(57)【要約】本発明は、特異的バイオマーカーまたは血管新生物質（angiogenic）の対象の発現レベルを評価することに基づいて抗アクチビン-A抗体またはアクチビン-A結合受容体などの抗アクチビン-A化合物を該対象に対して投与する段階によって、該対象における卵巣癌を治療する方法に関する。いくつかの態様においては、少なくとも2つの化合物が該対象に対して投与され、第1の化合物が抗アクチビンA化合物であり、かつ第2の化合物が化学療法化合物、例えばカペシタビンである。本発明はさらに、治療因子に関して対象を同定する方法にも関する。2016508504.tif 000078
2016508504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つの化合物である第1の化合物および第2の化合物の治療的有効量を投与する段階であって、該第1の化合物が抗アクチビン-A化合物であり、かつ該第2の化合物が化学療法化合物である、段階を含む、対象における卵巣癌を治療する方法。
【請求項２】
前記少なくとも2つの化合物のうち1つまたは複数が、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記第1の化合物が投与された後に前記第2の化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記第2の化合物が投与された後に前記第1の化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記第1の化合物および前記第2の化合物が同時に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（a）i．合計2アミノ酸以下の付加、置換、および／もしくは欠失によって、本明細書に開示された軽鎖CDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列と異なる、軽鎖CDR3配列；
2016508504.tif 000074
からなる群より選択される配列を含む、軽鎖CDR3であって、
X73がメチオニン残基、グルタミン残基、もしくはアルギニン残基であり、X74がアラニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、もしくはセリン残基であり、X75がロイシン残基、チロシン残基、もしくはアスパラギン残基であり、X76がグルタミン残基、セリン残基、もしくはトレオニン残基であり、X77がトレオニン残基、チロシン残基、もしくはイソロイシン残基であり、X78がプロリン残基もしくはセリン残基であり、X79がシステイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、もしくはプロリン残基であり、X80がセリン残基もしくはトレオニン残基であり、X81がトレオニン残基もしくはセリン残基であり、X82がプロリン残基もしくはトレオニン残基であり、X83がフェニルアラニン残基もしくはトリプトファン残基であり、X84がアルギニン残基もしくはセリン残基であり、X85がバリン残基もしくはアラニン残基であり、かつX86がバリン残基もしくは残基なしであり、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、軽鎖CDR3、または
（b）i．合計3アミノ酸以下の付加、置換、および／もしくは欠失によって、本明細書に開示された重鎖CDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列と異なる、重鎖CDR3配列；
2016508504.tif 000075
からなる群より選択される配列を含む、重鎖CDR3であって、
X87が、バリン残基もしくは残基なしであり、X88が、グルタミン残基もしくは残基なしであり、X89がアスパラギン酸残基、トリプトファン残基、もしくは残基なしであり、X90がセリン残基、ロイシン残基、もしくは残基なしであり、X91がイソロイシン残基、グルタミン酸残基、もしくはグルタミン残基であり、X92がアラニン残基、ロイシン残基、もしくはグリシン残基であり、X93がアラニン残基もしくはロイシン残基であり、X94がプロリン残基、チロシン残基、もしくはグリシン残基であり、X95がアスパラギン酸残基もしくは残基なしであり、X96がグルタミン残基もしくは残基なしであり、X97がアスパラギン酸残基もしくはアラニン残基であり、X98がチロシン残基もしくはグリシン残基であり、X99がセリン残基もしくはチロシン残基であり、X100がセリン残基もしくはアルギニン残基であり、X101がフェニルアラニン残基もしくは残基なしであり、X102がグリシン残基もしくはアスパラギン酸残基であり、X103がヒスチジン残基もしくはプロリン残基であり、X104がグリシン残基もしくは残基なしであり、X105がセリン残基、グルタミン酸残基、もしくは残基なしであり、X106がアルギニン残基、セリン残基、もしくは残基なしであり、X107がアスパラギン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、もしくはグルタミン残基であり、X108がセリン残基、アルギニン残基、もしくはトリプトファン残基であり、X109がグリシン残基、アスパラギン酸残基、アスパラギン残基、チロシン残基、もしくはロイシン残基であり、X110がセリン残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、もしくは残基なしであり、X111がセリン残基、バリン残基、アスパラギン残基、もしくはチロシン残基であり、X112がセリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、もしくはヒスチジン残基であり、X113がトリプトファン残基、チロシン残基、もしくはグルタミン残基であり、X114がヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、チロシン残基、もしくは残基なしであり、X115がフェニルアラニン残基、アラニン残基、もしくはグリシン残基であり、X116がアスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、もしくはメチオニン残基であり、X117がチロシン残基もしくはアスパラギン酸残基であり、X118がイソロイシン残基、バリン残基、もしくは残基なしであり、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、重鎖CDR3、または
（c）（a）の軽鎖CDR3配列および（b）の重鎖CDR3配列
を含み、かつ、前記抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（d）i．本明細書に開示された軽鎖CDR1配列；ii．本明細書に開示された軽鎖CDR2配列；およびiii．本明細書に開示された軽鎖CDR3配列を含む、軽鎖可変ドメイン、または
（e）i．本明細書に開示された重鎖CDR1配列；ii．本明細書に開示された重鎖CDR2配列；およびiii．本明細書に開示された重鎖CDR3配列を含む、重鎖可変ドメイン、または
（f）（d）の軽鎖可変ドメインおよび（e）の重鎖可変ドメイン
をさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（a）i．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸の配列；ii．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；およびiii．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列からなる群より選択される、軽鎖可変ドメイン配列、または
（b）i．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸の配列；ii．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；およびiii．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列からなる群より選択される、重鎖可変ドメイン配列、または
（c）（a）の軽鎖可変ドメインおよび（b）の重鎖可変ドメイン
を含み、
前記抗原結合タンパク質がヒトアクチビン-Aと結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（d）本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン配列；または
（e）本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14からなる群より選択される重鎖可変ドメイン配列；または
（f）（d）の軽鎖可変ドメインおよび（e）の重鎖可変ドメイン
をさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗アクチビン-A化合物が、安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）を含み、該ポリペプチドが、
（a）SEQ ID NO：2に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（b）SEQ ID NO：2のアミノ酸19〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（c）SEQ ID NO：2のアミノ酸23〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（d）SEQ ID NO：2のアミノ酸25〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；ならびに
（e）（a）〜（d）のいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドであって、その配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTであり、該ポリペプチドが、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗アクチビン-A化合物が、安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）を含み、該ポリペプチドが、
（a）SEQ ID NO：4、6、12、および14からなる群に示された配列からなるポリペプチド；
（b）（a）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド；ならびに
（c）（a）に対して少なくとも95％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、少なくとも1つの異種ポリペプチドと機能的に連結している、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが位置64にアラニン残基を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドがIgG Fcドメインを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種ポリペプチドがリンカー配列によって前記抗アクチビン-A化合物と機能的に連結している、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーが、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（a）SEQ ID NO：8、10、16、および18からなる群に示された配列からなるポリペプチド；
（b）（a）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド；ならびに
（c）（a）に対して少なくとも95％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法化合物がカペシタビンである、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法化合物がドキソルビシン脂質複合体である、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記卵巣癌が漿液性卵巣癌である、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
対照と比較してまたは前記対象におけるバイオマーカーCA-125および／もしくはアクチビン-Aの以前のレベルと比較して該対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aのレベルの増加を検出することによって、該対象を同定する段階をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの前記対象の発現レベルを評価する段階；
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの該対象の発現レベルを、陰性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルと比較する段階；ならびに
該対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-A因子の発現レベルが、該陰性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルを上回ることを判定する段階
を含む方法によって該対象を同定する段階をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの前記対象の発現レベルを評価する段階；
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの該対象の発現レベルを、陽性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルと比較する段階；ならびに
該対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-A因子の発現レベルが、該陽性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルに合致するかまたはそれを上回ることを判定する段階
を含む方法によって該対象を同定する段階をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
前記卵巣癌が明細胞卵巣癌、顆粒膜細胞卵巣癌、ライディッヒ細胞腫、または性索間質性精巣腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
前記卵巣癌が明細胞卵巣癌である、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
対照と比較して前記対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子のレベルの増加を検出することによって、該対象を同定する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の前記対象の発現レベルを評価する段階；
アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の該対象の発現レベルを、陰性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルと比較する段階；ならびに
該対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルが、該陰性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルを上回ることを判定する段階
を含む方法によって該対象を同定する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の前記対象の発現レベルを評価する段階；
アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の該対象の発現レベルを、陽性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルと比較する段階；ならびに
該対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルが、該陽性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルと合致するかまたはそれを上回ることを判定する段階
を含む方法によって該対象を同定する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗アクチビン-A化合物が対象に対して皮下、静脈内、または腹腔内に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗アクチビン-A化合物が対象に対して少なくとも0.5mg／kgの投与量で週1回投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗アクチビン-A化合物が対象に対して皮下、静脈内、または腹腔内に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗アクチビン-A化合物が対象に対して0.5mg／kgまたは0.5mg／kg超の投与量で週1回投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
前記カペシタビンが対象に対して皮下、静脈内、または腹腔内に投与される、請求項18に記載の方法。
【請求項３４】
前記カペシタビンが対象に対して経口投与される、請求項18に記載の方法。
【請求項３５】
前記カペシタビンが対象に対して1250mg／m2の投与量で1日2回、2週間投与される、請求項18に記載の方法。
【請求項３６】
前記カペシタビンが2週間投与された後に1回の1週間の休止期間がある、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記ドキソルビシン脂質複合体が対象に対して皮下、静脈内、または腹腔内に投与される、請求項19に記載の方法。
【請求項３８】
前記ドキソルビシン脂質複合体が対象に対して40mg／m2IVの投与量で4週間毎に1回投与される、請求項19に記載の方法。
【請求項３９】
それを必要とする対象において漿液性卵巣癌を治療するための方法であって、抗アクチビン-A化合物の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項４０】
前記抗アクチビン-A化合物が、安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）を含み、該ポリペプチドが、
（a）SEQ ID NO：6、4、12、および14からなる群に示された配列からなるポリペプチド；
（b）（a）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド；ならびに
（c）（a）に対して少なくとも95％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（a）i．合計2アミノ酸以下の付加、置換、および／もしくは欠失によって、本明細書に開示された軽鎖CDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列と異なる、軽鎖CDR3配列；ならびに
2016508504.tif 000076
からなる群より選択される配列を含む、軽鎖CDR3であって、
X73がメチオニン残基、グルタミン残基、もしくはアルギニン残基であり、X74がアラニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、もしくはセリン残基であり、X75がロイシン残基、チロシン残基、もしくはアスパラギン残基であり、X76がグルタミン残基、セリン残基、もしくはトレオニン残基であり、X77がトレオニン残基、チロシン残基、もしくはイソロイシン残基であり、X78がプロリン残基もしくはセリン残基であり、X79がシステイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、もしくはプロリン残基であり、X80がセリン残基もしくはトレオニン残基であり、X81がトレオニン残基もしくはセリン残基であり、X82がプロリン残基もしくはトレオニン残基であり、X83がフェニルアラニン残基もしくはトリプトファン残基であり、X84がアルギニン残基もしくはセリン残基であり、X88が、バリン残基もしくはアラニン残基であり、かつX86がバリン残基もしくは残基なしであり、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、軽鎖CDR3、または
（b）i．合計3アミノ酸以下の付加、置換、および／もしくは欠失によって、本明細書に開示された重鎖CDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列と異なる、重鎖CDR3配列；
2016508504.tif 000077
からなる群より選択される配列を含む、重鎖CDR3であって、
X87がバリン残基もしくは残基なしであり、X88が、グルタミン残基もしくは残基なしであり、X89がアスパラギン酸残基、トリプトファン残基、もしくは残基なしであり、X90がセリン残基、ロイシン残基、もしくは残基なしであり、X91がイソロイシン残基、グルタミン酸残基、もしくはグルタミン残基であり、X92がアラニン残基、ロイシン残基、もしくはグリシン残基であり、X93がアラニン残基もしくはロイシン残基であり、X94がプロリン残基、チロシン残基、もしくはグリシン残基であり、X95がアスパラギン酸残基もしくは残基なしであり、X96がグルタミン残基もしくは残基なしであり、X97がアスパラギン酸残基もしくはアラニン残基であり、X98がチロシン残基もしくはグリシン残基であり、X99がセリン残基もしくはチロシン残基であり、X100がセリン残基もしくはアルギニン残基であり、X101がフェニルアラニン残基もしくは残基なしであり、X102がグリシン残基もしくはアスパラギン酸残基であり、X103がヒスチジン残基もしくはプロリン残基であり、X104がグリシン残基もしくは残基なしであり、X105がセリン残基、グルタミン酸残基、もしくは残基なしであり、X106がアルギニン残基、セリン残基、もしくは残基なしであり、X107がアスパラギン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、もしくはグルタミン残基であり、X108がセリン残基、アルギニン残基、もしくはトリプトファン残基であり、X109がグリシン残基、アスパラギン酸残基、アスパラギン残基、チロシン残基、もしくはロイシン残基であり、X110がセリン残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、もしくは残基なしであり、X111がセリン残基、バリン残基、アスパラギン残基、もしくはチロシン残基であり、X112がセリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、もしくはヒスチジン残基であり、X113がトリプトファン残基、チロシン残基、もしくはグルタミン残基であり、X114がヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、チロシン残基、もしくは残基なしであり、X115がフェニルアラニン残基、アラニン残基、もしくはグリシン残基であり、X116がアスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、もしくはメチオニン残基であり、X117がチロシン残基もしくはアスパラギン酸残基であり、X118がイソロイシン残基、バリン残基、もしくは残基なしであり、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、重鎖CDR3、または
（c）（a）の軽鎖CDR3配列および（b）の重鎖CDR3配列
を含み、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（d）i．本明細書に開示された軽鎖CDR1配列；ii．本明細書に開示された軽鎖CDR2配列；およびiii．本明細書に開示された軽鎖CDR3配列を含む、軽鎖可変ドメイン、または
（e）i．本明細書に開示された重鎖CDR1配列；ii．本明細書に開示された重鎖CDR2配列；およびiii．本明細書に開示された重鎖CDR3配列を含む、重鎖可変ドメイン、または
（f）（d）の軽鎖可変ドメインおよび（e）の重鎖可変ドメイン
をさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（a）i．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸の配列；ii．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；およびiii．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列からなる群より選択される、軽鎖可変ドメイン配列、または
（b）i．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸の配列；ii．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；およびiii．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列からなる群より選択される、重鎖可変ドメイン配列、または
（c）（a）の軽鎖可変ドメインおよび（b）の重鎖可変ドメイン
を含み、
前記抗原結合タンパク質がヒトアクチビン-Aと結合する、請求項39に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（d）本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列から選択される軽鎖可変ドメイン配列；または
（e）本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列から選択される重鎖可変ドメイン配列；または
（f）（d）の軽鎖可変ドメインおよび（e）の重鎖可変ドメイン
をさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗アクチビン-A化合物が、安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）を含み、該ポリペプチドが、
（a）SEQ ID NO：2に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（b）SEQ ID NO：2のアミノ酸19〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（c）SEQ ID NO：2のアミノ酸23〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（d）SEQ ID NO：2のアミノ酸25〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；ならびに
（e）（a）〜（d）のいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドであって、その配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTであり、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、少なくとも1つの異種ポリペプチドと機能的に連結している、請求項40に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが位置64にアラニン残基を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４９】
前記異種ポリペプチドがIgG Fcドメインを含む、請求項47に記載の方法。
【請求項５０】
前記異種ポリペプチドがリンカー配列によって前記抗アクチビン-A化合物と機能的に連結している、請求項47に記載の方法。
【請求項５１】
前記リンカーが、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50からなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗アクチビン-A化合物が、
（d）SEQ ID NO：8、10、16、および18からなる群に示された配列からなるポリペプチド；
（e）（d）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド；ならびに
（f）（d）に対して少なくとも95％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５３】
対照と比較して前記対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aのレベルの増加を検出することによって、該対象を同定する段階をさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項５４】
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの前記対象の発現レベルを評価する段階；
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの該対象の発現レベルを、陰性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルと比較する段階；ならびに
該対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-A因子の発現レベルが、該陰性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルを上回ることを判定する段階
を含む方法によって該対象を同定する段階をさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項５５】
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの前記対象の発現レベルを評価する段階；
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの該対象の発現レベルを、陽性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルと比較する段階；ならびに
該対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-A因子の発現レベルが、該陽性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルに合致するかまたはそれを上回ることを判定する段階
を含む方法によって該対象を同定する段階をさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、変異導入したアクチビン遺伝子または変異導入したアクチビン対抗制御遺伝子を有する、請求項39に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、変異導入したアクチビン遺伝子または変異導入したアクチビン対抗制御遺伝子を有する、請求項40に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、変異導入したアクチビン遺伝子を有し、かつ該変異がAsn386Ser変異、Arg60Leu変異、またはGly280Glu変異である、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、変異導入したアクチビン遺伝子を有し、かつ該変異がAsn386Ser変異、Arg60Leu変異、またはGly280Glu変異である、請求項57に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年2月1日に出願された米国仮特許出願第61／759,961号および2013年4月23日に出願された米国仮特許出願第61／815,220号の優先権を主張する。これらの出願のすべての教示は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本出願はさらに、2009年11月25日に出願された米国特許出願第12／626,375号；2011年4月5日に出願された米国特許出願第13／080,515号；2011年12月19日に出願された米国特許出願第13／329,897号；2012年7月16日に出願された米国特許出願第13／550,447号；2007年9月7日に出願された米国特許第8,309,082号；2008年3月5日に出願された米国特許第7,947,646号；2007年9月7日に出願されたPCT出願番号WO 2008／031061；2008年3月6日に出願されたPCT出願番号WO 2008／109167；および2009年11月25日に出願されたPCT出願番号WO 2010／062383にも関し、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、ASCIIテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。配列表は参照により組み入れられる。配列表に示されたSEQ ID NO識別子は無視されるべきである。2014年1月31日に作成された外ASCIIコピーは、名称が25885PCT_CRF_sequencelisting.txtであり、サイズが218,613バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
アクチビン-Aは、当初、生殖腺液中で同定されたTGF-βファミリーのメンバーである。これは下垂体からの卵胞刺激ホルモン（FSH）放出を制御することによって月経周期の調節に重要な役割を果たす。アクチビン-Aはまた、細胞の成長および分化、免疫応答、ならびに創傷治癒といった他の多様な機能にも役立つことが知られている。
【０００５】
卵巣癌は、あらゆる婦人科癌の中で最も致死性が高い。米国では、女性のおよそ60人に1人が卵巣癌を発症し、毎年25,000人超の症例が新たに診断されている。癌が卵巣を越えて広がる前に診断が下される卵巣癌症例は25％未満に過ぎず、末期卵巣癌の5年生存の見込みは30％未満である。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本明細書に開示するのは、抗アクチビン-A抗体および／またはアクチビン受容体を含む、抗アクチビン-A化合物を対象に投与する段階によって対象における卵巣癌を治療するための方法である。対象における特定のタンパク質のレベルを評価する段階によって卵巣癌の治療のための対象を同定する方法も同じく開示される。
【０００７】
1つの態様において、本方法は、抗アクチビン-A化合物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。別の態様において、抗アクチビン-A化合物は薬学的に許容される担体とともに製剤化される。
【０００８】
1つのさらなる態様において、抗アクチビン-A化合物は、
（a）i．合計2アミノ酸以下の付加、置換、および／もしくは欠失によって、本明細書に開示された軽鎖CDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列と異なる、軽鎖CDR3配列；ならびに
2016508504.tif 000003
からなる群より選択される配列を含む、軽鎖CDR3であって、
X73がメチオニン残基、グルタミン残基、もしくはアルギニン残基であり、X74がアラニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、もしくはセリン残基であり、X75がロイシン残基、チロシン残基、もしくはアスパラギン残基であり、X76がグルタミン残基、セリン残基、もしくはトレオニン残基であり、X77がトレオニン残基、チロシン残基、もしくはイソロイシン残基であり、X78がプロリン残基もしくはセリン残基であり、X79がシステイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、もしくはプロリン残基であり、X80がセリン残基もしくはトレオニン残基であり、X81がトレオニン残基もしくはセリン残基であり、X82がプロリン残基もしくはトレオニン残基であり、X83がフェニルアラニン残基もしくはトリプトファン残基であり、X84がアルギニン残基もしくはセリン残基であり、X85がバリン残基もしくはアラニン残基であり、X86がバリン残基もしくは残基なしであり、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、軽鎖CDR3、または
（b）i．合計3アミノ酸以下の付加、置換、および／もしくは欠失によって、本明細書に開示された重鎖CDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列と異なる、重鎖CDR3配列；
2016508504.tif 000004
からなる群より選択される配列を含む重鎖CDR3であって、
X87がバリン残基もしくは残基なしであり、X88が、グルタミン残基もしくは残基なしであり、X89がアスパラギン酸残基、トリプトファン残基、もしくは残基なしであり、X90がセリン残基、ロイシン残基、もしくは残基なしであり、X91がイソロイシン残基、グルタミン酸残基、もしくはグルタミン残基であり、X92がアラニン残基、ロイシン残基、もしくはグリシン残基であり、X93がアラニン残基もしくはロイシン残基であり、X94がプロリン残基、チロシン残基、もしくはグリシン残基であり、X95がアスパラギン酸残基もしくは残基なしであり、X96がグルタミン残基もしくは残基なしであり、X97がアスパラギン酸残基もしくはアラニン残基であり、X98がチロシン残基もしくはグリシン残基であり、X99がセリン残基もしくはチロシン残基であり、X100がセリン残基もしくはアルギニン残基であり、X101がフェニルアラニン残基もしくは残基なしであり、X102がグリシン残基もしくはアスパラギン酸残基であり、X103がヒスチジン残基もしくはプロリン残基であり、X104がグリシン残基もしくは残基なしであり、X105がセリン残基、グルタミン酸残基、もしくは残基なしであり、X106がアルギニン残基、セリン残基、もしくは残基なしであり、X107がアスパラギン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、もしくはグルタミン残基であり、X108がセリン残基、アルギニン残基、もしくはトリプトファン残基であり、X109がグリシン残基、アスパラギン酸残基、アスパラギン残基、チロシン残基、もしくはロイシン残基であり、X110がセリン残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、もしくは残基なしであり、X111がセリン残基、バリン残基、アスパラギン残基、もしくはチロシン残基であり、X112がセリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、もしくはヒスチジン残基であり、X113がトリプトファン残基、チロシン残基、もしくはグルタミン残基であり、X114がヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、チロシン残基、もしくは残基なしであり、X115がフェニルアラニン残基、アラニン残基、もしくはグリシン残基であり、X116がアスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、もしくはメチオニン残基であり、X117がチロシン残基もしくはアスパラギン酸残基であり、X118がイソロイシン残基、バリン残基、もしくは残基なしであり、かつ、該抗アクチビン-A化合物がヒトアクチビン-Aと特異的に結合する、重鎖CDR3、または
（c）（a）の軽鎖CDR3配列および（b）の重鎖CDR3配列
を含み、該抗アクチビン-A化合物はヒトアクチビン-Aと特異的に結合する。
【０００９】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、
（a）i．本明細書に開示された軽鎖CDR1配列；ii．本明細書に開示された軽鎖CDR2配列；およびiii．本明細書に開示された軽鎖CDR3配列を含む、軽鎖可変ドメイン、または
（b）i．本明細書に開示された重鎖CDR1配列；ii．本明細書に開示された重鎖CDR2配列；およびiii．本明細書に開示された重鎖CDR3配列を含む、重鎖可変ドメイン、または
（c）（a）の軽鎖可変ドメインおよび（b）の重鎖可変ドメイン
を含む。
【００１０】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、
（a）i．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸の配列；ii．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；およびiii．本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14の軽鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列からなる群より選択される、軽鎖可変ドメイン配列、または
（b）i．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも80％同一であるアミノ酸の配列；ii．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；およびiii．本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14の重鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列からなる群より選択される、重鎖可変ドメイン配列、または
（c）（a）の軽鎖可変ドメインおよび（b）の重鎖可変ドメイン
を含み、抗原結合タンパク質はヒトアクチビン-Aと結合する。
【００１１】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、
（a）本明細書に開示された軽鎖可変ドメイン配列のL1〜L14からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン配列；または
（b）本明細書に開示された重鎖可変ドメイン配列のH1〜H14からなる群より選択される重鎖可変ドメイン配列；または
（c）（a）の軽鎖可変ドメインおよび（b）の重鎖可変ドメイン
を含む。
【００１２】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）を含み、該ポリペプチドは、
（a）SEQ ID NO：2に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（b）SEQ ID NO：2のアミノ酸19〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（c）SEQ ID NO：2のアミノ酸23〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；
（d）SEQ ID NO：2のアミノ酸25〜134に示された配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTである、ポリペプチド；ならびに
（e）（a）〜（d）のいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドであって、その配列が位置28でのアミノ酸置換および位置44でのアミノ酸置換を含み、該位置28での置換が、WおよびYからなる群より選択され、かつ該位置44での置換がTであり、該ポリペプチドが、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択される。
【００１３】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）を含み、該ポリペプチドは、
（a）SEQ ID NO：4、6、12、および14からなる群に示された配列からなるポリペプチド；
（b）（a）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド；ならびに
（c）（a）に対して少なくとも95％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択される。
【００１４】
1つのさらなる態様において、ポリペプチドは、少なくとも1つの異種ポリペプチドと機能的に連結している。別の態様において、ポリペプチドは位置64にアラニン残基を含む。別の態様において、異種ポリペプチドはIgG Fcドメインを含む。別の態様において、異種ポリペプチドはリンカー配列によって抗アクチビン-A化合物と機能的に連結している。1つのさらなる態様において、リンカーは、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50からなる群より選択される。
【００１５】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、
（a）SEQ ID NO：8、10、16、および18からなる群に示された配列からなるポリペプチド；
（b）（a）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド；ならびに
（c）（a）に対して少なくとも95％の配列同一性を有し、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、対象における卵巣癌（漿液性卵巣癌および明細胞卵巣癌を含む）を治療する方法は、少なくとも2つの化合物である第1の化合物および第2の化合物の治療的有効量を投与する段階を含み、第1の化合物は抗アクチビン-A化合物であり、かつ第2の化合物は化学療法化合物である。例えば、化学療法化合物は、カペシタビンまたはドキソルビシン脂質複合体であってよい。1つのさらなる態様において、少なくとも2つの化合物のうち1つまたは複数は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される。別の態様において、第2の化合物は第1の化合物が投与された後に投与される。別の態様において、第1の化合物は第2の化合物が投与された後に投与される。別の態様において、第1の化合物および第2の化合物は同時に投与される。
【００１７】
1つのさらなる態様において、対象は、対照と比較して対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aのレベルの増加を同定することによって、同定される。別の態様において、対象は、バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの対象の発現レベルを評価する段階；バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの対象の発現レベルを、陰性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルと比較する段階；ならびに対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-A因子の発現レベルが、陰性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルを上回ることを判定する段階を含む方法によって、同定される。別の態様において、対象は、バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの対象の発現レベルを評価する段階；バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの対象の発現レベルを、陽性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルと比較する段階；ならびに対象におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-A因子の発現レベルが、陽性対照試料におけるバイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルに合致するかまたはそれを上回ることを判定する段階を含む方法によって、同定される。
【００１８】
別の態様において、対象は、対照と比較して対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子のレベルの増加を検出することによって、同定される。別の態様において、対象は、アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の対象の発現レベルを評価する段階；アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の対象の発現レベルを、陰性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルと比較する段階；ならびに対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルが、陰性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルを上回ることを判定する段階を含む方法によって、同定される。別の態様において、対象は、アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の対象の発現レベルを評価する段階；アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の対象の発現レベルを、陽性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルと比較する段階；ならびに、対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルが、陽性対照試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の発現レベルと合致するかまたはそれを上回ることを判定する段階を含む方法によって、同定される。
【００１９】
別の態様において、抗アクチビン-A化合物は、対象に対して皮下、静脈内、または腹腔内に投与される。1つのさらなる態様において、抗アクチビン-A化合物は、対象に対して少なくとも0.5mg／kgの投与量の投与量で週1回投与される。別の態様においては、カペシタビンが対象に対して皮下、静脈内、腹腔内に投与される。1つのさらなる態様において、カペシタビンは対象に対して経口投与される。1つのさらなる態様において、カペシタビンは、対象に対して1250mg／m2の投与量で1日2回、2週間にわたって投与される。いくつかの態様においては、カペシタビンが2週間投与された後に1回の1週間の休止期間がある。別の態様においては、ドキソルビシン脂質複合体が、対象に対して皮下、静脈内、または腹腔内に投与される。別の態様において、ドキソルビシン脂質複合体は、対象に対して40mg／m2IVの投与量で4週間毎に1回投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明のこれらおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明および添付の図面を見ることによってさらに良く理解されるであろう。
【図１】卵巣癌対象（OC）および正常対照対象におけるアクチビン-Aレベルを示している。*** p＜0.001；studentのt検定；n＝20。
【図２Ａ】inh-KOマウスにおける血清アクチビン-Aレベルに対するsActRIIB処置の効果を経時的に示しているグラフである。*** WTとの比較でp＜0.001；studentのt検定；n＝6〜12。
【図２Ｂ】inh-KOマウスにおける血清アクチビン-Aレベルに対するsActRIIB処置の効果を経時的に示している棒グラフである。バーが3本ずつの各群において、左のバーは野生型であり、中央のバーはKO＋PBSであり、右のバーはKO＋sActRIIBである。
【図３Ａ】inh-KOマウスにおける卵巣腫瘍量に対するsActRIIB処置の効果を経時的に示しているグラフである。*** WTとの比較でp＜0.001。Studentのt検定；n＝6〜12。
【図３Ｂ】sActRIIB処置後のinh-KOマウスにおける進行性卵巣腫瘍を描写している代表的な肉眼形態である。スケールバー＝5mm。
【図４】図4Aは、inh-KOマウスにおける精巣腫瘍量に対するsActRIIB処置の効果を経時的に示しているグラフである。バーが3本ずつの各群において、左のバーは野生型であり、中央のバーはKO＋PBSであり、右のバーはKO＋sActRIIBである。図4Bは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスにおける進行性精巣腫瘍を描写している代表的な肉眼形態である。スケールバー＝10mm。
【図５】図5Aは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスの卵巣腫瘍におけるアクチビン-A mRNAの2つのノーザンブロット分析を示している。n＝10。図5Bは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスの卵巣腫瘍におけるp-Smad2シグナル伝達の2つのウエスタンブロット分析を示している。n＝10。
【図６】図6Aは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスの卵巣腫瘍におけるE-カドヘリンタンパク質のウエスタンブロット分析を示している。n＝10。図6Bは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスにおける卵巣切片中のE-カドヘリンの免疫組織化学染色を示しており、E-カドヘリンはグレーに染色されており、細胞核は赤色に対比染色されている。スケールバー＝50μm。
【図７】図7Aは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスにおける卵巣切片の代表的なH&E顕微鏡画像を示している。スケールバー＝500μm。図7Bは、sActRIIB処置後のinh-KOマウスにおける精巣組織切片の代表的なH&E顕微鏡画像を示している。スケールバー＝500μm。
【図８Ａ】inh-KOマウスにおける血清VEGFに対するsActRIIB処置の効果を描写している2つのグラフを示している。* p＜0.05；studentのt検定；n＝10。
【図８Ｂ】inh-KOマウスの卵巣（上）および精巣（下）腫瘍切片におけるVEGFおよびAng-1免疫反応性に対するsActRIIB処置の効果を描写している免疫染色の代表的な画像を示している。スケールバー＝100μm。** p＜0.01；studentのt検定。棒グラフは、VEGFおよびAng-1免疫反応性の定量分析を示している。
【図８Ｃ】sActRIIB処置後のinh-KOマウスの卵巣または精巣腫瘍におけるAng-2 mRNA発現レベルのノーザンブロット分析を示している。
【図８Ｄ】sActRIIB処置後のinh-KOマウスの卵巣腫瘍におけるエンドグリン、オステオポンチン、IGFBP-1およびIGFBP-2タンパク質のウエスタンブロット分析を示している。
【図９】inh-KOマウスの卵巣（上）および精巣（下）腫瘍におけるカスパーゼ-3活性化に対するsActRIIB処置の効果を描写している免疫染色の代表的な画像を示している。矢印は活性カスパーゼ-3を指し示している。棒グラフは、活性カスパーゼ-3の定量分析を示している。n＝10。* p＜0.05、** p＜0.01；studentのt検定。
【図１０】図10Aは、皮下TOV-21G移植後のヌードマウスにおける血清アクチビン-Aレベルを示しているグラフである。** p＜0.01；studentのt検定；n＝10。図10Bは、sActRIIBまたはアクチビン-A抗体による処置後のTOV-21G腫瘍体積の変化を示しているグラフである；PBSとの比較で* p＜0.05、*** p＜0.001；n＝12。
【図１１】ナイーブCHO細胞またはアクチビン-AをトランスフェクトしたCHO細胞を移植したCD1ヌードマウスのアクチビン-A抗体処置後の腫瘍重量または腫瘍生着率（移植後第21日の時点で肉眼的に同定しうる腫瘍を四頭筋に有するマウスのパーセンテージと定義）のいずれかを描写している2つのグラフを示している。*** p＜0.001；一元配置ANOVA；n＝12。
【図１２】アクチビン-AをトランスフェクトしたOV-90細胞を移植したCD1ヌードマウスのsActRIIB処置後の腫瘍体積または腫瘍重量のいずれかを描写している2つのグラフを示している。* p＜0.05；n＝12〜13。
【図１３】TOV-21G細胞を移植したヌードマウスにおけるsActRIIBおよび5-フルオロウラシルによる処置後の腫瘍体積を示しているグラフである。*** PBSとの比較でp＜0.001；# 5-FUとの比較でp＜0.05；¶ sActRIIBとの比較でp＜0.01；n＝12。
【図１４】TOV-21G細胞の増殖に対するsActRIIBおよびアクチビン-A抗体の効果を示しているグラフである。
【図１５Ａ】マウスのTOV-21G異種移植腫瘍におけるVEGF、Ang-1およびオステオポンチンに対するsActRIIB処置の効果を描写している免疫染色の代表的な画像を示している。棒グラフは、VEGF、Ang-1およびオステオポンチン免疫反応性の定量分析を示している。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001。
【図１５Ｂ】マウスのTOV-21G異種移植腫瘍におけるCD31に対するsActRIIB処置の効果を描写している免疫染色の代表的な画像を示している。棒グラフはCD31免疫反応性の定量分析を示している。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001。
【図１５Ｃ】マウスのTOV-21G異種移植腫瘍におけるカスパーゼ-3活性化および細胞アポトーシスに対するsActRIIB処置の効果を描写している免疫染色の代表的な画像を示している。棒グラフは、カスパーゼ-3免疫反応性およびアポトーシスに起因する免疫反応性変化の定量分析を示している。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001。
【図１６】図16Aは、組換えアクチビン-AおよびsActRIIBによる処置後のTOV-21G、BAEC、MRC-5、CCD-LuおよびU937細胞培養物におけるVEGF-A mRA発現レベルのグラフを示している。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；studentのt検定；n＝3。図16Bは、組換えアクチビン-AおよびsActRIIBによる処置後のBAEC、MRC-5およびCCD-Lu細胞培養物におけるAng-1 mRNA発現レベルのグラフを示している。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；studentのt検定；n＝3。
【図１７】図17Aは、組換えアクチビン-AおよびsActRIIBによる処置後のTOV-21G、MRC-5、CCD-LuおよびTHP-1細胞培養物におけるVEGFレベルのグラフを示している。*p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；studentのt検定；n＝3。図17Bは、組換えアクチビン-AおよびsActRIIBによる処置後のMRC-5およびCCD-Lu細胞培養物におけるAng-1レベルのグラフを示している。*p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；studentのt検定；n＝3。
【図１８】組換えアクチビン-AおよびsActRIIBによる処置後のTOV-21G、BAEC、MRC-5、CCD-Lu、U937およびTHP-1細胞培養物におけるアクチビン-A mRNA発現レベルのグラフを示している。
【図１９】ヌードマウスにおけるヒトG361黒色腫異種移植片の増殖に対するsActRIIB処置の効果およびヌードマウスにおける5637膀胱癌異種移植片の増殖に対するアクチビン-A抗体の効果を示している。*p＜0.05；** p＜0.01。
【図２０】Oncomineマイクロアレイデータベースの分析に基づく、さまざまな細胞型におけるアクチビン-A転写物のレベルを示している。
【図２１】雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスにおける体重に対する、sActRIIBの単回用量、投与中止、および再投与量の効果を示している。雌性Inhα KOマウスの体重を平均±SEMとしてプロットした；*** sActRIIBにより処置したInhα KO群とPBSとの比較でp＜0.001。sActRIIBで処置したInhα KO群とWT群との比較で、& p＜0.05および&& p＜0.01。### PBSで処置したInhα KO群とWT群との比較でp＜0.001。
【図２２】sActRIIBの単回用量に起因する雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスにおける生存率のグラフを示しており、カイ二乗値＝23.72、P値＜0.0001であり、生存曲線は有意に異なる。生存データは、GraphPad Prism 5.0 Softwareを用いてカイ二乗t検定によって解析した。p＜0.0001：sActRIIBとPBSとの比較、n＝8〜18。
【図２３】sActRIIBの単回用量から2週後の時点の雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスにおける卵巣腫瘍重量を描写している棒グラフである。データは平均±SEMとしてプロットした；** p＜0.01。標準的なStudentの両側t検定（MS Excel 5.0）、n＝8。
【図２４】sActRIIBの単回用量から8週後、ならびにsActRIIBの単回での再投与（第8週）から12週後の時点の雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスにおける卵巣腫瘍重量を描写している棒グラフである。データは平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001。
【図２５】TOV-21G腫瘍担持マウスの体重に対するsActRIIBとドキソルビシンとの組み合わせの効果に関するグラフを示している。体重を長期的に記録した。データは平均±SEMとしてプロットした。n＝10〜18匹／群。統計的有意性は、aaap＜0.001：TOV-21G＋sActRIIBとTOV-21G＋PBSとの比較；bb p＜0.01、bbb p＜0.001：TOV-21G＋sActRIIBと正常＋PBSとの比較；c p＜0.05 TOV-21G＋DOXと正常＋PBSとの比較；dd p＜0.01：TOV-21G＋DOX＋sActRIIBと正常＋PBSとの比較；eee p＜0.001：TOV-21G＋DOX＋sActRIIBとTOV-21G＋PBSとの比較；ff p＜0.01、fff p＜0.001 TOV-21G＋DOX＋sActRIIBとTOV-21G＋DOX＋PBSとの比較によって表されている。
【図２６】TOV-21G腫瘍担持マウスの腫瘍サイズ（上）および重量（下）に対するsActRIIBとドキソルビシンとの併用の効果を示している。腫瘍サイズ（上のパネル）および腫瘍重量（下のパネル）を、平均±平均の標準誤差（SEM）としてプロットした；n＝10〜18匹／群。統計的有意性は、* p＜0.05、** p＜0.01：TOV-21G＋DOX＋sActRIIBとTOV-21G＋PBSとの比較；# p＜0.05；## p＜0.01：TOV-21G＋DOXとTOV-21G＋PBSとの比較；& p＜0.05：TOV-21G＋DOX＋sActRIIBとTOV-21G＋DOXとの比較によって表されている。
【図２７】TOV-21G腫瘍担持マウスの筋肉量に対するsActRIIBとドキソルビシンとの組み合わせの効果を図示した棒グラフを示している。除脂肪屠体重量および腓腹筋重量を最終剖検時に決定した。データは平均＋SEMとしてプロットした；n＝10〜18匹／群。統計的有意性は* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001によって表されている。
【図２８】雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの血清アクチビンAレベルに対するアクチビン-A抗体の効果を図示した棒グラフを示している。雌性Inhα KOマウス群における遊離アクチビンAレベルの測定値を平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001および** p＜0.01。
【図２９】雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの体重に対するアクチビン-A抗体処置の効果を示している。雌性Inhα KOマウスの体重の測定値を平均±SEMとしてプロットした；** p＜0.01および*** p＜0.001、アクチビン-A抗体により処置したInhα KO群とPBSとの比較。& p＜0.05および&& p＜0.01、アクチビン-A抗体で処置したInhα KO群とPBSで処置したWT群との比較。# p＜0.05、PBSで処置したInhα KO群とPBSで処置したWT群との比較。
【図３０】雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの除脂肪体重および体脂肪量に対するアクチビン-A抗体処置の効果を示している。雌性Inhα KOマウスの除脂肪体重（上のパネル）および体脂肪量（下のパネル）の測定値を平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001および** p＜0.01、アクチビン-A抗体により処置したInhα KO群とPBSとの比較。&&& p＜0.001、アクチビン-A抗体で処置したInhα KO群とPBSで処置したWT群との比較。### p＜0.001、PBSで処置したInhα KO群とPBSで処置したWT群との比較。
【図３１】雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの腓腹筋重量に対するアクチビン-A抗体処置の効果を図示した棒グラフを示している。除脂肪筋重量を平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001、** p＜0.01、*p＜0.05。
【図３２】図32Aは、雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの卵巣重量に対するアクチビン-A抗体処置の効果を示している。データは平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001、** p＜0.01。図32Bは、雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの子宮重量に対するアクチビン-A抗体処置の効果を示している。データは平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001、** p＜0.01。
【図３３】雌性Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの血清VEGFレベルに対するアクチビン-A抗体処置の効果を図示した棒グラフを示している。血清VEGFレベルの測定値を平均±SEMとしてプロットした；*** p＜0.001、*p＜0.05。
【図３４】Inhα KOマウスおよび野生型同腹仔対照マウスの卵巣腫瘍組織におけるVEGFおよびアンジオポエチン-1のタンパク質発現レベルに対するアクチビン-A抗体処置の効果を示している。上のパネル：卵巣組織切片上のVEGFおよびAng-1免疫染色（灰色がかった青色）の代表的画像。核はFast Redで対比染色した。棒グラフ：各群当たり3匹からの卵巣切片におけるVEGFおよびAng-1の免疫反応性をMetamorphソフトウエアによる画像化によって定量し、平均±SEMとしてプロットした。*** p＜0.001および*p＜0.05。
【図３５】TOV-21G腫瘍担持マウスの体重に対する、アクチビン-A抗体とドキソルビシンとの併用の効果を示している。体重を長期的に記録した。矢印はドキソルビシン投与のタイミングを指し示している。データは平均±SEMとしてプロットした；n＝各群当たり8〜14匹。群間差の解析には、標準的なStudentの両側t検定（MS Excel 5.0）を用いた。統計的有意性は、*：p＜0.05：正常とTOV-21G＋PBSとの比較；#：p＜0.05、##：p＜0.01、###：p＜0.001：正常とTOV-21G＋DOXとの比較；￥：p＜0.05：TOV-21G＋PBSとTOV-21G＋アクチビンAbとの比較によって表されている。
【図３６】TOV-21G腫瘍担持マウスの腫瘍サイズに対するアクチビン-A抗体とドキソルビシンとの併用の効果を示している。腫瘍サイズの測定値を平均±平均の標準誤差（SEM）としてプロットした；n＝各群当たり8〜14匹。群間差の解析には、標準的なStudentの両側t検定（MS Excel 5.0）を用いた。統計的有意性は、* p＜0.05、** p＜0.01：TOV-21G＋アクチビンAbとTOV-21G＋PBSとの比較、## p＜0.01；###：p＜0.001：TOV-21G＋DOXとTOV-21G＋PBSとの比較；&& p＜0.01；&&& p＜0.001：TOV-21G＋DOX＋アクチビンAbとTOV-21G＋PBSとの比較；￥ p＜0.05；￥￥ p＜0.01：TOV-21G＋DOX＋アクチビンAbとTOV-21G＋DOXとの比較によって表されている。
【図３７】TOV-21G腫瘍担持マウスの腫瘍重量に対するアクチビン-A抗体とドキソルビシンとの併用の効果を示している。腫瘍重量の測定値を、平均±平均の標準誤差（SEM）としてプロットした；n＝各群当たり8〜14匹。群間差の解析には、標準的なStudentの両側t検定（MS Excel 5.0）を用いた。統計的有意性は、*：p＜0.05；**：p＜0.01；*** ：p＜0.001によって表されている。
【図３８】TOV-21G腫瘍担持マウスの筋肉量に対するアクチビン-A抗体とドキソルビシンとの併用の効果を示している。除脂肪屠体重量および腓腹筋重量を、最終的な剖検手技時に決定した。データは平均＋SEMとしてプロットした；n＝各群当たり8〜14匹。群間差の分析には、標準的なStudentの両側t検定（MS Excel 5.0）を用いた。統計的有意性は、*：p＜0.05；**：p＜0.01；*** ：p＜0.001によって表されている。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本発明は、アクチビン-Aを遮断することの効果に関する。アクチビン-Aをインビボで遮断することにより、いくつかの腫瘍血管新生因子が減少して腫瘍の新血管形成が防止され、それにより、腫瘍アポトーシスが誘導される。いくつかの局面において、本発明は、さまざまな因子の対象の発現レベルを評価する段階によって、対象における卵巣癌を同定するための方法を提供する。いくつかの局面において、本発明はまた、抗アクチビン-A抗体およびアクチビン受容体を含む抗アクチビン-A化合物を対象に投与する段階によって、漿液性卵巣癌を含む卵巣癌を治療する方法も提供する。いくつかの局面において、本発明はさらに、少なくとも1つの抗アクチビン-A化合物および1つの化学療法化合物を対象に投与する段階によって、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌、顆粒膜細胞卵巣癌、ライディッヒ細胞腫、および性索間質性精巣腫瘍を含む卵巣癌を治療する方法を提供する。
【００２２】
1つまたは複数の態様の詳細を以下の説明に示す。他の特徴、目的、および利点は、その説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２３】
アクチビン-Aは、ポリペプチド鎖βAのホモ二量体である（GenBankアクセッション番号：NM_002192を参照のこと）。アクチビンA、B、およびABはそれぞれ、2つのポリペプチド鎖βAおよびβBのホモ二量体およびヘテロ二量体である。「アクチビン」という用語は、アクチビン-A、-B、および-AB、ならびにそのタンパク質の変異体および種相同体のことを指す。
【００２４】
本発明は、アクチビン-Aを作動させる（agonize）かまたはアクチビン-Aに拮抗する分子および抗原結合タンパク質、例えばアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）、svActRIIB断片、svActRIIB誘導体、抗アクチビン-A抗体、抗体断片、および抗体誘導体、例えば、拮抗性抗アクチビン-A抗体、抗体断片、または抗体誘導体などを含む、アクチビン-Aと結合する分子に関係する組成物、キット、および方法を提供する。また、アクチビン-Aの一部分、例えばアクチビン-Aのアミノ酸R13〜Y39またはアミノ酸V82〜N107などと特異的に結合する分子に関係する組成物、キット、および方法も提供される。そのような分子には、抗体、抗体断片、および抗体誘導体が含まれうる。また、アクチビン-Aと結合するポリペプチドの全体または一部分をコードするヌクレオチドの配列、例えば、アクチビンIIB受容体、svActRIIB断片、svActRIIB誘導体、抗アクチビン-A抗体、抗体断片、抗体変異体、または抗体誘導体の全体または一部をコードする核酸、そのような核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにそのような核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞または細胞株などを含む、核酸ならびにその誘導体および断片も提供される。提供される方法には、例えば、アクチビン-Aと結合する分子、例えばアクチビンIIB受容体、抗アクチビン-A抗体などを作製、同定、または単離する方法、ある分子がアクチビン-Aと結合するか否かを判定する方法、アクチビン-Aと結合する分子を含む組成物、例えば薬学的組成物などを作製する方法、ならびにアクチビン-Aと結合する分子を対象に投与するための方法、例えば、アクチビン-Aによって媒介される病状を治療するため、およびアクチビン-Aの生物活性をインビボまたはインビトロでモジュレートするための方法が含まれる。
【００２５】
本発明は、完全長アクチビン-Aとも結合する抗体によって認識されるシステインノットドメインを含むヒトアクチビン-Aの領域、および／またはアクチビン-Aのシステインノット領域と一部重複するかもしくはそれを範囲に含むアクチビン-Aの領域、ならびにこれらのシステインノットドメインを作製および使用する方法に関する。本発明はまた、アクチビン-Aまたはアクチビン-Aの一部分と特異的に結合する、抗体を含む抗原結合性物質、およびそのような結合性物質を用いるための方法も提供する。結合性物質は、1つまたは複数のリガンドに対するヒトアクチビン-Aの結合を遮断するかまたは弱めるために有用である。
【００２６】
アクチビンは、構造的に関連のある2つのクラスのセリン／トレオニンキナーゼ受容体（I型およびII型）と相互作用することができる。インヒビンは、プロテオグリカン、βグリカンと結合し、II型アクチビン受容体と安定的な複合体を形成して、それによってそれを封鎖する一方で、I型受容体を排除することによって、アクチビンに拮抗する。アクチビンには2つの主要な型が存在し：アクチビン-AはβA-サブユニットのホモ二量体であり、アクチビンBはβB-サブユニットのホモ二量体である（Vale, et al., Recent Prog Horm Res V. 44: 1-34, 1988）。いずれのβ-サブユニットとも類似していないα-サブユニットのヘテロ二量体は、機能的アンタゴニストであるインヒビンを生じる。
【００２７】
文献により、アクチビン-Aは癌組織において過剰発現されること、および／または局在することが示されている。例えば、子宮内膜癌および子宮頸癌を有する女性では、高レベルの血清アクチビン-Aが見いだされている（Petraglia, F. et al., Jour. Clin. Endocrin. Metab. 83: 1194-1200, 1998）。アクチビン-Aは、病期IVの結腸直腸癌において過剰発現されていた（Wildi, S. et al., Gut 49:409-417, 2001）。卵巣癌におけるアクチビン-Aの役割も報告されている（Steller, M.D. et al., Mol. Cancer Res. 3:50-61, 2005）。
【００２８】
また文献により、腎疾患におけるアクチビン-Aの関与も示唆されている（Yamashita, S. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 15:91-101, 2004）。正常対象および疾患を有する患者における血清中の免疫反応性アクチビン-Aレベルは、Harada, K. et al. in J. Clin. Endocrin. and Metab. 81:2125-2130, 1996によって報告されている。アクチビン-Aは、腎間質線維芽細胞の強力な活性化物質である（Harada, K. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15:91-101, 2004）。糸球体アクチビン-Aの過剰発現は、抗Thy1糸球体腎炎における線維症と関連づけられている（Gaedeke, J. et al., Neph. Dial. Transpl. 20:319-328, 2005）。
【００２９】
心不全患者における血清アクチビン-Aレベルは、疾患重症度に応じて増大していた（Yndestal et al., Circulation 109: 1379-1385, 2004）。心不全のラットモデルでは、血清アクチビン-Aは心筋梗塞の直後に増加して6カ月間持続し、アクチビン-A免疫染色は心筋細胞のみに局在していた（Yndestad et al., 2004）。心不全におけるアクチビン-Aレベルの増加が報告されている（Yndestad, A. et al., Circulation 709: 1379-1385, 2004）。
【００３０】
本明細書において別に定める場合を除き、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別様に必要とされる場合を除き、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、ならびにそれらの手法は、当技術分野において周知であって一般的に用いられるものである。本発明の方法および手法は、別に指定される場合を除き、一般に、当技術分野において周知であり、本明細書の全体を通じて引用および考察されるさまざまな一般的な参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているような、従来の方法に従って行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)およびHarlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み入れられる。酵素反応および精製手法は、当技術分野において一般的に遂行されるような、または本明細書に記載されるような、製造元の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに薬学的化学および製薬化学に関連して用いられる専門用語、ならびにその検査手技および手法は、当技術分野において周知であり一般的に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製物、製剤化、および送達、ならびに患者の治療のためには、標準的な手法を用いることができる。
【００３１】
以下の用語は、別に指定される場合を除き、以下の意味を有すると解釈されるものとする。
【００３２】
「単離された分子」という用語（分子が、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体である場合）は、その起源または由来源のために、（1）そのネイティブ状態でそれに随伴する、少なくとも1つの天然に付随する構成要素が付随していない、（2）同じ種の他の分子を実質的に含まない、（3）異なる種の細胞によって発現される、または（4）天然に存在しない、分子のことである。したがって、化学的に合成されるか、またはそれが天然に生じる細胞と異なる細胞系において合成される分子は、その天然に付随する構成要素から「単離」されていると考えられる。また、分子を、当技術分野において周知の精製手法を用いる単離によって、天然に付随する構成要素を実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度または均一性は、当技術分野において周知のいくつかの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、当技術分野において周知の手法を用い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を用いてアッセイすることができる。ある種の目的には、HPLCまたは当技術分野において周知の精製のための他の手段を用いることによって、より高い分解能を得ることができる。
【００３３】
「抗アクチビン-A化合物」、「アクチビン-A阻害物質」および「アクチビン-Aアンタゴニスト」という用語は互換的に用いられる。それぞれは、アクチビン-Aの機能の少なくとも1つを検出可能な程度に阻害する分子である。その反対に、「アクチビン-Aアゴニスト」とは、アクチビン-Aの機能の少なくとも1つを検出可能な程度に増大させる分子のことである。アクチビン-A阻害物質によって引き起こされる阻害は、それがアッセイ法を用いて検出可能である限り、完全である必要はない。アクチビン-Aの機能に関するあらゆるアッセイ法を用いることができ、その例は本明細書に提示されている。アクチビン-Aの機能の例には、アクチビン-A阻害物質によって阻害されうる、またはアクチビン-Aアゴニストによって増大する、アクチビン-Aとの結合が含まれる。アクチビン-A阻害物質およびアクチビン-Aアゴニストの種類の例には、抗原結合タンパク質（例えば、アクチビン-A阻害性の抗原結合タンパク質）、アクチビンIIB受容体（svActRIIB）、svActRIIB断片、svActRIIB誘導体、抗体、抗体断片および抗体誘導体といった、アクチビン-A結合性ポリペプチドが非限定的に含まれる。
【００３４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語はそれぞれ、ペプチド結合によって互いに結びつけられた2つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含む分子のことを指す。これらの用語は、例えば、ネイティブなタンパク質および人工タンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチド類似体（ムテイン、変異体および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後にまたは他の様式で共有結合性もしくは非共有結合性に改変されたタンパク質を範囲に含む。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体であっても重合体であってもよい。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、標準的な1文字または3文字略号を用いて指し示される。別に指定される場合を除き、ポリペプチド配列はそのアミノ末端を左側に、そのカルボキシ末端を右側に有し、一本鎖核酸配列および二本鎖核酸配列の上鎖（top strand）は、その5'末端を左側に、その3'末端を右側に有する。また、特定のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を、それが参照配列とどのように異なるかを説明することによって記述することもできる。別に指定する場合を除き、ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列はそれぞれ、列記された各核酸またはアミノ酸のほかに、介在性の核酸またはアミノ酸も含むものと解釈される。例えば、ポリペプチド配列R13〜Y39は、アミノ酸R13およびY39、ならびにポリペプチド配列中のR13とY39との間に見いだされるアミノ酸を含むポリペプチド配列を記述している。これに対応して、ポリヌクレオチド配列C1〜T5は、核酸C1およびT5、ならびに配列の位置2、3および4にある核酸を含むポリヌクレオチド配列を記述している。したがって、SEQ ID NO：1〜5の名称は、同様に、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：5という包括的な群を指定している。なお、アミノ酸のグループ分けも、別様に指定されない限り、包括的であることを意図している。例えば、「SEQ ID NO：28のアミノ酸1〜5」という語句は、SEQ ID NO：28の位置1、2、3、4、および5にあるアミノ酸を含む。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、例えば、（1）タンパク質分解に対する感受性を低下させるため、（2）酸化に対する感受性を低下させるため、（3）タンパク質複合体の形成に関する結合親和性を変化させるため、（4）結合親和性を変化させるためおよび（4）他の物理化学的特性または機能的特性を付与または改変するために、あらゆる方法で、かつあらゆる理由で改変されたポリペプチドを含む。類似体には、ポリペプチドのムテインが含まれる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列の中に（例えば、分子間接触を形成するドメインの外側にあるポリペプチドの部分に）作製することができる。「保存的アミノ酸置換」とは、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないもののことである（例えば、置き換えられたアミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊する傾向、または親配列を特徴決定するかもしくはその機能性のために必要である、他の種類の二次構造を撹乱する傾向を有するべきではない）。当技術分野で認知されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；およびThornton et al. Nature 354: 105 (1991)に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【００３６】
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書で用いる場合、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に欠失を有するポリペプチドのことを指す。断片は、例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150、または200アミノ酸の長さであってよい。断片はまた、例えば、最大で1,000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11、または10アミノ酸の長さであってもよい。断片は、その末端のいずれか一方または両方に、1つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、異なる天然のタンパク質（例えば、Fcもしくはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）由来のアミノ酸の配列をさらに含みうる。
【００３７】
ポリペプチド（例えば、抗体）の「変異体」は、ネイティブなポリペプチド配列に比して、1つまたは複数のアミノ酸残基が挿入された、除去されたおよび／または置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、ネイティブなポリペプチドと本質的に同じ生物活性を保つ。ポリペプチドの生物活性は、当技術分野において標準的な手法を用いて測定することができる（例えば、変異体が抗体である場合、その活性は、本明細書に記載されるような結合アッセイ法によって試験することができる）。本発明の変異体には、断片、類似体、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドおよび／または融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドの「誘導体」とは、例えば、別の化学成分、例えばポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などに対する結合体化、リン酸化およびグリコシル化を介して化学的に改変されたポリペプチド（例えば、抗体）のことである。別に指定する場合を除き、「抗体」という用語は、2つの完全長重鎖および2つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、およびムテインを含み、その例は以下に記載されている。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、全体を通じて互換的に用いられ、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたDNAまたはRNAの類似体（例えば、ペプチド核酸および非天然に存在するヌクレオチド類似体）およびそれらのハイブリッドが含まれる。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。1つの態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその断片、誘導体、ムテインもしくは変異体をコードする連続したオープンリーディングフレームを含む。
【００３９】
2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、「同一性」パーセントという用語は、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行い、GAPコンピュータープログラム（GCG Wisconsin Package、バージョン10.3（Accelrys, San Diego, CA）の一部）をそのデフォールトパラメーターを用いて用いることによって決定した場合に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基が指定のパーセンテージを有する、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列のある領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在することもでき、または代替的に、比較される2つの配列の全長にわたって存在することもできる。
【００４０】
配列比較のためには、典型的には、1つの配列を、被験配列と比較するための参照配列として役立てる。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。続いて、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムのパラメーターに基づいて、参照配列を基準として被験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００４１】
2つの一本鎖ポリヌクレオチドは、1つのポリヌクレオチド中のあらゆるヌクレオチドが、ギャップの導入を伴わず、かついずれの配列の5'末端にも3'末端にも非対合ヌクレオチドを伴わずに、他のポリヌクレオチド中のその相補的ヌクレオチドと正対するように、それらの配列を逆平行の向きにアラインメントすることができるならば、互いの「相補体」である。ポリヌクレオチドは、2つのポリヌクレオチドが、中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしうるならば、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、その相補体になることなく、別のポリヌクレオチドに対して相補的でありうる。
【００４２】
「ベクター」とは、それと連結された別の核酸を細胞内に導入するために用いうる核酸のことである。ベクターの1つの種類は「プラスミド」であり、これは追加の核酸セグメントを内部にライゲートすることができる線状または環状の二本鎖DNA分子のことを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製能を欠くレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、この場合には追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中に導入することができる。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。また他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、その結果、宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を導きうるベクターの一種である。
【００４３】
ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは部位）に影響を及ぼすならば、調節配列と「機能的に連結している」。「調節配列」とは、それと機能的に連結している核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは部位）に影響を及ぼす核酸のことである。調節配列は、例えば、調節される核酸に対してその効果を直接的に発揮してもよく、または1つもしくは複数の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸と結合するポリペプチド）の作用を介して発揮してもよい。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列のさらなる例は、例えば、Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06に記載されている。
【００４４】
「宿主細胞」とは、核酸、例えば本発明の核酸を発現させるために用いうる細胞のことである。宿主細胞は原核生物、例えば、大腸菌（E. coli）であってもよく、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマトの植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例には、CS-9細胞、サル腎細胞のCOS-7株（ATCC CRL 1651）（Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175を参照のこと）、L細胞、C127細胞、3T3細胞（ATCC CCL 163）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、またはそれらの誘導体、例えば、無血清培地中で増殖するVeggie CHO細胞株および関連細胞株など（Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31）、HeLa細胞、BHK（ATCC CRL 10）細胞株、アフリカミドリザル腎細胞株CV1に由来するCV1／EBNA細胞株（ATCC CCL 70）（McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821）、ヒト胎児腎細胞、例えば293、293 EBNAまたはMSR 293など、ヒト表皮A431細胞、ヒトColo205細胞、他の形質転換された霊長動物細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養物に由来する株化細胞、初代移植片、HL-60、U937、HaKまたはJurkat細胞が含まれる。典型的には、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸によって形質転換またはトランスフェクションを行うことができる培養細胞であり、続いてこの核酸を宿主細胞において発現させることができる。「組換え宿主細胞」という語句は、発現させようとする核酸によって形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主細胞を表すために用いうる。宿主細胞はまた、核酸を含むものの、調節配列が宿主細胞に導入されて、その結果、それが核酸と機能的に連結されなければ、核酸を所望のレベルで発現しない細胞であってもよい。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものと了解されたい。突然変異または環境的影響のいずれかに起因してある種の改変が後続世代で起こりうるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるものの、それでもなお、本明細書で用いるこの用語の範囲に含まれる。
【００４５】
核酸
1つの局面において、本発明は単離された核酸分子を提供する。核酸には、例えば、抗原結合タンパク質の全体または一部、例えば、本発明の抗体の一方もしくは両方の鎖、またはその断片、誘導体、ムテイン、もしくは変異体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異導入、または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーまたはシークエンシング用プライマーとして用いるのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸および前記のものの相補的配列が含まれる。核酸は任意の長さであってよい。それらは、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000個のヌクレオチド、もしくはそれ以上の長さであってよく、かつ／または1つもしくは複数の追加の配列、例えば、調節配列を含んでもよく、かつ／またはより長い核酸、例えばベクターの一部であってもよい。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、RNAおよび／またはDNAヌクレオチド、ならびにそれらの人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含んでもよい。
【００４６】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードする核酸は、アクチビン-Aによる免疫処置を受けたマウスのB細胞から単離することができる。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの従来の手技によって単離することができる。
【００４７】
重鎖の可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列は本明細書に示されている。当業者は、遺伝暗号の縮重性のために、本明細書に開示されるポリペプチド配列のそれぞれが多数の他の核酸配列によってコードされることを理解するであろう。本発明は、本発明の各抗原結合タンパク質をコードするそれぞれの縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、他の核酸（例えば、A1〜A14のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）と特定のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は当技術分野において周知である。例えば、Curr. Prot. in Mol. Biol, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6を参照のこと。本明細書において定義する場合、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、5×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、0.5％ SDS、1.0mM EDTA（pH 8.0）を含有する予洗溶液、約50％ホルムアミド、6× SSCのハイブリダイゼーション緩衝液および55℃のハイブリダイゼーション温度（または他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば約50％ホルムアミドを含有するものなどを、42℃のハイブリダイゼーション温度で）および0.5× SSC、0.1％ SDS中、60℃の洗浄条件を用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、6× SSC中にて45℃でハイブリダイズさせ、その後に0.1× SSC、0.2％ SDS中にて68℃で1回または複数回の洗浄を行う。さらに、当業者は、互いに少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98、または99％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままに保たれるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めるかまたは低下させるために、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメーターおよび適した条件を考案するための手引きは、例えば、Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11；およびCurr. Prot. in Mol. Biol. 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4）に記載されており、例えば、DNAの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定されうる。
【００４９】
変異によって核酸に変化を導入し、それにより、それがコードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列の変化をもたらすことができる。変異は、当技術分野において公知の任意の手法を用いて導入することができる。1つの態様においては、1つまたは複数の特定のアミノ酸残基を、例えば、部位特異的変異誘発プロトコールを用いて変化させる。別の態様においては、1つまたは複数のランダムに選択された残基を、例えば、ランダム変異誘発プロトコールを用いて変化させる。しかし、変異型ポリペプチドを発現させて、所望の特性（例えば、アクチビン-Aとの結合）に関してスクリーニングすることもできる。
【００５０】
核酸への変異の導入は、それがコードするポリペプチドの生物活性を著しく変化させずに行うことができる。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を作製することができる。1つの態様においては、A1〜A14に関して本明細書に提供されるヌクレオチド配列、またはその所望の断片、変異体、もしくは誘導体を、それが、A1〜A14に関して本明細書に示されているアミノ酸残基の1つまたは複数の欠失または置換を含むアミノ酸配列をコードし、2つまたはそれ以上の配列が異なるような残基となるように、変異導入する。本明細書において記載する場合、特に、A1〜A14とは、14種の配列、A1およびA14、ならびに12個の介在性アミノ酸残基のことを指す。別の態様においては、変異誘発により、2つまたはそれ以上の配列が異なるような残基となるように、A1〜A14に関して本明細書において示されている1つまたは複数のアミノ酸残基に隣接してアミノ酸が挿入される。または、核酸に、それがコードするポリペプチドの生物活性（例えば、アクチビン-Aの結合）を選択的に変化させる1つまたは複数の変異を導入することもできる。例えば、変異は生物活性を量的または質的に変化させることができる。量的変化の例には、活性を増大させる、低下させる、または除去することが含まれる。質的変化の例には、抗原結合タンパク質の抗原特異性を変化させることが含まれる。
【００５１】
別の局面において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに適した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして用いうる断片、または本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、アクチビン-A結合部分）をコードする断片を含みうる。
【００５２】
本発明の核酸の配列に基づくプローブは、核酸または類似の核酸、例えば、本発明のポリペプチドをコードする転写物を検出するために用いることができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素または酵素補因子などを含むことができる。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために用いることができる。
【００５３】
発現ベクター
本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム性哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが非限定的に含まれる。
【００５４】
本発明の別の局面においては、本発明の核酸分子およびポリヌクレオチドを含有する発現ベクターも提供され、そのようなベクターによって形質転換された宿主細胞、ならびにポリペプチドを生産する方法も提供される。「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターのことを指す。ポリペプチドの発現のためのベクターは、ベクターの増殖およびクローニングされた挿入物の発現のために必要な最小限の配列を含有する。発現ベクターは、（1）遺伝子発現における調節の役割を有する1つまたは複数の遺伝要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、（2）mRNAへと転写されてタンパク質へと翻訳される、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列、ならびに（3）適切な転写開始配列および終結配列、の集成物を含む転写ユニットを含む。これらの配列が選択マーカーをさらに含んでもよい。宿主細胞における発現のために適したベクターは容易に入手可能であり、核酸分子は標準的な組換えDNA手法を用いてベクター中に挿入される。そのようなベクターには、特定の組織において機能するプロモーターおよび標的とするヒト細胞または動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのウイルスベクターが含まれうる。例えば、svActRIIBの発現のために適した発現ベクターは、svActRIIBポリヌクレオチドを含有するpDSRa（WO 90／14363に記載、これは参照により本明細書に組み入れられる）およびその誘導体、ならびに当技術分野において公知の任意のさらなる適したベクターである。
【００５５】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現のために適した形態で含みうる。組換え発現ベクターは、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択された1つまたは複数の調節配列を含み、それは発現させようとする核酸配列と機能的に連結している。調節配列には、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの（例えば、SV40初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、ある種の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列、Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237を参照のこと。これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）および特定の治療または状態に応じてヌクレオチド配列の誘導性発現を導くもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニン（metallothionin）プロモーター、ならびに原核細胞系および真核細胞系の両方におけるtet応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同上参照）が含まれる。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存しうることが理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより、本明細書に記載されるような核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【００５６】
本発明はさらに、ポリペプチドを作製するための方法を提供する。種々の他の発現系／宿主系を用いてもよい。ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクションの手法を介して原核細胞系または真核細胞系に導入することができる。これらの系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌（例えば、大腸菌）などの微生物；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）によってトランスフェクトされるか、もしくは細菌性発現ベクター（例えば、TiもしくはpBR322プラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が非限定的に含まれる。組換えタンパク質の生産に有用な哺乳動物細胞には、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、またはそれらの誘導体、例えば、無血清培地中で増殖するVeggie CHO細胞株および関連細胞株（Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31を参照のこと）、またはDHFRが欠損したCHOのDX-B11株（Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20を参照のこと）など、COS細胞、例えばサル腎細胞のCOS-7株（ATCC CRL 1651）（Gluzman et al., 1981, Cell 23:175を参照のこと）など、W138、BHK、HepG2、3T3（ATCC CCL 163）、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、L細胞、C127細胞、BHK（ATCC CRL 10）細胞株、アフリカミドリザル腎細胞株CV1に由来するCV1／EBNA細胞株（ATCC CCL 70）（McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821を参照のこと）、ヒト胎児腎細胞、例えば293、293 EBNA、またはMSR 293など、ヒト表皮A431細胞、ヒトColo205細胞、他の形質転換された霊長動物細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する株化細胞、初代移植片、HL-60、U937、HaK、またはJurkat細胞が非限定的に含まれる。哺乳動物での発現により、増殖培地から回収しうる分泌性または可溶性のポリペプチドの生産が可能になる。
【００５７】
哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションに関しては、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション手法によっては、外来性DNAがゲノム中に組み込まれるのは細胞のごくわずかな割合に過ぎないことが知られている。これらの組み込み体を同定して選択する目的で、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性に関するもの）をコードする遺伝子が、関心対象の遺伝子とともに、宿主細胞に一般に導入される。ひとたびそのような細胞が、選択可能なマーカーならびに所望の発現カセットを含有するベクターによって形質転換されたところで、細胞を強化培地中で増殖させて、その後にそれらを、例えば選択培地に切り換えることができる。選択可能なマーカーは、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収が可能になるように設計される。安定的に形質転換された細胞の耐性細胞塊を、使用する細胞株に適した組織培養手法を用いて増殖させることができる。組換えタンパク質の発現に関する概説は、Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990)に見ることができる。好ましい選択可能なマーカーには、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸によって安定的にトランスフェクトされた細胞は、いくつかある方法の中でも特に、薬物選択（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
【００５８】
原核細胞系を用いる発現などのいくつかの場合において、発現された本発明のポリペプチドを、生物学的に活性にするために、「リフォールディング」および酸化によって適正な三次構造にして、ジスルフィド結合を生じさせることが必要なことがある。リフォールディングは、当技術分野において周知のいくつかの手法を用いて実現することができる。そのような方法には、例えば、可溶化されたポリペプチドを、カオトロピック剤の存在下で通常は7を上回るpHに曝露させることが含まれる。カオトロープの選択は、封入体の可溶化のために用いられる選択と同様である；しかし、カオトロープは典型的にはより低い濃度で用いられる。例示的なカオトロピック剤はグアニジンおよび尿素である。ほとんどの場合には、リフォールディング／酸化溶液は、還元剤も、その酸化型に加えて、システイン架橋の形成のためにジスルフィド・シャフリングが起こることを可能にする特定の酸化還元電位を生じる特定の比で含有すると考えられる。いくつかの一般的に用いられる酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオスレイトールDTT／ジチアンDTTおよび2-メルカプトエタノール（bME）／ジチオ-bMEが含まれる。多くの場合には、リフォールディングの効率を高めるために共溶媒を用いてもよい。一般的に用いられる共溶媒には、グリセロール、さまざまな分子量のポリエチレングリコールおよびアルギニンが含まれる。
【００５９】
加えて、本発明のタンパク質およびポリペプチドを、従来の手法に従って、溶液中または固体支持体上で合成することも可能である。さまざまな自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984)；Tarn et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983)；Merrifield, Science 232:341-347 (1986)；Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284；Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987)を参照のこと。
【００６０】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製手法に従って精製することができる。これらの手法は、1つの段階で、タンパク質性画分および非タンパク質性画分の粗分別を伴う。ペプチド、ポリペプチドが他のタンパク質から分離されたところで、クロマトグラフィーおよび電気泳動の手法を用いて、関心対象のペプチドまたはポリペプチドをさらに精製して、部分的または完全な精製（または均質になるまでの精製）を達成することができる。「精製されたポリペプチド」という用語は、本明細書で用いる場合、ポリペプチドがその天然に得られる状態に比してある程度精製されている、他の構成要素から単離しうる組成物を指すことを意図している。精製されたポリペプチドは、このため、天然に存在しうる環境から隔たれたポリペプチドのことも指す。一般に、「精製された」とは、さまざまな他の構成要素を除去するための分別に供されたポリペプチド組成物のことを指すと考えられ、その組成物はその発現された生物活性を実質的に保っている。「実質的に精製された」という用語が用いられる場合、この表記は、ポリペプチドまたはペプチドが組成物の主要な構成要素をなしている、例えば、組成物中のタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約85％、もしくは約90％、またはそれ以上の割合を構成する、ペプチド組成物またはポリペプチド組成物のことを指すと考えられる。
【００６１】
精製に用いるのに適したさまざまな手法が当業者には周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体（免疫沈降）などとの沈殿、または熱変性とその後の遠心分離；クロマトグラフィー、例えば、アフィニィークロマトグラフィー（プロテインAカラム）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなど、等電点電気泳動、ゲル電気泳動およびこれらの手法の組み合わせが含まれる。当技術分野において一般に公知であるように、さまざまな精製段階を実施する順序を変更してもよく、またはある特定の段階を省略してもよく、それでもなお、実質的に精製されたポリペプチドの調製のために適した方法がもたらされると考えられる。例示的な精製段階は以下の実施例において提示される。
【００６２】
ポリペプチドの精製の度合いを定量するためのさまざまな方法が、本開示に鑑みて当業者には公知であると考えられる。これらには、例えば、活性画分の特異的な結合活性を決定すること、または画分中のペプチドもしくはポリペプチドの量をSDS／PAGE分析によって評価することが含まれる。ポリペプチド画分の純度を評価するための1つの好ましい方法は、画分の結合活性を計算してそれを最初の抽出物の結合活性と比較し、そのようにして、本明細書において「精製倍数値」によって評価される精製の度合いを計算することである。結合活性の量を表す実際の単位は、当然ながら、精製を行うために選択された具体的なアッセイ手法およびポリペプチドまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すか否かに依存すると考えられる。
【００６３】
抗アクチビン-A抗体
アクチビン-Aは、アクチビン-Aをコードする遺伝子によってトランスフェクトされた宿主細胞から、塩勾配を用いるヘパリンHPカラムを用いた宿主細胞培養物の濾過上清の溶出によって精製することができる。
【００６４】
「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリンまたはその結合性断片のことを指す。抗体は、完全な抗体分子（完全長重鎖および／または軽鎖を有するポリクローナル性、モノクローナル性、キメラ性、ヒト化型またはヒト型を含む）を含んでもよく、またはその抗原結合性断片を含んでもよい。抗体断片には、F(ab')2、Fab、Fab'、Fv、FcおよびFd断片が含まれ、これらを単一ドメイン抗体、単鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NARおよびbis-scFvに組み込むことができる（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech., 23, 9, 1126-1136を参照のこと）。
【００６５】
Fab断片は、VL、VH、CL、およびCH1ドメインを有する一価断片である；F(ab')2断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を有する二価断片である；Fd断片はVHドメインおよびCH1ドメインを有する；Fv断片は、抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインを有する；dAb断片は、VHドメイン、VLドメイン、またはVHドメインもしくはVLドメインの抗原結合性断片を有する（米国特許第6,846,634号、同第6,696,245号、米国特許出願公開第05／0202512号、同第04／0202995号、同第04／0038291号、同第04／0009507号、同第03／0039958号、Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）。
【００６６】
具体的な軽鎖および重鎖可変ドメインのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、以下に記載されている。軽鎖および重鎖を含む抗体は、軽鎖可変ドメインの名称と重鎖可変ドメインの名称とを組み合わせることによって名づけられる。例えば、「L4H7」は、L4の軽鎖可変ドメインおよびH7の重鎖可変ドメインを含む抗体を指し示している。
【００６７】
κ軽鎖定常配列は、SEQ ID NO：84、100および108に示されており、重鎖定常配列はSEQ ID NO：214、215および221に示されている。これらの配列をコードするポリヌクレオチドは、軽鎖についてはそれぞれSEQ ID NO：222、223、および239に示されており、重鎖についてはそれぞれSEQ ID NO：240、241、および242に示されている。したがって、本明細書に開示されるような可変配列に加えて、抗体は、SEQ ID NO：84および214；またはSEQ ID NO：215および223；またはSEQ ID NO：108および221のうち一方または両方を含みうる。これらの配列は以下の表に示されている。
2016508504.tif 000005
2016508504.tif 000006
2016508504.tif 000007
2016508504.tif 000008
【００６８】
他の態様において、抗体は、相補的な軽鎖または重鎖可変ドメインが特定されないままで、特定の重鎖または軽鎖を含んでもよい。特に、本明細書におけるある態様は、相補的な重鎖または軽鎖が乱交雑性またはさらには無関係でさえありうるが、例えば、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって決定されるような、特定の軽鎖または重鎖を介して特定の抗原（アクチビン-Aなど）を結合させる抗体を含む。Portolano et al., J. Immunol. V. 150 (3), pp. 880-887 (1993)；Clackson et al., Nature v. 352 pp. 624-628 (1991)。
【００６９】
天然に存在する免疫グロブリン鎖は、比較的保存されているフレームワーク領域（FR）が相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって結びついている、同じ全体構造を示す。軽鎖および重鎖はいずれも、N末端からC末端の方向に、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991の定義に従う。
【００７０】
「ヒト抗体」という用語は、「完全ヒト抗体」とも称され、ヒト免疫グロブリン配列に由来する1つまたは複数の可変領域および定常領域を有するすべての抗体を含む。1つの態様において、可変ドメインおよび定常ドメインはすべて、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体はさまざまなやり方で調製することができ、その例は以下に記載されるが、これには、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝的に改変されたマウスへの関心対象の抗原による免疫処置によるものが含まれる。
【００７１】
ヒト化抗体は、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有し、その結果、ヒト化抗体はヒト対象に投与された場合に、非ヒト種抗体と比較して免疫応答を誘発する可能性が低く、かつ／またはより重度でない免疫応答を誘発する。1つの態様においては、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメインにおける特定のアミノ酸を変異して、ヒト化抗体を作製する。別の態様においては、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインと融合させる。別の態様においては、非ヒト抗体の1つまたは複数のCDR配列における1つまたは複数のアミノ酸残基を、ヒト対象に投与された場合の非ヒト抗体の予想される免疫原性を低下させるために変化させるが、変化したアミノ酸残基は、抗体のその抗原との免疫特異的結合にとって決定的ではないか、またはアミノ酸配列に加わる変化が保存的変化であるかのいずれかであり、その結果、ヒト化抗体の抗原との結合は、非ヒト抗体の抗原との結合よりも著しくは劣らない。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第6,054,297号、同第5,886,152号、および同5,877,293号に見ることができる。
【００７２】
「キメラ抗体」という用語は、1つの抗体由来の1つまたは複数の領域および1つまたは複数の他の抗体由来の1つまたは複数の領域を含む抗体のことを指す。1つの態様において、CDRの1つまたは複数はヒト抗アクチビン-A抗体に由来する。別の態様において、CDRはすべて、ヒト抗アクチビン-A抗体に由来する。別の態様においては、複数のヒト抗アクチビン-A抗体由来のCDRを混合し、マッチングを行ってキメラ抗体にする。例えば、キメラ抗体は、第1のヒト抗アクチビン-A抗体の軽鎖由来のCDR1、第2のヒト抗アクチビン-A抗体の軽鎖由来のCDR2およびCDR3、ならびに第3の抗アクチビン-A抗体由来の重鎖のCDRを含みうる。さらに、フレームワーク領域は、同じ抗アクチビン-A抗体の1つ、ヒト抗体などの1つもしくは複数の異なる抗体、またはヒト化抗体に由来しうる。キメラ抗体の一例において、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種由来の抗体と同一であるか、相同であるか、もしくはそれに由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し、一方、残りの鎖は、他の種由来の抗体と同一であるか、相同であるか、もしくはそれに由来する、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する。また所望の生物活性（すなわち、アクチビン-Aを特異的に結合させる能力）を示す、そのような抗体の断片も含まれる。
【００７３】
抗体の断片または類似体は、本明細書の教示に従い、当技術分野において周知の手法を用いて、当業者によって容易に調製されうる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界付近に存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データと、公開配列データベースまたは所有権下にある配列データベースとの比較によって同定することができる。コンピューター化された比較方法を用いて、公知の構造および／または機能を有する他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質高次構造ドメインを同定することができる。フォールディングして公知の三次元構造となるタンパク質配列を同定するための方法は公知である。例えば、Bowie et al., 1991, Science 253:164を参照のこと。
【００７４】
抗体に由来する抗原結合性断片は、例えば、抗体のタンパク質加水分解、例えば、従来の方法に従った抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。一例として、抗体断片を、F(ab')2と命名された5S断片を得るためのペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成させることができる。この断片を、チオール還元剤を用いてさらに切断して、3.5S Fab'一価断片を生成させることができる。任意で、切断反応を、ジスルフィド結合の切断によってもたらされるスルフヒドリル基に対する保護基を用いて行うこともできる。代替法として、パパインを用いる酵素的切断により、2つの一価Fab断片および1つのFc断片が直接生成される。これらの方法は、例えば、Goldenberg, 米国特許第4,331,647号、Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960；Porter, Biochem. J. 73:119, 1959；Edelman et al. , in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967)；およびAndrews, S.M. and Titus, J.A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, New York (2003), pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10A.1-2.10A.5によって記載されている。抗体を切断するための他の方法、例えば、重鎖を分離して一価軽鎖-重鎖断片（Fd）を形成させること、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的手法なども、断片が無傷の抗体によって認識される抗原と結合する限り、用いることができる。
【００７５】
また、抗体断片は、任意の合成タンパク質または遺伝的に操作されたタンパク質であってもよい。例えば、抗体断片には、軽鎖可変領域からなる単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子（scFvタンパク質）が含まれる。
【００７６】
別の型の抗体断片は、抗体の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）を含むペプチドである。CDR（「最小認識単位」または「超可変領域」とも呼ばれる）を分子内に共有結合性または非共有結合性に組み入れて、それを抗原結合性タンパク質にすることができる。CDRは、関心対象のCDRをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、抗体産生細胞のmRNAをテンプレートとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、可変領域を合成することによって調製される（例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991 ；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)；およびWard et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照のこと）。
【００７７】
したがって、1つの態様において、結合性物質は、本明細書に記載されるような少なくとも1つのCDRを含む。結合性物質は、本明細書に記載されるような少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含んでもよい。結合性物質がさらに、本明細書に記載される抗体の可変領域ドメインの少なくとも1つを含んでもよい。可変領域ドメインは任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、ヒトアクチビン-Aとの結合を担い、かつ1つまたは複数のフレームワーク配列に隣接しているかまたはそれとインフレームにある、少なくとも1つのCDR配列、例えば、本明細書に具体的に記載されているCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3および／または軽鎖CDRなどを一般に含むと考えられる。一般的に言って、可変（V）領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖（VH）および／または軽鎖（VL）可変ドメインの任意の適した配列物であってよい。したがって、例えば、V領域ドメインが単量体であり、以下に記載されるように少なくとも1×10-7Mに等しいかまたはそれ未満の親和性でヒトアクチビン-Aと独立して結合しうるVHドメインまたはVLドメインであってもよい。または、V領域ドメインが二量体であってもよく、かつVH-VH、VH-VL、またはVL-VL二量体を含有してもよい。V領域二量体は、非共有結合性に結びついていてよい少なくとも1つのVH鎖および少なくとも1つのVL鎖を含む（本明細書では以下、Fvと称する）。必要に応じて、これらの鎖は、直接的に、例えば2つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介するか、またはリンカー、例えばペプチドリンカーを介するかのいずれかによって共有結合性にカップリングして、単鎖Fv（scFV）を形成してもよい。
【００７８】
可変領域ドメインは、天然に存在する任意の可変ドメインまたはその操作された相当物であってよい。操作された相当物とは、組換えDNA工学の手法を用いて作製された可変領域ドメインのことを意味する。そのような操作された相当物には、例えば、特異的抗体のアミノ酸配列における、またはそれに対する挿入、欠失、もしくは変化によって、特異的抗体の可変領域から作製されたものが含まれる。具体的な例には、第1の抗体由来の少なくとも1つのCDRおよび任意で1つまたは複数のフレームワークアミノ酸、ならびに第2の抗体由来の可変領域ドメインの残りの部分を含む、操作された可変領域ドメインが含まれる。
【００７９】
可変領域ドメインは、C末端アミノ酸で少なくとも1つの他の抗体ドメインまたはその断片と共有結合性に結びついていてよい。したがって、例えば、可変領域ドメイン内に存在するVHドメインが、免疫グロブリンCH1ドメインまたはその断片と連結していてもよい。同様に、VLドメインがCKドメインまたはその断片と連結していてもよい。このように、例えば、抗体は、抗原結合ドメインがそのC末端でそれぞれCH1ドメインおよびCKドメインと共有結合性に連結している付随したVHドメインおよびVLドメインを含有するFab断片であってもよい。CH1ドメインは、例えば、Fab'断片に存在するヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部分を与えるため、または抗体CH2およびCH3ドメインなどのさらなるドメインを与えるために、さらなるアミノ酸によって延長されてもよい。
【００８０】
本明細書に記載されるように、抗体はこれらのCDRのうち少なくとも1つを含む。例えば、1つまたは複数のCDRを公知の抗体フレームワーク領域（IgG1、IgG2など）に組み入れること、またはその半減期を延長するために適したビヒクルと結合体化することができる。適したビヒクルには、Fc、ポリエチレングリコール（PEG）、アルブミン、トランスフェリンなどが非限定的に含まれる。これらのビヒクルおよび他の適したビヒクルは、当技術分野において公知である。そのような結合体化されたCDRペプチドは、単量体、二量体、四量体または他の形態にあってよい。1つの態様においては、1つまたは複数の水溶性ポリマーが、結合性物質の1つまたは複数の特定の位置、例えばアミノ末端に結合している。
【００８１】
抗原特異的（すなわち、アクチビン-A特異的）抗体は、相補的可変ドメインのライブラリーをスクリーニングするために特定のVLドメインまたはVHドメインを用いることにより、当技術分野における公知の方法によって作製することができる。抗体のそのような作製方法は当技術分野において公知である。例えば、マイナーコートタンパク質などの別のタンパク質と融合させた抗体断片を用いて、抗原を有するファージを用いることができる。続いて、抗原（例えば、アクチビン-A）に対して免疫のあるマウス由来の再配列された（rearragned）重鎖（VH）および軽鎖（VL）のランダムコンビナトリアルライブラリーを用いて、抗体断片の多様なライブラリーをファージの表面に提示させる。これらのライブラリーを相補的可変ドメインに関してスクリーニングして、ドメインを、例えばアフィニィーカラムを用いて精製することができる。Clackson et al., Nature, V. 352 pp. 624-628 (1991)を参照のこと。
【００８２】
別の例では、抗体（すなわち、アクチビン-A抗体）由来の個々のVL鎖またはVH鎖を、抗原結合性断片（またはFab）を同じ特異性で形成しうると考えられる他のVH鎖またはVL鎖を探索するために用いることができる。このため、VH鎖およびVL鎖Ig遺伝子のランダムな組み合わせを、バクテリオファージライブラリー（fdまたはλファージなど）において抗原結合性断片として発現させることができる。例えば、コンビナトリアルライブラリーは、親VL鎖またはVH鎖ライブラリーを、それぞれ抗原結合特異的VL鎖またはVH鎖ライブラリーと組み合わせて用いることによって作製することができる。続いて、コンビナトリアルライブラリーを、従来の手法によって、例えば放射性標識プローブ（放射性標識アクチビン-Aなど）を用いることによってスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. V. 150 (3) pp. 880-887 (1993)を参照のこと。
【００８３】
「CDRグラフト抗体」とは、特定の種またはアイソタイプの抗体に由来する1つまたは複数のCDRおよび同じ種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体のことである。
【００８４】
「多重特異性抗体」とは、1つまたは複数の抗原上の複数のエピトープを認識する抗体のことである。この種の抗体のサブクラスには、同じまたは異なる抗原上の2つの別個のエピトープを認識する「二重特異性抗体」がある。
【００８５】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」とは、抗原と相互作用して、抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の成分）を含有する、抗原結合タンパク質の一部分のことである。その抗原と特異的に結合する抗体の場合、これは、そのCDRドメインのうち少なくとも1つの少なくとも一部を含むと考えられる。
【００８６】
「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体によって）結合される、分子の部分のことである。エピトープは、分子の非連続部分（例えば、1つのポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列中では連続していないが、ポリペプチドの三次構造および四次構造の状況下では抗原結合タンパク質によって結合される程度に互いに十分に近傍にあるアミノ酸残基）を含むことができ、列記された末端配列アミノ酸を含む。例えば、ポリペプチド配列R13〜Y39は、アミノ酸R13およびY39、ならびに配列中のR13とY39との間に見いだされるアミノ酸を含む。エピトープが分子の非連続部分を含む態様において、配列にはそれに応じて注記がなされると考えられる。
【００８７】
抗原結合タンパク質
1つの局面において、本発明は、アクチビン-A、例えばヒトアクチビン-Aと結合する、抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体ムテインおよび抗体変異体）を提供する。
【００８８】
「抗原結合タンパク質」とは、抗原と結合する一部分および任意で、抗原結合部分が抗原結合タンパク質の抗原との結合を促進する高次構造をとることを可能にするスカフォールド部分またはフレームワーク部分を含むタンパク質のことである。抗原結合タンパク質の例には、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体類似体が含まれる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替的なタンパク質スカフォールド、またはグラフトCDRまたはCDR誘導体を有する人工スカフォールドを含みうる。そのようなスカフォールドには、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された変異を含む抗体由来スカフォールド、ならびに、例えば生体適合性ポリマーを含む全合成スカフォールドが非限定的に含まれる。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129；Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654を参照のこと。加えて、ペプチド抗体模倣体（「PAM」）、ならびにフィブロネクチン構成要素をスカフォールドとして用する抗体模倣体に基づくスカフォールドを用いることもできる。
【００８９】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有しうる。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体はポリペプチド鎖の2つの同一な対で構成され、各対は1つの「軽」鎖（約25kDa）および1つの「重」鎖（約50〜70kDa）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100〜110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域の範囲を定める。ヒト軽鎖はκ軽鎖およびλ軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEに定める。軽鎖および重鎖の内部で、可変領域および定常領域は約12個またはそれ以上のアミノ酸の「J」領域によって接続され、重鎖は約10個を上回るアミノ酸の「D」領域も含む。概説については、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照のこと（その全体があらゆる目的のために参照により組み入れられる）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが2つの結合部位を有するような抗体結合部位を形成する。
【００９０】
本発明による抗原結合タンパク質は、アクチビン-Aの生物活性を阻害する抗原結合タンパク質を含む。例えば、抗原結合タンパク質が悪液質を減弱させてもよく、この活性は抗原結合タンパク質が完全ヒト抗体などのように完全ヒト性である場合に存在しうる。
【００９１】
異なる抗原結合タンパク質が、アクチビン-Aの異なるドメインもしくはシステインノットドメインと結合するか、または異なる作用機序によって作用してもよい。その例には、1つもしくは複数の特定のシステインノットドメイン、またはジスルフィド結合の間に点在する領域を特異的に結合させる抗原結合タンパク質が非限定的に含まれ、その領域には、以下の配列：
2016508504.tif 000009
のおよそアミノ酸4〜12、アミノ酸11〜81、アミノ酸11〜33、アミノ酸13〜39、アミノ酸40〜113、アミノ酸44〜115、アミノ酸81〜111、および／またはアミノ酸82〜107の範囲にわたる領域が含まれる。本明細書において特に指示するように、別に指定する場合を除き、ドメイン領域は群を包括するように名づけられる。例えば、アミノ酸4〜12は、9個のアミノ酸：位置4および12にあるアミノ酸のほか、配列中の7個の介在性アミノ酸も指す。他の例には、アクチビン-Aのその受容体に対する結合を阻害する抗原結合タンパク質が含まれる。抗原結合タンパク質は、本発明において有用である上で、アクチビン-Aにより誘導される活性を完全に阻害する必要はない；そうではなくて、アクチビン-Aの特定の活性を低下させる抗原結合タンパク質も同じく用いることを想定している。（特定の疾患を治療する上でのアクチビン-A結合性抗原結合タンパク質に関する特定の作用機序についての本明細書における考察は例示的であるに過ぎず、本明細書において提供される方法はそれによっては拘束されない。）
【００９２】
別の局面において、本発明は、A1〜A14からなる群より選択される軽鎖可変領域またはA1〜A14からなる群より選択される重鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、ムテインおよび変異体を提供する。そのような抗原結合タンパク質は「LxHy」という呼称を用いて表すことができ、以下の配列中に標識されているように、「x」は軽鎖可変領域の数に対応し、「y」は重鎖可変領域の数に対応する。すなわち、例えば、「A1HC」は抗体A1の重鎖可変領域を表し；「A1LC」は抗体A1の軽鎖可変領域を表す、などである。より一般的に言えば、「L2H1」は、L2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域およびH1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗原結合タンパク質を表す。わかりやすく言うと、1つの群のメンバーの少なくとも2つによって表されるすべての範囲は、範囲の端のメンバーも含めて、その群のすべてのメンバーを含む。したがって、群の範囲A1〜A14は、A1とA14との間のすべてのメンバーのほかに、メンバーA1およびA14自体も含む。群の範囲A4〜A6は、メンバーA4、A5、およびA6などを含む。
【００９３】
以下にはまた、抗原結合部位の一部を作製するCDR（下線部）の部位も示されており、フレームワーク領域（FR）は、これらの可変ドメイン配列の介在性セグメントである。軽鎖可変領域および重鎖可変領域のいずれにも、3つのCDR（CDR 1〜3）および4つのFR（FR 1〜4）がある。各軽鎖および重鎖のCDR領域は、抗体の種類（A1、A2、A3など）によってもグループ分けされる。本発明の抗原結合タンパク質には、例えば、L1H1（抗体A1）、L2H2（抗体A2）、L3H3（抗体A3）、L4H4（抗体A4）、L5H5（抗体A5）、L6H6（抗体A6）、L7H7（抗体A7）、L8H8（抗体A8）、L9H9（抗体A9）、L10H10（抗体A10）、L11H11（抗体A11）、L12H12（抗体A12）、L13H13（抗体A13）およびL14H14（抗体A14）からなる組み合わせの群から選択される軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせを有する抗原結合タンパク質が含まれる。
【００９４】
抗体A1〜A14重鎖および軽鎖可変領域ポリヌクレオチド（本明細書ではH1〜H14およびL1〜L14とも称する）。
2016508504.tif 000010
2016508504.tif 000011
2016508504.tif 000012
2016508504.tif 000013
2016508504.tif 000014
2016508504.tif 000015
2016508504.tif 000016
2016508504.tif 000017
【００９５】
抗体A1〜A14アミノ酸配列、軽鎖可変領域。CDR領域には下線を付している；介在性のセグメントまたは領域を本明細書ではフレームワーク（FR）と称している。
2016508504.tif 000018
2016508504.tif 000019
2016508504.tif 000020
【００９６】
抗体A1〜A14アミノ酸配列、重鎖可変領域。CDR領域には網掛けおよび下線を付している；他の領域を本明細書ではフレームワーク（FR）と称している。
2016508504.tif 000021
2016508504.tif 000022
2016508504.tif 000023
【００９７】
（表１）抗体A1〜A14に関する軽鎖CDR1コンセンサス配列
2016508504.tif 000024
2016508504.tif 000025
【００９８】
（表２）抗体A1〜A14に関する軽鎖CDR2コンセンサス配列
2016508504.tif 000026
【００９９】
（表３）抗体A1〜A14に関する軽鎖CDR3コンセンサス配列
2016508504.tif 000027
【０１００】
（表４）抗体A1〜A14に関する重鎖CDR1コンセンサス配列
2016508504.tif 000028
2016508504.tif 000029
【０１０１】
（表５）抗体A1〜A14に関する重鎖CDR2コンセンサス配列
2016508504.tif 000030
2016508504.tif 000031
2016508504.tif 000032
【０１０２】
（表６）抗体A1〜A14に関する重鎖CDR3コンセンサス配列
2016508504.tif 000033
2016508504.tif 000034
2016508504.tif 000035
【０１０３】
1つの態様において、本発明は、L1からL14までからなる群より選択される軽鎖可変ドメインの配列と15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1残基のみが異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、そのような配列の相違のそれぞれが、独立して、1つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである、抗原結合タンパク質を提供する。別の態様において、軽鎖可変ドメインは、L1〜L14からなる群より選択される軽鎖可変ドメインの配列に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、または99％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、軽鎖可変ドメインは、L1〜L14からなる群（L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、およびL14を含む）より選択される軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、または99％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、軽鎖可変ドメインは、L1〜L14からなる群より選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、軽鎖可変ドメインは、L1〜L14からなる群より選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、軽鎖可変ドメインは、L1〜L14の軽鎖ポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、H1〜H14の重鎖可変ドメインからなる群より選択される配列と15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1残基のみが異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、そのような配列の相違のそれぞれが、独立して、1つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである、抗原結合タンパク質を提供する。別の態様において、重鎖可変ドメインは、H1〜H14からなる群より選択される重鎖可変ドメインの配列に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、または99％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、重鎖可変ドメインは、H1〜H14からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、または99％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、重鎖可変ドメインは、H1〜H14からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、重鎖可変ドメインは、H1〜H14からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の態様において、重鎖可変ドメインは、本明細書において開示される重鎖ポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
【０１０５】
本発明の抗原結合タンパク質の特定の態様は、本明細書において言及されるCDRおよび／またはFRのうち1つまたは複数のアミノ酸配列と同一である1つまたは複数のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖CDR1配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖CDR2配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖CDR3配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖CDR1配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖CDR2配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖CDR3配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖FR1配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖FR2配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖FR3配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された軽鎖FR4配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖FR1配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖FR2配列。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖FR3配列を含む。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示された重鎖FR4配列を含む。
【０１０６】
1つの態様において、本発明は、上に示されているCDR配列と5、4、3、2、または1アミノ酸残基以下が異なる1つまたは複数のCDR配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０１０７】
別の態様において、抗原結合タンパク質のCDR3配列の少なくとも1つは、表7または表8に示されているようなA1〜A14からのCDR3配列である。別の態様において、抗原結合タンパク質の軽鎖CDR3配列は、表7に示されているようなA1〜A14からの軽鎖CDR3配列であり、抗原結合タンパク質の重鎖CDR3配列は、表8に示されているようなA1〜A14からの重鎖配列である。別の態様において、抗原結合タンパク質は、それぞれが独立してA1〜A14のCDR配列と6個、5個、4個、3個、2個、1個、または0個の単一のアミノ酸の付加、置換、および／または欠失によって異なる1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのCDR配列を含み、抗原結合タンパク質は、それぞれが独立してCDR配列と6個、5個、4個、3個、2個、1個、または0個の単一のアミノ酸付加、置換、および／または欠失によって異なる1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのCDR配列をさらに含む。
【０１０８】
抗体A1〜A14の軽鎖CDRは以下の表7に示されており、抗体A1〜A14の重鎖CDRは以下の表8に示されている。
【０１０９】
（表７）軽鎖CDR
2016508504.tif 000036
【０１１０】
（表８）重鎖CDR
2016508504.tif 000037
【０１１１】
A1〜A14のヌクレオチド配列、またはA1〜A14のアミノ酸配列は、非変異ポリヌクレオチドと比較して1つまたは複数の特定のヌクレオチド置換、欠失または挿入を含む、改変されたポリヌクレオチドを作製するために、例えば、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発）によって改変することができる。そのような改変を作製するための手法の例は、Walder et al., 1986, Gene 42:133；Bauer et al. 1985, Gene 37:73；Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19；Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press；ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に記載されている。これらの方法および他の方法を用いて、所望の特性、例えば、誘導体化されていない抗体と比較して、アクチビン-Aに対する親和性、結合力もしくは特異性の増大、インビボもしくはインビトロでの活性もしくは安定性の増大、またはインビボでの副作用の低下などを有する、抗アクチビン-A抗体の誘導体を作製することができる。
【０１１２】
本発明の範囲内にある抗アクチビン-A抗体の他の誘導体には、抗アクチビン-A抗体ポリペプチドのN末端またはC末端と融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、抗アクチビン-A抗体またはその断片の、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合性または凝集性の結合体が含まれる。例えば、結合体化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母α因子リーダーなど、またはエピトープタグなどのペプチドであってよい。抗原結合タンパク質を含有する融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製または同定を容易にするために付加されるペプチド（例えば、ポリHis）を含みうる。また、抗原結合タンパク質を、Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988および米国特許第5,011,912号に記載されたように、FLAGペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DYKDDDDK）（SEQ ID NO：226）と連結させることもできる。FLAGペプチドは抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体（mAb）によって可逆的に結合されるエピトープをもたらして、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイ法および容易な精製を可能にする。FLAGペプチドを所与のポリペプチドと融合させた融合タンパク質を調製するために有用な試薬は市販されている（Sigma, St. Louis, MO）。
【０１１３】
「Fcポリペプチド」という用語は、本明細書で用いる場合、抗体のFc領域に由来するネイティブ型およびムテイン型のポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、そのようなポリペプチドの短縮型も含まれる。Fc成分を含む融合タンパク質（およびそれらから形成されるオリゴマー）は、プロテインAまたはプロテインGカラムを通じてのアフィニィークロマトグラフィーによる容易な精製という利点をもたらす。
【０１１４】
PCT出願WO 93／10151（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている1つの適したFcポリペプチドは、ヒトIgG1抗体のFc領域のN末端ヒンジ領域からネイティブなC末端までに及ぶ単鎖ポリペプチドである。別の有用なFcポリペプチドは、米国特許第5,457,035号およびBaum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001に記載されているFcムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変化し、アミノ酸20がLeuからGluに変化し、かつアミノ酸22がGlyからAlaに変化している点を除き、WO 93／10151に提示されているネイティブなFc配列のものと同一である。このムテインはFc受容体に対する親和性の低下を示す。
【０１１５】
他の態様において、抗アクチビン-A抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分の代わりに用いてもよい。
【０１１６】
1つまたは複数の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーを、アクチビン-Aアンタゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合性に連結するかまたは非共有結合性に連結した二量体、三量体またはより高次のオリゴマーの形態にあってよい。2つまたはそれ以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーを用いることを用いることを想定しており、その一例はホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが含まれる。
【０１１７】
1つの態様は、抗原結合タンパク質と融合させたペプチド成分間の共有結合性または非共有結合性の相互作用を介して接続された複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーを対象とする。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパーおよび抗体に由来するある種のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、それと結びついた抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進しうるペプチドの1つである。
【０１１８】
特定の態様において、オリゴマーは2つから4つまでの抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、例えば、変異体または断片といった、上記の形態の任意のもののような、任意の形態にあってよい。好ましくは、オリゴマーは、アクチビン-A結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
【０１１９】
1つの態様において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドのさまざまな部分（Fcドメインを含む）と融合させたある種の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535；Byrn et al., 1990, Nature 344:677；およびHollenbaugh et al., 1992 Curr. Prot.s in Immunol, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11に記載されている。
【０１２０】
本発明の1つの態様は、抗アクチビン-A抗体のアクチビン-A結合断片を抗体のFc領域と融合させることによって作製された、2つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を適切な発現ベクター中に挿入し、組換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞において遺伝子融合物を発現させた上で、鎖間ジスルフィド結合がFc成分間に形成されて二量体が生じるように、発現された融合タンパク質を抗体分子とほとんど同じように集成させることによって作製される。
【０１２１】
または、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を伴うかまたは伴わずに複数の抗原結合タンパク質を含む、融合タンパク質である。適したペプチドリンカーの中には、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号に記載されたものがある。
【０１２２】
オリゴマー性抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、それらが見いだされるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは当初、いくつかのDNA結合タンパク質で同定され（Landschulz et al., 1988, Science 240:1759）、それ以来、種々のさまざまなタンパク質で見いだされている。公知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然のペプチドおよびそれらの誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を調製するために適したロイシンジッパードメインの例は、PCT出願WO 94／10308に記載されており、肺界面活性物質プロテインD（SPD）由来のロイシンジッパードメインが、参照により本明細書に組み入れられるHoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191に記載されている。それと融合させた異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする改変ロイシンジッパーの使用が、Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。1つのアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドと融合させた抗アクチビン-A抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を適した宿主細胞において発現させ、形成された可溶性オリゴマー性抗アクチビン-A抗体断片または誘導体を培養上清から回収する。
【０１２３】
1つの局面において、本発明は、アクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合を妨げる抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗原結合タンパク質を、アクチビン-A、またはその断片、変異体、もしくは誘導体に対して作製して、アクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合を妨げる能力に関して従来のアッセイ法でスクリーニングすることができる。適したアッセイ法の例には、アクチビン-A受容体を発現する細胞に対するアクチビン-Aの結合を阻害する能力に関して抗原結合タンパク質を試験するアッセイ法、または細胞表面アクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合に起因する生物学的応答もしくは細胞応答を低下させる能力に関して抗原結合タンパク質を試験するアッセイ法がある。例えば、抗体を、固定化された抗体表面（アクチビン-Aおよび／またはアクチビンB）と結合するその能力に関してスクリーニングすることができる。アクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合を阻止する抗原結合タンパク質は、悪液質を非限定的に含む、あらゆるアクチビン-A関連病状の治療に使用することができる。1つの態様においては、トランスジェニックマウスの免疫処置を伴う手技によって生成されるヒト抗アクチビン-Aモノクローナル抗体が、そのような病状の治療に使用される。
【０１２４】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合性断片は、従来の手法によって作製することができる。そのような断片の例には、Fab断片およびF（ab')2断片が非限定的に含まれる。遺伝子工学の手法によって作製される抗体断片および誘導体も想定している。
【０１２５】
さらなる態様は、キメラ抗体、例えば、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体のヒト化相当物を含む。そのようなヒト化抗体は公知の手法によって調製することができ、それらの抗体がヒトに投与された場合に免疫原性の低下という利点をもたらす。1つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変ドメイン（またはその抗原結合部位の全体もしくは一部）およびヒト抗体に由来する定常ドメインを含む。または、ヒト化抗体断片が、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する可変ドメイン断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。キメラ性モノクローナル抗体およびさらに操作されたモノクローナル抗体の作製のための手技は、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934およびWinter et al., 1993, TIPS 14: 139に記載されたものが含まれる。1つの態様において、キメラ抗体はCDRグラフト抗体である。抗体をヒト化するための手法は、例えば、米国特許第5,869,619号、同第5,225,539号、同第5,821,337号、同第5,859,205号、同第6,881,557号、Padlan et al., 1995, FASEB J. 9: 133-39およびTamura et al., 2000, J. Immunol. 164: 1432-41に考察されている。
【０１２６】
非ヒト動物においてヒト抗体または部分的ヒト抗体を産生させるための手技が開発されている。例えば、1つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子がさまざまな手段によって不活性化されているマウスが調製されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに導入することにより、不活性化されたマウス遺伝子が置き換えられる。この動物において産生される抗体は、その動物に導入されたヒト遺伝物質によってコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を組み入れている。1つの態様においては、トランスジェニックマウスなどの非ヒト動物にアクチビン-Aポリペプチドによる免疫処置を行い、その結果、アクチビン-Aポリペプチドを対象とする抗体がその動物で産生されるようにする。
【０１２７】
適した免疫原の一例は、可溶性ヒトアクチビン-A、例えば、以下の配列を有するタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチド：
2016508504.tif 000038
、またはこのタンパク質の他の免疫原性断片などである。ヒト抗体または部分的ヒト抗体の生産のためのトランスジェニック動物の作製および使用のための手法の例は、米国特許第5,814,318号、同第5,569,825号、および同第5,545,806号、Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200, Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods . 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. Inter'l Immunol. 5 (1993): 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51, Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, Inter'l Immunol. 6: 579-91, Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Pro. Nat'lAcad. Sci. USA 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Pro.Nat'lAcad.Sci. USA 90: 3720-24およびTuaillon et al., 1994, J.Immunol. 152: 2912-20に記載されている。
【０１２８】
別の局面において、本発明は、アクチビン-Aと結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、種々の公知の手法を用いて作製することができる。一般に、特異的抗原と結合するモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって入手可能である（例えば、Kohler et al., Nature 256:495, 1975；Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991)；米国特許第RE 32,011号、同第4,902,614号、同第4,543,439号、および同第4,411,993号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980)；ならびにAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)；Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)を参照のこと）。抗体断片は、タンパク質分解消化などの任意の適した標準的な手法を用いて、または任意で、タンパク質分解消化（例えば、パパインまたはペプシンを用いる）の後のジスルフィド結合の穏やかな還元およびアルキル化によって、それから得られることができる。または、そのような断片を、本明細書に記載されるような組換え遺伝子工学の手法によって作製することもできる。
【０１２９】
モノクローナル抗体は、例えばトランスジェニック性またはノックアウト性のものを含む動物、例えばラット、ハムスター、ウサギまたは好ましくはマウスに対して、当技術分野において公知であって本明細書に記載されている方法に従って、ヒトアクチビン-A
2016508504.tif 000039
を含む免疫原、またはその断片を注射することによって得ることができる。特異的抗体産生の存在は、血清試料を入手して、当技術分野において公知であって本明細書に記載されるいくつかの免疫検出方法のいずれか1つを用いて、ヒトアクチビン-Aまたはペプチドと結合する抗体の存在を検出することにより、初回注射後および／または追加注射後にモニターすることができる。所望の抗体を産生する動物から、脾臓またはリンパ節由来の最も一般的な細胞であるリンパ細胞を取り出して、Bリンパ球を得る。Bリンパ球を続いて、好ましくは免疫処置を受けた動物と同系のものであり、かつ任意で他の望ましい特性（例えば、内因性Ig遺伝子産物を発現することができない、例えば、P3X63-Ag 8.653（ATCC No. CRL 1580）；NSO、SP20など）を有する薬物感作骨髄腫細胞融合パートナーと融合させて、不死真核細胞株であるハイブリドーマを作製する。
【０１３０】
リンパ系（例えば、脾臓）細胞および骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤などの膜融合促進剤と数分間一緒にして、続いて、ハイブリドーマ細胞の増殖は支援するが、非融合骨髄腫細胞の増殖は支援しない選択培地上に低密度でプレーティングする。好ましい選択培地は、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間、通常は約1〜2週間の後に、細胞のコロニーが観察される。単一のコロニーを単離して、細胞によって産生された抗体を、当技術分野において公知であって本明細書に記載される種々のイムノアッセイ法のいずれか1つを用いて、ヒトアクチビン-Aとの結合活性に関して試験することができる。ハイブリドーマをクローニングして（例えば、限界希釈クローニングによって、または軟寒天プラーク単離によって）、アクチビン-Aに対して特異的な抗体を産生する陽性クローンを選択して培養する。ハイブリドーマ培養物からのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離することができる。
【０１３１】
マウスモノクローナル抗体の生産のための代替的な方法は、ハイブリドーマ細胞を、同系マウス、例えば、モノクローナル抗体を含有する腹水の形成を促進するための処置を受けた（例えば、プリスタン感作された）マウスの腹膜腔内に注入することである。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された手法によって単離して精製することができる。そのような単離手法には、プロテインA Sepharoseを用いるアフィニィークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3；Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照のこと）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖または軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択された適切なリガンドを用いるアフィニィークロマトグラフィーによって精製することができる。固体支持体上に固定化された適したリガンドの例には、プロテインA、プロテインG、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体およびTGF-β結合タンパク質、またはそれらの断片もしくは変異体が含まれる。
【０１３２】
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の手法を用いて、例えば、免疫処置スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾細胞を不死化することによって作製することができる。脾細胞は、当技術分野において公知の任意の手法を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成させることによって、不死化することができる。アクチビン-Aポリペプチドを結合させる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。そのようなハイブリドーマ細胞株およびそれらによって産生される抗アクチビン-Aモノクローナル抗体は、本発明の範囲に含まれる。ハイブリドーマを生成させる融合手技に用いるための骨髄腫細胞は、好ましくは、抗体を産生せず、高い融合効率を有し、かつ、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支援するある種の選択培地中で増殖することを不可能にする酵素欠損を有する。マウス融合に用いるための適した細胞株の例には、Sp-20、P3-X63／Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1／1.Ag 4 1、Sp210-Agl4、FO、NSO／U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7およびS194／5XX0 Bulが含まれる；ラット融合に用いるための細胞株の例には、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210が含まれる。細胞融合のために有用な他の細胞株には、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6が含まれる。ハイブリドーマまたはmAbを、アクチビン-Aにより誘導される活性を阻止する能力などの特定の特性を有するmAbを同定するために、さらにスクリーニングしてもよい。
【０１３３】
また、本発明の抗体が完全ヒトモノクローナル抗体であってもよい。アクチビン-Aのシステインノット領域（アミノ酸C11〜S33および／またはアミノ酸C81〜E111）と特異的に結合する、単離された完全ヒト抗体であって、抗原結合タンパク質がヒト抗アクチビン-A抗体のインビボ生物活性の少なくとも1つを保有している、完全ヒト抗体が提供される。生物活性は、悪液質、例えば、例えば本明細書に記載される結腸癌マウスモデルにおけるような結腸癌における悪液質の減弱化であってよい。そのような治療に適する悪液質は、体重減少、筋肉量の減少および／または体脂肪量の減少を伴う。悪液質が、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルなどにおける関節リウマチに伴うこともある。本明細書に記載される完全ヒト抗体による治療により、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、インビボでの体重減少、筋肉量の減少および／または体脂肪量の減少が改善する。本明細書に記載される完全ヒト抗体は、AAV-アクチビン-Aをトランスフェクトした動物モデルにおける体重減少を改善する。アクチビン-Aのシステインノット領域（アミノ酸C11〜S33および／またはアミノ酸C81〜E111）と特異的に結合する、本明細書に記載される完全ヒト抗体は、インビトロでのアクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合を阻害する。アクチビン-Aのシステインノット領域（アミノ酸C11〜S33および／またはアミノ酸C81〜E111）と特異的に結合する、完全ヒト単離された抗体は、インビボでのアクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合を阻害する。
【０１３４】
完全ヒトモノクローナル抗体は、当業者であれば精通しているであろういくつもの手法によって作製することができる。そのような方法には、ヒト末梢血細胞（例えば、Bリンパ球を含有する）のEpstein Barrウイルス（EBV）形質転換、ヒトB細胞のインビトロ免疫処置、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫処置トランスジェニックマウス由来の脾細胞の融合、ヒト免疫グロブリンV領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野において公知であり本明細書における開示に基づくような他の手技が非限定的に含まれる。例えば、完全ヒトモノクローナル抗体は、抗原刺激に応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスから完全ヒト抗体を得るための方法は、例えば、Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994；Lonberg et al., Nature 368:856, 1994；Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994；米国特許第5,877,397号；Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58；Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35に記載されている。この手法では、ヒト重鎖および軽鎖座位のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖座位の標的化破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する（Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)も参照）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、ミニ遺伝子構築物、または酵母人工染色体上の導入座位であってよく、これはマウスリンパ組織においてB細胞特異的なDNA再配列および超変異を受ける。完全ヒトモノクローナル抗体は、このトランスジェニックマウスに免疫処置を行うことによって得ることができ、このマウスはこの場合、アクチビン-Aに対して特異的なヒト抗体を産生することができる。免疫処置を受けたトランスジェニックマウスのリンパ球を用いて、本明細書に記載されている方法に従って、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生させることができる。また、完全ヒト抗体を含有するポリクローナル血清を、免疫処置を受けた動物の血液から得ることもできる。
【０１３５】
本発明のヒト抗体を作製するための別の方法は、ヒト末梢血細胞をEBV形質転換によって不死化させることを含む。例えば、米国特許第4,464,456号を参照のこと。アクチビン-Aと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するそのような不死化B細胞株（またはリンパ芽球細胞株）は、本明細書において提供される免疫検出方法、例えばELISAによって同定して、続いて標準的なクローニング手法によって単離することができる。抗アクチビン-A抗体を産生するリンパ芽球細胞株の安定性は、当技術分野において公知の方法に従って、形質転換細胞株をマウス骨髄腫と融合させてマウス-ヒトハイブリッド細胞株を作製することによって向上させることができる（例えば、Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのさらに別の方法はインビトロ免疫処置であり、これはヒト脾臓B細胞をヒトアクチビン-Aによって初回刺激し、初回刺激されたB細胞をその後にヘテロハイブリッド融合パートナーと融合させることを含む。例えば、Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95を参照のこと。
【０１３６】
ある態様においては、抗ヒトアクチビン-A抗体を産生するB細胞を選択した上で、当技術分野において公知であり（WO 92／02551；米国特許第5,627,052号；Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)）、かつ本明細書に記載されている分子生物学手法に従って、そのB細胞から軽鎖および重鎖可変領域をクローニングする。免疫処置を受けた動物からのB細胞を、アクチビン-Aと特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することによって、脾臓、リンパ節または末梢血試料から単離することができる。また、B細胞を、ヒトから、例えば末梢血試料から単離することもできる。所望の特異性を有する個々のB細胞を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞分取、インビトロ刺激とその後の特異的抗体の検出などによる。特異的抗体を産生するB細胞の選択のための方法には、例えば、ヒトアクチビン-Aを含有する軟寒天中でB細胞の単細胞懸濁液を調製することが含まれる。B細胞によって産生される特異的抗体の抗原との結合により、複合体の形成がもたらされ、それを免疫沈降物として視認することができる。所望の抗体を産生するB細胞を選択した後に、特定の抗体遺伝子を、当技術分野において公知であって本明細書に記載されている方法に従って、DNAまたはmRNAを単離および増幅することによって、クローニングすることができる。
【０１３７】
本発明の抗体を得るための1つのさらなる方法は、ファージディスプレイによる。例えば、Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55；Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280を参照のこと。ヒトまたはマウスの免疫グロブリンの可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーをファージベクター中に作製して、TGF-β結合タンパク質またはその変異体もしくは断片と特異的に結合するIg断片（Fab、Fv、sFv、またはそれらの重合体）を選択するためにそれをスクリーニングすることができる。例えば、米国特許第5,223,409号；Huse et al., 1989 Science 246:1275-81；Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989)；Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)；Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66；Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388；Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52およびそれらのに引用された参照文献を参照のこと。例えば、Ig可変領域断片をコードする多数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーを、糸状バクテリオファージ、例えばM13またはその変異体などのゲノム中に、ファージコートタンパク質をコードする配列とインフレームに挿入することができる。融合タンパク質は、コートタンパク質と軽鎖可変領域ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメインとの融合物であってもよい。ある態様によれば、免疫グロブリンFab断片をファージ粒子上に提示させてもよい（例えば、米国特許第5,698,426号を参照のこと）。
【０１３８】
また、重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを、例えば、λlmmunoZap（商標）（H）およびλImmunoZap（商標）（L）ベクター（Stratagene, La Jolla, California）を用いて、λファージ中に調製することもできる。手短に述べると、mRNAをB細胞集団から単離し、これを用いて、重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーをλImmunoZap（H）およびλImmunoZap（L）ベクター中に作製する。これらのベクターを個々にスクリーニングしてもよく、または共発現させてFab断片もしくは抗体を形成させてもよい（Huse et al., 前記；また、Sastry et al., 前記も参照のこと）。その後に陽性プラークを、大腸菌からのモノクローナル抗体断片の高レベル発現を可能にする非溶菌性プラスミドに変換することができる。
【０１３９】
1つの態様においては、ハイブリドーマにおいて、関心対象のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域を、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。これらのプライマーは当業者によって合成されてもよく、または市販の供給元から購入してもよい（例えば、数多くある中でも特に、VHa、VHb、VHc、VHd、CH1、VLおよびCL領域に対するプライマーを含む、マウスおよびヒトの可変領域に対するプライマーを販売しているStratagene（La Jolla, California）を参照のこと）。これらのプライマーを用いて重鎖または軽鎖の可変領域を増幅し、それらを続いて、それぞれImmunoZAP（商標）HまたはImmunoZAP（商標）L（Stratagene）などのベクター中に挿入することができる。これらのベクターを続いて、発現のために大腸菌、酵母または哺乳動物に基づく系に導入することができる。VHドメインとVLドメインの融合物を含有する大量の単鎖タンパク質を、これらの方法を用いて産生させることができる（Bird et al., Science 242:423-426, 1988を参照のこと）。
【０１４０】
本発明による抗体を産生する細胞が、上記の免疫処置および他の手法のいずれかを用いてひとたび得られれば、本明細書に記載されるような標準的な手技に従ってそれらからDNAまたはmRNAを単離および増幅することによって、特異的抗体の遺伝子をクローニングすることができる。それによって産生された抗体をシークエンシングすることができ、同定されたCDRおよびそのCDRをコードするDNAを以前に記載されたように操作して、本発明による他の抗体を作製することができる。
【０１４１】
本発明のアクチビン-A結合性物質は、本明細書に記載の細胞ベースのアッセイ法および／または本明細書に記載のインビボアッセイ法においてアクチビン-Aの機能をモジュレートすること、および／または本明細書に記載のシステインノットドメインの1つもしくは複数と結合すること、および／または本出願に記載の抗体のうち1つの結合を交差遮断すること、および／または本出願に記載の抗体のうち1つによってアクチビン-Aとの結合が交差遮断されることが好ましい。したがって、そのような結合性物質は、本明細書に記載のアッセイ法を用いて同定することができる。
【０１４２】
ある態様において、抗体は、本明細書に提供されるシステインノットドメインの1つもしくは複数と結合し、かつ／または本出願に記載の抗体を本明細書に記載の細胞ベースのアッセイ法および／もしくはインビボアッセイ法において中和および／または交差遮断し、かつ／または本出願に記載の抗体の1つによってアクチビン-Aとの結合が交差遮断される、抗体をまず同定することによって作製される。続いて、これらの抗体由来のCDR領域を、適切な生体適合性フレームワークへの挿入に用いて、アクチビン-A結合性物質を作製する。結合性物質の非CDR部分はアミノ酸で構成されてもよく、または非タンパク質性分子であってもよい。本明細書に記載のアッセイ法により、結合性物質の特徴決定が可能になる。本発明の結合性物質は、本明細書に定義されたような抗体であることが好ましい。
【０１４３】
本発明による他の抗体を、本明細書に記載され、当技術分野において公知であるような従来の免疫処置および細胞融合の手技によって得ることもできる。
【０１４４】
抗体結合部位の中心における相補性決定領域（CDR）の分子進化は、Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551に記載されているように、親和性の増大した抗体、例えば、c-erbB-2に対する親和性が増大した抗体を単離するために用いられている。このため、そのような手法は、アクチビン-Aに対する抗体を調製する上で有用である。アクチビン-Aを対象とする抗原結合タンパク質は、例えば、アクチビン-Aポリペプチドの存在をインビトロまたはインビボで検出するためのアッセイ法に用いることができる。また、抗原結合タンパク質を、イムノアフィニィークロマトグラフィーによってアクチビン-Aタンパク質を生成するために使用することもできる。
【０１４５】
本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片および抗体誘導体）は、当技術分野において公知のあらゆる定常領域を含みうる。軽鎖定常領域は、例えば、κ型またはλ型の軽鎖定常領域、例えば、ヒトのκ型またはλ型軽鎖定常領域でありうる。重鎖定常領域は、例えば、α型、δ型、ε型、γ型またはμ型の重鎖定常領域、例えば、ヒトのα型、δ型、ε型、γ型またはμ型の重鎖定常領域でありうる。1つの態様において、軽鎖定常領域または重鎖定常領域は、天然に存在する定常領域の断片、誘導体、変異体またはムテインである。
【０１４６】
関心対象の抗体から異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を得る、すなわち、サブクラススイッチのための手法は公知である。したがって、例えば、IgM抗体からIgG抗体を得ることができ、その逆を行うこともできる。そのような手法により、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに伴う生物学的特性を示す新たな抗体の調製が可能になる。組換えDNA手法を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローニングされたDNA、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするDNAを、そのような手技に使用することができる。Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16も参照されたい。
【０１４７】
1つの態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、A1〜A14のいずれかのIgG1重鎖ドメイン（H1〜H14）、またはA1〜A14のいずれかのIgG1重鎖ドメイン（H1〜H14）の断片を含む。別の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、A1〜A14のκ軽鎖定常鎖領域（L1〜L14）、またはA1〜A14（L1〜L14）のκ軽鎖定常領域の断片を含む。別の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、A1〜A14のIgG1重鎖ドメインまたはその断片（L1〜L14）と、A1〜A14のκ軽鎖ドメインまたはその断片（L1〜L14）の両方を含む。
【０１４８】
したがって、本発明の抗原結合タンパク質には、例えば、所望のアイソタイプ（例えば、IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgEおよびIgD）を有する可変ドメインの組み合わせであるL1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、およびL14H14を含むもの、ならびにそれらのFab断片またはF（ab')2断片が含まれる。さらに、IgG4が所望であれば、IgG4抗体における不均一性をもたらしうるH鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するために、参照により本明細書に組み入れられるBloom et al., 1997, Protein Science 6:407に記載されているような、ヒンジ領域における点変異（CPSCP→CPPCP）を導入することが望ましい場合もある。
【０１４９】
1つの態様において、抗原結合タンパク質は、1×104 s-1またはそれ未満のKoffを有する。別の態様において、Koffは5×10-5 s-1またはそれ未満である。別の態様において、Koffは、L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、およびL14H14からなる組み合わせの群より選択される軽鎖可変ドメイン配列と重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを有する抗体と実質的に同じである。別の態様において、抗原結合タンパク質は、L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、およびL14H14からなる組み合わせの群より選択される軽鎖可変ドメイン配列と重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを有する抗体由来の1つまたは複数のCDRを含む抗体と実質的に同じKoffで、アクチビン-Aと結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示されたアミノ酸配列の1つを含む抗体と実質的に同じKoffで、アクチビン-Aと結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、上に図示されたアミノ酸配列の1つを含む抗体由来の1つまたは複数のCDRを含む抗体と実質的に同じKoffで、アクチビン-Aと結合する。
【０１５０】
ヒト抗体、部分的ヒト抗体、またはヒト化抗体が、多くの用途、特にヒト対象への抗体の投与を伴うものには適すると考えられるが、他の種類の抗原結合タンパク質もある種の用途には適すると考えられる。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長動物（サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー）など）といった任意の抗体産生動物に由来しうる。本発明の非ヒト抗体は、例えば、インビトロおよび細胞培養に基づく用途、または、本発明の抗体に対する免疫応答が生じないか、重大でないか、予防しうるか、問題とならないか、または所望される、他の任意の用途に用いることができる。1つの態様において、本発明の非ヒト抗体は非ヒト対象に投与される。別の態様において、非ヒト抗体は非ヒト対象において免疫応答を誘発しない。別の態様において、非ヒト抗体は非ヒト対象と同じ種に由来し、例えば、本発明のマウス抗体はマウスに投与される。特定の種由来の抗体は、例えば、その種の動物に対して所望の免疫原（例えば、可溶性アクチビン-Aポリペプチド）による免疫処置を行うか、またはその種の抗体を生成させるための人工的な系（例えば、特定の種の抗体を生成させるための細菌またはファージディスプレイに基づく系）を用いることにより、または、例えば、抗体の定常領域を他の種由来の定常領域によって置き換えることによって1つの種由来の抗体を別の種由来の抗体に変換することにより、または他の種由来の抗体の配列により近く類似するように抗体の1つもしくは複数のアミノ酸残基を置き換えることにより、作製することができる。1つの態様において、抗体は、2つまたはそれ以上の異なる種由来の抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
【０１５１】
抗原結合タンパク質を、数多くの従来の手法の任意のものによって、調製し、所望の特性に関してスクリーニングすることができる。手法のうちあるものは、関心対象の抗原結合タンパク質（例えば、抗アクチビン-A抗体）のポリペプチド鎖（またはその部分）をコードする核酸を単離すること、および組換えDNA技術を通じて核酸を操作することを伴う。核酸を、関心対象の別の核酸と融合させること、または例えば、1つもしくは複数のアミノ酸残基を付加する、除去する、もしくは置換するために改変すること（例えば、変異誘発または他の従来の手法によって）ができる。その上、当技術分野において公知の任意の手法を用いて、抗原結合タンパク質を、それを天然に発現する細胞から精製することもでき（例えば、抗体を、それを産生するハイブリドーマから精製することができる）、または組換え発現系を用いて産生させることもできる。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980)；およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)を参照のこと。
【０１５２】
当技術分野において公知のあらゆる発現系を、本発明の組換えポリペプチドを作製するために用いることができる。発現系については、上記で包括的に詳述している。一般に、宿主細胞を、所望のポリペプチドをコードするDNAを含む組換え発現ベクターによって形質転換させる。使用しうる宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属（Bacilli）が含まれる。高等真核細胞には、昆虫細胞および哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。適した哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎細胞のCOS-7株（ATCC CRL 1651）（Gluzman et al., 1981, Cell 23:175）、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3細胞（ATCC CCL 163）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、BHK（ATCC CRL 10）細胞株、および、McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821によって記載されたようなアフリカミドリザル腎細胞株CVIに由来するCVI／EBNA細胞株（ATCC CCL 70）が含まれる。細菌性、真菌性、酵母性および哺乳動物性の細胞宿主とともに用いるのに適切なクローニングおよび発現ベクターは、Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)によって記載されている。
【０１５３】
形質転換細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養して、従来のタンパク質精製手技（上に定義したような）によってポリペプチドを回収することができる。そのような精製手技の1つは、例えば、アクチビン-Aの全体または一部分（例えば、細胞外ドメイン）を結合させたマトリックスに通す、アフィニィークロマトグラフィーの使用を含む。本明細書における使用を想定しているポリペプチドには、混入性の内因性物質が実質的に存在しない、実質的に均一な組換え哺乳動物抗アクチビン-A抗体ポリペプチドが含まれる。
【０１５４】
1つの局面において、本発明は、本発明の抗アクチビン-A抗体の抗原結合性断片を提供する。そのような断片は、すべてが抗体由来配列からなってもよく、またはさらなる配列を含んでもよい。抗原結合性断片の例には、Fab、F(ab')2、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が含まれる。他の例は、Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06に提示されている。
【０１５５】
単鎖抗体（scFv）は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（Fv領域）の断片をアミノ酸架橋（短いペプチドリンカー、例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結させて、単一のポリペプチド鎖を生じさせることによって形成させることができる。そのような単鎖Fv（scFv）は、2つの可変ドメインポリペプチド（VLおよびVH）をコードするDNAの間に、ペプチドリンカーをコードするDNAを融合させることによって調製されている。その結果得られたポリペプチドは、2つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、それ自体に対してフォールディングを行って抗原結合性単量体を形成するか、またはそれらは多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成する（Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423；Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108, Bird et al., 1988, Science 242:423-26およびHuston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83）。異なるVLおよびVHを含むポリペプチドを組み合わせることにより、異なるエピトープと結合する多量体scFvを形成させることができる（Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40）。単鎖抗体の作製のために開発された手法には、米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242:423；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879；Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87に記載されたものが含まれる。本明細書に提供される抗体に由来する単鎖抗体には、可変ドメインの組み合わせであるL1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、およびL14H14を含むscFvsが非限定的に含まれ、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０１５６】
ダイアボディは2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同一の鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするにはあまりにも短く、それ故に各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対合することを可能にするリンカーによって接続されたVHドメインおよびVLドメインを含む（例えば、Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48、およびPoljak et al., 1994, Structure 2:1 121-23を参照のこと）。ダイアボディの2つのポリペプチド鎖が同一である場合には、それらの対合によって生じるダイアボディは、2つの同一な抗原結合部位を有すると考えられる。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いることで、2種の異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ3つおよび4つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、同じでも異なってもよい3つおよび4つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【０１５７】
フィブロネクチンポリペプチドモノボディを含む抗体ポリペプチドも、米国特許第6,703,199号に開示されている。他の抗体ポリペプチドは米国特許出願公開第2005／0238646号に開示されており、これらは単鎖ポリペプチドである。
【０１５８】
ある好ましい態様において、抗体は1つまたは複数の水溶性ポリマー付着物（attachment）を含み、これには、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールが非限定的に含まれる。例えば、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号、および同第4,179,337号を参照のこと。ある態様において、誘導体結合性物質は、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の糖質ベースのポリマー、ポリ-(N-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにそのようなポリマーの混合物のうち1つまたは複数を含む。ある態様において、1つまたは複数の水溶性ポリマーは、1つまたは複数の側鎖にランダムに結びついている。ある態様において、PEGは、結合性物質、例えば抗体などの治療能力を向上させるように作用しうる。ある種のそのような方法は、例えば、米国特許第6,133,426号に考察されており、それはあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
本発明の抗体は、その抗体が結合特異性を保つことを条件として、少なくとも1つのアミノ酸置換を有してもよいことが認識されると考えられる。したがって、抗体構造の改変物は、本発明の範囲に含まれる。これらには、抗体のアクチビン-A結合能力を破壊しない、保存的であっても非保存的であってもよいアミノ酸置換が含まれうる。保存的アミノ酸置換は天然に存在しないアミノ酸残基を範囲に含んでよく、これらは典型的には、生体系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み入れられる。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸成分の他の逆向き形態または逆方向形態が含まれる。保存的アミノ酸置換にはまた、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響を及ぼさない、標準的な残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換も含まれうる。
【０１６０】
非保存的置換は、1つのクラスのアミノ酸またはアミノ酸模倣物のメンバーを、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラス由来のメンバーと交換することを含みうる。そのような置換された残基は、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域に導入されうるか、またはその分子の非相同領域に導入されうる。
【０１６１】
さらに、当業者は各所望のアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む被験変異体を作製することもできる。続いて、これらの変異体を当業者に公知の活性アッセイ法を用いてスクリーニングすることができる。そのような変異体は、適切な変異体に関する情報を集めるために用いうると考えられる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化により、活性の破壊、望ましくない低下、または不適切な活性がもたらされたことが発見されたならば、そのような変化を有する変異体を避けることができる。換言すれば、そのような慣行的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換を単独でまたは他の変異と組み合わされるかのいずれかで避けるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１６２】
当業者は、周知の手法を用いて、本明細書に示されたようなポリペプチドの適した変異体を決定することができる。ある態様において、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変化させることができる、分子の適切な領域を同定することができる。ある態様においては、類似するポリペプチドの間で保存されている、分子の残基および部分を同定することができる。ある態様においては、生物活性または構造にとって重要である可能性のある領域でさえ、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【０１６３】
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である、同様なポリペプチド中の残基を同定した構造-機能研究を再検討することができる。そのような比較に鑑みて、同様なタンパク質において活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、あるタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのようにして予測された重要なアミノ酸残基に化学的に類似するアミノ酸置換を選択することができる。
【０１６４】
当業者はまた、同様なポリペプチドにおけるその構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。ある態様において、当業者は、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に劇的な変化を加えないことを選択しうるが、これは、そのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるためである。
【０１６５】
多くの科学刊行物が、二次構造の予測を対象としている。Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochem., 13(2):222-245 (1974)；Chou et al., Biochem., 113(2):211-222 (1974)；Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978)；Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276およびChou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979)を参照のこと。さらに、現在では、コンピュータープログラムを二次構造の予測の補助に用いることができる。二次構造を予測する1つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、30％超の配列同一性または40％超の類似性を有する2つのポリペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、同様な構造的トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（PDB）の最近の発展により、ポリペプチドの構造またはタンパク質の構造内にある折りたたみの考えられる数を含め、二次構造の予測性が高まっている。Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)を参照のこと。所与のポリペプチドまたはタンパク質内に限られた数の折りたたみが存在すること、ならびにひとたび決定的な数の構造が解明されると、構造予測の精度は劇的に高まることが示唆されている（Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)）。
【０１６６】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（threading）」（Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997)；Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)）、「プロファイル分析」（Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991)；Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990)；Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)）、および「進化的連鎖」（Holm、前記(1999)、およびBrenner、前記(1997)を参照のこと）が含まれる。
【０１６７】
ある態様において、抗体の変異体には、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、グリコシル化部位の数および／または型が変更されているグリコシル化変異体が含まれる。ある態様において、変異体は、ネイティブなタンパク質よりも多いかまたは少ない数のN結合型グリコシル化部位を含む。N結合型グリコシル化部位は、配列：Asn-X-SerまたはAsn-X-Thrを特徴とし、Xと名づけられたアミノ酸残基は、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であってよい。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換により、N結合型糖質鎖を付加する可能性のある1つの新たな部位がもたらされる。または、この配列を消失させる置換は、既存のN結合型糖質鎖を除去すると考えられる。1つまたは複数のN結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が消失し、1つまたは複数の新規なN結合型部位が作製されるN結合型糖質鎖の再配列も提供される。さらなる好ましい抗体変異体には、その親アミノ酸配列と比較して、1つまたは複数のシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）によって置換されているシステイン変異体が含まれる。不溶性の封入体の単離の後などに、抗体が生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディングされなければならない場合には、システイン変異体が有用でありうる。システイン変異体は一般に、天然のタンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、典型的には、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にするために偶数のシステイン残基を有する。
【０１６８】
所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、そのような置換が所望される場合に当業者によって決定されうる。ある態様において、アミノ酸置換は、アクチビン-Aに対する抗体の重要な残基を同定するため、または本明細書に記載のアクチビン-Aに対する抗体の親和性を増大もしくは低下させるために用いることができる。
【０１６９】
ある態様によれば、好ましいアミノ酸置換は、（1）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（2）酸化に対する感受性を低下させるもの、（3）タンパク質複合体の形成に関する結合親和性を変化させるもの、（4）結合親和性を変化させるもの、および／または（4）他の物理化学的特性もしくは機能的特性を付与もしくは改変するものである。ある態様によれば、単一または複数のアミノ酸置換（ある態様においては、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（ある態様においては、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの一部）において行われることができる。ある態様において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造的特徴を実質的に変化させなくてよい（例えば、置き換えられたアミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊する傾向を持たず、親配列を特徴決定する他の種類の二次構造を破壊する傾向も持たないべきである）。当技術分野において認知されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；およびThornton et al. Nature 354: 105 (1991)に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７０】
ある態様において、本発明の抗体は、ポリマー、脂質、または他の成分と化学的に結合されていてよい。
【０１７１】
結合性物質は、本明細書に記載のCDRのうち少なくとも1つを、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれた形で含みうる。1つの例では、この生体適合性フレームワーク構造は、高次構造的に安定な構造支持体、またはフレームワーク、またはスカフォールドを形成するのに十分であるポリペプチドまたはその部分を含み、これは限局性の表面領域において、抗原と結合するアミノ酸の1つまたは複数の配列（例えば、CDR、可変領域など）を提示することができる。そのような構造は、天然に存在するポリペプチドもしくはポリペプチドの「折りたたみ」（構造モチーフ）でありうるか、または天然に存在するポリペプチドまたは折りたたみと比較して、アミノ酸の付加、欠失もしくは置換などの1つまたは複数の改変を有しうる。これらのスカフォールドは、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌またはウイルスなどの任意の種の（または複数の種の）ポリペプチドに由来しうる。
【０１７２】
典型的には、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スカフォールドまたは骨格に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン（neocarzinostain）、シトクロムb、CP1ジンクフィンガー、PST1、コイルドコイル、LACI-D1、Zドメインおよびテンダミスタットドメインに基づくものを用いることができる（例えば、Nygren and Uhlen, 1997, Curr. Opin. in Struct. Biol, 7, 463-469を参照のこと）。
【０１７３】
本発明の抗体には本明細書に記載のヒト抗体が含まれることが理解されると考えられる。本明細書に記載されたものなどのヒト抗体は、当業者に公知の手法を用いて作製することができる（Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12):1445-1451, 2005；Hwang W. et al., Methods. 36(1):35-42, 2005；Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005；およびClark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000）。
【０１７４】
さらに、当業者は、適した結合性物質が、本明細書に具体的に開示されるような、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3のうち1つまたは複数といった、これらの抗体の部分を含むことを認識するであろう。CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の領域の少なくとも1つは、抗体が非置換CDRの結合特異性を保つことを条件として、少なくとも1つのアミノ酸置換を有しうる。抗体の非CDR部分は非タンパク質分子であってよく、結合性物質は本明細書に開示される抗体のアクチビン-Aとの結合を交差遮断する、かつ／またはアクチビン-Aを中和する。抗体の非CDR部分は非タンパク質分子であってよく、この場合、抗体は競合結合アッセイ法において、ヒトアクチビン-Aペプチドに対して、抗体A1〜A14のうちの少なくとも1つによって示されるものと同様の結合パターンを示し、かつ／またはアクチビン-Aを中和する。抗体の非CDR部分はアミノ酸で構成されてもよく、この場合、抗体は組換え結合タンパク質または合成ペプチドであり、組換え結合タンパク質は、本明細書に開示される抗体のアクチビン-Aとの結合を交差遮断する、かつ／またはアクチビン-Aを中和する。抗体の非CDR部分はアミノ酸で構成されてもよく、この場合、抗体は組換え抗体であり、組換え抗体は、ヒトアクチビン-Aペプチドエピトープ競合結合アッセイ法（下記）において、ヒトアクチビン-Aペプチドに対して、抗体A1〜A14のうち少なくとも1つによって示されるものと同様の結合パターンを示し、かつ／またはアクチビン-Aを中和する。
【０１７５】
抗体が、上記のように、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3のうち1つまたは複数を含む場合、それは、これらの配列をコードするDNAを含有する宿主細胞からの発現によって得ることができる。各CDR配列をコードするDNAをCDRのアミノ酸配列に基づいて決定し、オリゴヌクレオチド合成手法、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手法を適宜用いて、任意の所望の抗体可変領域フレームワークおよび定常領域DNA配列とともに合成することができる。可変領域フレームワークおよび定常領域をコードするDNAは、当業者には、GenBank（登録商標）などの遺伝子配列データベースから広く入手可能である。
【０１７６】
ひとたび合成されれば、本発明の抗体またはその断片をコードするDNAを、いくつかの公知の発現ベクターを用いて、核酸の切り出し、ライゲーション、形質転換、およびトランスフェクションのための種々の周知の手技のいずれかに従って増殖させ、発現させることができる。したがって、ある態様において、抗体断片の発現は、大腸菌などの原核生物宿主内におけることが好ましい場合がある（例えば、Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515を参照のこと）。他のある態様において、抗体またはその断片の発現は、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris））、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）または植物細胞を含む、真核宿主細胞内であることが好ましい場合がある。適した動物細胞の例には、骨髄腫細胞（マウスNSO株など）、COS細胞、CHO細胞、またはハイブリドーマ細胞が非限定的に含まれる。植物細胞の例には、タバコ細胞、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、およびイネ細胞が含まれる。
【０１７７】
抗体可変領域および／または定常領域をコードするDNAを含む1つまたは複数の複製可能な発現ベクターを調製し、それを用いて、適切な細胞株、例えば、マウスNSO株などの非産生型骨髄腫細胞株、または大腸菌などの細菌の形質転換を行うことができ、その中で抗体が産生される。効率的な転写および翻訳を得るためには、各ベクター中のDNA配列は、適切な調節配列、特に可変ドメイン配列と機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含むべきである。このようにして抗体を生産するための具体的な方法は一般に周知であり、慣行的に用いられている。例えば、基本的な分子生物学的手技は、Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；また、Maniatis et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)も参照のこと）に記載されている。DNAのシークエンシングは、Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977)）およびAmersham International plc sequencing handbookに記載された通りに行うことができ、部位特異的変異誘発は当技術分野において公知の方法に従って実施することができる（Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984)；Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985)；Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987)；the Anglian Biotechnology Ltd. handbook）。さらに、多くの刊行物が、DNAの操作による抗体の調製、発現ベクターの作製、ならびに適切な細胞の形質転換および培養に適した手法を記載している（Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK)；"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York）。
【０１７８】
上述したCDRの1つまたは複数を含む、本発明による抗体の親和性を向上させることが望ましい場合には、CDRの維持（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖のシャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌の変異株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996）、DNAシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol, 256, 7-88, 1996）およびセクシュアルPCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。これらの親和性成熟の方法はすべて、Vaughan et al. (Nature Biotech., 16, 535-539, 1998）によって考察されている。
【０１７９】
抗体などのいくつかのタンパク質が、種々の翻訳後修飾を受ける可能性があることは、当業者には理解されるであろう。これらの修飾の種類および程度は、タンパク質を発現させるために用いられる宿主細胞株ならびに培養条件に依存することが多い。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギンアミド分解の差異が含まれうる。よく見られる修飾の1つは、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端の塩基性残基（リジンまたはアルギニンなど）の喪失である（Harris, R.J. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995）。
【０１８０】
svActRIIB：アクチビンIIB受容体
本発明は、安定化されたヒトアクチビンIIB受容体（svActRIIB）ポリペプチドを含む、単離されたタンパク質を開示する。本発明のタンパク質およびポリペプチドは、3種のTGF-βタンパク質、ミオスタチン（GDF-8）、アクチビン-A、またはGDF-11のうち少なくとも1つと結合する能力、これらのタンパク質のうち少なくとも1つの活性を阻害する能力、およびその他のActRIIB可溶性受容体と比較して改善された製造性特性を有する能力を特徴とする。安定化されたヒトアクチビンIIB受容体ポリペプチドは、以下の配列：
2016508504.tif 000040
に示されたActRIIBの細胞外ドメインに対する、E28およびS44の両方の位置でのアミノ酸置換を特徴とする。1つの態様において、安定化されたヒトアクチビンIIB受容体ポリペプチドは、上記の配列の位置64にアラニンの置換をさらに有してもよい。
【０１８１】
「TGF-βファミリーメンバー」または「TGF-βタンパク質」とは、アクチビンを含むトランスフォーミング増殖因子ファミリーに構造的に関係した増殖因子、および増殖分化因子（GDF）タンパク質のことを意味する（Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al., Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. IB, D. LeRoith and C. Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357-393）。
【０１８２】
GDF-8は、ミオスタチンとも称され、骨格筋組織の負の調節因子である（McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)）。ミオスタチンは、長さがおよそ375アミノ酸の、ヒトの場合にはGenBankアクセッション番号：AAB86694を有する不活性タンパク質として合成される。この前駆体タンパク質は、四塩基性のプロセシング部位でのタンパク分解によって活性化されて、N末端不活性プロドメインおよびおよそ109アミノ酸のC末端タンパク質を生じ、後者が二量体化して約25kDaのホモ二量体を形成する。このホモ二量体は、成熟した生物学的に活性なタンパク質である（Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)）。
【０１８３】
「プロドメイン」または「プロペプチド」とは、切断されて活性型C末端タンパク質を放出する、不活性N末端タンパク質のことを意味する。本明細書で用いる場合、「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」という用語は、単量体、二量体またはその他の形態の、成熟した生物学的に活性なC末端ポリペプチド、ならびに対立変異体、スプライシング変異体、および融合ペプチドおよびポリペプチドを含む、生物学的に活性な断片または関連ポリペプチドのことを意味する。成熟ミオスタチンは、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、シチメンチョウおよびラットを含む多くの種の間で100％の配列相同性を有することが報告されている（Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)）。
【０１８４】
GDF-11とは、Swissprotアクセッション番号O95390を有するBMP（骨形態形成タンパク質）、ならびにそのタンパク質の変異体および種相同体のことを意味する。GDF-11は軸骨格の前／後パターニングの調節に関与するが（McPherron et al., Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999)；Gamer et al., Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999)）、出生後の機能については分かっていない。
【０１８５】
受容体ポリペプチド
アクチビンIIB型受容体（ActRIIB）は、アクセッション番号NP_001097を有するヒトアクチビン受容体、またはその変異体、例えば位置64にあるアルギニンがアラニンによって置換されたものでありうる。可溶性ActRIIB（野生型）という用語は、ActRIIBの細胞外ドメイン、SEQ ID NO：2の1から134までのアミノ酸（シグナル配列を含む）、または19から134までのアミノ酸（シグナル配列を含まない）のことを意味する。
【０１８６】
本発明は、安定化されたActIIB受容体ポリペプチド（本明細書では「svActRIIBポリペプチド」と称される）を含む、単離されたタンパク質を提供する。「svActRIIBタンパク質」とは、安定化されたActRIIBポリペプチドを含むタンパク質のことである。「単離された」という用語は、内因性物質からある度合いまで精製されたタンパク質分子またはポリペプチド分子のことを指す。これらのポリペプチドおよびタンパク質は、改善された製造性特性を有することに加えて、アクチビン-A、ミオスタチン、またはGDF-11のいずれか1つと結合して、その活性を阻害する能力を有するとして特徴決定される。
【０１８７】
安定化されたActRIIBポリペプチドは、SEQ ID NO：2の位置28および44の両方にアミノ酸置換を有することを特徴する。一貫性を保つために、安定化されたActRIIBポリペプチドおよびタンパク質上のアミノ酸位置は常に、ポリペプチドが成熟しているか短縮しているかにかかわらず、SEQ ID NO：2における位置によって言及される。本明細書で用いる場合、「成熟した」という用語は、そのシグナル配列を伴わないポリペプチドまたはペプチドのことを指す。本明細書で用いる場合、「短縮した」という用語は、N末端アミノ酸またはC末端アミノ酸が除去されたポリペプチドのことを指す。
【０１８８】
1つの態様において、単離された安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）は、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2に示されたポリペプチド配列を有する。別の態様において、ポリペプチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2のアミノ酸19〜134に示された配列を有する。別の態様において、ポリペプチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2のアミノ酸23〜134に示された配列を有する。別の態様において、ポリペプチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2のアミノ酸25〜134に示された配列を有する。別の態様において、ポリペプチドは、上記のポリペプチドのいずれか1つに対して少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、このポリペプチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであり、かつ、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。1つの態様において、上記のポリペプチドの位置28での置換はWであり、位置44での置換はTであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。
【０１８９】
1つの態様において、svActRIIBポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO：4、8、12、および16のシグナル配列を含む（配列については以下参照）。しかし、本出願のポリペプチドの調製には、さまざまなシグナルペプチドを用いることができる。シグナルペプチドは、例えば、SEQ ID NO：4のアミノ酸1〜19に示された配列、またはSEQ ID NO：31および32に示されたシグナル配列を有しうる。svActRIIBポリペプチドを発現させるために有用な、他の任意のシグナルペプチドを用いてもよい。他の態様においては、シグナル配列が除去され、成熟ペプチドが残される。シグナル配列を欠くsvActRIIBポリペプチドの例には、例えば、SEQ ID NO：6、10、14、および18が含まれる。
【０１９０】
1つの態様において、タンパク質は安定化されたアクチビンIIB受容体ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、SEQ ID NO：4、6、12、および14からなる群に示された配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。これらのポリペプチドはSEQ ID NO：2のアミノ酸25〜134に相当し、このポリペプチドは位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換はTであり、かつこのポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができ、SEQ ID NO：2に示されたものと異なるシグナル配列を伴うかまたは伴わない。別の態様において、タンパク質は、SEQ ID NO：4、6、12、または14に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、かつ、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。1つの態様において、位置28での置換はWであり、かつ位置44での置換はTであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。
【０１９１】
1つのさらなる態様において、svActRIIBタンパク質は異種タンパク質をさらに含む。1つの態様において、異種タンパク質はFcドメインである。1つのさらなる態様において、FcドメインはヒトIgG Fcドメインである。1つの態様において、タンパク質は、SEQ ID NO：8、10、16、および18からなる群に示された配列を有するポリペプチドを含む。別の態様において、タンパク質は、SEQ ID NO：8、10、16、または18に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、このポリペプチドは、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、かつ、このポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。1つの態様において、位置28での置換はWであり、かつ位置44での置換はTであり、このポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。
【０１９２】
1つのさらなる態様において、タンパク質は上記のポリペプチドのいずれか1つを含み、位置64のアミノ酸残基はアラニンである。
【０１９３】
別の態様において、svActRIIBポリペプチドおよびタンパク質という用語は、N末端およびC末端の短縮を含む、SEQ ID NO：2、4、6、12、および14の断片を含むタンパク質を範囲に含み、位置28はWまたはYであり、かつ位置44はTであり、かつこのポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。
【０１９４】
svActRIIBポリペプチドの「誘導体」という用語は、共有結合性または凝集性の結合体を形成するための少なくとも1つのさらなる化学成分、または少なくとも1つのさらなるポリペプチド、例えば、グリコシル基、脂質、アセチル基、またはC末端もしくはN末端融合ポリペプチド、PEG分子との結合体化、および以下により十分に記載される他の修飾物などの結びつきのことを指す。安定化されたActRIIB受容体ポリペプチドはまた、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母、および他の組換え宿主細胞といったさまざまな細胞型における発現に起因するプロセシングによって生じるC末端およびN末端への修飾を含む、さらなる改変体および誘導体も含む。
【０１９５】
本発明のsvActRIIBタンパク質は、融合タンパク質を形成するために、直接的またはリンカー配列を介してsvActRIIBポリペプチドと結びついた異種ポリペプチドをさらに含みうる。本明細書で用いる場合、「融合タンパク質」という用語は、組換えDNA手法を介して結びつけられた異種ポリペプチドを有するタンパク質のことを指す。異種ポリペプチドには、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO 00／29581に記載されたような、安定化されたActRIIBポリペプチドのオリゴマー形成およびさらなる安定化を促進するためのFcポリペプチド、hisタグ、およびロイシンジッパードメインなどが非限定的に含まれる。1つの態様において、異種ポリペプチドはFcポリペプチドまたはドメインである。1つの態様において、Fcドメインは、ヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：23）、改変IgG1 Fc（SEQ ID NO：47）、IgG2 Fc（SEQ ID NO：22）、およびIgG4 Fc（SEQ ID NO：24）ドメインから選択される。svActRIIBタンパク質は、IgG1（SEQ ID NO：29）、IgG2（SEQ ID NO：28）、またはIgG4（SEQ ID NO：30）のヒンジ配列の全体または一部分をさらに含んでもよい。例示的なsvActRIIBポリペプチドは、SEQ ID NO：8、10、16および18に示される配列からなるポリペプチド、ならびに位置28および44での置換が保たれている、これらの配列に対して実質的な相同性を有するポリペプチドから選択される。本明細書で用いる場合、「実質的な相同性」とは、SEQ ID NO：8、10、16、および18のいずれかに対して少なくとも80％同一、85％同一、90％同一、95％同一、96％同一、97％同一、98％同一、99％同一である配列を指し、このポリペプチドは、位置28のWまたはY、および位置44のTを保っており、かつミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。1つの態様において、位置28での置換はWであり、位置44での置換はTであり、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。
【０１９６】
svActRIIBポリペプチドは任意で、「リンカー」配列をさらに含むことができる。リンカーは主として、ポリペプチドと第2の異種ポリペプチドもしくはその他の型の融合体との間の、または2つもしくはそれ以上の安定化されたActRIIBポリペプチド間のスペーサーとして機能する。1つの態様において、リンカーは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された、天然に存在する20種のアミノ酸から選択される1〜20個のアミノ酸で構成される。当業者は理解するであろうが、これらのアミノ酸の1つまたは複数がグリコシル化されていてもよい。1つの態様において、この1〜20個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択されうる。1つの態様において、リンカーの大半は、立体障害のないアミノ酸、例えばグリシンおよびアラニンなどから構成される。リンカーの例には、ポリグリシン（特に（Gly）5（SEQ ID NO：289）、（Gly）8（SEQ ID NO：290）、ポリ（Gly-Ala）、およびポリアラニンが含まれる。下記の実施例において示されるように、1つの例示的な適したリンカーは、（Gly）4Ser（SEQ ID NO：25）である。1つのさらなる態様において、svActRIIBは、SEQ ID NO：27に例示されたような、ヒンジ領域に隣接して提供されるリンカー配列、またはIgGの部分的なヒンジ領域である「ヒンジリンカー」を含んでもよい。ヒンジ配列には、IgG2 Fc（SEQ ID NO：28）、IgG1 Fc（SEQ ID NO：29）、およびIgG4 Fc（SEQ ID NO：30）が含まれる。
【０１９７】
またヒンジリンカー配列を、製造性およびsvActRIIB-Fcタンパク質の安定性を向上させるために設計することもできる。1つの態様においては、SEQ ID NO：27、38、40、42、44、45、および46のヒンジリンカーが、svActRIIBポリペプチドと結びついた場合に製造性を向上させるように、IgG2Fc（SEQ ID NO：22）を用いて設計される。1つの態様においては、svActRIIBポリペプチドがヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：23）または改変されたヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：47）と結びついた場合に製造性を向上させるように、例えば、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49およびSEQ ID NO：50を有するヒンジリンカー配列が設計される。
【０１９８】
リンカーはまた、非ペプチド性リンカーであってもよい。例えば、s＝2〜20である、-NH-(CH2)s-C(O)-などのアルキルリンカーを用いることができる。これらのアルキルリンカーを、低級アルキル（例えば、C1〜C6）低級アシル、ハロゲン（例えばCl、Br）、CN、NH2、フェニルなどの非立体障害基によってさらに置換することもできる。
【０１９９】
本明細書に開示されるsvActRIIBポリペプチドを、分解を減少させるため、および／または半減期を延長するため、毒性を減少させるため、免疫原性を低下させるため、および／またはsvActRIIBポリペプチドの生物活性を高めるため、といった所望の特性を付与する目的で、非ポリペプチド分子と結びつけることもできる。例示的な分子には、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリリジン、デキストランなどの線状ポリマー；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；糖質、またはオリゴ糖分子などが非限定的に含まれる。
【０２００】
svActRIIBタンパク質およびポリペプチドは、他のActRIIB可溶性ポリペプチドと比較して向上した製造性特性を有する。本明細書で用いる場合、「製造性」という用語は、特定のタンパク質の、そのタンパク質の組換え発現および精製における安定性のことを指す。製造性は発現および精製の条件下における分子固有の特性に起因すると考えられている。
【０２０１】
svActRIIBポリペプチドの活性には、ミオスタチンまたはアクチビン-AまたはGDF-11と結合する能力、およびミオスタチンまたはアクチビン-AまたはGDF-11の活性を阻害または中和する能力が非限定的に含まれる。本明細書で用いる場合、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11と「結合することができる」という用語は、当技術分野において公知の方法によって測定される結合のことを指す。ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11のインビトロでの阻害は、例えば、pMARE C2C12細胞ベースのアッセイ法によって測定することができる。インビボ活性は、マウスモデルにおける除脂肪体重の増加によって実証されている。svActRIIBポリペプチドおよびタンパク質のインビボ活性には、体重の増加、除脂肪体重の増加、および体脂肪量に対する除脂肪体重の比率の増加が非限定的に含まれる。治療活性にはさらに、特定の種類の腫瘍によって引き起こされる悪液質を低下または予防すること、特定の種類の腫瘍の増殖を予防すること、および特定の動物モデルの生存率を高めることが含まれる。svActRIIBタンパク質およびポリペプチド活性についてのさらなる考察は以下に提示されている。
【０２０２】
別の局面において、本発明は、本発明のsvActRIIBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、内因性物質からある程度まで精製された核酸分子のことを指す。
【０２０３】
1つの態様において、ポリヌクレオチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2に示された配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、ポリヌクレオチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2のアミノ酸19〜134に示された配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、ポリヌクレオチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2のアミノ酸23〜134に示された配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、ポリヌクレオチドは、位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換がWまたはYから選択され、位置44での置換がTであることを除き、SEQ ID NO：2のアミノ酸25〜134に示された配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様において、ポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドのいずれか1つに対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％または99％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、このポリペプチドは位置28に単一のアミノ酸置換および位置44に単一のアミノ酸置換を有し、位置28での置換はWまたはYから選択され、位置44での置換はTであり、かつこのポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。1つの態様において、上記の態様のポリヌクレオチドは、位置28での置換がWでありかつ位置44での置換がTである、ポリペプチドをコードする。
【０２０４】
1つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO：4、6、12、および14からなる群に示された配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の態様において、核酸は、SEQ ID NO：4、6、12、または14に対して少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリペプチドは位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、かつ、ポリペプチドはアクチビン-A、GDF-11、またはミオスタチンを結合させることができる。1つの態様において、上記の態様のポリヌクレオチドは、位置28での置換がWであり位置44での置換がTである、ポリペプチドをコードし、かつ、ポリペプチドはアクチビン-A、GDF-11、またはミオスタチンを結合させることができる。
【０２０５】
別の態様において、単離された核酸分子は、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。1つの態様において、異種タンパク質はFcドメインであり、1つのさらなる態様において、FcドメインはヒトIgG Fcドメインである。別の態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：25、27、38、40、42、44、45、46、48、49、または50に示されたリンカーおよびヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。1つのさらなる態様において、そのようなポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：26、37、39、41、および43からなる群より選択される配列を有する。
【０２０６】
1つの態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：8、10、16、および18からなる群に示された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の態様において、核酸は、SEQ ID NO：8、10、16、および18からなる群に対して少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリペプチドは、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有し、かつ、該ポリペプチドはアクチビン-A、GDF-11、またはミオスタチンを結合させることができる。1つの態様において、上記の態様のポリヌクレオチドは、位置28での置換がWでありかつ位置44での置換がTである、ポリペプチドをコードし、かつこのポリペプチドはミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11を結合させることができる。
【０２０７】
1つの態様において、単離された核酸分子は、SEQ ID NO：3、5、11、もしくは13からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む。別の態様において、単離された核酸分子は、配列SEQ ID NO：7、9、15、および17からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む。1つのさらなる態様において、単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下または中程度の条件下で、SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、または17とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドはSEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、または18と実質的に同様であり、該ポリペプチドは、位置28にWまたはYを有しかつ位置44にTを有する、アミノ酸配列を含み、かつ、コードされるポリペプチドはアクチビン-A、ミオスタチン、またはGDF-11を結合させること、またはそれを阻害することができる。
【０２０８】
本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖の両方のDNA、ならびにそのRNA相補鎖を含む。DNAは、例えば、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、PCRによって増幅されたDNA、およびその組み合わせを含む。ゲノムDNAは、標準的な手法によって、例えば、SEQ ID NO：3、5、11、もしくは13のDNA、または適したその断片をプローブとして用いることなどによって、単離することができる。ActRIIBポリペプチドをコードするゲノムDNAは、数多くの種について使用可能であるゲノムライブラリーから得られる。合成DNAは、一部重複したオリゴヌクレオチド断片を化学合成し、その後に断片の集成によって、コード領域およびフランキング配列の一部または全体を再構築することによって入手可能である。RNAは、T7プロモーターおよびRNAポリメラーゼを用いたベクターなどの高レベルのmRNA合成を誘導する原核生物発現ベクターから得ることができる。cDNAは、ActRIIBを発現するさまざまな組織から単離されたmRNAを用いて調製されたライブラリーから得られる。本発明のDNA分子は、完全長遺伝子、ならびにポリヌクレオチドおよびその断片を含む。完全長遺伝子はまた、N末端シグナル配列をコードする配列を含んでもよい。
【０２０９】
本発明は、上述の核酸分子をさらに提供し、ポリヌクレオチドは、転写調節配列または翻訳調節配列に機能的に連結されている。
【０２１０】
例示的なポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
シグナル配列を伴わないsvActRIIB
2016508504.tif 000041
シグナル配列を伴うsvActRIIB（E28W、S44T）
2016508504.tif 000042
シグナル配列を伴うsvActRIIB（E28W、S44T）
2016508504.tif 000043
シグナル配列を伴わないsvActRIIB（E28W、S44T）
2016508504.tif 000044
シグナル配列を伴わないsvActRIIB（E28W、S44T）
2016508504.tif 000045
シグナル配列を伴うsvActRIIB-Fc（E28W、S44T）ポリヌクレオチド配列
2016508504.tif 000046
シグナル配列を伴うsvActRIIB-Fc（E28W、S44T）ポリペプチド配列
2016508504.tif 000047
シグナル配列を伴わないsvActRIIB-Fc（E28W、S44T）ポリヌクレオチド配列
2016508504.tif 000048
シグナル配列を伴わないsvActRIIB-Fc（E28W、S44T）ポリペプチド配列
2016508504.tif 000049
シグナル配列を伴うsvActRIIB（E28Y、S44T）
2016508504.tif 000050
シグナル配列を伴うsvActRIIB（E28Y、S44T）
2016508504.tif 000051
シグナル配列を伴わないsvActRIIB（E28Y、S44T）
2016508504.tif 000052
シグナル配列を伴わないsvActRIIB（E28Y、S44T）
2016508504.tif 000053
シグナル配列を伴うsvActRIIB-Fc（E28Y、S44T）ポリヌクレオチド配列
2016508504.tif 000054
シグナル配列を伴うsvActRIIB-Fc（E28Y、S44T）ポリペプチド配列
2016508504.tif 000055
シグナル配列を伴わないsvActRIIB-Fc（E28Y、S44T）ポリヌクレオチド配列
2016508504.tif 000056
シグナル配列を伴わないsvActRIIB-Fc（E28Y、S44T）ポリペプチド配列
2016508504.tif 000057
2016508504.tif 000058
2016508504.tif 000059
2016508504.tif 000060
2016508504.tif 000061
【０２１１】
安定化されたアクチビンII型Bポリペプチドは、筋肉分解カスケードを活性化するリガンドと結合する。svActRIIBポリペプチドは、リガンドであるアクチビン-A、ミオスタチンおよび／またはGDF-11と結合してその活性を阻害することができ、筋萎縮を伴う疾患、ならびにある種の癌および他の疾患を治療する能力を有する。
【０２１２】
治療のための薬学的組成物および方法
治療方法
1つの局面において、本発明は、対象を治療する方法を提供する。本方法は、例えば、対象の健康状態に対して全般的に有益な効果を有することができ、例えば、これは対象の予想寿命を延長させることができる。または、本方法は、例えば、疾患、障害、病状、または疾病（「病状」）を治療すること、予防すること、治癒させること、緩和すること、または改善すること（「治療すること」）ができる。本発明に従って治療される病状は、アクチビン-Aの不適切な発現または活性を特徴とする。そのようないくつかの病状において、発現または活性レベルは過度に高く、治療は、本明細書に記載されるようなアクチビン-Aアンタゴニストを投与する段階を含む。本明細書で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳動物などの任意の動物のことを指す。
【０２１３】
本発明の方法および組成物を用いて治療しうる型の病状の一例は、細胞増殖を伴う病状、例えば、悪液質を伴う癌性病状である。したがって、1つの態様において、本発明は、癌性病状を治療するための組成物および方法を提供する。特に、癌性病状は、卵巣および精巣の腫瘍を含む生殖腺癌である。（Fujii, Y. et al., Am. J. Phys. Endocrin. Metab., 286:E927-E931, 2004；Reis, F. M. et al., J. Clin. Endocrin. 57:2277-2282, 2005）。アクチビン-Aは、脳下垂体においてFSH生合成および分泌を刺激するその作用の点で知られており、生殖腺機能の調節において生理的役割を有する。アクチビン-Aは、多くの種類のヒト癌、特に生殖器系の腫瘍と関連づけられている。具体的には、アクチビン-Aの過剰発現または調節不全は、卵巣癌（Menon U, et al., BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology；107(9): 1069-74, 2000. Choi KC, et al., Molecular & Cellular Endocrinology. 174(1-2):99-110, 2001；Zheng W, et al., American Journal of Reproductive Immunology. 44(2): 104-13, 2000；Lambert-Messerlian GM, et al., Gynecologic Oncology. 74(1):93-7, 1999；Steller MD, et al., Molecular Cancer Research: MCR. 3(1): 50-61, 2005；Corbellis L., et al., Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11(4):203-6, 2004；Welt CK, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11):3720-7, 1997；およびHarada K., et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 81(6):2125-30, 1996、子宮内膜腺癌 Otani, T, et a., Gynecologic Oncology. 83(1):31-8, 2001；Tanaka T, et al., International Journal of Oncology. 23(3):657-63, 2003、および前立腺癌（Thomas TZ, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11):3851-8, 1997；Zhang, Z, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications. 234(2):362-5, 1997；およびRisbridger GP, et al., Molecular & Cellular Endocrinology. 180(1-2):149-53, 2001における関与が示唆されている。
【０２１４】
癌性病状は、本明細書に含まれる組成物、例えば、抗アクチビン-A化合物、例えばアクチビンIIB受容体ポリペプチド（svActRIIB）など、およびアクチビン-A抗原結合性タンパク質、例えば抗アクチビン-A抗体、抗体断片、または抗体誘導体などを用いて治療しうる任意の癌性病状でありうる。癌性病状の例には、例えば、急性リンパ性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明細胞腫、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路および視床下部）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼球内黒色腫、膵島細胞癌（膵島）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ性、急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性、およびヘアリー細胞）、口唇および口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、エイズ関連、バーキット、皮膚T細胞性、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および尿管移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部肉腫、扁平上皮癌、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明細胞腫、原発部位不明の癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が含まれる。
【０２１５】
本明細書において提供されるある種の方法は、アクチビン-A結合性タンパク質を対象に投与し、それによって、特定の病状に影響を及ぼすアクチビン-A誘発性の生物学的応答を減少させる段階を含む。特定の態様において、本発明の方法は、例えば、対象への投与またはエクスビボ手技を介して、内因性アクチビン-Aをアクチビン-A結合性タンパク質と接触させる段階を含む。
【０２１６】
「治療」という用語は、障害の症状もしくは他の局面の少なくとも1つの緩和もしくは予防、または疾患重症度の低下などを範囲に含む。さらに、「治療」は、それを必要とする対象における疾患の症状または他の局面の少なくとも1つを予防または緩和するための、本明細書に記載の治療的物質を投与することにもさらに関する。抗原結合タンパク質は、実用性のある治療的物質であるために、完全な治癒を達成する必要はなく、疾患のあらゆる症状または症状発現を根絶する必要もない。関連分野において認識されているように、治療的物質として用いられる薬物は、所与の疾患状態の重症度を低下させうるが、有用な治療的物質と見なされるためには、疾患のあらゆる徴候を消失させる必要はない。同様に、予防処置的に実施される治療は、実用性のある予防薬であるために、病状の発症を予防するのに完全に有効である必要はない。単に疾患の影響を減少させること（例えば、その症状の数もしくは重症度を減少させることによって、または別の治療の有効性を高めることによって、または別の有益な効果を生じさせることによって）、または疾患が、対象において生じるもしくは悪化する可能性を減少させることで十分である。本発明の1つの態様は、特定の疾患の重症度を反映する指標のベースラインを上回る持続的改善を誘導するのに十分な量および時間で、アクチビン-Aアンタゴニストを患者に投与することを含む方法に関する。
【０２１７】
また、エクスビボ手技における抗原結合タンパク質の使用も想定している。例えば、患者の血液または他の体液を、完全長アクチビン-A、1つもしくは複数のアクチビン-Aアイソフォーム、または他の部分長アクチビン-Aを結合させる抗原結合タンパク質とエクスビボで接触させることができる。抗原結合タンパク質を、適した不溶性マトリックスまたは固体支持材料と結合させてもよい。
【０２１８】
治療のための対象の同定
バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aの対象のレベルを、漿液性卵巣癌を含む卵巣癌（表面上皮-間質腫瘍を含む卵巣新生物）に対する治療を必要とする対象を同定するためにモニターすることができる。例えば、バイオマーカーCA-125および／またはアクチビン-Aのレベルを対象において検出して、対照と比較することができる。まず、CA-125および／またはアクチビンAの対象の発現レベルを評価する。次に、CA-125および／またはアクチビン-Aの対象の発現レベルを、陰性対照試料または陽性対照試料における発現レベルと比較する。対象におけるCA-125および／またはアクチビン-Aの発現レベルが、陰性対照試料における発現レベルを上回るか、または発現レベルが陽性対照試料における発現レベルに合致するかもしくはそれを上回るならば、その対象は、卵巣癌の治療を必要とする者として同定される。いくつかの局面において、発現レベルが、以前の時点で、特に腫瘍がその初期段階にある時点で得られた対象の発現レベルを上回るならば、その対象は卵巣癌の治療を必要とする者として同定することができる。例えば、対象の血清中の、CA-125および／またはアクチビン-Aレベルの測定には、公知の手法を使用することができる。血液試料におけるCA-125および／またはアクチビン-Aレベルは、任意の適した手法、例えば、ELISAまたはRT-PCRを用いて測定することができる。
【０２１９】
アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子の対象のレベルをモニターすることで、明細胞卵巣癌（胎児中腎から生じる上皮卵巣新生物）、顆粒膜細胞卵巣癌（性索間質細胞由来の新生物）、ライディッヒ細胞腫瘍（ライディッヒ細胞に由来する精巣腫瘍）および性索間質性精巣腫瘍（精巣および卵巣の間質に由来する）を含む、卵巣癌の治療を必要とする対象を同定することができる。アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1因子のレベルを対象において検出して、対照と比較することができる。まず、アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1の対象の発現レベルを評価する。次に、アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1の対象の発現レベルを、陰性対照試料または陽性対照試料における発現レベルと比較する。対象におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1の発現レベルが、陰性対照試料における発現レベルを上回るか、または発現レベルが陽性対照試料における発現レベルに合致するかもしくはそれを上回るならば、その対象は、卵巣癌の治療を必要とする者として同定される。1つの態様において、対象におけるアクチビン-Aレベルが同じ年齢の平均的な人におけるアクチビン-Aレベルの3倍の高さであるならば、または対象におけるアクチビン-Aレベルが3200pg／mLを上回るならば、その特定の対象は治療を受けることを始めるべきである。例えば、対象の血清中の、アクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1レベルの測定には、公知の手法を使用することができる。血液試料におけるアクチビン-A、VEGF、および／またはAng-1レベルは、任意の適した手法、例えば、ELISAを用いて測定することができる。
【０２２０】
いくつかの態様において、対象は、変異導入したアクチビン遺伝子、または例えばインヒビンなどの変異導入したアクチビン対抗制御遺伝子を有する。さらなる態様において、変異は、インヒビンもしくはアクチビンタンパク質のβ-A-サブユニット（GenBankアクセッション番号：NM_002192.2；MIM #147290；www.lovd.nl/inhba）におけるAsn386Ser変異、インヒビンもしくはアクチビンタンパク質のαプロドメイン（GenBankアクセッション番号：NM_002191.3；www.lovd.nl/inha）のArg60Leu変異、またはインヒビンもしくはアクチビンタンパク質のαプロドメイン（GenBankアクセッション番号：NM_002192.2）のGly280Glu変異である（Tournier et al., Hum. Mutat. 0:1-4, 2013を参照のこと）。
【０２２１】
組成物
本発明のタンパク質およびポリペプチドを含有する薬学的組成物も提供される。そのような組成物は、ポリペプチドまたはタンパク質の治療的または予防処置的な有効量を、薬学的に許容される材料、および生理的に許容される製剤材料と混合された形で含む。薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透などを改変するため、維持するため、または保持するための製剤材料を含有しうる。
【０２２２】
適した製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗微生物剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス-HCl、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；充填剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖および他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤；矯味矯臭剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20、ポリソルベート80などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（tyloxapal）など）；安定性強化剤（スクロースまたはソルビトール）；張性強化剤（ハロゲン化アルカリ金属など（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的補助剤などが非限定的に含まれる。中性緩衝食塩水、または同種血清アルブミンと混合された食塩水は、適切な希釈剤の例である。適切な業界標準に従って、ベンジルアルコールなどの保存料が添加されてもよい。組成物を、希釈剤としての適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を用いて、凍結乾燥物として製剤化することもできる。適した構成要素は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。薬学的製剤において使用されうる構成要素のさらなる例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. (1980) and 20th Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PAに提示されている。
【０２２３】
任意で、組成物がさらに、1つまたは複数の生理的活性物質、例えば、その非排他的な例が本明細書において提示される、第2のアクチビン-A受容体阻害物質、抗血管新生性物質、化学療法物質（カペシタビン、5-フルオロウラシルまたはドキソルビシンなど）、鎮痛性物質などを含んでもよい。さまざまな特定の態様において、組成物は、アクチビン-A結合タンパク質に加えて、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの生理的活性物質を含む。
【０２２４】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される組成物を、中性または塩の形態で製剤化することもできる。薬学的に許容される例示的な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が含まれ、これは例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩を、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることもできる。製剤化の際には、投与製剤に適合した様式、および治療的に有効であるような量で溶液が投与されうる。
【０２２５】
担体はさらに、溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド、ならびに同様のもののうち任意のものおよびすべてを含むことができる。薬学的活性物質に対するそのような媒体および剤の使用は当技術分野で周知である。従来のいかなる媒体もしくは剤も、活性成分と不適合でない限り、治療用組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分を組成物中に組み入れることもできる。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与された場合、アレルギー反応または類似の好ましくない反応を生じさせない分子的実体および組成物のことを指す。
【０２２６】
最適な薬学的組成物は、例えば、意図する投与経路、送達形式、および所望の投与量などに応じて、当業者によって決定されると考えられる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、前記を参照のこと。そのような組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度、インビボクリアランス速度に影響を及ぼしうる。例えば、適した組成物は、非経口投与用の注射用水、生理的食塩溶液であってよい。
【０２２７】
治療の実施
製剤は、種々の方法で、例えば、皮下に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経口的に、または吸入療法によって送達することができる。そのようなアプローチは当業者には周知であり、そのいくつかは、例えば、米国特許第5,543,158号、米国特許第5,641,515号、および米国特許第5,399,363号にさらに記載されている。非経口的投与を想定している場合には、本発明に用いるための治療的組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のポリペプチドを含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水性溶液の形態にあってよい。非経口的注射に特に適したビヒクルは、ポリペプチドが適切に保存された無菌等張溶液として製剤化されている無菌蒸留水である。さらに別の調製物は、生成物の制御放出または持続放出をもたらし、続いてデポー注射を介して送達されうる、所望の分子の、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの作用物質との製剤を含むことができる。ヒアルロン酸を用いることもでき、これは循環中に存在する期間の持続を促進する効果を有しうる。所望の分子を導入するための他の適切な手段には、植え込み型の薬物送達デバイスが含まれる。
【０２２８】
別の局面において、注射可能な投与に適した薬学的製剤を、水性溶液中、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝された生理食塩水などの生理学的に適合しうる緩衝液中に製剤化することもできる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘性を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してもよい。さらに、適切な油性注射懸濁物として、活性化合物の懸濁物を調製してもよい。適した親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを送達のために用いることもできる。任意で、懸濁物はまた、適した安定化剤、または化合物の溶解度を高めて非常に濃縮された溶液の調製を可能にする作用物質も含有してもよい。別の態様において、薬学的組成物を吸入用に製剤化してもよい。また、吸入溶液をエアロゾル送達用の噴霧剤を用いて製剤化してもよい。さらに別の態様において、溶液を噴霧してもよい。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載しているPCT出願番号PCT／US94／001875にさらに記載されている。
【０２２９】
1つの態様において、水溶液としての非経口的投与のためには、必要に応じて、溶液は適した緩衝化を受けるべきであり、液体希釈剤にまず十分な食塩水またはグルコースによって等張性を与えるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用しうる無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、1回の投与量を1mlの等張NaCl溶液中に溶解させて、1000mlの皮下注入液中に添加するか注入が提案される部位に注入することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038および1570-1580を参照のこと）。投与量のある程度の変更は、治療される対象の状態に応じて必ず起こりうる。さらに、ヒトへの投与のためには、調製物は当然ながら、FDAの生物製剤部の基準によって要求される無菌性基準、発熱原性基準、ならびに一般的安全性および純度基準を満たすものと考えられる。
【０２３０】
また、ある種の製剤は経口的に投与してもよいことが想定される。本発明の1つの態様において、この方式で投与される分子を、錠剤またはカプセル剤などの固形剤形の調合に通例用いられる担体とともに、またはそのような担体を伴わずに製剤化することができる。例えば、カプセル剤を、生物学的利用能が最大になり、かつ体循環前（pre-systemic）分解が最小限に抑えられるような消化管内の箇所で製剤の活性部分が放出されるように設計することができる。治療用分子の吸収が容易になるように、さらなる作用物質を含めることができる。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤を用いてもよい。また、経口投与用の薬学的組成物を、経口投与に適した投与量で、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体を用いて製剤化することもできる。そのような担体により、薬学的組成物を、患者によって摂取されるための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。
【０２３１】
経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固形賦形剤と混和し、その結果得られた顆粒の混合物を（任意で、粉砕後に）錠剤または糖衣錠コアが得られるように加工することによって得ることができる。所望であれば、適した助剤を添加することがができる。好適な賦形剤には、糖質またはタンパク質充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が含まれる。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、およびアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどを添加してもよい。
【０２３２】
糖衣錠コアは濃厚糖溶液などの適切なコーティングとともに用いることができ、それはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適した有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴決定するために、錠剤または糖衣錠のコーティングに染料または顔料を加えてもよい。
【０２３３】
経口的に用いうる薬学的調製物には、ゼラチン製のプッシュフィット式（push-fit）カプセル剤、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとで作られた密封軟カプセル剤も含まれる。プッシュフィット式カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合性物質、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、そして任意で安定化剤と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定化剤を伴うかまたは伴わずに、適した液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁させることができる。
【０２３４】
持続送達製剤または制御送達製剤中のポリペプチドを伴う製剤を含むさらなる薬学的組成物は、当業者には明白であると考えられる。他のさまざまな持続送達手段または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体浸食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射剤などを製剤化するための手法も、当業者には公知である。例えば、薬学的組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出が記載されているPCT／US93／00829を参照のこと。持続放出調製物のさらなる例には、フィルムまたはマイクロカプセルなどといった造形品の形態にある半透過性ポリマーマトリックスがある。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートとのコポリマー（Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277, (1981)；Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105(1982))、エチレン酢酸ビニル（Langer et al.、前記）またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を含みうる。持続放出組成物には、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含まれる。例えば、Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949を参照のこと。
【０２３５】
ある態様において、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、脂質粒子、小胞などは、適した宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために用いられる。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体、またはナノ粒子などに封入された状態での送達のために製剤化することができる。または、本発明の組成物を、そのような担体ビヒクルの表面と共有結合性または非共有結合性に結合させることもできる。
【０２３６】
薬物担体としての可能性のあるリポソームおよびリポソーム様調製物の製剤化および使用は、当技術分野において一般に公知である（例えば、Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998；Takakura, Nippon Rinsho 5d(3):691-95, 1998；Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8):801-09, 1997；Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 72(2-3):233-61, 1995；米国特許第5,567,434号；米国特許第5,552,157号；米国特許第5,565,213号；米国特許第5,738,868号 および米国特許第5,795,587号を参照のこと。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる）。リポソームの使用は、全身性送達後の自己免疫反応および容認できない毒性を伴わないように考えられる。ある態様において、リポソームは、水性媒質中に分散されたリン脂質から形成され、多重膜同心円性二分子膜小胞（多重膜小胞（MLV）とも称される）を自発的に形成する。
【０２３７】
または、他の態様において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を適した再現性のある様式で封入することができる（例えば、Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998を参照のこと）。細胞内のポリマー過負荷による副作用を避けるために、そのような超微粒子（0.1μm前後のサイズ）を、インビボで分解されうるポリマーを用いて設計してもよい。そのような粒子は、例えば、Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1):1-20, 1988；zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998；Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3):31-40, 1998；および米国特許第5,145,684号に記載されているように作製することができる。
【０２３８】
インビボ投与に用いられる薬学的組成物は、典型的には無菌的でなくてはならない。これは無菌的な濾過膜を通すことによって実現されうる。組成物が凍結乾燥されている場合には、この方法は凍結乾燥および再構成の前またはその後のいずれに実施されてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥の形態または溶液中で保存してもよい。加えて、非経口的組成物は一般に、無菌的なアクセスポートを有する容器、例えば点滴用輸液バッグまたは皮下注射針によって貫通させることのできる栓を有するバイアル内に入れられる。
【０２３９】
ひとたび薬学的組成物が製剤化されれば、それを溶液、懸濁液、ゲル、乳化剤、固体、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として、無菌的なバイアル内に貯蔵することができる。これらの製剤は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれとして貯蔵してもよい。
【０２４０】
1つの特定の態様において、本発明は、単回用量投与単位を生産するためのキットを対象とする。これらのキットはそれぞれ、乾燥したタンパク質を有する第1の容器および水性製剤を有する第2の容器の両方を含んでよい。また、単一のチャンバーおよび複数のチャンバーにあらかじめ充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringe））を含むキットも、本発明の範囲に含まれる。
【０２４１】
加えて、本発明の薬学的組成物を、そのような薬学的組成物の使用に関する説明書を提供する包装材料とともに、容器に入れてもよい。一般に、そのような説明書は、試薬濃度を記載する明確な表現を含むと考えられ、さらにある態様では、薬学的組成物を再構成するために必要と考えられる賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、食塩水、またはPBS）の相対量も含むと考えられる。
【０２４２】
本発明はまた、本発明による少なくとも1つの抗アクチビン-A結合性物質を含む診断用キットも提供する。結合性物質は抗体であってよい。さらに、そのようなキットは、任意で以下の1つまたは複数を含んでもよい：（1）スクリーニング、診断、予後予測、治療モニタリングまたはこれらの用途の任意の組み合わせのために1つまたは複数の結合性物質を用いるための説明書、（2）抗アクチビン-A結合性物質に対する標識結合パートナー、（3）抗アクチビン-A結合性物質が固定化された固相（試薬紙など）、および（4）スクリーニング、診断、予後予測もしくは治療的使用、またはそれらの任意の組み合わせに対する規制認可を示すラベルまたは挿入物。結合性物質に対する標識結合パートナーが提供されない場合には、結合性物質自体を1つまたは複数の検出可能なマーカー、例えば、化学発光、酵素、蛍光、または放射性成分によって標識することができる。
【０２４３】
治療的に使用される薬学的組成物の有効量は、例えば、治療状況および治療目的に依存すると考えられる。したがって、治療のために適切な投与量レベルが、送達される分子、そのポリペプチドが使用される適応症、投与の経路、患者のサイズ（体重、体表または臓器サイズ）および状態（年齢および全身の健康状態）に部分的に依存して変化することは、当業者には理解されると考えられる。したがって、臨床医は、最適な治療効果が得られるように投与量を微調節し、投与経路を変更することができる。典型的な投与量は、上述の要因に依存して、約0.1mg／kgから最大約100mg／kgまたはそれ以上の範囲に及びうる。ポリペプチド組成物は、好ましくは、静脈内に注射または投与することができる。長時間作用性の薬学的組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、3日〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に投与することができる。投与の頻度は、用いる製剤中のポリペプチドの薬物動態パラメーターに依存すると考えられる。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで投与される。組成物はこのため、単回用量として、または時間をかけて（同じまたは異なる濃度／投与量での）複数回用量として、または持続注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる微調整は慣行的に行われる。適切な投与量は、適切な用量反応データの使用を通じて確認することができる。
【０２４４】
投与量および投与の頻度は、投与経路、使用される具体的なタンパク質、治療される疾患の性質および重症度、状態が急性であるかそれとも慢性であるか、ならびに対象のサイズおよび全身症状などの要因に応じて異なりうる。適切な投与量は、関連技術、例えば、用量漸増試験を伴いうる臨床試験において公知の手技によって決定されうる。
【０２４５】
本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、1回、または複数回、例えばある期間にわたって一定の間隔で投与されうる。特定の態様において、タンパク質は、少なくとも1カ月またはそれ以上の期間にわたって、例えば、1カ月、2カ月、もしくは3カ月、またはさらに無期限にわたって投与される。慢性病状を治療するためには、長期治療が一般に最も有効である。しかし、急性病状を治療するためには、より短い期間、例えば、1〜6週間の投与で十分なことがある。一般に、タンパク質は、患者が、選択した1つまたは複数の指標に関するベースラインにわたって、医学的に意味のある程度の改善を呈示するまで投与される。
【０２４６】
本発明の特定の態様は、1日当たりおよび対象の体重のkg当たり約1ngの抗原結合タンパク質（「1ng／kg／日」）から約10mg／kg／日、より好ましくは約500ng／kg／日から約5mg／kg／日、最も好ましくは約5μg／kg／日から約2mg／kg／日の投与量でタンパク質を対象に投与することを含む。さらなる態様において、アクチビン-A媒介性の疾患、病状または障害、例えば、本明細書に開示された医学的障害を治療するために、成人に対して週1回、週2回、または週3回もしくはそれ以上の回数、タンパク質は投与される。注射される場合、1回の成人用量当たりのタンパク質の有効量は、1〜20mg／m2の範囲であってよく、好ましくは約5〜12mg／m2である。または、固定用量を投与してもよく、その量は5〜100mg／用量の範囲であってよい。固定用量の1つの範囲は、1回の用量当たり約20〜30mgである。本発明の1つの態様においては、25mg／用量の固定用量が注射によって繰り返し投与される。注射以外の投与経路を用いる場合には、用量は標準的な医療行為に応じて適切に調整される。治療レジメンの一例は、約20〜30mgの用量のタンパク質を少なくとも3週間の期間にわたって週1〜3回注射することを含むが、所望の程度の改善を誘導するために、より長い期間の治療が必要なこともある。小児対象（4〜17歳）の場合には、1つの例示的で適したレジメンは、週2回または3回投与される、最大用量25mgまでの0.4mg／kgのタンパク質の皮下注射を含む。
【０２４７】
本明細書において提供される方法の特定の態様は、週1回または2回、0.5mgから10mg、好ましくは3〜5mgのタンパク質の皮下注射を含む。別の態様は、週1回、3mgまたはそれ以上のタンパク質の肺内投与（例えば、ネブライザーによる）を対象とする。
【０２４８】
本明細書において提供される治療レジメンの例は、アクチビン-Aシグナル伝達が役割を果たす病状を治療するために、週1回、1.5〜3mgの用量でのタンパク質の皮下注射を含む。そのような病状の例は本明細書に提示されており、これには例えば、悪液質、癌、関節リウマチ、および体重、体質量、体脂肪の減少、または体重、体質量、体脂肪を維持できないことが影響を及ぼすすべての病状が含まれる。タンパク質の毎週の投与は、所望の結果が達成されるまで、例えば、対象の症状が鎮静化するまで継続される。治療を必要に応じて再開してもよく、または代替的に維持用量を投与してもよい。
【０２４９】
本明細書において提供される治療レジメンの他の例は、対象のキログラム体重当たり0.5、1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、15、または20ミリグラムの用量の本発明のアクチビン-A阻害物質の皮下または静脈内投与を含む（mg／kg）。用量は、対象に1回、または一定の間隔で複数回、例えば、1日1回、週3回、週2回、週1回、月3回、月2回、月1回、2カ月毎に1回、3カ月毎に1回、6カ月毎に1回、もしくは年1回投与することができる。治療の持続時間、ならびに治療の用量および／または頻度への任意の変化は、対象の特定の必要性を満たすために、治療経過中に改変または変更することができる。
【０２５０】
薬学的組成物の他の投与経路は、公知の方法に従って、例えば経口的に、または静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病変内経路による注射で、または髄内、髄腔内、室内、経皮、皮下、または腹腔内に、さらには鼻腔内、腸内、外用、舌下、尿道、膣、または直腸手段によって、または持続放出システムによって、または埋め込みデバイスによって行われる。所望であれば、組成物をボーラス注射によって投与するか、注入によって持続的に投与するか、埋め込みデバイスによって投与することができる。これに代えて、またはこれに加えて、所望の分子が吸収またはカプセル化されている膜、スポンジ、または他の適切な材料の埋め込みによって、組成物を局所的に投与することもできる。埋め込みデバイスを使用する場合、デバイスは任意の適切な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または持続的投与によることができる。
【０２５１】
別の態様において、タンパク質は、治療されている疾患の重症度を反映する少なくとも1つの指標において改善を、好ましくは持続性改善を誘導するのに十分な量または時間で、対象に投与される。対象の疾病、疾患、または病状の程度を反映するさまざまな指標を、治療の量および時間が十分であるかどうかを判定するために評価することができる。そのような指標には、例えば、当該の障害の疾患重症度、症状、または病状発現に関して臨床的に認知されている指標が含まれる。1つの態様において、改善は、対象が、2週から4週で区切られる少なくとも2回の機会で改善を呈する場合に、持続性であると見なされる。改善の程度は一般に医師によって判定され、医師は徴候、症状、生検、または他の試験結果に基づいて判定を下すことができ、また、医師は所与の疾患に対して開発された生活の質に関する質問票などの、対象に与えられる質問票を用いることができる。
【０２５２】
アクチビン-Aの対象のレベルは、もしあれば、それらのレベルの変化を検出するために、抗原結合タンパク質での治療前、その間および／またはその後にモニターすることができる。いくつかの障害については、アクチビン-Aレベル増加の発生率は、疾患の病期または疾患の特定の形態などの要因に応じて異なりうる。例えば、対象の血清などにおけるアクチビン-Aレベルを測定するために、公知の手法を用いることができる。血液試料中のアクチビン-Aレベルは、任意の適した手法、例えば、ELISAを用いて測定することができる。1つの態様において、対象におけるアクチビン-Aレベルが同じ年齢の平均的な人におけるアクチビン-Aレベルの3倍の高さであるならば、または対象におけるアクチビン-Aレベルが3200pg／mLを上回るならば、そのことは、その特定の対象が治療を受けることを始めるべきであることを指し示している。1つのさらなる態様においては、治療を継続すべきであるか否かを判定するために、アクチビン-Aレベルをモニターすることができる。例えば、対象におけるアクチビン-Aレベルが、ある治療期間の後にベースラインレベルから低下した場合には、そのことは、その特定の対象が治療による恩恵を受けていて、治療を継続すべきであることを指し示している。
【０２５３】
場合によっては、本発明のポリペプチドを、本明細書に記載された方法などを用いて、ポリペプチドを発現して分泌するように遺伝的に操作されたある種の細胞を移植することによって送達することができる。そのような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であってよく、自家性、異種由来（heterologous）、または異種性（xenogeneic）であってよい。任意で、細胞を不死化してもよい。免疫学的応答が起こる可能性を低下させる目的で、周囲組織への浸潤を回避するために細胞をカプセル封入してもよい。カプセル封入材料は、典型的には、ポリペプチド製品の放出は可能にするが、患者の免疫系による、または周囲組織からの他の有害因子による細胞の破壊は妨げる、生体適合性半透過性ポリマーの囲いまたは膜である。
【０２５４】
本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドの誘導体をコードする核酸分子を対象に直接導入する、インビボでの遺伝子治療も考えられる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適切な送達ベクターとともに、またはそれを伴わずに、核酸構築物の局所注射によって標的細胞に導入する。代替的なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびパピローマウイルスベクターが非限定的に含まれる。ウイルスベクターの物理的移入は、所望の核酸構築物または所望の核酸配列を含有する他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介性導入、直接注入（裸のDNA）、または微粒子ボンバードメント（遺伝子銃）によって達成することができる。
【０２５５】
併用療法
本開示の組成物は、単独で用いてもよく、またはそれらの治療効果を強化するため、もしくは起こりうる副作用を減少させるために、他の治療的物質と組み合わせて用いることもできる。本発明の方法および組成物の特定の態様は、抗原結合タンパク質と1つまたは複数のさらなるアクチビン-Aアンタゴニスト、例えば、2種またはそれ以上の本発明の抗原結合タンパク質、または本発明の抗原結合タンパク質と1つまたは複数の他のアクチビン-Aアンタゴニストの使用を含む。さらなる態様において、抗原結合タンパク質は、単独で、または患者が罹患している病状を治療するために有用な他の剤と組み合わせて投与される。そのような剤の例には、タンパク質性薬物および非タンパク質性薬物の両方が含まれる。複数の治療剤を同時投与する場合には、投与量は、関連技術において認知されているように、それに応じて調節することができる。「同時投与」および併用療法は、同時投与には限定されず、少なくとも1つの他の治療的物質薬を患者に投与することを伴う治療経過中に、タンパク質が少なくとも1回投与される治療レジメンも含む。
【０２５６】
タンパク質とともに同時投与してもよい他の剤の例には、治療しようとする特定の病状に従って選択される他のタンパク質または治療用ポリペプチドがある。または、上記に考察した特定の病状のうち1つを治療する上で有用な非タンパク質性薬物を、アクチビン-Aアンタゴニストとともに同時投与してもよい。
【０２５７】
1つの態様において、併用療法は、腫瘍内の複数の部位または分子標的を攻撃することによって、相乗作用または相加的効果を達成する。本発明に関連して用いることができる併用療法の種類には、単一の疾患関連経路における複数の結節点、1つの標的細胞における複数の経路、および標的組織内（例えば、腫瘍内）の複数の細胞型を（適宜）阻害または活性化することが含まれる。例えば、本発明のアクチビン-A阻害物質を、アポトーシスを促進するかまたは血管新生を阻害する治療と組み合わせることができる。別の態様においては、単独で用いた場合には治療的に所望の効果を誘発することができない標的化作用物質を、例えば、癌細胞を感作させるため、または他の作用物質の治療効果を増強するために用いうると考えられる。別の態様において、本発明によるアクチビン-A阻害物質は、細胞傷害性薬物またはアポトーシスを誘導する他の標的化作用物質と組み合わせて用いられる。別の態様において、アクチビン-A阻害物質は、細胞生存に関与する異なる標的（例えば、PKB、mTOR）、異なる受容体チロシンキナーゼ（例えば、ErbB1、ErbB2、c-Met、c-kit）、または異なる細胞型（例えば、KDR阻害剤、c-fms）を阻害する1つまたは複数の作用物質と組み合わせて用いられる。別の態様において、本発明のアクチビン-A阻害剤は、特定の病状に対する既存の標準治療に加えられる。別の例において、併用療法は、アクチビン-A阻害タンパク質および抗癌治療（外科手術、超音波、放射線療法、化学療法、または別の抗癌薬による治療など）によって対象を治療することを含む。
【０２５８】
併用療法が複数の治療を対象に実施することを含む場合、投与の順序、タイミング、回数、濃度、および容積は、医学的要求および治療の制限によってのみ制限され、すなわち、2つの治療は、例えば同時に、継続的に、交互に、または任意の他のレジメンに従って対象に実施しうることが理解される。本明細書に記載のアクチビン-Aアンタゴニストと組み合わせて投与することができる剤の例には、カペシタビン、5-フルオロウラシル、ドキソルビシン、タキソール、タキソテール、CPT-11、好中球増加剤、イリノテカン、SN-38、ゲムシタビン、ハースタチン、またはアクチビン-A結合性ハースタチン誘導体（例えば、米国特許出願第05／0272637号に記載）、アバスチン（AVASTIN）（登録商標）（Genentech, South San Francisco, CA）、ハーセプチン（HERCEPTIN）（登録商標）（Genentech）、リツキサン（RITUXAN）（登録商標）（Genentech）、アリミデックス（ARIMIDEX）（登録商標）（AstraZeneca, Wilmington, DE）、イレッサ（IRESSA）（登録商標）（AstraZeneca）、ベキサール（BEXXAR）（登録商標）（Corixa, Seattle, WA）、ゼバリン（ZEVALIN）（登録商標）（Biogen Idec, Cambridge, MA）、エルビタックス（ERBITUX）（登録商標）（Imclone Systems Inc., New York, NY）、ジェムザール（GEMZAR）（登録商標）（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN）、カンプトサール（CAMPTOSAR）（登録商標）（Pfizer, New York, NY）、グリベック（GLEEVEC）（登録商標）（Novartis）、SU-1 1248（Pfizer）、BMS-354825（Bristol-Myers Squibb）、パニツムマブ（Abgenix, Fremont, CA／Amgen Inc., Thousand Oaks, CA）およびデノスマブ（Amgen Inc., Thousand Oaks, CA）が非限定的に含まれる。
【０２５９】
1つの態様においては、抗アクチビン-A化合物およびカペシタビンの両方が対象に投与される。カペシタビンまたはゼローダR（XELODAR）（登録商標）（Roche）（これは体内で5-フルオロウラシルに変換される）を、対象に1250mg／m2で1日2回、2週間にわたって経口投与し、その後は1回の1週間の休止期間をおく。また、カペシタビンを異なる投与量およびスケジュールで投与することもできる。別の態様においては、抗アクチビン-A化合物およびドキソルビシン脂質複合体の両方を対象に投与する。ドキソルビシン脂質複合体またはドキシル（DOXIL）（登録商標）（Janssen Biotech, Inc.）は、対象に、40mg／m2IVで4週間毎に1回投与することができる。ドキソルビシン脂質複合体を異なる投与量およびスケジュールで投与することもできる。
【０２６０】
例えば、皮下、経口的、非経口的、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および製剤を含む、種々の治療レジメンにおいて、本明細書に記載された特定の組成物を用いるための、適した投与レジメンおよび治療レジメンの開発は、当技術分野において周知であり、上述されている。
【０２６１】
抗体治療
およそC11〜S33（第1のループ）およびおよそC81-E111（第2のループ）の領域における配列がネイティブなアクチビン-Aの高次構造を保っている、無傷のアクチビン-Aと特異的に結合する治療用抗体を用いることができる。
【０２６２】
オリゴペプチドまたはポリペプチドは、それが、抗体A1〜A14のCDRの少なくとも1つに対して；および／または抗体A1〜A14のうち少なくとも1つのアクチビン-Aに対する結合を交差遮断する、および／または抗体A1〜A14のうち少なくとも1つによってアクチビン-Aとの結合から交差遮断するアクチビン-A結合性物質のCDRに対して、および／または結合性物質がアクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの結合を遮断しうるアクチビン-A結合性物質のCDRに対して、少なくとも75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を有するならば、本発明の範囲内にある。
【０２６３】
アクチビン-A結合性物質ポリペプチドおよび抗体は、それらが、抗体A1〜A14のうち少なくとも1つの可変領域に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ抗体A1〜A14のうち少なくとも1つのアクチビン-Aに対する結合を交差遮断し、かつ／または抗体A1〜A14のうち少なくとも1つによってアクチビン-Aとの結合から交差遮断され；かつ／またはアクチビン-A受容体に対するアクチビン-Aの阻害効果を遮断しうるならば、本発明の範囲内にある。
【０２６４】
本発明による抗体は、1×10-7Mに等しいかもしくはそれ未満、1×10-8Mに等しいかもしくはそれ未満、1×10-9Mに等しいかもしくはそれ未満、1×10-10Mに等しいかもしくはそれ未満、1×10-11Mに等しいかもしくはそれ未満、または1×10-12Mに等しいかもしくはそれ未満の、ヒトアクチビン-Aに対する結合親和性を有してよい。
【０２６５】
抗体または結合パートナーの親和性、ならびに抗体が結合を阻害する程度は、従来の手法、例えば、Scatchard et al. (Ann. N. Y. Acad. Set 51:660-672 (1949)）に記載されたもの、または表面プラズモン共鳴（SPR、BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ）によって、当業者によって判定されうる。表面プラズモン共鳴の場合には、標的分子は固相上に固定化され、フローセルに沿って移動する移動相中のリガンドに曝露される。固定化された標的に対するリガンド結合が起これば、局所屈折率が変化してSPR角度の変化を導き、これを反射光の輝度における変化を検出することによってリアルタイムでモニターすることができる。SPRシグナルの変化速度を分析して、結合反応の会合相および解離相の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比によって、見かけの平衡定数（親和性）が与えられる（例えば、Wolff ef al, Cancer Res. 53:2560-65 (1993)を参照のこと）。
【０２６６】
本発明による抗体は、例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、またはIgAなどの任意の免疫グロビンクラスに属してよい。これは、動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）およびマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、もしくは他のげっ歯類、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長動物を非限定的に含む哺乳動物から得られてもよく、またはこれらに由来してもよい。抗体は細胞内侵入抗体であってもよい。抗体の作製については、米国特許出願公開第2004／0146888 A1号に一般に開示されている。
【０２６７】
特定のA1〜A14 CDRを新たなフレームワークおよび／または定常領域へと操作することを含む、本発明による抗体を産生するための上記の方法において、所望の抗体を選択するために適切なアッセイ法が使用可能である（すなわち、アクチビン-Aに対する結合親和性を決定するためのアッセイ法；交差遮断アッセイ法；Biacoreに基づく競合結合アッセイ法；インビボアッセイ法）。
【０２６８】
svActRIIB治療
本発明は、インビボおよびインビトロで、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11の量または活性を減少させるかまたは中和するための方法および薬学的組成物を提供する。svActRIIBポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン-A、およびGDF-11に対する高い結合親和性を有し、ミオスタチン、アクチビン-A、およびGDF-11のうち少なくとも1つの生物活性を低下させること、および阻害することができる。
【０２６９】
1つの局面において、本発明は、ミオスタチンに関係したおよび／またはアクチビン-Aに関係した障害を、svActRIIB組成物の有効量を対象に投与する段階によって、そのような治療を必要とする対象において治療するための方法および試薬を提供する。
【０２７０】
本発明の組成物は、対象において除脂肪筋肉量を増加させるために有用である。組成物はまた、除脂肪筋肉量の体脂肪量に対する割合を増加させ、このため、対象の体重におけるパーセンテージとしての体脂肪量を減少させるために有用な可能性もある。実施例3は、本発明のsvActRIIBポリペプチドおよびタンパク質が動物における除脂肪筋肉量を増加させうることを実証している。
【０２７１】
svActRIIB組成物によって治療しうる障害には、さまざまな形態の筋肉消耗、ならびに糖尿病および関連障害などの代謝性障害、および骨粗鬆症などの骨変性障害などが非限定的に含まれる。
【０２７２】
筋肉消耗性障害には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ランドゥジー・デジュリン筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー、および乳児神経軸索性筋ジストロフィーなどのジストロフィーも含まれる。そのほかの筋肉消耗性障害は、筋萎縮性側索硬化症、鬱血性閉塞性肺障害、癌、AIDS、腎不全、臓器萎縮、アンドロゲン欠乏、および関節リウマチなどの慢性疾患または障害から生じる。
【０２７３】
ミオスタチンおよび／またはアクチビンの過剰発現は、重篤な筋肉消耗症候群である悪液質の一因となる可能性がある。悪液質は癌から生じ、関節リウマチ、糖尿病性腎症、腎不全、化学療法、熱傷による傷害、ならびにその他の原因によっても生じる。別の例では、AIDSに関係した筋肉消耗を呈している男性において、ミオスタチン免疫反応性タンパク質の血清中濃度および筋肉内濃度が増加し、これが除脂肪量と反比例していることが見いだされた（Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)）。ミオスタチンレベルは熱傷に反応しても増加し、異化筋肉効果を生じることが示されている（Lang et al., FASEB J 15, 1807-1809 (2001)）。筋肉消耗を生じるさらなる病状は、車椅子への拘束、発作による長期臥床、疾病、脊髄損傷、骨折または外傷、および微小重力環境（宇宙飛行）での筋肉消耗など、身体障害による活動不足から生じる可能性もある。例えば、血漿中ミオスタチン免疫反応性タンパク質が長期臥床の後で増加することが見いだされた（Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2):11(1999）。また、スペースシャトルでの飛行中に微小重力環境に曝露されたラットの筋肉では、微小重力環境に曝露されていないラットの筋肉と比較してミオスタチンの発現量が増加したことも見いだされている（Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417-28 (2000)）。
【０２７４】
加えて、年齢に関係した筋肉に対する脂肪の比率の増加、および年齢に関係した筋肉消耗がミオスタチンと関係していると考えられる。例えば、血清中ミオスタチン免疫反応性タンパク質の平均値は、若年（19〜35歳）、中高年（36〜75歳）および老年（76〜92歳）の男性および女性の群で年齢に伴って増加し、これらの群における筋肉量と除脂肪体重の平均は年齢に伴って減少する（Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)）。加えて、現在では、ミオスタチンが心筋において低レベルで発現し、この発現が梗塞後の心筋細胞において上方制御されることも見いだされている（Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1):1-9 (1999)）。このため、心筋においてミオスタチンレベルを減少させることにより、梗塞後の心筋の回復が改善する可能性がある。
【０２７５】
ミオスタチンはまた、2型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、および肥満を含む代謝性障害にも影響を及ぼすように考えられる。例えば、2種のマウスモデルにおいて、ミオスタチンの欠損が肥満および糖尿病の表現型を改善することが示されている（Yen et al. FASEB J. 5:479 (1994)。本開示のsvActRIIBポリペプチドは、それらの代謝性障害を治療するのに適する。このため、本発明の組成物を投与することにより、適した対象における糖尿病、肥満、および高血糖の病状が改善されると考えられる。加えて、svActRIIBポリペプチドを含有する組成物は、肥満個体における食品摂取を減少させる可能性もある。
【０２７６】
本発明の安定化ActRIIBポリペプチドの投与は、骨強度を改善して、骨粗鬆症および他の変性骨障害を減少させる可能性がある。例えば、ミオスタチン欠損マウスにおいては、ミネラル含量とマウス上腕骨密度の増加、および筋肉が結合している領域での骨小柱と皮質の両方におけるミネラル含量の増加、ならびに筋肉量の増加が見られる（Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002)）。加えて、本発明のsvActRIIB組成物は、例えば、前立腺癌の治療のためにアンドロゲン除去療法が用いられたような例において、アンドロゲン除去の影響を治療するために用いることができる。
【０２７７】
本発明はまた、svActRIIBタンパク質の有効量を動物に投与することによって、食用動物における筋肉量を増加させるための方法および組成物を提供する。成熟C末端ミオスタチンポリペプチドが、試験されたすべての種において同様または同一であることから、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、およびブタを含む、農業上重要なあらゆる種において、svActRIIBポリペプチドが除脂肪筋肉量の増加および脂肪の減少に有効であることが予想される。
【０２７８】
本発明のsvActRIIBポリペプチドおよび組成物はまた、下記のインビトロアッセイ法において示されるように、アクチビン-Aの活性に拮抗する。アクチビン-Aは、特定の種類の癌、特に卵巣癌などの性腺腫瘍において発現し、重篤な悪液質を起こすことが知られている（Ciprano et al. Endocrinol 141 (7):2319-27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (11):5000-5 (1997)；Coerver et al., Mol Endocrinol 10(5):534-43 (1996)；Ito et al. British J Cancer 82(8): 1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al., Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999)。このため、本開示の組成物は、アクチビン-Aの過剰発現ならびにミオスタチン発現に関係する病状、例えば、ある種の癌による悪液質の治療のため、およびある種の性腺型腫瘍の治療に用いられる可能性がある。
【０２７９】
加えて、本発明のsvActRIIBポリペプチドは、任意のいくつかのアッセイ法において、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11の検出および定量のために有用である。一般に、本発明の安定化されたActRIIBポリペプチドは、例えば、Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)に記載されたものに類似する種々のアッセイ法において、ミオスタチン、アクチビン-A、またはGDF-11と結合して固定化する補足剤として有用である。ポリペプチドをいくつかの様式で標識してもよく、またはミオスタチンを検出して定量することを可能にするために標識された抗体などの第3の分子と反応させてもよい。例えば、ポリペプチドまたは第3の分子を、酵素標識されたストレプトアビジンなどの第4の分子とその後結合することができるビオチンなどの、検出可能な成分、またはその他のタンパク質によって修飾することもできる（Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985)；Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)）。
【実施例】
【０２８０】
以下は、本発明を実施するための具体的な態様の例である。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明の範囲を限定することは全く意図していない。用いる数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するための努力は行っているが、ある程度の実験誤差および偏差は当然ながら許容されるべきである。
【０２８１】
本発明の実施は、別に指定する場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある、タンパク質化学、生化学、組換えDNA手法および薬理学の従来の方法を用いうると考えられる。そのような手法は、文献に十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照のこと。
【０２８２】
方法
材料
sActRIIB（可溶性ActRIIB-Fc）発現構築物を、ヒトアクチビン2B型受容体の細胞外ドメイン（aa7〜100）に対応するcDNA断片をIgG2 Fc融合スプリットベクター中にサブクローニングすることによって作製した。構築物をCHO細胞にトランスフェクトさせて、mAb Select SuReアフィニィーカラム（GE）を用い、その後にFractogelクロマトグラフィー（EMD Chemicals）を用いて、組換えsActRIIBを細胞培地から精製した。
【０２８３】
アクチビン-A抗体（アクチビン-Aに対する完全ヒトモノクローナル抗体）は、XenoMouse技術（Amgen Inc）を用いて作製した。組換えアクチビン-Aは、哺乳動物発現系（Amgen Inc）を用いて産生させた。
【０２８４】
以下で用いたsActRIIBペプチドおよびアクチビン-A抗体の配列を以下の表に示している。
【０２８５】
（表９）sActRIIB配列
2016508504.tif 000062
【０２８６】
（表１０）アクチビン-Aの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの配列
2016508504.tif 000063
【０２８７】
（表１１）アクチビン-Aの軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメインの配列
2016508504.tif 000064
【０２８８】
マウスモデル
倫理委員会の承認。マウス実験はすべて、施設内動物管理使用委員会（Intitutional Animal Care and Use Committee）の承認を得た上で実験動物の管理および使用に関するNIH指針（NIH Guide for the CareおよびUse of Laboratory Animals）に準拠して行った。
【０２８９】
Inh-KOマウス。卵巣腫瘍または精巣腫瘍が十分に樹立された12週齡の雌性および8週齡の雄性inh-KOマウスに対して、PBSまたはsActRIIB（30mg／kg、SC）の単回注射を行った。対照として、齢数を一致させた野生型同腹仔に対してPBSの単回注射を行った。卵巣および精巣の臓器重量を、注射から14日後に剖検によって決定した。
【０２９０】
TOV-21G異種移植片。5×106個のTOV-21G卵巣癌細胞を、個々の雌性無胸腺nu／nuマウス（Harlan）に皮下移植した。平均腫瘍体積がおよそ150mm3に達した、腫瘍移植から第12日の時点で治療を開始した。マウスは、PBS、sActRIIB（30mg／kg、SC、1回／週）またはアクチビン-A抗体（30mg／kg、SC、2回／週）の投与を受けた。別個の化学療法併用実験では、マウスを、PBS、sActRIIB（10mg／kg、SC、1回／週）、5-FU（50mg／kg、IP、3サイクル、1サイクル当たり1日4回の注射）、または上記と同じ用量でのsActRIIBと5-FUの組み合わせによって処置した。
【０２９１】
CHO異種移植片。3×106個のナイーブCHO細胞またはアクチビン-AをトランスフェクトしたCHO細胞を、個々の雌性CD1ヌードマウス（Harlan）の右四頭筋に筋肉内移植した。マウスは、PBSまたはアクチビン-A抗体（20mg／kg、1回／週、SC）の投与を移植の時点に受けた。
【０２９２】
OV-90異種移植片。アクチビン-Aをトランスフェクトした3×106個のOV-90卵巣癌細胞を、個々の雌性CD1ヌードマウス（CRL）に皮下移植した。マウスに対して、平均腫瘍体積がおよそ150mm3に達した腫瘍移植後第11日の時点から、PBSまたはsActRIIB（20mg／kg、SC、1回／週）による処置を開始した。
【０２９３】
G361および5637異種移植片。5×106個のG361黒色腫細胞および5637膀胱癌細胞をそれぞれ、個々の無胸腺nu／nuマウス（HarlanInc）に皮下接種した。治療は、腫瘍体積が130mm3〜150mm3に達した、5637移植から4日後、G361移植から14日後に開始した。5637を移植したマウスは、PBSまたはアクチビン-A抗体（10mg／kg、SC、2回／週）の投与を受けた。G361を移植したマウスは、PBSまたはsActRIIB（20mg／kg、SC、1回／週）の投与を受けた。
【０２９４】
腫瘍のサイズおよび重量
すべての異種移植実験に関して、電子キャリパーを用いて、腫瘍サイズを長期的に測定した。1回目用量の直前に、異なる群間での腫瘍サイズの均等な分布が確保されるように、腫瘍担持マウスをランダム化した。腫瘍体積（mm3）は、腫瘍の長さ（mm）×腫瘍の幅（mm）×腫瘍の高さ（mm）として算出した。腫瘍重量は剖検によって求めた。
【０２９５】
細胞培養
初代BAEC培養物（Lanza）を、10％ウシ胎仔血清を含むDMEM（Invitrogen）中で、5％ CO2下において37℃で増殖させた。TOV-21G細胞（ATCC）は、MCDB 105培地（Sigma、M6395）15％ウシ胎仔血清を含有するMedium 199（Invitrogen）の1：1混合物中で培養した。MRC-5細胞およびCCD-Lu細胞（ATCC）は、10％ FBSを加えたMEM（Invitrogen）中で培養した。U937細胞およびTHP-1細胞（ATCC）は、10％ FBSおよびL-グルタミンを含有するRPMI1640培地（Invitrogen）中で増殖させた。
【０２９６】
インビトロ増殖アッセイ法
TOV-21G癌細胞のインビトロ増殖速度は、リアルタイム生細胞画像化システム（IncuCyte）を製造元の推奨プロトコールに従って用いて分析した。
【０２９７】
リアルタイムRT-PCR
全RNAを、RNeasy mini RNAキット（QIAGEN）を用いて細胞培養物から単離した。25ngの全RNAを、TaqMan one-Step RT-PCR Master Mix試薬およびPrism 7900HT Detection System（Applied Biosystems）を用いる一段階定量RT-PCR分析に供した。GAPDHを、遺伝子発現レベルを基準化するために用いた。ヒトβAプライマーセットを除き、リアルタイムPCR分析用に用いたプライマーはすべて、Applied Biosystemsから入手した。本試験に用いた特異的プライマーのカタログ番号は、以下の通りである：ウシプライマー：VEGF（Bt03213282）、Ang-1（Bt03249559）；アクチビン（βA）（Bt03259358）、GAPDH（Bt03210913）；ヒトプライマー：VEGF（Hs00900054）、Ang-1（Hs00375822）、GAPDH（Hs02758991）。用いたヒトβAプライマー配列は、以下の通りである：
2016508504.tif 000065
。
【０２９８】
ノーザンブロット
全RNAを、Trizol（Invitrogen）中での均質化の後に、個々の組織試料から単離した。各群について、個々の動物から単離された等量の全RNAを含有する10μg RNAのプールを、ノーザンブロット分析に供した。βAおよびAng-2に対して用いたノーザンプローブは、RT-PCR（Phusion、Biolabs）を用いることによって作製した。βAプライマーセット：
2016508504.tif 000066
。発現を基準化するためにノーザンブロット膜をβ-アクチンによって再びプローブ探索した。
【０２９９】
ウエスタンブロット
タンパク質抽出物を、プロテアーゼ阻害物質の混合物（Roche）を含有するT-PER組織タンパク質抽出試薬（Pierce）中で、細胞培養物または組織から調製した。個々の動物から単離した等量のタンパク質抽出物を含有する各群に関する50μgの全タンパク質のプールを、NuPAGE 4〜12％ Bis-Trisゲル（Invitrogen）によって分離し、PVDFに移行させた。膜のプローブ探索を、全Smad2、p-Smad2またはE-カドヘリン（1：1000；Cell Signalling）、エンドグリン、オステオポンチン（1：500；R&D Systems）、IGFBP-1、IGFBP-2（1：500；Abcam）に対する一次抗体によって、続いてHRP結合二次抗体（1：2000；Cell Signalling）によって行った。膜を細片化して、α-チューブリンに対する抗体（1：1000；Cell Signalling）により、再びプローブ探索を行った。
【０３００】
アクチビン-A ELISA
卵巣癌患者および健康対象からの血清試料はすべて、インフォームドコンセントを得た上で収集されており、Bioreclamation, Incから購入した。血清試料を緩衝液（DY995、R&D Systems）中に希釈した上で、アクチビン-Aと結合したタンパク質をすべて解離させるために、4M尿素（Sigma）とともに4℃で一晩前処理した。続いて試料を、アクチビン-Aモノクローナル抗体でプレコーティングした96ウェルプレートに移した。室温での2時間のインキュベーションおよび洗浄段階（0.05％ Tween 20、DPBS中）の後に、ビオチン標識アクチビン-Aモノクローナル抗体を添加して室温で1時間おいた。続いてプレートを洗浄し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（Amersham）とともに室温で1時間インキュベートした。洗浄段階の後に、テトラメチルベンジジン（KPL）基質をウェルに添加して室温で10分間おいた。酸性停止溶液（KPL）を添加して、基質の酵素代謝回転の度合いを450nmでの波長吸光度測定によって決定した。測定される吸光度は、存在するアクチビン-Aの濃度と直接比例する。吸光度対アクチビン-A濃度の標準曲線を用いて、被験試料中のアクチビン-Aの量を決定した。inh-KOマウスにおける血清アクチビン-Aレベルは、ELISAを用いることによって測定した。
【０３０１】
VEGFおよびAng-1 ELISA
inh-KOマウスにおける血清VEGFレベルは、イムノアッセイキット（R&D Systems）を用いることによって測定し、細胞株細胞培地におけるヒトVEGFおよびAng-1のレベルは、Invitrogen（VEGF）およびR&D Systems（Ang-1）から購入したELISAキットを製造元の推奨プロトコールに従って用いて定量した。
【０３０２】
組織学的検査および光学顕微鏡検査
inh-KOマウス由来の精巣および卵巣を亜鉛ホルマリンによって固定した。組織切片をH&E染色に供し、続いてNikon Eclipse 90i顕微鏡で検査した。
【０３０３】
免疫組織化学
亜鉛ホルマリンで固定した4μm厚のパラフィン腫瘍組織切片を調製した。切片をUnmask溶液（Vector H-3300）中での3分間のマイクロ波処理による抗原回収に供し、その後に10μg／mlプロテイナーゼ-K中でのインキュベーションを20分間、1％ H2O2を含むdH2O中でのインキュベーションを室温で10分間行った。切片をさらに、細胞膜の透過処理のために0.1％ Tween-20を含むPBS中で3分間インキュベートし、非特異的結合をブロックするためにヤギ血清中で30分間インキュベートした。続いて切片を特異的一次抗体とともに室温で3時間インキュベートし、その後にビオチン化または蛍光標識した二次抗体とのインキュベーションを行った。基質をベクターSGキット（SK-4700）またはDAB中で発色させ、核をベクターFast Red（H-3403）またはヘマトキシリン中で対比染色した。免疫染色した組織切片の分析および写真撮影を、DS-Rilカメラを装着したNikon Eclipse 90i顕微鏡を用いて行った。用いた一次抗体およびそれらの希釈度は以下の通りである：VEGF（BD Pharmingen 550549）1：20またはVEGF（Abcam ab46154）1：100、活性カスパーゼ-3（Abcam ab32042）1：50、Ang-1（Abcam ab8451）1：500、オステオポンチン（Abcam ab8448）1：200、CD-31（Abcam ab56299）1：100、E-カドヘリン（Abcam ab76319）1：80。免疫蛍光染色のためには、FITC結合二次抗体（Invitrogen）をPBS中に1：50希釈して添加し、30分間インキュベートした。細胞核はVectashield PE（Vector）で対比染色した。
【０３０４】
TUNELアッセイ法
TOV-21G腫瘍における細胞アポトーシスは、腫瘍切片における断片化DNAの量を、DeadEnd Fluorometric TUNEL Systemを製造元の推奨プロトコール（Promega、G3250）に従って用いて測定することによって分析した。フルオレセイン-12-dUTP標識DNA を、Nikon蛍光顕微鏡検査によって可視化した。
【０３０５】
統計
組織試料の群を、Studentのt検定を用いて比較した。長期的測定値は、反復測定ANOVAによって分析した。0.05未満のP値を有意と見なした。
【０３０６】
実施例1：アクチビン遮断はインヒビン欠損マウスにおける進行した卵巣腫瘍および精巣腫瘍の退縮を引き起こす
inh-KOマウスにおけるアクチビン-A測定
血清アクチビン-Aレベルを、卵巣癌を有する患者および健康対照において測定した。図1に示されているように、流血中アクチビン-Aレベルは卵巣癌患者において有意に高かった。
【０３０７】
次に、アクチビン-Aが腫瘍増殖に影響を及ぼす機序を解明するために、インヒビン-α KOマウス（アクチビン調節不全、自然発生的腫瘍形成および癌悪液質のモデル）（以下ではinh-KOマウスと称する）において十分に樹立された性腺腫瘍のさらなる増殖に対するアクチビン遮断の効果を分析した。性腺腫瘍が進行病期へと進展した後に、アクチビン拮抗の治療的可能性をさらによく評価するために、アクチビンシグナル伝達を途絶させた。
【０３０８】
inh-KOマウスにおける齢数の関数としての腫瘍重量の測定値により、雌性では12週までに、雄性では8週までに、卵巣腫瘍および精巣腫瘍が十分に樹立したことが指し示された。アクチビン-アンタゴニストであるsActRIIBの単回用量を12週齡の雌性inh-KOマウスおよび8週齡の雄性inh-KOマウスに投与し、その結果起こったアクチビン-Aレベルならびに卵巣腫瘍および精巣腫瘍サイズの変化を検討した。予想通り、樹立した性腺腫瘍を有するこれらのinh-KOマウスでは、血清アクチビン-Aレベルの顕著な増大がみられた（図2Aおよび図2B）。しかし、投与後1日以内に、sActRIIBは、inh-KOマウスにおける増加したアクチビン-Aを、野生型（WT）マウスで見られる正常対照レベルに低下させ、このアクチビン-A中和効果は14日間の試験期間の全体を通じて持続した。予想外のことに、sActRIIB処置によるアクチビン中和により、inh-KOマウスにおける非常に大きな卵巣腫瘍量が、WT対照マウスで見られるサイズへと急速に退縮したことが剖検分析によって明らかになった（図3Aおよび図3B）。同様に、sActRIIBで処置した雄性inh-KOマウスでは、精巣腫瘍量のWT対照レベルへの劇的な退縮がみられた（図4Aおよび図4B）。このように、sActRIIBは、inh-KOマウスにおいて十分に樹立された卵巣腫瘍塊および精巣腫瘍塊を急速かつ完全に根絶させた。
【０３０９】
ノーザンブロット分析
次に、腫瘍におけるアクチビン-A（βA）mRNAの発現をノーザンブロット分析によって検討した。腫瘍におけるβA転写物のレベルはWT対照よりもはるかに高かったが、この増大はsActRIIB処置によって完全に阻止された（図5A）。この所見は、アクチビン-Aがそれ自体の発現を上方制御トするという腫瘍内での新規フィードフォワードループの存在を示唆する（以下参照）。アクチビン-Aにより誘導されるSmad2シグナル伝達も、ホスホ-Smad2の量のウエスタンブロットアッセイ法によって示されるように、腫瘍ではWT対照におけるレベルよりも顕著に増大していた。さらに、sActRIIB処置により、腫瘍組織におけるホスホ-Smad2のこの増大は消失した（図5B）。このように、sActRIIBは、卵巣腫瘍および精巣腫瘍におけるアクチビン-A mRNAの上方制御およびSmad2シグナル伝達の活性化の両方を防止した。
【０３１０】
ウエスタンブロット分析
sActRIIB処置に反応して起こった卵巣腫瘍サイズの顕著な減少が腫瘍退縮を真に反映していることを検証するために、ウエスタンブロット分析を用いて、卵巣の正常分化の維持において決定的に重要な細胞接着タンパク質であるE-カドヘリンの腫瘍における発現について検討した。注目すべきことに、非処置inh-KOマウスでは卵巣腫瘍内にE-カドヘリンタンパク質は全く検出されなかったが、sActRIIBの単回注射により、喪失していたE-カドヘリンが劇的に回復した（図6A）。これらの観察所見は免疫染色によっても裏づけられた。E-カドヘリンに対する免疫反応性は非処置inh-KOマウスにおける卵巣腫瘍の切片中では検出されなかったが、sActRIIB処置により、卵巣切片における明確なE-カドヘリン免疫反応性の再出現がもたらされた（図6B）。このように、アクチビンシグナル伝達の増大により、卵巣においてE-カドヘリンは下方制御される。E-カドヘリンの喪失は卵巣癌進行への関与が示唆されているため、この下方制御の撤回は注目すべきである。
【０３１１】
光学顕微鏡検査分析
卵巣腫瘍および精巣腫瘍における形態的変化を、光学顕微鏡検査によって検討した。非処置雌性inh-KOマウスでは、大きく肥大した卵巣が固形腫瘍塊および多くの出血性病変によってほとんど満たされており、認めうる卵胞は事実上全く残っていなかった。対照的に、sActRIIBで処置した雌性inh-KOマウスでは、卵巣は正常なサイズであり、認めうる卵胞を多く含み、腫瘍細胞浸潤はごくわずかであり、出血性病変もわずかであった（図7A）。非処置雄性inh-KOマウスでは、精巣における正常な構造が大量の未分化性固形腫瘍塊によって置き換えられており、精細管は全く認められなかった。対照的に、sActRIIBで処置した雄性inh-KOマウスでは、精巣は正常なサイズであり、精細管で満たされていたが、精原細胞の数は正常よりも少なく、少数の小さな領域が依然として腫瘍細胞を含んでいた（図7B）。これらの組織学的所見は、sActRIIB処置が性腺腫瘍の退縮を引き起こしただけでなく、正常組織分化も促進したことを意味する。このため、sActRIIB処置による腫瘍の縮小（図3A、図3B、図4Aおよび図4B）は、塊の単なる退縮ではなく、分化した表現型への回復を表している。
【０３１２】
実施例2：アクチビン遮断は性腺腫瘍における血管新生因子の誘導を消失させてカスパーゼ-3活性化を引き起こす
アクチビン中和によって著明な腫瘍抑制が認められたことからみて、腫瘍由来のアクチビン-Aは、公知の腫瘍形成関連因子を誘導することによって腫瘍進行を刺激する可能性が高い。この可能性を検証するために、腫瘍血管新生および腫瘍形成における役割が十分に確立されている血管新生性因子VEGFおよびアンジオポエチンを分析した。ELISAにより、進行した卵巣腫瘍および精巣腫瘍を有するinh-KOマウスでは、その流血中のVEGFレベルが大きく増大していることが明らかになった。sActRIIBの単回用量により、増加したVEGFはWT対照レベルに急速に低下した（図8A）。さらに、卵巣腫瘍および精巣腫瘍の切片におけるVEGFおよびAng-1の免疫反応性は両方とも劇的に増加していたが；しかし、sActRIIB処置により、腫瘍におけるVEGFおよびAng-1誘導は完全に消失した（図8B、それぞれ上および下）。加えて、ノーザンブロット分析により、卵巣腫瘍および精巣腫瘍ではAng-2 mRNAが高レベルで発現されるが、sActRIIB処置によってその過剰発現が阻害されることも明らかになった（図8C）。その上、ウエスタンブロット分析により、エンドグリン、オステオポンチン、IGFBP-1およびIGFPB-2を含む、卵巣腫瘍の血管新生および増殖に関与することが知られているいくつかの他の因子は卵巣腫瘍において顕著に上方制御されるが、これらの腫瘍形成関連タンパク質の誘導はsActRIIB投与によって完全に消失したことも明らかになった（図8D）。
【０３１３】
次に、免疫染色を用いて、アポトーシス酵素であるカスパーゼ-3の活性を腫瘍組織切片において分析した。非処置inh-KOマウスの卵巣腫瘍または精巣腫瘍切片では、活性カスパーゼ-3は検出されなかったが；しかし、sActRIIBで処置したinh-KOマウスでは、卵巣および精巣組織切片において残留性の腫瘍細胞がクラスターを形成している領域で活性カスパーゼ-3の強い免疫染色が見いだされ（図9）、このことは腫瘍アポトーシスの活性化を指し示している。これらの結果は、腫瘍におけるアクチビン-Aの増大が腫瘍血管新生および腫瘍形成に関連した複数の因子の過剰産生を生じさせ、そのため、腫瘍由来のアクチビン-Aを遮断することによってこれらの因子の喪失が引き起こされて、続いて腫瘍細胞におけるカスパーゼ-3活性化およびアポトーシスを誘導し、腫瘍抑制をもたらすことを示している。
【０３１４】
実施例3：アクチビン-アンタゴニストはヒト卵巣癌異種移植片のインビボ増殖を阻害し、化学療法との相加効果を有する
アクチビン拮抗によって、アクチビン-Aを分泌する腫瘍の増殖を抑制しうるか否かをさらに明らかにするために、ヌードマウスにおける複数の異種移植腫瘍のインビボ増殖について分析した。この分析では、ヒト上皮卵巣癌モデルであるTOV-21G異種移植片のインビボ増殖を特に重点的に扱ったが、これは、培養物中でこれらの癌細胞が大量のアクチビン-Aを分泌するためである。ヌードマウスにおけるTOV-21Gの皮下移植は、血清アクチビン-Aの急激な上昇をもたらした（図10A）。本発明者らは、TOV-21Gを移植したマウスに対して、腫瘍が樹立された後にsActRIIBまたはアクチビン-A抗体を投与した。どちらのアクチビン-Aアンタゴニストも、TOV-21G卵巣癌異種移植片の増殖を有意に阻害した（図10B）。
【０３１５】
卵巣腫瘍増殖に対するアクチビン-A増加の機能的意義をさらに評価するために、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）およびヒト卵巣癌OV-90異種移植片を含む、さらに2種の卵巣腫瘍異種移植片も分析した。四頭筋への移植後に、ナイーブCHO細胞は検出可能な腫瘍を形成することができなかった。しかし、CHO細胞にアクチビン-Aをトランスフェクトしたところ、それらはヌードマウスにおいて腫瘍をよく形成しうるようになった。さらに、アクチビン-アンタゴニスト処置により、アクチビン-AをトランスフェクトしたCHO細胞による腫瘍形成の速度は大きく低下した（図11）。その上、アクチビン遮断により、ヌードマウスにおけるアクチビン-A過剰発現性OV-90異種移植片の増殖は顕著に阻害された（図12）。これらの観察所見は、アクチビン-Aの増加が腫瘍増殖の重要な刺激であるというさらなる証拠を与えるものである。
【０３１６】
これらの所見により、アクチビン拮抗が卵巣癌治療における有意義な治療法である可能性が示唆された。5-フルオロウラシル（5-FU）化学療法を受けているTOV-21G異種移植片の増殖に対するsActRIIBの効果について検討した。sActRIIB処置または5-FUの投与をTOV-21G異種移植片担持マウスに単独で行ったところ、それぞれは腫瘍増殖の速度を有意に低下させた（図13）が、sActRIIBおよび5-FUを一緒に注入した場合には、腫瘍増殖阻害に対するさらに大きな効果が観察された（図13）。このように、sActRIIBおよび5-FUは腫瘍抑制における相加効果を明らかに示す。
【０３１７】
別の実験では、無胸腺ヌードマウスの側腹部にTOV-21G異種移植片を投与した。14日後から、hu-sActRIIB-Fcを単独で、または5-FUと組み合わせて毎週皮下投与した。
【０３１８】
ビヒクルで処置した腫瘍担持群とANOVAを用いて比較したところ、腫瘍細胞の注入から52日後に、hu-sActRIIB-Fc処置は腫瘍増殖の43％の減少（p＜0.0001）をもたらした。5-FU単剤療法は腫瘍増殖の47％の減少（p＜0.0001）をもたらし、hu-sActRIIB-Fcと5-FUの組み合わせは腫瘍増殖の73％の減少（p＜0.0001）をもたらした。この実験の経過中に、hu-sActRIIB-Fcの投与を受けているマウスの体重は26％増加し、一方、hu-sActRIIB-Fcおよび5-FUの投与を受けているマウスの体重は22％増加したが、ビヒクルの投与を受けている対照腫瘍担持マウスは10％の体重減少を示した。
【０３１９】
次に、細胞培養物におけるTOV-21Gの増殖に対するアクチビン-Aアンタゴニストの効果について検討した。驚いたことに、sActRIIBまたはアクチビン-A抗体の濃度を高めることは、インビトロでのTOV-21G細胞増殖に対して直接的な効果を及ぼさなかった（図14）。このことからみて、TOV-21G異種移植マウスにおけるアクチビン-アンタゴニストの腫瘍抑制効果は、インビボでの間接的な機序を通じて達成されたのに違いない。
【０３２０】
実施例4：アクチビン-Aの遮断はヒト卵巣癌異種移植片における血管新生を妨げてアポトーシスを誘導する
アクチビン-Aがinh-KOマウスの腫瘍においていくつかの血管新生性因子の過剰発現を誘導したことから、インビボでのTOV-21G腫瘍異種移植片における血管新生に対するアクチビン-Aの遮断の影響について分析した。TOV-21G腫瘍切片の検査により、非処置切片ではVEGFおよびAng-1の強い免疫染色が認められたが、sActRIIBで処置した切片ではこれらは事実上全く認められなかった（図15A）。同様の結果は、腫瘍切片における、腫瘍血管新生および癌進行に関与する分泌性タンパク質であるオステオポンチンの免疫染色についても見いだされた（図15A）。新たに形成された微小血管のマーカーであるCD31の免疫染色により、非処置腫瘍切片における新生微小血管系の存在、およびsActRIIBで処置した腫瘍の切片におけるそのような新たな微小血管の欠如がさらに実証された（図15B）。これらの結果は、sActRIIB処置によって複数の血管新生因子が抑制され、TOV-21G腫瘍における新血管形成が妨げられたことを指し示している。腫瘍アポトーシスに対するこの血管新生喪失の影響について評価するために、活性カスパーゼ-3免疫染色およびTUNELアッセイ法を腫瘍切片に対して行った。図15Cに示されているように、sActRIIB処置は、処置した腫瘍における活性カスパーゼ-3の著明な増大およびDNA断片化をもたらした。このように、inh-KOマウスにおける性腺腫瘍に対する所見とも一致していることから、TOV-21G卵巣癌異種移植片によるこれらの所見は、腫瘍血管新生および増殖におけるアクチビン-Aの主な役割をさらに実証している。
【０３２１】
実施例5：アクチビン-Aは癌細胞および間質細胞における血管新生因子の過剰発現を刺激する
腫瘍微小環境は、癌細胞のほかに、近傍の間質細胞、内皮細胞および浸潤性免疫細胞も含む。腫瘍における癌細胞と非癌細胞との間の複雑な相互作用が、腫瘍の悪性状態および進行を決定づける上で非常に重要であるという証拠が蓄積されつつある。アクチビン-Aが腫瘍増殖を調節する細胞機序を解明するために、血管新生因子の発現に対するアクチビン-Aの影響について、腫瘍内に認められる4種類の細胞型‐癌細胞、線維芽細胞、内皮細胞および単球において検討した。具体的には、TOV-21G癌細胞、BAEC内皮細胞、MRC-5またはCCD-Lu線維芽細胞、およびU937単球細胞の培養物をそれぞれ組換えアクチビン-Aで処置し、VEGFおよびAng-1の発現をリアルタイムPCRによって分析した。アクチビン-A処置は、これらのすべての培養物においてVEGF転写物のレベルの顕著な増大を引き起こし（図16A）、BAEC、MRC-5およびCCD-Lu培養物ではAng-1 mRNAレベルの顕著な増大も引き起こした（図16B）。このように、アクチビン-アンタゴニストであるsActRIIBは、組換えアクチビン-AによるVEGFおよびAng-1のこの誘導を妨げた（図16Aおよび図16B）。さらに、ELISAにより、アクチビン-A処置がTOV21G、MRC-5、CCD-LuおよびTPH-1細胞による細胞培地中へのVEGFの放出（図17A）、ならびにMRC-5およびCCD-Lu細胞によるAng-1の放出（図17B）を増加させ、一方、sActRIIBがアクチビン-Aにより誘導される血管新生性因子のこの放出を完全に遮断したことも明らかになった（図17Aおよび図17B）。このように、アクチビン-Aは、腫瘍微小環境に存在するさまざまな細胞型において血管新生因子の転写および分泌を上方制御することができる。さらに、アクチビン-Aへの曝露の影響についても、特に、曝露によってこれらの細胞株におけるアクチビン-A（βA）mRNAの内因性発現が誘導されるか否かを明らかにするために検討した。注目すべきことに、TOV21G、BAEC、MRC-5、CCD-Lu、U937およびTHP-1培養物に対する組換えアクチビン-Aの添加により、これらのすべての細胞においてβA発現が顕著に上方制御され（図18）、この誘導はsActRIIBによって完全に遮断することができた。したがって、アクチビン-Aの産生は癌細胞において、さらに内皮細胞、線維芽細胞および単球においても、それ自体の発現を増幅させることができる。これらの所見は、癌細胞由来のアクチビン-Aがオートクリンおよびパラクリン作用を介して複数の細胞型におけるアクチビン-A過剰発現をますます高度に誘発し、腫瘍微小環境におけるVEGFおよびAng-1の産生強化をもたらすという新規なフィードフォワード血管新生機序を実証するものである。
【０３２２】
実施例6：アクチビン遮断によりヒト黒色腫および膀胱癌異種移植片の増殖が阻害される
アクチビン-Aが卵巣癌以外の癌の発生病理にも寄与するか否かについて調べるために、インビトロで培養した時にアクチビン-Aを放出することが示されているという理由から、G361ヒト黒色腫および5637ヒト膀胱癌という他の2種類の癌のインビボ増殖についても検討した。ヌードマウスにG361および5637異種移植片を移植し、腫瘍が樹立された後に、移植マウスをsActRIIBまたはアクチビン-A抗体で処置した。図19に示されているように、アクチビン-A遮断により、これらの非卵巣異種移植片の両方で増殖速度およびサイズが有意に減少した。この阻害は、アクチビン-Aがさまざまな悪性腫瘍の進行に影響を及ぼしている可能性を示すものである。
【０３２３】
実施例7：アクチビン-A転写物は多くのヒト癌において高度に増加している
複数の種類の癌においてアクチビン-Aが増加していることの証拠が蓄積されつつある。ヒト癌におけるアクチビン-A過剰発現についてさらに検証するために、Oncomineマイクロアレイデータベースを用いてアクチビン-A（βA）発現レベルを検索した。図20に示されているように、乳癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌および頭頸部癌を含む、検査した多岐にわたる種類のヒト癌において、βA転写物のレベルは、各々の対照組織と比較して、癌性組織において増加していた。
【０３２４】
実施例8：雌性のインヒビン-αノックアウトマウスにおける卵巣腫瘍増殖および悪液質に対する、sActRIIBの投与中止および再投与の影響
この試験の目的は、樹立された卵巣腫瘍を有するInhα KO（インヒビン-α欠損ノックアウト）マウスの体重、腫瘍量および生存に対するsActRIIBの投与中止、および再投与の長期的薬理学的影響について検討することであった。Inhα KOマウス（Matzuk et al., 1992）の使用許諾は、Dr. Martin M. Matzuk (Baylor College of Medicine, Houston, TX）から得た。マウスは混在性C57BL6／129S6／SvEv遺伝的バックグラウンドで維持されており、コロニーはCharles River Laboratories, Inc.（Wilmington, MA）で飼育されている。Inhα KOマウスの遺伝子型判定はゲノム尾部DNAを用いるPCRによって実施され、これはEngineered Models and Services（Charles River Laboratories, Inc. Wilmington, MA）によって行われた。
【０３２５】
体重19.41〜26.82グラムの11〜14週齡の雌性Inhα KOマウスに対して、30mg／kgのsActRIIBまたはPBSのいずれかを皮下（SC）注射した。齢数を一致させたWT同腹仔対照マウスにPBSを注射し、ベースライン対照として用いた。試験は注射から2週後の剖検によって終えた。マウスの2つのコホートをこの試験に用いた。体重17.7〜27.4グラムの11〜13週齡の雌性Inhα KOマウスに対して、30mg／kgのsActRIIBまたはPBSのいずれかをSC注射した。齢数を一致させたWT同腹仔対照マウスにPBSを注射し、ベースライン対照として用いた。投与中止は8週間持続させた。投与中止の終了時に、sActRIIBで処置したマウスを、体重が均等になるように2群に分けた（第3群および第4群）。
【０３２６】
第2群および第3群は卵巣腫瘍を検査するために安楽死させた。第4群は30mg／kgのsActRIIBのさらなる用量を受け、4週後にマウスをWTマウスとともに安楽死させた（合計12週）。マウスの体重を最長12週間にわたって週1回記録した。剖検のために、マウスをCO2チャンバーで安楽死させた。WTマウスにおける正常卵巣およびInhα KOマウスにおける卵巣腫瘍を収集して秤量した。結果はすべて、平均±平均の標準誤差（SEM）として表した。群間差の統計的有意性は、MS Excel 5.0ソフトウエアにてStudentの両側t検定を用いて解析した。動物の生存期間の差の検討には、カイ二乗検定（GraphPad Software Inc, San Diego, CA）を用いた。群間の統計的有意性は、p＜0.05値によって表している。
【０３２７】
（表１２）sActRIIBの単回投与、2週間の試験スケジュール
2016508504.tif 000067
【０３２８】
（表１３）sActRIIBの投与中止および再投与のスケジュール
2016508504.tif 000068
【０３２９】
sActRIIBの単回用量（30mg／kg、SC）により、最初の4週間で、Inhα KOマウスにおいて、WT同腹仔対照のレベルを上回る持続的な体重増加がもたらされた。それ以後および初回用量から最長8週間後までは、sActRIIBで処置したInhα KOマウスの体重はWT対照と同程度であったが、PBSで処置したKOマウスの平均体重は試験期間全体を通じてWT対照よりも有意に少なかった。第8週の時点で、sActRIIBで処置したInhα KOマウスのうち11匹に対して、sActRIIBのさらなる単回用量を与えた。sActRIIBの再投与により、以後の4週間の期間（第12週まで）において、Inhα KOマウスにおけるさらなる体重増加が刺激された（図21）。
【０３３０】
PBSで処置したInhα KOマウスでは卵巣腫瘍が発育し、15週齡前後で筋肉および臓器の劇的な消耗を呈した。致死的な病状がマウスに起こった時点で、CO2吸入によってそれらを安楽死させた。WTマウスの1匹は、死因に関して明らかな説明がつかない状態でケージ内死亡（DIC）が認められた。またsActRIIBで処置したInhα KOマウスの1匹も、初回用量から7週後の時点でDICが認められた。Inhα KOマウスを、sActRIIBの単回用量後の8週間の期間にわたって生存率に関して分析した。第8週の時点で、sActRIIBで処置したInhα KOマウスの生存率は94％（18匹中17匹が生存）であり、これに対して、PBSで処置したInhα KO群では12.5％（8匹中1匹が生存）であった（図22）。
【０３３１】
sActRIIBの単回用量から2週後に、KOマウスの平均腫瘍重量はWT対照レベルまで減少した。同じ期間中に、PBSで処置したInhα KOマウスでは大きな卵巣腫瘍が発育した（図23）。初回単回用量からの投与中止8週後の時点で、sActRIIBで処置したInhα KOマウスにおける卵巣腫瘍重量はPBSで処置したInhα KOマウスのものと同程度に増大し、このことは化合物の投与中止期間における卵巣腫瘍の再増殖を示唆している。sActRIIBの再投与を、投与中止したInhα KOマウスの11匹に対して第8週に行った。第12週の時点（再投与から4週後）で分析した卵巣腫瘍量は、8週間の投与中止後のsActRIIBの再投与により、腫瘍量が有効に減少したことを指し示している（図24）。
【０３３２】
本試験は、sActRIIBが雌性Inhα KOマウスにおいて癌悪液質を好転させて卵巣腫瘍増殖を抑制するのに有効であることを実証している。sActRIIBの単回用量は、Inhα KOマウスにおける体重増加に対して長期にわたる効果を有する。このデータは、sActRIIB処置がInhα KOマウスにおける卵巣腫瘍増殖を有意に抑制したことを指し示している。Inhα KOマウスにおける卵巣腫瘍量は、sActRIIBの単回用量処置から2週後にWT対照レベルまで退縮した。sActRIIBの初回用量から8週間の投与中止後には、Inhα KOマウスにおける卵巣腫瘍の重量はPBS処置群でみられるものとほぼ同じであった。しかし、sActRIIBの再投与により、卵巣腫瘍量はWT対照群のサイズまで有効に退縮した。これらのデータは、8週間という長い間隔をおいて行ったsActRIIBの間欠的投与が、雌性Inhα KOマウスにおける体重減少を防止し、卵巣腫瘍増殖を抑制し、かつ生存を延長させる上で、非常に有効であったことを指し示している。
【０３３３】
実施例9：TOV-21G卵巣癌を移植した雌性ヌードマウスにおける腫瘍増殖、体重、および筋肉量に対するsActRIIBとドキソルビシンの併用の効果
本試験の目的は、TOV-21G卵巣異種移植腫瘍を移植したヌードマウスにおける体重、腫瘍増殖および筋肉量に対する、sActRIIB、ドキソルビシン（dox）、およびsActRIIB＋ドキソルビシンのそれぞれの薬理学的投与の効果を検討することであった。8週齡の雌性無胸腺ヌードマウスに対して、0.2mLの5×106個のTOV-21G細胞をマウスの下腹部の左側部位にSC注射した。腫瘍移植から10日後に、マウスを体重および腫瘍サイズ別に4群に分けて、ビヒクル、sActRIIB、ドキソルビシン、またはsActRIIBとドキソルビシンの組み合わせによる処置を行った。加えて、非腫瘍担持マウスの1群を正常対照として用い、PBSを投与した。投与および治療のスケジュールは以下の表に示されている。
【０３３４】
（表１４）投与および治療のスケジュール
2016508504.tif 000069
【０３３５】
マウスの体重を毎週測定した。体重データは長期的に記録した。腫瘍サイズは、電子キャリパーを用いて長期的に記録した。実際の腫瘍体積を算出するには、以下の式を用いた（Tomayko M and Reynolds C, 1989）：（直角性の固形腫瘍の体積：腫瘍体積（mm3）＝腫瘍の長さ（mm）×幅（mm）×高さ（mm））。試験の終了時に、全群のマウスを最終剖検に供し、標準的な解剖学的解体手技を用いて除脂肪屠体重量（皮膚、脂肪組織、内臓、および頭部を除く）を決定した。各マウスの左側および右側の腓腹筋を摘出して秤量した。結果はすべて、平均±SEM（平均の標準誤差）として表した。統計分析については、標準的な両側t検定をMS Excel 5.0ソフトウエアとともに用いて、統計的差異を判定した。0.05未満のp値を、統計学的に有意であると見なした。
【０３３６】
図25に示されているように、TOV-21G腫瘍担持マウスは、非腫瘍担持正常対照マウスと比較して体重減少を示した。TOV-21G腫瘍担持マウスにおけるsActRIIB投与により、体重減少が有効に防止された。ドキソルビシン処置により、TOV-21G移植マウスにおける体重がさらに減少した（統計学的に有意ではない）；しかし、この減少は第38日時点で正常対照マウスと比較すると有意であった。sActRIIBをドキソルビシンと併用して投与することにより、ドキソルビシンで処置したTOV-21G移植マウスで認められた体重減少は有効に緩和された。
【０３３７】
個々の各マウスの腫瘍サイズを、4週間の試験期間全体を通じて毎週測定した。腫瘍重量は第4週時点の最終剖検手技によって記録した。図26に示されているように、DOXは、TOV-21G腫瘍担持マウスにおける腫瘍サイズおよび腫瘍重量を、ビヒクルで処置したTOV-21G群と比較して有意に減少させた。sActRIIBとDOX処置の組み合わせにより、ビヒクルで処置したTOV-21G腫瘍担持マウスと比較して、さらに腫瘍増殖が阻害され、腫瘍サイズが減少した。第38日の時点で、sActRIIBとDOX処置との組み合わせにより、DOXで処置したTOV-21G腫瘍担持マウスと比較して腫瘍サイズは有意に減少し、腫瘍重量は25％減少した。加えて、sActRIIBおよびドキソルビシンは、腫瘍抑制に対する相加効果も有していた。このように、sActRIIBおよびドキソルビシンはそれぞれ、ヌードマウスにおいてTOV-21G腫瘍増殖を阻害することができ、それらを組み合わせた場合にはTOV-21G腫瘍増殖のより大きな阻害をもたらした。
【０３３８】
マウスの除脂肪屠体重量および腓腹筋重量を、4週間の実験の終了時に剖検手技によって決定した。図27に示されているように、TOV-21G腫瘍担持マウスは、正常対照と比較して除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の有意な減少を示したが；しかし、sActRIIBの投与により、TOV-21Gを移植したヌードマウスにおける除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の減少は防止された。ドキソルビシンは、TOV-21G異種移植マウスにおける除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の減少に対して全く効果を有しなかったが；しかし、sActRIIBとの併用処置により、TOV-21Gを移植したヌードマウスにおける除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の減少は有意に防止された。このように、単独で、またはドキソルビシンと組み合わせて投与されたsActRIIBは、TOV-21G腫瘍担持マウスにおける筋肉減少を防止することができる。
【０３３９】
単独で、またはドキソルビシンと組み合わせて投与されたsActRIIBは、腫瘍担持ヌードマウスにおけるTOV-21G異種移植腫瘍増殖を阻害し、筋肉消耗を低減させた。さらに、sActRIIBおよびドキソルビシンは、ヌードマウスにおけるTOV-21G異種移植腫瘍増殖の抑制に対して相加効果を有するように考えられる。
【０３４０】
実施例10：雌性のインヒビン-αノックアウトマウスにおける体重、筋肉量、除脂肪体重および体脂肪量、臓器重量、卵巣腫瘍増殖、ならびに腫瘍血管新生因子発現に対する、アクチビン-A抗体によるアクチビンA遮断の効果
この試験の目的は、樹立された卵巣腫瘍および悪液質を有するInhα KOマウスにおける、流血中アクチビンAレベル、体重、除脂肪体重および体脂肪量、筋肉および臓器の重量および卵巣腫瘍重量、ならびに卵巣組織における腫瘍血管新生因子（VEGFおよびAng-1）の発現レベルに対するアクチビン-A抗体の薬理学的効果を検討することであった。
【０３４１】
Inhα KOマウスの使用許諾は、Dr. Martin M. Matzuk (Baylor College of Medicine, Houston, TX）から得た。マウスは混在性C57BL6／129S6／SvEv遺伝的バックグラウンドで維持されており、コロニーはCharles River Laboratories, Inc.（Wilmington, MA）で飼育されている。Inhα KOマウスの遺伝子型判定はゲノム尾部DNAを用いるPCRによって実施され、これはEngineered Models and Services（Charles River Laboratories, Inc. Wilmington, MA）によって行われた。
【０３４２】
4週間の実験に関する毎週の注射
2016508504.tif 000070
【０３４３】
11週齡の雌性Inhα KOマウスに対して、20mg／kgのアクチビン-A抗体またはPBS（ビヒクル対照）のいずれかを皮下（SC）注射した。用いたアクチビン-A抗体は、上記の材料の項に記載されたものと同じであった。齢数を一致させたWT同腹仔対照マウスに対して、20mg／kgのアクチビン-A抗体またはPBS（ベースライン対照として用いる）を注射した。週1回の注射を4週間続けた。4週間の試験の終了時に、最終血液試料を心臓穿刺によって採取し、アクチビンA分析のために血清を-80℃で貯蔵した。MSD Standardプレートを、製造元によって提供されているプロトコールに従って用いて、遊離アクチビンAレベルを検出した。剖検時に収集した血清をこのアッセイ法に用いた。VEGF Immunoassayキットを、提供されているプロトコールに従って用いて、VEGF（血管内皮増殖因子）レベルを検出した。
【０３４４】
マウス体重を週1回、4週間にわたって記録した。体組成（除脂肪体重および体脂肪量）は、第0週および第4週に、Mini Spec NMR撮像装置（Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Germany）を製造元によって提供されているプロトコールに従って用いる核磁気共鳴（NMR）イメージングによって分析した。4週間の試験の終了時に、動物をすべてCO2チャンバーで安楽死させて、最終剖検手技に供した。安楽死の直後に、Inhα KOマウスにおける腓腹筋および卵巣、ならびに子宮を摘出して秤量した。
【０３４５】
マウスの卵巣および卵巣腫瘍は、亜鉛ホルマリンで固定してパラフィンブロックとした。4μm厚のパラフィン切片をIHCのために用いた。抗原回収は、Unmask Solution（Vector H-3300）における3分間のマイクロウェーブ処理によって行った。非特異的染色のブロッキングは、CAS（Zymed Lab 00-8120）中にて室温で30分間行った。CAS中に希釈した一次抗体は以下の通りである：ウサギ抗アンジオポエチン1（Abcam ab8451）1：500；ウサギ抗VEGF（Abcam ab46154）1：150。インキュベーションは室温で3時間とした。二次抗体には、ベクターEliteウサギIgG ABCキット（pk-6101）連結させた。ベクターSGキット（SK-4700）を青色／グレー染色のために用い、核はFast Red（Vector H-3403）で対比染色した。結果はすべて平均±平均の標準誤差（SEM）として表した。アクチビン-A抗体処置群間とPBS処置群との間の差の統計的有意性を、Studentの両側t検定を用いて、すべてのデータに関して分析した。群間の統計的有意性はp＜0.05値によって表される。
【０３４６】
血清アクチビンAレベルは、WT対照群と比較してInhα KOマウスにおいて有意に増加していた。アクチビン-A抗体の注射により、4週間にわたる処置後にInhα KOマウスにおける血清アクチビン-Aの増加は完全に消失した（図28）。Inhα KOマウスにおけるアクチビンA抗体の投与により、体重は、PBSで処置したInhα KO同腹仔およびWT同腹仔と比較して、処置から1週間以内に有意に増加した。この有意な体重増加は第4週まで続いた。この4週間の期間中に、PBSで処置したInhα KOマウスの体重は一定のままに保たれた。WT同腹仔群では、アクチビン-A抗体は体重に対して全く影響を及ぼさなかった（図29）。
【０３４７】
NMRイメージングによって明らかになったように、雌性Inhα KOマウスにおける20mg／kgのアクチビン-A抗体の投与は、第4週までに、PBSで処置したInhα KOマウスおよびWT同腹仔のものを上回る、除脂肪体重の有意な増加をもたらした。反対に、PBSで処置したInhα KOマウスは、WTマウスおよびアクチビン-A抗体で処置したInhα KOマウスと比較して、有意に少ない除脂肪体重を有していた。WT同腹仔対照群では、アクチビン-A抗体は除脂肪体重に対して全く影響を及ぼさなかった。Inhα KOマウスにおけるアクチビン-A抗体は、4週間の治療期間の終了時までに、体脂肪量をWT同腹仔対照群のレベルまで減少させ、それはPBSで処置したInhα KOマウスのものよりも有意に大きかった。WT同腹仔対照群では、アクチビン-A抗体は体脂肪量に対して有意な影響を及ぼさなかった（図30）。
【０３４８】
腓腹筋肉量を試験終了時に最終剖検手技によって測定した。Inhα KOマウスのアクチビン-A抗体投与は、PBSで処置したInhα KOマウスおよびWT同腹仔対照群と比較して、筋肉量の有意な増加をもたらした。アクチビン-A抗体は、WT同腹仔対照群では腓腹筋肉量に対して有意な影響を及ぼさなかった（図31）。
【０３４９】
卵巣および子宮（Inhα KOマウスのみ）を、試験終了時に剖検手技によって検査した。そのデータにより、雌性Inhα KOマウスではすべて、大きな出血性卵巣腫瘍が発育したことが明らかになった。Inhα KOマウスの卵巣の総重量は、WT同腹仔対照群のものよりも有意に大きかった。Inhα KOマウスにおけるアクチビン-A抗体の投与は、PBSで処置したInhα KOマウスにおける腫瘍と比較して、有意に小さい腫瘍サイズをもたらした。さらに、PBSを用いたInhα KO群における子宮のほとんどは、大量の液体によって拡大していた。アクチビン-A抗体処置により、子宮重量は90％、有意に減少した。アクチビン-A抗体は、WT同腹仔対照群では卵巣重量に対して全く影響を及ぼさなかった（図32）。
【０３５０】
血清VEGF ELISAにより、進行した卵巣腫瘍を有するInhα KOマウスでは、流血中のVEGFレベルが大きく増大していることが明らかになった（図33）。VEGFおよびアンジオポエチン-1（Ang-1）の免疫反応性はいずれも、PBSで処置したInhα KOマウス由来の卵巣腫瘍の切片では有意に増加していた。アクチビン-A抗体処置により、卵巣におけるVEGFおよびAng-1の誘導は消失した（図34）。
【０３５１】
本試験による結果は、4週間にわたる20mg／kg アクチビン-A抗体の1週間用量が、雌性Inhα KOマウスにおいて流血中アクチビンレベルを低下させ、悪液質を改善し、卵巣腫瘍増殖を抑制し、かつ腫瘍血管新生因子の発現を減少させたことを指し示している。アクチビン-A抗体投与は、Inhα KOマウスにおいて体重および骨格筋量を有意に増加させ、卵巣腫瘍サイズを減少させ、かつ卵巣におけるVEGFおよびAng-1の過剰発現を消失させた。
【０３５２】
実施例11：TOV-21G卵巣癌を移植した雌性ヌードマウスにおける腫瘍増殖、体重、および筋肉量に対する、アクチビン-A抗体とドキソルビシンの併用の効果
この試験の目的は、TOV-21G卵巣異種移植腫瘍を移植したヌードマウスにおける体重、腫瘍増殖および筋肉量に対する、アクチビン-A抗体、ドキソルビシン、およびアクチビン-A抗体＋ドキソルビシンの薬理学的投与の効果を検討することであった。用いたアクチビン-A抗体は、上記の材料の項に記載されたものと同じであった。8週齡の雌性無胸腺ヌードマウスに対してそれぞれ、2.2×106個のTOV-21G細胞をマウスの下腹部の左側部位に皮下（SC）注射した。腫瘍移植後の第12日に、マウスを体重および腫瘍サイズ別に4群に分けて、続いてビヒクル、アクチビン-A抗体、ドキソルビシン、またはアクチビン-A抗体とドキソルビシンの組み合わせによる処置を行った。加えて、非腫瘍担持マウスの1群を正常対照として用い、PBSを投与した。投与および治療のスケジュールは以下の表に示されている。
2016508504.tif 000071
*第5群の2匹のマウスは、ケージ内に複数匹を収容していたところ（マウス4匹／ケージ）、他のマウスによってケージ内で殺された。
【０３５３】
マウスの体重を毎週測定した。体重データは長期的に記録した。腫瘍サイズは、電子キャリパー（Fred V. Fowler Company, Inc.）を用いて長期的に記録した。実際の腫瘍体積を算出するには、以下の式を用いた（Tomayko M and Reynolds C, 1989）：直角性の固形腫瘍の体積：腫瘍体積（mm3）＝腫瘍の長さ（mm）×幅（mm）×高さ（mm）。試験の終了時に、全群のマウスを最終剖検に供し、標準的な解剖学的解体手技を用いて除脂肪屠体重量（皮膚、脂肪組織、内臓、および頭部を除く）を決定した。各マウスの左側および右側の腓腹筋を摘出して秤量した。結果はすべて、平均±SEMとして表した。統計分析については、標準的な両側t検定を用いて統計学的差異を判定した。0.05未満のp値を、統計学的に有意であると見なした。
【０３５４】
図35に示されているように、TOV-21G腫瘍担持マウスは、非腫瘍担持正常対照マウスと比較して体重の有意な減少を示した。アクチビン-A抗体投与により、TOV-21G腫瘍担持マウスにおける体重減少は防止された。ドキソルビシン処置は、TOV-21G移植マウスにおける体重のさらなる減少（統計学的に有意ではない）をもたらした。アクチビン-A抗体とドキソルビシンとの併用処置によって引き起こされる体重減少は、ドキソルビシン処置単独よりも少ない（統計学的に有意ではない）ように考えられた。
【０３５５】
個々の各マウスの腫瘍サイズを、5週間の試験期間全体を通じて毎週測定した。腫瘍重量は第5週時点の最終剖検手技によって記録した。図36および図37に示されているように、アクチビン-A抗体で処置したTOV-21G担持マウスでは、ビヒクルで処置したTOV-21G担持マウスと比較して、第47日の時点で腫瘍サイズおよび腫瘍重量の統計学的に有意な減少が観察された。加えて、アクチビン-A抗体とドキソルビシンとの併用処置は、腫瘍抑制に対する相加効果も有していた。このように、アクチビン-A抗体またはドキソルビシンはそれぞれ、ヌードマウスにおいてTOV-21G腫瘍増殖を阻害することができ、それら2つの作用物質を組み合わせた場合にはTOV-21G腫瘍増殖のより大きな阻害を引き起こした。
【０３５６】
マウスの除脂肪屠体重量および腓腹筋重量を、5週間の実験の終了時に剖検手技によって決定した。図38に示されているように、TOV-21G腫瘍担持マウスは、正常対照と比較して除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の有意な減少を示したが；しかし、アクチビン-A抗体の投与により、TOV-21Gを移植したヌードマウスにおける除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の減少は防止された。ドキソルビシンは、TOV-21G異種移植マウスにおける除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の減少に対して全く効果を有しなかったが；しかし、アクチビン-A抗体との併用処置により、TOV-21Gを移植したヌードマウスにおける除脂肪屠体重量および腓腹筋肉量の減少は低減された。このように、単独で、またはドキソルビシンと組み合わせて投与されたアクチビン-A抗体は、TOV-21G腫瘍担持マウスにおける筋肉減少を防止することができた。
【０３５７】
単独でまたはドキソルビシンと組み合わせて投与されたアクチビン-A抗体は、腫瘍担持ヌードマウスにおけるTOV-21G異種移植腫瘍増殖を阻害し、筋肉消耗も低減させた。さらに、アクチビン-A抗体処置は、ヌードマウスにおけるTOV-21G異種移植腫瘍のインビボ増殖の抑制に対して、ドキソルビシン化学療法との相加効果を有するように考えられた。
【０３５８】
本発明を、好ましい態様およびさまざまな代替的な態様を参照しながら具体的に示し、説明してきたが、関連技術の当業者には、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それらに形態および詳細の点でさまざまな変化を加えうることが理解されるであろう。
【０３５９】
本明細書の本文に引用されたすべての参照文献、交付された特許および特許出願は、それらの全体が、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０３６０】
参照文献
2016508504.tif 000072
2016508504.tif 000073
【図１】
2016508504.tif 000079
【図２Ａ】
2016508504.tif 000080
【図２Ｂ】
2016508504.tif 000081
【図３Ａ】
2016508504.tif 000082
【図３Ｂ】
2016508504.tif 000083
【図４】
2016508504.tif 000084
【図５】
2016508504.tif 000085
【図６】
2016508504.tif 000086
【図７】
2016508504.tif 000087
【図８Ａ】
2016508504.tif 000088
【図８Ｂ】
2016508504.tif 000089
【図８Ｃ】
2016508504.tif 000090
【図８Ｄ】
2016508504.tif 000091
【図９】
2016508504.tif 000092
【図１０】
2016508504.tif 000093
【図１１】
2016508504.tif 000094
【図１２】
2016508504.tif 000095
【図１３】
2016508504.tif 000096
【図１４】
2016508504.tif 000097
【図１５Ａ】
2016508504.tif 000098
【図１５Ｂ】
2016508504.tif 000099
【図１５Ｃ】
2016508504.tif 000100
【図１６】
2016508504.tif 000101
【図１７】
2016508504.tif 000102
【図１８】
2016508504.tif 000103
【図１９】
2016508504.tif 000104
【図２０−１】
2016508504.tif 000105
【図２０−２】
2016508504.tif 000106
【図２０−３】
2016508504.tif 000107
【図２０−４】
2016508504.tif 000108
【図２０−５】
2016508504.tif 000109
【図２１】
2016508504.tif 000110
【図２２】
2016508504.tif 000111
【図２３】
2016508504.tif 000112
【図２４】
2016508504.tif 000113
【図２５】
2016508504.tif 000114
【図２６−１】
2016508504.tif 000115
【図２６−２】
2016508504.tif 000116
【図２７】
2016508504.tif 000117
【図２８】
2016508504.tif 000118
【図２９】
2016508504.tif 000119
【図３０】
2016508504.tif 000120
【図３１】
2016508504.tif 000121
【図３２】
2016508504.tif 000122
【図３３】
2016508504.tif 000123
【図３４−１】
2016508504.tif 000124
【図３４−２】
2016508504.tif 000125
【図３５】
2016508504.tif 000126
【図３６】
2016508504.tif 000127
【図３７】
2016508504.tif 000128
【図３８】
2016508504.tif 000129
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月4日(2015.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016508504000001.app
【国際調査報告】
2016508504.tif 000130
2016508504.tif 000131
2016508504.tif 000132
2016508504.tif 000133
2016508504.tif 000134
2016508504.tif 000135