(57)【要約】本開示は、刺激応答性磁性ナノ粒子、磁性ナノ粒子を作製する方法、および磁性ナノ粒子を使用する方法を提供する。磁性ナノ粒子は、金属酸化物コアと、金属酸化物コアに直接配位する終端基を有する刺激応答性ポリマーを含むシェルとを含む。刺激応答性ポリマーは、少なくとも金属酸化物コアに対してポリマーの近位終端にはミセル形成基を含まない。一態様では、本開示は、（１）大気圧で１５０℃を上回る沸点を有する溶媒、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｄ、ＤｙおよびＭｎから選択される元素の金属カチオンに配位しているキレート化剤を含む金属錯体、ならびに刺激応答性ポリマーを含む混合物を準備するステップと、（２）混合物を加熱して刺激応答性磁性ナノ粒子を得るステップとを含み、刺激応答性ポリマーが末端ミセル形成基を含まない、刺激応答性磁性ナノ粒子を作製するためのプロセスを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大気圧で１５０℃を上回る沸点を有する溶媒、
Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｄ、ＤｙおよびＭｎから選択される元素の金属カチオンに配位しているキレート化剤を含む金属錯体、
ならびに刺激応答性ポリマー
を含む混合物を準備するステップと、
前記混合物を加熱して刺激応答性磁性ナノ粒子を得るステップと
を含み、前記刺激応答性ポリマーが終端ミセル形成基を含まない、刺激応答性磁性ナノ粒子を作製するためのプロセス。
【請求項２】
前記溶媒が２．４を上回る極性指数を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記溶媒が、ジグリム、トリグライム、テトラグライム、アセチルアセトン、アニソール、ベンゾニトリル、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、ジエチレングリコール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、キシレン、トルエン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記溶媒がオリゴエチレングリコールエーテルを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記溶媒がテトラグライムである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記キレート化剤が、カルボン酸、第１級アミン、第２級アミン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記キレート化剤が、Ｃ８〜Ｃ２８脂肪酸、ビピリジン、４−ビニルピリジン、エチレンジアミンおよびエチレンジアミン四酢酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記キレート化剤がオレイン酸である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記混合物が前記金属錯体を５ｍｇ／ｍＬ〜１１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記刺激応答性ポリマーがＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーが、カルボン酸、第１級アミン、第２級アミン、チオール、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、アジド、ヒドラジド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される終端官能基で置換されている、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記混合物が前記刺激応答性ポリマーを２ｍｇ／ｍＬ〜７５ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記加熱ステップが酸素を含む雰囲気下で行われる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記加熱ステップが１００℃〜２４０℃の間の温度までの加熱を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記加熱ステップが１４０℃〜２４０℃の間の温度までの加熱を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記加熱ステップが、前記混合物を１〜１０時間の持続時間で環流させることを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記刺激応答性ナノ粒子が、前記金属カチオンから形成される磁性金属酸化物を含むコアを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記磁性金属酸化物が、酸化第二鉄、酸化第一鉄、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記刺激応答性ポリマーが、前記刺激応答性ポリマー上の終端官能基を介して前記コアに配位している、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記刺激応答性ナノ粒子が、温度、ｐＨ、光、電場およびイオン強度からなる群から選択される刺激に応答する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記刺激応答性ナノ粒子が１０ｎｍ〜６０ｎｍの流体力学直径を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２２】
金属酸化物コアと、
前記金属酸化物コアを取り囲み、終端カルボキシレート基を含む刺激応答性ポリマーを含むシェルと、
を含み、
前記終端カルボキシレート基が前記金属酸化物コアに直接配位し、前記刺激応答性ポリマーが終端ミセル形成基を含まない、
刺激応答性磁性ナノ粒子。
【請求項２３】
前記金属酸化物コアが、酸化鉄、酸化ニッケル、酸化ニッケル、酸化クロム、酸化ガドリニウム、酸化ジスプロシウムおよび酸化マンガンからなる群から選択される金属酸化物を含む、請求項２２に記載の刺激応答性磁性ナノ粒子。
【請求項２４】
前記刺激応答性ポリマーが、ミセルを形成することが可能な、アルキル基、アリール基、疎水性コポリマーブロックまたはポリペプチドを、前記金属酸化物コアに近位の終端および遠位の終端に含まない、請求項２２に記載の刺激応答性磁性ナノ粒子。
【請求項２５】
前記刺激応答性ポリマーがＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーを含む、請求項２２に記載の刺激応答性磁性ナノ粒子。
【請求項２６】
前記刺激応答性ポリマーが、式
【化２】
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を有する前記金属酸化物コアに遠位の終端を含む、請求項２２に記載の刺激応答性磁性ナノ粒子。
【請求項２７】
前記ナノ粒子が１０ｎｍ〜６０ｎｍの流体力学直径を有する、請求項２２に記載の刺激応答性磁性ナノ粒子。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が、約１：１〜３：１の刺激応答性ポリマー対金属酸化物の質量比を備える、請求項２２に記載の刺激応答性磁性ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年５月２９日に出願された米国特許出願第６１／８２８，２６８号の利益を主張し、当該出願の開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
政府のライセンス権利の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって与えられたＥＢ０００２５２の下での、そしてＲ４４  ＧＭ１００５５８の下での政府支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
診断および画像化用途における磁性ナノ粒子（ｍＮＰ）技術の開発に近年大きな関心が集まっている。大きい磁性粒子と比較して、小さいナノ粒子（ＮＰ）はそれらの拡散特性および超常磁性において潜在的な利点を示す。磁気泳動移動度μｍは磁場の存在下での物体の加速度と定義され、これは磁場内での物体の動きを制御する能力を決定する。室温およびそれ超における個々の粒子のμｍは
【数１】
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と定義され、式中、μ０は磁気定数であり、ＭＳ，ＣはｍＮＰの飽和磁気モーメントであり、ＤＣはｍＮＰの直径であり、ｋＢはボルツマン定数であり、ηは媒体の粘度であり、Ｔは温度である。ｍＮＰのμｍは、それらの粒径が小さくそれによってランダム化された磁気モーメントが生じるので、通常小さい。これは、小さいｍＮＰの好ましい拡散特性が有利である用途、例えばｍＮＰが抗体抗原相互作用によって診断標的を捕捉するのに使用される用途において、固有の課題をもたらす。一方では小さい粒子はより良好な会合特性および結合特性を示すが、他方ではそれらの小さいサイズが磁気捕捉効率を低下させる。
【０００４】
ｍＮＰにおける小さいμｍを克服する取り組みとしては、複数のｍＮＰで標識されたより大きい巨大分子または物体を使用すること、より大きいＭＳ，Ｃを有する材料からｍＮＰを作製すること、不可逆的に凝集したｍＮＰを使用すること、または大きい磁気勾配を使用することが挙げられる。しかし、これらの取り組みの大部分は好ましい拡散特性の消失をもたらす。さらに、大きい磁気勾配は多数のコイルおよび高電流を必要とする。高いＭＳ，Ｃを有する材料は通常は金属または合金であり、それらは表面／体積比が高いために、酸化事象を生じる傾向があり、これはそれらのＭＳ，Ｃを低下させることがある。ｍＮＰをプレ凝集させてより大きい構造にすると、表面／体積比の永久的な低下をもたらし、ｍＮＰｓの好ましい拡散特性の減少につながる。小さい磁場中で容易に分離させることもできる、好ましい拡散特性を有するｍＮＰが必要とされている。
【０００５】
刺激応答性（「インテリジェント」または「スマート」）材料および分子は、ｐＨ；温度；ＵＶ−可視光；イオン強度；特定の化学物質の濃度、例えば、多価イオン、いずれかの電荷のポリイオン、または酵素基質（グルコースなど）；および光照射または電場への曝露などの外部刺激の小さな変化に応答して急激な特性変化を示す。通常はこれらの変化は、いったん刺激が取り除かれると完全に元に戻り得る。
【０００６】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）は、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示す温度応答性ポリマーであり、下限臨界共溶温度付近ではポリマーが可逆的に凝集する。ＬＣＳＴ未満では、ＰＮＩＰＡＡｍ鎖は水和して膨張構造を形成し；ＬＣＳＴを超えると、ＰＮＩＰＡＡｍ鎖は脱水して収縮構造を形成する。この特性は水分子と疎水性基（特にイソプロピル基）との熱可逆性相互作用に起因し、ＬＣＳＴ未満で低エントロピーの疎水結合した水分子を生じ、ＬＣＳＴを超えるとそれらの水分子の放出を引き起こす。ＰＮＩＰＡＡｍによるｍＮＰの修飾は、ＬＣＳＴを通って温度サイクルを行うと溶液中で可逆的に凝集することができるナノ粒子をもたらす。
【０００７】
ＰＮＩＰＡＡｍ修飾ｍＮＰに関する過去の研究は、粒子の合成後化学修飾に依存してきた。ＣｈｉｕらはＦｅＣｌ３およびＦｅＣｌ２を共沈させることによりＦｅ３Ｏ４磁性流体を合成した。次いで磁性流体をＰＮＩＰＡＡｍ溶液と混合し架橋させて磁性ポリマーネットワークを形成させた。Ｌｉｎ，  Ｃ．Ｌ．およびＷ．Ｙ．  Ｃｈｉｕ、Ｊ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．  ４３巻、５９２３〜５９３４頁、２００５年。ＷａｎｇらもＦｅＣｌ３およびＦｅＣｌ２を共沈させてＦｅ３Ｏ４粒子を合成した。Ｄｅｎｇ，  Ｙ．ら、Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １５巻、１７２９〜１７３２頁、２００３年。粒子をシリカの層で被覆し、３−アミノプロピルトリメトキシシランで修飾してＮＩＰＡＡｍの沈殿重合のシードとした。両方の方法において、合成後官能化は複数のステップを必要とし、粒子の凝集を引き起こす場合がある。膨大な合成後のワークアップステップを必要とせず粒子の凝集を最小限にする刺激応答性ポリマー修飾ｍＮＰを作製する方法が必要とされている。
【０００８】
刺激応答性ｍＮＰの過去の合成戦略にはミセル内の鉄前駆体Ｆｅ（Ｃｏ）５の熱分解も含まれていた。例えば、Ｆｅ（Ｃｏ）５を、ミセル状に形成された３．６ｍＭ  ＰＮＩＰＡＡｍを含有する１００℃のテトラグライム溶液中へ注入した。２−（ドデシルスルファニルチオカルボニルスルファニル）−２−メチルプロピオン酸（ＤＭＰ）連鎖移動剤による可逆的フラグメンテーション連鎖移動重合を使用して、終端ミセル形成部分を有するＰＮＩＰＡＡｍ（約５ｋＤａ）を合成した（例えば、Ｌａｉら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．  ２３巻（１３号）：７３８５〜７３９１頁、２００７年を参照）。ＰＮＩＰＡＡｍミセルを含有するテトラグライム溶液中へ鉄前駆体を注入した後、溶液を１９０℃まで上昇させ、６時間環流させた後に精製して、刺激応答性ｍＮＰの金属酸化物コアの近くに位置するミセル形成基を有する刺激応答性ｍＮＰを得た。例えば、米国特許第８，５０７，２８３号および同第７，９８１，６８８号を参照。
【０００９】
刺激応答性材料および分子は、生体医学／医薬分野において、ならびにバイオテクノロジーおよび関連する産業において多くの潜在的な用途がある。スマートコンジュゲート、スマート表面、スマートポリマーミセルおよびスマートヒドロゲルはすべて、様々な診断、分離、細胞培養、薬物送達およびバイオプロセスの用途において研究されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８，５０７，２８３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９８１，６８８号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｉｎ，  Ｃ．Ｌ．およびＷ．Ｙ．  Ｃｈｉｕ、Ｊ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．  ４３巻、５９２３〜５９３４頁、２００５年
【非特許文献２】Ｄｅｎｇ，  Ｙ．ら、Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １５巻、１７２９〜１７３２頁、２００３年
【非特許文献３】Ｌａｉら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．  ２３巻（１３号）：７３８５〜７３９１頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
診断および画像化用途のためのｍＮＰ技術の発展にもかかわらず、可逆的に凝集してより大きい構造となる能力を有するだけでなく好ましい拡散特性を有する刺激応答性ｍＮＰ、およびナノ粒子を作製するためのより簡単な方法が必要とされている。本開示は、これらの必要性を満たしさらなる関連する利点を提供することを試みるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この概要は、発明を実施するための形態において以下でさらに説明するコンセプトからの抜粋を簡略した形で紹介するために示されるものである。この概要は特許請求の範囲に記載される主題の重要な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求の範囲に記載される主題の範囲を決定するのに役立つものとして使用されることも意図していない。
【００１４】
一態様では、本開示は、（１）大気圧で１５０℃を上回る沸点を有する溶媒、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｄ、ＤｙおよびＭｎから選択される元素の金属カチオンに配位しているキレート化剤を含む金属錯体、ならびに刺激応答性ポリマーを含む混合物を準備するステップと、（２）混合物を加熱して刺激応答性磁性ナノ粒子を得るステップとを含み、刺激応答性ポリマーが末端ミセル形成基を含まない、刺激応答性磁性ナノ粒子を作製するためのプロセスを特徴とする。
【００１５】
別の態様では、本開示は、金属酸化物コアと、金属酸化物コアを取り囲み、終端カルボキシレート基を含む刺激応答性ポリマーを含むシェルとを含む、刺激応答性磁性ナノ粒子を特徴とする。終端カルボキシレート基は金属酸化物コアに直接配位し、刺激応答性ポリマーは終端ミセル形成基を含まない。
【００１６】
さらに別の態様では、本開示は刺激応答性磁性ナノ粒子を使用する方法を特徴とする。
【００１７】
前述の態様および付随するこの開示の利点の多くは、添付の図面と併せると、以下の発明を実施するための形態を参照することによってさらに良く理解されるようになり、より容易に認識されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本開示のｍＮＰを作製するプロセスの実施形態のフローチャートである。
【００１９】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、本開示のｍＮＰの実施形態を捕捉および放出する方法の概略図である。
【００２０】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、本開示の刺激応答性ｍＮＰの実施形態の構造特性および機能特性を示すグラフである。ｍＮＰはミセル形成基をポリマーの近位終端に含まない親水性刺激応答性ポリマーを含む。図３Ａは動的光散乱により測定される６つの異なるｍＮＰバッチの粒径を示すグラフである。図３Ｂは温度応答性の指標であるｍＮＰの３１℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示すグラフである。図３Ｃは熱重量分析により測定されるｍＮＰの刺激応答性ポリマー対Ｆｅの質量比を示すグラフである。図３ＤはＬＣＳＴより下（２２℃）および上（３７℃）におけるｍＮＰの分離効率を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、本開示の刺激応答性ｍＮＰの実施形態の構造特性および機能特性を示すグラフである。ｍＮＰはミセル形成基をポリマーの近位終端に含まない親水性刺激応答性ポリマーを含む。図３Ａは動的光散乱により測定される６つの異なるｍＮＰバッチの粒径を示すグラフである。図３Ｂは温度応答性の指標であるｍＮＰの３１℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示すグラフである。図３Ｃは熱重量分析により測定されるｍＮＰの刺激応答性ポリマー対Ｆｅの質量比を示すグラフである。図３ＤはＬＣＳＴより下（２２℃）および上（３７℃）におけるｍＮＰの分離効率を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、本開示の刺激応答性ｍＮＰの実施形態の構造特性および機能特性を示すグラフである。ｍＮＰはミセル形成基をポリマーの近位終端に含まない親水性刺激応答性ポリマーを含む。図３Ａは動的光散乱により測定される６つの異なるｍＮＰバッチの粒径を示すグラフである。図３Ｂは温度応答性の指標であるｍＮＰの３１℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示すグラフである。図３Ｃは熱重量分析により測定されるｍＮＰの刺激応答性ポリマー対Ｆｅの質量比を示すグラフである。図３ＤはＬＣＳＴより下（２２℃）および上（３７℃）におけるｍＮＰの分離効率を示すグラフである。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、本開示の刺激応答性ｍＮＰの実施形態の構造特性および機能特性を示すグラフである。ｍＮＰはミセル形成基をポリマーの近位終端に含まない親水性刺激応答性ポリマーを含む。図３Ａは動的光散乱により測定される６つの異なるｍＮＰバッチの粒径を示すグラフである。図３Ｂは温度応答性の指標であるｍＮＰの３１℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示すグラフである。図３Ｃは熱重量分析により測定されるｍＮＰの刺激応答性ポリマー対Ｆｅの質量比を示すグラフである。図３ＤはＬＣＳＴより下（２２℃）および上（３７℃）におけるｍＮＰの分離効率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、刺激応答性磁性ナノ粒子（ｍＮＰ）、ｍＮＰを作製する方法、およびｍＮＰを使用する方法を提供する。ｍＮＰは、金属酸化物コアと、金属酸化物コアに直接配位する終端基を有する刺激応答性ポリマーを含むシェルとを含む。刺激応答性ポリマーは、少なくとも金属酸化物コアに対してポリマーの近位終端にはミセル形成基を含まない。
【００２２】
本開示の刺激応答性ポリマー（すなわち、金属酸化物コアに配位している場合に、ｍＮＰの金属酸化物コアに対して近位のポリマー終端にミセル形成基がない）は、ｍＮＰの金属酸化物コアに近位のポリマー終端にミセル形成基を含む刺激応答性ポリマーと比較した場合に、多くの利点をもたらす。以下の実施例１で実証されるように、ミセル形成基をどのポリマー終端にも含まない刺激応答性ポリマーを本開示のプロセスで使用した場合、ミセル形成基をポリマー終端に含む刺激応答性ポリマーを使用して作製されたｍＮＰと比較して、予想外に改善された特性を有するｍＮＰが生成された。具体的には、ミセル形成基をポリマー終端に含む刺激応答性ポリマーを使用して作製されたｍＮＰは、収率が低く、サイズの均一性が低く、再現性良く合成することができず、水性環境中で望ましくない不溶性を有することがある。さらに、ミセル形成基をポリマー終端に有する刺激応答性ポリマーで作製されたｍＮＰは、望ましくない大きいサイズおよび低いＬＣＳＴ値（すなわち、室温に近い）を有することがあり、これはナノ粒子を周囲条件で操作するのが困難なものにする。
【００２３】
定義
本発明の明細書中の様々な場所で、本開示の化合物の置換基はグループまたは範囲で開示される。具体的には、本開示はそのようなグループおよび範囲の構成要素のありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことを意図している。例えば、用語「Ｃ１〜６アルキル」は、具体的にはメチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキルおよびＣ６アルキルを個々に開示することを意図している。
【００２４】
明確にするために別々の実施形態の文脈において説明される、本開示のある特定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて記載することもできることがさらに認識される。
【００２５】
逆に、簡潔にするために１つの実施形態の文脈において説明される、本開示の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な部分的組み合わせで提供することもできる。
【００２６】
本明細書で使用する用語「金属錯体」とは、中心金属原子またはイオンと、周囲の結合した分子またはイオンのアレイ（すなわち配位子）とを含む金属含有化合物を指す。
【００２７】
本明細書で使用する用語「配位する」または「配位している」とは、配位子（例えばキレート化剤）と中心金属原子との間で形成される結合を指し、配位子は一般に電子を孤立電子対から金属の空軌道へ与えることにより中心原子に結合し、その結果配位子が原子に配位する。一部の実施形態では、電子を孤立電子対から金属の空軌道へ与える代わりに、アルケンなどの有機配位子のπ結合が金属の空軌道に配位することができる。
【００２８】
本明細書で使用する用語「キレート化剤」とは、中心原子に対して２つまたはそれを超える別々の配位結合を形成することができる化合物を指す。
【００２９】
本明細書で使用する用語「流体力学直径」とは、動的光散乱により測定される、溶媒（例えば水）中で水和した可溶性刺激応答性ｍＮＰの見かけのサイズを指す。
【００３０】
本明細書で使用する用語「コポリマー」とは、２種またはそれを超える異なるモノマーの重合の結果であるポリマーを指す。各構成単位の数および性質は１つのコポリマー中で別々に制御できる。構成単位は、明確に別段示されない限り、純粋なランダム、交互ランダム、規則的交互、規則的ブロックまたはランダムブロックの配置で配列していてもよい。純粋なランダム配置は、例えばｘ−ｘ−ｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｙ−ｚ−ｙ−ｚ−ｚ−ｚ．．．またはｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｚ−ｙ−ｚ−ｘ−ｘ．．．であってもよい。交互ランダム配置は、ｘ−ｙ−ｘ−ｚ−ｙ−ｘ−ｙ−ｚ−ｙ−ｘ−ｚ．．．であってもよく、規則的交互配置は、ｘ−ｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｚ−ｘ−ｙ−ｚ．．．であってもよい。規則的ブロック配置は以下の一般的配置：．．．ｘ−ｘ−ｘ−ｙ−ｙ−ｙ−ｚ−ｚ−ｚ−ｘ−ｘ−ｘ．．．を有するが、ランダムブロック配置は一般的配置：．．．ｘ−ｘ−ｘ−ｚ−ｚ−ｘ−ｘ−ｙ−ｙ−ｙ−ｙ−ｚ−ｚ−ｚ−ｘ−ｘ−ｚ−ｚ−ｚ−．．．を有する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「置換された」または「置換」とは、Ｈ以外の置換基で水素原子を置き換えることを指すことを意味する。例えば、「Ｎ−置換されたピペリジン−４−イル」とは、ピペリジニルのＮＨに由来するＨ原子を例えばアルキルなどの非水素置換基で置き換えることを指す。
【００３２】
本明細書で使用する用語「アルキル」とは、直鎖または分岐鎖の完全に飽和した（二重結合または三重結合がない）炭化水素（炭素および水素のみ）基を指す。アルキル基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、第３級ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。本明細書で使用する「アルキル」は「アルキレン」基を含み、アルキレン基は他の基に結合するための１つではなく２つのオープンな原子価を有する、直鎖または分岐鎖の完全に飽和した炭化水素基を指す。アルキレン基の例としては、限定はされないが、メチレン、−ＣＨ２−、エチレン、−ＣＨ２ＣＨ２−、プロピレン、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ｎ−ブチレン、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ｓｅｃ−ブチレン、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−が挙げられる。この開示のアルキル基は１つまたは複数のフッ素基により任意選択で置換されていてもよい。
【００３３】
本明細書で使用する用語「アリール」とは、単環または多環（例えば、２、３または４つの縮合環を有する）の芳香族炭化水素、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニルおよびインデニルなどを指す。一部の実施形態では、アリール基は６〜約２０個の炭素原子を有する。
【００３４】
本明細書で使用する用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。
【００３５】
本明細書で使用する用語「脂肪酸」とは、長鎖脂肪族を含むカルボン酸を有する分子を指し、飽和または不飽和のいずれかである。
【００３６】
本明細書で使用する用語「疎水性ブロック」とは、親水性構成単位よりも多くの疎水性構成単位を含むポリマーブロックを指す。疎水性構成単位は典型的な水性条件においてイオン化可能ではなく、１つまたは複数の疎水性部分（例えば、アルキル基、アリール基など）を含む。
【００３７】
本明細書で使用する、ポリマーの「構成単位」という用語は、ポリマー中の原子または原子のグループを指し、鎖の一部を、もしあればそのペンダント原子または原子のグループと共に含む。構成単位は繰り返し単位を指すことがある。構成単位はポリマー鎖上の末端基を指すこともある。例えば、ポリエチレングリコールの構成単位は、繰り返し単位に相当する−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、または末端基に相当する−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり得る。
【００３８】
本明細書で使用する用語「繰り返し単位」は最小の構成単位に相当し、その繰り返しは規則的な巨大分子（またはオリゴマー分子またはブロック）を構成する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「末端基」とは、ポリマー鎖への接続を１つのみ有し、ポリマーの末端に位置している構成単位を指す。例えば、モノマー単位が重合された場合、末端基はポリマーの末端にあるモノマー単位に由来していてもよい。別の例として、末端基はポリマーを合成するのに使用された連鎖移動剤または開始剤の一部であってもよい。
【００４０】
本明細書で使用するポリマーの「終端」という用語は、ポリマー骨格の末端に位置しているポリマーの構成単位を指す。
【００４１】
本明細書で使用する、ポリマーの「近位終端」という用語は、本明細書に記載のプロセスを使用してｍＮＰが形成される場合、ｍＮＰの金属酸化物コアに配位するポリマー骨格の末端に配置しているポリマーの構成単位を指す。ポリマー骨格の末端にある構成単位（すなわち末端基）は、例えば、ポリマーの末端にあるモノマー単位に由来していてもよく（モノマー単位が重合された場合）、または末端基はポリマーを合成するのに使用された連鎖移動剤または開始剤の一部であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用する、ポリマーの「遠位終端」という用語は、ポリマーの近位末端から離れて位置しているポリマー骨格の末端に配置されている構成単位を指す。一部の実施形態では、分岐ポリマーの場合などにおいて、ポリマーは１つを超える遠位終端を有していてもよく、ここで、遠位終端はポリマーの近位終端から離れて位置しているポリマー骨格のあらゆる末端に相当する。
【００４３】
本明細書で使用する用語「ミセル形成基」とは、極性溶媒中でミセルを形成することが可能な基を指す。
【００４４】
本明細書で使用する用語「刺激応答性」とは、ｐＨ、温度、ＵＶ−可視光、光照射、電場への曝露、イオン強度、およびある特定の化学物質の濃度などの外部刺激の変化に、特性変化を示すことによって応答することができる材料を指す。
【００４５】
別段の定義がされない限り、本明細書において使用されるあらゆる技術的および科学的用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等の方法および材料を本開示の実施または試行に使用できるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義も含めて本発明の明細書が支配的となる。加えて、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
ｍＮＰを作製するプロセス
【００４６】
一態様では、刺激応答性ｍＮＰを作製するためのプロセスが提供される。図１を参照すると、プロセスは、溶媒、金属錯体および刺激応答性ポリマーを含む混合物を準備するステップ１００と、混合物を加熱して刺激応答性ｍＮＰを得るステップ１１０とを含む。刺激応答性ｍＮＰは、金属酸化物コアと、金属酸化物コアに直接配位する終端基を有する刺激応答性ポリマーを含むシェルとを含む。刺激応答性が刺激応答性ｍＮＰに配位しているとき、刺激応答性ポリマーは少なくとも金属酸化物コアに近位のポリマー終端にはミセル形成基を含まない。
【００４７】
ここで第１のステップ１００の混合物をより詳細に説明する。
【００４８】
混合物は溶媒を含む。一実施形態では、溶媒は大気圧で１５０℃を上回る沸点を有する。一部の実施形態では、溶媒は２．４を上回る極性指数を有する。ある特定の実施形態では、溶媒は比較的極性である。適切な溶媒の非限定的な例としては、ジグリム、トリグライム、テトラグライム、アセチルアセトン、アニソール、ベンゾニトリル、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、ジエチレングリコール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、キシレン、トルエン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、溶媒混合物を使用する場合、すべての溶媒成分の総百分率が１００％であるとするならば、溶媒は溶媒混合物に対して体積で０％から（例えば、１０％から、２０％から、３０％から、４０％から、または４５％から）５５％まで（例えば、４５％まで、４０％まで、３０％まで、２０％まで、または１０％まで）の１つの溶媒（例えば、キシレンおよび／またはトルエン）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、適切な溶媒は金属錯体および／または刺激応答性ポリマーを溶解させることができる。一部の実施形態では、溶媒はテトラグライムなどのオリゴエチレングリコールエーテルを含む。
【００４９】
混合物は金属錯体も含む。金属錯体は、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、クロム（Ｃｒ）、コバルト（Ｃｏ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、またはマンガン（Ｍｎ）の金属カチオンであってもよい、金属カチオンに配位したキレート化剤を含む。金属錯体は１０００Ｄａ未満（例えば、７５０Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、または２５０Ｄａ未満）の分子量を有するキレート化剤を含む。ある特定の実施形態では、キレート化剤は小分子である。キレート化剤は混合物中の刺激応答性ポリマーとは異なる。一部の実施形態では、キレート化剤は、金属カチオンに配位することができる官能基、例えば、カルボン酸（カルボン酸塩の形態で配位することができる）、第１級アミン、および／または第２級アミンを含む。例えば、キレート化剤は、飽和または不飽和（すなわち、１つまたは複数の二重または三重結合を含む）であってもよいＣ８〜２８脂肪酸、ビピリジン、４−ビニルピリジン、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、およびそれらの誘導体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、飽和または不飽和Ｃ８〜２８脂肪酸、ビピリジン、４−ビニルピリジン、エチレンジアミン、およびエチレンジアミン四酢酸はそれぞれ、Ｃ１〜４アルキル、ハロまたはハロアルキルから選択される１、２、３または４つの置換基により任意選択で置換されていてもよい。飽和または不飽和Ｃ８〜２８脂肪酸の非限定的な例としては、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、アラキドン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸が挙げられる。一部の実施形態では、キレート化剤はオレイン酸である。
【００５０】
一部の実施形態では、金属錯体は混合物へ取り込まれる前に、例えば別の反応で生成させる。金属錯体は、混合物中に添加する前に別の反応から単離されてもよい。他の実施形態では、金属錯体は例えば、金属カチオン（例えば、ＦｅＣｌ３などの鉄（ＩＩＩ））およびキレート化剤（例えば、オレイン酸ナトリウムなどのオレイン酸塩）を混合物へ加えることによって、混合物中でｉｎ  ｓｉｔｕで生成させる。
【００５１】
一部の実施形態では、金属カチオンはＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｍｎ、またはそれらの組み合わせの金属カチオンである。金属カチオンの非限定的な例としては、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｃｒ（ＶＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＶ）、Ｍｎ（ＶＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、金属カチオンはＦｅ、ＮｉまたはＣｏの金属カチオンである。例えば、金属カチオンはＦｅ（ＩＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、またはＣｏ（ＩＩＩ）であってもよい。一実施形態では、金属カチオンはＦｅ（ＩＩＩ）である。
【００５２】
ある特定の実施形態では、金属錯体はオレイン酸鉄である（例えば、鉄（ＩＩＩ）トリス（オレエート））。
【００５３】
一部の実施形態では、混合物は溶媒の５ｍｇ／ｍＬから（例えば、２０ｍｇ／ｍＬから、４０ｍｇ／ｍＬから、６０ｍｇ／ｍＬから、または８０ｍｇ／ｍＬから）１１０ｍｇ／ｍＬまで（例えば、８０ｍｇ／ｍＬまで、６０ｍｇ／ｍＬまで、４０ｍｇ／ｍＬまで、または２０ｍｇ／ｍＬまで）の濃度で金属錯体を含んでいてもよい。
【００５４】
混合物は刺激応答性ポリマーも含む。刺激応答性ポリマーは本開示の刺激応答性ｍＮＰを作製するプロセスの間に混合物中でミセルを形成しない。刺激応答性ポリマーは任意の公知の刺激応答性ポリマーであってもよいが、ただし、ポリマーはミセルを形成することが可能な基をポリマーの近位終端でまたは近位および遠位両方のポリマー終端で含まない。本開示のプロセスで使用できる刺激応答性ポリマーの非限定的な例を以下でさらに詳細に説明する。一部の実施形態では、刺激応答性ポリマーはどの終端にもミセル形成基を有していない。一部の実施形態では、刺激応答性ポリマーはミセル形成基を有していない（例えば、どの終端においても、ペンダント基としても、またはポリマー骨格上にも、ミセル形成基がない）。実施例１において以下に論じるように、驚くべきことに、どのポリマー終端にもミセル形成基を含まない刺激応答性ポリマーを本開示のプロセスに使用した場合、ミセル形成基をポリマー終端に含む刺激応答性ポリマーを使用して作製されたｍＮＰと比較して、予想外により良好な特性を有するｍＮＰが生成されたことが分かった。
【００５５】
ある特定の実施形態では、刺激応答性ポリマーは、カルボン酸、第１級アミン、第２級アミン、チオール、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、アジド、ヒドラジド、またはそれらの任意の組み合わせなどの終端官能基（例えば、近位終端基、または近位もしくは遠位終端基のいずれか１つ）により任意選択で置換されていてもよい、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーを含む。混合物は、刺激応答性ポリマーを２ｍｇ／ｍＬから（例えば、１５ｍｇ／ｍＬから、３０ｍｇ／ｍＬから、４５ｍｇ／ｍＬから、または６０ｍｇ／ｍＬから）７５ｍｇ／ｍＬまで（例えば、７２ｍｇ／ｍＬまで、６０ｍｇ／ｍＬまで、４５ｍｇ／ｍＬまで、３０ｍｇ／ｍＬまで、または１５ｍｇ／ｍＬまで）の濃度で含んでいてもよい。
刺激応答性ポリマー
【００５６】
刺激応答性ポリマーは、ポリマーがミセルを形成することが可能な基を近位のポリマー終端でまたは近位および遠位両方のポリマー終端で含まないならば、刺激応答性を有する任意のポリマーであってもよい。刺激応答性ポリマーは、刺激に応答してそれらの会合性（例えば、親水性から疎水性への変化）を変化させる様々なポリマーの任意の１つであってもよい。刺激応答性ポリマーは、ｐＨ、温度、ＵＶ−可視光、光照射、電場への曝露、イオン強度、およびある特定の化学物質の濃度などの外部刺激の変化に、特性変化を示すことによって応答する。化学物質ならばカルシウムイオンなどの多価イオン、いずれかの電荷のポリイオン、またはグルコースなどの酵素基質であってもよい。例えば、温度応答性ポリマーは水溶液中でＬＣＳＴを示すことにより温度の変化に応答する。刺激応答性ポリマーは、ポリマーが２つまたはそれを超える外部刺激における同時のまたは順次の変化の組み合わせに応答して特性変化を示す、多重応答性ポリマーであってもよい。
【００５７】
刺激応答性ポリマーは、温度、光、ｐＨ、イオンまたは圧力の変化などの刺激に応答して、折りたたみ／展開転移などの可逆的なコンホメーション変化もしくは物理化学的変化、可逆的沈殿挙動、または他のコンホメーション変化を示す、合成または天然ポリマーであってもよい。代表的な刺激応答性ポリマーとしては、温度感受性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、および光感受性ポリマーが挙げられる。
【００５８】
本明細書に記載のナノ粒子の作製に有用な刺激応答性ポリマーは、ポリマーの顕著なコンホメーション変化を引き起こす刺激に対して感受性である任意のものであってもよい。本明細書に記載の例示的なポリマーとしては、温度、ｐＨ、イオンおよび／または光に感受性のポリマーが挙げられる。Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ａ．  Ｓ．、「Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ．  １９巻：４５８〜４６７頁、１９９５年；Ｃｈｅｎ，  Ｇ．  Ｈ．およびＡ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ、「Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−  ａｎｄ  Ｐｈ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  １９６巻：１２５１〜１２５９頁、１９９５年；Ｉｒｉｅ，  Ｍ．およびＤ．  Ｋｕｎｇｗａｔｃｈａｋｕｎ、「Ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｍｅｃｈａｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  Ｌｅｕｃｏ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５巻：８２９〜８３２頁、１９８５年；およびＩｒｉｅ，  Ｍ．、「Ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｐｈａｓｅ」、ＡＣＳ  Ｐｏｌｙｍ．  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、２７巻（２号）：３４２〜３４３頁、１９８６年；これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
本明細書に記載のナノ粒子において有用な、分子量の範囲が約１，０００〜５０，０００ダルトンである刺激応答性オリゴマーおよびポリマーは合成することができる。一実施形態では、これらの合成は本明細書および以下によって記載されているように、連鎖移動により開始されるビニル系モノマーのフリーラジカル重合に基づく。（１）  Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．，  ”Ｇｅｌｓ”，  Ｓｃｉ．  Ａｍｅｒ．  ２４４：１２４−１３８．  １９８１；  （２）  Ｏｓａｄａ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｂ．  Ｒｏｓｓ−Ｍｕｒｐｈｙ，  ”Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｇｅｌｓ”，  Ｓｃｉ．  Ａｍｅｒ，  ２６８：８２−８７，  １９９３；  （３）  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ａ．  Ｓ．，  ”Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，  Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ  １９：４５８−４６７，  １９９５；  ａｌｓｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｙｍｐ．  ９８：６４５−６６４，  １９９５；  （４）  Ｆｅｉｊｅｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ”，  １１ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｆ．  ｏｎ  Ｂｉｏｍｔｌｓ：２５６−２６０，  １９９４；  （５）  Ｍｏｎｊｉ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ”Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ”，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４：１０７−１２０，  １９８７；  （６）  Ｆｕｊｉｍｕｒａ，  Ｍ．，  Ｔ．  Ｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｔｏｓａ，  ”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｕｂｌｅ−Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ”，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２９：７４７−７５２，  １９８７；  （７）  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ａ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｈ．  Ｔ．  Ｌｕｏｎｇ，  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ３４：１１８６−１１９０，  １９８９；  （８）  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ−Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ３４：１０９２−１０９７，  １９８９；  （９）  Ｍｏｎｊｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ−Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｉｎ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １７２：６５２−６６０，  １９９０；  （１０）  Ｍｏｎｊｉ，  Ｎ．  Ｃ．  Ａ．  Ｃｏｌｅ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ”Ａｃｔｉｖａｔｅｄ，  Ｎ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｔｌｓ．  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄ．  ５：４０７−４２０，  １９９４；  （１１）  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ”Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｂｙ  Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｂｉｏｍｔｌｓ．  １１：６３１−６３４，  １９９０；  （１２）  Ｐａｒｋ，  Ｔ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｏｌｕｂｌｅ，  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｔｌｓ．  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄ．  ４：４９３−５０４，  １９９３；  （１３）  Ｃｈｅｎ，  Ｇ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ−Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，  Ｐｈａｓｅ−Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｏｌｉｇｏ（ＮＩＰＡＡｍ）  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ４：５０９−５１４，  １９９３；  （１４）  Ｄｉｎｇ，  Ｚ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ）−Ｔｒｙｐｓｉｎ”，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ７：  １２１−１２５，  １９９５；  （１５）  Ｃｈｅｎ，  Ｇ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ”Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−  ａｎｄ  ｐＨ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  １９６：１２５１−１２５９，  １９９５；  （１６）  Ｔａｋｅｉ，  Ｙ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  １．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｄ  Ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ４：４２−４６，  １９９３；  （１７）  Ｔａｋｅｉ，  Ｙ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  ２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−��ｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ４：３４１−３４６，  １９９３；  （１８）  Ｔａｋｅｉ，  Ｙ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  ３．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ５：５７７−５８２，  １９９４；  （１９）  Ｍａｔｓｕｋａｔａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙ（Ｎ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−Ｌｉｐａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１６：６８２−６８６，  １９９４；  （２０）  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｏ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ５：５０４−５０７，  １９９４；および（２１）  Ｓｔａｙｔｏｎ，  Ｐ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｔｉｍｕｌｉ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ”，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：４７２−４７４，  １９９５。
【００６０】
本開示のナノ粒子において有用な刺激応答性ポリマーとしては、刺激応答性挙動を有するホモポリマーおよびコポリマーが挙げられる。他の適切な刺激応答性ポリマーとしては、１つまたは複数の刺激応答性ポリマー成分を有するブロックおよびグラフトコポリマーが挙げられる。適切な刺激応答性ブロックコポリマーとしては、例えば温度感受性ポリマーブロック、またはｐＨ感受性ブロックを挙げることができる。適切な刺激応答性グラフトコポリマーとしては、例えば、ｐＨ感受性ポリマー骨格およびペンダント温度感受性ポリマー成分、または温度感受性ポリマー骨格およびペンダントｐＨ感受性ポリマー成分を挙げることができる。温度感受性またはｐＨ感受性成分を有するポリマーは、それらのＬＣＳＴ未満で親水性であってもよく、ミセル形成基を近位終端でまたは近位および遠位両方の終端で有していない。
【００６１】
刺激応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーなどの、親水性および疎水性基のバランスがとれたポリマーを含んでいてもよい。スマートビニル系ポリマーにおける適切な親水性／疎水性バランスは、例えば、水と疎水結合した約２〜６個の炭素のペンダント疎水性基、および水とＨ−結合したアミド、酸、アミンまたはヒドロキシル基などのペンダント極性基によって実現される。他の極性基としては、スルホン酸、硫酸、リン酸およびアンモニウムイオン基が挙げられる。好ましい実施形態は、３〜４個の炭素（例えば、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチル）とアミド基を組み合わせたもの（例えばＰＮＩＰＡＡｍ）、または２〜４個の炭素（例えば、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチル）とカルボン酸基を組み合わせたもの（例えば、ＰＰＡＡ）である。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯの組成を有するＰＬＵＲＯＮＩＣポリマーなどの、ポリエーテルのスマートＡ−Ｂ−Ａ（Ａ−Ｂ−Ｃも）ブロックコポリマー、またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡなどのポリエステル−エーテル組成物のファミリーもある。一実施形態では、刺激応答性ポリマーは温度応答性ポリマーであるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）である。親水性基および疎水性基のバランスがとれたポリマーは、それらのＬＣＳＴ未満で親水性であってもよく、ミセル形成基を近位終端でまたは近位および遠位両方の終端で有していない。
【００６２】
本開示において有用な刺激応答性ポリマーは、ｐＨまたは光に応答するホモポリマーなどの、異なるまたは複数の刺激反応性を有するスマートポリマーであってもよい。ｐＨおよび温度、光および温度、またはｐＨおよび光などの二重感受性を有する、ブロック、グラフトまたはランダムコポリマーも使用してもよい。
温度感受性ポリマー
【００６３】
相互作用可能な分子とコンジュゲートさせることができる、多くの様々なタイプの温度感受性ポリマーの例示的な実施形態は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）のポリマーおよびコポリマーである。ＰＮＩＰＡＡｍは、その下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）、または曇り点である３２℃で水から析出する熱感受性ポリマーである（ＨｅｓｋｉｎｓおよびＧｕｉｌｌｅｔ、Ｊ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．−Ｃｈｅｍ．  Ａ２：１４４１〜１４５５頁、１９６８年）。ＰＮＩＰＡＡｍをアクリルアミドなどのより親水性の高いコモノマーと共重合させる場合、ＬＣＳＴは上昇する。Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミドなどのより疎水性の高いコモノマーと共重合させる場合、その反対のことが起きる。ＮＩＰＡＡｍとＡＡｍなどのより親水性の高いモノマーとのコポリマーは、ＬＣＳＴが高くなり、析出の温度範囲が広くなるが、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミドなどのより疎水性の高いモノマーとのコポリマーは、ＬＣＳＴが低くなり、通常はＰＮＩＰＡＡｍの明瞭な転移特性をより維持しやすい（ＴａｙｌｏｒおよびＣｅｒａｎｋｏｗｓｋｉ、Ｊ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．  １３巻：２５５１〜２５７０頁、１９７５年；Ｐｒｉｅｓｔら、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３５０巻：２５５〜２６４頁、１９８７年；ならびにＨｅｓｋｉｎｓおよびＧｕｉｌｌｅｔ、Ｊ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．−Ｃｈｅｍ．  Ａ２：１４４１〜１４５５頁、１９６８年、これらの開示は本明細書に組み込まれる）。ＬＣＳＴがより高いかまたはより低く、析出の温度範囲がより広いコポリマーを製造できる。本開示のＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーは親水性および疎水性コモノマーの可変の特性を有していてもよいが、ミセル形成基を近位終端で、または近位および遠位両方の終端で有していない。
【００６４】
アミノ終端ポリマーの合成は、開始剤としてのＡＩＢＮおよび連鎖移動試薬としての１−アミノエタンチオール塩酸塩の存在下でＮＩＰＡＡｍをラジカル重合させることにより進行する。−ＣＯＯＨまたは−ＯＨ終端基を有する鎖を合成するには、それぞれカルボキシルチオールまたはヒドロキシルチオール連鎖移動剤がアミノチオールの代わりに使用されてきた。末端反応性ポリマーの合成は連鎖移動による開始および停止のメカニズムに基づいていることに注意すべきである。これは、およそ１０００Ｄａと２５，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａの間の分子量を有する、比較的短いポリマー鎖をもたらす。分子量が１０，０００未満である最も短い鎖は通常「オリゴマー」と呼ばれる。単純にモノマー対連鎖移動試薬の比を変化させ、それらの濃度レベルを開始剤の濃度レベルと共に制御することによって、様々な分子量のオリゴマーを合成できる。本開示において有用なポリマーは、可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によっても調製できる。
【００６５】
開始剤としてのＡＩＢＮと、チオール（−ＳＨ）基を一方の末端に有し所望の「反応性」基（例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２）を他方の末端に有する連鎖移動剤とを使用して、ＮＩＰＡＡｍをラジカル重合させることにより、一方の末端に反応性基を有するＮＩＰＡＡｍ（または他のビニルモノマー）のオリゴマーを調製する。Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ４巻：５０９〜５１４頁、１９９３年、ならびにＣｈｅｎおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄ．  ５巻：３７１〜３８２頁、１９９４年、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＮＩＰＡＡｍのオリゴマーは、ミセル形成基を近位終端で、または近位および遠位両方の終端で有していない。ＤＭＦ中の適切な量のＮＩＰＡＡｍ、ＡＩＢＮおよび連鎖移動試薬を厚肉重合管に入れ、凍結および真空排気し次いで解凍すること（４回）によって混合物を脱ガスする。最後に冷却した後、重合前に管を真空排気し密封する。管を６０℃の水浴中に４時間浸す。得られるポリマーをジエチルエーテル中に析出させることにより単離し、秤量して収率を決定する。ポリマーの分子量を、滴定（末端基がアミンまたはカルボキシルである場合）、蒸気相浸透圧測定法（ＶＰＯ）、またはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）のいずれかによって決定する。
【００６６】
一部の実施形態では、温度感受性オリゴペプチドもナノ粒子に組み込んでもよい。
ｐＨ感受性ポリマー
【００６７】
本明細書に記載のナノ粒子を作製するのに有用な合成ｐＨ感受性ポリマーは、典型的にはｐＨ感受性ビニルモノマー、例えば、アクリル酸（ＡＡｃ）、メタクリル酸（ＭＡＡｃ）ならびに他のアルキル置換アクリル酸（エチルアクリル酸（ＥＡＡｃ）、プロピルアクリル酸（ＰＡＡｃ）およびブチルアクリル酸（ＢＡＡｃ）など）、無水マレイン酸（ＭＡｎｈ）、マレイン酸（ＭＡｃ）、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、Ｎ−ビニルホルムアミド（ＮＶＡ）、Ｎ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）（最後の２つは重合後に加水分解してポリビニルアミンとしてもよい）、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）、ホスホリルエチルアクリレート（ＰＥＡ）、またはメタクリレート（ＰＥＭＡ）などに基づく。ｐＨ感受性ポリマーはまた、ポリペプチドとしてアミノ酸（例えば、ポリリジンもしくはポリグルタミン酸）から合成されてもよく、またはタンパク質（例えば、リゾチーム、アルブミン、カゼイン）もしくは多糖（例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、カラギーナン、キトサン、カルボキシメチルセルロース）もしくは核酸（ＤＮＡなど）などの天然ポリマーに由来していてもよい。ｐＨ応答性ポリマーは通常、−ＯＰＯ（ＯＨ）２、−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２基などのペンダントｐＨ感受性基を含有する。ｐＨ応答性ポリマーを使用すると、ＰＮＩＰＡＡｍの溶液に対する温度の効果と同様に、ｐＨの小さい変化が相分離を促進し得る（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２９巻：７４７〜７５２頁、１９８７年）。熱感受性ＮＩＰＡＡｍをＡＡｃなどの少量（例えば、１０モルパーセント未満）のｐＨ感受性コモノマーと共にランダム共重合させることにより、コポリマーは温度およびｐＨ感受性の両方を示すことになる。コモノマーがイオン化されないｐＨでは、そのＬＣＳＴはほとんど影響を受けず、場合によりさらに数度低下することになるが、ｐＨ感受性基がイオン化されると劇的に上昇することになる。ｐＨ感受性モノマーがより高い含量で存在する場合、温度感受性成分のＬＣＳＴの応答は「除去」される場合がある（例えば、１００℃までおよびそれ超で相分離が見られない）。本開示のｐＨ感受性ポリマーは、近位終端で、または近位および遠位両方の終端でミセル形成基を有していない。
【００６８】
ｐＨおよび温度  転移の両方を独立に保持する、ｐＨおよび温度感受性モノマーのグラフトおよびブロックコポリマーを合成できる。Ｃｈｅｎ，  Ｇ．  Ｈ．、およびＡ．  Ｓ．  Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３巻：４９〜５２頁、１９９５年。例えば、ｐＨ感受性ブロック（ポリアクリル酸）および温度感受性ブロック（ＰＮＩＰＡＡｍ）を有するブロックコポリマーは本開示において有用であり得る。本開示のｐＨおよび温度感受性の両方を有するグラフトおよびブロックコポリマーは、近位終端で、または近位および遠位両方の終端でミセル形成基を有していない。
光感受性ポリマー
【００６９】
光応答性ポリマーは通常、ポリマーの主鎖にペンダントしているまたはポリマーの主鎖に沿った発色団を含有し、適切な波長の光に曝露すると、トランス型から双極性でより親水性の高いシス型へ異性化させることができ、可逆的なポリマーのコンホメーション変化を引き起こすことができる。他の光感受性化合物も、光刺激によって、比較的非極性、疎水性、非イオン化の状態から、親水性、イオン性の状態へ転換させることができる。
【００７０】
ペンダント光感受性基ポリマーの場合、芳香族アゾ化合物またはスチルベン誘導体などの光感受性色素を、反応性モノマーへコンジュゲートさせ（すでにビニル基を有するクロロフィリンなどの色素は例外である）、次いで単重合させる、または他の従来のモノマーと共重合させる、または上記のように連鎖移動重合を使用して温度感受性もしくはｐＨ感受性モノマーと共重合させることができる。光感受性基はまた、異なる応答性の（例えば、温度）ポリマーの一方の末端にコンジュゲートさせてもよい。そのような色素がコンジュゲートしたモノマーの合成における多くのプロトコルが公知である。
【００７１】
ペンダントおよび主鎖の両方の光感受性ポリマーが合成されてもよく、本明細書に記載の方法および用途に有用であるが、好ましい光感受性ポリマーおよびそれらのコポリマーは典型的には光感受性ペンダント基を含有するビニルモノマーから合成される。これらのタイプのモノマーのコポリマーは、アクリルアミドなどの「通常の」水溶性コモノマーと共に、およびさらにはＮＩＰＡＡｍまたはＡＡｃなどの温度またはｐＨ感受性コモノマーと共に調製される。本開示の光感受性ポリマーおよびコポリマーは、ミセル形成基を近位終端で、または近位および遠位両方の終端で有していない。
【００７２】
光感受性化合物は、ある特定の波長の光を吸収すると異性化またはイオン化し、疎水性から親水性のコンホメーションへ転換する色素分子であってもよく、またはそれらはある特定の波長の光を吸収すると熱を発生する他の色素分子であってもよい。前者の場合は異性化が単独で鎖膨張または崩壊を生じさせることができるが、一方、後者の場合はポリマーが温度感受性でもある場合にのみ析出することになる。
【００７３】
光応答性ポリマーは通常、ポリマーの主鎖にペンダントする発色団を含有する。使用されてきた典型的な発色団は芳香族ジアゾ色素である（Ｃｉａｒｄｅｌｌｉ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２３巻：１４２３〜１４３７頁、１９８４年；ＫｕｎｇｗａｔｃｈａｋｕｎおよびＩｒｉｅ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ９巻：２４３〜２４６頁、１９８８年；ＬｏｈｍａｎｎおよびＰｅｔｒａｋ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５巻：２６３頁、１９８９年；Ｍａｍａｄａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２３巻：１５１７頁、１９９０年、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。このタイプの色素に３５０〜４１０ｎｍの紫外線を当てると、芳香族ジアゾ色素のより疎水性が高いトランス型が、双極性でより親水性が高いシス型へ異性化され、これはポリマーのコンホメーション変化を引き起こし、骨格への色素のコンジュゲートの度合いおよび骨格の主な単位の水溶性に応じて、懸濁したポリマー溶液を透明にさせる。約７５０ｎｍの可視光に曝露すると、この現象を逆方向にすることになる。そのような光感受性色素はまた、骨格の主鎖に沿って組み込まれてもよく、その結果色素の光誘起性の異性化に起因するコンホメーション変化がポリマー鎖のコンホメーション変化を引き起こすことになる。親水性または疎水性の状態へのペンダント色素の転換は、個々の鎖がそれらのコンホメーションを膨張または収縮させることも引き起こし得る。ポリマー主鎖が光感受性基（例えばアゾベンゼン色素）を含有する場合、光誘起性の異性化において、光刺激状態は実際には収縮しより親水性となり得る。光感受性ポリマーはペンダントまたは骨格アゾベンゼン基を有するポリマーを含んでいてもよい。
具体的なイオン感受性ポリマー
【００７４】
カラギーナンなどの多糖は、カリウムまたはカルシウムなどの特定のイオンへの曝露の関数として、それらのコンホメーションを例えばランダムから秩序的コンホメーションへ変化させ、刺激応答性ポリマーとしても使用できる。別の例において、アルギン酸ナトリウムの溶液はカルシウムへの曝露によってゲル化することがある。他の具体的なイオン感受性ポリマーとしては、ヒスチジンまたはＥＤＴＡなどの、ペンダントイオンキレート性基を有するポリマーが挙げられる。
二重または多重感受性ポリマー
【００７５】
光感受性ポリマーが熱感受性でもある場合、骨格に沿ってコンジュゲートした発色団がＵＶまたは可視光刺激により転換してより疎水性または親水性のコンホメーションとなることは、ポリマー組成および温度に応じて、コポリマーの溶解または析出も促進し得る。色素が光を吸収し、異性化を促進するよりもむしろ光を熱エネルギーへ変換する場合、系の温度が相分離温度に近いと、局部加熱はＰＮＩＰＡＡｍなどの温度感受性ポリマーにおける相変化も促進し得る。温度および光感受性、または温度およびｐＨ感受性などの多重感受性を１つの骨格に沿ってビニルモノマー共重合により組み込む能力は、応答性ポリマー−タンパク質コンジュゲートの合成および特性に高い汎用性をもたらす。例えば、タンパク質認識部位に結合する色素を使用でき、光誘起異性化は結合ポケットからの色素の解放または脱離を引き起こすことができる（Ｂｉｅｔｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６４巻：１１０３〜１１０６頁、１９６９年）。これは、炭化物から得られるエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ランダムコポリマーなどの温度応答性ポリマーのフリーの末端に色素をコンジュゲートすることにより親和性プロセスを操作するのに使用できる。これらのポリマー−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２ＣＨＣＨ３Ｏ）ｙ−は２つの反応性末端基を有する。相分離点（曇り点）は、ＥＯ／ＰＯ比、分子量および濃度に応じて広い範囲にわたって変化させることができ、一方の末端は配位子色素で誘導体化してもよく、他方の末端はビニルスルホン（ＶＳ）などの−ＳＨ反応性基で誘導体化してもよい。
【００７６】
再び図１を参照すると、刺激応答性ナノ粒子を作製するプロセスは、混合物を加熱して刺激応答性ｍＮＰを得るステップ１１０をさらに含む。この方法により製造される刺激応答性ｍＮＰは以下にさらに詳細に説明されるタイプのものである。
【００７７】
一部の実施形態では、加熱ステップは酸素を含む雰囲気下（例えば周囲雰囲気）で行われる。他の実施形態では、加熱ステップは実質的に酸素を含まない雰囲気下（例えば、９５％酸素フリー、９７％酸素フリー、９９％酸素フリー、またはそれを超える）で行われる。加熱ステップは１００℃〜２４０℃の間の温度（例えば、１４０℃〜２４０℃、１６０℃〜２００℃、１６０℃〜１９０℃、１７０℃〜２４０℃、または１９０℃〜２４０℃の間）までであってもよい。一部の実施形態では、加熱ステップは溶媒の沸点に相当する温度で混合物を環流させることを含む。一部の実施形態では、加熱ステップは圧力下で行うことができる。例えば、加熱ステップは１ｂａｒの大気圧から（例えば、５０ｂａｒから、１００ｂａｒから、１５０ｂａｒから）２００ｂａｒまで（例えば、１５０ｂａｒまで、１００ｂａｒまで、５０ｂａｒまで）の圧力で行うことができる。加熱ステップは１時間から（例えば２時間から、４時間から、６時間から、または８時間から）１０時間まで（例えば、８時間まで、６時間まで、４時間まで、または２時間まで）の持続時間で行うことができる。
【００７８】
一部の実施形態では、加熱ステップの後、刺激応答性ｍＮＰを、刺激応答性ｍＮＰが不溶性である溶媒（例えば、ペンタンなどの疎水性溶媒）中で析出により単離する。刺激応答性ｍＮＰは、例えば、接線流ろ過により、透析によりまたは限外ろ過により、精製できる。
磁性ナノ粒子
【００７９】
別の態様では、上記のプロセスは、金属酸化物コアと、金属酸化物コアを取り囲むシェルとを含む刺激応答性ｍＮＰを提供する。シェルは、カルボキシレート、第１級アミン、および／または第２級アミンなどの、金属酸化物コアに直接配位する終端基を有する刺激応答性ポリマーを含む。刺激応答性ポリマーはミセル形成基を少なくともポリマーの近位終端には含まない。
【００８０】
一部の実施形態では、刺激応答性ナノ粒子は、金属カチオンから形成される磁性金属酸化物を含むコアを含む。磁性金属酸化物の非限定的な例としては、例えば、酸化鉄（例えば、酸化第二鉄、酸化第一鉄）、酸化ニッケル、酸化ニッケル、酸化クロム、酸化ガドリニウム、酸化ジスプロシウムおよび酸化マンガン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００８１】
一部の実施形態では、刺激応答性ポリマーは、刺激応答性ポリマー上の終端官能基（例えば、カルボキシレート、第１級アミン、第２級アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、アジド、および／またはヒドラジド）を介してコアに配位する。刺激応答性ポリマーは、ミセルを形成することが可能な基（例えば、アルキル基、アリール基、疎水性コポリマーブロック、ポリペプチドなど）を、金属酸化物コアに近位のポリマー終端、または金属酸化物コアに近位および遠位両方のポリマー終端に含まない。一部の実施形態では、刺激応答性ポリマーはどの終端にもミセル形成基を有していない。一部の実施形態では、刺激応答性ポリマーはミセル形成基を有していない（例えば、どの終端においても、ペンダント基としても、またはポリマー骨格上にも、ミセル形成基がない）。
【００８２】
特定の実施形態では、刺激応答性ポリマーはＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーを含み、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーおよびコポリマーは、式
【化１】
2016529209.tif 000004
を有する、金属酸化物コアに遠位の終端を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、刺激応答性ｍＮＰは、１：１〜３：１（例えば、２：１〜３：１、または１：１〜２：１）の刺激応答性ポリマー対金属酸化物の質量比を含む。例えば、ポリマー対金属酸化物の質量比は２：１であってもよい。ポリマーの質量比は、例えば熱重量分析により、刺激応答性ポリマー分解の質量減少およびポリマー除去後に残っている質量の比から決定できる。
【００８４】
一部の実施形態では、刺激応答性ナノ粒子は１０ｎｍから（例えば、２０ｎｍから、３０ｎｍから、または４０ｎｍから）６０ｎｍまで（例えば、４０ｎｍまで、３０ｎｍまで、または２０ｎｍまで）の流体力学直径を有する。例えば、刺激応答性ナノ粒子は１０ｎｍ〜３５ｎｍ（例えば、１５ｎｍ〜３０ｎｍ）の流体力学直径を有していてもよい。刺激応答性ナノ粒子は温度、ｐＨ、光、電場、および／またはイオン強度などの刺激に応答することができる。
ポリマー捕捉
【００８５】
結合対。一部の実施形態では、刺激応答性ｍＮＰｓは、捕捉分子を共有結合により連結させるための遠位の終端官能基を有するポリマーを含む。刺激応答性ポリマー上の終端官能基とは、カルボキシル、ヒドロキシルおよびアミン基などの捕捉部分と反応可能にするために誘導体化されていてもよい、任意の反応性基を指す。終端官能基は、チオール、ケトン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシマレイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カルボニルイミダゾール、カルボジイミドエステル、ビニルスルホン、アクリレート、ベンジルハロゲン化物、トシレート、トレシレート、アルデヒド、ヒドラジド、酸ハロゲン化物、ｐ−ニトロフェノールエステル、およびヒドロペルオキシドなどの反応性基を形成するように誘導体化されていてもよい。一実施形態では、刺激応答性ポリマー上の終端官能基はカルボン酸基である。
【００８６】
刺激応答性ポリマー上の終端官能基は、共有結合を介して捕捉分子と連結させることができ、共有結合としては、限定はされないが、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、ケトン、無水物、ウレタン、尿素およびカルバメート結合が挙げられる。一実施形態では、ビオチン部分がアミド結合を介して刺激応答性ポリマーに連結される。
【００８７】
終端官能基は、タンパク質、核酸オリゴマー（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、抗体、抗原、酵素または酵素基質などの捕捉分子に、共有結合により連結させてもよい。捕捉部分は、タンパク質、核酸オリゴマー（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、抗原、抗体、酵素または酵素基質などの標的分子と、共有結合性または非共有結合性相互作用によってさらに連結させてもよい。一実施形態では、終端官能基を捕捉分子であるビオチンに連結してビオチン化ナノ粒子を得る。一実施形態では、ビオチン化ナノ粒子は、標的分子であるストレプトアビジンにさらにコンジュゲートさせて、ストレプトアビジンにコンジュゲートしたビオチン化ナノ粒子を得ることができ、これはビオチン化標的分子に連結させることができる。
【００８８】
捕捉分子および標的分子は結合対を形成する。各々が他方に対する親和性を有する（例えば、抗原および抗体）。捕捉分子および標的分子の各々は、ペプチド、タンパク質、多糖またはオリゴ糖、糖タンパク質、脂質およびリポタンパク質、ならびに核酸のほか、細胞膜受容体などの標的部位に結合する、抗生物質または抗炎症性剤などの規定の生体活性を有する合成有機または無機分子を含めた、様々な異なる分子であってもよい。例示的なタンパク質としては、抗体（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、または他の組替え型）、それらのタンパク質／ペプチド抗原、タンパク質／ペプチドホルモン、ストレプトアビジン、アビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、成長因子、およびそれらのそれぞれの受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、細胞膜受容体、エンドソーム膜受容体、核膜受容体、ニューロン受容体、視覚受容体、ならびに筋細胞受容体が挙げられる。例示的なオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、およびＲＮＡａｓｅ  Ｐの外部ガイドシーケンスが挙げられ、短いオリゴヌクレオチドプライマーから完全な遺伝子までのサイズの範囲であってもよい。炭水化物としては、腫瘍関連炭水化物（例えば、Ｌｅｘ、シアリルＬｅｘ、Ｌｅｙ、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９７１，９０５号に記載のような、その他腫瘍関連と特定されたもの）、細胞接着性受容体と関連した炭水化物（例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０巻：１１３０〜１１３２頁、１９９０年）、ならびに細胞膜受容体に対して特異的である分子およびそれらの類似物を結合する他の特定の炭水化物が挙げられる。
【００８９】
タンパク質の中でも、ストレプトアビジンは本明細書に記載の他の捕捉部分−標的分子結合対の系のモデルとして特に有用である。ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン−ビオチン親和性複合体の非常に強い会合を使用する多くの分離および診断技術において重要な成分である（ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９０年；およびＧｒｅｅｎ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８４巻：５１〜６７頁）。ＩｇＧ抗体に結合するタンパク質であるタンパク質Ｇ（Ａｃｈａｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１巻：１０４４９〜１０４５７頁、１９９２年、ならびにＡｋｅｒｓｔｒｏｍおよびＢｊｏｒｃｋ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１巻：１０２４０〜１０２４７頁、１９８６年）も、モデルの系として有用である。代表的な免疫親和性分子としては、操作された一本鎖Ｆｖ抗体（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁、１９８８年、およびＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体が挙げられる。
【００９０】
一実施形態では、捕捉分子は抗体であり標的分子は抗原である。別の実施形態では、捕捉分子および標的分子の両方がタンパク質である。別の実施形態では、捕捉分子は核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり標的分子は相補的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。別の実施形態では、標的分子は核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり捕捉分子はタンパク質である。別の実施形態では、捕捉分子は細胞膜受容体であり標的分子は配位子である。別の実施形態では、捕捉部分は酵素であり標的分子は基質である。別の実施形態では、捕捉分子はビオチンであり標的分子はストレプトアビジンまたはアビジンである。別の実施形態では、標的部分は細胞である（例えば生細胞）。
刺激応答性ナノ粒子を使用するための方法
【００９１】
他の態様では、開示はナノ粒子を使用するための方法を提供する。
【００９２】
一実施形態では、本開示は
（ａ）標的を含む媒体を複数の刺激応答性ｍＮＰと接触させるステップであり、各ナノ粒子が標的に対して反応可能な捕捉部分を含む、ステップと；
（ｂ）外部刺激を加えて凝集ナノ粒子を得るステップと；
（ｃ）凝集ナノ粒子を磁場にさらして磁気凝集ナノ粒子を得るステップと；
（ｄ）刺激および磁場を除去してナノ粒子を再生させるステップであり、再生したナノ粒子が標的をさらに含む、ステップと
を含む、標的を捕捉するための方法を提供する。
【００９３】
上記の方法において、外部刺激は温度、ｐＨまたは光であり得る。一実施形態では、刺激応答性ｍＮＰは温度応答性ナノ粒子であり、外部刺激は温度である（例えば、温度の変化）。一実施形態では、刺激応答性ｍＮＰはｐＨ応答性ナノ粒子であり、外部刺激はｐＨである。一実施形態では、刺激応答性ｍＮＰは光応答性ナノ粒子であり、外部刺激は光である。一実施形態では、刺激応答性ｍＮＰはイオン応答性ナノ粒子であり、外部刺激は特定のイオンのイオン強度である。
【００９４】
本開示は、
（ａ）診断標的を含む媒体を複数の温度応答性ｍＮＰｓと接触させるステップであり、各ナノ粒子が診断標的に対して反応可能な捕捉部分を含む、ステップと；
（ｂ）ナノ粒子の下限臨界共溶温度を超える温度まで媒体の温度を上昇させて熱凝集ナノ粒子を得るステップと；
（ｃ）熱凝集ナノ粒子を磁場にさらして磁気凝集ナノ粒子を得るステップと；
（ｄ）ナノ粒子の下限臨界共溶温度未満まで温度を低下させ磁場を除去してナノ粒子を再生させるステップであり、再生したナノ粒子が診断標的をさらに含む、ステップと
を含む、診断標的を捕捉するための方法を提供する。
【００９５】
一実施形態では、本開示は、
（ａ）診断標的を含む媒体を複数の温度応答性ｍＮＰと接触させるステップであり、各ナノ粒子が診断標的に対して反応可能な捕捉部分を含む、ステップと；
（ｂ）ナノ粒子の下限臨界共溶温度を超える温度まで媒体の温度を上昇させて熱凝集ナノ粒子を得るステップと；
（ｃ）熱凝集ナノ粒子を磁場にさらして磁気凝集ナノ粒子を得るステップと；
（ｄ）ナノ粒子の下限臨界共溶温度未満まで温度を低下させ磁場を除去してナノ粒子を再生させるステップであり、再生したナノ粒子が診断標的をさらに含む、ステップと
を含む、診断標的を濃縮するための方法を提供する。
【００９６】
上記の方法において、ステップ（ｂ）から（ｄ）を繰り返してもよい。
【００９７】
上記の方法において、診断標的分子および捕捉部分はそれぞれ、他方に対する親和性を有し、結合対を形成することが可能である。本明細書で使用する用語「診断標的」とは、罹患状態を示すもしくは毒素への曝露の指標である分子、または対象に投与されていてその濃度をモニタリングしなければならない治療薬剤を指す。
【００９８】
一実施形態では、診断標的分子は抗体であり捕捉部分は抗原である。一実施形態では、診断標的分子は抗原であり捕捉部分は抗体である。一実施形態では、診断標的分子は核酸オリゴマー（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり捕捉部分は相補的核酸オリゴマーである。一実施形態では、診断標的分子は核酸オリゴマー（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり捕捉部分はタンパク質である。一実施形態では、診断標的分子はタンパク質であり捕捉部分は核酸オリゴマー（ＲＮＡまたはＤＮＡ）である。一実施形態では、診断標的分子は酵素であり捕捉部分は基質である。一実施形態では、診断標的分子は酵素基質であり捕捉部分は酵素である。
【００９９】
開示の磁気および熱二重応答性ｍＮＰは、診断標的の単離および／またはアッセイを容易にするように設計される。温度応答性ｍＮＰはＬＣＳＴの上および下で温度サイクルを行うと可逆的に凝集する。ｍＮＰの凝集は有効粒径の増加をもたらし、小さい磁場の印加によるナノ粒子の磁気分離を容易にする。温度をＬＣＳＴ未満に戻し印加した磁場を除去すると、捕捉されたナノ粒子を迅速に回収できる。ｍＮＰは磁場への曝露後にどれだけのｍＮＰを溶液から分離できたかの指標である分離効率を有し得る。一部の実施形態では、所与の波長での上澄み溶液の吸光度を測定でき、吸光度の損失を対照ｍＮＰ溶液の吸光度と比較でき、吸光度の損失を分離効率として定量化できる。一部の実施形態では、分離効率は８０％またはそれ超であってもよい（例えば、９０％またはそれ超、９５％またはそれ超、９７％またはそれ超、９８％またはそれ超、または９９％またはそれ超）。
【０１００】
図２Ａ〜２Ｃは本開示のｍＮＰの実施形態を捕捉および解放する代表的な方法の概略図である。図２Ａを参照すると、ＰＮＩＰＡＡｍ  ｍＮＰ  ２１０が壁２０４を有する容器２０２に含有されている。温度がＰＮＩＰＡＡｍ  ｍＮＰのＬＣＳＴ未満である場合、ｍＮＰ  ２１０は溶液中で可溶性であり自由に拡散する。ＰＮＩＰＡＡｍ  ｍＮＰのサイズは磁気泳動移動度が低いｍＮＰをもたらすことができ、その結果それらはＬＣＳＴ未満で印加される磁場により捕捉される。ｍＮＰはこのようにＬＣＳＴ未満で拡散し、単離されたナノ粒子として標的２１２を捕捉できる。図２Ｂを参照すると、ｍＮＰのＬＣＳＴを超える温度刺激を加えた後、ｍＮＰは凝集して凝集ｍＮＰ  ２２０を形成する。凝集ｍＮＰは、ＬＣＳＴを超えて温度を上昇させる場合および磁場を印加する場合にのみ捕捉される（容器底壁２０４で）。図２Ｃを参照すると、温度をＬＣＳＴ未満に低下させる場合、温度誘起性の凝集の可逆的な性質によって、捕捉された凝集ｍＮＰが解放および再分散されｍＮＰ  ２１０が反応溶液へ拡散的に再び入る結果となる。
刺激応答性ナノ粒子を利用するアッセイ
【０１０１】
本開示は刺激応答性ナノ粒子使用するアッセイも提供する。
【０１０２】
一実施形態では、本開示は
（ａ）診断標的を複数の刺激応答性ｍＮＰと接触させるステップであり、各ナノ粒子が診断標的に対して親和性を有する捕捉部分を含む、ステップと；
（ｂ）診断標的を刺激応答性ｍＮＰと合わせることによりナノ粒子コンジュゲートを形成するステップと；
（ｃ）外部刺激を加えることによりナノ粒子コンジュゲートを凝集させるステップと；
（ｄ）凝集ナノ粒子コンジュゲートを磁場にさらすことによりナノ粒子コンジュゲートをさらに凝集させるステップと；
（ｅ）刺激および磁場を除去することによりナノ粒子コンジュゲートを再生させるステップと；
（ｆ）診断標的を含む再生ナノ粒子を分析するステップと
を含む、診断標的を検出するためのアッセイを提供する。
【０１０３】
上記の方法において、診断標的を刺激応答性ｍＮＰと合わせることによるナノ粒子コンジュゲートの形成は、捕捉部分に結合した診断標的を含むコンジュゲートをもたらす。上記の方法において、刺激および磁場を除去することによるナノ粒子コンジュゲートの再生は、診断標的が捕捉部分に結合している、解放され自由に流動するナノ粒子コンジュゲートをもたらす。
【０１０４】
診断標的を含む再生したナノ粒子は、診断標的をナノ粒子から放出するかどうかにかかわらず、分析することができる。
【０１０５】
診断標的は、罹患状態を示すもしくは毒素への曝露の指標である分子、または対象に投与されていてその濃度をモニタリングしなければならない治療薬剤であってもよい。診断標的は、疾患に関連する任意のタンパク質、抗体、または核酸であってもよい。一実施形態では、診断標的はＢ型肝炎ウイルスに対する抗体である。一実施形態では、診断標的はＣ型肝炎ウイルスに対する抗体である。一実施形態では、診断標的分子はＡＩＤＳウイルスに対する抗体である。一実施形態では、診断標的分子はマラリア寄生虫抗原、または抗マラリア原虫抗体、または寄生虫代謝生成物、またはマラリア原虫核酸フラグメントである。一実施形態では、診断標的分子は結核菌に対する抗体である。一実施形態では、診断標的分子はデング熱ウイルスまたは抗体である。
【０１０６】
ｍＮＰを使用する方法、デバイスおよびアッセイが、例えば米国特許第８，５０７，２８３号および第７，９８１，６８８号ならびにＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５２５６に記載され、その各々の開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
以下の実施例は、記載される実施形態を限定するのではなく例証する目的で含まれる。
【実施例】
【０１０８】
代表的な刺激応答性磁性ナノ粒子の調製および特性決定
この実施例では、本開示の代表的な温度応答性ナノ粒子の調製、特性決定、および使用を記載する。
前駆体試薬の合成
【０１０９】
刺激応答性磁性ナノ粒子（ｍＮＰ）の鉄源としてオレイン酸鉄（Ｆｅ−オレエート３）を使用した。過去に公開された方法に従ってＦｅ−オレエート３を調製した。例えば、Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、３巻：８９１〜８９５頁、２００４年を参照。
【０１１０】
簡潔には、オレイン酸ナトリウム（ＴＣＩ、＞９７％）および塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、９７％）を、ヘキサン、エタノール、および脱イオン水の混合溶媒系に溶解させた。溶液を７０℃で４時間環流させ、脱イオン水で３回洗浄し、乾燥させて粘性の暗赤色油を得た。収率＝７５％。３００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ分光計で１Ｈ−ＮＭＲによりＣＤＣｌ３中で組成を確認した。
【０１１１】
この実施例において、刺激応答性ポリマーは温度の変化に応答した。温度応答性、親水性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）モノマーに基づいており、例えば、Ｃｈｉｅｆａｒｉ，  Ｊ．ら、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｆｒｅｅ−Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ−Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：  Ｔｈｅ  ＲＡＦＴ  Ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３１巻：５５５９〜５５６２頁、１９９８年に記載される、可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）技術により合成される。分子量および分子量分布を、サイズ排除クロマトグラフィーにより多角度レーザー光散乱（Ｗｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ）および屈折率（Ｗｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ）検出器で決定した。ポリマー組成を１Ｈ−ＮＭＲにより上記のように確認した。
ｍＮＰの合成および精製
【０１１２】
典型的な反応において、丸底フラスコに０．９ｇの刺激応答性ポリマーおよび５０ｍＬのテトラ（エチレングリコール）ジメチルエーテル（Ｓｉｇｍａ、≧９９％）を装入した。溶液を１００℃で３０分加熱してポリマーを溶解させた。次いで、１．３６９ｇのＦｅ−オレエート３をフラスコに加えた。温度を１９０℃まで上昇させ（加熱速度は約３．５℃／分）、１９０℃で６時間維持し、その間溶液は暗赤色から黒色へ変化した。反応物を＜１００℃まで冷却し、ペンタンから析出させた。析出したｍＮＰをテトラヒドロフラン中に再溶解させ、ペンタンからさらに２回析出させた。析出後、ｍＮＰを真空内で一晩乾燥させる。乾燥済みｍＮＰを脱イオン水に溶解させて約４ｍｇ／ｍＬとし、次いで接線流ろ過（ＴＦＦ）によりＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０  １００ｋＤａ  ＰＥＳカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で精製する。ＴＦＦ後、ｍＮＰを＞５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで凍結乾燥させる。収率は３１±２．０％であった（ｎ＝６）。
ｍＮＰの特性決定
【０１１３】
ｍＮＰの流体力学的サイズを、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＺｅｔａＰＡＬＳ装置を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）により、脱イオン水中で１ｍｇ／ｍＬにて測定した。６つの異なるｍＮＰバッチの数加重平均直径を図３Ａおよび表１に示した。
【０１１４】
ｍＮＰを２５℃〜３７℃に加熱したときのＵＶ−可視分光光度計によるｍＮＰ溶液の透過率を追跡することにより、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を測定した（図３Ｂ）。ＬＣＳＴ（３１℃）において、ｍＮＰは凝集し、溶液の透過率の低下を生じた。
【０１１５】
ポリマー：鉄の質量比を熱重量分析（ＴＧＡ）によりＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＴＧＡ  Ｑ５０で測定した（図３Ｃ）。
【０１１６】
ｍＮＰ分離効率は、単純な磁石に２分さらした後にどれだけのｍＮＰが溶液から分離できたかの指標とした。ｍＮＰ溶液（５％血清を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ中、２ｍｇ／ｍＬ）を２２℃または３７℃の条件に２分さらした。溶液を２２℃または３７℃で維持し、次いで特別設計の磁気ホルダーの中に２分置いた。Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２プレートリーダーで上澄みの吸光度（５００ｎｍ）を測定した。比較した吸光度の損失をｍＮＰ対照溶液と比較し、分離効率として定量化した（図３Ｄ）。
【０１１７】
表１．刺激応答性ｍＮＰの構造特性および機能特性（データは６つの異なるｍＮＰバッチについての平均±標準偏差として示され、小さい偏差はｍＮＰ製造プロセスの再現性を示す）。
【表１】
2016529209.tif 000005
【０１１８】
結果
Ｆｅ−オレエート３錯体の組成を１Ｈ−ＮＭＲにより決定し、これはオレイン酸の適切なシフトおよび積分値を示した。サイズ排除クロマトグラフィーにより測定すると、親水性、刺激応答性ポリマーは６．１８±０．４５５ｋＤａであり、多分散指数は１．０３±０．００７（ｎ＝５）であった。低い多分散指数が好ましいＲＡＦＴの特性であった。ここで、ポリマーはほぼ単分散であることを示しており、このことは、温度の変化に応答して親水性ポリマーから疎水性凝集物へ急速で不連続な転移をすることにつながる。
【０１１９】
図３Ａは、ＤＬＳにより測定されるｍＮＰの６つの異なるバッチの流体力学直径（数加重平均）を示す。これらのｍＮＰバッチの直径は１８ｎｍ〜２８ｎｍの範囲であった。装置の誤差はおよそ５ｎｍであった。ＬＣＳＴは親水性ポリマーが凝集して疎水性凝集体となる温度を表し、曇り点、または溶液透過率（図３Ｂ）により測定される。ＮＩＰＡＭ系ポリマーのＬＣＳＴは典型的にはおよそ３２℃であり、ｍＮＰのＬＣＳＴ値と一致する。したがって、ポリマーをｍＮＰと組み合わせることは、ポリマーの刺激応答性挙動に影響を与えなかった。
【０１２０】
ＴＧＡの間、乾燥試料を急速に加熱し、それによって有機材料を蒸発または燃焼させ、そうして試料の質量の減少を引き起こす。ここで、ｍＮＰの無機酸化鉄ナノ粒子コアの周囲に取り込まれたポリマーの量を測定するためにＴＧＡを使用した。約１００℃における質量の損失は約５％であり、凍結真空乾燥により除去されなかった水の消失を表していた。ポリマーの分解は広い範囲の温度（約２５０〜４００℃）にわたって生じた。残留する質量は典型的には３２％であり、これはｍＮＰの酸化鉄コアを表していた。ポリマー：Ｆｅの質量比は表１に示され、主な分解の質量損失および残留する質量から計算された。
【０１２１】
分離効率（図３Ｄ）はｍＮＰの重要な機能特性である。ＬＣＳＴを下回って２２℃では、ｍＮＰは可溶性であり、単純な磁石による分離には小さすぎた（分離効率は約５％）。ＬＣＳＴを上回ると、ｍＮＰは単純な磁石により容易に分離される大きい凝集物を形成した（分離効率は約９８％）。したがって、ｍＮＰの刺激応答性挙動は有用な機能特性につながる。
【０１２２】
図３Ｂ〜３Ｄは１つの代表的なｍＮＰバッチからのデータを示す。同じ特性（平均±標準偏差）をｍＮＰの６つの異なるバッチによる表１に示す。小さい標準偏差は、ｍＮＰの製造によって再現性のある構造特性および機能特性を有するｍＮＰを得られることを示す。
【０１２３】
近位のミセル形成終端基を含有するＮＩＰＡＭ系刺激応答性ポリマーについても、刺激応答性ｍＮＰ（ｎ＝３）は製造された。しかし、これらのｍＮＰは不十分な構造特性および機能特性を示した。３つのバッチの１つは水不溶性であった。収率ははるかに低かった（１８±４％）。ｍＮＰのサイズははるかに大きく（５７±１８ｎｍ）、このことは２２℃での分離効率がより高いことを説明すると考えられる（８±４％）。より低いＬＣＳＴ値（２７±３℃）は室温に近く、これは通常の卓上での操作中にｍＮＰを凝集させる可能性がある。さらに、より大きい標準偏差は、これらのｍＮＰがミセル形成終端基を含まない刺激応答性、親水性ポリマーで作製されたものとは異なり、再現性良く製造できないことを示していた。
結論
【０１２４】
実施例１は、本開示の刺激応答性ｍＮＰの実施形態は合成が容易であり再現性があることを実証している。刺激応答性ｍＮＰは、ミセル形成基を近位終端に含有していた刺激応答性ポリマーを使用して作製される刺激応答性ｍＮＰと比較した場合、より優れた特性を示す。
【０１２５】
例示的な実施形態を例証し説明してきたが、開示の精神および範囲を逸脱せずに様々な変更を行うことができることが認識される。
独占権または特権を主張する本発明の実施形態は以下のように定義される：
【図１】
2016529209.tif 000007
【図２】
2016529209.tif 000008
【図３Ａ】
2016529209.tif 000009
【図３Ｂ】
2016529209.tif 000010
【図３Ｃ】
2016529209.tif 000011
【図３Ｄ】
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【国際調査報告】
2016529209.tif 000013