(57)【要約】  本方法は、ポリマーナノ粒子を製造する。ポリマー溶液は、コレクタに対しノズルを通してスプレーされる。電界を形成するために、電圧をノズルに対して印加するなどして、電界がノズルに形成される。ノズルに印加される電圧は、約１０（キロボルト）から約３０（キロボルト）であり、ノズル先端からコレクタまでの距離は約１（センチメートル）から約１０（センチメートル）、及びポリマー濃度は、約０．０１％から約０．５％ｗ／ｗである。好ましくは、接地された液体コレクタが使用される。本発明は、約３００ｎｍより小さい、好ましくは、約１５０ｎｍより小さいサイズを有する生体適合性単分散ナノ粒子を提供する。ペイロードは、同じ粒子上に、治療剤及び診断剤のような一つ以上のペイロードを含んで、関連付けられ、及び効果を保持し得る。好ましい粒子は、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ）又はアクリル酸エステル類似物である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーナノ粒子を形成する方法であって、前記方法は、
ノズルを通してコレクタに対してポリマー溶液をスプレーすること、及び、
スプレーと同時に前記ノズルの周辺に電界を印加することを含み、
ノズル先端からコレクタまでの距離が、約１（センチメートル）から約１０（センチメートル）であり、及びポリマー濃度が約０．０１％から約０．５％ｗ／ｗである、
ことを特徴とする、
ポリマーナノ粒子を形成する方法。
【請求項２】
前記電界は、前記ノズルに電圧を印加することによって形成され、前記電圧は約１０（キロボルト）から約３０（キロボルト）である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コレクタが液体を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記液体が、接地された脱イオン水を含む、
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、ナノ粒子に変形するために、少なくとも５ｋＤａの分子量、及び十分な粘弾性を有するポリマーを含むポリマーである、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーは、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ、又はそのアクリル酸エステル類似物を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アクリル酸エステル類似物が、ポリ（アクリル酸エチル）と、ポリ（アクリル酸ブチル）と、ポリ（アクリル酸メチル）と、中性、アルカリ性及び酸性のアクリル酸エチル及びアクリル酸メチルのポリマーの共重合体と、メタクリル酸アンモニウム共重合体と、アミノアルキルメタクリレート共重合体と、ポリ（メタクリル酸メチル）ＰＭＭＡ、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ＰＨＥＭＡ、及びポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）］メタクリルアミドを含むビニルラクタム共重合体と、から選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー溶液を調製する最初のステップをさらに含み、前記調製は、前記ポリマー溶液にペイロードを混合することをさらに含み、前記ペイロードは、前記スプレー及び印加の間にカプセル化される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペイロードが、治療又は診断のための分子の一つを含む、
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペイロードが、多様な治療又は診断のための分子を含む、
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペイロードは、治療及び診断のための分子の両方を含む、
こと特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
均一サイズ化された単分散ナノ粒子を得るために、ナノ粒子を収集すること、及びサイズ分離すること、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子の表面の官能基化すること、
をさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ溶液が、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／メタノール（Ｍｅ）溶媒を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記スプレーが、前記ノズルを通して一定の比率でポリマーを流すことを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノ粒子内にペイロードをカプセル化すること、又は埋め込むこと、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペイロードが薬理活性剤、抗炎症剤、薬剤、又は生物活性剤の一つを含む、
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コレクタが液体を含み、及び前記スプレーの間に前記液体を攪拌することをさらに含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
約３００ｎｍより小さいサイズを有する、
生体適合性単分散ポリマーナノ粒子。
【請求項２０】
薬理活性剤、抗炎症剤、又は生物活性剤のひとつであるペイロードに関連付けられる、
請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
薬剤であるペイロードを埋め込み、又はカプセル化する、
請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
複数のペイロードを埋め込み、又はカプセル化する、
請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記ポリマーが、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ）、又はアクリル酸エステル類似物を含む、
請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
前記アクリル酸エステル類似物が、ポリ（アクリル酸エチル）と、ポリ（アクリル酸ブチル）と、ポリ（アクリル酸メチル）と、中性、アルカリ性及び酸性のアクリル酸エチル及びアクリル酸メチルのポリマーの共重合体と、メタクリル酸アンモニウム共重合体と、アミノアルキルメタクリレート共重合体と、ポリ（メタクリル酸メチル）ＰＭＭＡ、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ＰＨＥＭＡ、及びポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］を含むビニルラクタムの共重合体と、から選択される、
ことを特徴とする請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
約１５０ｎｍより小さいサイズを有する、
請求項１９に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１/８９５，１００号に基づいて、米国特許法第１１９条の下、及び全ての適用可能な法律及び条約から、優先権を主張するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明の分野は、ナノ材料である。本発明は、ポリマーナノ粒子、形成方法、及び適用に関する。適用例は、画像化、診断法、及びドラッグデリバリーを含む。
【背景技術】
【０００３】
生分解性及び生体適合性ポリマーのポリマーナノ粒子は、様々な適用を目的とし、制御されたドラッグデリバリー及び薬物標的を具体的な目的とする。薬剤のようなペイロードを輸送するために、多様な技術がポリマーナノ粒子の形成及びナノ粒子の官能基化に関して研究されてきた。ドラッグデリバリーポリマーナノ粒子を作成するための形成技術の例は、バルク混合、高圧均質化、ナノ沈殿、及び二重エマルションを含む。非特許文献１を参照する。
【０００４】
ナノ沈殿及び二重エマルション技術は、ポリマーナノ粒子化合物を得るために、水中油型（Ｏ／Ｗ）でポリマーを含む有機溶媒を乳化する。基本的な処理の改良は、溶媒効果、濃度効果、高圧均質化、及び同様の変化によって得られる。共通する合成手順は、水中油型又は油中水型エマルション処理として残っている。残存する有機溶媒及び残存するモノマーの存在により引き起こされる毒性のために、問題が生じる。非特許文献２を参照する。
【０００５】
ＭＭＡ（メタクリル酸メチル）モノマーを用いたエマルション処理によるＰＭＭＡ（ポリ（メタクリル酸メチル））ナノ粒子の合成も報告されている。非特許文献３を参照する。このアプローチの重大な欠点は、ＭＭＡモノマー及び残存する有機溶媒の存在による毒性であり、前記毒性は、低い薬剤のカプセル化効率をもたらす。エマルション技術は、高サイズ（１００ｎｍより大きい）の多分散粒子も不要に製造する。加えて、これらの技術によって製造された粒子は、凝集への強い傾向を有する。これらの問題に対処したいくつかの報告されている試みは、ポリマー／溶媒の体積の０．１重量％までにポリマーの濃度を制限している。しかしながら、ポリマー濃度を低下させることは、薬剤のカプセル化についてさらなる課題をもたらす。
【０００６】
ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、事前に決められた時間の間、一般に数十時間の間、カプセル化された化合物の効果的な輸送のために体循環に残るべきである。全身に投与されたＤＤＳナノ粒子は、細網内皮系によってクリアランスされる前に標的組織におけるＤＤＳナノ粒子の蓄積量を増やすため、及び、標的細胞内に効率的に取り入れられるために、より長い時間の間、循環内に残るべきである。前記蓄積は、粒子のサイズ、表面特性及び粒子の形のようなナノ粒子の物理化学的な特徴によって著しく影響を受け得る。約３００ｎｍより実質的に大きい粒子又は分子、及び多分散粒子は、血管系内で非効率的かつ十分に吸収されない傾向がある。非特許文献４を参照する。これは、ドラッグデリバリーとして大きい粒子に対する全身へのドラッグデリバリーの効能を無効にする。
【０００７】
他の先行技術は、ナノ粒子を形成する重合の前に、ＭＭＡとＰＥＧとの共重合によってＰＭＭＡナノ粒子を製造する。例えば、非特許文献５を参照する。このアプローチは、表面及びナノ粒子内の両方に存在するＰＥＧを有するナノ粒子の結果となり得る。この存在は、１）ＰＥＧの水溶性が高いことによる、薬剤放出特性の非常に多様な変化、２）ナノ粒子の前例のない分解、及び３）ＰＭＭＡ並びにＰＭＭＡ類似物の固有の物理化学的特性の変化、のような欠点をもたらし得る。
【０００８】
Ｊａｖｏｒｅｋは電気流体力学（ＥＨＤ）の処理を用いた粒子の合成に関する４０以上の研究のレビューを刊行した。しかし、この処理では、３００ｎｍ又はそれ以上の粒子の製造を実証しただけである。非特許文献６を参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｕｍａｒｅｓｈ  Ｓ．  Ｓｏｐｐｉｍａｔｈ，  Ｔｅｊｒａｊ  Ｍ．  Ａｍｉｎａｂｈａｖｉ，  Ａｎａｎｄｒａｏ  Ｒ．  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，  Ｗａｌｔｅｒ  Ｅ．  Ｒｕｄｚｉｎｓｋ，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌｕｍｅ７０，Ｉｓｓｕｅｓ１−２，Ｐａｇｅｓ１−２０，（２００１）．
【非特許文献２】Ｃａｔａｒｉｎａ  Ｐｉｎｔｏ  Ｒｅｉｓ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ｊ．  Ｎｅｕｆｅｌｄ，  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｊ．  Ｒｉｂｅｉｒｏ，  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｖｅｉｇａ，“Ｎａｎｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｉｓｓｕｅ１，Ｐａｇｅｓ８−２１（２００６）．
【非特許文献３】Ａ．Ｎ．Ｍｅｎｄｅｓ，  Ｉ．Ｈｕｂｂｅｒ，  Ｍ．Ｓｉｑｕｅｉｒａ，  Ｇ．Ｍ．Ｂａｒｂｏｓａ，  Ｄ．Ｌ．Ｍｏｒｅｉｒａ，  Ｃ．Ｈｏｌａｎｄｉｎｏ，  Ｊ．Ｃ．Ｐｉｎｔｏ，  Ｍ．Ｎｅｌｅ，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，”  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，３１９，３４−４０（２０１２）．
【非特許文献４】Ｙｕａｎ，  Ｆａｎ；  Ｄｅｌｌｉａｎ，  Ｍａｒｃ；  Ｆｕｋｕｍｕｒａ，  Ｄａｉ；  Ｌｅｕｎｉｇ，  Ｍｉｃｈａｅｌ；  Ｂｅｒｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ａ．；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｐ．；  Ｊａｉｎ，  Ｒａｋｅｓｈ  Ｋ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，“Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｚｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｕｔｏｆｆ  ｓｉｚｅ，”５５（１７），３７５２−６（１９９５）．
【非特許文献５】Ｊｉｎ  Ｓｏｏｋ  Ｋｉｍ及びＪｉ  Ｈｏ  Ｙｏｕｋ，“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ  ｌａｙｅｒ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１７，ｉｓｓｕｅ１１，ｐｐ９２６−３０（２００９）．
【非特許文献６】Ａ．Ｊａｗｏｒｅｋ，“Ｍｉｃｒｏ−  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｎｇ，”Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １７６，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｐａｇｅｓ  １８−３５（２００７）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本方法は、ナノ粒子を製造する。ポリマー溶液は、コレクタに対してノズルを通してスプレーされる。電界を形成するために電圧をノズルに対して印加するなどして、電界がノズルに形成される。ノズルに印加される電圧は、約１０（キロボルト）から約３０（キロボルト）であり、ノズルの先からコレクタまでの距離は、約１（センチメートル）から約１０（センチメートル）であり、及びポリマーの濃度は、約０．０１％から約０．５％ｗ／ｗである。好ましくは、接地された液体コレクタが用いられる。本発明は、約３００ｎｍより小さい、好ましくは約１５０ｎｍより小さいサイズを有する生体適合性単分散ポリマーナノ粒子を提供する。ペイロードは、同じ粒子上に治療剤及び診断剤のような、一つ以上のペイロードを含んで、関連付けられ、及び効果を保持し得る。好ましい粒子は、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ）又はアクリル酸エステル類似物である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子（ナノ粒子）合成のための好ましい実施形態である、エレクトロスプレー法を説明する概略図である。
【図２】好ましい実施形態である、ナノ粒子にカプセル化された二つの化合物の概略図である。
【図３Ａ】ＰＥＧを用いてナノ粒子の表面官能基化のための好ましい合成方法を説明する概略図である。
【図３Ｂ】表面官能基化のための好ましい処理を段階的に説明する概略図である。
【図４Ａ】実験的に製造された、本発明のナノ粒子にカプセル化されたＩＣＧのＴＥＭ画像である。
【図４Ｂ】実験的に製造された、本発明のナノ粒子にカプセル化されたＩＣＧのＴＥＭ画像である。
【図５】実験的に合成された、カプセル化されたＩＣＧを伴うペグ化されていない及びペグ化されたナノ粒子のサイズ分布の結果（ＤＬＳ結果）のデータグラフであり、
【図６】実験で製造された本発明のＩＣＧ溶液及びナノ粒子にカプセル化されたＩＣＧ溶液のＵＶ−Ｖｉｓ分光法を示すデータグラフである。
【図７】実験的に製造された本発明のナノ粒子の安定性分析を、ＤＳＬ測定に基づくサイズに関して説明するグラフであり、エラーバーは平均値からの標準偏差を表す。
【図８Ａ】実験的に製造されたナノ粒子の保持を説明するための、ＩＶＩＳ画像化システムを用いたマウスの全体像の蛍光撮影の画像である。
【図８Ｂ】実験的に製造されたナノ粒子の保持を説明するための、ＩＶＩＳ画像化システムを用いたマウスの全体像の蛍光撮影の画像である。
【図８Ｃ】実験的に製造されたナノ粒子の保持を説明するための、ＩＶＩＳ画像化システムを用いたマウスの全体像の蛍光撮影の画像である。
【図９】実験的に製造されたナノ粒子を用いた、マウスの全体像に対する規格化された平均強度を詳述した定量分析を説明するするデータのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、画像化、診断法、及びドラッグデリバリーシステムに適用するための新規な、及び安定なポリマーナノ粒子の開発に関する。本発明の好ましい方法は、組成物の制御された高電界電気流体力学形成方法を提供する。前記方法は、ポリマーナノ粒子及びナノ粒子ドラッグデリバリーシステムを製造し得る。前記ナノ粒子は単分散、及び約３００ｎｍ又はそれより小さく、好ましくは約１５０ｎｍ又はそれより小さくなり得る。
【００１３】
好ましいナノ粒子は、一つ以上のペイロードを輸送し得る。多様な薬剤等の多様な化合物が、ナノ粒子の好ましい実施形態に関連付けられ得る。
【００１４】
本発明の好ましい制御されたエレクトロスプレー法は、一つのポリマーマトリクス内に多様な化合物を取り込むことができ、マトリクスに存在する任意の与えられた化合物の所望の固有の特性、及びポリマーマトリクスの完全性は、ポリマーマトリクスの存在、又は任意の他のカプセル化された化合物若しくは化合物の群の存在によって、悪影響を受けないことを特徴とする。これらの属性は、ナノ粒子システムを形成する各々の個々の成分に対して、独立及び関連した特性を与える。
【００１５】
好ましい実施形態は、ナノ粒子の表面官能基化を含む。実施形態は、カルボキシル基に官能基化されたナノ粒子を提供する。
【００１６】
本発明の具体的に好ましい形成方法は、ナノ粒子のサイズの制御、及び単分散粒子を提供する高電界電気流体力学方法によって、ポリ（メタクリル酸メチル−コ−メタクリル酸）（ＰＭＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨとも呼ばれる）、及びその他のアクリル酸エステル類似物を形成する。好ましい実施形態は、単分散であって、約３００ｎｍ又はそれより小さいＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子を提供する。具体的な好ましい実施形態は、単分散であって、１５０ｎｍ又はそれより小さい。具体的なサイズは、形成パラメータを調節することによって選択され得、及び輸送される一又は複数のペイロードに依存して選択され得る。一つ以上のペイロードは、前記形成法の間に、ドラッグデリバリーの輸送体を形成するために取り込まれ得る。
【００１７】
本発明の好ましい方法において、エレクトロスプレーに対する電圧は、約１０（キロボルト）から約３０（キロボルト）であり、先端からコレクタまでの距離は約１（センチメートル）から約１０（センチメートル）及び、ポリマー濃度は、約０．０１％から約０．５％ｗ／ｗ（±１０％）である。好ましい実施形態において、液体コレクタが使用され、及び好ましくは接地された脱イオン水である。本発明の好ましい実施形態は、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ及びその類似物で構成される高度に均一なナノ粒子を提供する。本発明の前記方法は、粒子のサイズの優れた制御を可能にするのに有利である。小さいサイズの均一な単分散粒子は、細網内皮系による患者からのクリアランスの低下及び標的細胞によるより効率的な吸収を提供する。
【００１８】
他の好ましい実施形態は、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨの類似物を含み、本方法の文脈中の前記ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ類似物は、少なくとも５ｋＤａより大きく、及び好ましくは２５ｋＤａより大きい分子量を有し、及びナノ粒子に変形するために十分な粘弾性を有するポリマーを含む。ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨの具体的に好ましい類似物は、ポリ（アクリル酸エチル）と、ポリ（アクリル酸ブチル）と、ポリ（アクリル酸メチル）と、中性、アルカリ性及び酸性のアクリル酸エチル及びアクリル酸メチルのポリマーの共重合体と、メタクリル酸アンモニウム共重合体と、アミノアルキルメタクリレート共重合体と、ポリ（メタクリル酸メチル）ＰＭＭＡ、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ＰＨＥＭＡ、及びポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］を含むビニルラクタムの共重合体と、を含む。好ましくは、前記ポリマーは、ポリ（メタクリル酸メチル）ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ、及びその類似物から選択される。
【００１９】
本発明の実施形態は、直径約３００ｎｍ及びそれより小さい、及び具体的な好ましい実施形態において、約１５０ｎｍ及びそれより小さい直径を有する単分散ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子を含む。輸送されるペイロードは、前記サイズに影響を与え得る。本発明の実施形態は、単分散ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子を形成するためのエレクトロスプレー法を含む。
【００２０】
必ずしも特許に必要ではないが、及び、前記理論に縛られるものではないが、本発明の実施形態は、ＤＤＳナノ粒子のより優れた制御と均一性を提供しつつ、ＤＤＳナノ粒子のサイズを同時に縮小させるための初の方法を提供すると発明者達は考えている。この発明は、均一なＤＤＳナノ粒子の事前調製の方法を提供する。本発明の方法の他の利点は、目標とする適用方法に基づいて「オンデマンド型」の表面官能基化を可能にする事前調製されたポリマー及び共重合体を利用できることである。
【００２１】
背景技術で記述したような先行技術とは異なって、本発明の好ましいエレクトロスプレー法は、一つのポリマーマトリクス内に多様な化合物を組み込み得る。所望の取り込まれた特性、及びポリマーマトリクス並びにマトリクス中に存在する化合物の完全性は、ポリマーマトリクスの存在、又はその他のカプセル化されている化合物、あるいは化合物の群の存在による悪影響を受けない。これらの属性は、ナノ粒子システムを形成する各々の個別の成分に独立した及び関連した特性を与える。
【００２２】
好ましいエレクトロスプレー法は、単分散した液滴を形成する。液滴のサイズは、処理のパラメータに依存して数十ナノメートルから数百マイクロメートルまで変化し得る。好ましい処理は制御された形態で構成されたナノ粒子を形成し、そして高い薬剤／核酸カプセル化効率を提供し得る。前記好ましい方法は、エマルション方法に固有の毒性の問題を回避する。
【００２３】
本発明の粒子は、特定の細胞に対し親和性を有する、又はより長い血中滞留時間を提供するために修飾された表面を有するようにも製造され得る。これらの特徴は、増強された浸透性及び保持力、又は細胞特定標的指向性を提供する。
【００２４】
本発明の好ましい方法は、事前調製されたＰＭＭＡポリマー又はその類似物を用いて、まだどこにも報告がなされていない比較的高いカプセル化の効率、薬剤負荷効率、及び均一な粒子サイズ分布を備える、ＰＭＭＡ、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ、又はその類似物の単分散ナノ粒子を提供する。ポリ（メタクリル酸メチル−コ−メタクリル酸）は、ポリ（メタクリル酸メチル）及びメタクリル酸の共重合から作られるポリマーである。ＰＭＭＡ内のこのメタクリル成分を使用する事の特定の目的は、表面の官能基化を重合システムに提供することである。換言すると、−ＣＯＯＨ基が存在するＰＭＭＡは、化学結合によって、生体適合性だけでなく官能基化が可能である。
【００２５】
前記理論に縛られるものではないが、本発明の実施形態は、相補的な機能性のためにＰＭＭＡナノ粒子システム内に多様な化合物をカプセル化する、例えば、治療と同時に可視化を可能にするため、各々のナノ粒子内に、所望の比率で造影剤及び治療剤をカプセル化する、初の方法を提供するものであると考えられる。
【００２６】
本発明を実証するための実験は、事前調製されたポリ（メタクリル酸メチル−コ−メタクリル酸）ポリマー（ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ）を用いて、カルボキシル基に官能基化されたＰＭＭＡナノ粒子のナノ粒子合成を実証した。
【００２７】
本発明の実施形態は、ナノ粒子と同時にナノファイバーの断続的な形成をもたらし得る、背景技術で述べられた先行の共重合技術と関連するような問題を回避する。ナノファイバーは、ドラッグデリバリーへの適用には望ましくない。本発明のナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでペイロードを輸送し得る。有利なことに、好ましい実施形態のＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子は、生体適合性であるが、生分解性ではない。本発明の診断及び治療の方法において、ＰＭＡＡ−ＣＯＯＨナノ粒子はｉｎ  ｖｉｖｏで輸送され、標的の位置で関連するペイロードを備えて多量に集合することを可能にする。関連するペイロードは、ナノ粒子上又はナノ粒子中にカプセル化され、埋め込まれ、付着させられ、結合され、又は浸透させられ、あるいは、その表面に吸着され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏの放出の好ましい方法において、ペイロードは、超音波又は電磁気エネルギーのような、適用される外部エネルギーに応答して放出される。他の好ましい方法において、ペイロードは酵素、タンパク質、又は化学反応によって放出される。
【００２８】
一又は複数の分子又は化合物は、治療又は診断効果を直接的又は間接的に補助するために、分子又は化合物の化学修飾をすることなく、ペイロードとして関連付けられ得る。分子は、ファンデルワールス力（結合）を含む、共有結合、静電結合、物理吸着によって、表面に付着させられ得る。
【００２９】
ゼロ距離クロスリンカーを含む表面官能基化試薬、すなわち、カルボジイミド及びその誘導体、具体的には、ＥＤＣ（カルボジイミド）が、本発明において採用される。それらは、標的分子との間の末端架橋部分（アミド結合）を形成せずに、一級アミン（−ＮＨ２）に対してカルボキシレート（−ＣＯＯＨ）の直接的な結合をもたらす。さらに、ＮＨＳエステル、すなわち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは、カルボキシレート分子のＥＤＣ活性化によって形成された反応基を用いるさらなる表面官能基化のステップのために使用される。
【００３０】
好ましいポリマーナノ粒子は、患者に対して全身、口、口腔、舌下、目、局所、皮膚、鼻、肺、及び／又は直腸への投与によって、ペイロードとして関連付けられた治療剤を輸送し得る。
【００３１】
ポリマーナノ粒子の好ましい実施形態は、ペイロードとして関連付けられた一又は多様な化合物を有し得る。好ましい実施形態において、一又は多様な化合物が、各々のナノ粒子内にカプセル化され又は埋め込まれている。化合物及びナノ粒子のその完全性並びに特性は、形成の間、保持される。
【００３２】
好ましいペイロードは、抗増殖剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗有糸分裂性剤、抗血小板薬、抗凝固剤、抗フィブリン、アンチトロンビン、細胞増殖抑制剤、抗生物質、抗アレルギー薬、抗酵素剤、抗血管新生薬、細胞保護剤、中枢神経系作用薬、抗菌薬、心保護薬、及び抗酸化剤、又は任意のそれらの組み合わせを含む群から選択される生物活性剤であり得る。
【００３３】
さらに好ましいペイロードは、ナノ粒子内に埋め込まれ又はカプセル化された一つ以上の活性薬効成分であり得、及び、造影剤も含み得る。
【００３４】
好ましいナノ粒子は、ナノ粒子中に埋め込まれ、結合され、浸透させられ、又はカプセル化され、又はナノ粒子の表面に吸着された薬剤、造影剤及び同様の組み合わせのような、粒子によって輸送される活性剤を含む。
【００３５】
好ましい実施形態は、ペグ化されたＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ及びその類似物のナノ粒子を調製する方法を提供する。前記方法は、カルボジイミド及びＮＨＳエステルを用いるＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ及びその類似物のカルボキシル基、及びＰＥＧとナノ粒子の間のＮＨ＋−ＣＯＯ−ＰＥＧ結合によってナノ粒子の表面上のＰＥＧの化学結合の活性化を含む。
【００３６】
本発明の好ましい画像化の方法は、粒子増強Ｘ線／断層撮影レントゲン写真術（ＣＴ）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。実施形態は、対象の体の標的細胞又は標的組織の診断方法を提供する。本発明のナノ粒子は、造影剤を含み、及び標的細胞又は標的組織へのターゲットデリバリに効果的な一つ以上の標的剤に関連付けられる。
【００３７】
ポリマーナノ粒子の好ましい実施形態は、多様な化合物に関連付けられ、及び相補的な機能性を提供する。相補的な機能は、例えば、画像強調及び治療の両方を提供するために、事前に決定された所望の比率で各々のナノ粒子に関連付けられ得る、造影剤及び治療剤を含み得る。
【００３８】
好ましいポリマーナノ粒子は、生分解性及び生体適合性のどちらでもなく、及び親水性の分子を備えて立体的に安定化された表面を有する。本発明の製造方法は、治療剤及び診断剤の輸送におけるナノ粒子のパフォーマンスを改良するために調整される表面修飾能、立体的安定性、表面官能基化、及び一般の特徴を提供する。
【００３９】
多くの活性成分は、好ましいナノ粒子に関連付けられ得る。活性成分は、物質が有機生物に投与されたとき、有機生物が活性成分であると見なす生物学的影響を有する物質である。好ましいナノ粒子は、親水性及び疎水性の活性成分に関連付けられ得る。
【００４０】
好ましいナノ粒子は、抗血小板試薬と、抗凝固剤と、抗フィブリンと、アンチトロンビンと、細胞増殖抑制剤と、抗生物質と、抗アレルギー薬と、抗増殖剤と、抗炎症剤と、抗腫瘍剤と、抗有糸分裂性剤と、抗酵素剤と、抗血管新生薬と、ＣＮＳ薬及び抗菌薬と、抗真菌剤と、局所麻酔薬と、細胞保護剤と、心保護薬と、抗酸化剤と、又は任意のそれらの組み合わせ、を含む群から選択される一つ以上の生物活性剤に関連付けられ得る。
【００４１】
好ましいナノ粒子は、限定されるものではないが、アルツハイマー病のために用いる薬、麻酔剤、先端巨大症治療剤、鎮痛剤、抗喘息薬、抗がん剤、抗凝固剤、及び抗血栓剤と、抗けいれん薬、糖尿病治療剤、鎮吐薬、抗緑内障薬、抗ヒスタミン剤、抗感染症薬、抗パーキンソン病薬、抗血小板薬、抗リウマチ薬、鎮痙剤、及び抗コリン薬と、鎮咳剤、炭酸脱水酵素阻害薬、循環器官用薬、コリンエステラーゼ阻害薬、ＣＮＳ疾患治療、ＣＮＳ刺激薬、避妊剤、嚢胞性繊維症管理、ドーパミン受容体作動薬、子宮内膜症管理、勃起不全治療、妊娠促進薬、胃腸薬、及び免疫調節薬と、疫抑制薬、記憶増強剤、偏頭痛薬、筋弛緩薬、ヌクレオシド誘導体、骨粗鬆症管理、副交感神経興奮薬、プロスタグランジン、精神治療剤、鎮静剤、催眠薬、及び精神安定剤と、肌疾患のために使用される薬剤、ステロイド剤、及びホルモン剤と、を含む、本発明で採用され得る薬理活性剤に関連付けられ得る。
【００４２】
好ましいナノ粒子は、限定されるものではないが、ナイトロジェンマスタード類、シクロホスファミド、メクロレタミン又はムスチン（ＨＮ２）、ウラムスチン又はウラシルマスタード、メルファラン、エニルラシル、クロランブシル、イホスファミド、ベンダムスチン、ニトロソ尿素類、カルムスチン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、ロムスチン、及びストレプトゾシン、のようなアルキル化剤と、ブスルファン、チオテパ、プロカルバジン、アルトレタミン、及びテトラジン類（ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド）、のようなアルキルスルホン酸及びその類似物と、ピコプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、及び四硝酸トリプラチン、のような白金製剤化学療法薬（白金類似物と呼ばれる）と、プリン、ピリミジン類似物、抗葉酸剤、塩基類似物、及びヌクレオシド類似物、のような代謝拮抗剤と、（アザチオプリン及びメルカプトプリン）、５−アザデオキシシトシン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、アラビノシルシトシン、カペシタビン、ゲムシタビン及びデシタビン、ペメトレキセド、メカプトプリン、チオグアニン、フルダラビンリン酸、フルオロウラシル、フロリジン、デオキシシチジン、５'−デオキシフルオロウリジン、５−アザシトシン、シタラビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、メトトレキサート、及びアザチオプリン、のような栄養阻害剤と、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、アロプリノール、２−クロロアデノシン、トリメトレキサート、及び９−ニトロカンプトテシン、のようなカンプトテシン誘導体と、ペルホスファミド、イホスファミド、及びメホスファミド、のようなアミド誘導体と、アミノプテリン、メチレン−１０−デアザアミノプテリン（ＭＤＡＭ）、エピルビシン、及びカレニテシン、のようなアミノプテリン誘導体と、のような抗腫瘍剤に関連付けられ得る。
【００４３】
好ましいナノ粒子は、ダクチノマイシンのようなアクチノマイシン誘導体と、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びバルルビシン、のようなアントラサイクリン誘導体と、プリカマイシン、ミトラマイシン、オリボマイシン類、クロモマイシン類、バリアマイシン、ブレオマイシン、及びミタラマイシン、のようなオーレオリン酸と、ストレプトゾシン、アシビシン、及びカリチアミシン、のようなミトマイシン類似物と、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンロシジン、ビンレウロシン、ビングリシネート、及びビンデシン、のようなビンカアルカロイド類及びそれらの類似物のような植物物質と、パクリタキセル（又はＤＨＡ−パクリタキセル又はＰＧ−パクリタキセル、のようなパクリタキセル誘導体）又はドセタキセル、のようなジテルペン誘導体又はタキサンと、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ビノレルビン、アスパラギナーゼ、ペガスパルガーゼ、アルトレタミン、ミトキサントロン塩酸塩、アドリアマイシン、硝酸ガリウム、アルセニックトリオキシド、ベキサロテン、サルグラモスチム、フィルグラスチム、ポルフィマーナトリウム、ミトタン、酢酸リュープロリド、トリプトレリンパモ酸塩、ゴセレリン酢酸塩、アナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタン、のような他の種々の化合物と、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ３、アルデスロイキン、デニロイキンジフチトクス、及びカルメット−ゲラン桿菌（ＢＧ）、のようなインターフェロンと、リツキシマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、のようなモノクローナル抗体と、リン酸（Ｐ３２）クロム、リン酸（Ｐ３２）ナトリウム、ヨウ化（Ｉ１３２）ナトリウム、塩化ストロンチウム８９、サマリウム（ＳＭ１５３）レキシドロナム、のような放射線治療剤と、メルカプトエタンスルホン酸、アミフォスチン、デクスラゾキサン、及びトロメタミン、のような細胞保護剤と、トリフルオロメチルアニリン、フルタミド、ニルタミド、及びビカルタミド、のようなアミド誘導体と、メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロール、のようなプロゲステロン及びその類似物と、のような抗腫瘍抗生物質に関連付けられ得る。
【００４４】
好ましいナノ粒子は、サリチル酸ナトリウム、サリチルアミド、アスピリン、サルサレート、ジフルニサル、チオサリチル酸ナトリウム、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、及びサリチル酸のアンモニウムと、リチウムと、ストロンチウムとの塩、のようなサリチル酸誘導体と、メフェナム酸、及びメクロフェナム酸ナトリウム、を含むＮ−アリールアントラニル酸誘導体と、インドメタシン、スリンダク、トルメチンナトリウム、イブプロフェン、ナプロキセン、デキシブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、エトドラク、のようなアリール酢酸誘導体と、オキサプロジン、ピロキシカム、メロキシカム、のようなアリールプロピオン酸誘導体と、セレコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブ、のようなＣＯＸ−２阻害剤と、アニリン、アセトアニリド、ｐ−アミノフェノール、ホルムアニリド、ベンズアニリド、サリチルアニリド、エキサルジン、アセトアミノフェン、アニシジン、フェネチジン、フェナセチン、ラクチルフェネチジン、フェノコール、クリオフィン、ｐ−アセトキシアセトアニリド、フェネトサール、ペルトナール、ピラゾロン、のようなアニリン及びｐ−アミノフェノール誘導体と、アンチピリン、アミノピリン、ジピロン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾンを含むピラゾリジンジオン誘導体と、を含む抗炎症鎮痛剤に関連付けられる。
【００４５】
好ましいナノ粒子は、イドクスリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、ファムシクロビル、及びペンシクロビル、シドフォビル、及びホスカルネットナトリウム、のようなヌクレオシド代謝拮抗剤と、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、及びラミブジン、のような逆転写酵素阻害剤と、リバビリンのような他の種々のヌクレオシド代謝拮抗剤と、ネビラピン、デラビルジン、及びエファビレンツのような非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤と、サキナビル、インジナビル、リトナビル、アムプレナビル、及びネルフィナビルのようなＨＩＶプロテアーゼ阻害剤と、を含む抗ウイルス剤に関連付けられ得る。
【００４６】
好ましいナノ粒子は、プロマジン、クロルプロマジン塩酸塩、トリフルプロマジン塩酸塩、チオリダジン塩酸塩、メソリダジンベシル酸、プロクロルペラジンマレイン酸塩、ペルフェナジン、及びフルフェナジン塩酸塩、のようなフェノチアジンと、チオキサンテン類、及びジベンゾオキサゼピン類、のようなフェノチアジンの環状類似物と、チオチキセン、コハク酸ロキサピン、及びクロザピンのようなジベンゾジアゼピンと、ハロペリドール、ドロペリドール、リスペリドン、ピモジド、及びペンフルリドール、のようなフルオロブチロフェノンと、モリンドン塩酸塩、のようなβ−アミノケトンと、レモキシプリド、オランザピン、及びクエチアピンを含むベンズアミドと、炭酸リチウム、及びクエン酸リチウムのようなリチウム塩のような抗躁薬と、を含む統合失調症治療剤に関連付けられ得る。
【００４７】
好ましいナノ粒子は、メホバルビタールのようなバルビツール酸と、フェニトイン、メフェニトイン、及びエトトインを含むヒダントインと、トリメタジオンのようなオキサゾリジンジオンと、フェンスクシミド、メトスクシミド、及びエトスクシミド、を含むスクシンイミドと、カルバマゼピンを含む、尿素及びモノアシル尿素と、バルプロ酸、ガバペンチン、チアガビン、フェルバメート、ラモトリギン、ゾニサミド、トピラマート（トパマックス）のような他の種々の剤と、クロナゼパム、及びジアゼパム及びクロラゼプ酸などを含むベンゾジアゼピンと、のような抗痙攣薬及び抗てんかん薬に関連付けられ得る。
【００４８】
好ましいナノ粒子は、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトインナトリウム、メキシレチン、トカイニド、フレカイニド酢酸、モリシジン、及びプロパフェノンのような細胞膜遮断薬と、アミオダロン、トシル酸ブレチリウム、ドフェチリド、イブチリド、ソタロール、及びアジミリドのようなβ−アドレナリン遮断薬と、ベラパミル、及びジルチアゼム、のような抗不整脈薬と、リシノプリル、のようなレニン−アンジオテンシン系阻害薬と、エナラプリルマレイン酸塩、ベナゼプリル塩酸塩、キナプリル塩酸塩、ラミプリル、フォシノプリルナトリウム、及びトランドラプリル、のようなＡＣＥ阻害剤プロドラッグと、ロサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、及びバルサルタンのようなアンジオテンシンII拮抗薬と、グアネチジンモノスルファネート、及び硫酸グアナドレル、のようなグアネチジン誘導体を含むアドレナリン作動系拮抗体と、プラゾシン、テラゾシン、及びドキサゾシン、を含む選択的α−アドレナリン拮抗体と、メチルドパ、クロニジン、グアナベンズ酢酸塩、及びグアンファシン塩酸塩、を含む中枢神経作用薬と、ヒドララジン、及びニトロプルシドナトリウムを含む血管拡張剤と、ジアゾキシド、及びミノキシジル、を含むカリウムチャネル阻害剤と、ジゴキシン、ジギタリス製剤、アムリノン、及びミルリノンのような変力薬と、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、デキストロシロキシンナトリウム、及びコレセベラムのような抗高脂血症薬と、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、及びアトルバスタチン、及びセリバスタチン、を含むＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬と、プロタミン硫酸塩、ジクマロール、ワルファリンナトリウム、及びアニシンジオン、を含む抗凝固剤と、トルブタミド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、及びグリクラジド、のようなスルホニル尿素を含む血糖降下薬と、レパグリニド、及びナテグリニド、を含む非スルホニル尿素と、ロシグリタゾン、及びピオグリタゾン、を含むチアゾリンジオンと、メトホルミン、を含むビスグアニジンと、アカルボース、及びミグリトールを含むα−グルコシダーゼ阻害剤と、などを含む抗不整脈薬に関連付けられ得る。
【００４９】
好ましいナノ粒子は、ペニシリン  Ｇ、ペニシリン  Ｖ、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、メズロシリン、クラブラン酸カリウム  ＵＳＰ、スルバクタム、及びタゾバクタム、を含むβ−ラクタム抗生物質と、チエナマイシン、イミペネム−シラスタチン、メロペネム、及びビアペネム、を含むカルバペネムと、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セフプロジル、ロラカルベフ、セフロキシムアキセチル、セフィキシム、セファロチン、セファピリン、セファゾリン、セファマンドール、セフォニシド、セフォラミド、セフロキシム、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフォペラゾン、セフォキシチン、セフォテタン、及びセフメタゾール、を含むセファロスポリンと、ストレプトマイシン硫酸塩、ネオマイシン硫酸塩、パロモマイシン硫酸塩、カナマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン硫酸塩、ネチルマイシン硫酸塩、シソマイシン硫酸塩、及びスペクチノマイシン塩酸塩、を含むモノバクタム誘導体と、テトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩、クロルテトラサイクリン塩酸塩、メタサイクリン塩酸塩、デメクロサイクリン  ＵＳＰ、スルホサリチル酸メクロサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリン、を含むテトラサイクリン誘導体と、
エリスロマイシン、エリスロマイシンステアリン酸、エリスロマイシンエチルスクシン酸、エリスロマイシンエストレート、グルコヘプトン酸エリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ジリトロマイシン、及びトロレアンドマイシン、を含むマクロライド誘導体と、リンコマイシン、クリンダマイシン塩酸塩、パルミチン酸塩、及びリン酸塩、を含むリンコマイシン誘導体と、バンコマイシン塩酸塩、テイコプラニン、バシトラシン、ポリミキシン硫酸塩Ｂ、コリスチン硫酸塩、コリスチメスエートナトリウム、グラミシジン、クロラムフェニコール、ノボビオシンナトリウム、ムピロシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リネゾリド、及びホスホマイシントロメタミン、を含むポリペプチド誘導体と、を含む抗生物質に関連付けられ得る。
【００５０】
好ましいナノ粒子は、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、フッ素（１８Ｆ）、ガリウム（６７Ｇａ）、ヨウ素（１３１Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、オンコシント（Ｏｎｃｏｓｃｉｎｔ）ＣＲ／ＯＶ、タリウム（２０１Ｔｌ）及びキセノン化合物（１３３Ｘｅ）を含む診断剤に関連付けられ得る。
【００５１】
好ましいナノ粒子は、その治療の患者又は受益者において、過度の望ましくない局所又は全身の効果を引き出すことなく、医療治療に関してその所望の機能を実施するために、その全てにおいて、すなわち、その完全な状態、その合成された状態、及びその分解された状態、すなわち、分解生成物において、生体適合性を提供する。
【００５２】
好ましいナノ粒子は、対象へのナノ粒子の全身並びに非全身的な輸送、及び／又は投与によってｉｎ  ｖｉｖｏに投与され得る。限定されるものではないが、投与は、静脈、皮下、及び筋肉注射、及びデポ内製剤、口、口腔、舌下、皮膚、局所、目、鼻、肺、及び腸、を経由する製剤を含む。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｖｏの具体的に好ましいペイロード放出方法は、身体的な条件内での酵素、タンパク質、又は他の化学刺激による、ナノ構造物の開裂のような内部トリガー放出機構と、高集束超音波刺激（ＨＩＦＵ）、レーザーアシストアブレーション、又はｉｎ  ｖｉｖｏでドラッグデリバリー及び診断剤輸送を引き起こすために外部から適用される任意の他のエネルギーを含む外部トリガー方法と、を含む。
【００５４】
好ましいナノ粒子は、特定の他の非本質的な成分を任意で含み得る製剤組成物のペイロードに関連付けられ得る。例えば、組成物は、従来の製薬のアジュバントを最大１０重量％まで含み得る。これらのアジュバンド又は添加剤は、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、及び粘度調整剤を含む。
【００５５】
具体的な実験及び実施形態は、以下で説明される。当業者は、実験の説明から本発明のより広い観点を理解するであろう。
【００５６】
（実験）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態の実証に含まれる。以下の実施例で開示された技術は、本発明の実施においてよく機能を果たすことが発明者によって発見された技術を表すものであり、及びそれにより、実施にとって好ましい態様を構成すると考えられ得ることは、当業者にとっては明らかである。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱する事なく、本開示を考慮して、多くの変更をなすことができ、同じ又は同様の結果をなお得ることが可能であることは、当業者にとって明らかである。
【００５７】
（材料）
ポリ（メタクリル酸メチル−コ−メタクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ、Ｍｗ  ３４ＫＤａ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アセトン、クロロホルム、及びインドシアングリーン（ＩＣＧ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミーズリー州）より入手した。カルボキシル−ポリエチレングリコール−アミン停止剤（ｃＰＥＧ−ＮＨ２、Ｍｗ  ３ＫＤａ）は、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（アラブ、アラバマ州）より購入し、全ての材料は、さらなる任意の精製を行わずに用いた。
【００５８】
ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子の合成
【００５９】
図１は、好ましい方法の実施例を説明する。ポリマー溶液は、ＤＣＭ  メタノール中のような、標準技術１０によって事前調製される。電気流体力学エレクトロスプレー処理１２は、シリンジポンプを通し、ポリマー溶液を一定の流速で輸送することによってナノ粒子を形成する。本発明の組成物の制御された高電界電気流体力学処理方法は、シリンジポンプを通してポリマー溶液を一定の速度で輸送した。前記溶液は、絶縁されたステンレス鋼ノズル（本実験においては２１ゲージ）の先端を通して、放出された。高陽電位電界１４が、前記ノズルに印加される。例えば、約１０（キロボルト）から約３０（キロボルト）がノズルへ印加されることによって、十分な電界が形成される。同様の電界は、あまり直接的ではない技術で形成され得るが、その電圧の印加が、直接的かつ利用しやすい。好ましいコレクタ１６は、接地された脱イオン水である。固体コレクタの代わりに液体コレクタを用いることは、ナノ粒子の表面上に存在する残留静電気力により、粒子の凝集を回避する補助となる。コレクタの一定の攪拌は、ナノ粒子の均質な懸濁液の製造を補助するために好ましい。代替の処理において、ナノ粒子を、固体基板に上で収集し、及びその後、水媒体中で粒子を懸濁させた。
【００６０】
実験において、ナノ粒子は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／メタノール（Ｍｅ）溶媒に溶解したＰＭＭＡ−ＣＯＯＨを用いてエレクトロスプレーされる。カプセル化されたＩＣＧ（インドシアニングリーン）を含む（１）０．５％のＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ、及び（２）０．５％ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨを含むナノ粒子の異なるサンプルが作成された。
【００６１】
実験方法は、室温及び周囲湿度で実施された。本発明の組成物の制御された高電界電気流体力学実験方法のパラメータを、表１において説明する。
【表１】
2016534156.tif 000003
【００６２】
後処理
【００６３】
少量の大きい粒子（＞１５０ｎｍ）を取り除くために、その後、ナノ粒子懸濁液を、１０，０００Ｇで１５分間、遠心分離した１８。これにより、上澄み１８を製造した。この上澄みは、そして、沈殿２４を製造するために、３０，０００Ｇで１時間のさらに遠心分離２２の対象になった。遠心分離機から得られた沈殿させられたペレットを、可溶化され２６、その後１５分間、超音波処理した２８。これにより、ＣＯＯＨ表面官能基３２を含む単分散ナノ粒子３０を製造する。表面修飾３４は、その後、表面付着によってペイロードと関連付けるために、実施され得る。
【００６４】
様々な調節で、ナノ粒子のサイズを修正し得る。遠心分離のスピードは、一例である。様々な異なるスピード及び時間で、様々な異なる媒体を用いて、サイズ分離を実施することが可能である。加えて、濾過を含み、及び様々な回転力を対象とする他の形式の精製も、同様の結果を与えるであろう。
【００６５】
カプセル化
【００６６】
薬剤と、プロテインと、染料及び造影剤を含む診断剤と、を含む治療剤のカプセル化を、実験的に実施した。一又は複数の薬剤（個々で、又は組み合わせて）を、ステップ１０においてポリマーと同時に溶媒中に均一に溶解、又は懸濁させた。前記実験方法の間に、ナノ粒子内への分子の完全な封入が達成された。本発明の方法の強固な性質の実証のため、治療用の及び造影用のペイロードのような、二つの異なるペイロードを含む、異なる特性を有するペイロードを取り込んだ。ＣＯＯＨ基４２と、第一ペイロード分子４４及び第二ペイロード分子４６と、を伴ったナノ粒子４０を、図２に表す。
【００６７】
表面修飾としてのＰＥＧ化
【００６８】
形成技術及び材料からもたらされたナノ粒子表面に存在するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の固有の存在を、表面修飾のために使用した。図３Ａにおいて、その処理を説明する。アミンから成る一つの末端基を有するポリエチレングリコールを、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応によってナノ粒子のカルボキシル基に結合させた。簡潔に、後処理の段階で得られるナノ粒子のペレットを、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（２−（Ｎ−モルホリノ））エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファ中に懸濁させた。バッファ中のナノ粒子の濃度はおよそ１ｍｇ／１ｍＬであった。１７ｍｇのＥＤＣ及び１０ｍｇのＮＨＳを、１ｍＬのＭＥＳバッファに溶解させ、及びその後、中間体５０を製造するためにナノ粒子溶液に加えた。反応は３時間実施された。その後、カルボキシル基を活性化されたナノ粒子を、ＭＥＳで洗浄し、及び第二中間体５２を製造するために、過剰のＥＤＣ及びＮＨＳを取り除いた。
【００６９】
ナノ粒子の表面にＰＥＧを結合させるために、ナノ粒子をＰＢＳバッファ中に再懸濁させ、及びＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを過剰に加えた。終夜反応によって、ＰＥＧ及びナノ粒子５４の間のＮＨ＋−ＣＯＯ−結合を介して、ＰＥＧは、ナノ粒子の表面上に化学結合し得る。ＰＥＧ中の末端停止剤として存在するＣＯＯＨ基の存在は、さらなる官能基化５６において抗体又は配位子付着のためにさらに用いられ得る。あるいは、抗体及び／又は配位子は、同時の反応としてＰＥＧ化のステップの間に、ナノ粒子の表面に対して官能基化され得た。図３Ｂは、カプセル化された化合物のポリマー粒子が、第一ステージで形成される場合の代替を示し、ＰＥＧ化は、第三ステージにおける抗体の付加を含む、第二ステージである。
【００７０】
粒子サイズの特徴
【００７１】
ナノ粒子の流体力学的サイズは、動的光散乱法を用いて特徴付けられる。Ｍａｌｖｅｒｎのゼタサイザーナノ  ＺＳが、粒子サイズ分散の決定に使用された。加えて、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）が、ＤＬＳ測定による結果の確認に使用された。
【００７２】
カプセル化されたナノ粒子及び初期のナノ粒子（カプセル化されている化合物を備えない）のサイズは、表２に詳述される。ナノ粒子の代表的なＴＥＭ画像及び動的光散乱（ＤＬＳ）の結果を、図４Ａ、４Ｂ、及び５に示す。本方法を用いて合成される様々なナノ粒子は、低い多分散性（ＰＤＩ）で、５０ｎｍから９０ｎｍの範囲の平均サイズであることが発見された。ナノ粒子のサイズは、図５に示すように、ＰＥＧ化後に１５ｎｍまで大きくなり、表面結合しているＰＥＧ分子の存在を示唆した。加えて、サイズにおける主立った変化は、カプセル化されたＩＣＧを５倍濃くした濃度であっても、観察されなかった。ＴＥＭ画像は、高分散させられ、非凝集させられ、及び球状に形成された同一のナノ粒子を裏付ける。
【表２】
2016534156.tif 000004
【００７３】
負荷効率
【００７４】
カプセル化された化合物の負荷効率は、ＵＶ−Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法で算出された。例えば、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ内のＩＣＧの存在量は、メタノール溶液にポリマーナノ粒子を溶解させることによって決定された。吸収の絶対値は、システム中のＩＣＧの含有量を決定するために、メタノール中のＩＣＧのキャリブレーション・カーブに相互に関連付けられた。カプセル化の％は、その後以下の式に基づいて算出された。
【数１】
2016534156.tif 000005
【００７５】
ここで、Ｍｄは、分光法分析を使用して決定されたＩＣＧの質量であり、及びＭｄ０は、本発明の組成物の制御された高電界電気流体力学方法の開始時の初期の染料負荷である。図６は、ナノ粒子内に存在するＩＣＧ含有量のＵＶ−ＶＩＳ分光分析を示す。
【００７６】
１０ｍｇのＩＣＧ及び３０ｍｇのＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ（初期内容物）を用いて本方法によって合成されたナノ粒子は、２０ｍＬのＤＩ水に収集された。理論上、１ｍｇのナノ粒子は、もし１００％カプセル化が得られるならば、７５０μｇのポリマー及び２５０μｇのＩＣＧを含むであろう。ＩＣＧのキャリブレーション・カーブに基づいて、ＩＣＧの存在量は、表面結合しているＩＣＧを洗浄した後、およそ１６５ｍｇと決定された。このように、カプセル化された化合物の量を確認するために、溶液を、１０μｇ／ｍｌまで適切に薄めた。分析のための最終サンプルは、ＩＣＧ及びナノ粒子の両方に対して、９５０μｌのメタノール及び５０μｌＤＩ水から構成された。図６に示すように、ＩＣＧの等量、すなわち、１６５μｇが、両方のサンプル溶液中に存在することは、この分析から明白である。それ故、カプセル化効率は６５％であると算出された。
【００７７】
安定性の調査
【００７８】
ナノ粒子の安定性は、２５℃のＤＩ水中で７日間、ナノ粒子を保温することによって特徴付けられる。分解又は凝集のいずれの形成が起こっているかどうかを決定するため、ナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を２４時間間隔で調査した。この研究の間、０．５％ｗ／ｗポリマー濃度を、本組成物の制御された高電界電気流体力学方法において使用し、及びナノ粒子の懸濁液を、０．２ミクロンのセルロースアセテートフィルターを通して濾過した。初期のナノ粒子の安定性の分析を、図７で詳述する。
【００７９】
初期のＰＭＭＡ−ＣＯＯＨナノ粒子は十分に安定であり、及びほとんどサイズ範囲がない（単分散ナノ粒子が得られる）ことが、図６におけるデータから観察され得る。ＤＩ水に懸濁させられたナノ粒子のサイズの僅かな増加は、ナノ粒子の膨脹によると考えられ得た。ナノ粒子の凝集の欠如は、（ｉ）大幅なサイズの増幅が観察されない、及び（ｉｉ）０．２より小さいＰＤＩの絶対値は、同様にほとんど一定を保っている、ことより示される。
【００８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏの調査 
【００８１】
近赤外線を使用した蛍光画像化を、ＩＶＩＳ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  画像化システムによって、ヌードマウスで実施した。簡潔に、フリーＩＣＧ溶液（０．１５ｍｇ／ｍｌ）のサンプルと、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ（ナノ粒子中に０．１５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧが存在）と、ＩＣＧ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）を含むペグ化されたナノ粒子と、の１００μｌのサンプルを、一度注射し、及びそれらの蛍光を図８Ａから図８Ｃに示すように様々な時点で記録した。その結果は、フリーＩＣＧの蛍光が６時間以内に消失し、及び２４時間以内にほぼゼロまで完全に減少したのに対して、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨのＮＩＲ蛍光は、完全に消失する前に１２時間保持され、一方、ペグ化されたナノ粒子は、４８時間後であっても存在する低い蛍光を伴って、より長い期間、蛍光を示したこと、を示した。蛍光の消失には、３つの考えられる理由、すなわち、（ｉ）生理学的条件におけるフリーＩＣＧの分解、（ｉｉ）体からのフリーＩＣＧの急速なクリアランス、又は（ｉｉｉ）両方の処理の組み合わせ、がある。
【００８２】
以下に示す理由のために、ペグ化されたナノ粒子が、ペグ化されていないナノ粒子、及びフリーＩＣＧ溶液よりも高い蛍光を示すことは、図７から説明され得る。第一に、ナノ粒子からＩＣＧの放出が行われたならば、蛍光は６時間以内に消失したはずだが、フリーＩＣＧ溶液において観察されたように、それは起こらなかった。第二に、ペグ化されていないナノ粒子は、ＩＣＧ溶液と比較されるとき、蛍光はナノ粒子に対してより長い時間の間、相互作用した。それ故、以下の結論が、上記二つの観察によって導かれ得る。（ｉ）ＩＣＧは相互作用を残して、ナノ粒子内にカプセル化され、（ｉｉ）ナノ粒子のペグ化は血循環時間を増加させた。
【００８３】
時間に対する平均強度の定量分析は、図９に示すように上記の観察で確認された。これらの結果は、選択的及び標的型放出の候補物質の利用に対する非常に良い指標である。カプセル化された分子の漏出を許さないマトリクスは、望ましい場所で治療剤を放出するために使用され得る。換言すると、たとえもしナノ粒子化合物の一定の比率が、所望の場所を標的にしないならば、治療剤は放出されず、その結果、健康な細胞に対して望ましくない危害を引き起こさないであろう。
【００８４】
本発明の具体的な実施形態が、示され、及び説明されてきたが、他の修正、置換及び変換が当業者には明らかであると理解されるべきである。このような修正、置換及び変換は、添付の特許請求の範囲から決定されるべき本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得る。
【００８５】
本発明の様々な特徴は、添付の特許請求の範囲において明らかにする。
【００８６】
（付記）
（付記１）
ポリマーナノ粒子を形成する方法であって、前記方法は、
ノズルを通してコレクタに対してポリマー溶液をスプレーすること、及び、
スプレーと同時に前記ノズルの周辺に電界を印加することを含み、
ノズル先端からコレクタまでの距離が、約１（センチメートル）から約１０（センチメートル）であり、及びポリマー濃度が約０．０１％から約０．５％ｗ／ｗである、
ことを特徴とする、
ポリマーナノ粒子を形成する方法。
【００８７】
（付記２）
前記電界は、前記ノズルに電圧を印加することによって形成され、前記電圧は約１０（キロボルト）から約３０（キロボルト）である、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８８】
（付記３）
前記コレクタが液体を含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８９】
（付記４）
前記液体が、接地された脱イオン水を含む、
ことを特徴とする付記３に記載の方法。
【００９０】
（付記５）
前記ポリマーが、ナノ粒子に変形するために、少なくとも５ｋＤａの分子量、及び十分な粘弾性を有するポリマーを含むポリマーである、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００９１】
（付記６）
前記ポリマーは、ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ、又はそのアクリル酸エステル類似物を含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００９２】
（付記７）
前記アクリル酸エステル類似物が、ポリ（アクリル酸エチル）と、ポリ（アクリル酸ブチル）と、ポリ（アクリル酸メチル）と、中性、アルカリ性及び酸性のアクリル酸エチル及びアクリル酸メチルのポリマーの共重合体と、メタクリル酸アンモニウム共重合体と、アミノアルキルメタクリレート共重合体と、ポリ（メタクリル酸メチル）ＰＭＭＡ、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ＰＨＥＭＡ、及びポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）］メタクリルアミドを含むビニルラクタム共重合体と、から選択される、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００９３】
（付記８）
前記ポリマー溶液を調製する最初のステップをさらに含み、前記調製は、前記ポリマー溶液にペイロードを混合することをさらに含み、前記ペイロードは、前記スプレー及び印加の間にカプセル化される、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００９４】
（付記９）
前記ペイロードが、治療又は診断のための分子の一つを含む、
ことを特徴とする付記８に記載の方法。
【００９５】
（付記１０）
前記ペイロードが、多様な治療又は診断のための分子を含む、
ことを特徴とする付記９に記載の方法。
【００９６】
（付記１１）
前記ペイロードは、治療及び診断のための分子の両方を含む、
こと特徴とする付記１０に記載の方法。
【００９７】
（付記１２）
均一サイズ化された単分散ナノ粒子を得るために、ナノ粒子を収集すること、及びサイズ分離すること、
をさらに含む付記１に記載の方法。
【００９８】
（付記１３）
前記ナノ粒子の表面の官能基化すること、
をさらに含む付記１２に記載の方法。
【００９９】
（付記１４）
前記ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ溶液が、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／メタノール（Ｍｅ）溶媒を含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【０１００】
（付記１５）
前記スプレーが、前記ノズルを通して一定の比率でポリマーを流すことを含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【０１０１】
（付記１６）
前記ナノ粒子内にペイロードをカプセル化すること、又は埋め込むこと、
をさらに含む付記１に記載の方法。
【０１０２】
（付記１７）
前記ペイロードが薬理活性剤、抗炎症剤、薬剤、又は生物活性剤の一つを含む、
ことを特徴とする付記１６に記載の方法。
【０１０３】
（付記１８）
前記コレクタが液体を含み、及び前記スプレーの間に前記液体を攪拌することをさらに含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【０１０４】
（付記１９）
約３００ｎｍより小さいサイズを有する、
生体適合性単分散ポリマーナノ粒子。
【０１０５】
（付記２０）
薬理活性剤、抗炎症剤、又は生物活性剤のひとつであるペイロードに関連付けられる、
付記１９に記載のナノ粒子。
【０１０６】
（付記２１）
薬剤であるペイロードを埋め込み、又はカプセル化する、
付記１９に記載のナノ粒子。
【０１０７】
（付記２２）
複数のペイロードを埋め込み、又はカプセル化する、
付記１９に記載のナノ粒子。
【０１０８】
（付記２３）
前記ポリマーが、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ−ＣＯＯＨ）、又はアクリル酸エステル類似物を含む、
付記１９に記載のナノ粒子。
【０１０９】
（付記２４）
前記アクリル酸エステル類似物が、ポリ（アクリル酸エチル）と、ポリ（アクリル酸ブチル）と、ポリ（アクリル酸メチル）と、中性、アルカリ性及び酸性のアクリル酸エチル及びアクリル酸メチルのポリマーの共重合体と、メタクリル酸アンモニウム共重合体と、アミノアルキルメタクリレート共重合体と、ポリ（メタクリル酸メチル）ＰＭＭＡ、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）ＰＨＥＭＡ、及びポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］を含むビニルラクタムの共重合体と、から選択される、
ことを特徴とする付記１９に記載のナノ粒子。
【０１１０】
（付記２５）
約１５０ｎｍより小さいサイズを有する、
付記１９に記載のナノ粒子。
【符号の説明】
【０１１１】
ＤＤＳ  ドラッグデリバリーシステム
ＥＤＨ  電気流体力学
ＩＣＧ  インドシアニングリーン
ＭＭＡ  メタクリル酸メチル
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ＰＭＭＡ  ポリ（メタクリル酸メチル）
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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