(57)【要約】  本発明は、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドを含む改良された固体経口医薬組成物、及びこれを製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドである活性ペプチド成分、
b) カプリル酸ナトリウム等のカプリル酸の塩、
c) ボーマン・バーク阻害剤 (BBI)、及び
d) 例えばソルビトールである、糖アルコール等のBBI可溶化剤
を含む、固体経口医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも10mgのカプリル酸の塩と少なくとも1mgのBBIが剤形あたりに存在する、請求項１に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項３】
10mg〜450mgのカプリル酸の塩と1mg〜200mgのBBIを含む、請求項１又は２に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項４】
10mg〜400mgのBBI可溶化剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項５】
カプセル内に含まれる粉末又は顆粒の形態である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項６】
前記カプセルが1000mgまでの粉末を含む、請求項５に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項７】
前記カプセルがハードカプセルである、請求項５又は６に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項８】
BBIが植物から単離されたものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項９】
BBIの純度が少なくとも９０％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項１０】
前記インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドがアシル化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項１１】
前記活性ペプチド成分がアシル化されたインスリンペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項１２】
前記活性ペプチド成分がアシル化されたGLP-1ペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項１３】
BBIに対するカプリル酸の塩の比率(w/w)が45:1以下である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項１４】
BBIに対するカプリル酸の塩の比率(w/w)が5.5:1以下である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【請求項１５】
BBIに対するカプリル酸の塩の比率(w/w)が約1:1以下である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の固体経口医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドを含む新規な経口医薬組成物、及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口経路は、投薬のために最も広く用いられる経路である。しかしながら、ペプチド及びタンパク質の投与は、胃腸(GI)管及び腸粘膜における酵素分解、並びに腸粘膜からの不十分で変動しやすい吸収等のいくつかの障害により、好ましい経口投与よりも非経口経路にしばしば制限される。
【０００３】
この障害を克服するために、経口製剤中には透過促進剤及びタンパク質分解酵素阻害剤が一般的に含まれる。
【０００４】
透過促進剤及びプロテアーゼ阻害剤を含むペプチド及びタンパク質のための経口製剤は、インスリン及びGLP-1等の薬学的に活性なペプチド又はタンパク質の経口吸収を可能にすると長い間提案されてきた。しかしながら、結局、医薬品のための経口固体製剤を開発及び調製するための通常の方法とはならなかった。
【０００５】
ダイズからのボーマン・バーク（Bowman Birk）阻害剤(BBI)の使用は、ペプチド及びタンパク質の経口投与のための有用なプロテアーゼ阻害剤として示唆されてきた。
【０００６】
ペプチド及びタンパク質の経口送達のためのよく知られた透過促進剤は、カプリン酸又はカプリン酸ナトリウムである。
【０００７】
Kyeongsoon Parkらは、非特許文献１において、経口タンパク質送達のために開発中の技術の概説を開示している。特許文献１には、タンパク質と少なくとも２つのプロテアーゼ阻害剤を含む組成物が開示されている。特許文献２には、流動化剤を含む疎水性媒体中に浸漬された水溶性組成物が記載されている。
【０００８】
しかしながら、例えばカプリン酸ナトリウムをプロテアーゼ阻害剤と組み合わせることによる、機能性経口医薬組成物の調製方法についての情報は、開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO09118722 A2
【特許文献２】US 2005/232981
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kyeongsoon Parkら、「Oral protein delivery: Current status and future prospect」、Reactive & Functional Polymers, vol. 71, no. 3, (2011), 280-28頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そのため、胃腸管（消化管）に投与された場合に、対象に治療上活性なペプチド成分の治療上有効な血中濃度をもたらすのに有効である、ペプチド及びタンパク質の経口送達のための経口医薬組成物の必要性が依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドを含む改良された固体経口医薬組成物を提供する。また、代わりに、本発明はインスリンペプチド又はGLP-1ペプチド、カプリル酸の塩、ボーマン・バーク阻害剤（Bowman-Birk阻害剤 (BBI)）、及びBBI可溶化剤を含む、改良された固体経口医薬組成物を提供する。
【００１３】
一態様において、本発明はインスリンペプチド又はGLP-1ペプチド、少なくとも10mgのカプリル酸の塩、及び少なくとも1mgのBBIを含む、改良された固体経口医薬組成物を提供する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、10 mg〜400 mgのBBI可溶化剤を含む。
【００１４】
本発明の一態様において、可溶化剤はソルビトール等の糖アルコールである。
【００１５】
本発明の一態様において、BBIの純度は少なくとも90%である。
【００１６】
本発明は、例示的な態様の開示から明らかである更なる課題を解決し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、インスリン又はGLP-1ペプチド等の薬学的に活性なペプチド又はタンパク質成分、カプリル酸ナトリウム等のカプリル酸の塩、及びボーマン・バーク阻害剤(BBI)を含む、固体経口医薬組成物に関する。
【００１８】
本明細書に記載したとおり、透過促進剤とプロテアーゼ阻害剤は互いに相互作用し、また治療上活性なペプチド成分とも相互作用するので、BBIとカプリル酸の塩の成功した組み合わせはささいなことではなく、非自明なことである。
【００１９】
一態様において、本発明は、a)インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドである活性ペプチド成分、b)カプリル酸ナトリウム等のカプリル酸の塩、c) ボーマン・バーク阻害剤(BBI))、及びd)糖アルコール、例えばソルビトール又はマンニトール等のBBI可溶化剤を含む、固体経口医薬組成物に関する。
【００２０】
用語「カプリル酸」は、式CH3(CH2)8COOHの飽和脂肪酸を意味するものとして本明細書で用いられる。カプリル酸の別名としては、デカン酸、n-カプリル酸、n-デカン酸、デシル酸 (Decylic acid)、及びn-デシル酸が挙げられる。
【００２１】
本発明の一態様において、カプリル酸の塩はカプリル酸ナトリウムである。
【００２２】
一態様において、カプリル酸の塩は送達（デリバリー）剤であり、すなわち、ペプチド又はタンパク質である活性成分の経口送達に有用な吸収促進剤である。
【００２３】
用語「送達剤」は、本明細書において、活性ペプチド成分の腸吸収を促進する、すなわち、難透過性ペプチド医薬品の透過性を向上し、これにより経口薬の生体利用効率を向上させる生物学的製剤及び化学薬品を意味する。そのため、経口経路による医薬品の送達は、前の組織での分解及び腸壁をわたる低い透過性により主に制限される。経口薬送達における大きな課題の一つは、腸上皮を超え難い透過性薬品の吸収を保証する新規剤形の開発である。
【００２４】
ボーマン・バーク阻害剤(BBIs)は、当業者にはセリンプロテアーゼ阻害剤として知られている。そのため、植物は種々のファミリーに分けられる様々なセリンプロテアーゼ阻害剤を含み得ることが知られている。ボーマン・バーク阻害剤(BBIs)は、双子葉及び単子葉植物に豊富に含まれるセリンプロテアーゼ阻害剤の広く研究されたファミリーに属する。
【００２５】
BBIは、ダイズからこのファミリーの一つを最初に単離し、特徴づけた科学者にちなんで名付けられている（Bowman DE、Differentiation of soy bean antitryptic factor, Proc Soc Exp Biol Med 63: 547-550 (1946)；Birk Y, Gertler A, Khalef S, A pure trypsin inhibitor from soya bean, Biochem J 87: 281-284 (1963))。BBIタンパク質は、例えばダイズ、エンドウ豆、レンズ豆、落花生、及びヒヨコマメ等のマメ科植物、並びにイネ科のファミリー中に確認されている。BBIファミリーのセリンプロテイナーゼ阻害剤は、酵素と相互作用し、標準的なプロテイナーゼ阻害立体構造を採用するむき出しの表面ループを介して阻害する。結果として生じる非共有結合の複合体は、プロテイナーゼを不活性化する。しかしながら、ボーマン・バーク阻害剤タンパク質の特別な特徴は、相互作用するループが特に明確に定義されており、ジスルフィド結合された短いベータストランド領域であることである。BBIファミリーの典型的なメンバーは、２つのそうした相互作用するループを含み、そのため、２つのセリンプロテアーゼまで阻害する。BBIファミリータンパク質は、典型的には、50〜80アミノ酸からなり、保存されたジスルフィドパターンを有する７つのジスルフィド結合を含む。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「プロテアーゼ阻害剤」又は「酵素阻害剤」は、プロテアーゼの機能を阻害する分子を意味する。本発明の一態様において、プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼのクラスに由来するプロテアーゼを阻害する(セリンプロテアーゼ阻害剤)。本発明の一態様において、プロテアーゼ阻害剤は、哺乳類の胃腸管でみられる膵酵素を阻害する。
【００２７】
膵酵素は膵液中に存在する酵素であり、例えば、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ、膵リパーゼ、ステロールエステラーゼ、ホスホリパーゼ、種々のヌクレアーゼ、及び膵アミラーゼ等のリパーゼ、プロテアーゼ、及びアミラーゼを含む。膵酵素を阻害するプロテアーゼ阻害剤は、哺乳類の胃腸管内に存在し、そのため、例えば、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ、膵リパーゼ、ステロールエステラーゼ、ホスホリパーゼ、種々のヌクレアーゼ、及び／又は膵アミラーゼ等の酵素を阻害する。
【００２８】
本発明の一態様において、プロテアーゼ阻害剤は、ペプチド／タンパク質の分解を妨げるようにタンパク質分解酵素に結合する化合物である。
【００２９】
一般的に、化合物は多くの異なる部位でタンパク質分解酵素に結合できるが、しかしながら、タンパク質分解の阻害剤をサーチする場合に興味があるのは、タンパク質分解酵素の機能を阻害する結合だけである。阻害剤を見つける最も良い方法は、調査対象のプロテアーゼにより触媒される酵素反応における潜在的な阻害剤の存在の効果を調べることである。酵素カイネティクスは、当業者に知られているように、酵素を阻害する化合物のためのいくつかの可能性を表している。酵素阻害は、例えば、競合、非競合、混合でありうる。異なる種類の酵素阻害を区別するための手順は、例えば、Athel Cornish-Bowdenによる「Fundamentals of Enzyme Kinetics」、ISBN-13: 978-3527330744等の多くの科学技術文献及びテキストにすでに示された。酵素カイネティクスに加えて、タンパク質分解酵素とそれらの阻害剤との相互作用は、多くの種々の方法、例えばX線結晶構造解析、NMR分光法、多数の分光技術（蛍光、円偏光二色性、UV-VIS）、質量分析、熱量測定等の当業者に公知の方法で通常測定される。化合物は酵素に強く結合するが、触媒反応速度には影響を与えない場合がある。 
【００３０】
BBIは、組み換え体産生又は植物からの単離等による当業者に公知の方法により得ることができる。
【００３１】
本明細書で同義に用いられる用語「BBI」、「ボーマン・バーク」又は「ボーマン・バーク阻害剤」は、これらに限定されないが、ダイズ他のマメ科植物、若しくはイネ科植物から単離されるボーマン・バーク阻害剤、又は大腸菌、枯草菌等の系に基づく細胞、若しくは植物ベースの細胞培養から組み換え技術により発現されるボーマン・バーク阻害剤等の、セリンプロテアーゼ阻害剤のボーマン・バークファミリーに由来する阻害剤を示す。
【００３２】
本発明の一態様において、ボーマン・バーク阻害剤は植物から単離される。一態様において、ボーマン・バーク阻害剤はマメ科植物から単離される。一態様において、ボーマン・バークはダイズ又はダイズ画分から単離される。例えばダイズ又はダイズ画分からBBIを単離する方法は、当該技術分野において公知である(例えば、Gladysheva, IPら、「Isolation and characterization of soybean Bowman Birk inhibitor from different sources」、Biochemistry (Mosc), 65(2):198-203 (2000)；Garcia, MCら、「Composition and Characterization of Soyabean and Related Products」、Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 37(4):361-391 (1997)；Yeboah, NAら、A rapid purification method for soybean Bowman Birk protease inhibitor using hydrophobic-interaction chromatography)、Protein expression and purification 7(3):309-314 (1996)、JP63051335-A、US4793996-A、WO2003007976-A、及びWO2011082338-A1)、また、市販品から入手可能である。
【００３３】
本発明で用いられるBBIの純度は、全BBIタンパク質濃度、特定の活性（キモトリプシン阻害単位／gタンパク質で計算される）であり、また、BBIのアンタゴニスト、毒素（トキシン）、又はBBIの単位量当たりの効能を単に薄める以上の有害な効果を有する他の成分として作用する成分の非存在に関する関数を意味する。通常、本明細書のBBI製品の全BBIタンパク質濃度は、少なくとも約90wt%である。典型的には、本明細書のBBI製品の全BBIタンパク質濃度は、少なくとも約90wt%、少なくとも約91wt%、少なくとも約92wt%、少なくとも約93wt%、少なくとも約94wt%、少なくとも約95wt%、少なくとも約96wt%、少なくとも約97wt%、少なくとも約98wt%、又は少なくとも約99wt%である。
【００３４】
一態様において、本発明で用いられる場合、BBIは、少なくとも90wt%、例えば少なくとも92wt%、94wt%、又は95wt%の全BBIタンパク質濃度で表される純度を有する。一態様において、BBIは、少なくとも96wt%の全BBIタンパク質濃度で表される純度を有する。一態様において、BBIは少なくとも97wt%、少なくとも98wt%、又は少なくとも99wt%の純度を有する。
【００３５】
本発明の一態様において、全BBIタンパク質濃度は、切断型の形態のBBIを含む。BBIの切断型の形態は、C末端及び／又はN末端から１〜１５のアミノ酸を欠損した以外は、BBIと同じ配列を有する。本発明の一態様において、全BBIタンパク質濃度は、BBIの切断された形態を含まない。
【００３６】
本発明で使用するためのBBIの純度の測定方法は、当業者にとって明らかであろう。純度は、例えば、一次元又は二次元SDS-PAGEゲルの電気泳動及び／又はRP-HPLC分離後に計算できる。一つの純度を計算できる非限定的な例は、例えば、本明細書の実施例２で例証している。
【００３７】
「純粋な」単量体タンパク質は、一次元又は二次元SDS-PAGEゲルの電気泳動の後で単一のバンドを示し、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、又はイオン交換カラムから単一の左右対称の吸収ピークとして溶出し、質量分析、核磁気共鳴(NMR)の単一セット又はW形の吸光スペクトルシグナルを示し、適切な場合、不純な（コンタミしている）酵素活性がないとされる。完全に純粋なものは得られないので、純粋さの単純な基準は、通常、SDS-PAGE後にタンパク質の単一バンド以外を検出できないことである(Mohan、「Determination of purity and yield」、Methods in Molecular Biology, 11, 307-323 (1992)を参照)。
【００３８】
製品のBBIタンパク質含有量、すなわち、本明細書の製品中に存在するBBIの量は、当業者に周知の通常の方法で測定することができ、例えば、クロマトグラフィー法（例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)、サイズ排除又はゲル浸透HPLC等）及び／又は分光法（例えば、NMR、UV-VIS、CD、IR等）、及び／又は抗体ベースの方法（例えば、ELISA、LOCI、RIA等）、及び／又は一般的なタンパク質含有量法（例えば、Ohnishi, S. T.及びBarr, J. K.の「A simplified method of quantitating proteins using the biuret and phenol reagents」Anal. Biochem., 86, 193 (1978)に記載されている、ブラッドフォード法、ローリー法等）が挙げられる。一般的なタンパク質含有量法により得られる結果は、もし活性成分(API)がタンパク質起源である場合、その活性成分も含む製品中に存在する全タンパク質量を反映する。そのため、BBIタンパク質含有量を得るためには、これらの方法により得られた結果からAPIの含有量を差し引く必要がある。
【００３９】
本発明の一態様において、ボーマン・バーク阻害剤は、細胞ベースのシステムにおいて、組み換え体技術により発現される。本発明の一態様において、ボーマン・バーク阻害剤は、これらに限定されないが、大腸菌、枯草菌、又は植物ベースの細胞培養等の細胞系システムにおいて組み換え技術により発現される。BBIの組み換え発現の方法は、当該技術分野で公知である（組み換え法の非限定的な例は、例えば、Li N.ら、「The refolding, purification, and activity analysis of a rice Bowman Birk inhibitor expressed in Escherichia coli.」、Protein Expr Purif. 1999 Feb;15(1):99-104又はVogtentanz Getら、Protein Expr Purif. 2007 Sep;55(1):40-52)に記載されている。
【００４０】
本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、少なくとも10 mgのカプリル酸の塩を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は450 mgまでのカプリル酸の塩を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は275 mgまでのカプリル酸の塩を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、200 mgまでのカプリル酸の塩を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、約275 mgのカプリル酸の塩を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は10 mg〜450 mgのカプリル酸の塩を含み、一態様において、10 mg〜350 mgのカプリル酸の塩、一態様において、10 mg〜275 mgのカプリル酸の塩、及び、一態様において、10 mg〜200 mgのカプリル酸の塩を含む。
【００４１】
本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、少なくとも1 mgのBBIを含む。一態様において、固体経口医薬組成物は、約10 mgのBBIを含み、一態様において、約25 mgのBBIを含み、一態様において、約50 mgのBBIを含み、また、一態様において、固体経口医薬組成物は約200 mgのBBIを含む。一態様において、固体経口医薬組成物は、1 mg〜200 mgのBBIを含み、一態様において、10 mg〜200 mgのBBIを含み、一態様において、25 mg〜200 mgのBBIを含み、一態様において、固体経口医薬組成物は、50 mg〜200 mgのBBIを含む。一態様において、固体経口医薬組成物は、1 mg〜50 mgのBBIを含み、一態様において、1 mg〜25 mgのBBIを含み、一態様において、固体経口医薬組成物は1 mg〜10 mgのBBIを含む。一態様において、固体経口医薬組成物は、10 mg〜50 mgのBBIを含み、一態様において、10 mg〜25 mgのBBIを含み、一態様において、固体経口医薬組成物は、25 mg〜50 mgのBBIを含む。
【００４２】
本発明は、固体経口医薬組成物において、BBI可溶化剤、例えば糖アルコールの使用にも関する。そのため、本発明者は、BBI可溶化剤の追加がin vivoの効果を向上し得ることを驚くべきことに見い出した。
【００４３】
用語「BBI可溶化剤」は、in vivoでのBBIの溶解を促進する薬剤を本明細書で意味する。そのため、この薬剤は、より多くの有効な薬放出を促進することにより、体内での活性ペプチド成分の生体利用効率を向上する。
【００４４】
本発明の一態様において、BBI可溶化剤は、糖アルコールである。一態様において、BBI可溶化剤はソルビトール又はマンニトールである。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「糖アルコール」は、一般式H(HCHO)n+1Hを有する糖質（炭水化物）の水素化形態を意味する。そのため、糖アルコールは、そのカルボニル基が一級又は二級ヒドロキシル基に還元された糖質である。例示的な糖アルコールは、例えば、ソルビトール及びマンニトールである。
【００４６】
あらゆる好適な糖アルコールが本発明の固体経口医薬組成物に含まれ得る。本明細書に用いられるように、本発明で用いられる「糖アルコール」は、単糖、二糖、及びオリゴ糖を含む。例示的な糖アルコールとしては、これらに限定されないが、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、ラクチトール、ペンチトール、及びヘキシトールが挙げられる。例示的な単糖としては、これらに限定されないが、グルコース、フルクトース、アルドース、及びケトースが挙げられる。例示的な二糖としては、これらに限定されないが、スクロース、イソマルトース（イソマルト）、ラクトース、トレハロース、及びマルトースが挙げられる。例示的なオリゴ糖としては、これらに限定されないが、マルトトリオース、ラフィノース、及びマルトテトラオースが挙げられる。一態様において、糖アルコールはソルビトール、マンニトール、又はキシリトールである。一態様において、糖アルコールはソルビトールである。一態様において、糖アルコールは二糖である。一態様において、糖アルコールはスクロースである。
【００４７】
本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、少なくとも10 mgのBBI可溶化剤を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、約275 mgのBBI可溶化剤を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、400 mgまでのBBI可溶化剤を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、10 mg〜400 mgのBBI 可溶化剤を含み、一態様において、10 mg〜275 mgのBBI可溶化剤を含む。本発明の一態様において、固体経口医薬組成物は、275 mg〜400 mgのBBI可溶化剤を含む。
【００４８】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、剤形中に含まれる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物を含む剤形はカプセルである。
【００４９】
「剤形」は本明細書において、薬剤が生産され、投薬される物理的な形態を意味すると解され、例えば、錠剤、粉体、複合粉体、カプセル、ペレット、ミニタブレット、カプセル化ペレット、カプセル化ミニタブレット、カプセル化微粒粉体、顆粒、又は粘膜付着形態（例えば、錠剤又はカプセル）であり得る。
【００５０】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物を含む剤形は、錠剤である。
【００５１】
本発明の一態様において、本発明の固体経口医薬組成物を含む剤形は、腸溶性コーティングを有するヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)カプセルである。
【００５２】
本発明の一態様において、BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)は、300:1〜1:1である。
【００５３】
本発明の一態様においてBBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)は、45:1〜1:1、30:1〜1:1、9:1〜1:1、又は5.5:1〜1:1である。
【００５４】
本発明の一態様において、BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)は、約45:1、約30:1、約9:1、約5.5:1、又は約1:1である。
【００５５】
本発明の一態様において、BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)は、約5.5:1である。
【００５６】
固体経口医薬組成物
本発明の固体経口医薬組成物は、活性ペプチド成分のナノ粒子、マイクロ粒子、顆粒、ペレット、又は他の種類の複合粉体剤形へのカプセル化を含み得る。上述した経口医薬組成物系は、錠剤に製剤化されるか、又は適当なハードシェル又はソフトシェルのカプセル中に充填され、これらは活性ペプチド成分を制御された態様で放出するか、又は好ましい腸部分で放出するように、コーティングされ得る。
【００５７】
一態様において、固体経口医薬組成物は顆粒を含む。一態様において、用語「顆粒体(granulate)」は、１以上の種類の顆粒を意味する。一態様において、用語「顆粒」は、より大きい粒子に固められた粒子を意味する。
【００５８】
一態様において、固体経口医薬組成物は、固体剤形の形状である。一態様において、固体経口医薬組成物は錠剤の形態である。一態様において、固体経口医薬組成物はカプセルの形態である。一態様において、固体経口医薬組成物は小袋の形態である。
【００５９】
一態様において、固体経口医薬組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「賦形剤（又は医薬添加剤）」は、活性成分以外、すなわち、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチド以外のあらゆる成分を広く意味する。賦形剤は、それ自体がどんな治療上の及び／又は予防効果を実質的に示さないという意味で不活性である、不活性材料であり得る。賦形剤は、様々な目的で用いられ、例えば、送達剤、吸収促進剤、ビヒクル、可溶化剤、充填剤（希釈剤とも言う）、バインダー、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、結晶化遅延剤、酸化剤、アルカリ化剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、錯化剤、界面活性剤、乳化剤、及び／又は可溶化剤、湿潤剤、安定剤、着色剤、芳香剤、及び／又は投薬として、及び／若しくは活性ペプチド成分の吸収を改善するためのものである。当業者は、通常の試験により、過度の負担なしに、固体経口剤形の特定の所望の特性に対する上記した賦形剤の１以上を選択できるだろう。用いられる各賦形剤の量は、当該技術分野の通常の範囲内で変動し得る。経口剤形を製剤化するのに用いられ得る技術及び賦形剤は、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」、第6版、Roweら、Eds., American Pharmaceuticals Association and the Pharmaceutical Press, publications department of the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain (2009)；及びRemington: the Science and Practice of Pharmacy、第２１版、Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。
【００６１】
一態様において、固体経口医薬組成物はバインダーを含む。一態様において、固体経口医薬組成物は崩壊剤を含む。一態様において、固体経口医薬組成物は滑剤を含む。一態様において、固体経口医薬組成物は、結晶化遅延剤、可溶化剤（界面活性剤とも言う）、湿潤剤、着色剤、及び／又はpH調整剤から選択される１以上の賦形剤を含む。
【００６２】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物を含むカプセルは、サイズ ４〜サイズ ０００のカプセル、例えば、サイズ １〜サイズ ００の範囲のカプセルであり、このサイズはツーピースカプセルの標準サイズの定義により測定される。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、錠剤、粉体、複合粉体、カプセル、ペレット、ミニタブレット、カプセル化ペレット、カプセル化ミニタブレット、カプセル化微粒粉体、又は粘膜付着形態（例えば、錠剤又はカプセル）の剤形であり得る。
【００６４】
一態様において、医薬組成物は、コーティング無しの剤形（例えば、カプセル又は錠剤）であり得る。一態様において、医薬組成物は、活性ペプチド成分及び促進剤の胃中での放出を最小化し、そのためその場での促進剤の濃度の希釈を最小化し、腸内で薬剤及び促進剤を放出する、遅延放出剤形中に含まれ得る（又は、その剤形であり得る）。他の態様において、医薬組成物は、遅延放出且つ迅速崩壊（迅速放出）剤形中に含まれ得る（又は、その剤形であり得る）。こうした剤形は、胃の中での活性ペプチド成分及び促進剤の放出を最小化し、そのため、その場での促進剤の希釈を最小化し、一方、腸内の適切な部位に達すると活性ペプチド成分と促進剤を迅速に放出し、吸収部位での活性ペプチド成分と促進剤の局所濃度を最大化することにより、難透過性の活性ペプチド成分の送達を最大化する。
【００６５】
一態様において、本発明の医薬組成物は、カプセル状経口剤形であり得る。一態様において、カプセル状剤形は、腸溶性のコーティングがされたカプセル状剤形であり得る。一態様において、カプセル状剤形は、腸溶性特性を有するカプセルである。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「カプセル」は、これらに限定されないが、経口投与のための医薬製剤のカプセル化に用いられる比較的安定なシェルを意味する。カプセルの２つの主な種類は、通常、乾燥した粉体成分、小型のペレット、又はミニタブレットに用いられるハードシェルカプセル、及び、主にオイル及びオイル中に溶解又は懸濁された活性成分に用いるソフトシェル型カプセルである。ハードシェルカプセル及びソフトシェルカプセルのどちらも、動物性タンパク質、例えばゼラチン、又は植物性多糖若しくはその誘導体、例えばカラギーナン、並びにデンプン及びセルロースの変性形態等のゲル化剤の水溶液から調製され得る。カプセルの硬さを低減する可塑剤、例えばグリセリン及び／又はソルビトール、着色剤、保存剤、崩壊剤、滑剤及び表面処理剤等の等の他の成分が、ゲル化剤溶液に加えられ得る。
【００６７】
固体経口医薬組成物の調製方法
本発明の固体経口医薬組成物は、当該技術分野に公知の方法で調製され得る。一態様において、固体経口医薬組成物は、実施例に記載した方法により調製され得る。
【００６８】
一態様において、固体経口医薬組成物はカプセルの形態である。
【００６９】
一態様において、本発明は、i) 15%(w/w)までのインスリン又はGLP-1ペプチド、ii) 少なくとも15%(w/w)のカプリル酸の塩を含む粉末又は顆粒を含む、ハードシェルカプセルの調製方法に関し、この方法は前記したハードシェルカプセルを充填する工程を含む。
【００７０】
一態様において、組成物の２以上の成分が混合される。充填剤の乾燥混合物（ブレンド）を調製するために、種々の成分を計量し、場合により分離し、それから組み合わせる。これらの成分の混合は、均一な混合物が得られるまで行われ得る。
【００７１】
一態様において、組成物の少なくとも一部分が乾式造粒されるか、湿式造粒される。顆粒は、当業者に公知の方法で製造でき、例えば、医薬活性成分及び／又は送達剤を賦形剤とともに圧縮し、比較的大きな成形体、例えばスラグ又はリボンを形成し、この成形体を製粉により粉末状にする（この粉末化材料を後でカプセルに充填する充填剤として用いる）、乾式造粒により製造できる。乾式造粒のための好適な装置は、これらに限定されないが、Gerteis社のローラー圧縮機、例えばGerteis MINI-PACTOR(Gerteis社により2013年に販売)を挙げることができる。一態様において、顆粒はローラー圧縮により調製される。一態様において、ローラー圧縮工程からの成形体は、粉体まで製粉化される。一態様において、用語「ローラー圧縮力」は、材料を圧縮して圧縮された材料の連続したストリップにする場合に、油圧を電気信号に変換する圧力変換器により測定される、ローラー圧縮機のロールの間の力を意味する。ローラー圧縮力は、キロニュートン（kN）又はロールの幅当たりのキロニュートン(kN/cm)単位で測定され得る。
【００７２】
代わりに、顆粒は、水中に溶解させた医薬的に活性なペプチド成分と、送達剤の乾燥混合物、及び場合により１以上の賦形剤とを混合した後、顆粒まで乾燥することにより行われ得る、湿式造粒によって得ることができる。
【００７３】
固形経口剤形、例えばハードシェルカプセル中に充填材料を充填するために、充填装置が使用され得る。充填装置において、例えば力による供給又は重力による供給により、充填材料は空洞内に充填される。充填材料は、充填装置により圧縮されてもよいし、圧縮されなくてもよい。続いて、得られたハードシェルカプセルを結合又はシール（密封）してもよいし、しなくてもよい。
【００７４】
物理的特性及びin vitro法
本発明の固体経口医薬組成物の物理的特性は、容易に取扱いでき、高含有量の活性ペプチド成分を含みつつも患者の容認及びコンプライアンスを強化する、小さくて容易に飲み込むことができる剤形が調製できるように、最小量の賦形剤を含む方がよく、また、優れた湿潤、崩壊、溶解、及び究極的には迅速かつ完全な薬物放出特性を有する剤形を提供するものであることが望ましい。
【００７５】
当業者は、剤形（例えば、カプセル又は錠剤）、活性ペプチド成分の性質、追加成分の性質、例えば、送達剤、崩壊剤、流動促進剤、滑剤、希釈剤、成分の量（比率）、粒径、及び錠剤の硬さ等の多くの異なる要因が固体経口医薬組成物の溶解時間に影響を与えることが分るであろう。
【００７６】
用語「溶解時間」は、所定量（又は割合）の薬剤が固体剤形から溶液中に放出されるのに必要な時間を意味すると解される。溶解時間は、溶液中の薬剤の量を時間の関数として測定できる実験装置中で、in vivoで溶解するのをシミュレートする条件下で、in vitroで測定される。
【００７７】
本発明の一態様によれば、本発明の固体経口医薬組成物は高い経口生体利用効率を有する。
【００７８】
通常、用語「生体利用効率」は、活性医薬成分（API）、例えば本発明の固体経口医薬組成物に含まれるインスリンペプチド又はGLP-1が、変化せずに全身循環に到達する投与量の割合を表す。定義により、APIが静脈内投与される場合、その生体利用効率は100%である。しかしながら、他の経路（例えば、経口）で投与される場合、その生体利用効率は、分解及び／又は不完全な吸収及び初回通過代謝により減少する。生体利用効率についての知識は、非静脈内経路の投与における投薬量を計算する場合に重要である。
【００７９】
時間に対する血漿濃度のプロットは、経口及び静脈内投与の後で作られる。絶対的生体利用効率(F)は、投与量当たりで経口投与後に算出される濃度曲線下面積（AUC）を、投与量当たりの、静脈内投与後に算出されるAUCで割ったものである。
【００８０】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、犬において測定された絶対的生体利用効率が少なくとも2%であり、例えば少なくとも3%であり、少なくとも4%であり、又は少なくとも5%である。
【００８１】
本発明の固体経口医薬組成物の経口生体利用効率及び吸収カイネティクスは、本明細書に記載するアッセイ（II）により測定できる。
【００８２】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも1mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも2 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも3 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも5 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも10 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも20 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも30 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも50 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも100 mgのキモトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも150 mgのキモトリプシンを阻害する。
【００８３】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも1 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも2 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも3 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも5 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも10 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも20 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも30 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも50 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも100 mgのトリプシンを阻害する。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、少なくとも150 mgのトリプシンを阻害する。
【００８４】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管（胃腸管）中のインスリンペプチドの半減期を、このインスリンペプチドを含むがBBI及びカプリル酸ナトリウムを含まない固体経口医薬組成物に比べて、少なくとも2倍増大させる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のインスリンペプチドの半減期を少なくとも3倍増大させる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のインスリンペプチドの半減期を少なくとも5倍増大させる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のインスリンペプチドの半減期を少なくとも10倍増大させる。
【００８５】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のGLP-1ペプチドの半減期を、このGLP-1ペプチドを含むがBBI及びカプリル酸ナトリウムを含まない固体経口医薬組成物に比べて、少なくとも２倍増大させる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のGLP-1ペプチドの半減期を少なくとも3倍増大させる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のGLP-1ペプチドの半減期を少なくとも5倍増大させる。一態様において、本発明の固体経口医薬組成物は、GI管中のGLP-1ペプチドの半減期を少なくとも10倍増大させる。
【００８６】
アッセイ（Ｉ）：溶解（崩壊）試験
溶解試験は、例えば、100 rpmのバスケットの回転速度を適用する装置１（United States Pharmacopeia (USP) General Chapter <711>で特定されている）を用いて行われる。リン酸バッファ(pH 6.8)である100mLの溶解媒体を37℃で用い得る。腸溶性コーティングされた製剤を２段階法で試験する。最初の段階では、胃と似たような酸のpHに１時間、その後腸と似た中性pHに２時間置く。中性pHはpH 6.0、6.5、6.8、7.2、又は7.4であり得る。溶解媒体は、0.1 %の含有量のTween80を含み得る。サンプルの一定分量を適当な間隔で回収する。放出は、例えばRP-HPLC法を用いて測定される。含有量は、例えば、クロマトグラムにおける、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドの参照のピーク面積に対する、インスリンペプチド又はGLPペプチドピークのピーク面積に基づいて計算される。HPLC法は、C18カラムでの勾配溶出に基づくことができる。この溶媒系は、215nmでのUV検出で、トリフルオロ酢酸とアセトニトリルであり得る。
【００８７】
アッセイ（II）：ビーグル犬に対する経口投与
動物、投与、及び血液採取
試験期間中に体重６〜１７ｋｇのビーグル犬を本試験で用いる。犬は絶食状態で投与される。固体経口医薬組成物を８匹のグループの犬に対し、単回経口投与により投与する。血液サンプルを以下の時間点で採取できる：投与前、投与後0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、及び288時間。i.v.（静脈内の）溶液（例えば、0.1 mg/mlのTween 20、5.5 mg/mlのフェノール、1.42 mg/mlのNa2HPO4、及び14 mg/mlのプロピレングリコールを含む、pH７．４の20 nmol/mL溶液）を、単回投与グループ(n=8)の同じ犬の集団において、0.1 mL/kgの投与量で投与する。血液サンプルは、以下の時間点で採取され得る：投与前、投与後0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、及び288時間。
【００８８】
血漿の調製
すべての血漿サンプルを安定化のためのEDTAを含む試験管に回収し、遠心分離するまで氷上で保管する。血液全体から遠心分離により血漿を分離し、この血漿を解析するまで−２０℃以下で保管する。
【００８９】
血漿サンプルの解析
発光酸素チャネリングイムノアッセイ(LOCI)を用いて、血漿をインスリンペプチド又はGLP-1ペプチドについて解析する。LOCIアッセイは、ストレプトアビジンでコートされたドナービーズと、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドの中間分子領域に結合するモノクローナル抗体と結合したアクセプタービーズを用いる。N-末端エピトープに特異的な、他のモノクローナル抗体はビオチン化される。このアッセイにおいて、３つの反応物質はインスリンペプチド又はGLP-1ペプチドと組み合わされ、2部位化免疫複合体(two-sited immuno-complex)を形成する。この複合体に光を当てると一重項酸素原子がドナービーズより放出され、アクセプタービーズへと向けられて化学発光を発するので、これをEnVisionプレートリーダーにて測定する。光の量はインスリンペプチド又はGLP-1ペプチドの濃度に比例しており、血漿における定量下限値(LLOQ)は100pMである。代わりに、LC-MS法が血漿中の活性ペプチド成分の濃度を測定するのに用いられる。
【００９０】
アッセイ(III)：酵素阻害
タンパク質分解酵素の活性を測定するための発色基質の使用は、当該技術分野においてよく知られている（例えばDelMar, E. G.ら、Anal. Biochem., 99, 316-320, (1979))。例えば、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリドは、キモトリプシン活性を測定するための基質として一般的に用いられる。4-ニトロアニリド基質の酵素的開裂は、4-ニトロアニリン（アルカリ条件下で黄色）をもたらす。
【００９１】
時間に対する395nmでの吸光度の増加を追跡するアッセイは、Varioskan Flash Multimode Meter (Thermo Scientific社)を用いて96穴ウェルフォーマット中で確立されている。それぞれのウェルに、70μlのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (Invitrogenカタログ #14190-094)、10μlのジメチルスルホキシド（DMSO）中のN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド (Sigma cat# S 7388、阻害定数を求めるために様々な濃度のものを用いる)、10μlの様々な濃度のBBI（例えば、溶解された固体剤形、BBI溶液等）を含むサンプル、及び10μlのキモトリプシンのストック溶液を注入する。37°Cでインキュベーションを行う。395nmでの吸光度を、96穴ウェルプレートに酵素を加えた直後、及びその後の８０分の間毎分測定する。阻害剤を加える場合と加えない場合で、酵素の濃度を初期の吸光度の増加の経時変化の傾きを測定することができるように最適化する。吸光度のグラフの直線部分(例えば、反応の最初の１０分間)の線形回帰により、傾きを計算する。それぞれのアッセイを２回行い、２回のグラフの平均を計算に用いる。阻害効果は、吸光度のグラフの傾きが50%非阻害反応(EC50)と等しくなるサンプルの濃度(EC50)としても表現される。これは、異なる濃度のサンプルで得られたこれらの傾きをこれらの濃度に対してプロッティングし、例えば、Ｓ字状のロジスティック回帰 (2パラメータ、Sigma Plot v 11)を用いて、試験結果を当てはめることにより行われる。本発明のBBIとタンパク質分解酵素との間の相互作用のための阻害定数は、様々な濃度の阻害剤及び基質を用いた上述したアッセイを行い、この結果を、例えば当該技術分野において公知であり、例えばHubalek、F.ら、J. Med. Chem. 47、1760-1766頁、(2004年)に記載されている二重逆数変換により解析して求めることができる。N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリドをN-(p-トシル)-Gly-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(Sigma T1637)に置き換える場合、トリプシンの阻害が測定され、N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリドに置き換える場合、エラスターゼの阻害が測定される。
【００９２】
カプセル化
本発明の固体経口医薬組成物は、カプセル化されていてもよい。固体経口医薬組成物は、任意の利用可能なハード又はソフトカプセル技術によりカプセル化され得る。
【００９３】
本明細書で用いられる、カプセル技術に関する用語「ハードカプセル」及び「ソフトカプセル」は、それぞれ、ハードシェルカプセル技術及びソフトシェルカプセル技術を意味する。
【００９４】
一態様において、本発明の固体経口医薬組成物のためのカプセル材料は、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス(HPMC)である。ハードカプセルはまた、ゼラチン又は他の医薬カプセル製造に適した材料からも調製され得る。一態様において、カプセル技術に用いられる場合の用語「腸溶性ハード」又は「腸溶性ソフト」は、少なくとも一つの腸溶性特性を有する要素、例えば少なくとも一層の腸溶性コーティングを含むソフト又はハードカプセル技術を指す。
【００９５】
本発明の固体経口医薬組成物は１以上の腸溶性又は放出制御コーティングを含み得る。固体経口医薬組成物はソフト又はハードカプセル技術に加えて、１以上の腸溶性又は放出制御コーティングを含み得る。一態様において、腸溶性又は放出制御コーティングは、インスリンペプチド又はGLP-1ペプチド成分が放出される部位を調節するために用いられ得る放出改変ポリマーを少なくとも一つ含む。一態様において、本明細書で用いられる用語「腸溶性コーティング」は、経口剤形の分解（崩壊）及び放出を制御するポリマーコーティングを意味し、固体剤形の崩壊及び放出の部位は標的領域、つまりインスリンペプチド又はGLP-1ペプチド成分の吸収が望まれる部位のpHに応じて設計されてもよく、したがって耐酸性保護コーティングもまた含まれる。ここで、前記した用語は公知の腸溶性コーティングを含むが、腸溶性特性を有している任意の他のコーティングもまた含まれており、ここで「腸溶性特性」という用語は固体経口剤形(すなわち本発明の固体経口医薬組成物)の崩壊及び放出を制御する特性を意味する。一態様において、本明細書で使用される用語「放出制御コーティング」は、特別な賦形剤(例えばポリマー)を含むか、又は特別な方法によって調製された、又はその両方で、活性ペプチド成分が放出される速度、場所又は時間を制御するように設計されたコーティングを指す。一態様において、放出制御コーティングは持続放出コーティング、遅延放出コーティング、及びパルス放出コーティングを含む。放出制御はpH依存的、又はpH非依存的なポリマーコーティングによって成され得る。
【００９６】
本発明の一態様において、カプセルはポリ（メタクリル酸−コ−アクリル酸エチル）（製品名：Eudragit L30D55（登録商標）、Evonik Industries AGにより2013年に販売）によりコーティングされている。
【００９７】
腸溶性コーティング又は放出制御コーティング等のコーティングは、当該技術分野で公知の方法により調製できる。
【００９８】
活性ペプチド成分 
本明細書で用いているとおり、「活性成分」及び「医薬活性成分」の同義語として用いられる用語「治療上の活性成分」は、有益な生物学的効果、好ましくは疾患又は異常な生理学的状態を治療する治療効果を有する、あらゆる化学化合物、複合体、又は組成物を示す。この用語はまた、本明細書で具体的に言及したこれらの活性剤の薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体を含み、この誘導体としては、例えば、これらに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、異性体、断片（フラグメント）、アナログ（類似物）等が挙げられる。用語「治療上の活性成分」又は「活性成分」が用いられ、特定の活性剤が具体的に特定された場合、本出願人は、その活性剤自体、その薬学的に許容される、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、異性体、フラグメント、アナログ等も含むことを意図している。
【００９９】
本発明の治療上の活性成分は、ヒトを含む動物に対して経口経路を介して投与するために適切なあらゆる活性成分を含む。
【０１００】
用語「活性ペプチド成分」は、本明細書中において、ペプチド又はタンパク質の形態であり、生物学的に活性である医薬品、すなわち、疾患の治癒、治療又は予防に薬理学的活性は他の直接的な効果をもたらすか、又はヒト又は動物の体の機能又は構造に影響を与えるペプチド又はタンパク質である医薬品中の薬剤物質のために用いられる。この用語は、ペプチド活性医薬成分(API)及びペプチドバルク活性物質も意味する。
【０１０１】
本発明の一態様において、活性ペプチド成分はペプチド又はタンパク質である。
【０１０２】
本発明の一態様において、活性ペプチド成分インスリンペプチド及びGLP-1ペプチドから選択される。
【０１０３】
本発明の一態様において、活性ペプチド成分はGLP-1ペプチドである。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「GLP-1ペプチド」は、ヒトGLP-1か、GLP-1活性を有するそのアナログ又は誘導体のいずれかであるペプチドを意味する。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「ヒトGLP-1」又は「ネイティブな（天然型の）GLP-1」は、その構造及び特性がよく知られているヒトGLP-1ホルモンを意味する。ヒトGLP-1は、GLP-1(7-37)とも示され、31アミノ酸を有し、プログルカゴン分子の選択的開裂に由来する。
【０１０６】
本発明のGLP-1ペプチドは、GLP-1活性を有する。この用語は、GLP-1受容体に結合し、当業者に公知なインスリン分泌促進作用又は他の生理的作用をもたらすシグナル伝達経路を開始する機能を意味する。例えば、本発明のアナログ及び誘導体は、標準的なGLP-1活性アッセイを用いてGLP-1活性を試験することができる。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「GLP-1アナログ」は、ヒトGLP-1の１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、並びに／又は１以上のアミノ酸残基がヒトGLP-1から欠失した、並びに／又は１以上のアミノ酸残基がヒトGLP-1に追加された及び／若しくは挿入された、改変（変異）型ヒトGLP-1を意味する。
【０１０８】
一態様において、GLP-1アナログは、ヒトGLP-1に対して、１０以下のアミノ酸改変（置換、欠失、追加（挿入を含む）、及びそれらの任意の組み合わせ）を含むか、代わりに９、８、７、６、５、４、３、又は２以下のアミノ酸改変を含み、さらに代わりにヒトGLP-1に対して１つの改変を含む。
【０１０９】
GLP-1分子における改変は、位置及び天然のアミノ酸残基と置換しているアミノ酸残基を示す１又は３の文字のコードで示される。
【０１１０】
配列表を用いる場合、配列の最初のアミノ酸残基をNo.1に割り当てる。しかしながら、GLP-1ペプチドにおいて確立された慣例により、この最初の残基はＮｏ．７として示され、続くアミノ酸残基は順番に番号が付され、No.37で終了する。そのため、通常、本明細書のGLP-1(7-37)配列のアミノ酸残基番号又は位置番号のあらゆる参照は、第７位のHisで始まり、第３７位のGlyで終わる配列を示す。アミノ酸の１文字のコードを用いると、34E、34Q、又は34Rのような用語は、第３４位のアミノ酸が、それぞれE、Q、及びRであることを示す。アミノ酸の３文字のコードを用いると、これに相当する表現は、それぞれ34Glu、34Gln、及び34Argである。
【０１１１】
「des7」又は「(又はDes7)」は、N末端アミノ酸であるヒスチジンが欠失しているネイティブなGLP-1を意味する。そのため、例えば、des7GLP-1(7-37)は、第７位のアミノ酸が欠失したヒトGLP-1のアナログである。このアナログは、GLP-1(8-37)とも表される。同様に、GLP-1(7-37)のアナログと関して、(des7+des8)；(des7、des8)；(des7-8)；又は(Des7、Des8)（ここで、GLP-1(7-37)の参照が暗示され得る）は、ネイティブなGLP-1の２つのN-末端アミノ酸に相当するアミノ酸である、ヒスチジン及びアラニンが欠失したアナログを示す。このアナログは、GLP-1(9-37)とも示され得る。
【０１１２】
本発明のアナログの非限定的な例としては、[Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)が挙げられ、これは第８位のアラニンがα-アミノイソ酪酸(Aib)に置換され、第３４位のリシンがアルギニンに置換されたGLP-1(7-37)アナログを示す。このアナログは、(8Aib、R34) GLP-1(7-37)とも示され得る。
【０１１３】
本明細書で用いられる用語「GLP-1誘導体」は、化学的に修飾（改変）された親GLP-1(7-37)又はそのアナログを意味し、ここで、修飾は、アミド、糖質（炭水化物）、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化、及びこれらの組み合わせ等の付加の形態である。
【０１１４】
本発明の一態様において、修飾（改変）としては、GLP-1(7-37)又はそのアナログへの側鎖の付加が挙げられる。特定の態様において、側鎖は、アルブミンと非共有結合性凝集体を形成することができ、これにより血流による誘導体の循環を促進し、且つ、GLP-1誘導体とアルブミンの凝集体が活性ペプチド成分を放出するのにゆっくりとしか崩壊しないという事実により、誘導体の作用の時間を長引かせる効果を有することができる。そのため、全体として、置換基又は側鎖は、アルブミン結合部分として好ましくは示される。特定の態様において、側鎖は少なくとも10個の炭素原子を有し、又は、少なくとも12、14、16、18、20、22、又は24個の炭素原子を有する。さらなる特定の態様において、側鎖は少なくとも5個のヘテロ原子、特にO及びNをさらに含むことができ、例えば、少なくとも7、9、10、12、15、17、又は20個のヘテロ原子を含むことができ、例えば、少なくとも1、2、又は3個のN原子、及び／又は少なくとも3、6、9、12、又は15個のO原子を含むことができる。
【０１１５】
別の特定の態様において、アルブミン結合部分は、特定のアルブミン結合に関連する部分、それによる延長を含み、このタンパク質はそのため「延長部分」とも示され得る。延長部分は、そのペプチドへ付加する箇所に対して、アルブミン結合部分に、又はその近く、またはその反対側に存在し得る。
【０１１６】
さらに特定の態様において、アルブミン結合部分は、延長部分とペプチドへ付加する箇所との間に、「リンカー」、「リンカー部分」、「スペーサ」等と示され得る部分を含む。リンカーはあってもなくてもよく、アルブミン結合部分が延長部分と同一である場合がある。
【０１１７】
特定の態様において、アルブミン結合部分及び／又は延長部分は、脂溶性であり、及び／又は生理的なpH(7.4)で負に帯電している。
【０１１８】
アルブミン結合部分、延長部分、又はリンカーは、例えば、GLP-1ペプチドのリシン残基に、アシル化により共有結合で付加され得る。好ましい態様において、好ましくは延長部分及びリンカーを含む、アルブミン結合部分の活性エステルは、リシン残基のアミノ基、好ましくはそのエプシロン-アミノ基に、アミド結合を形成して共有結合する（このプロセスはアシル化と表される）。
【０１１９】
他の言及がない限り、リシン残基のアシル化がされる場合、そのエプシロン-アミノ基がアシル化されると解される。
【０１２０】
本発明の目的のために、用語「アルブミン結合部分」、「延長部分」、及び「リンカー」は、これらの分子の未反応の形態及び反応後の形態を含み得る。いずれの形態を意味するかは、この用語が用いられる文脈から明らかである。
【０１２１】
GLP-1ペプチドへの付加のために、脂肪酸の酸基、又は脂肪二酸の酸基の１つは、GLP-1ペプチドのリシン残基のエプシロン-アミノ基と、好ましくはリンカーを介して、アミド結合を形成する。                     
【０１２２】
用語「脂肪二酸(fatty diacid)」は、オメガ位に追加のカルボン酸を有する上述した脂肪酸を示す。そのため、脂肪二酸はジカルボン酸である。
【０１２３】
本発明の誘導体の２つのリンカーのそれぞれは、以下の第１リンカー要素を有し得る。
【０１２４】
【化１】
2016524617.tif 000002
【０１２５】
ここで、ｋは１〜５の範囲の整数であり、ｎは１〜５の範囲の整数である。
【０１２６】
特定の態様において、k=1でn=1の場合、このリンカー要素はOEG、又は8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジ-ラジカルと示すことができ、及び／又はこれは以下の化学式で表され得る。
化学式 II：  NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
【０１２７】
別の特定の態様において、本発明の誘導体のそれぞれのリンカーは、独立に、第２リンカー要素、好ましくはGluジ-ラジカル、例えば以下の化学式III及び／又はIVを含む。
【０１２８】
【化２】
2016524617.tif 000003
【０１２９】
ここで、Gluジ-ラジカルをp回含むことができ、pは１〜３の範囲の整数である。
【０１３０】
化学式IIIは、本明細書において別のリンカー要素又はリシンのエプシロン-アミノ基への結合に用いられるのが、アミノ酸であるグルタミン酸のガンマ-カルボキシ基であるという事実により、ガンマ-Glu、又は単にγGluとも示すことができる。上述したように、他のリンカー要素は、例えば、別のGlu残基、又はOEG分子であってもよい。Gluのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基と、又は、もし存在する場合、例えばOEG分子のカルボキシ基と、又は、もし存在する場合、例えば別のGluのガンマ-カルボキシ基と順にアミド結合を形成する。
【０１３１】
化学式IVは、本明細書において別のリンカー要素、又はリシンのエプシロン-アミノ基への結合に、アミノ酸であるグルタミン酸のアルファ-カルボキシ基が用いられるという事実により、アルファ-Glu、又は単にαGlu、又は単純にGluとも示され得る。
【０１３２】
上述した化学式III及び化学式IVの構造は、GluのL-型とD-型を含む。特定の態様において、化学式III及び／又は化学式IVは独立に、a) L-型、又はb) D-型である。
【０１３３】
さらなる別の特定の態様において、リンカーはa)５〜４１個のC原子、及び／又はb)４〜２８個のヘテロ原子を有する。
【０１３４】
本発明のGLP-1誘導体の血漿中の濃度は、任意の好適な方法を用いて測定できる。例えば、LC-MS（液体クロマトグラフィー質量分析）が使用でき、又はRIA（放射免疫測定）、ELISA(酵素結合免疫吸着法)、及びLOCI（発光酸素チャネリングイムノアッセイ）法等の免疫アッセイが使用できる。RIA及びELISAアッセイの好適な通常の方法は、例えば、WO09/030738の116〜118頁に記載されている。
【０１３５】
GLP-1アナログと活性化した側鎖との結合は、任意の通常の方法、例えば、以下の参考文献（これらにはポリマー分子の活性化のための好適な方法も記載されている）に記載された方法を用いて行われる：R. F. Taylor、(1991年)、「Protein immobilisation. Fundamental and applications」、Marcel Dekker、N.Y.; S. S. Wong、(1992年)、「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」、CRC Press、Boca Raton; G. T. Hermansonら、(1993年)、「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press、N.Y.)。当業者は、用いられる活性化方法及び／又は結合化学反応が、ポリペプチドの付加基（この例は上述した）、及びポリマーの官能基（例えば、アミン、ヒドロキシ、カルボキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、又はハロアセテート）に応じて変化することは理解できるだろう。
【０１３６】
ここで、ペプチド又はタンパク質の命名は、以下の原則により行われる。名称は、ヒトGLP-1 (GLP-1(7-37))等の親ペプチド又はタンパク質に対する改変及び修飾（例えばアシル化）により与えられる。アシル部分の命名において、命名はIUPAC命名法及び他のペプチド命名法の場合に基づいて行う。例えば、アシル部分：
【０１３７】
【化３】
2016524617.tif 000004
【０１３８】
は、例えば「(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル」、「オクタデカンジオイル-γGlu-OEG-OEG」、「オクタデカンジオイル-gGlu-OEG-OEG」、「オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG」、又は「17-カルボキシヘプタデカノイル-γGlu-OEG-OEG」と命名することができ、ここで、OEGは、アミノ酸残基、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-の簡単な表記であり、γGlu(又はgGlu)は、アミノ酸ガンマL-グルタミン酸部分の簡単な表記である。
【０１３９】
一例は、以下に配列／構造を示す実施例４のアシル化GLP-1ペプチドであり（特許出願WO 2006/097537の実施例４も参照）、これは、「N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド」と名付けられ、GLP-1(7-37)の第８位のアミノ酸アラニン(Ala又はAと略される)が非タンパク質アミノ酸α-アミノイソブチル酸(Aibと略される)に変異し、GLP-1(7-37)の３４位のアミノ酸がアルギニン(Arg又はRと略される)に変異し、GLP-1(7-37)の２６位のアミノ酸リシン(Lys又はKと略される)が２６位のリシン残基のエプシロン窒素（N{エプシロン-26}と示される）において、残基2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル (代わりに、例えば「(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル」又は「オクタデカンジオイル-γGlu-OEG-OEG」と示される)により、アシル化により修飾されていることをしめす。代わりに、このペプチドは、例えば、「N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34] GLP-1(7-37)ペプチド」とも示される。下記式中のアスタリスクは、対象の残基が、GLP-1(7-37)と比べて異なる（例えば、変異されていることを表す、また、本発明の医薬組成物のアシル化GLP-1ペプチドは、IUPAC命名法(OpenEye, IUPAC形式)によっても名づけることができ、例えば、「Ne26 [(S)-(22,40-diカルボキシ-10,19,24-トリオキソ-3,6,12,15-テトラオキサ-9,18,23-トリアザテトラコタン-1-オイル)] [Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)ペプチド」となる。本明細書において、用語「アミノ酸残基」は、カルボキシ基からヒドロキシ基が除かれた、及び／又はアミノ基から水素原子が除かれたアミノ酸である。
【０１４０】
【化４】
2016524617.tif 000005
【０１４１】
配列表において、配列番号１の最初のアミノ酸残基（ヒスチジン）は、no.1と割り当てられる。しかしながら、確立した慣例により、このヒスチジン残基は、本明細書においてno.7として示され、続くアミノ酸残基はこれに沿って順に番号が付され、グリシンのno.37で終了する。そのため、通常、GLP-1(7-37)配列のアミノ酸残基番号又は位置番号に対するあらゆる参照は、７位のＨｉｓから始まり、３７位のＧｌｙで終了する配列でる。
【０１４２】
本発明の一態様において、活性ペプチド成分はインスリンペプチドである。
【０１４３】
本明細書で用いられる用語「インスリンペプチド」は、ヒトインスリン又は、インスリン活性を有するそのアナログ若しくは誘導体を意味する。
【０１４４】
本明細書で用いられる用語「ヒトインスリン」は、その構造及び特性が公知なヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖及びＢ鎖と名付けられた２つのポリペプチドを有する。Ａ鎖は２１個のアミノ酸ペプチドであり、Ｂ鎖は３０個のアミノ酸ペプチドであり、２つの鎖はジスルフィド架橋により結合している。最初の架橋はＡ鎖の第７位のシステインとＢ鎖の第７位のシステインの間であり、２番目の架橋はＡ鎖の第２０位のシステインとＢ鎖の第１９位のシステインとの間である。三番目の架橋は、Ａ鎖の第６位と第１１位のシステイン間に存在する。
【０１４５】
人体において、ホルモンは、24個のアミノ酸のプレペプチドから成る単鎖前駆体プロインスリン（プレプロインスリン）として合成され、続いて立体構造中に86個のアミノ酸を含むプロインスリンになる（プレペプチド-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A、ここで、Cは31個のアミノ酸の結合ペプチドである）。Arg-Arg及びLys-Argは、A及びB鎖からの結合ペプチドの開裂のための開裂部位である。
【０１４６】
本発明において使用するためのインスリンペプチドは、少なくとも0.01%の、以下に定義されるインスリン受容体親和性を有する。例えばヒトインスリンペプチドの、非常に低いインスリン受容体親和性であっても、同じヒトインスリンアナログにおいてin vivoでの生物学的活性を達成することができます(例えば、Diabetes 39, 1033-1039 (1990), Ribelらに開示されている)。
【０１４７】
本明細書で用いられる用語「インスリンアナログ」は、１以上のインスリンのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、並びに／又は１以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失した、及び／又は１以上のアミノ酸残基がインスリンに追加及び／若しくは挿入された、改変ヒトインスリンを意味する。
【０１４８】
一態様において、インスリンアナログは、ヒトインスリンと比較して、10個以下のアミノ酸改変（置換、欠失、追加（挿入を含む）及びこれらの任意の組み合わせ）を含み、又は、9、8、7、6、5、4、3若しくは2個以下の改変を含み、又は、ヒトインスリンと比較して1個の改変を含む。
【０１４９】
インスリン分子中の改変は、鎖（A又はB）、位置、及び天然のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基のための１又は３文字のコードで示される。
【０１５０】
「結合ペプチド（connecting peptide）」又は「C-ペプチド」は、単鎖プロインスリン分子のB-C-Aポリペプチド配列の結合部分「C」を意味する。ヒトインスリン鎖において、C-ペプチドは、B鎖の第３０位及びA鎖の第１位に結合し、また、３５アミノ酸残基の長さである。結合ペプチドは、２つの末端二塩基性アミノ酸配列、例えば、Arg-Arg及びLys-Argを含み、これらはA及びB鎖から結合ペプチドが開裂するための開裂部位として機能し、２鎖のインスリン分子を形成する。
【０１５１】
「desB30」又は「B(1-29)」は、B30アミノ酸を欠失したネイティブな(天然型)インスリンのB鎖又はそのアナログを意味し、「A(1-21)」は、ネイティブなインスリンのA鎖を意味する。そのため、例えばA14Glu、B25His、desB30ヒトインスリンは、A鎖の第14位のアミノ酸がグルタミン酸と置換し、B酸の第25位のアミノ酸がヒスチジンと置換し、B鎖の第30位のアミノ酸が欠損したヒトインスリンのアナログである。
【０１５２】
ここで、用語「A1」、「A2」、及び「A3」等は、それぞれインスリンのA鎖中の第１、２、及び３位のアミノ酸を示す（N末端から数える）。同様に、用語B1、B2、及びB3等は、それぞれインスリンのB鎖中の第１、２、及び３位のアミノ酸を示す（N末端から数える）。アミノ酸の１文字コードを用いると、A21A、A21G、及びA21Q等の用語は、A21位のアミノ酸が、それぞれA、G、及びQであることを示す。アミノ酸のための３文字コードを用いると、上記に相当する表現は、それぞれA21Ala、A21Gly、及びA21Glnである。
【０１５３】
インスリンアナログの例は、A14位のアミノ酸がGluであり、B25位のアミノ酸がHisであり、場合により１以上の追加の改変を含むものがある。インスリンアナログのさらなる例は、欠損アナログ、例えば、ヒトインスリン中のB30が欠損したアナログ（des(B30)ヒトインスリン）がある。A鎖及び／又はB鎖がN末端延長を有するインスリンアナログ、及びA鎖及び／又はB鎖がC末端延長を有するインスリンアナログ、例えば２つのアルギニン残基がB鎖のC末端に付加したものも、インスリンアナログの例である。
【０１５４】
本明細書で用いられる用語「インスリン誘導体」は、化学的に修飾された親インスリン又はそのアナログを意味し、ここで修飾は、アミド、糖質（炭水化物）、アルキル基、アシル基、エステル、及びペグ化等の付加の形態である。
【０１５５】
本発明の一態様において、修飾（改変）はヒトインスリン又はそのアナログへの側鎖の付加を含む。特定の態様において、この側鎖はアルブミンとの非共有結合性の凝集体を形成することができ、これにより血流による誘導体の循環を促進し、且つ、インスリン誘導体とアルブミンの凝集体が徐々に崩壊して活性ペプチド成分を放出するという事実により、誘導体の作用の時間を長引かせる効果を有することができる。そのため、全体として、置換基又は側鎖は、アルブミン結合部分として好ましくは示される。特定の態様において、側鎖は少なくとも10個の炭素原子を有し、又は、少なくとも12、14、16、18、20、22、又は24個の炭素原子を有する。さらなる特定の態様において、側鎖は少なくとも5個のヘテロ原子、特にO及びNをさらに含むことができ、例えば、少なくとも7、9、10、12、15、17、又は20個のヘテロ原子を含むことができ、例えば、少なくとも1、2、又は3個のN原子、及び／又は少なくとも3、6、9、12、又は15個のO原子を含むことができる。
【０１５６】
別の特定の態様において、アルブミン結合部分は、特にアルブミン結合に関連する部分、それによる延長を含み、この部分はそのため「延長部分」とも示され得る。延長部分は、そのペプチドへ付加する箇所に対して、アルブミン結合部分に、又はその近く、またはその反対側に存在し得る。
【０１５７】
さらに特定の態様において、アルブミン結合部分は、延長部分とペプチドへ付加する箇所との間に、「リンカー」、「リンカー部分」、「スペーサ」等と示され得る部分を含む。リンカーはあってもなくてもよく、所定の場合、アルブミン結合部分が延長部分とは同一である。
【０１５８】
特定の態様において、アルブミン結合部分及び／又は延長部分は、親油性であり、及び／又は生理的なpH (7.4)で負に帯電している。
【０１５９】
アルブミン結合部分、延長部分、又はリンカーは、例えば、ヒトインスリン又はインスリンアナログのリシン残基に、アシル化により共有結合で付加され得る。
【０１６０】
一態様において、好ましくは延長部分及びリンカーを含む、アルブミン結合部分の活性エステルは、リシン残基のアミノ基、好ましくはそのエプシロン-アミノ基にアミド結合の形成に基づいて共有結合する（このプロセスはアシル化と表される）。
【０１６１】
他の言及がない限り、リシン残基のアシル化を示す場合、そのエプシロン-アミノ基がアシル化されると解される。
【０１６２】
本発明の目的のために、用語「アルブミン結合部分」、「延長部分」、及び「リンカー」は、これらの分子の未反応の形態及び反応後の形態を含み得る。いずれの形態を意味するかは、この用語が用いられる文脈から明らかである。
【０１６３】
ヒトインスリン又はインスリンアナログへの付加のために、脂肪酸の酸基、又は脂肪二酸の酸基の１つは、ヒトインスリン又はインスリンアナログのリシン残基のエプシロン-アミノ基と、好ましくはリンカーを介して、アミド結合を形成する。
【０１６４】
用語「脂肪二酸」は、オメガ位に追加のカルボン酸を有する上述した脂肪酸を示す。そのため、脂肪二酸はジカルボン酸である。
【０１６５】
本発明の誘導体の２つのリンカーのそれぞれは、以下の第１リンカー要素を有し得る。
【０１６６】
【化５】
2016524617.tif 000006
【０１６７】
ここで、ｋは１〜５の範囲の整数であり、ｎは１〜５の範囲の整数である。
【０１６８】
特定の態様において、k=1でn=1の場合、このリンカー要素はOEG、又は8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジ-ラジカルと示すことができ、及び／又はこれは以下の化学式で表され得る。
化学式 II：  NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
【０１６９】
別の特定の態様において、本発明の誘導体のそれぞれのリンカーは、独立に、第２リンカー要素、好ましくはGluジ-ラジカル、例えば以下の化学式III及び／又はIVを含む。
【０１７０】
【化６】
2016524617.tif 000007
【０１７１】
ここで、Gluジ-ラジカルをp回含むことができ、pは１〜３の範囲の整数である。
【０１７２】
化学式IIIは、別のリンカー要素又はリシンのエプシロン-アミノ基への結合に、アミノ酸のグルタミン酸のガンマ-カルボキシ基が用いられるという事実により、ガンマ-Glu、又は単にγGluとも示すことができる。上述したように、他のリンカー要素は、例えば、別のGlu残基、又はOEG分子であってもよい。Gluのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基と、又は、例えば、もし存在する場合、OEG分子のカルボキシ基と、又は、もし存在する場合、例えば別のGluのガンマ-カルボキシ基と順にアミド結合を形成する。
【０１７３】
化学式IVは、別のリンカー要素、又はリシンのエプシロン-アミノ基への結合に、アミノ酸のグルタミン酸のアルファ-カルボキシ基が用いられるという事実により、アルファ-Glu、又は単にαGlu、又は単純にGluとも示され得る。
【０１７４】
上述した化学式III及び化学式IVの構造は、GluのL-型とD-型を含む。特定の態様において、化学式III及び／又は化学式IVは独立に、a) L-型、又はb) D-型である。
【０１７５】
さらなる別の特定の態様において、リンカーはa)５〜４１個のC原子、及び／又はb)４〜２８個のヘテロ原子を有する。
【０１７６】
ここで、インスリンペプチドの命名は、本明細書においてGLP-1ペプチドに関して上記で説明したように行われる。名称は、親ペプチド、例えばヒトインスリンに対する変異及び修飾（例えばアシル化）として付けられる。
【０１７７】
一例は、配列／構造を以下に示す、実施例３（特許出願WO 2009/115469中の実施例９も参照）のアシル化インスリンペプチドインスリン１はであり、これは「N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル][GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)」と名付けられ、ヒトインスリンのＡ鎖の１４位のアミノ酸チロシンがアミノ酸グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥと略される）に変異していることを示し、ヒトインスリンのＢ鎖の２５位のアミノ酸フェニルアラニンがヒスチジン（His又はHと略される）に変異していることを示し、ヒトインスリンのＢ鎖の３０位のアミノ酸スレオニンが欠失し、ヒトインスリンのＢ鎖の２９位のアミノ酸リシン（Lys又はKと略される）がリシン残基のエプシロン窒素で、残基[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]（代わりに、「オクタデカンジオイル-γGlu-OEG-OEG」とも示される）により、アシル化により修飾されていること（N{エプシロン-B29}と示される）を示す。
【０１７８】
【化７】
2016524617.tif 000008
【０１７９】
加えて、本発明の医薬組成物のアシル化インスリンは、「A14E, B25H, B29K(Nεオクタデカンジオイル-γGlu-OEG-OEG), desB30ヒトインスリン」又はIUPAC命名法(OpenEye, IUPAC形式)により、例えば、「N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)」と命名される。
【０１８０】
本発明の固体経口医薬組成物に使用するためのインスリンアナログの誘導体の非限定的な例としては、N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル][GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)が挙げられる。
【０１８１】
ポリペプチドと活性化ポリマー分子の結合は、任意の通常の方法、例えば、以下の参考文献（これらにはポリマー分子の活性化のための好適な方法も記載されている）に記載された方法を用いて行われる：R. F. Taylor、(1991年)、「Protein immobilisation. Fundamental and applications」、Marcel Dekker、N.Y.; S. S. Wong、(1992年)、「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」、CRC Press、Boca Raton; G. T. Hermansonら、(1993年)、「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press、N.Y.)。当業者は、用いられる活性化方法及び／又は結合化学反応が、ポリペプチドの付加基（これらのさらなる例は上述した）、及びポリマーの官能基（例えば、アミン、ヒドロキシ、カルボキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、又はハロアセテート）に応じて変化することは理解できるだろう。
【０１８２】
本明細書で使用する、「治療上有効な量の促進剤」は、経口投与により治療上有効な量の治療上の活性ペプチド成分の摂取を可能にする促進剤の量を意味する。難吸収性薬剤の胃腸吸収の向上における促進剤の有効性は、投与部位、薬剤及び促進剤に応じて変化する最適送達部位に依存することが示されている。
【０１８３】
本発明の実施形態
以下は、本発明の実施形態の非限定的な例である。
【０１８４】
1. a) インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドである活性ペプチド成分、
b) カプリル酸ナトリウム等のカプリル酸の塩、
c) ボーマン・バーク阻害剤(BBI)、及び
d) 例えばソルビトールである、糖アルコール等のBBI可溶化剤
を含む固体経口医薬組成物
2. 少なくとも10 mgのカプリル酸の塩と、少なくとも1 mgのBBIが１剤形あたりに存在する、実施形態１の固体経口医薬組成物
3. 10 mg〜450 mgのカプリル酸の塩と、1 mg〜200 mgのBBIを含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
4. 10 mg〜450 mgのカプリル酸の塩と、10 mg〜200 mgのBBIを含む、上記いずれか一つの上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
5. 10 mg〜275 mgのカプリル酸の塩と、1 mg〜200 mgのBBIを含む、実施形態１〜３のいずれか一つの固体経口医薬組成物
6. 10 mg〜275 mgのカプリル酸の塩と、10 mg〜200 mgのBBIを含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
7. 10 mg〜450 mgのカプリル酸の塩と、10 mg〜50 mgのBBIを含む、実施形態１〜４のいずれか一つの固体経口医薬組成物
8. 10 mg〜275 mgのカプリル酸の塩と、約50 mgのBBIを含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
9. 約275 mgのカプリル酸の塩と、10 mg〜50 mgのBBIを含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
10. 10 mg〜400 mgのBBI可溶化剤を含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
11. 100 mg〜275 mgのソルビトールを含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
12. カプセルに含まれる粉末又は顆粒の形態である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
13. カプセルが１０００ｍｇまでの粉末、例えば６５０ｍｇまでの粉末を含む、実施形態１２の固体経口医薬組成物
14. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１】
2016524617.tif 000009
15. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表２】
2016524617.tif 000010
16. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表３】
2016524617.tif 000011
17. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表４】
2016524617.tif 000012
18. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表５】
2016524617.tif 000013
19. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表６】
2016524617.tif 000014
20. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表７】
2016524617.tif 000015
21. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表８】
2016524617.tif 000016
22. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表９】
2016524617.tif 000017
23. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１０】
2016524617.tif 000018
24. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１１】
2016524617.tif 000019
25. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１２】
2016524617.tif 000020
26. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１３】
2016524617.tif 000021
27. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１４】
2016524617.tif 000022
28. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１５】
2016524617.tif 000023
29. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１６】
2016524617.tif 000024
30. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１７】
2016524617.tif 000025
31. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１８】
2016524617.tif 000026
32. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表１９】
2016524617.tif 000027
33. 実施形態１〜１３のいずれか一つの固体経口医薬組成物は、以下を含む:
【表２０】
2016524617.tif 000028
34. カプセルがハードカプセルである、実施形態１２又は１３の固体経口医薬組成物
35. さらにコーティングを含む、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
36. コーティングが腸溶性コーティングである、実施形態１５の固体経口医薬組成物
37. BBIが植物から単離される、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
38. BBIがマメ科植物から単離される、実施形態１〜１７のいずれか一つの固体経口医薬組成物
39. BBIがダイズから単離される、実施形態１〜１７のいずれか一つの固体経口医薬組成物
40. BBIが凍結又はスプレー乾燥される、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
41. BBIの純度が少なくとも９０％である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
42. BBIが組換え技術により生産される、実施形態１〜１６、２０、及び２１のいずれか一つの固体経口医薬組成物
43. インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドがアシル化されている、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
44. 活性ペプチド成分がアシル化されたインスリンペプチドである、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
45. インスリンペプチドが、N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
46. インスリンペプチドが以下の群から選択される、実施形態１〜４４のいずれか一つの固体経口医薬組成物
N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)； N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)； N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)； N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)； N{エプシロン-B29}-テトラデカノイル-des-ThrB30-インスリン(ヒト)； N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-des-ThrB30-インスリン(ヒト), N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)； N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)； 及びN{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
47. 活性ペプチド成分がアシル化されたGLP-1ペプチドである、実施形態１〜４４のいずれか一つの固体経口医薬組成物
48. GLP-1ペプチドが、N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-26}-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル],N{エプシロン-37}-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；及びN{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-37}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチドから選択される、実施形態47の固体経口医薬組成物
49. GLP-1ペプチドがN{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチドである、実施形態４８の固体経口医薬組成物
50. BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)が45:1以下である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
51. BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)が30:1以下である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
52. BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)が9:1以下である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
53. BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)が5.5:1以下である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
54. BBIに対するカプリル酸の塩の比(w/w)が約1:1以下である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
55. 錠剤に含まれる粉末である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
56. カプセルに含まれる粉末の形態である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
57. カプセルに含まれる顆粒の形態である、上記いずれか一つの実施形態の固体経口医薬組成物
【実施例】
【０１８５】
一般手順
以下の実施例は詳細説明のためのものであり、限定するものではない。
【０１８６】
略語一覧
HCl: 塩化水素
MeCN: アセトニトリル
OEG: [2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチルカルボニル
RPC: 逆相クロマトグラフィー
RT: 室温
TFA: トリフルオロ酢酸
DMSO: ジメチルスルホキシド
GI: 胃腸 
TRIS: トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
CH3CN: アセトニトリル
BSA : ウシ血清アルブミン
HEPES: 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HBSS: ハンクス平衡塩溶液
Tween 20: ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート20
LOCIアッセイ: 発光酸素チャネリングイムノアッセイ
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
FPLC: 高速タンパク質液体クロマトグラフィー
RP: 逆相
UV: 紫外(光)
LC-MS: 液体クロマトグラフィー質量分析
MALDI MS: マトリックス支援レーザー脱離質量分析法
NMR: 核磁気共鳴
TLC: 薄層クロマトグラフィー
GLP-1: グルカゴン様ペプチド-1
GI液: 胃腸液
HI: ヒトインスリン
BBI: ボーマン・バーク阻害剤
【０１８７】
一般的な調製方法
インスリンペプチド及びGLP-1ペプチドを、当業者に公知の方法、例えば、WO 2009/115469、WO.2006/097537、及びWO 2011/080103の実施例に記載された方法に従って調製した。
【０１８８】
通常、インスリンペプチド及びGLP-1ペプチドは、組み換え体発現、例えばE. coli (FEBS Lett. 1997, 402, 124)又はS. cerevisae(Protein Sci. 2013, 22, 296-305)によって調製できる。代わりに、インスリンペプチド及びGLP-1ペプチドは、固相又は液相合成のいずれかを用いる、完全な化学合成(J Am Chem Soc. 2013, 135, 3173-85. )によっても調製でき、又は、組み換え体発現と化学合成との組み合わせ(例えば、WO 2009/083549に記載されている)によっても調製できる。インスリン及びGLP-1ペプチドによる修飾は、標準のアシル化技術 （例えば、WO 2010/029159及びWO 2013/098191に記載されている) により行った。
【０１８９】
カプリル酸は、出発原料としてヤシ油を用いて製造した。カプリル酸をNaOHと混合した。この溶液をスプレー乾燥してカプリル酸ナトリウム粉末を得た。最後に、スプレー乾燥したカプリル酸ナトリウムを、ローラー圧縮機を用いて乾燥造粒した。
【０１９０】
ボーマン・バーク阻害剤を、Sigma-Aldrichから入手し、使用する前にさらに精製した(実施例１を参照)。
【０１９１】
通常、ボーマン・バーク阻害剤は、特許文献に記載されているように、植物材料から精製するか、又は組換え体発現系から精製することができる。
【０１９２】
精製
インスリンペプチド又はGLP-1ペプチドの典型的な精製方法：
用いられるHPLCシステムは、Model 215 Liquidハンドラー、Model 322-H2ポンプ及びModel 155 UV検出器を備える、Gilsonシステムであった。典型的には210 nm及び280 nmで検出を行った。
The Akta Purifier FPLCシステム(GE)は、以下を備えていた: Model P-900ポンプ、Model UV-900 UV検出器、Model pH/C-900 pH及び導電率検出器、Model Frac-950フラクションコレクター。典型的には214 nm、254 nm、及び276 nmでUV検出を行った。
【０１９３】
酸性HPLC:
カラム:         Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
流速:           8 ml/分
バッファA:     0.1% TFA アセトニトリル溶液
バッファB:     0.1% TFA 水溶液
グラジェント:
0.0 - 5.0 分:     10% A
5.00 - 30.0 分:  10% A〜90% A
30.0 - 35.0 分:  90% A
35.0 - 40.0 分:  100% A
【０１９４】
中性HPLC:
カラム:         Phenomenex, Jupiter, C4 5μm 250 x 10.00 mm, 300 Å
流速:           6 ml/分
バッファA:     5 mM TRIS, 7.5 mM (NH4)2SO4, pH = 7.3, 20% CH3CN
バッファB:     60% CH3CN, 40% 水
グラジェント:
0 - 5 分:               10% B
5 - 65 min:             10- 90% B
65 - 69 min:     90% B
69 - 80 min:     90% B
【０１９５】
脱塩:
カラム:         HiPrep 26/10
流速:           10 ml/分, 6 カラム容量
バッファ:       10 mM NH4HCO3
【０１９６】
インスリン／GLP-1ペプチド及びBBIの検出及び特性評価の一般的方法
インスリン及び／又はGLP-1ペプチド及び／又はBBIの同定及び精製を、典型的には、RP-HPLC解析、LC-MS解析、及び／又はMALDI MS解析で行った。RP-HPLCシステムは、Acquity UPLCコンポーネント、オートサンプラー(Model Acq-SM)、ポンプ(Model Acq-BSM)、カラムオーブン(Model Acq-SM)及び検出器(Model Acq-TUV; Waters, Milford, MA)を備えていた。種々のRP-HPLCカラム及びバッファ組成物が、適切な分離を達成するのにこのシステムで用いることができ、例えば、Acquity BEH 1.7 μM C18 1x50 mmカラム(Waters)には、0.2 M硫酸ナトリウム、0.04Mリン酸ナトリウム、pH=7.2のアセトニトリル溶液の直線勾配が適用された。ピークは、典型的には、例えば220 nmでのUV吸収により検出され、適切な標準（例えば、インスリン解析においてはヒトインスリン等）を用いて定量した。
【０１９７】
Waters Acquity UPLCシステム(Waters)のLC-MSシステムは、オートサンプラー(Model Acq-SM)、ポンプ(Model Acq-BSM)、カラムオーブン(Model Acq-SM)、検出器(Model Acq-TUV)、及びLTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher)を備えていた。RP-HPLC分離は、CSH C18カラム(Waters, 1x150 mm)を用いて、0.1 ml/分の流速、４５℃で、0.1%ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配により達成された。
【０１９８】
インスリンペプチド、GLP-1ペプチド、及びBBIは、典型的には酸として説明されたが、用いられる精製手順及び／又はストック溶液を調製する際に適用されるバッファに基づいて、これらの化合物の様々な塩形態が存在したことが理解される。こうした塩としては、これらに限定されないが、ナトリウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、重炭酸塩等が挙げられる。
【０１９９】
実施例1：BBIの精製
Sigma社から入手したBBI（すべてのBBI関連種）の純度（実施例２に記載の方法により測された）は、バッチに応じて変化するが、５０〜７０％の範囲であった。そのため、以下のRP-HPLC手順により、使用する前にBBIをさらに精製した。
装置：Akta
カラム：Gemini_NX_5μ_C18_110Å カラム(Phenomenex,Torrance, CA, USA, 176.7 ml)
平衡化溶媒：5 v/v % アセトニトリル、0.1 v/v % TFA
溶出溶媒：アセトニトリル中の0.1 v/v % TFA
流速：10 ml/分
グラジェント：25カラム容量当たり0% - 20%溶出溶媒
【０２００】
純粋なBBIを含む画分を合わせて、水で2倍希釈して凍結乾燥させた。典型的には、BBIに関連しないすべての不純物をこの精製手順により除去し、LC-MS解析により測定されるいくつかの切断形態のみを含む本質的に純粋なBBIが得られた。精製後のBBI純度(すべてのBBI関連種)は少なくとも90%であった。
【０２０１】
実施例2：BBIの解析 − 純度、完全性
BEH Shield RP18 2,1mm x 150mm - 1,7μm, 130Åカラム(Waters)を備えるUPLCシステム(Waters, Milford, MA)を用いて画分を解析し、６０℃で、以下のグラジェントを用いる0.1 % TFA中のアセトニトリルの直線勾配で溶出した。
【０２０２】
【表２１】
2016524617.tif 000029
【０２０３】
この方法において、BBIは単一のピークとして溶出された。BBIの純度を、215nm（又は280nm）のUV曲線を積分し、BBIに対応するピーク面積を、BBI及び不純物に対応するピーク面積の合計で割ることにより求めた。結果を％で表した。BBI含有量は、特定の波長におけるBBIの拡張係数（extension coefficient）又は既知のBBIの量に対応するピーク面積の標準曲線のいずれかを用いて計算できる。
【０２０４】
実施例3：BBIの存在下でのGI抽出物によるインスリンペプチド分解
96ウェルプレートを、最低60分間0.4% BSA溶液でインキュベートすることによりコーティングした。各ウェルに、210μlのバッファ（0.005 % Tween 20及び0.005 % BSAを含むHBSS-HEPESバッファ、pH 6.5）、30μlの基質（バッファ中の100 μMインスリンペプチド）、及び30 μlのBBI (1%)を加えた。プレートを、GI液を加える前に６０分間、３７℃で前もってインキュベートした。30μlのGI液を加えた後、プレートを振とう器上で60分間、３７℃でインキュベートした。サンプル（40μl）を、0、3、6、10、30、及び60分で採取し、3容量の96%低温EtOH(エタノール)、1w% HCOOH(ギ酸)で反応を停止し、遠心分離した(4500 rcf、10分間、4℃)。得られたサンプルからの上清をバッファで５倍希釈し、LC-MS解析に供した。標準サンプル(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μM)を調製し、サンプルと同じに扱った。順番の最初と最後の両方で標準曲線を解析した。各試験条件での２回の繰り返しを行った。各サンプルにおいて、そのままのインスリンペプチドを測定した。結果をインキュベーション時間に対してプロットした。インスリンペプチドの半減期を、例えばGraph Pad Prismを用いる結果の非線形回帰により測定した。この半減期は、BBIを含まない場合のインスリンペプチドの半減期に対して、阻害剤が存在する場合に得られた半減期をBBIが存在しない場合に得られた半減期で割ることにより表わされた。GI液を、雄のSprague Dawleyラット(200〜250 g)から約20cmの中間の空腸断片を切除し、内部を2.5 mlの0.9%塩化ナトリウム溶液でリンスすることにより調製した。塩化ナトリウム溶液を遠沈管内で回収した（すべてのラット(20)から取り出し、4500rpmで10分間、4°Cで遠心分離した）。上清をチューブ内に等分し、-80°Cで保管した。
【０２０５】
結果を以下の表１に示す。
【０２０６】
【表２２】
2016524617.tif 000030
インスリン 1: N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 2: N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 3: N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 4: N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 5: N{エプシロン-B29}-テトラデカノイル-des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 6: N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 7: N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 8: N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 9: N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２０７】
実施例4: BBIの存在下でのGI抽出物によるGLP-1ペプチド分解
96ウェルプレートを、最低60分間0.4% BSA溶液でインキュベートすることによりコーティングした。各ウェルに、210μlのバッファ（0.005 % Tween 20及び0.005 % BSAを含むHBSS-HEPESバッファ、pH 6.5）、30μlの基質（バッファ中の100 μMのGLP-1ペプチド）、及び30 μlのBBI (1%)を加えた。プレートを、GI液を加える前に６０分間、３７℃で前もってインキュベートした。30μlのGI液を加えた後、プレートを振とう器上で60分間、３７℃でインキュベートした。サンプル（40μl）を、0、3、6、10、30、及び60分で採取し、3容量の96%低温EtOH(エタノール)、1w% HCOOH(ギ酸)で反応を停止し、遠心分離した(4500 rcf、10分間、4℃)。得られたサンプルからの上清をバッファで５倍希釈し、LC-MS解析に供した。標準サンプル(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μM)を調製し、サンプルと同じに扱った。順番の最初と最後の両方で標準曲線を解析した。各試験条件での２回の繰り返しを行った。各サンプルにおいて、そのままのGLP-1ペプチドを測定した。結果をインキュベーション時間に対してプロットした。GLP-1ペプチドの半減期を、例えばGraph Pad Prismを用いる結果の非線形回帰により測定した。この半減期は、BBIを含まない場合のGLP-1ペプチドの半減期に対して、阻害剤が存在する場合に得られた半減期をBBIが存在しない場合に得られた半減期で割ることにより表わされた。GI液を、雄のSprague Dawleyラット(200〜250 g)から約20cmの中間の空腸断片を切除し、内部を2.5 mlの0.9%塩化ナトリウム溶液でリンスすることにより調製した。塩化ナトリウム溶液を遠沈管内で回収した（すべてのラット(20)から取り出し、4500rpmで10分間、4°Cで遠心分離した）。上清をチューブ内に等分し、-80°Cで保管した。
【０２０８】
結果を以下の表２に示す。
【０２０９】
【表２３】
2016524617.tif 000031
【０２１０】
実施例5：カプリル酸ナトリウム及びBBIの存在下での粘液産生E12細胞単層を超えるインスリンペプチドの輸送
細胞培養
HT29-MTX (E12)細胞をDavid Brayden氏（University College of Dublin (Dublin, Ireland)）から戴いた。10％ウシ胎児血清(FBS)、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、及び1％非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養した。輸送アッセイのために、12ウェルのトランスウェルプレート(1.13 cm2、0.4 μm ポアサイズ)中で、105 細胞／ウェルの濃度で組織培養処理されたポリカーボネートフィルター上でE12細胞を播種した。細胞を３７℃で、5% CO2雰囲気下で培養した。培養培地を１日おきに交換した。輸送試験を培養液中で１４〜１８日後に行った。
【０２１１】
経上皮輸送
ドナーチャンバー（頂端側、アピカル側）からレシーバーチャンバー（基底側）に輸送された化合物の量を測定した。輸送試験を、輸送用バッファ中の、400μlの溶液(100μMのインスリンペプチド + 13 mMのカプリル酸ナトリウム +／- 0.2%のボーマン・バーク阻害剤(BBI))、及び0.4 μCi/μl [3H]マンニトールをドナーチャンバーに加え、1000μlの輸送用バッファをレシーバーチャンバーに加えることにより開始した。輸送用バッファは、10mMのHEPES(0.1%)を含むハンクス平衡生理食塩水溶液で構成され、化合物の追加の後pH 7.4に調整した。[3H]マンニトール（傍細胞輸送のためのマーカー）の輸送を上皮の完全性を検証するために測定した。
【０２１２】
試験の前に、上皮の両側で、輸送用バッファで６０分間E12細胞を平衡化した。次いで、バッファを除去し、試験を開始した。ドナーサンプル(20μl)を0分と試験の終わりで採取した。レシーバーサンプル(200 μl)を15分毎に採取した。5%CO2、95%O2の雰囲気下、37°で、振とうプレート(30 rpm)上で試験を行った。
【０２１３】
インスリンペプチド及びマンニトールを用いるすべてのサンプルにおいて、LOCIアッセイ及びシンチレーションカウンターをそれぞれ用いて濃度を測定した。
【０２１４】
試験の前及び間で、細胞単層の経上皮電気抵抗(TEER)を測定した。選ばれた試験において、試験後に輸送用バッファを培地に取り換えて、試験後２４時間にTEERを測定した。TEERは、Chopsticksに連結したEVOM(登録商標) Epithelial Voltohmmeterを用いて測定した。
【０２１５】
それぞれの0.2% BBIを含むか又は含まない、インスリンペプチド、カプリル酸ナトリウム、マンニトール溶液において、ドナーチャンバー（アピカル側）からレシーバーチャンバー（基底側）に輸送されたインスリンペプチドの測定量を表３に示す。
【０２１６】
【表２４】
2016524617.tif 000032
インスリン 1: N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 2: N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 3: N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
インスリン 4: N{エプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２１７】
実施例６：カプリル酸ナトリウム及びBBIの存在下での粘液産生E12細胞単層を超えるGLP-1ペプチドの輸送
細胞培養
HT29-MTX (E12)細胞をDavid Brayden氏（University College of Dublin (Dublin, Ireland)）から戴いた。10％ウシ胎児血清(FBS)、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、及び1％非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養した。輸送アッセイのために、12ウェルのトランスウェルプレート(1.13 cm2、0.4 μmポアサイズ)中で、105 細胞／ウェルの濃度で組織培養処理されたポリカーボネートフィルター上でE12細胞を播種した。細胞を３７℃で、5%CO2雰囲気下で培養した。培養培地を１日おきに交換した。輸送試験を培養液中で１４〜１８日後に行った。
【０２１８】
経上皮輸送
ドナーチャンバー（頂端側、アピカル側）からレシーバーチャンバー（基底側）に輸送されたGLP-1ペプチドの量を測定した。輸送試験を、輸送用バッファ中の、400μlの溶液(100μMのGLP-1ペプチド + 13 mMのカプリル酸ナトリウム +／- 0.2%のボーマン・バーク阻害剤(BBI))、及び0.4 μCi/μl [3H]マンニトールをドナーチャンバーに加え、1000μlの輸送用バッファをレシーバーチャンバーに加えることにより開始した。輸送用バッファは、10mMのHEPES(0.1%)を含むハンクス平衡生理食塩水溶液で構成され、化合物の追加後にpH 7.4に調整した。[3H]マンニトール（傍細胞輸送のためのマーカー）の輸送を上皮の完全性を検証するために測定した。
【０２１９】
試験の前に、上皮の両側で、輸送用バッファで６０分間E12細胞を平衡化した。次いで、バッファを除去し、試験を開始した。ドナーサンプル(20μl)を0分と試験の終わりで採取した。レシーバーサンプル(200 μl)を15分毎に採取した。5%CO2、95%O2の雰囲気下、37°で、振とうプレート(30 rpm)上で試験を行った。
【０２２０】
GLP-1ペプチド及びマンニトールを用いるすべてのサンプルにおいて、LOCIアッセイ（又はLC-MSアッセイ）及びシンチレーションカウンターをそれぞれ用いてGLP-1ペプチドの濃度を測定した。
【０２２１】
試験の前及び間で、細胞単層の経上皮電気抵抗(TEER)を測定した。選ばれた試験において、試験後に輸送用バッファを培地に取り換えて、試験後２４時間にTEERを測定した。TEERは、Chopsticksに連結したEVOM(登録商標) Epithelial Voltohmmeterを用いて測定した。
【０２２２】
それぞれの0.2% BBIを含むか又は含まない、GLP-1ペプチド、カプリル酸ナトリウム、マンニトール溶液において、ドナーチャンバー（アピカル側）からレシーバーチャンバー（基底側）に輸送されたGLP-1ペプチドの測定量を表４に示す。
【０２２３】
【表２５】
2016524617.tif 000033
GLP-1ペプチド 1: N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 2: N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 3: N{エプシロン-26}-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル],N{エプシロン-37}-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 4: N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 5: N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 6: N{エプシロン-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 7: N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 8: N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 9: N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
GLP-1ペプチド 10: N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{エプシロン-37}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
【０２２４】
実施例 7：固体製剤のためのBBIの調製
乾燥精製したBBIを、pHを8.0に調整した水に20mg/mlの濃度まで溶解させた。この溶液を短い直径のサイクロン及び0.7 mm/1.5 mmノズルを備えるBuchi Mini-Spray Dryer B-290を用いて、スプレー乾燥させた。この手順の条件は、以下であった：空気入口温度: 120°C; 溶液流速: 4 ml/分 溶液流; 窒素流速: 35 mm, アスピレータ: 100%。スプレー乾燥した粉末を固体剤形に用いた。
【０２２５】
実施例８：インスリンペプチド、カプリル酸ナトリウム（デカン酸ナトリウム）、及びBBIを含むハードカプセル
本発明のハードカプセル乾燥充填材料の製剤化を以下に示すとおりに行った。この実施例は、以下を含む本発明の製剤に関する。
インスリンペプチド        1.39 % (w/w)
BBI        8.33 % (w/w)
デカン酸ナトリウム (カプリル酸ナトリウム)   45.83 % (w/w)
ソルビトール      43.93 % (w/w) 
ステアリン酸マグネシウム        0.52 % (w/w)
【０２２６】
１８個のハードシェルカプセルの乾燥充填のための製造手順を以下のとおりに行った。
【０２２７】
製粉（粉砕）したインスリンペプチド粉末を0.25 mmのメッシュサイズの篩に通した。篩後、正確な量のインスリンペプチドを計量した。ソルビトール粉末を0.5 mmメッシュサイズの篩に通した。篩後、正確な量のソルビトールを計量した。小型容器中でインスリンペプチド及びソルビトールを混合した。インスリンペプチドの量と同等の量のソルビトールをこの小型容器に加え、手動で撹拌した。次いで、先ほどの追加量の２倍に相当する量のソルビトールを加えて、インスリンペプチドとすべてのソルビトールが十分に混合されるまで手動で撹拌した。その後、ターブラーミキサー中での機械的混合により、混合を完了し、均一な粉末を得た。その後、ローラー圧縮された顆粒形態のカプリル酸ナトリウムをインスリンペプチド-ソルビトール粉末に等容量で加え、ターブラーミキサー中での機械的混合で仕上げた。最後に、ステアリン酸マグネシウムを0.25 mmメッシュサイズの篩に通した。ステアリン酸マグネシウムを計量し、粉末に加え、ターブラーミキサー中で機械的に混合した。
【０２２８】
その後、粉末をHPMCハードカプセル、サイズ00(Quali-V, Qualicaps)に充填し、600mg/カプセルの質量を満たした。
【０２２９】
より高い濃度のBBI（例えば、33％）を含むカプセルを製造した場合、BBIの増加した容量を対応する全体のソルビトール量を減らすことにより補正をした（表５を参照）。
【０２３０】
より低い濃度のBBI（例えば、4.2%）を含むカプセルを製造した場合、減少したBBIの容量を対応する全体のソルビトール量を増加することにより補正をした（表５を参照）。
【０２３１】
より低い濃度のBBI（例えば、1.7%）を含むカプセルを製造した場合、減少したBBIの容量を対応する全体のソルビトール量を増加することにより補正をした（表５を参照）。
【０２３２】
【表２６】
2016524617.tif 000034
【０２３３】
より高い濃度のカプリル酸ナトリウム含有量（例えば、58％）を含むカプセルを製造した場合、増加した量のカプリル酸塩を対応する全体のソルビトール量を減らすことにより補正した（表６を参照）。
【０２３４】
より高い濃度のカプリル酸ナトリウム含有量（例えば、75％）を含むカプセルを製造した場合、増加した量のカプリル酸塩を対応する全体のソルビトール量を減らすことにより補正した（表６を参照）。
【０２３５】
より低い濃度のカプリル酸ナトリウム含有量（例えば、25％）を含むカプセルを製造した場合、減少した量のカプリル酸塩を対応する全体の加えるソルビトール量を増やすことにより補正した（表６を参照）。
【０２３６】
【表２７】
2016524617.tif 000035
【０２３７】
より低い濃度のBBI（例えば、1.7％）及びより高い濃度のカプリル酸ナトリウム含有量（例えば、75％）を含むカプセルを製造した場合、BBIとカプリル酸ナトリウムを組み合わせた容量の相違は、対応するソルビトールの全体量を減少させることにより補正した（表７を参照）。
【０２３８】
【表２８】
2016524617.tif 000036
【０２３９】
この実施例において上記したとおりに調製したハードシェルカプセルを腸溶性コーティングでコートした。
【０２４０】
この目的において、「ポリ(メタクリル酸-コ-エチルアクリレート)」 (製品名：Eudragit L30D55（登録商標）)と示されるコポリマーファミリーのポリマーを用いた。
【０２４１】
105.0gの水性分散体ポリ(メタクリル酸-コ-エチルアクリレート)(製品名：Eudragit L30D55（登録商標）)を適切な撹拌装置を有するビーカーに入れた。グリセロールモノステアレート、可塑剤クエン酸トリエチル、及びポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエート（15.8gのPlasAcryl T20（登録商標）の形態）、4.8gのクエン酸トリエチル、1.8gのTween 80、並びに72.6gの純水を、15.75％の全量の乾燥ポリマーに加えた。これらの成分を上記した水性分散体のポリ(メタクリル酸-コ-エチルアクリレート)(製品名：Eudragit L30D55（登録商標）)に加えた。この混合物を６０分間混合し、0.24mmのメッシュフィルターに通して塊を除去した。
【０２４２】
ハードカプセルのコーティングをパンコーター又は流動床コーターで行った。8.5’’のパンサイズを有するパンコーターにおいて、開口部が1.0mmの通常パターンのエアーシュリックスプレーノズル、0.5〜0.6 barの霧化及びパターン空気圧、35℃の入口空気温度、130 kg/時間の空気流で、ポリマー溶液をノズル中に通して噴出させることによりコーティングを行った。ハードカプセルに均等に５〜７ｗ／ｗ％のポリマーを噴霧させた後、スプレーを止めた。
【０２４３】
実施例９：GLP-1ペプチド、カプリル酸ナトリウム（デカン酸ナトリウム）、及びBBIを含むハードカプセル
本発明のハードカプセル乾燥充填材料の製剤化を以下に示すとおりに行った。この実施例は、以下を含む本発明の製剤に関する。
GLP-1ペプチド  3.39 % (w/w)
BBI 8.33 % (w/w)
デカン酸ナトリウム (カプリル酸ナトリウム)   45.83 % (w/w)
ソルビトール    41.93 % (w/w) 
ステアリン酸マグネシウム      0.52 % (w/w)
【０２４４】
手順を以下のとおりに行った。
スプレー乾燥させたGLP-1ペプチドの正確な量を計量した。ソルビトール粉末を0.5 mmメッシュサイズの篩に通した。篩後、正確な量を計量した。小型容器中でGLP-1ペプチド及びソルビトールを混合した。GLP-1ペプチドの量と同等の量のソルビトールをこの小型容器に加え、手動で撹拌した。その後、先ほどの追加量の２倍に相当する量のソルビトールを加えて、GLP-1ペプチドとすべてのソルビトールが十分に混合されるまで手動で撹拌した。その後、ターブラーミキサー中での機械的混合により、混合を完了し、均一な粉末を得た。その後、ローラー圧縮された顆粒形態のカプリル酸ナトリウムをGLP-1ペプチド-ソルビトール粉末に等容量で加えた。これを、２段階で行い、ターブラーミキサー中での機械的混合工程で仕上げた。最後に、ステアリン酸マグネシウムを0.25 mmメッシュサイズの篩に通した。ステアリン酸マグネシウムを計量し、粉末に加え、ターブラーミキサー中で機械的に混合した。その後、粉末をHPMCハードカプセル、サイズ00(Quali-V, Qualicaps)に充填し、600mg/カプセルの質量を満たした。
【０２４５】
より高い濃度のBBI（例えば、33％）を含むカプセルを製造した場合、BBIの増加した容量を対応する全体のソルビトール量を減らすことにより補正をした（表８を参照）。
【０２４６】
より低い濃度のBBI（例えば、1.7%）を含むカプセルを製造した場合、減少したBBIの容量を対応する全体のソルビトール量を増加することにより補正をした（表８を参照）。
【０２４７】
【表２９】
2016524617.tif 000037
【０２４８】
実施例10: インスリンペプチド N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)における犬 PD/PK結果
【０２４９】
カプセルの調製は実施例８に記載している。それぞれのカプセルは、8 mgのインスリンペプチド N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)を含んでいた。Harlan Gannat, Franceから入手した、入手時に約３６〜４８週齢で約９〜１１ｋｇの範囲の約８匹の雄のビーグル犬（HsdRcc:DOBE）を用いて各試験を行った。これらの動物にコーティングしたカプセルを経口投与した。t=0のサンプルを採取した後、直ぐにカプセルを投与した。カプセルを犬の口の奥に置いて、咬まないで飲み込ませた。カプセルが飲む込まれた後、シリンジで１０ｍＬの水を与えた。
【０２５０】
それぞれの動物において、完全な血漿濃度−時間プロファイルを得た。
【０２５１】
血液サンプル
各時間点において、血液の最初の一滴を廃棄した。約800μlの血液を血漿のための1.5mL EDTAエッペンドルフチューブに回収し、10μlキャピラリーチューブをグルコースのために充填した。
【０２５２】
時間点：
投与前 (0)、及び15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、270、300、360、480、600、720分、24、30、48、及び72時間
【０２５３】
頻繁なサンプリング期間の間、血液サンプルを開いたままの頭部静脈中のVenflonカテーテルから、ヘパリン生理食塩水を用いて採取した。他の血液サンプルを頸静脈から採取した。
【０２５４】
血液サンプルを最大で２０分間氷上に保持し、４℃、４分、１３００Ｇで遠心分離した。
【０２５５】
各血液サンプルから血漿を直ちに２つのマイクロチューブに移し、各チューブには80μlの血漿を入れ、−２０℃でアッセイまで保管した。
【０２５６】
10μlの血液全部を500 μlの解析用バッファに入れたサンプルを用いて、固定化グルコースオキシダーゼ法によりグルコース濃度を解析した(Biosen自動解析装置及びバッファ溶液)。
【０２５７】
血漿サンプルの解析
発光酸素チャネリングイムノアッセイ(LOCI)を用いてインスリンペプチドにおいて血漿を解析した。LOCIアッセイは、ストレプトアビジンでコートされたドナービーズと、インスリンペプチドの中間分子領域に結合するモノクローナル抗体と結合したアクセプタービーズを用いた。N-末端エピトープに特異的な、他のモノクローナル抗体をビオチン化した。アッセイにおいて、３つの反応物質をインスリンペプチドと組み合わせて、2部位化免疫複合体を形成した。この複合体に光を当てると一重項酸素原子がドナービーズより放出され、アクセプタービーズへと向けられて化学発光を発するので、これをEnVisionプレートリーダーにて測定した。光の量はインスリンペプチドの濃度に比例しており、血漿における定量下限値(LLOQ)は100pMである。
【０２５８】
WinNonlin 5.2 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)における非コンパートメント薬物動態解析により、血漿の濃度−時間プロファイルを解析した。各動物からのそれぞれの濃度−時間値を用いて計算を行った。経口生体利用効率の計算のために、ビーグル犬を用いた前の試験からのiv(i.v.)データを適用した。
【０２５９】
結果を以下の表９にまとめる。
【０２６０】
【表３０】
2016524617.tif 000038
【０２６１】
実施例11：GLP-1ペプチドにおける犬の PD/PK結果
カプセルの調製は実施例９に記載している。各カプセルは、20 mgのGLP-1ペプチド N{エプシロン-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチドを含んでいた。各試験を８匹の雄のビーグル犬で行った。
【０２６２】
動物たちに、内視鏡を用いてコーティングされていないカプセルを十二指腸に投与するか、又はコーティングされたカプセルを経口投与(PO)した。コーティングは実施例８のインスリンカプセルと同様に行った。内視鏡手順において、動物たちをメデトミジンi.v.及びプロポフォールi.v.によって鎮静化させた。カプセルを食道及び胃における液体に触れさせないで十二指腸まで確実に送達できるカスタムメイドのデバイスを備える内視鏡を用いて、カプセルを投与した。犬にメデトミジンと反作用する、沈静化のための解毒剤（アンチセダン）を投与し、i.v.プロポフォールを迅速に除去した。投与後、犬を１５〜３０分目が覚めた状態にした。PO手順において、カプセルを犬の口の奥に置いて、咬まないで飲み込ませた。カプセルの燕下を促進するためにシリンジで１０ｍＬの水を口に与えた。コーティングしたカプセルを用いるP.O.試験のために、胃酸分泌を経口錠剤の投与の前に誘導した。PO投与の20分前に4μg/kg体重（120 μg/mL）の投与量でペンタガストリンを皮下に投与した。
【０２６３】
標準的な血液サンプリング計画において、20サンプル(投与前から１１日まで)を使用して、各動物における完全な血漿濃度-時間プロファイルを得た。
【０２６４】
血液サンプル:
各時間点において、血液の最初の一滴を廃棄した。約800μlの血液を血漿のための1.5mL EDTAエッペンドルフチューブに回収し、10μlキャピラリーチューブをグルコースのために充填した。
【０２６５】
時間点: 
投与前、並びに投与後0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、及び288 時間
【０２６６】
血液サンプルを最大で２０分間氷上に保持し、４℃、４分、１３００Ｇで遠心分離した。血漿を直ちに２つのマイクロチューブに移し、各血液サンプルから各チューブに80μl の血漿を入れ、−２０℃でアッセイまで保管した。
【０２６７】
10μlの血液全部を500 μlの解析用バッファに入れたサンプルを用いて、固定化グルコースオキシダーゼ法によりグルコース濃度を解析した(Biosen自動解析装置及びバッファ溶液)。
【０２６８】
血漿サンプルの解析
発光酸素チャネリングイムノアッセイ(LOCI)を用いてGLP-1ペプチドのために血漿を解析した。LOCIアッセイは、ストレプトアビジンでコートされたドナービーズと、GLP-1ペプチドの中間分子領域に結合するモノクローナル抗体と結合したアクセプタービーズを用いた。N-末端エピトープに特異的な、他のモノクローナル抗体をビオチン化した。アッセイにおいて、３つの反応物質をGLP-1ペプチドと組み合わせて、2部位化免疫複合体を形成した。この複合体に光を当てると一重項酸素原子がドナービーズより放出され、アクセプタービーズへと向けられて化学発光を発するので、これをEnVisionプレートリーダーにて測定した。光の量はGLP-1ペプチドの濃度に比例しており、血漿における定量下限値(LLOQ)は100pMである。
【０２６９】
Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)における非コンパートメント薬物動態解析により、血漿の濃度−時間プロファイルを解析した。各動物からのそれぞれの濃度−時間値を用いて計算を行った。経口生体利用効率の計算のために、ビーグル犬を用いた前の試験からのivデータを適用した。
【０２７０】
結果を表10にまとめる。
【０２７１】
【表３１】
2016524617.tif 000039
【０２７２】
【表３２】
2016524617.tif 000040
【０２７３】
実施例12: インスリン錠剤（タブレット）の調製 
インスリン、ボーマン・バーク阻害剤、及びナトリウムのカプリル酸の塩 (デカン酸ナトリウム)を含む、錠剤コア材料の処方、錠剤コアの圧縮、及びタブレットのコーティング
【０２７４】
錠剤コア材料の処方を以下に示したとおりに行った。この実施例は、以下の成分を含む本発明の処方に関する。
インスリン                 1.09 % (w/w)
デカン酸ナトリウム (ナトリウムのカプリル酸の塩)   72.37 % (w/w)
ソルビトール                                 19.49 % (w/w)
ボーマン・バーク阻害剤                      6.58 % (w/w)
ステアリン酸                                0.47 % (w/w)
【０２７５】
手順を以下のとおりに行った：
インスリン粉末を0.3mmのメッシュサイズの篩で篩った。篩後、正確な量のインスリンを計量した。ソルビトール粉末をメッシュサイズ0.5mmの篩を用いて篩った。篩後、正確な量を計量した。
【０２７６】
小型容器内にインスリンとソルビトールを混合した。インスリンの量と同等の量のソルビトールをこの小型容器に加え、手動で撹拌した。その後、先ほどの追加量の２倍に相当する量のソルビトールを加えて、インスリンとすべてのソルビトールが十分に混合されるまで手動で撹拌した。その後、ターブラーミキサー中での機械的混合により、混合を完了し、均一な粉末を得た。ボーマン・バーク阻害剤をこの混合物に加え、手動で混合した。
【０２７７】
その後、ローラー圧縮された顆粒形態のナトリウムのカプリル酸の塩を、インスリン-ソルビトール粉末に等容量で加えた。これを、２段階で行い、ターブラーミキサー中での機械的混合工程で仕上げた。
【０２７８】
最後に、ステアリン酸マグネシウムを0.3 mmメッシュサイズの篩を用いて篩った。ステアリン酸を計量し、粉末に加え機械的に混合した。
【０２７９】
その後、ロータリー打錠機で粉末を圧縮し、760mgの質量の錠剤を形成した。
【０２８０】
上述した錠剤コアをポリマー腸溶性コーティングでコーティングした。
【０２８１】
8.5’’のパンサイズを有するパンコーターにおいて、開口部が1.0mmの通常パターンのエアーシュリックスプレーノズル、0.55 barの霧化及びパターン空気圧、36℃の入口空気温度、100 m3/時間の空気流で、ポリマー溶液をノズル中に通して噴出させることによりコーティングを行った。錠剤コアに均等に７〜８ｗ／ｗ％のポリマーを噴霧させた後、コーティングを止めた。
【０２８２】
腸溶性コーティングの適用の完了後、錠剤間の粘着を避けるために、生成物をコーティング装置内に低回転で5分間保持して２８℃より下まで冷却した。
【０２８３】
生成物をコーティング装置から除いた後、生成物を40℃の加熱キャビネット内で２時間保持して、上昇した温度に晒してポリマーを硬化させた。
【０２８４】
実施例13: 錠剤形態のインスリンペプチド N{エプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト) における犬のPD/PK結果
【表３３】
2016524617.tif 000041
【０２８５】
本発明の所定の特徴は、上記に例証し、説明したが、多くの改良、置換、変更、及び同等物が、当業者のにおいてなされ得る。そのため、本願の特許請求の範囲は、本発明の本質的な精神の範囲内で、すべてのそうした改良及び変更を保護することが意図される。
【配列表】
2016524617000001.app
【国際調査報告】
2016524617.tif 000042
2016524617.tif 000043
2016524617.tif 000044