(57)【要約】本開示は、メタンまたは天然ガス等の炭素供給原料を利用するメタン資化性細菌を使用して、イソプレンを生物学的に産生するための組成物および方法を提供する。例えば、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌であって、炭素供給原料をイソプレンに変換することができるメタン資化性細菌が提供される。炭素供給原料の存在下、イソプレンの産生に十分な条件下で、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌を培養するステップを含む、イソプレンを産生する方法もまた提供される。
2016508737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌であって、炭素供給原料をイソプレンに変換することができるメタン資化性細菌。
【請求項２】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記核酸が、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaに由来する、請求項１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項３】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸配列が、前記メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、請求項１または２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項４】
前記イソプレンシンターゼが、Ｎ末端色素体標的化配列を含まない、請求項１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号１〜６のうちいずれか１種に示されているアミノ酸配列をコードする、請求項２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号１４〜１９のうちいずれか１種に示されている配列を含む、請求項２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項７】
イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項８】
前記発現制御配列が、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項７に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項９】
親メタン資化性細菌による内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現することができるか、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せである、請求項１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１０】
親メタン資化性細菌による内因性メバロン酸経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性メバロン酸経路酵素を過剰発現することができるか、メバロン酸経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せである、請求項１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１１】
前記ＤＸＰ経路酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せである、請求項９に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１２】
前記メバロン酸経路酵素が、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼまたはこれらの組合せである、請求項１０に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１３】
バリアントＤＸＰ経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸で形質転換されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１４】
少なくとも１種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、２種のバリアントＤＸＰ経路酵素を含み、前記２種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、突然変異ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）および突然変異３，４ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）を含む、請求項１３に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１５】
約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌのイソプレンを産生することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１６】
Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylocella、Methylocapsaである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１７】
Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  methanica  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium  petroleiphilumまたはMethylomicrobium  alcaliphilumである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１８】
前記炭素供給原料が、メタン、メタノール、天然ガスまたは非在来型天然ガスである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項１９】
炭素供給原料の存在下、イソプレンの産生に十分な条件下で、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌を培養するステップを含む、イソプレンを産生する方法。
【請求項２０】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記核酸が、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸配列が、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、Ｎ末端色素体標的化配列を含まない、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記外因性核酸が、配列番号１〜６のうちいずれか１種に示されているアミノ酸配列をコードする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記外因性核酸が、配列番号１４〜１９のうちいずれか１種に示されている配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現制御配列が、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記メタン資化性細菌が、親メタン資化性細菌による内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現することができるか、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＸＰ経路酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記メタン資化性細菌が、バリアントＤＸＰ経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸で形質転換される、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、２種のバリアントＤＸＰ経路酵素を含み、前記２種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、突然変異ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）および突然変異３，４ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記メタン資化性細菌が、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylocella、Methylocapsaである、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記メタン資化性細菌が、Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  methanica  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium  petroleiphilumまたはMethylomicrobium  alcaliphilumである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記炭素供給原料が、メタン、メタノール、天然ガスまたは非在来型天然ガスである、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記メタン資化性細菌が、約１ｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌのイソプレンを産生することができる、請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記メタン資化性細菌が、発酵により培養され、前記発酵により産生される前記イソプレンが、オフガスとして回収される、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記回収されたイソプレンが、二量体（１０炭素）炭化水素、三量体（１５炭素）炭化水素またはこれらの組合せへとさらに改変される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記二量体炭化水素、三量体炭化水素またはこれらの組合せが、長鎖分枝状アルカンへと水素化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記回収されたイソプレンが、イソプレノイド産物へとさらに改変される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
突然変異メタン資化性細菌をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記メタン資化性細菌を突然変異原に曝露して、突然変異メタン資化性細菌を生成するステップと、
（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸で、前記突然変異メタン資化性細菌を形質転換するステップと、
（ｃ）増殖に十分な条件下で、前記形質転換された突然変異メタン資化性細菌を培養するステップと
を含み、
ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸を含有する参照メタン資化性細菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す突然変異メタン資化性細菌が、イソプレン前駆体合成の増加を示す方法。
【請求項４０】
前記突然変異原が、放射線、化学物質、プラスミドまたはトランスポゾンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前に行われ、続いて前記形質転換された突然変異メタン資化性細菌が、増殖に十分な条件下で培養される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
赤色色素沈着が増加した前記突然変異メタン資化性細菌またはそのクローン細胞が、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸で形質転換される、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする前記核酸のうち少なくとも１種が、前記突然変異メタン資化性細菌から除去されるかまたはこれにおいて不活性化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
メタン資化性細菌におけるイソプレン経路遺伝子をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記メタン資化性細菌を、
（ｉ）イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸、
（ｉｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸
で形質転換するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記メタン資化性細菌を、増殖に十分な条件下で培養するステップと
を含み、
ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸を含有し、イソプレン経路酵素をコードする外因性核酸を含有しない参照メタン資化性菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す前記形質転換されたメタン資化性細菌が、イソプレン前駆体合成の増加を示す方法。
【請求項４５】
前記イソプレン経路酵素が、ＤＸＰ経路酵素またはメバロン酸経路酵素である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、異種核酸である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、同種核酸である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記同種核酸が、前記メタン資化性細菌において過剰発現される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、天然に存在しないバリアントである、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記天然に存在しないバリアントが、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発またはこれらの組合せにより作製される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記天然に存在しないバリアントが合成される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記天然に存在しないバリアントが、イソプレン経路酵素をコードする参照核酸と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
イソプレン組成物であって、前記イソプレンが、約−３０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、イソプレン組成物。
【請求項５５】
前記イソプレンが、約−４０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、請求項５３に記載のイソプレン組成物。
【請求項５６】
前記イソプレンが、約−５０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、請求項５３に記載のイソプレン組成物。
【請求項５７】
前記イソプレンが、約−３０‰〜約−５０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、請求項５３に記載のイソプレン組成物。
【請求項５８】
前記イソプレンが、約−３０‰〜約−４０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、請求項５３に記載のイソプレン組成物。
【請求項５９】
前記イソプレンが、約−４０‰〜約−５０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、請求項５３に記載のイソプレン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提供されており、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、２００２０６＿４１１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、５８．５ＫＢであり、２０１４年３月４日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子提出されている。
【０００２】
背景
技術分野
本開示は、イソプレンを生物学的に産生するための組成物および方法を提供し、より詳細には、メタン資化性細菌を使用して、メタンまたは天然ガス等の炭素基質からイソプレンを産生するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
２−メチル−１，３−ブタジエンとしても公知のイソプレンは、揮発性の５炭素炭化水素である。イソプレンは、微生物、植物および動物種を含む種々の生物によって産生される（Kuzuyama、２００２年、Biosci  Biotechnol.  Biochem.６６巻：１６１９〜１６２７頁）。イソプレン生合成には２種の経路が存在する：メバロン酸（ＭＶＡ）経路、および１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路としても公知の非メバロン酸（またはメバロン酸非依存的）経路。ＭＶＡ経路は、真核生物、古細菌および高等植物のサイトゾルに存在する（Kuzuyama、２００２年、Biosci.  Biotechnol.  Biochem.６６巻：１６１９〜１６２７頁）。ＤＸＰ経路は、大部分の細菌、緑藻類および高等植物の葉緑体に見出される（Kuzuyama、２００２年、Biosci  Biotechnol.  Biochem.６６巻：１６１９〜１６２７頁）。
【０００４】
イソプレンは、タイヤおよびゴム産業における使用のためのポリイソプレン；履物、医療用品、ラテックス、スポーツ用品における使用のためのエラストマー；接着剤；ならびに薬のためのイソプレノイドの産生に重要なプラットフォーム化学物質である。イソプレンは、代替燃料として利用することもできる。イソプレンは、二量体（１０炭素）および三量体（１５炭素）炭化水素となるよう触媒を使用して化学修飾して、アルケンを作製することができる（Clementら、２００８年、Chem.  Eur.  J.１４巻：７４０８〜７４２０頁；Gordilloら、２００９年、Adv.  Synth.  Catal.３５１巻：３２５〜３３０頁）。これらの分子は、水素化して長鎖分枝状アルカンを作製した後に、ディーゼルまたはジェット燃料代用としての使用に適することができる。
【０００５】
現在、イソプレンの産業使用は、その供給不足により限定されている。大部分の合成ゴムは、イソプレンよりも実質的に毒性が高いブタジエンポリマーに基づく。天然ゴムは、中央および南アメリカならびにアフリカの熱帯雨林由来のゴムノキまたはゴムの木から得られる。イソプレンは、石油から、最も一般的には精製した石油のナフサ部分に存在する炭化水素をクラッキングすることにより調製することもできる。１ガロンの化石ベースのイソプレンを作製するには、約７ガロンの粗製油が必要とされる。天然に産生する生物から得られるイソプレン収量は、商業的に魅力がない。
【０００６】
たゆまぬ努力により、豊富で対費用効果の高い再生可能資源からイソプレンへの微生物による産生が可能になったまたは増強された。特に、Ｅ．ｃｏｌｉ、藻類およびラン藻等、組換え微生物が使用されて、バイオマス由来の供給原料（feedstock）をイソプレンに変換した。しかし、相対的に安価なセルロース性バイオマスを供給原料として使用したとしても、炭水化物供給原料の質量の半分超は酸素で構成されており、これは変換効率における顕著な限界を表す。イソプレンおよびその誘導体（イソプレノイド等）は、供給原料よりも顕著に低い酸素含量を有しており、このことは、酸素を廃棄物として排除しなければならないため、理論上の収量を限定する。よって、炭水化物供給原料からのイソプレンおよびその誘導体の産生の経済的側面は、法外に高価である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kuzuyama、２００２年、Biosci.  Biotechnol.  Biochem.６６巻：１６１９〜１６２７頁
【非特許文献２】Clementら、２００８年、Chem.  Eur.  J.１４巻：７４０８〜７４２０頁
【非特許文献３】Gordilloら、２００９年、Adv.  Synth.  Catal.３５１巻：３２５〜３３０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
イソプレンおよび関係する化合物の産生のための炭水化物に基づく発酵方法に伴う限界に鑑みて、本技術分野において、イソプレンを産生するための、代替的な対費用効果の高い環境に優しい方法の必要がある。本開示は、このような必要を満たし、他の関係する利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
簡単な概要
簡潔に述べると、本開示は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌であって、炭素供給原料をイソプレンに変換することができるメタン資化性細菌を提供する。
【００１０】
イソプレンシンターゼをコードする核酸は、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifolia等、内因性イソプレンシンターゼを含有する任意の生物に由来し得る。ＩｓｐＳをコードする外因性核酸は、メタン資化性細菌における発現のためにさらにコドン最適化することができる。イソプレンシンターゼは、配列番号１〜６のうちいずれか１種を含むアミノ酸配列をさらに含むことができる。イソプレンシンターゼは、Ｎ末端色素体標的化配列を含まなくてもよい。イソプレンシンターゼをコードする核酸は、配列番号１４〜１９のうちいずれか１種をさらに含むことができる。
【００１１】
イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸は、発現制御配列にさらに作動可能に連結され得る。発現制御配列は、さらに、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース（hexulose）−６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸（phsophoenolpyruvate）カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターとなり得る。
【００１２】
天然に存在しないメタン資化性細菌は、内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現する、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換される、またはこれらの組合せである、メタン資化性細菌をさらに含むことができる。ＤＸＰ経路酵素は、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せとなり得る。天然に存在しないメタン資化性細菌は、メバロン酸経路酵素をコードする形質転換された外因性核酸を発現するメタン資化性細菌をさらに含むことができる。メバロン酸経路酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸（phophomevalonate）キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼまたはこれらの組合せであり得る。天然に存在しないメタン資化性細菌は、バリアントＤＸＰ経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸をさらに含むことができる。バリアントＤＸＰ経路酵素は、突然変異ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）および突然変異３，４ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）を含むことができる。
【００１３】
メタン資化性細菌は、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌのイソプレンをさらに産生することができる。
【００１４】
イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ等、メタン資化性細菌に導入することができる。ある特定の実施形態において、メタン資化性細菌は、Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  methanica  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium  petroleiphilumまたはMethylomicrobium  alcaliphilumである。
【００１５】
ある特定の実施形態において、炭素供給原料は、メタン、メタノール、天然ガスまたは非在来型天然ガスである。
【００１６】
本明細書において、イソプレンを産生するための方法であって、炭素供給原料の存在下、イソプレンの産生に十分な条件下で、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌を培養するステップを含む、方法も提供される。本方法は、天然に存在しないメタン資化性細菌に関して記載されている様々な実施形態の使用を含む。ある特定の実施形態において、本方法は、発酵オフガスから産生されたイソプレンを回収するステップをさらに含む。回収されたイソプレンは、二量体（１０炭素）炭化水素、三量体（１５炭素）炭化水素またはこれらの組合せへとさらに改変（modify）することができる。二量体炭化水素、三量体炭化水素またはこれらの組合せは、長鎖分枝状アルカンへとさらに水素化することができる。他の実施形態において、回収されたイソプレンは、イソプレノイド産物へとさらに改変することができる。
【００１７】
別の態様において、本開示は、突然変異メタン資化性細菌をスクリーニングするための方法であって、ａ）前記メタン資化性細菌を突然変異原に曝露して、突然変異メタン資化性細菌を生成するステップと、ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸で、前記突然変異メタン資化性細菌を形質転換するステップと、ｃ）増殖に十分な条件下で、ステップｂ）から得た前記突然変異メタン資化性細菌を培養するステップとを含み、突然変異原に曝露されておらず、ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸で形質転換された参照メタン資化性細菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す突然変異メタン資化性細菌により、赤色色素沈着が増加した前記突然変異メタン資化性細菌が、前記参照メタン資化性細菌と比較して増加したイソプレン前駆体合成を示すことが示される方法を提供する。ある特定の実施形態において、突然変異原は、放射線、化学物質、プラスミドまたはトランスポゾンである。ある特定の実施形態において、赤色色素沈着が増加した突然変異メタン資化性細菌またはそのクローン細胞は、ＩｓｐＳをコードする外因性核酸で形質転換される。さらなる実施形態において、ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする核酸のうち少なくとも１種は、赤色色素沈着が増加した突然変異メタン資化性細菌から除去されるまたはこれにおいて不活性化される。
【００１８】
さらに別の態様において、本開示は、メタン資化性細菌におけるイソプレン経路遺伝子をスクリーニングするための方法であって、ａ）前記メタン資化性細菌を、ｉ）イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸、ｉｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸で形質転換するステップと、ｂ）ステップａ）から得た前記メタン資化性細菌を、増殖に十分な条件下で培養するステップとを含み、ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸で形質転換され、イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸を含有しない参照メタン資化性細菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す前記形質転換されたメタン資化性細菌により、イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、前記参照メタン資化性細菌と比較して増加したイソプレン前駆体合成を付与することが示される方法を提供する。イソプレン経路酵素は、ＤＸＰ経路酵素またはメバロン酸経路酵素を含む。イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸は、異種または同種の核酸を含むことができる。イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸は、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化することができる。同種核酸は、メタン資化性細菌において過剰発現させることができる。イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸は、天然に存在しないバリアントを含むことができる。
【００１９】
本開示は、また、イソプレンが約−３０％〜約−５０％の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、イソプレン組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、イソプレン合成のための１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路を示す。使用されている略語：ＤＸＳ＝１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）シンターゼ；ＤＸＲ＝１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）レダクトイソメラーゼ（reductoisomerase）、ＩｓｐＣとしても公知；ＩｓｐＤ＝４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）シンターゼ；ＩｓｐＥ＝４−ジホスホシチジル（disphophocytidyl）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）キナーゼ；ＩｓｐＦ＝２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ｃＰＰ）シンターゼ；ＩｓｐＧ＝１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）シンターゼ；ＩｓｐＨ＝１−ヒドロキシ−２−メチル−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）レダクターゼ；ＩＤＩ＝イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ、ＩＰＩとしても公知；ＩｓｐＳ＝イソプレンシンターゼ。
【図２】図２は、イソプレン合成のためのメバロン酸（ＭＶＡ）経路を示す。使用されている略語：ＡＡＣＴ＝アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ；ＨＭＧＳ＝ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ）シンターゼ；ＨＭＧＲ＝ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ）レダクターゼ；ＭＫ＝メバロン酸（ＭＶＡ）キナーゼ；ＰＭＫ＝ホスホメバロン酸キナーゼ；ＭＰＤ＝メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、ジホスホメバロン酸（disphosphomevalonate）デカルボキシラーゼ（ＤＰＭＤＣ）としても公知；ＩＤＩ＝イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ；ＩｓｐＳ＝イソプレンシンターゼ。
【図３】図３は、例として、ＩｓｐＳをコードする外因性核酸でメタン資化性菌を形質転換することにより、本開示に提供されているメタン資化性細菌が、イソプレン産生のために低級アルカン（メタン、エタン、プロパン、ブタン）を利用し得る仕方を示す。
【図４】図４は、様々な炭素源のδ１３Ｃ分布を示す。
【図５】図５は、（Ａ）ｐＭＳ３ベクターおよび（Ｂ）ｐＭＳ３［Ｐｍｄｈ＋Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．ＩｓｐＳ］で形質転換されたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株の封入された培養物に由来する、ヘッドスペース試料のＧＣ／ＭＳクロマトグラフを示す。矢印は、イソプレンに相当するピークを示す。Ａにおけるピーク面積の定量化によるイソプレン収量は、検出限界を下回る。Ｂにおけるイソプレン収量は、約１０ｍｇ／Ｌである。
【図６】図６は、メタン資化性宿主細菌へと形質転換して、イソプレン前駆体代謝物の産生の改善に関する突然変異細菌株のスクリーニングに使用することができる、リコペン経路の下部分を示す。使用されている略語：ＧＧＰＰＳ＝ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ｐＬａｃＩｑ−Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｉｓｐＳを含有する発現ベクターで形質転換され、ＩＰＴＧの存在または非存在下で増殖させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株の封入された培養物から得られるヘッドスペース試料における、ＧＣ／ＭＳクロマトグラフによって検出されたイソプレンの量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本開示は、低級アルカン（メタン、エタン、プロパンおよびブタン）等、天然ガスに存在する炭素供給原料からのイソプレンの生合成のための組成物および方法を提供する。例えば、メタン資化性細菌は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸で形質転換され、炭素供給原料（例えば、天然ガス）と共に培養されて、イソプレンを生成する。本明細書に記載されている組換えメタン資化性細菌および関係する方法は、タイヤもしくはゴム産業、医薬品における使用または代替燃料としての使用のための、炭素供給原料からイソプレンへのメタン資化性生物変換を可能にする。
【００２２】
背景として、特に天然ガスの形態におけるメタンは、安価で豊富な天然資源を表す。先に述べた通り、炭水化物に基づく供給原料は、その質量の半分超の酸素を含有する。イソプレンは、酸素分子を全く含有せず、イソプレノイドは、このような供給原料よりもはるかに低い酸素含量を有するため、このことは、変換効率における顕著な限界となる。現在の生合成系の限界の解法は、変換のための供給原料として、天然ガスにおけるメタンまたは他の低級アルカンを利用することである。天然ガス由来のメタンおよび他の低級アルカン（例えば、エタン、プロパンおよびブタン）は、酸素を持たず、変換効率における顕著な改善を可能にする。さらに、天然ガスは、炭水化物供給原料とは対照的に安価で豊富であり、イソプレン産生の経済的側面の改善に寄与する。
【００２３】
本開示において、炭素供給原料からイソプレンへの生物変換は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸を宿主メタン資化性細菌に導入することにより達成される。その上、イソプレン経路に関連するネイティブまたは外因性遺伝子（例えば、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはＩＤＩ）を過剰発現させて、イソプレン前駆体を増加させることにより、宿主メタン資化性細菌の代謝工学を使用して、イソプレン収量を増加させることができる。細菌へとリコペン経路を遺伝子操作して比色分析読み取りをもたらすことにより、イソプレン前駆体産生の増加に関して突然変異メタン資化性細菌をスクリーニングするための方法も提供される。
【００２４】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書に使用される特定の用語の定義を提示することが本開示の理解に役立つ。追加的な定義は、本開示を通して説明される。
【００２５】
本明細書において、用語「約」は、他に断りがなければ、示されている範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「から本質的になる」は、指定されている材料またはステップおよび請求されている発明の基礎および新規特徴に実質的に影響を与えない材料またはステップに特許請求の範囲を限定する。単数形の用語（「ａ」および「ａｎ」）が、本明細書において、列挙されている構成成分の「１個または複数」を指すことを理解されたい。二者択一（例えば、「または」）の使用が、選択肢のいずれか一方、両方またはそれらの任意の組合せを意味すること理解されたい。本明細書において、用語「含む（include）」および「有する」は、同義的に使用されており、これらの用語およびその異形は、非限定的に解釈されるよう企図される。用語「含む（comprise）」は、特許請求の範囲に言及されている記述されている特色、整数、ステップまたは構成成分の存在を意味するが、これは、１種または複数の他の特色、整数、ステップ、構成成分またはこれらの群の存在または追加を妨げない。
【００２６】
本明細書において、「２−メチル−１，３−ブタジエン」としても公知の用語「イソプレン」は、式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２で表される有機化合物を指す。イソプレンは、種々の植物、微生物および動物種によって産生される無色、疎水性、揮発性の液体である。イソプレンは、合成ゴムを含む種々の合成ポリマーに重大な意味を持つ出発材料であり、燃料に使用することもできる。
【００２７】
本明細書において、用語「イソプレン合成経路」、「イソプレン生合成経路」または「イソプレン経路」は、イソプレンを産生するための任意の生合成経路を指す。イソプレン生合成は、一般に、２種の経路を経て達成される：真核生物、古細菌および高等植物のサイトゾルに存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路と、原核生物起源のまたは植物色素体に由来し得る、メチル−エリスリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）または（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸）ＤＸＰ経路としても公知の非メバロン酸経路。イソプレン経路は、公知の生合成経路または遺伝子操作された生合成経路の経路バリアントまたは改変物を含むこともできる。
【００２８】
本明細書において、用語「イソプレノイド」は、イソプレン単位（５炭素分枝鎖イソプレン構造）から合成されたまたはこれを含有する任意の化合物を指す。イソプレノイドは、テルペン、ギンコライド、ステロールおよびカロテノイドを含むことができる。
【００２９】
本明細書において、用語「メバロン酸経路」または「ＭＶＡ経路」は、真核生物および古細菌において一般に存在するイソプレン生合成経路を指す。メバロン酸経路は、図２に記載されている古典的経路と、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）によりメバロン酸リン酸をイソペンテニルリン酸に変換し、これをイソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）によりイソペンテニル二リン酸に変換する経路等、改変されたＭＶＡ経路の両方を含む。
【００３０】
本明細書において、用語「非メバロン酸経路」または「１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路」は、細菌および植物色素体に一般に存在するイソプレン生合成経路を指す。例示的なＤＸＰ経路を図１に示す。
【００３１】
本明細書において、用語「ＤＸＰ」は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を指す。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）は、グリセルアルデヒドおよびピルビン酸の縮合を触媒して、ＤＸＰ経路におけるイソプレンの前駆体分子であるＤＸＰを形成する。
【００３２】
本明細書において、用語「イソプレンシンターゼ」（例えば、ＩｓｐＳ）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３３】
本明細書において、用語「リコペン経路」は、リコペンを産生するための生合成経路を指す。リコペンは、トマトならびに他の赤色果実および野菜に通常存在する鮮紅色カロテノイド色素である。リコペン経路の一例を図６に示す。一般に、真核生物の植物および原核生物におけるリコペン生合成は、同様であり、メバロン酸から始まり、これをジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。ジメチルアリル二リン酸が３分子のＩＰＰと縮合されて、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を産生する。２分子のＧＧＰＰがテイル−テイル様式で縮合されてフィトエンを生じ、これが数回の不飽和化ステップを経て、リコペンを産生する。
【００３４】
本明細書において、用語「宿主」は、イソプレン生合成経路構成成分（例えば、ＩｓｐＳ）で遺伝子改変されて、炭素基質供給原料（例えば、メタン、天然、低級アルカン）をイソプレンに変換することができる微生物（例えば、メタン資化性細菌）を指す。宿主細胞は、イソプレン前駆体合成（例えば、ＤＭＡＰＰまたはＩＰＰ）のための内因性経路を含有することができるか、あるいは遺伝子改変されて、前駆体産生を可能にするまたは増強することができる。その上、宿主細胞は、本明細書に開示されているイソプレン生合成経路とは無関係の所望の特性を付与する他の遺伝子改変を既に保有していてよい。例えば、宿主細胞は、高度な増殖、夾雑物もしくは特定の培養条件の耐性、追加的な炭素基質を代謝する能力または望ましい産物もしくは中間体を合成する能力を付与する遺伝子改変を保有することができる。
【００３５】
本明細書において、用語「メタン資化性菌」、「メタン資化性細菌」または「メタン資化性細菌（複数）」は、主要なまたは唯一の炭素およびエネルギー源として、メタンまたは非在来型天然ガス等、Ｃ１基質を利用することができるメチロトローフ細菌を指す。本明細書において、「メタン資化性細菌」は、炭素およびエネルギー源としてＣ１基質のみを利用することができる「偏性メタン資化性細菌」と、その主要なまたは唯一の炭素およびエネルギー源として、Ｃ１基質に加えて酢酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩またはエタノール等、多炭素基質を天然に使用することができる「通性メタン資化性細菌」を含む。通性メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、ＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2、Methylocystis  bryophila、およびMethylocapsa  aurea  KYG)、およびMethylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)を含む。
【００３６】
本明細書において、用語「Ｃ１基質」または「Ｃ１供給原料」は、炭素−炭素結合を欠く任意の炭素含有分子を指す。例として、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ギ酸塩、メチル化アミン（例えば、モノ、ジおよびトリメチルアミン）、メチル化チオールおよび二酸化炭素が挙げられる。
【００３７】
本明細書において、用語「低級アルカン」は、メタン、エタン、プロパンもしくはブタンまたはこれらの任意の組合せを指す。低級アルカンは、９５〜９８％メタンである「パイプライン品質の天然ガス」もしくは「乾性天然ガス」等、実質的に精製された組成物、または他の炭化水素（例えば、エタン、プロパンおよびブタン）が未だ除去されておらず、メタンが組成物の６０％超を占める「湿性天然ガス」等の未精製の組成物を含むことができる。低級アルカンは、パイプライン品質の乾性天然ガスを生成するための加工の際に湿性天然ガスから分離される様々な炭化水素（例えば、エタン、プロパン、ブタン）を指す、「天然ガス関連炭化水素」としても公知の「液体天然ガス」として提供することもできる。「部分的に分離された湿性天然ガス誘導体」は、液体天然ガスを含む。
【００３８】
本明細書において、用語「天然ガス」は、主にメタンで構成されている天然に存在する炭化水素ガス混合物を指し、これは、１種または複数の他の炭化水素（例えば、エタン、プロパンおよびブタン）、二酸化炭素、窒素および硫化水素を有することができる。天然ガスは、在来型天然ガスおよび非在来型天然ガス（例えば、タイトガスサンド（tight  gas  sand）、ガスシェール（gas  shale）、ガスハイドレート（gas  hydrate）および炭層メタン）を含む。天然ガスは、乾性天然ガス（またはパイプライン品質の天然ガス）または湿性（未加工の）天然ガスを含む。
【００３９】
本明細書において、「組換え」または「トランスジェニック」としても公知の用語「天然に存在しない」は、微生物に関して使用される場合、微生物が、参照種の野生型株を含む参照種の天然に存在する株に正常であれば存在しない少なくとも１種の遺伝子変異（genetic  alternation）を有することを意味する。遺伝子変異は、例えば、タンパク質をコードする発現可能な核酸分子、他の核酸付加、核酸欠失、核酸置換または細菌の遺伝子材料の他の機能破壊を導入する改変を含む。このような改変は、例えば、参照種の異種または同種のポリペプチドのコード領域およびその機能断片を含む。追加的な改変は、例えば、修飾が遺伝子またはオペロンの発現を変更する非コード調節領域を含む。例示的なタンパク質は、イソプレン経路内のタンパク質（例えば、ＩｓｐＳ）を含む。酵素をコードする核酸分子またはその機能断片への遺伝子改変は、その天然に存在する状態から変更された天然に存在しない微生物に、生化学的反応能力もしくは代謝経路能力またはこのような能力の改善を付与することができる。
【００４０】
本明細書において、「外因性」は、参照分子（例えば、核酸）または参照活性（例えば、イソプレンシンターゼ活性）が、宿主微生物に導入されることを意味する。分子は、例えば、宿主染色体への組み込み等、宿主遺伝子材料への核酸の導入により、またはプラスミドにおける等、非染色体遺伝子材料としての核酸の導入により導入することができる。コード核酸の発現に関してこの用語が使用される場合、これは、宿主微生物への発現可能な形態でのコード核酸の導入を指す。この用語は、酵素またはタンパク質活性に関して使用される場合、宿主参照微生物に導入される活性を指す。したがって、用語「内因性」または「ネイティブ」は、宿主微生物に存在する参照分子または活性を指す。用語「キメラ」は、核酸に関して使用される場合、本来であれば共に存在しない配列を含む、内因性ではない任意の核酸を指す。例えば、キメラ核酸は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、本来存在する様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むことができる。用語「異種」は、参照種または株以外の供給源に由来する分子または活性を指し、一方、「同種」は、その宿主微生物に由来する分子または活性を指す。したがって、本開示に提供されている外因性核酸を含む微生物は、異種または同種の核酸のいずれか一方または両方を利用することができる。
【００４１】
微生物に外因性核酸が含まれる場合、外因性核酸が、上に記す参照コード核酸またはタンパク質活性を指すことが理解される。このような外因性核酸を、別々の核酸分子、ポリシストロニック核酸分子、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子またはこれらの組合せにおいて宿主微生物に導入することができ、これが依然として２種以上の外因性核酸として考慮されることも理解される。例えば、本明細書に開示されている通り、微生物を改変して、イソプレン経路由来の酵素（例えば、イソプレンシンターゼ）をコードする１種または複数の外因性核酸を発現させることができる。イソプレン経路由来の酵素をコードする２種の外因性核酸が宿主微生物に導入される場合、２種の外因性核酸を、単一の核酸分子として例えば、単一のプラスミドにおいて、または別々のプラスミドにおいて導入することができ、宿主染色体の単一の部位または複数の部位に組み込むことができ、これが依然として２種の外因性核酸と考慮されることが理解される。同様に、宿主微生物に３種以上の外因性核酸分子を、いずれか所望の組合せで、例えば、単一のプラスミドまたは別々のプラスミドにおいて導入することができ、宿主染色体の単一の部位または複数の部位に組み込むことができ、これが依然として２種以上の外因性核酸と考慮されることが理解される。よって、参照外因性核酸または酵素活性の数は、宿主微生物に導入された別々の核酸分子の数ではなく、コード核酸の数またはタンパク質活性の数を指す。
【００４２】
本明細書において、ポリヌクレオチドとしても公知の「核酸」は、共有結合により連結された、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットで構成された高分子化合物を指す。核酸は、両者共に一本鎖であっても二本鎖であってもよい、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡを含む。
【００４３】
本明細書において、「過剰発現された」は、遺伝子またはタンパク質に関して使用される場合、遺伝子またはタンパク質の発現または活性の増加を指す。増加された発現または活性は、発現または活性または遺伝子またはタンパク質が、野生型（非遺伝子操作）対照または参照微生物におけるそのレベルを上回って増加する場合を含む。正常に発現されないまたは正常な活性を持たない微生物において発現または活性が為される場合、遺伝子またはタンパク質は過剰発現される。野生型対照または参照微生物よりも長い期間微生物において発現または活性が存在する場合、遺伝子またはタンパク質は過剰発現される。
【００４４】
宿主メタン資化性細菌
形質転換は、宿主微生物のゲノムへの核酸（例えば、外因性核酸）の移入を指し、遺伝的に安定的な継承をもたらす。形質転換された核酸を含有する宿主微生物は、「天然に存在しない」または「組換え」または「形質転換された」または「トランスジェニック」微生物と称される。宿主微生物は、炭素およびエネルギー源としてメタンを酸化する能力を有する細菌を一般に含む、メタン資化性細菌から選択することができるか、またはそれから作製された天然に存在しない微生物となり得る。
【００４５】
メタン資化性細菌は、その炭素同化経路および内部膜構造に基づき３群に分類される：Ｉ型（ガンマプロテオバクテリア）、ＩＩ型（アルファプロテオバクテリア）およびＸ型（ガンマプロテオバクテリア）。Ｉ型メタン資化性菌は、炭素同化のためにリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）経路を使用し、一方、ＩＩ型メタン資化性菌は、セリン経路を使用する。Ｘ型メタン資化性菌は、ＲｕＭＰ経路を使用するが、セリン経路の低レベルの酵素も発現する。メタン資化性細菌は、いくつかの属にグループ化される：Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylocystis、Methylosinus、Methylomicrobium、Methanomonas、およびMethylocella。
【００４６】
メタン資化性細菌は、唯一の炭素およびエネルギー源として一部の多炭素基質を利用する能力を天然に有する、偏性メタン資化性菌および通性メタン資化性菌を含む。通性メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、ＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、およびMethylocapsa  aurea  KYG）を含む。例示的なメタン資化性細菌種は、Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium  petroleiphilum、およびMethylomicrobium  alcaliphilumを含む。
【００４７】
選択されるメタン資化性宿主細菌は、選択的条件下における株適応に付して、産生に関する特性が改善されたバリアントを同定することもできる。改善された特性は、増加された増殖速度、所望の産物の収量および可能性のあるプロセス夾雑物の耐性を含むことができる（例えば、Ｕ．Ｓ．６，６８９，６０１を参照）。特定の実施形態において、高増殖バリアントメタン資化性細菌は、唯一の炭素およびエネルギー源としてのメタンで増殖することができる生物であり、その親、参照または野生型細菌よりも速い対数期増殖速度（即ち、より短い倍加時間）を保有する。
【００４８】
イソプレン合成経路、核酸およびポリペプチド
本開示は、イソプレンを産生する能力により遺伝子操作されたメタン資化性細菌を提供する。ＤＸＰ経路の上部分を含む酵素は、多くのメタン資化性細菌に存在する。しかし、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）からイソペンテニル（isoprentenyl）二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（dipshophate）（ＤＭＡＰＰ）への変換後に、現在公知のメタン資化性菌は、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換するためのイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）を欠く。代わりに、メタン資化性菌は、ゲラニルトランスフェラーゼおよびファルネシル二リン酸（disphosphate）シンターゼ（ＩｓｐＡ）によりＤＭＡＰＰをファルネシル二リン酸に変換し、次にこれをカロテノイドに変換する（例えば、米国特許第７，１０５，６３４号を参照）。
【００４９】
ある特定の実施形態において、本開示は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌であって、炭素供給原料をイソプレンに変換することができるメタン資化性細菌を提供する。イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸により形質転換されたメタン資化性細菌は、一般に、図１に示すＤＸＰ経路を使用して、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸をイソプレンに変換することができる。
【００５０】
イソプレンシンターゼ核酸およびポリペプチド配列は、本技術分野において公知のものであり、イソプレンシンターゼを天然に保有する任意の生物から得ることができる。ＩｓｐＳ遺伝子は、例えば、ポプラ、アスペンおよびクズ（kudzu）を含む多数の植物から単離およびクローニングされてきた。多数の細菌が、ＤＸＰ経路を保有するが、原核生物由来のｉｓｐＳ遺伝子の配列は、現在のいかなるデータベースにおいても利用できない（例えば、Xueら、２０１１年、Appl.  Environ.  Microbiol.７７巻：２３９９〜２４０５頁を参照）。ある特定の実施形態において、イソプレンシンターゼをコードする核酸は、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaに由来する。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるイソプレンシンターゼの核酸配列の例として、受託番号ＡＢ１９８１８０（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、ＡＹ３４１４３１（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ＡＪ２９４８１９（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ×Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）、ＡＹ３１６６９１（Ｐｕｅｒａｒｉａ  Ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）、ＨＱ６８４７２８（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）およびＥＵ６９３０２７（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドの例を表１に示す。下線が引かれた配列は、切断型バージョンにおいて除去されるＮ末端色素体標的化配列を表す。ある特定の実施形態において、外因性核酸は、配列番号１〜６のうちいずれか１種に示されているアミノ酸配列を有するイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする。
【表１−１】
2016508737.tif 000003
【表１−２】
2016508737.tif 000004
【表１−３】
2016508737.tif 000005
【００５１】
本明細書に記載されている組成物および方法における使用のためのイソプレンシンターゼ核酸およびポリペプチド配列は、溶解性、発現、安定性、触媒活性および代謝回転速度が改善されたバリアントを含む。例えば、これにより本明細書にその全体が組み込まれる米国特許第８，１７３，４１０号は、溶解性、発現および活性が増強された特異的イソプレンシンターゼアミノ酸置換を開示する。
【００５２】
ある特定の実施形態において、内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現させて、または外因性ＤＸＰ経路遺伝子を宿主メタン資化性菌に導入して、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ産生ならびにイソプレン収量を増大することが望ましくなり得る。ある特定の実施形態において、本明細書に提供されているイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌は、内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して内因性ＤＸＰ経路酵素をさらに過剰発現する、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換される、またはこれらの両方である。「内因性」または「ネイティブ」は、宿主メタン資化性細菌に存在する参照分子または活性を指す。さらなる実施形態において、本明細書に提供されているイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌は、２、３、４、５、６、７、８種以上の内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して、２、３、４、５、６、７、８種以上の内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現する；２、３、４、５、６、７、８種以上のＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換される；またはこれらの任意の組合せである。ＤＸＳ等、ＤＸＰ経路由来の内因性酵素の過剰発現は、イソプレン産生を増強することができる（Xue  and  Ahring、２０１１年、Applied  Environ.  Microbiol.７７巻：２３９９〜２４０５頁）。理論に制約されることは望まないが、ＤＸＳの量の増加が、ＤＸＰ経路を通る炭素の流動を増加させ、イソプレン産生の増加をもたらすことが考えられる。ある特定の実施形態において、液体クロマトグラフィー・質量分析を使用した代謝物プロファイリングを使用して、イソプレン合成経路におけるボトルネックおよび過剰発現させるべき酵素を同定する（例えば、Piteraら、２００７年、Metabolic  Engineering  ９巻：１９３〜２０７頁を参照）。
【００５３】
宿主生物において核酸を過剰発現させるための方法は、本技術分野において公知のものである。過剰発現は、内因性ＤＸＰ経路酵素をコードする核酸またはＤＸＰ経路酵素をコードする外因性（例えば、異種）核酸のコピーを宿主メタン資化性細菌に導入することにより達成することができる。例として、内因性ＤＸＳ酵素をコードする核酸は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸と共に宿主メタン資化性細菌を形質転換することができるか、あるいは、非宿主メタン資化性（methantrophic）種に由来するＤＸＳ酵素をコードする外因性核酸は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸と共に宿主メタン資化性細菌を形質転換することができる。内因性ＤＸＰ経路酵素の過剰発現は、内因性プロモーターまたは調節領域を、転写増強をもたらすプロモーターまたは調節領域に置き換えることにより達成することもできる。
【００５４】
ある特定の実施形態において、宿主メタン資化性細菌において過剰発現されるＤＸＰ経路酵素は、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せである。一部の実施形態において、宿主メタン資化性菌において過剰発現されるＤＸＰ経路酵素は、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦまたはこれらの組合せである。
【００５５】
ＤＸＰ経路酵素の供給源は、本技術分野において公知のものであり、幅広い種類の植物および細菌種を含むＤＸＰ経路を天然に保有する任意の生物に由来し得る。例えば、ＤＸＰ経路酵素は、Bacillus  anthracis、Helicobacter  pylori、Yersinia  pestis、Mycobacterium  tuberculosis、Plasmodium  falciparum、Mycobacterium  marinum、Bacillus  subtilis、Escherichia  coli、Aquifex  aeolicus、Chlamydia  muridarum、Campylobacter  jejuni、Chlamydia  trachomatis、Chlamydophila  pneumoniae、Haemophilus  influenzae、Neisseria  meningitidis、Synechocystis、Methylacidiphilum  infernorum  V4、Methylocystis  sp.  SC2、Methylomonas  16A株、Methylococcus  capsulatus  Bath株、Scenedesmus  oliquusを含む一部の単細胞藻類と共に、Arabidopsis  thaliana、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaを含む大部分の植物種の色素体に存在し得る。
【００５６】
ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＤＸＳの核酸配列の例として、受託番号AF035440、(Escherichia  coli);Y18874(Synechococcus  PCC6301);AB026631(Streptomyces  sp.  CL190);AB042821(Streptomyces  griseolosporeus);AF11814(Plasmodium  falciparum);AF143812(Lycopersicon  esculentum);AJ279019(Narcissus  pseudonarcissus);AJ291721(Nicotiana  tabacum);AX398484.1(Methylomonas  16A株);NC_010794.1(領域1435594..1437486、補体)(Methylacidiphilum  infernorum  V4);および  NC_018485.1(region  2374620..2376548)(Methylocystis  sp.  SC2)が挙げられる。
【００５７】
ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＤＸＲの核酸配列の例として、受託番号AB013300(Escherichia  coli);AB049187(Strepomyces  griseolosporeus);AF111813(Plasmodium  falciparum);AF116825(Mentha  x  piperita);AF148852(Arabidopsis  thaliana);AF182287(Artemisia  annua);AF250235(Catharanthus  roseus);AF282879(Pseudomonas  aeruginosa);AJ242588(Arabidopsis  thaliana);AJ250714(Zymomonas  mobilis  ZM4株);AJ292312(Klebsiella  penumoniae);AJ297566(Zea  mays);および  AX398486.1(Methylomonas  16A株)が挙げられる。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＩｓｐＤの核酸配列の例として、受託番号AB037876(Arabidopsis  thaliana);AF109075(Clostridium  difficile);AF230736(E.  coli);AF230737(Arabidopsis  thaliana);および  AX398490.1(Methylomonas  16A株)が挙げられる。
【００５８】
ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＩｓｐＥの核酸配列の例として、受託番号AF216300(Escherichia  coli);AF263101(Lycopersicon  esculentum);AF288615(Arabidopsis  thaliana);および  AX398496.1(Methylomonas  16A株)が挙げられる。
【００５９】
ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＩｓｐＦの核酸配列の例として、受託番号AF230738(Escherichia  coli);AB038256(Escherichia  coli);AF250236(Catharanthus  roseus);AF279661(Plasmodium  falciparum);AF321531(Arabidopsis  thaliana);およびAX398488.1(Methylomonas  16A株)が挙げられる。
【００６０】
ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＩｓｐＧの核酸配列の例として、受託番号AY033515(Escherichia  coli)  YP_005646(Thermus  thermopilus)、およびYP_475776.1(Synechococcus  sp.)が挙げられる。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＩｓｐＨの核酸配列の例として、受託番号AY062212(Escherichia  coli)、YP_233819.1(Pseudomonas  syringae)、およびYP_729527.1(Synechococcus  sp.)が挙げられる。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるＩＤＩの核酸配列の例として、受託番号AF119715(E.  coli)、P61615(Sulfolobus  shibatae)、およびO42641(Phaffia  rhodozyme)が挙げられる。
【００６１】
様々な実施形態において使用することができるＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株（ＡＴＣＣ  ３３００９）由来のＤＸＰ経路酵素のアミノ酸配列を表２に示す。
【表２−１】
2016508737.tif 000006
【表２−２】
2016508737.tif 000007
【表２−３】
2016508737.tif 000008
【００６２】
当業者であれば、宿主メタン資化性細菌に導入される各ＤＸＰ経路酵素の供給源が同じであってよい、宿主メタン資化性細菌に導入される２種以上のＤＸＰ経路酵素の供給源が同じであってもよい、または宿主メタン資化性細菌に導入される各ＤＸＰ経路酵素の供給源が互いに異なっていてもよいことが理解できる。ＤＸＰ経路酵素の供給源（複数可）は、ＩｓｐＳの供給源と同じであっても異なっていてもよい。ある特定の実施形態において、２種以上の供給源に由来する核酸によるハイブリッド経路が使用されて、イソプレン産生を増強する（例えば、Yangら、２０１２年、PLoS  ONE  ７巻：ｅ３３５０９を参照）。
【００６３】
代替経路を経てイソプレン前駆体ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの合成を増加させることにより、イソプレン産生を増大させることも望ましくなり得る。例として、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰは、メバロン酸経路を経て合成することもできる（図２を参照）。理論に制約されることは望まないが、細胞におけるＤＭＡＰＰおよびＩＰＰポリペプチドの量の増加が、産生されるイソプレンの量を増加し得ることが考えられる。現在のところ、内因性メバロン酸経路は、完全に配列決定されたいくつかのメタン資化性細菌において未だ同定されていない。しかし、メバロン酸経路は、いくつかの細菌種において同定されている。メバロン酸経路が、宿主メタン資化性菌に存在しない場合、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰ前駆体の産生のためのメバロン酸経路の構築に必要な遺伝子を導入することが望ましくなり得る。メバロン酸経路が、宿主メタン資化性菌に存在する場合、ある特定のメバロン酸経路遺伝子を導入または過剰発現させて、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの産生を増強することも望ましくなり得る。ある特定の実施形態において、ＩｓｐＳをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌は、ネイティブメバロン酸経路酵素の正常発現レベルと比較して内因性メバロン酸経路酵素を過剰発現する、メバロン酸経路酵素をコードする形質転換された外因性核酸を発現する、またはこれらの組合せである。さらなる実施形態において、本明細書に提供されているＩｓｐＳをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌は、それぞれの内因性メバロン酸経路酵素の正常発現レベルと比較して、１、２、３、４、５、６種以上の内因性メバロン酸経路酵素を過剰発現する；１、２、３、４、５、６種以上のメバロン酸経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換される；またはその両方である。
【００６４】
メタン資化性菌へのメバロン酸経路の遺伝子操作または内因性メバロン酸経路の増強は、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰ前駆体の供給を増加させることにより、イソプレン産生を増強し得る（例えば、Martinら、２００３年、Nature  Biotechnol.２１巻：７９６〜８０２頁を参照）。ある特定の実施形態において、液体クロマトグラフィー・質量分析を使用した代謝物プロファイリングを使用して、イソプレン合成経路におけるボトルネックおよび過剰発現させるべき酵素を同定する（例えば、Piteraら、２００７年、Metabolic  Engineering  ９巻：１９３〜２０７頁を参照）。過剰発現は、内因性メバロン酸経路酵素をコードする核酸またはメバロン酸経路酵素をコードする外因性（即ち、異種）核酸を宿主メタン資化性細菌に導入することにより達成することができる。例として、内因性メバロン酸（mevlaonate）酵素をコードする核酸のコピーは、非宿主メタン資化性種に由来するＩｓｐＳをコードする外因性核酸またはメバロン酸酵素をコードする外因性核酸と共に、宿主メタン資化性細菌を形質転換することができ、ＩｓｐＳをコードする外因性核酸と共に、宿主メタン資化性細菌を形質転換することができる。内因性メバロン酸経路酵素の過剰発現は、内因性プロモーターまたは調節領域を、転写増強をもたらすプロモーターまたは調節領域に置き換えることにより達成することもできる。ある特定の実施形態において、宿主メタン資化性細菌において過剰発現されるメバロン酸経路酵素は、ＡＡＣＴ、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＭＫ、ＰＭＫ、ＭＰＤ、ＩＤＩまたはこれらの組合せである。一部の実施形態において、Ａｌａ１１０Ｇｌｙ置換（反応速度を増加させる）を有するポリペプチドをコードする突然変異ＨＭＧＳ核酸が、宿主メタン資化性細菌に導入される（Steussyら、２００６年、Biochem.４５巻：１４４０７〜１４頁）。
【００６５】
メバロン酸経路酵素の供給源は、本技術分野において公知のものであり、幅広い種類の植物、動物、真菌、古細菌および細菌種を含む、メバロン酸経路を天然に保有する任意の生物に由来し得る。例えば、メバロン酸経路酵素は、Caldariella  acidophilus、Halobacterium  cutirubrum、Myxococcus  fulvus、Chloroflexus  aurantiacus、Saccharomyces  cerevisiae、Schizosaccharomyces  pombe、Caenorhabditis  elegans、Arabidopsis  thaliana、Lactobacillus  plantarum、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  carnosus、Staphylococcus  haemolyticus、Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  mutans、Streptococcus  pneumoniae、Streptococcus  pyogenes、Streptomyces  aeriouvifer、Borrelia  burgdorferi、Chloropseudomonas  ethylica、Myxococcus  fulvus、Euglena  gracilis、Enterococcus  faecalis、Enterococcus  faecium、Archaeoglobus  fulgidus、Methanobacterium  thermoautotrophicum、Methanococcus  jannaschii、Homo  sapiens、Enterococcus  gallinarum、Enterococcus  casseliflavus、Listeria  grayi、Methanosarcina  mazei、Methanococcoides  buronii、Lactobacillus  sakei、およびStreptomyces  CL190に存在し得る。当業者であれば、メタン資化性宿主細菌に導入される各メバロン酸経路酵素の供給源が同じであってよい、２種以上のメバロン酸経路酵素の供給源が同じであってもよい、あるいは各メバロン酸経路酵素の供給源が互いに異なっていてもよいことが理解できる。メバロン酸経路酵素の供給源（複数可）は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）の供給源と同じであっても異なっていてもよい。ある特定の実施形態において、２種以上の供給源に由来する核酸によるハイブリッド経路が使用されて、イソプレン産生を増強する（Yangら、２０１２年、PLoS  ONE  ７巻：ｅ３３５０９）。
【００６６】
ある特定の実施形態において、ＩｓｐＳをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌は、本明細書に記載されている遺伝子改変されたＤＸＰおよびメバロン酸経路をさらに含むことができる。例えば、本明細書に記載されている天然に存在しないメタン資化性細菌は、内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現することができるか、ＤＸＰ経路酵素をコードする形質転換された外因性核酸を発現するか、またはその両方であり；ネイティブメバロン酸経路酵素の正常発現レベルと比較して内因性メバロン酸経路酵素を過剰発現する、メバロン酸経路酵素をコードする形質転換された外因性核酸を発現する、またはその両方である；あるいはこれらの任意の組合せである。先に述べた通り、あらゆるＤＸＰおよびメバロン酸経路酵素の供給源が同じであってよい、一部のＤＸＰまたはメバロン酸経路酵素の供給源が同じであってもよい、あるいはＤＸＰおよびメバロン酸経路酵素の供給源は全て互いに異なっていてもよい。
【００６７】
本開示の天然に存在しないメタン資化性細菌は、バリアントイソプレン生合成経路または酵素を含むよう遺伝子操作することもできる。イソプレン合成経路における変種は、経路の１または複数の個々のステップにおいて生じ得る、あるいは完全に新しい経路に関与し得る。特定の経路反応は、公知のイソプレン酵素に対する配列、構造または触媒類似性を持たなくてよい異なるクラスの酵素によって触媒され得る。例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ２３０８は、ＤＸＲを除くＤＸＰ経路の遺伝子を含有する。代わりに、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ２３０８は、ＤＸＲ様遺伝子（ＤＲＬ）を使用して、ＤＸＰからの２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）の形成を触媒する（Sangariら、２０１０年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０７巻：１４０８１〜１４０８６頁）。別の例において、それぞれピルビン酸デヒドロゲナーゼおよび３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼの触媒Ｅサブユニットをコードする突然変異ａｃｅＥおよびｒｉｂＥ遺伝子が同定され、これらはそれぞれ、ＤＸＳ欠損突然変異細菌をレスキューすることができ、バリアントＤＸＰ経路を経てＤＸＰを産生する（Perez-Gilら、２０１２年、PLoS  ONE  ７巻：ｅ４３７７５）。さらに別の例において、様々な型のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼも同定された（Kanedaら、２００１年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９８巻：９３２〜７頁；Laupitzら、２００４年、Eur.  J.  Biochem.２７１巻：２６５８〜６９頁）。ＤＸＰおよびメバロン酸経路に加えて、代替的イソプレン合成経路が存在することもできる（Poliquinら、２００４年、J.  Bacteriol.１８６巻：４６８５〜４６９３頁；Ershovら、２００２年、J  Bacteriol.１８４巻：５０４５〜５０５１頁を参照）。ある特定の実施形態において、特定の経路反応は、ＤＲＬ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼの触媒Ｅサブユニット、バリアントイソペンテニル二リン酸イソメラーゼまたはこれらの任意の組合せ等、バリアントまたは代替的イソプレン酵素により触媒される。
【００６８】
イソプレン経路構成成分をコードする核酸（例えば、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする核酸）は、コードされたイソプレン経路ポリペプチドの少なくとも１種の活性（例えば、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力）を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。本技術分野において公知の方法を使用して、基質を産物に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドが、特定の活性を有するか決定することができる（例えば、Silverら、１９９５年、J.  Biol.  Chem.２７０巻：１３０１０〜１３０１６頁を参照）。
【００６９】
数百種の生物に利用できる完全ゲノム配列により、例えば、ホモログ、オルソログ、パラログ等を含む、近縁または遠縁種におけるイソプレンシンターゼおよび他のイソプレン経路酵素をコードする遺伝子の同定は、本技術分野において周知のものである。したがって、特定の生物由来の特定の核酸を参照しつつ本明細書に記載されているイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ等をコードする外因性核酸は、他の生物由来のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ等をコードする他の核酸を容易に含むことができる。
【００７０】
イソプレンシンターゼおよび他のイソプレン経路酵素等、本明細書に記載されているタンパク質、タンパク質ドメインおよびこれらの断片のポリペプチド配列およびコード核酸は、天然におよび組換えにより遺伝子操作されたバリアントを含むことができる。核酸バリアントは、１個または複数の置換、付加、欠失、挿入を含有し得る、あるいは参照核酸の断片（複数可）となり得るまたはこれを含み得る核酸を指す。参照核酸は、特定のイソプレン経路酵素（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする選択された野生型または親核酸を指す。バリアント核酸が、その必要な機能または生物学的活性（例えば、ＩｓｐＳに関して、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する）を依然として行うことができるポリペプチドをコードする限りにおいて、バリアント核酸は、参照核酸に対して４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％，７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することができる。バリアントポリペプチドが、その必要な機能または生物学的活性（例えば、ＩｓｐＳに関して、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する）を依然として行うことができる限りにおいて、バリアントポリペプチドは、参照タンパク質に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することができる。ある特定の実施形態において、本明細書に提供されている天然に存在しないメタン資化性細菌に導入されるイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）は、配列番号１〜６に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％，少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのバリアントは、親（または野生型）タンパク質よりも改善された機能および生物学的活性（例えば、より高い酵素活性、基質に対する改善された特異性またはより高い代謝回転速度）を有することができる。遺伝暗号における冗長性により、核酸バリアントは、アミノ酸配列に影響を与えても与えなくてもよい。
【００７１】
核酸バリアントは、参照アミノ酸配列と比較して、１個または複数の保存的置換を含むアミノ酸配列をコードすることもできる。保存的置換は、ポリペプチドにおいて天然に生じ得る（例えば、天然に存在する遺伝的バリアント）、あるいはポリペプチドが組換えにより産生される際に導入され得る。保存的置換は、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標性質が実質的に未変化となることを当業者が予想するような、あるアミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸に置換される置換である。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性または両親媒性性質における類似性に基づいて為すことができ、本技術分野において公知のものである。
【００７２】
アミノ酸の置換、欠失および付加は、周知のルーチンに実施されている突然変異誘発方法を使用して、ポリペプチドに導入することができる（例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、NY、２００１年を参照）。オリゴヌクレオチド指定部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発手順を用いて、所望の置換、欠失または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更されたポリヌクレオチドをもたらすことができる。タンパク質の欠失または切断バリアントは、所望の欠失に隣接する簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することにより構築することもできる。あるいは、アラニンスキャニング突然変異誘発、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発およびオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発等、ランダム突然変異誘発技法を使用して、ポリペプチドバリアントを調製することができる（例えば、Sambrookら、上記を参照）。
【００７３】
野生型（または親または参照）核酸またはポリペプチドおよびこれらのバリアントの間の差を公知の方法により決定して、検査した配列間に最大のマッチをもたらすよう設計された同一性を決定することができる。配列同一性を決定するための方法は、公開されているコンピュータプログラムから適用することができる。２配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法は、例えば、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ（Altschul,  S.F.ら、J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）およびＦＡＳＴＡ（Pearson  and  Lipman、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻；２４４４〜２４４８頁（１９８８年））を含む。
【００７４】
ポリペプチドバリアントが、非バリアントポリペプチドまたは断片に匹敵する立体構造へとフォールドするか決定するためのアッセイは、例えば、ネイティブまたはアンフォールドエピトープに特異的なモノまたはポリクローナル抗体と反応するタンパク質の能力、リガンド結合機能の保持、酵素活性の保持（該当する場合）およびプロテアーゼによる消化に対する突然変異タンパク質の感受性または抵抗性を含む（Sambrookら、上記を参照）。ポリペプチド、バリアントおよびこれらの断片は、得られたタンパク質分子の生物学的活性を変更することなく（即ち、統計学的に有意なまたは生物学的に有意な様式で１種または複数の機能活性を変更することなく）調製することができる。例えば、このような置換は、一般に、アミノ酸を、極性残基、荷電残基、疎水性残基、または小分子残基その他の群等の同じ群内に含まれる別のアミノ酸と相互交換することによって為される。いずれかのアミノ酸置換の効果は、単に、生物学的アッセイにおいて機能するまたは同族リガンドもしくは標的分子に結合する能力に関して得られた修飾タンパク質を検査することにより、経験的に決定することができる。
【００７５】
ある特定の実施形態において、宿主メタン資化性細菌に導入されるＩｓｐＳまたは他のイソプレン経路酵素をコードする外因性核酸は、Ｎ末端色素体標的化配列を含まない。一般に、多くの植物イソプレンシンターゼおよび他のイソプレン経路酵素等、葉緑体タンパク質は、核にコードされており、サイトゾルにおいて前駆体として合成される。シグナルペプチドまたは輸送ペプチドとしても公知のＮ末端色素体標的化配列は、葉緑体包膜への標的化に必要とされるシグナルをコードし、このシグナルは、葉緑体移入後にペプチダーゼにより開裂除去される。Ｎ末端標的化配列の除去は、異種核酸の発現を増強することができる。Ｎ末端色素体標的化配列は、ＣｈｌｏｒｏＰ（Emannuelssonら、１９９９年、Protein  Sci.８巻：９７８〜９８４頁）；ＰＬＣＲ（Scheinら、２００１年、Nucleic  Acids  Res.２９巻：ｅ８２）；ＭｕｌｔｉＰ（http://sbi.postech.ac.kr/MultiP/）を含む、本技術分野において公知の予測プログラムを使用して決定することができる。Ｎ末端色素体標的化配列は、メタン資化性細菌への導入に先立ち、組換え手段により核酸から除去することができる。ある特定の実施形態において、Ｎ末端色素体標的化配列を欠くＩｓｐＳのアミノ酸配列は、配列番号２、４および６のうちいずれか１種に示されている。他の実施形態において、宿主メタン資化性細菌に導入されるイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）または他のイソプレン経路酵素をコードする外因性核酸は、他の細胞小器官、例えば、アピコプラストまたは小胞体に対する標的化配列を含まない。
【００７６】
ある特定の実施形態において、イソプレンシンターゼまたは他のイソプレン経路酵素をコードする外因性核酸は、発現制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、それに動作可能に連結された核酸の転写を方向づける核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター（例えば、構成的、リーキーまたは誘導性）またはエンハンサーを含む。ある特定の実施形態において、発現制御配列は、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＭＤＨ）、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである。理論に制約されることは望まないが、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターは、メタン資化性細菌における異種ポリペプチドの発現を可能にする変動する強度のプロモーターを提供する。
【００７７】
ある特定の実施形態において、ＩｓｐＳをコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。誘導性プロモーター系は、本技術分野において公知のものであり、テトラサイクリン誘導性プロモーター系；ＩＰＴＧ／ｌａｃオペロン誘導性プロモーター系、熱ショック誘導性プロモーター系；金属応答性プロモーター系；ナイトレート誘導性プロモーター系；光誘導性プロモーター系；エクジソン誘導性プロモーター系等を含む。例えば、天然に存在しないメタン資化性菌は、ｌａｃＯオペレーター配列に隣接したプロモーターに作動可能に連結されたイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸を含むことができ、構成的プロモーター（例えば、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼプロモーター）に作動可能に連結されたｌａｃＩリプレッサータンパク質をコードする外因性核酸も含む。ＬａｃＩリプレッサータンパク質は、ＩｓｐＳプロモーターに隣接するｌａｃＯオペレーター配列に結合し、転写を防止する。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーに結合して、ｌａｃＯ配列からこれを放出させて、転写を可能にする。誘導性プロモーター系を使用することにより、イソプレン合成は、誘導因子の添加により制御することができる。ＩｓｐＳまたは他のイソプレン経路酵素をコードする核酸は、他の核酸配列、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントその他と組み合わせることもできる。
【００７８】
ある特定の実施形態において、ＤＸＰ経路酵素およびイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）またはメバロン酸経路酵素およびイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）の発現の強度およびタイミングを、本技術分野において公知の方法を使用してモジュレートして、イソプレン産生を改善することができる。例えば、変動するプロモーター強度または遺伝子コピー数を使用して、発現レベルをモジュレートすることができる。別の例において、発現のタイミングは、配置された遺伝子順による誘導性プロモーター系またはポリシストロニックオペロンを使用することによりモジュレートすることができる。例えば、ＤＸＰ経路酵素およびイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）またはメバロン酸経路酵素およびイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）の発現は、培養の増殖期および定常期においてまたは定常期のみにおいて発現させることができる。別の例において、イソプレンＤＸＰ経路酵素およびＩｓｐＳまたはメバロン酸経路酵素およびＩｓｐＳは、順序付けられた同時発現に付すことができる。様々なＤＸＰ経路酵素をコードする核酸の順序付けられた同時発現は、イソプレン産生を増強することが見出された（Lvら、２０１２年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.、「Significantly  enhanced  production  of  isoprene  by  ordered  coexpression  of  genes  dxs,  dxr,  and  idi  in  Escherichia  coli」、オンラインで公表、２０１２年１１月１０日）。
【００７９】
コドン最適化
組換えタンパク質の発現は、多くの場合、その本来の宿主の外では困難である。例えば、細菌の異なる種にわたり、コドン使用の偏りにおける変種が観察された（Sharpら、２００５年、Nucl.  Acids.  Res.３３巻：１１４１〜１１５３頁）。組換えタンパク質の過剰発現は、そのネイティブ宿主内であっても、同様に困難となり得る。本発明のある特定の実施形態において、本発明の微生物に導入するべき核酸（例えば、イソプレンシンターゼをコードする核酸）は、タンパク質発現を増強するためのコドン最適化に付すことができる。コドン最適化は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変更することのない、宿主生物の典型的コドン使用を反映するための、生物の形質転換のための核酸の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更を指す。ある特定の実施形態において、ＩｓｐＳ、他のイソプレン経路構成成分またはリコペン経路構成成分をコードする外因性核酸は、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される。異種生物における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、本技術分野において公知のものであり、以前に記載されている（例えば、Welchら、２００９年、PLoS  One  ４巻：ｅ７００２；Gustafssonら、２００４年、Trends  Biotechnol.２２巻：３４６〜３５３頁；Wuら、２００７年、Nucl.  Acids  Res.３５巻：Ｄ７６〜７９；Villalobosら、２００６年、BMC  Bioinformatics  ７巻：２８５頁；米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１３号；および米国特許出願公開第２００８／０２９２９１８号を参照）。
【００８０】
Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株における発現のためにコドン最適化されたイソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）ポリヌクレオチド配列の例を表３に示す。配列番号１５、１７および１９は、そのＮ末端色素体標的化配列を欠くそれぞれＰｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ、Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａおよびＳａｌｉｘに由来する切断型ＩｓｐＳ配列である。配列番号１４、１６および１８は、それぞれＰｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ、Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａおよびＳａｌｉｘに由来する全長ＩｓｐＳ配列（Ｎ末端色素体標的化配列あり）である。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【００８１】
メタン資化性菌の例示的な培養
本明細書に記載されている天然に存在しないメタン資化性細菌は、本技術分野において周知の材料および方法を使用して培養することができる。ある特定の実施形態において、天然に存在しないメタン資化性細菌は、宿主メタン資化性細胞に導入された１種または複数の核酸（例えば、ＩｓｐＳ）の発現を可能にする条件下で培養される。
【００８２】
古典的バッチ培養方法は、培養の始めに培地の組成が設定され、培養プロセスの間に外部変更に付されない閉鎖系である。よって、培養プロセスの始めに、所望の生物（複数可）を培地に接種し、この系に何も加えずに増殖または代謝活性を生じさせる。典型的には、しかし、「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合、ｐＨおよび酸素濃度等の因子の制御において試みが為される。バッチ系において、系の代謝物およびバイオマス組成物は、培養終止時まで絶えず変化する。バッチ培養内において、細胞は、静的遅滞期から高増殖対数期へと進行し（moderate）、最終的に、増殖速度が縮小または停止する定常期となる。処理しなければ、定常期の細胞は最終的に死亡する。対数期の細胞は、多くの場合、一部の系における最終産物または中間体の大量産生の原因となる。定常または対数期後産生は、他の系において得ることができる。
【００８３】
フェドバッチ系は、標準バッチ系の変種である。フェドバッチ培養プロセスは、培養が進行するにつれて徐々に基質が添加されるという改変が為された典型的バッチ系を含む。異化産物抑圧が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、また、培地に限定された量の基質を有することが望ましい場合に、フェドバッチ系が有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２等の廃棄ガスの分圧等、測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ培養方法は、本技術分野において一般的で公知のものである（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Thomas  D.  Brock,  Biotechnology:  A  Textbook  of  Industrial  Microbiology、第２版（１９８９年）Sinauer  Associates,  Inc.、Sunderland、MA；Deshpande、１９９２年、Appl.  Biochem.  Biotechnol.３６巻：２２７頁を参照）。
【００８４】
連続的培養は、バイオリアクタに規定の培地が連続的に添加され、加工のために等量の馴化培地が同時に除去される「開放」系である。連続的培養は、一般に、一定の高い液相密度に細胞を維持し、細胞は主に対数期増殖中である。あるいは、連続的培養は、固定化された細胞を用いて実施することができ、炭素および栄養分が連続的に添加され、細胞集団から価値ある産物、副産物および廃棄物が連続的に除去される。細胞固定化は、天然または合成材料で構成された広範囲の固体支持体を使用して行うことができる。
【００８５】
連続的または半連続的培養は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える一因子または任意の数の因子のモジュレーションを可能にする。例えば、一方法は、炭素源または窒素レベル等、限定的な栄養分を定率に維持し、他の全パラメータをモジュレートさせる。他の系において、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に維持しつつ、増殖に影響を与える多数の因子を連続的に変更することができる。連続的な系は、定常状態増殖条件を維持するよう努力し、よって、培地が取り除かれることによる細胞損失は、培養物における細胞増殖速度に対して平衡を保つ必要がある。連続的培養プロセスのための栄養分および増殖因子をモジュレートする方法と共に、産物形成の速度を最大化するための技法は、本技術分野において周知のものであり、Brock、上記により種々の方法が詳述されている。
【００８６】
メタン資化性細菌は、ホールセル触媒として固体基板に固定化して、イソプレン産生のための発酵条件に付すこともできる。
【００８７】
本開示に提供されているメタン資化性細菌は、単離された純粋培養物として、増殖の助けとなり得る異種非メタン資化性生物（複数可）と共に育成することができるか、あるいはメタン資化性細菌の１種または複数の異なる株／または種を組み合わせて、混合培養物を作製することができる。
【００８８】
炭素供給原料とも称される、メタン資化性細菌によって代謝され得る任意の炭素源、炭素含有化合物は、本明細書に記載されている天然に存在しないメタン資化性細菌の培養に使用することができる。炭素供給原料は、生存率を維持する、メタン資化性細菌を増殖させるために使用することができるか、あるいはイソプレンに変換される。
【００８９】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている１種または複数のイソプレン経路酵素により遺伝子操作された天然に存在しないメタン資化性細菌は、Ｃ１基質である炭素供給原料をイソプレンに変換することができる。Ｃ１基質として、メタン、メタノール、天然ガスおよび非在来型天然ガスが挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在しないメタン資化性細菌は、多炭素基質等、非Ｃ１基質をイソプレンに変換することもできる。イソプレン生合成能力が細菌に導入されると、天然に存在しないメタン資化性細菌は、低級アルカン（エタン、プロパンおよびブタン）等、多炭素基質をイソプレンに変換する能力を内因的に有することができる（図３を参照）。あるいは、天然に存在しないメタン資化性細菌は、代替的炭素供給原料を使用するための追加的な遺伝子操作を要求することができ（例えば、その全体が参照により組み込まれる、２０１２年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／７１８，０２４号、「Engineering  of  Multi-Carbon  Substrate  Utilization  Pathways  in  Methanotrophic  Bacteria」を参照）、次にこの供給原料を、本開示に従ってイソプレンに変換することができる。メタン資化性細菌は、メタンまたは乾性天然ガス等、単一炭素基質で大部分が構成された純粋または相対的に純粋な炭素供給原料を与えることができる。メタン資化性細菌は、メタンおよび低級アルカンを含む湿性天然ガス等、混合炭素供給原料を与えることもできる。
【００９０】
天然に存在しないメタン資化性細菌の構築
本明細書において使用されている組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、本技術分野において周知のものであり、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York（２００１年）；およびAusubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  and  Sons、Baltimore,  MD（１９９９年）に記載されている。
【００９１】
メタン資化性細菌（bactera）における異種核酸の導入のための組換え方法は、本技術分野において公知のものである。メタン資化性細菌における異種核酸の発現に有用な発現系および発現ベクターは、公知のものである。メタン資化性細菌の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、公知のものである。
【００９２】
Ｃ１代謝細菌のエレクトロポレーションは、Toyamaら、１９９８年、FEMS  Microbiol.  Lett.１６６巻：１〜７頁（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）；Kim  and  Wood、１９９７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.４８巻：１０５〜１０８頁（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１）；Yoshidaら、２００１年、Biotechnol.  Lett.２３巻：７８７〜７９１頁（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．株１２Ｓ）およびＵＳ２００８／００２６００５（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）において以前に記載されている。
【００９３】
ドナーおよびレシピエント細胞の直接的接触に関与する形質転換の特定の型を指す細菌接合は、メタン資化性細菌への核酸の移入のためにより頻繁に使用される。細菌接合は、「ドナー」および「レシピエント」細胞を互いに密接に接触した状態で共に混合するステップに関与する。接合は、ドナーおよびレシピエント細菌の間に細胞質連絡を形成し、新たに合成されたドナー核酸をレシピエント細胞に一方向性移入することにより行われる。接合反応におけるレシピエントは、ドナー細菌からの水平移入により核酸を受容することができる任意の細胞である。接合反応におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾンまたは動員されたプラスミドを含有する細菌である。ドナープラスミドの物理的移入は、自己伝播性プラスミドによりまたは「ヘルパー」プラスミドの補助により起こり得る。メタン資化性細菌を含むＣ１代謝細菌に関与する接合は、Stolyarら、１９９５年、Mikrobiologiya  ６４巻：６８６〜６９１頁；Martin  and  Murrell、１９９５年、FEMS  Microbiol.  Lett.１２７巻：２４３〜２４８頁；Motoyamaら、１９９４年、Appl.  Micro.  Biotech.４２巻：６７〜７２頁；Lloydら、１９９９年、Archives  of  Microbiology  １７１巻：３６４〜３７０頁；およびOdomら、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／１８６１７；Aliら、２００６年、Microbiol.１５２巻：２９３１〜２９４２頁において以前に記載されている。
【００９４】
本明細書に記載されている通り、様々な上流イソプレン経路遺伝子を過剰発現させて、産生を増強することが望ましくなり得る。内因性または異種核酸の過剰発現は、マルチコピープラスミドまたは強いプロモーター等、本技術分野において公知の方法を使用して達成することができる。メタン資化性菌におけるマルチコピー発現系の使用は、本技術分野において公知のものである（例えば、Cardy  and  Murrell、１９９０年、J.  Gen.  Microbiol.１３６巻：３４３〜３５２頁；Sharpeら、２００７年、Appl.  Environ.  Microbiol.７３巻：１７２１〜１７２８頁を参照）。例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける異種遺伝子のトランスポゾンに基づくマルチコピー発現が記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００８／００２６００５号を参照）。外因性核酸の高発現のための適した同種または異種のプロモーターを利用することもできる。例えば、米国特許第７，０９８，００５号は、メタン資化性細菌における異種遺伝子発現のための、メタンまたはメタノールの存在下で高度に発現されるプロモーターの使用について記載する。使用することができる追加的なプロモーターは、デオキシ−キシルロースリン酸シンターゼメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター（Springerら、１９９８年、FEMS  Microbiol.  Lett.１６０巻：１１９〜１２４頁）；ＰＨＡ合成のためのプロモーター（Foellnerら、１９９３年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.４０巻：２８４〜２９１頁）；またはメチロトローフにおけるネイティブプラスミドから同定されたプロモーター（ＥＰ２９６４８４）を含む。使用することができる非ネイティブプロモーターは、ｌａｃオペロンＰｌａｃプロモーター（Toyamaら、１９９７年、Microbiology  １４３巻：５９５〜６０２頁）またはＰｔｒｃ等のハイブリッドプロモーター（Brosiusら、１９８４年、Gene  ２７巻：１６１〜１７２頁）を含む。使用することができる追加的なプロモーターは、リーキープロモーターまたは誘導性プロモーター系を含む。例えば、メチロトローフおよびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現のリプレッサー／オペレーター系は、米国特許第８，２１６，８２１号に記載されている。
【００９５】
あるいは、競合するエネルギーまたは炭素シンクを排除するため、イソプレン経路前駆体の蓄積を増強するため、あるいはイソプレンのさらなる代謝を防止するために、ある特定の遺伝子の破壊が望ましくなり得る。破壊のための遺伝子の選択は、経験的証拠に基づき決定することができる。破壊のための候補遺伝子は、ＩｓｐＡを含むことができる。メタン資化性細菌は、イソプレン前駆体ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰをめぐって競合し得るカロテノイド生合成経路を保有することが公知である（米国特許第６，９６９，５９５号を参照）。ＩｓｐＡは、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰからゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が形成される一連の３つのプレニルトランスフェラーゼ反応を触媒するゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシル二リン酸シンターゼ酵素を指す。メタン資化性細菌における内因性遺伝子機能を下方調節、不活性化、ノックアウトまたは欠失させるための様々な方法は、本技術分野において公知のものである。例えば、標的化遺伝子破壊は、構造的遺伝子に外来性ＤＮＡを挿入して転写を破壊する、遺伝子下方調節のための有効な方法である。破壊しようとする標的宿主遺伝子の部分に対し高度な相同性を有する配列に隣接する外来性挿入ＤＮＡ（通常、遺伝的マーカー）を含む遺伝的カセットが、宿主メタン資化性細菌に導入される。外来性ＤＮＡは、ネイティブＤＮＡ複製機構により標的宿主遺伝子を破壊する。メタン資化性細菌を含むＣ１代謝細菌において欠失／挿入突然変異体を構築するためのアレル交換は、Toyama  and  Lidstrom、１９９８年、Microbiol.１４４巻：１８３〜１９１頁；Stolyarら、１９９９年、Microbiol.１４５巻：１２３５〜１２４４頁；Aliら、２００６年、Microbiology  １５２巻：２９３１〜２９４２頁；Van  Dienら、２００３年、Microbiol.１４９巻：６０１〜６０９頁；Martin  and  Murrell、２００６年、FEMS  Microbiol.  Lett.１２７巻：２４３〜２４８頁に記載されている。
【００９６】
ＩｓｐＳ、ＤＸＰ経路酵素、メバロン酸経路酵素またはリコペン経路酵素をコードする核酸等、宿主メタン資化性細菌に形質転換される核酸は、別々の核酸分子として、ポリシストロニック核酸分子において、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子において、またはこれらの組合せとして導入することができる。２種以上の核酸分子は、宿主メタン資化性細菌に導入される場合、ランダム順序または関連する代謝経路に従った逐次的順序を含む様々な順序で導入することができる。ある特定の実施形態において、選択された生合成経路に由来する複数の酵素をコードする複数の核酸は、宿主メタン資化性細菌に形質転換される場合、選択された生合成経路と一貫した逐次的順序を保持する仕方で形質転換される。
【００９７】
イソプレンを産生する方法
炭素供給原料の存在下、イソプレンの産生に十分な条件下で、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌を培養するステップを含む、イソプレンを産生するための方法が本明細書に提供されている。メタン資化性細菌培養物の増殖および維持のための方法は、本技術分野において周知のものである。イソプレンを産生する方法において、本明細書に記載されている天然に存在しないメタン資化性細菌の様々な実施形態を使用することができる。
【００９８】
ある特定の実施形態において、イソプレンは、細胞増殖の特異的な時期（例えば、遅滞期、対数期、定常期または死滅期）において産生される。供給原料由来の炭素が、メタン資化性細菌の増殖および維持ではなく、イソプレンに変換されることが望ましくなり得る。一部の実施形態において、本明細書に提供されている天然に存在しないメタン資化性細菌は、低から中間の細胞密度（ＯＤ６００）まで培養され、続いてイソプレンの産生が開始される。一部の実施形態において、メタン資化性細菌がもはや分裂しないまたは非常にゆっくりと分裂しながら、イソプレンが産生される。一部の実施形態において、イソプレンは、定常期においてのみ産生される。一部の実施形態において、イソプレンは、対数期および定常期において産生される。
【００９９】
本明細書に提供されている天然に存在しないメタン資化性細菌によって産生されたイソプレンを含む発酵槽オフガスは、生物学的発酵プロセスに関連する他の有機化合物をさらに含むことができる。例えば、発酵の生物学的副産物は、次のうち１種または複数を含むことができる：アルコール、エポキシド、アルデヒド、ケトンおよびエステル。ある特定の実施形態において、発酵槽オフガスは、次のアルコールのうち１種または複数を含有することができる：メタノール、エタノール、ブタノールまたはプロパノール。ある特定の実施形態において、発酵槽オフガスは、次のエポキシドのうち１種または複数を含有することができる：エチレンオキシド、プロピレンオキシドまたはブテンオキシド。Ｈ２Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯ  Ｎ２、Ｈ２、Ｏ２ならびにメタン、エタン、プロパンおよびブタン等の未利用の炭素供給原料等、他の化合物も発酵槽オフガスに存在し得る。
【０１００】
ある特定の実施形態において、本明細書に提供されている天然に存在しないメタン資化性細菌は、培養物１Ｌ当たり約０．００１ｇ〜培養物１Ｌ当たり約５００ｇのイソプレンを産生する。一部の実施形態において、産生されるイソプレンの量は、培養物１Ｌ当たり約１ｇ〜培養物１Ｌ当たり約１００ｇである。一部の実施形態において、産生されるイソプレンの量は、約０．００１ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ、約０．０２５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ、約０．１５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ、約０．２５ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約３５ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約４５ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ、約２２５ｇ／Ｌ、約２５０ｇ／Ｌ、約２７５ｇ／Ｌ、約３００ｇ／Ｌ、約３２５ｇ／Ｌ、約３５０ｇ／Ｌ、約３７５ｇ／Ｌ、約４００ｇ／Ｌ、約４２５ｇ／Ｌ、約４５０ｇ／Ｌ、約４７５ｇ／Ｌまたは５００ｇ／Ｌである。
【０１０１】
本明細書に提供されている組成物および方法を使用して産生されるイソプレンは、炭素フィンガープリンティングにより、石油化学製品から産生されるイソプレンまたは非メタン資化性細菌から生合成されるイソプレンから識別することができる。背景として、安定的同位体測定およびマスバランスアプローチが広く使用されて、メタンの包括的供給源およびシンクを評価する（Whiticar  and  Faber、Org.  Geochem.１０巻：７５９頁、１９８６年；Whiticar、Org.  Geochem.１６巻：５３１頁、１９９０年を参照）。微生物によるメタン酸化に起因する炭素同位体分別の程度の尺度は、残渣メタンの同位体サイン（即ち、安定的同位体１３Ｃ：１２Ｃの比）値を測定することにより決定することができる。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素、メタンモノオキシゲナーゼ（monoxygenase）（ＭＭＯ）によりメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに、その後、ホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドは、ＣＯ２にさらに酸化されて、還元当量（ＮＡＤＨ）の形態で細胞にエネルギーをもたらし得る、あるいは光合成生物における炭素同化経路に直接的に類似したＲｕＭＰまたはセリンサイクルのいずれかによりバイオマスに取り込まれ得る（Hanson  and  Hanson、Microbiol.  Rev.６０巻：４３９頁、１９９６年）。特に、Ｉ型メタン資化性菌は、バイオマス合成のためにＲｕＭＰ経路を使用し、ＣＨ４から完全にバイオマスを生成し、一方、ＩＩ型メタン資化性菌は、ＣＨ４から細胞炭素の５０〜７０％およびＣＯ２から３０〜５０％を同化するセリン経路を使用する（Hanson  and  Hanson、１９９６年）。例えば、Templetonら（Geochim.  Cosmochim.  Acta  ７０巻：１７３９頁、２００６年）において、炭素同位体組成を測定するための方法が提供され、その方法はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。イソプレンの１３Ｃ／１２Ｃ安定炭素同位体比（千分の一単位、‰で表すδ１３Ｃ値として報告される）は、使用されるＣ１基質の供給源および純度に応じて変動する（例えば、図４を参照）。
【０１０２】
例えば、石油に由来するイソプレンは、約−２２‰〜約−２４‰のδ１３Ｃ分布を有する。主にトウモロコシ由来のグルコース（δ１３Ｃ−１０．７３‰）から生合成されたイソプレンは、約−１４．６６‰〜−１４．８５‰のδ１３Ｃを有する。再生可能炭素源から生合成されたイソプレンは、石油に由来するイソプレンよりも小さい負数のδ１３Ｃ値を有すると予想される。しかし、天然ガス由来のメタンのδ１３Ｃ分布は、原油よりも大きい負数のδ１３Ｃ分布によって、大部分の炭素源から区別される。メタン資化性細菌は、１２Ｃ利用に対する優先度を呈し、過剰メタン条件下におけるその１３Ｃ摂取を低下させて、δ１３Ｃ値のさらなる負数シフトを生じる。本明細書に記載されているメタン資化性細菌により産生されるイソプレンは、約−３０‰〜約−５０‰の範囲の、原油または再生可能炭素源由来のイソプレンよりも大きい負数のδ１３Ｃ分布を有する。ある特定の実施形態において、イソプレン組成物は、約−３０‰、−４０‰または−５０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する。ある特定の実施形態において、イソプレン組成物は、約−３０‰〜約−４０‰または約−４０‰〜約−５０‰のδ１３Ｃ分布を有する。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、イソプレン組成物は、約−３０‰、−４０‰または−５０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する。ある特定の実施形態において、イソプレン組成物は、約−３０‰〜約−４０‰または約−４０‰〜約−５０‰のδ１３Ｃ分布を有する。さらなる実施形態において、イソプレン組成物は、−３０‰未満、−３１‰未満、−３２‰未満、−３３‰未満、−３４‰未満、−３５‰未満、−３６‰未満、−３７‰未満、−３８‰未満、−３９‰未満、−４０‰未満、−４１‰未満、−４２‰未満、−４３‰未満、−４４‰未満、−４５‰未満、−４６‰未満、−４７‰未満、−４８‰未満、−４９‰未満、−５０‰未満、−５１‰未満、−５２‰未満、−５３‰未満、−５４‰未満、−５５‰未満、−５６‰未満、−５７‰未満、−５８‰未満、−５９‰未満、−６０‰未満、−６１‰未満、−６２‰未満、−６３‰未満、−６４‰未満、−６５‰未満、−６６‰未満、−６７‰未満、−６８‰未満、−６９‰未満、または−７０‰未満のδ１３Ｃを有する。
【０１０４】
イソプレン産生の測定
イソプレン産生は、本技術分野において公知の方法を使用して測定することができる。例えば、発酵槽ガスのオフガス由来の試料は、短鎖炭化水素を検出するよう選択された水素炎イオン化検出器およびカラムを備えるガスクロマトグラフィーにより分析することができる（Lindbergら、２０１０年、Metabolic  Eng.１２巻：７０〜７９頁）。産生されたイソプレンの量は、純粋イソプレン標準との比較により推定することができる。Silverら、J.  Biol.Chem.２７０巻：１３０１０頁、１９９５年、米国特許第５，８４９，９７０号およびこれらに引用されている参考文献は、酸化水銀ガス検出器によるガスクロマトグラフィーを使用してイソプレン産生を測定するための方法を記載し、その方法はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
イソプレンの回収および精製
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法のいずれかは、宿主メタン資化性細菌によって産生されたイソプレンを回収または精製するステップをさらに含むことができる。後述する例示的な回収および精製方法は、イソプレンを想定しているが、イソプレノイドまたはイソプレンに由来する他の化合物に適用することもできる。
【０１０６】
本開示に提供されている組成物および方法を使用して産生されたイソプレンは、イソプレン産生メタン資化性菌の培養物にガス流（例えば、窒素、空気）を通気することにより、発酵系から回収することができる。発酵オフガスにおけるイソプレンの濃度を増強するために発酵培地のガス散布速度を変更する方法は、本技術分野において公知のものである。イソプレンは、ガスストリッピング、蒸留、ポリマー膜増強分離、分画、浸透気化法、吸着／脱離（例えば、シリカゲル、炭素カートリッジ）、固相からのイソプレンの熱もしくは減圧脱離、または溶媒による固相に固定化もしくは吸着されたイソプレンの抽出（例えば、これらのそれぞれに由来する方法は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０３，００７号、米国特許第４，５７０，０２９号、米国特許第４，１４７，８４８号、米国特許第５，０３５，７９４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０７５５３４を参照）等、本技術分野において公知の技法を使用してさらに回収および精製される。アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノールまたはこれらの組合せ）による抽出蒸留を使用して、イソプレンを回収することができる。イソプレン回収は、液状のイソプレンの単離に関与し得る（例えば、イソプレンのニート溶液または溶媒によるイソプレンの溶液）。気体状態のイソプレンの回収は、発酵オフガスからのイソプレン蒸気が連続的様式で除去されるガスストリッピングに関与し得る。ガスストリッピングは、例えば、固相への吸着、液相への分配または直接的凝縮を含む種々の方法を使用して達成することができる。蒸気の露点を超えた希釈イソプレン蒸気流の膜濃縮を使用して、液体イソプレンを凝縮することもできる。イソプレンガスは、圧縮および凝縮することもできる。
【０１０７】
イソプレンの回収および精製は、１ステップまたは複数のステップを含むことができる。回収および精製方法を個々にまたは組み合わせて使用して、高純度イソプレンを得ることができる。一部の実施形態において、発酵オフガスからのイソプレンガスの除去および液相への変換は、同時に行われる。例えば、イソプレンは、オフガス流から液体へと直接的に凝縮することができる。他の実施形態において、発酵オフガスからのイソプレンガスの除去および液相への変換は、逐次的に行われる（例えば、イソプレンを固相に吸着し、続いて溶媒により抽出することができる）。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている組成物および方法を使用して培養系から回収されたイソプレンは、さらなる精製に付される（例えば、イソプレン産生におけるイソプレン液体または蒸気に存在する１種または複数の非イソプレン構成成分からの分離）。ある特定の実施形態において、イソプレンは、実質的に精製された液体である。精製方法は、本技術分野において公知のものであり、抽出蒸留およびクロマトグラフィーを含み、純度は、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳ分析等の方法によって評価することができる。ある特定の実施形態において、イソプレンは、重量で少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の純度を有する。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、イソプレン回収の１または複数のステップ後に残る気相の少なくとも一部は、リサイクルのため発酵系に戻される。
【０１１０】
イソプレンのさらなる加工
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して産生されたイソプレンは、本技術分野において公知の方法を使用して、他の高価値産物へとさらに加工することができる。回収または精製後に、様々な触媒を使用してイソプレンを重合させて、様々なポリイソプレン異性体を形成することができる（Senyek、「Isoprene  Polymers」、Encyclopedia  of  Polymer  Science  and  Technology、２００２年、John  Wiley  &  Sons,  Inc.）。イソプレンをスチレンまたはブタジエンと重合させて、様々なエラストマーを形成することもできる。過酸化水素により開始されるイソプレンの光化学重合は、感圧接着剤として使用することのできるヒドロキシル終止ポリイソプレンを形成する。イソプレンテロメル化産物は、燃料としても有用である（Clementら、２００８年、Chem.  Eur.  J.１４巻：７４０８〜７４２０頁；Jackstellら、２００７年、J.  Organometallic  Chem.６９２巻：４７３７〜４７４４頁）。イソプレンは、触媒を使用して二量体（１０炭素）および三量体（１５炭素）炭化水素アルケンへと化学修飾することもできる（Clementら、２００８年、Chem.  Eur.  J.１４巻：７４０８〜７４２０頁；Gordilloら、２００９年、Adv.  Synth.  Catal.３５１巻：３２５〜３３０頁）。アルケンを水素化して、燃料または溶媒として使用することができる長鎖分枝状アルカンを形成することができる。イソプレンは、テルペン、ギンコライド、ステロールまたはカロテノイド等のイソプレノイド化合物に変換することができる。イソプレンは、ファルネサン（farnesane）、ビサボラン（bisabolane）、ピネン、イソペンタノール（isopentanol）またはこれらの任意の組合せ等のイソプレノイドに基づくバイオ燃料に変換することもできる（Peralta-Yahyaら、２０１２年、Nature  ４８８巻：３２０〜３２８頁）。
【０１１１】
イソプレン経路前駆体が増加した突然変異体をスクリーニングする方法
イソプレン前駆体の産生を改善する努力において、ゲノムまたは遺伝子特異的突然変異を宿主メタン資化性細菌において誘導することができる。ゲノム突然変異を誘発する方法は、本技術分野において公知のものであり（例えば、Thomas  D.  Brock、Biotechnology:  A  Textbook  of  Industrial  Microbiology、第２版（１９８９年）Sinauer  Associates,  Inc.、Sunderland,  MA；Deshpande、１９９２年、Appl.  Biochem.  Biotechnol.３６巻：２２７頁を参照）、例えば、ＵＶ照射、化学的突然変異誘発（例えば、アクリジン色素、ＨＮＯ２、ＮＨ２ＯＨ）およびトランスポゾン突然変異誘発（例えば、Ｔｙ１、Ｔｎ７、Ｔｎ５）を含む。ランダム突然変異誘発技法、例えば、エラープローンＰＣＲ、ローリングサークルエラープローンＰＣＲまたはミューテーター株を使用して、特異的遺伝子または遺伝子セットのランダム突然変異体ライブラリーを作製することができる。部位特異的突然変異誘発を使用して、特異的遺伝子または遺伝子セットの突然変異体ライブラリーを作製することもできる。
【０１１２】
本開示は、メタン資化性細菌においてリコペン経路を遺伝子操作することによりイソプレン前駆体の産生が改善された突然変異メタン資化性株をスクリーニングするための方法を提供する。リコペンおよびイソプレン合成経路は、同じ普遍的前駆体、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を使用する（図１および図６を参照）；リコペンおよびイソプレン生合成は、ＤＸＰ経路の大部分を共有する。細菌の赤色色素沈着の増加により測定される、改善されたリコペン（lycoprene）産生をもたらす有益なゲノム突然変異は、突然変異が、重複する経路構成成分に影響を与える場合、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ産生を増加させることにより、改善されたイソプレン合成をもたらすこともできる。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、突然変異メタン資化性細菌をスクリーニングするための方法は、（ａ）突然変異原にメタン資化性細菌を曝露して、突然変異メタン資化性細菌を生成するステップと、（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸で、前記突然変異メタン資化性細菌を形質転換するステップと、（ｃ）増殖に十分な条件下で、前記突然変異メタン資化性細菌を培養するステップとを含み、ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩで形質転換され、突然変異原に曝露されていない参照メタン資化性細菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す突然変異メタン資化性細菌により、赤色色素沈着が増加した前記突然変異メタン資化性細菌が、前記参照メタン資化性細菌と比較してイソプレン前駆体の合成の増加を示すことが示される。ある特定の実施形態において、イソプレン前駆体は、ＩＰＰまたはＤＭＡＰＰである。一部の実施形態において、突然変異原は、放射線、化学物質、プラスミドまたはトランスポゾンである。次に、リコペン経路活性の増加によりイソプレン前駆体産生が増加したと同定された突然変異メタン資化性細菌を、本明細書に記載されているイソプレン生合成経路により遺伝子操作することができる。一部の実施形態において、赤色色素沈着が増加した突然変異メタン資化性細菌またはそのクローン細胞は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）をコードする外因性核酸で形質転換される。ある特定の実施形態において、リコペン経路遺伝子（ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩ）のうち少なくとも１、２または全種は、ＩｓｐＳをコードする核酸で形質転換する前または後に、イソプレン前駆体産生が増加したと同定された突然変異メタン資化性細菌から除去または不活性化される。機能的イソプレン経路と機能的リコペン経路との同時発現は、共有される前駆体ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰをめぐって競合し、イソプレン産生を低減し得る。次に、本明細書に記載されているスクリーニング方法により同定された突然変異メタン資化性細菌におけるイソプレン産生を、イソプレン生合成能力を有する参照メタン資化性細菌と比較して、イソプレンレベルの増加を確認することができる。当業者であれば、その後の使用のために、方法における各ステップにおいてクローン細菌ストックを取り分けてよいことが明らかである。例えば、赤色色素沈着が増加したと同定された特定の細菌に関して、リコペン経路による形質転換に先立ち取り分けたこの細菌のクローンストック（即ち、リコペンスクリーニングにより同定されるイソプレン合成の潜在的に有益な突然変異を有するが、外因性リコペン経路を持たない細菌）は、イソプレンシンターゼ（例えば、ＩｓｐＳ）で形質転換することができる。
【０１１４】
本開示において、メタン資化性細菌におけるイソプレン経路遺伝子をスクリーニングするための方法も提供される。このようなスクリーニング方法を使用して、比色分析読み取りとして、メタン資化性細菌においてリコペン経路を遺伝子操作することによりイソプレン前駆体ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの合成の増加をもたらすイソプレン経路遺伝子を同定することができる。リコペンおよびイソプレン合成経路は、同じ普遍的前駆体、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを使用する（図１および図６を参照）。メタン資化性細菌は、異種イソプレン経路遺伝子、同種のイソプレン経路遺伝子の過剰発現、バリアントイソプレン経路遺伝子またはこれらの任意の組合せで改変して、細菌の赤色色素沈着の増加により測定される、リコペン産生が改善された細菌を同定することができる。リコペン産生が増加していると同定された細菌は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ産生の増加により、イソプレン合成の改善を示すこともできる。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、メタン資化性細菌におけるイソプレン経路遺伝子をスクリーニングするための方法は、（ａ）前記メタン資化性細菌を、（ｉ）イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸、（ｉｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸で形質転換するステップと、（ｂ）増殖に十分な条件下で、ステップ（ａ）から得た前記メタン資化性細菌を培養するステップとを含み、ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸で形質転換され、イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸を含有しない参照メタン資化性細菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す前記形質転換されたメタン資化性細菌により、イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、前記参照メタン資化性細菌と比較してイソプレン前駆体合成の増加を付与することが示される。ある特定の実施形態において、イソプレン経路酵素は、ＤＸＰ経路酵素（例えば、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはＩＤＩ）またはメバロン酸経路酵素（例えば、ＡＡＣＴ、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＭＫ、ＰＭＫ、ＭＰＤまたはＩＤＩ）である。イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸は、異種核酸または同種核酸であり得る。異種核酸は、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化することができる。一部の実施形態において、同種核酸は、メタン資化性細菌において過剰発現される。本明細書に記載されている様々な実施形態において、イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸は、天然に存在しないバリアントとなり得る。天然に存在しないバリアントは、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発により作製することができるか、あるいは合成することができる（全体的にまたは部分的に）。ある特定の実施形態において、天然に存在しないバリアントは、イソプレン経路酵素をコードする参照核酸と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。
【０１１６】
リコペン経路酵素の供給源は、本技術分野において公知のものであり、植物、光合成細菌、真菌および藻類の種を含む、リコペン経路を天然に保有する任意の生物であり得る。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの核酸配列の例として、受託番号AB000835(Arabidopsis  thaliana);AB016043(Homo  sapiens);AB019036(Homo  sapiens);AB016044(Mus  musculus);AB027705(Dacus  carota);AB034249(Croton  sublyratus);AB034250(Scoparia  dulcis);AF049659(Drosophila  melanogaster);AF139916(Brevibacterium  linens);AF279807(Penicillum  paxilli);AJ010302(Rhodobacter  sphaeroides);AJ133724(Mycobacterium  aurum);L25813(Arabidopsis  thaliana);U44876(Arabidopsis  thaliana);およびU15778(Lupinus  albus)が挙げられる。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるフィトエンシンターゼの核酸配列の例として、受託番号AB001284(Spirulina  platensis);AB032797(Daucus  carota);AB034704(Rubrivivax  gelatinosus);AB037975(Citrus  unshui);AF009954(Arabidopsis  thaliana);AF139916(Brevibacterium  linens);AF152892(Citrus  x  paradise);AF218415(Bradyrhizobium  sp.  ORS278);AF220218(Citrus  unshiu);AJ133724(Mycobacterium  aurum);および  AJ304825(Helianthus  annuus) が挙げられる。ＮＣＢＩデータベースにおいて利用できるフィトエンデヒドロゲナーゼの核酸配列の例として、受託番号AB046992(Citrus  unshiu);AF139916(Brevibacterium  linens);AF218415(Bradyrhizobium  sp.  ORS278);AF251014(Tagetes  erecta);L16237(Arabidopsis  thaliana);L39266(Zea  mays);M64704(Glycine  max);AF364515(Citrus  x  paradisi);D83514(Erythrobacter  longus);M88683(Lycopersicon  esculentum);およびX55289(Synechococcus)が挙げられる。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１）
ＭＥＴＨＡＮＯＣＯＣＣＵＳ  ＣＡＰＳＵＬＡＴＵＳ  ＢＡＴＨ株におけるイソプレンシンターゼのクローニングおよび発現
【０１１８】
イソプレン産生メタン資化性株を作製するために、イソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳ）をコードする遺伝子を含有するメタン資化性菌発現ベクターを、接合性交配によりＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂおよびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６Ａに挿入した。エピソーム発現プラスミド（複製起点、移入起点、薬物抵抗性マーカー（カナマイシン）および多重クローニング部位をコードする配列を含有）を使用して、メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）プロモーター下流のコドン最適化Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．ＩｓｐＳポリヌクレオチド配列（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈのための配列番号１９）またはＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）プロモーター下流のＰｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａコドン最適化ＩｓｐＳポリヌクレオチド配列（アミノ末端葉緑体標的化配列を除去）（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈのための配列番号１７）のいずれかをクローニングした。ＩｓｐＳを持つプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ株（ドナー株）およびｐＲＫ２０１３プラスミド（ＡＴＣＣ）を含有するＥ．ｃｏｌｉ（ヘルパー株）のコロニーを、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＬＢに接種し、３７℃で一晩増殖させた。レシピエントメタン資化性株との交配に使用する３〜５時間前に、それぞれ１パートの液体ドナー培養物およびヘルパー培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１００部の新鮮ＬＢに接種した。メタン資化性（レシピエント）株を、交配に先立つ１〜２日間、対数増殖期（約０．３のＯＤ６００）に達するまで約４０ｍＬのメタンを有する液体ＭＭ−Ｗ１培地（Piejaら、２０１１年、Microbial  Ecology  ６２巻：５６４〜５７３頁）に接種した。
【０１１９】
ＯＤ６００比が２：１：１となるような体積でレシピエント、ドナーおよびヘルパー株を調製することにより、トリペアレンタルメイティングを行った（例えば、ＯＤ６００が１．５のメタン資化性菌１ｍＬと、ＯＤ６００が０．７５のドナー１ｍＬと、ＯＤ６００が０．７５のヘルパー１ｍＬ）。次に、５，３００ｒｐｍ、７分間、２５℃の遠心分離により、これらの細胞を収集した。上清を除去し、５００μＬのＭＭ−Ｗ１に細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。Ｅ．ｃｏｌｉドナーおよびヘルパー株のために遠心分離および再懸濁をさらに２回反復して、抗生物質の除去を確実にした。次に、レシピエント、ドナーおよびヘルパー株の等体積の再懸濁した細胞を組み合わせ、穏やかなピペッティングにより混合した。交配組成物を１３．２ｋｒｐｍで３０〜６０秒間スピンダウンし、可能な限り上清を除去した。次に、細胞ペレットを穏やかに混合し、交配寒天（無菌０．５％酵母エキスを含有する完全ＭＭ−Ｗ１培地）上に一液滴として置いた。レシピエントとしてＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂまたはＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａを使用する場合は３０℃において、あるいはレシピエント株としてＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを使用する場合は３７℃において、メタンおよび空気を含有するｏｘｏｉｄチャンバー内で交配プレートを４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、プレートに１ｍＬのＭＭ−Ｗ１培地を加え、懸濁された細胞を２ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移すことにより、交配プレートから細胞を採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、１００μＬの新鮮ＭＭ−Ｗ１で再懸濁し、その後、選択プレート（カナマイシン１０μｇ／ｍＬを含有する完全ＭＭ−Ｗ１寒天培地）上にプレーティングして、構築物を安定的に維持する細胞を選択した。メタン−空気混合物を含有するｏｘｏｉｄチャンバー内における、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株の場合は４２℃約１週間のインキュベーション後に、あるいはＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂの場合は３０℃１週間のインキュベーション後に、プラスミドを有するメタン資化性菌がこれらのプレートに現れた。続いて、１ｍＬ液体培地においてＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株クローンを培養し、イソプレン産生を分析した。
【０１２０】
（実施例２）
ＭＥＴＨＡＮＯＣＯＣＣＵＳ  ＣＡＰＳＵＬＡＴＵＳ  ＢＡＴＨ株によるイソプレンの産生
【０１２１】
構成的ＭＤＨプロモーター−Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．ＩｓｐＳを含有するベクターまたはＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）プロモーター−Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ＩｓｐＳ（０．１〜１０ｍＭ  ＩＰＴＧの存在または非存在下で育成）を含有するベクターのいずれかを含有するＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株を一晩育成した封入５ｍＬ培養物由来のヘッドスペースガス試料（２５０μｌ）を得た。水素炎イオン化検出器を備えるガスクロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０）にガス試料を注入した。クロマトグラフィー条件は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＰ−ＰｏｒａＢＯＮＤ  Ｕ（２５ｍ×０．３２ｍｍ  ｉ．ｄ．）カラム、オーブンプログラム５０℃、１．５分間；２５℃、１分間；３００℃、１０分間を含む。水素炎イオン化により溶出ピークを検出し、イソプレン標準（脱イオン水に溶解した純粋イソプレン）との比較により、積分ピークを定量化した。
【０１２２】
Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈは、Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ＩｓｐＳを発現する場合、Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．ＩｓｐＳの発現と比較してより多くのイソプレンを産生した。加えて、Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ＩｓｐＳを発現するＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおいて産生されたイソプレンの量は、ＩＰＴＧによるＬａｃＩｑプロモーターの誘導と直接的に相関した（図７Ａを参照）。図５および図７Ｂは、それぞれＳａｌｉｘ  ｓｐ．およびＰｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａバリアント試料由来のヘッドスペース試料のＧＣ／ＭＳクロマトグラフィーを示す。図５において、試料Ａは、非形質転換細胞由来のヘッドスペースのバックグラウンドシグナルを示す陰性対照である。図５の試料Ｂにおけるイソプレン収量は、約１０ｍｇ／Ｌである。図７Ｂは、産生されているイソプレンの実質的な量を示す。
【０１２３】
（実施例３）
イソプレン産生が改善されたＤＸＰ経路の遺伝子操作
【０１２４】
全体的に見てイソプレンにコミットした前駆体（ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ）の合成のための酵素の改善をもたらす、経路内の新規遺伝子配列または調節エレメントを作製する目的のため、ＤＸＰ経路オペロン（即ち、ＤＸＳ−ＤＸＲ−ＩｓｐＤ−ＩｓｐＥ−ＩｓｐＦ−ＩｓｐＧ−ＩｓｐＨ）にランダム突然変異が導入される。改善されたＤＸＰ経路を単離するための容易なハイスループットスクリーニング方法を構築するため、ｇｇｐｐｓ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩを含むリコペン合成経路を比色分析レポーターとして利用した。ＧＥＮＥＭＯＲＰＨ（登録商標）ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、エラープローンＰＣＲにより、低、中および高突然変異率のＤＸＰ経路のランダム突然変異誘発ライブラリーを作製する。次に、ｇｇｐｐｓ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩ遺伝子配列を含有するメタン資化性発現プラスミドにライブラリーをクローニングし、それにより、強いメタン資化性菌プロモーター配列（例えば、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター）によりそのポリシストロニック発現が駆動される。次に、およそ１０６個超のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂの形質転換体から、プラスミドを含有するライブラリーのプールが単離される。次に、プラスミドライブラリーを使用して、メタン資化性株を形質転換する。延長されたインキュベーション期間の後に、鮮紅色を呈するコロニーを単離する（ＭＭ−ＷＩプレートにおいて可視化される）。プラスミド抽出および配列決定後に、突然変異ＤＸＰ経路遺伝子を、エラープローンＰＣＲの次のラウンドにおけるプールとして使用する。ｇｇｐｐｓ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩを含有するプラスミドと共に野生型ＤＸＰ経路遺伝子を含有するメタン資化性菌株は、突然変異ＤＸＰ経路遺伝子を単離するためのリコペン生成のベースライン比較として役立つ。赤色増加を呈する追加的なコロニーが同定されなくなったら、突然変異およびスクリーニングの反復を停止する。次に、メタン資化性菌宿主から、新規ＤＸＰ経路遺伝子を持つプラスミドを単離する。続いて、メタン資化性宿主細菌においてこのような新規ＤＸＰ経路遺伝子をＩｓｐＳと共に同時発現させて、イソプレン産生の改善を確認する。
【０１２５】
（実施例４）
Ｃ１代謝微生物における安定炭素同位体分布
【０１２６】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍバイオマスの乾燥試料を、ＩｓｏＰｒｉｍｅ１００  ＩＲＭＳ（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ、Ｃｈｅａｄｌｅ、ＵＫ）と連結されたＣＨＮＯＳ元素分析計（ｖａｒｉｏ  ＩＳＯＴＯＰＥ  ｃｕｂｅ、Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した元素分析計／連続フロー同位体比質量分析により、炭素および窒素含量（％乾燥重量）ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比に関して分析した。発酵槽または血清ボトルにおいて培養したメタン資化性バイオマスの試料を遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、０．２〜２ｍｇの炭素（約０．５〜５ｍｇ乾燥細胞重量）に相当する体積を５×９ｍｍスズカプセル（Ｃｏｓｔｅｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に移し、８０℃で２４時間乾燥させた。０．１ｍｇの炭素を含有する標準は、信頼できるδ１３Ｃ値をもたらした。
【０１２７】
同位体比は、「デルタ」表示法（‰）で表し、百万分率偏差（on  a  per  million  deviation  basis）に基づく、標準に相対的な材料の同位体組成が、δ１３Ｃ（またはδ１５Ｎ）＝（Ｒ試料／Ｒ標準−１）×１，０００（式中、Ｒは、重対軽同位体型の分子比である）により得られる。炭素の標準は、Ｖｉｅｎｎａ  Ｐｅｅ  Ｄｅｅ  Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅ（Ｖ−ＰＤＢ）であり、窒素の標準は空気である。ＮＩＳＴ（米国標準技術局（National  Institute  of  Standards  and  Technology））提案のＳＲＭ（標準参照材料（Standard  Reference  Material））Ｎｏ．１５４７、モモの葉を較正標準として使用した。あらゆる同位体分析は、カリフォルニア大学、バークレーの安定同位体生物地球化学センター（Center  for  Stable  Isotope  Biogeochemistry）で行った。ＣおよびＮ同位体分析の長期外部精度は、それぞれ０．１０‰および０．１５‰である。
【０１２８】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株を３種の異なる発酵バッチにおいてメタンで育成し、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを２種の異なる発酵バッチにおいてメタンで育成し、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａを単一の発酵バッチにおいてメタンで育成した。これらの培養物のそれぞれに由来するバイオマスを安定炭素同位体分布に関して分析した（δ１３Ｃ値；表４を参照）。
【表４−１】
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【表４−２】
2016508737.tif 000016
【０１２９】
（実施例５）
安定炭素同位体分布におけるメタン源および純度の効果
【０１３０】
天然ガス構成成分を含有するメタンにおけるメタン資化性菌の増殖を試験するために、１００ｍＬの規定培地ＭＭＳ１．０を含有する一連の０．５リットル血清ボトルに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給した同じ培地で育成した血清ボトルバッチ培養物（５％ｖ／ｖ）から、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂまたはＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを接種した。培地ＭＭＳ１．０の組成を次に示す：０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０．７μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、６μＭ  ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１０μＭ  ＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡおよび１リットル当たり１ｍＬの微量金属溶液（１Ｌ当たり次の成分を含有：５００ｍｇ  ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇ  ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ  ＭｎＣｌ２＊７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ  ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ  ＮｉＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、２５０ｍｇ  ＥＤＴＡ）。リン酸塩、炭酸水素塩およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡは、培地をオートクレーブして冷却した後に加えた。培地の最終ｐＨは７．０±０．１であった。
【０１３１】
接種したボトルをゴムスリーブ栓で密封し、シリンジによって無菌０．４５μｍフィルターおよび無菌２７Ｇ針を通して６０ｍＬメタンガスを注入した。２個複製した培養物にそれぞれ、６０ｍＬ体積の（Ａ）９９％純度のメタン（グレード２．０、Ｐｒａｘａｉｒ、Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｇａｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）、（Ｂ）天然ガス標準を表す７０％純度のメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；９％エタン、６％プロパン、３％メチルプロパン、３％ブタンおよび他の微少炭化水素構成成分も含有）、（Ｃ）メタン源ＡおよびＢの１：１混合物として送達される８５％純度のメタン、ならびに（Ｄ）＞９３％メタン（グレード１．３、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ；組織内（in-house）分析は組成＞９９％メタンを示した）を注入した。３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株）または４２℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）にて２５０ｒｐｍで回転式振盪しつつ培養物をインキュベートし、１ｍＬ試料を取り出してＯＤ６００を決定することにより、およそ１２時間間隔で増殖を測定した。これらの時点において、ボトルに通気孔をつけ、ヘッドスペースを、６０ｍＬのそれぞれのメタン源（Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）および６０ｍＬの濃縮酸素（少なくとも８５％純度）に置き換えた。約２４時間間隔で５ｍＬ試料を除去し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により細胞を回収し、次に分析前に−８０℃で貯蔵した。
【０１３２】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株およびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに由来するメタン資化性バイオマスに関する、炭素および窒素含量（％乾燥重量）ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比の分析を、実施例４に記載されている通りに行った。表５は、異なるレベルの純度を有するメタンで、ボトル培養物の様々なバッチにおいて育成したＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のバイオマス試料の安定炭素同位体分析の結果を示す。
【表５】
2016508737.tif 000017
【０１３３】
１種のメタン源（Ａ、９９％）で育成したＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは、−４１．２±１．２であり、一方、異なるメタン源（Ｂ、７０％）で育成したＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは、−４４．２±１．２であった。メタン源ＡおよびＢを混合した場合、−４３．８±２．４の中間的平均δ１３Ｃが観察された。これらのデータは、メタン源ＡおよびＢで育成した細胞材料のδ１３Ｃが、インプットメタンのδ１３Ｃの差により、互いに有意に異なることを示す。しかし、２種のガスの混合物における細胞育成は、１２Ｃを優先的に利用し、したがって、より負数のδ１３Ｃ値の傾向を示す。
【０１３４】
同様の実験を行って、異なるメタン源で、ボトル培養物の様々なバッチにおいて育成した２種の異なるメタン資化性菌、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂが、δ１３Ｃ分布の差を示すか試験した（表６を参照）。
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１３５】
第１のメタン源（Ａ）で育成したＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃは−４４．５±８．８であり、一方、同じメタン源で育成したＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−４７．８±２．０であった。第２のメタン源（Ｂ）で育成したＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃは−３７．９±０．４であり、一方、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−３９．８±４．５であった。これらのデータは、あるメタン源で育成した細胞材料のδ１３Ｃが、同じメタン源で育成した異なる株に由来する細胞材料のδ１３Ｃと高度に類似していることを示す。よって、細胞材料の観察されたδ１３Ｃは、試験中の特定の細菌株の特性ではなく、インプットガスの組成に主に依存すると思われる。
【０１３６】
上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。米国特許出願第６１／７７４，３４２号および米国特許出願第６１／９２８，３３３号が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に参照されているまたは出願データシート（Application  Data  Sheet）に列挙されているあらゆる米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願および刊行物の概念を用いて、さらに別の実施形態を提供する必要があれば、実施形態の態様を修正することができる。
【０１３７】
上に詳述されている説明を踏まえつつ、実施形態に対し上述および他の変更を為すことができる。一般に、次の特許請求の範囲において、使用されている用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特異的な実施形態に限定するものと解釈するべきではないが、このような特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲と共にあらゆる可能な実施形態を含むものと解釈するべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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