(57)【要約】本発明は、安定化ワクチンを製造するための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）抗原を、下記のものを含む溶液と混合すること：（ｉ）キトサン；（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；および（ｉｉｉ）糖；および（ｂ）前記（ａ）で得られた混合物を乾燥させること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化ワクチンを製造するための方法であって、
（ａ）抗原を、下記のものを含む溶液と混合すること：
（ｉ）キトサン；
（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；および
（ｉｉｉ）糖；
および
（ｂ）前記（ａ）で得られた混合物を乾燥させること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
少なくとも３種類のアミノ酸が
（ａ）非極性、脂肪族Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｂ）極性、非荷電Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｃ）正に荷電したＲ基をもつアミノ酸；
（ｄ）負に荷電したＲ基をもつアミノ酸；および
（ｅ）芳香族Ｒ基をもつアミノ酸
の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶液が、
（ａ）非極性、脂肪族Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｂ）極性、非荷電Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｃ）正に荷電したＲ基をもつアミノ酸；
（ｄ）負に荷電したＲ基をもつアミノ酸；および
（ｅ）芳香族Ｒ基をもつアミノ酸
の各群から選択される少なくとも１種類のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
溶液が、少なくともアミノ酸
（ａ）アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン；
（ｂ）アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン；
（ｃ）プロリン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、フェニルアラニン；
（ｄ）チロシン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、バリン；
（ｅ）アルギニン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、リジン、トリプトファン；または
（ｆ）アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸のうち１種類以上が、天然の非タンパク質構成アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１（ａ）（ｉｉ）の少なくとも１種類のジペプチドが、カルノシン、グリシルチロシン、グリシルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
糖がトレハロースである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
溶液がさらに少なくとも１種類のサポニンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗原がスプリットウイルス抗原である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
スプリットウイルス抗原がインフルエンザウイルス抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスがＡ  Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルスである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
混合物を乾燥させる工程が、噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥および風乾からなる群から選択される方法により達成される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）で得られた乾燥ワクチンをその後、滅菌する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ワクチンが、筋肉内、皮下、皮内、経皮、口腔、経口、鼻腔、および／または吸入による適用のためのものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化ワクチンを製造するための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）抗原を、下記のものを含む溶液と混合すること：（ｉ）キトサン；（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；および（ｉｉｉ）糖；および（ｂ）前記（ａ）で得られた混合物を乾燥させること。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に、特許出願および製造業者のマニュアルを含めた多数の文献を引用する。これらの文献の開示内容が本発明の特許性に関係するとは考えられないけれども、それの全体を本明細書に援用する。より具体的には、援用するすべての文献は、各文献それぞれが具体的かつ個別に援用すると指示されたと同程度に援用される。
【０００３】
今日、ワクチン接種の分野における大きな問題は、開発途上国でもウイルス疾患に対抗するために、熱安定ワクチンを開発することおよびニードルフリー（無針）ワクチン接種方式を確立することであり（非特許文献１）、それはＷＨＯ地球規模の免疫化に関する展望と戦略(WHO Global Immunization Vision and Strategy)（非特許文献２）の戦略的目標の１つでもある。さらに、パンデミックアウトブレイクに対してより十分に備えるために、安定ワクチン配合物の備蓄品が必要である（非特許文献３）。たとえば、２０１１年にドイツ政府は、可能性のあるＨ１Ｎ１アウトブレイクを予想して製造した１６００万回量の抗Ａ型インフルエンザワクチンを貯蔵寿命の限界のため処分せざるをえなかった。使用しなかった量のコストは莫大であった。
【０００４】
液体製剤は分子移動性が高く、化学反応および物理的不安定性の可能性が増すため、貯蔵に際して高リスクの不安定性に直面する（非特許文献４）。そのため、多くの液体ワクチン製剤は冷蔵下で貯蔵および輸送する必要があり、貯蔵寿命が短い。液体抗原製剤について、ｐＨ緩衝塩類の選択および安定化のためのアミノ酸の使用によってしばしば安定性が増大する（非特許文献５、６）。
【０００５】
そのような製剤の安定性、特にそれらの熱安定性は、抗原を乾燥させることによって大幅に増大させることができる。したがって、貯蔵安定性を高めるために一般に適用されている１方法は凍結乾燥であり、それによって分子移動性および分子間反応のリスクが最小限に抑えられる。この方法は、抗原が両工程に際して安定化されていることを必要とする：凍結工程（凍結保護(cryoprotection)）および後続の乾燥工程（凍結乾燥保護(lyoprotection)）（非特許文献７）。これはたとえば、水をそれの代わりに水素結合形成パートナーとして使用できる他の親水性分子で交換することにより達成できる。他の可能性は、糖ガラス(sugar glass)マトリックスの形成であり、それはワクチン製剤を安定化するためにも使用できる（非特許文献８）。
【０００６】
この一般原理は他の乾燥法、たとえば噴霧凍結乾燥または噴霧乾燥にも転用できる。噴霧乾燥は、凍結工程を回避し、凍結乾燥と比較して必要なエネルギーコストがより低いので、しばしば選択される方法である。噴霧乾燥は、高い温度との接触時間が短かいことおよびそれの特別なプロセス制御性のため、生体分子に適した特に有利な乾燥操作であることも示された（非特許文献９〜１２）。したがって、１工程だけで分散性乾燥粉末が得られる方法である噴霧乾燥は生体分子を凍結乾燥するためにしばしば好まれる（非特許文献１３）。得られる製品は、粉末の取り扱い、パッケージングおよび効果的な再分散を可能にするために、水または緩衝液と接触した際に良好な分散特性ならびに低い凝集および粘着傾向をもつように設計できる。これは、したがって大量のワクチンのバルク製造に特別に適した噴霧乾燥について特に当てはまる（非特許文献１４）。しかし、噴霧乾燥により処理される抗原は高温および機械的ストレスに曝露され、それらが分子の統合性および有効性の損失を生じる可能性がある。したがって、抗原保護はこの１工程製造法に際してすらそれにもかかわらず要求される。
【０００７】
ワクチン製造における他のハードルは、有意の材料損失なしにワクチン製剤を滅菌することである。生体分子の標準的な除菌（濾過滅菌）は、無菌的な充填および仕上げ処理に際しての汚染のリスクを残し（非特許文献１５）、よって著しい経済的損失につながる可能性がある。したがって、生体分子の最終滅菌(terminal sterilisation)を可能にする技術に対するニーズが増している（非特許文献１６〜１８）。照射は高いエネルギー入力と関連し、ミスフォールディング、凝集物形成および断片化を伴なう化学的および物理的修飾のリスクを高めるので、現在は生物製剤に有効な滅菌プロトコルとはみなされていない（非特許文献１９〜２１）。特に、凝集物は療法適用した生物製剤の免疫原性の変異につながる可能性がある（非特許文献２２）。他の滅菌法、たとえば加熱滅菌または高圧蒸気滅菌は製品の著しい熱ストレスのため不適切である。
【０００８】
全体的にみて、スプリットウイルスワクチン、たとえばＡ型インフルエンザワクチンなどを含めた高度に安定な最終滅菌した粉末ワクチンの開発は、まだ達成されていない。これの開発の主なボトルネックは、十分な量のワクチン粉末を得ること、そのワクチン粉末を滅菌すること、承認されていない抗原修飾を避けること、および特異的免疫原性の損失、したがって有効性の損失を避けることである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Scherlies R. Delivery of antigens used for vaccination - recent advances and challenges. Therapeutic Delivery 2011;2(10):1351-68.
【非特許文献２】WHO. GIVS: Global Immunization Vision and Strategy. Geneva: WHO; 2005.
【非特許文献３】Amorij J-P, Huckriede A, Wilschut J, Frijlink HW, Hinrichs WLJ. Development of S表Influenza Vaccine Powder Formulations: Challenges and possibilities. Pharm Res 2008;25(6):1256-73.
【非特許文献４】Hasija M, Li L, Rahman N, Ausar SF. Forced degradation studies: an essential tool for the formulation development of vaccines. Vaccine: Development and Therapy 2013(3):11-33.
【非特許文献５】Brandau DT, Jones LS, Wiethoff CM, Rexroad J, Middaugh CR. Thermal Stability of Vaccines. J Pharm Sci 2003;92(2):218-31.
【非特許文献６】Taneja S, Ahmad F. Increased thermal stability of proteins in the presence of amino acids. Biochem J 1994;303:147-53.
【非特許文献７】Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics 2000;203:1-60.
【非特許文献８】Amorij J-P, Meulenaar J, Hinrichs WLJ, Stegmann T, Huckriede A, Coenen F, et al. Rational design of an influenza subunit vaccine powder with sugar glass technology: Preventing conformational changes of haemagglutinin during freezing and freeze-drying. Vaccine 2007;25:6447-57.
【非特許文献９】Vehring R. Pharmaceutical Particle Engineering via Spray Drying. Pharm Res 2008;25:999-1022.
【非特許文献１０】Maury M, Murphy K, Kumar S, Mauerer A, Lee G. Spray-drying of proteins: effects of sorbitol and trehalose on aggregation and FT-IR amide I spectrum of an immunoglobulin G. EJPB 2005;59:251-61.
【非特許文献１１】Elkordy AA, Forbes RT, Barry BW. Stability of crystallised and spray-dried lysozyme. International journal of pharmaceutics 2004;278(2):209-19.
【非特許文献１２】Saluja V, Amorij J-P, Kapteyn JC, de Boer AH, Frijlink HW, Hinrichs WLJ. A comparison between spray drying and spray freeze drying to produce an influenza subunit vaccine powder for inhalation. J Controlled Release 2010;144:127-33.
【非特許文献１３】Abdul-Fattah AM, Truong-Le V, Yee L, Pan E, Ao Y, Kalonia DS, et al. Drying-Induced Variations in Physico-Chemical Properties of Amorphous Pharmaceuticals and Their Impact on Stability II: Stability of a Vaccine. Pharmaceutical Research 2007;24(4):715-27.
【非特許文献１４】Lal M. Technologies for the Development of Thermos表Vaccines: PATH; 2013.
【非特許文献１５】Son Y-J, McConville JT. Development of a Standardized Dissolution Test for Inhalable Formulations. Respiratory Drug Delivery; 2008; Scottsdale, Arizona,  USA: DHI; 2008. p. 927-30.
【非特許文献１６】Rathore N, Rajan RS. Current perspectives on stability of drug products during formulation, fill and finish operations. Biotechnol Prog 2008;24:504-14.
【非特許文献１７】Shire SJ. Formulation and manufacturability of biologics. Current Opinion in Biotechnology 2009;20:708-14.
【非特許文献１８】Bhamra K, Harrison P, Philipps J, Hale G. Aseptic vial filling. Methods Mol Med 2000;40:313-7.
【非特許文献１９】Zbikowska HM, Nowak P, Wachowicz B. Protein modification caused by a high dose of gamma irradiation in cryo-sterilized plasma: Protective effects of ascorbate. Free Radical Biology & Medicine 2006;40:536-42.
【非特許文献２０】Garrison WM, Jayko ME, Bennett W. Radiation-induced oxidation of protein in aqueous solution. Radiat Res 1962;16:483-502.
【非特許文献２１】Kapoor S, Priyadarisini KI. Protection of Radiation-Induced Protein Damage by Curcumin. Biophys Chem 2001;92:119-26.
【非特許文献２２】De Groot AS, Scott DW. Immunogenicity of protein therapeutics. TRENDS in Immunology 2007;28(11):482-90.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、製造、滅菌および貯蔵に際してのワクチンの安定性を向上させるのに適した方法を提供することに多くの研究が注がれてきたという事実にもかかわらず、依然として長期間かつ種々のストレス条件下で貯蔵できる安定化ワクチンを製造するための改良法を提供することに対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このニーズは、特許請求の範囲に特徴を示す態様の提供によって対処される。
したがって、本発明は、安定化ワクチンを製造するための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）抗原を、下記のものを含む溶液と混合すること：（ｉ）キトサン；（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；および（ｉｉｉ）糖；および（ｂ）前記（ａ）で得られた混合物を乾燥させること。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。種々の濃度のトレハロース（Ａ）中におけるモデルタンパク質の熱変性曲線。
【図１Ｂ】図１Ｂ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。種々の濃度のキトサン（Ｂ）中におけるモデルタンパク質の熱変性曲線。
【図１Ｃ】図１Ｃ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。種々の濃度のＳＰＳ（Ｃ）中におけるモデルタンパク質の熱変性曲線。
【図１Ｄ】図１Ｄ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。種々の濃度のＳＰＳ＋トレハロース（Ｄ）中におけるモデルタンパク質の熱変性曲線。
【図１Ｅ】図１Ｅ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。種々の濃度のＳＰＳ＋キトサン（Ｅ）中におけるモデルタンパク質の熱変性曲線。
【図１Ｆ】図１Ｆ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。種々の濃度のＳＰＳ＋トレハロース＋キトサン（Ｆ）中におけるモデルタンパク質の熱変性曲線。
【図１Ｇ】図１Ｇ：示差走査型蛍光定量。種々の安定化用の賦形剤単独または賦形剤混合物と組み合わせたモデルタンパク質の正規化した熱変性曲線を、ＰＢＳ緩衝液中におけるモデルタンパク質の対応する熱変性プロファイルと比較したもの。選択した濃度範囲におけるすべての賦形剤および賦形剤混合物についての被分析モデルタンパク質の正規化した熱変性曲線の比較（Ｇ）。
【図２Ａ】図２Ａ：選択したバリアントの経時的ＳＤＳ−ＰＡＧＥモニタリング。噴霧乾燥および後続の２５ｋＧｙ（電子線(e-beam)）における照射の前と後の種々のインフルエンザワクチン配合物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）；時点ｔ＝０。各処理条件について試料は下記の順序で装填されている：Ｍａｒｋ１２（レーン１）；液体ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ＳＤ前（レーン２）；ＳＤ  ＳＰＳ  トレハロース  ｆｉｎａｌ（レーン３）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ（レーン４）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ（陽性対照；レーン５）；液体Ｍ  ＳＤ前（レーン６）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ（レーン７）；Ｍａｒｋ１２（レーン８）。
【図２Ｂ】図２Ｂ：選択したバリアントの経時的ＳＤＳ−ＰＡＧＥモニタリング。噴霧乾燥および後続の２５ｋＧｙ（電子線(e-beam)）における照射の前と後の種々のインフルエンザワクチン配合物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）；時点ｔ＝０。各処理条件について試料は下記の順序で装填されている：Ｍａｒｋ１２（レーン１）；液体ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ＳＤ前（レーン２）；ＳＤ  ＳＰＳ  トレハロース  ｆｉｎａｌ（レーン３）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ（レーン４）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ（陽性対照；レーン５）；液体Ｍ  ＳＤ前（レーン６）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ（レーン７）；Ｍａｒｋ１２（レーン８）。
【図２Ｃ】図２Ｃ：噴霧乾燥および後続の２５ｋＧｙ（電子線）における照射の前と後の種々のインフルエンザワクチン配合物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣおよびＥ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＤおよびＦ）；時点ｔ＝１か月（Ｃ、Ｄ）およびｔ＝３か月（Ｅ、Ｆ）。それぞれの処理条件について試料は下記の順序で装填されている：Ｍａｒｋ１２（レーン１）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２〜８℃（レーン２）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン３）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン４）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン５）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン６）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン７）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ＋キトサン−ＨＣｌ（レーン８）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ（陽性対照；レーン９）；Ｍａｒｋ１２（レーン１０）
【図２Ｄ】図２Ｄ：噴霧乾燥および後続の２５ｋＧｙ（電子線）における照射の前と後の種々のインフルエンザワクチン配合物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣおよびＥ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＤおよびＦ）；時点ｔ＝１か月（Ｃ、Ｄ）およびｔ＝３か月（Ｅ、Ｆ）。それぞれの処理条件について試料は下記の順序で装填されている：Ｍａｒｋ１２（レーン１）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２〜８℃（レーン２）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン３）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン４）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン５）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン６）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン７）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ＋キトサン−ＨＣｌ（レーン８）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ（陽性対照；レーン９）；Ｍａｒｋ１２（レーン１０）
【図２Ｅ】図２Ｅ：噴霧乾燥および後続の２５ｋＧｙ（電子線）における照射の前と後の種々のインフルエンザワクチン配合物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣおよびＥ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＤおよびＦ）；時点ｔ＝１か月（Ｃ、Ｄ）およびｔ＝３か月（Ｅ、Ｆ）。それぞれの処理条件について試料は下記の順序で装填されている：Ｍａｒｋ１２（レーン１）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２〜８℃（レーン２）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン３）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン４）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン５）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン６）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン７）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ＋キトサン−ＨＣｌ（レーン８）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ（陽性対照；レーン９）；Ｍａｒｋ１２（レーン１０）
【図２Ｆ】図２Ｆ：噴霧乾燥および後続の２５ｋＧｙ（電子線）における照射の前と後の種々のインフルエンザワクチン配合物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣおよびＥ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＤおよびＦ）；時点ｔ＝１か月（Ｃ、Ｄ）およびｔ＝３か月（Ｅ、Ｆ）。それぞれの処理条件について試料は下記の順序で装填されている：Ｍａｒｋ１２（レーン１）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２〜８℃（レーン２）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン３）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン４）；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン５）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２〜８℃（レーン６）；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ  ２５℃  ６０％  ｒＨ（レーン７）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ＋キトサン−ＨＣｌ（レーン８）；オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ（陽性対照；レーン９）；Ｍａｒｋ１２（レーン１０）
【図３】図３：Ｐａｎｄｅｍｒｉｘワクチンに対するマカク(macaque)の免疫応答。Ａ，赤血球凝集抑制アッセイ(Haemagglutination inhibition assay)（ＨＡＩ）力価；Ｂ，マイクロ中和アッセイ(Microneutralisation assay)（ＭＮ）力価。各チャートにおいて、棒は各グループについての幾何平均力価を表わす。グループ１：陰性対照グループ（ＰＢＳ）；グループ２：オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ；グループ３：ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ；グループ４：ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ；グループ５：ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ。＊，グループ２、４および５の平均から有意差，ｐ＜０．０１。グループ２、４および５についての平均はいずれの時点においても互いに有意差がない。
【図４ＡＢ】図４ＡＢ：動的光散乱。動的光散乱法によるサイズ分布：Ａ）オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ；ＳＤ  Ｍ；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ、Ｂ）ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ，調製直後、ならびに２〜８℃で、および２５℃、６０％  ｒＨで、１および３か月間の貯蔵後。
【図４ＣＤ】図４ＣＤ：動的光散乱。動的光散乱法によるサイズ分布：Ｃ）ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ；調製直後、ならびに２〜８℃で、および２５℃、６０％  ｒＨで、１および３か月間の貯蔵後、Ｄ）ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ，調製直後、ならびに２〜８℃で、および２５℃、６０％  ｒＨで、１および３か月間の貯蔵後。
【図５Ａ】図５Ａ：ＳＥＣ−分析。ＳＥＣクロマトグラム：Ａ）オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ；ＳＤ  Ｍ；ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ；ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ。
【図５Ｂ】図５Ｂ：ＳＥＣ−分析。ＳＥＣクロマトグラム：Ｂ）ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ，調製直後、ならびに２〜８℃で、および２５℃、６０％  ｒＨで、１および３か月間の貯蔵後。
【図５Ｃ】図５Ｃ：ＳＥＣ−分析。ＳＥＣクロマトグラム：Ｃ）ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ；調製直後、ならびに２〜８℃で、および２５℃、６０％  ｒＨで、１および３か月間の貯蔵後。
【図５Ｄ】図５Ｄ：ＳＥＣ−分析。ＳＥＣクロマトグラム：Ｄ）ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ，調製直後、ならびに２〜８℃で、および２５℃、６０％  ｒＨで、１および３か月間の貯蔵後。
【図６】図６：カールフィッシャー滴定により測定した噴霧乾燥後の種々の配合物の含水率％。結果を平均±ＳＤ値として示す（ｎ＝３）。
【図７】図７：４種類のＳＰＳバリアント中において５０℃の温度で液体貯蔵した際の、貯蔵前ｔ＝０日目、ならびに貯蔵後２日目、４日目、７日目および１４日目のＬＤＨ酵素活性（標準活性に対する％に正規化）を、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中におけるＬＤＨ貯蔵と比較したもの。測定したＬＤＨ活性を標準曲線に対して正規化した。
【図８】図８：液体貯蔵の前（ｔ＝０日目）および後の指示した時点（ｔ＝１４；１６；１８および２１日目）における特異的ＬＤＨ酵素活性の比較；トレハロースおよびキトサン（図の左側）または７種類のアミノ酸、トレハロースおよびキトサンの混合物（図の右側）のいずれかを配合。
【図９】図９：WO 2009/014774で用いられた主成分（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７およびｒＨＳＡ）を配合したＬＤＨの液体貯蔵の前（ｔ＝０）および後におけるＬＤＨ酵素活性（標準活性に対する％に正規化）を、これらの成分を含む７種類のアミノ酸、トレハロースおよびキトサンの組合わせと比較したもの；５０℃で貯蔵し、指示した時点（ｔ＝２；４および７日目）で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明によれば、特に製造、滅菌および貯蔵の過程で安定であるワクチンを製造するための方法が提供される。用語“安定化した”は、本発明によれば、ワクチンの生物学的、免疫学的活性が完全または部分的に保持されていること、すなわちワクチンが被験体、たとえばヒト被験体の免疫系を刺激してワクチンを外来因子として認識し、それを破壊し、その後、それに対してワクチンが開発された疾患に対し免疫系が被験体を保護できるようにする能力が、完全または部分的に保持されていることに関する。ワクチンを製造するために用いた抗原が本発明の製造方法に使用する前に有する活性の少なくとも５０％をワクチンが保持していれば、そのワクチンは安定であるとみなされる。より好ましくは、ワクチンは、そのワクチンを製造するために用いた抗原が本発明の製造方法に使用する前に有する活性の少なくとも６０％、たとえば少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％を保持している。より好ましくは、ワクチンは、そのワクチンを製造するために用いた抗原が本発明の製造方法に使用する前に有する活性の少なくとも９８％、たとえば少なくとも９９％、最も好ましくは１００％を保持している。ワクチンが安定化されているかどうかを試験する手段は当業者に周知であり、限定ではなく、赤血球凝集アッセイ(Haemagglutination assay)（ＨＡ）、ラジオイムノアッセイ、バイオセンサー分析、免疫沈降またはＥＬＩＳＡアッセイで試験することを含む。代表的方法を付随する実施例に示す。
【００１４】
本発明の安定化ワクチンの製造方法の第１工程で、抗原を、列挙した安定化用賦形剤を含む溶液と混合する。
ワクチン製造に適した抗原は当技術分野で周知であり、当技術分野で一般に適用されているワクチン製造用抗原の選択のための考慮事項を、必要な変更を加えて本発明によるワクチン製造に適した抗原の選択に関して適用する。したがって、当技術分野で既に入手できる抗原および新規抗原を本発明方法に使用できる。
【００１５】
一般に、抗原はタンパク質および多糖類であるが、脂質または核酸である可能性もあり、ただし、それらはタンパク質および多糖類と組み合わせた場合にのみ抗原性である。抗原はしばしば細菌、ウイルスおよび他の微生物の一部、たとえばそれらの外膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛(fimbrae)、または毒素に由来する。抗原は非微生物性のもの、たとえば自己抗原、または外因性（非自己）抗原、たとえば花粉、卵白、もしくは移植組織／臓器に由来するタンパク質、もしくは輸血した血球の表面にあるものである可能性もある。
【００１６】
本発明によれば、用語“抗原”には限定ではなく下記のものが含まれる：（ｉ）１種類の特定の分子タイプの抗原である抗原、たとえば１種類の特定のタンパク質；ならびに（ｉｉ）異なる分子タイプの抗原の抗原混合物、たとえば異なるタンパク質の混合物、またはタンパク質と多糖類の混合物；ならびに（ｉｉｉ）さらなる成分を含む抗原製剤、たとえばウイルスをたとえば界面活性剤または他の方法により破砕し、他のウイルス成分をさらに除去していない製剤である、スプリット−ウイルス抗原。したがって、抗原はたとえばサブユニット抗原、ウイルス様粒子、生ウイルス、ならびにウイルスベクター、たとえばＭＶＡまたはアデノウイルスであってもよい。
【００１７】
本発明によれば、抗原を、列挙したレシピエントを含む溶液と混合する。この溶液は水性溶液または非水性溶液であってよい。本発明に関して、用語“水性溶液”は一方では水溶液を表わし、他方では緩衝液、および水と混和性でありしたがって均一相を形成する親水性溶媒にも拡大される。水性溶液の例は水、メタノール、エタノールまたはより高級のアルコール類、ならびにその混合物を含むが、これらに限定されない。非水性溶媒の例には、限定ではなく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチルベンゼン、および他の極性溶媒が含まれる。
【００１８】
好ましくは、溶液は“水性溶液”であり、より好ましくは本発明の方法による溶液中の溶媒は水である。
本発明の方法による溶液の概念において、用語“含む (comprising)”は、溶液中にさらなる成分が存在する可能性があることを示す。そのようなさらなる成分の限定ではない例には、水、緩衝液または溶媒のほかに、後記に述べるサポニン類が含まれる。好ましくは、溶液はいずれのタンパク質も含有しない。より好ましくは、溶液は下記のものから構成される:（ｉ）キトサン−ＨＣｌ；（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；（ｉｉｉ）糖；ならびに（ｉｖ）少なくとも１種類のサポニン。よりさらに好ましくは、溶液は下記のものから構成される:（ｉ）キトサン−ＨＣｌ；（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；ならびに（ｉｉｉ）糖。溶液が６〜８の範囲のｐＨ値をもつことがさらに好ましく、より好ましくは溶液は７のｐＨ値をもつ。
【００１９】
キトサンは、ランダムに分布したβ−（１−４）−連結したＤ−グルコサミニン（脱アセチル化単位）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミニン（アセチル化単位）から構成される多糖である。キトサンは、甲殻類の外骨格および真菌の細胞壁の構造要素であるキチンの脱アセチル化により商業的に製造されている。方法によって生成物の分子量および脱アセチル化度ならびに栄養的価値のあるタンパク質の分解度が変化する。キトサンの分子量は３８００〜２０．０００ダルトンである。脱アセチル化度（％ＤＤ）はＮＭＲ分光分析により決定でき、市販キトサンの％ＤＤは６０％から１００％までの範囲である。キトサンは、たとえばＨｅｐｐｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ＧｍｂＨ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈその他の業者から入手できる。
【００２０】
本明細書中で用いる用語キトサンは、キトサンの塩類および誘導体、たとえば塩類であるキトサン−ＨＣｌ、グルタミン酸キトサン、アスパラギン酸キトサン、クエン酸キトサン、酢酸キトサン、カルボキシメチル−キトサン、ならびにキトサン誘導体、たとえばトリメチルキトサン、双性イオン性キトサン、および糖化キトサンを含む。
【００２１】
キトサンが溶液中に可溶性形態で存在しなければならないことは理解されるであろう。当業者は使用する溶液に応じて適切なキトサンを選択する方法を知っている。たとえば、溶液が水性溶液である場合、または溶液が７のｐＨをもつ場合、使用するのに好ましいキトサンはキトサン−ＨＣｌである。
【００２２】
キトサン、特にキトサン−ＨＣｌの好ましい使用量は０．０１〜１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくはその量は２ｍｇ／ｍｌである。
【００２３】
本発明による用語“アミノ酸”は、カルボン酸基、アミノ基、および異なるアミノ酸間で変動する側鎖をもつ、有機分子に関する。アミノ酸はタンパク質の必須構築ブロックである。本発明によれば、用語“アミノ酸”は、互いに結合してジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質などのオリゴマーまたはポリマー（本明細書中でポリペプチドとも呼ぶ）を形成してはいない、遊離アミノ酸を表わす。
【００２４】
本発明の溶液中に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸および人工アミノ酸またはこれらの天然もしくは人工アミノ酸の誘導体から選択できる。
天然アミノ酸は、たとえば２０種類のタンパク質構成アミノ酸であるグリシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、システイン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、バリン、チロシン、トレオニンおよびトリプトファンである。他の天然アミノ酸は、たとえばカルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジンまたはベータ−アラニンである。人工アミノ酸は、異なる側鎖長および／または側鎖構造をもち、および／またはアルファ−Ｃ−原子とは異なる部位にアミン基をもつアミノ酸である。アミノ酸の誘導体には、限定ではなく、ｎ−アセチル−トリプトファン、ホスホノセリン、ホスホノトレオニン、ホスホノチロシン、メラニン、アルギニノコハク酸およびその塩類、ならびにＤＯＰＡが含まれる。本発明に関して、これらすべての用語が各アミノ酸の塩類をも含む。
【００２５】
本発明によれば、互いに異なる３種類以上のアミノ酸が溶液中に含まれる。たとえば、用語“少なくとも３種類のアミノ酸”は、少なくとも４種類の異なるアミノ酸、たとえば少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０種類の異なるアミノ酸、またはそれ以上、たとえば少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７または少なくとも１８種類の異なるアミノ酸に関するものでもある。この用語はさらに、厳密に３、厳密に４、厳密に５、厳密に６、厳密に７、厳密に８、厳密に９、厳密に１０、厳密に１１、厳密に１２、厳密に１３、厳密に１４、厳密に１５、厳密に１６、厳密に１７または厳密に１８種類の異なるアミノ酸を含む。本明細書中でアミノ酸に言及する場合、１分子より多いそのアミノ酸を意図することは当業者が容易に理解するであろう。したがって、列挙した異なるアミノ酸の数量は異なるタイプのアミノ酸の数量を限定するためのものであって、１タイプのアミノ酸の分子数を限定するためのものではない。たとえば、３種類のアミノ酸という用語は３種類の異なるタイプのアミノ酸を表わし、その際、それぞれ個々のアミノ酸の量が特に限定されるのではない。好ましくは、異なるアミノ酸の数は１８種類の異なるアミノ酸を超えない。
【００２６】
本明細書中で用いる用語“ジペプチドまたはトリペプチド”は、それぞれ２または３つのアミノ酸からなるペプチドに関する。代表的ペプチドはグリシルグルタミン（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）、グリシルチロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）、アラニルグルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）およびグリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である。天然ジペプチドの限定ではないさらなる例は、カルノシン（ベータ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）、Ｎ−アセチル−カルノシン（Ｎ−アセチル−（ベータ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）、アンセリン（ベータ−アラニル−Ｎ−メチル  ヒスチジン）、ホモアンセリン（Ｎ−（４−アミノブチリル）−Ｌ−ヒスチジン）、キョートルフィン(kyotorphin)（Ｌ−チロシル−Ｌ−アルギニン）、バレニン(balenine)（またはオフィジン(ophidine)）（ベータ−アラニル−Ｎ  タウ−メチル  ヒスチジン）、グロリン(glorin)（Ｎ−プロピオニル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−オルニチン−δ−ｌａｃ  エチルエステル）およびバレッチン(barettin)（シクロ−［（６−ブロモ−８−エン−トリプトファン）−アルギニン］）である。人工ジペプチドの例には、限定ではなく、アスパルテーム（Ｎ−Ｌ−ａ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン  １−メチルエステル）およびシュードプロリンが含まれる。
【００２７】
代表的なトリペプチドは、グルタチオン（γ−グルタミル−システイニル−グリシン）およびそれのアナログであるオフタルミン酸（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−α−アミノブチリル−グリシン）、ならびにノルオフタルミン酸（γ−グルタミル−アラニル−グリシン）である。トリペプチドの限定ではないさらなる例には、イソロイシン−プロリン−プロリン（ＩＰＰ）、グリプロメート(glypromate)（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ，チロリベリン(thyroliberin)またはプロチレリン(protirelin)：Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−ヒスチジニル−Ｌ−プロリンアミド）、メラノスタチン（プロリル−ロイシル−グリシンアミド）、ロイペプチン（Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニナール）およびエイセニン(eisenin)（ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−ＯＨ）が含まれる。医療適用に関連して用いる場合、少なくとも１種類のジ−またはトリペプチド、より好ましくはすべてのジ−またはトリペプチドが、何ら薬理学的特性を及ぼさないことが好ましい。
【００２８】
本発明によれば、溶液は、あるいは、またはさらに、１種類以上のジ−またはトリペプチドを含むことができる。用語“少なくとも１種類のジ−またはトリペプチド”は、少なくとも２種類のジ−またはトリペプチド、たとえば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９種類のジ−またはトリペプチドに関するものでもある。この用語にはさらに、厳密に１、厳密に２、厳密に３、厳密に４、厳密に５、厳密に６、厳密に７、厳密に８または厳密に９種類のジ−またはトリペプチドが含まれる。１種類より多いジ−またはトリペプチドが溶液中に含まれる場合、ジペプチドおよびトリペプチドの混合物が明らかに想定される。ジ−およびトリペプチドの数は互いに独立して選択でき、たとえば溶液は２種類のジペプチドおよび３種類のトリペプチドを含むことができる。本明細書中で特定数のジ−およびトリペプチドに言及した場合、その数は列挙した異なるタイプのジ−およびトリペプチドの量を限定するためのものであって、１タイプのジペプチドまたトリペプチドの分子数を限定するためのものではないことは、当業者が容易に理解するであろう。したがって、たとえば用語“４種類のジペプチドまたはトリペプチド”は、４種類の異なるタイプのジペプチドおよび／またはトリペプチドを表わし、その際、それぞれ個々のジ−および／またはトリペプチドの量は特に限定されない。好ましくは、（異なる）ジ−またはトリペプチドの数は９種類のジ−またはトリペプチドを超えない。
【００２９】
好ましくは、使用するすべてのアミノ酸、ジペプチドおよび／またはトリペプチドの総量（すなわち、溶液中のこれらの成分すべての和）は、０．１〜１６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは４０〜１００ｍｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは６０〜９０ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくはその量は８０ｍｇ／ｍｌである。
【００３０】
本発明によれば、溶液はさらに糖を含む。いずれかのタイプの糖類、すなわち単糖、二糖またはオリゴ糖の形態の炭水化物、ならびに糖アルコール類がこの用語に含まれる。ワクチン配合方法に一般に用いられる糖類の例には、限定ではなく、サッカロース、トレハロース、スクロース、グルコース、ラクトース、ソルビトールまたはマンニトールが含まれる。溶液は、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌの糖、より好ましくは８０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの糖、よりさらに好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ〜１８０ｍｇ／ｍｌの糖、最も好ましくは１６０ｍｇ／ｍｌの糖を含む。用語“糖”が１タイプの糖に限定されないことは明らかに予想される；すなわち、その用語は１以上のタイプの糖、たとえば２つの異なるタイプの糖の混合物をも含む。好ましくは、この用語は１タイプの糖のみ、たとえばトレハロースを表わす。異なるタイプの糖の混合物を用いる場合、前記に列挙した好ましい量はその溶液中のすべての糖類を表わす。
【００３１】
本明細書中で用いる用語“乾燥製剤”は、液体含有物を除去または低減した製剤を表わす。抗原製剤を乾燥させるのに適した方法には、限定ではなく、凍結乾燥(lyophilisation, freeze-drying)、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、風乾（空気乾燥）もしくは真空乾燥または超臨界乾燥が含まれる。
【００３２】
液体が体積の２０％未満、たとえば１０％未満、たとえば８％未満、より好ましくは体積の７％未満、たとえば５％未満または１％未満に低減されれば、液体含量が低減されたとみなされる。よりさらに好ましくは、液体は０．５％以下にまで低減される。最も好ましくは、液体は完全に低減され、すなわち標準法により決定した残存液体は０％である。
【００３３】
本発明の方法によれば、乾燥ワクチンが得られる。ワクチンは粉末ワクチンであることが特に好ましい。噴霧乾燥の場合、生成する乾燥ワクチンは粉末の形態で得られる。乾燥ワクチンが粉末としてではなく、代わりにたとえば乾燥ケーキの形態で得られる場合、当業者は粉末を得るためにさらにワクチンを改変する方法を承知している。
【００３４】
含水率の低減により製品内での分子運動性が低減し、よって分解が最小化／低減／阻止され、したがって貯蔵中の抗原の付加的な保護が得られる。さらに、宿主細胞結合のために必要な表面抗原およびタンパク質（たとえばウイルスのエンベロープまたは外被上に存在するもの）、サブユニット抗原、ウイルス様粒子、生ウイルス、ウイルスベクター、たとえばＭＶＡ、アデノウイルスなどが、乾燥工程および可能性のある後続滅菌工程に際して本発明の溶液によって保護され、こうして抗原の抗原性が保持される。したがって、再構成した後、その抗原はワクチンに対応する。
【００３５】
本発明方法のさらなる好ましい態様において、本方法はさらに、安定化ワクチンをその後、約−９０℃から約４５℃までから選択される温度で貯蔵する工程を含む。より好ましくは、安定化ワクチンをその後、約−９０℃〜約−７０℃、約−３０℃〜約−１０℃、約１℃〜約１０℃、約１５℃〜約２５℃、および約３０℃〜約４３℃からなる群から選択される温度範囲で貯蔵する。よりさらに好ましくは、安定化ワクチンをその後、約−８５℃〜約−７５℃、約−２５℃〜約−１５℃、約２℃〜約８℃、および約２０℃〜約４０℃からなる群から選択される温度範囲で貯蔵する。最も好ましくは、安定化したウイルスまたは細菌をその後、約−８０℃、約−２０℃、室温、約４℃、および約２５℃から選択される温度で貯蔵する。
【００３６】
本明細書中で用いる用語“約(about)”は、明確に列挙した数値およびそれからの小さな偏差を含む。言い換えると、“約−９０℃”の温度は−９０℃を含むが、厳密にその列挙した量でなければならないわけではなく、数度の差があってもよく、よってたとえば−９１℃、−９２℃、−８９℃または−８８℃を含む。当業者は、それらの数値が列挙した数値にほぼ対応する限り、そのような数値は完全な正確度を要求しない相対値であることを承知している。したがって、列挙した数値からのたとえば１５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは５％の偏差は用語“約”に含まれる。
【００３７】
本発明によれば、安全性および有効性に関する前臨床試験を実施して、新規ワクチン配合物を耐熱性、貯蔵安定性、および照射媒介損傷に対する抵抗性について評価する。付随する例に示すように、意外にも乾燥によるワクチン配合は高度に安定かつ有効なワクチン粉末、たとえばＡ型インフルエンザワクチン粉末を製造する戦略であることを立証できた。これらのワクチンは最終滅菌（たとえば、β線照射）に適することすら示された。
【００３８】
新規な抗原安定化および保護溶液（本明細書中で“本発明溶液”とも呼ぶ）をＨ１Ｎ１スプリットウイルス抗原の保護に関して実験条件下に in vitro および in vivo で評価した。オリジナルワクチンまたは本発明溶液で再緩衝化したワクチンを噴霧乾燥し、２５ｋＧｙ（電子線）で照射することにより最終滅菌し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、動的光散乱法、サイズ排除クロマトグラフィーおよび機能性赤血球凝集アッセイにより抗原統合性をモニターした。in vitro スクリーニング実験により、キトサンを含有する多数の高度に安定な組成物が明らかになった。
【００３９】
前記で考察したように、乾燥ワクチン、特に乾燥粉末ワクチンの開発に際して対処する幾つかの抗原安定性問題がある。たとえば、噴霧乾燥は生体分子、たとえばタンパク質に対して高温および機械的剪断ストレスを伴ない、その結果、タンパク質の凝集および分解が生じる可能性がある [3]。したがって、安定化用賦形剤は特に熱ストレスに対する安定化効力をもつべきである。
【００４０】
一般に、安定ワクチン組成物の開発を開始する前に、熱ストレスに対する安定化用賦形剤の安定化効力を判定するために、一般的なモデルタンパク質を用いて示差走査型蛍光定量（ＤＳＦ）による予備スクリーニングを実施する [23、24]。この蛍光ベースのサーマルシフトアッセイ(thermal shift assay)は、熱変性に際してのタンパク質コンホメーション安定性をモニターするための信頼性のある計量法であり、タンパク質または抗原を安定化する条件をスクリーニングするために優れたものである。プローブとして、アンフォールディングすると次第に露出する疎水性タンパク質領域に結合した際に量子収量が増大する環境感受性蛍光色素を適用して、タンパク質の熱アンフォールディングをモニターする。タンパク質の異なる安定化環境におけるタンパク質融解温度Ｔｍ、すなわちフォールドしたタンパク質とアンフォールドしたタンパク質の濃度が等しくなる平衡状態の温度の比較は、分析される賦形剤混合物がタンパク質安定性に及ぼす安定化効果を評価するための好都合な方法である。そのような方法を用いて、意外にもキトサン（ここではその塩であるキトサン−ＨＣｌ）を安定化用賦形剤とモデルタンパク質の混合物に添加すると、モデルタンパク質の熱プロファイルがより高い温度へ顕著にシフトするのを示すことができた；これは、それらの賦形剤単独または安定化用賦形剤混合物では達成できなかった。
【００４１】
キトサンは抗細菌効果をもち [34]、これによりそれは製造プロセス全体においてワクチン製剤に対する特に有利な添加剤となる。さらに、キトサンはアジュバント効果をもつこと [25, 27]、ならびに粘膜へのワクチンの生体接着が改善されるためワクチン接種効力を向上させること、生物学的利用能を高めること、および粘膜免疫応答をブーストすること [30-33] がこれまでに報告されている。これによりワクチン製剤へのそれの添加はさらに有利になる；許容度がより低い追加成分、たとえば殺細菌剤であるチオメルサール(thiomersal)またはスクアレンをもはやアジュバントＡＳ０３の一部としてワクチンに含有させる必要がないからである。したがって、乾燥ワクチンの製造プロセスに際してのキトサンの添加は、望ましくない殺細菌剤およびアジュバントの使用が避けられるだけでなく、ワクチンに対するさらに意外な安定化効果をもたらす；実施例２、３、４および５を参照。
【００４２】
貯蔵データにより保護ワクチンの高い安定性が明らかになった；すなわち、照射したまたは照射しない噴霧乾燥ワクチンを貯蔵した後、２〜８℃（普通の冷蔵貯蔵条件である）または２５℃／６０％相対湿度（促進安定性貯蔵条件である）で３か月の貯蔵期間にわたって関連の安定性損失はモニターされなかった（実施例４）。したがって、２５℃で３か月間の貯蔵からのデータは、２〜８℃で１２か月間のリアルタイム貯蔵安定性に対する証拠を提示する。
【００４３】
さらに他の in vivo 実験により、オリジナルワクチンを投与された動物は、赤血球凝集阻害アッセイおよびマイクロ中和アッセイにより査定して２１日後（初回抗原刺激）および４８日後（ブースト）に予想レベルのセロコンバージョン(seroconversion)を示した。しかし、噴霧乾燥および照射したワクチンを接種された動物は２１日後にセロコンバージョンを示すことができなかった。この活性損失は、ワクチンを本発明溶液により保護した場合（本明細書中で、“保護されたワクチン”とも呼ぶ）には阻止することができ、オリジナルワクチンを接種したものと類似のセロコンバージョンレベルを示した。保護されたワクチンによるブースト免疫化は強いセロコンバージョン増大を生じたが、保護されていないワクチンで処理した動物においてはわずかな効果があったにすぎない。
【００４４】
キトサンは特に放射線、たとえばγ線に曝露されると不安定であると当技術分野で記載されていたので、この知見は特に意外である [28]。付随する実施例に示すように、それにもかかわらずキトサンは抗原の調製および後続の滅菌に際して安定化効果をもたらすことが見出された。
【００４５】
こうして、ワクチン、たとえばＨ１Ｎ１スプリットウイルスワクチンの噴霧乾燥および最終滅菌を本発明の保護溶液の存在下で実施できることを示すことができた。本発明者らが知る限り、最終滅菌した乾燥粉末Ａ型インフルエンザワクチンを用いて成功した前臨床データはこれまで報告されていない。これらの知見は、ニードルフリーワクチン接種経路のために、また確実なコールドチェーン設備をもたない国々への配送のためにそのような配合ワクチンを利用する可能性を指摘し、それによりワクチンの製造および配送において現在遭遇している大きな欠点、すなわち低温貯蔵が必要であり、最終滅菌が不可能であるという欠点が克服される。
【００４６】
別態様において、本発明は、安定化（ポリ）ペプチドを製造するための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）（ポリ）ペプチドを、下記のものを含む溶液と混合すること：（ｉ）キトサン；（ｉｉ）少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド；および（ｉｉｉ）糖；および（ｂ）前記（ａ）で得られた混合物を乾燥させること。
【００４７】
安定化ワクチンを製造するための方法に関して本明細書に記載するすべての定義および好ましい態様を、必要な変更を加えてこの安定化（ポリ）ペプチドを製造するための別態様に適用する。
【００４８】
本発明による用語“（ポリ）ペプチド”は、最大３０個のアミノ酸からなるペプチドのグループ、および３０個より多いアミノ酸からなるペプチドのグループを含む、分子のグループを記述する。用語“（ポリ）ペプチド”には、タンパク質およびタンパク質フラグメントも含まれる。（ポリ）ペプチドはダイマー、トリマーおよびより高次のオリゴマー、すなわち１より多い（ポリ）ペプチド分子からなるものを形成していてもよい。そのようなダイマー、トリマーなどを形成する（ポリ）ペプチド分子は同一であっても同一でなくてもよい。対応する、より高次の構造体は、したがってホモ−またはヘテロダイマー、ホモ−またはヘテロトリマーなどと呼ばれる。ホモ−またはヘテロダイマーなども用語“（ポリ）ペプチド”の定義に属する。用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は、本明細書中で互換性をもって用いられる。用語“（ポリ）ペプチド”は、自然に修飾された（ポリ）ペプチドをも表わし、その際、修飾はたとえば翻訳後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などにより行なわれる。そのような修飾は当技術分野で周知である。
【００４９】
好ましい態様において、（ポリ）ペプチドは、療法用タンパク質、たとえば抗体、増殖因子、サイトカイン、タンパク質もしくはペプチドホルモン、成長ホルモン、血液因子、療法用酵素、療法用ワクチン、またはそのフラグメントであってそれらの生物活性を保持しているものからなる群から選択される。これらの（ポリ）ペプチドは、たとえば療法または診断の目的に使用できる。そのような目的は当技術分野で周知である。
【００５０】
用語“抗体”は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、およびその誘導体であってそれらの結合特異性を保持するものを含む。この用語は、合成、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、またはその誘導体もしくはフラグメントであってなおそれらの結合特異性を保持するものをも含む。抗体のフラグメントには、特にＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントが含まれる。抗体およびそのフラグメントを調製するための手法は当技術分野で周知であり、たとえば Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988、およびHarlow and Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998に記載されている。さらに、トランスジェニック動物を用いてヒト化抗体を発現させることができる。最も好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を調製するためには、連続細胞系培養により産生された抗体を提供するいずれかの手法を使用できる。そのような手法の例には、ハイブリドーマ法(Koehler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72)、およびヒトモノクローナル抗体を調製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)が含まれる。抗体はいずれのクラスの抗体であってもよい。抗体はモノクローナル、およびＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＹクラスのものであることが最も好ましい。ＩｇＹ抗体はＩｇＧ抗体のニワトリにおけるアナログである。
【００５１】
本明細書中で用いる用語“増殖因子”は、細胞表面にある受容体に結合して細胞の増殖および／または分化を活性化する一次結果をもたらすタンパク質を表わす。多くの増殖因子が多能性(versatile)であり、多数の異なる細胞タイプにおいて細胞分裂を刺激するが、他は特定の細胞タイプに対して特異的である。本発明による好ましい増殖因子には、限定ではなく、エリスロポエチン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１，最初はソマトメジンＣと呼ばれていた）およびインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）が含まれる。
【００５２】
本発明による用語“サイトカイン”は、細胞連絡、免疫機能および胚形成において広く使われるシグナル伝達タンパク質のクラスに関する。サイトカインは多様な造血および非造血細胞タイプにより産生され、ホルモンと同様にオートクリン、パラクリンおよびエンドクリン作用を及ぼすことができる。しかし、多くのサイトカインが増殖因子活性を示す。サイトカインは特異な増殖因子ファミリーである。主に白血球から分泌されるサイトカインは、体液性および細胞性の両方の免疫応答ならびに食細胞の活性化を刺激する。リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと呼ばれ、これに対し単球またはマクロファージにより分泌されるものはモノカインと呼ばれる。大きなファミリーのサイトカインが身体の種々の細胞により産生される。リンホカインの多くはインターロイキン（ＩＬ）としても知られる；それらは白血球により分泌されるだけでなく、白血球の細胞応答に作用することもできるからである。具体的には、インターロイキンは造血細胞由来の細胞をターゲティングする増殖因子である。サイトカインには、限定ではなく、インターロイキン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）が含まれる。
【００５３】
用語“タンパク質ホルモンまたはペプチドホルモン”は、血流中へ分泌され、生存動物においてエンドクリン機能をもつペプチドのクラスを表わす。他のタンパク質と同様に、ペプチドホルモンは細胞においてアミノ酸からｍＲＮＡ鋳型に従って合成され、この鋳型自体が細胞核内でＤＮＡ鋳型から合成される。ペプチドホルモン前駆体（プレ−プロホルモン）は、次いで一般に小胞体において、Ｎ末端シグナル配列の除去および時にはグリコシル化を含む数段階でプロセシングされて、プロホルモンになる。プロホルモンは次いで膜結合型分泌小胞(membrane-bound secretory vesicle)内にパッケージされ、それは特定の刺激、たとえば細胞質中のカルシウムおよびｃＡＭＰの濃度の増大に応答して細胞からエキソサイトーシスにより分泌可能になる。これらのプロホルモンはしばしば、ホルモン分子のフォールディングを指令してそれの活性立体構造にするのに必要であるけれどもホルモンがフォールディングした時点では機能をもたない、余分なアミノ酸残基を含む。細胞内の特異的エンドペプチダーゼは、プロホルモンが血流中へ放出される直前にそれを開裂して、成熟ホルモン形の分子を生成する。成熟ペプチドホルモンは次いで血液を通して身体の全細胞へ拡散し、そこでそれらはそれらのターゲット細胞の表面にある特異的受容体と相互作用する。あるペプチド／タンパク質ホルモン（アンギオテンシンＩＩ、塩基性線維芽細胞増殖因子−２、副甲状腺ホルモン関連タンパク質）は、細胞質または核内にある細胞内受容体ともイントラクリン機序により相互作用する。幾つかの重要なペプチドホルモンが下垂体から分泌される。下垂体前葉は、乳腺に作用するプロラクチン、副腎皮質に作用してグルココルチコイドの分泌を調節する副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ならびに骨、筋肉および肝臓に作用する成長ホルモンを分泌する。下垂体後葉は、抗利尿ホルモン（バソプレッシンとも呼ばれる）およびオキシトシンを分泌する。ただし、ペプチドホルモンは、心臓（心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ＡＮＰ）または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ））および膵臓（インスリンおよびソマトスタチン）、胃腸管（コレシストキニン、ガストリン）ならびに脂肪組織蓄積物（レプチン）を含めた多種多様な臓器および組織により産生される。ある神経伝達物質はペプチドホルモンと類似の様式で分泌および放出され、ある‘神経ペプチド’は血中へ放出された際にホルモンとして作用するほかに神経系における神経伝達物質として使われる可能性がある。ペプチドホルモンが細胞の表面にある受容体に結合すると、第２メッセンジャーが細胞質中に出現し、それが細胞内応答を始動する。ペプチドホルモンには、限定ではなく、インスリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン、ヒト甲状腺刺激ホルモン、アンギオテンシンＩＩ、塩基性線維芽細胞増殖因子−２、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、バソプレッシン、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ＡＮＰ）または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、および脂肪組織蓄積物（レプチン）が含まれる。
【００５４】
用語“成長ホルモン”（ＧＨ）は、下垂体前葉の外側翼(lateral wing)内の成長ホルモン分泌細胞(somatotroph cell)により分泌される１９１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドからなるタンパク質ベースのペプチドホルモンを表わす。成長ホルモンが身体組織に及ぼす効果は、一般に同化性（構築性）と記載することができる。大部分の他のタンパク質ホルモンと同様に、それは細胞表面の特異的受容体と相互作用することにより作用する。小児期の身長増大はＧＨの最も広く知られている効果である。身長は少なくとも２つの機序により刺激されると思われる：１．ポリペプチドホルモンは脂溶性ではないので、それらは筋細胞膜(sarcolemma)を貫通できない。よって、ＧＨはそれのある効果をターゲット細胞上の受容体への結合によって及ぼし、そこでそれはＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を活性化する。この機序により、ＧＨは軟骨の軟骨細胞の分裂および増殖を直接刺激する。２．ＧＨは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路により、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１，以前はソマトメジンＣとして知られていた）、すなわちプロインスリンと相同なホルモンの産生をも刺激する。肝臓はこのプロセスについてＧＨの主要なターゲット臓器であり、かつＩＧＦ−１産生の主要部位である。ＩＧＦ−１は広範な組織に対して成長刺激効果をもつ。追加のＩＧＦ−１がターゲット組織内で生成し、これによりそれはエンドクリンホルモンおよびオートクリン／パラクリンホルモンの両方であるように見える。ＩＧＦ−１は骨芽細胞および軟骨細胞の活性に対する刺激効果も備えており、骨の成長を促進する。小児および青年の身長を増大させるほかに、成長ホルモンは身体に対して他の多数の効果をもつ：カルシウム保持を増大させる、ならびに骨のミネラリゼーションを強化および増大させる、サルコメア(sarcomere)過形成により筋量を増大させる、脂肪分解を促進する、タンパク質合成を増大させる、脳以外のすべての内臓の増殖を刺激する、ホメオスタシスにおいて役割を果たす、肝臓のグルコース取込みを低減する、肝臓における糖新生を促進する、膵島の維持および機能に寄与する、免疫系を刺激する。
【００５５】
ソマトトロピン(somatotropin)は自然界で動物において産生される成長ホルモン１を表わし、これに対し用語ソマトロピン(somatropin)は組換えＤＮＡ技術により製造された成長ホルモンを表わし、ヒトの場合は“ＨＧＨ”と略称される。それは成長、細胞の増殖および再生を刺激する。
【００５６】
用語“血液因子”は、血液凝固カスケードの機能を支配するタンパク質を表わす。人体の凝固カスケードは一連の複雑な生化学反応からなり、それらは血液因子タンパク質により調節されている。これらのタンパク質には、たとえば第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子などの凝固促進因子、ならびにプロテインＣおよびアンチトロンビンＩＩＩを含めた凝固阻止因子が含まれる。
【００５７】
本明細書中で用いる用語“療法用酵素”は、化学反応を触媒し、それにより出発分子（基質）を異なる分子（生成物）に変換するタンパク質を表わす。療法用酵素の機能は、それらの分子構造およびコンホメーションに直接依存する。不可逆的なコンホメーション変化および不可逆的な凝集は療法用酵素の不活性化につながる。本発明による好ましい酵素には、限定ではなく、リソソーム蓄積症を酵素置換療法により処置するための療法用酵素、すなわちヒトβ-グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病(Gaucher disease)）、ヒトガラクトシダーゼＡ（ファブリー病(Fabry disease)）、血栓溶解薬、すなわちストレプトキナーゼ（虚血性脳卒中の処置における血栓溶解薬）、ウロキナーゼ、（組換え体）組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＴＮＫａｓｅ；Ｌ−アスパラギナーゼ（細胞増殖抑制薬）、尿酸オキシダーゼ、パパインが含まれる。
【００５８】
（ポリ）ペプチドを製造するための多数の方法が当技術分野にある。たとえば、（ポリ）ペプチドは適宜な宿主において産生させることができる。宿主が単細胞生物、たとえば原核生物、哺乳動物細胞または昆虫細胞であれば、当業者は多様な培養条件を再考できる。好都合には、産生された（ポリ）ペプチドを培地、培養生物の溶解物から、または単離した（生体）膜から、確立された手法により収穫する。多細胞生物の場合、宿主はその生物の一部である細胞または一部に由来する細胞であってもよく、たとえば宿主細胞は植物の収穫可能な部分であってもよい。好ましい方法は、上記に示した宿主における（ポリ）ペプチドの組換え産生を伴なう。たとえば、本発明に従ってフォールディングすべき／アンフォールディング阻止すべき（ポリ）ペプチドをコードする核酸をＰＣＲにより合成し、発現ベクターに挿入することができる。その後、適切な宿主をその発現ベクターで形質転換することができる。その後、宿主を培養して目的（ポリ）ペプチド（単数または複数）を産生させ、それ／それらを単離し、本発明方法に使用する前に場合により精製する。
【００５９】
本発明方法に使用する（ポリ）ペプチドを製造するための別法は、ｍＲＮＡの in vitro 翻訳である。適切な無細胞発現系には、ウサギ網状赤血球溶解物、麦芽抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌(E. coli)Ｓ３０抽出物、およびカップリングした転写／翻訳系、たとえばＴＮＴ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。これらの系は、コーディング領域および適宜なプロモーターエレメントを含むクローニングベクター、ＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡ配列を添加すると、組換え（ポリ）ペプチドを発現できる。
【００６０】
組換え製造のほかに、本発明方法に使用する（ポリ）ペプチドは合成により、たとえば固相法を用いる直接ペプチド合成により製造できる(参照：Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154)。合成ペプチドの合成は、手動法を用いて、または自動化により実施できる。自動合成は、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、製造業者が提示する指示に従って達成できる。種々のフラグメントを個別に化学合成し、化学的方法を用いて結合させて、全長分子を製造することができる。前記に示したように、化学合成、たとえばHoughton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135により記載された固相法を使用できる。さらに、（ポリ）ペプチドは半合成により、たとえば組換え体製造と合成製造の組合わせにより製造できる。
【００６１】
（ポリ）ペプチドの単離および精製は、幾つかの既知手法のいずれかにより達成できる；たとえば、限定ではなく、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ならびに分取ディスクゲル電気泳動。
【００６２】
本発明方法の好ましい態様において、少なくとも３種類のアミノ酸は、（ａ）非極性、脂肪族Ｒ基をもつアミノ酸；（ｂ）極性、非荷電Ｒ基をもつアミノ酸；（ｃ）正に荷電したＲ基をもつアミノ酸；（ｄ）負に荷電したＲ基をもつアミノ酸；および（ｅ）芳香族Ｒ基をもつアミノ酸のグループから選択される。
【００６３】
天然アミノ酸だけでなく、天然アミノ酸以外のもの、たとえば人工アミノ酸も、上記の特徴的グループに分類でき(Nelson D.L. & Cox M.M., “Lehninger Biochemie” (2005), pp. 122-127)、それらのうちから少なくとも３種類のアミノ酸を本発明による溶液のために選択する。
【００６４】
より好ましい態様において、少なくとも３種類のアミノ酸は異なるグループ（ａ）〜（ｅ）から選択される。言い換えると、この好ましい態様において、３種類のアミノ酸が溶液中に含まれる場合、それら３種類のアミノ酸は少なくとも２つの異なるグループから、より好ましくは３つの異なるグループから、たとえば１つはグループ（ａ）から、１つはグループ（ｂ）から、そして１つはグループ（ｃ）から選択できる。さらなる組合わせ、たとえば（ｂ）−（ｃ）−（ｄ）、（ｃ）−（ｄ）−（ｅ）、（ｅ）−（ａ）−（ｂ）、（ｂ）−（ｄ）−（ｅ）なども本発明において明らかに想定される。４種類のアミノ酸が溶液中に含まれる場合も同じ考えが適用され、その場合はアミノ酸を（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも２つの異なるグループから、より好ましくは少なくとも３つの異なるグループから、最も好ましくは４つの異なるグループから選択すべきである。特に、５種類のアミノ酸が溶液中に含まれる場合、それらのアミノ酸を（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも２つの異なるグループから、より好ましくは少なくとも３つの異なるグループから、よりさらに好ましくは少なくとも４つの異なるグループから、最も好ましくは５つの異なるグループから選択すべきである。５種類を超えるアミノ酸、たとえば６または７種類のアミノ酸が溶液中に含まれる場合も同じ考えが適用され、その場合はこれらのアミノ酸は（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも２つの異なるグループから、より好ましくは少なくとも３つの異なるグループから、よりさらに好ましくは少なくとも４つの異なるグループから、最も好ましくは５つの異なるグループすべてから選択される。
【００６５】
本発明方法のより好ましい態様において、溶液は、（ａ）非極性、脂肪族Ｒ基をもつアミノ酸；（ｂ）極性、非荷電Ｒ基をもつアミノ酸；（ｃ）正に荷電したＲ基をもつアミノ酸；（ｄ）負に荷電したＲ基をもつアミノ酸；および（ｅ）芳香族Ｒ基をもつアミノ酸の各グループから選択される少なくとも３種類のアミノ酸を含む。
【００６６】
当業者はさらに、本発明に従って使用する溶液中に各グループの同数のアミノ酸が存在する必要はないことを理解している。むしろ、各グループの少なくとも１種類のアミノ酸が存在する限りいかなる組合わせのアミノ酸も選択できる。
【００６７】
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液は少なくとも下記のアミノ酸を含む：（ａ）アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン；（ｂ）アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン；（ｃ）プロリン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、フェニルアラニン；（ｄ）チロシン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、バリン；（ｅ）アルギニン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、リジン、トリプトファン；または（ｆ）アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン。
【００６８】
この態様によれば、少なくとも上記に列挙した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のいずれのグループのアミノ酸も本発明による溶液中に存在する。言い換えると、上記に列挙したアミノ酸より多くが本発明溶液中に存在してもよいが、少なくとも上記に列挙したアミノ酸が存在することが要求される。より好ましくは、溶液は厳密に、列挙したアミノ酸を含み、他のアミノ酸を含まない。
【００６９】
本発明方法のさらなる好ましい態様において、１種類以上のアミノ酸が、天然の非タンパク質構成アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される。
用語“非タンパク質構成アミノ酸(non-proteinogenic amino acid)”は、本発明によれば、自然界でポリペプチドおよびタンパク質に取り込まれないアミノ酸に関する。非タンパク質構成アミノ酸はタンパク質構成アミノ酸、すなわちＬ−α−アミノ酸から、翻訳後修飾により得ることができる。そのような非タンパク質構成アミノ酸は、たとえばランチオニン、２−アミノイソ酪酸、ジヒドロアラニン、および神経伝達物質ガンマ−アミノ酪酸である。タンパク質構成Ｌ−アミノ酸のＤ−鏡像異性体も非タンパク質構成アミノ酸である。非タンパク質構成アミノ酸の限定ではないさらなる例には、カルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジンまたはベータ−アラニンが含まれる。
【００７０】
本明細書中で用いる用語“合成アミノ酸”は、自然界に存在しないアミノ酸に関する。合成アミノ酸の限定ではない例には、（２Ｒ）−アミノ−５−ホスホノ吉草酸、Ｄ−フェニルグリシンまたは（Ｓ）−および（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ロイシンが含まれる。
【００７１】
本発明方法の他の好ましい態様において、少なくとも１種類のジペプチドはカルノシン、グリシルチロシン、グリシルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される。
【００７２】
大部分の注射用医薬配合物について、おおよそ３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの生理的モル浸透圧濃度が要求される。おおよそ４００ｍＯｓｍｏｌ／ｌｋｇのモル浸透圧濃度が広く受け入れられている。しかし、たとえば１０成分（アミノ酸）の混合物のモル浸透圧濃度はこれより有意に高いモル浸透圧濃度に達する。大部分の安定化適用において、側鎖は分子の保護効力に関連する反応性部分である。したがって、同じ側鎖を含むジペプチド類の適用は配合物のモル浸透圧濃度を低下させる可能性がある。さらに、ある官能基の反応性はジペプチドにおいて低下する可能性がある。
【００７３】
本発明方法の他の好ましい態様において、糖はトレハロースである。
トレハロースは２つのα−グルコース単位間のα，α−１，１−グルコシド結合により形成される天然α−結合二糖である。それはミコース(mycose)またはトレマロース(tremalose)としても知られる。トレハロースは当技術分野で周知であり、たとえば付随する実施例に示すようにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。
【００７４】
トレハロースの好ましい使用量は糖の使用量に関して前記に述べたものである。
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液はさらに少なくとも１種類のサポニンを含む。
【００７５】
サポニンは、二次代謝産物を形成する化合物のクラスであり、天然源中にみられるか、天然源から誘導されるか、あるいは化学合成できる。サポニンは多様な植物種中に特に多量にみられる。サポニンは両親媒性配糖体であり、現象的には水溶液中で振とうした際にそれらが生じるセッケン様の起泡により、構造的には親油性のステロイド系またはトリテルペノイド系アグリコンと結合したそれらの１以上の親水性グリコシド部分の組成により分類される。それらの構造多様性はそれらの物理化学的および生物学的特性に反映される。サポニンの限定ではない例は、グリチルリチン酸(glycyrrhizic acid)、グリチルレチン酸(glycyrrhetinic acid)、グルクロン酸、エスチン(escin)、ヘデラコシド(hederacoside)およびジギトニンである。
【００７６】
好ましくは、サポニンはグリチルリチン酸またはその誘導体である。グリチルリチン酸はグリチルリシン酸(glycyrrhicic acid)、グリチルリチン(glycyrrhizin)またはグリチルリチン酸(glycyrrhizinic acid)としても知られる。グリチルリチン酸は水溶性であってアニオンとして存在し、それは有効成分のカチオン分子と静電会合複合体を形成する潜在的リガンドとなることができる。理論により拘束されたくはないが、本発明者らはアニオン性グリチルリチン酸は本発明の溶液中に存在するアミノ酸（すなわち、アルギニンまたはリジン）と静電相互作用、水素結合または両方により複合体を形成するという仮説を立てている。この複合体形成は、本発明の溶液がワクチンを乾燥および貯蔵に際して安定化する能力を高めると考えられる。さらに、グリチルリチン酸が有効成分のカチオン分子と複合体を形成する能力は、貯蔵過程でタンパク質表面に露出しているカチオン性側鎖との安定化相互作用をもたらすことができる。
【００７７】
グリチルリチン酸の誘導体は当技術分野で周知であり、グリチルリチン酸をカルボキシル基およびヒドロキシル基において変換することによるか、アミノ酸残基を炭水化物部分にコンジュゲートさせるか、または２−アセトアミド−β−ｄ−グルコピラノシルアミンをグリチルリチン酸のグリコシド鎖に導入することにより製造されたものを含む。他の誘導体は、グリチルリチン酸のアミド、２つのアミノ酸残基および遊離３０−ＣＯＯＨ官能基をもつグリチルリチン酸コンジュゲート、ならびにグリチルリチン酸分子の炭水化物部分における少なくとも１つのアミノ酸アルキルエステル残基のコンジュゲートである。具体的な誘導体の例は、たとえばKondratenko et al. (Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol 30(2), (2004), pp. 148-153)中に見出すことができる。
【００７８】
グリチルリチン酸（またはその誘導体）の好ましい使用量は、０．０１〜１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌであり、、最も好ましくはその量は２ｍｇ／ｍｌである。
【００７９】
当技術分野で知られているように、サポニン、特にグリチルリチン酸は、他の賦形剤の安定化効果を高めるので安定化配合物中に存在するのが有利であることが見出されている。
【００８０】
本発明方法のさらなる好ましい態様において、抗原はインフルエンザサブユニット抗原、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｂ型肝炎表面抗原、トキソイド、ＨＩＶエンベロープタンパク質、炭疽菌組換え防御抗原、他の病原体表面タンパク質およびウイルスエンベロープ成分からなる群から選択される。
【００８１】
本発明方法のより好ましい態様において、抗原はスプリットウイルス抗原である。
スプリットウイルス抗原は当技術分野で周知であり、ワクチンの基礎として一般的に用いられている(WHO, Unicef, WorldBank. State of the world’s vaccines and immunization. 3rd ed. Geneva: World Health Organisation, 2009.)。スプリットウイルス抗原は、たとえば界面活性剤により、または他の手法によりウイルスを不活性化および崩壊させ、他のウイルス成分をさらに除去することなく得られる。スプリットウイルスワクチンは、特にインフルエンザ、Ａ型肝炎、日本脳炎、ポリオまたは狂犬病に対するワクチン接種にしばしば用いられる。スプリットウイルス抗原がインフルエンザウイルス抗原であることがよりさらに好ましい。インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)の一部であり、ウイルスグループＶ（（−）ｓｓＲＮＡ）に属する。既知の３つのインフルエンザウイルス属−Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルス−は、それらの核タンパク質およびマトリックスタンパク質における抗原性の相異により同定される。Ａ型インフルエンザウイルスはヒト、他の哺乳動物および鳥類に感染し、インフルエンザパンデミックを引き起こす；Ｂ型インフルエンザウイルスはヒトおよびアザラシに感染し、Ｃ型インフルエンザウイルスはヒトおよびブタに感染する。
【００８２】
インフルエンザスプリットワクチンの主な抗原構造体は、内在性膜糖タンパク質(integral membrane glycoprotein)であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）である [3, 26]。それらは、マトリックスタンパク質（ＭＰ１；ＭＰ２）および核タンパク質（ＮＰ）ならびに膜脂質マトリックスからの幾つかの副成分を含めた他のタンパク質と一緒に、スプリットワクチンの構成要素を形成する。
【００８３】
安定なスプリット−ウイルスインフルエンザワクチンの製造は一般に困難である；ヘマグルチニンの三次元構造は高疎水性領域を含み、それにより他のインフルエンザ構成要素との可溶性凝集体およびタンパク質複合体を形成しやすいからである [26]。さらに、ヘマグルチニンは凍結ストレスを受けやすく、特に凍結に際してのｐＨ低下および溶質濃度変化に対して感受性であり、その結果、不可逆的なコンホメーション変化および変性を生じ、一方で高い温度はウイルス抗原の不活性化を引き起こす可能性がある [3]。さらに、最終滅菌の問題はこれまで解決できていない。
【００８４】
この数十年間に、乾燥インフルエンザワクチンを用いた幾つかの報文が発表された。しかし、乾燥状態インフルエンザワクチンの開発はまだごく初期の段階である。インフルエンザワクチンを非晶質ガラス質炭水化物マトリックスに取り込ませることにより、異なるタイプの乾燥方法に付随するストレスに対して多様な抗原を安定化することができる。しかし、それぞれの乾燥方法およびそれぞれのインフルエンザ抗原について、ワクチンの安定性は選択した炭水化物ガラス質マトリックスのタイプに依存していた。異なる乾燥方法に付随する異なるストレスに対して、各ワクチンタイプがそれ自体の固有感受性をもっている可能性がある。インフルエンザワクチンの安定化の多くの観点、特に安定化インフルエンザワクチンの製造のための異なる乾燥方法の比較を、さらに検討しなければならない。結果として、炭水化物ガラスへのワクチン配合物の取込みを、配合および乾燥の両プロセスの考慮によって最適化する必要がある。乾燥インフルエンザワクチン配合物の長期安定性ならびに前臨床試験および臨床試験に関する追加データはごく限られている。乾燥状態で、特に高い温度におけるインフルエンザワクチンの長期安定性は、まだごく限られている。乾燥インフルエンザワクチンの貯蔵安定性は、炭水化物のタイプ、緩衝液のタイプ、および貯蔵条件に依存することが示された。最終滅菌は現在までインフルエンザワクチン抗原の製造法の一部とはみなされていなかった [3]。
【００８５】
本発明によれば、本発明の方法によりこれらの問題に効果的に対処でき、それにより、付随する実施例に示すように安定性の高いスプリット−ウイルスインフルエンザワクチン粉末が製造される。それらのデータから明らかなように、糖マトリックスのみに取り込ませるのは、ワクチンを噴霧乾燥または凍結乾燥、それに続く最終滅菌に際して安定化するのに不十分であった。さらに、本発明の溶液を用いる安定化なしでは、液体製剤についても乾燥製剤についても熱安定化を達成できなかった。
【００８６】
より好ましくはインフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザウイルスであり、最も好ましくはインフルエンザウイルスはＡ  Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルスである。よりさらに好ましくは、Ａ  Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルスは不活化スプリットビリオンＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス様株（ｘ−１７９ａ）である。
【００８７】
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液の賦形剤と抗原のｗ／ｗ比は約１：１〜約３０．０００：１である。
この態様によれば、溶液の賦形剤は、溶液の安定化される抗原ではない非水性成分である。
【００８８】
より好ましくは、溶液の成分と抗原のｗ／ｗ比は約１：１〜約２５．０００：１、たとえば約５：１〜約２０．０００：１である。最も好ましくは、ｗ／ｗ比は約１６．２６７：１である。これらの比に含まれるいずれの数値も明らかに本発明において想定されることは理解されるであろう。さらに、本明細書中で用いる約という用語は、明確に列挙した比およびそれから±１０％の偏差を含む。
【００８９】
本発明方法のさらなる好ましい態様において、混合物を乾燥させる工程は噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥、超臨界乾燥、および風乾または真空乾燥からなる群から選択される方法により達成される。
【００９０】
噴霧乾燥は当技術分野で周知であり、溶液、懸濁液またはエマルジョンを１工程で固体粉末に変換するための方法である。一般に、濃厚な液体製品を噴霧デバイスへポンプで送り、そこでそれは小滴に分断される。これらの液滴は高温の空気流に出会い、それらの湿分をきわめて急速に失なうが、なお乾燥用空気中に分散している。この乾燥粉末をサイクロン内で遠心作用により湿潤空気から分離し、密な粉末粒子はサイクロン壁に向けて押しやられ、一方でより軽い湿潤空気は排気パイプを通って運び去られる。
【００９１】
凍結乾燥(lyophilisation, freeze-dryingとも言う)も当技術分野で周知であり、試料を凍結し、その後、材料中の凍結水を固相から気相へ直接昇華させるのに十分な熱を加えながら周囲圧力を降下させる工程を含み、二次乾燥期がこれに続く。好ましくは、湿分の再吸収を阻止するために凍結乾燥製剤を次いで密封する。
【００９２】
噴霧凍結乾燥も当技術分野で周知であり、凍結乾燥と噴霧乾燥に共通の処理工程を組み合わせる方法である。試料供給物を凍結媒体（たとえば、液体窒素）中へ噴霧すると、それによって急速凍結(shock-frozen)液滴の分散物が生成する。この分散物を次いで凍結乾燥機で乾燥させる。
【００９３】
超臨界乾燥は当技術分野で周知の他の手法である。この方法は、臨界温度（Ｔｃ）および臨界圧力（ｐｃ）を超える高温および高圧によって液体を気体に変化させる；その際、相境界を超えるのではなく、その代わりに液体から気体への転移は気体と液体の区別がつかない超臨界領域を通る。臨界点乾燥では液相と気相の密度が等しくなる。
【００９４】
風乾は、場合により試料の中程度の加熱、乾燥チャンバーの換気または排気（真空乾燥）と組み合わせて、試料を周囲の空気に曝露することにより乾燥させることを表わす。
本発明方法のさらなる好ましい態様において、工程（ｂ）で得られた乾燥ワクチンをその後、滅菌する。好ましくは、ワクチンは最終滅菌工程の前に単回量または多数回量容器にパックされる。
【００９５】
用語“滅菌”は、すべての生存微生物を死滅させるプロセスを表わす。滅菌の方法は当技術分野で周知であり、たとえばベータ線照射による滅菌、ガンマ線照射による滅菌、熱滅菌、ガス滅菌、エチレンオキシド（ＥＯ）による滅菌、およびプラズマ滅菌を含む。好ましくは、滅菌はガンマ線またはベータ線の照射により行なわれる。
【００９６】
好ましくは、こうして得られた滅菌ワクチン粉末を、その後、それを使用するまで密閉条件下で、たとえば密閉した容器またはバイアル内に貯蔵する。
付随する実施例に示すように、本発明方法に従って製造したワクチン粉末中に存在する抗原の抗原性は滅菌後に保持されている。したがって本発明の方法は、抗原を本発明による溶液中で安定化し、それによりそれらの天然の三次元外観を保持する、安定かつ安全な抗原の製造を可能にするワクチン製造方法を提供する。
【００９７】
本発明方法のさらなる好ましい態様において、ワクチンは筋肉内、皮下、経皮、口腔(oral)、経口(peroral)、鼻腔、および／または吸入による適用のためのものである。
本発明はさらに、抗原（単数または複数）、キトサン、少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド、ならびに糖を含む、ワクチンに関する。このワクチンは、貯蔵および滅菌に際して向上した安定性をもつ。好ましくは、本発明の安定化ワクチンは、本発明の安定化ワクチン製造方法により得られた、または得ることができるワクチンである。本発明の安定化ワクチンを製造する方法に関するすべての定義および好ましい態様を、必要な変更を加えて本発明の安定化ワクチンにも適用する。
【００９８】
本発明はさらに、（ポリ）ペプチド（単数または複数）、キトサン、少なくとも３種類の異なるアミノ酸および／または少なくとも１種類のジペプチドもしくはトリペプチド、ならびに糖を含む、（ポリ）ペプチド組成物に関する。この（ポリ）ペプチド組成物は、貯蔵および滅菌に際して向上した安定性をもつ。好ましくは、本発明の安定化（ポリ）ペプチドは、本発明の安定化（ポリ）ペプチド製造方法により得られた、または得ることができる（ポリ）ペプチド組成物である。本発明の安定化（ポリ）ペプチドを製造する方法に関するすべての定義および好ましい態様を、必要な変更を加えて本発明の安定化（ポリ）ペプチド組成物にも適用する。
【００９９】
本明細書、特に特許請求の範囲に特徴を示した態様に関して、従属請求項に述べる各態様はその従属請求項が従属する各請求項（独立または従属）の各態様と組み合わせられるものとする。たとえば、独立請求項１が３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを列挙し、従属請求項２が３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを列挙し、請求項３が請求項１および２に従属しかつ３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを列挙している場合、別に記載しない限り、本明細書は明確に下記の組合わせに対応する態様を開示すると解釈すべきである：Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉ。
【０１００】
同様に、独立および／または従属請求項が別形態を列挙していない場合も、従属請求項が複数の先行請求項に言及していれば、それらによりカバーされる主題のいかなる組合わせも明白に開示されたとみなされる。たとえば、独立請求項１、請求項１に言及している従属請求項２、および請求項２および１の両方に言及している従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組合わせが明瞭かつ明確に開示されていることになり、請求項３、２および１の主題の組み合わせも同じである。請求項１〜３のいずれか１項に言及しているさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１の主題、請求項４、２および１の主題、請求項４、３および１の主題、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合わせが明瞭かつ明確に開示されていることになる。
【０１０１】
上記の考察を、必要な変更を加えて付随するすべての請求項に適用する。限定ではない例を挙げれば、請求項の構造からみて、請求項１２、７と請求項４（ａ）〜４（ｆ）のいずれか１つの組み合わせが明瞭かつ明確に開示されていることになる。同じことが、たとえば請求項１２、８、７と請求項４（ａ）〜４（ｆ）のいずれか１つの組み合わせに適用される、など。
【０１０２】
別に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。矛盾する場合、定義を含めて本発明の明細書が支配するであろう。
【実施例】
【０１０３】
実施例により本発明を説明する。
実施例１：材料および方法
安定化および保護溶液(Stabilizing and Protecting Solution（ＳＰＳ）)
特許保護された水性Stabilizing and Protecting Solution（ＳＰＳ；ＬＥＵＫＯＣＡＲＥ，ドイツ、ミュンヘン）は、種々の小分子（この場合は大部分がアミノ酸）および配糖体系の賦形剤（この場合はグリチルリチン酸）から構成され、通常は８０ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ７）の原液濃度で提供される。すべての成分が医薬用品質で用いられている；それらは無毒性であり、非経口溶液中にルーティンに用いられている。
【０１０４】
インフルエンザ株
Ｐａｎｄｅｍｒｉｘ（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）を抗原ワクチンとして用いた。Ｐａｎｄｅｍｒｉｘは２本のバイアルで提供され、それらのうち１つには主抗原ヘマグルチニンを含むＡ型インフルエンザ（スプリットビリオン，不活化）／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス様株（ｘ−１７９ａ）が収容されている。第２バイアルにはアジュバントであるＡＳ０３（スクアレン（１回分につき１０．６９ｍｇ）、ＤＬ−α−トコフェロール（１１．８６ｍｇ）およびポリソルベート８０（４．８６ｍｇ））が収容されている。１５μｇ／ｍｌの抗原分散液を、通常は注射前に１：１でアジュバントと混合する（１回分５００μｌにつき３．７４μｇのＨＡ）。この試験のために、第１バイアルのスプリットウイルス抗原を前記に従って再配合し、乾燥および滅菌した。注射前にこの再配合した抗原製剤を上記のように１：１でアジュバントに再懸濁し、混合した。
【０１０５】
示差走査型蛍光定量
ＳＹＰＲＯオレンジ（５０００×原液；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド）を種々の濃度の安定化用賦形剤混合物中またはＰＢＳ緩衝液中に１：１０００希釈して、５×最終濃度にした。次の工程において、それぞれこれら種々の濃度の安定化用賦形剤または緩衝液の５×ＳＹＰＲＯオレンジ溶液で、モデルタンパク質を３００μｇ／ｍｌおよび６００μｇ／ｍｌに希釈し、その後、５０μｌアリコートとして９６ウェルＰＣＲプレート（４ｔｉｔｕｄｅ，ベルリン）のウェルに配分した。気泡の形成を避け、かつ溶液をウェルの底に集めるために、ＰＣＲプレートをＰＣＲフィルム（４ｔｉｔｕｄｅ，ベルリン）でシールし、５００ｇ、室温で１分間遠心した。その後、プレートをｑ−ＰＣＲ  Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）上で２０℃から９５℃まで、上昇速度３℃  ｍｉｎ−１で加熱した。フィルター構成の設定は、ＳＹＰＲＯオレンジに最適な励起波長４９８ｎｍおよび発光波長６１０ｎｍであった。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いてデータをボルツマン方程式(Boltzmann equation)に当てはめることにより、熱変性の中間点Ｔｍを計算した。モデルタンパク質のＰＢＳ中における対照試料と安定化用賦形剤を含む配合物中における試料とのＴｍの差をサーマルシフトとして計算した。
【０１０６】
配合物バリアント
in vitro 試験のために、ある範囲の配合物バリアントを噴霧乾燥させ、それらのうち少数を in vivo 試験のために選択した。本出願全体を通して用いた配合物バリアントおよび名称のまとめを表３に示す。オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘを供給されたまま用いて各量のマトリックス成分と混合するか、あるいはＳＰＳ含有配合物の場合はＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（カットオフ３．５ｋＤａ；体積３〜１２ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ドイツ、シュベルテ−ガイゼッケ）を用いて各濃度のＳＰＳ（ｐＨ７）に対して一夜透析した。その後、追加成分マンニトール、トレハロースおよびグリチルリチン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ、ミュンヘン）を、それぞれ添加した。in vivo バッチについては、キトサン−ＨＣｌ（Ｈｅｐｐｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ＧｍｂＨ，ドイツ、ハレ・アン・デア・ザーレ）も添加した。
【０１０７】
噴霧乾燥
Ｂｕｅｃｈｉ  Ｂ−２９０実験室用噴霧乾燥機（Ｂｕｅｃｈｉ，スイス、フラヴィル）をワクチン製剤の噴霧乾燥に用いた（パラメーターについては表４を参照）。高性能サイクロンを用いて乾燥製品を製品容器に採集し、ガラスバイアル内に密封し、分析するまで２〜８℃で貯蔵した。in vivo 試験のバッチについては、噴霧乾燥機のすべての構成部品を使用前に７０％（Ｖ／Ｖ）イソプロパノールで消毒した。前滅菌したガラスバイアル（タイプＩ，２Ｒ，ＰＲＩ−ＰＡＣ  ｅ．Ｋ．，ドイツ、エシュヴァイラー）に乾燥製品を個別用量で無菌条件下に充填した。
【０１０８】
赤血球凝集アッセイ
乾燥試料を水中に再構成した（１５μｇ  ＨＡ／ｍＬ）。ＨＡ力価を決定するために、５０μＬの希釈スプリットワクチン配合物を、Ｕ底  ９６マイクロタイタープレート内で、等体積の新鮮な０．５％（Ｗ／Ｖ）ニワトリ赤血球懸濁液（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，英国レスターシャー、ベルトン）と混合した５０μＬのＰＢＳ中に２倍系列希釈した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを凝集について採点した。力価を、赤血球の凝集を引き起こした最大希釈度の逆数として示す。
【０１０９】
電気泳動
噴霧乾燥製品を水中に再構成した（１５μｇ  ＨＡ／ｍＬ）。変性条件について、１２μＬのワクチン配合物を１２μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液  ２×濃度（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツ、ダルムシュタット）と混合することにより試料を調製した。分離を２００Ｖの定電圧で実施し、泳動時間は約９０分であった。ゲルを銀染色キット（ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ銀染色キット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。分子量標準品（Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ  １２（商標）  非染色標準品，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ゲル上で分析した。
【０１１０】
照射プロトコル
噴霧乾燥および凍結乾燥したワクチンの滅菌を、密閉ガラスバイアル内でＢＧＳ（ドイツ、ザール・アン・デア・ドナウ）により、β線照射を用いて２５または４０ｋＧｙで実施した。in vivo 試験および長期貯蔵のための試料は２５ｋＧｙでβ線照射した。
【０１１１】
長期貯蔵
in vivo 試験のために選択した配合物について、製造直後および貯蔵期間にわたって広範な特性分析を実施した。すべての配合物をガラスバイアルにパックし、密閉し、それぞれ２〜８℃で、または２５℃（±２℃）、６０％（±５％）の相対湿度（ｒＨ）で貯蔵した。１か月後および３か月後に試料を分析した。特性分析には赤血球凝集アッセイ、ＤＬＳ測定、含水率、ＳＥＣプロファイリングおよび電気泳動が含まれていた。
【０１１２】
サイズ排除クロマトグラフィー(Size exclusion chromatography)（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、２１４ｎｍのＵＶ検出器を備えたＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｄ  ７０００システム（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ，ドイツ、ダルムシュタット）および１３μｍ  ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷＸＬ  ＳＥＣカラム（７．８×３００ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ，ドイツ、シュツットガルト）を用いて実施された。試料をＰＢＳ  ｐＨ７．４の移動相中で試験した（流速０．７ｍＬ分）。１５μｇのＨＡと同等量の試料を各分析に用いた。すべての測定を二重反復試験で実施した。
【０１１３】
動的光散乱法(Dynamic Light Scattering)（ＤＬＳ）
動的光散乱法は、タンパク質凝集物を分析するために、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，英国ウスターシャー）を用いて実施された。１５μｇのタンパク質（ＨＡ）と同等量の試料を２回蒸留水に再分散し、測定した。すべての結果は３０の個別スキャン３セットの平均である。
【０１１４】
含水率
５０ｍｇの噴霧乾燥製品を１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、カールフィッシャー滴定装置（Ｖ２０，Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＡＧ，スイス、シュベルツェンバッハ）の滴下フラスコに添加した。次いで前決定した力価（ｍｇ  Ｈ２Ｏ／ｍＬ）のカールフィッシャー試液を用いて滴定を実施した。各試料について三重反復試験で含水率を決定し、溶媒についてのものを差し引いた。結果を平均±ＳＤ値として示す。
【０１１５】
動物試験
この試験は、英国公衆衛生庁(Public Health England)（英国ソールズベリー、ポートン）の動物実験委員会(Ethical Review Process)および内務省(Home Office)によりプロジェクトライセンス(Project License)  ＰＰＬ３０／２９９３で承認された。この試験は、ＢＳ  ＥＮ  ＩＳＯ９００１−２０００に対応するＰＨＥ  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍに従って実施された。
【０１１６】
動物（カニクイザル(Macaca fascicularis)）は、各グループの雌雄動物分布が等しい成熟成体からなっていた。雌雄の成熟成体動物２６匹（試験開始時に年齢範囲４〜６歳および体重範囲３．６〜５．９ｋｇ）を英国内の内務省認定繁殖コロニーから入手した。すべての動物を、ヘルペスウイルス・シミエ(Herpesvirus simiae)（Ｂ−ウイルス）、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（ＴＢ）、サルＴリンパ球向性ウイルス(Simian T-cell Lymphotropic virus)（ＳＴＬＶ）およびサル免疫不全ウイルス(Simian immunodeficiency virus)（ＳＩＶ）が無いことを検査した一般的なコロニー内で飼育し、インフルエンザ抗体の非存在についてスクリーニングしたコホートの動物から選択した。
【０１１７】
動物をそれらの既存の社会集団で、英国内務省Code of Practice for the Housing and Care of Animals Used on Scientific Procedures (1989)の要求に従って設計した囲い内に収容した。各動物を固有番号を用いた永久タトゥーにより個別に同定した。水道水およびＥｘｐａｎｄｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ飼料（ＰＭＥ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，英国）を、規則的に与えられる強化おやつ、野菜および果物と共に適宜摂取できた。
【０１１８】
動物グループ：
グループ１：  陰性対照（ＰＢＳ）                          ２匹
グループ２：  オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘ                ６匹
グループ３：  ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ                        ６匹
グループ４：  ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ                ６匹
グループ５：  ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ    ６匹
オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘは、ヒトワクチン配合物から構成され、別のフラスコとして提供されるＡＳ０３アジュバントを含んでいた。噴霧乾燥製品は単回量バイアル中で供給され、ワクチン接種直前に無菌水およびＡＳ０３アジュバントで再構成された。各動物に３．７５μｇのＨＡ抗原を含有する０．５ｍｌのワクチン調製物（成人用量）を投与した。すべてのワクチン接種を筋肉内注射により施した。対照血清をワクチン接種の８日前に採取し、ワクチン接種後２１、３４および４８日目に血清を採取した。ワクチン接種後２８日目に、等用量の適宜処理したワクチンでブースター免疫化を施した。すべてのサンプリング時またはワクチン接種時に、各動物を秤量し、直腸温度を測り、浅リンパ節（鼠径および腋窩）を触診し、ワクチン接種部位を調べ、全身状態の検査を行なった。さらに、それぞれの血液サンプリング時にヘモグロビンレベルを検査した。
【０１１９】
赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）
血清を受容体破壊酵素(receptor-destroying enzyme)（ＲＤＥ，デンカ生研株式会社，日本）で処理し、続いて熱不活化した。処理した血清を次いで９６ウェル  Ｕ底プレート内で２倍系列希釈し、続いて４ＨＡ単位のウイルス（Ａ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／０９）を添加した。室温でインキュベートした後、ＨＡアッセイについて前記に述べたようにニワトリ赤血球の０．５％  ｗ／ｖ懸濁液を添加した。エンドポイントは、完全なＨＡ不活化活性を示す最高血清希釈度と定義された。
【０１２０】
マイクロ中和アッセイ（ＭＮ）
ＲＤＥ処理した血清を９６ウェル細胞培養プレート内で２倍系列希釈した。希釈血清を、１００  ＴＣＩＤ５０のＡ型インフルエンザ／カリフォルニア／０７／０９ウイルスを含有する等体積の培地と混合した。インキュベーション後、１００μｌのＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎(Madin-Darby canine kidney)（ＭＤＣＫ）細胞を各ウェルに添加した。プレートを１８〜２０時間インキュベートした。細胞単層をＰＢＳで洗浄し、固定した。ウイルス抗原の存在を、Ａ型インフルエンザ  ＮＰ  タンパク質に対する一次抗体、続いて二次ペルオキシダーゼコンジュゲートで検出した。染色後、４９２ｎｍにおける吸光度を読み取った。中和活性について陰性と採点される最低希釈度に対応する血清希釈度の逆数が５０％中和抗体価である。
【０１２１】
データ解析
動物試験からのデータを、グループ当たりｎ＝６の動物の幾何平均値として表示する。Ｍｉｎｉｔａｂ  １５ソフトウェアを用いて、マン−ホイットニー順位和検定(Mann-Whitney Rank Sum Test)を使用するノンパラメトリック解析を実施した。ｐ＜０．０１でグループ間の差を有意とみなした。
【０１２２】
実施例２：示差走査型蛍光定量（ＤＳＦ）−サーマルシフトアッセイ
蛍光が消失する水性溶液と比較してアンフォールドしたタンパク質の疎水性部位のような非極性環境では高蛍光性である環境感受性蛍光色素の存在下で、モデルタンパク質の熱プロファイルをモニターした。タンパク質がアンフォールドするのに伴なって露出するタンパク質の疎水性部分に対して親和性をもつ適用色素の蛍光の増強により、タンパク質がアンフォールドする温度を測定する。温度の関数としての蛍光強度のプロットは、２つの状態転移により記述できるＳ字状曲線を形成した。ボルツマン方程式を用いて曲線を当てはめることにより、これらの転移曲線の変曲点（Ｔｍ）を計算した。
【０１２３】
ＰＢＳ緩衝液中のモデルタンパク質について、タンパク質濃度に依存したＴｍ  ７０．２℃および７０．７℃が得られた。このタンパク質溶液にトレハロースのみを添加すると、２〜３℃のサーマルシフトが生じ、より高い濃度範囲のトレハロースではわずかに低下した（図１Ａ、Ｇおよび表１）。これと対照的に、キトサンのみの添加は既にモデルタンパク質の熱変性プロファイルに対してより顕著な安定化効果をもたらした。キトサンによるＴｍのサーマルシフトは３〜５℃であり、キトサン濃度の増大に伴なって増大した（図１Ｂ、Ｇおよび表１）。ＳＰＳプラットフォーム技術に基づく賦形剤混合物によるモデルタンパク質の２．５〜３．２℃のサーマルシフトは、このアッセイにおいてトレハロースの安定化効果にほぼ匹敵した（図１Ｃ、Ｇおよび表１）。ＳＰＳプラットフォーム技術に基づくこの賦形剤混合物にキトサンを添加した後、サーマルシフトの顕著な濃度依存性増大がみられた。低濃度範囲における３℃超からより高い濃度範囲におけるおおよそ９℃までが、この賦形剤混合物について測定された（図１Ｅ、Ｇおよび表１）。ＳＰＳベースの賦形剤混合物にトレハロースを添加した場合、２．５℃から６．５℃までの濃度依存性サーマルシフト増大がみられた（図１Ｄ、Ｇおよび表１）。ＳＰＳおよびトレハロースの混合物にさらにキトサンを添加すると、濃度依存性の様式でさらにサーマルシフト増大がもたらされた。モデルタンパク質のＴｍは、混合物の濃度増大に伴なって２．７℃からほぼ１１℃にまで上昇し、これは種々の賦形剤混合物と組み合わせたキトサンの相乗的安定化効果を示唆する（図１Ｆ、Ｇおよび表１）。Ｈ１Ｎ１スプリットワクチンの安定性を考慮するさらなる試験には、最高濃度および対応する最高のサーマルシフト１１℃をもつキトサン、ＳＰＳおよびトレハロースの混合物を適用した。
【０１２４】
実施例３：構造解析
ＳＰＳ配合ワクチンの機能活性と構造統合性の保持との相関性を調べるために、これらの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動パターンを陽性対照と比較した（図２）。オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘの非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、高度精製したスプリットワクチンに典型的な泳動パターンを示した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘの場合、６つの分離したバンドを示した（図２Ａ）。
【０１２５】
内在性膜タンパク質ヘマグルチニンは疎水性が高く、その結果、溶液中で可溶性凝集物および他のタンパク質成分との複合体を著しく形成しやすいので、単一バンド（複数）を単一成分（複数）に割り当てるのはきわめて難しい。還元条件下で２００ｋＤａおよび２００〜１１６．５ｋＤａの分子量に泳動するタンパク質バンドが無いのは、非還元条件下でみられたオリゴマー形がジスルフィド結合ＨＡ０オリゴマー、特にダイマーおよびトリマーであることを示した（図２ＡおよびＢ）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるほぼ６５ｋＤａのバンド（複数）も、同様に還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見られなかったジスルフィド結合ＨＡ０モノマー（複数）に対応すると思われる。ほぼ５５．４ｋＤａにおけるバンドは、核タンパク質と複合体形成した、より少量のＨＡ１に対応する可能性がある。３１〜２１．５ｋＤａの小さなバンドは、ＨＡ２とマトリックスタンパク質Ｍ１のタンパク質複合体に対応すると思われる。ジスルフィド結合ＨＡ０ならびにダイマーおよびトリマーの少量の分解はそれぞれ、非還元のための試料調製の結果である可能性がある−試料を９０℃で１０分間加熱すると、タンパク質へのＳＤＳの結合が最大になる（図２Ａ）。ジスルフィド結合ＨＡ０モノマーならびにヘマグルチニンダイマーおよびトリマーに対応するバンドが失われると、還元ＳＤＳ−ＰＡＧにおける２つの顕著なバンドはそれぞれ核タンパク質およびマトリックスタンパク質と複合体形成したヘマグルチニンのＨＡ１およびＨＡ２サブユニットに対応すると思われる（図２Ｂ）。
【０１２６】
スプリットワクチン配合物中に存在する核タンパク質およびマトリックスタンパク質がヘマグルチニンの検出を妨害する可能性があることは文献から知られている [26, 31]。噴霧乾燥前の液体ＳＤ  Ｍの場合、非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて陽性対照と同じ泳動パターンが見られた（図２ＡおよびＢ）。これと対照的に、ＳＤ  Ｍはスプリットワクチンの主抗原性成分に対応するバンドのかなりの強度損失を示し（データを示していない）、これはＨＡアッセイにおける顕著な機能統合性損失と一致する。その後、この配合物を２５ｋＧｙでβ線照射すると、典型的な泳動パターンがほとんど完全に失なわれ、これはタンパク質構成成分の実質的な分断を示唆する（図２ＡおよびＢ）。ＳＰＳ配合ワクチンの泳動パターンからは、キトサン含有製剤である液体ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ（ＳＤ前）、ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌおよびＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ（図２ＡおよびＢ，レーン２〜４）は個々のバンドを覆う長いスメア(smear)を生じることが分かる。キトサンが脂質に結合できることは周知である [29]。したがって、キトサン−ＨＣｌがこれらの配合物においてスプリットワクチンの脂質膜の残存フラグメントに結合した可能性があり、それがこの効果をもたらすと思われる。ＳＰＳ保護ワクチンでは噴霧乾燥および照射の後にいずれかのタンパク質バンド、特にヘマグルチニンの損失はなかった。
【０１２７】
実施例４：貯蔵安定性の分析
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動
２〜８℃および２５℃（ｒＨ  ６０％）で１か月間（図２ＣおよびＤ；レーン２〜５）および３か月間（図２ＥおよびＦ；レーン２〜５）の貯蔵後、分析はＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌおよびＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙの泳動パターンにｔ＝０における対応する泳動パターン（図２ＡおよびＢ；レーン２〜４）と比較して変化を示さなかった。ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙの場合、２５℃（ｒＨ  ６０％）で１および３か月間の貯蔵は、２〜８℃における貯蔵（図２Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ；レーン６）および時点ｔ＝０における貯蔵（図２ＡおよびＢ；レーン７）と比較して、スプリットワクチンの残存タンパク質成分のさらなる損失を生じた（図２Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ；レーン７）。これは、ＳＰＳ安定化された噴霧乾燥配合物、特に照射した配合物が、冷蔵貯蔵に際してだけでなく、２５℃，６０％  ｒＨでの貯蔵に際しても安定なままであったことを示し、これは熱安定性の増大を立証する。
【０１２８】
動的光散乱法（ＤＬＳ）
ＤＬＳデータはコロイド状成分および凝集物のサイズを示す。図４ａにみられるように、オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘは一定サイズ分布のコロイド状成分からなるが、大きな凝集物は見られなかった。噴霧乾燥後、５０００ｎｍ付近の第２ピークにより示されるようにＳＤ  Ｍ配合物については凝集物が見られたが、ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  配合物（図４ａおよびｂ）については見られなかった。照射後に、ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ配合物について凝集物のわずかな増加が見られる可能性がある（図４ａおよびｄ）。それぞれ１か月間および３か月間の貯蔵に際して、ＳＰＳを含む噴霧乾燥および後続照射した配合物は図４ｃおよびｄに示すように貯蔵条件に関係なく凝集増大を示さなかった。これは、再分散に際して凝集を増大させる不安定化プロセスが貯蔵時間にわたって起きないことを示す。
【０１２９】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、タンパク質の高疎水性によりタンパク質複合体としての溶出が生じる。ＳＥＣクロマトグラムを図５に示す。オリジナルＰａｎｄｅｍｒｉｘの約１１ｍｌにおける第１ピークは、タンパク質成分の＞５００ｋＤａの高分子量複合体に割り当てることができた。１６ｍｌにおける第２ピークは、２５５ｋＤａのＨＡトリマーを表わすと思われる；それはＳＤ  Ｍではより大きくなり、ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙでは著しく増大する（図５ａ）。第３ピークはＨＡモノマーであるとすることができ、それは対応する照射配合物ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙでは完全に失われる（図５ａ）。ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌはトリマーおよびモノマーと同じピークを示すが、高分子量複合体は消失し（図５ａおよびｃ）、これは安定配合物であることを示す。
【０１３０】
これと対照的に、ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙは、特に２５℃／６０％  ｒＨで１および３か月間貯蔵した際にトリマーピーク領域に変化を示し（図５ａおよびｂ）、これは抗原が適正に安定化されず、再分散に際して凝集が増大したことを示す。ＳＥＣクロマトグラフ（図５ｃおよびｄ）は、ＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌまたはＳＤ  ＳＰＳ  Ｔ  ｆｉｎａｌ  ２５ｋＧｙ配合物ではいずれの貯蔵条件でも１および３か月間の貯蔵後に、調製直後の配合物と比較して変化を示さなかった。
【０１３１】
含水率
貯蔵安定性は密閉条件下で調べたので、顕著な変化は不適正シーリングの指標となるであろう。そのような影響はみられなかった（図６）。
【０１３２】
実施例５：in vivo 分析
実験期間全体を通して、動物はその種についての予想範囲内の体重、ヘモグロビンレベルおよび体温を維持した。注射部位に有害反応はみられず、触診によりリンパ節腫脹は検知されなかった。ワクチン接種後２１日目に、グループ４および５のすべての動物、ならびにグループ２の６匹の動物のうち５匹は、ＨＡＩ力価≧４０により示されるようにセロコンバージョンしていた（図３ａ）。これと対照的にグループ３（ＳＤ  Ｍ  ２５ｋＧｙ）の６匹すべての動物が血清陰性のままであった（ＨＡＩ力価≦２０）。これらの所見はＭＮ力価により確認され、グループ３の血清は模擬ワクチン接種した対照血清と同等であることを示し（ＭＮ力価４０〜８０）、グループ２、４および５のすべての動物が１６０〜５１２０のＭＮ力価を示した（図３ｂ）。
【０１３３】
次いですべての動物に初回ワクチン接種後２８日目にブースターワクチン接種を施し、分析のためにブースト後６日目および２０日目に血清を採取した。ブースト後、グループ３のすべての動物がＨＡＩおよびＭＮ力価によりセロコンバージョンを示した。しかし、グループ３の平均力価は、両アッセイにおいてグループ２、４および５の平均力価より有意に低いままであった（図３）。グループ２、４および５の平均力価は互いに有意差がなかった。模擬ワクチン接種動物はＰＢＳでブーストされ、セロコンバージョンしなかった。これらのデータは、保護しない場合は噴霧乾燥および照射が平均ＨＡＩ力価の＞１０倍低下および平均ＭＮ力価の＞１５倍低下を生じたことを立証する；これに対し、本発明溶液の存在下では、照射による有意の力価低下はなかった。さらに、本発明溶液の存在下でのワクチンの噴霧乾燥は、非処理ワクチンと比較して免疫原性に対する有害作用をもたなかった。
【０１３４】
実施例６：モデル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の５０℃、液体状態での貯蔵安定性
個々の化合物が貯蔵中にタンパク質の安定性に及ぼす影響を示すためにさらなる実験を実施した。さらに、WO 2009/014774に記載された結果との直接比較を実施した；そこには、キトサンとトレハロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７およびｒＨＳＡとの組合わせが３７℃でのインキュベーションに際して抗原力価損失の低減を示したと主張されている。しかし、ｒＨＳＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においてヘマグルチニンと同じサイズのバンドに存在するので、試料中にｒＨＳＡが存在することにより上記で用いたスプリットウイルス製剤に及ぼす影響の分析が不可能になる。それにもかかわらず直接比較を可能にするために、概念実証としてモデル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を用いて下記の実験を実施した。ＬＤＨは噴霧乾燥配合物（凍結乾燥）の開発に際して一般に用いられるモデルタンパク質であり、貯蔵がこの酵素に及ぼす影響は酵素アッセイ読み出しで簡便に分析できる。
【０１３５】
材料および方法
上記に詳述した理由で、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ、ミュンヘン）を大腸菌(E. coli)において組換え発現させてモデルタンパク質として用いた。この酵素の凍結乾燥粉末を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７，５に溶解することにより、５０ｍｇ／ｍｌのＬＤＨ原液を調製した。配合物バリアントの調製のために、ＬＤＨ原液を各配合物でさらに希釈して１ｍｇ／ｍｌの酵素濃度にした。これらのＬＤＨ配合物をその後５０℃で２１日間インキュベートし、指示した時点（ｔ＝０；２；４；７；１４；１６；１８；および２１日目）で乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を測定した。
【０１３６】
ＬＤＨ酵素活性は、ピルビン酸から乳酸への酵素反応に際して還元された補因子ＮＡＤＨの吸光度低下を３４０ｎｍの波長および２２℃の温度でモニタリングすることにより決定された。活性を測定する前に、配合物を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７，５で３７，５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。７９０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７，５；１００μｌのピルビン酸原液（２０ｍＭ）および１００μｌのＮＡＤＨ原液（１ｍＭ）の反応混合物を調製し、１０μｌのＬＤＨ希釈液（３７，５μｇ／ｍｌ）の添加により酵素反応を開始した。
【０１３７】
結果
５０℃で液体貯蔵した後のＬＤＨの酵素活性を種々の時点で測定した。図７は、４種類の異なるバリアントＳＰＳのうちの１つと配合した後のＬＤＨ貯蔵について得られた結果を緩衝液配合物と比較してまとめたものである。ＳＰＳ  １７は、４種類のアミノ酸の混合物であり、ＳＰＳ  １８は４種類のアミノ酸とトレハロースの混合物であり、ＳＰＳ  １９は４種類のアミノ酸をキトサンと組み合わせた混合物であり、ＳＰＳ  ２０は４種類のアミノ酸をトレハロースおよびキトサンと組み合わせた混合物である。
【０１３８】
図７に示すように、緩衝液配合物のみを用いた場合、５０℃で貯蔵した際に有意の活性損失がみられた。これと対照的に、４種類のバリアントＳＰＳのいずれかの使用はＬＤＨをそのような活性損失から保護した。さらに、キトサンの添加は両方の場合とも（参照：ＳＰＳ  １９およびＳＰＳ  ２０）、キトサンを含まない同じＳＰＳ配合物（ＳＰＳ  １７およびＳＰＳ  １８）と比較して液体貯蔵した際のＬＤＨの酵素活性が増大した。
【０１３９】
図８、左グループの棒は、アミノ酸を含まないトレハロースおよびキトサンのみの混合物が、５０℃で１６；１８および２１日間の液体貯蔵後に劇的な酵素機能損失を生じたことを示す。しかし、このトレハロースおよびキトサンの混合物にアミノ酸を添加することにより、ＬＤＨを５０℃で最大２１日間貯蔵した際に酵素機能の保持をもたらすことができた。WO 2009/014774に記載された結果との直接比較のために、WO 2009/014774の主成分、すなわちＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７およびｒＨＳＡを、トレハロースと、またはトレハロースおよびキトサンと、またはアミノ酸、トレハロースおよびキトサンと組み合わせた。図９、右グループの棒に示されるように、アミノ酸、トレハロースおよびキトサンとＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７およびＨＳＡとの混合物は、５０℃での貯蔵後に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７およびＨＳＡとトレハロースのみ（左グループの棒）との混合物またはトレハロースおよびキトサン（中グループの棒）との混合物と比較して、ＬＤＨ活性を２０〜４０％増大させた。
【０１４０】
【表１】
2016534070.tif 000002
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
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【図７】
2016534070.tif 000006
【図８】
2016534070.tif 000007
【図９】
2016534070.tif 000008
【図１Ａ】
2016534070.tif 000009
【図１Ｂ】
2016534070.tif 000010
【図１Ｃ】
2016534070.tif 000011
【図１Ｄ】
2016534070.tif 000012
【図１Ｅ】
2016534070.tif 000013
【図１Ｆ】
2016534070.tif 000014
【図１Ｇ】
2016534070.tif 000015
【図２Ａ】
2016534070.tif 000016
【図２Ｂ】
2016534070.tif 000017
【図２Ｃ】
2016534070.tif 000018
【図２Ｄ】
2016534070.tif 000019
【図２Ｅ】
2016534070.tif 000020
【図２Ｆ】
2016534070.tif 000021
【図３】
2016534070.tif 000022
【図４ＡＢ】
2016534070.tif 000023
【図４ＣＤ】
2016534070.tif 000024
【図５Ａ】
2016534070.tif 000025
【図５Ｂ】
2016534070.tif 000026
【図５Ｃ】
2016534070.tif 000027
【図５Ｄ】
2016534070.tif 000028
【図６】
2016534070.tif 000029
【国際調査報告】
2016534070.tif 000030
2016534070.tif 000031
2016534070.tif 000032