、対照と同じ条件下で育てて揚げたときにＳＥを示さない。
【図２】新鮮ジャガイモスライスにおける重度（Ａ）および軽度（Ｂ）のゼブラチップ症状。塊茎果肉の至るところに見られる組織壊死の重度症状は、収穫３５日前および収穫２８日前（ｄｂｈ）に感染した塊茎において明らかである。より少ない壊死が、２１ｄｂｈにおける軽度感染塊茎スライスにおいて明らかである。１４および７ｄｂｈにおける塊茎において、壊死はほとんどまたは全く観察されない。
【図３】（Ａ）収穫３５日前（ｄｂｈ）；（Ｂ）２８ｄｂｈ；（Ｃ）２１ｄｂｈ；（Ｄ）１４ｄｂｈ；および（Ｅ）７ｄｂｈにおける、「Ｒａｎｇｅｒ」対照（左側）およびインベルターゼをサイレンシングした系統１６３２−１（右側）由来のチップス試料。チップスを、６〜８個の塊茎のスライスから製造し、３７５°Ｆで３分間揚げた。最終２％含水量が達成された。
【図４】ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）のサイレンシングは、ゼブラチップに感染した塊茎の酸化的黒ずみを排除する。非感染品種「Ａｔｌａｎｔｉｃ」塊茎（Ａ）におけるポリフェノールオキシダーゼ作用は、切断した塊茎表面において無色のカテコール基質を暗色の沈殿物へと変換する。非感染（Ｂ）および感染（Ｃ）のＰｐｏサイレンシングされた塊茎のどちらも、黒ずみを示さない。３個の異なる塊茎を示す。写真は、切断した塊茎表面の全体に０．４Ｍカテコール溶液を適用してから１５分後に撮影した。
【図５】ノーザンは、インベルターゼ（Ａ）およびＰｐｏ（Ｂ）のサイレンシングを実証する。各ノーザンブロットの下に示すエチジウムブロマイド染色したＲＮＡゲルは、ローディング参照のためのものである。温室栽培した塊茎から全ＲＮＡ（２０μｇ）を単離した。遺伝子内事象および対照の塊茎組織を、Ｉｎｖ（Ａ）およびＰｐｏ（Ｂ）プローブとハイブリダイズさせた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読フォーマットのコピー（ファイル名：ＪＲＳＩ００２０２ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録された日付：２０１３年１１月８日、ファイルサイズ２０キロバイト）。
【００１８】
定義
本明細書において使用する場合、本明細書および特許請求の範囲において使用されている動詞「を含む」およびその活用形は、この単語に続くものが含まれるが、具体的に言及されていないものが除外されないことを意味するよう、その非限定的な意義で使用されている。
【００１９】
用語「ａ」または「ａｎ」は、その実体の１個またはそれより多くを指す；例えば、「遺伝子（ａ  ｇｅｎｅ）」は、１個もしくはそれより多くの遺伝子または少なくとも１個の遺伝子を指す。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１個またはそれより多く」および「少なくとも１個」は、本明細書において互換的に使用されている。加えて、文脈が、唯一の要素が存在することを明らかに要求するのでない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」の言及は、１個より多くの要素が存在する可能性を除外しない。
【００２０】
本明細書において使用する場合、用語「植物」は、植物界に属する任意の生きている生物体（即ち、植物界における任意の属／種）を指す。これは、樹木、草本、低木、イネ科草本、つる植物、シダ、コケおよび緑藻等が挙げられるがこれらに限定されない、身近な生物体を含む。この用語は、単子葉類とも呼ばれる単子葉植物と、双子葉類とも呼ばれる双子葉植物の両方を指す。例えば、一部の実施形態では、植物は、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓ．ｓｔｅｎｏｔｏｍｕｍ、Ｓ．ｐｈｕｒｅｊａ、Ｓ．ｇｏｎｉｏｃａｌｙｘ、Ｓ．ａｊａｎｈｕｉｒｉ、Ｓ．ｃｈａｕｃｈａ、Ｓ．ｊｕｚｅｐｃｚｕｋｉｉ、およびＳ．ｃｕｒｔｉｌｏｂｕｍ等、Ｓｏｌａｎｕｍ属における種である。一部の実施形態では、植物は、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ種のジャガイモ変種である。
【００２１】
本明細書において使用する場合、用語「植物体部分」は、シュート、根、茎、腋芽、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節、節間部、樹皮、毛じ、分げつ、根茎、葉状体、葉身、花粉、雄蕊、微小塊茎その他が挙げられるがこれらに限定されない、植物体のいずれかの部分を指す。
【００２２】
本明細書において使用する場合、用語「生殖質」は、生物体の遺伝的品質の物理的基盤を含むその特異的な分子的および化学的な構成を有する遺伝材料を指す。
【００２３】
本明細書において使用する場合、語句「から誘導された」は、起源またはソースを指し、天然に存在する、組換え、未精製の、または精製された分子を含み得る。起源またはソースから誘導された核酸またはアミノ酸は、本明細書の他の箇所で定義されているあらゆる種類のヌクレオチド変化またはタンパク質修飾を有し得る。
【００２４】
本明細書において使用する場合、用語「子孫」は、１種もしくはより多くの親植物体またはその末裔の栄養生殖または有性生殖から得られる後代として生じる任意の植物を指す。例えば、子孫植物体は、親植物体のクローニングもしくは自家受粉により、または２種の親植物体の交雑により得ることができ、自家受粉株、ならびにＦ１またはＦ２またはさらに後の世代を包含する。Ｆ１は、その少なくとも一方が形質のドナーとして初めて使用される親から産生される第一世代子孫であり、一方、第二世代（Ｆ２）またはその後の世代（Ｆ３、Ｆ４等）の子孫は、Ｆ１の自家受粉やＦ２の自家受粉等から産生される検体である。よって、Ｆ１は、２種の真の育種親（真の育種親は、ある形質についてホモ接合型である）間の交雑から得られた雑種であり得る（通常そうである）が、Ｆ２は、前記Ｆ１雑種の自家受粉から得られた子孫であり得る（通常そうである）。
【００２５】
本明細書において使用する場合、用語「交雑」、「交雑すること」、「他家受粉」または「交雑育種」は、ある植物体におけるある花の花粉が、別の植物体における花の胚珠（柱頭）に付けられる（人為的にまたは自然に）プロセスを指す。
【００２６】
本明細書において使用する場合、用語「栽培品種」は、園芸技法または農学技法によって産生され、通常は野生個体群に見いだされない、植物の変種、株または品種を指す。
【００２７】
本明細書において使用する場合、用語「植物体組織」は、植物体の任意の部分を指す。植物器官の例として、葉、茎、根、塊茎、種子、枝、毛じ（pubescence）、根粒（nodule）、葉腋（leaf  axil）、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花弁、花柄、柄、柱頭、花柱、苞葉、果実、幹、心皮、萼片、葯、胚珠、小花柄、針状葉、球果、根茎、ストロン、シュート、果皮、胚乳、胎座、液果、雄蕊および葉鞘が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において使用する場合、「植物プロモーター」は、その起源が植物細胞であるか否かにかかわらず、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターである。
【００２９】
本明細書において使用する場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミドの存在下における一晩（１２〜２４時間）、４２℃でのハイブリダイゼーションとその後の洗浄、または約１２時間〜約２４時間の約６５℃における５×ＳＳＣとその後の約１時間の６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「構成的プロモーター」は、大部分の条件下でおよび／または大部分の発生ステージにおいて活性を有するプロモーターである。植物バイオテクノロジーにおいて使用される発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用には、いくつかの利点があり、例えば：トランスジェニック細胞または植物の選択に使用される高レベルのタンパク質産生；容易な検出および定量化を可能にする、高レベルのレポータータンパク質またはスコア化可能なマーカーの発現；調節転写系の部分である転写因子の高レベル産生；植物における遍在的活性を要求する化合物の産生；ならびに植物発生の全ステージにおいて要求される化合物の産生。非限定的な例示的構成的プロモーターとして、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、オピンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター等が挙げられる。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「非構成的プロモーター」は、ある特定の条件下で、ある特定の種類の細胞において、および／またはある特定の発生ステージにおいて活性を有するプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先、細胞型特異的、細胞型優先、誘導性のプロモーターおよび発生制御下のプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生制御下のプロモーターの例として、茎、葉、根または種子等、ある特定の組織において転写を優先的に開始させるプロモーターが挙げられる。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「誘導性」または「抑制性」プロモーターは、化学要因または環境要因の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによって転写をもたらすことができる環境条件の例として、嫌気性条件またはある特定の化学物質または光の存在が挙げられる。
【００３３】
本明細書において使用する場合、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの相互作用する遺伝子調節レベルの結果である。したがって、本技術分野において、相同または近縁の植物種由来のプロモーターを使用して、特定の組織における導入遺伝子の効率的かつ信頼のおける発現を達成することが好ましい場合もある。これは、科学および特許文献の両方に、特定の植物体および組織から単離された組織特異的プロモーターが大量に見出される主な理由の１つである。組織特異的プロモーターの非限定例として、塊茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、根特異的プロモーター、花特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、分裂組織特異的プロモーター等が挙げられる。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「細胞型特異的」プロモーターは、１種またはそれより多くの器官におけるある特定の細胞型における発現を主に駆動するプロモーターである。
【００３５】
本明細書において使用する場合、用語「変種」は、他の類似の一連の個体とは形態または機能が明確に異なる、種内の個体の群からなる種の細区分を指す。
【００３６】
本明細書において使用する場合、用語「遺伝子型」は、個々の細胞、細胞培養物、組織、生物体（例えば、植物体）または生物群の遺伝的構成を指す。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「クローン」は、単一の前駆体から派生したかまたはこれから誘導され、これと遺伝的に同一または実質的に同一である、細胞、細胞群、部分、組織、生物（例えば、植物）または生物群を指す。一部の実施形態では、クローンは、少なくとも１回の無性ステップを含むプロセスにおいて産生される。
【００３８】
本明細書において使用する場合、用語「雑種」は、１種またはそれより多くの遺伝子が異なる親の間の交雑から得られた任意の個々の細胞、組織または植物体を指す。
【００３９】
本明細書において使用する場合、用語「近交系」または「近交系系統」は、相対的に真の育種系統を指す。
【００４０】
本明細書において使用する場合、用語「個体群」（population）は、共通の遺伝的由来を共有する植物体の遺伝的に均一または不均一なコレクションを意味する。
【００４１】
本明細書において使用する場合、用語「変種」または「栽培品種」は、構造的特色および性能により、同じ種内の他の変種から同定することができる同様の植物体群を意味する。用語「変種」は、本明細書において使用する場合、ジュネーブにおいて１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日および１９９１年３月１９日に改正された、１９６１年１２月２日の植物の新品種の保護に関する国際条約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）（ＵＰＯＶ条約）における対応する定義と同一の意義を有する。よって、「変種」は、最小の公知ランクの単一の植物学的分類群内の植物グループ分けを意味し、このグループ分けは、育成者権の付与の条件が完全に満たされるか否かにかかわらず、ｉ）所定の遺伝子型または遺伝子型の組合せにより得られる特徴の発現により定義されることができ、ｉｉ）前記特徴のうち少なくとも１種の発現により任意の他の植物グループ分けから区別されることができ、ｉｉｉ）無変化で繁殖することの適切性に関して１単位と考えることができる。
【００４２】
本明細書において使用する場合、語句「シュガーエンド」は、塊茎の一端、通常、ストロン端における高レベルの糖蓄積から生じる塊茎の生理的病害を指す。シュガーエンドを有する塊茎から得たフレンチフライは、望ましくない加工上の欠陥である暗褐色端を有する。
【００４３】
本明細書において使用する場合、用語「ゼブラチップ」は、ジャガイモキジラミＢａｃｔｅｒｉｃｅｒａ  ｃｏｃｋｅｒｅｌｌｉによって媒介される、病原体Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍによって引き起こされるジャガイモの病害を指す。ゼブラチップに感染したジャガイモから得たチップスおよびフレンチフライは、褐色とより明るい褐色との交互のパターンを有し、これにより通常商品に不適となる。
【００４４】
詳細な説明
ジャガイモ
世界中に約５千種類のジャガイモ変種が存在する。そのうち３千種類は、アンデス単独で、主に、ペルー、ボリビア、エクアドル、チリおよびコロンビアにおいて見出される。これらは、分類学の流派に応じて、８種または９種に属する。この５千種類の栽培変種とは別に、約２００種類の野生種および亜種が存在し、その多くは、栽培変種と交雑育種することができ、これが繰り返し為されて、ある特定の有害生物および病害に対する抵抗性を、野生種の遺伝子プールから栽培ジャガイモ種の遺伝子プールへと伝えてきた。
【００４５】
世界中で育てられている主要種は、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（４８本の染色体を有する四倍体）であり、この種の現代の変種が、最も広く栽培されている。４種類の二倍体種（２４本の染色体を有する）も存在する：Ｓ．ｓｔｅｎｏｔｏｍｕｍ、Ｓ．ｐｈｕｒｅｊａ、Ｓ．ｇｏｎｉｏｃａｌｙｘ、およびＳ．ａｊａｎｈｕｉｒｉ．。２種類の三倍体種（３６本の染色体を有する）が存在する：Ｓ．ｃｈａｕｃｈａおよびＳ．ｊｕｚｅｐｃｚｕｋｉｉ。１種類の五倍体栽培種（６０本の染色体を有する）が存在する：Ｓ．ｃｕｒｔｉｌｏｂｕｍ。Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍには２種類の主要亜種が存在する：ａｎｄｉｇｅｎａ、すなわちアンデス系；およびｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、すなわちチリ系。アンデス系ジャガイモは、この起源の山岳赤道地方および熱帯地方においてよく見られる短日条件に適応している。チロエ諸島（Ｃｈｉｌｏｅ’  Ａｒｃｈｉｐｅｌａｇｏ）が原産のチリ系ジャガイモは、チリ南部のより高緯度地方においてよく見られる長日条件に適応している。
【００４６】
ジャガイモは、収量が多く、植物が土壌から十分な水を集めてデンプン質の塊茎を形成するのに十分なほど気候が冷涼で湿潤である限り、多様な気候に容易に適応する。ジャガイモは、貯蔵において非常に長持ちする訳ではなく、貯蔵塊茎で育ちこれを急速に腐敗させるカビに対し脆弱である。対照的に、穀物は、大した腐敗のリスクがなく、数年間貯蔵することができる。
【００４７】
ジャガイモは、ビタミンおよびミネラル、ならびにカロテノイドおよび天然フェノール等の植物化学物質一式を含有する。クロロゲン酸は、ジャガイモ塊茎天然フェノールのうちの最大で９０％を構成する。他にも、４−Ｏ−カフェオイルキナ酸（クリプト−クロロゲン酸）、５−Ｏ−カフェオイルキナ酸（ネオ−クロロゲン酸）、３，４−ジカフェオイルキナ酸および３，５−ジカフェオイルキナ酸がジャガイモに見出されている［５８］。皮付きの中サイズの１５０ｇ（５．３ｏｚ）のジャガイモは、２７ｍｇのビタミンＣ（一日摂取量（Daily  Value；ＤＶ）の４５％）、６２０ｍｇのカリウム（ＤＶの１８％）、０．２ｍｇのビタミンＢ６（ＤＶの１０％）ならびに微量のチアミン、リボフラビン、フォレート、ナイアシン、マグネシウム、リン、鉄および亜鉛を提供する。皮付きジャガイモの繊維含量（２ｇ）は、多くの全粒粉パン、パスタおよびシリアルのものに等しい。
【００４８】
栄養の観点から、ジャガイモは、その炭水化物含量（中型ジャガイモにおいておよそ２６グラム）で最もよく知られている。この炭水化物の優勢的な形態は、デンプンである。このデンプンのごく一部ではあるが重大な一部は、胃および小腸における酵素による消化に対し抵抗性であり、よって、基本的に無傷で大腸に達する。この難消化性デンプンは、繊維と同様の生理的効果および健康利益を有すると考えられる：これは、かさをもたらし、結腸がんに対する保護を与え、耐糖能およびインスリン感受性を改善し、血漿コレステロールおよびトリグリセリドの濃度を下げ、満腹を増加させ、おそらく、脂肪貯蔵を低下させさえする。ジャガイモにおける難消化性デンプンの量は、調製方法に大いに依存する。ジャガイモを調理し、続いて冷却すると、難消化性デンプンが有意に増加される。例えば、調理したジャガイモデンプンは、約７％の難消化性デンプンを含有し、これは、冷却すると約１３％に増加する。
【００４９】
ジャガイモは、育種されて、多くの標準または周知変種となり、そのそれぞれが、特定の農業属性または料理属性を有する。一般に、変種は、共通の特徴に基づきラセット、赤、白、黄（Ｙｕｋｏｎとも呼ばれる）および紫等、いくつかの主要な群へと分類される。料理目的のため、変種は、多くの場合、その粘質性（waxiness）の観点から説明される。粉っぽい、すなわち粉質（焼き）ジャガイモは、粘質の（茹で）ジャガイモ（１６〜１８％）よりも多くのデンプン（２０〜２２％）を有する。この差異は、アミロースおよびアミロペクチンの比較比率のバリエーションからも生じ得る。一部の実施形態では、本発明のジャガイモ変種は、Ｗｈｉｔｅ  Ｒｏｕｎｄｓジャガイモ変種、Ｒｅｄ  Ｒｏｕｎｄｓジャガイモ変種またはＲｕｓｓｅｔジャガイモ変種である。
【００５０】
一部の実施形態では、ジャガイモは、ジャガイモ生殖質のＩＳＯ公認コレクションを保持する、ペルーのリマを拠点にする国際ポテトセンター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託された変種である。国際ジャガイモゲノム配列決定コンソーシアム（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）は、ジャガイモゲノムのドラフト配列を達成したことを２００９年に発表した。ジャガイモゲノムは、１２本の染色体および８億６千万塩基対を含有し、中型サイズの植物ゲノムとする。現在育てられているジャガイモの現在の全変種の９９パーセント超は、チリ中南部の低地にかつて育てられていた亜種の直接の末裔である。一部の他の実施形態では、ジャガイモは、欧州栽培ジャガイモデータベース（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄａｔａｂａｓｅｄ）（ＥＣＰＤ）、米国ポテト協会（Ｐｏｔａｔｏ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、コーネルジャガイモ変種リスト（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  Ｌｉｓｔ）、カナダジャガイモ変種登録（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）、ＵＰＯＶジャガイモ変種コレクション（ＵＰＯＶ  ｐｏｔａｔｏ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、英国ジャガイモ変種データベース（Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、国際ポテトセンター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ジャガイモ変種管理研究所（Ｐｏｔａｔｏ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、米国ジャガイモＧｅｎＢａｎｋ、ノースカロライナ州立大学ジャガイモ変種データベース、テキサスＡ＆Ｍジャガイモ育種＆変種開発プログラム（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ＆  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）、ミシガン州立大学ジャガイモ育種および遺伝学プログラム（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ）ならびに北米ジャガイモ変種目録（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）等に含まれる変種である。
【００５１】
本発明のための例示的なジャガイモ変種として、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｉｎｎｏｖａｔｏｒ、Ａｔｌａｎｔｉｃ、Ｕｍａｔｉｌｌａ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ａｄｉｒｏｎｄａｃｋ  Ｂｌｕｅ、Ａｄｉｒｏｎｄａｃｋ  Ｒｅｄ、Ａｇａｔａ、Ａｌｍｏｎｄ、Ａｐｌｉｎｅ、Ａｌｔｕｒａｓ、Ａｍａｎｄｉｎｅ、Ａｎｎａｂｅｌｌｅ、Ａｎｙａ、Ａｒｒａｎ  Ｖｉｃｔｏｒｙ、Ａｖａｌａｎｃｈｅ、Ｂａｍｂｅｒｇ、Ｂａｎｎｏｃｋ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｂｅｌｌｅ  ｄｅ  Ｆｏｎｔｅｎａｙ、ＢＦ−１５、Ｂｉｌｄｔｓｔａｒ、Ｂｉｎｔｊｅ、Ｂｌａｚｅｒ、Ｂｕｓｓｅｔ、Ｂｌｕｅ  Ｃｏｎｇｏ、Ｂｏｎｎｏｔｔｅ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｑｕｅｅｎｓ、Ｃａｂｒｉｔａｓ、Ｃａｍｏｔａ、Ｃａｎｅｌａ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｃａｒａ、Ｃａｒｏｌａ、Ｃｈｅｌｉｎａ、Ｃｈｉｌｏｅ’、Ｃｉｅｌｏ、Ｃｌａｖｅｌａ  Ｂｌａｎｃａ、Ｄｅ’ｓｉｒｅ’ｅ、Ｅｓｔｉｍａ、Ｆｉａｎｎａ、Ｆｉｎｇｅｒｌｉｎｇ、Ｆｌａｖａ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｂｕｔｔｅｒｂａｌｌ、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｏｎｄｅｒ、Ｇｏｌｄｒｕｓｈ、Ｈｏｍｅ  Ｇｕａｒｄ、Ｉｒｉｓｈ  Ｃｏｂｂｌｅｒ、Ｊｅｒｓｅｙ  Ｒｏｙａｌ、Ｋｅｎｎｅｂｅｃ、Ｋｅｒｒ’ｓ  Ｐｉｎｋ、Ｋｅｓｔｒｅｌ、Ｋｅｕｋａ  Ｇｏｌｄ、Ｋｉｎｇ  Ｅｄｗａｒｄ、Ｋｉｐｆｌｅｒ、Ｌａｄｙ  Ｂａｌｆｏｕｒ、Ｌａｎｇｌａｄｅ、Ｌｉｎｄａ、Ｍａｒｃｙ、Ｍａｒｆｏｎａ、Ｍａｒｉｓ  Ｐｉｐｅｒ、Ｍａｒｑｕｉｓ、Ｍｅｇａｃｈｉｐ、Ｍｏｎａｌｉｓａ、Ｎｉｃｏｌａ、Ｐａｃｈａｃｏｎ〜ａ、Ｐｉｋｅ、Ｐｉｎｋ  Ｅｙｅ、Ｐｉｎｋ、Ｆｉｒ  Ａｐｐｌｅ、Ｐｒｉｍｕｒａ、Ｒａｔｔｅ、Ｒｅｃｏｒｄ、Ｒｅｄ  ＬａＳｏｄａ、Ｒｅｄ  Ｎｏｒｌａｎｄ、Ｒｅｄ  Ｐｏｎｔｉａｃ、Ｒｏｏｓｔｅｒ、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｎｏｒｋｏｔａｈ、Ｓｅｌｍａ、Ｓｈｅｐｏｄｙ、Ｓｉｅｇｌｉｎｄｅ、Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ、Ｒｕｓｓｅｔ、Ｓｉｒｃｏ、Ｓｎｏｗｄｅｎ、Ｓｐｕｎｔａ、Ｓｔｏｂｒａｗａ、Ｓｕｐｅｒｉｏｒ、Ｖｉｖａｌｄｉ、Ｖｉｔｅｌｏｔｔｅ、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｉｎｎ、Ｙｕｋｏｎ  Ｇｏｌｄ、青色ジャガイモ変種（例えば、Ｃｒｅａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｏｐ）、Ｉｇｏｒｏｔａ、Ｓｏｌｉｂａｏ、Ｇａｎｚａ、Ｅｌｉａｎｅ、ＢｅｌＲｕｓ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｈｉｌｉｔｅ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｋｒａｎｔｚ、Ｌｅｍｈｉ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｎｏｏｋｓａｃｋ、Ｎｏｒｇｏｌｄ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｎｏｒｋｉｎｇ  Ｒｕｓｓｅｔ、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｎｕｇｇｅｔ、Ａｌｌｅｇａｎｙ、Ｂｅａｃｏｎ  Ｃｈｉｐｐｅｒ、ＣａｌＷｈｉｔｅ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｓｔｉｌｅ、Ｃｈｉｐｅｔａ、Ｇｅｍｃｈｉｐ、Ｉｔａｓｃａ、Ｉｖｏｒｙ  Ｃｒｉｓｐ、Ｋａｎｏｎａ、Ｋａｔａｈｄｉｎ、Ｋｅｎｎｅｂｅｃ  Ｓｔｏｒｙ、Ｌａ  Ｃｈｉｐｐｅｒ、Ｌａｍｏｋａ、Ｍｏｎｏｎａ、Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ、Ｎｏｒｃｈｉｐ、Ｎｏｒｗｉｓ、Ｏｎａｗａｙ、Ｃｈｉｅｆｔａｉｎ、Ｌａ  Ｒｏｕｇｅ、ＮｏｒＤｏｎｎａ、Ｎｏｒｌａｎｄ、Ｒｅｄ  Ｌａ  Ｓｏｄａ、Ｒｅｄ  Ｐｏｎｔｉａｃ、Ｒｅｄ  Ｒｕｂｙ、Ｓａｎｇｒｅ、Ｖｉｋｉｎｇ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｐｉｋｅ、Ｓｅｂａｇｏ、Ｓｈｅｐｏｄｙ、Ｓｎｏｗｄｅ��、Ｓｕｐｅｒｉｏｒ、Ｗａｎｅｔａ、Ｗｈｉｔｅ  Ｐｅａｒｌ、Ｗｈｉｔｅ  Ｒｏｓｅａｎｄおよびあらゆる遺伝子改変変種が挙げられるがこれらに限定されない。さらなるジャガイモ変種は、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる、Cloughら、Hort Technology、２０１０年、２０巻（１号）：２５０〜２５６頁；Potato Variety Handbook、National Institute of Agricultural Botany、２０００年；Chaseら、North American Potato Variety Inventory、Potato Association of America、１９８８年に記載されている。
【００５２】
伝統的なジャガイモ成長は、５フェーズに分けられてきた。第１フェーズにおいて、種イモから芽が出て、根の成長が始まる。第２フェーズにおいて、植物が葉および枝を発達させるにつれて光合成が始まる。第３フェーズでは、葉腋下部の茎からストロンが発達し、地面へと下向きに成長し、このストロンにおいて、ストロンの膨らみと共に新たな塊茎が発達する。このフェーズは、しばしば（しかし、必ずしもそうとは限らないが）開花を伴う。塊茎形成は、地温が８０°Ｆ（２６．７℃）に達すると停止する；したがって、ジャガイモは、寒冷期作物と考えられる。植物が、その新たに形成された塊茎においてその資源の大部分を費やし始めると、第４フェーズにおいて塊茎膨化が起こる。このステージにおいて、収量を得るためにいくつかの要因が決定的となる：最適土壌水分および温度、土壌栄養素利用能およびバランスならびに有害生物攻撃に対する抵抗性。最終フェーズは成熟である：植物体地上部が枯れ、塊茎の皮が硬化し、その糖がデンプンに変換される。
【００５３】
ジャガイモを使用して、アルコール飲料、ヒトや家畜用の食物を生産することができる。ジャガイモデンプンは、食品産業においてスープおよびソースの増粘剤および結合剤として、繊維産業において接着剤として、また、紙および板の製造のために使用することができる。廃棄ジャガイモを使用して、プラスチック製品のためのポリ乳酸を生産することができる、または生分解性包装の基剤として使用することができる。ジャガイモの皮は、蜂蜜と共に、熱傷のための民間療法である。新鮮なジャガイモは、焼き、茹で、または揚げて、驚異的な範囲のレシピにおいて使用される：数例を挙げると、マッシュポテト、ジャガイモのパンケーキ、ジャガイモのダンプリング、トゥワイス・ベークド・ポテト、ジャガイモのスープ、ポテトサラダおよびポテトグラタン。ジャガイモを使用して、世界中のレストランおよびファストフードのチェーン店で出されるフレンチフライ（英国での「チップス」）、またはポテトクリスプ（米国での「チップス」）等のスナック食品を生産することもできる。脱水されたジャガイモフレークは、小売マッシュポテト製品において、スナックにおける成分として、さらには食糧援助として使用される。別の脱水製品であるジャガイモ粉は、食品産業によって、肉混合物を結合し、グレイビーおよびスープを濃くするために使用される。ジャガイモデンプンは、コムギデンプンおよびトウモロコシデンプンよりも高い粘度をもたらし、より美味な製品を届ける。これは、ソースおよびシチューのための増粘剤として、ケーキミックス、ドウ、ビスケットおよびアイスクリームにおける結合剤として使用される。東欧およびスカンジナビアにおいて、破砕したジャガイモを加熱して、そのデンプンを発酵性糖に変換し、これをウォッカおよびアクアビット等のアルコール飲料の蒸留において使用する。
【００５４】
サツマイモ
サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ）は、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ科に属する双子葉植物である。その大型のデンプン質の甘味がある塊状根は、重要な根菜である。若い葉およびシュートが、葉もの野菜として食されることもある。Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅのおよそ５０属および１，０００種超のうち、Ｉ．ｂａｔａｔａｓは、主要で重要な唯一の作物である  −  他のいくつかは地域により使用されているが、多くは実際には有毒である。サツマイモは、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）とは遠縁でしかない。柔らかくオレンジ色のサツマイモは、北米の一部で「ヤムイモ」と誤表示されることが多いが、サツマイモは、アフリカおよびアジアが原産で単子葉類Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ科に属する本物のヤムイモとは植物学的に非常に明確に異なる。
【００５５】
インベルターゼ
インベルターゼ（Ｉｎｖ）（ＥＣ３．２．１．２６）、別名、ベータ−フルクトフラノシダーゼは、スクロースの加水分解を触媒し、フルクトースおよびグルコースをもたらす酵素である。スクラーゼは、インベルターゼに関係する。インベルターゼおよびスクラーゼは、スクロースを加水分解して、グルコースおよびフルクトースの同じ混合物を与える。インベルターゼが、Ｏ−Ｃ（フルクトース）結合を切断する一方、スクラーゼは、Ｏ−Ｃ（グルコース）切断を開裂する。
【００５６】
ジャガイモインベルターゼは、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bhaskarら、Plant Physiology、２０１０年１０月、１５４巻、９３９〜９４８頁、Draffehnら、BMC Plant Biology、２０１０年、１０巻：２７１頁、Yeら、J. Agric. Food Chem.、２０１０年、５８巻：１２１６２〜１２１６７頁および米国特許第７０９４６０６号に記載されている。追加的なジャガイモインベルターゼは、ＤＱ４７８９５０．１、ＪＮ６６１８５９．１、ＪＮ６６１８６０．１、ＡＹ３４１４２５．１、ＪＮ６６１８５４．１、ＥＵ６２２８０６．１、Ｌ２９０９９．１、ＪＮ６６１８５７．１、ＪＮ６６１８５５．１、ＪＮ６６１８５８．１、ＪＮ６６１８５６．１、ＪＮ６６１８５３．１、ＪＮ６６１８５２．１、ＥＵ６２２８０７．１、Ｘ７０３６８．１、ＪＮ６６１８６２．１、およびＪＮ６６１８６１．１の受託番号でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。ジャガイモインベルターゼに対し高い相同性を共有する配列は、ＨＨ７７２３２１．１、ＨＨ７７２３２３．１、ＨＨ７７２３２４．１、ＨＨ７７２３２２．１、ＡＲ９２８２１９．１、ＢＤ０７３５７０．１、Ｉ６１４２９．１、Ｉ２９０７１．１、Ｉ６４６４１．１、Ｅ５４１０５．１、Ｅ１６２９３．１、Ｅ０８９７６．１、Ｅ０９８５３．１、Ｅ０７１０８．１、ＨＨ９７７８０６．１、Ｉ６４６４４．１、Ｉ６４６４２．１、Ｉ２９０７４．１およびＩ２９０７２．１の受託番号でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。当業者であれば、公知のジャガイモインベルターゼ遺伝子に基づき追加的なジャガイモインベルターゼ遺伝子を同定および単離することができよう。
【００５７】
シュガーエンド
シュガーエンドは、ジャガイモの加工において主に観察される内部塊茎病害であり、大部分は、「Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ」等の長い塊茎に生じる。これは、通常は塊茎の茎側の端である、フレンチフライの一端の揚げた後の黒ずみとして顕れる。
シュガーエンドは、低温貯蔵したジャガイモ塊茎における還元糖の蓄積の現象である低温誘導性の甘味化とは異なる（DaleおよびBradshaw、２００３年、Progress in improving processing attributes in potato、Trends Plant Sci ８巻：３１０〜３１２頁；Bhaskarら、Suppression of the Vacuolar Invertase Gene Prevents Cold-induced Sweetening in Potato、Plant Physiology、２０１０年１０月、１５４巻：９３９〜９４８頁）。低温誘導性の甘味化は、そのプロセスにおけるヘキソース糖の蓄積による、多くの栽培品種におけるジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）の塊茎の低温貯蔵後の塊茎品質課題である。これは、デンプンがスクロースに分解し、これが液胞酸性インベルターゼによりグルコースおよびフルクトースへと切断されることが原因で起こる。影響をうけた塊茎の加工の際に、焼くことや揚げることに関与する高温は、還元糖と遊離アミノ酸との間にメイラード反応を引き起こし、アクリルアミドの蓄積をもたらす。しかし、シュガーエンドは、ストロン付着領域付近の一端に蓄積する還元糖のカラメル化が原因の黒ずみを指す。シュガーエンドは、典型的には、塊茎開始および初期膨化において高い気温および地温の期間を耐える必要があった植物に関連する。いかなる理論に制約されることも望まないが、高い地温は、塊茎における糖からデンプンへの変換を阻害し、影響をうけた組織における還元糖の濃度を増加させると考えられている（Thompsonら、Am. J. Potato Res.８５巻（５号）：３７５〜３８６頁、２００８年）。この決定的な時期における水欠乏も、組織間の糖の輸送に干渉することによりシュガーエンドを増悪化させ得る。栽培者がシュガーエンドに対抗する必要がある管理オプションは、初期塊茎膨化において水分ストレスが最小にされることを確実にすることと、シーズンを通して茎葉地上部が急速に達成および保存される環境を作ることとを含む。シュガーエンドは、農家に、高品質作物を生育する潜在力が最大化された領域および圃場でジャガイモを育てることを強いる場合がある。
【００５８】
ゼブラチップ
ジャガイモ栽培者にとって懸念となる新たな生物的ストレスは、細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍによって引き起こされるゼブラチップである。Secorら（Association of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ with Zebra Chip Disease of Potato Established by Graft and Psyllid Transmission, Electron Microscopy, and PCR、Plant Diseases、９３巻（６号）：５７４〜５８３頁）およびLieftingら（‘Candidatus Liberibacter solanacearum’, associated with plants in the family Solanaceae、International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology、２００９年、５９巻（９号）：２２７４〜２２７６頁）を参照されたい。２０００年にテキサス南部において最初に発見されたゼブラチップ（ＺＣ）は、ミシシッピ川の西側の全主要ジャガイモ生産州へと広がった。これは、グアテマラ、ホンジュラス、メキシコおよびニュージーランドにおいても主要な問題であり、感染植物についた塊茎における収量低下および品質課題を引き起こす。現在、公知のＺＣ病原体遺伝的抵抗性は存在しない。栽培者は、殺虫剤を散布して、この病害の媒介昆虫、ジャガイモキジラミ（Ｂａｃｔｅｒｉｃｅｒａ  ｃｏｃｋｅｒｅｌｌｉ）を妨害することしかできない。ＺＣ病原体は、感染した塊茎に、チップスを製造して揚げた後に暗色および明色の変色の劇的な縞模様のパターンを提示させる。特徴的な縞模様が、進行した細胞死を示す重度に感染した塊茎と、目に見える細胞死が全くない軽度に感染した塊茎から明らかである。
【００５９】
ゼブラチップに感染した塊茎は、フェノール類化合物およびチロシンのレベルが上昇し、これは、切断した塊茎の急速な褐変応答の原因となり得る（Navarreら、Amer. J. Potato Res.８６巻：８８〜９５頁、２００９年）。ゼブラチップに罹患したジャガイモ塊茎は、宿主フェノール類、アミノ酸および防御関連タンパク質のレベル増加により特徴付けられる（Wallisら、Physiological and Molecular Plant Pathology ７８巻（２０１２年）６６〜７２頁）。ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）のサイレンシングは、以前に塊茎における症状発現の低下に関連付けされたため（Rommensら、J. Agric. Food Chem.２００６年、５５巻、９８８２〜９８８７頁）、Ｐｐｏサイレンシングが、感染塊茎におけるＺＣの症状を減少させ得ることが仮定されよう。しかし、Ｐｐｏサイレンシングが、病害易罹患性の高まりに関連し得るという仮定も存在するため（Thipyapongら、Planta ２００４年、２２０巻、１０５〜１１７頁）、Ｐｐｏサイレンシングは、ＺＣの症状および重症度を単に悪化させるかもしれない。本発明は、ＺＣ感染塊茎におけるＰｐｏ応答の高まりを確認するが、ＺＣに感染したフライドポテトにおけるカラメル化色を減少させる能力を示さない。さらに、Ｐｐｏサイレンシングしていない系統と比較してＰｐｏサイレンシングした系統における症状発症の減少を示すことは不可能であった。上述の参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒは、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科におけるグラム陰性細菌の属である。用語Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓは、培養においてこの細菌を維持することが可能であると判明していないことを示すために使用される。ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ類の検出は、特異的プライマーによるその１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に基づく。この属のメンバーは、キジラミによって大部分が伝染される植物病原体である。この属は本来、Ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒと綴った。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒの非限定的な種として、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｐｓｙｌｌａｕｒｏｕｓおよびＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍが挙げられる。
【００６１】
「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ」の完全ゲノム配列は、開示されている（Linら、The Complete Genome Sequence of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’, the Bacterium Associated with Potato Zebra Chip Disease、PLOS One、２０１、６巻（４号）：ｅ１９１３５）。予備的伝染治験は、Ｂ．ｃｏｋｅｒｅｌｌｉが、「Ｃａ．Ｌ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ」の媒介者であることを強く示唆した。キジラミがこの細菌を獲得できることが実証されたが、伝染を確認する必要がある。加えて、疾患疫学の多くの他の側面が、未だに研究されていない（例えば、種子または接木を通した伝染）。長い距離を超えて、感染植物およびキジラミの取引は、この細菌を広げることができる。「Ｃａ．Ｌ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ」は、他のキジラミ種であるＢ．ｔｒｉｇｏｎｉｃａおよびＴ．ａｐｉｃａｌｉｓと関連して、ならびに他の病原体（例えば、Ａｓｔｅｒ  ｙｅｌｌｏｗｓ  ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｃｉｔｒｉ）との混合型感染において見出された。
【００６２】
「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ」の存在または非存在は、当業者に公知の任意の方法により、例えば、ジャガイモ塊茎におけるゼブラチップ症状を観察することにより、または従来のもしくはリアルタイムＰＣＲ等のヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づく方法により検出することができる（Crosslinら、「Detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in the Potato Psyllid, Bactericera cockerelli (Sulc), by Conventional and Real-Time PCR」、Southwestern Entomologist、３６巻（２号）：１２５〜１３５頁、２０１１年）。他の方法として、沈降および凝集検査、イムノゴールド標識、免疫吸着電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ（例えば、ラテラルフロー検査またはＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ＲＩＡならびに／またはドットブロット検査ならびにこれらの組合せからなる群から選択される免疫学的検出検査が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
方法
本発明は、フレンチフライまたはチップス等、ジャガイモ製品におけるシュガーエンドの発生率がより低いジャガイモ塊茎を産生する方法を提供する。本発明は、また、ゼブラチップ病原体に軽度に感染したが、低力価の病原体の存在にもかかわらず、重症度の低い症状を有する、例えば、揚げた後に退色が少ないジャガイモ製品を製造するための方法を提供する。
【００６４】
ジャガイモ製品におけるシュガーエンドの発生率は、後述する実施例１に記載されている方法等、当業者に公知の方法により評価することができる。一部の実施形態では、ジャガイモ製品のためのＵＳＤＡマンセルカラーチャート等、カラーチャートの助けを借りて、検査しようとするジャガイモ塊茎から製造されたジャガイモ製品の色が、シュガーエンドの指標として使用され、対照ジャガイモ塊茎から製造されたジャガイモ製品に対して測定される。適した対照ジャガイモ塊茎は、破壊されていないインベルターゼを有する任意の対応するジャガイモ変種であり得るが、対照ジャガイモ塊茎は、検査しようとするジャガイモ塊茎と同じ条件下で生育、収穫および処理されている。一部の実施形態では、シュガーエンド表現型を有する、本発明のジャガイモ塊茎から製造されたジャガイモ製品のパーセンテージは、対照ジャガイモ塊茎のパーセンテージよりも有意に低い。例えば、シュガーエンド表現型を有する、本発明のジャガイモ塊茎から製造されたジャガイモ製品のパーセンテージは、約０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％である。
【００６５】
ジャガイモ製品におけるゼブラチップ（ＺＣ）病原体の症状は、後述する実施例２に記載されている方法等、当業者に公知の方法により評価することができる。一部の実施形態では、植物が病原体で処理された後の塊茎において、ＺＣ重症度の目視評価（即ち、塊茎果肉の壊死性斑点形成）を行うことができる。症状重症度の査定において、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒの存在または非存在についてのＰＣＲ検証用に塊茎試料を採取した。ＺＣの存在は、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ陽性キジラミ（pysllids）に植物をより長時間曝露するにつれてますます暗色になるチップスと相関する。一部の実施形態では、揚げた製品に関して、製品は、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間またはそれより長く約３００Ｆ、３５０Ｆ、４００Ｆまたは４５０Ｆの油で揚げて、比較前に製品における約１％、２％、３％、％、５％の最終水分を達成することができる。一部の実施形態では、製品の発色は、目視観察により検査され、Ａｇｔｒｏｎ読み取り値に反映される。より高いＡｇｔｒｏｎ読み取り値は、より明るい色に相関する。破壊されたインベルターゼ遺伝子を有するジャガイモ塊茎から製造された製品は、対照ジャガイモ塊茎から製造された製品と比較してより明るい色を有し、重症度のより低い症状を示す。
【００６６】
一部の実施形態では、本方法は、前記ジャガイモ植物におけるインベルターゼ遺伝子／酵素活性を破壊することを含む。一部の実施形態では、インベルターゼは、液胞インベルターゼである。一部の実施形態では、インベルターゼ遺伝子／酵素活性は、少なくともジャガイモ塊茎において破壊される。一部の実施形態では、インベルターゼ遺伝子／酵素活性は、ジャガイモ塊茎においてのみ破壊される。本明細書において使用される場合、用語「破壊される」、「破壊する」または「破壊」は、ジャガイモ植物における液胞インベルターゼ酵素活性が、対照植物におけるインベルターゼ酵素活性と比較して下がる、減少する、またはさらには完全に消失することができる仕方で改変されることを指す。
【００６７】
酵素の活性を破壊する方法は、当業者に公知である。これらの方法として、変異誘発（例えば、化学的変異誘発、放射線変異誘発、トランスポゾン変異誘発、挿入変異誘発、符号タグ化変異誘発、部位特異的変異誘発および天然変異誘発）、ノックアウト／ノックイン、アンチセンスおよびＲＮＡ干渉が挙げられるがこれらに限定されない。様々な種類の変異誘発を使用して、破壊された液胞インベルターゼ酵素活性を有するジャガイモ植物を産生および単離することができる。このようなものとして、部位特異的、ランダム点変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップを有する二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発その他が挙げられるがこれらに限定されない。追加的な適した方法は、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、総遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復その他を含む。例えば、キメラ構築物に関与する変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、天然に存在する分子または変更もしくは変異した天然に存在する分子の公知情報、例えば、配列、配列比較、物理特性、結晶構造その他によりガイドされ得る。薬剤、プロトコール等、植物における変異誘発のさらなる情報に関して、Acquaahら（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Principles of plant genetics and breeding、Wiley-Blackwell、２００７年、ＩＳＢＮ  １４０５１３６４６４、９７８１４０５１３６４６４）を参照されたい。
【００６８】
一部の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ干渉のためのヌクレオチド配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび／または立体妨害オリゴヌクレオチド等、１種またはより多くの阻害性ヌクレオチド配列を使用することにより、ジャガイモ植物における内在性インベルターゼ遺伝子の活性を破壊することを含む（それぞれ、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Koleら、RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides、Drug Discovery、２０１２年、１１巻：１２５〜１４０頁；Ossowskiら、Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs、The Plant Journal、２００８年、５３巻（４号）：６７４〜６９０頁；Wangら、Application of gene silencing inplants、Current Opinion in Plant Biology、２００２年、５巻（２号）：１４６〜１５０頁；Vaucheretら、Post-transcriptional gene silencing in plants、Journal of Cell Science、２００１年、１１４巻：３０８３〜３０９１頁；Stamら、Review Article: The Silence of Genesin Transgenic Plants、annals of Botany、７９巻（１号）：３〜１２頁；Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis、The Plant Cell、２００６年、１８巻（５号）：１１２１〜１１３３頁；David Allisら、Epigenetics、CSHL Press、２００７年、ＩＳＢＮ  ０８７９６９７２４５、９７８０８７９６９７２４；Sohailら、Gene silencing by RNA interference:technology and application、CRC Press、２００５年、ＩＳＢＮ  ０８４９３２１４１７、９７８０８４９３２１４１２；Engelkeら、RAN Interference、Academic Press、２００５年、ＩＳＢＮ  ０１２１８２７９７６、９７８０１２１８２７９７７；およびDoranら、RNA Interference: Methods for Plants and Animals、CABI、２００９年、ＩＳＢＮ  １８４５９３４１０５、９７８１８４５９３４１０１を参照されたい）。
【００６９】
阻害性ヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーター等、植物プロモーターに作動可能に連結することができる。
【００７０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、動物および植物における配列特異的、転写後遺伝子サイレンシングまたは転写遺伝子サイレンシングのプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と配列が相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される。本発明において有用な好ましいＲＮＡエフェクター分子は、本発明の方法のいずれかが行われた後に機能が攪乱されていないことが企図されるいかなる宿主ポリヌクレオチド配列とも配列が十分に明確に異なっている必要がある。コンピューターアルゴリズムを使用して、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列と宿主の必須正常配列との間の相同性の必須の欠如を定義することができる。
【００７１】
用語「ｄｓＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ分子」または「二本鎖ＲＮＡエフェクター分子」は、二本鎖高次構造である少なくとも約１９ヌクレオチドまたはそれより長いヌクレオチドの領域を含有する少なくとも部分的に二本鎖のリボ核酸分子を指す。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、２本の別々のＲＮＡ鎖から形成された二重鎖の二本鎖ＲＮＡであり得る、または少なくとも部分的に二本鎖のヘアピン高次構造（即ち、ヘアピンｄｓＲＮＡまたはステムループｄｓＲＮＡ）を採ることができる自己相補性領域を有する単一のＲＮＡ鎖であり得る。様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リボヌクレオチドから完全になる、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド等、リボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物からなる。ｄｓＲＮＡは、分子のある１セグメントにおけるヌクレオチドが、分子の別の１セグメントにおけるヌクレオチドと塩基対形成するように、自己相補性領域を有する単一の分子であり得る。一態様では、自己相補性領域同士は、分子の別の部分に対する相補性を欠き、よって一本鎖を維持する、少なくとも約３〜４ヌクレオチドまたは約５、６、７、９〜１５ヌクレオチドもしくはそれより長い領域（即ち、「ループ領域」）によって連結される。かかる分子は、短い一本鎖５’および／または３’末端を場合によって有する、部分的に二本鎖のステムループ構造をとる。一態様では、ヘアピンｄｓＲＮＡの自己相補性領域または二重鎖ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、エフェクター配列およびエフェクター相補体（例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡにおける一本鎖ループ領域によって連結された）を含む。エフェクター配列またはエフェクター鎖は、ＲＩＳＣに組み入れられるまたはこれと会合する二本鎖領域または二重鎖の鎖である。一態様では、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、インベルターゼ遺伝子のＲＮＡに対する逆向きの相補体または逆鎖複製中間体である、少なくとも１９連続したヌクレオチドエフェクター配列、好ましくは、１９〜２９、１９〜２７もしくは１９〜２１またはより長いヌクレオチドを含む。
【００７２】
一実施形態では、前記二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、ジャガイモの植物体、植物組織または植物細胞に、１種またはそれより多くの二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含む発現構築物を与えることにより提供される。一実施形態では、発現構築物は、ジャガイモにおけるインベルターゼ遺伝子に由来する二本鎖ＲＮＡを含む。
【００７３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、「ヘアピンｄｓＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡヘアピン」、「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」、即ち、少なくとも１５〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７〜５０ｎｔ、１９〜２９ｎｔ）の少なくとも１ストレッチが、同じＲＮＡ分子に位置する相補配列と塩基対形成し（単一ＲＮＡ鎖）、前記配列および相補配列が、少なくとも約４〜７ヌクレオチド（または約９〜約１５ｎｔ、約１５〜約１００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ）の不対領域により離間されている、およそ４００〜５００ヌクレオチド未満または１００〜２００ｎｔ未満のＲＮＡ分子であり、これは、塩基相補性の２領域により作製されるステム構造の上に一本鎖ループを形成する。ｓｈＲＮＡ分子は、阻害しようとする標的配列と相同かつ相補的な約１７〜約５００ｂｐ；約１７〜約５０ｂｐ；約４０〜約１００ｂｐ；約１８〜約４０ｂｐ；または約１９〜約２９ｂｐの二本鎖ステム領域と、塩基相補性の２領域により作製されたステム構造の上に一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチドまたは約９〜約１５ヌクレオチド、約１５〜約１００ｎｔ、約２５０〜５００ｂｐ、約１００〜約１０００ｎｔの不対ループ領域とを含む、少なくとも１個のステムループ構造を含む。しかし、ある配列とその直後にその逆向きの相補体を含むＲＮＡ分子は、無意味な「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列により離間していなくてもステムループ高次構造を採る傾向があるため、「ループ領域」または「ループ配列」を含むことが厳密には必要とされないことが認識される。
【００７４】
１種またはそれより多くの二本鎖ＲＮＡエフェクター分子へと転写され得るＤＮＡ配列を含む本発明の発現構築物は、ジャガイモ植物を形質転換することができ、形質転換された植物は、破壊されたインベルターゼ活性を有する。ｄｓＲＮＡエフェクター分子により阻害すべき標的配列として、コード領域が挙げられるがこれに限定されない。
【００７５】
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ構築物は、１種またはそれより多くの逆方向反復を含む。逆方向反復は、ジャガイモ植物において干渉ＲＮＡ分子へと転写され得る。一部の実施形態では、転写された干渉ＲＮＡ分子は、ジャガイモにおけるインベルターゼ遺伝子のプロモーター領域、コード領域、イントロン、５’ＵＴＲ領域および／または３’ＵＴＲ領域を標的とすることができる。
【００７６】
一部の実施形態では、逆方向反復は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、センス鎖（stand）およびアンチセンス鎖は、互いに完璧に相補的である。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、全長にわたり互いに完璧に相補的という訳ではないが、少なくとも部分的に相補的である。一部の実施形態では、センス鎖は、ジャガイモにおけるインベルターゼ遺伝子に対し約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはより高い相同性を共有する。一部の実施形態では、センス鎖は、インベルターゼ遺伝子の＋５３〜＋７３３に対応する断片を含む（プライマーである配列番号１および配列番号１９により増幅することができる）。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、インベルターゼ遺伝子の＋５５２〜＋４９に対応する断片を含む（プライマーである配列番号２および配列番号２０により増幅することができる）。一部の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、インベルターゼ遺伝子の６７３〜１１６８、１３１０〜１８１８または１８４５〜２３５１に対応する断片を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、インベルターゼ活性は、ジャガイモ塊茎において少なくとも中断される。一部の実施形態では、インベルターゼ活性は、ジャガイモ塊茎において唯一または主に中断される。塊茎特異的中断を達成するために、本発明のインベルターゼサイレンシングポリヌクレオチドは、１種またはそれより多くの塊茎特異的プロモーターにより駆動することができる。塊茎特異的プロモーターの非限定例として、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yeら、２０１０年（例えば、配列番号６等、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）遺伝子に関連するプロモーターまたはその機能的バリアント、断片）、Twellら（Plant Molecular Biology、９巻：３６５〜３７５頁（１９８７年）、S. Rosahlら（「The 5’Flanking DNA of a patatin gene directs tuber specific expression of a chimaericgene potato」、「Organ-Specific Gene Expression in Potato:Isolation and Characterization of Tuber-Specific cDNA Sequences」、Molecular Gen Genet、（１９８６年）２０２巻：３６８〜３７３頁）ならびに米国特許第５４３６３９３号（例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに由来するパタチン遺伝子のＢ３３プロモーター配列またはその機能的バリアント、断片）および米国特許第６１８４４４３号（例えば、ジャガイモα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列またはその機能的バリアント、断片）に記載されているプロモーターが挙げられる。
【００７８】
一部の実施形態では、本方法は、自然に変異したインベルターゼ遺伝子を有するジャガイモ植物をスクリーニングすることにより、インベルターゼ活性を破壊することを含む。あるいは、ジャガイモ植物は、当業者に公知の方法により変異誘発することができ、変異したインベルターゼ遺伝子を有するジャガイモ植物を同定および単離することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、インベルターゼが破壊されたジャガイモ植物は、１種またはそれより多くの農業的に重要な形質を有する。本明細書において使用する場合、「農学的に重要な形質」は、ヒトの使用に有用なまたは有利な植物または植物部分における任意の表現型を含む。農学的に重要な形質の例として、バイオマス生産、特異的バイオ燃料の生産の増加、食品生産の増加、食品品質の改善、種子油含量の増加等をもたらす形質が挙げられるがこれらに限定されない。農学的に重要な形質の追加的な例として、有害生物抵抗性、活力、発育時間（収穫までの期間）、栄養素含量の増強、新たな成長パターン、風味または色、耐塩性、耐熱性、耐乾性および耐寒性その他が挙げられる。一部の実施形態では、ジャガイモ植物の農業的に重要な形質として、適応性、調理後の黒変、液果、調理の種類、調理した質感、クリスプに適した性質、休眠期間、乾燥抵抗性、乾物含量、早期収穫生産力、酵素褐変、いぼ品種に対する圃場免疫力、花色、花の頻度、茎葉被覆率、フレンチフライに適した性質、霜抵抗性、揚げ色、成長クラッキング、成長習慣、空胴病傾向、内部さび病スポット、明るい芽の色、成熟度、花粉稔性、疫病Ｒ遺伝子の存在、一次塊茎果肉色、タンパク質含量、膨化速度、アブラムシに対する抵抗性、細菌軟腐病（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．）に対する抵抗性、細菌青枯れ病（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に対する抵抗性、黒脚病（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．）に対する抵抗性、そうか病（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）に対する抵抗性、乾腐（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｏｅｒｕｌｅｕｍ）に対する抵抗性、乾腐（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）に対する抵抗性、乾腐（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）に対する抵抗性、夏疫病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に対する抵抗性、外部損傷に対する抵抗性、フザリウム萎凋病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対する抵抗性、指斑病（Ｐｈｏｍａ  ｆｏｖｅａｔａ）に対する抵抗性、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄに対する抵抗性、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓに対する抵抗性、内部挫傷に対する抵抗性、茎葉における疫病に対する抵抗性、塊茎における疫病に対する抵抗性、ジャガイモ葉巻ウイルスに対する抵抗性、ジャガイモモップトップウイルスに対する抵抗性、ジャガイモウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭＳ、Ｘ、Ｙ、ＹＮ）に対する抵抗性、粉状そうか病（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）に対する抵抗性、輪腐病（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｓｐ．ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）に対する抵抗性、ナメクジに対する抵抗性、枝枯れ病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に対する抵抗性、タバコ茎壊疽ウイルスに対する抵抗性、塊茎ガに対する抵抗性、試料状態、二次成長、二次塊茎果肉色、デンプン含量、ストロン付着、ストロンの長さ、貯蔵能力、いぼ品種に対する易罹患性、食味、検査条件、塊茎の眼の色、塊茎の眼の深さ、塊茎グリコアルカロイド、収穫前の塊茎緑化、塊茎形状、塊茎形状均一性、塊茎サイズ、塊茎皮色、塊茎皮、質感、植物当たりの塊茎、いぼ（Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｅｎｄｏｂｉ��ｔｉｃｕｍ）および生産力に関係する形質が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
本発明は、また、シュガーエンドの発生率がより低いジャガイモ塊茎および／またはゼブラチップ病原体に軽度に感染した場合に退色が少ないジャガイモ塊茎を産生するジャガイモ植物を育種するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、（ｉ）ドナーとして破壊されたインベルターゼ遺伝子を含む本発明の植物のうちいずれか１種をレシピエント植物系統と交雑して、Ｆ１個体群を作製することと、（ｉｉ）前記Ｆ１個体群に由来する子孫におけるシュガーエンドおよび／またはゼブラチップ表現型を評価することと、（ｉｉｉ）シュガーエンドの発生率がより低いジャガイモ塊茎および／またはゼブラチップ病原体に軽度に感染した場合に退色が少ないジャガイモ塊茎を産生する子孫を選択することとを含む。一部の実施形態では、レシピエント植物は、１種またはそれより多くのある特定の農学的に重要な形質を有するエリート系統である。
【００８１】
植物形質転換
新たな遺伝材料を植物ゲノムに導入するための最も一般的な方法は、染色体組み込みのために植物の核をターゲティングする転移ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡの一部を個々の植物細胞へと文字通り注入するための（通常、組織を傷つけた後に）、細菌病原体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの生細胞の使用を含む。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの使用のために特に設計された特定のＤＮＡ送達プラスミドに係る多数の特許が存在する  −  例えば、ＵＳ４５３６４７５、ＥＰ０２６５５５６、ＥＰ０２７０８２２、ＷＯ８５０４８９９、ＷＯ８６０３５１６、ＵＳ５５９１６１６、ＥＰ０６０４６６２、ＥＰ０６７２７５２、ＷＯ８６０３７７６、ＷＯ９２０９６９６、ＷＯ９４１９９３０、ＷＯ９９６７３５７、ＵＳ４３９９２１６、ＷＯ８３０３２５９、ＵＳ５７３１１７９、ＥＰ０６８７３０、ＷＯ９５１６０３１、ＵＳ５６９３５１２、ＵＳ６０５１７５７およびＥＰ９０４３６２Ａ１。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換は、第１のステップとして、プラスミドにクローニングされたＤＮＡ断片を、生きたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞へと配置し、続いてこれをその後、個々の植物細胞への形質転換に使用することを含む。よって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換は、間接的植物形質転換方法である。Ｐ−ＤＮＡを有するベクターの使用を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換の方法も、当業者に周知であり、本発明において適用性を有し得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２５０，５５４号を参照されたい。
【００８２】
ジャガイモ形質転換方法の非限定例は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７５３４９３４号、同第８２７３９４９号、同第７８５５３１９号、同第７６１９１３８号、同第７９４７８６８号、同第８１９３４１２号、同第７８８００５７号、同第８２５２９７４号、同第７２５０５５４号、同第８１４３４７７号、同第８１３７９６１号、同第７６０１５３６号、同第７９２３６００号、同第７４４９３３５号、同第７９２８２９２号、同第７７１３７３５号、同第８１５８４１４号、同第７５９８４３０号、同第５１８５２５３号、Beaujeanら（Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using sliceintermodal explants: an efficient protocol of transformation、Journal of Experimental Botan、４９巻（３２６号）：１５８９〜１５９５頁）、Chakravartyら（Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influencing Agrobacterium-mediated transformation、Advances in Bioscience and Biotechnology、２０１０年、１巻：４０９〜４１６頁）、Barrellら（Alternative selectable markers for potato transformation using minimal T-DNA vectors、Plant Cell, Tissue and Organ Culture、７０巻、１号（２００２年）、６１〜６８頁）、Anderssonら（A novel selection system for potato transformation using a mutated AHAS gene、Plant Cell Rep.、２００３年、２２巻（４号）：２６１〜２６７頁）、Valkovら（High efficiency plastid transformation in potato and regulation of transgene expression in leaves andtubers by alternative 50 and 30 regulatory sequences、Transgenic Res（２０１１年）２０巻：１３７〜１５１頁）およびTavazzaら（Genetic transformation of potato (Solanum tuberosum): An efficient method to obtain transgenic plants、Plant Science、５９巻、２号、１９８９年、１７５〜１８１頁）に記載されている。
【００８３】
育種方法
ジャガイモの一般育種方法は、Hybridization of crop plants（American Society of Agronomy and Crop Science Society of America、１９８０年、第３４章）、Bradshawら（Genetic Resources and Progress in Their Utilization in Potato Breeding、Potato Research、２００６年、４９巻：４９〜６５頁）、Barone（Molecular Marker-assisted Selection for Potato Breeding、Amer. J. of Potato Res.２００４年、８１巻：１１１〜１１７頁）、Douchesら（Assessment of Potato Breeding Progress in the USA over the Last Century、Crop Science、３６巻（６号）：１５４４〜１５５２頁）、Advances in Potato chemistry and Technology（Academic Press、２００９年、ＩＳＢＮ  ０１２３７４３４９４、９７８０１２３７４３４９７、第８章、Potato Breeding Strategy、Bradshaaw）およびJanickら（Potato Breeding via Ploidy Manipulations、Plant Breeding Reviews、２０１０年）に記載されているがこれらに限定されない。追加的育種方法は、当業者に公知であり、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ChahalおよびGosal（Principles and procedures of plant breeding: biotechnological and conventional approaches、CRC Press、２００２年、ＩＳＢＮ  ０８４９３１３２１Ｘ、９７８０８４９３１３２１９）、Tajiら（In vitro plant breeding、Routledge、２００２年、ＩＳＢＮ  １５６０２２９０８Ｘ、９７８１５６０２２９０８７）、Richards（Plant breeding systems、Taylor & Francis US、１９９７年、ＩＳＢＮ  ０４１２５７４５００、９７８０４１２５７４５０４）、Hayes（Methods of Plant Breeding、出版社：READ BOOKS、２００７年、ＩＳＢＮ  １４０６７３７０６２、９７８１４０６７３７０６６）に記されている方法が挙げられる。
【００８４】
本発明に古典的育種方法が含まれて、本発明の１種またはそれより多くの組換え発現カセットを、他の植物変種または本発明のトランスジェニック植物との交雑が適合性の他の近縁種に導入することができる。
【００８５】
放任受粉した個体群。ライムギ、多くのトウモロコシおよびサトウダイコン、牧草、アルファルファおよびクローバー等のマメ科植物、ならびにカカオ、ココナツ、アブラヤシおよび一部のゴムノキ等の熱帯樹木作物等、作物の放任受粉した個体群の改善は、基本的に、高い（但し、最大には程遠い）程度のヘテロ接合性を維持しつつ、都合よい対立遺伝子の固定に向けて遺伝子頻度を変化させることに依存する。かかる個体群における均一性は不可能であり、放任受粉した変種における型忠実性は、個々の植物の特徴ではなく、全体としての個体群の統計学的特色である。よって、放任受粉した個体群の不均一性は、近交系系統、クローンおよび雑種の均一性（または実質的均一性）と対照をなす。
【００８６】
個体群改善方法は、集団選択と通常呼ばれる純粋に表現型選択に基づく群と、後代検定による選択に基づく群の２群へと自然に分けられる。個体群間改善は、放任育種個体群の概念を利用する；ある個体群から別の個体群へと遺伝子を流動させる。ある個体群（栽培品種、株、生態型またはいずれかの生殖質ソース）における植物は、他の個体群由来の植物と自然に（例えば、風による）または人の手によりまたはミツバチにより（一般に、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  Ｌ．またはＭｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｏｔｕｎｄａｔａ  Ｆ．）交雑される。選択は、両方のソースから望ましい形質を有する植物を単離することにより、一方の（場合によっては両方の）個体群を改善するために適用される。
【００８７】
放任受粉個体群改善には基本的に２種の主な方法が存在する。第一に、選ばれた選択手順により個体群が集団で変化する状況がある。その成果は、隔絶されたその個体群内のランダム交配により無制限に繁殖可能な改善された個体群である。第二に、合成変種は、個体群改善と同じ結末を達成するが、それゆえ、それ自体は繁殖可能ではない；これは、親系統またはクローンから再構築される必要がある。放任受粉された個体群を改善するためのこれらの植物育種手順は、当業者に周知であり、他家受粉した植物を改善するために慣用的に使用される育種手順の包括的レビューは、Allard、Principles of Plant Breeding、John Wiley & Sons, Inc.（１９６０年）；Simmonds、Principles of Crop Improvement、Longman Group Limited（１９７９年）；HallauerおよびMiranda、Quantitative Genetics in Maize Breeding、Iowa State University Press（１９８１年）；ならびにJensen、Plant Breeding Methodology、John Wiley & Sons, Inc.（１９８８年）を含む多数のテキストおよび論文において提示されている。
【００８８】
集団選択。集団選択において、望ましい個々の植物が選ばれ、収穫され、後代検定なしで種子が混成されて、次の世代を産生する。選択は、母方の親のみに基づき、受粉に対する制御が存在しないため、集団選択は、選択ありのランダム交配の形態ということになる。本明細書に記されている通り、集団選択の目的は、個体群における優れた遺伝子型の比率を増加させることである。
【００８９】
合成。合成変種は、あらゆる可能な雑種組合せにおける優れた組合せ能力に関して選択された数多くの遺伝子型を内々で交雑し、放任受粉により変種をその後に維持することにより産生される。親が、一部のサトウダイコンおよびマメ（Ｖｉｃｉａ）のように（程度の差はあれ近交系の）種子繁殖した系統であるか、または牧草、クローバーおよびアルファルファのようにクローンであるかは、原則として大した差はない。親は、時には検定交雑またはトップ交雑により、より一般的には多交雑により、一般組合せ能力で選択される。親種子系統は、計画的に同系交配することができる（例えば、自家受粉または同胞交雑により）。しかし、親が、計画的に同系交配されない場合であっても、系統維持における系統内の選択は、ある程度の同系交配が生じることを確実にする。クローン親は、当然ながら無変化のままであり、高度にヘテロ接合性であり続ける。
【００９０】
合成が、親種子生産プロットから農家へと直接進むことができるか、先ず１または２サイクルの増殖を経る必要があるかは、種子生産および種子需要の規模に依存する。実際には、イネ科草本およびクローバーは、一般に、１回または２回増殖され、よって、本来の合成から相当に除去される。
【００９１】
集団選択が使用されることもあるが、その操作上の単純性および目標との明らかな関連性、即ち、合成における一般組合せ能力の実施のため、多交雑には後代検定が一般に好ましい。
【００９２】
合成に入る親系統またはクローンの数は、幅広く変動する。実際には、親系統の数は、１０〜数百の範囲に及び、１００〜２００が平均である。１００種またはそれより多くのクローンから形成される広い範囲の合成は、種子増殖において狭い範囲の合成よりも安定的であることが予想される。
【００９３】
系統変種。系統変種は、分離個体群からの個々の植物の選択、これに続く自家受粉した子孫の繁殖および種子増加と、数世代にわたる遺伝子型の慎重な検定から開発された優れた遺伝子型である。これは、自然に自家受粉する種に十分に効果がある、放任受粉方法である。この方法は、変種開発における集団選択と組み合わせて使用することができる。系統におけるバリエーションおよび集団選択の組合せは、自家受粉作物において変種を作製するための最も一般的な方法である。
【００９４】
雑種。雑種は、異なる遺伝子型の親の間での交雑から生じる個々の植物である。商業的雑種は、現在、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、サトウダイコン、ヒマワリおよびブロッコリーを含む多くの作物において広範に使用されている。雑種は、直接的な２種の親の交雑（単交雑雑種）、単交雑雑種と別の親との交雑（３元または三系交雑雑種）または２種の異なる雑種の交雑（４元または二重交雑雑種）を含む数多くの異なる仕方で形成することができる。
【００９５】
厳密に言えば、異系交配（即ち、放任受粉）個体群における大部分の個体は雑種であるが、この用語は通常、親同士が、互いのゲノムが異なる種または亜種として認識されるほど十分に明確に異なる個体である場合に用いられる。雑種は、両親のゲノムの定性的および／または定量的な差に応じて、稔性または不稔性であり得る。ヘテロシスすなわち雑種強勢は通常、雑種形成に使用した親系統と比較して、雑種の成長活力、生存および稔性の増加をもたらすヘテロ接合性増加と関連する。最大ヘテロシスは通常、２種の遺伝的に異なる高度に近交系な系統を交雑することにより達成される。
【００９６】
雑種の生産は、十分に発達した産業であり、親系統と、該系統の交雑から生じる雑種の両方の隔絶した生産を含む。雑種生産プロセスの詳細な考察に関しては、例えば、Wright、Commercial Hybrid Seed Production ８巻：１６１〜１７６頁、In Hybridization of Crop Plantsを参照されたい。
【００９７】
次の実施例により本発明をさらに例証するが、これを限定的に解釈するべきではない。本願を通じて引用されているあらゆる参考文献、特許および公開特許出願の内容と共に、図面および配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
野外ストレスに曝された塊茎におけるシュガーエンドの発生率を最小にするためのインベルターゼサイレンシング
【００９９】
２組のプライマー対（配列番号１および配列番号１９；配列番号２および配列番号２０）を使用して、ジャガイモ変種「Ｒａｎｇｅｒ」Ｒｕｓｓｅｔの塊茎ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ由来ライブラリーから、Ｉｎｖ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ４７８９５０）のｃＤＮＡのセンス断片およびアンチセンス断片を増幅した。増幅された断片は、Ｉｎｖ遺伝子のそれぞれ＋５３位〜＋７３３位（センス）および＋５５２位〜＋４９位（アンチセンス）に対応した。インベルターゼｃＤＮＡの２１〜２３塩基対まで減ったいずれかの断片を使用して、Ｉｎｖ遺伝子（配列番号５）をサイレンシングすることができた。ジャガイモ変種「Ｒａｎｇｅｒ」Ｒｕｓｓｅｔ由来の調節エレメント：ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子（受託ＨＭ３６３７５２、配列番号６）の２．２ｋｂ塊茎特異的プロモーターと、ユビキチン−３遺伝子（受託ＧＰ７５５５４４、配列番号７）の０．３ｋｂターミネーターとの間に、逆方向反復（配列番号３および４）として、クローニングされた断片を配置した。選択可能マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）遺伝子の発現カセットも保有するｐＳＩＭ４０１由来Ｔ−ＤＮＡ領域（Rommensら、Plant Physiol.１３９巻：１３３８〜１３４９頁、２００５年）へと、得られたサイレンシングカセットを挿入することにより、ベクターｐＳＩＭ１６３２を得た。
【０１００】
ｐＳＩＭ１６３２  Ｉｎｖサイレンシングベクターを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、細菌およびベクターを選択するための抗生物質を含有するＬＢ培地（２０ｇ／Ｌ  ＬＢブロス、Ｓｉｇｍａ）において一晩２８℃で増殖させた。一晩培養物の１０倍希釈を対数期になるまで５〜６時間増殖させ、そして３０００ｒｐｍにて沈殿させた。ペレットを、３％スクロースを補充したＭ４０４液体培地（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｈａｗｎｅｅ、ＫＳ）において洗浄し、同じ液体培地において再懸濁して、ＯＤ６００が０．２の細胞密度を得た。
【０１０１】
マゼンタボックスにおいて、３％スクロースおよび２ｇ／Ｌゲルライトを含有する４０ｍｌの半分に薄めたＭ５１６培地（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｈａｗｎｅｅ、ＫＳ）、ｐＨ５．７により、外植片材料のためのストック植物を維持した。４週齢の植物から４〜６ｍｍのジャガイモ節間セグメントを切断し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染させ、３％スクロースおよび６ｇ／Ｌ寒天を補充したＭ４０４培地、ｐＨ５．７へと移した。２日間の共存培養の後に、３％スクロース、２．５ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、６ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ５．７およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを排除するための１５０ｍｇ／Ｌチメンチンおよび選択薬剤としての１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを加えたＭ４０４培地である、カルス誘導培地上に外植片を置く。カルス誘導培地上に１カ月置いた後に、シュートが得られるまで、外植片をシュート誘導培地（３％スクロース、２．５ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、０．３ｍｇ／Ｌ  ＧＡ３、６ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ５．７、１５０ｍｇ／Ｌチメンチンおよび１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを加えたＭ４０４培地）へと移す。３％スクロース、ゲル化剤および１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを加えたＭ４０４培地においてシュートが発根する。カナマイシンの存在下で発根するシュートを、導入遺伝子の存在についてＰＣＲによりスクリーニングする。ノーザン解析は、ＺＣ実験について選択される系統におけるＩｎｖ遺伝子のサイレンシングを確認する（図５Ａ）。対象とする遺伝子がサイレンシングされた系統をｉｎ  ｖｉｔｒｏで繁殖させ、種子生産のために温室内で生育させる。
【０１０２】
１年目および２年目に、アイダホ州パルマのアイダホ大学パルマ研究普及センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｄａｈｏ  Ｐａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）において、非形質転換対照、空ベクター対照およびインベルターゼサイレンシング系統を使用した野外試験を行った。多量栄養素および微量栄養素の施用は、アイダホ大学によって示唆される管理推奨に従った。プロットは、固定セットシステムを使用して散水灌漑し、生育期全体を通じて６５％を上回るよう水分を維持した。１年目に、各対照およびトランスジェニック系統を、５ヒルの１プロットにより表した。２年目に、各対照およびトランスジェニック系統を、２０ヒルの５プロットにより表した。両年共に、作条内間隔は、１０インチであり、作条間は３６インチであった。植えてから１３０〜１４０日間で塊茎を収穫し、揚げるまで５５℃で貯蔵した（約２週間）。
【０１０３】
１年目に、揚げもの試料は、５ヒルのプールした試料から取り出した最小で１２ポンドの塊茎からなった。２年目に、２０ヒルの各複製のプールした集塊から得た２０個の塊茎を使用し、全５複製を測定した。系統毎の塊茎の２年目の平均数は、５×２０または１００塊茎であった。３／８インチ×３／８インチグリッドフライナイフにおいて、全塊茎を長手方向に切断し、４個の中央条片を３７５華氏温度で３分間揚げた。揚げた条片を白いトレーに横たえ、フレンチフライしたジャガイモのためのＵＳＤＡマンセルカラーチャートと比較した。ＳＥフライは、条片の色が最も暗い２側面において１／４インチまたはそれより長い長さの端を有し、条片全幅に対し、ＵＳＤＡマンセルカラーチャートと比較してナンバー３またはそれよりも暗いか検査する。
【０１０４】
表１に示す通り、両年共にアイダホ州パルマの圃場において、シュガーエンドの誘導に適した条件が存在した。１年目に、限られた種子供給による小さい試料サイズは、全系統のシュガーエンドが減少した傾向を明らかにした。非形質転換対照（Ｒａｎｇｅｒ対照）および空ベクター対照の中央条片フライのほとんど半分が、シュガーエンドを示すが、インベルターゼサイレンシング系統は全て、劇的な減少を示す。この事実は、試料毎の中央条片フライを全て示す図１における例証からも明らかである。図１に例証される通り、ごく僅かなインベルターゼサイレンシング系統がシュガーエンドを有する任意のフライを示した。系統１および系統４は、揚げた試料におけるシュガーエンドなしにより際立った。他のインベルターゼ系統は、揚げによりフライの１４％未満がシュガーエンドがあること（対４２％のシュガーエンド対照フライ）を示した。インベルターゼサイレンシング系統が、シュガーエンドの相当な減少を示したという同じパターンが、より多くの複製が可能な２年目に観察された。系統１６３２−１は、両年共に優秀であり、平均４±２．３（±標準偏差）個のフレンチフライしか、いかなる程度のシュガーエンドも示さなかった。２複製は、シュガーエンドを有する条片がなかった。他の系統は、２年目により少ない程度の減少を示し、シュガーエンドを研究する際のより大きい試料サイズの重要性を実証した。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
（実施例２）
チップスおよびフレンチフライ等、フライドポテト製品のゼブラチップ誘導性の黒ずみの重症度を最小にするためのインベルターゼサイレンシング
【０１０７】
ゼブラチップ（ＺＣ）実験において使用したインベルターゼサイレンシング系統の作製は、上述の通りであった。ゼブラチップの病因に感染したチップスにおける発色を最小にする能力に関して、シュガーエンド頻度の低下を示す同じ系統を検査した。テキサス州ブッシュランドのテキサスＡ＆Ｍ大学ブッシュランド研究普及センター（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｕｓｈｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）において、非形質転換対照、空ベクター対照およびインベルターゼサイレンシング系統の温室栽培した種子を使用して野外試験を行った。４月１１日に種子を植えた。１ブロックにおいて処理毎に４本の植物を植え、発芽後にテントで覆った。テントは、望まれない動物相を植物から遠ざけ、感染したキジラミ（ＺＣ原因生物体の媒介者）を植物に保持するために役立てた。テント内に収容した各系統の４本の植物体は、収穫３５、２８、２１、１４および７日前に、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒを保有する３０匹のキジラミに感染させた。このようにして、漸進的に程度の差はあれゼブラチップに感染した各系統および対照から塊茎を作製した。収穫３５日前に感染した植物は、全身的に感染している可能性が高く、ＺＣの非常に強い症状を示し（図３Ｂおよび図４）、得られたチップスは、非常に暗い色に揚がった。収穫２１日前に感染した植物は、塊茎におけるごく軽度な感染症状のみを示すことが予想され（図３Ａ）、中等度の量の黒ずみで揚がる可能性が高い。収穫のほんの７日前に感染した植物は、感染の徴候をほとんどまたは全く示さないことが予想され、黒ずみがほとんどまたは全くない状態で揚がる塊茎を有する可能性が高い。
【０１０８】
収穫時に、各系統および処理から得た塊茎をＺＣ症状に関して解析した。各処理から得た８個の塊茎において、ＺＣ重症度（即ち、塊茎果肉の壊死性斑点形成）の目視検査を行った。ストロン端を切断し、症状に関して０〜３の評点を塊茎に与え、３は最大量の塊茎壊死を示し、０は壊死なしを示す。表２は、各感染時間における各系統の病害重症度スコアをまとめる。予想された通りに、対照塊茎は、収穫３５および２８日前（ｄｂｈ）において重度感染の徴候を示し、塊茎果肉の至るところに壊死性組織の明らかなスポットおよび条斑を有した（図２Ａを参照されたい）。図２Ｂに示す通り、２１ｄｂｈに感染した塊茎は、時に、塊茎の皮層に軽い壊死性斑点形成の徴候を示す可能性がある。壊死がほとんどまたは全くないことにより際立つ漸進的により少なくなる感染徴候が、収穫により近い日において明らかであった。インベルターゼサイレンシング系統は、非形質転換「Ｒａｎｇｅｒ」Ｒｕｓｓｅｔ対照と同様のスコアを示し、新鮮（ｆｒｅｓｈ）症状が、インベルターゼのサイレンシングによって軽減できないことを示す。症状重症度の査定において、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒの存在または不存在についてのＰＣＲ検証のために塊茎試料を採取した。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
感染日数毎に６〜８個の対照塊茎のチップス形成を行って、完成したチップスの色におけるＺＣ感染の影響を観察した。チップスにおける２％最終水分を達成するために、スライスの１ポンド試料を３分間３５０Ｆにて油で揚げた。図３から分かる通り、ＺＣの存在は、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ陽性キジラミに植物をより長時間曝露するにつれてますます暗い色になるチップスに相関する。Ａｇｔｒｏｎ読み取りデータによって測定されるチップス色は、収穫により近い日付においてＺＣの圧力が減弱化するにつれて、「Ｒａｎｇｅｒ」対照チップスにおいて明るくなる（表３）。感染日数毎に６〜８個のインベルターゼサイレンシング塊茎のチップス形成を行って、揚げたチップスにおけるＺＣ影響発色の顕在化におけるインベルターゼサイレンシングの影響を観察した。Ａｇｔｒｏｎ読み取り値において反映される通り、およびチップス色の目視検査から、インベルターゼサイレンシングは、全感染時点においてより低いチップス色をもたらした。重度に感染した塊茎であっても、「Ｒａｎｇｅｒ」対照塊茎と比較してより明るい；しかし、３５および２８ｄｂｈから得たチップスは、やはり商品にならない。軽度に感染した塊茎（≦２１ｄｂｈ）から得たチップスは、本実験の成果によると、全て売り物になる可能性が高い。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
（実施例３）
ポリフェノールオキシダーゼサイレンシングは、ゼブラチップに伴う症状を最小にしない
【０１１３】
２個の収束的プロモーター（ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子プロモーター（Ａｇｐ、配列番号６）および顆粒結合性シンターゼ遺伝子プロモーター（Ｇｂｓｓ、配列番号１１））の間に、逆方向反復として、ポリフェノールオキシダーゼ−５  ５’−ＵＴＲのセンス断片およびアンチセンス断片（Ｐｐｏ５、配列番号８および９）を並べて、Ｐｐｏ５遺伝子のサイレンシングを誘導した。Ｐｐｏ  ５’ＵＴＲのセンス断片およびアンチセンス断片は、非コードスペーサーＤＮＡ（配列番号１２）により離間された。以前に（Yanら、Plant Physiol.１４１巻：１５０８〜１５１８頁、２００６年）記載されたこの遺伝子サイレンシング方法は、Ｐｐｏ遺伝子のサイレンシングを確実にするが、Ｐｐｏ  ｃＤＮＡ配列の２１〜２３塩基対まで減ったＰｐｏ遺伝子の任意の断片をサイレンシングに使用してもよい。遺伝子内系統Ｆ１０、Ｅ１２およびＪ３の産生に使用されるＰ−ＤＮＡベクターおよびマーカー・フリー方法は、以前に記載されている（Rommensら、Plant Biotechnol. J.、６巻：８４３〜８５３頁、２００８年）。
【０１１４】
ポリフェノールオキシダーゼサイレンシングカセットを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＬＢＡ４０４４株の調製および生育は、先の実施例に記載されている通りに進めた。Ｐｐｏサイレンシング系統を作製するためのジャガイモ形質転換は、先の実施例１におけるインベルターゼサイレンシング系統の作製に関して記載されている通りに進めた。非形質転換植物の塊茎におけるＰｐｏ５遺伝子およびその遺伝子内対応物の転写産物レベルを、ノーザンブロット解析により決定した（図５Ｂ）。温室栽培した塊茎において、Ｐｐｏ５遺伝子の転写レベルは、その非形質転換対照と比較して、Ｆ１０、Ｅ１２およびＪ３遺伝子内事象において強く低下し、改変塊茎においてＰｐｏ５遺伝子がサイレンシングされたことを示した。本出願人らは、「Ａｔｌａｎｔｉｃ」、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋおよび「Ｒａｎｇｅｒ」Ｒｕｓｓｅｔ変種のバックグラウンドにおいてＰｐｏをサイレンシングすることを選んだ。３変種の全ては、打撲黒斑に対し易罹患性であるが、Ｐｐｏサイレンシングカセットで形質転換されると、打撲黒斑に対する易罹患性を示さない。この事実は、図４Ａおよび図４Ｂにおける「Ａｔｌａｎｔｉｃ」野生型およびＰｐｏサイレンシング均等物について図示される。
【０１１５】
テキサス州ブッシュランドのテキサスＡ＆Ｍ大学ブッシュランド研究普及センターにおいて、上述のインベルターゼサイレンシング系統に関して記載されている通りに、非形質転換対照、空ベクター対照およびＰｐｏサイレンシング系統の温室栽培した種子を使用して野外試験を行った。Ｐｐｏサイレンシング系統およびそれらそれぞれの対照の新鮮ＺＣ症状をスコア化する手段は、上述の通りであり、表２にまとめられている。これらのスコアから、Ｐｐｏサイレンシングが、３種の変種バックグラウンドのいずれにおいても、ＺＣ感染塊茎における新鮮症状発症を最小にしないことが明らかである。ポリフェノールオキシダーゼサイレンシング系統は、非形質転換対照と同様のスコアを示し、新鮮症状が、Ｐｐｏのサイレンシングにより軽減できないことを示す。より重要なことに、実施例２における上述の方法に従って利用できる系統を揚げた後に、Ｐｐｏサイレンシングが、ＺＣ感染チップスをより明るくしないことが明らかである。表４におけるＡｇｔｒｏｎ読み取り値は、ＰｐｏサイレンシングＪ３が、非形質転換「Ａｔｌａｎｔｉｃ」対照よりも明るくないことを示す。Ｅ１２系統をＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照と、またはＦ１０系統を「Ｒａｎｇｅｒ」Ｒｕｓｓｅｔ対照と比較した場合、これは真である。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
本出願人らは、切断したまたは皮をむいたＺＣ感染塊茎の急速な褐変応答を確認した（Navarreら、Amer. J. Potato Res.８６巻：８８〜９５頁、２００９年）。図４に可視化されている通り、ポリフェノールオキシダーゼサイレンシングは、この反応を抑制する。非感染（４Ｂ）塊茎と感染（４Ｃ）Ｐｐｏサイレンシング塊茎のいずれも、黒ずみを示さない。
【０１１８】
他に規定がなければ、本明細書におけるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様または均等ないかなる方法および材料を使用することもできるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。引用されているあらゆる刊行物、特許および特許公報は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
本明細書に記されている刊行物は、本願の出願日に先立つその開示のために単に提示されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明に基づきかかる刊行物に先行する権利を与えられないことの承認として解釈するべきではない。
【０１２０】
その具体的な実施形態に関連して本発明を説明してきたが、これをさらに修正することが可能であり、本願が、一般に本発明の原理に従った、本発明が属する技術分野内の公知または慣行的な実施の範囲内に収まり、上文に説明され次の添付の特許請求の範囲に示す本質的特色に適用できるような本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなるバリエーション、使用または適応の網羅も企図していることを理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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