(57)【要約】  本発明の対象は，式（I）に従ったヒアルロン酸の光反応性誘導体及びその調製方法であり，初めにグルコサミン環の６位で酸化したヒアルロン酸のアルデヒド誘導体を調製し，その後，還元剤の存在下で光反応性種を有するアミン，例えば１‐（２‐アミノエチル）ピリジン‐２（１Ｈ）‐オンと酸化誘導体を反応させて光反応性誘導体を形成する。調製した光反応性誘導体を，その後，光架橋してもよく，ここではその反応は［４＋４］光環付加に基づいている。更に本発明は加水分解安定性の増加及び吸収特性の向上を示し，最終用途の要件，更に組織工学，再生医療，薬剤若しくは製剤又は化粧品におけるその使用に従って，その物理特性を更に設計できる可能性を有するヒアルロン酸の３Ｄ架橋誘導体（式II）に関するものである。2016506422.tif 0000162016506422.tif 000017【選択図】図１，図２
2016506422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）に従ったヒアルロン酸の光反応性誘導体であって，式中，Ｒは水素又はアルカリ金属カチオンであることを特徴とする光反応性誘導体。
2016506422.tif 000014
【請求項２】
ヒアルロン酸又はその無機塩の分子量が１×１０４〜５×１０６の範囲内であることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の光反応性誘導体。
【請求項３】
初めにグルコサミン環の６位で酸化したヒアルロン酸のアルデヒド誘導体を調製し，その後，還元剤の存在下で光反応性種を有するアミンと酸化誘導体を反応させて前記光反応性誘導体を形成することを特徴とする請求項１又は２で定義した光反応性誘導体の調製方法。
【請求項４】
ヒアルロン酸のグルコサミン部分の６位におけるアルデヒドの選択的調製のために，非プロトン性媒体中の酸化剤デス・マーチンペリオジナンを使用するか，或いは水性媒体中のＮａＣｌＯを有するＴＥＭＰＯラジカルを使用することを特徴とする請求項３記載の調製方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸のアルデヒド誘導体が光反応性種を有するアミンのアミノ基と反応し，水性媒体又は水‐有機溶媒系中で還元剤ＮａＢＨ３ＣＮの存在下において１つの工程で直接第２級アミンへと還元されるイミンが形成されることを特徴とする請求項３又は４記載の光反応性誘導体の調製方法。
【請求項６】
光反応性種を有するアミンが１‐（２‐アミノエチル）ピリジン‐２（１Ｈ）‐オンであることを特徴とする請求項３〜５いずれか１項記載の光反応性誘導体の調製方法。
【請求項７】
酸化ヒアルロン酸のＤＳが１〜４０%の範囲内であり，請求項６記載の光反応性種を有する第２級アミンのＤＳが１〜４０%，好ましくは１５〜２０%の範囲内であることを特徴とする請求項３〜６いずれか１項記載の光反応性誘導体の調製方法。
【請求項８】
ヒアルロン酸のアルデヒド誘導体の１〜２重量%水溶液を調製し，１〜２当量の光反応性種を担持したアミンを添加した後，１〜３．５当量の還元剤ＮａＢＨ３ＣＮを添加し，式（I）に従った前記光反応性誘導体が形成されることを特徴とする請求項３〜７いずれか１項記載の光反応性誘導体の調製方法。
【請求項９】
請求項１又は２で定義した光反応性誘導体を波長２８０〜３１５nmの電磁放射線に暴露することを特徴とするヒアルロン酸の３Ｄ架橋誘導体の調製方法。
【請求項１０】
前記光反応性誘導体が粉末，凍結乾燥物，薄膜，ナノファイバー又はマイクロファイバー構造の形態であることを特徴とする請求項９記載の調製方法。
【請求項１１】
式（II）に従ったヒアルロン酸の３Ｄ架橋誘導体。
2016506422.tif 000015
【請求項１２】
組織工学，再生医療，医療機器又は化粧品のための請求項１１で定義した３Ｄ架橋誘導体の使用。
【請求項１３】
骨格，充填剤，薬物担体，特に軟骨細胞，繊維芽細胞，神経細胞等のタイプの幹細胞又は分化細胞の細胞増殖用の支持ナノ又はマイクロ構造，表面創傷のために生物学的活性物質の放出を制御できる生分解性絆創膏の製造用，フェイシャルマスクの製造用のナノ又はマイクロ構造の調製，又は，保護効果又は再生効果を有するサンローションへの添加剤としての，請求項１２で定義された３Ｄ架橋誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光化学的架橋によって調製されたヒアルロン酸の３Ｄ構造の調製に関する。その方法論はヒアルロン酸のポリマー鎖に組み込まれた好適な発色団の分子間光環付加又は光二量化反応に基づいている。光反応は不活性雰囲気ではない状態で行い，反応は，有機溶媒の使用の必要がなく，所望の生成物に必要な単離工程又は副産物の処理もせずに室温で空気中において進行する。光科学的反応の生成物はヒアルロン酸ポリマー鎖に結合した低分子発色団の二量体構造（所謂，架橋）である。これらの手段によりヒアルロン酸の３Ｄ架橋構造の形成が確実になり，それは水媒体中で，初期材料より大幅に低い溶解度及び高い安定性を示す。
2016506422.tif 000003
スキーム１：ヒアルロン酸分子に組み込まれた発色団及び二炭素リンカー１‐（２‐アミノエチル）ピリジン‐２（１Ｈ）‐オン（ＡＥＰ）
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの天然ヘテロ多糖であり，β（１→３）及びβ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合により互いに結合したＤ‐グルクロン及びＮ‐アセチル‐Ｄグルコサミンサブユニットから成る。ヒアルロン酸は多数の結合組織，滑液，皮膚及び軟骨において自然発生する（Smeds K.A., Grinstaff M.W. 2001年.J Biomed Mater Res 54:115）。ヒアルロン酸は酵素分解しやすく（Burdick J.A., Chung C., Jia X., Randolph M.A.及びLanger R.2005年.Biomacromolecules 6:386），組織の水和，細胞分化（Park Y.D., Tirelli N., Hubbell J.A.2003年.Biomaterials 24:893），創傷治癒（Leach J.B.及びSchmidt C.E.2003年.Biotechnol Bioeng.82:578），血管形成（Leach J.B.及びSchmidt C.E.2005年.Biomaterials 26:125），及び慢性疾患の治療（Jia X.Q.,Burdick J.A., Kobler J., Clifton R.J., Rosowski J.J., Zeitels S.M., Langer R.2004年.Macromolecules 37:3239）において重要な役割を担う。
【０００３】
ヒアルロン酸は特に組織工学においてバイオマテリアルの応用の観点から興味深い。ポリマー構造中の官能基（ＯＨ，ＣＯＯＨ）は，その後の化学的誘導体化を可能にし（例えば，選択的酸化，Buffa R., Kettou S.及びVelebny V.,PV 2009年‐835,2009年‐836），これにより化学的（Burdick J.A.及びPrestwich D.G. 2011年. Adv Mater 23,H41）又は光化学的架橋が起こり，加水分解に安定な共有結合が生じる（Seidlits S.K., Khaing Z.Z., Petersen R.R., Nickels J.D., Vanscoy J.E., Shear J.B., Christine E. Schmidt Ch.E.2010年.Biomaterials 31:3930）。
【０００４】
ＨＡの光環付加反応
マクロマーＨＡ鎖を架橋させる最も頻繁に使用されている光化学反応の１つに，所謂［２+２］光環付加又は［２+２］光二量化がある。これら２つの分子間反応中では，２つの不飽和π結合から飽和σ結合への形質転換が起こり，側鎖が生体高分子構造に結合している四員シクロブタン環（架橋）が形成される（スキーム２）。
2016506422.tif 000004
スキーム２：２つのオレフィンの［２＋２］光環付加を介したシクロブタン環形成の一般スキーム
【０００５】
多糖の場合，共役二重結合を含む発色団が多く存在し，これらはＵＶ光により励起されて［２＋２］光環付加を受ける。これらの光反応性化合物には：アクリル酸，メタクリル酸，フリルアクリル酸，チエニルアクリル酸，フマル酸，マレイン酸，ソルビン酸，そのｐ‐アミノ誘導体を含む桂皮酸，マレインイミドとそのアルキル及びアリール誘導体，ピリミジン塩基（ウラシル，チミン及びシトシン），ピラン‐２‐オン，クマリン，ソラレン，トランス‐カルコン，トランス‐スチルベンとそのメトキシル誘導体，並びに第四ピリジニウム塩（トランス‐４‐スチリルピリジニウムハロゲン化物）が挙げられる。
【０００６】
［２＋２］光環付加反応の応用
生化学工業株式会社（日本）の複合的な特許（Matsuda T., Moghaddam m.J, Sakurai K.1993年,EP0554898B1）が１９９３年に公開された。著者らは光反応性ヘテロ多糖，特にヒアルロン酸を含むＧＡＧ（英国のグルコサミノグリカン由来）の調製を報告した。心臓形態形成に桂皮酸をベースとする光化学的に架橋したヒアルロン酸を使用することを試みた。
【０００７】
特許（Motani Y.,生化学工業株式会社,日本,1997年,EP0763754A2）において，著者らはトランス‐桂皮酸で置換したヒアルロン酸の誘導体を提供している。コンタクトレンズに３Ｄ架橋生成物を使用した。その架橋誘導体は眼球の表面上に使用可能な透明で小型のハイドロゲルであった。著者らは使用材料の形態安定性，付着防止特性，明確な機械特性及び吸収特性（ゲル体積の２０〜９９%が水をベースとしている）を主張している。
【０００８】
特許文献（Waki M.及びMotani Y.,生化学工業株式会社,日本,2000年,US006025444）ではトランス‐桂皮酸の使用が開発され，最適化されている。著者らは，ヒアルロン酸構造においてトランス‐桂皮酸の反応性が低い理由をうまく説明している。競合する光化学反応‐光異性化を理由付けている。著者らによれば，ヒアルロン酸の選択された光反応性誘導体の濃度は，生じた光環状付加物と光化学的に不活性な桂皮酸のシス‐異性体の形態のその競合物との比率に大きく影響を及ぼした。
【０００９】
複合的な特許出願（Sato T.,2003年,生化学工業株式会社,日本,EP1607405B1）では，２つの光反応基，トランス‐桂皮酸及びピリミジン塩基‐チミンを主張している。著者らは生体高分子の凍結光反応性誘導体の照射により，或いは照射液へのキレート剤や洗浄剤の添加により幹細胞の増殖に好適な骨格が形成されるとして進歩性を主張している。
【００１０】
２００６年，ヒアルロン酸と結合したトランス‐桂皮酸の光化学分野で，特許（Miyamoto K., Kurahashi Y.,生化学工業株式会社，日本，2006年,EP1217008B1）が与えられた。著者らは光化学反応中，アルカリ条件を利用した実験において進歩性を見出した。向上させた反応pH（７．２〜１１．０），理想的には（７．５〜１０．０）はヒアルロン酸の溶解度（親水性）及びその二次及び三次構造の性質にも重要な影響を及ぼした。これにより，光反応基の自己集合の効率が大幅に増加し，それに続いて量子収量が高まった。
【００１１】
特許文献（Miyamoto K., Yasuda Y.,生化学工業株式会社，日本，2008年．EP1905456A1，国際出願，2007年,W02007/004675）は共有結合的に組み込まれた薬物（好ましくは消炎剤）を含有するトランス‐桂皮酸由来のＨＡの光反応性誘導体を提供している。ヒアルロン酸誘導体のゾル‐ゲル転移，及び得られたハイドロゲルのパラメーターは，圧力（０．５〜５kg/cm2）での器官への皮下投与（針：２０〜２５）で薬物が投与部位で経時計画的に放出されたことを反映していた。薬物は特に，ナプロキセン，イブプロフェン，フルビプロフェン（flubiprofen），フェルビナク，エトドラク又はアクタリットなどの非ステロイド炎症剤（ＮＡＩＤ）であった。
【００１２】
国際特許出願（Francotte E.,CIBA‐Geigy,CH,1996年.WO96/27615 特許ファミリー:2000年,US6011149;2002年,EP08137546B1）は，カラムクロマトグラフィーがアノマー混合液を効率的に分離するための新たな固定相の設計分野において，［２＋２］光環付加反応の興味深く有用な用途を提供する。著者らは，カルバマート結合により必要なキラル情報を有する多糖鎖に結合した置換マレインイミドの二量体化反応を紹介した。当該特許はセルロース，アミロース，キトサン，デキストラン，キシラン又はイヌリンなどの数種の多糖を主張している。
【００１３】
１９８９年からの包括的な刊行物（Katritzky A.R., Dennis N.,1989年.Chem Rev 89:827）は，６員複素環化合物の環状付加反応の（光）化学を詳細に論じている。著者らは元の文献を参照して，窒素塩基，並びにキノリン‐１‐酸化物，ピラン‐２‐オン，クマリン，置換クロモン，ジヒドロピリジン及びジヒドロピラン‐２，４‐ジオン由来の他の発色団の［２＋２］光環付加反応の範囲を報告した。
【００１４】
光二量化反応の分野において，ピリミジン塩基（シトシン，チミン，ウラシル）の応用に多大な努力が注がれ，（Grasshoff J.M, Taylor D.L., Warner N., Polaroid corporation, UK,1995年.US5455349）；（Matsuda  T., Nakao H.,生化学工業株式会社,日本,2000年.US6075066);(Sato T., 生化学工業株式会社,日本,2003年.EP1369441A1）；（Warner J.C.,Morelli A.,Ku M.Ch., University of Massachusetts, 2005年.US20050266546A1);(Warner J.C., Cannon A.S., Raudys J., Undurti A., University of Massachusetts,2009年.US7550136）など多数の特許が付与された。それらの応用は化粧品産業，光学，組織工学及び再生医療の分野が対象であった。
【００１５】
［２＋２］光環付加により，生成物として飽和シクロブタン環（二重結合の無い４員）が生じ，ここでは更なる化学修飾は起こり得ず，その構造は生物学的原動力とはならない。それに対して，［４＋４］光環付加を含む本発明は独創的であり，いくつかの利点がもたらされる。［４＋４］光環付加により，生成物として不飽和β‐ラクタム環（二重結合の無い８員）がもたらされ，これは更に化学修飾することが可能である。更に，シクロオクタジエン架橋は架橋構造に導入された興味深い生物学的原動力と考えられる（Holten K.B., Onosuko  E.M. 2000年.,American Family Physician 62:611;Elander R.P.,2003年.Applied Microbiology and Biotechnology 61:385）。
【００１６】
光二量化手法に基づいた他のアプローチと比べて，［４＋４］光環付加の別の利点は形成された架橋の特有な構造にある。４員環及び飽和シクロブタン環のみが形成される［２＋２］光環付加反応とは対照的に，上記の性質は２つの多重結合を含む８員環の形成を可能にする。架橋中の単離された二重結合は，追加的化学修飾（酸化，還元又は付加）に容易に利用できる。これまで［４＋４］光環付加はヒアルロン酸の光化学架橋に利用されてこなかった。上記の［４＋４］光環付加は固定相で進行するため，溶媒，反応混合液の脱気，試料の複雑な調製を必要とせず，濃度又は粘度などの溶液パラメーターに依存しない。提供した手法の大きな利点としては，反応に毒性溶媒を使用しないこと，反応の選択性が高いこと，不活性雰囲気も最終生成物の単離も必要としないことが挙げられ，コストを大幅に削減し，実験自体が促進される。更に，工程の効率が大幅に高まる（単離，分離，精製，廃棄物の量）。工業的な観点からこれらの要素は非常に望ましい。
【００１７】
また，本発明に従った重要な革新性は，２‐ピリドンをベースとする光反応基の性質でもある。発色団の多くは酸素に対する感受性が高く，望ましくないオゾン分解が生じやすくなるか，或いは非常に反応性の高い基が形成されて生体高分子が光分解される。従ってこのような場合では，光化学反応は自由に空気雰囲気に開放して実行することができない。最初に，反応混合液の脱気（脱酸素）をした後に不活性雰囲気の流れを確実にしなければならず，そのようにして初めて光化学反応自体の進行が可能となる。酸素への感受性がないことから，本発明の光反応基にはこのような事前準備は必要ない（Sieburth S.M, Cunard T.N.,1996年. Tetrahedron 52:6251;Dilling W.L., Mitchell A.B.,1973年.Mol.Photochem.5:,371:Matsushima R., Terada K.  1985年.J.Chem.Soc. Perkin Trans.2,1445)。その安定性は二重結合の分解への感受性を大幅に減少させるその共役を反映している。すなわち，本発明に従った解決策は，多糖の光架橋の技術水準と比較して，大幅に簡略化され，経済的により有利なものとなる。
【００１８】
発明の対象
本発明の対象は［４＋４］光環付加に基づくヒアルロン酸の光反応誘導体の光架橋方法である。これらの反応は横方向の結合（架橋）を形成し，それによりヒアルロン酸の架橋構造を形成することができる。光二量化手法に基づく他の解決策と比較して，［４＋４］光環付加の別の利点は，形成された架橋構造の性質にある。４員飽和シクロブタン環のみが形成される［２＋２］光環付加反応と対照的に，前記性質により２つの多重結合を含む８員環が形成される。このような構成の単離二重結合は追加的化学修飾（酸化，還元又は付加）に容易に利用できる。
【００１９】
更に，光反応基としての２‐ピリドンの使用は，大気酸素にはそれほど感受性を示さず，よって他の発色団と比較して実験的な実現がかなり簡単になる。その理由は，この複素環の共鳴に起因する共役多重結合のπ‐電子の部分的非局在化にある。当然ながら，本発明は２‐ピリドンとその誘導体だけに限定されるものではない。有用である可能性が高い発色団には例えばアクリジジニウム塩，アントラセン，２‐ピロン，ベンゾフラン等が挙げられる。
【００２０】
ヒアルロン酸の光架橋誘導体は，その物理特性が向上されていることが特徴であり，加水分解安定性が高まることや，水性媒体中への溶解性が限定的であることが挙げられる。更にそれは水性媒体中で膨張し，ハイドロゲルや不溶性粒子を形成し，吸着特性を示し，液体，染料，場合により生物学的活性物質の保持を確実にすることが特徴的である。
【００２１】
ヒアルロン酸の３Ｄ架橋生成物の形成に関する提供されたアプローチは，３工程（スキーム３）から構成される。ヒアルロン酸の光反応性誘導体の調製は，その酸化形態（工程１，スキーム３）及び標的発色団を有するアミンから出発する。反応混合液中で，加水分解に不安定なイミンが形成され，原位置で水素化物により，加水分解に安定的な第二級アミンへと直接還元される（工程２，スキーム３）。このために，２‐ピリドン（１‐（２‐アミノエチル）ピリドン‐２（１Ｈ）‐オン）（以下，ＡＥＰと省略）のＮアルキル化誘導体を２‐（Ｂｏｃ‐アミノ）臭化エチルでピリジン‐２（１Ｈ）‐オンを選択的Ｎ‐アルキル化することにより合成した。最終工程は，調製したＨＡ誘導体の光架橋自体（工程３，スキーム３）であり，３Ｄ架橋生成物が形成される。架橋はＵＶＢ光で開始し，固相で，すなわち溶媒，化学触媒又は不活性雰囲気の無い状態で行う。この種の光反応は［４＋４］光環付加又は［４＋４］光二量化に分類される。
2016506422.tif 000005
スキーム３：本発明の合成手法
【００２２】
本発明は特に，式（I）に従ったヒアルロン酸の光反応性誘導体に関し，式中，Ｒは水素又はアルカリ金属カチオンである。
2016506422.tif 000006
【００２３】
ヒアルロン酸又はその無機塩は，１×１０４〜５×１０６の範囲内の分子量を有する。
【００２４】
本発明は更に式（I）に従った光反応性誘導体の調製方法に関し，初めにグルコサミン環の６位で酸化したヒアルロン酸のアルデヒド誘導体を調製し，その後，還元剤の存在下で光反応性種を有するアミンと酸化誘導体を反応させて前記光反応性誘導体を形成する。ヒアルロン酸のグルコサミン部分の６位におけるアルデヒドの選択的調製は，非プロトン性媒体中の酸化剤デス・マーチンペリオジナン又は水性媒体中のＮａＣｌＯを有するＴＥＭＰＯラジカルを用いて行われてもよい。次に，ヒアルロン酸のアルデヒド誘導体が光反応性種を有するアミンのアミノ基（すなわち，結合された二炭素リンカーを有する発色団）と反応し，水性媒体又は水‐有機溶媒系中で，還元剤ＮａＢＨ３ＣＮの存在下において１つの工程で直接第２級アミンへと還元されるイミンが形成される。光反応性種を有するアミンは１‐（２‐アミノエチル）ピリジン‐２（１Ｈ）‐オンでもよい。
【００２５】
他の態様では，本発明は式（I）に従った光反応性誘導体を波長２８０〜３１５nmの電磁放射線により処理されるヒアルロン酸の３Ｄ架橋誘導体の調製方法に関する。光反応性誘導体は，粉末，凍結乾燥物，薄膜，ナノファイバー又はマイクロファイバー構造の形態であってもよい。
【００２６】
更に本発明は，式（II）に従ったヒアルロン酸の３Ｄ架橋誘導体，並びに，組織工学，再生医療，医療機器又は化粧品のためのその使用に関する。
2016506422.tif 000007
【００２７】
したがって，調製された３Ｄ架橋誘導体は，加水分解安定性の増加及び吸収特性の向上を示し，実際の複合的な必要性に応じてその物理特性を更に設計する余地を提供する。これは例えば，組織工学（骨格，充填剤，薬物送達システム），再生医療（細胞−例えば軟骨細胞，繊維芽細胞，神経細胞等の幹細胞又は分化細胞の増殖用の支持ナノ又はマイクロ構造）のための個々の用途，創傷治療の用途（ナノ又はマイクロ構造，織布，編地は，表面創傷のために生物学的活性物質の放出を制御できる生分解性絆創膏の製造に使用し得る）及び化粧品における広範な用途（例えば，フェイシャルマスクの製造，保護効果又は再生効果を有するサンローションへの添加剤）を示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＵＶ照射前のヒアルロン酸の１種類の光反応性誘導体（Ｍｗ＝２５kDa，ＤＳ＝１８%）における３種の異なる形態の比較を示す。ＰＢＳ中，２０℃での４８時間の膨張後の光架橋誘導体（ｔ＝１h，Ｅ＝２３４００mJ・cm-2）のＳＥＭ分析の顕微鏡写真。Ａ上段‐薄膜（Ｔ）：範囲：２mm，５００μm，２μm。中段‐凍結乾燥物（Ｌ）：範囲（５００，５０，１０）μm。Ａ下段‐ナノファイバー層（Ｎ）：範囲：（５００，５０，１０）μm。
【図２】ナノファイバー層の形態のヒアルロン酸の光反応性誘導体（２５kDa，ＤＳ＝１８%）のＳＥＭ分析の顕微鏡写真を示し，範囲は１０μm，倍率は３．２２kx（k＝１０００），繊維径は１８９±５０nmである。
【図３】水中で（１時間）膨張したナノファイバー層の形態の凍結乾燥させたヒアルロン酸の光架橋誘導体（２５kDa，ＤＳ＝１８%，ｔｅｘｐ＝１ｈ，Ｅ＝２３４００mJ・cm-2）のＳＥＭ分析の顕微鏡写真を示し，スケールは２０μm，倍率は２．０２kxである（左）。詳細図では，スケールは５μm，倍率は５．５４kx，繊維径は３１４±２０２nmである（右）。
【図４】ヒアルロン酸の光反応性誘導体（Ｍｗ＝３４kDa，ＤＳ＝２０%）の環境における３Ｔ３線維芽細胞の細胞生存率試験の結果を示す。時間Ｔ＝０h（１００%）の対照と比較している百分率で表した増殖曲線。５回繰り返したＭＴＴ法による評価，ｎ＝６。
【図５】３Ｔ３線維芽細胞の細胞生存率に対するＵＶＡ（３１５〜３８０nm）の影響の試験結果を示す。陽性（アントラセン）及び陰性（ＳＤＳ）対照。３回繰り返したＭＴＴ法による評価，ｎ＝３。物質の濃度：アントラセン（１〜３０μg/ml），ＳＤＳ（１〜１５μg/ml），添加物の無い対照（１００%）。
【図６】３Ｔ３線維芽細胞の細胞生存率に対するＵＶＡ（３１５〜３８０nm）の影響の試験結果を示す。５回繰り返したＭＴＴ法による評価，ｎ＝５。光反応性誘導体（Ｍｗ＝３４kDa，ＤＳ＝２０%）の濃度＝１，３，３０，１００，５００，１０００，５０００μg/ml，誘導体の無い対照（１００%）。
【図７】１mgの試料に対するヒアルロン酸の光架橋誘導体（Ｍｗ＝３４kDa，ＤＳ＝２０%）の酵素分解を示し，当量のグルコースヘミアセタールで表している。
【００２９】
実施例
ＤＳはＮＭＲ（核磁気共鳴）により測定し，以下の関係式に従って計算した：ＤＳ＝置換度＝１００%＊  結合した置換基のモル量／全多糖二量体のモル量。計算はグルコサミンサブユニットの６位ある２つのジアステレオトピックな水素のシグナルの積分値の相対比から行い，これはＮアセチル基の積分に対して改善が加えられていることが特徴的である。ＴＥＭＰＯラジカルは２，２，６，６‐テトラメチルピペリジニルオキシ基である。
【００３０】
試料のＮＭＲスペクトルはＤ２Ｏ又はＣＤＣｌ３中，BRUKER AVANCE 500MHz装置で測定した。化学シフトは３‐トリメチルシリルプロパン酸（ＴＳＰＡ）の重水素化ナトリウム塩の内部標準に調整した。データはソフトウエアBruker TOPSPIN1.2又はソフトウエアSpinworks3.1.7で処理した。
【００３１】
特段の指示が無ければ，本明細書で使用の用語「当量（eq）」はヒアルロン酸の二量体に対するものである。特段の指示が無ければ，百分率は重量百分率として使用する。
【００３２】
初期のヒアルロナン（ソース：コンティプロ  ビオテック  スポレチノスト  エス  ルチェニム  オメゼニム(Contipro Biotech s.r.o)，ドルニ  ドブロウク，チェコ）の分子量はＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳで測定していた。
【００３３】
ＦＴ‐ＩＲスペクトルは，Nicolet6700FTIRスペクトロメーターによりＫＢｒ錠剤又は薄膜の形態で，４０００〜４００cm-1の範囲内で測定した。
【００３４】
ＵＶ‐ＶＩＳスペクトルは２００〜８００nmの範囲内でShimadzu UV‐2401PC装置で測定し，UV Probeソフトウエア，バージョン2.00で処理した。
【００３５】
凍結乾燥させた試料の表面形状を走査電子顕微鏡Tescan VEGA II LSUで調査した。試料は２０℃で測定し，VegaTC3.5.2.1ソフトウエア（１０kV，作動距離３．４mm，倍率１０００〜２０kx）で評価した。
【００３６】
方法Ａ〜Ｃに従って，UV Crosslinker CL‐1000M（３０２nm，６．７５mW/cm2）を使用して光架橋を行った。
【００３７】
実施例１  ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
乾燥ＤＭＳＯ中の酸形態のヒアルロン酸の２%溶液（２．０g，５．２９mmol，Ｍｗ＝２７０kDa）を調製する。得られた溶液にＤＭＰ（１．９１g，４．４９mmol）を添加し，反応混合液を５時間撹拌する。その後，ＥｔＯＨ（３ml）を添加する。生成物を限外濾過し，凍結乾燥する。
2016506422.tif 000008
スキーム４：デス‐マーチンペリオジナンによるヒアルロン酸の酸化
ＤＳ＝２０%，Ｍｗ＝３４kDa，単離収率９１%
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ５．２６（ｓ，１Ｈ，ポリマー‐ＣＨ（ＯＨ）２）ppm‐ジェミナルジオール（水和アルデヒド）
ＨＳＱＣ（Ｄ２Ｏ）クロスピーク  δ５．２６ppm（１Ｈ）‐９０ppm（１３Ｃ）ポリマー‐ＣＨ（ＯＨ）２
ＦＴ‐ＩＲ（ＫＢｒ）  １７４０cm-1  ‐ＣＨ＝Ｏ
【００３８】
実施例２  Ｔｅｍｐｏ／ＮａＯＣｌによるヒアルロン酸の酸化
ヒアルロン酸の２%（aq）溶液（５．０g，１２．５０mmol，Ｍｗ＝９５０kDa）を調製する。ＮａＢｒ（６４２．５mg，６．２５mmol）及びＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（９．７１g，２７．１２mmol）を添加する。反応混合液を室温で１５分間撹拌する。反応混合液を５℃まで冷却する。次いで，４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（２６．７mg，０．１３mmol）及びＮａＣｌＯ溶液（１．４７ml，６．２５mmol）を添加する。反応混合液を５℃で２時間撹拌する。その後，ＥｔＯＨ（７．２９ml，１２５．０mmol）を添加する。生成物を限外濾過し，凍結乾燥する。
2016506422.tif 000009
スキーム５：ＮａＣｌＯ存在下でのＴｅｍｐｏラジカルによるヒアルロン酸の酸化
ＤＳ＝８%，Ｍｗ＝２８８kDa，単離収率８２%
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ５．２６（ｓ，１Ｈ，ポリマー‐ＣＨ（ＯＨ）２）ppm
ＨＳＱＣ（Ｄ２Ｏ）クロスピーク  δ５．２６ppm（１Ｈ）‐９０ppm（１３Ｃ）ポリマー‐ＣＨ（ＯＨ）２
ＦＴ‐ＩＲ（KBr）  １７４０cm-1  ‐ＣＨ＝Ｏ
【００３９】
実施例３  １‐（２‐アミノエチル）ピリジン‐２（１Ｈ）‐オン（ＡＥＰ）の合成，２‐（Ｂｏｃ‐アミノ）臭化エチルによるピリジン‐２（１Ｈ）‐オンのＮ‐アルキル化
撹拌子，冷却器及び不活性ガス入りバルーンを備えた三つ口フラスコに入った２mlのＥｔＯＨ（乾燥）にピリジン‐２（１Ｈ）‐オン（１００．０mg，１．０５１mmol）を溶解する。溶液にＫＯＨ（６６．１mg，１．１８２mmol）を添加し，反応混合液を３０分撹拌する。その後，２‐（ｂｏｃ‐アミノ）臭化エチル（３１３．３mg，１．３９８mmol）を添加する。反応混合液を５時間還流する。溶液を真空ロータリーエバポレーターで蒸発させる。蒸発残留物を１０mlのＣＨＣｌ３に溶解する。溶液にＮＨ４ＯＨの２５%溶液（１０ml）を添加する。有機相をＨ２Ｏ（２×５ml）及び（通常使用する）かん水（１×５ml）で洗浄する。それをＭｇＳＯ４で乾燥し，濾過し，溶媒を真空ロータリーエバポレーターで蒸発させる。生成物を，勾配（ＭｅＯＨ，ＣＨＣｌ３）によりＳｉゲルのカラムクロマトグラフィーで単離する。
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スキーム６：ピリジン‐２（１Ｈ）‐オンのアルキル化
Ｎ‐アルキル生成物：tert‐ブチル２‐（２‐オキソピリジン‐１（２Ｈ）‐イル）エチルカルバマート，Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ３，Ｍｗ＝２３８．２８３g/mol，無色結晶，ＲＦ（ＴＢ‐１６‐Ｆ２）＝０．７０（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ／９：１），単離収率＝４１%，１Ｈ  ＮＭＲ（５００MHz，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０；６．６；２．１Hz，１Ｈ），７．２４‐７．２６（ｍ；１Ｈ）；６．５４（ｄ；Ｊ＝９．０Hz；１Ｈ）；６．１６（ｔ；Ｊ＝６．６Hz；１Ｈ）；５．１３（ｂｓ；１Ｈ）；４．０７（ｔ；Ｊ＝６．０Hz；２Ｈ）；３．４２（ｑ；Ｊ＝６．０Hz；２Ｈ）；１．３９（ｓ；９Ｈ）ppm
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５MHz；ＣＤＣｌ３）：δ＝１６２．９；１５６．１；１３９．８；１３８．２；１２０．８；１０６．２；７９．５；４９．３；３９．８；２８．３（３Ｃ）ppm
Ｏ‐アルキル生成物：tert‐ブチル２‐（ピリジン‐２‐イルオキシ）エチルカルバマート；Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ３；Ｍｗ＝２３８．２８３g/mol；無色粘性油；ＲＦ＝０．８０（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ／９：１）；単離収率＝５%；
１Ｈ  ＮＭＲ（５００MHz；ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１２（ｄｄ；Ｊ＝４．９；１．５Hz；１Ｈ）；７．５５‐７．５８（ｍ；１Ｈ）；６．８５（ｄｄｄ；Ｊ＝５．９；５．１；０．７Hz；１Ｈ）；６．７２（ｔ；Ｊ＝８．４Hz；１Ｈ）；４．９５（ｂｓ；１Ｈ）；４．３６（ｔ；Ｊ＝５．２Hz；２Ｈ）；３．４５（ｑ；Ｊ＝５．２Hz；２Ｈ）；１．４４（ｓ；９Ｈ）ppm
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５MHz；ＣＤＣｌ３）：δ＝１６３．５；１５５．６；１４６．９；１３８．７；１１６．９；１１０．９；８１．１；６５．０；４０．２；２７．８（３Ｃ）ppm
【００４０】
実施例４  tert‐ブチル２‐（２‐オキソピリジン‐１（２Ｈ）‐イル）エチルカルバマートの脱保護
Ｎ２の不活性雰囲気下でＢｏｃ‐アミン（４３．０mg，０．１８０mmol）をジクロロメタン（３００μl）に溶解する。ＴＦＡ（２７５μl，３．６mmol）を添加し，反応混合液を室温で２時間撹拌する。過剰量のトリフルオロ酢酸（ｂ．ｐ．＝７２．４℃）及びジクロロメタンを真空ロータリーエバポレーターで蒸発させ，蒸発残留物をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で中和する。２mlのＣＨＣｌ３を水溶液に添加する。抽出物をＨ２Ｏ（１×２ml）及びかん水（１×２ml）で洗浄し，ＭｇＳＯ４で乾燥する。反応混合液を濾過し，真空ロータリーエバポレーターで蒸発させる。
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スキーム７：tert‐ブチル２‐（２‐オキソピリジン‐１（２Ｈ）‐イル）エチルカルバマートの脱保護
１‐（２‐アミノエチル）ピリジン‐２（１Ｈ）‐オン，Ｃ７Ｈ１０Ｎ２Ｏ，Ｍｗ＝１３８．１６７g/mol，帯黄色の液体；ＲＦ＝０．１８（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ／１：１）；単離収率＝８０%，
１Ｈ  ＮＭＲ（５００MHz；Ｄ２Ｏ）：δ＝７．６５‐７．６８（ｍ；２Ｈ）；６．６６（ｄ；Ｊ＝９．５Hz；１Ｈ）；６．７２（ｄｔ；Ｊ＝６．８；１．２Hz；１Ｈ）；４．０９（ｔ；Ｊ＝６．１Hｚ；２Ｈ）；２．９９（ｔ；Ｊ＝６．１Hz；２Ｈ）ppm
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５MHz；Ｄ２Ｏ）：δ＝１６７．１；１４５．２；１４２．２；１２２．０；１１２．２；５５．１；４２．４ppm
【００４１】
実施例５  ２当量のＡＥＰでの還元的アミノ化，生体高分子への発色団の導入
酸化形態のヒアルロナン（１００．０mg，０．２６５mmol，ＤＳ＝２０%，Ｍｗ＝３４．４kDa）を１０mlの蒸留水に溶解する（１%溶液）。前記溶液にＡＥＰ（１４．６mg，０．１０６mmol，２当量）を添加する。反応混合液を２時間撹拌する。その後，ＮａＢＨ３ＣＮ（２６．５mg，０．４２５mmol）を添加し，反応混合液を更に１２時間撹拌する。最終溶液を透析し，凍結乾燥する。
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スキーム８：還元的アミノ化‐ヒアルロン酸構造への発色団の導入
ＤＳ＝１６%；Ｍｗ＝３４kDa；単離収率６５%
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ＋ＮａＯＤ）  δ２．７８（ｂｓ；１Ｈ；ポリマー‐Ｈ６ａ）；２．９９（ｂｓ；１Ｈ；ポリマー‐Ｈ６ｂ）；２．９４‐３．００（ｍ；２Ｈ；‐ＮＨＣＨ２‐）；４．１３‐４．１７（ｍ；２Ｈ；‐ＮＣＨ２‐）；６．５８（ｂｓ；１Ｈ；Ｈｈｅｔａｒ）；６．６６（ｂｓ；１Ｈ；Ｈｈｅｔａｒ）；７．６４‐７．７０（ｍ；２Ｈ；Ｈｈｅｔａｒ）ppm，
Ｈ‐Ｈ  ＣＯＳＹ（Ｄ２Ｏ＋ＮａＯＤ）  クロスピーク  δ２．７８‐２．９９；３．００‐４．１６；６．５８‐７．６５；６．６６‐７．６９ppm
ＨＳＱＣ（Ｄ２Ｏ＋ＮａＯＤ）  クロスピーク  δ２．７８（１Ｈ）‐４９．０（１３Ｃ）；２．９９（１Ｈ）‐４９．０（１３Ｃ）；３．００（１Ｈ）‐４７．４（１３Ｃ）；４．１６（１Ｈ）‐５０．０（１３Ｃ）；６．５８（１Ｈ）‐１１０．２（１３Ｃ）；６．６６（１Ｈ）‐１１８．１（１３Ｃ）；７．６９（１Ｈ）‐１３６．４（１３Ｃ）；７．６５（１Ｈ）‐１４５．０（１３Ｃ）ppm
ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ＋ＮａＯＤ）  
ｌｏｇＤ（２．０３ppm；Ｍｅ‐ＣＯ‐ＮＨ‐ポリマー）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（２．７８ppm；ポリマー‐Ｈ６ａ）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（２．９９ppm；ポリマー‐Ｈ６ｂ）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（３．００ppm；‐ＮＨＣＨ２‐）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（４．１６ppm；‐ＮＣＨ２‐）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（６．５８ppm；Ｈｈｅｔａｒ）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（７．６５ppm；Ｈｈｅｔａｒ）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（７．６５〜７．６９ppm；Ｈｈｅｔａｒ）〜−１０．４５m2/s
ｌｏｇＤ（４．７２ppm；Ｈ２Ｏ）〜−８．６m2/s
ＦＴ‐ＩＲ（ＫＢｒ）  １６５４cm-１  Ｎｈｅｔａｒ‐Ｃ＝Ｏ
ＵＶ／ｖｉｓ（０．００５%；Ｈ２Ｏ）  λｍａｘ＝２９９nm；ｎ→π＊  Ｎｈｅｔａｒ‐Ｃ＝Ｏ
【００４２】
実施例６  １当量のＡＥＰでの還元的アミノ化
酸化形態のヒアルロナン（１００．０mg，０．２６５mmol，ＤＳ＝８%，Ｍｗ＝２８８kDa）を１０mlの蒸留水に溶解する（１%溶液）。前記溶液にＡＥＰ（３．１mg，０．０２２mmol，１当量）を添加する。反応混合液を２時間撹拌する。その後，ＮａＢＨ３ＣＮ（２６．５mg，０．４２５mmol）を添加し，反応混合液を更に１２時間撹拌する。最終溶液を透析し，凍結乾燥する。
ＤＳ＝３%，Ｍｗ＝２２９kDa，単離収率９５%（ＮＭＲにて測定，詳細は実施例５）
【００４３】
実施例７  ２当量のＡＥＰ及び２%（ａｑ）溶液での還元的アミノ化
酸化形態のヒアルロナン（１００．０mg，０．２６５mmol，ＤＳ＝２０%，Ｍｗ＝３４．４kDa）を５mlの蒸留水に溶解する（２%溶液）。前記溶液にＡＥＰ（１４．６mg，０．１０６mmol，２当量）を添加する。反応混合液を２時間撹拌する。その後，ＮａＢＨ３ＣＮ（２６．５mg，０．４２５mmol）を添加し，反応混合液を更に１２時間撹拌する。最終溶液を透析し，凍結乾燥する。
ＤＳ＝２０%，Ｍｗ＝３４kDa；単離収率７４%（ＮＭＲにて測定，詳細は実施例５）
【００４４】
実施例８  １．５当量のＡＥＰ，更に１当量のＮａＨＣＯ３及び２%（ａｑ）溶液での還元的アミノ化
酸化形態のヒアルロナン（１００．０mg，０．２６５mmol，ＤＳ＝２０%，Ｍｗ＝３４．４kDa）を５mlの蒸留水に溶解する（２%溶液）。前記溶液にＡＥＰ（１１．０mg，０．０８０mmol，１．５当量）及びＮａＨＣＯ３（２２．２mg，０．２６５mmol）を添加する。反応混合液を２時間撹拌する。その後，ＮａＢＨ３ＣＮ（２６．５mg，０．４２５mmol）を添加し，反応混合液を更に１２時間撹拌する。最終溶液を透析し，凍結乾燥する。
ＤＳ＝１７%，Ｍｗ＝３１kDa，単離収率７９%（ＮＭＲにて測定，詳細は実施例６）
【００４５】
実施例９  ヒアルロン酸の光反応性誘導体の光架橋‐方法Ａ
薄膜の照射材料はヒアルロン酸の光反応性誘導体（ＤＳ＝１８%，Ｍｗ＝２５kDa）の５%（aq）溶液を蒸発させて調製した。溶液をペトリ皿に移し，熱風乾燥機中，４０℃で１２時間蒸発させた。調製した薄膜をペトリ皿内のアルミニウム箔上に置き，１時間照射した（Ｅ＝２４３００mJ/cm2）。材料を曝露した後，その物理特性の変化を非照射試料と比較して試験した（溶解度及び安定性）。蒸留水及びＰＢＳ（pH＝７）中，２５℃で分析を行った。未溶解の材料を濾過し，凍結乾燥させてＳＥＭ分析に供した。濾液を蒸発させ，ＮＭＲで分析した。曝露した材料の抽出液の試験及びＮＭＲ分析の結果を表１に示す。写真解析を図１に示す。
【表１】
2016506422.tif 000013
Ｈ２Ｏ及びＰＢＳ（pH＝７．４）中のヒアルロン酸の光架橋誘導体の分析結果。Ｌ‐凍結乾燥形態，Ｎ‐ナノファイバー層，Ｔ‐薄膜。＋は陽性の結果を示し，−は陰性の結果を示す。
【００４６】
実施例１０  ヒアルロン酸の光反応性誘導体の光架橋‐方法Ｂ
照射材料は，ヒアルロン酸の光反応性誘導体（ＤＳ＝１８%，Ｍｗ＝２５kDa）の５%（aq）溶液を凍結乾燥して調製した凍結乾燥物の形態であった。凍結乾燥物の薄層（厚さ約０．５〜１．０mm，及び規模２×２cm）をペトリ皿内のＡｌ箔上に置いた。凍結乾燥物を１時間照射した（Ｅ＝２４３００mJ/cm2）。材料を曝露した後，その物理特性（溶解度及び安定性）の変化を非照射試料と比較して試験した。蒸留水及びリン酸緩衝液（ＰＢＳ‐リン酸緩衝生理食塩水，pH＝７）中，２５℃で分析を行った。未溶解の材料を濾過し，凍結乾燥させてＳＥＭ（走査電子顕微鏡）分析に供した。濾液を蒸発させ，ＮＭＲで分析した。曝露した材料の抽出液の試験及びＮＭＲ分析の結果を表１に示す。写真解析を図１に示す。
【００４７】
実施例１１  ヒアルロン酸の光反応性誘導体の光化学架橋‐方法Ｃ
照射材料は，平均坪量０．３mg/cm2のナノファイバー層の形態である。コンティプロ  ビオテック  スポレチノスト  エス  ルチェニム  オメゼニム製の装置４Ｓｐｉｎを使用し，ナノファイバー層を静電紡糸（電界紡糸）により調製した。紡糸水溶液の濃度は１０重量%であった。ヒアルロン酸の光反応性ポリマー（ＤＳ＝１８%，Ｍｗ＝２５kDa）と支持ポリマーのポリエチレンオキシド（Ｍｗ＝６００kDa）との相対重量比は（８０／２０）であった。寸法（２×２ｃｍ）のポリプロピレン基布に被覆したナノ層をペトリ皿内のアルミニウム箔上に置いた。材料を１時間照射した（Ｅ＝２４３００mJ/cm2）。材料を曝露した後，その物理特性（溶解度及び安定性）の変化を非照射試料と比較して試験した。蒸留水及びＰＢＳ（pH＝７）中，２５℃で分析を行った。未溶解の材料を濾過し，凍結乾燥させてＳＥＭ分析に供した。濾液を蒸発させ，ＮＭＲで分析した。曝露した材料の抽出液の試験及びＮＭＲ分析の結果を表１に示す。写真解析を添付する（図１，図２，図３）。
【００４８】
実施例１２  光反応性誘導体の細胞生存率試験
試験物質（ＤＳ＝１８%，Ｍｗ＝２５kDa）を３Ｔ３細胞培地に溶解した。溶液を濾過器（０．２２μm）で濾過した。溶液の最終試験濃度は１００，５００，１０００μg/mlであった。１ウェル当たり３０００個の密度の３Ｔ３細胞を９６ウェル試験プレートのウェルに播種した。試験に先立って，完全細胞培地中で２４時間細胞を培養した。細胞生存率は３‐［４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル］‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）法により０，２４，４８及び７２時間の間隔で測定した。アッセイでは，生細胞によりＭＴＴが減少し，紫色の水不溶性ホルマザンが生成され，これは後に分光光度法により測定される。
各ウェルに入った２００μlの細胞培地に２０μlのＭＴＴ原液（５mg/ml）を添加した。温度調節器内において３７℃でプレートを２．５時間インキュベートした。その後，細胞の上方の溶液を吸引し，体積２２０μlの可溶化溶液を添加した。マイクロプレートリーダーVERSAmaxにより５７０nm（６９０nmのバックグラウンド）で溶液の光学密度を測定した。影響を与えない多数の対照及び空試料により実験全体を補足した。光学密度の測定データに基づいて，Ｔ０時間での対照に対する百分率表示を計算し（影響のない対照Ｔ０の光学密度に対する，影響のある試料の光学密度の比率に１００を乗じる），平均の標準偏差を求めた（ＳＥＭ）。生存率試験の結果は添付書類に図表を用いて示す（図４）。
【００４９】
実施例１３  光反応性誘導体の光毒性試験
１ウェル当たり１００００個の密度の３Ｔ３細胞を９６ウェルパネルに播種した。試験に先立って，完全細胞培地中で２４時間細胞を培養した。その後，ＰＢＳ（pH＝７．００）で細胞を洗浄し，ＰＢＳに溶解した試験物質（試験物質ＴＢ‐１３：ＤＳ＝２０%，Ｍｗ＝３４kDa；１，３，３０，１００，５００，１０００，５０００μg/ml；光毒性アントラセン‐１，３，３０μg/ml；非光毒性ＳＤＳ‐１，３，１５μg/ml）と共に１時間インキュベートした。ランプ（Oriel Instruments）を使用して線量０．１J/cm2のＵＶＡ（３１５〜４００nm）を細胞に照射し，その出力を光度計ＰＭＡ２１００（Solar light Co.）で測定した。曝露の１０分後，上清を細胞から除去し，完全細胞培地を添加した。照射の２４時間後にＭＴＴ法により分光光度的に細胞生存率を評価した。試験結果は添付書類に図表を用いて示す（図５及び図６）。
【００５０】
実施例１４  光架橋誘導体の生分解性試験
ヒアルロン酸の光架橋誘導体：凍結乾燥物（Ｌ）＝１６．３mg及びナノ層形態：ｍ（Ｎ）＝９．０mgを滅菌状態で調製し，２mlのＰＢＳ（pH＝７．３８）を上に積層し，２４時間膨張させた。各試料に，２００ＵのＢＴＨ（ＢＴＨ＝ウシ精巣ヒアルロニダーゼ，ＥＣ３．２．１．３５）を添加し，試料を３７℃で４３時間インキュベートした。０，４，８，１９及び４３時間の間隔で，各試料１００μlを取り，最終分析まで−２０℃で維持した。同時に，対照（ＰＢＳ＋ＢＴＨ，及び純粋誘導体を含有するＰＢＳ）をインキュベートした。対照ＰＢＳ＋ＢＴＨの吸光度をバックグラウンド１として差し引いた。膨張後の誘導体を含む緩衝液の吸光度（時間Ｔ＝０）をバックグラウンド２として差し引いた。同時に，試料が自然分解するか否かを確認するため，純粋誘導体を含み，酵素を含まない純粋ＰＢＳの対照をインキュベートした。Somogyi‐Nelson試験により遊離の還元末端を以下の手順で測定した：５０μlの試料を，新たに調製した同量のSomogyi試薬と混合した。混合後，混合液をサーモブロック中，１００℃で１５分間インキュベートした。冷却後，１００μlのNelson試薬を添加し，試料を混合し，遠心分離し，５４０nmでの吸光度を測定した。バックグラウンドを差し引いた後，較正曲線からグルコース当量の値（遊離の還元末端の類推）を算定した。試験結果は添付書類に図表を用いて示す（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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