(57)【要約】本発明は、ＡｐｏＢを標的とするＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）の複合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｐｏＢ核酸を標的としており、更なる領域（領域Ｃ）と共有結合している、ＬＮＡオリゴマーの第一の領域（領域Ａ、例えばＬＮＡギャップマーオリゴマー）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体であって、アシアロ糖タンパク質受容体標的複合体及び親油性複合体からなる群から選択される複合体部分を含み、ここで親油性複合体、及び場合によりアシアロ糖タンパク質受容体標的複合体が、生物学的に開裂可能なリンカーを介してＬＮＡオリゴマーに結合しているアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２】
複合体部分（Ｃ）が、ステロール、例えばコレステロール又はトコフェロール、例えばＣｏｎｊ５又はＣｏｎｊ６を含む、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３】
複合体部分（Ｃ）が、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）部分、例えば三価のＧａｌＮａｃ部分を含む、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４】
生物学的に開裂可能なリンカーが、ペプチド又はポリぺプチド、例えばリシンリンカー、又は生理学的に不安定なヌクレオチドリンカーを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５】
ＬＮＡオリゴマーが、１以上のホスファート結合ヌクレオシド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド（領域Ｂ）、例えばホスホジエステルヌクレオチドリンカーの領域を介して、複合体部分に共有結合している、請求項１〜４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項６】
ＬＮＡオリゴマーが、１〜６のホスファート結合ＤＮＡヌクレオシド（領域Ｂ）の領域Ｂを介して、複合体部分に共有結合している、請求項１〜５のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴマー複合体。
【請求項７】
領域Ｂ（ホスホジエステルヌクレオチド結合）が、１、２、又は３の隣接するＤＮＡホスホジエステルヌクレオチド、例えば２の隣接するＤＮＡホスホジエステルヌクレオチド、例えば５’ＣＡ３’ジヌクレオチドを含む、請求項６記載のアンチセンスオリゴマー複合体。
【請求項８】
ＬＮＡオリゴマー及び領域Ｂが、隣接するヌクレオチド配列を形成し、ここで領域Ａが、ＡｐｏＢ標的の対応する領域に相補的であり、領域Ｂが、ＡｐｏＢ標的の対応する領域に相補的であることができ、又は相補的ではないことができる、請求項５〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項９】
複合体部分が、複合体部分を、ＬＮＡオリゴマー、或いは１以上のホスファート結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオチドの領域（領域Ｂ）のいずれかに共有結合させるリンカー（Ｙ）を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１０】
リンカー領域Ｙが、脂肪酸、例えばＣ６リンカーを含む、請求項９記載のアンチセンスオリゴマー複合体。
【請求項１１】
複合体部分が、Ｃｏｎｊ１、Ｃｏｎｊ２、Ｃｏｎｊ３、Ｃｏｎｊ４、Ｃｏｎｊ１ａ、Ｃｏｎｊ２ａ、Ｃｏｎｊ３ａ、及びＣｏｎｊ４ａからなる群から選択される三価のＧａｌＮａｃ部分を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１２】
ＬＮＡオリゴマーが、配列番号１、又は配列番号２：
配列番号１  （３８３３）  ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣＡ
配列番号２  （４９５５）  ＧＴｔｇａｃａｃｔｇＴＣ
からなる群から選択される隣接するヌクレオチド配列を含み、ここで大文字は、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを表し、小文字は、ＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡシトシンは、場合により５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートである、請求項１〜１１のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１３】
配列番号７、２０、２８、又は３０からなる群から選択される、請求項１２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体、及び薬学的に許容しうる希釈剤、担体、塩、又は補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための、例えば急性冠症候群、又は高コレステロール血症若しくは関連障害、例えばアテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症（例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ））、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される障害の処置のための、請求項１〜１４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又は医薬組成物。
【請求項１６】
急性冠症候群、又は高コレステロール血症若しくは関連障害、例えばアテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症（例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ））、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される障害の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又は医薬組成物の使用。
【請求項１７】
急性冠症候群、又は高コレステロール血症若しくは関連障害、例えばアテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症（例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ））、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される障害を処置する方法であって、有効量の請求項１〜１４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又は医薬組成物を、高コレステロール血症若しくは関連障害を罹患している、又は罹患している可能性がある患者に投与することを含む方法。
【請求項１８】
ＡｐｏＢを発現している細胞においてＡｐｏＢを阻害するためのインビボ又はインビトロ方法であって、該細胞に請求項１〜１４のいずれか一項記載のオリゴマー、又は複合体、又は医薬組成物を投与して該細胞におけるＡｐｏＢを阻害することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡｐｏＢを標的とするＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）の複合体に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願第１２１９２７７３．５号、欧州特許出願第１３１５３２９６．２号、欧州特許出願第３１５７２３７．２号、及び欧州特許出願第１３１７４０９２．０号の優先権を主張するものである。
【０００３】
背景
参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００７／０３１０８１号、国際公開公報第２００８／１１３８３０号、国際公開公報第２０１０／１４２８０５号、及び国際公開公報第２０１０／０７６２４８号の背景の項を参照のこと。ＳＰＣ３８３３及びＳＰＣ４９５５（配列番号１及び２を有する）は、ヒトＡｐｏＢ  ｍＲＮＡを標的とする強力な化合物として既に確認されている２つのＬＮＡ化合物である。
【０００４】
国際公開公報第２００７／１４６５１１号は、より長い化合物よりもより強力で、かつ毒性が低いことが明らかである短い二環式（ＬＮＡ）ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドについて報告している。例示されている化合物は、長さ１４ヌクレオチド（nts）であろう。
【０００５】
Van Poelgeest et al., (American Journal of Kidney Disease, 2013 Oct;62(4):796-800)によると、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドＳＰＣ５００１の投与は、ヒトでの臨床試験において、急性腎傷害を惹起しえる。
【０００６】
欧州特許第１９８４３８１号、Seth et al., Nucleic Acids Symposium Series 2008 No. 52 553-554、及びSwayze et al., Nucleic Acid Research 2007, vol 35, pp687 - 700によると、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、動物において顕著な肝毒性を惹起する。国際公開公報第２００７／１４６５１１号によると、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの毒性は、１２〜１４ヌクレオチドと短い長さのＬＮＡギャップマーを用いることにより避けることができる。欧州特許第１９８４３８１号は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性を減ずるために、６’置換二環式ヌクレオチドを用いることを勧めている。Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性は、それらの配列及び修飾パターンから推測することができる。
【０００７】
オリゴヌクレオチド複合体は、ｓｉＲＮＡにおける使用のために広く評価されており、インビボでの十分な有効性を得るには、それらが必須であると考えられている。例えば、ＲＮＡ干渉経路を介して遺伝子発現を調節する修飾オリゴマー化合物について記載している国際公開公報第２００４／０４４１４１号を参照のこと。そのオリゴマー化合物は、１以上の複合体部分を含んでおり、それが、結合されたオリゴマー化合物の薬物動態学的及び薬力学的特性を改変又は増強することができる。
【０００８】
国際公開公報第２０１２／０８３０４６号は、ｓｉＲＮＡに対するガラクトースクラスター薬物動態学的モジュレーター標的部分について報告している。
【０００９】
反対に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、抱合又は製剤化されずに治療投与されるのが一般的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの主な標的組織は、肝及び腎であるが、リンパ節、脾臓、骨髄を含む広範囲な他の組織もまた、アンチセンス法（antisense modality）により到達可能である。
【００１０】
国際公開公報第２００５／０８６７７５号は、治療用の化学的部分、開裂可能なリンカー、及び標識ドメインを用いる、特定の器官を標的とした治療剤の送達について記載している。開裂可能なリンカーは、例えば、ジスルフィド基、ペプチド、又は制限酵素が開裂可能なオリゴヌクレオチドドメインであることができる。
【００１１】
国際公開公報第２０１１／１２６９３７号は、小分子リガンドとの抱合を介したオリゴヌクレオチドの標的細胞内送達について記載している。
【００１２】
国際公開公報第２００９／０２５６６９号は、ピリジルジスルフィド部分を含む重合体の（ポリエチレングリコール）リンカーについて記載している。Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758 - 766もまた参照のこと。
【００１３】
Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827 - 836は、カチオン性リポソームへアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するためにコレステロール修飾モノナー、ダイマー、及びテトラマーオリゴヌクレオチドを用いてデンドリマー送達系を生成したことを報告している。コレステロールは、リシンリンカーを介してオリゴヌクレオチドに抱合している。
【００１４】
ｓｉＲＮＡ及びアンタゴミル（antagomir）に肝臓を標的とさせるために、他の非開裂可能なコレステロール複合体が用いられている。例えば、Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173 - 178、及びKrutzfeldt et al., Nature 2005 vol 438, 685 - 689を参照のこと。部分的にホスホロチオール化したｓｉＲＮＡ及びアンタゴミルについては、肝標的物質としてのコレステロールの使用が、インビボでの活性にとって必須であることが認められている。
【００１５】
したがって、増強された有効性及び減じられた毒性リスクを有するＡｐｏＢ標的ＬＮＡアンチセンス化合物が求められている。
【００１６】
発明の概要
本発明は、ＡｐｏＢ核酸を標的としており、更なる領域（領域Ｃ）と共有結合しているオリゴマーの第一の領域（領域Ａ、例えばＬＮＡオリゴマー、ギャップマーオリゴマー、又はＬＮＡギャップマーオリゴマー）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体であって、アシアロ糖タンパク質受容体標的複合体及び親油性複合体からなる群から選択される複合体部分を含み、ここで親油性複合体、及び場合によりアシアロ糖タンパク質受容体標的複合体が、生物学的に開裂可能なリンカーを介してＬＮＡオリゴマーに結合しているアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体（本発明の化合物）を提供する。
【００１７】
本発明は、ＡｐｏＢ核酸を標的とするＬＮＡアンチセンスオリゴマー（Ａ）（本発明の化合物）、及び該オリゴマー（Ａ）と共有結合している少なくとも１の非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分（Ｃ）を含み、ここで非ポリヌクレオチド部分が、アシアロ糖タンパク質受容体標的複合体及び親油性複合体からなる群から選択され、親油性複合体、及び場合によりアシアロ糖タンパク質受容体標的複合体が、生物学的に開裂可能なリンカー（領域Ｂ）を介してＬＮＡアンチセンスオリゴマーに共有結合している複合体を提供する。
【００１８】
ある態様では、本発明は、オリゴマー化合物であって、ＡｐｏＢ核酸標的を標的とし、以下の３の領域：
ｉ）７〜２６の隣接するヌクレオチドを含み、ＡｐｏＢ核酸標的に相補的である、第１の領域（領域Ａ）；
ｉｉ）１〜１０の間のヌクレオチドを含み、第１の領域の５’若しくは３’ヌクレオチドに、ヌクレオシド間結合基、例えばホスホジエステル結合を介するなどして共有結合しており、ここで、
ａ．第１及び第２の領域間のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり、第１の領域に（直接のように）隣接している第２の領域のヌクレオシドが、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれかであるか；及び／又は
ｂ．第２の領域の少なくとも１のヌクレオシドが、ホスホジエステル結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシドである；
かのいずれかである、第２の領域（領域Ｂ）；
ｉｉｉ）複合体部分、標的部分、反応性基、活性化基、又は遮断部分を含む第３の領域（Ｃ）（ここで、第３の領域は、第２の領域と共有結合している）；
を含むオリゴマー化合物（本発明の化合物）を提供する。
【００１９】
ある態様では、領域Ａ及び領域Ｂは、８〜３５ヌクレオチド長の単一の隣接したヌクレオチド配列を形成している。
【００２０】
ある側面では、第１及び第２の領域間のヌクレオシド間結合は、第２の領域の一部であると考えることができる。
【００２１】
ある態様では、第２及び第３の領域間には、リン含有結合基がある。リン結合基は、例えば、ホスファート（ホスホジエステル）、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又はボラノホスファート基である。ある態様では、このリン含有結合基は、第２の領域と、第３の領域に結合しているリンカー領域の間に位置する。ある態様では、ホスファート基は、ホスホジエステルである。
【００２２】
したがって、ある側面では、オリゴマー化合物は、少なくとも２のホスホジエステル基を含み、ここで少なくとも１は、上記の発明の記載のとおりであり、もう一方は、第２及び第３の領域の間、場合により結合基及び第２の領域の間に位置する。
【００２３】
ある態様では、第３の領域は、活性化基、例えば抱合に使用される活性基である。この点において、本発明はまた、領域Ａ及びＢ、並びに活性化基、例えば引き続いての第３の領域への結合に適当な（抱合に適当であるような）中間体を含む活性化されたオリゴマーを提供する。
【００２４】
ある態様では、第３の領域は、反応性基、例えば抱合に使用される反応性基である。この点において、本発明はまた、領域Ａ及びＢ、並びに反応性基、例えば引き続いての第３の領域への結合に適当な（抱合に適当であるような）中間体を含むオリゴマーを提供する。ある態様では、反応性基は、アルコール基のアミン、例えばアミン基を含む。
【００２５】
ある態様では、領域Ａは、少なくとも１の、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４の、ホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、及びボラノホスファート、並びにメチルホスホナート、例えばホスホロチオアートからなる群から（場合により独立して）選択されるヌクレオシド間結合を含む。ある態様では、領域Ａは、少なくとも１のホスホロチオアート結合を含む。ある態様では、領域Ａにおいて、少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合、例えばヌクレオシド間結合の全てが、ホスホジエステル以外であり、例えばホスホロチオアート結合である。ある態様では、領域Ａにおいて、全てのヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル以外である。
【００２６】
ある態様では、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１の領域、及び場合により第２の領域であることができ、又は含むことができる。この点において、ある態様では、領域Ｂは、（核酸）標的に相補的である隣接した核酸塩基配列の一部を形成することができる。他の態様では、領域Ｂは、標的に対する相補性を欠いていてもよい。
【００２７】
或いはまた、ある態様では、本発明は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオシドに結合している少なくとも１の末端（５’及び／又は３’）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを有し、ここで末端ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドは、複合体部分、標的部分、又は遮断部分に、場合によりリンカー部分を介して更に共有結合している非ホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオアート結合）、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供する。
【００２８】
本発明は、本発明の化合物、及び薬学的に許容しうる希釈剤、担体、塩、又は補助剤を含む医薬組成部を提供する。
【００２９】
本発明は、医薬として使用するための、例えば急性冠症候群、又は高コレステロール血症若しくは関連障害、例えばアテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症（例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ））、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される障害の処置のための本発明の化合物又は医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明は、急性冠症候群、又は高コレステロール血症若しくは関連障害、例えばアテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症（例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ））、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される障害の処置のための医薬の製造のための本発明の化合物又は医薬組成物の使用を提供する。
【００３１】
本発明は、急性冠症候群、又は高コレステロール血症若しくは関連障害、例えばアテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症（例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ））、後天性高脂血症、スタチン耐性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される障害を処置する方法であって、有効量の本発明による化合物又は医薬組成物を、高コレステロール血症若しくは関連障害を罹患している、又は罹患している可能性がある患者に投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
本発明は、ＡｐｏＢを発現している細胞においてＡｐｏＢを阻害するためのインビボ又はインビトロ方法であって、該細胞に本発明化合物を投与して該細胞におけるＡｐｏＢを阻害することを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明は、医療において用いるための、例えば医薬として使用するための本発明の化合物を提供する。
【００３４】
本発明はまた、ＬＮＡオリゴマーであって、ＡｐｏＢ核酸標的の対応する領域に相補的である１２〜２４のホスホロチオアート結合ヌクレオシドの隣接する領域を含み、更にＬＮＡオリゴマーに隣接する１〜６の間のＤＮＡヌクレオシドを含み、ここでＤＮＡ間のヌクレオシド間結合、及び／又はＤＮＡヌクレオシドに隣接するヌクレオシド間結合が、生理学的に不安定である、例えばホスホジエステル結合などである、ＬＮＡオリゴマーを提供する。このようなＬＮＡオリゴマーは、本明細書に記載するように複合体の形であることができ、又は例えば、引き続いての抱合の工程において使用される中間体であることもできる。抱合する場合には、複合体は例えば、ステロール、例えばコレステロール又はトコフェロールであるか、又はこれらを含むことができ、或いは（非ヌクレオチド）炭水化物、例えばＧａｌＮａｃ複合体、例えばＧａｌＮａｃクラスター、例えばｔｒｉＧａｌＮａｃ、若しくは本明細書に記載の別の複合体であるか、又はこれらを含むことができる。
【００３５】
本発明は、ＬＮＡアンチセンスオリゴマー（本明細書では、領域Ａと記載することができる）であって、ＡｐｏＢ核酸標的の対応する領域に相補的である１２〜２４のホスホロチオアート結合ヌクレオシドの連続する領域、及びアシアロ糖タンパク質受容体標的部分複合体部分、例えばＧａｌＮＡｃ部分（これは、更なる領域の一部を形成することができる）（領域Ｃと記載する）を含むアンチセンスオリゴマーを含むＬＮＡアンチセンスオリゴマーを提供する。ＬＮＡアンチセンスオリゴマーは、１２〜２４であることができ、ギャップマーオリゴマーの形であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】活性化基（すなわち、保護された反応性基、第３の領域として）に結合している本発明のオリゴマーの非限定的な図である。ヌクレオシド間結合Ｌは、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナート、例えばホスホジエステルであることができる。ＰＯは、ホスホジエステル結合である。化合物ａ）は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを有する領域Ｂであり、第２及び第１の領域の間の結合は、ＰＯである。化合物ｂ）は、ホスホジエステル結合で結合した２つのＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ）ヌクレオシドを有する。化合物ｃ）は、ホスホジエステル結合で結合した３つのＤＮＡ／ＲＮＡ（例えばＤＮＡ）ヌクレオシドを有する。ある態様では、領域Ｂは、更なるホスホジエステルＤＮＡ／ＲＮＡ（例えばＤＮＡヌクレオシド）によって更に延長されていることができる。活性化基は、各化合物の左側に図示し、場合によりリンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いはある態様では、トリアゾール結合を介して領域Ｂの末端ヌクレオシドに結合していることができる。化合物ｄ）、ｅ）、及びｆ）は、領域Ｂ及び活性化基の間に更にリンカー（Ｙ）を含み、領域Ｙは、例えばリンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは別の態様では、トリアゾール結合を介して、領域Ｂに結合していることができる。
【図２】図１に示したのと同等の化合物であるが、活性化基の代わりに反応性基が使用されている。反応性基は、ある態様では、活性化基の活性化の結果（例えば、脱保護）であることができる。反応性基は、アミン又はアルコールであることができるが、これらに限定する例ではない。
【図３】本発明化合物の非限定的な図である。図１と同じ用語体系である。Ｘは、ある態様では、複合体、例えば親油性複合体、例えばコレステロール、又は別の複合体、例えば本明細書に記載のものであることができる。更に、或いはまた、Ｘは、標的基又は遮断基であることができる。ある側面では、Ｘは、活性化基（図１を参照）、又は反応性基（図２を参照）であることができる。Ｘは、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して領域Ｂに共有結合しているか、又は替わりの結合、例えばトリアゾール結合（化合物ｄ）、ｅ）、及びｆ）におけるＬを参照）を介して結合していることができる。
【図４】化合物が、第３の領域（Ｘ）と第２の領域（領域Ｂ）の間に任意のリンカーを含む本発明の化合物の非限定的な図である。図１と同じ用語体系である。適当なリンカーが本明細書に開示されており、例えばアルキルリンカー、例えばＣ６リンカーを包含する。化合物Ａ、Ｂ、及びＣでは、Ｘと領域Ｂの間のリンカーは、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートなどを介して領域Ｂに結合しているか、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合（Ｌｉ）を介して結合していることができる。これらの化合物では、Ｌｉｉは、第１（Ａ）、及び第２の領域（Ｂ）の間のヌクレオシド間結合を表す。
【図５】５ｂは、本発明化合物の合成方法の非限定的な例を示す。ＵＳは、オリゴヌクレオチド合成の支持体を表し、これは、固体の支持体であることができる。Ｘは、第３の領域、例えば複合体、標的基、遮断基などである。任意の前工程では、Ｘを、オリゴヌクレオチド合成支持体に加える。そうでない場合には、あらかじめＸを結合させた支持体を得てもよい（ｉ）。第１の工程では、領域Ｂを合成し（ii）、続いて領域（Ａ）を合成し（iii）、その後オリゴヌクレオチド合成支持体から本発明のオリゴマー化合物を開裂させる（iv）。別の方法では、前工程には、領域Ｘ及びリンカー基（Ｙ）を結合させたオリゴヌクレオチド合成支持体を提供することが含まれる（図５ａを参照）。ある態様では、Ｘ又はＹ（存在する場合）のいずれかを、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合を介して領域Ｂに結合させる。
【図６】第３の領域（Ｘ）と第２の領域（Ｂ）の間にリンカー（Ｙ）を含む本発明化合物の合成方法の非限定的な例である。ＵＳは、オリゴヌクレオチド合成支持体を表し、これは、固体の支持体であることができる。Ｘは、第３の領域、例えば複合体、標的基、遮断基などである。任意の前工程では、Ｙを、オリゴヌクレオチド合成支持体に加える。そうでない場合には、あらかじめＹを結合させた支持体を得てもよい（ｉ）。第１の工程では、領域Ｂを合成し（ii）、続いて領域（Ａ）を合成し（iii）、その後オリゴヌクレオチド合成支持体から本発明のオリゴマー化合物を開裂させる（iv）。ある態様では（示されているように）、領域Ｘを、開裂の工程（ｖ）の後にリンカー（Ｙ）に加えてもよい。ある態様では、Ｙを、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合を介して領域Ｂに結合させる。
【図７】活性化基を用いる本発明化合物の合成方法の非限定的な例である。任意の前工程では、活性化基をオリゴヌクレオチド合成支持体に付着させる（ｉ）か、又は活性化基を有するオリゴヌクレオチド合成支持体を別の方法で得る。工程ii）では、領域Ｂを合成し、続いて領域Ａを合成する（iii）。次にオリゴヌクレオチド合成支持体からオリゴマーを開裂させる（iv）。次に中間体オリゴマー（活性化基を含む）を活性化させてもよく（vi）又は（viii）、第３の領域（Ｘ）を、場合によりリンカー（Ｙ）を介して（ix）、加える（vi）。ある態様では、Ｘ（又は存在する場合にはＹ）を、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合を介して領域Ｂに結合させる。
【図８】二官能性オリゴヌクレオチド合成支持体を用いる本発明化合物の合成方法の非限定的な例である（ｉ）。このような方法では、当初の一連の工程（ii）〜(iii)においてオリゴヌクレオチドを合成した後、第３の領域（場合によりリンカー基Ｙを介して）を結合させ、次いで本発明のオリゴマー化合物を開裂させることができる（v）。或いはまた、工程（vi）〜（ix）に示すように、第３の領域（場合によりリンカー基（Ｙ）を有する）をオリゴヌクレオチド合成支持体（これは、任意の前工程であることができる）に結合させるか、又はそうでなければ第３の領域（場合によりＹを有する）を有するオリゴヌクレオチド合成支持体を提供し、次いでオリゴヌクレオチドを合成する（vii〜viii）。次いで、本発明のオリゴマー化合物を開裂させてもよい（ix）。ある態様では、Ｘ（又は、存在する場合にはＹ）を、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合を介して領域Ｂに結合させる。ＵＳは、ある態様では、方法（例えば、前工程など）に先だって、オリゴヌクレオチドの独立した合成と、基Ｘ、Ｙ（又はＸ及びＹ）の共有結合による支持体への結合（これは、例えばトリアゾール、またヌクレオシド基を用いることによって行うことができる）を可能とする双方向性（二官能性）基を加える工程を含むことができる。次に、オリゴマーが結合した双方向性（二官能性）基を、支持体から開裂させることができる。
【図９】本発明化合物の合成方法の非限定的な例：当初の工程では、第１の領域（Ａ）を合成し（ii）、その後領域Ｂを合成する。ある態様では、次いで第３の領域を、場合によりホスファートヌクレオシド結合（又は、例えばトリアゾール結合）を介して、領域Ｂに結合させる（iii）。本発明のオリゴマー化合物を次いで開裂させてもよい（iv）。リンカー（Ｙ）を用いる場合、ある態様では、工程（ｖ）〜（viii）に続いてもよい。領域Ｂの合成後、リンカー基（Ｙ）を加え、次いで（Ｙ）に結合させるか、又は続く工程において領域Ｘを加える（vi）。次いで、本発明のオリゴマー化合物を開裂させてもよい（vii）。ある態様では、Ｘ（又は、存在する場合にはＹ）を、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合を介して領域Ｂに結合させる。
【図１０】本発明化合物の合成方法の非限定的な例：この方法では、活性化基を使用する：工程（ｉ）〜（iii）は、図９のとおりである。しかし、オリゴヌクレオチドの合成後（工程iii）、活性化基（又は反応性基）を場合によりホスファートヌクレオシド結合を介して領域Ｂに加える。次いでオリゴヌクレオチドを支持体（ｖ）から開裂させる。続いて活性化基を活性化して、反応性基を生成し、次いで第３の領域（Ｘ）、例えば複合体、遮断基、又は標的基を、反応性基（活性化された活性化基、又は反応性基であることができる）に加えて、オリゴマー（vi）を生成する。（vii）〜（viii）に示すように、開裂後、リンカー基（Ｙ）を加え（vii）、次いで（Ｙ）に結合させるか、又は続く工程で、領域Ｘを加えて、オリゴマーを生成する(viii)。代替案では、工程（ii）〜（viii）の全てを、オリゴヌクレオチド合成支持体上で行うことができることは確認されるべきであり、このような場合、支持体からオリゴマーを開裂させる最終工程を行うことができる。ある態様では、反応性基又は活性化基を、リンヌクレオシド結合基、例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート、又はメチルホスホナートを介して、或いは代わりの結合、例えばトリアゾール結合を介して領域Ｂに結合させる。
【図１１】コレステロール複合体によるインビボでのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのサイレンシングである。マウスに、非抱合ＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（#3833）１mg/kg、又は異なるリンカーによりコレステロールに抱合したＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（表３）等モル量を単回注射し、投与１、３、７、及び１０日目に屠殺した。肝及び腎からＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ特異的ＲＴ−ｑＰＣＲに付した。肝試料から得たＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの定量は、ＧＡＰＤＨで標準化し、同等の食塩水の対照Ｂの平均のパーセンテージとして示す。腎試料から得たＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの定量は、ＧＡＰＤＨで標準化し、同等の食塩水の対照の平均のパーセンテージとして示す。
【図１２−１】本発明の化合物においてＸ−Ｙ−として使用することができるコレステロールＣ６複合体、更に実施例で用いた具体的化合物（本発明の具体的化合物を含む）を示す。
【図１２−２】本発明の化合物においてＸ−Ｙ−として使用することができるコレステロールＣ６複合体、更に実施例で用いた具体的化合物（本発明の具体的化合物を含む）を示す。
【図１２−３】本発明の化合物においてＸ−Ｙ−として使用することができるコレステロールＣ６複合体、更に実施例で用いた具体的化合物（本発明の具体的化合物を含む）を示す。
【図１２−４】本発明の化合物においてＸ−Ｙ−として使用することができるコレステロールＣ６複合体、更に実施例で用いた具体的化合物（本発明の具体的化合物を含む）を示す。
【図１２−５】本発明の化合物においてＸ−Ｙ−として使用することができるコレステロールＣ６複合体、更に実施例で用いた具体的化合物（本発明の具体的化合物を含む）を示す。
【図１３−１】使用することができるｔｒｉ−ＧａｌＮａｃ複合体の例である。複合体１〜４は、４種の適当なＧａｌＮａｃ複合体部分を示し、複合体１ａ〜４ａは、複合体をオリゴマー（領域Ａ、又は生物学的に開裂可能なリンカー、例えば領域Ｂ）に結合させるために用いる追加のリンカー部分（Ｙ）を有する同じ複合体を指す。波線は、オリゴマーへの共有結合を表す。
【図１３−２】使用することができるｔｒｉ−ＧａｌＮａｃ複合体の例である。複合体１〜４は、４種の適当なＧａｌＮａｃ複合体部分を示し、複合体１ａ〜４ａは、複合体をオリゴマー（領域Ａ、又は生物学的に開裂可能なリンカー、例えば領域Ｂ）に結合させるために用いる追加のリンカー部分（Ｙ）を有する同じ複合体を指す。波線は、オリゴマーへの共有結合を表す。
【図１３−３】使用することができるｔｒｉ−ＧａｌＮａｃ複合体の例である。複合体１〜４は、４種の適当なＧａｌＮａｃ複合体部分を示し、複合体１ａ〜４ａは、複合体をオリゴマー（領域Ａ、又は生物学的に開裂可能なリンカー、例えば領域Ｂ）に結合させるために用いる追加のリンカー部分（Ｙ）を有する同じ複合体を指す。波線は、オリゴマーへの共有結合を表す。
【図１３−４】使用することができるｔｒｉ−ＧａｌＮａｃ複合体の例である。複合体１〜４は、４種の適当なＧａｌＮａｃ複合体部分を示し、複合体１ａ〜４ａは、複合体をオリゴマー（領域Ａ、又は生物学的に開裂可能なリンカー、例えば領域Ｂ）に結合させるために用いる追加のリンカー部分（Ｙ）を有する同じ複合体を指す。波線は、オリゴマーへの共有結合を表す。
【図１４】コレステロール及びトコフェロール複合体部分の例である。波線は、オリゴマーへの共有結合を表す。
【図１５】異なる複合体によるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのインビボサイレンシングである（実施例４を参照）。マウスを、生物学的に開裂可能なリンカーを有しない、又はジチオ−リンカー（ＳＳ）若しくはＤＮＡ／ＰＯ−リンカー（ＰＯ）を有する異なる複合体を有するＡＳＯ１mg/kgで処理した。ＲＮＡを肝（Ａ）及び腎（Ｂ）試料から単離し、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンについて分析した。データを、食塩水（＝１）と比較して示す。
【図１６】実施例８−ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの発現。
【図１７ａ】実施例８−血清中の総コレステロール。
【図１７ｂ】実施例８−血清中の総コレステロール。
【図１８ａ】実施例８−肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量。
【図１８ｂ】実施例８−肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量。
【図１８ｃ】実施例８−肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量。
【図１８ｄ】実施例８−肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量。
【図１８ｅ】実施例８−肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量。
【図１８ｆ】実施例８−肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量。
【００３７】
発明の詳細な説明
ある態様では、本発明は、ＡｐｏＢ核酸を標的とするオリゴマー化合物、例えばホスホジエステル結合ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む短い領域（例えば１〜１０）を介して、複合体基、標的基、反応性基、活性化基、又は遮断基に共有結合しているＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００３８】
オリゴマー
本発明と関連して、語「オリゴマー」は、２以上のヌクレオチド（すなわちオリゴヌクレオチド）の共有結合により形成される分子を指す。本明細書では、単一のヌクレオチド（ユニット）はまた、モノマー又はユニットとして記載することができる。ある態様では、語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」、及び「モノマー」は、交互に区別しないで使用される。ヌクレオチド又はモノマーの配列を記載する場合には、記載されるのは、塩基、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵの配列であることは、確認されよう。
【００３９】
本発明のオリゴマーは、ＬＮＡオリゴマーであることができ、すなわち少なくとも１のＬＮＡヌクレオシドユニット、又はギャップマー、例えばＬＮＡギャップマーを含む。
【００４０】
本発明のオリゴマーは、長さ１０〜２２、例えば１２〜２２のヌクレオチドを含むことができる。本発明のオリゴマーは、対応する長さのＡｐｏＢ核酸標的に相補的、例えば完全に相補的である、隣接する１０〜２０のヌクレオチドの配列を含むことができる（例えば、ＮＭ＿０００３８４、又はgenbankアクセッション番号ＮＧ＿０１１７９３、ＮＭ＿０００３８４．２  ＧＩ：１０５９９０５３１、及びＮＧ＿０１１７９３．１  ＧＩ：２２６４４２９８７は、参照により本明細書に組み入れられる）。隣接する１０〜２０のヌクレオチドの配列は、例えばホスホロチオアート結合により結合していることができる。
【００４１】
例えば、本発明のオリゴマーは、配列番号１又は配列番号２に示す核酸塩基の配列を含むことができる。
【００４２】
本発明の化合物（例えば、オリゴマー又は複合体）は、ＡｐｏＢを標的とし、それ自体は、該ＡｐｏＢを発現している細胞において、ＡｐｏＢ、例えばヒトＡｐｏＢを阻害することができる。
【００４３】
ある態様では、隣接する配列のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であることができ、親和性増強ヌクレオチドアナログを含んでいることができる。
【００４４】
ある態様では、ヌクレオチドアナログは、糖修飾ヌクレオチド、例えばロックド核酸（ＬＮＡ又はＢＮＡ）ユニット；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、及び２’−フルオロ−ＤＮＡユニットからなる群から独立して、又は従属して選択される糖修飾ヌクレオチドである。
【００４５】
ある態様では、ヌクレオチドアナログは、ロックド核酸（ＬＮＡ、又はＢＮＡとしても公知である）ユニットを含むか、又はそれである。
【００４６】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、ギャップマー、例えばＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれである。
【００４７】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、対応する長さのＡｐｏＢ核酸標的に相補的であり、場合により更に１〜１０、例えば１〜６のヌクレオチド（これは、生物学的に開裂可能なヌクレオチド領域、例えばホスファートヌクレオチドリンカーを形成するか、又は含んでいることができる）を含んでいることができる隣接する１３、１４、１５、又は１６のヌクレオチドの配列を含む。適切には、生物学的に開裂可能なヌクレオチド領域は、生理学的に不安定な短い伸長（例えば、１、２、３、４、５、又は６）のヌクレオチドから形成されている。これは、ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドとのホスホジエステル結合を用いることによって得られるか、又は生理学的な不安定さが維持される場合には、その他のヌクレオシドを使用することができる。
【００４８】
したがって本発明のオリゴマーは、対応する長さのＡｐｏＢ核酸標的（Ａ第１領域、又は領域Ａ）に相補的である、１０〜２０のヌクレオチド長の隣接するヌクレオチド配列を含んでいることができる。本発明のオリゴマーは、更なるヌクレオチド領域を含んでいることができる。ある態様では、更なるヌクレオチド領域は、生物学的に開裂可能なヌクレオチド領域、例えばホスファートヌクレオチド配列（第２の領域、領域Ｂ）を含み、これが、非ヌクレオチド部分、例えば複合体基（第３の領域、又は領域Ｃ）へ、領域Ａを共有結合させていることができる。ある態様では、本発明のオリゴマーの隣接するヌクレオチド配列（領域Ａ）は、領域Ｃと直接、共有結合している。ある態様では、領域Ｃは、生物学的に開裂可能である。
【００４９】
オリゴマーは、１０〜２２、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１ヌクレオチド長、例えば１３〜１６、又は１３若しくは１４、又は１５若しくは１６ヌクレオチド長の隣接するヌクレオチド配列からなるか、又は含む。したがって、オリゴマーは、領域Ａ及び領域Ｂの組み合わせた長さ、例えば（領域Ａ１０〜１６ヌクレオチド）及び領域Ｂ（１〜６ヌクレオチド）を指すことができる。
【００５０】
各種の態様では、本発明の化合物は、ＲＮＡ（ユニット）を含まない。ある態様では、本発明による化合物、第１の領域、又は第１及び第２の領域は一緒になって（例えば、一本の隣接する配列として）、直鎖状の分子であるか、又は直鎖状の分子として合成される。したがってオリゴマーは、一本鎖の分子であることができる。ある態様では、オリゴマーは、短い領域、例えば同じオリゴマー内の同等の領域（すなわち、デュプレックス）に相補的である少なくとも３、４、又は５の隣接するヌクレオチドの短い領域を含まない。ある態様では、オリゴマーは、（本質的には）二本鎖でなくてもよい。ある態様では、オリゴマーは、本質的には二本鎖でなくてもよく、例えばｓｉＲＮＡではない。
【００５１】
標的
本発明のオリゴマーは、ＡＰＯ−Ｂ遺伝子、例えばＡｐｏＢ−１００、又はＡｐｏＢ−４８（ＡＰＯＢ）の発現を適切に下方制御することができる。この点に関連しては、本発明のオリゴマーは、典型的には哺乳動物、例えばヒト細胞、例えば肝細胞においてＡＰＯＢの阻害に影響することができる。ある態様では、本発明のオリゴマーは、標的核酸に結合し、正常な発現レベルと比較して、少なくとも１０％又は２０％、より好ましくは正常な発現レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の発現の阻害を行う。ある態様では、０．０４〜２５nMの間、例えば０．８〜２０nMの間の濃度の本発明の化合物を用いた場合に、このような調節が見られる。同一又は異なる態様では、発現の阻害は、１００％未満、例えば９８％未満の阻害、９５％未満の阻害、９０％未満の阻害、８０％未満の阻害、例えば７０％未満の阻害である。発現レベルの調節は、タンパク質濃度を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥと引き続いての標的タンパク質に対する適当な抗体を用いたウエスタンブロット法などの方法で測定することにより決定することができる。或いは、発現レベルの調節は、ｍＲＮＡ濃度を、例えばノーザンブロット法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定することにより決定することができる。ｍＲＮＡレベルを介して測定する場合、適当な量、例えば０．０４〜２５nMの間、例えば０．８〜２０nMの間の濃度を用いた場合の下方制御のレベルは、ある態様では、典型的には、本発明化合物の非存在下での正常レベルの１０〜２０％の間のレベルに対する。
【００５２】
したがって、本発明は、ＡＰＯ−Ｂタンパク質及び／又はｍＲＮＡを発現している細胞において、ＡＰＯ−Ｂタンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現を下方制御又は阻害する方法であって、本発明の化合物を、本発明に、該細胞に投与して、該細胞におけるＡＰＯ−Ｂタンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現を下方制御又は阻害する方法を提供する。細胞は、哺乳動物の細胞、例えばヒト細胞であるのが適当である。投与は、ある態様では、インビトロで行うことができる。ある態様では、投与は、インビボで行うことができる。
【００５３】
本明細書で用いる語「標的核酸」は、哺乳動物のＡＰＯ−Ｂポリペプチド、例えばヒトＡＰＯ−Ｂ１００をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばヒトＡＰＯ−Ｂ１００ｍＲＮＡを指す。ＡＰＯ−Ｂ１００をコードする核酸又は天然に存在するその変種、及びそれから誘導されるＲＮＡ核酸、好ましくはｍＲＮＡ、例えば、プレｍＲＮＡ（好ましくは成熟ｍＲＮＡであるが）。ある態様では、例えば、研究又は診断において使用する場合、「標的核酸」は、ｃＤＮＡ、又は上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的から誘導される合成オリゴヌクレオチドであることができる。本発明によるオリゴマーは、好ましくは、標的核酸にハイブリダイズすることができる。ヒトＡＰＯ−Ｂ  ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ配列であり、それ自体、成熟ｍＲＮＡ標的配列に対応するが、ｃＤＮＡ配列では、ウラシルは、チミジンで置き換えられていることは認識されよう。
【００５４】
語「天然に存在するその変種」は、定義された分類学上の群（例えば、哺乳動物、例えば、マウス、サル、及び好ましくはヒト）内に天然に存在する核酸配列のＡＰＯ−Ｂ１ポリペプチドの変種を指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然に存在する変種」を指す場合、その語は、染色体転位又は重複による、ＡＰＯ−ＢをコードするゲノムＤＮＡの任意の対立遺伝子変異型、及びそれから誘導されるｍＲＮＡなどのＲＮＡをも含む。「天然に存在する変種」はまた、ＡＰＯ−Ｂ１００ｍＲＮＡの選択的スプライシングから誘導される変種も含む。特定のポリペプチド配列について記載する場合、その語は、例えば同時翻訳又は翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解開裂、グリコシル化など）により処理されているかもしれないタンパク質の天然に存在する形も含む。
【００５５】
オリゴマー（領域Ａ）は、例えばヒトＡＰＯ−Ｂ  ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列の逆相補鎖配列に対応する隣接するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなることができる。
【００５６】
オリゴマー（領域Ａ）は、哺乳動物のＡＰＯ−Ｂ（例えば、ヒトＡＰＯ−Ｂ１００ｍＲＮＡ）をコードする核酸の同等の領域に十分に相補的（完全に相補的である）である隣接するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなることができる。したがって、オリゴマー（領域Ａ）は、アンチセンスヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなることができる。
【００５７】
しかし、ある態様では、オリゴマーは、標的配列にハイブリダイズする場合、１又は２のミスマッチには耐えることができ、標的に十分に結合して所望の効果、すなわち標的の下方制御を示すことができる。ミスマッチは、例えばオリゴマーヌクレオチド配列の長さの延長、及び／又はヌクレオチド配列に存在するヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡの数の増加によって代償されることができる。
【００５８】
ある態様では、オリゴマーのヌクレオチド配列は、追加の５’−又は３’−ヌクレオチド、例えば独立して、１、２、３、４、５、又は６の追加のヌクレオチド５’及び／又は３’（これは、標的配列には非相補的であり、このような非相補的オリゴヌクレオチドは、領域Ｂを形成することができる）を含むことができることは、認識される。この点において、本発明のオリゴマーは、ある態様では、追加のヌクレオチドによって５’及び／又は３’がフランキングされている隣接するヌクレオチド配列を含むことができる。ある態様では、追加の５’又は３’ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。ある態様では、追加の５’又は３’ヌクレオチドは、本明細書においてギャップマーオリゴマーとの関連で記載されている領域Ｄを表すことができる。ある態様では、追加のヌクレオチドの間、そして場合により追加のヌクレオチドとオリゴマーの間のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【００５９】
ある態様では、本発明によるオリゴマーは、配列番号１のヌクレオチド配列、又は少なくともその１０又は１２の核酸塩基のサブ配列からなるか、又はそれを含む。
【００６０】
ある態様では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２のヌクレオチド配列、又は少なくともその１０又は１２の核酸塩基のサブ配列からなるか、又はそれを含む。
【００６１】
以下の表に、オリゴマー及び複合体の具体的な組み合わせを提供する。
【００６２】
【表１】
2016503300.tif 000002
【００６３】
表１：オリゴマー／複合体の組み合わせ。生物学的に開裂可能なリンカー（Ｂ）は、複合体部分（Ｃ）及びオリゴマー（Ａ）の間に存在することができ、又は存在しないことができることに留意されたい。Ｃｏｎｊ１〜４、及び１ａ〜４ａについては、ＧａｌＮａｃ複合体自体は、ＧａｌＮａｃクラスター内のペプチドリンカーを利用して生物学的に開裂可能であり、更なる生物学的に開裂可能なリンカー（Ｂ）は、使用することができ、又は使用しないことができる。しかし、予備的データは、生物学的に開裂可能なリンカー（Ｂ）、例えば本明細書に開示されているホスファートヌクレオチドリンカーを含めると、このようなＧａｌＮａｃクラスターオリゴマー複合体の活性を増強することができることを示している。Ｃｏｎｊ５及びＣｏｎｊ６との使用については、生物学的に開裂可能なリンカーの使用は、化合物の活性を大きく増強し、生物学的に開裂可能なリンカー（Ｂ）、例えば本明細書に開示されているホスファートヌクレオチドリンカーを含めることが勧められる。複合体部分（及び領域Ｂ又は領域Ｙ、又はＢ及びＹ）は、配列番号に対して例えば５’又は３’、例えば領域Ａに対して５’に位置することができる。
【００６４】
語「対応している」及び「対応する」は、オリゴマーのヌクレオチド配列（すなわち、核酸塩基、又は塩基配列）又は隣接するヌクレオチド配列（第１の領域／領域Ａ）と、核酸標的、又はその小領域の逆相補配列の間の対比を指す。
【００６５】
ヌクレオチドアナログを、それらと同等又は対応するヌクレオチドと直接対比する。好ましい態様では、オリゴマー（又はその第１の領域）は、標的領域又は小領域と相補的、例えば十分に相補的である。
【００６６】
本明細書で使用される語「逆相補」、「逆相補的」及び「逆相補性」は、「相補」、「相補的」、及び「相補性」と区別しないで使用される。
【００６７】
語「対応するヌクレオチドアナログ」、及び「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチドアナログ中のヌクレオチドと、天然に存在するヌクレオチドが同一であることを示すことを意図している。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボースユニットが、アデニンと結合している場合、「対応するヌクレオチドアナログ」は、アデニンと結合したペントースユニット（２−デオキシリボースとは異なる）を含む。
【００６８】
語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を指し、天然に存在するものと、天然には存在しない変種の両方を含む。したがって、「核酸塩基」は、公知のプリン及びピリミジン複素環ばかりなく、その複素環アナログ及び互変異性体をも含む。領域ＢのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドは、天然に存在する、及び／又は天然に存在しない核酸塩基を有することができることは、認識されよう。
【００６９】
核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。ある態様では、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、５−メチルシトシンからなる群から独立して選択することができる。ある態様では、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、及び５−メチルシトシンからなる群から独立して選択することができる。
【００７０】
ある態様では、オリゴマー中に存在する核酸塩基の少なくとも１は、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾された核酸塩基である。
【００７１】
長さ
オリゴマーは、合計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２の間の隣接するヌクレオチド長の隣接するヌクレオチド配列を含むことができるか、又はそれからなることができる。長さは、例えば領域Ａ、又は領域Ａ及びＢを含むことができる。
【００７２】
ある態様では、オリゴマーは、合計１０〜２２の間、例えば１２〜１８の間、例えば１３〜１７の間、又は１２〜１６の間、例えば１３、１４、１５、１６の隣接するヌクレオチド長の隣接するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなることができる。
【００７３】
ある態様では、本発明によるオリゴマーは、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１５、１６、又は１７のヌクレオチドからなる。ある態様では、本発明のオリゴマーは、２０未満のヌクレオチドを含む。
【００７４】
ヌクレオチドアナログ
本明細書で使用される語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分、及び共有結合した基、例えばホスファート又はホスホロチオアートのヌクレオチド間結合基を含む配糖体であり、天然に存在するヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、並びに修飾された糖及び／又は塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチド（本明細書では、これも「ヌクレオチドアナログ」と記載する）の両方を含む。本明細書では、単一のヌクレオチド（ユニット）は、モノマー又は核酸ユニットとも記載する。
【００７５】
生化学の分野では、語「ヌクレオシド」は、糖部分と塩基部分を含む配糖体を指すために通常用いられており、したがってオリゴマーのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合により共有結合されたヌクレオチドユニットを指す場合にも使用することができる。
【００７６】
当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、５’ヌクレオチド間結合基を含まないが、５’末端基を含むことができるし、含まないこともできる。
【００７７】
天然に存在しないヌクレオチドは、修飾された糖部分を有するヌクレオチド、例えば二環式ヌクレオチド、又は２’修飾ヌクレオチド、例えば２’置換ヌクレオチドを含む。
【００７８】
「ヌクレオチドアナログ」は、天然のヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドの、糖及び／又は塩基部分における修飾による変種である。アナログは、原則として、オリゴヌクレオチドという状況下で、天然のヌクレオチドに対して単に「無変化」（silent）又は「同等」であることができる、すなわちオリゴヌクレオチドが作用して標的遺伝子の発現を阻害する工程にたいして機能的な効果を有しない。しかし、このような「同等の」アナログは、例えばそれらが製造するのに容易若しくは安価である場合、又は保存若しくは製造条件に安定である場合、又はタグ若しくは標識を表す場合には有用である。しかし、好ましくは、アナログは、オリゴマーが作用して発現を阻害する工程において、例えば標的に対する結合親和性を増大させる、及び／又は細胞内ヌクレアーゼに対する耐性を増大させる、及び／又は細胞内への移送をより容易にすることによって機能的な効果を有するであろう。ヌクレオチドアナログの具体的な例は、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443、及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213,及びスキーム１に記載されている。
【００７９】
【化１】
2016503300.tif 000003
【００８０】
したがってオリゴマーは、天然に存在するヌクレオチド、好ましくは２’−デオキシヌクレオチド（ここでは、全般に「ＤＮＡ」と記載する）の単純な配列と、また可能であればリボヌクレオチド（ここでは、全般に「ＲＮＡ」と記載する）、又はこのような天然に存在するヌクレオチドと、１以上の天然には存在しないヌクレオチド、すなわちヌクレオチドアナログとの組み合わせを含むか、又はこれらからなる。このようなヌクレオチドアナログは、標的配列に対するオリゴマーの親和性を適当に増大させることができる。
【００８１】
適当かつ好ましいヌクレオチドアナログの例は、国際公開公報第２００７／０３１０９１号によって提供されるか、又はそこで参照されている。本発明のオリゴマーにおいて使用することができる他のヌクレオチドアナログは、三環式核酸を含むが、例えば参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２０１３／１５４７９８号及び国際公開公報第２０１３／１５４７９８号を参照されたい。
【００８２】
親和性を増大させるヌクレオチドアナログを、例えばＬＮＡ又は２’−置換糖のオリゴマーに導入することにより、非特異的又は異常な結合が起きる前に特異的に結合しているオリゴマーのサイズを小さくすることができ、また上限をオリゴマーのサイズに引き下げることができる。
【００８３】
ある態様では、オリゴマーは、少なくとも２のヌクレオチドアナログを含む。ある態様では、オリゴマーは、３〜８のヌクレオチドアナログ、例えば６又は７のヌクレオチドアナログを含む。圧倒的に最も好ましい態様では、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１が、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり；例えばヌクレオチドアナログの少なくとも３若しくは少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は８は、ＬＮＡであることができる。ある態様では、全てのヌクレオチドアナログがＬＮＡであることができる。
【００８４】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列を指す場合、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在する１以上のヌクレオチドの代わりに対応するヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡユニット又は他のヌクレオチドアナログ（これが、オリゴマー／標的デュプレックスのデュプレックス安定性／Ｔｍを上昇させる（すなわち、親和性増大ヌクレオチドアナログ））を含むことができる。
【００８５】
Ｔｍアッセイ：オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（ＰＯ）デュプレックスを、ＲＮアーゼを含まない水 ５００ml中で３mMまで希釈し、２×Ｔｍ緩衝液（２００mM ＮａＣｌ、０．２mM ＥＤＴＡ、２０mM リン酸ナトリウム、pH７．０）５００mlと混合する。溶液を９５℃まで３分間加熱し、次いで室温で３０分間、アニーリングさせる。デュプレックスの融解温度（Ｔｍ）を、PE Templab ソフトウエア（Perkin Elmer）を用いて、Peltier温度プログラマーPTP6を備えたLambda 40 UV/VIS分光光度計を用いて測定する。２６０nmでの吸光度を測定しながら、温度を、２０℃から９５℃まで上昇させ、次いで２５℃まで引き下げる。最初の誘導体と、溶融及びアニーリング両方の局所最大値を用いて、デュプレックスのＴｍを評価する。
【００８６】
ＬＮＡ
語「ＬＮＡ」は、Ｃ２＊〜Ｃ４＊ビラジカル（架橋）を含む二環式ヌクレオシドアナログを指し、「ロックド核酸」として知られている。それは、ＬＮＡモノマーを指すことができ、又は「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」との関連で使用される場合には、ＬＮＡは、１以上のこのような二環式ヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドを指す。ある局面では、二環式ヌクレオシドアナログは、ＬＮＡヌクレオチドであり、したがって、これらの語は、区別しないで用いることができ、このような態様では、両者とも、リボース糖環のＣ２’及びＣ４’の間にリンカー基（架橋など）が存在することを特徴とする。
【００８７】
ある態様では、第１の領域（Ａ）に存在する少なくとも１のヌクレオシドアナログは、二環式ヌクレオシドアナログであり、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８（領域ＢのＤＮＡ及び／又はＲＮＡヌクレオシドを除く）は、糖修飾ヌクレオシドアナログ、例えば二環式ヌクレオシドアナログ、例えばＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−Ｘ−ＬＮＡ又はアルファ−Ｌ−Ｘ−LＮＡ（ここで、Ｘは、オキシ、アミノ、又はチオである））、又は本明細書で開示されている他のＬＮＡであり、（Ｒ／Ｓ）ｃＥＴ、ｃＭＯＥ、又は５’−Ｍｅ−ＬＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチド化合物に用いられるＬＮＡは、好ましくは一般式II：
【化２】
2016503300.tif 000004
の構造を有し、式中、Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒｅ）、及び／又は−ＣＨ２−からなる群から選択され；Ｚ及びＺ＊は、ヌクレオチド間結合、ＲＨ、末端基、又は保護基から独立して選択され；Ｂは、天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し；ＲＨは、水素、及びＣ１−４−アルキルから選択され；Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅは、水素、場合により置換されたＣ１−１２−アルキル、場合により置換されたＣ２−１２−アルケニル、場合により置換されたＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−及びジ−（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−及びジ−（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−及びジ−（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、及びリガンドからなる群から場合により独立して選択され、ここでアリール及びヘテロアリールは、場合により置換されていることができ、ここで２のジェミナルな置換基Ｒａ及びＲｂは、一緒になって場合により置換されたメチレン（＝ＣＨ２）を示すことができ；ＲＨは、水素、及びＣ１−４−アルキルから選択される。ある態様では、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅは、水素、及びＣ１−６−アルキル、例えばメチルからなる群から、場合により独立して選択される。全てのキラル中心については、不斉基は、Ｒ又はＳ位のいずれかであり、例えば２の典型的な立体化学的異性体はベータ−Ｄ、及びアルファ−Ｌ−アイソフォームを含み、これらは、下記のように示される。
【００８９】
【化３】
2016503300.tif 000005
【００９０】
具体的な典型的なＬＮＡユニットを下記に示す：
【化４】
2016503300.tif 000006
【００９１】
語「チオ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＹが、Ｓ又は−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ及びアルファ−Ｌ−の立体配置の両方であることができる。
【００９２】
語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、及び−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択され、ここでＲは、水素、及びＣ１−４−アルキルから選択されるロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ及びアルファ−Ｌ−の立体配置の両方であることができる。
【００９３】
語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＹが、−Ｏ−を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ及びアルファ−Ｌ−の立体配置の両方であることができる。
【００９４】
語「ＥＮＡ」は、上記一般式中のＹが、−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’−位に結合している）であるロックドヌクレオチドを含む。Ｒｅは、水素又はメチルである。
【００９５】
典型的な態様のあるものでは、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、及びベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡから選択され、特にはベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００９６】
本明細書で使用される「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例は、４’及び２’リボース環原子の間に架橋を有するヌクレオシドを含むが、これらに限定されるものではない。ある態様では、本明細書で提供される化合物は、架橋が、４’〜２’二環式ヌクレオシドを含む１以上の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’〜２’二環式ヌクレオシドの例は、式：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’、及び４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２＊、並びにそれらのアナログ（２００８年７月１５日発行の米国特許第７，３９９，８４５号を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’、及びそのアナログ（２００９年１月８日公開の国際公開公報第２００９／００６４７８号を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’、及びそのアナログ（２００８年１２月１１日公開の国際公開公報第２００８／１５０７２９号を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日公開の米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（ここで、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、又は保護基である）（２００８年９月２３日発行の米国特許第７，４２７，６７２号を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Chattopadhyaya, et al, J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134を参照）；並びに４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’及びそのアナログ（２００８年１２月８日公開の国際公開公報第２００８／１５４４０１号を参照）の一つを含むが、これに限定されるものではない。また、例えば、Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007)；Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7；Oram et al, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；米国特許第６，６７０，４６１号、７，０５３，２０７号、６，２６８，４９０号、６，７７０，７４８号、６，７９４，４９９号、７，０３４，１３３号、６，５２５，１９１号、７，３９９，８４５号；国際公開公報第２００４／１０６３５６号、９４／１４２２６号、２００５／０２１５７０号、及び２００７／１３４１８１号；米国出願公開第２００４／０１７１５７０号、２００７／０２８７８３１号、及び２００８／００３９６１８号；米国特許出願第１２／１２９，１５４号、６０／９８９，５７４号、６１／０２６，９９５号、６１／０２６，９９８号、６１／０５６，５６４号、６１／０８６，２３１号、６１／０９７，７８７号、及び６１／０９９，８４４号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４、及びＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号を参照されたい。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えばα−Ｌ−リボフラノース及びベータ−Ｄ−リボフラノースを含む１以上の立体化学的糖立体配置を有するものから調製される（国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３を参照、１９９９年３月２５日に国際公開公報第９９／１４２２６号として公開）。
【００９７】
ある態様では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分は、ペントフラノース糖部分の４’位及び２’位の間に少なくとも１の架橋を有する化合物を含むが、これに限定されるものではなく、ここでこのような架橋は、−［ＣｉＲａＸＲｂ）］−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、及び−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１又は２〜４の結合基を独立して含み、ここでｘは、０、１、又は２であり；ｎは、１、２、３、又は４であり；Ｒａ及びＲｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換されているＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換されているＣ５−Ｃ２０アリール、複素環基、置換されている複素環基、ヘテロアリール、置換されているヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式基、置換されているＣ５−Ｃ７脂環式基、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換されているアシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；Ｊ１及びＪ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されているＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換されているＣ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換されているアシル、複素環基、置換されている複素環基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換されているＣ１−Ｃ１２アミノアルキル、又は保護基である。
【００９８】
ある態様では、二環式糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−、又は−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある態様では、架橋は、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、ここでそれぞれのＲは、独立して、Ｈ、保護基、又はＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【００９９】
ある態様では、二環式ヌクレオシドは、異性体立体配置によって更に定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ立体配置、又はベータ−Ｄ立体配置にあることができる。アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドに、あらかじめα−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡを導入した（Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365- 6372）。
【０１００】
ある態様では、二環式ヌクレオシドは、以下に示すように、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）ベータ−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、及び（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡを含むが、それに限定されるものではない。
【０１０１】
【化５】
2016503300.tif 000007
［式中、Ｂｘは、塩基部分であり、Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、又はＣ１−Ｃ２アルキルである］。
【０１０２】
ある態様では、式Ｉ：
【化６】
2016503300.tif 000008
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、又は−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
Ｒｃは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又はアミノ保護基であり；
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合である］
を有する二環式ヌクレオシド。
【０１０３】
ある態様では、式ＩＩ：
【化７】
2016503300.tif 000009
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
Ｚａは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、置換されているＣ２−Ｃ６アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、置換されているアシル、置換されているアミド、チオール、又は置換されているチオである］
を有する二環式ヌクレオシド。
【０１０４】
ある態様では、置換基のそれぞれは、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、及びＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択される置換基でモノ又はポリ置換されており、ここでＪｃ、Ｊｄ、及びＪｅのそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又は置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＮＪｃである。
【０１０５】
ある態様では、式ＩＩＩ：
【化８】
2016503300.tif 000010
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
Ｒｄは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、置換されているＣ２−Ｃ６アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルキニル、又は置換されているアシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である］
を有する二環式ヌクレオシド。
【０１０６】
ある態様では、式ＩＶ：
【化９】
2016503300.tif 000011
［式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
Ｒｄは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルキニルであり；ｑｂ、ｑｃ、及びｑｄは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃｅアルケニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、置換されているＱ−Ｃ６アルコキシ、アシル、置換されているアシル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、又は置換されているＣ１−Ｃ６アミノアルキルである］
を有する二環式ヌクレオシド。
【０１０７】
ある態様では、式Ｖ：
【化１０】
2016503300.tif 000012
［式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；ｑａ、ｑｂ、ｑｃ、及びｑｆは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換されているＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換されているＣ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであるか；或いはｑｅ及びｑｆは、一緒になって＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；ｑｇ及びｑｈは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は置換されているＣ１−Ｃ１２アルキルである］
を有する二環式ヌクレオシド。
【０１０８】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡモノマー、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製は、そのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に、記載されている（例えば、Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630を参照）。ＢＮＡ及びその調製は、国際公開公報第９８／３９３５２号及び第９９／１４２２６号にも記載されている。
【０１０９】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び２’−チオ−ＢＮＡのアナログも、調製されている（例えば、Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222を参照）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチドデュプレックスを含むロックドヌクレオシドアナログの調製もまた、記載されている（例えば、Wengel et al., 国際公開公報第９９／１４２２６を参照）。更に、立体配置的に制限されている新規な高親和性オリゴヌクレオチドアナログである２’−アミノ−ＢＮＡの合成は、文献に記載されている（例えば、Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039を参照）。加えて、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製され、相補ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖とのデュプレックスの熱安定性が既に報告されている。
【０１１０】
ある態様では、二環式ヌクレオシドは、式ＶＩ：
【化１１】
2016503300.tif 000013
［式中、
Ｂｘは複素環式塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；ｑｊ、ｑｊ、ｑｋ、及びｑｌは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換されているＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換されているＣ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換されているＣ２−Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、又は（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；ｑｉ及びｑｊ、又はｑｌ及びｑｋは、一緒になって＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、ここでｑｇ及びｑｈは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は置換されているＣ１−Ｃ６アルキルである］
を有する。
【０１１１】
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋及びアルケニルアナログ、架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’を有する一つの炭素環二環式ヌクレオシドが記載されている（例えば、Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429- 4443、及びAlbaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-77 '40を参照）。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、そのオリゴマー化及び生化学的研究と共に、記載されている（例えば、Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379を参照）。
【０１１２】
本明細書で使用される「４’−２’−二環式ヌクレオシド」、又は「４’〜２’二環式ヌクレオシド」は、２’炭素原子と４’炭素原子をつなぐ架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指す。
【０１１３】
本明細書で使用される「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分ではない修飾された糖部分を含むヌクレオシドを指す。ある態様では、ヌクレオシドの糖部分、又は糖部分アナログは、任意の位置で修飾されていても、置換されていてもよい。
【０１１４】
本明細書で使用される「２’−修飾糖」は、２位で修飾されたフラノース糖を意味する。ある態様では、このような修飾には、ハロゲン化合物、置換及び非置換アルコキシ、置換及び非置換チオアルキル、置換及び非置換アミノアルキル、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリル、並びに置換及び非置換アルキニルから選択される置換基が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある態様では、２’修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）,,ＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）,,ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）,,ＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（ここで、ｎ及びｍは、１〜約１０である）を含むが、これらには限定されない置換基から選択される。
【０１１５】
他の２’−置換基もまた、Ｃ１−Ｃ１２アルキル；置換されているアルキル；アルケニル；アルキニル；アルカリール（alkaryl）；アラルキル；Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル；ＳＨ；ＳＣＨ３；ＯＣＮ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；Ｒ；開裂基；レポーター基；インターカレーター；薬物動態学的特性を改善するための基；及びアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基；及び同様の特性を有するその他の置換基から選択することができる。ある態様では、修飾ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ側鎖を含む（例えば、Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 1 1944-12000を参照）。このような２’−ＭＯＥ置換は、非修飾ヌクレオシド及びその他の修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルと比較して改善された結合親和性を有すると記載されている。２−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドは、インビボでの使用に向けて期待できる特性を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害物質であることも示されている（例えば、Martin, P., He/v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504；Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176；Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637；及びAltmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926を参照）。
【０１１６】
本明細書で使用される「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」又は「修飾ＴＨＰヌクレオシド」は、通常のヌクレオシドにおけるペントフラノシル残基の代わりに６員のテトラヒドロピラン「糖」を有するヌクレオシドを意味する（糖サロゲート（sugar surrogate））。修飾？ＴＨＰヌクレオシドは、当該技術においてヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マンニトール核酸（ＭＮＡ）（Leumann, CJ. Bioorg. and Med. Chem. (2002) 10:841-854を参照）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と称されるもの、又は式Ｘ：
【化１２】
2016503300.tif 000014
［式中、Ｘは、式Ｘの少なくとも１のテトラヒドロピランヌクレオシドアナログとは、互いに独立しており；
Ｂｘは、複素環塩基部分であり；
Ｔ３及びＴ４は、互いに独立して、テトラヒドロピランヌクレオシドアナログをアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であるか、或いはＴ３及びＴ４の一方が、テトラヒドロピランヌクレオシドアナログをアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ３及びＴ４の他方が、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合した複合体基、又は５’若しくは３’−端末基であり；ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換されているＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換されているＣ２−Ｃ６アルキニルであり；Ｒ１及びＲ２の一方が水素であり、他方が、ハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、ＮＪ、Ｊ２、ＳＪ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、及びＣＮから選択され、ここでＸは、Ｏ、Ｓ、又はＮＪ１であり、Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３は、それぞれ独立して、Ｈ、又はＣ１−Ｃ６アルキルである］
を有する化合物を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
ある態様では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ、及びｑｕがそれぞれＨである式Ｘの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある態様では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ、及びｑｕの少なくとも１がＨ以外である。ある態様では、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ、及びｑｕの少なくとも１がメチルである。ある態様では、Ｒ１及びＲ２の一方がＦである式ＸのＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある態様では、Ｒ１がフルオロであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がＨであり、そしてＲ１がメトキシエトキシであり、Ｒ２がＨである。
【０１１８】
本明細書で使用される「２’−修飾」、又は「２’−置換」は、２位における置換基がＨ又はＯＨ以外である糖を含むヌクレオシドを指す。２’−修飾ヌクレオシドは、架橋を形成していない２’置換基、例えばアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（ここで、Ｒｍ及びＲ,,は、互いに独立して、Ｈ、又は置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである）を有するヌクレオシドを含むが、これらの限定されるものではない。２’−修飾ヌクレオシドは、例えば糖及び／又は核酸塩基のその他の位置において、更に他の修飾を含んでいることができる。
【０１１９】
本明細書で使用される「２’−Ｆ」は、２’位にフルオロ基を含む糖を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される「２’−ＯＭｅ」又は「２’−ＯＣＨ３」又は「２’−Ｏ−メチル」は、それぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０１２１】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシドを含む化合物を指す。
【０１２２】
ある態様では、複数のヌクレオシドの１又はそれ以上が修飾されている。ある態様では、オリゴヌクレオチドは、１以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を含む。
【０１２３】
アンチセンス化合物へ取り込むためにヌクレオシドを修飾するために用いることができる他の多くの二環及び三環系糖サロゲート環系も、当該技術において知られている（例えば、総説：Leumann, J. C, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854を参照）。このような環系は、更なる各種の置換を受けて、活性を増強することができる。修飾糖の調製方法は、当業者には周知である。修飾された糖部分を有するヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然、修飾、又はその組み合わせ）は、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されている。
【０１２４】
ある態様では、アンチセンス化合物は、修飾された糖部分を有する１以上のヌクレオチドを含む。ある態様では、修飾された糖部分は、２’−ＭＯＥである。ある態様では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフに配置されている。ある態様では、修飾された糖部分は、ｃＥｔである。ある態様では、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウイングを通して配置されている。
【０１２５】
ある態様では、ＢＮＡ（ＬＮＡ）において、Ｒ４＊及びＲ２＊は、一緒になってビラジカルである−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸、Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を、Ｒ−又はＳ−立体配置のいずれかで示す。
【０１２６】
ある態様では、ＢＮＡ（ＬＮＡ）において、Ｒ４＊及びＲ２＊は、一緒になってビラジカルである−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸、Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を、Ｒ−又はＳ−立体配置のいずれかで示す。
【０１２７】
ある態様では、ＢＮＡ（ＬＮＡ）において、Ｒ４＊及びＲ２＊は、一緒になってビラジカルである−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を、Ｒ−又はＳ−立体配置のいずれかで示す。ある態様では、Ｒ４＊及びＲ２＊は、一緒になってビラジカルである−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０１２８】
ある態様では、ＢＮＡ（ＬＮＡ）において、Ｒ４＊及びＲ２＊は、一緒になってビラジカルである−Ｏ−ＮＲ−ＣＨ３−（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０１２９】
ある態様では、ＬＮＡユニットは、下記基：
【化１３】
2016503300.tif 000015
から選択される構造を有する。
【０１３０】
オリゴマーへの親和性増強ヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ、（例えば）ＬＮＡ、又は２’−置換糖の導入により、特異的に結合するオリゴマーのサイズを減少させることができ、また非特異的又は異常な結合が起きる前に、オリゴマーのサイズに対する上限を引き下げることができる。
【０１３１】
ある態様では、オリゴマーは、少なくとも１のヌクレオシドアナログを含む。ある態様では、オリゴマーは、少なくとも２のヌクレオチドアナログを含む。ある態様では、オリゴマーは、３〜８のヌクレオチドアナログ、例えば６又は７のヌクレオチドアナログを含む。圧倒的に最も好ましい態様では、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１は、ＢＮＡ、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）であり；ヌクレオチドアナログの例えば少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は８は、ＢＮＡ、例えばＬＮＡであることができる。ある態様では、全てのヌクレオチドアナログがＢＮＡ、例えばＬＮＡであることができる。
【０１３２】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列を指す場合、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在する１以上のヌクレオチドの代わりに対応するヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡユニット又は他のヌクレオチドアナログを含むことができ、これが、オリゴマー／標的デュプレックスのデュプレックス安定性／Ｔｍを上昇させる（すなわち、親和性増大ヌクレオチドアナログ）ことが、認められよう。
【０１３３】
好ましいヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、例えばオキシ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、及びアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）、及び／又はアミノ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、及びアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）、及び／又はチオ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、及びアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）、及び／又はＥＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−ＥＮＡ、及びアルファ−Ｌ−ＥＮＡ）である。
【０１３４】
ある態様では、本発明のオリゴマー、例えば領域Ａは、ＢＮＡ又はＬＮＡユニット、及び他のヌクレオチドアナログを含むことができる。本発明のオリゴマーに存在する更なるヌクレオチドアナログは、独立して、例えば：２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、ＢＮＡユニット、例えばＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’−フルオロ−ＡＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡ（挿入核酸（intercalating nucleic acid）、Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、参照により本明細書に組み入れられる）ユニット、及び２’ＭＯＥから選択される。ある態様では、本発明のオリゴマーに存在する上記の種類のヌクレオチドアナログのうち一つのみが存在する（例えば、第１の領域、又はその隣接するヌクレオチド配列）。
【０１３５】
ある態様では、本発明によるオリゴマー（領域Ａ）は、したがって、少なくとも１のＢＮＡ、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）ユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、若しくは８のＢＮＡ／ＬＮＡユニット、例えば、３〜７若しくは４〜８のＢＮＡ／ＬＮＡユニット、又は３、４、５、６、若しくは７のＢＮＡ／ＬＮＡユニットを含むことができる。ある態様では、全てのヌクレオチドアナログがＢＮＡ、例えばＬＮＡである。ある態様では、オリゴマーは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、及び１以上の、以下のＬＮＡユニット（ベータ−Ｄ−若しくはアルファ−Ｌ−立体配置、又はその組み合わせのいずれかであるチオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、及び／又はＥＮＡ）の両方を含むことができる。ある態様では、全てのＢＮＡ、例えばＬＮＡ、シトシンユニットが、５’メチル−シトシンである。本発明のある態様では、オリゴマー（例えば第１の領域、及び場合により第２の領域）は、ＢＮＡ、及びＬＮＡ、及びＤＮＡユニットの両方を含むことができる。ある態様では、ＬＮＡ及びＤＮＡユニットの組み合わせた合計は、１０〜２５、例えば１０〜２４、好ましくは１０〜２０、例えば１０〜１８、例えば１２〜１６である。本発明のある態様では、オリゴマー、その第１の領域のヌクレオチド配列、例えば隣接するヌクレオチド配列は、少なくとも１のＢＮＡ、例えばＬＮＡからなり、残りのヌクレオチドユニットは、ＤＮＡユニットである。ある態様では、オリゴマー、又はその第１の領域は、ＢＮＡ、例えばＬＮＡ、ヌクレオチドアナログ、及び天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）と、場合により修飾されたヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオアートのみを含む。
【０１３６】
ＲＮアーゼリクルートメント
オリゴマー化合物が、ＲＮアーゼを介しない標的ｍＲＮＡの分解（例えば、翻訳の立体障害、又はその他の方法）により機能することは確認されている。ある態様では、本発明のオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えばＲＮアーゼＨをリクルートすることができる。
【０１３７】
このようなオリゴマー、例えば領域Ａ、又は隣接するヌクレオチド配列が、少なくとも６、例えば少なくとも７の連続するヌクレオチドユニット、例えば少なくとも８又は少なくとも９の連続するヌクレオチドユニット（残基）（７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続するヌクレオチドを含む）の領域を含み、相補的標的ＲＮＡとのデュプレックスが形成されると、ＲＮアーゼをリクルートすることができるのが好ましい（例えば、ＤＮＡユニット）。本明細書で記載されるギャップマーと関連して記載されるように、ＲＮアーゼをリクルートすることができる隣接する配列は、領域Ｙ’であることができる。ある態様では、ＲＮアーゼをリクルートすることができる隣接する配列、例えば領域Ｙ’のサイズは、高いことができ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドユニットであることができる。
【０１３８】
欧州特許第１２２２３０９号は、ＲＮアーゼＨ活性を決定するインビトロ方法を提供しており、これは、ＲＮアーゼＨのリクルート能を決定するために使用することができる。オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的が提供された場合に、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供される方法を用い、同一の塩基配列を有するが、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマーの間にホスホロチオアート結合基を有するＤＮＡモノマーのみを含むＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定する初期速度に対して、少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、又は２０％を超える初期速度（pmol/l/minで測定）を有するのであれば、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができるとみなされる。
【０１３９】
ある態様では、相補的ＲＮＡ標的とＲＮアーゼＨが提供された場合に、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供される方法を用い、オリゴヌクレオチドのみであり、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチドの間にホスホロチオアート結合基を有する同等のＤＮＡを用いて決定する初期速度に対して、ＲＮアーゼＨ初期速度（pmol/l/minで決定）が、１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満、又は２０％未満であれば、オリゴマーは、ＲＮアーゼＨを本質的にリクルートすることができないとみなされる。
【０１４０】
その他の態様では、相補的ＲＮＡ標的とＲＮアーゼＨが提供された場合に、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供される方法を用い、オリゴヌクレオチドのみであり、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチドの間にホスホロチオアート結合基を有する同等のＤＮＡを用いて決定する初期速度に対して、ＲＮアーゼＨ初期速度（pmol/l/minで決定）が、すくなくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％であれば、オリゴマーは、ＲＮアーゼをリクルートすることができるとみなされる。
【０１４１】
典型的には、相補的標的ＲＮＡとのデュプレックスが形成されると、ＲＮアーゼをリクルートすることができる連続するヌクレオチドユニットを形成するオリゴマーの領域は、ＤＮＡ／ＲＮＡのような、ＲＮＡ標的とのデュプレックスを形成するヌクレオチドユニットからなる。本発明のオリゴマー、例えば第１の領域は、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの両方を含むヌクレオチド配列を含み、例えばギャップマーの形態であることができる。
【０１４２】
ギャップマーのデザイン
ある態様では、本発明のオリゴマー、例えば第１の領域は、ギャップマーを含むか、ギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、ＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨ、例えば少なくとも６又は７のＤＮＡヌクレオチドの領域（本明細書においては、領域Ｙ’（Ｙ’）と記載する）をリクルートすることができる、隣接するストレッチのヌクレオチドを含むオリゴマーであり、ここで領域Ｙ’は、親和性増大ヌクレオチドアナログの領域（例えば、ヌクレオチドの隣接するストレッチに対して、１〜６ヌクレオチドアナログ５’及び３’）により５’及び３’の両方でフランキングされており、これがＲＮアーゼをリクルートすることができる（これらの領域は、それぞれ領域Ｘ’（Ｘ’）及びＺ’（Ｚ’）と記載する）。ギャップマーの例は、国際公開公報第２００４／０４６１６０号、国際公開公報第２００８／１１３８３２号、及び国際公開公報第２００７／１４６５１１号に開示されている。
【０１４３】
ある態様では、ＲＮアーゼをリクルートすることができるモノマーは、ＤＮＡモノマー、アルファ−Ｌ−ＬＮＡモノマー、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡモノマー（国際特許出願ＰＣＴ/ＥＰ２００９/０５０３４９号、及びVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300を参照。参照により本明細書に組み入れられる）、及びＵＮＡ（非結合核酸）ヌクレオチド（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照。参照により本明細書に組み入れられる）からなる群から選択される。ＵＮＡは、ロックされていない核酸であり、典型的には、リボースのＣ２−Ｃ３のＣ−Ｃ結合が除去されており、ロックされていない「糖」残基が形成されている。好ましくは、ギャップマーは、式（５’〜３’）Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’の（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、ここで、領域Ｘ’（Ｘ’）（５’領域）は、少なくとも１のヌクレオチドアナログ、例えば少なくとも１のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニット、例えば１〜６のヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなるか、又は含み；領域Ｙ’（Ｙ’）は、（相補的ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ標的とデュプレックスを形成した場合）ＲＮアーゼをリクルートすることができる少なくとも５の連続するヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチドからなるか、又は含み；領域Ｚ’（Ｚ’）（３’領域）は、少なくとも１のヌクレオチドアナログ、例えば少なくとも１のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡユニット）、例えば１〜６のヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）ユニットからなるか、又は含む。
【０１４４】
ある態様では、領域Ｘ’は、１、２、３、４、５、又は６のヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニット、例えば２〜５のヌクレオチドアナログ、例えば２〜５のＬＮＡユニット、例えば３又は４のヌクレオチドアナログ、例えば３又は４のＬＮＡユニットからなり；及び／又は領域Ｚ’は、１、２、３、４、５、又は６のヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニット、例えば２〜５のヌクレオチドアナログ、例えば２〜５のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡユニット）、例えば３又は４のヌクレオチドアナログ、例えば３又は４のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。
【０１４５】
ある態様では、Ｙ’は、ＲＮアーゼをリクルートすることができる５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２の連続するヌクレオチド、又はＲＮアーゼをリクルートすることができる６〜１０、若しくは７〜９、例えば８の連続するヌクレオチドからなるか、又は含む。ある態様では、領域Ｙ’は、少なくとも１のＤＮＡヌクレオチドユニット、例えば１〜１２のＤＮＡユニット、好ましくは４〜１２のＤＮＡユニット、より好ましくは、６〜１０のＤＮＡユニット、例えば７〜１０のＤＮＡユニット、最も好ましくは８、９、又は１０のＤＮＡユニットからなるか、又は含む。
【０１４６】
ある態様では、領域Ｘ’は、３又は４のヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）からなり、領域Ｘ’は、７、８、９、又は１０のＤＮＡユニットからなり、領域Ｘ’は、３又は４のヌクレオチドアナログ、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）からなる。このようなデザインは、（Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’）３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３を含む。
【０１４７】
更なるギャップマーのデザインは、国際公開公報第２００４／０４６１６０号に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。米国仮出願第６０／９７７，４０９号の優先権を主張しており、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００８／１１３８３２号は、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーについて記載していいる。ある態様では、ここで提示されるオリゴマーは、このようなショートマーギャップマーであることができる。
【０１４８】
ある態様では、オリゴマー、例えば領域Ｘ’は、合計１０、１１、１２、１３、又は１４のヌクレオチドユニットの隣接するヌクレオチド配列からなり、ここで隣接するヌクレオチド配列は、式（５’−３’）、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’を含むか、又はその配列であり、式中、Ｘ’は、１、２、又は３のヌクレオチドアナログユニット、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなり；Ｙ’は、相補的ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ標的）とデュプレックスを形成するとＲＮアーゼをリクルートすることができる７、８、又は９の隣接するヌクレオチドユニットからなり；Ｚ’は、１、２、又は３のヌクレオチドアナログユニット、例えばＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。
【０１４９】
ある態様では、Ｘ’は、１のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。ある態様では、Ｘ’は、２のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。ある態様では、Ｘ’は、３のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。ある態様では、Ｚ’は、１のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。ある態様では、Ｚ’は、２のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。ある態様では、Ｚ’は、３のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなる。ある態様では、Ｙ’は、７のヌクレオチドユニットからなる。ある態様では、Ｙ’は、８のヌクレオチドユニットからなる。ある態様では、Ｙ’は、９のヌクレオチドユニットからなる。ある態様では、領域Ｙ’は、１０のヌクレオシドモノマーからなる。ある態様では、領域Ｙ’は、１〜１０のＤＮＡモノマーからなるか、又は含む。ある態様では、Ｙ’は、１〜９のＤＮＡユニット、例えば２、３、４、５、６、７、８、又は９のＤＮＡユニットを含む。ある態様では、Ｙ’は、ＤＮＡユニットからなる。ある態様では、Ｙ’は、アルファ−Ｌ立体配置であり、アルファ−Ｌ立体配置において例えば２、３、４、５、６、７、８、又は９のＬＮＡユニットである、少なくとも１のＢＮＡを含む。ある態様では、Ｙ’は、アルファ−Ｌ−立体配置における全てのＬＮＡユニットが、アルファ−Ｌ−オキシＬＮＡユニットである少なくとも１のアルファ−Ｌ−ＢＮＡ／ＬＮＡユニットを含む。ある態様では、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’に存在するヌクレオチドの数は、（ヌクレオチドアナログユニット−領域Ｙ’−ヌクレオチドアナログユニット）：１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４、又は；１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、又は；１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１からなる群から選択される。ある態様では、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’におけるヌクレオチドの数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４、及び４−７−３からなる群から選択される。ある態様では、領域Ｘ’及びＹ’のそれぞれは、３のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）モノマーからなり、領域Ｙ’は、８、９、又は１０のヌクレオシドモノマー、好ましくはＤＮＡモノマーからなる。ある態様では、Ｘ’及びＺ’の両方は、それぞれ、２のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ユニットからなり、Ｙ’は、８又は９のヌクレオチドユニット、好ましくはＤＮＡユニットからなる。各種の態様では、その他のギャップマーデザインは、領域Ｘ’及び／又はＺ’が、３、４、５、又は６のヌクレオシドアナログ、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖（２’−ＭＯＥ）を含むモノマー又は２’−フルオロ−デオキシリボース糖を含むモノマーからなり、領域Ｙ’が、８、９、１０、１１、又は１２のヌクレオシド、例えばＤＮＡモノマーからなり、領域Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’が、３−９−３、３−１０−３、５−１０−５、又は４−１２−４モノマーを有するものを含む。更なるギャップマーデザインは、国際公開公報第２００７／１４６５１１Ａ２に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
ＢＮＡ及びＬＮＡギャップマー：ＢＮＡギャップマーは、少なくとも１のＢＮＡヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域Ａ）である。ＬＮＡギャップマーは、少なくとも１のＬＮＡヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域Ａ）である。配列番号２及び３は、ＬＮＡギャップマーオリゴマーである。対応する長さの配列番号３３又は３４に相補的である隣接する１０〜１６のヌクレオチドの配列のオリゴマーもまた、ギャップマーオリゴマー、例えばＢＮＡギャップマー又はＬＮＡギャップマーであることができる。
【０１５１】
ヌクレオチド間結合
本明細書に記載されるオリゴマーのヌクレオシドモノマー（例えば第１及び第２の領域）は、［ヌクレオシド間］結合基を介して一緒に結合する。それぞれのモノマーが結合基を介して３’隣接モノマーに結合するのが適当である。
【０１５２】
当業者であれば、本発明と関連して、オリゴマー末端の５’モノマーが、５’末端基を含むか、又は含まないにもかかわらず、５’結合基を含まないことを理解するであろう。
【０１５３】
語「結合基」又は「ヌクレオチド間結合」は、２つのヌクレオチドを一緒に共有結合することができる基を意味することが意図されている。具体的かつ好ましい例は、ホスファート基及びホスホロチオアート基である。
【０１５４】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド又はその隣接するヌクレオチド配列は、結合基を介して一緒に結合することができる。それぞれのヌクレオチドが、結合基を介して３’の隣接するヌクレオチドと結合するのが適当である。
【０１５５】
適当なヌクレオチド間結合には、国際公開公報第２００７／０３１０９１号に挙げられているもの、例えば国際公開公報第２００７／０３１０９１号の３４ページの第１パラグラフに挙げられているヌクレオチド間結合が含まれる（参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１５６】
ある態様では、（存在する場合には）領域Ｂのホスホジエステル結合以外では、その正常なホスホジエステルから、ヌクレアーゼによる攻撃に対してより耐性であるもの（例えばホスホロチオアート又はボラノホスファート）（これら二つは、ＲＮアーゼＨにより開裂可能である）へ、ヌクレオチド間結合を修飾するための好ましいものにより、標的遺伝子の発現の低下におけるアンチセンスによる阻害ルートが可能となる。
【０１５７】
本明細書で提供される適当な硫黄（Ｓ）含有ヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオアート又はホスホジチオアートが好ましい。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合もまた、特に第１の領域に好ましい（例えばギャップマー、ミクスマー、アンチミール（antimir）スプライススイッチオリゴマー、及びトータルマー（totalmer））。
【０１５８】
ギャップマーについては、オリゴマーにおけるヌクレオチド間結合は、例えば標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨによる開裂を可能とするために、ホスホロチオアート又はボラノホスファートであることができる。ヌクレアーゼ耐性の向上、及びその他の理由、例えば製造の容易さのためには、ホスホロチオアートが好ましい。
【０１５９】
ある側面では、第１及び第２の領域の間、そして場合により領域Ｂ内のホスホジエステル結合を除いて、本発明のオリゴマー、ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチドアナログの残りのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート基により互いに結合している。ある態様では、第１の領域におけるヌクレオシド間のヌクレオシド間結合の、少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば全てが、ホスホジエステル（ホスファート）以外であり、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又はボラノホスファートからなる群から選択される。ある態様では、第１の領域におけるヌクレオシド間のヌクレオシド間結合の、少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば全てが、ホスホロチオアートである。
【０１６０】
国際公開公報第０９／１２４２３８号は、３’又は５’末端へ中性ヌクレオシド間結合により結合した少なくとも１の二環式ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物について記載している。したがって本発明のオリゴマーは、３’又は５’末端へ中性ヌクレオシド間結合、例えば１以上のホスホトリエステル、メチルホスホナート、ＭＭＩ、アミド−３、ホルムアセタール、又はチオホルムアセタールにより結合した少なくとも１の二環式ヌクレオシドを有することができる。残りの結合は、ホスホロチオアートであることができる。
【０１６１】
オリゴマー複合体
オリゴヌクレオチドに用いられている代表的な複合体部分は、ステロイド分子を含む親油性分子（芳香族性及び非芳香族性）；タンパク質（例えば、抗体、酵素、血清タンパク質）；ペプチド；ビタミン（水溶性又は脂溶性）；ポリマー（水溶性又は脂溶性）；薬物、毒素、レポーター分子及び受容体リガンドを含む小分子；炭水化物複合体；核酸開裂複合体；金属キレート剤（例えば、ポルフィリン、テキサフィリン、クラウンエーテルなど）；ハイブリッドフォトヌクレアーゼ／インターカレーターを含むインターカレーター；架橋剤（例えば光活動性、酸化還元活性のある）、並びにこれらの組み合わせ及び誘導体を含むことができる。多数の適当な複合体部分、それらの調製、及びオリゴマー化合物への結合が、例えば国際公開公報第９３／０７８８３号、及び米国特許第６，３９５，４９２号に提供されており、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる。オリゴヌクレオチド複合体、及びそれらの合成は、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001、及びManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的な総説において報告されており、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６２】
ある態様では、本発明のオリゴマーは、肝を標的としており、すなわち全身投与後、化合物は、肝臓の細胞（例えば肝細胞）に蓄積する。肝を標的とすることは、複合体部分（Ｃ）を加えることにより、大きく増強される。しかし、オリゴマーの有効性を最大限にするためには、複合体（又は標的部分）が、生物学的に開裂可能なリンカー（Ｂ）、例えばヌクレオチドホスファートリンカーを介してオリゴマーに結合していることが望ましいことが多い。したがって、肝細胞への取り込みと活性を増強する複合体部分を用いることが望ましい。活性の増強は、取り込みの増強によることができ、または肝細胞における化合物の効力の増大によることもできる。
【０１６３】
ある態様では、オリゴマー化合物は、ＢＮＡ又はＬＮＡオリゴマー、例えばギャップマー、又は例えば、アンチセンスオリゴマー、場合により生物学的に開裂可能なリンカー、例えば領域Ｂ、及び炭水化物複合体（領域Ｃと記載することができる）を含むＬＮＡアンチセンスオリゴマー（本明細書においては、領域Ａと記載することができる）である。ＬＮＡアンチセンスオリゴマーは、７〜３０、例えば８〜２６ヌクレオシド長であることができ、少なくとも１のＬＮＡユニット（ヌクレオシド）を含む。ある態様では、炭水化物複合体は、直鎖状炭水化物ポリマーではない。
【０１６４】
ある態様では、オリゴマー化合物は、ＬＮＡオリゴマー、例えばアンチセンスオリゴマー、本明細書で定義される領域Ｂ、及びアシアロ糖タンパク質受容体標的部分複合体部分、例えばＧａｌＮＡｃ部分（領域Ｃと記載することができる）を含む、ＬＮＡアンチセンスオリゴマー（本明細書では、領域Ａと記載することができる）である。炭水化物部分は、多価であることができ、例えば２、３、４、又は４の同一又は非同一の炭水化物部分は、場合により１又は複数のリンカー（例えば領域Ｙ）を介して、オリゴマーに共有結合していることができる。
【０１６５】
ＧａｌＮａｃ複合体部分
ある態様では、炭水化物部分は、直鎖状の炭水化物ポリマーではない。しかし、炭水化物部分は、多価であることができ、例えば２、３、４、又は４の同一又は非同一の炭水化物部分が、場合により１又は複数のリンカーを介して、オリゴマーに共有結合していることができる。ある態様では、本発明は、本発明のオリゴマー及び炭水化物複合体部分を含む複合体を提供する。ある態様では、本発明は、本発明のオリゴマー及びアシアロ糖タンパク質受容体標的部分複合体部分、例えばＧａｌＮＡｃ部分（これは、更なる領域の一部を形成していることができる（領域Ｃと記載する））を含む複合体を提供する。
【０１６６】
本発明はまた、アシアロ糖タンパク質受容体標的部分に抱合したＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。ある態様では、複合体部分（例えば、第３の領域、又は領域Ｃ）は、アシアロ糖タンパク質受容体標的部分、例えばガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、及びＮ−イソブタノイルガラクトサミンを含む。ある態様では、複合体は、ガラクトースクラスター、例えばＮ−アセチルガラクトサミン三量体を含む。ある態様では、複合体部分は、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、例えば一価、二価、三価、又は四価のＧａｌＮＡｃを含む。三価のＧａｌＮＡｃ複合体は、化合物に肝を標的とさせるために用いることができる。ＧａｌＮＡｃ複合体は、メチルホスホナート及びＰＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第５，９９４５１７号、及びHangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701）、及びｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開公報第２００９／１２６９３３号、国際公開公報第２０１２／０８９３５２号、及び国際公開公報第２０１２／０８３０４６号）と使用されている。本明細書におけるＧａｌＮＡｃに関する記載、及びその具体的複合体は、参照により本明細書に組み入れられる。国際公開公報第２０１２／０８３０４６号は、本発明における使用に適当である、開裂可能な薬物動態学的モジュレーターを含むＧａｌＮＡｃ複合体部分を有するｓｉＲＮＡを開示しており、好ましい薬物動態学的モジュレーターは、Ｃ１６疎水性基、例えばパルミトイル、ヘキサデカ−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル、ジオクタノイル、及びＣ１６−Ｃ２０アシルである。国際公開公報第’０４６号の開裂可能な薬物動態学的モジュレーターは、コレステロールであることもできる。
【０１６７】
標的部分（複合体部分）は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、Ｎ−イソ−ブタノイル−ガラクトサミン、ガラクトースクラスター、及びＮ−アセチルガラクトサミン三量体からなる群から選択され、１６以上の炭素原子を有する疎水性基、１６〜２０の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル、ジオクタノイル、及びＣ１６〜Ｃ２０アシル、及びコレステロールからなる群から選択される薬物動態学的モジュレーターを有していることができる。国際公開公報第’０４６号に開示されているある種のＧａｌＮａｃクラスターには、（Ｅ）−ヘキサデカ−８−エノイル（Ｃ１６）、オレイル（Ｃ１８）、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル（Ｃ１８）、オクタノイル（Ｃ８）、ドデセカノイル（Ｃ１２）、Ｃ−２０アシル、Ｃ２４アシル、ジオクタノイル（２×Ｃ８）が含まれる。標的部分−薬物動態学的モジュレーター標的部分は、生理学的に不安定な結合、又は例えばジスルフィド結合、又はＰＥＧリンカーを介して、ポリヌクレオチドに結合していることができる。本発明はまた、オリゴマー、及び複合体基（これらは、本明細書では、領域Ｂとして記載されており、ＬＮＡオリゴマーと炭水化物複合体基の間に適当に位置している）間のホスホジエステル結合の使用にも関する。
【０１６８】
肝における標的肝細胞については、好ましい標的リガンドは、ガラクトースクラスターである。
【０１６９】
ガラクトースクラスターは、例えば２〜４の末端ガラクトース誘導体を含む分子を含むことができる。本明細書で使用されるように、語「ガラクトース誘導体」には、ガラクトース、及びアシアロ糖タンパク質受容体に対して、ガラクトースのそれと同等か若しくはそれ以上の親和性を有するガラクトースの誘導体が含まれる。末端ガラクトース誘導体は、そのＣ−１炭素を介して分子に結合している。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）は、肝細胞に特異的であり、分岐鎖状のガラクトース末端糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスターは、アシアロ糖タンパク質受容体にそれぞれ親和性を有する３の末端ガラクトサミン、又はガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、３の末端Ｎ−アセチルガラクトサミンを有する。当該技術において常識的であるその他の語としては、トリ−アンテナリーガラクトース、三価ガラクトース、及びガラクトース三量体が含まれる。トリ−アンテナリーガラクトース誘導体クラスターは、ビ−アンテナリー又はモノ−アンテナリーガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で、ＡＳＧＰｒに結合していることは公知である（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982,1. Biol. Chern., 257,939-945）。nMでの親和性を達成するには、多価であることが必要である。国際公開公報第２０１２／０８３０４６号によると、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する単一のガラクトース誘導体の結合では、送達ポリマーと同時投与された場合に肝細胞へのＲＮＡｉポリヌクレオチドのインビボでの機能的な送達は可能ではない。
【０１７０】
ガラクトースクラスターは、中心の分岐点にそれぞれ結合している２、又は好ましくは３のガラクトース誘導体を含んでいることができる。ガラクトース誘導体は、糖類のＣ−１炭素を介して、中心の分岐点に結合している。ガラクトース誘導体は、好ましくはリンカー又はスペーサーを介して分岐点に結合している。好ましいスペーサーは、可撓性の親水性のスペーサーである（米国特許第５８８５９６８号；Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい可撓性の親水性のスペーサーは、ＰＥＧスペーサーである。好ましいＰＥＧスペーサーは、ＰＥＧ３スペーサーである。分岐点は、オリゴマーへの３のガラクトース誘導体の結合を可能とし、更に分岐点の結合を可能とする任意の小分子である。典型的な分岐点基は、ジ−リシンである。ジ−リシン分子は、３のアミン基（それを介して３のガラクトース誘導体が結合していることができる）、及びカルボキシル反応性基（それを介して、ジ−リシンは、オリゴマーに結合していることができる）を含む。オリゴマーへの分岐点の結合は、リンカー又はスペーサーを介して起きることができる。好ましいスペーサーは、可撓性を有する親水性のスペーサーである。可撓性を有する好ましい親水性のスペーサーは、ＰＥＧスペーサーである。好ましいＰＥＧスペーサーは、ＰＥＧ３スペーサーである（３のエチレンユニット）。ガラクトースクラスターは、当該技術で公知の方法を用いて、オリゴマーの３’又は５’末端に結合していることができる。
【０１７１】
好ましいガラクトース誘導体は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するその他の糖は、ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、及びＮ−イソブタノイルガラクトサミンを含むリストから選択することができる。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が検討されている（例えば、Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996,271,6686を参照）か、又は当該技術において典型的である方法を用いて速やかに決定される。
【０１７２】
【化１４】
2016503300.tif 000016
【０１７３】
本発明の複合体の更なる例を以下に示す。
【０１７４】
【化１５】
2016503300.tif 000017
【０１７５】
ＢＮＡ又はＬＮＡオリゴマー（例えば、場合によりＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いる場合、上記のＧａｌＮａｃクラスター複合体中の疎水性又は親油性（又は更なる複合体）部分（すなわち、薬物動態学的モジュレーター）はどこにあるのか。
【０１７６】
本研究において用いている具体的なＧａｌｎａｃクラスター、Ｃｏｎｊ１、２、３、４、及びＣｏｎｊ１ａ、２ａ、３ａ、及び４ａ（ＧａｌＮａｃクラスターをオリゴマーに結合させる任意のＣ６リンカーと共に示されている）については、図を参照のこと。
【０１７７】
したがって、Ｇａｌｎａｃクラスター（例えばＧａｌＮＡｃ）のそれぞれの炭水化物部分は、スペーサー、例えば（ポリ）エチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）、例えばジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ−エチレングリコールリンカーを介してオリゴマーに結合していることができる。上記で示したように、ＰＥＧ部分は、ガラクトース糖部分及びペプチド（トリリシンが示されている）リンカーの間にスペーサーを形成している。
【０１７８】
ある態様では、ＧａｌＮａｃクラスターは、ペプチドリンカー、例えばＴｙｒ−Ａｓｐ（Ａｓｐ）トリペプチド、又はＡｓｐ（Ａｓｐ）ジペプチドを含み、これがオリゴマー（又は領域Ｙ若しくは領域Ｂ）に、ビラジカルのリンカーを介して結合しており、例えば、ＧａｌＮａｃクラスターは、以下のジラジカルリンカーを含むことができる：
【化１６】
2016503300.tif 000018
【０１７９】
Ｒ１は、好ましくは−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ５Ｈ１０−、−Ｃ６Ｈ１２−、１，４−シクロヘキシル（−Ｃ６Ｈ１０−）、１，４−フェニル（−Ｃ６Ｈ４−）、−Ｃ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４−、−Ｃ２Ｈ４（ＯＣ２Ｈ４）２−、又は−Ｃ２Ｈ４（ＯＣ２Ｈ４）３−から選択されるビラジカルである。
【０１８０】
炭水化物複合体（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、又は炭水化物−リンカー部分（例えば、炭水化物−ＰＥＧ部分）は、分岐点基、例えばアミノ酸、又はペプチド（適当には、２以上のアミノ基（例えば３、４、又は５）を含む）、例えばリシン、ジ−リシン、トリ−リシン、又はテトラ−リシンを介してオリゴマーに共有結合（結合）していることができる。トリ−リシン分子は、４のアミン基を含み、これを介して３の炭水化物複合体基、例えばガラクトース及び誘導体（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、及び更なる複合体、例えば疎水性又は親油性部分／基が、結合していることができ、またカルボキシル反応性基を含み、これを介してトリ−リシンがオリゴマーに結合していることができる。更なる複合体、例えば親油性／疎水性部分は、オリゴマーに結合しているリシン残基に結合していることができる。
【０１８１】
薬物動態学的モジュレーター
本発明の化合物は、更に１以上の追加の複合体基を含むことができ、その親油性又は疎水性部分は、例えば複合体基が炭水化物部分である場合に特に興味深い。このような親油性又は疎水性部分は、薬物動態学的モジュレーターとして作用することができ、炭水化物複合体、炭水化物複合体をオリゴマーに結合させるリンカー、又は多数の炭水化物複合体（多価）複合体をオリゴマーに結合させるリンカーのいずれかに、場合によりリンカー、例えば生物学的に開裂可能なリンカーを介して共有結合していることができる。
【０１８２】
したがって、オリゴマー又は複合体部分は、薬物動態学的モジュレーター、例えば親油性又は疎水性部分を含むことができる。このような部分は、国際公開公報第２０１２／０８２０４６号において、ｓｉＲＮＡ複合体との関連で開示されている。疎水性部分は、飽和又は不飽和であることができるＣ８〜Ｃ３６脂肪酸を含むことができる。ある態様では、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、Ｃ２４、Ｃ２６、Ｃ２８、Ｃ３０、Ｃ３２、及びＣ３４脂肪酸を用いることができる。疎水性基は、１６以上の炭素原子を有することができる。典型的な適当な疎水性基は、ステロール、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル、ジオクタノイル、及びＣ１６〜Ｃ２０アシルを含む群から選択することができる。国際公開公報第’３４６号によると、１６未満の炭素原子を有する疎水性基は、ポリヌクレオチド標的を増強するにはそれほど有効ではないが、複数回用いて（例えば、２×、例えば２×Ｃ８又はＣ１０、Ｃ１２又はＣ１４）、効果を増強することができる。ポリヌクレオチド標的部分として有用な薬物動態学的モジュレーターは、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、及びアラルキニル基（それぞれは、直鎖状、分岐鎖状、又は環状であることができる）からなる群から選択することができる。薬物動態学的モジュレーターは、好ましくは炭素及び水素原子のみを含む炭化水素である。しかし、置換、又は疎水性を維持するヘテロ原子、例えばフッ素は、許容することができる。
【０１８３】
ある態様では、複合体は、炭水化物であるか、又は含むことができ、或いは炭水化物基を含む。ある態様では、炭水化物は、ガラクトース、乳糖、ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、及びマンノース−６−リン酸からなる群から選択される。ある態様では、複合体基は、マンノース又はマンノース−６−リン酸であるか、含むことができる。炭化水素複合体は、様々な組織、例えば肝及び／又は筋における送達又は活性を増強するために用いることができる。例えば欧州特許第１４９５７６９号、国際公開公報第９９／６５９２５号、Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21、Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17を参照のこと。
【０１８４】
驚くべきことに、本発明者らは、ＬＮＡオリゴマーと使用するためのＧａｌＮａｃ複合体が、薬物動態学的モジュレーターを必要とせず、ある態様では、ＧａｌＮａｃ複合体は、親油性又は疎水性部分に共有結合しておらず、例えば本明細書に記載されているそれらは、Ｃ８〜Ｃ３６脂肪酸又はステロールを含まないことを発見した。したがって本発明は、親油性又は疎水性の薬物動態学的モジュレーター又は複合体部分／基を含まないＬＮＡオリゴマーＧａｌＮａｃ複合体も提供する。
【０１８５】
親油性複合体
ある態様では、複合体基は、親油性部分、例えばステロール（例えば、コレステロール、コレステリル、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、及びエルゴステロール）であるか、又は含んでいることができる。ある態様では、複合体は、トコフェロールであるか、又は含んでいる。ある態様では、複合体は、コレステロールであるか、又は含んでいることができる。
【０１８６】
ある態様では、複合体は脂質、リン脂質、又は親油性アルコール、例えばカチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、及び脂肪酸、例えばステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノールエライジン酸（linoleaidic acid）、リノレン酸、及びミリスチン酸であるか、又は含むことができる。ある態様では、脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ３０飽和又は不飽和アルキル鎖を含む。アルキル鎖は、直鎖状又は分岐鎖状であることができる。
【０１８７】
親油性複合体部分は、例えば、オリゴマー化合物の親水性特性を無効にし、細胞への浸透を亢進するために用いることができる。
【０１８８】
親油性部分は、例えばステロール、スタノール、及びステロイド、並びに関連する化合物、例えばコレステロール（米国特許第４，９５８，０１３号、及びLetsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、チオコレステロール（Oberhauser et al, Nucl Acids Res., 1992, 20, 533）、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、１７−ヒドロキシコルチコステロン、それらの誘導体などを含む。ある態様では、複合体は、コレステロール、チオコレステロール、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、及び１７−ヒドロキシコルチコステロンからなる群から選択することができる。他の親油性複合体部分は、脂肪族基、例えば直鎖、分岐鎖、及び環式アルキル、アルケニル、及びアルキニルを含む。脂肪族基は、例えば５〜約５０、６〜約５０、８〜約５０、又は１０〜約５０の炭素原子を有することができる。脂肪族基の例としては、ウンデシル、ドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、テルペン、ボルニル、アダマンチル、それらの誘導体などが含まれる。ある態様では、脂肪族基の１以上の炭素原子は、ヘテロ原子、例えばＯ、Ｓ、又はＮで置き換えられていることができる（例えば、ゲラニルオキシヘキシル）。更なる適当な親油性複合体部分には、グリセロールの脂肪族誘導体、例えばアルキルグリセロール、ビス（アルキル）グリセロール、トリス（アルキル）グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドが含まれる。ある態様では、親油性複合体は、ジ−ヘキシルデシル−ｒａｃ−グリセロール、又は１，２−ジ−Ｏ−ヘキシルデシル−ｒａｃ−グリセロール（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea, et al., Nuc. Acids Res., 1990, 18, 3777）、又はそれらのホスホン酸エステルである。飽和及び不飽和脂肪酸官能基、例えば脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、及び脂肪族アミンもまた、親油性複合体部分として機能を果たすことができる。ある態様では、脂肪酸官能基は、約６〜約３０、又は約８〜約２２の炭素を含むことができる。典型的な脂肪酸には、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコセン酸などが含まれる。
【０１８９】
更なる態様では、親油性複合体基は、６〜約５０、１０〜約５０、又は１４〜約４０の炭素原子を有する多環式芳香族基であることができる。多環式芳香族基の例としては、ピレン、プリン、アクリジン、キサンテン、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、キノリン、イソキノリン、ナフタレン、それらの誘導体などが含まれる。その他の適当な親油性複合体基としては、メントール、トリチル（例えばジメトキシトリチル（ＤＭＴ））、フェノキサジン、リポ酸、リン脂質、エーテル、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール））、それらの誘導体などが含まれる。オリゴマー化合物の親油性複合体の調製は、当該技術、例えばSaison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10, 1111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49; (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229, and Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651に詳細に記載されている。
【０１９０】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に対する親和性を有する複合体部分を含むオリゴマー化合物は、有効な標的送達システムを提供するのに有用である。腫瘍細胞上のＬＤＬに対する受容体の発現レベルが高いと、ＬＤＬは、これらの細胞への薬物の選択的送達にとって魅力的な担体となる（Rump, et al., Bioconjugate Chem., 1998, 9, 341; Firestone, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 105; Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）。ＬＤＬに対する親和性を有する部分には、多くの親油性基、例えばステロイド（例えば、コレステロール）、脂肪酸、それらの誘導体、及びそれらの組み合わせが含まれる。ある態様では、ＬＤＬ親和性を有する複合体部分は、コール酸、例えばケノデオキシコール酸及びリトコール酸のジオレイルエステルであることができる。
【０１９１】
ある態様では、親油性複合体は、ビオチンであるか、含むことができる。ある態様では、親油性複合体は、グリセリド又はグリセリドエステルであるか、含むことができる。
【０１９２】
親油性複合体、本明細書で開示されているような、例えばステロール、スタノール、及びステイン、例えばコレステロールは、オリゴヌクレオチドの、例えば肝（典型的には肝細胞）への送達を増強するために用いることができる。
【０１９３】
以下の参考文献も、親油性複合体の使用を記載している：Kobylanska et al., Acta Biochim Pol. (1999); 46(3): 679 - 91. Felber et al,. Biomaterials (2012) 33(25): 599-65); Grijalvo et al., J Org Chem (2010) 75(20): 6806 - 13.  Koufaki et al., Curr Med Chem (2009) 16(35): 4728-42.  Godeau et al J. Med. Chem. (2008) 51(15): 4374-6。
【０１９４】
リンカー（例えば、領域Ｙ）
結合又はリンカーは、対象である一つの化学基又は部分を、対象の別の化学基又は部分と、１以上の共有結合を介して結合する２の原子の間の連結である。複合体部分（又は、標的若しくは遮断部分）は、直接、又は結合部分（リンカー又はテザー）、リンカーを介して、オリゴマー化合物に結合していることができる。リンカーは、第３の領域、例えば複合体部分を、オリゴマー化合物（例えば、領域Ｂ）に共有結合させるのに有用な、二官能性部分である。ある態様では、リンカーは、鎖構造又は繰り返し単位、例えばエチレングリオール若しくはアミノ酸単位のオリゴマーを含む。リンカーは、少なくとも２の官能基を有し、一つは、オリゴマー化合物への結合のため、もう一つは、複合体部分への結合のためである。代表的なリンカー官能基は、オリゴマー又は複合体部分上の求核性基と反応させるための求電子性であるか、又は求電子性基と反応させるための求核性であることができる。ある態様では、リンカーの官能基には、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ホスファート、ホスファイト、不飽和（例えば、二重又は三重結合）などが含まれる。ある代表的なリンカーには、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）、６−アミノヘキシルオキシ、４−アミノ酪酸、４−アミノシクロヘキシルカルボン酸、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミド−カプロアート）（ＬＣＳＭＣＣ）、スクシンイミジル  ｍ−マレイミド−ベンゾイラート（ＭＢＳ）、スクシンイミジル  Ｎ−ｅ−マレイミド−カプロイラート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル  ６−（ベータ−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル  Ｎ−（ａ−マレイミドアセタート）（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、ベータ−アラニン（ベータ−ＡＬＡ）、フェニルグリシン（ＰＨＧ）、４−アミノシクロヘキサン酸（ＡＣＨＣ）、ベータ−（シクロプロピル）アラニン（ベータ−ＣＹＰＲ）、アミノドデカン酸（ＡＤＣ）、アリレンジオール（alylene diol）、ポリエチレングリコール、アミノ酸などが含まれる。
【０１９５】
複合体部分のオリゴマー化合物への結合に有用であることができる広範囲な更なるリンカーが、当該技術においては公知である。多くの有用なリンカー基に関する総説を、例えばAntisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350に見出すことができる。オリゴヌクレオチドの３’末端をペプチドに結合させるためにジスルフィド結合が使用されている（Corey, et al., Science 1987, 238, 1401; Zuckermann, et al, J Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1614; and Corey, et al., J Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8524）。Nelson, et al., Nuc. Acids Res. 1989, 17, 7187は、ビオチンをオリゴヌクレオチドの３’−末端に結合させるための結合試薬について記載している。この試薬、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ＤＭＴ−３−アミノ−１，２−プロパンジオールは、Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.)から３’−アミン（3'-Amine）の名称で販売されている。これはまた、Glen Research Corporation (Sterling, Va.)から、3'-Amino-Modifier試薬の名称で販売されている。この試薬は、Judy, et al., Tetrahedron Letters 1991, 32, 879が報告するように、ペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させるために使用されていた。オリゴヌクレオチドの５’−末端へ結合させるための同様の市販されている試薬が、5'- Amino-Modifier C6である。これらの試薬は、Glen Research Corporation (Sterling, Va.)から販売されている。これらの化合物又は類似する化合物は、Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161によって、フルオレセインをオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合させるために用いられていた。その他の化合物、例えばアクリジンは、オリゴヌクレオチドの３’−末端のリン酸基に、ポリメチレン結合を介して結合している（Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297）。［００７４］上記の基のいずれも、単一のリンカーとして、或いは１以上の更なるリンカーと組み合わせて用いることができる。
【０１９６】
リンカー、及びオリゴマー化合物の複合体の調製におけるそれらの使用は、当該技術、例えば国際公開公報第９６／１１２０５号及び国際公開公報第９８／５２６１４号、並びに米国特許第４，９４８，８８２号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５８０，７３１号；５，４８６，６０３号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６６７，０２５号；５，２５４，４６９号；５，２４５，０２２号；５，１１２，９６３号；５，３９１，７２３号；５，５１０４７５号；５，５１２，６６７号；５，５７４，１４２号；５，６８４，１４２号；５，７７０，７１６号；６，０９６，８７５号；６，３３５，４３２号；及び６，３３５，４３７号、国際公開公報第２０１２／０８３０４６号を介して提供されるが、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１９７】
本明細書で使用される、生理学的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇される条件、又はそれに類似する条件下で開裂可能な不安定な結合である（開裂可能な結合とも記載する）。生理学的に不安定な結合基は、それらが、ある種の生理学的状態に存在する場合に化学的な変換（例えば、開裂）を受けるように選択される。哺乳動物の細胞内の状態には、哺乳動物の細胞内で確認される、又はそれらと類似する化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化又は還元条件又は試薬、及び塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内の状態にはまた、哺乳動物の細胞内に通常存在する酵素、例えばタンパク質分解酵素又は加水分解酵素の活性の有無が含まれる。ある態様では、開裂可能なリンカーは、例えば標的細胞で発現されているかもしれないヌクレアーゼに感受性を有し、本明細書に記載されるように、リンカーは、短い領域（例えば１〜１０）のホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えばＤＮＡヌクレオシドであることができる
【０１９８】
化学的な変換（不安定な結合の開裂）は、細胞への薬学的に許容しうる試薬の添加により開始されるかもしれず、又は不安定な結合を有する分子が、適当な細胞内、及び／又は細胞外環境に到達した場合に自然発症的に起きるかもしれない。例えば、ｐＨに不安定な結合は、分子が酸性のエンドソームに入ると開裂するかもしれない。したがって、ｐＨに不安定な結合は、エンドソームにより開裂される結合であると考えることができる。酵素により開裂可能な結合は、酵素、例えばエンドソーム若しくはリソソーム内、又は細胞質に存在する酵素に曝されると開裂しうる。ジスルフィド結合は、分子が、細胞の細胞質のより還元性の環境に入ると、開裂しうる。したがって、ジスルフィドは、細胞質により開裂可能な結合であると考えることができる。本明細書で使用されているｐＨに不安定な結合は、酸性条件（ｐＨ＜７）下で選択的に破壊される不安定な結合である。細胞のエンドソーム及びリソソームは、７未満のｐＨを有するため、このような結合はまた、エンドソームに不安定な結合と称されることができる。
【０１９９】
オリゴマー結合生物学的に開裂可能な複合体
オリゴマー化合物は、場合により、オリゴマー（領域Ａと記載する）及び複合体（領域Ｃと記載する）の間に位置する第２の領域（領域Ｂ）を含むことができる。領域Ｂは、リンカー、例えば開裂可能なリンカー（生理学的に不安定な結合であるとも記載する）であることができる（実施例７を参照）。
【０２００】
ヌクレアーゼに感受性を有する生理学的に不安定な結合：ある態様では、本発明のオリゴマー（オリゴマー化合物とも記載される）（又は複合体）は、３の領域を含む：
ｉｖ）１０〜１８の隣接するヌクレオチドを含む第１の領域（領域Ａ）；
ｖ）生物学的に開裂可能なリンカーを含む第２の領域（領域Ｂ）；
ｖｉ）複合体部分、標的部分、活性化部分を含む第３の領域（Ｃ）（ここで、第３の領域は、第２の領域に共有結合している）。
【０２０１】
ある態様では、領域Ｂは、ホスファートヌクレオチドリンカーであることができる。例えば、このようなリンカーは、複合体が、親油性複合体、例えば脂質、脂肪酸、ステロール、例えばコレステロール又はトコフェロールである場合に用いることができる。ホスファートヌクレオチドリンカーはまた、その他の複合体、例えば炭水化物複合体、例えばＧａｌＮａｃにも用いることができる。
【０２０２】
ペプチドリンカー
ある態様では、生物学的に開裂可能なリンカー（領域Ｂ）は、ペプチド、例えばポリＧａｌＮａｃ複合体、例えばトリＧａｌＮａｃ複合体に使用することができるトリリシンペプチドリンカーである。使用することができる当該技術において公知のその他のリンカーには、ジスルフィドリンカーが含まれる。
【０２０３】
ホスファートヌクレオチドリンカー
ある態様では、領域Ｂは、１〜６の間のヌクレオチドを含み、これが、第１の領域の５’又は３’ヌクレオチドに、例えばヌクレオシド間結合基、例えばホスホジエステル結合を介して共有結合しており、ここで、
ａ．第１の領域及び第２の領域の間のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり、第１の領域に［例えば直接］隣接する第２の領域のヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかであるか；及び又は
ｂ．第２の領域の少なくとも１のヌクレオシドは、ホスホジエステル結合ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドであるか；
のいずれかである。
【０２０４】
ある態様では、領域Ａ及び領域Ｂは、１２〜２２ヌクレオチド長の単一の隣接するヌクレオチド配列を形成する。
【０２０５】
ある側面では、第１の領域及び第２の領域の間のヌクレオシド間結合は、第２の領域の一部であると考えることができる。
【０２０６】
ある態様では、第２の領域及び第３の領域の間にリン含有結合基がある。リン結合基は、例えばホスファート（ホスホジエステル）、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又はボラノホスファート基である。ある態様では、このリン含有結合基は、第２の領域と、第３の領域に結合しているリンカー領域の間に位置する。ある態様では、ホスファート基は、ホスホジエステルである。
【０２０７】
したがって、ある側面では、オリゴマー化合物は、少なくとも２のホスホジエステル基を含み、ここで少なくとも一方は、本発明の上記記載のとおりであり、もう一方は、第２の領域と第３の領域の間、場合によりリンカー基と第２の領域の間に位置する。
【０２０８】
ある態様では、第３の領域は、活性化基、例えば抱合に用いるための活性化基である。この点において、本発明はまた、領域Ａ及び領域Ｂ、並びに活性化基、例えば引き続いての第３の領域への結合に適した、例えば抱合に適した中間体を含む活性化されたオリゴマーを提供する。
【０２０９】
ある態様では、第３の領域は、反応性基、例えば抱合に用いるための反応性基である。この点において、本発明はまた、領域Ａ及び領域Ｂ、並びに反応性基、例えば引き続いての第３の領域への結合に適した、例えば抱合に適した中間体を含むオリゴマーを提供する。ある態様では、反応性基は、アルコール基のアミン、例えばアミン基を含むことができる。
【０２１０】
ある態様では、領域Ａは、ホスホジエステルのほかに、少なくとも１、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１のヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、及びボラノホスファート、並びにメチルホスホナートからなる群、例えばホスホロチオアートから（場合により独立して）選択されるヌクレオシド間結合を含む。ある態様では、領域Ａは、少なくとも１のホスホロチオアート結合を含む。ある態様では、少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合、例えば領域Ａ内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル以外であり、例えばホスホロチオアート結合である。ある態様では、領域Ａ内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル以外である。
【０２１１】
ある態様では、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１の領域、及び場合により第２の領域であるか、又は含むことができる。この点において、ある態様では、領域Ｂは、（核酸）標的に相補的である隣接する核酸塩基配列の一部を形成することができる。その他の態様では、領域Ｂは、標的に対する相補性を欠いていることができる。
【０２１２】
代わりに述べたように、ある態様では、本発明は、ホスホジエステルが結合していない、例えばホスホロチオアートが結合しているオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）であって、オリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオシドにホスホジエステル結合を介して結合している少なくとも１の末端（５’及び／又は３’）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを有し、末端ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドが、複合体部分、標的部分、又は遮断部分に、場合によりリンカー部分を介して更に共有結合しているオリゴヌクレオチドを提供する。
【０２１３】
ある態様では、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１の領域、及び場合により第２の領域であるか、又は含むことができる。この点において、ある態様では、領域Ｂは、（核酸）標的に相補的である隣接する核酸塩基配列の一部を形成することができる。その他の態様では、領域Ｂは、標的に対する相補性を欠いていることができる。
【０２１４】
ある態様では、第２の領域の少なくとも２の連続するヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシド（例えば、少なくとも３、４、又は５の連続するＤＮＡヌクレオチド）であることができる。
【０２１５】
ある態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式：
５’−Ａ−ＰＯ−Ｂ［Ｙ）Ｘ−３’、又は３’−Ａ−ＰＯ−Ｂ［Ｙ）Ｘ−５’
により記載することができ、ここでＡは、領域Ａであり、ＰＯは、ホスホジエステル結合であり、Ｂは、領域Ｂであり、Ｙは、任意の結合基であり、Ｘは、複合体基、標的基、遮断基、又は反応性若しくは活性化基である。
【０２１６】
ある態様では、領域Ｂは、３’−５’又は５’−３’：ｉ）領域Ａの５’ヌクレオシドに対するホスホジエステル結合、ｉｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド、例えばＤＮＡヌクレオシド、及びｉｉｉ）更なるホスホジエステル：
５’−Ａ−ＰＯ−Ｂ−ＰＯ−３’、又は３’−Ａ−ＰＯ−Ｂ−ＰＯ−５’
を含む。
【０２１７】
更なるホスホジエステル結合は、領域Ｂヌクレオシドを、１以上の更なるヌクレオシド、例えば１以上のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと結合させるか、或いは場合により結合基（Ｙ）を介してＸ（複合体、標的若しくは遮断基、又は反応性若しくは活性化基である）に結合させることができる。
【０２１８】
ある態様では、領域Ｂは、３’−５’又は５’−３’：ｉ）領域Ａの５’ヌクレオシドに対するホスホジエステル結合、ｉｉ）２〜１０の間のＤＮＡ又はＲＮＡホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えばＤＮＡヌクレオチド、及び場合によりｉｉｉ）更なるホスホジエステル結合：
５’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−［Ｙ］−Ｘ  ３’、又は３’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ［Ｙ］−Ｘ  ５’
５’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−ＰＯ−［Ｙ］−Ｘ  ３’、又は３’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−ＰＯ−［Ｙ］−Ｘ  ５’
を含む。
【０２１９】
ここで、Ａは、領域Ａを表し、［ＰＯ−Ｂ］ｎは、領域Ｂを表し、ここでｎは、１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり、ＰＯは、領域Ｂ及びＸ（又は存在する場合にはＹ）の間の任意のホスホジエステル結合基である。
【０２２０】
ある態様では、本発明は、以下の式の一つによる（又は含む）化合物を提供する：
５’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］３’−Ｙ−Ｘ
５’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ３’−Ｙ−Ｘ
５’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］３’−Ｘ
５’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ３’−Ｘ
３’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］５’−Ｙ−Ｘ
３’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ５’−Ｙ−Ｘ
３’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］５’−Ｘ
３’［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ５’−Ｘ
【０２２１】
領域Ｂは、例えば以下を含むか、又は以下からなることができる。
５’ＤＮＡ３’
３’ＤＮＡ５’
５’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−３’
３’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−５’
５’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ３’
３’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ５’
５’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ３’
３’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ５’
５’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ３’
３’ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ５’
【０２２２】
ホスファートが結合した生物学的に開裂可能なリンカーが、ＤＮＡ及びＲＮＡ以外のヌクレオシドを用いることができることは、認識すべきである。生物学的に開裂可能なリンカーは、例えば実施例７におけるアッセイを用いて確認することができる。
【０２２３】
ある態様では、本発明の化合物は、生物学的に開裂可能なリンカー（生理学的に不安定なリンカー、ヌクレアーゼに感受性を有する生理学的に不安定な結合、又はヌクレアーゼに感受性を有するリンカーとしても記載される）、例えばホスファートヌクレオチドリンカー（例えば領域Ｂ）、又はペプチドリンカーを含み、これらがオリゴマー（又は隣接するヌクレオチド配列又は領域Ａ）を複合体部分（又は領域Ｃ）に結合させる。
【０２２４】
実施例７に示すアッセイにおける開裂に対する感受性は、リンカーが生物学的に開裂可能な又は生理学的に不安定であるかどうかを決定するのに用いることができる。
【０２２５】
本発明による生物学的に開裂可能なリンカーとは、標的組織、例えば肝及び／又は腎において開裂に対して感受性を有する（すなわち、生理学的に不安定）リンカーを指す。標的組織において見られる開裂速度は、血清中におけるものよりも大きいほうが好ましい。組織（例えば、肝又は腎）及び血清中の開裂のレベル（％）を決定するための適当な方法は、実施例６に見られる。ある態様では、生物学的に開裂可能なリンカー（生理学的に不安定なリンカー、又はヌクレアーゼに感受性を有するリンカーとも記載される）、例えば本発明の化合物における領域Ｂは、実施例７の肝又は腎ホモジネートアッセイにおいて、少なくとも約２０％開裂され、例えば少なくとも約３０％開裂され、例えば少なくとも約４０％開裂され、例えば少なくとも約５０％開裂され、例えば少なくとも約６０％開裂され、例えば少なくとも約７０％開裂され、例えば少なくとも約７５％開裂される。ある態様では、実施例７におけるアッセイで使用した血清における開裂（％）は、約３０％未満、約２０％未満、例えば約１０％未満、例えば約５％未満、例えば約１％未満である。
【０２２６】
ある態様では、生物学的に開裂可能なリンカー（生理学的に不安定なリンカー、又はヌクレアーゼに感受性を有するリンカーとも記載される）、例えば本発明の化合物の領域Ｂは、同一又は異なることができるが、Ｓ１ヌクレアーゼによる開裂に感受性を有する。Ｓ１開裂に対する感受性は、実施例７に示すＳ１ヌクレアーゼアッセイを用いて評価することができる。ある態様では、生物学的に開裂可能なリンカー（生理学的に不安定なリンカー、又はヌクレアーゼに感受性を有するリンカーとも記載される）、例えば本発明の化合物における領域Ｂは、実施例７において用いたアッセイにより、Ｓ１ヌクレアーゼとの１２０分間のインキュベーション後、少なくとも約３０％開裂され、例えば少なくとも約４０％開裂され、例えば少なくとも約５０％開裂され、例えば少なくとも約６０％開裂され、例えば少なくとも約７０％開裂され、例えば少なくとも約８０％開裂され、例えば少なくとも約９０％開裂され、例えば少なくとも約９５％開裂される。
【０２２７】
第２の領域における配列の選択
ある態様では、オリゴヌクレオチド領域Ａ及びＢを相補的標的配列に整列させると、領域Ｂは、相補的配列を形成しない。
【０２２８】
ある態様では、オリゴヌクレオチド領域Ａ及びＢを、相補的標的配列に整列させると、領域Ｂは、相補的配列を形成する。この点において、領域Ａ及びＢは、一緒になって、標的配列に相補的である単一の隣接する配列を形成することができる。
【０２２９】
ある態様では、標的組織若しくは細胞若しくは細胞内コンパートメントに存在する優性なエンドヌクレアーゼ開裂酵素に基づき、領域Ｂにおける塩基の配列を選択して、最適なエンドヌクレアーゼ開裂部位を提供する。この点において、標的細胞及び非標的細胞からの細胞抽出物を単離することにより、非標的細胞（例えば腎）と比較して所望の標的細胞（例えば、肝／肝細胞）における好ましい開裂活性に基づいて、領域Ｂにおいて使用するためのエンドヌクレアーゼ開裂配列を、選択することができる。この点において、標的の下方制御のための化合物の力価は、所望の組織／細胞に応じて最適化することができる。
【０２３０】
ある態様では、領域Ｂは、配列ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、又はＧＧのジヌクレオチドを含むことができ、ここでＣは、５−メチルシトシンであることができ、及び／又はＴは、Ｕで置き換えられていてもよい。ある態様では、領域Ｂは、配列ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、及びＧＧＧのトリヌクレオチドを含み、ここでＣは、５−メチルシトシンであるか、及び／又はＴは、Ｕで置き換えられていてもよい。ある態様では、領域Ｂは、配列ＡＡＡＸ、ＡＡＴＸ、ＡＡＣＸ、ＡＡＧＸ、ＡＴＡＸ、ＡＴＴＸ、ＡＴＣＸ、ＡＴＧＸ、ＡＣＡＸ、ＡＣＴＸ、ＡＣＣＸ、ＡＣＧＸ、ＡＧＡＸ、ＡＧＴＸ、ＡＧＣＸ、ＡＧＧＸ、ＴＡＡＸ、ＴＡＴＸ、ＴＡＣＸ、ＴＡＧＸ、ＴＴＡＸ、ＴＴＴＸ、ＴＴＣＸ、ＴＡＧＸ、ＴＣＡＸ、ＴＣＴＸ、ＴＣＣＸ、ＴＣＧＸ、ＴＧＡＸ、ＴＧＴＸ、ＴＧＣＸ、ＴＧＧＸ、ＣＡＡＸ、ＣＡＴＸ、ＣＡＣＸ、ＣＡＧＸ、ＣＴＡＸ、ＣＴＧＸ、ＣＴＣＸ、ＣＴＴＸ、ＣＣＡＸ、ＣＣＴＸ、ＣＣＣＸ、ＣＣＧＸ、ＣＧＡＸ、ＣＧＴＸ、ＣＧＣＸ、ＣＧＧＸ、ＧＡＡＸ、ＧＡＴＸ、ＧＡＣＸ、ＣＡＧＸ、ＧＴＡＸ、ＧＴＴＸ、ＧＴＣＸ、ＧＴＧＸ、ＧＣＡＸ、ＧＣＴＸ、ＧＣＣＸ、ＧＣＧＸ、ＧＧＡＸ、ＧＧＴＸ、ＧＧＣＸ、及びＧＧＧＸのトリヌクレオチドを含み、ここでＸは、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、及びそれらのアナログからなる群から選択することができ、ここでＣは、５−メチルシトシンであるか、及び／又はＴは、Ｕで置き換えられていてもよい。（天然に存在する）核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ｃについて記載する場合、これらは、同等の天然の核酸塩基として機能する核酸塩基アナログで置換されていてもよい（例えば、相補的ヌクレオシドを有する塩基対）。
【０２３１】
アミノアルキル中間体
本発明はさらに、（例えば、末端５’又は３’）アミノアルキル、例えばＣ２〜Ｃ３６アミノアルキル基（例えば、Ｃ６及びＣ１２アミノアルキル基を含む）を含むアンチセンスＬＮＡオリゴマーを含むＬＮＡオリゴマー中間体を提供する。アミノアルキル基は、例えば（例えば保護されている）アミノアルキルホスホルアミダイトを用いて、標準的なオリゴヌクレオチド合成の一部としてＬＮＡオリゴマーに付加することができる。アミノアルキルとＬＮＡオリゴマーの間の結合基は、例えばホスホロチオアート又はホスホジエステル、或いは例えば本明細書で記載されるその他のヌクレオシド結合基の一つであることができる。アミノアルキル基は、例えばＬＮＡオリゴマーの５’又は３’に、例えばヌクレオシド結合基、例えばホスホロチオアート又はホスホジエステル結合により、共有結合していることができる。
【０２３２】
本発明はまた、ＬＮＡオリゴマーの連続合成、例えば固相オリゴヌクレオチド合成を含むＬＮＡオリゴマーの合成方法であって、アミノアルキル基をオリゴマーに、例えばオリゴヌクレオチド合成の最初又は最終ラウンドの間に加える工程を含む合成方法を提供する。合成方法は、複合体を、アミノアルキル−ＬＮＡオリゴマーと反応させる工程（抱合工程）を更に含むことができる。複合体は、適当なリンカー及び／又は分岐点基、そして場合により更なる複合体基、例えば本明細書に記載する疎水性又は親油性基を含むことができる。抱合の工程は、オリゴマーを固体支持体に結合させながら（例えば、オリゴヌクレオチド合成後であるが、固体支持体からのオリゴマーの溶出前）、又は連続的に（すなわち、溶出後）行うことができる。本発明は、本発明のオリゴマーの合成におけるアミノアルキルリンカーの使用を提供する。
【０２３３】
製造／合成の方法
本発明は、オリゴマー化合物、例えば本発明のオリゴマー化合物を合成（又は製造）する方法であって、下記のいずれか：
ａ）下記：
ｉ）リンカー基（−Ｙ−）
ｉｉ）複合体、標的基、遮断基、反応性基（例えば、アミン又はアルコール）、又は活性化基（Ｘ−）からなる群から選択される基
ｉｉｉ）−Ｙ−Ｘ基
の一つが結合している（第３の領域）［固相］オリゴヌクレオチド合成支持体を提供する工程；及び
ｂ）領域Ｂ、次いで領域Ａの［連続的］オリゴヌクレオチド合成の工程、及び／又は；
ｃ）第１の領域（Ａ）、及び第２の領域（Ｂ）の［連続的］オリゴヌクレオチド合成の工程、本合成工程に続いて、
ｄ）以下：
ｉ）リンカー基（−Ｙ−）
ｉｉ）複合体、標的基、遮断基、反応性基（例えば、アミン又はアルコール）、又は活性化基（Ｘ−）からなる群から選択される基
ｉｉｉ）−Ｙ−Ｘ基
を含む第３の領域［ホスホルアミダイト］を付加する工程；続いて
ｅ）［固相］支持体からのオリゴマー化合物の開裂（場合により、下記：
ｆ）第３の基が活性化基である場合には、活性化基を活性化して、反応性基を生成し、ついで、場合によりリンカー基（Ｙ）を介して複合体、遮断、又は標的基を反応性基に付加する工程；
ｇ）第３の領域が反応性基である場合には、場合によりリンカー基（Ｙ）を介して複合体、遮断、又は標的基を反応性基に、付加する工程；
ｈ）第３の領域がリンカー基（Ｙ）である場合には、複合体、遮断、又は標的基をリンカー基（Ｙ）に付加する工程；
から選択される更なる工程を含む）
を含む方法を提供し、ここで、工程ｆ）、ｇ）、又はｈ）は、オリゴヌクレオチド合成支持体からのオリゴマー化合物の開裂の前又はそれに引き続いて行うかのいずれかである。ある態様では、本方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて行うことができ、それ自体は、領域Ｘ及び／又は領域Ｘ又は領域Ｘ及びＹは、ホスホルアミダイトとして、オリゴマーへの導入前に提供することができる。本発明の方法の非限定的側面を説明した図５〜１０を参照のこと。
【０２３４】
本発明は、オリゴマー化合物、例えば本発明のオリゴマー化合物を合成（又は製造する）方法であって、第１の領域（Ａ）及び場合により第２の領域（Ｂ）の［連続的］オリゴヌクレオチド合成の工程（ここで、本合成の工程には、領域Ｘ（領域Ｃとしても記載されている）又はＹ、例えば複合体、標的基、遮断基、官能基、反応性基（例えば、アミン又はアルコール）、又は活性化基（Ｘ）、或いは−Ｙ−Ｘ基からなる群から選択される基を含む第３の領域［ホスホルアミダイト］を付加し、［固相］支持体からオリゴマー化合物を開裂する工程が続く）を含む方法を提供する。
【０２３５】
しかし、領域Ｘ、又はＸ−Ｙは、固体支持体からの開裂後に付加することができることは認識される。或いはまた、本合成方法は、第１（Ａ）、及び場合により第２の領域（Ｂ）を合成する工程と、それに続く支持体からのオリゴマーの開裂、続いての第３の領域、例えばＸ又はＸ−Ｙ基のオリゴマーへの付加の工程を含むことができる。第３の領域の付加は、例えばオリゴマー合成の最終工程（支持体上）においてアミノホスホルアミダイトユニットを付加することによって行うことができ、これは、支持体からの開裂後、Ｘ又はＸ−Ｙ基へ、場合によりＸ又はＹ（存在する場合）基上の活性化基を介して結合させるために用いることができる。ある態様では、開裂可能なリンカーがヌクレオチド領域ではない場合、領域Ｂは、ヌクレオチド非開裂可能なリンカー、例えばペプチドリンカーであることができ、これは、領域Ｘ（領域Ｃとも記載される）の一部を形成、又は領域Ｙ（又はその一部）であることができる。
【０２３６】
本方法のある態様では、領域Ｘ（例えばＣ）、又は（Ｘ−Ｙ）、例えば複合体（例えば、ＧａｌＮＡｃ複合体）は、活性化基、（活性化された官能基）を含み、合成の方法においては、活性化された複合体（又は領域Ｘ、又はＸ−Ｙ）を、第１及び第２の領域、例えばアミノ結合オリゴマーに加える。アミノ基は、標準的なホスホルアミダイト化学により、例えばオリゴマー合成の最終工程としてオリゴマーに付加することができる（これは、典型的には、オリゴマーの５’末端のアミノ基に起きるであろう）。例えば、オリゴヌクレオチド合成の最終段階の間に、保護されたアミノ−アルキルホスホルアミダイト、例えばＴＦＡ−アミノＣ６ホスホルアミダイト（６−（トリフルオロアセチルアミノ）−ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト）を用いる。領域Ｘ（又は本明細書では、領域Ｃとして記載される）、例えば複合体（例えば、ＧａｌＮａｃ複合体）は、ＮＨＳエステル法により活性化することができ、次いでアミノ結合オリゴマーを付加する。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を領域Ｘ（又は領域Ｃ、例えば複合体、例えばＧａｌＮａｃ複合体部分）の活性化基として用いることができる。本発明は、本発明の方法で調製されるオリゴマーを提供する。
【０２３７】
ある態様では、領域Ｘ及び／又は領域Ｘ又は領域Ｘ及びＹは、ホスファートヌクレオシド結合、例えば本明細書に記載されているホスホジエステル又はホスホロチオアートなど、或いは替わりの基、例えばトリアゾール基を介して領域Ｂに共有結合（結合）することができる。
【０２３８】
ある態様では、第１及び第２の領域の間のヌクレオシド間結合は、第２の領域の最初の（又は唯一の）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドに結合しているホスホジエステルであるか、又は領域Ｂは、少なくとも１のホスホジエステルが結合したＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む。
【０２３９】
ある態様では、第２の領域は、ホスホジエステルで結合していることができる更なるＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む。第２の領域は、例えば複合体、標的基、反応性基、及び／又は遮断基であることができる第３の領域に更に共有結合している。
【０２４０】
ある側面では、本発明は、不安定な領域、第１の領域と結合している第２の領域、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び複合体又は官能基、例えば標的又は遮断基の提供に基づく。不安定な領域は、少なくとも１のホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを含む。ある態様では、オリゴマー化合物は、開裂可能な（不安定な）リンカーを含む。この点において、開裂可能なリンカーは、好ましくは領域Ｂ（又は、ある態様では、領域Ａ及び領域Ｂの間）に存在する。
【０２４１】
或いは、別の態様では、本発明は、ホスホジエステルが結合していない、例えば、オリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオシドに、ホスホジエステル結合を介して結合した少なくとも１の末端（５’及び／又は３’）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを有する、ホスホロチオアートが結合しているオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）であって、末端ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドが、場合によりリンカー部分を介して複合体部分、標的部分、又は遮断部分に更に共有結合しているオリゴヌクレオチドを提供する。
【０２４２】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬製剤及び組成物において使用することができる。適当には、このような組成物は、薬学的に許容しうる希釈剤、担体、塩、又は補助剤を含む。国際公開公報第２００７／０３１０９１号は、適当かつ好ましい薬学的に許容しうる希釈剤、担体、及び補助剤を提供しており、これらは、参照により本明細書に組み入れられる。適当な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤型、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開公報第２００７／０３１０９１号において提供されており、これらは、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４３】
適用
本発明のオリゴマーは、例えば診断、治療及び予防のための研究用試薬として用いることができる。
【０２４４】
研究においては、このようなオリゴマーは、細胞及び実験動物において、ＡＰＯＢタンパク質の合成を特異的に阻害し（典型的には、ｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防ぐ）、それにより、標的の機能的分析、又は治療介入の標的としてのその有用性の評価を促進するために用いることができる。
【０２４５】
診断においては、オリゴマーは、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション又は同様の技術により、細胞及び組織におけるＡＰＯＢの発現を検出し、定量化するために用いることができる。
【０２４６】
治療のためには、ＡＰＯＢの発現を調節することによって処置することができる疾患又は障害を有することが疑われる動物又はヒトを、本発明によるオリゴマー化合物を投与することによって処置する。更には、ＡＰＯＢの発現と関連する疾患又は状態を有する、又はその傾向があることが疑われる哺乳動物を処置する、例えばヒトを処置する方法であって、治療又は予防有効量の１以上の本発明のオリゴマー又は組成物を投与することによる方法が提供される。本発明によるオリゴマー、複合体、又は医薬組成物は、典型的には有効量投与される。
【０２４７】
本発明はまた、本明細書に記載される障害の処置のための医薬の製造のための、又は本明細書に記載される障害の処置の方法のための、記載される本発明の化合物又は複合体の使用を提供する。
【０２４８】
本発明はまた、本明細書に記載される障害を処置する方法であって、本明細書に記載される本発明による化合物、及び／又は本発明による複合体、及び／又は本発明による医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【０２４９】
医療の適応症
本発明によるオリゴマー及びその他の組成物は、ＡｐｏＢの突然変異バージョンの過剰発現又は発現と関連のある状態の処置に用いることができる。
【０２５０】
本発明は更に、本明細書に記載される疾患、障害又は状態の処置のための医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０２５１】
一般的に述べると、本発明の一つの側面は、ＡＰＯＢの異常なレベル及び／又は活性と関連する状態を罹患する、又はそれに罹患しやすい哺乳動物を処置する方法であって、ＡＰＯＢを標的とする、１以上のＬＮＡユニットを含む治療有効量のオリゴマーを哺乳動物に投与することを含む方法に向けられる。本発明によるオリゴマー、複合体、又は医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
【０２５２】
本明細書に記載される疾患又は障害は、ある態様では、ＡＰＯＢ遺伝子、又はそのタンパク質産生がＡＰＯＢと関連している、又は相互作用している遺伝子の突然変異と関連していることができる。したがって、ある態様では、標的ｍＲＮＡは、ＡＰＯＢ配列の突然変異形態である。
【０２５３】
本発明の興味深い側面は、本明細書に記載される疾患、障害、又は状態の処置のための医薬の製造のための、本明細書で定義されるオリゴマー（化合物）又は本明細書で定義される複合体の使用に向けられる。
【０２５４】
本発明の方法は、好ましくは、ＡＰＯＢの異常レベル及び／又は活性によって惹起される疾患に対する治療又は予防のために用いられる。
【０２５５】
或いはまた、ある態様では、本発明は更に、ＡＰＯＢの異常レベル及び／又は活性を処置する方法であって、本発明のオリゴマー、又は本発明の複合体、又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法に向けられる。
【０２５６】
本発明はまた、医薬として使用するための本明細書で定義されるオリゴマー、組成物、又は複合体に関する。
【０２５７】
本発明は更に、ＡＰＯＢの異常レベル及び／又は活性、或いはＡＰＯＢの突然変異形態の発現（例えば、対立遺伝子変異型、例えば、本明細書に記載される疾患の一つと関連するそれら）の処置のための医薬の製造のための、本明細書で定義される化合物、組成物、又は複合体の使用に関する。
【０２５８】
更に、本発明は、疾患又は状態、例えば本明細書に記載されるそれらを罹患する被験者を処置する方法に関する。
【０２５９】
処置を必要とする患者は、疾患又は障害を罹患している、又は罹患している可能性がある患者である。
【０２６０】
ある態様では、本明細書で使用される語「処置」は、存在している疾患（例えば、本明細書に記載される疾患又は障害）の処置、或いは疾患の予防、すなわち予防の両方を指す。したがって、本明細書に記載される処置は、ある態様では、予防的であることができることが認識されよう。
【０２６１】
ある態様では、本発明は、高コレステロール血症及び関連する障害の処置のための化合物又は化合物を含む組成物、又は高コレステロール血症及び関連する障害を処置するためのこのような化合物又は組成物を用いる処置方法に関し、ここで高コレステロール血症を指す場合の語「関連する障害」は、アテローム性動脈硬化、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えばＡＰＯＢの機能突然変異の獲得、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常、脂質異常症、例えば家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、及び冠性心疾患（ＣＨＤ）からなる群から選択される１以上の状態を指す。
【０２６２】
実施例
オリゴヌクレオチド
ＡｐｏＢ標的化合物
オリゴヌクレオチド配列モチーフ
【０２６３】
【表２】
2016503300.tif 000019
【０２６４】
ＦＡＭ標識複合体を有するＡｐｏＢ標的化合物
【０２６５】
【表３】
2016503300.tif 000020
【０２６６】
マウス実験：別途特定しない限り、マウス実験は、以下の通りに行うことができる。
投与量の投与及び試料採取：
７〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ６−Ｎ系マウスを用い、動物の週齢及び性別を一致させた（メスは、研究１、２、及び４用、オスは、研究３用とした）。化合物を、尾静脈から静脈内注射した。中間での血清採取のためには、血液２〜３滴を顔面静脈の穿刺により採取し、下大静脈から最終採血した。血清を、ゲル含有血清分離管（Greiner）に集め、分析するまで凍結保存した。
【０２６７】
Ｃ５７ＢＬ６系マウスに、示した情報に従って、食塩水に配合したＡＳＯ１mg/kg（又は示した量）又は食塩水のみを静脈内に単回投与した。投与後、例えば４又は７日目（又は示した時間）に動物を屠殺し、腎及び肝を採取した。
【０２６８】
ＲＮＡ単離及びｍＲＮＡ分析：Qantigene  ｍＲＮＡ定量化キット（「ｂＤＮＡ−アッセイ」、Panomics/Affimetrix）を用い、製造業者の手順書に従って、組織由来のｍＲＮＡ分析を行った。組織溶解物については、Proteinase Kを含有する溶解用緩衝液１ml中での超音波処理により組織５０〜８０mgを溶解させた。ｂＤＮＡアッセイのためには、ＲＮＡ抽出なしで溶解物を直接使用した。Panomicsからのカスタムデザインされた標的及びＧＡＰＤＨのプローブセットを得た。分析には、標的遺伝子用に得られた発光ユニットをハウスキーパーＧＡＰＤＨで標準化させた。
【０２６９】
ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びコレステロールについての血清分析を、血清１０μlを用いて、「Cobas INTEGRA 400 plus」臨床化学プラットフォーム（Roche Diagnostics）で行った。
【０２７０】
第VII因子の血清中濃度の定量化のために、製造業者の手引書に従って、BIOPHEN FVII酵素活性キット（(#221304, Hyphen BioMed）を用いた。
【０２７１】
オリゴヌクレオチドの定量化のためには、蛍光標識したＰＮＡプローブを、組織溶解物中の、興味の対象であるオリゴにハイブリダイズさせる。ｂＤＮＡアッセイについては、正確に秤量した組織と共に同じ溶解物を用いる。ＡＥＸ−ＨＰＬＣ及び蛍光検出を用いて、ヘテロデュプレックスを定量化する。
【０２７２】
実施例１：化合物の合成
ウリジンユニバーサル支持体上で、Expedite 8900/MOSS合成装置（Multiple Oligonucleotide Synthesis System）を用いるホスホルアミダイト法を用い、４μmolのスケールでオリゴヌクレオチドを合成した。合成の終了時に、室温で１〜２時間アンモニア水を用いて、オリゴヌクレオチドを固相から開裂させ、更に６５℃で１６時間脱保護した。オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製し、ＵＰＬＣにより特徴づけし、更にＥＳＩ−ＭＳにより分子量を確認した。詳細については、以下を参照のこと。
【０２７３】
オリゴヌクレオチドの伸長
活性化剤としてアセトニトリル中０．１M ５’−ＤＭＴ−保護アミダイト溶液、及びアセトニトリル中ＤＩＣ（４，５−ジシアノイミダゾール）（０．２５M）を用いて、β−シアノエチル−ホスホルアミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、ＬＮＡ−Ｔ、又はＣ６−Ｓ−Ｓリンカー）のカップリングを行う。最後のサイクルのためには、市販のＣ６−結合コレステロールホスホルアミダイトを、ＤＣＭ中、０．１Mで用いた。ホスホロチオアート結合の導入のためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１M）を用いて行う。ホスホルジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中０．０２M ヨウ素を用いて導入する。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に典型的に用いられるものである。固相合成後の抱合のためには、市販のＣ６アミノリンカーホスホルアミダイトを、固相合成の最後のサイクル及び脱保護及び固体支持体からの開裂後において用い、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドを単離した。標準的な合成方法を用いて官能基の活性化を介して、複合体を導入した。
【０２７４】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製
Phenomenex Jupiter C18  １０μ  １５０×１０mmカラムによる分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより粗化合物を精製した。０．１M 酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを、流速５mL／分で緩衝液として用いた。集めた画分を凍結乾燥して、精製した化合物を典型的には白色の固体として得た。
【０２７５】
略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
【０２７６】
実施例２：ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン
実施例及び図において用いたオリゴマー。配列番号は、実施例及び図面を通して使用する識別子である。
【０２７７】
【表４】
2016503300.tif 000021
【０２７８】
実施例３：コレステロール−複合体によるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのインビボでのノックダウン
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系マウスに、単回量の食塩水、又は非抱合ＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（#3）若しくは等モル量の、異なるリンカーでコレステロールに抱合しているＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド１mg／kgを注射し、下記の表のとおりに１〜１０日目に屠殺した。肝及び腎からＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ特異的プライマー及びプローブによるｑＰＣＲに付して、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを分析した。
【０２７９】
結論
ホスホジエステル−骨格を有する２又は３ＤＮＡから構成されるリンカーにより、ＡｐｏＢＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに抱合したコレステロール（配列番号4及び配列番号５）は、ＡｐｏＢの肝特異的ノックダウンに対する優先性を示した（図１１）。これは、抱合されていない化合物（配列番号３）、更には安定なリンカー（配列番号４）及びジスルフィドリンカー（配列番号５）とのコレステロール複合体と比較すると、肝組織におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンの効果及び期間が増大していること、そして同時に腎組織では、配列番号６及び配列番号７のノックダウン活性が小さいことを意味している。
【０２８０】
材料及び方法
実験デザイン
【０２８１】
【表５】
2016503300.tif 000022
2016503300.tif 000023
【０２８２】
投与量。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍ系のメスの動物（到着時約２０ｇ）に、上記の表に従って、食塩水に配合した化合物、又は食塩水のみを１０ml／kg体重（０日目の体重に基づく）静脈内投与した。
【０２８３】
肝及び腎組織の採取。動物に７０％ＣＯ２−３０％Ｏ２により麻酔をかけ、上記の表にしたがって、頚椎脱臼により屠殺した。大きい肝葉の半分及び腎臓の一方を刻み、RNAlaterに浸した。
【０２８４】
全ＲＮＡの単離及び第１鎖の合成：製造業者の手引書に従って、Qiagen RNeasyキット（Qiagen cat. no. 74106）を用いてRLT-Lysis緩衝液の存在下、ビーズミリングによってホモゲナイズした組織最大３０mgから全ＲＮＡを抽出した。第１鎖合成は、製造業者の手引書に従って、Ambion社のReverse Transcriptase試薬を用いて行った。
【０２８５】
各試料０．５μgにつき、ＲＮアーゼを含まないＨ２Ｏで全ＲＮＡを調整し（１０．８μlまで）、ランダムデカマー（５０μM）２μl及びｄＮＴＰミックス４μl（それぞれ２．５mMｄＮＴＰ）と混合し、７０℃まで３分間加熱し、その後、試料を速やかに氷上で冷却した。１０×緩衝液ＲＴ２μl、MMLV Reverse Transcriptase（１００U/μl）１μl、及びＲＮアーゼ阻害剤（10U/μl）０．２５μlを各試料に加え、４２℃で６０分間のインキュベーション、９５℃で１０分間の酵素の熱不活性化を続けて行い、次いで試料を４℃まで冷却した。ｃＤＮＡ試料を１：５に希釈し、製造業者の手引書に従って、Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems Cat #4364103）を用いてＲＴ−ＱＰＣＲに、そしてTaqman遺伝子発現アッセイ（mApoB, Mn01545150_m1及びmGAPDH #4352339E）に付し、Applied Biosystems RT-qPCR装置（7500/7900又はViiA7）で高速モードで処理した。
【０２８６】
実施例４．ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの異なる複合体によるインビボでのサイレンシング
ＡｐｏＢ化合物の活性に対する異なる複合体部分及びリンカーの影響を探索するために、配列番号３を、モノＧａｌＮＡｃ、葉酸、ＦＡＭ、又はトコフェロールのいずれかに、非開裂可能なリンカー又は生物学的に開裂可能なリンカー（ジチオ（ＳＳ）又はホスホジエステル骨格（ＰＯ）との２ＤＮＡヌクレオチド）を用いて抱合させた。更に、モノＧａｌＮＡｃを、ＧａｌＮＡｃクラスター（複合体２ａ）と比較した。Ｃ５７ＢＬ６ｌｎ系マウスに、対照である食塩水、又はＡＳＯ複合体１又は０．２５mg／kgの単回投与量を静脈内投与した。７日後、動物を屠殺し、肝及び腎試料からＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの発現を分析した（図１５）。
【０２８７】
結論：ＤＮＡ／ＰＯ−リンカー（#26）によりＡｐｏＢ化合物に抱合したトコフェロールは、抱合していないＡｐｏＢ化合物（#3）と比較して、肝におけるＡｐｏＢのノックダウンを増大させた一方、腎においては活性を低下させた（図１５Ａ及び１５Ｂを比較）。これは、トコフェロールが、腎から肝へＡｐｏＢ化合物の指向性を変えることができることを指している。非開裂可能体（#24）及びＳＳ−リンカー（#25）は、両方の組織において不活性であった。非開裂可能体（#17）及び生物学的に開裂可能なＤＮＡ／ＰＯリンカー（#19）とのモノ−ＧａｌＮＡｃ複合体は、腎においては抱合していない化合物（#3）の活性を保持する傾向を示した一方、肝では活性の改善を示す。ＳＳ−リンカーの導入により、両方の組織において活性が低下した（図１５Ａ及びＢを比較）。異なるＧａｌＮＡｃ複合体、例えばモノＧａｌＮＡｃＰＯ（#19）及びＧａｌＮＡｃクラスター（#20）の抱合により、肝又は腎のいずれかに対して焦点を有する化合物の活性を微調整することが可能である（図１５Ｃ）。葉酸、及び開裂可能なＤＮＡ／ＰＯ−リンカー（配列番号１６及び２３）によるＦＡＭ複合体は、抱合していない化合物と同等な挙動を示す（３）。ここで同様に、非開裂可能（１４又は２１）或いはＳＳ−リンカー（１５及び２２）の導入は、両方の組織において化合物の活性を低下させる（図１５ａ及び１５ｂを比較）。
【０２８８】
材料及び方法：
実験デザイン
【０２８９】
【表６】
2016503300.tif 000024
【０２９０】
投与量の投与及び試料採取。Ｃ５７ＢＬ６系マウスに、上記の表に従って、食塩水に配合したＡＳＯ１mg／kg若しくは０．２５mg／kg、又は食塩水のみを単回静脈内投与した。投与後７日目に動物を屠殺し、肝及び腎を採取した。ＲＮＡ単離及びｍＲＮＡ分析。肝及び腎試料から全ＲＮＡを抽出し、分岐鎖ＤＮＡアッセイを用いてＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを分析した。
【０２９１】
実施例５：非ヒト霊長類研究
霊長類を対象とした本研究は、カニクイザルへ、抗ＡｐｏＢＬＮＡ抱合化合物を緩徐に単回ボラス注射した後７週間にわたって選択した脂質マーカーを検討し、サルにおける化合物の潜在的毒性を評価することである。本研究で用いた化合物は、滅菌食塩水（０．９％）中、初期濃度０．６２５及び２．５mg／mlで調製した配列番号７、２０、２８、及び２９である。
【０２９２】
少なくとも２４月齢のメスのサルを用い、水道水を自由に摂取させ、OWM(E) SQC SHORT拡張飼料（expanded diet）（Dietex France, SDS, Saint Gratien, France）を１匹当たり毎日１８０ｇ配布する。各ケージに配布される食物の総量は、その日のケージ内の動物数により計算される。更に、果物又は野菜が各動物に毎日与えられる。動物は、処置期間の開始前の少なくとも１４日の期間で、研究条件に慣らされる。この期間の間に、前処置研究が行われる。動物は、例えば０．２５mg／kg又は１mg／kgの量で静脈内投与される。投与の容量は、０．４mL／kgである。１群当たり２匹の動物を使用する。３週間後、データを分析し、より高量又は低量を投与する投与計画を用いる動物の第２群を開始することができ−予備投与設定量は、０．５mg／kg及び１mg／kgであるか、又は最初のデータセットに基づきそれよりも低量である。
【０２９３】
投与製剤は、１日目に１回投与される。動物は、処置後７日間観察され、５１日目に研究から解放される。１日目は、処置期間の第１日に相当する。臨床的観察並びに体重及び食物摂取量（群当たり）を、研究前及び研究の間、観察する。
【０２９４】
下記の時点で血液を採取し、分析する。
【０２９５】
【表７】
2016503300.tif 000025
【０２９６】
ＲＣＰ  ０  通常の臨床病態、ＬＳＢ＝肝安全性生化学、ＰＫ＝薬物動態、ＯＡ＝その他の分析、Ｌ＝脂質
【０２９７】
血液生化学
以下に示す場合において、全ての生存動物について、下記のパラメーターを測定する：
・  生化学的パネル全て（下記のリスト全部）  −８、１５、及び５０日目
・  肝安全性（ＡＳＡＴ、ＡＬＰ、ＡＬＡＴ、ＴＢＩＬ、及びＧＧＴのみ）  −４、８、２２、及び３６日目
・  脂質プロフィール（総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、及びトリグリセリド）、及びＡｐｏ−Ｂのみ  −１、４、８、２２、２９、３６、及び４３日目
【０２９８】
血液（約１．０mL）を（ADVIA 1650血液生化学アナライザーを用いて）リチウムヘパリン管に採取する：Ａｐｏ−Ｂ、ナトリウム、カリウム、塩素イオン、カルシウム、無機リン、グルコース、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素、クレアチニン、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルブミン／グロブリン比。
【０２９９】
血液の分析：ＡｐｏＢの分析のための血液試料を、群１〜１６の動物のみ（すなわち、抗ＰＣＳＫ９化合物で処置した動物）から、−８、−１、４、８、１５、２２、２９、３６、４３、及び５０日目に採取する。静脈血（約２mL）を各動物の適当な静脈から血清分離管（ＳＳＴ）に採取し、室温で少なくも６０±３０分の間凝固させる。冷蔵条件（＋４℃を維持するように設定されている）下、１０００ｇで１０分間、血液を遠心分離する。血清を３本の別々の試験管に移し、ＥＬＩＳＡ法を用いてCitoxLAB Franceで分析するまで−８０℃で保存する（Circulex Human PCSK9 ELISAキット、CY-8079、カニクイザルからの試料についてバリデーションされている）。
【０３００】
その他の分析：国際公開公報第２０１０／１４２８０５号は、以下の分析：ｑＰＣＲ、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ分析のための方法を提供している。その他の分析には、ＡｐｏＢタンパク質ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ（Mercodia No. 10-1106-01）による血清Ｌｐ（ａ）分析、組織及び血漿オリゴヌクレオチド分析（薬物含有量）、試料の抽出、標準的−及びＱＣ−試料、ＥＬＩＳＡによるオリゴヌクレオチド含有量の決定。
【０３０１】
実施例６：ラットにおける肝及び腎毒性の評価
本発明の化合物は、げっ歯類、例えばマウス又はラットにおける毒性プロフィールについて評価することができる。例えば、以下のプロトコールを用いることができる：Wistar Han Crl:WI(Han)を、約８週齢で用いる。この週齢では、オスは、約２５０ｇの体重であるはずである。全ての動物は、SSNIFF R/M-Hペレット状維持飼料（SSNIFF Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany）及びボトルに充填した水道水（０．２２μmのフィルターでろ過）を自由に摂取することができる。投与量１０及び４０mg／kg／投与を用い（皮下投与）、１及び８日目に投与する。動物は、１５日目に安楽死させる。７及び１４日目に尿及び血液試料を採取する。１４日目の臨床病理的評価を行う。試験前、投与第１日目、及び剖検１週間前に体重を測定する。１群当たりの食糧摂取量を毎日評価する。絶食の６時間後に尾静脈を介して血液試料を採取する。以下の血液血清分析を行う：赤血球数、平均細胞容積、ヘマトクリット値、ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球ヘモグロビン、血小板数、白血球数、白血球百分率（細胞形態による）、網状赤血球数、ナトリウム、カリウム、塩素イオン、カルシウム、無機リン、グルコース、尿素、クレアチニン、総ビリルビン、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルブミン／グロブリン比。α−ＧＳＴ、β−２ミクログロブリン、カルビンジン、クラステリン、シスタチンＣ、ＫＩＭ−１、オステオポンチン、ＴＩＭＰ−１、ＶＥＧＦ、及びＮＧＡＬについて尿分析を行う。７種の分析物（カルビンジン、クラステリン、ＧＳＴ−α、ＫＩＭ−１、オステオポンチン、ＴＩＭＰ−１、ＶＥＧＦ）は、パネル１において定量化する（MILLIPLEX（登録商標）MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 1, RKTX1MAG-37K）。３種の分析物（β−２ミクログロブリン、シスタチンＣ、リポカリン−２／ＮＧＡＬ）は、パネル２で定量化する（MILLIPLEX（登録商標）MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2, RKTX2MAG-37K）。ラット尿中のこれらのバイオマーカーの濃度の決定のためのアッセイは、Luminex xMAP（登録商標）の技術に基づく。抗−α−ＧＳＴ／β−２ミクログロブリン／カルビンジン／クラステリン／シスタチンＣ／ＫＩＭ−１／オステオポンチン／ＴＩＭＰ−１／ＶＥＧＦ／ＮＧＡＬ抗体で被覆されたマイクロスフェアを２種類の異なる蛍光染料で色分けする。以下のパラメーターを決定する（ADVIA1650を用いた尿）：尿タンパク質、尿クレアチニン。定量的パラメーター：容積、ｐＨ（10-Multistix SG試験片／Clinitek 500尿アナライザーを用いる）、比重（屈折計を用いる）。半定量的パラメーター（10-Multistix SG試験紙／Clinitek 500尿アナライザーを用いる）：タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、亜硝酸塩、血液、ウロビリノーゲン、残渣の細胞診（顕微鏡検査による）。定性的パラメーター：外観、色。屠殺後、体重、並びに腎、肝、及び脾の重量を測定し、体重に対する器官の比率を算出する。腎及び肝試料を採取し、凍結するか、又はホルマリン中で保存する。顕微鏡による分析を行う。
【０３０２】
実施例７  ＦＡＭ標識複合体を用いるＡｐｏＢ標的化合物
【０３０３】
【表８】
2016503300.tif 000026
【０３０４】
大文字は、ＬＮＡヌクレオシド（例えば、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ）、小文字は、ＤＮＡヌクレオシドである。下付き文字ｓは、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を表す。ＬＮＡシトシンは、場合により５−メチルシトシンである。
【０３０５】
異なるＤＮＡ／ＰＯ−リンカーでＦＡＭ標識されたＡＳＯを、Ｓ１ヌクレアーゼ抽出物、肝若しくは腎ホモゲネート、又は血清のいずれかにおいて、インビトロ開裂に付した。
【０３０６】
異なるＤＮＡ／ＰＯ−リンカーでＦＡＭ標識されたＡＳＯ１００μMを、ヌクレアーゼ緩衝液中のＳ１ヌクレアーゼ（６０U pr.１００μL）により、２０及び１２０分間、インビトロ開裂に付した（下記表を参照）。酵素活性は、緩衝液溶液にＥＤＴＡを加えることによって停止した。次にDionex DNApac p-100カラム、及び１０mM〜１Mの範囲の過塩素酸ナトリウムのグラジエント（pH７．５）を用いるDionex Ultimate 3000によるＡＩＥ  ＨＰＬＣ分析に付した。開裂した、及び開裂しなかったオリゴヌクレオチド含有量は、６１５nmでの蛍光検出器及び２６０nmでのＵＶ検出器の両方を用いて標準に対して決定した。
【０３０７】
【表９】
2016503300.tif 000027
【０３０８】
結論：ＰＯリンカー（又は、本明細書に記載される領域Ｂ）は、開裂される複合体（又は群Ｃ）をもたらし、リンカーの長さ及び／又は配列の組成は、領域Ｂの核酸分解による開裂に対する感受性を調節するのに用いることができる。ＤＮＡ／ＰＯ−リンカーの配列は、ヌクレアーゼＳ１抽出物において２０分後に見られたように、開裂速度を調節することができる。したがって、領域Ｂ（例えば、ＤＮＡ／ＰＯ−リンカーについて）についての配列選択を用いて、血清、及び標的組織の細胞における開裂レベルを調節することができる。
【０３０９】
肝、腎、及び血清をオリゴヌクレオチド配列番号３２により、２００μg/g・組織の濃度までスパイクした（下記の表を参照）。ＮＭＲＩ系マウスから採取した肝及び腎試料を、ホモゲナイズ用緩衝液（０．５％Igepal CA-630、２５mMトリス、pH８．０、１００mM ＮａＣｌ、pH８．０（１N ＮａＯＨで調製））中でホモゲナイズした。ホモゲネートを３７℃で２４時間インキュベートし、その後ホモゲネートをフェノール−クロロホルムで抽出した。肝、腎、及び血清由来の抽出物における開裂した、及び開裂しなかったオリゴヌクレオチドの含有量を、上記ＨＰＬＣ法を用いて標準に対して決定した。
【０３１０】
【表１０】
2016503300.tif 000028
【０３１１】
結論：ＰＯリンカー（又は、本明細書に記載される領域Ｂ）は、腎又は肝ホモゲネートにおいて、オリゴヌクレオチドからの複合体（又は群Ｃ）の開裂をもたらすが、血清ではもたらさない。注：上記アッセイにおける開裂は、開裂しうるリンカーの開裂を指し、オリゴマー又は領域Ａは、機能的に無傷なまま残るはずである。
【０３１２】
実施例７に示すアッセイにおける開裂に対する感受性は、リンカーが生物学的に開裂可能であるか、生理学的に不安定であるかどうかを決定するために用いることができる。
【０３１３】
実施例８：ＧａｌＮＡｃ−複合体によるインビボにおけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウン、組織含有量、及び総コレステロール
【０３１４】
【表１１】
2016503300.tif 000029
【０３１５】
大文字は、ＬＮＡヌクレオシド（例えば、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ）、小文字は、ＤＮＡヌクレオシドである。下付き文字ｓは、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を表す（領域Ａ）。ＬＮＡシトシンは、場合により５−メチルシトシンである。２ＰＯリンカー（領域Ｂ）は、配列領域Ａに対して５’であり、ホスホジエステル結合により結合している２のＤＮＡヌクレオシドを含み、領域Ａの３’ＤＮＡヌクレオシドと領域Ａの５’ＬＮＡヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合（これもホスホジエステルである）を有する。結合基（Ｙ）は、存在する場合には複合体基を領域Ｂ、又はＡに結合させるのに用いることができる（配列番号７、２０、及び３０）。
【０３１６】
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ系マウスに、食塩水、又は非抱合ＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３）０．２５mg／kg、又はＧａｌＮＡｃ１、ＧａｌＮＡｃ２、若しくはコレステロール（２ＰＯ）に抱合させたＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの等モル量量を静脈内又は皮下のいずれかに単回注射し、下記の表（実験デザイン）に従って、１〜７日目に屠殺した。
【０３１７】
肝及び腎からＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ特異的プライマー及びプローブを用いてｑＰＣＲに付して、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを分析した。オリゴヌクレオチド含有量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定し、血清中総コレステロールを測定した。
【０３１８】
結論：ＡｐｏＢＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３０及び２０）に抱合したＧａｌＮＡｃ１及びＧａｌＮＡｃ２は、非抱合ＡｐｏＢＬＮＡよりもＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを示した（図１６）。ＧａｌＮＡｃ１複合体（配列番号３０）では、静脈内投与のほうが皮下投与よりも良好であると思われ、反対の結果が別のＧａｌＮＡｃクラスターで報告されている（Alnylam, 8th Annual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society）ため、これは意外である。総コレステロールのデータでは、静脈内投与及び皮下投与の両方において、ＧａｌＮＡｃクラスター複合体（配列番号30及び20）が、非抱合及びコレステロール抱合化合物（配列番号７）よりも良好な結果を示すことが示されている（図１７、ａ及びｂ）。オリゴヌクレオチドの組織含有量（図１８、ａ〜ｆ）は、親化合物と比較して、複合体が肝への取り込みを増大させる一方、腎への取り込みは低いことを示している。これは、静脈内投与及び皮下投与の両方でその状態である。静脈内投与すると、ＧａｌＮＡｃ１（配列番号３０）は、肝においてＧａｌＮＡｃ２（配列番号２０）と比較して大きい取り込みをもたらすが、両方の化合物で活性は良好であるので、ＧａｌＮＡｃ２複合体は、ＧａｌＮＡｃ１複合体よりも高い特異的活性を誘導すると考えられ、薬物動態学的モジュレーターを有しないＧａｌＮＡｃ複合体が、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドについては特に有用であろうことが示されている。
【０３１９】
材料及び方法
実験デザイン
【０３２０】
【表１２】
2016503300.tif 000030
【０３２１】
投与量の投与。到着時体重約２０ｇのＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍ系のメスの動物に、上記の表に従って、食塩水に配合した化合物、又は食塩水のみを１０ml／kg・体重（０日目の体重による）静脈内又は皮下投与した。
【０３２２】
肝及び腎組織の採取。動物に７０％ＣＯ２−３０％Ｏ２により麻酔をかけ、上記の表にしたがって、頚椎脱臼により屠殺した。大きい肝葉の半分及び腎臓の一方を刻み、RNAlaterに浸した。肝のもう一方の半分及びもう一方の腎臓を凍結し、組織分析に使用した。
【０３２３】
全ＲＮＡの単離及び第１鎖の合成：製造業者の手引書に従って、Qiagen RNeasyキット（Qiagen cat. no 74106）を用いてRLT-Lysis緩衝液の存在下、ビーズミリングによってホモゲナイズした最大３０mgの組織から全ＲＮＡを抽出した。第１鎖合成は、製造業者の手引書に従って、Ambion社のReverse Transcriptase試薬を用いて行った。
【０３２４】
各試料０．５μgにつき、ＲＮアーゼを含まないＨ２Ｏで（１０．８μlまで）全ＲＮＡを調整し、ランダムデカマー（５０μM）２μl及びｄＮＴＰミックス４μl（それぞれ２．５mMｄＮＴＰ）と混合し、７０℃まで３分間加熱し、その後、試料を速やかに氷上で冷却した。１０×緩衝液ＲＴ２μl、MMLV Reverse Transcriptase（１００U/μl）１μl、及びＲＮアーゼ阻害剤（１０Ｕ／μl）０．２５μlを各試料に加え、４２℃で６０分間のインキュベーション、９５℃で１０分間の酵素の熱不活性化を続けて行い、次いで試料を４℃まで冷却した。ｃＤＮＡ試料を１：５に希釈し、製造業者の手引書に従って、Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems Cat #4364103）を用いてＲＴ−ＱＰＣＲに、そしてTaqman遺伝子発現アッセイ（mApoB, Mn01545150_m1及びmGAPDH #4352339E）に付し、Applied Biosystems RT-qPCR装置（7500/7900又はViiA7）で高速モードで処理した。肝及び腎におけるオリゴヌクレオチド含有量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０３２５】
血清コレステロール分析：屠殺の直前に、血清の調製のために、S-monovette Serum-Gelバイアル（Sarstedt, Numbrecht, Germany）を用いて、後眼窩洞血を採取した。製造業者の手引書に従って、ABX Pentra Cholesterol CP（Triolab, Brondby, Denmark）を用いて、総コレステロールについて血清を分析した。
【図９】
2016503300.tif 000031
【図１０】
2016503300.tif 000032
【図１４】
2016503300.tif 000033
【図１】
2016503300.tif 000034
【図２】
2016503300.tif 000035
【図３】
2016503300.tif 000036
【図４】
2016503300.tif 000037
【図５】
2016503300.tif 000038
【図６】
2016503300.tif 000039
【図７】
2016503300.tif 000040
【図８】
2016503300.tif 000041
【図１１】
2016503300.tif 000042
【図１２−１】
2016503300.tif 000043
【図１２−２】
2016503300.tif 000044
【図１２−３】
2016503300.tif 000045
【図１２−４】
2016503300.tif 000046
【図１２−５】
2016503300.tif 000047
【図１３−１】
2016503300.tif 000048
【図１３−２】
2016503300.tif 000049
【図１３−３】
2016503300.tif 000050
【図１３−４】
2016503300.tif 000051
【図１５】
2016503300.tif 000052
【図１６】
2016503300.tif 000053
【図１７ａ】
2016503300.tif 000054
【図１７ｂ】
2016503300.tif 000055
【図１８ａ】
2016503300.tif 000056
【図１８ｂ】
2016503300.tif 000057
【図１８ｃ】
2016503300.tif 000058
【図１８ｄ】
2016503300.tif 000059
【図１８ｅ】
2016503300.tif 000060
【図１８ｆ】
2016503300.tif 000061
【配列表】
2016503300000001.app
【国際調査報告】
2016503300.tif 000062
2016503300.tif 000063
2016503300.tif 000064
2016503300.tif 000065
2016503300.tif 000066
2016503300.tif 000067
2016503300.tif 000068