(57)【要約】  滅菌インジケータシステム、および滅菌プロセスの効力を測定するための該システムの使用方法。このシステムは、任意の第１の区画と、１種またはそれ以上の微生物の出芽胞子により単糖に変換可能な二糖、オリゴ糖、または多糖の１つまたはそれ以上を含む増殖培地を含む第２の区画とを有するバイアルであって、使用前に単糖を含有していないバイアル；単糖を酸化し、かつ生じる電気信号を運ぶための２つまたはそれ以上の電極を含むストリップ；ならびに酸化から生じる電気信号を検出かつ測定するための装置を含み得る。適切な生物学的インジケータの胞子が第１の区画内および／またはストリップ上に配置され得る。
2016515807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌インジケータシステムであって：
１種またはそれ以上の微生物の胞子；
任意の第１の区画と、該１種またはそれ以上の微生物の出芽胞子により単糖に変換可能な二糖、オリゴ糖、または多糖の１つまたはそれ以上を含む増殖培地を含む第２の区画とを備えるバイアルであって、該バイアルが、該バイアルが滅菌剤に曝された後に分析のために該第２の区画の内容物と胞子とを合わせるために適合されている、バイアル；
該単糖を酸化し、かつ該単糖の該酸化から生じる電気信号を運ぶために適合した２つまたはそれ以上の電極を含むストリップであって、ここで、該２つまたはそれ以上の電極がインキュベーションの間および／または後に該第２の区画および該胞子の合わせた内容物との接触を提供するように適合されている、ストリップ；ならびに
該２つまたはそれ以上の電極に連結または連結可能であり、そして該単糖が該２つまたはそれ以上の電極によって酸化される際に電子の移動から生じる該電気信号を検出かつ測定するために適合した装置；
を備え、
ここで、該システムが該滅菌剤に曝される前に該単糖を含んでいない、システム。
【請求項２】
前記第１の区画がなく、前記胞子が前記ストリップ上に配置されており、そして該ストリップが最初に前記第２の区画から分離されている、請求項１に記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項３】
前記第１の区画が存在し、前記胞子が前記ストリップ上に配置されており、そして該ストリップが最初に該第１の区画と前記第２の区画との両方から分離されている、請求項１に記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項４】
前記第１の区画が存在し、前記胞子が該第１の区画内に配置されており、そして前記ストリップが最初に該第１の区画と前記第２の区画との両方から分離されている、請求項１に記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項５】
前記第１の区画が存在し、前記胞子が該第１の区画内に配置されており、そして前記ストリップが最初に該第１の区画内にある、請求項１に記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項６】
前記第１の区画が存在し、前記胞子が前記ストリップ上に配置されており、そして該ストリップが最初に該第１の区画内にある、請求項１に記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項７】
前記第１の区画が存在し、前記胞子が該第１の区画内に配置されており、そして前記ストリップが最初に前記第２の区画内にある、請求項１に記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項８】
前記単糖がグルコースである、先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項９】
前記１種またはそれ以上の微生物が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスおよびバシラス・アトロフェウスのうちの１種または両方を含む、先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項１０】
前記装置がグルコースリーダである、先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項１１】
前記２つまたはそれ以上の電極が、ワイヤレスリンクによってグルコースリーダに連結可能である、先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項１２】
前記二糖が、前記出芽胞子によって生成されるか、または存在するグルコシダーゼによりグルコースに変換されるマルトースである、先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの電極が、黒鉛、グラフェン、カーボン、カーボンナノチューブ、金、白金、パラジウム、銀、ニッケルまたは銅、あるいはそれらの任意の２つまたはそれ以上の組合せまたは合金を含む、先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステム。
【請求項１４】
滅菌プロセスの効力を判定する方法であって、
先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステムを滅菌プロセスにおいて滅菌剤に曝す工程；
前記第１の区画および第２の区画の内容物を合わせ、そして該合わせた内容物をインキュベートする工程；
前記２つまたはそれ以上の電極を用いて任意の単糖をインキュベートおよび酸化する前および／または間に、前記ストリップを該合わせた内容物と接触させる工程；
前記装置を該２つまたはそれ以上の電極に連結する工程；
該２つまたはそれ以上の電極に連結した該装置を用いて、該酸化から該２つまたはそれ以上の電極により生じた電気信号を検出かつ測定する工程；ならびに
該電気信号の存在または不在に基づいて該滅菌プロセスの効力を判定する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、滅菌プロセスの効力を試験するための生物学的インジケータに関し、より詳細には、このような生物学的インジケータをモニタリングするための非酵素ベースの方法であって、このようなモニタリングが電子的に実施され得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インジケータの最も重要なクラスの１つは、生物学的インジケータ（ＢＩ）である。生物学的インジケータは、滅菌条件がプロセッサまたは処理した充填物（processed load）それ自体内に合っていることの最高度の保証を提供する。このタイプのインジケータでは、インジケータ内またはインジケータ上にその特定プロセスに対して高耐性の非常に多くの数の生物を与えることにより、処理システムにとって最も悪い事例を表すことが意図されている。通常、細菌胞子が、滅菌システムをモニタリングするのに選択される生物である。
【０００３】
生物学的インジケータは、典型的には、キャリア材料上に接種された微生物からなる。微生物は、典型的には、それらが用いられるべき特定の滅菌媒体に対して非常に耐性であることが知られている細菌胞子である。キャリアは、医療デバイス充填物と共に滅菌サイクル内に配置される。サイクルの完了後、生物学的インジケータは、最長７日間インキュベートされて、増殖についてモニタリングされる。生物学的インジケータの増殖は、その滅菌プロセスが完全な滅菌の達成には十分ではなかったこと、およびその医療デバイス充填物が使用前に再処理される必要があることを示す。生物学的インジケータの増殖がないことは、滅菌器内の条件が、少なくともインジケータ上に投入した細菌胞子の数（例えば、１０６個の細菌胞子）を殺傷するのに十分であったことを確認し、よって、医療デバイス充填物が滅菌されたものであるとの保証レベルを提供する。不運にも、実際には、使用者が完全なインキュベーションの結果を知る前に、多くの医療デバイスが用いられている。したがって、病院には、生存する生物学的インジケータ胞子を最短の可能な時間枠にて検出する必要性がある。
【０００４】
歴史的に、生存する生物学的インジケータの検出は、検出の可視手段に依存した。生存生物の増殖および倍加は、増殖培地における濁度によって示されるように観察／検出され得る。この濁度は、認知できるようになるには数日かかり得る。検出の別の可視手段であってより一般的な手段は、比色分析ｐＨインジケータを用いることである。生存生物が代謝し始めて栄養源（例えば、増殖培地中に提供されている糖）を使い尽くすと、それらは、酸性廃棄物を排泄する。これらの酸性廃棄物が増殖培地に蓄積すると、システムのｐＨが低下し、ｐＨインジケータが存在する場合増殖培地の変色を生じる。この手段による検出は、通常、１８〜４８時間かかる。
【０００５】
より最近では、蛍光が、増殖培地に蛍光性酵素基質を添加することにより、目的の生物により生産される酵素の活性を検出するために用いられている。このより新しい方法は、インキュベーション時間を数日から数時間に減少させる。しかし、蛍光方法について見られるのを超える、インキュベーション時間の減少についての主な制限は、プラスチックバイアルおよび増殖培地を含む生物学的インジケータの多くの成分と共に天然に生じる固有のバックグラウンド蛍光である。真の検出可能な信号は、この固有の本来のバックグラウンド蛍光を越えて識別可能であるように十分に高いものでなければならない。したがって、システムの感度を増大させるために、バックグラウンド蛍光（ノイズ）を減少させるか、またはより高い感度（信号）を有する異なる技術に移行する必要がある。
【０００６】
したがって、従来および現在の技術では、生物学的インジケータは、生存度を決定するために、比色分析または蛍光分析手段に依存する。検出は、発生した信号（比色分析または蛍光分析か）が実質的なバックグラウンドレベルを上回る必要性によって制限される。これは、バックグラウンドレベルを上回って検出可能であるのに十分な信号が蓄積されるために、数時間〜数日程度の生存生物の検出時間を生じた。生物学的インジケータにおける生存生物の検出時間が数分以下のオーダーとなることが、病院および患者にとって有益である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
信号対ノイズ比を越える制御を許容する１つのこのような方法は、電気的検出である。システムの電気特性の変化のモニタリングは、そのシステム内の他の変化についてモニタリングするための高感度の手段である。生じた電気出力は、次いで、電子的手段により調節され、増幅されフィルタリングされた信号（それらを発生する試薬に正比例する）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、複合糖（complex sugar）の酵素的分解から生じるグルコースのような単純糖（simple sugar）の蓄積を検出する非酵素ベースの電子的検出方法を用いた、生物学的インジケータの生存微生物の迅速な検出を提供する。本発明の非酵素ベースのシステムは、生存胞子に存在する少なくとも１つの天然に存在するグリコシダーゼと、生存胞子中にグリコシダーゼにより生成された単純糖（例えばグルコース）を酸化するように適合された電極との組合せを備える。胞子の滅菌後に提供されるインキュベーションまたは増殖培地は、単純糖を含まずに複合糖（例えば、二糖または多糖）を有するものが提供される。グリコシダーゼは、増殖培地に添加された複合糖と反応し、かつ単純糖（例えば、少なくとも１つのグルコースを含む）にそれを分解する。単純糖産物は、次いで、グルコースを選択的に酸化するように適合されているストリップ上の電極に曝露され、単純糖のその酸化の一部として電子の移動を生じる。電子の移動の量は、生存胞子により生産される単純糖の量に比例する。酸化における自由電子の移動がモニタリングされ、そして電子的に測定され得る。電子的モニタリングが電子の移動を検出した場合、それは、少なくともいくらかの胞子が生存しており、滅菌プロセスで生残したことを意味し、したがって、滅菌が有効でなかったことを示す。電極は、標準的な技術水準の血中グルコースモニタリングデバイスにおいて用いられるものであり得、実際、公知の技術水準の血中グルコースモニタリングデバイスが、合わせた培地中のグルコースまたは単純糖の存在の決定に使用するために容易に適合され得る。したがって、本発明は、簡便に実施され得、かつ電子的に測定され得る非常に特異的で非常に感度の高い方法により滅菌プロセスの効力の決定を可能にする。１つの実施形態では、システムおよびプロセスは、糖尿病患者における血中グルコース値のモニタリングに使用するために設計された標準的な技術水準のデバイスを使用する。
【０００９】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、滅菌インジケータシステムに関し、当該システムが、以下：
１種またはそれ以上の微生物の胞子；
任意の第１の区画と、当該１種またはそれ以上の微生物の出芽胞子により単糖に変換可能な二糖または多糖の１つまたはそれ以上を含む増殖培地を含有する第２の区画とを備えるバイアルであって、当該バイアルが滅菌剤に曝露された後、分析のために当該第２の区画の内容物と胞子とを合わせるように適合されているバイアル；
当該単糖を酸化しかつ当該単糖の酸化から生じる電気信号を運ぶように適合された２つまたはそれ以上の電極を備えるストリップであって、当該２つまたはそれ以上の電極が、インキュベーションの間および／または後に当該第２の区画の内容物と当該胞子との組合せとの接触を提供するように適合されている、ストリップ；ならびに
当該２つまたはそれ以上の電極に連結されたまたは連結可能であり、かつ当該単糖が当該２つまたはそれ以上の電極により酸化された場合に電子の移動から発生する電気信号を検出および測定するように適合された、装置
を備え、
当該システムが、滅菌剤に曝露される前に当該単糖を含まない。
【００１０】
１つの実施形態では、当該第１の区画がなく、当該胞子が当該ストリップ上に配置され、そして当該ストリップが初めは当該第２の区画から分離されている。
【００１１】
１つの実施形態では、当該第１の区画が存在し、当該胞子が当該ストリップ上に配置され、そして当該ストリップが初めは当該第１の区画および当該第２の区画の両方から分離されている。
【００１２】
１つの実施形態では、当該第１の区画が存在し、当該胞子が当該第１の区画内に配置され、そして当該ストリップが初めは当該第１の区画および当該第２の区画の両方から分離されている。
【００１３】
１つの実施形態では、当該第１の区画が存在し、当該胞子が当該第１の区画内に配置され、そして当該ストリップが初めは当該第１の区画内にある。
【００１４】
１つの実施形態では、当該第１の区画が存在し、当該胞子が当該ストリップ上に配置され、そして当該ストリップが初めは当該第１の区画内にある。
【００１５】
１つの実施形態では、当該第１の区画が存在し、当該胞子が当該第１の区画内に配置され、そして当該ストリップが初めは当該第２の区画内にある。
【００１６】
１つの実施形態では、当該単糖はグルコースである。
【００１７】
１つの実施形態では、当該１種またはそれ以上の微生物は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）およびバシラス・アトロフェウス（Bacillus atrophaeus）の１つまたは両方を含む。
【００１８】
１つの実施形態では、当該装置は、グルコースリーダーである。
【００１９】
１つの実施形態では、当該２つまたはそれ以上の電極が、ワイヤレスリンクによりグルコースリーダーに連結可能である。
【００２０】
１つの実施形態では、当該二糖が、当該出芽胞子により生産されるまたは当該発芽胞子中に存在するグルコシダーゼによりグルコースに転換されるマルトースである。
【００２１】
１つの実施形態では、当該少なくとも２つの電極が、グラファイト、グラフェン、炭素、カーボンナノチューブ、金、白金、パラジウム、銀、ニッケルもしくは銅、またはそれらの任意の２つもしくはそれ以上の組合せまたは合金を含む。
【発明の効果】
【００２２】
したがって、本発明は、滅菌プロセスの効力を迅速に決定するという課題に対して洗練された簡潔な解決策を提供し、そしてそのような使用に特別に適合された装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施形態を用いた使用に適切な滅菌インジケータの第１の実施形態の使用可能前の構成の模式断面図である。
【図２】図１の滅菌インジケータの使用可能構成の模式断面図である。
【図３】図１と同様の、本発明の実施形態を用いた使用に適切な滅菌インジケータの第２の実施形態の使用可能前の構成の模式断面図である。
【図４】本発明の実施形態における使用に適切な３つの電極を含む導電性ストリップの模式図である。
【図５】本発明の実施形態における使用のための試験インキュベータ／リーダーの模式図である。
【図６】本発明の実施形態による、試験インキュベータ／リーダーにおける、増殖培地に差し込まれた図４と同様の導電性ストリップとのインキュベーションの間の滅菌インジケータの実施形態の模式断面図である。
【図７ａ】本発明の実施形態による、胞子が第１の区画内にありかつインキュベーション培地およびストリップが第２の区画内にあるバイアルを有する滅菌インジケータシステムの模式図である。
【図７ｂ】本発明の実施形態による、胞子が第１の区画内にありかつインキュベーション培地およびストリップが第２の区画内にあるバイアルを有する滅菌インジケータシステムの模式図である。
【図８】本発明の実施形態による、胞子およびストリップが第１の区画内にあるが互いに離れており、かつインキュベーション培地が第２の区画内にあるバイアルを有する滅菌インジケータシステムの模式図である。
【図９】本発明の実施形態による、胞子が第１の区画内にありかつインキュベーション培地が第２の区画内にあるバイアルを有し、そしてストリップがバイアルから離れている滅菌インジケータシステムの模式図である。
【図１０】本発明の実施形態による、胞子がストリップ上にありかつストリップが第１の区画内にあり、そしてインキュベーション培地が第２の区画内にあるバイアルを有する滅菌インジケータシステムの模式図である。
【図１１】本発明の実施形態による、胞子がストリップ上にありかつストリップがバイアルから分離されており、第１の区画内には何もなく、かつインキュベーション培地が第２の区画内にあるバイアルを有する滅菌インジケータシステムの模式図である。
【図１２】反応電極により生じた信号を受信し、それをデジタル信号に変換し、そしてそれをマイクロコントローラに伝達するためのデバイスの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、種々の滅菌装置を用いて有用であり得る。添付の図面は、本発明のよりよい理解を提供する目的で、適切な滅菌装置の例示の非限定的な図示を提供し、かつ開示されたプロセスを示すことを意図し、いかなるようにも限定することを意図しない。添付の図面においては、同様の部および特徴は同様の参照を有し得る。
【００２５】
図示の単純化および明確性のために、図に示す要素は必ずしも正寸ではないことが留意されるべきである。例えば、要素のいくつかの寸法は、明確性のため互いに関して誇張され得る。さらに、適切と考えられる場合、参照番号は、対応する要素を示すために図の間で繰り返されている。
【００２６】
さらに、以下に記載のプロセスの工程および構造は、最終使用に適した（end-useable）滅菌インジケータを製造するための完全なプロセスフローを形成するものでなくてもよいことが理解されるべきである。本発明は、当該分野で近年用いられる装置および加工技術と共に実施され得、そして一般に実施されているプロセス工程のうち限られたものが本発明の理解のために必要なものとして含まれているにすぎない。
【００２７】
以下に記載の生物学的インジケータは、胞子生存性を検出するために新規な機構に依存する。本明細書に記載の発明は、生存生物が複合糖を分解する能力から生じる単糖（例えば、グルコース）の蓄積に基づいて発生する電子信号を利用する。グルコースに基づく電子的検出方法は、糖尿病患者の血液中のグルコース値のモニタリングのために何年間にもわたって容易に利用可能であった。しかし、今まで、滅菌プロセス後の生存生物を検出する手段としてのこれらの電子的検出機構の使用はなく、適合させることの示唆もなかった。
【００２８】
ほとんどの生物が、複合糖（例えば、マルトース）を単純糖（例えば、グルコース）に分解する固有の能力を有する。これは、より有用な単純糖分子が生物によりエネルギー源として用いられ得るようにするためである。血中グルコース値のモニタリングに利用される同じ基本反応が、滅菌サイクルを生残し得る生存生物（例えば、胞子）を検出するように適合され得る。本発明の１つの実施形態では、同じ電子的グルコースモニターが、滅菌プロセスの効力のモニタリングにおける使用に適合され得る。しかし、グルコースが蔓延していて直接測定される血中グルコースモニタリングとは異なり、本発明においては、初めはグルコースが存在せず、グルコースは、検出不能な複合糖質分子から得られるのみである。まず、この複合糖質分子が生存生物によって作用され、その後、グルコースが放出され、検出可能となる。滅菌条件を生残する生存生物がない場合、検出されるグルコースは全く存在しない。したがって、本発明においては、単純糖（通常、グルコース）は、モニタリングされる滅菌条件を生残した生存微生物が複合糖質を分解して単純糖を形成することがない場合および形成するまでは、存在しない。この分解が生じる場合および生じたとき、それは、本発明に従って検出および測定され得る。
【００２９】
生存胞子が発芽し始めると（基本生命活動）、それらは、複合糖を、より容易に利用可能な単純糖（例えば、グルコース）に分解することを可能とする酵素を生産して放出する。複合糖（例えば、二糖、オリゴ糖および／または多糖（滅菌インジケータに選択した生存試験生物の活性酵素によりそれらが分解され得ることに基づいて、選択される））が多い培地を処方することにより、この培地に生存胞子を曝露した際に単糖（例えばグルコース）の増加が予想され、増殖培地におけるこの単糖濃度の増加は、単糖を酸化するように適合された電極によって、電子的に検出され得る。滅菌条件下、胞子は死滅し、滅菌前に胞子が有していた酵素は破壊される。したがって、本発明の培地へのこれらの胞子の曝露後に単糖の増加が検出されることは、生物が生存していることを意味している（生存証明）。複合糖からグルコースへの胞子を媒介する変換は、本発明の方法に従って生存生物を検出する際の第１の工程を表す。第２の工程は、２つまたはそれ以上の電極によるこのように生産された単糖の酸化であり、そして第３の工程は、酸化に伴う電気信号の検出である。
【００３０】
滅菌プロセスをモニタリングするために最も関心のある生物は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスおよびバシラス・アトロフェウスである。両生物の出芽胞子は、複合糖のマルトースを２つのグルコース分子に分解し得る酵素を生産し、このような酵素として、例えば、α−グルコシダーゼが挙げられる。これは、本発明において第１の工程を達成するための単なる１手段を例示するにすぎない。他の胞子生産酵素もまた、他の複合糖（例えば、二糖、オリゴ糖または多糖）を分解して単糖（例えば、グルコース）を生成するために用いられ得る。
【００３１】
次いで、単糖（例えば、グルコース）は電極により酸化されて、本発明における第２の工程を達成し得る。単糖は、例えば、新たに形成された単糖分子の直接の電気化学的決定のために定電位クロノアンペロメトリー法を用いて、非酵素的グルコースバイオセンサによって検出され得る。適切な掃引電位法が当業者に知られている。例えば、C. Fang、C. Yi、Y. Wang、Y. CaoおよびX. Liu、Biosens. Bioelectron. 24 (2009) 3164は、用いられ得る分子鋳型ポリマーを開示する。非酵素的グルコースバイオセンサによる他の検出方法もまた、当該分野で知られている。
【００３２】
したがって、この方法は、当該方法における第１の工程に依存し、ここでは、出芽胞子が、複合糖質（例えば、マルトースまたはラクトース）をより単純な糖（例えば、グルコース）に分解し得る酵素を生産する。（胞子が死滅した場合に生じるような）第１の工程の終産物の生産を達成することができなければ、第２の工程における単純糖の検出が妨げられる。そこで、第１の反応の産物（例えば、マルトースから変換されたグルコース）がない場合、信号は生じないかまたは観測されない。この場合、単糖（例えば、グルコース）の酸化から生じる信号がない場合、モニタリングした滅菌が成功したことを意味する。
【００３３】
適切な二糖の例は、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、およびイソマルトースである。
【００３４】
適切なオリゴ糖の例は、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、アラビアゴム、グアーガム、およびグアー加水分解物である。
【００３５】
適切な多糖の例は、デンプン、デキストリン、グリコーゲン、セルロースおよびペクチンである。他の可能な適切な多糖は、ゲラン、ガティガム、カラヤ、トラガカント、オオバコ種子、キサンタン、グアー、アイボリーナットマンナン、コニャック、ローカストビーン、タマリンド、タラ、カラギーナン、アルギネート、フコイダン、ラミナリン、寒天、プルラン、ウェランおよびスクレログルカンが挙げられる。
【００３６】
他の適切な二糖、オリゴ糖および／または多糖は当業者に知られ得、また、本発明を用いる場合に有用であり得る。
【００３７】
本発明は、インジケータ生物の出芽胞子の存在時に複合糖の分解から発生する単純糖の出現の検出に依存する電子信号を利用する。糖に基づく電子的検出方法は、糖尿病患者の血液中のグルコース値のモニタリングのために何年間にもわたって容易に利用可能であった。しかし、今まで、滅菌プロセス後の生存生物を検出する手段として、これらの電子検出機構は使用されておらず、使用について示唆もされていなかった。ここでは、出芽胞子の存在に起因して存在するようになる単糖のいずれをも非常に高い感度で測定することを同時に提供する一方、生存している生残胞子が存在しなければ単糖（例えば、グルコース）はシステム内に存在せず、よって何も検出されないように条件が設定され得る、という理解によって可能になる。したがって、本発明は、より有用なグルコース分子が生物によりエネルギー源として用いられ得るようにするため、ほとんどの生きている生物が、複合糖（例えば、マルトース）を単純糖（例えば、グルコース）に分解する固有の能力を有するという事実を利用する。酵素ベースの電子的検出方法によるグルコースモニタリング（例えば、グルコースオキシダーゼベースのバイオセンサ）が、糖尿病患者の血液中のグルコース値のモニタリングのために何年間にもわたって容易に利用可能であった。血中グルコース値のモニタリングのためのこれらの同じ基本的な方法が、滅菌サイクルを生残し得る生存生物（例えば、胞子）を検出するように変更および適合され得る。生存胞子が発芽し始めると、それらは、複合糖を、より容易に利用可能な単純糖（例えば、グルコース）に分解することを可能とする酵素を生産する。複合糖（選択した生存生物の活性酵素によりそれらが分解され得ることに基づいて、選択される）が多い培地を処方することにより、この培地への生存胞子の曝露およびインキュベーションの際にグルコースの増加が予想される。滅菌条件下、胞子は死滅し、胞子が既に有し得る胞子由来酵素のいずれもが破壊される。
【００３８】
したがって、この培地へのこれらの胞子の曝露後に検出されるグルコースの増加は、生物が生存していることを確認する。複合糖の単純糖への出芽胞子を媒介する変換は、本発明の電気触媒プロセスにおいて直接的に検出される。これは、酵素を外部から添加したり、いかなる信号発生化学物質をも添加したりする必要なく、生存インジケータ胞子の検出に対し、これまで利用できなかった方法を提供する。
【００３９】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、滅菌インジケータシステムに関し、当該システムが、１種またはそれ以上の微生物の胞子；任意の第１の区画と、当該１種またはそれ以上の微生物の出芽胞子により単糖に変換可能な二糖、オリゴ糖または多糖の１つまたはそれ以上を含む増殖培地を含有する第２の区画とを備えるバイアルであって、当該バイアルが滅菌剤に曝露された後、分析のために第２の区画の内容物と胞子とを組み合わせるように適合されているバイアル；当該単糖を酸化しかつ当該単糖の酸化から生じる電気信号を運ぶように適合された２つまたはそれ以上の電極を備えるストリップであって、当該２つまたはそれ以上の電極が、インキュベーションの間および／または後に第２の区画の内容物と該胞子との組合せとの接触を提供するように適合されている、ストリップ；ならびに当該２つまたはそれ以上の電極に連結されたまたは連結可能であり、かつ当該単糖が当該２つまたはそれ以上の電極により酸化された場合に電子の移動から生じる電気信号を検出および測定するように適合された、装置、を備え、当該システムが、滅菌剤に曝露される前に当該単糖を含まない。このシステムは滅菌剤への曝露前に単糖を含まないので、検出および測定される電気信号は、生存している出芽胞子の存在を示し得る。次いで、これは、インジケータが生残胞子を含有したので、滅菌プロセスが充填物を十分に滅菌できなかったことを示し得る。
【００４０】
本発明を用いる場合に使用に適した電極は、種々の電極タイプ、感度、線形範囲、検出限界およびインクジェット、シルクスクリーンまたは同様の方法による蒸着適合性を包含する。これらの電極の組成および物理的形態によって電子触媒として規定され、以下が挙げられるがこれらに限定されない：多孔性またはインターカレート層（例えば、銅、ニッケル、銀、白金および金の１つまたはそれ以上を含む）、グラファイト、グラフェン、炭素、カーボンナノチューブ、ナノ粒子（例えば、例えば銅およびカーボンナノチューブ、ドープした白金および金属フィルムを含む）、非修飾金属（例えば、銅、ニッケル、銀、白金および金）、化学修飾電極、合金（例えば、ニッケル−チタン、ニッケル−銅、およびニッケル−クロム−鉄）、電気化学蒸着形態（例えば（例えば、酸化銅およびバイメタル金／銅））、ならびにポリマーおよび複合物（例えば、ポリマー性酸化ニッケルおよび金／Nafion（登録商標））。２×１０−４〜２００ｍＡ／ｍＭ（ミリモル当たりミリアンペア）以上の感度範囲が報告され、線形範囲は、４〜５オーダーの振幅程の高さである。検出限界は、２×１０−８ｍＭ程の低さで達成され得る。これらの物理的電気特性の多くは血中グルコース測定に必要とされるものよりもずっと下回っているが、それらは、少数の生残インジケータ胞子の存在下のグルコース発生のモニタリングに理想的に適合される。
【００４１】
非酵素的グルコースセンサが、例えば、リニア掃引サイクリック矩形波ボルタンメトリのような掃引電位法を用いて操作され得る。分析物（例えば、新たに出現したグルコース）が電極表面に吸着した際に、非酵素的電気触媒のプロセスが生じ、これは、グルコースの酸化を触媒し、そして電子の移動を誘導して、交互に吸脱着する結合を形成する。このエネルギーフローは、システム内のグルコース量に比例するものであり、従って生存胞子の存在が検出され得る手段である。
【００４２】
以下の例示の反応は、滅菌プロセスを生残する出芽胞子において天然に存在する酵素、および本発明の一実施形態によるインキュベーション／回収培地（マルトースが複合糖（二糖）であり、そしてグルコースが単純糖または単糖である）に添加されたストリップ中の電極による酸化の機能を図示する：
【００４３】
【化１】
2016515807.tif 000003
【００４４】
作用電極および参照電極を横断して差動電圧が印加されるとき、作用電極が分極されるようになり、電子の移動から生じる酸化電流が生成される。この酸化電流を測定することができ、そしてこの酸化電流は、滅菌およびインキュベーション前には何もなかったとき、滅菌およびインキュベーション後のシステム中に存在する単純糖の量に比例する。
【００４５】
本発明は、生存胞子により単糖（例えば、単純糖グルコース）に還元され得る複合糖（例えば、二糖、オリゴ糖および／または多糖）を用いて処方された特殊化培地とともに、モニタリングされる滅菌プロセスに耐性の生物を利用する。したがって、生存胞子が存在する場合のシステム中の単純糖レベルの増大が、電子的にモニタリングされ得る。
【００４６】
１つの実施形態では、少なくとも２つの電極が、グラファイト、グラフェン、炭素、カーボンナノチューブ、金、白金、パラジウム、銀、ニッケルもしくは銅、またはそれらの任意の２つもしくはそれ以上の組合せまたは合金を含む。血中グルコースのモニタリング技術において知られているような他の適切な電極材料は、当業者により理解される通り用いられ得る。
【００４７】
本明細書中で用いられるように、「単糖の酸化から生じる電気信号」および「グルコースの酸化から生じる電気信号」という句は、電気信号が、参照電極の使用により提供され得るようなバックグラウンド信号と比較して酸化から生じる信号であることを意味する。したがって、たとえ酸化が存在しなくても電極間にいくらかの閾値電気信号が存在し得るが、本発明において目的としかつ測定されるのは、酸化から生じる信号である。
【００４８】
図面に言及すると、図１および２は、本発明の第１の例示の実施形態を用いて有用である滅菌インジケータシステム１０を示す。以下の記載は、例示の滅菌システムがどのように作動するかの一般的な説明のために提供されるものであり、本発明を限定することを意図しない。インジケータシステム１０は、容器３０の上に取り付け可能なキャップ２０を備える。容器３０は、閉じられた底端３１および開口する上端を備え、そして内部空間３４を規定する。キャップ２０は、外壁２２、開口する下端、および閉じられた上端２３を有する。キャップはまた、内壁（または複数の壁）２４を備え、これは、キャップの外壁の内部に配置され、分離壁を形成し、そして内部チャンバ２６を規定する。内部チャンバ２６は、単数または複数の壁２４の底端に隣接した開口部２５を備える。チャンバ２６は流体５０を含有し、そしてキャップ２０は、破壊可能な隔壁４０を備え、これは、チャンバ２６の開口部２５の周囲に配置されて、チャンバ２６内に流体５０を封入する。
【００４９】
図１および２に図示された実施形態では、インジケータシステムは、キャップ２０がスナップフィットの関係で容器３０に取り付けられるように構成されている。他の実施形態（図示せず）では、インジケータシステムは、キャップがねじ式の関係で容器に取り付けられるように構成されてもよく、ここでは、キャップがねじにより容器と係合され、そしてシステムが、キャップを容器に対して回転させることにより、すなわち、容器上にさらにキャップをねじって取り付けることにより使用可能にする。図１および２に示すように、容器３０は、環状突起３２を備え、これは、容器の上端に隣接してまたは近傍にリッジまたはリップを形成する。キャップ２０は、環状突起２９を備え、これは、キャップの底部に隣接してリッジまたはリップを形成する。キャップ２０は、容器のリッジ３２の上にキャップのリッジ２９をスライドすることにより、容器３０上に取り付けられ得る。容器３０のリッジ３２がキャップ２０上のリッジ２９を係合し、キャップ２０および容器３０が分離することを防ぐ。キャップ２０および容器３０は、リッジ３２が、キャップ２０に対して、キャップ２０に外部から下方の力を付することなくキャップ２０が下方にスライドすることを防ぐのに十分な量の圧を発揮できるような大きさとされ得る。このようにして、破壊可能な隔壁４０は穿孔部材３６の縁３８から離れた位置に維持され得、インジケータを使用可能にすることが所望とされるような時間まで、破壊可能な隔壁４０が穿孔部材と接触せずかつ／またはそれにより破壊されないようにされる。
【００５０】
図１および２に示すように、容器３０は、破壊可能な隔壁４０を破壊するように適合される。容器は、破壊可能な隔壁４０を有するキャップ２０が、突起３６の縁３８に向かって下方に動きそして隔壁４０がそれと接触するとき、破壊可能な隔壁４０を破壊または穿孔するように適合された縁３８を有する１つまたはそれ以上の突起３６（これは、本明細書中で「穿孔部材」とも称され得る）を備える。穿孔部材３６は、容器の底壁３７と一体してかつそこから延びたものとして示されている。別の実施形態（図示せず）では、穿孔部材３６は、側壁３５および底壁３７の両方から延びたものであり得る。
【００５１】
滅菌プロセスを評価するために、較正濃度の微生物が、容器３０の内部３４内に配置される。微生物は、図６〜１１に関して以下に説明するように、容器の壁３５上に直接配置され得るか、または容器３０内または種々に設置され得る電極上に配置された支持部材（例えば、支持部材７０）上に提供され得る。次いで、回収培地充填キャップ２０を容器３０上に取り付けることにより、滅菌インジケータが組み立てられる。キャップ２０は、上記のようにキャップ２０を容器３０上にスナップフィットすることにより、または例えばねじ式で取り付けることにより、取り付けられ得る。図１を参照すると、回収培地充填キャップ２０は、第１の非使用可能（または開口）位置で容器３０上に取り付けられ、破壊可能な隔壁４０はそのままであって、穿孔部材３６によって穿孔されないようにする。所望であれば、第１の非使用可能位置で、破壊可能な隔壁４０は、穿孔部材３６の縁３８から離れた位置にあり、これと接触しない。
【００５２】
図１に示すようなものとしてインジケータ１０が組み立てられたとき、滅菌インジケータは、次いで、滅菌プロセスに供され得る。キャップ２０がアパーチャ２８を有するものとして示され、そのアパーチャを通じて滅菌剤蒸気が侵入してインジケータシステム内に流れ得る。滅菌剤は、（外壁２２と内壁２４との間の空間に）アパーチャ２８を通じてキャップの中に侵入し、そしてキャップ２０上の内壁２４の外表面と容器３０上の壁３５の内表面との間で規定された空間６０を通じて容器３０に流れる。この実施形態では、滅菌剤蒸気は容器３０に流れ、そして生物学的インジケータの微生物に作用する。
【００５３】
滅菌プロセスが完了した後、滅菌インジケータが、キャップ２０を容器３０に向かって下方に第２の（または閉鎖もしくは使用可能）位置にまで動かすことにより使用可能にされ得る。これを図２に示す。キャップ２０は、キャップ２０上に十分な下方の力または圧力を加えることにより下方に動かされる。キャップ２０が下方に動かされると、破壊可能な隔壁４０が穿孔部材３６の縁３８と接触されるようになり、最終的には、穿孔部材３６の縁３８が、破壊可能な隔壁４０を穿孔または貫通する位置に動かされる。破壊可能な隔壁４０が穿孔されるとき、図２に示すように、チャンバ２６の開口部２５が曝露され、液体回収培地５０が容器３０の内部領域３４に流れ、微生物と接触する。
【００５４】
図１および２に示すように、本実施形態において、キャップ２０の内表面は、第２の環状突起２７を備え、そしてキャップは突起２７の上部が容器３０のリッジ３２の底部に係合し、そしてキャップ２０が第２の閉鎖／使用可能位置に保持されるような位置に下方に動かされ得る。第２の閉鎖／使用可能位置は、容器３０と密封された関係においてキャップ２０を保持する役割を果たし得、このシステムに追加の微生物が入ることを防止し得る。突起２７の使用は、滅菌システムの他の実施形態では任意である。米国特許第５，７７０，３９３号は、他の適切な構成を示し、そしてこの特許は、キャップおよび容器の構成に関連するその教示について参照として本明細書中に援用される。別の他の実施形態では、キャップ２０の内表面および容器３０の外表面はねじ込まれ得、そしてキャップ２０は容器３０上のキャップ２０を捩じることにより閉鎖位置に移動かつ維持され得、キャップ２０は、例えば、米国特許第８，１７３，３８８号公報（バイアルの本実施形態の追加の詳細について言及され得、かつ本実施形態および先の実施形態のバイアルおよびキャップ構成に関連するその教示について参照として本明細書中に援用される）に示すようにねじ込まれ得る。これらの別の構成のすべてが本発明の範囲内にある。
【００５５】
上記のように、図１および２に示す実施形態におけるキャップ２０は、インジケータに蒸気滅菌剤の侵入を可能にするためのアパーチャ２８を有するように示されている。しかし、キャップがこのような特徴とともに提供される必要がないと理解される。アパーチャの数、大きさ、形状、および／または配置は、滅菌インジケータが使用される特定の滅菌剤を考慮して所望に応じて選択され得る。例えば、キャップおよび／または容器におけるアパーチャの配置、形状および大きさは、微生物と周囲環境との間の滅菌蒸気の入口および出口に屈曲した経路を提供するように選択され得る。屈曲した経路はまた、外部の物質(external agents)からの汚染を抑制または防止しかつ充分量の滅菌剤が利用可能であることを確実にするための役割を果たし得る。屈曲した経路を含むことにより、充填物の全体が滅菌剤に曝され、それにより、滅菌インジケータ内の検査生物が死滅する前に現存する微生物を死滅させやすくなりそうである。
【００５６】
アパーチャは、キャップ内にアパーチャを提供することに加えて、またはその代替として容器内に提供され得る。アパーチャがキャップ内に提供されない場合、内壁は、キャップの内壁と容器の内表面との間の空間を提供するために配置される必要はない。さらに、アパーチャが容器内に提供される場合、それらは、インジケータが使用可能とされかつ隔壁が破られる場合に、増殖培地がこのようなアパーチャを通じて漏出または溢流のないように配置されなければならない。
【００５７】
図３は、キャップ２０内のアパーチャ２８に加えて、アパーチャ８０が容器３０の側壁３５に適当な位置で形成されているインジケータ１０を示す。図３に示すアパーチャは、使用可能となった後の漏出または溢流を避けるために、穿刺部材３６の縁３８付近の容器３０の頂部付近にある容器３０の側壁３５内にある。図３から見られ得るように、使用可能となった後、この配置にてアパーチャ８０は、使用可能位置でキャップ２０によって被覆される。図３に示すインジケータ１０は、キャップ２０内にアパーチャ２８を含むが、これは必須ではないことが留意される。１つの実施形態（図示せず）では、容器３０は、アパーチャ８０を含み、そしてキャップ２０と類似するが、アパーチャ２８のようなアパーチャを含まないキャップとともに用いられる。そのため、アパーチャは、キャップ内または容器内のいずれかに提供され得るか、あるいはキャップと容器との両方に提供され得る。
【００５８】
滅菌プロセスが完了した後、キャップ２０は穿刺部材３６の縁３８が突き刺さり、かつ破断可能な隔壁４０を破断するように下方に押圧または捩じ込まれて、滅菌プロセスに生き残り得た任意の生物学的インジケータ微生物のいずれかとともに混合かつインキュベートするために、空間２６における増殖培地を放出する。回収培地５０は、必要に応じて生物の出芽、代謝およびその後の成長(grow out)をまかなう水性培地または水溶液を含む。水性培地または水溶液は緩衝化され得る。
【００５９】
次いで、滅菌インジケータ１０は、微生物の生存力が測定可能となるのに充分な時間インキュベートされる。インキュベートの間、任意の生存微生物が代謝および出芽を開始し、そしてこの代謝および出芽は、二糖、オリゴ糖または多糖を分解して単糖を生成（例えば、マルトースを分解してグルコースを生成）するための酵素による活性を含む。本発明によれば、次いで、グルコース「副生成物」は、提供される電極によって酸化されることができる。この酸化は、本明細書中に記載される２つまたはそれ以上の電極によって生じる電気信号を介して検出される。
【００６０】
図４は、本発明の実施形態における使用に適切な３つの電極４０２ａ、４０２ｂおよび４０２ｃを含む導電性ストリップ４００の模式図である。ストリップ４００はさらに、電極４０２ａ、４０２ｂおよび４０２ｃ間の電気通信を提供するために適合させた電子機器４０４、および電極に連結した、または連結可能な装置（存在する任意のグルコースが電極によって酸化される際に電子の移動から生じる電気信号を検出かつ測定するために適合されている）を備える。開示かつ記載されているように、電極４０２ａ、４０２ｂおよび４０２ｃは単糖（例えば、グルコース）に作用可能であり、単糖を酸化しそして検出可能な電子移動を生じる。記載したように、少なくとも２つの電極は、酸化に関係する２つの電極を含んでいてもよく、その一方で、第３の電極は参照電極として機能し得る。図示しない他の実施形態は、種々の数の電極を含み得る。例えば、参照電極が省略されてもよく、あるいは追加の電極または電極対が追加されてもよい。電子機器４０４は、電極と、発生する任意の電気信号を検出かつ測定する外部装置との間の任意の適切な電気接続を含み得る。このような接続は、限定されないが、ハード配線、物理的電気接続（例えば、スプリング装荷またはジャック(spring-loaded or jacks)、Ethernet、Bluetooth、８０２．１１，ワイヤレス・ローカルエリア・ネットワーク(WLAN)、WiFi、WiMaxなど）、あるいは当該分野において公知の任意の他の有線または無線通信タイプを含み得る。
【００６１】
図５は、本発明の実施形態における使用のための検査インキュベータ／リーダの模式図である。検査インキュベータ／リーダは、記載された接続のうちの１つを介して図４に関して記載された３つの電極に接続するために適切な電気接続を含み得る。検査インキュベータ／リーダは、熱および気圧コントロールを備え、滅菌インジケータの第１の区画および第２の区画の合わせた内容物をインキュベートするために適切な温度および気圧を提供し得る。検査インキュベータ／リーダはさらに、本発明にしたがって、電極上に提供された酵素が単糖（例えば、グルコース）を自由電子を含む反応生成物に変換する際に発生した任意の電気信号を検出かつ測定するために適合した電気回路を備えていてもよい。図６は、図５に示す検査インキュベータ／リーダのための適切な配置の例を提供する。
【００６２】
図６は、適所に電極を含むストリップを有する、例示の検査インキュベータ／リーダ６００におけるインキュベーション中の、例示の滅菌インジケータのかなり模式的な断面図である。図６に示す検査インキュベータ／リーダは、低部容器６０２およびキャップまたは蓋６０４を備える。図６に示すように、検査インキュベータ／リーダ６００内に配されているのは、滅菌インジケータバイアル６０６であり、回収／インキュベーション培地６０８が、本発明の実施形態にしたがって効力の判定にかけられる滅菌プロセス後、選択された検査生物（例えば、ゲオバチルス・ステオロサーモフィルス）の胞子と合わされる。検査インキュベータ／リーダ６００は、（図４のものに類似する）導電性ストリップ６１０を備え、本発明の実施形態にしたがって検査インキュベータ／リーダ６００における容器６０２内の第１および第２の区画の合わせた内容物に挿入されている。検査インキュベータ／リーダ６００はさらに、ストリップ６１０上の３つの電極と、単純糖から反応生成物への酵素変換により発生した任意の電気的活性を検出するために用いられる電気回路との間のハード配線の電気接続体６１２を備える。図４に関して記載されるように、検査インキュベータ／リーダ６００は、任意の適切な方法を介してストリップ６１０と通信し得る。
【００６３】
図６は、１つのみの区画がある場合（例えば、選択的な第１の区画がなく、胞子がストリップ６１０上に配置され、そしてストリップ６１０が初期に第２の区画から分離されている場合）のバイアル６０６の実施形態の代表図である。図６に示すように、初期分離ストリップ(initially separate strip)６１０は、任意の微生物が滅菌プロセスで生存したならば、１つまたはそれ以上の微生物の任意の出芽胞子によって単糖に変換可能な二糖、オリゴ糖および多糖の１つまたはそれ以上を含む増殖培地６０８内に配置されている。第１の区画がなく、増殖培地６０８が必ずしも滅菌プロセスにかけられない場合の実施形態において、この実施形態では、ストリップ６１０（その上に配置された胞子を有する）は滅菌条件にかけられることのみが必要である。もちろん、より複雑な糖から単純糖を製造し得る任意の微生物を増殖培地が含まないことを確実にするために適切な工程が行われるべきであり、それ故、それは滅菌またはストリップのように同様の滅菌条件にかけられてもよい。
【００６４】
図７は、バイアル７００を備える滅菌インジケータシステムの模式図であり、本発明の実施形態にしたがって胞子は第１の区画内にあり、そしてインキュベーション培地およびストリップは第２の区画内にある。図７に示すように、バイアル７００は、キャップ７０２および容器７０４を備える。容器７０４は第１の区画を形成し、そしてキャップ７０２はインキュベーションまたは回収培地７０６を含有する第２の区画を備える。図７の実施形態において、適切な微生物の胞子は、第１の区画内に配置され、そして本実施形態においては、胞子はキャリア７０８に固定化される。容器７０４は穿刺部材７１０を備え、これはバイアル７００が滅菌プロセスにかけられた後にインキュベートのために活性化される場合に、破壊可能な隔壁７１２を穿刺するために配置される。滅菌インジケータシステムはさらに、２つまたはそれ以上の電極（本実施形態では３つの電極）を有する導電性ストリップ７１４を備え、これは最初に第２の区画（すなわち、キャップ７０２）内に配置されている。ストリップ７１４は、図４に関して上述したストリップに実質的に類似しているが、これに限定されない。図４に関して記載するように、ストリップ７１４は適切な電子機器を備え、電極と、存在する任意の単純糖（例えば、グルコース）が電極によって酸化される際の電子の移動から生じる電気信号を検出かつ測定するために適合された装置との間の連結を提供する。図７は、第１の区画が存在し、胞子が第１の区画に配置され、そしてストリップが最初に第２の区画に存在する実施形態の例である。
【００６５】
図８は、バイアル８００を有する滅菌インジケータシステムの模式図であり、本発明の実施形態にしたがって、胞子およびストリップは第１の区画内に存在するが、互いに分離しており、そしてインキュベーション培地は第２の区画に存在する。図８に示すように、バイアル８００は、キャップ８０２および容器８０４を備える。容器８０４は第１の区画を形成し、そしてキャップ８０２は、インキュベーションまたは回収培地８０６を含有する第２の区画を備える。適切な微生物の胞子が第１の区画内に配置され、１つの実施形態では、胞子がキャリア８０８上に固定化される。容器８０２は穿刺部材８１０を備え、これは、これはバイアル８００が滅菌プロセスにかけられた後にインキュベートのために活性化される場合に、破壊可能な隔壁８１２を穿刺するために配置される。滅菌インジケータシステムはさらに、２つまたはそれ以上の電極（本実施形態では３つの電極）を有するストリップ８１４を備え、これは第１の区画内に配置されている。ストリップ８１４は、図４に関して上述したストリップに実質的に類似しているが、これに限定されない。図４に関して記載するように、ストリップ８１４は適切な電子機器を備え、電極と、存在する任意の単純糖（例えば、グルコース）が電極によって酸化される際の電子の移動から生じる電気信号を検出かつ測定するために適合された装置との間の連結を提供する。図８は、第１の区画が存在し、胞子が第１の区画に配置され、そしてストリップが最初に第１の区画に存在する実施形態の例である。
【００６６】
図９は、バイアル９００を有する滅菌インジケータシステムの模式図であり、本発明の実施形態にしたがって、胞子は第１の区画内に存在し、そしてインキュベーション培地は第２の区画内に存在し、そしてストリップはバイアルから分離している。図９に示すように、バイアル９００は、キャップ９０２および容器９０４を備える。容器９０４は第１の区画を形成し、そしてキャップ９０２は、インキュベーションまたは回収培地９０６を含有する第２の区画を備える。適切な微生物の胞子が第１の区画内に配置され、１つの実施形態では、胞子がキャリア９０８上に固定化される。容器９０２は穿刺部材９１０を備え、これはバイアル９００が滅菌プロセスにかけられた後にインキュベートのために活性化される場合に、破壊可能な隔壁９１２を穿刺するために配置される。滅菌インジケータシステムはさらに、２つまたはそれ以上の電極（本実施形態では３つの電極）を有するストリップ９１４を備え、これはバイアル９００から分離して配置されている。ストリップ９１４は、図４に関して上述したストリップに実質的に類似しているが、これに限定されない。図４に関して記載するように、ストリップ９１４は適切な電子機器を備え、電極と、存在する任意の単純糖（例えば、グルコース）が電極によって酸化される際の電子の移動から生じる電気信号を検出かつ測定するために適合された装置との間の連結を提供する。図９は、第１の区画が存在し、胞子が第１の区画に配置され、そしてストリップが最初に第１の区画と第２の区画との両方から分離している実施形態の例である。
【００６７】
図１０は、バイアル１０００を有する滅菌インジケータシステムの模式図であり、本発明の実施形態にしたがって、胞子はストリップ上に存在し、そしてストリップは第１の区画内に存在し、そしてインキュベーション培地は第２の区画内に存在する。図１０に示すように、バイアル１０００は、キャップ１００２および容器１００４を備える。容器１００４は第１の区画を形成し、そしてキャップ１００２は、インキュベーションまたは回収培地１００６を含有する第２の区画を備える。本実施形態では、適切な微生物の胞子がストリップ１０１４上の第１の区画内に配置される。容器１００２は穿刺部材１０１０を備え、これはバイアル１０００が滅菌プロセスにかけられた後にインキュベートのために活性化される場合に、破壊可能な隔壁１０１２を穿刺するために配置される。滅菌インジケータシステムはさらに、２つまたはそれ以上の電極（本実施形態では３つの電極）を有するストリップ１０１４を備え、これは第１の区画内に配置されている。ストリップ１０１４は、図４に関して上述したストリップに実質的に類似しているが、本実施形態においてストリップ１０１４がまた胞子を保持することを除き、これに限定されない。図４に関して記載するように、ストリップ１０１４は適切な電子機器を備え、電極と、存在する任意の単純糖（例えば、グルコース）が電極によって酸化される際の電子の移動から生じる電気信号を検出かつ測定するために適合された装置との間の連結を提供する。図１０は、第１の区画が存在し、胞子がストリップ上に配置され、そしてストリップが最初に第１の区画内に存在する実施形態の例である。
【００６８】
図１１は、バイアル１１００を有する滅菌インジケータシステムの模式図であり、本発明の実施形態にしたがって、胞子はストリップ上に存在し、そしてストリップはバイアルから分離し、第１の区画には何もなく、そしてインキュベーション培地は第２の区画内に存在する。図１１に示すように、バイアル１１００は、キャップ１００２および容器１１０４を備える。容器１１０４は第１の区画を形成し、そしてキャップ１１０２は、インキュベーションまたは回収培地１１０６を含有する第２の区画を備える。容器１１０２は穿刺部材１１１０を備え、これは、これはバイアル１１００が滅菌プロセスにかけられた後にインキュベートのために活性化される場合に、破壊可能な隔壁１１１２を穿刺するために配置される。滅菌インジケータシステムはさらに、２つまたはそれ以上の電極（本実施形態では３つの電極）を有するストリップ１１１４を備え、これはバイアル１１００から分離して配置されている。本実施形態では、適切な微生物の胞子がストリップ１１１４上に配置されている。ストリップ１１１４は、図４に関して上述したストリップに実質的に類似しているが、本実施形態においてストリップ１１１４もまた胞子を保持することを除き、これに限定されない。図４に関して記載するように、ストリップ１１１４は適切な電子機器を備え、電極と、存在する任意の単純糖（例えば、グルコース）が電極によって酸化される際の電子の移動から生じる電気信号を検出かつ測定するために適合された装置との間の連結を提供する。図１１は、第１の区画が存在し、胞子がストリップ上に配置され、そしてストリップが最初に第１の区画と第２の区画との両方から分離している実施形態の例である。
【００６９】
図１２は、作用電極によって生じた信号を受容し、それをデジタル信号に変換し、そしてそれをマイクロコントローラに転送するためのデバイスの模式図である。当業者によって理解されるように、検査ストリップ内の作用電極から得られた異なる信号は、トランスインピーダンスアンプによって改変されかつ測定されるように、アナログデジタルコンバータ（ＡＤＣ）に供給され、次いで、マイクロコントローラ／マイクロプロセッサユニット（ＭＣＵ／ＭＰＵ）に供給される。そして、次に表示に結果を出力し、これによりユーザーは検査の結果および滅菌が合格したかどうかを判定し得る。
【００７０】
適切な非酵素グルコースリーダが本発明の使用のために当業者によって選択され得る。市販されているこのようなリーダとしては、Roche Diagnostics製のAccu-Chek（登録商標）、Abbott Diabetes Care製のFreeStyleLite（登録商標）、およびJohnson & Johnson製のOneTouch Ultra（登録商標）が挙げられる。実験室開発検査システムには、EC epsilon電気化学ワークステーション(Bioanalytical Systems,Inc.)がある。血糖リーダの追加情報のために、Electrochemistry Encyclopedia、「Electrochemical Blood Glucose Test Strips for People with Diabetes」、Ben Feldman, ２００９年１０月も参照のこと。
【００７１】
したがって、１つの実施形態では、本発明はさらに、滅菌プロセスの効力を判定するための方法を提供する。本実施形態によれば、この方法は以下の工程：
先行する請求項のいずれかに記載の滅菌インジケータシステムを滅菌プロセスにおいて滅菌剤に曝す工程；
第１の区画および第２の区画の内容物を合わせ、そして合わせた内容物をインキュベートする工程；
２つまたはそれ以上の電極を用いて任意の単糖をインキュベートおよび酸化する前および／または間に、ストリップを合わせた内容物と接触させる工程；
２つまたはそれ以上の電極に装置を連結する工程；
２つまたはそれ以上の電極に連結した装置を用いて、酸化から２つまたはそれ以上の電極により生じた電気信号を検出かつ測定する工程；ならびに
電気信号の存在または不在に基づいて滅菌プロセスの効力を判定する工程；
を包含する。
【００７２】
上記方法は、上記説明で提供された詳細に従いかつ当業者の知識と一体となって実施され得る。いくつかの少しの検査および実験が必要とされ、適切な滅菌インジケータシステムの製造と、開示された滅菌インジケータシステムを用いる適切な滅菌方法の実行とを最適化し得る一方、任意のこのような検査または実験はほんの最小限である。
【００７３】
本発明において、生存生物の検出は、生物の出芽胞子の個体群における単純糖の出現から生じる電気信号のモニタリングを通して行われる。滅菌条件を生き残った生存胞子のみがこの活性を発現し得、そして単純糖のそうした出現が生存胞子の陽性のインジケータ（滅菌性能を評価する際の不合格条件）である。逆に言えば、これらの検査条件下での単純糖の不在は、生物学的インジケータ中の胞子が生存可能ではないことの指標（有効な滅菌性能の合格条件）である。
【００７４】
１つの実施形態では、本発明は、糖尿病患者のための血中グルコース濃度の非酵素的測定に使用されるもののようなグルコースメータを使用するか、または使用のために適合させる。しかし、本発明とこのようなグルコースメータの公知の使用との間には１つの決定的な相違点があり、それは測定される単糖（例えば、グルコース）の濃度に関連する。血中グルコース濃度は一般に、約２ｍＭ（ミリモル濃度）〜約３０ｍＭの範囲である。本発明により測定される単糖（例えば、グルコース）の濃度は、非常に低く、既存の計装の限界に近づく。知られているように、例えば、ＣｕＯナノワイヤ修飾電極および固定電位クロノアンペロメトリー法(fixed potential chronoamperometric method)を使用する場合、検出限界は、約０．０００５ｍＭ、または標準血中グルコース濃度よりも４ｌｏｇ低い。知られているように、分子インプリントポリマーグラフト金電極（「MIP Au」）を使用する場合、検出限界は約２×１０−６ｍＭであるか、または電気的モニタリングの電位走査法を用いる場合、標準血中グルコース濃度よりも６ｌｏｇ低い。上記検出限界は、「Electrochemical Non-Enzymatic Glucose Sensors: A Perspective and an Evaluation, Kathryn E Toghill and Richard Compton; Int. J. Electrochem. Sci., 5 (2010) 1246-1301」に開示されている。より大きな感度の例が存在するが、上記は既存の商業的方法から本発明の重要な起点を明確に示す。
【００７５】
本発明の実施形態にしたがって、滅菌プロセスに生き残った生存出芽胞子の存在を示し得る単糖（例えば、グルコース）の濃度の検出限界は、従来技術の滅菌インジケータを越えてかつ血中グルコース測定に関して非常に向上する。向上した検出限界により、検査される滅菌プロセスの有用性の大変より早い測定が提供される。これは、滅菌プロセスが不合格となり、胞子が生き残った場合には、胞子が出芽し始めるので、単糖の初期濃度が非常に低いためである。本発明を用いて、単糖の非常に低濃度の検出を可能にすることにより、任意の単糖が検出される前の時間の遅れが、従来の滅菌インジケータによって必要とされる数時間から数日と比較して、数分または数秒にさえ減じられるかもしれない。これは、従来の滅菌インジケータに関する重要かつ顕著な改良点を表す。
【００７６】
本発明によって検出され得る最も低いレベルにおそらく限定する１つのファクターは、増殖培地に用いられる二糖、オリゴ糖または多糖の純度である。これらのより高次の糖が純粋ではなく、かつ顕著な量の関連単糖を含む場合、二糖をさらに精製する必要があり得る。あるいは、またはそれに加えて、同様の増殖培地を用いるが、死滅または生存する任意の胞子を用いない、ブランクのサンプルが分析され、ベースラインが決定され得る。そのような場合において、単糖が電極によって酸化される際の電子移動から生じる電気信号は、どのようなベースラインの信号がブランクのサンプルを用いて得られようともそれを越える信号である。
【００７７】
本発明は、１つの実施形態では、ゲオバチルス・ステオロサーモフィルス胞子の使用に関し、これはスチームおよび過酸化水素蒸気を用いる滅菌器サイクルの評価のための許容されたインジケータ生物である。本発明は、別の実施形態では、バシラス・アトロフェウス胞子の使用に関し、これは滅菌剤としてエチレンオキシドおよび乾性温熱を用いる滅菌器のための許容されたインジケータ生物である。本発明は、滅菌後の生存胞子の（可能性のある）出現が関連する滅菌プロセスの効力の評価においてモニターされる分析物としての単純糖（例えば、グルコース）のレベルの増大を発生させるための天然に生じる胞子付随グリコシダーゼ（例えば、α−グルコシダーゼ）のための基質としての添加されたオリゴ糖（例えば、マルトース）の使用においてユニークである。単純糖の出現レベルがなければ、滅菌インジケータの胞子がもはや生存せず、そのため滅菌プロセスが合格した証拠を示すことになる。逆に言えば、生存出芽胞子の副生成物である単純糖の出現レベルがあれば、滅菌器が滅菌の合格に必要な条件を作り出すことができなかったことを示すことになる。この同様のプロセスが、他の胞子付随酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）を用いて、分析物の単純糖（例えば、グルコース）を発生させるように他の二糖、オリゴ糖、または多糖（例えば、ラクトース）を変換し得る。活性胞子付随酵素の存在、または評価の下での滅菌事象後のそれらの生成は、出芽プロセスにおいて非常に早くに起こるので、インジケータ生物はまだ、胞子のすべての形態的特性および膜特性を有している。一方、単純糖が検出される時点で、胞子はまさに出芽し始めている。好ましい実施形態では、補充される炭化水素はマルトースであり、これは特に利点を有する。第１の利点として、二糖は、電極との相互作用を示さず、活性酵素（例えば、グルコシダーゼ）を発現する生存出芽胞子との相互作用を有することなく信号を生じる。別の利点として、マルトースは、グルコース１分子よりもむしろグルコースの２分子を提供する。これは、ラクトースのような多くの他の可能性のある複合糖についてもあてはまる。誰もがβ−ガラクトシダーゼのような胞子由来の他の天然に生じる酵素、およびラクトース（１つのグルコース分子と１つのガラクトース分子を生成する）のような対応する基質を使用することができ、同様の結末（検査溶液中に存在するグルコースの増加）を達成する。いずれの場合においても、第１工程の生成物（例えば、グルコース）は引用した例の電極バイオセンサと相互作用を示し、本発明の検出可能な信号を生じる。第３の利点は、残存する生存インジケータ胞子に関して合格または不合格の判定を導く結果の検出および評価のための携帯式グルコースバイオセンサを使用することができる点である。このようなバイオセンサの使用は、数秒から数分の読み取り時間を可能にし、滅菌サイクルのモニタリングの分野にとっても新規である。
【００７８】
本発明の重要な長所は、生物学的インジケータのより早い読み取り時間である。加えて、信号は電気的に測定されるので、信号のコンディショニングおよび増幅の機会がある。さらに、単純糖の量に対する酸化電流の直接的な関係を関連付ける単純なアルゴリズムを用いて、合格および不合格の判断がユーザーには必要とされない。類似技術にわたる別の長所は、コストを付加し、保存寿命を減らし、そして生物学的センサの性能を律速拡散および酵素の反応速度の影響に供する任意の添加される酵素とは独立していることである。
【００７９】
（利用可能なデータが多く存在する）血液検査における非酵素グルコース検出の適用は、血液および血漿中に見出されるインヒビターによって影響を受け、そして中性ｐＨを含む生理学的条件で使用されなければならない。これらのインヒビターは、本発明の滅菌インジケータシステムにおいて使用される胞子製剤中では存在せず、そして非常に広範の温度、ｐＨ、イオン強度、および他の条件が胞子とともに使用され得るので、このような条件は、生理学的条件を維持する制約に関わらず電極システムの電気触媒的ニーズを最適化するために調節され得る。例えば、非常に大きな感度が、他の酵素ベースの生物学的インジケータシステムではなし得なかったｐＨ値で達成され得る。
【００８０】
本発明の原理を、ある特定の実施態様に関連して説明したが、これらの実施形態は、例示の目的のために提供される。それらの種々の改変は本願明細書を読む当業者にとって明らかなものであると理解すべきである。したがって、本明細書中に開示された発明については、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まるようにこのような改変が網羅されていることが意図されていることを理解すべきである。本発明の範囲は特許請求の範囲の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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