(57)【要約】  本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株を含むＰＣＶ２から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、本明細書の配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。【選択図】図５
2016531854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタを、強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株を含むＰＣＶ２から保護するためのワクチン組成物であって、前記組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、前記ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記組成物は、前記ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現する不活化ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスの形態である、請求項１に記載の前記組成物。
【請求項３】
前記組成物は、不活化キメラウイルスの形態であり、前記キメラウイルスは、前記ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現する不活化組換えブタサーコウイルス１型を含む、請求項１に記載の前記組成物。
【請求項４】
前記組成物は、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの形態である、請求項１に記載の前記組成物。
【請求項５】
前記単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、ベクターから発現される、請求項４に記載の前記組成物。
【請求項６】
前記ベクターは、バキュロウイルスまたはパラポックスウイルスである、請求項５に記載の前記組成物。
【請求項７】
前記ベクターは、生または不活化ベクターである、請求項５に記載の前記組成物。
【請求項８】
前記ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される少なくとも１つの残基をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項９】
前記ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）及び残基２３４にリジン（Ｋ）をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに一項に記載の前記組成物。
【請求項１０】
前記ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）をさらに含む請求項９に記載の前記組成物。
【請求項１１】
前記ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片によって表される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの追加のブタ抗原をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの追加の抗原は、微生物によって引き起こされるブタ内の疾患から保護する、請求項１２に記載の前記組成物。
【請求項１４】
前記微生物は、細菌、ウイルス、または原生動物を含む、請求項１３に記載の前記組成物。
【請求項１５】
前記微生物は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・マルトシダ、ストレプトコッカム・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｕｉｓ）、スタフィロコッカス・ヒカス、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレレスイス、サルモネラ・エンテリティディス、ブタ丹毒菌、マイコプラマ（Ｍｙｃｏｐｌａｍａ）・ハイオリニス、マイコプラズマ・ハイオシノビエ、レプトスピラ細菌、ローソニア・イントラセルラリス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、大腸菌抗原、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス、ロタウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｋｙ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす病原体、ブタコレラ（ＣＳＦ）、及びブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の前記組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントは、水中油アジュバント、ポリマー及び水アジュバント、油中水アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバント、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の前記組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の前記組成物。
【請求項１９】
ブタをＰＣＶ２ｂ分岐株に対して免疫化する方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の前記組成物を前記ブタに投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記組成物は、鼻腔内、筋肉内、皮内、経皮、皮下、または経口で投与される、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
前記組成物は、単回用量で投与される、請求項１９または請求項２０に記載の前記方法。
【請求項２２】
前記組成物は、２回用量として投与される、請求項１９または請求項２０に記載の前記方法。
【請求項２３】
前記組成物は、ＰＣＶ２に対する母性由来の抗体を有するブタに投与される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項２４】
前記組成物は、３週齢以上のブタに投与される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項２５】
ブタを強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株から保護するためのワクチン組成物を含む瓶を含むキットであって、前記組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、前記ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む、前記キット。
【請求項２６】
前記ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される少なくとも１つの残基をさらに含む、請求項２５に記載の前記キット。
【請求項２７】
前記瓶中の前記組成物は、即使用可能な液体組成物として提供される、請求項２５または請求項２６に記載の前記キット。
【請求項２８】
前記組成物は、凍結乾燥形態で提供される、請求項２５または請求項２６に記載の前記キット。
【請求項２９】
希釈剤をさらに含む、請求項２８に記載の前記キット。
【請求項３０】
前記ワクチン組成物の投与に関する情報を含む取り扱い説明書をさらに含む、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタサーコウイルスに関する。より具体的には、本発明は、強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株を含むＰＣＶ２及び離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）からブタを保護するための、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２抗原を含むワクチン組成物及びワクチンにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サーコウイルス科サーコウイルス属のメンバーであるブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、１９９８年に初めて発見された、小さくエンベロープを持たない環状ウイルスである。ＰＣＶ２は、ブタ産業が遭遇した２つの最も流行している病原体のうちの１つであり、もう一方は、マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）である。ＰＣＶ２に感染したブタは、一般的に離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と称される症状を呈する。ＰＭＷＳは、衰弱、皮膚の蒼白さ、発育不良、呼吸困難、下痢、及び黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ、ｊａｕｎｄｉｃｅ）によって、臨床的に特徴付けられる。ＰＭＷＳに加え、ＰＣＶ２は、偽性狂犬病、ブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ）、流行性肺炎、グレーサー病、連鎖球菌性髄膜炎、サルモネラ症、離乳後大腸菌病、食事性肝臓症、及び化膿性気管支肺炎を含む、いくつかの他の疾患と関連してきた。あらゆる年齢層のブタにおけるＰＣＶ２感染の様々な臨床症状は、ブタサーコウイルス関連疾病（ＰＣＶＡＤ）として知られ、衰弱及び発育遅延によって特徴付けられる。ＰＲＲＳウイルス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、Ｍ．ｈｙｏ、及び他の細菌が、ＰＣＶＡＤの発症における重要な補助因子として、関連があるとされている。ＰＣＶＡＤは、絶えず国際的ブタ産業にとっての脅威であり、大きな経済損失をもたらしている。
【０００３】
ＰＣＶ２分離株は、現在ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、及びＰＣＶ２ｃの３つの遺伝子型にさらに細分される。ＰＣＶ２は、複製（ＯＲＦ１、９４５ヌクレオチド）と関連するタンパク質及びウイルスキャプシド（ＯＲＦ２、７０２ヌクレオチド）をコードする２つの主な読み取り枠（ＯＲＦ）を含む。ＰＣＶ２は、近年、著しい遺伝的変異を起こしている。典型的なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂ遺伝子型と比較して、ＯＲＦ２コード化キャプシドタンパク質のＣ端末に追加のリジン（Ｋ）を有する新興ＰＣＶ２変異体は、２００８年に、流産したブタからの血清試料から単離された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ７：２７３）。この新興ＰＣＶ２変異体において、ゲノム配列の１０３９位の１つの塩基欠失が、ＯＲＦ２の終止コドンの変異（ＵＡＡからＡＡＧへ）をもたらし、７０５ヌクレオチドのＯＲＦ２遺伝子及び新しい終止コドンを生じさせた（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ８：２９１）。さらに、Ｋｎｅｌｌらは、欠失（Ｔ）が１つの株（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ７１３４７０）の１７６７ヌクレオチドのゲノムの１０４２位に見られ、これが、ＯＲＦ２コード化キャプシドタンパク質のＣ末端の１つのアミノ酸（リジン）によって伸長へとつながったために、変異が、ＯＲＦ２遺伝子で起こり得たと、以前に報告した（Ｋｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０９：１６９−１７７）。Ｏｌｖｅｒａらもまた、ＯＲＦ２の終止コドンの変異に起因するキャプシドタンパク質のＣ末端の１つのリジン残基による伸長を報告した（Ｏｌｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３５７：１７５−１８５）。さらに、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＱ４１３８０８の「ＪＳＴＺ」と名付けられたＰＣＶ２株が、中国の激しく下痢した子ブタの糞便試料において検出及び同定され、その完全な１７６７ヌクレオチドのゲノムが配列決定された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ｊｖｉ．ａｓｍ．ｏｒｇ），ｐ．４７１６）。ＰＣＶ２株ＪＳＴＺのゲノム及び他の中国のＰＣＶ２株のＯＲＦに基づく系統発生解析は、ＰＣＶ２株ＪＳＴＺが、中国の新規遺伝子型に属することを示した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２（上記））。
【０００４】
Ｇｕｏらは、２００８年にＰＭＷＳで流産したブタからの試料から回収されたＰＣＶ２ｂ／ｒＢＤＨまたはＢＤＨ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ受託番号ＨＭ０３８０１７）と名付けられたＰＣＶ２変異株の相対毒性を評価し、典型的なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂ遺伝子型と関連するものよりも強力な、子ブタ内のＰＣＶ２変異株の毒性を確認した（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（ｐｌｏｓｏｎｅ．ｏｒｇ），Ｖｏｌ．７，Ｉｓｓｕｅ７，ｅ４１４６３，１−１０）。このＰＣＶ２変異株は、さらに深刻なＰＭＷＳと一致する徴候を示し、衰弱、咳嗽、呼吸困難、下痢、粗い被毛、及び元気消失によって特徴付けられた。加えて、病理学的病変及びウイルス血症、ならびにリンパ節、扁桃腺、及び脾臓におけるウイルス量は、典型的なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂでチャレンジされた群のものたちと比較して、ＰＣＶ２変異株でチャレンジされた子ブタに関してさらに著しく深刻であった。さらに、ＰＣＶ２変異株でチャレンジされた群において、一般的なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂ遺伝子型でチャレンジされた群よりも著しく低い日々の平均体重増加が記録された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２（上記））。
【０００５】
米国に位置する生産システムのＰＭＷＳに罹患したブタのワクチン不全が疑われたケースにおいて、ＵＳ２２６２５−３３及びＵＳ２２６６４−３５の２つのＰＣＶ２株が、最近同定された（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ｊｖｉ．ａｓｍ．ｏｒｇ），Ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．２２，ｐ．１２４６９）。これら２つのＵＳ株の全ゲノムは、１７６７ヌクレオチドからなることが見出され、そのＯＲＦ２遺伝子の大きさは、７０５ヌクレオチドであり、一般的なＰＣＶ２のものよりもアミノ酸が１つ長い２３４アミノ酸のＯＲＦ２タンパク質をコードする。典型的なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂ株のＯＲＦ２のヌクレオチド配列を用いた系統発生解析は、米国ＰＣＶ２株のＵＳ２２６２５−３３及びＵＳ２２６６４−３５の両方が、ＰＣＶ２ｂと近縁関係にあることを示唆した。典型的なＰＣＶ２ｂと比較して、ＯＲＦ２遺伝子内の単一の塩基欠失は、ＯＲＦ２タンパク質のＣ端末への単一のアミノ酸（リジン）の追加をもたらした。さらなる配列ＢＬＡＳＴ及び比較は、両方の米国ＰＣＶ２株が、中国で発見されたＰＣＶ２株のＢＤＨと高レベルの同一性を有したことを示し、毒性の増加したものであることを報告した。ＯＲＦ１における１つの沈黙突然変異（１６７７Ａ→１６７７Ｔ）が、ＢＤＨと２つの米国変異体ＰＣＶ２ｓとの間で発見された。新規ＰＣＶ２遺伝子型定義及び命名基準（Ｃｏｒｔｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：５２２−５２３；Ｓｅｇａｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１６２：８６７−８６８）に従って、これら新規変異体ＰＣＶ２株のすべてが、ＯＲＦ２遺伝子のヌクレオチド配列の系統発生解析に基づいて、ＰＣＶ２ｂ遺伝子型に分類され得る（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２（上記））。
【０００６】
新規ＰＣＶ２ｂ分岐の報告された毒性の増加、ならびに米国におけるワクチン不全の疑いのケースにおけるその存在を考慮すると、求められているものは、この新規ＰＣＶ２ｂ分岐に対する有効なワクチンである。好ましくは、このワクチンは、Ｍ．ｈｙｏ及びＰＲＲＳウイルス等の他のブタ抗原と互換性があるであろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株を含むＰＣＶ２から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。一実施形態において、組成物は、典型的なＰＣＶ２ａ株及びＰＣＶ２ｂ株に対しても異種保護を提供する。
【０００８】
一実施形態において、組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現する不活化ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスの形態である。
【０００９】
別の実施形態において、組成物は、不活化キメラウイルスの形態であり、キメラウイルスは、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現する不活化組換えブタサーコウイルス１型を含む。
【００１０】
なおも別の実施形態において、組成物は、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの形態である。一実施形態において、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、ベクターから発現される。別の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスまたはパラポックスウイルスである。さらなる実施形態において、ベクターは、生または不活化ベクターである。
【００１１】
一実施形態において、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含むＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される少なくとも１つの残基をさらに含む。
【００１２】
別の実施形態において、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含むＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）及び残基２３４にリジン（Ｋ）をさらに含む。
【００１３】
さらなる実施形態において、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、１３４位にアスパラギン（Ｎ）、残基５９にリジン（Ｋ）、及び残基２３４にリジン（Ｋ）を含むＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）を含む。
【００１４】
一実施形態において、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片によって表される。
【００１５】
別の実施形態において、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む組成物は、少なくとも１つの追加のブタ抗原をさらに含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加の抗原は、微生物によって引き起こされるブタの疾患に対して防御的である。
【００１６】
一実施形態において、微生物は、細菌、ウイルス、または原生動物を含む。別の実施形態において、微生物は、以下から選択されるが、これらに限定されない：ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・マルトシダ、ストレプトコッカム・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｕｉｓ）、スタフィロコッカス・ヒカス、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレレスイス、サルモネラ・エンテリティディス、ブタ丹毒菌、マイコプラマ（Ｍｙｃｏｐｌａｍａ）・ハイオリニス、マイコプラズマ・ハイオシノビエ、レプトスピラ細菌、ローソニア・イントラセルラリス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、大腸菌抗原、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス、ロタウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｋｙ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす病原体、ブタコレラ（ＣＳＦ）、及びブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはこれらの組み合わせ。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、アジュバントをさらに含む。一実施形態において、アジュバントは、水中油アジュバント、ポリマー及び水アジュバント、油中水アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバント、ならびにこれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００１８】
本発明は、上述のとおり、ＰＣＶ２ｂ分岐株を含むＰＣＶ２に対して、ブタを免疫化する方法も提供し、本方法は、本発明の組成物をブタに投与することを含む。投与のためのこの組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。上述のとおり、このＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つの残基をさらに含み得る：配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）。
【００１９】
一実施形態において、投与のための組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現するウイルスを含む。別の実施形態において、投与のための組成物は、単離された、組換えＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２ポリペプチドを含む。
【００２０】
本発明の方法の一実施形態において、組成物は、筋肉内、皮内、経皮、皮下、鼻腔内、もしくは経口、または当業者に既知の他の経路によって投与されてもよい。別の実施形態において、組成物は、単回用量で投与される。なおも別の実施形態において、組成物は、２回用量として投与される。
【００２１】
さらなる実施形態において、組成物は、ＰＣＶ２に対する母性由来の抗体を有するブタに投与される。
【００２２】
一実施形態において、組成物は、３週齢以上のブタに投与される。
【００２３】
本発明は、キットをさらに提供する。このキットは、ブタを強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株から保護するための本発明に従ったワクチン組成物を含む瓶を含む。このワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。上述のとおり、このＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つの残基をさらに含み得る：配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）。
【００２４】
キットの一実施形態において、ワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現するウイルスの形態である。キットの別の実施形態において、ワクチン組成物は、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの形態である。
【００２５】
キットの一実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、即使用可能な液体組成物として提供される。キットの別の実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、凍結乾燥形態で提供される。さらなる実施形態において、キットは、希釈剤を含むことができる。なおも別の実施形態において、キットは、ワクチン組成物の投与に関する情報を含む取り扱い説明書をさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】「ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ」と名付けられたＰＣＶ２ｂ分岐株のキャプシド配列と（ＩＳＵ−４０８９５と名付けられた）典型的なＰＣＶ２Ａ株及び（ＮＭＢと名付けられた）典型的なＰＣＶ２ｂ株のキャプシド配列との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２】処置日別のＤＮＡコピー数の幾何最小二乗平均を示すグラフである。＊すべての「０」は、グラフ化の目的のために、１に変換した。
【図３】チャレンジ後の処置日別の糞便排出（ＤＮＡコピー数）の幾何最小二乗平均を示すグラフである。＊すべての「０」は、グラフ化の目的のために、１に変換した。
【図４】処置日及び処置別のＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ  ＬＳ平均力価のグラフを示す。
【図５】処置日別のＤＮＡコピー数の逆変換幾何最小二乗平均のグラフである。
【図６】チャレンジ後処置日別の糞便排出（ＤＮＡコピー数）の逆変換幾何最小二乗平均のグラフである。
【図７】研究日別の、ＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ  ＬＳ平均力価を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
配列の簡単な説明
本明細書において使用する場合、配列番号１〜５７及び６６によって表されるＰＣＶ２分離株は、ＰＣＶ２ｂ分岐株の代表的例である。
【００２８】
配列番号１は、本明細書において、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴと名付けられたＰＣＶ２ｂ分岐株の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号２は、本明細書において、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴと名付けられたＰＣＶ２ｂ分岐株の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ４６２３８４のＰＣＶ２株：７９８−１の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ４６２３８４のＰＣＶ２株：７９８−１の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ２３１５１６のＰＣＶ２株：ＦＦの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号６は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ２３１５１６のＰＣＶ２株：ＦＦの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ９９０６４５のＰＣＶ２株：ＶＣ２００２−ｋ２の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ９９０６４５のＰＣＶ２株：ＶＣ２００２−ｋ２の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＱ８４５０２５のＰＣＶ２分離株：ＧＹ０９の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＱ８４５０２５のＰＣＶ２株：ＧＹ０９の完全長キャプシドをコードするヌクレオチドである。
配列番号１１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＱ８４５０２８のＰＣＶ２分離株：ＸＳ０９の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＱ８４５０２８のＰＣＶ２株：ＸＳ０９の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ５３５６４０のＰＣＶ２分離株：ＳＤｌｄ０１の完全長キャプシドと対応するアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ５３５６４０のＰＣＶ２分離株：ＳＤｌｄ０１の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ７５５８８０のＰＣＶ２分離株：ＳＤｌｄ０２の完全長キャプシドと対応するアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ７５５８８０のＰＣＶ２分離株：ＳＤｌｄ０２の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ７５５８８１のＰＣＶ２分離株：ＨＭ０１の完全長キャプシドと対応するアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ７５５８８１のＰＣＶ２分離株：ＨＭ０１の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＱ３７８１５７のＰＣＶ２株：ＮＩＶＳ−１の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＱ３７８１５７のＰＣＶ２株：ＮＩＶＳ−１の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ６８３３９４のＰＣＶ２分離株：Ｃ／２０１０−２＊の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ６８３３９４のＰＣＶ２分離株：Ｃ／２０１０−２＊の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ６８３４０８のＰＣＶ２分離株：Ｇ／２００９−２の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ６８３４０８のＰＣＶ２分離株：Ｇ／２００９−２の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８４のＰＣＶ２分離株：Ｉ／２０１０の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８４のＰＣＶ２分離株：Ｉ／２０１０の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８５のＰＣＶ２分離株：Ｊ／２０１０の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８５のＰＣＶ２分離株：Ｊ／２０１０の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８６のＰＣＶ２分離株：Ｋ／２０１０の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８６のＰＣＶ２分離株：Ｋ／２０１０の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８８のＰＣＶ２分離株：Ｍ／２０１０の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＦ９２７９８８のＰＣＶ２分離株：Ｍ／２０１０の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ００６４４５のＰＣＶ２分離株：ＷＢ／ＲＯＭ８９の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ００６４４５のＰＣＶ２分離株：ＷＢ／ＲＯＭ８９の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ３８２１８８のＰＣＶ２分離株：ＥＵ−ＲＯ−Ｆ４−３の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号３６は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ３８２１８８のＰＣＶ２分離株：ＥＵ−ＲＯ−Ｆ４−３の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ４１１０９６のＰＣＶ２分離株：ＨＮｉｎｇ０９の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ４１１０９６のＰＣＶ２分離株：ＨＮｉｎｇ０９の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ４１１０９９のＰＣＶ２分離株：ＹＷｕ０９の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号４０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ４１１０９９のＰＣＶ２分離株：ＹＷｕ０９の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５８６のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ４の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５８６のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ４の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号４３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５８８のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ６の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５８８のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ６の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号４５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５８９のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ７の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５８９のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ７の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号４７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９０のＰＣＶ２分離株の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号４８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９０のＰＣＶ２分離株の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号４９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９１のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ９の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号５０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９１のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ９の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号５１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９２のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ１０の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９２のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ１０の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号５３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９３の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ９８４５９３のＰＣＶ２分離株：ＣＨ−ＩＶＴ１１の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号５５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ５１９２９３のＰＣＶ２分離株：ＧＤＹＸの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号５６は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ５１９２９３のＰＣＶ２分離株：ＧＤＹＸの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５７は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ５１９２９３のＰＣＶ２分離株：ＧＤＹＸの全ゲノム配列である。
配列番号５８は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２６４０４２の典型的なＰＣＶ２ａ分離株：ＩＳＵ−４０８９５の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号５９は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２６４０４２のＰＣＶ２ａ分離株：ＩＳＵ−４０８９５の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６０は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５３９２の典型的なＰＣＶ２ａ分離株：Ｉｍｐ．１０１０−Ｓｔｏｏｎの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号６１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５３９２の典型的なＰＣＶ２ａ分離株：Ｉｍｐ．１０１０−Ｓｔｏｏｎの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ７９９５７６の典型的なＰＣＶ２ｂ株：ＮＭＢの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号６３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ７９９５７６の典型的なＰＣＶ２ｂ分離株：ＮＭＢの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６４は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ１４８５０３の典型的なＰＣＶ２ｃ株：ＤＫ１９８０ＰＭＷＳｆｒｅｅの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号６５は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ１４８５０３の典型的なＰＣＶ２ｃ株：ＤＫ１９８０ＰＭＷＳｆｒｅｅの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６６は、「ＰＣＶ２ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ」と名付けられたＰＣＶ２分岐の全ゲノム配列である。
【００２９】
発明を実施するための形態
本明細書及び請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「１つのタンパク質抗原」という用語は、タンパク質抗原の混合物を含む複数のタンパク質抗原を含む。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「を含む」という用語は、組成物及び方法が、引用される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「ＰＣＶ２ｂ分岐株」、「ＰＣＶ２ｂ分岐」、「ＰＣＶ２変異体」、「新規変異体ＰＣＶ２」、「変異体ＰＣＶ２」等の用語は、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含むＯＲＦ２キャプシドポリペプチドをコードする強毒性のＰＣＶ２ｂ株を指す。コードされたＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）から選択される少なくとも１つの残基をさらに含み得る。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド」という用語は、ＯＲＦ２ポリペプチドが、ウイルス自体の成分（例えば、ウイルスのタンパク膜）であるような、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現するウイルスを含むことが意図される。ウイルスは、ＰＣＶであり得るが、それに限定されると解釈されるべきではなく、他のウイルスも含み得る。この用語は、また、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドも含むことが意図される。
【００３３】
「抗原」という用語は、動物内で抗体またはＴ細胞反応、またはこれら両方の生成を刺激することができる化合物、組成物、または免疫原性物質を指し、動物に注入されるかそれ内で吸収される組成物を含む。免疫反応は、分子全体、または分子の一部分（例えば、抗原決定基または部分抗原）に生じ得る。「抗原」という用語は、全ウイルス、ポリペプチド、またはこれらの断片を含み得る。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「ワクチン組成物」という用語は、宿主内で免疫反応を誘導するのに有用な薬学的に許容されるビヒクル中に少なくとも１つの抗原または免疫原を含む。ワクチン組成物は、年齢、性別、体重、種、及び受容動物の状態、ならびに投与経路等の要因を考慮した投与量で、医療または獣医療の分野の当業者に周知の技法によって、投与されてもよい。投与経路は、経皮、粘膜投与（例えば、経口、経鼻、経肛門、膣内）を介して、または非経口経路（皮内、経皮、筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内）を介してもよい。ワクチン組成物は、単独で投与されるか、他の処置または治療とともに、同時投与または連続的に投与されてもよい。投与の形態は、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤、及び滅菌懸濁液またはエマルション等の非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注入可能な投与）のための調製物を含んでもよい。ワクチン組成物は、噴霧剤として投与されるか、食品及び／もしくは水に混合されるか、または好適な担体、希釈剤、もしくは滅菌水、生理食塩水、グルコース等の賦形剤との混合剤の状態で投与されてもよい。組成物は、投与経路及び所望の調製によって、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化もしくは粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、顔料等の補助剤を含有してもよい。不要な実験をすることなく、調製する好適な調製物を調製するのに「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１９９０）等の標準薬学的教科書を参考にしてもよい。
【００３５】
本明細書に定義されるとおり、「免疫原性または免疫学的組成物」は、目的の組成物またはワクチンに対する細胞免疫反応及び／または抗体触媒性免疫反応の、宿主内の免疫学的反応を引き出す少なくとも１つの抗原を含む物質の組成物を指す。
【００３６】
「免疫反応」という用語は、本明細書において使用する場合、動物内で引き出された反応を指す。免疫反応は、細胞免疫（ＣＭＩ）、液性免疫を指し得るか、これらの両方を伴い得る。本発明は、また、免疫系の一部に限定される反応も企図する。通常、「免疫学的反応」には、以下の作用のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つの抗原または複数の抗原に特異的に向けられる、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／もしくは細胞傷害性Ｔ細胞ならびに／またはｙｄ  Ｔ細胞の生成ならびに活性化。好ましくは、宿主は、新しい感染に対する耐性が向上する及び／または疾患の臨床的重症度が低減されるような、治療的または防御的免疫学的反応のいずれかを示す。このような防御は、通常感染した宿主によって示される症状の低減もしくは無症状、より迅速な回復時間、及び／または感染した宿主内の低減されたウイルス価によって示されるであろう。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「免疫原性」という用語は、宿主動物内に１つの抗原または複数の抗原に対する免疫反応を生成し得ることを意味する。この免疫反応は、ワクチンによって引き出された特異的な感染性生物に対する防御免疫の基礎を形成する。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「アジュバント」は、抗原（複数可）に対する免疫反応を向上させる１つ以上の物質からなる組成物という意味である。アジュバントがどのような機構で作用するかは、完全にはわかっていない。いくつかのアジュバントが、抗原をゆっくりと放出することにより免疫反応を向上させると考えられている一方で、他のアジュバントは、それら自体が、免疫原性が強く、相乗的に機能すると考えられている。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「多価」という用語は、同じ微生物学的種から（例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエまたはＰＣＶの異なる分離株）、異なる種から（例えば、パスツレラ・ヘモリチカ及びパスツレラ・マルトシダの両方からの分離株）に関わらず、２つ以上の抗原を含むワクチン、または異なる属からの抗原の組み合わせを含むワクチン（例えば、パスツレラ・マルトシダ、サルモネラ、大腸菌、ヘモフィルス・ソムナス、及びクロストリジウムからの抗原を含むワクチン）を意味する。
【００４０】
本明細書において使用する場合、「ブタ」または「子ブタ」という用語が、ブタの血統の動物を意味する一方で、「雌ブタ」は、生殖年齢及び生殖能力のあるメスのブタを指す。「未経産ブタ」は、妊娠したことのないメスブタのことである。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「毒性」という用語は、動物宿主内で感染性になる能力を保持し、宿主動物に疾患を生じ得る分離株を意味する。
【００４２】
「不活化ワクチン」とは、もはや複製または成長する能力がない感染性生物または病原体を含むワクチン組成物を意味する。病原体は、細菌、ウイルス、原生動物、または菌類起源であり得る。不活性化は、その免疫原性を維持すると同時に、凍結融解、化学的処置（例えば、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）またはホルマリンでの処理）、超音波処理、放射線、熱、または生物の複製または成長を阻止するのに十分な任意の他の従来の方法を含む様々な方法によって達成し得る。
【００４３】
本明細書において使用する場合、「変異型」という用語は、ポリペプチドまたは１つ以上の保存的アミノ酸変化もしくは野生型ポリペプチドと比較すると、対応するポリペプチドが実質的に同等機能を有するような他の若干の改変を有するポリペプチドをコードする、核酸配列を指す。「変異型」という用語は、また、前記変異または改変を有するポリペプチドまたは核酸配列を含む微生物も指し得る。
【００４４】
「保存的変異」は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換、またはコードされたアミノ酸残基が変化しないか、別の生物学的に類似する残基であるような核酸配列にあるヌクレオチドの置換を意味する。保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン等の１つの疎水性残基で別の疎水性残基を置換、またはアルギニンでリジンを、グルタミン酸でアスパラギン酸を、もしくはグルタミンでアスパラギンを置換する等の、１つの極性残基で別の極性残基を置換する置換等が挙げられる。「保存的変異」という用語は、親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸も含むが、但し、置換ポリペプチドへと作成された抗体も、親（非置換）ポリペプチドと免疫反応することを条件とする。
【００４５】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」及び「薬学的に許容されるビヒクル」という用語は、互換性があり、有害作用なしに宿主内へと注入され得るワクチン抗原を含有するための流体ビヒクルを指す。当分野で既知の好適な薬学的に許容される担体には、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。担体には、希釈剤、安定剤（すなわち、砂糖及びアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度増強添加剤、着色添加剤等を含むが、これらに限定されない助剤を挙げられ得る。
【００４６】
「北米ＰＲＲＳウイルス」とは、１９９０年代初期頃に米国で初めて単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６を参照）、北米ＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）、ＰＲＲＳウイルスのケベックＬＡＦ−ｅｘｐ９１株（Ｍａｒｄａｓｓｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）、及び北米ＰＲＲＳウイルス分離株ＶＲ２３８５（Ｍｅｎｇ，Ｘ．−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１）等の、これらに限定されないが、北米ＰＲＲＳウイルス分離株と関連がある遺伝子特徴を有する任意のＰＲＲＳウイルスを意味する。北米ＰＲＲＳウイルス株の追加の例は、当分野で既知である。遺伝子特徴は、北米ＰＲＲＳウイルス株と共有する、ゲノムヌクレオチド配列類似性及びアミノ酸配列類似性を指す。中国ＰＲＲＳウイルス株は、概して、北米株との約８０〜９３％のヌクレオチド配列類似性を証明する。
【００４７】
「欧州ＰＲＲＳウイルス」は、１９９１年頃に欧州で初めて単離されたＰＲＲＳウイルスと関連する遺伝子特徴を有するＰＲＲＳウイルスの任意の株を指す（例えば、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０を参照）。「欧州ＰＲＲＳウイルス」は、時折、当分野で「レリースタットウイルス」とも称される。欧州ＰＲＲＳウイルス株のさらなる例は、当分野で既知である。
【００４８】
本明細書において使用する場合、遺伝子改変のウイルスが、その非改変親株よりも低い毒性である場合、「弱毒化」されている。株が、疾患重症度を決定する１つ以上のパラメータにおいて統計学的に有意な減少を示す場合、その株は、「弱毒性」である。そのようなパラメータには、ウイルス血症の程度、熱、呼吸困難の重症度、生殖の症状の重症度、または病理学的病変の数または重症度等が挙げられ得る。
【００４９】
「感染性クローン」は、実験室で特異的かつ意図的に改変され、次いで生きた遺伝子改変生物を再形成するために使用され得る病原体（例えばウイルス）の、単離またはクローニングされたゲノムである。感染性クローンから生成された生きた遺伝子改変ウイルスは、生ウイルスワクチンに使用され得る。あるいは、不活化ウイルスワクチンは、感染性クローン由来の生ウイルスを、ホルマリン、ベータ−プロプリオラクトン、バイナリーエチレネミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｍｉｎｅ）、または疎水性溶媒、酸等の不活化剤で処理することによって、紫外線またはＸ線で照射することによって、加熱することによってなどで、調製することができる。
【００５０】
本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株を含むＰＣＶ２から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。上述のとおり、このＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つの残基をさらに含み得る：配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）。
【００５１】
一実施形態において、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含むＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）及び残基２３４にリジン（Ｋ）をさらに含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、１３４位にアスパラギン（Ｎ）、残基５９にリジン（Ｋ）、及び残基２３４にリジン（Ｋ）を含むＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）をさらに含む。
【００５３】
一実施形態において、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはそれらの断片によって表される。しかしながら、本発明は、この実施形態に限定されない。例えば、他の実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号５のアミノ酸配列またはその断片、配列番号７のアミノ酸配列またはその断片、配列番号９のアミノ酸配列またはその断片、配列番号１１のアミノ酸配列またはその断片、配列番号１３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号１３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号１５のアミノ酸配列またはその断片、配列番号１７のアミノ酸配列またはその断片、配列番号１９のアミノ酸配列またはその断片、配列番号２１のアミノ酸配列またはその断片、配列番号２３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号２５のアミノ酸配列またはその断片、配列番号２７のアミノ酸配列またはその断片、配列番号２９のアミノ酸配列またはその断片、配列番号３１のアミノ酸配列またはその断片、配列番号３３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号３５のアミノ酸配列またはその断片、配列番号３７のアミノ酸配列またはその断片、配列番号３９のアミノ酸配列またはその断片、配列番号４１のアミノ酸配列またはその断片、配列番号４３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号４５のアミノ酸配列またはその断片、配列番号４７のアミノ酸配列またはその断片、配列番号４９のアミノ酸配列またはその断片、配列番号５１のアミノ酸配列またはその断片、配列番号５３のアミノ酸配列またはその断片、配列番号５５のアミノ酸配列またはその断片から選択され得るが、これらに限定されない。
【００５４】
一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の抗原を含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加の抗原は、微生物によって引き起こされるブタの疾患に対して防御的である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の抗原成分は、ブタに感染することが知られている細菌、ウイルス、または原生動物によって引き起こされるブタの疾患に対して防御的である。そのような微生物の例には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｍ．ｈｙｏ、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・マルトシダ、ストレプトコッカム・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｕｉｓ）、スタフィロコッカス・ヒカス、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレレスイス、サルモネラ・エンテリティディス、ブタ丹毒菌、マイコプラマ（Ｍｙｃｏｐｌａｍａ）・ハイオリニス、マイコプラズマ・ハイオシノビエ、レプトスピラ菌、ローソニア・イントラセルラリス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、大腸菌抗原、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス、ブタロタウイルス（例えば、Ａ群、Ｂ群、及びＣ群）、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｋｙ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす病原体、ブタコレラ（ＣＳＦ）、及びブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはこれらの組み合わせ。
【００５６】
一実施形態において、少なくとも１つの追加の抗原は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）である。別の実施形態において、少なくとも１つの追加の抗原は、北米ＰＲＲＳウイルス株、中国ＰＲＲＳウイルス株、または欧州ＰＲＲＳウイルス株等のＰＲＲＳウイルスである。また、少なくとも１つの追加の抗原が、典型的なＰＣＶ２ａ株、典型的なＰＣＶ２ｂ株、または他のＰＣＶ２遺伝子型等のＰＣＶ２の異なる分離株になり得ることが予測されている。
【００５７】
一実施形態において、組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現する、不活性化のＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスの形態である。
【００５８】
一実施形態において、ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスのＯＲＦ２キャプシド遺伝子は、配列番号２に対応する。さらなる実施形態において、ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスによって発現されたＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１またはその断片に対応する。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスによって発現されるＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下の配列またはこれらの断片のいずれかから選択され得る：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、または配列番号５５。対応するＯＲＦ２遺伝子配列は、本明細書に記載される。
【００５９】
別の実施形態において、組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド（キメラＰＣＶ１−２ｂウイルス）を含む及び／または発現する不活化組換えブタサーコウイルス１型を含む不活化キメラウイルスの形態である。キメラブタサーコウイルス及びこれらの調製方法は、国際公開第０３／０４９７０３  Ａ２号、ならびに米国特許第７，２７９，１６６号及び同第７，５７５，７５２号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６０】
一実施形態において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスのＯＲＦ２キャプシド遺伝子は、配列番号２に対応する。さらなる実施形態において、キメラＰＣＶ１−２ｂウイルスによって発現されるＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１またはその断片に対応する。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、キメラＰＣＶ１−２ｂウイルスによって発現されるＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下の配列またはこれらの断片のいずれかから選択される：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、または配列番号５５。
【００６１】
なおも別の実施形態において、組成物は、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの形態である。一実施形態において、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、バキュロウイルス等のベクターから発現される。あるいは、パラポックスベクター等を含む他の既知の発現ベクターが、使用されてもよいが、これに限定されない。一実施形態において、ベクターは、生または不活化ベクターでもよい。
【００６２】
さらなる実施形態において、組換え的に発現されたＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１またはその断片に対応する。あるいは、いくつかの実施形態において、組換え的に発現されたＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下のいずれかまたはこれらの断片から選択され得る：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、または配列番号５５。
【００６３】
いくつかの形態において、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性部分が、組成物の抗原成分として使用される。例えば、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質の短縮及び／もしくは置換された形態または断片が、本発明の組成物に使用されてもよい。
【００６４】
ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの変異型が、本発明の組成物に使用され得るが、但し、これらが、本発明のワクチン組成物内においてそれを有用なものにする抗原的特徴を依然保持することを条件とすることが、当業者によって理解される。好ましくは、ＰＣＶ２ｂ分岐変異型は、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴと名付けられたＰＣＶ２分離株の完全長ゲノム配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに一層好ましくは少なくとも９５％同一であるとみなす、配列を有する。例えば、免疫学的組成物の抗原的特徴は、実施例に提供されるとおりのチャレンジ実験によって推定される。加えて、配列番号１を有する野生型ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２タンパク質と比較して、改変抗原が、防御免疫の少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％をもたらすとき、改変ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２抗原の抗原的特徴が、依然として保持される。
【００６５】
ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２抗原成分は、所望の免疫反応を誘導するのに効果的な、すなわち本明細書でＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴと名付けられたウイルスの例である強毒性のＰＣＶ２ｂ株への感染から生じる臨床徴候の発症を低減するか、またはその重症度を減らす抗原包含レベルで、免疫原性／ワクチン組成物に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、典型的なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂ株に対する異種保護も提供する。
【００６６】
一実施形態において、本発明に従ったワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド（キメラＰＣＶ１−２ｂＤＩＶウイルス）を含む及び／または発現する不活化組換えブタサーコウイルス１型の形態である。このキメラウイルスは、本発明の組成物に少なくとも１．０≦ＲＰ≦５．０のレベルで含まれ、ＲＰは、参照ワクチンと比較するＥＬＩＳＡ抗原定量化（体外力価試験）によって決定される、相対的効力単位である。別の実施形態において、キメラＰＣＶ１−２ｂＤＩＶウイルスは、２０倍（２０×）濃縮バルクＰＣＶ１−２ｂＤＩＶ抗原の約０．５％〜約５％の最終濃度で本発明の組成物に含まれる。
【００６７】
別の実施形態において、本発明に従ったワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現する不活化ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスの形態である。このウイルスは、本発明の組成物に少なくとも１．０≦ＲＰ≦５．０のレベルで含まれ、ＲＰは、参照ワクチンと比較するＥＬＩＳＡ抗原定量化（体外力価試験）によって決定される、相対的効力単位である。別の実施形態において、不活化ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスは、２０倍（２０×）濃縮バルクＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２抗原の約０．５％〜約５％の最終濃度で本発明の組成物に含まれる。
【００６８】
なおも別の実施形態において、本発明に従ったワクチン組成物は、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの形態である。ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２組換えタンパク質は、最終免疫原性／ワクチン組成物（μｇ／ｍｌ）の少なくとも０．２μｇ抗原／ｍｌのレベルで本発明の組成物に含まれてもよい。さらなる実施形態において、組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド包含レベルは、約０．２〜約４００μｇ／ｍｌである。なおも別の実施形態において、組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド包含レベルは、約０．３〜約２００μｇ／ｍｌである。さらなる実施形態において、組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド包含レベルは、約０．３５〜約１００μｇ／ｍｌである。さらに別の実施形態において、組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド包含レベルは、約０．４〜約５０μｇ／ｍｌである。
【００６９】
一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド及び少なくとも１つのＭ．ｈｙｏ可溶性抗原（例えば、２つ以上）の組み合わせを含む。一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド及び以下のＭ．ｈｙｏ特異的タンパク質抗原のうちの１つ以上を含む：およそ４６ｋＤ（ｐ４６）、６４ｋＤ（ｐ６４）、及び９７ｋＤ（ｐ９７）分子量のＭ．ｈｙｏタンパク質。およそ６４ｋＤ（ｐ６４）のＭ．ｈｙｏタンパク質は、Ｋｉｍらの「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８（８）：２６３７−２６４３（１９９０）」、及び米国特許第５，７８８，９６２号によって記載される、Ｍ．ｈｙｏからのｐ６５表面抗原と代替的に称され得る。Ｆｕｔｏらは、本発明の組成物に使用することができるＭ．ｈｙｏからの４６ｋＤ表面タンパク質のクローニング及び特徴付けを記載した「Ｊ．Ｂａｃｔ１７７：１９１５−１９１７（１９９５）」。Ｚｈａｎｇらは、Ｍ．ｈｙｏのｐ９７アドヘシンタンパク質を記載し、特徴付けた「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１０１３−１０１９，１９９５」。さらに、Ｋｉｎｇらは、Ｍ．ｈｙｏのＰ−５７２２株からのＭｈｐ１と名付けられた１２４ｋＤタンパク質を記載し、Ｍｈｐ１及びｐ９７が、同じタンパク質であることを示唆するデータを提示した「Ｖａｃｃｉｎｅ１５：２５−３５（１９９７）」。そのようなｐ９７タンパク質は、本発明の組成物に使用され得る。本発明のワクチン組成物は、およそ４１ｋＤ（ｐ４１）、４２ｋＤ（ｐ４２）、８９ｋＤ（ｐ８９）、及び６５ｋＤ（ｐ６５）のタンパク質等のさらなるＭ．ｈｙｏ特異的タンパク質抗原を含んでもよいが、これらに限定されない。Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ４７：５２７−５３３及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８（８）：２６３７−２６４３を参照のこと。さらに、Ｍ．ｈｙｏ成分は、およそ１０２ｋＤ（ｐ１０２）及び２１６ｋＤ（ｐ２１６）のＭ．ｈｙｏ特異的タンパク質抗原を含んでもよい。Ｍｉｎｉｏｎらへの米国特許第６，１６２，４３５号及び同第７，４１９，８０６号を参照のこと。
【００７０】
別の実施形態において、本発明のワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチド、少なくとも１つのＭ．ｈｙｏ可溶性抗原（例えば、２つ以上）、及びＰＲＲＳウイルス抗原の組み合わせを含む。本発明のＰＣＶ２ｂ分岐／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ組成物への使用のための好適なＰＲＲＳウイルス抗原は、北米ＰＲＲＳウイルス分離株、中国ＰＲＲＳウイルス株、及び欧州ＰＲＲＳウイルス株、ならびにそのような分離株／株の遺伝子改変バージョンを含む。一実施形態において、本発明に従った組成物に使用されるＰＲＲＳウイルス抗原成分は、北米ＰＲＲＳウイルスである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物に使用されるＰＲＲＳウイルス抗原成分は、Ｐ１２９と名付けられた北米ＰＲＲＳウイルス分離株またはその生きた遺伝子改変のバージョンである。好ましくは、遺伝子改変ＰＲＲＳウイルスは、病原性感染を引き起こすことはできないが、野生型ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する、効果的な免疫防御性反応を引き出すことができる。
【００７２】
本発明の組成物での使用のための遺伝子改変ＰＲＲＳウイルスは、感染性クローンから生成され得る。Ｐ１２９と名付けられた北米ＰＲＲＳウイルス分離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製は、米国特許第６，５００，６６２号に記載され、参照により本明細書に完全に組み込まれる。Ｐ１２９ｃＤＮＡの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４９４０４２及び米国特許第６，５００，６６２号に開示される。
【００７３】
一実施形態において、ＰＣＶ２ｂ分岐／Ｍ．ｈｙｏ混合ワクチンは、１瓶のワクチンで単一用量として提供される。別の実施形態において、ＰＣＶ２ｂ分岐／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳウイルス混合ワクチンは、２瓶のワクチンで単一の用量として提供される。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＣＶ２ｂ分岐／Ｍ．ｈｙｏ混合は、第１の瓶に安定した液体組成物として提供され、ＰＲＲＳウイルスは、第２の瓶に凍結乾燥状態で提供される。いくつかの実施形態において、追加のブタ抗原が、第１の瓶または第２の瓶のいずれかに添加されてもよい。
【００７４】
一実施形態において、ＰＲＲＳウイルス成分は、凍結乾燥の遺伝子改変生ウイルスとして提供される。投与前に、３つの抗原すべてが単一用量で動物に投与されることができるように、第１の瓶からのＰＣＶ２ｂ分岐／Ｍ．ｈｙｏ液体が、第２の瓶のＰＲＲＳウイルスを再水和するために使用されてもよい。
【００７５】
本発明のワクチンは、標準の緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤、及び／または可溶化剤等の、ヒト（該当する場合）を含む動物のための薬学的に許容される担体を含むために、許容される慣習に従って製剤化されてもよく、持続する放出を促進するように製剤化されてもよい。希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等が挙げられる。等張性のための添加剤には、数あるなかでも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。安定剤には、数ある中でも、アルブミンが挙げられる。改変生ワクチンの製剤化に特に有用なものを含む他の好適なワクチンビヒクル及び添加剤は、当業者に既知であるか、明らかになるであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照のこと。
【００７６】
本発明のワクチンは、例えば、数ある中でも、アジュバントまたはサイトカイン等の１つ以上追加の免疫調節性成分をさらに含んでもよい。本発明の組成物に使用のための好適なアジュバントの種類には、以下が挙げられる：水中油アジュバント、ポリマー及び水アジュバント、油中水アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバント、ならびにこれらの組み合わせ。アジュバントのいくつかの特定の例には、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、コリネバクテリウムパルバム、無菌化ウシ型結核菌、水酸化アルミニウムゲル、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント、アミノ酸のポリアミノ酸及びコポリマー等の特定の合成ポリマー、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ及びＡｖｒｉｄｉｎｅリピド−アミンアジュバント（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、「ＲＥＧＲＥＳＳＩＮ」（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ、Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）、パラフィン油、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ムラミルジペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明のワクチンに有用な水中油エマルションの非限定的な例には、修飾ＳＥＡＭ６２製剤及びＳＥＡＭ１／２製剤が挙げられる。修飾ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（シグマ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗浄剤（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、及び０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する水中油エマルションである。修飾ＳＥＡＭ１／２は、５％の（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤、０．７％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０洗浄剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、及び５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含む、水中油エマルションである。
【００７８】
本発明の組成物で有用なアジュバントの別の例は、ＳＰ油である。明細書及び請求の範囲において使用する場合、「ＳＰ油」という用語は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、及び緩衝塩類溶液を含む、油エマルションを示す。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、固形成分及び液体成分を懸濁させる補助をする界面活性剤である。これらの界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商標名の下、ポリマーとして市販されている。好適な界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ−１２１の商標名の下市販されている、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０１である。一般に、ＳＰ油エマルションは、約１〜３％ｖｏｌ／ｖｏｌのブロックコポリマー、約２〜６％ｖｏｌ／ｖｏｌのスクアラン、さらに具体的には、約３〜６％のスクアラン、及び約０．１〜０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含み、残部は、緩衝塩類溶液である、免疫賦活性アジュバント混合物である。一実施形態において、ＳＰ油エマルションは、最終組成物に約１％〜２５％のｖ／ｖ量、好ましくは約２％〜１５％、さらに好ましくは約５％〜１２％ｖ／ｖで存在する。
【００７９】
本発明の組成物の使用のための好適なアジュバントのさらに別の例は、通常、軽質流動パラフィンである油に溶解し脱油されたレシチンからなるＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）アジュバントである。
【００８０】
本発明の組成物に有用なアジュバントの他の例は、以下の商標登録されたアジュバントである：Ｍｉｃｒｏｓｏｌ  Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）デュエルエマルションアジュバントシステム（ｄｕｅｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｅｍｕｎａｄｅアジュバント、及びＸｓｏｌｖｅアジュバント。ＥｍｕｎａｄｅアジュバントとＸｓｏｌｖｅアジュバントの両方は、水中の軽油のエマルションであるが、Ｅｍｕｎａｄｅは、アルハイドロゲルも含有し、ｄ，ｌ−α−トコフェロール酢酸エステルが、ＸＳｏｌｖｅアジュバントの一部である。本発明の組成物に使用のための好適なアジュバントのさらなる例は、ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（商標）アジュバント（油中水アジュバント）である。好適なアジュバントのさらなる例は、Ｃａｒｂｏｍｅｒ（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））系アジュバントである。好適なＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）アジュバントには、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４ポリマー及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９４１ポリマーが挙げられる。
【００８１】
一実施形態において、アジュバントまたはアジュバント混合物が、一用量あたり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で添加される。別の実施形態において、アジュバント／アジュバント混合物は、一用量あたり約２００μｇ〜約５ｍｇの量で添加される。なおも別の実施形態において、アジュバント／アジュバント混合物は、約３００μｇ〜約１ｍｇ／用量の量で添加される。
【００８２】
アジュバントまたはアジュバント混合物は、典型的に本発明のワクチン組成物中に約１％〜２５％のｖ／ｖ量で、好ましくは約２％〜１５％、さらに好ましくは約５％〜１２％ｖ／ｖで存在する。
【００８３】
ワクチンに含むことができる他の「免疫調節剤」には、例えば、１つ以上のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインが挙げられる。一実施形態において、アジュバントは、米国特許第６，１６５，９９５号及び同第６，６１０，３１０号それぞれに記載されるもの等の、シクロデキストリン誘導体またはポリアニオン性ポリマーであってもよい。
【００８４】
上述のとおり、本発明は、ＰＣＶ２ｂ分岐株を含むＰＣＶ２に対して、ブタを免疫化する方法も提供し、本方法は、本発明に従って組成物をブタに投与することを含む。投与のためのこの組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。上述のとおり、このＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つの残基をさらに含み得る：配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）。
【００８５】
一実施形態において、投与のための組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現するウイルスを含む。別の実施形態において、投与のための組成物は、単離された、組換えＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２ポリペプチドを含む。
【００８６】
本発明の方法の一実施形態において、組成物は、筋肉内、皮内、経皮、皮下、または経口で投与される。別の実施形態において、組成物は、単回用量で投与される。なおも別の実施形態において、組成物は、２回用量として投与される。
【００８７】
さらなる実施形態において、組成物は、ＰＣＶ２に対する母性由来の抗体を有するブタに投与される。
【００８８】
一実施形態において、組成物は、３週齢以上のブタに投与される。
【００８９】
本発明に従ったワクチン組成物は、年齢、性別、体重、種、及び受容動物の状態、ならびに投与経路等の要因を考慮した投与量で、医療または獣医療の分野の当業者に周知の技法によって、投与されてもよい。投与経路は、経皮、粘膜投与（例えば、経口、経鼻、経肛門、膣内）を介して、または非経口経路（皮内、経皮、筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内）を介してもよい。本発明に従ったワクチン組成物は、単独で投与されるか、他の処置または治療とともに、同時投与または連続的に投与されてもよい。投与の形態は、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤、及び滅菌懸濁液またはエマルション等の非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注入可能な投与）のための調製物を含んでもよい。本発明に従ったワクチン組成物は、噴霧剤として投与されるか、食品及び／もしくは水に混合されるか、または好適な担体、希釈剤、もしくは滅菌水、生理食塩水、グルコース等の賦形剤との混合剤の状態で投与されてもよい。組成物は、投与経路及び所望の調製によって、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化もしくは粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、顔料等の補助剤を含有してもよい。
【００９０】
本発明は、キットをさらに提供する。このキットは、ブタを強毒性のブタサーコウイルス２ｂ型（ＰＣＶ２ｂ）分岐株から保護するための本発明に従ったワクチン組成物を含有する瓶を含む。このワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含み、ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号１の番号付与に従って、８９位にロイシン（Ｌ）、９０位にスレオニン（Ｔ）、及び１３４位にアスパラギン（Ｎ）を含む。上述のとおり、このＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つの残基をさらに含み得る：配列番号１の番号付与に従って、残基５９にリジン（Ｋ）、残基２３４にリジン（Ｋ）、残基１９０にスレオニン（Ｔ）、残基５３にイソロイシン（Ｉ）、残基６８にアスパラギン（Ｎ）、残基１６９にアルギニン（Ｒ）またはグリシン（Ｇ）、及び残基２１５にイソロイシン（Ｉ）。
【００９１】
キットの一実施形態において、ワクチン組成物は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを含む及び／または発現するウイルスの形態である。キットの別の実施形態において、ワクチン組成物は、単離された組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの形態である。
【００９２】
本発明のキットの一実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、即使用可能な液体組成物として提供される。キットの別の実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、凍結乾燥形態で提供される。さらなる実施形態において、キットは、希釈剤を含むことができる。なおも別の実施形態において、キットは、ワクチン組成物の投与に関する情報を含む取り扱い説明書をさらに含むことができる。
【００９３】
本発明の別の態様は、不活化キメラウイルスの形態のワクチン組成物の生成方法を提供し、キメラウイルスは、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを発現する不活化組換えブタサーコウイルス１型を含む。キメラブタサーコウイルス及びこれらの調製方法は、国際公開第０３／０４９７０３  Ａ２号、ならびに米国特許第７，２７９，１６６号及び同第７，５７５，７５２号に記載される。ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを発現する不活化ＰＣＶ１を含むキメラブタサーコウイルスの生成方法は、下記実施例１に記載される。一実施形態において、最終組成物は、不活化ｃＰＣＶ１−２ｂウイルスを、好適なアジュバント及び／または他の薬学的に許容される担体と混合することにより調製される。
【００９４】
本発明のさらなる態様が、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２ポリペプチドを発現する不活化ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスの形態であるワクチン組成物の生成方法を提供する。そのような方法は、下記実施例３に記載される。一実施形態において、最終組成物は、不活化ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴウイルスを、好適なアジュバント及び／または他の薬学的に許容される担体と混合することにより、調製される。
【００９５】
本発明のさらに別の態様は、ｉ）培養下の感受性のある細胞が、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２のＤＮＡコード配列を含む組換えウイルスベクターに感染することを許容し、ＯＲＦ２タンパク質は、組換えウイルスベクターによって発現され、ｉｉ）その後、上清中のＯＲＦ２タンパク質を回収することによる、組換えＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質の生成方法を提供する。典型的に、多量のＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質は、上清中で回収され得る。多量のＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２とは、約２０μｇ／ｍＬ超の上澄み、好ましくは約２５μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約３０μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約４０μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約５０μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約６０μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約８０μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約１００μｇ／ｍＬ超、さらに一層好適な約１５０μｇ／ｍＬ超、もっとも好適な約１９０μｇ／ｍＬ超を意味する。  
【００９６】
好適な細胞培養は、合計約０．３〜２．０×１０６個の間の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約０．３５〜１．９×１０６個の間の細胞／ｍＬ、よりさらに好ましくは約０．４〜１．８×１０６個の間の細胞／ｍＬ、さらに一層好ましくは約０．４５〜１．７×１０６個の間の細胞／ｍＬ、もっとも好ましくは約０．５〜１．５×１０６個の間の細胞／ｍＬの細胞を有する。好適な細胞は、当業者によって決定可能である。好適な細胞は、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２  ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質を発現する適切な組換えウイルスベクターへの感染に対して感染性のあるものである。好ましくは、細胞は、昆虫細胞であり、さらに好ましくは、これらは、Ｓｆ＋昆虫細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．）の商標の下販売されている昆虫細胞を含む。
【００９７】
適切な成長培地もまた、当業者によって決定可能であり、好適な成長培地は、Ｅｘ細胞４２０（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓ．）等の無血清昆虫細胞培地である。好適なウイルスベクターには、特に生成細胞が昆虫細胞である場合、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）等のバキュロウイルスが挙げられる。バキュロウイルス発現システムが好適であるが、他の発現システムが本発明の目的、すなわち細胞培養の上清内へのＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２の発現に機能するであろうことが当業者によって理解される。そのような他の発現システムは、培地へのＯＲＦ２発現を生じさせるために、シグナル配列の使用を必要とし得る。しかしながら、ＯＲＦ２がバキュロウイルス発現システムによって生成されるときには、一般に培地へのＯＲＦ２の発現を生じさせるための任意のシグナル配列またはさらなる改変は必要ではない。このタンパク質は、ウイルス様粒子を独立して形成することができ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０００，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．２２８１−２２８７）、培養上清内へ分泌され得ると考えられている。感受性のある細胞の感染に対して使用される場合、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２のＤＮＡ配列を含む組換えウイルスベクターは、約０．０３〜１．５、さらに好ましくは約０．０５〜１．３、よりさらに好ましくは約０．０９〜１．１、もっとも好ましくは約０．１〜１．０の間の好適な感染の多重度（ＭＯＩ）を有する。好ましくは、上述のＭＯＩは、１ｍＬの細胞培養流体に関する。好ましくは、本明細書に記載される方法は、０．３５〜１．９×１０６個の細胞／ｍＬ、よりさらに好ましくは約０．４〜１．８×１０６個の細胞／ｍＬ、さらに一層好ましくは約０．４５〜１．７×１０６個の細胞／ｍＬ、もっとも好ましくは約０．５〜１．５×１０６個の細胞／ｍＬのＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２  ＤＮＡを含む組換えウイルスベクターへの感染を含み、約０．０３〜１．５、さらに好ましくは約０．０５〜１．３、よりさらに好ましくは約０．０９〜１．１、もっとも好ましくは約０．１〜１．０の間のＭＯＩ（感染の多重度）を有するＰＣＶ２分岐ＯＲＦタンパク質を発現する。
【００９８】
次いで、感染細胞を、最大１０日、さらに好ましくは約２日〜約１０日、よりさらに好ましくは約４日〜約９日、もっとも好ましくは約５日〜約８日の期間にわたって培養する。好適な培養状態には、約２２〜３２℃、さらに好ましくは約２４〜３０℃、よりさらに好ましくは約２５〜２９℃、さらに一層好ましくは約２６〜２８℃、もっとも好ましくは約２７℃の間の温度が挙げられる。好ましくは、Ｓｆ＋細胞は、特徴バキュロウイルス誘導変化の植え付け後に観察する。そのような観察には、細胞密度傾向及び感染後期間中の生存率の減少の測定が含まれ得る。ピークウイルス価は、典型的に感染から３〜５日後に観察され、細胞から上清内へのピークＯＲＦ２放出は、典型的に５〜８日目の間及び／または細胞生存率が１０％未満に減少したときに得られる。
【００９９】
好ましくは、回収プロセスは、分離ステップを介して、培地で発現したＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２ポリペプチドからの細胞残屑の分離から始める。好適な分離ステップには、濾過、最大約２０，０００×ｇの速度での遠心分離、連続流入遠心法、イオン交換またはゲル濾過を用いるクロマトグラフ分離、及び従来の免疫親和法が挙げられる。これらの方法は、当業者に知られている（例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌ（ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ−−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  １９９５）。好適な濾過方法には、中空糸濾過法を含むデッドエンド精密濾過法及びタンジェント流（または十字流）濾過法が挙げられる。これらの中でも、デッドエンド精密濾過法が好適である。デッドエンド精密濾過法の好適な細孔の大きさは、約０．３０〜１．３５μｍの間、さらに好ましくは約０．３５〜１．２５μｍの間、よりさらに好ましくは約０．４０〜１．１０μｍの間、もっとも好ましくは約０．４５〜１．０μｍの間である。
【０１００】
免疫原性またはワクチン等の免疫学的組成物に使用されるであろう組換えＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２ポリペプチドの回収のためには、不活性化ステップを含めることが、ウイルスベクターを不活性化するために好適である。好ましくは、この不活性化は、濾過ステップの直前か直後のいずれかに行われ、濾過ステップ後が不活性化に好適な時間である。任意の従来の不活性化方法が、本発明の目的のために使用され得る。したがって、不活性化は、化学的及び／または物理的処置によって実施され得る。好適な形態において、採取流体の体積を決定し、温度を、約３２〜４２℃の間、さらに好ましくは約３４〜４０℃の間、もっとも好ましくは約３５〜３９℃の間にもっていく。好適な不活性化方法には、好ましくは約１〜約２０ｍＭ、好ましくは約２〜約１０ｍＭ、よりさらに好ましくは約２〜約８ｍＭ、よりさらに好ましくは約３〜約７ｍＭ、もっとも好ましくは約５ｍＭの濃度の環化バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）添加が挙げられる。例えば不活性化には、約５ｍＭのＢＥＩの最終濃度を得るために、０．３ＮのＮａＯＨ中で０．２Ｍのバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）に環化された、好ましくは約０．４Ｍの２−ブロモエチレンアミン（ｂｒｏｍｏｅｔｈｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ）臭化水素酸塩の溶液の、流体への添加が挙げられる。好ましくは、次いで流体が、７２〜９６時間連続的に撹拌され、不活化採取流体は、−４０℃以下または約１〜７℃の間で冷凍保存され得る。不活性化の完了後、好ましくは１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液が、添加され、任意の残基ＢＥＩを中和させる。好ましくは、不活性化のために先に添加されたＢＥＩと比較して、当量のチオ硫酸ナトリウムが添加される。例えば、ＢＥＩが５ｍＭの最終濃度に添加される場合、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液が、５ｍＭの最終最低濃度を得るために添加され、任意の残基ＢＥＩを中和させる。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質及び不活化ウイルスベクターを含む組成物の調製方法に関する。この方法は、ｉ）増幅ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２遺伝子を移入ベクター内にクローニングするステップと、ｉｉ）組換えＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２遺伝子を含む移入ベクターの部分を、ウイルス内に導入するステップと、ｉｉｉ）培地の細胞を導入したウイルスベクターで感染させるステップと、ｉｖ）導入したウイルスベクターに、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２遺伝子からＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２組換えタンパク質を発現させるステップと、ｖ）上清から細胞を分離するステップと、ｖｉ）発現したＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質を上清から回収するステップと、ｖｉｉ）組換えウイルスベクターを不活性化するステップとを含む。好ましくは、組換えウイルスベクターは、バキュロウイルス含有ＯＲＦ２のＤＮＡコード配列であり、細胞は、Ｓｆ＋細胞である。好適な分離ステップは、上述のものであり、もっとも好適なものは、濾過ステップである。好適な不活性化ステップは、上述のものである。好ましくは、不活性化は、約３５〜３９℃の間で、２〜８ｍＭのＢＥＩの存在下、よりさらに好適には約５ｍＭのＢＥＩの存在下で実施される。好ましくは、不活性化は、少なくとも２４時間、さらに一層好適には２４〜７２時間実施される。
【０１０２】
さらなる態様に従って、ＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２タンパク質及び不活化ウイルスベクターを含む組成物の調製方法は、上述のとおり、ステップｖｉｉ）の後に、中和ステップも含む。このステップｖｉｉｉ）は、溶液内で不活性化剤を中和する当量の作用剤を添加することを含む。好ましくは、不活性化剤がＢＥＩである場合、当量のチオ硫酸ナトリウムの添加が好適である。さらなる態様に従って、ステップｖｉｉｉ）は、不活性化剤がＢＥＩである場合、約１〜約２０ｍＭ、好ましくは約２〜約１０ｍＭ、よりさらに好ましくは約２〜約８ｍＭ、よりさらに好ましくは約３〜約７ｍＭ、もっとも好ましくは約５ｍＭの最終濃度に、チオ硫酸ナトリウム溶液を添加するステップを含む。
【０１０３】
本発明の別の態様において、ＰＣＶ２分岐株に対する免疫反応を誘導するための組成物、好ましくは、例えばワクチン等の抗原性組成物の調製方法が提供される。一般に、この方法は、構築物をウイルス内に導入するステップを含み、この構築物は、ｉ）ＰＣＶ２分岐株のＯＲＦ２からの組換えＤＮＡと、ｉｉ）成長培地の細胞を導入したウイルスで感染させることと、ｉｉｉ）ウイルスにＰＣＶ２分岐ＯＲＦ２から組換えタンパク質を発現させることと、ｉｖ）発現したＯＲＦ２タンパク質を上清から回収することと、ｖ）回収されたタンパク質に好適なアジュバント及び／または他の薬学的に許容される担体を混合することによって、組成物を調製することとを含む。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明に従った好適な材料及び手順を記載する。しかしながら、これらの実施例は、単に例証として提供され、これらのいずれも、本発明の全範囲への制限であるとみなされるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：キメラブタサーコウイルス（ｃＰＣＶ）１−２の生成方法
非病原性ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のゲノム骨格内に、（「ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ」と名付けられた）病原性ブタサーコウイルス２ｂ型分岐株の免疫原性キャプシド遺伝子を、ｃＰＣＶ１−２をクローニングすることにより構築する。キメラＤＮＡクローンの構築手順は、例えば、米国特許第７，２７９，１６６号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。０．０５％のラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン、及び５％のウシ胎仔血清を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で成長したブタの腎臓（ＰＫ）−１５細胞に感染させるのに、キメラウイルスの感染性ストックを使用する。２〜３％のウシ胎仔血清を用いることを除き、同じ成長培地を使用して、得られたｃＰＣＶ１−２感染ＰＫ−１５細胞をあと４回連続継代することにより、さらに増殖させる。第５継代を冷凍、解凍、及び濾過し、得られた溶解物を、プレマスターシード及び後続マスターシードを調製するのに使用する。
【０１０６】
ウイルスシードを生成するのに使用する培地は、ウイルスストックを生成するのに使用するものと同じである。成長培地について、ＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、または同等のものが、増生のためにＰＫ−１５細胞株を植えるのに使用することができる基本培地である。成長培地には、最大１０％のウシ血清、最大０．５％のラクトアルブミン加水分解物、最大０．５％のウシ血清アルブミン、及び最大３０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充することができる。ウイルス増殖培地について、ＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、または同等のものを使用する。ウイルス増殖培地には、最大０．５％のラクトアルブミン加水分解物、最大２％のウシ血清、最大０．５％のウシ血清アルブミン、及び最大３０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充することができる。細胞を持続させるために必要に応じて、最大５ｇ／Ｌのグルコース及び最大５ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンを、成長培地及び／またはウイルス増殖培地に添加することができる。
【０１０７】
ｃＰＣＶ１−２マスターシードウイルスを、ＰＫ−１５細胞の細胞懸濁液に添加し、最大３時間吸収させる。シードウイルスを、成長基本培地内で希釈し、０．１〜０．２の感染の多重度（ＭＯＩ）を提供する。
【０１０８】
細胞を植える際か、細胞がおよそ２０％〜５０％の密集度に達したときに、ＰＫ−１５細胞の培養を、最初はワーキングシードウイルスとともに植え付ける。この最初の継代は、抗原ストックの生成のための「ワンステップ感染法」と称され得るか、または連続継代のためにさらに使用してもよい。連続継代に関しては、ｃＰＣＶ１−２感染ＰＫ−１５細胞は、１：５〜２０のウイルス増殖率での連続分割によって、最大継代７までさらに増殖する。前の継代からの感染細胞懸濁液を含有する培地は、次の継代のためのシード材料として機能する。細胞が≧９０％密集度に達したら、ｃＰＣＶ１−２感染細胞を、３６±２℃でそれぞれの継代について３〜１４日間培養する。ｃＰＣＶ１−２ウイルスは、ウイルス複製の間、観察可能な細胞変性病変を生じる。採取時には、細胞の円形化及び多量の浮遊残屑が観察される。培養では、細菌及び真菌汚染の目に見える痕跡も観察される。ｃＰＣＶ抗原の採取と採取との間の培養時間は、下記表１に提供される。
【０１０９】
【表１】
2016531854.tif 000003
【０１１０】
ｃＰＣＶ１−２培養流体を、滅菌槽に採取し、既知の方法を用いてマイコプラズマ汚染のための試料採取をする。複数の採取は、ローラーボトル、生物反応器、及び灌流槽から行われてもよい。
【０１１１】
採取したｃＰＣＶ１−２ウイルスの不活性化の前に、１つ以上の抗原ロットが、限外濾過によって濃縮されてもよい（例えば、最大６０倍）。濃縮物を平衡塩類溶液で洗浄し、血清タンパク質を還元してもよい。
【０１１２】
ｃＰＣＶ１−２ウイルスの不活性化、弱毒化、または無毒化方法は、これより記載される。ｃＰＣＶ抗原濃縮後、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を、プールｃＰＣＶ１−２ウイルス性物質に添加し、０．２％ｖ／ｖの近似の濃度を得る。次いで、プールウイルス流体を最低１５分間かき混ぜ、次いで、不活性化バルク抗原流体を、第２の滅菌槽に移入する。移入した抗原流体を、最低２４時間、一定で撹拌しながら２〜７℃で維持する。最低２４時間後、０．２％ｖ／ｖのＢＰＬの第２の添加を、プール懸濁液に添加する。内容物を、続いてかき混ぜ、第３の槽に移入し、８４時間以上の追加時間一定で撹拌しながら２〜７℃で維持する。一般に、総不活性化時間は、１０８時間以上１２０時間以下である。不活性化方法は、下記表２に要約される。
【０１１３】
【表２】
2016531854.tif 000004
【０１１４】
チオ硫酸ナトリウムの最終濃度０．１Ｍ以下の溶液の添加によって、不活性化を終了させる。ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、不活化抗原ストックのｐＨを、約６．８に調整する。不活性化に続き、代表的試料をプールから取り、不活性化の完了を試験する。力価ＥＬＩＳＡを介して測定される１．０ＲＰ超の目標を達成するために、不活化ｃＰＣＶ１−２抗原生成物を標準化する。一実施形態において、最終組成物は、不活化ｃＰＣＶ１−２ｂウイルスを、好適なアジュバント及び／または他の薬学的に許容される担体と混合することにより調製される。
【０１１５】
実施例２：組換えＰＣＶ２ｂ分岐キャプシドタンパク質の生成方法
サブユニットワクチンの生成は、２段階プロセスの結果である：第１に、バキュロウイルス発現システムにおけるＯＲＦ２サブユニット抗原の生成、第２に、最終生成物の製剤化／製造。最初のステップ（組換えバキュロウイルス構築及びＯＲＦ２抗原の生成）について、使用される基本の技術プロセスが、これより記載される。ＰＣＶ２ｂ分岐株からのＯＲＦ２遺伝子の発現のために、バキュロウイルス発現システムを使用する。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを、以下の通り生じさせる：ウイルスＤＮＡを、本明細書で「ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ」として同定されるＰＣＶ２ｂ分岐株感染ＰＫ−１５細胞から単離する。このＰＣＶ２ｂ分岐株からのＯＲＦ２遺伝子を、５フィートのコザック配列（ｃｃｇｃｃａｔｇ）及び３フィーとのＥｃｏＲ１部位（ｇａａｔｔｃ）を含むためにＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）へとクローニングする。次いで、続いてこれを摘出し、移入ベクターｐＶＬ１３９２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）へとサブクローニングする。次いで、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２遺伝子を含むｐＶＬ１３９２プラスミドを、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）バキュロウイルスＤＮＡとともに、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｆ＋）昆虫細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．）内へ共導入し、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを生じさせる。このＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを、プラーク純化し、マスターシードウイルス（ＭＳＶ）を、ＳＦ＋細胞株上で増殖させ、等分し、−７０℃で貯蔵する。バキュロウイルス特異的プライマを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰにより、ＭＳＶを、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２バキュロウイルスとして、明白に同定した。ＭＳＶまたはワーキングシードウイルスを生じさせるための、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞は、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原を発現するウサギ中でＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴに対して作成された過免疫血清を用いて免疫測定法によってか、またはモノクローナル抗体を用いて間接蛍光抗体法で、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴのＯＲＦ２遺伝子の発現を確認する。あるいは、ＰＣＶ２ｂ分岐株と交差反応する典型的なＰＣＶ２ａまたはＰＣＶ２ｂに対して作成された抗体を用いて、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴのＯＲＦ２遺伝子の発現を、免疫測定法によって確認する。さらに、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２バキュロウイルスの同一性を、Ｎ端末アミノ酸配列決定によって確認する。ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２バキュロウイルスＭＳＶは、連邦規則９Ｃ．Ｆ．Ｒ．１１３．２７（ｃ）、同１１３．２８、及び同１１３．５５に従って、純度も試験した。
【０１１６】
ＰＣＶ２  ＯＲＦ２のＤＮＡ配列を含む組換えウイルスベクターは、感受性のある細胞の感染に対して使用される場合、約０．０３〜１．５、さらに好ましくは約０．０５〜１．３、よりさらに好ましくは約０．０９〜１．１、もっとも好ましくは約０．１〜１．０の間の好適な感染の多重度（ＭＯＩ）を有する。好ましくは、本明細書に記載される方法は、０．３５〜１．９×１０６個の細胞／ｍＬ、よりさらに好ましくは約０．４〜１．８×１０６個の細胞／ｍＬ、さらに一層好ましくは約０．４５〜１．７×１０６個の細胞／ｍＬ、もっとも好ましくは約０．５〜１．５×１０６個の細胞／ｍＬのＰＣＶ２  ＯＲＦ２  ＤＮＡを含む組換えウイルスベクターへの感染を含み、約０．０３〜１．５、さらに好ましくは約０．０５〜１．３、よりさらに好ましくは約０．０９〜１．１、もっとも好ましくは約０．１〜１．０の間のＭＯＩ（感染の多重度）を有するＰＣＶ２  ＯＲＦタンパク質を発現する。
【０１１７】
次いで、感染細胞を、最大１０日、さらに好ましくは約２日〜約１０日、よりさらに好ましくは約４日〜約９日、もっとも好ましくは約５日〜約８日の期間にわたって培養する。好適な培養状態には、約２２〜３２℃、さらに好ましくは約２４〜３０℃、よりさらに好ましくは約２５〜２９℃、さらに一層好ましくは約２６〜２８℃、もっとも好ましくは約２７℃の間の温度が挙げられる。好ましくは、Ｓｆ＋細胞は、特徴バキュロウイルス誘導変化の植え付け後に観察する。そのような観察には、細胞密度傾向及び感染後期間中の生存率の減少の測定が含まれ得る。ピークウイルス価は、典型的に感染から３〜５日後に観察され、細胞から上清内へのピークＯＲＦ２放出は、典型的に５〜８日目の間及び／または細胞生存率が１０％未満に減少したときに得られる。
【０１１８】
一実施形態において、１０００ｍＬのスピナーフラスコに、３００ｍＬのＥｘ細胞４２０培地におよそ１．０×１０６Ｓｆ＋個の細胞／ｍｌが播種される。次いで、このフラスコを２７℃で培養し、１００ｒｐｍでかき混ぜる。続いて、フラスコに、０．１ＭＯＩを有するＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２／Ｂａｃ（ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルス）ウイルスシードを、培養の２４時間後に播種する。
【０１１９】
次いで、フラスコを、２７℃で合計６日間培養する。培養後、フラスコの内容物を、遠心分離機にかけ、得られた上清を採取し、０．４５〜１．０μｍの細孔サイズの膜を通過させて精密濾過し、不活化する。上清の温度を３７＋／−２℃にもっていき、上清に１０ｍＭのバイナリーエチリレンイミン（ｅｔｈｌｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）を添加することによって、上清を不活性化する。次いで、上清を４８時間連続して撹拌する。５ｍＭの最終的な最低濃度を得るために、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液を添加し、任意の残基ＢＥＩを中和する。次いで、中和した上清中のＯＲＦ２の量を、Ｅｉｃｈｍｅｙｅｒらへの米国特許第７，７００，２８５号の実施例１に記載されるもののような、ＥＬＩＳＡ測定手順を用いて定量化する。使用した検出抗体は、ＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２キャプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体である。
【０１２０】
本発明は、組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２の小規模生成から、組換えＰＣＶ２ｂ分岐ＯＲＦ２の大規模生成まで拡張可能である。
【０１２１】
ワクチン生成の第２の段階は、最終生成物の製剤化／製造である。ブレンドの計画は、ａ）１回の用量あたりの固定抗原含有量、及びｂ）少なくとも１つのアジュバントの定量に基づく。一実施形態において、最終生成物の剤型は、水中油エマルションに相当する。最終ワクチンを調製するために、アジュバントを抗原画分に添加し、均質のエマルションが得られるまで、撹拌する。十分な均質性の兆候が提供される。１バッチのワクチンが、特許請求の有効性をもたらすであろうことを確実にするために、その相対的効力を有効な生体内アッセイ法によって決定する。実施する分析に基づき、力価試験は、通常の効力より弱いバッチを検出することが可能である。
【０１２２】
実施例３：不活化ＰＣＶ２ｂ分岐全ウイルスの生成方法
ＰＣＶ２ｂ分岐ウイルスの感染性ストック：０．０５％のラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン、及び５％のウシ胎仔血清を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）内で成長したブタの腎臓（ＰＫ）−１５細胞に、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴを感染させるのに使用する。０．５〜３％のウシ胎仔血清を用いることを除き、同じ成長培地を使用してさらに４回連続継代することにより、得られたＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ感染ＰＫ−１５細胞を、さらに増殖させる。第５継代を冷凍、解凍、及び濾過し、得られた溶解物を、プレマスターシード及び後続マスターシードを調製するのに使用する。  
【０１２３】
ウイルスシードを生成するのに使用する培地は、ウイルスストックを生成するのに使用するものと同じである。成長培地について、ＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、または同等のものが、増生のためにＰＫ−１５細胞株を植えるのに使用することができる基本培地である。成長培地には、最大１０％のウシ血清、最大０．５％のラクトアルブミン加水分解物、最大０．５％のウシ血清アルブミン、及び最大３０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充することができる。ウイルス増殖培地については、ＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、または同等のものを使用する。ウイルス増殖培地には、最大０．５％のラクトアルブミン加水分解物、最大２％のウシ血清、最大０．５％のウシ血清アルブミン、及び最大３０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充することができる。細胞を持続させるために必要に応じて、最大５ｇ／Ｌのグルコース及び最大５ｍｍｏｌ／ＬのＬグルタミンを、成長培地及び／またはウイルス増殖培地に添加することができる。
【０１２４】
ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴマスターシードウイルスを、ＰＫ−１５細胞の細胞懸濁液に添加し、最大３時間吸収させる。シードウイルスを、成長基本培地内で希釈し、０．１〜０．２の感染の多重度（ＭＯＩ）を提供する。
【０１２５】
細胞を植える際か、細胞がおよそ２０％〜５０％の密集度に達したときに、ＰＫ−１５細胞の培養を、最初はワーキングシードウイルスとともに植え付ける。この最初の継代は、抗原ストックの生成のための「ワンステップ感染法」と称され得るか、または連続継代のためにさらに使用してもよい。連続継代について、感染ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ  ＰＫ−１５細胞は、１：５〜２０のウイルス増殖率での連続分割によって、最大継代７までさらに増殖する。前の継代からの感染細胞懸濁液を含有する培地は、次の継代のためのシード材料として機能する。細胞≧９０％密集度に達したら、ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ感染細胞を、３６±２℃で、それぞれの継代に対して３〜１４日間培養する。ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴウイルスは、ウイルス複製の間、観察可能な細胞変性病変を生じ得る。採取時には、細胞の円形化及び多量の浮遊残屑が観察される。培養では、細菌及び真菌汚染の目に見える痕跡も観察される。ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ抗原の採取と採取との間の培養時間は、下記表１に提供される。
【０１２６】
ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ培養流体を、滅菌槽に採取し、既知の方法を用いてマイコプラズマ汚染の試料採取をする。複数の採取は、ローラーボトル、生物反応器、及び灌流槽から行われてもよい。
【０１２７】
採取したＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴウイルスの不活性化の前に、１つ以上抗原ロットが、限外濾過によって濃縮されてもよい（例えば、最大６０倍）。濃縮物を平衡塩類溶液で洗浄し、血清タンパク質を還元してもよい。
【０１２８】
ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴウイルスの不活性化、弱毒化、または無毒化方法は、上記実施例１及び表２に記載されるものと同じである。不活性化を、チオ硫酸ナトリウムの最終濃度０．１Ｍ以下の溶液の添加によって終了させる。ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、不活化抗原ストックのｐＨを、約６．８に調整する。不活性化に続き、代表的試料をプールから取り、不活性化の完了を試験する。力価ＥＬＩＳＡを介して測定される１．０ＲＰ超の目標を達成するために、不活化ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴ抗原生成物を標準化する。一実施形態において、最終組成物は、不活化ＰＣＶ２Ｂ−ＤＩＶ−ＭＵＴウイルスを、好適なアジュバント及び／または他の薬学的に許容される担体と混合することにより、調製される。
【０１２９】
実施例４：ＰＣＶ２ｂの原理証明研究
本研究の目的は、同種保護及び異種保護のためのＰＣＶ２ｂ分岐の候補ワクチンを評価することであった。研究設計は、表３に概説される。Ｔ０４、Ｔ０８、及びＴ１２のＩＶＰは、１０％のＳＰ油でアジュバント化された死滅ＰＣＶ２ｂ分岐ウイルスからなる。Ｔ０２、Ｔ０６、及びＴ１０のＩＶＰは、１０％のＳＰ油でアジュバント化された死滅キメラＰＣＶ１：２ａウイルスからなる。Ｔ０３、Ｔ０７、及びＴ１１のＩＶＰは、１０％のＳＰ油でアジュバント化された死滅キメラＰＣＶ１：２ｂウイルスからなる。
【０１３０】
【表３】
2016531854.tif 000005
【０１３１】
ブタは、ワクチン接種した０日目に、３〜４週齢の間であった。単回用量の２ｍＬの指定のワクチンを、首の右側内の筋肉内（ＩＭ）に投与した。１インチまたは３／４インチ針を有する単一の３ｍＬ滅菌注射器を各ブタに使用した。ワクチン接種の詳細を記録した。ブタを、各ワクチン接種後、昏睡、努力性呼吸、嘔吐、及び協調運動失調を含むが、これらに限定されない異常な臨床徴候を１時間（±３０分）以内に観察した。観察されたあらゆる臨床徴候を、一般健康用紙に記録した。獣医師に、全体的な不調及び健康の悪化の徴候を示した２匹のブタの経過観察をするように通知した。これらの動物を、人道的に安楽死させた。
【０１３２】
ブタが約６〜７週齢である２１日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に４．８〜５．８ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈した合計３ｍＬのそれぞれのチャレンジウイルスを、各鼻孔の鼻腔内（ＩＮ）に１ｍＬずつと、筋肉内（ＩＭ）に１ｍＬを投与して、植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスをチャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。
【０１３３】
−１日目（ワクチン接種前）ならびに７日目、１４日目、２０／２１日目、２８日目、３５日目、及び４２日目に血清分離管（ＳＳＴ）に、個々の血液試料（５〜１０ｍＬ）を採取した。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵して、後にＥＬＩＳＡによってＰＣＶ２抗体力価を、ｑＰＣＲによってＰＣＶ２ウイルス血症を試験した。
【０１３４】
個々の糞便拭き取り検体も、チャレンジ前（２０／２１日目）及びチャレンジ後週１回、各ブタからとった。個々の滅菌ポリエステル綿棒を、糞便拭き取り検体を採取するのに使用し、３ｍＬの滅菌ＰＢＳ培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に５秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量ＰＣＲ手順により、ウイルス排出の試験をした。
【０１３５】
検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片も２連で採取し、個々に同定し、１０％の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は保存し、もう一組は、リンパ球枯渇（ＰＣＶＡＤ）及び組織球性置換（組織球性置換）のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有（＋）または無（−）として記録した。ブタが、１つ以上の組織が「＋」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、ＩＨＣによってＰＣＶ２抗原の試験もした。結果を、０（染色なし）及び１〜３（染色の異なるレベル）として、記録した。０点は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（−）としてみなし、１点以上は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（＋）としてみなした。ブタが、１つ以上の組織がＩＨＣ（＋）であった場合、ＩＨＣ（＋）とみなした。
【０１３６】
プラシーボと比較して、主な成果は、候補ワクチンの同種及び異種保護であった。主要変数は、ウイルス血症であり、副次変数は、糞便排出及び組織病理学的病変であった。
【０１３７】
結果は、表４及び表５に示したとおり、チャレンジ前には、ブタが、ＰＣＶ２ウイルス血症及び糞便排出が陰性のままだったことを示した。しかしながら、研究を通して、ＰＣＶ２ウイルス血症（表４）及びＰＣＶ２糞便排出（表５）の定量ＰＣＲによって評価されたとおり、すべての処置群のすべてのブタが、ある時点でＰＣＶ２陽性になった。
【０１３８】
【表４】
2016531854.tif 000006
【０１３９】
【表５】
2016531854.tif 000007
【０１４０】
ＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡによって測定して、チャレンジ前力価は、すべての処置群の最小二乗（ＬＳ）平均力価が、ＰＣＶ２抗体陰性であったことを示した（表６）。ＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡ抗体力価＞０．５は、ＰＣＶ２抗体陽性であるとみなされた。
【０１４１】
【表６】
2016531854.tif 000008
【０１４２】
実験的なＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン処置（Ｔ０４、Ｔ０８、及びＴ１２）は、ＰＣＶ２ウイルス血症（表４）及び糞便排出を数値的に減少させた（表５）。これはまた、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）点（表７）、及びリンパ球枯渇点（表８）によって示されるとおり、プラシーボと比較して、ほとんどの時点で組織病理学的病変の減少をもたらした。チャレンジ後、ＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡ抗体力価におけるわずかな既往反応が、すべてのチャレンジ群で観察され（表６）、ワクチン抗原用量に、さらなる最適化が必要であったことを示唆している可能性がある。この研究で統計的な比較は行わなかったが、ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン処置が、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、及びＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジ株に対して保護したことは明白である。
【０１４３】
ＰＣＶ２ワクチンの有効性の評価において、多くの人が、ウイルス血症及びリンパ球枯渇を、測定のためのキーパラメータとなるとみなしている。この研究において、ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチンが、ＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジに対して、ＰＣＶ２ａまたはＰＣＶ２ｂワクチンのいずれかが収めた成績よりも、数値的によりよい成績を収めたことに気付くことが重要である。
【０１４４】
【表７】
2016531854.tif 000009
【０１４５】
【表８】
2016531854.tif 000010
【０１４６】
実施例５：ＰＣＶ２ｂチャレンジモデル最適化研究
この研究の目的は、ＰＣＶ２ｂチャレンジ物質の滴定及び投与経路を評価することであった。さらに、新規のＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジ調製物の予備評価を、現在有効なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂチャレンジモデルと並行して行った。研究設計の概説が、表９に示される。
【０１４７】
【表９】
2016531854.tif 000011
【０１４８】
０日目におよそ６週齢で、ＰＣＶ２に対する血清抗体が低程度から陰性、かつＰＣＶ２ウイルス血症のない交雑ブタを、分離した空気の空間を有するＢＳＬ−２施設内の指定の囲い／部屋内に配置した。３つの部屋のそれぞれ内に、１つの囲いあたり１２頭のブタが入っている４つの囲いがあった。ブタは、研究を通して、指定の囲いにとどまった。研究を通して、ブタには、水及び非薬用の年齢に応じた完全飼料への不断アクセスがあった。すべてのブタを、最低３日間、順応させた。
【０１４９】
ブタが約６週齢である０日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に４．０〜６．０＋／−０．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈した合計３ｍＬのそれぞれのチャレンジウイルスを、処置群によって、２ｍＬを各鼻孔の鼻腔内（ＩＮ）及び１ｍＬを筋肉内（ＩＭ）に、または３ｍＬをＩＮに投与して、植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスをチャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。
【０１５０】
−２１日目、−１日目（ワクチン接種前）ならびに７日目、１４日目、及び２１日目に、個々の血液試料（５〜１０ｍＬ）を血清分離管（ＳＳＴ）に採取した。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。−２１日目、−１日目、７日目、１４日目、及び２１日目の血清を、ＥＬＩＳＡによってＰＣＶ２抗体力価を、ｑＰＣＲによってＰＣＶ２ウイルス血症を試験した。
【０１５１】
チャレンジ前（−１日目）及びチャレンジ後週１回、個々の糞便拭き取り検体を各ブタからとった。糞便拭き取り検体を採取するのに、個々の滅菌ポリエステル綿棒を使用し、３ｍＬの滅菌ＰＢＳ培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に５秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量ＰＣＲ手順により、ウイルス排出の試験をした。
【０１５２】
検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片を２連で採取し、個々に同定し、１０％の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は、リンパ球枯渇（ＰＣＶＡＤ）及び組織球性置換（組織球性置換）のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有（＋）または無（−）として記録した。ブタは、１つ以上の組織が「＋」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、ＩＨＣによってＰＣＶ２抗原の試験もした。結果を、０（染色なし）及び１〜３（染色の異なるレベル）として、記録した。０の点数は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（−）としてみなし、１点以上は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（＋）としてみなした。ブタが、１つ以上の組織がＩＨＣ（＋）であった場合、ＩＨＣ（＋）とみなした。
【０１５３】
ＰＣＶ疫学の実際の複雑さ及びＰＣＶ２  ｑＰＣＲの感受性に起因して、数頭のブタがチャレンジ前にウイルス血症になる可能性がある。チャレンジ前にウイルス血症の試験をするブタは、研究から除去してもよく、臨床出資者の裁量に基づいて、データ分析に含めなくてもよい。
【０１５４】
主な成果は、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂの有効なモデルと比較して試験した、ＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジ分離株であった。
結果
ＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジ分離株を投与された動物は、処置群全体において、チャレンジ前から研究の終了までに、抗体力価の上昇があった。不希釈チャレンジ群と、続いてＴ１２群（１：５で希釈、ＩＮに投与）が、チャレンジ後１４日にピークウイルス血症を示し、それぞれ４００万個超及び１００万個超のＤＮＡコピー数／ｍＬを有していた。不希釈チャレンジ物質のピークＰＣＶ２排出は、７５４，１１４個のＤＮＡコピー数／ｍＬであった。不希釈ＩＭ／ＩＮ及び１：５のＩＮのみは、組織病理学的異常及びＰＣＶ２コロニー形成に対して、陽性の動物の最大数をもたらした。
【０１５５】
このＰＣＶ２ｂチャレンジ最適化研究から採取したデータに基づいて（データは示さず）、チャレンジ経路及び用量を、３ｍＬの鼻腔内に変更した。チャレンジ経路及び用量の変更は、筋肉内投与によって引き起こされ、受けるチャレンジ全体を上昇させると考えられる有害事象の確率を減少させると考えられた。
【０１５６】
実施例６：ＰＣＶ２ｂチャレンジに対する２つのワクチン候補の評価
本研究の目的は、キメラＰＣＶ２ｂワクチン及びＰＣＶ２ｂ分岐ワクチンの、ＰＣＶ２ｂチャレンジに対する保護を評価することであり、それぞれが、低抗原用量及び高抗原用量で表される。本研究設計は、表１０に概説される。プラシーボ（Ｔ０１）は、１０％のＳＰ油であった。ＩＶＰは、以下の通りであった：Ｔ０２、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ１：ＰＣＶ２ｂキャプシドキメラ低用量（ｃＰＣＶ２ｂ低）；Ｔ０３、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ１：ＰＣＶ２ｂキャプシドキメラ高用量（ｃＰＣＶ２ｂ高）；Ｔ０４、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン低用量（ＰＣＶ２ｂＤＩＶ低）；Ｔ０５、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン高用量（ＰＣＶ２ｂＤＩＶ高）。ワクチンを、２０倍濃縮抗原を用いて生成し、次いで０．６９％の抗原投入量＝低用量または３．００％の抗原投入量＝高用量で、ワクチンを製剤化した。
【０１５７】
【表１０】
2016531854.tif 000012
【０１５８】
ブタは、ワクチン接種の０日目に約３週齢（生後２１±７日）だった。処置投与者が、単回用量の２ｍＬの指定のワクチンを、首の右側の筋肉内（ＩＭ）に投与した。１インチまたは３／４インチ針を有する単一の３ｍＬ滅菌注射器を各ブタに使用した。ワクチン接種の詳細を記録した。ブタを、各ワクチン接種後、昏睡、努力性呼吸、嘔吐、及び協調運動失調を含むが、これらに限定されない異常な臨床徴候を１時間（±３０分）以内に観察した。観察されたあらゆる臨床徴候を、一般健康用紙に記録した。獣医師に、上述の徴候のいずれかを示すブタ（複数可）の経過観察をするように通知した。
【０１５９】
ブタが約６週齢だった２１日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に４．８〜５．８ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈した合計３ｍＬの毒性ＰＣＶ２ｂ株の培養を、鼻腔内（ＩＮ）に植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスを、チャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。
【０１６０】
−１日目（ワクチン接種前）、ならびに７日目、１４日目、２０／２１日目、２８日目、３５日目、及び４２日目に、個々の血液試料（５〜１０ｍＬ）を、血清分離管（ＳＳＴ）に採取した。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。これらを、ＥＬＩＳＡによってＰＣＶ２抗体力価を、ｑＰＣＲによってＰＣＶ２ウイルス血症を、後ほど試験した
チャレンジ前（２０／２１日目）、及びチャレンジ後週１回、個々の糞便拭き取り検体を各ブタからとった。糞便拭き取り検体を採取するのに、個々の滅菌ポリエステル綿棒を使用し、３ｍＬの滅菌ＰＢＳ培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に５秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量ＰＣＲ手順により、ウイルス排出の試験をした。
【０１６１】
検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片を２連で採取し、個々に同定し、１０％の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は保存し、もう一組は、リンパ球枯渇（ＰＣＶＡＤ）及び組織球性置換（組織球性置換）のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有（＋）または無（−）として記録した。ブタは、１つ以上の組織が「＋」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、ＩＨＣによってＰＣＶ２抗原の試験もした。結果を、０（染色なし）及び１〜３（染色の異なるレベル）として、記録した。０点は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（−）としてみなし、１点以上は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（＋）としてみなした。ブタは、１つ以上の組織がＩＨＣ（＋）である場合、ＩＨＣ（＋）とみなした。
【０１６２】
プラシーボと比較して、主な成果は、ＰＣＶ２ｂチャレンジに対する４つの候補ワクチンのうちの１つの保護だった。主要変数は、ウイルス血症であり、副次変数は、糞便排出及び組織病理学的病変であった。
結果
ＰＣＶ２ウイルス血症
血清を、週１回採取し、定量ＰＣＲによってＰＣＶ２ウイルス血症を分析した。各研究日の幾何最小二乗平均が、図２に例示される。すべてのブタが、下記表１１に示したとおり、チャレンジ前はＰＣＶ２ウイルス血症に対して陰性のままだった。
【０１６３】
【表１１】
2016531854.tif 000013
【０１６４】
処置及びチャレンジによるＰＣＶ２ウイルス血症（ＤＮＡコピー数）は、下記表１２に記載される。すべての処置群は、チャレンジ後の３５日目及び４４日目にＴ０１群と著しく異なった（Ｐ＜０．０００１）。
【０１６５】
研究の過程を通して終始陽性だった動物のパーセントは、下記（表１２）に列挙される。プラシーボ群は、ワクチン投与を受けた群と比較して、著しく多い数の終始陽性だった動物を有した（Ｐ＜０．０１２４）。
【０１６６】
【表１２】
2016531854.tif 000014
【０１６７】
ＰＣＶ２糞便排出
研究日別の糞便排出幾何最小二乗平均は、図３に例示される。処置及びチャレンジによるＰＣＶ２糞便排出（ＤＮＡコピー数）は、下記表１３に記載される。すべての処置群は、チャレンジ後の３５日目及び４４日目にＴ０１群と著しく異なった（Ｐ＜０．０００１）。
【０１６８】
【表１３】
2016531854.tif 000015
【０１６９】
研究の過程を通して排出が終始陽性だった動物のパーセントは、下記（表１４）に列挙される。プラシーボ群は、ワクチン投与を受けた群と比較して、著しく多い数の終始排出していた動物を有した（Ｐ＜０．０１２４）。
【０１７０】
【表１４】
2016531854.tif 000016
【０１７１】
血清抗体反応
研究日別の各処置のＰＣＶ２抗体力価平均を、図４に例示する。すべてのブタは、ワクチン接種前にＰＣＶ２血清反応陰性だった。プラシーボ群のブタは、チャレンジ前に血清反応陰性のままだった。
【０１７２】
ＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡ抗体力価は、下記表１５に要約される。すべての力価の＞０．５を、ＰＣＶ２抗体陽性であるとみなした。すべてのワクチン群のブタは、プラシーボと比較するとワクチン接種後２８〜４４日目にＰＣＶ２抗体力価の著しい増加（Ｐ≦０．０８９５）を示し、ワクチン接種後にＰＣＶ２に対する活発な免疫反応を示した。さらに、Ｔ０３及びＴ０５は、ワクチン接種後２０日目に著しくより高い力価を有した（それぞれＰ≦０．０６８４及びＰ≦０．０７３８）。
【０１７３】
【表１５】
2016531854.tif 000017
【０１７４】
病理組織学：リンパ球枯渇（ＬＤ）及びリンパ組織内のウイルス感染（ＩＨＣ）
リンパの病変及びＰＣＶ２抗原の存在を検討する際、ＰＣＶ２パーセント異常病理組織学点（データは示さず）は、プラシーボ群とワクチン投与を受けた群との間に有意差を示さなかった。
【０１７５】
この研究からのデータは、１）ワクチン接種の時点からチャレンジの時点まで、週１回の間隔で採取した血清中に、検出可能なＰＣＶ２  ＤＮＡがなく、２）Ｔ０１群間において、チャレンジ前にＰＣＶ２への任意の意図しない暴露があったという、血清学的証拠がないことによって証明されるとおり、２１日目のチャレンジまで、研究のすべてのブタが、ＰＣＶ２への無感染を維持していたことを示した。すべてのワクチンは、ワクチン投与を受けた動物が、チャレンジ後にウイルス血症になることから保護した。また、すべてのワクチンは、チャレンジ後の、ワクチン投与を受けた動物のＰＣＶ２の糞便排出を著しく低減した。すべてのワクチン群のブタは、プラシーボと比較すると、ワクチン接種後２８〜４４日目にＰＣＶ２抗体力価の著しい増加（Ｐ≦０．０８９５）を示し、ワクチン接種後にＰＣＶ２に対する活発な免疫反応を示した。対照群に対してすべてのワクチン投与を受けた群においてコロニー形成（ＩＨＣ）の数値的減少があったが、統計学的に有意ではなかった。群間の有意差の欠如は、対照群に見られた弱いチャレンジ獲得に起因した可能性がある。
【０１７６】
実施例７：ＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジに対する２つのワクチン候補の評価
本研究の目的は、キメラＰＣＶ２ｂワクチン及びＰＣＶ２ｂ分岐ワクチンのそれぞれが、低抗原用量及び高抗原用量で表される、キメラＰＣＶ２ｂワクチン及びＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン、ならびにバキュロウイルス内で発現したＰＣＶ２ａキャプシドの、ＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジに対する保護を評価することであった。研究設計は、表１６に概説される。プラシーボ（Ｔ０１）は、１０％のＳＰ油であった。ＩＶＰは、以下の通りであった：Ｔ０２、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ１：ＰＣＶ２ｂキャプシドキメラ低用量（ｃＰＣＶ２ｂ低）；Ｔ０３、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ１：ＰＣＶ２ｂキャプシドキメラ高用量（ｃＰＣＶ２ｂ高）；Ｔ０４、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン低用量（ＰＣＶ２ｂＤＩＶ低）；Ｔ０５、１０％のＳＰ油でアジュバント化した死滅ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン高用量（ＰＣＶ２ｂＤＩＶ高）；Ｔ０６、水系アジュバント中のＰＣＶ２ａキャプシドを発現する死滅バキュロウイルス（比較生成物）。Ｔ０２〜Ｔ０５ワクチンを、２０倍濃縮抗原を用いて生成し、次いで０．６９％の抗原投入量＝低用量または３．００％の抗原投入量＝高用量で、ワクチンを製剤化した。
【０１７７】
【表１６】
2016531854.tif 000018
【０１７８】
ワクチン接種の０日目に、ブタは、約３週齢（生後２１±８日）だった。処置投与者が、単回用量の２ｍＬ（Ｔ０１〜Ｔ０５）または１ｍＬ（Ｔ０６）の指定のワクチンを、首の右側の筋肉内（ＩＭ）に投与した。１インチまたは３／４インチ針を有する単一の３ｍＬ滅菌注射器を各ブタに使用した。ワクチン接種の詳細を記録した。ブタを、各ワクチン接種後、昏睡、努力性呼吸、嘔吐、及び協調運動失調を含むが、これらに限定されない異常な臨床徴候を１時間（±３０分）以内に観察した。観察されたあらゆる臨床徴候を、一般健康用紙に記録した。獣医師に、上述の徴候のいずれかを示すブタ（複数可）の経過観察をするように通知した。
【０１７９】
ブタが約６週齢だった２１日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に４．８〜５．８ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈した合計３ｍＬの毒性ＰＣＶ２ｂ分岐株の培養を、鼻腔内（ＩＮ）に植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスを、チャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。
【０１８０】
−１日目（ワクチン接種前）、ならびに７日目、１４日目、２０／２１日目、２８日目、３５日目、及び４２日目に、個々の血液試料（５〜１０ｍＬ）を、血清分離管（ＳＳＴ）に採取した。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。これらを、ＥＬＩＳＡによってＰＣＶ２抗体力価を、ｑＰＣＲによってＰＣＶ２ウイルス血症を、後ほど試験した
チャレンジ前（２０／２１日目）、及びチャレンジ後週１回、個々の糞便拭き取り検体を各ブタからとった。糞便拭き取り検体を採取するのに、個々の滅菌ポリエステル綿棒を使用し、３ｍＬの滅菌ＰＢＳ培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に５秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−６５℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量ＰＣＲ手順により、ウイルス排出の試験をした。
【０１８１】
検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片を２連で採取し、個々に同定し、１０％の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は保存し、もう一組は、リンパ球枯渇（ＰＣＶＡＤ）及び組織球性置換（組織球性置換）のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有（＋）または無（−）として記録した。ブタは、１つ以上の組織が「＋」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、ＩＨＣによってＰＣＶ２抗原の試験もした。結果を、０（染色なし）及び１〜３（染色の異なるレベル）として、記録した。０点は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（−）としてみなし、１点以上は、ＰＣＶ２  ＩＨＣ（＋）としてみなした。ブタが、１つ以上の組織がＩＨＣ（＋）であった場合、ＩＨＣ（＋）とみなした。
【０１８２】
プラシーボと比較して、主な成果は、ＰＣＶ２ｂ分岐チャレンジに対する４つの候補ワクチンのうちの１つ及びバキュロウイルスワクチンの保護だった。主要変数は、ウイルス血症であり、副次変数は、糞便排出及び組織病理学的病変であった。
ＰＣＶ２ウイルス血症
血清を、週１回採取し、定量ＰＣＲによってＰＣＶ２ウイルス血症を分析した。各研究日の幾何最小二乗平均が図５に例示される。下記表１７に示したとおり、Ｔ０４群及びＴ０５群の両方の１頭の動物を除いたすべてのブタは、チャレンジ前に、ＰＣＶ２ウイルス血症に対して陰性のままだった。
【０１８３】
【表１７】
2016531854.tif 000019
【０１８４】
研究の過程を通して終始陽性だった動物のパーセントは、下記（表１８）に列挙される。プラシーボ群は、ワクチン投与を受けた群と比較して、著しく高いパーセントの終始陽性だった動物を有した（Ｐ≦０．００４６）。
【０１８５】
【表１８】
2016531854.tif 000020
【０１８６】
ＰＣＶ２糞便排出
研究日別の糞便排出幾何最小二乗平均が、図６に例示される。処置及びチャレンジによるＰＣＶ２糞便排出（ＤＮＡコピー数）が、下記表１９に記載される。Ｔ０４群の１頭の動物が、チャレンジの前日に排出していた。すべてのワクチン群が、チャレンジ後である３５日目及び４３日目に、プラシーボ群よりも著しく少ない（Ｐ≦０．０００１）最小二乗平均ＰＣＶ２  ＤＮＡコピー数を排出していた。さらに、Ｔ０３、Ｔ０５、及びＴ０６群もまた、研究の２８日目に、著しく少ない最小二乗平均ＤＮＡコピー数（Ｐ≦０．０８３０）を排出したことが認められた。
【０１８７】
【表１９】
2016531854.tif 000021
【０１８８】
研究の過程を通して排出が終始陽性だった動物のパーセントは、下記（表２０）に列挙される。チャレンジ後、プラシーボ群と比較すると、群Ｔ０３〜Ｔ０６が、ＰＣＲ検出可能なＰＣＶ２  ＤＮＡを排出していたブタのパーセントに著しい低下（Ｐ≦０．００２８）があった。
【０１８９】
【表２０】
2016531854.tif 000022
【０１９０】
血清抗体反応
ＰＣＶ２抗体力価に関して、結果は、ＥＬＩＳＡによって評価されるとおり、ＰＣＶ２ｂ分岐ワクチン処置（Ｔ０４；Ｔ０５）が、研究１日目に、チャレンジ前の他の処置と比較してより強い血清学的反応を有したことを示した（表２１；図７）。しかしながら、チャレンジ後、ＰＣＶ２ｂ分岐処置は、他の処置ほどは強く反応しなかった（図７）。１つの考えられる結論は、この動物が、すでに特異的強い抗ＰＣＶ２ｂ分岐抗体反応を有しており、チャレンジウイルスを非常に迅速に中和及び除去することができたということであった。これは、異種ワクチンのものと比べると、チャレンジ後の抗体反応の減少と解釈された、血清学が、有効性と同じではない一方で、有効なワクチンを投与されたブタ内の減少した抗体力価は、保護を示すことを示した（Ｔｈａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃ  ＡＡＳＶ，２１７）。
【０１９１】
【表２１】
2016531854.tif 000023
【０１９２】
病理組織学：リンパ球枯渇（ＬＤ）及びリンパ組織のウイルス感染（ＩＨＣ）
検死の時点で、プラシーボ群と比較すると、すべてのワクチン群は、著しく少ないパーセントの顕微鏡的リンパ病変（ＬＤ）及びＰＣＶ２抗原コロニー形成（ＩＨＣ）を有する動物を有した（Ｐ≦０．０９９５）。
【０１９３】
ＰＣＶ２  ＩＨＣデータは、下記表２２に要約される。
【０１９４】
【表２２】
2016531854.tif 000024
【０１９５】
ＰＣＶ２リンパ球枯渇（ＬＤ）データは、下記表２３に要約される。
【０１９６】
【表２３】
2016531854.tif 000025
【０１９７】
この研究からのデータは、すべての処置群の最小二乗平均ＰＣＶ２力価が、ワクチン接種前に血清反応陰性であったことを示した。プラシーボ群のブタは、チャレンジ前に血清反応陰性のままだった。Ｔ０４及びＴ０５群の両方の１頭の動物は、チャレンジの前日にウイルス血症であった。Ｔ０４群の動物もまた排出していたが、１０％未満の動物が、チャレンジ前にウイルス血症になり、研究は、有効であるとみなした。チャレンジ後、プラシーボ群と比較すると、すべてのワクチン投与を受けた群には、ウイルス血症ブタのパーセントに著しい低下があった。チャレンジ後、プラシーボ群と比較すると、群Ｔ０３〜Ｔ０６が、ＰＣＲ検出可能なＰＣＶ２  ＤＮＡを排出していたブタのパーセントに著しい低下があった。検死の時点で、プラシーボ群と比較すると、すべてのワクチン群は、著しく少ないパーセントの顕微鏡的リンパ病変（ＬＤ）及びＰＣＶ２抗原コロニー形成を有する動物を有した。この研究は、ｃＰＣＶ１−２ｂ、ＰＣＶ２ｂ分岐、及びＰＣＶ２ａキャプシドワクチンを発現するバキュロウイルスが、ＰＣＶ２ｂ分岐株チャレンジに対して、交差防御をすることを示した。
【０１９８】
上記実施例は、単に例証として提供され、これらのいずれも、本発明の全範囲への制限であるとみなされるべきではないことを理解されたい。
【図１】
2016531854.tif 000026
【図２】
2016531854.tif 000027
【図３】
2016531854.tif 000028
【図４】
2016531854.tif 000029
【図５】
2016531854.tif 000030
【図６】
2016531854.tif 000031
【図７】
2016531854.tif 000032
【国際調査報告】
2016531854.tif 000033
2016531854.tif 000034
2016531854.tif 000035
2016531854.tif 000036
2016531854.tif 000037