(57)【要約】融合タンパク質とペプチドの製造方法及びシステムを提供する。更にこの方法で作られた融合タンパク質とペプチドも提供する。また、本開示によって製造された融合タンパク質とペプチドの利用方法も提供する。例えば、本発明によれば、融合タンパク質の製造方法であって、該方法は、ペプチドまたはタンパク質ドメインとリポカリンタンパク質とを含む融合タンパク質を細胞内で発現させ、それにより融合タンパク質を製造する方法が提供される。【選択図】図５
2016505251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質の製造方法であって、該方法は、ペプチドまたはタンパク質ドメインとリポカリンタンパク質とを含む融合タンパク質を細胞内で発現させ、それにより融合タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
更にリポカリンタンパク質からペプチドまたはタンパク質ドメインを分離し、それによりペプチドまたはタンパク質ドメインを製造する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドまたはタンパク質ドメインは抗体断片である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体はトラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＯＫＴ３、またはＦｃである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドまたはタンパク質ドメインは、ヒトヘムオキシゲナーゼ１またはマウスヘムオキシゲナーゼ１である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、更に開裂サイトを持っている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記開裂サイトはフューリン開裂サイト、トリプシン開裂サイト、またはＴＥＶ開裂サイトである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
リポカリンタンパク質からのペプチドまたはタンパク質ドメインの分離は、融合タンパク質における該開裂サイトでの開裂の結果によって起こることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リポカリンタンパク質からのペプチドまたはタンパク質ドメインの分離は、該融合タンパク質の細胞からの分泌に続いて起こる、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は哺乳動物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドは、約５００ｍｇ／リットル未満、約４００ｍｇ／リットル未満、約３００ｍｇ／リットル未満、約２００ｍｇ／リットル未満、約１００ｍｇ／リットル未満、または約５０ｍｇ／リットル未満の濃度で作られる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドは、ジスルフィド結節ペプチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質、またはコノトキシンＣＶＩＣである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳ、シデロカリン、ＴＥＶと興味対象の結節ペプチド配列からなる群から選ばれるペプチドを含んでいる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドはノッチンを含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
融合タンパク質組成物であって、該組成物はリポカリンタンパク質とペプチドまたはタンパク質ドメインとを含む組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドは結節ペプチドである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質及びコノトキシンＣＩＶＣからなる群から選ばれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記リポカリンタンパク質はヒトシデロカリン、マウスシデロカリン、チキンＥｘ−ＦＡＢＰまたはウズラＱ８６である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記結節ペプチドは少なくとも２つのジスルフィド結合を含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記融合タンパク質は各サブユニットの隣接するサブユニットとの直接融合により生成される、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
更にリポカリンタンパク質とペプチドまたはタンパク質ドメインとの間にリンカー配列を含んでいる、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
ペプチドライブラリーを含んでいる組成物であって、該ペプチドライブラリーは更に少なくとも１つの天然リジン残基を欠いている複数のペプチドを含んでいる組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドはアダプター分子と結合されている、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記アダプター分子はペプチドである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドは質量分光分析で測定される独自のサインを持っている、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ペプチドの製造方法であって、該方法は、ペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を細胞内で発現させることと、該ペプチドを該リポカリンタンパク質から分離し、それによりペプチドを製造すること、とを含む方法。
【請求項３４】
前記ペプチドはタンパク質加水分解によりまたは融合タンパク質のフューリン開裂サイトにおける開裂によってリポカリンタンパク質から分離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は哺乳動物細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドは約２００ｍｇ／リットル未満の濃度で作られる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記結節ペプチドはカイモトリプシン阻害因子、ヘフトキシン、気泡タンパク質、ミドカインのＣ末端ドメイン及びエピレグリンからなる群から選ばれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンを含んでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＰ−ペプチドを含んでいる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドは結節ペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ペプチドとリポカリンタンパク質を含んでいる融合タンパクを含んでいる組成物。
【請求項４４】
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記結節ペプチドはカイモトリプシン阻害因子、ヘフトキシン、気泡タンパク質、ミドカインのＣ末端ドメイン、ポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子及びエピレグリンからなる群から選ばれる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記結節ペプチドは少なくとも２つのジスルフィド結合を含んでいる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
前記融合タンパク質はＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４９】
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、請求項に４９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、契約番号Ｒ０１ＣＡ１３５４９１、ＮＩＨ  ＲＯＩ  ＡＩ０５９５４３、ＡＩ０９４４１９、及びＡＩ０９７７８６の契約に基づき合衆国政府の後援により国立衛生研究所によってなされた。
【背景技術】
【０００２】
新しい有用な薬剤を見分け開発するため、幅広い技術と財源を使い、薬剤発見に向けた努力が続いている。残念ながら、新しい薬剤の発見はこれまでずっと困難なことであった。例えば、損傷をより抑えかつより精確に目的の癌を治療するための開発は必要不可欠である。しかし、数十年にわたる研究の後も、科学者たちは依然として、薬効と癌を標的にする性質、すなわち治療方針として役立つことがあり得る治療化合物の可能性を減じるのみならず外科的切除の成功法を必要とするような性質、を適切なバランスで持つ治療化合物を見分けようと奮闘している。
【０００３】
これまで、幅広い治療目的のため、多様なタイプの化合物が研究され調べられてきた。例えば、小化学分子やより大きな生物薬剤（例えば、抗体）は様々な成功とともに過度に治療用途に用いられてきた。より小さいペプチドの中にも、薬剤として、例えば、それらの天然の有効性により、有用であるものがあることが分かった。
【０００４】
これまで、臨床用途のペプチドやタンパク質の迅速かつ効率的な製造方法がなかったので、治療化合物として役立つことがあり得るペプチドやタンパク質の発見が制限されてきた。ペプチドやタンパク質製造を高めるため、ペプチド、タンパク質ドメイン、またはタンパク質の異なるタンパク質への融合を作り出すことは細菌発現システム、例えば、大腸菌遺伝子発現など、において探求されてきた。しかしながら、細菌によるタンパク質発現システムは、概して、タンパク質折り畳み効率の誤差により限界がある。このように、迅速かつ効率的なペプチド、タンパク質ドメイン、及びタンパク質製造を可能とする方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明はシデロカリン融合タンパク質の製造方法に関する。様々な様相において、本発明は該製造方法によって作られた融合タンパク質に関する。ある様相においては、本開示に従って融合タンパク質を分断しそれによってペプチドを製造する。本発明は、更に、リポカリンタンパク質と、ペプチドまたはタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を細胞内で発現させ、それにより融合タンパク質を製造することを特徴とする融合タンパク質の製造方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、更に、ペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を細胞内で発現させ、該ペプチドを該リポカリンタンパク質から分離させ、それにより該ペプチドを製造することを特徴とするペプチドの製造方法に関する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明はリポカリンタンパク質と、ペプチドまたはタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の組成物に関する。いくつかの実施形態において、本発明は少なくとも１つのネイティブリジン残基を欠く複数のペプチドを更に含むペプチドライブラリーを含む組成物に関する。また、本発明はペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を含む組成物に関する。
【０００７】
参考文献
本明細書に書かれた全ての出版物、特許、及び特許出願書は、それぞれの出版物、特許、または特許出願が個別的かつ具体的に参照により組み込まれることが示されるように、同程度に本明細書において参照により組み込まれるものである。
【０００８】
本発明の新規な特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に述べられている。本発明の特徴と利点は、以下の発明の原理に基づく具体的な実施形態の詳細な説明及び添付図面により、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従った、多様なスカフォールドを示すゲル画像である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従った、ペプチドライブラリー製造方法の一例を示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従った、ノッチン（例えば、気泡タンパク質）を作るのに用いられ得る融合システムの一例を図示している。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従った、質量分析法による大きなペプチドライブラリーの分析を示す。
【図５】図５は、本発明の実施形態に従った、ノッチン変異型を発現させるシデロカリン融合を用いる方法の一例を示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従った、ノッチンスカフォールドを発現させるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示している。
【図７Ａ】図７は、本発明の実施形態に従った、プールされたライブラリー作成の概略図である。図７Ｂは図７Ａの拡大図である。
【図７Ｂ】図７は、本発明の実施形態に従った、プールされたライブラリー作成の概略図である。図７Ｂは図７Ａの拡大図である。
【図８】図８は、本発明の実施形態に従った、クローンノッチンライブラリーから得られた代表的な配列データを示す。
【図９】図９は、本発明の実施形態に従った、３０００の構成要素を含むノッチンライブラリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１０】図１０は、本開示の一つの様相に従った、一般的なノッチン作成方法を示す。
【図１１】図１１は、本開示の一つの様相に従った、一般的なノッチン作成方法を示す。
【図１２】図１２は、本開示の一つの様相に従った、一般的なノッチン作成方法を示す。この側面によれば、フューリンとノッチンの界面に開裂が起こる。
【図１３】図１３は、本開示の一つの様相に従った、ダイダロスシステムによって作られたノッチンの例と対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ダイダロスシステムは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（２１）：ｅ１４３に述べられている。
【図１４−１】図１４は、１８の種から得られたＳｃｎ配列アライメントを示す。該アライメントは、認識可能な相同分子種を持つ１８種間で、高次の配列保存性を示している。星印の位置は、配位子結合可能なサイトを示す。Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｃ．＆  Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｋ．（２０１３）‘Ｉｒｏｎ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ’Ｉｎ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．＆  Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ａ．，ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐｐ．３４９−５９
【図１４−２】図１４は、１８の種から得られたＳｃｎ配列アライメントを示す。該アライメントは、認識可能な相同分子種を持つ１８種間で、高次の配列保存性を示している。星印の位置は、配位子結合可能なサイトを示す。Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｃ．＆  Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｋ．（２０１３）‘Ｉｒｏｎ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ’Ｉｎ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．＆  Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ａ．，ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐｐ．３４９−５９
【図１５】図１５は、本開示の一つの様相に従った、超安定Ｓｃｎの３Ｄモデルを示す。このＳｃｎ形において、Ｎ末端を確保し、熱安定性を高めるため、第二のジスルフィド結合がなされた。
【図１６】図１６は、本開示の種々の様相において用いることのできる一般的なＳｃｎ融合の概略図を示す。精製を促進するため、ネイティブシグナルペプチドは除かれ外因性ｓＦＬＡＧとＨＩＳタグが加えられた。これらの変更は、本開示の種々の様相において任意になされる。
【図１７】図１７は、本開示の一つの様相に従った、Ｓｃｎと軽鎖抗体の融合の概略図と対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１８】図１８は、本開示の一つの様相に従った、開裂前と後のＳｃｎ融合の発現と細胞質酵素、ＨＭＯＸ１、を比較するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１９】図１９は、本開示の一つの様相に従った、細胞質ウイルス性タンパク質Ａｄｖ２とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２０】図２０は、本開示の一つの様相に従った、細胞外ウイルス性糖タンパク質ＨＩＶ  ｇｐ１２０とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２１】図２１は、本開示の一つの様相に従った、ノッチンタンパク質、すなわち、インペラトキシンとのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２２】図２２は、本開示の一つの様相に従った、細胞外チロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１の小サブドメイン（すなわち、クリングルドメイン）とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２３】図２３は、本開示の一つの様相に従った、７量体及び３量体サブドメインとのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２４】図２４は、本開示の一つの様相に従った、ノッチンとのＥｘＦＡＢＰ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。ＥｘＦＡＢＰは機能性Ｓｃｎの別のものである。本開示に従って、この組み立ては周辺質細菌システムにおいて用いられ、多様なクライアントタンパク質を分泌することができる。
【図２５】図２５は、Ｔｈ配位子とＳｃｎの結晶構造を示す。
【図２６】図２６蛍光性シデロホアを捉えた図を示す。左図はタンパク質シデロホア複合体のサイズ排除精製を示し、右図は概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示の方法及びシステムは融合タンパク質とそれらを製造する方法に関する。ある側面に従えば、本方法によって製造されたペプチドは創薬の分野で構成要素として用いることができる。ある側面から、方法は、発現システムよって治療効果の可能性のある第一のタンパク質またはペプチドと生産性を高めるような第二のタンパク質との融合を作り出すこと、及び第一のタンパク質を折り畳むことに関する。ある側面から、融合タンパク質の発現精製の後、融合タンパク質はそれぞれ別の第一のタンパク質と第二のタンパク質になるように開裂される。ある側面から、第二のタンパク質はリポカインである。第二のタンパク質は、例えば、シデロカリンのような具体的なリポカインであり得る。
【００１１】
結合体
ある側面において、本発明は、融合タンパク質、ペプチド、またはここに述べられたそれらの結合体を含む。例えば、ペプチドの性質を変更するため、該融合タンパク質またはペプチドの一部または全ては選択された一部分として結合してもよい。
【００１２】
ある側面において、本発明は、Ｎ末端において疎水性（例えば親油性）部分と結合された融合タンパク質またはペプチドを含む。本開示の該融合タンパク質またはペプチドの全てまたは一部は、例えば、内部リジンポジションにおける結合を避けるため内部リジンを欠いていてもよく、それによってペプチドのアミノ末端への結合が可能となる。ある実施形態においては、疎水性部分のＮ末端への結合は本開示の融合タンパク質またはペプチドの半減期を延長するために採用することができる。ある実施形態において、単式炭素鎖（例えば、ミリストイル化及び／またはパルミチル化）を融合タンパク質またはペプチドに結合してもよい。ある側面において、単式炭素鎖は非抱合型材料から融合タンパク質またはペプチドを容易に分離可能にし得る。抱合型材料から融合タンパク質またはペプチドを分離するために採用され得る方法は限られてはいないが、例えば、溶媒抽出、逆相クロマトグラフィーなどである。親油性部分は血清アルブミンとの可逆的な結合を通して半減期を延ばすことができる。ある実施形態において、結合された融合タンパク質またはペプチドの追跡を可能にするために、近赤外染料を融合タンパク質またはペプチドのＮ末端へ付着させることもできる。また、ある実施形態において、結合されたペプチドの追跡を可能にするために、近赤外染料を該ペプチドのリジンに付着させることもできる。更に、該染料に対する抗体により、該染料は追跡マーカー及び検索ハンドルの二重の役割を果たすことができる。結合された融合タンパク質またはペプチドは更に、組織や体液から該ペプチドを回収するための親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供するといった別の役割を果たすことができるその他の部分にも結合させることもできる。
【００１３】
他の修飾を用いることができる。例えば、融合タンパク質、ペプチド、またはそれらの結合体は翻訳後修飾（例えば，メチル化及び／またはアミド化）も含んでいてもよい。ある実施形態において、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、例えば、該ペプチドの性質を変更したり変化をもたらしたりできる他の部分へ結合することができる。結合される部分は、例えば、血清アルブミンへの可逆的結合を通して該ペプチドの半減期を延長させる親油性部分であり得る。また、ある実施形態において、該親油性部分はコレステロールまたはコレステン類、コレスタン類、コレスタジエン類、オキシステロール類などのコレステロール誘導体であり得る。ある実施形態において、該ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体に結合してもよい。
【００１４】
ある実施形態において、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、結合されたペプチドの生体分布を追跡、検出または可視化し得るように検出可能なラベルに結合してもよい。検出可能なラベルは蛍光性ラベル（例えば、蛍光性染料）であり得る。ある実施形態において、該蛍光染料は、特定の用途に対し望ましい発光特徴を持つことができる。蛍光性ラベルは、例えば、５００ｎｍから１１００ｎｍの範囲の間、６００ｎｍから１０００ｎｍの範囲の間、６００ｎｍから８００ｎｍの範囲の間、６５０ｎｍから８５０ｎｍの範囲の間、７００ｎｍから８００ｎｍの範囲の間、７２０から７８０ｎｍの範囲の間、または７２０から７５０ｎｍの範囲の間に最大発光波長を持つ発光性染料であり得る。例えば、特定の条件下でシアニン５．５は約６９５ｎｍに発光極大を持ってもよく、ＩＲ染料８００は約８００ｎｍに発光極大を持ってもよく、インドシアニングリーンは約８２０ｎｍに発光極大を持ってもよい。当業者であれば種々の染料が検出可能なラベルとして使用でき上記発光特徴を持つことを理解できるであろう。
【００１５】
ここで用いられている用語「検出可能なラベル」とは、小化学分子、ペプチド、タンパク質、またはそれらの切片または一部分に付加できる標識または修飾を意味し、それにより該標識または修飾の検出を可能にするデバイス、装置、あるいは方法により該小化学分子、ペプチド、タンパク質、または切片を認識させることができる。
【００１６】
ある側面において、検出可能なラベルは発光性染料である。本開示において結合分子として用いられ得る発光性染料は特に限定されないが、例えば、ローダミン、ロドール、フルオロセイン、チオフルオロセイン、アミノフルオロセイン、カルボキシフルオロセイン、クロロフルオロセイン、メチルフルオロセイン、スルフォフルオロセイン、アミノロドール、カルボキシロドール、クロロロドール、メチルロドール、スルフォロドール；アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルフォローダミン、チオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、シアニン染料（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサジアゾール、ベンズオキサヂアゾール、ピレン誘導体、カスケイドブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、キサンテン染料、スルホン化キサンテン染料、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ）（例えば、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル７００）、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィリン、フタロシアニンとビリルビンである。ある実施形態において、該染料は、Ｃｙ５．５、ＩＲ染料８００、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）などの近赤外染料でもよい。ある実施形態において、近赤外染料はシアニン染料（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）を含むことができる。ある実施形態において、上記検出可能ラベルはキサンテン染料またはアレクサフルオル（例えば、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル７００）などのスルホン化キサンテン染料である。染料に対する抗体を見つけることができれば、結合された染料は追跡、検出、可視化マーカーとして、また検索ハンドルとして用いることができる。
【００１７】
本発明の融合タンパク質またはペプチドはビオチンにも結合することができる。ビオチンは半減期の延長に加え、ペプチドを組織や他の位置から検索するための親和性ハンドルとしても機能することができる。ある実施形態において、ペプチドは、例えば遊離ビオチン生成酵素（ビオチニダーゼ）耐性ビオチン（例えば、ＮＨＳ−ｄＰＥＧ４−ビオチニダーゼ耐性ビオチン）にＰＥＧ結合子によって結合できる。ある実施形態において、検出可能なラベルとしてまた親和性ハンドルとして両方の役割を果たし得る蛍光性ビオチン結合体を用いることができる。市販されている蛍光性ビオチン結合体の非限定的な例としてはアットー４２５−ビオチン、アットー４８８−ビオチン、アットー５２０−ビオチン、アットー５５０ビオチン、アットー５６５−ビオチン、アットー５９０−ビオチン、アットー６１０−ビオチン、アットー６２０−ビオチン、アットー６５５−ビオチン、アットー６８０−ビオチン、アットー７００−ビオチン、アットー７２５−ビオチン、アットー７４０−ビオチン、フルオロセインビオチン、ビオチン−４−フルオロセイン、ビオチン−（５−フルオロセイン）結合体、更にビオチン−Ｂ−フィコエリスリン、アレクサフルオル４８８ビオシチン、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミン、テトラメチルローダミンビオシチン等がある。結合体の他の例としては、化学発光化合物、コロイド状金属、発光化合物、酵素、放射性同位体、常磁性ラベル等がある。
【００１８】
ある側面において、本発明の融合タンパク質及びペプチドは胃、小腸、または結腸から血流中に吸収されるビタミンや典型的に食物の中に発見される他の分子に結合され得る。特に限定はされないが、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどである。これらの結合の狙いは経口による生体利用性や消化管系からのペプチドの吸収を改善することである。
【００１９】
例えば、ある種のペブチドが消化管、血液脳関門、細胞膜、核膜などの生体障壁を超えるのを助長するように思われる選択された一連のアミノ酸が識別され得る。また、新たなペプチドが同様の生体障壁を超えるのを助長することを目的として遺伝的または物理的に他のペプチドに接ぎ木され得る。他のケースでは、同様なアプローチを採用して、配列をペプチドに接ぎ木し新たなペプチドがある種の生体障壁を超えるのを防止することができる。例えば、この方法により薬剤を修飾し、よってＢＢＢ浸透を防止し起こり得る中枢神経系への副作用を減じることができる。
【００２０】
ある実施形態において、蛍光性ラベルは、特定の用途にとって望ましい発光特徴を持ってもよい。蛍光性ラベルは、例えば、５００ｎｍから１１００ｎｍの範囲の間、６００ｎｍから１０００ｎｍの範囲の間、６００から８００ｎｍの範囲の間、６５０ｎｍから８５０ｎｍの範囲、７００ｎｍから８００ｎｍの範囲の間、７２０から７８０ｎｍの範囲の間、または７２０から７５０ｎｍの範囲の間に最大発光波長を持つ発光性染料であり得る。当業者であれば種々の染料が検出可能なラベルとして使用でき上記発光特徴を持つことを理解できるであろう。例えば、特定の条件下でシアニン５．５は約６９５ｎｍに発光極大を持ってもよく、ＩＲ染料は約８００ｎｍに発光極大を持ってもよく、インドシアニングリーンは約８２０ｎｍに発光極大を持ってもよい。
【００２１】
本開示において結合分子として用いられ得る発光性染料の非限定的な例としては、ローダミン、ロドール、フルオロセイン、チオフルオロセイン、アミノフルオロセイン、カルボキシフルオロセイン、クロロフルオロセイン、メチルフルオロセイン、スルフォフルオロセイン、アミノロドール、カルボキシロドール、クロロロドール、メチルロドール、スルフォロドール；アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルフォローダミン、チオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサジアゾール、ベンズオキサヂアゾール、ピレン誘導体、カスケイドブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィリン、フタロシアニンとビリルビンである。ある実施形態において、検出可能なラベルは、Ｃｙ５．５、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、ＩＲ染料８００、などの近赤外染料を含み得るが、それに限定されない。ある実施形態において、近赤外染料はシアニン染料（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）を含み得る。ある実施形態において、上記検出可能ラベルはキサンテン染料またはアレクサフルオル（例えば、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル７００）などのスルホン化キサンテン染料を含み得る。加えて、染料に対する抗体が同定できれば、結合された染料は追跡、検出、または可視化マーカーとして、また検索ハンドルとして用いることができる。
【００２２】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、その結合体にその他の修飾をしてもよい。例えば、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、それにより血清の半減期などに影響するが、翻訳後修飾（例えば，メチル化及び／またはアミド化）を含んでいてもよい。ある実施形態において、融合タンパク質またはペプチドは、例えば、該ペプチドの性質を変性したり変化をもたらしたりできる他の部分へ結合することもできる。結合される部分は、例えば、血清アルブミンへの可逆的結合を通して該ペプチドの半減期を延長させる親油性部分であり得る。ある実施形態において、単式炭素鎖を（例えば、ミリストイル化により）融合タンパク質またはペプチドに結合してもよい。ある実施形態において、該親油性部分はコレステロールまたはコレステン類、コレスタン類、コレスタジエン類、オキシステロール類などのコレステロール誘導体であり得る。ある実施形態において、該ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体に結合してもよい。
【００２３】
本開示の融合タンパク質またはペプチドは、更に組織や体液から該ペプチドを回収するための親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供するといった別の役割を果たすことができるその他の部分にも結合させることもできる。例えば、本発明のペプチドはビオチンに結合することもできる。ビオチンは半減期の延長に加え、ペプチドを組織や他の位置から検索するための親和性ハンドルとしても機能する。ある実施形態において、検出可能なラベルとしてまた親和性ハンドルとして両方の役割を果たし得る蛍光性ビオチン結合体を用いることができる。市販されている蛍光性ビオチン結合体の非限定的な例としてはアットー４２５−ビオチン、アットー４８８−ビオチン、アットー５２０−ビオチン、アットー５５０ビオチン、アットー５６５−ビオチン、アットー５９０−ビオチン、アットー６１０−ビオチン、アットー６２０−ビオチン、アットー６５５−ビオチン、アットー６８０−ビオチン、アットー７００−ビオチン、アットー７２５−ビオチン、アットー７４０−ビオチン、フルオロセインビオチン、ビオチン−４−フルオロセイン、ビオチン−（５−フルオロセイン）結合体、更にビオチン−Ｂ−フィコエリスリン、アレクサフルオル４８８ビオシチン、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミン、テトラメチルローダミンビオシチン等がある。結合体の他の例としては、化学発光化合物、コロイド状金属、発光化合物、酵素、放射性同位体、常磁性ラベル等がある。
融合タンパク質及びペプチドの製造方法
【００２４】
更にその他の様相では、本発明は、本開示による融合タンパク質またはペプチドの製造方法を含む。
【００２５】
ある実施形態において、本発明は、本開示による融合タンパク質またはペプチドの製造方法を含む。以下に述べるように、本発明は、本開示による融合タンパク質またはペプチドを生成するための開始点として用いられ得るスカフォールドを含む。これらのスカフォールドならびに種々のスカフォールド変異形はいくつかの異なる手法を用いて作成できる。ある様相において、本開示による融合タンパク質またはペプチドは、当分野で一般的に知られているペプチド合成技術を用いて製造することができる。従来のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、マイクロチップを用いたオリゴヌクレオチド合成）も採用できる。例えば、合成手法は種々の発現システムと組み合わせてもよい。一つの実施形態の例として、ランダム変異を誘発するため縮重コドンを用いてスカフォールド内の特定の残基位置を標的にして、マイクロチップを用いたオリゴヌクレオチド合成により作られスカフォールド変異形の大規模ライブラリーを暗号化することができる種々のＤＮＡの組み合わせを作り出すことができる。
【００２６】
ある実施形態において、スカフォールド及びスカフォールド変異形を符号化するための分子コードは様々な発現システムにおいて発現され得、またある実施形態においては、融合系の一部として組み合わせることができる。スカフォールド及びスカフォールド変異形のＤＮＡ分子コードは、例えば、２９３ＨＥＫまたは大腸菌などのいくつかの異なるタイプの細胞の中で発現することができる融合系と組み合わせることができる。２９３ＨＥＫ細胞の融合は、特に限定はないが、ＩｇＫリーダ配列及び／またはシデロカリン、リポカリン２、ヒト血清アルブミンなどの分泌融合タンパク質を含んでもよい。
【００２７】
ある実施形態において、ここで述べられているペプチド（例えば、結節ペプチド）はリポカリンタンパク質との融合体として発現され得る。ある様相では、本発明は、ペプチド（例えば、結節ペプチド）とリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を細胞内で発現することを含むことができるペプチドの製造方法を含む。該方法は、更にリポカリンタンパク質からペプチドを分離しそれによってペプチド（例えば、結節ペプチド）を製造することも含むことができる。本発明は、また、ペプチド（例えば、結節ペプチド）とリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質の組成物を含む。この融合システムは従来の融合システムに対してペプチド（例えば、結節ペプチド）の製造において様々な優位性を提供する。従来、リポカリンは、どのようにも制限されるものではないが、８鎖のベーターバレル構造と側面にあるアルファへリックスによって特徴づけられる保存折り畳み構造を持つことができるタンパク質の一種である。Ｌｃｎ２、ＮＧＡＬ、やシデロカリンのようなリポカリンタンパク質の哺乳動物細胞における発現量は、Ｆｃ融合を含む他の多くの融合システムに等しいかまたは上回る。本発明は、融合タンパク質を製造する方法に関し、この方法は、細胞内でリポカリンタンパク質とともにペプチドまたはタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を発現しそれにより融合タンパク質を製造することを含んでいる。ある実施形態において、該方法は、更に、該ペプチドまたはタンパク質ドメインを該リポカリンタンパク質から分離させ、それによりペプチドまたはタンパク質ドメインを製造すること含んでいる。ある実施形態において、ペプチドまたはタンパク質ドメインは抗体断片である。ある実施形態において、該抗体はトラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＯＫＴ３、またはＦｃである。
【００２８】
ある実施形態において、該ペプチドまたはタンパク質ドメインはヒトヘムオキシゲナーゼ１またはマウスヘムオキシゲナーゼ１である。ある実施形態において、融合タンパク質は、更に、開裂サイトを含んでいる。ある実施形態において、該開裂サイトはフューリン開裂サイト、トリプシン開裂サイト、またはＴＥＶ開裂サイトである。ある実施形態において、リポカリンタンパク質からのペプチドまたはタンパク質ドメイン分離は、融合タンパク質の開裂サイトにおける開裂による結果である。ある実施形態において、リポカリンタンパク質からのペプチドまたはタンパク質ドメインの分離は、細胞からの融合タンパク質の分泌に伴って起こる。ある実施形態において、該細胞は哺乳動物細胞である。
【００２９】
本発明は、ペプチドの製造方法に関し、該方法は、細胞内でペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を発現すること、及び該ペプチドを該リポカリンタンパク質から分離し、それによって該ペプチドを製造することを含んでいる。ある実施形態において、細胞からの分泌に際し、該ペプチドがリポカリンタンパク質から開裂されるように該ペプチドはタンパク質加水分解によりまたは融合タンパクのフューリン開裂サイトにおける開裂によってリポカリンタンパク質から分離される。ある実施形態において、該細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態において、該ペプチドは約２００ｍｇ／リットル未満の濃度で製造される。
【００３０】
ある実施形態において、本発明はペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を含む組成物に関する。ある実施形態において、該ペプチドは結節ペプチドを含んでいる。ある実施形態において、該結節ペプチドはカイモトリプシン阻害因子、ヘフトキシン、気泡タンパク質、ミドカインのＣ末端ドメイン、ポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子及びエピレグリンからなる群から選ばれる。ある実施形態において、該リポカリンタンパク質はシデロカリンである。ある実施形態において、該結節ペプチドは少なくとも２つのジスルフィド結合を含む。
【００３１】
ここで述べられているペプチド（例えば、結節ペプチド）は種々のリポカリンタンパク質を用いて発現される。ここで用いられている用語「リポカリン」は、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｄａｒｒｅｎ  Ｒ．Ｆｌｏｗｅｒ，Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｃ．Ｔ．Ｎｏｒｔｈ，Ｔｅｒｅｓａ  Ｋ．Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２：５，７５３−７６１に定義されているタンパク質を意味している。リポカリンは、特に制限はないが、番号付きリポカリン（例えば、Ｌｃｎ２（ＮＧＡＬ、シデロカリン、２４ｐ３とも言う）など、チキンＥｘ−ＦＡＢＰやウズラＱ８６を含んでいる。
【００３２】
本開示の様々な様相において、シデロカリンは分泌パートナーとして用いられる。ここで用いられている用語「シデロカリン（ｓｉｄｅｒｏｃａｌｉｎ）」は小さなキレーターを結合することのできるリポカリンのことである。ある様相において、キレーターは天然のものであってもまたは設計されていてもよい。ある様相において、シデロカリンは、シデロホアや三価鉄シデロホア複合体に結合している。例えば、特に限定されないが、シデロカリンはシデロカリンまたはＥｘ−ＦＡＢＰである。ここで用いられている用語「シデロカリン（Ｓｉｄｅｒｏｃａｌｉｎ）」（固有名詞として）はヒト原型シデロカリンに関連するオルソロガスなタンパク質ファミリーのことである。
【００３３】
分泌パートナーとして用いられる場合、シデロカリンは細胞内ペプチド、タンパク質とペプチドドメインを含む種々のペプチド、タンパク質とタンパク質ドメインの分泌のために用いることができる。
【００３４】
シデロカリンは、より大きなタンパク質（成熟タンパク質は１７８のアミノ酸からなり２０５４７Ｄａの分子量を持つ）と比べサイズ的に小さいので、より大きなタンパク質のための融合パートナーとして有用である。また、シデロカリンのＣ８７Ｓ変異体は、二量化を防ぐことができ、純粋な単量体の融合タンパク質をもたらす（参照、Ｇｏｅｔｚ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．‘Ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ＮＧＡＬ  ｉｓ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｒｏｎ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  （２００２）１０：１０３３−４３）。シデロカリンにある分子内のジスルフィド単結合はその安定性を増す。また、シデロカリンは、分泌前にＥＲにおいて正しい処理を引き起こすＮ−結合グリコシル化部位を１つだけ持っている。ある様相において、ペプチドはマウスＳＣＮとの融合ペプチド（２４ｐ３としても知られている）として発現され得るが、この融合ペプチドは分泌パートナーとしても大変よく機能する。他のホモログもまた用いることができる。加えて、このペプチド（例えば、結節ペプチド）はまたＬｃｎ１、Ｌｃｎ６、Ｌｃｎ８、Ｌｃｎ９、Ｌｃｎ１０、Ｌｃｎ１２、Ｌｃｎ１５を含む他のリポカリンファミリーのメンバーとの融合系として発現され得る。ある実施形態において、該ペプチドはジスルフィド結節ペプチドを含んでいる。ある実施形態において、結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質、またはコノトキシンＣＶＩＣである。他の実施形態においてペプチドはノッチンを含む。ある実施形態において、リポカリンタンパク質はシデロカリンを含む。ある実施形態において、リポカリンタンパク質はシデロカリンである。ある実施形態において、リポカリンタンパク質はヒトシデロカリン、マウスシデロカリン、チキンＥｘ−ＦＡＢＰまたはウズラＱ８６である。
【００３５】
ある実施形態において、ＳＣＮとの融合体としてペプチド（例えば、結節ペプチド）の発現は、内因的なＳＣＮ開裂、すなわちＣＩＤＧ直後のＲＡＲＹＫＲと、外因的に開裂されたもの、すなわちその位置にあるＥＮＬＹＦＱとともに利用することができる。タンパク質輸送（例えば、フューリンによる）の際、前者は哺乳動物細胞により開裂され、遊離ＳＣＮと結節ペプチドは周辺の媒体に分泌され得る。ＥＮＬＹＦＱはタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）タンパク質分解酵素部位であるが、この部位は哺乳動物細胞内では内因的には見つけられない。後に外因的ＴＥＶタンパク質分解酵素を加えることによって結節ペプチドが開裂し除かれることができるように、このシステム内の構造体が融合体として分泌され得る。このことがノッチンの回復のために有用であり得る。ある実施形態において、ポリヒスチジンやポリアルギニンなどの精製「ハンドル」がＳＣＮに加えられ、その後タンパク質加水分解によって除かれ得る。結節ペプチドに加え、これらの融合システムはケモカイン、インターロイキン、ペプチドホルモンなどの難発現性の医療的に興味あるタンパク質にも利用することができる。
【００３６】
ある実施形態において、ペプチドは結節ペプチドを含んでいる。ある実施形態において、結節ペプチドはカイモトリプシン阻害因子、ヘフトキシン、気泡タンパク質、ミドカインのＣ末端ドメイン及びエピレグリンからなる群から選ばれる。ある実施形態において、リポカリンタンパク質はシデロカリンを含んでいる。
【００３７】
リポカリン融合体（例えば、結節ペプチドと融合されているシデロカリン及び／またはＬｃｎ２）はいくつかの異なる方法で用いることができる。その半減期を増加させるために、目的のタンパク質（例えば、治療剤として有望視されているもの）の大きさを増加させるのに利用することも可能である。細胞質の中で自然に発現される目的タンパク質をそこで分泌するのに利用することも可能である。ＳＣＮはまた特有の配位子特異性を持っており強固にカテコレートシデロホア（細菌性鉄キレーター）と結合する。それによって、有益な特性を持つ化学治療的または放射性の試薬やある種または化合物といった特異な配位子とのＳＣＮ融合体を負荷する可能性が開けた。シデロホアと鉄とともに導入された場合、ＳＣＮはクロマトグラフィーやその他の精製工程において補助となり得る深紅色を示す。
【００３８】
本開示のリポカリン融合体（例えば、ＨＯ−１と融合したＳＣＮ）は種々の方法で用いることができる。例えば、融合体は、その生体的半減期を増加させるために目的のタンパク質（例えば、治療剤として有望視されているもの）の大きさを増加させるのに利用することができる。融合体は、細胞質の中で自然に発現される目的タンパク質をそこで分泌するのに利用することができる。融合体は、治療効果を最大限に引き出すため、融合パートナータンパク質を特定の位置に狙い定めることにも用いられ得る。ＳＣＮはまた強固にカテコレートシデロホア（細菌性鉄キレーター）を結合するという特有の配位子特異性を持っており、また腎臓保護効果も持っている。ＨＯ−１のような他の腎臓保護剤とＳＣＮとの組み合わせによって相乗的な機能的効果を生み出すことも可能である。このことによっても、放射性金属原子（例えば、５５ＦｅまたはＴｈ）などの特別な配位子とのＳＣＮ融合体を負荷する可能性が開け生体内追跡や特定の細胞毒性活動が可能となる。いくつかのその他の利点に加え、リポカリン融合システムは比較的短い時間枠で大量のタンパク質の製造に用いることができる。いくつかの実施形態において、得られるペプチド量は約１０ｍｇ／Ｌ未満、約２０ｍｇ／Ｌ未満、約４０ｍｇ／Ｌ未満、約５０ｍｇ／Ｌ未満、約１００ｍｇ／Ｌ未満、約１５０ｍｇ／Ｌ未満、約１８０ｍｇ／Ｌ未満、または約２００ｍｇ／Ｌ未満であり得る。いくつかの実施形態において、得られるペプチド量は約１０ｍｇ／Ｌと２００ｍｇ／Ｌの間、約５０ｍｇ／Ｌと２００ｍｇ／Ｌの間、約１００ｍｇ／Ｌと２００ｍｇ／Ｌの間、及び約１５０ｍｇ／Ｌと２００ｍｇ／Ｌの間である。いくつかの実施形態において、ペプチドは約５００ｍｇ／リットル未満、約４００ｍｇ／リットル未満、約３００ｍｇ／リットル未満、約２００ｍｇ／リットル未満、約１００ｍｇ／リットル未満、または約５０ｍｇ／リットル未満の濃度で作られる。
【００３９】
他の実施形態において、ここで述べられているペプチドのいくつかは文献で知られている様々な方法で発現され得る。例えば、該ペプチドは大腸菌、コリネバクテリウムや蛍光菌などを含む細菌系の中で発現される。大腸菌用の発現の場は周辺質発現または細胞質発言を含むことができる。周辺質の発現のためには、融合体はｐｅIＢ、ｄｓｂＡ、とＥｘＦＡＢＰ融合体を含むことができる。ペプチドは昆虫細胞系や哺乳動物系を含む真核生物系でも発現され得る。
【００４０】
いくつかの様相において、ここに開示されているペプチドは、外来ＤＮＡを真核生物細胞の核へ導入する工程を含んでいる技術である形質移入によって導入され得る。いくつかの様相において、ペプチドは一過性形質移入（ＤＮＡは真核生物細胞のゲノムと一体化しないが、遺伝子は、２４〜９６時間の間発現される）によって合成され得る。外来ＤＮＡをホスト細胞に導入するため種々の方法を採用することができ、また形質移入はリン酸カルシウムによるなどの化学作用に基づく手段、デンドリマーによって、リポソームによって、あるいは陽イオン性ポリマーの使用によって達成することができる。化学作用によらない形質移入方法としては、電気穿孔法、音響穿孔法、光学的形質移入、原形形質融合、インペールフェクションや流体力学的デリバリーがある。いくつかの実施形態において、形質移入は、ＤＮＡを不活性固体のナノ粒子と組み合わせその後直接標的細胞の核に「打ち込む」遺伝子銃などを含む、粒子に基づく方法によって達成することができる。他の粒子に基づく方法としては磁石補助による形質移入やインペールフェクションがある。
【００４１】
ＤＮＡはまたキャリアーとしてウイルスを用いて（ウイルス変換）レトロウイルスまたはレントウイルスを用いて細胞に導入することもできる。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドはダイダロス発現システムを用いて準備され得る。Ａｓｈｏｋ  Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；３９（２１）：ｅ１４３、これはその全体が本明細書に参考により組み込まれる。この技術は、無血清の哺乳動物培養システムと結び付けてもよい。また、直接媒体からの一回のサイズ除外工程で精製できるタグなしタンパク質を発現することもできる。
【００４２】
ある様相において、本発明は、高いレベルで数百から数千以上のペプチド変異体を作る方法を提供する。従来の結節ペプチドを作る方法は、結節ペプチドの活動がペプチドの適切な折り畳みに依存し得るという点で限界があり得る。製造過程を通じて、適切に折り畳んだ結節ペプチドを作るのに成功するにはこれまで限界があった。本発明はこれらの問題をこの分野で知られている他の技術によって解決する。図２は本発明のペプチドライブラリー製造方法の一例を示す。示されているように、ウイルスは特定のオリゴヌクレオチド配列を詰め、該配列をウイルスに転写し、ペプチドを発現させるとことにより作られ得る。ペプチドが回収され増加され得、そののち、サンプルが精製され分析され得る。この工程は効率的に（例えば、３週間で）に行われ得、大量（例えば、２００ｍｇ／リットル）のペプチドが作られ得る。いくつかの例では、ここで述べられている方法による製造の純度故、クロマトグラフによる精製は、必ずしも必要ではない。
【００４３】
一つの実施形態の例において、本発明は開裂可能なリンカーを通してシデロカリンに融合された結節ペプチドの融合タンパク質を含んでいる。図３は、結節ペプチドライブラリーを作るために用いられ得る融合システムの一例を示している。示されているように、融合システムは、ＩｇＫ  ＳＰ、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳ、シデロカリン、ＴＥＶ、と興味対象の結節ペプチド配列を含む配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、これらの融合体はダイダロス発現システムと結ぶことができる。Ａｓｈｏｋ  Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；３９（２１）：ｅ１４３、これはその全体が本明細書に参考により組み込まれる。レントウイルスは、ヒト腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３細胞内で、迅速かつ安定した発現を引き起こすのに用いることができる。シデロカリンはこのシステムで高度に発現され得、例えば、結節ペプチドも同様に発現されるのを手助けする。開裂可能なリンカーの特性により、外因的に加えられたタンパク質分解酵素を通して、タンパク質が発現されているのに合わせまたはその後、融合体は開裂されてもよい。シデロカリン融合パートナーは、例えば、難発現性タンパク質のための一般化可能な発現強化システムであり得また、より小さなタンパク質の大きさを増強するため及び／または（例えば、最終的に得られる融合タンパク質の大きさを糸球体濾過限度超に増強することによってペプチドの血清半減期を改善するためにタグとして用いることができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる。ある実施形態において、融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＰ−ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、ペプチドは結節ペプチドである。
【００４４】
ＨＥＫ２９３細胞は強固で一般的なタンパク質発現に用いられるが、レントウイルスは幅広い様々な細胞に感染し得る。このこととタンパク質が発現される際に該タンパク質を開裂させるシステムとを組み合わせることによって、自己分泌または傍分泌の仕方で（すなわち、ペプチドが該ペプチドを分泌している細胞上で、または近接する細胞上で作用する）分泌されたペプチドに依存する一連の強力な分析を行うことを可能にする。これの一例としては、標的の癌細胞を、ペプチドを発現しているレントウイルスライブラリーに感染させ、そののちその細胞のうち細胞自滅（例えば、アネキシンＶ発現）のサインを示す細胞を流動細胞分析法により選択することであろう。アポトーシスストレスの兆候を示す細胞を選別することができ、ウイルスは本質的に自己分泌様式でアポトーシスを誘導したペプチドを発現した細胞を探し、配列決定した。一連の関連する選択は拡散を律速する基質（例えば、軟寒天培地）で行うこともあり得るが、この基質内で、ペプチドを発現する細胞は標的の細胞と混合され寒天はペプチドの拡散を制限した。標的細胞の死滅のエリアは活発な分泌ペプチドを示すものであるだろう。このように実行される振い分けは非常に大きいライブラリーを使用することもあり得る、というのも逆重畳は、ペプチドを発現させる遺伝子を配列するのと同じように容易だからであろう。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、従来の結合スクリーン（例えば、その中で標的分子がカラムやビーズに繋ぎ止められ、薬剤候補はその標的との親和性によって識別できるようなスクリーン）を利用できるようにするためノッチンタンパク質が哺乳動物細胞の表面に繋ぎ止められたまま残り得るようにノッチンを製造する方法を含んでいてもよい。他の知られている方法（例えば、ファージや酵母菌表示）とは対照的に、ここで述べられている方法は、上記の「ルール」（例えば、ペプチド中の酸性／塩基性アミノ酸の比）に従い設計され、また生体内で薬剤発見の工程を通して確立された、及び／またはすでに事前に特定の生物物理的、薬理的性質を選択されたペプチドライブラリーを発現するため、融合システム（例えば、本発明のシデロカリンシステム）を採用している。該方法において、例えば、全てのＤＮＡ配列やタンパク質製品は、すでに知られておりすでに有効とされている（例えば、ペプチドは全て適切に折り重なり血清の半減期を改善している）。本発明の方法は、他の既知の表示技術と正反対であるが、この既知の表示技術において、表示されたタンパク質は知られておらずまた事前に有効性が確認されておらず、むしろその配列は順不同で（変異原性オリゴヌクレオチドと縮重ＮＮＮコドンを用いている）非常に大きなサイズの（一般に、１０７を超える）ライブラリーを産し、多くのタンパク質が有害な転換により適切に折り重なっていない。
結節ペプチドと関連する組成物の製造方法
【００４６】
本開示の融合システムは種々の様相においてペプチド、ノッチンと細胞質分泌タンパク質のために用いることができる。いくつかの様相において、ここで述べられている方法と組成物は標的タンパク質及び／またはペプチドとリポカリンの融合を含み、それによってリポカリンは細胞によって標的タンパク質の発現及び分泌を促す。例えば、リポカリンは、８鎖のベーターバレル構造と側面にあるアルファへリックスによって特徴づけられる保存折り畳み構造を持ち多用途のスカフォールドをサポートする。いくつかの様相において、リポカリン融合タンパク質システムは、リポカリン融合タンパク質を用いないシステムと比べ、哺乳動物細胞の中でより多く融合タンパク質の発現をもたらす。例えば、リポカリン融合タンパク質システムは、リポカリン融合タンパク質を欠くシステムに比べ、哺乳動物細胞の中で０．５倍未満、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍の融合タンパク質の発現をもたらす。
【００４７】
いくつかの様相において、リポカリン（例えば、ＳＣＮ）は、免疫原として興味あるタンパク質またはペプチドを安定化するために融合パートナーとして用いることができる。様相において、リポカリン配列が派生する種は受容種とは異なる。いくつかの様相において、リポカリン配列が派生する種は、受容種と同じである。
【００４８】
分泌パートナーとして用いられるとき、ＳＣＮと、関連するタンパク質は分泌タンパク質とペプチドの製造を有利に改善する。更に、ＳＣＮと、関連するタンパク質は有利に小さくそれによって生物学的利用能が改善する。例えば、成熟タンパク質は１７８のアミノ酸からなり２０５４７Ｄａの分子量を持っている。ＳＣＮは分子内のジスルフィド単結合を持っている、この結合はその安定性を増加させ、また１つのＮ−結合グリコシル化部位を持っている。
【００４９】
いくつかの様相において、リポカリン２（ＳＣＮ）の天然の配列中のアミノ酸の少なくとも１つは非天然アミノ酸に置き換えることができる。いくつかの様相において、突然変異が引き起こされＳＣＮが二量化することを防止することができる。例えば、システイン残基で１つのＳＣＮタンパク質が他のＳＣＮタンパク質と二量化することができる、またはシステイン残基で１つのＳＣＮタンパク質が異なるタンパク質と二量化することができる。例えば、ＳＣＮ中でＣ８７Ｓ突然変異を起こすことでシステイン残基での二量化が防止できる（参照、Ｇｏｅｔｚ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，‘Ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ＮＧＡＬ  ｉｓ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｒｏｎ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００２）１０：１０３３−４３）。
【００５０】
いくつかの様相において、ヒトＳＣＮにオルソロガスな非ヒトリポカリンタンパク質の天然配列中のアミノ酸の少なくとも１つは非天然アミノ酸に置き換えることができる。例えば、ここで述べる方法や組成物とともに用いられ得るヒトリポカリンタンパク質の非ヒトオルソログは、特に制限はされないが、マウスＬｃｎ２（例えば、２４ｐ３）、Ｌｃｎ１、Ｌｃｎ６、Ｌｃｎ８、Ｌｃｎ９、Ｌｃｎ１０、Ｌｃｎ１２とＬｃｎ１５（図１４参照）である。いくつかの様相において、突然変異が引き起こされヒトＳＣＮにオルソロガスな非ヒトリポカリンタンパク質が二量化することを防止することができる。例えば、ヒトＳＣＮタンパク質にオルソロガスな１つの非ヒトリポカリンタンパク質はヒトＳＣＮタンパク質にオルソロガスな他非ヒトリポカリンタンパク質とシステイン残基において二量化し得る、またはヒトＳＣＮタンパク質にオルソロガスな１つの非ヒトリポカリンタンパク質は異なるタンパク質とシステイン残基において二量化し得る。例えば、ヒトリポカリンタンパク質中のＣ８７Ｓ変種にオルソロガスなサイトで突然変異が起こることによってシステイン残基における二量化は防止できる（参照、Ｇｏｅｔｚ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，‘Ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ＮＧＡＬ  ｉｓ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｒｏｎ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００２）１０：１０３３−４３）。
【００５１】
典型的な様相において、リポカリン融合タンパク質は次のようなタンパク質配列を持っていてもよい。
MPLGLLWLGLALLGALHAQAQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
この配列において、注記はシグナルペプチド、グリコシル化サイト、ジスルフィド結合、とＣ８７Ｓ変種を示す。
【００５２】
いくつかの様相において、リポカリンと興味対象のタンパク質またはペプチドとの融合は標的タンパク質の生物学的性質を改善することができる（例えば、治療的可能性）。例えば、リポカリンと興味対象のタンパク質またはペプチドとの融合は、タンパク質全体の大きさを増大させることによって興味対象のタンパク質またはペプチドの半減期を増加させることができる。例えば、大きさの増大したタンパク質は興味対象のタンパク質またはペプチドの糸球体濾過を防止できる。いくつかの様相において、抗体断片といった小タンパク質の融合は糸球体濾過の減少を示す。これらの効果は酵素とＦａｂ抗体断片により観察できる。いくつかの実施形態において、融合タンパクは更に、ＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳ、シデロカリン、ＴＥＶと興味対象の結節ペプチド配列からなる群から選ばれるペプチドを含んでいる。ある実施形態において、融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、結節ペプチドは少なくとも２つのジスルフィド合を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる。ある実施形態において、融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、各サブユニットの隣接するサブユニットとの直接融合によって製造される。ある実施形態において、組成物は更に、ペプチドまたはタンパク質ドメインとリポカリンタンパク質との間にリンカー配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ペプチドは結節ペプチドを含んでいる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は更に、ＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる。ある実施形態において、融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる。別の実施形態において、ペプチドは結節ペプチドを含んでいる。
【００５５】
いくつかの様相において、興味対象のタンパク質またはペプチドのリポカリンとの融合は製造後その興味対象のタンパク質またはペプチドの精製を促進することができる。例えば、リポカリンと融合された興味対象のタンパク質またはペプチドはタンパク質発現システム（例えば、融合タンパク質発現システム）から作り出すことができる。例えば、興味対象のタンパク質またはペプチドがリポカリンと融合されていない場合、興味対象のタンパク質またはペプチドは、製造中に細胞の区画の中に保たれたままになってしまうことがある。
【００５６】
いくつかの様相において、ＳＣＮは、生体内で治療法融合パートナーの基として融合パートナーに与えられる生体内保護の性質を持っている。いくつかの様相において、これらの治療法は、誘発された融合パートナーへの免疫応答に集中するためにリポカリン配列を提供する種を受容種のものとマッチングさせながら、免疫原としての利用のため安定化させることができる。ＳＣＮはまた特有の配位子特異性も持っており強固にシデロホア（第三価鉄キレーター）と結合する。
【００５７】
ここで述べられている方法と組成物は、ＳＣＮとＳＣＮ配位子と組み合わされた興味対象のタンパク質またはペプチドの融合タンパク質を含んでいる。いくつかの様相において、ＳＣＮに対する配位子は、特に制限はないが、シデロホアまたは有機化金属を含んでいてもよい。いくつかの様相において、ＳＣＮ配位子を含む融合タンパク質はフルオロホアと組み合わせてもよい。例えば、その組み合わせは、共有結合によってなされてもよい。いくつかの様相において、ＳＣＮ配位子を含む融合タンパク質は蛍光シデロホアと組み合わせてもよい。いくつかの様相において、蛍光シデロホアは金属複合体も含んでいてもよい。
【００５８】
いくつかの様相において、融合タンパク質へのＳＣＮ配位子の付加は、融合タンパク質の標的タンパク質または標的ペプチドを検出するか局在化するのに採用できるであろう。例えば、検出と局在化は生体外か生体内で行うことができるであろう。いくつかの様相において、融合タンパク質へのＳＣＮ配位子の付加は、混合体から融合タンパク質を精製するのに採用することができよう。例えば、ＳＣＮ配位子（例えば、シデロホア／金属複合体）は、特に制限はないが、アルミニウム、ガドリニウム、インジウム、バナジウム、プルトニウム、や他の全ての関連する同位体以外の１つの浄化樹脂金属に接触させることができよう。
【００５９】
いくつかの様相において、融合タンパク質へのＳＣＮ配位子の付加は、核種を標的組織へ配送するため採用することができるであろう。いくつかの様相において、融合タンパク質へのＳＣＮ配位子の付加は、鉄を標的へ配送するため採用することができるであろう。加えて、シデロホアと鉄に結合されたＳＣＮは深紅色をしていてもよい。例えば、深紅色は、クロマトグラフの方法や組成物または精製方法のその他の工程と組み合わせることができる。
【００６０】
典型的な様相において、融合タンパク質を製造するため自己開裂ＳＣＮアイソフォームを興味対象のペプチドまたはタンパク質に添加することができる。例えば、自己開裂ＳＣＮアイソフォームはＣＩＤＧアミノ酸配列に直ちに続くＲＡＲＹＫＲアミノ酸配列を含んでいてもよい。この場合、ＲＡＲＹＫＲアミノ酸配列は、融合タンパク質を送出する間に、内因的酵素によってタンパク質発現システムの細胞（例えば、哺乳動物細胞）へ付着させられ得る。例えば、フューリンは、ＲＡＲＹＫＲアミノ酸配列を開裂することができる。この場合、ＳＣＮと興味対象のペプチドまたはタンパク質は遊離し細胞外スペースにあり得る。
【００６１】
典型的な様相において、融合タンパク質を作り出すため、外因的に開裂されたＳＣＮアイソフォームは興味対象のペプチドまたはタンパク質に加えてもよい。例えば、外因的に開裂されたＳＣＮアイソフォームはＣＩＤＧアミノ酸配列に直ちに続くＥＮＬＹＦＱアミノ酸配列を含んでいてもよい。この場合、ＥＮＬＹＦＱアミノ酸配列は、融合タンパク質を送出する間または後に、外因的酵素によってタンパク質発現システムの細胞（例えば、哺乳動物細胞）へ付着させられ得る。例えば、タバコエッチタンパク質分解酵素は、ＥＮＬＹＦＱサイトを開裂することができる。
【００６２】
いくつかの様相において、融合タンパク質は、融合タンパク質としてタンパク質発現システムの細胞（例えば、哺乳動物細胞）から分泌され得る。この場合、興味対象のペプチドまたはタンパク質はＴＥＶタンパク質分解酵素によってＳＣＮタンパク質から開裂される。例えば、ＴＥＶタンパク質分解酵素は、タンパク質発現システムの細胞（例えば、哺乳動物細胞）に加えられるかまたは細胞から融合タンパク質を除いた後に加えられ得る。
【００６３】
いくつかの様相において、ＳＣＮペプチドは変性され精製または分離のため化合物を含有することができる。いくつかの様相において、該化合物は、１つのアミノ酸または２つ以上のアミノ酸である。例えば、該化合物はポリヒスチジンまたはポリアルギニンであり得、融合タンパク質の中のＬｃｎ２とシグナルペプチドの間に位置し得る。いくつかの様相において、該化合物は酵素またはタンパク質分解酵素を用いてＬｃｎ２から除かれ得る。
【００６４】
本発明はペプチドライブラリーを含んでいる組成物に関し、該ペプチドライブラリーは更に少なくとも１つの天然リジン残基を欠いている複数のペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、ペプチドはアダプター分子と結合されている。ある実施形態において、アダプター分子はペプチドである。いくつかの実施形態において、該ペプチドは質量分析法によって測定される特異なサインを持っている。
【００６５】
適用法
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、治療的及び／または診断的用途などその他の種々の用途に適用できる。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、病気治療方法に用いることができる。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、例えば、被験体の脳にある腫瘍に薬剤を届けるために用いることができる。
【００６６】
本発明は、またここで述べられている融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を服用するための組成物を、診断的及び／または治療的応用を促進するため被験体に提供する。
【００６７】
ある実施形態において、組成物は医薬的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。本発明において有用な医薬賦形剤は、結合剤、フィラー、崩壊剤、滑剤、コーティング、甘味剤、香料、顔料、などであるが、これらに限定されない。当業者であれば他の医薬賦形剤が本発明において有用であることを認識するであろう。ここで用いられている用語「医薬組成物」は、例えば、錠剤、カプセル、ピル、などの固体及び／または液体剤形を含んでいる。
【００６８】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、例えば組成物として当分野であらゆる適切な利用可能な技術によって投与することができる。例えば、これらは、時間ごと、日ごと、週ごと、または月ごとのように必要に応じた頻度で投与することができる。該融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、本発明の方法において利用され得、例えば、採用される方法の要求に基づいて様々に異なり得る適用量で投与され得る。ここで述べられている融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、非経口的、皮下的に、静脈内に、気管に、鼻腔内に、皮内に、筋肉内に、結腸内に、直腸に、尿道に、腹腔内に、などの様々な仕方で被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または経口で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は全身的に投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、被験体のリンパ球への送り出しなど、腫瘍内及び／またはこぶ内に投与され得る。ある実施形態において、投与は、経口投与、直腸投与や胃瘻管または十二指腸栄養管による投与などの経腸投与を含むことができる。投与は又静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、脳内、側脳内または皮下（皮膚下）投与も含む。いくつかの実施形態において、経皮（皮膚への塗布）や吸引を含む局所的手段によって投与することができる。
【００６９】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を含む経口剤は、液体、錠剤、カプセル、等の経口投与に適したどのような形状であってもよい。経口製剤は更に、胃での溶解を防いだり減じたりするためコーティングや他の処理がなされてもよい。本発明の組成物は、当分野で既知の適切な方法によって、被験体に投与することができる。本発明における使用のための適切な製剤やデリバリー方法は当分野で一般的によく知られている。例えば、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、医薬組成物として医薬的に許容されている希釈剤、キャリアー、賦形剤などとともに処方される。該組成物は、生理学的状態に近づけるため必要とされる、ｐＨ調節緩衝剤、等張化剤、湿潤剤といった医薬的に許容されている補助物質を含んでいてもよい。具体的には、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、等である。
【００７０】
ここで用いられている「被験体」とはヒトまたは非ヒト動物である。いくつかの実施形態において、被験体はマウス、ラット、ウサギ、ヒトや他の動物であるが、これらに限定されない。他の実施形態において、被験体は、癌を持っているまたは癌を持つ危険があるヒトのようなヒトである。ある実施形態において、被験体または生物源は、悪性の疾病、障害や状態（例えば、癌）などの疾病、障害や状態であるかあるいは危険があると思われる。ある実施形態において、被験体または生物源は、過剰増殖性疾患（例えば、癌、肉腫）などの疾病、障害や状態であるかあるいは危険があると思われる、また本開示のある実施形態において、被験体または生物源はそのような疾病、障害や状態を逃れているかあるいは抱えていると分かっているものであり得る。
【００７１】
「処置」「処置する」や「改善する」は、治療的処置または予防的／防止的処置を意味する。処置は、個々に受ける処置において疾病の少なくとも一症状（例えば、癌のような、過剰増殖性障害）が改善する、または処置が個体において進行性疾病の悪化を遅らせることができる、または伴う関連疾患（例えば、癌の転移）の発病を防止できる場合、治療的である。
【００７２】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を含んでいる組成物の「治療効果のある量（服用量）」または「効果のある量（投与量）」とは、１つ以上の疾患症状が統計上有意な改善結果につながる十分な化合物量を表す。個々に活性な成分に関しては、それのみで服用された場合、治療効果のある用量はその成分（例えば、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体）のみの服用量のことである。組み合わせの場合は、治療効果のある用量は、順次あるいは同時服用（同じ製剤か異なる製剤か）にかかわらず、治療効果の見られた活性成分の組み合わせの量のことである。
【００７３】
用語「医薬的に許容されている」は、当分野でよく知られている経路に従って被験者に投与された場合、アレルギー反応または他の深刻な副作用を引き起こさない分子実体や組成物を意味する。
【００７４】
用語「必要としている患者」あるいは「必要としている被験者」は、疾病、傷害、または状態（例えば、癌）の危険があるまたは患っている、ここに述べられている本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体によって治療または改善できる余地のある患者または被験者を言う。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は更に、治療を促進する他の薬剤を含んでいてもよい。例えば、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は更に、細胞毒性薬（例えば、融資分裂阻害因子）、毒物、アンチセンスヌクレオチド、癌治療薬（例えば、アルキル化剤）、ヌクレオチド薬剤、代謝抵抗物質、代謝調節剤、放射線増感剤、ペプチド治療薬、ペプチド−薬剤結合体、放射性核種、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【００７６】
細胞毒性薬は、例えば、細胞増殖を阻止することによって癌を治療することに用いられる薬剤を含んでいる。細胞毒性薬としては、例えば、ビンカアルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン、エポチロンがあり得る。これらの分類の中には、例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノブテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、ミトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド；エトポシド、エトポシドリン酸またはテニポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクラスチン、ロイロシダイン、ビンデシン、ロイロシン、パクリタクセル等のポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体；及びこれらの治療的に効果的な類似体と誘導体がある。その他の有用な抗腫瘍薬は、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ゲムシチビン、イホスファミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキセート、トリメトレキセート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、アラ‐Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、インターロイキンなどがある。
【００７７】
適切な代謝調節剤は、ノニダミン、ジクロロ酢酸、α−トコフェリルコハク酸、メチルジャスモン酸、ベツリン酸、レスベラトロール等であってもよいが、これらに限定されない。
【００７８】
放射線増感剤は、電磁波（例えば、ｘ−線）照射の有害な効果に対する癌性細胞の感受性を増強させることで知られている。ｘ−線活性放射線増感剤としては、メトロニダゾール、ミソニダゾール、脱メチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、ミトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチン酸アミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−イオドデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦｕｄＲ）、ハイドロキシウレア、シスプラチン及びこれらの治療的に効果的な類似体と誘導体が例示されるが、これらに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、放射性核種を及び／または複合化された放射性核種を含んでいてもよい。適切な放射性核種はＳｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３、Ａｃ−２２５、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２やＲａ−２２３であり得るが、これらに限定されない。
【００８０】
ある実施形態において、本発明は、グリオ腫、星状細胞腫  髄芽腫、脈絡叢細胞腫、上衣腫、その他の脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、細胞腫、黒色腫、卵巣癌、子宮頚部癌、リンパ腫、甲状腺癌、肛門癌、大腸癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、喉頭癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、胃癌、精巣腫瘍、ウィルムス腫瘍のような疾病、傷害及び／または状態を治療することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、グリオ腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、前立腺癌、膵臓癌、やこれらの組み合わせなどの疾病、傷害及び／または状態を治療することを含んでいてもよい。ある実施形態において、本方法は、乳癌、大腸、皮膚、肺、リンパ腫、グリオ腫、髄芽腫、前立腺、膵臓癌、口腔扁平上皮癌及び／または血管外皮細胞腫を治療するため採用できる。
【００８１】
本発明は、更に本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を投与する方法を含んでいる。例えば、一つの様相において、本発明は、正常組織の中の標的腫瘍を選択的に狙うことができるように効果的な服用量の本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体、または本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を含む組成物を、腫瘍を持つ被験者に投与する工程を含んでいる。
【００８２】
該方法は更に被験者の癌組織（例えば、腫瘍）の切除を促進することも含んでいてもよい。例えば、本発明は、正常組織の中の標的癌組織（例えば、腫瘍組織）を選択的に狙うことができるように、効果的な服用量の本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体、または本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を含む組成物を癌組織（例えば、腫瘍）を持つ被験者に投与することを含んでいてもよい。該方法は、例えば、ペプチドの高められた結合を示す組織を検出することにより癌組織を描きそれによって癌組織の位置を示すことを含んでいてもよい。位置の特定は被験者から癌組織を切除する工程を提供することができる。切除は、例えば、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体の結合により特定できた癌組織を手術中可視化することを含んでいてもよい。
【００８３】
本発明はまた、診断及び／または治療的適用を促進するため、被験者に本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体の投与用の組成物を提供する。ある実施形態において、該組成物は医薬的に許容されている賦形剤を含んでいてもよい。本発明において有用な医薬賦形剤は、結合剤、フィラー、崩壊剤、滑剤、コーティング、甘味剤、香料、顔料、などであるが、これらに限定されない。当業者であれば他の医薬賦形剤が本発明において有用であることを認識するであろう。ここで用いられている用語「医薬組成物」は、例えば、錠剤、カプセル、ピル、などの固体及び／または液体剤形を含んでいる。
【００８４】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、時間ごと、日ごと、週ごと、または月ごとのように必要に応じた頻度で投与することができる。本発明の方法において利用される本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、例えば、採用される方法の要求に基づいて様々に異なり得る適用量で投与され得る。本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、非経口的、皮下的に、静脈内に、気管に、鼻腔内に、皮内に、筋肉内に、結腸内に、直腸に、尿道に、腹腔内に、などの様々な仕方で被験者に投与され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または経口で投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、被験体のリンパ球への送り出しなど、腫瘍内及び／またはこぶ内に投与され得る。ある実施形態において、投与は、経口投与、直腸投与や胃瘻管または十二指腸栄養管による投与などの経腸投与を含み得る。投与は又静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、脳内、側脳内または皮下（皮膚下）投与も含み得る。
【００８５】
ここで述べられているペプチドまたは融合タンパク質を含む経口剤は、液体、錠剤、カプセル、等の経口投与に適したどのような形状であってもよい。経口製剤は更に、胃での溶解を防いだり減じたりするためコーティングや他の処理がなされてもよい。本発明の組成物は、当分野で既知の適当な方法によって、被験体に投与することができる。本発明における使用のための適切な製剤やデリバリー方法は当分野で一般的によく知られている。例えば、ここで述べられているペプチドまたは融合タンパク質は、医薬組成物として医薬的に許容されている希釈剤、キャリアー、賦形剤などとともに処方され得る。該組成物は、生理学的状態に近づけるため必要とされる、ｐＨ調節緩衝剤、等張化剤、湿潤剤といった医薬的に許容されている補助物質を含んでいてもよい。具体的には、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、等である。
【００８６】
本発明は、更に、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体の機能的分析も含んでいる。本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体の腫瘍や癌組織に結合する可能性は、上述しているように、当分野で知られている生体外結合、生体内イメージ、動物モデル、その他の分析法により分析することができる。腫瘍や癌組織への結合を検出したり測定したりする機能分析の説明については、例えば、双方とも本明細書に参考により組み込まれる、ＵＳ２００８０２７９７８０やＷＯ２０１１／１４２８５８号を参照のこと。
【００８７】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体の生体内での活動測定に有用な動物モデルに関しては、当業者によく知られている。例えば、米国国立癌研究所は特定の癌モデルのデータベースを保存している。米国国立癌研究所ウエブサイト上の癌モデルデータベースを参照のこと。全ての動物は、米国国立衛生研究所の実験動物施設管理ガイドの厳しい規定に従って取り扱われている。ＮＤ２：ＳｍｏＡｌ随芽細胞腫のマウス、ＴＲＡＭＰ前立腺癌のマウス、及びＡｐｃ１６３８Ｎ腸線、腸管腺癌のマウスはこれまでに報告されている。各々その全体が本明細書に参考により明確に組み込まれる、Ｆｏｄｄｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ａｐｃ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４．９１（１９）：ｐ．  ８９６９−７３；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９５．９２（８）：ｐ．３４３９−４３；Ｋａｐｌａｎ−Ｌｅｆｋｏ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２００３．５５（３）：ｐ．２１９−３７；Ｈａｌｌａｈａｎ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＳｍｏＡ１  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００４．６４（２１）：ｐ．７７９４−８００を参照のこと。
【００８８】
ここで述べられている方法やシステムによって作られ製造された融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は様々な用途に採用され得る。例えば、タンパク質及びペプチドは治療的及び／または診断的目的で用いることができる。使用例としては、限定されないが、例えば、生体イメージング用に融合タンパク質またはペプチドを放射性ラベル及び／または蛍光分子に結合させる、ペプチドを細胞毒性薬に結び付ける、生化学的分析や獣医学的目的、殺虫剤、抗生物質、除草剤、不凍液組成物や抗毒素のためペプチドを生体外診断用に用いるなどの用途がある。
【００８９】
当業者によって十分に理解される通り、ここで述べられている融合タンパク質やペプチドは、広い範囲の標的（例えば、治療的標的）用に適合させることができる。いくつかの実施形態において、標的は種々の疾病や障害と関連している。標的は、特に限定されないが、例えば、グリピカン−２（ＧＰＣ２）、プロトカデヘリン（１α（ＰＣＤＨＡ１）、Ｃａｖ２．２、Ｋｖ１．３、Ｎａｖ１．２、ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８、ＣＩＣ−３、ｎＡＣｈＲ、ＮＭＤＡ−Ｒ、ＮＰＲＡ、ＧＬＰ−１Ｒ、α１Ｂ−ＡＲ、ＮＴ−Ｒ−１、ＡＣＥ、ＮＥＴｍＴｏｒ、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、Ｏｒａｉ１、ＣＤ４７、Ｒａｆ、ＮＦκＢ、ブロモドメイン、ＨＡＴＳ、ＨＤＡＣ、ＬＤＨ、ＩＤＨ２、ＣＤ２２、ＭＩＣ、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、ＰＨＦ５Ａ、ＢＵＢ１Ｂ、Ｂｃｌ−２、ｋ−Ｒａｓ、Ｎｏｔｃｈ１、ｐ５３、α５β３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８及び／またはＭｃｌ−１であり得る。
【００９０】
本発明は、更に、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体の被験者への投与用の組成物を提供し、診断及び／または治療的応用を促進する。ある実施形態において、組成物は医薬的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。本発明において有用な医薬賦形剤は、結合剤、フィラー、崩壊剤、滑剤、コーティング、甘味剤、香料、顔料、などであるが、これらに限定されない。当業者であれば他の医薬賦形剤が本発明において有用であることを認識するであろう。ここで用いられている用語「医薬組成物」は、例えば、錠剤、カプセル、ピル、などの固体及び／または液体剤形を含んでいる。
【００９１】
本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、時間ごと、日ごと、週ごと、または月ごとのように必要に応じた頻度で投与することができる。本発明の方法において利用される、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、例えば、採用される方法の要求に基づいて様々に異なり得る適用量で投与され得る。本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、非経口的、皮下的に、静脈内に、気管に、鼻腔内に、皮内に、筋肉内に、結腸内に、直腸に、尿道に、腹腔内に、などの様々な仕方で被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または経口で投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は全身的に投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、被験体のリンパ球への送り出しなど、腫瘍内及び／またはこぶ内に投与され得る。ある実施形態において、投与は、経口投与、直腸投与や胃瘻管または十二指腸栄養管による投与などの経腸投与を含むことができる。投与はまた、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、脳内、側脳内または皮下（皮膚下）投与も含むことができる。いくつかの実施形態において、経皮（皮膚への塗布）や吸引を含む局所的手段によって投与することができる。
【００９２】
ここで述べられている本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体を含む経口剤は、液体、錠剤、カプセル、等の経口投与に適したどのような形状であってもよい。経口製剤は更に、胃での溶解を防いだり減じたりするためコーティングや他の処理がなされてもよい。本発明の組成物は、当分野で既知の適当な方法によって、被験体に投与することができる。本発明における使用のための適切な製剤やデリバリー方法は当分野で一般的によく知られている。例えば、本開示の融合タンパク質、ペプチド、またはその結合体は、医薬組成物として医薬的に許容されている希釈剤、キャリアー、賦形剤などとともに処方され得る。該組成物は、生理学的状態に近づけるため必要とされる、ｐＨ調節緩衝剤、等張化剤、湿潤剤といった医薬的に許容されている補助物質を含んでいてもよい。具体的には、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、等である。
【実施例】
【００９３】
実施例１：ノッチン生成用ペプチド構造発現
本実施例では、培養によるペプチド構造の発現方法更に、特に薬剤として、それらの開発を大いに促進する方法を説明する。
【００９４】
図５に示されているように、種々のノッチンが、レンチウイルス発現に基づく方法により発現する。この方法は、例えば、詰めこみ、転移、発現とそれに続く発現したノッチンペプチドの分離及び／または精製を含んでいる。いくつかの暗号化構造が用いられ得る。この実施例では、ノッチンペプチドのコード化はＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ノッチンを含むポリヌクレオチド構造を含んでいた。いくつかの構造例の具体的な配列は、以下の[配列］に示されている。図６は、図５で示されている方法によって作られたノッチンの実例のゲルデータを示している。示されているように、カイモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、エピレグリン（ＥＰＩ）、ヘフトキシン（ＨＴＸ）、気泡タンパク質（ＢＵＢ）及びポテトカルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＣＩ）は適切に折り畳まれていた。
【００９５】
図９は、ノッチンのプールされたライブラリー製造を概略的に説明している。この実施例において、数千のノッチン配列がオリゴヌクレオチドプールに符号化され得（１）特異なプライマーペアを用いて選択的に増幅され得る（２）。ＤＮＡサブライブラリーは発現ベクターの中にクローン化され得、それが、例えば、質量分光分析などの現在の技術を用いて解像可能であり得る特異な親の質量サインや特異なトリプシン断片質量サインを持つことができるノッチン変異体になる。
【００９６】
図８は、クローン化されたノッチンライブラリーからの代表的な配列を示すノッチン変異体の例である。配列は一回のライブラリークローニングからの生の配列データを示している。灰色で強調表示されている配列部分は、全てノッチン変異体である。オリゴヌクレオチド合成における誤差は、切り縮められ延長されたペプチド配列を説明することができる。
【００９７】
この実施例で述べられた方法を用いて、いくつかのノッチンスカフォールドの変異体が生成され分析された。図９は、例えば、ヘフトキシン、ノッチン及びカイモトリプシン阻害剤用の３０００のメンバーからなるノッチンライブラリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示めしている。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルカラムは、３０００のノッチンタンパク質変異体プールを精製したサンプルを本来の還元条件下で走らせた結果を示している。組み合わされた結合間の移行ずれはジスルフィドの形成を示している。
【００９８】
４つのスカフォールドが定義されたライブラリー、すなわち、ヘフトキシン、ＣＴＩ、ノッチンとエピレグリン、の生成のため選らばれた。標的アミノ酸配列のリストがコンピュータ上（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）に作られ、それによって各ライブラリーの全メンバーは独自の質量のトリプシン断片を持つことになり、また結合する抗原決定基を発生させるため、突然変異体は構造的に隣接するように選ばれた。Ｎ−末端結合を不明確にするため、システインは変異されず、リジンは特に避けられた。各スカフォールドの３０００の変異体が生成され、そして各スカフォールドはＰＣＲプライマーサイトの特異な組み合わせによって並べられそれによって４のサブライブラリーの各々は独立して増幅することができた。全ての構造は、Ｎ−末端ＢａｍＨＩサイトとＣ−末端ＮｏｔＩサイトを持っていた、そして１２０００のオリゴヌクレチドプールからの各サブライブラリーのＰＣＲ増幅に続いて、各サブライブラリーは、確立された技術によって制限的に消化され、ＳＣＮ融合タンパク質としてカットされた親ベクター（両フューリン開裂及びＴＥＶ−開裂形）にクローン化された。ＨＥＫ２９３はダイダロス発現のために必要とされるこのプラスミドライブラリーとアクセサリプラスミドによって形質移入され、そして、３から４日後にウイルスが媒体の中で収穫された。ウイルスは遠心分離により濃縮され確立された手順に従ってタンパク質生成用のＨＥＫ２９３細胞を感染させるために用いられた。本発明者は、ライブラリーを作る際、ＴＥＶ−開裂性構造がニッケル樹脂上のＩＭＡＣにより融合体が容易に回収されるので、ＴＥＶ−開裂性構造が技術的により取り扱いやすいことが分かった。ＩＭＡＣに引き続き、融合タンパク質は透析されＰＢＳとなり、６ｘＨｉｓで標識化されたＴＥＶタンパク質分解酵素により一晩開裂するようにされ、そして、その後ＳＣＮとタンパク質分解酵素は物質を再びニッケル樹脂に通すことによって除かれた。開裂したペプチドライブラリーを含む通過分画は更に精製されバッファがサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）によって１０ｍＭ蟻酸アンモニウムに替えられ、ペプチドを含む分画は一つに集められ凍結乾燥された。
【００９９】
クローン化にはシームレスクローニング（Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と制限酵素切断／ライゲーションに基づく方法の２通りの仕方がある。シームレスクローニングは、典型的にＩＤＴから合成された「ｇＢｌｏｃｋｓ」を使い単一構造を作るために用いられた。製造者の指示に従って行われた。制限酵素切断／ライゲーション方法が基本的に採用されライブラリーのクローン化は次のようにして行われた、すなわち、関連するサブライブラリーを増幅するために、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙのプールされたオリゴヌクレオチドがＰＣＲ処理に付された。増幅されたプールはキアゲン製のカラムを使いアガロースゲルで精製、純化された。精製された断片は、(Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ)製のＦａａｓｔＤｉｇｅｓｔ、ＢａｍＨＩとＮｏｔｌによって消化され結さくされて２つの同じ制限酵素によって切断された親ベクターを得た。単集合クローンは配列が確かめられ、ライブラリーの質を確かめるため４８メンバーからなる各ライブラリーが配列された。
【０１００】
（“Ｄａｅｄａｌｕｓ：Ａ  Ｒｏｂｕｓｔ，Ｔｕｒｎｋｅｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｃｉｇｒａｍ  Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（２１）：ｅ１４３）の記載に従って、クローン化されたノッチンまたはライブラリーは、ＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入され、媒体が回収された。融合タンパク質は、ニッケルＩＭＡＣを用いて単離され組み換え型ＴＥＶタンパク質分解酵素によって開裂された。過剰のシデロカリンはサイズ排除クロマトグラフによって除かれた。この処理は、バッファを１０ｍＭの蟻酸アンモニウムに替えて行われた。分画を含むノッチンはその後凍結乾燥された。適切な畳み込みとペプチドの均一性がＳＥＣクロマトグラフ、逆相ＨＰＬＣ、質量分光分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元対非還元サンプルにおけるゲルシフトによって示された。
【０１０１】
３〜１０折り畳み過剰な、市販の活性化されたＰＢＳ中のエステル結合体を用いて、パルミチン酸、ＩＣＧまたは、耐ビオチニターゼビオチンへの結合が実行された。安定性に問題がある場合、アセトニトリルが加えられた。単集合を得るため最終的物質はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製され、過剰な結合体はライブラリーから透析によって除かれた。
【０１０２】
実施例２：融合タンパク質システム
本実施例ではノッチンペプチドを含む種々のペプチドの効率的な製造のための発現システムについて述べる。有利には、これらの方法によって製造されるペプチドは、分泌され安定である。
【０１０３】
本開示に従って、シデロカリンが、Ｓｃｎペプチド融合体の構築のため用いられるが、Ｓｃｎペプチド融合体は分泌され開裂されて分泌されたペプチドの効率的作成につながり得る。図２４はＳｃｎとＴｈ配位子の結晶構造を示している。
【０１０４】
図１４は、１８の種から得られたＳｃｎ配列アライメントを示す。該アライメントは、認識可能な相同分子種を持つ１８種間で、高次の配列保存性を示している。
星印の位置は、配位子結合可能なサイトを示す。
【０１０５】
図１５は、本開示の一つの様相に従った、超安定Ｓｃｎの３Ｄモデルを示す。このＳｃｎ形において、Ｎ末端を確保し、熱安定性を高めるため、第二のジスルフィド結合がなされた。
【０１０６】
図１０〜１２は、ノッチンペプチドの効率的製造を可能にする本開示に従った種々の製造方法を示している。図１０は、シデロカリン融合タンパク質の要素及びノッチンペプチド作成のためのその使用を示している。この実施例では、ノッチンはシデロカリンとの融合タンパク質として分泌されている。ＩｇＫシグナルペプチドはマウスの軽鎖ＩｇＧから派生している。ｓＦＬＡＧは、長ＦＬＡＧシグナルペプチドに関連するシグナルペプチドの開裂増強のための短ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＥ）である。Ｈｉｓはヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）であり、ＴＥＶはタバコエッチ病ウイルスタンパク質分解酵素部位（ＥＮＬＹＦＱ）である。本方法により、図１２に示されているように、開裂と分離に続いて、融合タンパク質が分泌される。ＩｇＫＳＰは、マウスＩｇＫ軽鎖シグナルペプチド、ｓＦＬＡＧは短くされたＦＬＡＧ抗原決定基、ＨＩＳは６ｘヒスチジンタグ、ＴＥＶはタバコエッチ病ウイルスタンパク質分解酵素（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）認識部位、ＦｕｒｉｎはＢａｍＨＩ部位を持つフューリン開裂サイトである。
【０１０７】
図１０は、シデロカリン融合タンパク質の要素及びノッチンペプチド作成のためのその使用を示している。この実施例では、ノッチンはＨＩＳ−タグをつけられたシデロカリンとして分泌されている。ＨＩＳタグは、可逆的にニッケルをつなぐ６つのヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ）のことであり、それゆえ、固定化金属クロマトグラフ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ））のための有用な精製タグである。ＩＭＡＣによる融合タンパク質の分離に続いて、融合体がＴＥＶタンパク質分解酵素で開裂され、開裂されたシデロカリンは別の回のＩＭＡＣで除かれ、純粋なノッチンが残る。
【０１０８】
図１１は、シデロカリン融合タンパク質の要素及びノッチンペプチド作成のためのその使用を示している。この方法は、混入物とシデロカリンの分泌、フューリン−ＨＩＳ結合点での細胞内開裂とＩＭＡＣによる精製工程を含んでいる。ＨＩＳタグがその後ノッチンからＴＥＶタンパク質分解酵素によって除かれ得る。図１１に示されている分泌方法は、図１０に示された方法と同じ制限サイトを採用している。
【０１０９】
図１２は、開裂したノッチンペプチドの分泌のためのシステムの要素を示している。この場合のシデロカリンは、翻訳の間存在し、タンパク質の時は細胞内フューリンによって開裂される。図１２に示されている分泌方法は、図１０に示された方法と同じ制限サイトを採用している。
【０１１０】
図１６は、本開示の種々の様相において用いることのできる一般的なＳｃｎ融合の概略図を示す。精製を促進するため、ネイティブシグナルペプチドは除かれ外因性ｓＦＬＡＧとＨＩＳタグが加えられた。これらの変更は、本開示の種々の様相において任意になされる。
【０１１１】
図１３は、ダイダロスシステムを使って作られた代表的なノッチンと本開示の一つの様相に従って対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。ダイダロスシステムは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（２１）：ｅ１４３に述べられている。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、還元（左）及び非還元（右）状態で実施された。図１３に示されているように、ここに述べられている方法に従い、多くの目的とするペプチドが作られ得る。
【０１１２】
図１７は、本開示の一つの様相に従った、Ｓｃｎと軽鎖抗体の融合の概略図とＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。このＳｃｎ融合体は、増加した分量（約７５ｋＤａ）を持つＦａｂ断片の製造を可能にし、血清の半減期を改善する。Ｓｃｎ部分の追加することによって、Ｓｃｎ配位子結合サイトを通じて外因性配位子を送り込むこともできる。更に、本開示の一つの様相に従い、構造物の非還元また還元状態下で行われたＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析も示している。
【０１１３】
図１８は、本開示の一つの様相に従った、開裂前と後のＳｃｎ融合の発現と細胞質酵素、ＨＭＯＸ１、を比較するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を表す。図１８に示されているように融合タンパク質を開裂することによって、ＨＭＯＸ１タンパク質が、Ｓｃｎから分離した後でも安定であることが示されている。この結果は、更に、ここに記述されている方法を採用することによって、細胞から分泌される酵素を培養系の哺乳動物細胞においても発現することができることを示唆している。
【０１１４】
図１９は、本開示の一つの様相に従った、細胞質ウイルス性タンパク質Ａｄｖ２とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図１９に示されているように融合タンパク質を開裂することによって、Ａｄｖ２タンパク質が、Ｓｃｎから分離した後でも安定であることが示されている。この結果は、更に、ここに記述されている方法を採用することによって、細胞から分泌される難ウイルスタンパク質を培養系の哺乳動物細胞においても発現することができることを示唆している。加えて、対応するＳｃｎ相同分子種を使い、ウイルス性抗原に対する抗体をラット、マウスあるいはウサギの中で増加させるために用いることができるので、この融合タンパク質は更なる利用価値がある。
【０１１５】
図２０は、本開示の一つの様相に従った、細胞外ウイルス性糖タンパク質ＨＩＶ  ｇｐ１２０とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２０の結果は、本開示の一つの様相によって安定化された糖タンパク質が発現され得ることを示している。加えて、対応するＳｃｎ相同分子種を使い、ウイルス性抗原に対する抗体をラット、マウスあるいはウサギの中で増加させるために用いることができるので、この融合タンパク質は更なる利用価値がある。
【０１１６】
図２１は、本開示の一つの様相に従った、ノッチンタンパク質、すなわち、インペラトキシンとのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２１の結果は、ノッチンタンパク質、インペラトキシン、がＳｃｎからの分離の後も安定であることを示している。これらの結果は、本開示の様相に従い細胞から分泌される哺乳動物細胞培養系においてもノッチンが発現され得るのを示している。適切に折り畳まれた状態では、ノッチンは驚くほど分泌するのが難しいことで知られているが、図２１の結果は、ここに記述されている方法によってその分泌が可能になることを示している。加えて、対応するＳｃｎ相同分子種を使い、ウイルス性抗原に対する抗体をラット、マウスあるいはウサギの中で増加させるために用いることができるので、この融合タンパク質は更なる利用価値がある。
【０１１７】
図２２は、本開示の一つの様相に従った、細胞外チロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１の小サブドメイン（すなわち、クリングルドメイン）とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２２の結果は、クリングルドメインはそれ単独では、発現に失敗したが、Ｓｃｎ融合体の一部としては発現することができたことを示している。これらの結果は、細胞外チロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１のクリングルドメインは本開示の一つの様相に従い効率的に準備できることを示している。加えて、対応するＳｃｎ相同分子種を使い、ウイルス性抗原に対する抗体をラット、マウスあるいはウサギの中で増加させるために用いることができるので、この融合タンパク質は更なる利用価値がある。
【０１１８】
図２３は、本開示の一つの様相に従った、７量体及び３量体サブドメインとのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２３に示されているように、ここに記述されている方法は、細胞からタンパク質を分泌する哺乳動物細胞培養系において、多量体のタンパク質構造の発現を可能にする。
【０１１９】
図２４は、本開示の一つの様相に従った、ノッチンとのＥｘＦＡＢＰ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。ＥｘＦＡＢＰは機能性Ｓｃｎの別のものである。本開示に従って、この組み立ては周辺質細菌システムにおいて用いられ、多様なクライアントタンパク質を分泌することができる。
【０１２０】
以上、本発明の好ましい実施形態を述べてきたが、そのような実施形態は例としてのみ述べられていることは当業者にとって明らかである。種々の変更、変化、置き換えは、本発明から逸脱することなく当業者に想起される。本発明の実施に当たり、本発明の実施形態への種々の変更が可能であると理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、またそれによって特許請求の範囲及びそれらの均等物内での方法、構成を網羅するものである。
配列
以下は対象の遺伝子、及び本明細書に定義される構成のＤＮＡ及び／またはアミノ酸配列である。
シームレスクローニングのための親構成の構成：
SEQ  ID  NO:  1  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-PARENTAL  for  Xho/Bam  cut  from  pUC57  and  ligation  into  pCVL
【化１】
2016505251.tif 000003
Fusion  protein  Sequences  −  original  set  of  10  −  cloned  into  NotI  cut  parent  above  by  seamless  cloning:
SEQ  ID  NO:  2  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-BubbleProtein 
【化２】
2016505251.tif 000004
SEQ  ID  NO:  3  -    
【化３】
2016505251.tif 000005
SEQ  ID  NO:  4  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Attractin 
【化４】
2016505251.tif 000006
SEQ  ID  NO:  5  -
【化５】
2016505251.tif 000007
SEQ  ID  NO:  6  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Hefutoxin 
【化６】
2016505251.tif 000008
SEQ  ID  NO:  7  -    
【化７】
2016505251.tif 000009
SEQ  ID  NO:  8  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Hanatoxin 
【化８】
2016505251.tif 000010
SEQ  ID  NO:  9  -
【化９】
2016505251.tif 000011
SEQ  ID  NO:  10  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-ChymotrypsinInhibitor 
【化１０】
2016505251.tif 000012
SEQ  ID  NO:  11-    
【化１１】
2016505251.tif 000013
SEQ  ID  NO:  12-      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-ToxinK
【化１２】
2016505251.tif 000014
SEQ  ID  NO:  13  -    
【化１３】
2016505251.tif 000015
SEQ  ID  NO:  14  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-EGFepiregulinCore
【化１４】
2016505251.tif 000016
SEQ  ID  NO:  15  -    
【化１５】
2016505251.tif 000017
SEQ  ID  NO:  16  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Circulin 
【化１６】
2016505251.tif 000018
SEQ  ID  NO:  17  -
【化１７】
2016505251.tif 000019
SEQ  ID  NO:  18  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Brazzein 
【化１８】
2016505251.tif 000020
SEQ  ID  NO:  19-
【化１９】
2016505251.tif 000021
SEQ  ID  NO:  20  -    
【化２０】
2016505251.tif 000022
Construction  of  parental  construct  for  BamH1/NotI  cloning:
SEQ  ID  NO:  21  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GS-PARENTAL
【化２１】
2016505251.tif 000023
BamHI  site:  GGATCC
NotI  site:  GCGGCCGC
A  BamHI  site  adds  “GS”  before  a  knottin.    This  construct  can  be  used  for  cloning  libraries.
Construction  of  parental  construct  for  furin  cleavage,  BamHI/NotI  cloning  can  include  an  idealized  furin  cut  site  is  RARYKRS  −RARYKRGS  can  be  used  for  a  Bam  HI  site.
SEQ  ID  NO:  22  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-furin-GS-PARENTAL
【化２２】
2016505251.tif 000024
SEQ  ID  NO:  23-      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GS-MIDKINE
【化２３】
2016505251.tif 000025
SEQ  ID  NO:  24  -    
【化２４】
2016505251.tif 000026
SEQ  ID  NO:  25  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Violacin  A 
【化２５】
2016505251.tif 000027
SEQ  ID  NO:  26  -    
【化２６】
2016505251.tif 000028
SEQ  ID  NO:  27  -    
IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Lambda  Toxin 
【化２７】
2016505251.tif 000029
SEQ  ID  NO:  28  -    
【化２８】
2016505251.tif 000030
SEQ  ID  NO:  29  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Lambda  Toxin  NG 
【化２９】
2016505251.tif 000031
SEQ  ID  NO:  30  -    
【化３０】
2016505251.tif 000032
SEQ  ID  NO:  31  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Potato  Carboxypeptidase  Inhibitor 
【化３１】
2016505251.tif 000033
SEQ  ID  NO:  32  -    
【化３２】
2016505251.tif 000034
Anti-CD3-STa  bispecific
The  anti-CD3  is  an  OKT3  variant  from  the  C-terminus  of  patent  7635462.    It  is  supposed  to  work  as  either  N-  or  C-  terminal.
SEQ  ID  NO:  33-    
GSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSNSSNYCCELCCNPACTGCY
This  is  designed  to  be  dropped  into  the  Bam/Not  cut  library  vector  as  a  TEV-cleavable  siderocalin  fusion:
SEQ  ID  NO:  34  -    
【化３４】
2016505251.tif 000035
Parental  cloning  construct  1  for  downstream  fusions:
【化３５】
2016505251.tif 000036
Parental  cloning  construct  2  for  downstream  fusions:
【化３６】
2016505251.tif 000037
【化３７】
2016505251.tif 000038
【化３８】
2016505251.tif 000039
SEQ  ID  NO:  39  -    
Homosapiens
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  40  -    
Pantroglodytes
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGRQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELQENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  41  -    
Canisfamiliaris  
QDSTPSLIPAPPPLKVPLQPDFQHDQFQGKWYVIGIAGNILKKEGHGQLKMYTTTYELKDDQSYNVTSTLLRNERCDYWNRDFVPSFQPGQFSLGDIQLYPGVQSYLVQVVATNYNQYALVYFRKVYKSQEYFKITLYGRTKELPLELKKEFIRFAKSIGLTEDHIIFPVPIDQCIDE
SEQ  ID  NO:  42  -    
Bostaurus
RSSSSRLLRAPPLSRIPLQPNFQADQFQGKWYTVGVAGNAIKKEEQDPLKMYSSNYELKEDGSYNVTSILLKDDLCDYWIRTFVPSSQPGQFTLGNIKSYRGIRSYTVRVVNTDYNQFAIVYFKKVQRKKTYFKITLYGRTKELTPEVRENFINFAKSLGLTDDHIVFTVPIDRCIDDQ
SEQ  ID  NO:  43  -    
Musmusculus
QDSTQNLIPAPSLLTVPLQPDFRSDQFRGRWYVVGLAGNAVQKKTEGSFTMYSTIYELQENNSYNVTSILVRDQDQGCRYWIRTFVPSSRAGQFTLGNMHRYPQVQSYNVQVATTDYNQFAMVFFRKTSENKQYFKITLYGRTKELSPELKERFTRFAKSLGLKDDNIIFSVPTDQCIDN
SEQ  ID  NO:  44  -    
Rattusnorvegicus
QDSTQNLIPAPPLISVPLQPGFWTERFQGRWFVVGLAANAVQKERQSRFTMYSTIYELQEDNSYNVTSILVRGQGCRYWIRTFVPSSRPGQFTLGNIHSYPQIQSYDVQVADTDYDQFAMVFFQKTSENKQYFKVTLYGRTKGLSDELKERFVSFAKSLGLKDNNIVFSVPTDQCIDN
SEQ  ID  NO:  45  -    
Macacamulatta
QDSSSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLSGNAVGRKDEAPLKMYATIYELKEDKSYNVTSILFRKEKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIQNHPGLTSYVVRVVSTNYKQYAMVFFKKVSQNKEYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFSVPIDQCING
SEQ  ID  NO:  46  -    
Tursiopstruncatus
QDSTPNLIPAPPLFRVPLQPNFQPDQFQGKWYIVGLAGNAFKKEKQGQFKMYATTYELKEDRSYNVTSALLRGKTQRCDHWIRTFVPSSRPGQFTLGNIKGFPGVQSYTVRVATTNYNQFAIVYFKKVYKNQEYFKTTLYGRTKELTPQLKENFIHFAKSLGLTDEYILFPVPIDKCIDDQ
SEQ  ID  NO:  47  -    
Gorillagorilla
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFREKAQKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  48  -    
Procaviacapensis
QEPTPTLIPAPPLSSIPLKPNFHNDKFQGKWYVVGVAGNAITKEKDPSLMYTTTYELRDDGSYNVTSTQFREKINCTHWTRTFVPTSQPGQFSLGNIDKYPHLSSYTVRVTATNYNYFAIVYFKKVSKNQEYFKTTLYKRIKKLTHGLKKHFIQFAKSLGLPDNHITFLVPTDRCIDDA
SEQ  ID  NO:  49  -    
Callithrixjacchus
QDSPSPLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAIRREDQDSLKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKAQKCDYWIRTFVPSSRPGEFKLGNIESHPGLTSYIVRVVNTDYKQHAMVFFMKASHNRKYFKVTLYGRTKELTSDLKENFTSFSKSLGLTENHIIFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  50  -    
Microcebusmurinus
QDSKEKLIPAPPLLRVPLQPDFQDDQFRETSWPRGSKMKETPAGSRDAGTGWATTYELKDHSYNVTSTLLRQNGKCDYWIRTFVLTSQPGQFALGNINRYPGIQSYTVRVVTTNYNQFAIVFFKKVSENKEYFKTTLYGRTKELPPELKENFIRFAKSLGLTEDHIIYPVPIDQCIDD
SEQ  ID  NO:  51  -    
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAIRREDKDSQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNTKGYPGLTSYLVRVVSTNYNQYAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPAPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  52  -    
Ochotonaprinceps
QELTTDLIPVPSLRKIHVQKNFQSDQFQGKWYVVGLAGNNIHNSDQEHQQMYSTTYELKEDGSYNVTSTLLRQRNQQCDHWIRTFVPGSKLGHFNLGNIKSYPTLKSYLIRVVTTDYNQFAIVFFRKVYKNNKKFFKIVLYGRTKELSPELRGRFTSFAKTLGLTDNHIVFPAPIGQCIDD
SEQ  ID  NO:  53  -    
Loxodontaafricana
QTHSPTLIPAPPLLRVPLQPDFQDDKFQGKWYVIGLAGNAVEKKEQGQFKMYTTTYELKEDGSYNVTSTLLQEDGKCSYWIRTFVPSFQPGQFNLGNIKNFPGLQSYTVRVTATNYNQFAIVFFKKVSKNGEYFKTTLYGRTKELTPELKERFIRFAKSLGLSDHIIFPVPIDRCIDD
SEQ  ID  NO:  54  -    
Oryctolaguscuniculus
QDPTPKLIPAPSLRRVPLQRNFQDEQFQGKWYVVGLAGNAVQKREEGQEPMYSTTYELNEDRSFNVTSTLLRDQRCDHWIRTFVPTSRPGQYNLGNIKSYPGVKNYIVRVVATDYSQYAMMFFRKGSRNKQFFKTTLYGRTKELSPELRERFTRFAKSLGLPDDRIVFPTPIDQCIDD  
SEQ  ID  NO:  55  -    
Murine  Scn  construct  for  downstream  viral  fusions:
【化５５】
2016505251.tif 000040
SEQ  ID  NO:  56  -    
【化５６】
2016505251.tif 000041
【化５７】
2016505251.tif 000042
【化５８】
2016505251.tif 000043
【化５９】
2016505251.tif 000044
【化６０】
2016505251.tif 000045
【化６１】
2016505251.tif 000046
【化６２】
2016505251.tif 000047
【化６３】
2016505251.tif 000048
【化６４】
2016505251.tif 000049
【化６５】
2016505251.tif 000050
【化６６】
2016505251.tif 000051
【化６７】
2016505251.tif 000052
Human  Scn  construct  for  downstream  viral  fusions:
【化６８】
2016505251.tif 000053
【化６９】
2016505251.tif 000054
【化７０】
2016505251.tif 000055
Human  Scn  construct  for  downstream  peptide  fusions:
【化７１】
2016505251.tif 000056
【化７２】
2016505251.tif 000057
【化７３】
2016505251.tif 000058
【化７４】
2016505251.tif 000059
【化７５】
2016505251.tif 000060
【化７６】
2016505251.tif 000061
Human  Scn  construct  for  downstream  HMOX1  fusions:
【化７７】
2016505251.tif 000062
【化７８】
2016505251.tif 000063
【化７９】
2016505251.tif 000064
【化８０】
2016505251.tif 000065
Human  Scn  construct  for  downstream  multimer  fusions:
【化８１】
2016505251.tif 000066
【化８２】
2016505251.tif 000067
【化８３】
2016505251.tif 000068
【化８４】
2016505251.tif 000069
【化８５】
2016505251.tif 000070
Human  Scn  construct  for  downstream  subdomain  fusions:
【化８６】
2016505251.tif 000071
【化８７】
2016505251.tif 000072
【化８８】
2016505251.tif 000073
SEQ  ID  NO:  89  -    
IgK  SP:  Murine  IgK  light  chain  signal  peptide:
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ  ID  NO:  90  -    
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT
SEQ  ID  NO:  91  -    
sFLAG:    Shortened  FLAG  epitope:
DYKDE
SEQ  ID  NO:  92  -    
GACTACAAGGACGAG
SEQ  ID  NO:  93  -    
HIS:  6xhistidine  tag
HHHHHH
SEQ  ID  NO:  94  -    
CATCATCATCATCATCAT
SEQ  ID  NO:  95  -    
TEV:    Tobacco  Etch  Virus  Protease  recognition  site:
ENLYFQ
SEQ  ID  NO:  96  -    
GAGAATTTATATTTTCAG
SEQ  ID  NO:  97  −
Furin  −  furin  cleavage  site  with  BamHI  site  (GGATCC):
SEQ  ID  NO:  99  −
RARYKRGS
SEQ  ID  NO:  100
CGGGCCCGGTATAAACGGGGATCC
【図２】
2016505251.tif 000074
【図５】
2016505251.tif 000075
【図８】
2016505251.tif 000076
【図１０】
2016505251.tif 000077
【図１１】
2016505251.tif 000078
【図１２】
2016505251.tif 000079
【図１４−１】
2016505251.tif 000080
【図１４−２】
2016505251.tif 000081
【図１】
2016505251.tif 000082
【図３】
2016505251.tif 000083
【図４】
2016505251.tif 000084
【図６】
2016505251.tif 000085
【図７Ａ】
2016505251.tif 000086
【図７Ｂ】
2016505251.tif 000087
【図９】
2016505251.tif 000088
【図１３】
2016505251.tif 000089
【図１５】
2016505251.tif 000090
【図１６】
2016505251.tif 000091
【図１７】
2016505251.tif 000092
【図１８】
2016505251.tif 000093
【図１９】
2016505251.tif 000094
【図２０】
2016505251.tif 000095
【図２１】
2016505251.tif 000096
【図２２】
2016505251.tif 000097
【図２３】
2016505251.tif 000098
【図２４】
2016505251.tif 000099
【図２５】
2016505251.tif 000100
【図２６】
2016505251.tif 000101
【配列表】
2016505251000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月2日(2015.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016505251000001.app
【国際調査報告】
2016505251.tif 000173
2016505251.tif 000174
2016505251.tif 000175