(57)【要約】  本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合された核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる人工転写因子に関する。特定の例では、核内受容体遺伝子のこれらのプロモーター領域はグルココルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、またはエストロゲン受容体ＥＳＲ１の発現を調節する。グルココルチコイド受容体を対象とする人工転写因子は、炎症過程、糖尿病、肥満、冠動脈疾患、ぜんそく、セリアック病、およびエリテマトーデスなどのグルココルチコイドによって調節される疾患の治療に有用である。アンドロゲン受容体を対象とする人工転写因子は、さまざまながん、冠動脈疾患、肥満若しくは糖尿病などの代謝障害、または統合失調症、うつ病、若しくは注意欠陥多動性障害などの気分障害などのテストステロンによって調節される疾患の治療に有用である。エストロゲン受容体を対象とする人工転写因子は、さまざまながん、心血管疾患、骨粗しょう症、または気分障害などのエストロゲンによって調節される疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる、人工転写因子。
【請求項２】
前記核内受容体遺伝子の前記プロモーター領域がアンドロゲン受容体プロモーターである、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項３】
前記核内受容体遺伝子の前記プロモーター領域がエストロゲン受容体プロモーターである、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項４】
六量体ジンクフィンガータンパク質を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項５】
前記ジンクフィンガータンパク質が抑制タンパク質ドメインに融合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項６】
前記抑制タンパク質ドメインが、配列番号１のＮ末端ＫＲＡＢ、配列番号２のＣ末端ＫＲＡＢ、配列番号３のＳＩＤ、または配列番号４のＥＲＤである、請求項５に記載の人工転写因子。
【請求項７】
前記ジンクフィンガータンパク質が活性化タンパク質ドメインに融合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項８】
前記活性化タンパク質ドメインが、配列番号５のＶＰ１６、配列番号６のＶＰ６４、配列番号７のＣＪ７、配列番号８のｐ６５ＴＡ１、配列番号９のＳＡＤ、配列番号１０のＮＦ−１、配列番号１１のＡＰ−２、配列番号１２のＳＰ１−Ａ、配列番号１３のＳＰ１−Ｂ、配列番号１４のＯｃｔ−１、配列番号１５のＯｃｔ−２、配列番号１６のＯｃｔ２−５ｘ、配列番号１７のＭＴＦ−１、配列番号１８のＢＴＥＢ−２、または配列番号１９のＬＫＬＦである、請求項７に記載の人工転写因子。
【請求項９】
前記核局在化配列がＫ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列を含有する塩基性アミノ酸クラスターまたは配列番号７５のＳＶ４０  ＮＬＳである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１０】
前記タンパク質形質導入ドメインが、配列番号２０のＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、配列番号２５の合成ペプチドｍＴ０２、配列番号２６の合成ペプチドｍＴ０３、配列番号２７のＲ９ペプチド、または配列番号２８のＡＮＴＰドメインである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１１】
配列番号３９〜４１、４８〜５３、および６６〜６８からなる群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含んでなる、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項１２】
抑制または活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列に融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる、人工転写因子。
【請求項１３】
ポリエチレングリコール残基をさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工転写因子を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項の人工転写因子を産生するための、配列番号９９〜１０３の発現コンストラクトを含んでなる大腸菌宿主細菌。
【請求項１６】
核内受容体のリガンドに対する細胞応答を調節するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１８】
治療上有効な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、核内受容体遺伝子の発現の調節が治療に有益である疾患の治療法。
【請求項１９】
前記核内受容体がアンドロゲン受容体であり、前記疾患がテストステロンによって調節され、がん、冠動脈疾患、肥満、糖尿病、統合失調症、うつ病、および注意欠陥多動性障害からなる群から選択される、請求項１８に記載の治療法。
【請求項２０】
前記核内受容体がエストロゲン受容体であり、前記疾患がエストロゲンによって調節され、がん、心血管疾患、骨粗しょう症、および気分障害からなる群から選択される、請求項１８に記載の治療法。
【請求項２１】
前記核内受容体がグルココルチコイド受容体であり、前記疾患がグルココルチコイドによって調節され、炎症過程、糖尿病、肥満、冠動脈疾患、ぜんそく、セリアック病、およびエリテマトーデスからなる群から選択される、請求項１８に記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑制ドメインまたは活性化ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合された、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルポリダクチルジンクフィンガータンパク質（複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質）、を含んでなる人工転写因子、並びにそのような核内受容体の活性によって引き起こされる疾患または調節される疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工転写因子（ＡＴＦ）は遺伝子発現を調節する有用なツールであることが提案されている（Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526）。天然の転写因子の多くは、遺伝子の転写を抑制または活性化することを通して発現に影響を及ぼし、ある特定のＤＮＡ配列を認識する複雑な特異的ドメインをもつ。このため、転写因子の特異性および標的遺伝子を改変しようとしても、転写因子は魅力ある操作対象ではない。しかし、転写因子のある特定の類は数個のいわゆるジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含み、そのジンクフィンガードメインはモジュラー（modular）であるので遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、３つのＤＮＡ塩基対をほぼ独立に標的とする短い（３０アミノ酸）ＤＮＡ結合モチーフである。よって、数個のそのようなジンクフィンガーが融合されたものを含むタンパク質は、長いＤＮＡ配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は１８塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ標的を認識するが、かかる塩基対はヒトゲノム全体でただ一つだけと言ってもよい。当初は全くコンテキストに依存しないと思われていたが、より詳細な解析からジンクフィンガーに関するいくらかのコンテキスト特異性が明らかになった（Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231）。ＺＦモジュールの結合特異性を変えるジンクフィンガー認識表面でのある特定のアミノ酸の変異は、大部分の５’−ＧＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＡＮＮ−３’、および幾つかの５’−ＴＮＮ−３’コドンの定義された（defined）ＺＦビルディングブロックをもたらした（例えば、いわゆるＢａｒｂａｓモジュール、Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810を参照されたい）。初期の人工転写因子の研究では、既知の３ｂｐ標的配列をもつ予め選択されたジンクフィンガーを組み合わせることに基づいた合理的な設計に注目が集まったが、ジンクフィンガーのある特定のコンテキスト特異性を認識するには、細菌若しくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、コンパートメント化（compartmentalized）リボソームディスプレイ、またはＦＡＣＳ分析を用いた生体内選択などの高度な方法を用いて調べられる大きなジンクフィンガーライブラリーの作製を必要とした。
【０００３】
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いて、ヒトゲノム内ＤＮＡ遺伝子座を高度に特異的に標的とすることができる。よって、これらのジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性をもつタンパク質ドメインを特異的なプロモーター配列に輸送して着目遺伝子の発現の調節をもたらすのに理想的なツールである。転写のサイレンシングに好適なドメインは、Ｎ末端としてのクルッペル関連ドメイン（ＫＲＡＢ）（配列番号１）またはＣ末端（配列番号２）ＫＲＡＢドメイン、Ｓｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ、配列番号３）、およびＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ、配列番号４）であり、一方で遺伝子転写の活性化は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６（配列番号５）またはＶＰ６４（ＶＰ１６の反復四量体、配列番号６）ドメインを通して達成される（Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）。転写活性を付与すると考えられるさらなるドメインは、ＣＪ７（配列番号７）、ｐ６５−ＴＡ１（配列番号８）、ＳＡＤ（配列番号９）、ＮＦ−１（配列番号１０）、ＡＰ−２（配列番号１１）、ＳＰ１−Ａ（配列番号１２）、ＳＰ１−Ｂ（配列番号１３）、Ｏｃｔ−１（配列番号１４）、Ｏｃｔ−２（配列番号１５）、Ｏｃｔ−２＿５ｘ（配列番号１６）、ＭＴＦ−１（配列番号１７）、ＢＴＥＢ−２（配列番号１８）、およびＬＫＬＦ（配列番号１９）である。くわえて、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１（http://amigo.geneontology.org/cgi bin/amigo/term_details?term=GO:0001071）によって定義されるタンパク質の転写活性のあるドメインは標的タンパク質の転写調節を達成すると考えられている。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質および調節ドメインを含んでなる融合タンパク質は人工転写因子と呼ばれる。
【０００４】
特異的な特徴は高度に保存されるため、低分子薬物は所与のタンパク質ファミリーのある特定のメンバータンパク質を常に選択的に標的とすることができるわけではない。一方、天然のタンパク質または遺伝子組み換えタンパク質を基礎とした生物学的製剤は抗体ベースの新規薬物に示されるように高い特異性をもたらす。しかし、これまでの生物学的製剤は実質的にすべて細胞外に作用する。とりわけ、上記人工転写因子は、治療上有用であるように遺伝子転写に影響を及ぼすのに好適であろうと思われる。しかし、そのような因子の作用部位−核−への送達は容易には達成されず、よって、例えばレトロウイルス送達での中継等、治療的な人工転写因子の方法の有用性は、免疫原性や細胞形質転換の可能性など、この方法に伴うあらゆる欠点により妨害される（Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082-9091）。
【０００５】
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は細胞膜をまたぐ細胞質基質／核質へのタンパク質移行を促進することが示された。ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド（配列番号２０）などの短いペプチドは、積み荷タンパク質の、細胞タイプに依存しないマクロピノサイトーシス（macropinocytotic）取り込みを誘導することが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。細胞質基質に達した際にそのような融合タンパク質は生物活性を有することが示された。興味深いことに、誤って折り畳まれたタンパク質でさえもタンパク質形質導入の後に機能的になることができ、これはおそらく細胞内シャペロンの作用による。
【０００６】
核内受容体はリガンド活性化転写因子のタンパク質スーパーファミリーである。他の大部分の細胞膜固定受容体と違って、それらは細胞質基質または核質に局在する可溶性タンパク質である。リガンドが結合し、それに続いて二量体化すると、核内受容体はＤＮＡ結合と遺伝子の発現調節とを通じて転写因子として作用することができる。核内受容体のリガンドは油脂肪親和性分子であり、それらには、ステロイドおよび甲状腺ホルモン、脂肪酸および胆汁酸、レチノイン酸、ビタミンＤ３、並びにプロスタグランジンがある（McEwan I.J., Methods in Molecular Biology: The Nuclear Receptor Superfamily, 505, 3-17）。リガンドが結合すると核内受容体は二量体化し、リガンド応答性遺伝子プロモーター内の特異的な転写因子特異的ＤＮＡ応答エレメントへの結合が起こり、遺伝子発現の活性化または抑制を引き起こす。核内受容体がステロイドなどの多くの広い範囲で作用するホルモンの活性および重要な代謝産物の活性を媒介することに関与することを考えれば、核内受容体の異常機能および機能障害は多くの疾患の自然経過に係わる。
【０００７】
核内受容体の活性を調節する作動剤または拮抗剤の使用が治療目的で採用されている。作動剤のデキサメタゾンなどのコルチコステロイドを使用したグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能の調節は、炎症性疾患に影響する一般的な臨床診療である。核内受容体活性の別の調節は経口の避妊法で例示され、そこにおいて、エストロゲン受容体（ＥＳＲ１／ＥＲ）およびプロゲステロン受容体の活性化は女性の卵受精を防ぐのに使われる。別の例では、フルタミドまたはビカルタミドなどの抗アンドロゲンを用いてアンドロゲン受容体（ＡＲ）を塞ぐことがＡＲ依存性の前立腺がんの治療に有用なことが証明された。さらに、エストロゲン合成およびエストロゲンの利用可能性を妨げることによるエストロゲン受容体の妨害は女性の乳がんまたは男性の女性化乳房症に対する標準的な治療である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合されたポリダクチルポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルポリダクチルジンクフィンガータンパク質、を含んでなる人工転写因子、並びにそのような人工転写因子を含んでなる医薬組成物に関する。さらに本発明は、核内受容体リガンドに対する細胞応答の調節、および特異的なエフェクターのそのような核内受容体への結合によって調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用に関する。
【０００９】
特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はアンドロゲン受容体プロモーター（配列番号２１）である。この特定の実施形態では、本発明は、テストステロンに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、アンドロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびテストステロンによって調節される疾患の治療で用いる、アンドロゲン受容体プロモーターを標的とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のアンドロゲン受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるテストステロンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００１０】
別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はエストロゲン受容体プロモーター（配列番号２２）である。この特定の実施形態では、本発明は、エストロゲンに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、エストロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびエストロゲンによって調節される疾患の治療で用いる、エストロゲン受容体プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のエストロゲン受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエストロゲンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００１１】
さらに別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はグルココルチコイド受容体プロモーター（配列番号２３）である。この特定の実施形態では、本発明は、グルココルチコイドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、グルココルチコイド受容体レベルを低下または増加させるための、およびグルココルチコイドによって調節される疾患の治療で用いる、特にグルココルチコイドによって調節される眼疾患の治療で用いる、グルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のグルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるグルココルチコイドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、本発明の人工転写因子をコードする核酸、それらを含んでなるベクター、およびそのようなベクターを含んでなる宿主細菌に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】形質導入可能人工転写因子を用いた遺伝子発現の調節  抑制／活性化ドメイン（ＲＤ＝調節ドメイン）および核局在化配列（ＮＬＳ）に融合された核内受容体遺伝子（Ｇ）のプロモーター（Ｐ）領域を特異的に標的とする六量体ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質を含む人工転写因子は、ＴＡＴなどのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の作用によって細胞内に輸送される。転写調節ドメインに依存して受容体遺伝子発現は増加（＋）または抑制（−）され、結果として核内受容体（ＮＲ）発現の増強または低下、ひいては核内受容体リガンド（Ｌ）に対する細胞応答の増強または低下をもたらす。
【図２】ヒトグルココルチコイド受容体プロモーターおよび人工転写因子標的部位  グルココルチコイド受容体プロモーター（配列番号２１）の５’非翻訳領域を示す。転写開始点（太字、７０７位）および本発明の人工転写因子の３つの結合部位（下線）が強調されている。
【図３】ヒトアンドロゲン受容体プロモーターおよび人工転写因子標的部位  アンドロゲン受容体プロモーター（配列番号２２）の５’非翻訳領域を示す。転写開始点（太字、７６８位）および本発明の人工転写因子の４つの結合部位（下線）が強調されている。
【図４】ヒトエストロゲン受容体プロモーターおよび人工転写因子標的部位  エストロゲン受容体プロモーター（配列番号２３）の５’非翻訳領域を示す。転写開始点（太字、９６０位）および本発明の人工転写因子の３つの結合部位（下線）が強調されている。
【図５】ＡＲ４ｒｅｐはルシフェラーゼリポーターアッセイにおいて遺伝子発現を抑制できる  ハイブリッドＣＭＶ／ＡＲ＿ＴＳ４プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼからなるリポーターコンストラクトを含むＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１μＭのＡＲ４ｒｅｐを用いて２時間処理した。関連のない人工転写因子ＡＴＦ対照（配列番号２４）での処理を対照とした（Ｃと表示）。ルシフェラーゼおよび分泌アルカリホスファターゼ活性をＡＲ４ｒｅｐ処理の２４時間後に測定した。分泌アルカリホスファターゼ活性に対して正規化したルシフェラーゼ活性を、相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＡ）として対照の百分率割合で表わした。統計的有意性を対応のないスチューデントの両側ｔ検定を用いて解析した。Ｐ値＜０．０１を＊＊で印す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質、を含んでなる人工転写因子、並びにそのような人工転写因子を含んでなる医薬組成物に関する。
【００１５】
膜に固定された、膜貫通タンパク質からなるまたは膜貫通タンパク質を含むほとんど全ての他の細胞受容体と対照的に、核内受容体は１つのポリペプチドにリガンド結合と転写因子活性を組み入れた可溶性タンパク質である。核内受容体は細胞質基質または核質のいずれかに局在し、そこでリガンドが結合すると活性化されて二量体化し、莫大な転写プログラムを制御する活性転写因子になる。細胞の外側でそのリガンドと結合し、細胞膜をまたいでシグナルを細胞内に伝達する上記の膜に固定された受容体と違って、核内受容体は、細胞膜を通過して対応する受容体へのアクセスを得ることができる脂肪親和性のリガンドと結合する。くわえて、大部分の膜結合受容体は、細胞での目的とする効果を達成する前の複雑なシグナル増幅機構に依存する。一方、核内受容体はリガンドの結合を細胞応答に直接変換する。
【００１６】
多くの疾患の治療が核内受容体シグナリングを調節することに基づく。例としては、グルココルチコイドがグルココルチコステロイド受容体を活性化する炎症性の過程、アンドロゲン受容体の拮抗剤が有益な治療効果を有する前立腺がん、またはエストロゲン受容体シグナリングを遮断することが有用であると分かっている乳がんがある。伝統的に、核内受容体作動剤または拮抗剤のいずれかの形態での低分子が治療目的で受容体シグナリングに強い影響を及ぼすのに使用される。しかし、核内受容体シグナリングは、核内受容体タンパク質発現の直接的な調節によっても影響される可能性があり、そのような調節が本発明の主題である。
【００１７】
本発明で考慮される核内受容体は、ヒト遺伝子ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ４Ｇ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＰＧＲ、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＢ、ＲＯＲＣ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＴＨＲＡ、ＴＨＲＢ、およびＶＤＲによってコードされるヒト核内受容体である。
【００１８】
さらに、ヒト以外の核内受容体、例えば、言及されたヒト核内受容体遺伝子に関連する遺伝子によってコード化されるブタ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、またはネズミの転写因子が考慮される。
【００１９】
技術水準によれば、人工転写因子の細胞内発現はウイルス形質導入を用いて達成される。ウイルスベクターは非常に高い潜在的免疫原性を有するので、ある種の治療を繰り返して適用するのにそれらのベクターを使用することは制限される。ジンクフィンガーモジュールは高度に保存され、そのため本発明の人工転写因子を適用した後にそのような免疫応答は少ないか若しくは存在しないことになり、またはそのような免疫応答は標的部位結合および機能を保持したまま免疫原性を消す全体構造への小さな変化によって回避若しくはさらに最小化されうる。さらに、ポリエチレングリコールによる本発明の人工転写因子の修飾が免疫原性を減らすために考慮される。くわえて、本発明の人工転写因子の、眼および脳などの免疫特権をもつ器官への適用は、いずれの免疫反応も回避して、人工転写因子に対する全身耐性を誘導することになる。免疫特権をもつ器官の外の慢性疾患の治療には、事前の眼内注射を通した免疫寛容の誘導が考慮される。
【００２０】
一群の治療薬として伝統的に使用されている低分子の類は、的を絞って遺伝子発現を調節するのには適切ではない。よって、有望な薬物標的および関連する疾患の多くは古典的な製薬方法を受け入れない。とりわけこれは、医薬品となりうるとみなされない転写因子に当てはまる。対照的に、本発明の人工転写因子は全て、高度に定義された全体組成をもつ同じ物質の類に属する。２つの大きく異なるプロモーター配列を標的とする２つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づいた人工転写因子でさえ、全体的に類似した三次構造とともに８５％もの最小アミノ酸配列同一性を有し、（下記の）標準化された方法によって迅速且つ経済的な方法で作製できる。よって、本発明の人工転写因子は、１つの類の分子内にあって、全体的に類似した組成と、非常に広範で多岐にわたる標的に対する非常に高い特異性とを兼ね備える。
くわえて、本発明の人工転写因子の薬品への製剤化はこれまでの経験に頼ることができ、さらに薬品開発過程をはかどらせる。
【００２１】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）によって媒介される人工転写因子の細胞内送達は、新しいやり方で生物学的製剤の標的受容体分子に対する高選択性を利用する新規の方法である。従来の薬物はある特定の受容体の活性を調節する。一方で人工転写因子はこれらのタンパク質の利用可能性を変える。人工転写因子はそのような受容体遺伝子のプロモーター領域に特異的に作用するように適応させて作られるので、本発明によって、密接に関連するタンパク質でさえも選択的に標的とすることが可能になる。これは密接に関連するタンパク質でさえもプロモーター領域は厳密に保存されないことに基づく。タンパク質形質導入ドメインによって媒介される人工転写因子の送達は、核内受容体のリガンドに対する細胞応答を調節するのに有用である。
【００２２】
考慮されるタンパク質形質導入ドメインは、細胞膜をまたいで積み荷を輸送できる、ＨＩＶ  ＴＡＴ、ｍＴ０２ペプチド（配列番号２５）、ｍＴ０３ペプチド（配列番号２６）、Ｒ９ペプチド（配列番号２７）、ＡＮＴＰドメイン（配列番号２８）などである。
【００２３】
本発明はまた、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質が核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とする、核内受容体リガンドの核内受容体への結合によって調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる疾患を治療する方法に関し、治療される疾患は、特異的なエフェクターの核内受容体への結合によって調節され、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質は受容体遺伝子プロモーターを特異的に標的とする。
【００２４】
考慮されるポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質である。「四量体」、「五量体」、「六量体」、「七量体」、および「八量体」とは、ジンクフィンガータンパク質がそれぞれ４、５、６、７、または８つの部分タンパク質構造体からなり、その各々が特定のヌクレオチドトリプレットに対する結合特異性を有することを意味する。好ましくは、人工転写因子は六量体ジンクフィンガータンパク質を含んでなる。
【００２５】
所与のプロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は機能的な人工転写因子の作製を成功させるのに決定的に重要である。生体内での核内受容体遺伝子発現を調節する人工転写因子に関して、人工転写因子は核内受容体遺伝子遺伝子のゲノムコンテキスト中のその標的部位に結合しなければならない。これにはＤＮＡ標的部位が接近可能であることを必要とされ、この領域の染色体ＤＮＡはヌクレオソームにおいてヒストンのまわりに密に詰まった状態ではなく、メチル化などのＤＮＡ修飾が人工転写因子の結合を妨害しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は密に詰まった状態で、転写的に不活性である一方で、活発に転写される遺伝子の転写開始点（−１０００〜＋２００ｂｐ）のすぐ近くは、内在転写因子およびＲＮＡポリメラーゼなどの転写機構が接近可能でなければならない。よって、いずれの所与の標的遺伝子のその領域内から標的部位を選択することは、所望の生体内機能をもつ人工転写因子の作製の成功率を大きく高めることになる。
【００２６】
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体遺伝子プロモーター内の標的部位の選択
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体オープンリーディングフレーム（図２、図３、および図４）の転写開始点を含む１０００ｂｐを含んでなるプロモーター領域を（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成をもつ１８ｂｐの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでＧはヌクレオチドのグアニン、Ｃはヌクレオチドのシトシン、Ａはヌクレオチドのアデニン、並びにＮはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表わす。プロモーターにおける３〜４つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択された。グルココルチコイド受容体遺伝子プロモーターに見出された標的部位はＧＲ＿ＴＳ１（配列番号２９）、ＧＲ＿ＴＳ２（配列番号３０）、ＧＲ＿ＴＳ３（配列番号３１）であり、アンドロゲン受容体に対する標的部位はＡＲ＿ＴＳ１（配列番号３２）、ＡＲ＿ＴＳ２（配列番号３３）、ＡＲ＿ＴＳ３（配列番号３４）、およびＡＲ＿ＴＳ４（配列番号３５）である。エストロゲン受容体遺伝子プロモーターで特定された標的部位はＥＲ＿ＴＳ１（配列番号３６）、ＥＲ＿ＴＳ２（配列番号３７）、およびＥＲ＿ＴＳ３（配列番号３８）である。転写開始の２０００ｂｐ上流のグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、およびアンドロゲン受容体の調節領域から選ばれた一般組成（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）5および（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の標的部位もまた考慮する。
【００２７】
グルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３（Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605）を用いて、いわゆるＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセット（Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810）から構成された。グルココルチコイド受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、ＧＲ＿ＴＳ１を標的とするＺＦＰ−ＧＲ１（配列番号３９）、ＧＲ＿ＴＳ２を標的とするＺＦＰ−ＧＲ２（配列番号４０）、およびＧＲ＿ＴＳ３を標的とするＺＦＰ−ＧＲ３（配列番号４１）は、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写活性化ドメインＶＰ６４に融合され、人工転写因子ＧＲ１ａｋｔ（配列番号４２）、ＧＲ２ａｋｔ（配列番号４３）、およびＧＲ３ａｋｔ（配列番号４４）が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ＺＦＰ−ＧＲ１〜ＺＦＰ−ＧＲ３はタンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写抑制ドメインＫＲＡＢに融合され、人工転写因子ＧＲ１ｒｅｐ（配列番号４５）、ＧＲ２ｒｅｐ（配列番号４６）、およびＧＲ３ｒｅｐ（配列番号４７）が得られた。
【００２８】
アンドロゲン受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３を用いて、いわゆるＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセットから構成された。ＡＲプロモーターを標的とするさらなるジンクフィンガータンパク質は、酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択された。アンドロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質である、ＡＲ＿ＴＳ１を標的とするＺＦＰ−ＡＲ１（配列番号４８）、ＡＲ＿ＴＳ２を標的とするＺＦＰ−ＡＲ２（配列番号４９）、ＡＲ＿ＴＳ３を標的とするＺＦＰ−ＡＲ３（配列番号５０）、並びにＡＲ＿ＴＳ４を標的とするＺＦＰ−ＡＲ４（配列番号５１）、ＺＦＰ−ＡＲ５（配列番号５２）、およびＺＦＰ−ＡＲ６（配列番号５３）は、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写活性化ドメインＶＰ６４に融合され、人工転写因子ＡＲ１ａｋｔ（配列番号５４）、ＡＲ２ａｋｔ（配列番号５５）、ＡＲ３ａｋｔ（配列番号５６）、ＡＲ４ａｋｔ（配列番号５７）、ＡＲ５ａｋｔ（配列番号５８）、およびＡＲ６ａｋｔ（配列番号５９）が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ＺＦＰ−ＡＲ１〜ＺＦＰ−ＡＲ６はタンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写抑制ドメインＳＩＤに融合され、人工転写因子ＡＲ１ｒｅｐ（配列番号６０）、ＡＲ２ｒｅｐ（配列番号６１）、ＡＲ３ｒｅｐ（配列番号６２）、ＡＲ４ｒｅｐ（配列番号６３）、ＡＲ５ｒｅｐ（配列番号６４）、およびＡＲ６ｒｅｐ（配列番号６５）が得られた。
【００２９】
エストロゲン受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３を用いて、いわゆるＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセットから構成された。エストロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、ＥＲ＿ＴＳ１を標的とするＺＦＰ−ＥＲ１（配列番号６６）、ＥＲ＿ＴＳ２を標的とするＺＦＰ−ＥＲ２（配列番号６７）、およびＥＲ＿ＴＳ３を標的とするＺＦＰ−ＥＲ３（配列番号６８）は、タンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写活性化ドメインＶＰ６４に融合され、人工転写因子ＥＲ１ａｋｔ（配列番号６９）、ＥＲ２ａｋｔ（配列番号７０）、およびＥＲ３ａｋｔ（配列番号７１）が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ＺＦＰ−ＥＲ１〜ＺＦＰ−ＥＲ３はタンパク質形質導入ドメインＴＡＴおよび転写抑制ドメインＳＩＤに融合され、人工転写因子ＥＲ１ｒｅｐ（配列番号７２）、ＥＲ２ｒｅｐ（配列番号７３）、およびＥＲ３ｒｅｐ（配列番号７４）が得られた。
【００３０】
本発明によるグルココルチコイド、アンドロゲン、またはエストロゲン受容体を標的とする人工転写因子はまた、配列番号３９〜４１、４８〜５３、および６６〜６８に開示されるジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質をそれぞれ含んでなり、そこにおいて、最大で４個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節する。
【００３１】
五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質を含む本発明の人工転写因子もまた考慮され、そこにおいて、個々のジンクフィンガーモジュールは交換されてそれぞれの核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和力を向上し、または忍容性を上げるためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的性状を変える。
【００３２】
本発明による核内受容体グルココルチコイド、アンドロゲン、および／またはエストロゲン受容体を標的とする人工転写因子はまた、配列番号３９〜４１、４８〜５３、および６６〜６８に開示されるジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質をそれぞれ含んでなり、そこにおいて、個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換される。
【００３３】
本発明の人工転写因子はまた、Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、およびＥＲＤドメインなど、好ましくはＳＩＤ、の、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の他の転写活性のあるタンパク質ドメインも含みうる。考慮される活性化タンパク質ドメインは、ＶＰ１６またはＶＰ６４（ＶＰ１６の反復四量体）など、好ましくはＶＰ６４、の、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の転写的に活性のあるドメインである。
【００３４】
さらに、本発明の人工転写因子は核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでなる。考慮される核局在化配列は、遺伝子オントロジーＧＯ：０００８１３９によって定義されるタンパク質への結合を通した核内移行を与えるアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基（Ｋ）それに続くリジン残基（Ｋ）若しくはアルギニン残基（Ｒ）、それに続く任意のアミノ酸（Ｘ）、それに続くリジン若しくはアルギニン残基（Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Bio 9, 2487-2492）を含む塩基性アミノ酸クラスターまたはＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号７５）があり、ＳＶ４０  ＮＬＳが好ましい。
【００３５】
核内受容体遺伝子のプロモーター領域を対象とするが、タンパク質形質導入ドメインを含まない人工転写因子もまた本発明の主題である。それらは、本明細書において上記で定義される本発明の人工転写因子の中間体である。核内受容体遺伝子のプロモーター領域を対象とするが、タンパク質形質導入ドメインを含まないそのような人工転写因子の特定の実施形態は、ともにタンパク質形質導入ドメインを含まない、アンドロゲン受容体遺伝子プロモーターを対象とする人工転写因子およびエストロゲン受容体遺伝子プロモーターを対象とする人工転写因子である。
【００３６】
さらに考慮されるのは、トランスフェクションによって、または限定はされないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに基づいたベクターなどのウイルスベクターを介して移される、核酸の形態での本発明の人工転写因子の代替的な送達方法である。
【００３７】
本発明の人工転写因子のドメインは短い柔軟なリンカーによって連結されてもよい。短く柔軟なリンカーは２〜８個の好ましくはグリシンおよびセリンであるアミノ酸をもつ。考慮される具体的なリンカーはＧＧＳＧＧＳ（配列番号７６）である。人工転写因子はその検出および処理を容易にするマーカーをさらに含んでもよい。
【００３８】
人工転写因子処理後のグルココルチコイド受容体調節の評価
グルココルチコイド受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したＨｅＬａ細胞を、デキサメタゾン処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、グルココルチコイド受容体標的遺伝子ＴＳＣ２２Ｄ３、ＩＧＦＢＰ１、およびＩＲＦ８の発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのグルココルチコイド応答性遺伝子の発現の減少は、グルココルチコイド受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
【００３９】
人工転写因子処理後のアンドロゲン受容体調節の評価
アンドロゲン受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したアンドロゲン受容体発現細胞を、テストステロン処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、アンドロゲン受容体標的遺伝子ＰＳＡ、ＳＰＡＫ、およびＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのアンドロゲン応答性遺伝子の発現の減少は、アンドロゲン受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
【００４０】
人工転写因子処理後のエストロゲン受容体調節の評価
エストロゲン受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したエストロゲン受容体発現細胞を、エストラジオール処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、エストロゲン受容体標的遺伝子ｂｃｌ−２、オボアルブミン、ｃ−ｆｏｓ、コラゲナーゼ、およびオキシトシンの発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのエストラジオール応答性遺伝子の発現の減少は、エストロゲン受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
【００４１】
ルシフェラーゼリポーターアッセイにおけるＡＲ４ｒｅｐ活性の評価
ハイブリッドＣＭＶ／ＡＲ＿ＴＳ４プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを含むＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞に基づくリポーター細胞株を用いてＡＲ４ｒｅｐの活性を評価した。図５に示されるように、ＡＲ４ｒｅｐでのこの種の細胞の処理は、対照処理した細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性の減少を引き起こした。
【００４２】
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合（ＰＥＧ化）が人工転写因子に溶解度を増加させ、その腎クリアランスを減少させ、その免疫原性を制御するために考慮された。大きさが１〜４０キロダルトンの範囲のアミンおよびチオール反応性ポリエチレングリコールが考慮される。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いて、人工転写因子の部位特異的ＰＥＧ化が達成される。本発明の人工転写因子においてチオール基を含む唯一の必須アミノ酸は、亜鉛配位に必須のジンクフィンガーモジュールに位置するシステイン残基である。これらのチオール基は亜鉛配位によりＰＥＧ化に利用できず、よって１つまたは幾つかのシステイン残基の本発明の人工転写因子への包含はチオール特異的ポリエチレングリコール試薬を使用したＰＥＧ化のための遊離チオール基を提供する。
【００４３】
医薬組成物
本発明はまた上記で定義された人工転写因子を含んでなる医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、とりわけヒトに対する非経口全身投与用組成物、特に静脈内投与用組成物、吸入用組成物、および局所投与用組成物、特に眼部局所投与用組成物、例えば点眼剤としての組成物、または硝子体内、結膜下、傍眼球（parabulbar）若しくは眼球後投与用の組成物である。特に好ましいのは、点眼剤および硝子体内、結膜下、傍眼球または眼球後投与用の組成物である。該組成物は活性成分を単独、または好ましくは薬理学的に許容される担体とともに含んでなる。さらに徐放製剤が考慮される。活性成分の投与量は、治療される疾患、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。
【００４４】
経口送達に有用な医薬組成物、特に、好適にカプセル化された活性成分を含んでなるか、そうでなければ腸内での分解から保護された組成物がさらに考慮される。例えば、そのような医薬組成物は膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含んでもよく、腸溶性コーティングによって包まれてもよい。
【００４５】
医薬組成物は活性成分を約１％〜約９５％含んでなる。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤などである。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法、例えば、従来の混合、溶解または凍結乾燥法を用いて調製される。
【００４７】
活性成分の溶液、また懸濁液または、分散液、とりわけ、例えば、活性成分を単独または担体、例えば、マンニトールとともに含んでなる凍結乾燥組成物の場合、使用前に作ることができる等張水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましい。医薬組成物は滅菌してもよく、並びに／または賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤および／若しくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩および／若しくは緩衝剤を含んでいてもよく、それ自体公知の方法、例えば、従来の溶解および凍結乾燥法を用いて調製される。前記溶液または懸濁液は、粘性増加剤、典型的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、若しくはゼラチン含んでいてもよく、または可溶化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）も含んでいてもよい。
【００４８】
油中の懸濁液は慣習的に注射目的で植物油、合成油、または半合成油を油成分として含んでなる。それらについては、酸成分として８〜２２個、とりわけ１２〜２２個の炭素原子をもつ長鎖脂肪酸を含む液体脂肪酸エステルが特記されうる。これらの脂肪酸エステルのアルコール構成成分は最大で６個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコール、とりわけ、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ひまし油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油がとりわけ有用である。
【００４９】
注射可能薬製剤の製造は通常無菌状態下で実施され、例えば、アンプルまたはバイアルへの充填や容器の密封も同様である。
【００５０】
非経口投与に関して、水溶性の活性成分、例えば、水溶性の塩の水溶液、または粘性増加物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラン、および所望の場合、安定剤を含む水性注射懸濁液がとりわけ好適である。活性成分は、随意に賦形剤とともに、凍結乾燥物の形態であることもでき、好適な溶媒を加えることによって非経口投与前に溶液にすることができる。
【００５１】
吸入用組成物は、エアロゾルの形態、スプレー、ミストとして、または液滴の形態で投与できる。エアロゾルは、定量噴霧式吸入器またはネブライザー、すなわち、特定量の薬剤を好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスを用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された薬剤の短いバーストの形態で、気道または肺に送達する装置を用いて送達できる、溶液または懸濁液から調製される。ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含む吸入粉末スプレー剤も提供できる。
【００５２】
好ましくは、点眼剤は涙液と等張（２９５〜３０５ｍＯｓｍ／ｌ）の組成を与える好適な薬剤を含んでなる活性成分の等張水溶液である。考慮される薬剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに組成物は、ｐＨを５〜８、好ましくは７．０〜７．４に維持するために、緩衝剤、例えば、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはトリスバッファー（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）含んでなる。組成物は、抗菌性保存剤、例えば、パラベン、塩化ベンザルコニウム、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）などの第四級アンモニウム塩をさらに含んでもよい。点眼剤はゲル状の点眼剤を作り出すキサンタンガム、および／またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、若しくはポリビニルピロリドンなどの他の粘性増強剤をさらに含んでもよい。
【００５３】
治療法における人工転写因子の使用
さらに本発明は、核内受容体リガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、核内受容体のレベルを低下または増加させるための、およびそのような核内受容体によって調節される疾患の治療で用いる、上記のように核内受容体のプロモーター領域を標的とするように構築された人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の核内受容体プロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体リガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
【００５４】
核内受容体リガンドによって調節される疾患は、例えば、副腎不全、副腎皮質不全、アルコール依存症、アルツハイマー病、アンドロゲン不応症、神経性無食欲症、大動脈瘤、大動脈弁硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、注意欠陥多動性障害、自閉症、無精子症、原発性胆汁性肝硬変、双極性障害、膀胱がん、骨がん、乳がん、心血管疾患、心血管心筋梗塞、セリアック病、胆汁うっ滞、慢性腎不全およびメタボリックシンドローム、肝硬変、口蓋裂、結腸直腸がん、先天性副腎皮質過形成、冠状動脈性心疾患、停留精巣、深部静脈血栓症、認知症、うつ病、糖尿病性網膜症、ドライアイ病、子宮内膜症、子宮内膜がん、Ｓ錐体増強症候群、本態性高血圧症、家族性部分型リポジストロフィー、神経膠芽腫、グルココルチコイド抵抗性、グレーブス病、高血清脂質レベル、高アポβリポタンパク質血症（hyperapobetalipoproteinemia）、高脂血症、高血圧［症］、高トリグリセリド血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、尿道下裂、不妊症、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血性心疾患、脂肪肝、肺がん、エリテマトーデス、大うつ病性障害、男性乳がん、代謝血漿脂質レベル、メタボリックシンドローム、偏頭痛、多発性硬化症、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、非ホジキンリンパ腫、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、卵巣がん、パーキンソン病、妊娠高血圧腎、プロゲステロン抵抗性、前立腺がん、偽性低アルドステロン症、乾癬、精神統合失調症、精神病、網膜色素変性症−３７、統合失調症、硬化性胆管炎、性転換、皮膚がん、ケネディーの球脊髄性萎縮症、心筋梗塞に対する感受性、乾癬に対する感受性、精巣がん、１型糖尿病、２型糖尿病、子宮がん、およびめまいである。
【００５５】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、副腎不全、副腎皮質不全、アルコール依存症、アルツハイマー病、アンドロゲン不応症、神経性無食欲症、大動脈瘤、大動脈弁硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、注意欠陥多動性障害、自閉症、無精子症、原発性胆汁性肝硬変、双極性障害、膀胱がん、骨がん、乳がん、心血管疾患、心血管心筋梗塞、セリアック病、胆汁うっ滞、慢性腎不全およびメタボリックシンドローム、肝硬変、口蓋裂、結腸直腸がん、先天性副腎皮質過形成、冠状動脈性心疾患、停留精巣、深部静脈血栓症、認知症、うつ病、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、子宮内膜がん、Ｓ錐体増強症候群、本態性高血圧症、家族性部分型リポジストロフィー、神経膠芽腫、グルココルチコイド抵抗性、グレーブス病、高血清脂質レベル、高アポβリポタンパク質血症（hyperapobetalipoproteinemia）、高脂血症、高血圧［症］、高トリグリセリド血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、尿道下裂、不妊症、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血性心疾患、脂肪肝、肺がん、エリテマトーデス、大うつ病性障害、男性乳がん、代謝血漿脂質レベル、メタボリックシンドローム、偏頭痛、多発性硬化症、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、非ホジキンリンパ腫、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、卵巣がん、パーキンソン病、妊娠高血圧腎、プロゲステロン抵抗性、前立腺がん、偽性低アルドステロン症、乾癬、精神統合失調症、精神病、網膜色素変性症−３７、統合失調症、硬化性胆管炎、性転換、皮膚がん、ケネディーの球脊髄性萎縮症、心筋梗塞に対する感受性、乾癬に対する感受性、精巣がん、１型糖尿病、２型糖尿病、子宮がん、およびめまいを治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジット（deposit）の眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【００５６】
さらに本発明は、アンドロゲン受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、アンドロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびアンドロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いる、上記のようにアンドロゲン受容体を対象とする人工転写因子に関する。
【００５７】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるアンドロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、前立腺がん、男性乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、精巣がん、冠動脈疾患、１型糖尿病、糖尿病性網膜症、肥満、アンドロゲン不応症、骨粗しょう症、変形性関節症、２型糖尿病、アルツハイマー病、偏頭痛、注意欠陥多動性障害、うつ病、統合失調症、無精子症、子宮内膜症、およびケネディーの球脊髄性萎縮症である。特に、ＡＲレベルを上方調節することはドライアイ病の治療に有益であり、一方、ＡＲレベルの下方調節はＡＲ遮断非感受性前立腺がんの治療に有益である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【００５８】
さらに本発明は、エストロゲン受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、エストロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびエストロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いる、上記のようにエストロゲン受容体を対象とする人工転写因子に関する。
【００５９】
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエストロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、前立腺がん、子宮がん、アルコール依存症、偏頭痛、大動脈瘤、心筋梗塞に対する感受性、大動脈弁硬化症、心血管疾患、冠動脈疾患、高血圧［症］、深部静脈血栓症、グレーブス病、関節炎、多発性硬化症、肝硬変、Ｂ型肝炎、慢性肝疾患、胆汁うっ滞、尿道下裂、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、アルツハイマー病、パーキンソン病、偏頭痛、めまい、神経性無食欲症、注意欠陥多動性障害、認知症、うつ病、精神病、子宮内膜症、および不妊症である。特に、ＥＲレベルの下方調節はホルモン依存性乳がんの治療に有益である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、０．５〜１ｍｇの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、１０ｍｇ／ｋｇの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
【００６０】
動物における人工転写因子の使用
さらに本発明は、そのような核内受容体の機能障害によって調節される疾患を治療するための、動物に見られる核内受容体を標的とする人工転写因子の使用に関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要としている動物への局所適用に好適な組成物の状態で直接適用される。
【実施例】
【００６１】
ＤＮＡプラスミドのクローニング
クローニングの全工程に関して、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼはニュー・イングランド・バイオラボから購入する。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）はプロメガから購入する。標準的なＰＣＲ反応には全て、高忠実度のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）を適用する。ＤＮＡ断片およびプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄキット、またはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓキット（マッハライ・ナーゲル社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて単離する。オリゴヌクレオチドはシグマ−アルドリッチから購入する。新たに作製されたプラスミドの関連ＤＮＡ配列はすべて、シークエンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社）によって確認した。
【００６２】
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
ＧＮＮおよび／またはＣＮＮおよび／またはＡＮＮ結合ジンクフィンガー（ＺＦ）モジュールを含む六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改変を含むGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。ＧＮＮ、ＣＮＮ、およびＡＮＮ  ＺＦモジュールをコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）に挿入し、それぞれｐＡＮ１０４９（配列番号７７）、ｐＡＮ１０７３（配列番号７８）、およびｐＡＮ１６７０（配列番号７９）を得た。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ライブラリーの段階的構築はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターで行う。個々のクローニングの各工程の間の、非機能性タンパク質をもたらす複数のＺＦモジュールの挿入を避けるために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（および１つのＺＦＰ、２つのＺＦＰ、または３つのＺＦＰを含有するその派生製品）、並びにｐＡＮ１０４９、ｐＡＮ１０７３、またはｐＡＮ１６７０を１つの制限酵素と最初にインキュベーションし、その後ＳＡＰで処理する。酵素をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  キットを用いて除去した後、第２の制限エンドヌクレアーゼを加える。
【００６３】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬのクローニングは、５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＸｈｏＩ、ＳＡＰで処理し、その後続いてＳｐｅＩで処理することによって行なう。１０μｇのｐＡＮ１０４９（１６個の異なるＧＮＮ  ＺＦモジュールの放出）またはｐＡＮ１０７３（１５個の異なるＣＮＮ  ＺＦモジュールの放出）またはｐＡＮ１６７０（１５個の異なるＡＮＮ  ＺＦモジュールの放出）をＳｐｅＩ、ＳＡＰとインキュベーションし、その後続いてＸｈｏＩとインキュベーションすることによってインサートを作製する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬの作製のために、７μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬをＡｇｅＩで切断し、脱リン酸化し、ＳｐｅＩで切断する。１０μｇのｐＡＮ１０４９またはｐＡＮ１０７３またはｐＡＮ１６７０にそれぞれＳｐｅＩ、ＳＡＰを加え、その後続いてＸｍａＩを加えることによってインサートを得る。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬのクローニングを、１４μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬをＡｇｅＩ、ＳＡＰで処理し、その後ＳｐｅＩで処理して切断されたベクターを得ることによって行なった。ＳｐｅＩ、ＳＡＰとインキュベーションし、その後続いてＸｍａＩとインキュベーションすることによって２０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬから３ＺＦＰＬインサートを放出させた。
【００６４】
１、２、および３つのＺＦＰを含むライブラリーのライゲーション反応を、３：１のインサート：ベクターのモル比で、２００ｎｇの切断ベクター、４００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｌの総容積でＲＴ（室温）にて一晩行なった。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのライゲーション反応は、２００μｌの総容積に、２０００ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬ、５００ｎｇの３ＺＦＰＬインサート、４０００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含み、それを十等分して２０μｌにして、別々にＲＴで一晩インキュベーションした。ライゲーション反応の一部を各ライブラリーに要するクローンの数に応じて数種の方法で大腸菌に形質転換した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬの作製のためには、３μｌのライゲーション反応を直接、大腸菌ＮＥＢ５−アルファのヒートショック形質転換に使用した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬのライゲーション反応のプラスミドＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌ＮＥＢ５−アルファに形質転換した（ＥｑｕｉＢｉｏ社のＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓエレクトロポレーション装置またはエッペンドルフのＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶおよび２５μＦ、バイオ・ラッドの２ｍｍエレクトロポレーションキュベット）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーのライゲーション反応をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットにかけ、ＤＮＡを１５μｌの脱イオン水に溶出した。約６０ｎｇの脱塩したＤＮＡを５０μｌのＮＥＢ１０−ベータエレクトロコンピテント大腸菌（ニュー・イングランド・バイオラボ）と混ぜ、エレクトロポレーションを、ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰｌｕｓまたはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶ、２５μＦ、および２ｍｍエレクトロポレーションキュベットを用いて製造業者の推奨通りに行なった。各ライブラリーについて複数のエレクトロポレーションを行い、その後細胞を直接貯えてライブラリーサイズを増やした。ヒートショック形質転換またはエレクトロポレーションの後、ＳＯＣ培地を細菌に加えた。３７℃にて２５０ｒｐｍで１時間インキュベーションした後、３０μｌのＳＯＣ培養物を連続希釈してアンピシリン含有ＬＢプレートに播いた。翌日、得られたライブラリークローンの総数を決定した。くわえて、各ライブラリーの１０個のクローンを選んでプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素切断によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドの少なくとも３つをシークエンシングしてライブラリーの多様性を確かめた。残りのＳＯＣ培養物を１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に移し、３７℃にて２５０ｒｐｍで一晩培養した。それらの細胞を使用して各ライブラリーのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ＤＮＡを調製した。
【００６５】
酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを適合プレイベクターに移す。その目的のために、ｐＧＡＤ１０（クロンテック）のマルチプルクローニングサイトを、ベクターをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＯＡＮ９７１（ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣ、配列番号８０）およびＯＡＮ９７２（ＡＡＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧ、配列番号８１）を挿入することによって変更した。結果として得られたベクターｐＡＮ１０２５（配列番号８２）を切断し、脱リン酸化した。６ＺＦＰライブラリーインサートをＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬから出した。ライゲーション反応およびＮＥＢ１０−ベータエレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションを、上記でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーについて記載したように行なった。
【００６６】
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを改良プレイベクターｐＡＮ１３７５（配列番号８３）にも移す。このプレイベクターは次のように構築された：ｐＲＳ３１５（配列番号８４）をＡｐａＩ／ＮａｒＩで切断し、アニールしたＯＡＮ１１４３（ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣ、配列番号８５）およびＯＡＮ１１４４（ＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧ、配列番号８６）を挿入してｐＡＮ１３７３（配列番号８７）を得た。ｐＡＮ１０２５からのＳｐｈＩインサートを、ＳｐｈＩで切断したｐＡＮ１３７３にライゲーションしてｐＡＮ１３７５を得た。
【００６７】
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを改良プレイベクターｐＡＮ１９２０（配列番号８８）にも移す。
【００６８】
いっそうさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーをプレイベクターｐＡＮ１９９２（配列番号８９）に挿入する。
【００６９】
酵母ワンハイブリッドスクリーニング用のベイトプラスミドのクローニング
各ベイトプラスミドについて、その中央に１８ｂｐの潜在的な人工転写因子標的部位を含む６０ｂｐ配列を選択し、制限酵素切断解析のためにＮｃｏＩ部位を含める。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断したｐＡｂＡｉ（クロンテック）に直接ライゲーションすることを可能にする５’ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’ＸｈｏＩ部位を作るようにオリゴヌクレオチドを設計してアニールする。生成物をＮｃｏＩで切断して、シークエンシングをしてベイトプラスミドの構築を確認する。
【００７０】
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエＹ１Ｈ  Ｇｏｌｄはクロンテックから購入し、ＹＰＤ培地およびＹＰＤ寒天はＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ社から購入した。合成ドロップアウト（ＳＤ）培地は、２０ｇ／ｌのグルコース、６．８ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、９．７ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（全てＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ社から）、１．４ｇ／ｌの酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、６．７ｇ／ｌの酵母窒素ベース、０．１ｇ／ｌのＬ−トリプトファン、０．１ｇ／ｌのＬ−ロイシン、０．０５ｇ／ｌのＬ−アデニン、０．０５ｇ／ｌのＬ−ヒスチジン、０．０５ｇ／ｌのウラシル（全てシグマ−アルドリッチから）を含有した。ＳＤ−Ｕ培地はウラシルを除く全ての構成成分を含み、ＳＤ−ＬはＬ−ロイシンを入れずに調製した。ＳＤ寒天プレートはリン酸ナトリウムを含まないが、１６ｇ／ｌのＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（ＢＤ）を含有した。オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）はクロンテックから購入した。
【００７１】
ベイト酵母株の調製
２０μｌの総容積中で約５μｇの各ベイトプラスミドをＢｓｔＢＩで直線化し、反応混合物の半分をサッカロマイセス・セレビシエＹ１Ｈ  Ｇｏｌｄのヒートショック形質転換に直接使用する。酵母細胞を形質転換の前日に５ｍｌのＹＰＤ培地に播種するのに使用し、ローラー上でＲＴ（室温）にて一晩培養する。１ミリリットルのこの前培養物を新鮮なＹＰＤ培地で１：２０に希釈し、３０℃にて２２５ｒｐｍで２〜３時間インキュベーションする。各形質転換反応について、１ＯＤ600の細胞を遠心分離によって採取し、酵母細胞を１ｍｌの滅菌水で１回洗い、１ｍｌのＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム）で１回洗う。そして最終的に、酵母細胞を５０μｌのＴＥ／ＬｉＡｃに再懸濁し、５０μｇのサケ精巣由来の一本鎖ＤＮＡ（シグマ−アルドリッチ）、１０μｌのＢｓｔＢＩで直線化したベイトプラスミド（上記）、および３００μｌのＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム、５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０）と混ぜる。細胞とＤＮＡをローラー上でＲＴにて２０分間インキュベーションし、その後４２℃の水浴に１５分間置く。そして最終的に、酵母細胞を遠心分離によって集め、１００μｌも滅菌水に再懸濁し、ＳＤ−Ｕ寒天プレート上に広げる。３０℃で３日間インキュベーションした後、各形質転換反応からＳＤ−Ｕ上に成長している８個のクローンを選び、それらのオーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する感受性を分析する。前培養をローラー上でＲＴにて一晩培養した。各培養物について、ＯＤ600を測定し、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調整した。この最初の希釈から、さらなる５回の１：１０希釈工程を、滅菌水を用いて調製した。各クローンについて、各希釈工程の５μｌを、ＳＤ−Ｕ、ＳＤ−Ｕ  １００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｕ  １５０ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｕ  ２００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡを含む寒天プレート上にスポットした。３０℃で３日間インキュベーションした後、ＳＤ−Ｕ上で良好に成長し、ＡｂＡに最も感受性がある３個のクローンをさらなる分析のために選ぶ。ベイトプラスミドの酵母ゲノムへの安定的な組み込みをＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃｈｅｃｋ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１（クロンテック）で製造業者の取扱説明書に従って確かめる。３個のうち１個クローンを後に続くＹ１Ｈスクリーニングに使用する。
【００７２】
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質転換
約５００μｌの酵母ベイト株の前培養物を１ＬのＹＰＤ培地に希釈し、３０℃および２２５ｒｐｍでＯＤ600＝１．６〜２．０まで（およそ２０時間）インキュベーションする。細胞をスイングアウトローターで遠心分離によって集める（５分、１５００×ｇ、４℃）。エレクトロコンピテント細胞の調製をBenatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各形質転換反応について、４００μｌのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を１μｇの６ＺＦＰライブラリーをコードするプレイプラスミドと混ぜ、氷上で３分間インキュベーションする。細胞−ＤＮＡ懸濁液を予め冷やした２ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母細胞懸濁液の全てが形質転換されるまで、複数回のエレクトロポレーション反応（ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓエレクトロポレーション装置またはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶおよび２５μＦ）を行う。エレクトロポレーション後、酵母細胞を１００ｍｌのＹＰＤ：１Ｍソルビトールの１：１混合物に移し、３０℃且つ２２５ｒｐｍで６０分間インキュベーションする。細胞を遠心分離によって集め、１〜２ｍｌのＳＤ−Ｌ培地に再懸濁する。２００μｌに分注したものを１０００〜４０００ｎｇ／ｍｌのＡｂＡを含有する１５ｃｍＳＤ−Ｌ寒天プレートに広げる。くわえて、５０μｌの細胞懸濁液を使って１／１００および１／１０００希釈を作り、５０μｌの未希釈細胞および希釈細胞をＳＤ−Ｌ上に播く。プレートを全て３０℃で３日間インキュベーションする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体を含むプレートから計算する。未希釈細胞を含むＳＤ−Ｌプレートは全ての形質転換体の成長を示す一方で、ＡｂＡ含有ＳＤ−Ｌプレートにはプレイ６ＺＦＰがそのベイト標的部位への結合が成功した場合にのみコロニーが形成された。
【００７３】
正の相互作用の検証と６ＺＦＰをコードするプレイプラスミドの回復
初期解析のために、４０個のかなり大きいコロニーを最も高い濃度のＡｂＡを含むＳＤ−Ｌプレートから採り、酵母細胞を１０００〜４０００ｎｇ／ｍｌのＡｂＡを含むＳＤ−Ｌ上に再度二回ストリークして単一コロニーを得た。各クローンについて、１個のコロニーを使って５ｍｌのＳＤ−Ｌ培地に播種し、細胞をＲＴで一晩培養する。翌日、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調整し、５つのさらなる１／１０希釈物を調製し、５μｌの各希釈工程を、ＳＤ−Ｌ、ＳＤ−Ｌ  ５００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、１０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  １５００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２５００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ３０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｌ  ４０００ｎｇ／ｍｌ  ＡｂＡプレート上にスポットする。クローンをその高ＡｂＡ濃度で成長する能力に従ってランクづける。最も良好に成長したクローンから、５ｍｌの初期ＳＤ−Ｌ前培養を用いて細胞を沈降させ、１００μｌの水または残存培地に再懸濁する。５０Ｕのリチカーゼ（lyticase）（シグマ−アルドリッチ、Ｌ２５２４）の添加後、細胞を水平振とう機で３７℃および３００ｒｐｍにて数時間インキュベーションする。生成したスフェロプラストを１０μｌの２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を加えることによって溶解し、１分間ボルテックスすることによって激しく混ぜ、−２０℃で少なくとも１時間凍らせる。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＰｌａｓｍｉｄキットのＡ１バッファー２５０μｌおよびスパチュラ先一杯分のガラスビーズ（シグマ−アルドリッチ、Ｇ８７７２）を加え、チューブを１分間ボルテックスすることによって激しく混ぜる。標準的なＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄキットプロトコールを続ける前に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＰｌａｓｍｉｄキットのＡ２バッファー２５０μｌを加え、ＲＴで少なくとも１５分間インキュベーションすることによってプラスミドの単離はさらに向上される。３０μｌの溶出緩衝液で溶出後、５μｌのプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５アルファにヒートショック形質転換によって形質転換する。２個の別々のコロニーをアンピシリン含有ＬＢプレートから採り、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートをシークエンシングする。各標的部位に対する６ＺＦＰ中のコンセンサス配列について、得られた結果を解析する。
【００７４】
形質導入可能人工転写因子活性を試験するための安定したルシフェラーゼ／分泌アルカリホスファターゼリポーター細胞株の作製用のリポータープラスミドのクローニング
ハイブリッドＣＭＶ／人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼと、恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼとを含むリポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含む４２ｂｐをｐＡＮ１６６０のＡｆｌＩＩＩ／ＳｐｅＩにクローニングした（配列番号９０）。これらのリポーターコンストラクトは、ＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ（インビトロジェン）細胞などのＦｌｐＩｎ部位含有細胞への安定した組み込みのためのＦｌｐＩｎ部位を含む。オリゴヌクレオチドＯＡＮ１６１２（配列番号９１）およびＯＡＮ１６１３（配列番号９２）を使用して、ＡＲ＿ＴＳ４を標的とする人工転写因子をテストするそのようなリポーターコンストラクトを作製した。
【００７５】
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩを用いる標準的な手順で哺乳類細胞における、着目したジンクフィンガーアレイ、ＳＶ４０  ＮＬＳ、３×ｍｙｃエピトープタグ、およびＮ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５５−配列番号９３）、Ｃ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５８−配列番号９４）、ＳＩＤドメイン（ｐＡＮ１２５７−配列番号９５）、またはＶＰ６４活性化ドメイン（ｐＡＮ１５１０−配列番号９６）の間の融合タンパク質としての発現用の哺乳類発現ベクターにクローニングする。
【００７６】
安定的にトランスフェクションされた、テトラサイクリン誘導可能細胞作製用プラスミドを次にように作製した：ポリダクチルジンクフィンガードメイン、調節ドメイン（Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＶＰ６４）、およびＳＶ４０  ＮＬＳを含んでなる人工転写因子をコードするＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶ／ＡｇｅＩを用いてｐＡＮ２０７１（配列番号９７）にクローニングする。これらの人工転写因子発現プラスミドは、ＡＡＶＳ１  Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶＳ１  Ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（ジーンコピア）との共トランスフェクションによってヒトゲノムのＡＡＶＳ１座に組み込まれる。
【００７７】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、４．５ｇ／ｌ  グルコース、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（全てシグマ−アルドリッチから）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ2、３７℃にて培養する。ルシフェラーゼリポーターアッセイのために、７０００個のＨｅＬａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播いた。翌日、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（キアゲン）を製造業者の取扱説明書に従って使用して共トランスフェクションを行う。人工転写因子およびルシフェラーゼをコードするＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ調製物を３：１の比率で用いる。トランスフェクションの６時間後および２４時間後に、培地をウェルあたり１００μｌの新鮮なＤＭＥＭで取り換えた。
【００７８】
Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株の作製および維持
安定した、テトラサイクリン誘導可能なＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株をＦｌｐリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔを用いて、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株をｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ標的部位ベクターおよびｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターをトランスフェクションすることによって作製する。誘導可能な２９３発現細胞株の作製のために、着目した遺伝子を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ発現ベクターを、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組み換えを介してＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株のＦＲＴ部位に組み込む。安定したＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）発現細胞株を、（ＤＭＥＭ；１０％  Ｔｅｔ−ＦＢＳ；２ｍＭ  グルタミン；１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン、および１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン）を含む選択培地で維持する。遺伝子発現を誘導するために、テトラサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。
【００７９】
ＴＡＬＥＮを用いた安定して人工転写因子を発現する細胞株の作製および維持
テトラサイクリン誘導可能なプロモーターの制御下で安定して人工転写因子を発現する細胞株を作製するために、細胞を、着目した人工転写因子を含むｐＡＮ２０７１をベースとした発現コンストラクト並びにＡＡＶＳ１  Ｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶＳ１  Ｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮ（ジーンコピア）プラスミドで、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン、トランスフェクション試薬）を製造業者の推奨に従って用いて共トランスフェクションする。トランスフェクションの８時間後に成長培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な成長培地を加えた。トランスフェクションの２４時間後、Ｔｅｔ仕様ＦＢＳ（テトラサイクリンを含まないＦＢＳ、タカラ）を含み、抗生物質を含まない成長培地に細胞を１：１０の比率で分けた。トランスフェクションの４８時間後、ピューロマイシン選択を細胞タイプに特異的な濃度で開始し、細胞を選択圧下で７〜１０日保持した。安定細胞のコロニーを貯め、選択培地中で維持した。
【００８０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現レベルの決定
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、全ＲＮＡを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを１０μｌ／ｍｌのβ−メルカプトエタノールを含むＲＬＴ  Ｐｌｕｓ溶解バッファーに再懸濁する。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを用いたホモジナイゼーションの後、溶解物の全てをｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに移してゲノムＤＮＡを除去する。同容積の７０％エタノールを加え、全溶解物をＲＮｅａｓｙスピンカラムに移す。数回の洗浄工程の後、ＲＮＡを最終容積が３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶出する。さらに使用するまでＲＮＡを−８０℃で保存する。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国）を製造業者の取扱説明書に従って用いてｃＤＮＡの合成を行う。２μｌ  １０×バッファー、０．８μｌ  ２５×ｄＮＴＰミックス、２μｌ  １０×ＲＴランダムプライマー、１μｌ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、および４．２μｌ  Ｈ2Ｏを含む２０μｌの総反応容積中でｃＤＮＡ合成を行う。最終容積が１０μｌのＲＮＡを加え、反応を次の条件下で行う：２５℃で１０分、それに続いて３７℃で２時間、および８５℃で５分の最終工程。１μｌの２０×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１０．０μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ともにアプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国）、および８μｌのＨ2Ｏを含む２０μｌの総反応容積中で定量ＰＣＲを実施する。各反応に１μｌのｃＤＮＡを加える。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国）を使用して次の条件下でｑＰＣＲを行う：５０℃で２分間の開始工程の後に、９５℃で１０分間の第一の変性並びに９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルからなるさらなる工程が続く。
【００８１】
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
Ｈｉｓ6でタグされた人工転写因子とＴＡＴタンパク質形質導入ドメインとの融合タンパク質として大腸菌で発現するためのｐＥＴ４１ａ＋（ノバジェン）をベースとする細菌発現ベクターｐＡＮ９８３（配列番号９８）に、ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩを用いる標準的な手順で人工転写因子をコードするＤＮＡ断片をクローニングする。
【００８２】
ＧＲ、ＡＲ、およびＥＲを標的とする、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な大腸菌宿主細菌における、形質導入可能な転写因子の細菌による産生用の発現コンストラクトは、ｐＡＮ２３４３（配列番号９９）、ｐＡＮ２３４４（配列番号１００）、ｐＡＮ２３４５（配列番号１０１）、ｐＡＮ２３４６（配列番号１０２）、およびｐＡＮ２３４７（配列番号１０３）である。
【００８３】
人工転写因子タンパク質の作製
所与の人工転写因子用の発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００μＭ  ＺｎＣｌ2を補充した１ＬのＬＢ培地でＯＤ600が０．８〜１に達するまで培養し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで２時間誘導した。細菌を遠心分離によって採取し、細菌溶解物をソニケーションによって調製し、封入体を精製した。この目的のために、封入体を遠心分離（５０００ｇ、４℃、１５分）によって集め、２０ｍｌの結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．５）で３回洗った。精製した封入体を３０ｍｌの結合バッファーＡ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）に氷上で１時間可溶化した。可溶化した封入体を４℃にて１３，０００ｇで４０分間遠心分離し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターを通してろ過した。ヒスチジンタグ人工転写因子を、結合バッファーＡおよび溶出バッファーＢ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）を用いてＡｋｔａｐｒｉｍｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア）のＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムで精製した。精製した人工転写因子を含む画分を貯め、ＳＩＤドメインを含む人工転写因子の場合はバッファーＳ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ７．５）に対して、またはＫＲＡＢドメインを含む人工転写因子はバッファーＫ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ８．５）に対して、４℃で一晩透析した。透析に続いて、タンパク質試料を１４，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離し、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターチップ（ミリポア）を用いて滅菌ろ過した。ＶＰ６４活性化ドメインを含む人工転写因子については、タンパク質を可溶性画分（結合バッファー：５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；溶出バッファー：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）から、Ｈｉｓ−Ｂｏｎｄ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ノバジェン）を製造業者の推奨に従って用いて作製した。タンパク質をＶＰ６４−バッファー（５５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、４００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2）に対して透析した。
【００８４】
タンパク質形質導入
培養密度が約８０％にまで成長した細胞を２時間〜１２０時間、０．０１〜１μＭの人工転写因子で処置または模擬処理し、随意に２４時間毎に人工転写因子をＯｐｔｉＭＥＭまたは成長培地に３７℃で加える。随意に１０〜５００μＭのＺｎＣｌ2を成長培地に加える。免疫蛍光のために、細胞をＰＢＳで１回洗い、トリプシン処理し、さらなる試験のためにカバーガラス上に播く。
【００８５】
免疫蛍光
細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１５％トリトンＸ−１００で処理し、１０％ＢＳＡでブロックし、マウス抗ＨＡ抗体（１：５００、Ｈ９６５８、シグマ）またはマウス抗ｍｙｃ（１：５００、Ｍ５５４６、シグマ）で一晩インキュベーションする。試料をＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗い、アレクサフルオル５４６結合ヤギ抗マウス抗体（１：１０００、インビトロジェン）でインキュベーションし、ＤＡＰＩ（１：１０００の１ｍｇ／ｍｌ、３分間、シグマ）を用いて対比染色する。蛍光顕微鏡観察を用いて試料を解析する。
【００８６】
ルシフェラーゼ／ＳＥＡＰプロモーター活性組み合せアッセイ
人工転写因子の活性をテストするために、リポーター細胞株を採用した。このリポーター細胞株は、ハイブリッドＣＭＶ／人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性ＣＭＶプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを含むＨＥＫ２９３  ＦｌｐＩｎ  ＴＲｅｘ細胞に基づく。
【００８７】
タンパク質形質導入の２４時間前に、１ウェル当たり１×１０5個のリポーター細胞を６ウェルプレートに播く。播種の２４時間後に、培地をプレートから吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗う。タンパク質処理のために、ＡＲ４ｒｅｐをＯｐｔｉＭＥＭで１μＭの最終濃度に希釈し、細胞に加え、インキュベーター（３７℃；５％ＣＯ2）で２時間インキュベーションした。タンパク質形質導入後に、細胞を通常成長培地で２４時間培養した。上澄みを９６ウェルプレートに移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ガウシアルシフェラーゼの測定のために、ピアス（商標）ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット（Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（サーモサイエンティフィック）を製造業者の取扱説明書に従って使用した。作業溶液（working solution）を室温に平衡化し、セレンテラジンを１：１００の希釈で加えた。２０μｌの細胞上澄みを不透明の９６ウェルプレートに移し、５０μｌの作業溶液を加えた。１０分間インキュベーションした後、発光をＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ（ベルトールドテクノロジー）を用いて１．０秒の積分時間で測定した。分泌アルカリホスファターゼ活性の測定のために、化学発光によるＳＥＡＰレポータージーンアッセイ（ＳＥＡＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ）（ロシュ）を製造業者の取扱説明書に従って使用した。細胞上澄みを希釈バッファーで１：４希釈し、６５℃で５分間熱不活化した。５０μｌの熱不活化試料を不透明の９６ウェルプレートに移し、５０μｌの不活化バッファーを加えた。室温で５分間インキュベーションした後、基質バッファー中の１：２０のＡＰ基質からなる５０μＬの基質試薬を加え、軽く撹拌しながら室温で１０分間インキュベーションした。発光をＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ（ベルトールドテクノロジー）を用いて１．０秒の積分時間で測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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