(57)【要約】本発明は、親の微生物に対してＮＡＤＰＨの全体的な利用が増加した組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を提供する。更に、本発明は、親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨの利用を呈する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を生成する方法を提供する。特に、本発明は、微生物による少なくとも１つの発酵生成物の生成を増加するために、組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物におけるＮＡＤＰＨの全体的な利用の増加に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するように適合されたまたは少なくとも１つの内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物であって、前記外因性酵素が発現されるときにまたは前記内因性酵素が過剰発現されるときに、前記微生物による前記ＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加されるように、前記酵素が選択される、組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びメチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及びギ酸水素リアーゼ複合体からなる群から選択される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在しており、前記組み換え型の微生物が、前記ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＮＡＤＨ依存性アイソフォームが、親の微生物に比較して弱化されるか無力化される、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
【請求項６】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼである、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
【請求項７】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択され、前記酵素のうちのいずれか１つが、ｐｈａＢ及びｐｈａＪ、ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｈｂｄからなる群から選択されるＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
【請求項８】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ及びブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択されており、前記酵素のうちのいずれか１つが、ｃｃｒ及びｃｃｒＲｓ、ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｔｅｒからなる群から選択されるＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
【請求項９】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、複数の共同因子依存性を更に呈しており、前記複数の共同因子依存性を呈する酵素が、ＮＡＤＨ／フェロドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素から選択される、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの酵素が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、前記微生物が、前記ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素が、それのＮＡＤＨ共同因子特異性に対してそれのＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するように修正される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの酵素であって、それにおいてＮＡＤＰＨ共同因子特異性が増加される、少なくとも１つの酵素が、オキシドレダクターゼ酵素である、請求項１１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項１３】
前記ＮＡＤＰＨの全体的な利用における前記増加が、前記微生物による少なくとも１つの発酵生成物の生成の増加を結果としてもたらす、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項１４】
前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
【請求項１５】
親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨの利用を呈する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を生成する方法であって、
ａ．少なくとも１つの外因性または内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を選択することと、
ｂ．親の微生物を転換して、前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性外因性酵素を発現するまたは前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性内因性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生成することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びメチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在しており、前記組み換え型の微生物が、前記ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＮＡＤＨ依存性アイソフォームが、親の微生物に比較して弱化されるか無力化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択されており、前記酵素のうちのいずれか１つが、ｐｈａＢ及びｐｈａＪ、ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｈｂｄからなる群から選択されたＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ及びブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを含む群から選択されており、前記酵素のうちのいずれか１つが、ｃｃｒ及びｃｃｒＲｓならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｔｅｒからなる群から選択されたＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵素が、複数の共同因子依存性を更に呈しており、前記複数の共同因子依存性を呈する酵素が、ＮＡＤＨ／フェロドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの酵素が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、前記微生物が、前記ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素の前記ＮＡＤＨ共同因子特異性に対して前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素の前記ＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加させることを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの酵素であって、それにおいてＮＡＤＰＨ共同因子特異性が増加される、少なくとも１つの酵素が、オキシドレダクターゼ酵素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換え型の微生物が、親の微生物に対して少なくとも１つの発酵生成物の増加された生成を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの発酵生成物を生成する方法であって、カルボキシド栄養性微生物の存在下でＣＯを含む基質を嫌気的に発酵させることを含み、前記カルボキシド栄養性微生物が、請求項１に記載の組み換え型の微生物または請求項１５によって生成される組み換え型の微生物である、方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの発酵生成物が、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、Ｃ５＋アルコール、ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレノイド、脂肪酸及び生体高分子からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
発酵反応において複数の共同因子を利用し得る組み換え型の微生物を生成する方法であって、
ａ．分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及びギ酸水素リアーゼ複合体からなる群から選択された少なくとも１つの酵素を選択することと、
ｂ．親の微生物を転換して、前記選択された酵素のうちの少なくとも１つを発現するか過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生成することと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記複数の共同因子が、フェロドキシン及びＮＡＤＰＨを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ギ酸水素リアーゼ複合体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５〜６７、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換し得る組み換え型の微生物を生成する方法であって、親の微生物を転換して、少なくとも１つの単一のＮＡＤＨ依存性還元型フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素を発現するか過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生成することを含む、方法。
【請求項３７】
前記Ｎｆｎ酵素が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１及びＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体からなる群から選択された前記アミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するためのポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、またはＣＬＩＵ＿ｃ３７２４０、あるいは少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単一のＮＡＤＨ依存性還元型フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素を含む、ポリペプチドの使用。
【請求項４０】
ＣＯ２及びＨ２からギ酸塩を生成する方法であって、
ａ．カルボキシド栄養性クロストリジウム属の親の微生物を転換して、少なくとも１つのギ酸水素リアーゼを発現するか過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生成することと、
ｂ．前記組み換え型の微生物の存在下でＣＯ２及びＨ２を含む基質を嫌気的に発酵させて、ギ酸塩を生成することと、を含む、方法。
【請求項４１】
前記ギ酸水素リアーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＨＱ８７６０１５、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＡＥＩ９０７２２、ＨＱ８７６０１６、ＳＥＱ  ＩＤ：９〜１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＹＰ＿００３７７８８７９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５〜２６、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記カルボキシド栄養性クロストリジウム属の親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのギ酸水素リアーゼが、ギ酸塩を変換してＣＯ２及びＨ２を形成することが更にできる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
ＣＯ２及びＨ２からギ酸塩を生成する方法であって、
ａ．カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物から少なくとも１つのギ酸水素リアーゼを精製することと、
ｂ．前記少なくとも１つの精製されたギ酸水素リアーゼの存在下でＣＯ２及びＨ２を含む基質を変換して、ギ酸塩を生成することと、を含む、方法。
【請求項４５】
前記ギ酸水素リアーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＨＱ８７６０１５、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＡＥＩ９０７２２、ＨＱ８７６０１６、ＳＥＱ  ＩＤ：９〜１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＹＰ＿００３７７８８７９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５〜２６、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのギ酸水素リアーゼが、ギ酸塩を変換してＣＯ２及びＨ２を形成することが更にできる、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によって所望の化合物の生成を最適化する酵素を選択する方法に関する。より詳細には、排他的にではないが、本発明は、発酵経路における共同因子の均衡及び代謝工学技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元当量、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）などは、酵素による酸化還元反応、例えばオキシドレダクターゼ反応などのための重要な補酵素であり、全ての生細胞において見つけられる。一般に、ＮＡＤＰＨプールは、ＮＡＤＨのプールよりもかなり小さいことが認められる（Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓａｎ、２００９）。ブドウ糖上で成長される大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）において、ＮＡＤＨのプールは、ＮＡＤＰＨプールよりも２０倍以上大きい（Ｂ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ、２００９）。この低いＮＡＤＰＨ利用可能性は、特に発酵プロセスにおいて、多くの生合成反応及び生物学的変換を制限する（Ｒ  Ｐｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、２００５）。ＮＡＤＰＨについての酵素の好みは、所望の生成物の生成を制限し得る（Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓａｎ、２００９）。これは、新しい反応や経路を微生物の中に工学操作するときに問題であり、バイオ燃料、化学物質、アミノ酸またはビタミンを含む化合物の効率的な生成プラットフォームの発生に対する大きな障害の１つである（Ｃｈｅｍｌｅｒ、Ｆｏｗｌｅｒ、ＭｃＨｕｇｈ、＆Ｋｏｆｆａｓ、２０１０）。
【０００３】
それにもかかわらず、代謝工学技術は、可能であれば、ＮＡＤＰＨ依存性反応を制限すること、回避することまたはバイパスすることによる広範囲の燃料及び化学物質の生成について成功裏に実証されている（Ｐｅｒａｌｔａ−Ｙａｈｙａ＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ、２０１０）。あるいは、エネルギーを消費するトランスヒドロゲナーゼが使用されており、それは、ＮＡＤＨプールとＮＡＤＰＨプールとの間で相互変換する。成功した代謝工学技術を実現するための別の戦略は、競合するＮＡＤＰＨ依存性反応の排除である。これらの進歩にもかかわらず、そのような新規な戦略は、生産歩留り及び／または成長率を犠牲にして追求されることが多い（Ａｕｒｉｏｌ、Ｂｅｓｔｅｌ−Ｃｏｒｒｅ、Ｃｌａｕｄｅ、Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ、＆Ｍｅｙｎｉａｌ−Ｓａｌｌｅｓ、２０１１）。更に、それらは、複数の修正を用いる広範囲にわたる工学技術作業によってのみ可能になる（Ｓ．Ｍ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）。それ故、これらの努力は、例えば大腸菌や出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのような、遺伝子的に扱い易い生物だけに制限されている（Ｐｅｒａｌｔａ−Ｙａｈｙａ＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ、２０１０）。これらの生物は、それらが糖だけを常食とするように制限される。したがって、それらの商業上の使用及び実現可能性は、土地利用、食料安全保障、供給の不安定さ及び環境問題をめぐるかなりの欠点に悩まされる。
【０００４】
カルボキシド栄養性（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）クロストリジウムは、大腸菌及び出芽酵母に代わるものを提供して、廃棄ガスや合成ガス上で成長することができる。限られた数の修正を有する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウムのいくつかの例がある（Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ＆Ｄuｒｒｅ、２０１２）。全ての既知の例は、ＮＡＤＨ依存性反応を使用する。
【０００５】
発明の目的は、先行技術の欠点の１つ以上を克服するか改善すること、または、少なくとも、有用な選択肢を社会に提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様において、発明は、１つ以上の外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するように適合された、及び／または１つ以上の内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を過剰発現するように適合された、組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を提供するものであり、酵素は、外因性酵素が発現されるときに、及び／または内因性酵素が過剰発現されるときに、微生物によるＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加されるように選択される。
【０００７】
第２の態様において、発明は、親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨの利用を呈する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を生成する方法であって、
ａ．１つ以上の外因性及び／または内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を選択することと、
ｂ．親の微生物を転換して、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性外因性酵素を発現する、及び／または１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性内因性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生じることと、を含む、方法を提供する。微生物におけるＮＡＤＰＨ依存性酵素の任意の１つ以上の発現または過剰発現は、親の微生物に対してＮＡＤＰＨの利用における全体的な増加を結果としてもたらす。
【０００８】
発明はまた、第２の態様の方法によって作製される組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウムを提供する。
【０００９】
第１または第２の態様の特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ヒドロゲナーゼ（例えば、Ｓｅｑ．ＩＤ（配列番号）６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、ＹＰ＿００３７８１０１６、ＹＰ＿００３７８１０１７、ＹＰ＿００３７７８８７９、ＹＰ＿００３７７９６４０、ＹＰ＿００３７７９８９３、ＹＰ＿００３７８０１９３もしくはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＥＩ９０７２１、ＡＥＩ９０７２３、ＡＥＩ９０７２５、ＹＰ＿００３７７９０６３、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＹＰ＿００３７８０１６８、ＡＥＩ９０７２２、ＡＥＩ９０７２４、ＡＥＩ９０７２６もしくはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）またはメチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＥＩ９０７５３、ＹＰ＿００３７８１８９１、ＡＥＩ９０７７１もしくはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
【００１０】
第１または第２の態様の特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームで存在しており、組み換え型の微生物が、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される。
【００１１】
特定の実施形態において、微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される一方、対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームの発現における変化と比較されるときに、実質的に変化しない、減る、または比較的小さな増加を呈する。１つの特定の実施形態において、微生物は、１つ以上のＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現が、親の微生物と比較して弱化されるか無力化されるように適合される。一実施形態において、その発現は、１つ以上のＮＡＤＨ依存性酵素をコード化する核酸を修正することによって、あるいはＮＡＤＨ依存性アイソフォームをコード化する１つ以上の核酸を、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームをコード化する１つ以上の核酸と置き換えることによって、弱化されるか無力化される。
【００１２】
第１または第２の態様の特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨの全体的な利用における増加は、経路であって、それにおいて１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が活性である、経路を通るＮＡＤＰＨ流動における増加を含む。特定の実施形態において、流動は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％だけ増加される。経路を通る流動は、代謝物及び生成物のレベル（メタボロミクス）（Ｐａｔｔｉ、Ｙａｎｅｓ、＆Ｓｉｕｚｄａｋ、２０１２）ならびに／またはＣ１３として標識付ける実験（フラクソミクス）（Ｎｉｉｔｔｙｌａｅ、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、Ｓａｕｅｒ、＆Ｆｒｏｍｍｅｒ、２００９、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、日付不明）によって測定され得る。
【００１３】
第１または第２の態様の１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨの全体的な利用における増加は、使用中に、微生物による１つ以上の生成物の生成の効率における増加を結果としてもたらす。
【００１４】
１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している１つ以上の酵素は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼであり、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォーム（ＥＣ１．１．１．３４、ＧＯ：０００４４２０、例えば、出芽酵母：ＤＡＡ０９８２２．１、ＢＫ００６９４６．２：１１５７３４．．１１８８９８またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）及びＮＡＤＨ依存性アイソフォーム（ＥＣ１．１．１．８８、ＧＯ：００４２２８２、例えば、シュードモナス・メバロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）：Ｐ１３７０２．１またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
【００１５】
１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している１つ以上の酵素は、ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ／３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドラターゼであり、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームｐｈａＢ（ＥＣ：１．１．１．３６、ＧＯ：００１８４５４、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）：ＹＰ＿７２５９４２．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８４から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）、ＮＡＤＰＨ依存性ｐｈａＪ（ＥＣ４．２．１．１１９、例えば、アエロモナス・プンクタタ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）：ＢＡＡ２１８１６．１から）ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｈｂｄ（ＥＣ１．１．１．１５７、ＧＯ：０００８６９１、例えば、Ｃ．アセトブチリクム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）：ＮＰ＿３４９３１４．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９１から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
【００１６】
１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している１つ以上の酵素は、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ／トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームｃｃｒ（ＥＣ１．３．１．８６、例えば、ストレプトマイセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）あるいはｃｃｒＲｓ（ＥＣ１．３．１．８５、例えば、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）：ＹＰ＿３５４０４４．１、遺伝子ＩＤ：３７２０７５１から）ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
【００１７】
更なる実施形態において、酵素は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームで存在しており、また、複数の共同因子依存性を呈する。第２の態様の一実施形態において、複数の共同因子依存性を呈する酵素は、ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素を含み得る。特定の実施形態において、酵素は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、微生物は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される。特定の実施形態において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームは、ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば、ユーグレナ・グラシリス（ミドリムシ）：ＡＹ７４１５８２．１から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）である。更なる実施形態において、ＮＡＤＨ／Ｆｄ依存性アイソフォームは、ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐ｂｃｄ−ｅｔｆＡＢ複合体（ＥＣ１．３．８．１、ＧＯ：０００４０８５、例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１７．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９４から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）である。
【００１８】
第１または第２の態様の特定の実施形態において、組み換え型の微生物は、１つ以上のＮＡＤＨ依存性酵素の弱化された発現を呈する。この実施形態において、親の微生物における酵素のＮＡＤＨ依存性アイソフォームは、組み換え型の微生物における酵素のＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームによって置き換えられている可能性がある。
【００１９】
第１または第２の態様の特定の実施形態において、微生物は、親の微生物と比較されるときに、発酵反応の間に増加された効率を呈する。
【００２０】
第１または第２の態様の１つの特定の実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・アセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・フォルミコアセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・マグナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ）を含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群から選択される。
【００２１】
第１または第２の態様の一実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、ＤＳＭ１００６１株の誘導体である。別の特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００２２】
第１の態様の更なる実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が、それのＮＡＤＨ共同因子特異性に対して、それのＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するように修正される。
【００２３】
第２の態様の更なる実施形態において、方法は、（複数の）酵素のＮＡＤＨ共同因子特異性に対して１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素のＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するステップを更に含む。一実施形態において、これは、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素をコード化する１つ以上の核酸を修正することを含む。
【００２４】
特定の実施形態において、１つ以上の酵素であって、それにおいてＮＡＤＰＨ共同因子特異性が増加される、１つ以上の酵素が、好ましくは、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ／トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、オキシドレダクターゼ酵素である。
【００２５】
特定の実施形態において、１つ以上の外因性または内因性酵素が、本明細書に記載されるような、分岐ＮＡＤＰ鉄のみの（Ｆｅ−ｏｎｌｙ）ヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体、あるいはそれらの機能的等価変異体を含む。
【００２６】
更なる実施形態において、発明は、本明細書に記載された態様のいずれかに記載されるような１つ以上の修正を有する第１の態様に係る組み換え型の微生物を提供する。
【００２７】
更なる実施形態において、発明は、本明細書に記載された態様のいずれかに記載されるような１つ以上の修正を有する第２の態様に係る組み換え型の微生物を生成する方法を提供する。
【００２８】
第３の態様において、発明は、１つ以上の発酵生成物を生成する方法であって、その方法が、カルボキシド栄養性微生物の存在下でＣＯを含む基質を嫌気的に発酵させることを含み、カルボキシド栄養性微生物が、第１の態様に記載されるようなまたは第２の態様によって生成されるような組み換え型の微生物である、方法を提供する。
【００２９】
特定の実施形態において、１つ以上の発酵生成物が、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、高級アルコール、ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレノイド、脂肪酸及び／または生体高分子を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、ＣＯを含む基質が、ＣＯを含むガス状基質である。一実施形態において、基質が、産業廃棄ガスを含む。一定の実施形態において、ガスが、製鋼所の廃棄ガスまたは合成ガスである。
【００３１】
一実施形態において、基質は、典型的には、ＣＯの大きな比率、例えば、容量で少なくとも約２０％から約１００％のＣＯ、容量で２０％から７０％のＣＯ、容量で３０％から６０％のＣＯ、及び容量で４０％から５５％のＣＯなど、を含有することになる。特定の実施形態において、基質は、容量で約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％のＣＯ、または約５５％のＣＯ、または約６０％のＣＯを含む。
【００３２】
第４の態様において、発明は、反応において複数の共同因子を利用する目的で、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体あるいはそれらの機能的等価変異体の使用を提供する。好ましくは、複数の共同因子が、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。
【００３３】
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２、及びそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
【００３４】
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
【００３５】
特定の実施形態において、分岐ギ酸水素リアーゼ複合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５から６７まで、またはそれらの機能的等価変異体のいずれか１つによってコード化される。
【００３６】
第５の態様において、発明は、組み換え型の微生物であって、微生物が、反応において複数の共同因子を利用するように適合されるように、微生物は、外因性分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体を発現するように、ならびに／あるいは内因性分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体を過剰発現するように適合された、組み換え型の微生物を提供する。
【００３７】
第６の態様において、発明は、反応において複数の共同因子を利用し得る組み換え型の微生物を作製する方法であって、少なくとも、
ａ）１つ以上の分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体を選択するステップと、
ｂ）親の微生物を転換して、反応において複数の共同因子を利用するように適合される組み換え型の微生物を生じるステップと、を含む、方法を提供する。
【００３８】
第５または第６の態様の一実施形態において、複数の共同因子が、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。
【００３９】
第５または第６の態様の一実施形態において、親の微生物は、カルボキシド栄養性クロストリジウムである。一実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム・フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナムを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群から選択される。一実施形態において、親の微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、ＤＳＭ１００６１株の誘導体である。別の特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００４０】
第５または第６の態様の一実施形態において、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼは、ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２、及びそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
【００４１】
第５または第６の態様の一実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
【００４２】
第５または第６の態様の一実施形態において、分岐ギ酸水素リアーゼ複合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５から６７まで、またはそれらの機能的等価変異体によってコード化される。
【００４３】
第５または第６の態様の特定の実施形態において、親の微生物は、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体をコード化する１つ以上の外因性ポリヌクレオチドで転換される。１つの特定の実施形態において、親の微生物は、ＨＱ８７６０１５、ＣＬＪＵ＿ｃ０６９９０、ＡＥＩ９０７２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５から６７まで、及びそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択された１つ以上の外因性ポリヌクレオチドで転換される。
【００４４】
関連した態様において、発明は、反応において複数の共同因子を利用する目的で、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体を含む組み換え型の微生物の使用を提供する。好ましくは、複数の共同因子が、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。一実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体は、第４の態様において記載されたようなものである。
【００４５】
第７の態様において、発明は、反応の効率を増す方法であって、その方法が、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／もしくはギ酸水素リアーゼ複合体、ならびに／またはそれらと同じものをコード化するポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらと同じものを発現する及び／または過剰発現するように適合された組み換え型の微生物の使用を含む、方法を提供する。特定の実施形態において、反応は、ＣＯを含む基質の発酵である。効率は、ＮＡＤＰＨのみではなくて、フェレドキシンとＮＡＤＰＨの両方を利用する分岐酵素に起因して、増される。理論によって縛られることを望まずに、発明者らは、フェレドキシンのより負の酸化還元電位（Ｅ０’＝−４１０ｍＶ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（Ｅ０’＝−３２０ｍＶ）に結合することは、より大きなエネルギーの電位を提供して、更なる発エルゴン反応を推進して、したがって、反応速度及びＣＯ基質処理量を増加することを信じている。
【００４６】
特定の実施形態において、第７の態様の分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体は、第４の態様に記載されたようなものである。
【００４７】
第８の態様において、発明は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するための組み換え型の微生物の使用を提供するものであり、組み換え型の微生物は、単一のＮＡＤＨ依存性還元型フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素を発現する及び／または過剰発現するように適合される。特定の実施形態において、Ｎｆｎ酵素が、ＳＥＱ＿ＩＤ  Ｎｏ．２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０のアミノ酸配列、または少なくとも７６％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を含む。Ｎｆｎ酵素は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換して、したがって、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性酵素の存在下で発現されるときに、酵素効率が増されて、ＮＡＤＰＨの高速反応速度と高速再生速度を導く。
【００４８】
特定の実施形態において、微生物は、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を含む。更なる実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群から選択される。
【００４９】
更なる実施形態において、発明は、第８の態様に記載されるような使用を提供するものであり、組み換え型の微生物が、第５の態様に記載されたような１つ以上の修正を含む。
【００５０】
第９の態様において、発明は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するためのポリペプチドの使用を提供するものであり、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０に従う単一のＮＡＤＨ依存性還元型フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素、または少なくとも７６％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、第８または第９の態様の単一のＮｆｎ酵素が、ポリヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３によってコード化されて、その配列は、ＹＰ＿００３７８１８５２．１またはＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０、あるいは少なくとも８３％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体をコード化する。
【００５２】
第１０の態様において、発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ  ＮＯ．１または３に係るポリヌクレオチドを提供する。
【００５３】
第１１の態様において、発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ  ＮＯ．２または４に係るポリペプチドを提供する。
【００５４】
第１２の態様において、発明は、第１０の態様に係るポリヌクレオチド、または第１１の態様に係るポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００５５】
第１３の態様において、発明は、第１０の態様に係るポリヌクレオチド、または第１１の態様に係るポリペプチドを発現するように適合された組み換え型の微生物を提供する。
【００５６】
本発明はまた、出願の明細書において参照されたか示された部分、要素及び特徴に、その部分、要素もしくは特徴のうちの２つ以上のいずれかまたは全ての組み合わせにおいて、個別的にあるいは集合的にあることが広く言えるであろうし、ここで、特定の整数が本明細書において述べられ、それは、本発明が関連する分野における既知の均等物を有しており、そのような既知の均等物は、個別に説明されるかのように、本明細書に組み込まれるようにみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照にして、ほんの一例として、次に記載されることになる。
【００５８】
【図１】それらの共同因子特異性を決定するためのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に関わるオキシドレダクターゼステップについての酵素測定の結果を示す。
【図２】共同因子の使用に関して（例えば、大腸菌における）糖分解と、カルボキシド栄養性クロストリジウム（例えば、Ｃ．オートエタノゲナム）におけるＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路による自己栄養成長との差を示す。
【図３】ギ酸水素リアーゼ複合体を形成することができるギ酸デヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼ遺伝子の構成を示す。
【図４】ｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現結果の分布を示しており、自己栄養成長の間に大いに発現されたＮＡＤＰＨ依存性反応を強調している。
【図５】Ｃ．オートエタノゲナムの第２級アルコールデヒドロゲナーゼならびに基質としてアセトン及び共同因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかを用いる酵素測定の結果を示す。活性は、ＮＡＤＨではなくて、ＮＡＤＰＨのみを用いて測定されて、この酵素が厳密にＮＡＤＰＨ依存性であることを実証している。
【図６】高い率でのＮＡＤＰＨ依存性第２級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によるアセトンのイソプロパノールへの連続的な変換を示す。アセトンが、バイオリアクタへの導入の直後にイソプロパノールに変換されることが見られ得る。２０ｇ／Ｌの高濃度でさえも、培養物が全てのアセトンをイソプロパノールに変換して、ＮＡＤＰＨプールが高い率でさえもこれを持続するのに十分であることを実証している。
【図７】新規な電子−分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ／ギ酸水素リアーゼ複合体によるＣＯ上の成長の間にＮＡＤＰＨ推進型生成物の形成を示す。
【図８】ブタノール生合成のための完全なＮＡＤＰＨ依存性経路を示す。各ステップは、イタリック体で注釈を付けられた遺伝子にコード化される酵素によって触媒される。
【図９】Ｃ．オートエタノゲナムＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨレベルの分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
用語「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド」（ＮＡＤＨ）は、ＮＡＤ＋（酸化型）とＮＡＤＨ＋Ｈ＋（還元型）の両方の酸化還元対のことを言い得る。
【００６０】
用語「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸」（ＮＡＤＰＨ）は、ＮＡＤＰ＋（酸化型）とＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋（還元型）の両方の酸化還元対のことを言い得る。
【００６１】
本明細書において呼ばれる際、「ＮＡＤＰＨ依存性酵素」は、主に（必ずしも排他的にではないが）共同因子としてＮＡＤＰＨを使用して、反応するための電子を供給する。同様に、ＮＡＤＨ依存性酵素は、主に（必ずしも排他的にではないが）共同因子としてＮＡＤＨを使用して、反応するための電子を供給する。また、いくつかの酵素が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨを利用できることと、二機能性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酵素として呼ばれ得ることとは、当業者によって理解されるであろう。
【００６２】
本明細書において呼ばれる際、言い回し「微生物によるＮＡＤＰＨの全体的な利用が増加される」、または同様のものは、特定の期間に酵素に結合するＮＡＤＰＨ共同因子の量における増加のことを言う。特定の実施形態において、増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％のものである。この増加は、実施例３において使用される方法、または当分野において既知の他の方法、例えば（Ｓ．Ｗａｎｇ、Ｈｕａｎｇ、Ｍｏｌｌ、＆Ｔｈａｕｅｒ、２０１０）に従って測定され得る。その言い回しはまた、経路を通るＮＡＤＰＨ流動における増加があり、その増加が上記したものと同じ量のものであることを意味するように解釈され得る。ＮＡＤＰＨ流動は、代謝物と生成物のレベル（メタボロミクス）及び／またはＣ１３として標識付ける実験（フラクソミクス）によって測定され得る。
【００６３】
本明細書において使用される際、「共同因子特異性」は、親和性の度合いであって、それをもって共同因子が反応の間に酵素に結合する、親和性の度合いのことを言う。酵素及び共同因子が絶対的な特異性を有することを意味するように取られるべきではないが、これは、あり得るかもしれず、また、特定の酵素と、別の共同因子を超える１つの共同因子との間の結合についての好みを少なくとも含む。
【００６４】
本明細書において呼ばれる際、酵素の「アイソフォーム」は、同じ反応を触媒して、全く同じではないが類似のアミノ酸配列を有することができる２つ以上の機能的に類似のタンパク質のいずれかである。
【００６５】
本明細書において呼ばれる際、「分岐酵素」は、複数の共同因子を利用することができる酵素であり、ここで、触媒され得ない反応を触媒する共役反応において、一方の共同因子が、より低い反応電位（例えばフェレドキシンなど）を有して、もう一方が、より高い反応電位（例えばＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨなど）を有しており、あるいは、ここで、反応は、より高い反応電位（例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなど）を有する共同因子だけによって、より低いレートで進むことになる。一実施形態において、分岐酵素は、複数の共同因子を利用し得、反応のレートを増加する。分岐酵素は、複合体、例えば本明細書に記載されたギ酸水素リアーゼ複合体などであり得る。
【００６６】
用語「ように適合される」は、本発明の組み換え型の微生物を記載するように本明細書において使用され得、例えば、微生物は、特定の酵素を表現する「ように適合される」。酵素の発現に関して使用されるとき、用語は、酵素が連続的に発現されることを暗示せず、酵素が発現され得、そのような発現が、構成性であり得るか誘発され得る状況を包含することが意図される。
【００６７】
本明細書において呼ばれる際、「発酵培養液」は、少なくとも栄養培地及び細菌細胞を含む培養培地である。
【００６８】
用語「効率を増す」、「増された効率」及び同様のものは、発酵プロセスに関して使用されるときに、限定されるものではないが、発酵を触媒する微生物の成長のレート、上昇した生成物濃度における成長及び／または生成物の生成、消費される基質の量当たりに生成される所望の生成物の量、所望の生成物の生成のレートまたは生成のレベル、ならびに発酵の他の副産物と比較した生成される所望の生成物の相対比率のうちの１つ以上を増やすことを含む。
【００６９】
言い回し「一酸化炭素を含む基質」や類似の用語は、任意の基質であって、それにおいて一酸化炭素が、例えば、成長及び／または発酵のために細菌の１つ以上の株（ｓｔｒａｉｎ）に利用可能である、任意の基質を含むことが理解されるべきである。
【００７０】
言い回し「一酸化炭素を含むガス状基質」及び類似の言い回しや用語は、あるレベルの一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。一定の実施形態において、基質は、容量で少なくとも約２０％から約１００％までのＣＯ、容量で２０％から７０％までのＣＯ、容量で３０％から６０％までのＣＯ、及び容量で４０％から５５％までのＣＯを含有する。特定の実施形態において、基質は、容量で約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％のＣＯ、または約５５％のＣＯ、または約６０％のＣＯを含む。
【００７１】
基質が水素を含有する必要はないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法に従う生成物形成の害にならない方がよい。特定の実施形態において、水素の存在は、アルコール生成の全体的な効率の改善を結果としてもたらす。例えば、特定の実施形態において、基質は、Ｈ２：ＣＯの約２：１、または１：１、または１：２の比率を含み得る。一実施形態において、基質は、容量で約３０％以下のＨ２、容量で２０％以下のＨ２、容量で約１５％以下のＨ２または容量で約１０％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、基質の流れは、例えば、５％よりも少ない、または４％よりも少ない、または３％よりも少ない、または２％よりも少ない、または１％よりも少ない低濃度のＨ２を含むか、あるいは実質的に水素がない。基質はまた、いくらかのＣＯ２、例えば、容量で約１％から約８０％までのＣＯ２、または容量で１％から約３０％までのＣＯ２などを含有し得る。一実施形態において、基質は、容量で約２０％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、基質は、容量で約１５％以下のＣＯ２、容量で約１０％以下のＣＯ２、容量で約５％以下のＣＯ２を含むか、あるいは実質的にＣＯ２を含まない。
【００７２】
後に続く記載において、本発明の実施形態は、「ＣＯを含有するガス状基質」を送り届けて発酵させる点で記載される。しかしながら、ガス状基質が代替の形態で提供されてもよいことが理解されるべきである。例えば、ＣＯを含有するガス状基質は、液体に溶解されて提供されてもよい。本質的に、液体は、ガスを含有する一酸化炭素で飽和されて、次いで、その液体は、バイオリアクタに追加される。これは、標準的な方法論を使用して実現され得る。例として、微小気泡分散発生器（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ  ｅｔ．ａｌ、Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１、Ｎｕｍｂｅｒ３／１０月、２００２）が使用され得る。更なる例として、ＣＯを含有するガス状基質が、固形支持体の上に吸着され得る。そのような代替の方法は、用語「ＣＯを含有する基質」及び同様のものの使用によって包含される。
【００７３】
本発明の特定の実施形態において、ＣＯを含有するガス状基質は、産業排ガスまたは廃棄ガスである。「産業廃棄ガスまたは排ガス」は、産業プロセスによって生成されたＣＯを含む任意のガスを含むように、ならびに鉄系金属生成物製造、非鉄生成物製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生成、カーボンブラック生成、及びコークス製造の結果として生成されたガスを含むように、広くみなされるべきである。更なる例が、本明細書における他の場所に提供され得る。
【００７４】
文脈が他のことを要求する場合を除いて、言い回し「発酵すること」、「発酵プロセス」または「発酵反応」及び同様のものは、本明細書において使用される際、プロセスの成長段階と生成物生合成段階の両方を包含することが意図される。本明細書において更に記載されることになるように、いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の成長リアクタ及び第２の発酵リアクタを含み得る。そういうものとして、発酵反応に対する金属または組成物の追加は、これらのリアクタのいずれかまたは両方に対する追加を含むように理解されるべきである。
【００７５】
用語「バイオリアクタ」は、１つ以上の容器及び／または塔もしくは配管から成る発酵デバイスを含み、それは、連続式撹拌槽リアクタ（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクタ（ＩＣＲ）、トリクルベッドリアクタ（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサー、あるいは気液接触に適した他の容器または他のデバイスを含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の成長リアクタ及び第２の発酵リアクタを含み得る。そういうものとして、バイオリアクタまたは発酵反応に対する基質の追加を言うときに、それは、適切な場合には、これらのリアクタのいずれかまたは両方に対する追加を含むことが理解されるべきである。
【００７６】
本明細書において呼ばれる際、「シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）微生物」は、微生物であって、それにおいてメチルトランスフェラーゼ酵素が発現され、目的微生物とは異なる微生物である。
【００７７】
本明細書において呼ばれる際、「目的微生物」は、微生物であって、それにおいて発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現され、シャトル微生物とは異なる微生物である。
【００７８】
「外因性核酸」は、微生物の外側に起因する核酸であり、その微生物に対してそれらが導入される。外因性核酸は、任意の適切な源から得られ得、限定されるものではないが、微生物であって、その微生物に対してそれらが導入されることになる微生物（例えば、親の微生物であって、その親の微生物から組み換え型の微生物が得られる、親の微生物）、生物とは異なる微生物の株もしくは種であって、それに対してそれらが導入されることになるか、それらが人工的または組み換え式に生成され得る、株もしくは種を含む。一実施形態において、外因性核酸は、微生物内に自然に存在する核酸配列であって、その微生物に対してそれらが導入されることになり、ならびにそれらが（例えば、配列（例えば、遺伝子）のコピー数を増やすことによって、または強いもしくは構成性プロモーターを導入して発現を増やすことによって、）特定の遺伝子の発現または過剰発現を増やすように導入される、核酸配列を表わす。別の実施形態において、外因性核酸は、微生物内に自然に存在しない核酸配列であって、その微生物に対してそれらが導入されることになり、ならびに微生物内に自然に存在しない生成物の発現または（例えば、プロモーターなどのような調整要素の導入の場合において）微生物生まれの遺伝子の発現の増加を可能にさせる、核酸配列を表わす。外因性核酸は、微生物のゲノムであって、その微生物に対してそれが導入されることになるか染色体外の状態にとどまる、微生物のゲノムに組み込むように適合され得る。
【００７９】
「外因性」はまた、タンパク質を言うために使用され得る。これは、親の微生物において存在しないか発現されることができないタンパク質であって、その親の微生物から組み換え型の微生物が得られる、タンパク質のことを言う。
【００８０】
用語「内因性」は、組み換え型の微生物及び核酸に関して本明細書において使用される際、親の微生物において存在する任意の核酸であって、その親の微生物から組み換え型の微生物が得られる、核酸のことを言う。タンパク質を説明するために使用されるとき、「内因性」は、親の微生物において存在するか発現されることができる任意のタンパク質であって、その親の微生物から組み換え型の微生物が得られる、タンパク質のことを言うようにみなされるべきである。
【００８１】
（「デヒドロゲナーゼ」または「オキシダーゼ」としても知られる）「オキシドレダクターゼ」は、電子供与体とも呼ばれる、１つの分子−還元剤から、電子受容体とも呼ばれる、別の分子−酸化剤への電子の伝達を触媒する酵素を含む。オキシドレダクターゼは、酵素のＥＣ番号分類においてＥＣ１として分類される。酵素のこの群は、通常、共同因子、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはフェレドキシンなどを要求する。
【００８２】
酵素による「反応」は、本明細書において呼ばれる際、酵素によって触媒される別の１つ以上の分子（生成物）への１つ以上の分子（基質）の変換である。
【００８３】
本発明は、核酸であって、その核酸の配列が、それらが実質的に同じ機能を果たすという前提で、本明細書において具体的に例示される配列とは異なる、核酸を使用して実施され得ることが理解されるべきである。タンパク質またはペプチドをコード化する核酸配列の場合、これは、コード化されるタンパク質またはペプチドが実質的に同じ機能を有することを意味する。プロモーター配列を表わす核酸配列の場合、変異体配列は、１つ以上の遺伝子の発現を促進する能力を有することになる。そのような核酸は、本明細書において「機能的等価変異体」として呼ばれ得る。例として、核酸の機能的等価変異体は、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片、突然変異（欠失、挿入、ヌクレオチド置換及び同様のもの）を含む遺伝子及び／または多形ならびに同様のものを含む。他の微生物からの相同遺伝子はまた、本明細書において具体的に例示された配列の機能的等価変異体の例として考えられ得る。これらは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、Ｃ．リュングダリイなどの種における相同遺伝子を含み、それらの詳細は、例えばＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのようなウェブサイト上で公的に利用可能である。言い回し「機能的等価変異体」はまた、核酸であって、その核酸の配列が特定の生物のためのコドン最適化の結果として変動する、核酸を含むようにみなされるべきである。文脈が他のことを要求する場合を除いて、本明細書における核酸の「機能的等価変異体」は、好ましくは、特定された核酸と少なくとも約７０％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の核酸配列同一性を有することになる。
【００８４】
また、本発明は、ポリペプチドであって、そのポリペプチドの配列が、本明細書において具体的に例示されたアミノ酸配列とは異なる、ポリペプチドを使用して実施され得ることも理解されるべきである。これらの変異体は、本明細書において「機能的等価変異体」として呼ばれ得る。文脈が他のことを要求する場合を除いて、タンパク質またはペプチドの機能的等価変異体は、特定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上のアミノ酸同一性を共有するそれらのタンパク質またはペプチドを含み、興味のあるペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ機能を有する。そのような変異体は、それらの範囲内にタンパク質またはペプチドの断片を含み、その断片が、ポリペプチドの切断形態を含み、欠失は、１から、５まで、１０まで、１５まで、２０まで、２５までのアミノ酸であり得、ポリペプチドの両端において残基１から２５まで拡張し得、欠失は、その領域内の任意の長さのものであり得、あるいは内部位置にあり得る。本明細書における特定のポリペプチドの機能的等価変異体はまた、例えば、前の段落に例示されたように、細菌の他の種における相同遺伝子によって発現されたポリペプチドを含むようにみなされるべきである。
【００８５】
本明細書において使用される際、「実質的に同じ機能」は、核酸またはポリペプチドが、核酸またはポリペプチドであって、その内、それが変異体である、核酸またはポリペプチドの機能を果たすことができることを意味するように意図される。例えば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同じ反応を触媒することができることになる。しかしながら、変異体が、ポリペプチドまたは核酸であって、その内、それが変異体である、ポリペプチドまたは核酸と同じレベルの活性を有することを意味するようにみなされるべきではない。
【００８６】
機能的等価変異体が、当業者に知られた方法を使用して、核酸またはポリペプチドであって、その内、それが変異体である、核酸またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有するかどうかを評価し得る。しかしながら、例として、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼまたはメチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼの活性について試験するための測定が、（Ｈｕａｎｇ、Ｗａｎｇ、Ｍｏｌｌ、＆Ｔｈａｕｅｒ、２０１２）に記載される。
【００８７】
本発明に関して使用されるとき、「過剰に発現」、「過剰発現」及び類似の用語や言い回しは、同じ条件下で親の微生物の（核酸を含む）タンパク質の発現レベルと比較して、（同じものをコード化する１つ以上の核酸の発現を含む）１つ以上のタンパク質の発現における任意の増加を含むように広くみなされるべきである。それは、タンパク質（または核酸）が、任意の特定のレベルで発現されることを意味するようにみなされるべきではない。
【００８８】
本明細書において呼ばれる際、「弱化された発現」は、親の微生物におけるそれの発現に対して減らされる核酸またはタンパク質の発現のことを言う。一実施形態において、弱化された発現は、実質的に発現がないこと（または実質的に「ゼロの」発現）を含み得る。これは、例えば、ＲＮＡサイレンシング、発現プロセスの修正（例えば、プロモーター機能の崩壊）、（１つ以上のヌクレオチドの欠失、追加及び置換を含む）核酸配列の変更または修正、あるいはゲノムから酵素をコード化する核酸の完全なまたは部分的な除去を含む、当業者に知られた任意の方法によって実現され得る。遺伝子が機能しないようにされる場合、それは、本明細書において「無力化する（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」または「無力化され（ｋｎｏｃｋｅｄ  ｏｕｔ）」ているあるいは類似の用語として呼ばれ得る。
【００８９】
「親の微生物」は、本発明の組み換え型の微生物を生じさせるために使用される微生物である。親の微生物は、自然に発生するもの（すなわち、野生型の微生物）、または前に修正されているものの本発明の主題の酵素の１つ以上を発現しないか過剰発現しないものであり得る。したがって、本発明の組み換え型の微生物は、親の微生物において発現されていないか過剰発現されていない１つ以上の酵素を発現するか過剰発現するように修正される。
【００９０】
一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム・フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナム、アセトバクテリウム・ウーディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）、アルカリバクラム・バッチィ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ）、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、スポロミュサ・オヴァタ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔｅ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ユーバクテリウム・リモーサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ）、サーモアナエロバクター・キウヴィ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉ）種を含む酢酸生成性カルボキシド栄養性生物の群から選択される。
【００９１】
これらのカルボキシド栄養性アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ、アセテート及び他の生成物を形成する嫌気条件下でエネルギー源として、ガス状の１つの炭素（Ｃ１）源、例えば一酸化炭素（ＣＯ）ならびに一酸化炭素（ＣＯ）及び／または水素（Ｈ２）を有する二酸化炭素（ＣＯ２）などの上で化学自己栄養的に利用して成長するそれらの能力によって定義される。それらは、発酵の同じ形態、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌまたは還元的なアセチル−ＣｏＡ経路を共有しており、ならびに一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）から成る酵素の組の存在によって定義されており、その組み合わせは、この種の細菌に特有であって固有である（Ｄｒａｋｅ、Ｋuｓｅｌ、Ｍａｔｔｈｉｅｓ、Ｗｏｏｄ、＆Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、２００６）。基質をバイオマス、二次代謝産物及びピルビン酸塩に変換する糖発酵細菌の化学従属栄養性の成長であって、そのバイオマス、二次代謝産物及びピルビン酸塩から生成物が（アセチル−ＣｏＡによってまたは直接的に）形成される成長とは対照的に、アセトゲン（ａｃｅｔｏｇｅｎ）では、基質は、アセチル−ＣｏＡに直接的に導かれ、そのアセチル−ＣｏＡから生成物、バイオマス、及び二次代謝産物が形成される。
【００９２】
一実施形態において、微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、及び「Ｃ．ラグスダレイ」種ならびに関連した分離株を含むカルボキシド栄養性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定されるものではないが、Ｃ．オートエタノゲナムＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ、Ｎａｖｅａｕ、＆Ｎｙｎｓ、１９９４）、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／２００９／０６４２００）、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ、Ｍｉｌｌｅｒ、＆Ｙａｎｇ、１９９３）、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、または「Ｃ．ラグスダレイＰ１１Ｔ」（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）（ＷＯ２００８／０２８０５５）株、及び関連した分離株、例えば「Ｃ．コスカチィ（Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ）」（米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ３５１」（Ｔｙｕｒｉｎ＆Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０１２）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ６５３」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ａ）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ６８３」（Ｂｅｒｚｉｎ、２０１２）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ９６２」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１３）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ１１２１」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ｂ）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ１２３０」（Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１３）、または「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ１９６２」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｔｙｕｒｉｎ、＆Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０１３）など、及びそれらの突然変異株、例えばＣ．リュングダリイＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０）または「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ８９６」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ｃ）などを含む。
【００９３】
これらの株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子レベル上で少なくとも９９％の同一性を有するものの、ＤＮＡ−ＤＮＡ再結合やＤＮＡ指紋採取実験によって決定されるような（ＷＯ２００８／０２８０５５、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）異なる種である、クロストリジウム属のｒＲＮＡクラスターＩ内にサブクラスターを形成する（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ、１９９４）。
【００９４】
このクラスターの株は、類似の遺伝子型と表現型の両方を有する、共通の特徴によって定義されており、それらは全て、エネルギー変換及び発酵性代謝の同じ形態を共有する。このクラスターの株は、シトクロムを欠いており、エネルギーをＲｎｆ複合体によって保存する。
【００９５】
このクラスターの全ての株は、約４．２ＭＢｐのゲノムサイズ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０）及び約３２％モルのＧＣ組成（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９３）（ＷＯ２００８／０２８０５５、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、ならびにＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸塩：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、２０１１）についてコード化する保存された必須の重要な遺伝子オペロンを有する。ガスの取り込みに関与する、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の構成や数は、核酸及びアミノ酸配列における差にもかかわらず、全種において同じであることが分かっている（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）。
【００９６】
株は全て、類似の形態やサイズを有しており（対数的に成長する細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍの間にあり）、中温性（３０〜３７℃の間の最適の成長温度）であり、厳密に嫌気性生物である（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９３）（ＷＯ２００８／０２８０５５）。その上、それらは全て、同じ主要な系統発生的形質、例えば同じｐＨ範囲（最適の最初のｐＨが５．５〜６で、ｐＨ４〜７．５）など、類似の成長率を有するＣＯ含有ガス上の強い自己栄養成長、ならびに一定の条件下で形成された少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸を伴う、主な発酵最終生成物としてエタノールと酢酸を有する代謝プロファイル（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１１、Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９３）を共有する（ＷＯ  様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用において区別する。それらの種のうちのいくつかは、一定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求体であることが発見された一方、他は発見されていない。それらの対応するアルコールへのカルボキシル酸の還元は、これらの生物の範囲において示されている（Ｐｅｒｅｚ、Ｒｉｃｈｔｅｒ、Ｌｏｆｔｕｓ、＆Ａｎｇｅｎｅｎｔ、２０１２）。
【００９７】
したがって、記載された形質は、Ｃ．オートエタノゲナムまたはＣ．リュングダリイのような１つの生物に特異的ではなくて、むしろ、カルボキシド栄養性の、エタノール合成クロストリジウムのための一般的な形質に特異的である。それ故、本発明は、これらの株にわたって作用することが期待され得るが、能力における差があり得る。
【００９８】
一定の実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイを含む群から選択される。一実施形態において、その群はまた、クロストリジウム・コスカティを含む。１つの特定の実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３である。
【００９９】
用語、核酸「構築物」または「ベクター」及び類似の用語は、遺伝物質を細胞に伝達する媒体としての使用に適した任意の（ＤＮＡとＲＮＡを含む）核酸を含むように広くみなされるべきである。それらの用語は、プラスミド、（バクテリオファージを含む）ウィルス、コスミド及び人工染色体を含むようにみなされるべきであり、例えば、構築物またはベクターは、１つ以上の調整要素、複製の元、マルチクローニングサイト及び／または選択可能なマーカーを含み得る。１つの特定の実施形態において、構築物またはベクターは、構築物またはベクターによってコード化される１つ以上の遺伝子の発現を可能にするように適合される。核酸構築物またはベクターは、細胞に送り届けることを容易にする裸の（ｎａｋｅｄ）核酸ならびに１つ以上の作用物質で構築される核酸（例えば、リポソーム抱合核酸、生物であって、その中に核酸が含まれる、生物）を含む。
【０１００】
廃棄ガスや合成ガス上で成長するカルボキシド栄養性クロストリジウムの全ての既知の例は、ＮＡＤＨ依存性反応を使用する。酸化還元対ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋／ＮＡＤＰ＋は、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋／ＮＡＤ＋酸化還元対より負の酸化還元電位を有する（Ａｕｒｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）。生体内の条件下において、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対の酸化還元電位Ｅ´は、約−２８０ｍＶ（Ｅｏ´＝−３２０ｍＶ）であるのに対して、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ対のＥ´は、約−３６０ｍＶ（Ｅｏ´＝−３２０ｍＶ）である。発明者らは、驚いたことには、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２ガスの取り込みや利用のための自己栄養成長に関わる多数の酵素（例えば、ヒドロゲナーゼ酵素及びＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素）は、ＮＡＤＨを超えてＮＡＤＰＨの利用の方に明確な偏りを示すことを発見した。これは、例えば、大部分の細菌性のプロセスのためのモデルとして機能するとともに完全にＮＡＤＨに偏った大腸菌などの細菌を利用する糖の糖分解とは完全に対照的である。これらの大腸菌をベースとした反応は、ＮＡＤＰＨ依存性反応ステップを含まないものの、いくつかのＮＡＤＨ依存性ステップ（グルコース＋２ＮＡＤ＋＋２ＡＤＰ＋２Ｐｉ−＞２ピルビン酸塩＋２ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋＋２ＡＴＰ＋２Ｈ２Ｏ、図２）を含む。
【０１０１】
大腸菌におけるＮＡＤＰＨ依存性反応は、ＮＡＤＰＨプールを急速に使い果たして、細胞成長の阻害や死に導くことが示されている。大腸菌におけるＮＡＤＰＨ容量のこの欠如は、ＮＡＤＰＨ依存性を減らすことを試みる先行研究につながっており、したがって、その研究は、ＮＡＤＰＨ利用の増加が発酵反応において望まれないであろうことを提案する。したがって、発明者らにとって、本明細書において参照されるカルボキシド栄養性クロストリジウムは、進行するＮＡＤＰＨ依存性反応のための比較的大きな容量を有することを発見することは驚きであった。
【０１０２】
発明者らは、ＮＡＤＰＨ依存性酵素によるバイオリアクタ内のアセトンの変換を監視する実験によって、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物において比較的大きな容量のＮＡＤＰＨプールを実証した（例３を参照）。したがって、発明者らは、ＮＡＤＨを超えるＮＡＤＰＨの使用は、発酵プロセスにおいて酵素による反応を推進するのに好ましいことを示した。
【０１０３】
それ故、ＮＡＤＨ依存性反応を使用して、ＮＡＤＰＨ依存性反応をバイパスする（それは、生産歩留りの低下を結果としてもたらして、広範囲にわたる修正を要求する）大腸菌のための既存の戦略は、カルボキシド栄養性クロストリジウムにおいて生産的ではない。本明細書に記載されるような発明は、カルボキシド栄養性クロストリジウムにおいてＮＡＤＰＨ依存性反応について優先的に選択することによってこれを克服する戦略を提供して、代謝工学技術のための最大の生産歩留りを実現する。ＮＡＤＰＨ依存性反応の容量や電位は、実施例３ならびに大腸菌を利用する糖に対する差に示される。同様に、この戦略は、非相同経路に適用され得、最大の生産歩留りや流動を実現する。
【０１０４】
更に、発明者らは、ＮＡＤＰＨ依存性反応が、カルボキシド栄養性微生物において急増することを特定した。これは、ＮＡＤＰＨプールを使用する酵素と遺伝子を特定して特徴付けるための選択技法の開発を可能にする。これらの技法に従って選択された酵素を発現するか過剰発現することができる組み換え型の微生物が、カルボキシド栄養性微生物の効率を改善することと、それらの所望の生成物の生成を増加することとにおいて、実用性を有する。
【０１０５】
例えば大腸菌などのような生物を利用する糖に関して先行技術によって教示されたものとは対照的に、発明者らは、ＮＡＤＰＨ依存性反応が、カルボキシド栄養性微生物を考慮するときに、望ましくない障害ではないことを考察する。発明者らは、実際、ＮＡＤＰＨを利用する酵素が、それらが、ＮＡＤＨの存在下でそれらの活性と比較されるときに、それの存在下で増加された活性を有するので、肯定的に望ましいことを信じている。
【０１０６】
ＮＡＤＰＨ依存性酵素が、所望の生成物の生成を推進するために使用され得るという発見は、発明者らに、これらの酵素を発現するか過剰発現することができる新規な組み換え型の微生物を工学操作させることを導いた。これらの組み換え型の微生物は、新規な経路が探究されることと、所望の生成物が生成されることと、を可能にする。特定の実施形態において、組み換え型の微生物は、カルボキシド栄養性微生物である。ＮＡＤＰＨ依存性酵素が回避されるかバイパスされるべきであることが以前考えられていたのに対して、発明者らは、驚いたことには、カルボキシド栄養性微生物におけるこれらの酵素の利用が、微生物の成長及び／または生成における減少をもたらさないことと、そのような酵素を回避する広範囲にわたる工学操作が必要ではないことと、を示した。
【０１０７】
本発明の第１の態様に従って、１つ以上の外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するように適合された、及び／または１つ以上の内因性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物が提供されており、酵素は、外因性酵素が発現されるときに、及び／または内因性酵素が過剰発現されるときに、微生物によるＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加されるように選択される。
【０１０８】
更なる態様において、本発明はまた、親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨ利用を呈する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を生成する方法であって、
ａ．１つ以上の外因性及び／または内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を選択することと、
ｂ．親の微生物を転換して、１つ以上の外因性酵素を発現する、及び／または１つ以上の内因性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生じることと、を含む方法を提供するものである。
微生物におけるＮＡＤＰＨ依存性酵素の任意の１つ以上の発現または過剰発現は、微生物に対するＮＡＤＰＨの利用であって、それにおいて１つ以上の酵素が、発現されないか過剰発現されない、微生物に対するＮＡＤＰＨの利用における全体的な増加を結果としてもたらす。
【０１０９】
１つ以上の酵素は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームで存在し得る。特定の実施形態において、組み換え型の微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される。本発明の方法は、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨの利用が類似の範囲内にある特定の実用性のものであり、すなわち、共同因子を利用するアイソフォームの活性が、それがＮＡＤＨ共同因子に結合するときに、それがＮＡＤＰＨ共同因子に結合するときのアイソフォームの活性に類似する。
【０１１０】
特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が、（例えば、Ｓｅｑ．ＩＤ６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、ＹＰ＿００３７８１０１６、ＹＰ＿００３７８１０１７、ＹＰ＿００３７７８８７９、ＹＰ＿００３７７９６４０、ＹＰ＿００３７７９８９３、ＹＰ＿００３７８０１９３に従う、アミノ酸配列、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を有する）ヒドロゲナーゼ、（例えば、ＡＥＩ９０７２１、ＡＥＩ９０７２３、ＡＥＩ９０７２５、ＹＰ＿００３７７９０６３、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＹＰ＿００３７８０１６８、ＡＥＩ９０７２２、ＡＥＩ９０７２４、ＡＥＩ９０７２６のアミノ酸配列、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を有する）ギ酸デヒドロゲナーゼ、あるいは（例えば、ＡＥＩ９０７５３、ＹＰ＿００３７８１８９１、ＡＥＩ９０７７１のアミノ酸配列、またはそれらの機能的等価変異体を有する）メチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼを含む。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性反応の選択肢が存在する。本発明は、親の微生物におけるＮＡＤＰＨ利用に対してＮＡＤＰＨの全体的な利用を増加させる手段として、ＮＡＤＨ依存性アイソフォームと比較してＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを優先的に使用する組み換え型の微生物及び方法を提供する。そのような経路及びオキシドレダクターゼ反応の例は、以下を含む。
・イソプレノイド生成物のためのメバロン酸経路：
〇ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ（Ｓ．Ｍ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）：
・ＮＡＤＰＨ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．３４、ＧＯ：０００４４２０、例えば、出芽酵母：ＤＡＡ０９８２２．１、ＢＫ００６９４６．２：１１５７３４．．１１８８９８）及び
・ＮＡＤＨ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．８８、ＧＯ：００４２２８２、例えば、シュードモナス・メバロニイ：Ｐ１３７０２．１）
・ブタノール／ＰＨＢ経路（Ｂｏｎｄ−Ｗａｔｔｓ、Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、＆Ｃｈａｎｇ、２０１１）：
〇３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ／３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドラターゼ：
・ＮＡＤＰＨ依存性ｐｈａＢ（ＥＣ：１．１．１．３６、ＧＯ：００１８４５４、例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ＿７２５９４２．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８４から）及び
・ＮＡＤＰＨ依存性ｐｈａＪ（ＥＣ４．２．１．１１９、例えば、アエロモナス・プンクタタ：ＢＡＡ２１８１６．１から）
・ＮＡＤＨ依存性ｈｂｄ（ＥＣ１．１．１．１５７、ＧＯ：０００８６９１、例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１４．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９１から）
〇クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ／クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−レダクターゼ／トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）：
・ＮＡＤＰＨ依存性ｃｃｒ（ＥＣ１．３．１．８６、例えば、ストレプトマイセス・コリナスから）またはｃｃｒＲｓ（ＥＣ１．３．１．８５、例えば、ロドバクター・スフェロイデス：ＹＰ＿３５４０４４．１、遺伝子ＩＤ：３７２０７５１から）
・ＮＡＤＨ依存性ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば、トレポネーマ・デンティコラから）
・ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐ｂｃｄ−ｅｔｆＡＢ複合体（ＥＣ１．３．８．１、ＧＯ：０００４０８５、例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１７．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９４から）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００８）または
・ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ二機能性依存性ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば、ユーグレナ・グラシリス：ＡＹ７４１５８２．１から）（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ、Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ、Ｎｏｗｉｔｚｋｉ、＆Ｍａｒｔｉｎ、２００５）
【０１１２】
デヒドロゲナーゼ（例えば、エタノールもしくはブタノールのためのアルコールデヒドロゲナーゼ、またはブタンジオールのためのジオールデヒドロゲナーゼ）及びオキシダーゼに関する大部分のオキシドレダクターゼ反応の場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性酵素の選択肢が利用可能であり、それぞれの酵素は、データベース、例えば、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＢＲＥＮＤＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｉｎｆｏ／）（Ｓｃｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）などを使用して特定され得る。
【０１１３】
特定の実施形態において、対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現が、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームの発現における変化と比較されるときに、変化しない、減る、または比較的小さな増加を呈する一方で、微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される。このようにして、ＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加される。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明は、組み換え型の微生物に、１つ以上のＮＡＤＨ依存性酵素の弱化された発現またはゼロの発現を提供する。１つの特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現は、親の微生物に比較して弱化されているか無力化されている。弱化／無力化は、１つ以上のＮＡＤＨ依存性酵素をコード化する核酸を修正することによって、またはＮＡＤＨ依存性アイソフォームをコード化する１つ以上の核酸を、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームをコード化する１つ以上の核酸と置き換えることによって、実現され得る。酵素の弱化または無力化は、任意の数の既知の転換及び組み換え型の核酸技法を使用して、本発明の微生物に到達するように親の微生物の転換によって実現され得る。カルボキシド栄養性アセトゲンにおける弱化または無力化を実現することができる特定の方法は、Ｌｅａｎｇ、Ｕｅｋｉ、＆Ｌｏｖｌｅｙ、２０１１に記載されており、更なる技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載されている。一般的な例として、突然変異を遺伝子に導入する場合、またはそうではなくて、遺伝子を分断するか無力化する場合において、適切な核酸構築物またはベクターが、遺伝子を分断するために親の微生物のゲノムに組み込むように設計され得る。そのような構築物は、典型的には、分断されることになる遺伝子内の範囲またはその遺伝子の側方に位置する範囲に相同である核酸配列（アーム）を含むことになり、それは、相同再結合が発生すること、及び突然変異の導入、遺伝子からの核酸の範囲の切除、または対照的なものについて核酸との遺伝子の範囲の置換が発生することを可能にする。構築物上のアームが、ゲノムにおける範囲であって、それらがターゲットとしている範囲に対して１００％の相補性を有することが好適であるが、配列が、興味の遺伝子範囲とのターゲットとされた再結合を可能にするのに十分に相補的であるという前提で、これは必要ではない。典型的には、アームは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８９に定義されるような、厳格な条件下で、ターゲット範囲に対する交配を可能にすることになる、あるレベルの相同性を有することになる。当業者は、本明細書に記載されるような発明に関わる酵素についての利用可能な配列情報を考慮して、ターゲットとされた相同再結合と、親の微生物のゲノムへの外因性核酸の組み込みと、を可能にするのに十分な核酸配列を理解するであろう。
【０１１５】
一実施形態において、酵素は、複数の共同因子依存性を呈し得る。そのような酵素は、ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素を含み得る。特定の実施形態において、酵素は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、微生物は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される。特定の実施形態において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームは、ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）：ＡＹ７４１５８２．１から、またはそれらの機能的等価変異体）である。更なる実施形態において、ＮＡＤＨ／Ｆｄ依存性アイソフォームは、ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐ｂｃｄ−ｅｔｆＡＢ複合体（ＥＣ１．３．８．１、ＧＯ：０００４０８５、例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１７．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９４から、またはそれらの機能的等価変異体）である。
【０１１６】
本発明の特定の実施形態において、微生物は、親の微生物に比較されるときに、発酵反応の間に増加された効率を呈する。発酵生成物の生成に関わる微生物は、共同因子としてＮＡＤＰＨを使用して、発酵生成物の成長や生成に関わる反応を促進する。そのような微生物が、ＮＡＤＨ共同因子と比較されるときに、ＮＡＤＰＨ共同因子のために高い親和性で酵素を発現する場合、ＮＡＤＰＨの利用の増加がある場合に、それらの効率（上記定義を参照）が増加されることになる可能性が存在する。
【０１１７】
本発明の酵素は、多数の生成物を生成する生合成経路に関わる。特定の実施形態において、経路は、メバロン酸経路またはブタノール合成経路である。
【０１１８】
本発明の一実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素の共同因子特異性は、それのＮＡＤＨ共同因子特異性に対してそれのＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するように修正され得る。
【０１１９】
特定の実施形態において、本発明は、酵素のＮＡＤＨ共同因子特異性に対してオキシドレダクターゼ酵素のＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加させることによって、カルボキシド栄養性微生物の効率を上げる方法を提供する。
【０１２０】
オキシドレダクターゼ酵素の共同因子特異性は、特に、それぞれのＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ結合ポケットの一部分に寄与するまたはその一部分を形成する酵素の範囲において、アミノ酸配列を修正することによって、ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨに（またはその逆に）修正され得る。ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ結合ポケットは、当分野において既知の他の手法で修正されてもよい。
【０１２１】
アミノ酸配列の修正は、１つ以上のアミノ酸残基の追加、欠失及び／または置換、あるいは当分野において容易に既知であり得る１つ以上の他の修正を含み得る。修正は、酵素の任意の範囲において起こり得る。しかしながら、一実施形態において、それは、ＮＡＤＨ結合ポケット内である。
【０１２２】
特定の実施形態において、アミノ酸配列の修正が、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素についてのグルタミン酸残基の例として、ＮＡＤＨ結合ポケットにおける（複数の）特定のアミノ酸残基の修正を含む。特定の実施形態において、グルタミン酸残基は、Ｃ．アセトブチリクムのｂｃｄにおけるＧｌｕ７５及び／またはＴ．デンティコラにおけるＧｌｕ８０である。一実施形態において、当分野において既知の所望された共同因子特異性を実現するための修正、例えば、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）に記載された修正が、使用され得る。
【０１２３】
特定の実施形態において、発明者らは、共同因子特異性の修正が、様々な種から上述のクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ／トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの構造上の分析、及びＮＡＤＰＨに対してＮＡＤＨを区別する際に重要な役割を果たすＧｌｕ（Ｃ．アセトブチリクムのｂｃｄにおけるＧｌｕ７５及びＴ．デンティコラにおけるＧｌｕ８０）の保護を通して、実現され得ることを想定する。理論によって縛られることを望まずに、これは、ＮＡＤＨのアデニンリボースの２’−ＯＨを認識する酵素によって起こることが信じられている。ＮＡＤＰＨ依存性酵素において、この残基は修正される（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）。
【０１２４】
共同因子特異性の修正を実現する方法は、当業者に知られることになる。しかしながら、例として、様々なオキシドレダクターゼ酵素のための共同因子特異性の変化に係わる以下の例において使用される方法が、使用され得る。
・１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（Ｃ．Ｍａ、Ｚｈａｎｇ、Ｄａｉ、＆Ｘｉｕ、２０１０）
・ｐ−ヒドロキシベンゾアートヒドロキシラーゼ（Ｅｐｐｉｎｋ、Ｏｖｅｒｋａｍｐ、Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ、＆Ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ、１９９９）
・１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＭｃＫｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２００２）
・ケトール酸レダクトイソメラーゼ（Ｒａｎｅ＆Ｃａｌｖｏ、１９９７）
【０１２５】
新規の分岐酵素
電子分岐は、嫌気細菌及び古細菌の細胞質において吸エルゴン的な酸化還元反応を発エルゴン的な酸化還元反応に結合する最近発見された機構である。現在までのところ、ごく少数の電子分岐酵素複合体が、特定されており、４つが特徴付けられている（Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｊａｙａｍａｎｉ、Ｍａｉ、＆Ｂｕｃｋｅｌ、２００８、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００８、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０１２、Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９、Ｇ．Ｗａｎｇ＆Ｗａｎｇ、１９８４）。２００８年に、酪酸形成クロストリジウムにおいて、ＮＡＤＨ（Ｅｏ´＝−３２０ＭＶ）でのクロトニル−ＣｏＡ（Ｅｏ´＝−１０ｍＶ）の発エルゴン的な還元が、ＮＡＤＨとのフェレドキシンの吸エルゴン的な還元（Ｅｏ´＝−４００ｍＶ）と結合されることと、その結合反応が、細胞質のブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ−電子伝達フラボタンパク質複合体Ｂｃｄ−ＥｔｆＡＢによって触媒されることと、が発見された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｊａｙａｍａｎｉ、Ｍａｉ、＆Ｂｕｃｋｅｌ、２００８、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００８）。このプロセスは、フラビンをベースとするものであり、タンパク質結合フラビンが、ＮＡＤＨによってヒドロキノンに還元され、それは、その後に、クロトニル−ＣｏＡによってセミキノン型ラジカルに再び酸化されて、それは、フェレドキシン（Ｆｄ）を還元するのに十分に負の酸化還元電位を有することが提案されている。現在までのところ、少数の電子分岐酵素複合体が、特定されており、４つが特徴付けられている（Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ、２００８、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００８、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０１２、Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９、Ｇ．Ｗａｎｇ＆Ｗａｎｇ、１９８４）。反応１のＢｃｄ−ＥｔｆＡＢ複合体に加えて、メタン生成古細菌からのＭｖｈＡＤＧ−ＨｄｒＡＢＣ複合体は、反応２を触媒して、細菌及び古細菌からのＮｆｎＡＢ複合体は、反応３を触媒して、細菌からのＨｙｄＡＢＣ複合体は、反応４を触媒する。
（１）２ＮＡＤＨ＋Ｆｄｏｘ＋クロトニル−ＣｏＡ→２ＮＡＤ＋＋Ｆｄｒｅｄ２−＋ブチリル−ＣｏＡ
ΔＧｏ´＝−４４ｋＪ／ｍｏｌ＊
（２）２Ｈ２＋ＣｏＭ−Ｓ−Ｓ−ＣｏＢ＋Ｆｄｏｘ→ＣｏＭ−ＳＨ＋ＣｏＢ−ＳＨ＋Ｆｄｒｅｄ２−＋２Ｈ＋
ΔＧｏ´＝−５０ｋＪ／ｍｏｌ＊
（３）ＮＡＤＨ＋Ｆｄｒｅｄ２−＋２ＮＡＤＰ＋＋Ｈ＋⇔ＮＡＤ＋＋Ｆｄｏｘ＋２ＮＡＤＰＨ
ΔＧｏ´＝−１６ｋＪ／ｍｏｌ＊
（４）ＮＡＤＨ＋Ｆｄｒｅｄ２−＋３Ｈ＋⇔ＮＡＤ＋＋Ｆｄｏｘ＋２Ｈ２
ΔＧｏ´＝＋２１ｋＪ／ｍｏｌ＊
＊−４００ｍＶのＥｏ´を使用する標準条件下（１Ｍ濃度の基質及び生成物、ガスの分圧＝１バール、ｐＨ＝７）
【０１２６】
これらの複合体の全ては、ＮＡＤＨ依存性であり、それらの間で２つ、異種の鉄のみのヒドロゲナーゼが、Ｈ２でのフェレドキシンの吸エルゴン的な還元を、Ｈ２でのＮＡＤの発エルゴン的な還元と可逆的に結合する（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０１２、Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９）。発明者らは、初めて、ＮＡＤＰＨ依存性分岐酵素（反応５）、ＮＡＤではなくてＮＡＤＰに特異的である新規な電子分岐［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼを特定した。
（５）ＮＡＤＰＨ＋Ｆｄｒｅｄ２−＋３Ｈ＋⇔ＮＡＤＰ＋＋Ｆｄｏｘ＋２Ｈ２
ΔＧｏ´＝＋２１ｋＪ／ｍｏｌ＊
＊−４００ｍＶのＥｏ´を使用する標準条件下（１Ｍ濃度の基質及び生成物、ガスの分圧＝１バール、ｐＨ＝７）
【０１２７】
この理論に拘束されずに、ヒドロゲナーゼに加えてこの複合体の役割は、ギ酸塩：水素リアーゼとして働くことである。この機能において、それは、Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ２−対の及びＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ対の細胞内の酸化還元電位がＣＯ過還元に起因して低くなり過ぎるときに、それぞれ、陽子とＣＯ２の還元によってＨ２及びギ酸塩を形成することによって、ＮＡＤＰＨ推進型の生成物形成のための電子オーバーフロー弁を表わす。
【０１２８】
生体内の条件下で、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対の酸化還元電位Ｅ´は約−２８０ｍＶ（Ｅｏ´＝−３２０ｍＶ）であり、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ対のＥ´は約−３６０ｍＶ（Ｅｏ´＝−３２０ｍＶ）である。Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ２−対の酸化還元電位Ｅ´は、かなり低い−４００ｍＶ（Ｃ．パストゥリアヌム・フェレドキシン（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）からのＥｏ´）である。そういうものとして、本発明のこの分岐プロセスの態様は、例えば高速反応速度などの利点を提供する。
【０１２９】
生体内の条件下で、フェレドキシンの酸化還元電位は、ほぼ−５００ｍＶであり、ＮＡＤＰは、ほぼ−３７０ｍＶの酸化還元電位にあり、ＮＡＤは、ほぼ−２８０ｍＶの酸化還元電位にあることが予測される。Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ２−対とＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対との間の約２００ｍＶの酸化還元電位差は、膜結合Ｒｎｆ複合体及びＦｏＦ１ＡＴＰシンターゼによって媒介された電子伝達リン酸化と結合されるのに十分大きい。フェレドキシンでのＮＡＤ＋還元は、ＣＯ上で成長するＣ．オートエタノゲナムのエネルギー代謝作用における主な結合部位であることが予測される。ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＰＨを生じるＮｆｎ触媒反応によって連続的に再生され、次いで、そのＮＡＤＰＨは、生成物形成を推進し得る（図７）。
【０１３０】
発明者らは、ＮＡＤではなくてＮＡＤＰに特異的である、新規な電子分岐［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼを特定した。発明者らはまた、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて発現されたギ酸デヒドロゲナーゼが、（本明細書において分岐ギ酸デヒドロゲナーゼと呼ばれる）ＮＡＤＰＨだけではなくて、フェレドキシンとＮＡＤＰＨの両方を利用できることも特定した。
【０１３１】
これらの酵素の新規な機能は、以前に知られておらず、特定されることになる最初のＮＡＤＰＨ依存性分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ及び分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ酵素である。発明者らによる更なる研究は、ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、本明細書においてギ酸水素リアーゼ複合体として呼ばれる、酵素複合体を形成することを示した。特定の実施形態において、この複合体はまた、複数の共同因子依存性を実現するための組み換え型の微生物の生成における実用性も有する。
【０１３２】
したがって、本発明は、反応において複数の共同因子（例えば、フェレドキシンやＮＡＤＰＨ）を利用する目的で、上記酵素を発現するかコード化する、組み換え型の微生物、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの使用を提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドが、ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２に従う分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を含む。
【０１３３】
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
【０１３４】
特定の実施形態において、分岐ギ酸水素リアーゼ複合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５から６７またはそれらの機能的等価変異体によってコード化される。
【０１３５】
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼまたはギ酸水素リアーゼ複合体をコード化するポリヌクレオチドが、ＨＱ８７６０１５、ＣＬＪＵ＿ｃ０６９９０、ＡＥＩ９０７２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７から６９、ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択された１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０１３６】
分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ及び分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼのために遺伝子をコード化するタンパク質は、ＮＡＤＰ結合部位を有する鉄−硫黄フラボタンパク質、鉄−硫黄（ＦｅＳ）タンパク質、ならびにセレノシステイン及びモリブドプテリン含有ギ酸デヒドロゲナーゼ（図３）のための遺伝子と共に、単一の遺伝子クラスターにおいて発明者らによって発見された。これらの遺伝子が、本明細書においてギ酸水素リアーゼ（実施例１を参照）と呼ばれることになる機能複合体をコード化することが、発明者らによって提案される。鉄−硫黄フラボタンパク質、鉄−硫黄（ＦｅＳ）タンパク質、ならびにギ酸塩及びモリブデン補助タンパク質は、以下の表１に示されるようにポリペプチドによってコード化される遺伝子クラスターを構成するものを含む。
【表１】
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【０１３７】
本発明はまた、反応において複数の共同因子を利用する目的のために使用されるときに、新規な分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ及び／またはギ酸水素リアーゼを発現する組み換え型のカルボキシド栄養性微生物を提供する。好ましくは、複数の共同因子は、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。
【０１３８】
本発明はまた、上記したように分岐ヒドロゲナーゼを発現する組み換え型のカルボキシド栄養性微生物を使用することによって、ＣＯ含有基質の発酵の効率を上げる方法を提供する。効率は、ＮＡＤＰＨだけではなくて、フェレドキシンとＮＡＤＰＨの両方を利用する分岐酵素に起因して増される。ＮＡＤＰＨと比較してフェレドキシンのより負の酸化還元電位は、より大きなエネルギーの電位を反応に提供して、したがって、反応速度とＣＯ基質処理量が増加する。
【０１３９】
加えて、発明者らは、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ及びＣ．ラグスダレイを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの種において新規なＮｆｎ酵素を特定した。このＮｆｎ酵素は、ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋に還元して、ＮＡＤＨ＋＋Ｈ＋を犠牲にしてプールを補給することができる（またはその逆）（反応２）：
（２）Ｆｄｒｅｄ２−＋ＮＡＤＨ＋２ＮＡＤＰ＋＋Ｈ＋⇔Ｆｄｏｘ＋ＮＡＤ＋＋２ＮＡＤＰＨ
【０１４０】
この酵素は、今までのところ、１つの生物、Ｃ．クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（Ｓ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１０）だけについて記載されており、ここで、それは、複合体を形成する２つのサブユニットＮｆｎＡ及びＮｆｎＢからなる。発明者らは、Ｃ．オートエタノゲナムの細胞における活性を特定して、対応する遺伝子を特定した（実施例４）。これは、初めて、単一のＮｆｎ遺伝子が特定されて、カルボキシド栄養性生物において初めて特定されたＮｆｎ酵素である。２つのサブユニットの複合体ではなくて、１つだけのサブユニットを有することは、酵素を生成することと修正することとを含む利点を有する。
【０１４１】
この理論に拘束されずに、発明者らは、２つの新規な複合体、電子分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ／ギ酸水素リアーゼ及びＮｆｎ複合体が、エネルギー保存及びＣＯから還元された生成物の形成において重大な役割を果たし、それが、反応７〜９（図７）の記載されたフェレドキシン依存性一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）、ＦｏＦ１Ｒｎｆ複合体（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、Ｔｒｅｍｂｌａｙ、Ｚｈａｎｇ、Ｄａｒ、Ｌｅａｎｇ、＆Ｌｏｖｌｅｙ、２０１２）と共にＮＡＤＰＨによって推進されることを信じている。
（７）ＣＯ＋Ｈ２Ｏ＋Ｆｄｏｘ⇔ＣＯ２＋Ｆｄｒｅｄ２−＋２Ｈ＋
（８）Ｆｄｒｅｄ２−＋ＮＡＤ＋＋Ｈ＋⇔．Ｆｄｏｘ＋ＮＡＤＨ＋ΔμＨ＋
（９）ΔμＨ＋＋０．５ＡＤＰ＋０．５Ｐｉ⇔０．５ＡＴＰ＋０．５Ｈ２Ｏ
【０１４２】
フェレドキシンは、−４００ｍＶよりも負の酸化還元電位で、ＮＡＤＰは、ほぼ−３６０ｍＶの酸化還元電位で、ＮＡＤは、ほぼ−２８０ｍＶの酸化還元電位で、生体内で作用する。Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ２−対とＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対との間の１２０ｍＶより大きな酸化還元電位差が、膜結合Ｒｎｆ複合体（反応８）及びＦｏＦ１ＡＴＰシンターゼ（反応９）によって媒介された電子伝達リン酸化と結合されるのに十分大きい。ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＰＨを生じるＮｆｎ複合体触媒反応６によって、及び他のＮＡＤＨ依存性反応によって、連続的に再生される。ＮＡＤＰＨは、次いで、特定された他のＮＡＤＰＨ依存性反応（図７）と共に、生成物形成を推進するために使用され得る。
【０１４３】
ＣＯのかなり負の酸化還元電位（−５２０ｍＶ）が原因で、これらの電子キャリアが十分迅速に再度酸化され得ないときに、フェレドキシン及びＮＡＤＰを過還元する可能性がある。フェレドキシン及びＮＡＤＰＨの再酸化のレートを上げるための１つの手法は、ＮＡＤＰＨ依存性反応を選択する還元される生成物形成のレートを上げることである。
【０１４４】
以下の表２における結果は、Ｎｆｎ酵素を発現するカルボキシド栄養性微生物が、ＮＡＤＰＨ依存性酵素による使用のために、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するための能力を有することを示す。
【表２】
2016508718.tif 000004
【０１４５】
Ｎｆｎ酵素は、Ｃ．クルイベリにおけるような２つではなくて、単一の遺伝子／タンパク質（それぞれ、Ｃ．オートエタノゲナムにおけるＳｅｑ．ＩＤ  Ｎｏ１及び２）に遡られることが、発明者らによって発見された。この酵素をコード化する類似の遺伝子がまた、Ｃ．リュングダリイ（ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０）（ここで、それは、グルタミン酸シンターゼとして注釈付けされる）及びＣ．ラグスダレイ（Ｓｅｑ＿ＩＤ  Ｎｏ：３及び４）に存在する。
【０１４６】
発明者らは、組み換え型の微生物において、Ｎｆｎ遺伝子またはそれの機能的変異体の発現を上方調整することは、ＮＡＤＰＨ依存性酵素の効率の向上を可能にして、発酵反応から高い生成物出力を導くことを想定する。
【０１４７】
したがって、特定の態様において、本発明は、Ｎｆｎ酵素複合体を発現するか過剰発現することによって、微生物の生成の効率を上げる方法を提供する。
【０１４８】
特定の実施形態において、本発明は、ＮＡＤＰＨプールサイズを増加する、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換する組み換え型の微生物の使用を提供して、組み換え型の微生物は、単一のＮｆｎ酵素を発現する及び／または過剰発現するように適合される。特定の実施形態において、Ｎｆｎ酵素は、ＳＥＱ＿ＩＤ  ＮＯ．２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０のアミノ酸配列、あるいは少なくとも７６％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を含む。Ｎｆｎ酵素は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換して、したがって、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性酵素の存在下で発現されるときに、酵素効率が上げられ、ＮＡＤＰＨの高速反応速度と高速再生速度をもたらす。
【０１４９】
特定の実施形態において、微生物が、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を含む。更なる実施形態において、微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群から選択される。
【０１５０】
本発明はまた、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するポリペプチドの使用を提供するものであり、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０に従う単一のＮｆｎ酵素、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を含む。更に、本発明は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するポリヌクレオチドの使用を提供するものであり、ポリヌクレオチドは、単一のＮｆｎ酵素をコード化して、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０もしくはＹＰ＿００３７８１８５２．１をコード化する配列、または少なくとも８３％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体を含む。
【０１５１】
更なる態様において、本発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ  ＮＯ．１または３に従うポリヌクレオチドを提供する。
【０１５２】
更なる態様において、本発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ  ＮＯ．２または４に従うポリペプチドを提供する。更なる態様において、本発明は、新規なＮｆｎポリヌクレオチド、及び／もしくは本発明の新規なＮｆｎポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むベクターならびに／または組み換え型の微生物を提供する。
【０１５３】
特定の実施形態において、本発明は、ＮＡＤＨ依存性反応の最適化を提供する。この場合において、それぞれのＮＡＤＰＨ依存性ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸水素リアーゼ、及び／またはメチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼは、例えばムーレラ・サーモアセチカまたはＡ．ウーディからの、対応するＮＡＤＨ依存性酵素と置き換えられ得る。これは、ＮＡＤＨのために設計され最適化された経路を通る流動を最適化することになる。この実施形態は、特定の実用性を有することになり、ここで、ＮＡＤＰＨ依存性酵素が利用可能であり、またはＮＡＤＰＨ依存性酵素を含む組み換え型の生物が、効率的に工学操作され得ない。
【０１５４】
特定の酵素の発現を増大するために、その酵素をコード化する核酸の発現が増大される。所望の酵素をコード化する核酸の発現を増大する方法は、以下に概説される。当業者は、使用の他の技法を容易に理解するであろう。
【０１５５】
本発明は、本明細書において参照されるタンパク質及びペプチドをコード化する核酸を含み得、または本発明における使用のタンパク質及びペプチドをコード化する核酸を使用し得る。一実施形態において、核酸は、核酸構築物またはベクターである。１つの特定の実施形態において、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターであるが、他の構築物及びベクター、例えばクローン化のために使用されるものなどが、本発明によって包含される。１つの特定の実施形態において、発現構築物またはベクターは、プラスミドである。
【０１５６】
本発明の発現構築物／ベクターは、所望される場合、プロモーターならびに更なるタンパク質の発現に適した追加の遺伝子に加えて任意の数の調整要素を含有し得ることが認識されるであろう。一実施形態において、発現構築物／ベクターは、１つのプロモーターを含む。別の実施形態において、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモーターを含む。１つの特定の実施形態において、発現構築物／ベクターは、発現されることになる各遺伝子に対して１つのプロモーターを含む。一実施形態において、発現構築物／ベクターは、１つ以上のリボソーム結合部位、好ましくは、発現されることになる各遺伝子のためのリボソーム結合部位を含む。
【０１５７】
本明細書に記載された核酸配列及び構築物／ベクター配列が、標準リンカーヌクレオチド、例えばリボソーム結合部位及び／または制限部位に要求されるものなどを含有し得ることは、当業者によって認識されるであろう。そのようなリンカー配列は、要求されていると解釈されるべきではないし、定義される配列上の限定をもたらすものではい。
【０１５８】
本発明の発現構築物／ベクターを含む、核酸及び核酸構築物は、当分野において標準の任意の数の技法を使用して構築され得る。例えば、化学合成または組み換え型の技法が使用され得る。そのような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載される。更なる例示的な技法は、この後に実施例の欄に記載される。本質的に、個々の遺伝子及び調整要素は、遺伝子が、所望のタンパク質を形成するように発現され得るように、互いに操作可能に連鎖されることになる。本発明における使用に適したベクターが、当業者によって認識されることになる。しかしながら、例として、以下のベクター、すなわち、ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、及びこの後に実施例の欄に例示されるプラスミドが、適切であり得る。
【０１５９】
本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形態にあり得ることが認識されるべきである。
【０１６０】
本発明はまた、ホスト生物、特に、微生物を提供するものであり、本明細書に記載された核酸の任意の１つ以上を含むウィルス、細菌、及び酵母を含む。
【０１６１】
組み換え型の微生物を生成する方法
１つ以上の外因性核酸は、裸の核酸として親の微生物に送り届けられ得、または転換プロセスを容易にする１つ以上の作用物質（例えば、リポソーム抱合核酸、生物であって、その中に核酸が含有される、生物）で構築され得る。１つ以上の核酸は、適切であるように、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。制限阻害剤が、一定の実施形態において使用され得、例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｎ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４、４１２．）を参照。
【０１６２】
本発明の微生物は、組み換え型の微生物を生成するための当分野において既知の任意の数の技法を使用して、親の微生物及び１つ以上の外因性核酸から準備され得る。ほんの一例として、（形質導入またはトランスフェクションを含む）転換は、電気穿孔法、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介転換、化学的または自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発または抱合によって実現され得る。適切な転換技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｒｏｔａｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、１９８９に記載される。
【０１６３】
電気穿孔法は、Ｃ．リュングダリイ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、Ｐｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１３０８７−９２、（Ｌｅａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３、ＷＯ２０１２／０５３９０５）、Ｃ．オートエタノゲナム（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３、ＷＯ２０１２／０５３９０５）、アセトバクテリウム・ウーディ（Ｓｔｒａｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１０３３−３７）またはムーレラ・サーモアセチカ（Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）のようないくつかのカルボキシド栄養性アセトゲンについて記載されており、多くのクロストリジウム、例えばＣ．アセトブチリクム（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、１９０−１９５）、Ｃ．セルロリティカム（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｊｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ、２０００、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４６：３０７１−３０８０）またはＣ．サーモセルム（ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（Ｔｙｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：８８３−８９０）などにおいて使用される標準方法である。プロファージ誘発は、Ｃ．スカトロゲネス（Ｐｒａｓａｎｎａ  Ｔａｍａｒａｐｕ  Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ、２０１０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ２５７７５  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔｓ、Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場合にはカルボキシド栄養性アセトゲンについても同様に実証されており、一方、抱合は、クロストリジウム・ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ、２００３、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２９：１０３−１１０）またはＣ．アセトブチリクム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ、１９９０、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：８１９−８２６）を含む多くのクロストリジウムのための選択の方法として記載されており、カルボキシド栄養性アセトゲンのための類似の様式において使用され得る。
【０１６４】
一定の実施形態において、転換されることになる微生物において活性である制限システムに起因して、微生物に導入されることになる核酸をメチル化する必要がある。これは、以下に記載されるもの、及びこの後に実施例の欄に更に例示されるものを含む種々の技法を使用して行われ得る。
【０１６５】
例として、一実施形態において、本発明の組み換え型の微生物は、以下のステップを含む方法によって生成される。
ａ．（ｉ）本明細書に記載されたような発現構築物／ベクターの、及び（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入、
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、
ｃ．シャトル微生物からの１つ以上の構築物／ベクターの分離、ならびに、
ｄ．目的微生物への１つ以上の構築物／ベクターの導入
【０１６６】
一実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子が構成的に発現される。
別の実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が誘発される。
【０１６７】
シャトル微生物は、微生物、好ましくは、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を容易にする制限消極的微生物である。特定の実施形態において、シャトル微生物は、制限消極的大腸菌、枯草菌、またはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）である。
【０１６８】
メチル化構築物／ベクターが、メチルトランスフェラーゼをコード化する核酸配列を含む。
【０１６９】
発現構築物／ベクター及びメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に一旦導入されると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が、誘発される。誘発は、本発明の１つの特定の実施形態では任意の適切なプロモーターシステムによるものであり得るが、メチル化構築物／ベクターは、誘発性ラックプロモーターを含み、乳糖またはそれらの類似物、より好ましくは、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の追加によって誘発される。他の適切なプロモーターは、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７システムを含む。本発明の更なる実施形態において、メチル化構築物／ベクタープロモーターは、構成性プロモーターである。
【０１７０】
特定の実施形態において、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子が、シャトル微生物において発現されるように、メチル化構築物／ベクターは、シャトル微生物の同一性に特異的である複製の元を有する。好ましくは、発現構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子が、目的微生物において発現されるように、発現構築物／ベクターは、目的微生物の同一性に特異的である複製の元を有する。
【０１７１】
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化を結果としてもたらす。発現構築物／ベクターは、次いで、多数の既知の方法のいずれか１つに従ってシャトル微生物から分離され得る。ほんの一例として、この後に記載される実施例の欄に記載された方法論が、発現構築物／ベクターを分離するために使用され得る。
【０１７２】
１つの特定の実施形態において、構築物／ベクターの両方が、同時に分離される。
【０１７３】
発現構築物／ベクターは、任意の数の既知の方法を使用して目的微生物に導入され得る。しかしながら、例として、この後に実施例の欄に記載された方法論が使用されてもよい。発現構築物／ベクターはメチル化されるので、発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は、目的微生物に組み込まれ、成功裏に発現されることができる。
【０１７４】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物に導入され得、過剰発現され得る。それ故、一実施形態において、結果として生じるメチルトランスフェラーゼ酵素は、既知の方法を使用して集められ得、生体外で使用され得、発現プラスミドをメチル化する。発現構築物／ベクターは、次いで、発現のために目的微生物に導入され得る。別の実施形態において、メチルトランスフェラーゼ遺伝子が、シャトル微生物のゲノムに導入されて、その後に、シャトル微生物への発現構築物／ベクターの導入、シャトル微生物からの１つ以上の構築物／ベクターの分離、次いで、目的微生物への発現構築物／ベクターの導入が、続く。
【０１７５】
上記で定義したような発現構築物／ベクター及びメチル化構築物／ベクターは、物質の組成を提供するために組み合わされ得ることが想定される。そのような組成は、本発明の組み換え型の微生物を生成するための制限バリア機構を回避する際の特定の実用性を有する。
【０１７６】
１つの特定の実施形態において、発現構築物／ベクター及び／またはメチル化構築物／ベクターは、プラスミドである。
【０１７７】
当業者は、本発明の微生物の生成における使用の多数の適切なメチルトランスフェラーゼを認識するであろう。しかしながら、例として、枯草菌ファージΦＴ１メチルトランスフェラーゼ及びこの後に実施例に記載されるメチルトランスフェラーゼが、使用されてもよい。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼは、ＷＯ／２０１２／０５３９０５に記載されている。
【０１７８】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適合された任意の数の構築物／ベクターは、メチル化構築物／ベクターを生じるために使用され得る。しかしながら、例として、この後に実施例の欄に記載されるプラスミドが、使用されてもよい。
【０１７９】
生成の方法
本発明のある実施形態において、微生物によって発酵されるガス状基質は、ＣＯを含有するガス状基質である。ガス状基質は、産業プロセスの副産物として、またはいくつかの他の源から、例えば自動車排気ガスなどから、得られるＣＯ含有廃棄ガスであり得る。一定の実施形態において、産業プロセスは、鉄金属生成物の製造、例えば製鋼所、非鉄生成物の製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成及びコークス製造などからなる群から選択される。これらの実施形態において、ＣＯ含有ガスは、任意の便利な方法を使用して、それが大気に放出される前に、産業プロセスから捕捉され得る。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素と水素を含むガス）の成分であり得る。産業プロセスから生成されるＣＯは、通常、広がって、ＣＯ２を生成して、したがって、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス放出を削減する際、及びバイオ燃料を生成する際における特定の実用性を有する。ガス状のＣＯ含有基質の組成に依存して、それを発酵に導入する前に、任意の所望されない不純物、例えば塵粒などを除去するようにそれを取り扱うこともまた望ましいであろう。例えば、ガス状基質は、既知の方法を使用して、フィルタリングされ得るかこすり落とされ得る。
【０１８０】
ＣＯ含有基質ガスに加えて、細菌の成長及び生成物の生成が起こるために、適切な液体栄養培地が、バイオリアクタに供給される必要があることになることが認識されるであろう。
【０１８１】
方法の態様の特定の実施形態において、発酵は、水性培養培地において起こる。方法の態様の特定の実施形態において、基質の発酵は、バイオリアクタ内で起こる。
【０１８２】
基質及び培地は、連続的な、回分（ｂａｔｃｈ）または流加回分（ｂａｔｃｈ  ｆｅｄ）様式でバイオリアクタに供給され得る。栄養培地は、使用される微生物の成長を可能にするのに十分なビタミン及びミネラルを含有することになる。ＣＯを使用する発酵に適した嫌気培地は、当分野において既知である。例えば、適切な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載される。本発明の一実施形態において、培地は、この後に実施例の欄に記載されるようなものである。
【０１８３】
発酵は、望ましくは、バイオ燃料の生成が起こるための適切な発酵条件下で実行されるべきである。考慮されるべきである反応条件は、圧力、温度、ガス流量率、液体流量率、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌率（連続式撹拌槽リアクタを使用する場合）、接種レベル、液相におけるＣＯが限界にならないことを確実にする最大のガス基質濃度、及び生成物の阻害を回避する最大の生成物濃度を含む。
【０１８４】
加えて、基質の流れのＣＯ濃度（または、ガス状基質におけるＣＯ分圧）を増大して、それ故、ＣＯが基質である発酵反応の効率が上がることが望まれることが多い。増大された圧力で操作することは、気相から液相へのＣＯ伝達率における著しい増加を可能にして、ここで、それは、発酵の生成のための炭素源として微生物に取り込まれ得る。これは、次いで、バイオリアクタが、大気圧ではなくて上昇した圧力に維持されるときに、（入力ガス流量率によって除算されるバイオリアクタ内の液体量として定義される）滞留時間が削減され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分的に依存することになる。しかしながら、一般に、発酵は、周囲圧力よりも高い圧力で行われることが好適である。また、所与のＣＯ変換率は、基質滞留時間に一部応じるものであり、所望の滞留時間を実現して、次いで、要求された容量のバイオリアクタを決定づけるので、加圧システムの使用は、要求されたバイオリアクタの容量、その結果として、発酵設備の資本費用を大いに削減し得る。米国特許第５，５９３，８８６号に与えられた例に従って、リアクタ容量は、リアクタ動作圧力の増加に線形比例して削減され得、すなわち、１０気圧で動作されるバイオリアクタは、１気圧で動作されるものの１０分の１の容量だけを必要とする。
【０１８５】
例として、上昇した圧力でガスからエタノールへの発酵を行うことの利益が、記載されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は、それぞれ、１５０ｇ／ｌ／日及び３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性を与える、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で行われるガスからエタノールへの発酵を説明する。しかしながら、大気圧において類似の培地及び入力ガス組成を使用して行われる発酵例は、１日につき１リットル当たり１０から２０分の１のエタノールを生成することが見付けられた。
【０１８６】
ＣＯ含有ガス状基質の導入率は、例えば、液相におけるＣＯの濃度が限界にならないことを確実にすることなどもまた望ましい。これは、ＣＯ限界条件の結果が、１つ以上の生成物が培養によって消費されることであり得るからである。
【０１８７】
発酵反応を与えるために使用されるガス流の組成は、その反応の効率及び／または費用にかなりの影響を与え得る。例えば、Ｏ２は、嫌気発酵プロセスの効率を減らし得る。発酵前または後の発酵プロセスの段階において望まれていないガスあるいは不必要なガスを処理することは、そのような段階への負担を増加し得る（例えば、ガス流がバイオリアクタに入る前に圧縮される場合、不必要なエネルギーが、発酵において必要とされないガスを圧縮するために使用され得る）。したがって、基質の流れ、特に、産業源に由来する基質の流れを取り扱うことが望ましい可能性があり、望まれていない成分を除去して、所望の成分の濃度を増加する。
【０１８８】
一定の実施形態において、本発明のバクテリアの培養は、水性培養培地において維持される。好ましくは、水性培養培地は、最小嫌気微生物の成長培地である。適切な培地は、当分野において既知であり、例えば米国特許第５，１７３，４２９号や第５，５９３，８８６号及びＷＯ０２／０８４３８に記載されており、ならびにこの後に実施例の欄に記載されるようなものである。
【０１８９】
また、培養液のｐＨが、活性炭に対する酢酸の吸着を強めるために上記したように調整された場合、そのｐＨは、バイオリアクタに戻される前に、発酵バイオリアクタにおける培養液のそれに類似のｐＨに再調整されるべきである。
【実施例】
【０１９０】
実施例１
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全部で５つのオキシドレダクターゼ酵素ステップを測定して、異なる基質の存在下でそれらの活性を決定した。これらの酵素は、反応を推進する共同因子を使用し得る。酵素は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２ガスの取り込みならびに利用を含む自己栄養成長に関わる。
【０１９１】
測定された酵素及びそれらの活性は、図１に詳細にされる。行われた全ての測定は、基準の、メチルビオロゲン（ＭＶ）またはベンジルビオロゲン（ＢＶ）のような合成酸化還元色素を使用して試験した。共同因子フェレドキシン（Ｆｄ）、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨまたはそれらの組み合わせを試験した。酵素測定は、ＣＯ及び水素上で自己栄養的に成長する典型的なリアクタランからの粗抽出物を使用して行った。
【０１９２】
発酵
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いる発酵は、３７℃においてならびに以下に記載されるような単一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鋼所ガスにおいて１．５Ｌのバイオリアクタ内で実行した。リットル当たり：ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する定義した培地を培養成長のために使用した。培地は、バイオリアクタの中に移動させて、１２１℃で４５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後、培地は、チアミン、パントテン酸塩（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）を補充して、３ｍＭのシステイン−ＨＣｌで還元した。嫌気性を実現するために、リアクタ容器は、０．２μｍフィルタを通して窒素を散布した。接種の前に、ガスは、ＣＯ含有製鋼所ガスに切り替えて、リアクタに連続的に供給した。供給ガス組成は、２％Ｈ２、４２％ＣＯ、２０％ＣＯ２、３６％Ｎ２であった。培養のｐＨは、５から５．２の間に維持した。
【０１９３】
細胞の採取
細胞を採取するときに、ガス消費は、５モルＣＯ  Ｌ−１日−１及び１０ミリモルＨ２  Ｌ−１日−１であって、以下の代謝物：１４ｇＬ−１日−１アセテート及び１９．５ｇＬ−１日−１エタノールを生成した。培養のｐＨは、Ｋ２ＣＯ３でｐＨ６に調整して、リアクタは、氷水浴において冷却した。約１．２Ｌの培養物は氷上に集めた。培養は、２×１−Ｌ遠心分離瓶の間で分離して（このステップ及び全ての後続するステップは、嫌気チャンバ内で実行して、無酸素性条件を確保して、酵素の不活性化を回避した）、細胞は、５０００ｒｐｍで１０分間造粒させた。上澄みは静かに移して、残りの液体は除去した。各造粒物は、１０ｍＭのＤＴＴで約３０ｍＬの５０ｍＭ  ＫＰＯ４ｐＨ７．０において再懸濁した。再懸濁は、予め重さを量った５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移動させて、細胞は、最高速度（５０００ｇ）で１５分間再び造粒させた。チューブは、嫌気チャンバから取り出して、測定の前に液体Ｎ２上で即時に凍らせた。
【０１９４】
粗細胞抽出及び酵素測定の準備
細胞は、無酸素性条件下で連続リアクタから採取した。それらは、（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）によって記載されるようなフレンチプレスを通る３つのパスによって破砕した。
【０１９５】
示される場合を除いて、全ての測定は、（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）によって記載されるように１．２×１０５Ｐａで０．８ｍｌの反応混合物及び０．７ｍｌのＮ２またはＨ２またはＣＯで満たされたゴム栓で閉じられた１．５ｍｌの嫌気キュベットにおいて３７℃で行った。
【０１９６】
ＣＯデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、メチレン−ＴＨＦデヒドロゲナーゼ及びメチレン−ＴＨＦレダクターゼは、（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）によって記載されるように全て測定した。
【０１９７】
ＣＯデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ及び約３０μＭのフェレドキシンならびに／あるいは１ｍＭのＮＡＤ＋または１ｍＭのＮＡＤＰ＋を含有した測定混合物を使用して測定した。気相は、１００％ＣＯであった。
【０１９８】
ヒドロゲナーゼ活性は、Ｈ２でのＮＡＤＰ＋依存性フェレドキシン還元の測定の追加を用いて記載されるように測定した。反応混合物には、フェレドキシン（３０μＭ）及び１ｍＭのＮＡＤＰを補充した。気相は、１００％Ｈ２であった。酵素フェレドキシンとの反応の開始後、還元は、４３０ｎｍ（εΔｏｘ−ｒｅｄ＝１３．１ｍＭ−１ｃｍ−１）で続けた。
【０１９９】
ギ酸水素リアーゼ活性は、１．２×１０５Ｐａで０．８ｍｌの反応混合物及び４．２ｍｌのＮ２で満たされたゴム栓で閉じた５ｍｌの嫌気性しょう液瓶において測定した。反応混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５及び２０ｍＭのギ酸塩を含有した。酵素の追加によって反応を開始した後に、Ｈ２生成は、ガスクロマトグラフィによって監視した。ギ酸塩に対するＨ２でのＣＯ２の還元についてのギ酸水素リアーゼ活性は、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、及び３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２４，０００ｄｐｍ／μモル）を含有する測定混合物を用いて測定した。気相は、１００％Ｈ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、１００μｌの液体サンプルは、１．５分毎に回収して、１００μｌの１５０ｍＭの酢酸を含有する１．５ｍｌのセーフシールマイクロチューブに追加して、酸化による反応を停止した。２００μｌの混合物は、次いで、４０℃で１０分間培養して、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて１，４００ｒｐｍで振って、全ての１４ＣＯ２を除去して、形成された１４Ｃギ酸塩を残した。その後に、１００μｌの混合物を５ｍｌのＱｕｉｃｋｓａｖｅ  Ａシンチレーション流体（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に追加して、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンタ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）において１４Ｃ放射能について分析した。
【０２００】
ギ酸デヒドロゲナーゼ測定は、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのギ酸塩を含有する測定混合物を用いて実行して、ここで、２５μＭのフェレドキシン、１ｍＭのＮＡＤＰ＋、１ｍＭのＮＡＤ＋及び／または１０ｍＭのメチルビオロゲンを示した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０２０１】
メチレン−Ｈ４Ｆデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのＭＯＰＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．４ｍＭのテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭのホルムアルデヒド及び０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋または０．５ｍＭのＮＡＤ＋を含有する測定混合物を使用して測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０２０２】
メチレン−Ｈ４Ｆレダクターゼは、以下の条件下で測定した。測定混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのアスコルビン酸塩、１０μＭのＦＡＤ、２０ｍＭのベンジルビオロゲン及び１ｍＭのメチル−Ｈ４Ｆを含有した。酵素との反応の開始の前に、ベンジルビオロゲンは、亜ジチオン酸ナトリウムで０．３のΔＡ５５５に還元した。
【０２０３】
アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼは、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒド、及び約２５μＭのフェレドキシンを含有する混合物を使用して測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０２０４】
ＣｏＡアセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒド、１ｍＭの補酵素Ａ、及び１ｍＭのＮＡＤＰ＋または１ｍＭのＮＡＤ＋を含有した混合物を使用して測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０２０５】
アルコールとブタンジオールデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒドまたはアセトインをそれぞれ、及び１ｍＭのＮＡＤＰＨまたは１ｍＭのＮＡＤＨを用いる測定で、測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
【０２０６】
フェレドキシンは、（Ｓｃｈoｎｈｅｉｔ、Ｗaｓｃｈｅｒ、＆Ｔｈａｕｅｒ、１９７８）によって記載されるようなＣ．パストゥリアヌムから精製した。
【０２０７】
結果
ヒドロゲナーゼ：この酵素は、エネルギー源として水素の取り込みに重要であり、ＣＯ２上のカルボキシド栄養性微生物の成長のために必須である。この酵素はまた、水素を放出することができ、ギ酸水素リアーゼとしてギ酸デヒドロゲナーゼと関連して作用し得る。
【０２０８】
Ｃ．オートエタノゲナムのゲノムにおいて、７つのヒドロゲナーゼ遺伝子（６つの鉄のみのヒドロゲナーゼと１つのＮｉＦｅヒドロゲナーゼ、Ｓｅｑ．ＩＤ５―２０）が存在する。これらの遺伝子のうちの５つについての相同物は、Ｃ．リュングダリイ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０）（ＹＰ＿００３７８１０１６／ＣＬＪＵ＿ｃ２６０６０、ＹＰ＿００３７８１０１７／ＣＬＪＵ＿ｃ２６０７０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０／ＹＰ＿００３７７８８７９、ＣＬＪＵ＿ｃ１４７００／ＹＰ＿００３７７９６４０、ＣＬＪＵ＿ｃ１７２８０／ＹＰ＿００３７７９８９３、ＣＬＪＵ＿ｃ２０２９０／ＹＰ＿００３７８０１９３）のゲノムに存在しており、また、Ｃ．ラグスダレイ（Ｓｅｑ．ＩＤ２１−３２）のゲノムにおいて特定され得る（表３）。
【表３】
2016508718.tif 000005
【０２０９】
単一の共同因子を使用して、活性は、ＮＡＤＰＨ（０．２Ｕ／ｍｇ）で観測した一方、ゼロの活性もしくはかなり低い活性は、ＮＡＤＨ（０．０５Ｕ／ｍｇ）またはフェレドキシン（＜０．０１Ｕ／ｍｇ）で観察した。これは、ヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨに特異的であることを実証する。
【０２１０】
最も高い活性は、共同因子の組み合わせを使用して見付けた。フェレドキシンの存在下におけるＮＡＤＰＨで０．６８Ｕ／ｍｇを測定した。対照的に、測定可能な活性が、ＮＡＤＨ（＜０．０１Ｕ／ｍｇ）で観測されず、ＮＡＤＰＨについてこの酵素の高い特異性を改めて確認した。このデータは、分岐ヒドロゲナーゼが、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９）またはアセトバテリウム・ウーディ（Ａｃｅｔｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０１２）またはムーレラ・サーモアセチカ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）にあるように存在することを示す。しかしながら、これらの他の生物において、酵素はＮＡＤＨ依存性である。そういうものとして、これは、発見された最初のＮＡＤＰＨ依存性分岐ヒドロゲナーゼである。
【０２１１】
ギ酸デヒドロゲナーゼ：この酵素は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分枝においてギ酸塩に対してＣＯ２の還元を触媒して、アセトゲンによるＣＯまたはＣＯ２及びＨ２上の自己栄養成長のために必須である。
【０２１２】
３つの遺伝子が、セレノ及び非セレノギ酸デヒドロゲナーゼについてコード化して、Ｃ．オートエタノゲナム（ＡＥＩ９０７２１、ＡＥＩ９０７２３、ＡＥＩ９０７２５、ＨＱ８７６０１５、ＨＱ８７６０１７、ＨＱ８７６０１９）、Ｃ．リュングダリイ（ＹＰ＿００３７７９０６３、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＹＰ＿００３７８０１６８、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＣＬＪＵ＿ｃ０６９９０、ＣＬＪＵ＿ｃ２００４０）ならびにＣ．ラグスダレイ（ＡＥＩ９０７２２、ＡＥＩ９０７２４、ＡＥＩ９０７２６、ＨＱ８７６０１６、ＨＱ８７６０１８、ＨＱ８７６０２０）（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、２０１１）のゲノムにおいて存在する。
【０２１３】
１つの共同因子だけを使用して、ＮＡＤではなくてＮＡＤＰＨについての特異性、すなわち、非常に少ない０．０３Ｕ／ｍｇを超える０．２Ｕ／ｍｇを検出した。
【０２１４】
しかしながら、著しく高い活性を２つの共同因子の組み合わせを使用して検出した。すなわち、ＮＡＤＰＨ及びフェレドキシンで１．１０Ｕ／ｍｇを検出したが、ＮＡＤＰＨの代わりにＮＡＤＨで０．０７だけであった。これは、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、前に説明されたことのない酵素の存在を示した。
【０２１５】
分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰＨ分岐ヒドロゲナーゼとギ酸水素複合体を形成し得ることを示す、ギ酸−水素リアーゼ、すなわち、Ｈ２を使用して２．４Ｕ／ｍｇの高い活性を検出した。
【０２１６】
ＮＡＤＰ結合部位を有する鉄−硫黄フラボタンパク質、鉄−硫黄（ＦｅＳ）タンパク質、ならびにセレノシステイン及びモリブドプテリンを含有するギ酸デヒドロゲナーゼのための遺伝子と共に、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＥＩ９０７２１、ＨＱ８７６０１５、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＡＥＩ９０７２２、ＨＱ８７６０１６）及び分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ（Ｓｅｑ．ＩＤ９―１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＹＰ＿００３７７８８７９、ＳｅｑＩＤ２５−２６）のための遺伝子をコード化するタンパク質を、１つの遺伝子クラスターにおいて見付けた（図３）。機能複合体の形成は、２つの酵素のための遺伝子が、ゲノムにおいて並んでいることを見付けることによって反映され、転写単位を形成し得る。
【０２１７】
ＣＯ２及びＨ２からギ酸塩にこの方向に作用するギ酸水素リアーゼは、前に説明されておらず、カルボキシド栄養性クロストリジウムに対して新規である（図１）。この反応の可逆性がまた、実証されており、ギ酸塩から水素及びＣＯ２を放出する。この酵素の使用は、水素を使用してギ酸塩の形態でＣＯ２の捕捉を可能にして、それは、次いで、再度放出され得る。精製された酵素を用いて、ＣＯ２＋Ｈ２からのギ酸塩の形成について４１Ｕ／ｍｇ及びギ酸塩からの水素形成について４０Ｕ／ｍｇのギ酸水素リアーゼ活性を測定した（表４）。
【表４】
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【０２１８】
表４に関して、Ｃ．オートエタノゲナムのギ酸水素リアーゼ複合体の精製は、室温で、厳密に無酸素条件下で行った。２ｍＭのＤＴＴ、５μＭのＦＡＤ、及び５μＭのＦＭＮ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）を含有する無酸素性の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を、プロセス全体を通して使用した。約４７ｍｇのタンパク質ｍｌ−１を有する細胞質断片を含有する１５０，０００×ｇ上澄みは、硫酸アンモニウムで断片化した。４０から５５％までの硫酸アンモニウム飽和の断片は、３０，０００×ｇ及び４℃における３０分間の遠心分離によって集めた。沈殿物は、０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含有する７ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ａにおいて溶解した。遠心分離によって溶解されなかったタンパク質を除去した後、上澄みは、０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含有するＢｕｆｆｅｒ  Ａと平衡状態を保たれたフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）高性能カラム（２．６ｃｍ×１２ｃｍ）の上に載せた。タンパク質は、５ｍｌ分−１の流量率で段階的な硫酸アンモニウム勾配（０．８０、０．６４、０．４８、０．３２、０．１６、及び０Ｍ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａにおいてそれぞれ１００ｍｌ）で溶離した。ヒドロゲナーゼ活性は、０．４８Ｍの硫酸アンモニウムにおけるピークにおいて溶離した。プールされた断片は、凝集して、５０ｋＤａのカットオフ膜を有するアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）細胞で脱塩した。次いで、凝集物は、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａと平衡状態を保たれたＱセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）高性能カラム（１．６ｃｍ×１３ｃｍ）の上につけた。カラムは、次いで、９０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した。タンパク質は、５ｍｌ分−１の流量率で０から１ＭのＮａＣｌ線形勾配で溶離した。ヒドロゲナーゼ活性は、約０．４ＭのＮａＣｌを溶離する単一のピークにおいて回復させた。断片は、凝集して、５０ｋＤａのカットオフＡｍｉｃｏｎフィルタで脱塩して、次いで、使用されるまで９５％Ｎ２／５％Ｈ２の大気下で、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａにおいて−２０℃で保管した。
【０２１９】
活性は、示されたｐＨにおいて１００ｍＭのリン酸カリウムにおいて３７℃で測定した。ギ酸塩からのＨ２の形成（ギ酸水素リアーゼ活性）を続けたとき、測定混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（表１）または１００ｍＭのリン酸カリウム（示されるようなｐＨ）（表３）、２ｍＭのＤＴＴ及び２０ｍＭのギ酸ナトリウムを含有した。気相は、１００％Ｎ２―であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相から気相中へのＨ２の移動を確保した。ガスサンプル（０．２ｍｌ）は、１分毎に回収して、Ｈ２は、ガスクロマトグラフィによって定量化した。ギ酸塩に対するＨ２でのＣＯ２の還元を測定したとき、測定混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウム（示されるような最終ｐＨ）、２ｍＭのＤＴＴ、及び３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２４，０００ｄｐｍ／μモル）を含有した。気相は、１００％Ｈ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、１００μｌの液体サンプルを１．５分毎に回収して、１００μｌの１５０ｍＭの酢酸を含有する１．５ｍｌのセーフシールマイクロチューブに追加して、酸化による反応を停止した。２００μｌの混合物は、次いで、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（タイプ５４３６、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において１，４００ｒｐｍで振って、４０℃で１０分間培養して、全ての１４ＣＯ２を除去して、形成された１４Ｃギ酸塩を残した。その後に、１００μｌの混合物を５ｍｌのＱｕｉｃｋｓａｖｅ  Ａシンチレーション流体（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に追加して、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンタ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）において１４Ｃ放射能について分析した。ギ酸塩に対して還元されたフェレドキシン及びＮＡＤＰＨでのＣＯ２の還元を続けたとき、測定混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウム（示されるような最終のもの）、２ｍＭのＤＴＴ、３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２４，０００ｄｐｍ／μモル）、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び還元されたフェレドキシン再生システム（１０ｍＭのピルビン酸塩、０．１ｍＭのチアミンピロリン酸、１ｍＭの補酵素Ａ、２５μＭのＣ．パストゥリアヌム・フェレドキシン、１Ｕのピルビン酸塩：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及び５Ｕのホスホトランスアセチラーゼ）を含有した。気相は、１００％Ｎ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、１００μｌの液体アリコートを１．５分毎に回収して、ギ酸塩について分析した。ギ酸塩に対して還元されたフェレドキシン及びＮＡＤＰＨでＣＯ２の還元を続けたときに、測定混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウム（示されるような最終のもの）、２ｍＭのＤＴＴ、３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２４，０００ｄｐｍ／μモル）、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び還元されたフェレドキシン再生システム（１０ｍＭのピルビン酸塩、０．１ｍＭのチアミンピロリン酸、１ｍＭの補酵素Ａ、２５μＭのＣ．パストゥリアヌムフェレドキシン、１Ｕのピルビン酸塩：フェレドキシンオキシドレダク���ーゼ、及び５Ｕのホスホトランスアセチラーゼ）を含有した。気相は、１００％Ｎ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、上記したように、１００μｌの液体アリコートを１．５分毎に回収して、ギ酸塩について分析した。Ｃ．パストゥリアヌムＤＳＭ５２５からの精製したフェレドキシン（Ｆｄ）をＳｃｈoｎｈｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９７８、８９：２１９−２２２）に従って準備して使用した。１ユニット（Ｕ）は、１分当たりに伝達される２μモルの電子に等しい。
【０２２０】
メチレン−ＴＨＦ−デヒドロゲナーゼ：この酵素は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸から５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸への反応を触媒するものであり、自己栄養成長に必須である。それは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の一部であり、明確にＮＡＤＰＨに特異的である（ＮＡＤＰＨで１．１２Ｕ／ｍｇであるが、ＮＡＤＨまたはフェレドキシンで検出可能な活性はない）ことを見い出した。
【０２２１】
この酵素及びそれぞれの遺伝子は、二機能性メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼとして、Ｃ．オートエタノゲナム（ＡＥＩ９０７５３、ＨＱ８７６０３１、ＧＩ：３３８２２５３５３）、Ｃ．リュングダリイ（ＹＰ＿００３７８１８９１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７６３０）及びＣ．ラグスダレイ（ＡＥＩ９０７７１、ＨＱ８７６０３２、ＧＩ：３３８２２５３７２）において特定した。
【０２２２】
この酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性であることになるムーレラ・サーモアセチカにおいて前に示したが、他の反応は、この生物においてＮＡＤＨまたはフェレドキシン依存性である（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）。
【０２２３】
測定可能な活性は、いずれかの共同因子を有する（合成色素だけを有する）メチレン−ＴＨＦレダクターゼについての生体外の測定において検出され得ない。しかしながら、発明者らは、この結果が、他の酵素、例えばＣ．リュングダリイまたはＡ．ウーディ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、Ｐｏｅｈｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）などについて提案されているように、追加酵素として未知の結合部位を要求する酵素によって説明され得ることを考察する。この結合機構は、ＮＡＤＰＨ依存性であり得る。ＣＯデヒドロゲナーゼ反応は、この種の酵素について前に報告されているように、フェレドキシン依存性であることが分かった。
【０２２４】
カルボキシド栄養性クロストリジウム属のクロストリジウム・オートエタノゲナムにおけるＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全部で５つの試験したオキシドレダクターゼ反応から、驚いたことには、どれもＮＡＤＨ依存性ではないことが分かり、むしろ、大部分はＮＡＤＰＨ依存性であることが分かった。これは、例えば、大腸菌（図２）として細菌を利用する糖の糖分解とは完全に対照的である。それ故、ＮＡＤＨ依存性反応を使用して、ＮＡＤＰＨ依存性反応をバイパスする（それは、生産歩留りの低下を結果としてもたらし、広範囲にわたる修正を要求する）大腸菌のための既存の戦略は、カルボキシド栄養性クロストリジウムにおいて生産的ではない。本明細書に記載されるような発明は、カルボキシド栄養性クロストリジウムにおけるＮＡＤＰＨ依存性反応について優先的に選択することによってこれを克服する戦略を提供して、代謝工学技術のための最大の生産歩留りを実現する。ＮＡＤＰＨ依存性反応の容量と可能性、ならびに大腸菌を利用する糖に対する差は、実施例３に示される。同様に、この戦略は、非相同経路に適用され得、最大の生産歩留り及び流動を実現する。
【０２２５】
実施例２
２００を超える遺伝子Ｃ．オートエタノゲナム遺伝子の相対発現を、実時間定量ＰＣＲを使用して分析して、最高の発現を伴う遺伝子を決定した。
【０２２６】
発酵
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３での発酵は、３７℃及び以下に記載されるような単一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鋼所ガスで１．５Ｌのバイオリアクタ内で実行した。１リットルにつき：ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する定義した培地を培養成長のために使用した。培地は、バイオリアクタの中に移動させて、１２１℃で４５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後、培地は、チアミン、パントテン酸塩（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）を補充して、３ｍＭのシステイン−ＨＣｌで還元した。嫌気性を実現するために、リアクタ容器は、０．２μｍフィルタを通して窒素を分散させた。接種の前に、ガスは、ＣＯ含有製鋼所ガスに切り替えて、リアクタに連続的に供給した。ガス流量は、最初に８０ｍｌ／分に設定して、中間の対数期の間に２００ｍｌ／分に増加させて、一方、撹拌は、２００ｒｐｍから３５０ｒｐｍまで増加させた。Ｎａ２Ｓは、０．２５ｍｌ／時でバイオリアクタの中に与えた。ＯＤ６００が０．５に一旦到達したら、バイオリアクタを１．０ｍｌ／分のレート（希釈率０．９６ｄ−１）で連続的な形態に切り替えた。培地サンプルをバイオマスと代謝物を測定するために取って、内外に流れるガスのヘッドスペース分析を定期的に行った。
【０２２７】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
２００を超える遺伝子を用いるｑＲＴ−ＰＣＲ研究は、適切なプライマーを使用して行った。サンプルは、成長期間全体（４日）にわたって、上記したように典型的な１．５Ｌの流加回分（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵ランから取った。サンプルは、遠心分離（６，０００×ｇ、５分、４℃）によって採取して、細胞造粒物は、液体窒素において急速凍結して、使用まで−８０℃で保管した。ＲＮＡは、氷上で細胞造粒物を解凍して、それを１００μｌのリゾチーム溶液（５０，０００Ｕのリゾチーム、０．５μＬ１０％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）において懸濁することによって分離した。５分後、（１０μＬの２−メルカプトエタノールを含有する）３５０μＬの溶解バッファーを追加した。細胞懸濁物は、１８〜２１ゲージ針を５回通過させることによって機構的に破壊した。ＲＮＡは、次いで、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ９２００８、ＵＳＡ）を使用して分離して、１００μＬのＲＮａｓｅフリー水において溶離した。ＲＮＡは、ＰＣＲ及びゲル電気泳動法によって調べて、分光光度法で定量化して、必要に応じてＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。逆の転写ステップは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ９２００８、ＵＳＡ）を使用して実行した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭの各プライマー、及び１ｘ  ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ）を用いて１５μｌの反応量でＭｙｉＱ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ）において行った。グアニル酸キナーゼ（ＧｎＫ）及びギ酸塩テトラヒドロ葉酸リガーゼ（ＦｏＴ４Ｌ）をハウスキーピング遺伝子として使用して、非テンプレートコントロール（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を含んだ。反応条件は、９５℃３分間であって、９５℃１５秒間、５５℃１５秒間及び７２℃３０秒間の４０サイクルを後に続けた。融解曲線分析は、増幅のプライマー二量化または他の人工物の検出のために、ｑＲＴ  ＰＣＲ（１℃／秒における５８℃から９５℃までの３８サイクル）の完了の直後に行った。発現レベル上のデータは、Ｂｉｏｒａｄ  ｉＱ５  ２．０ソフトウェアによって計算されるようなＰＣＲ基線減算曲線あてはめ方法に基づいて閾値サイクル（Ｃｔ）値の形態で計算した。生のＣｔ値は、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｔｏｏｌ（ＲＥＳＴ（著作権））２００８  Ｖ２．０．７を使用して更に分析した。
【０２２８】
結果
自己栄養的に成長するときに、カルボキシド栄養性微生物は、炭素及びエネルギー源として働くガスを取り込む。図４は、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて発現された遺伝子の相対発現を示す。特定された３つの酵素は、自己栄養成長及びガス取り込みに関わっており、発明者らは、それらが、最も強く発現した遺伝子の中で微生物内にあることが分かった。実施例１に示されるように、これらの同じ酵素が、ＮＡＤＨと比較してＮＡＤＰＨの高いまたは独占的な利用を呈することが分かった。ＮＡＤＨ依存性酵素の発現は、かなり低いレベルにあった。これらの遺伝子がコード化する酵素が、ＮＡＤＰＨ依存性であることが分かっていると仮定すると、これは、（大腸菌として生物を利用する糖とは対照的に）ＮＡＤＰＨプールが非常に重要であり、ＮＡＤＰＨ依存性反応が、障害ではないことを示す。カルボキシド栄養性クロストリジウム細胞における工学技術経路について、これは、ＮＡＤＰＨ依存性反応を選択することができるので大きな利点であり、これらの反応が、回避されるかバイパスされる必要はない。更に、ＮＡＤＰＨプールは、性能が低下しないほどに大きく、広範囲にわたる工学技術は、必要ではない。
【０２２９】
実施例３
第１級−第２級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、アセトンをイソプロパノールに変換する厳密にＮＡＤＰＨ依存性酵素である。それの活性は、アセトンならびに０．２ｍＭのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（Ｉｓｍａｉｅｌ、Ｚｈｕ、Ｃｏｌｂｙ、＆Ｃｈｅｎ、１９９３）を含有する発酵培養液から準備した粗抽出物を用いる酵素測定を使用して実証する。
【０２３０】
Ｃ．オートエタノゲナムを用いるリアクタ研究を、高い率でイソプロパノールへのアセトンの効果的なＮＡＤＰＨ依存性変換を実証するために行った。安定したバイオマス及び代謝物生成を伴う連続的な形態で、アセトンをバイオリアクタと流加培地の両方に追加した。アセトンをリアクタの中に一定のレベルまで混ぜて、次いで、それを連続的な流加によって取得した。最初に、１ｇ／Ｌアセトンを追加して、代謝物濃度を一旦安定化させて、濃度を５ｇ／Ｌ、１５ｇ／ｌまで、また、第２の実験では２０ｇ／Ｌまで増加させた。
【０２３１】
材料及び方法
代謝物の分析
アセトン、イソプロパノール及び他の代謝物のＨＰＬＣ分析は、３５℃（屈折率検出器）で動作されるＲＩＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステム及び６０℃に保たれたＡｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を使用して行った。わずかに酸性化した水を０．７ｍｌ／分の流量率で移動相として使用した（０．００５ＭのＨ２ＳＯ４）。タンパク質及び他の細胞残基を除去するために、４００μｌのサンプルを１００μｌの２％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合して、１４，０００×ｇで３分間遠心分離して、沈殿した残基を分離した。次いで、１０μｌの上澄みを分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【０２３２】
アセトン、イソプロパノール及び他の代謝物のＧＣ分析は、Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＰＤＭＳ  １００  １ｃｍファイバーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ＮヘッドスペースＧＣ、Ａｌｌｔｅｃｈ  ＥＣ−１０００（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム、及び炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を使用して行った。５ｍｌのサンプルは、Ｈｕｎｇａｔｅチューブの中に移して、水浴中において４０℃まで加熱して、正確に５分間ファイバーに露出した。注入器は、２５０℃に保ち、１ｍｌ／分の一定流量でヘリウムをキャリアガスとして使用した。炉のプログラムは、４０℃５分間であって、２００℃まで１０℃／分の増加を後に続けた。温度は、次いで、５０℃／分のレートで２２０℃まで更に増加させて、温度を５０℃／分のレートで４０℃まで低下させて最後の１分保持する前に、この温度を５分保持することを後に続けた。ＦＩＤは、構成ガスとして水素４０ｍｌ／分、空気４５０ｍｌ／分及び窒素１５ｍｌ／分で２５０℃に保った。
【０２３３】
ヘッドスペース分析
測定は、２つの備え付けチャネルを有するＶａｒｉａｎ  ＣＰ−４９００  ｍｉｃｒｏ  ＧＣ上で実行した。チャネル１は、７０℃、２００ｋＰａのアルゴン及び４．２秒のバックフラッシュ時間で動作する１０ｍ分子ふるいカラムであった一方で、チャネル２は、９０℃、１５０ｋＰａのヘリウム及びバックフラッシュなしで動作する１０ｍＰＰＱカラムであった。両方のチャネルのための注入器温度は７０℃であった。実行時間は１２０秒に設定したが、興味のある全てのピークは、通常、１００秒前に溶離することになる。
【０２３４】
細胞の採取
４の光学濃度（ＯＤ）を有するとともにエタノール、アセテート及び２，３−ブタンジオールを生成するＣＯならびにＨ２を利用する、１．５Ｌバイオリアクタからの細胞は、ゴム栓で閉じられるとともに主としてＮ２で満たされた２リットル瓶の中に管を介してゆっくりと移した。過剰圧力は、その栓を通る針によって解放した。瓶は、０℃以下の温度に保って、培養の移動は、培養を移動後に出来るだけ迅速に０℃まで冷却するようにゆっくりと実行した。移動が完了したときに、瓶は、嫌気性のテント状のもの（ｔｅｎｔ）内に置いた。チューブを遠心分離して、次いで、上澄みを静かに移して、残りの液体をろ紙で除去した。造粒物は、１０ｍＭのジチオスレイトールを含有する５０ｍＭの嫌気性リン酸カリウムｐＨ７において懸濁した。いくつかの瓶の懸濁物は、組み合わせて、遠心分離させて、乾燥させて、重さを量って、ドライアイス上に保管した。
【０２３５】
酵素測定
酵素測定は、Ｈｕａｎｇ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１２）及びＩｓｍａｉｅｌ（Ｉｓｍａｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ、１９９３）に概説される方法に従って行った。
【０２３６】
結果
イソプロパノールに対するアセトンの還元は、図５に示されるように、厳密にＮＡＤＰＨ依存性の第２級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の相関関係であることが分かった。活性は、ＮＡＤＨではなくてＮＡＤＰＨだけで測定して、この酵素が厳密にＮＡＤＰＨ依存性であることを実証する。
【０２３７】
ＣＯ上の自己栄養成長の間のＮＡＤＰＨプールの容量を実証するために、アセトンを、アセトン上で成長するリアクタの中に連続的に流加した。アセトンが、高い率でこのＮＡＤＰＨ依存性の第２級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によってイソプロパノールに効率的に変換されたことが分かった．図６は、アセトンが、バイオリアクタへの導入直後にイソプロパノールに変換されることを示す。２０ｇ／Ｌの高濃度でさえも、全てのアセトンをイソプロパノールに変換した培養は、ＮＡＤＰＨプールが、高い率でさえもこれを持続するのに十分であることを実証する。
【０２３８】
この実験は、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物が、持続的なＮＡＤＰＨ依存性反応を推進するために有する容量を実証する。大腸菌では、ＮＡＤＰＨ容量は、フルフラールの研究（ＥＮ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２００９、Ｅｌｌｉｏｔ  Ｎ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２００９）に示されるように、かなり低い。
【０２３９】
実施例４
ＮＡＤＨ依存性酵素とＮＡＤＰＨ依存性酵素の間に選択肢を提供するいくつかの経路、例えば、ブタノール経路が存在する。最も大きな工学技術努力は、今までのところ、ＮＡＤＰＨ依存性反応を回避する一方でＮＡＤＨ依存性反応を使用することに集中している。これは、経路の選択を制限して、ＮＡＤＰＨによってもたらされる更なる推進力を無視する。
【０２４０】
ブタノール生合成のための新規で完全にＮＡＤＰＨ依存性の経路が設計されており、チオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９、ｂｔｋＢ、例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ＿７２５９４８．１、遺伝子ＩＤ：４２４８８１５から、ｐｈａＡ、例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ＿７２５９４１．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８３から）、ＮＡＤＰＨ依存性Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１．３６、ｐｈａＢ  ＧＯ：００１８４５４、例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ＿７２５９４２．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８４から）及び３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９、ｐｈａＪ、例えば、アエロモナス・プンクタタ：ＢＡＡ２１８１６．１から）、ＮＡＤＰＨ依存性クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ／レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８６、ｃｃｒ、例えば、ストレプトマイセス・コリナスから、ＥＣ１．３．１．８５、ｃｃｒＲｓ、例えば、ロドバクター・スフェロイデス：ＹＰ＿３５４０４４．１、遺伝子ＩＤ：３７２０７５１から）及びブチリル−ＣｏＡに対するＮＡＤＰＨ依存性エチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４１、例えば、ハツカネズミ：ＮＰ＿００１１０３６６５．１、遺伝子ＩＤ：５２６６５から）から成り、それは、次いで、アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼを通して直接的に、あるいはホスホトランスアセチラーゼ及びブチレートキナーゼを介してブチレートによって、ブタノールに変換され得、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性ブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．２．１０、ｂｌｄｈ、例えば、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニクム（ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｍ）Ｎ１−４：ＡＧＦ５９４１３．１、遺伝子ＩＤ：Ｃｓｐａ＿ｃ５６８８０から）ならびにアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１、ａｄｈＡ、例えば、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ．ＰＣＣ６８０３：ＮＰ＿４４３０２８．１、遺伝子ＩＤ：９５１８９６から）（図７）が、使用され得る。
【０２４１】
アセチル−ＣｏＡの２つの分子は、ラルストニア・ユートロファからｐｈａＡＢＪによってコード化される３つの酵素によってクロトニル−ＣｏＡに変換される。２つのアセチル−ＣｏＡは、チオラーゼによってアセトアセチル−ＣｏＡに凝縮され、ＮＡＤＰＨに特異的なＲ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによるＲ−３ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する還元が後に続く。Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、次いで、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼによってクロトニル−ＣｏＡに変換される。
【０２４２】
ロドバクター・スフェロイデス（Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ、２００７）からのクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ／レダクターゼとハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）（Ｌｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）からのエチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼの組み合わせは、まず、二酸化炭素でクロトニル−ＣｏＡの凝縮物を触媒して、ＮＡＤＰＨの消費を伴ってエチルマロニル−ＣｏＡを形成して、ブチリル−ＣｏＡに対するエチルマロニル−ＣｏＡの脱カルボキシル化が後に続く。
【０２４３】
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニクムＮＩ−４からのブチリル−ＣｏＡレダクターゼは、ブチリル−ＣｏＡからＣｏＡの一部分を切断して、ブチルアルデヒドを形成する。クロストリジウム・ベイジェリンキ（ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ５９２からの相同物が、ＮＡＤＰＨ（Ｙａｎ及びＣｈｅｎ、１９９０）と最も活性的であるので、酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性であると推定される。
【０２４４】
シアノバクテリアのシネコシスティスｓｐ．ＰＣＣ６８０３のアルデヒドレダクターゼは、アルコールに対する中間鎖長及び芳香族アルデヒドのＮＡＤＰＨ還元に対して強い好みを有する（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ、２００９）。ブタノールの酸化に対するブタノールへのブチルアルデヒドの還元についての好みは、還元を優先して２５１：１である。
【０２４５】
実施例５
ブドウ糖上で成長した大腸菌細胞において、ＮＡＤＨのプールがＮＡＤＰＨプールよりも２０倍以上大きく（Ｂ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ、２００９）、それは、特に発酵プロセスにおいて、多くの生合成反応や生物変換を制限する（Ｒ  Ｐｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、２００５）ことが実証されている。ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨプールは、カルボキシド栄養性酢酸生成クロストリジウムにおいて測定した。
【０２４６】
実施例２に記載したようなクロストリジウム・オートエタノゲナムを用いる連続的な発酵からのサンプルを取って分析した。５ｍＬの培養サンプルは、遠心分離（−１０℃で５分間１３０００ｒｐｍ）によって迅速に造粒して、上澄みは除去して、細胞造粒物は、液体窒素において急速凍結して、次いで、分析まで−８０℃に保管した。代謝物分析は、記載されるように微生物の造粒物上で行った（Ｂ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ、２００９、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ＡＴＣＣ２７４０５  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ、ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｓｔｒｅｓｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１２、１３：３３６、Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ  Ｅ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｇａｒ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｇａｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｕｓｉｎｇ  ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ２００９、４、５８-６３。
【０２４７】
大腸菌とは対照的に、Ｃ．オートエタノゲナムでは、ＮＡＤＰＨプールは、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋及びＮＡＤＨに対してＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋及びＮＡＤＰが２．２：１の比率で、ＮＡＤＨプールよりも大きいことがわかった（図７７）。それぞれ、３６．８：１のＮＡＤＨ＋Ｈ＋に対するＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋は、基質としてＣＯを用いる酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウムにおいてＮＡＤＰＨの推進力を実証する。
【０２４８】
標準法的な段落
読み手が、不適当な実験を用いずに発明を実施することを可能にするために、本発明は、一定の好適な実施形態を参照にして、本明細書に記載されている。しかしながら、当業者は、構成要素及びパラメータの多くが、本発明の範囲から逸脱すること無く、一定の範囲に変えられ得るか修正され得、または既知の均等物に置換され得ることを容易に認識するであろう。そのような修正及び均等物が、本明細書において個別に定められるように組み込まれることが認識されるべきである。タイトル、見出し、または同様のものは、この書類の読み手の理解を増すように提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして読み取られるべきではない。
【０２４９】
上記や下記の全ての出願、特許及び刊行物の全開示は、もしあれば、参照によって本明細書に組み込まれる。しかしながら、この明細書における任意の出願、特許及び刊行物に対する参照は、それらが、有効な先行技術を構成するという、または、いずれの国においても普通の一般的知識の一部を形成するという認識もしくは任意の形態の提案ではないし、あるいは、そのようにみなされるべきではない。
【０２５０】
この明細書及び後続する任意の特許請求の範囲全体を通して、文脈が他のものを要求する場合を除いて、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び同様のものは、排他的な意味とは対照的に包括的な意味に、すなわち、「限定されるものではないが、〜を含む」という意味に、解釈されることになる。
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Ｋｉｔａ、Ａ．、Ｉｗａｓａｋｉ、Ｙ．、Ｓａｋａｉ、Ｓ．、Ｏｋｕｔｏ、Ｓ．、Ｔａｋａｏｋａ、Ｋ．、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｔ．、Ｙａｎｏ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２０１２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｃｅｔｏｇｅｎ  Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｘｘ（ｘｘ）、１-６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｓｃ．２０１２．１０．０１３
Ｋoｐｋｅ、Ｍ．、Ｈｅｌｄ、Ｃ．、Ｈｕｊｅｒ、Ｓ．、Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ、Ｈ．、Ｗｉｅｚｅｒ、Ａ．、Ｗｏｌｌｈｅｒｒ、Ａ．、Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ、Ａ．ｅｔ  ａｌ（２０１０）．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｙｎｇａｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、１０７（２９）、１３０８７-９２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００４７１６１０７
Ｋoｐｋｅ、Ｍ．、Ｍｉｈａｌｃｅａ、Ｃ．、Ｌｉｅｗ、Ｆ．、Ｔｉｚａｒｄ、Ｊ．Ｈ．、Ａｌｉ、Ｍ．Ｓ．、Ｃｏｎｏｌｌｙ、Ｊ．Ｊ．、Ａｌ−Ｓｉｎａｗｉ、Ｂ．ｅｔ  ａｌ（２０１１）．２，３−Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｒｏｕｔｅ  Ｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｗａｓｔｅ  Ｇａｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７７（１５）、５４６７-７５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．００３５５−１１
Ｌｅａｎｇ、Ｃ．、Ｕｅｋｉ、Ｔ．、＆Ｌｏｖｌｅｙ、Ｄ．Ｒ．（２０１１）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．Ｐｏｓｔｅｒ．
Ｌｉ、Ｆ．、Ｈｉｎｄｅｒｂｅｒｇｅｒ、Ｊ．、Ｓｅｅｄｏｒｆ、Ｈ．、Ｚｈａｎｇ、Ｊ．、Ｂｕｃｋｅｌ、Ｗ．、＆Ｔｈａｕｅｒ、Ｒ．Ｋ．（２００８）．Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｔｏｎｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ（ＣｏＡ）ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＮＡＤＨ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／Ｅｔｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９０（３）、８４３-５０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．０１４１７−０７
Ｍａ、Ｃ．、Ｚｈａｎｇ、Ｌ．、Ｄａｉ、Ｊ．、＆Ｘｉｕ、Ｚ．（２０１０）．Ｒｅｌａｘｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｂｙ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４６（４）、１７３-８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１０．０２．００５
Ｍａ、Ｓ．Ｍ．、Ｇａｒｃｉａ、Ｄ．Ｅ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ−Ｊｏｈａｎｓｏｎ、Ａ．Ｍ．、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ、Ｇ．Ｄ．、Ｃｈａｎ、Ｒ．、Ｂａｔｔｈ、Ｔ．Ｓ．、Ｈａｌｉｂｕｒｔｏｎ、Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２０１１）．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｔ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１３（５）、５８８-９７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１１．０７．００１
ＭｃＫｅｅｖｅｒ、Ｂ．Ｍ．、Ｈａｗｋｉｎｓ、Ｂ．Ｋ．、Ｇｅｉｓｓｌｅｒ、Ｗ．Ｍ．、Ｗｕ、Ｌ．、Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｒ．Ｐ．、Ｍｏｓｌｅｙ、Ｒ．Ｔ．、＆Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｓ．（２００２）．Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ８０  ｉｎ  １７β−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ＮＡＤＰＨ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ／ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１６０１（１）、２９-３７．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１５７０−９６３９（０２）００４３４−Ｘ
Ｍｉｌｌｅｒ、ＥＮ、Ｊａｒｂｏｅ、Ｌ．Ｒ．、Ｙｏｍａｎｏ、Ｌ．Ｐ．、Ｙｏｒｋ、Ｓ．Ｗ．、Ｓｈａｎｍｕｇａｍ、Ｋ．Ｔ．、＆Ｉｎｇｒａｍ、Ｌ．Ｏ．（２００９）．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅｓ（ｙｑｈＤ  ａｎｄ  ｄｋｇＡ）ｉｎ  ｆｕｒｆｕｒａｌ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７５（１３）、４３１５-２３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．００５６７−０９
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｌｌｉｏｔ  Ｎ、Ｊａｒｂｏｅ、Ｌ．Ｒ．、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｐ．Ｃ．、Ｐｈａｒｋｙａ、Ｐ．、Ｙｏｍａｎｏ、Ｌ．Ｐ．、Ｙｏｒｋ、Ｓ．Ｗ．、Ｎｕｎｎ、Ｄ．ｅｔ  ａｌ（２００９）．Ｆｕｒｆｕｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｓｕｌｆｕｒ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＬＹ１８０．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７５（１９）、６１３２-４１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０１１８７−０９
Ｎｉｉｔｔｙｌａｅ、Ｔ．、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、Ｂ．、Ｓａｕｅｒ、Ｕ．、＆Ｆｒｏｍｍｅｒ、Ｗ．Ｂ．（２００９）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｎ−１３  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｆｌｕｘｏｍｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、５５３、３５５-７２．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６０３２７−５６３−７＿１９
Ｐａｔｔｉ、Ｇ．Ｊ．、Ｙａｎｅｓ、Ｏ．、＆Ｓｉｕｚｄａｋ、Ｇ．（２０１２）．Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ：Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ：ｔｈｅ  ａｐｏｇｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｍｉｃｓ  ｔｒｉｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、１３（４）、２６３-９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３３１４
Ｐｅｒｅｚ、Ｊ．Ｍ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ、Ｈ．、Ｌｏｆｔｕｓ、Ｓ．Ｅ．、＆Ａｎｇｅｎｅｎｔ、Ｌ．Ｔ．（２０１２）．Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ａｌｃｏｈｏｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１-３０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２４７８６
Ｐｏｅｈｌｅｉｎ、Ａ．、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｓ．、Ｋａｓｔｅｒ、Ａ．−Ｋ．、Ｇｏｅｎｒｉｃｈ、Ｍ．、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ、Ｊ．、Ｔｈuｒｍｅｒ、Ａ．、Ｂｅｒｔｓｃｈ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２０１２）．Ａｎ  Ａｎｃｉｅｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＡＴＰ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ａ．Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、Ｅｄ．）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、７（３）、ｅ３３４３９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３４３９
Ｒａｎｅ、Ｍ．Ｊ．、＆Ｃａｌｖｏ、Ｋ．Ｃ．（１９９７）．Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｋｅｔｏｌ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ＮＡＤＰＨ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、３３８（１）、８３-９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／９０１５３９１から取得される。
Ｓｃｈｅｅｒ、Ｍ．、Ｇｒｏｔｅ、Ａ．、Ｃｈａｎｇ、Ａ．、Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ、Ｉ．、Ｍｕｎａｒｅｔｔｏ、Ｃ．、Ｒｏｔｈｅｒ、Ｍ．、Ｓoｈｎｇｅｎ、Ｃ．ｅｔ  ａｌ（２０１１）．ＢＲＥＮＤＡ、ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、３９（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）、Ｄ６７０−６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ１０８９
Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ、Ｋ．、＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｖ．（２０１２）．Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｉｆｕｒｃａｔｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９５０３８
Ｓｃｈｕｔ、Ｇ．Ｊ．、＆Ａｄａｍｓ、Ｍ．Ｗ．Ｗ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｉｒｏｎ−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  ＮＡＤＨ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ：ａ  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９１（１３）、４４５１-７．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．０１５８２−０８
Ｓｃｈoｎｈｅｉｔ、Ｐ．、Ｗaｓｃｈｅｒ、Ｃ．、＆Ｔｈａｕｅｒ、Ｒ．Ｋ．（１９７８）．Ａ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ、８９（２）、２１９-２２．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／６５８４０９から取得される。
Ｔａｎｇ、Ｙ．Ｊ．、Ｍａｒｔｉｎ、Ｈ．Ｇ．、Ｍｙｅｒｓ、Ｓ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｓ．、Ｂａｉｄｏｏ、Ｅ．Ｅ．Ｋ．、＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ、Ｊ．Ｄ．（日付不明）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘｅｓ  ｖｉａ（１３）Ｃ  ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ、２８（２）、３６２-７５．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍａｓ．２０１９１
Ｔａｎｎｅｒ、Ｒ．Ｓ．、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ．Ｍ．、＆Ｙａｎｇ、Ｄ．（１９９３）．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｓｐ．ｎｏｖ．、ａｎ  ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｒＲＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｇｒｏｕｐ  Ｉ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、４３（２）、２３２．ｈｔｔｐ：／／ｉｊｓ．ｓｇｍｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／４３／２／２３２．ｓｈｏｒｔから取得される。
Ｔｙｕｒｉｎ、Ｍ．、＆Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、Ｍ．（２０１２）．Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ａｃｅｔｏｇｅｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＭＴ  ３５１  ｗｉｔｈ  ｅｒｍ（Ｂ）ｏｒ  ｃａｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１-１２．ｈｔｔｐ：／／ｌｕ３８３６１．ｗｅｂ．ｏｆｆｉｃｅｌｉｖｅ．ｃｏｍ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／２０１２ｖ４ｐ１−１２．ｐｄｆから取得される。
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Ｗａｎｇ、Ｓ．、Ｈｕａｎｇ、Ｈ．、Ｍｏｌｌ、Ｊ．、＆Ｔｈａｕｅｒ、Ｒ．Ｋ．（２０１０）．ＮＡＤＰ＋  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  ＮＡＤＰ＋  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＮＡＤＨ  ａｒｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｖｉａ  ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｂｉｆｕｒｃａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９２（１９）、５１１５-２３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００６１２−１０
Ｖｉｄａｌ  Ｒ．、Ｌ´ｏｐｅｚ−Ｍａｕｒｙ  Ｌ．、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ  Ｆ．Ｊ．（２００９）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｈｉｋ３４−Ｒｒｅ１  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９１、４３８３-４３９１．
Ｃｏｏｌｅｙ  Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｖｅｒｍａａｓ  Ｗ．Ｆ．（２００１）Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３：ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８３、４２５１-４２５８．
Ｅｒｂ  Ｔ．、Ｂｅｒｇ  Ｉ．ａｎｄ  Ｂｒｅｃｈｔ  Ｖ．（２００７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃ５−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃ２−ｕｎｉｔｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ｔｈｅ  ｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｐａｔｈｗａｙ．ＰＮＡＳ、ＵＳＡ１０４、１-６．
Ｌａｎ  Ｅ．Ｉ．ａｎｄ  Ｌｉａｏ  Ｊ．Ｃ．（２０１２）ＡＴＰ  ｄｒｉｖｅｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １−ｂｕｔａｎｏｌ  ｉｎ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．ＰＮＡＳ、ＵＳＡ１０９、６０１８-６０２３．
Ｌｉｎｓｔｅｒ  Ｃ．Ｌ．、Ｎｏ¨ｅｌ  Ｇ．、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ  Ｖ．、Ｖｅｒｔｏｍｍｅｎ  Ｄ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ．Ｆ．、Ｂｏｍｍｅｒ  Ｇ．Ｔ．、Ｖｅｉｇａ−ｄａ  Ｃｕｎｈａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ  Ｅ．（２０１１）Ｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８６、４２９９２-４３００３．
Ｙａｎ  Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  Ｊ．Ｓ．（１９９０）Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ−ａｃｙｌａｔｉｎｇ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｒｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ５９２．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６、２５９１−２５９９．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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