(57)【要約】本発明は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチドならびに、非活性化形態のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩＩａ受容体のαおよび／またはβサブユニットに特異的に結合する抗体およびその抗原結合分子を含んでいるキメラＦＶＩＩ分子を提供する。この抗体および抗原結合分子は、異種部分、例えば、半減期延長部分に遺伝的に融合および／または結合させることができる。さらに本発明には、これらのキメラ分子を生産する方法および使用する方法も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩ因子（「ＦＶＩＩ」）、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子であって、ここで前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、
（ａ）前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体と、同じＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのエピトープに特異的に結合する；
（ｂ）前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体への結合を競合的に阻害する；または
（ｃ）前記ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、または２８Ｆ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択されるＣＤＲまたはその変異体を少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ含む、
という特徴のうちの１つ以上を示す、前記キメラ分子。
【請求項２】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＣＤＲまたはその変異体を６つ含む、請求項１のキメラ分子。
【請求項３】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号２５、３１、３７、４３または１１１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２６、３２、３８、４４または１１２のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７、３３、３９、４５または１１３のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号２８、３４、４０、１１７、または１１４のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号２９、３５、４１、１１８、または１１５のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号３０、３６、４２、１１９、または１１６のいずれか１つと少なくとも約６０、７０、８０、９０、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項４】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）共通配列Ｘ１ＹＡＭＳ（ここでＸ１はアミノ酸残基Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＡｌａ（Ａ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）共通配列ＳＩＸ２Ｘ３ＧＸ４Ｘ５ＴＹＸ６Ｘ７ＤＳＶＫＸ８（ここでＸ２はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＡｓｎ（Ｎ）を表し、Ｘ３はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｙ（Ｇ）を表し、Ｘ４はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｙ（Ｇ）を表し、Ｘ５はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＴｈｒ（Ｔ）を表し、Ｘ６はアミノ酸残基Ｔｙｒ（Ｙ）またはＰｈｅ（Ｆ）を表し、Ｘ７はアミノ酸残基Ｌｅｕ（Ｌ）またはＰｒｏ（Ｐ）を表し、およびＸ８はアミノ酸残基Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｒｇ（Ｒ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）共通配列ＧＧＤＹＧＹＡＸ９ＤＹ（ここでＸ９はアミノ酸残基Ｌｅｕ（Ｌ）またはＭｅｔ（Ｍ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列ＲＡＳＳＳＶＮＹＭＹ（配列番号２８）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＹＴＳＮＬＡＰ（配列番号２９）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＦＳＳＳＰＷＴ（配列番号３０）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３。
【請求項５】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号２５、３１、３７、４３および１１１からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１配列；
（ｉｉ）配列番号２６、３２、３８、４４および１１２からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７、３３、３９、４５および１１３からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ３配列；
（ｉｖ）配列番号２８、３４、４０、１１７および１１４からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１配列；
（ｖ）配列番号２９、３５、４１、１１８および１１５からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ２配列；および、
（ｖｉ）配列番号３０、３６、４２、１１９および１１６からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ３配列、
を含む、請求項４のキメラ分子。
【請求項６】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、配列番号１、３、５、７、または９７のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨおよび配列番号２、４、６、９９、または９８のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、を含んでいるキメラ分子。
【請求項７】
前記ＶＨが配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号２のアミノ酸配列を含む（３４Ｄ１０抗体）、請求項６のキメラ分子。
【請求項８】
前記ＶＨが配列番号３のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号４のアミノ酸配列を含む（２Ａ２抗体）、請求項６のキメラ分子。
【請求項９】
前記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号６のアミノ酸配列を含む（３６Ａ８抗体）、請求項６のキメラ分子。
【請求項１０】
前記ＶＨが配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号９９のアミノ酸配列を含む（４Ｂ１１抗体）、請求項６のキメラ分子。
【請求項１１】
前記ＶＨが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号９８のアミノ酸配列を含む（３５Ｄ１抗体）、請求項６のキメラ分子。
【請求項１２】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインまたはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の細胞外ドメインにあるエピトープに結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項１３】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項１４】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号４６、５２、１２０、または１２６のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号４７、５３、１２１、または１２７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号４８、５４、１２２、または１２８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４９、５５、１２３、または１２９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５０、５６、１２４、または１３０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号５１、５７、１２５、または１３１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項１５】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、配列番号８、１０、１００、または１０２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨおよび配列番号９、１１、１０１、または１０３のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを含む、請求項１、２および１４のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項１６】
前記ＶＨが配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号９のアミノ酸配列を含む（１Ｈ６抗体）、請求項１５のキメラ分子。
【請求項１７】
前記ＶＨが配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１１のアミノ酸配列を含む（３８Ａ８抗体）、請求項１５のキメラ分子。
【請求項１８】
前記ＶＨが配列番号１００のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１０１のアミノ酸配列を含む（３８Ｇ８抗体）、請求項１５のキメラ分子。
【請求項１９】
前記ＶＨが配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１０３のアミノ酸配列を含む（２１Ｆ１０抗体）、請求項１５のキメラ分子。
【請求項２０】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインに局在しているエピトープに結合する、請求項１、２および１４〜１９のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に競合する、請求項１、２および１４〜２０のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項２２】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号５８と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号５９と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号６０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号６１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号６２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および
（ｖｉ）配列番号６３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項２３】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、配列番号１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨおよび配列番号１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを含む（１８Ｆ７抗体）、請求項１、２および２２のキメラ分子。
【請求項２４】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインに局在しているエピトープに結合する、請求項２２または２３のキメラ分子。
【請求項２５】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に競合する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項２６】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号６４、７０、または１３５のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号６５、７１、または１３６のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号６６、７２、または１３７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号６７、１３２、または１３８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号６８、１３３、または１３９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号６９、１３４、または１４０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項２７】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列ＳＹＷＩＥ（配列番号６４）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）共通配列ＥＩＬＰＧＸ１４ＧＸ１５ＴＫＹＮＸ１６ＫＦＫＧ（配列番号＿＿）（ここでＸ１４はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）を表し、Ｘ１５はアミノ酸残基Ｉｌｅ（Ｉ）またはＴｙｒ（Ｙ）を表し、およびＸ１６はアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列ＬＩＳＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号６６）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６７）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号６８）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ（配列番号６９）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３。
【請求項２８】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、配列番号１４、１６、または１０５のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨおよび配列番号１５、１０４、または１０６のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを含む、請求項１、２、２６および２７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項２９】
前記ＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１５のアミノ酸配列を含む（１２Ｂ２抗体）、請求項２８のキメラ分子。
【請求項３０】
前記ＶＨが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１０４のアミノ酸配列を含む（３８Ｆ６抗体）、請求項２８のキメラ分子。
【請求項３１】
前記ＶＨが配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１０６のアミノ酸配列を含む（１３Ｃ１抗体）、請求項２８のキメラ分子。
【請求項３２】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインに局在しているエピトープに結合する、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項３３】
前記ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合しない、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項３４】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８５または１４７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８６または１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８７または１４９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号１４１、１４４、８２、８８、または１５０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号１４２、１４５、８３、８９、または１５１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号１４３、１４６、８４、９０、または１５２のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項３５】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、配列番号１７、１８、１９、２１、または１０９のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨおよび配列番号１０７、１０８、２０、２２、または１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを含む、請求項１、２および３４のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項３６】
前記ＶＨが配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいる（５Ｃ４抗体）、請求項３５のキメラ分子。
【請求項３７】
前記ＶＨが配列番号１８のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいる（２３Ｃ１０抗体）、請求項３５のキメラ分子。
【請求項３８】
前記ＶＨが配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号１１０のアミノ酸配列を含んでいる（３７Ｃ７抗体）、請求項３５のキメラ分子。
【請求項３９】
前記ＶＨが配列番号１９のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号２０のアミノ酸配列を含んでいる（２８Ｃ２抗体）、請求項３５のキメラ分子。
【請求項４０】
前記ＶＨが配列番号２１のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬが配列番号２２のアミノ酸配列を含んでいる（９Ｄ６抗体）、請求項３５のキメラ分子。
【請求項４１】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインに局在しているエピトープに結合する、請求項１、２および３４〜４０のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項４２】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に競合する、請求項１、２および３４〜４１のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項４３】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号９１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号９２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号９３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号９４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号９５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および
（ｖｉ）配列番号９６と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項４４】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、配列番号２３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨおよび配列番号２４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを含む（２８Ｆ４抗体）、請求項１、２および４３のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項４５】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインに局在しているエピトープに結合する、請求項４４のキメラ分子。
【請求項４６】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に競合する、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項４７】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が、
（ａ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦＶ」）；
（ｂ）ディアボディ；
（ｃ）ミニボディ；
（ｄ）抗体のポリペプチド鎖；
（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；または、
（ｄ）Ｆ（ａｂ）
を含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項４８】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が血小板の機能を阻害しない、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項４９】
前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子が血小板を活性化しない、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５０】
前記キメラ分子が血小板減少症を誘発しない、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５１】
前記ＦＶＩＩが活性型ＦＶＩＩ（「ＦＶＩＩａ」）である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５２】
ＦＶＩＩと前記ＸＴＥＮポリペプチドとの間、ＦＶＩＩと前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子との間、または前記ＸＴＥＮポリペプチドと前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子との間に、随意のリンカーをさらに含んでいる、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５３】
（ａ）ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｘ−（Ｌ２）−Ｔｍ；
（ｂ）ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−Ｘ；
（ｃ）Ｔｍ−（Ｌ１）−Ｘ−（Ｌ２）−ＦＶＩＩ；
（ｄ）Ｔｍ−（Ｌ１）−ＦＶＩＩ−（Ｌ２）−Ｘ；
（ｅ）Ｘ−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−ＦＶＩＩ；および、
（ｆ）Ｘ−（Ｌ１）−ＦＶＩＩ−（Ｌ２）−Ｔｍ；
からなる群より選択される式を含む請求項１〜５２のいずれか１項に記載のキメラ分子であって、式中、
ＦＶＩＩはＦＶＩＩａであり、
Ｘは前記ＸＴＥＮポリペプチドであり、
Ｔｍは前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；
Ｌ１は第一の随意のリンカーであり、および、
Ｌ２は第二の随意のリンカーである、
前記キメラ分子。
【請求項５４】
互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と前記ＸＴＥＮポリペプチドを含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖と前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む；
（ｂ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖と前記ＸＴＥＮポリペプチドを含む；
（ｃ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖、前記ＸＴＥＮポリペプチドおよび前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順序で含み、かつ、前記第二の鎖はＦＶＩＩの重鎖を含む；または
（ｄ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、前記第二の鎖はＦＶＩＩの重鎖、前記ＸＴＥＮポリペプチドおよび前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順序で含む、
請求項１〜５０のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５５】
互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ｇ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＨの式を含む；
（ｈ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＨの式を含む；
（ｉ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨの式を含む；
（ｊ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨの式を含む；
（ｋ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、または、および、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨの式を含む；または、
（ｌ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨの式を含む、
請求項１〜５０のいずれか１項に記載のキメラ分子であって、
式中、
ＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；
Ｔｍは前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；
ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；
Ｘは前記ＸＴＥＮポリペプチドである、
前記キメラ分子。
【請求項５６】
（ｆ）Ｘ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ；
（ｇ）Ｔｍ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ；
（ｈ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍまたはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；
（ｉ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸまたはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；
（ｊ）ＦＶＩＩＬ−Ｘ−Ｔｍ：ＦＶＩＩＨまたはＦＶＩＩＨ：Ｔｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬ；および、
（ｋ）ＦＶＩＩＬ−Ｔｍ−Ｘ：ＦＶＩＩＨまたはＦＶＩＩＨ：Ｔｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬ、
からなる群より選択される式を含んでいる請求項１〜５０のいずれか１項に記載のキメラ分子であって、
式中、
ＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；
Ｔｍは前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；
ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；
Ｘは前記ＸＴＥＮポリペプチドであり、
（：）は２つのポリペプチド鎖の接続である、
前記キメラ分子。
【請求項５７】
前記第一のポリペプチド鎖と前記第二のポリペプチド鎖との前記接続が共有結合または非共有結合である、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５８】
前記第一のポリペプチド鎖と前記第二のポリペプチド鎖との前記接続が、ＦＶＩＩの前記重鎖と前記軽鎖との間の共有結合である、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項５９】
前記共有結合がジスルフィド結合である、請求項５８のキメラ分子。
【請求項６０】
一本鎖のポリペプチド鎖を含む請求項１〜５０のキメラ分子であって、前記一本鎖ポリペプチド鎖がＮ末端からＣ末端方向に、
（ａ）ＦＶＩＩの軽鎖、前記ＸＴＥＮポリペプチド、プロテアーゼ切断部位、ＦＶＩＩの重鎖および前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含むか、または、
（ｂ）ＦＶＩＩの軽鎖、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、プロテアーゼ切断部位、ＦＶＩＩの重鎖および前記ＸＴＥＮポリペプチドを含む、
前記キメラ分子。
【請求項６１】
前記プロテアーゼ切断部位が細胞内プロセシング部位である、請求項６０のキメラ分子。
【請求項６２】
前記細胞内プロセシング部位がプロタンパク質転換酵素によって処理される、請求項６１のキメラ分子。
【請求項６３】
前記プロタンパク質転換酵素がＰＣ５、ＰＡＣＥ、ＰＣ７、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項６２のキメラ分子。
【請求項６４】
互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子であって、ここで、
（ｅ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖と血小板に結合する標的化部分を含む；
（ｆ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と血小板に結合する標的化部分を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含む；
（ｇ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分を含む；または、
（ｈ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分、またはＸＴＥＮポリペプチドを含む、
前記キメラ分子。
【請求項６５】
請求項６４のキメラ分子であって、ここで、
（ｅ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＨの式を含み；
（ｆ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＨの式を含み；
（ｇ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨの式を含み；または、
（ｈ）前記第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、前記第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
式中、
ＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの前記重鎖であり；
Ｔｍは血小板に結合する前記標的化部分であり、
ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの前記軽鎖であり；
Ｘは前記ＸＴＥＮポリペプチドである、
前記キメラ分子。
【請求項６６】
（ｅ）Ｘ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−ＴｍまたはＴｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ−Ｘ；
（ｆ）Ｔｍ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−ＸまたはＸ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ−Ｔｍ；
（ｇ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍまたはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；および、
（ｈ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸまたはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；
からなる群より選択される式を含んでいる請求項６４のキメラ分子であって、
式中、
ＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの前記重鎖であり；
Ｔｍは血小板に結合する前記標的化部分であり、
ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの前記軽鎖であり；
Ｘは前記ＸＴＥＮポリペプチドであり；および、
（：）は２つのポリペプチド鎖の接続である、
前記キメラ分子。
【請求項６７】
前記第一のポリペプチド鎖と前記第二のポリペプチド鎖との前記接続が共有結合または非共有結合である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項６８】
前記第一のポリペプチド鎖と前記第二のポリペプチド鎖との前記接続が、ＦＶＩＩの前記重鎖と前記軽鎖との間の共有結合である、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項６９】
前記共有結合がジスルフィド結合である、請求項６８のキメラ分子。
【請求項７０】
一本鎖ポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子であって、前記一本鎖ポリペプチド鎖がＮ末端からＣ末端方向に、
（ａ）ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、および血小板に結合する標的化部分；
（ｂ）ＦＶＩＩの軽鎖、血小板に結合する標的化部分、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、およびＸＴＥＮポリペプチド；
（ｃ）ＦＶＩＩの軽鎖、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分；
（ｄ）ＦＶＩＩの軽鎖、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分、およびＸＴＥＮポリペプチドを含む、
前記キメラ分子。
【請求項７１】
前記プロテアーゼ切断部位が細胞内プロセシング部位である、請求項７０のキメラ分子。
【請求項７２】
前記細胞内プロセシング部位がプロタンパク質転換酵素によって処理される、請求項７１のキメラ分子。
【請求項７３】
前記プロタンパク質転換酵素がＰＣ５、ＰＡＣＥ、ＰＣ７、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項７２のキメラ分子。
【請求項７４】
前記標的化部分が、抗体またはその抗原結合分子、受容体の受容体結合部分、およびペプチドからなる群より選択される、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項７５】
前記標的化部分が休止状態にある血小板または活性状態にある血小板に選択的に結合する、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項７６】
前記標的化部分が、ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、ＧＰＩＸ、非活性化形態の糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」）、活性化形態のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＯＸ−１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的に選択的に結合する、請求項６４〜７５のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項７７】
前記標的化分子が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに結合する抗体またはその抗原結合分子である、請求項７６のキメラ分子。
【請求項７８】
ＦＶＩＩの半減期が、前記重鎖と前記軽鎖からなるＦＶＩＩａよりも長い、請求項１〜７７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項７９】
ＦＶＩＩの前記半減期が、前記重鎖と前記軽鎖からなるＦＶＩＩａよりも少なくとも約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、または約１５倍長い、請求項７８のキメラ分子。
【請求項８０】
ＦＶＩＩの凝固活性が、前記重鎖と前記軽鎖からなるＦＶＩＩａと同じかまたはそれよりも高い、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項８１】
前記凝固活性がＲＯＴＥＭアッセイによって測定される、請求項８０のキメラ分子。
【請求項８２】
前記凝固活性がａＰＴＴアッセイによって測定される、請求項８１のキメラ分子。
【請求項８３】
前記ＸＴＥＮポリペプチドが、ＡＥモチーフ、ＡＧモチーフ、ＡＤモチーフ、ＡＭモチーフ、ＡＱモチーフ、ＡＦモチーフ、ＢＣモチーフ、ＢＤモチーフ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜８２のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項８４】
前記ＸＴＥＮポリペプチドが、約４２個のアミノ酸、約７２個のアミノ酸、約１０８個のアミノ酸、約１４４個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸、約２１６個のアミノ酸、約２５２個のアミノ酸、約２８８個のアミノ酸、約３２４個のアミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約３９６個のアミノ酸、約４３２個のアミノ酸、約４６８個のアミノ酸、約５０４個のアミノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５７６個のアミノ酸、約６１２個のアミノ酸、約６２４個のアミノ酸、約６４８個のアミノ酸、約６８４個のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、約７５６個のアミノ酸、約７９２個のアミノ酸、約８２８個のアミノ酸、約８３６個のアミノ酸、約８６４個のアミノ酸、約８７５個のアミノ酸、約９１２個のアミノ酸、約９２３個のアミノ酸、約９４８個のアミノ酸、約１０４４個のアミノ酸、約１１４０個のアミノ酸、約１２３６個のアミノ酸、約１３１８個のアミノ酸、約１３３２個のアミノ酸、約１４２８個のアミノ酸、約１５２４個のアミノ酸、約１６２０個のアミノ酸、約１７１６個のアミノ酸、約１８１２個のアミノ酸、約１９０８個のアミノ酸、約２００４個のアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８３のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項８５】
前記ＸＴＥＮポリペプチドが、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項８４のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項８６】
前記ＸＴＥＮポリペプチドが、配列番号２２４〜２３９、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項８５のキメラ分子。
【請求項８７】
ＦＶＩＩの前記軽鎖と前記ＸＴＥＮポリペプチド、ＦＶＩＩの前記重鎖と前記標的化部分、またはその両方をつなぐリンカーをさらに含んでいる、請求項５４〜５９、６４〜６９、および７４〜９７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項８８】
ＦＶＩＩの前記軽鎖と前記標的化部分、ＦＶＩＩの前記重鎖と前記ＸＴＥＮポリペプチド、またはその両方をつなぐリンカーをさらに含んでいる、請求項５４〜５９、６４〜６９、および７４〜９７のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項８９】
前記リンカーが、少なくともアミノ酸を約１個、アミノ酸を約１０個、アミノ酸を約２０個、アミノ酸を約３０個、アミノ酸を約４０個、アミノ酸を約５０個、アミノ酸を約６０個、アミノ酸を約７０個、アミノ酸を約８０個、アミノ酸を約９０個、アミノ酸を約１００個、アミノ酸を約１１０個、アミノ酸を約１２０個、アミノ酸を約１３０個、アミノ酸を約１４０個、アミノ酸を約１５０個、アミノ酸を約１６０個、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８７または８８のキメラ分子。
【請求項９０】
前記リンカーが［（Ｇｌｙ）ｘ−Ｓｅｒｙ］ｚの式を有するペプチドを含み、式中、ｘは１〜４、ｙは０または１、およびｚは１〜５０である、請求項８７〜８９のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項９１】
ＦＶＩＩの前記重鎖が、配列番号１７８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一を含む、請求項１〜９０のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項９２】
ＦＶＩＩの前記軽鎖が、配列番号１７９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一を含む、請求項１〜９１のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項９３】
配列番号１９２または配列番号１９３によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９２のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項９４】
配列番号１９２または配列番号１９３によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項９３のキメラ分子。
【請求項９５】
ＦＶＩＩの前記重鎖、ＦＶＩＩの前記軽鎖、前記ＸＴＥＮポリペプチド、前記標的化部分、またはそれらの任意の組み合わせに融合させた異種部分をさらに含む、請求項１〜９４のいずれか１項に記載のキメラ分子。
【請求項９６】
前記異種部分がポリペプチド性の部分であるかまたは非ポリペプチド性の部分である、請求項９５に記載のキメラ分子。
【請求項９７】
前記異種部分が、ＦＶＩＩの前記半減期を延長する、請求項９６に記載のキメラ分子。
【請求項９８】
前記異種部分が、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチドまたは脂肪酸、Ｆｃ、トランスフェリン、ＰＡＳ、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性低分子、ｖＷＦ、追加のＸＴＥＮポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項９７のキメラ分子。
【請求項９９】
請求項１〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子と薬学上許容可能な担体を含んでいる医薬組成物。
【請求項１００】
請求項１〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子をコードしているポリヌクレオチドおよびその相補体。
【請求項１０１】
請求項５４〜５９、６４〜６９、および７４〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子のうちの１つの前記第一のポリペプチド鎖をコードしている第一のポリヌクレオチドまたはその相補体、および前記キメラ分子の前記第二のポリペプチドをコードしている第二のポリヌクレオチドまたはその相補体を含んでいる一組のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
請求項１００のポリヌクレオチドもしくはその相補体、または請求項１０１の一組のポリヌクレオチドもしくはその相補体を含んでいるベクター。
【請求項１０３】
請求項１０１の第一のポリヌクレオチドまたはその相補体を含んでいる第一のベクター、および第二のポリヌクレオチドまたはその相補体を含んでいる第二のベクターを含んでいる一組のベクター。
【請求項１０４】
前記細胞内プロセシング部位を処理する酵素をコードしているヌクレオチド配列をさらに含んでいる、請求項１０２のベクターまたは請求項１０３の一組のベクター。
【請求項１０５】
請求項１０２もしくは１０４のベクターまたは請求項１０３もしくは１０４の一組のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１０６】
前記細胞内プロセシング部位を処理する酵素をコードしているヌクレオチド配列をさらに含んでいる、請求項１０５の宿主細胞。
【請求項１０７】
請求項１０２もしくは１０４のベクターまたは請求項１０３もしくは１０４の一組のベクターで宿主細胞を形質移入すること、および前記細胞を好適な条件で培養することを含んでいるキメラ分子の作成方法。
【請求項１０８】
前記キメラ分子を単離することをさらに含んでいる、請求項１０７の方法。
【請求項１０９】
請求項１〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子、請求項９９の組成物、請求項１００のポリヌクレオチドまたは請求項１０１の一組のポリヌクレオチド、請求項１０２もしくは１０４のベクターまたは請求項１０３もしくは１０４の一組のベクター、または請求項１０５もしくは１０６の宿主細胞を投与することを含んでいる、出血の頻度または程度の低減方法であって、それを必要とする対象における、前記方法。
【請求項１１０】
請求項１〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子、請求項９９の組成物、請求項１００のポリヌクレオチドまたは請求項１０１の一組のポリヌクレオチド、請求項１０２もしくは１０４のベクターまたは請求項１０３もしくは１０４の一組のベクター、または請求項１０５もしくは１０６の宿主細胞を投与することを含んでいる、出血の発症予防方法であって、それを必要とする対象における、前記方法。
【請求項１１１】
前記対象が既に第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）、第ＩＸ因子（「ＦＩＸ」）またはその両方に対する阻害剤を生じているか、またはそのような阻害剤を生じる可能性のある、請求項１０９または１１０の方法。
【請求項１１２】
ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する前記阻害剤が、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはこの両方に対する中和抗体である、請求項１１１の方法。
【請求項１１３】
前記出血が血液凝固障害によって引き起こされる、請求項１０９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記血液凝固障害が血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求項１１３の方法。
【請求項１１５】
前記出血が、関節血症、筋肉出血、口内の出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項１０９〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象がヒト対象である、請求項１０９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
出血の頻度もしくは程度を低減することを必要とする対象において低減するため、または出血の発症を予防することを必要とする対象において予防するために使用する、請求項１〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子、請求項９９の組成物、請求項１００のポリヌクレオチドまたは請求項１０１の一組のポリヌクレオチド、請求項１０２もしくは１０４のベクターまたは請求項１０３もしくは１０４の一組のベクター、または請求項１０５もしくは１０６の宿主細胞。
【請求項１１８】
出血の頻度もしくは程度を低減することを必要とする対象において低減するため、または出血の発症を予防することを必要とする対象において予防するための薬物の製造における、請求項１〜９８のいずれか１項に記載のキメラ分子、請求項９９の組成物、請求項１００のポリヌクレオチドまたは請求項１０１の一組のポリヌクレオチド、請求項１０２もしくは１０４のベクターまたは請求項１０３もしくは１０４の一組のベクター、または請求項１０５もしくは１０６の宿主細胞の使用。
【請求項１１９】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号３１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号３２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号３３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号３４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号３５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号３６と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列。
【請求項１２０】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であって、以下を含む、前記抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子：
（ｉ）配列番号３１の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号３２の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；
（ｉｉｉ）配列番号３３の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；
（ｉｖ）配列番号３４の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
（ｖ）配列番号３５の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；および、
（ｖｉ）配列番号３６の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）。
【請求項１２１】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、ならびにＶＨおよびＶＬを含む抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子であって、ここで前記ＶＨが配列番号１のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
【請求項１２２】
ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、ならびにＶＨおよびＶＬを含む抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子であって、ここで前記ＶＬが配列番号２のアミノ酸配列を含む、前記キメラ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
止血を改善するためにはこれまで、患者に凝固因子が投与される場合があった。組換えＤＮＡ技術の発展によって、凝固障害患者の治療は大きく改善され、安全で確実なタンパク質製剤の開発が可能になっている。例えば、血友病ＡまたはＢ、凝固因子ＸＩ、ＦＶＩＩの欠乏症、血小板機能異常症、血小板減少症、またはフォン・ヴィルブランド病患者の大量出血の治療には、組換え活性化第ＶＩＩ因子（「ＦＶＩＩ」）が広く利用されるようになっている。
そのような組換え分子は有効だが、薬剤を凝固部位に局在させる、より良い薬物動態特性を有する、より良い製造性、血栓形成性の低減もしくはより高い活性、またはこれらの特徴を２つ以上有するなど、改善へのニーズがある。
【背景技術】
【０００２】
補充療法による血友病の治療は凝固活性の回復を目的とする治療である。出血した場合の治療または出血を予防的治療によって予防するには、現在のところ、血漿由来凝固因子および組換え凝固因子による製品が使用可能である。これら製品の半減期に基づき、その治療計画においては静脈内投与を頻繁に行う必要があるが、このような頻回投与は苦痛を伴い、かつ、手間がかかる。凝固因子の半減期を長くするための戦略としては、ペグ化（Ｒｏｓｔｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０００；１１：３８７−９６）、グリコペグ化（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ＨＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８；１００：９２０−８）、ペグ化したリポソームを含む製剤（Ｓｐｉｒａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：３６６８−３６７３，Ｐａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：２８０２−２８１１）およびアルブミンとの共役（Ｓｃｈｕｌｔｅ  Ｓ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２００８；１２２  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ１４−９）などが挙げられる。
【０００３】
（ｉ）ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する中和抗体（阻害剤）を保持している血友病患者、（ｉｉ）ＦＶＩＩ因子欠乏症の患者、または（ｉｉｉ）阻害剤を保持している血友病ＡまたはＢ患者の手術中に出血が起こった場合には、その治療に、組換え活性化第ＦＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ；ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標））が使用されている。しかしながら、ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）の効力は弱い。ＦＶＩＩａは、活性化された血小板への親和性が低く、半減期が短く、かつ組織因子がない場合にはその酵素活性が弱いため、出血を制御するためには、ＦＶＩＩａを高濃度で反復投与することが必要となる場合がしばしばある。従って、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ阻害剤を保持しているおよび／またはＦＶＩＩが欠乏している血友病患者のより良い治療および予防オプションへの医療的ニーズが未だにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｏｓｔｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０００；１１：３８７−９６
【非特許文献２】Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ＨＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８；１００：９２０−８
【非特許文献３】Ｓｐｉｒａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：３６６８−３６７３，Ｐａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：２８０２−２８１
【非特許文献４】Ｓｃｈｕｌｔｅ  Ｓ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２００８；１２２  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ１４−９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラＦＶＩＩ分子を開示するものであり、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ａ）抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体と、同じＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのエピトープに特異的に結合する；
（ｂ）抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体への結合を競合的に阻害する；または
（ｃ）抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択されるＣＤＲまたはその変異体を少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ含む、
という特徴のうちの１つ以上を示す。
【０００６】
例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＣＤＲまたはその変異体を６つ含む場合がある。
【０００７】
一態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２５、３１、３７、４３または１１１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２６、３２、３８、４４、または１１２のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７、３３、３９、４５、または１１３のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号２８、３４、４０、１１７、または１１４のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号２９、３５、４１、１１８、または１１５のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；
（ｖｉ）配列番号３０、３６、４２、１１９、または１１６のいずれか１つと少なくとも約６０、７０、８０、９０、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０００８】
別の態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）共通配列であるＸ１ＹＡＭＳ（ここでＸ１はアミノ酸残基Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、またはＡｌａ（Ａ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）共通配列であるＳＩＸ２Ｘ３ＧＸ４Ｘ５ＴＹＸ６Ｘ７ＤＳＶＫＸ８（ここでＸ２はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＡｓｎ（Ｎ）を表し、Ｘ３はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｙ（Ｇ）を表し、Ｘ４はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｙ（Ｇ）を表し、Ｘ５はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｎ（Ｎ）、またはＴｈｒ（Ｔ）を表し、Ｘ６はアミノ酸残基Ｔｙｒ（Ｙ）またはＰｈｅ（Ｆ）を表し、Ｘ７はアミノ酸残基Ｌｅｕ（Ｌ）またはＰｒｏ（Ｐ）を表し、およびＸ８はアミノ酸Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｒｇ（Ｒ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）共通配列であるＧＧＤＹＧＹＡＸ９ＤＹ（ここでＸ９はアミノ酸残基Ｌｅｕ（Ｌ）またはＭｅｔ（Ｍ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列ＲＡＳＳＳＶＮＹＭＹ（配列番号２８）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＹＴＳＮＬＡＰ（配列番号２９）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＦＳＳＳＰＷＴ（配列番号３０）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【０００９】
一実施形態においてキメラ分子に有用な抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２５、３１、３７、４３および１１１からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１配列；
（ｉｉ）配列番号２６、３２、３８、４４および１１２からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７、３３、３９、４５および１１３からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ３配列；
（ｉｖ）配列番号２８、３４、４０、１１７および１１４からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１配列；
（ｖ）配列番号２９、３５、４１、１１８および１１５からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ２配列；および、
（ｖｉ）配列番号３０、３６、４２、１１９および１１６からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ３配列、
を含む。
【００１０】
別の実施形態においてキメラ分子はＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１、３、５、７、または９７のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号２、４、６、９９、または９８のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３４Ｄ１０抗体）。さらに他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（２Ａ２抗体）。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号６のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３６Ａ８抗体）。ある特定の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号９９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（４Ｂ１１抗体）。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号９７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号９８のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３５Ｄ１抗体）。抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインまたはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の細胞外ドメインにあるエピトープに結合することができる。ある特定の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合しない。
【００１１】
いくつかの態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号４６、５２、１２０または１２６のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号４７、５３、１２１または１２７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号４８、５４、１２２または１２８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４９、５５、１２３または１２９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５０、５６、１２４または１３０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；
（ｖｉ）配列番号５１、５７、１２５または１３１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【００１２】
他の態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号８、１０、１００、または１０２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号９、１１、１０１、または１０３のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む。一実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（１Ｈ６抗体）。別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３８Ａ８抗体）。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３８Ｇ８抗体）。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（２１Ｆ１０抗体）。ある特定の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインにあるエピトープに結合する。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【００１３】
ある特定の態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号５８と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号５９と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号６０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号６１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号６２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号６３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【００１４】
一実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（１８Ｆ７抗体）。別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインにあるエピトープに結合する。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【００１５】
また、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子も提供し、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号６４、７０または１３５のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号６５、７１または１３６のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号６６、７２または１３７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号６７、１３２または１３８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号６８、１３３または１３９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；
（ｖｉ）配列番号６９、１３４または１４０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【００１６】
他の態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列ＳＹＷＩＥ（配列番号６４）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）共通配列ＥＩＬＰＧＸ１４ＧＸ１５ＴＫＹＮＸ１６ＫＦＫＧ（配列番号＿）（ここでＸ１４はアミノ酸残基Ｓｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）を表し、Ｘ１５はアミノ酸残基Ｉｌｅ（Ｉ）またはＴｙｒ（Ｙ）を表し、および、Ｘ１６はアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列ＬＩＳＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号６６）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６７）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号６８）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ（配列番号６９）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【００１７】
一実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１４、１６、または１０５のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１５、１０４、または１０６のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む。別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１５のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（１２Ｂ２抗体）。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３８Ｆ６抗体）。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（１３Ｃ１抗体）。さらに別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインにあるエピトープに結合する。さらに別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合しない。
【００１８】
他の態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８５、または１４７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８６、または１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８７、または１４９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号１４１、１４４、８２、８８、または１５０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号１４２、１４５、８３、８９、または１５１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および
（ｖｉ）配列番号１４３、１４６、８４、９０、または１５２のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【００１９】
一実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１７、１８、１９、２１、または１０９のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０７、１０８、２０、２２、または１１０のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む。別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（５Ｃ４抗体）。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（２３Ｃ１０抗体）。さらに他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号１１０のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（３７Ｃ７抗体）。さらに他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号２０のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（２８Ｃ２抗体）。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号２２のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（９Ｄ６抗体）。ある特定の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインにあるエピトープに結合する。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【００２０】
いくつかの態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号９１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号９２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号９３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号９４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号９５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および
（ｖｉ）配列番号９６と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【００２１】
一実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号２３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨと配列番号２４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬとを含む（２８Ｆ４抗体）。別の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインにあるエピトープに結合する。
【００２２】
他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、（ａ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；（ｂ）二重特異性抗体；（ｃ）ミニボディ；（ｄ）抗体のポリペプチド鎖；（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；または（ｆ）Ｆ（ａｂ）を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの態様においてキメラ分子は、ＦＶＩＩとＸＴＥＮポリペプチドとの間、ＦＶＩＩと抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子との間、またはＸＴＥＮポリペプチドと抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子との間に、随意のリンカーをさらに含む。
【００２４】
一実施形態においてキメラ分子は、（ｉ）ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｘ−（Ｌ２）−Ｔｍ；（ｉｉ）ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−Ｘ；（ｉｉｉ）Ｔｍ−（Ｌ１）−Ｘ−（Ｌ２）−ＦＶＩＩ；（ｉｖ）Ｔｍ−（Ｌ１）−ＦＶＩＩ−（Ｌ２）−Ｘ；（ｖ）Ｘ−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−ＦＶＩＩ；および（ｖｉ）Ｘ−（Ｌ１）−ＦＶＩＩ−（Ｌ２）−Ｔｍ；からなる群より選択される式を含み、式中、ＦＶＩＩは活性化ＦＶＩＩ（「ＦＶＩＩａ」）を含み；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり；Ｔｍは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；Ｌ１は第一の随意のリンカーであり、およびＬ２は第二の随意のリンカーである。
【００２５】
別の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖と抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み；
（ｂ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み；
（ｃ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチドおよび抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順序で含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖を含み；または
（ｄ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチドおよび抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順序で含む。
【００２６】
他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
（ｂ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
（ｃ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
（ｄ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
（ｅ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、または、および、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨの式を含み、または
（ｆ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨの式を含み、
ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；およびＸはＸＴＥＮポリペプチドである。
【００２７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、
（ａ）Ｘ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ；
（ｂ）Ｔｍ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ；
（ｃ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍまたはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；
（ｄ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸまたはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；
（ｅ）ＦＶＩＩＬ−Ｘ−Ｔｍ：ＦＶＩＩＨまたはＦＶＩＩＨ：Ｔｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬ；および
【００２８】
ＦＶＩＩＬ−Ｔｍ−Ｘ：ＦＶＩＩＨまたはＦＶＩＩＨ：Ｔｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬからなる群より選択される式を含み、ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり、（：）は２つのポリペプチド鎖の間の接続である。
【００２９】
第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続は、共有結合、例えば、ジスルフィド結合であっても、または非共有結合であってもよい。
【００３０】
本発明のある特定の態様においてキメラ分子は、一本のポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端方向に、（ａ）ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子；または（ｂ）ＦＶＩＩの軽鎖、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、およびＸＴＥＮポリペプチドを含む。プロテアーゼ開裂部位は、プロタンパク質転換酵素によってプロセシングされ得る細胞内プロセシング部位であってもよい。
【００３１】
いくつかの態様においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖と血小板に結合する標的化部分を含み；
（ｂ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と血小板に結合する標的化部分を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み；
（ｃ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分を含み；または
（ｄ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分、またはＸＴＥＮポリペプチドを含む。
【００３２】
他の態様においてキメラタンパク質は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
（ｂ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
（ｃ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨの式を含み、または
（ｄ）ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨの式を含み、
ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは血小板に結合する標的化部分であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；およびＸはＸＴＥＮポリペプチドである。
【００３３】
また、
（ａ）Ｘ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−ＴｍまたはＴｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ−Ｘ；
（ｂ）Ｔｍ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−ＸまたはＸ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ−Ｔｍ；
（ｃ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍまたはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；および
（ｄ）ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸまたはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；からなる群より選択される式を含んでいるキメラ分子も提供し、ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは血小板に結合する標的化部分であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり、および（：）は２つのポリペプチド鎖の間の接続である。第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続は、共有結合、例えば、ジスルフィド結合であっても、または非共有結合であってもよい。
【００３４】
ある特定の態様においてキメラ分子は、一本のポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端方向に、
（ａ）ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、および血小板に結合する標的化部分；
（ｂ）ＦＶＩＩの軽鎖、血小板に結合する標的化部分、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、およびＸＴＥＮポリペプチド；
（ｃ）ＦＶＩＩの軽鎖、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分；
（ｄ）ＦＶＩＩの軽鎖、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分、およびＸＴＥＮポリペプチドを含む。プロテアーゼ開裂部位は、プロタンパク質転換酵素によってプロセシングされる細胞内プロセシング部位であってもよい。
【００３５】
キメラ分子に有用な標的化部分は、抗体またはその抗原結合分子、受容体の受容体結合部分、および血小板に結合するペプチドからなる群より選択することができる。例えば、標的化部分は、休止状態にある血小板または活性状態にある血小板に選択的に結合し得る。いくつかの実施形態において標的化部分は、ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、ＧＰＩＸ、非活性化形態の糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」）、活性化形態のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＯＸ−１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的に選択的に結合する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キメラ分子に含まれているＦＶＩＩの半減期は、重鎖と軽鎖からなるＦＶＩＩａと比較して長い。他の実施形態では、キメラ分子に含まれているＦＶＩＩの血液凝固活性は、重鎖と軽鎖からなるＦＶＩＩａと同等かまたはそれより高い。血液凝固活性は、ＲＯＴＥＭアッセイ、ａＰＴＴアッセイ、または任意の既知のアッセイによって測定することができる。
【００３７】
ある特定の実施形態においてＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥモチーフ、ＡＧモチーフ、ＡＤモチーフ、ＡＭモチーフ、ＡＱモチーフ、ＡＦモチーフ、ＢＣモチーフ、ＢＤモチーフ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば、キメラ分子用のＸＴＥＮポリペプチドは、約４２個のアミノ酸、約７２個のアミノ酸、約１０８個のアミノ酸、約１４４個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸、約２１６個のアミノ酸、約２５２個のアミノ酸、約２８８個のアミノ酸、約３２４個のアミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約３９６個のアミノ酸、約４３２個のアミノ酸、約４６８個のアミノ酸、約５０４個のアミノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５７６個のアミノ酸、約６１２個のアミノ酸、約６２４個のアミノ酸、約６４８個のアミノ酸、約６８４個のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、約７５６個のアミノ酸、約７９２個のアミノ酸、約８２８個のアミノ酸、約８３６個のアミノ酸、約８６４個のアミノ酸、約８７５個のアミノ酸、約９１２個のアミノ酸、約９２３個のアミノ酸、約９４８個のアミノ酸、約１０４４個のアミノ酸、約１１４０個のアミノ酸、約１２３６個のアミノ酸、約１３１８個のアミノ酸、約１３３２個のアミノ酸、約１４２８個のアミノ酸、約１５２４個のアミノ酸、約１６２０個のアミノ酸、約１７１６個のアミノ酸、約１８１２個のアミノ酸、約１９０８個のアミノ酸、約２００４個のアミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。特定の実施形態においてＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キメラ分子はさらにリンカーを含み、ここでリンカーは、キメラ分子の任意の構成要素同士、例えば、ＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチド、ＦＶＩＩの重鎖と標的化部分、もしくはその両方、またはＦＶＩＩの軽鎖と標的化部分、ＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチド、もしくはその両方を接続する。他の実施形態においてリンカーは、［（Ｇｌｙ）ｘ−Ｓｅｒｙ］ｚの式を有するペプチドを含み、式中、ｘは１〜４、ｙは０または１、およびｚは１〜５０である。
【００３９】
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩの重鎖、ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、標的化部分、またはそれらの任意の組み合わせに融合させた異種部分をさらに含む。異種部分はポリペプチド部分であってもまたは非ポリペプチド部分であってもよく、ＦＶＩＩの半減期をさらに長くする。いくつかの実施形態において異種部分は、対象に投与した時のキメラ分子の半減期を、異種部分を含まないＦＶＩＩよりも長くする。特定の実施形態では異種部分を、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチドまたは脂肪酸、Ｆｃ、トランスフェリン、ＰＡＳ、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性低分子、ｖＷＦ、追加のＸＴＥＮポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。
【００４０】
また、キメラ分子を含んでいる医薬組成物、キメラ分子をコードしているポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組、ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組を含んでいるベクター、ポリヌクレオチドの組を含んでいるベクターの組、ベクターもしくはベクターの組を含んでいる宿主細胞または、キメラ分子の作成方法であって、宿主細胞をベクターもしくはベクターの組で形質移入すること、およびその細胞を、キメラ分子を発現するのに適した条件で培養することを含んでいる、方法も提供する。
【００４１】
さらに、キメラ分子、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組、ベクター、ベクターの組、または宿主細胞を投与することを含んでいる、出血の頻度もしくは程度を低減する、または出血の発症を予防するための方法であって、それを必要とする対象において低減する、または予防するためのも提供する。いくつかの実施形態では、対象は既に、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはこの両方に対する阻害剤、例えばＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはこの両方に対する中和抗体を生じているか、またはそれらを生じる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド（Ｘ）、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（例えば３４Ｄ１０）由来ｓｃＦｖを含んでいるキメラ分子の模式図である。ＦＶＩＩは活性化ＦＶＩＩの場合もある。ＸＴＥＮポリペプチド、ＦＶＩＩ、およびｓｃＦｖは１つ以上の随意のリンカーによって接続されている場合がある。キメラ分子に含まれているＳｃＦｖはＶＨとＶＬを任意の順序で、つまりＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序で含んでいてもよい。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは２つのポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子の模式図である。図２Ａは、互いが接続している２つのポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子（例えば、ＦＶＩＩ−２１１）の模式図を示し、第一の鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含んでおり（これらは必要に応じてリンカーによって融合しており）、第二の鎖はＦＶＩＩの重鎖と抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体由来のｓｃＦｖを含んでいる（これらは別のリンカーによって融合されている）。図２Ｂは互いが接続している２つのポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子の模式図であり、この場合、第一の鎖はＦＶＩＩの軽鎖と抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体由来のｓｃＦｖを含んでおり、第二の鎖はＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含んでいる。ここで、ＦＶＩＩの軽鎖は第一の随意のリンカーによってｓｃＦｖと融合しており、ＦＶＩＩの重鎖は第二の随意のリンカーによってＸＴＥＮポリペプチドと融合している。図２Ｃは、２つのポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子（例えば、ＦＶＩＩ−２００）の模式図であり、この場合、第一の鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含んでおり、第二の鎖はＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体由来のｓｃＦｖを含んでいる。ここで、重鎖は第一の随意のリンカーによってＸＴＥＮポリペプチドと融合しており、ＸＴＥＮポリペプチドは第二の随意のリンカーによってｓｃＦｖと融合している。図２Ｄは互いが接続している２つのポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子の模式図であり、この場合、第一の鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含んでおり、第二の鎖はＦＶＩＩの重鎖、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体由来のｓｃＦｖおよびＸＴＥＮポリペプチドを含んでいる。ここで、重鎖は第一の随意のリンカーによってｓｃＦｖと融合しており、ｓｃＦｖは第二の随意のリンカーによってＸＴＥＮと融合している。キメラ分子に含まれているＳｃＦｖはＶＨとＶＬを任意の順序で、つまりＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序で含んでいてもよい。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の配列（図３Ａ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の配列（図３Ｂ）に対応する同一性のマトリックスを示している。この図の灰色で示している部分にあたる抗体は、同一のＶＬまたはＶＨ配列を共有している。
【図４】図４は、１Ｈ６、３８Ａ８、１２Ｂ２、３８Ｆ６、２Ａ２、３６Ａ８、４Ｂ１１、３４Ｄ１０、２８Ｆ４、２３Ｃ１０、２８Ｃ２、５Ｃ４、９Ｄ６、および１８Ｆ７抗体のＶＨ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて複数配列を整列させた図である。相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置も示している。各ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置はＥＵ指標に従って示している。同一、保存、部分的に保存されているアミノ酸残基の位置を整列図の下に示している。
【図５】図５は、２８Ｃ２、９Ｄ６、１Ｈ６、３８Ａ８、１２Ｂ２、１８Ｆ７、２８Ｆ４、３４Ｄ１０、３６Ａ８、および２Ａ２抗体のＶＬ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて複数の配列を整列させた図である。ＥＵ指標による各ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置も示している。同一、保存、部分的に保存されているアミノ酸残基の位置を整列図の下に示している。
【図６】図６は、複数の配列をＣｌｕｓｔａｌＸによって整列させた図５（上段のマトリックス）および図４（下段のマトリックス）で示した配列の同一性をパーセンテージで示しているマトリックスである。
【図７】図７は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαまたはβサブユニットに対する特異性に従って分類した図４のＶＨ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて整列させた複数配列の図である。
【図８】図８は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαまたはβサブユニットに対する特異性に従って分類した図５のＶＬ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて整列させた複数配列の図である。
【図９】図９は、フィブリノゲンに競合してＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する能力に従って分類した図４のＶＨ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて整列させた複数配列の図である。
【図１０】図１０はフィブリノゲンに競合してＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する能力に従って分類した図５のＶＬ配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて整列させた複数配列の図である。
【図１１】図１１Ａは、可溶性組織因子依存性プロトロンビン時間（ｓＴＦ−ＰＴ）アッセイによって測定したｒＦＶＩＩａおよびｒＦＶＩＩ−ＸＴＥＮのＦＶＩＩａ活性を示している（図１１Ａ）。ｒＦＶＩＩａは組換えによって作出した活性化ＦＶＩＩであり、ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩの重鎖をＸＴＥＮポリペプチドに融合させた活性化ＦＶＩＩである。Ｘ軸は時間（時）を、およびｙ軸は投与したＨｅｍＡマウスの血漿におけるＦＶＩＩａ活性の回復率（％）を示している。図１１Ｂは、ＲＯＴＥＭアッセイで測定したｒＦＶＩＩａおよびｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの血液凝固時間（ＣＴ）を示している。Ｘ軸は、ヒト血友病Ａ血液にクエン酸と共に加えた所定のタンパク質の濃度（ｎＭ）を、ｙ軸はＲＯＴＥＭで記録した凝固時間を示している。凝固はカルシウムを使って誘導した。
【図１２】図１２Ａは、ヒトの全血における血小板結合を示している。タンパク質を希釈した（１：５０）全血に加え、ＦＩＴＣ−抗ＦＶＩＩとＡＰＣ−ＣＤ４２ｂで染色し、血小板におけるＦＶＩＩの蛍光の中央値（ＦＶＩＩ  ＭＰＶ）をフローサイトメトリー法で測定した。３種類の構築物（ＦＶＩＩ−２００（丸）、ＦＶＩＩ−１８９（三角）、およびＦＶＩＩ−２１１（×）、いずれも上述）の血小板結合を試験した。Ｘ軸は、ヒトの血液に加えたタンパク質の濃度を、およびｙ軸は、血小板に結合したタンパク質の相対量を表すＦＶＩＩの中央蛍光値（ＦＶＩＩ  ＭＦＶ）を示している。図１２Ｂは、ＲＯＴＥＭアッセイで測定したｒＦＶＩＩａ（丸）およびＦＶＩＩ−２００（三角）の血液凝固活性を示している。Ｘ軸は濃度（ｎＭ）を、ｙ軸は凝固時間を示している。
【図１３】図１３Ａには、αＩＩｂトランスジェニックマウスから採取した血液中でのＦＶＩＩ−２００（丸）、ＦＶＩＩ−１８９（三角）、およびＦＶＩＩ−２１１（×）の血小板結合を示している。Ｘ軸は濃度（ｎＭ）を、ｙ軸には血小板でのＦＶＩＩ中央蛍光値（ＦＶＩＩ  ＭＦＶ）を示している。図１３Ｂでは、ヒトαＩＩｂトランスジェニックマウスから採取した血小板におけるｒＦＶＩＩ−２００（丸）、ＦＶＩＩ−２１１（ｘ）、およびＦＶＩＩ−１７９（三角）のＦＶＩＩの回収率を、タンパク質を投与した後の時間の関数として示している。マウスに所定のタンパク質を５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、フローサイトメトリー解析によって、血小板に対するＦＶＩＩ中央蛍光値を生成した。ＦＶＩＩの回収率（％）は、投与５分後の値に関連した、血小板に残留しているＦＶＩＩ  ＭＦＶのパーセンテージを表している。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板標的化部分を含んでいるキメラ分子の模式図である。図１４Ａは、ＦＶＩＩの重鎖と共有結合しているＦＶＩＩの軽鎖を含んでおり、これがさらにＰＤＧ１３抗体由来のｓｃＦｖと融合しているキメラタンパク質（つまり血小板標的化抗体）を示している。図１４Ｂは、ＦＶＩＩの重鎖と共有結合しているＦＶＩＩの軽鎖を含んでおり、これがさらにＸＴＥＮポリペプチドと融合しているキメラタンパク質を示している。図１４Ｃおよび１４Ｄは、ＦＶＩＩの重鎖と共有結合している軽鎖であって、これがさらにＰＤＧ１３抗体由来ｓｃＦｖおよびＸＴＥＮポリペプチド（図１４Ｃ）、ならびにＸＴＥＮポリペプチドおよびＰＤＧ１３抗体由来ｓｃＦｖ（図１４Ｄ）と連結している軽鎖を示している。図１４Ｅは、ＰＤＧ１３抗体由来ｓｃＦｖに融合したＦＶＩＩ軽鎖を含む第一のポリペプチド鎖とＸＴＥＮポリペプチドに融合したＦＶＩＩ重鎖を含む第二のポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子を示している。図１４Ｆは、ＸＴＥＮポリペプチドに融合したＦＶＩＩ軽鎖を含んでいる第一の鎖と、ＰＤＧ１３抗体由来ｓｃＦｖに融合したＦＶＩＩ重鎖を含んでいる第二の鎖の２本のポリペプチド鎖を含んでいるキメラ分子を示している。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、ｒＦＶＩＩａとキメラＦＶＩＩ分子の凝固時間を比較したＲＯＴＥＭアッセイの結果である。図１５Ａでは、抗ＦＶＩＩＩ抗体で刺激したヒト血友病血液におけるｒＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩ−１６５、およびＦＶＩＩ−１７８の凝固時間を示している。健常なヒト提供者から得られた血液にクエン酸を加え、その後、抗ＦＶＩＩＩ抗体および所定のタンパク質で処理した。カルシウムを加えることで血液凝固を誘導し、ＲＯＴＥＭ装置で凝固時間を記録した。ＢＬ、未処理血液の基準レベル；ＢＬ＋Ａｂ、抗ＦＶＩＩＩ抗体で処理した場合の基準レベル。図１５Ｂはクエン酸を加えたヒト血友病Ａ血液におけるｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ−１７９の凝固時間をＲＯＴＥＭで測定した結果を示している。凝固はカルシウムによって誘導した。図１５Ｃおよび１５Ｄは、クエン酸を加えたヒト血友病Ａ血液におけるｒＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩ−１７５、１７７、１７８の凝固時間をＲＯＴＥＭで測定した結果を示している。凝固は組織因子とカルシウムによって誘導した。
【図１６】図１６では、血小板／ＮＳＧマウスにおける血小板と結合したＦＶＩＩａのクリアランスを示している。ＦＶＩＩ−２１１およびＦＶＩＩ−１７９両方の構築物については上述した。ＮＳＧマウスにヒト血小板を輸血した３０分後に、ＦＶＩＩ−２１１またはＦＶＩＩ−１７９のいずれかを２５ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で投与した。各時点におけるヒト血小板結合型ＦＶＩＩの中央蛍光値を、タンパク質投与５分後の量に対して正規化した。Ｘ軸はＦＶＩＩ−２１１またはＦＶＩＩ−１７９を投与した後の時間（時）を、ｙ軸は輸血したヒト血小板に対するＦＶＩＩの回収率（％）を示している。
【図１７】図１７ＡはＸＴＥＮ  ＡＥ２８８の配列を示している。図１７Ｂは、抗ＧＦＰ抗体で検出した、インビトロのサル血漿（上段）、インビボのサル試料（中央）、およびインビトロのラット腎臓ホモジネート（下段）におけるＧＦＰ−ＸＴＥＮの安定性を示している。下にｒＦＶＩＩａおよびｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの模式図を示した。
【図１８】図１８では、ｒＦＶＩＩａおよびｒＦＶＩＩ−ＸＴＥＮのＦＶＩＩａ血漿活性を示している。ｒＦＶＩＩａは組換えによって作出した活性化ＦＶＩＩであり、ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩの重鎖をＸＴＥＮポリペプチドに融合させた活性化ＦＶＩＩである。Ｘ軸は時間（時）を、およびｙ軸は正規化したＦＶＩＩａ血漿活性（％）を示している。
【図１９】図１９では、ｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ−２００のＦＶＩＩａ血漿活性を示している。ＦＶＩＩ−２００は活性型ＦＶＩＩ（つまり重鎖と軽鎖）を含み、活性型化ＦＶＩＩの重鎖はＸＴＥＮ配列（例えば、ＡＥ２８８）に融合しており、これがさらに抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体由来のｓｃＦｖに融合している。Ｘ軸は時間（時）を、およびｙ軸は正規化したＦＶＩＩａ血漿活性（％）を示している。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃでは、ｓＴＦ−ＰＴ法で測定した血小板標的化ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ変異体の活性を示している。図２０Ａでは、いくつかのＸＴＥＮ（つまり７２個のアミノ酸、１４４個のアミノ酸、または２８８個のアミノ酸）に融合させたＦＶＩＩ軽鎖と、リンカーによって３４Ｄ１０  ｓｃＦｖに融合させたＦＶＩＩ重鎖とを含む配置Ａの模式図、３つの構築物、つまりＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、およびＦＶＩＩ−２１１の表、ならびにこれらの構築物とｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ−１８９のｓＴＦ−ＰＴアッセイを示している。ＦＶＩＩ−１８９構築物については上述した。図２０Ｂでは、ＦＶＩＩ軽鎖と、いくつかのＸＴＥＮ（つまり７２個のアミノ酸、１４４個のアミノ酸、または２８８個のアミノ酸）によって３４Ｄ１０  ｓｃＦｖに融合させたＦＶＩＩ重鎖とを含む配置Ｂの模式図、３つの構築物、つまりＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、およびＦＶＩＩ−２００の表、ならびにこれらの構築物とｒＦＶＩＩａのｓＴＦ−ＰＴアッセイを示している。図２０Ｃでは、いくつかのＸＴＥＮ（つまり４２個のアミノ酸、７２個のアミノ酸、または７２個のアミノ酸）に融合させたＦＶＩＩ軽鎖と、いくつかのＸＴＥＮ（つまり７２個のアミノ酸、４２個のアミノ酸、または７２個のアミノ酸）によって３４Ｄ１０  ｓｃＦｖに融合させたＦＶＩＩ重鎖とを含む配置Ｃの模式図、３つの構築物、つまりＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３、およびＦＶＩＩ−２３８の表、ならびにこれらの構築物とｒＦＶＩＩａのｓＴＦ−ＰＴアッセイを示している。
【図２１−１】図２１Ａ〜Ｄでは、ＲＯＴＥＭ法で測定した血小板標的化ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ変異体の活性を示している。図２１Ａは、ＸＴＥＮの結合の模式図、ＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、およびＦＶＩＩ−２１１の長さ、ならびにＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、およびＦＶＩＩ−２１１のＦＶＩＩ活性を示している。図２１Ｂは、ＸＴＥＮの結合の模式図、ＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、およびＦＶＩＩ−２００の長さ、ならびにＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、およびＦＶＩＩ−２００のＦＶＩＩ活性を示している。図２１Ｃは、ＸＴＥＮの結合の模式図、ＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３、およびＦＶＩＩ−２３８の長さ、ならびにＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３、およびＦＶＩＩ−２３８のＦＶＩＩ活性を示している。ＦＶＩＩ活性は、ｒＦＶＩＩａと比較した場合のＦＶＩＩ活性の差（倍）で表している。図２１Ｄは、ＦＶＩＩ−２００の模式図と、ＦＶＩＩ−１８９（ＦＶＩＩ軽鎖：ＦＶＩＩ重鎖標的化部分）、ＦＶＩＩ−１６５（ＦＶＩＩ軽鎖：ＦＶＩＩ重鎖ＸＴＥＮ）、およびＦＶＩＩ−２００（ＦＶＩＩ軽鎖：ＦＶＩＩ重鎖ＸＴＥＮ標的化部分）のＦＶＩＩ活性の比較を示している。ＦＶＩＩ活性は、ｒＦＶＩＩａと比較した場合のＦＶＩＩ活性の差（倍）で表している。構築物に含まれているＳｃＦｖはＶＨとＶＬを任意の順序で、つまりＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序で含んでいてもよい。
【図２１−２】図２１Ａ〜Ｄでは、ＲＯＴＥＭ法で測定した血小板標的化ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ変異体の活性を示している。図２１Ａは、ＸＴＥＮの結合の模式図、ＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、およびＦＶＩＩ−２１１の長さ、ならびにＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、およびＦＶＩＩ−２１１のＦＶＩＩ活性を示している。図２１Ｂは、ＸＴＥＮの結合の模式図、ＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、およびＦＶＩＩ−２００の長さ、ならびにＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、およびＦＶＩＩ−２００のＦＶＩＩ活性を示している。図２１Ｃは、ＸＴＥＮの結合の模式図、ＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３、およびＦＶＩＩ−２３８の長さ、ならびにＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３、およびＦＶＩＩ−２３８のＦＶＩＩ活性を示している。ＦＶＩＩ活性は、ｒＦＶＩＩａと比較した場合のＦＶＩＩ活性の差（倍）で表している。図２１Ｄは、ＦＶＩＩ−２００の模式図と、ＦＶＩＩ−１８９（ＦＶＩＩ軽鎖：ＦＶＩＩ重鎖標的化部分）、ＦＶＩＩ−１６５（ＦＶＩＩ軽鎖：ＦＶＩＩ重鎖ＸＴＥＮ）、およびＦＶＩＩ−２００（ＦＶＩＩ軽鎖：ＦＶＩＩ重鎖ＸＴＥＮ標的化部分）のＦＶＩＩ活性の比較を示している。ＦＶＩＩ活性は、ｒＦＶＩＩａと比較した場合のＦＶＩＩ活性の差（倍）で表している。構築物に含まれているＳｃＦｖはＶＨとＶＬを任意の順序で、つまりＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序で含んでいてもよい。
【図２２】図２２は、ＰＫを向上させるには、２８８個のアミノ酸を含む１つのＸＴＥＮだけで十分であることを示している。種々のＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ構築物、つまりＦＶＩＩａＸＴＥＮ８６４、ＦＶＩＩａＸＴＥＮ２８８、およびｒＦＶＩＩａ）をＨｅｍＡマウスに投与した。投与したマウスの血漿におけるＦＶＩＩ活性をｓＴＦ−ＰＴアッセイで測定した。ｘ軸は時間（時）を、およびｙ軸は正規化した活性回復率（％）を示している。
【図２３】図２３は、ＸＴＥＮの長さを１４４または７２に短くするとクリアランス率が上昇したことを示している。投与した動物の血漿における３つの構築物、つまりＦＶＩＩ−２００／Ｈｃ−ＸＴＥＮ２８８、ＦＶＩＩ−２３２／Ｈｃ−ＸＴＥＮ１４４、およびＦＶＩＩ−２３１／Ｈｃ−ＸＴＥＮ７２のＦＶＩＩ活性をｓＴＦ−ＰＴアッセイで測定した。ｘ軸は時間（時）を、およびｙ軸は正規化した活性回復率（％）を示している。
【図２４】図２４は、それぞれが７２の２つのＸＴＥＮと単一の２８８のＸＴＥＮとの比較データを示している。ＦＶＩＩ−２３８／Ｈｃ−ＸＴＥＮ７２／Ｌｃ−ＸＴＥＮ７２のＦＶＩＩ活性をＦＶＩＩ−２００／Ｈｃ−ＸＴＥＮ２８８およびｒＦＶＩＩａのＦＶＩＩ活性と比較した。ｙ軸は正規化した活性回復率（％）を示している。
【図２５】図２５は、それぞれが７２の２つのＸＴＥＮと単一の２８８のＸＴＥＮとの比較データを示している。タンパク質をαＩＩｂトランスジェニックマウスに尾静脈から注入した。全血を回収し、蛍光標識した抗体で染色して血小板を可視化し、フローサイトメトリーによってＦＶＩＩを測定した。血小板に結合したタンパク質の濃度を、血小板上の中央蛍光強度（ＭＦＩ）を定量することで測定し、投与５分後のＭＦＩと比較した回収率（％）として表した。ＦＶＩＩ−２３８／Ｈｃ−ＸＴＥＮ７２／Ｌｃ−ＸＴＥＮ７２の回収率（％）を、ＦＶＩＩ−２００／Ｈｃ−ＸＴＥＮ２８８およびＦＶＩＩ−１８９（ＸＴＥＮを含んでいない）の回収率と比較した。
【図２６】図２６は、重鎖および軽鎖におけるＸＴＥＮの長さ（αＩＩｂトランスジェニックマウスにおける血小板ＰＫ）を比較したデータである。回収率は図２５と同様に算出した。ＦＶＩＩ−２３８／Ｈｃ−ＸＴＥＮ７２／Ｌｃ−ＸＴＥＮ７２の回収率（％）を、ＦＶＩＩ−２４３／Ｈｃ−ＸＴＥＮ４２／Ｌｃ−ＸＴＥＮ７２およびＦＶＩＩ−２４２／Ｈｃ−ＸＴＥＮ７２／Ｌｃ−ＸＴＥＮ４２の回収率と比較した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１の項で開示の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）を含んでいるキメラ分子に関する。本発明は、少なくとも部分的には、凝固因子の効力、薬物動態特性、および／または製造可能性を向上させる新規方法の開発に基づいている。キメラ分子は、凝固部位における凝血促進活性を高め、薬物動態特性を向上させる方法によって開発される。バイパス治療において外から投与される凝固因子は、それらが活性化された状態で投与される場合にのみ有効である。しかしながらそのような活性型の凝固因子は、内在性経路（例えば、アンチトロンビンＩＩＩ、ＴＦＰＩ）によって迅速に不活性化され、その結果、活性型は排出され、有効な半減期が短くなる。より高濃度で投与すると血栓形成効果が現れるため、高濃度での投与では上述の問題を解決しない。従って一実施形態において本発明は、凝固因子を傷害部位に誘導する標的化部分に融合させたＦＶＩＩを含む、活性の高いキメラＦＶＩＩ分子構築物に関する。これらの分子はまた、半減期などの様々な薬物動態特性を向上させることのできるＰＫ向上部分、つまりＸＴＥＮポリペプチドも含む。
【００４４】
本発明の構築物の例を、添付の図面および配列表に示す。一実施形態において本発明は、図に示す構造を有しているポリペプチドに関する。別の実施形態において本発明は、添付の配列表に示す配列を有しているポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。一実施形態において本発明は、添付の配列表に示す配列を有しているポリペプチドの成熟型に関する。当然のことながら、これらの構築物およびそれらをコードしている核酸分子は、対象における止血の改善に用いることができる。
【００４５】
本明細書および請求項をより深く理解するために、定義を以下に提供する。
【００４６】
定義
「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の実体は、１つ以上のその実体を指すことに留意されたい。例えば、「１つのヌクレオチド配列」とは１つ以上のヌクレオチド配列を表していると理解される。つまり、「１つ（ａ）」（または「１つ（ａｎ）」）、「１つ以上」および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される場合がある。
【００４７】
さらに、本明細書で使用する場合「および／または」は、所定の２つの特徴または要素のうちのどちらか一方だけの特定の開示、またはもう片方も含む特定の開示であると見なされる。従って、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」という句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される「および／または」という用語は、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）の各実施形態を包含することを意図している。
【００４８】
「含んでいる」という語を使った実施形態が本明細書のどこかに記載されているとしても、「からなる」および／または「本質的に〜からなる」という観点で記載される類似の実施形態もまた提供していると理解される。
【００４９】
本出願で特定している様々な範囲の中で使用される数値は、そうでないことが明示されていない限り、規定している範囲の最小値と最高値の両方があたかも「約」という語を伴っているかのように、およその値を意味している。この様式では、特定している範囲を僅かに超えた値および僅かに下回る値も、この範囲内の値と同じように、実質的に同じ結果を達成するために用いることができる。本明細書で使用する場合、数値を指すときの「約」および「およそ」という用語は、問題となっている範囲または要素に関連する当業者にとって明確で普通の意味を有する。
【００５０】
厳密な数値境界からの広がりの量は、多くの要素に依存する。例えば、考慮される要因のいくつかとしては、請求の主題の性能に影響を及ぼすであろう要素の重要性および／またはある所定量の変動の効果、ならびに当業者に知られている他の検討事項を挙げることができる。従って一般的には、「約」または「およそ」が数値範囲を広げる。例えば、いくつかの例では、「約」または「およそ」とは、関連する技術に依存するが、±５％または±１０％を意味する場合がある。さらに、開示している範囲は、記載した値の最小値と最高値の間にある全ての値を含めた連続している範囲であることを意図している。
【００５１】
特段の規定のない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的な用語は、本開示が関連する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが当業者にとって、本開示で使用する多くの用語の基本的な辞書となる。
【００５２】
単位、接頭語、および符号は、国際単位系（ＳＩ）に従って記載している。数値範囲は、その範囲を規定している数値も含むものとする。別段の指定のない限りアミノ酸配列は左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端方向に記載している。本明細書で提供する見出しは、その開示の様々な実施形態を限定するものではなく、明細書全体を参照することで可能となる。従って、以下で定義する用語は、本明細書全体を参照することでよりはっきりと定義される。本明細書においてアミノ酸は、一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が推奨している１文字記号で表す。同様に、ヌクレオチドは一般的に受け入れられている１文字コードで表す。
【００５３】
本明細書で使用する場合「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」と複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、また、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に結合しているモノマー（アミノ酸）から構成されている分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、任意の鎖もしくは２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。従って、アミノ酸の鎖もしくは２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「アミノ酸の鎖」または他のいかなる用語も、「ポリペプチド」という用語の定義に含まれる。また「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれもの変わりに、あるいはそれらと同じ意味で使用することができる。
【００５４】
本明細書で使用する場合「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチドから構成されている分子を包含することを意図し、これらは場合によって、アミド結合以外の結合によって接続している。
【００５５】
ポリペプチドは単量体であっても多量体のいずれであってもよい。例えば一実施形態では、抗体、その抗原結合分子、または本発明のキメラ分子は、二量体ポリペプチドである可能性がある。二量体抗体、その抗原結合分子は、２本のポリペプチド鎖を含む場合も、または１本のポリペプチド鎖から構成されている場合（例えばｓｃＦｃ分子のように）もある。一実施形態において二量体は、２つの同一の単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの同一のＦｃ部分または２つの同一の生物学的に活性な部分）を含んでいるホモ二量体である可能性がある。別の実施形態において二量体は、２つの同一ではない単量体サブユニットまたはポリペプチドを含んでいる（例えば、２つの異なる凝固因子もしくはその一部、または１つの凝固因子のみを含んでいる）ヘテロ二量体である可能性がある。例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第７，４０４，９５６号を参照のこと。
【００５６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、発現後、修飾を受けた産物を指すことを意図しており、修飾には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解による切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾が挙げられる。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然の生物学的源に由来する場合も、あるいは組換え技術によって生産される場合もあるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳する必要はない。化学合成を含むいかなる方法によっても生成することができる。
【００５７】
「単離した」ポリペプチドとは、天然に見られる形態とは異なる形態をとっているポリペプチドである。単離したポリペプチドには、それらがもはや天然に見られる形態をとらない程度まで精製されたポリペプチドも含まれる。いくつかの実施形態では、単離したポリペプチドは実質的に純粋である。
【００５８】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、その抗原結合分子、または本発明のキメラ分子の「誘導体」とは、天然のポリペプチドまたはタンパク質に見られるのとは別の特徴を示すように変化させたポリペプチドまたはタンパク質である。「誘導体」には、２０種類の一般的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を１つ以上含むペプチドも含まれる。指定のポリペプチドまたはタンパク質「から誘導された」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、そのポリペプチドの起源を指す。一実施形態では、特定の配列から誘導されたポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、ここで一部分とは、少なくとも約１０〜約２０個のアミノ酸、少なくとも約２０〜約３０個のアミノ酸、または少なくとも約３０〜約５０個のアミノ酸から構成されているか、あるいは、当業者がその配列に由来すると同定可能な配列である。
【００５９】
別のポリペプチドの「変異体」であるポリペプチドは、最初のポリペプチドに関連する１つ以上の突然変異、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置き換えられているか、または１つ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する場合がある。一実施形態においてポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含む。このような変異体は必然的に、最初のポリペプチドに対し、１００％未満の配列同一性または相同性を有する。別の実施形態において変異体は、最初のポリペプチドに対して約７５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または相同性、例えば約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００％未満、約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の、および約９５％〜１００％未満の配列同一性または相同性を有する（例えば変異体分子の長さを超えて）、アミノ酸配列を有するであろう。一実施形態では、最初のポリペプチド配列とそれに由来する配列との間には１個のアミノ酸の違いがある。
【００６０】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、その抗原結合分子、本発明のキメラ分子または凝固因子を指す場合の「断片」という用語は、言及しているポリペプチドまたはタンパク質の特性の少なくともいくつかを保持している任意のポリペプチドまたはタンパク質を指す。ポリペプチドの断片には、タンパク質分解性の断片ならびに欠失性の断片が含まれる。例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の断片は抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体と同じエピトープに特異的に結合する可能性がある。別の例としては、ＦＶＩＩの血液凝固活性、例えばｒＦＶＩＩａに相当するＦＶＩＩの血液凝固活性を有するＦＶＩＩ断片が挙げられる。
【００６１】
タンパク質配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはアミノ酸配列を指すときに使用される「配列」という用語は、そのポリペプチドを構成しているアミノ酸を、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、直線的に表しているものを意味し、この表現の中で互いに隣あっている残基は、ポリペプチドの一次構造において連続している残基同士である。
【００６２】
「アミノ酸」という用語は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を含む。
【００６３】
一般的でないアミノ酸も本発明の範囲に含まれ、そのようなアミノ酸としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、および他のアミノ酸残基類似体、例えば、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されているものが挙げられる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するには、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記、の方法を用いることができる。簡単に説明すると、これらの方法は、サプレッサーｔＲＮＡを天然に存在しないアミノ酸残基で活性化することと、その後、インビトロで転写させＲＮＡを翻訳することを含む。一般的でないアミノ酸の導入も、当該分野で知られているペプチド化学によって達成することができる。本明細書で使用する場合「極性アミノ酸」という用語は、正味電荷が０であるが、側鎖の様々な部位の電荷が部分的には０でないアミノ酸（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、およびＣ）を含む。これらのアミノ酸は、疎水性の相互作用および静電性の相互作用に関わる場合がある。本明細書で使用する場合「荷電アミノ酸」という用語は、側鎖の正味電荷がゼロではない可能性があるアミノ酸（例えばＲ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、およびＤ）を含む。これらのアミノ酸は、疎水性の相互作用および静電性の相互作用に関わる場合がある。
【００６４】
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列（最初のポリペプチドのアミノ酸配列）に含まれている少なくとも１つのアミノ酸残基を別の、それとは異なる「置換」アミノ酸残基で置き換えることを指す。「アミノ酸の挿入」とは、所定のアミノ酸配列に、少なくとも１つのアミノ酸を追加することを指す。一般的に挿入は、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入から構成されるが、より長い「ペプチド挿入」、例えば約３〜約５個、さらには約１０個、１５個、または２０個までのアミノ酸残基の挿入も行うことができる。挿入される残基は、上で開示したように、天然に存在する残基であっても天然に存在しない残基であってもよい。「アミノ酸の欠失」とは、所定のアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを指す。
【００６５】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）、酸性側鎖（例えば、ＡｓｐおよびＧｌｕ）、非電荷極性側鎖（例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓ）、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐ）、β−分岐側鎖（例えば、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＩｌｅ）および芳香族側鎖（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＨｉｓ）が含まれる。従って、ポリペプチドに含まれているアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられている場合、その置換は保存的であると見なされる。別の実施形態では、一定の長さのアミノ酸は、構造的に類似しているが、順番および／または側鎖ファミリーメンバーの組成が異なる、一定の長さのアミノ酸によって保存的に置換されている場合がある。
【００６６】
非保存的置換には、（ｉ）電気的に陽性の側鎖残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）が電気的陰性の残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）に置き換わるもしくはこれらで置き換えられること、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）に置き換わるもしくはこれらで置き換えられること、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが他の任意の残基に置き換わるもしくはこれらで置き換えられること、または（ｉｖ）大きく、疎水性または芳香族の側鎖をもつ残基（例えば、ＶａＩ、Ｈｅ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）がより小さい側鎖をもつ残基（例えば、ＡｌａまたはＳｅｒ）または側鎖をもたない残基（例えば、Ｇｌｙ）に置き換わるもしくはこれらで置き換えられることが含まれる。
【００６７】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「パーセント配列同一性」という用語は、２つの配列を最適に整列させるために導入される追加または欠失（つまりギャップ）を考慮にいれたときに、比較した範囲に含まれる配列全体で見て、同一配列が一致した位置の数を指す。一致した位置とは、標的配列と参照配列の両方に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在している全ての位置である。ギャップはヌクレオチドでもアミノ酸でもないため、標的配列に含まれるギャップはカウントされない。同様に、参照配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるため、参照配列中のギャップもカウントされない。
【００６８】
パーセンテージ配列同一性は、両方の配列で同一のアミノ酸残基または核酸塩基が生じている位置の数を決定して一致している位置の数を求め、一致している位置の数を比較範囲に含まれている位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことによって算出される。配列の比較および２つの配列間のパーセンテージ配列同一性の決定は、インターネット上でおよびダウンロードして容易に使用することが可能なソフトウェアによって実施することができる。タンパク質およびヌクレオチド両方の整列に好適なソフトウェアプログラムは様々なルートから入手可能である。
【００６９】
パーセント配列同一性の決定に好適なプログラムの１つ米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能な一連のＢＬＡＳＴプログラムのうちの一部であるｂｌ２ｓｅｑがある。Ｂｌ２ｓｅｑはＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に用いられる。他の好適なプログラムとしては、例えば、一連のＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクス用プログラムの一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒがあり、これらはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）のｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａから入手できる。
【００７０】
単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列に含まれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する様々な領域は、それら独自のパーセント配列同一性を有する場合がある。パーセント配列同一性の値は、小数第二位で四捨五入するとされる。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は四捨五入して８０．１になるが、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は四捨五入して８０．２となる。また、長さの値は常に整数となる。
【００７１】
ある特定の実施形態では、第一のアミノ酸配列の第二のアミノ酸配列に対するパーセンテージ同一性「Ｘ」は１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、この場合Ｙは、第一と第二の配列を整列させたときに（目視で特定の配列アライメントプログラムで整列させたときに）同一の一致したアミノ酸残基として評価された数であり、Ｚは第二の配列に含まれている残基の総数である。第一の配列の長さが第二の配列よりも長い場合には、第一の配列の第二の配列に対するパーセント同一性は、第二の配列の第一の配列に対するパーセント同一性よりも高くなる。
【００７２】
当業者であれば、パーセント配列同一性を算出するために配列を整列させることは、主に一次配列のデータに由来する２つの配列間の比較に限定されないことを理解できる。複数の配列を比較させたものからも配列は整列させることができる。複数の配列を整列させるのに好適なプログラムの１つとしては、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２がある（ＣｌｕｓｔａｌＸはウインドウズ環境で動くバージョンのＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムである）。別の好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌから入手可能なＭＵＳＣＬＥがある。あるいは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２もＭＵＳＣＬＥも、例えば、ＥＢＩから入手可能である。
【００７３】
当然のことながら、配列データを、構造に関するデータ（例えば、タンパク質の結晶学的な構造）、機能に関するデータ（例えば、変異の位置）、または系統発生学的なデータなどの起源の異なるデータと統合することで、配列を整列させることができる。起源の異なるデータを統合して、複数の配列を比較するのに好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用できる、あるいはＥＢＩから入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅがある。また、パーセント配列同一性を算出するのに使用される最終的な整列データは、自動または手動のいずれかで精選することができる。
【００７４】
一実施形態では、抗体およびその抗原結合分子ならびに本発明のキメラ分子は、ヒトタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列を含む場合がある。しかしながら、抗体およびその抗原結合分子ならびに本発明のキメラ分子は、別の種の哺乳動物に由来する１つ以上のアミノ酸を含む可能性もある。ある特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合分子ならびに本発明のキメラ分子は免疫原性をもたない。
【００７５】
本明細書で使用する場合「連結した」、「融合させた」または「融合」という用語は、ペプチド結合（例えば、遺伝的融合）、化学的な共役、または当該分野で知られている他の手段による結合を指す。例えば、分子または部分を結合させることができる方法の１つにおいては、ペプチド結合で分子または部分を連結するペプチドリンカーが用いられる。「遺伝的に融合させた」、「遺伝的に連結した」または「遺伝的融合」という用語は同じ意味で用いられ、かつ、２つ以上のタンパク質、ポリペプチド、または断片をコードしている単一のポリヌクレオチド分子の遺伝的な発現を通じて、それらのタンパク質、ポリペプチド、またはその断片が、それら個々のペプチド骨格を介して共直線的に共有結合または接続していることを指す。そのような遺伝的融合の結果、単一の連続した遺伝配列が発現する。
【００７６】
好ましい遺伝的融合はインフレームのもの、つまり２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、本来のＯＲＦの正しい読み枠を維持しながら、連続したより長いＯＲＦを形成するように融合されているものである。従って、結果として生じる組換え融合タンパク質は、本来のＯＲＦによってコードされているポリペプチドに相当する２つ以上のタンパク質セグメントを含む（これらのセグメントは天然にはそのように連結していない）単一のポリペプチドとなる。この場合、単一のポリペプチドはプロセシングの過程で切断され、２本のポリペプチド鎖を含んでいる二量体分子が得られる。
【００７７】
本明細書で使用する場合「と接続している」という用語は、第一のアミノ酸鎖と第二のアミノ酸鎖との間に形成されている共有または非共有結合を指す。一実施形態では、「と接続している」という用語は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。別の実施形態では、「と接続している」という用語は、化学的に架橋していない、共有、非ペプチド結合または非共有結合を指す。別の実施形態では、ペプチド結合以外の共有結合を指す。いくつかの実施形態では、この接続はコロン、つまり（：）で表される。例えば、ＦＶＩＩの構造を表す場合の「ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ」は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＦＶＩＩＬの軽鎖にジスルフィド結合したＦＶＩＩＨの重鎖を含んでいる二量体を指す。
【００７８】
共有結合の例としては、限定されないが、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ（σ）結合、パイ（π）結合、デルタ（δ）結合、グリコシド結合、不可知論的結合、曲がった結合、双極性結合、パイ（π）骨格、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられる。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン−π結合もしくは塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合、もしくは対称的水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー的な力、または化学的極性が挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用する場合「化学的架橋」および「共役」という用語は同じ意味で用いられ、かつ、アミノ酸の酸側鎖同士が、直接またはリンカー（例えばペプチドリンカー）を介して共有結合によって化学的に繋がっていることを指す。化学的架橋には、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分同士の分子内もしくは分子間ジスルフィド結合も、活性型凝固因子のアミノ酸とエンハンサー部分のアミノ酸との間にある改変されていないジスルフィド結合も含まれない。化学的架橋は通常、架橋剤、例えばヘテロ二官能性架橋剤を添加することによって生じる。化学的架橋の例としては、光反応性（ｐｈｏｔｏ）−Ｉｌｅ、光反応性−Ｍｅｔ、および光反応性−Ｌｅｕを化学的に結合させることによる、１つ以上の光反応性結合がある（Ｓｕｃｈａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：２６１−２６７を参照のこと）。
【００８０】
「抗体」という用語は、標的、例えばタンパク質（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、そのサブユニット、もしくは受容体複合体）、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはこれらの組み合わせを、免疫グロブリン分子の可変領域内にある少なくとも１つの抗原認識部位を介して認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。
【００８１】
抗体は一般的に、ジスルフィド結合によって相互に接続している少なくとも２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）を含む。重鎖はそれぞれ、「重鎖可変領域」または「重鎖可変ドメイン」（本明細書ではＶＨと略記する）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域には、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインが含まれている。軽鎖はそれぞれ、「軽鎖可変領域」または「軽鎖可変ドメイン」（本明細書ではＶＬと略記する）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、Ｃｌを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化することができ、ＣＤＲの間には、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれ、より保存されている領域が挿入されている。
【００８２】
各ＶＨおよびＶＬ領域は３つのＣＤＲと４つのＦＷで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端の方向に向かって、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４の順に配置されている。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、完全なポリクローナル抗体、完全なモノクローナル抗体、抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、多重特異性抗体（少なくとも２つの完全な抗体から生成した二重特異性抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含んでいる融合タンパク質、および他の、抗原認識部位を含んでいる改変された任意の免疫グロブリン分子（それらが所望の生物学的活性を示す限り）を包含する。従って「抗体」という用語には、抗体全体および任意の抗原結合断片またはその単一の鎖が含まれる。抗体は、ネイキッド抗体であっても、または他の分子、例えば毒素や放射性同位元素などと結合しているものであってもよい。
【００８３】
ＣＤＲの位置を決定するための技術が少なくとも２つある：（１）種間の配列の違いに基づくもの（つまりＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））；（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくもの（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８）。加えて、当該分野では、これら２つのアプローチを組み合わせた手法がＣＤＲの決定に用いられることもある。
【００８４】
Ｋａｂａｔの方法に従うアミノ酸の位置の番号付けとは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに用いられている番号付けシステムである。この番号付けシステムを利用すると、実際の直線状のアミノ酸配列はより短くなるまたは付加的なアミノ酸を含む可能性があり、これは、可変ドメインのＦＷもしくはＣＤＲの短縮、またはこれへの挿入に相当するものである。例えば、重鎖可変ドメインが、Ｈ２の５２番目の残基の後にアミノ酸１つ（Ｋａｂａｔの方法による残基５２ａ）の挿入を含む場合や、重鎖ＦＷの８２番目の残基の後に複数の残基（例えば、Ｋａｂａｔの方法による残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）が挿入されている場合がある。
【００８５】
所与の抗体に関するＫａｂａｔの残基番号付けは、抗体の配列に含まれている相同的な領域を、Ｋａｂａｔの方法によって番号が付けられている「標準的な」配列と整列させることによって決定することができる。代わりにＣｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ−Ｈ１ループの末端にＫａｂａｔの番号付けシステムで番号をふると、ループの長さによってＨ３２からＨ３４と多様になる（これは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムではＨ３５ＡとＨ３５Ｂの位置に挿入が入るためであり、３５Ａも３５Ｂもいずれも存在しない場合にはループ末端は３２となり、３５Ａだけが存在する場合にはループ末端は３３となり、３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合にはループ末端は３４になる）。ＡｂＭの超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの歩み寄りを示しており、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアに用いられている。
【００８６】
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）も、ＣＤＲを含む免疫グロブリン可変領域についての番号付与システムを提供している。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）を参照のこと。ＩＭＧＴの番号付けシステムは、５，０００を上回る配列の比較、構造データ、および超可変ループの特徴付けに基づくものであり、多くの種の可変領域およびＣＤＲ領域を容易に比較することができる。ＩＭＧＴの番号付けシステムでは、ＶＨ−ＣＤＲ１は２６〜３５番目に、ＶＨ−ＣＤＲ２は５１〜５７番目に、ＶＨ−ＣＤＲ３は９３〜１０２番目に、ＶＬ−ＣＤＲ１は２７〜３２番目に、ＶＬ−ＣＤＲ２は５０〜５２番目に、およびＶＬ−ＣＤＲ３は８９〜９７番目に位置している。
【００８７】
本明細書全体で使用する場合、本明細書に記載されるＶＨ  ＣＤＲ配列とは、慣例にならって、Ｋａｂａｔの番号付けの位置に対応するものとする。すなわち、ＫａｂａｔのＶＨ−ＣＤＲ１は３１〜３５番目に、ＶＨ−ＣＤＲ２は５０〜６５番目に、およびＶＨ−ＣＤＲ３は９５〜１０２番目に位置している。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３もまた、慣例的なＫａｂａｔの番号付けの位置に従い、それぞれ、１４〜２４番目、５０〜５６番目、および８９〜９７番目に位置している。
【００８８】
本明細書で使用する場合、軽鎖（ＶＬ）または重鎖（ＶＨ）可変領域中にあるＣＤＲに関する「共通配列」という用語は、複数配列の比較に基づき、所与の位置にあるアミノ酸残基が存在しているという情報によって規定された、アミノ酸配列のまとまり、または一般化されたアミノ酸配列を指す。従って、ＶＬまたはＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３に関する「共通配列」中には、ある特定のアミノ酸位置がその位置に生じる可能性のある複数のアミノ酸残基のうちの１つが存在する。例えば、特定の位置Ｘにアルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）が存在している場合、共通配列中のその位置もアルギニンまたはセリン（ＲまたはＳ）となる可能性がある。そのような出現は例えば、Ｎ−Ｚ１Ｚ２ＸｎＺｔ−１Ｚｔ−Ｃと表すことができ、ここでＺ１＞ｔは複数配列の比較において変化しないアミノ酸であり、Ｘは変動のあるアミノ酸（例えば、ＲまたはＳ）で占められていることを表し、下付のｎは序数である。本明細書で使用され、ポリペプチド配列が共通配列からなるまたは共通配列を含んでいると言う場合、これは、そのポリペプチド配列が、共通配列として示されていて、生じる可能性のある複数のアミノ酸配列のうちの１つからなるまたはそれを含むことを意味する。
【００８９】
「抗原結合断片」という用語は、完全な抗体の一部分を指し、また、完全な抗体の抗原決定性の可変領域であることを指す。当該分野では、抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片によることが知られている。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直鎖抗体、一本鎖抗体および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００９０】
「Ｆａｂ」という用語は、免疫グロブリン（通常はＩｇＧ）を酵素であるパパインで消化して得られるものと本質的に等価な抗体断片を指す。Ｆａｂ断片の重鎖セグメントがＦｄ部分である。このような断片は、完全な抗体を酵素でまたは化学的に断片化すること、部分的な抗体配列をコードしている遺伝子から組換えることで生産することができ、あるいは全体をまたは一部分を合成して生産することができる。
【００９１】
「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２断片に含まれている２つの重鎖部分を結合しているジスルフィド架橋または架橋構造を還元することで得られるものと本質的に等価な抗体断片を指す。このような断片は、完全な抗体を酵素を用いてまたは化学的に断片化すること、部分的な抗体配列をコードしている遺伝子から組換えることで生産することができ、あるいは全体をまたは一部分を合成して生産することができる。
【００９２】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、免疫グロブリン（通常はＩｇＧ）を酵素であるペプシンを用い、４．０〜４．５のｐＨで消化して得られるものと本質的に等価な断片を指す。このような断片は、完全な抗体を酵素でまたは化学的に断片化すること、部分的な抗体配列をコードしている遺伝子から組換えることで生産することができ、あるいは全体をまたは一部分を合成して生産することができる。
【００９３】
「Ｆｖ」という用語は、非共有的な相互作用で結合している１つのＮＨドメインと１つのＮドメインからなる抗体断片を指す。
【００９４】
「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定因子またはエピトープの非常に特異的な認識と結合に関わっている、均一な抗体集団を指す。これは、通常複数の異なる抗原決定因子に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、完全な抗体および完全長モノクローナル抗体の両方ならびに抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含んでいる融合タンパク質、および抗体認識部位を含んでいる他の任意の改変されている免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選抜、組換え発現、およびトランスジェニック動物などを含む、任意の数の方法で産生されたそのような抗体を指す。
【００９５】
「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当該分野で知られている任意の技術によって、人為的に産生された抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を指す。このヒト抗体の定義には、完全なまたは完全長抗体、その断片、および／またはヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを少なくとも１つ含んでいる抗体、例えばマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含んでいる抗体が含まれる。「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含むように改変した非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２以上の種に由来する抗体を指す。通常、軽鎖および重鎖の可変領域は両方とも、１種類の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来し、所望の特異性、親和性、および性能を有する抗体の可変領域に相当するが、定常領域はその種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種（一般にヒト）由来の抗体に含まれている配列と相同である。
【００９６】
一実施形態では、本発明の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体は抗体変異体を含む。「抗体変異体」または「改変された抗体」という用語は、自然には発生せず、かつ、本明細書に記載する少なくとも１つのアミノ酸もしくはアミノ酸の改変によって、天然に由来する抗体とは異なるアミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学を有する抗体を含む。本明細書で使用する場合「抗体変異体」という用語は、天然には存在しない形に変化している人工の抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖抗体部分を含むが、２つの完全な重鎖を含まない抗体（例えば、ドメイン欠損抗体またはミニボディ）；２つ以上の異なる抗原または単一の抗原にある２つ以上の異なるエピトープに結合するように改変しされた多重特異的な形態の抗体（例えば、二重特異的、三重特異的など）；ｓｃＦｖ分子に連結している重鎖分子；一本鎖抗体；二重特異性抗体；トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）；および改変したエフェクター機能を有する抗体などを含む。
【００９７】
本明細書で使用する場合「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ分子」という用語は、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその一部分と１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）またはその一部分からなる結合分子であって、各可変ドメイン（またはその一部）が同じまたは異なる抗体に由来する、結合分子を含む。一本鎖Ｆｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入されたｓｃＦｖリンカーを含むことが好ましい。一実施形態においてｓｃＦｖは、（Ｎ−末端）ＶＨ−任意のｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（Ｃ−末端）を含む。別の実施形態においてｓｃＦｖは、（Ｎ−末端）ＶＬ−任意のｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（Ｃ−末端）を含む。ｓｃＦｖ分子の例は当該分野で知られており、また、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７：５１（１９８９）；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７（１９９１）；Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３（１９９１）；Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７（１９９１）に記載されている。
【００９８】
本明細書で使用する場合「ｓｃＦｖリンカー」という用語は、ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインの間に挿入された部分を指す。ｓｃＦｖリンカーは好ましくは、抗原結合の立体構造でｓｃＦｖ分子を維持する。一実施形態においてｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むかまたはこれからなる。ある特定の実施形態においてｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒペプチドリンカーを含むかまたはこれからなる。他の実施形態においてｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【００９９】
本明細書で使用する場合「抗原結合分子」という用語は、本明細書で開示の１つ以上の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体に由来するＣＤＲを少なくとも１つ含んでいる抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体断片、変異体、またはその誘導体を含む分子を指す。いくつかの実施形態では、抗原結合分子はタンパク質である。他の実施形態において抗原結合分子は、本明細書で開示の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体のうちの１つに由来するＣＤＲを少なくとも１つ含んでいるタンパク質足場（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）または非タンパク質足場である。いくつかの実施形態において抗原結合分子は、本明細書で開示の方法で同定した、本明細書で開示のＣＤＲ配列のうちの１つと同一のＣＤＲを少なくとも１つ含んでいる、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体である。「抗原結合分子」という用語はまた、本明細書で開示の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の１つ以上に由来するＶＨおよび／またはＶＬ領域を含んでいるいかなる分子をも包含する。
【０１００】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、１つだけの核酸および複数の核酸を包含することを意図しており、かつ、単離した核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある特定の実施形態においてポリヌクレオチドは、標準的なホスホジエステル結合または標準的でない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含む。
【０１０１】
「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに含まれている任意の１つ以上核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離した」核酸またはポリヌクレオチドとは、天然の環境から取り出した核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを意図する。単離したポリヌクレオチドの例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中で他のポリヌクレオチドから精製（部分的にまたは実質的に）されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離したＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物がある。本発明による単離したポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、合成したそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルなどの調節エレメントを含む場合がある。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「コード領域」または「コード配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」（ｔａｇ、ｔｇａ、またはｔａａ）は通常アミノ酸には翻訳されないが、これもコード領域の一部だと見なすことができる。しかし、隣接している配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロンなどはいずれも、コード領域の一部ではない。コード領域の境目は通常、結果として生じるポリペプチドのアミノ末端をコードしている５’末端の開始コドンと結果として生じるポリペプチドのカルボキシ末端をコードしている３’末端の転写終止コドンによって規定される。
【０１０３】
２つ以上の本発明のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター中に、または別々のポリヌクレオチド構築物、例えば、別々の（異なる）ベクター中に含まれる場合がある。そのため、単一のベクターがコード領域を１つだけ含む場合と、２つ以上のコード領域を含む場合がある。例えば、後述するように、単一のベクターが結合ドメイン−Ａと結合ドメイン−Ｂを別々にコードしている場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は本発明の結合ドメインをコードしている核酸に融合しているまたは融合していないかいずれかの異種コード領域をコードしている場合がある。異種コード領域としては、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが挙げられる。
【０１０４】
本発明で使用する「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本発明に従って所望のポリヌクレオチドを細胞内に導入し発現させるための媒体として使用されるベクターを意味する。当業者に知られているように、そのようなベクターはプラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群より容易に選択することができる。当該発明に合致するベクターは一般的に、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進し、真核細胞もしくは原核細胞内への進入能力および／または細胞内での複製能力を高める適切な制限酵素部位を含む。
【０１０５】
数多くの発現ベクター系を使用して本発明の抗体、その抗原結合分子またはキメラ分子を生産することができる。例えば、あるクラスのベクターでは、動物ウイルス、例えばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス由来のＤＮＡエレメントが利用される。加えて、形質移入された宿主細胞を選抜することができる１つ以上のマーカーを導入することで、細胞の染色体にＤＮＡが組み入れられた細胞を選択することができる。マーカーは、栄養要求性の宿主には原栄養性を、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を付与することができる。選択マーカーの遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接結合させるか、あるいは同時形質転換によって同じ細胞に導入させることができる。一実施形態では、誘導性の発現系を利用することができる。ｍＲＮＡの最適な合成には、さらなるエレメントが必要となる場合がある。そのようなエレメントとしては、シグナル配列、スプライスシグナルならびに、転写のプロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが挙げられる。一実施形態では、分泌シグナル、例えば、解析が進んでいるいくつかの細菌のリーダーペプチド（例えば、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、またはｏｍｐＡ）のうちのいずれか１つを、本発明のポリペプチドのＮ末端に読み枠を合わせて融合させ、ポリペプチドの最適な分泌を得ることができる。（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）．ＰＮＡＳ，８７：８０９５）。
【０１０６】
哺乳類細胞から分泌されるある特定のタンパク質は分泌シグナルペプチドと接続しており、生成中のタンパク質鎖の粗面小胞体を通る排出が開始されると、成熟タンパク質から切り出される。当業者であれば、シグナルペプチドは通常、ポリペプチドのＮ−末端に融合されており、完全なまたは「完全長」ポリペプチドから切り出されて分泌型または「成熟型」形態のポリペプチドが生産されることを知っている。ある特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチドまたはそれらの配列の機能性誘導体であって、その配列が操作可能に接続しているポリペプチドの分泌を促す能力を保持している配列が使用される。あるいは、別種の哺乳類のシグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）もしくはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはそれらの機能性誘導体を使用することができる。
【０１０７】
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって生産されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。組換え技術によって生産され、宿主細胞中で発現しているポリペプチドおよびタンパク質は、好適な技術のいずれかによって分離された、分画化された、または部分的にもしくは実質的に精製された天然のまたは組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと見なされる。
【０１０８】
「宿主細胞」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードしているベクターによって形質転換した細胞を指す。タンパク質を組換え宿主から単離する過程に関する記述では、「細胞」および「細胞培養」という用語は同じ意味で使用され、そうでないことが明示されていない限り、タンパク質の供給源を表す。言い換えると、「細胞」からのタンパク質の回収とは、遠心して集めた細胞全体または培地とそれに懸濁している細胞の両方を含む細胞培養のいずれかから回収することを意味する場合がある。タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳動物由来の細胞株である。当業者であれば、発現させる所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を選択的に決定する能力を有するだろう。宿主細胞株の例としては、限定されないが、ＣＨＯ細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌腫）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を含むＣＶＩ誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＰｅｒＣ６細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、およびＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）が挙げられる。宿主細胞株は通常、商用のサービス、アメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、または公開されている文献から入手できる。
【０１０９】
ＩＩ．  キメラＦＶＩＩ分子
ＩＩ．Ａ．  抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体とＸＴＥＮを含んでいるキメラ分子
本発明は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板表面にあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的に結合する抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体およびその抗原結合分子を含んでいるキメラ分子を提供する。キメラ分子は、ＦＶＩＩの血中半減期を延ばし、活性型血小板への結合親和性が高まり、そのことによって投与頻度が下げられるように構築される。その結果本発明のキメラ分子は、長い半減期と高い活性の組み合わせられた、持続性でより強力な形のＦＶＩＩ変異体である。血中半減期を改良するために、ｒＦＶＩＩａを、ペイロードタンパク質の流体力学半径を大きくする親水性で構造が定まっていないポリペプチドであるＸＴＥＮポリペプチドに融合させた。加えて、高い親和性で血小板受容体αＩＩβ３に結合する抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子によってｒＦＶＩＩａを血小板に標的化することで凝固活性が高まる。
【０１１０】
キメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、またはＩＩ．Ａ．１．項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順番で含む可能性がある。一実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、およびＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む。別の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩ、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、およびＸＴＥＮポリペプチドを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＸＴＥＮポリペプチド、ＦＶＩＩ、およびＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、ＦＶＩＩ、およびＸＴＥＮポリペプチドを含む。その上さらに他の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＸＴＥＮポリペプチド、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、およびＦＶＩＩを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、ＸＴＥＮポリペプチド、およびＦＶＩＩを含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、（ａ）ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｘ−（Ｌ２）−Ｔｍ；（ｂ）ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−Ｘ；（ｃ）Ｔｍ−（Ｌ１）−Ｘ−（Ｌ２）−ＦＶＩＩ；（ｄ）Ｔｍ−（Ｌ１）−ＦＶＩＩ−（Ｌ２）−Ｘ；（ｅ）Ｘ−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−ＦＶＩＩ；および（ｆ）Ｘ−（Ｌ１）−ＦＶＩＩ−（Ｌ２）−Ｔｍ；からなる群より選択される式を含み、式中、ＦＶＩＩはＦＶＩＩａを含み；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり；ＴｍはＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；Ｌ１は第一の随意のリンカーであり、およびＬ２は第二の随意のリンカーである。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖とを含んでいる１本のポリペプチド鎖または２本のポリペプチド鎖である。
【０１１２】
一実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖とＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む。別の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順序で含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖を含む。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を任意の順序で含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＨの式を含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＨの式を含む。他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨの式を含む。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨの式を含む。その上さらに他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、または、および、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨの式を含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨの式を含む。キメラ分子の各要素は以下の様に記載する：ＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；ＴｍはＩＩ．Ａ．１．の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；およびＸはＸＴＥＮポリペプチドである。
【０１１４】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、Ｘ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ、Ｘ−ＦＶＩＩＬ：Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ、ＦＶＩＩＬ−Ｘ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ、ＦＶＩＩＬ−Ｘ：Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ、Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：Ｘ−ＦＶＩＩＬ、Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ−Ｘ、ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ：ＦＶＩＩＬ−Ｘ、またはＦＶＩＩＨ−Ｔｍ：Ｘ−ＦＶＩＩＬの式を含み、ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；ＴｍはＩＩ．Ａ．１．の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり、（：）は２つのポリペプチド鎖の間の接続である。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ−Ｔｍ；Ｔｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−Ｘ；またはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬの式を含み、ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；ＴｍはＩＩ．Ａ．１．の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり、（：）は２つのポリペプチド鎖の間の接続である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖は、例えば共有結合または非共有結合によって接続している。他の実施形態において第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続は、凝固因子の重鎖と軽鎖の間の共有結合である。具体的な実施形態では、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続はジスルフィド結合である
【０１１６】
本発明のキメラ分子は、１本のポリペプチド鎖をコードしている１本のポリヌクレオチド鎖または２本以上のポリペプチド鎖をコードしている２本以上のポリヌクレオチド鎖から生産することができる。一実施形態では、１本のポリヌクレオチド鎖によってコードされている１本のポリペプチド鎖を、２本以上のポリペプチド鎖に加工することができる。別の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、タンパク質切断部位、ＦＶＩＩの重鎖およびＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む１本のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩの軽鎖、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、タンパク質切断部位、ＦＶＩＩの重鎖およびＸＴＥＮポリペプチドを含む１本のポリペプチド鎖を含む。他の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩの軽鎖、任意のタンパク質切断部位、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む１本のポリペプチド鎖を含む。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩの軽鎖、任意のタンパク質切断部位、ＦＶＩＩの重鎖、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子およびＸＴＥＮポリペプチドを含む１本のポリペプチド鎖を含む。その上さらに他の実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、任意のタンパク質切断部位およびＦＶＩＩの重鎖を含む１本のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、ＦＶＩＩの軽鎖、ＩＩ．Ａ．１の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、ＸＴＥＮポリペプチド、任意のタンパク質切断部位およびＦＶＩＩの重鎖を含む１本のポリペプチド鎖を含む。他の実施形態では、タンパク質切断部位は細胞内プロセシング部位である。細胞内プロセシング部位は、プロテアーゼ酵素のうちのいずれか、例えば、ＰＣ５、ＰＡＣＥ、ＰＣ７、およびそれらの任意の組み合わせなどのプロタンパク質転換酵素によってプロセシングされる可能性がある。
【０１１７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、配列番号１９２または配列番号１９３によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態においてキメラ分子は、配列番号１９２または配列番号１９３によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
ＩＩ．Ａ．１  抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子
「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体」、「抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体」、「抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」、「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する抗体」という用語およびその文法的な変異形はいずれも、十分な親和性でＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的に結合することが可能な抗体であって、そのため、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを標的とする治療薬または診断薬の一部として有用な抗体を指す。本明細書で開示の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体が、無関係の非ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａタンパク質に結合する度合いは、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（組換えＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを分析物として、抗体をリガンドとして用いる、もしくは逆でもよい）、または当該分野で知られている他の結合アッセイで測定した場合、抗体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する度合いの約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、または≦０．１ｐＭの解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１１９】
本明細書で使用する場合「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」および「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体」という用語は、血小板に見られるインテグリン複合体である糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（インテグリンαＩＩｂβ３としても知られている）を指す。インテグリンはαサブユニットとβサブユニットの２本の鎖から構成されており、これらの鎖はカルシウム依存性の非共有結合によって互いに連結している。ＧＰＩＩｂはαサブユニットを構成しており、二価のカチオン結合ドメインを含む。一方、ＧＰＩＩＩａは一般的なβサブユニットの前駆体（β３）である。血中に含まれる血小板のそれぞれに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体が３５，０００〜１００，０００個存在している。大部分は血小板表面に分布しており、一部が血小板内部に貯蔵されている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体は、血小板が外生のアゴニスト、例えばＡＤＰまたはトロンビンによって活性化されるまで、その血漿リガンドと相互作用しない。血小板が活性化されると内側から外側に向かってシグナルが生成され、その結果、複合体の細胞外部分の構造が変化し、分子はフィブリノゲンや他のリガンドと結合できるようになる。２０１３＿０５（２０１３年５月１日）に公開されたユニバーサル・プロテイン・リソース（Ｕｎｉｐｒｏｔ）データベースに記載されているユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）登録番号Ｐ０５１０６（ＩＴＢ３＿ヒト；ＧＰＩＩＩａ：ＣＤ６１；インテグリンβ−３；インテグリンβ３）およびＰ０８５１４（ＩＴＡ２Ｂ＿ヒト；ＧＰＩＩｂ；ＣＤ４１；インテグリンα−２ｂ；インテグリンαＩＩ）を参照のこと（この全体は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２０】
本発明のキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに特異的に結合する抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む場合があり、このエピトープは、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体（表３を参照のこと）のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合エピトープを含むか、またはこれらと重複している。一実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに特異的に結合する抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む場合があり、このエピトープは、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体（表３を参照のこと）のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合エピトープと同じである。本明細書で使用する場合「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される、特定のアミノ酸配列、改変されたアミノ酸配列、またはタンパク質の二次もしくは三次構造を指す。「特異的に認識している」、「特異的に認識する」という用語および文法的な変異形はいずれも、抗体またはその抗原結合分子が、エピトープ、例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのアミノ酸と特異的に相互作用するおよび／または結合することが可能なことを意味している。そのような結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性として例えることができる。従って、抗原結合ドメインのアミノ酸配列に含まれている特定のモチーフとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子およびエピトープは、それらの一次、二次または三次構造ならびに構造の二次的な改変の結果、互いに結合する。
【０１２１】
別の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチドおよび抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体（表１を参照のこと）と結合するのを競合的に阻害する。他の実施形態において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに特異的に結合する抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４（表１に開示する抗体）の１つ以上からなる群より選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその変異体を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ含む。さらに他の実施形態において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合分子は、本明細書で開示する３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４の１つ以上からなる群より選択される抗体のＣＤＲまたはその変異体を６つ含む。いくつかの実施形態においてＣＤＲは、３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または６つの抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域に由来するＣＤＲまたはその変異体から独立して選択される。
【０１２２】
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および／または、
（ｖｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｉｉｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１２４】
他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｉｉｉ）３４Ｄ１０、１２Ｂ２、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、および１８Ｆ７からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、および１８Ｆ７からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、および１８Ｆ７からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、および１８Ｆ７からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、および１８Ｆ７からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および／または
（ｖｉ）３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、および１８Ｆ７からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＨ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ１と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ２と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および／または、
（ｖｉ）１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、および２８Ｆ４からなる群より選択される抗体のＶＬ−ＣＤＲ３と、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２５、３１、３７、４３または１１１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号２６、３２、３８、４４、または１１２のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７、３３、３９、４５、または１１３のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号２８、３４、４０、１１７、または１１４のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号２９、３５、４１、１１８、または１１５のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号３０、３６、４２、１１９、または１１６のいずれか１つと少なくとも約６０、７０、８０、９０、または９５％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）共通配列Ｘ１ＹＡＭＳ（ここでＸ１は任意のアミノ酸残基、例えば、非荷電で極性をもつまたは極性をもたない側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＴｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、またはＡｌａ（Ａ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）共通配列ＳＩＸ２Ｘ３ＧＸ４Ｘ５ＴＹＸ６Ｘ７ＤＳＶＫＸ８（ここでＸ２は任意のアミノ酸残基、例えば、非荷電で極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）またはＡｓｎ（Ｎ）を表し、Ｘ３は任意のアミノ酸残基、例えば非荷電で極性をもたない側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）またはＧｌｙ（Ｇ）を表し、Ｘ４は任意のアミノ酸残基、例えば、非荷電で極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）またはＧｌｙ（Ｇ）を表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基、例えば、非荷電で極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）、Ａｓｎ（Ｎ）、またはＴｈｒ（Ｔ）を表し、Ｘ６は任意のアミノ酸残基、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＴｙｒ（Ｙ）またはＰｈｅ（Ｆ）を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸残基、例えば極性をもたない側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＬｅｕ（Ｌ）またはＰｒｏ（Ｐ）を表し、およびＸ８は任意のアミノ酸残基、例えば、塩基性側鎖もしくは非荷電で極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えば、Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｒｇ（Ｒ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）共通配列ＧＧＤＹＧＹＡＸ９ＤＹ（ここでＸ９は任意のアミノ酸残基、例えば、極性をもたない側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＬｅｕ（Ｌ）またはＭｅｔ（Ｍ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列ＲＡＳＳＳＶＮＹＭＹ（配列番号２８）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＹＴＳＮＬＡＰ（配列番号２９）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＦＳＳＳＰＷＴ（配列番号３０）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２５、３１、３７、４３および１１１からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１配列；
（ｉｉ）配列番号２６、３２、３８、４４および１１２からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７、３３、３９、４５および１１３からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ３配列；
（ｉｖ）配列番号２８、３４、４０、１１７および１１４からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１配列；
（ｖ）配列番号２９、３５、４１、１１８および１１５からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ２配列；および、
（ｖｉ）配列番号３０、３６、４２、１１９および１１６からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ３配列、
を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１、３、５、７、または９７のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号２、４、６、９９、または９８のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。他の実施形態において抗体またはその抗原結合分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗体またはその抗原結合分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号６のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗体またはその抗原結合分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号９９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗体またはその抗原結合分子は、配列番号９７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号９８のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインに局在しているＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープまたはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の細胞外ドメインから形成される結合部位に結合する。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合しない。
【０１３１】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号４６、５２、１２０、または１２６のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号４７、５３、１２１、または１２７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号４８、５４、１２２、または１２８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号４９、５５、１２３、または１２９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号５０、５６、１２４、または１３０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号５１、５７、１２５、または１３１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列ＮＹＬＩＥ（配列番号４６）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列ＶＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号４７）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列ＧＲＹＥＷＹＦＤＶ（配列番号４８）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）共通配列ＲＡＳＱＤＩＸ１０ＮＹＬＮ（ここでＸ１０は任意のアミノ酸残基、例えば、非荷電で、極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）を表す）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号５０）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＧＹＴＬＰＹＴ（配列番号５１）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号４６、５２、１２０、および１２６からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１配列；
（ｉｉ）配列番号４７、５３、１２１、および１２７からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号４８、５４、１２２、および１２８からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ３配列；
（ｉｖ）配列番号４９、５５、１２３、および１２９からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１配列；
（ｖ）配列番号５０、５６、１２４、および１３０からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ２配列；および、
（ｖｉ）配列番号５１、５７、１２５、および１３１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ３配列、
を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号８、１０、１００、または１０２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号９、１１、１０１、または１０３のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインに局在しているＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープまたはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の細胞外ドメインから形成される結合部位に結合する。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【０１３５】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号５８と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号５９と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号６０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号６１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号６２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号６３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号５８を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５９を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号６０を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ））配列番号６１を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号６２を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；
（ｖｉ）配列番号６３を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子のエピトープは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニットの細胞外ドメインに局在している。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【０１３８】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号６４、７０または１３５のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号６５、７１または１３６のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号６６、７２または１３７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号６７、１３２または１３８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号６８、１３３または１３９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号６９、１３４または１４０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１３９】
他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、（ｉ）配列ＳＹＷＩＥ（配列番号６４）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；（ｉｉ）共通配列ＥＩＬＰＧＸ１４ＧＸ１５ＴＫＹＮＸ１６ＫＦＫＧ（配列番号＿＿）（ここでＸ１４は任意のアミノ酸、例えば、非荷電で極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）を表し、Ｘ１５は任意のアミノ酸、例えば、非荷電で極性をもつ側鎖もしくはβ分岐型の側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＩｌｅ（Ｉ）またはＴｙｒ（Ｙ）を表し、およびＸ１６は任意のアミノ酸、例えば、酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列ＬＩＳＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号６６）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６７）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；（ｖ）配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号６８）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、（ｖｉ）配列ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ（配列番号６９）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号６４、７０、および１３５からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１配列；
（ｉｉ）配列番号６５、７１、および１３６からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号６６、７２、および１３７からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ３配列；
（ｉｖ）配列番号６７、１３２、および１３８からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１配列；
（ｖ）配列番号６８、１３３、および１３９からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ２配列；および、
（ｖｉ）配列番号６９、１３４、および１４０からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ３配列、
を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１４、１６、または１０５のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１５、１０４、または１０６のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１５のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインにあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに結合する。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合しない。
【０１４２】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８５または１４７のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８６、または１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８７、または１４９のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号１４１、１４４、８２、８８、または１５０のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号１４２、１４５、８３、８９、または１５１のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号１４３、１４６、８４、９０、または１５２のいずれか１つと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）共通配列ＴＳＧＸ１１ＧＶＧ（ここでＸ１１は任意のアミノ酸残基、例えば、極性をもたない側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＭｅｔ（Ｍ）またはＬｅｕ（Ｌ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）共通配列ＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＸ１２ＬＫＳ（ここでＸ１２は任意のアミノ酸残基、例えば、極性をもたない側鎖もしくはβ分岐型の側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＡｌａ（Ａ）またはＴｈｒ（Ｔ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）共通配列ＳＨＹＸ１３ＧＴＦＹＦＤＸ１４（ここでＸ１３は任意のアミノ酸残基、例えば、非荷電で極性をもつ側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＴｙｒ（Ｙ）またはＡｓｎ（Ｎ）を表し、およびＸ１４は任意のアミノ酸残基、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＴｙｒ（Ｙ）またはＰｈｅ（Ｆ）を表す）を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号８２）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号８３）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列ＱＱＨＩＥＹＰＷＴ（配列番号８４）を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８５および１４７からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１配列；
（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８６および１４８からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ２配列；
（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８７および１４９からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ３配列；
（ｉｖ）配列番号１４１、１４４、８２、８８および１５０からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１配列；
（ｖ）配列番号１４２、１４５、８３、８９および１５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ２配列；および、
（ｖｉ）配列番号１４３、１４６、８４、９０および１５２からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ３配列、
を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体または抗原結合分子は、配列番号１７、１８、１９、２１、または１０９のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０７、１０８、２０、２２、または１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体または抗原結合分子は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号１１０のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体または抗原結合分子は、配列番号１９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号２０のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体または抗原結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号２２のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのβサブユニットの細胞外ドメインにあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに結合する。他の実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【０１４７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号９１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）配列；
（ｉｉ）配列番号９２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）配列；
（ｉｉｉ）配列番号９３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変重鎖ＣＤＲ−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）配列；
（ｉｖ）配列番号９４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）配列；
（ｖ）配列番号９５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）配列；および、
（ｖｉ）配列番号９６と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一の可変軽鎖ＣＤＲ−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）配列、
を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号９１を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号９２を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号９３を含んでいるＶＨ−ＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号９４を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号９５を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ２；および、
（ｖｉ）配列番号９６を含んでいるＶＬ−ＣＤＲ３、
を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチド、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含み、ここで抗体またはその抗原結合分子は、配列番号２３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ領域と配列番号２４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ領域とを含む。いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、その分子の細胞外ドメインにあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに結合し、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について競合する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、（ａ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；（ｂ）ディアボディ；（ｃ）ミニボディ；（ｄ）抗体のポリペプチド鎖；（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；または（ｆ）Ｆ（ａｂ）を含むか、またはこれらからなる。ある特定の実施形態では、好適な抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子としては、例えば、特定の結合対、抗体、モノクローナル抗体、または本明細書で開示の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体に由来する誘導体もしくは類似体、例えば、限定されないが、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖ドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ならびに前述したものの多価型；多価の結合剤、例えば、限定されないが、単一特異性もしくは二重特異性抗体（ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、直列型ｓｃＦｖ（（ｓｃＦｖ）断片）など）、ディアボディ、トリボディもしくはテトラボディ（これらは通常、共有結合しているか、そうでなければ安定化している（つまりロイシンジッパーもしくはヘリックスで安定している）ｓｃＦｖ断片である）のいずれかのメンバーが挙げられる。
【０１５１】
ＩＩ．Ｂ．  標的化部分とＸＴＥＮを含んでいるキメラ分子
本発明はまた、ＦＶＩＩの軽鎖、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分の組み合わせを含んでいるキメラ分子も提供する。血液凝固活性および薬物動態特性を改善するためにキメラ分子は、半減期を延長する部分、つまりＸＴＥＮポリペプチドと血小板標的化部分を含む場合がある。
【０１５２】
一実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖と血小板に結合する標的化部分を含む。別の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と血小板に結合する標的化部分を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分を含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分、またはＸＴＥＮポリペプチドを含む。
【０１５３】
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＨの式を含む。いくつかの実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬ−ＸもしくはＸ−ＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−ＴｍもしくはＴｍ−ＦＶＩＩＨの式を含む。他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｘ−ＴｍもしくはＴｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨの式を含む。その上さらに他の実施形態においてキメラ分子は、互いに接続している第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＬの式を含み、かつ、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−ＸもしくはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨの式を含む。キメラ分子の各構成要素は次のように表す：ＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは血小板に結合する標的化部分であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；およびＸはＸＴＥＮポリペプチドである。
【０１５４】
他の実施形態においてキメラ分子は、Ｘ−ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ、Ｘ−ＦＶＩＩＬ：Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ、ＦＶＩＩＬ−Ｘ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ、ＦＶＩＩＬ−Ｘ：Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ、Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：Ｘ−ＦＶＩＩＬ、Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ−Ｘ、ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ：ＦＶＩＩＬ−ＸまたはＦＶＩＩＨ−Ｔｍ：Ｘ−ＦＶＩＩＬの式を含み、ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは血小板に結合する標的化部分であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり、および（：）は２つのポリペプチド鎖の間の接続である。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｘ−Ｔｍ；Ｔｍ−Ｘ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬ；ＦＶＩＩＬ：ＦＶＩＩＨ−Ｔｍ−Ｘ；またはＸ−Ｔｍ−ＦＶＩＩＨ：ＦＶＩＩＬの式を含み、ここでＦＶＩＩＨはＦＶＩＩの重鎖であり；Ｔｍは血小板に結合する標的化部分であり；ＦＶＩＩＬはＦＶＩＩの軽鎖であり；ＸはＸＴＥＮポリペプチドであり、および（：）は２つのポリペプチド鎖の間の接続である。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、キメラ分子の第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖は互いに接続している。第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続は、共有結合、または非共有結合であってもよい。いくつかの実施形態において第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続は、ＦＶＩＩの重鎖と軽鎖の間の共有結合である。他の実施形態では、第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖との間の接続は共有結合、つまりジスルフィド結合である
【０１５６】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、一本鎖のポリペプチド鎖を含み、この一本鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端方向に、
（ａ）ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、および血小板に結合する標的化部分；
（ｂ）ＦＶＩＩの軽鎖、血小板に結合する標的化部分、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、およびＸＴＥＮポリペプチド；
（ｃ）ＦＶＩＩの軽鎖、追加のプロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分；または、
（ｄ）ＦＶＩＩの軽鎖、追加のプロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分、およびＸＴＥＮポリペプチドを含む。一実施形態では、タンパク質切断部位は細胞内プロセシング部位を含む。別の実施形態では、細胞内プロセシング部位は、プロプロテイン変換酵素、例えば、ＰＣ５、ＰＡＣＥ、ＰＣ７、およびそれらの任意の組み合わせによって処理される。
【０１５７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、配列番号１９１または配列番号１９２によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、配列番号１８８または配列番号１９０によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
一実施形態において本発明のキメラ分子は、７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、またはＡＥ７２＿３）に融合させたＦＶＩＩ軽鎖と、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（例えば、３４Ｄ１０）のｓｃＦｖに融合させたＦＶＩＩ重鎖とを含む。別の実施形態において本発明のキメラ分子は、１４４個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ１４４、ＡＥ１４４＿２、ＡＥ１４４＿３、またはＡＧ１４４）に融合させたＦＶＩＩ軽鎖と、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（例えば、３４Ｄ１０）のｓｃＦｖに融合させたＦＶＩＩ重鎖とを含む。他の実施形態においてキメラ分子はＦＶＩＩ軽鎖とＦＶＩＩ重鎖を含み、ここでＦＶＩＩ重鎖は、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（例えば、３４Ｄ１０）のｓｃＦｖに７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、またはＡＥ７２＿３）で融合している。いくつかの実施形態においてキメラ分子はＦＶＩＩ軽鎖とＦＶＩＩ重鎖を含み、ここでＦＶＩＩ重鎖は、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（例えば、３４Ｄ１０）のｓｃＦｖに１４４個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ１４４、ＡＥ１４４＿２、ＡＥ１４４＿３、またはＡＧ１４４）で融合している。ある特定の実施形態においてキメラ分子は、４２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ４２、ＡＥ４２＿２、またはＡＥ４２＿３）に融合しているＦＶＩＩ軽鎖と、７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、またはＡＥ７２＿３）によって抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体のｓｃＦｖに融合しているＦＶＩＩ重鎖とを含む。他の実施形態においてキメラ分子は、７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、またはＡＥ７２＿３）に融合しているＦＶＩＩ軽鎖と、４２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ４２、ＡＥ４２＿２、またはＡＥ４２＿３）によって抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体のｓｃＦｖに融合しているＦＶＩＩ重鎖とを含む。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、またはＡＥ７２＿３）に融合しているＦＶＩＩ軽鎖と、７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮポリペプチド（例えば、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、またはＡＥ７２＿３）によって抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体のｓｃＦｖに融合しているＦＶＩＩ重鎖とを含む。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、血小板に結合する標的化部分は、抗体またはその抗原結合分子、受容体の受容体結合部分、およびペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において標的化部分は、休止状態にある血小板または活性状態にある血小板に選択的に結合する。他の実施形態において標的化部分は、ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、ＧＰＩＸ、非活性化形態の糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」）、活性化形態のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＯＸ−１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的に選択的に結合する。具体的な実施形態において標的化部分は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａエピトープに結合する抗体またはその抗原結合分子（「抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子」）である。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、「血小板に結合する」、「血小板との結合」という句およびその変異形は通常、（ｉ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子または（ｉｉ）本開示のキメラ分子が、血小板表面にある抗原部位、例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体のαおよび／またはβサブユニットの細胞外ドメインにあるエピトープに特異的に結合することを指す。当業者には、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが二カ所、つまり、休止状態の血小板の原形質膜プールおよび血小板が活性化した際に発現するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの内部プールに蓄えられていることが明らかである。例えば、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７：４９６−５００（２００１）を参照のこと。従って、いくつかの具体的な実施形態、特に血小板の原形質膜を透過処理してもよい診断的な実施形態では、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子と血小板との結合または本開示のキメラ分子と血小板との結合は、原形質膜プールおよび／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの内部プールとの結合を指す場合がある。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、キメラ分子に含まれる標的化部分は、抗体またはその抗原結合分子、受容体の受容体結合部分、およびペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において標的化部分は、休止状態にある血小板または活性状態にある血小板に選択的に結合する。他の実施形態において標的化部分は、ＧＰ１ｂａ（ユニプロット：Ｅ７ＥＳ６６；Ｅ７ＥＳ６６＿ヒト）、ＧＰＶＩ（ユニプロット：Ｑ９ＨＣＮ６；ＧＰＶＩ＿ヒト）、ＧＰＩＸ（ユニプロット：Ｐ１４７７０；ＧＰＩＸ＿ヒト）、非活性化形態の糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ」）、活性化形態のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、Ｐ−セレクチン（ユニプロット：Ｑ１４２４２；ＳＥＬＰＬ＿ヒト）、ＧＭＰ−３３（例えば、Ｄａｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８６：８８７−９３（２００１）を参照のこと）、ＬＡＭＰ−１（ユニプロット：Ｐ１１２７９；ＬＡＭＰ１＿ヒト）、ＬＡＭＰ−２（ユニプロット：Ｐ１３４７３；ＬＡＭＰ２＿ヒト）、ＣＤ４０Ｌ（ユニプロット：Ｐ２９９６５；ＣＤ４０Ｌ＿ヒト）、ＬＯＸ−１（ユニプロット：Ｐ７８３８０；ＯＬＲ１＿ヒト）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的に選択的に結合する。上で参照したユニプロットの識別番号は、２０１３＿０５（２０１３年５月１日）に公開されたユニバーサル・プロテイン・リソース（Ｕｎｉｐｒｏｔ）データベースの中で公開されている登録番号に対応し、これらの番号は参照により組み込まれる。ある特定の実施形態において標的化部分は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む。具体的な実施形態においてＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子は、ＩＩ．Ａ．１の項で開示したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子である。
【０１６３】
ＩＩ．Ｃ．  ＸＴＥＮポリペプチド
本発明で使用する「ＸＴＥＮ配列」とは、主に小さい親水性アミノ酸で構成されており、生理的な条件では二次構造または三次構造をとる程度が低い、またはそのような構造をとらない配列を有する、実質的に非反復性の、天然には存在しない長いポリペプチドを指す。キメラ分子のパートナーとしてのＸＴＥＮは、凝固因子、凝固因子の重鎖、凝固因子の軽鎖、標的化部分、もしくは他のいずれかの配列またはキメラ分子上の分子に連結させた場合、ある特定の所望の薬物動態、物理化学的な特性および医薬特性をもたらす担体として役立つ可能性がある。そのような所望される特性としては、限定されないが、改善された薬物動態指標および溶解度特性が挙げられる。本明細書で使用する場合「ＸＴＥＮ」からは、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片などの抗体または抗体断片は特異的に除外される。
【０１６４】
本発明のキメラ分子は１つのＸＴＥＮポリペプチドまたは２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドを含む可能性がある。一実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、第一のＸＴＥＮポリペプチド、第二のＸＴＥＮポリペプチドおよび抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子を含む。従ってキメラ分子は、ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｘ１−（Ｌ２）−Ｔｍ−（Ｌ３）−Ｘ２、Ｘ２−（Ｌ１）−Ｔｍ−（Ｌ２）−Ｘ１−（Ｌ３）−ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩ−（Ｌ１）−Ｘ１−（Ｌ２）−Ｘ２−（Ｌ３）−ＴｍまたはＴｍ−（Ｌ３）−Ｘ２−（Ｌ２）−Ｘ１−（Ｌ１）−ＦＶＩＩの式を含む可能性があり、ここでＦＶＩＩはＦＶＩＩａを含み、Ｘ１は第一のＸＴＥＮポリペプチドであり、Ｘ２は第二のＸＴＥＮポリペプチドであり、ＴｍはＩＩ．Ａ．１．の項に記載の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子であり、Ｌ１は第一の随意のリンカーであり、Ｌ２は第二の随意のリンカーであり、およびＬ３は第三の随意のリンカーである。別の実施形態においてキメラ分子は、互いが接続している２本のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と第一のＸＴＥＮポリペプチドを含んでおり、第二のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの重鎖、第二のＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分を任意の順番で含んでいる。他の実施形態においてキメラ分子は、互いが接続している２本のポリペプチド鎖を含み、ここで第一のポリペプチド鎖はＦＶＩＩの軽鎖と第一のＸＴＥＮポリペプチドを含んでおり、第二のポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端の方向に、ＦＶＩＩの重鎖、第二のＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分を、またはＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分および第二のＸＴＥＮポリペプチドを含んでいる。
【０１６５】
いくつかの実施形態において本発明のＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００よりも多くのアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態においてＸＴＥＮは、約２０〜約３０００よりも多くのアミノ酸残基、３０〜約２５００よりも多くの残基、４０〜約２０００よりも多くの残基、５０〜約１５００よりも多くの残基、６０〜約１０００よりも多くの残基、７０〜約９００よりも多くの残基、８０〜約８００よりも多くの残基、９０〜約７００よりも多くの残基、１００〜約６００よりも多くの残基、１１０〜約５００よりも多くの残基、または１２０〜約４００よりも多くの残基を含むペプチドまたはポリペプチドである。
【０１６６】
本発明のＸＴＥＮ配列は、９〜１４個のアミノ酸残基を含む配列モチーフを１つ以上、またはこの配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む可能性があり、ここでこのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される４〜６種類のアミノ酸を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。ＵＳ２０１０−０２３９５５４  Ａ１を参照のこと。
【０１６７】
いくつかの実施形態においてＸＴＥＮは重複していない配列モチーフを含み、これらの配列約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％は、複数の、表１から選択される単一のモチーフファミリーから選択される重複していない配列からなり、その結果、ファミリー配列を構成している。本明細書で使用する場合「ファミリー」とは、ＸＴＥＮが、表１に挙げる単一の分類に入るモチーフからのみ選択されるモチーフつまりＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ  ＸＴＥＮを含むこと、およびこのファミリーモチーフに由来しない、ＸＴＥＮに含まれている他のアミノ酸はいずれも、必要とされる特性、例えばコードしているヌクレオチドによる制限酵素部位の導入や開裂配列の導入を可能にすること、またはＦＶＩＩとのより良い結合を達成するために選択されることを意味している。ＸＴＥＮファミリーのいくつかの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーのうち、複数の、重複していない配列モチーフを含み、得られるＸＴＥＮは、上述した程度の相同性を示す。他の実施形態においてＸＴＥＮは、表１に挙げる２つ以上のモチーフファミリーからの、複数のモチーフ配列から構成される。これらの配列は、以下により詳細に記載するように、モチーフのアミノ酸組成によって付与される所望の物理的／化学的特徴、例えば、実効電荷、親水性などの特性、二次構造の欠如または反復性の欠如を達成するように選択することができる。この段落で上述した実施形態では、ＸＴＥＮに組み入れられるモチーフは、ＸＴＥＮが約３６〜約３０００個のアミノ酸残基を含むように、本明細書に記載の方法を利用して選択および構成することができる。ＦＶＩＩと結合しているＸＴＥＮのさらなる非限定的な例が米国特許出願公開第２０１２／０２６３７０１号に開示されており、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【表１−１】
2016530218.tif 000002
【表１−２】
2016530218.tif 000003
【０１６８】
ＸＴＥＮの長さは多様になり得る。一実施形態においてＸＴＥＮポリペプチドの長さは、融合タンパク質において達成される特性または機能に基づいて選択される。目的の特性または機能により、ＸＴＥＮは短くても、または中間的な長さになる場合があり、あるいは担体として役立つ可能性のあるより長い配列になり得る。ある特定の実施形態においてＸＴＥＮは、約６〜約９９アミノ酸残基の短いセグメント、約１００〜約３９９アミノ酸残基の中間的な長さのセグメント、および約４００〜約１０００、最大約３０００までのアミノ酸残基を含むより長いセグメントを含む。従って、ＦＶＩＩ（例えば、重鎖もしくは軽鎖）または標的化部分に結合しているＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または最長約３０００までの長さのアミノ酸残基になる可能性がある。他の実施形態においてＸＴＥＮ配列は、約６〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００、または約２０００〜約３０００までの長さのアミノ酸残基となる。ＦＶＩＩ（例えば、軽鎖もしくは重鎖）または標的化部分（Ｔｍ）に結合させることが可能なＸＴＥＮポリペプチドの正確な長さは、ＦＶＩＩの活性におよぼす悪影響を伴わずに、多様になり得る。一実施形態では、本明細書で使用される１つ以上のＸＴＥＮは、約４２個のアミノ酸、約７２個のアミノ酸、約１０８個のアミノ酸、約１４４個のアミノ酸、約１８０個のアミノ酸、約２１６個のアミノ酸、約２５２個のアミノ酸、約２８８個のアミノ酸、約３２４個のアミノ酸、約３６０個のアミノ酸、約３９６個のアミノ酸、約４３２個のアミノ酸、約４６８個のアミノ酸、約５０４個のアミノ酸、約５４０個のアミノ酸、約５７６個のアミノ酸、約６１２個のアミノ酸、約６２４個のアミノ酸、約６４８個のアミノ酸、約６８４個のアミノ酸、約７２０個のアミノ酸、約７５６個のアミノ酸、約７９２個のアミノ酸、約８２８個のアミノ酸、約８３６個のアミノ酸、約８６４個のアミノ酸、約８７５個のアミノ酸、約９１２個のアミノ酸、約９２３個のアミノ酸、約９４８個のアミノ酸、約１０４４個のアミノ酸、約１１４０個のアミノ酸、約１２３６個のアミノ酸、約１３１８個のアミノ酸、約１３３２個のアミノ酸、約１４２８個のアミノ酸、約１５２４個のアミノ酸、約１６２０個のアミノ酸、約１７１６個のアミノ酸、約１８１２個のアミノ酸、約１９０８個のアミノ酸、または約２００４アミノ酸の長さを有し、１つ以上のＸＴＥＮファミリー配列、つまりＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、ＢＤ、またはそれらの任意の組み合わせから選択することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明において使用されるＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４２＿２、ＡＥ４２＿３、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＥ７２＿２、ＡＥ７２＿３、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＥ１４４＿２、ＡＥ１４４＿３、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ２９５、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＥ８７２、ＡＥ８８４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０−０２３９５５４  Ａ１を参照のこと。
【０１７０】
一実施形態においてＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。別の実施形態においてＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。具体的な実施形態においてＸＴＥＮ配列はＡＥ２８８である。本発明のある特定のＸＴＥＮ配列のアミノ酸配列を表２に示す。
【表２−１】
2016530218.tif 000004
【表２−２】
2016530218.tif 000005
【０１７１】
ＸＴＥＮの１００％未満のアミノ酸が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４、５、または６種類のアミノ酸からなっている、または配列の１００％未満が表１に挙げる配列モチーフもしくは表２のＸＴＥＮ配列からなっているいくつかの実施形態では、ＸＴＥＮのその他のアミノ酸残基はその他１４種類の天然のＬ−アミノ酸のいずれからも選択されるが、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％が、または少なくとも約９９％が親水性のアミノ酸を含むように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。必要とされる特性、例えば、コードしているヌクレオチドによる制限酵素部位の導入を可能にすること、またはペイロード要素との結合を促進すること、あるいは開裂配列の導入を達成するために、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）以外の個別のアミノ酸または短いアミノ酸配列をＸＴＥＮに組み込んでも良い。ＸＴＥＮに含まれているグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）ではないアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体にわたって散在している、配列モチーフ中もしくは配列モチーフの間に配置されている、あるいはＮ末端もしくはＣ末端においてまたはそれらの近くなど、ＸＴＥＮ配列の短い範囲のうちの１カ所以上に集中している。疎水性のアミノ酸はポリペプチドに立体構造をもたらすため、本発明では、共役構築物に利用されるＸＴＥＮに含まれている疎水性アミノ酸含量が、典型的には５％未満、または２％未満、または１％未満のＸＴＥＮを提供する。ＸＴＥＮの構築にあまり好ましくない疎水性の残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。加えて、メチオニン（酸化を回避するため）、アスパラギンおよびグルタミン（アミド分解を避けるため）を、５％未満または４％未満または３％未満または２％未満または１％未満含む、またはこれらを全く含まないＸＴＥＮ配列を設計することもできる。他の実施形態では、共役構築物に使用されるＸＴＥＮの要素に含まれるメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含量は、一般的に、５％未満、または２％未満であり、最も好ましくは１％未満である。他の実施形態においてＸＴＥＮは、正電荷を有するアミノ酸残基を１０％未満、または正電荷を有するアミノ酸残基を約７％未満もしくは約５％未満もしくは未満約２％含む配列を有し、メチオニンとトリプトファン残基の合計は２％未満、アスパラギンとグルタミン残基は全ＸＴＥＮ配列の５％未満となるだろう。
【０１７２】
さらなる実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮポリペプチドは、物理的または化学的な特性、例えば、本発明のキメラ分子の薬物動態に影響を及ぼす。本発明で使用されるＸＴＥＮ配列は、以下に挙げる利点を１つ以上示す場合がある：構造的な柔軟性、高い水溶性、高度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳類の受容体に対する低い結合性、または改善された流体力学（またはストークス）半径。具体的な実施形態では、本発明のＦＶＩＩまたは標的化部分（例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子）に結合したＸＴＥＮポリペプチドは、終末相半減期を長くするまたは曲線下面積（ＡＵＣ）を大きくするなど薬物動態特性を向上させ、それによって、本明細書に記載のキメラ分子は野生型の凝固因子よりも長い間インビボに留まる。さらなる実施形態では、本発明に使用されるＸＴＥＮポリペプチドは、終末相半減期を長くするまたは曲線下面積（ＡＵＣ）を大きくするなど薬物動態特性を向上させ、それによって凝固因子は野生型ＦＶＩＩａよりも長い期間インビボに留まる。
【０１７３】
ＸＴＥＮポリペプチドを含んでいるタンパク質の物理的／化学的特性は、様々な方法およびアッセイを用いることで決定することができる。このような方法には、限定されないが、遠心分析法、ＥＰＲ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、およびＵＶ／可視分光法が含まれる。その他の方法は、Ａｍａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  ４８，１−１３（２００６）に開示されている。
【０１７４】
本発明に従って使用することのできるＸＴＥＮポリペプチドのその他の例には以下の文献に開示されている：米国特許第７，８５５，２７９号、同第７，８４６，４４５号、米国特許出願公開第２００９／００９２５８２号Ａ１、同第２０１０／０２３９５５４号Ａ１、同第２０１０／０３２３９５６号Ａ１、同第２０１１／００４６０６０号Ａ１、同第２０１１／００４６０６１号Ａ１、同第２０１１／００７７１９９号Ａ１、同第２０１１／０１７２１４６号Ａ１、同第２０１３／００１７９９７号Ａ１、または同第２０１２／０２６３７０１号Ａ１、国際特許公開ＷＯ２０１００９１１２２  Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２  Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８  Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８  Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９  Ａ１、またはＷＯ２０１１０２８３４４  Ａ２；または２０１１年８月１９日に出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４８５１７。
【０１７５】
ＩＩ．Ｄ．  異種部分をさらに含んでいるキメラ分子
本開示はまた、さらに少なくとも１つの異種部分に融合させたおよび／または共役させたおよび／またはさもなければ接続させた「キメラ分子」も提供する。従って、本明細書で開示のキメラ分子（例えば、ＦＶＩＩ、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａの項で開示したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子を少なくとも１つ含んでいるキメラ分子またはＦＶＩＩＨ、ＦＶＩＩＬ、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ｂ．の項で開示したように血小板に結合する標的化部分を含んでいるキメラ分子）は、少なくとも１つの異種部分（例えば、半減期延長部分）をさらに含んでいる全ての分子を包含する。いくつかの実施形態では、キメラ分子はキメラタンパク質である。つまり、キメラ分子に含まれる全ての要素（異種部分および／またはリンカー）がポリペプチドである。他のキメラ分子は、非ポリペプチド性異種部分（例えば、ＰＥＧ、脂質、炭水化物、核酸、低分子治療薬、放射性核種、蛍光プローブなど）および／または非ポリペプチド性リンカーを含む可能性がある。
【０１７６】
本明細書で使用する場合「部分」という用語は、本発明のキメラ分子の要素の一部分または構成要素を指す。本明細書で使用する場合「異種部分」という用語は、キメラ分子のいずれかの要素に、遺伝的に融合させた、共役させた、および／またはさもなければ接続した部分を指す。ある特定の実施形態においてキメラ分子は、１、２、３、４、５つ、または５つを上回る異種部分を含む場合がある。
【０１７７】
本明細書で開示のキメラ分子の異種部分（単数）または部分（複数）は、予防薬および／または治療薬（例えば、凝固因子）、薬物動態（ＰＫ）特性を改善することが可能な分子（例えば、血漿半減期延長部分）、検出可能な部分（例えば、蛍光分子もしくは放射性核種）などを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる場合がある。
【０１７８】
いくつかの実施形態において異種部分は、そのような異種部分を欠いているキメラ分子の物理化学的特性を変化させる場合がある。例えば、キメラ分子の流体力学半径を大きくする場合がある。他の実施形態では、異種部分をキメラ分子に組み込むことによって、その生物学的活性または機能（例えば、ＦＶＩＩを含んでいるキメラ分子の凝血促進活性）に有意な影響を及ぼすことなく、１つ以上薬物動態特性が改善される可能性がある。
【０１７９】
いくつかの実施形態において異種部分は、少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００個、または４０００個のアミノ酸を含んでいる、本質的にそれらからなっている、またはそれらからなるポリペプチドである。他の実施形態において異種部分は、約１００〜約２００個のアミノ酸、約２００〜約３００個のアミノ酸、約３００〜約４００個のアミノ酸、約４００〜約５００個のアミノ酸、約５００〜約６００個のアミノ酸、約６００〜約７００個のアミノ酸、約７００〜約８００個のアミノ酸、約８００〜約９００個のアミノ酸、または約９００〜約１０００個のアミノ酸を含んでいる、本質的にそれらからなっている、またはそれらからなるポリペプチドである。
【０１８０】
他の実施形態において異種部分は、本発明のキメラ分子またはその断片の安定性を高める。本明細書で使用する場合「安定性」という用語は、環境条件（例えば、高温または低温）に反応してもキメラ分子の１つ以上の物理学特性が維持されていることを示す、当該分野において認識されている指標である。ある特定の実施形態において物理学的特性とは、キメラ分子の共有構造が維持されていること（例えば、タンパク分解による切断、望ましくない酸化もしくはアミド分解が見られないこと）である可能性がある。他の実施形態において物理学的特性とは、キメラ分子が正確な折り畳み構造を維持していること（例えば、可溶性もしくは不溶性の凝集体もしくは沈殿が存在しないこと）である可能性がある。一実施形態においてキメラ分子の安定性は、キメラ分子の生物物理的な特性、例えば熱安定性、ｐＨ変性プロファイル、グリコシル化の安定した除去、溶解度、生化学的機能（例えば、タンパク質、受容体またはリガンドへの結合能）など、および／またはその組み合わせを検定することによって測定される。別の実施形態では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって示される。一実施形態では、タンパク質安定性の指標は熱安定性、つまり温度変化に対する耐性である。安定性は当該分野で知られている方法、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）などで測定することができる。熱安定性の測定方法としては、限定されないが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、および熱負荷アッセイが挙げられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、「半減期延長部分」である異種部分を少なくとも１つ含む。本明細書で使用する場合「半減期延長部分」という用語は、タンパク質、例えばキメラ分子のインビボでの半減期を長くする異種部分を指す。「半減期」という用語は、特定のタンパク質またはポリペプチド（例えば凝固因子もしくは本明細書で開示のキメラ分子）のインビボでの生物学的な半減期を指す。半減期は、対象に投与した量の半分の量が、動物の血中および／または他の組織から排出されるのに必要とされる時間として表すことができる。所与のポリペプチドまたは本発明のキメラ分子の排出曲線を時間の関数として構築した場合、その曲線は通常、迅速なα相とより長いβ相の二相を含む。α相は一般的に、投与されたＦｃポリペプチドの血管内外での平衡を表し、かつ、部分的にはそのポリペプチドの大きさによって決定される。β相は一般的に、血管内腔におけるポリペプチドの異化作用を表している。いくつかの実施形態では、本発明の凝血促進化合物は単相性で、従って、α相を示さず、単一のβ相だけを示す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される半減期という用語は、凝血促進化合物のβ相での半減期を指す。ヒト抗体の人体でのβ相半減期は、一般的に２１日間である。キメラ分子のインビボにおける半減期は、当業者に知られているいかなる方法によって決定してもよい。ある特定の実施形態において半減期延長部分は、非ポリペプチド部分（例えば、ＰＥＧ）への結合部位を含む場合がある。
【０１８２】
以下で詳細に論じる半減期延長部分は、例えば、（ｉ）さらなるＸＴＥＮポリペプチド、（ｉｉ）アルブミン、（ｉｉｉ）アルブミン結合ポリペプチドまたは脂肪酸、（ｉｖ）Ｆｃ、（ｖ）トランスフェリン、（ｖｉ）ＰＡＳ、（ｖｉｉ）ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、（ｖｉｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、（ｉｘ）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、（ｘ）アルブミン結合性低分子、（ｘｉ）ｖＷＦ、（ｘｉｉ）キメラ分子が排出性受容体に結合するのを阻害する排出性受容体またはその断片、または（ｘｉｉｉ）それらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において半減期延長部分は、Ｆｃ領域を含む。他の実施形態において半減期延長部分は、リンカーによって融合されている２つのＦｃ領域を含む。また、異種部分の例としては例えば、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、ＦｃＲｎに結合する完全なＦｃ領域またはその一部）、一本鎖Ｆｃ領域（ｓｃＦｃ領域、例えば、米国特許出願公開第２００８−０２６０７３８号および国際公開第ＷＯ２００８−０１２５４３およびＷＯ２００８−１４３９５４５に記載されているもの）、またはプロセシング可能なｓｃＦｃ領域も挙げられる。いくつかの実施形態において異種部分は、非ポリペプチド部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、もしくはこれらの部分の任意の誘導体、変異体、または組み合わせに対する結合部位を含む場合がある。
【０１８３】
ある特定の実施形態において本発明のキメラ分子は、少なくとも１つの半減期延長部分を含み、この半減期延長部分とは、そのような異種部分を含んでいない対応するキメラ分子の血中半減期と比較して、キメラ分子の血中半減期を延ばすものである。キメラ分子の血中半減期は当業者に知られているいかなる方法によっても、例えば活性アッセイ（発色性のアッセイまたは凝固１段ａＰＴＴアッセイ）、ＥＬＩＳＡなどによって決定することができる。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の半減期延長部分を含む結果、キメラ分子の半減期は、そのような１つ以上の半減期延長部分を含まない、対応するキメラ分子の半減期と比較して長くなる。半減期延長部分を含んでいるキメラ分子の半減期は、そのような半減期延長部分を含んでいない対応するキメラ分子の血中半減期の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長い。
【０１８５】
一実施形態では、半減期延長部分を含んでいるキメラ分子の半減期は、そのような半減期延長部分を含んでいない対応するキメラ分子のインビボでの半減期の約１．５倍〜約２０倍、約１．５倍〜約１５倍、または約１．５倍〜約１０倍長い。別の実施形態では、半減期延長部分を含んでいるキメラ分子の半減期は、そのような半減期延長部分を含んでいない対応するキメラ分子のインビボでの半減期と比較して、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２．５倍〜約１０倍、約２．５倍〜約９倍、約２．５倍〜約８倍、約２．５倍〜約７倍、約２．５倍〜約６倍、約２．５倍〜約５倍、約２．５倍〜約４倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約７倍、または約６倍〜約８倍長い。
【０１８６】
ＩＩ．Ｄ．１．  Ｆｃ領域
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、Ｆｃ領域を含んでいる異種部分を少なくとも１つ含む。本明細書で使用する場合「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、特段の規定のない限り、Ｆｃドメイン、変異体、またはその断片を含んでいる、機能性の、新生児期Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーを意味する。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合し得るいずれもの分子であり、その結果、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による能動輸送が起こる。従ってＦｃという用語には、機能をもつＩｇＧ  Ｆｃの変異体も全て含まれる。ＦｃＲｎ受容体に結合する、ＩｇＧのＦｃ部分の領域については、Ｘ線結晶学に基づいた記載がある（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９（１９９４）、この全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの接合部に近い部分が、ＦｃのＦｃＲｎと主に接触する部分である。Ｆｃ−ＦｃＲｎは、単一のＩｇ重鎖のなかでのみ接触する。ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、限定されないが、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの結合領域を完全に含むＩｇＧの他の断片が挙げられる。Ｆｃは、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む可能性があり、これは、免疫グロブリンのヒンジ領域を含む場合も含まない場合もある。また、キメラ分子のＦｃ領域がもつ望ましい特性を維持する、例えば、インビボでの半減期などの半減期を高めるＦｃ断片、変異体、または誘導体も含まれる。無数の突然変異体、断片、変異体、および誘導体が、例えば、ＰＣＴ出願されているＷＯ２０１１／０６９１６４、ＷＯ２０１２／００６６２３、ＷＯ２０１２／００６６３５、またはＷＯ２０１２／００６６３３に記載されており、これらの全体は参照することによって本明細書に組み入れられる
【０１８７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＦｃ領域を含む。
【０１８８】
ＩＩ．Ｄ．２．  ｓｃＦｃ（一本鎖Ｆｃ）領域
一実施形態においてキメラ分子は、単一のポリペプチド鎖の中に１つの遺伝的に融合しているＦｃ領域またはその一部を含んでいる異種部分（つまり一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域）を含む。プロセシングを受けていないポリペプチドは、少なくとも２つの免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えば、Ｆｃ部分もしくはドメイン（例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上の数のＦｃ部分もしくはドメイン））を、折り畳まれると（例えば、分子内または分子間の折り畳みによって）、Ｆｃペプチドリンカーによって連結している１つの機能性ｓｃＦｃ領域を形成することが可能な同じ直鎖状ポリペプチド鎖の中に含む。例えば一実施形態では、半減期を改良するまたは免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、食作用、または補体依存細胞毒性（ＣＤＣＣ））を誘発するためにおよび／または製造を容易にするために、本発明のポリペプチドをそのｓｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃ受容体（例えば、ＦｃＲｎ、Ｆｃ・Ｒ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）、または相補的タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ））に結合させることが可能である。
【０１８９】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、凝固因子（例えばＦＶＩＩ）、標的化部分（例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびｓｃＦｃ領域を含む。
【０１９０】
ＩＩ．Ｄ．３．  アルブミン
ある特定の実施形態においてキメラ分子は、アルブミンまたはその機能性断片を含んでいる異種部分を含む。完全長の形態では６０９個のアミノ酸を含むタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、血清の浸透圧に大きく関与しており、また、内生および外生のリガンドの担体としても機能する。本明細書で使用する場合「アルブミン」という用語は、完全長のアルブミンまたはその機能性断片、変異体、誘導体、または類似体を含む。アルブミンまたはその断片もしくは変異体の例は、米国特許出願公開のＵＳ２００８／０１９４４８１、ＵＳ２００８／０００４２０６、ＵＳ２００８／０１６１２４３、ＵＳ２００８／０２６１８７７もしくはＵＳ２００８／０１５３７５１、またはＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／０３３４１３、ＷＯ２００９／０５８３２２もしくはＷＯ２００７／０２１４９４に開示されており、これらの全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびアルブミンを含む。
【０１９２】
ＩＩ．Ｄ．４．  アルブミン結合ポリペプチドおよび脂質
ある特定の実施形態では、異種部分はアルブミン結合部分を含む可能性があり、それらには、アルブミン結合ペプチド、細菌性アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、アルブミン結合タンパク質は細菌性アルブミン結合タンパク質、ドメイン抗体を含む抗体または抗体断片であってよい（例えば、米国特許第６，６９６，２４５号を参照のこと）。アルブミン結合タンパク質は例えば、細菌性アルブミン結合ドメイン、例えば連鎖球菌タンパク質Ｇのうちの１つであってもよい（Ｋｏｎｉｇ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１８，７３−８３）。共役パートナーとして使用可能なアルブミン結合ペプチドの他の例としては、例えば、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ共通配列を有するものが挙げられ、ここでＸａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり；Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり；Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり；およびＸａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、これらについては、米国特許出願公開ＵＳ２００３／００６９３９５またはＤｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７，３５０３５−３５０４３に記載されている。
【０１９３】
Ｋｒａｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８：１９０−１９４（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１１：２０６−２１３（２００２）により開示されている連鎖球菌タンパク質Ｇのドメイン３は、細菌性アルブミン結合ドメインの１つである。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列であるＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号＿＿）を含む一連のペプチドがある。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体断片の例は、Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９−３２６（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３−３１７（２００７）、およびＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．，２１：２８３−２８８（２００８）に開示されており、これらの全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。そのようなアルブミン結合部分の例としては、Ｔｒｕｓｓｅｌｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０：２２８６−２２９２（２００９）により開示されている、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサン酸（「Ａｌｂｕ」タグ）がある。脂肪酸、具体的には長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）および長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を、本発明のキメラ分子のインビボでの半減期を延ばすために使用することができる。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例としては、１６−（1−（３−（９−（（（２，５−ジオキソプロリジン−1−イルオキシ）カルボニルオキシ）−メチル）−７−スルホ−９Ｈ−フルオレン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イルチオ）ヘキサデカン酸が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照のこと）。
【０１９４】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびアルブミン結合ポリペプチドまたは脂質を含む。
【０１９５】
ＩＩ．Ｄ．５．  ＣＴＰ
ある特定の実施形態において本明細書で開示のキメラ分子は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニットまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を１つ含んでいる異種部分を少なくとも１つ含む。ＣＴＰペプチドを１つ以上組換えタンパク質に挿入することで、そのタンパク質のインビボにおける半減期が長くなることが分かっている。例えば、米国特許第５，７１２，１２２号を参照のこと。その全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
ＣＴＰペプチドの例としては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号＿）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号＿）が挙げられる。例えば、参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１号を参照のこと。いくつかの実施形態においてキメラ分子は２つの異種部分を含み、これらはいずれもＣＴＰ配列である。いくつかの実施形態では、３つの異種部分がＣＴＰ配列である。いくつかの実施形態では、４つの異種部分がＣＴＰ配列である。いくつかの実施形態では、５つの異種部分がＣＴＰ配列である。いくつかの実施形態では、６つ以上の異種部分がＣＴＰ配列である。
【０１９７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＣＴＰを含む。
【０１９８】
ＩＩ．Ｄ．６．  ＰＡＳ
他の実施形態では、少なくとも１つの異種部分はＰＡＳ配列である。本明細書で使用する場合、ＰＡＳ配列とは、主にアラニンとセリン残基を含んでいるかまたは主にアラニン、セリンおよびプロリン残基を含んでいるアミノ酸配列を意味し、このアミノ酸配列は生理学的条件においてランダムコイルの立体構造を形成する。従ってＰＡＳ配列は、アラニン、セリンおよびプロリンを含んでいる、本質的にこれらからなっているまたはこれらからなる構成成分、アミノ酸ポリマーまたは配列カセットであり、これらはキメラ分子の異種部分の一部として使用することができる。さらに当業者であれば、ＰＡＳ配列の中にアラニン、セリンおよびプロリン以外の残基が微量成分として含まれていても、このアミノ酸ポリマーがランダムコイルの立体構造を形成することが可能だということが分かる。
【０１９９】
本明細書で使用する場合「微量要素」という用語は、アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸をＰＡＳ配列に一定の度合いで、例えば約１２％まで、つまりＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、約１０％まで、つまりＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１０個、約９％まで、つまり１００個のアミノ酸のうちの約９個、約８％まで、つまり１００個のアミノ酸のうちの約８個、約６％、つまり１００個のアミノ酸のうちの約６個、約５％、つまり１００個のアミノ酸のうちの約５個、約４％、つまり１００個のアミノ酸のうちの約４個、約３％、つまり１００個のアミノ酸のうちの約３個、約２％、つまり１００個のアミノ酸のうちの約２個、約１％、つまり１００個のアミノ酸のうちの約約１個、の度合いで付加することが可能であることを意味する。
【０２００】
アラニン、セリンおよびプロリンではないアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群より選択することができる。
【０２０１】
生理学的条件で、ＰＡＳ配列はランダムコイルの立体構造を形成し、この構造を介して、キメラ分子のインビボおよび／またはインビトロでの安定性の向上に介在する場合がある。ランダムコイルドメインはそれ自体では安定な構造または機能をもたないため、キメラ分子中の活性化凝固因子が介在する生物学的活性は本質的に保たれる。他の実施形態においてランダムコイルドメイン由来のＰＡＳ配列は、生物学的に活性をもたない。特に、血漿中におけるたんぱく質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面受容体への結合または内部移行の点では不活性であるが、それでもなお生分解性であり、そのため、ＰＥＧなどの合成ポリマーよりも明らかに有用である。
【０２０２】
ランダムコイルの立体構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的な例としては、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号１５５）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１５６）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１５７）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１５８）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１５９）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１６０）およびＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１６１）またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。その他のＰＡＳ配列の例は、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／１５５１３４  Ａ１に見られる。
【０２０３】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＰＡＳを含む。
【０２０４】
ＩＩ．Ｄ．７．  ＨＡＰ
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの異種部分はグリシンに富むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、グリシンの反復配列を含む場合があり、長さは少なくともアミノ酸５０個、少なくともアミノ酸１００個、アミノ酸１２０個、アミノ酸１４０個、アミノ酸１６０個、アミノ酸１８０個、アミノ酸２００個、アミノ酸２５０個、アミノ酸３００個、アミノ酸３５０個、アミノ酸４００個、アミノ酸４５０個、またはアミノ酸５００個である。一実施形態においてＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合させたまたは連結させた部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、限定されないが、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられ、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一実施形態においてｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態においてｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０：２７３−２８４（２００７）を参照のこと。
【０２０５】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＨＡＰを含む。
【０２０６】
ＩＩ．Ｄ．８．  トランスフェリン
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの異種部分はトランスフェリンまたはペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体である。いずれのトランスフェリンも本発明のキメラ分子の作成に使用可能である。一例として、野生型ヒトＴＦ（ＴＦ）はおよそ７５ＫＤａ（グリコシル化は考慮しない）のアミノ酸が６７９個のタンパク質で、２つの大きなドメインであるＮ（約３３０個のアミノ酸）とＣ（約３４０個のアミノ酸）を含み、この２つは遺伝子重複の結果であると考えられている。Ｎドメインは２つのサブドメインであるＮ１ドメインとＮ２ドメインを含み、Ｃドメインも２つのサブドメインであるＣ１ドメインとＣ２ドメインを含む。ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照のこと。これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態においてトランスフェリン異種部分は、トランスフェリンのスプライシング変異体を含む。一例では、トランスフェリンスプライシング変異体は、ヒトトランスフェリン、例えばジェンバンク受託番号ＡＡＡ６１１４０のスプライシング変異体であってよい。別の実施形態では、キメラ分子のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【０２０７】
トランスフェリンは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）介在性エンドサイトーシスによって鉄を輸送する。鉄がエンドソーム区画に放出され、Ｔｆ−ＴｆＲ複合体が細胞表面に再生した後、Ｔｆは、次回の鉄輸送に備えて細胞外間隙に戻される。Ｔｆは１４〜１７日を超える長い半減期をもつ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：２０６−２０９（２００２））。トランスフェリン融合タンパク質については、半減期の延長、癌治療に関連する標的輸送、経口輸送およびプロインスリンの活性の維持に関して研究されている（Ｂｒａｎｄｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２９：２３０−２３８（２０１１）；Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：７２９２−７２９６（２００５）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３３４：６８２−６９２（２０１０）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５５：３８６−３９２（２０１１））。
【０２０８】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびトランスフェリンを含む。
【０２０９】
ＩＩ．Ｄ．９．  ＰＥＧ
いくつかの実施形態において少なくとも１つの異種部分は、当該分野で知られている可溶性のポリマーであり、例えば、限定されないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、またはポリビニルアルコールが挙げられる。いくつかの実施形態においてＰＥＧ異種部分を含んでいるキメラ分子は、免疫グロブリンの定常領域またはその一部（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミン、断片、またはその変異体からなる群より選択される異種部分をさらに含む。さらに他の実施形態においてキメラ分子は、活性型凝固因子またはその断片およびＰＥＧ異種部分を含み、ここでこのキメラ分子は、免疫グロブリンの定常領域またはその一部（例えばＦｃ部分）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミン、断片、またはその変異体からなる群より選択される異種部分をさらに含む。その上さらに他の実施形態においてキメラ分子は、凝固因子またはその断片、第二の凝固因子またはその断片、およびＰＥＧ異種部分を含み、ここでこのキメラ分子は、免疫グロブリンの定常領域またはその一部（例えばＦｃ部分）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミン、断片、またはその変異体からなる群より選択される異種部分をさらに含む。
【０２１０】
他の実施形態においてキメラ分子は、凝固因子またはその断片、合成された凝固促進ポリペプチド、およびＰＥＧ異種部分を含み、ここでこのキメラ分子は、免疫グロブリンの定常領域またはその一部（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミン、断片、またはその変異体からなる群より選択される異種部分をさらに含む。他の実施形態においてキメラ分子は、２つの合成された凝固促進ペプチド、およびＰＥＧ異種部分を含み、ここでこのキメラ分子は、免疫グロブリンの定常領域またはその一部（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミン、断片、またはその変異体からなる群より選択される異種部分をさらに含む。その上さらに別の実施形態においてキメラ分子は、凝固因子またはその断片、凝固因子の補因子（例えば、凝固因子が第ＶＩＩ因子の場合には組織因子）、およびＰＥＧ異種部分を含み、ここでこのキメラ分子は、免疫グロブリンの定常領域またはその一部（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミン、断片、またはその変異体からなる群より選択される異種部分をさらに含む。
【０２１１】
ポリマーはどのような分子量のものであってもよく、また、分岐していも分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールに関して一実施形態では、取り扱いや製造が容易になるように、分子量は約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。所望のプロファイル（例えば、所望される持続放出期間、効果（生物学的活性に関してある場合）、取り扱いやすさ、抗原性の度合いまたは欠如および他に知られているポリエチレングリコールがタンパク質または他の類似体に及ぼす効果）に応じて、その他の大きさものものを使用することができる。例えば、ポリエチレングリコールの平均分子量は、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａであってよい。
【０２１２】
いくつかの実施形態においてポリエチレングリコールは、分岐構造を有する場合がある。分岐しているポリエチレングリコールについては例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
本発明のキメラ分子それぞれに結合しているポリエチレングリコール部分の数（つまり置換の度合い）は多様になり得る。例えば、ペグ化されているキメラ分子は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個、またはそれ以上の数のポリエチレングリコール部分に結合している場合がある。同様に、タンパク質分子１つ当たりのポリエチレングリコール部分の置換の度合いは、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０のような範囲に入る。置換の度合いを決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）で考察されている。
【０２１４】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ペグ化されている場合がある。ペグ化キメラ分子は、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む。他の実施形態では、ポリマーは水溶性である場合がある。ポリマーの非限定的な例は、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイルモルホリン）であってよい。その他の種類の、ポリマーと凝固因子との共役体は、米国特許第７，１９９，２２３号に開示されている。また、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５：１８０２−１８２６（２００８）も参照のこと。
【０２１５】
当業者がＰＥＧを結合するために使用可能な方法は多数あり、例えば、Ｍａｌｉｋ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−３５（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４−１０（１９９２）；欧州特許出願公開ＥＰ０４０１３８４、ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４；ならびに国際特許出願公開ＷＯ９２／１６２２１およびＷＯ９５／３４３２６がある。
【０２１６】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＰＥＧを含む。
【０２１７】
ＩＩ．Ｄ．１０．  ＨＥＳ
ある特定の実施形態において少なくとも１つの異種部分はポリマー、例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、またはその誘導体である。ヒドロキシデンプン（ＨＥＳ）は、天然に生じるアミロペクチンの誘導体であり、体内ではαアミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、炭水化物ポリマーであるアミロペクチンの置換誘導体であり、これは、トウモロコシデンプン中には、最大９５重量％の濃度で存在する。ＨＥＳは優れた生物学的特性を示し、血液量補充薬として使用され、また、診療所での血液希釈療法で用いられる（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８（１９８７）；およびＷｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８（１９９１））。
【０２１８】
アミロペクチンはグルコース部分を含み、ここで主鎖にはα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐している部分には、α−１，６−グリコシド結合が見られる。この分子の物理的化学的特性は主として、グリコシド結合の種類によって規定される。切れ目のあるα−１，４−グリコシド結合によって、１つのターンに６個のグルコース単量体を含むらせん構造が作られる。ポリマーの物理化学的特性ならびに生物学的特性も置換によって変化させることができる。アルカリ性のヒドロキシエチル化を介してヒドロキシエチル基を導入することができる。反応条件を調整することによって、ヒドロキシエチル化の点で、置換されていないグルコース単量体に含まれているそれぞれのヒドロキシ基の様々な反応性を利用することが可能である。この事実によって、当業者は、置換のパターンを限定された程度の範囲で及ぼすことができる。
【０２１９】
ＨＥＳは主に、分子量の分布および置換の度合いによって特徴付けられる。ＤＳと呼ばれる置換の度合いは、当業者に知られているように、モル濃度での置換に関する。上記引用文献であるＳｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８（１９８７）、特に２７３頁を参照のこと。
【０２２０】
一実施形態においてヒドロキシエチルデンプンの平均分子量（重量平均）は、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤである。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、０．１〜３、好ましくは０．１〜２、より好ましくは０．１〜０．９、好ましくは０．１〜０．８モル程度の置換を示し、ヒドロキシエチル基については、Ｃ２：Ｃ６置換の割合は、２〜２０となる可能性がある。平均分子量が約１３０ｋＤのＨＥＳの非限定的な例は、置換の度合いが０．２〜０．８、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または０．８、好ましくは０．４〜０．７、例えば０．４、０．５、０．６、または０．７であるＨＥＳである。具体的な実施形態において平均分子量が約１３０ｋＤのＨＥＳは、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社のＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は人工的に作成されたコロイドで、例えば、血液量減少の治療および予防における治療適用において、血液量補充療法で利用されている。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、平均分子量が１３０，０００＋／−２０，０００Ｄであることと、モル量置換が０．４であること、およびＣ２：Ｃ６比が約９：１であることを特徴とする。他の実施形態では、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、例えば、４〜７０ｋＤまたは１０〜７０ｋＤまたは１２〜７０ｋＤまたは１８〜７０ｋＤまたは５０〜７０ｋＤまたは４〜５０ｋＤまたは１０〜５０ｋＤまたは１２〜５０ｋＤまたは１８〜５０ｋＤまたは４〜１８ｋＤまたは１０〜１８ｋＤまたは１２〜１８ｋＤまたは４〜１２ｋＤまたは１０〜１２ｋＤまたは４〜１０ｋＤの範囲である。その上さらに他の実施形態では、使用されるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、４ｋＤよりも大きく７０ｋＤ未満の範囲、例えば約１０ｋＤ、あるいは９〜１０ｋＤもしくは１０〜１１ｋＤもしくは９〜１１ｋＤの範囲、または約１２ｋＤ、あるいは１１〜１２ｋＤの範囲、または１２〜１３ｋＤもしくは１１〜１３ｋＤ、または約１８ｋＤ、あるいは１７〜１８ｋＤもしくは１８〜１９ｋＤもしくは１７〜１９ｋＤの範囲、または約３０ｋＤ、あるいは２９〜３０もしくは３０〜３１ｋＤの範囲、または約５０ｋＤ、あるいは４９〜５０ｋＤもしくは５０〜５１ｋＤもしくは４９〜５１ｋＤの範囲である。
【０２２１】
ある特定の実施形態において異種部分は、異なる平均分子量および／または異なる置換の度合いおよび／または異なるＣ２：Ｃ６置換の比を有する複数のヒドロキシエチルデンプンの混合物であってもよい。そのため、異なる平均分子量および異なる置換の度合いおよび異なるＣ２：Ｃ６置換の比を有する、または異なる平均分子量および異なる置換の度合いおよび同じもしくはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換の比を有する、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換の度合いおよび異なるＣ２：Ｃ６置換の比を有する、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換の度合いおよび異なるＣ２：Ｃ６置換の比を有する、または異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換の度合いおよび同じもしくはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換の比を有する、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換の度合いおよび同じもしくはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換の比を有する、または同じもしくはほぼ同じ平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換の度合いおよび異なるＣ２：Ｃ６置換の比を有する、またはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ置換の度合いおよびほぼ同じＣ２：Ｃ６置換の比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物を使用することができる。
【０２２２】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＨＥＳを含む。
【０２２３】
ＩＩ．Ｄ．１１．  ＰＳＡ
ある特定の実施形態において少なくとも１つの異種部分は、ポリマー、例えば、ポリシアル酸（ＰＳＡ）またはその誘導体である。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然に存在する、分岐していないシアル酸のポリマーで、ある特定の細菌株や、哺乳動物のある特定の細胞で生産される（Ｒｏｔｈ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍａｎ，ｅｄｓ  Ｒｏｔｈ  Ｊ．，  Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ  Ｕ．，  Ｔｒｏｙ  Ｆ．Ａ．  （Ｂｉｒｋｈaｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），ｐｐ  ３３５−３４８）。シアル酸は、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基からｎ＝２になるまで、限定的な酸性加水分解もしくはノイラミニダーゼによる消化によって、様々な度合いに重合化した状態で生産することができ、または、天然の、細菌由来の形態のポリマーを分画することによっても生産することができる。種々のポリシアル酸を含む組成物も多様であり、そのため、大腸菌Ｋ１株およびＢ群髄膜炎菌の莢膜多糖を含んでいるホモポリマー形態、つまりα−２，８−結合型ポリシアル酸も存在し、これはまた、胎児型ニューロン細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）で見られる。ヘテロポリマー形態、例えば大腸菌Ｋ９２株の交互結合型α−２，８α−２，９ポリシアル酸や髄膜炎菌のＣ群多糖も存在する。シアル酸は、髄膜炎菌のＷ１３５群またはＹ群のように、シアル酸以外の単量体を含む、交互共重合体の中にも見られる。ポリシアル酸は、病原性細菌による免疫および補体系の回避、ならびに胎児発達途中の未成熟ニューロンとグリア細胞との接着の制御（ここでポリマーは抗接着機能を有している）Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｔｒｏｙ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，９１（１９９４）１１４２７−１１４３１などの重要な生物学的機能を有するが、哺乳動物でのポリシアル酸の受容体はまだ分かっていない。本発明を例示するために、「コロミン酸」としても知られている大腸菌Ｋ１株のα−２，８−結合型ポリシアル酸（様々な長さの）を使用した。ポリシアル酸をポリペプチドに結合または共役させるための様々な方法が既に報告されている（例えば、米国特許第５，８４６，９５１号；ＷＯ-Ａ−０１８７９２２号およびＵＳ２００７／０１９１５９７  Ａ１を参照のこと。これらは参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２４】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＰＳＡを含む。
【０２２５】
ＩＩ．Ｄ．１２．  クリアランス受容体
ある特定の実施形態では、本発明のキメラ分子のインビボ半減期を延長することができ、ここでキメラ分子は、クリアランス受容体、断片、変異体、またはその誘導体を含んでいる異種分子を少なくとも１つ含む。キメラ分子が、可溶性のクリアランス受容体であるＸ因子、例えば低比重リポ蛋白関連タンパク質受容体ＬＲＰ１またはその断片を含む具体的な実施形態では、Ｘ因子とクリアランス受容体との結合が阻止され、それによってインビボでの半減期を延ばすことができる。
【０２２６】
ＬＲＰ１は６００ｋＤａの膜内在性タンパク質であり、様々なタンパク質、例えばＦＶＩＩＩまたはＸの受容体介在性クリアランスに関与している。例えば、Ｎａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９１：５５５−５６０（１９９８）；Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １６：６−１６（２０１０）を参照のこと。他の好適なクリアランス受容体には、例えば、ＬＤＬＲ（低比重リポ蛋白受容体）、ＶＬＤＬＲ（超低比重リポ蛋白受容体）およびメガリン（ＬＲＰ−２）またはその断片が挙げられる。例えば、Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６：９０６−９１２（２００５）；Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  １１６：５４３９−５４４０（２０１０）；Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６：５６８８−５６９７（２０１０）を参照のこと。
【０２２７】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、ＦＶＩＩ、標的化部分（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、ＸＴＥＮポリペプチドおよびクリアランス受容体、断片、変異体またはその誘導体を含む。
【０２２８】
ＩＩ．Ｅ．  第ＶＩＩ因子
キメラ分子は、第ＶＩＩ因子の成熟形態であるＦＶＩＩまたはその変異体を含む。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；第７因子、凝固因子ＶＩＩ、血清因子ＶＩＩ、血清プロトロンビン変換活性化因子、ＳＰＣＡ、プロコンバーチンおよびエプコグアルファとも呼ばれる）は、凝固カスケードの一端を担うセリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２）ならびにセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含み、このセリンプロテアーゼドメインは、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリー全メンバーの中で、例えばキモトリプシンに対して、高度に保存されているドメインである。ＦＶＩＩは、一本鎖のチモーゲン、活性型チモーゲン様二本鎖ポリペプチド（例えば、活性化可能なＦＶＩＩ）および完全に活性化した二本鎖の形態として生じる。
【０２２９】
本明細書で使用する場合「チモーゲン様」タンパク質またはポリペプチドとは、タンパク分解による切断によって活性化されているが、それでもなお、チモーゲンに関連する特性、例えば、活性が低いもしくは活性がない、またはチモーゲンタンパク質の構造に似た構造を示すタンパク質を指す。例えば、二本鎖活性化形態のＦＶＩＩは、組織因子に結合していない場合にはチモーゲン様タンパク質であり、切断されていないＦＶＩＩチモーゲンと同様の構造を保持しており、そのため、活性が非常に低い。組織因子に結合すると二本鎖活性形態ＦＶＩＩの構造が変化し、凝固因子としての完全な活性を獲得する。
【０２３０】
例示的なＦＶＩＩ変異体としては、特定の活性が高いもの、例えばその酵素活性（ＫｃａｔまたはＫｍ）を高めることでＦＶＩＩの活性を改善する突然変異体などが挙げられる。そのような変異体については当該分野において既に記述があり、例えば、Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１３５８３（２００１）；Ｐｅｔｒｏｖａｎ  ａｎｄ  Ｒｕｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６６１６（２００１）；Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９１９５（２００１）；Ｓｏｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７２２９（２００１）；Ｓｏｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：４９０２７（２００２）に記載されている分子の突然変異形態などが含まれる。
【０２３１】
一実施形態においてＦＶＩＩの変異体は、突然変異体、例えばＶ１５８Ｄ−Ｅ２９６Ｖ−Ｍ２９８Ｑを含む。別の実施形態においてＦＶＩＩの変異体は、ＥＡＳＹＰＧＫ（配列番号＿）のアミノ酸を含む成熟したＦＶＩＩ配列のトリプシン１７０ループからの、６０８〜６１９番目のアミノ酸（ＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮ、１７０ループに相当する）の置換を含む。特定の活性が高いＦＶＩＩ変異体は、当該分野で知られている。例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎ．Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６１：１６７１，２００９）はＲ３３８Ｌ突然変異体を記載している。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２０８９，１９８８）およびＰｉｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：４７９，２００９）はＲ３３８Ａ突然変異体を記載している。この他の突然変異も当該分野で知られており、また、例えばＺｏｇｇ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １７：１６６９（２００９）；Ｓｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１２１（２００３）；およびＳｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２：２９５（１９９７）に記載されているものがある。これら参考文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
チモーゲン用形態からの構造変化に際しておきる完全な活性化は、その補因子、つまり組織因子との結合によって起こる。また、組織因子がなくても構造変化を起こす突然変異を導入することができる。従って、ＦＶＩＩａへの参照は、チモーゲン様形態と完全に活性化された二本鎖形態の両方の二本鎖形態を含む。
【０２３３】
一実施形態においてＦＶＩＩの重鎖は、配列番号１７８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一のアミノ酸配列を含み、ここで重鎖を含んでいるＦＶＩＩはＦＶＩＩ凝固活性を有する。別の実施形態においてＦＶＩＩの軽鎖は、配列番号１７９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一のアミノ酸配列を含み、ここで軽鎖を含んでいるＦＶＩＩはＦＶＩＩ凝固活性を有する。
【０２３４】
ＩＩ．Ｆ．  リンカー
本明細書で使用する場合「リンカー」または「リンカー部分」（本明細書で開示の式中では、Ｌ、Ｌ１もしくはＬ２と表す）という用語は、その主な機能が、ポリペプチド鎖の直線状のアミノ酸配列中に２つのドメインを連結することである、例えば本発明のキメラ分子中に２つの異種部分を連結する、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドもしくはポリペプチド配列）または非ペプチドリンカーを指す。従っていくつかの実施形態においてリンカーは、２つの異種部分の間に、異種部分と血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示した抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）との間に、ＦＶＩＩ（重鎖または軽鎖のいずれか）と血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示した抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）との間に、あるいはＦＶＩＩ（重鎖または軽鎖のいずれか）と異種部分との間に挿入される。
【０２３５】
本発明の１つのキメラ分子中に複数のリンカーが含まれる場合、それぞれのリンカーは同じであっても異なっていてもよい。基本的に、リンカーはキメラ分子に柔軟性を付与する。通常、リンカーは切断されないが、ある特定の実施形態では、そのような切断が望ましい場合もある。従っていくつかの実施形態においてリンカーは、１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含んでいてもよく、それらの部位は、リンカー配列中に配置されていても、リンカー配列のいずれかの末端側の隣接した位置に配置されていてもよい。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、キメラ分子は１つ以上のリンカーを含み、ここで１つ以上のリンカーはペプチドリンカーを含む。他の実施形態では、１つ以上のリンカーは非ペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態においてペプチドリンカーは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個のアミノ酸を含む可能性がある。他の実施形態においてペプチドリンカーは、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、または少なくとも１，０００個のアミノ酸を含む可能性がある。いくつかの実施形態においてペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００のアミノ酸を含む可能性がある。
【０２３７】
ペプチドリンカーは、１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸、１００〜２００個のアミノ酸、２００〜３００個のアミノ酸、３００〜４００個のアミノ酸、４００〜５００個のアミノ酸、５００〜６００個のアミノ酸、６００〜７００個のアミノ酸、７００〜８００個のアミノ酸、８００〜９００個のアミノ酸、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１７００〜１８００、１８００〜１９００、または１９００〜２０００個のアミノ酸を含む可能性がある。
【０２３８】
ペプチドリンカーの例は当該分野で良く知られており、例としては、［（Ｇｌｙ）ｘ−Ｓｅｒｙ］ｚの式を有し、式中、ｘは１〜４、ｙは０または１、およびｚは１〜５０のリンカーが挙げられる。一実施形態においてペプチドリンカーはＧｎの配列を含み、ここでｎは１〜１００の整数であり得る。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーの配列はＧＧＧＧである。ペプチドリンカーは（ＧＡ）ｎの配列を含み得る。ペプチドリンカーは（ＧＧＳ）ｎの配列を含み得る。他の実施形態においてペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎの配列（配列番号２４０）を含む。さらに他の実施形態においてペプチドリンカーは、（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎの配列（配列番号２４１）を含む。これらの例では、ｎは１〜１００までの整数であり得る。他の例では、ｎは、１〜２０までの整数、つまり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０になる可能性がある。リンカーの例としては、限定されないが、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２４２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２４３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２４４）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２４５）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２４６）が挙げられる。他の実施形態においてリンカーは、ポリ−Ｇ配列（ＧＧＧＧ）ｎであり、ここでｎは１〜１００までの整数となり得る（配列番号２４７）。
【０２３９】
例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列（配列番号２４８）を含み、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００と同じかまたはそれより大きい整数である。一実施形態ではｎ＝１であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号２４９）である。一実施形態ではｎ＝２であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号２５０）である。別の実施形態ではｎ＝３であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２５１）である。別の実施形態ではｎ＝４であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２５２）である。別の実施形態ではｎ＝５であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号２５３）である。さらに別の実施形態ではｎ＝６であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号２５４）である。別の実施形態ではｎ＝７であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号２５５）である。さらに別の実施形態ではｎ＝８であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号２５６）である。別の実施形態ではｎ＝９であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号２５７）である。さらに別の実施形態ではｎ＝１０であり、つまりリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号２５８）である。
【０２４０】
別の例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列（配列番号２４８）を含み、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００と同じかまたはそれより大きい整数である。一実施形態ではｎ＝１であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号２５９）である。一実施形態ではｎ＝２であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号２６０）である。別の実施形態ではｎ＝３であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２６１）である。別の実施形態ではｎ＝４であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２６２）である。別の実施形態ではｎ＝５であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号２６３）である。さらに別の実施形態ではｎ＝６であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号２６４）である。さらに別の実施形態ではｎ＝７であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号２６５）である。さらに別の実施形態ではｎ＝８であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号２６６）である。さらに別の実施形態ではｎ＝９であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号２６７）である。さらに別の実施形態ではｎ＝１０であり、つまりリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号２６８）である。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを、ペプチドリンカーの２つの他の配列（例えば、本明細書に記載の任意のペプチドリンカー配列）の間に挿入することができる。他の実施形態ではＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを、ペプチドリンカーの別の配列（例えば、本明細書に記載の任意のペプチドリンカー配列）の片方または両方の端に連結する。さらに他の実施形態では、２つ以上のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを連続して、ペプチドリンカーの中に組み入れる。一実施形態において本発明のペプチドリンカーは、少なくとも上部ヒンジ領域の一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子由来の）、少なくとも中間ヒンジ領域の一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子由来の）および連続しているＧｌｙ／Ｓｅｒアミノ酸残基（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）を含む。
【０２４２】
ペプチドリンカーは当該分野で知られている技術によって、ポリペプチド配列中に導入することができる。ＤＮＡ配列を解析することで変化を確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、作成したポリペプチドを安定的に生産するために宿主細胞を形質転換することができる。
【０２４３】
ＩＩ．Ｇ．  プロテアーゼ切断部位
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、キメラ分子のいずれか２つの構成要素、例えば、ＦＶＩＩの軽鎖とＦＶＩＩの重鎖をつないでいるプロテアーゼ開裂部位を含む。プロテアーゼ開裂部位は、切断および活性化に有用な細胞内プロセシング部位であってもよい。例えばキメラ分子は、ＦＶＩＩの軽鎖、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子、プロテアーゼ開裂部位、ＦＶＩＩの重鎖およびＸＴＥＮポリペプチド、またはＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、プロテアーゼ開裂部位および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体もしくはその抗原結合分子を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合がある。プロテアーゼ切断部位は、宿主細胞で細胞内プロセシング酵素によって切断される場合も、または凝集部位でプロテアーゼによって切断される場合もある。
【０２４４】
細胞内プロセシング酵素の例としては、フューリン、酵母Ｋｅｘ２、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としても知られている）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られている）、ＰＣＳＫ３（フューリンまたはＰＡＣＥとしても知られている）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られている）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５もしくはＰＣ６としても知られている）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても知られている）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、もしくはＳＰＣ７としても知られている）が挙げられる。他のプロセシング部位も当該分野で知られている。１つ以上のプロセシング部位または切断部位を含む構築物では、それらの部位は同じであっても異なっていてもよいと理解される。
【０２４５】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、例えばＦＶＩＩチモーゲンの軽鎖とＦＶＩＩチモーゲンの重鎖を接続しているプロテアーゼ開裂部位を含む場合がある。ＦＶＩＩチモーゲンの軽鎖とＦＶＩＩチモーゲンの重鎖を接続しているプロテアーゼ切断部位は、当該分野で知られているいずれのプロテアーゼ切断部位からも選択することができる。
【０２４６】
ＩＩＩ．  調整方法
本開示はまた、本明細書で開示しているいずれかのキメラ分子をコードしている核酸分子もしくは一組の核酸分子、またはその相補体も提供する。
【０２４７】
一実施形態において本発明は、ＦＶＩＩの軽鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、細胞内プロセシング部位、ＦＶＩＩの重鎖および血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）を含むポリペプチド鎖をコードしている核酸分子を含む。別の実施形態において本発明の核酸分子は、ＦＶＩＩの軽鎖、血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）、細胞内プロセシング部位、ＦＶＩＩの重鎖およびＸＴＥＮポリペプチドを含んでいるポリペプチド鎖をコードしている。他の実施形態において核酸分子は、ＦＶＩＩの軽鎖、細胞内プロセシング部位、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチドおよび血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）を含んでいるポリペプチド鎖をコードしている。いくつかの実施形態において核酸分子は、ＦＶＩＩの軽鎖、細胞内プロセシング部位、ＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）およびＸＴＥＮポリペプチドを含んでいるポリペプチド鎖をコードしている。
【０２４８】
いくつかの実施形態において核酸分子は一組のヌクレオチド配列を含み、ここで第一のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩの軽鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含んでいる第一のポリペプチド鎖をコードしており、第二のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩの重鎖と血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）を含んでいる第二のポリペプチド鎖をコードしている。他の実施形態において核酸分子は一組のヌクレオチド配列を含み、ここで第一のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩの軽鎖と血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）含んでいる第一のポリペプチド鎖をコードしており、第二のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩの重鎖とＸＴＥＮポリペプチドを含んでいる第二のポリペプチド鎖をコードしている。他の実施形態において核酸分子は一組のヌクレオチド配列を含み、ここで第一のヌクレオチド配列はＦＶＩＩの軽鎖をコードしており、第二のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド、および血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）をコードしている。いくつかの実施形態において本発明の核酸分子は一組のヌクレオチド配列を含み、ここで第一のヌクレオチド配列はＦＶＩＩの軽鎖をコードしており、第二のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩの重鎖、血小板に結合する標的化部分（例えば、ＩＩ．Ａ．１．の項で開示している抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子）およびＸＴＥＮポリペプチドをコードしている。
【０２４９】
いくつかの実施形態においてキメラ分子をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１または配列番号１９２のヌクレオチド酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一を含む。
【０２５０】
また、このような核酸分子もしくは一組の核酸分子またはその相補体を含んでいるベクターまたは一組のベクター、ならびにベクターを含んでいる宿主細胞も提供する。
【０２５１】
当開示はまた、本明細書で開示のキメラ分子を生産するための方法も提供し、そのような方法は、本明細書で開示の宿主細胞を培養すること、および培地からキメラ分子を回収することを含んでいる。
【０２５２】
いくつかの実施形態においてキメラ分子は、第一の供給源に由来する第一のアミノ酸配列であって、第二の供給源に由来する第二のアミノ酸配列に、共有的にまたは非共有的に結合している第一のアミノ酸配列を含み、ここで第一の供給源と第二の供給源は同じものではない。同じものではない第一の供給源と第二の供給源は、２種類の異なる生物学的実体、または同じ生物学的実体に由来する２種類の異なるタンパク質、あるいは同じ生物学的実体と非生物学的実体を含む場合がある。キメラ分子は例えば、少なくとも２種類の生物学的供給源に由来するタンパク質を含む可能性がある。生物学的供給源には、いずれもの人工的に生産されたものではない核酸またはアミノ酸配列（例えば、ゲノムもしくはｃＤＮＡ配列、プラスミドもしくはウイルスベクター、天然のビリオンまたは突然変異体もしくは類似体、本明細書に記載されている限り、上述したもののいずれか）が含まれ得る。人工的な供給源には、生物学的なシステムによってではなく、化学的に（例えば、アミノ酸配列の固相合成によって）生産されたタンパク質または核酸配列を含み得る。キメラ分子は、少なくとも２種類の人工的な供給源に由来するタンパク質または少なくとも１種類の生物学的供給源と少なくとも１種類の人工的な供給源に由来するタンパク質も含む場合がある。キメラ分子はまた、第一の供給源に由来する第一のアミノ酸配列であって、任意の供給源に由来する核酸または任意の供給源に由来する低分子有機物もしくは低分子無機物に共有的にまたは非共有的に結合している第一のアミノ酸配列を含む場合がある。キメラ分子はまた、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列の間に、または第一のアミノ酸配列と核酸の間に、または第一のアミノ酸配列と低分子有機物もしくは低分子無機物の間にリンカー分子を含む場合がある。
【０２５３】
本明細書で開示のキメラ分子を組換えで生産するためには、様々な方法が利用できる。遺伝子コードの縮重によって、様々な核酸配列が特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードすると理解される。デノボにおける固相ＤＮＡ合成、または前もって準備しておいたポリヌクレオチドにＰＣＲで突然変異を入れることで、所望のポリヌクレオチドを生産することができる。
【０２５４】
オリゴヌクレオチド介在性突然変異生成は、アミノ酸置換をコードしているコドンを導入するために（例えばキメラ分子に）、置換、インフレームでの挿入、または変化（例えば別のコドン）を調製するための方法の１つである。例えば、所望の突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの鋳型にハイブリダイズさせることで、最初のポリペプチドＤＮＡを変化させる。ハイブリダイゼーションした後、ＤＮＡポリメラーゼを使って、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込む鋳型の、第二の相補鎖全長を合成する。一実施形態では遺伝子改変、例えばプライマーを使ったＰＣＲ突然変異生成、が、本明細書で開示のキメラ分子のいずれかをコードしているポリヌクレオチドを作成するために、本明細書で定義した変化を組み入れるのに有効である。
【０２５５】
組換えによって生産するためには、ポリペプチド（例えば、本明細書で開示のキメラ分子のいずれか）をコードしているポリヌクレオチド配列を、適切な発現媒体、つまり、挿入したコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入する。
【０２５６】
本明細書で開示のキメラ分子のいずれかをコードしている核酸を、正しい読み枠でベクターに挿入する。その後、発現ベクターを、ポリペプチドを発現する好適な標的細胞に導入する。当該分野で知られている形質移入の技術としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈降法（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７８，Ｃｅｌｌ  １４：７２５）およびエレクトロポレーション法（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１）が挙げられる。本明細書で開示のキメラ分子のいずれかを真核細胞中で発現させるためには、様々な宿主発現ベクター系が使用できる。一実施形態では、真核細胞は動物細胞であり、哺乳動物の細胞（例えば、２９３細胞、ＰｅｒＣ６、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ヒーラ細胞）などを含む。真核細胞の中でポリペプチドが発現するときには、本明細書で開示のキメラ分子のいずれかをコードしているＤＮＡは、そのポリペプチドを分泌させるためのシグナル配列もコードし得る。当業者は、ポリペプチドが翻訳されると、細胞によってシグナル配列が切断されて成熟型のキメラ分子が形成されることを知っている。当該分野では様々なシグナル配列が知られており、例えば、天然のＦＶＩＩシグナル配列、天然のＦＩＸシグナル配列、天然のＦＸシグナル配列、天然のＧＰＩＩｂシグナル配列、天然のＧＰＩＩＩａシグナル配列、およびマウスＩｇＫの軽鎖シグナル配列がある。あるいは、シグナル配列が含まれていない場合には、細胞を溶解することによって、本明細書で開示のキメラ分子を回収することができる。
【０２５７】
本明細書で開示のキメラ分子を、トランスジェニック動物、例えば齧歯類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、またはウシを使って合成することができる。「トランスジェニック動物」という用語は、ゲノム中に外生の遺伝子が組み込まれているヒトではない動物を指す。この遺伝子が生殖系の組織に存在することから、遺伝子は親から子へと受け継がれる。外生の遺伝子は、単一細胞の胚に導入される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８）。免疫グロブリン分子を生産するトランスジェニック動物など、トランスジェニック動物の作出方法は当該分野で知られている（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｃｅｌｌ  ３４：３３５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：８３１；Ｒｏｂｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０：２６７）。
【０２５８】
発現ベクターは、組換えによって生産されたポリペプチドの生成または同定を容易にするためのタグをコードしている場合もある。例としては、限定されないが、本明細書で開示のキメラ分子をコードしている配列が、ベクター中でｌａｃ  ｚのコード領域にインフレームで連結されており、それによって複合型ポリペプチドを生産することができるｐＵＲ２７８ベクター（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）；タンパク質を発現させるためにグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）タグと共に使用できるｐＧＥＸベクターが挙げられる。これらのタンパク質は一般的に可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズに吸着させて、その後、遊離グルタチオン存在下で溶出することによって、細胞から容易に精製することができる。精製後、タグを簡単に除去するために、ベクターは切断部位、例えばプレシジョンプロテアーゼの切断部位（ファルマシア、ピーパック、ニュージャージー）を含む。
【０２５９】
本発明の目的では、多数の発現ベクター系を利用することができる。これらの発現ベクターは通常、宿主生物中で、エピソームとしてまたは宿主の染色体ＤＮＡの一部として複製されることができる。発現ベクターは、発現制御配列、例えばこれらには限定されないが、プロモーター（例えば、天然の関連があるプロモーターまたは異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、および転写終結配列などを含む場合がある。発現制御配列は、真核宿主細胞の形質転換または形質移入が可能なベクター中における、真核のプロモーター系であることが好ましい。発現ベクターでは、動物ウイルス、例えばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０ウイルス由来のＤＮＡエレメントを利用することもできる。その他のベクターは、内部リボソーム結合部位を伴うポリシストロン性の系の使用を含む。
【０２６０】
通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするための選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含む（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。形質転換された宿主細胞を選抜することができる１つ以上のマーカーを導入することで、細胞の染色体にＤＮＡが組み入れられた細胞を選択することができる。マーカーは、栄養要求性の宿主には原栄養性を、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を付与することができる。選択マーカーの遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接結合させるか、あるいは同時形質転換によって同じ細胞に導入させることができる。
【０２６１】
発現ベクターの例としては、ＮＥＯＳＰＬＡが挙げられる（米国特許第６，１５９，７３０号）。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビンの主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１とエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域の遺伝子および定常領域遺伝子の組み込み、細胞の形質移入、その後、Ｇ４１８含有培地およびメトトレキサートの増幅による選抜を行った際に、抗体を非常に高レベルで発現するとして発見されたものである。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および同第５，６５８，５７０号でも教示されており、それぞれの全体は参照することで本明細書に組み込まれる。この系では、例えば３０ｐｇ／細胞／日を上回るなど、高レベルでの発現がもたらされる。その他のベクター系の例としては、米国特許第６，４１３，７７７号で開示されているものが挙げられる。
【０２６２】
他の実施形態ではポリシストロン性の構築物を使って本発明のキメラポリペプチドを発現させることができる。これらの発現系では、複数の目的の遺伝子産物、例えば多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドを、１つのポリシストロン性構築物を使って生産することができる。これらの系は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を都合よく利用して、真核宿主細胞内で、本発明のポリペプチドを比較的高レベルで提供する。適したＩＲＥＳ配列は米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、これもまた本明細書に組み込まれる。当業者であれば、このような発現系を使用して、当出願で開示するポリペプチド全体を効率的に生産することができることが理解できる。
【０２６３】
より一般的には、ベクターまたはポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列が一旦準備できれば、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。つまり、宿主細胞を形質転換することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者であればよく知っている様々な技術によって達成することができる。そのような技術には、これらには限定されないが、形質移入（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、細胞とエンベロープＤＮＡとの融合、マイクロインジェクションならびに完全なウイルスによる感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．の「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」第２４．２章、４７０〜４７２頁、Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、ボストン、マサチューセッツ、１９８８）を参照のこと。プラスミドをエレクトロポレーションによって宿主に導入することが最も好ましい。形質転換した細胞を軽鎖および重鎖の生産に適した条件で生育させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質の合成に関して検定する。検定法の例としては、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、免疫組織化学などが挙げられる。
【０２６４】
本明細書で使用する場合「形質転換」という用語は、広い意味で、受容細胞の遺伝子型を変え、その結果、受容細胞が変化するようなＤＮＡの受容宿主細胞への導入を指す。
【０２６５】
その延長線上で「宿主細胞」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードしているベクターによって形質転換した細胞を指す。ポリペプチドを組換え宿主から単離する過程に関する記述では、「細胞」および「細胞培養」という用語は同じ意味で使用され、そうでないことが明示されていない限り、ポリペプチドの供給源を表す。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、遠心して集めた細胞全体または培地とそれに懸濁している細胞の両方を含む細胞培養のいずれかから回収することを意味する場合がある。
【０２６６】
一実施形態において宿主細胞は、成熟型ポリペプチドを形成する過程で、ｓｃＦｃリンカー（例えば、そのようなリンカーが存在し、細胞内プロセシング部位を含む場合に）を切断するのに必要な酵素（または複数の酵素）を内因性で発現する。このプロセシング過程において、ｓｃＦｃリンカーは実質的に除去され、外来性のアミノ酸の含有量を抑えることができる。本発明の別の実施形態では、ｓｃＦｃリンカーのプロセシングが起こるかまたは改善されるように、その宿主細胞にとって外生の酵素が１種類以上発現されるように、宿主細胞を形質転換する。
【０２６７】
一実施形態では、細胞によって内因性でまたは外来性で発現される得る酵素は、酵素のフューリンファミリーのメンバーである。ヒトフューリン（つまりＰＡＣＥ）の完全長ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は１９９０年に公開された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｕｗｅｌａｎｄ  Ａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６６４；Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１３３２（１９９０）。Ｂａｒｒらに付与された米国特許第５，４６０，９５０号には、組換えＰＡＣＥと、活性で成熟した異種タンパク質の発現を向上させるために、ＰＡＣＥと異種タンパク質の基質前駆ポリペプチドを同時に発現させることが記載されている。同様に米国特許第５，９３５，８１５号には、組換えヒトフューリン（つまりＰＡＣＥ）についてと、活性で成熟した異種タンパク質の発現を向上させるために、フューリンと異種タンパク質の基質前駆ポリペプチドを同時に発現させることが記載されている。使用可能な基質前駆体は本特許に開示されており、第ＩＸ因子の前駆体などが挙げられる。ＰＡＣＥに加えて、哺乳類のフューリン／スブチリシン／Ｋｅｘ２ｐ様プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）ファミリーの中の、他のファミリーメンバーも報告されており、これらには、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としても知られている）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られている）、ＰＣＳＫ３（フューリンもしくはＰＡＣＥとしても知られている）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られている）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５もしくはＰＣ６としても知られている）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても知られている）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８もしくはＳＰＣ７としても知られている）が含まれている。これら様々なメンバーは、全体的に、ある特定の保存された全体的な構造的特性を共有しているが、組織分布、細胞内局在、切断特異性、および好ましい基質の点で異なっている。概要についてはＮａｋａｙａｍａ  Ｋ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２７：６２５−３５を参照のこと。ＰＡＣＥと同様に、これらのプロタンパク質転換酵素は通常、アミノ末端から順に、シグナルペプチド、プロペプチド（自己触媒的に切断され得る）、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、およびＡｓｎ／Ａｓｐ残基を特徴とするスブチリシン様触媒的ドメイン、これもまたならびに触媒活性に必須で、かつ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を特徴とするホモＢドメインを含む。ＰＡＣＥ、ＰＡＣＥ４、およびＰＣ５はさらに、Ｃｙｓに富むドメインを含むが、その機能は分かっていない。加えて、ＰＣ５には膜貫通ドメインをもつイソ型と膜貫通ドメインをもたないイソ型があり、これら２種類のイソ型はそれぞれ、ＰＣ５ＢおよびＰＣ５Ａとして知られている。ＰＡＣＥの触媒ドメインのアミノ酸配列と、プロタンパク質転換酵素のこのファミリーに属している他のメンバーの触媒ドメインのアミノ酸配列によって、ＰＣ４とは７０パーセント；ＰＡＣＥ４およびＰＣ５とは６５パーセント；ＰＣ１／ＰＣ３とは６１パーセント；ＰＣ２とは５４パーセント；およびＬＰＣ／ＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７とは５１パーセント同一であることが分かっている。Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ（１��９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２７：６２５−３５。
【０２６８】
ＰＡＣＥおよびＰＡＣＥ４は部分的に重複しているが、別個の基質をもつことが報告されている。具体的には、ＰＡＣＥ４はＰＡＣＥとは大きく異なり、ＦＩＸの前駆ポリペプチドをプロセシングできないことが報告されている。Ｗａｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−６５；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１１５８６−９０。米国特許第５，８４０，５２９号は、ヒトＰＣ７のヌクレオチド配列とアミノ酸配列、および、他のＰＣファミリーメンバーと比較した場合のＰＣ７の注目すべき能力である、ＨＩＶ  ｇｐ１６０をｇｐ１２０とｇｐ４１に切断することを開示している。
【０２６９】
最初、Ｌｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６６９１−５によって齧歯類ＰＣ５のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列がＰＣ５と報告され、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１３：１３２−５によってＰＣ６と報告された。米国特許第６，３８０，１７１号は、膜貫通ドメインをもたないイソ型であるヒトＰＣ５Ａのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を開示している。これら酵素の配列、およびそれらのクローニング方法は当該分野において知られている。
【０２７０】
本発明のポリペプチドをコードしている遺伝子は、細菌もしくは酵母または植物細胞などの非哺乳動物細胞中でも発現させることができる。この点においては、細菌など、様々な非哺乳動物の単細胞類微生物、つまり培地中で培養することができるまたは発酵させることができる微生物を形質転換することができると理解される。形質転換に対して感受性をもつ細菌としては、腸内細菌のメンバー、例えば大腸菌またはサルモネラ菌株；バシラス科、例えば枯草菌；肺炎連鎖球菌；連鎖球菌およびインフルエンザ菌が挙げられる。さらに、細菌中で発現させた場合には、ポリペプチドは通常、封入体の一部となると理解される。ポリペプチドは単離され、精製され、次いで機能をもつ分子に組み立てられなければならない。
【０２７１】
原核生物に加えて、真核微生物も使用することができる。多数の他の株が一般的に利用可能であるが、真核微生物野中でも出芽酵母、つまり一般的なパン酵母が、最も一般的に使用されている。
【０２７２】
酵母類での発現に関しては、例えば、プラスミドＹＲｐ７が一般的に利用されている（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））。このプラスミドはそもそも、トリプトファン存在下で生育する能力を欠損した突然変異酵母株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））の選択マーカーとなるＴＲＰ１遺伝子を含む。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてトリプトファン障害があるため、トリプトファン非存在下で生育させることが、形質転換体を検出するために有効な環境となる。
【０２７３】
その他の酵母宿主細胞、例えばピキアも利用することができる。発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列などを含む酵母発現ベクターが望ましい。一般的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、中でも、アルコール脱水素酵素由来プロモーター、イソシトクロムＣ、ならびにメタノール、麦芽糖、およびガラクトースの利用に関与する酵素が挙げられる。
【０２７４】
あるいは、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、トランスジェニック動物のゲノムに導入するための導入遺伝子に組み込み、その後、トランスジェニック動物の乳中で発現させることもできる（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、同第５，３０４，４８９号および同第５，８４９，９９２号を参照のこと）。好適な導入遺伝子には、ポリペプチドのコード配列であって、乳腺特異的遺伝子、例えばカゼインまたはβラクトグロブリン由来のプロモーターおよびエンハンサーに操作可能に連結されているものがある。
【０２７５】
インビトロでの生産を、大量の所望のポリペプチドが得られるまでスケールアップすることができる。組織培養条件で哺乳動物の細胞を培養するための技術は当該分野で知られており、均一な懸濁培養、例えばエアリフトリアクターもしくは連続撹拌反応器中での培養、または固定化したもしくは封入した細胞培養、例えば中空のファイバー中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ表面もしくはセラミックカートリッジ中での培養が含まれる。必要であれば、および／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を慣習的なクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースを使ったクロマトグラフィーまたは（免疫）アフィニティクロマトグラフィーによって、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドを優先的に生合成した後、または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー工程の前もしくは後に精製することができる。その後の精製を容易にするために、アフィニティタグ配列（例えばＨｉｓ（６）タグ）を、ポリペプチド配列に随意選択で結合させるまたは含めることができる。
【０２７６】
一旦発現されれば、キメラ分子は当該分野において標準的手順によって、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などで精製することができる（基本的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照のこと）。特に、本明細書の実施例において使用している方法を参照のこと。医薬用途には、実質的に純粋なタンパク質、少なくとも約９０〜９５％均一なタンパク質が好ましく、９８〜９９％またはそれ以上均一なタンパク質が最も好ましい。
【０２７７】
ＩＶ．  使用方法
本発明はまた、
（ｉ）本明細書で開示のキメラ分子；
（ｉｉ）本明細書で開示の核酸分子もしくは一組の核酸分子；
（ｉｉｉ）本明細書で開示のベクターもしくは一組のベクター；または
（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ、
および薬学上許容可能な担体、を含んでいる医薬組成物も提供する。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、（ｉ）本明細書で開示のキメラ分子、（ｉｉ）本明細書で開示の核酸分子もしくは一組の核酸分子、（ｉｉｉ）本明細書で開示のベクターもしく一組のベクター、または（ｉｉｉ）本明細書で開示の医薬組成物を投与することを、例えば、出血の頻度もしくは程度を低減することを必要とする対象において低減するために、および／または出血の発症を抑制するもしくは阻害することを必要とする対象において抑制もしくは阻害するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、対象は既に、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはこの両方を用いた治療に対する阻害剤を生じているか、またはそれらを生じる可能性がある。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害剤は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはこの両方に対する中和抗体である。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、出血は、血液凝固障害、例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂによって誘発される場合がある。他の実施形態において出血は、関節血症、筋肉出血、口内の出血、大出血、筋内への大出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、腸腰筋鞘における出血由来の出血またはそれらの任意の組み合わせであってよい。ある特定の実施形態では、対象はヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象はマウス対象である。
【０２８０】
当該開示はまた、
（ａ）ＦＶＩＩを血小板表面に標的指向化する方法であって、薬剤を、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａ．１．の項で開示したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子のうちの１つ、または血小板に結合する標的化部分に融合させることを含む方法；
（ｂ）ＦＶＩＩの活性を高める方法であって、ＦＶＩＩを、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａ．１．の項で開示した抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、または血小板に結合する標的化部分に融合させることを含んでいる方法；または、
（ｃ）ＦＶＩＩの薬物動態特性を改善する方法であって、ＦＶＩＩを、ＸＴＥＮポリペプチドおよびＩＩ．Ａ．１．の項で開示した抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子、または血小板に結合する標的化部分に融合させることを含んでいる方法；を提供する。
【０２８１】
本発明はまた、治療上有効量の本発明のキメラ分子を対象に投与することを含んでいる、止血障害の治療、緩和、または予防方法に関する。キメラ分子による治療、緩和および予防はバイパス治療であってもよい。バイパス治療を受ける対象は、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害剤を発現している対象であっても、または凝固因子阻害剤を発現する可能性がある対象であってもよい。対象に投与するための組成物は、本発明のキメラ分子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
【０２８２】
一実施形態において本発明のキメラ分子組成物は、少なくとも１種類の、止血を促す薬剤との併用で投与される。止血剤の例としては、これらには限定されないが、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、プロトロンビンまたはフィブリノゲン、あるいはこれらいずれかの活性型が挙げられる。凝固因子または止血剤はまた、抗線維素溶解薬、例えばε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸を含むことができる。
【０２８３】
本発明のキメラ分子は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、または任意の粘膜の表面を介して、例えば、経口的に、舌下に、頬側に、舌下に、経鼻的に、直腸内に、経腟的にまたは肺を経由して投与することができる。キメラ分子を所望の部位に持続放出することを可能にする生体ポリマー固相支持体中にキメラ分子を埋め込むことまたはそれに結合させることができる。
【０２８４】
経口投与用の医薬組成物は、標準的な手段によって調製した錠剤またはカプセルの形態をとる場合がある。組成物はまた、液体例えばシロップまたは懸濁液として調製することもできる。液体は、沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂質）、乳化剤（レシチンまたはアカシアゴム）、非水性の媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画した植物油）、および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を含む場合がある。また、調整物は、香料、着色料および甘味料を含む場合もある。あるいは、組成物は、水または別の好適な媒体で再構成するための乾燥した製品であってもよい。頬側および舌下投与用の組成物は、錠剤、ロゼンジまたは慣習的なプロトコールによる易溶フィルムの形態をとる場合もある。吸入投与用の場合には、本発明に従って使用するためのキメラ分子は、好適な噴霧剤を使った圧縮パックまたはネブライザー（例えばＰＢＳ中）から、エアロゾルスプレーの形態で慣習的に送達される。
【０２８５】
一実施形態では、本発明のポリペプチドの投与経路は非経口投与である。本明細書で使用する場合、非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内の、皮下の、直腸または経膣投与を含む。静脈内形態の非経口投与が好ましい。明らかに、これら全ての投与形態が本発明の範囲内に入ると想定されるが、投与形態は、注入用の溶液、具体的には、静脈内もしくは動脈内注入または点滴用の注入用溶液である。一般に、注入に好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸もしくはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、随意選択で安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。しかしながら、本明細書の教示に合致した他の方法では、有害な細胞集団のある部位にポリペプチドを直接送達し、それによって、病気の組織の治療剤への暴露を増やすことができる。
【０２８６】
非経口投与用の調整物としては、無菌的な水性のまたは非水性の溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。非水性の溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルがある。水性の担体としては、水、アルコール／水性溶液、乳剤または懸濁液が挙げられ、生理食塩水や緩衝した媒体が含まれる。対象の発明において薬学上許容可能な担体としては、限定されないが、０．０１〜０．１Ｍの、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の生理食塩水が挙げられる。他の一般的な非経口用媒体としては、ナトリウムリン酸溶液、リンゲル液（デキストロース）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内投与用の媒体としては、水分および栄養分補充剤、電解質補充剤、例えば、デキストロースを使用したリンゲル液に基づく補充剤などが挙げられる。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤や他の添加剤が含まれる場合もある。
【０２８７】
より具体的には、注入用途に好適な医薬組成物としては、無菌的な水性溶液（水溶性の場合）または分散剤および無菌的な注入用溶液または分散剤の即時調製用の無菌的な粉末が挙げられる。このような場合、組成物は無菌的でなければならず、また、簡単にシリンジで扱える程度の流動性をもつ。製造および保存の条件で安定的でなければならず、好ましくは、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対しても安定的である。担体は溶媒であっても分散媒であってもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコールなど）、および好適なそれらの混合物が挙げられる。例えば、レシチンなどの被覆剤を使うこと、分散剤の場合には必要とされる粒径を維持すること、および界面活性剤を使うことによって、求められる流動性を保つことができる。
【０２８８】
様々な抗菌剤や抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを使うことで、微生物の作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。組成物に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを含めることで、注入用組成物の吸収を持続させることができる。
【０２８９】
いずれの場合にも無菌的な注入用の溶液は、必要量の活性化合物（例えば、ポリペプチドのみ、または他の活性薬剤との組み合わせ）を適切な溶媒に、単独であるいは本明細書で列挙する成分と一緒に組み込み、必要な場合にはその後濾過滅菌することで調製することができる。分散剤は通常、活性化合物を、基本的な分散媒とこれまでに挙げた必要とされる他の成分を含む無菌的な媒体に組み込むことで調製される。無菌的な注入用溶液を調製するための無菌的な粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌しておいた溶液の真空乾燥および凍結乾燥であり、これらの方法では、活性成分の粉末に加えて、その溶液に由来するその他の所望の成分が得られる。注入用の調整物は、加工され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に充填され、その後、当該分野で知られている方法によって無菌的な条件で密閉される。さらに、調製物を梱包し、キットとして販売することもできる。そのような物品の製造物は、その組成物が凝固障害を患っているまたは凝固障害の素因のある対象の治療に有用であることを示すラベルまたは添付文書を含むことが好ましい。
【０２９０】
医薬組成物は、例えば、標準的な座剤用基剤（例えばカカオバターまたは他のグリセリド）を含有している座剤または貯留浣腸として、直腸投与用に調製することもできる。
【０２９１】
症状の治療に有効な本発明の組成物の量は、多くの様々な要因、例えば投与手段、標的部位、患者の生理学的な状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の薬剤、およびその治療が予防的なものか治療的なものかによって変化する。通常患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒトではない哺乳動物も治療することができる。治療のための投与量を、当業者であれば知っている慣習的な方法によって滴定し、安全性と効力を最適化することができる。
【０２９２】
一実施形態では、生物学的に活性な部分（例えば、ＦＶＩＩを含んでいる）の用量は、約９０〜２７０μｇ／ｋｇまたは０．０９０〜０．２７０ｍｇ／ｋｇの範囲となり得る。別の実施形態では、生物学的に活性な部分（例えば、ＦＸを含んでいる）の用量は、約１μｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇの範囲となり得る。
【０２９３】
用量は、体重１キログラム当たり１０００μｇ〜０．１ｎｇとなり得る。一実施形態において用量は、１uｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの範囲である。タンパク質は、継続的にまたは特定の時間間隔をおいて投与することができる。インビトロアッセイによって、最適な用量範囲および／または投与計画を決定することができる。凝固因子活性を測定するためのインビトロアッセイは当該分野で知られており、例えば、ＳＴＡ−ＣＬＯＴ  Ｖｌｌａ−ｒＴＦ凝固アッセイがある。加えて、動物モデル、例えば血友病のイヌ（Ｍｏｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：２６７０）から得られた用量反応曲線を使って、有効な用量を補外することもできる。
【０２９４】
上述した範囲の中間適度の用量も、本明細書の範囲に入る。このような用量を対象に１日１回、２日に１回、１週間に１回または実験的な解析によって決定した他の任意の計画に沿って投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば少なくとも６ヶ月間の頻回投与を続けることを伴う。いくつかの方法では、２つ以上のポリペプチドを同時に投与することができる。このような場合、各ポリペプチドの投与量は指示された範囲内に入る。
【０２９５】
本発明のポリペプチドは何回も投与することができる。各投与間の間隔は、１日単位、１週間単位、１ヶ月単位、または１年単位であってよい。また投与間隔は、改変されたポリペプチドまたは抗原の患者における血中レベルの測定を指標として、不定期になってもよい。あるいは、ポリペプチドを持続放出製剤として投与してもよく、この場合には、必要とされる投与頻度はより少なくなる。用量および頻度は、ポリペプチドの患者体内での半減期に応じて様々である。
【０２９６】
投与の用量および頻度は、その治療が予防的かまたは治療的なものかによっても変わり得る。予防的な使用では、疾患の状態にはまだない患者に、その疾患への耐性を高めるまたは疾患の影響を最小限に抑えるために、本発明のポリペプチドまたはその混合物を含有している組成物を投与する。そのような量は「予防上有効な用量」と定義される。比較的少ない用量を、比較的低頻度で長期間にわたって投与する。一部の患者は、そのような治療を生きている間ずっと継続する。
【０２９７】
本発明のポリペプチドは、治療（例えば、予防または治療）が必要な障害または症状の治療に有効な他の薬剤と併用して投与してもよい。
【０２９８】
本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチドを補助的治療と連携させてまたは組み合わせて投与するとは、治療と本開示のポリペプチドを、順番に、同時に、一定の範囲内で、併用して、両立させてもしくは同時期に投与または使用することを意味する。併用治療の計画に含まれる様々な要素を投与するまたは使用する期間を限定して、その治療の全体的な効果を向上させてもよいことを当業者は理解する。当業者（例えば医師）は必要以上の実験を行わなくても選択した補助的治療および本明細書の教示に基づいて、容易に有効な併用療法を見定めることができる。
【０２９９】
さらに、当該発明のポリペプチドを、薬剤と連携してまたは併用して使用できることも（例えば、併用療法を提供するために）理解される。本発明のポリペプチドと併用することができる薬剤の例としては、治療する特定の障害の現行の標準治療となっているものが挙げられる。そのような薬剤は、天然の化学物質または生物製剤であってもよい。「生体材料」または「生物製剤」という用語は、生物によって作られた薬学的に活性な薬剤および／または治療として用いられることを意図したそれらの産物を指す。
【０３００】
当該発明のポリペプチドと併用して使用する薬剤の量は対象によって多様になり得、または、当該分野で知られている方法に従って投与することができる。例えば、「Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」１２３３−１２８７頁の、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  ＣｈａｂｎｅｒらによるＡｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版、１９９６）を参照のこと。別の実施形態では、そのような薬剤の量は、投与される標準治療と合致する。
【０３０１】
前述したように、本発明のポリペプチドを薬学上有効な量で凝固障害のインビボでの治療用に投与することができる。その際、活性薬剤の投与を容易にし、安定性を高めるように本発明のポリペプチドを製剤化することができることが理解される。本発明に従う医薬組成物は、薬学上許容可能で毒性のない無菌的な担体、例えば生理食塩水、毒性のない緩衝剤、防腐剤などを含むことが好ましい。当然のことながら、本発明の医薬組成物は、薬学的に有効な量のポリペプチドを提供するために、単回投与することもまたは複数回投与することもできる。
【０３０２】
一実施形態において本発明のキメラ分子は、核酸分子として投与される。核酸分子は当該分野で知られている技術、例えばベクター、プラスミド、リポソーム、ＤＮＡ注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、静脈内注入または肝動脈注入によって投与することができる。遺伝子治療の実施形態で使用されるベクターは当該分野で知られている。
【０３０３】
本開示の範囲を踏まえて、本発明のキメラ分子を前述した治療方法に従って、治療または予防効果を発揮するのに十分な量で、ヒトまたは他の動物に投与することができる。
【０３０４】
当業者であれば理解できるように、本発明のキメラ分子には多数の用途があり、そのような用途の例としては、限定されないが、疾患または症状のある対象の治療方法がある。疾患または症状の例としては、限定されないが、止血障害がある。
【０３０５】
一実施形態において本発明は、治療上有効量の少なくとも１種類の本発明のキメラ分子を投与することを含んでいる、止血障害を有する患者の治療方法に関する。
【０３０６】
本発明のキメラ分子は、フィブリン血栓の形成を促進することで、止血障害を治療または予防する。本発明のキメラ分子は、凝血カスケードに含まれる任意のメンバーを活性化することができる。凝固因子は、外因性の経路、内因性の経路、あるいはその両方に関わっている場合がある。本発明のキメラ分子は止血障害、例えばキメラ分子に含まれている特定の凝固因子で治療できることが知られている止血障害を治療するために用いることができる。本発明のキメラ分子の投与によって治療可能な止血障害としては、限定されないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィルブランド病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、ならびにフィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子もしくは第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常がある。
【０３０７】
一実施形態において止血障害は、遺伝性の障害である。一実施形態では、対象は血友病Ａ患者で、キメラ分子は活性化ＦＶＩＩを含み、活性化ＦＶＩＩはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子およびＸＴＥＮポリペプチドに連結または接続されている。別の実施形態では、対象は血友病Ｂ患者で、キメラ分子は活性化ＦＶＩＩを含み、活性化ＦＶＩＩはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子およびＸＴＥＮポリペプチドに連結または接続されている。いくつかの実施形態では、対象はＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａに対する阻害的な抗体を有し、キメラ分子は活性化ＦＶＩＩを含み、活性化ＦＶＩＩはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子およびＸＴＥＮポリペプチドに連結または接続されている。さらに他の実施形態では、対象はＦＩＸまたはＦＩＸａに対する阻害的な抗体を有し、キメラ分子は活性化ＦＶＩＩを含み、活性化ＦＶＩＩはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体またはその抗原結合分子およびＸＴＥＮポリペプチドに連結または接続されている。
【０３０８】
ＦＶＩＩを含んでいる本発明のキメラ分子は、止血障害の患者を予防的に治療するのに使用することができる。ＦＶＩＩを含んでいる本発明のキメラ分子は、止血障害の患者における急性出血の治療に使用することができる。
【０３０９】
一実施形態において止血障害の原因は、凝固因子、例えばＦＶＩＩ、ＦＩＸ、またはＦＶＩＩＩの欠損である。別の実施形態において止血障害の原因は、凝固因子の欠損である可能性がある。別の実施形態において止血障害は、後天的な障害である可能性がある。後天的疾患は、根底にある二次性疾患または症状によって生じる可能性がある。無関係な症状としては、例えば、癌、自己免疫疾患または妊娠が挙げられるがこれらには限定されない。後天的疾患は、加齢または根底にある二次性疾患を治療するための医薬（例えば癌の化学療法）によって生じる可能性がある。
【０３１０】
本発明はまた、止血障害でない対象または止血障害を発生させる二次性疾患もしくは症状のない対象の治療方法にも関する。従って本発明は、治療上有効量の少なくとも１種類の本発明のキメラ分子を投与することを含んでいる、一般的な止血剤を必要としている対象の治療方法に関する。一実施形態において一般的な止血剤を必要としている対象とは、例えば、手術を受けているまたは受ける予定の対象である。本発明のキメラ分子を予防的に、手術の前または後に投与することができる。本発明のキメラ分子を手術中または手術後に投与して急な出血を制御することができる。手術には、肝臓移植、肝臓摘出または幹細胞移植が挙げられるがこれらには限定されない。別の実施形態では、本発明のキメラ分子を、止血障害ではないが急に出血した対象の治療に使用することができる。急な出血は重篤な外傷、例えば手術、交通事故、創傷、銃創またはその他の出血が制御されていない状況でのいずれもの外傷によって生じる可能性がある。
【０３１１】
ここまで本発明を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することで本発明をより深く理解できるだろう。実施例は例示する目的のためだけに本明細書に含められるものであり、本発明を限定することを意図しない。本明細書で参照する特許および刊行物は全て、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３１２】
基本的な材料および方法
基本的に本発明の実践には、別段の指定のない限り、化学、生物物理学、分子生物学の標準的な技術、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）および電気泳動の標準的な技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
【０３１３】
実施例１
血小板を標的とする抗体の同定と解析
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａをコードしているＤＮＡ配列（配列番号１８３および１８４）を含有しているプラスミドで免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスから、当該分野で知られている方法でハイブリドーマを生成した。その後、フローサイトメトリーを使ってヒトおよびカニクイザルサル血小板への結合に関して、および酵素免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を使ってＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に関してハイブリドーマをスクリーニングした。ヒトおよびサル血小板との結合を決定するために、ゲルで精製したヒトまたはサル（カニクイザル）の血小板をハイブリドーマ上清と共にタイロード緩衝液中でインキュベートした。３０分間インキュベートした後、１％ホルムアルデヒドで細胞を固定した。固定した後、タイロード緩衝液中で細胞を洗浄し、検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合型）を添加した。抗体の結合をフローサイトメトリーで検出した。
【０３１４】
ハイブリドーマ上清とヒトＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ）との結合をＥＬＩＳＡで以下のように検出した：Ｃｏｓｔａｒプレート（カタログ番号３５９０）を１ウェル当たり１００μｌの５μｇ／ｍＬのヒトＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５２８２４０）でコーティングし（測定用緩衝液、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＭｎＣｌ２を使用）、３７℃で１時間、撹拌しながらインキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回、プレート洗浄機で洗浄した。５％のＢＳＡ（ウシ胎仔血清、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号００１  ０００  １７３）を含む測定用緩衝液を１ウェル当たり２００μｌ使用、３７℃で１時間、撹拌しながらインキュベートすることでブロッキングを行った。アッセイ用のウェルに１００μＬのハイブリドーマ上清を加え、３７℃で１時間、撹拌しながらインキュベートし、その後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０１０  ０５）を測定用緩衝液で１０，０００倍に希釈し、３７℃で１時間、撹拌しながらインキュベートし、その後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢでＨＲＰの有無を展開し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のプレートリーダーを用い、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３１５】
ＥＬＩＳＡアッセイで陽性だったハイブリドーマ上清を血小板と混合し、フローサイトメトリーを使って以下の通り、血小板の活性化についてスクリーニングした。
（ａ）試薬：クエン酸添加ヒト全血；セファロース２Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）含有タイロード緩衝液（カルシウムは含まない）；ＣａＣｌ２（５ｍＭ）およびＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）含有タイロード緩衝液；３２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＰＡＣ１  ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ、カタログ番号３４０５０７）；ＣＤ６２  ＰＥ抗体（ＢＤ、カタログ番号５５５５２４）；ＡＤＰ；ＳＦＦＬＲＮペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号２４１９１）；ＩＶ．３  Ｆａｂｂ抗ＣＤ３２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、カタログ番号０１４７０）。
（ｂ）血小板の精製：１０ｍＬのセファロース２Ｂビーズをカラムに充填し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むタイロード緩衝液３０ｍＬで平衡化した。１〜１．５ｍＬ容量の血小板に富む血漿（ＰＲＰ）を平衡化したセファロースカラムに負荷し、重力によって自然に充填したビーズ内に浸透させ、その後、およそ５ｍＬのタイロード緩衝液を加えた。血小板を含んだ濁った液滴を回収した。
（ｃ）アッセイ：まず、５０μＬのハイブリドーマ上清を、丸底の９６ウェルプレートのアッセイ用ウェルに入れた。１０μＬのＰＡＣ１  ＦＩＴＣと１０μＬのＣＤ６２ＰＥを対照用およびアッセイ用のウェルの全てに加えた。１０μＬのＡＤＰと１０μＬのＳＦＦＬＲＮを対照用のウェル（ハイブリドーマ上清を含まない）に加えた。活性化がＦｃによるものかまたは抗体によるものかを見るために、１０μＬのＩＶ．３阻害剤（ＦｃγＲＩＩＡに対する抗体）を加えた。次に、上述したように精製し、濃縮した５０μＬの休止状態の血小板を全てのウェルに加えた。プレートを、暗所、室温で３０分間インキュベートした。細胞を、最終濃度が１％のＰＦＡで１０分間、室温で固定した（ウェル内のＰＦＡ含量が２％になる量を加えた）。固定した後、試料をフローサイトメトリーで解析した。
【０３１６】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合しても血小板を活性化させなかった抗体を凝固因子標的化部分として選抜した。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合すると血小板を活性化する抗体は除外した。
【０３１７】
抗体は、Ｆｃ領域を介してＦｃγＲＩＩＡ受容体と結合することでも血小板を活性化する場合があるが、抗体の抗原結合部分はＦｃ領域を含まず、ＦｃγＲＩＩＡ受容体と結合しないことから、これらは除外しなかった。これらの抗体は、阻害剤でＦｃγＲＩＩＡ受容体を遮断することで同定することができる。
【０３１８】
活性でないハイブリドーマの上清を、（ｉ）抗体とヒトおよびカニクイザル血小板との結合を確認するため、（ｉｉ）抗体の、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαおよび／またはβサブユニットとの結合特異性を決定するため、および（ｉｉｉ）血小板との結合に関して抗体がフィブリノゲンと競合するか否かを決定するために、さらに解析した。フィブリノゲンはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの天然のリガンドで、血小板が凝集するには、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂＩＩＩａの結合が必須である。そのため、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に競合する抗体は除外した。
【０３１９】
抗体とＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαおよび／またはβサブユニットとの結合をＥＬＩＳＡで評価し、抗体とフィブリノゲンとの競合をフローサイトメトリーで評価した。非活性型と決定した抗体（例えばクローン３４Ｄ１０、２Ａ２、３５Ｄ１、３６Ａ８、４Ｂ１１、１Ｈ６、３８Ｇ８、２１Ｆ１０、３８Ａ８、１８Ｆ７、１２Ｂ２、３８Ｆ６、１３Ｃ１、５Ｃ４、２３Ｃ１０、３７Ｃ７、２８Ｃ２、９Ｄ６、１３Ａ１）を、ＶＨドメインの配列相同性、αまたはβサブユニット特異性、フィブリノゲンとの競合能、ならびにＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーで測定されたシグナルの相対的な強度によって６群に分類した（表３を参照のこと）。
【表３−１】
2016530218.tif 000006
【表３−２】
2016530218.tif 000007
【０３２０】
上述したスクリーニング方法によって同定した非活性型抗体のうちのいくつかには、表３に示すように、同じＶＨまたはＶＬドメインが含まれていた。例えば、３５Ｄ１と３４Ｄ１０は同じＶＨドメインを含んでいた。
【０３２１】
前述したように同定した抗体のＶＨドメインとＶＬドメインに対応する複数の配列のアライメントを、それぞれ、図４および図５に示す。複数配列のアライメントでは、ＶＨおよびＶＬドメイン中の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の位置、およびそれらのＥＵ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）’’Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，’’  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｔ．Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆ．Ｎｏ．１６５−４９２，Ｎｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）による位置を示している。
【０３２２】
図６では、図４および図５の複数配列のアライメントに含めたＶＨおよびＶＬ配列のそれぞれのペアについて、パーセント同一性のマトリックスとして、配列同一性のパーセンテージを示している。縦列の番号は、マトリックス中の各列の配列との比較に使った配列の番号（横列にふった番号）に対応する。例えば、縦列の２は、「２：配列２２−９Ｄ６ＬＣ」に相当する。図４および図５で整列させた配列を、抗体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニット特異的であるかβサブユニット特異的であるかによって（図７および図８を参照のこと）、および、フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合に競合する能力に従って（図９および図１０を参照のこと）分類した。
【０３２３】
実施例２
抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、ＸＴＥＮおよびＦＶＩＩａを含んでおり、血小板を標的とするキメラ分子の構築
ＦＶＩＩａ凝固因子を血小板表面に標的指向化するために、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体を使用した。従って、ＩＩ．Ａ．１．の項で同定した血小板特異的モノクローナル抗体由来のｓｃＦｖを、当該分野で知られている分子生物学的な方法によって、ＦＶＩＩａに融合させた。この構築物をＨＥＫ２９３細胞内で一過的に発現させ、当該分野において利用可能な標準的方法によって精製した。結果として得られるキメラ分子では、ＦＶＩＩ重鎖のＣ末端が、非活性化血小板標的指向化抗体由来のＶＨおよびＶＬドメインを含んでいるｓｃＦｖのＮ末端に融合しており、かつ、ＦＶＩＩ軽鎖のＣ末端が、ＸＴＥＮポリペプチドのＮ末端に融合していた（図２Ａを参照のこと）。ＦＶＩＩａの重鎖に融合させたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニット特異的な３４Ｄ１０抗体由来のｓｃＦｖとＦＶＩＩの軽鎖に融合させたＸＴＥＮポリペプチド（つまり＿＿＿＿）を含んでいるキメラ分子を「ＦＶＩＩ−２１１」と命名した。ＦＶＩＩの軽鎖ならびに、ＦＶＩＩの重鎖、ＸＴＥＮポリペプチド（つまりＡＥ２８８）およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニット特異的３４Ｄ１０抗体由来のｓｃＦｖからなる融合ペプチドを含んでいる第二のキメラ分子を「ＦＶＩＩ−２００」と命名した。ＦＶＩＩおよび、ＦＶＩＩ重鎖のＣ末端に融合させたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのαサブユニット特異的３４Ｄ１０抗体由来のｓｃＦｖを含んでいるキメラ分子を「ＦＶＩＩ−１８９」と命名した。これらの血小板標的指向化ＦＶＩＩａ変異体の血小板への結合能、凝血促進活性および薬物動態特性を、動物を使って解析した。
【０３２４】
実施例３
ＸＴＥＮはｒＦＶＩＩａの薬物動態特性を改善するが、その活性を弱める。
薬物動態特性を評価するために、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのｒＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮのいずれかを、ＨｅｍＡマウスに一回、静脈内投与した。投与後、様々な時点で血漿試料を回収し、ＦＶＩＩａ特異的、可溶性組織因子依存性プロトロンビン時間（ｓＴＦ−ＰＴ）アッセイでＦＶＩＩａの活性を決定した（図１１Ａ）。ＰＫ指標はＰｈｏｅｎｉｘ６プログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を使って求めた。
【０３２５】
図１１Ａおよび表４に示すように、ＸＴＥＮをｒＦＶＩＩａのＣ末端に結合すると、ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩａの血中半減期が約８倍に延びた。同様に他のＰＫ指標も改善され、平均滞留時間（ＭＲＴ）が０．８２〜１１時間に改善され、血漿活性対時間のグラフにおいて用量で正規化した曲線下面積（ＡＵＣ）がおよそ５倍に増えることが示された（図１１Ａ）。
【表４】
2016530218.tif 000008
【０３２６】
ＸＴＥＮはｒＦＶＩＩａの薬物動態を改善するが、ＲＯＴＥＭで測定したヒト血友病Ａ患者血液でのｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの血液凝固活性は、ｒＦＶＩＩａの活性のおよそ２５％まで低下した（図１１Ｂ）。
【０３２７】
実施例４
血小板の標的化とＸＴＥＮを組み合わせることで、その活性およびＰＫが向上する
ｒＦＶＩＩａまたはｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮを血小板へと標的指向化することで、凝固部位（血小板）での局所的なタンパク質濃度が高まり、その結果、凝固活性が向上し得る。血小板を標的とするキメラ分子のＦＶＩＩ−２００、ＦＶＩＩ−２１１およびＦＶＩＩ−１８９を、モノクローナル抗体３４Ｄ１０由来のｓｃＦｖを標的化部分として含むように構築した。これら構築物の構造については上述の通りである。３つの分子は全て、用量依存的にヒト血小板に結合することが可能で（図１２Ａ）、かつ、この結合は３４Ｄ１０に依存した。しかしながらこのアッセイでは、ｒＦＶＩＩａ単独は検出可能な程度の血小板結合活性を示さなかった。この結果から、３４Ｄ１０由来のｓｃＦｖがｒＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ−１８９）またはｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ（ＦＶＩＩ−２００およびＦＶＩＩ−２１１）を血小板へと誘導できたことが分かった。
【０３２８】
血小板との結合能を示す結果から、ＲＯＴＥＭで試験した場合のヒト血友病Ａ患者の血液における３４Ｄ１０で標的化したｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮキメラ分子の血液凝固活性が高まることが示された（図１２Ｂ）。ＲＯＴＥＭで記録した凝固時間に基づいて、ＦＶＩＩ−２００の活性はｒＦＶＩＩａの２〜５倍高いと予測された。対照的に、ｒＦＶＩＩ−ＸＴＥＮはｒＦＶＩＩａの２５％しか活性がなかった（図１１Ｂ）。従って、３４Ｄ１０によって血小板に標的指向化すると、ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの活性が実質的に改善された。
【０３２９】
モノクローナル抗体３４Ｄ１０はマウスの血小板には結合しないが、３４Ｄ１０はヒトαＩＩｂトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（ｈａｌｌｂ＋／ｍａｌｌｂ−）の血液に含まれる血小板には結合する。さらに、３４Ｄ１０で標的化したＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ−１８９）およびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ（ＦＶＩＩ−２００およびＦＶＩＩ−２１１）はヒトαＩＩｂ  Ｔｇマウス由来の血小板に結合する能力を保持していた（図１３Ａ）。従って、これらのＴｇマウスの使用が正当化され、３４Ｄ１０を含むｒＦＶＩＩａキメラ分子の薬物動態特性を評価した。
【０３３０】
図１３Ｂに示すように、αＩＩｂ−Ｔｇマウスにおける血小板結合型ＦＶＩＩａキメラ分子のクリアランスは２相崩壊モデルになる。３４Ｄ１０で標的指向化したｒＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ−１８９）と比較すると、ＸＴＥＮを加えることで（ＦＶＩＩ−２００およびＦＶＩＩ−２１１）終末相半減期が長くなるだけでなく、最初のα相崩壊も長くなった。中でも、ＦＶＩＩ−２００のＰＫプロファイルがＦＶＩＩ−２１１のプロファイルよりも顕著に高かったことから分かるように、ＸＴＥＮの位置がＰＫの改善に影響を与えた。ＰＫ特性が向上したことと血液凝固活性がｒＦＶＩＩａの２〜５倍高いことから、このキメラ分子が持続して治療効果をもつ可能性があることが分かる。
【０３３１】
実施例５
ＸＴＥＮと標的化部分の配置がそれぞれ異なる血小板標的指向化ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮキメラ分子
モノクローナル抗体ＰＤＧ１３由来のｓｃＦｖを使って、ＦＶＩＩａ、ＰＤＧ１３およびＸＴＥＮを含んでいる一群のキメラ分子を構築し（図１４）、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、その後精製した。ＰＤＧ１３とＸＴＥＮの配置が異なる試験した構築物（図１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅ、１４Ｆ）の中では、ｒＦＶＩＩａの軽鎖にＸＴＥＮを含み、重鎖にＰＤＧ１３を含むＦＶＩＩ−１７９（図１４Ｆ）の活性が最も高かった。ヒト血友病Ａ患者の血液では、ｒＦＶＩＩａと比較すると、ＦＶＩＩ−１７９は約５倍高い血液凝固活性を示した（図１５Ｂ）。他の全キメラ分子、つまりＦＶＩＩ−１７５（図１４Ｃ、１５Ｃ）、ＦＶＩＩ−１７８（図１４Ｄ，１５Ａ、１５Ｄ）、ＦＶＩＩ−１７７（図１４Ｄ、１５Ｄ）の凝固活性はｒＦＶＩＩａと同等で、血小板標的化部分を含まないｒＦＶＩＩａとＸＴＥＮを含んでいるキメラ分子であるＦＶＩＩ−１６５（図１４Ｂ）よりは数倍高い活性を示した。
【０３３２】
標的化部分がＰＫに及ぼす影響について調べた。図１６に示すように、ＮＳＧマウスを使って、注入したヒト血小板量に結合した投与タンパク質の回収率を経時的に解析したところ、ＦＶＩＩ−２１１の回収率は、タンパク質を投与した５分後からずっとＦＶＩＩ−１７９よりも高かった。このことは、これら２つのタンパク質が、血小板標的化部分がＦＶＩＩ−２１１では３４Ｄ１０由来で、ＦＶＩＩ−１７９ではＰＤＧ１３由来であるという点以外は同一の構造を有しているにもかかわらず、血小板に結合したＦＶＩＩ−２１１のクリアランスがＦＶＩＩ−１７９よりも遅いことを示している。この結果から、標的化部分がＰＫの向上に寄与することが分かった。
【０３３３】
実施例６
マウスでのインビトロ活性が高く、半減期が改善された組換え第ＦＶＩＩａ因子融合タンパク質
半減期を延ばして予防的に使用できるようにするため、ＸＴＥＮ技術の使用について調査した。ＸＴＥＮ配列は、治療用のペプチドおよびタンパク質に付与するとその薬物動態特性が高まる、６種類のアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ａ、Ｐ）から構成された反復配列を含んでいる不定形のタンパク質配列である（図１７）。ＸＴＥＮ技術によって、融合タンパク質の流体力学半径が大きくなり、腎排泄が阻害され、およびクリアランス受容体からおよび／またはプロテアーゼによる切断から融合タンパク質を防護することができる。組換えの性質によって、組成、長さおよび位置（複数の挿入物を含むが化学的修飾は含まない）を正確に制御することができる。腎ホモジネートを使ってインビトロで示したように、ＸＴＥＮはインビボで代謝可能な天然のアミノ酸を含有する（図１７Ｂ）。ＸＴＥＮ  ＡＥ２８８配列をｒＦＶＩＩａのＣ末端に組換えによって融合させ、インビトロおよびインビボで解析した。この解析の目的は、血友病であって阻害剤を生じている患者の予防に使えるように、ＦＶＩＩａの半減期を延長するためのＸＴＥＮ技術を利用することである。
【０３３４】
ＸＴＥＮをｒＦＶＩＩａのＣ末端に連結すると、血友病Ａマウスにおけるその血中半減期が８倍長くなり（図１８）、その結果、全般的な薬剤への暴露（ＡＵＣ）が５倍に高まった。しかしながらＲＯＴＥＭアッセイでは、ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの活性は、ｒＦＶＩＩａの活性のおよそ２５％にまで低下した。ｒＦＶＩＩａを含むｓｃＦｖとＸＴＥＮの融合体で、その構造が異なる数種類の構築物について、血友病Ａマウスでの薬物動態およびＲＯＴＥＭアッセイでの活性を試験した。配置が最適であれば、半減期とｒＦＶＩＩａへの全般的な暴露（ＡＵＣ）は有意に高まり（図１９）、かつ、ＲＯＴＥＭで測定した活性もｒＦＶＩＩａの２〜５倍に高まった。
【０３３５】
まとめると、血小板を標的とするｒＦＶＩＩａ分子は、ＲＯＴＥＭで測定すると、ｒＦＶＩＩａの活性よりも２５〜５０倍高い活性を示し、血小板機能を活性化も阻害もせず、および／またはインビボでの血小板クリアランスに影響を及ぼさない。血小板を標的とするｒＦＶＩＩａ分子にＸＴＥＮ技術を適用すると、その半減期はｒＦＶＩＩａの８倍に延ばすことができるが、ＲＯＴＥＭ活性は４分の１まで低下する。血小板標的指向化とＸＴＥＮ技術の組み合わせについては、ＸＴＥＮとｓｃＦｖ部分との配置が最適であれば、ＡＵＣが６倍に高まり、ＲＯＴＥＭ活性も２〜５倍に高まることが示された。このような技術の組み合わせによって、野生型ＦＶＩＩ配列を使ったバイパス治療を改善することができるかも知れない。
【０３３６】
実施例７
血小板を標的とする構築物、ＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、ＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、ＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３およびＦＶＩＩ−２３８の構築と発現
血小板を標的とするｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮについて、３種類の、配置の異なる変異体を生成した：配置Ａ（ＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、ＦＶＩＩ−２１１）、ＸＴＥＮと標的化部分をそれぞれ、軽鎖のＣ末端とＦＶＩＩａ重鎖に融合させた；配置Ｂ（ＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、ＦＶＩＩ−２００）、ＸＴＥＮと血小板標的化部分の両方をｒＦＶＩＩａ重鎖のＣ末端に融合させた；および配置Ｃ（ＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３およびＦＶＩＩ−２３８）、ＸＴＥＮを重鎖および軽鎖両方のＣ末端に融合させ、標的化部分を重鎖ＸＴＥＮのＣ末端に融合させた。それぞれの配置について、７２〜２８８個のアミノ酸を含む、長さの違う複数のＸＴＥＮを試験した。これらのタンパク質をコードしているＤＮＡを、当該分野で知られている分子生物学的な方法によって生成した。この構築物をＨＥＫ２９３細胞内で一過的に発現させ、標準的方法によって精製した。
【０３３７】
実施例８
タンパク質ＦＶＩＩ−１６５、ＦＶＩＩ−１８９、ＦＶＩＩ−２００、ＦＶＩＩ−２２７、ＦＶＩＩ−２２８、ＦＶＩＩ−２３１、ＦＶＩＩ−２３２、ＦＶＩＩ−２４２、ＦＶＩＩ−２４３およびＦＶＩＩ−２３８の活性の解析
これらの変異体の活性を、血小板非依存性の方法（ｓＴＦ−ＰＴ）および血小板依存性の方法（ＲＯＴＥＭ）によって解析した。ｓＴＦ−ＰＴ法では、血小板標的指向化ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ変異体の特異的活性は、いずれの配置をとっている場合も、ｒＦＶＩＩａの活性よりもモル基準で低かった（図２０Ａ〜Ｃ）。配置Ａ変異体は、ｒＦＶＩＩａの４４％〜１５％と、最も高い特異的活性を示し、その活性はＸＴＥＮの長さに強く依存し、かつ、ＸＴＥＮの長さと逆の相関関係があった。配置Ｂ変異体の活性はより弱く、かつ、ＸＴＥＮの長さへの依存度も弱かった。今回の方法では、配置Ｃ構築物の活性が最も弱かった。血友病Ａ提供者からのヒト全血を使って血小板に依存する方法（ＲＯＴＥＭ）を試験した場合、全ての配置がｒＦＶＩＩａと同等かまたはそれよりも高い活性を示した（図２１Ａ〜Ｃ）。この方法では、配置Ａ変異体が最も高い活性を示し、その活性はｒＦＶＩＩａの活性の１５倍に達し、また、活性はＸＴＥＮの長さと逆の相関関係にあった。配置ＢおよびＣ変異体の活性はＸＴＥＮの長さにそれほど依存していなかった。図２１Ｄは、ＲＯＴＥＭアッセイではＦＶＩＩ−２００（ＬＣ：ＨＣ−ＸＴＥＮ−標的化部分）がＦＶＩＩ−１６５（ＬＣ：ＨＣ−ＸＴＥＮ）よりも高いＦＶＩＩ活性を示したことを表している。この結果は、血小板標的指向化部分の付加は、ＸＴＥＮ部分による活性の低下を部分的に相殺することを示している。
【０３３８】
実施例９
ＸＴＥＮの長さがＰＫに及ぼす影響
２８８個のアミノ酸から構成されているＸＴＥＮ１つだけで、ＰＫが有意に改善されることが分かった。２８８個または８６４個のアミノ酸から構成されているＸＴＥＮをＦＶＩＩａのＣ末端に融合させ、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ２８８およびＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ８６４のそれぞれを生成した。一過的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞でタンパク質を生産し、タンパク質を馴化培地から精製した。ＰＫを評価するために、タンパク質をＨｅｍＡマウスに注入し、投与後、様々な時点における血漿活性をＦＶＩＩａ依存性可溶性組織因子−プロトロンビン時間（ｓＴＦ−ＰＴ）アッセイで測定した。図２２に示すように、ＸＴＥＮ２８８をＦＶＩＩａに融合させることでクリアランスが遅くなったが、ＸＴＥＮの長さが２８８より長くてもＰＫにさらなる利益はもたらされなかった。このことは、ＰＫの改善にはアミノ酸２８８個のＸＴＥＮ１つだけで十分であることを表している。
【０３３９】
次に、２８８個よりも少ない数のアミノ酸から構成されているＸＴＥＮについて評価した。図２３の実験では、２８８、１４４、または７２個のアミノ酸から構成されているＸＴＥＮをＦＶＩＩａ重鎖のＣ末端に融合させ、その後、モノクローナル抗体３４Ｄ１０の一本鎖可変領域に融合させた。タンパク質をｈｅｍＡマウスに投与し、その後、投与を受けたマウス由来の血漿の活性をｓＴＦ−ＰＴアッセイで測定した。図２３に示すように、時間に対する活性回復率の結果から、それぞれ１４４および７２個のアミノ酸を含むＸＴＥＮであるＦＶＩＩ２３２および２３１が、ＦＶＩＩ２００よりも早く排出されたことが示された。このことは、ＸＴＥＮの長さをアミノ酸２８８個から１４４個に減らすと、マウスでのクリアランス速度が上がることを表している。
【０３４０】
２８８個よりも少ないアミノ酸から構成されるＸＴＥＮ１つだけではＰＫに十分な利益がもたらされなかったので、ＸＴＥＮを２つ融合させた場合の効果について調べた。図２４の実験では、７２個のアミノ酸から構成されているＸＴＥＮを２つ、ＦＶＩＩａに融合させた；１つを、ＦＶＩＩａ重鎖のＣ末端と３４Ｄ１０のＮ末端の間に挿入し、もう１つをＦＶＩＩａ軽鎖のＣ末端に連結させた。得られたタンパク質、ＦＶＩＩ２３８について、ＨｅｍＡマウスにおける血漿活性ＰＫを解析した。図２４に示すように、アミノ酸がわずか７２個だけのＸＴＥＮを２つ使うと、クリアランス率は１０９ｍｌ／時／ｋｇ〜約１５ｍｌ／時／ｋｇまで下がり、その結果、ＨｅｍＡマウスにおける全体的なタンパク質への暴露が７倍増加する。このＰＫの改善は、アミノ酸２８８個のＸＴＥＮを１つ使用した場合と同等かまたはそれよりも良かった（ＦＶＩＩ−２００、図２４）。
【０３４１】
さらにＦＶＩＩ−２３８のＰＫを、ヒト化αＩＩｂトランスジェニックマウスを使って評価した。図２５の実験では、ＦＶＩＩ−２３８をαＩＩｂマウスに投与し、投与後様々な時点で、尾静脈から全血を採取した。血小板に結合したＦＶＩＩタンパク質の濃度を、蛍光標識した抗ヒトＦＶＩＩ抗体を使い、フローサイトメトリーで測定した。ＦＶＩＩ−２００およびＦＶＩＩ−１８９も同様に投与し、解析した。図２５に示すように、抗体３４Ｄ１０由来の血小板に結合する一本鎖可変領域を含むＦＶＩＩ−１８９は、古典的な２相崩壊を示した：ｒＦＶＩＩａの血中での変化と同様な率を示す、迅速に起こる最初の相と、ｒＦＶＩＩａと比較すると顕著に遅い、終末相である。アミノ酸２８８個のＸＴＥＮを１つだけ付加しても（ＦＶＩＩ−２００）、またはそれぞれ７２個のアミノ酸のＸＴＥＮを２つ付加しても（ＦＶＩＩ−２３８）、最初のクリアランス率が劇的に低下し、その結果、どちらも同じようにＰＫプロファイルが改善した。興味深いことに、２つのＸＴＥＮを付加した場合には、重鎖（ＦＶＩＩ−２４３）または軽鎖（ＦＶＩＩ−２４２）のどちらかに一方に融合させたＸＴＥＮの長さを７２個から４２個に減らすと、図２５で説明したように血小板ＰＫで測定したクリアランス率が高まる傾向にあった（図２６）。
【０３４２】
その結果、アミノ酸２８８個のＸＴＥＮを１つ、ｒＦＶＩＩａ重鎖のＣ末端に結合させるか（つまりＦＶＩＩ−２００）、またはアミノ酸７２個の２つのＸＴＥＮを、１つは重鎖に、もう１つを軽鎖に融合させる（つまりＦＶＩＩ−２３８）ことで、血小板を標的とするＦＶＩＩａの薬物動態が改善され、その結果、全般的な暴露（ＡＵＣ）が６〜７倍に高まった。
【０３４３】
実施例７〜９は特に、血小板標的指向化モチーフ（血小板受容体ＧＰＩＩｂＩＩＩａを指向するｓｃＦｖ）をＸＴＥＮ部分に融合させたＦＶＩＩａ変異体を生成することで、ｒＦＶＩＩａの活性および薬物動態特性を改善できることを示している。ＸＴＥＮと血小板を標的指向化することがＰＫと活性のそれぞれに及ぼす効果を最大にするために、血小板標的指向化ｒＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮについて、配置の異なる３種類の変異体を生成した：配置Ａ、ＸＴＥＮと標的化部分をそれぞれ、ＦＶＩＩａ軽鎖のＣ末端と重鎖のＣ末端に融合させた；配置Ｂ、ＸＴＥＮの両方をｒＦＶＩＩａ重鎖のＣ末端に融合させ、血小板標的化部分をＸＴＥＮのＣ末端に融合させた；および配置Ｃ、ＸＴＥＮを重鎖および軽鎖両方のＣ末端に融合させ、標的化部分も重鎖ＸＴＥＮのＣ末端に融合させた。それぞれの配置について、７２〜２８８個のアミノ酸を含む、長さの違う複数のＸＴＥＮを試験した。
【０３４４】
血小板に依存しない方法（ｓＴＦ−ＰＴ）によれば、これら変異体の特異的活性は、全ての配置で、ｒＦＶＩＩａの活性よりもモル基準で低かった。配置Ａ変異体はｒＦＶＩＩａの４４％に相当する最も高い特異的活性を示したが、ＸＴＥＮが重鎖のＣ末端（配置Ｂ）にある方が、ｓＴＦに基づく活性に対してはより効果が大きかった。今回の方法では、配置Ｃ変異体の活性が最も弱かった。しかしながら、ＲＯＴＥＭを使った血小板に依存する方法で全血を調べた場合には、全ての配置がｒＦＶＩＩａの活性と同等かまたはそれよりも高い活性を示した。この方法では、配置Ａ変異体が最も高い活性を示し、その活性はｒＦＶＩＩａの活性の１５倍に達した。基本的に、ＸＴＥＮエレメントの長さは活性と逆の相関にあった。ＸＴＥＮ部分が血小板を標的化することに及ぼす影響を評価するために、各配置の代表的な変異体とＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとの結合をバイオレイヤー干渉法で測定した。これらのアッセイによって、血小板標的指向化ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮ変異体のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する親和性が、ＸＴＥＮの長さと反比例することが明らかになった。血小板への標的化とＸＴＥＮ技術を組み合わせることで、全血を使った凝固アッセイでの活性がより強力なｒＦＶＩＩａ変異体を作成した。いくつかの例では、ＸＴＥＮはｒＦＶＩＩａ変異体のαＩＩｂβ３に対する親和性に影響を及ぼす可能性がある。そのため、ＸＴＥＮはｒＦＶＩＩａの薬物動態特性を改善することができるが、血小板標的指向化技術の効果を最大限引き出すために、ＸＴＥＮの位置と長さを最適化する必要がある。
【０３４５】
さらに、実施例５〜９では種々の長さのＸＴＥＮを組み込むことができることを示している。ＦＶＩＩａ特異的可溶性組織因子−プロトロンビン時間（ｓＴＦ−ＰＴ）アッセイで測定した血友病Ａマウスの血漿活性ＰＫによれば、ＸＴＥＮ１つだけでＰＫを改善するためには、アミノ酸が２８８個の長さ（ＸＴＥＮ２８８）が有効であり、アミノ酸８６４個のＸＴＥＮでも、ＰＫはそれ以上改善されないことが分かった。αＩＩｂβ３を標的とするＦＶＩＩａのＰＫを改善するために、ＸＴＥＮ２８８が１つの場合についてさらに調べた。止血活性がＦＶＩＩａと同等かそれより高い２種類の配置について調べた。１）重鎖ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ２８８を重鎖に融合させ、αＩＩｂβ３−ｓｃＦｖをＸＴＥＮ２８８にさらに連結したもの、および２）軽鎖ＸＴＥＮ、αＩＩｂβ３−ｓｃＦｖを重鎖に、ＸＴＥＮ２８８を軽鎖に融合させたもの。蛍光標識したＦＶＩＩ抗体を使い、フローサイトメトリーによって血小板結合型タンパク質を定量したヒト化αＩＩｂトランスジェニックマウスの血小板ＰＫ解析から分かるように、血小板に結合した重鎖ＸＴＥＮは、軽鎖ＸＴＥＮよりも排出が遅かった。ｒＦＶＩＩａと比較すると、重鎖ＸＴＥＮの血漿活性ＰＫ解析からは、クリアランスが約７分の１に低下したこと、および全般的な暴露が６倍高まったことが分かった。ＸＴＥＮの長さを１４４または７２個に減らすとクリアランス率が向上するが、アミノ酸７２個のＸＴＥＮを２つ、１つを重鎖に、もう１つを軽鎖に付加することでも血小板および血漿ＰＫを重鎖ＸＴＥＮ２８８と同程度まで効果的に改善することができた。
【０３４６】
ここまで、特定の機能の実行やそれらの関係を図示している機能性構築ブロックの助けを借りて本発明を説明してきた。簡単に説明するために本明細書では、これら機能性構築ブロックの境界を任意に定義している。特定の機能およびその関係性が適切に実施される限りにおいて、別の境界を定義することもできる。
【０３４７】
前述した具体的な実施形態の説明は本発明の基本的な性質を十分に明らかにするものであり、人々は当該分野で知られている知識を適用することで、過度の実験をしなくても、かつ、本発明の基本的な概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態に容易に修正を加えるおよび／または具体的な実施形態を様々な用途に適応させることができる。そのため、そのような適応および修正は、本明細書の教示および指導に則って、開示した実施形態の意味および範囲の中に入ると意図される。本明細書で使用した表現および用語は説明する目的のために使用したものであり、本発明を限定するものではないと理解され、当業者は本教示および指導を考慮して本明細書の用語または表現を解釈する。
【０３４８】
本発明の大きさおよび範囲は前述した例示的な実施形態のいずれによっても限定されず、添付の特許請求項およびその均等物によってのみ規定される。本明細書および本明細書で開示している本発明の実施を考慮すれば、本発明の他の実施形態は当業者には明らかである。
【０３４９】
本明細書で引用した全ての特許および刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【化１】
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【化３８】
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【化３９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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