(57)【要約】キメラ抗原受容体を形質導入したＴ細胞を宿主に投与して、がん細胞を死滅させることができる。キメラ抗原受容体は、エキスタチンポリペプチドを含むがこれに限定されない、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含むことができる。標的化部分は、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有するように修飾することもできる。一局面において、がん細胞を死滅させるための化合物が提供され、上記化合物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植したＴ細胞を含み、上記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む。
2016526536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞を死滅させるための化合物であって、前記化合物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植したＴ細胞を含み、前記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、化合物。
【請求項２】
前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、前記Ｔ細胞のゼータ鎖に連結している、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植するための方法であって、前記方法は、
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質導入するステップを含み、前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞のゼータ鎖のコード配列、およびαｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分のコード配列を含む、方法。
【請求項７】
前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、前記Ｔ細胞のゼータ鎖の前記コード配列および前記エキスタチンポリペプチドの前記コード配列の間にＣＤ２８ドメインをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、前記ＣＤ２８ドメインおよび前記エキスタチンポリペプチドの前記コード配列の間にｃ−Ｍｙｃタグをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主におけるがん細胞を死滅させる方法であって、前記方法は、
前記宿主に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入したＴ細胞を投与するステップを含み、前記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、方法。
【請求項１４】
前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、前記Ｔ細胞のゼータ鎖に連結している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
形質導入した前記Ｔ細胞が、１種または複数の抗腫瘍性小分子と同時投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
形質導入した前記Ｔ細胞が、１種または複数の抗血管新生剤と同時投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗血管新生剤が、アンジオポエチン２、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブおよびアキシチニブのうち少なくとも１種を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年６月１４日に出願された米国仮出願第６１／８３５，１４７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
政府による財政上の支援：
ＮＩＨ参照番号Ｒ０１ＣＡ１３２７９２。
【背景技術】
【０００３】
数種の有望な免疫療法が、がんと戦うために開発されている。例えば、ある種の免疫療法は、細胞媒介性免疫における抗原特異的Ｔ細胞の利益を活用する。Ｔ細胞は、がん細胞表面に見いだされる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示される抗原性ペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してその標的を認識する。共起刺激分子の存在下で、この結合は、Ｔ細胞の活性化と、その後の結合した標的細胞の溶解をもたらす（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ＰＡら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１巻：６５９〜８４頁（２００３年））。しかし、大部分の腫瘍関連抗原は、自己タンパク質であり、免疫系は、これに対する耐容性を発達させてきた。よって、がん免疫療法に直面する主な課題の１つは、十分な数の高結合親和性腫瘍特異的Ｔ細胞の作製における困難である（Ｋａｍｍｅｒｔｏｅｎｓ  Ｔら、Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９巻：２３４５〜５３頁（２００９年））。
【０００４】
研究者らは、近年、Ｔ−ＣＡＲと呼ばれる、グラフトによってキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によりＴ細胞を遺伝子改変することにより、がん細胞抗原に対する免疫系の寛容に対抗しようと試みた（Ｊｅｎａ  Ｂら、Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：１０３５〜４４頁（２０１０年））。ＣＡＲは、通常、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を、細胞内シグナル伝達ドメイン、通常、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のゼータ鎖へと連結することにより作製される。ＣＡＲの最新の構築は、エフェクター細胞生存および増殖を改善し得る、ＣＤ２８または４１ＢＢ等、共起刺激分子も含有する（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  Ｃら、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ，  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｄｏｍａｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６巻：３３６０〜５頁（２００９年））。がん療法のため、Ｔ−ＣＡＲは、天然のＴ細胞受容体に優る少なくとも３種の主な利点を有する。第一に、ｓｃＦｖの抗原結合親和性は、典型的に、大部分のＴＣＲの結合部分よりもはるかに高い。高い親和性の結合は、効率的Ｔ細胞活性化に望まれる。第二に、ｓｃＦｖ媒介性抗原結合の性質により、Ｔ−ＣＡＲ認識は、非ＭＨＣ拘束性であり、抗原プロセシングとは無関係である。このことは、異なるＭＨＣハプロタイプを有する患者へのＴ−ＣＡＲの使用を広げる。第三に、Ｔ−ＣＡＲ認識は、非ＭＨＣ拘束性であるため、がん細胞を標的化するその能力は、ＭＨＣを下方調節するがん細胞の能力（腫瘍細胞が、がん免疫療法を逃れる重要な機構）によって妨害されない。
【０００５】
ＣＡＲは、様々な腫瘍関連抗原に結合するｓｃＦｖにより以前に構築されている（Ｄａｖｉｅｓ  ＤＭら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇｒａｆｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ａｒｃｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｅｘｐ．  （Ｗａｒｓｚ）５８巻：１６５〜７８頁（２０１０年））。励みとなる前臨床データは、メラノーマ、リンパ腫、神経芽細胞腫および結腸直腸がんを含む、異なる組織起源を有する腫瘍の処置のために、これらのＣＡＲを移植したＴ細胞の養子移入を使用した一連の臨床治験を促した（Ｄａｖｉｅｓ  ＤＭら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇｒａｆｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ａｒｃｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｅｘｐ．  （Ｗａｒｓｚ）５８巻：１６５〜７８頁（２０１０年）；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦら、Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．２９巻：９１７〜２４頁（２０１１年）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮら、Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ＣＤ１９、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４０９９〜１０２頁（２０１０年）；Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３６５巻：７２５〜３３頁（２０１１年）；Ｐｕｌｅ  ＭＡら、Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．１４巻：１２６４〜７０頁（２００８年）；Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ＭＲら、Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃａｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｕｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｃｏｌｉｔｉｓ．、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．１９巻：６２０〜６頁（２０１１年））。これらの治験の多くは、有望な結果、さらには場合によっては、確立された腫瘍の完全寛解を示した。
【０００６】
ネイティブＴエフェクター細胞を上回るＴ−ＣＡＲの目覚ましい改善にもかかわらず、顕著な欠点が存在する。例えば、Ｔ−ＣＡＲは、腫瘍部位へと能動的に遊走せず、腫瘍組織へと血管外遊出するための能動機構を欠く。細胞遊走問題を回避するために開発された戦略の１つは、腫瘍関連ケモカイン環境に応答し得るケモカイン受容体を発現するようＴ細胞を操作することを含んだ（Ｊｅｎａ  Ｂら、Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：１０３５〜４４頁（２０１０年）；Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  Ａら、Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＣＲ４  ａｎｄ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＤ３０  ｈａｖｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｏｍｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ、Ｂｌｏｏｄ  １１３巻：６３９２〜４０２頁（２００９年））。しかし、この戦略は、腫瘍へと遊走するエフェクター細胞の能力を改善したが、腫瘍組織に血管外遊出するその能力の促進には殆ど効果がなかった。
【０００７】
改善を必要とする別の治療様式は、ナノ粒子媒介性薬物送達である。ここ数年、ナノ粒子は、化学療法薬のための有望な送達ビヒクルとして広範に探索されてきた。ナノ粒子は、多くの小分子薬物の不十分な生物製剤特性を打ち消し、その薬物動態を変更する潜在力を有する。しかし、その驚異的な見込みにもかかわらず、ナノ粒子媒介性抗腫瘍性薬物送達は、期待したほど最適ではなかった。悪性組織へのナノ粒子の優先的体内分布および保持は、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果と命名された特色である、固形腫瘍内における不十分に組織化された、多くの場合漏出性の血管と、リンパ管の欠如に頼る（Ｇｒｅｉｓｈ  Ｋ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  （ＥＰＲ）  ｅｆｆｅｃｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．６２４巻：２５〜３７頁（２０１０年））。しかし、固形腫瘍へのナノ粒子送達を容易にするＥＰＲの能力は、依然として議論の余地がある。腫瘍組織へのナノ粒子の分布を容易にすることができる明確に定義された機構は、臨床適用におけるその有用性を大幅に改善するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ＰＡら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３年）２１巻：６５９〜８４頁
【非特許文献２】Ｋａｍｍｅｒｔｏｅｎｓ  Ｔら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９年）３９巻：２３４５〜５３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、本技術分野において、修飾されたＴ細胞が、全身性投与後に腫瘍細胞にアクセスできるように、血管壁の障壁を克服することができる修飾されたＴ細胞の必要がある。本技術分野において、腫瘍血管の透過性を増加させて、腫瘍組織へのナノ粒子の優先的沈着を可能にするための方法および組成物の必要もある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
実施形態において、Ｔ細胞は、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含むキメラ抗原受容体を移植することができる。別の実施形態において、標的化部分は、エキスタチンポリペプチドとなり得る。さらに別の実施形態において、標的化部分は、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有するように修飾することができる。
【００１１】
一実施形態において、キメラ抗原受容体を形質導入したＴ細胞を宿主に投与して、がん細胞を死滅させることができる。キメラ抗原受容体は、エキスタチンポリペプチドを含むがこれに限定されない、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含むことができる。一実施形態において、標的化部分は、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有するように修飾することができる。
【００１２】
前述の概要および次の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解できるであろう。単なる図解目的のために、ある特定の実施形態が図面に示されている。しかし、本明細書に開示されている発明概念が、図面に示されている正確な配置および手段に限定されないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態に従った、レトロウイルスベクター構築物におけるｅＣＡＲの略図を図解する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施形態に従った、ｅＣＡＲの形質導入効率を図解する。
【図２Ａ】図２Ａは、実施形態に従った、ＨＵＶＥＣにおけるαｖβ３発現のフローサイトメトリー解析を図解する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施形態に従った、Ｔ−ｅＣＡＲによるＨＵＶＥＣの細胞溶解を図解する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施形態に従った、標的細胞のＴ−ｅＣＡＲおよびＴ−Ｈｅｒ２ＣＡＲ媒介性死滅の際のＩＬ−２放出の定量化を図解する。
【図２Ｄ】図２Ｄ  実施形態に従った、標的細胞のＴ−ｅＣＡＲおよびＴ−Ｈｅｒ２ＣＡＲ媒介性死滅の際のＩＦＮ−γ放出の定量化。
【図３Ａ】図３Ａは、実施形態に従った、Ｂ１６−Ｆ０細胞におけるαｖβ３発現のフローサイトメトリー解析を図解する。
【図３Ｂ】図３Ｂ〜図３Ｃは、実施形態に従った、Ｂ１６−ＧＦＰｌｕｃに対するＴ−ｅＣＡＲの細胞溶解効果を図解する。
【図３Ｃ】図３Ｂ〜図３Ｃは、実施形態に従った、Ｂ１６−ＧＦＰｌｕｃに対するＴ−ｅＣＡＲの細胞溶解効果を図解する。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｂは、実施形態に従った、Ｔ−ｅＣＡＲの全身性投与後の腫瘍血管の選択的破壊を図解する。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｂは、実施形態に従った、Ｔ−ｅＣＡＲの全身性投与後の腫瘍血管の選択的破壊を図解する。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、実施形態に従った、メラノーマ（５Ａ）または前立腺がん（５Ｂ）のいずれかの確立された固形腫瘍に対するＴ−ｅＣＡＲの治療効果を図解する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、実施形態に従った、メラノーマ（５Ａ）または前立腺がん（５Ｂ）のいずれかの確立された固形腫瘍に対するＴ−ｅＣＡＲの治療効果を図解する。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｂは、実施形態に従って、Ｔ−ｅＣＡＲが、その全身性送達後に、ローダミン標識ナノ粒子の腫瘍分布を増強することを図解する。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、実施形態に従って、Ｔ−ｅＣＡＲが、その全身性送達後に、ローダミン標識ナノ粒子の腫瘍分布を増強することを図解する。
【図７】図７は、Ｔ−ｅＣＡＲの前投与が、抗血管新生薬（ＡＡＤ）の治療効果を強めることを図解する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
少なくとも一実施形態を詳細に説明する前に、本明細書に示されている発明概念が、その適用において、次の記述に示されているまたは図面に図解されている構築の詳細または構成成分の配置に限定されないことを理解されたい。本明細書に用いられている表現および用語法が、単なる説明目的のものであり、限定的に考慮するべきではないことも理解されたい。
【００１５】
記載されている特色のうちいずれか１種を別々に、または他の特色と組み合わせて使用することができることをさらに理解されたい。他の考案されたシステム、方法、特色および利点は、本明細書における図面および詳細な説明を検討することによって、当業者に明らかである、または明らかとなろう。このような追加的なシステム、方法、特色および利点は全て、添付の特許請求の範囲によって保護されることが企図される。
【００１６】
本願に引用されている全ての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
ほぼ全てのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍細胞の表面に発現される腫瘍関連抗原に結合するよう構築される。実施形態において、代替案は、腫瘍関連新生血管構造（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を標的化するＣＡＲを作製することである。このアプローチは、他のＴ−ＣＡＲに伴う非効率的な腫瘍実質浸透問題を克服する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲは、標的化部分としてエキスタチンを含む（以後「ｅＣＡＲ」）。別の実施形態において、ＣＡＲは、エキスタチン由来のペプチド配列を、Ｔ細胞のゼータ鎖に連結することにより構築することができる。エキスタチンは、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒液に見出すことができる４９アミノ酸ディスインテグリンである（配列番号００１）。これは、腫瘍新生血管構造の内皮細胞の表面に豊富に発現されるαｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する（Ｋｕｍａｒ  ＣＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．２８３巻：８４３〜５３頁（１９９７年）；Ｃａｉ  Ｗら、Ｃｈｅｎ  Ｘ．、Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．６巻：４０７〜２８頁（２００６年））。
【００１８】
別の実施形態において、選択されたエキスタチンは、α５β１へのその結合を低下するために、２８番目のアミノ酸のメチオニンがロイシンに置き換えられた、修飾されたＤＮＡ配列を含む（配列番号００２）（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ−Ｐａｔｙｎｏｗｓｋｉ  Ｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ（３）  ａｎｄ  ａｌｐｈａ（５）ｂｅｔａ（１）  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７４巻：３７８０９〜１４頁（１９９９年））。αｖβ３とは異なり、α５β１は一般的に、多くの健康な組織において発現されるため、α５β１へのエキスタチン結合を回避することが重要である。
【００１９】
別の実施形態において、Ｔ細胞にｅＣＡＲを移植する（Ｔ−ｅＣＡＲ）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｔ−ｅＣＡＲは、αｖβ３インテグリンを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞および腫瘍細胞を効率的に溶解することができる。さらに別の実施形態において、腫瘍組織に明らかな出血があり、正常組織血管への損傷の証拠がないことによって判断される通り、全身性Ｔ−ｅＣＡＲ投与は、腫瘍血管の大規模破壊をもたらし得る。また別の実施形態において、腫瘍血管のＴ−ｅＣＡＲによる破壊は、確立された巨大腫瘍の成長を有意に阻害することができる。
【００２０】
実施形態において、戦略的に設計された時間的順序でナノ粒子と同時送達されたＴ−ｅＣＡＲは、腫瘍細胞におけるナノ粒子沈着を劇的に増加させることができる。別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲは、ナノキャリアと同時送達して、抗腫瘍性薬物を腫瘍組織に選択的に送達するその能力を増加させることができる。
【００２１】
腫瘍新生血管構造を標的化するためのＣＡＲ
実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍新生血管構造を標的化するよう構築される。例えば、一実施形態において、エキスタチン配列は、Ｔ細胞のゼータ鎖に連結することができる（Ｔ−ｅＣＡＲ）。別の実施形態において、エキスタチンは、２８番目のアミノ酸のメチオニンをロイシンに置換することにより修飾することができる。この修飾は、Ｔ−ｅＣＡＲが健康な組織を破壊することを実質的に防止することができる。例えば、野生型エキスタチンは、インテグリンファミリーの３種のメンバー、αｖβ３、α５β１およびαＩＩｂβ３に対し強い結合親和性を有する。αｖβ３およびαＩＩｂβ３の両方は、狭い分布を有する。例えば、αｖβ３は主に、活性化された内皮細胞の表面に発現される一方、αＩＩｂβ３は、血小板によって発現される。しかし、α５β１は、より広く分布する（Ｃｏｘ  Ｄら、Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．９巻：８０４〜２０頁（２０１０年））。修飾されたエキスタチンにおけるロイシンによるメチオニンの置き換えは、α５β１に対するエキスタチンの結合親和性を減少させる（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ−Ｐａｔｙｎｏｗｓｋｉ  Ｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ（３）  ａｎｄ  ａｌｐｈａ（５）ｂｅｔａ（１）  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７４巻：３７８０９〜１４頁（１９９９年））。さらに、この修飾は、αｖβ３またはαＩＩｂβ３に対するＴ−ｅＣＡＲ結合親和性に有意な影響を与えない。
【００２２】
図１Ａは、単なる一例として、ｅＣＡＲの構築（配列番号００３）の実施形態を図解する。レトロウイルスベクターの５’および３’末端反復配列が標識されている。エキスタチン、ＣＤ２８（膜貫通ドメインを含有）およびゼータ鎖のコード配列も標識されている。エキスタチンのＤＮＡ配列（Ｅｃｈｉ）は、エキスタチンの修飾型をコードし得る。例えば、２８番目のアミノ酸のメチオニンをロイシンに置き換えて、非αｖβ３インテグリンに対するその結合親和性を低下させることができる（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ−Ｐａｔｙｎｏｗｓｋｉ  Ｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ（３）  ａｎｄ  ａｌｐｈａ（５）ｂｅｔａ（１）  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７４巻：３７８０９〜１４頁（１９９９年））。配列を合成し、Ｔ細胞の安定的トランスフェクションのためにレトロウイルスベクターに挿入することもできる。シグナルペプチド（ＳＰ）は、融合遺伝子の５’端に付加することができる。ＣＤ２８ドメインは、共起刺激（ｃｏ−ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）機能の目的で、エキスタチンおよびゼータ鎖の間に挿入することができる。ｃ−Ｍｙｃタグは、エキスタチンおよびＣＤ２８の間に挿入して、ｅＣＡＲ発現の検出を容易にすることができる。一実施形態において、ｃ−Ｍｙｃタグは、ベクター構築の際に挿入される。
【００２３】
実施形態において、ｅＣＡＲの形質導入効率を測定することができる。脾細胞は、ｅＣＡＲまたはＧＦＰ含有レトロウイルス（ＳＦＧ−ＧＦＰ）のいずれかを形質導入することができる。実施形態において、脾細胞は、ＧＦＰマーカー遺伝子を含むことにより構築することができる。模擬（ｍｏｃｋ）形質導入細胞は、陰性対照として含まれてよい。細胞は、ＧＦＰおよびｅＣＡＲの両方を検出するための二色フローサイトメトリーによって解析される前に、ＰＥ結合体化抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で染色することができる。単なる一例として図１Ｂを参照すると、ｅＣＡＲ形質導入脾細胞のほぼ半分が、ＰＥ陽性である一方、ＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入細胞も対照細胞も、いかなる有意なＰＥ染色も示さなかった。他方では、高いパーセンテージのＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入細胞が、ＧＦＰ陽性である一方、ｅＣＡＲ形質導入細胞も対照細胞も検出不能であった。結果として、一実施形態において、脾細胞は、レトロウイルス構築物によりｅＣＡＲを効率的に移植することができる。
【００２４】
ｅＣＡＲを移植したＴ細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を選択的かつ効率的に死滅させることができる
一実施形態において、ｅＣＡＲの有効性を決定するために、これを、αｖβ３インテグリンを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と共インキュベートすることができる。図２Ａに示す通り、ＨＵＶＥＣは、同様にαｖβ３インテグリンに対する高い結合親和性を有するＦＩＴＣ結合体化ＲＧＤペプチドで染色することができる。フローサイトメトリー解析は、αｖβ３インテグリンが、大部分のＨＵＶＥＣにおいて高度に発現されることを示す。別の実施形態において、図２Ｂに図解される通り、活性Ｔ−ｅＣＡＲおよび対照ＳＦＧ−ＧＦＰ構築物を、異なる比でＨＵＶＥＣと２４時間の期間混合して、αｖβ３インテグリンを発現する標的細胞を死滅させるＴ−ｅＣＡＲの能力を検査することができる。脾細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーから得ることができ、Ｔ−ｅＣＡＲまたは対照ＳＦＧ−ＧＦＰ構築物のいずれかを含むレトロウイルスを形質導入することができる。次に、Ｔ細胞は、洗浄することにより除去することができ、残る単層は、クリスタルバイオレットで染色して、ＨＵＶＥＣの細胞生存率を決定することができる。対照ウェルは、ＨＵＶＡＣ単独を表すことができる。一実施形態において、ＳＦＧ−ＧＦＰを移植した脾細胞は、ＨＵＶＥＣにおけるいかなる有意な毒性も示さない。さらに別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲは、最も低いエフェクター対標的比を有するウェル内であっても、あらゆる細胞を完全に溶解することができる。
【００２５】
さらに別の実施形態において、図２Ｃ〜図２Ｄに図解される通り、ＨＵＶＥＣのＴ−ｅＣＡＲ媒介性死滅の際に放出されるサイトカインを測定することができる。結果は、Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞のＨｅｒ２−ＣＡＲ媒介性死滅と比較することもできる。実施形態において、２種の免疫活性シグナル伝達分子である、ＩＬ−２およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の両方は、これら２種のＣＡＲによって媒介される細胞溶解の際に、殆ど等価なレベルで放出される。これは、２種のＣＡＲが、同じ死滅機構を共有することを示す。さらに、以前の研究は、抗原特異的ＴＣＲを移植されたＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方が、エフェクター細胞として作用して、腫瘍細胞を効率的に死滅させ得ることを示した（Ｆｒａｎｋｅｌ  ＴＬら、Ｂｏｔｈ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅｑｕａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｈｅｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｖｉｄ  ＴＣＲ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４巻：５９８８〜９８頁（２０１０年）；Ｋｅｒｋａｒ  ＳＰら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＤ８＋  ａｎｄ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４巻：３４３〜５２頁（２０１１年））。したがって、別の実施形態において、ｅＣＡＲを移植したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞は、エフェクター細胞として作用して、標的細胞を効率的に死滅させ得る。
【００２６】
活性化された内皮細胞に加えて、腫瘍転移に関連することが見出された一部の腫瘍細胞は、上昇したレベルのαｖβ３インテグリンを発現することも報告された（Ｈｉｅｋｅｎ  ＴＪら、Ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．、Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｒｅｓ．６３巻：１６９〜７３頁（１９９６年）；Ｄｕａｎ  Ｘら、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２１巻：７４７〜５３頁（２００４年））。より高レベルのαｖβ３インテグリン発現を有する腫瘍細胞株の１つは、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞株である（Ｇｏｎｇ  Ｗら、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２３巻：７０２〜８頁（２００８年））。一実施形態において、図３Ａに図解される通り、Ｂ１６−Ｆ０（Ｂ１６−ＧＦｐｌｕｃの親株）におけるαｖβ３インテグリンの発現は、ＦＩＴＣ結合体化ＲＧＤペプチドで細胞を染色した後に、フローサイトメトリーにより決定することができる。実施形態において、高パーセンテージのＢ１６−Ｆ０が、αｖβ３インテグリンを発現する。
【００２７】
さらに別の実施形態において、図３Ｂ〜図３Ｃに図解される通り、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを含有する融合遺伝子を安定的に形質導入したＢ１６細胞株（Ｂ１６  ＧＦＰｌｕｃ）を死滅させるＴ−ｅＣＡＲの能力を解析することができる。例えば、細胞溶解性死滅効果は、ＧＦＰの直接的な可視化により簡便に評価することができる（図３Ｂ）。ｅＣＡＲまたは対照ＳＦＧ−ＧＦＰ構築物のいずれかを含有するレトロウイルスを形質導入した脾細胞は、Ｂ１６−ＧＦｐｌｕｃと１０：１、５：１および２．５：１比で混合することができる。細胞は、解析前に４８時間培養することができる。実施形態において、蛍光顕微鏡検査による可視化は、Ｔ−ｅＣＡＲとＢ１６−ＧＦＰｌｕｃ細胞とのインキュベーション（Ｅ：Ｔ比＝５：１）が、ウェル内のＧＦＰ陽性細胞の数を有意に低下させることを示す。さらに別の実施形態において、蛍光顕微鏡検査による可視化は、対照ＳＦＧ−ＧＦＰ構築物を形質導入した脾細胞が、細胞単層の完全性に対して影響を殆ど示さないまたは全く示さないことを示す。
【００２８】
また別の実施形態において、細胞溶解性死滅効果は、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、細胞溶解の非放射性定量的アッセイにより簡便に評価することができる（図３Ｃ）（Ｆｕ  Ｘら、Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０年；５巻：ｅ１１８６７頁（２０１０年））。ｅＣＡＲまたは対照ＳＦＧ−ＧＦＰ構築物のいずれかを含有するレトロウイルスを形質導入した脾細胞は、Ｂ１６−ＧＦｐｌｕｃと１０：１、５：１および２．５：１比で混合することができる。対照ウェルは、腫瘍細胞のみを含有することができる。細胞死滅のパーセンテージは、次式により計算することができる：細胞死滅（％）＝［１−（エフェクター細胞を含有するウェルの読み取り値）／（エフェクター細胞を含有しないウェルの読み取り値）］×１００。ＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入エフェクター細胞と比較して＊ｐ＜０．０５。細胞は、解析前に４８時間培養することができる。実施形態において、ルシフェラーゼ活性の定量的測定は、Ｔ−ｅＣＡＲが、最低Ｅ：Ｔ比（２．５：１）であってもＢ１６−ＧＦＰｌｕｃ細胞の少なくとも６０％を死滅させ得ることを示す。別の実施形態において、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）活性の定量的測定は、ＳＦＧ−ＧＦＰ構築物のみを移植したＴ細胞が、最高Ｅ：Ｔ比（１０：１）でＢ１６細胞の僅かな溶解を引き起こすことを示す。
【００２９】
実施形態において、腫瘍細胞が、上昇したレベルのαｖβ３インテグリンを発現する場合、Ｔ−ｅＣＡＲは、腫瘍新生血管構造と腫瘍実質を同時に破壊する能力を有する。本明細書に記載されている方法は、αｖβ３を発現するいかなる固形腫瘍にも適用可能である。
【００３０】
Ｔ−ｅＣＡＲのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、腫瘍における大規模出血を誘導するが、正常組織においては誘導しない
図４Ａは、単なる一例として、Ｔ−ｅＣＡＲが腫瘍血管においてｉｎ  ｖｉｖｏで有し得る効果を実証する。一実施形態において、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部における腫瘍量は、２×１０５個の新鮮に収集されたＢ１６細胞の皮下植え込みにより確立することができる。腫瘍が、およそ８ｍｍの直径に達したら、マウスに、ｅＣＡＲまたはＳＦＧ−ＧＦＰのいずれかを形質導入した５×１０６個の脾細胞の注射（全身性注入）を、尾静脈を介して与えることができる。別の群のマウスに、陰性対照としてＰＢＳのみを与えることができる。次に、養子細胞移入後３日目にマウスを安楽死させることができる。実施形態において、腫瘍および正常臓器組織は、組織学的検査およびＨ＆Ｅ染色のために、パラフィン包埋後の組織切片の調製のために採取することができる。一実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲで処置した腫瘍において大規模出血が存在する（図４Ａ）。腫瘍実質は、赤血球細胞および他の血液細胞成分で満たされ得る。別の実施形態において、ＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入脾細胞で処置した腫瘍は、非常に僅かな出血かを示すか出血を示さない。ｅＣＡＲおよびＳＦＧ−ＧＦＰ構築物の間の唯一の差は、後者が、エキスタチンコード配列をＧＦＰ遺伝子に置き換えたことである。よって、一実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ投与後の腫瘍血管破壊は主に、ｅＣＡＲにおける取り込まれたエキスタチン配列によるものである。さらに別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ投与後の腫瘍血管破壊は主に、新生血管構造関連のαｖβ３インテグリンに結合して、Ｔ細胞媒介性死滅効果を誘発するＴ−ｅＣＡＲの能力によるものである。
【００３１】
実施形態において、肺、肝臓および腎臓由来のものを含む正常臓器組織は、Ｔ−ｅＣＡＲ投与後にいかなる有意な出血も現れない（図４Ｂ）。別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ処置腫瘍における出血は、導入されたＴ細胞による腫瘍血管の選択的破壊に由来する。
【００３２】
Ｔ−ｅＣＡＲの養子移入は、確立された固形腫瘍の成長を有意に阻害する
一実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲによる腫瘍血管破壊の結果を決定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ１６細胞のため）およびＳＣＩＤマウス（ＰＣ−３細胞のため）の右側腹部に、１×１０５個のＢ１６腫瘍細胞（同系マウスメラノーマ）またはＰＣ−３ヒト前立腺がん細胞（異種移植腫瘍）を最初に皮下植え込みすることにより行うことができる。５日後、腫瘍が触知できるようになったときに、マウスに、ＰＢＳ、またはｅＣＡＲもしくはＳＦＧ−ＧＦＰのいずれかを形質導入した４×１０６個の脾細胞の静脈内全身性注入を与えることができる。第３の群におけるマウスに、ＰＢＳのみを与えることができる。腫瘍を毎週測定して、腫瘍体積を決定することができる。ＳＦＧ−ＧＦＰおよびＰＢＳと比較して＊ｐ＜０．０５、＋ｐ＜０．０１。
【００３３】
実施形態において、図５Ａに図解されている通り、ＰＢＳ、またはＳＧＦ−ＧＦＰを形質導入した脾細胞で処置したマウスにおける腫瘍成長は、本質的に停止されていない可能性がある。Ｂ１６メラノーマの処置開始後２８日目までに、両群における腫瘍が、大きいサイズに達する場合があり、動物は、予め設定されたエンドポイントに達することにより安楽死される必要がある可能性がある。対照的に、別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲの投与は、腫瘍成長を有効に減速することができる。処置開始後４２日目までに、Ｔ−ｅＣＡＲ処置群における腫瘍は、相対的に小さい可能性があり、大部分の動物は生き続けることができる。図５Ｂにおける別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ処置は、処置後１１および１４日目に有意により小さいサイズの腫瘍をもたらした。よって、両方の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ媒介性の腫瘍血管破壊は、異なる組織起源の確立された固形腫瘍に対する有意な治療利益をもたらし得る。
【００３４】
図５Ａの実施形態において、養子移入されたＴ−ｅＣＡＲは、腫瘍血管および腫瘍細胞の両方を攻撃し得る。したがって、初期腫瘍血管破壊は、腫瘍細胞と近接して接触した腫瘍実質へのＴ−ｅＣＡＲの効率的浸潤を可能にし得る。これは、Ｔ−ｅＣＡＲが他の仕方では保有することができない特徴である、活性血管外遊出の必要を回避し得る。したがって、また別の実施形態において、腫瘍細胞を直接的に死滅させるための血管破壊およびその後のＴ−ｅＣＡＲ浸潤の組合せは、どちらかの作用単独よりも優れた治療効果のために協同し得る。
【００３５】
実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲの効果は、これを、Ｔ−ｅＣＡＲ投与後の新たな腫瘍血管形成を防止し得る、アンジオポエチン２、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、アバスチン、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、バタラニブ（ｖａｔａｌａｎｉｂ）、セジラニブ（ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）等の抗血管新生剤と組み合わせることにより最大化される。別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ媒介性腫瘍血管破壊は、腫瘍血管形成の相対的に遅い過程を、抗血管新生化合物に対する治療応答を最大化し得る急性事象へと変換し得るため、このような組合せは、相乗効果を生じ得る。
【００３６】
Ｔ−ｅＣＡＲによる腫瘍血管破壊は、ナノ粒子腫瘍浸透を増大し得る
別の実施形態において、図４Ａに図解されている通り、Ｔ−ｅＣＡＲの注入後に、悪性組織において有意な出血が観察され得る。これは、Ｔ−ｅＣＡＲが、その全身性投与後に腫瘍へのナノ粒子送達を増強する手段として使用され得ることを示す。よって、実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲをナノ粒子と並行して投与して、腫瘍のナノ粒子透過性を増大させることができる。全ての腫瘍血管は、実質的に高レベルのαｖβ３インテグリンを含有し、したがって、Ｔ−ｅＣＡＲの効果に対し感受性があるため、これらの方法は、全ての腫瘍血管に適用可能である。
【００３７】
さらに別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲ、またはＳＦＧ−ＧＦＰ対照構築物を形質導入したＴ細胞を、マウスに投与することができる（図４Ａ〜図４Ｂ）。例えば、実施形態において、マウスメラノーマは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に確立することができる。腫瘍が、およそ８ｍｍの直径に達したら、マウスに、４×１０６個のＴ−ｅＣＡＲまたはＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入脾細胞の静脈内注入を与えることができる。４８時間後に、１０ｍｇ／ｋｇのローダミン標識リポソームナノ粒子を、マウスに静脈内投与することができる。次に、リポソームナノ粒子投与の１〜２日後に動物を安楽死させることができる。実施形態において、腫瘍および主要臓器を採取して、図６Ａに図解されている凍結蛍光顕微鏡検査に使用することができる冷凍切片を調製することができる。一実施形態において、ＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を与えたマウスから調製された組織切片にわたり、ローダミン染色は、低密度にしか見ることができない。対照的に、別の実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲを与えたマウスの腫瘍実質全体にわたり、広汎なローダミン染色を見ることができる。目に見える血管は、破壊された区域（白い矢印で示す）を有するものと思われる。さらに別の実施形態において、図６Ｂに図解されている通り、腫瘍組織におけるローダミンの定量化は、ＳＦＧ−ＧＦＰおよびＴ−ｅＣＡＲ処置の間に有意差が存在し得ることを確認する。腫瘍組織は、ＭｉｃｒｏＳｕｉｔｅ（商標）ＦＩＶＥソフトウェアを使用して定量化することができる。強度の値としてソフトウェアによってもたらされる結果は、各腫瘍試料から１枚得た３枚のスライドにわたる１５個のランダムに選ばれた区域の平均値を表す。＊ｐ＜０．０１、ＳＦＧ−ＧＦＰと比較。
【００３８】
正常臓器の組織切片の検査は、血管がローダミンでやや染色されたようにみえ得る肺を除いて、ローダミン沈着の証拠を殆ど明らかにしなかった。この観察は、リポソームナノ粒子が、全身性送達後に肺に捕捉される傾向を有するという初期の報告と一貫する（Ｌｉｕ  Ｙら、Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻：１６７〜７３頁（１９９７年））。肺におけるこの機械的な捕捉にもかかわらず、肺におけるナノ粒子の実質分布の証拠は殆どない。この事実は、肺（および他の正常臓器組織）においていかなる有意な出血も検出できないこと（図４Ｂ）と組み合わせて、この仮定を支持する。これらの結果は合わせて、１）腫瘍組織における透過性および滞留の亢進（ＥＰＲ）効果の存在の報告にもかかわらず、これが、その全身性送達後に腫瘍間隙へと進入するための効率的なナノ粒子沈着を可能にしないこと、２）Ｔ−ｅＣＡＲが、腫瘍新生血管構造に対するその強力な破壊的効果にもかかわらず、正常臓器組織における血管への有意な損傷を引き起こさないこと、３）Ｔ−ｅＣＡＲによって媒介される腫瘍血管破壊が、全身性送達されたナノ粒子の、腫瘍実質への深く効率的な進入を可能にすることを示唆する。したがって、実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標））、ペントスタチン、チオグアニン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、クロラムブシル、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、ブスルファン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、テモゾロミド（テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（登録商標））、チオテパ、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン（ｏｘａｌａｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））、エピルビシン、イダルビシン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、イクサベピロン（イグゼンプラ（登録商標））、ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））、エストラムスチン（エムシット（Ｅｍｃｙｔ）（登録商標））等、多くの抗腫瘍性小分子のナノ粒子媒介性薬物送達と組み合わせることができる。
【００３９】
さらに、実施形態において、ローダミン標識ナノ粒子の送達後の主要臓器の検査は、いかなる有意な血管漏出も明らかにしない。この観察は、Ｔ−ｅＣＡＲ投与から腫瘍血管に有意な損傷を示す同じ動物において為され得る。これは、肺および他の正常臓器組織においていかなる有意な出血も検出できないことと組み合わせて、Ｔ−ｅＣＡＲが、正常組織に対し有意な毒性を持たないことを示唆する。別の実施形態において、正常組織の一部の内皮細胞は、がん血液細胞と同様にαｖβ３インテグリンを発現するが、発現のレベルは、Ｔ−ｅＣＡＲによって容易に検出可能な閾値を下回る。
【００４０】
さらなる実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲは、いずれかの抗血管新生薬（ＡＡＤ）と同時投与されて、後者の治療効果を増強することができる。抗血管新生薬として、アンジオポエチン２、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、アキシチニブ等を挙げることができるがこれらに限定されない。抗血管新生療法は、血管形成が、固形腫瘍の本質的な症状発現であるという確かな命題に基づく。数種の選択的抗血管新生薬（ＡＡＤ）がここ数年で開発されてきた。しかし、これまでのところ、これらの化合物の枠組みは、大部分は中程度の効果しか生じておらず、これらの化合物のいずれも、全生存に対していかなる改善も示さない。ＡＡＤの最適ではない治療成績の主な理由の１つは、腫瘍血管形成が、相対的に遅い過程であるからである。これは、延長された処置を必要とし、その間に腫瘍は、治療に対する抵抗性を発達することが多い。ＡＡＤとＴ−ｅＣＡＲの組合せは、この課題を解決することができる。例えば、一実施形態において、Ｔ−ｅＣＡＲによる腫瘍血管の初期破壊は、腫瘍血管形成の相対的に遅い過程を急性事象へと変換することができ、これは、抗血管新生療法に対する腫瘍の応答性を増大させるであろう。別の例として、実施形態において、また、図７に図解されている通り、腫瘍を有する動物へのＴ−ｅＣＡＲの前投与は、ＡＡＤ（例えば、パゾパニブ）の治療効果を劇的に増強させた。一実施形態において、結腸がんは、ＣＴ２６腫瘍細胞を植え込むことにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に確立することができる。腫瘍が、ほぼ５ｍｍの直径に達したら、腫瘍は、１）ＰＢＳ、２）Ｔ−ｅＣＡＲ単独、３）ＡＡＤ単独および４）Ｔ−ｅＣＡＲプラスＡＡＤで処置することができる。別の実施形態において、最良の治療結果は、Ｔ−ｅＣＡＲプラスＡＡＤによる腫瘍のコンビナトリアル処置から得ることができ、これは、Ｔ−ｅＣＡＲ媒介性腫瘍血管破壊が、ＡＡＤの治療効果を強めることを示す。あらゆるＡＡＤは、血管形成を阻害するため、いずれかのＡＡＤの治療効果をＴ−ｅＣＡＲによって強めて、治療効果を強めることができる。
【００４１】
上述は図解目的であって、制限目的ではないと企図されていることが理解される。材料は、当業者であれば、本明細書に記載されている発明概念を作製および使用できるように提示されており、特定の実施形態の文脈において提供されており、その変種は、当業者であれば容易に明らかとなるであろう（例えば、開示されている実施形態の一部は、互いに組み合わせて使用することができる）。多くの他の実施形態は、上述を見直すことにより、当業者に明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と共に、このような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲に関して決定されるべきである。添付の特許請求の範囲において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「ｉｎ  ｗｈｉｃｈ」は、それぞれの用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「ｗｈｅｒｅｉｎ」の分かりやすい英語（ｐｌａｉｎ−Ｅｎｇｌｉｓｈ）の均等物として使用されている。
【実施例】
【００４２】
細胞株。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｆ０をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＨＵＶＥＣは、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＡＴＣＣ処方ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；カタログ番号３０−２００２）において培養し、Ｂ１６−Ｆ０細胞は、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含有する１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭにおいて成長させた。Ｂ１６−ＧＦＰｌｕｃ細胞は、以前に記載された通りに、ｐＩＲ−ｅＧＦＰ−ｌｕｃおよびｐＣＭＶ−ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドをＢ１６−Ｆ０にコトランスフェクトし、続いてフローサイトメトリー選別および単一細胞クローニングを行うことにより、本発明者らの研究室において樹立した（Ｆｕ  Ｘら、Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０年；５巻：ｅ１１８６７頁（２０１０年））。
【００４３】
レトロウイルスベクター構築および産生。レトロウイルスベクターの構築は、図１Ａに模式的に提示されている。Ｌｅｕ−２８−エキスタチン（ＭＥＣＥＳＧＰＣＣＲＮＣＫＦＬＫＥＧＴＩＣＫＲＡＲＧＤＤＬＤＤＹＣＮＧ  ＫＴＣＤＣＰＲＮＰＨＫＧＰＡＴ；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ２７２１３．１）およびＭｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）のコード配列は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）により、制限部位ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩを含有するように合成した。次に、ＨＥＲ２  ＳｃＦｖコード配列を置き換えることにより、この構築物をベクターＳＦＧ６  ＦＲＧ５−ＣＤ２８−ゼータへとクローニングした（Ａｈｍｅｄ  Ｎら、Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＨＥＲ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７巻：５９５７〜６４頁（２００７年））。シグナルペプチド（ＳＰ）を融合遺伝子の５’に付加した。その上、ｃ−Ｍｙｃタグ（ｃ−Ｍｙｃ）をエキスタチンおよびＣＤ２８の間に挿入して、ｅＣＡＲ発現の検出を容易にした。構築物をｅＣＡＲと命名した。ＳＦＧ−ＧＦＰを構築するために、ＧＦＰ遺伝子マイナス終止コドンを同様にＳＦＧ−ＦＲＧ５−ＣＤ２８−ゼータに挿入した。ウイルスストックを調製するために、レトロウイルスベクター構築物を、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅにトランスフェクトした（Ｍｏｒｉｔａ  Ｓら、Ｐｌａｔ−Ｅ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７巻：１０６３〜６頁（２０００年））。４８および７２時間後に上清を収集し、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。精製した上清を組み合わせ、２９３細胞において力価決定して、ウイルス収量を決定した。
【００４４】
レトロウイルスベクターによるマウス脾細胞の形質導入。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾細胞を収集し、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｎＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地により培養した。懸濁物中の細胞（２×１０６／ｍｌ）をコンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびマウスＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ；ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）で２４時間刺激し、その後、ｅＣＡＲまたはＳＦＧ−ＧＦＰレトロウイルスの形質導入のためにＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ．Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）コーティングした非組織培養２４ウェルプレートに移した。次に、形質導入した脾細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２を補充した新鮮培地において４８時間培養した。
【００４５】
ｅＣＡＲおよびＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析。ｅＣＡＲレトロウイルスを形質導入した脾細胞を、２％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳで１回洗浄し、その後、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体を含有するＭｏｕｓｅ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）と共に３０分間４℃でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後に、ＰＥ結合体化Ｍｙｃ−タグマウス抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）またはアイソタイプ抗体で、３０分間４℃で暗所にて細胞を染色した。解析に使用する前に、細胞を２回洗浄した。全く染色することなく解析するために、ＳＦＧ−ＧＦＰ形質導入細胞を直接的に使用した。次に、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において両方の細胞調製物を解析し、＞１０，０００事象に対してデータ解析した。αｖβ３インテグリン発現を決定するために、ＨＵＶＥＣまたはＢ１６−Ｆ０細胞を、１００μｌの１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中１０μｇのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）で３０分間４℃にて染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後に、同じＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩにより細胞を解析した。
【００４６】
レトロウイルス形質導入脾細胞の細胞毒性アッセイ。可視化または近年報告された非放射性定量的測定（Ｆｕ  Ｘら、Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０年；５巻：ｅ１１８６７頁（２０１０年））のいずれかにより、標的細胞に対するレトロウイルス形質導入脾細胞の細胞毒性をアッセイした。可視化検出のため、５×１０４個の標的細胞ウェルを４８ウェルプレートに最初に播種した。レトロウイルス形質導入脾細胞（エフェクター細胞）を、２０：１〜２．５：１に及ぶエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間後に添加した。２４または４８時間後に細胞を固定し、光学顕微鏡下で可視化および画像化するために、２０％エタノール中１％クリスタルバイオレットで染色した。レトロウイルス形質導入脾細胞の細胞毒性の定量的測定のため、１×１０４個の標的細胞を先ず９６ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞を、２０：１〜２．５：１に及ぶＥ：Ｔ比で２４時間後に添加した。４８時間後に培地を除去し、細胞をＰＢＳですすいだ。次に、５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を各ウェルに添加した。細胞が完全に溶解されるように、プレートを穏やかに２分間振盪した。次に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）による発光測定のため、細胞溶解産物を９６ウェル不透明プレートに移した。細胞毒性活性を次式により計算した：細胞死滅（％）＝［１−（エフェクター細胞を含有するウェルの読み取り値）／（エフェクター細胞を含有しないウェルの読み取り値）］×１００。
【００４７】
サイトカイン放出の測定。Ｃ５７ＢＬ／６ドナーから脾細胞を得た。この細胞に、形質導入しなかった（ＵＴ）またはＳＦＧ−ＧＦＰ、ｅＣＡＲ（Ｔ−ｅＣＡＲ）もしくはＨｅｒ２ＣＡＲ（Ｔ−Ｈｅｒ２ＣＡＲ）を形質導入した。Ｈｅｒ２ＣＡＲ構築の詳細は、本発明者らの以前の刊行物において報告されている（Ｆｕ  Ｘら、Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０年；５巻：ｅ１１８６７頁（２０１０年））。ＣＡＲ媒介性細胞溶解におけるサイトカイン放出を測定するために、ＨＵＶＥＣまたはＨｅｒ２発現４Ｔ１−Ｈｅｒ２を、４８ウェルプレートにおいて相当するＴ−ＣＡＲと１：５比で混合した。全Ｔ−ＣＡＲは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られる脾細胞から調製したため、４Ｔ１−Ｈｅｒ２標的のための同種異系エフェクターＴ細胞として提示した。２４時間インキュベーション後に培養上清を採取した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの含量をＥＬＩＳＡにより製造者の説明書に従って決定した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。
【００４８】
動物実験。腫瘍を確立するため、１×１０５個のＢ１６−Ｆ０マウスメラノーマ細胞を、６〜８週齢雄免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の右側腹部に植え込んだ。腫瘍が触知できるようになったら（５日目前後）、マウスに、ｅＣＡＲもしくはＳＦＧ−ＧＦＰレトロウイルス形質導入脾細胞（１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に４×１０６個）またはＰＢＳ（１群当たりｎ＝１０匹のマウス）のいずれかを静脈内注射した。実験終了まで腫瘍サイズを１週間に２回測定した。腫瘍体積を次式により計算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）］×［幅（ｍｍ）］２×０．５２。
【００４９】
腫瘍血管に対するレトロウイルストランスフェクト脾細胞の効果を決定するために、相当に大きいＢ１６−Ｆ０腫瘍（およそ８ｍｍの直径）を有するマウスに、ｅＣＡＲもしくはＳＦＧ−ＧＦＰレトロウイルス形質導入脾細胞（１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に５×１０６個）またはＰＢＳ（各群ｎ＝３匹のマウス）のいずれかを静脈内注射した。マウスを３日後に人道的に屠殺し、その腫瘍を切除した。腫瘍を１０％ホルマリンにおいて２４時間固定し、次に、さらに２４時間７０％エタノールに置いた。これに続き、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  ＥＳ組織プロセッサ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において一晩脱水した。連続的５μｍ厚切片を切断し、キシレンおよび減少するエタノール濃度（１００％から５０％）において脱水した。次に、顕微鏡下での観察および顕微鏡写真のため、ヘマトキシリンおよびエオシンで切片を染色した。
【００５０】
腫瘍血管破壊後のナノ粒子送達を調べるために、ｅＣＡＲまたはＳＦＧ−ＧＦＰレトロウイルス形質導入脾細胞を、上述通り、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。４８時間後、マウスに、ローダミンＤＨＰＥ（ＦｏｒｍｕＭａｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）で標識したＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥリポソームナノ粒子（１００μｍのサイズ）の静脈内注射を、１００μｌのＰＢＳに希釈した１０ｍｇ／ｋｇの用量で与えた。リポソーム注射２４時間後にマウスを屠殺し、腫瘍ならびに肺、腎臓および肝臓を含む主要臓器を採取した。採取した腫瘍および臓器を４％パラホルムアルデヒドにおいて４℃で２４時間固定し、次に２５％スクロースでさらに２４時間４℃で処理し、その後、ＯＣＴに包埋した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１）下での観察および顕微鏡写真のため、連続した５μｍ厚の凍結切片を調製した。ローダミン像の強度をＭｉｃｒｏＳｕｉｔｅ（商標）ＦＩＶＥソフトウェアにより定量化した。簡潔に説明すると、各スライドにおいて５個の区域をランダムにクリックして、強度値の読み取り値を得た。合計３枚のスライド（各動物から１枚）を定量化に付して、各処置群の平均値を得た。
【００５１】
統計解析。全定量的データは、平均＋／−ＳＤとして報告されている。分散分析およびスチューデントｔ検定を使用して、多重比較のために統計解析を行った。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【図２Ａ】
2016526536.tif 000003
【図２Ｃ】
2016526536.tif 000004
【図２Ｄ】
2016526536.tif 000005
【図３Ａ】
2016526536.tif 000006
【図１Ａ】
2016526536.tif 000007
【図１Ｂ】
2016526536.tif 000008
【図２Ｂ】
2016526536.tif 000009
【図３Ｂ】
2016526536.tif 000010
【図３Ｃ】
2016526536.tif 000011
【図４Ａ】
2016526536.tif 000012
【図４Ｂ】
2016526536.tif 000013
【図５Ａ】
2016526536.tif 000014
【図５Ｂ】
2016526536.tif 000015
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2016526536.tif 000017
【図７】
2016526536.tif 000018
【配列表】
2016526536000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月20日(2016.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞を死滅させるための組成物であって、前記組成物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植したＴ細胞を含み、前記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、組成物。
【請求項２】
前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、前記Ｔ細胞のゼータ鎖に連結している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植するための方法であって、前記方法は、
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質導入するステップを含み、前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞のゼータ鎖のコード配列、およびαｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分のコード配列を含む、方法。
【請求項７】
前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、前記Ｔ細胞のゼータ鎖の前記コード配列および前記エキスタチンポリペプチドの前記コード配列の間にＣＤ２８ドメインをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、前記ＣＤ２８ドメインおよび前記エキスタチンポリペプチドの前記コード配列の間にｃ−Ｍｙｃタグをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主におけるがん細胞を死滅させるための組成物であって、前記組成物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入したＴ細胞を含み、前記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、組成物。
【請求項１４】
前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、前記Ｔ細胞のゼータ鎖に連結している、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、１種または複数の抗腫瘍性小分子と同時投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、１種または複数の抗血管新生剤と同時投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗血管新生剤が、アンジオポエチン２、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブおよびアキシチニブのうち少なくとも１種を含む、請求項１３に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
前述の概要および次の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解できるであろう。単なる図解目的のために、ある特定の実施形態が図面に示されている。しかし、本明細書に開示されている発明概念が、図面に示されている正確な配置および手段に限定されないことが理解される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
がん細胞を死滅させるための化合物であって、上記化合物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植したＴ細胞を含み、上記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、化合物。
（項目２）
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目１に記載の化合物。
（項目３）
上記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、上記Ｔ細胞のゼータ鎖に連結している、項目２に記載の化合物。
（項目４）
上記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目１に記載の化合物。
（項目５）
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、項目４に記載の化合物。
（項目６）
Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を移植するための方法であって、上記方法は、
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質導入するステップを含み、上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞のゼータ鎖のコード配列、およびαｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分のコード配列を含む、方法。
（項目７）
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目６に記載の方法。
（項目９）
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、シグナルペプチドをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目１１）
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、上記Ｔ細胞のゼータ鎖の上記コード配列および上記エキスタチンポリペプチドの上記コード配列の間にＣＤ２８ドメインをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１２）
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、上記ＣＤ２８ドメインおよび上記エキスタチンポリペプチドの上記コード配列の間にｃ−Ｍｙｃタグをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
宿主におけるがん細胞を死滅させる方法であって、上記方法は、
上記宿主に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入したＴ細胞を投与するステップを含み、上記ＣＡＲは、αｖβ３インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、方法。
（項目１４）
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、上記Ｔ細胞のゼータ鎖に連結している、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記標的化部分が、α５β１インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸２８にロイシンでの置換を有する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
形質導入した上記Ｔ細胞が、１種または複数の抗腫瘍性小分子と同時投与される、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
形質導入した上記Ｔ細胞が、１種または複数の抗血管新生剤と同時投与される、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
上記抗血管新生剤が、アンジオポエチン２、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブおよびアキシチニブのうち少なくとも１種を含む、項目１３に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月22日(2016.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016526536000001.app
【国際調査報告】
2016526536.tif 000019
2016526536.tif 000020