(57)【要約】気道感染症および他の医学的状態の処置のための、リポソームと相互作用してリポソームから薬物を放出する界面活性剤を含む即時放出および持続放出リポソーム生成物の製剤化法および組成物ならびにその送達、ならびに、それらに関連して用いられる装置および製剤を記載する。2016534155.tif 000013
2016534155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に活性な薬物を封入している化合物で構成されたリポソーム；
薬学的に活性な遊離薬物；
薬学的に許容される賦形剤；および
薬物封入を減少させて該リポソームからの薬物放出を調節するように該リポソームと相互作用する、界面活性剤
を含む組成物。
【請求項２】
ヒト肺への吸入のための製剤である粒子へとエアロゾル化されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記リポソームが単層であり、かつ、リン脂質およびコレステロールならびにポリソルベートを含む前記界面活性剤で構成されている、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記界面活性剤が、アルキルフェニルアルコキシレート、アルコールアルコキシレート、脂肪アミンアルコキシレート、ポリオキシエチレングリセロール脂肪酸エステル、ひまし油アルコキシレート、脂肪酸アルコキシレート、脂肪酸アミドアルコキシレート、脂肪酸ポリジエタノールアミド、ラノリンエトキシレート、脂肪酸ポリグリコールエステル、イソトリデシルアルコール、脂肪酸アミド、メチルセルロース、脂肪酸エステル、シリコーン油、アルキルポリグリコシド、グリセロール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールエーテルブロックコポリマー、ポリアクリレート、アクリル酸グラフトコポリマー、アルキルアリールスルホネート、フェニルスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルアリールエーテルスルフェート、アルキルポリグリコールエーテルホスフェート、ポリアリールフェニルエーテルホスフェート、アルキルスルホスクシネート、オレフィンスルホネート、パラフィンスルホネート、石油スルホネート、タウリド（tauride）、サルコシド（sarcoside）、脂肪酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リグノスルホン酸、スルホン化ナフタレンの縮合物、亜硫酸リグニン廃液、アルキルホスフェート、四級アンモニウム化合物、アミンオキシド、およびベタインからなる群より選択される化合物を含み；
前記組成物が、5.0μm〜12μmの範囲内の空気力学的直径を有する粒子へとエアロゾル化されており；かつ
界面活性剤対リポソームの重量比が1：20〜1：4である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記薬学的に活性な薬物が抗感染剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗感染剤がシプロフロキサシンである、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗感染剤が、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、βラクタム、βラクタムおよびβラクタマーゼの阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス（ciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、ならびにテルビナフィンからなる群より選択される、請求項5に記載の組成物。
【請求項８】
前記リポソームが、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、およびそれらの混合物からなる群より選択されるリン脂質で構成されており；
該リン脂質が、コレステロール、ステアリルアミン、ステアリン酸、トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群より選択される改変物質との混合物中に提供され；かつ
前記遊離薬物が、遊離薬物およびリポソーム封入薬物の合計の約5〜約50％を構成する、請求項3に記載の組成物。
【請求項９】
前記製剤が、1時間あたり2〜10％の封入薬物の放出速度を提供し、抗生物質のほぼ完全な放出が約1〜24時間後に起こり、かつ前記界面活性剤がポリソルベート20である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記界面活性剤が前記リポソームと相互作用して遊離薬物の1〜50％の増大をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、IVRアッセイ法により測定した場合の前記リポソームからの薬物放出速度の約5％〜50％の増大を引き起こす、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
緑膿菌（P. aeruginosa）感染症を処置または寛解するための、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記リポソームが単層であり、かつ界面活性剤対リポソームの体積比が約1：100〜1：2である、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
前記組成物が、0.5マイクロメートル〜12マイクロメートルの範囲内の空気力学的直径を有する粒子へとエアロゾル化されており、かつ、前記界面活性剤が、前記リポソームと相互作用して、該リポソームからの薬物の放出を引き起こし、それにより遊離薬物の量を1〜50％増大させる、請求項12または13に記載の使用。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、IVRアッセイ法により測定した場合の前記リポソームによる放出速度を20％〜200％増大させる様式で、該リポソームと相互作用し、かつ、該界面活性剤がポリソルベート20である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
リポソーム製剤への界面活性剤の添加を含む、薬学的組成物およびそれらの調製法を開示する。嚢胞性線維症（CF）、非CF気管支拡張症、重症COPD、および非結核性抗酸菌（NTM）疾患の処置のために即時放出および持続放出抗感染剤を組み合わせて吸入によって送達する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
気道感染症は様々な微生物によって引き起こされる。そのような感染症は、地域社会にとっては、処置の負担および費用の増大を含む無数の結果を有しており、かつ、患者にとっては、より侵襲性が高い処置パラダイムと重篤な病気または死亡の可能性とに関する無数の結果を有している。致死的な吸入微生物による意図的感染がヒトに対する攻撃において使用されており、重大な安全上の脅威であり続けていることは残念である。そのような脅威に対する有効な広域スペクトルの予防および処置は非常に価値があると考えられる。
【０００３】
重大な健康管理上の負担の一例として、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）により高率で肺コロニーが形成され、これらの感染症の根絶が難しいことが、肺機能の低下、増悪の数および/または頻度の増大、入院増加、ならびに、嚢胞性線維症（CF）、非CF気管支拡張症の患者、および重症慢性閉塞性肺疾患（COPD）を患っている患者の健康の全般的低下を引き起こしうる。非結核性抗酸菌（NTM）感染症を含む他の肺感染症も、罹患率および死亡率を高める可能性を有する。これらの問題により、患者の肺感染症をより有効に処置するための、安全かつ有効な吸入抗生物質についての研究が必要とされている。
【０００４】
CF感染症を処置するために、現在認可されている2つの吸入抗生物質がある：アミノグリコシドのトブラマイシン（TOBI）およびモノバクタムのアズトレオナムリジン（カイストン（Cayston））。カイストンは1日3回の吸入処置が認可されているが、TOBIは1日2回投与される。CF患者のために、現在認可されている吸入抗生物質よりも簡便（例えば、1日1回）、または有効な、さらなる吸入抗生物質の選択肢があれば、理想的であると考えられる。さらに、非CF気管支拡張症患者に対しては認可された吸入抗生物質はない。
【０００５】
シプロフロキサシンは、CFおよび非CF気管支拡張症患者でよく見られる、緑膿菌による下気道感染症の処置のために指示されるフルオロキノロン抗生物質である。シプロフロキサシンは広域スペクトルで、緑膿菌に加えていくつかの他の型のグラム陰性およびグラム陽性菌に対して有効である。したがって、アミノグリコシドであるトブラマイシン（TOBI）、またはアズトレオナムリジン（カイストン）に対する耐性を発生したCF患者でも、シプロフロキサシンで処置することができる可能性が高い。シプロフロキサシンと他のクラスの抗菌剤との間に交差耐性は知られていない。
【０００６】
その魅力的な抗菌特性にもかかわらず、経口および/またはIVシプロフロキサシンは、GI不耐性（嘔吐、下痢、腹部不快感）、ならびに眩暈、不眠、被刺激性、および不安のレベル上昇などのやっかいな副作用を生じうる。これらの衰弱させる副作用をきたすことなく、長期的に用いることができる改善された処置レジメンが明らかに必要とされている。シプロフロキサシンを吸入エアロゾルとして送達することは、感染の主要部位である気道における薬物の送達および作用を区分化することにより、これらの問題に対処する可能性を有している。
【０００７】
現在のところ、主要感染領域を標的として抗生物質を送達しうる、ヒトへの使用が規制により認可されたエアロゾル化型のシプロフロキサシンはない。これは部分的には、薬物が苦いために、吸入に適した製剤の開発が阻害されていることによる。さらに、肺における薬物の滞留時間が短すぎて、経口またはIV経路で投与した薬物を上回る追加の治療上の利点を提供することができない。したがって、治療特性および利便性が改善されたシプロフロキサシンのリポソーム製剤を開発するための努力がなされてきた（Yim et al, 2006；Serisier et al, 2013；Bruinenberg et al., 2011；Cipolla et al., 2011, 2013a, 2013b；Cipolla and Chan, 2013）。
【０００８】
薬剤の放出特性、または特定の器官もしくは細胞への標的指向送達を調節する能力が評価されてきた、リポソームを含む様々な製剤化技術がある（Drummond et al. 2000）。薬物送達系としてのリン脂質ビヒクルが1965年に「リポソーム」として再発見された（Bangham et al., 1965）。多くの活性薬物成分（API）の治療特性を、リポソーム薬物送達系に組み込むことによって改善することができる。一般用語であるリポソームは多様な構造を包含するが、一般にはすべてはその中に薬物を封入することができる水性間隙を囲い込んでいる1つまたは複数の脂質二重層で構成されている。
【０００９】
リポソーム封入は、薬物の薬物動態および生体内分布の変化、担体からの持続的薬物放出、患部への送達増強、ならびに活性薬物種の分解からの保護を含むいくつかのメカニズムを通して生物薬剤学的特徴を改善する。小分子、ペプチド、および核酸を含む多様な薬物がリポソームに製剤化されており；親水性薬物は一般に水性区画に溶解される一方、疎水性薬物は脂質二重層に結合する（Drummond et al. 2000、Cipola et al. 2013b）。抗癌剤ドキソルビシン（Myocet(登録商標)/Evacet(登録商標)、Doxyl(登録商標)/Caelyx(登録商標)）、ダウノルビシン（DaunoXome(登録商標)）、および硫酸ビンクリスチン（Marquibo(登録商標)）、抗真菌剤アムホテリシンB（Abelcet(登録商標)、AmBisome(登録商標)、Amphotec(登録商標)）、およびベンゾポルフィリン（Visudyne(登録商標)）のリポソーム製剤は、過去20年間に米国、欧州、および日本の市場への導入に成功した製品の例である。脂質系担体の安全性および有効性が証明されたことで、これらは薬剤の製剤化のための魅力的な候補となっている。
【００１０】
リポソームの物理化学的性質、特にそれらの薬物放出特性を、下記を含む様々な戦略によって製剤へと操作することができる：リポソーム組成（例えば、ホスファチジルコリン（PC）のアシル鎖長の増大がリポソームビンクリスチンの放出速度を低下させた（Boman et al. 1993））、ステロールの存在および濃度（例えば、多くのリポソーム製剤では30％コレステロールの添加が膜透過性を低下させ、薬物放出速度の低下を引き起こす）、ポリエチレングリコール（PEG）による表面修飾（例えば、PEGを含むドキソルビシンリポソームが、卵PC/コレステロールリポソームよりも長い循環半減期および遅い放出を有した（Abraham et al. 2005））、リポソームのサイズおよび層状態（例えば、単層リポソームが典型的には、多層状小胞よりもそれらの内容物を速い速度で放出する）、薬物対脂質の比（例えば、高い薬物対脂質の比がリポソームビンクリスチンの放出速度を低下させ、その有効性を高めることも判明した（Johnston et al. 2006））、小胞内部の薬物の状態（例えば、沈積したドキソルビシンを含むリポソームが、溶液中のドキソルビシンを含むものよりも遅い放出を有した（Lasic et al. 1995））、薬物負荷法の選択（例えば、膜内外のpH勾配が大きいと、リポソームドキソルビシンの放出速度が低下した（Mayer et al. 1990））、ならびにモル浸透圧濃度、pH、および緩衝液と賦形剤との選択を含む他の因子。本発明者らは、リポソームシプロフロキサシン製剤の封入状態および放出特性は界面活性剤の添加により改変されうるかを調べることに興味を持った。
【００１１】
いくつかの米国特許は吸入のためのリポソーム製剤を記載している：US 8,414,915；US 8,268,347；US 8,119,156；およびUS 8,071,127。これらの特許はリポソームシプロフロキサシンおよびリポソームシプロフロキサシンと遊離シプロフロキサシンとの混合物の製剤を記載している。これらのリポソーム製剤は、薬物の封入が主に不変であるように、噴霧工程に左右されないよう設計された。現行の経口またはIVシプロフロキサシン製剤に比べて、リポソームシプロフロキサシンエアロゾル製剤は次のいくつかの利点を提示する：（1）肺における高い薬物濃度、（2）注射部位における持続放出による薬物滞留時間延長、（3）副作用減少、（4）嗜好性増大、（5）細菌への良好な浸透性、および（6）細菌に感染した細胞への良好な浸透性。以前、リポソーム封入フルオロキノロン抗生物質の吸入は肺感染症の処置において有効でありうることが示され、野兎病菌（F. tularensis）のマウスモデルにおいて、リポソーム封入フルオロキノロン抗生物質は生存率を高めることにより、遊離または非封入フルオロキノロンよりもすぐれていることが示された（CA2,215,716、CA2,174,803、およびCA2,101,241）。
【００１２】
米国特許の別の群は、肺感染症の処置のためのリポソームアミノグリコシドの吸入製剤を記載している：US 8,226,975、US 7,879,351、およびUS 7,718,189。
【００１３】
しかし、性質および放出特性が改善された新規リポソーム製剤を開発する機会は残っており、それらのうち1つが、単純かつ柔軟な様式でそれらの性質を改変する能力である。本発明者らは、界面活性剤の添加によってこれらの新規リポソーム製剤を開発するために用いた戦略を記載する。既存のリポソーム製剤への界面活性剤の添加は、適切に設計および実行された場合、遊離薬物の量および放出プロファイルを生成物に合わせることを可能にしうる。
【００１４】
生体膜を可溶化して膜構造および機能の解明を可能にするために用いられている洗浄剤の長い歴史がある（Helenius and Simons 1975）。特に、リン脂質を可溶化する界面活性剤の能力が概説された（Lichtenberg et al. 1983）。典型的には、界面活性剤をリン脂質に添加すると、界面活性剤は最初溶液とリン脂質二重層の間を分断し、二重層の透過性は構造の損失なしに増大しうる（Lichtenberg et al. 1983）。いったんリン脂質二重層が界面活性剤で飽和状態になると、さらなる界面活性剤の添加は、残りの界面活性剤飽和二重層のすべてが混合ミセルに変換されるまで、界面活性剤とリン脂質との混合ミセルを形成することになる。界面活性剤の任意のさらなる添加は、リン脂質含有量がより希薄になるため、ミセルのサイズの低下につながる。小胞-界面活性剤系はしばしば、それらの光散乱特性をモニターすることによって特徴決定されており、最大の濁度は一般には界面活性剤飽和二重層の状態に関連し（Velluto, Gasbarri et al. 2011）、続いて、いったん二重層が界面活性剤によって完全に可溶化されると、濁度が速やかに低下する（Paternostre et al. 1988、Ribosa et al. 1992、Lasch 1995、Cho et al. 1999、Deo and Somasundaran 2003）。
【００１５】
リポソームは生体膜の単純化モデルとして用いられてきた。細菌膜の破損によって機能する抗菌剤の開発における興味は、界面活性剤様分子とリポソームとの相互作用のより十分な理解に拍車をかけた（Nagawa and Regen 1992、Liu and Regen 1993）。加えて、リポソームは薬物送達ビヒクルとして研究されており、したがって封入薬物の放出のタイミングおよび速度に影響をおよぼす因子の知識は最も重要である。インビボ投与の後、リポソームは生理液中に存在する多くの天然両親媒性物質と接触する。界面活性剤は複雑な生態環境に対する単純化として使用することができ、界面活性剤存在下でのリポソームからの薬物放出の特徴決定を可能にする（Ruiz et al. 1988）。
【００１６】
添加した界面活性剤に反応してのリポソーム封入カルボキシフルオレセイン（CF）の2つの放出メカニズムが特定された（Nagawa and Regen 1992）。リポソームと界面活性剤とのいくつかの組み合わせの場合は、界面活性剤濃度の増大に伴い、すべての小胞から封入物質が徐々に放出された。他の組み合わせの場合は、小胞のサブセットがそれらの全封入ペイロードを急速に放出する破局的破裂が起こるものもあれば、影響を受けないものもあった。これらの知見は、そのモノマー型のトリトンX-100（そのCMC未満）は試験したすべてのリポソームからのCFの漏出を誘導したが、トリトンX-100がそのミセル型（そのCMCよりも上）の場合、ゲル相小胞（Tm未満）および高密度液相小胞（すなわち、かなりのコレステロールを含むもの）のみを破裂させることができたが、液相リポソームは破裂させなかった（Liu and Regen 1993）ことを示すことにより、拡大された。封入物質の性質はその放出挙動にも影響をおよぼしうる。小さい分子のグルコースに対し、大きい分子のデキストランの等しいパーセンテージを放出するには、より多くの界面活性剤が必要であった（Ruiz et al. 1988）。最後に、CFの放出の動態が、溶解濃度以下のトリトンX-100を用いて、卵またはダイズPCで構成された超音波処理リポソームと押し出しリポソームの両方について調べられた（Memoli et al. 1999）。いずれの場合にも、CFの放出はほとんど即時で、数分以内に安定した値に達し、低レベルの界面活性剤とリポソームとの結合後に一時的な細孔が形成されたが、これらの細孔は次いで閉鎖されてCFのさらなる放出を制限することが示唆された（Memoli et al. 1999）。これに対して、可溶化レベルの界面活性剤を添加すると、封入薬物の完全な放出を伴う、0.2秒以内のリポソーム構造の完全な崩壊があった（Velluto et al. 2011）。界面活性剤とリポソームとの相互作用は機械論的基本原理に基づいてより詳細に探究されているが、治療的目的のためにリポソームの封入状態および放出特性を改変するための、界面活性剤のこの性質の利用にはほとんど興味が持たれなかった。
【００１７】
本発明者らは、リポソーム製剤の放出特性を改変するための界面活性剤を含む、シプロフロキサシンの新規リポソーム製剤の開発を記載する。リポソームシプロフロキサシンは、嚢胞性線維症（CF）および非CF気管支拡張症などの適応症において呼吸器感染症を処置するための1日1回吸入抗生物質として開発中であり(Bruinenberg et al., 2011、Cipolla et al., 2011、Cipolla and Chan, 2013、Cipolla et al., 2013b、Serisier et al., 2013、Yim et al., 2006）；野兎病（Conley et al. 1997）およびペスト（Hamblin et al. 2013）を含む可能性がある様々な生物テロ感染症に対しても有効であると考えられる。これに対して、現在認可されている嚢胞性線維症に対する吸入抗生物質は、リポソームに封入されておらず、1日2回または3回投与しなければならない（Cipolla and Chan, 2013）。これらの抗生物質は嚢胞性線維症以外での認可のために十分な有効性および安全性を示すことができなかった（Cipolla and Chan, 2013）。臨床で2つのリポソームシプロフロキサシン製剤が試験中であり：すべてのシプロフロキサシンがリポソーム中に封入されているLipoquin(商標)ならびに遊離非封入シプロフロキサシンとリポソーム封入シプロフロキサシンの両方の混合物を含む、Pulmaquin(商標)なる名称の組み合わせ製剤である。本発明者らは、LipoquinまたはPulmaquinに比べて改変された放出特性を有しうる、様々な割り当ての遊離シプロフロキサシンと封入シプロフロキサシン両方の混合物を作製するための界面活性剤の添加を特に介してLipoquin製剤を改変することに、進歩性を適用できるかどうかを判定したいと動機づけられた。加えて、本発明者らは、そのような製剤が長期間の冷蔵保存後、ならびに吸入エアロゾルを生成するための噴霧後にそれらの物理的性質を保持するよう設計しうるかどうかを調査した。本発明者らはまた、リポソームシプロフロキサシン製剤への界面活性剤の添加からの知識を、一般にはリポソーム系に、および、肺感染症または吸入経路による投与に限らず多様な適応症を処置するために、広く応用しうると考えている。
【発明の概要】
【００１８】
ヒト患者へのエアロゾル化送達のために設計された製剤でありうる組成物を開示する。製剤は、薬物を封入しているリポソームを含む組成物であってもよい。この薬物は、製剤内で遊離薬物として存在し、遊離薬物およびリポソームは薬学的に許容される賦形剤担体内に保持されてもよい。薬物は薬理学的効果を有するが、担体は活性ではない。製剤には、薬物のリポソームからの放出に影響をおよぼし、それにより患者の肺に投与すると製剤の薬物放出プロファイルに影響をおよぼす様式で、リポソームと相互作用する界面活性剤が含まれる。
【００１９】
異なる化合物をリポソームの構築のために用いることができ、異なる界面活性剤を用いることができる。有用な界面活性剤は、比較的少量で、例えば0.01重量％〜5重量％または0.05重量％〜1重量％の範囲内で存在するポリソルベート20である。トゥイーン20などの界面活性剤の包含は、重量パーセンテージ（重量/重量）または体積パーセンテージ（v/v）のいずれかでありうる。しかし、界面活性剤の密度は約1g/mlであるため、異なる学術用語を用いることもできる。
【００２０】
異なる薬物を製剤内に含めることができる。有用な薬物の例は、遊離シプロフロキサシン（FCI）としての遊離型でならびにリポソームシプロフロキサシン（CFI）と呼ばれる封入型で存在するシプロフロキサシンである。遊離シプロフロキサシンは患者に初期治療量を提供するのに十分な量で存在し、シプロフロキサシンの残りはリポソーム内に封入されていてもよい。封入薬物は経時的にゆっくり放出されて、好ましい治療レベルよりも低下することなく、または有害効果をきたすレベルよりも上昇することなく、患者において薬物の治療レベルを維持する。肺送達のための製剤のために、封入シプロフロキサシン（CFI）は、4.5〜5.5の範囲内のpHを有する製剤中、0.1〜1.0重量％のポリソルベート20と組み合わせて10〜20mg/mlの濃度で存在してもよい。
【００２１】
界面活性剤の量対リポソームの量の比にはいくらかの重要性があり、この比は、界面活性剤およびリポソームの質量に基づく界面活性剤対リポソーム 1：1000〜1：1、または1：100〜1：2、または1：20〜1：4の範囲内であってもよい。
【００２２】
製剤中のシプロフロキサシンまたは薬物の合計量に基づいて、遊離シプロフロキサシンは5％〜50％の範囲内の量で存在してもよく、封入シプロフロキサシンは50％〜95％の量で存在してもよい。比は30％遊離シプロフロキサシン±20％〜70％封入シプロフロキサシン±20％などの約30％遊離薬物±20％〜70％封入薬物±20％の範囲内であってもよい。
【００２３】
特定のリポソーム組成物の例は実施例において提供する。製剤がエアロゾル化された場合にリポソームがそれらの構造的完全性を維持するようにリポソームは構築され、結果は、エアロゾル化された場合にリポソームの90％もしくはそれ以上が構造的完全性を維持すること、または、リポソームの95％もしくはそれ以上またはリポソームの98％もしくはそれ以上がエアロゾル化後にそれらの構造的完全性を維持することを示している。
【００２４】
本発明の有用な製剤は、肺へのエアロゾル化送達のために有用な薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、これは、製剤中の全シプロフロキサシンの合計量に基づいて、その中に遊離シプロフロキサシンを30％の量で、およびリポソーム封入シプロフロキサシンを70％の量で有し、製剤はポリソルベート20をさらに含み、4.5〜5.5の範囲内のpHを有する。
【００２５】
ヒト患者の肺にエアロゾルを介して送達されるか、または様々な代替投与経路により送達される、界面活性剤およびリポソームを含む製剤を送達する。封入薬物を含むリポソーム製剤は、所与のパーセンテージの封入薬物の一時的放出を引き起こすように界面活性剤の添加により改変され、この所与のパーセンテージの封入薬物は即時放出成分に寄与するが、残りのリポソーム封入薬物は持続放出成分を提供する。界面活性剤の組成、その濃度、リポソーム製剤のモル浸透圧濃度または張性、ならびにpHを変動させることにより、封入薬物および遊離薬物の量を製剤へと設計することができる。加えて、界面活性剤とリポソームとの結合は、残りの封入薬物の放出プロファイルを調節する。薬物の選択は抗感染剤に限定されず、任意のクラスの治療物質に特定的でもない。
【００２６】
本発明者らは、界面活性剤と結合したリポソーム製剤の新規調製法も記載する。典型的には、コレステロール、脂質、およびリポソームの組成物中で用いられる他の成分をすべて、リポソーム製造工程中に添加する。しかし、本発明者らは本明細書で、界面活性剤をリポソーム生成物の製造後に添加するための、本発明の別の局面を記載する。したがって、界面活性剤の選択およびその濃度は、リポソームに添加して薬物封入の状態を変えるようにまたは活性物質の放出プロファイルを調節するように、後日選択することができる。界面活性剤は、リポソーム製造の直後、あるいは数年後、使用の直前、または対象もしくは患者を処置するためにリポソーム生成物が使用される数ヶ月もしくは数年前に添加することができる。本発明の利点は、リポソームの製造が複雑である場合が多いことである。したがって、危険かつ高価でありうる新規製造工程によって界面活性剤を含む新規リポソームを開発する代わりに、界面活性剤を、すでに開発されたリポソーム製剤にその性質を調節するための改変物質として添加することがはるかに好ましい。
【００２７】
本発明の別の局面は、リポソームを溶解しない濃度であるが、リポソームがそれらの小胞サイズ、形状、および層状態を保持するが薬物封入および/または薬物放出速度プロファイルが変化するという結果になる濃度で、界面活性剤を添加することである。
【００２８】
リポソームは、単層または多層状であってもよく、かつ、ヒアルロン酸などの分子を含む細胞接着性であってもよい。遊離抗感染剤およびリポソーム封入抗感染剤に加えて、少なくとも1つの治療物質も組成物中に含まれうる。その治療物質は、ヒト肺への直接吸入のために有用な薬学的に許容される担体と共に存在する遊離薬物または封入薬物であってもよい。他の薬物には、DNアーゼもしくは他の粘液溶解剤などの粘液の粘弾性を低下させるための酵素、塩素イオンチャネルを上方制御するためもしくは細胞を横切るイオンの流量を高めるための化学物質、P2Y2アゴニスト、α-1抗トリプシン（AAT）を含むエラスターゼ阻害物質、気管支拡張剤、ステロイド、N-アセチルシステイン、インターフェロンγ、インターフェロンα、サリチル酸ナトリウムなどのバイオフィルム細菌に対する抗生物質の活性を増強する作用物質（Polonio RE et al., 2001）、または当業者には公知の抗生物質が含まれうる。
【００２９】
本発明のさらなる局面は、患者の嚢胞性線維症、非CF気管支拡張症、またはNTMなどの疾患に関連する肺感染症を処置するための方法であって、シプロフロキサシンなどの抗感染剤を含む界面活性剤改変リポソームの製剤を患者に投与する段階を含む、方法である。製剤は、好ましくは、吸入によって患者に投与する。
【００３０】
本発明の別の局面に従い、遊離抗感染剤と封入抗感染剤の両方を含む製剤は、望ましくない細菌を根絶するためにまたは該細菌のレベルを低減するために障壁を克服するための、肺における抗感染剤の高い初期治療レベルを提供する。即時放出抗感染剤、例えば、シプロフロキサシンに関する目的は、したがって、肺における抗生物質の濃度を治療レベルまで迅速に高めることである。持続放出抗感染剤、例えば、シプロフロキサシンは、肺における抗生物質の治療レベルを維持するのに役立ち、それにより長い時間枠で継続的な治療を提供し、有効性を高め、投与の頻度を減らし、かつ耐性コロニー形成の可能性を抑える。抗感染剤の持続放出は、抗感染剤が、阻害濃度未満に決して下がらず、したがって抗感染剤への耐性を生じる確率を低下させることを確実にしうる。
【００３１】
本発明の局面は、
封入薬物を含むリポソーム；
遊離薬物；
薬学的に許容される賦形剤；および
薬物封入を減少させてリポソームからの薬物放出を調節するようにリポソームと相互作用する、界面活性剤
を含む組成物である。
【００３２】
本発明の別の局面において、組成物は製剤である粒子へとエアロゾル化されている。
【００３３】
本発明の別の局面において、リポソームは単層である。
【００３４】
本発明の別の局面において、界面活性剤は、アルキルフェニルアルコキシレート、アルコールアルコキシレート、脂肪アミンアルコキシレート、ポリオキシエチレングリセロール脂肪酸エステル、ひまし油アルコキシレート、脂肪酸アルコキシレート、脂肪酸アミドアルコキシレート、脂肪酸ポリジエタノールアミド、ラノリンエトキシレート、脂肪酸ポリグリコールエステル、イソトリデシルアルコール、脂肪酸アミド、メチルセルロース、脂肪酸エステル、シリコーン油、アルキルポリグリコシド、グリセロール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールエーテルブロックコポリマー、ポリアクリレート、アクリル酸グラフトコポリマー、アルキルアリールスルホネート、フェニルスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルアリールエーテルスルフェート、アルキルポリグリコールエーテルホスフェート、ポリアリールフェニルエーテルホスフェート、アルキルスルホスクシネート、オレフィンスルホネート、パラフィンスルホネート、石油スルホネート、タウリド（tauride）、サルコシド（sarcoside）、脂肪酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リグノスルホン酸、スルホン化ナフタレンの縮合物、亜硫酸リグニン廃液、アルキルホスフェート、四級アンモニウム化合物、アミンオキシド、およびベタインからなる群より選択され；
組成物は粒子型の吸入エアロゾルである。
【００３５】
本発明の別の局面において、界面活性剤対リポソームの比は約1：1000〜1：1である。
【００３６】
本発明の別の局面において、界面活性剤対リポソームの比は約1：100〜1：2である。
【００３７】
本発明の別の局面において、界面活性剤対リポソームの比は約1：20〜1：4である。
【００３８】
本発明の別の局面において、界面活性剤の濃度は、製剤の全体積に基づく0.01〜2体積％である。
【００３９】
本発明の別の局面において、界面活性剤の濃度は、製剤の全体積に基づく約0.1〜1体積％である。
【００４０】
本発明の別の局面において、エアロゾルの粒子は約0.5マイクロメートル〜約12マイクロメートルの範囲内の空気力学的直径を有する。
【００４１】
本発明の別の局面において、エアロゾルの粒子は約1マイクロメートル〜約6マイクロメートルの範囲内の空気力学的直径を有する。
【００４２】
本発明の別の局面において、エアロゾルの粒子は約2マイクロメートル〜約4マイクロメートルの範囲内の空気力学的直径を有する。
【００４３】
本発明の別の局面において、封入薬物は抗感染剤である。
【００４４】
本発明の別の局面において、抗感染剤はシプロフロキサシンである。
【００４５】
本発明の別の局面において、抗感染剤は、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、βラクタム、βラクタムおよびβラクタマーゼの阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス（ciclopirax）、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、およびテルビナフィンからなる群より選択される。
【００４６】
本発明の別の局面において、リポソームは約10nm〜約10μmの範囲内の直径を有する。
【００４７】
本発明の別の局面において、リポソームは約20nm〜約1μmの範囲内の直径を有する。
【００４８】
本発明の別の局面において、リポソームは直径約100nm±20％である。
【００４９】
本発明の別の局面において、リポソームは、脂肪酸；リゾ脂質；スフィンゴ脂質；ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；スフィンゴミエリン；糖脂質；グルコリピド；スフィンゴ糖脂質；ホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；スルホン化単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖を有する脂質；エーテルおよびエステル連結脂肪酸による脂質、重合脂質、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、カルジオリピン、長さが炭素6〜8個の短鎖脂肪酸によるリン脂質、不斉アシル鎖を有する合成リン脂質；ならびに共有結合ポリマーを有する脂質からなる群より選択される脂質をさらに含む。
【００５０】
本発明の別の局面において、リポソーム封入抗感染剤はリン脂質を用いて調製される。
【００５１】
本発明の別の局面において、リン脂質は、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００５２】
本発明の別の局面において、リン脂質は、コレステロール、ステアリルアミン、ステアリン酸、トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群より選択される改変物質との混合物中に提供される。
【００５３】
本発明の別の局面において、遊離薬物は遊離薬物およびリポソーム封入薬物の合計の約1〜約75％を構成する。
【００５４】
本発明の別の局面において、遊離薬物は遊離薬物およびリポソーム封入薬物の合計の約5〜約50％を構成する。
【００５５】
本発明の別の局面において、製剤は約1時間〜約1週間の期間の封入薬物の90％のインビボ放出を提供する。
【００５６】
本発明の別の局面において、製剤は約8〜24時間の期間の封入薬物の90％のインビボ放出を提供する。
【００５７】
本発明の別の局面において、製剤は1時間あたり0.1〜100％の封入薬物の放出速度を提供する。
【００５８】
本発明の別の局面において、製剤は1時間あたり0.5〜20％の封入薬物の放出速度を提供する。
【００５９】
本発明の別の局面において、製剤は1時間あたり2〜10％の封入薬物の放出速度を提供し、抗生物質のほぼ完全な放出は約1〜24時間後に起こる。
【００６０】
本発明の別の局面において、界面活性剤はリポソームを含む製剤に添加され、かつ界面活性剤は、リポソームと相互作用して、それにより製剤中の非封入遊離薬物のパーセンテージを約1〜50％、または2〜25％もしくは5〜20％増大させる。
【００６１】
本発明の別の局面において、界面活性剤は、IVRアッセイ法により測定した場合の約1％〜200％の薬物放出速度の増大を引き起こす。
【００６２】
本発明の別の局面において、界面活性剤は、IVRアッセイ法により測定した場合の約5％〜50％の薬物放出速度の増大を引き起こす。
【００６３】
本発明の別の局面は、前述の組成物を用いて緑膿菌感染症を処置または寛解する方法を提供する。
【００６４】
封入薬物が抗感染剤である、方法の別の局面が提供される。
【００６５】
抗感染剤がシプロフロキサシンである、方法の別の局面が提供される。
【００６６】
組成物をエアロゾル化送達のために製剤化する、方法の別の局面が提供される。
【００６７】
リポソームが単層である、方法の別の局面が提供される。
【００６８】
界面活性剤が、アルキルフェニルアルコキシレート、アルコールアルコキシレート、脂肪アミンアルコキシレート、ポリオキシエチレングリセロール脂肪酸エステル、ひまし油アルコキシレート、脂肪酸アルコキシレート、脂肪酸アミドアルコキシレート、脂肪酸ポリジエタノールアミド、ラノリンエトキシレート、脂肪酸ポリグリコールエステル、イソトリデシルアルコール、脂肪酸アミド、メチルセルロース、脂肪酸エステル、シリコーン油、アルキルポリグリコシド、グリセロール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールエーテルブロックコポリマー、ポリアクリレート、アクリル酸グラフトコポリマー、アルキルアリールスルホネート、フェニルスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルアリールエーテルスルフェート、アルキルポリグリコールエーテルホスフェート、ポリアリールフェニルエーテルホスフェート、アルキルスルホスクシネート、オレフィンスルホネート、パラフィンスルホネート、石油スルホネート、タウリド、サルコシド、脂肪酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リグノスルホン酸、スルホン化ナフタレンの縮合物、亜硫酸リグニン廃液、アルキルホスフェート、四級アンモニウム化合物、アミンオキシド、およびベタインからなる群より選択される、方法の別の局面が提供される。粒子型の吸入エアロゾルである、請求項1に記載の組成物。
【００６９】
界面活性剤対リポソームの比が約1：1000〜1：1である、方法の別の局面が提供される。
【００７０】
界面活性剤対リポソームの比が約1：100〜1：2である、方法の別の局面が提供される。
【００７１】
界面活性剤対リポソームの比が約1：20〜1：4である、方法の別の局面が提供される。
【００７２】
界面活性剤の濃度が0.01〜2％である、方法の別の局面が提供される。
【００７３】
界面活性剤の濃度が約0.1〜1％である、方法の別の局面が提供される。
【００７４】
エアロゾルの粒子が約0.5マイクロメートル〜約12マイクロメートルの範囲内の直径を有する、方法の別の局面が提供される。
【００７５】
エアロゾルの粒子が約1マイクロメートル〜約6マイクロメートルの範囲内の直径を有する、方法の別の局面が提供される。
【００７６】
エアロゾルの粒子が約2マイクロメートル〜約4マイクロメートルの範囲内の直径を有する、方法の別の局面が提供される。
【００７７】
抗感染剤が、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、βラクタム、βラクタムおよびβラクタマーゼの阻害物質、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィンからなる群より選択される1つまたは複数である、方法の別の局面が提供される。
【００７８】
リポソームが、約10nm〜約10μmの範囲内の直径を有する、方法の別の局面が提供される。
【００７９】
リポソームが、約20nm〜約1μmの範囲内の直径を有する、方法の別の局面が提供される。
【００８０】
リポソームが直径約100nm±20％である、方法の別の局面が提供される。
【００８１】
前記リポソームが、脂肪酸；リゾ脂質；スフィンゴ脂質；ホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；スフィンゴミエリン；糖脂質；グルコリピド；スフィンゴ糖脂質；ホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；スルホン化単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖を有する脂質；エーテルおよびエステル連結脂肪酸による脂質、重合脂質、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、カルジオリピン、長さが炭素6〜8個の短鎖脂肪酸によるリン脂質、不斉アシル鎖を有する合成リン脂質；ならびに共有結合ポリマーを有する脂質からなる群より選択される脂質をさらに含む、方法の別の局面が提供される。
【００８２】
リポソーム封入抗感染剤をリン脂質を用いて調製する、方法の別の局面が提供される。
【００８３】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、方法の別の局面が提供される。
【００８４】
前記リン脂質が、コレステロール、ステアリルアミン、ステアリン酸、トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群より選択される改変物質との混合物中に提供される、方法の別の局面が提供される。
【００８５】
遊離薬物が、遊離薬物およびリポソーム封入薬物の合計の約1〜約75％を構成する、方法の別の局面が提供される。
【００８６】
遊離薬物が、遊離薬物およびリポソーム封入薬物の合計の約5〜約50％を構成する、方法の別の局面が提供される。
【００８７】
封入薬物の90％のインビボ放出が約1時間〜約1週間である、方法の別の局面が提供される。
【００８８】
封入薬物の90％のインビボ放出が約8〜24時間である、方法の別の局面が提供される。
【００８９】
封入薬物の放出速度が1時間あたり0.1〜100％である、方法の別の局面が提供される。
【００９０】
封入薬物の放出速度が1時間あたり0.5〜20％である、方法の別の局面が提供される。
【００９１】
封入薬物の放出速度が1時間あたり2〜10％であり、抗生物質のほぼ完全な放出が約1〜24時間後に起こる、方法の別の局面が提供される。
【００９２】
界面活性剤が、約1〜50％の封入状態の変化を引き起こす、方法の別の局面が提供される。
【００９３】
界面活性剤が、IVRアッセイ法により測定した場合の約1％〜200％の薬物放出速度の増大を引き起こす、方法の別の局面が提供される。
【００９４】
界面活性剤が、IVRアッセイ法により測定した場合の約5％〜50％の薬物放出速度の増大を引き起こす、方法の別の局面が提供される。
【００９５】
薬物が、酵素、DNアーゼ、粘液溶解剤、塩素イオンチャネルを上方制御する化学物質もしくは細胞の上皮表面を横切るイオンの流量を高める化学物質、気管支拡張剤、ステロイド、P2Y2アゴニスト、α-1抗トリプシン（AAT）などのエラスターゼ阻害物質、N-アセチルシステイン、サリチル酸ナトリウムなどのバイオフィルム細菌に対する抗感染剤の活性を増強する作用物質、γインターフェロン、αインターフェロン、フルオロキノロン、または抗生物質からなる群より選択される、方法の別の局面が提供される。
【００９６】
薬物が、アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、イルロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ロソクサシン、ルフロキサシン、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、およびトスフロキサシンからなる群より選択されるフルオロキノロン、または、トブラマイシン、コリスチン、アジスロマイシン、アミカシン、セファクロル（Ceclor）、アズトレオナム、アモキシシリン、セフタジジム、セファレキシン（Keflex）、ゲンタマイシン、バンコマイシン、イミペネム、ドリペネム、ピペラシリン、ミノサイクリン、もしくはエリスロマイシンの群より選択される抗生物質である、方法の別の局面が提供される。
【００９７】
本発明の別の局面は、製剤の薬物放出速度を調節する方法であって、
リポソームが薬物およびホスファチジルコリンで構成されている、薬学的に許容される担体およびリポソームで構成された製剤を提供する段階；
ポリソルベート20を製剤に0.1〜1体積％の量で添加し、それによりリポソームの薬物放出プロファイルを調節する段階
を含む、方法を提供する。
【００９８】
本発明の別の局面は、
製剤を患者に投与する段階；および
添加するポリソルベート20の量を患者の特徴に基づいて調節する段階
をさらに含む。
【００９９】
製剤が吸入によって投与され、かつ患者の特徴が肺機能である、本発明の別の局面が提供される。
【０１００】
患者の特徴が、体質量、除脂肪体重、身長、年齢、性別、腎クリアランス評価、肝機能評価、および患者の血中で定量した薬物濃度からなる群より選択される、本発明の別の局面が提供される。
【０１０１】
患者の特徴が、観察される副作用、処置中の患者感染の型、および薬物の公知の最小阻害濃度からなる群より選択される、本発明の別の局面が提供される。
【０１０２】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、当業者であれば以下により完全に記載する製剤および方法の詳細を読めば明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】シプロフロキサシン封入の状態に対する、様々な界面活性剤の添加の効果を示すグラフである。0.01、0.05、0.1、0.5、または1.0％の最終界面活性剤濃度を達成するために、水、次いで1％界面活性剤または10％界面活性剤のいずれかのアリコートで50mg/mlシプロフロキサシンのCFIを最終濃度約12.5mg/mlまで希釈した。調査した界面活性剤には、プルロニックL44、プルロニックL62、SPAN 20、SPAN 80、ポリソルベート20、およびポリソルベート80が含まれた。各試料をボルテックス処理し、少なくとも30分間平衡化させた後、シプロフロキサシン封入状態を二つ組で遠心ろ過により判定した。0.5％または1％SPAN 20では溶液の混和性が低いため、これらの濃度を用いたデータ点はない。
【図２Ａ】CFIの封入の状態に対する、ポリソルベート20の添加の効果を示すグラフである。最終界面活性剤濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、または2.0％を達成するために、塩化ナトリウム中の等張ヒスチジン緩衝液、次いで、1％ポリソルベート20または10％ポリソルベート20のいずれかのアリコートで、50mg/mlシプロフロキサシンのCFIを最終濃度30、20、15、12.5、および10mg/mlまで希釈した。黒色点線は界面活性剤対リポソームの一定の比を示す。
【図２Ｂ】CFIの封入の状態に対する、ポリソルベート20の添加の効果を示すグラフである。最終界面活性剤濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、または2.0％を達成するために、水、次いで1％ポリソルベート20または10％ポリソルベート20のいずれかのアリコートで、50mg/mlシプロフロキサシンのCFIを最終濃度30、20、15、12.5、および10mg/mlまで希釈した。黒色点線は界面活性剤対リポソームの一定の比を示す。
【図２Ｃ】図2Bと同様のグラフであり、最終濃度0.03、0.07、0.13、0.27、0.4、0.53、および0.67％ポリソルベート20を達成するために水で30mg/mlのCFIおよび0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、または2.0％ポリソルベート20を最終濃度10mg/mLまで希釈した。別の実験では、最終界面活性剤濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、または2.0％を達成するために、水および1％または10％ポリソルベート20で50mg/mlシプロフロキサシンのCFIを最終濃度12.5mg/mlまで希釈した。ある実験では、水をCFIにポリソルベート20の前に添加し、他の実験では、ポリソルベート20をCFIに水の前に添加した。
【図３】7つの顕微鏡写真画像を含み、画像3A、3B、3C、3D、3E、3F、および3Gはリポソームシプロフロキサシンの様々な調製物のクライオTEM顕微鏡写真である。各顕微鏡写真の左下隅のスケールバーは3A、3D、3E、3F、および3Gでは100nm、3Bおよび3Cでは200nmである。すべての試料は約10mg/mLリポソームの濃度で適用した。（A）12.5mg/ml CFI；（B）0.05％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI；（C）0.2％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI；（D）0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI；（E）空のリポソーム；（F）空のリポソームとCFIの1：1混合物；（G）メッシュ噴霧後の0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI。
【図４】6つのグラフ4A、4B、4C、4D、4E、および4Fを含み、これらはIVRアッセイ法におけるリポソーム組成の効果の評価を示す。50％ウシ血清および10mM HEPES緩衝食塩水、pH7.4中、37℃で4時間インキュベートした後の25μg/mLシプロフロキサシンの放出を報告している。（A）対照CFI（白菱形）、DRCFI（白丸）、0.05％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI（×印）、0.1％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI（白三角）、0.2％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI（星形）、および0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI（陰付き四角）のIVRプロファイル。（B）対照CFI（白菱形）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH5.5（×印）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH5.2（白三角）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.9（星形）、および0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.7（陰付き四角）の初期時点のIVRプロファイル。（C）対照CFI（白菱形）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH5.2（白三角）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.9（星形）、および0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.7（陰付き四角）の6ヶ月の時点のIVRプロファイル。（D）対照CFI（白菱形）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH5.2（白三角）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.9（星形）、および0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.7（陰付き四角）の12ヶ月の時点のIVRプロファイル。（E）それぞれ噴霧器残留溶液および収集エアロゾルの噴霧後6ヶ月の時点のIVRプロファイル：0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH5.2（白菱形および×印）、0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.9（白三角および星形）、および0.4％ポリソルベート20中12.5mg/ml CFI、pH4.7（陰付き四角および白三角）。（F）対照CFI（白菱形）、DRCFI（白三角）、および0.2％ポリソルベート80中12.5mg/ml CFI（白菱形）のIVRプロファイル。各値は平均±SD（n＝2）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
発明の詳細な説明
嚢胞性線維症、非CF気管支拡張症、NTM、および他の医学的状態などの疾患に関連する様々な肺感染症の予防および/または処置のための、本発明の界面活性剤結合リポソームの製剤化法およびその送達法、ならびに、それに関連して用いられる装置および製剤を記載する前に、記載する特定の方法、装置、および製剤は、当然のことながら変動しうるため、本発明はそのような方法、装置、および製剤に限定されないことが理解されるべきである。本明細書において用いられる用語は特定の態様を記載するためのものにすぎず、また本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【０１０５】
値の範囲が示されている場合、その範囲の上限と下限との間に介在する、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり下限の単位の10分の1までの各値も、具体的に開示されることが理解される。任意の指定された値または指定された範囲に介在する値と任意の他の指定された値またはその指定された範囲に介在する値との間のより小さい範囲はそれぞれ本発明の範囲内に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、この範囲内に含まれてもまたはこの範囲において除外されてもよく、指定された範囲において任意の具体的に除外される限界があることを前提として、より小さい範囲に限界のいずれかが含まれるか、限界のいずれも含まれないか、または限界の両方が含まれる、各範囲はまた本発明の範囲内に含まれる。指定された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【０１０６】
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書において言及するすべての出版物は、その出版物が引用されるものに関連して方法および/または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるとおり、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「製剤（a formulation）」についての言及は複数のそのような製剤を含み、「方法（the method）」についての言及は1つまたは複数の方法および当業者には公知のその等価物についての言及を含み、他も同様である。
【０１０８】
本明細書において論じる出版物は、本出願の提出日よりも前に開示されたために提示しているにすぎない。本明細書におけるいかなる開示も、本発明が、先行発明のためにそのような出版物に先行する権利がないと認めたと解釈されるべきではない。さらに、提示する出版物の日付は実際の出版日と異なることがあり、これは個別に確認する必要がある。
【０１０９】
本明細書において用いられる抗感染剤とは、細菌、ウイルス、真菌、ミコバクテリア、または原虫感染症などの、感染症に対して作用する物質を意味する。
【０１１０】
本発明によって包含される抗感染剤には、キノロン（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、シプロフロキサシンおよびノルフロキサシンなど）、スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメタオキサゾール、スルフイソキサゾール、スルファセタミドなど）、アミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンなど）、テトラサイクリン（例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンなど）、パラアミノ安息香酸、ジアミノピリミジン（例えば、スルファメトキサゾールと併用されることが多いトリメトプリム、ピラジンアミドなど）、ペニシリン（例えば、ペニシリンG、ペニシリンV、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンなど）、ペニシリナーゼ抵抗性ペニシリン（例えば、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリンなど）、第一世代セファロスポリン（例えば、セファドロキシル、セファレキシン、セフラジン、セファロチン、セファピリン、セファゾリンなど）、第二世代セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォテタン、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフィネタゾール、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォラニドなど）、第三世代セファロスポリン（例えば、セフェピム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテンなど）、他のβラクタム（例えば、イミペネム、メロペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタムなど）、βラクタマーゼ阻害物質（例えば、クラブラン酸）、クロラムフェニコール、マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシンなど）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンB、ポリミキシン（例えば、ポリミキシンA、B、C、D、E1（コリスチンA）、もしくはE2、コリスチンBもしくはCなど）、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（例えば、ダプソン、スルホキソンナトリウムなど）、クロファジミン、サリドマイド、または脂質に封入しうる任意の他の抗菌剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗感染剤には、ポリエン抗真菌剤（例えば、アムホテリシンB、ナイスタチン、ナタマイシンなど）、フルシトシン、イミダゾール（例えば、ミコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾールなど）、トリアゾール（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾールなど）、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラクス、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィン、または脂質に封入もしくは複合しうる任意の他の抗真菌剤およびその薬学的に許容される塩な��びにその組み合わせを含む、抗真菌剤が含まれうる。考察および例は主にシプロフロキサシンに指向されているが、本出願の範囲はこの抗感染剤に限定されることを意図していない。薬物の組み合わせを用いることもできる。
【０１１１】
本明細書において用いられる「製剤」とは、乾燥粉末として、または液体中に懸濁もしくは溶解してのいずれかで、任意の賦形剤または追加の活性成分と共に、リポソームに封入された抗感染剤を意味する。
【０１１２】
「界面活性剤（surfactant）」なる用語は、「表面活性剤（surface active agent）」なる語句の短縮から来ている。薬学的適用において、界面活性剤は液体薬学的製剤において有用であり、界面活性剤は、乳化剤、可溶化剤、および湿潤剤として作用するいくつかの目的にかなう。乳化剤は親油性物質または部分的親油性物質の水性溶液を安定化する。可溶化剤は薬学的組成物の成分の溶解性を高めて、達成されうる濃度を高める。湿潤剤は流体の表面張力を低下させて、流体が適用される表面上で容易に広がるよう誘導し、したがって流体による表面の「湿潤」さえも引き起こす、化学添加物である。湿潤剤は、液体製剤が粘膜または薬学的製剤が接触する他の表面領域との密接な接触を達成するための手段を提供する。
【０１１３】
リポソームを調製することができかつ当技術分野において周知である、多くのやり方がある。リポソームシプロフロキサシン製剤を調製するためのいくつかの方法がUS 8,414,915に記載されている。一般には、シプロフロキサシンを好ましくは本発明の製剤において用いるが、当業者には公知の他の抗生物質または抗感染剤を用いてもよい。しかし、本発明は抗感染剤のリポソーム製剤に限定されない。
【０１１４】
薬物製剤の形態に関係なく、約0.5μm〜12μm、好ましくは1μm〜6μm、より好ましくは約2〜4μmの範囲内の吸入用の液滴または粒子を作製することが好ましい。比較的狭い範囲のサイズを有する吸入粒子を作製することにより、薬物送達系の効率をさらに高め、投薬の再現性を改善することが可能である。したがって、粒子が0.5μm〜12μmまたは2μm〜6μmまたは約3〜4μmの範囲内のサイズを有することのみならず、患者に送達される粒子の80％またはそれ以上が、平均粒径の±20％、好ましくは±10％、より好ましくは平均粒径の±5％以内である粒径を有するように、平均粒径が狭い範囲内であることが好ましい。
【０１１５】
本発明の製剤は、使い捨て包装と、AERx装置（US 5,823,178）などの携帯用手持ち式電池駆動装置とを用いて患者に投与してもよい。または、本発明の製剤は、機械的（非電子）装置を用いて実施してもよい。通常のジェット噴霧器、超音波噴霧器、ソフトミスト吸入器、ドライパウダー吸入器（DPI）、定量吸入器（MDI）、凝縮エアロゾル発生器、および他のシステムを含む、他の吸入装置を用いて製剤を送達してもよい。
【０１１６】
エアロゾルは、薬物を膜の細孔に押し込むことにより作製されてもよく、この細孔は約0.25〜6マイクロメートルの範囲内のサイズを有する（US 5,823,178）。細孔がこのサイズを有する場合、エアロゾルを作製するために細孔を通って漏出する粒子は0.5〜12マイクロメートルの範囲内の直径を有しうる。薬物粒子は、粒子をこのサイズ範囲内に維持することを意図する気流により放出してもよい。小粒子の作製を、約800〜約4000キロヘルツの範囲内の振動数を提供する振動装置を用いて促進してもよい。当業者であれば、いくつかの態様の目的は約0.5〜12マイクロメートルの範囲内の直径を有するエアロゾル化粒子の提供であることを念頭に置いて、製剤の密度および粘性に基づき、薬物が放出される細孔のサイズ、振動数、圧、および他のパラメーターなどのパラメーターにおいて、いくつかの調節を行いうることを理解するであろう。
【０１１７】
1つの態様において、低沸点高揮発性噴射剤を本発明のリポソームおよび薬学的に許容される賦形剤と混合する。リポソームは噴射剤中の懸濁液もしくはドライパウダーとして提供してもよいか、または、別の態様においては、リポソームを噴射剤内の溶液に溶解する。これらの製剤はいずれも、その唯一の開口としてバルブを有する容器内に容易に含まれうる。噴射剤は、高揮発性であるため、すなわち、低沸点を有するため、容器の内容物は加圧下に置くことになる。
【０１１８】
別の製剤に従い、シプロフロキサシン含有リポソームはそれ自体でドライパウダーとして提供され、かつ別の製剤に従い、シプロフロキサシン含有リポソームは溶液製剤中に提供される。ドライパウダーは、各送達について測定された同じ吸気流速および吸気体積においてのみ吸入を可能にすることにより、直接吸入してもよい。パウダーは水性溶媒に溶解して溶液を作製してもよく、これは多孔性膜を通って移動し、吸入のためのエアロゾルを作製する。
【０１１９】
肺内経路を介して患者に吸入および送達されうる、シプロフロキサシン含有リポソームのエアロゾル化型を生成することを可能にする、任意の製剤を本発明と関連して用いてもよい。エアロゾル化送達装置と関連して用いることができる製剤に関する特定の情報は、Remington's Pharmaceutical Sciences, A. R. Gennaro editor（最新版）Mack Publishing Companyに記載されている。
【０１２０】
前記に基づき、当業者であれば、複数の異なる処置および投与手段を用いて1人の患者を処置しうることを理解するであろう。したがって、例えば、静脈内シプロフロキサシンまたは抗生物質などの、そのような薬物療法をすでに受けている患者が、本発明の製剤の吸入から利益を得る場合がある。吸入によるシプロフロキサシン含有リポソーム製剤だけを受ける場合がある患者もいる。そのような患者は、嚢胞性線維症または非CF気管支拡張症の症状を有する場合があるか、肺感染症と診断されている場合があるか、またはシプロフロキサシンなどの抗生物質の患者への投与から利益を受けうる、医学的状態の症状を有する場合がある。本発明の製剤を、診断的に用いてもよい。1つの態様において、例えば、患者は、肺感染症を診断するための手順の一部として、本発明のある用量の製剤を受け入れることができ、患者の症状の1つまたは複数が製剤に反応して改善する。
【０１２１】
患者は典型的には約0.01〜10mg/kg/日の吸入リポソームシプロフロキサシン製剤、±20％または±10％の用量を受けることになる。この用量は典型的には、エアロゾル装置から少なくとも1回、好ましくは数回の「パフ」または吸入によって投与されることになる。1日の合計用量を好ましくは1日に少なくとも1回投与するが、1日に2回またはそれ以上の用量に分割してもよい。数日間または数週間のより高い用量またはより高頻度の投与とその後の減少した用量または維持用量で患者にシプロフロキサシンを「負荷」する期間から利益を得る場合が患者もいる。嚢胞性線維症および非CF気管支拡張症は典型的には慢性状態であるため、患者はそのような治療を長期間受けると予想される。
【０１２２】
したがって、前述のとおり、本発明のいくつかの局面の製剤は、薬物放出プロファイルを改変する能力を有するリポソーム封入シプロフロキサシンとの組み合わせで遊離または非封入シプロフロキサシンを含む。そのような製剤は、細菌コロニーまたはバイオフィルムを取り囲みかつそれらの生存度を低下させる、肺液中の抗生物質濃度の急速な上昇をもたらす、遊離シプロフロキサシンによる速効性の利益と、続いて細菌を死滅させ続けるもしくは細菌の増殖能力を低下させ続けるか、または抗生物質耐性コロニーが生じる可能性を減少させる、封入シプロフロキサシンからの持続的利益を提供しうる。
【０１２３】
いくつかの特許はリポソームおよび界面活性剤の特定の製剤を記載しているが、封入薬物の封入状態および/または放出速度を改変するために本発明者らが記載する組み合わせを予想したものはなく、また既存のリポソーム製剤への界面活性剤の添加を記載するものもない。例えば、交付済み特許のUS 7,923,029は、肺投与のための噴霧凍結乾燥製剤を記載している。この特許の焦点は、安定性を保つために製剤を噴霧凍結乾燥することにあるが、薬物の封入状態および/またはその放出プロファイルを変えるための、界面活性剤を既存のリポソーム製剤と混合する可能性を予想していない。
【０１２４】
別の交付済み特許のUS 7,749,485は、治療的および/または診断的使用のためのリポソーム集合体を記載している。この集合体はリポソームおよびそれに結合した複数のミセル成分を含み、該ミセル成分は該リポソームの外皮の外側表面に実質的に静電相互作用を通して結合されており、活性化合物はリポソーム内ではなくミセル中に組み込まれている。この特許の焦点は、血流中のリポソームの滞留時間を延ばすための、ミセルに結合したリポソームにあるが、リポソームの封入状態および/または薬物放出プロファイルを変えるための、界面活性剤の使用を予想していない。
【０１２５】
別の交付済み特許のUS 7,368,129は、空間的に異なる部位において、少なくとも2つの疎水性残基に結合した親水性材料またはポリマーを組み込む、両親媒性分子の構造クラスを記載している。しかし、この発明者らは界面活性剤の共有結合を必要としているが、本発明では、封入状態および/またはリポソームからの薬物の放出速度を改変するために共有結合を必要とすることなく、界面活性剤をリポソームと混合する。
【０１２６】
米国特許第7,033,574号は、リポソームまたは界面活性剤から作製しうる安定な微小気泡懸濁液を記載しているが、両方を一緒に使用することは予想しておらず、薬物の封入状態および/またはその放出プロファイルを改変するための組成物を記載していない。
【０１２７】
別の特許のUS 6,767,554は、カチオン性リポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体を記載している。本発明は封入薬物の封入状態および放出速度を改変するための界面活性剤の使用を記載しているが、この特許はリポソームの表面上に位置する核酸と複合するための手段としてカチオン性リポソームを用いる。核酸がリポソーム中に封入されていることはなかった。したがって、この特許は封入核酸を含む封入薬物の封入状態および放出速度を改変するための界面活性剤の使用を予想していない。
【０１２８】
US 6,296,870は、リン脂質、コレステロール、脂質二重層に結合した活性物質（リポソームの内部水性環境内に封入されているのに対し）、および、脂質二重層内に含まれる特定の界面活性剤で構成されている、リポソームを記載し、これは二重層に組み込まれる活性物質のより高い濃度をもたらす。他の関連特許のUS 5,882,679、US 5,827,533、およびUS 6,143,321は、リポソーム小胞内に捕捉された界面活性剤ミセルを有するリポソームを記載している。これらの特許は、リポソームの内部に封入された薬物を包含することもなく、また封入薬物の封入状態および/または放出プロファイルを改変するための界面活性剤の使用を予想してもいない。
【０１２９】
US 5,902,604は、再構成を補助するための、親油性薬物の凍結乾燥したプレリポソーム製剤中の少量の界面活性剤の添加を記載している。この発明者らは、薬物の封入状態および/または放出速度を調節するために、封入薬物を含む既存のリポソーム製剤に界面活性剤を添加する利点を予想しなかった。
【０１３０】
US 5,328,628は、リポソームへのアニオン性界面活性剤の添加によりリポソームを溶解する方法を記載している。これは、リポソームはその構造を保持するが、封入状態および放出速度を改変しうる、本発明と対照的である。
【０１３１】
US 5,019,394は、高クラフト点のアニオン性界面活性剤がリポソーム膜の成分であるリポソームを記載している。これは、封入状態および/または薬物放出速度を改変するために、リポソームをあらかじめ形成し、界面活性剤を続いてリポソームに添加し、界面活性剤がリポソームと結合する、本発明と対照的である。
【０１３２】
本発明のリポソーム製剤を、本明細書において記載する他の薬物と同時に投与してもよい。例えば、本発明のリポソームを、DNアーゼ、粘液溶解剤、塩素イオンチャネルを上方制御する化学物質もしくは細胞の上皮表面を通過するイオンの流量を高める化学物質、気管支拡張剤、ステロイド、P2Y2アゴニスト、α-1抗トリプシン（AAT）などのエラスターゼ阻害物質、N-アセチルシステイン、サリチル酸ナトリウムなどのバイオフィルム細菌に対する抗生物質の活性を増強する作用物質、インターフェロンγ、インターフェロンα、気管支拡張剤、ステロイド、またはアミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、イルロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ロソクサシン、ルフロキサシン、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、およびトスフロキサシンからなる群より選択されるフルオロキノロン、または、トブラマイシン、コリスチン、アジスロマイシン、アミカシン、セファクロル（Ceclor）、アズトレオナム、アモキシシリン、セフタジジム、セファレキシン（Keflex）、ゲンタマイシン、バンコマイシン、イミペネム、ドリペネム、ピペラシリン、ミノサイクリン、もしくはエリスロマイシンの群より選択される抗生物質などの薬物と共に用いてもよい。
【０１３３】
前述したものは、本発明の原理を単に例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書において明確に記載または示していなくても、本発明の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な取り合わせを考案しうることが理解されるであろう。さらに、本明細書において列挙するすべての例および条件用語は、主に読み手が本発明の原理および本発明者らによって技術を促進するために与えられた概念の理解を助けることが意図され、そのような特別に列挙される例および条件に限定されることはないと解釈されるべきである。さらに、本明細書において、本発明の原理、局面、および態様を列挙する全ての陳述、ならびにその特定の例は、その構造的等価物と機能的等価物の両方を含むことが意図される。加えて、そのような等価物は、現在公知の等価物と、将来的に開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす任意の開発される要素との両方を含むことが意図される。本発明の範囲は、したがって、本明細書において示され、記載される例示的な態様に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【０１３４】
ここまで、CF、非CF気管支拡張症、および非TBミコバクテリア患者における感染症を処置するための本発明の適用を主に論じてきた。しかし、本発明がこれらの適応症以外に有用性および利点を有することは当業者には明白であろう。この処置法は、気管支拡張症、結核、人工呼吸器関連肺炎、市中感染性肺炎、気管支肺炎、大葉性肺炎を含むが、それらに限定されるわけではない肺炎；肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、クラミジア（Chlamydia）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumonia）、ブドウ球菌（staphylococci）による感染症、感染が生じうる状態、例えば、挿管または人工呼吸患者の予防的処置もしくは防止、肺移植患者における感染症、気管支炎、百日咳（百人咳）、内耳感染症、連鎖球菌性咽頭感染症、吸入炭疽、野兎病、または副鼻腔炎を含むが、それらに限定されるわけではない、鼻の通路、気道、内耳、または肺の感染症を含む他の疾患状態に適用される。
【実施例】
【０１３５】
以下の実施例は、当業者に本発明を実施および使用する方法の完全な開示および記載を提供するように提示するものであり、本発明者らがその発明と考えるものの範囲を限定する意図も、また以下の実験が実施された唯一の実験であることを意味する意図もない。用いた数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するよう努力してきたが、いくつかの実験誤差および偏差は説明されるべきである。特に記載がないかぎり、割合は重量割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、かつ圧は大気圧またはそれに近い圧である。
【０１３６】
実施例1
材料
遊離シプロフロキサシン（FCI）、20mg/mlはpH3.3の酢酸緩衝化水性製剤中に存在し、Lipoquin、リポソームシプロフロキサシン（CFI）、50mg/mlはpH6.0のヒスチジン緩衝化水性製剤中に存在する。ドナーウシ血清はHyClone（Logan、Utah）から入手した。
【０１３７】
リポソームシプロフロキサシンの調製
Lipoquinは、水素添加ダイズホスファチジルコリン（HSPC）およびコレステロールを含む、約80nmの単層リポソームの水性分散液である。Lipoquin、リポソームシプロフロキサシン（CFI）の調製は、以前に報告されている（Ong et al. 2012）。簡単に言うと、多層状リポソームを膜から押し出して単層リポソームを生成し、次いでこれにシプロフロキサシンを能動的に負荷する（Webb et al. 1998、Yim et al., 2006）。任意の非封入シプロフロキサシンをダイアフィルトレーションによりろ過し、＞99％の封入シプロフロキサシンを50mg/mlシプロフロキサシンの標的濃度で生じる。Pulmaquin、吸入用二重放出シプロフロキサシン（DRCFI）は、FCIとCFIとの等量混合物であり、約70％封入シプロフロキサシンおよび約30％遊離シプロフロキサシンを生じる。
【０１３８】
CFIへの界面活性剤の添加
1つの一連の実験では、リポソームシプロフロキサシン、CFIの性質を改変するための、SPAN 20、SPAN 80、プルロニックL62、プルロニックL44、ポリソルベート20、およびポリソルベート80を含む、様々な界面活性剤の使用を調査した。これらの試験において、製剤は各界面活性剤0.01、0.05、0.1、0.5、または1％中、12.5mg/mlのCFI（すなわち、4倍希釈した）を含んでいた。ポリソルベート20だけを用いた第二の一連の実験において、CFIを水および界面活性剤で50mg/mlから30、20、15、12.5、または10mg/mlに希釈して、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、および2.0％ポリソルベート20の最終濃度を得た。界面活性剤がリポソームと結合するのに十分な時間を提供するように、両方の実験セットの試料を少なくとも30分間平衡化させた。試料をより長い時間平衡化させた場合、これらの製剤の性質にそれ以上の変化は観察されなかった（データは示していない）。ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFIについて、これらの調製物の性質がCFIへの水および界面活性剤の添加の順序に依存するかどうかを判定するための実験を行った。別の実験において、30分間の平衡化後、様々なレベルの界面活性剤を含む30mg/ml CFI調製物を水で10mg/ml CFIに希釈して、製剤の性質に対する希釈の効果を判定した。これらの調製物のいくつかについて、小胞サイズ分布、薬物の封入状態、クライオTEM画像、およびIVRプロファイルを調べた。
【０１３９】
小胞サイズ
各CFI試料を食塩水で約1mg/ml CFI（2mg/mlリポソーム）の濃度に希釈し、Submicron Particle Sizer Autodilute Model 370（Nicomp、USA）を用いた小胞サイズ分析のために、0.5mlを使い捨て培養チューブ（Kimble Glass Inc.、USA）に移した。以下の機器パラメーターを選択した：温度、23℃；粘度、0.933；屈折率、1.333；強度設定点、300KHz；チャネル幅、10μ秒；散乱角、90；実行時間、5分；モード、小胞；ガウス分布。小胞サイズ分布の平均および標準偏差（SD）を記録した。
【０１４０】
薬物封入
分子量カットオフ10,000または30,000のろ過膜を有するNanosep遠心分離装置を用いて、遊離薬物をリポソーム封入薬物から分離した。各試料を酢酸緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、145nM NaCl、pH4.0）中で10倍に希釈し、400μLを遠心分離装置に移し、10,000rpm（8,100g）で18分間遠心分離した。遊離シプロフロキサシン成分に相当するろ液をHPLCでシプロフロキサシン含有量について分析した。CFI試料を80％メタノール中で20倍に希釈してリポソームを「可溶化」した後、封入薬物と遊離薬物の両方に相当する、シプロフロキサシンの合計量を、HPLCにより定量した。各試料中の封入パーセントを、遊離薬物と合計薬物とを比較することにより求めた。
【０１４１】
低温透過型電子顕微鏡法（クライオTEM）
リポソーム製剤の視覚像を得るために、クライオTEM分析を200kVで操作するJEOL 2100（Tokyo、Japan）機器を用いて実施した。CFI試料を水で約5mg/ml（10mg/mlリポソーム）に希釈し、各試料3μLを、22℃および100％RHに制御したチャンバー内のグロー放電Quantifoilカーボングリッド（Jena、Germany）に適用した。グリッドをろ紙により2mmのブロッティング角で2秒間1回ブロットし、Vitrobot（F.E.I.、Eindhoven、Netherlands）を用いて液体エタン中に入れることによりガラス化した。ガラス化した試料は、クライオTEM分析まで液体窒素中で保存した。
【０１４２】
インビトロ放出（IVR）
IVRアッセイ法は、50％ウシ血清中、37℃でインキュベートした場合の封入シプロフロキサシンの放出を測定する。簡単に言うと、CFI試料をHEPES緩衝食塩水（HBS：20mM HEPES、145mM NaCl、pH7.4）中で50μg/mlシプロフロキサシンに希釈し、冷却（2〜8℃）ウシ血清（Hyclone）と1対1で混合し、37℃および150rpmの振盪水浴（Techne、TSBS40（Staffordshire、UK））に入れた。二つ組の試料を定期的に、例えば、30、60、120、および240分で取り出し、氷水浴に入れてリポソームからの封入薬物のそれ以上のいかなる放出も停止した。各冷却試料400μLをNanosep遠心分離装置に移し、10,000rpmで18分間遠心分離することにより、放出したシプロフロキサシンをリポソーム封入シプロフロキサシンから分離した。ろ液を、続くHPLCによる放出シプロフロキサシンの定量のために取り出した。この値に1.05を掛けることにより標準化し、血清存在下、ろ過装置中での遊離薬物の少量であるが再現性のある損失を補正した（Cipolla et al., 2013、提出済み）。元のCFI試料を80％メタノール中で希釈して、リポソームを溶解し、HPLCによるシプロフロキサシンの合計量の定量を可能にした。各時点での放出パーセントを、遊離薬物と合計薬物とを比較することにより算出した。
【０１４３】
高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）
各試料中のシプロフロキサシンの量を、以前に記載されたHPLC法（Cipolla DC et al., 2010）を用いて定量した。簡単に言うと、HPLCを、いずれも35℃のNucleosil C-18ガードカラム（4×3.0mm、Phenomenex、USA）で保護したNucleosil C-18カラム（5μm、4.6×150mm、Canadian Life Science、CA）を用いて実施した。移動相は水中0.5％TEA、pH3.0と100％メタノールとの混合物（83：17v/v）であり、均一濃度溶離を流速0.9ml/分で実施した。シプロフロキサシンを波長277nmで検出および定量した。
【０１４４】
長期安定性
12.5mg/ml CFIおよび0.4％ポリソルベート20を含有するがpHが異なる、4つのリポソームシプロフロキサシン製剤を、長期安定性の評価のために冷蔵条件で保存した。未調節のpHは5.5であり、調節したpH製剤の標的値は5.2、4.9、および4.7であった。これらの試料のうち3つにおいて、様々な量の25mM酢酸緩衝液、pH4.0を添加することにより、pHを低下させた。各製剤50mlを調製し、約6mlのアリコートを8つの10mlガラスバイアル中にピペットで移し、使用まで2〜8℃で保存した。初期、1ヶ月、10週間、6ヶ月、および1年を含む様々な時点で、バイアルを、その外観、pH、小胞サイズ分布、薬物封入、およびIVRプロファイルの分析のために取り出した。エアロゾル特性を初期、1ヶ月、および6ヶ月の時点で判定した。
【０１４５】
エアロゾル特徴決定
0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFI製剤、pH5.5のエアロゾル粒径分布を、レーザー回折（HELOS/BF、Sympatec GmbH、Clausthal-Zellerfeld、Germany）を用いて判定した。エアロゾル産出物を、光学レンズの前にあるフロースルーセルを通して12.5L/分で抜き取り、各500μ秒の20回分スライスを分析した。形状因子1.00、密度1.019g/cm3、およびMie分析モードであると想定してWINDOX 5ソフトウェアを用いて体積平均径（VMD）および幾何標準偏差（GSD）を算出した。
【０１４６】
初期の時点で、5mlのアリコートの対照CFI製剤ならびに0.4％ポリソルベート20含有pH5.5、4.9、および4.7 CFI製剤を、4μmメッシュを有するPari eFlow(登録商標) rapid噴霧器レザバー（Pari Pharma、Starnberg、Germany）中に装填し、噴霧器をオンにし、エアロゾル産出物を、5mlの25mM酢酸緩衝液、pH4.0を含むSKC BioSampler（USA）中に収集した。噴霧時間と噴霧器の残留および収集エアロゾル区画中のリポソームシプロフロキサシンの質量とを二つ組の実験のそれぞれで判定した。噴霧器レザバー中および収集エアロゾル中の回収した製剤について、噴霧前および噴霧後に平均小胞サイズおよび封入の状態を記録した。その後の1ヶ月および6ヶ月の時点の特徴決定実験において、メッシュを通過した液滴の影響を表すエアロゾル評価を、装置のマウスピースに蓄積した製剤に対して実施した。これは、BioSamplerへの収集中に起こる可能性があるリポソーム破損を避けるために行った。1および6ヶ月の時点で、小胞サイズと封入状態の両方を評価した。IVRプロファイルも、6ヶ月の時点でのみ特徴決定した。
【０１４７】
結果
界面活性剤とリポソームシプロフロキサシンとの相互作用
水での希釈による低張環境下での、最終濃度12.5mg/mlのリポソームシプロフロキサシン（CFI）への界面活性剤の添加後、すべての界面活性剤は封入シプロフロキサシンのいくらかの放出を引き起こし、放出量は界面活性剤濃度の上昇と共に増加した（図1）。封入薬物の放出は非常に急速に、十分30分の時間内に起こり、その後さらなる放出は観察されなかった（長期安定性の項参照）。しかし、放出された薬物の量は、界面活性剤の選択に大いに依存し、ポリソルベート20およびポリソルベート80はいずれもシプロフロキサシンの実質的な放出を引き起こしたが、試験した他の界面活性剤はどれも、評価した界面活性剤濃度の全範囲で封入薬物の1〜2％を超える放出を起こすことはなかった（図1）。CFIの平均小胞サイズは、プルロニックL44またはプルロニックL62のいずれかの存在下では変化せず、SPAN 20、SPAN 80、およびポリソルベート20では1〜3nm増大し、ポリソルベート80では最大8nmまで増大した（表1）。調査した界面活性剤はすべて遊離薬物の量のいくらかの増加を引き起こした。
【０１４８】
次の一連の実験において、希釈媒として等張ヒスチジン緩衝液または水のいずれかを用いて、CFIと界面活性剤（ポリソルベート20）の両方の濃度を変えた場合の効果を調査した。希釈媒として等張ヒスチジン緩衝液を用いると、CFIの封入状態に対する界面活性剤の添加の効果ははるかに少なかった（図2A）。
【０１４９】
しかし、希釈媒として水を用いた以外は同じ条件下では、封入状態に劇的な違いがあった。任意の所与の濃度のポリソルベート20では、より濃縮されたCFI製剤の場合よりもより希釈された低張環境のCFI製剤の場合は、封入シプロフロキサシンの放出の程度がより大きかった（図2B）。CFI濃度のこの3倍範囲の全体で、界面活性剤対リポソームの一定の比では、シプロフロキサシンの同等の放出パーセンテージではなかった（図2Bの点線）。代わりに、30mg/ml CFI製剤では、封入状態は約95％であったが、10mg/ml CFIでは約56％に低下した。別の実験において、一連のポリソルベート20濃度での30mg/ml CFIの封入状態を、30分間の平衡化後に測定し、次いで水で10mg/ml CFIに希釈した後に再測定した（図2C）。3倍希釈後に封入の低下があったが、10mg/ml CFI製剤を50mg/ml CFIから界面活性剤の添加により直接調製した場合に比べて、低下は比較的小さかった。同じグラフに示す最後の実験において、水による希釈の直前または水による希釈の直後に界面活性剤を50mg/ml CFIに添加することにより、希釈の順序を評価した。この場合、2つの調製物の間の封入状態にほとんど差はなかった（図2C）。
【０１５０】
クライオTEM
様々なレベルのポリソルベート20有りまたは無しの12.5mg/ml CFI試料を、クライオTEMにより撮像した。界面活性剤を含まないCFI製剤は、粒径約50〜100nmの球状単層リポソームで構成されていた（図3A）。0.05％ポリソルベート20（図3B）、0.2％ポリソルベート20（図3C）、および0.4％ポリソルベート20（図3D）を含有するCFI試料はすべて、リポソームのサイズおよび層状態に関してCFIと質的に類似していると考えられた。しかし、ポリソルベート20の濃度が上がるにつれ、シェーディングがより明るいリポソームの比率が大きく、封入シプロフロキサシンの損失が示唆された（図3D）。破裂したリポソームの破片に相当しうる、非常にわずかな割合のディスク状断片があった（図3D）。密度がより小さいリポソームは封入薬物の損失に一致しているかどうかを判定するために、空のリポソーム、および、空のリポソームとCFIの50：50混合物も撮像した（図3Eおよび3F）。空のリポソームは、サイズおよび層状態に関してCFIと同等であったが、密度は小さかった（図3E）。空のリポソームとCFIの1：1混合物は、ほぼ等しい比率で明るいシェーディングと暗いシェーディングの両方を有するリポソームのモザイクを示した（図3F）。これらの結果は、最大0.4％までポリソルベート20の添加量を増加させることで、リポソームの一部からシプロフロキサシンの漏出を引き起こしたが、これらのリポソームは封入薬物の損失後もその物理的完全性を保持していることを示唆するものである。
【０１５１】
IVRプロファイル
IVRアッセイ法は、37℃でウシ血清と共にインキュベートした後のリポソームからの封入シプロフロキサシンの放出を測定する。封入アッセイ法データ（図2）と一致して、IVRアッセイ法におけるゼロ時間の放出値（図4A）は、放出剤とのインキュベーション前の封入の状態を表している。対照CFIバイアルでは、ゼロ時間の放出値は約1％である。DRCFIは約70％CFIと30％遊離シプロフロキサシンとの混合物であり、ゼロ時間の値は約30％である。様々なレベルの界面活性剤を含む12.5mg/ml CFIでは、遊離シプロフロキサシンの量はポリソルベート20の増加に伴い、0.05％ポリソルベート20での約2％から0.4％ポリソルベート20での約27％まで増大した。4時間の最終時点までに、製剤は全て、IVRアッセイ法におけるプラトー値に達し、封入シプロフロキサシンのほぼ100％の放出を示した。
【０１５２】
0.05および0.1％ポリソルベート20を含有するCFI製剤のIVRプロファイルは、CFI単独のものと非常に類似していた。しかし、0.4％ポリソルベート20を含有するCFI製剤のIVRプロファイルはCFIのものとは顕著な相違を有していた。T30分値はCFIの放出の「中点」の概算表示である（Cipolla et al., 2013、提出済み）。T30分値はポリソルベート20の増加につれ、CFI単独の約44％から0.4％ポリソルベート20を含有するCFIの約66％まで増大した。しかし、開始時の封入状態は等しくなかったため、放出速度に対する変化を評価するためにこれらの製剤のT30分値を直接比較することはできない。この問題に取り組むために、初期値（T0分）を減じ、放出の全有効範囲（T240分−T0分）で割り、パーセンテージに変換することによって、T30分を「標準化」することができる。標準化したT30分値はCFIでは44.4％であり、0.05、0.1、0.2、および0.4％ポリソルベート20を含有するCFIではそれぞれ43.4％、46.8％、47.6％、および55.7％であった。封入シプロフロキサシンの放出は、界面活性剤を添加していないCFIよりも0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/mlリポソーム製剤からの方が速かった。加えて、0.4％ポリソルベート20を含有するCFIはDRCFIと同等の初期放出値を有し、それぞれ27％と30％であったが、その放出速度はDRCFIよりも速く、T30分値はそれぞれ66％と57％であった。界面活性剤が、リポソームの膜透過性およびしたがってそれらの放出プロファイルを変化させたかどうか、または、代わりに界面活性剤が血清のように放出ビヒクル自体として単純に機能しているのかどうかが疑問視される可能性がある。この仮説を試験するために、対照CFIをポリソルベート20有りまたは無しの放出ビヒクル（血清）中で希釈し、IVRアッセイ法を繰り返した。この実験におけるIVRアッセイ法中の界面活性剤の濃度（0.0008％）は、IVRアッセイ法緩衝液中で500倍希釈した後の0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFIのものと同じであった。IVRプロファイルに対しては界面活性剤の効果はなかった（データは示していない）。
【０１５３】
長期安定性
シプロフロキサシンは中性pH付近では難溶性であるため、約25〜30％シプロフロキサシンの放出を引き起こした、0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFI製剤は良好な長期安定性を有すると予想されなかった。事実、pHを調節しなかった場合、界面活性剤添加後48時間以内に、光学顕微鏡下でシプロフロキサシンの棒状結晶がリポソームの外側に観察された（データは示していない）。許容される長期安定性を有する製剤を開発するために、0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFIの外部pHを、非改変製剤のpH5.5から、pH4.0の酢酸ナトリウム緩衝液の添加によりpH5.2、4.9および4.7に低下させた。これらの製剤を、外観、小胞サイズ分布、シプロフロキサシン封入、pH、およびIVRプロファイルについての定期的評価のために冷蔵保存した。pH4.7および4.9の0.4％ポリソルベート20を含有するCFI製剤の外観は、1年間の試験中ずっと粒子を含まないままであったが、pH5.2の製剤では、2.5、6、および12ヶ月の時点で少数の微粒子が観察された。リポソームの平均小胞サイズは4つの製剤すべてで90〜97nmであり、pHが最も低い製剤では他よりも平均小胞サイズがわずかに大きかった（表2）。1年間の試験中に、いかなる製剤についても小胞サイズに意味のある変化はなかった。CFI対照試料の封入は、1年間の試験で約99％のままであった（表3）。pH5.5の0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFI製剤は70〜75％の薬物封入を有していたが、封入パーセントはpHを5.2、4.9、および4.7に低下させると、それぞれ約80、約85、および約92％に増大した（表3）。これらの封入値は1年間の冷蔵保存期間を通してかなり一定なままであった。pH4.7および4.9の0.4％ポリソルベート20を含有するCFI製剤のpHは、1年間の試験中ずっと変化しなかったが、pH5.2の製剤では6および12ヶ月の時点でわずかに低下した（表4）。
【０１５４】
これら3つの製剤のIVRプロファイルは、pH改変なしの製剤と類似の特徴を示す（図4B）。しかし、T=0放出値はpHの低下につれて、pHが未改変の試料の場合の約27％から、pH4.7での約12％に低下した。T=0放出値は表3に報告している封入値と同等である。0.4％ポリソルベート20を含有するそれらの製剤の放出プロファイルは、同等であったが、その内容物のほとんどを最初の30分以内に放出したpH4.7製剤を除いて、0.4％ポリソルベート20無しのCFIの場合よりも速かった。0.4％ポリソルベート20を含有するpH5.2、4.9、および4.7 CFI製剤のIVRプロファイルを、6ヶ月間（図4C）および1年間（図4D）の冷蔵保存後にアッセイした。pH5.2、4.9、および4.7で0.4％ポリソルベート20を含有するCFI製剤のIVRプロファイルは、この1年間の時間枠を通して変化しなかった。
【０１５５】
エアロゾル特徴決定
最初に、0.4％ポリソルベート20を含有するCFI製剤を、それらのエアロゾル性能を特徴決定するために、様々なジェット噴霧器を用いて評価した。界面活性剤の存在は、過度の発泡を引き起こして、非常に低く、一貫性のないエアロゾル産出速度につながり、したがってジェット噴霧をこれらの製剤を用いた使用には不適切なものにした。次いで、振動メッシュ噴霧器、PARI eFlow rapidへの移行が行われた。この装置を用いて、各製剤5mLを3.4〜4.0分で、界面活性剤を含まないCFI対照よりもわずかに速く噴霧した（表5）。3つの実験製剤の放出用量（ED）値は、噴霧器中に充填した用量の57〜61％であり、CFI対照で観察された約72％のEDよりも低かった（表5）。より速い噴霧時間を考慮すると、ED値が実験製剤で低いことは理にかなっている。実験製剤のより低いED値は、おそらくは、メッシュを通過するために利用可能な製剤の量を低減したと考えられる、レザバー中で観察される少量の泡が原因であった。物質収支の回収は平均90％を超えていた。3つの実験製剤すべてで、平均小胞サイズは、噴霧器レザバーから回収された材料で約3nm、および収集エアロゾルでさらに約30nm増大した（表5）。これは、噴霧器レザバーまたは収集エアロゾル区画のいずれでも平均小胞サイズに有意差がなかった対照CFI製剤の場合とは対照的である（表5）。噴霧器レザバーから回収したシプロフロキサシンの封入は、3つの製剤すべてで65〜77％まで有意に低下したが、対照CFI製剤における封入状態は変化がなかった（表5）。
【０１５６】
1ヶ月の時点で、0.4％ポリソルベート20を含有するpH5.2、4.9、および4.7のCFI製剤をエアロゾル化したが、今回は、分析用のBioSampler中のエアロゾルを収集する代わりに、マウスピースの内側に凝縮したエアロゾル液滴を、小胞サイズおよび封入状態について評価した。この変更は、初期時点でのエアロゾル試料において観察された小胞サイズの増大を説明しうる、試料の状態の変化にBioSampler収集工程が貢献していた場合に行った。3つの製剤すべてで、噴霧器レザバー中の残留溶液の平均小胞サイズにわずかな増大があり、初期評価と一致していた（表6）。しかし、ゼロ時間での以前の結果とは対照的に、3つの製剤すべてで、収集したエアロゾル試料の小胞サイズにそれ以上の増大はなかった（表6）。噴霧器レザバー中に残っている製剤の封入状態は、3つの製剤のいずれでも、ゼロ時間の分析ほど有意に低下しなかった。しかし、収集したエアロゾル試料はすべて、70〜80％の封入状態まで低下し、ゼロ時間で観察されたものと一致していた（表6）。
【０１５７】
6ヶ月の時点で、0.4％ポリソルベート20を含有するpH5.2、4.9、および4.7のCFI製剤のエアロゾル化の効果を、小胞サイズ、封入状態、およびIVRプロファイルに関して評価した。3つの製剤すべてで、平均小胞サイズは、噴霧器レザバーから回収した試料では2〜3nm、かつマウスピース中で収集したエアロゾル試料ではさらに1〜3nm増大し（表6）、1ヶ月の時点で観察されたものと一致していた。封入状態は、噴霧器レザバーから回収したかまたはエアロゾル化後であるかにかかわらず、3つの製剤すべてで1〜6％わずかに低下した（表6）。3つの製剤すべてで、収集したエアロゾル試料のIVRプロファイルは、噴霧器レザバー中に残っている残留製剤のものと同等であった（図4E）。エアロゾル化した0.4％ポリソルベート20を含有するpH5.2および4.9 CFI製剤も、未噴霧対照試料のものと同等であった（図4D）。しかし、0.4％ポリソルベート20を含有するpH4.7 CFI製剤では、収集したエアロゾルと噴霧器レザバー試料の両方のIVRプロファイル（図4E）は、未噴霧対照で観察された急速な放出（図4D）は示さなかったが、代わりに、より高いpHの製剤と類似のIVRプロファイルを有していた。
【０１５８】
メッシュ噴霧後の0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFI調製物のエアロゾル粒径分布は、VMD＝3.74μm（SD＝0.01μm、n＝3）およびGSD＝1.72（SD＝0.02、n＝3）を有していた。0.4％ポリソルベート20を含有する12.5mg/ml CFI製剤のメッシュ噴霧工程への曝露後、マウスピース中で回収したエアロゾル試料は、クライオTEM分析によりリポソーム構造または完全性に関して損傷はなかった（図3G）。非噴霧試料と比べて、リポソームのサイズ分布におけるまたはリポソームのディスク状断片もしくはシェーディングがより明るいリポソームの比率の増大における顕著な変化はなかった。
【０１５９】
（表１）以下の界面活性剤存在下での12.5mg/mL CFIについての小胞サイズ分布：プルロニックL44、プルロニックL62、SPAN 20、SPAN 80、ポリソルベート20、およびポリソルベート80。小胞サイズデータは平均（nm）および［SD］として報告している。
2016534155.tif 000003
ND：実施なし  *調製物は混和性溶液を生成しなかった。
【０１６０】
（表２）2.5、6、および12ヶ月間の冷蔵保存後のCFI対照および0.4％ポリソルベート20含有pH調節12.5mg/ml CFI製剤の小胞サイズ分布。小胞サイズデータは平均（nm）および［SD］として報告している。
2016534155.tif 000004
【０１６１】
（表３）1、2.5、6、および12ヶ月間の冷蔵保存後のCFI対照および0.4％ポリソルベート20含有pH調節12.5mg/ml CFI製剤のシプロフロキサシンの封入パーセント。
2016534155.tif 000005
【０１６２】
（表４）1、6、および12ヶ月間の冷蔵保存後のCFI対照および0.4％ポリソルベート20含有pH調節12.5mg/ml CFI製剤のシプロフロキサシンのpH。
2016534155.tif 000006
【０１６３】
（表５）CFI対照および0.4％ポリソルベート20含有pH調節12.5mg/ml CFI製剤の噴霧の効果の特徴決定。小胞サイズデータは平均（nm）および［SD］として報告している。シプロフロキサシン封入の状態はパーセンテージで報告している。噴霧器レザバー中および収集したエアロゾル（放出用量）中のシプロフロキサシンの回収率％により物質収支の算出が可能である。噴霧時間は分で記録している。
2016534155.tif 000007
【０１６４】
（表６）0.4％ポリソルベート20含有pH調節12.5mg/ml CFI製剤についての1および6ヶ月間冷蔵保存後および噴霧後のシプロフロキサシンのリポソーム小胞サイズ分布および封入パーセント。小胞サイズデータは平均（nm）および［SD］として報告している。単一の実験を6ヶ月の時点で行ったのに対して、二つ組の噴霧実験を１ヶ月の時点で行った。
2016534155.tif 000008
【０１６５】
考察
本発明者らは、封入状態および放出特性が改変された新規製剤を開発することを目標として、界面活性剤とリポソームシプロフロキサシン製剤との相互作用を調査してきた。本発明者らの戦略は、リポソーム小胞がその完全性を保持しているが、改変された薬物放出速度を有しうるように、リポソームを溶解するレベルよりも低い溶解量以下の界面活性剤を使用することであった（Ruiz, et al. 1988、Memoli, et al. 1999）。界面活性剤はすべて、CFIと混合すると封入薬物のいくらかの損失をきたし；放出薬物の量は添加する界面活性剤の濃度が高くなるにつれて増大した（図1）。これらの実験はすべて低張環境下で行い、これはリポソームの浸透膨潤を促進し、したがって界面活性剤のリポソームと相互作用する能力を増強すると考えられる。
【０１６６】
リポソームの新規製剤は、本発明者らの1年間の安定性試験で観察されたとおり、その構造的完全性を長期間維持する。CFIと低レベルのポリソルベート20との混合物のクライオTEM顕微鏡写真は、CFI単独と実質的に識別不能である（図3A〜3C）。3つの顕微鏡写真はすべて、主に直径50〜100nmの円形の単層リポソームを示す。最大0.2％までの、低濃度のポリソルベート20では、12.5mg/ml CFIのIVR放出速度に対しても意味のある効果ではないと考えられた（図4A）。
【０１６７】
これに対して、より高い濃度、例えば0.4％のポリソルベート20では、12.5mg/ml CFIのIVR放出速度に有意な増大があった（図4A）。加えて、第二のリポソーム群が出現し、これらはサイズ、形状、および層状態がCFIリポソームと同等であったが、シェーディングがより明るかった（図3D対3A）。0.4％ポリソルベート20と混合した12.5mg/mlリポソームシプロフロキサシンの場合の厳密な界面活性剤相互作用および薬物放出メカニズムには関係なく、封入薬物を保持するリポソームはCFI単独に比べてIVR放出プロファイルが改変されていると考えられる。このリポソーム-界面活性剤系について本発明者らが得た結果は、他の系に対して一般化しうる。
【０１６８】
別の興味深い結果は、リポソームに対する界面活性剤の一定の比でリポソームからのシプロフロキサシン放出量は均一ではないということであった（図2B）。代わりに、30mg/mlの最も高いCFI濃度では、95％よりも多くが封入されたままであったが、10mg/mlの最も低いCFI濃度では、56％だけが封入されたままであった。これはおそらく、水による希釈度が大きいため、30mg/ml CFI調製物に比べて10mg/ml CFIでは低張性が大きいことに関連している。リポソームの内側と外側との間で生じた浸透圧不均衡が、リポソームの浸透膨潤をもたらすと考えられる。浸透膨潤との界面活性剤の添加の組み合わせは、封入におけるより大きい損失との相乗作用をもたらすと考えられる（図2B対2A）。界面活性剤を30mg/ml CFIと混合し、平衡化させた後、界面活性剤対リポソームの比を一定に保って、水により3倍希釈しても、封入薬物のさらなる損失が大して起こらず、確実に10mg/ml CFIのレベルに近づくことはなかった（図2C）。最大0.2％までの、低濃度のポリソルベート20では、12.5mg/ml CFIのIVR放出速度に対して効果は大してないように見られ、膜透過性および充填はあまり撹乱されないことが示唆された（図4A）。しかし、0.4％ポリソルベート20を12.5mg/ml CFIに添加すると、IVRアッセイ法において封入薬物のより急速な放出につながった（図4A）。SPAN 20およびSPAN 80界面活性剤はポリソルベートよりもはるかに破損性が低かった。これに対して、疎水性ポリオキシプロピレン区分で構成され2つのポリオキシエチレン親水性鎖が隣接している、プルロニック界面活性剤は両方とも薬物封入に対してほとんど効果がなかった（図1）。
【０１６９】
治療的ニオソームを生成するための界面活性剤の使用は大いに注目されてきたが、薬物放出を調節するため、その物理化学的性質を意図的に改変するように界面活性剤をリン脂質小胞またはリポソームに添加した、文献における例はほとんどない。1つの試験において、ポリソルベート20、60、または80をダイズホスファチジルコリンに添加して、モデル薬物としてカフェインを含む単層小胞または多層状凝集物（MLV）が生成された（Fadda, Baroli et al. 1998）。放出プロファイルは溶液中のカフェインと同等であったため、界面活性剤が存在するかどうかにかかわらず、単層リポソームからのカフェインの持続放出はなかった（Fadda et al. 1998）。これに対して、単層リポソームを用いた本発明者らの試験では、少量のポリソルベート20または80の存在は放出速度に対して最小限の効果しかなかったが、より高いポリソルベート濃度はIVRアッセイ法においてより速い放出プロファイルを引き起こした。この試験における他の差別化因子は、その性質を改変するために界面活性剤をリポソーム製造中に添加したことであるが、本発明者らの試験では、界面活性剤を無傷の既存のリポソームに添加した。
【０１７０】
pH4.7および4.9調製物は、48時間以内にシプロフロキサシンの結晶を形成したpH5.5製剤とは対照的に、1年間の冷蔵保存後に良好な外観を保持していた。pH5.2製剤の外観は、いくつかの小さい粒子を示したが、それ以外はさらなる悪化を示すことはなかった。
【０１７１】
1つの予想外の知見は、pHの低下が封入の増大に関連しており、最も低いpHの製剤では封入が最大であることであった（表3）。この新規封入状態がいったん確立されると、1年間の冷蔵保存の経過中に変動することはなかった（表3）。調製後のpHの低下に伴い、小胞サイズのわずかな増大もあったが、1年間の冷蔵保存の経過を通してそれ以上の小胞サイズの変化はなかった（表2）。pH5.2および4.9のリポソーム-界面活性剤製剤のIVRプロファイルは、pH5.5製剤のものとほぼ同等であり（図4B）、12ヶ月の冷蔵保存を通してその改変放出プロファイルを保持した（図4C〜4D）。これに対して、pH4.7の界面活性剤-リポソーム製剤は、IVRアッセイ法においてはるかに速い放出プロファイルを有し（図4B）、これは1年間の冷蔵保存後に無変化のままであった（図4C〜4D）。
【０１７２】
多くのリポソーム生成物が、肺疾患を処置するための吸入投与を意図して開発された（Cipolla, et al. 2013b）。しかし、噴霧工程に左右されないと判明したものはほとんどない（Cipolla, et al. 2013a）。界面活性剤を含むリポソームは、噴霧に反応して、伝統的リポソームよりも歴史的にさらに安定性が低く、小胞サイズおよび/または封入の変化を伴った（Egle, et al. 2008、Elhissi, et al. 2012）。硫酸サルブタモールを含み、ダイズPC、ポリソルベート80、およびコレステロールで構成された超変形可能リポソーム製剤を、ジェット、超音波、およびメッシュ噴霧器で評価し、すべての組み合わせは薬物封入の顕著な損失および小胞サイズの変化を有することが判明した（Elhissi, et al. 2012）。シクロスポリンを含み、ダイズPCおよびポリソルベート80で構成されたリポソームを、メッシュ噴霧に曝露し、平均小胞サイズは噴霧前の51nmから噴霧後の107nmに倍増した（Egle, et al. 2008）。しかし、難溶性のシクロスポリン薬物は疎水性リポソーム二重層と結合したままであり、かつリポソーム小胞内に封入されなかったため、薬物封入における損失は報告されなかった（Behr et al., 2009）。本発明者らのリポソームシプロフロキサシン製剤は、ジェット噴霧に対して安定であり、小胞サイズまたは薬物封入の損失に意味のある変化を伴わないことがすでに明らかにされている（Cipolla et al. 2010、Cipolla et al. 2013a）。メッシュ噴霧後、0.4％ポリソルベート20を含有するリポソームシプロフロキサシン製剤は、平均小胞サイズのわずかな増大（数nm）を示し、薬物封入は70〜85％に標準化された（表6）。
【０１７３】
0.4％ポリソルベート20または0.2％ポリソルベート80を含有するリポソームシプロフロキサシン製剤は、改変された放出特性を有し（図4Bおよび4F）、いくつかの製剤は6ヶ月間の冷蔵保存およびメッシュ噴霧後にそのIVR特質を保持していることが判明した（図4E）。
【０１７４】
結論
界面活性剤-リポソームの相互作用は歴史的に、界面活性剤による生体膜の可溶化および崩壊の単純化モデルとして調査されてきた。これに対して、本発明者らの目標はリポソームの封入および放出特性を改変するために界面活性剤を用いることであった。広範な放出プロファイルを支持するために界面活性剤の添加によって改変しうる1つのリポソーム製剤を製造することができることは、それぞれ組成が異なりかつそれ自体の特有の放出プロファイルを有する、複数のバッチのリポソームの製造よりも、高い柔軟性を提供すると考えられる。リポソームシプロフロキサシン製剤を、様々な界面活性剤の添加によって改変した。これらの製剤を、クライオTEM撮像法によるリポソーム構造、動的光散乱による小胞サイズ、遠心ろ過による薬物封入、およびインビトロ放出性能に関して特徴決定した。低張環境下でのリポソームシプロフロキサシンへのポリソルベート20またはポリソルベート80の添加は、封入薬物の濃度依存的損失をもたらし、0.4％ポリソルベート20または0.2％ポリソルベート80よりも上では、改変されたインビトロ放出プロファイルももたらした。この試験は、リポソーム製剤の封入および放出特性は、適切な判断で選択された界面活性剤の添加とリポソームの浸透膨潤との組み合わせにより、製造後に改変することができ、処置する患者への個人化したアプローチを支持しうることを示す。
【０１７５】
生成物が「適時に適切量の薬物」を放出するように生成物を個人のニーズに合わせるための個人化した医療の目標に即して、この戦略は、所望の放出プロファイルの広範囲を包含するように、組成が異なる複数のバッチのリポソームを製造する代替法よりも柔軟性を提供する。
【０１７６】
リポソーム製剤の放出速度改変についてのこれらの試験は、治療を個人のニーズに合わせることの将来性に言及しているが、医療活動においてこれらの原理を適用するには他の段階が必要でありうることが理解される。個人化は製剤における比較的小さな質的変化を含み、その主な目的は各患者に対する処置の有効性および安全性を最適化するためにPKプロファイルを調節することであるため、このアプローチは基本的に異なる組成または製造工程を有する生成物の導入よりも調節がはるかに容易であると考えられる。別のハードルは、各患者に対する理想的な放出プロファイルをいかにして決定するかであると考えられる。答えは明らかに、取り組んでいる特定の疾患、送達中の治療法の性質、および個人化した療法を要求する患者の特質に依存しうる。薬物の合計量は患者の体質量に基づいて個別化され、かつ、所望の治療効果および可能性のある副作用に関して、各患者における、担体（リポソーム）のクリアランスの速度、担体からの薬物の放出速度、および薬物のクリアランスの速度に依存して、各患者に対する個人化が行われうる。例えば、患者からの痰試料が、より高い最小阻害濃度（MIC）を有する細菌株によるコロニー形成を示した場合、最も有効な処置は、リポソーム封入抗生物質の急速な放出プロファイルであり、抵抗性の高い病原体を良好に死滅させるための、肺における高いシプロフロキサシン濃度をもたらす。患者の身長、体重、年齢、性別、体質量、除脂肪体重、肥満指数、肺機能（FEV1、FVCなど）、腎クリアランス評価、肝機能評価、ならびに、痰試料中に存在するかまたは肺に定住している病原体、病原体の病原性、および、以前の処置経験および転帰を含む疾患の性質を含む、患者または疾患状態の他の特徴も評価することができる。選択した製剤は、患者が副作用を訴える場合、治療が無効である場合、新規微生物が出現した場合、または前述の任意の組み合わせの場合、医師および患者が治療の転帰を改善すると考えるものに変更してもよい。
【０１７７】
参照文献
下記のそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【国際調査報告】
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