(57)【要約】  本開示は、ＣＤ２５に対する抗体に関し、例えば、臓器移植片拒絶を抑制する、または多発性硬化症を治療するための、このような抗体の使用に関する。
2016515524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、
（ｃ）ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％である、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項２】
ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大４０％である、請求項１に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３】
ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大３０％である、請求項２に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４】
配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体のＣＨ２ドメインを含み、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ａ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２６３置換、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２６６置換および
（ｃ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２７３置換
から選択される、１つ以上の置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５】
配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体のＣＨ２ドメインを含み、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ａ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２６３置換および
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２７３置換
から選択される、１つ以上の置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６】
配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体のＣＨ２ドメインを含み、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される、１つ以上の置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７】
配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体のＣＨ２ドメインを含み、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌおよび／または
（ｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換
から選択される、１つ以上の置換を有する、請求項６に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖ、および（ｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋを含み、任意選択により、（ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｒ、Ｓ５３ＫまたはＳ５３Ｎ、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５６Ｒ、（ｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ５８Ｑ、（ｖｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ７３Ｋ、（ｖｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋ、および（ｖｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅのうちの１つ以上を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖ、（ｉｉ）Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｎ、および（ｉｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋ、（ｉｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋ、および（ｖ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅを含み、任意選択により、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｙ５６Ｒをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１０】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、（ｉｉ）Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｋ、（ｉｉｉ）Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋ、および（ｉｖ）Ｙ５６Ｒ、（ｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１１】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２ＫおよびＴ５４Ｒを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１２】
配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅをさらに含む、請求項１１に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１３】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｓ５３ＲおよびＴ５４Ｋならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１４】
配列番号３（ＦＲ−Ｈ１）、配列番号５（ＦＲ−Ｈ２）、配列番号７（ＦＲ−Ｈ３）、配列番号９（ＦＲ−Ｈ４）、配列番号１０（ＦＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＦＲ−Ｌ２）、配列番号１４（ＦＲ−Ｌ３）および配列番号１６（ＦＲ−Ｌ４）のフレームワークと比較して、最大４つのアミノ酸置換を有するフレームワーク領域を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１５】
配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片と比較して、Ｔ細胞免疫原性が低減された、請求項１４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１６】
配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１７】
配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍを欠く、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項１８】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、
（ｃ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖ、および（ｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋを含み、任意選択により、（ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｒ、Ｓ５３ＫまたはＳ５３Ｎ、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５６Ｒ、（ｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ５８Ｑ、（ｖｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ７３Ｋ、（ｖｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋ、および（ｖｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅのうちの１つ以上を含み、任意選択により、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項１９】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、
（ｃ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖ、（ｉｉ）Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｎおよび（ｉｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋ、（ｉｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅを含み、任意選択により、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｙ５６Ｒをさらに含み、任意選択により、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項２０】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、
（ｃ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、（ｉｉ）Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｋ、（ｉｉｉ）Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋ、および（ｉｖ）Ｙ５６Ｒ、（ｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄを含み、任意選択により、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項２１】
配列番号３（ＦＲ−Ｈ１）、配列番号５（ＦＲ−Ｈ２）、配列番号７（ＦＲ−Ｈ３）、配列番号９（ＦＲ−Ｈ４）、配列番号１０（ＦＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＦＲ−Ｌ２）、配列番号１４（ＦＲ−Ｌ３）および配列番号１６（ＦＲ−Ｌ４）のフレームワークと比較して、最大４つのアミノ酸置換を有するフレームワーク領域を含む、請求項１８から［００４６］のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２２】
配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片と比較して、Ｔ細胞免疫原性が低減された、請求項２１に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２３】
配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍを含む、請求項２１または請求項２２に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２４】
配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のＩ４８での置換を含まない、請求項２１または請求項２２に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２５】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ｃ）ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％であり、任意選択的に、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項２６】
ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大４０％である、請求項２５に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２７】
ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大３０％である、請求項２６に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２８】
配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体と比較して、免疫原性が低減された、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項２９】
配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍを含む、請求項２８に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３０】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２ＫおよびＴ５４Ｒ、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のアミノ酸置換Ｓ２９Ｋならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｄをさらに含む、請求項２９に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３１】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２ＫおよびＴ５４Ｒならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅをさらに含む、請求項２９に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３２】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｓ５３ＲおよびＴ５４Ｋをさらに含む、請求項２９に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３３】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｔ５４Ｓを含む、請求項２８に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３４】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｔ５４Ｓをさらに含む、請求項２９に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３５】
配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のアミノ酸置換Ｓ２９Ｋおよび配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｄをさらに含む、請求項３４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３６】
配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅをさらに含む、請求項３４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３７】
配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｓ５３ＲおよびＴ５４Ｋをさらに含む、請求項３４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３８】
配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のアミノ酸置換Ｓ２９Ｋおよび配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｄをさらに含む、請求項３７に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項３９】
配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅをさらに含む、請求項３７に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４０】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、
（ｃ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲを有する抗体と比較して、
（ｉ）表２０に示されたＣＤＲ変異体Ｈ１−Ｈ３５４のうちのいずれかに存在する、少なくとも１つの置換を含む重鎖ＣＤＲならびに／または
（ｉｉ）表２１に示されたＣＤＲ変異体Ｌ１−Ｌ２８８およびＬ６４９のうちのいずれかに存在する、少なくとも１つの置換を含む軽鎖ＣＤＲ
を有し、任意選択的に、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項４１】
配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲを有する抗体と比較して、表２０に示されたＣＤＲ変異体Ｈ３６１−Ｈ３６９、Ｈ４０５−Ｈ４４３、Ｈ４４９−Ｈ４８７；Ｈ４９３−Ｈ５３１；Ｈ５３７−Ｈ５７２；Ｈ５７８−Ｈ６１３；Ｈ６１９−Ｈ６５４；Ｈ６６０−Ｈ６９０；Ｈ６９６−Ｈ７２６；Ｈ７３２−Ｈ７６２；Ｈ７６８−Ｈ７９８；Ｈ８０４−Ｈ８３４；Ｈ８４０−Ｈ８６５；Ｈ８７１−Ｈ８９６；Ｈ９０２−Ｈ９２７；Ｈ９３３−Ｈ９５８；Ｈ９６４−Ｈ９８９；Ｈ９９５−Ｈ１０１５；Ｈ１０２１−Ｈ１０４１；Ｈ１０７−Ｈ１０６７；Ｈ１０７３−Ｈ１０９３；Ｈ１０９９−Ｈ１１１９；Ｈ１１２５−Ｈ１１４１；Ｈ１１４７−Ｈ１１６３；Ｈ１１６９−Ｈ１１８５；Ｈ１１９１−Ｈ１２０７；Ｈ１２１３−Ｈ１２２６；Ｈ１２３２−Ｈ１２４５；Ｈ１２５１−Ｈ１２６４；Ｈ１２７０−Ｈ１２８０；Ｈ１２８６−Ｈ１２９６；Ｈ１３０２−Ｈ１３１２；Ｈ１３１６−Ｈ１３２７；Ｈ１３３３−Ｈ１３４１；Ｈ１３４７−Ｈ１３５１；Ｈ１３５７−Ｈ１３６１；Ｈ１３６７−Ｈ１３７１；Ｈ１３７７−Ｈ１３８１；Ｈ１３８７−Ｈ１３９１；Ｈ１４２５−Ｈ１４７６；Ｈ１４７８−Ｈ１５１７；およびＨ１５１９−Ｈ１５５８のうちのいずれかに存在する、少なくとも２つの置換を含む重鎖ＣＤＲを有する、請求項４０に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４２】
配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲを有する抗体と比較して、表２１に示されたＣＤＲ変異体Ｌ２８９−Ｌ６４８およびＬ６５０−Ｌ６７９のうちのいずれかに存在する、少なくとも２つの置換を含む軽鎖ＣＤＲを有する、請求項４０または請求項４１に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４３】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｉ４８Ｍを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４４】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｉ４８Ｖを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４５】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｉ５１Ｌを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４６】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｔ５４Ｓを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４７】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｉ４８ＭおよびＩ５１Ｌを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４８】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｉ４８ＶおよびＴ５４Ｓを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項４９】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有し、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、重鎖置換Ｉ４８ＭおよびＴ５４Ｓを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５０】
その重鎖可変領域が、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５１】
その軽鎖可変領域が、配列番号２の軽鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５２】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する重鎖可変領域であって、重鎖が、配列番号１の重鎖と比較して、
（ｉ）Ｉ４８Ｍ、
（ｉｉ）Ｉ４８Ｖ、
（ｉｉｉ）Ｉ５１Ｌ、
（ｉｖ）Ｔ５４Ｓ、
（ｖ）Ｉ４８ＭおよびＩ５１Ｌ、
（ｖｉ）Ｉ４８ＶおよびＴ５４Ｓならびに
（ｖｉｉ）Ｉ４８ＭおよびＴ５４Ｓ
から選択される少なくとも１つの置換または置換の組合せを含む重鎖可変領域を有し、
（ｃ）配列番号２の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を有し、任意選択的に、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項５３】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片であって、
（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、
（ｂ）配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ｃ）表７Ａ−７Ｃに示された組合せ変異体である、Ｃ１−Ｃ１９、Ｃ２１およびＣ２４−Ｃ６３のうちのいずれかに存在するアミノ酸置換を含み、任意選択的に、
（ｄ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、
（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または
（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または
（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または
（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換
から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む、
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片。
【請求項５４】
表８Ａによる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ置換および／または表８Ｂによる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ置換を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５５】
表８Ａによる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ置換が、
（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２４Ｖ、
（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＡ２５Ｉ、Ａ２５ＴまたはＡ２５Ｍ、
（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２６Ｌ、
（ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２７Ｋ、Ｓ２７Ｒ、Ｓ２７ＡまたはＳ２７Ｎ、
（ｅ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ａ、Ｓ２９ＫまたはＳ２９Ｒ、
（ｆ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＭ３３Ｇ、
（ｇ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＴ５０Ａ、
（ｈ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＳ５２Ａ、Ｓ５２Ｖ、Ｓ５２Ｄ、Ｓ５２ＥまたはＳ５２Ｍ、
（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ａ、Ｎ５３Ｄ、Ｎ５３Ｅ、Ｎ５３ＦまたはＮ５３Ｙ、
（ｊ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＬ５４Ｈ、
（ｋ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＳ５６Ａ、
（ｌ）ＣＤＲ−Ｌ３内のＴ９３Ｑ、Ｔ９３Ｒ、Ｔ９３Ｍおよび
（ｍ）ＣＤＲ−Ｌ３内のＴ９７Ｓ
のうちの１つ以上を含む、請求項５４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５６】
表８Ｂによる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ置換が、
（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１内のＳ３１Ｆ、Ｓ３１Ｋ、Ｓ３１ＲもしくはＳ３１Ｗ、
（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１内のＹ３２Ｓ、Ｙ３２ＴもしくはＹ３２Ｖ、
（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ１内のＭ３４Ａ、Ｍ３４ＴもしくはＭ３４Ｖ、
（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＩ５１Ｗ、Ｉ５１Ｌ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１ＫもしくはＩ５１Ｖ、
（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＮ５２Ａ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２Ｒ、Ｎ５２ＳもしくはＮ５２Ｖ、
（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｋ、Ｓ５３Ｔ、Ｓ５３ＰもしくはＳ５３Ａ、
（ｇ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＴ５４Ａ、Ｔ５４Ｋ、Ｔ５４ＳもしくはＴ５４Ｖ、
（ｈ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５６Ｋ、Ｙ５６ＲもしくはＹ５６Ａ、
（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＴ５７Ａ、Ｔ５７ＤもしくはＴ５７Ｇ、
（ｊ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５９Ｅ、
（ｋ）Ｆ６３Ｓ、
（ｌ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＫ６４Ａ、Ｋ６４Ｄ、Ｋ６４ＶもしくはＫ６４Ｇ、
（ｍ）ＣＤＲ−Ｈ３内のＤ１０１Ｇおよび／または
（ｎ）ＣＤＲ−Ｈ３内のＹ１０２Ｄ、Ｙ１０２Ｋ、Ｙ１０２ＱもしくはＹ１０２Ｔ
のうちの１つ以上を含む、請求項５４または請求項５５に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５７】
表８Ａによる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ置換および／または表８Ｂによる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ置換を含み、野生型の非ヒスチジン残基が、ヒスチジンで置換された、請求項１から５６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５８】
その重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と比較して、併せて少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのアミノ酸置換を含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項５９】
その６つのＣＤＲが併せて、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲ配列と比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、請求項１から５４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６０】
任意の個々のＣＤＲが、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する抗体の、対応するＣＤＲ配列と比較して、３つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項５４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６１】
ＣＤＲ−Ｈ２以外の任意の個々のＣＤＲが、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する抗体の、対応するＣＤＲ配列と比較して、２つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項５４または請求項６０に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６２】
任意の個々のフレームワーク領域が、配列番号３、５、７、９、１０、１２、１４および１６のフレームワーク配列を有する抗体の、対応するフレームワーク配列と比較して、５つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６３】
任意の個々のフレームワーク領域が、配列番号３、５、７、９、１０、１２、１４および１６のフレームワーク配列を有する抗体の、対応するフレームワーク配列と比較して、４つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６４】
任意の個々のフレームワーク領域が、配列番号３、５、７、９、１０、１２、１４および１６のフレームワーク配列を有する抗体の、対応するフレームワーク配列と比較して、３つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６５】
任意の個々のフレームワーク領域が、配列番号３、５、７、９、１０、１２、１４および１６のフレームワーク配列を有する抗体の対応するフレームワーク配列と比較して、２つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６６】
任意の個々のフレームワーク領域が、配列番号３、５、７、９、１０、１２、１４および１６のフレームワーク配列を有する抗体の対応するフレームワーク配列と比較して、１つ以下のアミノ酸置換を有する、請求項１から６５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６７】
そのＶＨ配列が、表２２−１から２２−３に示された、変異体ＸＨ１からＸＨ１６のうちのいずれかのＶＨ配列からなるものではない、請求項１から６６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６８】
そのＶＬ配列が、表２２−４から２２−８に示された、変異体ＸＬ１からＸＬ２５のうちのいずれかのＶＬ配列からなるものではない、請求項１から６７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項６９】
そのＶＨ配列およびＶＬ配列が、表２２−９に示された、抗体ＸＦ１からＸＦ１５のＶＨ配列およびＶＬ配列からなるものではない、請求項１から６６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７０】
ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはヒト抗体もしくはヒト化抗体のそれぞれの抗ＣＤ２５結合性断片である、請求項１から６９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７１】
このような請求項が、請求項４から７、１８から［００４６］、２５、４０、５２および５３のいずれか一項に従属する程度において、ＣＨ２ドメインが、配列番号１７のＦｃドメインのＣＨ２ドメインと比較して、最大２０、最大１５、最大１２、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有するＦｃドメインの一部である、請求項８から１７、２１から２４、２６から３９、４１から５１および５４から７０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７２】
Ｆｃドメインが、配列番号１７のＦｃドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項７１に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７３】
ＩｇＧである、請求項１から７０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７４】
ＩｇＧ１である、請求項７３に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７５】
アイソタイプＩｇＧ１  ｆａである、請求項７４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７６】
アイソタイプＩｇＧ１  ｆａではない、請求項７４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７７】
ＩｇＧ２である、請求項７３に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７８】
ＩｇＧ２Ｍ３である、請求項７７に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項７９】
ＩｇＧ４である、請求項７３に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８０】
そのＦｃドメインが、置換Ｍ４２８Ｌを含む、請求項７１から７９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８１】
そのＦｃドメインが、置換Ｔ２５０Ｑをさらに含む、請求項８０に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８２】
Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメインを有する、請求項１から８１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８３】
ＡＤＣＣ活性を増大させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８４】
ＡＤＣＣ活性を減少させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８５】
そのＦｃドメインが、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、請求項８４に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８６】
フコシル化されていない、請求項１から８２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８７】
ＦｃγＲへの結合を増大させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８８】
ＦｃγＲへの結合を減少させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項８９】
ＦｃＲｎへの結合を増大させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含む、請求項１から８２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９０】
ＣＤ２５に対するアフィニティーが、配列番号１に対応するＶＨ配列および配列番号２に対応するＶＬ配列を有する、対応する抗体のＣＤ２５に対するアフィニティーの少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍である、請求項１から８９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９１】
ＣＤ２５に対するアフィニティーが、配列番号１に対応するＶＨ配列および配列番号２に対応するＶＬ配列を有する、対応する抗体のＣＤ２５に対するアフィニティーの最大１０倍、最大１５倍、最大２０倍または最大３０倍である、請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９２】
ＣＤ２５に対するアフィニティーが、配列番号１に対応するＶＨ配列および配列番号２に対応するＶＬ配列を有する、対応する抗体のＣＤ２５に対するアフィニティーの３から１５倍、５から１０倍または２から３０倍である、請求項１から９１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９３】
精製されている、請求項１から９２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９４】
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の均質性まで精製されている、請求項９３に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片。
【請求項９５】
請求項１から９２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９６】
請求項１から９２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片または請求項９５に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項９７】
請求項１から９２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９８】
請求項９７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９９】
請求項９８に記載のベクターで形質転換された、原核宿主細胞。
【請求項１００】
請求項９８に記載のベクターで形質転換された、真核宿主細胞。
【請求項１０１】
請求項９７に記載のヌクレオチド配列を発現するように操作された、真核宿主細胞。
【請求項１０２】
哺乳動物宿主細胞である、請求項１０１に記載の真核宿主細胞。
【請求項１０３】
抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片を作製する方法であって、
（ａ）請求項１０１または請求項１０２に記載の真核宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）抗ＣＤ２５抗体または抗体の抗ＣＤ２５結合性断片を回収するステップと
を含む方法。
【請求項１０４】
臓器移植片拒絶を防止する方法であって、臓器移植片拒絶の防止を必要とするヒトに、治療有効量の、請求項１から９４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片、請求項９５に記載の抗体−薬物コンジュゲートまたは請求項９６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１０５】
喘息、多発性硬化症、ブドウ膜炎、眼炎症または１型ヒトＴ細胞白血病ウイルス関連Ｔ細胞白血病を治療する方法であって、前記治療を必要とするヒトに、治療有効量の、請求項１から９４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片、請求項９５に記載の抗体−薬物コンジュゲートまたは請求項９６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願との相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下において、２０１３年３月１５日に出願され、参照によりその全体において組み込まれている、仮出願第６１／７９８，２３５号の利益を主張する。
【０００２】
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、配列表を含有する。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年３月１３日に創出され、３８１４９３−８８５ＷＯ（１２９６８２）＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、６７，６４９バイトのサイズである。
【０００３】
３．発明の分野
本発明は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２５抗体を含む医薬組成物およびこのような抗体の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
高アフィニティーのインターロイキン２受容体（ＩＬ２−Ｒ：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、αポリペプチド鎖、βポリペプチド鎖およびγｃポリペプチド鎖からなる、ヘテロ三量体の細胞表面受容体である（ＫＤ：１０−１１Ｍ）。ＩＬ２−Ｒα、ＣＤ２５、ｐ５５およびＴａｃ（Ｔ細胞活性化）抗原としてもまた公知である、５５ｋＤａのα鎖は、ＩＬ２−Ｒに固有である。β（ＣＤ１２２；Ｐ７５）鎖およびγｃ（ＣＤ１３２）鎖は、サイトカイン受容体スーパーファミリー（ヘマトポエチン受容体）の一部であり、ＩＬ−１５Ｒなど、他のサイトカイン受容体の機能的な構成要素である（Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４（６）：２６４−７０；Ｅｌｌｅｒｙら、２００２、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３（１）：２７−４０）。中程度のアフィニティーの受容体が、β鎖およびγｃ鎖（ＫＤ：１０−９Ｍ）からなる二量体であるのに対し、低アフィニティーの受容体は、シグナル伝達能を有さない単量体のαサブユニット（ＫＤ：１０−８Ｍ）（Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４（６）：２６４−７０）からなる。
【０００５】
休眠Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球は、ＣＤ２５分子をほとんど発現させない。しかし、受容体は、急速に転写され、活性化すると発現する（Ｅｌｌｅｒｙら、２００２、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３（１）：２７−４０；Ｍｏｒｒｉｓら、２０００、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５９（増刊１）：１１０９−１４）。高アフィニティーのＩＬ２−Ｒを発現させる細胞は、ＣＤ２５（ＣＤ２５サブユニット）を過剰に発現させ、高アフィニティーのＩＬ２結合プロファイルおよび低アフィニティーのＩＬ２結合プロファイルの両方をもたらす（Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ、８２（６）：１７０１−１２；ｄｅ  Ｊｏｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１３３９−４８）。ＺＥＮＡＰＡＸという商標名の下で既に市販されているヒト化抗ＣＤ２５抗体である、抗ＣＤ２５抗体であるダクリズマブは、臓器移植片拒絶（Ｐａｓｃｕａｌら、２００１、Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０（１２）：１２８２−９０により総説されている。）、喘息（例えば、Ｂｕｓｓｅら、２００８、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１７８（１０）：１００２−１００８を参照されたい。）、多発性硬化症（例えば、Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００９、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、６６（４）：４８３−９を参照されたい。）、ブドウ膜炎（Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、９６：７４６２−７４６６）、眼炎症（Ｂｈａｔら、２００９、Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２４７：６８７−６９２）および１型ヒトＴ細胞白血病ウイルス関連Ｔ細胞白血病（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２０１０、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１０、ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２８（５月２０日増刊）：８０４３）など、免疫系に影響を及ぼす、様々なこのような状態における臨床有効性を示している。
【０００６】
本出願の２節または他の任意の節における、任意の参考文献の引用または同定は、このような参考文献が、本開示に対する先行技術として利用可能であることの容認とみなされないものとする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗａｌｄｍａｎｎ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４（６）：２６４−７０
【非特許文献２】Ｅｌｌｅｒｙら、２００２、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３（１）：２７−４０
【非特許文献３】Ｍｏｒｒｉｓら、２０００、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５９（増刊１）：１１０９−１４
【非特許文献４】Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ、８２（６）：１７０１−１２
【非特許文献５】ｄｅ  Ｊｏｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１３３９−４８
【非特許文献６】Ｐａｓｃｕａｌら、２００１、Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０（１２）：１２８２−９０
【非特許文献７】Ｂｕｓｓｅら、２００８、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１７８（１０）：１００２−１００８
【非特許文献８】Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００９、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、６６（４）：４８３−９
【非特許文献９】Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、９６：７４６２−７４６６
【非特許文献１０】Ｂｈａｔら、２００９、Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２４７：６８７−６９２
【非特許文献１１】Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２０１０、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１０、ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２８（５月２０日増刊）：８０４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要旨）
５．要旨
本開示は、配列において、抗ＣＤ２５抗体であるダクリズマブと類縁であるが、ＣＤ２５に対するアフィニティーの増大、ＩＬ２活性の阻害（ＩＬ２誘導性Ｔ細胞増殖を阻害する能力など）の増大または免疫原性の低減など、特性の改善により特徴づけられる、抗ＣＤ２５抗体に関する。興味深いことに、本発明者らは、ＩＬ２活性を阻害する能力が、ＣＤ２５に対するアフィニティーと常に相関するわけではないことを発見した。さらに、本発明者らは、ダクリズマブの免疫原性を低減し、ＩＬ２活性に対するその阻害を改善する、ある種のアミノ酸置換も同定した。
【０００９】
ダクリズマブの重鎖（配列番号１）は、本明細書では、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（アミノ末端からカルボキシ末端の順序で）と称される、３つの重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）により隔てられた、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４（アミノ末端からカルボキシ末端の順序で）と称される、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含有する可変領域を有する。ダクリズマブの重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）および配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）と呼ばれる。ダクリズマブの重鎖ＦＲ配列は、配列番号３（ＦＲ−Ｈ１）、配列番号５（ＦＲ−Ｈ２）、配列番号７（ＦＲ−Ｈ３）および配列番号９（ＦＲ−Ｈ４）と呼ばれる。
【００１０】
同様に、ダクリズマブの軽鎖（配列番号２）も、本明細書では、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（アミノ末端からカルボキシ末端の順序で）と称される、３つの軽鎖ＣＤＲにより隔てられた、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３およびＦＲ−Ｌ４と称される（アミノ末端からカルボキシ末端の順序で）、４つのフレームワーク領域を含有する可変領域を有する。ダクリズマブの軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）と呼ばれる。ダクリズマブのＦＲ配列は、配列番号１０（ＦＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＦＲ−Ｌ２）、配列番号１４（ＦＲ−Ｌ３）および配列番号１６（ＦＲ−Ｌ４）と呼ばれる。
【００１１】
本開示は、ＣＤＲ配列がダクリズマブのＣＤＲと類縁である、抗体および結合性断片を提示する。抗体および結合性断片はまた、ダクリズマブのＦＲ配列と類縁であるＦＲ配列も有しうる。したがって、いくつかの態様では、本開示の抗体および断片は、配列がダクリズマブのＶＨ領域およびＶＬ領域と類縁である、ＶＨ配列およびＶＬ配列を含む。ダクリズマブの可変領域の配列は、図１Ａおよび１Ｂに示され、ＣＤＲおよびフレームワーク領域の番号付けは、表１（重鎖について）および表２（軽鎖について）に示されている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片（集合的に「抗ＣＤ２５抗体」と称される。）は、以下の特性（ａ）（ｉ）から（ａ）（ｖ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ全ておよび特性（ｂ）（ｉ）から（ｂ）（ｉｉ）のうちの一方または両方：
（ａ）（ｉ）抗ＣＤ２５抗体が、配列番号１および配列番号２の可変領域のＶＨ配列およびＶＬ配列と比較して、併せて少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つもしくは少なくとも５つのアミノ酸置換を含むこと、
（ｉｉ）抗ＣＤ２５抗体の６つのＣＤＲが併せて、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲ配列と比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つもしくは最大４つのアミノ酸置換を有すること、
（ｉｉｉ）任意の個々のＣＤＲが、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する抗体の、対応するＣＤＲ配列と比較して、３つ以下のアミノ酸置換を有する、もしくはＣＤＲ−Ｈ２以外の任意の個々のＣＤＲが、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する抗体の、対応するＣＤＲ配列と比較して、２つ以下のアミノ酸置換を有すること、
（ｉｖ）個々のフレームワーク領域が、配列番号３、５、７、９、１０、１２、１４および１６のフレームワーク配列を有する抗体の、対応するフレームワーク配列と比較して、１、２、３、４もしくは５つ以下のアミノ酸置換を有することならびに／または
（ｖ）本開示の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列が、ダクリズマブのＶＨ配列およびＶＬ配列（配列番号１および配列番号２）に対して、少なくとも７５％の配列同一性（さらに、ある種の実施形態では、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有すること、
（ｂ）（ｉ）抗ＣＤ２５抗体が、ダクリズマブと比較して、少なくとも１つのＣＤＲ内に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことおよび／または
（ｉｉ）抗ＣＤ２５抗体が、ダクリズマブと比較して、少なくとも１つのフレームワーク領域内に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むこと
により特徴づけられる。
【００１３】
本開示の抗ＣＤ２５抗体に、単独または組合せで組み込まれうる、例示的な個々のＣＤＲ置換およびＦＲ置換は、表６−８および１１−２１に示されている。
【００１４】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、表６Ａに示された少なくとも１つのアミノ酸置換および／または表７Ａ−７Ｃによる少なくとも１つの置換の組合せを含むことが好ましい。したがって、特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、Ｓ２９、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、Ｓ３４、Ｓ３５、Ｓ３６、Ｓ３７、Ｓ３８、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｓ４１、Ｓ４２、Ｓ４３、Ｓ４４、Ｓ４５、Ｓ４６、Ｓ４７、Ｓ４８、Ｓ４９、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ５４、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｓ５７、Ｓ５８、Ｓ５９、Ｓ６０、Ｓ６１、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｓ６４、Ｓ６５、Ｓ６６、Ｓ６７、Ｓ６８、Ｓ６９、Ｓ７０、Ｓ７１、Ｓ７２、Ｓ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｓ７６、Ｓ７７、Ｓ７８およびＳ７９による少なくとも１つの置換（表６Ａを参照されたい。）および／またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２、Ｃ４３、Ｃ４４、Ｃ４５、Ｃ４６、Ｃ４７、Ｃ４８、Ｃ４９、Ｃ５０、Ｃ５１、Ｃ５２、Ｃ５３、Ｃ５４、Ｃ５５、Ｃ５６、Ｃ５７、Ｃ５８、Ｃ５９、Ｃ６０、Ｃ６１、Ｃ６２、およびＣ６３による少なくとも１つの置換の組合せ（表７Ａ−７Ｃを参照されたい。）を含む。任意選択により、本開示の抗体はまた、表８、１１−２１および２２−１から２２−９に示されている、１つ以上の置換または置換の組合せも含みうる。
【００１５】
具体的な実施形態では、重鎖および軽鎖の、ダクリズマブのＶＨ配列およびＶＬ配列と比較した配列同一性百分率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性または少なくとも９９％の配列同一性から独立に選択される。ある種の態様では、本開示の抗体は、ダクリズマブのＶＨ配列および／またはＶＬ配列に対して、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列を有する。
【００１６】
多様な態様では、本開示の抗体は、（ａ）それらのＣＤＲ内の、ダクリズマブと比較した、最大１７のアミノ酸置換および／または（ｂ）それらのフレームワーク領域内の、ダクリズマブと比較した、最大２０のアミノ酸置換を有する。（ａ）の具体的な実施形態では、本開示の抗体は、それらのＣＤＲ内の、ダクリズマブと比較した、最大２つ、最大３つ、最大４つ、最大５つ、最大６つ、最大７つ、最大８つ、最大９つ、最大１０、最大１１、最大１２、最大１３、最大１４、最大１５、最大１６または最大１７のアミノ酸置換を有する。（ｂ）の具体的な実施形態では、本開示の抗体は、それらのＣＤＲ内の、ダクリズマブと比較した、最大１つ、最大２つ、最大３つ、最大４つ、最大５つ、最大６つ、最大７つ、最大８つ、最大９つ、最大１０、最大１１、最大１２、最大１３、最大１４、最大１５、最大１６、最大１７、最大１８、最大１９または最大２０のアミノ酸置換を有する。
【００１７】
本開示の抗体の活性は、５．４節でさらに記載されたＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＩＣ５０を測定することにより、決定することができる。ＩＣ５０の測定は、多様な抗体の間の比較を可能とする。したがって、一態様では、本開示は、（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、（ｃ）ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％である、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の結合性断片を提示する。
【００１８】
典型的な実施形態では、ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０は、配列番号４、６、８、１１、１３および１５のＣＤＲを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％、最大４０％または最大３０％でありうる。
【００１９】
ある種の態様では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、本発明者らにより、ダクリズマブの免疫原性を低減し、さらに／またはＩＬ２活性に対するその阻害を改善することが示された、多様なアミノ酸置換を含みうる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２ＫおよびＴ５４Ｒを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｓ５３ＲおよびＴ５４Ｋならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のアミノ酸置換Ｎ５３Ｅを含む。
【００２０】
抗ＣＤ２５抗体はまた、それらのフレームワーク領域内の置換も含みうる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号３（ＦＲ−Ｈ１）、配列番号５（ＦＲ−Ｈ２）、配列番号７（ＦＲ−Ｈ３）、配列番号９（ＦＲ−Ｈ４）、配列番号１０（ＦＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＦＲ−Ｌ２）、配列番号１４（ＦＲ−Ｌ３）および配列番号１６（ＦＲ−Ｌ４）のフレームワークと比較して、最大４つのアミノ酸置換を有するフレームワーク領域を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ２５結合性断片と比較して、Ｔ細胞免疫原性が低減されている。
【００２１】
具体的な実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍを含む。具体的な実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較して、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍを欠く。
【００２２】
別の態様では、抗ＣＤ２５抗体は、ダクリズマブと比較して特徴づけられうる。したがって、本開示は、（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、（ｂ）配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、（ｃ）ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％である、抗ＣＤ２５抗体を提示する。
【００２３】
典型的な実施形態では、ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０は、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％、最大４０％または最大３０％でありうる。
【００２４】
多様な実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号５のＦＲ−Ｈ２と比較した、ＦＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｉ４８Ｍ、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２ＫおよびＴ５４Ｒならびに配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄ、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２ＫおよびＴ５４Ｒならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｅ、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｓ５３ＲおよびＴ５４Ｋ、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｔ５４Ｓ、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のアミノ酸置換Ｓ２９Ｋおよび配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄ、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｓ５３ＲおよびＴ５４Ｋ、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のアミノ酸置換Ｓ２９Ｋおよび配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄならびにこれらの組合せを含む、１つ以上の特異的な置換を含む。
【００２５】
抗ＣＤ２５抗体は、表２０（重鎖の置換について）および／または表２１（軽鎖の置換について）に示された、単一アミノ酸置換または二重アミノ酸置換のうちの１つ以上を含みうる。表２０および２１の単一アミノ酸置換は、予備的な結合アッセイにおいて、ＣＤ２５への結合に対して有害な作用を及ぼさず、任意選択により、ＣＤ２５への結合に対して有益な効果を及ぼすことが少なくとも示されている。したがって、一態様では、本開示は、（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、（ｃ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲを有する抗体と比較して、（ｉ）表２０に示されたＣＤＲ変異体Ｈ１−Ｈ３５４のうちのいずれかに存在する、少なくとも１つの置換を含む重鎖ＣＤＲならびに／または（ｉｉ）表２１に示されたＣＤＲ変異体Ｌ１−Ｌ２８８およびＬ６４９のうちのいずれかに存在する、少なくとも１つの置換を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を提示する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、表２０に示された、ＣＤＲ変異体Ｈ３６１−Ｈ３６９、Ｈ４０５−Ｈ４４３、Ｈ４４９−Ｈ４８７；Ｈ４９３−Ｈ５３１；Ｈ５３７−Ｈ５７２；Ｈ５７８−Ｈ６１３；Ｈ６１９−Ｈ６５４；Ｈ６６０−Ｈ６９０；Ｈ６９６−Ｈ７２６；Ｈ７３２−Ｈ７６２；Ｈ７６８−Ｈ７９８；Ｈ８０４−Ｈ８３４；Ｈ８４０−Ｈ８６５；Ｈ８７１−Ｈ８９６；Ｈ９０２−Ｈ９２７；Ｈ９３３−Ｈ９５８；Ｈ９６４−Ｈ９８９；Ｈ９９５−Ｈ１０１５；Ｈ１０２１−Ｈ１０４１；Ｈ１０７−Ｈ１０６７；Ｈ１０７３−Ｈ１０９３；Ｈ１０９９−Ｈ１１１９；Ｈ１１２５−Ｈ１１４１；Ｈ１１４７−Ｈ１１６３；Ｈ１１６９−Ｈ１１８５；Ｈ１１９１−Ｈ１２０７；Ｈ１２１３−Ｈ１２２６；Ｈ１２３２−Ｈ１２４５；Ｈ１２５１−Ｈ１２６４；Ｈ１２７０−Ｈ１２８０；Ｈ１２８６−Ｈ１２９６；Ｈ１３０２−Ｈ１３１２；Ｈ１３１６−Ｈ１３２７；Ｈ１３３３−Ｈ１３４１；Ｈ１３４７−Ｈ１３５１；Ｈ１３５７−Ｈ１３６１；Ｈ１３６７−Ｈ１３７１；Ｈ１３７７−Ｈ１３８１；Ｈ１３８７−Ｈ１３９１；Ｈ１４２５−Ｈ１４７６；Ｈ１４７８−Ｈ１５１７；およびＨ１５１９−Ｈ１５５８のうちのいずれかに存在する少なくとも２つの置換ならびに／または表２１に示された、ＣＤＲ変異体Ｌ２８９−Ｌ６４８およびＬ６５０−Ｌ６７９のうちのいずれかに存在する少なくとも２つの置換を含む。
【００２７】
また、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、それらの重鎖内に、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する抗ＣＤ２５抗体も提示されている。いくつかの実施形態では、これらの抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１の重鎖可変領域と比較して、それらの重鎖内に、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を、Ｉ４８Ｍ；Ｉ４８Ｖ；Ｉ５１Ｌ；Ｔ５４Ｓ；Ｉ４８ＭおよびＩ５１Ｌ；Ｉ４８ＶおよびＴ５４Ｓ；Ｉ４８ＭおよびＴ５４Ｓなど、免疫原性を低減する、特異的な重鎖置換と組み合わせて有する。他の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号２の軽鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する。
【００２８】
一態様では、本開示は、（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、（ｂ）配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する重鎖可変領域であって、重鎖が、配列番号１の重鎖と比較して、（ｉ）Ｉ４８Ｍ、（ｉｉ）Ｉ４８Ｖ、（ｉｉｉ）Ｉ５１Ｌ、（ｉｖ）Ｔ５４Ｓ、（ｖ）Ｉ４８ＭおよびＩ５１Ｌ、（ｖｉ）Ｉ４８ＶおよびＴ５４Ｓならびに（ｖｉｉ）Ｉ４８ＭおよびＴ５４Ｓから選択される、少なくとも１つの置換または置換の組合せを含む重鎖可変領域を有し、（ｃ）配列番号２の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を有する、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を提示する。
【００２９】
別の態様では、本開示は、（ａ）ヒトＣＤ２５に結合し、（ｂ）配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、（ｃ）表７Ａ−７Ｃに示された組合せ変異体、例えば、変異体Ｃ１−Ｃ１９、Ｃ２１およびＣ２４−Ｃ６３のうちのいずれかに存在するアミノ酸置換を含む、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を提示する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、表８Ａによる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ置換および／または表８Ｂによる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ置換を含む。具体的な実施形態では、表８Ａによる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ置換が、（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２４Ｖ、（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＡ２５Ｉ、Ａ２５ＴまたはＡ２５Ｍ、（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２６Ｌ、（ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２７Ｋ、Ｓ２７Ｒ、Ｓ２７ＡまたはＳ２７Ｎ、（ｅ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ａ、Ｓ２９ＫまたはＳ２９Ｒ、（ｆ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＭ３３Ｇ、（ｇ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＴ５０Ａ、（ｈ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＳ５２Ａ、Ｓ５２Ｖ、Ｓ５２Ｄ、Ｓ５２ＥまたはＳ５２Ｍ、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ａ、Ｎ５３Ｄ、Ｎ５３Ｅ、Ｎ５３ＦまたはＮ５３Ｙ、（ｊ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＬ５４Ｈ、（ｋ）ＣＤＲ−Ｌ２内のＳ５６Ａ、（ｌ）ＣＤＲ−Ｌ３内のＴ９３Ｑ、Ｔ９３Ｒ、Ｔ９３Ｍおよび（ｍ）ＣＤＲ−Ｌ３内のＴ９７Ｓのうちの１つ以上を含む。
【００３１】
具体的な実施形態では、表８Ｂによる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ置換が、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１内のＳ３１Ｆ、Ｓ３１Ｋ、Ｓ３１ＲもしくはＳ３１Ｗ、（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１内のＹ３２Ｓ、Ｙ３２ＴもしくはＹ３２Ｖ、（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ１内のＭ３４Ａ、Ｍ３４ＴもしくはＭ３４Ｖ、（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＩ５１Ｗ、Ｉ５１Ｌ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１ＫもしくはＩ５１Ｖ  ｉｎ、（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＮ５２Ａ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２Ｒ、Ｎ５２ＳもしくはＮ５２Ｖ、（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｋ、Ｓ５３Ｔ、Ｓ５３ＰもしくはＳ５３Ａ、（ｇ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＴ５４Ａ、Ｔ５４Ｋ、Ｔ５４ＳもしくはＴ５４Ｖ、（ｈ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５６Ｋ、Ｙ５６ＲもしくはＹ５６Ａ、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＴ５７Ａ、Ｔ５７ＤもしくはＴ５７Ｇ、（ｊ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５９Ｅ、（ｋ）Ｆ６３Ｓ；（ｌ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＫ６４Ａ、Ｋ６４Ｄ、Ｋ６４ＶもしくはＫ６４Ｇ、（ｍ）ＣＤＲ−Ｈ３内のＤ１０１Ｇおよび／または（ｎ）ＣＤＲ−Ｈ３内のＹ１０２Ｄ、Ｙ１０２Ｋ、Ｙ１０２ＱもしくはＹ１０２Ｔのうちの１つ以上を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖおよび（ｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋを含み、任意選択により、（ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｒ、Ｓ５３ＫまたはＳ５３Ｎ、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５６Ｒ、（ｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ５８Ｑ、（ｖｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ７３Ｋ、（ｖｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋおよび（ｖｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅのうちの１つ以上を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖ、（ｉｉ）Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｎおよび（ｉｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋ、（ｉｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅを含み、任意選択により、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｙ５６Ｒをさらに含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、（ｉｉ）Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｋ、（ｉｉｉ）Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋおよび（ｉｖ）Ｙ５６Ｒ、（ｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄを含む。
【００３５】
ある種の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、野生型の非ヒスチジン残基が、ヒスチジンで置換された、表８Ａによる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ置換および／または表８Ｂによる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ置換を含む。
【００３６】
ある種の具体的な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、特定のアミノ酸置換の非存在により特徴づけられる。例えば、ある種の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、以下の特色：
（ａ）ＶＨ配列が、表２２−１から２２−３に示された、変異体ＸＨ１からＸＨ１６のうちのいずれかのＶＨ配列からなるのもではないこと、
（ｂ）ＶＬ配列が、表２２−４から２２−８に示された、変異体ＸＬ１からＸＬ２５のうちのいずれかのＶＬ配列からなるのもではないこと、
（ｃ）ＶＨ配列およびＶＬ配列が、表２２−９に示された、抗体ＸＦ１からＸＦ１５のＶＨ配列およびＶＬ配列からなるのもではないこと、
（ｄ）ＶＨ配列が、置換Ｅ７３Ｋを含まないこと、
（ｅ）本開示の抗ＣＤ２５抗体のＶＨが、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ３１Ｋ、（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ３１Ｒ、（ｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ３内のＳ９２Ｋおよび（ｉｖ）ＣＤＲ−Ｌ３内のＳ９２Ｒの置換のうちの１つ、２つ、３つまたは全てを含まず、または、このような置換が存在する場合、抗ＣＤ２５抗体が、表６−８、２０および２１から選択される、１つ以上の他の置換を含むことならびに
（ｅ）本開示の抗ＣＤ２５抗体のＶＬが、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＮ５２Ｋ、（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＮ５２Ｒ、（ｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｒおよび（ｉｖ）ＣＤＲ−Ｈ２内のＴ５４Ｒの置換のうちの１つ、２つ、３つまたは全てを含まず、または、このような置換が存在する場合、抗ＣＤ２５抗体が、表６−８、２０および２１から選択される、１つ以上の他の置換を含むこと
のうちの１つまたはこれらのうちの任意の２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ全ての組合せにより特徴づけられる。
【００３７】
本開示の抗体は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはこれらの抗ＣＤ２５結合性断片でありうる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Ｍ３およびＩｇＧ４を含むＩｇＧである。抗体は、アイソタイプＩｇＧ１  ｆａでありうるが、具体的な実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＧ１  ｆａではない。開示される抗体は、置換Ｍ４２８Ｌを含み、任意選択により、置換Ｔ２５０Ｑをさらに含む、Ｆｃドメインを有しうる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む。
【００３８】
抗ＣＤ２５抗体は、それらのＦｃ領域と関連する修飾を有しうる。ヒトＩｇＧ１（配列番号１７）に由来する野生型Ｆｃドメインは、図１１に示された。図１１の野生型ＦｃドメインのＣＨ２ドメイン（配列番号１８８）に二重下線が施され、図１１の野生型ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン（配列番号１８９）は太字とされている。したがって、開示されるいくつかの抗ＣＤ２５抗体は、ＡＤＣＣ活性を増大させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含む。他の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ＡＤＣＣ活性を減少させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異（例えば、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙ）を含む。本開示の抗体は、フコシル化されない場合があり、ＦｃγＲへの結合を増大させる、ＦｃγＲへの結合を減少させる、またはＦｃＲｎへの結合を増大させる、Ｆｃ領域内の１つ以上の突然変異を含みうる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１７のＦｃドメインのＣＨ２ドメインと比較して、最大２０、最大１５、最大１２、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する変異体Ｆｃドメインを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１７のＦｃドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体Ｆｃドメインを含む。
【００４１】
多様な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ａ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２６３置換、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２６６置換および（ｃ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２７３置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４２】
他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ａ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２６３置換、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＢに対するアフィニティーを増大させ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを減少させるＶ２７３置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４３】
他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４４】
なおも他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌおよび／または（ｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４５】
なおも他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、（ｂ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖおよび（ｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋを含み、任意選択により、（ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＳ５３Ｒ、Ｓ５３ＫまたはＳ５３Ｎ、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＹ５６Ｒ、（ｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ５８Ｑ、（ｖｉ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のＥ７３Ｋ、（ｖｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋおよび（ｖｉｉｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅのうちの１つ以上を含み、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４６】
さらに他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、（ｂ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｋ、Ｎ５２ＲまたはＮ５２Ｖ、（ｉｉ）Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｎおよび（ｉｉｉ）Ｔ５４Ｒ、Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋ、（ｉｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３ＤまたはＮ５３Ｅを含み、任意選択により、（ｉｖ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換Ｙ５６Ｒをさらに含み、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４７】
さらに他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、（ｂ）配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２と比較した、ＣＤＲ−Ｈ２内のアミノ酸置換（ｉ）Ｎ５２Ｓ、（ｉｉ）Ｓ５３ＲまたはＳ５３Ｋ、（ｉｉｉ）Ｔ５４ＳまたはＴ５４Ｋおよび（ｉｖ）Ｙ５６Ｒ、（ｖ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ１と比較した、ＣＤＲ−Ｌ１内のＳ２９Ｋならびに（ｖｉ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ２と比較した、ＣＤＲ−Ｌ２内のＮ５３Ｄを含む、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４８】
さらに他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、（ｂ）ＩＬ２依存Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＣ５０が、配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれを有する、対応する抗体のＩＣ５０の最大５０％であり、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００４９】
さらに他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲと比較して、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つ、最大４つ、最大３つまたは最大２つのアミノ酸置換を有するＣＤＲを含み、（ｂ）配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ２）および配列番号１５（ＣＤＲ−Ｌ３）のＣＤＲを有する抗体と比較して、（ｉ）表２０に示されたＣＤＲ変異体Ｈ１−Ｈ３５４のうちのいずれかに存在する、少なくとも１つの置換を含む重鎖ＣＤＲならびに／または（ｉｉ）表２１に示されたＣＤＲ変異体Ｌ１−Ｌ２８８およびＬ６４９のうちのいずれかに存在する、少なくとも１つの置換を含む軽鎖ＣＤＲを有し、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００５０】
さらに他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号１の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する重鎖可変領域であって、重鎖が、配列番号１の重鎖と比較して、（ｉ）Ｉ４８Ｍ、（ｉｉ）Ｉ４８Ｖ、（ｉｉｉ）Ｉ５１Ｌ、（ｉｖ）Ｔ５４Ｓ、（ｖ）Ｉ４８ＭおよびＩ５１Ｌ、（ｖｉ）Ｉ４８ＶおよびＴ５４Ｓならびに（ｖｉｉ）Ｉ４８ＭおよびＴ５４Ｓから選択される、少なくとも１つの置換または置換の組合せを含む重鎖可変領域を含み、（ｂ）配列番号２の重鎖可変領域と比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を有し、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００５１】
さらに他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、（ａ）配列番号１および配列番号２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれと比較して、最大１２、最大１１、最大１０、最大９つ、最大８つ、最大７つ、最大６つ、最大５つまたは最大４つのアミノ酸置換を有する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、（ｂ）表７Ａ−７Ｃに示された組合せ変異体である、Ｃ１−Ｃ１９、Ｃ２１およびＣ２４−Ｃ６３のうちのいずれかに存在するアミノ酸置換を含み、任意選択により、（ｃ）配列番号１８８のＣＨ２ドメインに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号１８８のＣＨ２ドメインに照らして、（ｉ）置換Ｖ２６３Ｌならびに／または（ｉｉ）置換Ｖ２６６Ｌならびに／または（ｉｉｉ）Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙから選択されるＶ２７３置換ならびに／または（ｉｖ）Ｖ３０５ＫおよびＶ３０５Ｗから選択されるＶ３０５置換から選択される、１つ以上の置換を有する変異体のＣＨ２ドメインを含む。
【００５２】
一態様では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ダクリズマブと比較した、ＣＤ２５に対するアフィニティーの改善を呈示する。したがって、抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５に対するアフィニティーが、配列番号１に対応するＶＨ配列および配列番号２に対応するＶＬ配列を有する、対応する抗体の、ＣＤ２５に対するアフィニティーの２倍から１００倍でありうる。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１に対応するＶＨ配列および配列番号２に対応するＶＬ配列を有する、対応する抗体の、ＣＤ２５に対するアフィニティーの、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍または少なくとも９０倍の改善を呈示する、または前出の値の任意の対（例えば、１０倍から５０倍、５倍から７０倍、２倍から３０倍、３倍から１５倍または５倍から１０倍）の間の範囲のアフィニティーの改善を呈示する。
【００５３】
抗ＣＤ２５抗体は、精製することができ、いくつかの実施形態では、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の均質性まで精製することができる。
【００５４】
本開示は、本開示の変異体抗ＣＤ２５抗体を含む医薬組成物のほか、本開示の抗ＣＤ２５抗体を含む、抗体−薬物コンジュゲートも提示する。
【００５５】
本明細書では、本開示の抗ＣＤ２５抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提示され、核酸を含むベクターも提示されている。加えて、本明細書では、抗ＣＤ２５抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核宿主細胞および真核宿主細胞のほか、ヌクレオチド配列を発現するように操作された真核（哺乳動物など）宿主細胞も提示されている。また、宿主細胞を培養することにより、抗ＣＤ２５抗体を作製する方法も提示されている。
【００５６】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、臓器移植片拒絶、喘息、多発性硬化症、ブドウ膜炎、眼炎症および１型ヒトＴ細胞白血病ウイルス関連Ｔ細胞白血病など、様々な免疫状態およびがんの治療に有用である。
【００５７】
本出願では、不定冠詞「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」ならびに定冠詞「その」が、文脈によりそうでないことが明確に指示されるのでない限り、特許出願において、１つ以上を意味することが一般的である通りに使用されることに注意されたい。さらに、本出願では、「または」という用語も、特許出願において、離接語である「または」または接続語である「および」を意味することが一般的である通りに使用される。
【００５８】
本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に含まれた、任意の文献の考察、法令、材料、デバイス、論文などは、本開示のための文脈を提示することだけを目的とするものである。これらの対象物のうちのいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成する、または本出願の優先日以前のいつかに存在した場合と同様に、本開示に関与的な分野において共通の一般的知見であったことの容認として理解されないものとする。
【００５９】
本開示の特色および利点は、その実施形態についての以下の詳細な記載からさらに明らかとなる。
【００６０】
６．表および図面の簡単な説明
本出願は、表および図を、５つの個別の部分：全ての図を含有する１つの部分、表１−１９を含有する１つの部分、表２０を含有する１つの部分、表２１を含有する１つの部分、および表２２−１から２２−９を含有する１つの部分に含む。全ての部分は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６１】
表１は、ダクリズマブの重鎖可変領域内のアミノ酸の番号付けを示す。
【００６２】
表２は、ダクリズマブの軽鎖可変領域内のアミノ酸の番号付けを示す。
【００６３】
表３は、ダクリズマブコンビナトリアルライブラリーに組み込まれたアミノ酸のリストを示す。ＶＬライブラリーおよびＶＨライブラリーのアミノ酸の複雑性は、それぞれ、６９，９８４および３４，８４８である。各欄の上方における太字のアミノ酸は、野生型を指し示す。最終的な濃縮の後で、理論的百分率の３倍超に濃縮されたアミノ酸または２倍超であるが３倍未満に濃縮されたアミノ酸に、それぞれ、二重線または一重線で下線が施される。濃縮の後で理論的百分率の０．５未満まで低減されたアミノ酸は、イタリックで示された。
【００６４】
表４は、ダクリズマブ変異体の結合反応速度および生物学的機能を示す。高アフィニティーダクリズマブ変異体では、ＶＨの５２、５３、５４位およびＶＬの２９、５３位によるアミノ酸の組合せが示される。突然変異体のアミノ酸は、太字で指し示された。親ＶＨ−ＶＬ（トランスフェクション対照として使用された）は、ＮＳＴ−ＳＮと表示されている。ＶＨの５６および５８位は、濃縮の後における、親アミノ酸に対するバイアスが大きかったために示されない。アラニン突然変異については、アラニンに置換された野生型のアミノ酸および位置が示される（例えば、アラニンに変化したセリン３１は、Ｓ３１Ａと表示される。）。会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｃｏｒｅによる表面プラズモン共鳴を使用して決定された。少なくとも３回にわたる個別の決定による平均数が示される。解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｎ／ｋｏｆｆから計算された。機能的な改善は、Ｋｉｔ２２５／Ｋ６細胞の増殖の阻害により測定された（ｎ＝２−３）。機能アッセイにおける親ダクリズマブのＩＣ５０値は、各セットの実験について０．１２−０．２３ｎＭの範囲であった。ダクリズマブ変異体のＫＤ値およびＩＣ５０値は、野生型ダクリズマブから得られたＫＤ値およびＩＣ５０値で標準化されて、アフィニティーおよび機能のそれぞれの改善が計算された。ｎ．ｄ．：決定なしである。
【００６５】
表５は、ダクリズマブ変異体についての精査を示す。会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｃｏｒｅによる表面プラズモン共鳴を使用して決定された。少なくとも３回にわたる個別の決定による平均数が示される。解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算された。ｎ．ｄ．：決定なしである。全ての変異体およびＮＳＴ−ＳＮ（対照）抗体は、サブクローニングの後で、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターの対を共トランスフェクトすることを介して発現した（改善倍数／突然変異）。機能的な改善は、Ｋｉｔ２２５／Ｋ６細胞の増殖の阻害により測定された。ＦＡＣＳ結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ競合アッセイおよび増殖阻害アッセイは、それぞれ、２回、３回および３−５回にわたる独立の実験の平均に基づいた。
【００６６】
表６Ａは、有益な特性を結果としてもたらす単一のＣＤＲアミノ酸置換またはフレームワークアミノ酸置換を有する変異体ダクリズマブの特徴を要約する。＊＝ＷＴと同様である。表６Ｂは、プレートをコーティングしたＣＤ２５へのＥＬＩＳＡ直接結合により、重鎖内で調べられた、さらなる単一アミノ酸置換についての試験の結果をまとめる表である。
【００６７】
表７Ａ〜７Ｃは、ＣＤＲ置換およびフレームワーク置換の組合せを有する、ダクリズマブの６３の変異体（変異体Ｃ１からＣ６３）について記載する。変異体は、「アイソタイプ」欄に示された、異なる定常領域にグラフトされた。表７Ｄは、ＣＤＲ置換およびフレームワーク置換の組合せを有する、ダクリズマブの６３の変異体（変異体Ｃ１からＣ６３）について記載する。選択された組合せ変異体についての反応速度活性および生物学的活性を提示する表である。「ＥＬＩＳＡ」は、ＥＬＩＳＡ競合アッセイにおける結合の改善を意味する。「ＦＡＣＳ」は、ＦＡＣＳにより測定された、Ｈｕｔ／Ｋｉｔ２２５細胞への相対結合を意味する。「Ｋｉｔ２２５」は、Ｋｉｔ２２５細胞のＩＬ２誘導性増殖に対する阻害の改善を意味する。「ＣＤ５６  ＮＫの増殖」は、ｒｈＩＬ２および表示の抗ＣＤ２５抗体変異体を伴うヒトＰＢＭＣを培養した後における、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の数の増大倍数を意味する。「ＭＬＲ（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）効力倍数」は、ヒト細胞ベースの混合リンパ球応答の阻害の改善倍数を意味する。ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｋｉｔ２２５アッセイ、ＭＬＲアッセイおよびＣＤ５６アッセイについての図は、組合せ変異体であるＣ２７（置換Ｉ４８Ｍ（ダクリズマブ重鎖のフレームワーク２内の）およびＴ５４Ｓ（ダクリズマブ重鎖のＣＤＲ２内の）を有する。）を上回る改善を表す。
【００６８】
表８Ａ〜８Ｂは、ダクリズマブのＣＤＲ内の突然変異であって、集団アッセイの文脈で評価された場合に結合にそれほど影響を及ぼさない突然変異を示す。表８Ａは、ダクリズマブの重鎖ＣＤＲ内の突然変異であって、ＣＤ２５への結合に実質的に影響を及ぼさず、本開示の抗体に組み込まれうる突然変異を示す。表８Ａは、配列番号１８５、１３および１５のそれぞれを、提示の順序に開示する。表８Ｂは、ダクリズマブの軽鎖ＣＤＲ内の突然変異であって、ＣＤ２５への結合に実質的に影響を及ぼさず、本開示の抗体に組み込まれうる突然変異を示す。表８Ｂは、配列番号６および１８６のそれぞれを、提示の順序に開示する。
【００６９】
表９は、Ｉ−ｍｕｎｅアッセイ（商標）で調べられた、ダクリズマブのＶＨペプチドおよびＶＬペプチドを示す。各ペプチドは、１５アミノ酸の長さであり、３つのアミノ酸を補充されている。ＣＤＲのアミノ酸に下線が施される。
【００７０】
表１０は、Ｅ．ＨＡＴ−ＶＨ合成オリゴヌクレオチドの配列（配列番号１２８−１３１を、それぞれ、提示の順序で）示す。
【００７１】
表１１は、Ｉ−ｍｕｎｅアッセイで調べるために選択された、ＶＨエピトープ領域のアミノ酸変異体を示す。「パーセント」は、被験全ドナー（ｎ＝７８）のうちで、刺激指数が２．９５以上であるドナーの百分率を表す。「平均ＳＩ（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）」は、全ての被験ドナーについての平均刺激指数である。ｓ．ｅ．ｍ．（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ）は、平均刺激指数の標準誤差である。表１１は、配列番号１３２〜１７８および１３２を、それぞれ、提示の順序で開示する。
【００７２】
表１２は、ダクリズマブＶＨエピトープ領域の単一アミノ酸変異体についてまとめられた増殖応答データを示す。「Ｐ」は、親エピトープペプチド配列を表す。２．９５を超える数字は、２．９５以上の刺激指数（ＳＩ）で増殖した、被験ドナー試料の総数を指し示す。レスポンダーのパーセントは、それらのＣＤ４＋  Ｔ細胞が、２．９５以上の刺激指数で応答したドナーのパーセントを指し示す。平均ＳＩは、全ての被験ドナーの平均刺激指数である。ｔ検定は、Ｉ４８Ｍ変異体についての刺激指数結果の、親ペプチドについての応答と比較した比較である。
【００７３】
表１３は、ダクリズマブＶＨエピトープ領域の二重アミノ酸変異体についてまとめられた増殖応答データを示す。「Ｐ」は、親エピトープペプチド配列を表す。２．９５を超える数字は、２．９５以上の刺激指数（ＳＩ）で増殖した、被験ドナー試料の総数を指し示す。レスポンダーのパーセントは、それらのＣＤ４＋  Ｔ細胞が、２．９５以上の刺激指数で応答したドナーのパーセントを指し示す。平均ＳＩは、全ての被験ドナーの平均刺激指数である。ｔ検定は、表示の変異体についての刺激指数結果の、親ペプチドについての応答と比較した比較である。
【００７４】
表１４は、４つの選択されたダクリズマブエピトープ領域変異体についてまとめられた応答データを示す。上パネルは、全７８例の被験ドナーからまとめられたデータである。下パネルは、親ペプチドに照らして、２．９５以上の応答を示すドナー（ｎ＝１８）に由来するデータである。２．９５を超える数字は、２．９５以上の刺激指数（ＳＩ）で増殖した、被験ドナー試料の総数を指し示す。レスポンダーのパーセントは、それらのＣＤ４＋  Ｔ細胞が、２．９５以上の刺激指数で応答したドナーのパーセントを指し示す。平均ＳＩは、全ての被験ドナーの平均刺激指数である。ｔ検定は、表示の変異体についての刺激指数結果の、親ペプチドについての応答と比較した比較である。表１４は、配列番号１３２、１３５、１４９、１５４、１６０、１３２および１７９−１８３を、それぞれ、提示の順序で開示する。
【００７５】
表１５は、ダクリズマブＨＹＰ（高収率工程（ｈｉｇｈｔ  ｙｉｅｌｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ）により製造されたダクリズマブ）、Ｅ．ＨＡＴおよび単一アミノ酸変異体のＩＬ２−Ｒα（ＣＤ２５）結合効力を示す。結合は、ＥＬＩＳＡフォーマットで測定する。
【００７６】
表１６は、ダクリズマブＨＹＰ、Ｅ．ＨＡＴおよび二重アミノ酸変異体のＩＬ２−Ｒα結合効力を示す。結合は、ＥＬＩＳＡフォーマットで測定する。
【００７７】
表１７は、表面プラズモン共鳴により測定された、単一アミノ酸変異体の抗体分子についてのアフィニティー測定を示す。
【００７８】
表１８は、表面プラズモン共鳴により測定された、ヒトＣＤ２５に対する二重アミノ酸変異体の抗体分子についてのアフィニティー測定を示す。
【００７９】
表１９は、表面プラズモン共鳴により測定された、カニクイザルＣＤ２５に対する二重アミノ酸変異体の抗体分子についてのアフィニティー測定を示す。
【００８０】
表２０は、ダクリズマブの重鎖ＣＤＲ変異体およびＦＲ変異体の例示的な分子種の配列を示す。表２０は、野生型配列を、配列番号６および１８６として開示する。
【００８１】
表２１は、ダクリズマブの軽鎖ＣＤＲ変異体の例示的な分子種の配列を示す。表２１は、野生型配列を、配列番号１１、１３および１８７として開示する。
【００８２】
表２２−１から表２２−９は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第８，３１４，２１３号において開示された、抗ＣＤ２５抗体の配列を示す。米国特許第８，３１４，２１３号の１６のＶＨ変異体配列は、表２２−１から２２−３に再掲され、ＸＨ１からＸＨ１６と表示されている。米国特許第８，３１４，２１３号の２４のＶＬ配列は、表２２−４から表２２−８に再掲され、ＸＬ１からＸＬ２５と表示されている。米国特許第８，３１４，２１３号において、異なる変異体のＶＨ配列およびＶＬ配列を組み合わせることにより作り出された、２５の変異体抗体分子は、表２２−９において規定されるセットであって、組合せＸＦ１からＸＦ２５の組み合わせとして表示されている。全て、提示の順序で、表２２−１は、配列番号４−５として野生型配列を表し、表２２−２は、配列番号６として野生型配列を表し、表２２−３は、配列番号７として野生型配列を表し、表２２−４は、配列番号１０として野生型配列を表し、表２２−５は、配列番号１１−１２として野生型配列を表し、表２２−６は、配列番号１３として野生型配列を表し、表２２−７は、配列番号１４として野生型配列を表し、表２２−８は、配列番号１５−１６として野生型配列を表す。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】ダクリズマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列である、配列番号１および配列番号２のそれぞれを、下線を施された文字列によるＣＤＲ領域で示す図である。
【図１Ｂ】ダクリズマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列である、配列番号１および配列番号２のそれぞれを、下線を施された文字列によるＣＤＲ領域で示す図である。
【図２Ａ】ダクリズマブの再ヒト化（実施例１を参照されたい。）で活用されたアミノ酸配列を示す図である（配列番号１および５２−５５を、それぞれ、提示の順序で開示する図である。）。
【図２Ｂ】ダクリズマブの再ヒト化（実施例１を参照されたい。）で活用されたアミノ酸配列を示す図である（配列番号２および５６−５９を、それぞれ、提示の順序で開示する図である。）。
【図２Ｃ】再ヒト化の、ＣＤ２５に対するダクリズマブのアフィニティーへの影響を示す図である。
【図２Ｄ】重鎖置換の、ＣＤ２５に対するダクリズマブのアフィニティーへの影響を示す図である。
【図３Ａ】結合反応速度および生物学的機能の関係を示す図である。アラニン置換体を含む全てのダクリズマブ変異体によるＩＬ２遮断活性の改善倍数は、アフィニティーであるＫＤの関数としてプロットされた（図３Ａ）。
【図３Ｂ】結合反応速度および生物学的機能の関係を示す図である。アラニン置換体を含む全てのダクリズマブ変異体によるＩＬ２遮断活性の改善倍数は、解離速度定数であるｋｏｆｆの関数としてプロットされた（図３Ｂ）。
【図３Ｃ】結合反応速度および生物学的機能の関係を示す図である。アラニン置換体を含む全てのダクリズマブ変異体によるＩＬ２遮断活性の改善倍数は、会合速度定数であるｋｏｎの関数としてプロットされた（図３Ｃ）。
【図４Ａ】Ｆａｂ内のＶＫＲ−ＳＮ、ＶＫＲ−ＫＤ、ＫＳＲ−ＳＮ、ＫＳＲ−ＳＥについての機能的な比較を示す図である。ＦａｂのＣＤ２５に対するアフィニティーを比較する競合ＥＬＩＳＡを示す図である。ビオチニル化野生型ダクリズマブＩｇＧの、ＣＤ２５への結合は、野生型ダクリズマブまたは変異体ダクリズマブから作り出された、滴定量のコンペティターＦａｂの存在下で解析された。
【図４Ｂ】Ｆａｂ内のＶＫＲ−ＳＮ、ＶＫＲ−ＫＤ、ＫＳＲ−ＳＮ、ＫＳＲ−ＳＥについての機能的な比較を示す図である。精製Ｆａｂを使用する、ＩＬ２−Ｒ遮断活性を示す図である。受容体の遮断は、ＩＬ２依存型細胞系であるＫｉｔ２２５／Ｋ６の増殖により測定された。データは、ダクリズマブＦａｂから得られたＩＣ５０値で標準化され、生物学的機能の改善倍数として示されている。
【図５】表９によるダクリズマブ軽鎖Ｖ領域ペプチドが、Ｉ−ｍｕｎｅアッセイで調べられた結果を示す図である。１１５例のドナー試料における応答パーセントが示されている。
【図６】表９によるダクリズマブ重鎖Ｖ領域ペプチドが、Ｉ−ｍｕｎｅアッセイで調べられた結果を示す図である。１１５例のドナー試料における応答パーセントが示されている。
【図７】ヒトＰＢＭＣの、Ｅ．ＨＡＴ  Ｆａｂおよび４つの変異体に対する平均増殖応答を示す図である。Ｅ．ＨＡＴおよび４つの変異体抗体に由来する熱不活化Ｆａｂ断片は、ヒトＰＢＭＣと共に、６日間にわたり共培養された。刺激指数は、各ドナーについて、各濃度において計算され、結果は平均された。データは、平均ＳＩ＋ｓｅｍとして示されている。
【図８】平均刺激指数を、ＳＩ＞１．９９で応答するドナーの百分率と対比して示す図である。２５ｕｇ／ｍｌの濃度に対するデータが選択され、その増殖応答が１．９９以上の値に到達したドナーのパーセントと対比されてグラフ化された。
【図９】図６のＥ．ＨＡＴ  Ｆａｂに対して、１．９９を超えるＳＩで応答したドナーによる、全ての被験変異体についての平均刺激指数を示す図である。その応答が２５μｇ／ｍｌの濃度において１．９９を超えた、全てのドナーに由来する増殖応答が平均された。データは、平均ＳＩ＋ｓｅｍとして示されている。
【図１０】平均刺激指数を、１．９９を超えるＳＩで応答するドナーの百分率と対比して示す図である。２５μｇ／ｍｌの濃度に対するデータが選択され、その増殖応答が１．９９以上の値に到達したドナーのパーセントと対比されてグラフ化された。
【図１１】ヒトＩｇＧ１に由来する野生型のＦｃドメインの配列（配列番号１７）を提示する図である。Ｆｃドメイン内の、ＣＨ２ドメイン（その配列は、
【化１】
2016515524.tif 000003
である。）に二重下線が施され、ＣＨ３ドメイン（その配列は、
【化２】
2016515524.tif 000004
である。）は太字とされている。残基２３６、２６６、２７３および３０５は、それぞれ、アステリスク（＊）、ダガー（†）、ダブルダガー（‡）および番号記号（＃）で指し示されている。
【図１２】ＦｃγＲＩＩＢをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する、ＷＴ  Ｆｃ領域を含有する抗体および変異体Ｆｃ領域を含有する抗体の結合曲線を示す図である。
【図１３】ＦｃγＲＩＩＩＡをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する、ＷＴ  Ｆｃ領域を含有する抗体および変異体Ｆｃ領域を含有する抗体の結合曲線を示す図である。
【図１４】ＡＤＣＣ活性をほとんど伴わないまたは全く伴わないＦｃ変異体を示す図である。
【図１５】ＡＤＣＣ活性が最も低度であるが、ＦｃγＲＩＩＢへの結合が保持／改善されたＦｃ変異体を、太字で示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
７．詳細な説明
７．１．抗ＣＤ２５抗体
本開示は、抗ＣＤ２５抗体を提示する。そうでないことが指し示されない限り、「抗体」（Ａｂ：ａｎｔｉｂｏｄｙ）という用語は、特定の抗原に特異的に結合するまたはこれに対して免疫反応性である免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体の形態、モノクローナル抗体の形態、遺伝子操作された抗体の形態、他の形で改変された抗体の形態であって、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二特異性抗体、ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディー）および抗体の抗原結合性断片であり、例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｒｌｇＧ断片およびｓｃＦｖ断片を含む抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない、改変された抗体の形態を含む。さらに、そうでないことが指し示されない限り、「モノクローナル抗体」という用語（ｍＡｂ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、無傷分子ならびにタンパク質に特異的に結合することが可能な抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片など）の両方を含むことが意図されている。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、無傷抗体のＦｃ断片を欠き、動物の循環からより急速に消失し、非特異的組織への結合が無傷抗体より弱い場合がある（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６）。
【００８５】
「ｓｃＦｖ」という用語は、従来の抗体に由来する重鎖および軽鎖の可変ドメインが、１つの鎖を形成するように接合された、単鎖Ｆｖ抗体を指す。
【００８６】
「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が、特異的標的に対する結合特異性を呈示するのに対し、免疫グロブリンは、抗体および標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。天然の抗体および免疫グロブリンは通例、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ドルトンの、ヘテロ四量体の糖タンパク質である。各重鎖は、アミノ末端において、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて、複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、アミノ末端における可変ドメイン（ＶＬ）およびカルボキシ末端における定常ドメインを有する。
【００８７】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５に結合し、細胞内のその活性を阻害する。
【００８８】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、配列が、抗体ダクリズマブのＣＤＲと類縁である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００８９】
ＣＤＲは、軽鎖可変ドメイン内および重鎖可変ドメイン内の両方で、超可変領域としてもまた公知である。可変ドメインのより高度に保存的な部分は、フレームワーク（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）と呼ばれる。当技術分野で公知の通り、抗体の超可変領域を画定するアミノ酸の位置／境界は、文脈および当技術分野で公知の多様な定義に応じて変化しうる。可変ドメイン内のいくつかの位置は、これらの位置が、１つの基準のセットの下では、超可変領域内に存在するとみなされうるのに対し、異なる基準のセットの下では、超可変領域の外にあるとみなされうるという点で、ハイブリッドの超可変位置として考えられうる。これらの位置のうちの１つ以上はまた、拡張された超可変領域内でも見出されうる。本開示は、これらのハイブリッドの超可変位置における修飾を含む抗体を提示する。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、βシート構造を接合し、任意選択により、βシート構造の一部も形成する、ループを形成する３つのＣＤＲにより接合された、βシートの立体配置を採用することにより、４つずつのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で、近接して一体に保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の標的結合性部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７）を参照されたい。）。本明細書で使用された、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、そうでないことが指し示されない限り、Ｋａｂａｔらによる免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従いなされている。
【００９０】
ダクリズマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、配列番号１および配列番号２のそれぞれにより表され、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列はまた、図１Ａにも表示されている。ダクリズマブのＣＤＲおよびそれらの対応する識別子の配列は、図１Ｂに提示されている。配列番号１または配列番号２をコードする任意のヌクレオチド配列は、本開示の組成物および方法において使用されうる。
【００９１】
本開示はさらに、ダクリズマブのＣＤＲ配列と類縁であるＣＤＲ配列を含む、抗ＣＤ２５抗体断片も提示する。「抗体断片」という用語は、全長抗体の部分、一般に、標的結合性領域または可変領域を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片を含む。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識および結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。この領域は、緊密に共有結合的に会合した（ＶＨ−ＶＬ二量体）、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインによる二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の標的結合性部位を規定するのは、この立体配置においてである。６つのＣＤＲが、標的結合特異性を抗体に付与することが多い。しかし、いくつかの場合には、単一の可変ドメイン（または標的に特異的な３つのＣＤＲだけを含む、Ｆｖの半分）でもなお、標的を認識し、標的に結合する能力を有しうる。「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを、単一のポリペプチド鎖内に含む。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、標的への結合に所望される構造を形成することを可能とするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間にさらに含む。「単一ドメイン抗体」は、標的に対する十分なアフィニティーを呈示する、単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる。具体的な実施形態では、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物抗体である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：２５−３８を参照されたい。）。
【００９２】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む、少数の残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２のペプシン消化産物のヒンジシステインにおける、ジスルフィド結合の切断により作製される。抗体断片のさらなる化学的カップリングも、当業者に公知である。
【００９３】
ある種の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書で使用された「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を介して作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核クローン、原核クローンまたはファージクローンを含む単一のクローンから導出された抗体を指すものであり、それが作製される方法を指すものではない。本開示との関連で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製されうる。本開示の抗ＣＤ２５抗体は、キメラ抗体、霊長動物化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。
【００９４】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、キメラ抗体でありうる。本明細書で使用された「キメラ」抗体という用語は、ラット抗体またはマウス抗体など、非ヒト免疫グロブリンから導出される可変配列およびヒト免疫グロブリン鋳型から選択されることが典型的なヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９（４７１９）：１２０２−７；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号および同第４，８１６３９７号を参照されたい。
【００９５】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ヒト化されうる。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから導出される最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の標的結合性サブドメインなど）である。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての可変ドメインまたは少なくとも１つの可変ドメインを含み、典型的に２つの可変ドメインを含み、これらの可変ドメイン内では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応している。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ：ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部も含みうる。抗体をヒト化する方法は、当技術分野で公知である。例えば、それらの全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−７；米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号およびＱｕｅｅｎらによる同第６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３ならびに米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。
【００９６】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ヒト抗体でありうる。完全「ヒト」抗ＣＤ２５抗体は、ヒト患者の治療的処置に所望でありうる。本明細書で使用された「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または１つ以上のヒト免疫グロブリンのためのトランスジェニック動物から単離され、内因性免疫グロブリンを発現させない抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から導出された抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法により作製されうる。それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号；同第ＷＯ９８／５０４３３号；同第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９８／１６６５４号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号および同第ＷＯ９１／１０７４１号を参照されたい。ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現させることが不可能であるが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させることが可能な、トランスジェニックマウスを使用しても作製されうる。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９２／０１０４７号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）およびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの企業も、上記で記載した技術と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに取り組みうる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と称される技法を使用して作り出されうる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するのに使用されている（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：８９９−９０３）。
【００９７】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、霊長動物化されうる。「霊長動物化抗体」という用語は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長動物化抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６５８，５７０号；同第５，６８１，７２２号および同第５，６９３，７８０号を参照されたい。
【００９８】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、二特異性抗体でありうる。二特異性抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であることが多いモノクローナル抗体であって、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。本開示では、結合特異性のうちの一方は、ＣＤ２５に方向づけられる可能性があり、他方は、他の任意の抗原に対する抗体、例えば、細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、細胞表面受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスによりコードされるエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質または細菌表面タンパク質などに対する抗体でありうる。
【００９９】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、誘導体化抗体を含む。例えば、限定を目的とするものではないが、誘導体化抗体は、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞内リガンドまたは他のタンパク質との連結（抗体コンジュゲートの考察については、５．８節を参照されたい。）などにより改変されることが典型的である。多数の化学的改変のうちのいずれかが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝による合成などを含むがこれらに限定されない公知の技法により実行されうる。加えて、例えば、Ａｍｂｒｘによる技術を使用して、誘導体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含有しうる（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ、２００６、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１３（１０）：１０１１−２を参照されたい。）。
【０１００】
本開示の抗ＣＤ２５抗体の定常ドメインは、提起される抗体の機能に関して、特に、要請されうるエフェクター機能について選択されうる。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体の定常ドメインは、ヒトＩｇＡドメイン、ヒトＩｇＥドメイン、ヒトＩｇＧドメインまたはヒトＩｇＭドメインである。具体的な実施形態では、ヒトＩｇＧの定常ドメイン、とりわけ、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプの定常ドメインは、とりわけ、本開示の抗ＣＤ２５抗体が、治療的使用のために意図され、抗体のエフェクター機能が、例えば、ＣＤ２５を発現させるがんの治療において必要とされる場合に使用される。代替的な実施形態では、ＩｇＧ２アイソタイプおよびＩｇＧ４アイソタイプは、本開示の抗ＣＤ２５抗体が、治療的使用のために意図され、抗体のエフェクター機能が、例えば、多発性硬化症またはブドウ膜炎の治療において要請されない、なおまたは所望されない場合に使用される。本開示の抗ＣＤ２５抗体の定常ドメインは、同じ種に由来する異なるアイソタイプまたは異なる種に由来する同じアイソタイプもしくは異なるアイソタイプのハイブリッド体でもなおありうる。例えば、ヒトＩｇＧ１のコンテクストでマウスヒンジを含有する、ＡＢＴ７００（抗ｃＭｅｔ）の定常領域が使用されうる。
【０１０１】
定常領域もまた、少なくとも１つの定常領域介在性生物学的エフェクター機能を、対応する野生型配列と比べて変化させるように改変されうる。
【０１０２】
例えば、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、少なくとも１つの定常領域介在性生物学的エフェクター機能を、改変されていない抗体と比べて低減する、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減するように改変されうる。ＦｃγＲへの結合は、ＦｃγＲとの相互作用に必要な特定の領域において、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることにより低減されうる（例えば、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１ならびにＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７−２６６２を参照されたい。）。抗体のＦｃγＲへの結合能の低減はまた、オプソニン化、食作用および抗原依存性細胞傷害作用（「ＡＤＣＣ」：ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など、ＦｃγＲとの相互作用に依拠する、他のエフェクター機能も低減しうる。
【０１０３】
他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、少なくとも１つの定常領域介在性生物学的エフェクター機能を、改変されていない抗体と比べて獲得または改善するように、例えば、ＦｃγＲとの相互作用を増強するように改変されうる（例えば、ＵＳ２００６／０１３４７０９を参照されたい。）。例えば、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、対応する野生型定常領域より大きなアフィニティーでＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡに結合する定常領域を有しうる。
【０１０４】
したがって、本開示の抗体は、オプソニン化、食作用またはＡＤＣＣの増大または減殺を結果としてもたらす、生物学的活性の変化を有しうる。このような変化は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低減する抗体内の修飾は、米国特許第５，８３４，５９７号において記載されている。例示的なＡＤＣＣ低下変異体は、米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示されている「突然変異体３」（または「Ｍ３」）であって、残基２３６が欠失し、残基２３４、２３５および２３７（ＥＵ番号付けを使用する。）がアラニンで置換されたＭ３に対応する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、低レベルのフコースを有する、またはフコースを欠く。フコースを欠く抗体は、とりわけ、抗体が低用量であるとき、ＡＤＣＣ活性の増強と相関している。Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３４６６−７３を参照されたい。フコース非含有抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）内の成長を含む。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素であるα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする、ＦＵＴ８  ｍＲＮＡを低レベルで発現させる。
【０１０６】
さらに別の態様では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、例えば、ＦｃＲｎとの相互作用に関与する特定の領域において、免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることにより、胎児性Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎに対するそれらの結合アフィニティーを増大させる、または低減するように改変された、抗体または抗体断片でありうる（例えば、ＷＯ２００５／１２３７８０を参照されたい。）。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの抗ＣＤ２５抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４、および４２８のうちの少なくとも１つが、単独でまたは２５０位および４２８位において、または２５０位および３１４位において、または３１４位および４２８位において、または２５０位、３１４位および４２８位においてなど、２５０位および４２８位を具体的な組合せとする、これらの任意の組合せで置換されるように、突然変異する。２５０位では、アミノ酸残基の置換は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシンを含むがこれらに限定されない、トレオニン以外の任意のアミノ酸残基でありうる。３１４位では、アミノ酸残基の置換は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンを含むがこれらに限定されない、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基でありうる。４２８位では、アミノ酸残基の置換は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンを含むがこれらに限定されない、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基でありうる。なおさらなる実施形態では、変異体Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対するアフィニティーを増強する少なくとも１つ以上の修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸残基２５１−２５６、２８５−２９０、３０８−３１４、３８５−３８９および４２８−４３６の修飾（例えば、Ｍ４２８Ｌ）または２５０位および４２８位における修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ）を有し、例えば、それらの全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、Ｈｉｎｔｏｎら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（８）：６２１３−６；ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３４６３１号および同第ＷＯ０２／０６０９１９号を参照されたい。このような突然変異は、抗体のＦｃＲｎへの結合を増大させ、これは、抗体を、分解から保護し、その半減期を延長する。
【０１０７】
さらに他の態様では、抗ＣＤ２５抗体は、例えば、Ｓ．ＪｕｎｇおよびＡ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：９５９−９６６；Ｙａｚａｋｉら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．、１７（５）：４８１−９において記載されている通り、その超可変領域のうちの１つ以上に挿入された１つ以上のアミノ酸を有する。
【０１０８】
多様な実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、異種宿主内の発現の増大のために改変された、抗体または抗体断片でありうる。ある種の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、異種宿主細胞内の発現および／または異種宿主細胞からの分泌の増大のために改変された、抗体または抗体断片でありうる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、エスケリキア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌内の発現の増大のために改変されている。他の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、酵母内の発現の増大のために改変されている（Ｋｉｅｋｅら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：５６５１−５６５６）。なおも他の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、昆虫細胞内の発現の増大のために改変されている。さらなる実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、ＣＨＯ細胞など、哺乳動物細胞内の発現の増大のために改変されている。
【０１０９】
ある種の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、作製時における抗体の安定性を増大させるように改変された、抗体または抗体断片でありうる。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの断片は、非酵素的脱アミド化を受けやすい、アスパラギンまたはグルタミンなど、１つ以上のアミノ酸を、脱アミド化を受けないアミノ酸で置き換えるように改変されうる（Ｈｕａｎｇら、２００５、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７７：１４３２−１４３９）。他の実施形態では、抗体またはそれらの断片は、酸化を受けやすい、メチオニン、システインまたはトリプトファンなど、１つ以上のアミノ酸を、酸化をたやすく受けないアミノ酸で置き換えるように改変されうる。なおも他の実施形態では、抗体またはそれらの断片は、環化を受けやすい、アスパラギンまたはグルタミン酸など、１つ以上のアミノ酸を、環化をたやすく受けないアミノ酸で置き換えるように改変されうる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体または断片は、エンドソーム内のＣＤ２５からの急速な解離を可能とする、ｐＨ感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）の抗原放出に対する感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を増大させる、１つ以上のアミノ酸置換を含むように操作される。急速な解離は、遊離抗体を、細胞内から放出して、循環に戻すことにより、抗体の薬物動態を改善しうる。Ｃｈａｐａｒｒｏ−Ｒｉｇｇｅｒｓら、２０１２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７（１４）：１１０９０−１１０９７およびＩｇａｗａら、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８（１１）：１２０３−１２０８を参照されたい。ｐＨ感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）の抗原放出に対する感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を増大させるアミノ酸残基は、ヒスチジンを含む。例示的なヒスチジン置換は、表８から選択されうる。
【０１１１】
７．２．核酸および発現系
本開示は、本開示の抗ＣＤ２５抗体をコードする核酸分子および宿主細胞を包摂する。
【０１１２】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、宿主細胞内の免疫グロブリン軽鎖遺伝子および免疫グロブリン重鎖遺伝子の組換え発現により調製されうる。抗体を組換えにより発現させるためには、軽鎖および重鎖が、宿主細胞内で発現し、任意選択により、宿主細胞が培養される培地であって、抗体が回収される培地に分泌されるように、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖をコードするＤＮＡ断片保有する、１つ以上の組換え発現ベクターをトランスフェクトする。標準的な組換えＤＮＡ法が、抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９８９）および米国特許第４，８１６，３９７号において記載されている宿主細胞などの宿主細胞に導入するのに使用されている。
【０１１３】
一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、１つ以上のＣＤＲ内の変化を除き、ダクリズマブと類似する（本明細書では、「ダクリズマブ類縁」配列を有する抗ＣＤ２５抗体と称される。）。別の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、１つ以上のフレームワーク領域内の変化を除き、ダクリズマブと類似する。さらに別の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、１つ以上のＣＤＲ内および１つ以上のフレームワーク領域内の変化を除き、ダクリズマブと類似する。このような抗ＣＤ２５抗体をコードする核酸を作り出すために、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片が、まず得られる。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の使用を介して、軽鎖可変配列および重鎖可変配列をコードする生殖細胞系列のＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅および修飾することにより得られる可能性がある。ヒト重鎖可変領域遺伝子およびヒト軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、当技術分野で公知である（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖細胞系列配列データベースを参照されたい；また、それらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６−１９８およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７−８３６も参照されたい。）。ダクリズマブの重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片が合成され、日常的な突然変異誘発法を使用して、本明細書で記載された通りに変異体を作り出す突然変異誘発のための鋳型として使用される場合もあり、代替的に、変異体をコードするＤＮＡ断片が直接合成される場合もある。
【０１１４】
ダクリズマブまたはダクリズマブ類縁のＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子へと転換するように、標準的な組換えＤＮＡ法により、さらに操作されうる。これらの操作では、ＶＬをコードするＤＮＡ断片またはＶＨをコードするＤＮＡ断片が、抗体の定常領域または可撓性のリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動的に連結される。この文脈で使用された「作動的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームを保持するように接合されていることを意味するように意図されている。
【０１１５】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３であり、任意選択により、ＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子に転換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号を参照されたい。）、これらの領域を包摂するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でありうるが、ある種の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域である。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結されうる。
【０１１６】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、ＣＬである軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に転換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号）を参照されたい。）、これらの領域を包摂するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域でありうるが、ある種の実施形態では、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨ配列およびＶＬ配列が、ＶＬ領域およびＶＨ領域が可撓性のリンカーにより接合された連続的な単鎖タンパク質として発現するように、ＶＨをコードするＤＮＡ断片およびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、可撓性のリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３、（配列番号１８）をコードする別の断片に作動的に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４を参照されたい。）。
【０１１７】
本開示の抗ＣＤ２５抗体を発現させるために、遺伝子が、転写制御配列および翻訳制御配列に作動的に連結されるように、上記で記載した通りに得られた、部分的軽鎖および部分的重鎖または全長軽鎖および全長重鎖をコードするＤＮＡは、発現ベクターに挿入される。この文脈では、「作動的に連結された」という用語は、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する、それらの意図された機能を果たすように、抗体コード配列が、ベクターにライゲーションされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、個別のベクターに挿入される場合もあり、より典型的に、両方遺伝子が、同じ発現ベクターに挿入される場合もある。
【０１１８】
抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的な制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。ダクリズマブまたはダクリズマブ類縁軽鎖配列もしくはダクリズマブ類縁重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは、抗体の定常領域配列を既に保有しうる。例えば、ダクリズマブまたはダクリズマブ類縁ＶＨ配列およびダクリズマブ類縁ＶＬ配列を、全長抗体遺伝子に転換する１つの手法は、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントに作動的に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに作動的に連結されるように、それらを、重鎖定常領域および軽鎖定常領域のそれぞれを既にコードしている発現ベクターに挿入することである。加えてまたは代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易とするシグナルペプチドもコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、インフレームで、抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドの場合もあり、異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）の場合もある。
【０１１９】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内の抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）において記載されている。当業者により、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存しうることが察知される。哺乳動物宿主細胞による発現に適する調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０：Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマから導出されたプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、哺乳動物細胞内の高レベルのタンパク質発現を方向づけるウイルス性エレメントを含む。ウイルス性調節的エレメントおよびそれらの配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１２０】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列も保有しうる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする（例えば、全てがＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照されたい。）。例えば、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与することが典型的である。適切な選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子（メトトレキセートによる選択／増幅を伴うＤＨＦＲ−宿主細胞における使用のための）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８による選択のための）を含む。軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技法により、宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の多様な形態は、外因性ＤＮＡを、原核宿主細胞または真核宿主細胞に導入するために一般に使用される多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包摂することが意図されている。
【０１２１】
本開示の抗体は、原核宿主細胞または真核宿主細胞において発現させることが可能である。ある種の実施形態では、抗体の発現は、適正にフォールドされ、免疫学的に活性の抗体の最適な分泌のために、真核細胞内、例えば、哺乳動物宿主細胞内で実施される。本開示の組換え抗体を発現させるための、例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞（例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１−６２１において記載されている、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６−４２２０において記載されている、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞およびＳＰ２／０細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内の抗体の発現または宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間にわたり、宿主細胞を培養することにより作製される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して、培養培地から回収されうる。宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子など、無傷抗体の一部を作製するのにも使用されうる。上記の手順に対する変化は、本開示の範囲内にあることが理解される。例えば、宿主細胞に、本開示の抗ＣＤ２５抗体の軽鎖または重鎖（両方ではない。）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが所望されうる。
【０１２２】
組換えＤＮＡ技術はまた、ＣＤ２５への結合に必要でない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去するのにも使用されうる。また、このような切断型ＤＮＡ分子から発現する分子も、本開示の抗体に包摂される。
【０１２３】
加えて、１つの重鎖および１つの軽鎖が、本開示の抗ＣＤ２５抗体であり、他の重鎖および軽鎖が、ＣＤ２５以外の抗原に特異的である、二官能性抗体も、例えば、本開示の抗体を、標準的な化学的架橋法を介して第２の抗体に架橋することにより作製されうる。二官能性抗体はまた、二官能性抗体をコードするように操作された核酸を発現させることによっても作製されうる。二官能性抗体を作り出すのに使用されうる、例示的な二官能性抗体技術は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２０１２、ｍＡｂｓ、４（２）：１８２−１９７、特に、図２により記載されている。
【０１２４】
特定の態様では、二官能性抗体は、二重可変ドメイン（「ＤＶＤ」：ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）免疫グロブリン（「ＤＶＤ−Ｉｇ」：ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）である（参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、ＧｕおよびＧｈａｙｕｒ、２０１２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５０２：２５−４１を参照されたい。）。ＤＶＤ−Ｉｇは、２つのモノクローナル抗体の標的結合性可変ドメインを、リンカーを介して組み合わせて、四価で二重ターゲティングである単一の薬剤を創出する。本開示のＤＶＤの軽鎖における使用に適するリンカーは、参照により本明細書に組み込まれている、ＧｕおよびＧｈａｙｕｒ、２０１２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５０２：２５−４１、３０ページの表２．１において同定されているリンカー：短鎖κ鎖リンカーであるＡＤＡＡＰ（配列番号１９）（マウス）およびＴＶＡＡＰ（配列番号２０）（ヒト）；長鎖κ鎖リンカーであるＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰ（配列番号２１）（マウス）およびＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２２）（ヒト）；短鎖λ鎖リンカーであるＱＰＫＡＡＰ（配列番号２３）（ヒト）；長鎖λ鎖リンカーであるＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号２４）（ヒト）；ＧＳ短鎖リンカーであるＧＧＳＧＧ（配列番号２５）、ＧＳ中鎖リンカーであるＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２６）およびＧＳ長鎖リンカーであるＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７）（全てのＧＳリンカーは、マウス鎖およびヒト鎖である。）を含む。本開示のＤＶＤの重鎖における使用に適するリンカーは、参照により本明細書に組み込まれている、ＧｕおよびＧｈａｙｕｒ、２０１２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５０２：２５−４１、３０ページの表２．１において同定されているリンカー：短鎖リンカーであるＡＫＴＴＡＰ（配列番号２８）（マウス）およびＡＳＴＫＧＰ（配列番号２９）（ヒト）；長鎖リンカーであるＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号３０）（マウス）およびＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号３１）（ヒト）；ＧＳ短鎖リンカーであるＧＧＧＧＳＧ（配列番号３２）、ＧＳ中鎖リンカーであるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）およびＧＳ長鎖リンカーであるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３４）（全てのＧＳリンカーは、マウス鎖およびヒト鎖である。）を含む。ヒトＤＶＤ−Ｉｇまたはヒト化ＤＶＤ−Ｉｇには、ヒトリンカーが使用されることが好ましい。ＤＶＤ免疫グロブリンの標的結合ドメインは、タンデムで配置され、１つの可変ドメインが、別の可変ドメインの上に積み重ねられて、内側のＦｖドメインおよび外側のＦｖドメインを形成することが典型的である。抗ＣＤ２５可変ドメインは、ＤＶＤの内側のＦｖドメインの場合もあり、ＤＶＤの外側のＦｖドメインの場合もある。
【０１２５】
ある種の実施形態では、二特異性抗体、すなわち、同じ結合性部位を使用して、ＣＤ２５および非類縁抗原に結合する抗体は、軽鎖ＣＤＲ内および／または重鎖ＣＤＲ内のアミノ酸残基を突然変異させることにより作製されうる。多様な実施形態では、ＣＤ２５およびＶＥＧＦなど、２つの抗原に結合する二特異性抗体は、抗原結合性部位の周縁部におけるアミノ酸残基を突然変異させることにより作製されうる（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２３：１６１０−１６１４）。二官能性抗体は、二特異性抗体をコードするように操作された核酸を発現させることにより作製されうる。
【０１２６】
本開示の抗ＣＤ２５抗体を組換え発現させるために、宿主細胞に、第１のベクターが、重鎖から導出されたポリペプチドをコードし、第２のベクターが、軽鎖から導出されたポリペプチドをコードする、本開示の２つの発現ベクターが共トランスフェクトされうる。２つのベクターは各々、個別の選択マーカーを含有することが典型的である。代替的に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする、単一のベクターも使用されうる。
【０１２７】
ダクリズマブまたはダクリズマブのＣＤＲ配列と類縁であるＣＤＲ配列を有する抗ＣＤ２５抗体の１つ以上の部分をコードする核酸が作り出されたら、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対するアフィニティーが低減された抗体または異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を作り出すように、さらなる変化または突然変異が、コード配列に導入されうる。
【０１２８】
本開示の抗ＣＤ２５抗体はまた、化学合成によっても作製されうる（例えば、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２版、１９８４、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．において記載されている方法により）。変異体抗体はまた、無細胞プラットフォームを使用しても作り出されうる（例えば、Ｃｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ、２号、２００１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を参照されたい。）。
【０１２９】
本開示の抗ＣＤ２５抗体が、組換え発現により作製されたら、免疫グロブリン分子を精製するための、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、ＣＤ２５には、プロテインＡ選択またはプロテインＧ選択およびサイズ除外カラムクロマトグラフィーの後におけるアフィニティークロマトグラフィー）、遠心分離、示差的可溶性またはタンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法により精製されうる。さらに、本開示の抗ＣＤ２５抗体またはそれらの断片は、本明細書で記載された異種ポリペプチド配列または当技術分野において他の形で公知の異種ポリペプチド配列に融合されて、精製を容易としうる。
【０１３０】
単離されたら、抗ＣＤ２５抗体は、所望の場合、例えば、高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ＷｏｒｋおよびＢｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８０）を参照されたい。）によりさらに精製される場合もあり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製される場合もある。
【０１３１】
７．３．抗ＣＤ２５抗体の生物学的活性
ある種の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ダクリズマブとＣＤ２５への結合について競合することまたはＣＤ２５活性を中和することなど、ある種の生物学的活性を有する。
【０１３２】
したがって、ある種の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ダクリズマブとＣＤ２５への結合について競合する。ＣＤ２５への結合について競合する能力は、８．３．１．１節において記載されている競合アッセイなどの競合アッセイを使用して調べられうる。競合アッセイのための他のフォーマットは、当技術分野で公知であり、援用されうる。
【０１３３】
他の態様では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、細胞増殖など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの範囲のＣＤ２５活性を阻害する（または中和する）。例えば、一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、Ｔ細胞増殖を阻害する能力についてアッセイされる。このようなアッセイは、公知の技法を使用して実行されうる。１つの技法では、ヒトＰＢＭＣは、適切な培地中で希釈され、次いで、濃度を変化させる抗ＣＤ２５抗体を添加して、それらがＴ細胞増殖に対して及ぼす効果を決定する前に、例えば、抗ＣＤ３抗体で刺激される。ＰＢＭＣ増殖アッセイは、下記の８．４．１．１節において記載されている通りに実行されうる。精製Ｔ細胞の増殖はまた、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下でも評価されうる。別の技法では、Ｋｉｔ２２５／Ｋ６細胞のＩＬ２依存性増殖を阻害する、本開示の抗ＣＤ２５抗体の能力が、下記の８．３．１．３節において記載されている通りに測定されうる。使用されうる別のアッセイは、抗ＣＤ２５への結合の、抗原特異的Ｔ細胞増殖応答に対する影響を示す混合リンパ球反応である。例示的な混合リンパ球反応は、下記の６．４．１．６節において記載されている通りに実施されうる。抗ＣＤ２５抗体は、抗原活性化ＰＢＭＣおよびマイトジェン活性化ＰＢＭＣからのサイトカインの分泌をブロッキングする。例えば、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）で活性化させた培養物に由来する上清は、ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのマルチプレックスアッセイおよびサイトカイン依存細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）アッセイなど、公知の技法をリードアウトとして使用して、多様なサイトカインおよびケモカインの存在について調べられうる。さらに別のアッセイでは、ヒトＰＢＭＣおよび組換えヒトＩＬ２の培養物中の抗ＣＤ２５の組入れによる、ＣＤ５６  ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が、下記の６．４．１．７節において記載されている通りに、実施されうる。
【０１３４】
ＣＤ２５中和アッセイのための他のフォーマットは、当技術分野で公知であり、援用されうる。
【０１３５】
多様な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、抗ＣＤ２５抗体を、０．０８μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度でまたは前出の値のうちのいずれかの間の範囲の濃度で（例えば、２μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で）使用する場合、標識されたダクリズマブの結合を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または前出の値のうちのいずれかの間の範囲の百分率だけ低減する（例えば、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、標識されたダクリズマブの結合を、５０％から７０％低減する。）。
【０１３６】
多様な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、抗ＣＤ２５抗体を、２ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度でまたは前出の値のうちのいずれかの間の範囲の濃度で（例えば、１μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で）使用する場合、ＣＤ２５を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または前出の値のうちのいずれかの間の範囲の百分率だけ中和する（例えば、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５活性を、５０％から７０％中和する。）。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５の中和において、ダクリズマブの少なくとも０．７倍有効、０．８倍有効、少なくとも０．９倍有効、少なくとも１倍有効、少なくとも１．１倍有効、少なくとも１．２５倍有効、少なくとも１．５倍有効、少なくとも２倍有効、少なくとも３倍有効、少なくとも５倍有効、少なくとも１０倍有効、少なくとも２０倍有効、少なくとも５０倍有効、少なくとも１００倍有効、少なくとも２００倍有効、少なくとも５００倍有効、少なくとも１０００倍有効である、またはＣＤ２５の中和において、ダクリズマブと比べて、前出の値の任意の対の間の範囲の有効性を有する（例えば、ＣＤ２５の中和において、ダクリズマブの０．９倍から５倍有効、ダクリズマブの１倍から３倍有効またはダクリズマブの２倍から５０倍有効である。）。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体の、ダクリズマブと比較した生物学的特性は、全長免疫グロブリン分子（これらは、任意の種類の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥでありうるが、免疫グロブリン二量体の形態であることが好ましい。）の文脈で評価される。他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体の、ダクリズマブと比較した生物学的特性は、Ｆａｂ断片の文脈で評価される。したがって、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、全長免疫グロブリン形態、Ｆａｂ形態、またはこれらの両方において、ダクリズマブと比較して、アフィニティーおよび／またはＩＬ２遮断活性が改善されている可能性がある。
【０１３９】
７．４．抗ＣＤ２５抗体の薬物動態特性
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ダクリズマブと比較して、ＣＤ２５に対する結合アフィニティーが改善されていることが典型的である。
【０１４０】
ある種の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、全長免疫グロブリン分子（これらは、任意の種類の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥでありうるが、免疫グロブリン二量体の形態であることが好ましい。）の文脈で評価される場合、ＣＤ２５に、５００ｐＭ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）で結合する。具体的な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ＫＤが、４８０ｐＭ以下、４５０ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下または２５ｐＭ以下である。さらに他の具体的な実施形態では、ＫＤは、少なくとも１ｐＭ、少なくとも３ｐＭ、少なくとも５ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも１５ｐＭまたは少なくとも２０ｐＭである。本開示の抗ＣＤ２５抗体のＫＤは、前出の値の任意の対から選択される上界および下界を伴う範囲（例えば、３ｐＭから５０ｐＭ、５ｐＭから２００ｐＭ、１０ｐＭから１００ｐＭ、５０ｐＭから３５０ｐＭ、１５ｐＭから１５０ｐＭ、２０ｐＭから４５０ｐＭ、１０ｐＭから２００ｐＭなど）で規定されうる。
【０１４１】
なおも他の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５に、ダクリズマブのＫＤの約０．００５倍から１倍の範囲のＫＤ、例えば、ダクリズマブのＫＤの０．００５倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．００７５倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．０１倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．０３倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．０５倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．１倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．２倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．３倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．４倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．５倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．７５倍のＫＤまたは前出の値の任意の対の間の範囲のＫＤ、例えば、ダクリズマブのＫＤの０．００５倍から０．１倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．００７５倍から０．３倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．１倍から０．４倍のＫＤ、ダクリズマブのＫＤの０．０５から１倍のＫＤなどで結合する。本開示の抗体の、ダクリズマブと比較した相対アフィニティーは、全長免疫グロブリン分子（これらは、任意の種類の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥでありうるが、免疫グロブリン二量体の形態であることが好ましい。）の文脈で評価される場合もあり、Ｆａｂ断片の文脈で評価される場合もある。
【０１４２】
ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）値は、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光偏光アッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅなど、他の任意のバイオセンサーにより決定することができる。多様な実施形態では、抗ＣＤ２５抗体の、ＣＤ２５受容体の細胞外ドメインとの相互作用についての結合定数は、それぞれ、８．３．１．２節および８．３．１．４節において記載されているＢＩＡｃｏｒｅアッセイまたはＦＡＣＳ結合アッセイなどの、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイまたはＦＡＣＳ結合アッセイを使用して決定することができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、全長免疫グロブリン分子（これらは、任意の種類の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥでありうるが、免疫グロブリン二量体の形態であることが好ましい。）の文脈で評価される場合、ＣＤ２５に結合し、０．２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．１２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０７５ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０２５ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、０．００２５ｎＭ以下または０．００１ｎＭ以下のＩＣ５０で細胞成長を阻害する（例えば、８．３．１．３節において記載されているＫｉｔ２２５増殖アッセイで）。本開示の抗ＣＤ２５抗体のＩＣ５０は、前出の値の任意の対から選択される上界および下界を伴う範囲（例えば、０．００１ｎＭから０．２ｎＭ、０．００５ｎＭから０．０２５ｎＭ；０．００１ｎＭから０．１ｎＭ、０．０２５ｎＭから０．１５ｎＭなど）で規定されうる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５に結合し、ダクリズマブのＩＣ５０の約０．０２倍から１倍の範囲のＩＣ５０、例えば、ダクリズマブのＩＣ５０の０．０５倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．１倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．２倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．３倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．４倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．５倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．７５倍のＩＣ５０または前出の値の任意の対の間の範囲のＩＣ５０、例えば、ダクリズマブのＩＣ５０の０．１倍から０．４倍のＩＣ５０、ダクリズマブのＩＣ５０の０．０５から１倍のＩＣ５０などで細胞成長を阻害する（例えば、８．３．１．３節において記載されているＫｉｔ２２５増殖アッセイで）。本開示の抗体の、ダクリズマブと比較した相対ＩＣ５０は、全長免疫グロブリン分子（これらは、任意の種類の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥでありうるが、免疫グロブリン二量体の形態であることが好ましい。）の文脈で評価される場合もあり、Ｆａｂ断片の文脈で評価される場合もある。
【０１４５】
７．５．抗ＣＤ２５抗体の免疫原性の低減
ある種の態様では、本開示は、免疫原性を、ダクリズマブと比較して低減された抗ＣＤ２５抗体を提示する。本開示は、それらのＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域内に、ダクリズマブのＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域と比較して、単一または複数のアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換が、抗体の、ダクリズマブと比較した免疫原性を低減する、抗ＣＤ２５抗体を提示する。ある種の実施形態では、免疫原性の低減は、１つ以上のＴ細胞エピトープの消失または減殺を結果としてもたらす、１つ以上のアミノ酸置換から生じる。
【０１４６】
ある種の態様では、本開示の免疫原性が低減された抗ＣＤ２５抗体は、生物学的活性、例えば、ＣＤ２５に対するアフィニティーまたはＣＤ２５活性の中和が、ダクリズマブと比較して同等である、または改善されている。このような特性は、例えば、上記の５．３節において記載されている方法により調べられうる。
【０１４７】
ある種の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体の免疫原性は、ダクリズマブと比べて低減されている。ある種の実施形態では、「免疫原性が低減された」変異体は、表９に示されたペプチドＰＨ１６またはペプチドＰＨ１７と比較して、末梢血単核細胞内の増殖応答の低減を誘発する、抗ＣＤ２５抗体を指す。増殖応答を査定するのに使用されうる、例示的な増殖アッセイは、下記の６．５．２節に示される。増殖応答の低減は、レスポンダーの百分率、刺激指数または両方との関連で反映されうる。
【０１４８】
ある種の実施形態では、免疫原性が低減された抗ＣＤ２５抗体は、重鎖ＣＤＲ２内の置換Ｔ５４Ｓおよび／または重鎖フレームワーク２内の置換Ｉ４８Ｍを有する。抗体はまた、１つ以上のさらなる置換、例えば、ＣＤ２５に対するアフィニティーを増大させる置換も有しうる。無傷抗体から導出されたＦａｂ断片であって、置換を含有するＦａｂ断片は、増殖の低減を誘導する。Ｆａｂ断片の相対免疫原性を決定するのに使用されうる、例示的な増殖アッセイは、下記の６．５．２節に示される。
【０１４９】
他の実施形態では、表９に示されたペプチドＰＨ１６またはペプチドＰＨ１７と比較して、変異体配列は、少なくとも２５％少ないレスポンダー、少なくとも３０％少ないレスポンダー、少なくとも３５％少ないレスポンダー、少なくとも４０％少ないレスポンダー、少なくとも４５％少ないレスポンダー、少なくとも５０％少ないレスポンダー、少なくとも６０％少ないレスポンダー、少なくとも６５％少ないレスポンダー、少なくとも７０％少ないレスポンダー、少なくとも７５％少ないレスポンダー、少なくとも８０％少ないレスポンダー、少なくとも８５％少ないレスポンダー、少なくとも９０％少ないレスポンダー、少なくとも９５％少ないレスポンダー、少なくとも１００％少ないレスポンダーまたは前出の値のうちのいずれかの間の範囲のレスポンダーの低減、例えば、２５％−７５％少ないレスポンダー、５０％−９０％少ないレスポンダー、６０％−１００％少ないレスポンダー、７０％−９０％少ないレスポンダーなどを結果としてもたらす。
【０１５０】
他の実施形態では、変異体配列は、表９に示されたペプチドＰＨ１６またはペプチドＰＨ１７により誘発された刺激指数より、少なくとも５％小さい、少なくとも１０％小さい、少なくとも１５％小さい、少なくとも２０％小さい、少なくとも２５％小さい、少なくとも３０％小さい、少なくとも３５％小さいまたは少なくとも４０％小さい刺激指数を結果としてもたらす、またはペプチドＰＨ１６またはＰＨ６９と比較して、例えば、５％−２０％小さい、１０％−３０％小さい、３０％−４０％小さいなど、前出の値のうちのいずれかの間の範囲だけ低減された刺激指数を結果としてもたらす。
【０１５１】
ダクリズマブと比較して免疫原性が低減された、候補抗ＣＤ２５抗体のさらなる例示的な実施形態は、表１１−１９に示された、ＣＤＲおよび／またはフレームワークの置換または置換の組合せのうちの１つ以上を含む。任意選択により、ダクリズマブと比較して免疫原性が低減された抗ＣＤ２５抗体は、表６−８、２０および２１のうちのいずれかにおけるＣＤＲ突然変異のうちの１つ以上など、１つ以上のさらなる置換を含む。
【０１５２】
７．６．抗体コンジュゲート
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、例えば、共有結合的接合が、ＣＤ２５への結合に干渉しないように、任意の種類の分子の、抗体への共有結合的接合により改変された抗体コンジュゲートを含む。
【０１５３】
ある種の態様では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、エフェクター部分または標識にコンジュゲートされうる。本明細書で使用された「エフェクター部分」という用語は、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素、生物学的に活性のタンパク質、例えば、酵素、他の抗体または抗体断片、合成または自然発生のポリマー、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、放射性核種、特に、放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子および蛍光化合物またはＮＭＲ分光法またはＥＳＲ分光法により検出されうる化合物などのレポーター基を含む。
【０１５４】
一例では、抗ＣＤ２５抗体は、所与の生物学的応答を修飾するように、細胞傷害剤、放射性核種または薬物部分などのエフェクター部分にコンジュゲートされうる。エフェクター部分は、例えば、毒素（アブリン、リシンＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素またはジフテリア毒素など）、シグナル伝達分子（α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子または組織プラスミノーゲン活性化因子など）、抗血栓剤または抗血管新生剤（例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン）またはサイトカインもしくは成長因子（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ））などの生物学的応答修飾剤などであるがこれらに限定されない、タンパク質またはポリペプチドでありうる。
【０１５５】
別の例では、エフェクター部分は、細胞毒素または細胞傷害剤でありうる。細胞毒素および細胞傷害剤の例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらの類似体または相同体を含む。
【０１５６】
エフェクター部分はまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ５およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ：シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシンまたはデュオカルミシン）、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含むがこれらに限定されない。
【０１５７】
他のエフェクター部分は、１１１Ｉｎ  および９０Ｙ、１７７Ｌｕ、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８０／レニウム１８８などであるがこれらに限定されない放射性核種ならびにアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンなどであるがこれらに限定されない薬物を含みうる。
【０１５８】
このようなエフェクター部分を抗体にコンジュゲートするための技法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、２版、６２３−５３ページ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７））；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９−５８およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３：６７−１２３を参照されたい。）。
【０１５９】
一例では、抗ＣＤ２５抗体またはその断片は、抗体のＮ末端もしくはＣ末端を介してまたは内部において、共有結合（例えば、ペプチド結合）により、別のタンパク質のアミノ酸配列（またはその部分；例えば、タンパク質の、少なくとも１０、２０または５０アミノ酸の部分）に融合される。抗体またはその断片は、抗体の定常ドメインのＮ末端において、他のタンパク質に連結されうる。このような融合体を創出するのに使用されうる組換えＤＮＡ手順は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５において記載されている手順である。別の例では、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長し、さらに／または上皮障壁を越える、免疫系への抗体の送達を増強しうる。この種類の適切なエフェクター分子の例は、ＷＯ２００５／１１７９８４において記載されているエフェクター分子など、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質またはアルブミン結合性化合物を含む。
【０１６０】
ある種の態様では、抗ＣＤ２５抗体は、低分子毒素にコンジュゲートされている。ある種の例示的な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、ドラスタチンまたはドロスタチンのペプチド類似体またはペプチド誘導体、例えば、アウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および同第５，７８０，５８８号）にコンジュゲートされている。ドラスタチン薬物部分またはアウリスタチン薬物部分は、そのＮ（アミノ）末端、Ｃ（カルボキシル）末端を介してまたは内部において抗体に接合されうる（ＷＯ０２／０８８１７２）。例示的なアウリスタチンによる実施形態は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第７，４９８，２９８号（例えば、リンカーおよびリンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製する方法について開示する。）において開示されている、Ｎ末端に連結された、モノメチルアウリスタチン薬物部分であるＤＥおよびＤＦを含む。
【０１６１】
他の例示的な実施形態では、低分子毒素は、カリケアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセンおよびＣＣ１０６５を含むがこれらに限定されない。本開示の一実施形態では、抗体は、１つ以上のメイタンシン分子（例えば、抗体分子１つ当たり約１つから約１０のメイタンシン分子）にコンジュゲートされている。メイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに転換され、これは、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元され、抗体と反応し（Ｃｈａｒｉら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２：１２７−１３１）て、メイタンシノイド−抗体またはメイタンシノイド−Ｆｃ融合コンジュゲートを作り出す。これらもまた使用されうるカリケアミシンの構造的類似体は、γ１１、α２１、α３１、Ｎ−アセチル−γ１１、ＰＳＡＧおよびθ１を含むがこれらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：３３３６−３３４２；Ｌｏｄｅら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８：２９２５−２９２８；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）。
【０１６２】
本開示の抗体はまた、ターゲティングされた送達のために、リポソームへもコンジュゲートされうる（例えば、Ｐａｒｋら、１９９７、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３９９−４３５；ＭａｒｔｙおよびＳｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０９：３８９−４０１を参照されたい。）。
【０１６３】
一例では、本開示の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に接合されうる。１つの特定の例では、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ部分は、抗体断片内に位置する、任意の結合可能なアミノ酸側鎖または末端のアミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、遊離イミノ基、遊離チオール基、遊離ヒドロキシル基または遊離カルボキシル基を介して接合されうる。このようなアミノ酸は、抗体断片内で自然発生する場合もあり、組換えＤＮＡ法を使用して、断片に操作される場合もある。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。２つ以上のＰＥＧ分子を接合するのに、複数の部位が使用されうる。ＰＥＧ部分は、抗体断片内に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して、共有結合的に連結されうる。チオール基が接合点として使用される場合、適切に活性化させたエフェクター部分、例えば、マレイミドなどのチオール選択性誘導体およびシステイン誘導体が使用されうる。
【０１６４】
具体例では、抗ＣＤ２５抗体コンジュゲートは、例えば、ＥＰ０９４８５４４において開示されている方法に従いＰＥＧ化されている、すなわち、それにＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合的に接合された、改変Ｆａｂ’断片である。また、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）；「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、１９９７）および「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍ．ＡｓｌａｍおよびＡ．Ｄｅｎｔ編、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８）ならびにＣｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４：５３１−５４５も参照されたい。ＰＥＧは、ヒンジ領域内のシステインに接合されうる。一例では、ＰＥＧ改変されたＦａｂ’断片は、マレイミド基が、改変ヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合的に連結されている。リシン残基は、マレイミド基に共有結合的に連結される可能性があり、リシン残基上のアミン基の各々へは、分子量を約２０，０００Ｄａとする、メトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが接合されうる。したがって、Ｆａｂ’断片に接合されたＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａでありうる。
【０１６５】
本明細書で使用された場合の「標識」という語は、本開示の抗ＣＤ２５抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされうる、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能な場合（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）もあり、酵素標識の場合、基質化合物または基質組成物の化学的変化であって、検出可能な化学的変化を触媒する場合もある。有用な蛍光部分は、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどを含むがこれらに限定されない。有用な酵素標識は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどを含むがこれらに限定されない。
【０１６６】
とりわけ、診断目的で有用な、さらなる抗ＣＤ２５抗体コンジュゲートは、下記の５．９節において記載されている。
【０１６７】
７．７．抗ＣＤ２５抗体の診断的使用
例えば、ビオチニル化、西洋ワサビペルオキシダーゼまたは他の任意の検出可能部分により改変された抗体を含む、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、診断目的で使用されると有利でありうる。
【０１６８】
特に、抗ＣＤ２５抗体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断法およびｉｎ  ｖｉｖｏの診断法の両方を含め、ＣＤ２５を精製または検出するのに使用されうるがこれらに限定されない。例えば、抗体は、生体試料中のＣＤ２５レベルを定性的に測定し、定量的に測定するための、イムノアッセイにおける使用を有する。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）を参照されたい。具体的な実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、血清中のＣＤ２５レベル、すなわち、細胞表面から脱落したＣＤ２５細胞外ドメインのレベルを検出および定量化するために使用されうる。
【０１６９】
本開示は、診断剤にコンジュゲートされた、抗体またはそれらの断片もさらに包摂する。抗体は、例えば、特異的な細胞内、組織内または血清中の対象の標的の発現を検出するように、診断的に使用される場合もあり、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定する臨床試験手順の一部として、免疫応答の発生または進行をモニタリングするように、診断的に使用される場合もある。検出は、抗体を、検出可能な物質にカップリングすることにより容易とされうる。検出可能な物質の例は、多様な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含む。検出可能物質は、抗体（またはその断片）に直接的にカップリングまたはコンジュゲートされる場合もあり、当技術分野で公知の技法を使用して、媒介物（例えば、当技術分野で公知のリンカーなど）を介して、間接的にカップリングまたはコンジュゲートされる場合もある。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロサイクリックオキシダーゼオキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含み、発光材料の例は、ルミノールを含み、生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびイクォリンを含み、適切な放射性材料の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、ｌ１１Ｉｎまたは９９Ｔｃを含む。
【０１７０】
本開示は、ＣＤ２５の発現の検出であって、１つ以上の、本開示の抗ＣＤ２５抗体（任意選択により、検出可能部分にコンジュゲートされた）を使用して、生体試料（個体の細胞、組織または体液）を接触させること、および試料がＣＤ２５の発現について陽性であるのかどうか、または試料が、発現を、対照試料と比較して変化させている（例えば、低減している、または増大させている）のかどうかを検出することを含む検出をもたらす。
【０１７１】
７．８．抗ＣＤ２５抗体を使用する治療的方法
７．８．１．臨床的利益
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、多様な免疫状態およびがん、臓器移植片拒絶、喘息、多発性硬化症、ブドウ膜炎、眼炎症および１型ヒトＴ細胞白血病ウイルス関連Ｔ細胞白血病などを治療するのに使用されうる。
【０１７２】
したがって、本開示は、それを必要とする患者における前出の疾患のうちのいずれかを治療する方法であって、患者に本開示の抗ＣＤ２５抗体を投与するステップを含む方法を提示する。任意選択により、投与は、例えば、１日後、２日後、３日後、５日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、２カ月後または３カ月後に反復される。反復投与は、同じ用量の場合もあり、異なる用量の場合もある。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回以上反復されうる。例えば、ある種の投与レジメンに従い、患者は、長期にわたり、例えば、６カ月間、１年間、２年間以上、任意選択により、多発性硬化症などの慢性疾患を治療する場合は無期限で抗ＣＤ２５治療を受ける。具体的な実施形態では、治療は、２週間から６カ月間、３カ月間から５年間、６カ月間から１または２年間、８カ月間から１８カ月間などにわたり継続される。治療レジメンは、不変用量レジメンの場合もあり、複数の可変用量レジメンの場合もある。
【０１７３】
患者に投与される抗ＣＤ２５抗体の量は、ある種の実施形態では、治療有効量である。本明細書で使用された「治療有効」量のＣＤ２５抗体は、単回投与として投与される場合もあり、治療レジメンにわたる、例えば、１週間、２週間、３週間、１カ月間、３カ月間、６カ月間、１年間以上にわたる場合もある。
【０１７４】
本開示に従い、疾患の治療は、任意の臨床段階における疾患の任意の形態もしくは症状（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）を有すると既に診断された患者の治療；疾患の症状（ｓｙｍｐｔｏｍ）もしくは徴候の発症もしくは進行もしくは悪化もしくは増悪の遅延ならびに／または疾患の防止および／もしくは疾患の重症度の軽減を包摂する。
【０１７５】
本開示の抗ＣＤ２５抗体が投与される「対象」または「患者」は、非霊長動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長動物（例えば、サルまたはヒト）などの哺乳動物であることが好ましい。ある種の実施形態では、対象または患者は、ヒトである。ある種の態様では、ヒトは、成人患者である。他の態様では、ヒトは、小児科患者である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体の定常ドメインは、ヒトＩｇＡドメイン、ヒトＩｇＥドメイン、ヒトＩｇＧドメインまたはヒトＩｇＭドメインである。具体的な実施形態では、ヒトＩｇＧの定常ドメイン、とりわけ、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプの定常ドメインは、とりわけ、本発明のヒト化抗体が、治療的使用のために意図され、抗体のエフェクター機能が、必要とされる場合に使用される。
【０１７７】
７．９．医薬組成物および投与経路
本開示の抗ＣＤ２５抗体を含み、任意選択により、下記の７．１０節において記載されている組合せ治療剤など、１つ以上のさらなる治療剤も含む組成物が、本明細書では提示されている。組成物は通例、通常医薬として許容される担体を含む滅菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、任意の適切な形態でありうる（それを患者に投与する所望の方法に応じて）。
【０１７８】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、経口経路、経皮経路、皮下経路、鼻腔内経路、静脈内経路、筋内経路、眼内経路、局所経路、髄腔内経路および脳室内経路など、様々な経路により、患者に投与されうる。任意の所与の場合において最も適切な投与経路は、対象ならびに疾患の性格および重症度ならびに対象の全身状態に依存する。
【０１７９】
本明細書で記載された適応を治療するために、本開示の抗ＣＤ２５抗体の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または持続投与当たり、約０．１から約５ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる場合もあり、治療される状態、投与経路ならびに対象の年齢、体重および状態に応じて、任意の有効範囲またはその中の値にわたる場合もある。ある種の実施形態では、各用量は、体重１キログラム当たり約０．５ｍｇから約２ｍｇの範囲にわたりうる。他の実施形態では、各用量は、約５０ｍｇから５００ｍｇの範囲にわたることが可能であり、例示的な実施形態では、約５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇまたは４００ｍｇである。抗体は、水溶液として製剤化され、皮下注射により投与されうる。具体的な実施形態では、水溶液は、ｐＨが、約ｐＨ５．５から約ｐＨ６．５の範囲にあり、約２０−６０ｍＭのコハク酸緩衝液、約０．０１％から約０．１％（または約０．０２％−０．０４％）のポリソルベート、約７５−１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、１２５ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ２５抗体を含む。
【０１８０】
医薬組成物は、単位用量当たりに所定量の本開示の抗ＣＤ２５抗体を含有する単位用量形態で提供されると好都合でありうる。このような単位は、例えば、０．１ｍｇから０．５ｇ、例えば、２０ｍｇから５００ｍｇ、５０ｍｇから２５０ｍｇまたは１００ｍｇから３００ｍｇを含有しうるがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、単位用量は、約１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇまたは３００ｍｇの抗ＣＤ２５抗体を含む。本開示における使用のための、医薬として許容される担体は、例えば、治療される状態または投与経路に応じて、多種多様な形態を取りうる。
【０１８１】
本開示の抗ＣＤ２５抗体の治療用処方物は、所望される程度の純度を有する抗体を、当技術分野で典型的に援用されている、任意選択の医薬として許容される担体、賦形剤または安定化剤（これらの全ては、本明細書では、「担体」と称される。）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤、およびその他の添加剤と混合することにより、凍結乾燥処方物または水溶液としての保管のために調製されうる。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版（Ｏｓｏｌ編、１９８０）を参照されたい。このような添加剤は、援用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性でなければならない。
【０１８２】
緩衝剤は、ｐＨを、生理学的状態を近似する範囲内に維持する一助となる。緩衝剤は、約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在しうる。本開示を伴う使用に適する緩衝剤は、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）など、それらの有機酸および有機塩ならびに無機酸および無機塩の両方を含む。加えて、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリスなどのトリメチルアミン塩も使用されうる。
【０１８３】
保存剤は、微生物の成長を遅延させるのに添加される可能性があり、０．２％−１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加されうる。本開示を伴う使用に適する保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウムおよびメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ベンタノールを含む。任意選択により「安定化剤」としても公知の等張は、本開示の液体組成物の等張性を確保するのに添加される可能性があり、多価糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなど、三価以上の糖アルコールを含みうる。安定化剤は、機能的に、バルキング剤から、治療剤を可溶化するまたは容器壁面への変性または付着を防止する一助となる添加剤の範囲にわたりうる、広範な範疇の賦形剤を指す。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール（上記で列挙された）；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコールであって、イノシトールなどのシクリトールを含む有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；チオ尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなど、硫黄を含有する還元剤；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖およびラフィノースなどの三糖およびデキストランなどの多糖でありうる。安定化剤は、活性タンパク質の重量当たりの重量で０．１から１０，０００の範囲内で存在しうる。
【０１８４】
非イオン性界面活性剤または非イオン性洗浄剤（「保湿剤」としてもまた公知の）は、治療剤を可溶化するほか、治療用タンパク質を、攪拌に誘導される凝集に対して保護する一助となるように添加される可能性があるが、また、タンパク質の変性を引き起こすことなく、処方物が表面せん断応力に曝露されることも可能とする。適切な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０など）、ポロキサマー（ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０など）を含む。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在しうる。
【０１８５】
さらなるその他の賦形剤は、バルキング剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒を含む。
【０１８６】
本開示の抗ＣＤ２５抗体は、米国特許公開第２０１１／０３１８３４３号において記載されている通り、安定的な医薬組成物に製剤化されうる。例示的な実施形態では、医薬組成物は、ｐＨが、ｐＨ５．５からｐＨ６．５であり、２０−６０ｍＭのコハク酸緩衝液、０．０２％−０．０４％のポリソルベート、７５−１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび５０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の抗ＣＤ２５抗体を含む。
【０１８７】
本明細書の処方物はまた、本開示の抗ＣＤ２５抗体に加えて、組合せ治療剤も含有しうる。
【０１８８】
皮下投与のための投与スケジュールは、疾患の種類、疾患の重症度および患者の抗ＣＤ２５抗体に対する感受性を含む、多数の臨床的因子に応じて、６カ月ごとに１回から毎日まで変化しうる。具体的な実施形態では、投与は、毎週、毎月または隔月である。
【０１８９】
投与される本開示の抗ＣＤ２５抗体の投与量は、特定の抗体、疾患の種類（例えば、免疫障害またはがん）、対象および疾患の重症度、対象の全身状態、治療レジメン（例えば、組合せ治療剤が使用されるのかどうか）および選択された投与経路に従い変化し、適切な投与量は、当業者によりたやすく決定されうる。
【０１９０】
当業者により、個々の本開示の抗ＣＤ２５抗体の最適の投与量および投与間隔は、治療される状態の性格および程度、投与形態、投与経路および投与部位ならびに治療される特定の対象の年齢および状態により決定され、主治医が、使用される適切な投与量を最終的に決定することが認識される。この投与量は、適切である限りにおいて、反復されうる。副作用が発症する場合、投与量および／または投与頻度は、通常の臨床慣行に従い、変化しうる、または低減されうる。
【０１９１】
７．１０．組合せ治療
下記では、本開示の抗ＣＤ２５抗体が活用されうる、組合せ法について記載される。本開示の組合せ法は、そのうちの第１が、本開示の抗ＣＤ２５抗体であり、そのうちの第２が、組合せ治療剤である、少なくとも２つの薬剤の患者への投与を伴う。抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤は、同時に投与される場合もあり、逐次的に投与される場合もあり、個別に投与される場合もある。
【０１９２】
本開示の組合せ療法は、相加効果を超える効果を結果としてもたらし、抗ＣＤ２５抗体または組合せ治療剤のいずれも、単独で治療的に有効な量では投与されていない場合に、治療的利益をもたらしうる。
【０１９３】
本方法では、本開示の抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤は、同時にまたは逐次的にである、共時的に投与されうる。本明細書で使用された、本開示の抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤は、患者に、同じ日、例えば、同じ患者来院時に投与された場合、逐次的に投与されたという。逐次的投与は、１、２、３、４、５、６、７または８時間隔てて生じうる。これに対し、本開示の抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤は、患者に、異なる日に投与された場合、個別に投与されたといい、例えば、本開示の抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤は、１日おき、２日おきまたは３日おき、１週間おき、２週間おきまたは毎月の間隔で投与されうる。本開示の方法では、本開示の抗ＣＤ２５抗体の投与は、組合せ治療剤の投与に先行する場合もあり、後続する場合もある。
【０１９４】
非限定的な例として、本開示の抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤が、ある期間にわたり共時的に投与された後、第２の期間が後続し、本開示の抗ＣＤ２５抗体の投与および組合せ治療剤が交互に施される可能性がある。
【０１９５】
本開示の抗ＣＤ２５抗体および組合せ治療剤を投与する潜在的な相乗効果のため、このような薬剤は、薬剤の一方または両方が単独で投与された場合、治療的に有効ではない量で投与されうる。
【０１９６】
多様な疾患を治療するのに使用される場合、本開示の抗ＣＤ２５抗体は、同じ疾患または類似の疾患に適する他の治療剤と組み合わされうることが想定される。加えて、抗ＣＤ２５抗体は、炎症性経路をターゲティングするため、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、メペリジン、デキサメタゾン、ペンタサ、メサラジン、アサコール、リン酸コデイン、ベノリレート、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラクおよびインドメタシン、アスピリンおよびイブプロフェンなどの抗炎症剤と組み合わせて使用されうる。
【０１９７】
がんを治療するために使用される場合、本開示の抗体は、手術、放射線治療、化学療法、抗血管新生剤またはこれらの組合せなど、従来のがん治療と組み合わせて使用されうる。
【０１９８】
適切な化学療法剤は、放射性分子、細胞毒素または細胞傷害剤ともまた称される毒素であって、細胞の生存能力に対して有害な任意の薬剤を含む毒素、薬剤および化学療法化合物を含有するリポソームまたは他の小胞を含むがこれらに限定されない。適切な化学療法剤の例は、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシル、デカルバジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、抗α５β１インテグリン抗体、アルキル化剤、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、アントラマイシン（ＡＭＣ））、抗有糸分裂剤、ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ：シスプラチン）、ジアミノジクロロ白金、アントラサイクリン、抗生剤、代謝拮抗剤、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ  ｌｉｖｅ（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウムおよびベタメタゾン酢酸エステル、ビカルタミド、ブレオマイシン硫酸塩、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、カリケアミシン、カペシタビン、カルボプラチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、コンジュゲートエステロゲン、シクロホスファミド、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビン、サイトカラシンＢ、Ｃｙｔｏｘａｎ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ダウノルビシンＨＣＬ、ダウノルビシンクエン酸塩、デニロイキンディフチトクス、デキスラゾキサン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ドセタキセル、ドラセトロンメシル酸塩、ドキソルビシンＨＣＬ、ドロナビノール、Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来Ｌ−アスパラギナーゼ、ボロシキシマブ、エメチン、エポエチンα、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属由来Ｌ−アスパラギナーゼ、エステル化エステロゲン、エストラジオール、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、臭化エチジウム、エチニルエストラジオール、エチドロネート、エトポシドシトロボラム因子、リン酸エトポシド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、フルダラビンリン酸エステル、フルオロウラシル、フルタミド、葉酸、ゲムシタビンＨＣＬ、グルココルチコイド、ゴセレリン酢酸塩、グラミシジンＤ、グラニセトロンＨＣＬ、ヒドロキシウレア、イダルビシンＨＣＬ、イホスファミド、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカンＨＣＬ、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド酢酸塩、レバミソールＨＣＬ、リドカイン、ロムスチン、メイタンシノイド、メクロレタミンＨＣＬ、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、メゲストロール酢酸エステル、メルファランＨＣＬ、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、メチルテストステロン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド酢酸塩、オンダンセトロンＨＣＬ、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペントスタチン、ピロカルピンＨＣＬ、プリカマイシン、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロザン２０、ポルフィマーナトリウム、プロカイン、プロカルバ��ンＨＣＬ、プロプラノロール、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テノポシド、テストラクトン、テトラカイン、チオテパ、クロランブシル、チオグアニン、チオテパ、トポテカンＨＣＬ、トレミフェンクエン酸塩、トレチノイン、バルルビシン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩およびビノレルビン酒石酸塩を含むがこれらに限定されない。
【０１９９】
がんを治療するために、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：２４９−２５７により列挙されている抗血管新生剤を含む、任意の抗血管新生剤が、本開示の抗ＣＤ２５抗体と共に使用されうる。ある種の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ変異体、可溶性のＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲブロッキングすることが可能なアプタマー、抗ＶＥＧＦＲ中和抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤および任意のこれらの組合せなどの、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストである。代替的にまたは加えて、抗ＶＥＧＦ抗体は、患者に共投与されうる。
【０２００】
多発性硬化症を治療するために使用される場合、本開示の抗体は、多発性硬化症を治療するのに有用な他のターゲティング剤、例えば、インターフェロンβ−１ａ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））またはインターフェロンβ−１ｂ（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）またはＥｘｔａｖｉａ（登録商標））などのインターフェロンβ；グラチラマー酢酸塩（例えば、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））；フィンゴリモド（例えば、Ｇｉｌｅｎｙａ（登録商標））；ミトキサントロン（例えば、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；ナタリズマブ（例えば、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））；オクレリズマブ（ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）；ＰＥＧ化インターフェロンβ−１ａ；ジメチルフマル酸塩（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ）；Ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ（例えば、Ｆａｍｐｙｒａ（米国でＡｍｐｙｒａとして市販されている、遅延放出型のＦａｍｐｒｉｄｉｎｅ錠剤）；アレムツズマブ（例えば、Ｌｅｍｔｒａｄａ（登録商標））；ＬａｑｕｉｎｉｍｏｄおよびＴｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ（例えば、Ａｕｂａｇｉｏ（登録商標））と組み合わせて使用されうる。
【０２０１】
臓器移植片拒絶を抑制するために使用される場合、本開示の抗体は、コルチコステロイド；シクロスポリンＡ；タクロリムス；ラパマイシン；ミコフェノール酸モフェチルおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤と組み合わせて使用されうる。
【０２０２】
７．１１．診断用キットおよび医薬キット
本開示には、本開示の抗ＣＤ２５抗体（抗体コンジュゲートを含む。）を含有する医薬キットが包摂される。医薬キットは、本開示の抗ＣＤ２５抗体（例えば、凍結乾燥形態でまたは水溶液として）および以下：
例えば、上記の５．１０節において記載されている、組合せ治療剤、
抗ＣＤ２５抗体を投与するためのデバイス、例えば、ペン、ニードルおよび／またはシリンジならびに
抗体が凍結乾燥形態である場合、抗体を再懸濁させる、医薬グレードの水または緩衝液
のうちの１つ以上を含むパッケージである。
【０２０３】
ある種の態様では、抗ＣＤ２５抗体の各単位用量は、個別にパッケージングされ、キットは、１つ以上の単位用量（例えば、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、８単位用量、１０単位用量以上）を含有しうる。具体的な実施形態では、１つ以上の単位用量は各々、シリンジ内またはペン内に格納されている。
【０２０４】
また、本開示の抗ＣＤ２５抗体（抗体コンジュゲートを含む。）を含有する診断キットも、本明細書に包摂される。診断キットは、本開示の抗ＣＤ２５抗体（例えば、凍結乾燥形態でまたは水溶液として）および診断アッセイを実施するのに有用な１つ以上の試薬を含むパッケージである。抗ＣＤ２５抗体が、酵素で標識されている場合、キットは、酵素により要求される、基質および共因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアをもたらす基質前駆体）を含みうる。加えて、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロッキング緩衝液または溶解緩衝液）など、他の添加剤も含まれうる。ある種の実施形態では、診断キット内に組み入れられた抗ＣＤ２５抗体が固体表面上に固定化される、または抗体が固定化されうる固体表面（例えば、スライド）がキットに組み入れられる。試薬の溶液中の濃度であって、アッセイの感度を実質的に最適化する濃度をもたらすように、多様な試薬の相対量は、広範に変化しうる。具体的な実施形態では、抗体および１つ以上の試薬は、通例、溶存すると適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む、凍結乾燥された乾燥粉末として（個別にまたは組み合わされて）提供されうる。
【実施例】
【０２０５】
８．実施例
８．１．概要
ヒト化ＩｇＧ１抗ＣＤ２５モノクローナル抗体ダクリズマブに対して拡張変異分析を実施し、有益な特性を有する変異体を特定した。ダクリズマブの生成は、Ｑｕｅｅｎ法により実施された最も初期の抗体ヒト化の一つである（Ｑｕｅｅｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８６：１００２９−３３）。ヒト化抗体はマウス親抗体（抗Ｔａｃ）の機能を維持し、腎臓移植における拒絶反応の防止が承認されているが、細胞結合アッセイにおいて、ヒト化の後、３倍の親和性の損失が認められた（Ｑｕｅｅｎら、上を参照）。ダクリズマブが生成されて以降、さらに入手可能となったヒトフレームワーク配列の有効性およびコンピュータモデリングの改善を考慮して、抗Ｔａｃは再ヒト化され、ＣＤ２５に対する親和性およびマウス親抗体の機能性を維持するヒト化設計の改善が存在するか評価した（実施例１参照）。さらなる変異分析として、ダクリズマブのＣＤＲ突然変異体におけるコンビナトリアルライブラリーの親和性成熟およびスクリーニングならびに個々のクローンの性状解析（下記実施例２参照）、結合に重要な残基特定のためのＣＤＲ残基アラニンスキャニング（実施例２参照）、ＣＤ２５と同等または高い親和性を示す変異体特定のためのＣＤＲ各位置の包括的な変異誘発、集団における変異行動分析、それに続く典型的な個々の変異体の結合特性、生物学的特性の確認（実施例３参照）、さらにダクリズマブのＴ細胞免疫原性に関与するアミノ酸の分析およびＣＤ２５に対する結合を維持する「脱免疫化」された変異体の特定（実施例４参照）が含まれている。これらの研究結果は表６−８に要約される。表６Ａは、個々のクローンレベルにおいて有益な特性を生じることが確認された個々のＣＤＲまたはフレームワークのアミノ酸置換を要約する。表６Ｂは、ＣＤ２５で被覆されたプレートに対するＥＬＩＳＡ直接結合アッセイでのみ検査されたＨＣ  ＣＤＲ内におけるさらなる単一アミノ酸置換を示す。表７Ａ−７Ｃは、個々のクローンレベルにおける検査時の複数のＣＤＲ置換を有するダクリズマブの変異体の動的および生物学的特性を要約する。表８Ａ−８Ｂは、変異体集団における行動から、ダクリズマブと比較して、ＣＤ２５に対し同等または改善された結合性を有すると示唆される個々のＣＤＲ置換を特定する。いくつかの場合において、この変異体はダクリズマブのＩｇＧ１以外の様々な定常領域に移植された。非ＩｇＧ１抗体のアイソタイプは、表に反映される。
【０２０６】
８．２．［実施例１］  マウス抗ＴＡＣモノクローナル抗体の再ヒト化
マウス抗ＴａｃのＶＨを再ヒト化するため、サブグループＩのＲ３．５Ｈ５Ｇ（Ｍａｎｈｅｉｍｅｒ−Ｌｏｒｙら、１９９２年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１６３９−１６５２）がヒトフレームワークとして使用された（図２Ａ）。９つのアミノ酸が構造的に重要であると予想され、６９位を除いたその中の８つが、ＮｕｈｕＴａｃにおいて対応するマウス残基（図２Ａの下線部）に置換された。本来のヒト化ではＥｕ（Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎ．Ｉ．Ｈ  ワシントンＤＣ）がヒトフレームワークとして使用されたが、１２の残基がマウス残基に置換された。ＮｕｈｕＴａｃのヒト化置換に加えて、Ｎ末端Ｇｉｎ由来のピログルタミン酸形成による異種性回避のため、ＧｌｕがＮ末端アミノ酸として選択された（Ｃｈｅｌｉｕｓら、２００６年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：２３７０−２３７６）。
【０２０７】
マウス抗Ｔａｃ  ＭａｂのＶＬを再ヒト化するため、サブグループＩＩＩのｋａ３ｄｌ（Ｑｌｅｅら、１９９２年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：８３１−８４２）がヒトフレームワークとして使用された。１つのアミノ酸が構造的に重要であると予想され、そのため、ＮｕｈｕＴａｃにおいて対応するマウス残基（図２Ｂの下線部）に置換された。本来のヒト化ではＥｕがヒトフレームワークとして使用されたが、３つの残基が対応するマウス残基に置換された。そのため、再ヒト化された抗体は、マウス残基の保有がより少なく、ダクリズマブより免疫原性が低いと予想された。さらに、Ｎ末端におけるＧｌｎとＧｌｕとの置換により、再ヒト化抗Ｔａｃは本来のヒト化抗Ｔａｃより異種性が低いと予想された。
【０２０８】
図２Ｃは、ダクリズマブおよびＮｕｈｕＴａｃの重鎖、軽鎖に対する４つの組合せの試験結果を示す。再ヒト化抗体（ＮｕｈｕＴａｃ）において、ＥＬＩＳＡ競合アッセイにより結合性に約２倍の向上が観察された。
【０２０９】
組合せ抗体は、（ａ）ＮｕｈｕＴａｃ  ＶＨとダクリズマブＶＬ、および（ｂ）ダクリズマブＶＨとＮｕｈｕＴａｃ  ＶＬを組み合わせることにより、生成された。ＮｕｈｕＴａｃ  ＶＨとダクリズマブＶＬの組合せは、ＮｕｈｕＴａｃの高い親和性を保持する一方、ダクリズマブＶＨとＮｕｈｕＴａｃ  ＶＬの組合せはＮｕｈｕＴａｃより低い親和性を有していた。そのため、重鎖の置換がＮｕｈｕＴａｃの親和性の向上を生じた可能性が高い。
【０２１０】
次に、親和性を改善させるＶＨにおける主要な置換が特定された。ダクリズマブとＮｕｈｕＴａｃのＶＨ間における６つの差異（図２ＡのダクリズマブＶＨ配列における下線部）から、６９位と７３位（図２ＡのダクリズマブＶＨ配列における二重線部）がＣＤＲループに接触すると予想されるため、特に重要であると仮定された（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２４：４８７−４９９）。従って、ダクリズマブに関して、置換Ｉ６９Ｍ、Ｉ６９ＬおよびＥ７３Ｋが試験された。図２Ｄに示される通り、Ｉ６９ＭまたはＩ６９Ｌではなく、Ｅ７３Ｋがダクリズマブに対するＮｕｈｕＴａｃの親和性向上に重要であることが証明された。
【０２１１】
８．３．［実施例２］  哺乳類細胞ベースの全ＩＧＧディスプレイライブラリーを用いたヒト化抗ＣＤ２５抗体の親和性成熟
ダクリズマブは、親和性成熟によりその生物学的機能がさらに改善され、ＩＬ２のＩＬ２受容体α鎖に対する結合を阻害する。ＥＢＶベースのエピソーマルベクターを用いることにより、抗体ライブラリーが哺乳類細胞表面上に全ＩｇＧ分子として提示され、磁気ビーズおよび蛍光活性化セルソーティングの組合せにより、特異的抗原結合についてスクリーニングされた（Ａｋａｍａｔｓｕら、２００７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２７：４０−５２）。コンビナトリアル変異とともにＶＨおよびＶＬライブラリーが個別にスクリーニングされ、有益な変異を特定した。次いで、これらの変異を合わせ、ミニライブラリーを生成し、最も高い結合親和性を実現するＶＨとＶＬの組合せを特定した。結果として、高親和性の変異体が首尾よく特定され、最も高い親和性は１４ｐＭであり、これは親ダクリズマブより２８倍向上している。３つのアミノ酸置換のみの導入により、ＩＬ２受容体遮断活性において最大３．９倍の改善が観察された。一般的に、高親和性（低ＫＤ）は、ＩＬ２受容体を遮断する機能の改善と相関していた。さらに、ＫＤの詳細から、速いｋｏｎ値と遅いｋｏｆｆ値はともに機能に対して正の影響をもたらすが、速いｋｏｎ値は遅いｋｏｆｆ値よりも機能の改善と強い相関を示したことが示された。Ｆａｂ断片として変異体が検査される時、機能的活性はＫＤとより強く相関していた。
【０２１２】
８．３．１．材料および方法
８．３．１．１．ＥＬＩＳＡ競合アッセイ
ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１３３８）を用いて、ダクリズマブをビオチン標識した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−ｌｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅｓ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク）のウェルを、０．２Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウムバッファ（ｐＨ９．４、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ）中の０．２μｇ／ｍＬ  ＣＤ２５（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニュージャージー）１００μＬを用いて、４℃で一晩被覆した。洗浄バッファを用いて洗浄した後、スーパーブロックブロッキングバッファ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ）２００μＬによってウェルを３０分間遮断しさらに洗浄した。ビオチン標識したダクリズマブ（８０ｎｇ／ｍＬ）の亜飽和量および段階希釈した競合抗体のＥＬＩＳＡバッファ中混合物を、最終体積１００μＬとなるようウェルに添加し、３７℃のシェーカーにおいて１時間インキュベートした。次いで、プレートは洗浄バッファによって３度洗浄した。洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファで希釈した１μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μＬを各ウェルに添加した。室温で３０分間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド）の添加により、結合した抗体を検出した。２％シュウ酸１００μＬ／ウェルの添加により反応を停止させ、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア）を用いて、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。ソフトウェアＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）により非線形回帰を用いて結合阻害曲線を引き、ＩＣ５０野性型／ＩＣ５０突然変異体（野生型対照と比べ改善した倍数）として報告した。
【０２１３】
８．３．１．２．ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
ダクリズマブ変異体の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００または３０００の表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｎｅｕｃｈａｔｅｌ、スイス）を用いて測定された。製造者の指示書に従い、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をチップに固定した。ダクリズマブおよびＣＤ２５の結合性の研究のため、室温、３０μＬ／分の流速において結合アッセイを実行した。１−１２８ｎＭの間の８つの異なる濃度のＣＤ２５（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）をダクリズマブおよびその変異体が捕獲される表面全体に注入し、３分間の結合段階、およびその後の１５分間の分離段階を経過させた。結合データは１：１ラングミュアモデルに合わせられ、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアから結合定数を導出した。結合速度データは全て、少なくとも３つの個別の決定法により分析された。
【０２１４】
８．３．１．３．ＩＬ２依存Ｋｉｔ２２５／Ｋ６増殖アッセイ
Ｋｉｔ２２５／Ｋ６はＴ細胞慢性白血病の罹患患者に由来するＩＬ２依存Ｔ細胞系統である（Ｈｏｒｉ、１９８７年、Ｂｌｏｏｄ  ７０：１０６９−１６７２）。この細胞は通常、増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＨＩ（熱不活性化）−ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）および５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ２（「ｒｈＩＬ２」）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、インディアナ州）中で維持される。検査当日、細胞をＲＰＭＩ−１６４０によって３度洗浄し、ＩＬ２フリー培地（細胞密度５０，０００細胞／ｍＬで１０％熱不活性化ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン含有のＲＰＭＩ１６４０培地）中に再懸濁した。段階希釈した抗体は、アッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％熱不活性化ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ２）含有のｒｈＩＬ２中に調製された。次に、９６ウェル無菌性組織培養プレート中において、希釈した抗体１００μＬを事前に調製された細胞１００μＬと混合した。ＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃で５４＋／−２時間インキュベートした後、細胞増殖のレベルを量的に測定するため、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カリフォルニア）２０μＬを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートした。１８＋／−１時間インキュベートした後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＳＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、分光蛍光法によりシグナルを読み取った（５４４ｎＭにおいて励起、５９０ｎＭにおいて発光）。統計的差異の分析には、ＡＮＯＶＡ（分散分析）が使用された。
【０２１５】
８．３．１．４．ＦＡＣＳ結合アッセイ
高親和性ＩＬ２−Ｒを発現するＫｉｔ２２５／Ｋ６またはＨｕＴ１０２（Ｇａｚｄａｒ、１９８０年、Ｂｌｏｏｄ  ５５：４０９−１７）２×１０５を９６ウェルブロック（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２ｍｌ容量アッセイブロック）の各ウェルに分注した。細胞をＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）６００μＬによって２度洗浄した。ダクリズマブおよびその突然変異体を５μｇ／ｍＬに調製し、ＦＡＣＳバッファにより１：３または１：５に段階希釈した。次いで、各ウェルにおいて、希釈した抗体１００μＬ（いくつかの場合では２５μＬ）を事前に洗浄した細胞と混合し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄した。１：２５０に希釈したヤギ抗ＨｕＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５μＬを各ウェルに添加し、氷上暗中で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＡＣＳバッファ４００μＬによって懸濁した。フローサイトメトリーＣｙａｎ（Ｄａｋｏ）により、細胞表面の抗原に結合した抗体量を測定した。
【０２１６】
８．３．２．ＶＨおよびＶＬライブラリーの構築と濃縮
ダクリズマブにおける重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲ１およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲ３が、ＣＤ２５結合に重要であると考えられた一方、残る３つのＣＤＲの寄与はより低度と思われた（Ｇｌａｓｅｒ、１９９２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６０７−２６１４）。ダクリズマブの親和性はｎＭ以下のレベルであるため、結合中心部は自然選択を通して近最適化されている可能性が高い。結合表面の周囲を微調整するため、結合に対して重要性が低いと考えられるＣＤＲが変異誘発された。対象箇所におけるアミノ酸の限定的な選択肢により、個別にＶＬおよびＶＨライブラリーが構築された。非常に可変的であり、結合表面の周囲に位置すると思われるＶＬの６箇所およびＶＨの５箇所（ＷｕとＫａｂａｔ、１９７０年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１−２５０）が変異誘発のために選択された。最大１０５のアミノ酸変異体の組合せを生成するため、保存的変化、極性から無極性への変化および部分的に荷電したアミノ酸が包含された。
【０２１７】
ＶＬライブラリーに関して、ＣＤＲ１から２箇所（２９と３１）、ＣＤＲ２から４箇所（５０、５１、５２および５３）が変異誘発のために選択された。ＶＨライブラリーに関して、ＣＤＲ２において排他的に５箇所（５２、５３、５４、５６および５８）が選択された。ＶＬおよびＶＨの対象箇所におけるアミノ酸変異体は表３に一覧される。
【０２１８】
各位置における変異は、縮重コドン含有のプライマーを用いたＰＣＲにより導入された。ライブラリー断片をＥＢＶベースのエピソーマルベクターにサブクローンし、ＩｇＧ１／κ型により抗体の変異体を提示した。ライブラリーの品質評価のため、各ライブラリーに由来する２０−９６クローンの微量調整ＤＮＡが配列決定され、その位置において設計時に変異が導入されたことが確認された（データは示さない。）。
【０２１９】
ＶＬおよびＶＨライブラリーのＤＮＡが、対照のベクターと同様に、ＩｇＧディスプレイのため個別に２９３ｃ１８にトランスフェクトされた。結果として、約２．９×１０７および３．３×１０６の非依存性クローンを含むＶＬおよびＶＨライブラリーがそれぞれ得られた。
【０２２０】
ＶＬライブラリーのトランスフェクタントを３回のＦＡＣＳ濃縮にかけ、より高い親和性によりヒトＣＤ２５に結合するダクリズマブ変異体を発現するクローンを選択した。各回において、まずラムダ軽鎖定常領域（ＣＤ２５−Ｃλ）に融合したＣＤ２５の細胞外ドメインとともに細胞をインキュベートした。洗浄後、抗原融合タンパク質に結合した細胞検出用のＰＥ標識ヤギ抗ヒトラムダ軽鎖抗体、および表面ＩｇＧのレベル監視用のＰＥＣｙ５標識抗ヒトガンマ鎖抗体により細胞を二重染色した。ソーティング前に各回に対する最適な結合条件を決定するため、抗原濃度の力価を測定した。親抗体より親和性の高い抗体を提示するクローンを濃縮するため、ダクリズマブ提示している細胞の染色に基づき、上記交差系統のダブルポジティブに対してソーティングゲートが設定された。典型的に、別段の記載がない限り本研究に記載される全ライブラリーの各回において、全細胞の１−３％がソートされた。選択、培養の各回の後、ＣＤ２５結合体の濃縮レベル監視のため、ＣＤ２５−Ｃλにより細胞を染色した。初回のソーティングにおいて、２つの異なる抗原濃度３ｎＭおよび１ｎＭを使用した。０．５ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを用いた２回目のソーティングのため、増殖培地において生じた集団を個別に培養した。これらの２集団はＦＡＣＳ染色（それぞれ１０％および７％が結合において陽性（データは示さない。））において同等と認められるため、混合し、０．３ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを用いた３回目の濃縮を実施した。挿入なしでディスプレイベクターをトランスフェクトした細胞は、表面Ｉｇを有さず、５ｎＭ  ＣＤ２５−Ｃλにおいて非特異的結合をほとんど示さなかった。未ソートのＶＬライブラリーが３ｎＭの抗原濃度によって染色される時、細胞の４．４％は、結合および表面Ｉｇ発現においてダブルポジティブであった。３回目の濃縮後、７２％が陽性となり、ディスプレイ親抗体がトランスフェクトされた陽性細胞の割合（２７％）を超えた。
【０２２１】
ＶＨライブラリーに対して、３回のＦＡＣＳ濃縮、および１回の非関連抗原への結合に対する陰性選択を実施した。初回のソーティングにおいて、２つの異なる条件、１時間または２分間において、ライブラリー細胞とともに５ｎＭ  ＣＤ２５−Ｃλをインキュベートした。２分間のインキュベーションにおいて、野性型ダクリズマブの結合は未だ飽和状態とはなっておらず、そのため、短時間のインキュベーションは、より速い結合速度にある程度焦点を置き高親和性抗体の濃縮を意図していた。これらの条件から収集される細胞集団を培養し、それぞれ、０．５ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを用いた１時間のインキュベーション、または３ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを用いた２分間のインキュベーションによる２回目のソーティングに使用した。ソートされた集団の増殖の後、細胞は、材料および方法で記載した通り磁気ビーズを用いた非特異的結合体を吸収するものとなり、次いで、０．１ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを用いた１時間のインキュベーション、または０．５ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを用いた２分間のインキュベーションによる３回目に向け濃縮された。未ソートのＶＨライブラリーを５ｎＭの抗原濃度条件で染色すると、まず細胞の３．５％が陽性の結合性を示した。３回目の濃縮の後、ソーティング条件のいずれにおいても、７９％が抗原結合で陽性となり、ディスプレイ親抗体がトランスフェクトされた陽性細胞の割合（５０％、データは示さない。）を超えた。
【０２２２】
ＶＬ変異体の性状解析において、アミノ酸置換により非特異的な特徴を得ると思われるいくらかの変異体の濃縮を実施した。このようなクローンは濃縮の最後まで生存可能であるが、プロテインＡカラムに対する非特異的結合のため、精製は困難となり得る。この経験から、非関連性タンパク質とコンジュゲートした磁気ビーズを用いるＶＨライブラリー濃縮に陰性選択が導入され、非特異的結合体は集団から除去された。結果として、ＶＨライブラリーから非特異的な特徴を得たクローンは特定されなかった。
【０２２３】
８．３．３．ＣＤ２５に対してより高い親和性を有するＶＬおよびＶＨ変異体の特定
最終濃縮の後、記載通りに細胞が増殖され、プラスミドＤＮＡが回収された。電気穿孔の後、数百の非依存性コロニーが得られた。制限酵素消化により膜繋留ドメインをコードする領域を除去することで、混合物として調製されたプラスミドを溶解性ＩｇＧ１産生型に転換した。消化されたベクターを再結合および形質転換し細菌とした。９６ウェルフォーマットで個々にコロニーを培養し、配列分析のためプラスミドＤＮＡが単離された。
【０２２４】
ＶＬ濃縮のため、各回においてプラスミドＤＮＡが回収され、特定の変異の濃縮進度が比較された。初回、２回目および３回目の濃縮からそれぞれ、全８６、８９および４１の配列が得られた。個々の配列数は、濃縮されるにつれ５２、４０および１６から減少し（６０％、４５％および３９％）、濃縮が進行するにつれ、集団は特定の組合せに偏ったことが示された。ＣＤＲ１におけるＲ２９Ｓ３１またはＲ２９Ｔ３１の観察頻度は、初回、２回目および３回目の濃縮の後、それぞれ２％、８％および１０％ならびに７％、９％および１０％と一貫して増加した。同様に、ＣＤＲ２のＴ５０Ｔ５１Ｓ５２Ｄ５３（配列番号１８４）の頻度は２％、８％および１２％と増加した。最終濃縮において５％超の頻度で濃縮された組合せは、非特異的結合特性を示した１つを除いて、他に認められなかった。分泌物にこれらの変異を含有するプラスミドは、抗体発現に対して一過的にトランスフェクトされ、ＥＬＩＳＡ競合により、精製された抗体の結合親和性を初回の性状解析と比較した。３つの変異体は全て、約２倍の結合性の改善を示した。ＣＤＲ１のＳ２９ＲおよびＳ２９Ｒ−Ｓ３１Ｔは、結合に有意な差異を示さなかったため、Ｓ３１Ｔはさらなる分析から除外された。２９位および５３位はともに中性残基から荷電残基に変化したため、この荷電が抗原結合性の改善の原因であるか検討するため、同様の特徴の別の残基を検査することとした。ＣＤＲ１の２９位に対して、別の正電荷のアミノ酸ＬｙｓとＡｒｇが検査された。ＣＤＲ２の５３位に対して、別の負電荷のアミノ酸ＧｌｕとＡｓｐが検査された。抗体は一過性発現の培養上清から精製され、競合ＥＬＩＳＡで検査された。ダクリズマブおよびその変異体は、ＣＤ２５に対する結合について、ビオチン標識したダクリズマブと濃度依存的に競合した。どちらの変異も結合性の改善（Ｎ５３ＥおよびＳ２９Ｋに対して、それぞれ約３倍および５倍のＩＣ５０の改善）を示し、ライブラリーから本来特定されるものよりはるかに良好であった（Ｎ５３ＤおよびＳ２９Ｒに対して、それぞれ約１．５倍および２倍のＩＣ５０の改善）。Ｓ２９Ｋは、２９位における選択肢として含まれなかったため、ライブラリーから特定されなかった。他方、Ｎ５３Ｅは、５３位における選択肢として含まれていたが、濃縮された変異として特定されなかった（表３左）。これは、トランスフェクションレベルにあるアミノ酸置換の起こり得る全ての組合せに対して、網羅が不完全のためである可能性が最も高い。この位置におけるＧｌｕ置換は、濃縮の終了時に低頻度（５％）で生存し、適切な組合せを有する突然変異体を発現する細胞は、初回の集団において入手できなかったことが示唆される。ライブラリー集団の不十分な網羅は、一部にはＶＬライブラリーに存在する親配列の高バックグラウンドのためであり得る。ＶＬライブラリーの親配列の割合は、濃縮の前後でそれぞれ１８％および３１％であった。同様の理由により、濃縮を位置毎に分析した所、野性型の残基が各位置において最も濃縮されるようであった。
【０２２５】
これらの有益な変異の組合せ全てがＶＬライブラリーから特定されるわけではないため、軽鎖発現ベクターにおいて個々に全８つの変異体を生成し、コンビナトリアル変異の影響を評価した。分泌物としての抗体産生のため、親重鎖を発現する発現ベクターとともに、これらのプラスミドを２９３Ｔに共トランスフェクトした。培養上清から抗体が精製され、結合速度がＢＩＡｃｏｒｅによって分析された。
【０２２６】
５３位において、ＧｌｕはＡｓｐよりわずかに良好な親和性を示した（ＮＳＴ−ＳＥおよびＮＳＴ−ＳＤ；それぞれ１９０ｐＭおよび２０４ｐＭ）。２９位において、ＬｙｓはＡｒｇより良好な親和性を示した（ＮＳＴ−ＫＮおよびＮＳＴ−ＲＮ；それぞれ２２７ｐＭおよび２６２ｐＭ）。しかし、Ｓ２９ＫとＮ５３Ｅの組合せは、最良のＶＬ変異体とはならなかった（ＮＳＴ−ＫＥ参照）。特定された単一のアミノ酸置換を有するＶＬ変異体の中で、Ｎ５３Ｅの親和性（ＫＤ）が最大であったが、２９位において変異と十分には結合していないようである。代わりに、Ｎ５３Ｄが５３位において、いずれの変異とも付加的に結合した（Ｓ２９Ｒ−Ｎ５３Ｄ：２．５×１．９＝約４．９倍；Ｓ２９Ｋ−Ｎ５３Ｄ：２．５×２．２＝約５．１倍）。結論として、最良のＶＬ変異体はＳ２９Ｋ−Ｎ５３Ｄと特定され、親和性は９８ｐＭであり、親抗体より最大５．１倍のＫＤの改善であった。
【０２２７】
ＶＨ濃縮について、プラスミドＤＮＡが濃縮の最終回から回収され、各位置において特定の変異の濃縮が比較された。異なる染色条件により選別した２つのプールから得られた配列に有意な差異は認められなかったため、結果を組み合わせ分析した。最終集団が大量の親配列を伴う特定の組合せに非常に偏ったＶＬライブラリーとは異なり、ＶＨライブラリーは、８２の配列から６７の独立した配列が得られたため（８２％）、３回目の濃縮の後、多様性を維持していた。得られた配列数（それぞれ６４および８２）から濃縮の前後で親配列は確認されなかった。ＶＨ変異において最も頻度の高い組合せは６度現れたＶＲＫＹＱであり（親ＶＨ位置Ｎ５２、Ｓ５３、Ｔ５４、Ｙ５６、Ｅ５８をＮＳＴＹＥと表す場合）、次いでＲＲＧＦＥ（４度）、そして２度現れたＲＫＧＦＥ、ＲＲＧＹＥ、ＲＫＧＦＮ、ＳＮＫＹＬ、ＱＲＫＦＨ、ＲＲＫＦＥ、ＶＫＲＦＱであった。これらの突然変異体の親和性を確認するため、各変異を含有するプラスミドから膜繋留を除去し、一過性トランスフェクションから溶解型を発現させ、競合ＥＬＩＳＡによりタンパク質を分析した。結果として、それらは全て、親抗体の約１０倍の高親和性を示す変異体であることが判明した。巨大なライブラリーサイズのため、この数の配列データから最も濃縮された組合せの特定は困難であったが、５２位、５３位および５４位において、正電荷配列が好まれた。各々の個々の位置における濃縮比を分析した所、５２位において、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＶａｌが一貫して論理的な割合より少なくとも２倍超濃縮されていた。他方、ＬｙｓおよびＧｉｎ以外の他の選択肢のほとんどは集団から除外され、濃縮比において０．３より低かった。５３位において、ＡｒｇおよびＬｙｓが３倍超濃縮された一方、Ｇｌｕ、ＩｌｅおよびＴｈｒは除外された。５４位において、Ｇｌｙ、ＬｙｓおよびＡｒｇは濃縮されたが、他の選択肢のほとんどはＡｓｐおよびＶａｌ以外除外された。各アミノ酸はほとんど同一数が回収されたため（３回目の選択から単離された８２の配列からＰｈｅ３９個およびＴｙｒ４３個）、５６位はいずれの選択肢に対しても選好を示さなかった。５８位において、ＧｌｕおよびＧｉｎがそれぞれ７倍、４倍濃縮された一方、Ａｓｎ、ＨｉｓおよびＧｌｙ以外の他の選択肢は除去された。興味深いことに、Ｎ５２またはＴ５４等のいくつかの場合において親残基さえ除去され、インビボの親和性成熟過程において、いくつかの位置は完全には最適化されないことが示唆された。
【０２２８】
５２、５３および５４の各位置において濃縮されたアミノ酸が親和性改善の原因であるか検査するため、単一クローンとして特定されなかった４つのアミノ酸の組合せ、ＲＫＲ、ＲＲＫ、ＳＲＫおよびＲＫＫ（５２位、５３位および５４位において、親抗体をＮＳＴと示す場合）をベクターにサブクローンし、分泌タンパク質を発現した。５６位および５８位は野性型（ＹおよびＥ）のままとした。溶解型ＩｇＧを２９３Ｔに一過性発現させ、精製された抗体をＢＩＡｃｏｒｅ分析で検査した。これらの変異体は全て、親抗体よりＫＤで２桁、親和性で７−２３倍の改善を示した。それらは全て、特定された最良のＶＬ変異体、Ｓ２９Ｋ−Ｎ５３Ｄ変異の９８ｎＭ（ダクリズマブの５．１倍の改善）より良好な親和性を示し、これらの３つの位置の各々が親和性向上の原因の可能性が高いことが示唆された。ＥＬＩＳＡの結果をまとめると、いくつかのアミノ酸の組合せにより、ダクリズマブより少なくとも１０倍より高い親和性が生じ得る。
【０２２９】
８．３．４．ＶＨおよびＶＬの変異を組み合わせるミニライブラリーの構築と濃縮
最高の親和性を実現するＶＬおよびＶＨの組合せを単離するため、個別に有益と確認されたものだけでなく、ＶＬおよびＶＨライブラリーで濃縮された変異も１つの小ライブラリーに組み合わせた。全ての変異が組み合わせられる時に付加的または相乗的効果を有し得るとは限らないため、野性型アミノ酸を各位置に含め、最小の変異数によって最高の親和性を実現した。ＶＨ−ＶＬミニライブラリーのアミノ酸レベルにおけるライブラリー複雑性は２，１６０であった（ヌクレオチドレベルでは２，５９２）。
【０２３０】
ミニライブラリーを含有する２９３ｃ１８安定トランスフェクタントを３回のＦＡＣＳベースの濃縮にかけ、ヒトＣＤ２５と最高の結合親和性を有するＶＨ−ＶＬコンビナトリアル変異体を得た。ミニコンビナトリアルライブラリーを染色し、２つの異なる手法で選別した。１つは、厳密さの向上を伴う簡易なＦＡＣＳ結合によるもの、もう１つは、ＦＡＣＳ染色に対する競合的な結合によるものである。前者の手法において、初回、２回目および最終回のソーティングに対して、それぞれ１ｎＭ、０．０７ｎＭおよび０．０２ｎＭのＣＤ２５−Ｃλを使用した。後者の手法について、１ｎＭの初回のソーティングにおいて、競合物なしで通常通りに細胞をソートした。次いで、２回目の濃縮のため、親ダクリズマブの存在下、０．１ｎＭ  ＣＤ２５−Ｃλで増殖細胞をインキュベートした。競合抗体の濃度は、細胞表面に提示されたダクリズマブの９０％に打ち勝つことができるよう最適化されている。ソーティングの後、細胞を１ｎＭ  ＣＤ２５−Ｃλによって染色し、ＦＡＣＳで分析し濃縮レベルを比較した。３回目の濃縮の後、ＩＬ１３Ｒαｌ−Ｃλに対する結合はほとんど観察されず、大部分の細胞がＣＤ２５の細胞外ドメインに対して特異的なＩｇＧを発現することが示された。競合的ソートの後の結合割合は、競合なしの３回目の濃縮の後に観察されたものと同等と見なされたため、競合ＦＡＣＳ濃縮の後、３回目の濃縮は実施しなかった。慣例的な３回のＦＡＣＳ濃縮法（ＦＳ３）により、６６のクローンから３４の独立した抗体配列が得られた。競合を伴う濃縮法（ＦＳ２Ｃ）により、８９のクローンから６７の独立した抗体配列が得られた。ＦＳ３において最も高頻度で観察されたＶＨ−ＶＬ組合せは、ＲＫＴＥ−ＳＥ（７度）であり、次いでＶＫＲＥ−ＲＥ（５度）であった（ここで親ＶＨ−ＶＬ組合せＮ５２Ｓ５３Ｔ５４Ｅ５８−Ｓ２９Ｎ５３をＮＳＴＥ−ＳＮと示した。）。ＦＳ３において、最も高頻度の２つのＶＨ変異体はＲＮＲＥ（８度）およびＲＫＴＥ（７度）であり、ＦＳ２Ｃにおいて、ＶＳＲＥ（１２度）およびＫＳＲＥ（６度）であった。ＦＳ２Ｃにおいて最も高頻度で観察されたＶＨ−ＶＬ組合せは、ＶＲＲＥ−ＳＥ（４度）およびＶＳＲＥ−ＫＤ（４度）であった。ＶＬについて、いずれの条件においても最も選好された組合せは、ＳＥ（ＦＳ３では５２度、ＦＳ２Ｃでは２４度）であり、次いでＲＥ（ＦＳ３では１８度、ＦＳ２Ｃでは２０度）であった。２９位において、親残基Ｓｅｒはいずれの条件下でも濃縮されたようであったが、ＬｙｓはＦＳ３において除外された。ＶＬの５３位において、いずれの条件でも親Ａｓｐ残基よりＧｌｕが選好された。ＶＨの５２位において、ＦＳ３およびＦＳ２Ｃにおいて、それぞれＡｒｇおよびＶｅｒが最も濃縮された。他方、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙは明確に除外され、一般的にＶＨライブラリーの結果を再現した（表１右）。５４位において、親残基ＴｈｒよりＬｙｓおよびＡｒｇがともに好まれるようであり、ＦＳ２ＣではＡｒｇが選好された。５３位において選択肢に対する選好はないようであるが、５８位はいずれの条件下でも重度にＧｌｕに偏っていた。これらの結果に基づき、濃縮されたアミノ酸の組合せを含有する６つの変異体、���Ｈライブラリー（Ｓ５２Ｒ５３Ｋ５４）において特定された最高の親和性のＶＨの組合せ、およびミニライブラリー（Ｓ２９Ｅ５３）において最も濃縮されたＶＬが、性状解析のために選択された。ライブラリーメンバーを一過性発現させ、プロテインＡカラムを通じて精製した。これらの変異体の結合親和性は、ＫＤにおいて１４−４０ｐＭの範囲であり、親抗体の１３−３６倍の改善となる。機能アッセイに対してもメンバーを検査し、ＩＬ２依存細胞系統Ｋｉｔ２２５／Ｋ６の増殖阻害により測定し、ＩＬ２−ＲのそのリガンドＩＬ２に対する結合を遮断する能力を比較した。改善されたＩＬ２−Ｒ遮断を有する変異体に対して、増殖を阻害するために必要な抗体量は減少するはずである。変異体のＩＣ５０値は親抗体の値により標準化され、機能改善として示された。興味深いことに、たとえ７つの変異体全ての親和性が高かったとしても、それらの全てが機能改善したわけではなく、生物学的機能への親和性の変換効率に関与する他の要因が関与していることが示唆された。
【０２３１】
８．３．５．結合速度と生物学的機能との相関関係
親和性と生物学的機能の関係性をさらに理解するため、次にダクリズマブの親和性を低下させるいくつかの変異の特定を試みた。抗原結合性を適度に低下させるが、完全にはノックダウンしそうにない変異を特定するため、溶液中における暴露が予測される、ＶＬ  ＣＤＲ１内およびＣＤＲ２内の８つの位置（Ｓ２７Ａ、Ｓ２９Ａ、Ｓ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｔ５０Ａ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５２ＡおよびＮ５３Ａ）においてアラニン置換を行った。ＥＬＩＳＡ競合アッセイにおけるプレスクリーニングの後、４つの抗体がＩＣ５０を少なくとも２倍増加させ、結合性の低下を示した（Ｓ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｔ５０ＡおよびＴ５１Ａ、データは示さない。）。これらをさらに検査し、結合速度およびＫｉｔ２２５／Ｋ６細胞の増殖を阻害する能力を測定した。検査されたアラニン置換のほとんどは、親抗体と同等の結合親和性を示したＴ５０Ａを除き、有意な機能低下を示した。結論として、少なくとも検査対象に対しては、親和性の低下が生物学的機能の低下を引き起こすようであった。
【０２３２】
本研究で得られた生物学的機能および結合速度の両方を含有するデータは全てグラフにプロットされている（図３Ａ−３Ｃ）。受容体遮断活性の改善はＫＤ値の小ささ（ｐ＝０．０２６１）と相関し、より高い親和性は、一般的にダクリズマブの生物学的機能に資することが示された（図３Ａ）。親和性データがｋｏｎおよびｋｏｆｆ（図３Ｂおよび３Ｃ）に細分された時でさえ、この相関性は依然として維持された。ｋｏｎ値の大きさ（ｐ＝０．０００８）は、ｋｏｆｆ値の小ささ（ｐ＝０．０４１６）より強く生物学的機能と相関し、ダクリズマブの効果改善には、低速の解離より高速の結合が好まれることが示された。
【０２３３】
８．３．６．最も速いオン速度、および最も遅いオフ速度を有する２つの変異体の精査
一般的に高い親和性と良好な生物学的機能との間に相関関係があったが、親和性のみが生物学的活性の改善の原因となるわけではない。例えば、Ｖ５２Ｓ５３Ｒ５３−Ｋ２９Ｄ５３（ＶＳＲ−ＫＤ）は、その最も遅いｋｏｆｆのため、あらゆる物の中で最高の親和性を示したが、この変異体において生物学的活性は最大限改善したわけではなかった。他方、Ｋ５２Ｓ５３Ｒ５３−Ｓ２９Ｅ５３（ＫＳＲ−ＳＥ）は、おそらくはその最も速いｋｏｎのため、最良の機能改善を示したが、これでさえ最大の親和性改善を示すものではなかった。
【０２３４】
ダクリズマブの機能を決定する関連要因をさらに理解するため、これらの２つの変異体がさらなる分析に対して選択された。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ断片を個別にベクターにサブクローンし、ＶＨおよびＶＬ変異の寄与を評価した。異なるＶＨおよびＶＬ変異の組合せは、共トランスフェクションにより容易に取り扱われた。ＶＬ変異を有する、または有さない６つの組合せの変異体抗体を発現させ、精製された抗体を競合ＥＬＩＳＡにかけた。興味深いことに、ＫＳＲ  ＶＨを含有する抗体はＶＳＲ  ＶＨを含有するものより良好な結合性を示した。ＶＬ変異の寄与はＥＬＩＳＡにおいて少ないようであったが、ＢＩＡｃｏｒｅにより測定された結合親和性には寄与した（表５）。実際、両方の抗体について、ＶＬ変異はＶＨ変異に対して付加的に寄与した（ＶＳＲ−ＫＤについて、６．４×４．６＝約２８、ＫＳＲ−ＳＥについて、３．９×２．６＝約１４）。ＢＩＡｃｏｒｅとＥＬＩＳＡデータの間の不一致は、ＥＬＩＳＡで使用される結合条件下においてＶＳＲ  ＶＨの解離速度が、非常に遅延であり結合が平衡に達しないためである可能性が高い（３７℃で１時間）。
【０２３５】
純粋な親和性に基づく活性を比較するため、完全な抗体からＦａｂ断片を生成し、その機能を競合ＥＬＩＳＡおよび増殖阻害アッセイにより比較した（図４）。競合ＥＬＩＳＡにおけるダクリズマブＦａｂのＩＣ５０値は、ＩｇＧのものより約２桁高く、２価であることにより結合において有意なアビディティ効果を示した。ＩｇＧフォーマットのＥＬＩＳＡと異なり、変異体間の順番は固有の親和性と一致し、ＶＳＲ−ＫＤにおいて最良の結合性を示した（図４Ａ）。同様に、Ｆａｂを用いた増殖阻害活性は、固有の親和性と相関している（図４Ｂ）。そのため、この実験設定において、抗ＣＤ２５抗体のＩＬ２−Ｒ遮断能はＩＬ２阻害と相関する。
【０２３６】
８．４．［実施例３］  ダクリズマブのさらなる変異体の特定と性状解析
別の研究において、ダクリズマブをそのＣＤＲにおける包括的な変異誘発にかけ、単一点変異によって変異体の集団を産生した。次いで、この変異体集団をスクリーニングし、集団中の抗体の挙動に基づき、ＣＤ２５に対して結合親和性の向上をもたらした点突然変異体を特定した。
【０２３７】
実施例２により特定されたものを含め５３の変異体が特定され、集団におけるその挙動は、ＣＤ２５に対してダクリズマブより高い結合親和性を示した。この変異誘発は、集団との関係において挙動からＣＤ２５に対してダクリズマブと有意に変化しない結合性が示された変異体も特定した。集団における変異体の挙動がＣＤ２５に対する実際の親和性を反映することを確認するため、いくつかの変異体をさらに、ＦＡＣＳおよび／または競合ＥＬＩＳＡにより分析した。加えて、Ｋｉｔ２２５増殖アッセイおよび／またはＰＢＭＣ増殖アッセイにおける活性について、いくつかの変異体をさらに分析した。
【０２３８】
８．４．１．材料および方法
８．４．１．１．ＰＨＡブラスト増殖阻害アッセイを誘導したＩＬ２
Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ドイツ）の製造者の指示書に従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）密度勾配遠心法により、ヒト全血からＰＢＭＣを単離し、１ｍＭＮａＰｙｒｕｂａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ）、１×非必須アミノ酸（ＨｙＣｌｏｎｅ）、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×  Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ）および１０％熱不活性化ＦＢＳを補填したＲＰＭＩ１６４０中に１０６／ｍＬで再縣濁した。１０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）でＰＨＡを添加し、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間培養した。採取されたＰＢＭＣブラストを簡素なＲＰＭＩ１６４０により３度洗浄し、完全なＲＰＭＩに１０６／ｍＬで再懸濁した。アッセイプレートを設置するため、２×最終濃度（１ｎｇ／ｍＬ、最終濃度が０．５ｎｇ／ｍＬとなる。）ＩＬ２を含有する完全なＲＰＭＩ１６４０に３倍希釈の抗体を調製し、９６ウェル丸底プレートのウェル毎に１００μＬを２回分注した。希釈は、４０μｇ／ｍＬから開始し、最終濃度２０μｇ／ｍＬ（２００μＬ／ウェル）まで行った。細胞をそれぞれ１００μＬ添加し、総計７２時間インキュベートした。採取する１６時間前に０．５μＣｉ／ウェル［３Ｈ］−チミジンによりプレートをパルスした。製造者推奨の条件を用いたセルハーベスター（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｏｍｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により細胞を採取し、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ）を用いて、チミジン取込みに由来するベータ粒子放射線を測定した。［３Ｈ］−チミジン関連放射線の分毎、および対照のみであるＩＬ２刺激に関する阻害割合毎の総計数としてデータを分析した。ソフトウェアＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ）により非線形回帰を用いて阻害曲線を引き、ＩＣ５０野性型／ＩＣ５０突然変異体（野生型対照と比べ改善した倍数）として報告した。
【０２３９】
８．４．１．２．競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡは、セクション６．２．１．の記載通り実施された。
【０２４０】
８．４．１．３．ＫＩＴ２２５アッセイ
ＫＩＴ２２５アッセイは、セクション６．２．３．の記載通り実施された。
【０２４１】
８．４．１．４．ＢＩＡｃｏｒｅ
泳動用バッファとして０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有のＨＢＳ−ＥＰ＋を用いて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ  ｍｏｄｅｌ  ２０００またはＴ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により親和性測定を実施した。約１０，０００ＲＵの４つのフローセル全てにおいて、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）にＣＭ５センサーチップをアミン結合させ、１ｕｇ／ｍＬ抗体５ｕＬの注入により、１０ｍＬ／分（約６０ＲＵ）でダクリズマブまたはその変異体を捕獲した。５０μＬ／分の流速における０．１９５−２５ｎＭ  ＣＤ２５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）の注入により、抗原結合を実施した。結合を５分間監視し、１５分間解離段階を続けた。１００ｍＬ／分における１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）５０ｕＬによる２度の継続的なパルスにより表面を再生した。１：１モデルを用いて、センサーグラムの結合段階と解離段階を同時に合わせることにより速度分析を行い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアから結合定数を導出した。
【０２４２】
８．４．１．５．ＦＡＣＳ結合
ＦＡＣＳ結合は、セクション６．２．４．の記載通り実施された。
【０２４３】
８．４．１．６．混合リンパ球反応
インビトロ由来のｍｏＤＣおよびヒトＰＢＭＣドナー由来の同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施した。つまり、セクション６．５．１．４．の記載通り、樹状細胞は成熟型ヒトＰＢＭＣであった。セクション６．５．１．５．の記載通り、同種ドナーの凍結した各一定分量からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。抗ＣＤ２５抗体の力価測定濃度を有する無血清ＡＩＭ  Ｖ培地において、精製されたＣＤ４Ｔ細胞および樹状細胞を１０：１の比率で共培養した。５日目、トリチウム標識したチミジンで培養物をパルスした。培養物をフィルターマットに採取し、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  Ｂｅｔａｍａｘ  １４５０；ｔｈｅ  Ｗａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｕｐｐｓａｌａ、フィンランド））を用いて、トリチウム標識したチミジンの取込みを検出した。阻害のＥＣ５０を計算した。各変異体に対して、複数のドナーを検査し、平均ＥＣ５０を計算した。各変異体について集計したＥＣ５０を親抗体のパラメトリックデータに対するベンチマークとし、倍数値力価を算出した。
【０２４４】
８．４．１．７．  ６．４．１．７  ＮＫ細胞増殖
ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞は、ｒｈＩＬ２および抗ＣＤ２５抗体の存在下において、特異的に増殖する（Ｍａｒｔｉｎら、２０１０年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｌ  １８５：１３１１−１３２０；Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０１１年、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｊ．１７：１４４１−１４４８）。１０％超低Ｉｇウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）含有のＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中において、１０ｎｇ  ｒｈＩＬ２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）、および２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２５抗体とともにヒトドナー由来のＰＢＭＣを共培養し、１０日間、Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、炭酸水素ナトリウム（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、非必須アミノ酸（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ペニシリンとストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、およびβ−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）を補填した。２４ウェルプレートにおいて、ウェル毎に４×１０６細胞となるようＰＭＢＣを定量した。２、３日毎に培地１ｍＬを未使用のＩＬ２および抗体含有の完全培地に交換した。１０日目、細胞培養物を収集、洗浄し、フローサイトメトリーにかけ、存在するＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞数を計数した。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の特定に使用したマーカーは、蛍光標識した抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６、および抗ＣＤ５６（いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）であった。ＣＤ３陰性、ＣＤ１６低陽性、ＣＤ５６陽性として、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞は特定された。１０日目の結果を培養開始日（ｄＤ＝０）に存在するＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞の割合と比較した。２５のドナーより結果を得て、親抗ＣＤ２５含有の培養物からの結果に対するベンチマークとした。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞のインビトロ誘導について、変異体Ｃ５４のみが統計的に有意な促進を示した。
【０２４５】
８．４．２．結果
ＶＨおよびＶＬにおいて、それぞれ全５８０（２９位×２０アミノ酸）および全５２０（２６位×２０アミノ酸）の単一アミノ酸置換を親和性毎に順番付けた。５８０中３３（５．７％）のＶＨ変異および、５２０中２０（３．８％）のＶＬ変異は、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡに対する少なくとも１．２倍の結合の改善とともに親和性改善を示すことが立証された。ＣＤＲにおける全５３の点変異のうち、最良の変異はＶＨにおけるＹ５６Ｒであり、ＢＩＡｃｏｒｅに基づき、１３．６倍の親和性改善を示した。
【０２４６】
８．５．［実施例４］  ダクリズマブの脱免疫化変異体の特定
８．５．１．材料および方法
８．５．１．１．ペプチド
ＰｅｐＳｃａｎ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）またはＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ａｄｅｌａｉｄｅ、オーストラリア）によるマルチピンフォーマットを用いて、ペプチドを合成した。ダクリズマブ軽鎖および重鎖のＶ領域配列は、１２アミノ酸ずつ重複する１５残基長のペプチドとして合成された（表９）。重鎖のペプチドセットにおける最初のペプチドは、不正確なシグナルペプチド切断により、低頻度で起こると知られている３つの付加的アミノ酸（ＶＨＳ）を含む。ペプチドＰＨ２は、正確に切断されたＶＨタンパク質の最初の１５のアミノ酸を表す（表９）。エピトープ領域ペプチド変異体は、特定された対象のペプチドを共に包含するため、１８残基長として合成された。得られたペプチドを凍結乾燥し、約１−２ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁した。貯蔵用ペプチドは−２０℃で凍結保存した。
【０２４７】
８．５．１．２．ヒト末梢血単核細胞
カリフォルニア州パロアルトのスタンフォード血液センターからコミュニティドナーのバフィーコート製品を購入した。カルシウムまたはマグネシウム非含有のＤＰＢＳと１：１ｖ：ｖでバフィーコート材料を希釈した。ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ−ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１２．５ｍｌを有する５０ｍｌコニカル遠心チューブ（ＳａｒｓｔｅｄまたはＣｏｓｔａｒ）中に、希釈したバフィーコート材料（２５−３５ｍｌ）を沈降させた。室温で３０分間、試料を９００ｇの遠心分離にかけた。界面から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集した。ＤＰＢＳ添加により最終容量を５０ｍｌとし、５分間細胞を３５０ｇの遠心分離にかけた。ペレット状の細胞をＤＰＢＳにより再懸濁し、細胞数を計数した。
【０２４８】
８．５．１．３．ＨＬＡ分析
商業的に利用可能なキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ヒトＰＢＭＣの凍結した各一定分量からＤＮＡを単離した。製造者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｄｙｎａｌ  ＲＥＬＩ  ＳＳＯタイピングシステム）に従い、ＨＬＡ−ＤＲβ１およびＨＬＡ−ＤＱβ対立遺伝子のＰＣＲベースのＳＳＯタイピングを実施した。ＨＬＡ対立形質を手動で割当てた。
【０２４９】
８．５．１．４．樹状細胞
樹状細胞の単離について、Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）に、全容量３０ｍｌのＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に新しく単離したＰＢＭＣ１０８を接種した。９０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０％ＤＭＳＯ中に５×１０７細胞／ｍｌとなるよう、−８０℃で過剰なＰＢＭＣを凍結した。５％ＣＯ２、３７℃で２時間、Ｔ７５フラスコをインキュベートした。非付着細胞を除去し、ＤＰＢＳで付着性単層を洗浄した。樹状細胞と単球を区別するため、８００ユニット／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５００ユニット／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）含有のＡＩＭ  Ｖ培地３０ｍｌを添加した。フラスコを５日間インキュベートした。５日目、ＩＬ−１α（Ｅｎｄｏｇｅｎ）およびＴＮＦ−α（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を５０ｐｇ／ｍｌおよび０．２ｎｇ／ｍｌとなるよう添加した。さらに２日間、フラスコをインキュベートした。７日目、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１６．５から３３μｇ／ｍｌマイトマイシンＣの最終濃度となるよう、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．５から１．０ｍｇ含有の１００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ３ｍｌを添加することにより、樹状細胞を収集した。代替的に、樹状細胞は、４，０００ラドの照射により固定され得る。５％ＣＯ２、３７℃でさらに１時間、フラスコをインキュベートした。樹状細胞を収集し、ＡＩＭ  Ｖ培地により２−３度洗浄した。
【０２５０】
８．５．１．５．細胞培養
７日目、３７℃の水浴中において先に凍結した自己ＰＢＭＣを急速に解凍した。直ちに、細胞をＤＰＢＳまたはＡＩＭ  Ｖ培地に希釈し、５分間３５０ｇの遠心分離にかけた。磁気ビーズを用いた陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮した（Ｅａｓｙ−Ｓｅｐ  ＣＤ４＋キット、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ９０７７）のウェル毎に樹状細胞２×１０４、ＣＤ４＋Ｔ細胞２×１０５で自己ＣＤ４＋Ｔ細胞および樹状細胞を共培養した。約５ｍｇ／ｍｌのペプチドを添加した。対照ウェルは、０．２５％ｖ：ｖでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）溶媒のみ含有した。陽性対照ウェルは、０．２５％ＤＭＳＯおよび１ｍｇ／ｍｌ破傷風トキソイド（Ｌｉｓｔ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓまたはＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）を含有した。培養物を５日間インキュベートした。５日目、ウェル毎にトリチウム標識したチミジン（ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）０．２５μＣｉを添加した。６日目、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅセルハーベスターを用いて、培養物をフィルターマットに採取した。Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  １４５０シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、シンチレーション計数を実施した。
【０２５１】
８．５．１．６．データ分析
６から１２の反復に由来する陰性対照ウェルの結果を平均化することにより、平均バックグラウンドＣＰＭ値が計算された。４つの陽性対照ウェルに対するＣＰＭ値が平均化された。各ペプチドに対する二重反復または三重反復ウェルが平均化された。平均実験ＣＰＭ値を平均陰性対照値で除算することにより、陽性対照およびペプチドウェルに対する刺激指標値が計算された。データセットに含めるために、破傷風トキソイド陽性対照ウェルにおいて約３の刺激指数が必要であった。刺激指数２．９５以上を生じるペプチドに対して、いずれも応答を注記した。１１５のドナー群由来の末梢血試料を用いて、ペプチドが検査された。全ペプチドに対する応答を取りまとめた。検査された各ペプチドに対して、刺激指数２．９５以上で応答したドナーセットの割合が計算された。さらに、全てのドナーに対する平均刺激指数も計算された。
【０２５２】
８．５．１．７．抗体変異体の生成
Ｑｕｅｅｎらにより記載されたヒト化抗Ｔａｃ（ＨＡＴ）の軽鎖Ｖ領域遺伝子（Ｑｕｅｅｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３）をＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片として、ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３−３６２１）へサブクローンした。細菌の複製開始点をｐＵＣ１８からの高コピー数の細菌の複製開始点（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５年、Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１１９）に置き換えることにより、発現ベクターをさらに修飾した。
【０２５３】
上においてＱｕｅｅｎらにより記述されたＨＡＴ重鎖Ｖ領域遺伝子は、シグナルペプチドをマウス重鎖Ｖ領域遺伝子ＥＰ−５Ｃ７（Ｈｅら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５）由来のものと置き換えることにより修飾された。修飾したシグナルペプチドおよびＨＡＴ−ＶＨ遺伝子のＮ末端半分を含むＭｌｕＩ−ＳａｌＩ制限断片が構築され、長さ約７５塩基の４つの重複する合成オリゴヌクレオチドを用いたＨｅらの方法に従って増幅された（表１０）。オリゴヌクレオチドを対としてアニーリングし、室温で１５分間、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、ビバリー、マサチューセッツ州）のＫｌｅｎｏｗ断片により伸長させ、２つの２重鎖断片を得た。得られた断片を変性、対としてアニーリングし、Ｋｌｅｎｏｗにより伸長させ、完全長の断片を得た。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を用いた、外部プライマーＥ．ＨＡＴ−５（５’−ＴＡＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＧ−３’）（配列番号３５）、およびＥ．ＨＡＴ−６（５’−ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＴＣＣ−３’）（配列番号３６）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、続いて９４℃で２分間のインキュベーション、９４℃で１０秒、５６℃で１０秒および７２℃で１分のサイクルを３５回、続いて７２℃で１０分間のインキュベーションを行い、得られた産物を増幅した。ＰＣＲにより増幅された断片をゲル精製し、ＭｌｕＩおよびＳａｌＩにより消化し、ＨＡＴ−ＶＨ遺伝子のＣ末端半分を含むＳａｌＩ−ＸｂａＩ制限断片と結合させ、ｐＶｇｌ．Ｄ．Ｔｔ（Ｃｏｌｅら、上）に挿入した。得られたＶ領域遺伝子は、指定のＥ．ＨＡＴ−ＶＨであり、上におけるＱｕｅｅｎらの記載と同様の成熟した重鎖Ｖ領域配列をコードする。修飾した重鎖Ｖ領域遺伝子の配列はヌクレオチド配列決定により証明された。
【０２５４】
ＤＮＡ配列決定を促進するため、変異誘発プライマーＪＸＧ１−４（５’−ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  Ｃ−３’）（配列番号３７）およびＪＸＧ１−５（５’−ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣ−３’）（配列番号３８）を用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」中、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９年）、６１−７０頁）を用いて、Ｅ．ＨＡＴ−ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を修飾した。初回のＰＣＲにおいて、左手断片に対して、外部プライマーＭＢＲ３（５’−ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＣＣ  −３’）（配列番号３９）とＪＸＧ１−５、また右手断片に対して、外部プライマーＭＤ８（５’−ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＴＧ−３’）（配列番号４０）とＪＸＧ１−４を使用した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、９５℃で５分間のインキュベーション、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で１分のサイクル３５回、続いて７２℃で１０分間のインキュベーションを行い、ＰＣＲを行った。次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、左手断片と右手断片を結合させるため、外部プライマーＭＢＲ３およびＭＤ８を用いて、上記の通り２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲで増幅された断片をＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化し、次いでｐＶｇｌ．Ｄ．Ｔｔにサブクローンした（Ｃｏｌｅら、上）。得られたＶ領域遺伝子は、指定のＥ．ＨＡＴ（ＧＧＡ）−ＶＨであり、上におけるＱｕｅｅｎらの記載と同様の成熟した重鎖Ｖ領域配列をコードする。修飾した重鎖Ｖ領域遺伝子の配列はヌクレオチド配列決定により証明された。細菌の複製開始点をｐＵＣ１８からの高コピー数の細菌の複製開始点（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、上）に置き換えることにより、発現ベクターをさらに修飾した。
【０２５５】
Ｅ．ＨＡＴ−ＶＨ遺伝子に対して、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ、同上）を用いて、部位特異的突然変異誘発を行った。Ｉ４８Ｌ、Ｉ４８ＭおよびＩ４８Ｖ変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ−４８Ｆ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＮＴ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号４１）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒ（５’−ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  Ｇ  −３’）（配列番号４２）を使用した。ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである。Ｉ５１Ａ、Ｉ５１ＬおよびＩ５１Ｖ変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ−５１Ｆ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＴＳＹ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号４３）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒを使用した。ここで、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴである。Ｔ５４Ａ、Ｔ５４ＶおよびＴ５４Ｓ変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ−５４Ｆ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＫＹ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号４４）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒを使用した。ここで、Ｋ＝ＧまたはＴである。Ｙ５６Ａ変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ−５６Ｆ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号４５）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒを使用した。初回のＰＣＲにおいて、左手断片に対して、外部プライマーＤＡＣ−５ＥＮＤ−Ｆ（５’−ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＡＧ−３’）（配列番号４６）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒ、また右手断片に対して、外部プライマーＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ１（５’−ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ−３’）（配列番号４７）またはＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ２（５’−ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＡ−３’）（配列番号４８）、およびＤＡＣ−４８Ｆ、ＤＡＣ−５１Ｆ、ＤＡＣ−５４ＦまたはＤＡＣ−５６Ｆを使用した。ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて、９４℃で５分間のインキュベーション、９４℃で２０秒および５６℃で３０秒、続いて７２℃で１分のサイクル３０回、続いて７２℃で１０分間のインキュベーションを行い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、次いで左手断片と右手断片を結合させるため、外部プライマーＤＡＣ−５ＥＮＤ−ＦおよびＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ１またはＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ２を用いて、上記の通り２回目のＰＣＲを行った。完全長のＰＣＲ産物をゲル精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＶｇｌ．Ｄ．Ｔｔにサブクローンした（Ｃｏｌｅら、同上）。変異はヌクレオチド配列決定により証明された。
【０２５６】
Ｅ．ＨＡＴ（ＧＧＡ）−ＶＨ遺伝子に対して、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ、上）を用いて、部位特異的突然変異導入を行った。Ｉ４８Ｍ／Ｉ５１Ｌの二重変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ４８Ｍ５１Ｌ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号４９）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒを使用した。Ｉ４８Ｍ／Ｔ５４Ｓの二重変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ４８Ｍ５４Ｓ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号５０）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒを使用した。Ｉ４８Ｖ／Ｔ５４Ｓの二重変異を生成するため、変異導入プライマーＤＡＣ４８Ｖ５４Ｓ（５’−ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号５１）およびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒを使用した。初回のＰＣＲにおいて、左手断片に対して、外部プライマーＤＡＣ−５ＥＮＤ−ＦおよびＤＡＣ−Ｎ１８６−Ｒ、右手断片に対して、外部プライマーＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ１またはＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ２、およびＤＡＣ４８Ｍ５１Ｌ、ＤＡＣ４８Ｍ５４ＳまたはＤＡＣ４８Ｖ５４Ｓを用いて上記の通り行った。左手断片と右手断片を結合させるため、外部プライマーＤＡＣ−５ＥＮＤＦおよびＤＡＣ−３ＥＮＤ−Ｒ２を用いて、上記の通り２回目のＰＣＲを行った。得られた完全長のＰＣＲ産物をゲル精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＵＣ１８からの高コピー数の細菌の複製開始点（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、上）を含有する修飾型ｐＶｇｌ．Ｄ．Ｔｔ（Ｃｏｌｅら、上）にサブクローンした。変異はヌクレオチド配列決定により証明された。
【０２５７】
８．５．１．８．一過性トランスフェクション
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）含有のＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）中に、ヒト腎臓細胞株２９３Ｔ／１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を７．５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中において維持した（以降、２９３培地と称する。）。一過性トランスフェクション後のモノクローナル抗体の発現および精製については、２％Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有のＤＭＥＭ中において、２９３Ｔ／１７細胞をインキュベートした（以降、ｌｏｗ−ＩｇＧ２９３培地と称する。）。
【０２５８】
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、製造者の推奨に従い、２９３Ｔ／１７細胞の一過性トランスフェクションを実施した。トランスフェクション毎に約２×１０７細胞を２９３培地５０ｍｌ中に含むＴ−１７５フラスコ中に平板培養し、一晩でコンフルエンスまで増殖させた。次の日、軽鎖プラスミド３５μｇおよび重鎖プラスミド３５μｇをＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＨＳＦＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、メリーランド州）３．７５ｍｌと組み合わせた。別のチューブにおいて、リポフェクタミン２０００のリガンド１７５μｌとＨＳＦＭ３．７５ｍｌを組み合わせ、室温で５分間インキュベートした。リポフェクタミン２０００−ＨＳＦＭ混合物３．７５ｍｌをＤＮＡ−ＨＳＦＭ混合物３．７５ｍｌと穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクションの１時間前に２９３Ｔ／１７細胞を含む培地を吸引、ｌｏｗ−ＩｇＧ２９３培地と置き換え、次いでリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体を細胞に滴下添加し、回転させることで穏やかに混合し、上清を採取する前に７．５％ＣＯ２のインキュベータを用いて、３７℃で５日間細胞をインキュベートした。
【０２５９】
８．５．１．９．ＥＬＩＳＡによる抗体発現測定
抗体発現をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）の０．２Ｍ、ｐＨ９．４炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウムバッファ中１：１０００希釈液１００μｌ／ウェルを用いて、４℃で一晩、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｎａｌｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ロチェスター、ニューヨーク州）を被覆し、洗浄バッファ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳ中のスーパーブロックブロッキングバッファ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）３００μｌ／ウェルを用いて、室温で１時間遮断した。洗浄バッファでの洗浄の後、上清をＥＬＩＳＡバッファ（１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ）で適宜希釈し、１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに導入した。基準として、ヒト化ＩｇＧｌ／κ抗体ダクリズマブ（ＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）を使用した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄バッファで洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、バーミングハム、アラバマ州）の１：１０００希釈液１００μｌ／ウェルを用いて結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベートし、洗浄バッファで洗浄した後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）１００μｌ／ウェルの添加により発色させた。室温で７分間インキュベートした後、２％シュウ酸１００μｌ／ウェルの添加により発色を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて、４１５ｎｍにおいて吸光度を読み取った。
【０２６０】
８．５．１．１０．抗体の精製
一過性トランスフェクションからの培養上清を遠心分離および滅菌濾過により採取した。濾過した上清のｐＨを１Ｍ、ｐＨ７．０クエン酸ナトリウム１／５０体積の添加により調整した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ、ｐＨ７．０ＮａＣｌと事前に平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）１ｍｌ上で、上清を泳動した。同様のバッファによってカラムを洗浄し、２０ｍＭ、ｐＨ３．５クエン酸ナトリウムにより結合した抗体を溶出した。１．５Ｍ、ｐＨ６．５クエン酸ナトリウム１／５０体積の添加により中和した後、１５ｍｌ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過器（３０，０００ダルトンＭＷＣＯ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて、貯蔵した抗体画分を約０．５−１．０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次いで、ＨＴタフリン膜を有する０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、イーストヒルズ、ニューヨーク州）を用いて、試料を滅菌濾過した。２８０ｎｍにおける吸光度を測定するＵＶ分光法により精製された抗体の濃度を決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４Ａ２８０）。
【０２６１】
精製された抗体試料５μｇを、還元状態または非還元状態においてＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で泳動させ、製造者の推奨に従い、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて染色した。
【０２６２】
精製された抗体試料５０μｇを、ＰＢＳ中７．８ｍｍ  ×  ３０ｃｍ  Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ  ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、モントゴメリービル、ペンシルベニア州）を用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、フラートン、カリフォルニア州）上における１．５ｍｌ／分のゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した。
【０２６３】
８．５．１．１１．抗原結合ＥＬＩＳＡ
組換えヒトＩＬ２−Ｒα（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ロッキーヒル、ニュージャージー州）のＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中５０ｎｇ／ｍｌ溶液１００μｌ／ウェルを用いて、４℃で一晩、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｎａｌｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を被覆し、洗浄バッファ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳ中のスーパーブロックブロッキングバッファ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）２００μｌ／ウェルを用いて、室温において３０分間遮断した。洗浄バッファによる洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファ（１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ）１００μｌ／ウェル中の試験抗体（４μｇ／ｍｌから開始し、３倍に段階希釈）を２回添加した。室温で１時間プレートをインキュベートし、洗浄バッファで洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）のＥＬＩＳＡバッファ中１：２０，０００希釈液１００μｌ／ウェルを用いて、結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベートし、洗浄バッファで洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）１５０μｌ／ウェルの添加により発色させた。室温で８分間インキュベートした後、２Ｎ硫酸５０μｌ／ウェルの添加により発色を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０２６４】
８．５．１．１２．抗体変異体のＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００および３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、ヒトＣＤ２５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびカニクイザルＣＤ２５−ＨＡ（ＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）に対するダクリズマブ野性型（ＨＹＰおよびＥ．ＨＡＴ）および変異抗体の速度測定を実施した。ヤギ抗ヒトＦｃγ（ＧＡＨＦｃ）試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）により、ダクリズマブ抗体を捕獲した。
【０２６５】
速度実験の前に、この一連の実験のためダクリズマブの捕獲体積および濃度を決定した。この速度研究において、望ましい捕獲シグナルに対する公式、ＲＬ＝Ｒｍａｘ／化学量論＊ＭＷＬｉｇａｎｄ／ＭＷＡｎａｌｙｔｅに基づき、論理的なＲｍａｘとして８０レゾナンスユニット（ＲＵ）を選択した。ここで化学量論＝２、ＭＷＬｉｇａｎｄ＝１５０ｋＤａ、ＭＷＡｎａｌｙｔｅ＝２２ｋＤａである。本研究において、ヒトＣＤ２５に対して予期されるＭＷ２２ｋＤａが使用され、ＢＩＡｃｏｒｅによる先の研究で使用されたものと一致する。この値は、質量分光測定法により決定された２７ｋＤａに近似する。カニクイザルＣＤ２５のＭＷは、ウェスタンブロット実験により３２ｋＤａと決定された。捕獲体積は、注入ループに各抗体５０μｌを付加し、５μｌ／分の遅い流速で１．５μｇ／ｍｌのＤａｃを５μｌ毎注入することにより決定され、望ましいＲＬの実現に必要な体積を決定した。研究対象のダクリズマブ抗体に対して、注入体積５μｌとともに最終濃度０．７６−０．９６μｇ／ｍｌおよび流速５μｌ／分が使用された。
【０２６６】
速度測定について、ＧＡＨＦｃをセンサーチップ表面に直接固定し、個々のフローセル上のダクリズマブ抗体を捕獲し、次いでヒトまたはカニクイザルＣＤ２５を注入し、バッファ流中のダクリズマブとの相互作用を観察した。この捕獲手法について、高いレスポンスユニット（２０，０００ＲＵ）を実現するため、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド、ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ＮＨＳ；およびエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて、研究用ＣＭ５センサーチップ上の各フローセルに３０μｇ／ｍｌ  ＧＡＨＦｃを固定した。上記の仕様を用いて、ダクリズマブ抗体を捕獲した。ダクリズマブおよびＣＤ２５の結合の研究のため、室温（２５℃に調節された内部温度）、３０μｌ／分の流速で結合アッセイを行った。ＣＤ２５に対する３分間の結合段階の後、ＨＢＳ−Ｐ泳動バッファ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％Ｐ−２０界面活性剤、ｐＨ７．４）の１５分間の注入により、各結合サイクルについて、サイクル毎の様々なＣＤ２５濃度における解離を監視した。各サイクルの終了時、１００μｌ／分の流速の２０ｍＭ  ＨＣｌによって表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅプログラムを用いて、異なる８つのＣＤ２５の濃度（１２８、６４、３２、１６、８、４、２および１ｎＭ）から収集されたセンサーグラムデータの大域解析から、各ＣＤ２５とダクリズマブ抗体ペアの結合速度を計算した。各解析において、二重参照を採用し参照表面およびバッファのみの対照（０ｎＭ）からのバックグラウンドレスポンスを排除した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアの１：１ラングミュアモデルを用いて、一連の分析物の濃度からの結合段階および解離段階のセンサーグラムを同時に当てはめることにより、各分析物（ヒトまたはカニクイザルＣＤ２５）の結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）から生じる各ダクリズマブ抗体に対する親和性（ＫＤ）を得た。データの標準偏差を評価するため、各実験セットを３度実施した。
【０２６７】
８．５．１．１３．Ｆａｂ断片の調製
親抗体Ｅ．ＨＡＴ、および４つの変異体タンパク質を２９３Ｔ／１７細胞において一過的に発現させた。２９３Ｔ／１７細胞は、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い抗体構築物がトランスフェクトされた。７日目に上清を採取し、プロテインＡカラムに対する親和性により抗体を精製した。製造者の指示に従い、精製された抗体を固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）により処理した。プロテインＡカラムに対する親和性により消化されたタンパク質が分離しＦｃ断片の除去が完了する時まで、タンパク質分解をＨＰＬＣにより評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、その後の抗ヒトＦｃ（ガンマ鎖特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）ウェスタンブロッティングにより、Ｆａｂ調製物の純度を評価した。使用前に、９５℃の１５分間の加熱によりＦａｂ調製物を不活性化した。これは、Ｆａｂタンパク質の有意な抗増殖活性のために必要であった。
【０２６８】
８．５．１．１４．Ｆａｂタンパク質増殖アッセイ
細胞培養培地中のヒトＰＢＭＣを、平底９６ウェルプレートに対してウェル毎に２×１０５分注した。エンドトキシン非含有の熱不活性化Ｆａｂタンパク質を添加し、培養物を３７℃で５日間インキュベートした。５日目、トリチウム標識したチミジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）０．２５ｕＣｉを各ウェルに添加した。２０−２４時間後、Ｐａｃｋａｒｄセルハーベスターを用いて培養物を採取した。Ｗａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘシステム（ウプサラ、フィンランド）を用いて、シンチレーション計数を実施した。各ドナーに対するデータを刺激指数に変換し、集約した。
【０２６９】
８．５．２．結果
８．５．２．１．ダクリズマブＶＨ領域におけるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの特定
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープペプチドは、レスポンス割合の分析により特定された。レスポンス割合の平均および標準偏差が、ダクリズマブ重鎖および軽鎖を示す検査された全ペプチドに対して計算された。平均のバックグラウンドレスポンスに標準偏差３つ分を加えたもの以上のレスポンスレートが、潜在的なＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと考えられた。ダクリズマブ軽鎖Ｖ領域について、３２ペプチドが試験検査され（表９）、平均のバックグラウンドレスポンスの割合を２．１２±１．３９％とした（図５）。バックグラウンドより上の標準偏差３つ分は６．３％と決定された。ダクリズマブ軽鎖ペプチドデータセットにおいて、このレベルのレスポンスを提示するペプチドは存在しなかった。ダクリズマブ重鎖Ｖ領域について、３６ペプチドが検査された（表９右列および図６）。平均のバックグラウンドレスポンスの割合は、１．８３±２．１２％であった。バックグラウンドより上の標準偏差３つ分は８．１８％であった。ダクリズマブ重鎖データセットの中では、１つのペプチドＰＨ１７が１０．３％のレスポンス割合を達成した。このペプチドに隣接するペプチドＰＨ１６は、レスポンス割合７．８％に達した。データセット中の全ペプチドに対して、平均刺激指数が計算された。重鎖ペプチドＰＨ１７は、１．６６±０．１８ｓ．ｅ．ｍの平均刺激指数値を有していた。重鎖ペプチドＰＨ１６は、１．５５±０．１１ｓ．ｅ．ｍの平均刺激指数を有していた。これらの値は共に、２つのデータセット中の全ペプチドに対する平均刺激指数（全６８の重鎖および軽鎖ペプチドに対して１．０２±０．０２）より有意に高い。隣接するペプチド（ＰＨ１６）がエピトープペプチド（ＰＨ１７）と１２のアミノ酸を共有するため、両方のペプチドをさらなる研究対象として選択した。
【０２７０】
データセット中の全ドナーに対して、ＨＬＡクラスＩＩ型が決定された。いずれかの関連する濃縮の存在について、ペプチドＰＨ１６およびＰＨ１７に対するレスポンダーのＨＬＡクラスＩＩ型が調査された。ペプチドＰＨ１６に対する増殖性レスポンスが、ＨＬＡ−ＤＱ６の存在と関連付けられることが判明した（ｐ＜０．０４）。ペプチドＰＨ１７に対するレスポンスとＨＬＡ型との明確な関連性は確認されなかった。
【０２７１】
８．５．２．２．免疫原性低下変異体の特定
エピトープペプチド領域（重鎖ペプチドＰＨ１６およびＰＨ１７、表９参照）は、フレームワーク２／ＣＤＲ２の接合部に位置している。ＣＤ２５の特異性の原因として知られる残基に着目して、アミノ酸配列の変異体が選択された。アラニン残基に置換される時、ダクリズマブの親和性に影響すると知られるいずれのＣＤＲ２残基も修飾は考慮されなかった。３つの残基、Ｉ５１、Ｔ５４およびＹ５６（Ｋａｂａｔナンバリング）が修飾に選択された。さらに、フレームワーク２領域中の４８位のイソロイシンは、本来の分子のヒト化において復帰突然変異したフレームワーク領域中の置換基であるため、修飾に選択された。Ｉ５１位について、ロイシン、バリンおよびアラニンが置換された。Ｔ５４位について、アラニン、バリン、およびセリンが置換された。Ｙ５６位について、アラニン置換のみが検査された。Ｉ４８位について、バリン、ロイシン、およびアラニンが置換された。これらの修飾により、全１０の単一アミノ酸変異体が生じた。選択された修飾の組合せも考慮された。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイの機能活性について、全ての起こり得る単一および二重変異を包含するペプチドセットが再検査された（表１１）。７８のコミュニティドナー細胞由来のアッセイの一組において、４つのペプチド配列変異体は、非修飾ペプチド配列に誘起されるレスポンスと比較すると、増殖性レスポンスを誘起する能力が有意に低下していた（四角枠の配列）。７８ドナーの変異体ペプチドデータセットのうち、親ペプチドＰＨ１７（表１１中の「Ｐ」）は２度検査された。親ペプチドに対するレスポンス割合は２３．１％および１９．２％、刺激指数は２．２５±０．２１および２．０３±０．２１であった。刺激指数の値は、両側の対のあるＴ検定分析において差異は認められない。増殖性レスポンスおよびレスポンス割合の両方を有意に低下させた４つの修飾は、Ｉ４８Ｍ（表１２）、Ｉ４８Ｍ  Ｉ５１Ｌ、Ｉ４８Ｍ  Ｔ５４ＳおよびＩ４８Ｖ  Ｔ５４Ｓ（表１３および表１４）であった。Ｉ４８Ｍ  １５１Ｌは、検査された変異体の中で誘起されたレスポンス割合が最も低かったため、最も好ましい変異体であり、「ノンレスポンダー」のドナー、つまり非修飾の親ペプチドに対して２．９５以上の増殖性レスポンスを呈さないドナーが、修飾ペプチドに応答することはなかった。
【０２７２】
８．５．２．３．変異体抗体分子のＣＤ２５結合活性
機能試験により選択された配列修飾は、ダクリズマブ重鎖Ｖ領域配列に組み込まれた。変異体の抗体タンパク質および非修飾ダクリズマブタンパク質（Ｅ．ＨＡＴ）が、一過性トランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞の上清から精製された。抗体における同等のバッチを作成するため、２９３Ｔ／１７細胞にトランスフェクトし、同時に上清から抗体が精製された。典型的に、約３０−５０μｇ／ｍｌの発現レベルが観察された。精製された抗体は、非還元状態および還元状態下において、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により性状解析された。非還元状態下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、精製された抗体は約１５０−１６０ｋＤａの分子量を有していることが示され、還元状態下における分析から、精製された抗体は約５０ｋＤａの分子量の重鎖および約２５ｋＤａの分子量の軽鎖から成ることが示された。ゲル濾過クロマトグラフィーから、精製された抗体は９７％超が単量体ＩｇＧであることが示された。
【０２７３】
ダクリズマブ高収率プロセス（ＨＹＰ）（ＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）におけるＥ．ＨＡＴタンパク質、Ｅ．ＨＡＴ変異体および陽性対照バッチが、直接結合の組換えヒトＣＤ２５のＥＬＩＳＡアッセイにおける結合能について検査された。示されたデータは、異なる抗体バッチを用いて実施された同様の分析の典型となる。抗体に対するＥＣ５０値が、３つの個別の実験において計算され、ダクリズマブＨＹＰ材料のベンチマークとした。３つの実験からの力価を平均し、表１５および表１６に示す。精製された抗体の個別バッチを用いた２回目の試験において、この値は、Ｉ４８Ｍ変異体に対する９４％（表１６）の低い値から、同Ｉ４８Ｍ変異体に対する１３６％（表１５）の高い値まで及んだ。Ｉ４８Ｍ材料の試験を除き全ての値は、ダクリズマブＨＹＰ材料の仕様の７０−１３０％内に収まり、このアッセイフォーマットにおいて同等の力価が示された。
【０２７４】
８．５．２．４．変異体抗体分子の親和性検査
修飾抗体タンパク質は、ＢＩＡｃｏｒｅデバイスの表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットを用いて、結合親和性について検査された。ダクリズマブＨＹＰ、Ｅ．ＨＡＴ抗体およびＥ．ＨＡＴ変異体抗体は、抗ヒト重鎖抗体を用いてセンサーチップ上に固定された。組換え溶解性ヒトＣＤ２５は、センサーチップ上において泳動され、質量の変化が検出された。データを解釈し、検査された全タンパク質に対するｋａ、ｋｄおよびＫＤ値を得た。この結合親和性を、ダクリズマブＨＹＰの結合親和性に対するベンチマークとした。表１７は、全１０の単一アミノ酸突然変異体タンパク質に対する親和性相対値を示す。３つの個別の実験において、親和性が測定され、ダクリズマブＨＹＰの値のベンチマークとし、平均化された。抗体に対するＫＤ相対値は、変異体Ｉ５１Ａに対する８０％から変異体Ｙ５６Ａに対する２５０％まで及んでいる。二重突然変異体タンパク質に対する親和性検査は、同様のプロトコルを用いて個別に実施された。この結合親和性を、ダクリズマブＨＹＰに対する値のベンチマークとした。表１８に示される通り、二重突然変異体タンパク質の親和性は非修飾親抗体と同等である。抗原特異性の保存および実用化開発を目的とする最終検査として、Ｅ．ＨＡＴ変異体抗体がカニクイザルＣＤ２５に対する結合性について検査された。結合親和性はＢＩＡｃｏｒｅを用いて検査され、ダクリズマブＨＹＰに対するベンチマークとした。表１９に示される通り、変異体抗体は全て、非修飾親抗体と同等のカニクイザルＣＤ２５に対する親和性を有していた。
【０２７５】
８．５．２．５．免疫原性低下の証明：Ｆａｂ増殖検査
全３１のドナーが、Ｅ．ＨＡＴ、４８Ｍ、４８Ｍ５４Ｓ、４８Ｍ５１Ｌおよび４８Ｔ５４Ｓ  Ｆａｂ断片を用いて、パラメトリックに検査された。データは、全ドナーに対して集約、平均化された（図７）。全ドナーが全Ｆａｂにより検査されたわけではないが、４８Ｍ  Ｆａｂに対するレスポンスは、親Ｅ．ＨＡＴ  Ｆａｂに対するレスポンスレートと差異はなく、そのため、１６ドナーを取りまとめた後、検査されなかった。さらに、タンパク質の量的制限のため、全てのドナーが全濃度範囲において検査されたわけではない。
【０２７６】
４８Ｍ５４Ｓ、４８Ｍ５１Ｌおよび４８Ｖ５４Ｓに対する平均的な増殖性レスポンスは同等であり、Ｅ．ＨＡＴおよび４８Ｍ  Ｆａｂ断片に対する平均的な増殖性レスポンスより低かった。２５μｇ／ｍｌにおいて、４８Ｖ５４Ｓおよび４８Ｍ５４Ｓに対する増殖性レスポンスは、Ｅ．ＨＡＴに対するレスポンスより有意に低かった（両側ノンパラメトリックｔ検定、ｐ＜０．０１）。４８Ｍ５１Ｌに対する増殖性レスポンスはｐ＝０．０６であった。
【０２７７】
データを再分析し、検査したドナー間のレスポンスレートの原因を明らかにした。２５μｇ／ｍｌ用量において、ＳＩ＝１．９９より大きい増殖性レスポンスはいずれも、陽性レスポンスとして集約された。図８はｘ軸にレスポンスレート、ｙ軸に各Ｆａｂタンパク質に対する対応する平均刺激指数を示す。この分析から、二重修飾したＦａｂタンパク質に対して増殖性レスポンスを呈するドナー試料は少なかったこと、全レスポンスレートは低かったことが示される。最後に、各々のＦａｂタンパク質に対するレスポンダーの平均的な増殖性レスポンスの規模を分析し、図９に示す。このデータは、全ドナーから増殖性レスポンスが１．９９より小さい刺激指数を除外している。Ｅ．ＨＡＴおよび４８Ｍ  Ｆａｂに対するレスポンスはそれぞれ４．０および４．０９である。二重突然変異体はレスポンスの誘起がより少なく、４８Ｍ５４Ｓおよび４８Ｖ５４Ｓ変異体については、平均的な増殖性レスポンスがさらに低かった。４８Ｍ５１Ｌに対する平均的な増殖性レスポンスは対照より高いが、これは非常に高いＳＩ（ＳＩ＝１０）を有する個々のドナーによるものである。４８Ｍ５４Ｓに対する増殖性レスポンスは、Ｅ．ＨＡＴと有意に差異があり（両側不等分散ｔ検定において、ｐ＜０．０２）、４８Ｖ５４Ｓに対する増殖性レスポンスには有意な差異はなかった（ｐ＝０．０６）。結論として、突然変異体タンパク質４８Ｍ５４Ｓおよび４８Ｖ５４Ｓは、親タンパク質Ｅ．ＨＡＴより低頻度で弱い増殖性レスポンスを誘起した。
【０２７８】
最後に、Ｔ５４Ｓ変異体が単一点変異として検査され、図１０にデータを示す。この結果から、Ｉ４８ＭとＴ５４Ｓの組合せが、インビトロにおいて全体的に最も低い免疫原性レスポンスを生じることが示される。
【０２７９】
８．６．［実施例５］エフェクター機能の低下を伴うＦＣ変異体の特定
８．６．１．概要
抗体の結晶性断片（「Ｆｃ」）領域は、２つの同一のタンパク質断片から成り、それらは抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体（「ＦｃＲｓ」）として知られる免疫細胞上の受容体に結合し、活性化および阻害シグナルの両方を誘導する。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６またはＣＤ１６ａとしても知られている）は、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージ上において確認され、Ｆｃ領域に対する低い親和性を有する。ＦｃリガンドのＦｃγＲＩＩＩＡ受容体への結合は、マクロファージによる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘起およびサイトカイン放出の誘起を引き起こし得る。対照的に、ＦｃγＲＩＩＢ受容体（ＣＤ３２ｂとしても知られる）は、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞および好酸球上において確認され、ＦｃリガンドのＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合により、細胞活性を阻害する。
【０２８０】
抗体のＦｃ領域を変更することにより、抗体の治療有効性の向上、抗体の半減期の延長および不要な副作用の軽減が実現できる。ＨＬＡ−ＤＲ（Ｓｈｉら、２００２年、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．４３（６）：１３０３−１２）のβ鎖特異的なモノクローナル抗体であるＨｕ１Ｄ１０が、モデルシステムとして使用され、Ｆｃエフェクター機能の低下を伴うＦｃ変異体を生成した。
【０２８１】
８．６．２．ＦｃγＲ発現細胞に対する変異体の結合
Ｈｕ１Ｄ１０  ＩｇＧ変異体抗体を溶解型で発現させ、精製し、次いでＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ細胞に対する結合の評価に使用した。ＩｇＧ変異体を２０μｇ／ｍＬまたは１３３ｎＭから開始して３倍に段階希釈し、次いで２×１０５細胞／試験となるよう添加した。変異体ＩｇＧの結合を検出するため、抗ヒトκ抗体を使用した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおいて試料を分析し、ＩｇＧ濃度に対して蛍光度をプロットした。
【０２８２】
Ｆｃドメインは２つのメインドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから成り、ＣＨ２ドメインに対してＮ末端となる小さいヒンジ領域を有する。ＣＨ２ドメイン内の２６３位、２６６位、２７３位または３０５位に置換基を有し、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合が改善した変異体が特定され、ここで、Ｆｃドメインの残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ内のＥＵ指数のものと同様である。これらのアミノ酸位置は、図１１のＦｃアミノ酸配列（配列番号１７）において、アステリスク（＊）、ダガー（†）、ダブルダガー（‡）および番号記号（＃）によりそれぞれ示される。
【０２８３】
図１２から、全ての変異体は、ＦｃγＲＩＩＢに対する最大の結合性について野性型抗体より高いことが確認される。Ｖ２７３ＦおよびＶ２７３Ｙは、野性型よりそれぞれ１．７０倍、１．６０倍ＥＣ５０が改善し、これらの改善が最大であった。
【０２８４】
Ｈｕ１Ｄ１０  ＩｇＧ変異体を精製し、ＦｃγＲＩＩＩＡ  ＣＨＯトランスフェクタントに対する結合の評価に使用した。ＩｇＧ変異体を２０μｇ／ｍＬまたは１３３ｎＭから開始して３倍に段階希釈し、次いで２×１０５細胞／試験となるよう添加した。変異体ＩｇＧの結合を検出するため、抗ヒトκ抗体の２次染色を使用した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおいて試料を分析し、図１３においてＩｇＧ濃度に対する蛍光度をプロットした。全ての変異体は、野性型Ｆｃ含有抗体と同等またはそれ以下でＦｃγＲＩＩＩＡに結合した。Ｖ２７３ＦおよびＶ２７３Ｙは、野性型のＥＣ５０よりそれぞれ０．３０倍、０．１９倍と結合性が最も低かった。
【０２８５】
８．６．３．ＦＡＣＳベースの抗体依存性細胞傷害
非放射性の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイが最適化され、Ｈｕ１Ｄ１０  ＩｇＧ変異体の検査に使用された（図１４）。新たに採取された全血から精製されたＲａｊｉ細胞およびＰＢＭＣが、それぞれ１：４０の比率で標的細胞およびエフェクター細胞として使用された。
【０２８６】
Ｒａｊｉ細胞を洗浄し、１０６細胞／ｍＬでＰＢＳ中に再懸濁し、次いでＣＳＦＥ（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、パート４００２）による１：２０００希釈液を用いて、３０分間インキュベートした。次いでＣＦＳＥを付加したＲａｊｉ細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ＋１０％熱不活性化ＦＢＳから成る増殖培地中に４×１０５／ｍＬとなるよう再懸濁した。Ｖ底プレートの各ウェルに細胞懸濁液５０μＬを添加した。１８μｇ／ｍＬから開始して３倍に段階希釈したＩｇＧ変異体５０μＬを各ウェルに添加した。
【０２８７】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いた標準的方法により、新たに採取したヘパリン血からＰＢＭＣを精製した。増殖培地中に８×１０６細胞／ｍＬとなるようＰＢＭＣを再懸濁した。標的／ＩｇＧ懸濁液の各ウェルに細胞懸濁液１００μＬを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５９９２５）の１：５希釈液により細胞懸濁液を染色し、３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおいて試料を分析した。
【０２８８】
細胞傷害は、（死細胞数／全細胞数）＊１００として計算された。ＩｇＧ濃度に対する細胞傷害の割合がグラフ化され、ＥＣ５０を決定した。図１３は、ＡＤＣＣを誘発しなかったｈｕ１Ｄ１０変異体を示し、文献によりＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合性の低下につながる置換（Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、二重変異「ＳＥＬＦ」）と比較する。Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３ＳおよびＶ２７３Ｙは、Ｌ３２８Ｆと同等のレスポンス、またＳ２６７ＥおよびＳＥＬＦより低いＡＤＣＣレスポンスを誘発した。
【０２８９】
図１５は、ＦｃγＲＩＩＢ結合の維持または改善を伴うＡＤＣＣ低活性から不活性を有する変異体に焦点を当てる。検査した変異体の中で、Ｖ２７３ＦおよびＶ２７３Ｙは、ＦｃγＲＩＩＢ結合に対して最大の改善、またＦｃγＲＩＩＩＡ結合に対して最大の低下を示した。
【０２９０】
９．具体的な実施形態、参考文献の引用
本出願で引用された、全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、各個別の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、参照により全ての目的で組み込まれることが個別に指し示された場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれている。
【０２９１】
多様な具体的な実施形態について例示および記載されてきたが、多様な変化は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされうることが察知される。
【０２９２】
【表１】
2016515524.tif 000005
2016515524.tif 000006
2016515524.tif 000007
【０２９３】
【表２】
2016515524.tif 000008
2016515524.tif 000009
2016515524.tif 000010
【０２９４】
【表３】
2016515524.tif 000011
【０２９５】
【表４】
2016515524.tif 000012
【０２９６】
【表５】
2016515524.tif 000013
【０２９７】
【表６Ａ】
2016515524.tif 000014
2016515524.tif 000015
2016515524.tif 000016
【０２９８】
【表６Ｂ】
2016515524.tif 000017
【０２９９】
【表７Ａ】
2016515524.tif 000018
【０３００】
【表７Ｂ】
2016515524.tif 000019
【０３０１】
【表７Ｃ】
2016515524.tif 000020
【０３０２】
【表７Ｄ】
2016515524.tif 000021
【０３０３】
【表８Ａ】
2016515524.tif 000022
【０３０４】
【表８Ｂ】
2016515524.tif 000023
【０３０５】
【表９】
2016515524.tif 000024
【０３０６】
【表１０】
2016515524.tif 000025
【０３０７】
【表１１】
2016515524.tif 000026
【０３０８】
【表１２】
2016515524.tif 000027
【０３０９】
【表１３】
2016515524.tif 000028
【０３１０】
【表１４】
2016515524.tif 000029
【０３１１】
【表１５】
2016515524.tif 000030
【０３１２】
【表１６】
2016515524.tif 000031
【０３１３】
【表１７】
2016515524.tif 000032
【０３１４】
【表１８】
2016515524.tif 000033
【０３１５】
【表１９】
2016515524.tif 000034
【０３１６】
【表２０】
2016515524.tif 000035
2016515524.tif 000036
2016515524.tif 000037
2016515524.tif 000038
2016515524.tif 000039
2016515524.tif 000040
2016515524.tif 000041
2016515524.tif 000042
2016515524.tif 000043
2016515524.tif 000044
2016515524.tif 000045
2016515524.tif 000046
2016515524.tif 000047
2016515524.tif 000048
2016515524.tif 000049
2016515524.tif 000050
2016515524.tif 000051
2016515524.tif 000052
2016515524.tif 000053
2016515524.tif 000054
2016515524.tif 000055
2016515524.tif 000056
2016515524.tif 000057
2016515524.tif 000058
2016515524.tif 000059
2016515524.tif 000060
2016515524.tif 000061
2016515524.tif 000062
2016515524.tif 000063
2016515524.tif 000064
2016515524.tif 000065
2016515524.tif 000066
2016515524.tif 000067
2016515524.tif 000068
2016515524.tif 000069
2016515524.tif 000070
2016515524.tif 000071
2016515524.tif 000072
2016515524.tif 000073
2016515524.tif 000074
2016515524.tif 000075
2016515524.tif 000076
【０３１７】
【表２１】
2016515524.tif 000077
2016515524.tif 000078
2016515524.tif 000079
2016515524.tif 000080
2016515524.tif 000081
2016515524.tif 000082
2016515524.tif 000083
2016515524.tif 000084
2016515524.tif 000085
2016515524.tif 000086
2016515524.tif 000087
2016515524.tif 000088
2016515524.tif 000089
2016515524.tif 000090
2016515524.tif 000091
2016515524.tif 000092
2016515524.tif 000093
2016515524.tif 000094
2016515524.tif 000095
【０３１８】
【表２２−１】
2016515524.tif 000096
【０３１９】
【表２２−２】
2016515524.tif 000097
【０３２０】
【表２２−３】
2016515524.tif 000098
【０３２１】
【表２２−４】
2016515524.tif 000099
【０３２２】
【表２２−５】
2016515524.tif 000100
【０３２３】
【表２２−６】
2016515524.tif 000101
【０３２４】
【表２２−７】
2016515524.tif 000102
【０３２５】
【表２２−８】
2016515524.tif 000103
【０３２６】
【表２２−９】
2016515524.tif 000104
【図１Ａ】
2016515524.tif 000105
【図１Ｂ】
2016515524.tif 000106
【図２Ａ】
2016515524.tif 000107
【図２Ｂ】
2016515524.tif 000108
【図２Ｃ】
2016515524.tif 000109
【図２Ｄ】
2016515524.tif 000110
【図３Ａ】
2016515524.tif 000111
【図３Ｂ】
2016515524.tif 000112
【図３Ｃ】
2016515524.tif 000113
【図４Ａ】
2016515524.tif 000114
【図４Ｂ】
2016515524.tif 000115
【図５】
2016515524.tif 000116
【図６】
2016515524.tif 000117
【図７】
2016515524.tif 000118
【図８】
2016515524.tif 000119
【図９】
2016515524.tif 000120
【図１０】
2016515524.tif 000121
【図１１】
2016515524.tif 000122
【図１２】
2016515524.tif 000123
【図１３】
2016515524.tif 000124
【図１４】
2016515524.tif 000125
【図１５】
2016515524.tif 000126
【配列表】
2016515524000001.app
【国際調査報告】
2016515524.tif 000127
2016515524.tif 000128
2016515524.tif 000129
2016515524.tif 000130
2016515524.tif 000131
2016515524.tif 000132
2016515524.tif 000133
2016515524.tif 000134
2016515524.tif 000135
2016515524.tif 000136
2016515524.tif 000137
2016515524.tif 000138