(57)【要約】  ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、及び関連する細菌におけるキメラ遺伝子の発現のための合成誘導体プロモーターを作製した。このプロモーターは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの９０位におけるヌクレオチドのＣのＴへの変化を有する。この変化を有するプロモーターは、このプロモーターが由来する天然プロモーターと比較して高い発現を有し、且つコード領域又は調節ＲＮＡを発現させてタンパク質又は調節ＲＮＡの高レベルの発現を得るための遺伝子操作に有用である。
2016531555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が配列番号１で示されている天然Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの９０位でＣのＴでの塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む合成核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、４、６、及び７からなる群から選択されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む合成核酸分子。
【請求項３】
異種核酸分子に機能的に連結された請求項１又は２に記載の合成核酸分子を含むキメラ遺伝子。
【請求項４】
前記異種核酸分子が、タンパク質又はペプチドをコードする、請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項５】
前記異種核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及び干渉ＲＮＡからなる群から選択される調節ＲＮＡ分子をコードする、請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の合成核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法であって、請求項１又は２に記載の合成核酸分子を前記細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項８】
導入するステップが、請求項１又は２に記載の合成核酸分子を前記細胞のゲノムに組み込むステップ、又は前記細胞内で安定に複製するプラスミドを維持するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の合成核酸を含む組換え細菌株。
【請求項１０】
単離核酸分子が、キメラ遺伝子のプロモーターである、請求項９に記載の組換え細菌株。
【請求項１１】
前記キメラ遺伝子が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、及びリボロース−リン酸３−エピメラーゼからなる群から選択される酵素をコードする単離核酸分子を含む、請求項１０に記載の組換え細菌株。
【請求項１２】
改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製する方法であって：
ａ）ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）又はザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む核酸断片を単離するステップ、及び
ｂ）前記単離した断片に、ａ）９０位におけるＣのＴでの塩基置換を導入し、これにより、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製するステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって作製される、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学及び遺伝子工学の分野に関する。より詳細には、細菌でのキメラ遺伝子の発現を誘導する新規なプロモーターが同定された。
【背景技術】
【０００２】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料の代替エネルギー源を可能にし、従って、最新の研究の重要な領域である。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）は、エタノールの商業生産に使用することができる天然のエタノロジェン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）である。しかしながら、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、加水分解リグノセルロース物質中の主なペントースであるキシロースを自然の状態では利用しない。リグノセルロースバイオマス加水分解物中で炭水化物基質を十分に利用するためには、エタノロジェンがキシロースを利用することが望ましい。
【０００３】
自然の状態ではキシロースを利用しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）及び他の細菌エタノロジェンを、１）キシロースのキシルロースへの転換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；及び４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロース利用のために遺伝子操作することができる。キシロース代謝のためのＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の遺伝子操作（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１、非特許文献２）及びザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）株の遺伝子操作（非特許文献３）に成功している。しかしながら、典型的には、遺伝子操作株は、グルコースと同様にキシロースでもエタノールを増加させず、産生もしない。
【０００４】
この遺伝子操作では、キシロース代謝の異種タンパク質をコードする遺伝子が、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞において活性を示すプロモーター、典型的には、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター又はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモーターから発現された。キシロース利用のために遺伝子操作された株は、キシロース培地での連続継代が行われ、特許文献５及び特許文献６に記載されているようにキシロース利用が改善された株が得られた。特許文献７及び特許文献８は、活性が改善されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、及びザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）でキシロース利用のためにキシロースイソメラーゼを発現させるためのこの使用を開示している。このプロモーターは、他の遺伝子の発現にも使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，５１４，５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７１２，１３３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５６６，１０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７２６，０５３号明細書
【特許文献５】米国特許第７２２３５７５号明細書
【特許文献６】米国特許第７７４１１１９号明細書
【特許文献７】米国特許第７９８９２０６号明細書
【特許文献８】米国特許第７９９８７２２号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４−３６１
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３
【非特許文献３】Ｙａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
キシロース利用を改善する遺伝子を発現させるためにザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）及び細菌エタノロジェンの遺伝子操作に使用できるさらなる強力なプロモーターがなお要望されている。これらのプロモーターは、他の遺伝子の発現にも使用し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、改善された活性を有する、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの誘導体である合成プロモーターを提供する。
【０００９】
従って、本発明は、９０位にＣのＴでの塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む合成核酸分子を提供し、この位置番号は配列番号１に対するものである。この塩基置換は、天然Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターと比較してプロモーターの強度を高める効果を有する。
【００１０】
他の態様では、本発明は、上述の塩基置換を有する合成核酸分子を含むキメラ遺伝子、及びこの合成核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法を提供し、この方法は、本発明の合成核酸分子をこの細胞に導入するステップを含む。
【００１２】
なお別の態様では、本発明は、本発明の合成核酸分子を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株を提供する。
【００１３】
なお別の実施形態では、本発明は、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製する方法を提供し、この方法は：
ａ）ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）又はザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む核酸断片を単離するステップ、
ｂ）この単離した断片に、ａ）９０位におけるＣのＴでの塩基置換を導入し、これにより、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製するステップ
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ｐＺＰ１３のプラスミドマップを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、以下の詳細な説明及び本出願の一部を構成する添付の配列の記載からより良く理解することができる。
【００１６】
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ”）に適合し、且つ世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）及びＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件（規則５．２及び４９．５（ａ−ｂｉｓ）、並びに実施細則の２０８項の付録Ｃ）を満たしている。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のデータに使用される記号及び形式は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に適合している。
【００１７】
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株の天然ＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。［４２３６の＃１］
【００１８】
配列番号２は、９０位でＣがＴで置換されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号３は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株の天然ＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。［４２３６の＃２］
【００２０】
配列番号４は、９０位でＣがＴで置換されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号５は、ｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。［４２３６のＴが欠失した＃３］
【００２２】
配列番号６は、９０位でＣがＴで置換されたｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号７は、ｐＺＢ４と同様の２８５位でＴが欠失し、且つ９０位でＣがＴで置換されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号８は、１，９５１ｂｐのＤＰ１３４１−Ｕ断片のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号９は、１，２５５ｂｐのＤＰ１３４１−Ｄ断片のヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１０は、ＧＵＳコード配列のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ３’ＵＴＲのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１２は、Ｓｐｅｃ−Ｒ発現カセットのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１３は、ｐＺＰ１３３２のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１４は、ｐＺＰ１３３７のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１５は、Ｓｐｅｃ−Ｒ発現カセットに対して５’側であるｌｏｘＰｗ断片のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１６は、Ｓｐｅｃ−Ｒ発現カセットに対して３’側であるｌｏｘＰｗ断片のヌクレオチド配列である。
【００３３】
ｌｏｘＰｗ部位及び制限部位であるフランキングｌｏｘＰｗ配列は、配列番号１５及び１６である。
【００３４】
以下の定義は、特許請求の範囲及び本明細書の理解に使用することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という語、又はこれらのその他の変形形態は、非排他的包含を含むものとする。例えば、列記された要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、製品、又は装置は、これらの要素のみに必ずしも限定されるものではなく、このような組成物、混合物、プロセス、方法、製品、又は装置に明確に列記されていない又は本来備えていない他の要素も含み得る。さらに、反対の意味が明確に記載されていない限り、「又は（ｏｒ）」は、包含的なｏｒを指し、排他的なｏｒを指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａは真実であり（又は存在し）且つＢは偽である（又は存在しない）、Ａは偽であり（又は存在せず）且つＢは真実である（又は存在する）、並びにＡ及びＢの両方が真実である（又は存在する）。
【００３６】
また、本発明の要素又は構成要素の前の不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、要素又は構成要素の事例（例えば、存在）の数を限定するものではない。従って、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は少なくとも１つを含むと理解するべきであり、要素又は構成要素の単数形の語形は、数が明らかに単数であることを意味しない限り複数形も含む。
【００３７】
本明細書で使用される「発明」又は「本発明」という語は、非限定の語であり、特定の発明のいずれか１つの実施形態を指すものではなく、本明細書及び特許請求の範囲で説明される全ての可能な実施形態を包含する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、利用される発明の成分又は反応物の量を修飾する「約」という語は、例えば、濃縮物の調製に使用される典型的な測定及び液体処理手順又は現場での溶液の使用によって；これらの手順における偶然の誤差によって；並びに組成物の調製又は方法の実施の際に利用される成分の製造、供給源、又は純度における差異などによって起こり得る数量の変動を指す。「約」という語はまた、特定の最初の混合で得られる組成物の異なる平衡条件によって異なる量も包含する。「約」という語によって修飾されるか、又はされないにかかわらず、特許請求の範囲は、数量に対する均等な量を含む。一実施形態では、「約」という語は、報告される数値の１０％の範囲内、好ましくは報告される数値の５％の範囲内を意味する。
【００３９】
「キシロースイソメラーゼ」という語は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換を触媒する酵素を指す。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）は、ＥＣ  ５．３．１．５に分類される酵素の群に属する。
【００４０】
「キシルロキナーゼ」という語は、キシルロースをリン酸化してキシルロース５−リン酸を形成する酵素を指す。
【００４１】
「トランスケトラーゼ」及び「トランスアルドラーゼ」という語は、キシルロース５−リン酸を、キシロースのエタノールへの代謝を可能にする解糖系のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ経路にペントース代謝を結合する中間体に変換するペントースリン酸経路の２つの酵素である。
【００４２】
「遺伝子」という語は、特定のタンパク質又は機能的なＲＮＡ分子を発現する核酸断片を指し、この核酸断片は、任意に、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）及びコード配列の後の調節配列（３’非コード配列）を含み得る。「天然遺伝子」又は「野生型遺伝子」とは、それ自体が調節配列を有する、自然で見られる遺伝子のことである。「キメラ遺伝子」とは、自然では一緒に見られない調節配列とコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子のことである。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、自然で見られる構成とは異なる方法で構成された調節配列及びコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおけるその自然の位置にある天然遺伝子のことである。「外来」遺伝子とは、宿主生物中では通常は見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子のことである。外来遺伝子は、非天然生物に挿入される天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含み得る。
【００４３】
「プロモーター」という語は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、全てが天然遺伝子に由来し得る、又は自然で見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成され得る、又は合成ＤＮＡ断片さえも含み得る。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は発生の異なる段階で、又は異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を誘導し得ることを理解されよう。殆どの細胞型でほぼ毎回遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。
【００４４】
本明細書で使用される「発現」という語は、遺伝子に由来するコード（ｍＲＮＡ）及び機能的ＲＮＡの転写及びこれらの安定した集積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指すことがある。「過剰発現」とは、正常な生物又は非形質転換生物での産生レベルを超える、トランスジェニック生物での遺伝子産物の産生のことである。
【００４５】
本明細書で使用される「形質転換」という語は、遺伝的に安定した遺伝となる、核酸断片の宿主生物への導入を指す。導入核酸は、宿主細胞で維持されるプラスミドの形態であっても良く、又は一部の導入核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれても良い。形質転換核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換」生物と呼ばれる。
【００４６】
本明細書で使用される「プラスミド」及び「ベクター」という語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子をしばしば運搬する染色体外要素を指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。このような要素は、任意の供給源に由来する一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの線状又は環状の、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ、又はヌクレオチド配列であり得、このようは配列では、多数の核酸配列が、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができるユニークな構造に結合又は組み換えられている。
【００４７】
「機能的に連結された」という語は、一方の機能が他方によって影響を受けるような核酸配列の単一核酸断片への結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることができる（即ち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合にそのコード配列に機能的に連結される。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向において調節配列に機能的に連結することができる。
【００４８】
「選択可能なマーカー」という語は、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することができる、通常は抗生物質又は化学物質耐性遺伝子である同定因子を意味し、この効果を使用して、目的の核酸の遺伝を追跡し、且つ／又は目的の核酸を受け継いだ細胞又は生物を同定する。
【００４９】
本明細書で使用される「コドンの縮重」という語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えずに、ヌクレオチド配列の多様性を可能にする遺伝子コードにおける性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドのコドン出現頻度において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分に認識している。従って、宿主細胞での発現の改善のために遺伝子を合成する場合は、そのコドン出現頻度が、宿主細胞の好ましいコドン出現頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。
【００５０】
様々な宿主の形質転換のための遺伝子又は核酸分子のコード配列を指すときの「最適化コドン」という語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン出現頻度に反映させる、遺伝子又は核酸分子のコード領域におけるコドンの変更を指す。
【００５１】
「異種」という語は、目的の位置で自然の状態では見られないことを意味する。例えば、異種遺伝子とは、宿主生物では自然の状態では見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子のことである。例えば、キメラ遺伝子中に存在する異種核酸分子は、自然の状態ではキメラ遺伝子の他のセグメントと結合して見られない核酸分子、例えば、自然の状態では互いに結合しては見られないコード領域とプロモーターセグメントを有する核酸分子である。
【００５２】
本明細書で使用される「合成核酸分子」とは、任意に合成の非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含む、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡの人工ポリマー又は操作されたポリマーのことである。ＤＮＡのポリマーの形態の合成核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
【００５３】
「Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター」及び「ＺｍＰｇａｐ」という語は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムにおけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする領域の上流に自然の状態で生じるヌクレオチド配列を有する、プロモーター活性を有する核酸分子を指す。これらの語は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株、例えば、ＣＰ４及びＺＭ４株（それぞれ配列番号１及び２）のプロモーター、並びに実質的に異なっていないレベルで発現を誘導する配列及び／又は長さにおける変異体、例えば、ｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ（配列番号３）を指す。
【００５４】
本発明で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（以降“Ｍａｎｉａｔｉｓ”）；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７に記載されている。
【００５５】
本発明は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、及び関連する細菌におけるキメラ遺伝子の発現のための合成の誘導体プロモーター（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に関する。プロモーターは、これらが由来する天然プロモーターと比較して高い発現を有し、高レベルの発現タンパク質又は調節ＲＮＡを得るためにザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、及び関連する細菌におけるコード領域又は調節ＲＮＡを発現させるための遺伝子操作に有用である。例えば、本プロモーターは、キシロース利用経路の酵素、例えば、キシロースイソメラーゼのコード領域の発現によって、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞による改善されたキシロース利用を達成するために遺伝子操作に使用することができる。
【００５６】
改善されたグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター
本プロモーターは、ＺｍＰｇａｐにおける９０位でＣがＴで置換されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＺｍＰｇａｐ）由来のプロモーターの誘導体であり、この９０位は、配列番号１におけるヌクレオチド＋９０を指す。このヌクレオチドが変換したプロモーターは、天然ＺｍＰｇａｐと比較して高い活性を有する。
【００５７】
一実施形態では、本プロモーターは、９０位のＴを除いて配列番号１と同一の配列番号２のヌクレオチド配列を有する。
【００５８】
様々な実施形態では、本プロモーターは、配列番号１のヌクレオチドに関して９０位でＣがＴで置換された任意のＺｍＰｇａｐである。ＺｍＰｇａｐの配列は、単一の配列ではなく、プロモーターの機能に対して実質的な影響を与えない配列におけるある程度の変化を有し得る。プロモーターの機能に対して実質的な影響を与えないとは、プロモーター配列が、天然ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株に存在するＺｍＰｇａｐによって誘導される発現のレベルと実質的に同様の発現レベルを誘導することを意味する。配列における変化は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の異なる単離株又は株間で自然の状態で起こり得、例えば、配列番号１のヌクレオチドに関して２７６位におけるＣＰ４株のＺｍＰｇａｐとＺＭ４株のＺｍＰｇａｐとの間の差異があり、ＣＰ４ではＡが存在し、ＺＭ４ではＧが存在する（それぞれ配列番号１及び３。一実施形態では、本プロモーターは、９０位でＣがＴで置換されたＺＭ４株のＺｍＰｇａｐの配列（配列番号４）を有する。
【００５９】
加えて、プロモーターの機能に対して実質的な影響のないＺｍＰｇａｐ配列における１つ以上の挿入又は欠失が存在し得、例えば、ｐＺＢ４ベクターに存在する。ｐＺＢ４ベクターのＺｍＰｇａｐは、配列番号１のヌクレオチドに関して２８５位のＴが喪失しており、配列番号５を付与した。このプロモーターは、ＣＰ４株と同様に２７６位にＡを有する。一実施形態では、本プロモーターは、９０位でＣがＴで置換されたｐＺＢ４ベクターのＺｍＰｇａｐの配列を有する（配列番号６）。
【００６０】
１つ以上の挿入又は欠失では、配列番号１に対する位置番号は、挿入又は欠失がプロモーターの５’末端間に生じるか否か、及び配列番号１の９０位が何であるかによって影響を受け得る。従って、ＣのＴへの変化の位置は、配列の前後関係によって最も良く認識することができる。ＣのＴへの変化の前後関係は：ＣＡＧＧＧＡＣＧＡＣＡＡＴであり、下線が引かれた太字のＣは、この誘導体プロモーターではＴに置換されるヌクレオチドである。当業者であれば、配列番号１に対する９０位と呼ばれるこのヌクレオチドにおける、ＣのＴでの置換と呼ばれるＣからＴへの変化が容易に分かるであろう。
【００６１】
別の実施形態では、本プロモーターは、９０位でのＣのＴでの置換、ｐＺＢ４と同様の２８５位でのＴの喪失、及びＺＭ４株と同様の２７６位のＧを有する（配列番号７）。９０位でのＣのＴでの置換、ｐＺＢ４と同様の２８５位でのＴの喪失、及びＣＰ４株と同様の２７６位のＡを有するプロモーターは、配列番号６と同じである。全ての位置は、配列番号１に対してである。
【００６２】
従って、本プロモーターの例は、配列番号２、４、６、及び７を含む。上記の前後関係を含め、９０位でのＣのＴでの置換を有するＺｍＰｇａｐは、本明細書ではＰｇａｐＵ又はＰｇａｐＵと呼ばれる。
【００６３】
改善されたＰｇａｐＵの調製
説明した９０位での置換は、当業者に公知の任意の方法によってＺｍＰｇａｐ核酸分子に導入することができる。例えば、突然変異を有し、且つＤＮＡ配列を取り囲むオリゴヌクレオチドを合成して、より大きなプロモーターＤＮＡ断片にクローニングして、９０位の置換なしでセグメントを置換することができる。ヌクレオチドの変化及び一部の隣接したプロモーター配列を含むプライマーを合成し、これをＰＣＲで使用してプロモーター断片を調製することができる。プロモーターＤＮＡ断片全体を、１つに結合される複数のオリゴヌクレオチドとして合成することができる。部位特異的突然変異を使用して、ヌクレオチド置換を導入することができる。
【００６４】
キメラ遺伝子及びベクターの改善されたＰｇａｐの細菌細胞への導入
本プロモーターを、細菌細胞で発現される異種核酸分子に機能的に連結して、キメラ核酸分子、又は本発明の別の態様であるキメラ遺伝子を形成することができる。キメラ遺伝子の設計及び構築は、当業者に周知である。キメラ遺伝子は、典型的には、プロモーター、発現される異種核酸分子、及び３’末端制御領域を含む。末端制御領域は、様々な遺伝子に由来しても良く、しばしば、標的宿主細胞に内在する遺伝子から得られる。機能的に連結された異種核酸分子は、例えば、タンパク質若しくはペプチドのコード領域、又は機能的ＲＮＡの発現のための核酸を含め、細菌細胞での発現が望ましい任意の核酸分子であり得る。機能的ＲＮＡは、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及び干渉ＲＮＡを含む。加えて、本明細書に記載のプロモーター及びこのプロモーターから発現される複数のコード領域を含むオペロンを構築することができる。
【００６５】
本明細書に記載のプロモーターは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）又はザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌での発現のためにキメラ遺伝子に使用することができる。キメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）又はザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の産物の産生に関与する任意のタンパク質の発現のために使用することができる。例えば、アミノ酸、例えば、アラニン又はソルビトール又はキシリトールの合成に関与する１つ以上の酵素は、これらのプロモーターを有するキメラ遺伝子から発現させることができる。キメラ遺伝子は、キシロースを利用しない天然ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株若しくは天然ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株、又はキシロースを利用する株で発現させることができる。また、本明細書に記載のプロモーターは、キシロース代謝又は別の代謝経路に関連した酵素の発現のために使用することができる。
【００６６】
本明細書に記載のキメラ遺伝子は、典型的には、さらなる操作のためにベクターで構築される又はベクターに導入される。ベクターは、当技術分野で周知である。特定のベクターは、広範囲の宿主細菌で複製することができ、且つ接合によって導入することができる。ｐＲＫ４０４の完全な注釈付き配列及び３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、及びｐＲＫ４４２（Ｈ）が利用可能である。これらの誘導体は、グラム陰性細菌での遺伝子操作のための貴重なツールであることが証明された（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ５０（１）：７４−７９（２００３））。
【００６７】
他の周知のベクターを、異なる標的宿主細胞に使用することができる。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）での発現に特に有用なベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の両方で複製できるベクター、例えば、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されているｐＺＢ１８８である。ベクターは、細胞での安定した自己複製用のプラスミド、及び細菌ゲノムに組み込まれる構築物を輸送するためのプラスミドを含み得る。ＤＮＡ組込み用のプラスミドは、トランスポゾン、標的細菌ゲノムに相同な核酸配列の領域、又は組込みを支援する他の配列を含み得る。別のタイプのベクターは、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）が市販するシステムを用いて作製されるトランスポソームであり得る。望ましい標的宿主及び望ましい機能のために適切なベクターを選択する方法は周知である。
【００６８】
本明細書に記載のプロモーターはまた、発現のための機能的に連結された核酸分子を用いずにベクターで構築して、これを内在性コード領域に近接して組み込んで、細菌ゲノムの内在性プロモーターを置換する、又は、例えば、オペロン内のコード領域にプロモーターを付加することもできる。染色体プロモーターの置換は、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００６）８：７９−９０），ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００７）５３：５６−６２）に記載されているような方法を用いて達成することができる。
【００６９】
本明細書に記載のプロモーターを含むベクターは、周知の方法によって、例えば、凍結融解形質転換、カルシウム媒介性形質転換、エレクトロポレーション、又は接合を用いて細菌細胞に導入することができる。
【００７０】
ＰｇａｐＵを用いた異種核酸分子の発現
キメラ遺伝子の発現レベルの増加は、本明細書に記載の改善されたＰｇａｐを用いて達成することができる。本明細書の実施例３に示されているように、コード領域に機能的に連結された本プロモーターを含むキメラ遺伝子の発現は、天然Ｐｇａｐから発現されるタンパク質の活性と比較すると、細胞抽出物で発現されるタンパク質の活性を４倍超増加させた。
【００７１】
様々な実施形態では、キシロース又はアラビノースの利用を改善するタンパク質をコードする１つ以上の配列を、本プロモーターを含むキメラ遺伝子の一部として発現させることができる。キシロース利用経路で発現させることができるコード領域は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼを含む。これらの酵素、これらをコードする配列、及びキシロース利用経路におけるこれらの関与は周知である。特に、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，９９８，７２２号明細書に開示されているいずれのキシロースイソメラーゼも、そのコード配列を本プロモーターに機能的に連結することによって発現させることができるキシロースイソメラーゼである。
【００７２】
加えて、アラビノースの利用では、発現させることができるコード領域は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８４３，７６０号明細書に開示されている、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、及びＬ−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼを含む。加えて、キシロース利用を改善する他のタンパク質をコードする配列、例えば、リブロース−５−リン酸とリボース−５−リン酸との相互変換を触媒し、且つＥＣ  ５．３．１．６として分類される酵素の群に属するリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２０１５６７４６号明細書に開示されている）、及びＤ−リブロース−５−リン酸とＤ−キシルロース５−リン酸との相互変換を触媒し、且つＥＣ  ５．１．３．１として分類される酵素の群に属するリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ＲＰＥ）（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１３０１５７３３１号明細書に開示されている）を発現させることができる。
【００７３】
一実施形態では、本プロモーターは、ＺｍＰｇａｐからの発現と比較して、キシロースイソメラーゼの発現の増加を誘導するためにキシロースイソメラーゼをコードする異種核酸分子を発現させるために使用される。改善されたＰｇａｐ及びキシロースイソメラーゼコード領域は、一般に３’末端制御領域も含むキメラ遺伝子を形成する。末端制御領域は、様々な遺伝子に由来しても良く、しばしば、標的宿主細胞に内在する遺伝子から得られる。キメラ遺伝子の構築は当技術分野で周知である。
【００７４】
いずれのキシロースイソメラーゼコード領域も、改善されたＰｇａｐＵからキシロースイソメラーゼを発現させるためにキメラ遺伝子で使用することができる。キシロースイソメラーゼ酵素は、群ＥＣ５．３．１．５に属する。使用することができる適切なキシロースイソメラーゼタンパク質及びコード配列の例は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，９９８，７２２号明細書及び米国特許出願公開第２０１１０３１８８０１号明細書に開示されている。
【実施例】
【００７５】
本発明は、以下の実施例でさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として記載されることを理解されたい。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な使用及び条件に適合するように本発明の様々な変化形態及び変更形態をなすことができる。
【００７６】
一般的な方法
省略形の意味は次の通りである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」又は「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼを意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味する。
【００７７】
本発明で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以降“Ｍａｎｉａｔｉｓ”）；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【００７８】
実施例１
プロモーター−ＧＵＳ試験組込みベクターの作製
ＤＮＡのザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムへの組込みのために、ｐＺＰ１３  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｃｒｏｓｓ  Ｏｖｅｒ（ＤＣＯ）スーサイドベクター（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ）を作製した。図１は、その概略マップを示している。このプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製部位は含むがＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）複製部位は含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖を有する。従って、このプラスミドは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では増殖しない。ゲノム組換えを目的とするｐＺＰ１３の２つの断片、ＤＰ１３４１−Ｕ及びＤＰ１３４１−Ｄを、ＰＣＲによってＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡから合成した。言及する配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列内にある：Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：６３−６８；ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６５２６．２）。１，９５１−ｂｐのＤＰ１３４１−Ｕ断片（配列番号８）は、ＺＭＯ１２５０コード配列の最初の２１７ｂｐ（ｎｔ−１〜ｎｔ−２１７）及び１，７３４−ｂｐの上流配列を含む。１，２５５−ｂｐのＤＰ１３４１−Ｄ断片（配列番号９）は、ＺＭＯ１２５０コード配列の最後の７０４ｂｐ（ｎｔ−２１８〜ｎｔ−９２１）及び５５１−ｂｐの下流配列を含む。これらの２つの断片は、これらの間に位置する導入遺伝子の、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのｎｔ−２１７とｎｔ−２１８との間のＺＭＯ１２５０コード配列への組込みを誘導する。ＺＭＯ１２５０は、１，３５５，１２９〜１，３５６，０４９のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列に位置するオープンリーディングフレームであり、３０６−ａａの仮定タンパク質をコードする。
【００７９】
ｐＺＰ１３を、標的断片間に位置するキメラＧＵＳ発現カセットも含むように作製し、これを、試験プロモーターの強度を決定するためにレポーターとして使用した。ｐＺＰ１３は、Ｓｐｅｌ及びＮｓｉｌ部位によって囲まれた試験プロモーター配列（Ｐｒｏ）、１，８１５−ｂｐのβ−グルクロニダーゼコード配列（ＧＵＳ；配列番号１０）、及び１６６−ｂｐの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＤ３’ＵＴＲ（ＥＣａｒａＤ３’ＵＴＲ；配列番号１１）からなる。標的断片間には、ｌｏｘＰｗ断片が隣接した、スペクチノマイシンを用いた形質転換Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の選択のための１，０１４−ｂｐのＳｐｅｃ−Ｒ発現カセット（配列番号１２）も位置する。隣接ｌｏｘＰｗ配列は、ｌｏｘＰｗ部位及び制限部位を含み、配列番号１５及び１６である。
【００８０】
ＧＵＳコード領域を発現させるために使用される試験プロモーターは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐｇａｐ）及びこのプロモーターの誘導体、ＰｇａｐＵとした。Ｐｇａｐは、強力な３０５−ｂｐの解糖系プロモーター（配列番号１）であり、組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株でキシロース−利用遺伝子を発現させるために以前に使用された。ＰｇａｐＵは、プロモーター配列の９０位でＣがＴに変化した３０５−ｂｐのＰｇａｐの誘導体（配列番号２）である。ＧＵＳの発現を促すこれらのプロモーターを含むｐＺＰ１３スーサイドベクターは、ｐＺＰ１３３２含有Ｐｇａｐ（配列番号１３）及びｐＺＰ１３３７含有ＰｇａｐＵ（配列番号１４）と命名した。
【００８１】
実施例２
プロモーター−ＧＵＳ発現カセットの組込み
試験プロモーター−ＧＵＳキメラ遺伝子を、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）のゲノムに組み込んだ。コンピテント細胞を、ＭＲＭ３Ｇ５（１％酵母エキス、１５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び５０ｇ／Ｌ  グルコース）中、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪させながらＺＷ１を一晩増殖させることによって調製した。ＯＤ６００値を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−１２００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。細胞を回収し、０．０５のＯＤ６００値になるまで新鮮な培地で再懸濁した。細胞を、同じ条件下で初中期対数期（ｅａｒｌｙ−ｍｉｄｄｌｅ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（０．５に近いＯＤ６００）まで増殖させ、次いで回収して、氷冷水で２回洗浄し、もう一度氷冷１０％グリセロールで洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集して、１００に近いＯＤ６００値になるまで氷冷１０％グリセロールで再懸濁した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には非メチル化ＤＮＡが必要なため、ｐＺＰ１３３２及びｐＺＰ１３３７は、まず大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞に形質転換した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。各形質転換では、形質転換細胞の１つのコロニーを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを含むＬＢブロス）中で一晩、３７℃で増殖させた。ＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて各１０ｍＬ培養液から調製した。
【００８２】
約１μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを、１  ＭＭエレクトロポレーションキュベット（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）中、５０μＬのＺＷ１コンピテント細胞と混合した。プラスミドＤＮＡを、ＢＴ７２０  Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ  Ｐｌｕｓ（ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて２．０ＫＶで細胞に電気穿孔した。形質転換細胞を、１ｍＬのＭＭＧ５培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、及び１ｍＭのＭｇＳＯ４）中、３０℃で４時間回収し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて嫌気ジャーの中でＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート（２５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン及び１５ｇ／Ｌの寒天を含むＭＭＧ５）で、３日間３０℃で増殖させた。スペクチノマイシン耐性コロニーを得て、これを新しいＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレートに画線し、上記と同じ条件下で増殖させ、これにより、キメラＧＵＳ／Ｓｐｅｃ−Ｒ導入遺伝子構築物がＺＷ１のゲノムに組み込まれたことを示した。ＧＵＳ発現カセットの組込み及び発現をさらに確かめるために、形質転換細胞を、１４ｍＬのキャップ付きＦａｌｃｏｎチューブ内の５ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００（２００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＭＲＭ３Ｇ５）に接種し、１５０ｒｐｍの振蘯機で一晩３０℃で増殖させた。１００μＬの培養液の細胞を、１．５ｍＬの遠心分離管で沈降させた。収集した細胞を、１ｍＬの０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液で洗浄し、次いで１００μＬのＧＵＳ染色液（１ｍＬの溶液は、５００μＬの０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０の２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の１０μＬの１０％トリトンＸ−１００、２０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇｌｕｅジメチルホルムアミド溶液、４５０μＬの水を含む）に再懸濁した。再懸濁液を３７℃で一晩インキュベートすることによって呈色反応を行った。この反応を、ＧＵＳ溶液を除去して、１００μＬの７０％  ＥｔＯＨを添加することによって停止させた。多数の形質転換細胞が、シグネチャブルーカラー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｂｌｕｅ  ｃｏｌｏｒ）によって決定される陽性ＧＵＳ染色を有していた。従って、これらの形質転換細胞は、キメラＧＵＳ／Ｓｐｅｃ−Ｒ構築物の組込みを有するだけではなく、ＧＵＳ導入遺伝子及びＳｐｅｃ−Ｒ導入遺伝子の両方を発現した。これらの形質転換細胞を、ＺＷ１−ＺＰ１３３２及びＺＷ１−ＺＰ１３３７と命名した。
【００８３】
実施例３
ＧＵＳ活性アッセイによるプロモーターの比較
ＧＵＳ活性を測定するために、ＺＷ１−ＺＰ１３３２（ＺＷ１−ＺＰ１３３２  ＃１１及び＃１２）又はＺＷ１−ＺＰ１３３７（ＺＷ１−ＺＰ１３３７  ＃１及び＃８）を含む２つの形質転換細胞を、１５０ｒｐｍで振盪しながら２ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００中、３０℃で一晩増殖させた。次いで、５０μＬの培養液を５ｍＬの新鮮なＭＲＭ３Ｇ５−Ｓｐｅｃ２００に添加し、ＯＤ６００が６に近づくまで、１４ｍＬのキャップ付きＦａｌｃｏｎチューブ内で、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１６時間増殖させた。遠心分離によって細胞を収集し、これを１ｍＬのＧＵＳアッセイベース緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０の１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、１ｍＬのタンパク質抽出物緩衝液（５％グリセロールを含むＧＵＳアッセイベース緩衝液）で再懸濁した。各細胞懸濁液を、溶解マトリックスＡビーズを含むＢＩＯ１０１  ２ｍＬのキャップ付きチューブ（ＢＩＯ１０１，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に入れて、２０秒間のステップ５で、ＢＩＯ１０１  Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２００で３回振蘯した。細胞残屑及びビーズを、微小遠心分離機で沈降させ、上清をタンパク質抽出物として収集した。
【００８４】
タンパク質抽出物中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。アッセイでは、０．０２５μｇ／μＬ、０．０５μｇ／μＬ、０．１μｇ／μＬ、及び０．２μｇ／μＬを含む１０μＬの標準ＢＳＡ溶液及び適切に希釈されたタンパク質抽出物を、９６ウェルプレート内にある２００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎと混合し、室温で５分間インキュベートした。ＯＤ５９５をＶｉｃｔｏｒ  ＩＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定し、タンパク質濃度を、得られた標準曲線に従って機器によって計算した。表１は、全ての抽出物中のタンパク質濃度の要約である。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
ＧＵＳ活性アッセイのプロトコルは、ＧＵＳプロトコル：遺伝子発現のレポーターとしてＧＵＳを使用する（Ｅｄ．Ｓｅａｎ  Ｒ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２）から作成した。このプロトコルは、９６ウェルプレートで行うために変更した。このアッセイでは、タンパク質抽出物緩衝液（５％グリセロールを含むＧＵＳアッセイベース緩衝液）を用いて、ＺＷ１−ＺＰ１３３２  ＃１１及び＃１２タンパク質抽出物を２０倍に希釈し、ＺＷ１−ＺＰ１３３７  ＃１及び＃８タンパク質抽出物を８０倍に希釈した。新しいＧＵＳアッセイワーキング緩衝液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を、３，９３０μＬのＧＵＳアッセイベース緩衝液、２０μＬの１Ｍ  ＤＴＴ、及び５０μＬの１００ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰＧ）と混合して調製し、３７℃に予熱した。Ｆａｌｃｏｎ９６ウェル平底プレートも、２００μＬの０．４Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３停止液を各ウェルに添加することによって準備した。ＧＵＳアッセイ反応を、２５μＬの希釈タンパク質抽出物及び１００μＬの予熱ＧＵＳワーキング緩衝液を添加することによって０．２ｍＬのＰＣＲ管で開始させ、次いで３７℃でインキュベートした。１５分後、３０分後、４５分後、及び６０分後に、２５μＬの反応液を反応管から除去し、準備した９６ウェルプレートで即座に２００μＬの停止液と混合した。３つの併発反応を、各タンパク質抽出物で行った。２０μＬのＧＵＳアッセイワーキング緩衝液と５μＬのタンパク質抽出物緩衝液との混合物を盲験としてウェルに添加した。反応の完了後、９６ウェルプレートをＶｉｃｔｏｒ  ＩＩＩプレートリーダーでスキャンして、各ウェルのＯＤ４０５を決定した。盲験の測定値を各反応から差し引いた。β−グルクロニダーゼによる４−ニトロフェノールの放出を反映する平均ＯＤ４０５を、反応時間に対してプロットし、１分当たりのＯＤ４０５の変化を示す勾配Ｓ（ＯＤ４０５／分）を得た。最後に、反応速度Ｒ（ＯＤ４０５／μｇタンパク質／分）を、反応勾配Ｓ及び反応に加えられたタンパク質の量に基づいて計算した。各タンパク質抽出物の反応勾配（Ｓ）及び反応速度（Ｒ）は、以下の表２に示されている。平均反応速度を使用して、Ｐｇａｐに対するプロモーター強度を示す相対活量を計算した。この結果は、ＰｇａｐＵプロモーターが、Ｐｇａｐプロモーターよりも約４．４倍高い強度を有することを実証した。
【００８７】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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