(57)【要約】  本発明は、有効物質の投与のためのナノカプセルシステムの設計及び開発に関するものであり、前記システムのナノカプセルは、平均径が1μm未満であり、(a)プロタミンシェルと、(b)油性コア、及び8より大きい親水性-親油性比率を有し、但しリン脂質ではない界面活性剤とを含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.ポリペプチドプロタミンを含む表層と、
b.油性コアと、
c.8より大きい親水性-親油性比率(親水性-親油性バランス(HLB))を有することによって特徴づけられるが、但しリン脂質ではない界面活性剤と、
d.場合により、少なくとも1種の有効物質と
を含む、有効成分の投与に適したナノカプセルシステム。
【請求項２】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween61(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween81(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(Tween65(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート(Tween85(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween21(登録商標))、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールステアレート、ポリエチレングリコールジラウレート、ポリエチレングリコールモノパルミテート、ポリエチレングリコールステアレート、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338、ポロキサマー407、Solutol HS15(登録商標)(ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート)、TPGS(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネート)、オレイン酸トリエタノールアンモニウム、オレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン(iriethanolamine)、トラガカントゴム及びドデシル硫酸ナトリウム又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される、請求項1に記載のナノカプセルシステム。
【請求項３】
界面活性剤が、エトキシル化ソルビタンエステル及び脂肪酸エステルからなるリストから選択される、請求項1に記載のナノカプセルシステム。
【請求項４】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween61(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween81(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(Tween65(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート(Tween85(登録商標))、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween21(登録商標))又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択されるエトキシル化ソルビタンエステルである、請求項3に記載のナノカプセルシステム。
【請求項５】
界面活性剤が、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールステアレート、ポリエチレングリコールジラウレート、ポリエチレングリコールモノパルミテート、ポリエチレングリコールステアレート、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338、ポロキサマー407、Solutol HS15(登録商標)(ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート)、及びTPGS(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネート)又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される脂肪酸エステルである、請求項3に記載のナノカプセルシステム。
【請求項６】
界面活性剤が、オレイン酸トリエタノールアンモニウム、オレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン(iriethanolamine)、トラガカントゴム及びドデシル硫酸ナトリウム又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される、請求項2に記載のナノカプセルシステム。
【請求項７】
界面活性剤が、コール酸ナトリウム、ポリエチレングリコールステアレート、Solutol HS15(登録商標)(ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート)、TPGS(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))又はそれらの任意の組合せである、請求項2に記載のナノカプセルシステム。
【請求項８】
油性親油性コアが、ピーナツ油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、ダイズ油、サフラワー油、ヤシ油、αトコフェロール(ビタミンE)、イソプロピルミリステート、スクアレン、Miglyol(登録商標)(デカノイル及びオクタノイルグリセリドの混合物)、Labrafil(登録商標)(オレオイルポリオキシル-6グリセリド)、Labrafac(登録商標)(プロピレングリコールジカプリロカプレート)、Peceol(登録商標)(グリセロールモノオレエート)及びMaisine(登録商標)(グリセロールモノリノレアート(monoolinoleate))又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項９】
油性親油性コアが、Miglyol(登録商標)(デカノイル及びオクタノイルグリセリドの混合物)、スクアレン又はαトコフェロールからなるリストから選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項１０】
親油性又は親水性の有効物質を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項１１】
有効物質が、ドセタキセル、組み換えB型肝炎抗原、インフルエンザ(H1N1)抗原、核酸、糖化合物、ペプチド、タンパク質又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項１２】
凍結乾燥されていることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項１３】
請求項1で定義されるナノカプセルシステムを製造するための1工程溶媒拡散方法であって、
a.プロタミンを含む水溶液を調製する工程と、
b.油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられる1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
c.工程a)及びb)で調製された溶液を撹拌下で混合してナノカプセルを製造する工程と、
d.場合により前述の工程で製造した混合物の有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む、1工程溶媒拡散方法。
【請求項１４】
請求項1で定義されるナノカプセルシステムを製造するための2工程溶媒拡散方法であって、
a.油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられる1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
b.工程a)で製造される溶液を、場合により水溶性界面活性剤を含有する水性相に添加して、撹拌し、ナノエマルジョンを形成する工程と、
c.場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と、
d.前述の工程で製造されたナノエマルジョンを、プロタミンを含む水溶液と共にインキュベーションするプロセスによって、コーティングする工程と
を含む、2工程溶媒拡散方法。
【請求項１５】
請求項1で定義されるナノカプセルシステムを製造するための2工程溶媒拡散方法であって、
a.プロタミン、及び場合により水溶性界面活性剤を含む水溶液を調製する工程と、
b.油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられるが、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含む油相を調製する工程と、
c.工程ii)で製造された溶液又は工程i)で製造された水溶液を、アリコートで、所与の時間間隔で、それぞれ、工程i)で製造された水溶液又は工程ii)で製造された溶液に添加する工程と、
d.場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む、2工程溶媒拡散方法。
【請求項１６】
ナノカプセルシステムが有効成分を含む場合、前記有効成分が親油性であれば有機溶液に添加し、親水性であれば水溶液に添加する、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
治療に使用するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載のシステム。
【請求項１８】
有効物質がドセタキセルである、請求項10に記載のナノカプセルシステム。
【請求項１９】
有効物質が組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)である、請求項10に記載のナノカプセルシステム。
【請求項２０】
有効物質が組み換えH1N1型インフルエンザ(HI)抗原である、請求項10に記載のナノカプセルシステム。
【請求項２１】
肺癌又は膵臓癌の処置に使用する医薬品の調製のための、請求項18に記載のシステムの使用。
【請求項２２】
B型肝炎の処置又は予防に使用される医薬品の調製のための、請求項19に記載のシステムの使用。
【請求項２３】
H1N1型インフルエンザの処置又は予防に使用される医薬品の調製のための、請求項20に記載のシステムの使用。
【請求項２４】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のナノカプセルシステムと、場合により1種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメートルサイズのプロタミンをベースとするナノカプセルを含む有効物質投与システム、並びにこのシステムを含む医薬組成物、及びそれらの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効成分をナノメートルサイズのシステムに組み込むことにより、分子が有する製剤的限界の解決が促され、さらにその治療的効力が増加する。有効成分の溶解性の改善、分解に対する保護、又は浸透性の増大は、作用分子をカプセル化又はポリマーシェルに吸着させることにより得られる利点の一部である。これらのシステムが有機体の外部障壁を越えて内部にアクセスする能力は、システムのサイズと組成に依存することも知られている。小型の粒子は、より大型の粒子に対して、送達度が増加する。直径1μm未満のナノシステムはこの基準に適合する。
【０００３】
さらに、これらのナノカプセルを、ポリマー材料でコーティングすることが可能である。ここで可能性のあるポリマー材料はプロタミンである。プロタミンは、アルギニンが豊富な天然ポリペプチドのファミリーに属し、多くの動植物の精子形成プロセスにおいて最終精子細胞段階で合成される。フリードリヒ・ミーシャが1868年にそれらの研究を始めたが、仕事の大部分は、このグループの約4000〜10000Daの分子量を有する強塩基性脂肪族ペプチドを特徴づけることに費やされている。
【０００４】
プロタミンは、薬学的賦形剤として承認されており、今日のその主な用途は、インシュリンの持続放出製剤:NPH(Neutral Protamine Hagedorn)におけるものである。さらにヘパリン中毒の解毒剤であることから有効物質として健康証明も得ている。
【０００５】
多くの様々な研究において、この賦形剤は、主にリポソームと組み合わせて、細胞内からDNAを放出するために(Gene Ther. 1997. 4, 961-968)、オリゴヌクレオチドと結合させて、proticleと称されるナノ粒子として(Nucleic Acids Res. 2000. 15, 28(10):E45)、血管作用性腸内ペプチドの放出のために(J Control Release.2008. 10, 130(2):192-8)、想定される抗微生物活性の利点を活用するために(J Antimicrob Chemother. 2008 Mar, 61(3):651-7)、特に使用されてきた。
【０００６】
固有の活性による前述の研究において、プロタミンは、遺伝物質との錯体を形成することについても広く使用及び研究されてきた。この錯体の形成は、アルギニン基からもたらされる高い正電荷と核酸のアニオン性基との静電的相互作用によるものであり、これにより、プロタミンは、その投与においてビヒクルとして使用される構造内でDNAに結合し、沈殿させることができる。
【０００７】
このポリペプチドの、インターロイキン2及びインターフェロンγの分泌並びにT細胞増殖を増加させるアジュバント活性も実証されている(J Control Release. 2008, 10, 130(2):161-7)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
にもかかわらず、油性コアを含むプロタミンナノカプセルの製剤化においてプロタミンを使用することは不可能であり、その理由は、このポリペプチドが、油/水エマルジョンを不安定にするためである。このことを考慮に入れて、プロタミンによって不安定化されることなく、その特性により利点が得られる新たなナノカプセルシステムを設計することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、プロタミンが組み込まれているが、プロタミンの存在により不安定にならないナノカプセルシステムを開発した。このナノカプセルシステムは安定であり、製造が容易であり、様々な種類の親水性有効成分及び親油性有効成分の両方を効果的に会合させることができる。小型化した前述のナノカプセルのサイズ(直径1μm未満)及びプロタミンの正の表面電荷によって、有機体、例えば粘膜の負に荷電された生物学的表面との相互作用が可能となり、その生物学的表面を通り抜けて、細胞が内部に取り入れることが可能となる。またポリマーシェルの存在により、ナノカプセルに、さらに増強された安定性とプロタミンに典型的な有益な特性がもたらされる。
【００１０】
したがって、本発明の第1の態様は、有効物質の投与に適したナノカプセルシステム(以下、「本発明のナノカプセルシステム」)であって、
a.ポリペプチドプロタミンからなる又はポリペプチドプロタミンを含む表層と、
b.油性コアと、
c.8より大きい親水性-親油性比率(親水性-親油性バランス(HLB))によって特徴づけられる界面活性剤と、
d.場合により少なくとも1種の有効物質と
を含み、但し、界面活性剤はリン脂質ではない、ナノカプセルシステムに関する。
【００１１】
本発明の実施に適した界面活性剤の例は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween61(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween81(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(Tween65(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート(Tween85(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween21(登録商標))、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールステアレート、ポリエチレングリコールジラウレート、ポリエチレングリコールモノパルミテート、ポリエチレングリコールステアレート、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338、ポロキサマー407、Solutol HS15(登録商標)、TPGS、オレイン酸トリエタノールアンモニウム、オレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン(iriethanolamine)、トラガカントゴム及びドデシル硫酸ナトリウム又は前述の界面活性剤の任意の組合せである。界面活性剤は、コール酸ナトリウム、ポリエチレングリコールステアレート、Solutol HS15(登録商標)、TPGS、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))又はそれらの界面活性剤の任意の組合せからなるリストから選択される。
【００１２】
本発明の実施に適した油性コアの成分の例は、ピーナツ油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、ダイズ油、サフラワー油、ヤシ油、αトコフェロール(ビタミンE)、イソプロピルミリステート、スクアレン、Miglyol(登録商標)、Labrafil(登録商標)、Labrafac(登録商標)、Peceol(登録商標)及びMaisine(登録商標)又はそれらの油の任意の組合せである。油性親油性コアは、好ましくは、Miglyol(登録商標)(例えばMiglyol812など)、スクアレン若しくはαトコフェロール又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される。
【００１３】
本発明の第1の態様の特定の実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、
a.ポリペプチドプロタミンからなる又はポリペプチドプロタミンを含む表層と、
b.Miglyol(登録商標)、スクアレン、αトコフェロール、又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される油性コアと、
c.8より大きい親水性-親油性比率(親水性-親油性バランス(HLB))によって特徴づけられ、コール酸ナトリウム、ポリエチレングリコールステアレート、Solutol HS15(登録商標)、TPGS、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される界面活性剤と、
d.場合により少なくとも1種の有効物質と
を含む。
【００１４】
本発明の第1の態様の別の実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、凍結乾燥されることによって特徴づけられる。
【００１５】
本発明の第2の態様は、本発明のナノカプセルシステムを製造する方法(以下、「本発明の製造方法」)に関する。前記の方法は、所望のサイズ範囲のナノカプセルの形成を達成するために、油と1種以上の界面活性剤とを含む油性コアを形成し、その表面上に様々な種類の相互作用を介してコーティングポリマーを結合させることで進行する。溶媒拡散プロセスは、制御された様式で行われ、システムに安定性をもたらし、成分間に共有結合を生成することを必要としない。
【００１６】
本発明の第2の態様の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、1工程溶媒拡散方法であって、
a.プロタミンを含む水溶液を調製する工程と、
b.油性コア成分と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられる1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
c.工程a)及びb)で調製された溶液を撹拌下で混合してナノカプセルを製造する工程と、
d.場合により前述の工程で製造した混合物の有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含み、但し、界面活性剤はリン脂質ではない、1工程溶媒拡散方法である。
【００１７】
本発明の第2の態様の別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、2工程溶媒拡散方法であって、
a.油性コア成分と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられる1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
b.工程a)で製造される溶液を、場合により水溶性界面活性剤を含有する水性相に添加して、撹拌し、ナノエマルジョンを形成する工程と、
c.場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と、
d.前述の工程で製造されたナノエマルジョンを、プロタミンを含む水溶液と共にインキュベーションプロセスによって、コーティングする工程と
を含み、但し、界面活性剤はリン脂質ではない、2工程溶媒拡散方法である。
【００１８】
本発明のナノカプセルシステムが有効物質を含む場合、本発明の方法は、前記有効物質が親油性であれば有機溶液へ添加すること、又は前記有効物質が親水性であれば水溶液へ添加することを含む。有効物質は、好ましくは、ドセタキセル、組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)、H1N1型インフルエンザ抗原、核酸、糖化合物、ペプチド、タンパク質又はそれらの任意の組合せからなるリストから選択される。
【００１９】
本発明の第3の態様は、治療に使用するための本発明のナノカプセルシステムに関する。
【００２０】
本発明の第3の態様の好ましい実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、有効物質としてドセタキセルを含み、癌、特に肺癌又は膵臓癌の処置に使用される。
【００２１】
本発明の第3の態様の別の好ましい実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、有効物質として組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)を含み、B型肝炎の処置又は予防に使用される。
【００２２】
本発明の第3の態様のさらに別の好ましい実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、有効物質としてH1N1型インフルエンザ(HI)組み換え抗原を含み、H1N1型インフルエンザの処置又は予防に使用される。
【００２３】
本発明の第4の態様は、本発明のナノカプセルシステムと、場合により1種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】プロタミンのDCXが充填されたナノカプセル、プロタミンのブランクナノカプセル、DCXのエタノール溶液及びエタノールと接触させてから24及び48時間後のA549癌細胞株の生存性を示す図面である。
【図２】プロタミンのDCXが充填されたナノカプセル、プロタミンのブランクナノカプセル、DCXのエタノール溶液及びエタノールと接触させてから24及び48時間後のH460癌細胞株の生存性を示す図面である。
【図３】プロタミンのDCXが充填されたナノカプセル、プロタミンのブランクナノカプセル、DCXのエタノール溶液及びエタノールと接触させてから24及び48時間後のMiaPaCa2癌細胞株の生存性を示す図面である。
【図４】プロタミンのDCXが充填されたナノカプセル、プロタミンのブランクナノカプセル、DCXのエタノール溶液及びエタノールと接触させてから24及び48時間後のBxPC3癌細胞株の生存性を示す図面である。
【図５】スクアレン油(SQL)及びαトコフェロール(TCPH)を用い、B型肝炎抗原(10μg)を充填したプロタミンのナノカプセルを、鼻内投与(in)(3回投与)、筋肉内投与(im)(2回投与)、及び組合せスケジュール(im、in)(筋肉内投与1回、及び鼻内投与2回)により投与した後のマウスにおける血中IgG抗体レベルを、水酸化アルミニウムに吸着させた抗原を筋肉内投与(2回投与)によって投与した場合と比較した図面である。
【図６】αトコフェロール(TCPH)コアを用いて、2及び7.5μgの用量でインフルエンザ抗原を充填したプロタミンのナノカプセルを皮下投与した後のマウスの血中IgG抗体により示される吸収レベルを示す図面である。
【図７】凍結乾燥プロセス後のプロタミンナノカプセルに吸着された組み換えB型肝炎抗原のウェスタンブロットを示す図面である。
【図８】プロタミン及びスクアレン(SQL)又はαトコフェロール(TCPH)コアのナノカプセルと接触後24及び48時間のRAW 264.7マクロファージ細胞株の生存性を示す図面である。
【図９】PEGステアレート/コール酸ナトリウム界面活性剤とMiglyol(登録商標)油とを組み合わせて調製したプロタミンナノカプセルの透過型電子顕微鏡(TEM)画像の図面である。
【図１０】PEGステアレート/コール酸ナトリウム界面活性剤とαトコフェロール油とで調製されたプロタミンナノカプセルの共焦点顕微鏡画像の図面である。ナノカプセルには、有効分子としてインフルエンザ(H1N1)抗原が充填されている。
【図１１】プロタミンナノカプセルによって誘発される補体活性化をウェスタンブロットによって分析した図面である。αトコフェロール(左)又はスクアレン(右)を用いたプロタミンのナノカプセルを様々な濃度で試験した。ネガティブコントロールはPBS(C -)、ポジティブコントロールはコブラ毒(C+)とした。
【図１２】αトコフェロール油性コアを有するプロタミンナノカプセルのRAW 264.7の生存性に対する効果をxCELLigenceによって測定した図面である。異なる濃度のプロタミンナノカプセル(灰色は25μg/ml、点線は50μg/ml、黒色実線は100μg/ml)をインキュベートした。値は、コントロール(培地のみとインキュベートした細胞)に対して標準化した細胞指標を表す。
【図１３】凍結乾燥rHBsAgを充填し、再懸濁し、室温で保存したプロタミンナノカプセルの物理化学的特性を示す図面である。
【図１４】凍結乾燥させ、室温で1年間保存した、ナノカプセルと会合させた抗原(rHBsAg)をウェスタンブロット解析した図面である。
【図１５】アガロースゲル電気泳動によるpDNAとプロタミンナノカプセルとの会合の分析を示す図面である。レーン1:分子量マーカー、2:コントロールpDNA、3:プロタミンナノカプセル+ pDNA、4:ヘパリン+コントロールpDNA、5:プロタミンナノカプセル+pDNA。サンプルを過剰のヘパリンとインキュベートさせて、製剤からpDNAを移行させた(2時間、37℃)。1レーンあたり1μgのpDNA。同様の結果がsiRNAについても得られた。
【図１６】プロタミンナノカプセルと会合させたpEGFPFのトランスフェクションから48時間後の蛍光顕微鏡画像を示す図面である。ウェルあたり1μgのpEGFPF(24ウェルプレート)、4時間のインキュベーション。トランスフェクション後48時間で生成された画像。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、有効物質の投与のためのナノカプセルシステムの設計及び開発に関するものであって、前記システムのナノカプセルは、平均径が1μm未満であり、(a)プロタミンシェルと、(b)油性コア、及び8より大きい親水性-親油性比率を有し、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含むことを特徴とする。
【００２６】
プロタミンは、油/水エマルジョンを不安定にすることが知られている。実際、リポタンパク質又は他のリン脂質構造を有する界面活性剤、例えばレシチン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンなどを使用しても、プロタミンが存在する前述の油/水型エマルジョンを安定化させることはできない。この事実は、本発明の発明者が、(a)プロタミンシェルと、(b)界面活性剤としてレシチン、修飾レシチン又はリゾホスファチジルコリンなどのリン脂質を使用する油性コアを含むことによって特徴づけられる1μm未満の平均径を有するナノカプセルシステムを形成しようとしたが成功しなかった実施例1において確認される。
【００２７】
したがってこの型の製剤でプロタミンを使用することはできない。それゆえ、この問題を解決する目的で、本発明の発明者は、プロタミンによって不安定化されず、その特性による利点が得られる新たなナノカプセルシステムを設計した。
【００２８】
この観点において、本発明の発明者は、(a)プロタミンシェルと(b)油性コアを含むことによって特徴づけられるプロタミンナノカプセルを含むシステムの製造方法が、8より大きい、好ましくは12より大きい親水性-親油性比率(親水性-親油性バランス(HLB))を有することで特徴づけられる特定の種類の界面活性剤の使用によって得られうることを発見した。実施例2.1〜2.18では、使用される界面活性剤が8より大きいHLBを有することで特徴づけられ、但しリン脂質ではないことを条件として、様々な界面活性物質を用いて、油性コア及びこの種のシステムの調製方法をどのように取得し得るかを例証している。同様に、これらの実施例は、その物理化学的特徴に対するシステムの万能性を実証するものである。
【００２９】
本発明の第1の態様は、有効物質の投与に適したナノカプセルシステム(本発明の「ナノカプセルシステム」)であって、
a.ポリペプチドプロタミンからなる又はポリペプチドプロタミンを含む表層と、
b.油性コアと、
c.8より大きい親水性-親油性比率(親水性-親油性バランス(HLB))によって特徴づけられる界面活性剤と、
d.場合により少なくとも1種の有効物質と
を含み、但し、界面活性剤はリン脂質ではない、ナノカプセルシステムに関する。
【００３０】
公知の他のナノカプセルシステム又はナノエマルジョンシステムに対するこの特定のナノカプセルシステムの利点は、シェル内にポリペプチドプロタミンが存在することである。このポリペプチドは、他の特性の中でも特に、ナノカプセルに対する安定性、並びに所与の標的細胞との相互作用における保護能力、浸透能力、及び特異性を提供する。ナノカプセルの表面上のプロタミンの存在は、さらに、アジュバント活性で実証されるような免疫細胞に対するより高い応答性をもたらす。プロタミンは、天然の化合物であり、アルギニンが高含量の他のポリマー、例えば合成分子であるポリアルギニンなどに対して利点を有する。プロタミンの存在により、本発明のナノカプセルは、迅速に代謝され、排泄されることが可能な安全なビヒクルとなり、したがって毒性を有する濃度に到達すること及び有機体内において蓄積することが妨げられる。さらに、プロタミンシェルを用いることにより、本発明のナノカプセルは、凍結乾燥用の凍結防止剤も必要とせず、望まない凝集を防ぐための高度の希釈も必要としない。
【００３１】
加えて、本発明の文脈において、用語プロタミンには、水溶性のプロタミン塩及び水溶性のプロタミン誘導体も含まれることが確認されるべきである。
【００３２】
さらに、充填する薬物の制限が一般的に条件付けられるリポソーム又はナノ粒子などの他のシステムと比較して、本発明のナノカプセルは、油性コアの存在によって、特に親油性の薬物の高度充填が可能である。本発明のナノカプセルが有する多大な利点のさらに1つは、様々な種類の薬物の組合せが可能なことであり、コアに親油性薬物をカプセル化し、シェルに親水性薬物を会合させることができる。同様にシェルはシステムに安定性と保護と特異性をもたらす。
【００３３】
さらにこれらのシステムは、他のサイズの大きいシステム(マイクロ粒子、ペレット、フィルム、スポンジ...)に対して、生物学的適用に関する利点を有する。実際、薬物放出システムの生物学表面との相互作用は、そのサイズによって高度に条件付けられることが知られている。それゆえナノカプセルは粘膜を通過し、細胞によって内部に取り入れられて薬物送達システムとして機能することが可能であるが、マイクロ粒子はその能力を有しない。同様に、これらのシステムの生物学的分布も、サイズによって高度に条件付けられる。近年の世界中で生成されたナノ医薬及び薬物放出ナノシステムに関する知識により、ナノメートルシステム(1ミクロン未満のサイズを有するもの、例えば、ナノ粒子及びナノカプセル)と、マイクロメートルシステム(マイクロ粒子及びマイクロカプセル)との間の境界が明確になっている。細胞によって内部に取り入れられる能力及び複雑な生物学的障壁を越える能力に関する挙動の差に加えて、抗腫瘍薬の静脈内投与を意図する製剤の場合には、毛細血管による障害を防ぐために、ナノメートルサイズの放出システムが不可欠となる。同様にナノシステムの腫瘍組織に達する可能性がそのサイズと密接に関連しており、システム表面の親水性とも関係することが知られている。
【００３４】
ナノカプセルシステムと「錯体」との間の差異を強調することも同様に重要である。「錯体」は、高分子電解質、又は高分子電解質と反対の荷電の界面活性剤との相互作用によって形成されたナノ構造として理解される。本発明のナノカプセルシステムは、錯体とは異なって、貯蔵型のナノカプセル担体システムであり、そのシステムのコアに多かれ少なかれ油性コアに親和性を有する分子を有効な数で収容することができ(カプセル化)、そのシステムのシェルには、シェルに一定の親和性を有する親水性分子を組み込むことができる(吸着)。これらの特性は、ナノ構造の完全性と機能性の維持を可能にするだけでなく、生体液の存在下での安定性を高めることにも寄与する。
【００３５】
したがって、本発明のナノカプセルシステムは、他の薬物投与及び/又は放出システムと比較して、以下の点で固有の挙動特性による利点を有する:
-  有効物質のカプセル化/会合:システムには、ナノ粒子、ミセル、錯体、ナノゲルにおける比率よりも大きな比率で、1種以上の親水性又は親油性の有効物質又はアジュバント物質を含めることができる。
-  有効物質の放出:シェルは、前記有効物質の放出速度における役割を果たし、用途及び必要性に応じて、有効物質の放出を制御することができる。
-  生体液中の安定性:ポリマーシェルにより油性コアに多大な安定性がもたらされ、この安定性は他のマイクロ及びナノエマルジョンシステムと比較して有利である。
-  所与の生物学的表面との特異的相互作用:ポリマーシェルは、油性コアに、粘膜表面並びに上皮細胞及び特定細胞と相互作用する可能性をもたらす。
-  プロタミンの迅速な代謝及び排泄は、このシステムに薬物動態学的に安全なプロファイルを提供する。同様のプロファイルを他の種類のシェル、例えばポリアルギニンのシェルを用いた他のナノカプセルシステムで実施することはできない。
-  凍結乾燥中の安定性:凍結乾燥プロセスのための凍結防止剤も、望まない凝集を防止するための高度の希釈も、本発明のナノカプセルでは必要とされない。
【００３６】
本発明のシステムのナノカプセルは、平均径が1μm未満であり、ナノシステムの定義、つまり、サイズが1μm未満、すなわち1〜999nm、好ましくは30〜500nmのサイズを有するポリマーをベースとするコロイドシステムという定義に該当する。平均径は、動的光散乱(DLS)法によって測定される直径と理解される。DLS法では測定粒子と同じ速度で散乱する球の流体力学的径によって粒径を定義する。ナノカプセルのサイズは、主に組成と形成条件によって影響を受け、当業者に公知の標準的方法と実施例の欄に記載の方法を使用して測定することができる。この点に関して、実証され得るように、サイズ自体は、製剤においてシェル化合物の比率を修正するとき、全ての場合で取得されるナノメートルサイズシステムを顕著に変化させない。
【００３７】
本明細書に記載のナノカプセルシステムは、懸濁液及び凍結乾燥形態の両方において適切な安定性を有する。次に、安定性試験においては、ヒト又は動物有機体に投与された後、急速な凝集又は破壊プロセスを経ていないようであり、むしろ標的組織又は細胞に達するまでナノカプセル形態のままであることが予期される。
【００３８】
他方、既に言及したように、本発明のナノカプセルシステムは、少なくとも1種の界面活性剤を含む。本発明において、用語「界面活性剤」は、官能基及び/又は製剤の親油性及び親水性部分と同時に相互作用可能な構造を有する成分を指す。本発明のナノカプセルシステムを調製するためには、使用する界面活性剤のHLBを考慮することが必要である。HLBの概念は、エマルジョンの安定性に関連するデータに基づいて特定のHLB数の乳化剤に対する属性から構成される実験方法に基づいている。このHLB数により潜在的にいくつかのパラメータが表され、システムの親水性-親油性バランスが説明される。本発明で定義されるHLBの計算方法は、試験する分子の官能基に基づくもので、親水性基の作用を考慮して、以下のように計算される:
HLB=7+m*Hh-n*Hl
ここで、mは親水性基の数であり、Hhは親水性基の値であり、nは親油性基の数であり、Hlはその値である(Davies, J. T. (1957) "A quantitative kinetic theory of emulsion type. I. Physical chemistry of the emulsifying agent. Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interfaces". Proceedings of 2nd International Congress Surface Activity, Butterworths, London, pp. 426-38)。
【００３９】
本発明の実施に適した界面活性剤の例は、エトキシル化ソルビタンエステル及び脂肪酸エステルから選択される。特定の実施形態において、ソルビタンエステルは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween61(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween81(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(Tween65(登録商標))、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート(Tween85(登録商標))、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween21(登録商標))から選択される。別の特定の実施形態において、脂肪酸エステルは、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールステアレート、ポリエチレングリコールジラウレート、ポリエチレングリコールモノパルミテート、ポリエチレングリコールステアレート、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338、ポロキサマー407、Solutol HS15(登録商標)(ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート)、TPGS(D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネート)から選択される。別の特定の実施形態において、界面活性剤は、オレイン酸トリエタノールアンモニウム、オレイン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン(iriethanolamine)、トラガカントゴム及びドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される。さらに別の特定の実施形態において、界面活性剤は、コール酸ナトリウム、ポリエチレングリコールステアレート、TPGS、Solutol HS15(登録商標)、Tween20、Tween80又はそれらの組合せである。
【００４０】
ポロキサマーは、以下の一般式で表されるエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの合成ブロックコポリマー(ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン)として定義することができる。
【００４１】
【化１】
2016503780.tif 000002
【００４２】
【表１】
2016503780.tif 000003
場合により適切な酸化防止剤を添加することができる(欧州薬局方5.0, 2264-2265頁)。
【００４３】
本発明を実施するために適切な他の界面活性剤の例は、非イオン性の製薬等級の界面活性剤から選択される。本発明の実施に適した製薬等級の非イオン性界面活性剤は、好ましくは、8〜18個の炭素原子を有する長鎖ヒドロキシル誘導体(脂肪アルコール)、エトキシル化カルボン酸、エトキシル化アミド、エトキシル化グリセリド、グリコールエステル及び誘導体、モノグリセリド、ポリグリセリルエステル、エステル及びポリアルコールエーテル、ソルビトール/ソルビタンエステル、リン酸トリエステル、エトキシル化脂肪アルコール誘導体及びポリエチレングリコールエーテルからなる群から選択される。
【００４４】
さらに、本発明のナノカプセルシステムは、他の成分の中でも特に、揮発性又は不揮発性の油から形成される油性コアを有することにより特徴づけられる。本発明の内容において、油性コアは、本発明のナノカプセルの内部構造を形成し、少なくとも1つの油と前述のような少なくとも1つの界面活性剤とから構成されるコアとして理解される。これらの油は、薬学的に使用するための天然、半合成、及び合成油であって、例えば、植物又は動物起源の油、炭化水素油、又はシリコーン油から選択することができる。本発明の実施に適切な油としては、限定されないが、鉱油、スクアレン油、香油、シリコーン油、精油、水不溶性ビタミン、イソプロピルステアレート、ブチルステアレート、オクチルパルミテート、セチルパルミテート、トリデシルベヘネート、ジイソプロピルアジペート、ジオクチルセバケート、メンチルアントラニレート、セチルオクタノエート、オクチルサリチレート、イソプロピルミリステート、ネオペンチルグリコールジカプレートケトール、Cerafilos(登録商標)、デシルオレエート、C12-C15アルキルラクテート、セチルラクテート、ラウリルラクテート、イソステアリルネオペンタノエート、ミリスチルラクテート、イソセチルステアロイルステアレート、オクチルドデシルステアロイルステアレート、炭化水素油、イソパラフィン、流動パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガン油、ナタネ油、チリ油、ココナツ油、トウモロコシ油、綿実油、アマニ油、ブドウ種子油、芥子油、オリーブ油、ヤシ油、分留ヤシ油、ピーナツ油、ヒマシ油、松の実油、ケシ油、パンプキン種子油、コメヌカ油、サフラワー油、茶油、トリュフ油、植物油、杏仁油、ホホバ油、マカダミアナッツ油、小麦胚芽油、アーモンド油、ダイズ油、ゴマ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒマワリ油、麻実油、紫壇油、ククイナッツ油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、オールスパイス油、杜松油、種子油、アーモンド種子油、アニス種子油、セロリ種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、バジル葉油、ベイ葉油、シナモン葉油、コモンセージ葉油、ユーカリ葉油、レモン葉油、メラレウカ葉油、オレガノ油、パチョリ葉油、ペパーミント葉油、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント油、チャノキ葉油、タイム油、ヒメコウジ葉油、花油、カモミール油、クラリセージ油、丁子油、ゼラニウム花油、ヒソップ花油、ジャスミン油、ラベンダー油、マウカ花油、マジョラム花油、オレンジ花油、ローズ花油、イランイラン花油、樹皮油、カシア樹皮油、桂皮油、サッサフラス樹皮油、桐油、カンフル桐油、セダー樹油、紫壇油、白檀油、ショウガ樹油、トール油、ヒマシ油、ミルラ油、皮油、ベルガモット皮油、グレープフルーツ皮油、レモン皮油、ライム皮油、オレンジ皮油、タンジェリン皮油、根油、吉草根油、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、エチルオレエート、Miglyol(登録商標)(デカノイル及びオクタノイルグリセリドの混合物)、Labrafil(登録商標)(オレオイルポリオキシル-6グリセリド)、Labrafac(登録商標)(プロピレングリコールジカプリロカプレート)、Rylo(登録商標)(脂肪酸の混合物)、Peceol(登録商標)(グリセロールモノオレエート)、及びMaisine(登録商標)(グリセロールモノ��ノレート)、それらの合成又は半合成誘導体、及びそれらの組合せが挙げられる。好ましくは、油はピーナツ油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、ダイズ油、サフラワー油、ヤシ油、αトコフェロール(ビタミンE)、イソプロピルミリステート、スクアレン、Miglyol(登録商標)、Labrafil(登録商標)、Labrafac(登録商標)、Peceol(登録商標)及びMaisine(登録商標)、又はそれらの混合物からなるリストから選択される。より好ましくは、油はMiglyol(登録商標)(例えば、Miglyol812(カプリル/カプリントリグリセリド))、スクアレン又はαトコフェロールである。
【００４５】
本発明の実施に適した他の油は、イソプレン単位(2-メチルブタ-1,3-ジエン)及びその炭素原子に応じた細分類:ヘミテルペン(C5)、モノテルペン(C10)、セスキテルペン(C15)、ジテルペン(C20)、セスタテルペン(C25)、トリテルペン(C30)、テトラテルペン(C40、カロテノイド)及びポリテルペンにより形成されるテルペンファミリー由来の油、ビタミンA及びスクアランを含む群から選択される。
【００４６】
上記で定義されるように、本発明のナノカプセルは、場合により少なくとも1種の有効物質も含む。用語「有効物質」は、疾患の処置、治癒、予防若しくは診断に使用又はヒト及び動物の身体的及び精神的健康を改善するために使用される任意の物質を指す。有効物質は、例えば、薬物、抗原、ビタミンなどであり得る。本発明の対象であるナノカプセルシステムは、親油性及び親水性の有効物質を組み込むために適している。
【００４７】
好ましい実施形態において、有効成分は、組み換えB型肝炎表面抗原、インフルエンザ(H1N1)抗原、及びドセタキセルである。
【００４８】
組み込まれる有効物質の割合は、それぞれの場合に組み込まれる有効成分、使用目的の適応症、投与効率に応じて決まる。
【００４９】
他方で、本発明のナノカプセルシステムを製造するための製造方法は、高温などの激しい条件の使用が防がれる単純な方法である。さらに、前述のようにシステムの製造に共有結合的相互作用が関与しないため、システムを製造するためにいずれの種類の化学反応も実施する必要がない。したがって、システムに組み込まれた、分解を受け易い分子の完全性が保護される。所望のサイズ範囲のナノカプセルの形成を達成するために、前記の方法は油と1種以上の界面活性剤とを含む油性コアの形成を続行し、その表面に様々な種類の相互作用を介してコーティングポリマーを結合させる。したがって溶媒拡散プロセスは、制御された様式で行われ、システムに安定性がもたらされ、成分間に共有結合を生成することを必要としない。
【００５０】
本発明のシステムを製造するための特定の方法(実施例において1工程溶媒拡散方法と呼ぶ)は、
a)プロタミン、及び場合により水溶性界面活性剤を含む水溶液を調製する工程と、
b)油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することで特徴づけられ、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
c)工程a)及びb)で調製された溶液を撹拌下で混合し、ナノカプセルを自発的に生成する工程と、
d)場合により前述の工程で製造した混合物の有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む。
【００５１】
本発明のシステムは、代替的方法(実施例において、2工程溶媒拡散方法と呼ぶ)によって調製することができ、この代替的方法は、プロタミンを、ポリマーの水溶液とインキュベーションするプロセスによってコーティングする工程を含む。同様に、ナノエマルジョンの形成は、超音波(実施例において超音波処理方法と呼ぶ)又はホモジナイズ(実施例においてホモジナイズ方法と呼ぶ)によって有利に行うことができる。
【００５２】
特定の実施形態において、インキュベーションプロセスは、ナノエマルジョンをコーティングポリマーの水溶液と混合することを含む。前記ナノエマルジョンは、少なくとも油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられる1種以上の界面活性剤と水性相とで構成される。水性相は、他の界面活性剤、塩類、及び他の助剤を含むことができる。
【００５３】
前述のナノエマルジョンの調製方法は、当該技術分野で知られており、調製方法には、拡散、超音波処理又はホモジナイズプロセスを含めることができる(Prego et al. J. Nanosci. Nanotechnol. (2006) 6:1、Tadros et al. Adv. Colloid Interface Sci. (2004) 109:303)。
【００５４】
特定のナノエマルジョン製造方法(実施例において溶媒拡散方法と呼ぶ)は、
i)油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられ、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
ii)工程i)で製造される溶液を、場合により水溶性の界面活性剤を含有する水性相に添加し、撹拌して、ナノエマルジョンを形成する工程と、
iii)場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む。
【００５５】
別の特定のナノエマルジョン製造方法(実施例において超音波処理方法と呼ぶ)は、
i)油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられ、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
ii)工程i)で製造される溶液を、場合により水溶性界面活性剤を含有する水性相に添加し、超音波処理する工程と、
iii)工程ii)で製造されたエマルジョンを水で希釈する工程と、
iv)場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む。
【００５６】
さらに別の特定のナノエマルジョン製造方法(実施例においてホモジナイズ方法と呼ぶ)は、
i)油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられ、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含む有機溶液を調製する工程と、
ii)工程i)で製造される溶液を、場合により水溶性界面活性剤を含有する水性相に添加し、ホモジナイズする工程と、
iii)工程ii)で製造されたエマルジョンを水で希釈してホモジナイズする工程と、
iv)場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む。
【００５７】
前述の方法の特定の実施形態によれば、有効物質が親油性又は両親媒性であれば、前記有効成分を工程b)又は工程i)の有機溶液に添加する。他の特定の実施形態によれば、有効成分が親水性であれば、前記有効成分を工程a)又は工程ii)の溶液に添加する。前記親水性の有効成分は、水性溶液に添加して溶解することが好ましい。さらに、親水性の有効成分は、工程d)で製造されたナノカプセル懸濁液へ吸着によって組み込むこと又はインキュベーションプロセスでナノカプセルが形成された後に組み込むこともできる。
【００５８】
別の特定のナノエマルジョンの調製方法(実施例において溶媒拡散方法の変形(ドリッピングによる)と呼ぶ)は、
i)プロタミン、場合により水溶性界面活性剤を含む水溶液を調製する工程と、
ii)油と、8より大きい親水性-親油性比率を有することにより特徴づけられ、但しリン脂質ではない1種以上の界面活性剤とを含む油相を調製する工程と、
iii)工程ii)で製造された溶液又は工程i)で製造された水溶液を、アリコートで、所与の時間間隔で、それぞれ工程i)で製造された水溶液又は工程ii)で製造された溶液に添加する工程と、
iv)場合により有機溶媒を一定の体積まで完全に又は部分的に蒸発させる工程と
を含む。
【００５９】
前述の方法の特定の実施形態によれば、有効物質が親油性又は両親媒性であれば、前記有効成分を工程ii)の有機溶液に添加する。他の特定の実施形態によれば、有効成分が親水性であれば、前記有効成分を工程i)の溶液に添加する。前記親水性の有効成分は、水性溶液に添加して溶解することが好ましい。さらに、親水性の有効成分は、ナノカプセル懸濁液へ吸着によって組み込むこと又はインキュベーションプロセスでナノカプセルが形成された後に組み込むこともできる。
【００６０】
本発明の文脈において、親油性は、分子、物質、有効物質、構造又はそれらの一部がそれ自体は水分子と相互作用できず、主に非極性の溶媒に溶解することとして理解される。
【００６１】
本発明の文脈において、両親媒性は、分子、物質、有効物質、構造又はそれらの一部が疎水性と親水性の両方の特性を有することとして理解される。
【００６２】
本発明の文脈において、親水性は、分子、物質、有効物質、構造又はそれらの一部が水と作用し、水又は極性の溶媒に溶解することができることとして理解される。
【００６３】
ナノカプセルの形成は、前述したナノエマルジョンを含有する溶液のまとまりを、様々な割合のコーティングポリマーの水溶液と、コーティングポリマーの比率を変えながら混合させるときに生じる。
【００６４】
有機溶液の溶媒は、好ましくは、極性溶媒、例えば、エタノール、イソプロパノール及びアセトンなどの混合物であることが好ましく、さらに、非極性溶媒、例えばジクロロメタンなどを含んでもよい。油及び8より大きい親水性-親油性比率を有することによって特徴づけられる1種以上の界面活性剤は、この有機相に組み込まれる。同様に有効成分も特定の組成で組み込まれる。
【００６５】
上述の第1の方法に従ったプロタミンを含む本発明のナノカプセルシステムを製造するための特定の例は、
a)0.05%w/vのプロタミンを含有する20mlの水溶液を調製する工程と、
b)エタノール/アセトン溶液、1種又は両方の界面活性剤(コール酸ナトリウム及び/又はPEGステアレート)で構成され、Miglyol(登録商標)812が加えられた油相を調製する工程と、
c)工程a)及びb)で調製された溶液を撹拌下で混合し、ナノカプセルを自発的に生成する工程と、
d)場合により前述の工程で製造した混合物の有機溶媒を一定の体積まで蒸発させる工程と
を含む。
【００６６】
ナノカプセルシステムを調製するための調製方法には、システムの貯蔵中に初期特性が保護されるように保存する目的で、付加的に凍結乾燥工程を含めてもよい。本発明のナノカプセルのシェルの性質及びその特徴によって、凍結乾燥中に凍結防止剤を使用することは必須ではない。別のさらなる利点は、凍結乾燥前にコロイドシステムを希釈する必要がないことであり、その理由は本発明のナノカプセルシステムが凍結乾燥物の再構成中に凝集物を形成しないためである。
【００６７】
代替的に、凍結防止効果を有する1種以上の糖、例えば、トレハロース、グルコース、ショ糖、マンニトール、マルトース、ポリビニルピロリドン(PVP)などを添加することができる。凍結乾燥された形態において、ナノカプセルは、長期間保存することができ、必要であれば、最適な量の水を単に加えることによって容易に再生させることができる。
【００６８】
この付加的工程によれば、本発明は、プロタミンシェルを含む凍結乾燥形態のナノカプセルシステムにも関する。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明は、さらに治療に使用するための本発明のナノカプセルシステムに関する。より詳細には、本発明のナノカプセルシステムと、場合により1種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。特に、本発明のナノカプセルに有効物質を組み込むことにより、それらの組成、特性及び形態に関する特徴がシステムにもたらされ、治療薬の分野において優れた候補物質となる。本発明のシステムに組み込まれる有効物質は、製剤が意図する治療用途に応じた適切な薬物療法学的特性を有する物質である。特定の実施形態において、有効物質は、ペプチド、タンパク質、脂質又は親油性化合物、糖化合物、核酸又はヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は言及した分子の組合せの化合物から選択される。
【００７０】
好ましい実施形態において、親油性有効物質は、ドセタキセルである。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、有効物質は、疎水性、両親媒性又は親水性である。疎水性又は両親媒性の有効物質は、本発明のナノカプセルの調製方法の工程b)において添加することが好ましい。親水性の有効物質は、本方法による工程a)、又はインキュベーションプロセスによる工程d)の後の工程で添加することが好ましい。しかしながら、本発明では、他の実施形態、例えば、工程b)において、親水性有効物質を少量の水性相に溶解させて添加すること等も企図される。ナノカプセル内にカプセル化される疎水性有効物質と異なり、親水性有効物質は、吸着によってシステムの表面と会合することができる。
【００７２】
好ましい実施形態において、親水性有効物質は、組み換えB型肝炎表面抗原及びインフルエンザ(H1N1)抗原である。
【００７３】
前記医薬組成物は、異なる投与経路、例えば、粘膜、局所又は非経口投与により、投与することができる。
【００７４】
システムに組み込まれる有効物質の割合は、ナノカプセルシステムの成分に対して、全乾燥重量基準で、最大約50重量%であり得る。しかしながら、適切な割合は、それぞれの場合において組み込まれる有効成分、使用目的の適応症、及び投与効率に応じて決まる。特定の実施形態において、親油性有効物質の割合は、最大約10重量%、好ましくは最大約5重量%に達し得る。
【００７５】
上述のように、本発明に記載のナノカプセルシステムには、2種以上の有効物質を組み込むことができ、この2種以上の有効物質は、組み込まれる分子の性質に応じて、分子間の任意の種類の化学的又は物理的な相互作用の発生を防ぎつつ、同じ溶液又は別個の溶液に溶解させてもよい。
【００７６】
上述のように、本発明は、医薬品の調製における前述のシステムの使用に関する。特定の実施形態では、前述の使用は、ワクチンの使用又は癌の処置に関する。この観点において、本発明の好ましい実施形態では、本発明のナノカプセルシステムは、有効物質としてドセタキセルを含み、癌、特に肺癌又は膵臓癌の処置に使用される。代替的に、本発明は、癌、特に肺癌又は膵臓癌を処置する医薬品を調製するための、有効物質としてドセタキセルを含む、本発明のナノカプセルシステムの使用にも関する。
【００７７】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、有効物質として組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)を含み、B型肝炎の処置又は予防に使用される。代替的に、本発明は、B型肝炎を処置又は予防する医薬品を調製するための、有効物質として組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)を含む本発明のナノカプセルシステムの使用にも関する。
【００７８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本発明のナノカプセルシステムは、有効物質としてH1N1型インフルエンザ(HI)組み換え抗原を含み、H1N1型インフルエンザの処置又は予防に使用される。代替的に、本発明は、H1N1型インフルエンザを処置又は予防する医薬品を調製するための、有効物質としてH1N1型インフルエンザ(HI)組み換え抗原を含む本発明のナノカプセルシステムの使用に関する。
【００７９】
本発明の特徴又は利点をよりよく理解するために、以下に一連の実施例を記述的に示すが、これらの実施例は前述の説明を完全にするためのものであって、いかなる意味でも前述の説明をこれらの実施例に限定するものではない。
【００８０】
[実施例]
実施例を通じて使用している略語の意味を、下記に示す。
1.Pr:プロタミン:以下の実施例で使用した塩はプロタミン硫酸塩(Yuki Gosei Kogyo Co, Ltd.)であった。別のプロタミン塩(SIGMA)が、いずれの実施例についても著しい差異なく使用された。
2.PEG:ポリエチレングリコールステアレートSimulsol(登録商標)M52 PEG-2000(Seppic)。
3.ナノエマルジョン(NE):この用語は、実施例において、油と、8より大きいHLBを有する1種以上の界面活性剤とを含むナノシステムを簡単に示すために使用する。好ましくは、使用した1種以上の界面活性剤は、コール酸ナトリウム、PEGステアレート、Solutol HS15(登録商標)、TPGS、Tween20(登録商標)、Tween80(登録商標)又はそれらの組合せであった。ナノカプセルとの唯一の差異は、システムの表面のコーティングにプロタミンが存在しないことである。
4.Prナノカプセル(NC)=この用語は、実施例及び図面において、油と、8より大きいHLBを有する1種以上の界面活性剤とを含むナノカプセルのナノシステムを簡単に示すために使用する。好ましくは、使用した1種以上の界面活性剤は、コール酸ナトリウム、PEG-ステアレート、Solutol HS15(登録商標)、TPGS、Tween20、Tween80又はそれらの組合せであった。最後にPrをコーティングしている。
5. DCX:ドセタキセル。
6. rHBsAg:組み換えB型肝炎抗原。
7. HI:H1N1型インフルエンザ抗原。
8. Miglyol(登録商標):Miglyol812。
【００８１】
[実施例1]
[実施例1.1]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、15mgのリン脂質(レシチン、リゾホスファチジルコリン、ヒドロキシル化レシチンYelkin(登録商標)、脱油レシチン(Ultralec(登録商標))とで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【００８２】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表1に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【００８３】
【表２】
2016503780.tif 000004
【００８４】
[実施例1.2]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、異なる量のリン脂質(レシチン又はリゾホスファチジルコリン)とで構成される油相を調製した。
ii)工程i)において製造される溶液を、10mlの水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノエマルジョンが自発的に生成される。
iii)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
iv)工程iii)で製造したナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度でPrから構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml: Prのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【００８５】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表2に、工程iv)のリン脂質の量及び異なるプロタミン比率に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【００８６】
【表３】
2016503780.tif 000005
【００８７】
[実施例1.3]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)ジクロロメタン/アセトン溶液(0.1:4.5 ml〜0.25:4.5 mlの比率)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、一定量のヒドロキシル化レシチン(Yelkin(登録商標))又は脱油レシチン(Ultralec(登録商標))とで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【００８８】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表1に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【００８９】
【表４】
2016503780.tif 000006
【００９０】
[実施例1.4]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)ジクロロメタン/アセトン溶液(0.1:4.5 ml〜0.25:4.5 mlの比率)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、様々な量のリン脂質(ヒドロキシル化レシチン又は脱油レシチン)とで構成される油相を調製した。
ii)工程i)において製造される溶液を、10mlの水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノエマルジョンが自発的に生成される。
iii)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
iv)工程iii)で製造したナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度でPrから構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml: Prのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【００９１】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表2に、工程iv)のリン脂質の量及び異なるプロタミン比率に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【００９２】
【表５】
2016503780.tif 000007
【００９３】
[実施例2]
[実施例2.1]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)Prが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。さらに、この溶液は、0.25%w/vのポロキサマー188を含有させてもよい。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、40mgのコール酸ナトリウムと、48mgのPEG-ステアレートとで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【００９４】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表3に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【００９５】
【表６】
2016503780.tif 000008
【００９６】
[実施例2.2]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、40mgのコール酸ナトリウムと、48mgのPEG-ステアレートとで構成される油相を調製した。
ii)工程i)において製造される溶液を、10mlの水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノエマルジョンが自発的に生成される。
iii)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
iv)工程iii)で製造したナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度でPrから構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml:プロタミンのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【００９７】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表4に、工程iv)のPrの量に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【００９８】
【表７】
2016503780.tif 000009
【００９９】
[実施例2.3]
油性αトコフェロールコア及び様々な量のPEG-ステアレートで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)プロタミンが0.05mg/mlの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、60mgのαトコフェロールと、様々な量のPEGステアレートとで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルを生成した。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１００】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表5に、PEG-ステアレートの量に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【０１０１】
【表８】
2016503780.tif 000010
【０１０２】
[実施例2.4]
油性αトコフェロールコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、60mgのαトコフェロールと、異なる量のPEG-ステアレートとで構成される油相を調製した。
ii)工程i)において製造される溶液を、10mlの水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノエマルジョンが自発的に生成される。
iii)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
iv)工程iii)で製造したナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度でPrから構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml:プロタミンのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【０１０３】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表6に、工程iv)のPEG-ステアレートの量及び異なるプロタミン比率に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【０１０４】
【表９】
2016503780.tif 000011
【０１０５】
[実施例2.5]
油性スクアレンコア及び様々な量の界面活性剤で構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)アセトン溶液(4.75ml)と、62.5μlのスクアレンと、様々な量のPEG-ステアレートとで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルを生成した。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１０６】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表7に、PEG-ステアレートの量に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【０１０７】
【表１０】
2016503780.tif 000012
【０１０８】
[実施例2.6]
油性スクアレンコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)アセトン溶液(4.5ml)と、62.5μlのスクアレンと、異なる量のPEG-ステアレートとで構成される油相を調製した。
ii)工程i)において製造される溶液を、10mlの水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノエマルジョンが自発的に生成される。
iii)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
iv)工程iii)で製造したナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度でPrから構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml:プロタミンのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【０１０９】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表8に、工程iv)のPEG-ステアレートの量及び異なるプロタミン比率に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【０１１０】
【表１１】
2016503780.tif 000013
【０１１１】
[実施例2.7]
油性αトコフェロールコア及び様々な界面活性剤で構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と3つの様々な比率のαトコフェロールで構成される油相を調製し、PEG-ステアレート(PEG-st)又はSolutol HS15を界面活性剤として使用した。αトコフェロール:界面活性物質の質量比は、それぞれ12:12、60:12及び60:60であった。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１１２】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表9に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【０１１３】
【表１２】
2016503780.tif 000014
【０１１４】
i)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と3つの様々な比率のαトコフェロールで構成される油相を調製し、Tween20又はTween80を界面活性剤として使用した。αトコフェロール:界面活性剤の質量比は、それぞれ12:12及び60:12であった。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１１５】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表10に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【０１１６】
【表１３】
2016503780.tif 000015
【０１１７】
i)プロタミンが0.05mg/mlの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、60mgのαトコフェロールと、24mgのTPGSとで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１１８】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表11に得られた値を示す。
【０１１９】
【表１４】
2016503780.tif 000016
【０１２０】
[実施例2.10]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)Prが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、40mgのコール酸ナトリウムとで構成される油相を調製した。
iii)工程i)及びii)で得られる溶液を10分間、磁気撹拌下で混合することにより、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１２１】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表12に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【０１２２】
【表１５】
2016503780.tif 000017
【０１２３】
[実施例2.11]
油性Miglyol(登録商標)コアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、62.5μlのMiglyol(登録商標)と、40mgのコール酸ナトリウムとで構成される油相を調製した。
ii)工程i)において製造される溶液を、10mlの水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノエマルジョンが自発的に生成される。
iii)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
iv)工程iii)で製造したナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度でPrから構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml:プロタミンのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【０１２４】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表13に、工程iv)のPrの量に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。
【０１２５】
【表１６】
2016503780.tif 000018
【０１２６】
[実施例2.12]
油性αトコフェロールコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程の超音波処理方法によって調製した:
i)ジクロロメタン(1ml)中の24mgのPEG-ステアレート及び120mgのαトコフェロールの溶液で構成される油相を調製した。
ii)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液を調製した。
iii)工程i)で製造された溶液を、2mlの水に添加し、30秒間、超音波処理した。
iv)製造されたエマルジョンをii)で製造された溶液で希釈し(1:10希釈)、NCを形成した。
v)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１２７】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表14に得られた値を示す。
【０１２８】
【表１７】
2016503780.tif 000019
【０１２９】
[実施例2.13]
油性αトコフェロールコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程のホモジナイズ方法によって調製した:
i)ジクロロメタン(1ml)中の24mgのPEG-ステアレート及び120mgのαトコフェロールの溶液で構成される油相を調製した。
ii)プロタミンが0.05w/vの濃度で溶解されている水溶液を調製した。
iii)工程i)で製造された溶液を、2mlの水に添加し、16,000rpmで5分間、その後さらに19,000rpmで5分間ホモジナイズした。
iv)製造されたエマルジョンを、ii)で調製された溶液で希釈し(1:10希釈)し、3分間、22,000rpmでホモジナイズして、NCを形成した。
v)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１３０】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表15に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【０１３１】
【表１８】
2016503780.tif 000020
【０１３２】
[実施例2.14]
油性αトコフェロールコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程の超音波処理方法によって調製した:
i)ジクロロメタン(1ml)中の24mgのPEG-ステアレート及び120mgのαトコフェロールの溶液で構成される油相を調製した。
ii)工程i)で製造された溶液を、2mlの水に添加し、30秒間、超音波処理した。
iii)製造されたエマルジョンを、水で希釈(1:10希釈)した。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させて、カチオン性ナノエマルジョンを形成した。
v)工程iv)で製造されたナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度のPrで構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml:プロタミンのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【０１３３】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表16に得られた値を示す。
【０１３４】
【表１９】
2016503780.tif 000021
【０１３５】
[実施例2.15]
油性αトコフェロールコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、2工程のホモジナイズ方法によって調製した:
i)ジクロロメタン(1ml)中の24mgのPEG-ステアレート及び120mgのαトコフェロールの溶液で構成される油相を調製した。
ii)工程i)で製造された溶液を、2mlの水に添加し、16,000rpmで5分間、その後さらに19,000rpmで5分間ホモジナイズした。
iii)製造されたエマルジョンを、水で希釈し(1:10希釈)、3分間、22,000rpmでホモジナイズした。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させて、ナノエマルジョンを形成した。
v)工程iv)で製造されたナノエマルジョンを、1又は2mg/mlの濃度のプロタミンで構成される水溶液(1ml)と1:1及び1:2(ナノエマルジョンのml:プロタミンのmg)の割合でインキュベーションするプロセスによってコーティングした。コーティングは温度にかかわらず、すぐに製造された。
【０１３６】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表17に、言及したパラメータについて得られた値を示す。
【０１３７】
【表２０】
2016503780.tif 000022
【０１３８】
[実施例3]
油性αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルの、プロタミン量に応じた物理化学的特性の評価
[実施例3.1]
油性αトコフェロールコアで構成されるプロタミンナノカプセルを、1工程溶媒拡散方法によって調製した:
i)1〜100mgのプロタミンが溶解されている水性プロタミン溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.25:4.5ml)と、60mgのαトコフェロールと、5mgのコール酸ナトリウムと、12mgのPEG-ステアレートとで構成される油相を調製した。
iii)工程ii)において製造された溶液を、i)で調製した10mlのプロタミン水溶液に、磁気撹拌下に添加し、10分間維持した。これによりナノカプセルが自発的に生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積まで蒸発させた。
【０１３９】
調製した後すぐに、それらの平均径、多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表18に、工程i)の水溶液中のプロタミンの量に応じた、言及されたパラメータについて得られた値を示す。Prの変化にかかわらずシステムの生産可能性を観察することができる。
【０１４０】
【表２１】
2016503780.tif 000023
【０１４１】
[実施例4]
プロタミンナノカプセル中に親油性薬物ドセタキセルをカプセル化する能力の評価
PEGステアレート及びαトコフェロール又はMiglyol(登録商標)で構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを調製した。次いで、実質的に水不溶性の抗腫瘍剤であるドセタキセルを使用して、親油性薬物を組み込んだ。調製方法は、前述の実施例2.1に記載の方法に相当するが、有効成分のエタノール溶液(1〜100mg/ml)の原液の少量のアリコートが油相に組み込まれることによる変更を伴った。次いで有機溶媒を一定体積になるまでRotavaporによって除去し、ドセタキセルがカプセル化されたプロタミンナノカプセルを形成した。
【０１４２】
ナノカプセルを本発明の方法に従って調製した後すぐに、カプセル化効率を測定し(遊離薬物を高速液体クロマトグラフィーにより評価、λ=227nm)、35%のカプセル化効率が得られた。平均粒径、多分散指数、及びゼータ電位パラメータも測定した(表19)。疎水性有効物質が効率よく組み込まれる可能性が、NEにおけるPrの包含に著しい差異なく見られ得る。
【０１４３】
【表２２】
2016503780.tif 000024
【０１４４】
[実施例5]
プロタミンナノカプセルの細胞増殖阻害能力に関する試験
プロタミンナノカプセルを、実施例4に記載の方法に従って調製し、ドセタキセルカプセル化プロタミンナノカプセルが、肺癌細胞株NCI-H460及びA549並びに膵臓癌細胞株MiaPaCa2及びBxPC3の細胞増殖を阻害する能力を評価した。この試験のために次の4つの処理について分析した:(i)エタノール、(ii)DCXのエタノール溶液、(iii)コントロールとしてのブランクのナノカプセル、及び(iv)培地(DMEM)で希釈したDCXを充填したナノカプセル。インキュベーション時間(24及び48時間)後、サンプルをクリスタルバイオレットで処理し、溶解した細胞を、分光光度測定法(λ=590nm)によって定量した。下記の図面(図1〜4)は、この試験の結果を示す。
【０１４５】
様々なグラフで観察し得るように、エタノール中のドセタキセルの活性は、異なる時間及び異なる細胞株において、Pr NCにカプセル化された同じ薬物の活性と同等である。このことから、システムの不合理な生体分布や主要な副作用の原因となる他の賦形剤、例えばCremophor又は高濃度のTween80などを必要とすることなく、これらのシステムがインビボで投与可能であると結論づけることができる。
【０１４６】
[実施例6]
プロタミンナノカプセルに他の親油性分子をカプセル化する能力の評価
[実施例6.1]
プロタミンナノカプセルへのローダミン6Gのカプセル化
αトコフェロールで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを調製した。次いで親油性分子を組み込んだ。この目的のために使用した親油性分子は、有機複素環化合物であることに加えて、蛍光性の造影剤であり、ローダミンファミリーに属するローダミン6Gである。調製方法は、前述の実施例2.1に記載の方法に相当するものであるが、有効成分のエタノール溶液(1mg/ml)の原液の少量のアリコートが油相に組み込まれることによる変更を伴った。次いで、システムの有機溶媒を一定体積になるまで除去し、ローダミン6Gカプセル化プロタミンナノカプセルを形成した。
【０１４７】
ナノカプセルを本発明の方法に従って調製した後すぐに、カプセル化の効率を測定した(遊離のローダミン量を可視分光法によって評価、λ=530nm)。平均粒径、多分散指数、及びゼータ電位パラメータを、表20に示す。結論づけられ得るように、Pr NCのコアに、様々な疎水性分子を含むことが可能である。
【０１４８】
【表２３】
2016503780.tif 000025
【０１４９】
[実施例6.2]
プロタミンナノカプセルへのクルクミンのカプセル化
αトコフェロールで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを調製した。次いで、親油性分子を組み込んだ。この目的のために使用した親油性分子は、天然フェノールで特に一定の抗腫瘍作用、鎮痛作用、及び抗菌作用を有するクルクミンである。調製方法は、前述の実施例2.8に記載の方法において界面活性物質としてTween80を使用し、αトコフェロール:Tween80の質量比60:12とした方法に相当するが、有効成分のエタノール溶液(1mg/ml)の原液の少量のアリコートが油相に組み込まれることによる変更を伴った。次いで、システムの有機溶媒を一定体積になるまで除去し、クルクミンカプセル化プロタミンナノカプセルを形成した。
【０１５０】
ナノカプセルを本発明の方法に従って調製した後すぐに、カプセル化の効率を測定した(遊離のクルクミン量を蛍光法によって評価)。
【０１５１】
平均粒径、多分散指数、及びゼータ電位パラメータを、表21に示す。結論づけられ得るように、使用する界面活性剤にかかわらず、Pr NCのコアに様々な疎水性分子を含むことが可能である。
【０１５２】
【表２４】
2016503780.tif 000026
【０１５３】
[実施例7]
プロタミンナノカプセルにおける組み換えB型肝炎抗原吸着能の評価
PEGステアレートで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、αトコフェロール、スクアレン、又はMiglyol(登録商標)812を油として使用して調製した。次いで親水性抗原を会合させた。この目的のために使用した親水性抗原は組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)である。調製方法は前述の実施例2.1に記載した方法に相当する。アリコートの抗原を、既に形成されたプロタミンナノカプセルと、異なる質量比(プロタミン:抗原)となるようにしてインキュベートした。
【０１５４】
吸着させた抗原を有するナノカプセルを調製した後すぐに、これらの製剤の一部の会合効率をELISAによって測定し、平均粒径、多分散指数及びゼータ電位パラメータを定量した(表22)。表から観察し得るように、Pr NCは大量のrHBsAgをその表面に効率よく会合させる。
【０１５５】
【表２５】
2016503780.tif 000027
【０１５６】
[実施例8]
組み換えB型肝炎抗原が充填されたプロタミンナノカプセルを用いた免疫試験
油性αトコフェロール(TCPH)及びスクアレン(SQL)コアを有するプロタミンナノカプセルを調製した。次いで、組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)を、NC:HBsAgの比率4:1で会合させた。調製方法は前述の実施例7で記載した方法に相当する。
【０１５７】
NCの免疫反応を引き起こす能力を、雌BALB/cマウスで、42、126及び183日目に反応をELISAによって定量して測定した。動物に、22℃の一定温度で水及び食事を自由に摂取させながら、12時間の明サイクルと12時間の暗サイクルを受けさせた。動物は免疫及びサンプリング中に意識があった。マウスは、スペイン法制(勅令1201/2005)のガイドラインに従って使用した。7匹のマウスからなる群をランダムに選択し、NC Prに吸着させた用量10μgの抗原を0及び28日目に筋肉内投与(im)し、0、28及び112日目に鼻内経路(in)を通して免疫した。組合せ投与はNC Pr-TOCOPHで試験し、0日目に筋肉内投与し、28日目と112日目に鼻内投与した(im、in)。以下のグラフに実施した試験で得られた結果を示す。
【０１５８】
100(mIU/ml)IgGの値が保護値であることを考慮すると、図5から、使用する油にかかわらず、NC Prが筋肉内投与及び組合せ処置(im、in)により前記保護を達成することが分かる。このレベルは鼻内投与によっては達成されないが、このような経粘膜投与により細胞型免疫応答が刺激されることが知られていることから、この疾患に対する保護は排除されない。
【０１５９】
[実施例9]
αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルへインフルエンザ抗原が吸着する能力の評価
PEGステアレートで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、油としてαトコフェロールを用いて調製した。次いで、親水性タンパク質抗原を会合させた。この目的のために使用した親水性タンパク質抗原はH1N1型インフルエンザ抗原(HI)である。調製方法は前述の実施例2.1に記載した方法に相当する。アリコートの抗原を、既に形成されたプロタミンナノカプセルと、異なる質量比(プロタミン:抗原)となるようにして、インキュベートした。
【０１６０】
吸着された抗原を有するナノカプセルを調製した後すぐに、会合効率が4:1のNC:抗原製剤をウェスタンブロットによって測定し、平均粒径、多分散指数及びゼータ電位パラメータを評価した(表20)。
【０１６１】
表23に示され得るように、システムの物理化学的特性はHIの吸着後において影響を受けていない。NC Prは効率的にタンパク質抗原と会合する。
【０１６２】
【表２６】
2016503780.tif 000028
【０１６３】
[実施例10]
H1N1型インフルエンザ抗原が充填されたプロタミンナノカプセルを用いた免疫試験
油性αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルを調製した。次いで、HI抗原をNC:HIの比率4:1で会合させた。調製方法は前述の実施例9に記載した方法に相当する。
【０１６４】
NCが免疫反応を誘発する能力を、雌BALB/cマウスで、反応を21、35、49及び196日目にELISAにより定量して測定した。動物に、22℃の一定温度で水及び食事を自由に摂取させながら、12時間の明サイクルと12時間の暗サイクルを受けさせた。動物は、免疫及びサンプリング中に意識があった。マウスは、スペイン法制(勅令1201/2005)のガイドラインに従って使用した。5匹のマウスからなる群をランダムに選択し、Prナノカプセルに吸着させた用量7.5又は2μgの抗原で0、21、35日目に皮下免疫し、抗原に対して特異的なIgG抗体の存在をELISA技術によって評価した。実施した試験について得られた結果を図6に示す。
【０１６５】
画像から観察できるように、NC Prは、インフルエンザ感染に対する保護に十分有効と考えられる1:64希釈液よりも高い血球凝集抑制力価を誘発する。
【０１６６】
[実施例11]
αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルへ遺伝物質が吸着する能力の評価
αトコフェロールで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、PEGステアレート又はPEGステアレート及びコール酸ナトリウムを界面活性剤として使用して調製した。次いで、遺伝物質EGFP-C1を会合させた。調製方法は前述の実施例2.1に記載した方法に相当する。アリコートのプラスミドを、既に形成されたプロタミンナノカプセルと、Prの質量に対して5、10及び20%の異なる充填比率が得られるようにインキュベートした。吸着されたpDNAを有するナノカプセルをインキュベートした後すぐに、平均粒径、多分散指数及びゼータ電位パラメータを評価した(表24)。
【０１６７】
表21に示されるように、システムの表面電荷が著しく減少し、電位の逆転も観察され、遺伝物質がNC Prの表面へ吸着されたことが示される。
【０１６８】
【表２７】
2016503780.tif 000029
【０１６９】
[実施例12]
[実施例12.1]
凍結乾燥プロセス後のプロタミンナノカプセルの粒子サイズに対するトレハロース及びグルコースの効果の評価
PEGステアレート及びスクアレンで構成された油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、前述の方法に従って調製した。凍結防止剤グルコース及びトレハロースがPrナノカプセルの凍結乾燥プロセス及びその後の再懸濁後の粒子サイズの回復に与える効果を、2つの凍結防止剤濃度5及び10%w/vで分析することによって評価した。凍結乾燥される懸濁液に対するナノカプセル濃度(0.025、0.05、0.08、0.1、0.25、0.5、0.75、及び1%w/v)の影響も評価した。コントロールとして、1.54%濃度のPr NCの懸濁液を、凍結防止剤なしで凍結乾燥した。表の結果は、凍結乾燥されたPrナノカプセルの再懸濁後の粒子サイズを示す(表25)。
【０１７０】
表22に示されるように、凍結防止剤を使用しなくとも、その物理化学的性質を失わないNC Prの乾燥製剤を得ることができる。乾燥粉末形態の製剤が、水性懸濁形態の製剤よりも安定性が高いことは公知であり、前記製剤が室温で安定であると予測される。
【０１７１】
【表２８】
2016503780.tif 000030
【０１７２】
[実施例12.2]
凍結乾燥プロセス後のプロタミンナノカプセルの粒子サイズ及びrHBsAgの完全性に対する効果の評価
PEGステアレート、コール酸ナトリウム及びαトコフェロールで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、前述の方法に従って調製した。1%濃度のNC Prの粒子サイズの効果を、凍結防止剤グルコース及びトレハロースを5%の濃度で使用して評価した。表の結果は、凍結乾燥Prナノカプセルの再懸濁後の粒子サイズを示す(表23)。吸着された抗原の完全性はウェスタンブロットによって分析した。
【０１７３】
表26に示されるように、rHBsAg抗原がその物理化学的性質を失うことなくシェルに吸着されているNC Prの乾燥製剤を得ることができる。画像から、凍結乾燥プロセス後のNC-Pr会合rHBsAg抗原の完全性が示される。
【０１７４】
ウェスタンブロット画像は、凍結乾燥プロセス後の分解がないことを示している。
【０１７５】
【表２９】
2016503780.tif 000031
【０１７６】
[実施例13]
保存中のプロタミンナノカプセル製剤の粒子サイズ変化の評価
αトコフェロール及びPEG-stで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、前述の実施例2.3に記載の方法に従って12mgのPEG-stを用いて調製した。粒子サイズの測定を長時間行い、経時的なシステムのサイズ変化に関する情報を得た。保存温度(4〜8℃)がナノカプセルの安定性に与える効果も評価した。表27に示す結果から、保存の間にPrナノカプセルのサイズ変動がほとんど無いことが示される。
【０１７７】
【表３０】
2016503780.tif 000032
【０１７８】
[実施例14]
プロタミンナノカプセルの細胞生存性への評価
プロタミンナノカプセルのRAW264.7免疫細胞の生存性を評価することを目的とした。この目的のために、プロタミンナノカプセルを、実施例2.1に記載の方法に従って、スクアレン(SQL)及びαトコフェロール油(TCPH)を用いて調製した。この試験のために、様々な濃度のナノカプセルを、言及した細胞株とインキュベートし、その生存性を24又は48時間後にQCCS(Quick Cell Countig Solution)法によって定量した。
【０１７９】
図5に示されるように、様々な濃度のプロタミンナノカプセルで、生存性は48時間のインキュベーション後でも約75%であり、本発明の毒性値が示される。
【０１８０】
[実施例15]
プロタミンナノカプセルが末梢血単核細胞のサイトカイン分泌を誘発する能力の評価
αトコフェロール又はスクアレンの油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、それぞれ実施例2.3及び2.5に記載の方法によって調製した。
【０１８１】
ナノカプセルを調製した後すぐに、末梢血単核細胞によって分泌される様々なサイトカインを測定した。この目的のために、健常な3個体からの血液をヘパリン処理し、PBSで希釈し、フィコール-Hypaqueによる勾配遠心分離によって分離し、単核細胞の分離を可能にした。サイトカイン産生を定量するために、2×105個のこれらの細胞を、10及び100μg/mlの2つの濃度のαトコフェロール又はスクアレンの油性コアを有するプロタミンナノカプセルの存在下で、24時間インキュベートした。ポジティブコントロールとしてLPS(10μg/ml)を使用した。分泌レベルを、Th1/Th2 FlowCytomix(商標)を製造者の指示に従って使用して測定した。表28に示されるように、ナノカプセルによりサイトカイン分泌が誘発され得る。この応答は、濃度及び/又は油性コアの成分に応じて調整することができる。(n/3)=応答対象の数。
【０１８２】
【表３１】
2016503780.tif 000033
【０１８３】
[実施例16]
プロタミンナノカプセルによる補体カスケード活性化の評価
αトコフェロール又はスクアレンの油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、それぞれ実施例2.3及び2.5に記載の方法に従って調製した。
【０１８４】
ナノカプセルを調製した後、補体活性化の測定を目的にウェスタンブロットによってC3生成物を分析した。様々な濃度のプロタミンナノカプセルを、ヒト血漿とインキュベートした。ポジティブコントロールとしてコブラ毒、及びネガティブコントロールとしてPBSを使用した。図11に示されるように、プロタミンナノカプセルが、油性コアの組成及び濃度に応じて補体カスケードを活性化することが観察できる。これは、新たな予防又は治療用免疫アジュバントを開発するために利用できる特徴である。
【０１８５】
[実施例17]
プロタミンナノカプセルと共にインキュベーションした後のRaw267.4細胞の細胞生存性の評価
油性αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルを、実施例2.3に記載の方法に従って調製した。
【０１８６】
ナノカプセルを調製した後、細胞生存性に対するプロタミンナノカプセルの影響を、実施例14に記載した方法とは異なる方法によって測定した。
【０１８７】
この目的のために、xCELLigence(登録商標)を製造業者の指示に従って使用して、細胞の生存性をRAW 264.7マクロファージで測定した。3つの濃度のナノカプセルを試験し、ナノカプセルを有しない細胞(レッドライン)をポジティブコントロールとして使用した。細胞生存性は、金電極の電気的なインピーダンスと関連づけて、15分ごとに48時間、細胞の数と形態を定量する。
【０１８８】
図12で示されるように、ナノカプセルを細胞と24時間連続的に接触させた後、最大50 g/mlの濃度まで細胞成長に変化は示されていない(つまりコントロールと同一のプロフィール)。
【０１８９】
[実施例18]
凍結乾燥させたB型肝炎抗原会合プロタミンナノカプセルの安定性の評価
油性αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルを、実施例2.3に記載の方法に従って調製した。
【０１９０】
ナノカプセルを調製した後すぐに、実施例7に詳述されるように、組み換えB型肝炎抗原(rHBsAg)をNC:rHBsAgの比率4:1で会合させた。次いでこの製剤を、実施例12に詳述されるように、1%のナノカプセル濃度で、5%のトレハロースを用いて凍結乾燥させた。凍結乾燥された製品を、室温(25℃)で保存し、物理化学的特性を評価する目的で様々な時間で再懸濁した。各時間点について、抗原の完全性をウェスタンブロットによって分析した。
【０１９１】
図13における物理化学的特性で観察できるように、凍結乾燥製品は安定なままであり、少なくとも12か月間、ナノメートルサイズと正のゼータ電位を有していた。ウェスタンブロット画像(図14)からは、プロタミンナノカプセルに吸着した抗原(レーン2、3及び4)が、凍結乾燥プロセス又は室温での保存期間を通じて、構造又は抗原性を失っておらず、4℃で保存した抗原(レーン6)と匹敵するものであることが示される。レーン5は室温で保存した遊離の凍結乾燥rHBsAgを示しており、プロタミンナノカプセルと会合させた場合と比較して、抗原が相対的に喪失していることが観察され得る。
【０１９２】
本発明のナノカプセルの少なくとも1年間の熱的安定性、及びこのビヒクルによってもたらされる会合した抗原又は分子に対する保護が、この実施例により実証される。
【０１９３】
[実施例19]
油性αトコフェノールコアからなるプロタミンナノカプセルを、得られる製剤のサイズ減少を目的に、実施例2.8に記載の方法の溶媒拡散方法の変形(ドリッピングによる)により調製した。
i)プロタミンが0.25及び0.125mg/mlの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.750:4.25ml)と、15mgのαトコフェロールと、6mgのTween(登録商標)80とで構成される油相を調製した。
iii) ii)で得られたエタノール溶液を、アリコートで0.250mlを20秒ごとにi)に添加すると、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積(5ml)まで蒸発させた。
【０１９４】
調製した後すぐに、それらの平均径、及び多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表29に得られた値を示す。
【０１９５】
【表３２】
2016503780.tif 000034
【０１９６】
[実施例20]
油性Miglyol(登録商標)コアからなるプロタミンナノカプセルを、得られる製剤のサイズ減少を目的に、溶媒拡散方法の変形(ドリッピングによる)により調製した。
i)プロタミンが0.25及び0.125mg/mlの濃度で溶解されている水溶液(10ml)を調製した。
ii)エタノール/アセトン溶液(0.750:4.25ml)と、15mgのMiglyol(登録商標)と、6mgのTween(登録商標)80とで構成される油相を調製した。
iii) ii)で得られたエタノール溶液を、アリコートで0.250mlを20秒ごとにi)に添加すると、自発的にナノカプセルが生成された。
iv)有機溶媒を一定の体積(5ml)まで蒸発させた。
【０１９７】
調製した後すぐに、それらの平均径、及び多分散指数(PI)、並びに表面電荷(ゼータ電位)を測定した。表30に得られた値を示す。
【０１９８】
【表３３】
2016503780.tif 000035
【０１９９】
[実施例21]
αトコフェロールコアを有するプロタミンナノカプセルの遺伝物質吸着能力の評価
αトコフェロールで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、Tween(登録商標)80を界面活性剤として用いて調製した。次いで、遺伝物質i)EGFP-C1 pDNA及びii)GL3 siRNAを会合させた。調製方法は前述の実施例2.1に記載した方法に相当する。アリコートのプラスミド及び/又はsiRNA(0.050ml)を、既に形成されたプロタミンナノカプセルと、プロタミンの質量に対して15.4%の遺伝物質の充填量が得られるようにインキュベートした。遺伝物質を有するナノカプセルがインキュベートされた後すぐに、平均粒径、多分散指数及びゼータ電位パラメータを評価した(表31)。
【０２００】
表31に示されるように、システムの表面電荷が著しく低下し、電位の逆転も観察され、遺伝物質がNC Prの表面上へ吸着されたことが示される。
【０２０１】
【表３４】
2016503780.tif 000036
一方で、遺伝物質の会合を、アガロースゲル電気泳動によって確認した(図15)。
【０２０２】
[実施例22]
αトコフェロールコアを有し、EGFP-C1 DNAプラスミドと会合しているプロタミンナノカプセルが、癌細胞、例えばU87MG膠芽腫株の内部に取り込まれ、トランスフェクトする能力の評価
αトコフェロールで構成される油性コアを有するプロタミンナノカプセルを、Tween(登録商標)80を界面活性剤として使用して調製した。次いで、遺伝物質EGFP-C1 pDNAを会合させた。調製方法は前述の実施例2.1で記載した方法に相当する。次いで、アリコートのプラスミド(0.050ml)を、既に形成されたプロタミンナノカプセル(0.250ml)と、プロタミンの質量に対して15.4%の遺伝物質の充填量が得られるようにインキュベートした。吸着された遺伝物質を有するナノカプセルがインキュベートされた後すぐに、平均粒径、多分散指数及びゼータ電位パラメータを評価した(表31)。癌細胞(U87MG)をトランスフェクトする効果も評価した。その目的のために、システムを細胞と4時間インキュベートし、会合されたプラスミドによってコードされる緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を、図16に示されるように、トランスフェクションから48時間後に蛍光顕微鏡法によって評価した。
【図１】
2016503780.tif 000037
【図２】
2016503780.tif 000038
【図３】
2016503780.tif 000039
【図４】
2016503780.tif 000040
【図５】
2016503780.tif 000041
【図６】
2016503780.tif 000042
【図７】
2016503780.tif 000043
【図８】
2016503780.tif 000044
【図９】
2016503780.tif 000045
【図１０】
2016503780.tif 000046
【図１１】
2016503780.tif 000047
【図１２】
2016503780.tif 000048
【図１３】
2016503780.tif 000049
【図１４】
2016503780.tif 000050
【図１５】
2016503780.tif 000051
【図１６】
2016503780.tif 000052
【国際調査報告】
2016503780.tif 000053
2016503780.tif 000054
2016503780.tif 000055
2016503780.tif 000056
2016503780.tif 000057
2016503780.tif 000058