(57)【要約】  本発明は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類、より具体的には、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）またはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞壁の最適な破壊方法であって、微細藻類バイオマスを処理するために、超高圧ホモジナイズ技術を実施する工業的規模の最適な破壊方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラ属の微細藻類の細胞壁を工業的規模で破壊する方法であって、前記細胞壁の破壊を高圧ホモジナイズにより実施する方法において、前記高圧ホモジナイズを、
３００〜４００ＭＰａの圧力下、少なくとも１回のパス、または
１５０〜３００ＭＰａの圧力下、少なくとも２回の連続するパス、
４〜４０℃の供給温度で、かつ
１５重量％〜５０重量％の固形分を含む微細藻類細胞のバイオマスにより、
細胞壁の破壊度が８０％を超え、生成されるエマルションの粒子径が１μｍ未満であり、かつ微生物負荷の減少が１０００倍であることを保証する方法で実施することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記クロレラ属の微細藻類は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、特にクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エマルション１ｇ当たりの全微生物が１０未満である微生物負荷を保証することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記高圧ホモジナイズは、３００〜４００ＭＰａの圧力下、１回のパスにより実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記高圧ホモジナイズは、１５０〜２５０ＭＰａの圧力下、２回、３回、４回または５回の連続のパスにより実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記高圧ホモジナイズは、１５０〜２５０ＭＰａの圧力下、２回の連続のパスにより実施されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２回の連続のパスの圧力は、同じであっても異なってもよい、請求項１〜３および５〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記供給温度は２０〜４０℃であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微細藻類バイオマスは、乾燥重量で少なくとも１０％の脂質を含み、好ましくは、乾燥重量で、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％または６０％の脂質を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
微細藻類の粉末を調製する方法であって、微細藻類バイオマスの生産、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法による細胞壁の破壊、および前記バイオマスの乾燥、特にスプレー乾燥による乾燥を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により得られる微細藻類の粉末であって、前記方法が、１５０〜３００ＭＰａの圧力下、少なくとも２回の連続するパスを含む粉末。
【請求項１２】
微細藻類の粉末を調製するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微細藻類の細胞壁を破壊する方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類、より具体的には、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）またはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の細胞壁に対する工業規模での最適な破壊方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）は、タンパク質およびその他の必須栄養素に富むため、潜在的な食料源であることは当業者によく知られている。
【０００３】
それらは、具体的には、タンパク質４５％、脂肪２０％、炭水化物２０％、繊維５％、ならびにミネラルおよびビタミンを１０％含有する。
【０００４】
クロレラを食品中で効率的に使用するためには、消化および吸収速度が促進されるよう、「細胞の破壊」を利用することが多い。
【０００５】
微細藻類のこの「細胞の破壊」については、以下に示すような各種の技術を用いるものが、特許文献および非特許文献に十分に記載されている。
−物理的技術（超音波、マイクロビーズ、ヒートショック、高圧など）
−化学的技術（酸、アルカリ、親水性有機溶媒など）
−酵素的技術（セルラーゼ、リパーゼなど）。
【０００６】
しかしながら、これらの各種の機械的、化学的または酵素的選択肢を選択しても、工業規模への大規模化は、一般にそれほどの成功を収めることはできず、基本的に実験室規模で記載されている。
【０００７】
さらに、細胞壁が特に高い機械的強度を有する場合（クロレラ属では特に）、また培地中の細胞密度が高い場合（＞１００ｇ／ｌ）、技術の選択は非常に限られてくる。
【０００８】
これに、大規模化という工業的問題（高生産能、信頼性、操業コスト、投資コストなど）も加わると、現実的な機械的方法の選択肢は、実質的にマイクロビーズを使用する粉砕と高圧技術に絞られる。
【０００９】
高圧ホモジナイズによる従来の細胞破壊技術、すなわち本発明が取り組んでいる分野は、例えば、中国特許第１０２４３３０１５号明細書（単細胞ランソウ類からのシアニンの抽出について）、中国特許第１０１８１７７３８号明細書（ＤＨＡ産生微生物からのＤＨＡの抽出について）、米国特許第５  ８８５  ５６４号明細書（リン脂質およびフッ化炭素を含む、酸素含有組成物を得るための）、または中国特許第１０１３５２２４９号明細書（微細藻類バイオマスからの脂質およびタンパク質成分の抽出について）に記載されている。
【００１０】
動的高圧ホモジナイズとしても知られている、高圧ホモジナイズ（以下、本開示では「ＨＰＨ」という）は、従来機より１０〜１５倍の圧力に達することができる、新世代のホモジナイザーの開発によって提案されている。
【００１１】
「破壊」される細胞物質の性質を考えると、ＨＰＨにより、実質的に細胞残屑、細胞内
水性液体および油の混合物からなるエマルションが生成される。
【００１２】
１９８０年代初頭に、微細エマルションの製造に対して新たな技術が提案されたが、これは、非常に高い圧力、すなわち１００ＭＰａ超３００〜５００ＭＰａ以下の圧力を液体中で発生かつ管理できる装置が利用可能になったこと、そしてまたホモジナイズチャンバーに新たな設計がなされたことによる。
【００１３】
こうして、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ、ＡＶＰ、ＡｖｅｓｔｉｎまたはＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉなどの、様々な高圧ホモジナイザーメーカーから、試作品または工業規模の装置が提案されている。
【００１４】
概念的には、基本的なホモジナイザーは、圧力増幅装置に連結された容積式ポンプなどの高圧発生装置で構成されており、圧力増幅装置から特殊な設計の１組のホモジナイズバルブを通して流体を押し出すものである。
【００１５】
処理流体の急速な加圧（３５０ＭＰａ以下）により、約３℃／１００ＭＰａの温度上昇が引き起こされるが、ホモジナイズバルブで生じる瞬時の圧力降下では、より大きな温度上昇（１５〜２０℃／１００ＭＰａ）がもたらされる。
【００１６】
第１の工程で生成する可能性のある凝集物を破壊するために、圧力降下がはるかに少ない二次バルブをメインバルブに並置することができる。
【００１７】
入口温度および操作圧力レベルに応じて最終温度が高くなることを考えると、被処理製品の熱不安定成分を維持する優れた方法は、処理流体の急速な冷却である。
【００１８】
これらの動的高圧操作では特に、流体は非常に短時間（１〜１０秒間）高圧に曝露される。
【００１９】
この間に、流体は増幅装置から破壊バルブへ流れなければならない。破壊操作は、高圧に曝露することによってではなく、調節可能な制限オリフィスを備えた放出弁を介してプロセス流体を高圧下で通過させることにより主として調節される。
【００２０】
ホモジナイズバルブの形式がいかなるものであっても、高圧下で処理される液体は、「ホモジナイズ部」と呼ばれる収束部を通過し、その後拡張して流れる。
【００２１】
圧力はアクチュエーターにより制御され、それによりバルブに作用する力を調節することができる。
【００２２】
したがって、効率的であるためには、このＨＰＨ技術は精密に制御されなければならず、かつ所期の目的に応じて調節されなければならない。
【００２３】
それ故、例えば、微細藻類をより消化し易くするために、またはその目的成分を放出させるために、微細藻類細胞壁を破壊する手段としてＨＰＨを使用するとともに、他の用途は微生物による汚染除去に関係する。
【００２４】
この分野では、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｌｔｄ社が、ホモジナイザーバルブの設計に関して顕著な改善を行っており、この改善は、流体の圧力レベルを３５０ＭＰａにまで増圧させることにより、エマルションまたはバイオポリマーのテクスチャーを改質して、その場での製品の滅菌を可能とするものである。
【００２５】
上記のこと全てから、この細胞破壊技術の有効な工業的大規模化を意図したとき、ＨＰＨ技術が有望であるように思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
しかしながら、この技術を微細藻類一般の、特にクロレラの細胞破壊に適用する必要があるとき、多くの問題が生じる。
【００２７】
ＨＰＨによるクロレラバイオマスの処理に関する第１の問題は、生成されるエマルションの性質と結びついている。
【００２８】
このエマルションの安定性は、とりわけ、界面に存在する分子に、そしてまたホモジナイズ技術による乳化に依存する。
【００２９】
一般に、前記エマルションの安定性は、そのエマルションを多くの食品に適用して使用するためには、不可欠である。
【００３０】
第２の問題は、前記エマルションの乾燥に関する。
【００３１】
実際、このエマルションを乾燥させた場合（例えば、噴霧乾燥によって）、エマルションの細かさが、粉末の流動特性、脂質のカプセル化特性、および酸化に対する安定性を決定する。
【００３２】
意図する用途によれば、最終製品は使用が一層容易になる。
【００３３】
十分に微細でかつ安定なエマルションを生成させるには、乳化に必要なエネルギーは、マトリックスによっては非常に大きくすることができる。
【００３４】
第３の問題は、クロレラ発酵マストなどの湿潤バイオマスを微細化／精製化処理するときに観察される微生物の品質の問題である。
【００３５】
微細化／精製化手順が非無菌環境で実施される場合、微生物汚染の進行を制限するために特定の予防措置を取らなければならない（例えば、冷凍処理、中間貯蔵段階持続時間の制限など）。
【００３６】
しかしながら、これらの予防手段は不十分であり、最終製品を生成する最終工程の中で、殺菌／滅菌工程が必要になることがある。
【００３７】
これらの３つの問題に直面すれば、当業者は、適切な技術と共に、粉砕工程、殺菌／滅菌工程およびホモジナイズ工程を連続して実施する手の掛かる方法に頼らざるを得ない。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
こうした制約を克服するために、出願人は、これら３つの処理を同時に適切に実施し、これにより一連の操作を大幅に単純化できるよう、非常に高い圧力（すなわち超高圧）技術の制御について研究することを選択した。
【００３９】
より具体的には、出願人は、従来当業者が別々に検討していたＨＰＨ技術の、２つの異なる応用分野を利用することにした。
【００４０】
第１の分野は、一般にエマルションの調製または安定化のために、ナノ粒子もしくはナ
ノ懸濁液型の調製のために、または粘度およびテクスチャーを変化させるために記載され使用される、懸濁液またはエマルションの粒子、液滴またはミセルの細径化および粒子径分布の先鋭化などの、ＨＰＨ技術によってもたらされる物理的変化に関する。
【００４１】
第２の分野は、食品および医薬品中の微生物負荷を低減させるためにＨＰＨが一般に使用されているバイオテクノロジーや製薬業界において、一般に細胞内物質の回収に適用される、ＨＰＨにより引き起こされる細胞「破壊」による効果を中心とするものである。
【００４２】
したがって、ＨＰＨをこのようにして実施すれば、以下のことに付随する問題に対処するために、この技術により提供されるあらゆる機能の利点を利用しながら、微細藻類の細胞を破壊するのにＨＰＨを単独で効率的に使用することができる：
−エマルションの製造、
−前記エマルションの乾燥
−溶解したバイオマスの微細化／精製化工程における潜在的な微生物汚染の存在。
【００４３】
また、微細藻類の細胞を効率的に破壊するために、ＨＰＨを、先行技術に記載されているような他の技術（微細藻類の細胞壁を分解する特定の酵素を使用する技術など）と組み合わせる必要をなくすことができる。
【００４４】
したがって、本発明は、クロレラ属の微細藻類の細胞壁を工業的規模で破壊する方法であって、細胞壁の破壊を高圧ホモジナイズにより実施する方法において、高圧ホモジナイズを、
−３００〜４００ＭＰａの圧力下、少なくとも１回のパス、または
−１５０〜３００ＭＰａの圧力下、少なくとも２回の連続するパス、および
−４〜４０℃の供給温度で、
細胞壁の破壊度が８０％超、生成されるエマルションの粒子径１μｍ未満、および微生物負荷の減少、特に１０００倍または１００００倍の減少を保証する方法で実施することを特徴とする方法に関する。
【００４５】
特に、本方法は、エマルション１ｇ当たり１０未満の総微生物負荷を保証する。
【００４６】
好ましくは、高圧ホモジナイズは、１５重量％〜５０重量％の固形分を含む微細藻類細胞のバイオマス、特に、微細藻類細胞の乾燥重量で、１５％〜５０％のバイオマスに対して実施される。
【００４７】
クロレラ属の微細藻類は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択されることが好ましく、より具体的には、クロレラ・プロトセコイデスであることが好ましい。好ましくは、微細藻類バイオマスは、少なくとも脂質の乾燥重量で１０％含み、好ましくは、少なくとも乾燥重量で２０％、３０％、４０％、５０％または６０％の脂質を含む。
【００４８】
特定の一実施形態では、供給温度は２０〜４０℃である。
【００４９】
好ましい一実施形態では、高圧ホモジナイズは３００〜４００ＭＰａの圧力下、１回のパスにより実施される。
【００５０】
別の好ましい一実施形態では、高圧ホモジナイズは、１５０〜３００ＭＰａの圧力下、好ましくは、１５０〜２５０ＭＰａの圧力下、２回、３回、４回または５回の連続のパス
により実施される。特に、高圧ホモジナイズは１５０〜２５０ＭＰａの圧力下、２回連続のパスにより実施される。２回連続のパスの圧力は、同じであっても異なってもよい。
【００５１】
本発明はまた、好ましくはクロレラ属の微細藻類、特にクロレラ・プロトセコイデスの粉末の調製方法であって、微細藻類バイオマスの生産、本発明の方法による細胞壁の破壊、およびバイオマスの乾燥、特にスプレー乾燥による乾燥を含む方法に関する。
【００５２】
本発明はまた、本方法により得られる微細藻類の粉末に関する。本方法は、１５０〜３００ＭＰａの圧力下、少なくとも２回の連続するパスを含むことが好ましい。
【００５３】
最後に、本発明は、上記のような微細藻類の粉末を調製するための、本発明の微細藻類の細胞壁を破壊する方法の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】圧力（１００ＭＰａ／１５０ＭＰａ）およびパスの回数に応じた破壊度の評価。
【図２】１回のパスにおける圧力に応じた破壊度の評価。
【図３】２回の連続のパスにおける圧力に応じた破壊度の評価。
【図４】供給時の製品温度の関数としての破壊度の評価。
【図５】ボールミリングで得られたエマルションの顕微鏡観察（倍率×７６０、スケール：バー＝２０μｍ）。１−白色光２−ナイルブルー染色および蛍光
【図６】３５０ＭＰａのＨＰＨ破壊により得られたエマルションの顕微鏡観察（倍率×７６０、スケール：バー＝２０μｍ）。１−白色光２−ナイルブルー染色および蛍光
【図７】ボールミリングまたはＨＰＨにより製造されたエマルションの、初期バイオマスと比較した粒子径の分析。
【図８】ＨＰＨにより製造されたエマルションの、加えられた圧力に応じた粒子径分析。
【図９】２５０ＭＰａにおける１回または２回のパスのＨＰＨにより製造されたエマルションの粒子径分析。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
出願人は、クロレラ属の微細藻類の細胞壁を破壊する、非常に高圧（または超高圧）のホモジナイズ技術を適切に実施することにより、所望の粉砕の品質を達成できることを見出した。
【００５６】
この適切な実施とは、微細藻類、この場合はクロレラ・プロトセコイデスのモデルに適合した、ＨＰＨを実施するための各パラメータに関する研究と最適化を意味するものと理解される。
【００５７】
本発明の好ましい微細藻類は、従属栄養条件下（炭素源としての糖、および暗所で）で成長することができる。出願人は、クロレラ属の脂質に富む微細藻類を選択することを推奨する。使用される微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の一種、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ルテオビリディス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕ
ｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・レイシグリィ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ）、パラクロレラ・ケスレリ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、パラクロレラ・ベイエリンキイ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉｉ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ）およびプロトテカ・モリホルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）から選択し得るが、これらに限定されるものではない。本発明で使用される微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス種に属するものであることが好ましい。
【００５８】
そうしたバイオマスを生産するために、微細藻類は液体培地中で培養される。本発明においては、微細藻類は、炭素源および窒素源を含む培地中、暗所で培養される（従属栄養条件）。固体および液体増殖培地は、一般に文献で入手することができ、非常に多様な微生物株に適した、特定の培地を調製するために推奨されるものは、例えば、テキサス大学オースティン校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ）が、その藻類カルチャーコレクション（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｇａｅ）（ＵＴＥＸ）について運営しているウェブサイトｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／から、オンラインで見出すことができる。バイオマスの生産は発酵槽（またはバイオリアクター）内で行われる。
【００５９】
微細藻類の増殖および脂質の効率を改善するために、バイオリアクター、培養条件、ならびに従属栄養増殖および増殖方法の具体例を、任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【００６０】
超高圧ホモジナイズ法が適用されるバイオマスは、乾燥重量で１５％〜５０％の固形分を有することが好ましい。特に、固形分は２５％〜４５％、好ましくは３５％〜４５％であってもよい。超高圧ホモジナイズを適用する前に、バイオマスは、洗浄され、濃縮されることが好ましい。好ましい一実施形態では、固形分に言及されるとき、それは乾燥重量による微細藻類細胞の含有率を意味する。
【００６１】
さらに、微細藻類バイオマスの脂質含有率は、最小値が少なくとも乾燥重量で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％、例えば２０％〜８０％または３０％〜７０％であることが好ましい。
【００６２】
加えられた圧力、パス回数および供給流体の温度に応じた細胞破壊度の評価
以下に例示するように、流体に加えられる圧力およびパス回数は細胞破壊の効率に大きく影響する。
【００６３】
したがって、本発明による方法によれば、
−３００〜４００ＭＰａの圧力下、少なくとも１回のパス、好ましくは１回のパス、または
−１５０〜３００ＭＰａの圧力下、好ましくは１５０〜２５０ＭＰａの圧力下、少なくとも２回の連続するパスで、かつ
−４〜４０℃の供給温度
での実施が推奨される。
【００６４】
この方法で、細胞壁の破壊の割合は８０％、８５％または９０％を超える。さらに、微生物負荷はこの方法で大きく減少する。特に、微生物負荷はエマルション１ｇ当たりの全微生物が１０未満である。
【００６５】
１回のパスの実施形態では、圧力は３００〜３２５ＭＰａ、３２５〜３５０ＭＰａ、３５０〜３７５ＭＰａまたは３７５〜４００ＭＰａであってもよい。
【００６６】
数回の連続するパスの実施形態では、圧力は１５０〜１７５ＭＰａ、１７５〜２００ＭＰａ、２００〜２２５ＭＰａ、２２５〜２５０ＭＰａ、２５０〜２７５ＭＰａまたは２７５〜３００ＭＰａであってもよい。圧力は、特に、２００〜３００ＭＰａまたは２００〜２５０ＭＰａであってもよい。
【００６７】
供給温度は、２０〜４０℃であってもよい。あるいは、供給温度は４〜１０℃、１０〜２０℃または３０〜４０℃であってもよい。
【００６８】
微粒子エマルションを生成するＨＰＨ技術の能力の評価
以下に示すように、染色した、または染色しない光学顕微鏡観察は、ＨＰＨによる破壊からなる本技術が、従来の細胞破壊法（代表的な例は、ボールミリングの使用）によって製造されたものより微細なエマルションの生成を可能にすることを示している。
【００６９】
ＨＰＨによる細胞破壊によって得られるエマルション画分は、粒子径が非常に小さいことを特徴とし、一方、ボールミリングで得られるものは、粒子径が１μｍから４０μｍ超とより粗いことを特徴とする。実際、本発明の方法によれば、１μｍ未満の粒子径を有する集団がかなりの量で存在しており、エマルション中で量的に優勢でさえあってもよい。
【００７０】
一実施形態では、本発明の方法で得られるＨＰＨ細胞破壊によるエマルション画分は、この粉末で調製されたエマルションの粒子径を有することを特徴としている。その後、エマルションはレーザー粒子径分析（Ｌａｓｅｒ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００Ｅ−Ｍａｌｖｅｒｎ）により分析される。
【００７１】
したがって、本発明の方法により得られるエマルションは、１μｍ未満の粒子径を有する集団が、全集団の少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％を占めることを特徴としている。「％」という用語は、本明細書では、粒子径の関数として体積％を表すグラフにおいて、面積分布率を意味するものである。
【００７２】
好ましい一実施形態では、本発明の方法により得られるエマルションは、１μｍ未満の粒子径を有する集団が全集団の５０％超を占めることを特徴とする。「％」という用語は、本明細書では、粒子径の関数として体積％を表すグラフにおいて、面積分布率を意味するものである。
【００７３】
特に好ましい一実施形態では、本方法は、１５０〜３００ＭＰａ、好ましくは２００〜３００ＭＰａ、特に２５０ＭＰａの圧力下、少なくとも２回の連続するパスを含み、本発明の方法により得られるエマルションは、１μｍ未満の粒子径を有する集団が全集団の５０％超を占めることを特徴としている。
【００７４】
したがって、高圧ホモジナイズにより得られるエマルションは、その粒子径特性のために、ボールミリングで得られるものよりはるかに安定している。
【００７５】
非常に高い、特に少なくとも３００ＭＰａという圧力を使用することにより、微細藻類の細胞破壊方法としては１回のパスで十分であることが示されたが、数回の連続するパスでエマルションが製造される場合には、非常に高い圧力のホモジナイズにより、はるかに安定したエマルションが得られることもまた出願人により示された。したがって、本方法は２回、３回、４回または５回の連続するパスを含んでもよい。しかしながら、工業的な
目的のためには、パスの回数を制限することが好ましい。したがって、好ましい一実施形態では、２回の連続するパスが使用される。各パスに使用される圧力は変えることができ、また一定にすることもできる。
【００７６】
本方法は、利用可能な任意の高圧ホモジナイザーで、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ、ＡＶＰ、ＡｖｅｓｔｉｎまたはＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉから提供されるもので実施することができる。
【００７７】
上記のように、本発明はまた、微細藻類の粉末を調製する方法であって、微細藻類バイオマスの生産、本発明の方法による細胞壁の破壊、およびバイオマスの乾燥、特にスプレー乾燥による乾燥を含む方法に関する。細胞壁の破壊の前に、バイオマスを洗浄および／または濃縮することができる。本発明はまた、上記の方法により得られる微細藻類の粉末に関する。
【００７８】
より一般的には、本発明は、本発明の微細藻類の細胞壁の破壊方法を使用して、上記の微細藻類の粉末を調製する方法に関する。したがって、本発明は、上記の微細藻類の粉末を調製するための、本発明の微細藻類の細胞壁を破壊する方法の使用に関する。
【００７９】
この微細藻類の粉末は食品部門において有用である。したがって、本発明はまた、本発明の粉末、または本発明の方法により得られる粉末の、食品部門における使用に関する。特に、本発明は、そのような微細藻類の粉末を食品組成物の成分に、または食品組成物に添加することを含む、食品組成物の調製方法に関する。そのような使用は、例えば特許出願、国際公開第２０１０／０４５３６８号パンフレット、国際公開第２０１０／１２０９２３号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０／０２９７２９６号明細書に記載されている。
【００８０】
「工業的規模」という用語は、
−粉砕または破壊チャンバーの容積が１００リットル以上、好ましくは５００リットル以上で、かつ／または
−流量が１ｍ３／ｈ超で、かつ／または
−１バッチが１〜２００ｍ３である
プロセスを意味するものとすることが好ましい。
【００８１】
さらに、好ましい工業的規模の一態様では、バイオマスは、特に細胞の乾燥重量で、固形分を１５重量％〜５０重量％含む。
【００８２】
本発明は、以下の実施例により、より明確に理解されるであろうが、それらの実施例は、説明のためのものであって、限定することを意図したものはない。
【実施例】
【００８３】
実施例１．クロレラ・プロトセコイデス微細藻類バイオマスの調製、および使用した方法の提示
発酵プロトコルは、国際公開第２０１０／１２０９２３号パンフレットに、一般的に、また全体が記載のものに適合させている。
【００８４】
生産発酵槽には、クロレラ・プロトセコイデスの前培養を接種する。接種後の体積は９０００ｌに達する。
【００８５】
使用する炭素源は、温度−時間プログラムを適用することにより滅菌された、５５％Ｗ／Ｗのグルコースシロップである。
【００８６】
発酵は、その間、残留グルコース濃度が３〜１０ｇ／ｌを維持するようグルコース流量が調節された、流加発酵である。
【００８７】
生産発酵槽時間は４〜５日間である。
【００８８】
発酵終了時に、細胞濃度は１８５ｇ／ｌに達する。
【００８９】
グルコース供給段階の間、培養培地中の窒素含有量を、脂質の蓄積が５０％（バイオマス重量の）の量になるよう制限する。
【００９０】
発酵温度は２８℃に維持する。
【００９１】
接種前の発酵ｐＨは６．８に調整し、その後も、発酵の間は、同じ値に調節される。
【００９２】
溶解酸素は、発酵槽の通気、逆圧および撹拌を制御することにより、３０％の最小値に維持する。
【００９３】
発酵マストは、ＨＴＳＴゾーン上で、７５℃で１分間、そして６℃へ冷却するスキームで熱処理する。
【００９４】
バイオマスを、その後、６対１（水／マスト）の希釈比の脱炭酸飲料水により洗浄し、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｆｅｕｘ  ５１０を使用する遠心分離により、２５０ｇ／ｌ（２５％ＤＣＷ、「乾燥細胞重量」）に濃縮する。
【００９５】
細胞破壊度の測定
粉砕後、顕微鏡下に残留細胞を計数することにより、初期参照用試料と比較して粉砕の程度を測定する。
【００９６】
試料は１／８００に希釈する。
【００９７】
分析は、倍率１０×４０の光学顕微鏡下に、標準の使用法に従ってＭａｌａｓｓｅｚセルで計数することにより実施する。
【００９８】
細胞破壊度を、参照用試料と比較して残留細胞の割合を計算することにより決定する。
【００９９】
実施例２．ＨＰＨによるクロレラ・プロトセコイデスの破壊効率に及ぼす圧力値、パス回数および温度の影響の測定
実施例１により調製されたバイオマスの、％破壊度で表した粉砕効率に対する使用圧力値（１００ＭＰａおよび１５０ＭＰａ）およびパスの回数の影響を試験する。
【０１００】
１５０ＭＰａまでの範囲の動的圧力で、ＳＥＯバルブを装着した、Ｒａｎｎｉｅ  ＬＡＢ  １０．５１ＶＨホモジナイザー（ＳＰＸ）の高圧ホモジナイズシステムを使用する。バイオマスを約６０ｌ／ｈの流量で供給する。
【０１０１】
図１は、圧力が高いほど、またパス回数が多いほど破壊効率が向上することを明確に示している。
【０１０２】
第２の一連の試験を、１回のパスで実施するが、加えられた圧力に応じた細胞破壊効率を評価するために、様々な圧力で実施する。
【０１０３】
これを実施するのに、３８０ＭＰａまでの範囲の動的圧力で、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｌｔｄ  １１３００（１５ｋＷ）連続式超高圧システムを使用する。
【０１０４】
生成物を、１回のパスにおいて、約１００ｌ／ｈの流量で連続的に供給する。
【０１０５】
図２に示すように、細胞の破壊は１００ＭＰａから観察されるようになり、１５０ＭＰａから顕著になり始める。
【０１０６】
細胞破壊度は３００ＭＰａで７０％を超え、この技術を使用して到達できる最大圧で８０％超の破壊度に達する。
【０１０７】
第３の一連の試験を、２回の連続するパスで実施するが、圧力は２５０ＭＰａに制限する。
【０１０８】
図３に示すように、この設定においては、２００ＭＰａ超の圧力で、２回連続のパスを累積すれば、約９０％の細胞破壊度が得られる。
【０１０９】
この設定で、ホモジナイズバルブに加わる圧力を２５０ＭＰａ未満の値に制限することが可能である。
【０１１０】
このスキームにより、ホモジナイズバルブの摩耗現象を抑えることができる。
【０１１１】
細胞破壊効率に及ぼす投入温度の影響を、別の一連の試験で評価する。
【０１１２】
生成物供給温度の上昇は、細胞破壊効率に良好に作用する（５％超の増加）−図４を参照。
【０１１３】
しかしながら、高圧ホモジナイズ法の発熱性が、非常に顕著な温度上昇をもたらし、出力における生成物の感度に応じて制限要因となり得る。したがって、投入温度は出力において許容される最大の閾値に応じて制限される。
【０１１４】
結論として、本発明による方法の好ましい一態様によれば、
−１回のパスでは３５０〜４００ＭＰａの圧力、または
−２回の連続のパスでは２００〜２５０ＭＰａの圧力で、
−４〜４０℃の供給温度で、
動作させることが推奨される。
【０１１５】
実施例３．ＨＰＨ破壊により生成されたエマルションの品質
実施例１の発酵により得られるバイオマスの組成は、主たる脂質画分（約５０％／乾燥）を有することを特徴とする。
【０１１６】
細胞破壊の後、エマルション（細胞残屑を有する水相／油）はこのように生成する。
【０１１７】
このエマルションの安定性は、脂肪球の細かさによって調整される。
【０１１８】
ホモジナイズの目的は、脂肪球の直径を最小化するとともに、それらを可能な限り均一にすることである。これにより、安定性が向上し、培地粘度が上昇する。
【０１１９】
したがって、高圧ホモジナイズ技術は、単なる細胞破壊の目的を越えて、ホモジナイズ化の可能性および生成したエマルションの安定化の可能性について、ボールミリング技術と比較した評価がされる。
【０１２０】
そこで、バイオマスを、直径０．５ｍｍのジルコニウムシリケートボールを用いたＮｅｔｚｓｃｈ  Ｌａｂｓｔａｒボールミル（周速：１２ｍ／ｓ、充填率９０％、流量：６ｋｇ／ｈ）で粉砕する。
【０１２１】
その後、使用した方法に応じたエマルションを比較するために、光学顕微鏡下での評価を実施する。
【０１２２】
図５および６は、２つの技術（３５０ＭＰａで、１回のパスで実施されたＨＰＨ、およびボールミリング）により生成したエマルションの大きさの違いの視覚化を可能にする。
【０１２３】
図６は、ボールミリングは、ＨＰＨ処理（図５）後に得られるものより大きく、かつより不均一な小球体を有する、はるかに粗いエマルションの生成をもたらす事実を示している。
【０１２４】
ＨＰＨ技術の乳化の可能性について、ボールミリングで得られるものと比較して、より正確にその特徴を明らかにするために、レーザー粒子径分析計（Ｌａｓｅｒ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００Ｅ−Ｍａｌｖｅｒｎ）により、製造者の仕様書にしたがって生成エマルションを分析する。
【０１２５】
図７は、微細で潜在的に安定なエマルションの生成に使用される方法の効率について、その特徴を明らかにすることを可能にする。
【０１２６】
細胞破壊の後で、初期バイオマスと比較すると、２つの場合において、二峰性の集団が観察される（一方で、初期バイオマスは単峰性の集団を有し、全細胞の直径が１〜１０μｍに分布している）。
【０１２７】
しかしながら、ボールミリングの場合には、顕微鏡観察によれば、エマルションは粗く、１〜１００μｍに分布している。
【０１２８】
すなわち、１〜３０μｍの第１の集団は、残留する全細胞、そしてまた大きさが＜３０μｍの脂肪球からなる。
【０１２９】
一方で、第２の集団は、直径が４０μｍ超の脂肪球からなるエマルションからなる。
【０１３０】
したがって、全体として、ボールミリングで得られるエマルションは粗く、非常に不均一である。
【０１３１】
高圧ホモジナイズによる細胞破壊の場合、残留する全細胞のみからなるのは、１〜１０μｍに分布する第２の集団である。
【０１３２】
細胞破壊により得られるエマルション画分は、１μｍ未満の非常に微小な粒子径を有する第１の集団として特徴づけられる。
【０１３３】
したがって、その粒子径特性のために、高圧ホモジナイズにより得られるエマルションは、ボールミリングにより得られるものよりはるかに安定である。
【０１３４】
次いで、図８は、エマルションの粒子径分布に対するホモジナイズ圧力の影響を示している。
【０１３５】
実際、注目すべきは、使用圧力が高いほど、残留する全細胞の量が減少することであり、この減少は対応する１μｍから１０μｍの集団の大きさが減少することを説明している。
【０１３６】
それであれば、乳化された脂肪球に対応する画分の大きさは、圧力の増加とともに増加し、その上平均粒子径分布が減少する。
【０１３７】
図９に示されている追加試験は、１回または２回の高圧（２５０ＭＰａ）パスを実施するシステムを評価することを目的としたものであった。
【０１３８】
したがって、注目すべきは、ホモジナイズ法が１回のパスからなるときよりも非常に高い圧力下で２回連続のパスからなるときに、圧力の影響がはるかに大きくなることである（したがって、１回のパスで達成可能な最大圧力より高い累積圧力を発生させる）。
【０１３９】
これらの超高圧ホモジナイズにより、細胞破壊により得られる脂質のエマルションは大きく安定化し、そのため、このエマルションを処理する残りの操作、そしてまたその応用に際しての使用が容易になる。
【０１４０】
実施例４．微生物負荷の減少
ホモジナイズの前に、バイオマスの汚染を低減する可能性に関して、超高圧処理を評価する。
【０１４１】
圧力によってホモジナイザーのバルブに発生する剪断力は、温度の上昇と組み合わされて、バイオマスの微生物負荷を顕著に減少させるため殺菌力が発生する。
【０１４２】
したがって、Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ  Ｌｔｄ  １１３００（１５ｋＷ）連続式超高圧システムにより、異なる圧力スキームのもと、除染能力を評価する。
【０１４３】
次表に、これらの条件で得られた微生物負荷の結果を示す。
【０１４４】
【表１】
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【０１４５】
超高圧ホモジナイズでは、殺菌に近いところまで、実質的に全微生物を減少することができることにより、微生物負荷を顕著に低減させることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2016524908.tif 000014
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