(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、ＧＰＲ１３９を活性化させることができる化合物である。また、ＧＰＲ１３９の活性を増大及び低減する方法も提供される。特定された化合物を使用して、ＧＰＲ１３９の活性、又はＧＰＲ１３９の活性により影響され得る状態を調節する方法も開示される。
2016515138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のＧＰＲ１３９を活性化する方法であって、
・ＧＰＲ１３９活性化を必要とする対象を特定することと、
・前記対象に対してＧＰＲ１３９を活性化するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することと、を含み、
それによって、ＧＰＲ１３９活性化レベルを、前記１つ以上の化合物を投与する前のＧＰＲ１３９活性化レベルと比べて増大させる、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの前記化合物が、
３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
スチリル−Ｌ−アラニン、
２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ナフチル−Ｌ−アラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｌ−アラニン、
１−ナフチル−Ｄ−アラニン、
（３Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル１−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸、
２−ナフチル−Ｄ−アラニン、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｌ−アラニン、
３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
４−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
１−ナフチル−Ｌ−アラニン、
４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｄ−２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸、
４−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、
α−メチル−４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，３−ジフェニル−Ｌ−アラニン、
４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
ｄ−ホモ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
３，５−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、又は
４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの前記化合物が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβ−フェニルエチルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、前記対象に対して局所投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、前記対象に対して経口投与又は静脈内投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＧＰＲ１３９活性化を検出するための方法であって、ＧＰＲ１３９を発現している細胞又は前記細胞から得られた膜組織を化合物に曝露することと、ＧＰＲ１３９が前記化合物によって活性化されたかどうかを判定することと、を含む方法。
【請求項７】
前記細胞株が、組み換えによりＧＰＲ１３９を発現するように修飾されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、細胞におけるＧＯ２ＱキメラＧタンパク質及びＧＰＲ１３９の共発現により得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、
３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
スチリル−Ｌ−アラニン、
２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ナフチル−Ｌ−アラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｌ−アラニン、
１−ナフチル−Ｄ−アラニン、
（３Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル１−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸、
２−ナフチル−Ｄ−アラニン、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｌ−アラニン、
３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
４−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
１−ナフチル−Ｌ−アラニン、
４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｄ−２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸、
４−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、
α−メチル−４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，３−ジフェニル−Ｌ−アラニン、
４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
ｄ−ホモ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
３，５−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、
４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファン、
Ｌ−フェニルアラニン、
トリプタミン、
アンフェタミン、
Ｄ−トリプトファン、
Ｄ−フェニルアラニン、及び
β−フェニルエチルアミンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
神経機能を調節する方法であって、脳細胞を、
３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
スチリル−Ｌ−アラニン、
２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ナフチル−Ｌ−アラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｌ−アラニン、
１−ナフチル−Ｄ−アラニン、
（３Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル１−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸、
２−ナフチル−Ｄ−アラニン、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｌ−アラニン、
３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
４−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
１−ナフチル−Ｌ−アラニン、
４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｄ−２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸、
４−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、
α−メチル−４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，３−ジフェニル−Ｌ−アラニン、
４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
ｄ−ホモ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
３，５−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、又は
４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン
である少なくとも１つの化合物と接触させ、それによって前記細胞におけるＧＰＲ１３９活性化レベルを増大させることを含む、方法。
【請求項１１】
神経機能を調節する方法であって、脳細胞を、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβ−フェニルエチルアミンである少なくとも１つの化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
前記化合物が、神経細胞を有する対象に対して局所投与される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、神経細胞を有する対象に対して経口投与又は静脈内投与される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全を調節する方法であって、細胞を、
３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
スチリル−Ｌ−アラニン、
２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ナフチル−Ｌ−アラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｌ−アラニン、
１−ナフチル−Ｄ−アラニン、
（３Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル１−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸、
２−ナフチル−Ｄ−アラニン、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸、
２−（５−ブロモチエニル）−Ｌ−アラニン、
３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
４−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
１−ナフチル−Ｌ−アラニン、
４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−ベンゾチエニル−Ｄ−アラニン、
４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
Ｄ−２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸、
４−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、
α−メチル−４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３，３−ジフェニル−Ｌ−アラニン、
４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
４−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、
４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２−トリフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニン、
２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
ｄ−ホモ−フェニルアラニン、
４−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、
３，５−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジメチル−Ｄ−フェニルアラニン、
２，４−ジニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、
３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、又は
４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン
である少なくとも１つの化合物と接触させ、それによって前記細胞におけるＧＰＲ１３９活性化レベルを増大させることを含む、方法。
【請求項１５】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全を調節する方法であって、細胞を、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβ−フェニルエチルアミンである少なくとも１つの化合物と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国特許出願第６１／７８２，１５８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、オーファン受容体ＧＰＲ１３９に対する生理的リガンド、生理的環境において受容体を活性化するためにそれらのリガンドを使用する方法、及びＧＰＲ１３９の活性化状態を変えることにより神経機能又は状態を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、創薬に関する有力なターゲットである。現在、市場にある薬剤の約３０％が、ＧＰＣＲを標的としている。ヒトゲノムのシークエンシングは、何百もの新しいＧタンパク質結合受容体を含む何千もの新しい遺伝子を明らかにし、創薬に多くの新しい機会を提供した。しかしながら、これらの新しいＧＰＣＲは、それらの配列並びに既知のＧＰＣＲ及びそれらのリガンドとの構造的類似点を基に特定されているため、それらの生物学的意義は知られていないままである。それらの受容体のリガンドなしには、その生理的機能を理解するのは難しい。更に、受容体のリガンドを発見することは、受容体の作用薬、拮抗薬、及び調節因子をスクリーニングするためのアッセイを確立するのに確実に役立つ。
【０００４】
ＧＰＲ１３９は、脳で顕著に発現するオーファンＧタンパク質結合受容体である（Ｖａｎｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０５（１）：６７〜７１（２００３）；Ｇｌｏｒｉａｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７２２（３）：２３５〜４６（２００５）：Ｍａｔｓｕｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３１（１）：３６３〜９（２００５））。これはＧｑ信号と結合し、哺乳類の細胞において組み換えにより発現するとき、構成的に活性であるように見える（Ｍａｔｓｕｏら、２００５）。ＧＰＲ１３９は、様々な種の中でも高度に保存される。例えば、ヒト、マウス、及びラットのＧＰＲ１３９タンパク質配列は、アミノ酸レベルにおいて９４％超の同一性を共有する（図１）。加えて、ヒトのＧＰＲ１３９は、鶏及びゼブラフィッシュのゲノムによりコード化される推定タンパク質に対してもそれぞれ９４％及び７２％の同一性を共有する。脳におけるＧＰＲ１３９の顕著な発現及び様々な種にわたる高度な配列相同性は、それが脊椎生理学において重要な役割を持つことを示唆しているが、ＧＰＲ１３９の生理的リガンドはこれまで確認されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書で提供されるのは、受容体をＬ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、又はそれらの誘導体と接触させることによってＧＰＲ１３９を活性化する方法である。
【０００６】
また、低減されたＧＰＲ１３９活性を必要とする対象を特定することによって、対象におけるＧＰＲ１３９の活性を低減させるための方法、及び対象に対してＧＰＲ１３９の活性を低減させるのに十分な量の１つ以上の化合物を投与するための方法も記載されており、それによってＧＰＲ１３９活性化のレベルが自然の活性化状態と比べて低減する。
【０００７】
対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象における神経機能又は神経状態を調節するための方法も、本明細書に記載されている。
【０００８】
また、対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象における膵臓の病状を調節するための方法も記載されている。
【０００９】
対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症を調節するための方法も、本明細書に記載されている。
【００１０】
更に、本明細書で提供されるのは、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体のいずれか１つを対象に投与する方法である。
【００１１】
更に、本発明は、細胞におけるＧＰＲ１３９の調節を検出するためのアッセイを提供する。このアッセイ方法は、細胞又はその細胞から得られた膜を化合物に曝露すること、及びＧＰＲ１３９がその化合物によって活性化されたかどうかを判定することによって、細胞におけるＧＰＲ１３９活性化を検出することを含む。
【００１２】
本明細書に記載するのは、キメラＧタンパク質、特定のＧＯ２Ｑ、及びＧＰＣＲの活性化を検出するためにそれを用いる方法である。また、細胞又はその細胞から得られた膜組織を化合物に曝露することにより細胞におけるＧＯ２ＱキメラＧタンパク質及びＧＰＲ１３９を共発現させること、並びにＧＰＲ１３９が該化合物によって活性化されたかどうかを判定することによって、ＧＰＲ活性化を検出するための方法も記載されている。
【００１３】
更に、本発明は、組み換えによりＧＰＲ１３９を発現する細胞をスクリーニングするためのアッセイを提供する。このアッセイ方法は、化合物調節因子（作用薬、拮抗薬、及びアロステリック調節因子）によって、組み換えによりＧＰＲ１３９を発現する細胞スクリーニングすることを含み、このスクリーニングは、全細胞又は組み換えＧＰＲ１３９発現のある細胞膜のいずれかを使用する。このアッセイ及び方法には、Ｔｒｐ、Ｐｈｅを代表的な促進因子として使用する、Ｃａ２＋可動化アッセイ、ＧＴＰγＳ結合アッセイ、放射性リガンド結合アッセイ、ＥｒＫリン酸化反応アッセイ、及びＳＲＥ−レポーターアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、Ｔｒｐ及びＰｈｅがＧＰＲ１３９の活性化因子として作用することが発見されたため、上記のアッセイの１つにおいて、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ又はＧＰＲ１３９の別の活性化因子を含有する細胞に化合物を加え、次いで細胞応答に応じて、この加えられた化合物が拮抗薬であるかどうかを判定することができる。別の態様では、Ｔｒｐ及びＰｈｅリガンドが上記のアッセイ及び方法で使用されて、アロステリック調節因子として作用する化合物を発見することができるが、そのようなアロステリック調節因子は、ＧＰＲ１３９に結合して、ＴＲＰ又はＰｈｅの効能又は有効性を高める又は低減する化合物である。
【００１４】
更に、本明細書で提供されるのは、ＧＰＲ１３９がインビトロでＲＮＡに転写され、続いてインビトロでタンパク質に転換するアッセイ及び方法である。得られるタンパク質は、タンパク質／化合物の相互作用に使用して、ＧＰＲ１３９調節因子をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト、マウス、及びラットのＧＰＲ１３９アミノ酸配列のアラインメントを示す。示される配列は、Ｇｅｎｂａｎｋでアクセッション番号に関して報告される配列と同一である。ＡＫ２９１３８４（ヒト）（配列番号：３）、ＮＭ＿００１０２４１３８（マウス）（配列番号：４）、及びＮＭ＿００１０２４２４１（ラット）（配列番号：５）。コンセンサス配列（配列番号：６）も示される。
【図２−１】トリプトファン、フェニルアラニン、及びそれらの誘導体がＧＰＲ１３９を活性化する。ヒト（Ａ及びＢ）又はマウス（Ｃ及びＤ）のＧＰＲ１３９は、キメラＧタンパク質ＧＯ２ＱとともにＣＯＳ７細胞に共導入された。導入された細胞からの細胞膜を、ＧＰＲ１３９を刺激するために様々なリガンドを異なる濃度で使用するＧＴＰγＳ結合研究に使用した。ＧＯ２Ｑにより導入されたＣＯＳ７細胞からの膜を、対照として使用した（Ｅ及びＦ）。
【図２−２】トリプトファン、フェニルアラニン、及びそれらの誘導体がＧＰＲ１３９を活性化する。ヒト（Ａ及びＢ）又はマウス（Ｃ及びＤ）のＧＰＲ１３９は、キメラＧタンパク質ＧＯ２ＱとともにＣＯＳ７細胞に共導入された。導入された細胞からの細胞膜を、ＧＰＲ１３９を刺激するために様々なリガンドを異なる濃度で使用するＧＴＰγＳ結合研究に使用した。ＧＯ２Ｑにより導入されたＣＯＳ７細胞からの膜を、対照として使用した（Ｅ及びＦ）。
【図３】Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、及びそれらの誘導体が、ＧＰＲ１３９を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＣａ２＋の可動化を刺激するかどうかを決定するために行われた実験の結果を示す（試験された特定の化合物の個別のグラフが示される）。
【図４】Ｌ−Ｐｈｅ又はＬ−Ｔｒｐの不在（Ａ）又は存在（Ｂ）下でＧＰＲ１３９と一時的に導入されたＨＥＫ−２９３細胞の顕微鏡画像を示す。
【図５】マウス脳細胞及びマウス膵臓細胞（Ｍｉｎ６）それぞれにおけるＧＰＲ１４２  ｍＲＮＡ（レーン１及び２）並びにＧＰＲ１３９  ｍＲＮＡ（レーン４及び５）の存在を示す。
【図６Ａ】３５Ｓラベルのアンチセンス配列を使用するリボプローブハイブリダイゼーションによる、ラット脳部分におけるＧＰＲ１３９の検出を示す。
【図６Ｂ】３５Ｓラベルのアンチセンス配列を使用するリボプローブハイブリダイゼーションによる、ラット脳部分におけるＧＰＲ１３９の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書及び請求項を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用される。別段の指示がない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「Ｔｒｐ」及び「Ｐｈｅ」は、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）又はＤ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）及びＬーフェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）又はＤーフェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）を指す。
【００１８】
「有効量」及び「十分な」量とは、本明細書では同じ意味で使われ、望まれる治療効果又は予防効果を、特定の病気、疾患、又は状態に対するそのような治療を必要とする患者に一般にもたらすのに十分な量又は投与量を意味する。本発明の化合物の有効量又は投与量は、モデリング、投与量増加研究、又は臨床試験などの常法により、また日常要因、例えば、投与様式若しくは投与経路又は薬物送達、化合物の薬物動態、病気、疾患、又は状態の重篤度及び経過、対象が以前又は現在受けている治療、対象の健康状態及び薬物に対する反応、並びに治療を施す医師の判断により確定することができる。化合物の投与量の一例は、対象の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約２００ｍｇ／日、好ましくは約０．０５〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は１回又は投薬単位を分割（例えば、ＢＤＩ、ＴＩＤ、ＱＩＤ）して約１〜３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。７０ｋｇのヒトでは、適切な投与量の例示的範囲は、約０．０５〜約７ｇ／日である。
【００１９】
用語「神経機能及び状態」とは、本明細書で使用するとき、睡眠障害（Ｖｏｄｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｕ．；Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎａｕｌｔ，Ｃ．（２０１２）アルツハイマー病．「睡眠障害」．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １０６．ｐｐ．５２７〜４０）、大鬱病性障害などの鬱病性障害（Ｋｅｓｓｌｅｒ  ＲＣ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｃ，ＭｃＧｏｎａｇｌｅ  ＫＡら（１９９６）．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１６８（ｓｕｐｐｌ  ３０）：１７〜３０）、治療抵抗性鬱病（Ｓｏｕｅｒｙ  Ｄ１，Ｐａｐａｋｏｓｔａｓ  ＧＩ，Ｔｒｉｖｅｄｉ  ＭＨ．Ｊ（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６７  Ｓｕｐｐｌ  ６：１６〜２２）、双極性障害（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｍ１，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＪＨ，Ｍｏｒｇａｎ  ＴＡ，Ｙｏｕｎｇ  Ｄ，Ｃｈｅｌｍｉｎｓｋｉ  Ｉ，Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ  Ｋ．（２０１３）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．７４（９）：８８０〜６）、統合失調症（Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＰＦ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＢＪ，Ｌｅｈｒｅｒ  ＤＳ，Ｃａｓｔｌｅ  ＤＪ（Ｍａｒｃｈ  ２００９）．Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｂｕｌｌ  ３５（２）：３８３〜４０２、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｊａｎｋｏｖｉｃ  Ｊ（Ａｐｒｉｌ  ２００８）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．７９（４）：３６８〜７６）、認識機能障害、アルツハイマー病（Ｗａｌｄｅｍａｒ  Ｇ．（２００７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．１４（１）：ｅ１〜２６）、注意力欠如障害（Ｌａｎｇｅ，ＫＷ．；Ｒｅｉｃｈｌ，Ｓ；Ｌａｎｇｅ，ＫＭ．；Ｔｕｃｈａ，Ｌ；Ｔｕｃｈａ，Ｏ（２０１９）．２（４）：２４１〜２５５）、神経伝達物質放出又は吸収、短期記憶（Ｄａｖｅｌａａｒ，Ｅ．Ｊ．；Ｇｏｓｈｅｎ−Ｇｏｔｔｓｔｅｉｎ，Ｙ．；Ｈａａｒｍａｎｎ，Ｈ．Ｊ．；Ｕｓｈｅｒ，Ｍ．；Ｕｓｈｅｒ，Ｍ（２００５），Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １１２（１）：３〜４２、長期記憶（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．；Ｓｈｉｆｆｒｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９６８）．２：８９〜１９５）、又は心的外傷後ストレス障害（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃ．Ｓ．；Ｕｒｓａｎｏ，Ｗ．（２００４）．Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １６１（８）：１３７０〜１３７６）、及び類似のそのような機能及び障害のうちのいずれか１つを指す場合がある。
【００２０】
「薬学的に許容できる」とは、連邦政府若しくは州政府の規制機関又は米国以外の国でのそれらに対応する機関により承認された、あるいは承認が見込まれていること、あるいは動物、より具体的にはヒトにおいての使用に関して、米国薬局方又はその他の一般に認識されている薬局方において記載されていることを意味する。
【００２１】
「薬学的に許容できる担体」とは、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない媒質、例えば本明細書に開示される化合物であり、投与される宿主に対して毒性ではない媒質を指す。
【００２２】
「特異的な結合」とは、抗体、すなわち抗原結合性フラグメントの、他の生体分子又は化合物と結合し得るより大きい親和性を有する特定の生体分子又は化合物と結合する能力を指す。
【００２３】
用語「対象」とは、本明細書で使用するとき、動物を指し得、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ロバ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳類である。より好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００２４】
本明細書で提供されるのは、ＧＰＲ１３９の活性化を必要とする対象を特定することによって、また対象に対してＧＰＲ１３９を活性化するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象のＧＰＲ１３９を活性化するための方法であり、それによってＧＰＲ１３９活性化のレベルが自然の活性化状態と比べて増大する。いくつかの実施形態では、この目的で投与することができる化合物は、表４に示されており、そのため、表４に記されている化合物のいずれか１つを対象に投与して、ＧＰＲ１３９を活性化させることができる。いくつかの実施形態では、この目的で投与することができる化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はそれらの誘導体のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、この目的で投与することができる化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンのいずれか１つである。代わりの実施形態では、表４に記される化合物のいずれかの組み合わせを対象に投与して、ＧＰＲ１３９を活性化させることができる。より具体的には、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はそれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与して、ＧＰＲ１３９を活性化させることができる。
【００２５】
本明細書で提供されるのは、低減されたＧＰＲ１３９活性を必要とする対象を特定することによって、また対称に対してＧＰＲ１３９の活性を低減させるのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象のＧＰＲ１３９の活性を低減させるための方法であり、それによってＧＰＲ１３９活性化のレベルが自然の活性化状態と比べて低減する。いくつかの実施形態において、この目的で投与することができる化合物は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体である。いくつかの実施形態において、妨害化合物は、タンパク質、タンパク質断片、又はＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つ、表４に記される化合物、若しくはこれらの化合物のいずれか１つの誘導体、又はＧＰＲ１３９を妨害することが可能な小分子であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、ＧＰＲ１３９に特異的に結合し、活性化化合物との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミン、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体に特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンに特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。
【００２６】
また、本明細書に記載されるのは、対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象における神経機能又は神経状態を調節するための方法である。また、本明細書に記載されるのは、対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象における脳細胞などの細胞に接触させることによって、神経機能又は神経状態を調節するための方法である。そのような脳細胞の例には、神経細胞、小膠細胞、星状膠細胞、及び乏突起膠細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、神経機能及び神経状態は、ＧＰＴ１３９の活性を高めることにより調節され得る。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９を活性化させるために表４に記される化合物のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９の活性レベルを増大させるために表４に記される化合物のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９を活性化させるためにＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はそれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９の活性レベルを増大させるためにＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はそれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、又は表４に記される化合物を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、神経機能又は神経状態は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ���フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態において、妨害化合物は、タンパク質、タンパク質断片、又はＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つ、表４に記される化合物、若しくはこれらの化合物のいずれか１つの誘導体、又はＧＰＲ１３９を妨害することが可能な小分子であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、ＧＰＲ１３９に特異的に結合し、活性化化合物との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミン、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体に特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンに特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。
【００２７】
本明細書に記載されるのは、対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象における膵臓の病状を調節するための方法である。いくつかの実施形態において、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９を活性化させるために表４に記されている化合物のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９の活性レベルを増大させるために表４に記されている化合物のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９を活性化させるためにＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はこれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９の活性レベルを増大させるためにＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はこれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、又は表４に記される化合物を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、膵臓の病状は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態において、妨害化合物は、タンパク質、タンパク質断片、又はＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、��−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つ、表４に記される化合物、若しくはこれらの化合物のいずれか１つの誘導体、又はＧＰＲ１３９を妨害することが可能な小分子であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、ＧＰＲ１３９に特異的に結合し、活性化化合物との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミン、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体に特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンに特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。
【００２８】
本明細書に記載されるのは、対象に対してＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な量の１つ以上の化合物を投与することによって、対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症を調節するための方法である。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）に関する遺伝子の突然変異を特徴とする常染色体劣性遺伝病であり、それを非機能性にする。この酵素は、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を代謝させるのに必要である。ＰＫＵを有する患者は、異常に高い濃度のＰｈｅを血漿及び組織において有し、未治療患者は、成長遅延及び脳に関する障害、例えば知的障害、発作、及びその他の深刻な医学的問題を抱えるようになる（Ｃｅｎｔｅｒｗａｌｌ，Ｓ．Ａ．＆  Ｃｅｎｔｅｒｗａｌｌ，Ｗ．Ｒ．（２０００）．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０５（１  Ｐｔ  １）：８９〜１０３；Ｂｌａｕ  Ｎ，ｖａｎ  Ｓｐｒｏｎｓｅｎ、Ｌｅｖｙ  ＨＬ：Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０、３７６：１４１７〜１４２７）。下垂体は、体内にある、小さいが非常に重要な器官である。これは、多くのホルモン分泌を生成又は制御する。体内の異常に高いＰｈｅは、その受容体であるＧＰＲ１３９の刺激過剰を引き起こす可能性があり、脳及び下垂体において高度に発現する。したがって、ＧＰＲ１３９は、下垂体機能亢進症（Ｃｏｌａｏ，Ａ，Ｌｏｃｈｅ，Ｓ，Ｃａｐｐａｂｉａｎｃａ，Ｐ．Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｓｔ．２０００；１０：３１４〜２７；Ｃｏｌａｏ，Ａ，Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｇ．Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｃｔ  ３１  １９９８；３５２（９１３８）：１４５５〜６１）又は下垂体機能低下症（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＨＪ，Ａｉｍａｒｅｔｔｉ  Ｇ，Ｋｒｅｉｔｓｃｈｍａｎｎ−Ａｎｄｅｒｍａｈｒ  Ｉ，Ｓｔａｌｌａ  ＧＫ，Ｇｈｉｇｏ  Ｅ（Ａｐｒｉｌ  ２００７）．Ｌａｎｃｅｔ  ３６９（９５７１）：１４６１〜７０）などの異常なホルモン分泌を引き起こすＰＫＵ及び下垂体障害において役割を果たすことができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。本発明の更なる実施形態は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症を調節する方法であって、対象の細胞（脳細胞、膵臓細胞、下垂体細胞又はその他のタイプの細胞）を、ＧＰＲ１３９の活性を調節するのに十分な１つ以上の化合物と接触させることを含む方法である。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９を活性化させるために表４に記されている化合物のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９の活性レベルを増大させるために表４に記されている化合物のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９を活性化させるためにＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はこれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９の活性レベルを増大させるためにＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、又はこれらの誘導体のいずれか１つを対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を増大させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物、又は表４に記される化合物を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）及び下垂体機能不全、例えば下垂体機能亢進症及び下垂体機能低下症は、ＧＰＲ１３９と、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンのいずれか１つと、の相互作用を妨害し得る化合物を対象に投与することにより、ＧＰＲ１３９の活性を低減させることによって調節することができる。いくつかの実施形態において、妨害化合物は、タンパク質、タンパク質断片、又はＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、若しくはβーフェニルエチルアミンのいずれか１つ、表４に記される化合物、若しくはこれらの化合物のいずれか１つの誘導体、又はＧＰＲ１３９を妨害することが可能な小分子であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、ＧＰＲ１３９に特異的に結合し、活性化化合物との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミン、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体に特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。いくつかの実施形態では、妨害化合物は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、又はβーフェニルエチルアミンに特異的に結合し、ＧＰＲ１３９との相互作用を抑制する又は防ぐ、抗体、又は抗体断片であり得る。
【００３０】
本発明の更なる実施形態は、化合物が、対象に対して局所投与される場合である。
【００３１】
本発明の更なる実施形態は、化合物が、対象に対して経口投与又は静脈内投与される場合である。
【００３２】
本発明の更なる実施形態は、化合物が、神経細胞を有する対象に対して局所投与される場合である。
【００３３】
本発明の更なる実施形態は、化合物が、神経細胞を有する対象に対して経口投与又は静脈内投与される場合である。
【００３４】
本発明の更なる実施形態は、ＧＰＲ活性化を検出するための方法であって、細胞におけるＧＯ２ＱキメラＧタンパク質及びＧＰＲ１３９を共発現させることと、細胞又はその細胞から得られた膜組織を化合物に曝露することと、ＧＰＲ１３９がその化合物によって活性化されたかどうかを判定することと、を含む、方法である。
【００３５】
また、本明細書で提供されるのは、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、トリプタミン、アンフェタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、βーフェニルエチルアミン、表４に記される化合物、又はこれらの化合物のいずれか１つの誘導体のいずれか１つを対象に投与する方法である。本明細書に記載される化合物のいずれか１つを、対象に対して、カプセル、錠剤、水性懸濁液、溶液など、許容できるいずれかの剤形で経口投与することができる。化合物のいずれか１つを、対象に対して、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、鼻腔内、局所、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射又は点滴技法など、非経口投与することもできるが、これらに限定されない。あるいは、化合物のいずれか１つを、対象に対して、例えば注射により静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。対象に対する本明細書に記載の化合物の投与は、本明細書に記載のＧＰＲ１３９を活性化又は阻害するための化合物のいずれか１つを含む、薬学的に許容できる製剤を使用して実施され得る。そのような製剤は、当該技術分野においてよく知られているように、薬学的に許容できる担体も含んでよい。
【００３６】
キメラＧタンパク質ＧＯ２Ｑ
歴史的に見て、Ｇｉ、Ｇｏ結合ＧＰＣＲは、ＧＴＰγＳ結合研究において、はるかに大きいＳＮ比を提供している。Ｇｓ及びＧｑ結合ＧＰＣＲに関しては、リガンドに刺激された特定の信号がＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて検出できるが、ＳＮ比は非常に小さいことが多い。本明細書に記載されるのは、ＧＴＰγＳ結合アッセイにおけるＳＮ比を増大させることによりＧＰＣＲ活性を検出させるのを可能にするために、細胞におけるＧＰＣＲと共発現できるキメラＧタンパク質である。いくつかの実施形態において、キメラＧタンパク質は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端及びＧｑタンパク質のＣ末端を、表１に示される割合の組み合わせのいずれかで有する。
【００３７】
【表１】
2016515138.tif 000003
【００３８】
いくつかの実施形態では、キメラＧタンパク質は、アミノ酸配列：ＭＧＣＴＬＳＡＥＥＲＡＡＬＥＲＳＫＡＩＥＫＮＬＫＥＤＧＩＳＡＡＫＤＶＫＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧＫＳＴＩＶＫＱＭＫＩＩＨＥＤＧＦＳＧＥＤＶＫＱＹＫＰＶＶＹＳＮＴＩＱＳＬＡＡＩＶＲＡＭＤＴＬＧＩＥＹＧＤＫＥＲＫＡＤＡＫＭＶＣＤＶＶＳＲＭＥＤＴＥＰＦＳＡＥＬＬＳＡＭＭＲＬＷＧＤＳＧＩＱＥＣＦＮＲＳＲＥＹＱＬＮＤＳＡＫＹＹＬＤＳＬＤＲＩＧＡＡＤＹＱＰＴＥＱＤＩＬＲＴＲＶＫＴＴＧＩＶＥＴＨＦＴＦＫＮＬＨＦＲＬＦＤＶＧＧＱＲＳＥＲＫＫＷＩＨＣＦＥＤＶＴＡＩＩＦＣＶＡＬＳＧＹＤＱＶＬＨＥＤＥＴＴＮＲＭＨＥＳＬＫＬＦＤＳＩＣＮＮＫＷＦＴＤＴＳＩＩＬＦＬＮＫＫＤＩＦＥＥＫＩＫＫＳＰＬＴＩＣＦＰＥＹＴＧＰＳＡＦＴＥＡＶＡＹＩＱＡＱＹＥＳＫＮＫＳＡＨＫＥＩＹＴＨＶＴＣＡＴＤＴＮＮＩｒｆｖｆａａｖｋｄｔｉｌｑｌｎｌｋｅｙｎｌｖ（配列番号１）を有し、ここで大文字の残基は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端からであり、小文字の残基は、Ｇｑタンパク質のＣ末端からである。本明細書に開示されるキメラＧタンパク質ＧＯ２Ｑは、配列番号１の配列からなる。いくつかの態様において、配列番号１の配列は、以下のＤＮＡ配列によってコード化されている：ＡＴＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＴＧＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＴＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＴＣＣＣＧＧＧＡＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣＣＧＡＡＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＣＧＣＧＣＴＣＡＧＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＣＣＡＣＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＴＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣｃｇｃｔｔｔｇｔｃｔｔｔｇｃｔｇｃｃｇｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｃｔｃｃａｇｔｔｇａａｃｃｔｇａａｇｇａｇｔａｃａａｔｃｔｇｇｔｃｔａａ（配列番号２）、ここで大文字の残基は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端をコード化する配列を表し、小文字の残基は、Ｇｑタンパク質のＣ末端をコード化する配列を表す。
【００３９】
また、本明細書に記載されるのは、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を使ってＧＰＣＲの活性化を検出するための方法である。記載される方法は、この種のキメラＧタンパク質によりもたらされる好ましいＳＮ比を十分に利用する。いくつかの実施形態では、記載される方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することにより行われる。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端及びＧｑタンパク質のＣ末端を、表１に示される割合の組み合わせのいずれかで有する。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、ＧＯ２Ｑである。いくつかの実施形態では、記載される方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することにより行われ、ここでＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端及びＧｑタンパク質のＣ末端を、表１に示される割合の組み合わせのいずれかで有し、ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、ＧＯ２Ｑであり、ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞内でキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及びＧＰＣＲを共発現させる細胞から得られた細胞膜で実行することができる。いくつかの実施形態では、記載される方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することにより行われる。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端及びＧｑタンパク質のＣ末端を、表１に示される割合の組み合わせのいずれかで有する。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、ＧＯ２Ｑである。いくつかの実施形態では、記載される方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することにより行われ、ここでＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端及びＧｑタンパク質のＣ末端を、表１に示される割合の組み合わせのいずれかで有し、ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を細胞内でＧＰＣＲと共発現させ、その細胞の細胞膜の一部分を単離し、その細胞膜を化合物と接触させ、その化合物がＧＰＣＲを活性化させるかどうかを判定することを伴い、ここでキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質は、ＧＯ２Ｑであり、ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３９である。
【００４１】
同じ細胞内で発現されたキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を使用するＧＰＣＲ活性化を評価するための記載される方法は、様々な細胞タイプを使用することができる。いくつかの実施形態では、記載される方法は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された哺乳類の細胞株を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、記載される方法に使用される細胞株は、線維芽細胞、腎臓細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞など）、又はＧＰＣＲ活性の評価に通常使用されるその他の似たタイプの細胞であり得る。更に、対象のＧＰＣＲを自然発現させる細胞は、ＧＰＲＣ活性をよりよく評価するために、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を発現するように修飾されることができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質又は対象のＧＰＣＲのいずれかを一時的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及び対象のＧＰＣＲの両方を一時的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質又は対象のＧＰＣＲのいずれかを安定的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及び対象のＧＰＣＲを安定的に発現するように修飾することができる。一実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を安定的に発現するように哺乳類の細胞株を修飾して、対象の任意のＧＰＣＲを一時的又は安定的のいずれかの発現により、記載される方法において使用する細胞を生成するように更なる修飾を可能にしてもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、記載される方法は、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された哺乳類の細胞株を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質又は対象のＧＰＣＲのいずれかを一時的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及び対象のＧＰＣＲの両方を一時的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質又は対象のＧＰＣＲのいずれかを安定的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように改良された細胞は、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及び対象のＧＰＣＲを安定的に発現するように修飾することができる。一実施形態では、表１に記載のキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を安定的に発現するように哺乳類の細胞株を修飾して、対象の任意のＧＰＣＲを一時的又は安定的のいずれかの発現により、記載される方法において使用する細胞を生成するように更なる修飾を可能にしてもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、記載される方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された哺乳類の細胞株を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質又は対象のＧＰＣＲのいずれかを一時的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及び対象のＧＰＣＲの両方を一時的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質又は対象のＧＰＣＲのいずれかを安定的に発現するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、キメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を対象のＧＰＣＲと共発現するように修飾された細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質及び対象のＧＰＣＲを安定的に発現するように修飾することができる。一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するキメラＧｏ２／Ｇｑ  Ｇタンパク質を安定的に発現するように哺乳類の細胞株を修飾して、対象の任意のＧＰＣＲを一時的又は安定的のいずれかの発現により、記載される方法において使用する細胞を生成するように更なる改良を可能にしてもよい。
【００４４】
本明細書に記載の実施形態をより詳細に説明するために、以下の実施例が提供される。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、実施形態を制限するものではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１−トリプトファン、フェニルアラニン、及びそれらの誘導体によるＧＰＲ１３９の活性化
ＧＰＲ１３９のリガンドを特定するために、リガンドの検出を可能にするための２点の改善を検出アッセイにおいて行った。第１に、生きた培養細胞を使用する代わりに、ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用することを選んだ。ＧＴＰγＳ結合アッセイは、生細胞ではなく、対象の細胞の細胞膜を使用する無細胞系である。このアッセイの１つの利点は、細胞膜を準備するときに、細胞培養培地に存在する潜在的リガンドが洗い流されることである。これにより、受容体を活性化する化合物を評価するときに、信号の基礎値が下がり、受容体リガンドを検出する可能性が高まる。第２に、ＧＯ２ＱキメラＧタンパク質が作られて、ＧＰＲ１３９と共発現し、その結果、ＧＴＰγＳ結合アッセイにおけるＳＮ比が増大した。歴史的に見て、Ｇｉ、Ｇｏ結合ＧＰＣＲは、ＧＴＰγＳ結合研究において、はるかに大きいＳＮ比を提供している。Ｇｓ及びＧｑ結合ＧＰＣＲに関しては、リガンドに刺激された特定の信号がＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて検出できるが、ＳＮ比は非常に小さいことが多い。これに対処するのが、Ｇｏ２タンパク質のＮ末端及びＧｑタンパク質のＣ末端を有する、キメラＧＯ２−ＧｑキメラＧタンパク質、ＧＯ２Ｑである。ヒスタミンをリガンドとして使用したときに、このキメラＧタンパク質は、Ｇｑ結合ＧＰＣＲ、例えばヒスタミンＨ１受容体と共発現すると、ＳＮ比を３：１に増大させることができた。
【００４６】
ＧＰＲ１３９を活性化する化合物に関して試験するために、異なるアミノ酸及びそれらの誘導体（表２）が、ＧＰＲ１３９及びＧＯ２Ｑを共発現するＣＯＳ７細胞からの細胞膜を使用するＧＴＰγＳ結合アッセイにおけるリガンドとして試験された。ＧＯ２Ｑを単独で発現する又は他のＧＰＣＲを共発現するＣＯＳ７細胞からの細胞膜も、対照としてＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて並行して試験された。各化合物は３回試験された。その結果、Ｌ−トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）は、試験された濃度（１ｍＭ）にてＧＰＲ１３９を活性化できることが示された。更に、トリプタミン、βーフェニルエチルアミン、及びアンフェタミンなどの、トリプトファン及びフェニルアラニン誘導体も、ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて１ｍＭの濃度にてＧＰＲ１３９を活性化した（表３の下のパネル、有益な結果は太字であり、表２に示される化合物の位置に対応する）。Ｌ−Ｔｒｐ及びＬ−Ｐｈｅ並びにそれらの誘導体によるＧＰＲ１３９の活性化は、特有であるように見えるが、それは、同じアッセイにおいて、これらの化合物が、Ｇｏ２Ｑを単独で（表３の上のパネル）発現する細胞、又はＧＯ２Ｑ及びその他のＧＰＣＲ（ＧＰＲ２１、ＧＰＲ５２、ＧＰＣＲ１１９、ＧＰＣＲ１３２、ＧＰＣＲ１３４、又はＧＰＲ１８２など（データなし））を共発現する細胞からの膜を活性化しなかったからである。
【００４７】
【表２】
2016515138.tif 000004
【００４８】
【表３】
2016515138.tif 000005
【００４９】
Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｐｈｅ、及びそれらの誘導体（Ｌ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、１−メチル−Ｌ−Ｔｒｐ、１−メチル−Ｄ−Ｔｒｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、トリプタミン、β−フェニルエチルアミン、及びアンフェタミンなど）がＧＰＲ１３９を活性化させた方法を評価するために、用量反応研究がＧＰＲ１３９の活性化に関して行われた。その結果は、それらの化合物全てが、用量反応性の方法でＧＰＲ１３９を明確に活性化することを示している（図２）。
【００５０】
活性化合物は、カルシウム可動化アッセイ（ＦＬＩＰＲ（登録商標）アッセイ）でも試験された。これらの実験のために、ヒトのＧＰＲ１３９をＨＥＫ２９３細胞内で一時的に発現させ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｐｈｅ、又はそれらの誘導体を用いて、カルシウム可動化を刺激した。その結果は、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｐｈｅ、及びそれらの誘導体も、カルシウム可動化を明確に刺激することを示した（図３）。ＧＰＲ  １３９発現細胞に関して、Ｌ−Ｔｒｐ及びＬ−Ｐｈｅは、１００〜２００μＭのＥＣ５０（５０％効果濃度）値を示した。ＧＴＰγＳ結合研究と同じように、１−メチル−Ｌ−Ｔｒｐ及び１−メチル−Ｄ−Ｔｒｐは、より高い効能を示した。多くの細胞培地におけるＬ−Ｔｒｐ及びＬ−Ｐｈｅの濃度（例えば、ＤＭＥＭはそれぞれ約８０μＭ及び７５０μＭである）は、ＧＰＲ１３９に関するＬ−Ｔｒｐ及びＬ−ＰｈｅのＥＣ５０値に近い。ＧＰＲ１３９が哺乳類細胞において組み換えにより発現され、それらの培地で培養されると、その培地において蓄積されたＧＰＲ１３９作用薬の濃度は、Ｌ−Ｔｒｐ及びＬ−ＰｈｅのＥＣ５０値をはるかに超え、したがって、受容体であるＧＰＲ１３９は、組織培養条件下で常に活性化される。これは、ＧＰＲ１３９が、哺乳類の細胞内で組み換えにより発現するときになぜ構造的に活性に見えるのかを説明し得る。
【００５１】
多くのＧＰＣＲは、活性化されると細胞により内在化される。ＧＰＲ１３９が、活性化されるときに内在化されるかどうかを判定するために、Ｎ末端ＶタグマウスＧＰＲ１３９を用いて内在化実験が行われた。これらの実験は、Ｖ５タグＧＰＲ１３９が、Ｌ−Ｔｒｐ及びＬ−Ｐｈｅにより刺激されると内在化されることを示した（図４）。
【００５２】
約３００の追加のフェニルアラニン類似体が、ＧＰＲ１３９活性化に関して、カルシウム可動化（ＦＬＩＰＲ（登録商標））アッセイを用いて試験された。これらの実験の結果は、これらの類似体の多くがやはりＧＰＲ１３９を活性化できることを示す。表４は、カルシウム可動化により３００μＭの濃度でＧＰＲ１３９を活性化すると判定された、特定のフェニルアラニン類似体を記載する（カルシウム可動化は、Ｌ−フェニルアラニンで観察されたカルシウム可動化に対する比率として表現される）。
【００５３】
【表４】
2016515138.tif 000006
【００５４】
実施例２：ＧＰＲ１３９の発現プロフィール
ＧＰＲ１３９を発現した組織又は細胞のタイプを評価するために、実験が行われた。初期のＲＴ−ＰＣＲ研究は、マウス脳及びマウス膵臓細胞（ｍｉｎ６細胞）における発現を評価することに焦点を当てた。これらの研究は、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、ＧＰＲ１３９及びＧＰＲ１４２（ＧＰＲ１３９と密接に関わるもう１つのオーファンＧＰＣＲ）がマウス脳並びにマウス膵臓β細胞において発現することを示した（図５）。ラット脳におけるＧＰＲ１３９の発現も、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより確認された（図６Ａ及び６Ｂ）。
【図１】
2016515138.tif 000007
【図２−１】
2016515138.tif 000008
【図２−２】
2016515138.tif 000009
【図３】
2016515138.tif 000010
【図４】
2016515138.tif 000011
【図５】
2016515138.tif 000012
【図６Ａ】
2016515138.tif 000013
【図６Ｂ】
2016515138.tif 000014
【配列表】
2016515138000001.app
【国際調査報告】
2016515138.tif 000015
2016515138.tif 000016
2016515138.tif 000017
2016515138.tif 000018
2016515138.tif 000019
2016515138.tif 000020