(57)【要約】  正常な乳房細胞表現型、並びにエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の様々な発現に基づく、乳癌のための新規の分類システム。この分類システムの様々なカテゴリは、異なる生存率及び予後に関連する。本発明は、乳癌を分類する方法を含み、この方法は、癌性組織中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを測定するステップと、発現レベルに従って乳癌を上述のカテゴリのうちの１つに分類するステップとを有してなる。本発明は、乳癌が分類されたカテゴリに応じて、患者の乳癌の予後を予測する方法及び乳癌のための処置レジメンを決定する方法を含む。本発明は、癌性組織中で検出されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現プロファイルに従って乳癌を処置する方法を含む。上記発現プロファイルを検出するためのキットも提供される。
2016524150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の分類システムであって：
乳癌腫瘍中にエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）発現が実質的に存在しないことによって定義される、第１のカテゴリ；
乳癌腫瘍中の、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの１つのみの発現によって定義される、第２のカテゴリ；
乳癌腫瘍中の、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つのいずれの組合せの発現によっても定義される、第３のカテゴリ；並びに
乳癌腫瘍中の、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲそれぞれの発現によって定義される、第４のカテゴリ
を含む、乳癌の分類システム。
【請求項２】
前記第１のカテゴリは、前記腫瘍中において、腫瘍細胞の約１％未満がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現を有するものとして定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記第１のカテゴリは、前記腫瘍中において、腫瘍細胞の約５％未満がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現を有するものとして定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記第１のカテゴリは、前記腫瘍中において、腫瘍細胞の約１０％未満がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現を有するものとして定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記第１のカテゴリは、前記腫瘍中において、腫瘍細胞の約３０％未満がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現を有するものとして定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記第１のカテゴリは、前記腫瘍中において、腫瘍細胞の約５０％未満がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現を有するものとして定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記第１のカテゴリ、前記第２のカテゴリ、前記第３のカテゴリ及び前記第４のカテゴリの腫瘍中の、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現レベルは、正常な乳房組織中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現レベルに対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記第１のカテゴリ、前記第２のカテゴリ、前記第３のカテゴリ及び前記第４のカテゴリの腫瘍は、患者の有意な生存の差に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
乳癌を分類する方法であって：
患者の癌性乳房組織中に発現したエストロゲン受容体（ＥＲ）のレベルを測定するステップ；
前記患者の前記癌性乳房組織中に発現したアンドロゲン受容体（ＡＲ）のレベルを測定するステップ；
前記患者の前記癌性乳房組織中に発現したビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のレベルを測定するステップ；及び
腫瘍中で測定されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの前記発現レベルに基づいて、前記乳癌を分類するステップ
を有してなる方法。
【請求項１０】
前記患者の前記癌性乳房組織中に発現したＨＥＲ２のレベルを測定するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍中で測定されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの前記発現レベルに基づいて、前記乳癌を複数のカテゴリのうちの１つに分類するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのいずれの実質的な発現も有しない場合に、前記乳癌を第１のカテゴリに分類するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの１つのみを発現する場合に、前記乳癌を第２のカテゴリに分類するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちのいずれか２つを発現する場合に、前記乳癌を第３のカテゴリに分類するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの全てを発現する場合に、前記乳癌を第４のカテゴリに分類するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍中で測定されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの前記発現レベルを、正常な乳房細胞中で測定されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現レベルと比較するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記乳癌を分類するステップは、ホルモン受容体陰性（ＨＲ０）状態、単一ホルモン受容体陽性（ＨＲ１）状態、二重ホルモン受容体陽性（ＨＲ２）状態、又は三重ホルモン受容体陽性（ＨＲ３）状態のうちの１つとして前記乳癌を分類するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一ホルモン受容体陽性（ＨＲ１）状態を、ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのいずれか１つが発現することとして定義する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記二重ホルモン受容体陽性（ＨＲ２）状態を、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つのいずれの組合せも発現することとして定義する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記三重ホルモン受容体陽性（ＨＲ３）状態を、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの全てが発現することとして定義する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
乳癌の予後を予測する方法であって：
患者の乳房組織の腫瘍中に発現したエストロゲン受容体（ＥＲ）のレベルを測定するステップ；
前記患者の前記腫瘍中に発現したアンドロゲン受容体（ＡＲ）のレベルを測定するステップ；
前記患者の前記腫瘍中に発現したビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のレベルを測定するステップ；
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの全てを発現した場合に、比較的高い生存率を決定するステップ；
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つのみを発現した場合に、中間の生存率を決定するステップ；及び
前記腫瘍がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの１つのみを発現した場合に、比較的低い生存率を決定するステップ
を有してなる方法。
【請求項２２】
乳癌患者のための処置レジメンを決定する方法であって：
前記患者の癌性乳房組織中に発現したエストロゲン受容体（ＥＲ）のレベルを測定するステップ；
前記患者の前記癌性乳房組織中に発現したアンドロゲン受容体（ＡＲ）のレベルを測定するステップ；
前記患者の前記癌性乳房組織中に発現したビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のレベルを測定するステップ；
前記組織がＥＲを発現した場合に、少なくとも１つのＥＲアンタゴニストを前記処置レジメンに含めるステップ；
前記組織がＡＲを発現した場合に、少なくとも１つのＡＲアゴニストを前記処置レジメンに含めるステップ；及び
前記組織がＶＤＲを発現した場合に、少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを前記処置レジメンに含めるステップ
を有してなる方法。
【請求項２３】
前記癌性乳房組織中に２つ以上のタイプの受容体が発現した場合に、少なくとも１つのＥＲアンタゴニスト、少なくとも１つのＡＲアゴニスト及び少なくとも１つのＶＤＲアゴニストの組合せを前記処置レジメンに含めるステップを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者の前記癌性乳房組織中に発現したＨＥＲ２のレベルを測定するステップ：及び
前記組織がＨＥＲ２を発現した場合に、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害剤を前記処置レジメンに含めるステップ
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
化学療法を前記処置レジメンに含めるステップを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍の照射を前記処置レジメンに含めるステップを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
乳癌を治療する方法であって；
患者の乳癌腫瘍中に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のレベルを測定するステップ；
前記乳癌腫瘍中にＥＲが検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＥＲアンタゴニストを前記患者に提供するステップ；
前記乳癌腫瘍中にＡＲが検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＡＲリガンドを前記患者に提供するステップ；及び
前記乳癌腫瘍中にＶＤＲが検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを前記患者に提供するステップ
を有してなる方法。
【請求項２８】
前記患者の前記乳癌腫瘍中のＨＥＲ２のレベルを測定するステップ；及び
前記乳癌腫瘍中にＨＥＲ２が検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＨＥＲ２阻害剤を前記患者に提供するステップ
を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記乳癌腫瘍中にＡＲ及びＨＥＲ２の両方が検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＡＲアンタゴニストを前記患者に提供するステップを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記乳癌腫瘍中にＡＲが検出され、前記乳癌腫瘍中にＨＥＲ２が実質的に検出されない場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＡＲアゴニストを前記患者に提供するステップを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＥＲアンタゴニスト、前記少なくとも１つのＡＲリガンド及び前記少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを、薬学的に許容可能な担体を含むものとして定義する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
治療上有効な量の前記少なくとも１つのＥＲアンタゴニスト、前記少なくとも１つのＡＲリガンド及び前記少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを同時に提供するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
治療上有効な量の前記少なくとも１つのＥＲアンタゴニスト、前記少なくとも１つのＡＲリガンド及び前記少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを順次提供するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者の前記乳癌腫瘍中に検出されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現レベルに基づいて、特定の患者の乳癌を分類するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１用量の化学療法を前記患者に投与するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１用量の照射を前記患者に投与するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
エストロゲン受容体（ＥＲ）の少なくとも１つの結合部位に結合できる、所定量の一次抗体；
アンドロゲン受容体（ＡＲ）の少なくとも１つの結合部位に結合できる、所定量の一次抗体；及び
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の少なくとも１つの結合部位に結合できる、所定量の一次抗体
を含む、抗体染色キット。
【請求項３８】
ＨＥＲ２の少なくとも１つの結合部位に結合できる、所定量の一次抗体を更に含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲに対する前記一次抗体のうちの少なくとも１つに結合できる、所定量の二次抗体を更に含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記二次抗体の存在を検出するための可視化デバイスを更に含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質に結合できる、所定量の第１のプローブ；
アンドロゲン受容体（ＡＲ）タンパク質に結合できる、所定量の第２のプローブ；及び
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）タンパク質に結合できる、所定量の第３のプローブ
を含む、キット。
【請求項４２】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ及び前記第３のプローブのいずれの検出を可能とするための、所定量の少なくとも１つの検出プローブを更に含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
ＨＥＲ２タンパク質に結合できる、所定量の第４のプローブを更に含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、前記第３のプローブ及び前記第４のプローブのいずれの検出を可能とするための、所定量の少なくとも１つの検出プローブを更に含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
エストロゲン受容体（ＥＲ）ｍＲＮＡに結合できる、所定量の第１のプローブ；
アンドロゲン受容体（ＡＲ）ｍＲＮＡに結合できる、所定量の第２のプローブ；及び
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）ｍＲＮＡに結合できる、所定量の第３のプローブ
を含む、キット。
【請求項４６】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ及び前記第３のプローブのいずれの検出を可能とするための、所定量の少なくとも１つの検出プローブを更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
ＨＥＲ２  ｍＲＮＡに結合できる、所定量の第４のプローブを更に含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、前記第３のプローブ及び前記第４のプローブのいずれの検出を可能とするための、所定量の少なくとも１つの検出プローブを更に含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
エストロゲン受容体（ＥＲ）活性を検出できる、所定量の第１のプローブ；
アンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を検出できる、所定量の第２のプローブ；及び
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）活性を検出できる、所定量の第３のプローブ
を含む、バイオアッセイキット。
【請求項５０】
前記第１のプローブは、ＥＲの少なくとも１つのパートナータンパク質の存在を検出する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記第２のプローブは、ＡＲの少なくとも１つのパートナータンパク質の存在を検出する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記第３のプローブは、ＶＤＲの少なくとも１つのパートナータンパク質の存在を検出する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】
ＨＥＲ２活性を検出できる、所定量の第４のプローブを更に含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５４】
前記第４のプローブは、ＨＥＲ２の少なくとも１つのパートナータンパク質の存在を検出する、請求項５３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【連邦政府資金による研究開発の記載】
【０００１】
本発明は、国立癌研究所及び乳癌研究財団が出資する認可番号Ｒ０１−ＣＡ１４６４４５−０１の米国政府の支援によって実施されたものである。米国政府は本発明の特定の権利を有し得る。
【技術分野】
【０００２】
本発明は疾患の分類に関し、より具体的には癌及び乳癌の分類に関する。本発明は更に、乳癌等の疾患の分類方法、及び上記分類に基づく処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は現在、米国における女性の死因の第２位であり、女性において最も一般的に診断される癌である。全体として米国の女性の８人に１人が一生の間に乳癌を発症することになる。米国だけで毎年４００００人超の女性が乳癌で死亡している。専門家達は、早期検出が、乳癌からより良好な予後を得るための１つの重要な要素であるという点で合意している。しかしながら乳癌等の疾患を適切に検出するためには、医学界はまずこの疾患を理解しなければならず、この疾患をその様々な形態において認識できなければならない。従って、正確な診断及び処置の開発を可能とするために、特定の疾患に対する正確で均一に受容される分類システムを有することが重要である。
【０００４】
疾患の分類には多数の方法が存在するが、過去２世紀以上に亘って、同一の組織の様々な疾患を定義するための基準点として、正常な組織の形態及び機能が良好に使用されてきた。このようなアプローチは最も顕著には、リンパ腫及び白血病等の造血器腫瘍を効果的に分類するために使用されてきた（１）。特定の正常な造血細胞タイプに対する白血病及びリンパ腫の様々なサブタイプの形態及び分子的な類似の発見は、このプロセスにおいて重要であった。
【０００５】
癌に対抗する最も顕著かつ最も早期の進歩のうちのいくつかは、造血器悪性腫瘍の処置において得られた（２）。この相対的成功には多くの因子が寄与しているが、造血器悪性腫瘍の正確な分類が重要な役割を果たした。造血細胞へのアクセスが比較的容易であること、及びこれらの細胞の表面における細胞タイプ特異的表面抗原分類（ＣＤ）マーカの識別により、効率的な免疫表現型検査、又は抗体染色によって識別される特定のタンパク質発現パターンに基づく細胞分類プロセスが可能であった（３）。これらＣＤマーカは後に、特定の正常な細胞タイプと略同一の表現型を有するリンパ腫及び白血病を識別するために使用され、これにより、これらの疾患の現行の分類システムの発展が可能となった（４、５）。
【０００６】
造血器悪性腫瘍の合理的分類及び処置における主要な成功にもかかわらず、正常な細胞タイプを使用した他のタイプの充実性腫瘍の分類は、広範に実施されていない。その主要な理由は、大半の充実性腫瘍における細胞タイプの多様性の理解が不十分であることである。充実性腫瘍における正常な細胞のサブタイプの特徴決定は困難である。
【０００７】
特に乳癌に関して、ヒトの乳房においては最近まで、内側の管腔細胞及び外側の筋上皮細胞の２つの細胞タイプしか形態的に説明されていない（６）。乳管を構成する細胞タイプに関するこのような限定的理解は、正常な細胞タイプに基づく分類システムの開発を妨げている。正常な乳房細胞のサブタイプに対する関心は近年増大しているが、この研究を、既存のヒト乳癌表現型と相関させるのは困難である（７）。
【０００８】
現在、ヒト乳癌は、エストロゲン受容体の存在（ＥＲ＋）、及びヒト上皮成長因子受容体２の存在（ＨＥＲ２＋）の存在に基づいて、又は三重陰性乳癌におけるこれらの不在（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２−、ＴＮＢＣ）によって、３つのカテゴリに臨床的にグループ分けされる。しかしながらこのような現行の分類は、様々な乳癌サブタイプの不均一性の高さを考慮しておらず、従って不十分な分類システムである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、癌及び特に乳癌の更に正確な分類が必要とされている。医学及び処置学により、乳癌腫瘍が１５〜２０年もの長い期間まで休眠状態又は無症候性であり得、このような長期間の後に再浮上し得ることが示されている。ストレス及びホルモンの変化、例えば閉経は、癌の悪性度及び侵襲性のシフトをもたらすことが知られている。従って、無症候性状態又は寛解であっても更に良好な患者予後を得るために、及びどの処置が最も効果的であるかをより良好に通知できるように、乳癌であることだけでなくどのタイプの乳癌であるかをより適切に診断するための方法が得られれば有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
乳癌をより良く理解して処置するために、本発明は、細胞集団の分化状態による、正常な乳房細胞表現型に基づくヒト乳癌のための分類システムを対象とする。適切かつ正確な分類システムは、乳癌の理解においてのみならず、結果として乳癌の識別及び処置においても重要となる。従って本発明は、乳癌医療のための堅固な基礎を提供する。
【００１１】
本発明の分類システムは、分類のための正常な乳房細胞表現型と乳癌細胞との比較に基づくものであり、上記正常な乳房細胞表現型についてはまだ示していない。従って、正常な乳房細胞サブタイプの理解は本発明において重要であるが、充実性腫瘍における正常な乳房細胞サブタイプの特徴決定は今日まで困難であった。正常なヒト乳房は、泌乳小葉と、母乳を乳首まで輸送する小葉間導管とからなる。導管と小葉との間の解剖学的区別は、乳癌の病態生理学を理解するために重要である。現在、ヒト乳房腫瘍の殆どは、病理学者によって、その由来細胞とは関係のない理由で、形態に基づいて「乳管癌腫」又は「小葉癌腫」として分類されている。それにもかかわらず、この難解な専門用語は、乳管及び小葉乳癌がそれぞれ正常な導管及び小葉において開始するという一般的な誤解につながっている。しかしながら、これら２つの腫瘍タイプの早期進行段階の殆ど全ては、その名称にかかわらず、略乳房の小葉のみに関連する。従って、組織構造を保存して導管、小葉及び上皮の他の層の判別を可能とする免疫組織化学（ＩＨＣ）染色等の方法を用いて、小葉中の正常な細胞を特異的に検査することが、本発明の分類システムを決定する第１のステップとなった。
【００１２】
ヒトの乳房においては最近まで、内側の管腔細胞及び外側の筋上皮細胞の２つの細胞タイプしか形態的に説明されていない（６）。乳管を構成する細胞タイプに関するこのような限定的理解は、正常な細胞タイプに基づく分類システムの開発を妨げている。この需要を満たすために、本発明は、これまでに行われたことのない、更に正確に乳癌を説明する方法により、正常な乳房細胞のサブタイプ及び乳癌のサブタイプを特徴決定する方法に関する。
【００１３】
より詳細には、本発明は、正常な乳房細胞の表現型に基づく乳癌のための分類システムを対象とし、上記表現型は、少なくとも組織内のエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の発現プロファイルに基づく、少なくとも４つのカテゴリ（ＨＲ０〜ＨＲ３とする）を含む。第１のカテゴリ（ＨＲ０）は、ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのいずれも発現しない組織を含む。第２のカテゴリ（ＨＲ１）は、ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのうちの１つのみを発現する組織を包含する。第３のカテゴリ（ＨＲ２）は、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つのいずれの組合せを有する組織を含む。第４のカテゴリ（ＨＲ３）は、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲ全てを発現する組織を含む。これら４つのカテゴリはそれぞれ、全管腔マーカＫ７、Ｋ８、Ｋ１８、増殖細胞マーカＫｉ６７及びＫ５といった特定の他のマーカの存在に基づいてサブクラスに更に分割できる様々なタイプの乳癌をより良好に分類できるということは、より良好でより正確な診断を意味する。従って本発明はまた、腫瘍試料中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲ発現のレベルを測定するステップと、本明細書に記載の分類システムに従って乳癌のタイプを分類するステップとを含む、乳癌を分類する方法を含む。
【００１４】
ＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ発現に基づく乳癌の４つの主要なカテゴリはそれぞれ、異なる生存率に関連し、現在可能なものよりも正確な予後の予測を可能とする。従って本発明はまた、腫瘍又は癌腫組織中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを測定するステップと本明細書に記載の分類システムに基づいて生存率を決定するステップとを含む、乳癌の予後の予測方法も対象とする。具体的には、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの３つ全てを発現する腫瘍を有する患者は、これらホルモン受容体のうちの２つのみを発現する腫瘍を有する患者よりも、生存に関して良好な結果が得られ、更に、上記ホルモン受容体のうちの２つのみを発現する腫瘍を有する患者は、上記ホルモン受容体のうちの１つのみを発現する腫瘍を有する患者よりも良好な推移を示す。ホルモン受容体が発現されない場合、生存率は診断後の最初の５年間は比較的良好でないが、その後良好となる。
【００１５】
本発明はまた、処置レジメンの決定方法と、乳癌中に存在するＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現プロファイルに応じて乳癌を処置する方法とを対象とする。癌腫組織中に存在する又は発現する対応する受容体に対してホルモン処置が提供される。２つ以上のホルモン受容体が存在する場合、多ホルモン処置レジメン及び投与を考える。これは、化学療法及び／又は放射線処置とは独立して又は化学療法及び／又は放射線処置と組み合わせて、並びに癌の重篤度及び進行に応じて実施できる。
【００１６】
本発明はまた、組織試料中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの存在を検出するための組織の染色に使用するための染色キットも対象とする。このキットは、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲに特異的な抗体を含み、また検出及び視覚化のための２次抗体も含んでよい。
【００１７】
本発明の上述の及びその他の目的、特徴及び利点は、図面及び「発明を実施するための形態」を考慮することにより更に明らかになるであろう。
【００１８】
本発明の特徴の更に完全な理解のために、以下の「発明を実施するための形態」を添付の図面と関連させて参照する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】正常なヒト乳房の解剖学的構造、並びに正常なヒト乳房上皮中のケラチン、表面抗原分類（ＣＤ）マーカ及びホルモン受容体の発現パターン。（Ａ）正常なヒト乳房上皮のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片であり、小葉及び小葉間導管を示す。（Ｂ）正常なヒト乳房上皮上のケラチンＫ１４に関する免疫組織化学。筋上皮細胞のみにおいて小葉間導管がＫ１４（茶色）で染色されているが、小葉内筋上皮細胞の大部分は、この切片中でＫ１４に関して陰性である。（Ｃ−Ｈ）表面抗原分類マーカＣＤ４９ｆ、Ｍｕｃ１、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４及びＣＤ３２６（Ｅｐ−ＣＡＭ）に関する免疫組織化学。これらのマーカは、小葉及び導管の大半の管腔上皮細胞において陽性であった。導管と小葉との間には差次的発現は存在しなかった。低いレベルで発現する細胞もあり、高いレベルで発現する細胞もあったが、明らかに陽性の集団及び陰性の集団は存在しなかった。（Ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）（赤色で示す）及びＣＤ３２６（緑色で示す）（Ｅｐ−ＣＡＭ）に関する免疫蛍光染色は、ＥＲ［＋］細胞及びＥＲ［−］細胞の両方がＣＤ３２６［＋］であることを示す。従ってこれら２つのマーカの発現には相関関係はない。（Ｊ）ＥＲ（緑色）及びＫ５（赤色）に関する免疫蛍光染色は、ＥＲ［＋］染色とＫ５［＋］染色は二峰性（二相性）であることを示す。各マーカに関して明らかにポジティブの細胞集団及びネガティブの細胞集団が存在していたＣＤマーカとは異なり、ＥＲ［＋］及びＫ５［＋］は相互に排他的であった。即ちある細胞がＫ５［＋］である場合、この細胞は殆ど常にＥＲ［−］であり、その逆もまた成り立つ。
【図２】正常なヒト乳房中の中間フィラメント及びエストロゲン受容体（ＥＲ）の発現の免疫蛍光画像。正常なヒトのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片の：（Ａ）Ｋ７／１８（褐色）；（Ｂ）Ｋ１８（赤色）及びＫ１９（褐色）；（Ｃ）Ｋ５／１４（褐色）；（Ｄ）ＣＤ１０（赤色）及びＫ１４（褐色）；（Ｅ）Ｋ５／１４（褐色）及び平滑筋アクチン（ＳＭＡ−赤色）；（Ｆ）Ｋ１８（緑色）；Ｋ１４（赤色）、Ｋ１８及びＫ１４の両方を発現する細胞（黄色）；（Ｇ）Ｋ５／１４（赤）及びエストロゲン受容体（ＥＲ−褐色）を用いた単回及び二重免疫染色。この細胞の集団［Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋］は、組織切片がこれらマーカで同時に染色されなかったため指名されている。（Ｈ）ＥＲ及びＫ５／７／１４／１７／１８／１９；（Ｉ）Ｋｉ−６７（褐色）及びＫ５／１４（青色）；（Ｊ）エストロゲン受容体（ＥＲ−緑色）及び増殖マーカＫｉ−６７（赤色）；（Ｋ）Ｋ１８（赤色）及びＫｉ−６７（褐色）の発現に基づく正常な管腔上皮細胞の分化状態を示すベン図。（Ｌ）ＥＲ、ケラチン及びＫｉ−６７に基づく正常な管腔上皮細胞の分化状態を示すベン図。免疫ペルオキシダーゼ（Ａ〜Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫ）、並びに免疫蛍光（Ｆ、Ｊ）染色の合成画像を示す。複数の患者の試料（ｎ＝３６）から代表的な画像を選択して示す。
【図３】小葉に対する、正常なヒト乳腺管におけるケラチン５、１４及び１７の発現。（Ａ〜Ｂ）マウスの乳腺のケラチン５免疫染色は、豊富な管腔Ｋ５発現（Ｋ５＝褐色）が得られるヒト乳房とは異なり、Ｋ５が筋上皮層のみに発現することを示す。（Ｃ〜Ｅ）ケラチン５、１４及び１７は正常なヒト乳房組織の小葉間導管中の内筋上皮（基底）層に発現する（Ｋ５、１４、１７を、青色の対照染色と共に茶色で示す）。（Ｆ〜Ｈ）ケラチン５、１４及び１７は、正常なヒト乳房細胞の小葉中の管腔層に発現する（Ｋ５、１４、１７を、青色の対照染色と共に茶色で示す）。（Ｉ〜Ｋ）汎用筋上皮マーカＣＤ１０及びＳＭＡを用いた二重免疫染色は、Ｋ５／１４／１７細胞が管腔に隣接するＣ１０／ＳＭＡ［＋］筋上皮細胞の上方に位置することを示す。Ｋ５は（Ｉ）において褐色で示されており、Ｋ１４は（Ｊ）において褐色で示されており、Ｋ１７は（Ｋ）において赤色で示されており、ＣＤ１０は（Ｉ）において赤色で示されており、ＳＭＡは（Ｊ）において赤色で示されており、ＣＤ１０は（Ｋ）において褐色で示されている。（Ｌ〜Ｐ）Ｋ５＋細胞の頻度は、同一の人物からの同一の切片内においてさえも、小葉毎に劇的に異なり得る。（Ｌ）多数の小葉において、Ｋ５＋細胞は殆ど存在しない。（Ｍ）僅かな小葉において、管腔細胞ではなく筋上皮細胞のうちのいくつかでＫ５が発現する。（Ｎ）多数の小葉において、管腔細胞のおよそ半分がＫ５＋である。（Ｏ〜Ｐ）いくつかの小葉では、単回Ｋ５染色（褐色で示されている、パネルＭ）によっても、又はこれらの細胞の管腔性質を確認する二重免疫染色（Ｋ５が赤色、ＳＭＡが緑色で示されている、パネルＮ）によっても、全ての管腔細胞がＫ５＋である。（Ｑ〜Ｓ）同一の小葉の複数の連続した切片の二重免疫染色により、いくつかの小葉では殆ど全ての細胞がＫ５及びＫ１８について二重に陽性であることが分かる。（Ｑ）ではＫ５は赤色、Ｋ１４は褐色で示されており、（Ｒ）ではＫ１８は赤色、Ｋ１４は褐色で示されており、（Ｓ）ではＫ５は褐色、Ｋ１８は青色で示されている。（Ｔ）二重免疫染色により、いくつかの小葉では殆ど全ての細胞がＫ１８及びＫ１４について二重に陽性であることが分かる。Ｋ１８は緑色、Ｋ１４は赤色、Ｋ１４／１８二重陽性細胞は黄色で示されている。（Ｕ）Ｋ５管腔細胞の大半は、分化のマーカであるＭｕｃ１を発現する。Ｋ５は緑色、Ｍｕｃ１は赤色で示されている。
【図４】正常なヒト乳房における中間フィラメント、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の発現の免疫蛍光画像。正常なヒト乳房ＦＦＰＥ切片の二重免疫染色（Ａ、Ｊ）及び合成した免疫蛍光画像（Ｂ、Ｃ、Ｅ〜Ｉ、Ｋ〜Ｍ）を示す。ベン図は、管腔（Ｄ、Ｎ）及び筋上皮（Ｏ）細胞タイプの分化状態を示す。（Ａ）Ｋ５／１４（赤色）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ、褐色）。（Ｂ）アンドロゲン受容体（ＡＲ、緑色）及び増殖マーカＫｉ−６７（赤色）。（Ｃ）ＥＲ（緑色）、ＡＲ（赤色）及び二重陽性細胞（黄色）。（Ｄ）ＥＲ、ケラチン、Ｋｉ−６７及びＡＲに基づく正常な管腔上皮細胞の分化状態を示すベン図。（Ｅ）ＣＤ１０（緑色）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ、赤色）。（Ｆ）ＶＤＲ（赤色）及びＫｉ−６７（緑色）。（Ｇ）Ｋ５（緑色）及びＶＤＲ（赤色）。（Ｈ）ＡＲ（緑色）、ＶＤＲ（赤色）及び二重陽性（黄色）。（Ｉ）ＥＲ（緑色）、ＶＤＲ（赤色）及び二重陽性（黄色）。（Ｊ）ＣＤ１０（赤色）及びＫｉ−６７（褐色）。（Ｋ）ＥＲ（緑色）、ＡＲ（赤色）、ＶＤＲ（青色）、ＥＲ＋ＡＲ（黄色）、ＥＲ＋ＶＤＲ（紫色）、ＶＤＲ＋ＥＲ（水色）。（Ｌ）三重ホルモン受容体陽性細胞ＥＲ＋ＡＲ＋ＶＤＲ（ＨＲ３＋、白色）。（Ｍ）ＨＲ３＋（ＥＲ＋ＡＲ＋ＶＤＲ）細胞（緑色）、増殖マーカＫｉ−６７（赤色）及び核マーカＤＡＰＩ（青色）。（Ｎ〜Ｏ）フルマーカパネルに基づいて正常な管腔（Ｎ）及び筋上皮（Ｏ）乳房細胞の分化状態を示すベン図。複数の患者の試料（ｎ＝３６）から代表的な画像を選択して示す。
【図５】ホルモン受容体ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲとＫ１４及びＫ５との共発現頻度を示す表。各行は、示されている二重免疫染色によって染色された異なる正常な乳房切片である。各マーカに関して陽性である細胞の総数（列１〜２）、両方のマーカに関して陽性である細胞の総数（列３）、各マーカに関して陽性である細胞（列４〜５）及び両方のマーカに関して陽性である細胞（列６）の分率としての二重陽性細胞の百分率が示されている。
【図６】ホルモン受容体ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲと増殖マーカＫｉ‐６７との共発現頻度を示す表。各行は、示されている二重免疫染色によって染色された異なる正常な乳房切片である。各マーカに関して陽性である細胞の総数（列１〜２）、両方のマーカに関して陽性である細胞の総数（列３）、各マーカに関して陽性である細胞（列４〜５）及び両方のマーカに関して陽性である細胞（列６）の分率としての二重陽性細胞の百分率が示されている。
【図７】正常なヒト乳房の管腔層細胞におけるホルモン受容体ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの共発現頻度を示す表。各行は、示されている二重免疫染色によって染色された異なる正常な乳房切片である。各マーカに関して陽性である細胞の総数（列１〜２）、両方のマーカに関して陽性である細胞の総数（列３）、各マーカに関して陽性である細胞（列４〜５）及び両方のマーカに関して陽性である細胞（列６）の分率としての二重陽性細胞の百分率が示されている。
【図８】ホルモン受容体Ｋ１４、Ｋ５及びＣＤ１０と増殖マーカＫｉ−６７との共発現頻度を示す表。各行は、示されている二重免疫染色によって染色された異なる正常な乳房切片である。各マーカに関して陽性である細胞の総数（列１〜２）、両方のマーカに関して陽性である細胞の総数（列３）、各マーカに関して陽性である細胞（列４〜５）及び両方のマーカに関して陽性である細胞（列６）の分率としての二重陽性細胞の百分率が示されている。
【図９】Ｋ１４及びＫ５とＫ１８との共発現頻度を示す表。各行は、示されている二重免疫染色によって染色された異なる正常な乳房切片である。各マーカに関して陽性である細胞の総数（列１〜２）、両方のマーカに関して陽性である細胞の総数（列３）、各マーカに関して陽性である細胞（列４〜５）及び両方のマーカに関して陽性である細胞（列６）の分率としての二重陽性細胞の百分率が示されている。
【図１０】多数の正常な乳房細胞のサブタイプを識別する１４個の異なるマーカによる、多数のドナー（ｎ＝３６）からの正常なヒト乳房切片の免疫染色結果と、これに基づく分類のための、結果として得られたグループ分けとを示す表。ヒト乳房小葉（Ｌ１〜１１）の管腔層中の１１個の分化状態は、ホルモン受容体陰性（ＨＲ０；Ｌ１〜３）、単一ホルモン受容体陽性（ＨＲ１＋：ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲ；Ｌ４〜Ｌ６）、二重ホルモン受容体陽性（ＨＲ２＋：ＥＲ／ＡＲ、ＥＲ／ＶＤＲ又はＡＲ／ＶＤＲ；Ｌ７〜Ｌ１０）、及び三重ホルモン受容体陽性（ＨＲ３＋：ＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ；Ｌ１１）状態にグループ分けされる。全ての管腔細胞はＫ７／１８及びＣｌｄ−４を発現した。筋上皮層では、全ての細胞が、Ｋ５／１４／１７［−］又はＫ５／１４／１７［＋］（Ｍｙ１及びＭｙ２）である２つのサブタイプで、ＳＭＡ、ＣＤ１０及びｐ６３を発現する。
【図１１】図１２の免疫蛍光データの生成に使用される様々な抗体を列挙した表。
【図１２】正常なヒト乳房における、インサイチュでの１２個の異なるマーカの複数回免疫蛍光実験。正常な乳房上皮の１つのＦＦＰＥ切片を、示されているマーカ：（Ａ）パンケラチン；（Ｂ）Ｋ１８；（Ｃ）Ｋ５；（Ｄ）ＤＡＰＩ；（Ｅ）ＥＲ；（Ｆ）ＡＲ；（Ｇ）ＶＤＲ；（Ｈ）Ｋｉ−６７；（Ｉ）ＳＭＡに関する各抗体を用いて連続して染色した。個々の免疫蛍光染色画像（Ａ〜Ｉ）を合成（Ｊ〜Ｏ）して、各細胞中での全てのマーカの共発現パターン：（Ｊ）Ｋ５（赤色）及びＳＭＡ（緑）；（Ｋ）Ｋ５（赤色）及びＫ１８（緑色）；（Ｌ）ＥＲ（赤色）、ＡＲ（緑色）、Ｋ５（青色）；（Ｍ）ＶＤＲ（赤色）及びＥＲ（緑色）；（Ｎ）ＶＤＲ（赤色）及びＡＲ（緑色）；（Ｏ）ＡＲ（赤色）、ＥＲ（緑色）、ＶＤＲ（青色）を明らかにした。（Ｐ）フルマーカパネルに基づいて正常な管腔乳房細胞の分化状態を示すベン図。多重化免疫蛍光技術（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて取得された代表的な画像を示す。
【図１３】正常なヒト乳房小葉の複数回免疫蛍光染色。正常な乳房上皮の同一の切片を、マーカ：Ｐａｎ−Ｋ、Ｋ１８、Ｋ５、ＥＲ、ＳＭＡ、Ｋｉ−６７、ＡＲ及びＶＤＲに関して連続して評価した。選択された画像に関する合成画像を示す。このケースにおける様々なマーカの動的関係を示すベン図を示す。この小葉は主にＡＲ＋、ＶＤＲ＋及びＡＲ／ＶＤＲ＋細胞からなる。ＥＲ＋、Ｋ５＋及びＫｉ−６７＋細胞は稀である。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ多重化免疫蛍光マーカプラットフォームからの代表的な画像を示す。
【図１４】正常なヒト乳房小葉の複数回免疫蛍光染色。正常な乳房上皮の同一の切片を、マーカ：ＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ、Ｃｌｎ−４（クローディン−４）、ＳＭＡ、Ｋ５、Ｋ１８に関して連続して評価した。選択された画像に関する合成画像を示す。このケースにおける様々なマーカの動的関係を示すベン図を示す。この小葉は主にＫ５＋、ＶＤＲ＋及びＫ５／ＶＤＲ＋細胞からなる。ＥＲ＋、ＡＲ＋及びＫｉ−６７＋細胞は稀である。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ多重化免疫蛍光マーカプラットフォームからの代表的な画像を示す。
【図１５】正常なヒト乳房小葉の同一の切片の複数回免疫蛍光染色の合成画像。（ｉ）中程度のレベルのホルモン受容体（ＨＲ）発現、及び相互に排他的なＫｉ−６７陽性増殖細胞（赤色）を有する典型的な乳房小葉。（ｉｉ〜ｉｉｉ）殆ど全体がＨＲ＋細胞（緑色）からなり、低頻度なＫ５＋（ｉｉ）及びＫｉ−６７＋（ｉｉｉ）セル（赤色）を伴う、乳房小葉。（ｉｖ〜ｖ）殆ど全体がＫ５＋細胞（赤色）からなり、低頻度なＫｉ−６７＋（ｉｖ）及びＨＲ＋（ｖ）細胞（緑色）を伴う、乳房小葉。（ｖｉ）多数のＫｉ−６７＋細胞（赤色）を有し、ＨＲ＋細胞（緑色）を有しない、高増殖性乳房小葉。（ｖｉｉ）推測された可能な乳房細胞のサブタイプの分化系統ツリーは、系統発生解析ソフトウェア（Ｍｅｓｑｕｉｔｅ）を用いて構成された。このモデルによると、全てのＨＲ＋細胞は、Ｋ５＋管腔細胞及び筋上皮細胞の共通の前駆細胞（Ｍ１−２）とは異なる共通の前駆細胞を有する。３つのグループ（ＨＲ＋、Ｋ５＋及びＭ１−２）全ての共通の前駆細胞は、増殖性トランジット増幅前駆細胞タイプと矛盾しない［Ｋｉ−６７／Ｋ１８］−陽性及び［ＨＲ／Ｋ５／ＳＭＡ］−陰性細胞であると思われる。
【図１６】（Ａ）ＥＲ＋（ｎ＝５１）、（Ｂ）ＨＥＲ２＋（ｎ＝４６）及び（Ｃ）三重陰性乳癌（ｎ＝１１９）に分割される（５１個のＥＲ＋、４６個のＨＥＲ２＋及び１１９個のＴＮＢＣを含む）２１６個のヒト乳癌腫瘍中の、Ｃｌｄ−４、Ｋ７、Ｋ１８、ＶＤＲ、ＡＲ、Ｋ５、Ｋ１４、ＣＤ１０、ＳＭＡ、ｐ６３、ＰＥ、ＥＲ及びＨＥＲ２のタンパク質レベルのヒートマップとしての、ヒト乳房腫瘍中の正常な細胞表現型の識別。管腔マーカ（Ｃｌｄ−４、Ｋ７、Ｋ１８、ＶＤＲ及びＡＲ）並びに基底マーカ（ＣＤ１０、ＳＭＡ及びｐ６３）が示されている。免疫染色された組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）切片を、光学顕微鏡及び０〜２５のスケールを用いてスコアリングした。染色された腫瘍細胞の百分率を、（０）＝０％、（１＋）＝１〜２０％、（２＋）＝２１〜４０％、（３＋）＝４１〜６０％、（４＋）＝６１〜８０％及び（５＋）＝８１〜１００％として定量化した。染色の強度は０〜５として定量化した。合計スコアは、百分率スコアと強度スコアとの乗算によって計算した。黄色は高発現（スコア２５）を示し、青色は低発現（スコア０）を示す。白色は中間の発現である。対応する正常な細胞の対照物のベン図を、ヒートマップの隣に示す。三重陰性腫瘍は、ＬＭ１（Ｋ５／１４−）、ＬＭ２（Ｋ５／１４＋）及びＭ（両管腔及び筋上皮マーカを発現）に分割される。階層クラスタリングを実施した（ペア毎の完全な結合）（Ｄ）正常な細胞の対照物が、観察された乳房腫瘍表現型に対応することを実証する表。
【図１７】ヒト乳房腫瘍における細胞特異的マーカの発現。正常な組織と同様に、ＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ、Ｋ５、Ｋ７、Ｋ１４、Ｋ１８、Ｃｌｄ−４、ＳＭＡ、ＣＤ１０が概ね二項的パターンで発現した。各マーカの典型的な例を、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）切片中の隣接するコアにおいて示しており、陰性のコアが左（＜１％の染色及び０強度＝スコア０）、陽性のコアが右（＞８０％の染色及び５強度＝スコア２５）である。これらのコアはＴＭＡ上で互いに隣接していた。インサイチュ染色の利点の１つは、細胞特異的発現を区別できることである。例えばＳＭＡ／ＣＤ１０は、いくつかのケースでは腫瘍細胞中で（スコア２５の右側のコア）、及び他のケースでは間質細胞中で（スコア０の左側のコア）、強く発現した。この種の細胞タイプ特異的発現情報は、腫瘍抽出物の分子解析では失われる。
【図１８】ヒト乳房腫瘍における細胞特異的マーカの発現。（Ｂ〜Ｅ）正常な組織と同様に、腫瘍中で、増殖性Ｋｉ−６７［＋］腫瘍細胞はＥＲ［＋］腫瘍細胞と相互に排他的である。（Ｆ〜Ｉ）正常な組織と同様に、腫瘍中で、増殖性Ｋｉ−６７［＋］腫瘍細胞はＡＲ［＋］腫瘍細胞と相互に排他的である。（Ｊ〜Ｍ）正常な組織と同様に、腫瘍中で、増殖性Ｋｉ−６７［＋］腫瘍細胞はＶＤＲ［＋］腫瘍細胞と相互に排他的である。（Ｎ〜Ｑ）いくつかの領域では、ＶＤＲ［＋］細胞はＫｉ−６７［＋］であった。これは、ＶＤＲ発現と増殖との間の関係がＥＲ及びＡＲとは異なることを示している。
【図１９】本発明の正常な細胞サブタイプに基づく分類によって得られる、異なる結果。（Ａ）本研究において分析したＮｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＮＨＳ）のケースの全パネルからのＥＲ＋、ＨＥＲ２＋及びＴＮＢＣのケースの分布を説明する円グラフ。（Ｂ）本研究において分析したＮＨＳのケースの全パネルからのＨＲ０〜３カテゴリに基づくＥＲ＋、ＨＥＲ２＋及びＴＮＢＣヒト乳房腫瘍の再分類。乳房腫瘍は、正常な組織の分化に基づいて４つのカテゴリ：ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲを共発現する三重陽性腫瘍（ＨＲ３）；ＥＲ−ＡＲ［＋］、ＡＲ−ＶＤＲ［＋］又はＥＲ−ＶＤＲ［＋］である二重陽性腫瘍（ＨＲ２）；ホルモン受容体のうちの１つのみを発現する（即ちＥＲ［＋］、ＶＤＲ［＋］又はＡＲ［＋］）単一陽性腫瘍（ＨＲ１）；並びにＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲに関して陰性であるホルモン受容体陰性腫瘍（ＨＲ０）に分割した。（Ｃ）ホルモン受容体の状態（ＨＲ３＋全陽性ケース、ＨＲ２＋二重陽性ケース及びＨＲ１＋単一陽性ケース）に従って、本研究において免疫組織化学によってスコアリングされた、Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙからの、侵襲性乳癌を有する全ての個体の全体的生存に関するカプラン・マイヤー生存分析。（Ｄ）８５５人の患者の乳房腫瘍データセット（３７）からの全ての侵襲性乳癌に関する、無再発生存のカプラン・マイヤー分析。腫瘍はＥＲに関する遺伝子発現値に従ってランク分けし、５０％カットオフポイントに基づいて「ＥＲ＿Ｈｉｇｈ」又は「ＥＲ＿Ｌｏｗ」としてスコアリングした。同一のアプローチを用いて、「ＡＲ＿Ｈｉｇｈ」及び「ＡＲ＿Ｌｏｗ」グループ、並びに「ＶＤＲ＿Ｈｉｇｈ」又は「ＶＤＲ＿Ｌｏｗ」を識別した。続いてこれらのグループを、ＨＲの状態：ＨＲ０、ｎ＝１４１；ＨＲ１、ｎ＝２８７；ＨＲ２、ｎ＝２８４；ＨＲ３、ｎ＝１４３に基づいて整理した。
【図２０】ヒト乳房腫瘍におけるケラチン５及び１４の発現。（Ａ）正常なヒト乳房細胞中のｍＲＮＡの分析。正常な管腔ｖｓ．基底特異的プロファイルは、高度に精製された管腔細胞ｖｓ．筋上皮細胞をプロファイリングする３つの異なる研究を組み合わせることによって得られた（６、２５）。３つの研究全てに一貫して、管腔細胞と筋上皮細胞との間で差次的に発現したのはｍＲＮＡの小さなサブセットのみであった。これらは、強力な管腔（緑色のバー）及び強力な筋上皮（暗青色）一致シグネチャのための基礎として役立った。３つの研究のうちの２つにおける差次的発現は、ヒートマップの左側の着色されたバーを用いて示される管腔（黒色）及び筋上皮（赤色）シグネチャのための基礎を形成した（２９〜３１、５４）。組み合わされたヒト乳房ｍＲＮＡ発現データセットを、これらの管腔基底遺伝子の発現に関して分析すると、基底腫瘍（水色）ｖｓ．管腔（非基底）腫瘍（ピンク色）としてヒートマップ上方の着色されたバーを用いてマークされる基底腫瘍と管腔（非基底）腫瘍との間に有意な差は存在しなかった。行は遺伝子を示し、列は各患者からの腫瘍試料を示す。過大発現は橙色、過小発現は青色で示されている。（Ｂ）Ｋ５／６免疫組織化学によってスコアリングされた、Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙからの、三重陰性侵襲性乳癌を有する全ての個体のカプラン・マイヤー分析（ｎ＝１７２）。Ｋ５／６［＋］（ｎ＝５９）腫瘍とＫ５／６［−］（ｎ＝１１３）腫瘍との間に統計的に有意な生存の差は存在しなかった（ｐ＝０．５６）。
【図２１】ＨＲ０〜３カテゴリ及び乳癌細胞株の薬剤応答に基づくヒト乳房腫瘍の再分類。（Ａ）臨床カテゴリＥＲ＋、ＨＥＲ２＋及びＴＮＢＣにおけるＨＲ０、１、２及び３腫瘍の頻度を示す表。ＨＲ分類に基づく乳房腫瘍の組成を示すベン図。（Ｃ〜Ｄ）ホルモン受容体カテゴリ（ＨＲ３＋＝黒色の曲線、ＨＲ２＋＝赤色の曲線、ＨＲ１＋＝黄色の曲線、ＨＲ０＝青色の曲線）に従って、本研究において免疫組織化学によってスコアリングされた、Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙからの侵襲性乳癌を有する全ての個体のカプラン・マイヤー分析。生存は、０〜５年の間（Ｃ）及び５〜２５年の間（Ｄ）の連続変数として試験した。
【図２２】ＨＲ０〜３カテゴリ及び乳癌細胞株の薬剤応答に基づくヒト乳房腫瘍の再分類。（Ｅ）Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙからの侵襲性乳癌を有する全ての個体のカプラン・マイヤー分析。この分析では、ＨＥＲ２＋腫瘍を有する患者は別個のグループとして分析した（ＨＲ３＋＝黒色の曲線、ＨＲ２＋＝赤色の曲線、ＨＲ１＋＝黄色の曲線、ＨＲ０＝青色の曲線、ＨＥＲ２＋＝ピンク色の曲線）。（Ｆ）８５５人の患者の乳房腫瘍データセット（３７）からの全ての侵襲性乳癌に関する、無肺転移生存のカプラン・マイヤー分析。腫瘍はＥＲに関する遺伝子発現値に従ってランク分けし、５０％カットオフポイントに基づいて「ＥＲ＿Ｈｉｇｈ」又は「ＥＲ＿Ｌｏｗ」としてスコアリングした。同一のアプローチを用いて、「ＡＲ＿Ｈｉｇｈ」及び「ＡＲ＿Ｌｏｗ」グループ、並びに「ＶＤＲ＿Ｈｉｇｈ」又は「ＶＤＲ＿Ｌｏｗ」を識別した。続いてこれらのグループを、ＨＲの状態に基づいて整理した。
【図２３】ＨＲ０〜３カテゴリ及び乳癌細胞株の薬剤応答に基づくヒト乳房腫瘍の再分類。（Ｇ）ｍＲＮＡ発現に基づくヒト乳癌細胞株のＨＲ０〜３分類。乳癌細胞株は、分化状態の転写産物（Ｃｌｄ−４、Ｋ７、Ｋ１８、ＶＤＲ、ＡＲ、Ｋ５、Ｋ１４、ＣＤ１０、ＳＭＡ、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＥＲ）のｍＲＮＡ発現によってクラスタリングした。細胞株は、それらが呈する正常な分化状態に従ってグループ分けした（Ｌ１〜Ｌ１１）。クラスタリングは、以下の「材料及び方法」の節に記載するように実施した。赤色は発現の相対的増加を示し、緑色は発現の相対的減少を示し、白色は無変化を示す。（Ｈ、Ｉ）乳癌細胞中のマーカのウェスタンブロット分析、及び結果をまとめた表。
【図２４】ＨＲ０〜３カテゴリ及び乳癌細胞株の薬剤応答に基づくヒト乳房腫瘍の再分類。（Ｊ〜Ｐ）併用ホルモン治療に対するＨＲ１〜３乳癌細胞株の応答。以下に記載の全ての実験（Ｊ〜Ｐ）において、併用した２つの薬剤の相加効果を実証するために、個々の薬剤は低用量（＜５０％抑制）で使用した。各実験を複数回繰り返し、同様の結果が得られた。１つの実験からの代表的な結果を示す。（Ｊ）ＨＲ１細胞株のＶＤＲ及びタキソールを併用した処置。ＥＲ／ＨＥＲ２陰性乳癌細胞株ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＳＵＭ１５９は従来ＴＮＢＣモデルと見做されているため、ホルモン処置の候補ではない。しかしながら本発明者らのＨＲ分類によると、これらＨＲ１（ＶＤＲ＋）腫瘍は、ＶＤＲアゴニストを用いた処置の候補とすることができる。これと矛盾することなく、これらＨＲ１乳癌細胞を、ＶＤＲアゴニストであるカルシトリオール（Ｃａｌ、２５ｎＭ）を単独で又はタキソール（０．５ｎＭ若しくは１ｎＭ）等の化学療法と併用して処置すると、増殖の低下が観察された。これらの薬剤の複合効果は各薬剤単独の場合よりも大きく、相加効果を示した。臨床環境では、これにより、各薬剤をより毒性が低い用量で使用して、より高用量でタキソールを単独で使用した場合と同一の効能を得ることができる。これらの結果は、ＴＮＢＣのＨＲ１サブタイプにおいて、ＶＤＲアゴニストと化学療法との併用を更に探求するべきであることを示している。（Ｋ）ＨＲ２細胞株のＥＲ及びＶＤＲ併用処置：乳癌細胞株ＺＲ７５Ｂは、ＥＲ／ＶＤＲ併用ホルモン治療を用いて潜在的に標的とすることができる、ＥＲ／ＶＤＲ＋  ＨＲ２腫瘍のモデルである。ＥＲアンタゴニストＩＣ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ、ＩＣＩ５ｎＭ）をＶＤＲアゴニストであるカルシトリオール（Ｃａｌ、５０ｎＭ）と併用し、各薬剤を単独で使用した場合よりも高い、これらの薬剤の複合効果が得られた。これらの結果は、このＨＲ２乳癌のサブタイプにおいて、ＥＲアンタゴニストとＶＤＲアゴニストとの併用を更に探求するべきであることを示している。（Ｌ）ＨＲ３細胞株のＡＲ及びＶＤＲ併用処置：乳癌細胞株ＥＲ＋Ｔ４７ＤはＡＲ及びＶＤＲ及びを発現する（ＨＲ３）。この細胞株において、ＡＲアゴニストであるＲ１８８１（メチルトリエノロン、５０ｎＭ）とＶＤＲアゴニストであるカルシトリオール（Ｃａｌ、５０ｎＭ）との組合せは、各薬剤単独の場合よりも効果的に増殖を阻害した。これらの実験は、以前に記載されているように、フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ＋５％チャコール処理ＦＢＳ及び１７−βエストラジオール（Ｅ２、１０ｎＭ）中で実施した（５５、５６）。多数の実験からの代表的な結果を示す。これらの結果は、このＨＲ３乳癌のサブタイプにおいて、ＡＲ及びＶＤＲアゴニストの併用を更に探求するべきであることを示している。（Ｍ）ＨＲ２／ＨＥＲ２細胞株のＡＲ及びＨＥＲ２併用処置：ＡＲアンタゴニストであるフルタミド（Ｆｌｕ、４５μＭ）とＨＥＲ２阻害剤であるラパチニブ（Ｌａｐ、０．５μＭ）との併用は、ＨＲ２＋／ＨＥＲ２＋乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の増殖を相加的に阻害した。（Ｎ）ＨＲ３／ＨＥＲ２細胞株のＥＲ及びＨＥＲ２併用処置：ＥＲアンタ���ニストであるＩＣＩ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ、ＩＣＩ  １０ｎＭ）とＨＥＲ２アンタゴニストであるラパチニブ（Ｌａｐ、１０ｎＭ）との併用は、以前に記載されているように、ＨＲ３＋／ＨＥＲ２＋乳癌細胞株ＢＴ４７４の増殖を相加的に阻害した（５７）。多数の実験からの代表的な結果を示す。以上の結果（Ｍ、Ｎ）は、ＨＥＲ２＋／ＨＲ＋乳癌に関して、ＥＲ及びＡＲアンタゴニストとＨＥＲ２標的処置との併用を更に探求するべきであることを示している。（Ｏ）ＥＲ陰性対照細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）では、遥かに高い濃度のＥＲアンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ、ＩＣＩ  １００ｎＭ）を用いて処置しても、細胞増殖の阻害は見られなかった。（Ｐ）ＶＤＲ陰性対照細胞株（ＢＴ５４９）では、１０ｎＭ、２５ｎＭ及び１００ｎＭという異なる複数の濃度のＶＤＲアゴニストであるカルシトリオール（Ｃａｌ）を用いて処置しても、細胞増殖の阻害は見られなかった。対照と１００ｎＭとのグループも示す。
【図２５】Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（１９７６〜１９９６）における交差分類ＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ状態（Ｎ＝１７３１）による、参加者の特質の平均及び頻度を示す表。
【図２６】ＨＲ状態（ＨＲ０、ＨＲ１、ＨＲ２及びＨＲ３）による乳癌特異的死亡率の多変量分析；診断からの時間による、Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙにおける乳癌特異的死亡率に関するハザード比及び９５％信頼区間を示す表。
【００２０】
図面のうちの複数の図を通して、同様の参照番号は同様の部分を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、乳癌のための新規の分類システム、及び上記分類システムに基づく処置方法を対象とする。このシステムは、乳房組織中の特定のホルモン受容体の発現レベルに基づいており、これは、正常な非癌腫乳房組織中のこれら同一のホルモン受容体の表現型細胞発現を反映する。本発明は現在のところ、本明細書でＨＲ０〜３として表される４つの特定のホルモン分化グループに対応する１１個の乳癌の細胞サブタイプに関連している。更に、各分化グループは様々な度合いの生存の達成と相関関係にある。従ってこのような存在論的分類システムはまた、ヒト乳癌の全てのサブタイプに対する作用可能なホルモン処置戦略を提供し、上記戦略を、患者及び患者が呈する特定のホルモン発現パターンに関してカスタマイズできる。
【００２２】
上記分類システム並びに本発明の分類システムに基づく診断、予後予測及び処置方法は、ホルモンが作用するいずれの癌に対して等しく適用されることを理解されたい。例えば本明細書では本発明を乳癌について記載及び説明しているが、本発明は、いくつかを例示目的で挙げると卵巣癌、前立腺癌及び甲状腺癌にも同様に適用される。
【００２３】
本発明について詳細に記載する前に、複数の用語を定義することが本発明の理解に有益であり得、従ってこれらの用語を以下の節において説明する。定義されていない場合、本明細書で使用される全ての専門用語、表記法及び他の科学用語又は用語法は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味を有することが意図されている。場合によっては、明確性のため及び／又は参照を容易にするために、一般に理解される意味を有する用語が本明細書で定義され、本明細書がこのような定義を含むことは、当該技術分野において一般に理解される意味に対する実質的な差異を表すものとは必ずしも解釈されないものとする。更に、一般的に使用される辞書中で定義される用語等の用語は、関連技術の文脈における、及び／又はそうでない場合は本明細書において定義されるこれらの用語と矛盾しない意味を有するものとして解釈されるものとする。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、特定の処置の受容者となる、ヒトに限定されないいずれの動物を指す。患者となり得る動物の他の非限定的な例としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、ヒトでない霊長類、齧歯類等が挙げられる。典型的には、用語「哺乳類」及び「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は本明細書では相互交換可能に使用できる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）」又は「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、タンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、又は特定のヌクレオチド配列、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントの生物学的及び／又は生化学的活性のレベルを指す。用語「発現する」及び「発現」は相互交換可能に使用できる。
【００２６】
更に、有意な又は適切なレベルの発現とは、タンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、又は生物学的及び／又は生化学的活性、又は経路の、疾患の状態及び／又は進行及び／又は寛解に相関する、又は上記タンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、若しくは生物学的及び／又は生化学的活性を阻害若しくは促進する（アゴニスト及びアンタゴニスト等の）リガンドに対する応答に相関するような度合いの発現を意味する。リガンドに対する応答は、インビトロ又はインビボで観察及び／又は測定され得るリガンド−受容体結合に対する、いずれの適切な生物学的、化学的、生化学的、医学的、病理学的、表現型的及び／又はいずれの他の応答であってよい。実例としては、細胞増殖及び／又は細胞成長の、細胞死、分化、成長停止、移動、侵入、転移の増大及び／又は減少；腫瘍サイズ、無疾患生存、無再発生存、全生存の増大及び／又は減少等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
生物学的及び／又は生化学的妥当性を満たさない発現のレベルは、発現していない、又は発現を実質的に欠いているものと考えられる。発現は定性的又は定量的であってよく、別個に又は連続的に定量化してよく、様々な発現レベルを示すために上記連続体に沿ったいずれの場所に特定の閾値を設定してよい。例えば発現は、いずれの検出可能な量のタンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、又は特定のヌクレオチド配列、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントの生物学的及び／又は生化学的活性を呈する集団中の細胞の個数によって決定してよい。他の実施形態では、発現は、検出可能な量のタンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、又は特定のヌクレオチド配列、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントの生物学的及び／又は生化学的活性の、レベル、度合い又は強度によって決定してよい。発現はまた、定量的特性と定性的特性との併用によって決定してもよい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」は、正常な機能を損なう、障害、疾病若しくは体調又は健康な若しくは正常な生物学的活動からの他の離脱を指す。用語「疾患」、「障害」及び「体調（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、本明細書全体を通して相互交換可能に使用できる。上記体調は、散発性又は遺伝性の遺伝子異常によって引き起こされ得る。上記体調はまた、非遺伝子的な異常によっても引き起こされ得る。疾患は、臨床的又は準臨床的症状を有する被験者に存在し得る。しかしながら被験者は、診断時には無症候性でもあり得る。疾患は、良性成長又は良性腫瘍（即ち非癌性成長）、及び癌（即ち癌性細胞又は癌性腫瘍）を含んでよい。例えば本明細書で使用される場合、少なくとも１つの実施形態「疾患」は乳癌を指し、より具体的にはヒト乳癌を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」又は「癌性の（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」は、細胞の制御されない成長及び分裂を指しこれは細胞の過成長、又は密集若しくは成長（即ち腫瘍）につながる。これは良性及び転移性の両方の形態の癌を含む。「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」に言及する場合、癌性腫瘍は「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ）と呼ばれることが多いが、文脈によっては、単に「腫瘍」と言うだけでも悪性腫瘍を指す場合がある。「癌」は、２つ以上の癌性細胞又は癌性細胞の密集体といった個々の癌性細胞及び腫瘍を総体的に指す。更に「癌」に対する言及は、腫瘍発生部位において成長し、進行して癌性成長を形成する初期腫瘍、及び初期腫瘍の１つ又は複数の悪性細胞に由来するものの初期腫瘍から離間した部位において成長する転移性病変又は１つ若しくは複数の腫瘍を含む。しかしながら、用語「癌」の使用は、初期腫瘍が既に転移していることを必ずしも意味しない。いくつかの癌は初め無痛性であっても又は侵攻性であってもよい。対照的に、いくつかの癌は、無痛性病変として良性であってよく、時間と共に変化して侵攻性となってよい。従って初期腫瘍はある期間は無痛性のままであってよく、転移を発生せずに極めてゆっくりと成長し、最終的に侵攻性となり、急速に成長して転移し得る。用語「癌」及び「腫瘍」の使用は、本発明中で利用されるような上述の全ての可能性を包含するものとする。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の発育又は進行を阻止若しくは阻害すること、若しくは阻止若しくは阻害することを試みること、並びに／又は障害、疾患及び／又はその症状の低減、抑制、退行若しくは緩和を引き起こすこと、若しくは引き起こすことを試みることを指す。当業者であれば理解できるように、様々な臨床的及び科学的方法論及びアッセイを用いて疾患の発育又は進行を評価してよく、また同様に、様々な臨床的及び科学的方法論及びアッセイを用いて疾患又はその症状の低減、退行又は緩和を評価してよい。「処置」は、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を指す。処置を必要とする対象としては、既に疾患を有する対象、及び疾患に罹り易い対象又は疾患を予防するべき対象が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、被験者に治療上有効な量の処置用製品を提供することを指す。処置用製品は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）及びＨＥＲ２を含む、本明細書中の分類システムに関与するホルモンのうちの少なくとも１つのためのシグナル伝達経路に影響を与えることができる、化学的、生化学的又は医薬的分子又は化合物と考えられる。例えば処置用製品は、限定するものではないがＩＣＩ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）等のＥＲアンタゴニストであってよい。処置用製品は、非限定的な例として、Ｒ１８８１（メチルトリエノロン）等のＡＲアゴニスト、又はカルシトリオール等のＶＤＲアゴニストであってよい。処置用製品は、ホルモン受容体に直接影響を与えてよく、又はシグナル伝達及び下流効果に関してホルモン及び／又はホルモン受容体と相互作用するか若しくはこれらに対して影響を有する「パートナータンパク質（ｐａｒｔｎｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」に影響を与えることによって作用してよい。更に処置用製品は、経口、硝子体内、眼内、眼、網膜下、髄腔内、静脈内、皮下、経皮、皮内、頭蓋内及び局所等のいずれの適切な投与方法を用いて患者に投与又は提供してよい。処置用製品は単独で、又は他の化合物、賦形剤、充填剤、結合剤、担体若しくは選択される投与経路及び標準的な薬学上の慣例に基づいて選択された他のビヒクルと共に、投与できる。投与は、無菌の水性若しくは非水性溶液又は生理食塩水を含む、注入可能な溶液；クリーム；ローション；カプセル；錠剤；顆粒；ペレット；粉末；懸濁液、エマルジョン又はマイクロエマルジョン；パッチ；ミセル；リポソーム；小胞；マイクロインプラントを含むインプラント；点眼薬；他のタンパク質及びペプチド；合成ポリマー；小球体；ナノ粒子等の、担体又はビヒクルによるものであってよい。
【００３２】
処置用製品はまた、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ガラクトース、オリゴ糖及び／又は多糖類、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、デンプンフラグメント、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、デキストラン、デキストリン等を含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能な担体、賦形剤、結合剤及び充填剤といった、他の非毒性化合物に含まれてもよく、又は上記他の非毒性化合物によって包装されてもよい。具体的には、本発明の実施にあたって使用が考えられる、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、結合剤及び充填剤は、本発明の化合物を、経口送達、硝子体内送達、眼内送達、眼送達、網膜下送達、髄腔内送達、静脈内送達、皮下送達、経皮送達、皮内送達、頭蓋内送達、局所送達等に適したものとするものである。更に、包装材料は生物学的に不活性であってよく、又は生体活性を有しなくてよく（可塑性ポリマー、シリコーン等）、また、上記包装材料を用いて包装及び／又は送達される処置用製品の効果に影響を与えることなく、患者が内服して処理できる。
【００３３】
本明細書中に記載の処置用製品に適用される場合、用語「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」又は「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」（これらは相互交換可能に使用できる）は、所望の治療結果を得るために必要な量を意味する。例えば有効な量は、治療用化合物、生物学的薬剤又は組成物の投与対象である疾患、例えば癌及び更に具体的には乳癌の症状を処置、治癒又は寛解するために効果的なレベルである。求められる特定の治療目標に対して効果的な量は：処置される疾患並びにその重篤度及び／又は発育／進行のステージ；使用される具体的な化合物、生物学的薬剤又は薬学的組成物の生体利用能及び活性；投与の経路又は方法及び被験者の導入部位；具体的な化合物又は生物学的薬剤の排出速度及び他の薬物動態学的特性；処置の期間；接種レジメン；具体的な化合物、生物学的薬剤又は組成物と併用される又は同時使用される薬剤；処置される被験者の年齢、体重、性別、食事、生理機能及び総合的健康状態；並びに関連する科学的分野の技能を有する者には公知の同様の因子を含む、様々な因子に左右されることになる。適用量のある程度の変化は、処置される被験者の状態に応じて必然的に発生することになり、いずれの場合においても、処置を投与する外科医又はその他の個体が、個々の患者に対して適切な用量を決定することになる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」は、受容体と結合することによって、同一の受容体と結合する他の分子の能力をブロックする、分子、医薬、薬剤又は化合物を意味する。アンタゴニストは、標的とする受容体と結合しても生物学的応答を生成せず、アンタゴニストの結合は、生物学的影響を引き起こし得る他の分子の結合を防止する。従ってアンタゴニストは、生物内の生化学的経路における下流でのイベントを阻害又はブロックする阻害分子と考えられる。アンタゴニストの影響は、受容体の活性部位への結合の結果であってよく、上記活性部位は、別の分子が同一の受容体に結合する場合と同一の部位である。アンタゴニストの効果はアロステリック結合の結果でもあってよく、このアロステリック結合においては、アンタゴニストは、受容体上の、別の分子が結合する場合とは異なる部位に結合するものの、それにも関わらず上記他の分子の結合を防止する。アンタゴニストは、受容体結合部位に対する様々なレベルの親和性を有してよく、従って、上記受容体との結合に関して他の内因性リガンド若しくは基質と競合してよく、及び／又は他の内因性リガンド若しくは基質に打ち勝ってよい。更に、アンタゴニスト−受容体結合は、アンタゴニスト、受容体、結合部位特性及びその親和性に応じて、可逆性又は不可逆性であってよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）」は、受容体と結合することによって応答をトリガする分子、医薬、薬剤又は化合物を意味する。例えば受容体は細胞上又は細胞内で発現されてよく、アゴニストの結合は、細胞上又は細胞内で影響又は変化を引き起こす。上記影響は本質的に生物学的又は生化学的なものであってよい。例えば、受容体に結合するアゴニストは、特定のタンパク質の発現を誘発してよく、又は生化学的経路若しくは生化学的経路内での反応の「カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）」の活性化を引き起こしてよい。アゴニストは、特定の受容体若しくは受容体上の結合部位に関して選択的であってよく、又は複数の受容体若しくは結合部位の１つのクラスに共通であってよい。更にアゴニストは、特定のアゴニスト及び標的受容体に応じて、その標的結合部位に関して様々な親和性及び特異性をもって結合してよい。アゴニストは、同様の受容体及び／又は結合部位に結合する他のリガンドと競合してよく、又はある受容体及び／又はある結合部位に対して一意的であってよい。更に、アゴニスト−受容体結合は、アゴニスト、受容体、結合部位特性及びその親和性に応じて、可逆性又は不可逆性であってよい。
【００３６】
これらの定義を念頭に置いて、これより本発明について説明する。具体的には、本発明は、特定のタンパク質、即ちエストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、並びに場合によってはＨＥＲ２、並びに乳房細胞の管腔層及び筋上皮層中で差次的に発現するケラチン等の特定のマーカの発現の正常な乳房細胞表現型に基づく乳癌の分類システムを対象とする。
【００３７】
この分類システムは、いくつかの理由から、これら特定の受容体及びマーカの存在に基づいている。第１に、ホルモン受容体は組織成長及び分化に主要な役割を果たすため、ホルモン受容体に関して文献の初期検証及び予備的な免疫染色を実施した。上記初期検証によって、３つの受容体ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲが、乳房小葉の管腔層における明確な二峰性発現（いくつかの細胞では強く発現し、他の細胞では全く発現しない）によって際立ったものであることが分かった。多くの他のホルモン受容体は二峰性発現を示さず、従って乳房組織中の細胞サブタイプ（即ち管腔ｖｓ．筋上皮）を識別するためのマーカとして使用できなかった。更に、Ｋ７、Ｋ８、Ｋ１８、Ｋ５、Ｋｉ６７（増殖細胞のためのマーカ）及びクローディン‐４（Ｃｌｄ‐４）等の特定のタンパク質及びケラチンは、乳房組織の管腔層細胞中で差次的に発現する。分化マーカＣＤ１０のクラスタ、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）及びｐ６３を含む他のケラチン及びタンパク質は、乳房組織の筋上皮層細胞に局在する。管腔層は増殖又は成長細胞を含み、癌細胞は本質的に制御できない細胞の成長であるため、乳房組織の管腔層中の細胞の表現型を理解することは、乳癌を理解及び分類するにあたって重要なステップであると考えられた。更に、ヒトの腫瘍の９５％は管腔層細胞の表現型と類似しており、正常な乳房中の殆ど全ての増殖は管腔層で発生する。
【００３８】
本発明は、いずれの形態のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲ、並びにこれらが結合するいずれのリガンドに基づく分類及び方法を含むことに留意されたい。例えば本発明は、限定するものではないがエストロン、エストラジオール、エストリオール、ステロール及びキセノエストロゲン類といった、ステロイド性及び非ステロイド性エストロゲン類に基づいて活性を識別するために使用できる。同様に本発明は、副腎性アンドロゲン等のＡＲを有するいずれのアンドロゲンに基づいて活性を識別するために使用でき、また限定するものではないが、テストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、ジヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、アンドロステンジオン、アンドロステンジオール及びアンドロステロンを含んでよい。更に、本発明に関与するＶＤＲ発現には、限定するものではないがビタミンＤ２及びＤ３といったいずれのビタミンＤが関連し得る。
【００３９】
より詳細には、本発明の分類システムは、乳癌腫瘍又は癌性組織中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現の実質的な不在によって定義される第１のカテゴリを含む。従ってこのカテゴリは、本明細書ではホルモン受容体陰性状態、又はＨＲ０とも呼ばれる場合があるが、これら３つの受容体の発現の不在に対応するいずれの名称も使用され得る。この命名法は、以下で説明する他のカテゴリにも同様に当てはまる。
【００４０】
ＨＲ０カテゴリに含まれるためには、乳癌組織は、有意な又は関連するレベルのＥＲ、ＡＲ又はＶＤを発現してはならないが、他のタンパク質は発現してよい。本明細書で使用される場合、発現の「実質的な不在（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｌａｃｋ）」は、例えば下流効果を生成しない等、機能的に関連しない発現のレベルを意味する。従ってこのカテゴリにおいて、ある程度の低いレベルのＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲは存在してよく及び／又は検出可能であってよく、無視できる程度の少量で存在してよい。例えば、限定的な意味に解釈するべきではないが、少なくとも１つの例において、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲの発現の実質的な不在は、組織試料中の細胞の１％未満が、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲを発現することが示された場合に決定してよい。他の実施形態では、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲの発現の実質的な不在の閾値は、発現する細胞のうちの５％未満、１０％未満、３０％未満、５０％未満、及び０％〜５０％の間の連続した範囲内のいずれの百分率が発現することである。更に他の実施形態では、発現は、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲを発現する細胞の数によってではなく、発現の強度又は度合いによって決定してよい。例えば、１％未満又は５０％未満の強度は、機能的に又は有意に関連しないと考えてよい。強度もまた、発現の決定のための連続的な又は非連続的なスケールにおいて考慮してよい。
【００４１】
更にこの第１のカテゴリ（ＨＲ０）は、図１０にＬ１〜Ｌ３として示されている多数のサブタイプ又はサブクラスを含む。これらのサブタイプは全て、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲに関して陰性であるとして分類されるが、いくつかの乳房組織は細胞増殖マーカＫｉ６７（Ｌ１）を発現し、他の乳房組織はケラチンＫ８（Ｌ２）を発現し、更に他の乳房組織はケラチンＫ５（Ｌ３）を発現する。
【００４２】
この分類システムはまた、ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのうちのいずれか１つの発現によって定義される第２のカテゴリも含む。従ってこのカテゴリは、本明細書では単一ホルモン受容体陽性状態、即ちＨＲ１又はＨＲ１＋とも呼ばれる場合がある。このカテゴリに含まれるためには、受容体ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのうちのいずれかが存在し得るが、１つしか発現できない。既に定義したように、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲは、機能的に有意な及び／又は関連するような高いレベルでこれらが存在する場合に、発現していると考えられる。少なくとも１つの実施形態では、発現は、細胞の少なくとも１％がタンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又は生物活性等のいずれの形態でＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲを呈することによって決定できる。他の実施形態では、発現の閾値は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも３０％及び少なくとも５０％として定義される。上述のように、発現は定性的又は定量的に定義してよく、別個であっても連続体に沿っていてもよい。
【００４３】
この発現は、乳房組織の管腔層においてのものである。従って図１０に示すように、ＨＲ１の多数のサブタイプ又はサブクラス（Ｌ４〜Ｌ７）が存在する。例えばあるサブタイプは、ＥＲのみを発現する組織に対応する（Ｌ４）。別のサブタイプはＡＲのみを発現する組織に対応する（Ｌ５）。別のサブタイプはＶＤＲのみを発現する組織に対応する（Ｌ６）。最後のサブタイプはＶＤＲのみを発現するもののケラチンＫ５も発現する組織に対応する（Ｌ７）。
【００４４】
この分類システムは、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちのいずれの２つの組合せの発現によっても定義される第３のカテゴリも含む。従ってこのカテゴリは、本明細書では二重ホルモン受容体陽性状態、即ちＨＲ２又はＨＲ２＋とも呼ばれる場合がある。上述のように、この発現は、管腔層においてのものである。従って図１０にＬ８〜Ｌ１０として示すように、特定の組合せそれぞれに対応する３つのサブタイプが存在する。例えばＬ８はＥＲ及びＡＲの両方を発現する細胞に対応する。Ｌ９はＥＲ及びＶＤＲの両方を発現する細胞に対応する。Ｌ１０はＡＲ及びＶＤＲの両方を発現する細胞に対応する。
【００４５】
この分類システムはまた、ＥＲ、ＡＲ及びはＶＤＲの３つ全ての発現によって定義される第４のカテゴリも含む。従ってこのカテゴリは、本明細書では三重ホルモン受容体陽性状態、即ちＨＲ３又はＨＲ３＋とも呼ばれる場合がある。これはまた、図１０に示すように唯一のサブクラスＬ１１であると考えられる。
【００４６】
特定の実施形態では、分類システムはまた、いくつかのタイプの乳癌に関連することが公知であるヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の発現も包含する。この発現は典型的には、比較的侵攻性の乳癌の指標と考えられており、ホルモン治療に対する耐性が比較的高いと考えられている。
【００４７】
本発明のこの分類システムは、乳癌腫瘍又は癌性組織を、良性又は悪性として分類するために使用される。この分類システムは、正常な乳房組織中でのＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの同様の表現型発現パターンに基づいており、これは多くの点で独特なものである。第１に、本システムは、表現型特性決定のための正常な組織との比較において、従来の乳がん分類システムからの離脱である。これにより、癌のサブタイプのより正確な識別が可能となる。第２に、識別のためにＥＲ、ＨＥＲ２及び三重陰性腫瘍のみを参照する公知の分類システムに比べて、本システムは、腫瘍分類の決定においてＡＲ又はＶＤＲレベルを評価する唯一の分類システムである。（更に詳細には、図１９及び以下の実施例９を参照されたい。）実際には本発明は、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲ、並びに場合によってはＨＥＲ２の発現レベルを共に考慮する統合システムである。本発明のこれらの態様は、本分類システムが、既存のグループを単に改称したものではなく、現在存在しているものよりも良好な腫瘍分類の構成を提供するものであることを示しており、これによってより正確な診断及びより効果的な処置レジメンの設計が可能となる。
【００４８】
本発明はまた、本分類システムを利用した乳癌の分類方法も対象とする。本質的には本方法は、患者の乳癌腫瘍又は癌性組織中に存在するＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを測定するステップと、これらタンパク質の発現レベルに基づいて癌を分類するステップとを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、ＨＥＲ２のレベルを測定するステップと、存在するＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ及びＨＥＲ２のレベルに基づいて癌を分類するステップとを含む。本明細書全体を通して使用される場合、レベルを「測定するステップ（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」は、当業者が理解できるいずれの適切な化学的、生物学的及び／又は生化学的方法で実施できる。限定するものではないが、例として：免疫染色、免疫蛍光、免疫アッセイ及び免疫沈殿等の抗体ベースアッセイ；タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡの質量分光測定；ウェスタンブロット分析等のタンパク質研究；ノーザンブロット分析、プローブハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡ研究、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、インサイチュハイブリダイゼーション等の核酸研究；並びに生物学的及び／又は生化学的活性を検出するためのバイオアッセイが挙げられる。本方法の範囲内においては、測定されるＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲのレベルは、ゼロ、又は上述のように実質的若しくは機能的なゼロを含むいずれの値を含むことができ、別個のものであっても連続していてもよいと考えられる。このような情報は、癌を複数のカテゴリに分類するにあたって利用される。既に更に詳細に説明したように、また「材料及び方法」の節において更に詳細に説明するように、試料中の細胞のうちの１％超が上述のいずれの発現又は活性を示す場合に、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲ陽性状態を割り当てることができる。他の実施形態では、陽性状態は、細胞のうちの５％超、細胞のうちの１０％超、及び／又は細胞のうちの５０％超として定義される。これらの間の様々な漸増分も本発明の精神に含まれる。
【００４９】
より詳細には、少なくとも１つの実施形態において、本方法は、腫瘍又は組織試料中で測定されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現のレベルに基づいて、癌を複数のカテゴリのうちの１つに分類するステップを含む。これらのカテゴリは、本発明の分類システムの説明において既に記載したものと同様であり、第１のカテゴリ（即ちＨＲ０）、第２のカテゴリ（ＨＲ１）、第３のカテゴリ（ＨＲ２）及び第４のカテゴリ（ＨＲ３）を含む。従って本方法はまた、腫瘍又は癌性組織中で測定されたＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを、乳房組織等の対応する正常な組織中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの同様の発現パターン及び／又はレベルと比較するステップも含む。組織は同様のタイプの細胞（同一の起源のもの等）の集合体で構成されるため、本明細書で使用される場合、「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」は少なくとも１つの細胞を含むことを理解されたい。
【００５０】
更に、（図及び以下で提供される実施例においてＨＲ０〜ＨＲ３として示される）本分類システムの様々なカテゴリは、乳癌と診断された患者の有意な生存差に対応する。本出願で使用される場合、「有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）」は、当該イベントが偶然によって引き起こされる可能性が略なく、特定の要因（この場合はＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲ並びにこれらの組合せの存在）の直接的な結果であるよう、統計的に有意であることを意味する。例えば、図１９に示されており、かつ以下の実施例１０において更に詳細に説明されるように、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの全てを発現する第４のカテゴリ（即ちＨＲ３）に分類される腫瘍を有する患者は、他のカテゴリに分類される腫瘍を有する患者と比較して、最良の生存率（及び従って最良の予後）を有する。ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちのいずれか２つを発現する第３のカテゴリ（即ちＨＲ２）の腫瘍はこれよりも悪い結果になるが、ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのうちの１つのみを発現する第２のカテゴリ（即ちＨＲ１）の腫瘍が、他のカテゴリと比較して最も低い生存率及び従って最も悪い予後を有する。これは図１９に視覚的に示されており、この図では、カプラン・マイヤー曲線は、ＨＲ３＋として分類される腫瘍を有する患者が、ＨＲ１＋腫瘍を有する患者よりも良好な推移を示すＨＲ２＋腫瘍を有する患者と比較して、診断後のいずれの所定の時点（即ち年数）においてより多く生存していることを示す。本明細書で使用される場合、「＋」を伴って使用されるカテゴリの呼称と、「＋」を伴わずに使用されるカテゴリの呼称とは等価であり、相互交換可能に使用できる（例えばＨＲ３及びＨＲ３＋）。ＨＲ０の腫瘍の場合、生存の見込みは診断後５年を超えて横這いであり、他の腫瘍よりも経時的に良好であるが、初期においては他の腫瘍よりも悪い。この情報に基づき、本発明の分類システムの結果として、より正確な予後を患者に提供できる。
【００５１】
従って本発明は更に、乳癌の予後を予測する方法を対象とし、この方法は、患者の腫瘍又は癌性腫瘍中に存在するＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを測定するステップを含む。本方法は、これらのレベルに基づいて：ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの３つ全てが見られる場合に比較的高い生存率を決定するステップ；ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つのみが見られる場合に中間の生存率を決定するステップ；並びにＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの１つのみが見られる場合に比較的低い生存率を決定するステップを含む。ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのいずれも見られない場合、本方法は混合生存率を決定するステップを含み、生存率は診断後最初の５年以内は比較的好ましくなく、その後、診断後２０年までに極めて好ましい状態へと平準化される。これらの生存率は絶対的なものではないが、以下の実施例１０において説明される本研究によって決定されるように、この予後の予測方法はその大部分が、図１９Ｃ及び１９Ｄに示すカプラン・マイヤー生存曲線に基づくものである。
【００５２】
乳癌に関する本分類システム及び生存率は、乳癌腫瘍又は癌性組織中に存在するＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルに基づくものであるため、これらのタンパク質に影響を与えることを目的とした処置レジメンは、乳癌の処置及び／又は管理に役立つはずである。上述のように、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の発育又は進行を阻止若しくは阻害すること、若しくは阻止若しくは阻害することを試みること、並びに／又は疾患及び／又はその症状の低減、抑制、退行若しくは緩和を引き起こすこと、若しくは引き起こすことを試みることを伴う。従って本発明は更に、癌患者のための処置レジメンを決定する方法を対象とし、この方法は、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを測定するステップ、並びに腫瘍又は癌性組織中に存在するＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲのそれぞれに関して、影響を与える少なくとも１つの分子を含めるステップを含む。従って、本発明の処置レジメン及び処置方法は、本分類システムに基づいて患者の特定の腫瘍又は癌性組織がどのカテゴリ及びサブクラスに分類されるかに応じて、各患者に対してカスタマイズされると考えられる。
【００５３】
例えば本方法は、ＥＲが腫瘍又は組織中に存在する場合に、少なくとも１つのＥＲアンタゴニストを処置レジメンに含めるステップを含む。エストロゲンは正常な乳房細胞の成長抑制因子である。対照的に、エストロゲンは乳癌の成長を促進する。従ってエストロゲンの役割は、正常な細胞と癌性細胞とで反転し、従って癌においてエストロゲンの作用をブロックすることが重要である。上述のように、「アンタゴニスト」は、受容体への結合作用の効果をブロック又は阻害する。エストロゲン受容体（ＥＲ）及びエストロゲンシグナル伝達は乳癌において細胞の増殖につながる役割を果たす。アンタゴニストを用いる等してＥＲの作用を阻害することによって、乳房細胞の下流での増殖又は成長も阻害され、これによって乳癌の発育及び／又は進行を減速させる。ＥＲを発現するこれらの腫瘍又は癌性細胞に関して、限定するものではないがＩＣＩ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）等のＥＲアンタゴニストによる処置は、乳癌成長の増殖を阻害する。更なる詳細に関しては実施例１２及び図２４を参照されたい。
【００５４】
処置レジメンを決定する方法は更に、腫瘍又は腫瘍細胞がＡＲを発現した場合に処置レジメンに少なくとも１つのＡＲリガンドを含めるステップを伴う。上述のように癌において役割が反転するエストロゲンとは対照的に、アンドロゲンは、患者がＨＥＲ２も発現するかどうかに応じて、患者の正常な細胞及び癌性細胞の両方における細胞成長に異なる影響を与える。従って、ある場合にはアンドロゲンの作用を促進することが癌の成長を阻害するにあたって有益であり、また他の場合にはアンドロゲンを阻害することが有益である。具体的には、ＨＥＲ２＋である患者及びＨＥＲ２−である患者において、ＡＲは反対の役割を果たす。ＨＥＲ２＋の患者ではＡＲを阻害する必要があり、従ってＡＲアンタゴニストが使用される。ＨＥＲ２−の患者ではＡＲを促進するべきであり、従ってＡＲをアゴニストが使用される。上で定義したように、「アゴニスト」は、受容体と結合することによって応答をトリガする。アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びホルモンアンドロゲンもまた、乳癌においてシグナル伝達経路を通してある役割を果たし、これは最終的に細胞増殖の阻害につながる。従って、ＡＲを含有する乳癌細胞に適用される、限定するものではないがＲ１８８１（メチルトリエノロン）等のＡＲアゴニストは、更なる乳癌細胞の増殖及び成長を阻害する。更なる詳細に関しては実施例１２及び図２４を参照されたい。しかしながら、ＨＥＲ２＋の患者においては、ＡＲは反対の役割を果たし、阻害する必要がある。従ってＨＥＲ２＋の患者ではＡＲアンタゴニストを用いて細胞成長を阻害する。従って本明細書で使用される場合、「リガンド（ｌｉｇａｎｄ）」は、ＡＲ等の標的受容体タンパク質と結合することになるいずれの分子を意味し、乳癌のサブタイプに応じてアゴニスト及びアンタゴニストの両方を包含する。
【００５５】
処置レジメンの決定方法はまた、腫瘍又は癌性細胞がＶＤＲを発現する場合に、処置レジメンに少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを含めるステップを伴う。アンドロゲンと同様に、ビタミンＤもまた、正常な細胞及び癌性細胞における細胞増殖を阻害する。従って、限定するものではないがカルシトリオール等のＶＤＲアゴニストもまた乳癌における細胞増殖を阻害する。更なる詳細に関しては実施例１２及び図２４を参照されたい。
【００５６】
更に、腫瘍又は癌性組織中にＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つ以上が検出される場合、処置レジメンを決定する方法は、処置レジメンに対して多ホルモンアプローチを含めるステップを含む。実例としては、腫瘍がＥＲ＋／ＶＤＲ＋である場合、ＥＲアンタゴニスト及びＶＤＲアゴニストの両方を処置レジメンに含めてよい。このような多ホルモン処置は、少なくとも相加効果を有し、場合によっては相乗効果を有し、組み合わせて投与した場合に、各ホルモン処置製品が単独で達成するものよりも遥かに強力な乳癌細胞成長の阻害を生成することが分かっている。更なる詳細に関しては実施例１２及び図２４を参照されたい。ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの対応する発現プロファイルに対する、多ホルモン処置のいずれの適切な組合せが、本発明の様々な実施形態の範囲内において考えられる。少なくとも１つの他の実施形態では、処置用製品はＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲに特異的に作用せず、「パートナータンパク質」に作用して、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲに直接作用するのと同様にシグナル伝達に影響を与える。
【００５７】
本発明は、乳癌に対して多ホルモン治療処置を使用する点で新規であり、既知の癌処置に対して多くの利点を提供する。例えば本処置方法は化学療法ではなく、従ってより安全であり、発生する副作用が少ない。更に、有効な結果を達成するために使用される、関連するホルモン処置用製品それぞれの用量が少なく、これにより容認性がより高くなく、副作用は更に少なくなる。乳癌の分類に従って多数の処置用製品が必要となる場合、処置用製品は、より迅速な効果及び／又は相加若しくは相乗効果のために患者に同時に投与してよい。他の実施形態では、いずれの悪影響を更に低減するために、多数の処置用製品を患者に、場合によっては１回に１つずつ交代で、順次投与してよい。
【００５８】
更に本処置方法は、他の処置プロトコルに対して便益を提供する。例えばアンドロゲンはある程度の女性において早期閉経を誘発することが知られており、これは身体的及び感情的に極めて不快であり得る。ビタミンＤはカルシウムシグナル伝達において重要であり、従ってビタミンＤ受容体に影響を与えると、身体中でのカルシウム利用に悪影響がある場合があり、また気孔率の低下及び骨粗鬆症につながり得る。しかしながら、特に組み合わせて投与した場合にＥＲシグナル伝達をブロックしてＡＲ及びＶＤＲシグナル伝達を促進する処置用製品を提供することによって、本発明は、それぞれを単独で用いた場合よりも良好な結果を提供し、また副作用を発癌効果とは無関連とすることができる。
【００５９】
既に説明したように、現在、乳癌は、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２に関するＥＲ＋、ＨＥＲ２＋又は三重陰性の存在又は不在に基づいて分類される。更にＨＥＲ２＋乳癌腫瘍の約９５％が少なくとも１つのホルモン受容体を発現する。従って、少なくとも１つの実施形態では、処置レジメンを決定する本方法は、少なくとも１つのＨＥＲ２阻害剤を処置レジメンに含めるステップを伴う。一例はラパチニブ（Ｌａｐ）であるが、いずれのＨＥＲ２阻害剤を使用してよい。これは、これらの受容体それぞれが腫瘍又は癌性細胞内に存在する又は検出される場合に、ＥＲアンタゴニスト、ＡＲアゴニスト及び／又はＶＤＲアゴニストのうちの少なくとも１つを処置レジメンに含めることに加えて実施される。このような実施形態では、ＨＥＲ２阻害剤はＥＲアンタゴニスト、ＡＲアゴニスト及び／又はＶＤＲアゴニストと相加的に作用して、腫瘍又は組織中での乳癌細胞増殖を阻害する。
【００６０】
癌の重篤度及び／又は癌のステージ、進行並びに侵攻性の程度に応じて、上述の１つ又は複数のホルモン処置と組み合わせて、処置レジメンに他の更なる従来の癌処置を含むと役に立つ場合がある。従っていくつかの実施形態では、処置レジメンを決定する方法は更に、処置レジメンに化学療法を含めるステップを伴う。本明細書で使用される場合、及び当該技術分野で共通して理解されるように、「化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」は、癌を処置するために使用される、乳癌等の癌のタイプに特異的であってよいいずれの薬剤、医薬、分子、化合物又は作用剤を意味する。化学療法用薬剤は本来的に毒性であるため、ここで利用される化学療法の用量、使用回数及び使用頻度は、外科医又は他の健康管理の専門家によって決定される。本発明と共に、化学療法用薬剤を含める及び／又は投与するかどうか、どの程度の量で化学療法用薬剤を含める及び／又は投与するか、並びにどのような頻度で化学療法用薬剤を含める及び／又は投与するかを決定するにあたって：処置される特定の疾患及び／又は癌、並びにその重篤度及び／又は発育／進行のステージ；使用される特定の化学療法用薬の生体利用能、活性及び毒性レベル（例えばＬＤ５０）；投与の経路又は方法及び被験者の導入部位；具体的な化学療法用薬剤の排出速度及び他の薬物動態学的特性；処置の期間；接種レジメン及び頻度；ＥＲアンタゴニスト、ＡＲアゴニスト、ＶＤＲアゴニスト等の具体的な化学療法剤と併用される又は同時使用される薬剤、並びに上記薬剤との間の起こり得る禁忌及び上記薬剤からの副作用；化学療法剤の排出に使用される肝臓及び腎臓等の必須の身体器官を含む、処置される被験者の年齢、体重、性別、食事、生理機能及び総合的健康状態；並びに関連する科学的分野の技能を有する者には公知の同様の因子を含む、様々な因子に左右されることになる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、処置レジメンを決定する方法はまた、処置レジメンに腫瘍又は癌性細胞の照射を含めるステップを伴う。本明細書で使用される場合、「照射（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」は、癌細胞を殺すために腫瘍又は癌細胞に適用されるエネルギを指す。これはＸ線又は他の形態の照射を含んでよい。いくつかの実施形態では、照射は、外部源から患者に適用又は配向される。他の実施形態では、照射は、放射性物質の一部分を患者に挿入及び／又は埋入することによって患者の体内から癌細胞に照射を放出する、小線源治療を伴う。本発明において利用される照射の波長、強度、持続期間及び周波数は、癌の処置に使用されているいずれのものであってよく、患者に対して特異的であり、処置される被験者の年齢、体重、性別、食事、生理機能及び総合的健康状態；放射線治療と共に提供される他の処置；起こり得る副作用及びその強度；並びに科学的分野の技能を有する者には公知の同様の因子に左右される。
【００６２】
本発明が乳癌を処置する方法も対象とし、これは本分類システムに基づくものであることは明らかであろう。具体的には、この乳癌を処置する方法は、患者の乳癌腫瘍又は細胞中のＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのレベルを測定するステップを含む。上述のように、これらのレベルはゼロ発現、又は特定のホルモン受容体の発現の変化するレベルを反映し得る。少なくとも１つの実施形態では、本方法はまた、乳癌腫瘍又は癌細胞中で検出されるＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの発現レベルに基づいて患者の乳癌を分類するステップを含む。このような分類は、本発明の分類システムに従ったものであり、また正常な乳房細胞の表現型に基づくものである。
【００６３】
本発明は更に、腫瘍又は癌性細胞中でＥＲが検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＥＲアンタゴニストを患者に提供するステップを含む。本明細書で使用される場合、「提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」は「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」と等価であり、「投与する」と相互交換可能に使用できる。本方法は更に、腫瘍又は癌性細胞中でＡＲが検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＡＲアゴニストを患者に提供するステップと、腫瘍又は癌性細胞中でＶＤＲが検出された場合に、治療上有効な量の少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを患者に提供するステップとを含む。腫瘍又は癌性細胞がＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲのうちの２つ以上を発現する場合、本方法は、上述のような乳癌細胞増殖の阻害の相加効果のために、治療上有効な量のＥＲアンタゴニスト、ＡＲアゴニスト及びＶＤＲアゴニストのうちの少なくとも１つを同時に又は組み合わせて提供又は投与するステップを含む。
【００６４】
乳癌を処置する本方法では、ＥＲアンタゴニスト、ＡＲアゴニスト、ＶＤＲアゴニスト及びＨＥＲ２阻害剤は、上の定義の節で識別したような適切な方法で投与できる。例えばこれらは、実例において示すように、経口投与又は静脈内投与できる。更にこれらは、既に定義したように薬学的に許容可能な担体を用いて投与でき、上記担体は液体、固体又は気体形態であってよい。
【００６５】
特定の実施形態では、乳癌を処置する方法はまた、既に更に詳細に議論したように、少なくとも１用量の化学療法を患者に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、乳癌を処置する方法は、これもまた上で更に詳細に議論したように、少なくとも１用量の照射を患者に投与するステップを含む。
【００６６】
本発明は更に、試料中でＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲを検出するために有用なキットを対象とし、任意にＨＥＲ２の試験も行ってよい。このようなキットは、固体組織試料、組織診、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織等の組織の薄い切片又はシート、組織マイクロアレイ、培養中の細胞又はマトリクス中の細胞、及び他の生物学的試料に対して使用できるが、これらはキットの一部として構成されていない。キットは、生体である患者又は死体からの生物学的試料に対して使用できる。
【００６７】
本発明のキットの一実施形態は、免疫染色及び検出のために、抗体ベースのものである。このようなキットは、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲそれぞれを検出するためにＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲそれぞれの少なくとも１つの結合部位と結合できる、所定の量の一次抗体を含む。従って、キットはこれらのホルモン受容体それぞれを検出するための一次抗体を含有する。好ましくはこのキットは、ホルモン受容体それぞれに対して１つずつ、３つの別個の一次抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットはまた、ＨＥＲ２を検出するためにＨＥＲ２の少なくとも１つの結合部位に結合できる、所定の量の一次抗体を含有する。キットに含まれる一次抗体の特定の量は、キットが目的とする試験の考えられる回数、及び／又は使用される試料のサイズに左右され得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、特定の標的分子を認識するために上記標的分子に対して産生され、上記標的分子と遭遇すると上記標的分子と結合する、抗体を意味する。これらはその特定の標的と高い親和性及び特異性で結合し、特定の結合部位、即ち一次抗体が結合する分子の部分に対して特異的であってよい。結合部位は、（タンパク質の場合）特定のアミノ酸配列、タンパク質の（αヘリックス、βひだ折れシート、ループ、β膨隆等の）特定の三次元構造、又は化学分子の特定の官能基であってよい。一次抗体は、マウス、ウサギ、ヤギ、ロバ及びヒツジを含むがこれらに限定されないいずれの適切な動物において産生してよい。一次抗体は、同一の抗体産生免疫細胞のクローンから作製されるモノクローナル抗体、又は免疫細胞の混合集団から作製されるポリクローナル抗体であってよい。
【００６９】
少なくとも１つの実施形態では、本染色キットはまた、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＶＤＲのための少なくとも１つの一次抗体に結合できる所定の量の二次抗体も含む。本明細書で使用される場合、「二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、一次抗体又はそのフラグメントに結合する、それ自体の位置、並びにこれに伴って一次抗体及び関連する標的分子の位置を可視化及び／又は識別するためのリポータ又は他のマーカを有する、抗体を指す。上記マーカ又はリポータの例としては、特定の波長の蛍光を発する蛍光体が挙げられ、これは多数の抗体の同時検出のための他の蛍光体とは異なってよい。一次抗体は、二次抗体結合のための抗原又は標的分子として作用する。二次抗体は、全Ｉｇ分子であってよいその標的又は一次抗体のフラグメント（重鎖若しくは軽鎖の部分、Ｆｃ若しくはＦａｂ領域等）に対して高い親和性及び特異性で結合する。二次抗体は、マウス、ウサギ、ヤギ、ロバ及びヒツジを含むがこれらに限定されないいずれの適切な動物において産生してよいが、標的である一次抗体が産生される動物とは異なる動物において産生される。二次抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってよい。二次抗体は二次抗体を検出するいずれの適切な方法によって及びいずれの適切なデバイスを用いて（例えば限定するものではないが蛍光光度計を用いて又は視覚的に）可視化してよい。
【００７０】
本発明のキットの別の実施形態は、ＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ及び／又はＨＥＲ２タンパク質を検出するためのプローブを使用する。従ってこのキットは、ＥＲタンパク質上のいずれの部位に結合できる少なくとも所定量の第１のプローブ、ＡＲタンパク質上のいずれの部位に結合できる第２のプローブ、及びＶＤＲタンパク質上のいずれの部位に結合できる第３のプローブを含む。これらのプローブは、細胞外又は細胞内で標的タンパク質に結合してよく、いずれのレベルの特異性及び親和性で結合してよいが、いくつかの実施形態では、比較的高いレベルの特異性及び親和性が好ましい場合がある。いくつかの実施形態ではこのキットはまた、検出のためにＨＥＲ２タンパク質上のいずれの部位に結合できる第４のプローブも含んでよい。
【００７１】
このキットは更に、タンパク質のための第１、第２、第３及び場合によっては第４のプローブの検出を可能とする１つ又は複数の検出プローブを含んでよい。他の実施形態では、これら第１、第２、第３及び第４のプローブは、各標的タンパク質との結合の際の配座変化によって、結合時のプローブの蛍光発光等による検出が可能となるように操作してよい。
【００７２】
同様に、別の実施形態では、キットは上述のようなプローブを使用するが、これらはプロテインではなくＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ又はＨＥＲ２  ｍＲＮＡに結合する。更に他の実施形態では、このキットは、ＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ及び場合によってはＨＥＲ２の生物学的活性を試験するために使用されるバイオアッセイキットである。このバイオアッセイキットは、各受容体が関与するシグナル伝達経路の下流効果等の特異的なＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ及び／又はＨＥＲ２生物学的活性を検出するためのプローブを含有し、これは例えば、いくつかの例として代謝、化学的又は細胞作用の存在を検出するステップに関与する。更に他の実施形態では、このキットは、受容体そのものではなくＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ及び／又はＨＥＲ２の特定の「パートナータンパク質」と結合できるプローブを含む。
【００７３】
従って、本発明のキットは免疫染色のために使用できる。特定の実施形態では、キットは、二次抗体の存在を検出するための可視化デバイスも含んでよい。例としてはハンドヘルド型又は携帯型蛍光光度計が挙げられる。少なくとも１つの実施形態では、このキットは、キットの内容物を使用するための説明書も含む。
【実施例】
【００７４】
本明細書に記載の方法及び組成物並びに関連するキットを、以下の実施例において更に例示する。これらの実施例は例示として提供されるものであり、限定を意図したものではない。成分の比率の変動及び成分の要素の代替は当業者には明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることを理解されたい。複数の理論的側面が提示されるが、出願人はここに提示される理論によって拘束されることは望んでいないことを理解されたい。そうでないことが明記されていない限り、全ての部又は量は重量である。
【００７５】
材料及び方法
組織試料
正常な乳房組織及び乳房腫瘍の外科的切除標本からのパラフィンブロックを、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＷＨ）の倫理審査委員会によって規定された過剰な組織の使用の規制に従って、ＢＷＨのアーカイブから得た。研究は、ヘルシンキ宣言に概説されている原則に従って実施された。三重陰性腫瘍（ＨＴＭＡ１１４）の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）については既に記載した（５４）。ＴＭＡ  ＢＲＣ１５０１及びＢＲＣ１５０２は、Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ（カリフォルニア州リッチモンド）から購入した。ＨＥＲ２陽性腫瘍は、ＩＨＣによって定義された（以下に記載するスコアスケールにおいて＞６の発現）。正常な乳房組織のＴＭＡ及びＮｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙからの試料のＴＭＡについては既に記載した（３６）。
【００７６】
組織の免疫組織化学及び免疫蛍光
図１１に示す抗体及び条件によってパラフィン切片を染色した。脱パラフィン化切片を３％Ｈ２Ｏ２でブロックし、Ｄａｋｏクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を含む加圧調理器を用いて１２０℃＋／−２℃、１５＋／−５ＰＳＩで抗原回復を実施し、スライドを３％の生理食塩水でブロックし、一次抗体（図１１に示す希釈液）を用いて室温で４０分間インキュベートした。一次抗体の適用に続いて、Ｄａｋｏ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ‐ＨＲＰを二次抗体として用いて３０分間のインキュベーションを行い、色原体として３’３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて可視化した。マイヤーヘマトキシリンを対象染色として使用した。免疫染色した切片を光学顕微鏡で精査し、視認によってスコアリングして、個々のコアそれぞれに対して値を割り当てた。同様の条件を用い、ただし蛍光イソシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ染料と結合させた、蛍光標識二次抗体を用いて、免疫蛍光法を実施した。
【００７７】
図１６では、２人の病理医が免疫染色した切片を別個に、光学顕微鏡及び０〜２５の等級を用いてスコアリングした。染色された腫瘍細胞の百分率を、（０）＝０％、（１＋）＝１〜２０％、（２＋）＝２１〜４０％、（３＋）＝４１〜６０％、（４＋）＝６１〜８０％及び（５＋）＝８１〜１００％として定量化した。染色の強度は０〜５として定量化した。合計スコアは、百分率スコアと強度スコアとの乗算によって計算した。従って、発現と強度との間には差が存在する。発現は、細胞のうちの少なくとも１％が発現の兆候を示すかどうかに基づく、オン又はオフの計数的又は二峰性の決定である。強度は、シグナルが存在する場合にそのシグナルがどの程度明るく現れるかを示す。合計スコアはこれら両方の決定に基づく。
【００７８】
評価は本質的に定性的又は定量的であってよい。例えば上述の実施形態では、組織中の細胞の少なくとも１％が関心対象のタンパク質を示す場合に、発現していると考えられる。別の実施形態では、細胞の少なくとも５％が陽性染色を呈することによって、又は他の同様の適切な検出技術によって、発現を決定してよい。別の実施形態では、発現の閾値は細胞の少なくとも１０％である。更に別の実施形態では、発現は細胞の少なくとも５０％が陽性検出を示すこととして決定される。これらの検出幅は、ＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ及びＨＥＲ２検出に等しく当てはまる。
【００７９】
Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＮＨＳ）に関して、図１９には１７３１人の患者それぞれに関して４つのコアが存在した（合計６９２４個のコア）。これらコアを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＳ）を、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＶＤＲ、ＡＲ、［Ｋ８／１８／Ｃｌｄ−４］、Ｋ５／６及び［ＳＭＡ／ｐ６３／ＣＤ１０］抗体で染色し、半定量的にスコアリングした。スコアリングするコアが多数であり（１７３１×４×７＝５５３９２）、パイロット研究で二峰性発現パターンが観察された（図１６）ため、本発明者らは本研究を、１％のカットオフポイントを有する二項的スコアリングシステムを用いて進めた。スコアリングは、染色なし（＜１％）に対して０、陽性染色に対して１とした。上記病理医らは、他方の病理医が挙げたスコア及び生存結果を隠されていた。スコアリングの平均を、２人の病理医の読み取りから全ての解釈可能なコアに対して割り当てられた値を用いて、ケース毎に決定した。診断組織が存在しない場合又は染色が３つのコア全てに関して解釈不可能である場合、そのケースの状態は不明（ｍｉｓｓｉｎｇ）として記録した。各ケースのＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の状態については既に記載した（５８）。
【００８０】
ＮＨＳは、１９７６年に開始された前向きコホート研究である。３０〜５５歳の１２１７００人の女性の米国登録看護師が、女性の健康に関連する因子を包含するアンケートに答え、被曝量情報を更新するため及び非致死性の偶発的な疾患を確認するために、２年毎の追跡アンケートが使用される。コホート、結果分析の選択基準、評価される共変数及び統計的分析方法は、（３６）において上述したとおりである。
【００８１】
多重免疫蛍光の分析
複合体の交差チャネル蛍光、一次抗体のハイブリダイゼーション条件の不適合性、及び二次抗体の種の限定（５９〜６１）を原因とする制限に関わる複数の理由から、同時に４つ以上の異なる抗体を用いてＦＦＰＥ組織切片を免疫染色するのは極めて困難であった。第１に、蛍光イソシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ染料等の蛍光複合体に関する励起及び放出波長は、理論上は重ならず、チャネル間のブリードスルーは稀ではない。従って同時多重化は、大幅に異なる励起及び放出波長を有する蛍光複合体の使用を必要とし、これはあらゆる実際的な目的に対して、同時に使用できる蛍光プローブの数を３個又は４個に制限する。第２に、単一の一次抗体を用いた組織の一次ハイブリダイゼーションと、３〜４個の異なる抗体を用いた組織の一次ハイブリダイゼーションとは、同じ結果を常に生成するわけではない。これは、場合によって、抗原回復条件が各抗体に関して異なるためであり、又は最適なハイブリダイゼーション条件が異なる温度若しくは時間を必要とし得るためである。従って、全ての抗体に同時に有効である条件を使用する必要があり得、これは多くの場合、抗体のうちの全てではないにしろいくつかにとっては最適以下のものである（６２）。第３に、大半の二次抗体の選択性は種に基づいており、これもまた、同時に多重化できる二次抗体の数を制限する。というのは、最も良好に特性決定された一次抗体はマウス、ウサギ、ラット又はニワトリにおいて生成されるためである。従ってあらゆる意図及び目的に関して、これらは同時多重化に対する上限を設けるものである。
【００８２】
これらの問題を解決するために、ここではＧＥ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ニューヨーク州ニスカユナ）が開発した順次多重化免疫蛍光法を使用した。この方法では２つの抗体を組織切片に一度にハイブリダイズして、２つのレーザで２つのチャネル内の組織を励起して画像を収集する。従ってこのアプローチにより、最適な抗原回復及びハイブリダイゼーション条件を各抗体に対して使用でき、表面上は蛍光の交差チャネルブリードスルーは存在しない（６３）。要するに、ＩＦベースの順次多重化法は、一次抗体とＣｙ３又はＣｙ５染料との直接的なコンジュゲーションを必要とする。各染色ラウンドについて、Ｃｙ３及びＣｙ５で標識された２つの一次抗体を用いて組織切片を順次染色し、その後画像を取得して、蛍光標識を不活性化した。続いて別の染色ラウンドを、別の２つのＣｙ３及びＣｙ５標識抗体を用いて実施した。関心対象の全ての抗体が染色されて画像が取得されるまで、このプロセスを繰り返した。この研究に関して、合計１２個の抗体を同一の組織切片上で多重化した。
【００８３】
画像分析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ７．７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ペンシルバニア州ダウニングタウン）を用いて実施した。管腔上皮細胞の分析結果が報告されている。ＤＡＰＩ画像を用いて、核マスク画像を生成した。全ての細胞核を識別するようにＤＡＰＩ強度閾値を設定し、切断／接合ツールを使用して各核の輪郭を描画した。次にケラチン陰性領域をマスキングして、間質細胞からシグナルを排除し、ＳＭＡ画像を用いて筋上皮細胞をマスキングした。統合形態分析／測定オブジェクト（ＩＭＡ／ＭＯ）を、７０ピクセルという最小オブジェクト領域で使用し、完全な細胞核とするには小さすぎるオブジェクトを排除した。得られた測定オブジェクト画像をバイナリ化して、核マスクを生成した。各マスク画像をバイナリ化し、続いて膨張させ（近傍２、反復回数５、クロージングを行わない膨張）、バイナリ細胞マスク画像を生成した。このバイナリ細胞マスク画像を、数値演算：ソースチャネル画像スタック及びバイナリ細胞マスクを用いて、全ての１１個の画像平面に適用した。得られた画像が全てのピクセルに関して開始強度値を有している場合、マスク画像は「オン（ｏｎ）」であり、全てのピクセルに関してゼロ値である場合、マスク画像は「オフ（ｏｆｆ）」であった。全てのチャネル内に全てのオブジェクトが現れることを保証するために、ＭｅｔａＭｏｒｐｈバイナリ細胞マスク画像を、値１（バイナリが「オン」である場合）及び０（バイナリが「オフ」である場合）を有する従来の１６ビット画像に変換した。続いてこの画像を各画像チャネルに追加し、その結果、各平面内の各チャネル−オブジェクトに関して等しい可能な最小強度値が得られ、全ての画像平面は同一のオブジェクトを有した。次に、オブジェクト領域及び強度に関する出力に対する閾値（１〜６５，５３５）を用いて、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。二重（ＨＲ２）及び三重（ＨＲ３）ホルモン受容体陽性細胞の分析を容易にするために、ＭｅｔａＭｏｒｐｈを用いて、ＨＲ２及びＨＲ３細胞を特徴とする画像を生成した。別個の細胞オブジェクトの１１個の平面画像スタックから開始して、関心対象の画像平面チャネル−ＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ（核）を保持するためのＫｅｅｐ  Ｐｌａｎｅｓコマンドを使用して、及びＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲ（核）シグナルのうちのいずれかが高い場合に明るい各シグナルを有する画像「ＨＲ２」又は「ＨＲ３」を生成するためのＳｔａｃｋ  Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ  Ａｖｅｒａｇｅを使用して、このスタックを複製した。表示を目的として、３個１組の画像のいくつかの組、例えば赤色＝ＥＲ、緑色＝ＡＲ、青色＝ＤＡＰＩに対してＣｏｌｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎｅも実施した。
【００８４】
Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ：設計及び集団
ＮＨＳは、１９７６年に開始された前向きコホート研究である。３０〜５５歳の１２１７００人の女性の米国登録看護師が、女性の健康に関連する因子を包含するアンケートに答え、被曝量情報を更新するため及び非致死性の偶発的な疾患を確認するために、２年毎の追跡アンケートが使用される。コホート、結果分析の選択基準、評価される共変数及び統計的分析方法は、（３６）において上述したとおりである。
【００８５】
ｍＲＮＡ発現プロファイルの分析
８５５人の患者の乳房腫瘍データセットからの全ての侵襲性乳癌に関する無再発生存のカプラン・マイヤー分析（３７）（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／）を、第１に、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲに関する遺伝子発現値に従って全ての８５５個の腫瘍を独立して順位付けすることによって実施した。次に、５０％値カットオフを用いて、互いに対して独立に、各遺伝子に関して「陽性／高」又は「陰性／低」として腫瘍を分類した。これらのグループを、各遺伝子に関する陽性又は陰性判定に基づいて整理した。全て陰性＝ＨＲ０、１つ陽性＝ＨＲ１＋、２つ陽性＝ＨＲ２＋、３つ全て陽性＝ＨＲ３＋とした。
【００８６】
乳癌細胞株の特性決定
全ての細胞株は、ＡＴＣＣのガイドラインに従って培養した。ＢＴ２０、ＨＣＣ１１８７、ＭＤＡＭＢ４６８及びＳＵＭ１５９細胞を、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いてトリプシン化し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の９６ウェルプレートに適切な密度（ＢＴ２０：６，０００、ＨＣＣ１１８７：１０，０００、ＭＤＡＭＢ４６８：４，０００及びＳＵＭ１５９：１，０００細胞／ウェル）で播種した。翌日、カルシトリオール及びタキソールを、それぞれ２５ｎＭ及び１．５ｎＭの濃度で添加した（０日目）。Ｚｒ７５Ｂに関しては、４０００細胞／ウェルをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の９６ウェルプレートに播種した。翌日、５０ｎＭのカルシトリオール及び５ｎＭのＩＣＩ１８０，７８２を、新鮮な培地と共に添加した（０日目）。培地は２日毎に補給し、６日目に、上記細胞株に対して細胞増殖アッセイを実施した。Ｔ４７Ｄ細胞を、フェノールレッド非含有ＴｒｉｐｌｅＥｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトリプシン化し、ＰＢＳで１回洗浄し、１０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレート中のフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ＋５％チャコール処理ＦＢＳ（ＣＳＦＢＳ）中に播種し、３日間培養した。４日目、非薬剤処置グループを除く全てのウェルに１０ｎＭの１７−βエストラジオール（Ｅ２）を添加し、これに加えて、フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ＋５％ＣＳＦＢＳ（０日目）を有する異なるグループに、１０ｎＭのＩＣＩ１８０，７８２、１０ｎＭのＲ１８８１及び５０ｎＭのカルシトリオールを添加した。同一の培地中で細胞を６日間培養した後計数した。全ての増殖アッセイは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施し、蛍光は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ分光光度計を５３０／２５ｎｍ（励起）及び５９０／３５ｎｍ（放出）で使用して測定した。Ｅ２が対照として使用されたＴ４７Ｄを除いて、全ての実験においてビヒクルのみのグループを対照として使用した。
【００８７】
統計的分析
カプラン・マイヤー分析を使用してイベントの結果を比較し、対数順位検定によってＰ値を決定した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｍａｄｅ４（Ｃｕｌｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５）を使用する階層的クラスタ分析（ピアソン相関係数、平均連結法）を用いて、ｆＲＭＡ正規化（ＭｃＣａｌｌ＆Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ２０１０，Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）遺伝子発現データ（ＧＳＥ３７４４、ＧＳＥ４９２２、ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ７３９０）中で、筋上皮及び管腔遺伝子細胞（２５〜２７）の腫瘍発現を調査した。グローバル試験（Ｇｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）を使用して、遺伝子発現と管腔又は筋上皮の分類との間の関連を評価した。上述のように、発明者らによって基底様サブタイプ分類が提供される場合（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）を除いて、腫瘍を基底又は非基底様腫瘍に分類した（Ｃｕｌｈａｎｅ＆Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ  ２００９）。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｇｌｏｂａｌｔｅｓｔ（Ｇｏｅｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，ｖａｎ．（２００４））から利用できるグローバル試験を用いて、個々の遺伝子と基底／非基底の区分との関連を決定した。
【００８８】
遺伝子発現分析
本分類システム及び本分類システムの使用方法を開発するために、癌性腫瘍又は組織を分類するための基準として使用するために正常な乳房細胞に対して実験を実施した。具体的には、多数の乳房上皮マーカのセットの系統的分析を実施した。この情報を用いて、正常な細胞のタイプに基づいてヒト乳房腫瘍を４つの主要なサブタイプに分類した。この新規の存在論的分類スキームは、有意な患者生存差に関連し、実施例及び図面において更に詳細に説明されるように、乳房腫瘍の処置のための有効な洞察を提供する。
【００８９】
実施例１：正常なヒト乳房中の表面抗原分類（ＣＤ）マーカの分析
上述のように、正常なヒト乳房は、泌乳小葉と、母乳を乳首まで輸送する小葉間導管とからなる（図１Ａ）。ヒト乳房腫瘍の殆どは、形態に基づいて「乳管癌腫」又は「小葉癌腫」として分類されており、これは、乳管及び小葉乳癌がそれぞれ正常な導管及び小葉において開始するという一般的な誤解につながっている。しかしながら、これら２つの腫瘍タイプの早期進行段階の殆ど全ては、その名称にかかわらず、略乳房の小葉のみに関連する。従って、組織構造を保存して導管、小葉及び上皮の他の層の判別を可能とする免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を用いて、小葉中の正常な細胞を検査していた。しかしながら、殆どのタンパク質はインビボにおいて傾斜パターンで発現し、これにより、ＩＨＣ等の半定量的方法を用いて細胞サブタイプを定義するためのこれらタンパク質の利用が制限される。従って、二峰性発現パターン（即ち明らかに陰性である補集団及び強い陽性である別の補集団）を有するマーカを、正常な乳房組織の免疫組織化学的染色に基づいて識別した（図１）。
【００９０】
実施例２：正常なヒト乳房中の中間フィラメントの分析
正常なヒト乳房中の二峰性発現パターンを用いて分子を識別する試みにおいて、これらの分子は別個の細胞タイプにおいて差次的に発現し、またこれらの発現は組織及び細胞タイプ両方に特異的であるため、中間フィラメントの発現を検査した。更に、中間フィラメントの細胞タイプ特異的発現が腫瘍中に留まることはよく認識されている（１０）。このため、発生学者は組織の分化を研究するために、そして病理医は腫瘍の組織起源を決定するために、中間フィラメントを有益に利用している（１１）。ヒト乳房細胞の補集団の識別に有用な、二峰性パターンで発現するサブセットが発見された。これらはＫ５、７、８、１４、１７、１８及び１９を含んでいた（図１Ｊ）。
【００９１】
次に、１２個の完全なＦＦＰＥ切片と、２４人の患者からの試料を有する組織マイクロアレイとを含む、３６の乳房縮小成形術からの正常な乳房組織を検査した。これらのケースを、Ｋ５、７、８、１４、１７、１８、１９、ＣＤ１０、ｐ６３及び平滑筋アクチン（ＳＭＡ）で免疫染色した。
【００９２】
正常な乳房小葉及び導管は、２つの細胞タイプ、即ち内側の泌乳管腔細胞タイプ及び外側の支持性筋上皮細胞タイプからなると考えられる２層上皮によって構成される。上述のように、Ｋ７、Ｋ１８及びクローディン−４（Ｃｌｄ−４）は、全ての管腔層細胞中で発現し、筋上皮層では発現しない（図２Ａ）（１２）。従ってこれら３つの抗体は、全ての管腔細胞を識別する全管腔マーカパネルを構成する。対照的に、ＣＤ１０、ＳＭＡ及びｐ６３は全ての筋上皮層細胞中で発現し、管腔層細胞では発現しない。従ってこれらは、全筋上皮マーカパネルを構成する。興味深いことに、管腔細胞の大半はＫ１９で染色される一方で、少数の小葉においてＫ１９は陰性であった（図２Ｂ）。従ってＫ１９はその発現パターンが管腔のみであるにもかかわらず、Ｋ１９は全管腔マーカではない。
【００９３】
ヒトの皮膚及びマウス乳房組織において、Ｋ５／１４／Ｋ１７は、皮膚の基底層及び乳房の筋上皮層のみに発現する（図３Ａ、３Ｂ）。これらの観察に基づき、これらのケラチンを通常「基底ケラチン」と呼ぶ（１３）。しかしながら正常なヒト乳房組織では、Ｋ５、Ｋ１４及びＫ１７は単一の層に限定されなかった。これらの発現は位置に応じて管腔層と基底層との間で切り替わった。ヒト乳房中の比較的内径が大きい小葉間導管では、Ｋ５／１４／１７は予想どおり筋上皮（基底）層で発現した（図１Ｂ、３Ｃ〜Ｅ）。しかしながら、乳癌の早期進行段階及び前駆病変が発育する部位である小葉中では、Ｋ５、Ｋ１４及びＫ１７は管腔層でより顕著に発現した（図２Ｃ〜Ｅ、１Ｊ、３Ｆ〜Ｈ）（７）。これら［Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋］陽性細胞の管腔での性質は、二重免疫染色で確認した。小葉中の［Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋］細胞は、ビメンチン＋、ＳＭＡ＋、ＣＤ１０＋及びｐ６３＋筋上皮細胞層の上方に、管腔の空間に直接対面して位置していた。これらの細胞はまた、筋上皮特異的マーカＣＤ１０、ＳＭＡ及びｐ６３に関しては陰性であり、これらの細胞の管腔表現型が確認された（図３Ｉ〜Ｋ）。
【００９４】
管腔［Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋］細胞は、検査した全ての患者（ｎ＝３６）において識別された。従ってこれは、管腔細胞の頑健で強い再生性を有する補集団であった。いくつかの小葉では管腔細胞のうちの僅かな百分率のみが［Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋］であったが、同一の患者からの組織の単一の切片中でさえも、他の小葉では管腔細胞の略１００％が［Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋］であったことに留意されたい（図３Ｌ〜３Ｏ）。
【００９５】
相互に排他的なマーカの発現によって２つの異なる細胞系統を定義する際、同一の細胞内でのこれらのマーカの共発現は、「幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」の証拠として使用されている。従来、Ｋ５、Ｋ１４又はＫ１７とＫ７又はＫ１８との共発現は、管腔／筋上皮混合表現型を有する二分化能細胞の証拠として解釈されている。しかしながらこの証拠はここでは、いくつかの小葉の全体がこのような二重陽性細胞からなり、このような小葉が、検査された殆ど全ての組織切片中に存在することを実証している（図２Ｆ、図３Ｐ〜Ｔ）。重要なことには、これらＫ５＋及びＫ１４＋細胞は、管腔分化のマーカであるＭｕｃ１も発現した（図３Ｕ）。全体が始原細胞／幹細胞からなる上皮組織が見つかることは極めて珍しいことであるため、これらの結果は、Ｋ５／１４／１７とＫ１８／１９とを共発現する管腔層細胞が、分化した管腔細胞の種類と矛盾しないことを示す。
【００９６】
これらのデータは、ケラチン５／１４／１７が、ヒト皮膚及びマウス乳房におけるこれらの均一な基底発現とは異なり、ヒト乳房において「基底ケラチン」に限られないことを示している。正常なヒト乳房の小葉において、Ｋ５／１４／１７は主に管腔層で発現する。対照的に、小葉間導管では、Ｋ５／１４／１７は主に筋上皮（基底）層で発現する（７、１４）。特にＫ５／１４／１７発現は管腔層中において二峰性であり、即ちＫ５、Ｋ１４及びＫ１７陰性の１つのサブセットと、Ｋ５＋、Ｋ１４＋又はＫ１７＋である別のサブセットとを有する、２つの別個の管腔層細胞集団が存在した。これらの研究全てにおいて、各マーカは、抗体アイソフォーム特異性の変異を除外するために、異なる種、製造元及びクローンからの複数の抗体を用いて検査された。全てのケースにおいて、異なる抗体間で結果は同様であった（これらの研究で使用された３７個の一次抗体のリストに関しては、図１１を参照されたい）。
【００９７】
実施例３：正常なヒト乳房中のホルモン受容体の分析
Ｋ５／１４／１７発現に基づいて管腔層細胞の２つのサブタイプを識別し、これらの細胞中でのホルモン受容体の発現を特性決定した（１５）。ホルモン受容体は組織分化の調整に密接に関わっており、二峰性発現パターンを有するホルモン受容体もあることから、ホルモン受容体は魅力的なマーカのセットとなる。
【００９８】
過去に公表されている研究の初期調査及び予備的な免疫染色において、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）は、小葉の管腔層における明確な二峰性発現（いくつかの細胞では強く発現し、他の細胞では全く発現しない）によって際立ったものであった。多くの他のホルモン受容体は二峰性発現パターンを有していないようであった（ＴＲＨ  α／βＰＴＨ１Ｒ、ＯＸＴＲ、ＳＳＴＲ１〜３、５、ＲＡＲα／β及びＲＸＲα／β）。従ってこれら他の受容体は、正常なヒト乳房中の細胞サブタイプを識別するための潜在的二峰性マーカとして有望でないようであった。プロゲステロン受容体の発現はＥＲの発現に関連するため、ＰＲは、既に広範なものであるマーカのパネルの本特性決定には含まなかった。
【００９９】
次に、Ｋ５／１４／１７及びＥＲを用いた二重免疫染色を実施した。この分析により、ＥＲ及びＫ５／１４／１７は同一の細胞中で共発現せず（＜０．５％オーバラップ、図５〜９）（図２Ｇ、図１Ｊ、図５）、従って以下の３つの相互に排他的な管腔細胞状態を定義することが実証された：（ａ）ＥＲ＋、（ｂ）Ｋ［５／１４／１７］＋及び（ｃ）ＥＲ−／Ｋ［５／１４／１７］−（図２Ｈ）。増殖細胞を細胞周期のいずれの地点にあるかにかかわらず標識するＫｉ−６７抗体を用いて、同一の切片を染色することにより、増殖性管腔細胞がＥＲ又はＫ５／１４／１７を発現するのは極めて稀である（＜０．４％オーバラップ、図６）ことが明らかになった（図２Ｉ〜Ｊ）。略全ての増殖性Ｋｉ−６７＋細胞は、Ｋ１８＋管腔細胞であった（図２Ｋ）。これらの結果により本発明者等は、正常な乳房の小葉において、以下の４つの相互に排他的な管腔細胞状態を定義できるようになった：（ａ）ＥＲ＋細胞、（ｂ）Ｋ［５／１４／１７］＋細胞、（ｃ）ＥＲ−／Ｋ［５／１４／１７］−細胞及び（ｄ）Ｋｉ−６７＋細胞（図２Ｌ）。これらの細胞は全て、全管腔マーカＫ７／１８に関して陽性であった。
【０１００】
二重免疫染色により、ＡＲ＋細胞もまたＫ５／１４／１７＋及びＫｉ−６７細胞と相互に排他的である（０．０％オーバラップ、図５、図４Ａ及びＢ）ものの、ＥＲ＋細胞とは部分的にオーバラップする（１１〜３６％、図７、図４Ｃ）ことが実証された。これらの結果は、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性細胞の３つのサブセット：ＥＲ＋、ＡＲ＋及びＡＲ／ＥＲ＋を示した（図４Ｄ）。ＡＲ発現は管腔層においてのみ見られ、筋上皮層では見られなかった。
【０１０１】
また二重免疫染色により、ＶＤＲ＋細胞は管腔層のみにあり、ＣＤ１０＋筋上皮細胞とのオーバラップを有しないことも実証された（図４Ｅ）。ＶＤＲ＋管腔細胞もまた増殖性Ｋｉ−６７＋細胞と相互に排他的であった（０．０％オーバラップ、図６、図４Ｆ）が、Ｋ５／１４＋細胞（１５〜２３％、図５、図４Ｇ）、ＡＲ＋細胞（１６〜３５％、図７、図４Ｈ）及びＥＲ＋細胞（２２〜７４％、図７、図４Ｉ）と部分的にオーバラップした。興味深いことに、Ｋｉ−６７＋増殖性細胞の殆どは、これらがＣＤ１０＋筋上皮細胞と相互に排他的であることによって証明されるように、管腔層にあった（図４Ｊ、図５〜９）。三重染色によって、三重ＨＲ＋（ＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ＋）細胞の存在が実証された（図４Ｋ、Ｌ、白色が三重陽性）。増殖性管腔細胞は、ホルモン受容体発現ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲ細胞とは相互に排他的であった（図４Ｍ）。
【０１０２】
これらの結果は、ヒト乳房小葉の管腔層中のホルモン受容体（ＨＲ）陽性細胞の、図４Ｎｎ示されている以下の７個のサブセットを示した：ＥＲ＋、ＡＲ＋、ＶＤＲ＋、ＡＲ／ＥＲ＋、ＥＲ／ＶＤＲ＋、ＡＲ／ＶＤＲ＋及びＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ＋。興味深いことに、ＶＤＲ＋細胞のみがＫ５／１４／１７＋管腔細胞と実質的にオーバラップし、増殖性（Ｋｉ−６７＋）管腔細胞はこれらのマーカ全てに関して陰性であった（図４Ｂ、Ｆ、Ｍ）。
【０１０３】
従って、ヒト乳房小葉の管腔層において合わせて１１個の分化状態が定義された（Ｌ１〜１１；図１０）。これらは３つのホルモン受容体陰性状態（ＨＲ０；図１０のＬ１〜３）と、８個のホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）状態（図１０のＬ４〜１１）とを含み：単一ホルモン受容体陽性（ＨＲ１＋：ＥＲ、ＡＲ又はＶＤＲ；Ｌ４−Ｌ７）；二重ホルモン受容体陽性（ＨＲ２＋：ＥＲ／ＡＲ、ＥＲ／ＶＲ又はＡＲ／ＶＤＲ；Ｌ８−Ｌ１０）；又は三重ホルモン受容体陽性（ＨＲ３＋：ＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ；Ｌ１１）にグループ分けされる（図１０）。全ての管腔細胞はＫ７／１８及びＣｌｄ−４を発現した。
【０１０４】
筋上皮層では、全ての細胞はＳＭＡ、ＣＤ１０及びｐ６３を発現し、Ｋ５／１４／１７［−］又はＫ５／１４／１７［＋］の２つのサブタイプを有していた（図１０、Ｍｙ１及びＭｙ２）。増殖性細胞は筋上皮層では極めて稀であり、ＣＤ１０とＫｉ−６７とは細胞の０．５％においてしかオーバラップしなかった（図４Ｊ、図１０、図１１Ｄ）。
【０１０５】
実施例４；新規の多重免疫蛍光法を用いた、正常なヒト乳房中の１２個のマーカの同時検査
上述の実験では、同一のＦＦＰＥ切片を、最大３つの異なる抗体で同時に染色した。既に議論したような複数の理由により、従来の方法を用いて更に多数の抗体を多重化するのは困難である。各切片の厚さは５マイクロメートルであり、従って同一の細胞は最高でも３つ以上の連続した切片中に存在しないため、連続的な切片の染色ではこれらの問題に対処できない。
【０１０６】
１２個の異なるマーカＥＲ、ＡＲ、ＶＤＲ、Ｋ５、Ｋ７、Ｋ８／１８、Ｃｌｄ−４、ＳＭＡ、ＣＤ１０、Ｋｉ−６７、ＮａＫＴＰａｓｅ及びＤＡＰＩ全てに関する二重及び三重免疫染色によって予測された同時発現パターンを確認するために、同一の細胞内でのこれらの発現を、多重免疫染色によって検査した。
【０１０７】
具体的には、１０を超える異なる抗体を順次用いて同一の組織切片を免疫染色できるようにする新規の技術が近年開発されている（ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ、米国ニューヨーク州）（１６）。この技術を使用し、２４人の患者からの正常なヒト乳房小葉を含有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、上記「材料及び方法」の節に従って染色することによって、上記結果を確認した。これらの実験において、全ケラチン染色を用いて全ての上皮細胞を識別した。ＤＡＰＩ及びＮａＫＡＴＰａｓｅを使用して、それぞれ核及び細胞膜を強調した。これらの実験は、図１０の全てのマーカの共発現パターンを独立して確認した（図１２〜１４）。ここでもまた、増殖性管腔細胞はホルモン受容体（ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲ）又はケラチン５／１４を発現しなかった。ホルモン受容体陽性細胞は管腔層のみにあり、これらは互いに部分的にオーバラップし、本発明者等が既に観察したＨＲ１、ＨＲ２及びＨＲ３表現型に一致していた（図１２〜１４）。
【０１０８】
ヒト乳房中の正常な管腔細胞に関して記載されている本発明の１１個の分化状態のうち、これらの実験は、以下の４つの主要な分化パターンを強調する：ホルモン受容体陽性状態（ＨＲ＋）、増殖性状態（Ｋｉ−６７＋）、並びに一方がＫ５＋、及び他方がＫ５−である２つのホルモン受容体陰性状態（図１３〜１５）。これらは全体として相互に排他的な状態であるため、小葉内で１つの表現型が膨張すると、他の表現型が収縮すると仮定された。これと矛盾することなく、Ｋｉ−６７及びＫ５＋細胞は、ＨＲ＋細胞が豊富な小葉中には稀であった（図１５ｉｉ〜ｉｉｉ）。Ｋ５＋細胞が膨張した場合、ＨＲ＋及びＫｉ−６７細胞は減少し（図１５ｉｖ〜ｖ）、強い増殖性を有する領域において、ＨＲ＋又はＫ５＋細胞はごく僅かしか存在しなかった（図１５ｖｉ）。従って、単一切片に対する多重染色技術により、所定の細胞が一度に１つの状態でしか存在できない場合、これらの分化状態が概ね相互に排他的であることが確認された（図１５ｖｉｉ）（１７）。
【０１０９】
実施例５：ＥＲ＋乳房腫瘍中のＨＲ＋及びＨＲ−細胞タイプの分析
正常な乳房上皮において単一細胞レベルで顕著な不均質が観察された場合に、乳房腫瘍が正常な細胞タイプ／分化特異的パターンのいずれを維持するかを調査した。
【０１１０】
２０個の乳癌の予備的なセットにおいて、第１に、完全なＦＦＰＥ切片における１２個のタンパク質マーカの染色パターンをＩＨＣで評価した（図１１）。これらの結果を、（５１個のＥＲ＋、４６個のＨＥＲ２＋及び１１９個のＴＮＢＣを含む）２１６個の腫瘍の第２のセットを含有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）において確認した（図１６）。ＴＭＡにおける腫瘍の染色を、（０）＝０％、（１＋）＝１〜２０％、（２＋）＝２１〜４０％、（３＋）＝４１〜６０％、（４＋）＝６１〜８０％及び（５＋）＝８１〜１００％として定量化した。染色の強度を、０（染色なし）〜５（最高強度）で定量化した。百分率スコアと強度スコアとを乗算することによって合計スコアを計算して、０〜２５の発現スケールを得た（図１７）。
【０１１１】
これら組織のセット両方において、全てのＥＲ＋ヒト乳癌は、複数の全管腔マーカ（Ｃｌｄ−４、Ｋ７及びＫ１８）を強く発現し、全筋上皮マーカ（ＣＤ１０、ＳＭＡ及びｐ６３）に関してはどれも陽性でなかった（図１６Ａ）。全てのＥＲ＋乳癌はまた、Ｋ５／１４に関して陰性であった（図１６Ａ）。興味深いことに、ＥＲ＋腫瘍の大半はＶＤＲ＋であり（９３％）、２／３がＡＲ＋であった（５９％）（図１６Ａ）。このパターンは、ＡＲ又はＶＤＲを共発現できるもののＫ５／１４／１７又は筋上皮マーカＣＤ１０／ＳＭＡに関しては極めて稀にしか陽性でない、正常な乳房のＥＲ＋細胞と同一であった。これらの結果は、全てのＥＲ＋腫瘍が、管腔層中の正常なＨＲ＋乳房細胞（正常な分化状態Ｌ４、Ｌ８、Ｌ９及びＬ１１）と同一の管腔表現型を有することを示している（図１６Ａ及びＤ）。興味深いことに、正常な組織と同様に、殆どの増殖性腫瘍細胞（Ｋｉ−６７＋）もまたＥＲ又はＡＲに関して陰性であった（図１８Ｂ〜Ｉ）。殆どのＫｉ−６７＋腫瘍細胞はＶＤＲ陰性であるが（図１８Ｊ〜Ｍ）、局所的にいくつかの増殖性腫瘍細胞はＶＤＲ＋でもあった（図１８Ｎ〜Ｑ）。
【０１１２】
実施例６：ＨＥＲ２＋乳房腫瘍中のＨＲ＋及びＨＲ−細胞タイプの分析
ＨＥＲ２＋腫瘍において、複数の全管腔マーカ（Ｃｌｄ−４、Ｋ７及びＫ１８）の強発現が観察され、全筋上皮マーカ（ＣＤ１０、ＳＭＡ、Ｐ６３）は存在しなかった（図１６Ｂ）。これらのデータは、ＨＥＲ２＋腫瘍の殆ど全て（４４／４６）が、正常な乳房細胞と同一のＨＲ＋管腔表現型（Ｌ４〜Ｌ１１）を有することを示した（図１６Ｂ、Ｄ）。僅かな残り（２／４６）は、ＨＲ陰性細胞と同様であった（図１６Ｂ、Ｄ）。ＨＲ０  ＨＥＲ２＋腫瘍がこれほど少ないことの考えられる１つの説明は、ＨＥＲ２過剰発現がＨＲ＋細胞腫瘍にとって有益である一方でＨＲ０細胞において有害であり得ることである。
【０１１３】
実施例７：三重陰性乳房腫瘍中のＨＲ＋及びＨＲ−細胞タイプの分析
三重陰性乳房癌腫（ＴＮＢＣ）は、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の発現を欠いているものとして定義される。本発明のために、ＨＲ及びケラチンマーカの発現に関して１１９個のＴＮＢＣを分析した。この作業により、Ｋ５／１４に関する染色に基づいて、管腔１（ＬＭ）、管腔２（ＬＭ２）及び混合（Ｍ）と呼ばれる３つの主要なサブグループが明らかとなった（図１６Ｃ）（１８）。ＴＮＢＣの約６６％（ｎ＝７８／１１９）が純粋な管腔表現型を有し、これらの腫瘍の表現型は、全管腔マーカに関して陽性、全筋上皮マーカ及びＥＲに関して陰性であるもののＡＲ、ＶＤＲ又はこれら両方に関して陽性である、正常な管腔細胞タイプの表現型と同様であった（図１６Ｃ）。これらのうち３７個は、Ｋ５／１４陰性である管腔細胞タイプ（Ｌ１〜２、Ｌ５〜７又はＬ１０細胞タイプ）と同一であり（ＬＭ１）、４１個は、Ｋ５／１４陽性である正常な管腔細胞タイプＬ３又はＬ７と同一である（ＬＭ２）（図１６Ｃ、Ｄ）。
【０１１４】
残りのＴＮＢＣ（３３％、ｎ＝４１）も全て、管腔マーカ（Ｃｌｄ−４、Ｋ７、ＡＲ、ＶＤＲ、Ｋ１８）を強発現したが、これらの腫瘍のうちの３８個は、正常な筋上皮細胞中に見られる抗原（ＣＤ１０、ＳＭＡ及びｐ６３）を発現した（図１６Ｃ）。これらの腫瘍は、管腔表現型及び真性基底表現型が略同じ割合である表現型を有し（即ちこれらは正に基底／筋上皮マーカを発現し）、従ってこれらは「混合表現型（ｍｉｘｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）」（Ｍ）と呼ばれる。
【０１１５】
これらのデータは、ヒト乳房腫瘍のうち驚くほど高い割合（〜９５％）が、単一の正常な乳房細胞サブタイプと表現型に関して同一であることを示しており、これは、これらの腫瘍が、これらの起源細胞の分化表現型を保持していること、又はこれらの腫瘍が正常な細胞の分化系統に沿って分化することを示している。混合分化を有するヒト腫瘍の僅かな部分（〜５％）に関して、対照物である正常な細胞タイプは識別できなかった。これらの腫瘍の正常な対照物は、腺及び筋上皮が混合された始原細胞等の細胞タイプであり得ること（１９）、又はこれらの腫瘍は、これらのマーカの不適切な発現をもたらす変異によって改変された表現型を呈し得ることが考えられる。
【０１１６】
実施例８：ＴＮＢＣにおける、正常な基底に特異的なｍＲＮＡの発現ｖｓ．正常な管腔に特異的なｍＲＮＡの発現
ＴＮＢＣの由来細胞は大きな関心の的であった（２０）。上述のように、ヒトの皮膚及び齧歯類の乳腺の基底層にはケラチンＫ５／１４／１７が発現する（図３Ａ、Ｂ）。従ってこれらのケラチンは、文献（１４）では通称として「基底ケラチン」と呼ばれている。その結果、Ｋ５／１４／１７を発現するＴＮＢＣの一部は「基底様癌腫」（ＢＬＣ）と呼ばれている（２１）。これに基づき、これらの腫瘍は正常な乳房の筋上皮（基底）細胞と同様であることが示唆される場合もあった。しかしながら本明細書において実証されているように、Ｋ５／１４／１７は正常なヒト乳房小葉の管腔層において主に発現し、またＫ５／６＋ＴＮＢＣ基底様癌（ＢＬＣ）はこれらの管腔細胞において発現するマーカと同一のマーカを発現する（図１０、Ｌ３及びＬ７）。
【０１１７】
ＴＮＢＣ／ＢＬＣカテゴリはマイクロアレイ分析におけるｍＲＮＡ発現に基づくものであるため（２２〜２４）、高度に精製された管腔細胞ｖｓ．筋上皮細胞をプロファイリングする３つの異なる研究からの結果を組み合わせることにより、正常なヒト乳房細胞におけるｍＲＮＡの分析を実施した（２５〜２７）。３つの研究全てに一貫して、管腔細胞と筋上皮細胞との間で差次的に発現したのはｍＲＮＡの小さなサブセットのみであった。これらは、正常な管腔細胞ｖｓ．正常な筋上皮細胞を区別する、強力な一致シグネチャを提供した。これらの遺伝子の発現を、基底様及び非基底様ヒト乳房腫瘍において検査した（２８〜３１）。
【０１１８】
興味深いことに、これらのコホートにおける「基底様腫瘍」と、正常な基底／筋上皮細胞の発現シグネチャとの間には、有意な相関関係は観察されなかった（図２０Ａ）。実際には、３つの既に公開されている「管腔」又は「筋上皮」シグネチャにおける遺伝子のリストは、基底又は非基底腫瘍においてより強く発現される遺伝子と有意にオーバラップしなかった（フィッシャー直接確率法Ｐ値＝０．２２）（図２０Ａ）。従って最も「基底様」である腫瘍は、正常な筋上皮細胞、真性基底細胞のｍＲＮＡ及びタンパク質マーカの発現によって定義される、真性基底表現型を表さなかった（図２０Ｂ）。興味深いことに、マウスモデルにおける近年の研究はまた、基底様癌腫の起源細胞は実際には管腔細胞であることを示唆している（１４、２０、３２）。いくつかのコホートでは、基底様腫瘍を有する患者は、ＴＮＢＣ腫瘍を有する患者よりも結果が悪い（２１）。本分析では、Ｋ５／６＋ＴＮＢＣ患者とＫ５／６−ＴＮＢＣ患者との間に観察可能な有意な差は存在しなかった（図２０Ａ）。
【０１１９】
これらのデータは、基底様腫瘍がｍＲＮＡプロファイリングに基づくＴＮＢＣの別個の再生可能なサブグループであるものの、名称「基底様」は、上記腫瘍の分化状態又は上記腫瘍の起源細胞の正確な説明ではない場合があることを示している（７、１４、３３）。ＢＬＣの分化状態は、乳房の正常なＫ５／１４／１７［＋］管腔細胞と極めて類似している。
【０１２０】
実施例９：ＮＨＳコホート中のＨＲ０〜３乳房腫瘍表現型の分布
上述の結果に基づいて、ヒト乳房腫瘍を、ヒト乳房組織の正常な分化状態に従って分類できると仮定した。この仮定を、２５年を越えて患者を追跡し、多数の患者（ｎ＝１７３１）からの乳癌試料を利用できるＮｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＮＨＳ）からの乳癌コホートを使用して試験した（３４〜３６）。１７３１人のＮＨＳ患者からの試料を含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＶＤＲ、ＡＲ、Ｋ８／１８／Ｃｌｄ−４、Ｋ５／６及びＳＭＡ／ｐ６３／ＣＤ１０抗体を用いて免疫染色し、半定量的にスコアリングした。パイロット研究により、腫瘍の大半にこれらのマーカが二峰性パターンで発現することが明らかになった（図１６）。従って、極めて多数のコア（＞５５０００）をスコアリングするため、ＮＨＳ  ＴＭＡをスコアリングする際、二項的スコアリングシステムを、１％の発現カットオフポイントと共に実装した。この研究では、乳房腫瘍を、正常な組織分化に基づいて以下の４つのカテゴリに分割した：ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲを共発現する三重陽性腫瘍（ＨＲ３）；ＥＲ／ＡＲ［＋］、ＡＲ／ＶＤＲ［＋］又はＥＲ／ＶＤＲ［＋］である二重陽性腫瘍（ＨＲ２）；ホルモン受容体のうちの１つのみを発現する（即ちＥＲ［＋］、ＶＤＲ［＋］又はＡＲ［＋］）単一陽性腫瘍（ＨＲ１）；並びにＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲに関して陰性であるホルモン受容体陰性腫瘍（ＨＲ０）。
【０１２１】
特に、上記４つのＨＲカテゴリは、現行のＥＲ＋、ＨＥＲ２＋及びＴＮＢＣ分類と同一ではない。例えば標準的分類に基づくと、ＮＨＳ研究の患者の約７５％はＥＲ＋腫瘍を有し（ｎ＝１３５６）、１０％はＨＥＲ２＋腫瘍を有し（ｎ＝１７７）、１５％は三重陰性腫瘍を有していた（ｎ＝２５３）（図１９Ａ、Ｂ）。対照的に、これらと同一の腫瘍は、ＨＲ３  ５８．１％（ｎ＝１００６）、ＨＲ２  ２４．８％（ｎ＝４２９）、ＨＲ１  １０．７％（ｎ＝１８５）及びＨＲ０  ６．４％（ｎ＝１１１）として分類された（図１９Ａ、図２５）。
【０１２２】
標準的乳癌カテゴリそれぞれの検査により、各サブタイプが複数のＨＲグループからなることが明らかになった。例えばＥＲ＋腫瘍のＨＲ分類により、７５％がＨＲ３＋（ＥＲ＋／ＶＤＲ＋／ＡＲ＋）であること、並びにＥＲ＋腫瘍の残りがＨＲ２＋（２３．４％）及びＨＲ１＋（１．５％）腫瘍からなることが明らかになった（図２１Ａ、Ｂ）。ＨＥＲ２＋腫瘍の約１／３（２９％）は、３つのホルモン受容体全てを発現し（ＨＲ３＋）、残りはＨＲ２＋（４３．５％）、ＨＲ１＋（２２．０％）及びＨＲ０（５．１％）腫瘍からなっていた（図２１Ａ、Ｂ）。従ってＨＲに基づく分類アプローチは、単に既存のグループを改名したものではなく、癌腫瘍を新規の方法で編成するものである。その結果、ＨＲ０〜３の患者の分布は、現行のカテゴリとは有意に異なる。三重陰性乳癌（ｎ＝２６２）のうち、３６．８％はいずれのホルモン受容体も発現せず（ＨＲ０）、４４．６％は少なくとも１つのホルモン受容体ＡＲ又はＶＤＲを発現し（ＨＲ１＋）、そして１８．６％はＡＲ及びＶＤＲの両方を発現した（ＨＲ２＋）（図２１Ａ、Ｂ）。
【０１２３】
実施例１０：正常な細胞系統表現型に基づく乳癌結果の分析
ＨＲ０〜３カテゴリ内の陽性受容体の総数と、乳癌の生存又は結果との間には、強い関連がある。具体的には、ＮＨＳコホートのカプラン・マイヤー分析により、ＨＲ３＋腫瘍を有する女性が最も良好な生存を有し、ＨＲ１＋腫瘍は最も悪い生存を有し、ＨＲ２＋腫瘍は中間の生存を有することが示された（図１９Ｃ）（ｐ＜０．０００１）。
【０１２４】
多変量分析において、これらの差は有意なままであった。ＨＲ３腫瘍と比較して、ＨＲ２腫瘍に関する相対ハザード比（ＲＨＲ）は２．９（９５％信頼区間［ＣＩ］１．６０〜５．２１）であり、ＨＲ１腫瘍に関してＲＨＲは５．３（９５％ＣＩ２．７７〜９．９７）であり、ＨＲ０に関してＲＨＲは６．９（９５％ＣＩ３．３７〜１４．３９）であった。
【０１２５】
興味深いことに、ＨＲ０グループは、最初の５年間に最も悪い結果を有するものの５年後に曲線が極めて良好な結果に一致するよう平坦になるＨＲ１腫瘍と同様の、二相性の結果曲線を有した（図１９Ｃ）。コックス比例モデルの重要な仮定は、経時的に一定のハザード比である。従って本発明者等は、多変量モデルに時間依存性共変数を追加し、５年のカットオフの前後で時間によって重層化された上記関係を再評価した。最初の５年の間、ＨＲ３腫瘍は最良の結果を有し、ＨＲ２腫瘍はＨＲ３腫瘍に比べて悪い結果を有し（ＲＨＲ＝１．６９、９５％ＣＩ＝１．１４〜２．５０）、そしてＨＲ１及びＨＲ０腫瘍は最悪の結果を有していた（ＨＲ１  ＲＨＲ＝２．４４、９５％ＣＩ＝１．５５〜３．８４；ＨＲ０  ＲＨＲ＝２．７、９５％ＣＩ＝１．５６〜４．７０）（Ｐ＜０．０００１）（図２１Ｃ、図２６）。５年後、ＨＲ３、２及び１の間には有意差は存在しなかったが、ＨＲ０グループのみが、より良好な結果ハザード比０．３４を有していた（ｐ＝０．０２）（図２１Ｄ）。ＨＥＲ２グループを別個に分析してもこれらの結果は変化しなかった（図２２Ｅ）。多変量分析では、年齢、ステージ、等級、ＨＥＲ２状態、処置及び照射といった多変数分析における他の因子を考慮した場合でさえ、これらの差は有意なままであった（図２５〜２６）。
【０１２６】
これらの生存に関する結果を、８５５個のヒト乳房腫瘍からの遺伝子発現マイクロアレイのデータセットを検査することによって、ｍＲＮＡ発現レベルにおいて確認した（３７）。無再発生存に関するカプラン・マイヤー分析は、ＨＲ３＋腫瘍を有する女性が最良の結果を有し、ＨＲ１＋及びＨＲ０腫瘍が最も侵攻性が高く、ＨＲ２＋腫瘍はこれらのグループの中間であることを示した。全体としての生存に極めて優位な差がある（ｐ＜０．０００１、図１９Ｃ）ＩＨＣに基づくＨＲカテゴリとは異なり、ｍＲＮＡに基づくＨＲグループでは、全体としての無再発生存の差はより穏やかであった（ｐ＝０．１３、図１９Ｄ）。しかしながら、ｍＲＮＡに基づくＨＲグループ間の肺の無再発生存は有意な差を有していた（ｐ＝０．００１４、図２０Ｆ）。
【０１２７】
まとめると、ホルモン受容体の総数と腫瘍細胞の分化状態とが相関すること、及びより多くの分化をより侵攻性が低い腫瘍の挙動と相関することを、これらのデータは支持する。重要なことには、これらの結果は、ＥＲ、ＡＲ及びＶＤＲの場合に、腫瘍の挙動を予測するために、タンパク質発現レベルの測定がｍＲＮＡレベルよりも妥当であることを示唆している。
【０１２８】
実施例１１：乳癌中のＨＲ＋及びＨＲ−細胞の分析
細胞株
乳癌細胞株中のＨＲ０〜３表現型の保存についても検査した。６０個を超える乳癌細胞株からの、公に入手可能なｍＲＮＡ発現データ（３８）を分析し、これにより、殆どの腫瘍細胞株が正常な起源細胞カテゴリのうちの１つに該当することが明らかになった。
【０１２９】
具体的には、ＨＲ＋純粋管腔乳癌細胞株（ＥＲ／ＡＲ／ＶＤＲ＋、ｎ＝１６）は、予想されたように、Ｋ５／１４／ＣＤ１０／ＳＭＡを殆ど発現しなかった（図２３Ｇ）。これはＨＥＲ２＋腫瘍細胞株（ｎ＝１３）にも当てはまり、これは予想されたようにＫ５／１４／ＣＤ１０／ＳＭＡを殆ど発現しなかったが、時折ＡＲ／ＶＤＲ＋を発現した。典型的なＴＮＢＣ−ＬＭ１表現型を有する５つの細胞株（ＢＴ−２０、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ−１１８７、ＳＵＭ１４９）、ＴＮＢＣ−ＬＭ２表現型を有する３つの細胞株（ＢＰＬＥＲ、ＨＣＣ−１１４３、ＨＣＣ−１５００）、及び混合表現型を有する５つの細胞株（ＨＭＬＥＲ、ＨＣＣ−７０、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ−３１５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）が存在した（図２３Ｇ）。これらの表現型もまた、乳癌細胞株中のタンパク質レベルにおいて確認し（図２３Ｈ）、これによってインビボＨＲ表現型に極めて一致した乳癌細胞株のサブセットを選択した（図２３Ｉ）。この乳癌細胞株のセットを、以下に記載するインビトロ薬剤応答研究のために検査した。
【０１３０】
興味深いことに、ヒト乳癌のモデルとして極めて頻繁に使用されるＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＵＭ−１５９、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５等の多数の細胞株（ｎ＝９）は、正常な乳房細胞又はヒト乳癌中に存在しない発現プロファイルを有していた。これらの特定の細胞株は、本研究において検証した上皮マーカの大半に関して陰性であった。このプロファイルはインビボでは殆ど見られないため、これらの細胞がその元の表現型を失ったか、又はこれらの細胞が極めて稀な腫瘍タイプに由来するものであったかのいずれかと思われる。従って、検査した細胞株のうち、これら特定の細胞株は、ヒト乳癌の最も一般的な形態に対して最も低い類似性を有しており、ヒトの疾患の典型的なモデルとして頻繁に使用することに対して注意が必要であると思われる。
【０１３１】
実施例１２：ＨＲ阻害に対する乳癌細胞株の応答
乳癌のＨＲ０〜３分類は、臨床的に有意な結果のグループに相関するだけではなく、これらの患者の治療をカスタマイズできる方法に関する洞察を提供する。例えば本発明は、ＥＲアンタゴニストをＡＲ及びＶＤＲアゴニストと組み合わせた三重ホルモン治療を用いてＨＲ３腫瘍を処置できると考えている。従ってこれらの概念のうちのいくつかを、乳癌細胞株において試験した。
【０１３２】
ＴＮＢＣはＥＲ及びＨＥＲ２に関して陰性であるため、現在のところＴＮＢＣの効果的な処置は極めて少ない。しかしながらＴＮＢＣの６３％がＡＲ又はＶＤＲ又はこれらの受容体両方を発現するため、ＴＮＢＣの大部分において化学療法と組み合わせたホルモン治療が可能であり得る。ＢＴ２０、ＨＣＣ１１８７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＳＵＭ１５９は、ＴＮＢＣ−ＨＲ１表現型に対応するＶＤＲ受容体のみを発現する。ＶＤＲアゴニストであるカルシトリオールをタキソールと併用すると、これらＨＲ１＋乳癌細胞の増殖が、これらの薬剤単独の場合よりも効果的に、相加的に阻害された（図２４Ｊ）。
【０１３３】
同様の併用治療戦略を、ＥＲ＋腫瘍細胞においても採用できる。例えばＨＲ２＋  ＺＲ７５Ｂ細胞はＥＲ及びＶＤＲ受容体を共発現し、ＶＤＲアゴニストであるカルシトリオールを、低用量のＥＲアンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ、ＩＣＩ０．５ｎＭ）と併用すると、これらの乳癌細胞の増殖が相加的に阻害された（図２４Ｋ）。別の例では、ＡＲアゴニストＲ１８８１（メチルトリエノロン、５０ｎＭ）とＶＤＲアゴニストであるカルシトリオール（Ｃａｌ、５０ｎＭ）との併用により、ＨＲ３＋乳癌細胞株Ｔ４７Ｄの増殖が相加的に阻害された（図２４Ｌ）。
【０１３４】
ＨＥＲ２＋乳癌細胞では、ＡＲアンタゴニストであるフルタミド（Ｆｌｕ４５μＭ）とＨＥＲ２阻害剤ラパチニブ（Ｌａｐ０．５μＭ）との併用により、ＨＲ２＋／ＨＥＲ２＋乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の増殖が相加的に阻害された（図２４Ｍ）。同様に、ＥＲ−アンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ、ＩＣＩ０．５ｎＭ）とＨＥＲ２アンタゴニストであるラパチニブ（Ｌａｐ、１０ｎＭ）との併用により、ＨＲ３＋／ＨＥＲ２＋乳癌細胞株ＢＴ４７４の増殖が相加的に阻害された（図２４Ｎ）。対照実験では、ＥＲアンタゴニストＩＣＩ１８２．７８０を用いてＥＲ陰性ＨＲ２  ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞において阻害は観察されず、又はＶＤＲアゴニストであるカルシトリオールを用いてＶＤＲ−陰性（ＢＴ５４９）対照細胞株において阻害は観察されなかった（図２４Ｐ）。
【０１３５】
ＨＥＲ２腫瘍の約９５パーセントが少なくとも１つのホルモン受容体を発現し、また２９％が３つのホルモン受容体全てを発現するため、これらの結果は、ＨＥＲ２腫瘍において、抗ＨＥＲ２治療と組み合わせてホルモン処置も可能となり得ることを示している。
【０１３６】
本発明の上述の好ましい実施形態に対して、細部の多くの修正例、変形例及び変更を行うことができるため、以上の記述中の全ての事項及び添付の図面に示した全ての事項は例示的なものとして解釈され、限定的な意味に解釈されないことが意図されている。従って本発明の範囲は、添付の請求項及びその法的均等物によって決定されるものとする。
【０１３７】
参考文献
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６．   Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．，  Ｍａｃｋａｙ，  Ａ．，  Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ａ．，  Ｃｏｓｓｕ，  Ａ．，  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｆｕｌｆｏｒｄ，  Ｌ．，  Ｄｅｘｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｓ．，  Ｂｕｌｍｅｒ，  Ｋ．，  Ｆｏｒｄ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｍｉｎａｌ  ａｎｄ  ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：３０３７−３０４５．
７．   Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ａ．，  Ｒｏｓｓ，  Ｄ．Ｔ．，  Ｈｅａｔｈ，  Ｖ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，  Ｔ．  ２００５．  Ｂａｓａｌ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：１４３−１４８．
８．   Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｊ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｐｕｓｚｔａｉ，  Ｌ．  ２０１１．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３７８：１８１２−１８２３．
９．   Ｎａｋｓｈａｔｒｉ，  Ｈ．，  Ｓｒｏｕｒ，  Ｅ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｂａｄｖｅ，  Ｓ．  ２００９．  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ：  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ  ｒａｇｅ  ｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ４：５０−６０．
１０． Ｋａｒａｎｔｚａ，  Ｖ．  ２０１１．  Ｋｅｒａｔｉｎｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｍｅｒｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：１２７−１３８．
１１． Ｃｈｕ，  Ｐ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｌ．Ｍ．  ２００２．  Ｋｅｒａｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４０：４０３−４３９．
１２． Ｉｎｃｅ，  Ｔ．Ａ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ａ．Ｌ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｇ．Ｗ．，  Ｓａｉｔｏｈ，  Ｍ．，  Ｇｏｄａｒ，  Ｓ．，  Ｋａｒｎｏｕｂ，  Ａ．Ｅ．，  Ｉｇｌｅｈａｒｔ，  Ｊ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｒ．Ａ．  ２００７．  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １２：１６０−１７０．
１３． Ｖａｎ  Ｋｅｙｍｅｕｌｅｎ，  Ａ．，  Ｒｏｃｈａ，  Ａ．Ｓ．，  Ｏｕｓｓｅｔ，  Ｍ．，  Ｂｅｃｋ，  Ｂ．，  Ｂｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ，  Ｇ．，  Ｒｏｃｋ，  Ｊ．，  Ｓｈａｒｍａ，  Ｎ．，  Ｄｅｋｏｎｉｎｃｋ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ｃ．  ２０１１．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７９：１８９−１９３．
１４． Ｍｏｌｙｎｅｕｘ，  Ｇ．，  Ｇｅｙｅｒ，  Ｆ．Ｃ．，  Ｍａｇｎａｙ，  Ｆ．Ａ．，  ＭｃＣａｒｔｈｙ，  Ａ．，  Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，  Ｈ．，  Ｎａｔｒａｊａｎ，  Ｒ．，  Ｍａｃｋａｙ，  Ａ．，  Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ａ．，  Ｔｕｔｔ，  Ａ．，  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  ＢＲＣＡ１  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｎｏｔ  ｆｒｏｍ  ｂａｓａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７：４０３−４１７．
１５． Ｃｏｎｚｅｎ，  Ｓ．Ｄ．  ２００８．  Ｍｉｎｉｒｅｖｉｅｗ：  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２２：２２１５−２２２８．
１６． Ｇｉｎｔｙ，  Ｆ．，  Ａｄａｋ，  Ｓ．，  Ｃａｎ，  Ａ．，  Ｇｅｒｄｅｓ，  Ｍ．，  Ｌａｒｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｃｌｉｎｅ，  Ｈ．，  Ｆｉｌｋｉｎｓ，  Ｒ．，  Ｐａｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｉ，  Ｑ．，  ａｎｄ  Ｍｏｎｔａｌｔｏ，  Ｍ．Ｃ．  ２００８．  Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｔ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：３８１４−３８２２．
１７． Ｍａｄｄｉｓｏｎ，  Ｗ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｍａｄｄｉｓｏｎ，  Ｄ．Ｒ．  ２０１１．  Ｍｅｓｑｕｉｔｅ：  ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．７５    ｈｔｔｐ：／／ｍｅｓｑｕｉｔｅｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．
１８． Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｍａｒｔｙｎｉａｋ，  Ａ．，  Ｋａｎｄｅｌ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｓｔａｄｌｅｒ，  Ｚ．Ｋ．，  Ｍａｓｃｉａｒｉ，  Ｓ．，  Ｍｉｒｏｎ，  Ａ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ａ．Ｌ．，  Ｓｃｈｎｉｔｔ，  Ｓ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｂｅｒ，  Ｊ．Ｅ．  ２００９．  Ｂａｓａｌ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ３３：１０９３−１０９７．
１９． Ｂｏｅｃｋｅｒ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｂｕｅｒｇｅｒ，  Ｈ．  ２００３．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｆｅｍａｌｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：  ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  （ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ）  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｐｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ  ３６  Ｓｕｐｐｌ  １：７３−８４．
２０． Ｍｏｌｙｎｅｕｘ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｓｍａｌｌｅｙ，  Ｍ．Ｊ．  ２０１１．  Ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｃａｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １６：５１−５５．
２１． Ｌａｖａｓａｎｉ，  Ｍ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｍｏｉｎｆａｒ，  Ｆ．  ２０１２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  “ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ”  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｊ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ５：３４５−３６６．
２２． Ｌｉｖａｓｙ，  Ｃ．Ａ．，  Ｋａｒａｃａ，  Ｇ．，  Ｎａｎｄａ，  Ｒ．，  Ｔｒｅｔｉａｋｏｖａ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｏｌｏｐａｄｅ，  Ｏ．Ｉ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ｐｅｒｏｕ，  Ｃ．Ｍ．  ２００６．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １９：２６４−２７１．
２３． Ｓｏｒｌｉｅ，  Ｔ．，  Ｐｅｒｏｕ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ｒ．，  Ａａｓ，  Ｔ．，  Ｇｅｉｓｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｊｏｈｎｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｈａｓｔｉｅ，  Ｔ．，  Ｅｉｓｅｎ，  Ｍ．Ｂ．，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｒｉｊｎ，  Ｍ．，  Ｊｅｆｆｒｅｙ，  Ｓ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：１０８６９−１０８７４．
２４． Ｓｏｒｌｉｅ，  Ｔ．，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ｒ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｊ．，  Ｈａｓｔｉｅ，  Ｔ．，  Ｍａｒｒｏｎ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｎｏｂｅｌ，  Ａ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｓ．，  Ｊｏｈｎｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｐｅｓｉｃｈ，  Ｒ．，  Ｇｅｉｓｌｅｒ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：８４１８−８４２３．
２５． Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ａ．，  Ｍａｃｋａｙ，  Ａ．，  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｄ．，  Ｉｓｅｌｉ，  Ｃ．，  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌ，  Ｃ．Ｖ．，  Ｖａｌｇｅｉｒｓｓｏｎ，  Ｈ．，  Ｆｅｎｗｉｃｋ，  Ｋ．，  Ｉｒａｖａｎｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＭＰＳＳ  ａｎｄ  ａｒｒａｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：Ｒ５６．
２６． Ｌａｋｈａｎｉ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｆｕｌｆｏｒｄ，  Ｌ．，  Ｐｅｎａｕｌｔ−Ｌｌｏｒｃａ，  Ｆ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｉｊｖｅｒ，  Ｍ．，  Ｐａｒｒｙ，  Ｓ．，  Ｂｉｓｈｏｐ，  Ｔ．，  Ｂｅｎｉｔｅｚ，  Ｊ．，  Ｒｉｖａｓ，  Ｃ．，  Ｂｉｇｎｏｎ，  Ｙ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ１  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｂａｓａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５１７５−５１８０．
２７． Ｒａｏｕｆ，  Ａ．，  Ｚｈａｏ，  Ｙ．，  Ｔｏ，  Ｋ．，  Ｓｔｉｎｇｌ，  Ｊ．，  Ｄｅｌａｎｅｙ，  Ａ．，  Ｂａｒｂａｒａ，  Ｍ．，  Ｉｓｃｏｖｅ，  Ｎ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．，  ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｓ．，  Ｅｍｅｒｍａｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：１０９−１１８．
２８． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ａ．Ｌ．，  Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｃ．，  Ｄｅ  Ｎｉｃｏｌｏ，  Ａ．，  Ｌｕ，  Ｘ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｍ．，  Ｍｉｒｏｎ，  Ａ．，  Ｌｉａｏ，  Ｘ．，  Ｉｇｌｅｈａｒｔ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇａｎｅｓａｎ，  Ｓ．  ２００６．  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１２１−１３２．
２９． Ｌｏｉ，  Ｓ．，  Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ，  Ｂ．，  Ｄｅｓｍｅｄｔ，  Ｃ．，  Ｗｉｒａｐａｔｉ，  Ｐ．，  Ｌａｌｌｅｍａｎｄ，  Ｆ．，  Ｔｕｔｔ，  Ａ．Ｍ．，  Ｇｉｌｌｅｔ，  Ｃ．，  Ｅｌｌｉｓ，  Ｐ．，  Ｒｙｄｅｒ，  Ｋ．，  Ｒｅｉｄ，  Ｊ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ．  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９：２３９．
３０． Ｉｖｓｈｉｎａ，  Ａ．Ｖ．，  Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｊ．，  Ｓｅｎｋｏ，  Ｏ．，  Ｍｏｗ，  Ｂ．，  Ｐｕｔｔｉ，  Ｔ．Ｃ．，  Ｓｍｅｄｓ，  Ｊ．，  Ｌｉｎｄａｈｌ，  Ｔ．，  Ｐａｗｉｔａｎ，  Ｙ．，  Ｈａｌｌ，  Ｐ．，  Ｎｏｒｄｇｒｅｎ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｇｒａｄｅ  ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  ｎｅｗ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１０２９２−１０３０１．
３１． Ｄｅｓｍｅｄｔ，  Ｃ．，  Ｐｉｅｔｔｅ，  Ｆ．，  Ｌｏｉ，  Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌａｌｌｅｍａｎｄ，  Ｆ．，  Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ，  Ｂ．，  Ｖｉａｌｅ，  Ｇ．，  Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ，  Ｍ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  ｄ’Ａｓｓｉｇｎｉｅｓ，  Ｍ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｓｔｒｏｎｇ  ｔｉｍｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７６−ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＲＡＮＳＢＩＧ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：３２０７−３２１４．
３２． Ｌｉｍ，  Ｅ．，  Ｖａｉｌｌａｎｔ，  Ｆ．，  Ｗｕ，  Ｄ．，  Ｆｏｒｒｅｓｔ，  Ｎ．Ｃ．，  Ｐａｌ，  Ｂ．，  Ｈａｒｔ，  Ａ．Ｈ．，  Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｌａｂａｔ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｇｙｏｒｋｉ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｗａｒｄ，  Ｔ．，  Ｐａｒｔａｎｅｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ＢＲＣＡ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５：９０７−９１３．
３３． Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，  Ｂ．  ２００９．  Ｄｏ  ‘ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ’  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅａｌｌｙ  ｅｘｉｓｔ？  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：１２８−１３４．
３４． Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｃｏｌｅ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｍａｒｏｔｔｉ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｈｕ，  Ｒ．，  Ｓｃｈｎｉｔｔ，  Ｓ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｉｍｉ，  Ｒ．Ｍ．  ２０１１．  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２４：９２４−９３１．
３５． Ｈｕ，  Ｒ．，  Ｄａｗｏｏｄ，  Ｓ．，  Ｈｏｌｍｅｓ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｓｃｈｎｉｔｔ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｏｌｅ，  Ｋ．，  Ｍａｒｏｔｔｉ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｃｏｌｄｉｔｚ，  Ｇ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｉｍｉ，  Ｒ．Ｍ．  ２０１１．  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：１８６７−１８７４．
３６． Ｓａｎｔａｇａｔａ，  Ｓ．，  Ｈｕ，  Ｒ．，  Ｌｉｎ，  Ｎ．Ｕ．，  Ｍｅｎｄｉｌｌｏ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｓｃｈｎｉｔｔ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ，  Ｌ．，  Ｔａｍｉｍｉ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ＨＳＦ１）  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：１８３７８−１８３８３．
３７． Ｈａｒｒｅｌｌ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｐｒａｔ，  Ａ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｆａｎ，  Ｃ．，  Ｈｅ，  Ｘ．，  Ｃａｒｅｙ，  Ｌ．，  Ａｎｄｅｒｓ，  Ｃ．，  Ｅｗｅｎｄ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐｅｒｏｕ，  Ｃ．Ｍ．  ２０１２．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ，  ｌｕｎｇ，  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｌａｐｓｅ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １３２：５２３−５３５．
３８． Ｎｅｖｅ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｃｈｉｎ，  Ｋ．，  Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ，  Ｊ．，  Ｙｅｈ，  Ｊ．，  Ｂａｅｈｎｅｒ，  Ｆ．Ｌ．，  Ｆｅｖｒ，  Ｔ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｌ．，  Ｂａｙａｎｉ，  Ｎ．，  Ｃｏｐｐｅ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｔｏｎｇ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １０：５１５−５２７．
３９． Ｃｕｒｔｉｓ，  Ｃ．，  Ｓｈａｈ，  Ｓ．Ｐ．，  Ｃｈｉｎ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｔｕｒａｓｈｖｉｌｉ，  Ｇ．，  Ｒｕｅｄａ，  Ｏ．Ｍ．，  Ｄｕｎｎｉｎｇ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｓｐｅｅｄ，  Ｄ．，  Ｌｙｎｃｈ，  Ａ．Ｇ．，  Ｓａｍａｒａｊｉｗａ，  Ｓ．，  Ｙｕａｎ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ２，０００  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：３４６−３５２．
４０． Ｂａｎｅｒｊｉ，  Ｓ．，  Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，  Ｋ．，  Ｒａｎｇｅｌ−Ｅｓｃａｒｅｎｏ，  Ｃ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，  Ａ．Ｍ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｓｉｖａｃｈｅｎｋｏ，  Ａ．Ｙ．，  Ｓｏｕｇｎｅｚ，  Ｃ．，  Ｚｏｕ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：４０５−４０９．
４１． Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｐ．Ｊ．，  ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｉｎ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｖａｒｅｌａ，  Ｉ．，  Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，  Ｅ．Ｄ．，  Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ，  Ｌ．Ａ．，  Ｌｅｒｏｙ，  Ｃ．，  Ｅｄｋｉｎｓ，  Ｓ．，  Ｍｕｄｉｅ，  Ｌ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４６２：１００５−１０１０．
４２． ＴＣＧＡ．  ２０１２．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９０：６１−７０．
４３． Ｎｉ，  Ｍ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．，  Ｌｉｍ，  Ｅ．，  Ｗｉｍｂｅｒｌｙ，  Ｈ．，  Ｂａｉｌｅｙ，  Ｓ．Ｔ．，  Ｉｍａｉ，  Ｙ．，  Ｒｉｍｍ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｓｈｉｒｌｅｙ  Ｌｉｕ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，  Ｍ．  ２０１１．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０：１１９−１３１．
４４． ＭａｃＣｏｎａｉｌｌ，  Ｌ．Ｅ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｋｅｈｏｅ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｂａｓｓ，  Ａ．Ｊ．，  Ｈａｔｔｏｎ，  Ｃ．，  Ｎｉｕ，  Ｌ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｍ．，  Ｙａｏ，  Ｋ．，  Ｈａｎｎａ，  Ｍ．，  Ｍｏｎｄａｌ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｓａｍｐｌｅｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７８８７．
４５． Ｙａｌｃｉｎ−Ｏｚｕｙｓａｌ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｂｒｉｓｋｅｎ，  Ｃ．  ２００９．  Ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｔｏ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：３０６．
４６． Ｇｏｄａｒ，  Ｓ．，  Ｉｎｃｅ，  Ｔ．Ａ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｇ．Ｗ．，  Ｆｅｌｄｓｅｒ，  Ｄ．，  Ｄｏｎａｈｅｒ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｂｅｒｇｈ，  Ｊ．，  Ｌｉｕ，  Ａ．，  Ｍｉｕ，  Ｋ．，  Ｗａｔｎｉｃｋ，  Ｒ．Ｓ．，  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｇｒｏｗｔｈ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐ５３  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １３４：６２−７３．
４７． ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，  Ｓ．Ｓ．，  Ｇｉｆｆｏｒｄ，  Ａ．Ｍ．，  Ｇｒｅｉｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，  Ｓ．Ｐ．，  Ｓａｅｌｚｌｅｒ，  Ｍ．Ｐ．，  Ｉｎｃｅ，  Ｔ．Ａ．，  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，  Ｆ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｌ．Ｎ．，  Ｈｙｌａｎｄｅｒ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｒｅｐａｓｋｙ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｉｎｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｏｌｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ．  Ｃｅｌｌ  １３３：９９４−１００５．
４８． Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．  ２００４．  Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｈｅｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０：７８９−７９９．
４９． Ｇｕｐｔａ，  Ｇ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．  ２００６．  Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ．  Ｃｅｌｌ  １２７：６７９−６９５．
５０． Ｔａｍｉｍｉ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｂａｅｒ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｍａｒｏｔｔｉ，  Ｊ．，  Ｇａｌａｎ，  Ｍ．，  Ｇａｌａｂｕｒｄａ，  Ｌ．，  Ｆｕ，  Ｙ．，  Ｄｅｉｔｚ，  Ａ．Ｃ．，  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｓｃｈｎｉｔｔ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｏｌｄｉｔｚ，  Ｇ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：Ｒ６７．
５１． Ｐａｎｃｈｉｓｉｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．Ｌ．，  Ｐｉｓｔｏｌｌａｔｏ，  Ｆ．，  Ｐａｐｉｎｉ，  Ｄ．，  Ｎｉ，  Ｈ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ｈａｗｌｅｙ，  Ｔ．Ｓ．  ２００７．  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１３３，  ＣＤ１５，  ａｎｄ  ＣＤ２４．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：１５６０−１５７０．
５２． Ｋｏｒｄｅｋ，  Ｒ．，  Ｐｏｔｅｍｓｋｉ，  Ｐ．，  Ｋｕｓｉｎｓｋａ，  Ｒ．，  Ｐｌｕｃｉｅｎｎｉｋ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｂｅｄｎａｒｅｋ，  Ａ．  ２０１０．  Ｂａｓａｌ  ｋｅｒａｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２９：３９．
５３． Ｉｎｃｅ，  Ｔ．Ａ．，  Ｗａｒｄ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｖａｌｌｉ，  Ｖ．Ｅ．，  Ｓｇｒｏｉ，  Ｄ．，  Ｎｉｋｉｔｉｎ，  Ａ．Ｙ．，  Ｌｏｄａ，  Ｍ．，  Ｇｒｉｆｆｅｙ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｃｒｕｍ，  Ｃ．Ｐ．，  Ｃｒａｗｆｏｒｄ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｂｒｏｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．  Ｄｏ−ｉｔ−ｙｏｕｒｓｅｌｆ  （ＤＩＹ）  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：９７８−９７９；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ９７９．
５４． Ｌｕ，  Ｘ．，  Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｃ．，  Ｉｇｌｅｈａｒｔ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ａ．Ｌ．  ２００８．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １０８：１９１−２０１．
５５． Ｂｉｒｒｅｌｌ，  Ｓ．Ｎ．，  Ｂｅｎｔｅｌ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｈｉｃｋｅｙ，  Ｔ．Ｅ．，  Ｒｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ，  Ｃ．，  Ｗｅｇｅｒ，  Ｍ．Ａ．，  Ｈｏｒｓｆａｌｌ，  Ｄ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｔｉｌｌｅｙ，  Ｗ．Ｄ．  １９９５．  Ａｎｄｒｏｇｅｎｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２：４５９−４６７．
５６． Ｎａｄｅｒｉ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ−Ｄａｖｉｅｓ，  Ｌ．  ２００８．  Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＥｒｂＢ２  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １０：５４２−５４８．
５７． Ｅｍｄｅ，  Ａ．，  Ｍａｈｌｋｎｅｃｈｔ，  Ｇ．，  Ｍａｓｌａｋ，  Ｋ．，  Ｒｉｂｂａ，  Ｂ．，  Ｓｅｌａ，  Ｍ．，  Ｐｏｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，  Ｙ．  ２０１１．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＨＥＲ２  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＨＥＲ２  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ  ４：２９３−３００．
５８． Ｄａｗｏｏｄ，  Ｓ．，  Ｈｕ，  Ｒ．，  Ｈｏｍｅｓ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｓｃｈｎｉｔｔ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，  Ｊ．，  Ｃｏｌｄｉｔｚ，  Ｇ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｉｍｉ，  Ｒ．Ｍ．  ２０１１．  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １２６：１８５−１９２．
５９． Ｇｅｒｎｅｒ，  Ｍ．Ｙ．，  Ｋａｓｔｅｎｍｕｌｌｅｒ，  Ｗ．，  Ｉｆｒｉｍ，  Ｉ．，  Ｋａｂａｔ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｅｒｍａｉｎ，  Ｒ．Ｎ．  ２０１２．  Ｈｉｓｔｏ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔ  ｍｉｃｒｏａｎａｔｏｍｙ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３７：３６４−３７６．
６０． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｓａｖａｇｅ，  Ｋ．，  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｊ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｉｓａｃｋｅ，  Ｃ．Ｍ．  ２００８．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  （ＦＦＰＥ）  ｔｉｓｓｕｅ．  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１３． 
６１． Ｔｓｕｒｕｉ，  Ｈ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｈ．，  Ｈａｔｔｏｒｉ，  Ｓ．，  Ｈｉｒｏｓｅ，  Ｓ．，  Ｏｋｕｍｕｒａ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉｒａｉ，  Ｔ．  ２０００．  Ｓｅｖｅｎ−ｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｕｌａｒ  ｖａｌｕｅ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４８：６５３−６６２．
６２． Ｓｈｉ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｓｈｉ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｃ．Ｒ．  ２０１１．  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｖｅｒ  ｔｗｏ  ｄｅｃａｄｅｓ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５９：１３−３２．
６３． Ｇｌａｓｓ，  Ｇ．，  Ｐａｐｉｎ，  Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｄｅｌｌ，  Ｊ．Ｗ．  ２００９．  ＳＩＭＰＬＥ：  ａ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｒａｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５７：８９９−９０５．
【図２】
2016524150.tif 000003
【図５】
2016524150.tif 000004
【図６】
2016524150.tif 000005
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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