(57)【要約】  遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド及びその調製方法、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ、その調製方法及び使用、当該ミニサークルＤＮＡを有する宿主細胞、その調製方法及びその使用が提供される。また、遺伝子操作された抗体、その調製方法及び使用も提供される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドであって、
前記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列が挿入されたプラスミドであり、
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド。
【請求項２】
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの調製方法であって、
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を用意又は調製するステップと、
（２）ステップ（１）で得られたＤＮＡ断片をミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に挿入し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを得るステップと、を含み、
ステップ（１）において、前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの調製方法。
【請求項３】
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡであって、
前記ミニサークルＤＮＡは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項４】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、シグナルペプチドの遺伝子配列及び／又はタグの遺伝子配列により遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む、
ことを特徴とする請求項３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項５】
前記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、下記の（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
（ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す）
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、
ことを特徴とする請求項３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項６】
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡであって、
前記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、
前記遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項７】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする塩基配列を有し、
前記遺伝子操作された抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位、及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有するデュアルターゲッティング特異的抗体である、
ことを特徴とする請求項６に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項８】
前記免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項９】
前記腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項１０】
前記デュアルターゲッティング特異的抗体は、前記腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する、
ことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項１１】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、
前記二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）：
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ここで、前記VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、前記VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、前記VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、前記VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、前記VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、前記VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される）
からなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項６に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項１２】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、宿主菌において部位特異的組み換えが発生したミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドからなる、
ことを特徴とする請求項６に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ。
【請求項１３】
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法であって、
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを用意又は調製するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドにより宿主菌を形質転換し、リコンビナーゼの存在下で、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製するステップと、
（３）ステップ（２）で得られたミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを単離及び精製するステップと、を含み、
ステップ（１）において、前記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列が挿入されたプラスミドであり、部位特異的組み換えに係る部位を有し、
ステップ（３）において、前記ミニサークルＤＮＡは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡである、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法。
【請求項１４】
前記部位特異的組み換えに係る部位は、ｐｈｉＣ３１部位特異的組み換えに係る部位、ｐａｒＡ部位特異的組み換えに係る部位、又はＣｒｅ部位特異的組み換えに係る部位である、
ことを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法。
【請求項１５】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法。
【請求項１６】
前記部位特異的組み換えに係る部位は、ａｔｔＢ及びａａｔＰ部位であり、
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、下記の（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
（ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す）
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法。
【請求項１７】
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法であって、
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを用意又は調製するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドにより宿主菌を形質転換し、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で、ａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミドＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製するステップと、
（３）ステップ（２）で得られたａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミドＤＮＡを、Ｉ−Ｓｃｅエンドヌクレアーゼで切断して線状ＤＮＡ断片を調製した後、プラスミドを宿主菌において分解させ、プラスミド精製用キットでａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを精製するステップと、を含み、
ステップ（１）において、前記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列が挿入されたプラスミドであり、前記ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドであり、前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含み、
ステップ（３）において、前記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナル含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法。
【請求項１８】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、
前記二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）：
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ここで、前記VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、前記VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、前記VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、前記VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、前記VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、前記VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される）
からなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項１７に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法。
【請求項１９】
請求項３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの使用であって、
下記の（１）〜（４）：
（１）前記ミニサークルＤＮＡは、単独で使用する薬を製造するために、
（２）前記ミニサークルＤＮＡは、化学療法、放射線療法、手術、生物療法、及び免疫療法のうちの１つ又はそれらの組み合わせと併用する薬を製造するために、
（３）前記ミニサークルＤＮＡは、標的化デリバリー法により患者に送達して治療を行う薬を製造するために、又は
（４）前記ミニサークルＤＮＡは、インビトロトランスフェクション技術により免疫エフェクター細胞にトランスフェクションした後、トランスフェクションされた免疫エフェクター細胞を患者に輸送して治療を行う薬を製造するために、
用いられることを特徴とする遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの使用。
【請求項２０】
前記（４）における免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、及び幹細胞からなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項１９に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの使用。
【請求項２１】
請求項３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを含む、ことを特徴とする宿主。
【請求項２２】
遺伝子操作された抗体であって、
前記遺伝子操作された抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位、及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有するデュアルターゲッティング特異的抗体である、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体。
【請求項２３】
前記遺伝子操作された抗体は、二重特異性一本鎖抗体であり、
前記二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）：
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ここで、前記VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、前記VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、前記VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、前記VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、前記VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、前記VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される）
からなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項２２に記載の遺伝子操作された抗体。
【請求項２４】
遺伝子操作された抗体の製造方法であって、
（１）ミニサークルＤＮＡを用意又は調製するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現して遺伝子操作された抗体を製造するステップと、を含み、
ステップ（１）において、前記ミニサークルＤＮＡは遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは遺伝子操作された抗体遺伝子を含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体の製造方法。
【請求項２５】
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む、
ことを特徴とする請求項２４に記載の遺伝子操作された抗体の製造方法。
【請求項２６】
前記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、
前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、下記の（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
（ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す）
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、
ことを特徴とする請求項２４に記載の遺伝子操作された抗体の製造方法。
【請求項２７】
遺伝子操作された抗体の製造方法であって、
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを用意又は調製するステップと、
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現して遺伝子操作された抗体を製造するステップと、
を含み、
ステップ（１）において、前記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、前記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む、
ことを特徴とする遺伝子操作された抗体の製造方法。
【請求項２８】
前記遺伝子操作された抗体は、二重特異性一本鎖抗体であり、
前記二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）：
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ここで、前記VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、前記VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、前記VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、前記VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、前記linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、上記linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示される）
からなる群より選ばれる１つである、
ことを特徴とする請求項２７に記載の遺伝子操作された抗体の製造方法。
【請求項２９】
請求項３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの、癌の治療薬を製造するための使用。
【請求項３０】
請求項３に記載の遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの、CD19陽性癌疾患の治療薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド、その調製方法及び使用、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ、その調製方法及び使用、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する宿主細胞及びその使用、並びに遺伝子操作された抗体、その発現方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床では、組換え抗体は、癌及び自己免疫疾患などを含む様々な疾患の治療に使われている。現在、遺伝子操作された抗体は、一般的に、インビトロで製造された後、体内に注入されて治療を行う。しかしながら、このような方法は、例えば、（１）製造、包装、輸送、保存などのためのコストが高いこと、（２）タンパク質抗体医薬は純度が低く、汚染物による副作用、安全上の潜在的危険性を有すること、（３）抗体の短半減期短による繰り返し注射を必要とするという問題がある。また、場合によって、マイクロポンプ投与法で体内における抗体の有効濃度を維持することも必要とし、抗体の臨床応用がより困難になり、治療コストも高くなる。
【０００３】
ヒト標的細胞に治療用遺伝子をトランスフェクションする遺伝子治療は、タンパク質抗体医薬の直接注射による問題を回避する効果的な方法の一つである。遺伝子治療において、効果的なベクターにより標的遺伝子を宿主細胞に安全かつ効率よく送達して発現することが非常に重要である。臨床上用いられる遺伝子治療用ベクターは、主として組換えアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含む。そのうち、ウイルスベクターは高導入率を持つが、製造コストが高く、その挿入突然変異のリスク及び免疫原性により、発癌のリスク及び患者の致命的な免疫応答を引き起こす。従来のプラスミドベクターはウイルスベクターよりも安全であるが、トランスフェクション率が低い。また、外来遺伝子は一過的にしか発現できない。外来遺伝子を安定的かつ持続的に発現しようとすると、ベクターが宿主細胞染色体にに組み込まれる必要があるから、挿入突然変異及び外来遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性がある。さらに、従来のプラスミドベクターに含まれる細菌複製配列、耐性遺伝子、非メチル化ＣｐＧ遺伝子配列などのいくつかの隠された信号は、プラスミド複製に必要であり、遺伝子治療において深刻な生物学的安全性の問題につながる可能性がある。
【発明の概要】
【０００４】
このような事情に鑑み、本発明の第１の態様は、ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが宿主菌においてミニサークルＤＮＡの組換え過程を完成し、原核プラスミド要素を取り除く、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを提供する。
【０００５】
本発明の第２の態様は、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの調製方法を提供する。
【０００６】
本発明の第３の態様は、ミニサークルＤＮＡが宿主細胞の染色体ＤＮＡから離れて、遺伝子操作された抗体遺伝子を安定的かつ持続的に発現する、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを提供する。
【０００７】
本発明の第４の態様は、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法を提供する。
【０００８】
本発明の第５の態様は、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを含む宿主細胞を提供する。
【０００９】
本発明の第６の態様は、遺伝子操作された抗体を提供する。
【００１０】
本発明の第７の態様は、遺伝子操作された抗体の発現方法を提供する。
【００１１】
本発明の第８の態様は、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの使用、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの使用、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを含む宿主細胞の使用、及び遺伝子操作された抗体の使用を提供する。
【００１２】
第１の態様において、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドであって、上記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットが遺伝子操作された抗体遺伝子を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが提供される。
【００１３】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ空プラスミド」は、部位特異的組み換えに係る部位（site-specificrecombination site）を有するプラスミドベクターを意味する。
【００１４】
本明細書において用いられる「プラスミドベクター」は、遺伝子操作の研究において、外来ＤＮＡを挿入可能、かつレシピエント細胞で複製可能なＤＮＡ構造を意味する。
【００１５】
本明細書において用いられる「プラスミド」の用語と「プラスミドベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【００１６】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」は部位特異的組み換えに係る部位を有し、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製できる組換え親プラスミドを意味する。
【００１７】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」の用語と「ミニサークルＤＮＡ親プラスミド」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【００１８】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」は、主に超らせん構造で存在し、原核プラスミドの骨格ＤＮＡ配列を含まないベクターを意味する。そのミニサークルＤＮＡは、ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れて、転写又は標的遺伝子を安定的かつ持続的に発現することができる。
【００１９】
本明細書において用いられる「標的遺伝子」は、遺伝子操作された抗体遺伝子であることが好ましく、その遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする遺伝子である。
【００２０】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」の用語と「ミニサークルＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【００２１】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターと比較して、ミニサークルＤＮＡは、細菌由来の骨格ＤＮＡ配列が取り除かれるので、炎症及びインビボ又はインビトロでの遺伝子発現のサイレンシングの発生可能性を低下させ、このようにして、より長期にわたりより強い発現が得られる。また、ミニサークルＤＮＡにおいて耐性マーカー遺伝子及び複製起点を含有する細菌の配列が欠けているため、臨床上の安全性が向上する。
【００２２】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ配列」は、標準プラスミドにおける細菌プラスミドの複製、又はプラスミドを含む宿主のスクリーニングを機能するＤＮＡ配列を有する。このようなＤＮＡ配列は、例えば、細菌複製配列、耐性遺伝子、及び非メチル化ＣｐＧ遺伝子配列などを含む。
【００２３】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【００２４】
好ましい実施形態において、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを宿主細胞に形質転換して誘導した後、そのミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換え事象（site-specific recombination event）により、ミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製する。
【００２５】
好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。
【００２６】
好ましくは、部位特異的組み換えに係る部位は、ｐｈｉＣ３１部位特異的組み換えに係る部位、ｐａｒＡ部位特異的組み換えに係る部位、又はＣｒｅ部位特異的組み換えに係る部位である。
【００２７】
本明細書において用いられる「部位特異的組み換え」は、Hu Chunsheng etal.「Letters inBiotechnology (22 (1): 104-109 (2011)」に報告されたｐｈｉＣ３１（ФＣ３１）リコンビナーゼシステム、ｐａｒＡリコンビナーゼシステム、又はＣｒｅリコンビナーゼシステムを使用することが好ましい。
【００２８】
好ましくは、骨格ＤＮＡは、少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を含有する。
【００２９】
さらに好ましくは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼである。
【００３０】
このような好ましい条件下で、骨格ＤＮＡは宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得るので、ミニサークルＤＮＡの精製を促進する。また、非組み換えミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、同様にＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を有するので、宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得る。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによりミニサークルＤＮＡを調製する。ここで、そのミニサークルＤＮＡ空プラスミドの部位特異的組み換えに係る部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位である。好ましいａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによって認識され得る最小認識配列である（ａｔｔＢ、ａｔｔＰの最小認識配列は、SEQ ID NO:31及びSEQ IDNO:32として示される）。
【００３２】
さらなる好ましい実施形態において、本明細書で構築されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、骨格ＤＮＡのヌクレオチド配列とミニサークルＤＮＡのヌクレオチド配列との間に存在するａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【００３３】
具体的に、そのａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換えを行うことが可能であり、ミニサークル親プラスミドがａｔｔＬ部位を含有するプラスミド骨格ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製するようにする。
【００３４】
当業者は、必要に応じて適切なリコンビナーゼシステムを選択し、対応するリコンビナーゼを発現し得る適切な宿主菌を選択し、対応する部位特異的組み換えに係る部位を有するミニサークルＤＮＡ空ベクターを構築することができる。
【００３５】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミド又はミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドに位置して、ミニサークルＤＮＡ調製時にミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドによって発現され得る。
【００３６】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、宿主細胞の遺伝子に位置して、その宿主細胞によって発現され得る。
【００３７】
好ましくは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドである。
【００３８】
本明細書において用いられる「ｐ２ФＣ３１空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【００３９】
具体的に、空プラスミドｐ２ФＣ３１の構築方法は、Chen ZY et al.,Molecμｌar Therapy, 8 (3), 495-500 (2003)、Chen ZY,et al., Human Gene Therapy, 16 (1), 126-131 (2005)、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に開示されている。
【００４０】
本明細書において用いられる「ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【００４１】
具体的に、空プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸの構築方法及び全ゲノム配列は、Chen ZY et al.,Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)に開示されている。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態に用いられるｐ２ФＣ３１プラスミド及びｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドは、ｐ２ФＣ３１ベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在する一方、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在しないため、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにより調製されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドはより良い品質を有し、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列の汚染を減少させるという点で異なる。しかしながら、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする機能を持つ大腸菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。ФＣ３１リコンビナーゼ（すなわち、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ）及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有しないｐＭＣ．ＢＥＳＰＸは、インビボの部位特異的組み換え（大腸菌ＴＯＰ１０はその機能を持たない）を発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。それに応じて、ｐ２ФＣ３１ベクターは、ＴＯＰ１０において部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＴＯＰ１０とともに使用される必要がある。
【００４３】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、天然抗体及び組換え抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【００４４】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【００４５】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、治療用抗体を含むがこれに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【００４６】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい遺伝子操作された抗体をコードする。
【００４７】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。
【００４８】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【００４９】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。
【００５０】
より好ましくは、そのプロモーターは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結される。
【００５１】
さらに好ましくは、シグナルペプチドは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドである。
【００５２】
さらに好ましくは、タグはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグのうちの少なくとも１つである。
【００５３】
以上のシグナルペプチド及びタグは、本発明において好適である。当業者は、必要に応じて適切なシグナルペプチド及びタグを選択することができる。
【００５４】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は、標的ポリペプチド（本発明における遺伝子操作された抗体）を発現するために必要なすべての要素を含む遺伝子発現システムを意味する。その遺伝子発現システムは、一般的に、プロモーター、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、及びターミネーターのような要素を含み、さらにシグナルペプチドのコード配列を含んでもよい。これらの要素は、作動可能に連結されている。
【００５５】
本明細書において用いられる「作動可能に連結される」は、２以上の核酸領域又は核酸配列が機能する配置を意味する。例えば、プロモーター領域を標的核酸配列に対して特定の位置に配置することで、そのプロモーター領域は、核酸配列の転写を促して、核酸配列に「作動可能に連結される」。
【００５６】
本発明の第１の態様の好ましい形態として、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドであって、上記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記ミニサークルＤＮＡ空プラスミドがｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットが下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが提供される。
【００５７】
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナル（tailing signal）を表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す。
【００５８】
本明細書において用いられる「ヌクレオチド配列」の用語は、遺伝子、又は二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のヌクレオチド配列を意味する。例えば、「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、下記の．．．からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む」は、「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は「下記の．．．からなる群より選ばれるヌクレオチド配列」の遺伝子断片を含むことを意味すると理解されるであろう。
【００５９】
ＤＮＡは、３，５−ホスホジエステル結合によって連結される４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＴ及びｄＴＭＰ）からなるデオキシリボ核酸である。ここで、「塩基配列」は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すために用いられると理解されるであろう。
【００６０】
本発明の第１の態様の好ましい形態として、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドであって、上記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記ミニサークルＤＮＡ空プラスミドがｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットが、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドが提供される。
【００６１】
本明細書において用いられる「塩基配列」の用語は、遺伝子、又は二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のヌクレオチド配列を意味する。例えば、「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列を含む」は、「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は「免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列」の遺伝子断片を含むことを意味すると理解されるであろう。
【００６２】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする塩基配列を有し、遺伝子操作された抗体は、デュアルターゲッティング特異的抗体であり、そのデュアルターゲッティング特異的抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位（targetingimmune effector cell antigen epitope binding site）及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位（tumor cell antigen epitopebinding site）を有する。
【００６３】
より好ましくは、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである。
【００６４】
さらに好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである。
【００６５】
以上の好ましい免疫エフェクター細胞及び腫瘍細胞は、実際に他の免疫エフェクター細胞及び腫瘍細胞の使用を制限するものではない。
【００６６】
より好ましくは、デュアルターゲッティング特異的抗体は、腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する。
【００６７】
好ましくは、空プラスミドｐ２ФＣ３１の構築方法は、Chen ZY et al.,Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA resμｌt inpersistent and high-level transgene expression in vivo, Molecμｌar Therapy, 2003, Volume8, Number3, 495-500、ChenZY et al., Improved production and purification of minicircle DNA vector freeof plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expressionin vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volume 16, Number 1,126-131、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に開示されている。
【００６８】
好ましくは、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドの全ゲノム配列は、Chen ZY et al.,A robust system for production of minicircle DNA vectors, Nature Biotechnology,2010, Volume 28, Number 12, 1289-1291に記載されている。
【００６９】
好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスＲＳＶプロモーター、ユビキチンＵＢＣプロモーター、及び伸長因子ＥＦ１αプロモーターを含む。
【００７０】
より好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターである。
【００７１】
好ましくは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:23に示される。
【００７２】
本発明に係るプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶ、ＲＳＶ、ＵＢＣ、及びＥＦ１αなどの真核生物プロモーターであってもよい。本発明において、ＣＭＶプロモーターは、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるプロモーターを使用することにより、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築する。
【００７３】
本発明で提供される免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドは、遺伝子操作された抗体遺伝子の分泌に寄与する。
【００７４】
好ましくは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列は、SEQ ID NO:24に示される。
【００７５】
本発明で提供されるＦｌａｇタグは、遺伝子操作された抗体遺伝子の発現に寄与し、ｃ−ｍｙｃ、グルタチオン−Ｓ転移酵素（ＧＳＴ）、インフルエンザウイルス血球凝集素エピトープ（ＨＡ）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの他の常用の標識より優れている。
【００７６】
好ましくは、Ｆｌａｇタグの塩基配列は、SEQ IDNO:25に示される。
【００７７】
本発明で提供されるＨｉｓ６タグは、抗体のインビトロでの精製及び検証に寄与する６つのヒスチジンペプチドである。
【００７８】
好ましくは、Ｈｉｓ６タグの塩基配列は、SEQ IDNO:26に示される。
【００７９】
本発明で提供されるＦｌａｇタグ及びヒスチジンタグは、それぞれ、遺伝子操作された抗体遺伝子の上流及び下流に位置している。具体的なベクターの構築過程において、それらの位置が交換可能である。
【００８０】
好ましくは、終止コドンの塩基配列はＴＴＡである。
【００８１】
好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡ又はＳＶ４０である。
【００８２】
さらに好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡである。
【００８３】
好ましくは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡの塩基配列は、SEQ ID NO:27に示される。
【００８４】
本発明に係るｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ＳＶ４０などであってもよい。本発明において、ｂｐＡテイルシグナルは、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるテイルシグナルを使用することにより、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築する。
【００８５】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、その二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる１つである。
【００８６】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
ここで、VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される。
【００８７】
本明細書における塩基とアミノ酸配列とポリペプチドとの間に示される表記「-」は、塩基とアミノ酸配列とポリペプチドとの間の順次連結を表す。
【００８８】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００８９】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下のようなアミノ酸配列を有する遺伝子操作された抗体をコードする。
【００９０】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQID NO:9-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:4- SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:6であり、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQID NO:10-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:3- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:5であり、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQID NO:10-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:3であり、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQID NO:8-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4であり、
（ｅ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4である。
【００９１】
ここで、表記「-」は、アミノ酸配列の間の順次連結を表す。
【００９２】
より好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下に示すような塩基配列を有する。
【００９３】
（ａ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:17であり、
（ｂ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:16であり、
（ｃ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-
SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:14であり、
（ｄ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:15であり、
（ｅ’）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:15であり、
ここで、SEQ ID NO:29（VLCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:33であり、SEQ ID NO:30（VHCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:34である。
【００９４】
ここで、（ａ’）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｅ’）及び（ｆ’）で表されるすべての塩基配列は、２つの一本鎖遺伝子（ＤＮＡ断片）の一方の鎖のヌクレオチド配列であり、表記「-」は、塩基配列の間の順次連結を表す。
【００９５】
ヌクレオチド配列の縮重又は突然変異の可能性があるため、当業者は塩基を調整できると理解されるであろう。塩基の変化がコドンの変化を引き起こすが、コドンによって翻訳されたアミノ酸の変化を引き起こすことはない。一般的に、ロイシンコドンは、例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵなどの様々なコドンを有することがある。
【００９６】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列である。
【００９７】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列であり、かつ、その遺伝子操作された抗体遺伝子がコードするアミノ酸配列は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列がコードするアミノ酸配列と完全に又は基本的に同一である。
【００９８】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、全遺伝子合成又はＰＣＲクローニング法で得られる。
【００９９】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、二重特異性一本鎖抗体をコードする遺伝子を有する。ここで、その二重特異性一本鎖抗体は、４つの異なるドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、すなわち、ヒトCD19抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD19）、ヒトCD19抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD19）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。VLCD19、VHCD19、VLCD3及びVHCD3ポリペプチドをコードする遺伝子は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ここで、VLCD19及びVHCD19がヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成し、VLCD3及びVHCD3がヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成するので、本発明に係る遺伝子操作された抗体は、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）であることが好ましい。
【０１００】
好ましくは、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の好適な構造形態は、
VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3であり、
ここで、Linkerは、主にグリシン及びセリンで構成されるポリペプチド配列を用いるリンカーペプチドである。グリシンは最も小さいアミノ酸であり、その最小の側鎖により側鎖の柔軟性を高めることができる。一方、セリンは親水性の最も強いアミノ酸であり、ペプチド鎖の親水性を増大させることができる。
【０１０１】
次に、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びＦｌａｇタグをコードする塩基配列を有することで、遺伝子操作された抗体のＮ末端に免疫グロブリン軽鎖κ鎖の分泌シグナルペプチド及びＦｌａｇタグを加えることを可能にする。このようにして、抗体を発現して宿主細胞外に分泌することを保証する。また、Ｈｉｓ６タグを遺伝子操作された抗体のＣ末端に連結することにより、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製することに寄与する。
【０１０２】
抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥ）は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD20抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD20）、ヒトCD20抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD20）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。
【０１０３】
本明細書で記載される塩基配列は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すと理解されるであろう。
【０１０４】
第２の態様において、本発明は、下記のステップ（１）、（２）を含む遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの調製方法を提供する。
【０１０５】
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を用意又は調製する。ここで、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０１０６】
（２）ステップ（１）で得られたＤＮＡ断片をミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に挿入し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを得る。
【０１０７】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ空プラスミド」は、部位特異的組み換えに係る部位を有するプラスミドベクターを意味する。
【０１０８】
本明細書において用いられる「プラスミドベクター」は、遺伝子操作の研究において、外来ＤＮＡを挿入可能、かつレシピエント細胞で複製可能なＤＮＡ構造を意味する。
【０１０９】
本明細書において用いられる「プラスミド」の用語と「プラスミドベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０１１０】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」は部位特異的組み換えに係る部位を有し、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製できる組換え親プラスミドを意味する。
【０１１１】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」の用語と「ミニサークルＤＮＡ親プラスミド」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０１１２】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」は、主に超らせん構造で存在し、原核プラスミドの骨格ＤＮＡ配列を含まないベクターを意味する。そのミニサークルＤＮＡは、ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れて、転写又は標的遺伝子を安定的かつ持続的に発現することができる。
【０１１３】
本明細書において用いられる「標的遺伝子」は、遺伝子操作された抗体遺伝子であることが好ましく、その遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする遺伝子である。
【０１１４】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」の用語と「ミニサークルＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０１１５】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターと比較して、ミニサークルＤＮＡは、細菌由来の骨格ＤＮＡ配列が取り除かれるので、炎症及びインビボ又はインビトロでの遺伝子発現のサイレンシングの発生可能性を低下させ、このようにして、より長期にわたりより強い発現が得られる。また、ミニサークルＤＮＡにおいて耐性マーカー遺伝子及び複製起点を含有する細菌の配列が欠けているため、臨床上の安全性が向上する。
【０１１６】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ配列」は、標準プラスミドにおける細菌プラスミドの複製、又はプラスミドを含む宿主のスクリーニングを機能するＤＮＡ配列を有する。このようなＤＮＡ配列は、例えば、細菌複製配列、耐性遺伝子、及び非メチル化ＣｐＧ遺伝子配列などを含む。
【０１１７】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０１１８】
好ましい実施形態において、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを宿主細胞に形質転換して誘導した後、そのミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換え事象により、ミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製する。
【０１１９】
好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。
【０１２０】
好ましくは、部位特異的組み換えに係る部位は、ｐｈｉＣ３１部位特異的組み換えに係る部位、ｐａｒＡ部位特異的組み換えに係る部位、又はＣｒｅ部位特異的組み換えに係る部位である。
【０１２１】
本明細書において用いられる「部位特異的組み換え」は、Hu Chunsheng etal.「Letters inBiotechnology (22 (1): 104-109 (2011)」に報告されたｐｈｉＣ３１（ФＣ３１）リコンビナーゼシステム、ｐａｒＡリコンビナーゼシステム、又はＣｒｅリコンビナーゼシステムを使用することが好ましい。
【０１２２】
好ましくは、骨格ＤＮＡは、少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を含有する。
【０１２３】
さらに好ましくは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼである。
【０１２４】
このような好ましい条件下で、骨格ＤＮＡは宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得るので、ミニサークルＤＮＡの精製を促進する。また、非組み換えミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、同様にＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を有するので、宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得る。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによりミニサークルＤＮＡを調製する。ここで、そのミニサークルＤＮＡ空プラスミドの部位特異的組み換えに係る部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位である。好ましいａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによって認識され得る最小認識配列である（ａｔｔＢ、ａｔｔＰの最小認識配列は、SEQ ID NO:31及びSEQ IDNO:32として示される）。
【０１２６】
さらなる好ましい実施形態において、本明細書で構築されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、骨格ＤＮＡのヌクレオチド配列とミニサークルＤＮＡのヌクレオチド配列との間に存在するａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０１２７】
具体的に、そのａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換えを行うことが可能であり、ミニサークル親プラスミドがａｔｔＬ部位を含有するプラスミド骨格ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製するようにする。
【０１２８】
当業者は、必要に応じて適切なリコンビナーゼシステムを選択し、対応するリコンビナーゼを発現し得る適切な宿主菌を選択し、対応する部位特異的組み換えに係る部位を有するミニサークルＤＮＡ空ベクターを構築することができる。
【０１２９】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミド又はミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドに位置して、ミニサークルＤＮＡ調製時にミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドによって発現され得る。
【０１３０】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、宿主細胞の遺伝子に位置して、その宿主細胞によって発現され得る。
【０１３１】
好ましくは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドである。
【０１３２】
本明細書において用いられる「ｐ２ФＣ３１空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０１３３】
具体的に、空プラスミドｐ２ФＣ３１の構築方法は、Chen ZY et al.,Molecμｌar Therapy, 8 (3), 495-500 (2003)、Chen ZY,et al., Human Gene Therapy, 16 (1), 126-131 (2005)、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に開示されている。
【０１３４】
本明細書において用いられる「ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０１３５】
具体的に、空プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸの構築方法及び全ゲノム配列は、Chen ZY et al.,Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)に開示されている。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態に用いられるｐ２ФＣ３１プラスミド及びｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドは、ｐ２ФＣ３１ベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在する一方、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在しないため、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターを用いて調製されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドがより良い品質を有し、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列の汚染を減少させるという点で異なる。しかしながら、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする機能を持つ大腸菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。ФＣ３１リコンビナーゼ（すなわち、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ）及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有しないｐＭＣ．ＢＥＳＰＸは、インビボの部位特異的組み換え（大腸菌ＴＯＰ１０はその機能を持たない）を発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。それに応じて、ｐ２ФＣ３１ベクターは、ＴＯＰ１０において部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＴＯＰ１０とともに使用される必要がある。
【０１３７】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、天然抗体及び組換え抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０１３８】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０１３９】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、治療用抗体を含むがこれに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０１４０】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい遺伝子操作された抗体をコードする。
【０１４１】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。
【０１４２】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０１４３】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。
【０１４４】
より好ましくは、そのプロモーターは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結される。
【０１４５】
さらに好ましくは、シグナルペプチドは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドである。
【０１４６】
さらに好ましくは、タグはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグのうちの少なくとも１つである。
【０１４７】
以上のシグナルペプチド及びタグは、本発明において好適である。当業者は、必要に応じて適切なシグナルペプチド及びタグを選択することができる。
【０１４８】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は、標的ポリペプチド（本発明における遺伝子操作された抗体）を発現するために必要なすべての要素を含む遺伝子発現システムを意味する。その遺伝子発現システムは、一般的に、プロモーター、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、及びターミネーターのような要素を含み、さらにシグナルペプチドのコード配列を含んでもよい。これらの要素は、作動可能に連結されている。
【０１４９】
本明細書において用いられる「作動可能に連結される」は、２以上の核酸領域又は核酸配列が機能する配置を意味する。例えば、プロモーター領域を標的核酸配列に対して特定の位置に配置することで、そのプロモーター領域は、核酸配列の転写を促して、核酸配列に「作動可能に連結される」。
【０１５０】
本発明の第２の態様の好ましい形態として、本発明は、下記のステップ（１）、（２）を含む遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの調製方法を提供する。
【０１５１】
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を用意又は調製する。ここで、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０１５２】
（２）ステップ（１）で得られたＤＮＡ断片をミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に挿入し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを得る。
【０１５３】
ここで、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む。
【０１５４】
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す。
【０１５５】
ＤＮＡは、３，５−ホスホジエステル結合によって連結される４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＴ及びｄＴＭＰ）からなるデオキシリボ核酸である。ここで、「塩基配列」は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すために用いられると理解されるであろう。
【０１５６】
本発明の第２の態様の別の好ましい形態として、本発明は、下記のステップ（１）〜（３）を含む遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの調製方法を提供する。
【０１５７】
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を用意又は調製する。ここで、上記ＤＮＡ断片は、順次連結した免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、及び終止コドンを有する。
【０１５８】
（２）ステップ（１）で得られたＤＮＡ断片を発現ベクターのマルチクローニング部位に挿入し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する組換え発現ベクターを得る。ここで、上記発現ベクターのマルチクローニング部位の端部にプロモーター及びｐｏｌｙＡテイルシグナルが存在する。
【０１５９】
（３）ステップ（２）で得られた組換え発現ベクターを２つの酵素で切断し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを含有するＤＮＡ断片を調製した後、その遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを含有するＤＮＡ断片を、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドに挿入し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを得る。ここで、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む。好ましくは、上記遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする塩基配列を有し、上記遺伝子操作された抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有するデュアルターゲッティング特異的抗体である。
【０１６０】
より好ましくは、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである。
【０１６１】
さらに好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０１６２】
より好ましくは、デュアルターゲッティング特異的抗体は、腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する。
【０１６３】
好ましくは、ステップ（２）において、発現ベクターのプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスＲＳＶプロモーター、ユビキチンＵＢＣプロモーター、及び伸長因子ＥＦ１αプロモーターを含む。
【０１６４】
より好ましくは、ステップ（２）において、発現ベクターのプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターである。
【０１６５】
好ましくは、ステップ（２）において、発現ベクターのｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡ又はＳＶ４０である。
【０１６６】
さらに好ましくは、ステップ（２）において、発現ベクターのｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡである。
【０１６７】
本発明に係るプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶ、ＲＳＶ、ＵＢＣ、及びＥＦ１αなどの真核生物プロモーターであってもよい。本発明において、ＣＭＶプロモーターは、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるプロモーターを使用することにより、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築する。本発明に係るｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ＳＶ４０などであってもよい。本発明において、ｂｐＡテイルシグナルは、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるテイルシグナルを使用することにより、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを構築する。
【０１６８】
好ましくは、ステップ（２）において、発現ベクターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡテイルシグナルを運ぶ。その発現ベクターのＣＭＶとｂｐＡとの間に存在するマルチクローニング部位には、所望の遺伝子断片が挿入され得る。
【０１６９】
本明細書において用いられる「マルチクローニング部位」は、複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有し、外来ＤＮＡに複数の挿入部位及び方法を提供するベクターの合成配列を意味する。
【０１７０】
本明細書において用いられる「所望の遺伝子断片」は、標的遺伝子を意味する。
【０１７１】
好ましくは、上記標的遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする遺伝子である。
【０１７２】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、天然抗体、天然抗原及び天然抗原エピトープと、組換え抗体、組換え抗原及び組換えエピトープとを含むがこれらに限定されない。
【０１７３】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない。
【０１７４】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、治療用抗体を含むがこれらに限定されない。
【０１７５】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい。
【０１７６】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。好ましくは、ステップ（２）において、発現ベクターはpＣＭＶ．ｂｐＡ発現ベクターである。
【０１７７】
本明細書で記載される「pＣＭＶ．ｂｐＡ発現ベクター」の用語は、大腸菌のマルチクローニング部位に挿入した遺伝子断片を複製可能及び増幅可能なプラスミドベクターを意味する。「pＣＭＶ．ｂｐＡ発現ベクター」のマルチクローニング部位は、上流にＣＭＶプロモーターを有し、下流にｂｐＡテイルシグナルを有する。
【０１７８】
当業者は、必要に応じて、pＣＭＶ．ｂｐＡの代わりの発現ベクターを選択することにより、ステップ（１）からのＤＮＡ断片の上流に異なるプロモーターを加えることができると理解されるであろう。
【０１７９】
好ましくは、pＣＭＶ．ｂｐＡ発現ベクターのＣＭＶ上流及びｂｐＡテイルシグナルの下流には、ぞれぞれ、ＳｐｅＩ及びＯＭＩエンドヌクレアーゼ部位（図１−ｂに示す）を有する。そのＳｐｅＩ及びＯＭＩエンドヌクレアーゼ部位は、MolecμｌarCloning: A Laboratory Manual（第４版）に記載される方法により構築される。より好ましくは、ＣＭＶプロモーター、ｂｐＡテイルシグナル、ＳｐｅＩ及びＯＭＩエンドヌクレアーゼ部位を含むpＣＭＶ．ｂｐＡ発現ベクターを構築する方法は、（ａ）空プラスミドベクターを選択するステップと、（ｂ）異なるマルチクローニング部位にＣＭＶプロモーター及びｂｐＡテイルシグナルを挿入するステップとを含み、ここで、上記ＣＭＶプロモーターとｂｐＡテイルシグナルとの間に外来遺伝子のためのマルチクローニング部位が存在し、ＣＭＶプロモーターの上流にＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ部位を有し、ｂｐＡテイルシグナルの下流にＰｓｐＯＭＩエンドヌクレアーゼ部位を有する。
【０１８０】
本発明の好ましい実施形態において、pＣＭＶ．ｂｐＡ発現ベクターは、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＰｓｐ ＯＭＩエンドヌクレアーゼ部位を有する。ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ部位とＰｓｐ ＯＭＩエンドヌクレアーゼ部位との間には、ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列及びｂｐＡテイルシグナルのヌクレオチド配列が存在する。ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列とｂｐＡテイルシグナルのヌクレオチド配列との間には、ＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ部位及びＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ部位が存在する。
【０１８１】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ断片を用意又は調製するステップ（ステップ（１））は、下記のステップ（１−１）、（１−２）を含む。
【０１８２】
（１−１）全ゲノム配列又はＰＣＲクローニング法を用いることにより、順次連結したＨｉｎｄＩＩＩ酵素部位、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びＥｃｏＲＩ酵素部位を含むＤＮＡ断片を合成する。
【０１８３】
（１−２）ステップ（１−１）で得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ５７ベクター（プラスミドマップは図１−ａを参照する）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入して増幅させ、２つの酵素で標的断を切断してＤＮＡ断片を回収する。
【０１８４】
好ましくは、ステップ（２）において、ステップ（１）で得られたＤＮＡ断片をpＣＭＶ．ｂｐＡベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入してpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターを得る。
【０１８５】
好ましくは、上記ステップ（３）にいおいて、ステップ（２）で得られた組換え発現ベクターを２つの酵素で切断し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するＤＮＡ断片を得る。遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するＤＮＡ断片を、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドに挿入するステップは、下記のステップ（１−４）〜（１−７）を含む。
【０１８６】
（１−４）ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドを用意する。
【０１８７】
（１−５）ＳｐｅＩ及びＰｓｐ ＯＭＩエンドヌクレアーゼでｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドを切断し、線状プラスミドを回収する。
【０１８８】
（１−６）ＳｐｅＩ及びＰｓｐ ＯＭＩエンドヌクレアーゼでpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターを切断し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するＤＮＡ断片を回収する。
【０１８９】
（１−７）ステップ（１−５）で回収された線状プラスミドを、ステップ（１−６）で回収されたＤＮＡ断片とＤＮＡリガーゼにより連結し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．Ｂａｂ又はｐＭＣ．Ｂａｂを得る。ここで、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したサイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、ｐｏｌｙＡテイルシグナル、及びウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡテイルシグナルを含む。
【０１９０】
好ましくは、ステップ（１−７）において、ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。
【０１９１】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、その二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる１つである。
【０１９２】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
ここで、VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される。
【０１９３】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０１９４】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下のようなアミノ酸配列を有する遺伝子操作された抗体をコードする。
【０１９５】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQID NO:9-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:4- SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:6であり、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQID NO:10-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:3- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:5であり、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQID NO:10-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:3であり、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQID NO:8-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4であり、
（ｅ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4である。
【０１９６】
ここで、表記「-」は、アミノ酸配列の間の順次連結を表す。
【０１９７】
より好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下に示すような塩基配列を有する。
【０１９８】
（ａ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:17であり、
（ｂ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:16であり、
（ｃ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-
SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:14であり、
（ｄ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:15であり、
（ｅ’）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:15であり、
ここで、SEQ ID NO:29（VLCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:33であり、SEQ ID NO:30（VHCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:34である。
【０１９９】
ここで、（ａ’）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｅ’）及び（ｆ’）で表されるすべての塩基配列は、２つの一本鎖遺伝子（ＤＮＡ断片）の一方の鎖のヌクレオチド配列であり、表記「-」は、塩基配列の間の順次連結を表す。
【０２００】
ヌクレオチド配列の縮重又は突然変異の可能性があるため、当業者は塩基を調整できると理解されるであろう。塩基の変化がコドンの変化を引き起こすが、コドンによって翻訳されたアミノ酸の変化を引き起こすことはない。一般的に、ロイシンコドンは、例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵなどの様々なコドンを有することがある。
【０２０１】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列である。
【０２０２】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列であり、かつ、その遺伝子操作された抗体遺伝子がコードするアミノ酸配列は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列がコードするアミノ酸配列と完全に又は基本的に同一である。
【０２０３】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、全遺伝子合成又はＰＣＲクローニング法で得られる。
【０２０４】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、二重特異性一本鎖抗体をコードする遺伝子を有する。ここで、その二重特異性一本鎖抗体は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD19抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD19）、ヒトCD19抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD19）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。VLCD19、VHCD19、VLCD3及びVHCD3ポリペプチドをコードする遺伝子は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ここで、VLCD19及びVHCD19がヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成し、VLCD3及びVHCD3がヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成するので、本発明に係る遺伝子操作された抗体は、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）であることが好ましい。
【０２０５】
好ましくは、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の好適な構造形態は、
VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3であり、
ここで、Linkerは、主にグリシン及びセリンで構成されるポリペプチド配列を用いるリンカーペプチドである。グリシンは最も小さいアミノ酸であり、その最小の側鎖により側鎖の柔軟性を高めることができる。一方、セリンは親水性の最も強いアミノ酸であり、ペプチド鎖の親水性を増大させることができる。
【０２０６】
次に、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びＦｌａｇタグをコードする塩基配列を有することで、遺伝子操作された抗体のＮ末端に免疫グロブリン軽鎖κ鎖の分泌シグナルペプチド及びＦｌａｇタグを加えることを可能にする。このようにして、抗体を発現して宿主細胞外に分泌することを保証する。また、Ｈｉｓ６タグを遺伝子操作された抗体のＣ末端に連結することにより、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製することに寄与する。
【０２０７】
抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥ）は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD20抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD20）、ヒトCD20抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD20）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。
【０２０８】
本明細書で記載される塩基配列は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すと理解されるであろう。
【０２０９】
本発明に係るｐ２ФＣ３１プラスミド及びｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドは、ｐ２ФＣ３１ベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在する一方、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在しないため、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターを用いて調製されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドがより良い品質を有し、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列の汚染を減少させるという点で異なる。しかしながら、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする機能を持つ大腸菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。ФＣ３１リコンビナーゼ（すなわち、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ）及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有しないｐＭＣ．ＢＥＳＰＸは、インビボの部位特異的組み換え（大腸菌ＴＯＰ１０はその機能を持たない）を発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。それに応じて、ｐ２ФＣ３１ベクターは、ＴＯＰ１０において部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＴＯＰ１０とともに使用される必要がある。
【０２１０】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、癌の治療薬に使用され得る。
【０２１１】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、CD19陽性癌疾患の治療薬に使用され得る。
【０２１２】
第３の態様において、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡであって、上記ミニサークルＤＮＡが遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットが遺伝子操作された抗体遺伝子を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡが提供される。
【０２１３】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」は、主に超らせん構造で存在し、原核プラスミドの骨格ＤＮＡ配列を含まないベクターを意味する。ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れたそのミニサークルＤＮＡは、転写又は標的遺伝子を安定的かつ持続的に発現することができる。
【０２１４】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」の用語と「ミニサークルＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０２１５】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターと比較して、ミニサークルＤＮＡは、細菌由来の骨格ＤＮＡ配列が取り除かれるので、炎症及びインビボ又はインビトロでの遺伝子発現のサイレンシングの発生可能性を低下させ、このようにして、より長期にわたりより強い発現が得られる。また、ミニサークルＤＮＡにおいて耐性マーカー遺伝子及び複製起点を含有する細菌の配列が欠けているため、臨床上の安全性が向上する。
【０２１６】
好ましい実施形態において、ミニサークルＤＮＡは、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えにより、ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドから調製される。
【０２１７】
本明細書において用いられるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０２１８】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ空プラスミド」は、部位特異的組み換えに係る部位を有するプラスミドベクターを意味する。
【０２１９】
本明細書において用いられる「プラスミドベクター」は、遺伝子操作の研究において、外来ＤＮＡを挿入可能、かつレシピエント細胞で複製可能なＤＮＡ構造を意味する。
【０２２０】
本明細書において用いられる「プラスミド」の用語と「プラスミドベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０２２１】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」は部位特異的組み換えに係る部位を有し、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製できる組換え親プラスミドを意味する。
【０２２２】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」の用語と「ミニサークルＤＮＡ親プラスミド」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０２２３】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ配列」は、標準プラスミドにおける細菌プラスミドの複製、又はプラスミドを含む宿主のスクリーニングを機能するＤＮＡ配列を有する。このようなＤＮＡ配列は、例えば、細菌複製配列、耐性遺伝子、及び非メチル化ＣｐＧ遺伝子配列などを含む。
【０２２４】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０２２５】
好ましい実施形態において、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを宿主細胞に形質転換して誘導した後、そのミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換え事象により、ミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製する。
【０２２６】
好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。
【０２２７】
好ましくは、部位特異的組み換えに係る部位は、ｐｈｉＣ３１部位特異的組み換えに係る部位、ｐａｒＡ部位特異的組み換えに係る部位、又はＣｒｅ部位特異的組み換えに係る部位である。
【０２２８】
本明細書において用いられる「部位特異的組み換え」は、Hu Chunsheng etal.「Letters inBiotechnology (22 (1): 104-109 (2011)」に報告されたｐｈｉＣ３１（ФＣ３１）リコンビナーゼシステム、ｐａｒＡリコンビナーゼシステム、又はＣｒｅリコンビナーゼシステムを使用することが好ましい。
【０２２９】
好ましくは、骨格ＤＮＡは、少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を含有する。
【０２３０】
さらに好ましくは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼである。
【０２３１】
このような好ましい条件下で、骨格ＤＮＡは宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得るので、ミニサークルＤＮＡの精製を促進する。
【０２３２】
また、非組み換えミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、同様にＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を有するので、宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得る。
【０２３３】
別の好ましい実施形態において、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによりミニサークルＤＮＡを調製する。ここで、そのミニサークルＤＮＡ空プラスミドの部位特異的組み換えに係る部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位である。好ましいａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによって認識され得る最小認識配列である（ａｔｔＢ、ａｔｔＰの最小認識配列は、SEQ ID NO:31及びSEQ IDNO:32として示される）。
【０２３４】
さらなる好ましい実施形態において、本明細書で構築されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、骨格ＤＮＡのヌクレオチド配列とミニサークルＤＮＡのヌクレオチド配列との間に存在するａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０２３５】
具体的に、そのａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換えを行うことが可能であり、ミニサークル親プラスミドがａｔｔＬ部位を含有するプラスミド骨格ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製するようにする。
【０２３６】
当業者は、必要に応じて適切なリコンビナーゼシステムを選択し、対応するリコンビナーゼを発現し得る適切な宿主菌を選択し、対応する部位特異的組み換えに係る部位を有するミニサークルＤＮＡ空ベクターを構築することができる。
【０２３７】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミド又はミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドに位置して、ミニサークルＤＮＡ調製時にミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドによって発現され得る。
【０２３８】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、宿主細胞の遺伝子に位置して、その宿主細胞によって発現され得る。
【０２３９】
好ましくは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドである。
【０２４０】
本明細書において用いられる「ｐ２ФＣ３１空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０２４１】
具体的に、空プラスミドｐ２ФＣ３１の構築方法は、Chen ZY et al.,Molecμｌar Therapy, 8 (3), 495-500 (2003)、Chen ZY,et al., Human Gene Therapy, 16 (1), 126-131 (2005)、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に開示されている。
【０２４２】
本明細書において用いられる「ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０２４３】
具体的に、空プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸの構築方法及び全ゲノム配列は、Chen ZY et al.,Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)に開示されている。
【０２４４】
本発明の好ましい実施形態に用いられるｐ２ФＣ３１プラスミド及びｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドは、ｐ２ФＣ３１ベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在する一方、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在しないため、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにより調製されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドはより良い品質を有し、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列の汚染を減少させるという点で異なる。しかしながら、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする機能を持つ大腸菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。ФＣ３１リコンビナーゼ（すなわち、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ）及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有しないｐＭＣ．ＢＥＳＰＸは、インビボの部位特異的組み換え（大腸菌ＴＯＰ１０はその機能を持たない）を発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。それに応じて、ｐ２ФＣ３１ベクターは、ＴＯＰ１０において部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＴＯＰ１０とともに使用される必要がある。
【０２４５】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、天然抗体及び組換え抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０２４６】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０２４７】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、治療用抗体を含むがこれに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０２４８】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい遺伝子操作された抗体をコードする。
【０２４９】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。
【０２５０】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０２５１】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。
【０２５２】
より好ましくは、そのプロモーターは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結される。
【０２５３】
さらに好ましくは、シグナルペプチドは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドである。
【０２５４】
さらに好ましくは、タグはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグのうちの少なくとも１つである。
【０２５５】
以上のシグナルペプチド及びタグは、本発明において好適である。当業者は、必要に応じて適切なシグナルペプチド及びタグを選択することができる。
【０２５６】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は、標的ポリペプチド（本発明における遺伝子操作された抗体）を発現するために必要なすべての要素を含む遺伝子発現システムを意味する。その遺伝子発現システムは、一般的に、プロモーター、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、及びターミネーターのような要素を含み、さらにシグナルペプチドのコード配列を含んでもよい。これらの要素は、作動可能に連結されている。
【０２５７】
本明細書において用いられる「作動可能に連結される」は、２以上の核酸領域又は核酸配列が機能する配置を意味する。例えば、プロモーター領域を標的核酸配列に対して特定の位置に配置することで、そのプロモーター領域は、核酸配列の転写を促して、核酸配列に「作動可能に連結される」。
【０２５８】
本発明の第３の態様の好ましい形態として、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡであって、上記ミニサークルＤＮＡがａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子発現カセットが下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡが提供される。
【０２５９】
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す。
【０２６０】
ＤＮＡは、３，５−ホスホジエステル結合によって連結される４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＴ及びｄＴＭＰ）からなるデオキシリボ核酸である。ここで、「塩基配列」は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すために用いられると理解されるであろう。
【０２６１】
本発明の第３の態様の好ましい形態として、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡであって、上記ミニサークルＤＮＡがａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子発現カセットが、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡが提供される。
【０２６２】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする塩基配列を有し、その遺伝子操作された抗体はデュアルターゲッティング特異的抗体であり、そのデュアルターゲッティング特異的抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有する。
【０２６３】
より好ましくは、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである。
【０２６４】
さらに好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０２６５】
より好ましくは、デュアルターゲッティング特異的抗体は、腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する。
【０２６６】
好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターを含む。
【０２６７】
より好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターである。
【０２６８】
好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡ又はＳＶ４０である。
【０２６９】
さらに好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡである。
【０２７０】
本発明に係るプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶ、ＲＳＶ、ＵＢＣ、及びＥＦ１αなどの真核生物プロモーターであってもよい。本発明において、ＣＭＶプロモーターは、ミニサークルＤＮＡを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるプロモーターを使用することにより、ミニサークルＤＮＡを構築する。本発明に係るｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ＳＶ４０などであってもよい。本発明において、ｂｐＡテイルシグナルは、ミニサークルＤＮＡを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるテイルシグナルを使用することにより、ミニサークルＤＮＡを構築する。
【０２７１】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、その二重特異性一本鎖抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、その二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる１つである。
【０２７２】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
ここで、VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される。
【０２７３】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０２７４】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、宿主菌において部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドから調製される。
【０２７５】
好ましくは、ａｔｔＲ部位の塩基配列はSEQ IDNO:28に示される。
【０２７６】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下のようなアミノ酸配列を有する遺伝子操作された抗体をコードする。
【０２７７】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQID NO:9-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:4- SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:6であり、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQID NO:10-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:3- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:5であり、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQID NO:10-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:3であり、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQID NO:8-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4であり、
（ｅ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4である。
【０２７８】
ここで、表記「-」は、アミノ酸配列の間の順次連結を表す。
【０２７９】
より好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下に示すような塩基配列を有する。
【０２８０】
（ａ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:17であり、
（ｂ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:16であり、
（ｃ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-
SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:14であり、
（ｄ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:15であり、
（ｅ’）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ IDNO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:15であり、
ここで、SEQ ID NO:29（VLCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:33であり、SEQ ID NO:30（VHCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:34である。
【０２８１】
ここで、（ａ’）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｅ’）及び（ｆ’）で表されるすべての塩基配列は、２つの一本鎖遺伝子（ＤＮＡ断片）の一方の鎖のヌクレオチド配列であり、表記「-」は、塩基配列の間の順次連結を表す。
【０２８２】
ヌクレオチド配列の縮重又は突然変異の可能性があるため、当業者は塩基を調整できると理解されるであろう。塩基の変化がコドンの変化を引き起こすが、コドンによって翻訳されたアミノ酸の変化を引き起こすことはない。一般的に、ロイシンコドンは、例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵなどの様々なコドンを有することがある。
【０２８３】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列である。
【０２８４】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列であり、かつ、その遺伝子操作された抗体遺伝子がコードするアミノ酸配列は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列がコードするアミノ酸配列と完全に又は基本的に同一である。
【０２８５】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、全遺伝子合成又はＰＣＲクローニング法で得られる。
【０２８６】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、二重特異性一本鎖抗体をコードする遺伝子を有する。ここで、その二重特異性一本鎖抗体は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD19抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD19）、ヒトCD19抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD19）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。VLCD19、VHCD19、VLCD3及びVHCD3ポリペプチドをコードする遺伝子は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ここで、VLCD19及びVHCD19がヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成し、VLCD3及びVHCD3がヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成するので、本発明に係る遺伝子操作された抗体は、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）であることが好ましい。
【０２８７】
好ましくは、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の好適な構造形態は、
VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3であり、
ここで、Linkerは、主にグリシン及びセリンで構成されるポリペプチド配列を用いるリンカーペプチドである。グリシンは最も小さいアミノ酸であり、その最小の側鎖により側鎖の柔軟性を高めることができる。一方、セリンは親水性の最も強いアミノ酸であり、ペプチド鎖の親水性を増大させることができる。
【０２８８】
次に、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びＦｌａｇタグをコードする塩基配列を有することで、遺伝子操作された抗体のＮ末端に免疫グロブリン軽鎖κ鎖の分泌シグナルペプチド及びＦｌａｇタグを加えることを可能にする。このようにして、抗体を発現して宿主細胞外に分泌することを保証する。また、Ｈｉｓ６タグを遺伝子操作された抗体のＣ末端に連結することにより、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製することに寄与する。
【０２８９】
抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥ）は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD20抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD20）、ヒトCD20抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD20）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。
【０２９０】
本明細書で記載される塩基配列は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すと理解されるであろう。
【０２９１】
従来のプラスミドベクターと比較して、本発明に係る遺伝子操作された抗体を有するミニサークルＤＮＡは、ミニサークルＤＮＡにおいて耐性マーカー遺伝子及び複製起点を含有する細菌の配列が欠けているため、臨床上の安全性が向上し、遺伝子操作された抗体遺伝子のより長期にわたりより強い発現が得られる。ウイルスベクターと比較して、そのミニサークルＤＮＡは、挿入突然変異のリスク及び免疫原性がなく、コストが低い。したがって、本発明に係る遺伝子操作された抗体を有するミニサークルＤＮＡは、安全かつ高効率で、経済的な治療ベクターである。
【０２９２】
第４の態様において、本発明は、下記のステップ（１）〜（３）を含む遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法を提供する。
【０２９３】
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを用意又は調製する。ここで、上記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、部位特異的組み換えに係る部位を有する。
【０２９４】
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドにより宿主菌を形質転換し、リコンビナーゼの存在下で、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製する。
【０２９５】
（３）ステップ（２）で得られたミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを単離及び精製する。ここで、上記ミニサークルＤＮＡは遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０２９６】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」は、主に超らせん構造で存在し、原核プラスミドの骨格ＤＮＡ配列を含まないベクターを意味する。ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れたそのミニサークルＤＮＡは、転写又は標的遺伝子を安定的かつ持続的に発現することができる。
【０２９７】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」の用語と「ミニサークルＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０２９８】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターと比較して、ミニサークルＤＮＡは、細菌由来の骨格ＤＮＡ配列が取り除かれるので、炎症及びインビボ又はインビトロでの遺伝子発現のサイレンシングの発生可能性を低下させ、このようにして、より長期にわたりより強い発現が得られる。また、ミニサークルＤＮＡにおいて耐性マーカー遺伝子及び複製起点を含有する細菌の配列が欠けているため、臨床上の安全性が向上する。
【０２９９】
本明細書において用いられるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０３００】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ空プラスミド」は、部位特異的組み換えに係る部位を有するプラスミドベクターを意味する。
【０３０１】
本明細書において用いられる「プラスミドベクター」は、遺伝子操作の研究において、外来ＤＮＡを挿入可能、かつレシピエント細胞で複製可能なＤＮＡ構造を意味する。
【０３０２】
本明細書において用いられる「プラスミド」の用語と「プラスミドベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０３０３】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」は部位特異的組み換えに係る部位を有し、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製できる組換え親プラスミドを意味する。
【０３０４】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」の用語と「ミニサークルＤＮＡ親プラスミド」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０３０５】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ配列」は、標準プラスミドにおける細菌プラスミドの複製、又はプラスミドを含む宿主のスクリーニングを機能するＤＮＡ配列を有する。このようなＤＮＡ配列は、例えば、細菌複製配列、耐性遺伝子、及び非メチル化ＣｐＧ遺伝子配列などを含む。
【０３０６】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０３０７】
宿主細胞として細菌又は真菌を用いる場合、「宿主細胞」の用語と「宿主菌」の用語は、同じ意味で使用できる。
【０３０８】
好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。
【０３０９】
好ましくは、部位特異的組み換えに係る部位は、ｐｈｉＣ３１部位特異的組み換えに係る部位、ｐａｒＡ部位特異的組み換えに係る部位、又はＣｒｅ部位特異的組み換えに係る部位である。
【０３１０】
本明細書において用いられる「部位特異的組み換え」は、Hu Chunsheng etal.「Letters inBiotechnology (22 (1): 104-109 (2011)」に報告されたｐｈｉＣ３１（ФＣ３１）リコンビナーゼシステム、ｐａｒＡリコンビナーゼシステム、又はＣｒｅリコンビナーゼシステムを使用することが好ましい。
【０３１１】
好ましくは、骨格ＤＮＡは、少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を含有する。
【０３１２】
さらに好ましくは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼである。
【０３１３】
このような好ましい条件下で、骨格ＤＮＡは宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得るので、ミニサークルＤＮＡの精製を促進する。また、非組み換えミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、同様にＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を有するので、宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得る。
【０３１４】
別の好ましい実施形態において、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによりミニサークルＤＮＡを調製する。ここで、そのミニサークルＤＮＡ空プラスミドの部位特異的組み換えに係る部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位である。好ましいａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによって認識され得る最小認識配列である（ａｔｔＢ、ａｔｔＰの最小認識配列は、SEQ ID NO:31及びSEQ IDNO:32として示される）。
【０３１５】
さらなる好ましい実施形態において、本明細書で構築されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、骨格ＤＮＡのヌクレオチド配列とミニサークルＤＮＡのヌクレオチド配列との間に存在するａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０３１６】
具体的に、そのａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換えを行うことが可能であり、ミニサークル親プラスミドがａｔｔＬ部位を含有するプラスミド骨格ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製するようにする。
【０３１７】
当業者は、必要に応じて適切なリコンビナーゼシステムを選択し、対応するリコンビナーゼを発現し得る適切な宿主菌を選択し、対応する部位特異的組み換えに係る部位を有するミニサークルＤＮＡ空ベクターを構築することができる。
【０３１８】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミド又はミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドに位置して、ミニサークルＤＮＡ調製時にミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドによって発現され得る。
【０３１９】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、宿主細胞の遺伝子に位置して、その宿主細胞によって発現され得る。
【０３２０】
好ましくは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドである。
【０３２１】
本明細書において用いられる「ｐ２ФＣ３１空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０３２２】
具体的に、空プラスミドｐ２ФＣ３１の構築方法は、Chen ZY et al.,Molecμｌar Therapy, 8 (3), 495-500 (2003)、Chen ZY,et al., Human Gene Therapy, 16 (1), 126-131 (2005)、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に開示されている。
【０３２３】
本明細書において用いられる「ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０３２４】
具体的に、空プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸの構築方法及び全ゲノム配列は、Chen ZY et al.,Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)に開示されている。
【０３２５】
本発明の好ましい実施形態に用いられるｐ２ФＣ３１プラスミド及びｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドは、ｐ２ФＣ３１ベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在する一方、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在しないため、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにより調製されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドはより良い品質を有し、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列の汚染を減少させるという点で異なる。しかしながら、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする機能を持つ大腸菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。ФＣ３１リコンビナーゼ（すなわち、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ）及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有しないｐＭＣ．ＢＥＳＰＸは、インビボの部位特異的組み換え（大腸菌ＴＯＰ１０はその機能を持たない）を発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。それに応じて、ｐ２ФＣ３１ベクターは、ＴＯＰ１０において部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＴＯＰ１０とともに使用される必要がある。
【０３２６】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、天然抗体及び組換え抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０３２７】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０３２８】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、治療用抗体を含むがこれに限定されない遺伝子操作された抗体をコードする。
【０３２９】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい遺伝子操作された抗体をコードする。
【０３３０】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。
【０３３１】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０３３２】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。
【０３３３】
より好ましくは、そのプロモーターは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結される。
【０３３４】
さらに好ましくは、シグナルペプチドは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドである。
【０３３５】
さらに好ましくは、タグはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグのうちの少なくとも１つである。
【０３３６】
以上のシグナルペプチド及びタグは、本発明において好適である。当業者は、必要に応じて適切なシグナルペプチド及びタグを選択することができる。
【０３３７】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は、標的ポリペプチド（本発明における遺伝子操作された抗体）を発現するために必要なすべての要素を含む遺伝子発現システムを意味する。その遺伝子発現システムは、一般的に、プロモーター、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、及びターミネーターのような要素を含み、さらにシグナルペプチドのコード配列を含んでもよい。これらの要素は、作動可能に連結されている。
【０３３８】
本明細書において用いられる「作動可能に連結される」は、２以上の核酸領域又は核酸配列が機能する配置を意味する。例えば、プロモーター領域を標的核酸配列に対して特定の位置に配置することで、そのプロモーター領域は、核酸配列の転写を促して、核酸配列に「作動可能に連結される」。
【０３３９】
本発明の第４の態様の好ましい形態として、本発明によれば、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法であって、上記部位特異的組み換えに係る部位がａｔｔＢ及びａａｔＰ部位であり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットが下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法が提供される。
【０３４０】
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す。
【０３４１】
ＤＮＡは、３，５−ホスホジエステル結合によって連結される４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＴ及びｄＴＭＰ）からなるデオキシリボ核酸である。ここで、「塩基配列」は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すために用いられると理解されるであろう。
【０３４２】
本発明の第４の態様の別の好ましい形態として、本発明は、下記のステップ（１）〜（３）を含む遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法を提供する。
【０３４３】
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドを用意又は調製する。ここで、上記ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む。
【０３４４】
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドにより宿主菌を形質転換し、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で、ａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミドＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製する。
【０３４５】
（３）ステップ（２）で得られたａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミドＤＮＡを、Ｉ−Ｓｃｅエンドヌクレアーゼで切断して線状ＤＮＡ断片を調製した後、プラスミドを宿主菌において分解させ、通常のプラスミド精製用キットでａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを精製する。ここで、上記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む。
【０３４６】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする塩基配列を有し、その遺伝子操作された抗体はデュアルターゲッティング特異的抗体であり、そのデュアルターゲッティング特異的抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有する。
【０３４７】
より好ましくは、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである。
【０３４８】
さらに好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０３４９】
より好ましくは、デュアルターゲッティング特異的抗体は、腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する。
【０３５０】
好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターを含む。
【０３５１】
より好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターである。
【０３５２】
好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡ又はＳＶ４０である。
【０３５３】
さらに好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡである。
【０３５４】
本発明に係るプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶ、ＲＳＶ、ＵＢＣ、及びＥＦ１αなどの真核生物プロモーターであってもよい。本発明において、ＣＭＶプロモーターは、ミニサークルＤＮＡを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるプロモーターを使用することにより、ミニサークルＤＮＡを構築する。本発明に係るｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ＳＶ４０などであってもよい。本発明において、ｂｐＡテイルシグナルは、ミニサークルＤＮＡを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるテイルシグナルを使用することにより、ミニサークルＤＮＡを構築する。
【０３５５】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、その二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる１つである。
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
ここで、VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される。
【０３５６】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０３５７】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０３５８】
好ましくは、ａｔｔＲ部位の塩基配列はSEQ IDNO:28に示される。
【０３５９】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下のようなアミノ酸配列を有する遺伝子操作された抗体をコードする。
【０３６０】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:9-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:4- SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:6であり、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:3- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:5であり、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:3であり、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:8-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4であり、
（ｅ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO: 29-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4である。
【０３６１】
ここで、表記「-」は、アミノ酸配列の間の順次連結を表す。
【０３６２】
より好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下に示すような塩基配列を有する。
【０３６３】
（ａ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ ID NO:21-SEQ IDNO:17であり、
（ｂ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:16であり、
（ｃ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:14であり、
（ｄ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:15であり、
（ｅ’）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:33-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:15であり、
ここで、SEQ ID NO:29（VLCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:33であり、SEQID NO:30（VHCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:34である。
【０３６４】
ここで、（ａ’）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｅ’）及び（ｆ’）で表されるすべての塩基配列は、２つの一本鎖遺伝子（ＤＮＡ断片）の一方の鎖のヌクレオチド配列であり、表記「-」は、塩基配列の間の順次連結を表す。
【０３６５】
ヌクレオチド配列の縮重又は突然変異の可能性があるため、当業者は塩基を調整できると理解されるであろう。塩基の変化がコドンの変化を引き起こすが、コドンによって翻訳されたアミノ酸の変化を引き起こすことはない。一般的に、ロイシンコドンは、例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵなどの様々なコドンを有することがある。
【０３６６】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列である。
【０３６７】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列であり、かつ、その遺伝子操作された抗体遺伝子がコードするアミノ酸配列は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列がコードするアミノ酸配列と完全に又は基本的に同一である。
【０３６８】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、全遺伝子合成又はＰＣＲクローニング法で得られる。
【０３６９】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、二重特異性一本鎖抗体をコードする遺伝子を有する。ここで、その二重特異性一本鎖抗体は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD19抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD19）、ヒトCD19抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD19）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。VLCD19、VHCD19、VLCD3及びVHCD3ポリペプチドをコードする遺伝子は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ここで、VLCD19及びVHCD19がヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成し、VLCD3及びVHCD3がヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成するので、本発明に係る遺伝子操作された抗体は、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）であることが好ましい。
【０３７０】
好ましくは、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の好適な構造形態は、
VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3であり、
ここで、Linkerは、主にグリシン及びセリンで構成されるポリペプチド配列を用いるリンカーペプチドである。グリシンは最も小さいアミノ酸であり、その最小の側鎖により側鎖の柔軟性を高めることができる。一方、セリンは親水性の最も強いアミノ酸であり、ペプチド鎖の親水性を増大させることができる。
【０３７１】
次に、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びＦｌａｇタグをコードする塩基配列を有することで、遺伝子操作された抗体のＮ末端に免疫グロブリン軽鎖κ鎖の分泌シグナルペプチド及びＦｌａｇタグを加えることを可能にする。このようにして、抗体を発現して宿主細胞外に分泌することを保証する。また、Ｈｉｓ６タグを遺伝子操作された抗体のＣ末端に連結することにより、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製することに寄与する。
【０３７２】
抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥ）は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD20抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD20）、ヒトCD20抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD20）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。
【０３７３】
本明細書で記載される塩基配列は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すと理解されるであろう。
【０３７４】
好ましくは、リコンビナーゼはФＣ３１リコンビナーゼである。
【０３７５】
好ましくは、宿主菌はＴＯＰ１０である。
【０３７６】
好ましくは、宿主菌はＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌である。
【０３７７】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドの、宿主菌で発生する部位特異的組み換え事象の過程は、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する組換え発現ベクターに含まれる、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔＰｔＰ部位により、ミニサークル親プラスミドが、ａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミドＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製することを含む。ａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡは、原核プラスミドの配列を含まず、ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れて、遺伝子操作された抗体を安定的かつ持続的に発現することができる。ａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミドＤＮＡは、Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼによって切断されて線状ＤＮＡを調製し、さらにそのプラスミドを宿主菌で分解させる。
【０３７８】
さらに、本発明は、第３の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの使用方法、又は第４の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法を提供する。ここで、上記方法は、下記の（１）〜（４）から選ばれる１つである。
【０３７９】
（１）ミニサークルＤＮＡを単独で適用する方法。
【０３８０】
（２）ミニサークルＤＮＡを化学療法、放射線療法、手術、生物療法、及び免疫療法のうちの１つ又はそれらの組み合わせと併用する方法。
【０３８１】
（３）ミニサークルＤＮＡを標的化デリバリー法（targeted delivery approach）により患者に送達して治療を行う方法。
【０３８２】
（４）ミニサークルＤＮＡをインビトロトランスフェクション技術により免疫エフェクター細胞にトランスフェクションした後、ミニサークルＤＮＡがトランスフェクションされた免疫エフェクター細胞を患者に輸送して治療を行う方法。
【０３８３】
好ましくは、方法（４）において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、及び幹細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０３８４】
方法（４）において、免疫エフェクター細胞はＣＩＫ細胞又はＤ−ＣＩＫ細胞である。
【０３８５】
ａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡは、原核プラスミドの配列を含まず、ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れて、遺伝子操作された抗体を安定的かつ持続的に発現する。そのミニサークルＤＮＡは、例えば、遺伝子操作された抗体を発現するための患者への送達、腫瘍細胞を特異的殺傷するためのＴ細胞の案内などの標的療法に単独で使用され得る。
【０３８６】
本発明に係るミニサークルＤＮＡは、インビトロで患者の免疫エフェクター細胞をトランスフェクションした後、ミニサークルＤＮＡがトランスフェクションされた免疫エフェクター細胞を患者に輸送して治療を行うために使用され得る。
【０３８７】
本発明に係るミニサークルＤＮＡは、化学療法、放射線療法、手術、生物療法、免疫療法と組み合わせて治療を行うために使用され得る。
【０３８８】
第５の態様において、本発明は、第３の態様又は第４の態様に記載されるミニサークルＤＮＡを含む宿主を提供する。
【０３８９】
好ましくは、宿主はヒト又は哺乳動物である。
【０３９０】
好ましくは、宿主はヒト細胞又は哺乳動物細胞である。
【０３９１】
より好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【０３９２】
第６の態様において、本発明は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有するデュアルターゲッティング特異的抗体である遺伝子操作された抗体を提供する
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、天然抗体及び組換え抗体を含むがこれらに限定されない。
【０３９３】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない。
【０３９４】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子」は、治療用抗体を含むがこれらに限定されない。
【０３９５】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい。
【０３９６】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。
【０３９７】
好ましくは、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである。
【０３９８】
好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞。及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０３９９】
好ましくは、デュアルターゲッティング特異的抗体は、腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する。
【０４００】
好ましくは、遺伝子操作された抗体は二重特異性一本鎖抗体であり、その二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる１つである。
【０４０１】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
ここで、VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、上記VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示され、VLCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:29に示され、VHCD20のアミノ酸配列はSEQ ID NO:30に示される。
【０４０２】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０４０３】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下のようなアミノ酸配列をを有する。
【０４０４】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQID NO:1-SEQ IDNO:9-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:4- SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:6であり、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:3- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:5であり、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:3であり、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:8-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4であり、
（ｅ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO: 29-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4である。
【０４０５】
ここで、表記「-」は、アミノ酸配列の間の順次連結を表す。
【０４０６】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下に示すような塩基配列を有する。
【０４０７】
（ａ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ ID NO:21-SEQ IDNO:17であり、
（ｂ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:16であり、
（ｃ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:14であり、
（ｄ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:15であり、
（ｅ’）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:33-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:15であり、
ここで、SEQ ID NO:29（VLCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:33であり、SEQID NO:30（VHCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:34である。
【０４０８】
ここで、（ａ’）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｅ’）及び（ｆ’）で表されるすべての塩基配列は、２つの一本鎖遺伝子（ＤＮＡ断片）の一方の鎖のヌクレオチド配列であり、表記「-」は、塩基配列の間の順次連結を表す。
【０４０９】
ヌクレオチド配列の縮重又は突然変異の可能性があるため、当業者は塩基を調整できると理解されるであろう。塩基の変化がコドンの変化を引き起こすが、コドンによって翻訳されたアミノ酸の変化を引き起こすことはない。一般的に、ロイシンコドンは、例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵなどの様々なコドンを有することがある。
【０４１０】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列である。
【０４１１】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列であり、かつ、その遺伝子操作された抗体遺伝子がコードするアミノ酸配列は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列がコードするアミノ酸配列と完全に又は基本的に同一である。
【０４１２】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、全遺伝子合成又はＰＣＲクローニング法で得られる。
【０４１３】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、二重特異性一本鎖抗体をコードする遺伝子を有する。ここで、その二重特異性一本鎖抗体は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD19抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD19）、ヒトCD19抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD19）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。VLCD19、VHCD19、VLCD3及びVHCD3ポリペプチドをコードする遺伝子は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ここで、VLCD19及びVHCD19がヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成し、VLCD3及びVHCD3がヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成するので、本発明に係る遺伝子操作された抗体は、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）であることが好ましい。
【０４１４】
好ましくは、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の好適な構造形態は、
VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3であり、
ここで、Linkerは、主にグリシン及びセリンで構成されるポリペプチド配列を用いるリンカーペプチドである。グリシンは最も小さいアミノ酸であり、その最小の側鎖により側鎖の柔軟性を高めることができる。一方、セリンは親水性の最も強いアミノ酸であり、ペプチド鎖の親水性を増大させることができる。
【０４１５】
次に、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びＦｌａｇタグをコードする塩基配列を有することで、遺伝子操作された抗体のＮ末端に免疫グロブリン軽鎖κ鎖の分泌シグナルペプチド及びＦｌａｇタグを加えることを可能にする。このようにして、抗体を発現して宿主細胞外に分泌することを保証する。また、Ｈｉｓ６タグを遺伝子操作された抗体のＣ末端に連結することにより、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製することに寄与する。
【０４１６】
抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥ）は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD20抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD20）、ヒトCD20抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD20）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。
【０４１７】
本明細書で記載される塩基配列は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すと理解されるであろう。
【０４１８】
第７の態様において、本発明は、下記のステップ（１）、（２）を含む遺伝子操作された抗体の製造方法を提供する。
【０４１９】
（１）ミニサークルＤＮＡを用意又は調製する。ここで、ミニサークルＤＮＡは遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０４２０】
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現して遺伝子操作された抗体を製造する。
【０４２１】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」は、主に超らせん構造で存在し、原核プラスミドの骨格ＤＮＡ配列を含まないベクターを意味する。ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れたそのミニサークルＤＮＡは、転写又は標的遺伝子を安定的かつ持続的に発現することができる。
【０４２２】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ」の用語と「ミニサークルＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０４２３】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターと比較して、ミニサークルＤＮＡは、細菌由来の骨格ＤＮＡ配列が取り除かれるので、炎症及びインビボ又はインビトロでの遺伝子発現のサイレンシングの発生可能性を低下させ、このようにして、より長期にわたりより強い発現が得られる。また、ミニサークルＤＮＡにおいて耐性マーカー遺伝子及び複製起点を含有する細菌の配列が欠けているため、臨床上の安全性が向上する。
【０４２４】
好ましい実施形態において、ミニサークルＤＮＡは、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えにより、ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドから調製される。
【０４２５】
本明細書において用いられるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドのマルチクローニング部位に、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットの遺伝子配列を挿入することにより得られ、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子を含む。
【０４２６】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ空プラスミド」は、部位特異的組み換えに係る部位を有するプラスミドベクターを意味する。
【０４２７】
本明細書において用いられる「プラスミドベクター」は、遺伝子操作の研究において、外来ＤＮＡを挿入可能、かつレシピエント細胞で複製可能なＤＮＡ構造を意味する。
【０４２８】
本明細書において用いられる「プラスミド」の用語と「プラスミドベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０４２９】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」は部位特異的組み換えに係る部位を有し、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製できる組換え親プラスミドを意味する。
【０４３０】
本明細書において用いられる「ミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミド」の用語と「ミニサークルＤＮＡ親プラスミド」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０４３１】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ配列」は、標準プラスミドにおける細菌プラスミドの複製、又はプラスミドを含む宿主のスクリーニングを機能するＤＮＡ配列を有する。このようなＤＮＡ配列は、例えば、細菌複製配列、耐性遺伝子、及び非メチル化ＣｐＧ遺伝子配列などを含む。
【０４３２】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０４３３】
好ましい実施形態において、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドを宿主細胞に形質転換して誘導した後、そのミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、部位特異的組み換えに係る部位の部位特異的組み換え事象により、ミニサークルＤＮＡ及び骨格ＤＮＡを調製する。
【０４３４】
好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。
【０４３５】
好ましくは、部位特異的組み換えに係る部位は、ｐｈｉＣ３１部位特異的組み換えに係る部位、ｐａｒＡ部位特異的組み換えに係る部位、又はＣｒｅ部位特異的組み換えに係る部位である。
【０４３６】
本明細書において用いられる「部位特異的組み換え」は、Hu Chunsheng etal.「Letters inBiotechnology (22 (1): 104-109 (2011)」に報告されたｐｈｉＣ３１（ФＣ３１）リコンビナーゼシステム、ｐａｒＡリコンビナーゼシステム、又はＣｒｅリコンビナーゼシステムを使用することが好ましい。
【０４３７】
好ましくは、骨格ＤＮＡは、少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を含有する。
【０４３８】
さらに好ましくは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼである。
【０４３９】
このような好ましい条件下で、骨格ＤＮＡは宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得るので、ミニサークルＤＮＡの精製を促進する。また、非組み換えミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、同様にＤＮＡエンドヌクレアーゼ部位を有するので、宿主細胞におけるＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されて分解され得る。
【０４４０】
別の好ましい実施形態において、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによりミニサークルＤＮＡを調製する。ここで、そのミニサークルＤＮＡ空プラスミドの部位特異的組み換えに係る部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位である。好ましいａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼによって認識され得る最小認識配列である（ａｔｔＢ、ａｔｔＰの最小認識配列は、SEQ ID NO:31及びSEQ IDNO:32として示される）。
【０４４１】
さらなる好ましい実施形態において、本明細書で構築されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、骨格ＤＮＡのヌクレオチド配列とミニサークルＤＮＡのヌクレオチド配列との間に存在するａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０４４２】
具体的に、そのａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換えを行うことが可能であり、ミニサークル親プラスミドがａｔｔＬ部位を含有するプラスミド骨格ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡを不可逆的に調製するようにする。
【０４４３】
当業者は、必要に応じて適切なリコンビナーゼシステムを選択し、対応するリコンビナーゼを発現し得る適切な宿主菌を選択し、対応する部位特異的組み換えに係る部位を有するミニサークルＤＮＡ空ベクターを構築することができる。
【０４４４】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミド又はミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドに位置して、ミニサークルＤＮＡ調製時にミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドによって発現され得る。
【０４４５】
好ましくは、ФＣ３１リコンビナーゼの発現カセットは、宿主細胞の遺伝子に位置して、その宿主細胞によって発現され得る。
【０４４６】
好ましくは、ミニサークルＤＮＡ空プラスミドは、ｐ２ФＣ３１プラスミド又はｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドである。
【０４４７】
本明細書において用いられる「ｐ２ФＣ３１空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０４４８】
具体的に、空プラスミドｐ２ФＣ３１の構築方法は、Chen ZY et al.,Molecμｌar Therapy, 8 (3), 495-500 (2003)、Chen ZY,et al., Human Gene Therapy, 16 (1), 126-131 (2005)、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に開示されている。
【０４４９】
本明細書において用いられる「ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ空プラスミド」は、ФＣ３１リコンビナーゼの存在下で組換え可能なａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有する。
【０４５０】
具体的に、空プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸの構築方法及び全ゲノム配列は、Chen ZY et al.,Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)に開示されている。
【０４５１】
本発明の好ましい実施形態に用いられるｐ２ФＣ３１プラスミド及びｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドは、ｐ２ФＣ３１ベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在する一方、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が存在しないため、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターにより調製されるミニサークルＤＮＡ親プラスミドはより良い品質を有し、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列の汚染を減少させるという点で異なる。しかしながら、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクターは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする機能を持つ大腸菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。ФＣ３１リコンビナーゼ（すなわち、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ）及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有しないｐＭＣ．ＢＥＳＰＸは、インビボの部位特異的組み換え（大腸菌ＴＯＰ１０はその機能を持たない）を発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要がある。それに応じて、ｐ２ФＣ３１ベクターは、ＴＯＰ１０において部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡを調製するために、ＴＯＰ１０とともに使用される必要がある
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、天然抗体及び組換え抗体を含むがこれらに限定されない。
【０４５２】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、ヒト抗体及びマウス抗体を含むがこれらに限定されない。
【０４５３】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、治療用抗体を含むがこれらに限定されない。
【０４５４】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体」は、シングルターゲッティング抗体、デュアルターゲッティング抗体、又はマルチターゲッティング抗体であってもよい。
【０４５５】
本明細書において用いられる「ターゲッティング」とは、抗体が抗原に特異的に結合することを意味する。「デュアルターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２つ有することを意味する。「マルチターゲッティング」とは、抗体が抗原への特異的結合部位を２以上有することを意味する。
【０４５６】
本明細書において用いられる「骨格ＤＮＡ」の用語と「骨格ＤＮＡベクター」の用語とは、同じ意味で使用できる。
【０４５７】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。
【０４５８】
より好ましくは、そのプロモーターは、シグナルペプチドの遺伝子配列及びタグの遺伝子配列のうちの少なくとも１つにより、遺伝子操作された抗体遺伝子に作動可能に連結される。
【０４５９】
さらに好ましくは、シグナルペプチドは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドである。
【０４６０】
さらに好ましくは、タグはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグのうちの少なくとも１つである。
【０４６１】
以上のシグナルペプチド及びタグは、本発明において好適である。当業者は、必要に応じて適切なシグナルペプチド及びタグを選択することができる。
【０４６２】
本明細書において用いられる「遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセット」は、標的ポリペプチド（本発明における遺伝子操作された抗体）を発現するために必要なすべての要素を含む遺伝子発現システムを意味する。その遺伝子発現システムは、一般的に、プロモーター、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、及びターミネーターのような要素を含み、さらにシグナルペプチドのコード配列を含んでもよい。これらの要素は、作動可能に連結されている。
【０４６３】
本明細書において用いられる「作動可能に連結される」は、２以上の核酸領域又は核酸配列が機能する配置を意味する。例えば、プロモーター領域を標的核酸配列に対して特定の位置に配置することで、そのプロモーター領域は、核酸配列の転写を促して、核酸配列に「作動可能に連結される」。
【０４６４】
本発明の第７の態様の好ましい形態として、本発明は、下記のステップ（１）、（２）を含む遺伝子操作された抗体の製造方法を提供する。
【０４６５】
（１）ミニサークルＤＮＡを用意又は調製する。ここで、上記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子発現カセットは、下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む。
【０４６６】
（ａ）A-a-B-d-e
（ｂ）A-b-B-d-e
（ｃ）A-B-c-d-e
（ｄ）A-a-b-B-c-d-e
（ｅ）A-a-B-c-d-e
（ｆ）A-a-b-B-d-e
（ｇ）A-b-B-c-d-e
ここで、Aはプロモーターをコードするヌクレオチド配列であり、Bは遺伝子操作された抗体をコードするヌクレオチド配列であり、a、b、c、d、eはそれぞれ、シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを表し、表記「-」は各塩基配列で表される遺伝子断片の間で「作動可能に連結される」ことを表す。
【０４６７】
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現して遺伝子操作された抗体を製造する。
【０４６８】
ＤＮＡは、３，５−ホスホジエステル結合によって連結される４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＴ及びｄＴＭＰ）からなるデオキシリボ核酸である。ここで、「塩基配列」は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すために用いられると理解されるであろう。
【０４６９】
本発明の第７の態様の別の好ましい形態として、本発明は、下記のステップ（１）、（２）を含む遺伝子操作された抗体の製造方法を提供する。
【０４７０】
（１）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを用意又は調製する。ここで、上記ミニサークルＤＮＡは、ａｔｔＲ部位及び遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する環状ＤＮＡであり、上記遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、順次連結したプロモーター、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列、遺伝子操作された抗体遺伝子、Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列、終止コドン、及びｐｏｌｙＡテイルシグナルを含む。
【０４７１】
（２）ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクションし、宿主細胞で発現して遺伝子操作された抗体を製造する。
【０４７２】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、遺伝子操作された抗体をコードする塩基配列を有し、その遺伝子操作された抗体はデュアルターゲッティング特異的抗体であり、そのデュアルターゲッティング特異的抗体は、ターゲッティング免疫エフェクター細胞抗原エピトープ結合部位及び腫瘍細胞抗原エピトープ結合部位を有する。
【０４７３】
より好ましくは、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージからなる群より選ばれる１つである。
【０４７４】
さらに好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞のＢリンパ球、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０４７５】
より好ましくは、デュアルターゲッティング特異的抗体は、腫瘍細胞の少なくとも１つの抗原エピトープに結合する。
【０４７６】
好ましくは、遺伝子操作された抗体は二重特異性一本鎖抗体であり、その二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列の連結形態は、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる１つである。
【０４７７】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｅ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｆ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3、
（ｇ）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
（ｈ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3、
ここで、VLCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示され、上記VHCD19のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示され、VLCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示される配列から選ばれる１つであり、VHCD3のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:7に示される配列から選ばれる１つであり、linker1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10に示される配列から選ばれる１つであり、linker2のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示される。
【０４７８】
好ましくは、二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｅ）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０４７９】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、宿主菌において部位特異的組み換えによりミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドから調製される。
【０４８０】
好ましくは、ａｔｔＲ部位の塩基配列はSEQ IDNO:28に示される。
【０４８１】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下のようなアミノ酸配列をを有する。
【０４８２】
（ａ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:9-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:4- SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:6であり、
（ｂ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:3- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:5であり、
（ｃ）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:3であり、
（ｄ）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:8-SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4であり、
（ｅ）VHCD20-linker1-VLCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3のアミノ酸配列は、
SEQ ID NO: 29-SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7- SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:4である。
【０４８３】
ここで、表記「-」は、アミノ酸配列の間の順次連結を表す。
【０４８４】
より好ましくは、本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子は、以下に示すような塩基配列を有する。
【０４８５】
（ａ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ ID NO:21-SEQ IDNO:17であり、
（ｂ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VLCD3-linker1-VHCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:16であり、
（ｃ’）VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:14であり、
（ｄ’）VHCD19-linker1-VLCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:15であり、
（ｅ’）VLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3をコードする塩基配列は、
SEQ ID NO:33-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:15であり、
ここで、SEQ ID NO:29（VLCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:33であり、SEQID NO:30（VHCD20のアミノ酸配列）をコードする塩基配列はSEQ ID NO:34である。
【０４８６】
ここで、（ａ’）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｅ’）及び（ｆ’）で表されるすべての塩基配列は、２つの一本鎖遺伝子（ＤＮＡ断片）の一方の鎖のヌクレオチド配列であり、表記「-」は、塩基配列の間の順次連結を表す。
【０４８７】
ヌクレオチド配列の縮重又は突然変異の可能性があるため、当業者は塩基を調整できると理解されるであろう。塩基の変化がコドンの変化を引き起こすが、コドンによって翻訳されたアミノ酸の変化を引き起こすことはない。一般的に、ロイシンコドンは、例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵなどの様々なコドンを有することがある。
【０４８８】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列である。
【０４８９】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列に対して９５％を超える（より好ましくは≧９８％）の同一性を有する塩基配列であり、かつ、その遺伝子操作された抗体遺伝子がコードするアミノ酸配列は、（ａ’）〜（ｅ’）で表されるいずれかの配列がコードするアミノ酸配列と完全に又は基本的に同一である。
【０４９０】
好ましくは、遺伝子操作された抗体遺伝子は、全遺伝子合成又はＰＣＲクローニング法で得られる。
【０４９１】
好ましくは、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、二重特異性一本鎖抗体をコードする遺伝子を有する。ここで、その二重特異性一本鎖抗体は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD19抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD19）、ヒトCD19抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD19）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。VLCD19、VHCD19、VLCD3及びVHCD3ポリペプチドをコードする遺伝子は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ここで、VLCD19及びVHCD19がヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成し、VLCD3及びVHCD3がヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成するので、本発明に係る遺伝子操作された抗体は、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）であることが好ましい。
【０４９２】
好ましくは、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の好適な構造形態は、
VLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3であり、
ここで、Linkerは、主にグリシン及びセリンで構成されるポリペプチド配列を用いるリンカーペプチドである。グリシンは最も小さいアミノ酸であり、その最小の側鎖により側鎖の柔軟性を高めることができる。一方、セリンは親水性の最も強いアミノ酸であり、ペプチド鎖の親水性を増大させることができる。
【０４９３】
次に、本発明に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列、及びＦｌａｇタグをコードする塩基配列を有することで、遺伝子操作された抗体のＮ末端に免疫グロブリン軽鎖κ鎖の分泌シグナルペプチド及びＦｌａｇタグを加えることを可能にする。このようにして、抗体を発現して宿主細胞外に分泌することを保証する。また、Ｈｉｓ６タグを遺伝子操作された抗体のＣ末端に連結することにより、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製することに寄与する。
【０４９４】
抗ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（すなわち、抗ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥ）は、４つの異なるドメイン、すなわち、ヒトCD20抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD20）、ヒトCD20抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD20）、ヒトCD3抗原に結合する軽鎖の可変ドメイン（VLCD3）、ヒトCD3抗原に結合する重鎖の可変ドメイン（VHCD3）を有する。
【０４９５】
本明細書で記載される塩基配列は、遺伝子のヌクレオチド配列を表すと理解されるであろう。
【０４９６】
好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターを含む。
【０４９７】
より好ましくは、プロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターである。
【０４９８】
好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡ又はＳＶ４０である。
【０４９９】
さらに好ましくは、ｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ウシ成長ホルモンポリヌクレオチドｂｐＡである。
【０５００】
本発明に係るプロモーターは、サイトメガロウイルスＣＭＶ、ＲＳＶ、ＵＢＣ、及びＥＦ１αなどの真核生物プロモーターであってもよい。本発明において、ＣＭＶプロモーターは、ミニサークルＤＮＡを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるプロモーターを使用することにより、ミニサークルＤＮＡを構築する。本発明に係るｐｏｌｙＡテイルシグナルは、ＳＶ４０などであってもよい。本発明において、ｂｐＡテイルシグナルは、ミニサークルＤＮＡを構築するためにより好ましいものである。本発明は、異なる宿主細胞によって異なるテイルシグナルを使用することにより、ミニサークルＤＮＡを構築する。
【０５０１】
抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体において、VLCD19及びVHCD19はヒトCD19抗原に結合する機能ドメインを構成する一方、VLCD3及びVHCD3はヒトCD3抗原に結合する機能ドメインを構成する。そのため、抗ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体は、Ｔ細胞（CD3抗原を持つ）及びCD19陽性癌細胞と効果的に結合してＴリンパ球を活性化し、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム及びＦａｓ／ＦａｓＬなどを放出して腫瘍細胞を殺傷することができるため、ＭＨＣ Ｉ分子に制限されず、共刺激分子も必要としない。
【０５０２】
第８の態様において、本発明は、第３の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの使用、第４の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法の使用、第５の態様に係る宿主の使用、第６の態様に係る遺伝子操作された抗体の使用、及び第７の態様に係る遺伝子操作された抗体の製造方法の使用を提供する。
【０５０３】
好ましくは、第３の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ、第４の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法、第５の態様に係る宿主、第６の態様に係る遺伝子操作された抗体、及び第７の態様に係る遺伝子操作された抗体の製造方法は、癌の治療薬に使用され得る。
【０５０４】
より好ましくは、第３の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ、第４の態様に係る遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法、第５の態様に係る宿主、第６の態様に係る遺伝子操作された抗体、及び第７の態様に係る遺伝子操作された抗体の製造方法は、CD19又はCD20陽性癌疾患の治療薬に使用され得る。
【０５０５】
第９の態様において、本発明は、下記の（１）〜（４）からなる群より選ばれるいずれか１以上の方法を含む、第７の態様に係る遺伝子操作された抗体の使用方法を提供する。
【０５０６】
（１）遺伝子操作された抗体を単独で適用する方法。
【０５０７】
（２）遺伝子操作された抗体を化学療法、放射線療法、手術、生物療法、及び免疫療法のうちの１つ又はそれらの組み合わせと併用する方法。
【０５０８】
（３）遺伝子操作された抗体を標的化デリバリー法により患者に送達して治療を行う方法。
【０５０９】
（４）遺伝子操作された抗体をインビトロトランスフェクション技術により免疫エフェクター細胞にトランスフェクションした後、遺伝子操作された抗体がトランスフェクションされた免疫エフェクター細胞を患者に輸送して治療を行う方法。
【０５１０】
好ましくは、方法（４）において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、及び幹細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０５１１】
好ましくは、方法（４）において、免疫エフェクター細胞はＣＩＫ細胞又はＤ−ＣＩＫ細胞である。
【０５１２】
第９の態様において、本発明は、下記の（１）〜（４）からなる群より選ばれるいずれか１つの方法を含む、癌又は腫瘍を治療するための遺伝子操作された抗体の使用方法を提供する。
【０５１３】
（１）癌又は腫瘍を治療するために遺伝子操作された抗体を単独で適用する方法。
【０５１４】
（２）癌又は腫瘍を治療するために遺伝子操作された抗体を化学療法、放射線療法、手術、生物療法、及び免疫療法のうちの１つ又はそれらの組み合わせと併用する方法。
【０５１５】
（３）癌又は腫瘍を治療するために遺伝子操作された抗体を標的化デリバリー法により患者に送達して治療を行う方法。
【０５１６】
（４）癌又は腫瘍を治療するために遺伝子操作された抗体をインビトロトランスフェクション技術により免疫エフェクター細胞にトランスフェクションした後、遺伝子操作された抗体がトランスフェクションされた免疫エフェクター細胞を患者に輸送する方法。
【０５１７】
好ましくは、遺伝子操作された抗体は、本発明の第７の態様に係る遺伝子操作された抗体、又は本発明の第８の態様に係る方法で製造された遺伝子操作された抗体である。
【０５１８】
好ましくは、方法（４）において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、及び幹細胞からなる群より選ばれる１つである。
【０５１９】
方法（４）において、免疫エフェクター細胞はＣＩＫ細胞又はＤ−ＣＩＫ細胞である。
【０５２０】
好ましくは、方法（４）において、０．０１〜０．０４ｕｇ/ｕｌの遺伝子操作された抗体は、４×１０４〜１６×１０４の免疫エフェクター細胞と混合される。
【０５２１】
より好ましくは、遺伝子操作された抗体は、遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体及び遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体のうちの少なくとも１つである。
【０５２２】
好ましくは、方法（４）において、遺伝子操作された抗体は、本発明の第７の態様に係る遺伝子操作された抗体のうちの少なくとも１つである。
【０５２３】
好ましくは、方法（４）において、遺伝子操作された抗体は、本発明の第８の態様に係る方法で製造された遺伝子操作された抗体のうちの少なくとも１つである。
【０５２４】
このような好ましい条件下で、免疫エフェクター細胞数と標的細胞数との比は２〜８：１であり、ここで、標的細胞は癌細胞又は腫瘍細胞である。
【０５２５】
ａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡは、原核プラスミドの配列を含まず、ヒト細胞及び哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡから離れて、遺伝子操作された抗体を安定的かつ持続的に発現する。そのミニサークルＤＮＡは、例えば、遺伝子操作された抗体を発現するための患者への送達、腫瘍細胞を特異的殺傷するためのＴ細胞の案内などの標的療法に単独で使用され得る。
【０５２６】
本発明に係るミニサークルＤＮＡは、インビトロで患者の免疫エフェクター細胞をトランスフェクションした後、ミニサークルＤＮＡがトランスフェクションされた免疫エフェクター細胞を患者に輸送して治療を行うために使用され得る。
【０５２７】
本発明に係るミニサークルＤＮＡは、化学療法、放射線療法、手術、生物療法、免疫療法と組み合わせて治療を行うために使用され得る。
【０５２８】
本発明は、下記の（１）〜（４）に示すような効果を有する。
【０５２９】
（１）本発明で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドは、宿主菌において組換え過程を完成し、原核プラスミド要素を取り除いて遺伝子操作された抗体を有するミニサークルＤＮＡを形成する。
【０５３０】
（２）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、宿主細胞において遺伝子操作された抗体遺伝子を安定的かつ持続的に発現することができる。そのミニサークルＤＮＡは、ウイルスベクターより安全かつ経済的で、通常のベクターより効果的であるため、安全かつ高効率で、経済的な遺伝子治療ベクターである。また、そのミニサークルＤＮＡは、Ｆｌａｇタグ及びＨｉｓ６タグを持つ遺伝子操作された抗体を発現し、精製及び後続研究に寄与する。
【０５３１】
（３）本発明に係る遺伝子操作された抗体は、Ｔ細胞（CD3抗原を持つ）を腫瘍細胞に結合させ、Ｔ細胞を促して腫瘍細胞を殺傷することが可能である。
【０５３２】
（４）遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ、そのミニサークルＤＮＡを含有する宿主、及びそのミニサークルＤＮＡによって発現される遺伝子操作された抗体は、癌患者に対して、単独で使用されてもよく、化学療法、放射線療法、手術、生物療法、及び免疫療法のうちの１以上の治療法と併用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０５３３】
【図１】図１は、実施例１で提供されるｐＵＣ５７及びpＣＭＶ．ｂｐＡベクターを示す。
【図２】図２は、実施例１で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．Ｂａｂを構築するプロセスを示す。
【図３】図３は、実施例１で提供されるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＵＣ５７．Ｂａｂを示す。
【図４】図４は、実施例１で提供される組換え発現ベクターpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂを示す。
【図５】図５は、実施例１で提供されるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．Ｂａｂを示す。
【図６】図６は、実施例２で提供されるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．ＢａｂによりミニサークルＤＮＡ ＭＣ．Ｒａｂを調製するプロセスを示す。
【図７】図７は、実施例２で提供されるミニサークルＤＮＡ ＭＣ．Ｒａｂを示す。
【図８】図８は、実施例６で提供される遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂを構築するプロセスを示す。
【図９】図９は、実施例６で提供されるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂを示す。
【図１０】図１０は、実施例６で提供されるミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．ＢａｂによりミニサークルＤＮＡＭＣ．Ｒａｂを調製するプロセスを示す。
【図１１】図１１は、誘導の前後で酵素によって切断された実施例２に係るミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．Ｂａｂのアガロースゲル電気泳動図を示す。
【図１２】図１２は、Ｒａｊｉに結合された実施例１２に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体のフローサイトメトリー分析図を示す。
【図１３】図１３は、精製された実施例１７に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１４】図１４は、実施例１８に係る遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体のフローサイトメトリー分析図を示す。
【図１５】図１５は、実施例１９に係るＣＣＫ−８細胞計数キットによる予備実験の結果を示す。
【図１６】図１６は、ＣＤ１９×ＣＤ３及びＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥにより増強された、Ｄ−ＣＩＫによるＲａｊｉ細胞の死滅の検出結果を示す。
【図１７】図１７は、ＣＤ１９×ＣＤ３及びＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥにより増強された、Ｄ−ＣＩＫによるＲａｊｉ細胞の死滅の検出結果を示す。
【図１８】図１８は、Ｂリンパ腫マウスの生存曲線を示す。
【図１９】図１９は、Ｂリンパ腫マウスの生存曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０５３４】
以下、好ましい実施形態に基づいて本発明を詳しく説明する。本発明の要旨を逸脱しない範囲で、様々な変形が可能であると理解されるであろう。
【０５３５】
本発明の実施例で使用されるプラスミドベクターｐＵＣ５７、pＣＭＶ．ｂｐＡ、菌株ＤＨ５α、及び大腸菌ＴＯＰ１０は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入される。ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌（大腸菌）はＳＢＩ社から購入される。空プラスミドｐ２ФＣ３１は、Chen ZY et al., Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA resμｌt in persistent and high-level transgene expression in vivo, Molecμｌar Therapy, 2003, Volume8, Number3, 495-500、ChenZY et al., Improved production and purification of minicircle DNA vector freeof plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expressionin vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volume 16, Number 1,126-131、及び米国特許ＵＳ７８９７３８０Ｂ２に記載される方法により構築される。空プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ及び全ゲノム配列の構築方法は、Chen ZY et al., A robust system for production of minicircle DNAvectros, Nature Biotechnology, 2010, Volume 28, Number 12, 1289-1291に開示されている。本明細書で使用されるすべての試薬は、市販品として入手され得る。
【０５３６】
＜実施例１＞
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．Ｂａｂの構築方法は、下記のステップ（１）〜（３）を含む。
【０５３７】
（１）図２−ａに示すような、遺伝子操作された抗体抗ＣＤ１９×ＣＤ３遺伝子（すなわち、ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）を有する組換えベクターｐＵＣ５７．Ｂａｂの構築
（１ａ）全ゲノム配列合成の方法で、順次連結したＨｉｎｄＩＩＩ酵素部位−免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列（SEQ ID NO:24）−Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列（SEQ ID NO:25）−ＢｉＴＥの遺伝子配列（SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-SEQID NO:19-SEQ ID NO:14）−Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列（SEQ ID NO:26）−終止コドン（ＴＴＡ）−ＥｃｏＲＩ酵素部位の塩基配列を合成した。ここで、SEQ IDNO:12-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:14はそれぞれ、ＢｉＴＥをコードするVLCD19-linker1-VHCD19-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3塩基配列に対応する。その順次連結した塩基配列は完全ゲノム合成遺伝子（すなわち、ＤＮＡ断片）二本鎖の一方の鎖であり、他方の鎖は順次連結した塩基配列に相補的である。
【０５３８】
（１ｂ）ｐＵＣ５７ベクター及びステップ（１ａ）で合成された塩基配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。その結果をアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。線状ｐＵＣ５７ベクター及びヌクレオチド断片を回収した。
【０５３９】
（１ｃ）ステップ（１ｂ）で得られたヌクレオチド断片と線状ｐＵＣ５７ベクターとを３：１のモル比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより１６℃にて一夜、又は室温にて２時間連結させた後、生成物を大腸菌ＤＨ５α株コンピテント細胞懸濁液に加えて形質転換し、アンピシリン含有のＬＢ平板に接種して３７℃にて一夜培養した。単一コロニーをピックアップして、２つの酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で組換えプラスミドベクターを検証した。さらに、陽性クローン（positive cloning）をシークエンシングで確認した。ステップ（１ａ）で合成された塩基配列と一致するヌクレオチド断片が挿入されたベクターは、ｐＵＣ５７．Ｂａｂ（４２４０ｂｐ）と称し、そのｐＵＣ５７．Ｂａｂ（４２４０ｂｐ）のプラスミドマップが図３に示された。
【０５４０】
（２）図２−ｂに示すような、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有する組換え発現ベクターpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂの構築
（２ａ）pＣＭＶ．ｂｐＡベクター及びｐＵＣ５７．ＢａｂをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。その結果をアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。線状pＣＭＶ．ｂｐＡベクター及びヌクレオチド断片を回収した。
【０５４１】
（２ｂ）ステップ（２ａ）で得られたヌクレオチド断片と線状pＣＭＶ．ｂｐＡベクターとを３：１のモル比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより１６℃にて一夜、又は室温にて２時間連結させた後、生成物を大腸菌ＤＨ５α株コンピテント細胞懸濁液に加えて形質転換し、アンピシリン含有のＬＢ平板に接種して３７℃にて一夜培養した。単一コロニーをピックアップして、２つの酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で組換えプラスミドベクターを検証した。さらに、陽性クローンをシークエンシングで確認した。ステップ（１ａ）で合成された塩基配列と一致するヌクレオチド断片が挿入されたベクターは、pＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ（４８１４ｂｐ）と称し、そのpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ（４８１４ｂｐ）のプラスミドマップが図４に示される。
【０５４２】
（３）図２−ｃに示すような、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐ２ФＣ３１．Ｂａｂの構築
（３ａ）ステップ（１ｃ）で取り出した陽性クローンを培養した。pＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターをプラスミド精製用キット（ＯＭＥＧＡ社）で精製した。
【０５４３】
（３ｂ）ｐ２ФＣ３１ベクター及びステップ（２ａ）で得られたpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターを、ＳｐｅＩ及びＰｓｐ ＯＭＩエンドヌクレアーゼで切断した。その結果をアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。線状ｐ２ФＣ３１ベクター及びヌクレオチド断片（遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを含有するＤＮＡ断片）を回収した。
【０５４４】
（３ｃ）ステップ（２）で得られたヌクレオチド断片と線状ｐ２ФＣ３１プラスミドとを３：１のモル比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより１６℃にて一夜、又は室温にて２時間連結させた後、生成物を大腸菌ＤＨ５α株コンピテント細胞懸濁液に加えて形質転換し、アンピシリン含有のＬＢ平板に接種して３７℃にて一夜培養した。単一コロニーをピックアップして、２つの酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で組換えプラスミドベクターを検証した。さらに、陽性クローンをシークエンシングで確認してｐ２ФＣ３１．Ｂａｂ（１２２９０ｂｐ）を得た。ｐ２ФＣ３１．Ｂａｂは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドであり、そのプラスミドマップが図５に示される。
【０５４５】
＜実施例２＞
図６に示すような、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡのフローチャートを参照して、本実施例は、下記のステップ（１ａ）〜（１ｃ）を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法を提供する。
【０５４６】
（１ａ）ＴＯＰ１０を実施例１で得られたｐ２ФＣ３１．Ｂａｂプラスミドにより形質転換して一夜培養した。
【０５４７】
（１ｂ）ステップ（１ａ）で得られた培地における細菌を１％アラビノース含有の新鮮な誘導培地に懸濁させ、２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃にて２時間培養した。ФＣ３１リコンビナーゼの発現を誘導し、ａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミド（ｐＢａｃｋｂｏｎｅ）ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡの形成をもたらした。
【０５４８】
（１ｃ）その後、培養温度を３７℃に上昇させた。Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼを誘導してＩ−Ｓｃｅ１部位でｐＢａｃｋｂｏｎｅを切断した。ｐＢａｃｋｂｏｎｅ ＤＮＡ鎖を細菌のエクソヌクレアーゼにより迅速に分解した。唯一の染色体外環状ＤＮＡとするミニサークルＤＮＡをアフィニティーカラムで抽出し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ（ＭＣ．Ｒａｂ（２６４０ｂｐ））を得た。得られたＭＣ．Ｒａｂのプラスミドマップが図７に示される。
【０５４９】
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、実施例３〜５が提供される。
【０５５０】
実施例３は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ ID NO:21-SEQ IDNO:17
である点で実施例１と異なっている。
【０５５１】
実施例４は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:16
である点で実施例１と異なっている。
【０５５２】
実施例５は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:15
である点で実施例１と異なっている。
【０５５３】
実施例３〜５において、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、実施例２に係る方法により構築された。
【０５５４】
［ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡ親プラスミドの構築］
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、遺伝子操作された抗体（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）を含有するミニサークルＤＮＡを構築する実施例が提供される。この実施例は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-SEQID NO:20-SEQ ID NO:15
である点で実施例１と異なっている。
【０５５５】
具体的には、全ゲノム配列合成の方法で、順次連結したＨｉｎｄＩＩＩ酵素部位−免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列（SEQ IDNO:24）−Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列（SEQ ID NO:25）−ＢｉＴＥの遺伝子配列（SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22- SEQ IDNO:18-SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:15）−Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列（SEQ ID NO:26）−終止コドン（ＴＴＡ）−ＥｃｏＲＩ酵素部位の塩基配列を合成した。ここで、SEQ IDNO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:15はそれぞれ、ＢｉＴＥをコードするVLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3塩基配列に対応する。その順次連結した塩基配列は完全ゲノム合成遺伝子（ＤＮＡ断片）二本鎖の一方の鎖であり、他方の鎖は順次連結した塩基配列に相補的である。
【０５５６】
［ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡの構築］
得られたＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、実施例２に係る方法により構築された。
【０５５７】
＜実施例６＞
遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂの構築方法は、下記のステップ（１）〜（３）を含む。
【０５５８】
（１）実施例１のステップ（１）に記載される方法による遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体（ＢｉＴＥ）遺伝子を有するｐＵＣ５７．Ｂａｂ組換えベクターの構築
（２）実施例１のステップ（２）に記載される方法による遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターの構築
（３）図８に示すような、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂの構築
（３ａ）ステップ（１ｃ）で取り出した陽性クローンを培養した。pＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターをプラスミド精製用キット（ＯＭＥＧＡ社）で精製した。
【０５５９】
（３ｂ）ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクター及びステップ（２ａ）で得られたpＣＭＶ．ｂｐＡ．Ｂａｂ組換え発現ベクターを、ＳｐｅＩ及びＰｓｐ ＯＭＩエンドヌクレアーゼで切断した。その結果をアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。線状ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸベクター及びヌクレオチド断片を回収した。
【０５６０】
（３ｃ）ステップ（２）で得られたヌクレオチド断片と線状ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸプラスミドとを３：１のモル比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより１６℃にて一夜、又は室温にて２時間連結させた後、生成物を大腸菌ＤＨ５α株コンピテント細胞懸濁液に加えて形質転換し、アンピシリン含有のＬＢ平板に接種して３７℃にて一夜培養した。単一コロニーをピックアップして、２つの酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で組換えプラスミドベクターを検証した。さらに、陽性クローンをシークエンシングで確認してｐＭＣ．Ｂａｂ（６６３９ｂｐ）を得た。ｐＭＣ．Ｂａｂは、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドであり、そのプラスミドマップが図９に示される。
【０５６１】
＜実施例７＞
図１０に示すような、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡのフローチャートを参照して、本実施例は、下記のステップ（１ａ）〜（１ｃ）を含む、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡの調製方法を提供する。
【０５６２】
（１ａ）組換え細菌ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔを実施例６で得られたｐＭＣ．Ｂａｂプラスミドにより形質転換して一夜培養した。
【０５６３】
（１ｂ）ステップ（１ａ）で得られた培地における細菌を１％アラビノース含有の新鮮な誘導培地に懸濁させ、２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃にて２時間培養した。ФＣ３１リコンビナーゼの発現を誘導し、ａｔｔＬ部位を含有する細菌プラスミド（ｐＢａｃｋｂｏｎｅ）ＤＮＡ及びａｔｔＲ部位を含有するミニサークルＤＮＡの形成をもたらした。
【０５６４】
（１ｃ）その後、培養温度を３７℃に上昇させた。Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼを誘導してＩ−Ｓｃｅ１部位でｐＢａｃｋｂｏｎｅを切断した。ｐＢａｃｋｂｏｎｅＤＮＡ鎖を細菌のエクソヌクレアーゼにより分解した。唯一の染色体外環状ＤＮＡとするミニサークルＤＮＡをアフィニティーカラムで抽出し、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ（ＭＣ．Ｒａｂ（２６４０ｂｐ））を得た。得られたＭＣ．Ｒａｂのプラスミドマップが図７に示される。
【０５６５】
ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸにはｐ２ФＣ３１ベクターに存在するФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする塩基配列がないため、ミニサークルＤＮＡへの塩基配列汚染を減少させ、ミニサークルＤＮＡ親プラスミドにより良い品質を与える。また、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸにはФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードする塩基配列がないため、リコンビナーゼ及びエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列のミニサークルＤＮＡへの汚染を減少させることができる。しかし、実施例６のミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、ミニサークルＤＮＡを調製するためにＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用された。これは、ФＣ３１リコンビナーゼ及びＩ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を持たないｐＭＣ．Ｂａｂが、インビボでの部位特異的組み換えを発生させて最終的にミニサークルＤＮＡ、すなわちＭＣ．Ｒａｂを調製するために、ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ組換え細菌とともに使用される必要があるためである。
【０５６６】
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、誘導の前後で酵素で切断された実施例６のミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂ（６６３９ｂｐ）のアガロースゲル電気泳動図が提供される。図１１（ａ）に示すように、レーン（ｌａｎｅ）１は、アラビノースにより誘導して精製されたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで切断した結果である。単一のバンドが見られることは、親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂの組換えが成功したこと、及び２種類のサークル（circle）が形成したことを示す。細菌配列を持つサークルは細菌における酵素により分解される一方、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩを持たない残りのミニサークルＤＮＡ（２６４０）は切断できず、すなわち、レーン１に示されるバンドになった。レーン２は、ＤＮＡマーカーであり、１ Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入される）である。レーン３は、アラビノースによる誘導の前に精製されたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸＣＭＩで切断した結果である。２つのバンドが見られることは、親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂが、誘導の前にＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔに存在することを示す。レーン４は、アラビノースによる誘導の前に精製されたプラスミドをＥｃｏＲＩで切断した結果である。単一のバンドが見られることは、親プラスミドｐＭＣ．ＢａｂのＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔにおける形質転換が成功したことを示す。
【０５６７】
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、実施例８〜１０も提供される。
【０５６８】
実施例８は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:15-
SEQ ID NO:21-SEQ IDNO:17
である点で実施例６と異なっている。
【０５６９】
実施例９は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:14-
SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:16
である点で実施例６と異なっている。
【０５７０】
実施例１０は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:18-
SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:15
である点で実施例６と異なっている。
【０５７１】
実施例８〜１０にいおて、遺伝子操作された抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、実施例７に係る方法により構築された。
【０５７２】
［ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡ親プラスミド（ｐＭＣ．Ｂａｂ−ＣＤ２０）の構築］
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、遺伝子操作された抗体（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）を含有するミニサークルＤＮＡを構築する実施例も提供される。この実施例は、ステップ（１ａ）におけるＢｉＴＥの塩基配列が、
SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-SEQID NO:19-SEQ ID NO:14
である点で実施例１と異なっている。
【０５７３】
具体的には、全ゲノム配列合成の方法で、順次連結したＨｉｎｄＩＩＩ酵素部位−免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをコードする塩基配列（SEQ ID NO:24）−Ｆｌａｇタグをコードする塩基配列（SEQ ID NO:25）−ＢｉＴＥの遺伝子配列（SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-SEQID NO:19-SEQ ID NO:14）−Ｈｉｓ６タグをコードする塩基配列（SEQ ID NO:26）−終止コドン（ＴＴＡ）−ＥｃｏＲＩ酵素部位の塩基配列を合成した。ここで、SEQ IDNO:33-SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:19-SEQ IDNO:14はそれぞれ、ＢｉＴＥをコードするVLCD20-linker1-VHCD20-linker2-VHCD3-linker1-VLCD3塩基配列に対応する。その順次連結した塩基配列は完全ゲノム合成遺伝子（ＤＮＡ断片）二本鎖の一方の鎖であり、他方の鎖は順次連結した塩基配列に相補的である。
【０５７４】
［ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡの構築］
得られたＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡ親プラスミドは、実施例７に係る方法により構築された。
【０５７５】
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、誘導の前後で酵素で切断されたＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥを含有するミニサークルＤＮＡ組換え親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂ−ＣＤ２０のアガロースゲル電気泳動図が提供される。図１１（ｂ）に示すように、レーン１は、ＤＮＡマーカーであり、１ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、品番１０７８７０２６である）である。レーン２はアラビノースにより誘導して精製されたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで切断した結果である。単一のバンドが見られることは、親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂの成功した組換え及び２種類のサークル（circle）の形成を示す。細菌配列を持つサークルは細菌における酵素により分解される一方、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩを持たない残りのミニサークルＤＮＡは切断できず、すなわち、レーン２に示されるバンドになった。レーン３は、アラビノースによる誘導の前に精製されたプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸＣＭＩで切断した結果である。２つのバンドが見られることは、親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂが誘導の前にＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔに存在すること、及び親プラスミドｐＭＣ．Ｂａｂ−２のＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔにおける形質転換が成功したことを示す。
【０５７６】
＜実施例１１＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体を発現及び精製する方法は、下記のステップ（１）、（２）を含む。
【０５７７】
（１）組換え抗体のＣＨＯ細胞及びＣＩＫ細胞における発現
ｓｕｐｅｒｆｅｃｔプラスミドトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＣＨＯ細胞及びＣＩＫ細胞にｐ２ФＣ３１．Ｂａｂ又はＭＣ．Ｒａｂをトランスフェクションした。無血清培地において３日間培養した後、ＣＨＯ細胞及びＣＩＫ細胞の上清を収集し、フローサイトメトリーで遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体の発現を検出した。
【０５７８】
（２）遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体の精製
ＣＨＯ細胞培養上清を低温で超遠心分離して上清を収集した。その後、収集された上清をニッケルカラムクロマトグラフィーにかけ、２８０ｎｍで測定した。非結合タンパク質を洗浄液で溶出させるとともに、結合タンパク質を溶離液で溶出させ、精製した遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体を得た。そのタンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法で検出した。得られた遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体含有の溶離液を脱塩、精製、凍結乾燥した後、−２０℃で長期保存した。
【０５７９】
＜実施例１２＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体によるインビトロで結合活性を検出する方法は、下記のステップ（１）、（２）を含む。
【０５８０】
（１）遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体とＲａｊｉ細胞との結合活性のフローサイトメトリーによる検出
（１ａ）遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体とＲａｊｉ細胞とを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．０２％アジ化ナトリウム含有のＰＢＳ（染色バッファー）で混合して実験群とした。Ｒａｊｉ細胞にｐ２ФＣ３１空プラスミドをトランスフェクションし、氷において３０分間培養して対照群とした。
【０５８１】
（１ｂ）ステップ（１ａ）で得られた培養液を遠心分離した。得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識された抗マウスＨｉｓ６抗体を加え、氷において３０分間培養した。
【０５８２】
（１ｃ）ステップ（１ｂ）で得られた培養液を遠心分離した後、得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄した。染色バッファー２００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーで検出した。検出結果は図１２に示される。図１２において、曲線１が対照群を表し、曲線２が実験群を表す。その結果によると、本発明に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体はＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ細胞に結合可能であることを示す。
【０５８３】
（２）遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体とＪｕｒｋａｔ細胞との結合活性のフローサイトメトリーによる検出
（２ａ）遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体とＪｕｒｋａｔ細胞とを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．０２％アジ化ナトリウム含有のＰＢＳ（染色バッファー）で混合し、氷において３０分間培養して実験群とした。
【０５８４】
（２ｂ）ステップ（２ａ）で得られた培養液を遠心分離した。得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識された抗マウスＨｉｓ６抗体を加え、氷において３０分間培養した。
【０５８５】
（２ｃ）ステップ（２ｂ）で得られた培養液を遠心分離した後、得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄した。染色バッファー２００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーで検出した。その結果によると、本発明に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体がＣＤ１９陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合可能であることを示す。
【０５８６】
＜実施例１３＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体によりインビトロで腫瘍細胞増殖活性を抑制する方法は、下記のステップ（１）、（２）を含む。
【０５８７】
（１）健康志願者の末梢血を採取し、Ｔリンパ球分離液により末梢血Ｔリンパ球を分離した後、得られたＴリンパ球を９６ウェル細胞培養プレート（１×１０４／ウェル、２００μｌ）に接種した。
【０５８８】
（２）濃度の異なる遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体を調製した後、ステップ（１）のＴリンパ球培養ウェルに加えた。４８時間培養した後、各ウェルに濃度５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴチアゾリルブル溶液２０μｌを加え、４時間培養した。
【０５８９】
（３）ステップ（２）で培養されたＴリンパ球を１０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０分間遠心分離した。培養ウェルにおける上清を取り除いた後、各ウェルに２００μｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、１０分間振盪して結晶を十分に溶解させた。その後、酵素結合免疫吸着法により５７０ｎｍ波長における吸光度を測定して細胞増殖曲線を作成した。
【０５９０】
本発明に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、Ｔリンパ球を効果的に活性化可能である。
【０５９１】
＜実施例１４＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡによりインビトロで腫瘍細胞増殖活性を抑制する方法は、下記のステップ（１）、（２）を含む。
【０５９２】
（１）健康志願者の末梢血を採取し、Ｔリンパ球分離液により末梢血Ｔリンパ球を分離した後、ＢＩＯ−ＲＡＤエレクトロポレーション装置により、得られたＴリンパ球に、遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ（ＭＣ．Ｒａｂ）及び空ベクター（ｐ２ФＣ３１）をそれぞれトランスフェクションした。
【０５９３】
（２）ステップ（１）でトランスフェクションされたＴリンパ球を９６ウェル細胞培養プレート（１×１０４／ウェル、２００μｌ）に接種した後、４８時間培養した。その後、各ウェルに濃度５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴチアゾリルブル溶液２０μｌを加え、４時間培養した。
【０５９４】
（３）ステップ（２）で培養されたＴリンパ球を１０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０分間遠心分離した。培養ウェルにおける上清を取り除いた後、各ウェルに２００μｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、１０分間振盪して結晶を十分に溶解させた。その後、酵素結合免疫吸着法により５７０ｎｍ波長における吸光度を測定して細胞増殖曲線を作成した。
【０５９５】
本発明に係るＭＣ．Ｒａｂは、Ｔリンパ球に効果的にトランスフェクションされ得る。
【０５９６】
＜実施例１５＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体及びＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞傷害性を測定する下記のステップ（１）〜（３）を含む。
【０５９７】
（１）Ｒａｊｉ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（１×１０４／ウェル、２００μｌ）に接種した。細胞がプレートに付着した後、ＣＩＫ細胞（エフェクター細胞、Ｅ）とＲａｊｉ細胞（標的細胞、Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ）１０：１、２０：１、４０：１で、ＣＩＫ細胞を培養プレートに加えるとともに、濃度の異なる組換え抗体を細胞培養ウェルに加えた。エフェクター細胞及び標的細胞を別々に培養して対照群（Ｔ）とした。
【０５９８】
（２）細胞を９６時間培養した。その後、各ウェルに濃度５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴチアゾリルブル溶液２０μｌを加え、さらに４時間培養した後、１０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０分間遠心分離した。培養ウェルにおける上清を取り除いた後、各ウェルに２００μｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、１０分間振盪して結晶を十分に溶解させた。
【０５９９】
（３）酵素結合免疫吸着法により５７０ｎｍ波長における吸光度を測定して細胞殺傷曲線を作成した。数式ＯＤＴ−（ＯＤＥ：Ｔ−ＯＤＥ）／ＯＤＴ×１００％に従って殺傷効率を計算した。その結果によると、本発明に係る組換え抗体はＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞への殺傷活性を増加できることを示す。
【０６００】
＜実施例１６＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ及びＣＩＫ細胞によりＲａｊｉ細胞を殺傷する方法は、下記のステップ（１）〜（３）を含む。
【０６０１】
（１）Ｒａｊｉ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（１×１０４／ウェル、２００μｌ）に接種した。細胞がプレートに付着した後、ＢＩＯ−ＲＡＤエレクトロポレーション装置により、ＣＩＫ細胞に、遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ（ＭＣ．Ｒａｂ）及び空ベクター（ｐ２ФＣ３１）をそれぞれトランスフェクションした。その後、トランスフェクションされたＣＩＫ細胞をそれぞれ、ＣＩＫ細胞（エフェクター細胞、Ｅ）とＲａｊｉ細胞（標的細胞、Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ）１０：１、２０：１、４０：１で培養プレートに加えた。エフェクター細胞（Ｅ）及び標的細胞（Ｔ）を別々に培養して対照群とした。
【０６０２】
（２）細胞を９６時間培養した。その後、各ウェルに濃度５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴチアゾリルブル溶液２０μｌを加え、さらに４時間培養した後、１０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０分間遠心分離した。培養ウェルにおける上清を取り除いた後、各ウェルに２００μｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、１０分間振盪して結晶を十分に溶解させた。
【０６０３】
（３）酵素結合免疫吸着法により５７０ｎｍ波長における吸光度を測定して細胞殺傷曲線を作成した。数式ＯＤＴ−（ＯＤＥ：Ｔ−ＯＤＥ）／ＯＤＴ×１００％に従って殺傷効率を計算した。その結果によると、本発明に係るＭＣ．ＲａｂはＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞への殺傷活性を増強できることを示す。
【０６０４】
＜実施例１７＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体及び遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体を発現及び精製する方法は、下記のステップ（１）、（２）を含む。
【０６０５】
（１）組換え抗体の２９３Ｆ細胞における発現
（１−１）馴化された２９３Ｆ
２９３Ｔ細胞をＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで培養した。２９３Ｔ細胞をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに適応するように継代培養した。細胞を付着培養から懸濁培養に変更した。
【０６０６】
（１−２）トランスフェクションシステム
馴化された２９３Ｆ細胞の細胞密度を、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍにより１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌに調整した。細胞懸濁液２７ｍｌを各７５ｃｍ２培養瓶に加えた。
【０６０７】
（１−３）トランスフェクションステップ（Ｅｘｐｉ２９３（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍＫｉｔ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡのガイドラインに従って処理する）
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ、及び遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡを、下記のステップ（１−３−１）〜（１−３−５）に従って処理した。
【０６０８】
（１−３−１）ミニサークルＤＮＡ３０μｇをＯｐｔｉ無血清培地１５００μｌと混合し、室温にて５分間反応させた。２９３ｒｅａｇｅｎｔ８１μｌをＯｐｔｉ無血清培地１５００μｌと混合し、室温にて５分間反応させた。
【０６０９】
（１−３−２）反応終了後、２つの反応液を混合して室温にて３０分間培養した。
【０６１０】
（１−３−３）得られた培養液を、２９３Ｆ細胞が含有される培養瓶に加えた。
【０６１１】
（１−３−４）得られた細胞を、細胞培養器において３７℃、５％ＣＯ２（飽和湿度）の条件下で１６時間〜１８時間培養した。その後、各培養瓶にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎ ２９３ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ１を１５０μｌ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎ ２９３ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ２を１５００μｌ加えた。
【０６１２】
（１−３−５）細胞を引き続き４８時間培養した。上清を収集して、検出又は後続のテストに用いた。
【０６１３】
（２）遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体及び遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体の精製
ステップ（１）で得られた遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体が含まれる上清、及び遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体が含まれる上清をそれぞれ、下記のステップ（２−１）〜（２−２）に従って処理した。
【０６１４】
（２−１）メカニズム：標的タンパク質に存在するＨｉｓタンパク質タグがＮｉ充填材と結合して高濃度イミダゾールで溶出され得るので、標的タンパク質の精製を実現できる。
【０６１５】
（２−２）精製ステップ：
（２−２−１）標的タンパク質が含まれる培地をＮｉ充填材と混合し、振動台で４℃にて一夜振動させ、標的タンパク質をＮｉ充填材と完全に結合させる。
【０６１６】
（２−２−２）培地とＮｉ充填材との混合物をカラムクロマトグラフィーにかけ、Ｎｉ充填材を取集した。
【０６１７】
（２−２−３）収集された充填材を２０ｍＭのイミダゾールで洗浄して非標的タンパク質を取り除いた。
【０６１８】
（２−２−４）５００ｍＭのイミダゾールで標的タンパク質１０ｍｌを溶出した。
【０６１９】
（２−２−５）溶出された標的タンパク質を１０ｋ限外濾過カラム（ultra-filtration column）で濃縮し、その後、ＰＢＳで洗浄してイミダゾールを取り除いた後、遠心分離した。限外濾過カラムにおける標的タンパク質をＴ５５１培地で溶解して保存した。精製した遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体及び遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体を得た。
【０６２０】
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、精製した遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像が提供される。図１３に示すように、レーン１〜３は、カラム負荷量の異なる遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体である。レーン４は、タンパク質Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、品番：２６６１６）である。図１３から、５５Ｋａの精製した遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体を製造することが分かる。
【０６２１】
＜実施例１８＞
遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体によるインビトロでの結合活性を検出する方法は、下記のステップ（１）を含む。
【０６２２】
（１）遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体とＲａｊｉ細胞との結合活性のフローサイトメトリーによる検出
（１ａ）実験群、対照群１及び対照群２
実験群：実施例１7で精製した遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体とＲａｊｉ細胞とを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．０２％アジ化ナトリウム含有のＰＢＳ（染色バッファー）で混合し、氷において３０分間培養した。
【０６２３】
培養液を遠心分離した。得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識された抗マウスＨｉｓ６抗体を加え、氷において３０分間培養した。
【０６２４】
対照群１：Ｒａｊｉ細胞にｐ２ФＣ３１空プラスミドをトランスフェクションした。
【０６２５】
対照群２：Ｒａｊｉ細胞にｐ２ФＣ３１空プラスミドをトランスフェクションした後、氷において３０分間培養した。
【０６２６】
培養液を遠心分離した。得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識された抗マウスＨｉｓ６抗体を加え、氷において３０分間培養した。
【０６２７】
（１ｂ）ステップ（１ａ）で得られた培養液を遠心分離した後、得られた細胞を染色バッファーで２回洗浄した。染色バッファー２００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーで検出した。検出結果は図１４に示される。図１４において、曲線１が対照群１を表し、曲線２が対照群２を表し、曲線３が実験群を表す。その結果によると、本発明に係る遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体はＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞に結合可能であることを示す。
【０６２８】
＜実施例１９＞
遺伝子操作された抗体及びＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞傷害性を測定する方法は、下記のステップ（１）、（２）を含む。
【０６２９】
（１）Ｒａｊｉ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（２×１０４／ウェル、２００μｌ）に接種した。細胞がプレートに付着した後、ＣＩＫ細胞（エフェクター細胞、Ｅ）とＲａｊｉ細胞（標的細胞、Ｔ）との比率（Ｅ：Ｔ）２：１、４：１、８：１で、ＣＩＫ細胞をそれぞれ培養プレート（培地：Ｔ５５１）に加えるとともに、濃度の異なる組換え抗体を細胞培養ウェルに加えた。エフェクター細胞及び標的細胞を別々に培養して対照群（Ｔ）とした。実施例１７で精製した遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体（ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥと称する）、遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥと称する）、ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥとＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥとの組み合わせを加えた。一方、単にＴ５５１培地を加えたものを対照群（Ｔ）とした。具体的な実験設計は表１及び表２に示される。
【０６３０】
エフェクター細胞（Ｅ）及び標的細胞（Ｔ）を別々に培養して対照群とした。その対照群を実験群と比較して細胞殺傷率を計算した。ここで、エフェクター細胞（Ｅ）対照群は３つ設定され、すなわち、４×１０４／ウェルＣＩＫ細胞（２００μｌ）、８×１０４／ウェルＣＩＫ細胞（２００μｌ）、１６×１０４／ウェルＣＩＫ細胞（２００μｌ）が設定された。標的細胞（Ｔ）対照群は１つ設定され、すなわち２×１０４／ウェルＲａｊｉ細胞（２００μｌ）が設定された。
【０６３１】
本実施例におけるＣＩＫ細胞は、Ｄ−ＣＩＫ細胞、すなわち、樹状細胞により活性化されかつサイトカインにより誘導される殺傷細胞（Ｄ−ＣＩＫ）である。
【０６３２】
（２）細胞を８時間培養した後、ＣＣＫ−８を加えた。２４時間後、４５０ｎｍで検出して殺傷効率を計算した。
【０６３３】
本実施例においてＣＣＫ−８細胞計数キット（ＤＯＪＩＮＤＯ、品番:ＣＫ０４）を使用した。
【０６３４】
その試薬に含まれるＷＳＴ−８は、電子キャリア１−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳの存在下で、デヒドロゲナーゼによって水溶性の黄色ホルマザン色素（ｙｅｌｌｏｗ ｆｏｒｍａｚａｎ ｄｙｅ）に還元され得る。ホルマザンの量が生細胞数に比例する一方、ホルマザンの量がその吸光度（４５０ｎｍ波長における吸光度）と比例する。そのため、ＥＬＩＳＡは各ウェルの４５０ｎｍ波長における吸光度の検出に使用可能であり、検出結果は細胞増殖及び毒性特性の分析に使用され得る。
【０６３５】
本発明の有益な効果を詳細に説明するために、ＣＣＫ−８細胞計数キットがＤ−ＣＩＫ細胞及びＲａｊｉ細胞に適用できるか否かを予めテストして確認した。実験結果は図１５に示される。図１５から、Ｄ−ＣＩＫ細胞（又はＲａｊｉ細胞）の数と４５０ｎｍにおける吸光度値との間に直線関係があるので、ＣＣＫ−８細胞計数キットは本実施例に使用され得ることが分かる。
【０６３６】
殺傷効率は、ＯＤ値により換算した細胞数に基づいて、下記の数式に従って計算された。
【０６３７】
殺傷効率＝［１−（エフェクター細胞及び標的細胞−対応エフェクター細胞）／対応標的細胞］×１００％
ここで、「エフェクター細胞及び標的細胞」は、エフェクター細胞及び標的細胞を含む実験群を表し、「対応エフェクター細胞」及び「対応標的細胞」は、エフェクター細胞及び標的細胞のいずれか一方を含む対照群を表す。
【０６３８】
ＣＤ１９×ＣＤ３及びＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥにより向上した、Ｄ−ＣＩＫによるＲａｊｉ細胞への殺傷の検出結果は、図１６、１７に示される。
【０６３９】
図１６において、エフェクター細胞の濃度、標的細胞の濃度、エフェクター細胞数の標的細胞数に対する比、エフェクター細胞にトランスフェクションされたミニサークルＤＮＡの濃度などのパラメーターは、表１に示される。
【０６４０】
【表１】
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【０６４１】
表１において、実験群1は、遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体及びＣＩＫ細胞によりＲａｊｉ細胞を殺傷する実験設計である。
【０６４２】
実験群２は、遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体及びＣＩＫ細胞によりＲａｊｉ細胞を殺傷する実験設計である。
【０６４３】
対照群において、Ｒａｊｉ細胞は正常に培養された。
【０６４４】
図１６において、表記「**」はＰ＜０．０１を表し、縦軸はエフェクター細胞数と標的細胞数との比（エフェクター／ターゲット比、Ｅ／Ｔ比）を表し、２−１、４−１、８−１はそれぞれ２：１、４：１、８：１を表し、横軸は細胞殺傷百分率を表す。図１６から、実験群1及び実験群２は、ＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞への殺傷能力を明らかに向上できることが分かる。
【０６４５】
また、遺伝子操作された抗体の濃度が同様である場合、Ｅ／Ｔ比の効率が高いほど、ＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞への殺傷能力が高くなる。すなわち、遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体又は遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体によりＣＩＫ細胞を活性化させることで、Ｒａｊｉ細胞への殺傷能力を向上させる。
【０６４６】
図１７において、エフェクター細胞の濃度、標的細胞の濃度、遺伝子操作された抗体の濃度などのパラメーターは、表２に示される。
【０６４７】
【表２】
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【０６４８】
表２において、実験群1は、ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ及びＣＩＫ細胞によりＲａｊｉ細胞を殺傷する実験設計である。
【０６４９】
実験群２は、異なる濃度のＣＤ２０×ＣＤ３ＢｉＴＥをＣＩＫ細胞と組み合わせてＲａｊｉ細胞を殺傷する実験設計である。
【０６５０】
実験群３は、異なる濃度の混合抗体（ＣＤ１９×ＣＤ３ＢｉＴＥ及びＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｉＴＥ）をＣＩＫ細胞と組み合わせてＲａｊｉ細胞を殺傷する実験設計である。
【０６５１】
対照群において、Ｒａｊｉ細胞は正常に培養された。
【０６５２】
図１７において、表記「**」はＰ＜０．０１を表し、横軸は細胞殺傷百分率を表す。図１７から、実験群1〜３は、ＣＩＫ細胞によるＲａｊｉ細胞への殺傷能力を明らかに向上できることが分かる。
【０６５３】
また、Ｅ／Ｔ比が８：１であり、遺伝子操作された抗体のトランスフェクション濃度が０．０１〜０．０４μｇ／μｌである場合、実験群1〜３のＣＩＫ細胞は、Ｒａｊｉ細胞への高い殺傷能力を示す。
【０６５４】
これらの結果によると、遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体、遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体、及び遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体と遺伝子操作された抗ＣＤ２０×ＣＤ３抗体との混合抗体はＴ細胞を明らかに活性化可能であるので、Ｔ細胞の腫瘍細胞及び癌細胞への殺傷能力が向上することを示す。
【０６５５】
＜実施例２０＞
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡ及びＣＩＫ細胞により腫瘍を治療する方法は、ステップ（１）、（２）を含む。
【０６５６】
実験動物は、中国医学院実験動物センター（ChineseMedicine Laboratory Animal Center）から得られる（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全）。
【０６５７】
実験群：
（ａ）対照群：同体積の生理食塩水。
【０６５８】
（ｂ）腫瘍動物モデル群：５＊Ｅ０６／匹でＲａｊｉ細胞を注射した。
【０６５９】
（ｃ）細胞治療群：５＊Ｅ０６／匹でＲａｊｉ細胞を、５＊Ｅ０６／匹でＤ−ＣＩＫ細胞を３回注射した（１日１回、３回）；
（ｄ）併用治療群：ＣＤ１９×ＣＤ３ミニサークルＤＮＡを１回注射し、５＊Ｅ０６／匹でＲａｊｉ細胞を、５＊Ｅ０６／匹でＤ−ＣＩＫ細胞を３回注射した（１日１回、３回）。
【０６６０】
実験手順：
（１）培養液（ＰＢＳ溶液）により（０．７〜１．９）×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの腫瘍細胞懸濁液を調製した。Ｒａｊｉ細胞５＊Ｅ０６を４０匹のマウスに腹腔内注射した（対照群では同体積の生理食塩水を注射した）。９日〜２１日後、リンパ腫マウスモデルを確立した。
【０６６１】
（２）ステップ（１）で得られたリンパ腫マウスモデルに対して、実験群（ｃ）及び（ｄ）に記載される手順を行った。ここで、治療群にＤ−ＣＩＫ細胞（５＊Ｅ０６／匹、１日１回、３回）を注射し、併用治療群にＣＤ１９×ＣＤ３ミニサークルＤＮＡを１回、Ｄ−ＣＩＫ細胞を３回（５＊Ｅ０６／匹、１日１回、３回）注射した。対照群及び腫瘍動物モデル群に同体積の生理食塩水を注射した。
【０６６２】
遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡにより治療されるＢリンパ腫マウスの生存曲線は、図１８（日として）及び図１９（週として）に示される。図１８〜１９から、対照群及び腫瘍動物モデル群と比較して、本発明の治療群及び併用治療群は腫瘍殺傷能力を示すことが分かる。しかし、併用治療群は、より良い腫瘍殺傷効果及びより長いリンパ腫マウスモデルの生存時間を示す。これは、本発明に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡが腫瘍の治療に使用可能であることを示す。また、本発明に係る遺伝子操作された抗ＣＤ１９×ＣＤ３抗体遺伝子発現カセットを有するミニサークルＤＮＡは、ＣＩＫ細胞を活性化させ、ＣＩＫ細胞の腫瘍殺傷効果を向上させることができる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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