(57)【要約】  本発明は、抗メソテリン免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４に特に好適な安定製剤に関する。記載される、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む安定な水系製剤は、治療的適用に直接、そしてその後の凍結乾燥に適している。その凍結乾燥粉末は、水で再生して再生溶液を得ることができ、当該溶液もまた治療的適用に好適である。治療的投与に好適な安定な再生タンパク質製剤を提供することも、更なる目的である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と；
ｂ．アミノ酸、ポリソルベート８０、およびショ糖からなる群から選択される１以上の賦形剤と
を含み、
ｐＨ５．０から８．０の緩衝水溶液である、免疫複合体製剤。
【請求項２】
ａ．１ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
ｂ．１０ｍＭから１５ｍＭのＬ−ヒスチジン
ｃ．１００ｍＭから２５０ｍＭのグリシン
ｄ．５％から１５％のショ糖
ｅ．０．００１％から０．１％のポリソルベート８０
を含む請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
ａ．５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、
ｂ．１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、
ｃ．１３０ｍＭのグリシン、
ｄ．５％のショ糖、および
ｅ．０．０１％のポリソルベート８０
を含む請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
ｐＨ５．５の緩衝水溶液である、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の液体免疫複合体製剤の凍結乾燥によって得られる凍結乾燥組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の凍結乾燥組成物の溶液中での再生によって得られる免疫複合体製剤。
【請求項７】
請求項５に記載の凍結乾燥組成物の水での再生によって得られる免疫複合体製剤。
【請求項８】
再生されて５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含むようになり、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４  １ｍｇ当たりＬ−ヒスチジン０．３１ｍｇ、グリシン１．９５ｍｇ、ショ糖９．９９ｍｇ、およびポリソルベート８０  ０．０２ｍｇを含み、水で再生したらｐＨが約５．５をである、請求項５に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項９】
治療的適用で使用される請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫複合体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗メソテリン免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４に特に好適な安定製剤に関する。記載のＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む安定水系製剤は、治療的適用および後の凍結乾燥に直接適している。凍結乾燥粉末は、水で再生して、やはり治療的適用に適した再生溶液を生じさせることができる。さらに別の目的は、治療的投与に好適な安定な再生タンパク質製剤を提供することにある。
【背景技術】
【０００２】
抗体による療法は、固形腫瘍などの各種癌の治療において非常に有効であることがわかっている。良好な抗体による療法開発の中心は、腫瘍細胞上で優先的に発現することが認められている細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。メソテリン前駆体ポリペプチドは、主として膜結合ＧＰＩ結合型で生じ（Ｃｈａｎｇ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉ．  Ｐａｓｔａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ，  （１９９６）  ９３（１）：１３６）、本明細書においてメソテリンと称される、タンパク質分解により開裂して３０ｋＤａのＮ末端分泌ポリペプチドおよび４０ｋＤａのＣ末端ポリペプチドとなるグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合グリコシル化細胞表面タンパク質である。メソテリンは、ある種の腫瘍細胞、特に中皮腫細胞、膵臓腫瘍細胞および卵巣癌細胞によって優先的に発現され、一方で、その発現は正常組織に限定されることで、それは腫瘍療法開発の魅力的な標的となる（Ａｒｇａｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００１）  ７（１２）：３８６２；Ｈａｓｓａｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００４）  １０（１２  Ｐｔ１）：３９３７）。
【０００３】
ＭＦ−Ｔ、抗原結合抗体断片およびこれら抗体の変種などの抗メソテリン抗体がＷＯ２００９／０６８２０４に記載されている。記載されている抗体は、免疫複合体としての使用に非常に好適なものとする特別な特徴を有する。免疫複合体は、腫瘍細胞抗原などの標的細胞抗原を特異的に認識する抗体、および１個もしくは数個の共有結合的に連結された薬剤分子、特にマイタンシノイドなどの細胞傷害性薬剤からなる。化学療法剤、例えばマイタンシノイド類またはその誘導体に連結された抗メソテリン抗体、抗体断片ならびにこれら抗体の変種および断片からなる免疫複合体が、ＷＯ２０１０／１２４７９７に記載されている。抗メソテリン免疫複合体の特別な好ましい実施形態は、ＷＯ２０１０／１２４７９７に詳細に記載されているＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０６８２０４
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１２４７９７
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉ．  Ｐａｓｔａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ，  （１９９６）  ９３（１）：１３６
【非特許文献２】Ａｒｇａｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００１）  ７（１２）：３８６２
【非特許文献３】Ｈａｓｓａｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００４）  １０（１２  Ｐｔ１）：３９３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の有機および無機薬剤とは異なり、抗体系薬剤は、相対的に大きく、より複雑である。これにより、抗体系薬剤をその生理活性型で保存し、分解を防止する製剤を開発するのが困難となる。崩壊は、化学的不安定性（新たな化学物質を生じる）または物理的不安定性のために起こり得る。疎水性の小分子であることが多い薬剤、特には細胞傷害性薬剤の、親水性モノクローナル抗体への結合によって、免疫複合体に対する不安定性がさらに高くなる。特に、タンパク質薬剤中での粒子形成によって、医薬化合物を不安定化することで製剤の効力が低下するか、臨床用途において有害となることもあり得る。例えば、注射医薬製剤中の粒子によって、患者には重大な傷害が生じる可能性がある。さらに、凝集塊の形成が、タンパク質医薬分解の主要経路であり（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２０，  １３２５−１３３６（２００３））、免疫原性などの望ましくない効果を生じる可能性がある。免疫複合体の化学的不安定性により、遊離細胞傷害性薬剤が発生する可能性があり、それによって有毒な副作用を生じ得る。
【０００７】
免疫複合体に好適な製剤は、長期間にわたり化学的および物理的不安定性を防止する。免疫複合体を含むマイタンシノイドに好適な安定液体もしくは凍結乾燥製剤が、例えばＷＯ２００４／００４６３９、ＷＯ２００４／１１０４９８およびＷＯ２００７／０１９２３２に記載されている。ＷＯ２００７／０１９２３２には、いくつかの賦形剤を含む液体免疫複合体製剤が記載されており、その製剤は緩衝水溶液である。ＷＯ２００４／１１０４９８は、液体およびマイタンシノイドに化学的に結合した抗体を含む凍結乾燥組成物を提供する。ＷＯ２００４／００４６３９には、免疫複合体ｈｕＣ２４２−ＤＭ１に好適な製剤が記載されている。
【０００８】
それにもかかわらず、これら刊行物全てからの一般的メッセージは、各免疫複合体（この場合はＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）が、抗体、リンカーおよび細胞傷害性薬剤の特別な組み合わせであるということである。この組み合わせによって、ある種の物理化学的特性がもたらされ、当該特性は、本発明で提供される好適な製剤のための予測できない溶液を必要とする
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（ｉ）ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、（ｉｉ）アミノ酸Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンを優先的に含む緩衝系、（ｉｉｉ）抗凍結剤、および適宜に（ｉｖ）界面活性剤を含む治療的適用に好適な製剤／組成物を提供し、当該組成物は５．０から８．０のｐＨを有する。
【００１０】
本発明はまた、（ｉ）ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、（ｉｉ）アミノ酸Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンを優先的に含む緩衝系、（ｉｉｉ）抗凍結剤、および、適宜（ｉｖ）界面活性剤を含む凍結乾燥組成物であって、水で再生した場合にｐＨ５．０から８．０を有する凍結乾燥組成物を提供する。この凍結乾燥組成物の再生溶液は、治療的適用に好適である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の医薬として好適な製剤に関するものであり、その製剤は（ｉ）ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、（ｉｉ）アミノ酸Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンを優先的に含む緩衝系、（ｉｉｉ）抗凍結剤、および適宜に（ｉｖ）界面活性剤を含み、その組成物はｐＨ５．０から８．０を有する。本発明はまた、（ｉ）ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、（ｉｉ）アミノ酸Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンを優先的に含む緩衝系、（ｉｉｉ）抗凍結剤、および適宜に（ｉｖ）界面活性剤を含む凍結乾燥組成物に関するものであり、その組成物は水で再生した場合にｐＨ５．０から８．０を有する。
【００１２】
免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、当該分野で公知である（ＷＯ２０１０／１２４７９７）。ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、マイタンシノイドに化学的に結合した抗体ＭＦ−Ｔを含む免疫複合体である（ＷＯ２００９／０６８２０４に記載）。
【００１３】
免疫複合体（この場合はＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）の分解は、医薬適用において望ましくない効果である。薬剤の効力または利用能が大幅に変わり得る。分解は、化学的不安定性（新たな化学物質を生じる）または物理的不安定性のために起こり得る。化学的不安定性は、例えば脱アミド、加水分解、酸化またはジスルフィド交換によって生じ得る。物理的不安定性は、例えば凝集または吸着によって生じ得る。疎水性小分子であることが多い薬剤、特には細胞傷害性薬剤の親、水性モノクローナル抗体への結合により、免疫複合体はさらに不安定化する。タンパク質医薬における粒子形成は特に、医薬化合物を不安定化することで、製剤の効力を低下させ、臨床的使用に有害にさえなり得る。例えば、注射医薬製剤中の粒子は、患者に重大な傷害を生じ得る。さらに、凝集体の形成は、タンパク質の主要な分解経路であり、免疫原性などの望ましくない効果を生じ得る。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、「高分子量凝集体」の形成を防止する免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の医薬として好適な製剤を提供することにある。本明細書で使用される「高分子量凝集体」または「ＨＭＷ」という用語は、２以上の免疫複合体分子を含む凝集体を指す。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、化学的不安定性を防止する免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の医薬的に好適な製剤を提供することである。免疫複合体の化学的不安定性により、遊離の細胞傷害性薬剤（この場合、遊離ＤＭ４マイタンシノイド種）が発生する可能性があり、それによって毒性副作用が生じ得る。従って、さらに、あらゆる種類の「低分子量」（ＬＭＷ）断片の存在または発生は低減または回避されるべきである。
【００１６】
本発明は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含有する組成物が得られ、それによって液体製剤ならびに凍結乾燥組成物としての有効期間を長期化できるという所見に基づくものである。この製剤により、凍結乾燥組成物（長い有効期間）として長期貯蔵が可能となり、再生後に、水溶液として長期間にわたり未使用部分を貯蔵することができる。
【００１７】
本発明の免疫複合体組成物における代表的な有効期限は、４℃で約１から５年、好ましくは１から４年、より好ましくは２から４年である。
【００１８】
この種類の製剤は、凝集および粒子形成を阻害または減らす賦形剤を含有させることで得ることができると考えられる。免疫複合体を安定される製剤は当該分野で公知である。マイタンシノイド含有免疫複合体のための好適な安定な液体または凍結乾燥製剤は、例えばＷＯ２００４／００４６３９、ＷＯ２００４／１１０４９８、およびＷＯ２００７／０１９２３２に記載されている。ＷＯ２００７／０１９２３２には、免疫複合体およびショ糖、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、シクロデキストリン、ブドウ糖、グリセリン、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムおよびアミノ酸からなる群から選択される１以上の賦形剤を含む液体免疫複合体製剤が記載されており、その製剤はｐＨ４．５から７．６を有する緩衝水溶液である。ＷＯ２００４／１１０４９８には、液体およびマイタンシノイドに化学的に結合した抗体を含む凍結乾燥組成物が提供されている。ＷＯ２００４／００４６３９には、免疫複合体ｈｕＣ２４２−ＤＭ１に好適な製剤が記載されている。しかしながら、各免疫複合体（この場合はＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）が、抗体、リンカーおよび細胞傷害性薬剤の特殊な組み合わせであることで、予測できない製剤問題を生じることも知られている。
【００１９】
本発明は、医薬組成物の投与に関するものでもある。かかる投与は、経口または非経口で行われる。免疫複合体においては、非経口投与経路がより好ましい。非経口送達の方法には、局所、動脈（腫瘍に直接）、筋肉、皮下、髄内、くも膜下、脳室内、静脈、腹腔内または経鼻投与などがある。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を医薬として使用可能な製剤に加工するのに役立つ賦形剤および補助剤を含む好適な医薬として許容される担体を含むことができる。製剤および投与の技術に関するさらなる詳細が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（編：Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）の最新版にある。
【００２０】
本発明の製剤は、注入器、ポンプ、注射器または当該分野で公知のいずれか他の機器を用いて、ならびに、重力によって投与することができる。針またはカテーテルを用いて、本発明の製剤をある種の非経口経路を介して患者身体に導入することができる。
【００２１】
本発明で使用するのに好適な医薬組成物には、有効成分が、所期の目的、すなわち特定の疾患の治療を達成する上での有効量で含まれる組成物などがある。有効用量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００２２】
あらゆる化合物について、治療上有効用量は、最初に細胞培養アッセイ、例えば腫瘍性細胞、または、動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタもしくはサルで推定することができる。動物モデルを用いて、所望の濃度範囲および投与経路も得られる。次に、そのようなデータを用いて、ヒトでの投与に有用な用量および経路を決定することができる。
【００２３】
本発明の組成物は、治療的適用において許容されるように製剤する。「治療的適用」とは、処置を必要とする対象者への、治療上有効量の免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の投与が関与する処置を指す。ここで、「治療上有効量」は、単独でもしくは他薬剤と組み合わせて、単一用量でまたは連続投与法で、メソテリン陽性細胞の増殖を低下させるか、対象者の処置領域でのメソテリン発現腫瘍の大きさを低下させるのに十分な量であり、悪い状態を改善するが毒物学的に耐容される免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の量と定義される。対象者は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の低次霊長類）であってよい。
【００２４】
正確な用量は、処置される患者を考慮して個々の医師が選択する。用量および投与を調節して、十分なレベルの活性部分を提供し、所望の効果を維持する。考慮し得る別の要素には、疾患状態の重症度、例えば腫瘍の大きさおよび位置；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時刻および回数、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および療法への耐容性／応答などがある。長期作用性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、例えば３から４日に１回、週１回、２週に１回、または３週に１回投与されるものと考えられる。
【００２５】
「医薬製剤」または「製剤」という用語は、それに含まれる有効成分の生理活性を有効にできるような形態であり、製剤が投与されるであろう対象者にとって許容できないほど有毒な別の成分を含まない調製物を指す。
【００２６】
本発明は、液体製剤の凍結乾燥粉末も提供する。「凍結乾燥（された）」は、組成物が減圧下で真空乾燥されていることを意味する。凍結乾燥の際、液体製剤は凍結され、溶質は溶媒から分離される。溶媒は、昇華（すなわち、一次乾燥）および次に脱離（すなわち、二次乾燥）によって除去される。凍結乾燥によって、長期間にわたって貯蔵可能なケーキもしくは粉末が得られる。投与の前に、凍結乾燥組成物を、溶媒、優先的には注射用無菌水で再生する。本明細書で使用される「再生製剤」という用語は、可溶化後のそのような凍結乾燥組成物を指す。
【００２７】
凍結乾燥方法は当該分野で公知である（例えば、Ｗａｎｇ，  Ｗ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．，  ２０３，  １−６０（２０００））。本発明の凍結乾燥組成物は、実施例に詳細に記載する二つの異なる凍結乾燥プロトコールで得られた。
【００２８】
凍結乾燥プロセス中の分解を防止するため、本発明の液体組成物は抗凍結剤を含む。本明細書で使用される「抗凍結剤」という用語は、凍結時に不安定な分子を保護する賦形剤を指す。当該分野で公知の好適な抗凍結剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、グリセリン、グルコース、トレハロースおよびショ糖などの成分であるが、それらに限定されるものではない。最も好ましくは、抗凍結剤はショ糖である。抗凍結剤がショ糖である場合、凍結乾燥前の液体組成物は、２％から１５％のショ糖、より好ましくは５％から１０％のショ糖を含む。最も好ましくは、凍結乾燥前の液体組成物は５％ショ糖を含む。
【００２９】
凍結乾燥組成物はさらに、増量剤、好ましくは結晶可能な増量剤を含むことができる。増量剤は代表的には、当該分野では、凍結乾燥の結果として製造される「ケーキ」に構造と重量を与えるのに使用される。好適な当該分野で公知の増量剤を、本発明の凍結乾燥組成物との関係で用いることができる。好適な増量剤には、例えば、マンニトール、デキストランおよびグリシンなどがある。
【００３０】
本発明の組成物は、界面活性剤を含んでいても良い。本明細書で使用される「界面活性剤」という用語は、親水性部分および疎水性部分を有する全ての洗浄剤を指し、ノニオン系、カチオン系、アニオン系および両性イオン系洗浄剤などがある。記載の組成物については、ノニオン系界面活性剤が好ましい。好ましい洗浄剤は、例えばポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０、またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレートとも称される）またはポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０、またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノラウレートとも称される）である。最も好ましくは、界面活性剤はポリソルベート８０である。界面活性剤は、０．００１％から０．２％の濃度で用いることができる。
【００３１】
本明細書で使用される「緩衝剤」という用語は、酸性もしくは塩基性物質の添加後にｐＨがわずかしか変化しない緩衝液を指す。緩衝液は、それぞれ弱酸およびその相当する塩基、または弱塩基およびその相当する酸の混合物を含む。本明細書で使用される「緩衝系」という用語は、上記の酸および塩基の１以上の混合物を指す。本発明の好ましい緩衝系は、１以上のアミノ酸を含む。最も好ましくは、緩衝系は、Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンの混合物を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびアミノ酸、抗凍結剤、および界面活性剤からなる群から選択される１以上の賦形剤を含む免疫複合体製剤であって、組成物がｐＨ５．０から８．０、より好ましくはｐＨ５．５から７．３、より好ましくはｐＨ５．５を有する製剤である。
【００３３】
本発明の一実施形態は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＬ−ヒスチジン、グリシン、抗凍結剤および界面活性剤からなる群から選択される１以上の賦形剤を含む免疫複合体製剤であって、組成物がｐＨ５．０から８．０、より好ましくはｐＨ５．５から７．３、より好ましくはｐＨ５．５を有する製剤である。
【００３４】
本発明の一実施形態は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２．０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約３．０ｍｇ／ｍＬ、約４．０ｍｇ／ｍＬ、約５．０ｍｇ／ｍＬ、約６．０ｍｇ／ｍＬ、約７．０ｍｇ／ｍＬ、約８．０ｍｇ／ｍＬ、約９．０ｍｇ／ｍＬ、または約１０．０ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む免疫複合体製剤である。
【００３５】
本発明の一実施形態は、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、または１０．０ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む免疫複合体製剤である。
【００３６】
本発明の一実施形態は、５．０ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、または５０ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む免疫複合体製剤である。
【００３７】
本発明の一実施形態は、１ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは５ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む免疫複合体製剤である。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態は、５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む免疫複合体製剤である。
【００３９】
本発明の一実施形態は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４および緩衝系を含む免疫複合体製剤である。好ましい実施形態において、緩衝系はアミノ酸Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンである。好ましい実施形態において、アミノ酸Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンは、それぞれ５ｍＭから２５０ｍＭの濃度を有する。より好ましくは、Ｌ−ヒスチジンおよびグリシン濃度はそれぞれ１０ｍＭから１５０ｍＭである。最も好ましくは、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンおよび１３０ｍＭグリシンを含む混合物である。
【００４０】
本発明の一実施形態は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、緩衝系および抗凍結剤を含む免疫複合体製剤である。好ましい実施形態において、抗凍結剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、グリセリン、グルコース、トレハロースおよびショ糖からなる群から選択される。最も好ましくは、抗凍結剤はショ糖である。抗凍結剤がショ糖である場合、液体組成物または凍結乾燥前の液体組成物は、２％から１５％のショ糖、より好ましくは５％から１０％のショ糖を含む。最も好ましくは、液体組成物または凍結乾燥前の液体組成物は５％のショ糖を含む。
【００４１】
本発明の一実施形態は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、緩衝系、抗凍結剤および界面活性剤を含む免疫複合体製剤である。好ましい実施形態において、界面活性剤はノニオン系界面活性剤である。より好ましい実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０からなる群から選択される。最も好ましい界面活性剤はポリソルベート８０である。界面活性剤は、０．００１％から０．１％の濃度を有する。最も好ましくは、０．０１％のポリソルベート８０を含む組成物である。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態は、１ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、１０ｍＭから１５ｍＭのＬ−ヒスチジン、１００ｍＭから２５０ｍＭのグリシン、５％から１５％のショ糖、０．００１％から０．１％のポリソルベート８０を含む免疫複合体製剤であって、製剤がｐＨ５．０から８．０、より好ましくはｐＨ５．５からｐＨ７．３、最も好ましくはｐＨ５．５を有する緩衝水溶液である。
【００４３】
本発明の非常に好ましい実施形態は、ｐＨ５．５でＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭのグリシン、５％のショ糖、および０．０１％のポリソルベート８０を含む免疫複合体製剤である。
【００４４】
本発明の最も好ましい実施形態は、ｐＨ５．５での５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭのグリシン、５％のショ糖、および０．０１％のポリソルベート８０を含む免疫複合体製剤である。
【００４５】
本発明の一実施形態は、本発明による液体免疫複合体製剤の凍結乾燥によって得られる凍結乾燥組成物、または本発明による液体免疫複合体製剤の凍結乾燥によって得ることのできる凍結乾燥組成物である。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態は、本発明による液体免疫複合体製剤の凍結乾燥によって得られる凍結乾燥組成物である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態は、実施例６で説明する方法を用いて、本発明による液体免疫複合体製剤を凍結乾燥させることで得られる凍結乾燥組成物である。
【００４８】
本発明の非常に好ましい実施形態は、ｐＨ５．５での５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭのグリシン、５％のショ糖および０．０１％のポリソルベート８０を含む液体免疫複合体製剤の凍結乾燥によって得られる凍結乾燥組成物、またはｐＨ５．５での５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭのグリシン、５％のショ糖および０．０１％のポリソルベート８０を含む液体免疫複合体製剤の凍結乾燥によって得ることができる凍結乾燥組成物である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、本発明による凍結乾燥組成物の再生によって得られる液体免疫複合体製剤（再生製剤と称される）である。本発明の好ましい実施形態では、凍結乾燥組成物を水、優先的には注射用無菌水で再生する。
【００５０】
従って、本発明によれば、再生して５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含むようになる凍結乾燥組成物の含有量は、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４  １ｍｇ当たりＬ−ヒスチジン０．３１ｍｇ、グリシン１．９５ｍｇ、ショ糖９．９９ｍｇ、およびポリソルベート８０  ０．０２ｍｇを含む。一旦水で再生すると、そのような凍結乾燥組成物はｐＨ約５．５を有する。
【００５１】
別段の断りがなければ、この場合の％値は全て、重量／体積％である。
【００５２】
本発明については、プロセスを説明する下記の実施例によってさらに説明し、本発明を限定するものと解釈すべきではない。当業者であれば、下記で提供される工程パラメータを採用および調整して特定のニーズに適合させることができる。
【００５３】
実施例１
本実施例は、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む各種液体組成物を製造した方法を示すものである。次に、下記実施例に記載の方法に従って、これらの組成物を分析した。
【００５４】
ＷＯ２０１０／１２４７９７に記載の方法に従って、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を製造した。いくつかの製剤組成物を調べるため、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む溶液を所定の方法で変えなければならない。ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む溶液を、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を充填した分取サイズ排除カラムに注入した。加えた溶液を対象となる最終緩衝溶液で溶離した。カラムのサイズにより、完全な緩衝液交換が可能となることで、回収される溶出分画が対象の緩衝溶液中のＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４からなるものとした。タンパク質濃度を、Ｖｉｖａｐｏｒｅ  Ｃｅｌｌ（１０／２０、７５００ＭＷＣＯ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いる限外濾過によって調節した。
【００５５】
実施例２
本実施例は、外観ならびに動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価される凝集に対する、そしてＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４についての示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で測定される免疫複合体安定性に対する、いくつかの緩衝系の効果を示すものである。
【００５６】
緩衝剤成分ならびにｐＨは、視認可能な粒子および視認できない粒子の形成を阻害または低減するのに強い影響を有する。外観観察により、視認可能な粒子を観察することができる。視認できない凝集は、動的光散乱（ＤＬＳ）を介して検出可能である。
【００５７】
ＤＳＣで測定される融点Ｔｍの上昇は、免疫複合体安定性が向上したことを強く示すものである。
【００５８】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、
（１）１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５
（２）１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ７．３
（３）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０％トレハロースｐＨ６．６
（４）１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５
（５）０．９％ＮａＣｌ
中、約５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【００５９】
表１：凝集挙動および安定性に対するいくつかの緩衝剤系の影響
【表１】
2016534062.tif 000002
【００６０】
当該緩衝系は、融点Ｔｍ１によって示される免疫複合体安定性に対して強い影響を有するが、粒子形成および凝集は影響されなかった。ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４に好ましいものは、表１に描いたように、約３℃のＴｍ１上昇を示すＬ−ヒスチジンおよびグリシンを含む緩衝系である。
【００６１】
実施例３
本実施例は、下記の３実験で外観、動的光散乱（ＤＬＳ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した凝集に対するいくつかの緩衝剤系の効果を示すものである。
【００６２】
ａ．２０℃での４８時間にわたる貯蔵実験
ｂ．２０℃での２４時間にわたる振盪ストレス試験
ｃ．２０℃での２４時間にわたるストッパー接触のある反転振盪ストレス試験。
【００６３】
これらの実験は、非至適処理（貯蔵）条件での免疫複合体安定性の評価を試みるものである。
【００６４】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、
（１）１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５
（２）１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ７．３
（３）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０％トレハロースｐＨ６．６
（４）１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５
（５）０．９％ＮａＣｌ
中、約５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【００６５】
表２：非至適処理条件での凝集挙動に対するいくつかの緩衝剤系の影響
【表２】
2016534062.tif 000003
【００６６】
緩衝条件は、実施例２では明らかでなかった非至適処理（貯蔵）条件での凝集挙動に対する強い効果を有する。実施例２において、Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンを含む緩衝系はＴｍ１上昇を示し、それがより高い免疫複合体安定性を示すことのみ観察できた。
【００６７】
表２に示したように、組成物１および組成物５は、凝集体を形成する強い挙動を有する。組成物１について、凝集体形成の傾向は、振盪試験ならびに反転振盪実験での外観検査によってすでに明らかである。組成物５について、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果は、凝集を示す大幅な免疫複合体モノマー低下を示すものである。組成物３は、免疫複合体二量体形成の増加を示していることから、凝集傾向を示すものである。
【００６８】
驚くべきことに、ｐＨ７．３でＬ−ヒスチジンおよびグリシンを含む組成物２は、反転振盪（ストッパー接触）実験でのタンパク質濃度の低下を示す。振盪実験（ｃＡｂ［％］）の前後のタンパク質濃度の関係は、ｐＨ５．５で、９９．６％と比較して９２％に過ぎない。このタンパク質低下は、ｐＨ５．５と比較したｐＨ７．３でのストッパーへの吸着増加によるものであると考えられる。ＤＳＣによって評価される免疫複合体安定性の低下および凝集増加挙動は認めることができなかったことから、これはさらにより驚くべきことである。
【００６９】
この実験は、Ｌ−ヒスチジンおよびグリシンを含むＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４用組成物が好ましく、ｐＨ５．５でＬ−ヒスチジンおよびグリシンを含むＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４用組成物が非常に好ましいことを示している。
【００７０】
実施例４
本実施例は、外観検査およびＤＬＳによって評価されるタンパク質凝集に対するポリソルベート８０の効果を示すものである。
【００７１】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、
０．０％から０．１％ポリソルベート８０を含む１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５中、約５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【００７２】
表３：タンパク質凝集に対するポリソルベート８０の影響
【表３】
2016534062.tif 000004
【００７３】
ポリソルベート８０の添加は、０．１％の濃度までは、好ましい緩衝剤系で負の効果は全く持たない（表３参照）。洗浄剤の添加は、貯蔵および使用時に制御されない吸着を回避するには好ましい。約０．０１％のポリソルベート８０濃度が好ましい。
【００７４】
実施例５
本実施例は、１４日間の期間にわたる好ましい液体製剤の安定性を示すものである。さらに、外観検査、ＤＬＳおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価されるタンパク質凝集に関して、２種類のショ糖濃度を調べた。
【００７５】
ショ糖は、非常に強力な一般に使用される凍結乾燥防止剤の一つである。液体貯蔵ならびに凍結乾燥に好適な製剤に関して、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４免疫複合体に対するショ糖の影響を評価した。
【００７６】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、
（１）１０％ショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５
（２）５％ショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５
中、約５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【００７７】
表４：タンパク質凝集に対するショ糖の影響
【表４】
2016534062.tif 000005
【００７８】
１４日の期間にわたり、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４免疫複合体を含む組成物は安定である。これらは、実施例６および実施例８に示した凍結乾燥に好適な組成物である。外観検査、ＤＬＳおよびＳＥＣでは、凝集は全く認めることができなかった。モノマー含有率は非常に安定である。４０℃という高温であっても、液体製剤は、１４日の期間にわたって凝集を示さない。
【００７９】
５％から１０％のショ糖を含む組成物が、好ましい製剤である。５％のショ糖を含む組成物は、低張性のために非常に好ましい。
【００８０】
この実験は、凍結乾燥後の再生溶液が凝集なく長期間にわたって貯蔵可能であることも示している。
【００８１】
実施例６
本実施例は、凍結乾燥の堅牢性および凍結乾燥への液体組成物の好適性を示すものである。さらに、凍結乾燥サンプルの再生後に得られた結果は、その組成物によってさらに、凍結乾燥製剤が可能であることを明瞭に示している。
【００８２】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、非常に好ましい実施形態において、１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシン、５％ショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．５中５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【００８３】
条件１：合計約６２．５時間を要する非常に厳しい方法、条件２：合計約９５．５時間を要するより温和な方法、の二つの凍結乾燥方法を用いた。凍結乾燥サイクルの詳細を表５にまとめた。
【００８４】
表５：使用した凍結乾燥サイクルのパラメータ
【表５】
2016534062.tif 000006
【００８５】
上記の凍結乾燥方法により、白色ケーキまたは粉末が得られ、それは水で急速に（ほぼ１分）再生することができる。凍結乾燥（５ｍｇ／ｍＬ）前と同じタンパク質濃度で再生した場合に、粒子が全くない透明溶液が認められた。凝集も凝集の徴候も検出されなかった（表６参照）。ＳＥＣモノマー含有率は、凍結乾燥がない場合と同じ範囲である（比較については表４参照）。
【００８６】
再生溶液の詳細な分析では、ＨＩＡＣ方法を介した視認できない粒子の検出を行い、さらに、より感受性の高いＭＦＩ（微小流動画像処理）法を行った。粒子／容器（体積１２．５ｍＬ）は、十分に許容基準内である。これは、医薬製品としての好適性のための重要な要件である。
【００８７】
表６に、注射用水による再生後のサンプルの特性をまとめた。
【００８８】
表６：水による再生後の凍結乾燥バッチの特性決定［最終体積１２．５ｍＬ／容器］
【表６】
2016534062.tif 000007
【００８９】
実施例７
本実施例は、１４日の期間にわたる、いくつかの好ましい液体製剤中の免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の化学的安定性を示すものである。二つの異なるショ糖濃度を用いた。
【００９０】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、
（１）１０％ショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５
（２）５％ショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシンｐＨ５．５
中、約５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【００９１】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１４日の期間にわたり、異なる貯蔵条件で安定である（表７参照）。２５℃または４０℃の高温であっても、ごく少量の遊離毒素族種（遊離ＤＭ４−リンカー、遊離ＤＭ４）しか検出できない。従って、好ましい組成物は、物理的にも化学的にも安定である。
【００９２】
表７：好ましい製剤中の免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の化学的安定性
【表７】
2016534062.tif 000008
【００９３】
実施例８
本実施例は、好ましい凍結乾燥組成物中での免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の長期安定性を示すものである。
【００９４】
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体を、１０ｍＭＬ−ヒスチジン、１３０ｍＭグリシン、５％ショ糖、０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．５中約５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。液体製剤を、実施例６に記載の方法に従って凍結乾燥した。従って、再生されて５ｍｇ／ｍＬのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含むようになる凍結乾燥組成物は、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４  １ｍｇ当たりＬ−ヒスチジン０．３１ｍｇ、グリシン１．９５ｍｇ、ショ糖９．９９ｍｇ、およびポリソルベート８０  ０．０２ｍｇを含む。水で再生したら、そのような凍結乾燥組成物はｐＨ約５．５を有する。
【００９５】
凍結乾燥組成物を、２℃から８℃で２４時間の期間保存した。一定の時間点（３、６、９、１２、１８、および２４ヶ月）で、サンプルを無菌水で再生した。
【００９６】
再生後（最終体積１２．５ｍＬ／バイアル）、医薬適用での有用性について液体組成物を分析した。物理的安定性（凝集、粒子形成など）および化学的安定性（遊離ＤＭ４種；ＤＭ４／抗体比）を分析する上記で記載のアッセイに加えて、免疫複合体としての効力も、細胞によるバイオアッセイで分析した。
【００９７】
表８に示したように、全ての関連パラメータは、２４ヶ月の期間にわたり安定である。免疫複合体の生理的効力などの全ての測定パラメータにより、好ましい製剤によって有効期限を長くできることがわかる。
【００９８】
表８：好ましい凍結乾燥製剤中の免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の長期安定性（２４ヶ月まで）。無菌水による再生後の試験結果。
【表８】
2016534062.tif 000009
【００９９】
使用した方法
タンパク質濃度の測定およびマイタンシノイド／抗体比（ＤＭ４／Ａｂ比）の測定
Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる２波長（２８０ｎｍおよび２５２ｎｍ）での吸収測定を介して、タンパク質濃度およびマイタンシノイド／抗体比（ＤＭ４／Ａｂ比）を測定した。各溶液を、独立の３サンプルについて２回測定した。
【０１００】
サンプルを製剤緩衝液で希釈して、０．６から１．２の範囲の２８０ｎｍでのＵＶ吸収を得た。ブランクとして製剤緩衝液を用いて、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでサンプルを測定した。下記に計算を示す。
【表９】
2016534062.tif 000010
【０１０１】
外観検査
外観に関して、粒子または濁度について暗色背景を用いて、ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む試験溶液を調べた。緩衝液交換またはストレス試験後の透明溶液は、二量体および／またはオリゴマー形成がわずかしか存在しないか存在しないことの徴候であり、溶液の視認される濁度は二量体およびオリゴマーの高い含有量と相関する。
【０１０２】
動的光散乱（ＤＬＳ）
動的光散乱は、レーザーによって発生する散乱光を分析する方法である。可溶化もしくは懸濁プローブによって散乱する光を用いて、流体力学半径（ｄＨ［ｎｍ］）を計算することができる。流体力学半径の増加が、免疫複合体凝集の指標である。Ｈｏｒｉｂａ  ＬＢ５５０（Ｒｅｔｓｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ＤＬＳによる流体力学半径を測定した。２５ｎｍより大きい測定ｄＨが臨界であることがわかった。１６ｎｍから２５ｎｍのｄＨ値が、良好な挙動の免疫複合体を示した。
【０１０３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
融点の測定を介して、タンパク質安定性を測定することができる。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、いくつかの溶液におけるＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の融点（Ｔｍ）を測定した。サンプルを２０℃から１０５℃まで加熱し、ＶＰ−ＤＳＣ熱量計（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて融点（Ｔｍ）を測定した。
【０１０４】
振盪ストレス試験
ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のような免疫複合体は、製造、充填または輸送時に行われる機械的撹拌に対して非常に敏感である。一定強度の運動があると、免疫複合体は凝集および変性を開始する。振盪ストレス試験中、制御された条件下の凝集および変性についてＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む液体組成物を分析した。
【０１０５】
温度制御チャンバ（ＭＭＭ、ＦｒｉｏＣｅｌｌ  ２００）において、実験室振盪器（ＩＫＡ、ＨＳ２６０）でＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４含有サンプルにストレスを加えた。２０℃および３００ｒｐｍで２４時間後に、重要な品質パラメータである凝集（外観検査およびＤＬＳによる）を測定した。
【０１０６】
サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ
モノマーおよび二量体含有量ならびに低分子量断片（ＬＭＷ）および高分子量（ＨＭＷ）含有量の測定のため、ＨＰＬＣシステムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を、蛍光検出器を用いて検出し、面積パーセント法を用いて定量した。タンパク質用の標準的なＨＰＬＣ  ＳＥＣカラム、例えばＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＴＳＫゲルＧ３０００  ＳＷＸＬ  ５μｍ、３００ｍｍ（長さ）×７．８ｍｍ（内径）を用いた。
【０１０７】
視認できない粒子ＨＩＡＣおよびＭＦＩの検出
視認できない粒子の検出およびカウンティングのために、ＨＩＡＣおよびＭＦＩ法を用いた。ＭＦＩ（微小流動画像処理）測定のため、供給者の説明書に従って、Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｏｗ  Ｉｍａｇｉｎｇ（商標名）ＤＰＡ  ４２００システム（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いた。供給者の説明書に従って、ＨＲＬＤ−１５０  １３−１５０μｍセンサーと組み合わせてＨＩＡＣ９７０３＋液体粒子カウンター（ＨＡＣＨ  Ｌａｎｇｅ）を用いて、ＨＩＡＣ測定を行った。
【０１０８】
ＨＰＬＣによる遊離マイタンシノイドの検出
ＨＰＬＣ法を用いて、遊離マイタンシノイドを測定した。Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−ＨＩＳＥＰ、５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または同等のカラムを、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、５０ｍｍ×２．１ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）または同等のカラムと組み合わせて用いた。それらのカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムとともに用いた。遊離マイタンシノイドをＨＩＳＥＰクロマトグラフィーによってタンパク質から分離し、その後逆相高速クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって定量した。カラムは３５℃で用いた。溶媒として、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡの水溶液）および移動相Ｂ（０．０８％ＴＦＡのアセトニトリル中溶液）を用いた。マイタンシノイド（ＤＭ４）および他の全ての成分の含有量を、ルチン水和物較正曲線の線形回帰分析を用いるＥｍｐｏｗｅｒ計算ルーチンによってμｇ／ｍＬで計算する。ルチン水和物およびＤＭ４の各種相関係数を補正するためには、ＤＭ４および他の全ての成分の結果に係数１．０５４９７を乗じなければならない。
【０１０９】
細胞による効力アッセイ（バイオアッセイ）
ＷＯ２０１０／１２４７９７に詳細に記載の細胞による効力アッセイを用いて、免疫複合体ＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の生理活性を調べた。すなわち、メソテリントランスフェクトＨＴ２９−細胞を９６ウェルプレートに接種し、４時間かけてのＭＦ−Ｔ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の連続希釈をしながらインキュベートを行った。免疫複合体を用いたこのインキュベーション後に、細胞を培地で注意深く洗浄し、さらに６８から９６時間インキュベートした。その後、標準法（例えば、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬、Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞増殖を定量した。標準値と比較した活性比を評価および報告する。
【国際調査報告】
2016534062.tif 000011
2016534062.tif 000012