(57)【要約】  敗血症の世界罹患率は、急速な老年人口による高齢患者における増加に関連して上昇し続けている。敗血症の診断及び／又は予後のための効果的なバイオマーカーが必要である。本発明は、診断及び／又は予測バイオマーカー、又は敗血症の検出及び／又は予測のためのバイオマーカーに関する。本発明は、敗血症コンティニュアムにおける健康状態又は状態を含む、被験者における敗血症の検出及び／又は診断のためのバイオマーカーである遺伝子の予め決められたパネルを開示する。
2016526888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において敗血症を検出する又は予測する方法であって、該方法が、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルと基準レベルとの差が、第１の試料中に存在する敗血症を示す、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、敗血症の存在が、被験者において、相応するバイオマーカーの基準レベルと比較して、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルにおける増加を検出することによって測定され、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、敗血症の存在が、被験者において、相応するバイオマーカーの基準レベルと比較して、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルにおける減少を検出することによって測定され、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記基準レベルが、敗血症でない少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記比較ステップが、被験者において敗血症の存在若しくは不在を決定又は予測するための決定則を適用することを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するための方法であって、該方法が、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルが、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記方法。
【請求項７】
前記基準レベルが、対照被験者、感染に陽性の被験者、感染を有さないＳＩＲＳに陽性の被験者、軽症敗血症に陽性の被験者、重症敗血症に陽性の被験者、及び潜在性ショックに陽性の被験者からなる群から選択される少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記比較ステップが、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを測定又は予測するための決定則を適用することを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ｉ．  被験者の第１の試料中のバイオマーカーのレベルを定量化するための少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  相応するバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料と、
を含む、前記キット。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの試薬が、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの抗体を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
さらに、第１の試料中で少なくとも１つの追加のバイオマーカーを特異的に結合できる少なくとも１つの追加の試薬と、相応する少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料と、を含む、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
請求項６から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ｉ．  被験者の第１の試料中のバイオマーカーのレベルを定量化するための少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  相応するバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料と、
を含む、前記キット。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの試薬が、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの抗体を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
さらに、第１の試料中で少なくとも１つの追加のバイオマーカーを特異的に結合できる少なくとも１つの追加の試薬と、相応する少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料と、を含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
被験者において敗血症を検出する又は予測するためのキットであって、該キットは、被験者から単離された第一の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーに選択的に結合できる抗体、及び抗体と少なくとも１つのバイオマーカーの相補体成分との間に形成された複合体の検出のための試薬を含み、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、基準試料は、相応するバイオマーカーの基準レベルを示し、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルと基準レベルとの差は、第１の試料中に存在する敗血症を示す、前記キット。
【請求項１６】
前記基準レベルが、敗血症でない少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するためのキットであって、該キットは、被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーに選択的に結合できる抗体、及び抗体と少なくとも１つのバイオマーカーの相補体成分との間に形成された複合体の検出のための試薬を含み、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、基準試料は、相応するバイオマーカーの基準レベルを示し、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記キット。
【請求項１８】
前記基準レベルが、対照被験者、感染に陽性の被験者、感染していないＳＩＲＳに陽性の被験者、軽症敗血症に陽性の被験者、重症敗血症に陽性の被験者、及び潜在性ショックに陽性の被験者からなる群から選択される少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
被験者において敗血症を検出する又は予測する方法であって、該方法は、
ｉ．  被験者から単離された第一の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つ又はそれ以上に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルと基準レベルとの差は、第１の試料中に存在する敗血症を示す、前記方法。
【請求項２０】
被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するための方法であって、該方法は、
ｉ．  被験者から単離された第一の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つ又はそれ以上に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第一の試料中で測定されたレベルは、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断バイオマーカー及び／又は予後バイオマーカー、又は敗血症の検出及び／又は予測のためのバイオマーカーに関する。
【０００２】
背景技術
背景技術に関する次の議論は、本発明の理解を容易にすることを目的とする。しかしながら、該議論は、承認ではなく、関連するあらゆる材料が、出願の優先日時点でのあらゆる権限において、発行され、公知であり、又は通常の一般知識の一部であることを認識すべきである。
【０００３】
敗血症は、細菌又は他の感染原因物質、例えばウィルス、真菌及び寄生虫によって生じる感染に対する宿主反応から生じる。この反応は、全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＳＩＲＳ）といわれる。敗血症の転帰は、侵入性病原体の毒性及び宿主反応によって決定され、臓器及び組織の間接的な損傷をもたらす過剰増殖であってもよい。典型的に、敗血症が生じる場合、宿主の身体は、炎症している血管の裏に形成される血餅を破壊することができず、臓器への血流を制限し、続いて臓器の機能不全又は壊疽を導く。
【０００４】
敗血症は、一般的に感染で始まり、続いてＳＩＲＳ、そして敗血症、重症敗血症、そして最終的に多臓器機能不全及び死を生じる敗血症性ショックによる異種の病気経過の連続である。敗血症の世界罹患率は、急速な老年人口による高齢患者における増加に関連して上昇し続けている。全ての重症敗血症患者のおよそ３分の１〜２分の１は、それらの疾患に負ける。敗血症に進行する前の感染の疑いのある患者における初期の層化及び適時の介入は、世界中の医者に対して重大な臨床の挑戦のままであり、それというのも敗血症がしばしば遅すぎる段階で診断されるからである。
【０００５】
敗血症の早期診断は、敗血症におけるＳＩＲＳの臨床サインが、生化学反応及び免疫学的反応により先行されるため、難しい。さらに、境界線の結果が診断の曖昧さをもたらすＳＩＲＳ診断基準が非常に一般的である。さらに、感染は、単に、ＳＩＲＳを導きうる多様な状態の１つであり、残りは無菌性炎症である。現在利用できる敗血症の標準的な研究サイン、例えば白血球、乳酸塩、血糖及び血小板の数は非特異的である。約３分の１の敗血症患者において、原因となる生物は、同定されることができず、さらに抗菌治療の早期開始、又はさらに悪いことに、抗菌薬に対する耐性を永続する広域スペクトル抗生物質の自由な使用を阻害する。
【０００６】
敗血症バイオマーカー、例えばサイトカイン、ケモカイン、急性期タンパク質、可溶性レセプター及び細胞表面マーカーを同定する以前の研究は、炎症の理由により感染と非感染とを確実に区別しなかった。敗血症の診断のための正確なバイオマーカーを得ることは難しく、それというのも、ＳＩＲＳの宿主反応及び感染に対する宿主反応が、多数の経路によって調節され、正確なバイオマーカーを得る試みを複雑にするからである。さらに、使用できる有用な予後バイオマーカーの数も非常に少ない。
【０００７】
従って、前記問題を克服するか又は少なくとも軽減する、強く、効率的なバイオマーカー、又は敗血症、及び敗血症コンティニュアム（ｓｅｐｓｉｓ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）の健康状態の診断及び／又は予後のためのバイオマーカーが要求される。
【０００８】
発明の概要
本発明は、
敗血症の検出及び／又は予測の現行の方法に関するいくつかの困難性を改善するために、及び敗血症の検出及び／又は予測の現行の方法を補足するために、被験者における敗血症、及び敗血症コンティニュアムの健康状態の検出及び／又は予後のための新規の方法を提供することを目的とする。本発明は、さらに、被験者における敗血症、及び敗血症コンティニュアムでの健康状態の検出及び／又は予後のためのキットを提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、敗血症について陽性反応を示した被験者において、敗血症の重症度を評価する及び／又は予測するための新規の方法を提供することも目的とする。好ましくは、前記方法は、被験者が、感染、軽症敗血症及び重症敗血症から選択される複数の状態の１つ、及び／又は敗血症コンティニュアムの健康状態から選択される複数の状態の１つを有するか、又はそれらを発症するリスクがあるかどうかを評価するための方法である。本発明は、さらに、敗血症について陽性反応を示した被験者において、敗血症の重症度を評価する及び／又は予測するためのキットを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は、存在する方法よりも著しく正確であり予測的である診断を提供する、患者の血液試料から単離された白血球における遺伝子発現プロファイリングに由来する診断バイオマーカーとして多数の遺伝子サインのアプローチに基づく。１組の遺伝子を含む診断バイオマーカーは、炎症反応、ホルモンシグナル、内皮機能不全の徴候、血液凝固、臓器損傷等の、広範な収斂性の効果に全体的に影響する。
【００１１】
本発明は、ｑＰＣＲアッセイによって確認された、広範なマイクロアレイゲノム発現プロフィールに由来する１組の遺伝子に関する。驚くべきことに、マイクロアレイゲノム発現プロファイリングの階層的な集積性は、敗血症コンティニュアムの異なる健康状態、すなわち、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は感染を有さないＳＩＲＳとして公知のもの、敗血症、重症敗血症、潜在性ショック及び敗血性ショックの患者の中で白血球の遺伝子発現パターンにおいて証明された著しい差異をもたらす。敗血症中に差次的に発現された遺伝子は、マイクロアレイ遺伝子プロファイリングに由来し、遺伝子パネルは、初めの３３０００から選抜される。さらに驚くべきことに、ｑＰＣＲを使用した分析確認は、遺伝子又はバイオマーカーのこのパネルを、マイクロアッセイ結果に関連して、敗血症コンティニュアムにかかった被験者において、上方制御又は下方制御のように、次第に調節不全にすることを示す。白血球中の遺伝子発現の変化が明らかに観察され、敗血症及び敗血症コンティニュアムの健康状態の診断及び／又は予後のために利用されうる。
【００１２】
前記に加え、驚くべきことに、任意の数の遺伝子又はバイオマーカーの予め決められたパネルを、あらゆる組合せで、敗血症及び敗血症コンティニュアムの健康状態の診断及び／又は予後のために使用できる。
【００１３】
本発明の第１の態様に従って、被験者において敗血症を検出する又は予測する方法であって、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを、相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルと基準レベルとの差は、第１の試料中に存在する敗血症を示す、前記方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、敗血症の存在は、被験者において、相応するバイオマーカーの基準レベルと比較して、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルにおける増加を検出することによって測定され、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、敗血症の存在は、被験者において、相応するバイオマーカーの基準レベルと比較して、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルにおける減少を検出することによって測定され、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択される。
【００１６】
好ましくは、基準レベルは、敗血症でない少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである。
【００１７】
好ましくは、比較ステップは、被験者において敗血症の存在又は不在を決定又は予測するための決定則を適用することを含む。
【００１８】
本発明の第２の態様に従って、被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するための方法であって、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルは、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記方法が提供される。
【００１９】
好ましくは、基準レベルは、対照被験者、感染に陽性の被験者、感染していないＳＩＲＳに陽性の被験者、軽症敗血症に陽性の被験者、重症敗血症に陽性の被験者、及び潜在性ショックに陽性の被験者からなる群から選択される少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである。
【００２０】
好ましくは、比較ステップは、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを測定又は予測するための決定則を提供することを含む。
【００２１】
本発明の第３の態様に従って、第１の態様の方法を実施するためのキットであって、
ｉ．  被験者の第１の試料中のバイオマーカーのレベルを定量化するための少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  相応するバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）
を含む、前記キットが提供される。
【００２２】
好ましくは、少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの抗体を含む。
【００２３】
好ましくは、キットは、さらに、第１の試料中で少なくとも１つの追加のバイオマーカーを特異的に結合できる少なくとも１つの追加の試薬と、相応する少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料を含む。
【００２４】
本発明の第４の態様に従って、第２の態様の方法を実施するためのキットであって、
ｉ．  被験者の第１の試料中のバイオマーカーのレベルを定量化するための少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの試薬と、
ｉｉ．  相応するバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料
を含む、前記キットが提供される。
【００２５】
好ましくは、少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの抗体を含む。
【００２６】
好ましくは、キットは、さらに、第１の試料中で少なくとも１つの追加のバイオマーカーを特異的に結合できる少なくとも１つの追加の試薬と、相応する少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルを示す基準試料を含む。
【００２７】
本発明の第５の態様に従って、被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーに選択的に結合できる抗体、及び抗体と少なくとも１つのバイオマーカーの相補体成分との間に形成された複合体の検出のための試薬を含む、被験者において敗血症を検出する又は予測するためのキットであって、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、基準試料は、相応するバイオマーカーの基準レベルを示し、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルと基準レベルとの差は、第１の試料中に存在する敗血症を示す、前記キットが提供される。
【００２８】
好ましくは、基準レベルは、敗血症を有さない少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである。
【００２９】
本発明の第６の態様に従って、被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するための、被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーに選択的に結合できる抗体、及び抗体と少なくとも１つのバイオマーカーの相補体成分との間に形成された複合体の検出のための試薬を含むキットであって、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、基準試料が、相応するバイオマーカーの基準レベルを示し、第１の試料中で測定した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記キットが提供される。
【００３０】
好ましくは、基準レベルは、対照被験者、感染に陽性の被験者、感染していないＳＩＲＳに陽性の被験者、軽症敗血症に陽性の被験者、重症敗血症に陽性の被験者、及び潜在性ショックに陽性の被験者からなる群から選択される少なくとも１人の被験者から単離された第２の試料中の相応するバイオマーカーのレベルである。
【００３１】
本発明の第７の態様に従って、被験者において敗血症を検出する又は予測する方法であって、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つ又はそれ以上に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルと基準レベルとの差が、第１の試料中に存在する敗血症を示す、前記方法が提供される。
【００３２】
本発明の第８の態様に従って、被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するための方法であって、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つ又はそれ以上、及びそれらのあらゆる組合せに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つ又はそれ以上に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルが、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記方法が提供される。
【００３３】
本発明の他の態様に従って、被験者における敗血症の診断のための遺伝子の予め決定されたパネルから選択された少なくとも１つの遺伝子が提供される。
【００３４】
本発明の他の態様は、被験者における敗血症の予後のための遺伝子の予め決定されたパネルから選択された少なくとも１つの遺伝子を提供する。
【００３５】
本発明の他の態様は、被験者における敗血症の検出又は予測のための方法を提供する。前記方法は、一般的に、被験者から得られた適した液体試料中で遺伝子の予め決められたパネルから選択された少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルを測定すること、及び測定されたレベルと少なくとも１人の対照被験者において相応する敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルとを比較することを含み、その際、対照被験者は、通常の被験者であり、少なくとも１つの敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルと、相応する敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルとの差は、被験者において存在する敗血症を示す。
【００３６】
本発明の他の態様は、被験者が、感染、軽症敗血症及び重症敗血症から選択された複数の状態の１つを有するかどうかを評価するための方法を提供する。前記方法は、一般的に、被験者から得られた適した液体試料中で遺伝子の予め決められたパネルから選択された少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルを測定するステップ、及び測定されたレベルと複数の対照被験者において相応する敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルとを比較するステップを含み、その際、対照被験者は、少なくとも１人の感染に陽性の被験者、少なくとも１人の軽症敗血症に陽性の被験者、及び少なくとも１人の重症敗血症に陽性の被験者であり、少なくとも１つの発現生成物のレベルは、対照被験者のいずれか１の相応する敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物のレベルに統計的に実質的に類似する場合に、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す。
【００３７】
本発明の他の態様は、被験者から得られた適した液体試料中で遺伝子の予め決められたパネルから選択された少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物に選択的に結合できる抗体、及び抗体と少なくとも１つの発現生成物の相補体成分との間に形成された複合体の検出のための試薬を含む、被験者における敗血症の検出及び／又は予後のためのキットを提供する。
【００３８】
本発明の他の態様は、被験者から得られた適した液体試料中で遺伝子の予め決められたパネルから選択された少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの敗血症コンティニュアムマーカー発現生成物に選択的に結合できる抗体、及び抗体と少なくとも１つの発現生成物の相補体成分との間に形成された複合体の検出のための試薬を含む、被験者における敗血症の重症度の評価及び／又は予測のためのキットを提供する。
【００３９】
好ましくは、前記キットは、被験者が、感染、軽症敗血症及び重症敗血症から選択される複数の状態の１つを有するか、又はそれらを発症するリスクがあるかどうかを評価するためのキットである。
【００４０】
好ましくは、少なくとも１つの遺伝子は、以下からなる遺伝子の予め決められたパネルから選択される：ホモサピエンスアシル−ＣｏＡシンテターゼ長鎖ファミリーナンバー１（ＡＣＳＬ１）遺伝子、ホモサピエンスアネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）遺伝子、ホモサピエンスシステインリッチ膜内外モジュール含有１（ＣＹＳＴＭ１）遺伝子、ホモサピエンス染色体１９オープンリーディングフレーム５９（Ｃ１９ｏｒｆ５９）遺伝子、ホモサピエンスコロニー刺激因子２レセプターベータ低親和性（顆粒球マクロファージ）（ＣＳＦ２ＲＢ）遺伝子、ホモサピエンスＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド６０様（ＤＤＸ６０Ｌ）遺伝子、ホモサピエンスＩｇＧのＦｃフラグメントの高親和性ｌｂのレセプター（ＣＤ６４）（ＦＣＧＲ１Ｂ）遺伝子、ホモサピエンス遊離脂肪酸レセプター２（ＦＦＡＲ２）遺伝子、ホモサピエンスホルミルペプチドレセプター２（ＦＰＲ２）遺伝子、ホモサピエンスヒートショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）遺伝子、ホモサピエンスインターフェロン誘発膜内外タンパク質１（ＩＦＩＴＭ１）遺伝子、ホモサピエンスインターフェロン誘発膜内外タンパク質３（ＩＦＩＴＭ３）遺伝子、ホモサピエンスインターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）遺伝子、ホモサピエンスインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ１ＲＮ）遺伝子、ホモサピエンス白血球イムノグロブリン様レセプターサブファミリーＡ（ＴＭドメインを有する）メンバー５（ＬＩＬＲＡ５）遺伝子、ホモサピエンスロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）遺伝子、ホモサピエンス骨髄性細胞白血病配列１（ＢＣＬ２−関連）（ＭＣＬ１）遺伝子、ホモサピエンスＮＬＲファミリーアポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）遺伝子、ホモサピエンス核因子インターロイキン３調節（ＮＦＩＬ３）遺伝子、ホモサピエンス５’−ヌクレオチダーゼサイトゾルＩＩＩ（ＮＴ５Ｃ３）遺伝子、ホモサピエンス６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）遺伝子、ホモサピエンスリン脂質スクランブラーゼ１（ＰＬＳＣＲ１）遺伝子、ホモサピエンスプロキネチシン２（ＰＲＯＫ２）遺伝子、ホモサピエンスＲＡＢ２４メンバーＲＡＳガン遺伝子ファミリー（ＲＡＢ２４）遺伝子、ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）遺伝子、ホモサピエンスセレクチンＬ（ＳＥＬＬ）遺伝子、ホモサピエンス溶質キャリヤーファミリー２２（有機カチオン／エルゴチオネイン輸送体）メンバー４（ＳＬＣ２２Ａ４）遺伝子、ホモサピエンススーパーオキシドジスムターゼ２ミトコンドリア（ＳＯＤ２）遺伝子、ホモサピエンスＳＰ１００核抗原（ＳＰ１００）遺伝子、ホモサピエンストール様レセプター４（ＴＬＲ４）遺伝子、ホモサピエンスケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）遺伝子、ホモサピエンスケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター７（ＣＣＲ７）遺伝子、ホモサピエンスＣＤ３ｄ分子デルタ（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）（ＣＤ３Ｄ）遺伝子、ホモサピエンスＣＤ６分子（ＣＤ６）遺伝子、ホモサピエンスＦａｓアポトーシス阻害分子３（ＦＡＩＭ３）遺伝子、ホモサピエンスＩｇＥのＦｃフラグメントの高親和性Ｉレセプターアルファポリペプチド（ＦＣＥＲ１Ａ）遺伝子、ホモサピエンスグランザイムＫ（グランザイム３；トリプターゼＩＩ）（ＧＺＭＫ）遺伝子、ホモサピエンスインターロイキン７レセプター（ＩＬ７Ｒ）遺伝子、ホモサピエンスキラー細胞レクチン様レセプターサブファミリーＢメンバー１（ＫＬＲＢ１）遺伝子、ホモサピエンス不完全Ｔ細胞分化タンパク質（ＭＡＬ）遺伝子。
【００４１】
有利には、遺伝子の予め決められたパネルから選択される少なくとも１つの遺伝子は、敗血症を有する被験者で上方制御又は下方制御される。
【００４２】
有利には、遺伝子の予め決められたパネルから選択される少なくとも１つの遺伝子は、対照及び感染を有さないＳＩＲＳから、ＳＩＲＳを有さない感染に、軽症敗血症に、重症敗血症に、進行的に上方制御又は下方制御される。
【００４３】
有利には、任意の数の遺伝子の予め決められたパネルを、あらゆる組合せで、敗血症の診断及び／又は予後のために選択又は使用してもよい。
【００４４】
有利には、任意の数の遺伝子の予め決められたパネルを、あらゆる組合せで、敗血症について陽性反応を示した被験者における敗血症の重症度の評価及び／又は予測のために選択又は使用してもよい。
【００４５】
好ましくは、少なくとも１つの敗血症コンティニュアムマーカー転写は、
（ａ）リスト１に列挙される配列のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）相応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、リスト１に列挙される配列のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される。
【００４６】
有利には、本発明を、敗血症でない患者と敗血症である患者とを識別するために使用できる。本発明を、敗血症である患者と重症敗血症である患者とを識別するためにも使用できる。
【００４７】
有利には、本発明は、敗血症の早期の検出及び診断のため、並びにかかる患者についての治療及び転帰の改良のための患者のモニタリングのためにも使用できる。
【００４８】
有利には、本発明は、敗血症の治療のための候補として、被験者又は患者を識別及び／又は分類するために使用できる。
【００４９】
本発明の他の態様及び特徴は、付属の図と共に、次の本発明の特定の実施形態の記載から当業者に明らかとなる。
【００５０】
例示のみによって、本発明の実施形態を説明する図は、以下である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ｑＰＣＲによる対照に対する感染（ＳＩＲＳを有さない）試料、軽症敗血症試料及び重症敗血症試料の相対平均倍率変化（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｖｅｒａｇｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示す図。（Ａ）３０の上方制御遺伝子、及び（Ｂ）１０の下方制御遺伝子。
【図２】４つの異なる遺伝子分類法から同定されたオーバーラップ遺伝子を示す図。
【図３】敗血症コンティニュアムにおいて上方制御又は下方制御された発現レベルを有する遺伝子の無監視の階層クラスタリングヒートマップを示す図。
【図４】敗血症／敗血症でない患者の分類を可能にする６モデル（Ａ〜Ｆ）に基づく箱型図を示す図。それぞれ水平な線によって示される敗血症／敗血症でないことの予め決められたカットオフは、達成可能な最も高い合計の正確性のための決定則に基づく。それぞれのモデルについて、１００の試料に基づくトレーニングセットを製造し（左）、６１の試料のブラインド試験（ｂｌｉｎｄｅｄ ｔｅｓｔ）を使用して（右）、モデルを確認した。モデルは、以下である：・（Ａ）標準化ハウスキーピング遺伝子として４０遺伝子及びＨＰＲＴ１を使用、・（Ｂ）標準化ハウスキーピング遺伝子として８遺伝子及びＨＰＲＴ１を使用、・（Ｃ）標準化ハウスキーピング遺伝子として４０遺伝子及びＧＡＰＤＨを使用、・（Ｄ）標準化ハウスキーピング遺伝子として８遺伝子及びＧＡＰＤＨを使用、・（Ｅ）標準化ハウスキーピング遺伝子として４０遺伝子並びにＨＰＲＴ１及びＧＡＰＤＨの双方を使用、・（Ｆ）標準化ハウスキーピング遺伝子として１１遺伝子並びにＨＰＲＴ１及びＧＡＰＤＨの双方を使用。
【図５】３７遺伝子（Ａ）又は１４遺伝子（Ｂ）に基づく８５の敗血症患者の箱形図を示す図。軽症敗血症から重症敗血症の分離を可能にする２つのモデルを使用して重さスコアリングシステムを実施した。
【図６】敗血症の重症度とタンパク質濃度との相関を示す、対照、感染、軽症敗血症及び重症敗血症／敗血性ショックからなる群から選択される患者における平均血漿タンパク質濃度（Ｓ１００Ａ１２）を示す図。
【００５２】
実施形態の詳細な説明
本発明は、現存する方法よりも著しく正確で早期の診断を提供する、被験者の血液試料から単離された白血球中での遺伝子発現プロファイリングに由来する診断バイオマーカーとしての多数の遺伝子サインアプローチを使用する。有利には、遺伝子発現プロファイリングは、機能遺伝子生成物、例えば炎症誘発タンパク質の合成前に遺伝子の上方制御又は下方制御が生じる故の敗血症の遅れた診断の問題を克服するか、又は少なくとも緩和する。有利には、本発明は、敗血症に罹った個人を確実に正確に分類することができ、又は症候群の進行に対する予後の手がかりを提供し、それによって、より効果的な治療介入を可能にする。
【００５３】
コホート研究法を実施した。敗血症である患者の救急分野の研究に関連するコホート研究法の目的は、（ｉ）敗血症である及び敗血症でない患者の白血球中で差次的に発現させた遺伝子発現パネルを提供及び確認して、敗血症の早期診断を高めること、及び（ｉｉ）遺伝子発現パネルの予後値を調査し、その開始時点で敗血症の重症度を予測することによって敗血症における治療を導くことを含む。
【００５４】
有利には、被験者において敗血症を検出する又は予測する方法が提供され、該方法は、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルと基準レベルとの差は、第１の試料中に存在する敗血症を示す。
【００５５】
有利には、被験者が、対照、感染、感染していない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、軽症敗血症、重症敗血症、敗血性ショック及び潜在性ショックからなる群から選択される複数の状態の１つを有するかどうかを検出又は予測するための方法であって、
ｉ．  被験者から単離された第１の試料中で少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、及び
ｉｉ．  測定したレベルを相応するバイオマーカーの基準レベルと比較すること
を含み、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれらのフラグメント、相同体、変異体若しくは誘導体を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）前記配列（ａ）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列であって、相応するアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、又はそれらの相補体の配列のいずれか１つに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
からなる群から選択され、ここで、第１の試料中で測定されたレベルは、基準レベルと統計的に実質的に類似し、被験者が前記状態の１つを有するかどうかを示す、前記方法が提供される。
【００５６】
本明細書において使用されるように、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、特に本明細書において明らかに示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００５７】
“又は”、“／”の使用は、特に明記されない限り“及び／又は”を意味する。さらに、“含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”及び“有している（ｈａｖｉｎｇ）”の用語、並びにそれらの用語の他の形、例えば“含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）”、“含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）”、“有する（ｈａｓ）”及び“有する（ｈａｖｅ）”の使用は制限されない。
【００５８】
本明細書において使用されるように、複数の指示対象を含む、“試料（ｓａｍｐｌｅ）”、“試験試料（ｔｅｓｔ ｓａｍｐｌｅ）”、“試験体（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）”、 “被験者からの使用した試料（ｓａｍｐｌｅ ｕｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｕｂｊｅｃｔ）”及び“患者試料（ｐａｔｉｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ）”は、互換的に使用してよく、血液、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、癒合細胞又は癒合組織、上皮細胞、白血球、又は単球の試料であってもよい。患者又は被験者から得られる試料を直接使用してよく、又は例えば濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活化、試薬の添加等によって前処理して、本明細書において議論されるか又はそうでなければ当業者に公知であるいくつかの方法で試料の特徴を改質してもよい。
【００５９】
任意の細胞タイプ、組織、又は体液を利用して、試料を得てもよい。かかる細胞タイプ、組織、又は体液は、組織の一部、例えば生検及び剖検試料、組織学的目的のために取られた凍結部分、血液（例えば全血）、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、唾液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、髪、皮膚、赤血球、血小板、間質液、接眼レンズ液、脳脊髄液、汗、鼻汁、関節液、月経分泌物、羊水、精液等を含んでよい。細胞タイプ及び組織は、リンパ液、腹水、婦人科学的液体、腹腔液、脳脊髄液、膣洗浄により採取した液体、又は膣の洗い流しにより採取した液体も含んでよい。組織又は細胞タイプは、動物から細胞の試料を取り出すことにより提供されてもよいが、しかし予め単離された細胞（例えば、他人によって単離された細胞、別時に単離された細胞、及び／又は他の目的のために単離された細胞）を使用することによっても達せされる。保存組織、例えば処理又は転帰の履歴を有する組織も使用してもよい。タンパク質又はヌクレオチドの単離及び／又は精製は必須であっても必須でなくてもよい。
【００６０】
最適に（適したヌクレオチド挿入又はヌクレオチド消失と共に）他の核酸（又はその相補的ストランド）と並べられる場合に、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常少なくとも約７０％、より通常少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及びより好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド塩基中でヌクレオチド配列同一性があるならば、核酸又はそれらのフラグメントは、他と“実質的に相同”（“又は実質的に類似”）である。
【００６１】
代わりに、実質的な相同性又は（同一性）は、核酸又はそれらのフラグメントが、選択的ハイブリダイゼーションの条件下での他の核酸（又はそれらの相補的ストランド）に、ストランドに、又はその相補体にハイブリダイズする場合に存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の完全な欠如よりも実質的に選択的であるハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。典型的に、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドの伸張に対して少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、及び最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性がある場合に生じる。前記のように相同性の比較の長さは、より長い伸張にわたってよく、ある実施形態においては、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的に少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的に少なくとも約３２ヌクレオチド、及び好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの伸張にわたってもよい。
【００６２】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、リスト１に示される配列又は本明細書に列挙している配列に対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。ヌクレオチド相同性の比較を、ポリペプチドについて以下で記載したように実施してもよい。好ましい配列の比較プログラムは、以下で記載したＧＣＧウィスコンシンベストフィットプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、それぞれ同一のヌクレオチドについて１０及びそれぞれミスマッチについて−９のマッチ数を有する。それぞれのヌクレオチドについて、デフォルトギャップ生成ペナルティは−５０であり、デフォルトギャップ伸張ペナルティは−３である。
【００６３】
本発明の記載内容において、相同体又は相同体配列は、配列表に又は以下のリスト１に示されるヌクレオチド配列を有する少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００又は１０００ヌクレオチドにわたってアミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５又は９８％の同一性であるヌクレオチド配列を含む。特に、典型的に、相同体は、必須でない隣接する配列よりも、タンパク質の機能について必須であることが公知の連続アミノ酸配列をコードする配列の領域に関して考慮されるべきである。本発明の好ましいポリペプチドは、配列中で示されるヌクレオチド配列の１つ以上に対して、５０、６０又は７０％よりも多い相同性、より好ましくは８０、９０、９５又は９７％より多い相同性を有する連続配列を含む。好ましいポリヌクレオチドは、代わりに又はさらに、相応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表に又は以下のリスト１に示される配列に対して、８０、９０、９５又は９７％より多い相同性を有する連続配列を含む。
【００６４】
他の好ましいポリヌクレオチドは、相応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする示される配列に対して４０、５０、６０又は７０％より多い相同性、より好ましくは８０、９０、９５又は９７％より多い相同性を有する連続配列を含む。
【００６５】
ヌクレオチド配列は、好ましくは、長さで少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは長さで少なくとも２０、３０、４０、５０、１００又は２００ヌクレオチドである。
【００６６】
一般的に、ポリヌクレオチドの長さが短くなると、選択的ハイブリダイゼーションを得るために要求される相同性は大きくなる。結果として、本発明のポリヌクレオチドが、約３０ヌクレオチド未満からなる場合に、同一性（％）は、本明細書における配列表に又は以下のリスト１に示されるヌクレオチド配列と比較して７５％より多い、好ましくは９０％又は９５％より多いことが好ましい。逆に、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本明細書における配列表に又はリスト１に示される配列と比較して５０又は１００ヌクレオチドより多くからなる場合には、例えば５０％より多く、好ましくは６０又は７５％より多くてもよい。
【００６７】
本発明の“ポリヌクレオチド”組成物は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、及び混合ポリマー、センス及びアンチセンスストランドの双方を含み、化学的又は生化学的に改質されてよく、又は非天然又は誘導されたヌクレオチド塩基を含んでよく、当業者によって容易に評価される。かかる改質は、例えば、ラベル付け、メチル化、類似体での１つ以上の天然に生じるヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改質、例えば無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント成分（例えばポリペプチド）、インターカレータ（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレーター、アルキレーター、及び改質結合（例えばアルファアノマー核酸等）を含む。水素結合及び他の化学相互作用を介して、設計された配列に結合するそれらの能力における擬似ポリヌクレオチドである合成分子も含まれる。かかる分子は、当業界において公知であり、例えば、ペプチド結合を分子の骨格中でホスフェート結合に置換する分子を含む。
【００６８】
“ポリペプチド”の用語は、アミノ酸及びその等価物のポリマーを指し、特定の長さの生成物を指さない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの改質、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等も指さず、又はそれらを除く。定義の範囲内に含まれるのは、例えば、アミノ酸（例えば天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含むポリペプチド、置換した結合を有するポリペプチド、並びに天然に及び非天然に生じる当業界において公知の他の改質物である。
【００６９】
本発明の記載内容において、相同配列は、相応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、配列表に又は以下のリスト１に示される配列を有する少なくとも２０、５０、１００、２００、３００又は４００個のアミノ酸に対して、アミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５又は９８％の同一性であるアミノ酸配列を含む。特に、相同体は、典型的に、必須でない隣接する配列よりも、タンパク質の機能について必須であることが公知の配列の領域に関して考慮されるべきである。本発明の好ましいポリペプチドは、相応するアミノ酸の１つ以上に対して、５０、６０又は７０％より多い相同性、より好ましくは８０又は９０％より多い相同性を有する連続配列を含む。
【００７０】
他の好ましいポリペプチドは、相応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表に又は以下のリスト１に示される配列の４０、５０、６０又は７０％より多い相同性を有する連続配列を含む。相同性が類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の用語で考慮されてもよいが、本発明の記載内容において、配列同一性の用語で相同性を表すことが好ましい。“実質的な相同性”又は“実質的な同一性”の用語は、ポリペプチドを指す場合に、該当のポリペプチド又はタンパク質が、全体の天然に生じるタンパク質又はそれらの一部と少なくとも約７０％の同一性、通常少なくとも約８０％の同一性、及び好ましくは少なくとも約９０又は９５％の同一性を有することを示す。
【００７１】
相同性の比較は、目によって、又はより通常は、容易に入手できる配列比較プログラムで実施されうる。これらの市販されているコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性（％）を計算できる。
【００７２】
相同性のパーセンテージ（％）は、連続配列について計算されてもよく、すなわち１つの配列は、他の配列、及び他の配列において相応するアミノ酸と直接比較される配列におけるそれぞれのアミノ酸で、１度に１つの残基が配置される。これは、“アンギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）”アライメントという。典型的に、かかるアンギャップアライメントは、比較的短い数の残基（例えば５０未満の連続アミノ酸）にわたってのみ実施される。
【００７３】
これは非常に単純で矛盾のない方法であるが、例えば、他の同一対の配列において、挿入又は消失は、アライメントに誤差を生させる続くアミノ酸残基を生じ、従って、グローバルアライメントを実施する場合に、潜在的に、相同性（％）における大きな減少をもたらす。従って、ほとんどの配列比較法は、過度に全体の相同性スコアにペナルティを与えずに、可能な挿入及び消失を考慮した最適なアライメントを製造するために設計される。これは、局所的な相同性を最大化するために配列アライメント中に“ギャップ”を挿入することによって得られる。
【００７４】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アライメントで生じるそれぞれのギャップに“ギャップペナルティ”を割り当て、その結果、同数の同一アミノ酸について、できるだけ少ないギャップを有する配列アライメント（２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する）は、多くのギャップを有する配列アライメントよりも高いスコアを得る。ギャップ及びそれぞれ続くギャップ中の残基についてより小さいペナルティの存在のための比較的高いコストがかかる“アフィンギャップコスト（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）”を、典型的に使用する。これは、最も慣用的にギャップスコアリングシステムを使用する。高いギャップペナルティは、もちろん、より少ないギャップを有する最適化されたアライメントを生じる。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティを改良することを可能にする。しかしながら、配列比較のためにかかるソフトウェアを使用する場合には、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（以下を参照）を使用する場合に、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティは、ギャップについて−１２及びそれぞれの伸張について−４である。
【００７５】
従って、最大の相同性（％）の計算は、最初に、ギャップペナルティを考慮して、最適なアライメントの製造を要求する。かかるアライメントを実施するための適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ．； Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例は、制限されることなく、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ ｉｂｉｄ − Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳセットを含む。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの双方は、オフライン及びオンラインサーチ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ ｉｂｉｄ、７−５８〜７−６０頁を参照）で入手できる。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
【００７６】
最終の相同性（％）は同一性に関して測定されるが、アライメントプロセス自体は、典型的に、全か無かの対比較に基づかない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいたそれぞれの対での比較にスコアを当てるスケール類似性スコアマトリックス（ａ ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が一般的に使用される。慣用的に使用されるかかるマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（プログラムのＢＬＡＳＴセットについてのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、一般的に、パブリックデフォルト値（ｐｕｂｌｉｃ ｄｅｆａｕｌｔ ｖａｌｕｅ）又は提供される場合にカスタムシンボル比較表（ｃｕｓｔｏｍ ｓｙｍｂｏｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔａｂｌｅ）（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照）を使用する。ＧＣＧパッケージについて、パブリックデフォルト値を使用することが好ましく、又は他のソフトウェアの場合に、デフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。
【００７７】
ソフトウェアが最適なアライメントを生じる場合に、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を計算することができる。ソフトウェアは、典型的に、配列比較の一部としてこれを行い、数で表した結果を生じる。
【００７８】
ポリペプチドの“フラグメント”、“一部”又は“セグメント”は、少なくとも約５〜７個の連続アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９個の連続アミノ酸、典型的に少なくとも約９〜１３個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０個又はそれ以上の連続アミノ酸のアミノ酸残基の伸張である。
【００７９】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列表に又は以下のリスト１に示される配列に実質的に類似した機能を有する。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列表に又は以下のリスト１に示される配列に実質的に類似した機能を有するポリペプチドをコードする。“実質的に類似した機能”は、配列表に又は以下のリスト１に示される配列、又は相応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列表に又は以下のリスト１に示される配列に関連する、配列表に又は以下のリスト１に示される配列の核酸又はポリペプチド相同体、変異体、誘導体、又はフラグメントを指す。
【００８０】
核酸のハイブリダイゼーションは、基礎組成物、相補的ストランドの長さ及びハイブリダイズした核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチ数に加えて、例えば塩濃度、温度又は有機溶媒のような条件によって影響され、当業者に容易に認識される。厳しい温度条件は、一般的に、３０℃を超える、典型的に３７℃を超える、及び好ましくは４５℃を超える温度を含む。厳しい塩条件は、通常、１０００ｍＭ未満、典型的に５００ｍＭ未満、及び好ましくは２００ｍＭ未満である。しかしながら、パラメータの組合せが、任意の単独のパラメータの測定値よりも非常に重要である。厳しいハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））である。
【００８１】
本明細書において使用される複数の指示対象を含む“被験者”、“患者”及び“個人”は、互換的に使用されてよく、制限されることなく哺乳動物を含む任意の脊椎動物を指す。ある実施形態において、被験者はヒトであっても又はヒトでなくてもよい。被験者又は患者は、他の形の治療を受けていても受けていなくてもよい。
【００８２】
本明細書において使用される“対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）”又は“複数の対照（ｃｏｎｔｒｏｌｓ）”は、あらゆる感染原因に関連しない（慢性炎症状態、自己免疫疾患又は免疫学的障害、例えば、喘息、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型真性糖尿病等に基づかない）あらゆる状態を指す。
【００８３】
本明細書において使用される“感染を有さない全身性炎症反応症候群（以後“ＳＩＲＳ”という）”又は“感染していないＳＩＲＳ”は、４つのＳＩＲＳ基準（以下の第２表を参照）の少なくとも２つを満たし、感染の臨床的／放射線学的な証拠がない。
【００８４】
本明細書において使用される“ＳＩＲＳを有さない感染”及び“感染”は、互換的に使用されてよく、以下の第２表における４つのＳＩＲＳ基準の少なくとも２つを満たさない。感染の臨床的／放射線学的な疑い又は確認もある。かかる状態を有する患者は、上気道感染／胸感染／肺炎（湿性咳、鼻水、咽頭痛、胸部Ｘ線に対する浸透物を含む）、尿路感染（混濁尿、排尿障害、尿検査で陽性の亜硝酸試験を含む）、胃腸炎（下痢、嘔吐、腹部痙攣を含む）、蜂巣炎／膿瘍（皮膚の赤み、膨張、痛み、紅斑を含む）の症状及びサインが存在してもよい。
【００８５】
本明細書において使用される“軽症敗血症”は、以下の第２表における４つのＳＩＲＳ基準の少なくとも２つを満たし、感染の臨床的／放射線学的な疑い又は確認がある。前記用語は、感染を有するＳＩＲＳともいう。
【００８６】
本明細書において使用される“重症敗血症”は、２ｍｍｏＬ／Ｌより多い血清中乳酸塩又は１より多い臓器障害の証拠を有する敗血症を指す（以下の第３表を参照）。
【００８７】
本明細書において使用される“潜在性ショック”は、低血圧症を有さない４ｍｍｏＬ／Ｌより多い血清中乳酸塩を有する敗血症を指す。
【００８８】
本明細書において使用される“敗血性ショック”は、１リットルの静脈内結晶の注入にかかわらず低血圧症を有する敗血症を指す。
【００８９】
本明細書において使用される敗血症コンティニュアムの“健康状態（ｓｔａｔｅ）”又は“状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）”は、対照、感染（ＳＩＲＳを有さない）、感染を有さないＳＩＲＳ、軽症敗血症、重症敗血症、潜在性ショック及び敗血性ショックを指す。本明細書において使用される“敗血症”は、軽症敗血症、重症敗血症、潜在性ショック及び敗血性ショックを含む健康状態又は状態の１つ以上を指す。例えば、被験者が敗血症を有する、又は敗血症を有すると予測されると言われる場合に、被験者は、軽症敗血症、又は重症敗血症、又は潜在性ショック、又は敗血性ショックに罹っていてもよい。本明細書において使用される“非敗血症（ｎｏｎ−ｓｅｐｓｉｓ）”又は“敗血症でない（ｎｏ ｓｅｐｓｉｓ）”は、対照、感染及び感染を有さないＳＩＲＳを含む健康状態又は状態の１つ以上を指す。例えば、被験者が敗血症でないと言われる場合に、被験者は、対照であるか、又は感染であるか、又は感染を有さないＳＩＲＳであってよい。
【００９０】
本明細書において使用される複数の指示対象を含む“予め決められたカットオフ”又は“カットオフ”は、予め決められたカットオフ／カットオフに対するアッセイ結果と比較することによって診断、予後、又は治療の効果の結果を評価するために使用されるアッセイカットオフ値を指し、ここで、予め決められたカットオフ／カットオフは、既に、種々の臨床パラメータ（例えば、病気／状態の存在、病気／状態のステージ、病気／状態の重症度、病気／状態の進行、非進行、又は改善等）に関連づけられるか関連している。本開示内容は、例示的に予め決められたカットオフ／カットオフを提供する。しかしながら、カットオフ値は、アッセイの性質（例えば、使用される抗体、反応条件、試料純度等）に非常に依存してもよいことが認識されている。さらに、本明細書における開示内容は、他のアッセイ、例えば免疫アッセイが、本開示内容によって提供される記載内容に基づくそれらの他のアッセイについての免疫アッセイに特異的なカットオフ値を得るために適していてもよいことが認識されている。予め決められたカットオフ／カットオフの正確な値がアッセイ間で変動する一方で、本明細書において記載された相関は、一般的に適用できる。
【００９１】
本明細書において定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的及び技術的な用語は、通常の当業者によって慣用的に理解される意味を有する。例えば、本明細書において記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、バイオテクノロジー、統計化学、タンパク質化学、核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用した、及びそれらの技術を使用したあらゆる名称は、周知であり、当業者に慣用的に使用される。前記用語の意味及び範囲は明確であるべきであり、しかしながらあらゆる潜在的なアンビギュイティの場合には、本明細書において提供される定義は、あらゆる辞書又は外部の定義に対する前例を取る。さらに、本記載内容によって要求されない限り、単数形は、複数形を含み、複数形は単数形を含む。
【００９２】
１．  材料及び方法
１．１．  患者コホート
シンガポールの国立大学病院（“ＮＵＨ”）、救急部門（“ＥＤ”）において、全体の敗血症コンティニュアムに加えて患者のコホート研究を実施した。入院した患者を、入院患者単位で追跡した。健康管理、及び感染の証拠がないＳＩＲＳを有するものを、早期診断のためのバイオマーカーの区別を証明するために採用した。
【００９３】
募集のための包含基準を満たすために同定された被験者に、この研究に参加するように持ちかけた。インフォームドコンセントを被験者から得た後に、血液１２ｍＬをＥＤＴＡ管中に抜き取り、そしてＡｃｕｍｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（“ＡＲＬ”）に氷上で輸送した。試料を、ＲＮＡ単離のために血液採取後３０分以内に処理した。直接ＥＤから退院した患者を、３０分以内にそれらの疾患のあらゆる臨床的再発について追跡し、抽出したバイオマーカーの試料の診断の正確性を確実にした。研究中に記録した全ての患者を、最終調査のために３０日後に追跡し、募集時点での診断の正確性を確実にした。
【００９４】
以下の第１表は、コホート研究のための被験者の募集のための包含基準を示す。
【表１】
2016526888.tif 000003
【００９５】
コホート研究のための被験者の募集のための排除基準は、以下を含む：２１歳未満、妊娠が分かっているもの、囚人、救急蘇生状態を試みない、緊急手術の要求、有効な化学療法、血液系腫瘍、内科医の治療が積極的なケアを不適切であると考えるもの、インフォームドコンセントを得ることができないもの、又は研究要求に従うことができないもの。
【００９６】
ＳＩＲＳのための４つの基準を以下の第２表において示す。
【表２】
2016526888.tif 000004
【００９７】
臓器障害の指示を以下の第３表において示す。
【表３】
2016526888.tif 000005
【００９８】
１．２  患者からの血液試料の採取
合計１２ｍＬの全血を、それぞれの患者から、４本のＥＤＴＡ被覆した血液採取管に抜き取った。全血を、氷上に移し、ＲＮＡ単離を試料採取の３０分以内に実施した。
【００９９】
１．３  ＲＮＡ試料製造
１．３．１．  白血球からのＲＮＡの抽出
白血球のＲＮＡ生成キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、白血球のＲＮＡ抽出のための製造者の指示に従って使用した。
【０１００】
１．３．２．  ＲＮＡの品質制御及び貯蔵
ＲＮＡ濃度及び品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。２６０／２８０及び２６０／２３０の割合のＲＮＡ濃度を記録した。そしてＲＮＡを、液体窒素中で、ＲＮａｓｅ及びＤＮＡｓｅを有さないクライオチューブ中に貯蔵した。
【０１０１】
バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＮａｎｏｄｒｏｐに加えて使用し、マイクロアッセイ研究において使用した試料のＲＮＡ品質を検査した。それぞれのＲＮＡ試料のＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を得て、バイオアナライザーによって画像を作り、その後それぞれの電気泳動操作を分析した。
【０１０２】
１．４．  遺伝子発現マイクロアッセイの前加工及び分析
全体のゲノムの遺伝子発現マイクロアッセイを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＨＴ−１２ ｖ４ ＢｅａｄＣｈｉｐで実施した。それぞれのアレイは、４７０００より多い転写を含み、ヒトトランスクリプトームの全てにわたって公知のスプライシング変異体である（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｒｅｌｅａｓｅ ３８）。
【０１０３】
簡単に、患者の血液試料から精製した合計ＲＮＡの５００ｎｇを、製造者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ複製キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、複製し、標識付けした。そして標識付けしたｃＲＮＡの合計７５０ｎｇを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ−１２ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐに対するハイブリダイゼーションのために製造した。ハイブリダイゼーション後に、ＢｅａｄＣｈｉｐｓを、ＢｅａｄＳｃａｎソフトウェアｖ３．２を使用してＢｅａｄＡｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒでスキャニングし、そしてそのデータを、さらなる分析のためにＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅソフトウェアｖ１．６中にアップロードした。
【０１０４】
前加工及び続く生物情報分析を、Ｒソフトウェア、及びｌｕｍｉパッケージ（バックグラウンドシグナルを調節すること、変位値の標準化、及び原料遺伝子の発現データの変動を安定化する変換）を使用して実施した。
【０１０５】
生物情報分析のために、マイクロアレイに対する品質検査を実施した。全ての試料を評価し、良好なＲＩＮ品質を示した。Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ距離及び平均結合を使用した無監視の階層クラスタリングは、より高い同様の生物学的複製を示した（図３を参照）。図３において示した潜在的な異常値（ｎ＝５）を取り除いた後に、マイクロアレイの有意分析（ＳＡＭ）を使用して、敗血症と非敗血症との有意差発現を有した遺伝子を選択した（２．０より大きい又は０．５未満の倍率変化、偽陽性率＝０）。
【０１０６】
感染、軽症敗血症及び重症敗血症において有意に差次的に発現した遺伝子のセットを、生物情報学により同定し、経路を分析した。最終的に、ヒートマップを、Ｊａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用して作成し、それぞれの患者群の遺伝子発現プロフィールの可視化を可能にした。
【０１０７】
１．５  ｑＰＣＲによる選抜したバイオマーカーの分析確認
１．５．１．  ｃＤＮＡの変換及び貯蔵
ＲＮＡ試料のｃＤＮＡ変換を、製造者の指示に従ってｉＳｃｒｉｐｔTMｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。
【０１０８】
１．５．２．  プライマー設計及び確認
プライマー対を、Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ、ＮＩＨ）及びＯｌｉｇｏ ７で設計した。全てのプライマー対を、標準曲線分析についてｑＰＣＲによって、及び患者試料における追加試験のために選抜する前に融解曲線について３つの異なるＲＮＡ試料中で確認した。
【０１０９】
プライマー対を、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースのｑＰＣＲによって試験した。感染と軽症敗血症の被験者との強い倍率変化（１．５未満の倍率変化）に特異的（無矛盾複製及びｑＰＣＲ融解曲線分析における単独のピーク）であったプライマー対を選択した。合計で４０の候補者の敗血症バイオマーカーを選抜した（３０の上方制御遺伝子、１０の下方制御遺伝子）。
【０１１０】
プライマー対を、標準曲線法も使用して試験して、ｑＰＣＲアッセイの効率を測定した（第１４表を参照）。ＰＣＲ効率を、鋳型希釈系列の線形回帰傾斜を使用して測定した。選抜したバイオマーカーを、線形Ｃｔ範囲（０．９９より大きいｒ２）で８０〜１２０％の効率を有するために要求した。全ての４２のプライマー対（４０の選抜した敗血症バイオマーカー及び２のハウスキーピング遺伝子）は、データ分析のための標準ｄｄＣｔ法が適用できたことを示す、８０％より大きいｑＰＣＲ効率を有した。
【０１１１】
１．５．３．  ｑＰＣＲによる患者試料中の選抜したバイオマーカー発現の分析
バイオマーカーの複製及び消失を、３つのシステム、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰｌｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５と一緒に使用し、一方でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉ及びＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）と一緒に使用した。双方のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキットについて、使用した最終反応体積は、１μＭの作業プライマー濃度及び４．１７μｇのｃＤＮＡ鋳型を有する１０μｌであった。
【０１１２】
全ての反応を、次のサイクル条件で実施した：１０分間９５℃（最初の変性）；１０秒間９５℃を４０〜４５サイクル（変性）、５秒間６０℃（アニーリング）及び２５秒間７２℃（伸張）、続いて融解曲線分析及び冷却。
【０１１３】
選抜したバイオマーカーのＣｔ曲線を、ハウスキーピング遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して標準化して、それぞれの遺伝子についてΔＣｔ値を得た。敗血症コンティニュアムにおけるカテゴリー間の相対発現差（ΔΔＣｔ値）も計算した。そしてΔΔＣｔを使用して、それぞれの遺伝子について遺伝子発現倍率変化を計算した。使用した式は以下である：
ΔＣｔ＝Ｃｔバイオマーカー  −  Ｃｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ＝Ｃｔ敗血症カテゴリー１  −  Ｃｔ敗血症カテゴリー２
倍率変化＝２-ΔΔCt。
【０１１４】
１．６．  敗血症診断のための予測モデルの開発及び確認
後に敗血症の重症度を予測する健康対照者から敗血症を有する患者を分類することができる予測モデルを開発した。これを、４０の有意な差次的に発現させた遺伝子に基づいて、４６の試料（９の対照、１４のＳＩＲＳ、１４の軽症敗血症、及び９の重症敗血症）の遺伝子発現（ｑＰＣＲからのΔＣｔ値）を使用して予測モデルをトレーニングすることによって実施した。予測モデルを、患者を敗血症と診断するタスクを専門とし、続いてそれぞれの敗血症の重症度を予測する２つの構成（分類モデル及び回帰モデル）で開発した。
【０１１５】
１０重交差確認を採用して、５つの分類モデル（ランダムフォレスト、決定木、ｋ−近傍、サポートベクターマシン、及びロジスティック回帰）を構築し、評価した。最も高い１０重交差確認の正確性を有するモデルを選択した（ロジスティック回帰）（第４表を参照）。同様に、敗血症の重症度を予測するために、１０重交差確認を実施して、異なる回帰モデル（線形回帰、サポートベクター回帰、多層パーセプトロン、ラッソ回帰、弾性ネット回帰）を試験及び評価した。同様に、１０重交差確認結果に関して最も良好に実施した回帰モデルを選択した（サポートベクター回帰）（第５表を参照）。
【０１１６】
以下の第４表は、５つのデータマイニングモデルの１０重交差確認を示す。
【表４】
2016526888.tif 000006
【０１１７】
以下の第５表は、５つの交差モデルの１０重交差確認を示す。
【表５】
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【０１１８】
予測モデルに、ブラインド確認プロセスを実施した。２４のブラインド試料を使用した。患者の敗血症カテゴリーの予測を、確立したモデルを使用して実施した。結果を、臨床的に設計したカテゴリーと比較するためにＮＵＨに送った。
【０１１９】
１．７．  敗血症の検出のためのｑＰＣＲ多重アッセイの開発及び確認
１．７．１．  アッセイ形式
バイオマーカーの複製及び消失を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。最終反応体積は、ＲＮＡの１０μＬ及び４．１７μｇであり、又はｃＤＮＡ鋳型を使用した。
【０１２０】
Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ ＲＴ−ＰＣＲキットについて、反応を、次のサイクル条件で実施した：２０分間５０℃（逆転写）、５分間９５℃（最初の変性）；１５秒間９５℃を４０〜４５サイクル（変性）、３０秒間６０℃（アニーリング及び伸張）、続いて冷却。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒについて、反応を、次のサイクル条件で実施した：５分間９５℃（最初の変性）；１０秒間９５℃を４０〜４５サイクル（変性）、３０秒間６０℃（アニーリング及び伸張）及び１秒間７２℃（定量化）、続いて冷却。
【０１２１】
１．７．２．  Ｔａｑｍａｎプローブの設計及び確認
Ｔａｑｍａｎプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）及びＯｌｉｇｏ ７を使用して設計した。Ａｕｔｏｄｉｍｅｒを使用して、全てのプライマー及びプローブの組合せの重合について試験した［１］。全てのプライマー−プローブを、標準曲線アッセイで確認した。プライマー滴定も実施して、可能な無矛盾のＣｔ値を有する最も低いプライマー濃度を測定した。
【０１２２】
１．７．３．  プライマー−プローブの組合せの確認
異なるプライマー−プローブの組合せを、Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ ＲＴ−ＰＣＲ ＋ Ｒキットを使用して多重アッセイで試験した。３重アッセイについて、バイオマーカーのために０．２μＭのプライマー及び０．２μＭのプローブを使用し、一方で０．４μＭのプライマー及び０．２μＭのプローブをハウスキーピング遺伝子のために使用した。合計２１の３重の組合せを８人の患者試料で試験した。３重アッセイと１重アッセイのＣｔ値を比較した。最良の５の３重の組合せ（全体の構成遺伝子について及び全体の敗血症カテゴリーカテゴリーにわたって１．０未満の平均ΔＣｔ差）のみをさらなる確認のために選択した。
【０１２３】
１．７．４．  Ｎａｓｃｅｎｔの３重プロトタイプ
最良の５の３重の組合せを、Ａｃｕｍｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで、１６の患者試料中で２回確認した。
【０１２４】
２．  結果
２．１．  患者コホート
１１４人の被験者が研究に包含された：１８人の健康な対照、３人の感染を有さないＳＩＲＳを有する被験者、３０人の感染を有する被験者、４５人の軽症敗血症を有する被験者、１５人の重症敗血症を有する被験者、及び３人の潜在性ショック又は敗血性ショックを有する被験者。被験者の人口統計及び臨床データを第６表において示す。年齢、性別及び人種の分布を、感染を有さないＳＩＲ及び潜在性／敗血性ショックのカテゴリーの群は少ない被験者数であったため除いて、全ての群にわたって類似した。補充した被験者において男性優位であった。
【０１２５】
患者の進行過程を、彼らの入院中に、及び投与の初日から３０日間追跡して、ＥＤへの再診及び病院への再入院について監視した。６人の患者が３０日以内にＥＤに戻ってきた。２人の患者は、最初の治療と同様の感染であった。
【０１２６】
以下の第６表は、敗血症コンティニュアムに従ってグループ分けした被験者の詳細を示す。
【表６】
2016526888.tif 000008
【０１２７】
２．２．  遺伝子発現プロファイリングで敗血症診断のための潜在マーカーを明らかにする
健康な対照と、感染及び軽症敗血症を有する被験者とを認識することができる潜在マーカーを同定するために、全体のゲノム発現マイクロアッセイ実験を実施した（前述の材料及び方法を参照）。対照に関連する遺伝子発現倍率変化に対するマイクロアッセイの有意分析（ＳＡＭ）を実施して、マイクロアッセイで最初に〜３３０００の遺伝子から候補者を選抜した。偽陽性率＝０及び２．０より大きいか又は０．５未満の倍率変化の厳しい閾値を使用して、敗血症において、４４４の有意な情報制御した遺伝子及び４６２の有意な下方制御した遺伝子を選択した。多くのこれらの同定された遺伝子、例えばＩＬＲ１Ｎ、ＩＬ１Ｂ、ＴＬＲ１、ＴＮＦＡＩＰ６は、炎症反応（ｐ＝１．４１×１０-5）、免疫反応（ｐ＝１．４１×１０-5）及び創傷反応（ｐ＝１．４１×１０-5）に含まれる。これは、敗血症が感染に対する炎症反応の結果である事実に一致する。
【０１２８】
２．３．  敗血症バイオマーカーとして選択された４０の遺伝子のパネル
ＳＡＭによって同定された９０６の遺伝子のリストを、予測モデルの開発のために臨床的二実施可能な数まで減少させるために、最大の倍率変化を有する遺伝子のみをさらなる試験のために選択した。合計で、８５の遺伝子を試験し、そのうち１１は下方制御した遺伝子であり、７４は上方制御した遺伝子であった。ｑＰＣＲ確認後に、４０の遺伝子のパネルを選抜した。パネルは、３０の上方制御した遺伝子、及び１０の下方制御した遺伝子からなる（以下のリスト１を参照）。
【０１２９】
ＨＲＰＴ１及びＧＡＰＤＨを、白血球中でのそれらの安定した発現のためのハウスキーピング遺伝子として選択した［２］。
【０１３０】
以下のリスト１は、３０の上方制御した遺伝子及び１０の下方制御した遺伝子のそれぞれについての配列をコードする遺伝子を挙げる。リスト２は、２つのハウスキーピング遺伝子を挙げる。
【０１３１】
リスト１：３０の上方制御した遺伝子及び１０の下方制御した遺伝子のそれぞれについての配列をコードする遺伝子
３０の上方制御した遺伝子
１．  ＡＣＳＬ１：ホモサピエンスアシル−ＣｏＡシンテターゼ長鎖ファミリーメンバー１（ＡＣＳＬ１）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１９９５．２（配列番号：１）
２．  ＡＮＸＡ３：ホモサピエンスアネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００５１３９．２（配列番号：２）
３．  ＣＹＳＴＭ１：ホモサピエンスシステインリッチ膜内外モジュール含有１（ＣＹＳＴＭ１）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０３２４１２．３（配列番号：３）
４．  Ｃ１９ｏｒｆ５９：ホモサピエンス染色体１９オープンリーディングフレーム５９（Ｃ１９ｏｒｆ５９）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿１７４９１８．２（配列番号：４）
５．  ＣＳＦ２ＲＢ：ホモサピエンスコロニー刺激因子２ベータ低親和性（顆粒球マクロファージ）（ＣＳＦ２ＲＢ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００３９５．２（配列番号：５）
６．  ＤＤＸ６０Ｌ：ホモサピエンスＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド６０様（ＤＤＸ６０Ｌ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１０１２９６７．１（配列番号：６）
７．  ＦＣＧＲ１Ｂ：ホモサピエンスＩｇＧのＦｃフラグメントの高親和性ｌｂのレセプター（ＣＤ６４）（ＦＣＧＲ１Ｂ）、転写変異体２、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１００４３４０．３（配列番号：７）
８．  ＦＦＡＲ２：ホモサピエンス遊離脂肪酸レセプター２（ＦＦＡＲ２）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００５３０６．２（配列番号：８）
９．  ＦＰＲ２：ホモサピエンスホルミルペプチドレセプター２（ＦＰＲ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ００１４６２．３（配列番号：９）
１０．  ＨＳＰＡ１Ｂ：ホモサピエンスヒートショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００５３４６．４（配列番号：１０）
１１．  ＩＦＩＴＭ１：ホモサピエンスインターフェロン誘発膜内外タンパク質１（ＩＦＩＴＭ１）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ００３６４１．３（配列番号：１１）
１２．  ＩＦＩＴＭ３：ホモサピエンスインターフェロン誘発膜内外タンパク質３（ＩＦＩＴＭ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ０２１０３４．２（配列番号：１２）
１３．  ＩＬ１Ｂ：ホモサピエンスインターロイキン１、ベータ（ＤＬ１Ｂ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００５７６．２（配列番号：１３）
１４．  ＩＬ１ＲＮ：ホモサピエンスインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ１ＲＮ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿１７３８４２．２（配列番号：１４）
１５．  ＬＩＬＲＡ５：ホモサピエンス白血球イムノグロブリン様レセプター、サブファミリーＡ（ＴＭドメインを有する）、メンバー（ＬＨＪＡ５）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０２１２５０．２（配列番号：１５）
１６．  ＬＲＧ１：ホモサピエンスロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０５２９７２．２（配列番号：１６）
１７．  ＭＣＬ１：ホモサピエンス骨髄性細胞白血病配列１（ＢＣＬ２−関連）（ＭＣＬ１）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０２１９６０．４（配列番号：１７）
１８．  ＮＡＩＰ：ホモサピエンスＮＬＲファミリー、アポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００４５３６．２（配列番号：１８）
１９．  ＮＦＩＬ３：ホモサピエンス核因子、インターロイキン３調節（ＮＦＬＬ３）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ００５３８４．２（配列番号：１９）
２０．  ＮＴ５Ｃ３：ホモサピエンス５’−ヌクレオチド、サイトゾルΙΠ（ＮＴ５Ｃ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１００２０１０．２（配列番号：２０）
２１．  ＰＦＫＦＢ３：ホモサピエンス６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ００４５６６．３（配列番号：２１）
２２．  ＰＬＳＣＲｌ：ホモサピエンス脂質スクランブラーゼ１（ＰＬＳＣＲｌ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０２１１０５．２（配列番号：２２）
２３．  ＰＲＯＫ２：ホモサピエンスプロキネチシン２（ＰＲＯＫ２）、転写変異体２、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０２１９３５．３（配列番号：２３）
２４．  ＲＡＢ２４：ホモサピエンスＲＡＢ２４、メンバーＲＡＳガン遺伝子ファミリー（ＲＡＢ２４）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１０３１６７７．２（配列番号：２４）
２５．  Ｓ１００Ａ１２：ホモサピエンスＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００５６２１．１（配列番号：２５）
２６．  ＳＥＬＬ：ホモサピエンスセレクチンＬ（ＳＥＬＬ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００６５５．４（配列番号：２６）
２７．  ＳＬＣ２２Ａ４：ホモサピエンス溶質キャリヤーファミリー２２（有機カチオン／エルゴチオネイン輸送体）、メンバー４（ＳＬＣ２２Ａ４）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００３０５９．２（配列番号：２７）
２８．  ＳＯＤ２：ホモサピエンススーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア（ＳＯＤ２）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００６３６．２（配列番号：２８）
２９．  ＳＰ１００：ホモサピエンスＳＰ１００核抗原（ＳＰ１００）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ００１０８０３９１．１（配列番号：２９）
３０．  ＴＬＲ４：ホモサピエンストール様レセプター４（ＴＬＲ４）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿１３８５５４．４（配列番号：３０）
１０の下方制御した遺伝子
１．  ＣＣＬ５：ホモサピエンスケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２９８５．２（配列番号：３１）
２．  ＣＣＲ７：ホモサピエンスケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター７（ＣＣＲ７）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１８３８．３（配列番号：３２）
３．  ＣＤ３Ｄ：ホモサピエンスＣＤ３ｄ分子、デルタ（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）（ＣＤ３Ｄ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００７３２．４（配列番号：３３）
４．  ＣＤ６：ホモサピエンスＣＤ６分子（ＣＤ６）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００６７２５．４（配列番号：３４）
５．  ＦＡ１Ｍ３：ホモサピエンスＦａｓアポトーシス阻害分子３（ＦＡＩＭ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００５４４９．４（配列番号：３５）
６．  ＦＣＥＲ１Ａ：ホモサピエンスＩｇＥのＦｃフラグメント、高親和性Ｉ、レセプター；アルファポリペプチド（ＦＣＥＲ１Ａ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２００１．３（配列番号：３６）
７．  ＧＺＭＫ：ホモサピエンスグランザイムＫ（グランザイム３；トリプターゼＩＩ）（ＧＺＭＫ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２１０４．２（配列番号：３７）
８．  ＢＬ７Ｒ：ホモサピエンスインターロイキン７レセプター（ＥＬ７Ｒ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２１８５．３（配列番号：３８）
９．  ＫＬＲＢ１：ホモサピエンキラー細胞レクチン様レセプターサブファミリーＢ、メンバー１（ＫＬＲＢｌ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２２５８．２（配列番号：３９）
１０．  ＭＡＬ：ホモサピエンス不完全Ｔ細胞分化タンパク質（ＭＡＬ）、転写変異体、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０２２４４０．２（配列番号：４０）。
【０１３２】
リスト２：２つのハウスキーピング遺伝子のそれぞれについての配列をコードする遺伝子
２のハウスキーピング遺伝子（“ＨＫＧ”）
１．  ＨＰＲＴｌ：ホモサピエンスハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００１９４．２（配列番号：４１）
２．  ＧＡＰＤＨ：ホモサピエンスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ｍＲＮＡ。ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２０４６．５（配列番号：４２）。
【０１３３】
２．４．  ４０候補の敗血症バイオマーカーのそれぞれは、敗血症診断のための高い選択性及び特異性を有した
対照試料から感染試料、軽症敗血症試料及び重症敗血症試料の相対平均倍率変化を、ｑＰＣＲによって比較した。敗血症コンティニュアムに伴う遺伝子発現の上方制御又は下方制御の進行度を観察した（図１を参照）。これは、選択された４０の遺伝子のパネルが、敗血症コンティニュアムに伴う正確に区別した被験者試料において使用するための可能性を有することを示す。
【０１３４】
健康な被験者（対照）と感染（感染、軽症敗血症、重症敗血症）を有する患者とを認識することが臨床的に重要である。遺伝子パネルを、対照と感染／軽症敗血症／重症敗血症、及び対照／感染と軽症敗血症／重症敗血症を区別する能力について特に試験した。
【０１３５】
敗血症コンティニュアムに対する遺伝子発現倍率変化は、１．５よりも大きく、区別のために使用されるためには著しく大きかった（第１５表）。
【０１３６】
それぞれの敗血症バイオマーカーの予測値を、対照と感染／軽症敗血症／重症敗血症、及び対照／感染と軽症敗血症／重症敗血症との区別のためにＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ））を使用して計算し、選抜したバイオマーカーが、敗血症の早期区別について高い予測値を有することを確実にした。対照と感染／軽症／重症とを区別する場合の予測値について、３のバイオマーカーは９５％より大きく、１８のバイオマーカーは９０〜９５％を有し、１６のバイオマーカーは８５〜９０％を有した。対照／感染と軽症／重症とを区別する場合の予測値について、１０のバイオマーカーは９５％より大きく、２０のバイオマーカーは９０〜９５％を有し、１０のバイオマーカーは８５〜９０％を有した。ｐ値は、双方の区別のための全てのバイオマーカーについて０．０１未満である。
【０１３７】
２．５．  敗血症診断において８９％を超える正確性を得た予測モデル
対照と、感染、軽症敗血症及び重症敗血症を有する被験者とを区別することができる予測モデルを構築した。このモデルは、２つの構成の集合である。第１の構成（分類モデル）は、敗血症を有する患者を対照と区別する。試料を感染又は敗血症と識別する場合に、第２の構成（回帰モデル）は、敗血症の重症度を予測する。
【０１３８】
４６の試料（９の対照、１４の感染、１４の軽症敗血症、及び９の重症敗血症）から早期に識別した４０の差次的に発現した遺伝子のｑＰＣＲ遺伝子発現データを使用して、１０重交差確認を使用することによって予測モデルの第１及び第２の構成を試験した。それぞれの構成において、異なるモデルを試験し、そして最も良好に実施できるモデルを、特定の構成について選択した。ロジスティック回帰モデルが試験した他のモデルを上廻ったため、ロジスティック回帰モデルを選択した。ロジスティック回帰モデルは、１０重交差確認評価において、敗血症と対照との分類において８９．１３％の高い全体の正確性を達成する（感度７７．８％、特異性９１．９％）。
【０１３９】
第２の構成について、サポートベクター回帰を、第１の構成において発見した敗血症の重症度を予測するために選択した。回帰モデルは、試料の８７％で敗血症の重症度を正確に予測することができた。
【０１４０】
２．６．  敗血症診断において８８％までの正確性を得るブラインド確認における予測モデル
モデルの適用性をさらに確認するために、予測モデルを構築して使用せず、独立のデータセットを使用して、ブラインド評価を実施した。２４の試料の独立データセットは、感染を有さないＳＩＲＳを有する３人の被験者、４人の対照、２人の感染、１２人の軽症敗血症、２人の重症敗血症及び１人敗血性ショックを臨床的に評価される。評価目的のために、敗血性ショックを有する被験者を、重症敗血症と共に分類した。
【０１４１】
予測モデルは、２つの目的：敗血症の診断及び敗血症の重症度の評価を有する２つの構成を含む。第１の構成は、対照から敗血症を分類した。選択したモデルは、８８％の高い全体の正確性、敗血症を有する１８人の被験者から１６人の正確な診断（感度９４％）、及び７人の対照から５人の正確な同定（特異性７１％）を有する。より重要なのは、感染を有さないＳＩＲを有する被験者が、対照と正確に分類され、候補バイオマーカーが効果的に敗血症から無菌性ＳＩＲＳを区別することができたことを示す。
【０１４２】
第２の構成は回帰モデルである。感染と軽症敗血症の高い類似性により敗血症の重症度の予測が困難であるにもかかわらず、前記モデルは、感染を軽症敗血症又は重症敗血症を認識することにおいて８２％の正確性であった。この比較的低い正確性は、危険性に対して臨床医を導くために使用される敗血症コンティニュアムにおける感染と軽症敗血症の記述についての任意の閾値が、感染原因論によって病気を呈している患者を層化することを示す。感染、軽症敗血症及び重症敗血症は、変動する程度で類似の炎症反応を誘発し、さらにモデルを使用する正確な予測をもたらす困難性を増加する。
【０１４３】
まとめると、これらの結果（第７表及び第８表を参照）は、本発明のアプローチが実施可能であるだけでなく、初期に敗血症を良好に正確に診断することを証明する。これらの結果は、回帰モデルの改善が、敗血症患者の重症度を良好に予測するために必要であることも示す。
【０１４４】
以下の第７表は、敗血症と対照を分類するためのバイオマーカーパネルの性能を示す。
【表７】
2016526888.tif 000009
【０１４５】
以下の第８表は、敗血症の重症度を分類するためのバイオマーカーパネルの性能を示す。
【表８】
2016526888.tif 000010
【０１４６】
２．７．  敗血症の検出のためのｑＰＣＲ多重アッセイの開発及び確認
２．７．１．  多重アッセイの開発
多数の開発のための最大の予測遺伝子を選択するために、１０重交差確認を実施した。分類法の４の異なる１０重交差確認から、８の反復／オーバーラップ遺伝子を同定した（図２を参照）。オーバーラップ法を選択した。それというのも、オーバーラップ法は、異なる仮定に従ってデータセットを分類する異なる分類法に固有の偏りを減少することができるからである。同時に、他の８の遺伝子を、ＲＯＣ曲線を使用した対照と感染／軽症敗血症／重症敗血症との比較からの予測値を使用して選択した。選択した遺伝子を以下の第１９表において示す。
【０１４７】
３重の組合せを、最大の予測遺伝子から設計した。３重アッセイの合計２１の組合せを、８の異なる患者試料を多重と一重でＣｔ値を比較することによってスクリーニングした。２１の組合せのうち、５の３重アッセイは同様のＣｔ値（１．０未満のΔＣｔ）を有し、さらなる確認のために選抜した。
【０１４８】
２．７．２．  患者試料を使用した多重アッセイの確認
選抜した５の３重アッセイを、さらに８の患者試料で試験した。多重と一重のアッセイにおける構成遺伝子のＣｔ値の比較を、アッセイの有効性を測定するために実施した（第２３表を参照）。Ｓ１００Ａ１２／ＦＦＡＲ２／ＨＰＲＴ１が、異なる敗血症カテゴリーからの患者試料において矛盾のない結果を提供したことを観察した。ＭＣＬ１／ＣＹＳＴＭ１／ＨＰＲＴ１は矛盾がより少なかった。他の３つの組合せにおいて、結果は、敗血症試料ではなく対照試料で矛盾しなかった。ハウスキーピング遺伝子、ＨＰＲＴ１のΔＣｔは、敗血症試料においてより高かった。これは、敗血症でより高く発現させたバイオマーカーによるＨＰＲＴ１複製のサプレッションによってであってもよい。
【０１４９】
３．  考察
３．１．  白血球からのバイオマーカーを敗血症診断のために使用できる
本発明のマイクロアッセイ遺伝子発現プロファイリング結果の階層クラスタリングは、感染及び敗血症を有する患者と感染及び敗血症を有さない患者との白血球の遺伝子発現パターンにおいて有意差を証明した。敗血症中に差次的に発現された遺伝子は、マイクロアレイ遺伝子プロフィールに由来し、パネル遺伝子又はバイオマーカーは、４０の遺伝子の場合に、初めの３３０００から選抜される。遺伝子の選抜したパネルを、ｑＰＣＲアッセイで確認した。ｑＰＣＲを使用する分析確認は、これらの選抜したバイオマーカーが、敗血症コンティニュアムに対して被験者において次第に調節不全にしたことを示す。これらの結果は、マイクロアッセイから得られたものに関連した。白血球中の遺伝子発現の変化を明らかに観察することができ、被験者における敗血症の診断及び／又は予後のため及び敗血症の重症度の評価及び／又は予測のために潜在的に使用できる。
【０１５０】
ＲＯＣ曲線のＡＵＣを使用して得られたそれぞれの遺伝子の予測値が推奨され、個々の遺伝子毎について８５％より高いスコアを有する。それぞれの遺伝子のこの高い予測値は、選択された遺伝子パネルを早期の診断マーカーとして使用できることを示唆する。これらの４０の遺伝子からの情報に対して完全に影響を及ぼすために、予測モデルを、全ての４０の遺伝子のｑＰＣＲのΔΔ値を使用して構築した。この予測モデルは、ブラインド試料の８８％を正確に診断することができた。誘導遺伝子発現パネルは、臨床の表現型に基づいた敗血症コンティニュアムに沿った被験者の免疫学的分離を可能にするために敗血症コンティニュアムに対して著しく明確であったことを示している。
【０１５１】
３．２．  敗血症診断のためのバイオマーカーの活用
３３０００を超える遺伝子を、マイクロアッセイ分析によって試験した。ＳＡＭを使用して、敗血症コンティニュアムに対して差次的に発現した９０６の遺伝子を同定し、後に４０の遺伝子まで減少させた。これらの４０の遺伝子の発現を、全ての被験者において、ｑＰＣＲによって分析的に確認し、ここで倍率変化の差を使用して予測モデルを構築した。
【０１５２】
前記モデルによる予測を、臨床的分類と比較し、合計で７のミスマッチした予測を見出した。７のミスマッチした予測のうち、４のミスマッチした予測は、患者の管理に差がなかったが、３のミスマッチした予測は、有害事象をもたらした。少数の感染を有さないＳＩＲＳの被験者にもかかわらず、前記モデルは、ブラインド試料試験において双方の被験者を正確に分類できた。しかしながら、後の臨床確認段階によって前記モデルのさらなる改良が実施され、その特異性及び感度を増加させる。遺伝子パネルは、費用効率及び再現性を改良するために、その正確性を犠牲にすることなく、潜在的にさらに減少させることができた。予測モデルを操作するためのより大きいデータセットの使用が、この目的に優先される。前記システムに対する他の改良、例えば新たなハウスキーピング遺伝子の使用は、比較のために使用した基準が安定であり、個人の年齢及び性別における差を説明することができることを確実にする。
【０１５３】
３．３．  診断キットのプロトタイピング
得られた定性遺伝子発現データを、異なる予測モデルの使用によって、感染した及び感染していない患者の区別、敗血症及び敗血症でない患者の区別、及び敗血症の重症度の段階を含む、多数の適用のために使用できる。存在するデータを、新たな予測モデルの構築において使用するためのさらなる研究からの新たなデータと合わせることができる。それが望ましいならば、新たな遺伝子を、マイクロアッセイデータから選択できる。これは、患者の病気進行に対する十分な情報が得られた場合に、及び特に患者の病気予後の分類において使用するための新たな遺伝子が同定されるべきであった場合に、有用であってもよい。従って、この研究から得られたデータを活用することは前例のない適応性である。
【０１５４】
一般に、白血球からのＲＮＡが、プロトタイプ開発のための鋳型として使用される。しかしながら最終のプロトタイプのための出発材料は、考慮されるべきである多数の要因、例えば加工時間及び複雑さ、アッセイの感度及び安定性、病院で入手できる装置、及び試料製造にかかる時間によって決定されてもよい。
【０１５５】
３．４．  診断キットの臨床的有用性
一般に、敗血症の診断のための至適基準はない。最初の試験は、陽性の血液培養に依存する。最終的な結果を得るために要求される長い時間（２４〜７２時間）、要求される大量の血液（通常２０ｍｌ〜４０ｍｌ）及び偽陽性率（０．６％〜１０％）を含む血液培養への依存についていくつかの主な欠点がある［３、４］。いくつかの病原体に基づく分子診断キット、例えばＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎパネル（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）が、この問題を回避するために市販されている。しかしながら、この方法は、病原体（及びその副生成物、例えばエンドトキシン）を同定するのみであり、これは、宿主炎症反応を刺激し、標的とした抗菌剤治療を設けることを可能にするが、過剰増殖の宿主炎症反応又は敗血症の重症度によってもたらされる付帯的損傷を示さない。
【０１５６】
血液培養の制限は、血液中の低い細菌濃度、培養容器中で抽出された不十分な血液、偏好性生物の存在、又は試用採取前の抗生物質の使用によって生じてよい偽陰性結果にも起因する。２００７年〜２０１２年のＮＵＨ ＥＤからのデータは、６５歳以上の患者について２１．４％のみの真陽性血液培養率を示した。
【０１５７】
感染／敗血症による遺伝子発現変化の形での宿主反応についてｑＰＣＲを使用する提案された診断キットは、前記の病原体に基づく分子技術を補完する。早期診断のための宿主反応を確実にする能力は、臨床的に最初に敗血症を示さなかったが、後に悪化しうる患者のより急速で正確な管理を可能にするために、病原体の同定の使用に先行する。従って、起源管理、早期の血行動態蘇生及び支持、及び人工呼吸支持を含む敗血症の管理の柱は、患者の転帰を改善するために早期に始められる。遺伝子発現診断キットによって要求される推定３時間は、病院におけるトリアージ及び治療の適切な場所を早い情報に基づいて決定するために、前線の医者、例えば救急医のために機会をもたらす。
【０１５８】
４．  補足方法
４．１．  遺伝子発現プロファイリング
４．１．１．  比較可能なマイクロアッセイ分析のための品質管理
マイクロアッセイハイブリダイゼーションのための品質管理（ＱＣ）を実施した。使用した管理メトリクスは、ハイブリダイゼーション法のためのハイブリダイゼーション管理、洗浄温度についての低い厳密性試験、Ｃｙ３結合についての高い厳密性試験、敗血症でないハイブリダイゼーションのための陰性対照、ハイブリダイゼーションの試料及び量の完全性のための遺伝子強度試験、及び異常値を検出するための最終的なシグナル分布分析であった。
【０１５９】
４．２．  ｑＰＣＲによる選抜したバイオマーカーの分析確認
４．２．１．  プライマー設計及び確認
国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ））のヌクレオチドデータベースを使用して、本発明において選択した遺伝子のそれぞれについてコードする配列を得た。そしてプライマーＢＬＡＳＴを操作して、それぞれの遺伝子について２０の異なるプライマー対を得た。使用したパラメータは、２００ｂｐの最大ＰＣＲ生成物サイズ、２０の繰り返しプライマー対、最小５９℃、最大６１℃及び最大差２℃のプライマー融解温度であった。そして、それぞれの対を、Ｏｌｉｇｏ ７を使用してケイ素中での安定性及び使用について試験した。７００点より高いスコアの上位２つのプライマー対を、ｑＰＣＲにおける使用のために選択した。
【０１６０】
実験を開始するために、それぞれのプライマー対を試験してそれらの品質を検査した。新たなプライマーを、３つの異なる試料でｑＰＣＲによって試験した。融解曲線を試験して、副生成物又はプライマーダイマーがなかったことを検証した。さらに、標準曲線分析を実施して、プライマー対の相関係数（ｒ２）及び効率（Ｅ）を計算した。効率を計算するために使用した式は、以下である：
Ｅ＝［−１＋１０（１／傾斜度）］×１００％。
【０１６１】
傾斜度を、標準曲線から計算した。そして、確認したプライマー対を分析確認のために使用した（第９表を参照）。
【０１６２】
以下の第９表は、使用したプライマーのリストを示す。
【表９】
2016526888.tif 000011
【０１６３】
４．３．  敗血症の検出のためのｑＰＣＲ多重アッセイの開発及び確認
４．３．１．  Ｔａｑｍａｎプローブの設計及び確認
Ｔａｑｍａｎプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を使用して、次のパラメータで設計した：プローブサイズは１８〜２７ｂｐであった；プローブ溶融温度（Ｔｍ）６５〜７３℃；ＧＣ含有率３０〜８０％。そして、それぞれプライマーを、Ｏｌｉｇｏ ７を使用してケイ素中での安定性及び使用について試験した。Ａｕｔｏｄｉｍｅｒを使用して、全てのプライマー及びプローブの組合せについて、プライマー−プローブ及びプローブ−プローブ及びプライマー−プライマーの重合について試験した［１］（第１０表を参照）。
【０１６４】
以下の第１０表は、プライマー−プローブの組合せのリストを示す。
【表１０】
2016526888.tif 000012
【０１６５】
プライマー−プローブ混合物を、最初に、２つの異なるキット：ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ− ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で鋳型ＲＮＡの段階希釈を使用して標準曲線アッセイで試験した。設定を確認して、プローブがプライマー対と相容性であることを確実にした。複製効率は、８０〜１２０％の範囲内であり、倍率変化は試験したＣｔ範囲にわたって線形である。
【０１６６】
次に、０．４μＭの推奨されるプライマー濃度からＣｔ値を維持しながら、０．０５μΜのステップで０．４〜０．０５μＭからプライマー滴定を実施して、可能な最も低いプライマー濃度を測定した。
【０１６７】
５．  補足結果
５．１．  ＲＮＡ試料製造
５．１．１．  ＲＮＡの質及び量
全てのＲＮＡ試料について、得られた平均ＲＮＡ濃度及び２６０／２８０及び２６０／２３０の比が見出された。得られたＲＮＡの質及び量は、５０ｎｇ／ｕＬより大きい濃度、２．０より大きい２８０／２６０比及び１．７より大きい２６０／２３０比を有し、これは、良好な収率がＲＮＡ抽出から得られ、使用したＲＮＡ試料が、タンパク質及び炭水化物で汚染されていなかったことを示した。
【０１６８】
５．２．  遺伝子発現プロファイリング
５．２．１．  マイクロアッセイのためのＲＮＡの質及び濃度
ＲＮＡの質及び完全性を、マイクロアッセイ試験のために使用する前にバイオアナライザーで試験した。マイクロアッセイにおいて使用したすべての試料についてのＲＮＡ完全数（ＲＩＮ）は７より大きかった。電気泳動操作は、急勾配のバンドのＲＮＡが存在したことを示した。結果は、マイクロアッセイにおいて使用したＲＮＡ試料が高い完全性を有し、劣化されなかったことを確認した。
【０１６９】
５．２．２．  マイクロアッセイハイブリダイゼーションのための品質管理
マイクロアッセイハイブリダイゼーションのための品質管理（ＱＣ）も実施した。パイロットマイクロアッセイ（第１２表を参照）及び第２マイクロアッセイ（第１３表を参照）操作の双方は、全ての品質管理試験を通過した。
【０１７０】
以下の第１２表は、パイロットマイクロアッセイのためのアレイ品質管理の要約を示す。
【表１１】
2016526888.tif 000013
【０１７１】
以下の第１３表は、マイクロアッセイの第２バッチのためのアレイ品質管理の要約を示す。
【表１２】
2016526888.tif 000014
【０１７２】
５．３．  ｑＰＣＲによって選抜した遺伝子の分析確認
５．３．１．  プライマー試験及び確認
プライマー対を、標準曲線法も使用して試験して、ｑＰＣＲアッセイの効率を測定した（第１４表を参照）。ＰＣＲ効率を、鋳型希釈系列の線形回帰傾斜を使用して測定した。選抜したバイオマーカーを、線形Ｃｔ範囲（０．９９より大きいｒ2）で８０〜１２０％の効率を有するために要求した。４１のプライマー対（４０の選抜した敗血症バイオマーカー及び１のハウスキーピング遺伝子）の中で、８０％未満のｑＰＣＲ効率を有したものはなかった。しかしながら、１１のプライマー対は１２０％より大きい効率を有した。１２０％より大きい効率を有するにもかかわらず、これらのプライマー対は、敗血症の間の遺伝子発現変化を研究するために未だ使用されていた。それというのも、融解曲線において偽生成物を検出しなかったからである。
【０１７３】
以下の第１４表は、選抜した敗血症バイオマーカーのプライマー対の効率及び線形Ｃｔ範囲を示す。
【表１３】
2016526888.tif 000015
【０１７４】
５．３．２．  選抜した遺伝子の診断性能
図１は、ｑＰＣＲによる対照に対する感染試料、軽症敗血症試料及び重症敗血症試料の相対倍率変化を示す。（Ａ）３０の上方制御遺伝子、及び（Ｂ）１０の下方制御遺伝子。
【０１７５】
以下の第１５表は、対照と感染、及び感染と軽症敗血症の倍率変化を示す。Ｃ−対照、Ｉ−感染、Ｍ−軽症敗血症。
【表１４】
2016526888.tif 000016
【０１７６】
以下の第１６表は、対照と感染／軽症敗血症／重症敗血症、及び対照／感染と軽症敗血症／重症敗血症についての、バイオマーカーパネルの予測値（曲線下面積；ＡＵＣ）、標準偏差及びｐ値を示す。
【表１５】
2016526888.tif 000017
【０１７７】
５．３．３．  敗血症カテゴリーの区別のための予測モデルの確認
ロジスティック回帰をもたらすために重さをそれぞれの遺伝子に与えた（第１７表を参照）。臨床確認中にブラインド患者試料を分類するために使用したアルゴリズムは以下である：
【数１】
2016526888.tif 000018
ｄＣt  −  ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した遺伝子サイクル閾値
ｗ  −  重さ
Ｉ  −  妨害
健康な対照試料について、ロジスティック回帰指数≧０
感染した／敗血症の試料について、ロジスティック回帰指数＜０。
【０１７８】
以下の第１７表は、それぞれの遺伝子についての重さ及びロジスティック回帰モデルからの妨害を示す。
【表１６】
2016526888.tif 000019
【０１７９】
サポートベクター回帰をもたらすために重さをそれぞれの遺伝子に与えた（第１８表を参照）。臨床確認中にブラインド患者試料を分類するために使用したアルゴリズムは以下である：
【数２】
2016526888.tif 000020
ｄＣt  −  ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した遺伝子サイクル閾値
ｗ  −  重さ
Ｉ  −  妨害
健康な対照試料について、サポートベクター回帰指数≧１．４１
軽症敗血症の試料について、ロジスティック回帰指数１．４１≧ｘ＜３．５２
重症敗血症の試料について、ロジスティック回帰指数＜３．５２。
【０１８０】
以下の第１８表は、それぞれの遺伝子についての重さ及びサポートベクター回帰モデルからの妨害を示す。
【表１７】
2016526888.tif 000021
【０１８１】
５．４．  敗血症の検出のためのｑＰＣＲ多重アッセイの開発及び確認
図２は、４の異なる分類法のオーバーラップから同定された最良の予測遺伝子を示す。
【０１８２】
以下の第１９表は、２の異なる選択法からの上位８の予測遺伝子のリストを示す。
【表１８】
2016526888.tif 000022
【０１８３】
プライマー−プローブを、標準曲線法で試験して、プライマー−プローブが複製曲線をもたらすことができることを確認し、そしてｑＰＣＲアッセイの効率を測定した。ＰＣＲ効率を、鋳型希釈系列の線形回帰傾斜を使用して測定した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎフォーマットを使用したｑＰＣＲに類似して、プライマー−プローブは、線形Ｃｔ範囲（ｒ2＞０．９９）で８０〜１２０％の効率を有することを要求する。
【０１８４】
１２のバイオマーカー及び１のハウスキーピング遺伝子についてのプライマー−プローブを設計した。２の遺伝子のプライマー−プローブは、複製曲線を提供することに失敗した。４のハウスキーピングプライマープローブのうち、１を最も矛盾しない結果のために選択した。操作した全てのプローブは、許容される効率（８０〜１２０％）及び試験したＣｔ範囲で線形を有した（第２０表を参照）。
【０１８５】
以下の第２０表は、試験した敗血症バイオマーカーのプライマー−プローブの効率及び線形Ｃｔ範囲を示す。
【表１９】
2016526888.tif 000023
【０１８６】
プライマー滴定を実施して、より高い大量の遺伝子のために使用したプライマー濃度を減少させた（第２１表を参照）。減少させたプライマー濃度は、０．４μＭの推奨された出発作業濃度と比較して、Ｃｔ値に影響しなかった。プライマー濃度の減少は、ｑＰＣＲ反応物の消費及び消失による低い大量の遺伝子に対するより高い大量の遺伝子の複製抑制の効果を制限する。可能な最小の最終プライマー濃度が０．２０〜０．０５μＭで変動するために、０．２μＭが全てのバイオマーカーのための最終プライマー濃度として選択される。低い豊富なハウスキーピング遺伝子についての最終プライマー濃度を０．４μＭで維持した。
【０１８７】
以下の第２１表は、試験した敗血症バイオマーカーのプライマー−プローブの効率及び線形Ｃｔ範囲を示す。
【表２０】
2016526888.tif 000024
【０１８８】
以下の第２２表は、試験した３重の組合せを示す。
【表２１】
2016526888.tif 000025
【０１８９】
以下の第２３表は、選抜した３重の組合せについて１．０より大きい多重アッセイ及び一重アッセイのＣｔ差を有する試料の数を示す。
【表２２】
2016526888.tif 000026
【０１９０】
図３は、敗血症データパネルの無監視の階層クラスタリングヒートマップを示す（赤＝高い発現、緑＝低い発現）。横列は遺伝子であり、縦列は敗血症／対照の試料である。ハイライトした試料は潜在的な異常値である。
【０１９１】
６．  さらなる実施例
バイオマーカーセット又はバイオマーカーパネルの有用性をさらに証明するために、１５１の患者の試料の次のコホートを使用した。１５１の試料の細分類は以下である：３６の対照、６の感染を有さないＳＩＲＳ、２４のＳＩＲＳを有する感染、６７の軽症敗血症、１２の重症敗血症、及び６の敗血性ショック／潜在性ショック。次の段落における実施例は、この試料セットに基づく。
【０１９２】
以下の第２４表は、対照と敗血症についてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルのそれぞれのバイオマーカーの予測値（曲線下面積（ＡＵＣ））を示す。ある実施形態において、本明細書において記載したそれぞれの方法又はキットは、第２４表において挙げられるバイオマーカー又は遺伝子のいずれか１つを使用する。
【表２３】
2016526888.tif 000027
【０１９３】
ある実施形態において、本明細書において記載したそれぞれの方法又はキットは、リスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子の１つ以上、及びそれらのあらゆる組合せを使用する。
【０１９４】
以下の第２５表は、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴ１／ＧＡＰＤＨを有する、対照と敗血症についてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルの２つのバイオマーカーの例示的なセットの予測値（曲線下面積（ＡＵＣ））を示す。
【表２４−１】
2016526888.tif 000028
【表２４−２】
2016526888.tif 000029
【表２４−３】
2016526888.tif 000030
【表２４−４】
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【表２４−５】
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【表２４−６】
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【表２４−７】
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【表２４−８】
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【表２４−９】
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【表２４−１０】
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【０１９５】
以下の第２６表は、対照／ＳＩＲＳを有さない感染／感染を有さないＳＩＲＳと軽症敗血症／重症敗血症／敗血性ショックについてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルのそれぞれのバイオマーカーに与えられた重さを示す。
【表２５−１】
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【表２５−２】
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【表２５−３】
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【０１９６】
以下の第２７表は、軽症敗血症と重症敗血症／敗血性ショックについてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルのそれぞれのバイオマーカーに与えられた重さを示す。
【表２６−１】
2016526888.tif 000041
【表２６−２】
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【表２６−３】
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【０１９７】
ある実施形態において、本明細書において記載したそれぞれ方法又はキットは、リスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のいずれか５つを使用する。
【０１９８】
以下の第２８表は、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴ１／ＧＡＰＤＨを有する、対照と敗血症についてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルの５つのバイオマーカーの例示的なセットの予測値（曲線下面積（ＡＵＣ））を示す。
【表２７】
2016526888.tif 000044
【０１９９】
ある実施形態において、本明細書において記載したそれぞれ方法又はキットは、リスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のいずれか１０を使用する。
【０２００】
以下の第２９表は、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴ１／ＧＡＰＤＨを有する、対照と敗血症についてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルの１０のバイオマーカーの例示的なセットの予測値（曲線下面積（ＡＵＣ））を示す。
【表２８−１】
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【表２８−２】
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【０２０１】
ある実施形態において、本明細書において記載したそれぞれ方法又はキットは、リスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のいずれか１２を使用する。
【０２０２】
以下の第３０表は、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴ１／ＧＡＰＤＨを有する、対照と敗血症についてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルの１２のバイオマーカーの例示的なセットの予測値（曲線下面積（ＡＵＣ））を示す。
【表２９−１】
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【表２９−２】
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【表２９−３】
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【表２９−４】
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【０２０３】
ある実施形態において、本明細書において記載したそれぞれ方法又はキットは、リスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のいずれか３０を使用する。
【０２０４】
以下の第３１表は、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴ１／ＧＡＰＤＨを有する、対照と敗血症についてのリスト１に列挙される４０のバイオマーカー又は遺伝子のバイオマーカーパネルの３０のバイオマーカーの例示的なセットの予測値（曲線下面積（ＡＵＣ））を示す。
【表３０−１】
2016526888.tif 000051
【表３０−２】
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【表３０−３】
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【表３０−４】
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【表３０−５】
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【０２０５】
図４は、敗血症／非敗血症の患者の分類を可能にする６モデル（Ａ〜Ｆ）を示す箱型図を示す。それぞれ水平な線によって示された、敗血症／非敗血症間の予め決められたカットオフは、達成可能な最も高い合計の正確性のための決定則に基づく。それぞれのモデルについて、１００の試料に基づくトレーニングセットを製造し（左）、６１の試料のブラインド試験を使用して、モデルを検証した。モデルは、以下である：
・（Ａ）標準化ハウスキーピング遺伝子として４０遺伝子及びＨＰＲＴ１を使用
・（Ｂ）標準化ハウスキーピング遺伝子として８遺伝子及びＨＰＲＴ１を使用
・（Ｃ）標準化ハウスキーピング遺伝子として４０遺伝子及びＧＡＰＤＨを使用
・（Ｄ）標準化ハウスキーピング遺伝子として８遺伝子及びＧＡＰＤＨを使用
・（Ｅ）標準化ハウスキーピング遺伝子として４０遺伝子並びにＨＰＲＴ１及びＧＡＰＤＨの双方を使用
・（Ｆ）標準化ハウスキーピング遺伝子として１１遺伝子並びにＨＰＲＴ１及びＧＡＰＤＨの双方を使用。
【０２０６】
以下の第３２表は、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴ１／ＧＡＰＤＨを有する、それぞれの遺伝子の数（すなわち４０遺伝子、８遺伝子、４０遺伝子、８遺伝子、４０遺伝子、１１遺伝子）についての、前記６モデルの予測値（ＡＵＣ）を示す。
【表３１】
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【０２０７】
図５は、３７遺伝子（Ａ）又は１４遺伝子（Ｂ）に基づく８５の敗血症患者の箱形図を示す。重症敗血症を軽症敗血症から分離することを可能にする２つのモデルを使用して重さスコアリングシステムを実施した。
【０２０８】
図６は、敗血症の重症度とタンパク質濃度との相関を示す、対照、感染、軽症敗血症及び重症敗血症／敗血性ショックから選択される患者における平均血漿タンパク質濃度（Ｓ１００Ａ１２）を示す。
【０２０９】
有利には、本発明において記載した方法、バイオマーカー又は複数のバイオマーカー、及びキットは、敗血症の早期の検出及び診断のため、並びにかかる患者についての治療及び転帰の改良のための患者のモニタリングのためにも使用できる。
【０２１０】
有利には、本発明において記載した方法、バイオマーカー又は複数のバイオマーカー、及びキットは、敗血症治療のための候補として、被験者又は患者を識別及び／又は分類するために使用できる。
【０２１１】
７．  診断キット
診断キットは、抗体、アプタマー、増幅システム、検出試薬（色素原、蛍光体、等）、希釈緩衝液、洗浄溶液、対比染料、又はそれらの任意の組合せを含んでよい。キットの構成を、前述の方法の、手動での又は部分的若しくは全体的に自動化した実施のためにひとまとめにしてもよい。キットを含む他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物、及び場合によりそれらの使用のための支持を含むキットを考慮する。かかるキットは、例えば、患者の集団を階層化すること、診断、予後、治療処置の決定を導くこと、及び他の適用を含む、種々の使用を有してもよい。
【０２１２】
当業者は、本明細書において記載された発明が、特に記載されているもの以外に、変更及び改変することが可能であることを認識している。本発明は、全てのかかる変更及び改変を含む。本発明は、本明細書に関する又は本明細書において示される、ステップ、特徴、調製物及び化合物の全て、個々に若しくは一括して及びあらゆる及び全ての組合せ、又は任意の２つ以上のステップ若しくは特徴も含む。
【０２１３】
本明細書において挙げられているそれぞれの文献、参照、特許文献又は特許は、参照をもって本明細書に例示的に組込まれ、本明細書の一部として読者によって読まれる及び顧慮されるべきであることを意味する。本明細書において挙げられているそれぞれの文献、参照、特許文献又は特許は、単に簡潔さの理由のために本明細書において繰り返さない。
【０２１４】
本明細書において挙げられている又は参照をもって本明細書に組込まれたあらゆる文献におけるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示、説明、製品仕様及び製品シートは、参照をもって本明細書に組込まれたものとし、本発明の実施において使用されてもよい。
【０２１５】
本発明は、本明細書において記載された特定の実施形態のいずれかによって範囲を制限されるべきでない。これらの実施形態は、例示のみの目的を意図している。機能的に同等の生成物、調製物及び方法は、明らかに、本明細書において記載された本発明の範囲内にある。
【０２１６】
本明細書において記載された発明は、１つ以上の値（例えばサイズ、濃度等）の範囲を含んでよい。値の範囲は、範囲を定義する値、及び範囲に境界線を定める値に直接に隣接する値と同様又は実質的に同様の結果を導く範囲に隣接した値を含む範囲内の全ての値を含むことを理解する。
【０２１７】
本明細書の全体にわたって、文脈上他に要求されない限り、“含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”の用語又はその変形、例えば“含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”又は“含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”は、あらゆる他の整数又は整数の群の除外ではなく、規定された整数又は整数の群の包含を意味することを理解する。本開示において、及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、例えば“含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“含有される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）”、“含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”等の用語は、米国特許法におけるものによる意味を有することができ、例えば、前記用語は、“含む（ｉｎｌｕｄｅｓ）”、“含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）”、“含んでいる（ｉｎｌｕｄｉｎｇ）”等の意味であってよく、例えば“から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）”及び“から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）”の用語は、米国特許法におけるものによる意味を有することができ、例えば、前記用語は、明確に列挙されていない要素を考慮するが、しかし、先行技術において見出される要素又は本発明の基本的な又は新規の特徴に影響する要素を除くことにも注意する。
【０２１８】
本明細書において使用される選択された用語についての他の定義は、本発明の詳細な説明の範囲内で見出されてよく、全体にわたって適用されてもよい。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての他の科学的及び技術的な用語は、本発明に属する通常の当業者に慣用的に理解される意味と同様の意味を有する。
【０２１９】
前記で特に挙げられていない本発明の他の特徴、利益及び利点は、当業者によるこの記載から理解されてもよい。
【０２２０】
前述の発明は、説明及び例によって、及び１つ以上の実施形態に関して多少詳細に記載されているが、明確な理解の目的のために、本発明の新規の教示及び利点を考慮して、ある変化、変更及び改良を、記載された本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく当業者に実施してもよいことは、当業者に容易に明らかである。
【０２２１】
本発明は個々の実施形態を包含するが、議論される実施形態の組合せも含むことがさらに認識される。例えば、一実施形態において記載された特徴は、他の実施形態において記載された特徴を相互に除外せず、本発明のさらに他の実施形態の形態と組み合わせてもよい。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016526888.tif 000069
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2016526888.tif 000071
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