(57)【要約】  本発明は、向上したプトレシン生産能を有する新規な変異オルニチンデカルボキシラーゼタンパク質及びその用途に関する。
2016524919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するオルニチンデカルボキシラーゼ（Ornithine decarboxylase, ODC）のＮ末端から１６３番目のイソロイシン（isoleucine）アミノ酸残基及び１６５番目のグルタミン酸（Glutamic acid）アミノ酸残基からなる群から選択される１つ以上が突然変異した、変異したＯＤＣタンパク質。
【請求項２】
前記１６５番目のグルタミン酸がアラニン（alanine）、グリシン（Glycine）、セリン（Serine）又はバリン（Valine）に置換されたものである、請求項１に記載の変異したＯＤＣタンパク質。
【請求項３】
前記１６３番目のイソロイシンがアラニン、グリシン、セリン 又はバリンに置換されたものである、請求項１に記載の変異したＯＤＣタンパク質。
【請求項４】
前記１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸が同時に変異したＯＤＣタンパク質であって、１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸がそれぞれアラニン−アラニン、アラニン−バリン、セリン−バリン又はバリン−バリンに置換されたものである、請求項１に記載の変異したＯＤＣタンパク質。
【請求項５】
配列番号３４〜５７のいずれかで表されるアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載の変異したＯＤＣタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項の変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項の変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項７のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
Ｌ−オルニチン（L-ornithine）、Ｌ−オルニチンが含まれる混合物、又はＬ−オルニチン発酵液に請求項１〜５のいずれかの変異したＯＤＣタンパク質を加えて反応させるステップを含むプトレシン製造方法。
【請求項１０】
前記変異したＯＤＣタンパク質が、精製された変異したＯＤＣタンパク質又は変異したＯＤＣタンパク質が含まれる微生物発酵液である、請求項９に記載のプトレシン製造方法。
【請求項１１】
プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物に請求項１〜５のいずれかの変異したＯＤＣタンパク質が導入された、プトレシン生産能が向上した組換え微生物。
【請求項１２】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜５のいずれかの変異したＯＤＣタンパク質を導入することにより向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記（ａ）ステップで得られた培養物からプトレシンを分離するステップとを含むプトレシン生産方法。
【請求項１４】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１３に記載のプトレシン生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な変異オルニチンデカルボキシラーゼタンパク質及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
プトレシン（又は１，４−ブタンジアミン）は、ナイロン４，６を含むポリアミド４，６の生産のための重要な原料物質である。産業的規模では、シアン化水素（hydrogen cyanide）の添加によりアクリロニトリル（acrylonitrile）から生産されるスクシノニトリル（succinonitrile）の水素化により生産される。これらの化学物質の合成経路においては、非再生的な石油化学産物を原料物質として要し、相対的に多重段階（multi step）、マルチリアクター設計（muti-reactor design）であるだけでなく、高価な触媒システムに関連して高温高圧を要する。その上、非常に強い毒性と可燃性を有する反応物であるので、従来の化学合成経路は環境的な面で好ましくない。よって、上記化学生産工程の代案として再生可能なバイオマス由来炭素源からプトレシンを生産する工程が求められており、近年、環境にやさしい微生物により生産するバイオ化学工程が大いに注目を集めている。プトレシンは、バクテリアから動植物に至る全ての有機体に見られるポリアミンの一種である。大腸菌におけるプトレシン濃度は約２．８ｇ／ｌと非常に高いことが知られている。また、微生物は、高濃度のポリアミンに対して潜在的に良好な耐性を有するので、高濃度のポリアミン存在下で生長又は生存することができる。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は３０ｇ／Ｌ以上のカダベリン（cadaverine）存在下でも成長できることが報告されている。よって、産業的に用いることのできる高濃度のポリアミンを生産するために微生物を用いる研究が続けられている。しかし、微生物によりポリアミンを生産する研究はいまだ産業的に適用するほどのレベルには至っていない状態であるので、高収率でポリアミンを生産する菌株の開発は今後も続けられるべきである（非特許文献１，２）。
【０００３】
一方、オルニチンデカルボキシラーゼ（Ornithine decarboxylase, ODC）は、ほとんどの微生物に存在する酵素であり、オルニチンをプトレシンに変換する酵素である。大腸菌において、ＯＤＣは一般にホモダイマーの形態であり、ダイマーのインターフェースに活性部位（active site）が形成される。ＯＤＣの反応メカニズムは、補因子（cofactor）としてピリドキサールリン酸 （pyridoxal phosphate、PLP）を必要とし、ＰＬＰが酵素の活性部位のリシン残基にシッフ塩基（Schiff base）を形成しているときに、基質（substrate）であるオルニチンがリシン残基に代替されると、脱カルボキシル化（decarboxylation）反応が起こる。プトレシンが生成されると、ＯＤＣは再びＰＬＰとシッフ塩基を形成する。
【０００４】
従来のプトレシン生産菌株であるコリネバクテリウム属菌株に導入されていたＯＤＣは、大腸菌のｓｐｅＣ遺伝子にコードされたタンパク質であり、活性が非常に低いことが報告されている。よって、高収率のプトレシン生産菌株を開発するために、プトレシン生産経路における最後の段階の酵素であるＯＤＣの改良は非常に重要であるといえる。しかし、ＯＤＣタンパク質においては、現在まで構造や反応メカニズムの研究のために変異導入などの実験が行われてきたにすぎず、活性増加に関する結果は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第３６６８０７２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１３／１０５８２７号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０７７９９５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng, 104: 651-662, 2009
【非特許文献２】Schneider J, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 88: 859-868, 2010
【非特許文献３】Sambrook et al., 1989, infra
【非特許文献４】Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981
【非特許文献５】Applebaum DM, et al., Biochemistry, 16: 1590-1581, 1977
【非特許文献６】Momany C, et al., J Mol Biol, 4: 849-854, 1995
【非特許文献７】Vienozinskiene J, et al, Anal Biochem, 146: 180-183, 1985
【非特許文献８】Ngo TT, et al., Anal Biochem, 160: 290-293, 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、プトレシンを生産する上で重要な役割を果たすが低い活性を示すＯＤＣタンパク質を改良すべく鋭意努力した結果、新規な変異位置を見出し、その位置に変異を導入することにより向上したプトレシン生産能力を有する変異したＯＤＣタンパク質を作製し、従来のプトレシンを生産する微生物に変異したＯＤＣタンパク質を導入することにより、プトレシンを高収率で作製できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、新規な変異オルニチンデカルボキシラーゼ（Ornithine decarboxylase, ODC）タンパク質を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、及び前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、Ｌ−オルニチン（L-ornithine）、Ｌ−オルニチンが含まれる混合物、又はＬ−オルニチン発酵液に前記変異したＯＤＣタンパク質を加えて反応させるステップを含むプトレシン製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物に前記変異したＯＤＣタンパク質を導入した、プトレシン生産能が向上した組換え微生物を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記変異したＯＤＣタンパク質を導入することにより向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を培養するステップと、前記ステップで得られた培養物からプトレシンを分離するステップとを含むプトレシン生産方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による変異したオルニチンデカルボキシラーゼタンパク質は、天然のものに比べてプトレシン変換活性が２１倍にまで増加するだけでなく、従来のプトレシン生産菌株に導入するとプトレシン生産活性を確実に増大させるので、従来の化学合成経路の代案として、より効率的なプトレシンの大量生産に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】大腸菌由来のＯＤＣタンパク質にＩ１６３Ａ又はＥ１６５Ａ変異を導入したタンパク質と天然タンパク質のプトレシン変換活性を比較測定した図である。具体的には、変換反応が起こることによってｐＨが増加するが、ｐＨ増加をフェノールレッドで確認することにより吸光度の増加を確認した。天然ＯＤＣタンパク質に比べて、Ｉ１６３ＡもしくはＥ１６５Ａ又は両変異が導入されたＯＤＣタンパク質のプトレシン変換活性が優れることが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するオルニチンデカルボキシラーゼ（Ornithine decarboxylase, ODC）のＮ末端から１６３番目のイソロイシン（isoleucine）アミノ酸残基及び１６５番目のグルタミン酸（Glutamic acid）アミノ酸残基からなる群から選択される１つ以上が突然変異した、新規な変異体である変異したＯＤＣタンパク質を提供する。
【００１６】
本発明における「オルニチンデカルボキシラーゼ（Ornithine decarboxylase, ODC）」とは、オルニチンからポリアミンを合成する最初の段階であってプトレシン生産経路の最後の段階である下記反応式を触媒する酵素である。Ｌ−オルニチンを基質としてプトレシンを生産するが、ピリドキサールリン酸（Pyridoxal phosphate, PLP）が補因子（cofactor）として作用する。
【００１７】
［反応式］
Ｌ−オルニチン⇔プトレシン＋ＣＯ２
【００１８】
本発明におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（Ornithine decarboxylase, ODC）は、具体的には大腸菌由来のＯＤＣであってもよく、より具体的には大腸菌（Escherichia coli）由来の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＯＤＣであってもよい。
【００１９】
本発明において、ＯＤＣ（Ornithine decarboxylase）を確保する方法には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができる。その方法の例としては、酵素発現に通常用いられる大腸菌において酵素を高効率で確保できるようにコドン最適化が含まれる遺伝子合成技術や、微生物の大量ゲノム情報に基づいて生物情報学的方法により有用酵素資源のスクリーニング方法を用いて確保することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明における「変異したＯＤＣタンパク質」とは、前記ＯＤＣタンパク質のアミノ酸配列上の１つ又はそれ以上のアミノ酸が追加、除去又は置換されたＯＤＣタンパク質を意味する。本発明においては、具体的には変異によりＯＤＣタンパク質の活性を野生型と比較して効率的に増加させたタンパク質を意味する。本発明における変異には、一般に酵素を改良する方法であって当業界で公知の方法を制限なく用いることができ、合理的設計（rational design）や指向性進化（directed evolution）などの戦略がある。例えば、合理的設計戦略としては特定位置のアミノ酸における部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）などが挙げられ、指向性進化戦略としてはランダム変異誘発（random mutagenesis）などが挙げられる。また、自然な突然変異により、外部操作なしに配列番号１の１６３番目及び／又は１６５番目のアミノ酸残基が突然変異したものであってもよい。本発明における「変異したＯＤＣタンパク質」、「ＯＤＣ変異体」及び「ｓｐｅＣ変異体」は混用される。
【００２１】
本発明の変異したＯＤＣタンパク質は、具体的には大腸菌（Escherichia coli）由来の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するオルニチンデカルボキシラーゼのＮ末端から１６３番目のイソロイシン（isoleucine）アミノ酸残基及び／又は１６５番目のグルタミン酸（Glutamic acid）アミノ酸残基が突然変異したもの、例えば前記１６５番目のグルタミン酸がアラニン、グリシン、セリン又はバリンに置換されたものであってもよく、前記１６３番目のイソロイシンがアラニン、グリシン、セリン又はバリンに置換されたものであってもよい。また、前記１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸が同時に変異したＯＤＣタンパク質であって、１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸がそれぞれアラニン、バリン、セリン及びグリシンからなる群から選択されるものに置換されたものであってもよく、具体的な例として、１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸がそれぞれアラニン−アラニン、アラニン−バリン、セリン−バリン又はバリン−バリンに置換されたものであってもよい。
【００２２】
本発明の実施例においては、様々な組み合わせの野生型ＯＤＣの１６３、１６５番目のアミノ酸に変異を導入するとプトレシン生産能が増加することが確認され、上記位置はプトレシン生産能が向上したＯＤＣ変異体を作製するのに最も重要な位置であることが確認された。特に、前記重要な変異位置に存在するアミノ酸を小さな残基（small residue）のアミノ酸（アラニン、セリン、バリン又はグリシン）に置換する変異によりプトレシン生産能が増加することが確認された。
【００２３】
また、本発明の変異したＯＤＣタンパク質は、配列番号３４〜５７のいずれかで表されるアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。具体的には、配列番号３４〜４２、４５、４９及び５７のいずれかで表されるアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。これには、Ｎ末端から１６３番目のイソロイシン又は１６５番目のグルタミン酸が小さな残基に変異したＯＤＣタンパク質のアミノ酸配列であって、前記変異を含んで野生型より優れたプトレシン変換活性を有するものであれば、前記配列と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％以上の相同性を有するポリペプチドが制限なく含まれる。
【００２４】
本発明における「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分間の同一性の割合を意味する。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定される。例えば、配列情報を整列させることのできる、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド分子又は２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列させることにより２つの部分間の相同性が決定される。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間に安定した二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、その後単鎖特異的なヌクレアーゼで分解し、分解したフラグメントのサイズにより決定することができる。
【００２５】
本発明における「相同」とは、全ての文法形態やスペリングの変異形態であるスーパーファミリー由来のタンパク質及び異種由来の相同タンパク質を含み、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係を意味する。それらのタンパク質（及びそれらのコーディング遺伝子）は、高度の配列類似性により反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な使用及び本発明における「相同」とは、「非常に高い」などの形容詞で修飾されると、共通の進化的起源を意味するのではなく、配列類似性を意味する。
【００２６】
本発明における「配列類似性」とは、共通の進化的起源を有するか、又は有さないタンパク質の塩基配列やアミノ酸配列間の同一性や相応性の程度を意味する。具体的には、２つのアミノ酸配列がアミノ酸配列の所定の長さに対して、ポリペプチドが少なくとも２１％（具体的には少なくとも約５０％、より具体的には約７５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９９％）の割合でマッチする場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」であるという。実質的に相同な配列は、データバンクで用いる標準ソフトウェアを用いるか、例えば特定のシステムのために定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）実験で配列を比較することにより確認することができる。定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内である（例えば、非特許文献３を参照）。
【００２７】
本発明の具体的な一実施例においては、大腸菌由来のＯＤＣタンパク質の構造分析を行い、構造情報に基づいて合理的な設計戦略による変異を誘導した。基質が活性部位に接近する通路の入口領域（entrance region）を広げるための変異（Ｖ１５６，Ｄ１６０，Ｉ１６３，Ｅ１６５，Ｑ６９１）及び活性部位に結合される補因子であるＰＬＰを安定化させるための変異（Ｎ１５３，Ｄ３０９）を設計及び作製した（実施例１及び２）。具体的には、通路の入口領域のかさ高い（bulky）残基を小さな残基であるアラニンに置換する変異により、Ｎ末端から１６３番目のアミノ酸であるイソロイシンと１６５番目のアミノ酸であるグルタミン酸をアラニンに置換すると、ＯＤＣタンパク質の活性が大幅に増加することが確認された（実施例３）。一方、ＰＬＰ安定化のための変異を含む他の６種の変異型Ｖ１５６Ａ、Ｄ１６０Ａ、Ｑ６９１Ａ、Ｎ１５３Ｄ、Ｎ１５３Ｅ、Ｄ３０９Ｅにより変異を導入したＯＤＣタンパク質は、野生型に比べて活性が非常に減少するか、ほとんどなくなるという結果を示した。これにより、大腸菌由来のＯＤＣタンパク質（配列番号１）の１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸は、タンパク質の活性を増加させる上で重要な残基であることが確認された。上記変異の導入は、表２に示すプライマーとＰＣＲを用いた部位特異的突然変異により行われる。
【００２８】
また、本発明の具体的な実施例においては、さらに、前記１６３番目のイソロイシンと１６５番目のグルタミン酸をアラニンに置換すること以外に、他の小さな残基であるセリン（serine）、バリン（valine）又はグリシン（glycine）にもさらに置換し、当該残基における変異を最適化しようとした（実施例４及び表４）。１６３及び１６５番目のアミノ酸残基にそれぞれグリシン（G, glycine）、セリン（S, serine）、バリン（V, valine）への単一変異を導入した結果、１６３番目のアミノ酸残基においてはセリンに、１６５番目のアミノ酸残基においてはバリンに置換した場合、ｋｃａｔ／ＫＭ値が野生型に比べてそれぞれ４．４倍、６．９倍に増加した活性を示すことが確認された（表５）。これらの結果に基づき、２つの残基に二重変異を導入して活性を確認した。単一変異を導入したときに活性が最も高かったＩ１６３ＳとＥ１６５Ｖの組み合わせを全て導入すると、野生型に比べて８倍に増加した活性を示すのに対して、１６３及び１６５番目のアミノ酸残基をどちらもバリンに置換すると、野生型に比べて２１．３倍増加した活性を示し、最も高い活性を有することが確認された（実施例４及び表５）。
【００２９】
全体的には、ＯＤＣ酵素変異体の活性増加は、ＫＭ値の減少よりも、ｋｃａｔ値の増加によるｋｃａｔ／ＫＭ値の増加として現れた。これは、変異導入により基質であるオルニチンの酵素に対する結合親和性の増加よりも、生成物であるプトレシンに変換される速度を増加させる方向にＯＤＣ酵素の構造が変化したことを示唆するものである。
【００３０】
本発明において、オルニチンをプトレシンに変換するＯＤＣ酵素の活性測定方法は、ＯＤＣ酵素が触媒する反応を用いる。具体的には、ＯＤＣ酵素がオルニチン１分子をプトレシンに変換する際に水１分子が消費され、プトレシンと共に二酸化炭素１分子とＯＨ−イオン１分子が生成される。よって、全体的なｐＨは増加するので、増加したｐＨをｐＨ指示薬の１つであるフェノールレッド（phenol red）により５５９ｎｍで測定すると、反応が進んでｐＨが増加した量に比例して吸光度の値も増加する。このような反応特性を用いて間接的にプトレシン生成量を測定した。
【００３１】
本発明における「オルニチン」とは、オルニチン回路において重要な役割を果たす塩基性アミノ酸であり、特にＬ−オルニチンは、植物、動物、微生物において広く見られる。一般に、オルニチン回路を有する生体内では尿素生産に関連して代謝における重要な役割を果たす。また、生体内でアルギニン、グルタミン酸、プロリンと互いに変換することができ、ａ−ケト酸、グリオキシル酸とアミノ基転移を行う。オルニチンデカルボキシラーゼによりアミン（プトレシン）を生成する基質であり、これによりポリアミンまで合成される。本発明においては、特にオルニチンデカルボキシラーゼの基質として用いられるＬ−オルニチンであってもよい。
【００３２】
本発明における「プトレシン」とは、オルニチンの脱炭酸反応やアグマチンの加水分解により生成される物質であり、腐敗物にも存在するが、生体に正常な成分として広く分布する。ポリアミンの一種であり、リボソームを構成し、細胞の生長を促進したり、ＲＮＡ合成を促進する機能を有する。特に、産業的にはナイロン４，６を含むポリアミド４，６の生産のための重要な原料物質に該当し、大量生産のための研究の必要性が依然として存在する物質である。
【００３３】
本発明の他の態様は、本発明の変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００３４】
本発明における「核酸分子」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包括する意味で用いられ、核酸分子における基本構成単位であるヌクレオチドには、天然ヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部分が変形したアナログ（analogue）も含まれる。
【００３５】
本発明のさらに他の態様は、本発明の変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
【００３６】
本発明における「ベクター」とは、宿主細胞への塩基のクローニング及び／又は転移のための任意の媒体を意味する。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合することにより、結合した断片の複製をもたらすことのできるレプリコン（replicon）であってもよい。「レプリコン」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち自己調節により複製可能な任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を意味する。「ベクター」には、試験管内、生体外又は生体内で宿主細胞に塩基を導入するためのウイルス及び非ウイルス媒体が含まれる。また、「ベクター」にはミニサークルＤＮＡが含まれてもよい。例えば、前記ベクターは、バクテリアＤＮＡ配列を有さないプラスミドであってもよい。ＣｐＧ領域における豊富なバクテリアＤＮＡ配列の除去は、転移遺伝子の発現サイレンシングを減少させてプラスミドＤＮＡベクターからさらに持続的な発現をもたらすために行われている。さらに、「ベクター」には、トランスポゾン又は人工染色体が含まれてもよい。
【００３７】
本発明において、本発明の変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又はバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核もしくは原核細胞において、前記核酸分子を複製及び／又は発現することのできるベクターであってもよい。具体的には、宿主細胞において前記ポリヌクレオチドが発現するように好適なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターであってもよく、より具体的には、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、レトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態であってもよい。
【００３８】
当業界で通常用いられるＴ７プロモーターを用いるｐＥＴシステム（novagen）はよく知られており、当業界で公知の様々な発現システムを用いることができるが、これらに限定されるものではない。具体的には、本発明において、変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターはｐＥＴ２８ａベクターであってもよい。
【００３９】
本発明の具体的な一実施例においては、ＰＣＲにより部位特異的突然変異が行われたＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子をｐＥＴ２８ａベクターに挿入した。これにより、変異したＯＤＣ（ｓｐｅＣ）発現ベクターである、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ａ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｇ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｖ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｅ１６５Ａ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｅ１６５Ｓ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｅ１６５Ｇ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｅ１６５Ｖ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ａ＿Ｅ１６５Ａ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ＿Ｅ１６５Ｖ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ａ＿Ｅ１６５Ｖ、ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｖ＿Ｅ１６５Ｖを作製し、変異導入の有無は配列分析により確認した。
【００４０】
本発明のさらに他の態様は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００４１】
本発明における形質転換体は、前記ベクターが導入されて本発明の変異型ＯＤＣを発現するものであれば特に限定されるものではないが、形質転換された大腸菌（E. coli）、コリネバクテリウム属、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞、酵母細胞、ピキア・パストリスなどの菌類細胞、ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞，chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞，baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓細胞，human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞、又は植物細胞が挙げられる。
【００４２】
本発明のさらに他の態様は、Ｌ−オルニチン（L-ornithine）、Ｌ−オルニチンが含まれる混合物、又はＬ−オルニチン発酵液に前記変異したＯＤＣタンパク質を加えて反応させるステップを含むプトレシン製造方法を提供する。
【００４３】
Ｌ−オルニチン、変異したＯＤＣタンパク質及びプトレシンなどは前述した通りである。
【００４４】
本発明において、プトレシン作製のために変異したＯＤＣタンパク質と反応させる物質は、Ｌ−オルニチン、Ｌ−オルニチンが含まれる混合物、又はＬ−オルニチン発酵液である。前記Ｌ−オルニチンが含まれる混合物とは、別途に存在するＬ−オルニチンと他の成分が混合した混合物を意味し、Ｌ−オルニチン発酵液とは、発酵の過程でＬ−オルニチンが生成されるか、含有量が上昇して反応のための十分なＬ−オルニチンを含む発酵液を意味するが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
例えば、発酵の過程でＬ−オルニチンを生成する方法及び生成された発酵液については、従来の特許文献１などに開示されており、本願において援用される（E.coli, ATCC 21104）。
【００４６】
本発明における前記変異したＯＤＣタンパク質は、精製された変異したＯＤＣタンパク質又は変異したＯＤＣタンパク質が含まれる微生物発酵液であってもよい。具体的には、前記微生物発酵液を作製する際に用いられる微生物は、本発明の変異したＯＤＣタンパク質を発現する微生物であってもよく、より具体的には、本発明の変異したＯＤＣタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換された形質転換体微生物であってもよい。
【００４７】
本発明のさらに他の態様は、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物に前記変異したＯＤＣタンパク質が導入された、プトレシン生産能が向上した微生物を提供する。
【００４８】
本発明における「微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物を全て含むものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が向上するか又は低下するなどの原因により、特定機序が低下又は向上した微生物であってもよい。
【００４９】
本発明における「プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物」とは、天然のもの又は変異によりプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。コリネバクテリウム属微生物の培養物がプトレシンを有することは既に知られている。しかし、プトレシンの生産能が非常に低く、生産機序に作用する遺伝子や機序原理が明らかにされていない状態である。よって、本発明における、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然菌株自体又は外部プトレシン生産機序に関する遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性を向上又は低下させることにより、向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。
【００５０】
本発明における「コリネバクテリウム属微生物」とは、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。より具体的には、本発明におけるコリネバクテリウム属微生物は、高濃度のプトレシンにさらしても細胞生長及び生存に影響を受けにくいコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。例えば、ＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を内在性活性より低下させることによりプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ１４６９）菌株であるが、これに限定されるものではない。前記ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ菌株は、細胞内でプトレシンがＮ−アセチルプトレシンに合成される経路を遮断するために、ＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子を欠失させたプトレシン過剰生産菌株であり、特許文献２に開示されている菌株である。
【００５１】
本発明の具体的な実施例においては、ＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を内在性活性より低下させることによりプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ１４６９））に基づき、前記プトレシン変換活性が増加したＯＤＣ Ｉ１６３Ｓ／Ｅ１６５Ｖ（ｓｐｅＣ）変異体を染色体内の野生型ｓｐｅＣに導入した変異菌株を作製した（実施例６）。前記変異菌株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０５７８と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０１３年６月１０日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１４２５Ｐとして寄託した。
【００５２】
本発明のさらに他の態様は、本発明の変異したＯＤＣタンパク質を導入することにより向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を培養するステップと、前記ステップで得られた培養物からプトレシンを分離するステップとを含むプトレシン生産方法を提供する。
【００５３】
具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよく、より具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０５７８（受託番号ＫＣＣＭ１１４２５Ｐ）菌株であってもよい。
【００５４】
本発明における「培養」とは、微生物を人工的に調節した好適な環境条件で生育させることを意味する。本発明において、コリネバクテリウム属微生物を用いてプトレシンを培養する方法は、当業界で周知の方法を用いることができる。具体的には、前記培養は、バッチ工程、流加工程又は反復流加工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続して培養することができるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
培養に用いられる培地は、好適な方法で特定菌株の要件を満たすものでなければならない。コリネバクテリウム属菌株の培養培地は公知である（例えば、非特許文献４）。用いることのできる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は単独で用いることもでき、又は混合物として用いることもできる。用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、単独で用いることもでき、又は混合物として用いることもできる。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、又は硫酸鉄などの金属塩が含まれてもよい。前記物質以外にも、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ式に添加されるか又は連続して添加されてもよい。
【００５６】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸もしくは硫酸などの酸化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を保持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃である。培養は、プトレシンの所望の生成量が得られるまで続ける。これらの目的は、通常１０〜１６０時間で達成される。プトレシンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれてもよい。
【００５７】
本発明のプトレシンを生産する方法は、細胞又は培養物からプトレシンを回収するステップを含む。細胞又は培養物からプトレシンを回収する方法は、当業界で公知の方法、例えば遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１：ＯＤＣ（Ornithine decarboxylase）の構造分析及び変異体の設計
一般に、大腸菌は２つの形態のＯＤＣを有することが知られている。一方は周辺のｐＨが酸性状態のときに発現が誘導されるｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＯＤＣ（ｓｐｅＦ）であり、他方はプトレシンなどのジアミン（diamine）の生産に関与するｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）である（非特許文献５）。そのうち、プトレシン生産に関与するｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ＯＤＣであるｓｐｅＣを標的遺伝子に選定した。
【００６０】
現在まで、バクテリアにおいてはビブリオ菌とラクトバチルス菌のＯＤＣの構造が明らかになっており、そのうち大腸菌のＯＤＣ（ｓｐｅＣ）はラクトバチルス３０ａ ＯＤＣに類似の構造を有するものと予測されていた。よって、ラクトバチルスＯＤＣの３Ｄ構造に基づいて、大腸菌ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）のアミノ酸配列をＧｅｎｅＤｏｃプログラムで整列比較（align）した（非特許文献６）。アミノ酸配列を比較した結果、大腸菌ｓｐｅＣとラクトバチルス３０ａ ＯＤＣの配列同一性は５３％、類似性は６５％であり、両酵素は非常に類似したタンパク質であることが判明した。よって、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録されているラクトバチルス３０ａ ＯＤＣ（PDB ID: 1ORD）の構造に基づいて、大腸菌ｓｐｅＣの構造をホモロジーモデリング（homology modeling）した。その結果、タンパク質の全体的な骨格が非常に類似しており、ＰＬＰ（pyridoxal phosphate）との結合に関与する活性部位（active site）のアミノ酸配列もほぼ同じであった。
【００６１】
両酵素の構造分析の結果、ＯＤＣは二量体の形態で細胞内に存在し、二量体の境界面（interface）に活性部位が形成されるが、基質が活性部位に接近する通路の入口領域（entrance region）が狭いものと分析された。よって、基質が活性部位に効果的に接近して生成物が速く変換されるように、入口領域を広くするために入口領域のかさ高い（bulky）残基を小さな残基に置換する変異を導入する設計を行った（Ｖ１５６，Ｄ１６０，Ｉ１６３，Ｅ１６５，Ｑ６９１）。
【００６２】
さらに、活性部位に結合されている補因子（cofactor）であるＰＬＰを安定化させるために、活性部位の周囲の残基にも変異を設計した（Ｎ１５３，Ｄ３０９）。
【００６３】
実施例２：大腸菌ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）遺伝子のクローニング及び発現
大腸菌ｓｐｅＣ遺伝子を発現させるために、酵素発現のために通常用いられるｐＥＴ２８ａ（Novagen）ベクターシステムを用いた。まず、ｓｐｅＣ遺伝子は、大腸菌野生型菌株Ｗ３１１０の染色体を鋳型とし、表１に示すプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅により得られた遺伝子断片とベクターｐＥＴ２８ａは、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素で処理（３７℃，３時間）し、その後通常のライゲーション方法を用いてｐＥＴ２８ａベクターにｓｐｅＣ遺伝子断片を挿入した。
【００６４】
【表１】
2016524919.tif 000003
【００６５】
前述したように作製したｓｐｅＣ発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ）の変異導入の有無は配列分析により確認した。
【００６６】
実施例１において、対象残基にはそれぞれ小さな残基であるアラニン（alanine）に置換する変異を導入し、ＰＬＰ安定化のためには、ＰＬＰと結合する位置によって異なる変異を導入した。
【００６７】
前述したように作製したｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣベクターを鋳型とし、表１及び２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。１次的にｓｐｅＣ遺伝子に変異を導入するために、変異を起こそうとする部位を中心に前方部分（５’）と後方部分（３’）にそれぞれＰＣＲを行い、次いで２次的に２つのＰＣＲ断片を組み合わせるＰＣＲを行った。例えば、ｓｐｅＣ Ｖ１５６Ａの場合、前方部分はｓｐｅＣ＿ｓｔａｒｔ（ＮｄｅＩ）＿５（配列番号２）及びｓｐｅＣ＿Ｖ１５６Ａ＿３（配列番号５）プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、後方部分はｓｐｅＣ＿Ｖ１５６Ａ＿５（配列番号４）及びｓｐｅＣ＿ｓｔｏｐ（ＸｈｏＩ）＿３（配列番号３）プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。１次ＰＣＲにより得られた２つのＰＣＲ断片を２次ＰＣＲの鋳型とし、ｓｐｅＣ＿ｓｔａｒｔ（ＮｄｅＩ）＿５（配列番号２）及びｓｐｅＣ＿ｓｔｏｐ（ＸｈｏＩ）＿３（配列番号３）プライマーを用いてＰＣＲを行った。最終的に得られたｓｐｅＣ Ｖ１５６Ａ遺伝子は、前記ｓｐｅＣ遺伝子断片と同じ方法でｐＥＴ２８ａベクターに挿入した。その他の変異も、表２に示すプライマーを用いて、前記と同様にＰＣＲを行ってｐＥＴ２８ａベクターに挿入した。
【００６８】
前述したように作製したｓｐｅＣ変異体発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｖ１５６Ａ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｄ１６０Ａ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ａ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｅ１６５Ａ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｑ６９１Ａ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｎ１５３Ｄ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｎ１５３Ｅ，ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ＿Ｄ３０９Ｅ）の変異導入の有無は配列分析により確認した。
【００６９】
【表２】
2016524919.tif 000004
【００７０】
実施例３：ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異体酵素のプトレシン合成活性の測定
３−１．ＯＤＣ変異体酵素の取得
ＤＥ３遺伝子型を有する大腸菌に実施例２で作製したｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ変異体ベクターを導入することにより、酵素を取得できる菌株を作製した。
【００７１】
前記ｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ変異体ベクターの発現は、ｐＥＴシステムマニュアル（Novagen）を参照した。具体的には、ＬＢ平板培地から各菌株の単一コロニーを選択して３ｍｌのＬＢ液体培地（＋カナマイシン ５０ｕｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１６時間培養した。これを新たな１５ｍｌのＬＢ培地（＋カナマイシン ５０ｕｇ／ｍｌ）に再接種し、ＯＤ６００が０．６程度になるように同じ培養条件で培養した直後に、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して１８℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養して酵素発現を誘導した。
【００７２】
酵素発現誘導後に得られた細胞を超音波粉砕し、その後遠心分離し、得られた上清を１次活性評価のために用いた。さらに、酵素の特性を把握するために精製後に２次活性評価を行ったが、酵素はｐＥＴベクターにより酵素に結合して発現したｈｉｓ−ｔａｇを用いてＮｉ−ＮＴＡ ｃｏｌｕｍｎで分離した。精製にはＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｅｘｃｅｌｌｏｓｅ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（Bioprogen）を用いた。前記過程で得られたＯＤＣ（ＳｐｅＣ野生型と変異型）酵素は、８％ ＳＤＳ ＰＡＧＥによりそれぞれ可溶な（soluble）形態で発現して上清から得られることが確認された。
【００７３】
３−２．ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異体酵素のプトレシン合成活性の測定
オルニチンを基質として用いて、ＯＤＣによるプトレシン合成可否の程度を評価するために、実施例３−１で得られたＯＤＣ（ＳｐｅＣ野生型と変異型）酵素の活性を測定した。プトレシン合成活性を把握するためのＯＤＣの活性評価条件は、既存の文献報告を参照して行った（非特許文献７）。
【００７４】
すなわち、オルニチン１分子からＯＤＣ酵素によりプトレシンが生成されると水１分子が消費され、プトレシンと共に二酸化炭素１分子とＯＨ−イオン１分子が生成されるので、全体的なｐＨは増加する（反応式１）。増加したｐＨに従ってｐＨ指示薬の１つであるフェノールレッド（phenol red）による５５９ｎｍでの吸光度が変化し、ｐＨが増加した量に比例して吸光度の値も増加する。このような反応特性を用いて間接的にプトレシン生成量を測定した。
【００７５】
［反応式１］
Ｌ−オルニチン＋Ｈ２Ｏ→プロレシン＋ＣＯ２＋ＯＨ−
【００７６】
ＯＤＣ酵素の１次活性評価のために、精製前に上清のタンパク質定量を行って濃度を同一にした。反応条件は、酵素上清３０ｕｇ、１０ｍＭオルニチン、１．２５ｕＭ ＰＬＰになるように反応液を作製し、その後４０ｕＭフェノールレッドでｐＨ変化量をモニタリングした。
【００７７】
測定した結果、ＯＤＣ変異型酵素のうち野生型よりプトレシン生成速度が増加したのはＩ１６３ＡとＥ１６５Ａであった。他の６種の変異型Ｖ１５６Ａ、Ｄ１６０Ａ、Ｑ６９１Ａ、Ｎ１５３Ｄ、Ｎ１５３Ｅ、Ｄ３０９Ｅにより変異を導入したＯＤＣは、５５９ｎｍでの吸光度の変化がほとんどなかった（図１参照）。
【００７８】
１次スクリーニングで選択されたＯＤＣ変異体Ｉ１６３ＡとＥ１６５Ａの２つの酵素の特性を具体的に把握するために、ｈｉｓ−ｔａｇで精製、定量して各オルニチン濃度におけるプトレシン合成速度を測定した。用いたＯＤＣ酵素濃度は１０ｕｇ、オルニチン濃度は０．１５〜１０ｍＭの範囲で、前述したようにフェノールレッドでｐＨ変化量を測定した。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
これらの結果から、ＯＤＣの構造分析により設計したＩ１６３Ａ、Ｅ１６５Ａ変異型ＯＤＣ酵素は、野生型に比べてＫＭ値がそれぞれ５３％、２７％減少し、基質であるオルニチンの結合親和性（binding affinity）が増加したことが分かる。また、ｋｃａｔ値は、ＷＴに比べてＩ１６３Ａ変異型は１２．５％、Ｅ１６５Ａ変異型は５０％増加した値となったので、オルニチンをプトレシンに変換する能力も増加したことが分かる。最終的に、酵素活性の特徴を示すｋｃａｔ／ＫＭ値を計算した結果、ＷＴに比べてＩ１６３Ａ変異型は２．４倍、Ｅ１６５Ａ変異型は２倍に増加したことが確認された（表３）。
【００８１】
実施例４：ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異の最適化
実施例３で確認されたように、ＯＤＣ活性に重要な残基である１６３番目のアミノ酸（イソロイシン）及び１６５番目のアミノ酸（グルタミン酸）に各種小さなサイズのアミノ酸への変異を導入した。変異導入は実施例１の方法と同様に行い、用いたプライマーは表４の通りである。さらに、１６３、１６５番目の位置にそれぞれ単一変異を導入し、その後各位置にＯＤＣ活性が増加した変異の組み合わせを導入した二重変異体（double mutant）を作製して評価した。
【００８２】
【表４】
2016524919.tif 000006
【００８３】
表４のプライマーにより導入されたＯＤＣ変異体を実施例２及び３の方法で精製し、プトレシン合成速度を測定した。前述したように作製したＯＤＣ変異体に対するプトレシン合成速度測定の結果は表５の通りである。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
表５に示すように、１６３、１６５番目のアミノ酸残基にそれぞれグリシン（G, glycine）、セリン（S, serine）、バリン（V, valine）への単一変異を導入した結果、１６３番目の残基においてはセリン、１６５番目の残基においてはバリンに置換した場合に、ｋｃａｔ／ＫＭ値が野生型に比べてそれぞれ４．４倍、６．９倍に増加した活性を示した。これらの結果に基づいて、２つの残基に二重変異を導入して活性を確認した。意外にも、単一変異を導入した際に最も高かったＩ１６３ＳとＥ１６５Ｖの組み合わせの二重変異の場合より、１６３、１６５番目の残基をどちらもバリンに置換した場合に、野生型に比べて２１．３倍増加した最も高い活性を示した。
【００８６】
全体的には、ＯＤＣ酵素変異体の活性増加は、ＫＭ値の減少よりも、ｋｃａｔ値の増加によるｋｃａｔ／ＫＭ値の増加として現れた。これは、変異導入により基質であるオルニチンの酵素に対する結合親和性の増加よりも、生成物であるプトレシンに変換される速度を増加させる方向にＯＤＣ酵素の構造が変化したことを示唆するものである。
【００８７】
実施例５：オルニチンを基質とするＯＤＣ変異体酵素発現菌株の作製及びプトレシン変換の測定
実施例４で変異を最適化したＯＤＣ変異体酵素が実際に微生物内でもオルニチンをプトレシンに変換する効果があるか否かを評価した。
【００８８】
具体的には、ＤＥ３遺伝子型を有する大腸菌に前述したように作製したｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ変異体ベクターを導入した菌株を用いて実験を行った。ＬＢ平板培地から各菌株の単一コロニーを選択して３ｍｌのＬＢ（＋カナマイシン ５０ｕｇ／ｍｌ）液体培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１６時間培養した。これを新たな２５ｍｌのＬＢ（＋カナマイシン ５０ｕｇ／ｍｌ及び０．２％ グルコース）液体培地に再接種し、ＯＤ６００値が０．５〜０．６になるように培養した。その後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＯＤＣ（ｓｐｅＣ）の発現を誘導し、１８℃、２００ｒｐｍの条件で２０時間培養し、次いで遠心分離により上清を除去して細胞を得た。凝集体（pellet）の形態で得られた細胞を再び１ＸＭ９最小培地（３．３７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，２．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．８６ｍＭ ＮａＣｌ，０．９４ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ）に再懸濁してＯＤ６００値が２０になるように調整し、さらに基質である１０ｍＭオルニチンと補因子である０．５ｕＭ ＰＬＰを添加して最終反応体積が１０ｍｌになるようにした。２５℃、２００ｒｐｍの条件で振盪しながら反応させ、所定時間毎にサンプリングしてＴＮＢＳを用いたプトレシン定量測定方法で変換されたプトレシン濃度を測定した（非特許文献８）。
【００８９】
ＴＮＢＳ方法は、前述したようにサンプリングした培養液を遠心分離し、その後上清を５０倍に希釈して分析を行った。希釈した分析試料０．５ｍｌに４Ｎ ＮａＯＨを１ｍｌ添加して十分に混合し、それに１−ペンタノールを２ｍｌ注いでさらに混合した。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後０．１Ｍ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ８．０）を１ｍｌ入れた新たなチューブに上清１ｍｌを注いで十分に混合した。さらに１０ｍＭ ＴＮＢＳを１ｍｌ添加して混合し、ＤＭＳＯを２ｍｌ注いで混合し、その後遠心分離し、次いで上清を取って４２６ｎｍで吸光度を測定した。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
野生型とＯＤＣ変異体３種に対してプトレシン変換測定実験を行った結果、反応２時間後のｓａｍｐｌｅにおいて、ＯＤＣ変異体はオルニチンをプトレシンに変換する速度が野生型に比べて相対的に約３２〜３９％増加した。ＯＤＣ変異体間の変換速度差はほとんどなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で見られた精製したＯＤＣ変異体間における大きな活性の差は見られなかったものの、野生型においては４時間経過しても反応が完全には終了しなかったが、変異体においては４時間以内に反応がほぼ終了した。上記結果から、ｉｎ ｖｉｖｏ実験である酵素変換菌株においてもＯＤＣ変異体の活性効果が向上することが確認された。
【００９２】
実施例６：ＯＤＣ変異体導入プトレシン生産菌株の作製及びプトレシン生産能の測定
前述したように作製したプトレシン変換活性が増加したＯＤＣ変異体を実際にプトレシン生産菌株に導入するとプトレシン生産性にいかなる影響を与えるかを確認するために、プトレシン生産能を測定した。
【００９３】
６−１．ＯＤＣ変異体導入プトレシン生産菌株の作製
ＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を内在性活性より低下させることによりプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ）に基づき、前記プトレシン変換活性が増加したＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異体を染色体内の野生型ｓｐｅＣに導入した変異菌株を作製した。
【００９４】
前記プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ）菌株は、特許文献２に開示されている菌株であり、母菌株として特許文献３に開示されているプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）を用いて作製した。より具体的な菌株作製方法は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の遺伝子ＮＣｇｌ１４６９の塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ１４６９のＮ末端部分とＣ末端部分をｐＤＺベクターにクローニングし、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）菌株に電気穿孔法を用いて導入し、その後カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含む培地に塗抹して選択した。ベクターの染色体挿入が正常に行われたものは、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む培地で青色を示すコロニーを選択し、１次染色体挿入が行われた菌株を栄養培地で培養し、その後希釈してＸ−ｇａｌを含む抗生物質を含まない培地に塗抹し、低い割合で出現する白色コロニーを選択することにより、交差（cross over）による最終のＮＣｇｌ１４６９遺伝子欠失菌株を選択した。最終的に作製されたＫＣＣＭ１１１３８Ｐ△ＮＣｇｌ１４６９菌株は、細胞内でプトレシン分解経路の１つであるプトレシンがＮ−アセチルプトレシンに分解される経路に関与するタンパク質であるＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子を欠失させることにより、母菌株であるＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株よりプトレシン生産能が向上したプトレシン過剰生産菌株である。
【００９５】
具体的には、表７に示すｓｐｅＣ＿ｓｔａｒｔ（ＢａｍＨＩ）＿５、ｓｐｅＣ＿ｓｔｏｐ（ＸｂａＩ）＿３プライマーを用いて、実施例２及び４で作製したＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異体のＤＮＡを増幅した。より具体的には、前述したように作製したｐＥＴ２８ａ−ｓｐｅＣ変異体（Ｉ１６３Ｓ，Ｉ１６３Ｖ，Ｉ１６３Ｓ Ｅ１６５Ｖ）ベクターを鋳型とし、表７に示すｓｐｅＣ＿ｓｔａｒｔ（ＢａｍＨＩ）＿５、ｓｐｅＣ＿ｓｔｏｐ（ＸｂａＩ）＿３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００９６】
【表７】
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【００９７】
ＰＣＲ増幅により得られた遺伝子断片とベクターｐＤＺをＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素で処理（３７℃，３時間）し、その後通常のライゲーション（ligation）方法を用いてｐＤＺベクターにｓｐｅＣ変異体の遺伝子断片を挿入した。作製された染色体挿入用組換えベクター（ｐＤＺ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ，ｐＤＺ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｖ，ｐＤＺ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ Ｅ１６５Ｖ）は配列分析により確認した。
【００９８】
ｓｐｅＣ変異体が染色体に挿入された菌株を得るために、前述したように作製したｐＤＺ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ、ｐＤＺ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｖ、ｐＤＺ−ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ Ｅ１６５Ｖ組換えベクターのそれぞれをＫＣＣＭ１１２４０Ｐ菌株に電気穿孔法でトランスフェクションし、その後ＢＨＩＳ平板培地（ブレインハートインフージョン ３７ｇ／ｌ，ソルビトール ９１ｇ／ｌ，寒天 ２％，１Ｌ中＋カナマイシン ２５ｕｇ／ｍｌ）に塗抹した。
【００９９】
ベクターの染色体挿入が正常に行われたか否かは、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かにより判別した。１次染色体挿入が行われた菌株を栄養培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、その後それぞれに段階希釈（serial dilution）を行い、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差により最終的にｓｐｅＣ変異体が染色体に導入された菌株が得られた。最終的に、菌株は変異体の配列分析により確認した。確認された菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ：：ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ：：ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｖ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ：：ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ Ｅ１６５Ｖと命名し、そのうちＫＣＣＭ１１２４０Ｐ：：ｓｐｅＣ＿Ｉ１６３Ｓ Ｅ１６５ＶをＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０５７８と命名し、２０１３年６月１０日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に受託番号ＫＣＣＭ１１４２５Ｐとして寄託した。
【０１００】
６−２．ＯＤＣ変異体導入プトレシン生産菌株のプトレシン生産能の測定
ＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異体導入によるプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の影響を確認するために、実施例６−１で作製した菌株を対象にプトレシン生産能を評価した。
【０１０１】
具体的には、前述したように作製した菌株を１ｍＭアルギニンを含むＣＭ平板培地（ブドウ糖１％，ポリペプトン １％，酵母抽出物０．５％，牛肉抽出物 ０．５％，ＮａＣｌ ０．２５％，尿素 ０．２％，５０％ ＮａＯＨ １００ｕｌ，寒天 ２％，ｐＨ６．８，１Ｌ中）で３０゜Ｃにて１６時間培養し、その後表８の組成からなる２５ｍｌの力価培地に１白金耳程度接種し、次いでこれを３０℃にて２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。作製された全ての菌株において、発酵時に培地に１ｍＭアルギニンを添加して培養した。
【０１０２】
【表８】
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【０１０３】
その結果、表９に示すように、活性が増加したＯＤＣ（ｓｐｅＣ）変異体を導入した菌株において、１２時間後の試料のプトレシン生産量が３７〜１０５％増加した。
【０１０４】
これらの結果は、ＯＤＣ変異体が導入されることにより、プトレシン生産菌株において糖消費の割に従来より高い濃度のプトレシンを生産できることを示すものである。
【０１０５】
【表９】
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【０１０６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【０１０７】
【表１０】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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