(57)【要約】インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）、または非ヌクレオシド阻害剤ＡもしくはＢ（ＮＮＩ−ＡまたはＮＮＩ−Ｂ）に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＨＣＶ集団の感受性を、効率的にかつ正確に決定するための方法および組成物を提供する。方法は、ＩＦＮ、ＲＢＶ、ＮＩ−１、２’ＣＭｅＡ、ＳＯＦ、ＮＮＩ−Ａ、またはＮＮＩ−Ｂ感受性関するＨＣＶの遺伝子型またはＨＣＶの表現型を決定するステップを含んでもよい。方法は、決定された遺伝子型または表現型に基づく適切な処置の選択をさらに含んでもよい。
2016515378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を有する患者に対して処置を選択するための方法であって、
（ａ）前記患者から生物試料を得るステップであって、前記生物試料が前記患者からのＨＣＶまたはＨＣＶ集団を含むステップと、
（ｂ）前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型を決定するステップと、
（ｃ）前記患者を
ｉ．前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が遺伝子型２（ＧＴ２）ＨＣＶ、遺伝子型３（ＧＴ３）ＨＣＶ、遺伝子型４（ＧＴ４）ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、リバビリンまたはヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）を含有する処置レジメン、または
ｉｉ．前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、ソホスブビルを含有する処置レジメン
で処置するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２ａ  ＨＣＶを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ３  ＨＣＶを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ４  ＨＣＶを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＨＣＶウイルス集団の感受性を決定するための方法であって、前記ＨＣＶ阻害剤が、インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、ヌクレオシド阻害剤−１（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）、または非ヌクレオシド阻害剤ＡもしくはＢ（ＮＮＩ−ＡまたはＮＮＩ−Ｂ）であり、前記方法は、
（ａ）前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が遺伝子型２（ＧＴ２）ＨＣＶ、遺伝子型３（ＧＴ３）ＨＣＶ、遺伝子型４（ＧＴ４）ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が、参照ウイルスに比べ、リバビリンに対して増大した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がソホスブビルに対して増大した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ３  ＨＣＶ、ＧＴ４  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がソホスブビルに対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶ、ＧＴ３  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が非ヌクレオシド阻害剤Ｂ（ＮＮＩ−Ｂ）に対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ、あるいは前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、前記ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が非ヌクレオシド阻害剤Ａ（ＮＮＩ−Ａ）に対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記ＨＣＶ阻害剤がヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＶ阻害剤がＲＢＶである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＶ阻害剤がＳＯＦである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＣＶ阻害剤が、部位ＡまたはＢを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−ＡまたはＮＮＩ−Ｂ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を決定するための方法であって、
（ａ）前記ＨＣＶウイルス集団からの患者由来のセグメントを含む耐性試験ベクターを細胞に導入するステップであって、前記細胞または前記耐性試験ベクターが、前記ＨＣＶに依存する検出可能なシグナルを生成する指標核酸を含むステップと、
（ｂ）前記ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤の非存在下または漸増濃度のＨＣＶポリメラーゼ阻害剤の存在下で、前記細胞内での前記指標遺伝子の発現を測定するステップと、
（ｃ）前記ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤に関する薬物感受性の標準曲線を作成するステップであって、ＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、両方、または勾配が、前記標準曲線で検出されるステップと、
（ｄ）前記ＨＣＶ集団のＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方を対照ＨＣＶ集団のＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方と比較するか、または前記ＨＣＶ集団の前記標準曲線の勾配を対照ＨＣＶ集団の標準曲線の勾配と比較するステップと、
（ｅ）前記ＨＣＶ集団に関するＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方が前記対照ＨＣＶ集団に関するＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方に比べて大きい場合は、前記ＨＣＶ集団が、前記ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤に対して増大した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するか、または前記ＨＣＶ集団の前記標準曲線の勾配が前記対照集団の標準曲線に比べて低下している場合は、前記ＨＣＶ集団が、前記ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤に対して低減した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記ＨＣＶ阻害剤が、インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）、または部位Ａ、Ｂ、Ｃ、もしくはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＣＶ阻害剤がヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＣＶ阻害剤がインターフェロンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＣＶ阻害剤がＲＢＶである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＣＶ阻害剤がＳＯＦである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＣＶ阻害剤が、部位ＡまたはＢを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−ＡまたはＮＮＩ−Ｂ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記対照ＨＣＶ集団が、Ｃｏｎ１  ＨＣＶ、Ｈ７７  ＨＣＶ、または前記ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者ＨＣＶ集団を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記耐性試験ベクターが、前記患者由来のセグメントおよび前記指標遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者由来のセグメントが、前記ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｅ）の感受性決定に基づいて、前記患者に対して適切な処置レジメンを決定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１５日に出願した米国仮出願第６１／８０２，２１２号；２０１３年６月４日に出願した米国仮出願第６１／８３１，１３４号；および２０１３年６月２７日に出願した米国仮出願第６１／８３９，９４７号に対する優先権を主張する。これらの出願の各々の内容全体は本明細書に参考として援用される。
【０００２】
分野
本発明の実施形態は、ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）またはＨＣＶ集団の感受性を決定するための方法に関する。感受性を決定するための方法は、遺伝子型または表現型方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＨＣＶは、世界中で推定１億７千万人もの人々を冒しており、そこには４百万人のアメリカ人、即ち米国人口の約１％が含まれ、最も一般的な血液感染病となっている。ＨＣＶ感染は、患者の約５５〜８５％が慢性状態になる。慢性ＨＣＶ感染の後期合併症には、肝硬変、肝細胞癌、および死亡が含まれる。ＨＣＶ感染を予防するための有効なワクチンはない。
【０００４】
ＨＣＶは、約９，０００ヌクレオチド（９ｋｂ）のプラスセンス直鎖状１本鎖ＲＮＡゲノムを含有する、エンベロープを持ったウイルスである。ＨＣＶは、フラビウイルスおよびペスチウイルスと共にＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に分類される。ＨＣＶゲノムの単一オープンリーディングフレームは、単一タンパク質生成物を生成するように翻訳され、次いでこの生成物がさらにプロセシングされてより小さい活性タンパク質を生成するが、このタンパク質には３種の構造タンパク質（ヌクレオカプシド（Ｃ）および２種のエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１およびＥ２））と７種の非構造タンパク質（とりわけ、セリンプロテアーゼ（非構造タンパク質３（ＮＳ３））、補助因子（非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ））、非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ））を含む）とが含まれる。
【０００５】
ＨＣＶ株は、系統発生（遺伝子配列）に基づいて「遺伝子型」により６つの遺伝子型（即ち、１〜６）の１つにグループ分けされ、これらがさらに、遺伝子型内のいくつかの異なるサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ）に特徴付けられる。１つのＨＣＶ遺伝子型による感染は、その遺伝子型または任意のその他の遺伝子型のＨＣＶに対する免疫性を患者に必ずしも与えず、したがって、複数のＨＣＶ遺伝子型分離株による同時感染が可能である。大部分において、ＨＣＶ遺伝子型は地理的に全く異なるものである。北米、欧州、および日本では、ＨＣＶ遺伝子型１（ＧＴ１）が最も流行する。遺伝子型１  ＨＣＶでは、サブタイプ１ａおよび１ｂがより流行し、サブタイプ１ｃはごく僅かな構成要素である。しかしその他の地域では、遺伝子型１以外のＨＣＶ遺伝子型（非ＧＴ１）が流行する。
【０００６】
ＨＣＶに対する直接作用型抗ウイルス（ＤＡＡ）薬の承認前は、ＨＣＶ感染のケアの標準は、リバビリン（ＲＢＶ）と組み合わせたペグ化インターフェロンα（ＰＥＧ−ＩＦＮ）による２４〜４８週間の処置に応答する、免疫調節を経たウイルス複製の間接的抑制に依拠していた。処置に対する応答は、以下にさらに論ずるように患者間で様々であり、患者の約４０〜６０％は、ウイルス複製の持続抑制を実現する（持続性ウイルス学的著効、ＳＶＲ）。血漿中の検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡレベルが上昇することによって明らかなように、標準ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法に対して初期応答がある全てのＨＣＶ感染患者が、それらの応答を持続するわけではない。ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の様々な効力および低耐容性により、ＨＣＶ複製を直接標的とする多数の新しい抗ウイルス薬が、前臨床開発プログラムおよび臨床試験で評価されつつあり、４種のＤＡＡ（ボセプレビル、テラプレビル、シメプレビル、ソホスブビル）が現在承認されている。承認されたＤＡＡには、ポリメラーゼ阻害剤（ソホスブビル）およびプロテアーゼ阻害剤（ボセプレビル、テラプレビル、シメプレビル）が含まれる。ＨＣＶゲノムのＮＳ３、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ領域によってそれぞれコードされたウイルスプロテアーゼ、非構造タンパク質５Ａ、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を標的とする追加の阻害剤は、最も開発が進んだものである（開発中の薬物のリスト、例えばhttp://www.hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/Quick_Ref_Guide.pdf参照）。
【０００７】
ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域は、長さ１，７７３ヌクレオチドであり、ＨＣＶ  ＲｄＲｐ酵素をコードする。ＨＣＶ  ＲｄＲｐ酵素はＨＣＶ  ＲＮＡゲノムを「コピー」し、プラスおよびマイナスセンスＨＣＶ  ＲＮＡを共に生成し、したがってＲｄＲｐはウイルス複製に不可欠である。いくつかのヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）および小分子非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）が現在開発されており、ソホスブビル（ＳＯＦ）が、併用療法での使用のために最近承認された。ＮＩは、活性部位で結合するためにＲｄＲｐの天然基質（リボヌクレオシド三リン酸）と競合することによって作用する。ＮＮＩは、非競合メカニズムによって、アロステリックに結合しＲｄＲｐ活性を阻害する。ＮＮＩは、それらの化学的構造および標的結合部位に基づいて区別されるいくつかのサブクラスにさらにグループ分けされ得る。特定のＲｄＲｐ阻害剤に対する耐性は、ＲｄＲｐ構造（例えば、ＮＮＩ）を変化させることによって、または阻害剤と天然基質（例えば、ＮＩ）とを区別するＲｄＲｐの能力を改善することによって、阻害剤の結合を制限する、酵素内に位置付けられたある特定のアミノ酸変異に関連することが報告されている。
【０００８】
現在利用可能なＨＣＶ阻害剤は、ＧＴ１  ＨＣＶおよびその他の遺伝子型のＨＣＶ（即ち、非ＧＴ１  ＨＣＶ）に対して異なるように影響を及ぼすので、異なる好ましい処置レジメンが実施された。ＧＴ１ウイルス感染に対するケアの標準は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶと組み合わせた異なるプロテアーゼ阻害剤またはヌクレオシド阻害剤ＳＯＦの使用の承認前は、リバビリン（ＲＢＶ）と組み合わせたペグ化インターフェロンα（ＰＥＧ−ＩＦＮ）であった。現在、ＧＴ１、ＧＴ４、ＧＴ５、およびＧＴ６  ＨＣＶに関するケアの標準は、リバビリン（ＲＢＶ）およびソホスブビル（ＳＯＶＡＬＤＩ、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳＯＦ）と組み合わせたペグ化インターフェロンα（ＰＥＧ−ＩＦＮ）であり、ＧＴ２およびＧＴ３  ＨＣＶに関するケアの標準は、ＲＢＶおよびＳＯＦである。ＩＦＮを受容するのに相応しくない患者のＧＴ１  ＨＣＶに関するケアの標準は、ＳＯＦ、ＲＢＶ、およびプロテアーゼ阻害剤シメプレビル（ＯＬＹＳＩＯ、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｓ、Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ、ＮＪ）を含む。非ＧＴ１ウイルスに感染した患者は、ＧＴ１ウイルスに感染した場合に比べ、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ処置の後、典型的にはより高い持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）率を実現することが、既に観察された。ＧＴ１ウイルスに比べ、非ＧＴ１ウイルスにおけるより良好なＳＶＲは、ヌクレオシ（チ）ドポリメラーゼ阻害剤（ＮＩ）による臨床試験でも観察された。遺伝子型間での応答差の理由は不明であるが、ウイルスの性質および相対的な阻害剤の感受性が含まれる可能性がある。いずれにしても、個体に関する最良の処置レジメンを決定するために、個体に感染するＨＣＶの阻害剤感受性を決定する方法を有することが非常に望ましい。
【０００９】
ＨＣＶ感染に関するケアの現行標準の部分である阻害剤リバビリンは、プロドラッグであり、これは代謝されるときにプリンＲＮＡヌクレオチドに似ており、ウイルス複製に必要なＲＮＡ代謝を妨げる。リバビリンがどのようにウイルス複製に影響を及ぼすかというメカニズムはわかっていない。多くのメカニズムがリバビリンに関して提案されてきたが、これらの中で今日まで判明したものはなく、その動作の原因となる多数のメカニズムが存在すると考えられる。リバビリンは、ＤＮＡに実質的に組み込まれず、ＤＮＡ合成に対して用量依存性阻害作用を発揮すると共に、遺伝子発現に対してその他の作用を発揮する。これは患者の貧血の原因でもある。著しい催奇作用が、リバビリンをテストした非霊長類動物種で認められ、リバビリンは体内で長い半減期を有することが認められた。リバビリンは、現在使用されている感受性アッセイにおいて細胞に対して毒性になる可能性もあり、特定のＨＣＶ集団に対するその影響を正確に決定することが難しい。個体用の処置レジメンにリバビリンを含むことが適切であるか否かを決定するために、またはおそらくは処置持続期間を決定するために、リバビリンに対する、個体に感染するＨＣＶの感受性を、正確にかつ効率的に決定する方法を有することが有利と考えられる。
【００１０】
ＨＣＶ感染に関するケアの現行標準の部分でもある阻害剤ソホスブビルは、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤である。ソホスブビルは、細胞内代謝を受けて薬理学的に活性なウリジン類似体三リン酸（ＧＳ−４６１２０３）を形成する、ヌクレオチドプロドラッグである。ソホスブビルは、ヌクレオチドを模倣するが、連鎖停止剤として働く。ソホスブビルが通常のヌクレオチドと置換される場合、ウイルスは複製できない。リバビリンと組み合わせて投与されたときに報告されたソホスブビルの悪影響は、疲労および頭痛であり、ＰＥＧ−ＩＦＮと組み合わせて投与されたときのソホスブビルの最も一般的な悪影響は、疲労、頭痛、吐き気、不眠、および貧血である。
【００１１】
現在利用可能な阻害剤のいくつかは、ウイルス複製の阻害に関して有効であることが示されてきたが、そのような薬物を感染個体に投与すると、抗ウイルス療法に対して感受性の低減した変異体ＨＣＶの急速出現をもたらすその急速変異率に起因して、それらはウイルスに対する耐性を発生させ易い。特定の薬物に対するこの低減した感受性は、その薬物による処置を、感染個体に対して無効にする。この理由により、施術者は、各ＨＣＶ感染個体に対して最も適切な処置レジメンを決定するために、薬物感受性をモニタリングできることが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、リバビリンおよびヌクレオシ（チ）ド阻害剤、標的ＨＣＶポリペプチドなどの薬物に対する感受性を、効率的に正確に決定するための方法および組成物が求められている。所望の方法および組成物は、（ａ）ＨＣＶ阻害剤感受性の自然なばらつき、および／または（ｂ）ＨＣＶ阻害剤耐性集団の出現および持続または減衰を表す処置前、処置時、および処置後の阻害剤感受性の相違の評価を容易にすると考えられる。ＨＣＶ集団の相対的な複製能力（ＲＣ）を評価するのに使用できる方法も求められている。これらおよびその他の必要性は、本発明によって満たされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本出願は、ＨＣＶ阻害剤に対する混合Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を効率的に正確に決定するための方法および組成物を提供する。
【００１４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を有する患者に対して処置を選択するための方法が提供される。ある特定の実施形態では、方法は、患者から生物試料を得るステップであって、生物試料が患者からのＨＣＶまたはＨＣＶ集団を含むステップと；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型を決定するステップと；決定されたＨＣＶの遺伝子型に基づいて、阻害剤および／または処置持続時間を含むことができる適切な処置過程を決定するステップとを含んでもよい。処置は、一部の実施形態において、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が実質的な量の遺伝子型２（ＧＴ２）ＨＣＶ、遺伝子型３（ＧＴ３）ＨＣＶ、遺伝子型４（ＧＴ４）ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、リバビリンまたはヌクレオシド阻害剤を含有する処置レジメンを含んでもよい。処置は、一部の実施形態において、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が実質的な量のＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、ソホスブビルを含有する処置レジメンを含んでもよい。処置は、ソホスブビルを含まなくてもよく、またはＨＣＶもしくはＨＣＶ集団が実質的な量のＧＴ３  ＨＣＶ、ＧＴ４  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、より長い期間にわたるソホスブビル処置を含んでもよい。処置は、部位Ｂを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ｂ）を含まなくてもよく、またはＨＣＶもしくはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶまたはＧＴ３  ＨＣＶを含む場合は、その阻害剤によるより長い処置を含有してもよく、処置は、部位Ａを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ）を含まなくてもよく、またはＨＣＶもしくはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、その阻害剤によるより長い処置を含有してもよい。
【００１５】
ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＨＣＶウイルス集団の感受性を決定するための方法であって、ＨＣＶ阻害剤が、インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、例えば、ヌクレオシド阻害剤−１（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）、または部位ＡもしくはＢを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−ＡもしくはＮＮＩ−Ｂ）などのヌクレオシ（チ）ド阻害剤を含めた１種または複数のヌクレオシ（チ）ド阻害剤である方法も提供される。ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型を決定するステップと；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が遺伝子型２（ＧＴ２）ＨＣＶ、遺伝子型３（ＧＴ３）ＨＣＶ、遺伝子型４（ＧＴ４）ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団は、参照ウイルスに比べ、リバビリンに対して増大した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団はソホスブビルに対して増大した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ３  ＨＣＶ、ＧＴ４  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団はソホスブビルに対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶ、ＧＴ３  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団は部位Ｂを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ｂ）に対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ；あるいはＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団は部位Ａを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ）に対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップとを含む。
【００１６】
ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＨＣＶ集団の感受性を決定するための方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤は、インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、例えば、ヌクレオシド阻害剤−１（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）、または部位Ａ、Ｂ、ＣもしくはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、ＮＮＩ−Ｄ）などのヌクレオシ（チ）ド阻害剤を含めた１種または複数のヌクレオシ（チ）ド阻害剤である。方法は、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来のセグメントを含む耐性試験ベクターを細胞に導入するステップであって、細胞または耐性試験ベクターが、ＨＣＶに依存する検出可能なシグナルを生成する指標核酸を含むステップと；ＨＣＶ阻害剤の非存在下または漸増濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、細胞内での指標遺伝子の発現を測定するステップと；ＨＣＶ阻害剤に対する薬物感受性の標準曲線を作成するステップであって、ＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、両方、または勾配が、この標準曲線で検出されるステップと；ＨＣＶ集団のＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方を対照ＨＣＶ集団のＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方と比較するか、またはＨＣＶ集団の標準曲線の勾配を対照ＨＣＶ集団標準曲線の勾配と比較するステップと；ＨＣＶ集団に関するＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方が対照ＨＣＶ集団に関するＩＣ５０倍率変化値、ＩＣ９５倍率変化値、もしくは両方に比べて低い場合は、ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ阻害剤に対して増大した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するか、またはＨＣＶ集団の標準曲線の勾配が対照集団の標準曲線に比べて低下している場合は、ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ阻害剤に対して低減した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するステップとを含んでもよい。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、例えば、ヌクレオシド阻害剤−１（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）、または部位ＡもしくはＢを標的とするヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−ＡもしくはＮＮＩ−Ｂ）を含めた１種または複数のヌクレオシ（チ）ド阻害剤であってもよい。ある特定の実施形態では、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。ある特定のその他の実施形態では、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者からのＨＣＶ集団である。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントおよび指標核酸を含む。一部の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法のある特定の実施形態では、宿主細胞はＨｕｈ７細胞である。
【００１７】
ある特定の実施形態では、方法は、患者に対して適切な処置レジメンの決定を容易にするのに使用される。ある特定の実施形態では、方法は、ＩＣ９５倍率変化値とＩＣ５０倍率変化値との比が検出されることを決定するステップであって、比の変化が、阻害剤に対するＨＣＶの感受性の変化を示すステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、患者に対して適切な処置レジメンの決定を容易にするのに使用される。本明細書に記述されるこれらのデータは、臨床試験の設計、処置前の判断（例えば、使用する薬物、組み合わせる薬物の数、処置の持続期間）を知らせるのに、ならびに耐性を評価するのに有用であり得る。特に、表現型データは臨床結果データと併せて、例えば臨床カットオフを作成するために、アッセイの有用性をさらに強化してもよい。
【００１８】
本発明の方法の非限定的な実施形態を、以下の図に具体化する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための表現型アッセイの概略図である。図は、ＨＣＶ阻害剤が、ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３、非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）、またはポリメラーゼＮＳ５Ｂを標的としている例を使用する。したがって、この例では、試験集団のＮＳ３、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ｂ領域がレプリコン試験ベクターに含まれる。
【００２０】
【図２】図２は、代表的なＨＣＶ阻害剤感受性曲線を示すグラフであり、ｘ軸上にＨＣＶ阻害剤の濃度が、またｙ軸上に阻害パーセントとして感受性の倍率変化がプロットされている。ＩＣ５０およびＩＣ９５が示されている。勾配は、ログシグモイド関数に基づく曲線当て嵌めによって計算されてもよい。例えば、阻害は、最高値−（最高値＋基底値）を、（１＋濃度／中心値）＾勾配で割った値に等しい。単純化すると、勾配はｌｏｇ（９５／１００−９５）／Δｘに等しい。Δｘは、ｌｏｇ（ＩＣ９５）−ｌｏｇ（ＩＣ５０）に等しい。
【００２１】
【図３】図３は、本発明のアッセイの正確度、精度、再現性、感度、および線形性を示す表である。
【００２２】
【図４】図４は、患者試料からのレプリコン含有ＮＳ５Ｂ集団を使用したアッセイ間のばらつきをさらに示す。代表的な再現性データを、左のグラフのＮＮＩ−Ａ感受性および右のグラフの複製能力に関する２つのグラフに示す。アッセイ１からのデータをｘ軸上にプロットし、アッセイ２からのデータをｙ軸上にプロットする。２またはそれ超の倍率変化は、このアッセイで再現可能に検出されることがわかった。
【００２３】
【図５】図５および６は、ＧＴ１ウイルスと比較した、非ＧＴ１ウイルスの、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）およびリバビリンに対する感受性のばらつきについて実証する。生データを図５に示し、そのデータを図６でグラフに示す。
【図６】図５および６は、ＧＴ１ウイルスと比較した、非ＧＴ１ウイルスの、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ）およびリバビリンに対する感受性のばらつきについて実証する。生データを図５に示し、そのデータを図６でグラフに示す。図６Ａには、ＧＴ１ウイルスデータを示す。非ＧＴ−１ウイルス感受性データは図６Ｂに示す。図６Ａおよび６Ｂでは共に、ＩＣ倍率変化がｙ軸上にプロットされ、阻害剤およびＩＣ値はｘ軸上に示される。図６Ｃおよび６Ｄでは、ＩＣ５０またはＩＣ９５倍率変化がそれぞれｙ軸上にプロットされ、阻害剤およびＨＣＶ遺伝子型がｘ軸上にプロットされる。
【００２４】
【図７】図７は、インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、ヌクレオシド阻害剤（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）に対する、異なる遺伝子型のＨＣＶウイルスの感受性のばらつきを実証している３つの表を示す。生データは、図７の表に示される。阻害剤および遺伝子型が示され、それと共に、指示される遺伝子型のウイルスの数（「ウイルスの数」）も示される。各阻害剤に関する各ウイルス遺伝子型ごとの、メジアン、最大値、最小値、およびＩＣ５０倍率変化の範囲（参照ウイルスのＩＣ５０と比較）が示される。試験をした遺伝子型の全ての間のＩＣ５０倍率変化の範囲を、表の底部に示す。
【００２５】
【図８】図８は、ウィルコクソン順位和検定を使用した、異なる遺伝子型のウイルス間での、インターフェロン、リバビリン、ヌクレオシド阻害剤、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）に対する感受性のばらつきの有意性を示す表である。阻害剤は第１欄に示され、比較される２種のウイルスの遺伝子型を、第２および３欄に示す。２種のウイルス間の、感受性の差の統計的有意性（ＩＣ５０倍率変化）を、第４欄に示し、Ｐ＜０．０５を有するそれらの値は、差が統計的に有意であったことを示すために「Ｙｅｓ」で示される。
【００２６】
【図９】図９は、異なる遺伝子型ＧＴ１（ａ／ｂ）、ＧＴ２（ａ／ｂ／ｋ）、ＧＴ３（ａ）、およびＧＴ４（ａ／ｄ／ｎ／未知）のウイルスの、インターフェロン、リバビリン、およびヌクレオシ（チ）ド阻害剤、例えばＮＩ−１、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）に対する感受性のばらつきを実証する。参照ウイルス値と比べたＩＣ５０倍率変化をｙ軸上にプロットし、試験をしたウイルスの阻害剤および遺伝子型をｘ軸上に示す。ｘ軸上に、サブタイプなしの数値によって示される遺伝子型は、その欄に示される結果が、その遺伝子型から評価されたサブタイプの全てに関する結果を含むことを示す（例えば、１欄に示されるドットを、１ａ欄および１ｂ欄に示されるドットと比較する）。
【００２７】
【図１０】図１０は、異なる遺伝子型ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３、およびＧＴ４のウイルスの、非ヌクレオシド阻害剤に対する感受性のばらつきを実証する。図１０Ａおよび１０Ｂにおいて、Ｃｏｎ１参照ウイルスに対するＩＣ５０またはＩＣ９５倍率変化はそれぞれｙ軸上にプロットされ、阻害剤およびＨＣＶ遺伝子型はｘ軸上にプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、抗ＨＣＶ薬物に対するＨＣＶ集団の感受性を決定するための、または患者に感染するＨＣＶの複製能力を決定するための方法を提供する。方法、およびこの方法を行うのに有用な組成物について、以下にさらに記述する。
【００２９】
（定義および略称）
下記の用語は、本出願で使用されるときに本明細書で定義される：
【００３０】
「ＰＣＲ」は、「ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase  chain  reaction）」の略称である。
【００３１】
「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎ウイルス（hapatitis  C  virus）の略称である。ある特定の実施形態では、ＨＣＶは、ＨＣＶ遺伝子型１を指す。ある特定の実施形態では、ＨＣＶは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２、２ａ、２ｂ、３、または４を指す。
【００３２】
２０の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸に関して本明細書で使用されるアミノ酸という表記は、従来通りであり、下記の通りである：
【表１−１】
2016515378.tif 000003
【表１−２】
2016515378.tif 000004
【００３３】
他に指示しない限り、ポリペプチド配列が一連の１文字および／または３文字略称で提示される場合は、その配列は通常の慣習に従ってＮ→Ｃ方向に提示される。配列中の個々のアミノ酸は、ＡＮとして本明細書で表され、Ａは配列中のアミノ酸に関する標準的な１文字記号であり、Ｎは配列中の位置である。変異は、Ａ１ＮＡ２として本明細書では表され、Ａ１は、参照タンパク質配列中のアミノ酸に関する標準的な１文字記号であり、Ａ２は、変異したタンパク質配列中のアミノ酸に関する標準的な１文字記号であり、Ｎはアミノ酸配列中の位置である。例えば、Ｇ２５Ｍ変異は、アミノ酸位置２５でのグリシンからメチオニンへの変化を表す。変異は、ＮＡ２として本明細書で表してもよく、Ｎはアミノ酸配列中の位置であり、Ａ２は、変異したタンパク質配列中のアミノ酸に関する標準的な１文字記号である（例えば、２５Ｍは、アミノ酸位置２５での野生型アミノ酸からメチオニンへの変化に関する）。さらに、本明細書では、変異はＡ１ＮＸとして表すことがあり、Ａ１は、参照タンパク質配列中のアミノ酸に関する標準的な１文字記号であり、Ｎはアミノ酸配列中の位置であり、Ｘは、変異したアミノ酸を任意のアミノ酸とすることができることを示す（例えば、Ｇ２５Ｘは、アミノ酸位置２５でのグリシンから任意のアミノ酸への変化を表す）。この表記は、変異したタンパク質配列中のアミノ酸が未知であるとき、変異したタンパク質配列中のアミノ酸を、参照タンパク質配列中に見出された場合を除いて任意のアミノ酸とすることができる場合、または変異した位置にあるアミノ酸が、その位置の２つまたはそれ超のアミノ酸の混合物として観察された場合に、典型的には使用される。アミノ酸位置には、変異を包含する領域が誘導されるタンパク質の完全長配列に基づいて、番号が付けられる。ＤＮＡ配列中のヌクレオチドおよび点変異の表示は、類似している。さらに変異は、Ａ１ＮＡ２Ａ３Ａ４として本明細書では表されてもよく、例えば、Ａ１は参照タンパク質配列中アミノ酸に関する標準的な１文字記号であり、Ｎはアミノ酸配列中の位置であり、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、変異したタンパク質配列中に存在し得るアミノ酸の、標準的な１文字記号である。
【００３４】
特定の核酸塩基配列を含む核酸を指すのに、明細書の全体を通して使用される略称は、従来の１文字略称である。したがって核酸に含まれる場合、天然に生ずるコード核酸塩基は、下記の通り省略される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）。他に指示しない限り、一連の１文字略称として表される１本鎖核酸配列と、２本鎖配列の上鎖は、５’→３’方向で提示される。
【００３５】
本明細書で使用される「表現型アッセイ」という文言は、対象に感染する例えばＨＣＶなどの特定のウイルスまたは例えばＨＣＶの集団などのウイルスの集団の、表現型を測定する試験である。測定することができる表現型には、特定の化学または生物抗ウイルス薬に対するウイルスのまたはウイルスの集団の耐性または感受性が含まれ、またはウイルスの複製能力を測定するものが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００３６】
本明細書で使用される「遺伝子型アッセイ」は、生物または生物の集団の遺伝子型（例えば、遺伝子型１、２、３、４）、生物または生物の集団の遺伝子型サブタイプ（例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ）を決定するアッセイである。ある特定の実施形態では、遺伝子型アッセイは、１種もしくは複数のある遺伝子の核酸配列、または特定の遺伝子型もしくは遺伝子型サブタイプを反映する関連ある配列の決定を含む。
【００３７】
本明細書で使用される「変異」という用語は、参照核酸またはポリペプチドに対する、アミノ酸配列のまたは対応する核酸配列の変化を指す。本発明のある特定の実施形態の場合、参照核酸は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ集団と比較するためのＣｏｎ１  ＨＣＶの核酸であり、またはＨＣＶ遺伝子型１ａ集団と比較するためのＨ７７  ＨＣＶである。同様に、参照ポリペプチドは、Ｃｏｎ１またはＨ７７  ＨＣＶ核酸配列によりコードされたポリペプチドである。あるいは、参照核酸またはポリペプチドは、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者集団からのものであってもよい。ペプチドのアミノ酸配列は、例えばエドマン分解または質量分光法によって直接決定することができるが、より典型的には、ペプチドのアミノ配列は、ペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列から推論される。当技術分野で公知の核酸の配列を決定するための任意の方法、例えば、マクサム・ギルバート配列決定法（Maxamら、１９８０年、Methods  in  Enzymology  ６５巻:４９９頁）、ジデオキシ配列決定法（Sangerら、１９７７年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ７４巻:５４６３頁）、またはハイブリダイゼーションをベースにした手法（例えば、Sambrookら、２００１年、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、第３版、NY；およびAusubelら、１９８９年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscience、NY参照）を使用することができる。本明細書で使用される「位置」および「コドン」という用語は、配列中の特定のアミノ酸を指すのに、同義で使用される。ある特定の実施形態では、変異は、薬物感受性の変化に関連することがわかっている。例えば、あるＮＳ５Ｂ変異は、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ；例えば、Ｓ２８２Ｔ変異体）、または非ヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤であって部位Ａ（ＮＮＩ−Ａ；例えば、Ｌ３９２ＩおよびＰ４９５Ａ／Ｌ変異体）、部位Ｂ（ＮＮＩ−Ｂ；例えば、Ｍ４２３Ｔ）、部位Ｃ（ＮＮＩ−Ｃ；例えば、Ｃ３１６ＹおよびＹ４４８Ｈ）、または部位Ｄ（ＮＮＩ−Ｄ；例えば、Ｃ３１６Ｙ）を標的とするものに対する、感受性の低減に関連する。
【００３８】
本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照ウイルス、遺伝子、またはタンパク質に対して１つまたは複数の変化を有する配列を有するウイルス、遺伝子、またはタンパク質を指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、全体を通して同義に使用される。同様に、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、全体を通して同義に使用される。
【００３９】
「野生型」という用語は、薬物感受性の変化（低減または増加）に関連することがわかっている変異を含まないウイルス遺伝子型を指すのに、本明細書では使用される。本明細書で使用される「薬物感受性」および「阻害剤感受性」という用語は、同義に使用される。
【００４０】
本明細書で使用される「感受性」という用語は、特定の薬物に対するウイルスの応答を指す。薬物に対して低下または低減させた感受性を有するウイルスは、薬物に耐性があるかもしれないかまたは薬物による処置を受け難いかもしれない。対照的に、薬物に対して増大または上昇した感受性（過感受性）を有するウイルスは、薬物による処置をより受け易い。ある特定の実施形態では、感受性を決定するために開示された方法は、患者に関する適正な処置レジメンの決定を容易にするように、医療提供者により使用されてもよい。
【００４１】
本明細書で使用される、試料中の所与の遺伝子型のＨＣＶの「実質的な量」という文言は、そのＨＣＶ遺伝子型の処置に有効な阻害剤による試料の処置が、試料中の生存可能なＨＣＶの量を低減させるのにも有効であるような、試料中のＨＣＶの量を指す。
【００４２】
「ＩＣ９５」という用語は、疾患を引き起こす微生物（例えば、ＨＣＶ）の再生を９５％抑制するのに必要な、試料中の薬物の濃度を指す。「ＩＣ５０」という用語は、疾患を引き起こす微生物の再生を５０％抑制するのに必要な、試料中の薬物の濃度を指す。
【００４３】
本明細書で使用される「倍率変化」という用語は、患者のウイルスおよび参照ウイルスの薬物感受性の数値比較である。例えば、変異体ＨＣＶ  ＩＣ５０と薬物に敏感な参照ＨＣＶ  ＩＣ５０との比が倍率変化である。倍率変化１．０は、患者のウイルスが薬物に敏感な参照ウイルスと同じ程度の薬物感受性を呈することを示す。１未満の倍率変化は、患者のウイルスが薬物に敏感な参照ウイルスよりも敏感であることを示す。１より大きい倍率変化は、患者のウイルスが薬物に敏感な参照ウイルスよりも感受性が低いことを示す。臨床カットオフ値に等しくまたはそれよりも大きい倍率変化は、患者のウイルスが、その薬物に対してより低い応答の確率を有することを意味する。臨床カットオフ値未満の倍率変化は、患者のウイルスがその薬物に敏感であることを意味する。
【００４４】
「臨床カットオフ値」という文言は、薬物の感度が終了する特定の点を指す。この文言は、特定の薬物による患者の処置失敗の確率が著しく増大する、薬物感受性レベルによって定義される。カットオフ値は、臨床研究で決定されるように、異なる抗ウイルス薬に関しては異なる。臨床カットオフ値は、耐性および結果のデータを評価することにより、臨床試験で決定される。表現型薬物感受性は、処置開始時に測定される。ウイルス負荷の変化などの処置応答が、処置の過程の所定の時点でモニタリングされる。薬物感受性は処置応答に相関し、臨床カットオフ値は、処置失敗に関連した感受性レベルによって決定される（試験結果全体の統計分析）。
【００４５】
ウイルスが、抗ウイルス処置に対する低減した感受性に相関する性質、例えば遺伝子型または変異を有する場合、このウイルスは、抗ウイルス処置に対して「低減した感受性を有する増大した尤度」を有しているかもしれない。その性質を有するウイルスの集団が、その性質を持たずにその他の点では同様であるウイルス集団よりも、平均して抗ウイルス処置に対してより低い感受性のものである場合、ウイルスの性質は、低減した感受性に相関する。したがって、性質の存在と低減した感受性との間の相関は、絶対的である必要がなく、また、低減した感受性を与えるのに、その性質が必要であり（即ち、その性質が、感受性の低減において原因となる役割を演ずる）または十分である（即ち、その性質のみの存在で十分である）という要件も存在しない。
【００４６】
「配列相同性％」という用語は、本明細書では「相同性％」、「配列同一性％」、および「同一性％」という用語と同義に使用され、配列アライメントプログラムを使用してアライメントされたときの、２つまたはそれ超のペプチド配列の間でのアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される８０％相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さ全体で８０％超の配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルには、所与の配列に対して６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８％、またはそれ超の配列同一性が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００４７】
２つの配列間の同一性を決定するのに使用することができる例示的なコンピュータプログラムには、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でインターネット上で公に利用可能な一揃いのＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮが含まれるが、これらに限定するものではない。Altschulら、１９９０年、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻:４０３〜１０頁（公開されたデフォルト設定、即ち、パラメータｗ＝４、ｔ＝１７を特に参照）と、Altschulら、１９９７年、Nucleic  Acids  Res.、２５巻:３３８９〜３４０２頁も参照されたい。配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列およびその他の公開データベース中のアミノ酸配列に対して所与のアミノ酸配列を評価するときに、典型的にはＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列およびその他の公開データベース中のアミノ酸配列に対して、全てのリーディングフレームで翻訳された核酸配列を検索するのに好ましい。ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸは共に、開始ギャップペナルティ１１．０および伸長ギャップペナルティ１．０のデフォルトパラメータを使用して実行し、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する。Altschulら、１９９７年を参照されたい。
【００４８】
２つまたはそれ超の配列の間の「同一性％」を決定するために、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、開始ギャップペナルティ１０．０、伸長ギャップペナルティ０．１、およびＢＬＯＳＵＭ  ３０類似性マトリックスを含めたデフォルトパラメータで動作するＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラム、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ版６．５を使用して行われる。
【００４９】
「極性アミノ酸」という用語は、側鎖を有する親水性アミノ酸であって、生理学的ｐＨでは変化せずかつ少なくとも１つの結合を有しており、そこでは一般に２個の原子により共有された電子対が原子の一方によってより緊密に保持されているアミノ酸を指す。遺伝的にコードされた極性アミノ酸は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＴｈｒ（Ｔ）を含む。
【００５０】
「無極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨでは変化せずに、一般に２個の原子により共有された電子対が２個の原子のそれぞれによって一般に等しく保持されている結合を有する、側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す（即ち、側鎖は無極性である）。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、およびＶａｌ（Ｖ）を含む。
【００５１】
「親水性アミノ酸」は、Eisenbergら、１９８４年、J.  Mol.  Biol.  １７９巻:１２５〜１４２頁の正規化コンセンサス疎水性スケールによりゼロ未満の疎水性を示す、アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＴｈｒ（Ｔ）を含む。
【００５２】
「疎水性アミノ酸」は、Eisenbergら、１９８４年、J.  Mol.  Biol.  １７９巻:１２５〜１４２頁の正規化コンセンサス疎水性スケールによりゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＶａｌ（Ｖ）を含む。
【００５３】
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、水素イオンの損失により、典型的には生理学的ｐＨで負に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸は、Ａｓｐ（Ｄ）およびＧｌｕ（Ｅ）を含む。
【００５４】
「塩基性アミノ酸」は、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、典型的には生理学的ｐＨで正に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、およびＬｙｓ（Ｋ）を含む。
【００５５】
本明細書で使用される「耐性試験ベクター」という用語は、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含んだ１つまたは複数の核酸を指す。耐性試験ベクターが複数の核酸を含む場合、患者由来のセグメントは１つの核酸に含有されかつ指標遺伝子は異なる核酸に含有されていてもよい。例えば、指標遺伝子および患者由来のセグメントは、単一ベクター内にあってもよく、または別々のベクター内にあってもよい。したがって耐性試験ベクターのＤＮＡまたはＲＮＡは、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に含有されていてもよく、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として宿主細胞に導入されてもよい。本明細書で使用される「患者由来のセグメント」という用語は、患者に感染するＨＣＶの核酸配列に対応したＨＣＶ核酸配列を含む、１つまたは複数の核酸を指し、この核酸配列は、抗ＨＣＶ薬の標的であるＨＣＶ遺伝子生成物をコードするものである。「患者由来のセグメント」は、例えば、感染した患者の細胞（例えば、抹消血液単核細胞、ＰＢＭＣ）、血清、またはその他の体液中に存在するウイルスＲＮＡから調製された、ウイルスＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの分子クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む、当業者に公知の適切な技法によって調製することができる。「患者由来のセグメント」は、患者に感染するＨＣＶを患者から単離した後に培養物に通さない技法を使用して、またはウイルスが培養された場合は、培養物中の変異の選択を低減させまたは本質的になくすために最小限の通過回数によって、好ましくは単離される。本明細書で使用される「指標」、「指標核酸」、または「指標遺伝子」という用語は、測定可能なまたは注目に値する態様、例えば、測定可能な波長の色もしくは光、または指標として使用されるＤＮＡもしくはＲＮＡの場合は特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ構造の変化もしくは発生を、直接引き起こしまたは反応を通して引き起こす、タンパク質、ＤＮＡ構造、またはＲＮＡ構造をコードする核酸を指す。好ましい指標遺伝子はルシフェラーゼである。その他の指標遺伝子について以下に記述するが、これらは当技術分野で周知である。
【００５６】
ＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定する遺伝子型方法
ある特定の実施形態では、方法は、患者から生物試料を得るステップであって、生物試料が患者からのＨＣＶまたはＨＣＶ集団を含むステップと；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型を決定するステップと；決定されたＨＣＶの遺伝子型に基づいて、適切な処置過程を決定するステップとを含んでもよい。処置は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が実質的な量の遺伝子型２（ＧＴ２）ＨＣＶ、遺伝子型３（ＧＴ３）ＨＣＶ、遺伝子型４（ＧＴ４）ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、リバビリンを含んでもよい。処置は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が実質的な量のＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、ソホスブビルを含んでもよく、処置は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が実質的な量のＧＴ３  ＨＣＶ、ＧＴ４  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、ソホスブビルを含まなくてもよい。
【００５７】
ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＨＣＶウイルス集団の感受性を決定するための方法であって、ＨＣＶ阻害剤がインターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、例えば、ヌクレオシド阻害剤−１（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、またはソホスブビル（ＳＯＦ）を含めた１種または複数のヌクレオシ（チ）ド阻害剤である方法も提供される。ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型を決定するステップと；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が遺伝子型２（ＧＴ２）ＨＣＶ、遺伝子型３（ＧＴ３）ＨＣＶ、遺伝子型４（ＧＴ４）ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団が、参照ウイルスに比べてリバビリンに対して増大した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ；ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がＧＴ２  ＨＣＶを含む場合は、ＨＣＶまたはＨＣＶ集団がソホスブビルに対して増大した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップ；またはＨＣＶもしくはＨＣＶ集団がＧＴ３  ＨＣＶ、ＧＴ４  ＨＣＶ、またはこれらの組合せを含む場合は、ＨＣＶもしくはＨＣＶ集団がソホスブビルに対して低下した感受性を有する可能性が高いことを決定するステップとを含んでもよい。
【００５８】
ＨＣＶまたはＨＣＶ集団の遺伝子型は、当業者に公知の任意の方法（例えば、配列決定）によって決定されてもよい。当技術分野で公知の核酸の配列を決定するための任意の方法を使用することができ、例えば、マクサム・ギルバート配列決定法（Maxamら、１９８０年、Methods  in  Enzymology  ６５巻:４９９頁）、ジデオキシ配列決定法（Sangerら、１９７７年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ７４巻:５４６３頁）、またはハイブリダイゼーションをベースにした手法（例えば、Sambrookら、２００１年、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、第３版、NY；およびAusubelら、１９８９年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscience、NY参照）を使用することができる。
【００５９】
特定の核酸配列の決定は、アレル特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づく制限断片長多型検出（KanおよびDozy、１９７８年、Lancet  ii:９１０〜９１２頁）、ミスマッチ修復検出（FahamおよびCox、１９９５年、Genome  Res  5:４７４〜４８２頁）、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Wagnerら、１９９５年、Nucl  Acids  Res  23:３９４４〜３９４８頁）、変性剤勾配ゲル電気泳動（Fisherら、１９８３年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ８０巻:１５７９〜８３頁）、１本鎖高次構造多型検出（Oritaら、１９８３年、Genomics  ５巻:８７４〜８７９頁）、ミスマッチ塩基対でのＲＮＡａｓｅ切断（Myersら、１９８５年、Science  ２３０巻:１２４２頁）、ヘテロ２本鎖ＤＮＡの化学（Cottonら、１９８８年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ８５巻:４３９７〜４４０１頁）または酵素（Youilら、１９９５年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ９２巻:８７〜９１頁）切断、オリゴヌクレオチド特異的プライマー伸長に基づく方法（Syvanenら、１９９０年、Genomics  ８巻:６８４〜６９２頁）、遺伝的ビット解析（Nikiforovら、１９９４年、Nucl  Acids  Res  ２２巻:４１６７〜４１７５頁）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Landegrenら、１９８８年、Science  ２４１巻:１０７７頁）、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション連鎖反応（「ＬＣＲ」）（Barrany、１９９１年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ８８巻:１８９〜１９３頁）、ギャップ−ＬＣＲ（Abravayaら、１９９５年、Nucl  Acids  Res  ２３巻:６７５〜６８２頁）、当技術分野で周知の標準的な手順を使用する放射性または蛍光ＤＮＡ配列決定、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）アッセイ（Orumら、１９９３年、Nucl.  Acids  Res.  ２１巻:５３３２〜５３５６頁；Thiedeら、１９９６年、Nucl.  Acids  Res.  ２４巻:９８３〜９８４頁）を含むがこれらに限定するものではない様々な方法によって実現することができる。
【００６０】
さらに、点変異、挿入、欠失、およびゲノム再編成を含めた遺伝子構造に関わる異常を検出するのに、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用してもよい。そのようなアッセイには、サザン解析（Southern、１９７５年、J.  Mol.  Biol.  ９８巻:５０３〜５１７頁）、１本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）（Oritaら、１９８９年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻:２７６６〜２７７０頁）、およびＰＣＲ解析（米国特許第４，６８３，２０２号；第４，６８３，１９５号；第４，８００，１５９号;および第４，９６５，１８８号；PCR  Strategies、１９９５年、Innisら（編）、Academic  Press,  Inc.）を含めてもよいが、これらに限定するものではない。
【００６１】
そのような診断方法では、例えば、ウイルス核酸と、組換えＤＮＡ分子、そのクローン化遺伝子または縮重変種を含む１種または複数の標識核酸試薬とを、接触させインキュベートすることができるが、この操作は、これらの試薬をそれらの相補的配列に特異的にアニールするのに好ましい条件下で行われる。好ましくは、これら核酸試薬の長さは少なくとも１５から３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、全ての非アニール核酸を、核酸分子ハイブリッドから除去する。次いでハイブリダイズした核酸の存在を、任意のそのような分子が存在する場合は、検出する。そのような検出スキームを使用して、ウイルスからの核酸を、例えば膜などの固体支持体またはマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズ上などのプラスチック表面に固定化することができる。この場合、インキュベーション後に、上述のタイプの非アニール標識核酸試薬が容易に除去される。残りのアニール標識核酸試薬の検出は、当業者に周知の標準的技法を使用して実現される。核酸試薬がアニールされたコード領域配列は、特定の遺伝子型または配列が存在するか否かを決定するために、公知のコード領域配列から予測されるアニーリングパターンと比較することができる。
【００６２】
これらの技法は、エンベロープタンパク質可変領域の長さおよび／またはウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質グリコシル化部位の数を決定するための高スループット法を提供するように、容易に適応させることができる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘからの遺伝子アレイ（Affymetrix,  Inc.、Sunnyvale、Calif.）を使用して、多数の個々のウイルスの遺伝子型を迅速に特定することができる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子アレイ、およびそのようなアレイを作製し使用する方法は、例えば、参照によりそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，５５１，７８４号、同第６，５４８，２５７号、同第６，５０５，１２５号、同第６，４８９，１１４号、同第６，４５１，５３６号、同第６，４１０，２２９号、同第６，３９１，５５０号、同第６，３７９，８９５号、同第６，３５５，４３２号、同第６，３４２，３５５号、同第６，３３３，１５５号、同第６，３０８，１７０号、同第６，２９１，１８３号、同第６，２８７，８５０号、同第６，２６１，７７６号、同第６，２２５，６２５号、同第６，１９７，５０６号、同第６，１６８，９４８号、同第６，１５６，５０１号、同第６，１４１，０９６号、同第６，０４０，１３８号、同第６，０２２，９６３号、同第５，９１９，５２３号、同第５，８３７，８３２号、同第５，７４４，３０５号、同第５，８３４，７５８号および同第５，６３１，７３４号に記載されている。
【００６３】
さらに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるAusubelら編、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、２００２年、４巻、Unit  25B、Ch.  22は、多数のウイルス分離株の遺伝子型を決定するために、遺伝子アレイの構築および使用に関してその他の指針を提供する。最後に、参照によりそのそれぞれの全体が組み込まれる米国特許第６，６７０，１２４号；第６，６１７，１１２号；第６，３０９，８２３号；第６，２８４，４６５号；および第５，７２３，３２０号は、当業者による多数のウイルス遺伝子型の素早い特定に容易に適合させることができる、関連のアレイ技術について記述する。
【００６４】
遺伝子特異的核酸分子を検出するための代替の診断方法では、例えばＰＣＲによってそれらの増幅を行い（米国特許第４，６８３，２０２号；第４，６８３，１９５号；第４，８００，１５９号；および第４，９６５，１８８号；PCR  Strategies、１９９５年、Innisら（編）、Academic  Press,  Inc.）、その後、当業者に周知の技法を使用して増幅分子を検出する。得られた増幅配列は、遺伝子変異が存在するか否かを決定するために、増幅された核酸がそれぞれの遺伝子の通常のコピーのみ含有した場合に予測され得るものと比較することができる。
【００６５】
ウイルス遺伝子生成物に対する抗体、即ちウイルスタンパク質またはウイルスペプチド断片を、ウイルスタンパク質中の変異を検出するのに使用することもできる。あるいは、目的のタンパク質のアミノ酸配列を得るために、目的のウイルスタンパク質またはペプチド断片を、当技術分野で公知の任意の配列決定方法によって配列決定することができる。そのような方法の例は、小タンパク質またはポリペプチドを配列決定するのに使用することができる、エドマン分解法である。より大きいタンパク質は、当技術分野で公知の化学または酵素試薬、例えば臭化シアン、ヒドロキシルアミン、トリプシン、またはキモトリプシンによって、最初に切断することができ、次いでエドマン分解法により配列決定することができる。
【００６６】
ＨＣＶ阻害剤に対する感受性を決定する表現型方法
ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を決定するための方法であって、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来のセグメントを含む耐性試験ベクターを細胞に導入するステップであって、細胞または耐性試験ベクターが、ＨＣＶに依存する検出可能なシグナルを生成する指標核酸を含むステップと；ＨＣＶ阻害剤の非存在下または漸増濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、細胞内での指標遺伝子の発現を測定するステップと；ＨＣＶ阻害剤に関する薬物感受性の標準曲線を作成するステップであって、ＩＣ９５倍率変化値が標準曲線で検出されるステップと；ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値を、対照ＨＣＶ集団のＩＣ９５倍率変化値と比較するステップと；対照ＨＣＶ集団に関するＩＣ９５倍率変化に比べて、ＩＣ９５倍率変化がＨＣＶ集団に関して高い場合は、ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤に対して低減した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するステップとを含む方法が提供される。
【００６７】
ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤はＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。一部の実施形態では、ＨＣＶは、ポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤はＮＳ５Ａを標的とする。一部の実施形態では、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、または遺伝子型４を含む。ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ある特定の実施形態において、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、または２ｂを含んでもよい。ある特定の具体的な実施形態では、対照ＨＣＶ集団が、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。ある特定のその他の具体的な実施形態では、対照ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者からのＨＣＶ集団である。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントおよび指標核酸を含む。一部の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法のある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。ある特定の実施形態では、方法は、患者に対して適切な処置レジメンの決定を容易にするのに使用される。ある特定の実施形態では、方法は、ＩＣ５０倍率変化値を決定するステップと、ＩＣ９５倍率変化値とＩＣ５０倍率変化値との比が検出されるのを決定するステップであって、比の変化が、阻害剤に対するＨＣＶの感受性の変化を示すステップをさらに含む。
【００６８】
ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を決定するための方法であって、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来のセグメントを含む耐性試験ベクターを細胞に導入するステップであって、細胞または耐性試験ベクターが、ＨＣＶに依存する検出可能なシグナルを生成する指標核酸を含むステップと；ＨＣＶ阻害剤の非存在下または漸増濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、細胞内での指標遺伝子の発現を測定するステップと；ＨＣＶ阻害剤に関するＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定するステップと；ＨＣＶ集団の標準曲線の勾配を対照ＨＣＶ集団の標準曲線の勾配と比較するステップと；対照集団の標準曲線と比較して、ＨＣＶ集団の標準曲線の勾配が低下している場合は、ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ阻害剤に対して低減した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するステップとを含む方法も提供される。ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤がＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。一部の実施形態では、ＨＣＶは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤はＮＳ５Ａを標的とする。一部の実施形態では、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、または遺伝子型４を含む。ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ある特定の実施形態において、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、または２ｂを含んでもよい。ある特定の具体的な実施形態では、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。ある特定のその他の具体的な実施形態では、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者からのＨＣＶ集団である。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む。一部の実施形態では、患者由来のセグメントが、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法のある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。ある特定の実施形態では、方法は、患者に対して適切な処置レジメンの決定を容易にするのに使用される。
【００６９】
ＨＣＶ阻害剤に対するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）集団の感受性を決定するための方法であって、ＨＣＶウイルス集団からの患者由来のセグメントを含む耐性試験ベクターを細胞に導入するステップであって、細胞または耐性試験ベクターが、ＨＣＶに依存する検出可能なシグナルを生成する指標核酸を含むステップと；ＨＣＶ阻害剤の非存在下または漸増濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、細胞内での指標遺伝子の発現を測定するステップと；ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の薬物感受性の標準曲線を決定するステップと；ＨＣＶ集団の最大阻害パーセンテージを、対照ＨＣＶ集団に関する最大阻害パーセンテージと比較するステップと；ＨＣＶ集団の最大阻害パーセンテージが対照集団の最大阻害パーセンテージに比べて低下している場合は、ＨＣＶ集団が、ＨＣＶ阻害剤に対して低減した感受性を有するＨＣＶ粒子を含むことを決定するステップとを含む方法も提供される。ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼを標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、例えば、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）または非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であってもよい。一部の実施形態では、ＨＣＶは、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とする非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤はＮＳ５Ａを標的とする。ある特定の態様では、ＨＣＶ阻害剤はＮＳ３を標的とする。一部の実施形態では、ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、または遺伝子型４を含む。ＨＣＶ集団および対照ＨＣＶ集団は、ある特定の実施形態においてＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、または２ｂを含んでもよい。ある特定の実施形態では、対照ＨＣＶ集団は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶまたはＨ７７  ＨＣＶを含む。ある特定のその他の具体的な実施形態では、対照ＨＣＶ集団は、ＨＣＶ阻害剤で処置する前の患者からのＨＣＶ集団である。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む。一部の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂ領域を含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらの方法の、ある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。ある特定の実施形態では、方法は、患者に対して適切な処置レジメンの決定を容易にするのに使用される。
【００７０】
表現型感受性解析
ある特定の実施形態では、特定のウイルスのＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための方法は、ＨＣＶ阻害剤の存在下で、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞中の指標遺伝子の活性を測定するステップと；測定された指標遺伝子の活性を、指標遺伝子の参照活性と比較するステップとを含み、参照活性に対して、測定された指標遺伝子の活性は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性に相関し、それによってＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が決定される。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の活性は、患者由来のセグメントによりコードされたポリペプチドの活性に依存する。好ましい実施形態では、患者由来のセグメントは、ＮＳ５Ｂをコードする核酸配列を含む。その他の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３またはＮＳ５Ａタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントはＨＣＶから得られる。
【００７１】
ある特定の実施形態では、指標遺伝子の参照活性は、ＨＣＶ阻害剤が存在しない状態で指標遺伝子の活性を決定することによって、決定される。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の参照活性は、ＮＩまたはＮＮＩに対する参照ＨＣＶの感受性を決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、参照活性は、標準的な実験室用ウイルスセグメントで本発明の方法を行うことによって決定される。ある特定の実施形態では、標準の実験室用ウイルスセグメントは、ＨＣＶ株Ｃｏｎ１またはＨ７７からの核酸配列を含む。
【００７２】
ある特定の実施形態では、ＨＣＶは、ＨＣＶ阻害剤に対して低減した感受性を有するように決定される。ある特定の実施形態では、ＨＣＶは、ＨＣＶ阻害剤に対して増大した感受性を有するように決定される。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントは、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、またはＰＣＲ反応単独で調製された。
【００７３】
ある特定の実施形態では、方法は、宿主細胞を培養する前に、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含むウイルス粒子を宿主細胞に感染させるステップをさらに含む。
【００７４】
ある特定の実施形態では、指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である。ある特定の実施形態では、指標遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である。ある特定の実施形態では、宿主細胞がヒト細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞がヒト肝細胞癌細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。その他の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７誘導体（例えば、Ｈｕｈ７．５、Ｈｕｈ７．５．１）である。Ｈｕｈ７．５細胞−ヒト肝細胞系は、安定して選択されたＨＣＶレプリコン含有細胞系をＩＦＮで治癒させることによって発生させた（Blight  KJら、J  Virol  ７６巻:１３００１〜１３０１４頁、２００２年）。ある特定のその他の実施形態では、宿主細胞がＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒトヘパトーマ細胞系由来である。ある特定の実施形態では、宿主細胞が初代培養肝細胞（例えば、胎児、成体、または再生肝由来）である。さらにその他の実施形態では、宿主細胞がリンパ球細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ腫）である。
【００７５】
別の態様では、本発明は、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ｂをコードする核酸配列を含む。ある特定の好ましい実施形態では、患者由来のセグメントは、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂをコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の活性は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂの活性に依存する。
【００７６】
ある特定の実施形態では、指標遺伝子は、機能性指標遺伝子である。ある特定の実施形態では、指標遺伝子が非機能性指標遺伝子である。ある特定の実施形態では、指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である。
【００７７】
別の態様では、本発明は、本発明のベクターを含むパッケージング宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、パッケージング宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である。ある特定の実施形態では、パッケージング宿主細胞がヒト宿主細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。その他の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７誘導体（例えば、Ｈｕｈ７．５、Ｈｕｈ７．５．１）である。Ｈｕｈ７．５細胞−ヒト肝細胞系は、安定して選択されたＨＣＶレプリコン含有細胞系をＩＦＮで治癒させることによって発生させた（Blight  KJら、J  Virol  ７６巻:１３００１〜１３０１４頁、２００２年）。ある特定のその他の実施形態では、宿主細胞がＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、またはこれらの誘導体である。ある特定の実施形態では、宿主細胞はヒトヘパトーマ細胞系由来である。ある特定の実施形態では、宿主細胞が初代培養肝細胞（例えば、胎児、成体、または再生肝由来）である。さらにその他の実施形態では、宿主細胞がリンパ球細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ腫）である。
【００７８】
別の態様では、本発明は、患者に感染するＨＣＶがＨＣＶ阻害剤に対して感受性があるかまたは耐性があるかを決定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本発明の方法によるＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を決定するステップと、ＨＣＶ阻害剤に対して決定されたＨＣＶの感受性を、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の標準曲線と比較するステップとを含む。ある特定の実施形態では、標準曲線に対する、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の低下は、ＨＣＶがＨＣＶ阻害剤に対して耐性があることを示す。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の低下の量は、ＨＣＶがＨＣＶ阻害剤に対して感受性がない程度を示す。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤は、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）またはプロテアーゼ阻害剤である。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤がインターフェロンである。一部の実施形態では、インターフェロンは、例えばペグ化インターフェロンα２ａ、ペグ化インターフェロンα２ｂ、ペグ化インターフェロンλ、その親もしくは誘導体、またはインターフェロンファミリーもしくはその誘導体であってＨＣＶに対して活性のある任意のメンバーを含んでもよい。その他の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤が、ポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを標的とする（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）、非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である。ある特定のその他の態様では、ＨＣＶ阻害剤がＮＳ５Ａを標的とする。ある特定のその他の態様では、ＨＣＶ阻害剤がＮＳ３を標的とする。ＨＣＶ阻害剤は、一部の実施形態において、下記の１種または下記の１種もしくは複数の組合せであってもよい：
ＮＳ３：
ＢＩＬＮ−２０６１、ＶＸ−９５０、ＳＣＨ−５０３，０３４、ＳＣＨ−９００，５１８、ＴＭＣ−４３５，３５０、Ｒ−７２２７  （ＩＴＭＮ−１９１）、ＭＫ−５１７２、ＭＫ−７００９、ＢＩ−２０１，３３５、ＢＭＳ−６５０，０３２、ＢＭＳ−８２４，３９３、ＰＨＸ−１７６６、ＡＣＨ−１６２５、ＡＣＨ−２６８４、ＶＸ−９８５、ＢＭＳ−７９１，３２５、ＩＤＸ−３２０、ＧＳ−９２５６、ＧＳ−９４５１、ＡＢＴ−４５０、ＶＸ−５００、ＢＩＴ−２２５
ＮＳ５Ａ：
ＢＭＳ−７９０，０５２、ＧＳＫ−２３３６８０５、ＰＰＩ−４６１、ＡＢＴ−２６７、ＧＳ−５８８５、ＡＣＨ−２９２８、ＡＺＤ−７２９５
ＮＳ５Ｂ：
ＮＭ−２８３、ＲＧ−７１２８、Ｒ−１６２６、ＰＳＩ−７８５１、ＩＤＸ−１８４、ＭＫ−０６０８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−９３８、ＧＳ−６６２０、ＴＭＣ−６４９，１２８、ＩＮＸ−１８９、ＶＸ−７５９、ＶＣＨ−９１６、ＶＸ−２２２、ＡＮＡ−５９８、ＨＣＶ−７９６、ＧＳ−９１９０、ＧＳ−９６６９、ＡＢＴ−３３３、ＰＦ−４８７８６９１、ＩＤＸ−３７５、ＡＢＴ−８３７，０９３、ＧＳＫ−６２５，４４３、ＡＢＴ−０７２。
【００７９】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する、患者に感染したＨＣＶの耐性の進行または発達を決定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、１回目に本発明の方法に従ってＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を決定するステップと；続く２回目に本発明の方法に従ってＨＣＶ阻害剤の有効性を評価するステップと；１回目および２回目に評価されたＨＣＶ阻害剤の有効性を比較するステップとを含む。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントは、ほぼ１回目に患者から得られる。ある特定の実施形態では、１回目と比較した、続く２回目のＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性の低下は、患者に感染するＨＣＶの、ＨＣＶ阻害剤耐性の発生または進行を示す。
【００８０】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する、患者に感染するＨＣＶの感受性を決定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、ＨＣＶから得られた患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む宿主細胞を培養するステップと、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤に関する宿主細胞内の指標遺伝子の活性を測定するステップと；ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶのＩＣ５０、ＩＣ９５、またはこれらの比を決定するステップであって、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶのＩＣ５０、ＩＣ９５、またはこれらの比がＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を示しているステップとを含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の活性は、患者由来のセグメントによりコードされたポリペプチドの活性に依存する。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、および／またはＮＳ３をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＨＣＶのＩＣ５０、ＩＣ９５、またはこれらの比は、観察された指標遺伝子の活性を、抗ＨＣＶ薬物濃度のｌｏｇに対してプロットすることにより決定することができる。あるいは、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性は、曲線で特定されたＨＣＶの勾配または最大阻害を参照ウイルスの曲線と比較することによって決定される。
【００８１】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する、患者に感染するＨＣＶの集団の感受性を決定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶ阻害剤の存在下で、ＨＣＶ集団からの複数の患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞内の指標遺伝子の活性を測定するステップと；測定された指標遺伝子の活性（ＩＣ５０、ＩＣ９５、もしくはこれらの比、または勾配もしくは最大阻害パーセンテージによって）を、指標遺伝子の参照活性と比較するステップとを含み、測定された指標遺伝子の活性と参照活性との間の差が、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性に相関し、それによってＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が決定される。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の活性は、複数の患者由来のセグメントによってコードされた複数のポリペプチドの活性に依存する。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ３をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、複数の患者由来のセグメントは、患者からの試料から得られた複数の核酸から患者由来のセグメントを増幅することによって調製される。
【００８２】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対する、患者に感染するＨＣＶの集団の感受性を決定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤の存在下で、ＨＣＶの集団からの複数の患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む宿主細胞を培養するステップと、様々な濃度のＨＣＶ阻害剤に関して、宿主細胞内の指標遺伝子の活性を測定するステップと；抗ウイルス薬に対するＨＣＶ集団のＩＣ５０、ＩＣ９５、またはこれらの比を決定するステップであって、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団のＩＣ５０、ＩＣ９５、またはこれらの比が、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶ集団の感受性を示すステップとを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の活性は、複数の患者由来のセグメントによりコードされた複数のポリペプチドの活性に依存する。ある実施形態では、複数の患者由来のセグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ３をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ集団のＩＣ５０、ＩＣ９５、またはこれらの比は、抗ＨＣＶ薬物濃度のｌｏｇに対して、観察された指標遺伝子の活性をプロットすることによって決定することができる。ある特定の実施形態では、複数の患者由来のセグメントは、患者からの試料から得られた複数の核酸から患者由来のセグメントを増幅することによって調製される。ある特定のその他の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性は、曲線で明らかにされたＨＣＶの勾配または最大阻害を、参照ウイルスの曲線と比較することによって決定される。
【００８３】
耐性試験ベクターの構築
ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントを指標遺伝子ウイルスベクターに挿入することによって作製することができる。一般に、そのような実施形態では、耐性試験ベクターは、完全に感染可能なウイルス粒子を生成するのに必要な全ての遺伝子を含むわけではない。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントをパッケージングベクターに挿入し、それと共に指標遺伝子を第２のベクターに、例えば指標遺伝子ウイルスベクターに含有させることによって作製することができる。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者由来のセグメントをパッケージングベクターに挿入し、それと共に指標遺伝子を、耐性試験ベクターに感染することになる宿主細胞ゲノムと一体化することによって、作製することができる。
【００８４】
薬物が、複数の機能性ウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を標的とした場合、各機能性ウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を含む患者由来のセグメントを、耐性試験ベクターに導入することができる。併用療法の場合、同じもしくは２種またはそれ超の異なる機能性ウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を標的とする２種またはそれ超の抗ＨＣＶ薬が評価され、そのような機能性ウイルスコード配列またはウイルス遺伝子産物のそれぞれを含む患者由来のセグメントを、耐性試験ベクターに挿入することができる。患者由来のセグメントは、選択された特定の構築物に応じて、指標遺伝子ウイルスベクターまたは例えばパッケージングベクター内の、患者配列アクセプター部位と呼ばれる独自の制限部位または指定場所に挿入することができる。
【００８５】
患者由来のセグメントは、限定することなく当業者に公知の適切なクローニング技法のいずれかを使用して、耐性試験ベクターに組み込むことができる。例えば、プラスミド主鎖および患者由来のセグメントの両方へのクラスＩＩ制限部位の導入を介したクローニングが好ましく、またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼプライマークローニングによる。
【００８６】
患者由来のセグメントは、分子クローニングもしくは遺伝子増幅、またはこれらの修正例の任意の方法によって、以下に記述する患者配列アクセプター部位を、耐性試験ベクターに導入される患者由来のセグメントの末端で導入することによって、得てもよい。好ましい実施形態では、ＰＣＲなどの遺伝子増幅法を使用して、患者配列アクセプター部位に相当する制限部位を、ＰＣＲ反応で使用されるプライマーの末端に組み込むことができる。同様に、ｃＤＮＡクローニングなどの分子クローニング法では、制限部位を、第１または第２のストランドｃＤＮＡ合成で使用されるプライマーの末端に組み込むことができ、またはＤＮＡのプライマー修復などの方法では、クローニングされたＤＮＡであってもクローニングされていないＤＮＡであっても、制限部位を、修復反応で使用されるプライマーに組み込むことができる。患者配列アクセプター部位およびプライマーは、患者由来のセグメントの提示が改善されるように設計することができる。設計された患者配列アクセプター部位を有する何組かの耐性試験ベクターは、１つの耐性試験ベクターのみにおいて提示不足になる可能性のある患者由来のセグメントの提示を可能にする。
【００８７】
耐性試験ベクターは、患者配列アクセプター部位を導入し、患者由来のセグメントを増幅しまたはクローニングし、増幅されまたはクローニングされた配列を、患者配列アクセプター部位で指標遺伝子ウイルスベクターに精密に導入することにより、指標遺伝子ウイルスベクターを修飾することによって、調製することができる。ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、指標遺伝子ウイルスベクターから構築することができ、即ち、以下にそのそれぞれが記述されるゲノムウイルスベクターまたはサブゲノムウイルスベクターおよび指標遺伝子カセットから誘導することができる。次いで耐性試験ベクターを、宿主細胞に導入することができる。あるいは、ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは、患者配列アクセプター部位をパッケージングベクターに導入し、患者由来のセグメントを増幅またはクローニングし、増幅またはクローニングされた配列をパッケージングベクターの患者配列アクセプター部位に正確に挿入し、このパッケージングベクターを指標遺伝子ウイルスベクターと共に同時トランスフェクトすることによって、調製することができる。
【００８８】
１つの好ましい実施形態では、耐性試験ベクターは、以下に定義されるように、パッケージング発現ベクターと共にパッケージング宿主細胞に導入されて、本明細書で「粒子ベース試験」と呼ばれる薬物耐性および感受性試験で使用される、耐性試験ベクターウイルス粒子を生成してもよい。代替の実施形態では、耐性試験ベクターは、本明細書では「非粒子ベース試験」と呼ばれる薬物耐性および感受性試験を実施するために、パッケージング発現ベクターが存在しない状態で宿主細胞に導入されてもよい。本明細書で使用される「パッケージング発現ベクター」は、パッケージングタンパク質（例えば、コアおよびエンベロープポリペプチドなどの構造タンパク質）、トランス作用因子、または複製欠損ＨＣＶにより必要とされる遺伝子などの因子を提供する。そのような状況において、複製能力のあるウイルスゲノムは、それ自体で複製できなくなるような手法で弱くなる。これは、パッケージング発現ベクターが、弱くなったゲノムを含有する細胞内に存在する欠損ウイルスゲノムを救済するのに必要なトランス作用または欠失遺伝子を生成することができるが、弱くなったゲノムはそれ自体を救済できないことを意味する。そのような実施形態は、完全に感染性のウイルス粒子を生成するのに必要な全てのウイルス遺伝子を含むわけではない、耐性試験ベクターを含むウイルス粒子を調製するのに特に有用である。
【００８９】
ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターは指標遺伝子を含むが、上述のように、指標遺伝子は、耐性試験ベクター内に必ずしも存在する必要はない。指標遺伝子の例には、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子、例えばＰｈｏｔｏｎｉｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）またはＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）のいずれかからのルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子、アルカリフォスファターゼ、緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする細菌性ＣＡＴ遺伝子が含まれるが、これらに限定するものではない。好ましい指標遺伝子は、ホタルルシフェラーゼである。指標遺伝子の追加の例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）などのアッセイによって容易に測定される分泌タンパク質または細胞表面タンパク質、例えば、増殖因子、サイトカイン、および細胞表面抗原（例えば、それぞれ成長ホルモン、Ｉｌ−２、またはＣＤ４）が含まれるが、これらに限定するものではない。さらにその他の例示的な指標遺伝子には、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞に関する適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、またはＥ．ｃｏｌｉ  ｇｐｔである。指標遺伝子の前述の例の場合、指標遺伝子および患者由来のセグメントは個別のものであり、即ち全く異なる別の遺伝子である。ある場合には、患者由来のセグメントは、指標遺伝子として使用されてもよい。患者由来のセグメントが、抗ＨＣＶ薬の標的である１つまたは複数のＨＣＶ遺伝子に対応する、１つのそのような実施形態では、ＨＣＶ遺伝子の１つが指標遺伝子として働いてもよい。例えば、ウイルスプロテアーゼ遺伝子は、それぞれの場合に発色反応を引き起こす、色素形成基質を切断するその能力または色素形成基質を切断する不活性チモーゲンを活性化するその能力により、指標遺伝子として働いてもよい。
【００９０】
上記にて論じたように、耐性試験ベクターは、指標遺伝子ウイルスベクターから組み立てることができる。本明細書で使用される「指標遺伝子ウイルスベクター」は、指標遺伝子と、その対照エレメントと、１つまたは複数のウイルス遺伝子またはコード領域とを含むベクターを指す。指標遺伝子ウイルスベクターは、以下に定義される指標遺伝子カセットおよび「ウイルスベクター」から組み立てることができる。指標遺伝子ウイルスベクターは、さらに、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化配列、転写終結因子、またはその他の調節配列を含んでもよい。さらに指標遺伝子ウイルスベクター内の指標遺伝子は、機能性であっても機能性でなくてもよい。抗ウイルス薬の標的であるウイルスセグメントが指標遺伝子ウイルスベクターに含まれない場合、それらは第２のベクターに提供することができる。「指標遺伝子カセット」は、指標遺伝子および対照エレメントを含み、任意選択で、ウイルスベクター内へのカセットの導入を容易にするために、その末端の制限酵素切断部位と共に構成される。「ウイルスベクター」は、下記のいくつかまたは全て、即ち：遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子、対照配列、ウイルスパッケージング配列、およびレトロウイルスの場合は統合配列の、いくつかまたは全てを含むベクターを指す。ウイルスベクターは、さらに、１つまたは複数のウイルスセグメントを含んでもよく、その１つまたは複数は、抗ウイルス薬の標的であってもよい。ウイルス遺伝子を含有するウイルスベクターの２つの例を、本明細書では「ゲノムウイルスベクター」および「サブゲノムウイルスベクター」と呼ぶ。「ゲノムウイルスベクター」は、ウイルス複製を不完全にするために、例えば完全感染性ウイルス粒子を生成するのに必要なタンパク質の全てを発現できないようにし、しかしその他の点については完全ウイルスのｍＲＮＡ発現およびプロセシング特性を保存するために、１つまたは複数のウイルス遺伝子の欠失を含んでもよいベクターである。ＨＣＶ薬感受性および耐性試験に関する一実施形態では、ゲノムウイルスベクターがＮＳ５Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ３コード領域を含む。「サブゲノムウイルスベクター」は、抗ウイルス薬の標的であるタンパク質をコードしてもよい１つまたは複数のウイルス遺伝子のコード領域を含むベクターを指す。好ましい実施形態では、サブゲノムウイルスベクターは、ＨＣＶポリメラーゼコード領域またはその一部分を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスコード遺伝子は、天然エンハンサー／プロモーターの制御下で存在することができる。ある特定の実施形態では、ウイルスコード領域は、外来ウイルスまたは細胞エンハンサー／プロモーターの制御下で存在することができる。好ましい実施形態では、ゲノムまたはサブゲノムウイルスコード領域は、天然エンハンサー／プロモーター領域またはＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサー／プロモーターの制御下で存在することができる。標的であり、または１つもしくは複数の抗ウイルス薬の標的であるタンパク質をコードする、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含有する指標遺伝子ウイルスベクターの、ある特定の実施形態では、ベクターは、患者配列アクセプター部位を含むことができる。患者由来のセグメントは、上述のように、耐性試験ベクターと後に呼ばれる指標遺伝子ウイルスベクター内の患者配列アクセプター部位に挿入することができる。
【００９１】
「患者配列アクセプター部位」は、患者由来のセグメントを挿入するための、ベクター内の部位である。ある特定の実施形態では、そのような部位は：１）ベクターに、部位特異的変異誘発により導入された、独自の制限部位；２）ベクター内の、天然に生ずる独自の制限部位；または３）代替のクローニング法（例えば、ＵＤＧクローニング）を使用して患者由来のセグメントを挿入してもよい、選択された部位であってもよい。ある特定の実施形態では、患者配列アクセプター部位は、部位特異的変異誘発によって指標遺伝子ウイルスベクターに導入される。患者配列アクセプター部位は、抗ウイルス薬の標的であるウイルスタンパク質のコード領域の内部または付近に位置付けることができる。患者配列アクセプター部位を導入するのに使用されるウイルス配列は、その位置で見出されたアミノ酸コード配列に変化がないように、好ましくは選択される。その位置でアミノ酸コード配列に変化があった場合、変化は、好ましくは保存的変化である。好ましくは、患者配列アクセプター部位は、患者由来のセグメントの導入を容易にするために、ウイルスゲノムの比較的保存された領域内に位置付けることができる。あるいは、患者配列アクセプター部位は、機能的に重要な遺伝子または調節配列の間に位置付けることができる。患者配列アクセプター部位は、対応する制限部位を患者由来のセグメントに導入するのに使用されるプライマーによってプライミングを可能にするために、比較的保存されたウイルスゲノム内の領域にまたは領域付近に位置付けてもよい。患者由来のセグメントの提示をさらに改善するために、そのようなプライマーを、ウイルス配列不均質性に順応する縮重プールとして設計してもよく、または多数の塩基対合能力を有するデオキシイノシン（Ｉ）などの残基を組み込んでもよい。同じまたは重なる制限部位間隔を定義する、患者配列アクセプター部位を有する何組かの耐性試験ベクターを、薬物耐性および感受性試験において一緒に使用して、所与の患者配列アクセプター部位と同一の内部制限部位を含有する患者由来のセグメントの提示を行ってもよく、したがって、耐性試験ベクター単独のいずれかにおいて提示不足になる可能性がある。
【００９２】
本発明のベクターの構築は、当技術分野で十分理解されている標準的なライゲーションおよび制限技法を用いる。例えば、Ausubelら、２００５年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology  Wiley--Interscience  and  Sambrookら、２００１年、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、N.Y.を参照されたい。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形に切断し、調整し、追放することができる。合成ＤＮＡを組み込む全てのＤＮＡ構築物の配列は、ＤＮＡ配列解析によって確認することができる。例えば、Sangerら、１９７７年、P.N.A.S.  USA  ７４巻:５４６３〜５４６７頁を参照されたい。
【００９３】
上記にて論じたエレメントに加え、本明細書で使用されるベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有してもよい。ある特定の実施形態では、選択遺伝子は、ベクターと共に形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要な、タンパク質をコードする。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、およびグルタミンシンターゼ遺伝子が含まれる。そのような選択マーカーを哺乳動物宿主細胞に移入するのに成功した場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧の下に配置された場合は生存することができる。選択的レジームには、２つの広く使用される全く異なるカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝と、補われた培地とは無関係に成長する能力に欠けている変異細胞系の使用とに基づく。第２のカテゴリーは、優性選択と呼ばれ、これは任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞系の使用を必要としない。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止させるために薬物を使用する。新規な遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現させると考えられ、選択物を生存させると考えられる。そのような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（SouthernおよびBerg、１９８２年、J.  Molec.  Appl.  Genet.  １巻:３２７頁参照）、ミコフェノール酸（MulliganおよびBerg、１９８０年、Science  ２０９巻:１４２２頁参照）、またはハイグロマイシン（Sugdenら、１９８５年、Mol.  Cell.  Biol.  ５巻:４１０〜４１３頁参照）を使用する。上記にて示した３つの例は、耐性を適切な薬物ネオマイシン（Ｇ４１８、ゲンチシン（genticin））、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンにそれぞれ伝達するために、真核制御下で細菌遺伝子を用いる。
【００９４】
宿主細胞
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む宿主細胞を培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞とすることができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ウイルス感染の主な標的であるヒト組織および細胞から誘導することができる。ヒト由来宿主細胞によれば、抗ウイルス薬を、細胞に効率的に進入させることが可能になりかつ細胞酵素の仕組みによって抗ウイルス阻害剤の代謝上関連ある形に変換することが可能になる。一部の実施形態では、宿主細胞を、本明細書では「パッケージング宿主細胞」、「耐性試験ベクター宿主細胞」、または「標的宿主細胞」と呼ぶことができる。「パッケージング宿主細胞」は、耐性試験ベクターウイルス粒子を生成するために、例えば耐性試験ベクターなど、本明細書で使用される複製欠損ウイルスベクターに必要とされる、トランス作用因子およびウイルスパッケージングタンパク質を提供する宿主細胞を指す。パッケージングタンパク質は、耐性試験ベクターそのもの、パッケージング発現ベクター、または両方の内部に含有されるウイルス遺伝子の発現を行ってもよい。パッケージング宿主細胞は、１つまたは複数のパッケージング発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞とすることができ、耐性試験ベクターがトランスフェクトされた場合は本明細書では「耐性試験ベクター宿主細胞」と呼ばれ、場合によってはパッケージング宿主細胞／耐性試験ベクター宿主細胞と呼ばれる。
【００９５】
ある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。その他の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７誘導体である（例えば、Ｈｕｈ７．５、Ｈｕｈ７．５．１）。Ｈｕｈ７．５細胞−ヒト肝細胞系は、安定に選択されたＨＣＶレプリコンを含有する細胞系をＩＦＮで治癒させることによって発生させた（Blight  KJら、J  Virol  ７６巻:１３００１〜１３０１４頁、２００２年）。ある特定のその他の実施形態では、宿主細胞がＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、宿主細胞が、ヒトヘパトーマ細胞系から誘導される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、初代培養肝細胞である（例えば、胎児、成体、または再生肝由来）。さらにその他の実施形態では、宿主細胞がリンパ球細胞である（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞リンパ球）。
【００９６】
他に提示しない限り、宿主細胞を形質転換するための本明細書で使用される方法は、Grahamおよびvan  der  Eb、１９７３年、Virology  ５２巻:４５６〜４５７頁のリン酸カルシウム共沈殿法である。トランスフェクションの代替の方法には、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション、および微粒子銃が含まれるが、これらに限定するものではない。例えば、Kriegler、１９９０年、Gene  Transfer  and  Expression:  A  Laboratory  Manual、Stockton  Pressを参照されたい。
【００９７】
宿主細胞は、本発明の発現ベクターがトランスフェクトされ、プロモーターを誘発させ形質転換体を選択しまたは遺伝子を増幅するのに適切であるように修飾された従来の栄養培地で培養することもできる。宿主細胞は、グルタミンが添加され抗生物質を含まないＦ１２：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）５０：５０で培養される。温度およびｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者に明らかにされよう。
【００９８】
薬物感受性および耐性試験
薬物感受性および耐性試験は、１つまたは複数の宿主細胞で実施されてもよい。ウイルス薬物感受性は、指標遺伝子発現の所与のパーセンテージが阻害される抗ウイルス薬の濃度として決定される（例えば、抗ウイルス薬に関するＩＣ５０は、指標遺伝子発現の５０％が阻害される濃度である）。所与の抗ウイルス薬の薬物感受性に関する標準曲線は、本発明の方法を使用して標準的な実験室用ウイルスセグメントまたは薬物耐性のない患者（即ち、いかなる抗ウイルス薬も投与されたことがない患者）からのウイルスセグメントに関して作成することができる。これに対応して、ウイルス薬耐性は、指標遺伝子発現の増大した阻害（即ち、低下した指標遺伝子発現）により決定されるように、薬物感受性をそのような所与の標準と比較することによりまたは同じ患者で経時的に逐次測定を行うことにより、所与の患者に関するウイルス薬感受性の低下を検出することによって決定することができる。
【００９９】
ある特定の実施形態では、耐性試験ベクターウイルス粒子は、パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクターおよびパッケージング発現ベクターをトランスフェクトすることによって調製された第１の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞そのもの）によって生成される。次いで耐性試験ベクターウイルス粒子を使用して、第２の宿主細胞（標的宿主細胞）に感染することができ、そこで指標遺伝子の発現が測定される。耐性試験ベクターがトランスフェクトされ後に耐性試験ベクター宿主細胞と呼ばれるパッケージング宿主細胞と、標的細胞とを含む、そのような２細胞系は、機能性または非機能性のいずれかの指標遺伝子の場合に使用される。機能性指標遺伝子は、パッケージング宿主細胞へのトランスフェクションによって効率的に発現し、したがって、耐性試験ベクター宿主細胞上澄みによる標的宿主細胞の感染は、薬物感受性を正確に決定するのに必要である。順序変更したプロモーター、順序変更したコード領域、または逆位イントロンを有する非機能性指標遺伝子は、パッケージング宿主細胞へのトランスフェクションによって効率的に発現せず、したがって標的宿主細胞の感染は、耐性試験ベクター宿主細胞および標的宿主細胞の共培養によって、または耐性試験ベクター宿主細胞上澄みを使用した標的宿主細胞の感染を通して、実現することができる。
【０１００】
薬物感受性および耐性試験の第２のタイプでは、単一宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）が、標的宿主細胞としても働く。パッケージング宿主細胞は、トランスフェクトされ、耐性試験ベクターウイルス粒子を生成し、パッケージング宿主細胞の一部は、耐性試験ベクター粒子によって感染の標的にもなる。単一宿主細胞型を用いる薬物感受性および耐性試験は、順序変更したプロモーター、順序変更したコード領域、または逆位イントロンを有する非機能性指標遺伝子を含むウイルス耐性試験ベクターにより可能である。そのような指標遺伝子は、第１の細胞へのトランスフェクションによって効率的に発現せず、第２の細胞の感染によってのみ効率的に発現し、したがって評価段階にある抗ウイルス薬の効果を測定する機会が提供される。機能性指標遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用した薬物感受性および耐性試験の場合、共培養手順も単一細胞型を使用した耐性および感受性試験も、標的細胞の感染に使用することができない。機能性指標遺伝子を含む耐性試験ベクターは、標的宿主細胞に感染させるため、耐性試験ベクター宿主細胞から濾過された上澄みを使用して、２細胞系を使用することができる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、粒子ベースの耐性試験を、パッケージング発現ベクターと共に同時トランスフェクトすることができる、ゲノムウイルスベクターから誘導された耐性試験ベクターで実施することができる。あるいは、粒子ベースの耐性試験は、パッケージング発現ベクターと共に同時トランスフェクションがなされたサブゲノムウイルスベクターから誘導された耐性試験ベクターで実施されてもよい。本発明の別の実施形態では、非粒子ベースの耐性試験は、パッケージング発現ベクターが存在しない状態で、選択された宿主細胞へのトランスフェクションにより、上述の耐性試験ベクターのそれぞれを使用して実施することができる。
【０１０２】
粒子ベースの感受性および耐性試験の場合、耐性試験ベクターウイルス粒子は、上述のように、パッケージング宿主細胞に耐性試験ベクターおよびパッケージング発現ベクターをトランスフェクトすることによって調製することができる、第１の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）によって生成することができる。次いで耐性試験ベクターウイルス粒子は、指標遺伝子の発現が測定される第２の宿主細胞（標的宿主細胞）に、感染するのに使用することができる。粒子ベースの感受性および耐性試験の第２のタイプでは、単一宿主細胞型（耐性試験ベクター宿主細胞）が両方の目的を果たし、所与の培養物におけるパッケージング宿主細胞の一部は、トランスフェクトすることができ耐性試験ベクターウイルス粒子を生成することができ、同じ培養物中の宿主細胞の一部は、そのように生成された耐性試験ベクター粒子による感染の標的とすることができる。単一宿主細胞型を用いる耐性試験は、順序変更したプロモーターを有する非機能性指標遺伝子を含む耐性試験ベクターで可能であるが、それはそのような指標遺伝子が、許容宿主細胞の感染によって効率的に発現できるが同じ宿主細胞型へのトランスフェクションによっては効率的に発現できないからであり、したがって、評価段階にある抗ウイルス薬の効果を測定する機会が提供される。同様の理由で、２細胞型を用いる耐性試験は、第１の細胞型の上澄みから得られたウイルス粒子を第２の細胞型に感染させる代替例として、２細胞型を共培養することによって実施されてもよい。
【０１０３】
非粒子ベースの感受性および耐性試験の場合、耐性試験は、パッケージング発現ベクターが存在しない状態で、単一宿主細胞に耐性試験ベクターをトランスフェクトすることによって行うことができる。非粒子ベースの耐性試験は、順序変更したプロモーター、順序変更したコード領域、または逆位イントロンのいずれかを有する非機能性指標遺伝子を含む耐性試験ベクターを使用して実施することができる。これらの非粒子ベースの耐性試験は、パッケージング発現ベクターが存在しない状態で単一宿主細胞型に各耐性試験ベクターをトランスフェクトすることによって行われる。これらの耐性試験ベクター内に含有される非機能性指標遺伝子は、宿主細胞へのトランスフェクションによって効率的に発現しないが、非ウイルス粒子ベースの逆転写から得られる検出可能な指標遺伝子発現がある。逆転写および鎖転移は、順序変更した非機能性指標遺伝子の、非順序変更機能性指標遺伝子への変換をもたらす。逆転写は、各耐性試験ベクター内に含有されるポリメラーゼ遺伝子の発現に完全に依存するので、抗ウイルス薬は、耐性試験ベクター内に含有される患者由来のセグメントによりコードされたポリメラーゼ遺伝子産物を阻害するその能力に関して試験されてもよい。
【０１０４】
パッケージング宿主細胞は、耐性試験ベクター宿主細胞を生成するために、耐性試験ベクターおよび適切なパッケージング発現ベクターをトランスフェクトすることができる。ある特定の実施形態では、個々の抗ウイルス薬は、適切な濃度範囲で、そのトランスフェクションの時点でパッケージング宿主細胞の個々のプレートに添加することができる。トランスフェクションから２４から４８時間後、標的宿主細胞は、共培養によって、耐性試験ベクター宿主細胞の濾過された上澄みから得られた耐性試験ベクター宿主細胞にまたは耐性試験ベクターウイルス粒子に感染することができる。各抗ウイルス薬またはそれらの組合せを、感染前または感染時に標的宿主細胞に添加して、トランスフェクションの最中に存在する所与の１種または複数の薬剤の同じ最終濃度を実現することができる。その他の実施形態では、抗ウイルス薬を、パッケージング宿主細胞培養物から省くことができ、感染前または感染時に宿主細胞にのみ添加することができる。
【０１０５】
共培養によってまたは濾過済みのウイルス上澄みに感染した標的宿主細胞での指標遺伝子の発現または阻害の決定は、指標遺伝子の発現または活性を測定して行うことができる。例えば、指標遺伝子がホタルｌｕｃ遺伝子である場合、ルシフェラーゼ活性を測定することができる。抗ウイルス薬がない状態での対照実験操作に比べ、１種または複数の所与の抗ウイルス薬の存在下で、耐性試験ベクターウイルス粒子の所与の調製物に感染した標的宿主細胞に関して観察されたルシフェラーゼ活性の低減は、一般に、Ｓ字形曲線としての抗ウイルス薬の濃度のｌｏｇに関連する。この阻害曲線は、耐性試験ベクター内に存在する患者従来のセグメントによってコードされたウイルス標的産物に関する、薬剤または薬剤の組合せの見掛けの阻害濃度（ＩＣ）を計算するのに使用することができる。
【０１０６】
１つの細胞感受性および耐性試験の場合、宿主細胞は、耐性試験ベクターおよび適切なパッケージング発現ベクターをトランスフェクトして、耐性試験ベクター宿主細胞を生成することができる。個々の抗ウイルス薬またはそれらの組合せを適切な濃度範囲で、トランスフェクトされた細胞の個々のプレートに、それらのトランスフェクション時に添加することができる。トランスフェクションから２４から７２時間後、細胞を収集し、指標遺伝子に関して、例えばホタルルシフェラーゼ、活性について、アッセイすることができる。培養物中のトランスフェクトされた細胞は指標遺伝子を効率的に発現せず、培養物中のトランスフェクトされた細胞は、培養物中の重感染細胞と同様に、指標遺伝子発現のための標的宿主細胞として働くことができる。抗ウイルス薬がない状態での対照実験操作に比べ、１種または複数の所与の抗ウイルス薬の存在下でトランスフェクトされた細胞に関して観察されたルシフェラーゼ活性の低減は、一般に、Ｓ字形曲線としての抗ウイルス薬の濃度のｌｏｇに関係する。この阻害曲線は、耐性試験ベクター内に存在する患者由来のセグメントによりコードされたウイルス標的産物に関し、薬剤または薬剤の組合せの見掛けの阻害濃度（ＩＣ）、勾配、および／または最大阻害パーセンテージを計算するのに使用することができる。
【０１０７】
抗ウイルス薬／薬物候補
試験システムに添加される抗ウイルス薬は、抗ウイルス薬の標的に応じて、選択された時点で添加することができる。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤は、ヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）またはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）である。ある特定の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤がインターフェロンである。一部の実施形態では、インターフェロンは、例えば、ペグ化インターフェロンα２ａ、ペグ化インターフェロンα２ｂ、ペグ化インターフェロンλ、上記の親もしくは誘導体、またはインターフェロンファミリーもしくはその誘導体であってＨＣＶに対して活性な、任意のメンバーを含んでもよい。その他の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤が非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）である。一部の実施形態では、ＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶポリメラーゼの部位Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを標的とするＮＮＩ（ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、ＮＮＩ−Ｃ、またはＮＮＩ−Ｄ）である。ＨＣＶ阻害剤は、一部の実施形態において、ＮＳ３−標的（例えば、ＢＩＬＮ−２０６１、ＶＸ−９５０、ＳＣＨ−５０３，０３４、ＳＣＨ−９００，５１８、ＴＭＣ−４３５，３５０、Ｒ−７２２７（ＩＴＭＮ−１９１）、ＭＫ−５１７２、ＭＫ−７００９、ＢＩ−２０１，３３５、ＢＭＳ−６５０，０３２、ＢＭＳ−８２４，３９３、ＰＨＸ−１７６６、ＡＣＨ−１６２５、ＡＣＨ−２６８４、ＶＸ−９８５、ＢＭＳ−７９１，３２５、ＩＤＸ−３２０、ＧＳ−９２５６、ＧＳ−９４５１、ＡＢＴ−４５０、ＶＸ−５００、ＢＩＴ−２２５）、ＮＳ５Ａ−標的（例えば、ＢＭＳ−７９０，０５２、ＧＳＫ−２３３６８０５、ＰＰＩ−４６１、ＡＢＴ−２６７、ＧＳ−５８８５、ＡＣＨ−２９２８、ＡＺＤ−７２９５）、またはＮＳ５Ｂ−標的（例えば、ＮＭ−２８３、ＲＧ−７１２８、Ｒ−１６２６、ＰＳＩ−７８５１、ＩＤＸ−１８４、ＭＫ−０６０８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−９３８、ＧＳ−６６２０、ＴＭＣ−６４９，１２８、ＩＮＸ−１８９、ＶＸ−７５９、ＶＣＨ−９１６、ＶＸ−２２２、ＡＮＡ−５９８、ＨＣＶ−７９６、ＧＳ−９１９０、ＧＳ−９６６９、ＡＢＴ−３３３、ＰＦ−４８７８６９１、ＩＤＸ−３７５、ＡＢＴ−８３７，０９３、ＧＳＫ−６２５，４４３、ＡＢＴ−０７２）、であってもよく、それと共にこれらの組合せであってもよく、標的宿主細胞の個々のプレートに、耐性試験ベクターウイルス粒子による感染時に、試験濃度で添加することができる。あるいは、抗ウイルス薬は、アッセイ全体を通して存在していてもよい。試験濃度は、典型的には約０．１ｎＭから約１００μＭの間、約１ｎＭから約１００μＭの間、約１０ｎＭから約１００μＭの間、約０．１ｎＭから約１０μＭの間、約１ｎＭから約１０μＭの間、約１０ｎＭから約１００μＭの間、約０．１ｎＭから約１μＭの間、約１ｎＭから約１μＭの間、または約０．０１ｎＭから約０．１μＭの間の濃度範囲から選択される。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、候補抗ウイルス化合物を、本発明の薬物感受性試験で試験することができる。候補抗ウイルス化合物は、候補抗ウイルスのタンパク質標的に応じて、適切な濃度でかつ選択された時に、試験システムに添加することができる。あるいは、複数の候補抗ウイルス化合物を試験してもよく、または１種の候補抗ウイルス化合物を、抗ウイルス薬と組み合わせて試験してもよい。候補抗ウイルス化合物の有効性は、指標遺伝子の活性を測定することによって評価することができる。候補化合物が、ウイルスポリペプチド活性の阻害時に有効である場合、指標遺伝子の活性は、候補化合物がない状態で観察された活性に比べ、候補化合物の存在下で低減することになる。本実施形態の別の態様では、薬物感受性および耐性試験を使用して、ウイルス変異体をスクリーニングしてもよい。公知の抗ウイルス薬または候補抗ウイルス薬に対する耐性変異体を特定した後、耐性変異体を単離し、ＤＮＡを解析することができる。したがってウイルス耐性変異体のライブラリーを組み立てて、単独でまたはその他の公知のもしくは推定される抗ウイルス薬と組み合わせて、候補抗ウイルス薬のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１０９】
ＨＣＶの複製能力を決定する方法
別の態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製能力を決定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、患者由来のセグメントおよび指標遺伝子を含む宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞内での指標遺伝子の活性を測定するステップとを含み、参照活性に対して測定された指標遺伝子の活性の間の指標遺伝子の活性はＨＣＶの複製能力を示し、それによってＨＣＶの複製能力が決定される。ある特定の実施形態では、指標遺伝子の活性は、患者由来のセグメントによりコードされたポリペプチドの活性に依存する。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントは、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３、および／またはＮＳ５Ａをコードする核酸配列を含む。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、指標遺伝子の参照活性は、標準の実験室用ウイルスセグメントで本発明の方法を行うことによって決定された、活性の量である。ある特定の実施形態では、標準の実験室用ウイルスセグメントは、ＨＣＶ株Ｃｏｎ１またはＨ７７からの核酸配列を含む。その他の実施形態では、参照ウイルスセグメントが、阻害剤で処置する前の患者ＨＣＶからの核酸配列である。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、ＨＣＶは、参照に対して増大した複製能力を有することが決定される。ある特定の実施形態では、ＨＣＶは、参照に対して低減した複製能力を有することが決定される。ある特定の実施形態では、宿主細胞がＨｕｈ７細胞である。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントがＮＳ５Ｂ、ＮＳ３、および／またはＮＳ５Ａをコードする。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、表現型解析を、組換えウイルスアッセイ（「ＲＶＡ」）を使用して行うことができる。ある特定の実施形態では、ＲＶＡは、相同組換えによってまたはウイルスベクターと患者のウイルスから増幅されたウイルス遺伝子配列との間に生成された、ウイルスストックを使用する。ある特定の実施形態では、患者のウイルスから増幅されたウイルス遺伝子配列をウイルスベクターに結合することによって、ＲＶＡウイルスストックが生成された。ある特定の実施形態では、患者由来のセグメントがＮＳ５Ｂ、ＮＳ３、および／またはＮＳ５Ａをコードする。
【０１１３】
複製能力を決定する方法は、例えば、増幅ウイルス遺伝子配列からの核酸と共に使用することができる。下記にて論じるように、核酸は、限定するものではないがウイルス遺伝子配列を含有するために、当業者に公知の任意の試料から増幅することができる。例えば試料は、ウイルスに感染したヒトもしくは動物からの試料、またはウイルス細胞の培養物からの試料とすることができる。ある特定の実施形態では、ウイルス試料は、遺伝子組換えされた実験室用株を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子組換えされた実験室用株が、部位特異的変異を含む。その他の実施形態では、ウイルス試料は、野生型分離株を含む。ある特定の実施形態では、野生型分離株は、処置を受けていない患者から得られる。ある特定の実施形態では、野生型分離株は、処置を経験した患者から得られる。
【０１１４】
次いで耐性試験ベクター（「ＲＴＶ」）は、遺伝子配列をベクターに組み込む当技術分野で公知の任意の方法を使用することにより、増幅ウイルス遺伝子配列を複製欠損ウイルスベクターに組み込むことによって構築することができる。一実施形態では、制限酵素および従来のクローニング法が使用される。Sambrookら、２００１年、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、第３版、NY;  およびAusubelら、１９８９年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscience、NYを参照されたい。好ましい実施形態では、ＡｐａＩ、ＰｉｎＡＩ、およびＸｈｏＩ制限酵素が使用される。好ましくは、複製欠損ウイルスベクターが、指標遺伝子ウイルスベクター（「ＩＧＶＶ」）である。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、ＲＴＶの複製を検出するための手段を含有する。好ましくは、ウイルスベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【０１１５】
アッセイは、最初に宿主細胞に、ＲＴＶ  ＤＮＡと、別のウイルス、例えば広宿主性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープタンパク質を発現するプラスミドとを同時トランスフェクトすることによって行うことができる。トランスフェクション後、ウイルス粒子を細胞培養物から収集し、これを使用して、様々な量の抗ウイルス薬の存在下で、新しい標的細胞に感染させることができる。新しい標的細胞における１回目のウイルス複製の終了は、ベクター内に含有される複製を検出する手段によって検出することができる。好ましい実施形態では、複製を検出するための手段は指標遺伝子である。好ましい実施形態では、指標遺伝子が、ホタルルシフェラーゼである。そのような好ましい実施形態では、ウイルス複製の１回目が終了した結果、ルシフェラーゼが生成される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、評価されるＨＣＶ株は、ＨＣＶの野生型分離株である。その他の実施形態では、評価されるＨＣＶ株は、ＨＣＶの変異株である。ある特定の実施形態では、そのような変異体は、患者から単離することができる。その他の実施形態では、変異体は、部位特異的変異誘発または当業者に公知のその他同等の技法によって構築することができる。さらにその他の実施形態では、変異体を細胞培養物から単離することができる。培養物は、抗ウイルス化合物の存在下で、細胞培養を通して多数の継代を含んで、そのような化合物の存在下で、培養物中に蓄積される変異を選択することができる。
【０１１７】
一実施形態では、ウイルス核酸、例えばＨＣＶ  ＲＮＡは、血漿試料から抽出され、ウイルスコード領域の断片または全体は、ＰＣＲなどであるがこれらに限定されない方法によって増幅することができる。例えば、Hertogsら、１９９８年、Antimicrob.  Agents  Chemother.  42(2):２６９〜７６頁を参照されたい。一例では、患者由来のセグメントを逆転写ＰＣＲで増幅し、次いで宿主細胞に、それらの配列のほとんどが欠失するプラスミドを同時トランスフェクトすることができる。次いで相同組換えにより、キメラウイルスを発生させることができる。キメラウイルスの複製能力は、当技術分野で公知の任意の細胞生存度アッセイによって決定することができ、参照の複製能力と比較して、ウイルスが変化した複製能力を有するかまたは抗ウイルス薬に対して耐性があるかもしくは過感受性であるかを評価することができる。ある特定の実施形態では、参照は、統計的に有意な数の個々のウイルス分離株の複製能力とすることができる。その他の実施形態では、参照は、Ｃｏｎ１またはＨ７７などの参照ウイルスの複製能力とすることができる。例えば、ＭＴ４細胞−３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドをベースにした細胞生存度アッセイを、高い試料スループットを可能にする自動システムで使用することができる。
【０１１８】
当業者に公知の抗ウイルス薬に対するウイルスの表現型感受性を評価するためのその他のアッセイは、複製能力を決定するようにまたは抗ウイルス薬感受性もしくは耐性を決定するように適応させることができる。
【０１１９】
当業者なら、ＨＣＶの複製能力を決定するための上述の方法を、ＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための方法を行うために容易に適応させることができることが理解されよう。同様に、当業者なら、阻害剤感受性を決定するための上述の方法を、ＨＣＶの複製能力を決定するための方法を行うために容易に適応させることができることが理解されよう。複製能力を決定するための方法の適応は、一般に、様々な濃度の抗ウイルス薬の存在下で本発明の方法を行うことを含むことができる。そのようにすることによって、薬物に対するＨＣＶの感受性を決定することができる。同様に、任意の抗ウイルス薬がない状態で阻害剤感受性を決定するための方法を行うことにより、方法で使用されるＨＣＶの複製能力の尺度を提供することができる。
【０１２０】
感受性または複製能力を決定するための、コンピュータ実装方法
別の態様では、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を決定しまたはＨＣＶの複製能力を決定するためのコンピュータ実装方法を提供する。そのような実施形態では、本発明の方法は、最新のコンピュータの処理能力を利用するように適合される。当業者なら、そのような手法で方法を容易に適応させることができる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を決定するためのコンピュータ実装方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本発明の方法により決定された指標遺伝子の活性および指標遺伝子の参照活性に関する情報と、本発明の方法により決定された指標遺伝子の活性を指標遺伝子の参照活性と比較する命令とを、コンピュータメモリに入力するステップと；本発明の方法により決定された指標遺伝子の活性を、コンピュータメモリ内で指標遺伝子の参照活性と比較するステップとを含み、参照活性に対する指標遺伝子の測定された活性の差が、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性に相関し、それによってＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性が決定される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を、コンピュータのディスプレーに表示するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を、紙上に印刷するステップをさらに含む。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、本発明の方法により決定されたＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を示すプリントアウトを提供する。さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法により決定されたＨＣＶ阻害剤に対するＨＣＶの感受性を示すデータを含む、コンピュータ可読性媒体を提供する。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶの複製能力を決定するためのコンピュータ実装方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本発明の方法により決定された指標遺伝子の活性および指標遺伝子の参照活性に関する情報と、本発明の方法により決定された指標遺伝子の活性を指標遺伝子の参照活性と比較する命令とを、コンピュータメモリに入力するステップと；本発明の方法により決定された指標遺伝子の活性を、コンピュータメモリ内で指標遺伝子の参照活性と比較するステップとを含み、指標遺伝子の測定された活性の、参照活性に対する比較が、ＨＣＶの複製能力を示し、それによってＨＣＶの複製能力が決定される。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶの複製能力をコンピュータのディスプレーに表示するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、ＨＣＶの複製能力を紙上に印刷するステップをさらに含む。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、ＨＣＶの複製能力を示すプリントアウトであって、複製能力が本発明の方法により決定されるプリントアウトを提供する。さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＶの複製能力を示すデータを含むコンピュータ可読性媒体であって、複製能力が本発明の方法により決定される媒体を提供する。
【０１２７】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法を行うためのコンピュータ可読性命令を含む製品を提供する。
【０１２８】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法を行うように構成されたコンピュータシステムを提供する。
【０１２９】
ウイルスおよびウイルス試料
当業者に公知の任意のウイルスは、限定するものではないが、本発明の方法で使用される患者由来のセグメントまたはウイルス配列の供給源として使用することができる。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＨＣＶであり、遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、遺伝子型４、遺伝子型５、または遺伝子型６であってもよい。本発明の一実施形態では、ウイルスが、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、または４である。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、または２ｂである。
【０１３０】
患者由来のセグメントまたはウイルス遺伝子配列が得られるウイルスは、ウイルス試料を得るために当技術分野で公知の任意の手段によって得られたウイルス試料中に見出すことができる。そのような方法には、ウイルスに感染した個体からウイルス試料を得ること、またはウイルス培養物からウイルス試料を得ることが含まれるが、これらに限定するものではない。一実施形態では、ウイルス試料は、ウイルスに感染したヒト個体から得られる。ウイルス試料は、感染した個体の身体の任意の部分またはウイルスを含有することが予測される任意の分泌物から得ることができる。そのような部分および分泌物の例には、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、精液、膣粘液、肝生検、およびその他の体液の試料が含まれるが、これらに限定するものではない。好ましい実施形態では、試料は、血液、血清、または血漿試料である。
【０１３１】
別の実施形態では、患者由来のセグメントまたはウイルスコード領域配列は、培養物から得ることができるウイルスから得ることができる。一部の実施形態では、培養物は、実験室から得ることができる。その他の実施形態では、培養物は、収集物、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得ることができる。
【０１３２】
別の実施形態では、患者由来のセグメントまたはウイルスコード領域配列は、遺伝子組換えされたウイルスから得ることができる。ウイルスは、ウイルスを遺伝子組換えするための当技術分野で公知の任意の方法を使用して、遺伝子組換えすることができる。例えば、ウイルスは、実験室の培養物中で所望の世代数に向けて成長させることができる。一実施形態では、選択圧を印加せず（即ち、ウイルスは、ある特徴を有するウイルスの複製を好む処置に供されない）、新しい変異が、ランダムな遺伝的浮動を通して蓄積される。別の実施形態では、選択圧が、培養物中で成長するときにウイルスに印加される（即ち、ウイルスは、１つまたは複数の特徴を有するウイルスの複製を好む条件下で成長する）。一実施形態では、選択圧は、抗ウイルス処置である。任意の公知の抗ウイルス処置は、選択圧として使用することができる。
【０１３３】
別の態様では、患者由来のセグメントまたはウイルスコード領域配列は、ウイルス、ウイルスゲノム、またはウイルスゲノムの一部を変異誘発させることによって作製することができる。当技術分野で公知の変異誘発の任意の方法は、この目的で使用することができる。ある特定の実施形態では、変異誘発は、本質的にランダムである。ある特定の実施形態では、本質的にランダムな変異誘発は、ウイルス、ウイルスゲノム、またはウイルスゲノムの部分を変異誘発処置に曝すことによって行われる。別の実施形態では、抗ウイルス療法の標的であるウイルスタンパク質をコードするコード領域または遺伝子が、変異誘発する。本質的にランダムな変異誘発処置の例には、例えば、変異誘発物質（例えば、臭化エチジウム、エチルメタンスルホネート、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）、放射線（例えば、紫外線）への曝露、転位因子（例えば、Ｔｎ５、Ｔｎ１０）の挿入および／または除去、または増大した変異誘発率を有する細胞、細胞抽出物、もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製系での複製が含まれる。例えば、Russellら、１９７９年、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA  ７６巻:５９１８〜５９２２頁；Russell,  W.、１９８２年、Environmental  Mutagens  and  Carcinogens:  Proceedings  of  the  Third  International  Conference  on  Environmental  Mutagensを参照されたい。当業者なら、変異誘発のこれらの方法のそれぞれは本質的にランダムであるが、分子レベルでは、それぞれがそれ自体の好ましい標的を有することが理解されよう。
【０１３４】
別の態様では、患者由来のセグメントまたはウイルスコード領域配列は、部位特異的変異誘発を使用して作製することができる。当技術分野で公知の部位特異的変異誘発の任意の方法を、使用することができる（例えば、Sambrookら、２００１年、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、第３版、NY；およびAusubelら、２００５年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscience、NY、SarkarおよびSommer、１９９０年、Biotechniques、８巻:４０４〜４０７頁参照）。部位特異的変異誘発は、例えば、特定のコード領域、遺伝子、もしくはゲノム領域、またはコード領域、遺伝子、もしくはゲノム領域の特定の部分、またはコード領域、遺伝子、もしくはゲノム領域内の１つもしくは数個の特定のヌクレオチドを対象とすることができる。一実施形態では、部位特異的変異誘発は、１つまたは複数の基準に基づいて、ウイルスゲノム領域、コード領域、遺伝子、遺伝子断片、またはヌクレオチドを対象とする。一実施形態では、コード領域もしくは遺伝子、またはコード領域もしくは遺伝子の一部分は、ＨＣＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＮＳ５Ｂコード領域またはその一部分など、抗ウイルス療法の標的であることが既知であるまたは疑われるタンパク質をコードするので、部位特異的変異誘発に供される。別の実施形態では、コード領域もしくは遺伝子の一部分、またはコード領域もしくは遺伝子内の１つもしくは数個のヌクレオチドは、部位特異的変異誘発用に選択される。一実施形態では、変異誘発されるヌクレオチドは、抗ウイルス化合物と相互作用することが既知であるまたは疑われるアミノ酸残基をコードする。別の実施形態では、変異誘発されるヌクレオチドは、１種または複数の抗ウイルス薬に対して耐性がありまたは感受性がありまたは過感受性があるウイルス株内で変異することが既知であるまたは疑われるアミノ酸残基をコードする。別の実施形態では、変異誘発したヌクレオチドは、抗ウイルス化合物と相互作用することが既知であるもしくは疑われる、または１種もしくは複数の抗ウイルス薬に対して耐性がありもしくは感受性がありもしくは過感受性があるウイルス株で変異することが既知であるもしくは疑われる、タンパク質残基の１次配列に隣接するまたは近くにあるアミノ酸残基をコードする。別の実施形態では、変異誘発したヌクレオチドは、抗ウイルス化合物と相互作用することが既知であるもしくは疑われる、または変化した複製能力を有するウイルス株で変異することが既知であるもしくは疑われる、タンパク質残基の２次、３次、または４次構造に隣接しまたはそれらの構造の近くにあるアミノ酸残基をコードする。別の実施形態では、変異誘発したヌクレオチドは、抗ウイルス化合物に結合することが既知であるまたは疑われるタンパク質の活性部位の中または近くにあるアミノ酸残基をコードする。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１）
表現型解析用の試料の調製
試料の調製および増幅
ほとんどの試料は、凍結血漿として得られ、ＨＣＶ遺伝子型および／またはサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、２、３、４）およびウイルス負荷を含む情報が添えられていた。試料を解凍し、必要に応じて凍結した一定分量を貯蔵し、２００μＬの一定分量を処理した。ウイルス粒子を、カオトロピック剤を含有する溶解緩衝液を添加することによって破砕した。ゲノムウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を、オリゴヌクレオチド結合磁気ビーズを使用して、ウイルス溶解物から抽出した。精製したｖＲＮＡを、逆転写酵素（ＲＴ）反応における第１ストランドｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。得られたｃＤＮＡを、ＮＳ５Ｂ領域全体の増幅をもたらすネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の第１ラウンドの鋳型として使用した。異なる遺伝子型同士の配列のばらつきにより、特定のＲＴと第１および第２ラウンドのＰＣＲプライマーを使用した。遺伝子型および／またはサブタイプ情報が利用できなかった場合、複数のプライマーの組を逐次または並行して使用することができる。
【０１３６】
耐性試験ベクターへの患者由来のセグメントのクローニング
第２ラウンド（ネステッド）ＰＣＲ増幅プライマーの組は、ＮＳ５Ｂ増幅産物を、表現型薬物感受性解析のためにＨＣＶレプリコン耐性試験ベクター（ＲＴＶ）にクローニングすることが可能な、制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含有していた。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動およびその後のカラムクロマトグラフィーにより精製して、残留プライマー、プライマー−ダイマー、および非特異的反応産物を除去し、次いで制限エンドヌクレアーゼ消化に供した。消化反応を、カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、次いで増幅産物をルシフェラーゼレポーターレプリコンＲＴＶに結合した。ライゲーション反応を使用して受容能力のあるＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。プラスミドＤＮＡを、シリカカラムクロマトグラフィーを使用して細菌培養物から精製し、分光光度法によって定量した。
【０１３７】
ＲＴＶ  ＲＮＡの調製
ＲＴＶ  のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の前に、プラスミドＤＮＡ鋳型を、制限エンドヌクレアーゼ消化によって直線化し、カラム精製した。ＲＴＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後にレプリコンＲＮＡを適切に終結させるため、肝炎δウイルスリボザイム配列を含有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡをカラム精製し、定量し、完全性を、電気泳動分離を使用して評価した。
【０１３８】
（実施例２）
ＨＣＶ阻害剤感受性を決定するための表現型解析
ＲＴＶ  ＲＮＡを、Ｈｕｈ７細胞系に電気穿孔し、電気穿孔された細胞を、連続希釈した阻害剤がない状態および存在下でインキュベートした。ＲＮＡの入力は、電気穿孔後４時間で電気穿孔細胞内で生成されたルシフェラーゼ活性の量を測定することによってモニタリングした。ルシフェラーゼ活性は、相対発光量（ＲＬＵ）として表される。複製能力（ＲＣ）は、ＲＮＡ入力および対照参照レプリコンＲＴＶ（Ｃｏｎ１）に対し、阻害剤がない状態で、電気穿孔後７２〜９６時間でルシフェラーゼ活性を評価することによって決定した。複製欠損Ｃｏｎ１レプリコン（Ｃｏｎ１ポリメラーゼ欠損）を利用して、アッセイバックグラウンドを決定した（データは示さず）。阻害剤感受性は、電気穿孔後７２〜９６時間で阻害剤がない状態および存在下で複製するＲＴＶの能力を評価することによって決定した。各連続希釈阻害剤濃度での阻害％は、下記の通り誘導された：
［１−（阻害剤の存在下でのルシフェラーゼ活性÷阻害剤がない状態でのルシフェラーゼ活性）］×１００
【０１３９】
阻害剤感受性プロファイル（曲線）をこれらの値から誘導し、阻害データ（例えば、ＩＣ５０、ウイルス複製を５０％低減させるのに必要とされる阻害剤濃度；およびＩＣ９５、ウイルス複製を９５％低減させるのに必要とされる阻害剤濃度）を、当て嵌め曲線から外挿した。阻害データは、同じアッセイバッチ（例えば、参照からのＩＣ５０倍率変化（ＦＣ））で処理された、参照ＲＴＶに対する倍率変化（例えば、ＩＣ５０（試料）／ＩＣ５０（参照））として報告される。ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイワークフローの一例を図１に示し、代表的な阻害剤感受性曲線を図２に示す。
【０１４０】
アッセイ精度は、十分特徴付けられたサブタイプ１ａ（Ｈ７７）および１ｂ（Ｃｏｎ１）参照配列と、ＨＣＶ  ＲｄＲｐの阻害剤に対して低減した感受性を与える変異を含有するように（データは示さず）部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によって設計製作されたサブタイプ１ａおよび１ｂ参照配列とのＮＳ５Ｂ領域を含有するＲＴＶのＨＣＶポリメラーゼ阻害剤感受性を評価することによって、評価した。阻害剤感受性データ（ＩＣ５０−ＦＣおよびＩＣ９５−ＦＣ）を、科学文献に報告された表現型データと一致させるために解析した。ＮＳ５Ｂ変異を含有するレプリコンは、ヌクレオシ（チ）ド（ＮＩ；Ｓ２８２Ｔ変異体）、および部位Ａを標的とする（ＮＮＩ−Ａ；Ｌ３９２ＩおよびＰ４９５Ａ／Ｌ変異体）、部位Ｂを標的とする（ＮＮＩ−Ｂ；Ｍ４２３Ｔ）、部位Ｃを標的とする（ＮＮＩ−Ｃ；Ｃ３１６ＹおよびＹ４４８Ｈ）、および部位Ｄを標的とする（ＮＮＩ−Ｄ；Ｃ３１６Ｙ）非ヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤に対する感受性の、予測される低減を示し、アッセイ精度を実証した（データは示さず）。
【０１４１】
阻害剤感受性測定におけるアッセイ内変動の解析から、複製物のＩＣ５０ＦＣおよびＩＣ９５ＦＣ値の９５％がそれぞれ、５３２のペアワイズ比較から１．３２および１．４倍の範囲内にあった。複製物ＲＣ値の９５％は、１０８のペアワイズ比較に基づいて、≦０．２２ｌｏｇ１０だけ変化した（図３）。阻害剤感受性測定におけるアッセイ内変動の解析から、複製物ＩＣ５０ＦＣおよびＩＣ９５ＦＣ値の９５％は、それぞれ２８５および２６０のペアワイズ比較から１．７５および１．７倍の範囲内にあった。複製物ＲＣ値の９５％は、５５のペアワイズ比較に基づいて≦０．２７ｌｏｇ１０だけ変化した（図３および４）。ウイルス負荷における３ｌｏｇ１０の範囲でのアッセイの直線性の評価は、ＩＣ５０ＦＣおよびＩＣ９５ＦＣ値の９５％が、２４３のペアワイズ比較からそれぞれ≦１．６２および１．７５倍の範囲内の変動を示すことを実証した。ＲＣ値の９５％は、連続希釈した血漿試料の５６のペアワイズ比較に基づいて、≦０．３ｌｏｇ１０だけ変動した（図３および４）。
【０１４２】
（実施例３）
ＲＢＶおよびＮＩに対する感受性を検出するためのＩＣ５０およびＩＣ９５の測定
リバビリンおよびヌクレオシ（チ）ド阻害剤に対する感受性を検出するのに、ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイの感受性を評価するために、ＧＴ１（ａ／ｂ）、ＧＴ２（ａ／ｂ／ｋ）、ＧＴ３（ａ／未知）、およびＧＴ４（ａ／ｄ／ｎ／未知）ウイルスからの患者由来のＮＳ５Ｂ領域を含有するレプリコンのパネルを作製した。様々なレプリコンを、本明細書に記述される表現型感受性アッセイで使用した。大多数のレプリコンは、阻害剤感受性を評価するのに十分な複製能力を示した（データは示さず）。ＩＦＮ、ＲＢＶ、およびＮＩに対する感受性は、生物学的なばらつきを評価するために試験した。生データを図５の表に示し、それらのデータを、図６にグラフで示す。図６では、阻害剤およびそのＩＣ値がｘ軸上に示され、参照ウイルス（Ｃｏｎ１  ＧＴ１ｂ）に対するＩＣ倍率変化をｙ軸上に示す。
【０１４３】
ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３、およびＧＴ４キメラレプリコンは、ＩＦＮに対して類似の感受性を有していた（図６Ａおよび６Ｂにおける左端の２つの群）。ＩＦＮ感受性は類似しているが、図６Ｃ、６Ｄ、および８に示すように、小さいが有意な差がある（以下に論じる）。ＧＴ１レプリコンは、ＲＢＶおよびＮＩに対して類似の感受性を有していた（図６Ａにおける右の４つのドット群）。同様に、ＧＴ１ａおよび１ｂウイルス間のＲＢＶおよびＮＩの差は類似しているが、図６Ｃ、６Ｄ、および８に示されるように小さいが有意な差がある。全体として、ＧＴ２、ＧＴ３、およびＧＴ４レプリコンは、ＲＢＶおよび／またはＮＩ感受性のばらつきを示し、多くのウイルスは、ＲＢＶおよび／またはＮＩに対して（図６Ｂにおける右の４つのドット群）増大した感受性を示している（最大約１０倍）。データを、図６Ｃおよび６Ｄに示されるように、遺伝子型サブタイプに関してさらに調査した。ＩＣ５０またはＩＣ９５倍率変化を、それぞれｙ軸上にプロットし、阻害剤およびＨＣＶ遺伝子型をｘ軸上にプロットした。
【０１４４】
ＧＴ１−４ウイルスからの、患者由来のＮＳ５Ｂ配列を含有するＨＣＶレプリコンのパネルを使用して、ＨＣＶ阻害剤感受性のばらつきを実証した。ＩＦＮ感受性は、遺伝子型の内部または遺伝子型同士で類似していた。ＲＢＶおよびＮＩ感受性は、ＧＴ１ａ／ｂ  ＮＳ５Ｂ領域を有するレプリコンの中で類似していたが、遺伝子型同士では、よりばらつきがあった。いくつかの非ＧＴ１ウイルスは、ＲＢＶおよび／またはＮＩに対して比較的増大した感受性を示した。この観察事項は、ＧＴ１ウイルスに比べ、非ＧＴ１ウイルスに感染した患者の中で、ＲＢＶおよび／またはＮＩ含有レジメンに対して改善されたＳＶＲ率に寄与し得る。したがって、そのような情報は、所与の個体に対して適切な処置レジメンを決定するのに有用と考えられる。
【０１４５】
これらのデータは、臨床試験設計、処置前判断（例えば、使用する薬物、組み合わせる薬物の数、処置持続時間）を知らせるのに、ならびに耐性を評価するのに、有用であってもよい。特に表現型データは、臨床結果データと併せて、例えば臨床カットオフを作製するためにアッセイの有用性をさらに強化することができる。
【０１４６】
（実施例４）
阻害剤感受性を検出するためのＩＣ５０ＦＣの測定
様々な阻害剤に対する種々の遺伝子型ウイルスの感受性を決定するために、ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイを使用した。ＧＴ１（ａ／ｂ）、ＧＴ２（ａ／ｂ／ｋ）、ＧＴ３（ａ／未知）、およびＧＴ４（ａ／ｄ／ｎ／未知）ウイルスからの、患者由来のＮＳ５Ｂ領域を含有する、レプリコンのパネルを作成した。様々なキメラレプリコンを、本明細書に記述される表現型感受性アッセイで使用した。インターフェロン（ＩＦＮ）、リバビリン（ＲＢＶ）、ヌクレオシド阻害剤−１（ＮＩ−１）、２’Ｃ−メチルアデノシン（２’ＣＭｅＡ）、ソホスブビル（ＳＯＦ）に対する感受性を試験して、生物学的ばらつきを評価した。生データを図９に示し、データの解析を図７の表に示し、統計的有意性を図８に示す。図７には、ウイルスの阻害剤および遺伝子型が示され、同様に、試験をした指標遺伝子型のウイルス数も示す（「値の数」）。各阻害剤に関する各ウイルス遺伝子型ごとの、メジアン、最大値、最小値、およびＩＣ５０倍率変化の範囲（参照ウイルスのＩＣ５０と比べた）を示す。試験をした遺伝子型の全ての間でのＩＣ５０倍率変化の範囲を、表の底部に示す。図８は、ウィルコクソン順位和検定を使用した、示されるような種々の遺伝子型のウイルス間での阻害剤に対する感受性のばらつきの有意性を示す。阻害剤を第１欄に示し、比較される２種のウイルスの遺伝子型を第２および第３欄に示す。統計的有意性を示す２種のウイルス間の感受性の差（ＩＣ５０倍率変化）は、第４欄に示す。
【０１４７】
図７の解析を作成するのに使用されるデータを、図９にグラフで示す。データの解析を図７および８に示し、そのデータを図８にグラフで示す。この図は、種々の遺伝子型ＧＴ１（ａ／ｂ）、ＧＴ２（ａ／ｂ／ｋ）、ＧＴ３（ａ／未知）、およびＧＴ４（ａ／ｄ／ｎ／未知）のウイルスのＩＦＮ、ＲＢＶ、ＮＩ−１、２’ＣＭｅＡ、およびＳＯＦに対する感受性のばらつきを実証する。参照ウイルス値と比べたＩＣ５０倍率変化をｙ軸上にプロットし、試験をしたウイルスの阻害剤および遺伝子型をｘ軸上に示す。
【０１４８】
上述のように、ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３、およびＧＴ４キメラレプリコンは、ＩＦＮに対して類似した感受性を有していた（図９における左端の８つの群）。ＧＴ１キメラレプリコンは、ＲＢＶ、ＮＩ、２’ＣｍｅＡ、およびＳＯＦに対して類似の感受性を有していた。全体的に、ＧＴ２、ＧＴ３、およびＧＴ４キメラレプリコンは、ＲＢＶに対する感受性で統計的に有意な増加（最大１５倍）を示し、ＧＴ３およびＧＴ４  ＮＳ５Ｂを含有するレプリコンは、特に感受性が高い。ＧＴ３およびＧＴ４キメラレプリコンは、ＧＴ１キメラレプリコンに比べて著しく低減したＳＯＦ感受性も示し、一方、ＧＴ２キメラレプリコンは増大した感受性を有し、ＧＴ２ａキメラレプリコンは、ＧＴ２ｂキメラレプリコンに比べてより増大した感受性を示していた（図８および図９）。その他のヌクレオシ（チ）ド阻害剤（ＮＩ）に対する感受性は、阻害剤および遺伝子型に応じて変化し、ＧＴ２およびＧＴ３ウイルスは共に、いくつかのＮＩに対して増大した感受性を示していた（図６Ｃ、６Ｄ、８、および９）。ＩＦＮ感受性は類似しているが、図６Ｃ、６Ｄ、および８に示されるように、小さいが有意な差がある。同様に、ＧＴ１ａおよび１ｂウイルスの間のＲＢＶおよびＮＩの差は類似しているが、図６Ｃ、６Ｄ、および８に示されるように小さいが有意な差がある。
【０１４９】
ＲＢＶおよびＳＯＦ感受性は、ＧＴ１ａ／ｂ  ＮＳ５Ｂを有するレプリコンの中で類似しており、しかし遺伝子型同士ではより可変であった。いくつかの非ＧＴ１ウイルスは、ＲＢＶに対して比較的増大した感受性を示した。この観察事項は、いくつかの非ＧＴ１ウイルスを有する患者の中の、ＲＢＶ含有レジメンに対するより高いＳＶＲを、部分的に説明することができる。全体として、ＧＴ３ウイルスは、ＧＴ２に比べてＳＯＦに対して低減した感受性を示し、これらの遺伝子型間での差別的なＳＯＦ／ＲＢＶ処置応答をさらに説明するのを助けることができる。これらのデータは、非ＧＴ１ウイルスに感染した患者の中で、ＲＢＶ、ＮＩ、２’ＣＭｅＡ、およびＳＯＦ含有レジメン、およびこれらの組合せに対する改善されたＳＶＲ率に寄与してもよい。したがってこの情報は、所与の個体に対して適切な処置レジメンおよび／または処置持続時間を決定するに際し、ヘルスケア提供者に有用と考えられる。これらのデータは、臨床試験設計、処置前判断（例えば、使用する薬物、組み合わせる薬物の数、処置持続時間）を知らせるのに、ならびに耐性を評価するのに有用でもある。特に表現型データは、臨床結果データと併せて、例えば臨床カットオフを作成するためにアッセイの有用性をさらに強化してもよい。
【０１５０】
（実施例５）
非ヌクレオシド阻害剤感受性を検出するためのＩＣ５０ＦＣおよびＩＣ９５ＦＣの測定
様々な非ヌクレオシド阻害剤に対する異なる遺伝子型ウイルスの感受性を決定するために、ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（登録商標）ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂアッセイを使用した。ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３、およびＧＴ４ウイルスからの、患者由来のＮＳ５Ｂ領域を含有するレプリコンのパネルを作成した。様々なキメラレプリコンを、本明細書に記述される表現型感受性アッセイで使用した。ＩＦＮ、ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、およびＮＮＩ−Ｄに対する感受性を試験して、生物学的ばらつきを評価した。結果を図１０に示す。参照Ｃｏｎ１ウイルス値と比べたＩＣ５０倍率変化を、図１０Ａのｙ軸上にプロットし、試験をしたウイルスの阻害剤および遺伝子型をｘ軸上に示す、同様に、参照Ｃｏｎ１ウイルス値と比べたＩＣ９５倍率変化を、図１０Ｂのｙ軸上にプロットし、試験をしたウイルスの阻害剤および遺伝子型をｘ軸上に示す。
【０１５１】
３種の異なるＮＮＩに対する種々の遺伝子型のウイルスの感受性は、その他の阻害剤で見られる場合よりも様々であった。ＧＴ２キメラレプリコンは、ＧＴ１キメラレプリコンおよび／またはＣｏｎ１参照に比べ、ＮＮＩ−Ａ、ＮＮＩ−Ｂ、およびＮＮＩ−Ｄ阻害剤に対して著しく低下した感受性を示した。ＧＴ３キメラレプリコンは、ＧＴ１キメラレプリコンおよび／またはＣｏｎ１参照に比べ、ＮＮＩ−Ｂ阻害剤に対しては著しく低下した感受性を、ＮＮＩ−ＡおよびＮＮＩ−Ｄ阻害剤に対しては増大した感受性を示した。ＧＴ４キメラレプリコンは、ＧＴ１キメラレプリコンおよび／またはＣｏｎ１参照に比べ、ＮＮＩ−ＢおよびＮＮＩ−Ｄ阻害剤に対して低下した感受性を有していた。ＮＮＩ−Ｄ阻害剤は、示される試験済みの遺伝子型の中で、汎遺伝子型活性を示すことができる。これらのデータは、所与の個体に対して適切な処置レジメンを決定するに際し、ヘルスケア提供者に有用と考えられる。これらのデータは、臨床試験設計、処置前判断（例えば、使用する薬物、組み合わせる薬物の数、処置持続時間）を知らせるのに、ならびに耐性を評価するのに有用でもある。特に、表現型データは、臨床結果データと併せて、例えば臨床カットオフを作成するためにアッセイの有用性をさらに強化することができる。
【０１５２】
本発明について、そのある特定の実施形態を参照しながら記述し例示してきたが、当業者なら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更、修正、および置換を行うことができることが理解されよう。本明細書で言及される全ての特許、公開特許出願、およびその他の非特許文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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