(57)【要約】試料中のＲＮＡを検出するための方法および材料が開示されている。一部の形態において、本方法は、（ａ）試料およびプローブアレイを接触させるステップと、（ｂ）プローブアレイとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ｈ等）とを接触させるステップと、（ｃ）プローブアレイと、標識されたヌクレオチドと、ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、ＲＮＡ鎖からの伸長中に標識されたヌクレオチドを取り込むことができる核酸ポリメラーゼ（クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ等）とを接触させるステップと、（ｄ）伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドを検出するステップとを伴う。
2016515827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料におけるＲＮＡを検出する方法であって、
（ａ）該試料およびプローブアレイを接触させるステップであって、該プローブアレイが、１種または複数のキメラプローブを含み、該キメラプローブが、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、該ＤＮＡ領域および該ＲＮＡ領域が近接しており、該ＤＮＡ領域が、該ＲＮＡ領域の５’にあり、該試料が、該キメラプローブのうち少なくとも１種のヌクレオチド配列と相補的なＲＮＡ分子を含有する場合、該ＲＮＡ分子が、該相補的キメラプローブとハイブリダイズするステップと、
（ｂ）該プローブアレイとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼとを接触させるステップであって、該キメラプローブの該ＤＮＡ領域にハイブリダイズした該ＲＮＡ分子の部分が分解されるステップと、
（ｃ）該プローブアレイと、標識されたヌクレオチドと、ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、該ＲＮＡ鎖からの伸長中に該標識されたヌクレオチドを取り込むことができる核酸ポリメラーゼとを接触させるステップであって、該ハイブリダイズしたＲＮＡ分子が伸長して、伸長した核酸鎖を形成し、少なくとも１個の標識されたヌクレオチドが、該伸長した核酸鎖に取り込まれ、該標識されたヌクレオチドのそれぞれが、第１の標識を含むステップと、
（ｄ）該プローブアレイおよび標識コンジュゲートを接触させることにより、該伸長した核酸鎖中の該標識されたヌクレオチドを検出するステップであって、該標識コンジュゲートが、特異的結合分子および第２の標識を含み、該特異的結合分子が、該第１の標識に結合し、該伸長した核酸鎖中の該標識されたヌクレオチドが、該第２の標識を検出することにより検出され、該第２の標識が、該プローブアレイおよび検出コンジュゲートを接触させることにより検出され、該検出コンジュゲートが、凝集化因子を含み、該凝集化因子が、該標識コンジュゲート上の検出コンジュゲートの凝集を媒介するステップと
を含み、該伸長した核酸鎖中の該標識されたヌクレオチドの検出が、該試料中の該ＲＮＡ分子の存在を示す方法。
【請求項２】
検出コンジュゲートが、前記第２の標識と会合または結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の標識が、前記標識コンジュゲート上のまたは該標識コンジュゲートおける前記検出コンジュゲートの凝集を媒介または可能にする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出コンジュゲートが、シグナルを含むまたはシグナルを生じる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出コンジュゲートが、複数コピーの標識を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
複数の検出コンジュゲートが、前記第２の標識と会合または結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出コンジュゲートが自己凝集する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の標識がビオチンを含み、前記特異的結合分子がストレプトアビジンを含み、前記第２の標識が金を含み、前記凝集化因子が銀を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、同時に行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識コンジュゲートが、ストレプトアビジンにコンジュゲートされた金ナノ粒子を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出コンジュゲートが、銀ナノ粒子を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅ  Ｈであり、前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブアレイが、固体基材をさらに含み、前記キメラプローブが、該固体基材上に固定化されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブアレイが、２種以上のキメラプローブを含み、各キメラプローブが、前記固体基材の異なる位置に固定化されており、各キメラプローブが、異なるヌクレオチド配列を有し、各キメラプローブが、異なるＲＮＡ分子に相補的であり、前記伸長した核酸鎖中の前記標識されたヌクレオチドが検出される該固体基材上の位置が、検出されたＲＮＡ分子の同一性を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キメラプローブが、安定化された核酸である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ領域が、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記キメラプローブのうち１種または複数が、ウイルス、細菌または微生物に特徴的なヌクレオチド配列に相補的である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記キメラプローブのうち１種または複数が、第２のＤＮＡ領域をさらに含み、前記第２のＤＮＡ領域が、前記ＲＮＡ領域の３’にある、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ領域および前記ＲＮＡ領域が近接している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記キメラプローブが、３’−連結基をさらに含み、該連結基が、該キメラプローブの固定化を媒介する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記３’−連結基が、アミノ基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
プローブアレイ、標識されたヌクレオチド、標識コンジュゲートおよび検出コンジュゲートを含むキットであって、
該プローブアレイが、１種または複数のキメラプローブを含み、該キメラプローブが、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、該ＤＮＡ領域および該ＲＮＡ領域が近接しており、該ＤＮＡ領域が、該ＲＮＡ領域の５’にあり、該キメラプローブのヌクレオチド配列が、目的のＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に相補的であり、
該標識されたヌクレオチドのそれぞれが、第１の標識を含み、該標識コンジュゲートが、特異的結合分子および第２の標識を含み、該特異的結合分子が、該第１の標識に結合し、
該検出コンジュゲートが、凝集化因子を含み、該凝集化因子が、前記標識コンジュゲート上の検出コンジュゲートの凝集を媒介するキット。
【請求項２３】
検出コンジュゲートが、前記第２の標識と会合または結合することができる、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記第２の標識が、前記標識コンジュゲート上のおよび該標識コンジュゲートにおける前記検出コンジュゲートの凝集を媒介または可能にすることができる、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記検出コンジュゲートが、シグナルを含むまたはシグナルを生じることができる、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記検出コンジュゲートが、複数コピーの標識を含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
複数の検出コンジュゲートが、前記第２の標識と会合または結合することができる、請求項２２から２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記検出コンジュゲートが、自己凝集することができる、請求項２２から２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記プローブアレイが、固体基材をさらに含み、前記キメラプローブが、該固体基材上に固定化されている、請求項２２から２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記プローブアレイが、２種以上のキメラプローブを含み、各キメラプローブが、前記固体基材の異なる位置に固定化されており、各キメラプローブが、異なるヌクレオチド配列を有し、各キメラプローブが、異なるＲＮＡ分子に相補的である、請求項２２から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記キメラプローブが、安定化された核酸である、請求項２２から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ領域が、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記キメラプローブのうち１種または複数が、ウイルス、細菌または微生物に特徴的なヌクレオチド配列に相補的である、請求項２２から３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記キメラプローブのうち１種または複数が、第２のＤＮＡ領域をさらに含み、該第２のＤＮＡ領域が、前記ＲＮＡ領域の３’にある、請求項３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ領域および前記ＲＮＡ領域が近接している、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記キメラプローブが、３’−連結基をさらに含み、該連結基が、該キメラプローブの固定化を媒介する、請求項２２から３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
前記３’−連結基が、アミノ基である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
１種または複数のキメラプローブを含むプローブアレイであって、該キメラプローブが、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、該ＤＮＡ領域および該ＲＮＡ領域が近接しており、該ＤＮＡ領域が、該ＲＮＡ領域の５’にあり、該キメラプローブのヌクレオチド配列が、目的のＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に相補的であるプローブアレイ。
【請求項３９】
前記プローブアレイが、固体基材をさらに含み、前記キメラプローブが、該固体基材上に固定化されている、請求項３８に記載のプローブアレイ。
【請求項４０】
前記プローブアレイが、２種以上のキメラプローブを含み、各キメラプローブが、前記固体基材の異なる位置に固定化されており、各キメラプローブが、異なるヌクレオチド配列を有し、各キメラプローブが、異なるＲＮＡ分子に相補的である、請求項３８または３９に記載のプローブアレイ。
【請求項４１】
前記キメラプローブが、安定化された核酸である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載のプローブアレイ。
【請求項４２】
前記ＲＮＡ領域が、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成される、請求項４１に記載のプローブアレイ。
【請求項４３】
前記キメラプローブのうち１種または複数が、ウイルス、細菌または微生物に特徴的なヌクレオチド配列に相補的である、請求項３８から４２のいずれか一項に記載のプローブアレイ。
【請求項４４】
前記キメラプローブのうち１種または複数が、第２のＤＮＡ領域をさらに含み、該第２のＤＮＡ領域が、前記ＲＮＡ領域の３’にある、請求項４３のいずれか一項に記載のプローブアレイ。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ領域および前記ＲＮＡ領域が近接している、請求項４４に記載のプローブアレイ。
【請求項４６】
前記キメラプローブが、３’−連結基をさらに含み、該連結基が、該キメラプローブの固定化を媒介する、請求項３８から４５のいずれか一項に記載のプローブアレイ。
【請求項４７】
前記３’−連結基が、アミノ基である、請求項４６に記載のプローブアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１３年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８０８，４４７号に対する利益を主張する。２０１３年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８０８，４４７号は、これによってその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表の参照
２０１４年４月４日に作成され「ＧＳＵＲＦ＿２０１３＿１７＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と命名された、４，８８９バイトのサイズを有するテキストファイルとして２０１４年４月４日に提出された配列表は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §  １．５２（ｅ）（５）に準じて参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
開示されている発明は、全般的には、核酸検出および分析の分野、詳細には、ＲＮＡ検出および分析の領域に存する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
天然のパンデミック（例えば、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）およびインフルエンザパンデミック）（Ｐｒｉｐｕｚｏｖａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７巻、ｅ４３２４６頁（２０１２年）；Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ、８７巻、５５９頁（２０１２年）；Ｂｒａｕｌｔら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｅｎｔｏｍｏｌ、４９巻、９３９頁（２０１２年）；Ｋｅｓａｖａｒａｊｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ、８７巻、３５９頁（２０１２年））および食中毒大流行（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７等）は、ヒトの健康および生命にとって致命的な脅威である。ポイントオブケアにおけるこれらのヒト病原体の迅速かつ正確な検出は、適切な医学的処置および救命に必須である。感染性疾患の迅速診断のためのウイルスおよび細菌病原体検出は、主要なヘルスケア上の課題である。例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ、ＷＮＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよび病原性Ｅ．ｃｏｌｉは、大流行の範囲および大流行の致命的影響を最小化するために、迅速に検出される必要がある。培養に基づく方法は、時間がかかり、結論を得るまでに通常２〜３日間を要する（ＭａｒｃｈおよびＲａｔｎａｍ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２３巻、８６９頁（１９８６年））。抗原−抗体に基づく免疫学的アッセイ（即ち、ＥＬＩＳＡ）は、迅速かつ頑強ではあるが、異なる株間の僅かな差を有効に区別することができない。他方では、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびｃＤＮＡアレイ等、核酸に基づく検出方法（Ｂｕｓｔｉｎ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２５巻、１６９頁（２０００年）；Ｃａｌｌ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３１巻、９１頁（２００５年）；Ｖｏｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、２２巻、２９４頁（２００８年））は、単一ヌクレオチドの差を検出し、高い検出特異性をもたらすことができる。しかし、これらの方法は、ＲＮＡを直接的に検出せず、逆転写（ＲＴ）および複数のステップが必要とされる。ＰＣＲ増幅は、厳密なコンタミネーション管理の欠如による偽陽性結果を引き起こし得る。核酸配列に基づく増幅（Ｚｈａｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４７巻、２０６７頁（２００９年））、質量分析（Ｌｉら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、８２巻、３３９９頁（２０１０年））およびローリングサークル増幅（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、４０巻、ｅ２２頁（２０１２年））等、多くの他の戦略が、ＤＮＡ検出のために開発されてきた。
【０００５】
さらに、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、マイクロＲＮＡプロファイリングおよび直接ＲＮＡ配列決定等、直接ＲＮＡ検出のための現在の方法（Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１巻、１５５頁（２００４年）；Ｓａｎｄｅｌｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、８巻、４２４頁（２００７年）；Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻、８１４頁（２００９年））は、労働集約的である、時間がかかる、コストがかかるおよび／または機材集約的である。これらのアプローチは、迅速かつ正確なＲＮＡ検出、特に、ポイントオブケア診断および野外の適用に十分に適しているとは限らない。近年、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくマルチプレックスＲＮＡバイオセンサー（Ｆａｎｇら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１２８巻、１４０４４頁（２００６年）；Ｌｅｅら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２２巻、５２４１頁（２００６年））ならびにロックド核酸（ＬＮＡ）およびＡｕ−ナノ粒子コンジュゲートに基づくマイクロＲＮＡマイクロアレイが実証された（Ｃａｓｔｏｌｄｉら、ＲＮＡ、１２巻、９１３頁（２００６年））。しかし、ＲＮＡ試料の調製および簡便な検出は、依然として複雑で時間がかかり、これは、ポイントオブケア病原体および疾患診断のための直接ＲＮＡ検出における主要な課題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｒｉｐｕｚｏｖａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７巻、ｅ４３２４６頁（２０１２年）
【非特許文献２】Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ、８７巻、５５９頁（２０１２年）
【非特許文献３】Ｂｒａｕｌｔら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｅｎｔｏｍｏｌ、４９巻、９３９頁（２０１２年）
【非特許文献４】Ｋｅｓａｖａｒａｊｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ、８７巻、３５９頁（２０１２年）
【非特許文献５】ＭａｒｃｈおよびＲａｔｎａｍ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２３巻、８６９頁（１９８６年）
【非特許文献６】Ｂｕｓｔｉｎ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２５巻、１６９頁（２０００年）
【非特許文献７】Ｃａｌｌ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３１巻、９１頁（２００５年）
【非特許文献８】Ｖｏｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、２２巻、２９４頁（２００８年）
【非特許文献９】Ｚｈａｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４７巻、２０６７頁（２００９年）
【非特許文献１０】Ｌｉら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、８２巻、３３９９頁（２０１０年）
【非特許文献１１】Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、４０巻、ｅ２２頁（２０１２年）
【非特許文献１２】Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１巻、１５５頁（２００４年）
【非特許文献１３】Ｓａｎｄｅｌｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、８巻、４２４頁（２００７年）；Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻、８１４頁（２００９年）
【非特許文献１４】Ｆａｎｇら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１２８巻、１４０４４頁（２００６年）
【非特許文献１５】Ｌｅｅら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２２巻、５２４１頁（２００６年）
【非特許文献１６】Ｃａｓｔｏｌｄｉら、ＲＮＡ、１２巻、９１３頁（２００６年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一目的は、核酸増幅の必要がない、ＲＮＡの迅速かつ高感度な検出のための方法および組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、高価なおよび／または操作が複雑な機器の必要がない、ＲＮＡの容易な検出のための方法および組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、病原体の検出のための方法および組成物を提供することである。
【００１０】
発明の簡単な概要
試料中のＲＮＡを検出するための方法および材料が開示されている。一部の形態において、本方法は、（ａ）試料およびプローブアレイを接触させるステップと、（ｂ）プローブアレイとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ｈ等）とを接触させるステップと、（ｃ）プローブアレイと、標識されたヌクレオチドと、ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、ＲＮＡ鎖からの伸長中に標識されたヌクレオチドを取り込むことができる核酸ポリメラーゼ（クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ等）とを接触させるステップと、（ｄ）伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドを検出するステップとを伴う。プローブアレイは、１種または複数のキメラプローブを含む。キメラプローブは、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域は近接しており、ＤＮＡ領域は、前記ＲＮＡ領域の５’にある。キメラプローブは、第２のＤＮＡ領域を含むこともできる。第２のＤＮＡ領域も、ＲＮＡ領域と近接することができ、ＲＮＡ領域の３’にあり得る。試料が、キメラプローブのうち少なくとも１種のヌクレオチド配列と相補的なＲＮＡ分子を含有する場合、ＲＮＡ分子は、相補的キメラプローブとハイブリダイズする。一部の形態において、試料およびプローブアレイを接触させるステップ、プローブアレイおよびリボヌクレアーゼを接触させるステップ、ならびにプローブアレイ、標識されたヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを接触させるステップ（ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ））は、同時に行われる。
【００１１】
本方法において、試料中のＲＮＡ分子は、相補的配列を有するキメラプローブにハイブリダイズすることができる。キメラプローブのＤＮＡ領域にハイブリダイズされたＲＮＡ分子の部分は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼによって分解される。続いて、ハイブリダイズしたＲＮＡ分子が伸長して、伸長した核酸鎖を形成することができ、ここでキメラプローブのＤＮＡ領域は、テンプレートとして役立つ。標識のため、少なくとも１個の標識されたヌクレオチドが、伸長した核酸鎖に取り込まれる。標識されたヌクレオチドは、第１の標識を含む。キメラプローブと、キメラプローブにハイブリダイズするＲＮＡ分子との間の配列関係性のため、伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドの検出は、試料中のＲＮＡ分子の存在を示す。
【００１２】
本方法の一部の形態において、標識および検出は、第１の標識を標識することにより増強することができる。これは、例えば、プローブアレイおよび標識コンジュゲートを接触させることにより達成することができ、ここで標識コンジュゲートは特異的結合分子および第２の標識を含み、特異的結合分子は第１の標識に結合する。続いて、伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドは、第２の標識を検出することにより検出される。第１の標識および標識コンジュゲートの有用な組合せの例は、第１の標識としてのビオチンと、標識コンジュゲートとしてのストレプトアビジンコンジュゲートされた金ナノ粒子とである。この例において、ストレプトアビジンは、第１の標識（ビオチン）に結合する特異的結合分子であり、金ナノ粒子は、第２の標識である。
【００１３】
第２の標識の部位の上にまたはこれに凝集することができる別のコンジュゲートを使用することにより、該部位における第２の標識の量が増加し、検出の感度を増加させ、検出をより容易にする。これは、例えば、プローブアレイおよび検出コンジュゲートを接触させることにより達成することができ、ここで検出コンジュゲートは凝集化因子（ａｇｇｒｅｇａｔｏｒ）を含み、凝集化因子は標識コンジュゲート上の検出コンジュゲートの凝集を媒介する。第２の標識および検出コンジュゲートの有用な組合せの例は、第２の標識としての金ナノ粒子と、検出コンジュゲートとしての銀ナノ粒子とである。この例において、銀ナノ粒子は、凝集化因子である。銀ナノ粒子は、金ナノ粒子と反応して、金ナノ粒子の部位に銀ナノ粒子を蓄積させる。反応した銀ナノ粒子の蓄積は、肉眼による検出に十分であり得る。
【００１４】
ポイントオブケアにおけるＲＮＡウイルス等の病原体の迅速かつ正確な検出は、適切な患者処置および救命を可能にする。開示されるＲＮＡマイクロチップは、逆転写およびＰＣＲ増幅を行わずに、ＲＮＡを直接的に検出することができる。開示されるＲＮＡマイクロチップは、ナノ粒子支援シグナル増幅を使用することができる。開示されるＲＮＡマイクロチップ技術は、単純かつ正確であり、単一ヌクレオチドの差を区別することができる。一部の形態において、ＲＮＡを１時間以内に高感度に検出することができ、シグナルは肉眼で検出することができる。この視覚的読み取り形式および単純さは、開示されるＲＮＡマイクロチップ技術を、診療所および最小限のリソースしかない野外での病原体の迅速かつ正確な検出によく適したものとする。
【００１５】
開示される技術を使用して、単一または複数の供給源からの任意のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを検出および分析することもできる。例えば、本技術を使用して、細胞および試料におけるＲＮＡ発現パターンを検出することができる。別の例として、プローブアレイは、例えば、ウイルス、細菌または微生物に特徴的なヌクレオチド配列に相補的なキメラプローブのうち１種または複数を含むことができる。特徴的なヌクレオチド配列の検出は、対応するウイルス、細菌または微生物の存在を示す。
【００１６】
開示される方法は、プローブアレイとしてキメラプローブが固定化された固体基材を使用することにより補助することができる。標識が検出された位置におけるキメラプローブの配列が分かっているため、特定のキメラプローブの位置は、検出されたＲＮＡ分子の同定を可能にする。プローブアレイ上に複数の異なるキメラプローブを含むことにより、複数の異なるＲＮＡ分子を検出することができる。プローブアレイ上の同じ位置に異なるＲＮＡ分子に特異的な異なるキメラプローブをグループ化することにより、関係するＲＮＡ分子を集合的に検出することができる。このことは、例えば、可変性配列を有する標的の検出を単純化することができる。
【００１７】
一部の形態において、キメラプローブは、安定化され得る。キメラプローブ等、安定化された核酸には、例えば、核酸を分解抵抗性にする、修飾されたヌクレオチドを使用することができる。有用な修飾されたヌクレオチドの例として、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。一部の形態において、キメラプローブは、キメラプローブの固定化を可能にする、容易にするまたは媒介するための３’−連結基を含むこともできる。例えば、３’−連結基は、アミノ基であり得る。
【００１８】
プローブアレイもまた開示される。開示の方法における使用のためのプローブアレイは、開示されるキメラプローブのうち１種または複数を含むことができる。キットも開示される。開示される方法における使用のためのキットは、全て本明細書に開示される通りである、プローブアレイ、標識されたヌクレオチドおよび標識コンジュゲートを含むことができる。キットは、それに加えておよび／またはその代わりに、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ｈ等）、ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、ＲＮＡ鎖からの伸長中に標識されたヌクレオチドを取り込むことができる核酸ポリメラーゼ（クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ等）またはその両方を含むことができる。
【００１９】
開示される方法および組成物の追加的な利点は、一部には、以下の記載において説明され、一部には、この記載から理解され、あるいは開示される方法および組成物の実施により知ることができる。開示される方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組合せによって実現および達成される。前述の概要および後述の詳細な説明の両方が、単に例示的かつ説明的なものであり、請求されている発明を制約するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を示し、その記載と共に、開示されている方法および組成物の原理の説明に役立つ。
【００２１】
【図１】図１は、ナノ粒子支援シグナル増幅を使用した、開示されるＲＮＡマイクロチップおよびＲＮＡの視覚的検出の例を示す。ＲＮＡの迅速かつ直接検出のフローチャートを示す。ＲＮＡプローブを標的ＲＮＡとハイブリダイズさせ、続いてＲＮａｓｅ  Ｈ消化およびクレノウ伸長およびビオチン標識ｄＮＴＰの取り込みが行われる。ストレプトアビジンコンジュゲートされたＡｕ−ＮＰは、ビオチンに結合し、続いてビオチン標識をＡｕ−ＮＰ標識に変換する。Ａｕ−ＮＰは、肉眼による（または拡大鏡で補助した）視覚的検出のためのＡｇ−ＮＰ形成および凝集を触媒する。
【００２２】
【図２Ａ】図２Ａは、マイクロチップ上での単一ヌクレオチド識別によるＲＮＡ直接検出を示す。上から下の順に、配列は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１０のヌクレオチド１〜１３、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１１である。シグナルスポットのサイズは、およそ７５ミクロンであり、これは、肉眼で（または拡大鏡で補助して）目に見える。全てのシグナルスポットは、このＲＮＡマイクロチップおよび他のＲＮＡマイクロチップ上で同様のサイズである。
【００２３】
【図２Ｂ−Ｆ】図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ＲＮＡマイクロチップおよびＲＮＡの視覚的検出を示す。（Ｂ）ビオチン化ｄＮＴＰの非存在下におけるＲＮＡ検出（陰性対照）。（Ｃ）ＲＮＡの非存在（陰性対照）。（Ｄ）ネイティブｄＮＴＰを使用（陰性対照）。（Ｅ）ＲＮＡおよびビオチン化ｄＮＴＰの存在下におけるＲＮＡ検出。（Ｆ）単一ヌクレオチド識別によるＲＮＡ検出。シグナルスポット（およそ７５ミクロン）は、肉眼で目に見える。全てのシグナルスポットは、このＲＮＡマイクロチップおよび他のＲＮＡマイクロチップ上で同様のサイズである。
【００２４】
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅおよび図３Ｆは、開示されるＲＮＡマイクロチップの例を用いた特異性および個々のｍＲＮＡ検出を示す。ＲＮＡマイクロチップにはＲＮＡプローブを固定化した。ＢＦ、ＡＦ、ＬａｃＺおよびＢＡプローブは、それぞれ鳥インフルエンザ（ｂｉｒｄ  ｆｌｕ）（ＢＦ）ＲＮＡ、トリインフルエンザ（Ａｖｉａｎ  ｆｌｕ）（ＡＦ）ＲＮＡ、ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（ＢＡ）ＲＮＡを検出する。標的ＲＮＡにビオチン標識ｄＮＴＰを特異的に取り込むことにより、標的ＲＮＡを検出した。（Ａ）試料は、ＢＡ  ＲＮＡを含有する。（Ｂ）試料は、ＬａｃＺおよびＢＡ  ＲＮＡを含有する。（Ｃ）試料は、ＢＦ、ＡＦおよびＬａｃＺ  ＲＮＡを含有する。（Ｄ）試料は、全種類のＲＮＡを含有する。（Ｅ）全ＲＮＡ中の個々のＲＮＡ（ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ）の検出。チップＩ：水（ＲＮＡなし；陰性対照）；チップＩＩ：ＩＰＴＧ誘導Ｅ．ｃｏｌｉから単離された全ＲＮＡ（ＬａｃＺを含有）；チップＩＩＩ：グルコース抑制Ｅ．ｃｏｌｉから単離された全ＲＮＡ（ＬａｃＺを含有せず）。（Ｆ）Ｅ．ｃｏｌｉのＮａＯＨ直接処理による単純ＲＮＡ試料調製による、個々のＲＮＡ（ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ）の検出。チップＩ：水（ＲＮＡなし；陰性対照）；チップＩＩおよびＩＩＩ：それぞれＮａＯＨ処理したＩＰＴＧ誘導およびグルコース抑制Ｅ．ｃｏｌｉ。
【００２５】
【図４】図４は、プローブ固定化の例として、ガラスマイクロチップ表面の活性化を示す。界面化学は、アミン修飾キメラプローブの固定化を可能にする。
【００２６】
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、開示されるＲＮＡマイクロチップの例を用いた高感度かつ迅速なＲＮＡ検出を示す。（Ａ）高感度検出。チップ１〜５は、それぞれ０、５、１５および５０フェムトモルのＬａｃＺ  ＲＮＡを含有する。（Ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびクレノウステップの統合によるＲＮＡ検出。（Ｃ）ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびクレノウステップの統合によるＲＮＡ検出（組み合わせたステップについて１５分間インキュベーション）。（Ｄ）迅速ＲＮＡ検出（ＲＮＡ試料調製を含め、４５分間）。ビオチン化−オリゴ−３５．２（陽性対照）；ＢＡプローブ（陰性対照）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡを検出しない。（Ｅ）ＩＰＴＧ誘導細胞を７０％エタノールで０、３０、４５および６０分間処理した後の、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡ（ＬａｃＺ  ＲＮＡ）の検出。グルコース抑制Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｇｌｕ）を陰性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
開示されている方法および組成物は、特定の実施形態に関する以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例と、図面ならびにそれに関する前記説明および以下の説明とを参照することにより、より容易に理解することができる。
【００２８】
マイクロアレイ技術は、細胞集団の特異的ｍＲＮＡの分析のための強力なツールを提示する。ＤＮＡマイクロアレイの有用性は、処理時間ならびに複数のバイアスおよびアーチファクトを増加させる、ＲＮＡの間接分析によって限定される。ＲＮＡは容易に分解され、ＲＮＡ混合物中の特定のＲＮＡの標識は困難であるため、ＲＮＡの直接検出は依然として課題であり続けている。例えば、病原体およびウイルスＲＮＡ検出のための、直接的で、迅速で、特異的な、使用が容易な、対費用効果の高い、高感度のマイクロチップを開示する。ヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびナノマテリアルの使用により、逆転写することなく特定のＲＮＡを検出することができる。本方法の多標的形態において、検出方法は、特異的であり、１時間未満で達成することができる。開示される技術を使用して、例えば、感染性疾患診断、食品安全性、遺伝子発現プロファイリングおよびがん検出を含む多彩な分野において特定のｍＲＮＡを検出および分析することができる。
【００２９】
一部の形態において、開示されるＲＮＡ検出系は単純である：ＲＮＡプローブの固定化されたＲＮＡマイクロチップへの標的ＲＮＡハイブリダイゼーション（Ｓｐｅｎｃｅｒら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、１１巻、１３７８頁（２０１０年））の後に、結合したＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼによりビオチン標識ｄＮＴＰを用いて伸長させる。ストレプトアビジンおよび金ナノ粒子（Ａｕ−ＮＰ）のコンジュゲートを使用して、次に、標的ＲＮＡに取り込まれたビオチン標識をＡｕ−ＮＰ標識に変換する。Ａｕ−ＮＰは、銀染色により銀ナノ粒子（Ａｇ−ＮＰ）の形成を触媒することができ（Ｔａｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９巻、１７５７頁（２０００年）；Ｃａｏら、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２２巻、３９３頁（２００６年）：Ｑｉら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、３９８巻、２７４５頁（２０１０年）；Ｔａｎｇら、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、６５巻、３７２頁（２００９年）；Ｚｈｏｕら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１３２巻、６９３２頁（２０１０年））、最大１００倍のシグナル増幅を可能にする。形成されたＡｇ−ＮＰ（図１および図２）は、ＲＮＡプローブの部位の上で暗いスポットとして凝集および沈着する。最後に、これらの暗いスポットのアレイの画像が、直接視覚的観察のために形成される。さらに、本発明者らは、このＲＮＡマイクロチップが、単一ヌクレオチドの差を区別し、低フェムトモルレベルのＲＮＡを検出できることを見出した。ＲＮＡ検出系は、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡテンプレート上のＲＮＡに標識ｄＮＴＰを直接的に取り込む、本発明者らのＲＮＡ３’標識アプローチに基づく（ＨｕａｎｇおよびＡｌｓａｉｄｉ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２２巻、２６９頁（２００３年）；Ａｌｓａｉｄｉら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、５巻、１１３６頁（２００４年））。ＲＮＡを直接的に検出するために、本発明者らは、ＲＮＡプローブとして官能化されたＲＮＡを設計する。ＲＮＡプローブは、ＲＮＡ３’領域およびＤＮＡ５’領域からなる（図１および図２）。
【００３０】
試料中のＲＮＡを検出するための方法および材料が開示される。一部の形態において、本方法は、（ａ）試料およびプローブアレイを接触させるステップと、（ｂ）プローブアレイとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ｈ等）とを接触させるステップと、（ｃ）プローブアレイと、標識されたヌクレオチドと、ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、ＲＮＡ鎖からの伸長中に標識されたヌクレオチドを取り込むことができる核酸ポリメラーゼ（クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ等）とを接触させるステップと、（ｄ）伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドを検出するステップとを伴う。プローブアレイは、１種または複数のキメラプローブを含む。キメラプローブは、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域は近接しており、ＤＮＡ領域は、ＲＮＡ領域の５’にある。試料が、キメラプローブのうち少なくとも１種のヌクレオチド配列と相補的なＲＮＡ分子を含有する場合、ＲＮＡ分子は、相補的キメラプローブとハイブリダイズする。一部の形態において、キメラプローブは、キメラプローブの固定化を可能にする、容易にするまたは媒介するための、３’−連結基を含むこともできる。例えば、３’−連結基は、アミノ基であり得る。
【００３１】
そうでないと指定されていなければ、開示される方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技法または特定の試薬に限定されず、変動し得ることを理解されたい。本明細書に使用されている用語法は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、限定的であることを意図しないことも理解されたい。
【００３２】
材料
開示される方法および組成物のために使用することができるか、それと併せて使用することができるか、その調製において使用することができるか、あるいはその産物である、材料、組成物および構成成分が開示される。これらの材料および他の材料が本明細書に開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の様々な個々のおよび集合的な組合せおよび順列それぞれの特定の参照が明確に開示されていない場合があるが、それぞれが、本明細書において具体的に企図され記載されていると理解される。例えば、キメラプローブが、開示および記述され、キメラプローブを含む多数の分子に施すことができる多数の修飾が記述されている場合、それとは反対のことが特に示されない限り、可能なキメラプローブおよび修飾のありとあらゆる組合せおよび順列が具体的に企図される。よって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスならびに組合せ分子の例Ａ〜Ｄが開示される場合、それぞれが個々に列挙されていない場合であっても、それぞれが、個々におよび集合的に企図される。よって、この例において、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに例としての組合せＡ〜Ｄの開示から、組合せＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜ＥおよびＣ〜Ｆのそれぞれが具体的に企図され、開示されると考えるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも具体的に企図および開示される。よって、例えば、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに例としての組合せＡ〜Ｄの開示から、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜ＦおよびＣ〜Ｅのサブグループが具体的に企図され、開示されると考えるべきである。さらに、上述の通りに企図および開示される材料、組成物、構成成分等のそれぞれはまた、かかる材料の任意の群、サブグループ、リスト、セット等に具体的かつ独立に含まれてもよいし、またはそこから除かれてもよい。このような概念は、開示される組成物を作製および使用する方法におけるステップが挙げられるがこれらに限定されない本願のあらゆる態様に適用される。よって、実施することができる種々の追加的なステップが存在する場合、これらの追加的なステップのそれぞれは、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せで実施することができ、かかる組合せのそれぞれが具体的に企図され、開示されていると考えるべきであることが理解される。
【００３３】
Ａ．キメラプローブ
キメラプローブは、配列特異的様式でＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである。キメラプローブは、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、ここでＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域は近接しており、ＤＮＡ領域は、ＲＮＡ領域の５’にある。一部の形態において、キメラプローブは、第２のＤＮＡ領域を含むこともできる。一部の形態において、第２のＤＮＡ領域も、ＲＮＡ領域と近接することができ、ＲＮＡ領域の３’にあり得る。開示される方法において、キメラプローブは、ＲＮＡ分子中に存在する相補的配列に基づいてＲＮＡ分子を捕捉するために使用される。キメラプローブのＤＮＡ領域（複数可）は、キメラプローブおよび目的のＲＮＡ分子の間のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの形成を可能にする。これは、ＲＮａｓｅ  Ｈ等、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド特異的リボヌクレアーゼによるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の選択的な分解を可能にする。
【００３４】
開示されている方法におけるキメラプローブの機能を促進するため、キメラプローブのＲＮＡ領域に近接するＤＮＡ領域（複数可）の全体または部分およびキメラプローブのＤＮＡ領域（複数可）に近接するＲＮＡ領域の全体または部分は、目的のＲＮＡ分子中の近接配列に相補的である。言い換えると、キメラプローブのＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域（複数可）の接合部にまたがるキメラプローブのヌクレオチド配列は、目的のＲＮＡ分子中の配列に相補的である。これにより、ＲＮＡ分子の部分を、キメラプローブのＲＮＡ領域にハイブリダイズさせ、ＲＮＡ分子の別の近接部分を、キメラプローブのＤＮＡ領域（複数可）にハイブリダイズさせることが可能となる。ＲＮＡ分子のハイブリダイズした部分は、キメラプローブのＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域（複数可）の接合部にまたがる。
【００３５】
キメラプローブは、キメラプローブを基材および追加的な核酸領域に取り付けるための、スペーサー、リンカー、連結基を含むこともできる。これらの追加的な構成成分は、キメラプローブの産生または取り扱いの補助、およびプローブアレイを形成するための基材上へのキメラプローブの固定化の補助等、適した目的のために使用することができる。一部の追加的な構成成分は、キメラプローブを作製する方法の副産物であり得る。キメラプローブのこれらの追加的な構成成分の性質は、一般に、開示される方法におけるキメラプローブの機能に決定的ではない。必要なことは、キメラプローブが、目的のＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、本方法の酵素が、ハイブリッドに作用することができることだけである。
【００３６】
キメラプローブは、基材上に固定化することができ、好ましくはそうされる。キメラプローブは、天然起源のヌクレオチドで構成される必要はない。修飾されたヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドならびにオリゴヌクレオチドアナログを使用することができる。必要なことは、プローブが、本明細書に記載される全般構造を有し、開示される方法において必要とされる相互作用および反応が可能であることだけである。特に、キメラプローブは、安定化された核酸であり得る。本明細書において使用する場合、安定化された核酸とは、核酸が分解または切断されにくくする、天然核酸と比べて１個または複数の修飾を含む核酸である。
【００３７】
キメラプローブの固定化を促進または媒介するために、キメラプローブは、３’−連結基を含むことができる。本明細書において使用する場合、３’−連結基は、基材への取り付けを促進または媒介する基または部分である。例えば、３’−連結基は、アミノ基であり得る。
【００３８】
キメラプローブは、好ましくは、相補的部分（プローブ部分（試料断片へのハイブリダイゼーションのためのもの）としても言及される）と、プローブ部分を基材にカップリングさせるリンカー部分とを含む。これらのリンカー部分は、任意の適した構造を有することができ、一般に、キメラプローブの固定化または合成の方法に基づき選ばれる。リンカー部分は、ヌクレオチドで構成されてもよいし、またはこれを含んでもよい。リンカー部分は、任意の適した長さを有することができ、好ましくは、プローブ部分を効果的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。便宜上、そうではないと示されなければ、キメラプローブの長さへの言及は、プローブのプローブ部分の長さを指す。固定化されたキメラプローブとは、支持体に固定化されたキメラプローブである。
【００３９】
キメラプローブは、種々の標的ＲＮＡ分子に対応するプローブのセット等、種々のプローブ配列を有するセットで使用することができる。例えば、キメラプローブのセットは集合的に、病原体のセットに特異的なＲＮＡ配列に相補的であり得る。キメラプローブは、各プローブが同じ長さを有するセットで使用することができる。キメラプローブの相補的部分に好ましい長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０ヌクレオチドである。キメラプローブのＲＮＡ領域の相補的部分は、好ましくは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ分子の配列が分解される際に、標的ＲＮＡ分子との安定的なハイブリッドの形成に十分である。キメラプローブのＲＮＡ領域の相補的部分に好ましい長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ヌクレオチドである。
【００４０】
キメラプローブは、天然起源のヌクレオチドで構成される必要はない。修飾されたヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドならびにオリゴヌクレオチドアナログを使用することができる。必要なことは、プライマーが、本明細書に記載される全般構造を有し、開示される方法において必要とされる相互作用および反応が可能であることだけである。キメラプローブのＤＮＡ領域は、一般に、デオキシリボヌクレオチドで構成され得る。ＲＮＡ領域の５’のＤＮＡ領域とＲＮＡ分子とのハイブリッドが、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド特異的リボヌクレアーゼの基質として認識および使用される限り、修飾された形態のヌクレオチドを使用することができる。修飾されたホスフェート結合は、修飾のこのカテゴリーに収まり得る。
【００４１】
キメラプローブのＲＮＡ領域は、一般に、リボヌクレオチドで構成され得る。ＲＮＡ領域が、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる限り、およびＲＮＡ領域とＲＮＡ分子とのハイブリッドが、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド特異的リボヌクレアーゼの基質として認識および使用されない限り、修飾された形態のヌクレオチドを使用することができる。誘導体化された２’−ヒドロキシおよび修飾されたホスフェート結合は、修飾のこのカテゴリーに収まり得る。例えば、プローブのＲＮＡ領域中のヌクレオチドのうち１個または複数は、２’−Ｏ−メチル  リボヌクレオチドであり得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、リボヌクレオチドは、２’ヒドロキシル官能基を有するヌクレオチドである。類似して、２’−デオキシリボヌクレオチドは、２’水素のみを有するヌクレオチドである。よって、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドは、本明細書において使用される場合、いかなる化学修飾も持たない、それぞれ、ヌクレオシド構成成分アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン、または２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジンおよびチミジンを有する天然起源のヌクレオチドを指す。
【００４３】
Ｂ．プローブアレイ
異なるキメラプローブを共にセットとして使用することができる。このセットは、プローブの全てまたはサブセットの混合物として使用してもよいし、別々の反応において別々に使用されるプローブとして使用してもよいし、あるいはアレイにおいて固定化されたプローブとして使用してもよい。別々にまたは混合物として使用されるプローブは、例えば、第１の標識、選別用タグの使用またはビーズ上への固定化により物理的に分離可能である。プローブアレイ（本明細書において、アレイとしても言及される）は、アレイ中の特定されたまたは予め定められた位置に固定化されたキメラプローブ等、複数のプローブを含む。この文脈において、複数のプローブは、それぞれ異なる配列を有する複数プローブを指す。アレイ中の予め定められた位置のそれぞれは、１種類のプローブを有する（即ち、該位置におけるプローブは全て同じ配列を有する）。各位置は、複数コピーのプローブを有する。アレイ中の異なる配列のプローブの空間的分離は、プローブにハイブリダイズするＲＮＡ分子の別々の検出および同定を可能にする。ＲＮＡ分子が、プローブアレイ中の所定の位置で検出される場合、断片がハイブリダイズした、核酸断片中の部位に隣接する配列が、アレイにおける該位置に固定化されたプローブに相補的であることを示す。
【００４４】
プローブアレイにおける使用のための固体基材として、オリゴヌクレオチドが直接的または間接的にカップリングされ得る任意の固体材料が挙げられる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸等の材料が挙げられる。固体基材は、薄膜またはメンブレン、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、繊維織物、成形ポリマー、粒子および微小粒子を含む任意の有用な形態を有することができる。固体基材についての好ましい形態は、シリコンチップ、スライドガラスおよびマイクロタイターディッシュである。
【００４５】
固体基材へのオリゴヌクレオチドの固定化のための方法は、十分に確立されている。キメラプローブは、確立されたカップリング方法を使用して、基材にカップリングすることができる。取り付け方法の例として、例えば、エポキシシランまたはイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｔｅ）コーティングされたガラスに取り付けることができるアミノ修飾されたオリゴヌクレオチド；例えば、アミノフェニルまたはアミノフェニル誘導体化されたガラスに取り付けることができる、スクシニル化されたオリゴヌクレオチド；例えば、メルカプトシラン処理されたガラスに取り付けることができる、ジスルフィド修飾されたオリゴヌクレオチド；および例えば、アルデヒドまたはエポキシドに取り付けることができる、ヒドラジンが挙げられる。適した取り付け方法の例は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｔｔａｃｈｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」（２０１１年）；Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻：５４５６〜５４６５頁（１９９４年）；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻（１１号）：５０２２〜５０２６頁（１９９４年）；Ｋｈｒａｐｋｏら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （Ｍｏｓｋ）  （ＵＳＳＲ）  ２５巻：７１８〜７３０頁（１９９１年）；Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：６３７９〜６３８３頁（１９９５年）；米国特許第５，８７１，９２８号、Ｆｏｄｏｒら；米国特許第５，６５４，４１３号、Ｂｒｅｎｎｅｒ；米国特許第５，４２９，８０７号；および米国特許第５，５９９，６９５号、Ｐｅａｓｅらに記載されている。
【００４６】
所定のプローブアレイが単一ユニットまたは構造であることは、好ましいが必要という訳ではない。プローブのセットは、任意の数の固体支持体にわたり分布させることができる。例えば、極端な話、各プローブは、別々の反応チューブまたは容器に固定化することができる。選別用タグを持たない化合物または複合体から選別用タグを有する化合物または複合体を選別または分離するために使用することができる化合物である、選別用タグは、マルチパートプローブアレイの部分の異なる群を選別および分離するために使用することができる。
【００４７】
アレイ中のプローブは、同様のハイブリッド安定性を有するよう設計することもできる。このことは、キメラプローブへのＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションをより効率的なものとし、ミスマッチハイブリダイゼーションの発生率を低下させる。プローブのハイブリッド安定性は、公知の式および熱力学の原理を使用して計算することができる（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５巻：３５５５〜３５６２頁（１９９６年）；Ｆｒｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：９３７３〜９３７７頁（１９８６年）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：３７４６〜３７５０頁（１９８６年）を参照）。プローブのハイブリッド安定性は、例えば、プローブを化学修飾することにより、より同様のものとすることができる（ハイブリッド安定性の円滑化と称され得るプロセス）（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻（１５号）：３０５９〜３０６５頁（１９９７年）；Ｈｏｈｓｉｓｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４巻（３号）：４３０〜４３２頁（１９９６年））。ハイブリッド安定性は、特殊化された条件下でハイブリダイゼーションを実施することにより円滑化することもできる（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７巻（６号）：１４９２〜１４９８頁（１９９９年）；Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻（６号）：１５８５〜１５８８頁（１９８５年））。
【００４８】
プローブのハイブリッド安定性を円滑化する別の仕方は、プローブの長さを変動させることである。このことは、全プローブが、同様のハイブリッド安定性を有するように、各プローブのハイブリッド安定性の調整を可能にする（可能な範囲で）。プローブから単一のヌクレオチドを付加または削除することは、固定の増分だけプローブのハイブリッド安定性を変化させるため、プローブアレイ中のプローブのハイブリッド安定性が等しくないことが理解される。このため、本明細書において使用する場合、ハイブリッド安定性の類似性とは、プローブのハイブリッド安定性の類似性における任意の増加（または換言すると、プローブのハイブリッド安定性の差の任意の低下）を指す。ハイブリッド安定性における任意のかかる類似性増加は、キメラプローブのハイブリダイゼーションおよびカップリングの効率および忠実度を改善し得るため、これは有用である。
【００４９】
試料断片へのキメラプローブのハイブリダイゼーションおよびカップリングの効率は、異なるハイブリダイゼーション条件に付すことができるプローブアレイのセクションまたはセグメントの中に、同様のハイブリッド安定性のキメラプローブをグループ化することによっても改善され得る。このようにして、ハイブリダイゼーション条件は、特定のクラスのプローブについて最適化され得る。
【００５０】
Ｃ．試料
開示される方法を使用して、任意の供給源に由来する任意のＲＮＡ分子を検出および分析することができる。よって、開示される方法のためのＲＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含有する試料の供給源は幅広い。開示される方法における使用のための試料は、一般に、ＲＮＡ分子を含有するまたは含有し得る任意の試料であり得る。任意の供給源に由来する任意の試料を、開示されている方法と共に使用することができる。適した標的試料の例として、細胞試料、組織試料、細胞抽出物、別の試料から精製された構成成分または画分、環境試料、培養試料、組織試料、体液および生検試料が挙げられる。多数の他の試料供給源が公知である、あるいは開発することができ、任意のものが、開示される方法と共に使用され得る。開示される方法と共に使用するのに好ましい試料は、細胞および組織の試料である。
【００５１】
Ｄ．標識されたヌクレオチド
開示される方法は、伸長した核酸鎖に取り込まれる標識（「第１の標識」と命名）を活用する。本方法において、この取り込みは、鎖の伸長の際の標識されたヌクレオチドの取り込みにより達成される。重合されている核酸への取り込みのための標識されたヌクレオチドは、周知のものであり、開示される方法において使用することができる。任意の標識および任意の標識されたヌクレオチド（核酸ポリメラーゼによって取り込むことができるもの）が使用できる。しかし、開示される方法は、一般に、標識ペアのメンバーである第１の標識を活用する。標識ペアとは、互いに結合または相互作用する化合物のペアである。ビオチンおよびストレプトアビジンならびに抗体およびそのハプテンは、標識ペアの例である。第１の標識は、好ましくは、標識ペアの一方のメンバーである（標識ペアの他方のメンバーは、標識コンジュゲートにおける特異的結合分子として使用するべきである）。第１の標識を用いて標識または誘導体化されたヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼによって合成されている核酸鎖中に取り込まれ得るように、標識ペアおよび第１の標識を選ぶことができる。有用な標識されたヌクレオチドとして、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、ジニトロフェノール含有ヌクレオチド、ブロモデオキシウリジンおよび蛍光ヌクレオチド（フルオレセイン含有ヌクレオチド等）が挙げられる。
【００５２】
第１の標識は、開示される方法において伸長した核酸鎖に取り込まれる、かつ特異的結合分子が会合し得る分子または部分である。第１の標識は、特異的結合分子の会合の標的として役立ち得るいずれの種類の分子または部分であってもよい。
【００５３】
Ｅ．標識コンジュゲート
標識コンジュゲートは、開示されている方法において、伸長した核酸鎖中に取り込まれた標識されたヌクレオチドに第２の標識を会合させるように使用される（よって、伸長したＲＮＡ分子に第２の標識を会合させる）。これらは、検出しようとするＲＮＡ分子と、検出のためのシグナルを増加させるために使用される検出コンジュゲートとの間のブリッジとして役立つ。標識コンジュゲートは、特異的結合分子および第２の標識のコンジュゲートである。標識コンジュゲートにおける特異的結合分子は、第１の標識と会合または結合するよう選ばれる。標識コンジュゲートにおける第２の標識は、検出コンジュゲートと会合または結合するよう選ばれる。標識コンジュゲートは、開示される方法における標識コンジュゲートの機能と一貫した、任意の構造および任意の追加的な構成成分を有してもよい。
【００５４】
本明細書において使用する場合、特異的結合分子とは、特定の分子または部分と特異的に相互作用する分子である。特異的結合分子と特異的に相互作用する分子または部分は、本明細書において、標的分子として言及される。一般に、第１の標識は、開示される方法の文脈における標的分子である。標的分子という用語は、別々の分子および分子の部分（例えば、特異的結合分子と特異的に相互作用するタンパク質のエピトープ）の両方を指すことを理解されたい。受容体／リガンドペアのいずれかのメンバーである抗体および特異的結合親和性を有する他の分子は、レポーター結合分子の親和性部分として有用な、特異的結合分子の例である。
【００５５】
開示される標識コンジュゲートにおいて、任意の特異的結合分子が使用され得る。しかし、開示される方法は、一般に、標識ペアのメンバーである特異的結合分子を活用する。特異的結合分子は、好ましくは、標識ペアの一方のメンバーである（標識ペアの他方のメンバーは、第１の標識として使用するべきである）。対応する第１の標識により標識または誘導体化されたヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼによって合成されている核酸鎖中に取り込まれ得るように、標識ペアおよび特異的結合分子を選ぶことができる。特異的結合分子は、標識コンジュゲートの一部であり、かつ第１の標識が会合し得る分子または部分である。好ましい特異的結合分子として、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン特異的抗体、ジニトロフェノール特異的抗体、ブロモデオキシウリジン特異的抗体、およびフルオレセイン特異的抗体が挙げられる。
【００５６】
特定の標的分子と特異的に相互作用する特異的結合分子は、該標的分子に特異的であると言われる。例えば、特異的結合分子が、特定の抗原に結合する抗体である場合、この特異的結合分子は、該抗原に特異的であると言われる。抗原は標的分子である。特異的結合分子を含有する標識コンジュゲートは、特定の第１の標識等、特定の標的分子に特異的であると言及することもできる。特異的結合分子は、好ましくは、抗体、リガンド、結合タンパク質、受容体タンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物、合成ポリアミドまたはオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
例えば、特異的結合分子、第１の標識および第２の標識として有用な抗体は、商業的に得ることができる、または十分に確立された方法を使用して産生することができる。例えば、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８７年）３０〜８５頁は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方の産生に有用な一般方法について記載する。本書全体は、アッセイ系における抗体の使用のための多くの一般技法および原理について記載する。
【００５８】
任意の標識が第２の標識として使用され得る。第２の標識は、標識コンジュゲートの一部であり、検出コンジュゲートが会合し得る分子または部分である。第２の標識は、検出コンジュゲートの会合の標的として役立ち得る任意の種類の分子または部分であってよい。好ましくは、第２の標識はまた、標識コンジュゲート上でのおよびそこにおける検出コンジュゲートの凝集を媒介または可能にする。好ましい第２の標識として、金、金ナノ粒子および他の金コンジュゲートが挙げられる。
【００５９】
Ｆ．検出コンジュゲート
検出コンジュゲートは、開示される方法において、ハイブリダイズおよび伸長したＲＮＡ分子に検出可能なシグナルを会合させるために使用される。検出コンジュゲートは、標識コンジュゲートにおける第２の標識と会合または結合する。検出コンジュゲートは、のシグナルを含むまたはそれを生じることができる。好ましくは、検出コンジュゲートは、第２の標識の上またはその周りに凝集し、複数の検出コンジュゲートの検出がより容易であるという効果がある。１個の検出コンジュゲートの会合が、多くの標識を標識コンジュゲートと会合させるように、検出コンジュゲートは、複数コピーの標識を含むこともできる。
【００６０】
凝集は、任意の適した様式で達成することができる。例えば、複数の検出コンジュゲートが第２の標識と会合または結合し得るように、第２の標識を選ぶことができる。検出コンジュゲートの会合は、例えば、結合、共有結合性カップリングまたは化学反応を介することができる。それに代えてまたはそれに加えて、検出コンジュゲートは、自己凝集することができる。検出コンジュゲートの凝集は、凝集化因子を介することができる。凝集化因子は、その複数コピーが、単一の標識コンジュゲートに結合または会合することができる化合物である。
【００６１】
有用な検出コンジュゲートは、銀ナノ粒子である。第２の標識としての金ナノ粒子と共に使用する場合、銀ナノ粒子は、金ナノ粒子と反応し、その上に凝集する。例えば、銀は、金の存在下において還元されて、この還元が、金表面上での銀の構築を引き起こし得る。
【００６２】
Ｇ．標識
標識を使用して、検出のためのシグナルを産生することができる。標識は、伸長している核酸鎖、標識コンジュゲートまたは検出コンジュゲートに直接的または間接的に含まれまたは取り込まれ得る、かつ直接的または間接的に測定可能な、検出可能なシグナルをもたらす任意の分子である。標識は、構成成分へと共有結合または非共有結合のいずれかによりカップリングまたは結合されている場合、該構成成分と会合されている。標識は、構成成分に共有結合によりカップリングされている場合、該構成成分にカップリングされている。核酸へと取り込む、核酸とカップリングするまたは核酸と会合するための多くの適した標識が公知である。開示される方法における使用に適した標識の例は、放射性同位元素、蛍光分子、リン光分子、生物発光分子、酵素、抗体およびリガンドである。
【００６３】
適した蛍光標識の例として、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ｐｈｅｎｙｌｉｎｏｄｏｌｅ）（ＤＡＰＩ）ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。同時検出について好ましい蛍光標識は、ＦＩＴＣならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光色素の吸収極大および発光極大は、それぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であるので、これらの同時検出が可能である。蛍光標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲオレゴン州ユージーンおよびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏオハイオ州クリーブランドを含む種々の商業的供給源から得ることができる。
【００６４】
標識されたヌクレオチドは、合成の際に核酸に直接的に取り込まれ得るため、標識の好ましい形態である。ＤＮＡまたはＲＮＡ中に取り込まれ得る標識の例として、ＢｒｄＵｒｄ（ＨｏｙおよびＳｃｈｉｍｋｅ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０巻：２１７〜２３０頁（１９９３年））、ＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２巻：２８３〜２９３頁（１９９３年））等のヌクレオチドアナログ、およびビオチンで修飾されたヌクレオチド（Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８巻：６６３３頁（１９８１年））またはジゴキシゲニン等の適したハプテンで修飾されたヌクレオチド（Ｋｅｒｋｈｏｆ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０５巻：３５９〜３６４頁（１９９２年））が挙げられる。適した蛍光標識されたヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻：３２２６〜３２３２頁（１９９４年））である。ＤＮＡのための好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸塩、Ｓｉｇｍａ）であり、ＲＮＡのための好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに連結することができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチンまたはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用することができる。
【００６５】
ビオチン等、核酸中に取り込まれた標識は、本技術分野において周知の高感度方法を使用してその後に検出することができる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、このコンジュゲートは、ビオチンに結合され、適した基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム、３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光によりその後に検出される。
【００６６】
他の標識として、分子または金属バーコード、質量標識、および核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強されたラマン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、リン光、化学発光、共鳴ラマン、マイクロ波または組合せにより検出可能な標識が挙げられる。質量標識は、質量分析において特有の質量特徴を有するか、または標識された構成成分にこれを与える化合物または部分である。質量分析が検出に使用される場合、質量標識が有用である。好ましい質量標識は、ペプチド核酸および炭水化物である。標識の組合せも有用であり得る。例えば、２６５種の固有の標識組合せを有する色で符号化したミクロビーズは、多数の構成成分の鑑別に例えば有用である。例えば、２５６種の異なるキメラプローブを一意的に標識および検出することができ、開示されている方法のマルチプレックス化および自動化を可能である。
【００６７】
有用な標識は、ｄｅ  Ｈａａｓら、「Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ  ａｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌ  ｆｏｒ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５巻（９号）：１２７９〜９２頁（１９９７年）；ＫａｒｇｅｒおよびＧｅｓｔｅｌａｎｄ「Ｄｉｇｉｔａｌ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｌｏｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｃａｍｅｒａ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０巻（２４号）：６６５７〜６５頁（１９９２年）；Ｋｅｙｅｓら、「Ｏｖｅｒａｌｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｆｉｖｅ−ａｔｏｍ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｓｐｉｎ  ｌａｂｅｌｓ」Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．７２巻（１号）：２８２〜９０頁（１９９７年）；Ｋｉｒｓｃｈｓｔｅｉｎら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤｅｌｔａＦ５０８  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＦＴＲ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｔｉｍｅ−  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ」Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．  ４８巻（２号）：４１５〜２１頁（１９９９年）；Ｋｒｉｃｋａ「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４０巻（３号）：３４７〜５７頁（１９９４年）；Ｋｒｉｃｋａ「Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．３７巻（９号）：１４７２〜８１頁（１９９１年）；Ｋｕｍｋｅら「Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６９巻（３号）：５００〜６頁（１９９７年）；ＭｃＣｒｅｅｒｙ「Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ」Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７巻（２号）：１２１〜４頁（１９９７年）；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ」Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ９巻（３号）：１４５〜５６頁（１９９５年）；Ｎｕｒｍｉら、「Ａ  ｎｅｗ  ｌａｂｅｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ａ  ｃｌｏｓｅｄ  ｔｕｂｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻（８号）：２８頁（２０００年）；Ｏｅｔｔｉｎｇら「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｂｅｒ  ８Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔａｉｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｅｌｅｃ���ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９巻（１８号）：３０７９〜８３頁（１９９８年）；Ｒｏｄａら、「Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ−ｖｉｄｅｏｃａｍｅｒａ  ｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈ」Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５７巻（１号）：５３〜６２頁（１９９８年）；Ｓｉｄｄｉｑｉら，「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−  ａｎｄ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ」Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ａｎａｌ．１０巻（６号）：４２３〜３１頁（１９９６年）；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、「Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：  ａ  ｎｅｗ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６巻（６号）：１１０４〜１１頁（１９９４年）；Ｖｏ−Ｄｉｎｈら、「Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｂｅｓ」Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６６巻（２０号）：３３７９〜８３頁（１９９４年）；Ｖｏｌｋｅｒｓら、「Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｌａｂｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．  ２９巻（１号）：５９〜６２頁（１９９１年）に記載されている。
【００６８】
分子バーコードの一形態である金属バーコードは、３０〜３００ｎｍ直径×４００〜４０００ｎｍの多層多金属棒である。このような棒は、アルミナモールドへの電着により構築され、続いてアルミナが除去され、これらの小型の多層物体が後に残る。この系は、最大７種の異なる金属において符号化された最大１２ゾーンを有することができ、ここでこの金属は、異なる反射率を有し、よって、金属に応じて光学顕微鏡中でより明るくまたはより暗く見える；これは、実際的に無制限の識別コードをもたらす。金属バーは、ガラスまたは他の材料でコーティングすることができ、プローブは、本技術分野において一般に公知の方法を使用してこのガラスに取り付けられる；アッセイ読み取りは、標的からの蛍光により、プローブの同一性は、バーコードの明暗パターンによる。
【００６９】
標識によって生じたシグナルを検出および測定するための方法は公知である。例えば、放射性同位元素は、シンチレーション計数または直接的な視覚化により検出することができ；蛍光分子は、蛍光分光光度計により検出することができ；リン光分子は、分光光度計により検出またはカメラにより直接的に視覚化することができ；酵素は、該酵素によって触媒された反応産物の検出または視覚化により検出することができ；抗体は、該抗体にカップリングされた二次検出標識を検出することにより検出することができる。かかる方法は、開示される増幅および検出方法において直接的に使用することができる。本明細書において使用する場合、検出分子とは、増幅された核酸と相互作用し、１個または複数の検出標識がカップリングされる分子である。検出の別の形態において、標識は、異なる蛍光、リン光または化学発光の発光寿命により時間的に鑑別することができる。マルチプレックス化された時間依存的検出が、Ｓｑｕｉｒｅら、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １９７巻（２号）：１３６〜１４９頁（２０００年）およびＷＯ００／０８４４３に記載されている。
【００７０】
標識の量または強度の定量的測定を使用することができる。例えば、定量化を使用して、所定の標識、よって、標識された構成成分が、閾値レベルまたは量において存在するかどうかを決定することができる。閾値レベルまたは量は、シグナルの任意の所望のレベルまたは量であり、実施されている方法の特定の形態の必要に適合するように選ぶことができる。
【００７１】
Ｈ．リボヌクレアーゼ
開示される方法では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼを使用して、キメラプローブのＤＮＡ領域（複数可）にハイブリダイズされたＲＮＡ分子の部分を分解する。開示される方法において、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに依存する任意のリボヌクレアーゼを使用することができる。好ましいリボヌクレアーゼは、十分に特徴付けされたＲＮａｓｅ  Ｈ（ＥＣ３．１．２６．４）である。ＲＮａｓｅ  Ｈの最適活性は、還元試薬の存在下において、７．５〜９．１の間に含まれるｐＨで達成される（Ｂｅｒｋｏｗｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４８巻：５９１４〜５９２１頁（１９７３年））。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、Ｎ−エチルマレイミド（ＳＨ基と反応する化学物質）の存在下において阻害されるが、高イオン強度によって著しく影響される訳ではない（０．３Ｍ  ＮａＣｌの存在下において５０％活性が保持される）。ＲＮａｓｅ  Ｈは、Ｍｇ２＋イオンを必要とするが、これは、部分的にＭｎ２＋イオンに置き換えることができる。
【００７２】
Ｉ．核酸ポリメラーゼ
開示されている方法は、核酸ポリメラーゼを使用して、キメラプライマーにハイブリダイズされたＲＮＡ分子の末端を伸長させる。ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、ＲＮＡ鎖からの伸長中に標識されたヌクレオチドを取り込むことができる、任意の適した核酸ポリメラーゼを使用することができる。大部分のＤＮＡポリメラーゼは、これらの要件を満たす。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く。有用な核酸ポリメラーゼの例として、クレノウ断片（ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片）（Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４５巻：６２３〜６２７頁（１９７４年））、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫａｂｏｏｒｄおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：１４９〜１５７頁（１９９５年））および修飾されたＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２巻：１５３３０〜１５３３３頁（１９８７年）；ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻：６４４７〜６４５８頁（１９８９年）；Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））が挙げられる。他の有用な核酸ポリメラーゼとして、バクテリオファージφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，１９８，５４３号および同第５，００１，０５０号、Ｂｌａｎｃｏら）、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ  ８４巻：２４７頁（１９８９年））、ファージφＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４巻：８２８７頁（１９８７年））、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８巻：１９６５〜１９７５頁（１９９３年））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｇｅｎｅ  ９７巻：１３〜１９頁（１９９１年））、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（ＺｈｕおよびＩｔｏ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １２１９巻：２６７〜２７６頁（１９９４年））、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５巻：６０〜８９頁（１９９０年））、ＤＥＥＰ  ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＲ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片（Ｌａｗｙｅｒら、ＰＣＲ  Ｍｅｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  ２巻（４号）：２７５〜２８７頁（１９９３年）、Ｋｉｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻（１８号）：１３０６１〜１３０６４頁（１９９４年））が挙げられる。
【００７３】
Ｊ．安定化された核酸
非修飾オリゴリボヌクレオチドは、有効なプローブとして機能することができるが、核酸修飾を使用することによりプローブが安定化されている場合、キメラプローブおよびプローブアレイは、より安定的であり、より長い有効期間を有することができる。キメラプローブのヌクレアーゼ抵抗性を大幅に増強する化学修飾を施すことができる。一般に、かかる修飾は、キメラプローブ中のヌクレオチドの２’位およびキメラプローブ中のヌクレオチド間のホスフェート結合に施すことができる。例えば、キメラプローブの塩基のうち１個または複数は、利用できる核酸合成方法を使用して、２’メトキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドまたはホスホロチオエートリボヌクレオチドであり得る。修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドならびにそれらの合成方法は公知である。そのうちの一部は、Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２巻：１２５７〜１２６２頁（１９９３年）；ＲｏｓｅｎｂｅｒｇらによるＷＯ９３／０１２８６；Ａｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：７０７９〜７０８３頁（１９８８年）；Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：７４４８〜７７９４頁（１９８９年）；Ｓｈａｗら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９巻：７４７〜７５０頁（１９９１年）；Ｏｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９巻：３４３５〜３４４１頁（１９９１年）；Ｐａｏｌｅｌｌａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１巻：１９１３〜１９１９頁（１９９２年）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：３１４〜３１７頁（１９９１年）；ＨｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈおよびＥｃｋｓｔａｉｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２６７巻：１９０４〜１９０９頁（１９９２年）；Ｈｙｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．によるＷＯ９１／１７０９３；Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．によるＥＰ０３３９８４２；Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によるＷＯ９５／２３２２５；ジョンズ・ホプキンス大学によるＷＯ９４／１５６１９；および米国特許第５，３３４，７１１号、Ｓｐｒｏａｔらに記載されている。
【００７４】
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびキメラプローブの修飾に使用される置換基の記載において、アルキルまたはアルキル基は、直鎖、分枝鎖および環状アルキル基を含む飽和脂肪族炭化水素を指す。この使用のため、かかるアルキル基が、１〜１２個の炭素を有することが好ましい。かかるアルキル基が、１〜６個の炭素を有することがより好ましい。かかるアルキル基が、１〜２個の炭素を有することがさらにより好ましい。かかるアルキル基が、１個の炭素を有することが最も好ましい。これらのアルキル基は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、１個もしくは複数のアミノ基またはその両方を含むこともできる。かかるヒドロキシルおよびアミノ基は、アルキル基中の任意の炭素原子にカップリングすることができる。本明細書において使用する場合、ヒドロキシアルキルという用語は、１個または複数のヒドロキシル基を含むアルキル基を指すために使用され、アミノアルキルという用語は、１個または複数のアミノ基を含むアルキル基を指すために使用され、ヒドロキシルアミノアルキルは、１個または複数のヒドロキシル基および１個または複数のアミノ基を含むアルキル基を指すために使用される。本明細書において使用する場合、アリルまたはアリル基は、直鎖、分枝鎖および環状アリル基を含む不飽和脂肪族炭化水素を指す。この使用のため、かかるアリル基が、１〜１２個の炭素を有することが好ましい。かかるアリル基が、１〜６個の炭素を有することがより好ましい。かかるアリル基が、２〜３個の炭素を有することがさらにより好ましい。かかるアリル基が、３個の炭素を有することが最も好ましい。アリール、アルカリルおよびアリールアルキル等、他の置換基を使用して、本明細書に記載されているヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびキメラプローブを修飾することもでき、ここでアリールは、ベンジル基を指し、アルカリルは、アリール基で置換されたアルキル基を指し、アリールアルキルは、アルキル基で置換されたアリール基を指す。
【００７５】
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびキメラプローブへの言及における、本明細書中の修飾という用語の使用は、従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドと比べてヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの化学的相違を指すことを意図する。本明細書中の修飾という用語の使用は、修飾されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびキメラプローブが産生される様式を限定することを意図しない。同様に、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはキメラプローブ中の化学基の置き換えにおける言及は、従来のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドと比べてヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの化学的相違を指すことを意図し、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはキメラプローブが産生される様式を限定することを意図しない。
【００７６】
３’および５’末端における修飾：オリゴヌクレオチドアナログの分解が、主に３’−エキソヌクレアーゼに起因し得ることが十分に立証される。いくつかの試験により、様々な３’修飾が、これらアナログのヌクレアーゼ感受性を大幅に減少させ得ることも実証された。よって、３’エキソヌクレアーゼに対する感受性を低下させる別の方法は、キメラプローブの３’末端ヒドロキシル基への遊離アミンの導入である（例えば、Ｏｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９巻：３４３５〜３４４１頁（１９９１年）を参照）。別の有用な３’末端修飾は、３’から３’への連結でキメラプローブのチミンヌクレオチド末端をカップリングすることである。かかる構造は、本明細書において、３’−３’チミンヌクレオチドまたはＴ（３’−３’）と言及される。
【００７７】
好ましい３’修飾は、キメラプローブの３’ヒドロキシルが、化学基、例えば、−Ｈ、−Ｏ−Ｒ１、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ１、−Ｎ−Ｒ１２、Ｆおよび−３’−ヌクレオチド（ここで、各Ｒ１は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、−ＰＲ２（Ｏ）−Ｒ２、または−ＰＲ２（Ｓ）−Ｒ２であり、ここで、各Ｒ２は独立的に、Ｏ、Ｓ、Ｆ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、Ｏ−Ｒ３、またはＳ−Ｒ３であり、ここで、各Ｒ３は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキルまたはアリルである）に置き換えられた修飾である。本明細書において使用する場合、キメラプローブの３’ヒドロキシルは、キメラプローブの３’末端ヌクレオチド中のリボース残基の３’炭素に通常存在するヒドロキシル基を指す。本明細書において使用する場合、キメラプローブの３’炭素は、キメラプローブの３’末端ヌクレオチド中のリボース残基の３’炭素を指す。
【００７８】
キメラプローブの５’末端は、ヒドロキシルまたはホスフェート基を有することが好ましいが、５’末端は、ヌクレアーゼに対するキメラプローブの抵抗性を増加させるよう修飾することができる。好ましい５’修飾は、キメラプローブの５’ヒドロキシルが、化学基、例えば、−Ｈ、−Ｏ−Ｒ４、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ４、−Ｎ−Ｒ４２およびＦ（ここで、各Ｒ４は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、−ＰＲ５（Ｏ）−Ｒ５または−ＰＲ５（Ｓ）−Ｒ５であり、ここで、各Ｒ５は独立的に、Ｏ、Ｓ、Ｆ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、Ｏ−Ｒ６、またはＳ−Ｒ６であり、各Ｒ６は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキルまたはアリルである）に置き換えられた修飾である。本明細書において使用する場合、キメラプローブの５’ヒドロキシルは、ホスフェート基が通常取り付けられる、キメラプローブの５’末端ヌクレオチド中のリボース残基の５’炭素に通常存在するヒドロキシルを指す。本明細書において使用する場合、キメラプローブの５’炭素は、キメラプローブの５’末端ヌクレオチド中のリボース残基の５’炭素を指す。別の有用な修飾は、５’末端ホスフェートへのアクリジン誘導体等、挿入剤の共有結合による取り付けである（例えば、ペンタメチレンブリッジを使用）（例えば、Ｍａｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５巻：７２５〜７３０頁（１９８９年）；Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６７巻：３３８９〜３３９５頁（１９９２年）を参照）。
【００７９】
ヌクレオチドの２’位における修飾：化学修飾の別の有用なクラスは、様々な細胞内および細胞外ヌクレアーゼの活性に決定的であることが示されてきた、ヌクレオチドのリボース部分の２’ＯＨ基の修飾である。典型的な２’修飾は、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（Ｐａｏｌｅｌｌａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１巻：１９１３〜１９１９頁（１９９２年））ならびに２’−フルオロおよび２’−アミノ−オリゴヌクレオチド（Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：３１４〜３１７頁（１９９１年）；ＨｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈおよびＥｃｋｓｔａｉｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２６７巻：１９０４〜１９０９頁（１９９２年））の合成である。キメラプローブは、デオキシリボヌクレオチドも含有する（ＤＮＡ領域（複数可）中に）。しかし、使用されているリボヌクレアーゼが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを認識するために２’位に未置換水素を必要とする程度まで、ＲＮＡ領域の５’にあるキメラプローブのＤＮＡ領域のヌクレオチド中に２’修飾を使用するべきではない。
【００８０】
好ましい２’修飾は、ヌクレオチドの２’ヒドロキシルが、化学基、例えば、−Ｈ、−Ｏ−Ｒ７、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ７、−Ｎ−Ｒ７２、Ｆおよび−２’−ヌクレオチド（ここで、各Ｒ７は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、−ＰＲ８（Ｏ）−Ｒ８、または−ＰＲ８（Ｓ）−Ｒ８、であり、ここで、各Ｒ８は独立的に、Ｏ、Ｓ、Ｆ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、Ｏ−Ｒ９、またはＳ−Ｒ９であり、ここで、各Ｒ９は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキルまたはアリルである）に置き換えられた修飾である。より好ましい２’修飾は、ヌクレオチドの２’ヒドロキシルが、−Ｈ、−Ｏ−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆ、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＯＰＯ（Ｏ）−ＣＨ３、および−ＯＰＯ（Ｓ）−ＣＨ３等の化学基に置き換えられた修飾である。最も好ましい２’修飾は、ヌクレオチドの２’ヒドロキシルが、−Ｏ−ＣＨ３に置き換えられた修飾である。
【００８１】
ホスフェート結合に対する修飾：キメラプローブ中のヌクレオチドを連結するホスフェート基に対する修飾を使用して、ヌクレアーゼに対するキメラプローブの抵抗性を増強することもできる。この目的のための典型的な修飾は、遊離酸素原子、硫黄またはハロゲンの一方または両方の置き換えを含む。遊離酸素原子または硫黄原子は、存在するのであれば、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキルまたはアリル等の化学基に連結することもできる。３’および／または５’ジハロホスホネート置換ヌクレオチド（例えば、３’および／または５’−ＣＦ２−ホスホネート置換ヌクレオチド）の使用等、かかる置換の例は、ＷＯ９５／２３２２５に記載されている。キメラプローブにおける使用に好ましい修飾されたホスフェート連結基として、−ＯＰＲ１０（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰＲ１０（Ｓ）Ｏ−および−ＯＰＯ（Ｓ）Ｏ−（式中、Ｒ１０は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキル、アリル、−Ｏ−Ｒ１１、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ１１、−Ｎ−Ｒ１１２またはＦであり、ここで、各Ｒ１１は独立的に、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、ヒドロキシルアミノアルキルまたはアリルである）が挙げられる。キメラプローブ中における使用により好ましい修飾されたホスフェート連結基として、−ＯＰＲ１２（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰＲ１２（Ｓ）Ｏ−、および−ＯＰＯ（Ｓ）Ｏ−（式中、Ｒ１２は、−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ−（ＣＨ３）２またはＦである）が挙げられる。キメラプローブ中における使用に最も好ましい修飾されたホスフェート連結基は、一般的にホスホロチオエートと称される、−ＯＰＯ（Ｓ）Ｏ−である。
【００８２】
別の有用な修飾は、配列中に存在し得る、シトシン塩基のメチル化である。キメラプローブ／ＲＮＡ分子ハイブリッドの安定性は、ＲＮＡ分子とより強い塩基対形成をするオリゴヌクレオチドをもたらす修飾されたヌクレオチドを使用することにより、増加させることができる。例えば、Ｃ−５プロピニルピリミドヌクレオチドは、核酸間の水素結合を増加させる（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３巻：５３０７〜５３１０頁（１９９２年））。
【００８３】
上述の修飾は、キメラプローブの限定された領域中で、および／または修飾されたキメラプローブのキメラをもたらすよう組み合わせて使用することができる。リボヌクレアーゼによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド領域および核酸ポリメラーゼによるＤＮＡ領域の認識のための要件のため、キメラプローブのある特定の領域は、他よりも修飾を受け入れ易い。例えば、開示される方法に影響を与えることなく、キメラプローブのＲＮＡ領域中に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを導入することができることが発見された。
【００８４】
Ｋ．オリゴヌクレオチド合成
キメラプローブおよび他の任意のオリゴヌクレオチドは、確立されたオリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドを産生または合成するための方法は、本技術分野において周知のものである。かかる方法は、標準酵素消化と続くヌクレオチド断片単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．、１９８９年）第５、６章を参照）から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州バーリントンのＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成機またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用したシアノエチルホスホラミダイト方法による純粋合成方法まで及び得る。オリゴヌクレオチドの作製に有用な合成方法は、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３巻：３２３〜３５６頁（１９８４年）、（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル方法）およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５巻：６１０〜６２０頁（１９８０年）、（ホスホトリエステル方法）によっても記載される。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５巻：３〜７頁（１９９４年）によって記載されている方法等、公知の方法を使用して作製することができる。
【００８５】
本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドの多くは、その間で安定的なハイブリッドが形成され得るように、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある特定の部分に相補的となるよう設計される。これらのハイブリッドの安定性は、ＬｅｓｎｉｃｋおよびＦｒｅｉｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４巻：１０８０７〜１０８１５頁（１９９５年）、ＭｃＧｒａｗら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８巻：６７４〜６７８頁（１９９０年）およびＲｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８巻：６４０９〜６４１２頁（１９９０年）に記載されている方法等、公知の方法を使用して計算することができる。
【００８６】
Ｌ．キット
上述の材料および他の材料は、任意の適した組合せで、開示される方法の実行にまたは実行補助に有用なキットとして、共に包装することができる。所定のキット中のキット構成要素が、開示される方法において共に使用するために設計および適応されている場合、これは有用である。例えば、ＲＮＡ分子を検出するためのキットであって、プローブアレイ、標識されたヌクレオチドおよび標識コンジュゲートを含むキットが開示される。本キットは、検出コンジュゲートを含有することもできる。開示されるキットは、リボヌクレアーゼ、核酸ポリメラーゼまたはその両方を含むこともできる。
【００８７】
Ｍ．混合物
開示される方法を実行または実行を準備することによって生成された混合物が開示される。例えば、プローブアレイおよび試料；プローブアレイおよびＲＮＡ分子；プローブアレイおよびリボヌクレアーゼ；プローブアレイおよび標識されたヌクレオチド；プローブアレイおよび核酸ポリメラーゼ；プローブアレイおよび標識コンジュゲート；プローブアレイおよび検出コンジュゲート；プローブアレイ、ＲＮＡ分子およびリボヌクレアーゼ；プローブアレイ、ＲＮＡ分子および核酸ポリメラーゼ；プローブアレイ、ＲＮＡ分子、標識されたヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼ；プローブアレイ、ＲＮＡ分子、リボヌクレアーゼおよび核酸ポリメラーゼ；ならびにプローブアレイ、ＲＮＡ分子、リボヌクレアーゼ、標識されたヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを含む混合物が開示される。
【００８８】
本方法が、組成物または構成成分または試薬を混合または接触させるステップを伴う場合、常に、本方法の実行は、多数の異なる混合物を生成する。例えば、本方法が、３つの混合ステップを含む場合、ステップが別々に実行されるとき、これらステップの各１つの後に、固有の混合物が形成される。加えて、どのようにステップが実行されたかにかかわらず、全ステップの完了時に混合物が形成される。本開示は、開示されている方法の実行によって得られるこのような混合物と共に、任意の開示されている試薬、組成物または構成成分、例えば、本明細書に開示されるものを含有する混合物を企図する。
【００８９】
Ｎ．システム
開示されている方法の実行または実行補助に有用なシステムが開示されている。システムは、一般に、製造の物品、例えば、構造物、機械、装置等と、組成物、化合物、材料等との組合せを含む。開示されているまたは本開示から明らかな、かかる組合せが企図されている。例えば、プローブアレイおよび反応コントローラを含むシステム（例えば、ＰＣＲ機械、自動ピペッティングシステムおよび反応インキュベーター）が開示および企図されている。
【００９０】
Ｏ．データ構造およびコンピュータ制御
開示されている方法において使用される、この方法により生成される、またはこの方法から生成されるデータ構造が開示される。データ構造は、一般に、組成または媒体内に収集、組織化、記憶および／または具体化された、任意の形態のデータ、情報および／またはオブジェクトである。ＲＡＭまたは記憶ディスク等、電子的形態で記憶されたＲＮＡ検出結果は、データ構造の１つの型である。
【００９１】
開示されている方法またはそのいずれかの部分またはそのための準備は、コンピュータ制御により制御、管理または他の仕方で支援することができる。かかるコンピュータ制御は、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法により達成することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造およびコンピュータプログラムが企図されており、本明細書に開示されていることが理解されるべきである。
【００９２】
使用
開示されている方法および組成物は、ＲＮＡ検出および分析等が挙げられるがこれらに限定されない、多数の分野に適用可能である。特に、開示されている方法および組成物を使用して、病原体、疾患細胞および疾患に特徴的なＲＮＡ分子等、特定の目的のＲＮＡ分子を検出することができる。他の使用は、細胞、試料等についての発現カタログを生成することを含む。他の使用は、開示されており、本開示から明らかであり、かつ／または当業者により理解される。
【００９３】
Ａ．同定に基づく行動
開示されている方法は、測定、検出、比較、分析、アッセイ、スクリーニング等に基づく、対象、疾患、状態、状況等の決定、同定、示唆、相関、診断、予後等（これらは「同定」として集合的に言及され得る）を含む。例えば、対象、位置または環境は、検出されたＲＮＡ分子に基づき、特定の微生物を有すると同定することができる。かかる同定は、多くの理由により有用である。例えば、特に、かかる同定によって、特定の為された同定に基づいて、かつこれに関連して、特定の行動をとることを可能にする。例えば、特定の対象における特定の疾患または状態の診断（および他の対象における該疾患または状態の診断の欠如）は、処置、行動、挙動等から恩恵を被る対象を診断に基づいて同定するという非常に有用な効果を有する。例えば、同定された対象における特定の疾患または状態の処置は、かかる同定を行わずに（またはこの同定を考慮せずに）全対象を処置することとは大きく異なる。処置を必要とするまたはその恩恵を被り得る対象は、処置を受け、処置を必要としないまたはその恩恵を被らない対象は、処置を受けない。
【００９４】
したがって、開示される同定に従ってこれに基づき特定の行動を起こすステップを含む方法も、本明細書に開示される。例えば、同定の記録を作成する（例えば、紙、電子等の物理的形態で）ステップを含む方法が開示される。よって、例えば、開示される方法に基づく同定の記録の作成は、測定、検出、比較、分析、アッセイ、スクリーニング等の単なる実行とは物理的かつ明白に異なる。記録は、例えば、他者（例えば、同定に基づき対象を処置、モニタリング、経過観察、助言等をすることができる者等）と連絡する；後の使用または再調査のために保持される；異なる測定、検出、比較、分析、アッセイ、スクリーニング等に基づく対象、処置有効性、同定の正確さのセットを評価するためのデータとして使用される等を行うことができる物的形態に同定を固定することができるという点において、かかる記録は特に、実質的かつ意義深い。例えば、同定の記録のかかる使用は、例えば、同定の記録を為した個人もしくは実体と同じ個人もしくは実体によって、それとは異なる個人もしくは実体によって、またはそれと同じ個人もしくは実体およびそれとは異なる個人もしくは実体の組合せによって作成され得る。開示される記録を作成する方法は、本明細書に開示されるいずれか１種または複数の他の方法、特に、開示される同定方法のいずれか１種または複数のステップと組み合わせることができる。
【００９５】
別の例として、１種または複数の他の同定に基づき、１種または複数のさらなる同定を為すステップを含む方法が開示される。例えば、他の同定に基づき、特定の処置、モニタリング、経過観察、助言等を同定することができる。例えば、高レベルの特定の構成成分または特徴により疾患または状態を有すると対象を同定することで、高レベルの構成成分または特徴に基づくまたはこれに向けた治療法で処置することができるまたは処置するべき対象としてさらに同定することができる。かかるさらなる同定の記録を作成することができ（例えば、上述の通り）、任意の適した方法で使用することができる。かかるさらなる同定は、例えば、他の同定、かかる他の同定の記録または組合せに直接的に基づくことができる。かかるさらなる同定は、例えば、他の同定を為した個人もしくは実体と同じ個人もしくは実体によって、それとは異なる個人もしくは実体によって、またはそれと同じ個人もしくは実体およびそれとは異なる個人もしくは実体の組合せによって為すことができる。開示されてさらなる同定を為す方法は、本明細書に開示されているいずれか１種または複数の他の方法、特に、開示される同定方法のいずれか１種または複数のステップと組み合わせることができる。
【００９６】
別の例として、開示される方法のいずれかにおいて同定された対象を処置、モニタリング、経過観察、助言等をするステップを含む方法が開示される。開示される方法のいずれかからの同定の記録が作成されている対象を処置、モニタリング、経過観察、助言等をするステップを含む方法も開示される。例えば、特定の処置、モニタリング、経過観察、助言等は、同定に基づきおよび／または同定の記録に基づき使用することができる。例えば、高レベルの特定の構成成分または特徴により疾患または状態を有すると同定された対象（および／またはかかる同定の記録が作成された対象）は、高レベルの構成成分または特徴に基づくまたはこれに向けた治療法で処置することができる。かかる処置、モニタリング、経過観察、助言等は、例えば、同定、かかる同定の記録または組合せに直接的に基づくことができる。かかる処置、モニタリング、経過観察、助言等は、例えば、同定および／または同定の記録を作成した個人もしくは実体と同じ個人もしくは実体によって、それとは異なる個人もしくは実体によって、またはそれと同じ個人もしくは実体およびそれとは異なる個人もしくは実体の組合せによって実行され得る。開示される処置、モニタリング、経過観察、助言等の方法は、本明細書に開示されるいずれか１種または複数の他の方法、特に、開示される同定方法のいずれか１種または複数のステップと組み合わせることができる。
【００９７】
方法
試料中のＲＮＡを検出するための方法が開示される。一部の形態において、本方法は、（ａ）試料およびプローブアレイを接触させるステップと、（ｂ）プローブアレイとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ｈ等）とを接触させるステップと、（ｃ）プローブアレイと、標識されたヌクレオチドと、ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ鎖を伸長させることができ、ＲＮＡ鎖からの伸長中に標識されたヌクレオチドを取り込むことができる核酸ポリメラーゼ（クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ等）とを接触させるステップと、（ｄ）伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドを検出するステップとを伴う。プローブアレイは、１種または複数のキメラプローブを含む。キメラプローブは、ＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域を含み、ここでＤＮＡ領域およびＲＮＡ領域は近接しており、ＤＮＡ領域は、ＲＮＡ領域の５’にある。キメラプローブは、第２のＤＮＡ領域を含むこともできる。第２のＤＮＡ領域も、ＲＮＡ領域と近接することができ、ＲＮＡ領域の３’にあり得る。試料が、キメラプローブのうち少なくとも１種のヌクレオチド配列と相補的なＲＮＡ分子を含有する場合、ＲＮＡ分子は、相補的キメラプローブとハイブリダイズする。一部の形態において、試料およびプローブアレイを接触させるステップ、プローブアレイおよびリボヌクレアーゼを接触させるステップ、ならびにプローブアレイ、標識されたヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを接触させるステップ（ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ））は、同時に行われる。
【００９８】
本方法の一部の形態において、標識および検出は、第１の標識を標識することにより増強することができる。これは、例えば、プローブアレイおよび標識コンジュゲートを接触させることにより達成することができ、ここで標識コンジュゲートは特異的結合分子および第２の標識を含み、特異的結合分子は第１の標識に結合する。続いて、伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドは、第２の標識を検出することにより検出される。第１の標識および標識コンジュゲートの有用な組合せの例は、第１の標識としてのビオチンおよび標識コンジュゲートとしてのストレプトアビジンコンジュゲートされた金ナノ粒子である。この例において、ストレプトアビジンは、第１の標識（ビオチン）に結合する特異的結合分子であり、金ナノ粒子は、第２の標識である。
【００９９】
第２の標識の部位の上にまたはそこに凝集することができる別のコンジュゲートを使用することにより、この部位における第２の標識の量が増加し、検出の感度を増加させ、検出をより容易にする。これは、例えば、プローブアレイおよび検出コンジュゲートを接触させることにより達成することができ、ここで検出コンジュゲートは凝集化因子を含み、凝集化因子は標識コンジュゲート上での検出コンジュゲートの凝集を媒介する。第２の標識および検出コンジュゲートの有用な組合せの例は、第２の標識としての金ナノ粒子および検出コンジュゲートとしての銀ナノ粒子である。この例において、銀ナノ粒子は、凝集化因子である。銀ナノ粒子は、金ナノ粒子と反応して、金ナノ粒子の部位に銀ナノ粒子を蓄積する。反応した銀ナノ粒子の蓄積は、肉眼による検出に十分であり得る。
【０１００】
ポイントオブケアにおけるＲＮＡウイルス等の病原体の迅速かつ正確な検出は、適切な患者処置および救命を可能にする。開示されるＲＮＡマイクロチップでは、逆転写およびＰＣＲ増幅を用いずに、ＲＮＡを直接的に検出することができる。開示されるＲＮＡマイクロチップでは、ナノ粒子支援シグナル増幅を使用することができる。開示されるＲＮＡマイクロチップ技術は、単純かつ正確であり、単一ヌクレオチドの差を区別することができる。一部の形態において、ＲＮＡは１時間以内に高感度に検出することができ、シグナルは肉眼で検出することができる。視覚的読み取り形式および単純さは、開示されるＲＮＡマイクロチップ技術を、診療所および最小限の資源しかない野外での病原体の迅速かつ正確な検出によく適したものとする。
【０１０１】
開示されている技術を使用して、単一または複数の供給源から任意のＲＮＡまたはＲＮＡの組合せを検出および分析することもできる。例えば、本技術を使用して、細胞および試料中のＲＮＡ発現パターンを検出することができる。別の例として、プローブアレイは、例えば、ウイルス、細菌または微生物に特徴的なヌクレオチド配列に相補的なキメラプローブのうち１種または複数を含むことができる。特徴的なヌクレオチド配列の検出は、対応するウイルス、細菌または微生物の存在を示す。
【０１０２】
Ａ．試料調製
試料は、任意の適した技法を使用して調製することができる。一般に、必要なことは、あるとすれば試料中の干渉する構成成分（ヌクレアーゼ等）の除去または低減と、ＲＮＡ分子の破壊の防止とだけである。しかし、ＲＮＡの精製は必要とされないことに留意されたい。開示される方法における使用には、単純な調製技法で十分である。開示される方法における使用にはＲＮＡ分子の小断片が十分かつ好ましいため、ある程度の試料中のＲＮＡ分解が好ましい。細胞試料からの好ましいＲＮＡ調製は、ＲＮＡ単離を全く行わないＮａＯＨ処理である。ＲＮＡ試料は、ＮａＯＨで生物学的検体を数分間上昇温度にて処理することにより調製することができ、これは、生物学的ＲＮＡを加水分解して、迅速なハイブリダイゼーションおよび検出のための短い断片にする。中和および遠心分離の後に、ＲＮＡ試料（上清）は、ＲＮＡの直接検出のための準備が整っている。
【０１０３】
例として、試料（細菌または単離された細菌全ＲＮＡ等）をＮａＯＨ（２００ｍＭ等）で５分間、上昇温度にて処理し、続いて中和および遠心分離することにより、試料は、１０分間未満で調製することができる。ＮａＯＨ処理により、生物学的ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等、通常、数千ヌクレオチドの長さ）を短い小片（１５〜２５ヌクレオチド等）に断片化し、これは、プローブアレイへのＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションを促進する（Ｓｐｅｎｃｅｒら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、１１巻、１３７８頁（２０１０年））。試料は、任意の適したＲＮＡ単離または調製技法を使用して調製することもできる。
【０１０４】
Ｂ．ハイブリダイゼーション
この方法において、試料中のＲＮＡ分子は、相補的配列を有するキメラプローブにハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、種々の条件下で達成することができる。一般に、温度は、ＲＮＡ分子とキメラプローブのＲＮＡ領域とのハイブリッドの融解温度を上回るべきではない。ｐＨおよび塩条件は変動し得るが、中性ｐＨおよび中等度塩条件が好ましい。リボヌクレアーゼおよび核酸ポリメラーゼと適合するｐＨ、塩および温度が最も好ましい。かかる条件は周知のものであるか、またはその決定は、核酸反応の分野の当業者の知識の範囲内である。
【０１０５】
Ｃ．ＲＮＡ分解
キメラプローブのＤＮＡ領域にハイブリダイズされたＲＮＡ分子の部分は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼによって分解される。この分解は、任意の適した条件下で行うことができる。一般に、温度は、ＲＮＡ分子とキメラプローブのＲＮＡ領域とのハイブリッドの融解温度を上回るべきではない。ｐＨおよび塩条件は変動し得るが、中性ｐＨおよび中等度塩条件が好ましい。リボヌクレアーゼおよび核酸ポリメラーゼと適合するｐＨ、塩および温度が最も好ましい。
【０１０６】
Ｄ．ＲＮＡ分子の伸長
続いて、ハイブリダイズしたＲＮＡ分子が伸長して、伸長した核酸鎖を形成することができ、ここでＲＮＡ領域の５’にあるキメラプローブのＤＮＡ領域は、テンプレートとして役立つ。標識のため、少なくとも１個の標識されたヌクレオチドが、伸長した核酸鎖中に取り込まれる。標識されたヌクレオチドは、第１の標識を含む。キメラプローブと、キメラプローブにハイブリダイズするＲＮＡ分子との間の配列関係性のため、伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドの検出は、試料中のＲＮＡ分子の存在を示す。
【０１０７】
この伸長は、任意の適した条件下で行うことができる。一般に、温度は、ＲＮＡ分子とキメラプローブのＲＮＡ領域とのハイブリッドの融解温度を上回るべきではない。ｐＨおよび塩条件は変動し得るが、中性ｐＨおよび中等度塩条件が好ましい。リボヌクレアーゼおよび核酸ポリメラーゼと適合するｐＨ、塩および温度が最も好ましい。
【０１０８】
ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションのための条件と、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡの分解のための条件と、ＲＮＡ分子の伸長のための条件とは適合し得るため、これらの操作および反応は、同時に行うことができる。
【０１０９】
Ｅ．二次標識
本方法の一部の形態において、標識および検出は、第１の標識を標識することにより増強することができる。これは、例えば、プローブアレイおよび標識コンジュゲートを接触させることにより達成することができ、ここで標識コンジュゲートは特異的結合分子および第２の標識を含み、特異的結合分子は第１の標識に結合する。続いて、伸長した核酸鎖中の標識されたヌクレオチドは、第２の標識を検出することにより検出される。第１の標識および標識コンジュゲートの有用な組合せの例は、第１の標識としてのビオチンと、標識コンジュゲートとしてのストレプトアビジンコンジュゲートされた金ナノ粒子とである。この例において、ストレプトアビジンは、第１の標識（ビオチン）に結合する特異的結合分子であり、金ナノ粒子は、第２の標識である。
【０１１０】
Ｆ．凝集（三次標識）
第２の標識の上にまたはその部位に凝集することができる別のコンジュゲートを使用することにより、この部位における第２の標識の量が増加し、検出の感度を増加させ、検出をより容易にする。これは、例えば、プローブアレイおよび検出コンジュゲートを接触させることにより達成することができ、ここで検出コンジュゲートは凝集化因子を含み、凝集化因子は標識コンジュゲート上での検出コンジュゲートの凝集を媒介する。第２の標識および検出コンジュゲートの有用な組合せの例は、第２の標識としての金ナノ粒子と、検出コンジュゲートとしての銀ナノ粒子とである。この例において、銀ナノ粒子は、凝集化因子である。銀ナノ粒子は、金ナノ粒子と反応して、金ナノ粒子の部位に銀ナノ粒子を蓄積する。形成された銀ナノ粒子の蓄積および凝集は、肉眼による（または拡大鏡の支援を用いた）検出に十分であり得る。
【０１１１】
Ｇ．検出
開示されている方法は、標識された構成成分を添加することにより、ＲＮＡ分子の高感度検出を可能にし、ここでＲＮＡ分子は、プローブアレイ中でハイブリダイズしている。開示されている方法の様々な形態において、ＲＮＡ分子は、例えば、（ａ）ＲＮＡ分子の伸長した鎖に取り込まれた標識されたヌクレオチドを検出することにより（第１の標識を介して）、（ｂ）ＲＮＡ分子と会合した標識コンジュゲート中の第２の標識を検出することにより、（ｃ）ＲＮＡ分子と会合または凝集した検出コンジュゲートを検出することにより、またはこれらの組合せにより検出することができる。好ましくは、ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ分子と会合した標識コンジュゲートを介してＲＮＡ分子と会合または凝集した検出コンジュゲートを検出することにより検出することができる。
【０１１２】
検出される構成成分は、他の構成成分および材料から検出しようとする構成成分を同定および識別することを可能にする、任意の技法または手段を使用して検出することができる。一般に、検出しようとする構成成分および標識は、適切な検出技法にマッチさせることができる。例えば、蛍光シグナルを産生する構成成分および標識は、例えば、分光光度計または写真により検出することができる。可視光シグナルを産生する構成成分および標識は、例えば、分光光度計または写真により視覚的に検出することができる。放射能を産生する構成成分および標識は、例えば、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。視覚的検出が好ましい。
【０１１３】
開示されている標識および構成成分は、確立された酵素結合検出系により検出することもできる。例えば、ビオチン−１６−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の取り込みにより標識された増幅された核酸は、次の通りに検出することができる。増幅された核酸中に存在する標的配列（またはその相補体）に相補的な相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（アドレスプローブ）とのハイブリダイゼーションにより、固体ガラス表面上に核酸を固定化する。ハイブリダイゼーション後に、スライドガラスを洗浄し、アルカリホスファターゼ−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベッドフォード）と接触させる。この酵素−ストレプトアビジンコンジュゲートは、増幅された核酸上のビオチン部分に結合する。このスライドを再度洗浄して、過剰な酵素コンジュゲートを除去し、化学発光基質ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を添加し、カバーガラスで覆う。次に、このスライドをＢｉｏｒａｄ  Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒにおいて撮像することができる。
【０１１４】
Ｈ．密接に関係したＲＮＡ分子間の識別
キメラプローブは、対立遺伝子等、密接に関係した標的配列を識別するよう設計することができる。実施例に示す通り、開示されている方法は、単一ヌクレオチドだけ異なるＲＮＡ分子からＲＮＡ分子を正確に同定することができる。これは、ＲＮＡ領域の５’にあるキメラプローブのＤＮＡ領域中に区別用ヌクレオチド（複数可）を含むことにより、最もよく達成される。ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化およびＤＮＡポリメラーゼ伸長は、塩基対形成に依存的であり、ＲＮＡ領域の５’にあるキメラプローブのＤＮＡ領域における塩基対形成は、これらステップの全てに関与するため、区別が増強される。これら３層の識別は、高い検出特異性の単純明快な達成に役立ち得る。これらの識別力の組合せは、単一ヌクレオチド識別を容易にもたらす。
【０１１５】
Ｉ．ＲＮＡ分子の群の検出
マルチプレックスＲＮＡ検出は、多数の別個の突然変異がある特定の疾患に関連する遺伝子あるいは複数の遺伝子における突然変異が関与する遺伝子における突然変異の検出に特に有用である。例えば、ハンチントン舞踏病の原因となる遺伝子が同定されたが、この遺伝子の異なる部分における広範な突然変異が罹患個体の間で生じる。結果として、個体が、多くのハンチントンの突然変異のうち１種または複数を有するかどうかを検出するための単一の検査は考案されなかった。単一のＲＮＡ検出アッセイを使用して、任意の数のＲＮＡ分子の群の１種または複数のメンバーの存在を検出することができる。これは、例えば、この群におけるＲＮＡ分子毎のキメラプローブを設計することにより達成することができる。キメラプローブの全ては、プローブアレイ中の同じ位置またはスポットに置かれる。ＲＮＡ分子のいずれかが、試料中に存在する場合、その存在は、プローブアレイ中の対応する位置で検出される。第１の標識、標識コンジュゲートおよび検出コンジュゲートは、全プローブおよび全ＲＮＡ分子について同じであり得るため、この群における任意のＲＮＡ分子またはその任意の組合せの存在下においてシグナルが産生され得る。検出は、ＲＮＡ分子群の少なくとも１種のメンバーが試料中に存在することを示す。
【０１１６】
Ｊ．処置
特定の病原体を有すると同定された対象および物体は、次に、この病原体を低減または排除するよう処置することができる。一般的および特定の病原体の両方におけるかかる処置のために、多数の組成物および方法が公知である。かかる処置は、開示される方法とともに、これに基づき、またはこれに従って使用することができる。
【０１１７】
本明細書において使用する場合、「対象」として、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生生物および他の任意の生物または実体が挙げられるがこれらに限定されない。対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯類）、魚類、鳥類あるいは爬虫類または両生類であり得る。対象は、無脊椎動物、より具体的には、節足動物（例えば、昆虫および甲殻類）であり得る。この用語は、特定の年齢または性別を表すものではない。よって、雄であれ雌であれ、成体および新生仔対象ならびに胎仔が網羅されるよう意図される。患者とは、疾患または障害を患う対象を指す。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学対象を含む。
【０１１８】
「処置」および「処置する」とは、疾患、病態または障害を治癒、寛解、安定化または防止する意図をもった対象の医学的管理を意味する。この用語は、能動的処置、即ち、特に、疾患、病態または障害の改善に向けた処置を含み、原因処置、即ち、関連する疾患、病態または障害の原因の除去に向けた処置も含む。加えて、この用語は、緩和処置、即ち、疾患、病態または障害の治癒ではなく症状の軽減のために設計された処置；防止的処置、即ち、関連する疾患、病態または障害の発達の最小化または部分的もしくは完全阻害に向けた処置；および支持的処置、即ち、関連する疾患、病態または障害の改善に向けた別の特異的治療法の補充に用いられる処置を含む。処置は、疾患、病態または障害を治癒、寛解、安定化または防止するよう企図されるが、治癒、寛解、安定化または防止を実際にもたらす必要はないことが理解される。処置の効果は、本明細書に記載されている通りに、また、本技術分野で公知の通りに、関与する疾患、病態または障害に適するように、測定または評価することができる。かかる測定および評価は、定性的および／または定量的見地において行うことができる。よって、例えば、疾患、病態もしくは障害および／または疾患、病態もしくは障害の症状の特徴または特色は、いずれかの効果またはいずれかの量まで低減され得る。
【０１１９】
用語「モニタリング」とは、本明細書において使用する場合、それにより活性を測定することができる本技術分野における任意の方法を指す。
【０１２０】
用語「提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」は、本明細書において使用する場合、本技術分野において公知の物に化合物または分子を加える任意の手段を指す。提供することの例として、ピペット、ピペットマン、シリンジ、針、チューブ、銃（ｇｕｎ）等の使用を挙げることができる。これは、手動であっても自動であってもよい。それは、ディッシュ、細胞、組織、無細胞系に核酸を提供する任意の手段または他の任意の手段によるトランスフェクションを含んでもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。
【０１２１】
用語「防止」は、本明細書において使用する場合、疾患または状態に関連する異常の生理学的顕在化を防止するための、疾患または状態の臨床症状の発症に先立つ化合物の投与を指す。
【０１２２】
細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。あるいは、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもよく、対象中に見出され得る。「細胞」は、細菌が挙げられるがこれに限定されない、任意の生物に由来する細胞であり得る。
【実施例】
【０１２３】
Ａ．ナノ粒子支援シグナル増幅を使用したＲＮＡマイクロチップ検出
本実施例は、直接視覚化およびナノ粒子支援シグナル増幅によりＲＮＡを直接的に検出するために使用される、開示されるＲＮＡマイクロチップの例について記載する。この技術は単純かつ正確であり、単一ヌクレオチドの差を効率的に区別することができる。ＲＮＡ試料調製は、単純であり、５分間で達成することができる。開示される迅速なＲＮＡ検出は、４５分間以内に完了することができ（試料調製時間を含む）、低フェムトモルレベルの検出感度を有する。加えて、検出シグナルは、肉眼でまたは拡大鏡により観察することができる。このアプローチは、ＰＣＲフリーであり、実行が容易であり、対費用効果が高い。さらに、この戦略は、精緻な機器を必要とせず、消毒処理のモニタリングに役立つよう使用することができる。視覚的検出フォーマットおよび単純さは、このＲＮＡマイクロチップ技術を、遠隔地、診療所および最小限の機器しかない野外での病原体の迅速かつ正確な検出によく適したものとする。開示される単純、迅速かつ正確な技術は、特に、感染性疾患大流行中のポイントオブケア適用に大きな利益をもたらす。
【０１２４】
本実施例は、ナノ粒子形成および視覚化による迅速かつ直接のＲＮＡ検出のための開示される単純なＲＮＡマイクロチップ（図１）の例について記載する。ナノ粒子は、シグナル増幅および肉眼での（４０μｍのサイズの小ささの物を見る）または単純なツール（拡大鏡等）の支援を用いた視覚的検出を支援する。ＲＮＡ検出系は単純である：ＲＮＡプローブが固定化されたＲＮＡマイクロチップ（Ｓｐｅｎｃｅｒら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、１１巻、１３７８頁（２０１０年））への標的ＲＮＡハイブリダイゼーションの後に、結合したＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼによりビオチン標識ｄＮＴＰで伸長する。ストレプトアビジンおよび金ナノ粒子のコンジュゲート（Ａｕ−ＮＰ）を使用して、次に、標的ＲＮＡに取り込まれたビオチン標識をＡｕ−ＮＰ標識に変換する。Ａｕ−ＮＰは、銀染色による銀ナノ粒子（Ａｇ−ＮＰ）の形成を触媒することができ（Ｔａｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９巻、１７５７頁（２０００年）；Ｃａｏら、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２２巻、３９３頁（２００６年）：Ｑｉら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、３９８巻、２７４５頁（２０１０年）；Ｔａｎｇら、Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、６５巻、３７２頁（２００９年）；Ｚｈｏｕら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１３２巻、６９３２頁（２０１０年））、シグナル増幅を可能にする。形成されたＡｇ−ＮＰ（図１および図２）は、ＲＮＡプローブ部位の上に暗いスポットとして凝集および沈着する。ヒトの裸眼によるこれらの暗いスポットのアレイの画像が、直接視覚的観察のために形成される（図２）。このＲＮＡマイクロチップが、単一ヌクレオチドの差を区別し、低フェムトモルレベルのＲＮＡを検出することができることも実証された。
【０１２５】
本方法は、生物学的ＲＮＡのための単純な試料調製プロトコールにより補助される。ＲＮＡ試料調製は簡便である：単に、生物学的試料（細菌等）をＮａＯＨで３分間直接的に処理する。他の技術とは異なり、ＲＮＡの単離および精製の必要はない。開示されるＲＮＡマイクロチップ方法により、単純かつ迅速なＲＮＡ検出を４５分間以内に達成することができる。
【０１２６】
ＲＮＡ検出系は、ＲＮＡ３’標識アプローチに基づき、ここでＤＮＡポリメラーゼは標識されたｄＮＴＰをＤＮＡテンプレート上のＲＮＡ中に直接的に取り込む、（ＨｕａｎｇおよびＡｌｓａｉｄｉ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２２巻、２６９頁（２００３年）；Ａｌｓａｉｄｉら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、５巻、１１３６頁（２００４年））。ＲＮＡを直接的に検出するために、官能化されたＲＮＡプローブを設計した。ＲＮＡプローブは、ＲＮＡ３’領域およびＤＮＡ５’領域からなる（図１）。ＲＮＡ領域は、標的ＲＮＡを捕捉するためのハイブリダイゼーション結合因子であり、ＲＮａｓｅに対するＲＮＡプローブの安定性を増加させるために２’−メチル化で修飾されている（Ｎｏｖｏｐａｓｈｉｎａら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２４巻、５２７頁（２００５年）；Ｍａｊｌｅｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２６巻、２２２４頁（１９９８年））。ＤＮＡ領域は、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化およびＤＮＡポリメラーゼ伸長のためのテンプレートとして役立つ。そのため、官能化されたＲＮＡプローブ（３’−ＮＨ２−ＲＮＡ−ＤＮＡ−５’）を設計して、チップ上へそれらを固定化することによりＲＮＡマイクロチップ（またはマイクロアレイ）を構築する。プローブの３’−ＮＨ２基は、表面上へのそれらの固定を可能にする。例えば、プローブは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）置換を介して１，４−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＩＴＣ）官能化された表面上に固定化することができる（図４）（Ｂｅｎｔｅｒｓら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２巻、６８６頁（２００１年）；ＷｉｔｔｍａｎｎおよびＡｌｅｇｒｅｔ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｃｈｉｐｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００５年））。
【０１２７】
ＲＮＡマイクロチップを実証するために、完全にマッチしたプローブ（図２ＡにおけるＭ；配列番号１１）およびミスマッチしたプローブ（Ｍｉｓ）をＲＮＡ配列について設計した。これら４種のＲＮＡプローブをチップに固定化した（図２）。およそ７５μのスポットサイズを作製するマイクロアレイ作製装置を使用することにより、プローブを表面にスポットした。
【０１２８】
チップを調製した後に、いくつかの対照実験を実施した。標的ＲＮＡの非存在（図２Ｂ）によって、いかなるシグナルも生じなかったことが観察された。また、クレノウ伸長ステップにおけるｄＮＴＰの包接（図２Ｃ）またはビオチン標識されたｄＮＴＰの非存在（図２Ｄ）では、いかなるシグナルも生じなかった。ＲＮＡプローブが固定化されたマイクロチップ上におけるＲＮＡおよびビオチン化ｄＮＴＰの両方の存在下においてのみ、所望のシグナルが観察された（図２Ｅ）。ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化およびＤＮＡポリメラーゼ伸長のプロセスは、塩基対形成に依存するため、全体的な検出特異性は、これら３ステップに帰する：ハイブリダイゼーション、消化および伸長。これら３層（またはステップ）の識別が、高い検出特異性の達成に役立ち得ることが発見された。驚くべきことに、ＲＮＡマイクロチップは、手軽に高い特異性をもたらす。デングウイルスＲＮＡ（ＤＶ  ＲＮＡ）を検出するために、数種類のＲＮＡプローブ（下のデングオリゴヌクレオチドライブラリープローブのリストを参照）を設計した。図２Ｆに実証されている通り、完全にマッチしたプローブ（Ｍ）のみで、ＤＶ  ＲＮＡを検出することができた一方、単一ヌクレオチドミスマッチのプローブおよび他のプローブ（Ｍｉｓ−１、−２および−３）では検出されなかった。本実験は、ＲＮＡマイクロチップによる単一核酸塩基区別を示す。３種の識別の組合せにより、ハイブリダイゼーション条件を厳密に調整することなく、単一ヌクレオチド識別が容易にもたらされ得ると思われる。
【０１２９】
図３は、複数の標的ＲＮＡの同時検出を示す。標的ＲＮＡのみが、マイクロチップ上に固定化された対応するプローブにハイブリダイズした。例えば、試料中にＢＡ  ＲＮＡが含まれた場合、Ａｇ−ＮＰはＢＡプローブ部位のみに沈着し（図３Ａ）、ＢＡ  ＲＮＡの存在を示した。試料中にＢＡおよびｌａｃＺ  ＲＮＡの両方が含まれた場合、Ａｇ−ＮＰは、それらのプローブ部位の両方に沈着し（図３Ｂ）、ＢＡおよびｌａｃＺ  ＲＮＡの存在を示した。試料中により多くの標的ＲＮＡが含まれた場合、より多くの対応するプローブ部位（図３Ｂ〜図３Ｄ）にＡｇ−ＮＰが沈着し、暗いスポットのアレイを形成し、対応するＲＮＡの存在を示した。ＲＮＡ検出シグナルのこれらのアレイは、肉眼でまたは拡大鏡の支援により検出可能であった。これらの実験は、開示されているＲＮＡマイクロチップ技術を使用して、複数のＲＮＡ標的を同時に検出することができることを明らかにする。
【０１３０】
全ＲＮＡ中の個々のｍＲＮＡの検出も実証した。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）によりＥ．ｃｏｌｉが誘導されて、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ（＞２３００ｎｔ．）およびベータ−ガラクトシダーゼを発現する場合、ＬａｃＺ  ＲＮＡプローブにより固定化されたＲＮＡマイクロチップを使用して、全ＲＮＡ中の発現されたＬａｃＺ  ｍＲＮＡを特異的に検出した（図３Ｅおよび図３Ｆの両方におけるチップＩＩ）。ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ検出の特異性を確認するために、グルコースを使用して、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡの発現を抑制した。Ｅ．ｃｏｌｉには数千種の異なるＲＮＡが存在するが（Ｒｈｏｄｉｕｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６巻：５９９〜６２４頁（２００２年））、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡも非特異的ＲＮＡもチップ上に示されなかった（図３Ｅおよび図３Ｆの両方におけるチップＩＩＩ）。これらの実験結果は、本発明者らのＲＮＡマイクロチップが、特異的であり、生物学的試料における個々のＲＮＡを選択的に検出することができることを実証した。加えて、ＲＮＡ試料調製中の単純かつ迅速な戦略を実証した。ＲＮＡ試料は、生物学的試料（Ｅ．ｃｏｌｉ等）を、ＮａＯＨ（４００ｍＭ）で３分間９５℃にて直接的に処理することにより調製することができる（５分以内）。中和および遠心分離後に、ＲＮＡ試料（上清）は、チップハイブリダイゼーションのための準備が整っている。ＮａＯＨ処理は、生物学的ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等、通常数千ヌクレオチドの長さ）を短い小片（１５〜２５ｎｔ．もの短さ）へと断片化し、このことは、マイクロチップ上での標的ＲＮＡハイブリダイゼーションおよび検出を大きく促進する（Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｌ．  Ｌｉｎ、Ｃ．  Ｆ．  Ｃｈｉａｎｇ、Ｚ．  Ｐｅｎｇ、Ｐ．  Ｈｅｓｋｅｔｈ、Ｊ．  Ｓａｌｏｎ、Ｚ．  Ｈｕａｎｇ、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１巻：１３７８〜１３８２頁（２０１０年））。この迅速な試料調製戦略により、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡは、選択的に検出され得る（図３Ｆ）。
【０１３１】
検出感度も実証した。図５Ａに示す通り、本マイクロチップにより様々な含量の標的ＲＮＡを試験した。ＲＮＡマイクロチップが、低フェムトモルレベル（１０−１５）までＲＮＡを検出し得ることが実証された。意義深いことに、最初の３ステップ（ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化およびＤＮＡポリメラーゼ伸長）を１ステップに統合することができ（図５Ｂおよび図５Ｃ）、これにより、検出系がさらに単純化されることが実証された。試料調製の初めから検出の終わりまでの検出全体を４５分以内で達成することができる（図３Ｆ、図５Ｄおよび図５Ｅ）。さらに、このＲＮＡマイクロチップを用いて、細菌を死滅させる７０％エタノールでＥ．ｃｏｌｉを処理した後に、細菌ＲＮＡの減少が観察された（図５Ｅ）。これは、ＲＮＡ合成終結および酵素による加水分解による、死んだ微生物におけるＲＮＡの迅速な分解と一貫している。よって、開示される方法は、消毒処理中および感染性疾患大流行の間の細菌の生死のモニタリングに有用であり得る。
【０１３２】
表１は、迅速な検出最適化の例を示す。迅速なＲＮＡマイクロチップを開発するために、段階的様式で最適化された数ステップが存在する。銀染色は５〜２０分で達成され、ＣＣＤカメラを使用して０．６秒間で写真を撮った。
【０１３３】
【表１】
2016515827.tif 000003
【０１３４】
１．材料と方法
ｉ．オリゴヌクレオチド設計および合成
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からネイティブＲＮＡを購入した。３４００  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において固相ホスホラミダイト化学を使用することにより、ハイブリッドプローブを設計および合成し、ポリアクリルアミドアミドゲル電気泳動により精製した。ＲＮＡプローブは、ＲＮＡ領域および５’−ＤＮＡ領域（および一部のプローブは３’−ＤＮＡ領域）からなる。ＲＮＡ領域は、２’メチル化で修飾されており、標的ＲＮＡを捕捉するためのハイブリダイゼーション結合因子である。３’−ＤＮＡ領域は、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化のためのテンプレートとして役立つ。５’−ＤＮＡ領域は、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化およびＤＮＡポリメラーゼ伸長のためのテンプレートとして役立つ。３’−ＮＨ２基は、マイクロチップ固定化のためのリンカーとして役立つ。そのため、官能化されたＲＮＡプローブ（３’−ＮＨ２−ＲＮＡ−ＤＮＡ−５’または３’−ＮＨ２−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−５’）を設計して、マイクロチップ上にそれらを固定化することによりＲＮＡマイクロチップ（またはマイクロアレイ）を構築する。
【０１３５】
ｉｉ．病原性オリゴヌクレオチド
ＬａｃＺ  ＲＮＡ：Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ（７２４−７４８  ｎｔ）：
５’−ＡＵＧＵＧＧＡＵＵＧＧＣＧＡＵＡＡＡＡＡＡＣＡＡ−３’（配列番号１）
ＬａｃＺプローブ：
５’−ｄ（ＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴ）−２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ（ＡＵＣＧＣＣＡＡＵＣＣＡＣＡＵ）−ｄ（ＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡ）−ＮＨ２−３’（配列番号２）
ＢＡ  ＲＮＡ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ＲＮＡ（致死因子ｍＲＮＡ、８５５−８９２  ｎｔ）：
５’−ＡＵＣＵＵＵＡＧＡＡＧＣＡＵＵＡＵＣＵＧＡＡＧＡＵＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号３）
ＢＡプローブ：
５’−ｄ（ＧＡＴＴＴＴＴＴＴ）−２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ（ＣＵＵＡＵＣＵＵＣＡＧＡＵＡＡ）−ｄ（ＴＧＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＴ）−ＮＨ２−３’（配列番号４）
ＢＦ  ＲＮＡ：鳥インフルエンザまたはトリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）ＲＮＡ［マトリックスタンパク質１（Ｍ１）ｍＲＮＡ（６９２〜７２９ｎｔ）］：
５’−ＡＡＵＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＡＵＵＵＧＣＡＧＡＣＣＵＡＣＣＡＡＡＡＡＣＧＡ−３’（配列番号５）
ＢＦプローブ：
５’−ｄ（ＴＣＧＴＴＴＴＴ）−２’−Ｏ−Ｍｅ−（ＧＧＵＡＧＧＵＣＵＧＣＡＡＡＡＵＵＵＵ）−ｄ（ＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴ）−ＮＨ２−３’（配列番号６）
ＡＦ  ＲＮＡ：鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）ＲＮＡ［マトリックスタンパク質（Ｍ２）ｍＲＮＡ（８３８−８７２  ｎｔ）］：
５’−ＣＡＵ  ＵＵＡＵＣＧＵＣＧＣ  ＣＵＵＵＡＡＡＵＡＣＧ  ＧＵＵＵＧ  ＡＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号７）
ＡＦプローブ：
５’−ｄ（ＣＴＣＴＴＴＴ）−２’−Ｏ−Ｍｅ−（ＣＡＡＡＣＣＧＵＡＵＵＵＡＡＧ）−ｄ（ＧＣＧＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧ）−ＮＨ２−３’（配列番号８）
ビオチン標識されたＤＮＡ（ＬａｃＺ  ＤＮＡ）：
３’−ＮＨ２−ＡＧＡＡＡＧＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧ−ビオチン−Ｃｙ３−５’（配列番号９）
【０１３６】
ｉｉｉ．デングＲＮＡゲノムから得られた、特異性試験のためのデングオリゴヌクレオチドライブラリー
【化１】
2016515827.tif 000004
【０１３７】
ｉｖ．写真／イメージングシステム
ＲＮＡマイクロチップ上のアレイは、肉眼で（または拡大鏡の支援により）目に見え、本発明者らは、アレイ写真を記録するための写真化／イメージングシステムを使用した。写真化／イメージングシステムは、冷却電荷結合素子カメラ（ＣＣＤ、ＶｅｒｓＡｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニュージャージー州プリンストン）を備える顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ）からなり、画像取得、処理および分析のためのＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ６．１コンピュータソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州シルバースプリング）により制御した。検出は、平均０．６秒間、２×レンズの２×２画像ビニングを使用して実行した。
【０１３８】
ｖ．マイクロチップ活性化
ガラスチップ（０．５×０．５ｃｍ）を先ず、ＣＨ２ＣＬ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）中で穏やかに振盪しつつ３０分間脱脂した。チップをその後、濃硫酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）中で４５分間、振盪しつつ清浄化した。最後の洗浄でｐＨ７．０に達するまで、このチップを脱イオン水で数回すすぎ、自然乾燥させた。チップを４５分間振盪しつつ、３％３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）（ＡＰＴＳ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）の水性エタノール（９５％エタノールおよび５％水）溶液中でインキュベートすることにより、シリル化を行った。シリル化が完了したら、チップを３回（エタノール、水およびエタノール）洗浄した。チップを自然乾燥させ、続いて１，４−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＩＴＣ；１０ｍＭ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）および１％ピリジン（Ｆｌｕｋａ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液中で２時間インキュベーションを行った。次に、チップをＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄し、自然乾燥させ、デシケーター内で室温にて貯蔵した。活性化プロセスの段階的表示を図４に示す。
【０１３９】
ｖｉ．ＲＮＡプローブ固定化
リン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）にハイブリッドＲＮＡプローブを溶解し（１００〜３００μＭ）、続いて、０．７ｎＬ／スポットを沈着させるステルスピン（ＳＭＰ３ピン）を備えるＯｍｎｉｇｒｉｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アーバイン）を使用して、これらのプローブを活性化したマイクロチップ上にプリントする。スポットしたチップを３７℃の水浴中で３０分間インキュベートする。
【０１４０】
ｖｉｉ．対照実験
ＬａｃＺ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよび鳥インフルエンザから設計した異なるプローブを対照実験のために４種の異なるチップ上に固定化した。続いてこの４種のチップをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキングバッファーと共に２０分間インキュベートした。全チップ上に、５×ＳＳＣバッファー（２０μＬ、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中の異なるＲＮＡをアプライし、チップＡを除き３７℃で１５分間インキュベートした。結合していないＲＮＡを１×ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４））で２回洗浄した。次に、チップをＲＮａｓｅ  Ｈバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のＲＮａｓｅ  Ｈ（０．５μＬ、５０００Ｕ  ｍＬ−１）と共にインキュベートし、続いて、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、消化したＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、続いて、チップＡおよびＤについてはクレノウバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のクレノウ大断片（０．５μＬ、５０００Ｕ  ｍＬ−１）およびビオチン標識したｄＡＴＰ（１μＬ、０．４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共にインキュベートしたが、チップＣにはｄＮＴＰをアプライした。チップを３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。チップを金コンジュゲート希釈バッファー（１００μＬ、ＫＰＬ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲイザースバーグ）中の金標識したストレプトアビジン（４μＬ）と共に１時間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。その後、暗いスポットが観察されるまで１００μＬの銀増強溶液をアプライした。チップを大量の水で洗浄して、さらなる銀沈着を停止させ、風乾させた。ＣＣＤカメラを使用して写真を撮った。
【０１４１】
ｖｉｉｉ．複数の病原体の選択性および同時検出
ＬａｃＺ、Ｂ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよび鳥インフルエンザから設計した異なるプローブを選択性および同時検出試験のためにチップ上に固定化した。続いて、チップをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキングバッファーと共に２０分間インキュベートした。その後、５×ＳＳＣバッファー中の異なるＲＮＡをこのチップに大量に流入させ、３７℃で１５分間インキュベートした。結合していないＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄した。次に、チップをＲＮａｓｅ  Ｈバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のＲＮａｓｅ  Ｈ（０．５μＬ、５０００Ｕ  ｍＬ−１）と共にインキュベートし、続いて、３７℃で１５分間インキュベーションを行った。次に、消化したＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、続いて、クレノウバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のクレノウ大断片（０．５μＬ、５０００Ｕ  ｍＬ−１）およびビオチン標識したｄＡＴＰ（１μＬ、０．４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共にインキュベーションを行った。チップを３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。チップを金コンジュゲート希釈バッファー（１００μＬ、ＫＰＬ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲイザースバーグ）中の金標識したストレプトアビジン（４μＬ）と共に１時間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。その後、暗いスポットが観察されるまで１００μＬの銀増強溶液をアプライした。チップを大量の水で洗浄して、さらなる銀沈着を停止させ、風乾させた。ＣＣＤカメラを使用して写真を撮った。
【０１４２】
ｉｘ．チップ上でのデング特異性
特異性試験のためにデングウイルス（ＤＥＮＶ）ＲＮＡの異なるセクションから異なるプローブを設計した。１００μＭの４種のデング血清型プローブをスポットし、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、チップをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＴＢＳ、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）ブロッキングバッファーと共に２０分間インキュベートした。次に、チップに５×ＳＳＣバッファー中のＤＥＮＶ−１  ＲＮＡを大量に流入させた。チップを６５℃で１５分間インキュベートした。結合されていないＲＮＡを１×ＰＢＳで２回洗浄した。次に、チップをＲＮａｓｅ  Ｈバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州）中のＲＮａｓｅ  Ｈ（０．５μＬ、５０００Ｕ／ｍＬ）と共にインキュベートし、続いて、６５℃で１５分間インキュベーションを行った。次に、消化したＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで３回洗浄し、続いて、クレノウバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州）中のクレノウ大断片（０．５μＬ、５０００Ｕ／ｍＬ）およびビオチン標識したｄＮＴＰ（１μＬ、０．４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共にインキュベーションを行った。チップを６５℃で３０分間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。次に、チップを金コンジュゲート希釈バッファー（１００μＬ、ＫＰＬ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲイザースバーグ）中の金標識したストレプトアビジン（４μＬ）と共にインキュベートし、続いて、１×ＰＢＳで３回洗浄した。その後、暗いスポットが観察されるまで１００μＬの銀増強溶液（１：１、ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カーディフ、ＣＦ１４  ５ＤＸ、英国）をアプライした。チップを水で洗浄して、金ナノ粒子上へのさらなる銀沈着を停止させた。乾燥させた後すぐに、ＣＣＤカメラを使用して写真を撮った。
【０１４３】
ｘ．ＲＮＡマイクロチップ上でのＲＮＡ検出の感度
ＬａｃＺプローブによりチップを３０分間固定化し、その後これらをＴＢＳブロッキングバッファーと共に２０分間インキュベートした。次に、チップに５×ＳＳＣバッファー中の異なる濃度のＬａｃＺ  ＲＮＡを大量に流入させ、３７℃で１５分間インキュベートした。結合されていないＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄した。次に、チップをＲＮａｓｅ  Ｈバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のＲＮａｓｅ  Ｈ（０．５μＬ、５０００Ｕ  ｍＬ−１）と共にインキュベートし、続いて、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、消化したＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、続いて、クレノウバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のクレノウ大断片（０．５μＬ、５０００Ｕ  ｍＬ−１）およびビオチン標識したｄＡＴＰ（１μＬ、０．４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共にインキュベーションを行った。チップを３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。次に、チップを金コンジュゲート希釈バッファー（１００μＬ、ＫＰＬ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲイザースバーグ）中の金標識したストレプトアビジン（４μＬ）と共にインキュベートし、続いて、１×ＫＰＬ洗浄バッファーで洗浄した。その後、暗いスポットが観察されるまで１００μＬの銀増強溶液をアプライした。チップを大量の水で洗浄して、さらなる銀沈着を停止させた。風乾させた後すぐに、ＣＣＤカメラを使用して写真を撮った。
【０１４４】
ｘｉ．迅速な検出
３種の異なるプローブをチップ上に固定化した：ビオチン標識したＬａｃＺプローブ、ＬａｃＺプローブおよびＢＡプローブ。固定化後に、チップに５×ＳＳＣバッファー中の異なる濃度のＬａｃＺ  ＲＮＡ試料を大量に流入させ、３７℃で５分間インキュベートした。結合されていないＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄した。次に、チップをＲＮａｓｅ  Ｈバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中のＲＮａｓｅ  Ｈ（０．５μＬ、５０００Ｕ／ｍＬ）と共にインキュベートし、続いて、３７℃で５分間インキュベーションを行った。次に、消化したＲＮＡを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、続いて、クレノウバッファー（２０μＬ、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州）中のクレノウ大断片（０．５μＬ、５０００Ｕ／ｍＬ）およびビオチン標識したｄＡＴＰ（１μＬ、０．４ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共にインキュベーションを行った。チップを３７℃で５分間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。チップを金コンジュゲート希釈バッファー（１００μＬ、ＫＰＬ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲイザースバーグ）中の金標識したストレプトアビジン（４μＬ）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳバッファーで洗浄した。その後、１００μＬの銀増強溶液をアプライし、３７℃で１５分間インキュベートした際に、暗いスポットが観察された。チップを水で洗浄して、さらなる銀沈着を停止させ、風乾させた。ＣＣＤカメラを使用して写真を撮った。検出は１時間未満で達成された。
【０１４５】
ｘｉｉ．ＲＮＡマイクロチップ検出のためのＥ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡからのＲＮＡ試料調製
１０ｍＬルリアブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）に、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞；１０μＬ細胞培養物）を接種し、これを２２０ＲＰＭで振盪しつつ３７℃で一晩インキュベートした。次に、この一晩培養物を、滅菌したＬＢ（１００ｍＬ）を含有する２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに加え、続いて、分割し（各５０ｍＬ）、１時間３７℃で培養した。イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を一方のフラスコに加えた（終濃度１ｍＭ）。他方のフラスコには、Ｄ−（＋）グルコース（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を加えた（終濃度１ｍＭ）。両方の培養物を３７℃で４時間インキュベートした後、次いで遠心分離により細胞を収集した。後にＲＮＡ抽出および単離に使用するために、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）に従って、Ｅ．ｃｏｌｉの全ＲＮＡを抽出および精製し、単離した全ＲＮＡをＴＥバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に溶解した。ＵＶ−可視光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して吸光度を測定することにより、全ＲＮＡの含量を決定した。
【０１４６】
加熱、アルカリおよび／または金属触媒の断片化により、ＲＮＡ断片化を行った。アルカリ触媒の断片化について、全ＲＮＡ（０．１〜１０μＬ、３μｇ／μＬ）を９５℃において水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、終濃度５０〜５００ｍＭ）で数分間消化した。酢酸を添加することにより、加水分解反応物を中和およびクエンチした。これにより、マイクロチップハイブリダイゼーションおよび検出のための準備が整った調製したＲＮＡ試料がもたらされる。金属イオン触媒の断片化について、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５ｍＭ）中で塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２、終濃度１０ｍＭ）および塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２、終濃度１０ｍＭ）と共に９５℃で５分間全ＲＮＡを加熱した。冷却後に、断片化した全ＲＮＡに５×ＳＳＣを添加した。これにより、マイクロチップハイブリダイゼーションおよび検出のための準備が整った調製したＲＮＡ試料がもたらされる。
【０１４７】
ｘｉｉｉ．直接ＮａＯＨ処理によるＥ．ｃｏｌｉからの迅速なＲＮＡ試料調製
Ｅ．ｃｏｌｉペレット（例えば、１ｍＬ  ＬＢ培養物から得られたもの）を、９５℃においてＮａＯＨ（２０μＬ、４００ｍＭ）で３分間処理し、続いて、中和（２μＬ、４Ｍ酢酸を添加）および１分間の遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行って、沈殿物を除去する。上清が、マイクロチップハイブリダイゼーションおよび検出のための調製したＲＮＡ試料である。ＲＮＡ試料調製は、５分以内に達成することができる。
【０１４８】
ｘｉｖ．ＲＮＡマイクロチップ上での直接的かつ迅速なＲＮＡ検出のための一般プロトコール
５×ＳＳＣバッファー（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中に溶解したＲＮＡ試料（２０μＬ）を、設計したＲＮＡプローブが固定化されたマイクロチップ上に添加し、続いて、３７℃における５〜１５分間のインキュベーションおよびハイブリダイゼーションを行った。１×ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１１．８ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ４、ｐＨ７．４）で２回洗浄することにより、結合していないＲＮＡを除去した。次に、チップを１×ＲＮａｓｅ  Ｈバッファー（２０μＬ）中のＲＮａｓｅ  Ｈ（２．５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）と共に３７℃で５〜１５分間インキュベートした。チップを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄することにより、消化したＲＮＡを除去し、続いて、１×クレノウバッファー（２０μＬ）中のクレノウ（２．５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびビオチン標識したｄＮＴＰ（各０．４ｍＭ終濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共に３７℃における５〜２０分間のインキュベーションを行った。チップを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄した後に、チップを、ストレプトアビジン標識した金ナノ粒子（４μＬ、ＫＰＬ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲイザースバーグ）と共にそのバッファー（１００μＬ）中で５〜３０分間インキュベートし、続いて、チップを１×ＰＢＳバッファーで２回洗浄した。その後、銀増強溶液（１００μＬの１：１混合物；ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カーディフ、ＣＦ１４  ５ＤＸ、英国）をチップにアプライし、暗いスポットのアレイがチップの表面上に形成されるまで、チップを３７℃で５〜３０分間インキュベートした。チップを水で洗浄して、銀沈着をクエンチし、自然乾燥させた。直接的かつ迅速なＲＮＡ検出のため（ＲＮＡ試料調製を含め全検出時間４５分間）、チップ上のスポットアレイを肉眼で（または拡大鏡の支援により）観察した。ＲＮＡマイクロチップの表面上のスポット−アレイ画像はまた、顕微鏡−ＣＣＤカメライメージングシステムを用いて写真化および分析した。
【０１４９】
開示されている方法および組成物は、変動し得るため、記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことが理解される。本明細書中で使用されている用語法が、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、本発明の範囲の限定を意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されることも理解されたい。
【０１５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形（「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」）は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数形への言及を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「キメラプローブ（ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｂｅ）」への言及は、複数のかかるキメラプローブを含み、「キメラプローブ（ｔｈｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｂｅ）」への言及は、１または複数のキメラプローブおよび当業者に公知のその均等物の言及である、などである。
【０１５１】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通じて、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等のこの単語の変種は、「が挙げられるがこれらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、構成成分、整数またはステップの除外を意図しない。
【０１５２】
「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載される事象、状況または材料が、発生または存在してもしなくてもよく、この記載が、該事象、状況または材料が発生または存在する場合と、それが発生または存在しない場合とを含むことを意味する。
【０１５３】
範囲は、本明細書において、「約」ある特定の値から、かつ／または「約」別の特定の値までと表現することができる。かかる範囲が表現される場合、文脈がそれ以外のことを特に示さない限り、ある特定の値から、かつ／または他の特定の値までの範囲も具体的に企図されており、開示されていると考えられる。同様に、先行詞「約」の使用により値が近似値として表現される場合、この特定の値が、文脈がそれ以外のことを特に示さない限り、開示されていると考えるべき別の具体的に企図される実施形態を構成していると理解される。範囲のそれぞれの終点は、文脈がそれ以外のことを特に示さない限り、他の終点との関連においておよび他の終点から独立して両方において有効であることがさらに理解される。最後に、文脈がそれ以外のことを特に示さない限り、明確に開示されている範囲内に含有される全ての個々の値および部分範囲の値も、具体的に企図され、開示されていると考えるべきであることが理解されるべきである。特定の事例において、これらの実施形態の一部または全てが明確に開示されているかどうかにかかわらず、前述が適用される。
【０１５４】
他に規定がなければ、本明細書で使用されるあらゆる技術および科学用語は、開示される方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本方法および組成物の実施または検査において、本明細書に記載されている方法および材料と同様または均等である任意の方法および材料を使用することができるが、特に有用な方法、装置および材料は、記載されている通りのものである。本明細書に引用される刊行物と、それに関して刊行物が引用されている材料とは、具体的に参考として本明細書に援用される。本明細書におけるいずれのものも、本発明が先行発明のために先行してかかる開示を行う権利を与えられていない、と自認することであると解釈するべきではない。いずれかの参考文献が、先行技術を構成することを自認することはない。参考文献の記述は、その著者らが主張する事柄を述べ、出願人は、引用されている文書の正確さおよび妥当性を検証する権利を有する。多数の刊行物が本明細書で参照されているが、かかる参考文献によって、これらの文書のいずれかが本技術分野における共通一般知識の一部を形成するという自認が構成されることはないことが明らかに理解される。
【０１５５】
材料、組成物、構成成分、ステップ、技法等の記載は、多数の選択肢および代替物を含み得るが、かかる選択肢および代替物が、互いに均等である、あるいは特に、明らかな代替物であると解釈するべきではなく、それを自認するものでもない。よって、例えば、異なる特異的結合分子のリストは、リストされている特異的結合分子が、互いに明らかであることを示すものではなく、均等性または明白性を自認するものでもない。
【０１５６】
本明細書に開示されている全構成成分は、具体的に本明細書に開示されていると意図されており、そうであると考えるべきである。さらに、本開示内で同定され得る全サブグループは、具体的に本明細書に開示されていると意図されており、そうであると考えるべきである。結果として、任意の構成成分または構成成分のサブグループが、使用のために具体的に含まれても、それから除外されてもよく、あるいは構成成分のリストに含まれてもそこから除外されてもよいことが具体的に企図される。
【０１５７】
当業者であれば、単にルーチン実験を使用して、本明細書に記載されている方法および組成物の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、あるいはこれを確認することができる。かかる均等物は、次の特許請求の範囲によって包含されると意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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