(57)【要約】  本発明は、一つには、治療上の利点を有する、インスリンタンパク質および医薬組成物に関する。ペプチドおよび小分子の薬物の有効性は、循環におけるこのような薬物の半減期、および実質的に一定の血漿レベルを得ることの困難さによって制限されることが多い。例えば、インクレチンＧＬＰ−１は、循環におけるその短い半減期に対処するために、比較的高用量で投与しなければならず、これらの高用量は、とりわけ嘔気を伴う。ＭｕｒｐｈｙおよびＢｌｏｏｍ、非ペプチド、グルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト：糖尿病の特効薬か？（MurphyおよびBloom、Nonpeptide glucagon-like peptide 1 receptor agonists: A magic bullet for diabetes?）
2016505627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖と、インスリン多量体形成を阻害する、５〜２００アミノ酸の前記インスリンＡ鎖の融合パートナーと、を含む治療用タンパク質。
【請求項２】
前記治療用タンパク質は、天然インスリンと比較して、ＩＧＦ受容体の活性低下を示す、請求項１に記載の治療用タンパク質。
【請求項３】
前記融合パートナーは、約５０〜約１５０個のアミノ酸を有する、請求項１または２に記載の治療用タンパク質。
【請求項４】
前記融合パートナーは、繰り返しβターンを含む伸長したコンフォメーションを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項５】
前記融合パートナーの配列が、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンから選択される、約３０％未満の疎水性残基を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項６】
前記治療用タンパク質は、体温で相転移を示さない、請求項５に記載の治療用タンパク質。
【請求項７】
皮下注入のために、医薬として適合する溶液として製剤化されている、請求項５または６に記載の治療用タンパク質。
【請求項８】
前記治療用タンパク質は、注入から４５分以内にピークのインスリン作用に達する、請求項７に記載の治療用タンパク質。
【請求項９】
前記Ａ鎖およびＢ鎖が、任意に、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換から独立して選択される１〜８個の修飾を有する、配列番号１３のアミノ酸配列を有し、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項１０】
前記インスリンＢ鎖の３位、２８位、２９位および３０位のうちの１つまたは複数が置換されており、かつ／または前記Ａ鎖の２１位が置換されている、請求項９に記載の治療用タンパク質。
【請求項１１】
前記Ａ鎖とＢ鎖が、１つもしくは複数のジスルフィド結合によって結合されており、またはペプチドもしくは化学リンカーを介して結合されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項１２】
前記融合パートナーは、ＥＬＰ単位を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項１３】
前記融合パートナーが、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）の約１０〜約２５個の繰り返しを含み、またはＡＶＧＶＰ（配列番号４）の約１０〜約２５個の繰り返しを含み、Ｘは、Ｖａｌ、ＧｌｙおよびＡｌａから独立して選択される、請求項１２に記載の治療用タンパク質。
【請求項１４】
前記融合パートナーは、１〜約１０個の負電荷アミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項１５】
Ｇ及びＡは、残基Ｘとしてほぼ等しい量で存在し、Ｖは、ＸとしてＧおよび／またはＡより高い頻度で存在する、請求項１３または１４に記載の治療用タンパク質。
【請求項１６】
融合タンパク質は、配列番号１６または配列番号１７の配列を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の治療用タンパク質。
【請求項１７】
前記融合パートナーは、約１０〜約２５個のＶＰＧＸＧ単位（配列番号３）を含み、ここで、Ｘは、Ｖ、ＧおよびＡから独立して選択され、ここで、Ｇ及びＡは、残基Ｘとしてほぼ等しい量で存在し、Ｖは、ＸとしてＧまたはＡより低い頻度で存在する、請求項１２に記載の治療用タンパク質。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、配列番号１８、または配列番号１９、配列番号２１、または配列番号２２の配列を有する、請求項１７に記載の治療用タンパク質。
【請求項１９】
２〜６個の正電荷残基を有する、請求項１７に記載の治療用タンパク質。
【請求項２０】
前記融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の治療用タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質、インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖を含む第２の融合タンパク質、および約４００〜約１０００のアミノ酸の融合パートナーを含む医薬組成物であって、前記第２の融合タンパク質が、体温で相転移を示し、それによって注入部位からの前記第２の融合タンパク質の持続放出をもたらす、医薬組成物。
【請求項２２】
前記第２の融合タンパク質は、繰り返しβターンを含む伸長したコンフォメーションを有する融合パートナーを有する、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記第１の融合タンパク質は、［ＶＰＧＸＧ］１２０（配列番号２９）を含む融合パートナーを有し、ここで、各Ｘは、Ｖ、ＧおよびＡから選択され、Ｖ：Ｇ：Ａの比は、約５：３：２である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
１日１回の投与のための、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記第１および第２の融合タンパク質は、タンパク質分解プロセシングによって単一の融合タンパク質から分離される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記医薬組成物は、約１：１の比で、前記第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
糖尿病または低インスリン血症を治療するための方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の治療剤、または請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記患者は、１型糖尿病もしくは２型糖尿病を有するか、または糖尿病前症患者である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療用タンパク質は、１日１〜３回投与される、または前記医薬組成物は、１日１回投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療用タンパク質または医薬組成物は、食事前約１５分以内に投与される、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
糖尿病または低インスリン血症を治療するための方法であって、即効型食事インスリンおよび長時間作用型基礎インスリンを患者に投与することを含み、即効型インスリンは、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の治療用タンパク質であり、かつ／または長時間作用型インスリンは、インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖ならびに約４００〜約１０００アミノ酸の融合パートナーを含み、前記長時間作用型インスリンは、体温で相転移を示し、それによって注入部位からの持続放出をもたらす、方法。
【請求項３２】
前記長時間作用型インスリンは、繰り返しβターンを含む伸長したコンフォメーションを有する融合パートナーを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記長時間作用型インスリンは、１週間に１回または１日１回投与される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記即効型インスリンは、食事開始前に１日１〜３回投与される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者は、１型もしくは２型の糖尿病を有するか、または糖尿病前症患者である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記即効型インスリンおよび前記長時間作用型インスリンは、血中グルコースをモニターするポンプシステムによって投与される、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
糖尿病、代謝疾患または臨床的肥満を治療する方法であって、インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖ならびに約４００〜約１０００アミノ酸の融合パートナーを含む長時間作用型インスリンのレジメンを投与することと、ＧＬＰ−１受容体アゴニストのレジメンを投与することとを含み、前記長時間作用型インスリンは、体温で相転移を示し、それによって注入部位からの持続放出をもたらす、方法。
【請求項３８】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、ＧＬＰ１−ＥＬＰ１−１２０である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記長時間作用型インスリンおよび前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、それぞれ、［ＶＰＧＸＧ］１２０（配列番号２９）を含む融合パートナーを有する、ここで、各Ｘは、Ｖ、ＧおよびＡから選択され、Ｖ：Ｇ：Ａの比は、約５：３：２である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
インスリン及び前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、別個にまたは一緒に製剤化されている、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
インスリン及び前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、共製剤化されており、１週間に約１回投与される、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
即効型インスリンおよび長時間作用型インスリン、ならびに前記即効型インスリン及び前記長時間作用型インスリンを接続するプロテアーゼ部位を含む、融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１３年１月１５日に出願された米国仮出願第６１／７５２，５４２号、および２０１３年５月３０日に出願された米国仮出願第６１／８２９，０７４号の利益を請求し、これらの出願に基づく優先権を主張する。各出願の内容を参照することによって、それらの全体を本明細書中に組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一つには、血糖コントロールに関する治療上の利点を提供する、インスリン融合タンパク質ならびに医薬組成物およびこれらの併用療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチド薬物および小分子薬物の有効性は、循環におけるこのような薬物の半減期、および実質的に一定の血漿レベルを得ることの困難によって制限されることが多い。例えば、インクレチンＧＬＰ−１は、循環におけるその短い半減期に対処するために、比較的高用量で投与しなければならず、これらの高用量は、とりわけ嘔気を伴う。ＭｕｒｐｈｙおよびＢｌｏｏｍ、Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｉｃ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ：  Ａ  ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔ  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｅｓ？  ＰＮＡＳ  １０４（３）：６８９−６９０（２００７）。さらに、ペプチド剤である血管作用性小腸ペプチド（VIP）は、一部の推定値では、１分未満の半減期を示し、このため、このペプチド剤は医薬としての使用には実用的でない。Ｄｏｍｓｃｈｋｅら、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｍａｎ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ、Ｇｕｔ  １９：１０４９〜１０５３（１９７８）；ＨｅｎｎｉｎｇおよびＳａｗｍｉｉｌｅｒ、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ：  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９：２７〜３７（２００１）。ペプチド薬の短い血漿内半減期は、速い腎クリアランスおよび体循環における酵素分解に起因することが多い。
【０００４】
インスリンまたはその誘導体は、同様な困難を欠点として有するが、さらなる課題も提示する。膵臓の島細胞は、食間および夜間に基礎レベルのインスリンを分泌して、血中グルコースレベルが確実に適切な範囲内で推移するようにし、特に夜間の低血糖を予防する。食事の摂取後、消化および吸収の後における循環へのグルコースの流入に備えて、大量のインスリンが循環に放出される。血糖レベルのコントロールを最適化しかつ高血糖を予防するためには、このいわゆる食事インスリン（prandial insulin）が、非常に急速に放出されなければなない。健常者では、インスリンのピークレベルは、食事開始後３０〜４５分で出現する。
【０００５】
１型および２型糖尿病の治療のための現在のインスリン療法は、本質的に２つの形態をとる：低レベルのインスリンを終日供給する基礎インスリン、および食事時間に体によって正常に放出されるインスリンを模倣するために食事直前に注入するインスリン。基礎インスリン製品に関する課題は、ピークレベルとトラフレベルとの間に大きな差がない一定レベルのインスリンを、理想的には１日１回だけ、好ましくは１週間に１回だけ注入により供給することである。食事インスリンに関しては、分子は、皮下注入部位から非常に急速に吸収される必要があり、そのレベルが２時間ほどで基礎レベル近くまで減衰する必要がある。
【０００６】
現在入手可能な食事インスリン製剤は、高いインスリン濃度を有し、これらのインスリン分子は、亜鉛の存在下で自己集合して六量体となる。したがって、インスリン分子は一般に、溶液中に六量体、二量体および単量体の動的平衡として存在し、それらの割合は溶液の濃度およびｐＨによって決まる。中性ｐＨの市販インスリン製剤においては、この平衡は、亜鉛によって安定化される六量体に非常に有利に働く。単量体インスリンは一般に不安定であって脱アミドを受けるので、これは保存安定性には有利である。皮下注入時に、六量体インスリンは、吸収されにくく、循環に取り込まれるためには二量体および単量体に解離しなければならず、これは、最大レベルへの到達が著しく遅れる原因となる。
【０００７】
即効型インスリンは、二量体および六量体を不安定化する、変更されたアミノ酸配列を有するので、このインスリンはより急速に単量体の形態に変換される。しかし、現在販売されている製品は、内因的に放出されるインスリンよりも、ピークレベルへの到達が依然として著しく遅く、最適なコントロールのためには食事の２０分前の注入を余儀なくされる。注入部位の加温による血流の増加、酵素の注入による皮下脂肪層のヒアルロン酸（hyaluranan）層の分解を含む、注入されたインスリンの取り込みをさらに加速するための多くのアプローチが、現在研究中である（HeinemannおよびMuchmore、2012. Ultrafast-Acting Insulins: State of the Art Journal of Diabetes Science and Technology 6、728〜742によって概説されている）。連続グルコースモニタリングからのデータを組み込み、最終的に、使用者からの入力をほとんどまたは全く必要としない閉ループシステムをもたらすことによって、インスリン送達のためのポンプの使用を拡大することへの関心が、ますます増大している。しかし、現在の即効型インスリンは、血中グルコースレベルに対する作用が著しく遅延されるので、このようなフィードバックループシステムを実際に可能にするには緩徐すぎる。ポンプリザーバー中の生理的に許容される溶液中で安定である、より即効型のインスリンがあれば、このようないわゆる「人工膵臓」システム系の開発が可能となるであろう（Cenzig、2012、Undeniable Need for Ultrafast- Acting Insulin: The Pediatric Perspective、Journal of Diabetes Science and Technology  6、797〜801）。
【０００８】
逆の状況が、基礎インスリン製品の開発に関係しており、この場合、目標は、注入部位からの取り込みを持続的にすること、もしくは延長された循環半減期を有するインスリン分子を得ること、またはこれら２つの組合せである。現在市場に出回っている最も普及している基礎インスリンはインスリングラルギンであるが、この製品は、まる２４時間のカバレッジを提供しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、改善された薬学的特性を示すインスリン療法が、例えば、改善された基礎インスリン製品およびより即効型の食事インスリンの両方の観点から、依然として必要である。特に、適合性がありかつ１日１回の投与を可能にするように一緒に製剤化し得る基礎インスリンおよび即効型インスリンであって、さもなければ最も高いまたは最も長期にわたるグルコース偏位をもたらすであろう食事、通常は朝食に対して、基礎成分に加えて食事カバレッジを提供する、基礎インスリンおよび即効型インスリンが必要である。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明の以下の説明から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、インスリンベースの医薬作用剤、ならびにそれらの組成物、組合せおよび製剤を提供する。これらの作用剤は、持続放出、即効作用（例えば、六量体形成の消失または低減による）、およびＩＧＦ受容体の活性低下から選択される、１つまたは複数の利点を示す。本発明は、種々の態様において、個別に投与することができる、または併用療法として別個にもしくは一緒に投与することができる、持続放出（例えば、長時間作用）または即効作用プロファイルを示すインスリンの融合パートナーに関する。
【００１２】
一態様において、本発明は、インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖と、５〜２００アミノ酸の、例えば、約５０〜約１５０個のアミノ酸残基を有する融合パートナーとを含む融合タンパク質であって、融合パートナーがインスリン多量体（例えば、六量体）形成を阻害する、融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、融合パートナーは、融合パートナーの一次配列のプロリン残基のパターンおよび／または全アミノ酸組成の結果であり得る、ランダムコイルまたは繰り返しβターンのコンフォメーションを形成し得る、伸長したコンフォメーションを有する。一部の実施形態において、融合パートナーの配列は、約３５％未満、または約３０％未満、または約２５％未満、または約２０％未満の疎水性残基を含有し、該疎水性残基としてはアラニン、グリシンおよびプロリンを除外する。例えば、これに関連する疎水性残基には、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびヒスチジンが含まれる。融合パートナーは、該融合パートナーの疎水性を低下させる１つまたは複数の正電荷残基を有する。一部の実施形態において、六量体形成を低減または排除する配列は、注入部位からの持続放出を誘導しない。さらなる実施形態において、この配列は、生理的に適合性の溶液中でインスリンを単量体または実質的に単量体の形態で安定化する。これらの態様において、本発明は、食事インスリンを提供するための治療剤および医薬組成物または製剤を提供する。
【００１３】
別の態様において、持続性血糖コントロールを提供するための、有効量の融合タンパク質と持続放出を達成するための医薬賦形剤とを含む医薬組成物および製剤であって、融合タンパク質が、インスリンアミノ酸配列（例えば、インスリンA鎖およびインスリンB鎖）と、注入部位からの持続放出を提供するアミノ酸配列を有する融合パートナーとを含む、医薬組成物および製剤を提供する。一部の実施形態において、融合パートナーは、融合パートナーのプロリン残基のパターンおよび／または全アミノ酸組成の結果であり得る、ランダムコイルまたは繰り返しβターンのコンフォメーションを形成し得る、伸長したコンフォメーションを有する。これらの実施形態における融合パートナーは、約３５℃または約末梢体温で相転移を示し、それによって注入部位からの薬物の持続放出をもたらすマトリックスまたは薬物デポーを形成することができる。これらの態様は、例えば、糖尿病患者において基礎インスリンを提供するのに有用である。
【００１４】
一部の実施形態において、本明細書中に記載する医薬作用剤および組成物は、ＩＧＦ受容体における結合および／または活性化が低下しているまたはごくわずかであるという利益をもたらすので、本発明の作用剤、組成物および製剤は、例えば、１型または２型の糖尿病患者の長期治療に特に好適となる。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載する活性作用剤の共製剤（co-formulation）および併用療法、例えば、基礎インスリンおよび即効型インスリン融合タンパク質の共製剤および併用療法ならびにインスリン剤と他の作用剤、例えば、ＧＬＰ−１受容体アゴニストとの共製剤を提供する。例えば、一部の実施形態において、本明細書中に記載する基礎インスリンおよび即効型インスリンの併用療法または共製剤は、単回注入でまる１日にわたって即効および持続性インスリン作用を提供する。さらに、持続放出型融合タンパク質とＧＬＰ−１受容体アゴニストとの共製剤は、血糖コントロールに対する相乗効果を提供することができ、例えば、一部の実施形態において、１週間に１回の投与で基礎インスリンレベルを提供することができる。
【００１６】
別の態様において、糖尿病、低インスリン血症または高血糖症を治療する方法であって、本明細書中に記載する医薬組成物もしくは製剤を投与するまたは本明細書中に記載する併用療法を施すことを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、患者は、１型糖尿病もしくは２型糖尿病を有するか、または糖尿病前症患者である。一部の実施形態において、この方法は、本明細書中に記載する医薬組成物を１カ月につき約１〜約３０回、例えば、１週間に約１回もしくは１週間につき２もしくは３回または１日に約１回の頻度で投与することを含む。一部の実施形態において、この方法は、医薬組成物を皮下または筋肉内に投与することを含む。一部の実施形態において、この方法は、作用剤を複数年にわたって投与する長期療法を提供する。食事インスリンを投与する場合、一部の実施形態において、この方法は、食事の直前に、例えば、食事開始の約１５分前、約１０分前、約５分前または１分未満前に医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、インスリンのピークレベルは、投与後および／または食事開始後３０〜４５分で得られる。
【００１７】
一部の実施形態において、この方法は、本明細書中に記載する１種または複数の医薬作用剤または組成物を、グルコースモニタリングシステムによって決定される血液中のグルコースのレベルに例えば基づいて、インスリンの送達量をコントロールする閉ループシステムを任意選択により有するポンプシステムによって投与することを含む。このシステムは、基礎インスリン（例えば、本明細書中に記載される）と即効型インスリン（例えば、本明細書中に記載される）の両方をコントロールおよび投与することができ、これもまた本明細書中に記載するＧＬＰ−１受容体アゴニストの投与もさらにコントロールすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ヒトプロインスリン配列（配列番号１３）を示す図である。プロインスリン配列は、Ｃペプチドによって連結されたＢ鎖およびＡ鎖からなる。２つの隣接した二塩基部位（下線が引かれたイタリック体）における酵素的切断後に、Ｃペプチドが除去されて、成熟インスリンを形成する。
【図１Ｂ】ＰＥ０１３９またはＩＮＳＵＭＥＲＡまたはインスリン−ＥＬＰ１−１２０と称する、１２０ＥＬＰ単位がインスリンＡ鎖のＣ末端と融合されている構築物を示す略図である。
【図２】ｐＰＥ０１３９プラスミドの地図を示す図である。
【図３】プロインスリンＥＬＰ１−１２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−１２０配列と融合されている。アミノ酸配列は、任意選択によりＮ末端に開始メチオニン残基を含む。
【図４】非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験を示す図である。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、酵素プロセシング後に、Ｃ−ペプチドが切断されたときに予想される減少した融合タンパク質分子量を示した。レーン１：ＳＥＥＢＬＵＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ２着色済みスタンダード（INVITROGEN）、レーン２：ＥＬＰ１−１２０、レーン３：プロインスリンＥＬＰ１−１２０、レーン４：インスリンＥＬＰ１−１２０  ３μｇ、レーン５：インスリンＥＬＰ１−１２０  ６μｇ、レーン６：ＳＥＥＢＬＵＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ２着色済みスタンダード（INVITROGEN）。
【図５】抗インスリンＢ鎖のウェスタンブロットを示す図である。抗インスリンＢ鎖のウェスタンブロットを行って、ＥＬＰと融合したＡ鎖およびＢ鎖の両方の存在を確認した。データは、非還元条件下でＢ鎖の存在を示した。これは、Ａ鎖とＢ鎖の間におけるジスルフィド結合の形成を示している。融合タンパク質およびジスルフィド結合の還元により、融合物からＢ鎖が除去された。レーン１：Ｂ鎖が非存在を示す、還元インスリンＥＬＰ融合物、レーン２：Ｂ鎖の存在を示す、非還元インスリンＥＬＰ融合物、レーン３：ＥＬＰ１−１２０、レーン４：Ｂ鎖の存在を示す、プロインスリンＥＬＰ融合物。
【図６】プロセシングされていないインスリンＥＬＰ１−１２０に関するＥＳＩ−ＭＳデータを示す図である。エレクトロスプレーイオン化質量分析は、５７００８．５ＤａのプロセシングされていないプロインスリンＥＬＰ融合物の質量を確認した（SGS Mスキャンコード１０４５３１＆１０４５３２）。さらなる塩付加物が存在した。
【図７】プロセシングされたｐＰＥ０１３９に関するＥＳＩ−ＭＳデータを示す図である。エレクトロスプレーイオン化質量分析は、Ｃ−ペプチドの酵素除去後の成熟インスリンＥＬＰ融合物の質量を確認した（SGS Mスキャンコード１０７６１０）。インスリンＥＬＰのＥＳＩ−ＭＳは、約５３２９８Ｄａの分子質量を有する主生成物のピークを示した。これは、Ｃ−ペプチド切断後の成熟インスリンＥＬＰを示している。微小ピークは、部分分解された融合物または塩付加物に起因するものと考えられる。
【図８】インスリン−ＥＬＰｌ−１２０融合物を用いた場合、インスリングラルギンと比較して正常マウスの血中グルコースが低下したことを示すグラフである。
【図９】１型真性糖尿病（1型糖尿病、T1DM）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）の投薬を示すグラフである。具体的には、単回投与データが示されている。結果は、ＩＮＳＵＭＥＲＡでは、等モルのＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）投薬と比較して、グルコース低下の持続時間が長いことを実証している。ＳＴＺはストレプトゾトシンであり；未処置群は正常な非糖尿病性動物を指し；Ｎ＝８／群である。
【図１０】１型真性糖尿病（1型糖尿病、T1DM）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）の投薬を示すグラフである。具体的には、毎日投薬のデータが示されている。結果は、活性および半減期に関して、ＩＮＳＵＭＥＲＡが、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して優れていることを実証している。ＳＴＺはストレプトゾトシンであり；未処置群は、正常な非糖尿病性動物を指し；６時間の時点で２５ｍｇ／ｋｇ群および５０ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝５；８時間の時点で２５ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝３および５０ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝２；２４時間の時点で２５ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝１および５ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝７である。
【図１１Ａ】１型真性糖尿病（1型糖尿病、T1DM）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）の低用量設定（low dose titration）を、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して示すグラフである。具体的には、図１１Ａは単回ｓ．ｃ．投与を示す。ＳＴＺはストレプトゾトシンであり；未処置群は、正常な非糖尿病性動物を指し；ＬＡＮＴＵＳ、ＰＥ０１３９  １ｍｇ／ｋｇ群および未処置群に関してＮ＝８；ＰＥ０１３９  ３．３３ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝７である。
【図１１Ｂ】１型真性糖尿病（1型糖尿病、T1DM）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）の低用量設定を、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して示すグラフである。具体的には、図１１Ｂは、１４日間毎日のｓ．ｃ．投薬を示す。ＳＴＺはストレプトゾトシンであり；未処置群は、正常な非糖尿病性動物を指し；ＬＡＮＴＵＳ、ＰＥ０１３９  １ｍｇ／ｋｇ群および未処置群に関してＮ＝８；ＰＥ０１３９  ３．３３ｍｇ／ｋｇ群に関してＮ＝７である。
【図１２Ａ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）が、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して血糖コントロールを有意に増加させたことを示すグラフである。１、３、７および１４日目にＬａｎｔｕｓと比較して、曲線下面積（AUC）血中グルコースの２７〜３９％の低下が見られる。具体的には、図１２Ａは、１日目の化合物投与および０〜２４時間における血中グルコースＡＵＣを示す。
【図１２Ｂ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）は、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して、血糖コントロールを有意に増加させたことを示すグラフである。１、３、７および１４日目にＬａｎｔｕｓと比較して、曲線下面積（AUC）血中グルコースの２７〜３９％の低下が見られる。具体的には、図１２Ｂは、１４日目の化合物投与および０〜２４時間における血中グルコースＡＵＣを示す。
【図１３Ａ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）が、皮下注入後に、小さいピーク対トラフ比を有する長い半減期を達成することを示すグラフである。具体的には、図１３Ａは、糖尿病のブタにおいて単回ｓ．ｃ．注入後の薬物の薬物動態（PK）レベルを示す。
【図１３Ｂ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）が、毎日の皮下注入後に、定常状態ピーク対トラフ薬物動態（PK）レベルを達成することを示すグラフである。具体的には、図１３Ｂは、糖尿病のブタにおける２週間にわたる毎日のｓ．ｃ．注入；投薬前に測定したＰＫレベルを示す。
【図１４】本開示による例示的な速効型インスリンの設計を示す図である。インスリンＢ鎖−インスリンＡ鎖−ＥＬＰ１−２０の配列が示されている（配列番号１５）。
【図１５】速効型インスリンの生成およびイオン交換クロマトグラフィーを示す図である。
【図１６】ＩＮＳＵＭＥＲＡと比較した速効型インスリンの効力を示す図である。図１６は、それらの効力が同等であることを示している。
【図１７】プラスミドｐＰＥ０２２４が、プロインスリンＥＬＰ１−２０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図１８】プロインスリンＥＬＰ１−２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。
【図１９】プラスミドｐＰＥ０２６２が、プロインスリンＥＬＰ１−１０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図２０】プロインスリンＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す図である。
【図２１】プラスミドｐＰＥ０２５９が、プロインスリンＥＬＰ２−２０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図２２】プロインスリンＥＬＰ２−２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す図である。
【図２３】プラスミドｐＰＥ０２６６が、プロインスリンＥＬＰ２−１０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図２４】プロインスリンＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す図である。
【図２５】プラスミドｐＰＥ０２８３が、プロインスリンＥＬＰ１−１０（4xGlu）融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図２６】プロインスリンＥＬＰ１−１０（4xGlu）融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す図である。
【図２７】プラスミドｐＰＥ０２８４が、リスプロＥＬＰ１−１０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図２８】リスプロＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す図である。
【図２９】プラスミドｐＰＥ０２８５が、リスプロＥＬＰ１−１０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図３０】アスパルトＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２２）を示す図である。
【図３１】プラスミドｐＰＥ０２８９が、ＥＬＰ２−１０  ＥＬＰ１−１２０ブレークアウェイ（breakaway）融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図３２】プラスミドｐＰＥ０２８５が、リスプロＥＬＰ１−１０融合タンパク質をコードすることを示す図である。
【図３３】プロインスリンＥＬＰ２−１０  ＥＬＰ１−１２０ブレークアウェイ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す図である。下線が引かれている配列はプロインスリンであり、ボールド体の配列はＥＬＰ２−１０であり、イタリック体の配列はＥＬＰ１−１２０である。下線が引かれている２つのアルギニンは、２つの構築物を解放するトリプシン部位である。
【図３４】ＳＴＺマウスにおける血中グルコースレベルに対する、ＰＥ０２４４およびＰＥ０１３９ならびに組合せの効果を示すグラフである。
【図３５Ａ】３μＭ、ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９が、Ｂｉａｃｏｒｅ光学バイオセンサーで示される、インスリン受容体への結合を示すことを示すグラフである。
【図３５Ｂ】３μＭ、ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９が、Ｂｉａｃｏｒｅ光学バイオセンサーを用いた場合に、ＩＧＦ−１受容体への検出可能な結合を示さないことを示すグラフである。
【図３６Ａ】ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９が、インスリン受容体への同様な結合を示すことを示すグラフである。
【図３６Ｂ】ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９が、インスリン受容体への同様な結合を示すことを示すグラフである。
【図３７】ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＰＥ０１３９の用量漸増（dose escalation）が、空腹時グルコースおよび食後グルコースに対して、次第に増加する効果を示すことを示すグラフである。
【図３８】ＰＥ０１３９への、固定用量のＰＢ１０２３（GLP-1-ELP1-120）の添加が、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、食後コントロールをさらに増強することを示すグラフである。
【図３９】ＰＢ１０２３用量漸増が、ｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時グルコースおよび食後グルコースに対して、次第に増加する効果を示すことを示すグラフである。
【図４０】ＰＢ１０２３への固定用量のＰＥ０１３９の添加が、ｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時コントロールおよび食後コントロールを増強することを示すグラフである。
【図４１】ＰＥ０１３９用量漸増が、血糖グルコースに対してほとんど効果を示さないこと、およびＰＢ１０２３用量漸増が、空腹時グルコースに対して次第に増加する効果を示しかつ食後グルコースに対してほとんど影響を示さないことを示すグラフである。
【図４２】低用量のＰＥ０１３９と低用量のＰＢ１０２３との組合せが、空腹時コントロールおよび食後コントロールを増強したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、治療上の利点、例えば、持続性血糖コントロール、即効作用（例えば、インスリン六量体形成の消失または低減による）、ならびに／またはＩＧＦ受容体の低下したもしくはごくわずかな結合および／もしくは活性化を示す、インスリンベースの医薬作用剤、組成物、製剤、組合せおよび併用療法を提供する。高血糖症、低インスリン血症、糖尿病（1型および2型を含む）、代謝疾患および肥満を含む疾患を、本発明の作用剤、組成物および製剤を用いて治療するための方法および使用も提供される。
【００２０】
一態様において、本発明は、インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖と、５〜２００アミノ酸の、例えば、約５０〜約１５０アミノ酸の融合パートナーとを含む融合タンパク質であって、融合パートナーがインスリン多量体（例えば、六量体）形成を阻害する、融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、融合パートナーは、融合パートナーの一次配列のプロリン残基のパターンまたは全アミノ酸組成に起因し得る、ランダムコイルまたは繰り返しβターンのコンフォメーションを形成し得る、伸長したコンフォメーションを有する。一部の実施形態において、融合パートナーの配列は、約３５％未満、または約３０％未満、または約２５％未満、または約２０％未満の疎水性残基を含有する（疎水性残基としてはアラニン、グリシンおよびプロリンを除外する）。例えば、これに関連する疎水性残基には、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが含まれる。一部の実施形態において、六量体形成を低減または排除する配列は、注入部位からの持続放出を誘導しないか、または体温で相転移を示さない。さらなる実施形態において、この配列は、生理的に適合性の溶液中でインスリンを単量体または実質的に単量体の形態で安定化する。これらの態様において、本発明は、本明細書中に記載する即効性作用に基づいて、食事インスリンを提供するための治療剤および医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、即効型インスリンは約４５分以内に、または約３５分以内に、または約３０分以内にピーク作用に達する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、インスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖と、約４００〜約１０００アミノ酸の、例えば、約４００〜約８００アミノ酸の融合パートナーとを含む融合タンパク質であって、融合パートナーが体温で相転移を示し、それによって注入部位からの活性作用剤の持続放出をもたらす、融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、融合パートナーは、アミノ酸配列中のプロリン残基のパターンまたは全アミノ酸組成に起因し得る、ランダムコイルまたは繰り返しβターンのコンフォメーションを形成し得る、伸長したコンフォメーションを有する。これらの態様において、本発明は、本明細書中に記載するような持続放出および緩徐なクリアランスに基づいて、基礎インスリンを提供するための治療剤ならびに医薬組成物および製剤を提供する。一部の実施形態において、持続放出型インスリンは、１日に１回または１週間に１回の投与のために１回分ずつ計量する。
【００２２】
種々の実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、Ａ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列を含み、Ａ鎖およびＢ鎖は、共同で、配列番号１３のアミノ酸配列（図１）を有し、任意選択により１〜８個または１〜５個のアミノ酸挿入、欠失または置換を有する。例えば、インスリンＢ鎖の３位、２８位、２９位および３０位ならびにＡ鎖の２１位を、例えば、Ｋ３、Ｇ２１、Ｋ２８、Ｄ２８、Ｐ２９、Ｑ２９で置換することができる。一部の実施形態において、１〜５個のアミノ酸をＢ鎖のＣ末端に付加するか、またはＢ鎖のＴ３０を除去する。このような変更は、任意選択により、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミルの配列に相当し得る。一部の実施形態において、注入部位からの緩徐な吸収を提供するまたはインスリン多量体形成を低減もしくは排除する、アミノ酸配列を、インスリンＡ鎖に共有結合させる。別の実施形態において、Ａ鎖とＢ鎖を、１つもしくは複数のジスルフィド結合によって結合させ、またはペプチドもしくは化学リンカーを介して結合させる。
【００２３】
種々の実施形態において、融合パートナーをインスリンＡ鎖に共有結合させ、融合パートナーは、望ましい生物学的作用が即効型かまたは持続性かによって、エラスチン様ペプチド（ELP）単位を、例えば、約５〜約１８０ＥＬＰ単位を含むことができる。一部の実施形態において、ＥＬＰは、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）の繰り返しを含み、各Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン残基から独立して選択される。一部の実施形態において、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＧおよびＷから独立して選択される。一部の実施形態において、ＥＬＰは、ＡＶＧＶＰ（配列番号４）、ＩＰＧＶＧ（配列番号６）またはＬＰＧＶＧ（配列番号８）の繰り返しを含む。融合パートナーのサイズおよびアミノ酸組成は、本明細書中でより詳細に記載されるように、即効作用または持続活性のいずれかを提供するように選択する。
【００２４】
即効型インスリンを提供するための一部の実施形態において、融合物は、融合パートナーの負電荷を増加させかつ融合パートナーの疎水性を低減するために、１〜約１０個の負電荷アミノ酸、例えば、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸などを含有できる。一部の実施形態において、ＥＬＰは、約１０〜約２５個のＶＰＧＸＧ単位から構成され（配列番号３）、ここで、Ｘは、Ｖ、ＧおよびＡから独立して選択され、ここで、Ｇ及びＡは、ゲスト残基としてほぼ等しい量（例えば、約１または２個以内）で存在し、Ｖは、ＧまたはＡの約２〜約３倍で存在する。あるいは、ＥＬＰ単位は、ＡＶＧＶＰ（配列番号４）である。例えば、即効作用型インスリンのための例示的な融合物または融合パートナーは、配列番号１６（図１８）または配列番号１７（図２０）によって例示される。他の実施形態において、ＥＬＰは、約１０〜約２５個のＶＰＧＸＧ単位（配列番号３）から構成され、ここで、Ｘは、Ｖ、ＧおよびＡから独立して選択され、ここで、Ｇ及びＡは、ゲスト残基としてほぼ等しい量（例えば、約１または２個以内）で存在し、Ｖは、ＧまたはＡの約１／２〜約１／３で存在する。例えば、即効作用型インスリンのための例示的な融合タンパク質または融合パートナーは、配列番号１８（図２２）または配列番号１９（図２４）または配列番号２１（図２８）または配列番号２２（図３０）によって例示される。他の実施形態において、ＥＬＰは、上記のように約１０〜約２５個のＶＰＧＸＧ単位（配列番号３）から構成されており、正電荷残基が一部のＥＬＰ単位の間に、例えば、約２〜約６カ所の場所（例えば、約３、４または５カ所の場所）に挿入される。これらの実施形態による例示的な融合タンパク質または融合パートナーは、図２６に示される（配列番号２０）。あるいは、正電荷残基を、ＥＬＰ配列の１つまたは複数のゲスト残基として、またはＥＬＰ単位の別の位置に挿入できる。
【００２５】
一部の実施形態において、持続放出および即効作用を提供する融合タンパク質は、「ブレークアウェイ」融合物として一緒に生成され、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）の作用によるプロセシングの間に放出される。このような設計は、図３３に示される（配列番号２３）。このような実施形態において、即効作用型および持続作用型インスリンの１：１の共製剤（または他の規定されたモル比）は、簡便に調製できる。種々の実施形態において、ブレークアウェイ構築物は、１〜５個（例えば、１または２個）の即効型インスリン単位を１〜５個（例えば、１または２個）の持続放出型インスリン単位と共に含み、単位はそれぞれ、プロテアーゼ切断部位によって接続されている。
【００２６】
一部の態様において、本発明は、持続放出型融合タンパク質を、持続放出を可能にしかつ／または即効作用型を主に単量体の状態に保つ賦形剤を含む医薬組成物として提供する。例えば、医薬組成物または製剤は、約２０ｍＭヒスチジンと共に約１１０ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度を有し得る。一部の実施形態において、医薬組成物は、１週間につき約１回または１日１回の投与のために製剤化する。
【００２７】
一部の態様において、本発明は、糖尿病または低インスリン血症を治療する使用および方法であって、本明細書中に記載する医薬組成物または製剤の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、使用および方法を提供する。一部の実施形態において、患者は１型もしくは２型糖尿病を有するか、または前糖尿病性患者であり、かつ／または代謝疾患もしくは臨床的肥満を有する。一部の実施形態において、持続放出のための医薬組成物は、１カ月につき１〜約３０回、または１週間に約１回もしくは１週間につき約２もしくは３回、または１日に約１回の頻度で投与する。一部の実施形態において、この方法はまた、食事インスリンを送達する。例えば、この方法は、食事インスリンを提供するために、即効型インスリンを含む医薬組成物を食事の直前に、例えば、食事の約１５分前、約１０分前、約５分前または１分未満前に投与することを含むことができる。本発明はさらに、このような疾患の治療用医薬の製造に使用するための、本明細書中に記載するインスリン融合タンパク質の方法および使用を提供する。
【００２８】
一部の実施形態において、この方法は、医薬組成物を皮下または筋肉内に投与することを含む。一部の実施形態において、本明細書中に記載する作用剤および組成物は、ＩＧＦ受容体の活性の低下のため、長期治療に好適である。一部の実施形態において、この方法は、作用剤を複数年にわたって、例えば、約２年超、約５年超、約１０年超またはそれ以上にわたって投与する長期療法を提供する。
【００２９】
一部の実施形態において、この方法は、医薬組成物を、グルコースモニタリングシステムによって決定される血液中のグルコースのレベルに基づいてインスリンの送達量をコントロールする閉ループシステムを任意選択により有するポンプシステムによって投与することを含む。ポンプシステムは、例えば、持続作用型インスリンを定期的な頻度で投与すると共に、上昇するグルコースレベルに応じてまたは食事開始前の送達にタイミングを合わせて即効作用型インスリンを投与することに基づいて、即効作用型および持続作用型インスリンを送達することができる。
【００３０】
種々の実施形態において、治療上の利点（例えば、持続放出または即効作用）を提供するアミノ酸配列は、融合パートナー中のプロリン残基のパターンの結果として、伸長したコンフォメーションまたはランダムコイルを有する。このパターンは、βターンの繰り返しパターンであることができる。例えば、一部の実施形態において、アミノ酸配列は、エラスチン様ペプチド（ELP）アミノ酸配列である。一部の実施形態において、ＥＬＰは、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）の繰り返しを含み、各Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン残基から独立して選択される。一部の実施形態において、ＥＬＰアミノ酸配列は、ＡＶＧＶＰ（配列番号４）、ＩＰＧＶＧ（配列番号６）またはＬＰＧＶＧ（配列番号８）の繰り返しを含む。種々の実施形態において、ＥＬＰは、ＥＬＰアミノ酸単位（本明細書中に記載する通り）の少なくとも５個、または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも３０個、または少なくとも６０個、または少なくとも９０個、または少なくとも１２０個、または少なくとも１８０個の繰り返しを含む。一部の実施形態において、ＥＬＰは、インスリン多量体の形成を回避するために、約６０ＥＬＰ単位未満または約３０ＥＬＰ単位未満である。一部の実施形態において、融合パートナーは、約５〜約３０ＥＬＰ単位、例えば、約１０、約１５、約２０および約２５ＥＬＰ単位を含む約１０〜約２５ＥＬＰ単位を有する。これらの実施形態において、ＥＬＰは注入部位からの持続放出を誘導せず、体温で逆相転移を示さない。別の実施形態において、ＥＬＰアミノ酸配列は、少なくとも９０ＥＬＰ単位および約１２０ＥＬＰ単位を含む少なくとも６０ＥＬＰ単位を含み、通常生理食塩溶液中で３７℃より少しだけ低い転移温度を有し、それによって持続放出作用を提供する。例えば、一部の実施形態において、ＥＬＰの転移温度は、約３６℃、または約３５℃、または約３４℃、または約３３℃、または約３２℃、または約３１℃、または約３０℃であることができる。
【００３１】
一部の実施形態において、治療上の利点を提供するアミノ酸配列は、ランダムコイルまたは非球状の伸長した構造または不定形のバイオポリマー、例えば、少なくとも５０％のアミノ酸が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定した場合に二次構造を欠いているバイオポリマーを形成する。このような実施形態において、融合パートナーは、ランダムコイルコンフォメーションと記載し得る。さらに別の実施形態において、持続放出を提供するアミノ酸配列は、以下により詳細に記載する伸長した非球状の構造またはランダムコイル構造を有するタンパク質であり、とりわけ、循環からの排出速度を低下させる大きい流体力学半径を提供する。
【００３２】
種々の実施形態において、本発明は、基礎インスリン（本明細書中に記載する持続放出型融合タンパク質を含む）および即効作用型インスリン（本明細書中に記載する融合タンパク質を含み得る）の共製剤を提供し、基礎および食事インスリンは、１日１〜２回、単回注入で投与することができる（例えば、朝食の前に）。これらまたは他の実施形態において、共製剤は、優れた血糖コントロールまたは基礎疾患としてのもしくは合併症としての代謝疾患もしくは過剰体重（例えば、臨床的肥満）のコントロールを提供し得る１種または複数のＧＬＰ−１受容体アゴニストを含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様および実施形態は、本発明の以下の詳細な説明から明らかとなる。
【００３４】
インスリンのアミノ酸配列
例えばヒトインスリンの、インスリン注入剤は、糖尿病の治療に使用できる。体のインスリン産生細胞は、β細胞と称され、膵臓の腺に見られる。これらの細胞は塊になって、それらを特定したドイツ人医学生にちなんで命名された、「ランゲルハンス島」を形成する。
【００３５】
インスリンの合成は、１１番染色体上に存在するインスリン遺伝子の翻訳から始まる。翻訳中に、２つのイントロンが、１１０アミノ酸長のタンパク質をコードするｍＲＮＡ産物からスプライシングで切り出される。この一次翻訳産物は、プレプロインスリンと称され、不活性である。これは、タンパク質が細胞膜を通過するのに必要な、２４アミノ酸長のシグナルペプチドを含有する。ヒトプロインスリンは、３１アミノ酸Ｃペプチドに連結されたＡ鎖およびＢ鎖からなる（図１）。
【００３６】
プレプロインスリンが小胞体に到達すると、プロテアーゼがシグナルペプチドを切断して、プロインスリンを作製する。具体的には、Ａ鎖とＢ鎖との間にジスルフィド結合が形成されると、プロインスリンは、インビボでトリプシン／カルボキシペプチダーゼＢ様系によるＣペプチドの除去によって成熟インスリンに変換される。プロインスリンは、３つのドメイン：アミノ末端Ｂ鎖、カルボキシル末端Ａ鎖、およびＣ−ペプチドとして知られる中央の結合ペプチドからなる。インスリンは、鎖Ａ（２１アミノ酸ＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ）（配列番号２４）および鎖Ｂ（３０アミノ酸ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ）（配列番号２５）と称される２つのアミノ酸鎖から構成され、これらが２つのジスルフィド架橋によって連結されている。Ａ鎖の６番目の残基と１１番目の残基とを連結する第３のジスルフィド架橋が、Ａ鎖内に存在する。ほとんどの種において、鎖Ａおよび鎖Ｂの長さおよびアミノ酸組成は類似しており、３つのジスルフィド結合の位置は高度に保存されている。このため、ブタインスリンは、糖尿病患者における不十分なヒトインスリンレベルを元に戻すことができる。今日では、ブタインスリンは、細菌によるヒトプロインスリン（組換え型インスリン）の大量生産によってほとんど取って代わられている。
【００３７】
インスリン分子は溶液中で二量体を形成する傾向があり、亜鉛イオンの存在下で、インスリン二量体は会合して六量体となる。インスリンの単量体が血液中に容易に拡散し、即効があるに対して、六量体は緩徐に拡散し、遅発性作用を有する。組換え型インスリンの設計において、インスリンの構造は、インスリン分子が二量体および六量体を形成する傾向を低減するがインスリン受容体に対する結合を妨げないように、修飾することができる。このようにして、短時間作用型から長時間作用型までの様々な製剤が作製される。
【００３８】
小胞体内で、プロインスリンは、Ｃペプチドを除去して成熟した活性形態のインスリンを生成するいくつかの特異的ペプチダーゼに曝露される。ゴルジ装置で、インスリンおよび遊離Ｃペプチドが分泌顆粒中にパッケージされ、これらがβ細胞の細胞質中に蓄積する。顆粒のエキソサイトーシスは、β細胞へのグルコースの侵入によって誘発される。インスリンの分泌は、代謝に対して広範な影響を及ぼす。
【００３９】
グルコースの上昇に応答するインスリン放出には２つの段階がある。第１の段階は、インスリンの即時放出である。これは、分泌顆粒中に貯蔵されている前もって形成されたインスリンの放出に起因する。少し遅れて、新たに合成されたインスリンのより長期にわたる第２の放出がある。
【００４０】
いったん放出されると、インスリンは、酵素によって分解される前の短時間しか活性でない。肝臓および腎臓で見られるインスリナーゼは、血漿中を循環するインスリンを分解し、結果としてインスリンの半減期はわずか約６分である。この短い作用持続時間により、インスリンの循環レベルに急速な変化が起こる。
【００４１】
改善された治療特性を有するインスリンアナログが開発されており（Owensら、2001、Lancet 358: 739〜46;Vajoら、2001、 Endocr Rev 22: 706〜17）、そのようなアナログは本発明と関連して用いることができる。インスリンＢ鎖のＣＯＯＨ末端端部の伸長およびアルブミンに対してかなりの親和性を有する脂肪酸−アシル化インスリンの操作を含む種々の戦略を使用して、より長時間作用型のインスリンアナログが生成される。しかし、入手可能なより長時間作用型のインスリン化合物でのインビボ治療はいまだに、高頻度の血糖低下偏位および血糖上昇偏位ならびにＨｂＡ１ｃの中程度の低下をもたらす。したがって、真に長時間作用型で安定なヒトインスリンアナログの開発は今なお、依然として重要な課題である。
【００４２】
本発明に従って用いることができるインスリンの機能的アナログとしては、即効型アナログ、例えば、リスプロ、アスパルトおよびグルリジンが挙げられ、これらは皮下注入後に急速に（３０分未満で）吸収され、１時間にピークがあり、比較的短い作用持続時間（３〜４時間）を有する。加えて、２つの長時間作用型インスリンアナログ：グラルギンおよびデテミルが開発され、これらは本発明と関連して用いることができる。長時間作用型インスリンアナログは、約２時間の作用発現を有し、４〜６時間で生物学的作用のプラトーに達し、２４時間まで持続し得る。
【００４３】
したがって、一実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、リスプロ（HUMALOG（Eli Lilly）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリンリスプロは、インスリンＢ鎖の２８位のプロリンがリシンで置換されている点、および２９位のリシンがプロリンで置換されている点で、ヒトインスリンと異なる。これらの修飾は受容体結合を変更しないが、それらはインスリン二量体および六量体を不安定化するのに役立ち、活性な単量体インスリンを食前注入（preprandial injection）後により迅速に放出できるようにする。しかし、これらのインスリンを、長期安定性を提供するように二量体および多量体として溶液中に存在するよう製剤化することが、依然として必要である。したがって、一部の実施形態において、リスプロのＡ鎖配列およびＢ鎖配列を、即効作用に関して本明細書中に記載する融合タンパク質戦略と関連して使用する。他の実施形態において、リスプロは、本明細書中に記載する持続放出型インスリン融合物と共製剤化する。
【００４４】
別の実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、アスパルト（NOVOLOG（Novo Nordisk）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリンアスパルトは、ヒトインスリンＢ鎖の２８位のアミノ酸プロリンをアスパラギン酸で単一置換することにより設計されている。この修飾は、インスリン六量体の形成を妨げて、より速効型のインスリンを作製するのに役立つ。したがって、一部の実施形態において、アスパルトのＡ鎖配列およびＢ鎖配列を、即効作用に関して本明細書中に記載する融合タンパク質戦略と関連して使用する。他の実施形態において、アスパルトは、本明細書中に記載する持続放出型インスリン融合物と共製剤化する。
【００４５】
さらに別の実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、グルリジン（APIDRA（Sanofi-Aventis）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリングルリジンは、ヒトインスリンＢ鎖の３位のアスパラギンの、リシンによる置換および２９位のリシンの、グルタミンによる置換によって作製される短時間作用型アナログである。インスリングルリジンは、ヒトレギュラーインスリンと比較してより即効性の作用およびより短い作用持続時間を有する。したがって、一部の実施形態において、グルリジンのＡ鎖配列およびＢ鎖配列を、本明細書中に記載する融合タンパク質戦略と関連して使用する。他の実施形態において、グルリジンは、本明細書中に記載する持続放出型インスリン融合物と共製剤化する。
【００４６】
別の実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、グラルギン（LANTUS（Sanofi-Aventis）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。ＬＡＮＴＵＳは、中性の生理的ｐＨの存在下でインスリン結晶の微小析出物の形成を引き起こすその酸性ｐＨにより、遅延吸収を有する。インスリングラルギンは、Ａ鎖の２１位のアミノ酸アスパラギンがグリシンによって置き換えられ、Ｂ鎖のＣ末端に２つのアルギニンが付加されている点で、ヒトインスリンと異なる。就寝時の中間型プロタミンＨａｇｅｄｏｒｎ（NPH）インスリン（中間作用型インスリン）と比較して、インスリングラルギンは、２型糖尿病の患者における夜間低血糖とそれほど関連しない。したがって、一部の実施形態において、インスリングラルギンのＡ鎖配列およびＢ鎖配列を、持続放出に関して本明細書中に記載する融合タンパク質戦略と関連して使用する。他の実施形態において、インスリングラルギンは、本明細書中に記載する即効作用型インスリン融合物と共製剤化する。
【００４７】
さらに別の実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、デテミル（LEVEMIR（Novo Nordisk）としても知られる）からのＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリンデテミルは、可溶性（中性pHで）の長時間作用型インスリンアナログであり、Ｂ３０のアミノ酸トレオニンが除去され、１４−炭素ミリストイル脂肪酸がＬｙｓＢ２９のイプシロン−アミノ基にアセチル化されている。皮下注入後、デテミルは解離し、それによって遊離脂肪酸を暴露させ、これがアルブミン分子に対する可逆的結合を可能にする。したがって、定常状態において、遊離非結合インスリンの濃度は大幅に低下し、その結果、安定な血漿グルコースレベルが得られる。したがって、一部の実施形態において、デテミルのＡ鎖配列およびＢ鎖配列を、持続放出に関して本明細書中に記載する融合タンパク質戦略と関連して使用する。他の実施形態において、デテミルは、本明細書中に記載する即効作用型インスリン融合物と共製剤化する。
【００４８】
一部の実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、単鎖インスリンアナログ（SIA）であり得る（例えば、参照することによってそれらの全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第６，６３０，４３８号およびＷＯ２００８／０１９３６８に記載されている通り）。単鎖インスリンアナログは、Ａ鎖およびＢ鎖がポリペプチドリンカーによって共有結合されている、１群の構造的に関連したタンパク質を包含する。ポリペプチドリンカーは、Ｂ鎖のＣ末端をＡ鎖のＮ末端に接続する。ＳＩＡがグルコース取り込みおよびインスリン受容体結合効果を有するのに必要な構造のコンフォメーションをリンカーが提供するならば、リンカーは任意の長さを有することができる。一部の実施形態において、リンカーは約５〜１８アミノ酸長である。他の実施形態において、リンカーは約９〜１５アミノ酸長である。特定の実施形態において、リンカーは約１２アミノ酸長である。特定の例示的実施形態において、リンカーは、配列ＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲ（配列番号２６）またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２７）を有する。しかし、グルコースの取り込みおよびインスリン受容体の結合活性における産生ＳＩＡの有効性を実質的に損なうことなく、この配列の多くの変異、例えば、アミノ酸の長さの変異（付加および欠失の両方）および置換が可能であることを理解すべきである。例えば、産生ＳＩＡの活性を実質的に減少させることなく、いくつかの異なるアミノ酸残基を、付加するまたはいずれかの末端から除去することができる。
【００４９】
現在臨床開発中の例示的単鎖インスリンアナログは、アルブリン（albulin）である（Duttaroyら、2005、Diabetes 54: 251〜8）。アルブリンは、酵母または哺乳類細胞中で産生させることができる。これは、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖（天然のヒトインスリンとの同一性１００％）がドデカペプチドリンカーによって連結されかつ天然のヒト血清アルブミンのＮＨ２末端に融合されたものからなる。アルブリンの発現および精製のために、４つの重複プライマーおよびＰＣＲ増幅を使用して、ドデカペプチドリンカーによって連結された成熟ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖を含有する単鎖インスリンをコードする合成遺伝子が構築された。得られたＰＣＲ産物を、酵母での発現のために、ｐＳＡＣ３５ベクター内に含有されるヒト血清アルブミン（HSA）のシグナルペプチドと成熟ＨＳＡのＮＨ２末端との間でインフレームライゲーションした。本発明に従って、アブリン（abulin）のＨＳＡ成分を、本明細書中で記載される持続放出を提供するアミノ酸配列と置き換えることができる。
【００５０】
したがって、一態様において、本発明は、例えば、エラスチン様ペプチド（ELP）を含む、改善された治療特性（例えば、持続放出または多量体形成の低減）を提供するアミノ酸配列と、インスリンアミノ酸配列とを含む医薬組成物を提供する。例えば、特定の実施形態において、インスリンは、哺乳類インスリン、例えば、ヒトインスリンまたはブタインスリンである。本発明に従って、持続放出を提供するまたは多量体形成を消失させるアミノ酸配列を、インスリンＡ鎖もしくはＢ鎖または両方と（例えば、組換え融合もしくは化学的コンジュゲーションによって）カップリングさせることができる。一部の実施形態において、注入部位からの緩徐な吸収を提供するアミノ酸配列を、インスリンＡ鎖と共有結合させる。インスリンは、プロインスリンであって鎖Ａ、ＢおよびＣのそれぞれを含み得るか、または鎖ＡおよびＢのみを含有する、プロセシングされた形態を含み得る。一部の実施形態において、鎖ＡおよびＢを、短い連結ペプチドによって接続して、単鎖インスリンを作製する。インスリンは、Ｎ末端および／またはＣ末端（鎖AおよびBのいずれかまたは両方の）に１〜１０個のアミノ酸、例えば、１、２、３または約５個のアミノ酸がトランケートされたまたは伸長された機能的フラグメントを含むヒトインスリンの機能的アナログであり得る。機能的アナログは、天然配列（例えば、配列番号２４および２５）に対して１〜１０個のアミノ酸挿入、欠失および／または置換（合計で）を含有することができ、いずれの場合にもペプチドの活性を保持する。例えば、インスリンＢ鎖の３位、２８位、２９位および３０位ならびにＡ鎖の２１位を、例えば、Ｋ３、Ｇ２１、Ｋ２８、Ｄ２８、Ｐ２９、Ｑ２９で置換することができる。一部の実施形態において、１〜５個のアミノ酸を、Ｂ鎖のＣ末端に付加するか、またはＢ鎖のＴ３０を除去することができる。このような変更は、任意選択により、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミルの配列に相当し得る。したがって、機能的アナログは、天然配列（鎖AおよびB、または鎖A、BおよびCを含有し得る）に対して１、２、３、４または５個のアミノ酸挿入、欠失および／または置換（合計で）を有することができ、一部の実施形態では、さらなる即効作用または遅延作用を支持し得る。このような活性は、本明細書中に記載するものを含む任意の利用可能なアッセイを使用して、確認またはアッセイすることができる。これらまたは他の実施形態において、インスリン鎖は、鎖ＡおよびＢの天然配列（配列番号２４および２５）のそれぞれと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。２つの配列間（例えば、天然配列と機能的アナログとの間）の配列同一性の決定は、Ｔａｔｕｓｏｖａら、Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：２４７〜２５０（１９９９）を含む、任意のアラインメントツールを使用して達成することができる。インスリン成分は、当技術分野で公知のさらなる化学修飾を含有し得��。
【００５１】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載する即効作用型および遅延作用型のインスリン療法の任意の組合せを含む、基礎インスリンと食前インスリンの併用療法であって、少なくとも１つのこのような作用剤が、多量体形成の消失または持続放出を提供する融合パートナーを有する、併用療法を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１種の作用剤は、インスリングラルギン、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギン、デテミル、単鎖インスリンアナログ（SIA）およびアルブリンである。
【００５２】
インスリンアナログまたは持続放出を提供するアミノ酸配列を含有するインスリンアナログのインビトロ結合特性を特性決定するために、インスリン受容体を発現する様々な細胞株で、競合結合アッセイを行うことができる（Jehleら、1996、Diabetologia 39: 421〜432）。例えば、ヒトインスリン受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞を使用する競合結合アッセイを、用いることができる。インスリンはまた、ＩＧＦ−１受容体と、インスリン受容体よりも低い親和性で結合することができる。持続放出を提供するアミノ酸配列を含有するインスリンアナログの結合親和性を決定するために、Ｌ６細胞で１２５Ｉ−標識ＩＧＦ−１を使用して競合結合アッセイを行うことができる。
【００５３】
インスリンの活性は、末梢グルコース処理の刺激および肝臓グルコース産生の阻害を含む。持続放出を提供するアミノ酸配列を含有するインスリンアナログがこれらの生物活性を媒介する能力は、公知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、持続放出を提供するアミノ酸配列を含有するアナログの、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みに対する効果を測定して、インスリンの効果と比較することができる。生物学的に活性なアナログでの細胞の前処理は一般に、２−デオキシグルコースの取り込みの用量依存的な増加をもたらす。持続放出を提供するアミノ酸配列を含有するインスリンアナログがグルコース産生を調整する能力は、任意の数の細胞型、例えば、Ｈ４ＩＩｅヘパトーマ細胞中で測定することができる。このアッセイにおいて、生物学的に活性なアナログでの前処理は一般に、グルコースの放出量の用量依存的な阻害をもたらす。
【００５４】
持続放出および／または多量体形成の消失を提供するアミノ酸配列
一部の実施形態において、持続放出を提供するアミノ酸配列は、タンパク質骨格基および／または側鎖基によって水素結合を形成しかつマトリックス形成に対する疎水性相互作用に寄与し得る構造単位を含む。一部の実施形態において、アミノ酸側鎖は水素結合ドナー基を含まず、水素結合は実質的にタンパク質骨格によって形成される。例示的なアミノ酸としては、プロリン、アラニン、バリン、グリシンおよびイソロイシンならびに類似のアミノ酸が挙げられる。一部の実施形態において、構造単位は、実質的に繰り返す構造モチーフ、および実質的に繰り返す水素結合能力を作製するような実質的に繰り返す構造単位である。これらおよび他の実施形態において、アミノ酸配列は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％のプロリンを含み、これは１つのパターンで配置され得る。プロリンのパターンは、反復するβターン構造を作製するか、または規定された二次構造をほとんどまたは全く有さない（例えば、βシートまたはαヘリックスを全く有さない）伸長したコンフォメーションを形成することができる。これらの実施形態において、融合パートナーは、ランダムコイルコンフォメーションと定義する。これに関連して、プロリン残基のパターンとは、アミノ酸配列のプロリン残基の少なくとも５０％または少なくとも７５％が、規定可能な単位または一次配列の一部であることを意味する。さらに他の実施形態において、アミノ酸配列は、水素結合ドナー側鎖を有するアミノ酸、例えば、セリン、トレオニンおよび／またはチロシンを含む。一部の実施形態において、繰り返し配列は、１〜約４個のプロリン残基を含有することができ、残りの残基は、非極性残基、例えば、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから独立して選択される。非極性または疎水性残基は、マトリックスの形成に対する疎水性相互作用に寄与し得る。
【００５５】
これらの実施形態におけるアミノ酸配列は、保存温度よりも高い温度で注入すると、「ゲル様」状態を形成し得る。例示的な配列は、繰り返しペプチド単位を有し、比較的低温では比較的不定形であり得、比較的高温では水素結合した構造化状態を達成し得る。
【００５６】
一部の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、４〜１０アミノ酸の繰り返し単位を有するペプチドである。繰り返し単位は、マトリックスの形成において１、２または３個の水素結合を形成し得る。特定の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、絹、エラスチン、コラーゲンもしくはケラチンまたはそれらの模倣物のアミノ酸配列、あるいは参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許第６，３５５，７７６号において開示されているアミノ酸配列である。
【００５７】
特定の実施形態において、アミノ酸配列は、エラスチン様タンパク質（ELP）配列である。ＥＬＰ配列は、エラスチンタンパク質に関連するもしくはエラスチンタンパク質の模倣物である構造ペプチド単位もしくは配列を含むか、またはこれらからなる。ＥＬＰ配列は、３〜約２０アミノ酸、または一部の実施形態においては、４〜１０アミノ酸、例えば、４、５もしくは６アミノ酸の構造単位から構築される。個々の構造単位の長さは、異なり得るか、または均一であり得る。例示的な構造単位としては、配列番号１〜１２（下記）によって定義される単位が挙げられ、これはタンデム−繰り返し単位を含む繰り返し構造単位として用いることができる、または何らかの組合せで用いることができる。したがって、ＥＬＰは、以下で定義する配列番号１〜１２から選択される構造単位を含むことができるか、またはこれらから本質的になることができる。
【００５８】
構造単位がＥＬＰ単位である実施形態を含む一部の実施形態において、アミノ酸配列は、約５０〜約５００個の構造単位、または特定の実施形態においては約５０〜約２００個の構造単位、または特定の実施形態においては約８０〜約１８０個の構造単位もしくは約１００〜約１５０個の構造単位、例えば、配列番号１〜１２によって定義される１つの単位もしくは単位の組合せを含むか、またはこれらから本質的になる。したがって、構造単位は、合計で約５０〜約２０００個のアミノ酸残基、または約１００〜約８００個のアミノ酸残基、または約２００〜約７００個のアミノ酸残基、または約４００〜約６００個のアミノ酸残基、または約４００〜約１０００個のアミノ酸残基、または約５００〜約１０００個のアミノ酸残基、または約６００〜約１０００個のアミノ酸残基、または約７００〜約１０００個のアミノ酸残基の長さを有し得る。
【００５９】
アミノ酸配列は、選択される製剤によっては、目に見える可逆的な逆相転移を示し得る。すなわち、アミノ酸配列は、構造的に無秩序であり得、転移温度（Tt）未満で製剤中に高溶解性であり得るが、製剤の温度がＴｔを超えて上昇すると急激な（２〜３℃の範囲）無秩序から秩序への相転移を示し得る。温度に加えて、アミノ酸ポリマーの長さ、アミノ酸組成、イオン強度、ｐＨ、圧力、温度、選択される溶媒、有機溶質の存在、およびタンパク質濃度もまた、転移特性に影響を及ぼす可能性があり、これらを製剤中で、所望の吸収プロファイルに合わせて調整することができる。吸収プロファイルは、インスリンアミノ酸配列の血漿濃度または活性を経時的に判定することによって、容易に試験することができる。
【００６０】
特定の実施形態において、ＥＬＰ成分は、限定するものではないが、以下を含む構造単位から形成することができる：
（ａ）テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＧ（配列番号１）；
（ｂ）テトラペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＧ（配列番号２）；
（ｃ）ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）、またはＶＰＧＸＧ（Xは任意の天然または非天然アミノ酸残基であり、Xは任意選択により、ポリマーまたはオリゴマー繰り返し間で異なる）；
（ｄ）ペンタペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、またはＡＶＧＶＰ（配列番号４）；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＸＧ（配列番号５）（Xは任意の天然または非天然アミノ酸残基であり、Xは任意選択により、ポリマーまたはオリゴマー繰り返し間で異なる）；
（ｆ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＶＧ（配列番号６）；
（ｇ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＸＧ（配列番号７）（Xは任意の天然または非天然アミノ酸残基であり、Xは任意選択により、ポリマーまたはオリゴマー繰り返し間で異なる）；
（ｈ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＶＧ（配列番号８）；
（ｉ）ヘキサペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＶＡＰＧＶＧ（配列番号９）；
（ｊ）オクタペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号１０）；
（ｋ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＦＧＶＧＡＧ（配列番号１１）；および
（ｌ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＶＧＶＰＧＧ（配列番号１２）。
【００６１】
配列番号１〜１２によって規定されるこのような構造単位は、構造反復単位を形成することができ、または組み合わせて使用してＥＬＰを形成することができる。一部の実施形態において、ＥＬＰ成分は、配列番号１〜１２から選択される構造単位の１つまたは組合せ（例えば、２、３または４個）から全て（またはほぼ全て）形成される。他の実施形態において、ＥＬＰ成分の少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、配列番号１〜１２から選択されかつ繰り返し単位として存在し得る構造単位の１つまたは組合せから形成される。
【００６２】
特定の実施形態において、ＥＬＰは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）の、タンデム繰り返し単位を含む反復単位を含み、ここで、Ｘは前述の通りであり、全ＥＬＰ成分（ＶＰＧＸＧ（配列番号３）以外の構造単位を含み得る）に対するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）単位の百分率は、ＥＬＰの約５０％超、または約７５％超、または約８５％超、または約９５％超である。ＥＬＰは、配列番号３のモチーフを含有することができ、ゲスト残基Ｘはモチーフ中の少なくとも２個または少なくとも３個の単位間で異なり得る。ゲスト残基は、例えば、非極性または疎水性残基から、例えば、アミノ酸Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＧおよびＷから独立して選択することができる（かつ所望の逆相転移特性を保持するように選択することができる）。
【００６３】
一部の実施形態において、ＥＬＰはβターン構造を形成し得る。βターン構造の作製に好適な例示的なペプチド配列は、参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６号に記載されている。例えば、配列ＶＰＧＸＧ（配列番号３）中の第４の残基（X）は、βターンの形成を排除することなく変更することができる。
【００６４】
例示的なＥＬＰの構造は、ＥＬＰｋ［ＸｉＹｊ−ｎ］という表記を使用して記載することができ、ここで、ｋは、特定のＥＬＰ反復単位を表し、括弧内の大文字は１文字のアミノ酸コードであり、それらの対応する下付き文字は、構造単位（該当する場合）中の各ゲスト残基Ｘの相対比を表し、ｎは、ＥＬＰの全長を構造繰り返しの数で記載している。例えば、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）（Xは、約5:2:3の相対比のバリン、アラニンおよびグリシンである）の１０個の繰り返し単位を含有するＥＬＰ成分を表し；ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）（Xは、約1:2:1の相対比のリシン、バリンおよびフェニルアラニンである）の４個の繰り返し単位を含有するＥＬＰ成分を表し；ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）（Xは、約1:7:1の相対比のリシン、バリンおよびフェニルアラニンである）の９個の繰り返し単位を含有するポリペプチドを表し；ＥＬＰ１［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）（Xはバリンである）の５個の繰り返し単位を含有するポリペプチドを表し；ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）（Xはバリンである）の２０個の繰り返し単位を含有するポリペプチドを表し；ＥＬＰ２［５］は、ペンタペプチドＡＶＧＶＰ（配列番号４）の５個の繰り返し単位を含有するポリペプチドを表し；ＥＬＰ３［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＩＰＧＸＧ（配列番号５）（Xはバリンである）の５個の繰り返し単位を含有するポリペプチドを表し；ＥＬＰ４［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＬＰＧＸＧ（配列番号７）（Xはバリンである）の５個の繰り返し単位を含有するポリペプチドを表す。
【００６５】
ＥＬＰに関して、Ｔｔは、ゲスト残基の疎水性の関数である。したがって、ゲスト残基の同一性およびそれらのモル分率を変動させることによって、広範囲にわたって逆転移を示すＥＬＰを合成することができる。したがって、所与のＥＬＰ長さでのＴｔは、ＥＬＰ配列中に組み込む疎水性ゲスト残基の割合を大きくするほど、減少させることができる。好適な疎水性ゲスト残基の例としては、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。中程度の疎水性を有するチロシンも、使用することができる。逆に、グルタミン酸、システイン、リシン、アスパルテート、アラニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グリシン、アルギニンおよびグルタミンから選択されるものなどの残基を組み込むことによって、Ｔｔを増加させることができる。
【００６６】
１００，０００超の分子量を有するポリペプチドについては、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６（参照することによってその全体が本明細書中に組み込まれる）中に開示されている疎水性尺度が、特定のＥＬＰ配列のおよそのＴｔを予測する１つの手段を提供する。１００，０００未満の分子量を有するポリペプチドについては、Ｔｔは、次の二次関数：Ｔｔ＝Ｍ０＋Ｍ１Ｘ＋Ｍ２Ｘ２（式中、Xは融合タンパク質のMWであり、Ｍ０＝１１６．２１；Ｍ１＝−１．７４９９；Ｍ２＝０．０１０３４９である）によって予測または決定することができる。
【００６７】
ＥＬＰは、一部の実施形態において、製剤条件で約１０〜約３７℃、例えば、約２０〜約３７℃または約２５〜約３７℃または約３０〜約３７℃の範囲のＴｔを提供するように、選択または設計する。一部の実施形態において、生理的条件（例えば、０．９％生理食塩水）における転移温度は、わずかに低い末梢温度を考慮すると、約３２〜３６℃（または約３５〜３６℃もしくは３５〜３６℃の範囲）である。
【００６８】
一部の実施形態において、水素結合能力を有するアミノ酸配列は、十分に短くかつ／またはそれほど疎水性でないので、インスリンの多量体形成を効果的に回避するが、持続放出機能を誘導しない。例えば、ＥＬＰ融合物を用いる場合、「速効型」インスリンは、約５〜約５０ＥＬＰ単位、例えば、約１０〜約３０ＥＬＰ単位、例えば、約１０、約１５、約２０もしくは約２５ＥＬＰ単位または約３０ＥＬＰ単位を含有し得る。
【００６９】
種々の実施形態において、速効作用を提供する融合パートナーは、５から２００個のアミノ酸、例えば、約５０〜約１５０個のアミノ酸を有することによって、インスリン多量体（例えば、六量体）形成を阻害することができる。一部の実施形態において、融合パートナーは、アミノ酸配列中のプロリン残基のパターンに起因し得る、ランダムコイルまたは繰り返しβターンのコンフォメーションを形成し得る、伸長したコンフォメーションを有する。一部の実施形態において、融合パートナーの配列は、約３５％未満、または約３０％未満、または約２５％未満、または約２０％未満の疎水性残基を含有する（疎水性残基としてはアラニン、グリシンおよびプロリンを除外する）。例えば、これに関連する疎水性残基には、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジンが含まれる。六量体形成を低減または排除する配列は、注入部位からの持続放出を誘導するべきでなく、または体温以下において逆相転移を示すべきでない。この配列は、生理的に適合性の溶液中でインスリンを単量体または実質的に単量体の形態で安定化すべきである。
【００７０】
一部の実施形態において、即効作用を提供する融合物は、融合パートナーの負電荷を増加させかつ融合パートナーの疎水性を低減するために、１〜約１０個の負電荷アミノ酸、例えば、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸などを含有する。このような残基は、一部の実施形態において、ＥＬＰ構造単位の間に挿入され得る。一部の実施形態において、ＥＬＰは、約１０〜約２５個のＥＬＰ単位（例えば、配列番号１〜１２）、例えば、ＶＰＧＸＧ単位（配列番号３）（XはV、GおよびAから独立して選択され、GおよびAは、ほぼ等しい量でゲスト残基として存在し（約１または２個）、Vは、GまたはAの約２〜約３倍で存在する）から構成される。あるいは、ＥＬＰ単位は、ＡＶＧＶＰ（配列番号４）である。例えば、即効作用型インスリンのための例示的な融合パートナーは、配列番号１６（図１８）または配列番号１７（図２０）によって例示される。他の実施形態において、ＥＬＰは、約１０〜約２５個のＶＰＧＸＧ単位（配列番号３）（XはV、GおよびAから独立して選択され、GおよびAは、ほぼ等しい量でゲスト残基として存在し（約１または２個）、Vは、GまたはAの約1/2〜約1/3で存在する）から構成される。例えば、即効作用型インスリンのための例示的な融合タンパク質は、配列番号１８（図２２）または配列番号１９（図２４）または配列番号２１（図２８）または配列番号２２（図３０）によって例示される。他の実施形態において、ＥＬＰは、上記のように約１０〜約２５個のＶＰＧＸＧ単位（配列番号３）から構成され、正電荷残基が一部のＥＬＰ単位の間に、例えば、約２〜約６カ所の場所（例えば、約３、４または５カ所の場所）に挿入される。これらの実施形態による例示的な融合パートナーは、図２６に示される（配列番号２０）。あるいは、正電荷残基を、ＥＬＰ単位内にゲスト残基として配置し、ＥＬＰ単位中の別の位置に挿入することができる。
【００７１】
一部の実施形態において、持続放出および即効作用を提供する融合タンパク質は、「ブレークアウェイ」融合物として一緒に生成され、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）の作用によるプロセシングの間に放出される。このような設計は、図３３に示される（配列番号２３）。このような実施形態において、即効作用型インスリンおよび持続作用型インスリンの１：１の共製剤（または他の規定されたモル比）は、簡便に調製できる。種々の実施形態において、ブレークアウェイ構築物は、１〜５個（例えば、１または２個）の即効型インスリン単位を１〜５個（例えば、１または２個）の持続放出型インスリン単位と共に含み、単位はそれぞれ、プロテアーゼ切断部位によって接続されている。
【００７２】
例示的な実施形態において、水素結合したマトリックスを体温で形成する（例えば、持続放出をもたらす）ことができるアミノ酸配列は、［ＶＰＧＸＧ］９０（配列番号２８）（各XはV、GおよびAから選択され、V:G:Aの比は約5:3:2であり得る）を含む。例えば、水素結合したマトリックスを体温で形成することができるアミノ酸配列は、［ＶＰＧＸＧ］１２０（配列番号２９）（各XはV、GおよびAから選択され、V:G:Aの比は約5:3:2であり得る）を含み得る。このＥＬＰの１２０個の構造単位は、約５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質で約３７℃の転移温度を提供することができる。約４０〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度において、相転移温度は摂氏約３３度、または約３４度、または約３５度、または約３６度（体温より少しだけ低い）であり、これにより末梢体温を３７℃よりも少しだけ低くすることができる。
【００７３】
あるいは、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、［ＶＰＧＶＧ］９０（配列番号２８）、または［ＶＰＧＶＧ］１２０（配列番号２９）を含む。本明細書中で示されるように、このＥＬＰの１２０個の構造単位は、約０．００５〜約０．０５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質で約３７℃の転移温度を提供することができる。
【００７４】
エラスチン様−ペプチド（ELP）タンパク質ポリマーおよび組換え型融合タンパク質は、参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許公開第２０１０／００２２４５５号中に記載されているようにして調製することができる。
【００７５】
他の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、ランダムコイルまたは非球状の伸長した構造を含み得る。例えば、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、それぞれ参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許公開第２００８／０２８６８０８号、ＷＩＰＯ特許公開第２００８／１５５１３４号、および米国特許公開第２０１１／０１２３４８７号中に開示されているアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、主に、プロリンとセリン、アラニンおよびグリシン残基のうちの１つまたは複数とから構成され得る。一部の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、プロリン、セリン、アラニンおよびグリシン残基（合計）が、５０％、または６０％、または７０％、または７５％、または８０％、または９０％である。
【００７６】
例えば、一部の実施形態において、アミノ酸配列は、少なくとも４０アミノ酸の不定形組換え型ポリマーを含む。例えば、不定形ポリマーは、不定形ポリマー中に含有されるグリシン（G）、アスパルテート（D）、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、グルタメート（E）およびプロリン（P）残基の合計が総アミノ酸の約８０％超を構成する場合と定義することができる。一部の実施形態において、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される場合、少なくとも５０％のアミノ酸が二次構造を欠いている。
不定形のポリマーは、約１００、１５０、２００個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、ランダムコイルドメインを形成する。特に、「ランダムコイルコンフォメーション」を有するかまたは形成するポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーは、規定された二次および三次構造を実質的に欠いている。
【００７７】
種々の実施形態において、意図する対象はヒトであり、体温は約３７℃であり、したがって、医薬組成物は、この温度で持続放出を提供するように設計する。水素結合および／または疎水性相互作用の逆転を伴う、循環中への徐放は、体温が一定のままであっても、注入部位において生成物が拡散するにつれて濃度が降下することによって、駆動される。他の実施形態において、対象は非ヒト哺乳類であり、医薬組成物は、哺乳類の体温で持続放出を示すように設計される。この体温は、一部の実施形態において、例えば、特定の飼い慣らされたペット（例えば、イヌまたはネコ）または家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジまたはブタ）については、約３０〜約４０℃であり得る。一般に、Ｔｔは、医薬組成物が注入用溶液中に残存するように、製剤の保存条件（１０〜約２５℃または１５〜２２℃であり得る）よりも高い。
【００７８】
一部の実施形態において、徐放は、本発明の医薬組成物の低温製剤（例えば、２〜１５℃、または２〜１０℃、または２〜５℃）を投与することによって影響される。したがって、一部の実施形態において、低温製剤を提供する。低温製剤は、約２〜約３℃、約２〜約４℃、約２〜約５℃、約２〜約６℃、約２〜約７℃、約２〜約８℃、約２〜約１０℃、約２〜約１２℃、約２〜約１４℃、約２〜約１５℃、約２〜約１６℃、約２〜約２０℃、約１０〜約２５℃、または１５〜２２℃で投与することができる。
【００７９】
持続放出プロファイル
一態様において、本発明は、持続放出型（例えば、長時間作用型）医薬製剤を提供する。この製剤は、全身投与用の医薬組成物であって、本明細書中に記載するように、インスリンアミノ酸配列と、対象の体温で可逆性マトリックスを形成することができるアミノ酸配列（すなわち、持続放出を提供するアミノ酸配列）とを含む、医薬組成物である。可逆性マトリックスは、水素結合（例えば、分子内および／または分子間水素結合）および疎水性寄与により形成される。この製剤は、投与時にマトリックスの形成を誘導する１種または複数の医薬として許容される賦形剤および／または希釈剤をさらに含む。マトリックスは、注入部位から循環への緩徐な吸収を提供する。注入部位からの持続放出または緩徐な吸収は、濃度が注入部位で散逸するにつれてマトリックスが緩徐に逆転することによる。生成物が循環中に移動すると、製剤は長い半減期および改善された安定性を与える。したがって、緩徐な吸収と長い半減期との独特の組合せが達成され、浅いピーク対トラフ比および／または長いＴｍａｘを有する望ましいＰＫプロファイルが得られる。
【００８０】
具体的には、本発明は、低いピーク対トラフ比および／または長いＴｍａｘを有する比較的フラットなＰＫプロファイルを含む、基礎インスリンの改善された薬物動態を提供する。ＰＫプロファイルは、比較的低頻度の投与スケジュールで、例えば、一部の実施形態においては１カ月につき１〜８回の注入で維持することができる。一部の実施形態において、基礎インスリンは、１週間に１回または１日１回の注入に好適なＰＫプロファイルを有し、毎日型では、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間または約２４時間にわたって、および毎週型では、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間または約７日間にわたって、かなりの生物学的作用を提供する。
【００８１】
一態様において、本発明は、持続放出型医薬製剤を提供する。この製剤は、全身投与用の医薬組成物であって、インスリンアミノ酸配列と、対象の体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列とを含む、医薬組成物を含む。可逆性マトリックスは、水素結合（例えば、分子内および／または分子間水素結合）および疎水性寄与により形成される。この製剤は、投与時にマトリックスの形成を誘導する１種または複数の医薬として許容される賦形剤および／または希釈剤をさらに含む。マトリックスは、注入部位から循環への緩徐な吸収を提供し、理論によって拘束されるものではないが、この緩徐な吸収は、タンパク質濃度が注入部位で減少するにつれてマトリックスが緩徐に逆転することによる。緩徐な吸収プロファイルは、フラットなＰＫプロファイル、および簡便で快適な投与レジメンを提供する。例えば、種々の実施形態において、毎日または毎週の持続放出型生成物では、数日間にわたる（例えば、２〜約６０日間または約４〜約３０日間にわたる）インスリンアミノ酸配列の血漿濃度は、１０倍を超えては、または約５倍を超えては、または約４倍を超えては、または約３倍は変化しない。一般に、このフラットなＰＫプロファイルが、製剤の複数回の（実質的に等間隔の）投与にわたって、例えば、少なくとも２回、少なくとも約５回、または少なくとも約１０回の投与にわたって認められる。一部の実施形態において、緩徐な吸収は、約１時間超、約２時間超、約５時間超または約１０時間超のＴｍａｘ（最大血漿濃度になるまでの時間）によって示される。
【００８２】
注入部位からの持続放出または緩徐な吸収は、水素結合したマトリックスを対象の体温で形成することができるアミノ酸配列、および製剤の成分によってコントロールされる。
【００８３】
製剤は、投与時にマトリックスの形成を誘導する１種または複数の医薬として許容される賦形剤および／または希釈剤を含む。例えば、このような賦形剤は、塩、および水素結合を安定化させるように作用し得る他の賦形剤を含む。例示的な塩としては、ナトリウム、カリウムおよびカルシウムなどのアルカリ土類金属の塩が挙げられる。対イオンとしては、塩化物イオンおよびリン酸イオンが挙げられる。例示的な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよびリン酸カリウムが挙げられる。
【００８４】
製剤中のタンパク質濃度は、賦形剤と共に、投与温度においてマトリックスの形成を駆動するように合わせて調整する。例えば、タンパク質濃度が高いほどマトリックスの形成の駆動に役立ち、この目的のために必要なタンパク質濃度は、使用するＥＬＰシリーズによって異なる。例えば、ＥＬＰ１−１２０、または同等の転移温度を有するアミノ酸配列を使用する実施形態において、タンパク質は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲で存在するか、または約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。例示的実施形態において、本発明は、治療剤を含む持続放出型医薬製剤であって、治療剤（例えば、ペプチドまたはタンパク質治療剤）が、インスリンアミノ酸配列と［ＶＰＧＸＧ］９０（配列番号２８）、または［ＶＰＧＸＧ］１２０（配列番号２９）（各XはV、GおよびAから選択され、Ｖ、ＧおよびＡは、約５：３：２の比に存在し得る）を含むアミノ酸配列とを含む、持続放出型医薬製剤を提供する。
【００８５】
医薬組成物は、体温（例えば、３７℃、またはいくつかの実施形態においては３２〜３６℃）でマトリックスの形成を駆動するのに十分なｐＨ、イオン強度において、一般にはその駆動に十分な賦形剤を用いて、製剤化する。医薬組成物は一般に、保存条件でマトリックスを形成しないように調製する。保存条件は一般に、製剤の転移温度未満、例えば、約３２℃未満、または約３０℃未満、または約２７℃未満、または約２５℃未満、または約２０℃未満、または約１５℃未満である。例えば、製剤は、血液と等張であるか、または生理的条件を模倣するイオン強度を有することができる。例えば、製剤は、イオン強度が、少なくとも２５ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度、または少なくとも３０ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度、または少なくとも４０ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度、または少なくとも５０ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度、または少なくとも７５ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度、または少なくとも１００ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度、または少なくとも１５０ｍＭ塩化ナトリウムのイオン強度であることができる。特定の実施形態において、製剤は、約０．９％生理食塩水より低いイオン強度を有する。一部の実施形態において、製剤は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウムおよび二塩基性リン酸ナトリウムのうちの２種以上を含む。特定の実施形態において、製剤は、約５０ｍＭヒスチジン、または約４０ｍＭヒスチジン、または約３０ｍＭヒスチジン、または約２５ｍＭヒスチジン、または約２０ｍＭヒスチジン、または約１５ｍＭヒスチジンを含み得る。液体製剤は、約１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび約２０ｍＭヒスチジンを含むことができ、冷蔵保存するかまたは室温で保存することができる。塩濃度を調整して、注入部位において等張性を提供することができる。
【００８６】
製剤は、１週間につき１回、１週間につき２回もしくは１カ月につき１〜８回投与するために前もって１回分が計量された（pre-dosed）ペンもしくは注入器の形態でパッケージすることができ、または従来のバイアルなどに充填することができる。
【００８７】
例えば、所望の安定性を達成するための他の製剤成分も、用いることができる。このような成分としては、１種または複数のアミノ酸または糖アルコール（例えば、マンニトール）、保存剤および緩衝剤が挙げられ、このような構成要素は、当技術分野で周知である。
【００８８】
一部の実施形態において、製剤は、１日に約１回投与し、皮下または筋肉内に投与できる。
【００８９】
即効性プロファイル
一態様において、本発明は、即効作用型インスリン製剤を提供する。この製剤は、全身投与用の医薬組成物であって、インスリンアミノ酸配列と、記載したようなインスリン多量体形成を阻害することができるアミノ酸配列とを含む、医薬組成物を含む。単量体状態は、製剤中で安定化され、即効性のインスリン作用を可能にし、食事インスリンを提供するのに好適である。
【００９０】
具体的には、即効性インスリンは、グルコース低下効果を１時間以内に示し、種々の実施形態においては、約３０分以内に、または約１５分以内に、または約１０分以内に、または約５分以内に示す。最大の効果は、約１時間で、一部の実施形態においては約３０分で示される。この効果は、約６時間を超えて、または約５時間を超えて、または約４時間を超えて実質的に持続することはなく、それによって、作用剤および製剤は食事インスリンを提供するのに好適となり、持続性（例えば、基礎）インスリン産物を補完する。
【００９１】
この製剤は１種または複数の医薬として許容される賦形剤および／または希釈剤を含み、それらは、即効性インスリンの単量体状態を安定化し、一部の実施形態においては、持続作用型インスリンのインビボ相転移を可能にするのと同じ条件であり、それによって実用的な共製剤を可能にする。例えば、このような賦形剤としては、ナトリウム、カリウムおよびカルシウムなどのアルカリ土類金属の塩が挙げられる。対イオンとしては、塩化物イオンおよびリン酸イオンが挙げられる。例示的な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよびリン酸カリウムが挙げられる。
【００９２】
製剤中のタンパク質濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬであることができ、または約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲で存在し得る。例示的な即効性インスリン構築物としては、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２、または同じもしくは同様な分子量（例えば、約１０％以内）を有する同様な構築物が挙げられる。一部の実施形態において、製剤は、モル比１：１の基礎および即効型インスリンを含む。
【００９３】
製剤は、１日１回、２回または３回投与するために、前もって１回分が計量されるペンもしくは注入器の形態でまたは従来のバイアルにパッケージすることができる。
【００９４】
例えば、所望の安定性を達成するための他の製剤成分も、用いることができる。このような成分としては、１種または複数のアミノ酸または糖アルコール（例えば、マンニトール）、保存剤および緩衝剤が挙げられ、このような構成要素は、当技術分野で周知である。
【００９５】
コンジュゲーションおよびカップリング
本発明の特定の実施形態に従って組換えで生成した融合タンパク質は、遺伝子融合によって互いに関連した、持続放出または多量体形成の低減を提供するアミノ酸配列（例えば、ELP）と、インスリンアミノ酸配列とを含む。例えば、融合タンパク質は、持続放出成分を提供するアミノ酸配列と共にインフレームクローニングされるインスリンアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの翻訳によって生成され得る。
【００９６】
特定の実施形態において、融合パートナーのアミノ酸配列とインスリンアミノ酸配列とを、種々の長さのリンカーペプチドを使用して融合させて、より大きい物理的分離を提供しかつ融合タンパク質間のより大きい空間移動性を可能にし、したがって、インスリンアミノ酸配列がその受容体と結合するための接近容易性を最大化することができる。リンカーペプチドは、可動性のまたはより強固なアミノ酸からなることができる。例えば、可動性リンカーは、比較的小さい側鎖を有し、親水性であることができるアミノ酸を含み得る。限定するものではないが、可動性リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を含み得る。より強固なリンカーは、例えば、より大きい立体障害を与えるアミノ酸側鎖、例えば（限定するものではないが）チロシンまたはヒスチジンを含有し得る。リンカーは、アミノ酸残基が約５０、４０、３０、２０、１０または５個未満であり得る。リンカーは、例えば、組換え融合によって、インスリンアミノ酸配列および持続放出成分を提供するアミノ酸配列に、ならびにそれらの間に共有結合させることができる。
【００９７】
リンカーまたはペプチドスペーサーは、プロテアーゼで切断可能なもの、または切断可能でないものであり得る。一例として、切断可能なペプチドスペーサーとしては、限定するものではないが、様々な型のプロテアーゼ（インビトロまたはインビボ）、例えば、Ｔｅｖ、トロンビン、第Ｘａ因子、プラスミン（血液プロテアーゼ）、メタロプロテアーゼ、カテプシン、および他の身体区画（corporeal compartment）で見られるプロテアーゼが挙げられる。切断可能なリンカーを用いる一部の実施形態において、融合タンパク質は、融合物として不活性である、それほど活性がない、またはそれほど強力でなく、その後に、インビボでスペーサーの切断時に活性化される。別法として、インスリンアミノ酸配列が融合物として十分に活性である場合には、切断可能でないスペーサーを用いることができる。切断可能でないスペーサーは、任意の好適な型のものであることができる。
【００９８】
他の実施形態において、本発明は、インスリンアミノ酸配列と、持続放出性の、低下した多量体機能を提供するアミノ酸配列との化学的コンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、持続放出成分を提供するアミノ酸配列を、インスリンアミノ酸配列に化学的にカップリングさせることによって、または所望の配列の固相合成によって、当技術分野において公知の任意の数の方法によって作製することができる（例えば、Nilssonら、2005、Ann Rev Biophys Bio Structure 34: 91〜118を参照）。一部の実施形態において、化学的コンジュゲートは、直接的に、または短いもしくは長いリンカー部分を介して、治療用タンパク質成分上の１つもしくは複数の官能基、例えば、アミン、カルボキシル、フェニル、チオールもしくはヒドロキシル基を介して、持続放出成分を提供するアミノ酸配列にインスリンアミノ酸配列を共有結合させて、共有結合性コンジュゲート（covalent conjugate）を形成することによって、形成できる。種々の従来のリンカー、例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、カルボジイミド、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどを使用できる。
【００９９】
加えて、非ペプチド化学的スペーサーは、任意の好適な型のもの、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Greg T. Hermanson、Academic Press, Inc.発行、1995）に記載されている官能性リンカー、およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．（Rockford、Illinois）から入手可能なＣｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋにおいて指定されているもの（これらの開示は、参照することによってそれらの全体がそれぞれ組み込まれる）などであることができる。例示的な化学的スペーサーとしては、Ｌｙｓのアミン基に結合できるホモ二官能性リンカー、ならびに一方の末端でＣｙｓにおよび他方の末端でＬｙｓに結合できるヘテロ二官能性リンカーが挙げられる。
【０１００】
特定の実施形態において、室温（またはヒト体温、例えば、Tt＞３７℃）で転移しない、比較的小さいＥＬＰ成分（例えば、約３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａまたは１０ｋＤａ未満のELP成分）を、化学的にカップリングまたは架橋させる。例えば、同一のまたは異なる特性を有する、２つの比較的小さいＥＬＰ成分を化学的にカップリングさせることができる。一部の実施形態において、このようなカップリングは、インビボで、ＥＬＰのＣ末端またはその近くにおける単一のシステイン残基の付加によって起こり得る。このようなＥＬＰ成分をそれぞれ、１つまたは複数のインスリンアミノ酸配列と融合させて、標的における活性またはアビディティーを増加させることができる。
【０１０１】
疾患を治療する方法
種々の実施形態において、治療は、持続性血糖コントロールを提供する。血糖コントロールは、真性糖尿病を有するヒトにおいて血糖（グルコース）の典型的なレベルに関連する。微小血管合併症を含む、糖尿病の長期的合併症の多くは、長年にわたる高血糖に起因する。良好な血糖コントロールが、糖尿病ケアの重要な目標である。血糖レベルは一日を通じて変動し、グルコースの記録はこれらの変化の不完全な指標であるので、グリコシル化されたヘモグロビンの百分率が、糖尿病を有するヒトの臨床試験（research trial）および臨床ケアにおける、長期的な血糖コントロールの代用尺度として使用される。この試験において、ヘモグロビンＡ１ｃまたは糖化ヘモグロビン（HbA1c）は、直前の２〜３カ月にわたる平均グルコース値を反映する。
【０１０２】
正常なグルコース代謝を有する、糖尿病にかかっていないヒトでは、糖化ヘモグロビンレベルは、通常、最も一般的な方法によって約４〜６％である（正常範囲は方法によって異なり得る）。「完全な血糖コントロール」とは、グルコースレベルが常に正常（例えば、約７０〜１３０ｍｇ／ｄｌまたは約３．９〜７．２ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、糖尿病を有さないヒトと区別できないことを示す。実際は、治療尺度が不完全であるため、「良好な血糖コントロール」であっても、たいていの場合には平均して正常より若干高い血中グルコースレベルを表す。「良好な血糖コントロール」と考えられるものは、年齢および低血糖に対する患者の感受性によって異なることに注意する。米国糖尿病協会（American Diabetes Association）は、患者および医師に対して、２００ｍｇ／ｄｌ（１１ｍｍｏｌ／ｌ）未満および８％未満の平均グルコースおよびヘモグロビンＡ１ｃ値を目指すよう提言した。「不良な血糖コントロール」とは、持続的に高い血中グルコースレベルおよびグリコシル化ヘモグロビンレベルを指し、これらのレベルは、例えば、重症合併症が起こる前の数カ月および数年にわたって約２００〜５００ｍｇ／ｄｌ（約１１〜２８ｍｍｏｌ／Ｌ）および約９〜１５％またはそれ以上の範囲であり得る。
【０１０３】
種々の実施形態において、本明細書中に記載する本発明の医薬組成物は、病態、例えば、糖尿病もしくは高血糖、または症状に対抗するもしくは症状を軽減するためにインスリン投与が適応となる任意の他の状態、および種々の代謝障害を含むそれらの状態の合併症を有する患者の管理およびケアに使用される。治療は、症状もしくは合併症の発症を予防し、症状もしくは合併症を軽減し、または疾患、状態もしくは障害を排除するための、本発明の作用剤、組成物または製剤の投与を含む。本方法は、１型糖尿病、すなわち、体がインスリンを生成せず、したがって、血液中の糖の量をコントロールすることができない状態、および２型糖尿病、すなわち、体がインスリンを正常に使用せず、したがって、血液中の糖の量をコントロールすることができない状態の治療を含む。一部の実施形態において、患者は、心血管系の合併症を含む、糖尿病の１つもしくは複数の合併症を有し、あるいは一部の実施形態において、患者は、代謝疾患を有し、かつ／または臨床的に肥満であるかもしくは過体重であると特徴付けられる。一部の実施形態において、患者は、（治療レジメンの開始時に）約１２％を超える、約１０％を超える、約９％を超える、または約８．５％を超える、または約８％を超える、または約７．５％を超える、または約７．０％を超える、または約６．５％を超えるＨｂＡ１ｃを有する。
【０１０４】
一部の実施形態において、活性作用剤は、ＩＧＦ受容体との相互作用がごくわずかであるかまたは低減されているので、本明細書中に記載する活性作用剤は、複数年（例えば、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約５年、少なくとも約１０年またはそれ以上）にわたる治療を含む長期療法に特に適している。
【０１０５】
一部の実施形態において、本発明は、基礎インスリンおよび食事インスリンの併用療法を施す方法であって、基礎インスリンおよび食事インスリンを別個にまたは一緒に投与することができる、方法を提供する。例えば、一部の実施形態において、患者は、即効型および／または長時間作用型インスリンのレジメンを受け、少なくとも１種のこのような作用剤は、多量体形成の消失または持続放出を提供する融合パートナーを有する。一部の実施形態において、多量体形成を低減する速効型インスリンは、インスリングラルギンまたはデテミルとの併用療法として提供する。すなわち、患者がインスリングラルギンまたはデテミルによる基礎インスリン治療法を受けている場合に、速効型インスリン融合物を、記載通りに患者に投与する。他の実施形態において、持続放出を提供する長時間作用型インスリンは、リスプロ、アスパルトまたはグルリジンのうちの１種または複数との併用療法として提供する。すなわち、患者がインスリンリスプロ、アスパルトまたはグルリジンによる食事インスリン療法を受けている場合に、長時間作用型インスリン融合物を、記載通りに患者に投与する。
【０１０６】
種々の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載する医薬組成物と、疾患、例えば、前述のような疾患の治療に有効な他の作用剤とを含む、併用療法および／または共製剤を提供する。
【０１０７】
一部の実施形態において、本発明は、（持続放出型インスリンまたは食事インスリンと）グルカゴン様受容体（GLP）−１受容体アゴニスト、例えば、ＧＬＰ−１（配列番号３０）、エキセンディン−４（配列番号３１）、または参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許第８，１７８，４９５号に開示されているそれらの機能的アナログおよび／もしくはそれらの誘導体との組合せまたは共製剤を提供する。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１（Ａ−Ｂ）（Aは1〜7の整数であり、Bは38〜45の整数である）である。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１（７−３６）もしくはその機能的アナログまたはＧＬＰ−１（７−３７）もしくはその機能的アナログである。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、持続放出も可能にする、例えば、参照することによって本明細書中に組み込まれるＵＳ２０１３／００９０２８５に開示されたＰＫプロファイルを有する融合パートナーを含む。したがって、ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、配列番号３２の配列を有し得る。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト融合パートナーは、ゲスト残基が５：２：３の近似比のバリン、アラニンおよびグリシンであるＥＬＰ１−１２０である。図３７〜４１に示すように、このような共製剤は、相乗効果を提供し、両方の作用剤をより低用量で投与することを可能にし得る。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、ＧＬＰ−２、ＧＩＰ、グルカゴンおよびオキシントモジュリンまたはそれらの機能的アナログおよび／もしくはその誘導体との組合せまたは共製剤を提供する。機能的アナログは、天然配列に対して１から１０個のアミノ酸挿入、欠失および／または置換（合計で）を含有し得る。
【０１０９】
種々の実施形態において、併用療法および／または共製剤は、２種以上の融合タンパク質を、例えば、ＥＬＰまたは本明細書中に記載するマトリックス形成成分と共に含む。一部の実施形態において、ＥＬＰは、少なくとも６０単位、または９０単位、または１２０単位、または１８０単位のＶＰＧＸＧ（配列番号３）（Xは、独立して選択されるアミノ酸である）を含む。種々の実施形態において、Ｘは、５：３：２の比のＶ、ＧもしくはＡ、または１：２：１の比のＫ、ＶもしくはＦ、または１：７：１の比のＫ、ＶもしくはＦ、またはＶである。
【０１１０】
種々の実施形態において、持続放出型のインスリンを含み、任意選択により即効性型のインスリンを含む組成物を、朝食前に１日１回投与する。
【実施例】
【０１１１】
実施例１
持続放出型インスリン構築物
ヒトプロインスリンをＥＬＰ１−１２０バイオポリマーと遺伝的に融合させ、大腸菌（E coli）の可溶性画分において発現させた。プロインスリン部分の、成熟インスリンへの精製酵素プロセシング後、融合タンパク質を、正常マウスモデルにおいてグルコース低下について試験し、インスリン単独と比較した。インスリンＥＬＰ融合物は、インスリンと同様なグルコース低下を示した。加えて、融合タンパク質の低下効果は、モデルにおいてインスリンよりも長い持続時間に及ぶことが示された。
【０１１２】
インスリン融合物の構築
ヒトプロインスリンは、３１アミノ酸Ｃペプチドによって連結されたＢ鎖およびＡ鎖からなる（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｂ鎖とＡ鎖との間にジスルフィドが形成されると、プロインスリンは、インビボで、トリプシン／カルボキシペプチダーゼＢ様系によるＣペプチドの除去によって成熟インスリンに変換される。このペプチドプロセシングは、インビトロで、組換え型トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを使用して再現することができる。融合物は、大腸菌の可溶性画分で発現されるので、リフォールディング工程は必要ない。
【０１１３】
プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＢ１０３１にサブクローニングしてＥＬＰ１−１２０配列のＮ末端に配置して、プラスミドｐＰＥ０１３９を作製した（図２）。
【０１１４】
図３は、プロインスリンＥＬＰ１−１２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれいている）がＥＬＰ１−１２０配列と融合されている。アミノ酸配列は、任意選択によりＮ末端に開始メチオニン残基を含む。
【０１１５】
発酵
インスリンＥＬＰ融合プラスミドｐＰＥ０１３９を、流加発酵法でＴ７プロモーターの制御下、大腸菌の細胞内画分中で発現させた。グリセロール細胞ストックを、主炭素源としてグリセロールおよび主窒素源として酵母エキスを含む半規定（semidefined）動物成分非含有培地（ECPM＋プロリン）中において、２段階振盪フラスコシードトレインを使用して増殖させた。シードトレインにおいて十分な細胞密度が達成された後、シードトレインと同じ培地を含有する発酵槽に培養物を移した。プロセスパラメーター（pH、温度、溶存酸素）を、ＰＩＤ制御によって設定点に維持した。培養物を、定常期に達するまで成長させ、その直後にグリセロール／酵母エキス／硫酸マグネシウムの供給を開始した。培養物を炭素制限下に維持し、ＩＰＴＧを使用してプロモーターの誘導を達成した。発酵の最後に、培養物を遠心分離して、インスリンＥＬＰ融合物を含有するバイオマスを使用済み培地から分離した。細胞ペーストを、その後の精製まで−７０℃で保存した。
【０１１６】
プロインスリンＥＬＰの精製
凍結細胞ペーストを、２Ｍ尿素（プロインスリンELPの解離のため）を含有する溶解用緩衝液中に再懸濁させ、均質になるまで混合した。マイクロフルイダイザーを使用して溶解を達成して、細胞膜を破壊し、次いで、遠心分離によって溶解物の最初の清澄化を行った。２段階タンジェント流ろ過（TFF）システムを使用して、生成物をさらに清澄化し、濃縮した。プロインスリンＥＬＰ融合物含有溶液を、濃縮緩衝液で１Ｍ塩化ナトリウムに調整し、捕捉工程としての疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）カラム（例えば、TOSOH PPG  ６００Ｍ）に通し、宿主細胞夾雑物を洗い流した。勾配を使用して生成物を溶離させて、生成物に関連する不純物（例えば、分解種）を全て分画した。プロインスリンＥＬＰの、インスリンＥＬＰへの酵素的変換の前に、選択された画分についてＴＦＦ緩衝液の交換を行って、残留塩を除去した。
【０１１７】
プロインスリンＥＬＰ融合物の酵素プロセシング
精製したプロインスリンＥＬＰ１−１２０を、組換え型トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢをそれぞれプロインスリン０．０５μｇ／ｍｇおよびプロインスリンＥＬＰ  ２．０μｇ／ｍｇの比で用いて、Ｃ−ペプチドの酵素消化によってインスリンＥＬＰに変換した。反応生成物を、室温（２０〜２５℃）で３〜４時間、Ｃ−ペプチドが完全に切断されて成熟インスリンＥＬＰが生成されるまでインキュベートした。
【０１１８】
インスリンＥＬＰの精製
インスリンＥＬＰに変換後、インスリンＥＬＰがカラムに結合しかつ残留酵素が通過する捕捉用ＨＩＣカラム上でインスリンＥＬＰを再びプロセシングすることによって、残留酵素および生成物バリアントを除去した。溶出生成物画分を、透析濾過してＮａＣｌを除去し、次いで陰イオン交換（例えば、POROS 50 PI）によって、生成物がカラムを通過しかつ宿主細胞夾雑物が捕獲される条件下で精製した。最後に、陽イオン交換カラム（例えば、POROS 50 HS）を使用して、生成物バリアント、宿主細胞タンパク質、内毒素およびＤＮＡを除去した。次いで、溶出された生成物を濃縮し、製剤緩衝液（例えば、２０ｍＭヒスチジン、１１０ｍＭ  NaCl、pH7.5）中に透析濾過した。
【０１１９】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４）は、酵素プロセッシング後に、Ｃ−ペプチドが切断されたときに予想される減少した融合タンパク質分子量の減少を示した。
【０１２０】
抗インスリンＢ鎖のウェスタンブロット（図５）を行って、ＥＬＰと融合したＡ鎖およびＢ鎖の両方の存在を確認した。データは、非還元条件下でＢ鎖の存在を示した。これは、Ａ鎖とＢ鎖の間におけるジスルフィド結合の形成を示している。融合タンパク質およびジスルフィド結合の還元により、融合物からＢ鎖が除去された。
【０１２１】
エレクトロスプレーイオン化質量分析は、プロインスリンＥＬＰ融合物（図６）およびＣ−ペプチドの酵素除去後の成熟インスリンＥＬＰ融合物（図７）の質量を確認した。さらなる塩付加物が両試料中に存在した。ジスルフィド結合の存在を、Ｅｌｌｍａｎ試薬アッセイを使用して確認した。遊離チオールが存在しないことは、ジスルフィド結合が形成されることを示した。
【０１２２】
インビボでのグルコース低下
正常なマウスを一晩絶食させ、生理食塩水（負の対照）、１３ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリングラルギン（正の対照）または３５ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリンＥＬＰ融合物（INSUMERA）を皮下注入した。投薬前にならびに投薬後８時間後まで１時間ごとにおよび投薬２４時間後に血中グルコース値を読み取った。投薬の１時間後に飼料を入手可能にした。図８は、血中グルコースデータ（平均+-SE）を示す。インスリンＥＬＰ融合物は、生理食塩水対照に対して有意な血中グルコースの低下を示す。加えて、インスリンＥＬＰ融合物は、インスリングラルギン対照（２時間）よりもさらに延長された（７時間）血中グルコースの低下を示した。
【０１２３】
１型糖尿病モデルにおけるインビボ効果
ＥＬＰ−インスリン融合物、ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）を、１型真性糖尿病（1型糖尿病、T1DM）マウスモデルに投薬した。具体的には、単回投与データを図９に示す。結果は、ＩＮＳＵＭＥＲＡでは、等モルのＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）投薬と比較して、グルコース低下の持続時間が長いことを実証した。化合物を毎日のレジメンで投薬した場合（図１０）、結果は、活性および半減期に関して、ＩＮＳＵＭＥＲＡがＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して優れていることを実証している。
【０１２４】
図１１Ａおよび１１Ｂは、１型真性糖尿病（1型糖尿病、T1DM）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）低用量設定を、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して示す。図１１Ａは単回ｓ．ｃ．投薬を示し、図１１Ｂは１４日間毎日のｓ．ｃ．投薬を示す。いずれの場合にも、ＩＮＳＵＭＥＲＡのより顕著で持続性の血中グルコース低下効果が示される。
【０１２５】
研究は、ＩＮＳＵＭＥＲＡの、患者における典型的な血糖レベルの尺度である血糖コントロールの程度を判定するためにも実施した。図１２Ａおよび１１Ｂは、ＩＮＳＵＭＥＲＡ（PE0139）が、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、SANOFI-AVENTIS）と比較して血糖コントロールを有意に増加させたことを示す。曲線下面積（AUC）血中グルコースの２７〜３９％の低下が見られる。図１２Ａは、１日目の化合物投与および０〜２４時間における血中グルコースＡＵＣを示す。図１２Ｂは、１４日目の化合物投与および０〜２４時間における血中グルコースＡＵＣを示す。両投薬レジメンにおいて、ＩＮＳＵＭＥＲＡは、ＬＡＮＴＵＳより血中グルコースＡＵＣを効果的に低下させた。
【０１２６】
研究は、ＩＮＳＵＭＥＲＡ治療の薬物動態（PK）を評価するためにも行った。糖尿病のブタにおいて、単回ｓ．ｃ．注入（図１３Ａ）または２週間毎日のｓ．ｃ．注入（図１３Ｂ）のいずれかのレジメンに従った。結果は、ＩＮＳＵＭＥＲＡが、皮下注入後に、小さいピーク対トラフ比を有する長い半減期を達成することを示す。
【０１２７】
インスリン／受容体相互作用
以下の研究の目標は、インスリンペプチド、ならびにヒトインスリンおよびＩＧＦ−１受容体に結合しているインスリンペプチド／タンパク質構築物のさらなる試験を行うことである。
【０１２８】
分析条件：ニッケル充電（nickel-charged）ＮＴＡセンサーチップを装着し、ランニング緩衝液（running buffer）（１０ｍＭ  HEPES、１５０ｍＭ  NaCl、０．０１％  Tween-20、pH7.8）で平衡させたＢｉａｃｏｒｅ  Ｓ５１光学バイオセンサーを使用して、２５℃において結合研究を行った。これらの研究では、ＬＣＲ−１０５４インスリンペプチドについては５８０８Ｄａの分子質量を、ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９については５０，０００Ｄａの分子質量を想定した。
【０１２９】
より高濃度におけるＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９のスクリーニングも行った。以前の試験では、ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９の受容体結合は、観察されなかった。これらの２つの分析物を３μＭで再び試験し、これらには、正の対照としてＬＣＲ−１０５４（６００ｎＭ）を含めた。
【０１３０】
３μＭにおいて、ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９は、インスリン受容体表面への結合を示した（図３５Ａ）。３μＭにおいて、ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９は、ＩＧＦ−１受容体への結合をそれほど示さなかった（図３５Ｂ）。
【０１３１】
これらの相互作用をより詳細に検討するために、ｒｈＩＲおよびｒｈＩＧＦ−１Ｒの新たな表面を調製した。Ｈｉｓタグ付きｒｈＩＲを、約１２００ＲＵの密度まで捕獲させた。ＩＧＦ−１Ｒを、同じセンサーチップ上に７５００ＲＵの密度までアミンカップリングさせた。これらの新しいｒｈＩＲおよびｒｈＩＧＦ−１Ｒ表面の活性を、６００ｎＭ  ＬＣＲ−１０５４の結合によって確認した。
【０１３２】
ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９の濃度系列。  ＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９を、２つの受容体表面への結合について２０μＭから始めて３倍希釈系列で試験した。２つの分析物は、インスリン受容体に対して同様な結合を示した（図３６Ａ）。
【０１３３】
応答を、分析物濃度に対してプロットし、単純な結合等温線に当てはめて、これらの相互作用の親和性推定値を得た（図３６Ｂ）。
【０１３４】
これに対して、いずれの分析物も、ｒｈＩＧＦ−１Ｒ表面に対して信頼性の高い結合を示さなかった。実際に、分析物は、固定化ＩＧＦ−１Ｒに対するよりも参照表面（タンパク質が結合されていないセンサーチップの領域）に対してより多くの結合を示したので、この表面から応答は、より高い濃度では陰性である。
【０１３５】
したがって、本実施例は、とりわけ、これらの分析条件下でＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９が約６〜８ｕＭの親和性でインスリン受容体と結合すること、ならびにＩＮＳ−ＥＬＰ（B30）およびＰＥ０１３９がＩＧＦ−１受容体に対して検出可能な結合を示さないことを示している。
【０１３６】
続いて、ＩＧＦ受容体を発現するように改変された細胞を使用する、受容体活性化についての細胞アッセイを使用して、ＩＧＦ−１Ｒへの構築物の結合を検討した。この系を使用した場合、即効型および持続放出型構築物は、ＩＧＦ受容体の若干の活性化を示したが、インスリンより著しく低いレベルであった（データは示さず）。
【０１３７】
実施例２
即効型インスリン構築物
「速効型」インスリンＥＬＰ融合物を作製するために、プロインスリン配列を、ｐＰＥ０１３９における１２０ＥＬＰ五量体繰り返しより短い長さを有するＥＬＰポリマーと遺伝的に融合させた。これらのより短いポリマーは、生理的条件よりかなり高い転移温度を有し、ポリマーの持続放出機能を効果的に取り除くが、インスリンの多量体化を防ぎかつ溶液中で安定性を与える能力を保持する。
【０１３８】
プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、制限酵素を使用してｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２２１にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ１−２０配列のＮ末端にプロインスリンを配置して、プラスミドｐＰＥ０２２４を作製する（図１７）。
【０１３９】
図１８は、プロインスリンＥＬＰ１−２０融合タンパク質（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−２０配列（ボールド体）と融合されている。
【０１４０】
ＥＬＰ１−２０より短い長さを有するポリマーと融合されたプロインスリンを構築するために、プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２１５にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ１−１０配列のＮ末端にプロインスリンを配置して、プラスミドｐＰＥ０２６２を作製する（図１９）。
【０１４１】
図２０は、プロインスリンＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−１０配列（ボールド体）と融合されている。
【０１４２】
ＥＬＰ１−２０よりさらに高い転移温度を有するポリマーと融合されたプロインスリンを構築するために、プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２４５にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ２−２０配列のＮ末端にプロインスリンを配置して、プラスミドｐＰＥ０２５９を作製する（図２１）。ＥＬＰ２−２０ポリマーは、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）ゲスト残基としてアラニンとグリシンを１：１の比で使用して、ＥＬＰ１−２０と比較してポリマーの疎水性を減少させる。
【０１４３】
図２２は、プロインスリンＥＬＰ２−２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ２−２０配列（ボールド体）と融合されている。
【０１４４】
ＥＬＰ１−２０より短い長さを有するポリマーと融合されたプロインスリンを構築するために、プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２６５にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ２−１０配列のＮ末端にプロインスリンを配置して、プラスミドｐＰＥ０２６６を作製する（図２３）。
【０１４５】
図２４は、プロインスリンＥＬＰ２−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ２−２０配列（ボールド体）と融合されている。
【０１４６】
ＥＬＰ１−１０より大きい負電荷を有するポリマーと融合されたプロインスリンを構築するために、プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２７４にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ五量体間に４個のグルタミン酸残基が挿入されているＥＬＰ１−１０配列のＮ末端にプロインスリンを位置させて、プラスミドｐＰＥ０２８３を作製する（図２５）。挿入されたグルタミン酸残基は、ポリマーの負電荷を増加させる。
【０１４７】
図２６は、プロインスリンＥＬＰ１−１０（4xGlu）融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）が、示された挿入グルタミン酸残基（下線が引かれたボールド体）を有するＥＬＰ１−１０（4xGlu）配列（ボールド体）と融合されている。
【０１４８】
ＥＬＰポリマーと融合されたリスプロインスリンを構築するために、リスプロヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２６５にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ１−１０配列のＮ末端にリスプロスリンを配置して、プラスミドｐＰＥ０２８４を作製する（図２７）。
【０１４９】
図２８は、リスプロＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。リスプロ配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−１０配列（ボールド体）と融合されている。
【０１５０】
ＥＬＰポリマーと融合されたインスリンアスパルトを構築するために、アスパルトヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＥ０２６５にサブクローニングした。これは、ＥＬＰ１−１０配列のＮ末端にインスリンアスパルトを配置して、プラスミドｐＰＥ０２８５を作製する（図２９）。
【０１５１】
図３０は、アスパルトＥＬＰ１−１０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。アスパルト配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−１０配列（ボールド体）と融合されている。
【０１５２】
発酵
上述したプロインスリンＥＬＰ融合物を、流加発酵法でＴ７プロモーターの制御下、大腸菌の細胞内画分中で発現させた。グリセロール細胞ストックを、主炭素源としてグリセロールおよび主窒素源として酵母エキスを含む半規定動物成分非含有培地（ECPM＋プロリン）中において、２段階振盪フラスコシードトレインを使用して増殖させた。シードトレインにおいて十分な細胞密度が達成された後、シードトレインと同じ培地を含有する発酵槽に培養物を移した。プロセスパラメーター（pH、温度、溶存酸素）を、ＰＩＤ制御によって設定点に維持した。培養物を、定常期に達するまで成長させ、その直後にグリセロール／酵母エキス／硫酸マグネシウムの供給を開始した。培養物を炭素制限下に維持し、ＩＰＴＧを使用してプロモーターの誘導を達成した。発酵の最後に、培養物を遠心分離して、インスリンＥＬＰ融合物を含有するバイオマスを使用済み培地から分離した。細胞ペーストを、その後の精製まで−７０℃で保存した。
【０１５３】
最初の精製
凍結細胞ペーストを、２Ｍ尿素（インスリンELPの解離のため）を含有する溶解用緩衝液中に再懸濁させ、均質になるまで混合した。マイクロフルイダイザーを使用して、溶解を達成して、細胞膜を破壊した。遠心分離によって溶解物の最初の清澄化を行った。２段階タンジェント流ろ過（TFF）システムを使用して、生成物をさらに清澄化し、濃縮した。プロインスリンＥＬＰ融合物を、捕捉工程としてのＨＩＣカラムに通し、宿主細胞夾雑物を洗い流した。勾配を使用して生成物を溶離させて、生成物に関連する不純物（分解種）を全て分画した。プロインスリンＥＬＰの、インスリンＥＬＰへのその後の変換の前に、選択された画分について、ｐＨ７．０〜９．０のＴｒｉｓ緩衝液を用いるＴＦＦ緩衝液の交換を行って、残留塩を除去した。
【０１５４】
プロインスリンＥＬＰ融合物の酵素プロセシング
捕捉されたプロインスリンＥＬＰを、組換え型トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢをそれぞれプロインスリン０．０５μｇ／ｍｇおよびプロインスリンＥＬＰ  ２．０μｇ／ｍｇの比で用いて、Ｃ−ペプチドの酵素消化によってインスリンＥＬＰに変換した。反応生成物を、室温（２０〜２５℃）で３〜４時間、Ｃ−ペプチドが完全に切断されて成熟インスリンＥＬＰが生成されるまでインキュベートした。
【０１５５】
最終的な精製
インスリンＥＬＰへの変換後、残留酵素および生成物バリアントを、２つのアプローチを使用して除去した。一つ目は、インスリンＥＬＰがカラムに結合しかつ残留酵素が通過する捕捉用ＨＩＣカラム上でインスリンＥＬＰを再びプロセシングすることによって、残留酵素を除去した。酵素除去後の最終的な仕上げ工程は、製品バリアント、宿主細胞タンパク質、内毒素およびＤＮＡを除去するための陽イオン交換カラム、ならびにあらゆる残留ＤＮＡおよび内毒素を除去するための陰イオン交換カラムを含んでいた。別法として、酵素の除去と仕上げ工程を、陽イオン交換カラムによって同時に達成することもできる。酵素は樹脂に強固に結合し、インスリンＥＬＰの選択的溶離により、酵素、宿主細胞タンパク質、内毒素およびＤＮＡからの生成物の分離が可能となる。それに続く陰イオン交換カラムによって、あらゆる残りの夾雑物を除去した。続いて、生成物を濃縮し、製剤緩衝液（例えば、２０ｍＭヒスチジン、１１０ｍＭ  NaCl）中に透析濾過した。
【０１５６】
１型糖尿病の齧歯動物モデルにおける、ＰＥ０２４４（速効型インスリン）およびＰＥ０１３９（持続放出型インスリン）のグルコースレベルに対する効果。
マウスにおいて、確立された方法によるストレプトゾトシン（７０ｍｇ／ｋｇ  IP）の投与によって、糖尿病を誘導した。１２日後、マウスを４時間絶食させ、次いでＰＥ０２４４、ＰＥ０１３９、ＰＥ０２４４とＰＥ０１３９の共製剤、またはビヒクルを投与した。血中グルコースを、注入後４時間までにわたって測定した。図Ｙは、ＰＥ０２４４は、循環中へのインスリンの急速な流入により、血中グルコースの急速な低下を引き起こしたが、観察期間の終わりに近づくにつれて効果はなくなり始めたことを示している。これに対して、ＰＥ０１３９は、注入部位におけるデポーからの徐放により、作用発現が著しく遅発性であるが、効果は観察期間を通じて持続された。組合せ製剤は、即効性と血中グルコースの持続性低下とを示した。これは、２つの分子が、この共製剤においてそれらの性質を保持したことを明白に示している。
【０１５７】
ＥＬＰ１−１２０配列は、大腸菌細胞質における溶解性およびインスリン融合物の下流プロセシング効率を改善する。より短いＥＬＰポリマー融合物に関してこれを利用するために、プロインスリンＥＬＰ２−１０ポリマーを、２つの間にトリプシン切断部位があるようにして、ＥＬＰ１−１２０量体ポリマーのＮ末端と融合させた。これにより、ポリマーは一緒に発現され、精製プロセスの酵素工程の間に分離されて、ｐＰＥ０２６６において発現されるのと同様なプロインスリンＥＬＰ２−１０融合物が得られる。この「ブレークアウェイ」構築物を構築するために、ＥＬＰ２−１０ポリマーのヌクレオチド配列を二重アルギニントリプシン部位と共に、プラスミドｐＰＢ１０３１にサブクローニングして、プラスミドｐＰＥ０２８９を作製した（図３１）。これは、ＥＬＰ２−１０ポリマーをＥＬＰ１−１２０ポリマーのＮ末端に配置する。次に、プロインスリンヌクレオチド配列をＥＬＰ２−１０配列のＮ末端上にクローニングして、プラスミドｐＰＥ０２９０を作製した（図３２）。
【０１５８】
図３３は、プロインスリンＥＬＰ２−１０ブレークアウェイタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−１０配列（ボールド体）と融合されており、これがさらにＥＬＰ１−１２０配列（イタリック体）と融合されている。ＥＬＰＳの間のトリプシン部位が示されている（下線が引かれたボールド体）。
【０１５９】
ブレークアウェイ構築物のプロセシング
ＥＬＰ１−１２０配列は、大腸菌細胞質における溶解性およびインスリン融合物の下流プロセシング効率を改善する。より短いＥＬＰポリマー融合物に関してこれを利用するために、プロインスリンＥＬＰ２−１０ポリマーを、２つの間にトリプシン切断部位があるようにして、ＥＬＰ１−１２０量体ポリマーのＮ末端と融合させた。これにより、ポリマーは一緒に発現され、精製プロセスの酵素工程の間に分離されて、ｐＰＥ０２６６において発現されるのと同様なプロインスリンＥＬＰ２−１０融合物が得られる。この「ブレークアウェイ」構築物を構築するために、ＥＬＰ２−１０ポリマーのヌクレオチド配列を二重アルギニントリプシン部位（double arginine tryptic site）と共に、プラスミドｐＰＢ１０３１にサブクローニングして、プラスミドｐＰＥ０２８９を作製した（図３１）。これは、ＥＬＰ２−１０ポリマーをＥＬＰ１−１２０ポリマーのＮ末端に配置する。次に、プロインスリンヌクレオチド配列をＥＬＰ２−１０配列のＮ末端上にクローニングして、プラスミドｐＰＥ０２９０を作製した（図３２）。
【０１６０】
図３３は、プロインスリンＥＬＰ２−１０ブレークアウェイタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。プロインスリン配列（下線が引かれている）がＥＬＰ１−１０配列（ボールド体）と融合されており、これがさらにＥＬＰ１−１２０配列（イタリック体）と融合されている。ＥＬＰＳの間のトリプシン部位が示されている（下線が引かれたボールド体）。
【０１６１】
実施例３
持続放出型インスリンおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストを用いる併用療法
持続放出型インスリン（PE0139）およびＧＬＰ−１受容体アゴニストを用いる併用療法を評価した。ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、配列番号３２によって表され（PB1023）、ＥＬＰ１−１２０融合物を含み、Ｘは、約５：３：２の比のＶａｌ、ＧｌｙおよびＡｌａである。以下の結果を、ｄｂ／ｄｂマウスで得た。空腹時グルコースおよび活性作用剤の種々の用量での食後グルコースに対する効果を評価した。マウスは時間０の前の約３．５時間にわたって絶食し、約２４０分にＩＰＧＴＴを行った。
【０１６２】
図３７は、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＰＥ０１３９の用量漸増が、空腹時グルコースおよび食後グルコースに対して、次第に増加する効果を示すことを示す。
【０１６３】
図３８は、ＰＥ０１３９への、固定用量のＰＢ１０２３（GLP-1-ELP1-120）の添加が、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、食後コントロールをさらに増強することを示す。
【０１６４】
図３９は、ＰＢ１０２３用量漸増が、ｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時グルコースおよび食後グルコースに対して、次第に増加する効果を示すことを示す。
【０１６５】
図４０は、ＰＢ１０２３への固定用量のＰＥ０１３９の添加が、ｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時コントロールおよび食後コントロールを増強することを示す。
【０１６６】
図４１は、ＰＥ０１３９用量漸増が、血糖グルコースに対してほとんど効果を示さないこと、およびＰＢ１０２３用量漸増が、空腹時グルコースに対して次第に増加する効果を示しかつ食後グルコースに対してほとんど影響を示さないことを示す。
【０１６７】
図４２は、低用量のＰＥ０１３９と低用量のＰＢ１０２３との組合せが、空腹時コントロールおよび食後コントロールを増強したことを示す。
【０１６８】
均等論
当業者ならば、ルーチン実験のみを用いて、本明細書中に具体的に記載した特定の実施形態に対する多くの均等形態を認識し、または確認することができるであろう。このような均等形態は、以下の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ】
2016505627.tif 000003
【図１Ｂ】
2016505627.tif 000004
【図２】
2016505627.tif 000005
【図３】
2016505627.tif 000006
【図４】
2016505627.tif 000007
【図５】
2016505627.tif 000008
【図６】
2016505627.tif 000009
【図７】
2016505627.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2016505627.tif 000013
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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