(57)【要約】本発明は、目的タンパク質を発現する植物細胞、これの製造方法及びこれを利用した目的タンパク質の生産方法に関する。前記植物細胞には目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていて、前記植物細胞は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む。ここで、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、植物から分離した先天的に未分化された細胞を含有する植物由来細胞株であって、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離されて、カルスへの脱分化過程を経てなかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする。本発明に係る目的タンパク質発現システムは、従来植物細胞培養の問題点を解消して、画期的な形質転換率によってバイオ医薬タンパク質を含む目的タンパク質を大量生産することができるようにして、植物由来タンパク質製品などのバイオ医薬品の商業化を可能にするのに有用である。【選択図】図４
2016508380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質を発現する植物細胞で、前記植物細胞には目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていて、前記植物細胞は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ：Ｃａｍｂｉａｌ  Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）またはカルスを含み、ここで、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項２】
前記植物細胞は、植物形質転換形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていることを特徴とする請求項１に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項３】
前記目的タンパク質をコードする遺伝子は、植物細胞で形質感染されて前記目的タンパク質が一時的に発現されることを特徴とする請求項２に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項４】
前記目的タンパク質をコードする遺伝子は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）で安定的に形質転換されることを特徴とする請求項２に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項５】
前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体から分離されることを特徴とする請求項２に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項６】
前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、保存タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブプロテイン（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の目的タンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項７】
前記植物は、トマト、タバコ、ニンジン、櫟及び山参で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の目的タンパク質発現用植物細胞。
【請求項８】
植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、植物細胞を目的タンパク質をコードする遺伝子で形質感染または形質転換する工程を含む目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法として、ここで、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
【請求項９】
前記製造方法は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、植物細胞を目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することを特徴とする請求項８に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記形質感染または形質転換する工程は、静置培養（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）工程をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記形質感染または形質転換する工程は、単回または間欠的静置培養工程をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
【請求項１２】
前記共培養は、前記植物細胞と前記目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムの培養物を１分乃至４８時間撹はんして培養した後、１分乃至９６時間静置培養した後、再び１乃至１４日間撹はん培養することを特徴とする請求項８に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記添加されるアグロバクテリウムのＯＤ６００は、０．００００１乃至２．０であることを特徴とする請求項８に記載の目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法。
【請求項１４】
次の工程を含む、目的タンパク質発現用植物体から目的タンパク質を製造する方法：
（ａ）目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程；
（ｂ）前記形質転換された植物体から形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を分離する工程；
（ｃ）前記分離された形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を培地で培養する工程；及び
（ｄ）前記形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
【請求項１５】
次の工程を含む、目的タンパク質発現用植物細胞から目的タンパク質を製造する方法:
（ａ）植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、目的タンパク質をコードする遺伝子に安定的形質転換または、一時的発現させる工程；及び
ここで、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は植物から分離した先天的に未分化された細胞を含有する植物由来細胞株で、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスロの脱分化過程を経ない分裂組織的連続性を持って、
（ｂ）前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を発現する植物細胞、これの製造方法及びこれを利用した目的タンパク質の生産方法に関する。また、本発明は、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターが導入された目的タンパク質発現用植物細胞及びこれの製造方法と、前記植物細胞を介して目的タンパク質を大量生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）とは、生体内に存在する物質を医薬品として用いるものをいい、より広い意味では先端バイオ技術である遺伝子組換え、細胞融合、細胞培養など生物工学技術を基盤として生産された医薬品と定義することができる。このようなバイオ医薬品は、タンパク質医薬品、治療用抗体、ワクチン、遺伝子治療剤及び細胞治療剤に分類される。
【０００３】
現在多くの組換えタンパク質は、動物細胞と昆虫細胞などの高等細胞を宿主として利用するか酵母やバクテリアのような微生物を介して生産されてきた。しかし、このような動物細胞培養は培地の価格が高く、ヒトに感染されうるウイルスの汚染可能性が高く、牛血清由来タンパク質の流入の可能性によって、これらを除去するための別の精製工程が必要な短所がある（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  ＭｃＤｏｎａｌｄ  ２００９）。
【０００４】
そこで、最近植物細胞培養が、組換えタンパク質の代替生産システムとして浮上している。植物細胞の場合、動物由来ウイルスや病原菌に感染しないだけでなく、動物由来物質混入の恐れがなくて安全な生産システムと考えられている。
【０００５】
しかし、植物細胞培養は、動物細胞を含む他の宿主に比べて相対的に低いタンパク質発現水準と遅い生長速度を示す。これに対して植物由来バイオ医薬品の商業化のためには、新しい植物細胞培養を介して組換えタンパク質の生産システムの開発が求められてきた。
【０００６】
本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであって、そこに本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって既知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、大量生産が可能な向上した生産性を持つ、目的タンパク質の製造方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は目的タンパク質を発現する植物細胞で、前記植物細胞には目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていて、前記植物細胞は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ：Ｃａｍｂｉａｌ  Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）またはカルスを含み、ここで、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株として、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする目的タンパク質発現用植物細胞を提供する。
【０００９】
本発明はまた、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、植物細胞を目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換する工程を含む目的タンパク質発現用植物細胞の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、下記の工程を含む、目的タンパク質発現用植物細胞から目的タンパク質を製造する方法を提供する：
（ａ）植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、目的タンパク質をコードする遺伝子に安定的形質転換または、一時的発現させる工程；及び
（ｂ）前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
【００１１】
本発明はさらに、下記の工程を含む、目的タンパク質発現用形質転換植物体から目的タンパク質を製造する方法を提供する：
（ａ）目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程；
（ｂ）前記形質転換された植物体から形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を分離する工程；
（ｃ）前記分離された形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を培地で培養する工程；及び
（ｄ）前記形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａは、材料植物(トマトの幹)の写真で、Ｂは、形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を誘導してその他組織由来カルス層と分離し始めた様子を観察した写真である。
【図２】本発明に係るトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ、Ａ）及びトマトカルス（Ｂ）の細胞凝集程度を観察した顕微鏡写真である。
【図３】本発明に係るトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）とトマトカルスの生長速度を示すグラフである。
【図４】トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）をアグロバクテリウムと共培養して５日経過後一時的発現で９０％以上の感染率を見せるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）発現写真である。
【図５】山参形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）をアグロバクテリウムと共培養して１０日経過後ＧＦＰの一時的発現写真である。
【図６】ニンジン形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）をアグロバクテリウムと共培養して１０日経過後ＧＦＰの一時的発現写真である。
【図７】トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に安定的形質転換で発現するＧＦＰ発現ｃｌｕｍｐと形質転換されなかったｃｌｕｍｐをＵＶ  ｌｉｇｈｔ下で観察した写真である。
【図８】ＧＦＰが安定的形質転換されたそ各々のトマト形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）に対する蛍光顕微鏡写真である。
【図９】蛍光発現が確認されたクラスターを選択して継続的に継代培養してＧＦＰを発現するｃｅｌｌを増殖させた写真である。
【図１０】トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスで沈積有無による安定的形質転換比較結果を示した写真である。
【図１１】ニンジン形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスで沈積有無による安定的形質転換比較結果を示した写真である。
【図１２】山参形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）で沈積有無による安定的形質転換比較結果を示した写真である。
【図１３】ＧＦＰが形質転換されたトマト形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を３Ｌバイオリアクターで培養してＵＶ  ｌｉｇｈｔを照射してＧＦＰ発現結果を示した写真である。
【図１４】形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを純化して植木鉢に生育させた結果を示した写真である。
【図１５】タバコの茎を採取して形態を観察した結果を示した写真である。
【図１６】ＧＦＰが形質転換されたタバコ植物体をｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎして観察した結果を示した写真である。
【図１７】形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの形成層部位で形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を分離した結果を示した写真である。
【図１８】形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｘａｎｔｈｉの形成層部位で形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）分離した結果を示した写真である。
【図１９】ＧＦＰが形質転換された植物体とその植物体から分離した形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）から全体水溶性タンパク質を利用してウェスタンブロット結果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１４】
目的タンパク質を発現する植物細胞で、前記植物細胞には目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されていて、前記植物細胞は、植物形成層由来幹細胞またはカルスを含む。
【００１５】
一実施例において、前記植物細胞は、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターが導入されている形質転換形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）であってもよい。
【００１６】
本出願の発明者等は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に目的タンパク質をコードする遺伝子を導入した結果、従来カルス培養時問題になった遅い生長速度及び低いタンパク質発現率による問題を解消することができて、植物の形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を形質転換して組換えタンパク質を生産する場合、従来知られた植物細胞に比べて画期的に形質転換率が向上して、目的タンパク質の一時的発現技術適用時組換えタンパク質の顕著に向上した生産が可能であることと安定的な形質転換が確立されることを確認した。
【００１７】
本願において、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、植物から分離した先天的に未分化の細胞を含有する植物由来細胞株として、前記細胞株は、植物の形成層組織から分離して、カルスへの脱分化過程を経なかった分裂組織的連続性を持つことを特徴とする。
【００１８】
本願において、カルスは分化した組織が傷によって脱分化過程を経て形成される無定形の細胞塊で、脱分化以後本来の特性を失って未分化状態に存在する。本願で用いられた植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、脱分化過程を経なかった先天的未分化状態を維持するという点でカルスと差がある。
【００１９】
本発明の一部発明者等は、初めて植物の形成層から、脱分化されたカルスとは異なって先天的に未分化された細胞である植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を分離した（ＫＲ１０−１０６４５１９Ｂ１）。このような植物形成層由来幹細胞は、（ａ）植物から形成層含有組織を収得する工程；（ｂ）前記収得された形成層含有組織を培地で培養する工程；及び（ｃ）前記培養された形成層含有組織から、形成層以外の部分または、形成層以外の部分から由来したカルスを含まない、形成層から培養された形成層由来細胞だけを分離・収得する工程と、を含む方法によって分離することができる。ここで、ａ）工程の形成層含有組織は、殺菌工程を経たものであることを特徴とする。
【００２０】
本願において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係がなく複製して機能できるか、または、一部の場合にはゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に用いられる形態であるため、本発明の明細書で「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には互いに交換的に用いられる。本発明の目的から、プラスミドベクターを利用することが好ましい。このような目的に用いられる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数個〜数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選抜できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入されることができる制限酵素切断部位を含む構造を持っている。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）または、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使えば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。ライゲーション後、ベクターは適切な宿主細胞で形質転換されなければならない。形質転換は、カルシウムクロライド方法または電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１，１９８２）等を使用して容易に達成できる。
【００２１】
本発明に係る遺伝子の過発現のために用いられるベクターは、当業界に公示された発現ベクターが用いられる。本発明では、通常植物体の形質転換に用いられるｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒが用いられた。
【００２２】
当業界に周知のように、宿主細胞において形質転換遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が転写及び翻訳発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは発現調節配列及び該当遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を一緒に含んでいる一つの組換えベクター内に含まれることになる。組換えベクターは、植物細胞内で有用な発現マーカーをさらに含むことが好ましい。
【００２３】
上述した組換えベクターによって形質転換された植物形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）は、本発明の別の側面を構成する。本願明細書に用いられた用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子として、または染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。一方、「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡを宿主細胞に導入して宿主細胞内において複製可能になることを意味する。
【００２４】
もちろん全ベクターが本発明の植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）システム内でＤＮＡ配列を発現するのに全部同等に機能を発揮はしないことを理解しなければならない。しかし、当業者ならば過度な実験的負担なく本発明の範囲を逸脱しないまま、種々のベクター及び発現調節配列のうち適切に選択できる。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現も考慮されなければならない。
【００２５】
このように、目的タンパク質をコードする遺伝子は、ベクターを介して植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）中一時的に発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）されるか、安定的に形質転換（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）される。
【００２６】
目的タンパク質をコードする遺伝子が、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）中に導入されて一時的発現すること以外にも、目的タンパク質をコードする遺伝子は、前記植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）のゲノムに導入されて、染色体上因子として存在することによって安定的に形質転換される。本発明が属する技術分野の当業者にとって、前記目的タンパク質をターゲットとする遺伝子を植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）のゲノム染色体に挿入しても、前記の通りに組換えベクターを植物形成層由来幹細胞に導入した場合と同じ効果を持つことは自明である。
【００２７】
従って、本発明は他の観点で、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の染色体に、目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、目的タンパク質発現用植物形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｃａｍｂｉａｌ  Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）に関する。
【００２８】
発明において、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターの導入または目的タンパク質をコードする遺伝子の染色体挿入は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することよっにて行われることができる。
【００２９】
一実施例で、前記共培養は、暗条件で行われることを特徴とする。前記共培養は、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞と前記目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウムの培養物を撹はんして培養するもので、以後静置培養（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）工程を追加で含んでもよい。
【００３０】
前記静置培養は、培養培地を撹はんせず容器を静置した状態で培養する方法で、本願では撹はんせず沈積するのと混用して用いられる。
【００３１】
前記静置培養は、単回または間欠的培養形態で含まれる。単回の静置培養が含まれる場合、例えば植物細胞とアグロバクテリウムの培養物を撹はんして共培養して、静置培養した後再び撹はん培養することを特徴とする。間欠的静置培養が含まれる場合、植物細胞とアグロバクテリウムの培養物を撹はんして共培養して、静置培養した後、再び撹はんして共培養する培養形態が数乃至数十回繰り返される。
【００３２】
この時、詳細には、前記培養は、前記植物細胞と前記目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムの培養物を１分乃至４８時間撹はんして共培養した後、１分乃至９６時間静置培養した後、再び１乃至１０日間撹はん培養することを特徴とする。共培養のために添加されるアグロバクテリウムのＯＤ６００は、０．００００１乃至２．０であってもよい。
【００３３】
アグロバクテリウムのＯＤ６００が低すぎると、一時的発現のための形質転換感染率が低くなる問題があって、高すぎると宿主細胞の生存率が急激に減少する問題がある。従って、前記定義された範囲のＯＤ６００を持つアグロバクテリウムを添加して共培養することが好ましい。
【００３４】
この時、アグロバクテリウムは、通常植物体形質転換のために用いられるアグロバクテリウムを用いてもよく、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが挙げられる。
【００３５】
このように形質転換された植物形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）は、培養して目的タンパク質を発現させて、回収することによって目的タンパク質を製造することができる。
【００３６】
また他の実施例で、前記形質転換された植物形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）は、目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体から分離されてもよい。
【００３７】
本出願の発明者等は、タバコに目的タンパク質をコードする遺伝子を形質転換して、これを植木鉢に生育させた結果、形成層で他の組織より目的タンパク質をコードする遺伝子の発現が優秀であることを確認した。
【００３８】
この時、本願で、前記目的タンパク質は制限されないか、例えば、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、保存タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブプロテイン（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びレポータータンパク質で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の目的タンパク質であることを特徴とする。
【００３９】
本発明の一実施例では、トマト、ニンジン、櫟及び山参の形成層からそれぞれ植物幹細胞を分離した後、これをＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を含有するアグロバクテリウムを利用して形質転換した後、ＧＦＰ発現を確認した。すなわち、一時的発現または安定的形質転換が成功したことを確認して、これを２週毎に継続的に継代培養した場合にも安定的に増殖して、目的タンパク質であるＧＦＰも安定的に発現することを確認することができた。
【００４０】
本発明の一実施例では、トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を前記アグロバクテリウムで一時的発現させた結果、共培養１〜９日目、最も好ましくは５日以後生きている細胞対比９０％以上のアグロバクテリウム感染及びＧＦＰ発現を確認することができた。共培養期間の間のトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の生存率は、１０％未満の減少を示し、ｃｅｌｌ  ｗａｌｌのｒｉｇｉｄｉｔｙがそのまま維持されることを確認した。従来には細胞培養水準で形質転換は、１０％以下と効率が低いと報告されているが、本発明に係る植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を適用する場合、９０％以上の顕著な発現率を確認することができた。
【００４１】
このように高い形質転換発現率は、一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を介して商業的水準に組換えタンパク質生産が可能であることを示し、別途の選別過程がなくとも可能であるため、ベクターから選別マーカーカセットを削除することができる。また、高い形質転換率で一度に目的タンパク質だけ同時に発現させれば良いので、効率面でも優秀な長所を持つ。
【００４２】
一方、トマトのカルスに対しても前記と同じ条件で反応させた結果、本発明の植物幹細胞とは異なってトマトカルスの場合、２６．４％の低い発現率を示した。但し、この数値は、従来報告されたカルス形質転換率である１０％に比べては２倍以上の顕著な効果を示すことを確認した。これは、本発明に係る組換えタンパク質の生産方法が、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）だけでなく、カルスでも適用可能であることを示す。
【００４３】
従って、他の観点において、本発明は、
下記の工程を含む、目的タンパク質発現用植物細胞から目的タンパク質を製造する方法に関する：
（ａ）植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）またはカルスを含む植物細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウムを添加して共培養することによって、目的タンパク質をコードする遺伝子に安定的形質転換または、一時的発現させる工程；及び
（ｂ）前記アグロバクテリウムで感染させた植物細胞培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
【００４４】
また他の観点において、本発明は、下記の工程を含む、目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を介して目的タンパク質を製造する方法に関する:
（ａ）目的タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された植物体を生長させる工程；
（ｂ）前記形質転換された植物体から形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を分離する工程；
（ｃ）前記分離された形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を培地で培養する工程；及び
（ｄ）前記形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）培養物で発現した目的タンパク質を回収する工程。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４６】
［実施例１］ナス科植物の形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の製造、増殖及び特性観察
１−１：トマト植物材料の準備
ナス科リコペルシクム属のトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、（株）世宗（セジョン）種苗）から形成層由来幹細胞を収得するために、幹と小枝（図１のＡ）を採取した後、直ちに抗酸化剤１００ｍｇ／Ｌアスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＵＣＨＥＦＡ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）溶液に沈積して運送・保管した。
【００４７】
その後、０．１％ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ，Ｄｏｎｇｂｕ  Ｈａｎｎｏｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｏｒｅａ）、０．１％ダコニル（ｄａｃｏｎｉｌ，Ｄｏｎｇｂｕ  Ｈａｎｎｏｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｏｒｅａ）、０．１％ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ，ＤＵＣＨＥＦＡ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、０．０１％セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ＤＵＣＨＥＦＡ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の混合溶液に１０分間前処理後、フェノール化合物（ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と残存化学物質を除去するために水道水（ｔａｐ  ｗａｔｅｒ）で５分間洗浄した。そして、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ、ＤＣ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）１分、１．５％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ、ＬＧ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）3分、０．５％  ＣＬＯＲＯＸ溶液に５分、０．１％ＣＬＯＲＯＸ溶液に５分表面殺菌後、３〜４回洗浄した。
【００４８】
１−２：トマト植物体の幹から形成層含む切片体の製造及び組織分離
前記実施例１−１の殺菌過程を経た幹を切って牧夫から分裂能が旺盛な形成層を含んだ師部（ｐｈｌｏｅｍ）皮層（ｃｏｒｔｅｘ）及び表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）組織を剥いだ。
【００４９】
１−３：トマトの形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）誘導工程
前記実施例１−２で準備した形成層を含む片体は、表１の形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）誘導培地（培地１）に種まきして培養した。
【００５０】
【表１】
2016508380.tif 000003
【００５１】
培地に生長調節剤として、ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＩＢＡ、２，４−Ｄ、ｐｉｃｌｏｒａｍといったオーキシン（Ａｕｘｉｎ）は０．５〜５ｍｇ／Ｌの濃度で添加することができ、ＮＡＡを１ｍｇ／Ｌの濃度で添加した。培養は、２５±１℃に調節された暗室で実施された。
【００５２】
前記のとおり、培養した結果、初期培養７〜１０日目形成層から細胞分裂が肉眼上で観察されて、培養３週（２１日）以後に、師部、皮層及び表皮からなる層から脱分化による無定形のカルスが誘導され始めた。培養３０日経過後、培養された形成層と師部を含む上層、すなわち無定形のカルス層に分離し始めた（図１のＢ）。二つの層が自然に分離するまで待って完全に分離した後、形成層の部分だけを分離培養した。分離後、生長率が良い白くて柔らかい部分を誘導培地と同じ新しい培地で毎１４日目継代培養した。
【００５３】
トマトの形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、長期培養時細胞の生長率、生長パターン、凝集程度に変異なしに安定的に維持されて大量培養が可能であることを確認した。しかし、トマトの幹で誘導したカルスの場合、長期培養時細胞の生長率、生長パターンに変異を示して、高い凝集程度結果、細胞の褐変現象及び壊死現象が現れて安定した大量培養が不可能であった。
【００５４】
１−４：トマトカルスの培養
トマトのカルス（ＰＣ１０６２３）は、生物資源センターで購入して、毎３週目継代培養した。
【００５５】
１−５：ナス科植物の形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の増殖及び特性観察
前記実施例１−３から分離したトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を下記表２の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件で２５±１℃で１００ｒｐｍの回転攪拌機（ｓｈａｋｅｒ）で培養した。持続的な培養のために、増殖培養が完了したトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、細胞対培地体積比を１：１０にして７日間懸濁培養した。
【００５６】
【表２】
2016508380.tif 000004
トマトのカルス（ＰＣ１０６２３）も同じ割合で接種して、液状培地は表３と同様である。
【００５７】
【表３】
2016508380.tif 000005
【００５８】
細胞凝集程度を光学顕微鏡（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＣＸ３１，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）で観察した結果、本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、図２のＡに示したように、懸濁培養時多数の単細胞を含み、一部は非常に小さいサイズの細胞集合体で存在することを確認することができた。すなわち、本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を培養した結果、最大凝集の大きさが５００ｕｍに過ぎなかった。これに対して、トマトのカルス（ＰＣ１０６２３）を観察した結果、図２のＢに示したように非常に凝集していて最大凝集の大きさが１０ｍｍまで現れた。追加で増殖培養完了後継代培養される前に本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）とカルス（ＰＣ１０６２３）の細胞をサンプリングして２％  Ｅｖａｎ‘ｓ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ（５ｍｉｎ）  ｍｅｔｈｏｄを利用して細胞生存率（％）を算出した結果、表４に示したように、本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、９６．３３％が生きている細胞である反面、カルスは６５．２％だけ生きている細胞と確認された。
【００５９】
【表４】
2016508380.tif 000006
【００６０】
［実施例２］植物の保存およそ形成層由来幹細胞（ＣＭＣｓ）の製造
２−１：山参の形成層由来幹細胞（ＣＭＣｓ）の製造
滑らかで傷がない山参を選別して細根を全部除去した後、２ｓｔｅｐで表面殺菌して準備して、殺菌処理した組織の褐変化防止のために抗酸化剤が含まれた表５のＢＩＭ（ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）に殺菌された主根を入れて、３０分乃至１時間程度振とう培養した後、滅菌されたろ過紙で水気を除去した。
【００６１】
【表５】
2016508380.tif 000007
【００６２】
殺菌過程を経た後、前記材料の褐変化防止のために、表６の抗酸化剤が含まれたＣＳ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）下で分裂能が旺盛な形成層の部分が含まれるように縦×横×高さ＝０．５〜０．７ｃｍ×０．５〜０．７ｃｍ×０．２〜０．５ｍｍの大きさで切断した。
【００６３】
【表６】
2016508380.tif 000008
【００６４】
用意した切片体で形成層だけを誘導させるために、１Ｍスクロース（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）溶液が入ったフラスコに入れて、冷蔵状態に１６〜２４時間浸透ストレスを処理した。その後、０．０５Ｍスクロース溶液（スクロース  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で５分間、０．１Ｍスクロース（スクロース）溶液で５分間処理して、高濃度のスクロース（スクロース）によるストレスを解除した。前記浸透ストレスが解除された形成層が含まれた切片体は、ろ過紙が敷かれた前播種培地（培地６）に載せて水気を除去した。
【００６５】
【表７】
2016508380.tif 000009
【００６６】
山参の形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を誘導するために、前記浸透ストレス処理した切片体を細胞株誘導培地（培地７）に播種した。播種に用いられた培地は、下記表８に記載されたとおりである。
【００６７】
【表８】
2016508380.tif 000010
【００６８】
前記の通りに浸透処理をして解除した後、形成層由来細胞株誘導培地（培地７）に播種した切片体は、他の組織では細胞が誘導されず形成層でだけ特異的に細胞が誘導された。
前記培地７で培養して形成層以外の他の組織が壊死された後、培地３−１で継代培養して形成層細胞だけを増殖させた。
【００６９】
【表９】
2016508380.tif 000011
【００７０】
一方、高麗人参子葉由来カルス（ＫＣＴＣ  １０２２４）は、生物資源センターで購入して毎３週目継代培養した。
【００７１】
２−２：ニンジンの形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の製造
ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．）を用意して、前記実施例２−１と同じ方法で表面殺菌して準備した。その後、準備された試料に対して、実施例２−１と同じ方法で浸透ストレス処理後、形成層細胞株を誘導した。
その結果、前記実施例２−１と同様に形成層以外の他の組織は壊死されて、分裂能を持つ形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）が誘導されることを確認した。ニンジンの形成層が含まれる切片体に対しも前記実施例２−１と同じ方法で増殖させた。
一方、対照群としてニンジンカルスを培養するために、ニンジンの根を採取した後、前記実施例２−１の方法で表面殺菌後、切片体を作って表１０のカルス誘導培地に播種して２１±１℃に調節された暗室で培養した。無定形のカルスを獲得後、毎１４日目継代した。
【００７２】
【表１０】
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【００７３】
２−３：保存およそ形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の増殖及び特性観察
前記実施例１から分離した山参形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を表２の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件で２１±１℃で１００ｒｐｍの回転攪拌機（ｓｈａｋｅｒ）で培養した。持続的な培養のために、増殖培養が完了した山参形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、細胞対培地体積比を１：１０にして１４日間懸濁培養した。また、前記実施例２−１で分離した山参のカルスも同じ条件で培養して、液状培地も山参形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）培養に使用した液状培地と同じである。
【００７４】
細胞凝集程度を光学顕微鏡（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＣＸ３１，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）で観察した結果、本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、図２のＡのように、懸濁培養時多数の単細胞を含み、一部は非常に小さいサイズの細胞集合体で存在することを確認することができた。すなわち、本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を培養した結果、最大凝集の大きさが２００ｕｍに過ぎなかった。これに対して対照群を観察した結果、図２のＢのように非常に凝集することを観察することができて、最大凝集の大きさが５００ｕｍまで現れた。追加的に増殖培養完了後、継代培養される前に本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）とカルスの細胞をサンプリングして２％  Ｅｖａｎ‘ｓ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ方法を利用して細胞生存率（％）を算出した結果、本発明に係る形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、９４．３％が生きている細胞である反面、カルスは６１％だけ生きている細胞と確認された。
【００７５】
一方、前記実施例２−２で分離したニンジン形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を下記の液状培地（培地３−１）が含まれたフラスコに入れて、暗条件で２５±１℃で１００ｒｐｍの回転攪拌機（ｓｈａｋｅｒ）で培養した。持続的な培養のために、増殖培養が完了したニンジン形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は細胞対培地体積比を１：１０にして１４日間懸濁培養した。また、前記実施例２−２で分離したニンジンのカルスも同じ条件で培養して、液状培地もニンジン形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）培養に使用した液状培地と同じである。
【００７６】
［実施例３］植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の形質転換のための発現ベクターの準備及びアグロバクテリウムの培養
ＧＦＰ遺伝子を含む植物発現用ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＢＩＮｍＧＦＰ５ＥＲ）を用いて、Ｔａｋａｒａ  Ｋｏｒｅａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから購入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４を用いて下記の実験を進行した（ＬＢＡ４４０４  Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｅｌｌｓ，ｃａｔ  ｎｏ．９１１５，Ｋｏｒｅａ）。
【００７７】
購入したＧＦＰを含むｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒのａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａへの導入は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｕｖｅｔｔｅ及びＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４製造社の指針書に従って行われた。
【００７８】
このように製造したｐＢＩＮｍＧＦＰ５ＥＲ／ＬＢＡ４４０４は、１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｓｔｏｃｋで白金耳（ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｐｏｏｌ）で取ってｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ  （ＴＣＩ，Ｊａｐａｎ）１００ｍｇ／Ｌ、ｋａｎａｍｙｃｉｎ  １００ｍｇ／Ｌを添加したＹＥＰ固体培地（培地９）にｓｔｒｅａｋｉｎｇして３日間２８℃で暗培養した（ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，Ｓｅｊｏｎｇ，Ｋｏｒｅａ）。
【００７９】
【表１１】
2016508380.tif 000013
【００８０】
アグロバクテリウム（ｐＢＩＮｍＧＦＰ５ＥＲ／ＬＢＡ４４０４）は、３日間隔で新しい培地にｓｔｒｅａｋｉｎｇする方式で２８℃暗培養で継代培養して用いた。
植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）にアグロバクテリウムを介した形質転換のために、前記アグロバクテリウムを懸濁培養した。
固体培地で培養されたアグロバクテリウムのｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙを取って５ｍｌＹＥＰ液体培地（表１２、培地１０）に解いて６〜１８時間２８℃、２００ｒｐｍで暗培養した後、培養液１〜５ｍｌをＹＥＰ培地１００ｍｌに入れて、６〜２４時間２８℃、２００ｒｐｍで培養した。
【００８１】
【表１２】
2016508380.tif 000014
【００８２】
用意されたアグロバクテリウム懸濁液とｃｏｎｔｒｏｌで用いるアグロバクテリウムを培養しなかったＹＥＰ液体培地（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ  １００ｍｇ／Ｌ、ｋａｎａｍｙｃｉｎ  １００ｍｇ／Ｌ添加)を各１ｍｌずつピペットでサンプリングしてキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に入れて、ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒに入れて６００ｎｍ波長のｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ６００）を測定した。前記ＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の製品を用いた。
【００８３】
アグロバクテリウムのｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎのために、ＯＤ６００値が０．４〜２．０である前記アグロバクテリウム懸濁液をｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ，ＵＳＡ）に分けて入れて、４℃、６０００ｇ−ｆｏｒｃｅで３〜１０分間遠心分離(Ｈａｎｉｌ科学産業、韓国)した。Ｔｕｂｅ壁に集まったアグロバクテリウムペレットを別に集めて、１０ｍＬのｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（培地２）にｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎした後、アグロバクテリウムのＯＤ６００値が０．００００１〜２．０になるようにして、Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）１０〜２００ｕＭを添加して、２８℃で１分〜２４時間２００ｒｐｍ  ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。
【００８４】
Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅは、本発明のようにアグロバクテリウムに処理してもよく、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に直接処理してもよく、アグロバクテリウムと植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に同時に処理してもよい。
【００８５】
［実施例４］植物形質転換用ベクターを利用した植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）で目的タンパク質の一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）形質転換のために、前記実施例３のようにアグロバクテリウムを用意して、形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）は、実施例１及び２の対数生長期のｃｅｌｌを用意して、細胞対培地体積比率が１：１０になるようにした。
【００８６】
実施例１で分離したトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）が入っている２５０ｍｌ  ｆｌａｓｋにｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎが完了したアグロバクテリウム懸濁液１０ｍＬを入れて、２５℃、１００ｒｐｍで共培養した。この過程で、トマトＣＭＣの形質転換効率を最大化するために、前記培養物を１分〜４８時間回転攪拌機（ｓｈａｋｅｒ、世宗、韓国)で１００ｒｐｍで暗培養した後、１分〜４８時間撹はんせず沈積した。その後、再び培養物を攪拌機で１００ｒｐｍで１〜９日間暗培養した。
【００８７】
１〜９日間共培養が完了した培養物をピペットで１ｍＬサンプリングして１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｅに入れて、サンプル１ｍＬ中１０μＬを再びＭａｒｉｅｎｆｅｌｄ社のｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒにサンプリングしてＩＸ７１  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ光源：Ｕ−ＲＦＬ−Ｔ）を利用して、ＧＦＰ発現を観察した。観察に用いられた光とフィルター波長帯は、ｇｒｅｅｎ、４６０−４９０／５２０ｎｍ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／Ｂａｒｒｉｅｒ）であった。同じスライドを光学顕微鏡を介して生きているｃｅｌｌ数対比ＧＦＰ発現したｃｅｌｌの頻度（％）を計数した。
【００８８】
トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を前記アグロバクテリウムで一時的発現させた結果、共培養１〜９日目、最も好ましくは５日以後図４のように生きている細胞対比９０％以上のアグロバクテリウムによる一時的発現を確認することができた。共培養期間中トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）の生存率は、１０％未満の減少を示して、ｃｅｌｌ  ｗａｌｌのｒｉｇｉｄｉｔｙがそのまま維持されることを確認した。
【００８９】
すなわち、細胞培養水準で形質転換は%で計算できない程難しいと知られているが、本発明に係るトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を適用する場合、９０％以上の顕著な発現率を確認することができた。
【００９０】
一方、トマトのカルスに対しても前記と同じ条件で反応させた結果、本発明のトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）とは異なって、実施例1のトマトカルスの場合、２６．４％の低い発現率を示した。但し、この数値は従来報告されたカルス形質転換率である１０％に比べては２倍以上の顕著な効果を見せた。
【００９１】
【表１３】
2016508380.tif 000015
【００９２】
追加で実施例２の山参及びニンジン形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）に対し前記と同じ方法で実験して、その結果を図７及び８にそれぞれ示した。
【００９３】
図５を参照すると、山参形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）をアグロバクテリウムで一時的発現させた結果、生きている細胞対比１３％以上のアグロバクテリウム感染及びＧＦＰ発現を確認することができた。
【００９４】
また、図６を参照すると、ニンジン形成層由来幹細胞をアグロバクテリウムで一時的発現させた結果、生きている細胞対比１７％以上のアグロバクテリウム感染及びＧＦＰ発現を確認することができた。山参及びニンジンは、トマトに比べて一時的発現率が低かったが、共培養及び静置培養時間を調整すると、トマトに準ずる一時的発現率を示すことができると予想される。
【００９５】
［実施例５］植物形質転換用ベクターを利用して植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）で目的タンパク質の安定的形質転換（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の確認
実施例４のように実行後、３〜２１日間２５０ｍｌ  ｆｌａｓｋでトマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）とアグロバクテリウムを共培養（２５℃、１００ｒｐｍ）して、ＧＦＰ発現が最も高い時点でアグロバクテリウムを除去するために、表２のｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（培地３）で５〜２０分間２回洗浄した。３回目にｋａｎａｍｙｃｉｎ（ＴＣＩ，Ｊａｐａｎ）  ３００ｍｇ／Ｌとｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ（ＴＣＩ，Ｊａｐａｎ）５００ｍｇ／Ｌを処理して１週間懸濁選抜培養（２５℃、１００ｒｐｍ  ｓｈａｋｉｎｇ）した。この後、形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を沈積させて、培地を最大限注いで捨てた後、フィルターペーパー（７０ｍｍ，Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ  Ｋａｉｓｈａ，Ｊａｐａｎ）で残りの培地をほとんど吸収させて、トマト形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を固体選抜培地（表Ｉ４、培地１１）に移した。これを２５±１℃暗培養して、ＧＦＰを発現する形質転換された形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を取得した。ニンジンの形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）も全て前記のような方法で処理して、山参は培地１１中ホルモンを抜いた培地にプレーティングした。
【００９６】
【表１４】
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【００９７】
獲得された細胞株をＵＶ  ｌｉｇｈｔ下で観察した結果、図７の左側クランプ（ｃｌｕｍｐ）のように安定的に形質転換された細胞株は、ＧＦＰを発光する反面、形質転換されなかった細胞株は右側クランプ（ｃｌｕｍｐ）のように発光しなかった。クランプ内の細胞株それぞれの緑色発光を確認するために、蛍光顕微鏡（ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ光源：Ｕ−ＲＦＬ−Ｔ）を利用して、蛍光発現程度を確認した。
【００９８】
その結果、図８に示したようにサンプリングされたすべての細胞でＧＦＰが発現することを確認して、本発明の植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）を利用して、安定的形質転換（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が成功的であったことを確認した。
【００９９】
追加で、前記で蛍光発現が確認されたクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を選択して（図９のＡ）継代培養して２次的にＧＦＰ発現の有無を確認した（図９のＢ）。その後、再び２週毎に継代培養を行って増殖させて（図９のＣ−１４日後、図９のＤ−連続的継代培養進行８２日後)、安定的にＧＦＰを発現することを確認することができた。
【０１００】
これは安定的形質転換が確認された植物形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を継代培養して、継続的な増殖が可能であることを提示する。注目すべき点は、ＧＦＰが形質転換された植物形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）で緑色蛍光を示す程度が非常に強い緑色で、植物形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）で強いＧＦＰ発現されたことを定性的に知ることが出来る。全体的なＧＦＰ発現率だけでなく、発現した細胞一つ一つがどの程度高収率でタンパク質を発現したのかも全体的な収得率に影響を及ぼすが、緑色蛍光の発現程度からみて形質転換形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）で目的タンパク質を非常に高い水準で発現させて収得する可能性があることを提示する。
【０１０１】
また、沈積によるトマト、ニンジン及び山参由来植物細胞への安定的形質転換結果を比較した。それと共に、実験素材が形成層由来幹細胞（ＣＭＣ）である時と、トカルスである時との結果も比較した。
【０１０２】
その結果、図１０に示したように、沈積過程を経なかったトマト形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ｂ）またはトマトカルス（Ｄ）に比べて、沈積過程を経たトマト形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ａ）または、トマトカルス（Ｃ）で多数のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）が形成されることを確認することができる。また、トマト形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ａ，Ｂ）がトマトカルス（Ｃ、Ｄ）に比べて多数のクラスターが形成されることを確認することができる。
【０１０３】
また、図１１に示したように、沈積過程を経なかったニンジン形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ｂ）またはニンジンカルス（Ｄ）に比べて、沈積過程を経たニンジン形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ａ）またはニンジンカルス（Ｃ）で多数のクラスター（図１３のＡ、Ｃの表示の部分）が形成されたことを確認することができる。また、ニンジン形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ａ，Ｂ）がニンジンカルス（Ｃ、Ｄ）に比べて多数のクラスターが形成されることを確認することができる。
【０１０４】
図１２でも同様に、沈積過程を経なかった山参形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ｂ）に比べて、沈積過程を経た山参形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ，Ａ）で多数のクラスターが形成されたことが確認された。
【０１０５】
クラスターの形成は、ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａのＴ−ＤＮＡが植物細胞ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）内に挿入されたことを意味して、図１０乃至図１２の結果から、沈積する過程を含むことが形質転換効率を上げるのに重要な要素であることを確認することができる。
【０１０６】
また、同じ条件で形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）がカルスに比べて、多数のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）が形成されることを確認することによって、形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を素材として用いることが形質転換効率を上げるのに重要な要素であることを確認することができる。
【０１０７】
［実施例６］大量培養の可能性確認
実施例４で９０％以上のＧＦＰ発現率を確認した２５０ｍＬフラスコ（ｆｌａｓｋ）に沈積された細胞ボリューム（ｓｅｔｔｌｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）７０ｍｌを３Ｌエアリフト型バイオリアクター（３Ｌ  ａｉｒ−ｌｉｆｔ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に細胞：培地（ｃｅｌｌ：ｍｅｄｉａ）の体積比率が１：３０になるべく接種した。乾燥細胞重量（ｄｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ）は、０．６ｇ／Ｌである。３Ｌバイオリアクターのワーキングボリューム（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）は、２，１００ｍｌで、バイオリアクターの体積使用率は全ボリューム（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）の７０％である。この時用いられた培地は、２５０ｍＬフラスコで用いられた培地と同じで、抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）で５〜２５ｍｇ／ＬのＧ４１８を添加した後、通気率（ａｅｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）は、０．１〜０．１５ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）で７〜１０日間２５℃±１、癌条件下で培養した。３Ｌバイオリアクターで継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）は、７〜１０日間隔に進行されて、好ましくは７日毎に継代培養された。
【０１０８】
形質転換されたトマト形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）を３Ｌバイオリアクターで培養した結果、図１３に示したように増殖培養７〜１０日目ＵＶ（３５０ｎｍ）を照射した時、２５０ｍｌフラスコ培養物と同じＧＦＰ発現率を確認することができた。トマト形質転換形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）の増殖率は、初期細胞接種量に比べて増殖培養完了後１０倍（ｆｏｌｄｓ）以上安定した細胞増殖率を示した。増殖培養期間完了後、トマト形質転換形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）の生存率は１０％未満の減少を示し、光学顕微鏡で観察した結果、細胞壁（ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ）の剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）は変わらず維持されることを確認した。
【０１０９】
【表１５】
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【０１１０】
［実施例７］形質転換タバコ植物体作製
７−１.アグロバクテリウム培養
ｐＢＩＮｍＧＦＰ５ＥＲ／ＬＢＡ４４０４  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙのアグロバクテリウムを取って５ｍｌ  ＹＥＰ培地に入れて、６ｈ、２８℃培養後、ＹＥＰ培地５０ｍｌに１：５０〜１：１００で添加して、１８ｈ、計２４ｈｒ内に培養した後、アグロバクテリウム培養液のＯＤを測定した。Ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅにアグロバクテリウム培養液を入れて、遠心分離機を利用して、ｃｅｌｌを４℃でｓｐｉｎ  ｄｏｗｎさせた。集められたアグロバクテリウムペレットにタバコ培養培地（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ  ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋ｐＨ５．８）を入れて解いた後、すでに測定されたアグロバクテリウムＯＤを使ってタバコ培養培地とアグロバクテリウム培養液を混ぜて、ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ  １０−２００ｕＭを添加して２５０ｒｐｍで２ｈｒ、２８℃で培養した。
【０１１１】
７−２．タバコ葉切片体準備
ピンセットで機内植物体の葉柄を取って葉を引き離して、予め準備しておいたｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈに置いた。ナイフで葉柄寄りの主脈部位を含んだ１．０ｃｍ×１．０ｃｍ（〜０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）の切片体を作った。
【０１１２】
７−３．共培養
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣ）切片体を別に分離して、ひっくり返して共培養培地（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ  ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋ｐＨ５．８＋０．８％  ａｇａｒ）に播種した後、３日間２５℃で暗培養した。前記７−２で製造した切片体（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ除外）を前記７−１で準備した培養液に入れて、５ｍｉｎ毎にそっと振りながら２０ｍｉｎ間漬けてａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎさせた。切片体を取り上げてｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒの上に置いてｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒを上げて水気を切った後、切片体を共培養培地（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ  ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋ｐＨ５．８＋０．８％  ａｇａｒ＋１００ｕＭ  ＡＳ）にひっくり返して播種して、３日間２５℃で暗培養した。
【０１１３】
７−４．選別
共培養が完了した切片体を滅菌数を利用して、３回ｗａｓｈｉｎｇした後、ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒで水気を切って、ＰＣ中ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）で用いる切片体を分離して、ＰＣは再生培地（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ  ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋ｐＨ５．８＋０．８％  ａｇａｒ）に、ＮＣは選抜培地（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ  ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ＋ｐＨ５．８＋０．８％  ａｇａｒ培地＋ｋａｎ  １００ｍｇ／Ｌ＋ｃｅｆ  ５００ｍｇ／Ｌ）にひっくり返して播種して、残りの切片体は選抜培地にひっくり返して播種した。
３週間暗培養した後、１６ｈ／８ｈ光周期で明培養して、新枝を形成させて、新枝が形成されると、１個の新枝だけを取り出して、根形成培地（ＭＳ＋ｋａｎ  １００ｍｇ／Ｌ  +  ｃｅｆ  ５００ｍｇ／Ｌ  ｐＨ５．８＋０．８％  ａｇａｒ）に移して根を形成させた。形質転換されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを純化して植木鉢に生育させた結果を図１４に示した。
【０１１４】
７−５．形態観察
生育３〜６ヶ月の幹を採取して形態を観察した。ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ，ｒａｄｉａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎを行って、組織区別のためにｘｙｌｅｍ特異染色試薬であるｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ−ＨＣｌで染色して観察した。図１５を参照すると、Ｘｙｌｅｍは赤く染色されて真上の形成層が２〜４（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉの場合、３〜６）層存在することを確認することができる。
また、ＧＦＰが形質転換されたタバコ植物体をｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎして、ＧＦＰ  ｆｉｌｔｅｒ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｂａｒｒｉｅｒ）：４６０−４９０／５２０ｎｍの条件で観察した結果、図１６に示したように形成層ｚｏｎｅで他の組織より明るい蛍光が確認された。
【０１１５】
７−６．形質転換されたタバコ形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）の分離
培養４日目Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの形成層部位で細胞分裂が観察された。培養２週後図１７のＡのように、増殖形成層以外師部組織をピンセットで取り外した。図１７のＢに示したように、分離以後師部以外組織観察時、他組織の細胞分裂様子や組織損傷は観察されなかった。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ＸａｎｔｈｉもＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａと同じ方法で形成層由来幹細胞分離して、図１８に示したようにＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉでも同じ結果を得た。
【０１１６】
７−７．タバコ形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）とタバコ植物体でタンパク質発現確認
ＧＦＰ遺伝子が形質転換されたタバコ形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）とタバコ植物体、そして形質転換されなかったタバコ植物体からそれぞれ全水溶性タンパク質を分離した。
分離した全水溶性タンパク質は、２枚のポリアクリルアミドゼリにＳＤＳ−ＰＡＧＥをして、ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使ってニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）ペーパーにトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。
【０１１７】
そこに５％脱脂粉乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）を用いて一晩中ブロッキングして、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＧＦＰ１次抗体と２次抗体を順次反応させた。その後、ＴＢＳＴ／ＴＮＭで洗浄して発色剤（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  ｓｏｌ.）を用いて発色してタンパク質バンドを確認した。
【０１１８】
その結果、図１９のように形質転換されなかった一般タバコ植物体では何らバンドも確認されなく、形質転換されたタバコ植物体とタバコ植物体から分離した形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）では、ＧＦＰの大きさと類似の位置でバンドが検出されることを確認することができた。
【０１１９】
また、形質転換されたタバコ植物体でより形質転換されたタバコ植物体で分離した形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）でＧＦＰタンパク質がさらに高く発現することを確認することができた。これは図１６でタバコ形成層由来幹細胞（ＴＣＭＣ）の結果がより高く出てきたことと一致する結果であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明に係る組換え植物細胞を利用した目的タンパク質発現システムは、従来植物細胞培養の問題点を解消して、画期的な形質転換率によってバイオ医薬タンパク質を含む目的タンパク質を大量生産することによって、植物由来タンパク質製品などのバイオ医薬品の商業化を可能にするのに有用である。
【０１２１】
本発明は、走光性を利用して改良された単細胞生物体を微細流体システムを利用して効果的に選別できるもので、細胞単位で容易なモニタリングが可能で、収集した結果の統計的分析を含んだ様々な分析を介して、変化した光反応性及び/または光敏感性を持つ突然変異菌株を容易にまたは高速で選別できて、走光性及び光転換効率の相関解明、光転換効率が向上した改良された単細胞生物体選別に有用に活用できる。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図３】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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