(57)【要約】標的遺伝子の発現を増加させるために有用な標的遺伝子のユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドが本明細書中に提供され；関連する組成物および方法も提供される。いくつかの実施形態において、これらのユークロマチン領域と相補的であり、送達、ハイブリダイゼーションおよび細胞内での安定性に適した化学的性質を有する、オリゴヌクレオチドが提供される。さらに、いくつかの実施形態において、インビボにおいてオリゴヌクレオチドの薬物動態、体内分布、バイオアベイラビリティおよび／または有効性をコントロールするために有用なオリゴヌクレオチドの化学的性質が提供される。
2016531570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において標的遺伝子の発現を増加させるための方法であって、該方法は、
標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと細胞とを接触させ、それにより、該細胞において該標的遺伝子の発現を増加させる工程を含み、ここで、該標的遺伝子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ転写物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を該ユークロマチン領域内に含む、、方法。
【請求項２】
前記細胞が、インビトロにおけるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、インビボにおけるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的遺伝子が、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子が、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標的遺伝子の不十分な発現レベルに関連する状態の処置を必要とする被験体において標的遺伝子の不十分な発現レベルに関連する状態を処置する方法であって、該方法は、
有効量の請求項７〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを該被験体に投与する工程
を含む、方法。
【請求項７】
標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該標的遺伝子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ転写物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を該ユークロマチン領域内に含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ユークロマチン領域内の前記少なくとも５個連続したヌクレオチドが、前記標的遺伝子のセンス鎖上に存在する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記ユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドが、前記標的遺伝子の前記アンチセンス鎖上に存在する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ転写物が、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅＲＮＡもしくはｓｎｏＲＮＡまたは他の任意の好適なＲＮＡ転写物である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ転写物の一部が、最初に転写されるヌクレオチドを該ＲＮＡ転写物の５’末端に含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記標的遺伝子の前記ユークロマチン領域が、適切なコントロールと比べてＤＮＡｓｅＩまたは小球菌ヌクレアーゼに対して高感受性の領域である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記標的遺伝子の前記ユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べて、リジン４メチル化ヒストンＨ３またはＨ４が富化されている、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記標的遺伝子の前記ユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べて、アセチル化ヒストンＨ３またはＨ４が富化されている、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記標的遺伝子の前記センス鎖が、メッセンジャーＲＮＡまたは非コードＲＮＡをコードする、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記標的遺伝子の前記センス鎖が、前記メッセンジャーＲＮＡのＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を前記ユークロマチン領域に含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記標的遺伝子の前記センス鎖が、前記メッセンジャーＲＮＡのイントロンの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を前記ユークロマチン領域に含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記標的遺伝子の前記センス鎖が、前記メッセンジャーＲＮＡのエキソンの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を前記ユークロマチン領域に含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、先行する請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド内結合を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
少なくとも１つのヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、少なくとも１つの２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドまたは少なくとも１つの橋架けヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記橋架けヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチドまたはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項７〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、ミックスマーである、請求項７〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは橋架けヌクレオチドとが交互になっているものを含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップマーである、請求項７〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記標的遺伝子が、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される、請求項７〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記標的遺伝子が、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される、請求項７〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、表３または表６に示されているような配列を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該標的遺伝子のセンス鎖は、第１のＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列を含み、該標的遺伝子のアンチセンス鎖は、第２のＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を該ユークロマチン領域に含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項７〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、一価カチオンと複合体を形成している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、凍結乾燥された形態で存在する、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが、水溶液で存在する、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項７〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよびキャリアを含む組成物。
【請求項３８】
請求項７〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを緩衝液中に含む組成物。
【請求項３９】
キャリアと結合体化された請求項７〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項４０】
請求項７〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の組成物が収容されている容器を備えるキット。
【請求項４２】
標的遺伝子の発現を増加させるための候補オリゴヌクレオチドを生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）標的遺伝子内のユークロマチン領域の位置を決定する工程；
（ｂ）ＲＮＡ転写物をコードする該標的遺伝子のアンチセンス鎖上の該ユークロマチン領域内のヌクレオチド配列の位置を決定する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の該ユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを生成する工程
を含む、方法。
【請求項４３】
標的遺伝子の発現を増加させるための１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを得るための方法であって、該方法は、
（ａ）標的遺伝子内のユークロマチン領域の位置を決定する工程；
（ｂ）ＲＮＡ転写物をコードする該標的遺伝子のアンチセンス鎖上の該ユークロマチン領域内のヌクレオチド配列の位置を決定する工程；
（ｃ）１０〜５０ヌクレオチド長の複数の異なるオリゴヌクレオチドを生成する工程であって、ここで、各オリゴヌクレオチドは、該標的遺伝子の該ユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する、工程；
（ｄ）該異なるオリゴヌクレオチドの各々を、該標的遺伝子を内包する細胞へのオリゴヌクレオチドの送達によって該細胞において該標的遺伝子の発現が増加するかを評価するアッセイに供する工程；および
（ｅ）（ｄ）における該標的遺伝子の発現を増加させるとの結果に基づいて同定された１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを得る工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）のもと、「遺伝子のユークロマチン領域を標的とするオリゴヌクレオチド」という名称であり、２０１３年８月１６日に出願された米国仮出願第６１／８６６，７７２号の利益を請求し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、オリゴヌクレオチドに基づく組成物、ならびにオリゴヌクレオチドに基づく組成物を使用して遺伝子発現を調節する方法に部分的に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトの疾患のかなりの部分は、疾患に関連する転写単位（非コードＲＮＡ、タンパク質をコードするＲＮＡまたは他の制御性のコードゲノム領域もしくは非コードゲノム領域）のタンパク質レベルおよび／またはＲＮＡレベルを選択的に変化させることによって処置され得る。そのような方法は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する工程または標的ＲＮＡの分解を引き起こす工程を含み得る。しかしながら、遺伝子の発現を増加させるために利用可能なアプローチは限られているので、遺伝子発現を調節するためのさらなるアプローチが、特に、発現レベルを増加させることに関して、望まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明のいくつかの態様によると、標的化された特異的な様式で遺伝子発現を増加させるために有用な方法および組成物が本明細書中に提供される。本発明の態様は、アンチセンスＲＮＡ転写物をコードする配列と重複する遺伝子のユークロマチン領域の同定に基づく。標的遺伝子のこれらの特定のユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、細胞に送達されたとき、標的遺伝子の発現を増加させるために有用であることが見出されている。いくつかの実施形態において、これらのユークロマチン領域と相補的であり、送達、ハイブリダイゼーションおよび細胞内での安定性に適した化学的性質を有する、オリゴヌクレオチドが提供される。さらに、いくつかの実施形態において、インビボにおいてオリゴヌクレオチドの薬物動態、体内分布、バイオアベイラビリティおよび／または有効性をコントロールするために有用なオリゴヌクレオチドの化学的性質が提供される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、低レベルの標的遺伝子に関連する疾患または状態の処置にとって有用である。
【０００５】
したがって、本発明のいくつかの態様において、標的遺伝子の発現を増加させるために有用なオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、それらのオリゴヌクレオチドは、１０〜５０ヌクレオチド長であり、標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する。いくつかの実施形態において、その標的遺伝子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ転写物の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列をユークロマチン領域内に含む。ある特定の実施形態において、ユークロマチン領域においてコードされるＲＮＡ転写物の一部は、１番目に転写されるヌクレオチドをそのＲＮＡ転写物の５’末端に含む。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドは、標的遺伝子のセンス鎖上に存在する。ある特定の実施形態において、ユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドは、標的遺伝子のアンチセンス鎖上に存在する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅＲＮＡもしくはｓｎｏＲＮＡまたは他の任意の好適なＲＮＡ転写物である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子のユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べてＤＮＡｓｅＩまたは小球菌ヌクレアーゼに対して高感受性の領域である。ある特定の実施形態において、標的遺伝子のユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べて、メチル化ヒストン（例えば、リジン４メチル化ヒストンＨ３またはＨ４）が富化されている。いくつかの実施形態において、標的遺伝子のユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べて、アセチル化ヒストン（例えば、アセチル化ヒストンＨ３またはＨ４）が富化されている。
【０００７】
ある特定の実施形態において、標的遺伝子のセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、標的遺伝子のセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡのＵＴＲをコードするヌクレオチド配列をユークロマチン領域に含む。ある特定の実施形態において、標的遺伝子のセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡのイントロンの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列をユークロマチン領域に含む。いくつかの実施形態において、標的遺伝子のセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡのエキソンの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列をユークロマチン領域に含む。ある特定の実施形態において、標的遺伝子のセンス鎖は、非コードＲＮＡをコードする。
【０００８】
ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド内（ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、少なくとも１つの２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドまたは少なくとも１つの橋架けヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含む。いくつかの実施形態において、橋架けヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチドまたはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）である。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは橋架けヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）である。
【０００９】
ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される。
【００１０】
ある特定の実施形態において、表３または表６に示されているようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの態様において、標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、標的遺伝子のセンス鎖は、第１のＲＮＡ転写物をコードするヌクレオチド配列を含み、標的遺伝子のアンチセンス鎖は、第２のＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列をユークロマチン領域に含む。いくつかの実施形態において、第１のＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、第１のＲＮＡ転写物は、機能性ＲＮＡ転写物（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）である。いくつかの実施形態において、第２のＲＮＡ転写物は、非コードＲＮＡ転写物である。
【００１２】
本発明のいくつかの態様において、細胞において標的遺伝子の発現を増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、細胞において標的遺伝子の発現を増加させるために有用な本明細書中に開示されるいずれか１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドと細胞とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、その細胞は、インビトロにおけるものである。いくつかの実施形態において、その細胞は、インビボにおけるものである。本発明の他の態様において、標的遺伝子の不十分な発現レベルに関連する状態の処置を必要とする被験体においてそのような処置を行うための方法が提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、有効量の、標的遺伝子の発現を増加させるために有用な本明細書中に開示されるいずれか１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含む。
【００１３】
本発明のいくつかの態様において、本明細書中に開示される１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、一価カチオン（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｓ＋）と複合体を形成している。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、凍結乾燥された形態で存在する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、水溶液で存在する。いくつかの実施形態において、キャリア（例えば、薬学的に許容され得るキャリア）と組み合わされるかまたは混合されたオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、緩衝液中に提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、キャリアと結合体化されている。本発明のいくつかの態様において、組成物が収容されている容器を備えるキットが提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの態様において、標的遺伝子の発現を増加させるための候補オリゴヌクレオチドを生成するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、１つまたはそれを超える以下の工程を含む。（ａ）標的遺伝子内のユークロマチン領域の位置を決定する工程；（ｂ）ＲＮＡ転写物をコードする標的遺伝子のアンチセンス鎖上のユークロマチン領域内のヌクレオチド配列の位置を決定する工程；および（ｃ）標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを生成する工程。
【００１５】
本発明のいくつかの態様において、標的遺伝子の発現を増加させるための１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを得るための方法が提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、１つまたはそれを超える以下の工程を含む。（ａ）標的遺伝子内のユークロマチン領域の位置を決定する工程；（ｂ）ＲＮＡ転写物をコードする標的遺伝子のアンチセンス鎖上のユークロマチン領域内のヌクレオチド配列の位置を決定する工程；（ｃ）１０〜５０ヌクレオチド長の複数の異なるオリゴヌクレオチドを生成する工程（ここで、各オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のユークロマチン領域内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する）；（ｄ）異なるオリゴヌクレオチドの各々を、標的遺伝子を内包する細胞へのオリゴヌクレオチドの送達によってその細胞において標的遺伝子の発現が増加するかを評価するアッセイに供する工程；および（ｅ）（ｄ）における標的遺伝子の発現を増加させるとの結果に基づいて同定された１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを得る工程。
【００１６】
本発明の１つまたはそれを超える実施形態の詳細は、下記の説明に示される。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な記載から明らかであり、また、添付の特許請求の範囲からも明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて１つまたはそれを超えるこれらの図面を参照することによってより良く理解され得る、本開示のある特定の態様をさらに示すために含められる。
【００１８】
【図１】図１は、標的ユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドに対するデザインスキームを示している略図である。
【００１９】
【図２−１】図２は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１４および４２９との相補性領域を示している。
【図２−２】図２は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１４および４２９との相補性領域を示している。
【図２−３】図２は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１４および４２９との相補性領域を示している。
【図２−４】図２は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１４および４２９との相補性領域を示している。
【図２−５】図２は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１４および４２９との相補性領域を示している。
【００２０】
【図３−１】図３は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１５との相補性領域を示している。
【図３−２】図３は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１５との相補性領域を示している。
【図３−３】図３は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１５との相補性領域を示している。
【図３−４】図３は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１５との相補性領域を示している。
【図３−５】図３は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおけるＦＸＮ遺伝子座内のＣＡＧＥデータ、ＤＮＡａｓｅＩ高感受性データおよびＦＡＩＲＥデータを示している略図である。黒色の方形は、オリゴヌクレオチド４１５との相補性領域を示している。
【００２１】
【図４】図４は、ＦＲＤＡを有する患者由来の細胞株をフラタキシン（ＦＸＮ）の標的ユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドで処理した後のＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを示しているグラフである。
【００２２】
【図５】図５は、ＦＲＤＡを有する患者由来の細胞株をフラタキシン（ＦＸＮ）の標的ユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドで処理した後のＦＸＮタンパク質のレベルを示しているグラフである。
【００２３】
【図６】図６は、ＦＲＤＡを有する患者由来の細胞株を、フラタキシン（ＦＸＮ）の標的ユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドと他のＦＸＮ標的化オリゴヌクレオチドとの組み合わせで処理した後のＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを示しているグラフである。
【００２４】
【図７】図７は、様々な濃度のオリゴ４２９で処理された細胞におけるＦＸＮタンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【００２５】
【図８】図８は、オリゴ５１７ｍ０８、５１８ｍ０２、５１９ｍ０８および５２１ｍ０２で処理された細胞におけるＦＸＮタンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【００２６】
【図９】図９は、オリゴ４１４で処理された細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明の態様は、遺伝子の発現を増加させるための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子の発現を増加させるために標的とし得るその遺伝子内のまたはその遺伝子に関連するある特定のユークロマチン領域の発見に関する。いくつかの実施形態において、これらの標的とするユークロマチン領域は、遺伝子の発現を阻害すると考えられているアンチセンスＲＮＡ転写物が転写される、その遺伝子のアンチセンス鎖上のヌクレオチド配列を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、これらのアンチセンス鎖ＲＮＡ転写物は、遺伝子のセンス鎖においてコードされるＲＮＡ転写物の転写、プロセシング、成熟および／または機能を破壊し得ると考えられている。したがって、いくつかの実施形態において、これらのアンチセンス転写物の機能を阻止するオリゴヌクレオチドを使用することにより、対応するセンスＲＮＡ転写物の転写、プロセシング、成熟および／または機能が回復し得ると考えられる。
【００２８】
本明細書中で使用されるとき、用語「ユークロマチン領域」とは、オープンクロマチンが富化されているゲノム領域のことを指す。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、例えば、ＤＮＡｓｅＩまたは小球菌ヌクレアーゼによるヌクレアーゼ消化に対して高感受性のゲノム領域である。したがって、いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、ＤＮａｓｅＩによる切断に感受性の領域の配列決定に基づくＤＮａｓｅ−Ｓｅｑ（ＤＮａｓｅＩ高感受性部位の配列決定）を使用して同定され得る
【００２９】
いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、ヌクレオソームが比較的少ないゲノム領域である。したがって、いくつかの実施形態では、ヌクレオソームが少ないゲノム領域よりもヌクレオソームに結合したＤＮＡにおいてホルムアルデヒド架橋がより効率的であるという観察結果に基づく、ＦＡＩＲＥ−Ｓｅｑ（制御エレメントのホルムアルデヒド支援単離）を使用して、ユークロマチン領域が同定され得る。この方法は、オープンクロマチンに通常見出される架橋されていないＤＮＡを分離して、そしてそれを配列決定する。そのプロトコルは、代表的には、架橋、フェノール抽出および水相中のＤＮＡの配列決定を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べてメチル化ヒストン（例えば、メチル化ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４）が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、適切なコントロールは、健常な被験体または健常な被験体の集団から得られた細胞、組織または体液における対応するゲノム領域である。本明細書中で使用されるとき、健常な被験体は、明らかに疾患がなく、病歴、例えば、フリードライヒ運動失調症または本明細書中に記載される別の疾患の履歴を有しない、被験体である。いくつかの実施形態において、適切なコントロールは、フリードライヒ運動失調症を有しない被験体由来の細胞における対応するゲノム領域であるか、またはフリードライヒ運動失調症を有しない被験体の集団由来の細胞集団における対応するゲノム領域である。いくつかの実施形態において、フリードライヒ運動失調症を有しない被験体または被験体集団は、第１イントロンに２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０個未満のＧＡＡリピート単位を含むＦＸＮ遺伝子を有する被験体である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン４においてモノメチル化またはトリメチル化されたヒストンＨ３が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン３６においてトリメチル化されたヒストンＨ３が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン９、リジン２７またはリジン７９においてモノメチル化されたヒストンＨ３が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン７９においてジメチル化またはトリメチル化されたヒストンＨ３が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン２０においてモノメチル化されたヒストンＨ４が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン５においてモノメチル化されたヒストンＨ２Ｂが富化されているゲノム領域である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、適切なコントロールと比べてアセチル化ヒストン（例えば、アセチル化ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４）が富化されているゲノム領域である。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、リジン９、リジン１４またはリジン２７においてアセチル化されているヒストンＨ３が富化されているゲノム領域である。
【００３２】
ヒストンの他の修飾（例えば、ヒストンテイルのリン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、シトルリン化およびＡＤＰ−リボシル化を含む）を使用して、ユークロマチン領域が同定されてもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ヌクレオソームマッピングを通じて得られた情報を使用して、制御領域（例えば、ユークロマチン領域）が同定され得る。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、他のゲノム領域（例えば、ヘテロクロマチン領域）と比べてヌクレオソームが少ない。
【００３４】
オープンクロマチンを同定するためのさらなる方法が利用可能であり、それらとしては、例えば、Ｂｏｙｌｅ，Ａ．Ｐ．ら、Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｐｅｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３２，Ｉｓｓｕｅ  ２，３１１−３２２，２５  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８；Ｓｏｎｇ  Ｌら、Ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ＤＮａｓｅＩ  ａｎｄ  ＦＡＩＲＥ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｓｈａｐｅ  ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｏｃｔ；２１（１０）：１７５７−６７；およびＣｒａｗｆｏｒｄ  ＧＥら、Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮａｓｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００６  Ｊａｎ；１６（１）：１２３−３１（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている方法が挙げられる。
【００３５】
ユークロマチン領域の位置に関する情報は、ＵＣＳＣゲノムブラウザおよび他の公的なデータベースにも見出され得る。例えば、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ）Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＡＷＧ）は、ＥＮＣＯＤＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍの中の複数のデータ生成グループによって生成されたデータセットに対して均一な処理を行い、ＵＣＳＣは、ＥＮＣＯＤＥのＤＮａｓｅＩデータのＡＷＧの均一な処理に基づくブラウザトラックを発表した。ＵＣＳＣにおけるデータは、生リード（ｒａｗ  ｒｅａｄｓ）またはＤＮＡｓｅ１高感受性位置の処理された位置として示され得る。例えば、ＵＣＳＣゲノムブラウザは、複数の異なる細胞型におけるオープンクロマチンエレメントのセットを細胞型ごとに基づいて表示するトラックである、ＥＮＣＯＤＥ／ＡｎａｌｙｓｉｓからＤＮａｓｅＩ高感受性均一ピーク（Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｐｅａｋｓ）を提供する。ＵＣＳＣゲノムブラウザは、アッセイされた細胞型にわたって均一なＤＮａｓｅＩ高感受性部位のクラスターを表示するＥＮＣＯＤＥからの細胞型におけるデジタルＤＮａｓｅＩ高感受性クラスターも提供する。したがって、オープンクロマチンが富化されているゲノム領域は、この情報を使用して同定され得る。
【００３６】
ユークロマチン領域は、標的遺伝子内の任意の領域または標的遺伝子に関連する任意の領域に存在し得る。例えば、ユークロマチン領域は、メッセンジャーＲＮＡのＵＴＲをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含む標的遺伝子の中のある位置に位置を決め得る。別の例では、ユークロマチン領域は、メッセンジャーＲＮＡのイントロンの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む標的遺伝子の中のある位置に位置を決め得る。別の例では、ユークロマチン領域は、メッセンジャーＲＮＡのエキソンの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む標的遺伝子の中のある位置に位置を決め得る。別の例では、ユークロマチン領域は、イントロン−エキソンの境界をコードするヌクレオチド配列を含む標的遺伝子の中のある位置に位置を決め得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、イントロンをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含まない。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、エキソンをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含まない。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、５’−ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含まない。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、３’−ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列またはその一部を含まない。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、プロモーター、エンハンサーもしくはサイレンサーをコードするヌクレオチド配列またはそれらのうちのいずれか１つの他の部分を含まない。
【００３８】
ユークロマチン領域は、標的遺伝子の特定の領域におけるオープンクロマチンのサイズによって決定されるとき、任意の長さであり得る。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、最大５０塩基対の長さ、最大１００塩基対の長さ、最大２００塩基対の長さ、最大５００塩基対の長さ、最大１０００塩基対の長さ、最大２０００塩基対の長さ、最大５０００塩基対の長さであるか、またはそれを超える長さである。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域は、５０〜１００塩基対の長さ、５０〜５００塩基対の長さ、１００〜１０００塩基対の長さ、１００〜２０００塩基対の長さ、５００〜５０００塩基対の長さであるか、またはそれを超える長さである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、遺伝子のユークロマチン領域の一部と相補的なオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、その遺伝子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ転写物（例えば、アンチセンスＲＮＡ転写物）の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列をユークロマチン領域に含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、遺伝子におけるユークロマチン領域から転写された配列を含むアンチセンスＲＮＡ転写物の機能を阻害する。そのようなオリゴヌクレオチドは、遺伝子のセンス鎖上またはアンチセンス鎖上の配列と相補的であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、センスＲＮＡ転写物またはアンチセンスＲＮＡ転写物とハイブリダイズし得、いずれの場合も、それらの２つの転写物が互いとハイブリダイズするのが阻害されるかまたは妨げられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、ある遺伝子におけるユークロマチン領域から転写された配列を有するアンチセンス転写物と相補的であるとき、そのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス転写物にハイブリダイズして、それを分解させることによって、そのアンチセンス転写物の機能を阻害し得る。したがって、いくつかの実施形態において、標的遺伝子の対応するセンスＲＮＡ転写物の高発現をもたらすアンチセンスＲＮＡ転写物の分解を引き起こすオリゴヌクレオチドが提供される。しかしながら、いくつかの実施形態では、標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡ転写物とセンスＲＮＡ転写物とのハイブリダイゼーションを阻害し、その標的遺伝子の高発現を効果的にもたらすオリゴヌクレオチドが提供される。また、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物の標的化を含まない様式で遺伝子の機能を阻害するオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ユークロマチン領域におけるＤＮＡに結合し、そのユークロマチン領域におけるタンパク質−ＤＮＡ相互作用を破壊する（例えば、転写因子またはそのＤＮＡに結合する他の因子を混乱させることなどによって）オリゴヌクレオチドが提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子から発現されたセンスＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡ転写物である場合、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドを使用することにより、翻訳に利用可能な高レベルのｍＲＮＡがもたらされるがゆえに、翻訳されたタンパク質のレベルの上昇がもたらされる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子から発現されたセンスＲＮＡ転写物が、非コードＲＮＡ転写物（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）である場合、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドを使用することにより、高レベルの非コードＲＮＡ転写物がもたらされるがゆえに、その非コードＲＮＡの活性が上昇する。
【００４１】
ＲＮＡ転写物（例えば、遺伝子に対してアンチセンスであるＲＮＡ転写物）をコードする配列と重複するユークロマチン領域を有するかまたはそのユークロマチン領域に関連する任意の遺伝子が、本明細書中に開示される組成物および方法を使用して標的化され得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴである。これらの遺伝子および他の遺伝子にとってのユークロマチン領域は、実験によって、またはＵＣＳＣゲノムブラウザなどのような公的なデータベースにおける情報に基づいて、選択され得るかまたは同定され得る。
【００４２】
さらに、ユークロマチン領域と重複する配列またはユークロマチン領域内に含まれる配列によってコードされるアンチセンスＲＮＡ転写物の非限定的な例としては、非コードＲＮＡ転写物、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ転写物、ｓｎｏＲＮＡなどが挙げられる。
アンチセンスＲＮＡ転写物の部位と重複するユークロマチン領域を標的とするオリゴヌクレオチド
【００４３】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現を増加させるための候補オリゴヌクレオチドを生成するための方法が提供される。通常、それらのオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してアンチセンスであるＲＮＡ転写物をコードする配列と重複するかまたはその配列を含むユークロマチン領域内の配列に相補的である。代表的には、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子内のユークロマチン領域の位置を決定し；ＲＮＡ転写物をコードする標的遺伝子のアンチセンス鎖上のユークロマチン領域内のヌクレオチド配列の位置を決定し；標的遺伝子のユークロマチン領域内の複数の（例えば、少なくとも５個）連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって、デザインされる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現を増加させるための１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを得るための方法が提供され、その方法は、複数の異なるオリゴヌクレオチドを生成する工程（ここで、各オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の標的ユークロマチン領域に複数の（例えば、少なくとも５個）連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する）；その異なるオリゴヌクレオチドの各々を、標的遺伝子を内包する細胞へのオリゴヌクレオチドの送達によってその細胞において標的遺伝子の発現が増加するかを評価するアッセイに供する工程；およびそのアッセイにおいて標的遺伝子の発現を増加させる１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを得る工程をさらに含む。
【００４５】
図１は、標的遺伝子１００の発現を増加させるオリゴヌクレオチドをデザインするための方法の非限定的な実施形態を描写している。描写されているように、標的遺伝子１００は、開始部位１０２および停止部位１０３を有する標的遺伝子転写物１０１（例えば、メッセンジャーＲＮＡ転写物）をコードする。この例では、標的遺伝子転写物１０１は、染色体のプラス鎖１０４から発現される。しかしながら、標的遺伝子は、染色体のプラス鎖またはマイナス鎖から発現され得る。標的遺伝子１００においてコードされる開始部位１０２および停止部位１０３が境界となっている領域内の染色体のマイナス鎖１０７から発現された２つのＲＮＡ転写物１０５、１０６も描写されている。
【００４６】
２つのＲＮＡ転写物１０５、１０６は、マイナス鎖１０７から発現され、標的遺伝子転写物１０１は、プラス鎖１０４上にコードされているので、それらの２つのＲＮＡ転写物１０５、１０６は、標的遺伝子１００に対してアンチセンスである。標的遺伝子標的が、マイナス鎖上にコードされている場合、その標的遺伝子に対してアンチセンスであるＲＮＡ転写物は、プラス鎖から発現されることが認識される。
【００４７】
３つのユークロマチン領域１０８、１０９、１１０が、標的遺伝子１００に存在し、そのうちの２つのユークロマチン領域１０９、１１０は、開始部位１０２および停止部位１０３が境界となっている領域内に完全に含まれている。この例では、標的遺伝子１００の発現を増加させるための候補オリゴヌクレオチドは、マイナス鎖ＲＮＡ転写物１０６が発現される領域と重複するユークロマチン領域１１０に対してデザインされている。一方の候補オリゴヌクレオチド１１１は、マイナス鎖に相補的であり、他方の候補オリゴヌクレオチド１１２は、プラス鎖に相補的である。他の類似の候補オリゴヌクレオチドもデザインされ得る。
【００４８】
標的ユークロマチン領域は、標的遺伝子の開始部位および停止部位が境界となっている領域内に完全に含まれる必要はないが、ただし、それらは、標的遺伝子に対してアンチセンスであるＲＮＡ転写物が発現される領域と重複する配列を含むことが認識されるべきである。
遺伝子発現を増加させるためのオリゴヌクレオチド
【００４９】
１つの態様において、本発明は、研究目的で（例えば、細胞において遺伝子の機能を研究するために）細胞において遺伝子発現を増加させるための方法に関する。別の態様において、本発明は、治療目的で細胞において遺伝子発現を増加させるための方法に関する。それらの細胞は、インビトロ、エキソビボまたはインビボにおけるもの（例えば、それを必要とする被験体、例えば、標的遺伝子の低発現または低活性に起因する疾患を有する被験体におけるもの）であり得る。いくつかの実施形態において、細胞において遺伝子発現を増加させるための方法は、本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドを送達する工程を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子発現は、適切なコントロールと比べて増加する。いくつかの実施形態において、遺伝子発現は、適切なコントロールと比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれを超えて増加する。いくつかの実施形態において、適切なコントロールは、遺伝子発現のコントロールレベルである。いくつかの実施形態において、適切なコントロールは、オリゴヌクレオチドが送達されていないかまたはネガティブコントロール（例えば、スクランブルオリゴ、キャリアなど）が送達された細胞、組織または被験体における遺伝子発現のコントロールレベルであり得る。
【００５０】
本記載全体にわたる化合物の使用に対するいずれの言及も、状態または疾患の処置において使用するための薬学的組成物または薬の調製におけるその化合物の使用を企図していると理解される。したがって、１つの非限定的な例として、本発明のこの態様は、疾患の処置において使用するための薬の調製におけるそのようなオリゴヌクレオチドの使用を含む。表１には、処置され得る疾患または状態の例を列挙した。
【表１−１】
2016531570.tif 000003
【表１−２】
2016531570.tif 000004
【表１−３】
2016531570.tif 000005
【表１−４】
2016531570.tif 000006
【表１−５】
2016531570.tif 000007
【００５１】
遺伝子発現を増加させるための本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得ることが認識されるべきである。一本鎖オリゴヌクレオチドは、二次構造、例えば、ループまたはヘリックス構造を含み得るがゆえに、ある特定の生理化学的条件下において１つまたはそれを超える二本鎖部分を有し得る。いくつかの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるような少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオシド間結合を含む。
【００５２】
本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、ひと続きのグアノシンヌクレオチド（例えば、３個またはそれを超える、４個またはそれを超える、５個またはそれを超える、６個またはそれを超える連続したグアノシンヌクレオチド）を含まない配列を有し得る。いくつかの実施形態において、ひと続きのグアノシンヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、ひと続きのグアノシンヌクレオチドを有しないオリゴヌクレオチドと比べて、高い非特異的結合および／またはオフターゲット効果を有し得る。
【００５３】
本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、オフターゲット遺伝子を含むゲノム位置またはオフターゲット遺伝子と近接したゲノム位置に位置する等しい長さのすべてのヌクレオチド配列と閾値レベル未満の配列同一性を有する配列を有し得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、それが、標的遺伝子のユークロマチン領域以外の、公知のすべての遺伝子（例えば、タンパク質をコードする公知のすべての遺伝子）を含むゲノム位置またはそれらと近接したゲノム位置に位置する配列を有しないことが確実になるようにデザインされ得る。配列同一性の閾値レベルは、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性であり得る。
【００５４】
本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、３０％超のＧ−Ｃ含量、４０％超のＧ−Ｃ含量、５０％超のＧ−Ｃ含量、６０％超のＧ−Ｃ含量、７０％超のＧ−Ｃ含量または８０％超のＧ−Ｃ含量を有する配列を有し得る。そのオリゴヌクレオチドは、最大１００％のＧ−Ｃ含量、最大９５％のＧ−Ｃ含量、最大９０％のＧ−Ｃ含量または最大８０％のＧ−Ｃ含量を有する配列を有し得る。オリゴヌクレオチドが８〜１０ヌクレオチド長であるいくつかの実施形態において、そのヌクレオチドの１、２、３、４または５つを除くすべてのヌクレオチドが、シトシンまたはグアノシンヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドと相補的であるｍＲＮＡの配列は、アデニンおよびウラシルから選択される３つ以下のヌクレオチドを含む。
【００５５】
本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、複数の異なる種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サルなど）の標的遺伝子に相補的であり得る。これらの特色を有するオリゴヌクレオチドは、複数の種（例えば、ヒトおよびマウス）における有効性についてインビボまたはインビトロにおいて試験され得る。このアプローチは、ヒトの疾患についての適切な動物が存在する種を選択することによって、そのヒト疾患を処置するための臨床候補の開発も容易にする。
【００５６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子のユークロマチン領域内）の少なくとも５〜１５、８〜１５、８〜３０、８〜４０または１０〜５０または５〜５０または５〜４０塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、相補性領域は、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子のユークロマチン領域内）の少なくとも５個または少なくとも８個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物もしくはＤＮＡ鎖またはそのいずれか一方の一部とハイブリダイズする相補性領域を含み、ここで、前記一部は、約５〜４０個または約８〜４０個または約５〜１５個または約５〜３０個または約５〜４０個または約５〜５０個連続したヌクレオチドの長さを有する。
【００５７】
相補的とは、この用語が当該分野において使用されるように、２つのヌクレオチド間において正確に対形成する能力のことを指す。例えば、オリゴヌクレオチドのある特定の位置におけるヌクレオチドが、標的核酸（例えば、ＲＮＡ転写物、ＤＮＡ鎖）の同じ位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのオリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。そのオリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、各分子における十分な数の対応する位置が、それらの塩基を介して互いと水素結合し得るヌクレオチドによって占有されるとき、互いに相補的である。したがって、「相補的」は、安定した特異的結合がオリゴヌクレオチドとその標的核酸との間に生じるような十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語である。例えば、オリゴヌクレオチドの１つの位置における塩基が、標的核酸の対応する位置における塩基と水素結合することができる場合、それらの塩基は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は、要求されない。
【００５８】
上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも８０％相補的（必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的のうちの１つ）であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドの部分と比べて１、２または３塩基のミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１５塩基にわたって最大３つのミスマッチまたは１０塩基にわたって最大２つのミスマッチを有し得る。
【００５９】
相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズ可能であるかまたは標的核酸に特異的であるために、その標的核酸のヌクレオチド配列に１００％相補的である必要がないことは当該分野において理解されている。いくつかの実施形態において、本開示の目的では、相補的な核酸配列は、標的核酸（例えば、ＲＮＡ転写物、ＤＮＡ鎖）に対するその配列の結合が、標的遺伝子の高発現をもたらすとき、ならびに非特異的結合の回避が望まれる条件下、例えば、インビボアッセイまたは治療的処置の場合における、およびインビトロアッセイの場合における生理学的条件下、インビトロアッセイが好適なストリンジェンシー条件下で行われる条件下、非標的配列に対するその配列の非特異的結合を回避するのに十分な相補性の程度が存在するとき、標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ）に対して特異的にハイブリダイズ可能であるかまたは標的核酸に特異的である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長である。
【００６１】
塩基対形成には、カノニカルなワトソン−クリック塩基対形成と非ワトソン−クリック塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成）の両方が含まれ得る。相補的な塩基対形成の場合、アデノシンタイプの塩基（Ａ）は、チミジンタイプの塩基（Ｔ）またはウラシルタイプの塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシンタイプの塩基（Ｃ）は、グアノシンタイプの塩基（Ｇ）に相補的であり、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドール）は、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴとハイブリダイズでき、かつ任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴに相補的であるとみなされることが理解される。イノシン（Ｉ）も、ユニバーサル塩基であると当該分野においてみなされており、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴに相補的であるとみなされる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、配列表に提供される配列を含む本明細書中に提供される配列におけるいずれか１つまたはそれを超えるチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）またはウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）は、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対を介する）に適した他の任意のヌクレオチドで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、配列表に提供される配列を含む本明細書中に提供される配列におけるいずれか１つまたはそれを超えるチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）またはウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）は、異なるピリミジンヌクレオチドで適切に置き換えられてもよいし、逆もまた同じである。いくつかの実施形態において、配列表に提供される配列を含む本明細書中に提供される配列におけるいずれか１つまたはそれを超えるチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）は、ウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）で適切に置き換えられてもよいし、逆もまた同じである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、好ましくは、約３０〜６０％である。連続した一続きの３つまたはそれを超えるＧまたはＣは、いくつかの実施形態において、好ましくないことがある。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、３つまたはそれを超えるひと続きのグアノシンヌクレオチドを含まない。
【００６４】
本明細書中に提供される任意のオリゴヌクレオチドが除外され得ることが理解されるべきである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２１７０７７１に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２１７０７７１Ａ１に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００６６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２９４８７０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２９４８７０に開示されているような配列番号４、５、６、６ａ、６ｂ、７、８、９、１０、１４または１５のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００６７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１０２８０１００に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１０２８０１００に開示されているような配列番号３のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００６８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１０１０５７６０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１０１０５７６０に開示されているような配列番号２、１７５または１７６のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００６９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１３１９４７５に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１３１９４７５に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００７０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１２９９１７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１２９９１７に開示されているような配列番号３、４、５または６のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０４６３４４に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０４６３４４に開示されているような配列番号８〜２２のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０６８３４０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０６８３４０に開示されているような配列番号９〜１３または図１のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０４６３４５に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０４６３４５に開示されているような配列番号３〜７のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０６８３４０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０６８３４０に開示されているような配列番号９〜１３または図１のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２３７６４９に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２３７６４９に開示されているような配列番号３〜６のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１３１９３１７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１３１９３１７に開示されているような配列番号３〜８のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２５２８６９に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２５２８６９に開示されているような配列番号５〜１４のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０７２４２１に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０７２４２１に開示されているような配列番号９〜２３または１４１〜１４３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１１４６６７４に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１１４６６７４に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０６４０４８に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０６４０４８に開示されているような配列番号４〜６のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０７１２３８に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０７１２３８に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００８２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２３７６５１に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２３７６５１に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１１３９３８７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１１３９３８７に開示されているような配列番号９〜２３、１４２または１４３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２３７６５０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１２３７６５０に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１４９７５９に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１４９７５９に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３２９８５５に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３２９８５５に開示されているような配列番号２〜４のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００８７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０３５３７２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０３５３７２に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３０９８１４に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３０９８１４に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００８９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０３５３７３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０３５３７３に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００９０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３２９７２７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３２９７２７に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３２２８５３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２３２２８５３に開示されているような配列番号６〜１２のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０８８８１７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０８８８１７に開示されているような配列番号４〜９のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０９４９３４に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０９４９３４に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１４２７５８に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１４２７５８に開示されているような配列番号３〜６のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０９５０８１に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０９５０８１に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【００９６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１７１１７０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１７１１７０に開示されているような配列番号４〜９のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０４６２３６に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０４６２３６に開示されているような配列番号３〜５のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２７７２９０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２７７２９０に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２８９５８３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２８９５８３に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１００】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０９５０７９に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０９５０７９に開示されているような配列番号３のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０９６１８３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０９６１８３に開示されているような配列番号１２〜２８のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３１１６３００に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３１１６３００に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０１０１５６に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２０１０１５６に開示されているような配列番号３のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２００４１８４に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２００４１８４に開示されているような配列番号３のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０６５９４７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０６５９４７に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０８５１１２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０８５１１２に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０８５１１２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０８５１１２に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３１３７７５１に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３１３７７５１に開示されているような配列番号２〜４または４２〜４４のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１３１９４７６に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１１３１９４７６に開示されているような配列番号２〜４または４２〜４４のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１１４６６７５に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１１４６６７５に開示されているような配列番号２〜４のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０７２５４６に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０７２５４６に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３１４３９４６に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３１４３９４６に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０５４７２３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０５４７２３に開示されているような配列番号２〜９のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０５８２６８に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０５８２６８に開示されているような配列番号２〜７のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１４２６１０に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１４２６１０に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１３５９４１に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２１３５９４１に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０４７９５６に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０４７９５６に開示されているような配列番号２〜７のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０２４４７８に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２０２４４７８に開示されているような配列番号２〜１６のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２００９３４７に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１２００９３４７に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１０９７５８２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１０９７５８２に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１０３８２０５に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１０３８２０５に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１０２５８６２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１１０２５８６２に開示されているような配列番号２または３のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５９に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５９に開示されているような配列番号２〜５のうちのいずれのヌクレオチド配列にも相補的でない。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５２に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５４に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５４に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２９５９５３に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２６４８１２に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、米国特許公開番号ＵＳ２０１２２６４８１２に開示されているような配列番号２のヌクレオチド配列に相補的でない。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１３０３６４０３に開示されているような天然のアンチセンス転写物に相補的でない。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を少なくとも約５０％（すなわち、通常の１５０％または１．５倍）または約２倍〜約５倍増加させ得ることが見出された。いくつかの実施形態において、発現は、少なくとも約１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくは１００倍または前述の数字のいずれかの間の任意の範囲だけ増加し得る。
【０１３０】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、修飾され得、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾ヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含み得る。さらに、それらのオリゴヌクレオチドは、以下の特性のうちの１つまたはそれを超える特性を示し得る：選択的スプライシングを媒介しない；免疫賦活性でない；ヌクレアーゼ抵抗性である；無修飾のオリゴヌクレオチドと比べて改善された細胞取り込みを有する；細胞もしくは哺乳動物に対して毒性でない；または改善されたエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｘｉｔ）を有する。
【０１３１】
本明細書中に開示される任意のオリゴヌクレオチドが、リンカー、例えば、切断可能なリンカーによって、本明細書中に開示される１つまたはそれを超える他のオリゴヌクレオチドに連結され得る。
【０１３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾を組み込むことなどによって、核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対して安定化され得る。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’または３’末端の少なくとも１番目、２番目または３番目のヌクレオシド間結合にホスホロチオエートを含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含み得る。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドのすべてが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、「ロック」されており、すなわち、リボース環が、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とを接続するメチレン橋架けによって「ロック」されている、核酸アナログを含む。
【０１３３】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドの修飾される化学的性質または修飾される形式の任意のものが、互いと組み合わされ得、その１、２、３、４、５個またはそれを超える異なるタイプの修飾が、同じ分子の中に含められ得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチド（本明細書中でヌクレオチドアナログとも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの橋架けヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、橋架けヌクレオチド（例えば、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル（ｃＥｔ）ヌクレオチドまたはエチレン橋架け核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド）を含み得る。そのようなヌクレオチドの例は、本明細書中に開示され、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または米国特許出願公開のうちの１つに開示されているヌクレオチドアナログを含む：米国特許第７，３９９，８４５号、同第７，７４１，４５７号、同第８，０２２，１９３号、同第７，５６９，６８６号、同第７，３３５，７６５号、同第７，３１４，９２３号、同第７，３３５，７６５号および同第７，８１６，３３３号、米国特許出願公開第２０１１０００９４７１号（これらの各々の全内容が、すべての目的のために参照により本明細書中に援用される）。オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える２’Ｏ−メチルヌクレオチドを有し得る。オリゴヌクレオチドは、全体的に、２’Ｏ−メチルヌクレオチドからなり得る。
【０１３５】
しばしば、上記オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超えるヌクレオチドアナログを有する。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを有しないオリゴヌクレオチドと比べてそのオリゴヌクレオチドのＴｍを１℃、２℃、３℃、４℃または５℃の範囲内で上昇させる少なくとも１つのヌクレオチドアナログを有し得る。上記オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログを有しないオリゴヌクレオチドと比べてそのオリゴヌクレオチドのＴｍを合計で２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃またはそれを超える範囲内で上昇させる複数のヌクレオチドアナログを有し得る。
【０１３６】
上記オリゴヌクレオチドは、最大５０ヌクレオチド長であり得、ここで、そのオリゴヌクレオチドの２〜１０個、２〜１５個、２〜１６個、２〜１７個、２〜１８個、２〜１９個、２〜２０個、２〜２５個、２〜３０個、２〜４０個、２〜４５個またはそれを超えるヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである。上記オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長であり得、ここで、そのオリゴヌクレオチドの２〜１０個、２〜１５個、２〜１６個、２〜１７個、２〜１８個、２〜１９個、２〜２０個、２〜２５個、２〜３０個のヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである。
【０１３７】
上記オリゴヌクレオチドは、８〜１５ヌクレオチド長であり得、ここで、そのオリゴヌクレオチドの２〜４個、２〜５個、２〜６個、２〜７個、２〜８個、２〜９個、２〜１０個、２〜１１個、２〜１２個、２〜１３個、２〜１４個のヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである。必要に応じて、そのオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド以外、すべてのヌクレオチドが修飾され得る。
【０１３８】
上記オリゴヌクレオチドは、全体的に、橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）からなり得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチドアナログとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）である５’ヌクレオチドを有し得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有し得る。
【０１３９】
上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’および３’末端の各々において少なくとも１つの橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）に隣接したデオキシリボヌクレオチドを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’および３’末端の各々において１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれを超える橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）に隣接したデオキシリボヌクレオチドを含み得る。上記オリゴヌクレオチドの３’位は、３’ヒドロキシル基を有し得る。上記オリゴヌクレオチドの３’位は、３’チオホスフェートを有し得る。
【０１４０】
上記オリゴヌクレオチドは、標識に結合体化され得る。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、その５’または３’末端において、ビオチン部分、コレステロール、ビタミンＡ、ホレート（ｆｏｌａｔｅ）、シグマレセプターリガンド、アプタマー、ペプチド、例えば、ＣＰＰ、疎水性分子、例えば、脂質、ＡＳＧＰＲまたはダイナミックポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびそれらのバリアントに結合体化され得る。
【０１４１】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分および／または修飾されたヌクレオシド間結合および／または修飾ヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含む１つまたはそれを超える修飾を含む。所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、本明細書中に記載される１つより多い修飾が、単一のオリゴヌクレオチドに、またはあるオリゴヌクレオチドの中の単一のヌクレオシド内に組み込まれ得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つまたはそれを超える化学的に異なる領域（各々が、少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている）を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には、１つまたはそれを超える有益な特性（例えば、高いヌクレアーゼ抵抗性、細胞内への多い取り込み、標的に対する高い結合親和性）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質である領域を含む。本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、上に記載されたような、２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造物として形成され得る。そのような化合物は、当該分野ではハイブリッドまたはギャップマーとも称されている。そのようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、糖の２’位において修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチドまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態において、ＲＮＡ修飾としては、ＲＮＡの３’末端のピリミジンのリボース上、無塩基残基上または反転した（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）塩基上の２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル修飾が挙げられる。そのような修飾は、日常的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【０１４４】
いくつかのヌクレオチド修飾は、天然のオリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより高い抵抗性が組み込まれたオリゴヌクレオチドをもたらすことが示されており；これらの修飾オリゴは、無修飾のオリゴヌクレオチドよりも長い時間にわたってインタクトな状態で残存する。修飾オリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格、例えば、修飾されたヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル糖間結合もしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子糖間結合もしくは複素環式糖間結合）を含むものが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格；ヘテロ原子骨格（例えば、メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格）；アミド骨格（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４を参照のこと）；モルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照のこと）；またはペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられ、それらのヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７を参照のこと）を有し得る。リン含有結合としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログおよび極性が反転したもの（ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とで連結される）が挙げられるが、これらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を参照のこと。
【０１４５】
モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６；および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。いくつかの実施形態において、モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：２３５−２３８，２００１；およびＷａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，１２：３５４−３６４，２０１０に記載されているようなもの；これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）である。
【０１４６】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２に記載されている。
【０１４７】
中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合とアルキルヌクレオシド間結合もしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合とが混合したもの（mixed  heteroatom  and  alkyl  or  cycloalkyl  internucleoside  linkages）、または１つもしくはそれを超える短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の構成要素部分が混合したその他のものが含まれる；米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１４８】
アラビノヌクレオチド残基もしくは修飾アラビノヌクレオチド残基に基づくかまたはそれらから構築されるオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドも知られている。アラビノヌクレオシドは、リボヌクレオシドの立体異性体であり、糖環の２’位における配置だけが異なる。いくつかの実施形態において、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆアラビノである。いくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）（例えば、Ｌｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１：３４５７−３４６７，２００２およびＭｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２６５１−２６５４，２００２に記載されているようなもの；これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）である。類似の修飾は、糖における他の位置、特に、３’末端のヌクレオシド上の、または２’−５’連結されたオリゴヌクレオチドにおける糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。
【０１４９】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６７３７８は、相補的なメッセンジャーＲＮＡへの会合を介した遺伝子発現の配列特異的阻害の改善のためのアラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマーおよびそれらのアナログを開示している。
【０１５０】
他の好ましい修飾としては、エチレン橋架け核酸（ＥＮＡ）（例えば、国際特許公開番号ＷＯ２００５／０４２７７７、Ｍｏｒｉｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌ  １：２４１−２４２，２００１；Ｓｕｒｏｎｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５：７４９−７５７，２００４；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：１４４−１４９，２００６およびＨｏｒｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ（Ｏｘｆ），４９：１７１−１７２，２００５；これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。好ましいＥＮＡとしては、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン橋架け核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５１】
ＬＮＡの例は、ＷＯ／２００８／０４３７５３に記載されており、それらとしては、以下の一般式の化合物が挙げられる。
【化１】
2016531570.tif 000008
式中、ＸおよびＹは、基−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−の中から独立して選択され、ここで、Ｒは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され；ＺおよびＺ＊は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され；Ｂは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分を構成し；不斉基は、いずれかの配向で見出され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用されるＬＮＡは、以下の式のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＡ単位を含み、
【化２】
2016531570.tif 000009
式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ（ＲＨ）であり；ＺおよびＺ＊は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され；Ｂは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用されるロックト核酸（ＬＮＡ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２のスキーム２に示されているいずれかの式に記載の少なくとも１つのロックト核酸（ＬＮＡ）単位を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーにおいて使用されるＬＮＡは、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここで、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。
【０１５５】
特に好ましいＬＮＡ単位を下に示す：
【化３】
2016531570.tif 000010
【０１５６】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＸまたはＹのうちの少なくとも１つがＳまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックトヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ配置とアルファ−Ｌ配置との両方で存在し得る。
【０１５７】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＸまたはＹのうちの少なくとも１つが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択されるロックトヌクレオチドを含み、ここで、Ｒは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ配置とアルファ−Ｌ配置との両方で存在し得る。
【０１５８】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＸまたはＹのうちの少なくとも１つが−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表わすロックトヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ配置とアルファ−Ｌ配置との両方で存在し得る。
【０１５９】
用語「ｅｎａ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＹが−ＣＨ２−Ｏ−であるロックトヌクレオチドを含む（ここで、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に結合する）。
【０１６０】
ＬＮＡは、本明細書中でさらに詳細に記載される。
【０１６１】
１つまたはそれを超える置換された糖部分、例えば、以下のうちの１つもまた、２’位に含められ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここで、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基および類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３］（Ｍａｒｔｉｎら、ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）が挙げられる。他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。類似の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物も有し得る。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドは、追加的にまたは代わりに、核酸塩基（当該分野では単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「無修飾」または「天然」の核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、天然の核酸ではまれにまたは一過性にのみ見出される核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、当該分野では５−Ｍｅ−Ｃと称されることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣ、イソシトシン、シュードイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンおよび２，６−ジアミノプリンまたは他のジアミノプリンが含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；およびＧｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：４５１３（１９８７））を参照のこと。当該分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも含められ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換として使用され得る。
【０１６３】
所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、本明細書中に記載される１つより多い修飾が、単一のオリゴヌクレオチドに、またはあるオリゴヌクレオチドの中の単一のヌクレオシド内に組み込まれ得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基の単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は、保持され、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
【０１６５】
オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える核酸塩基（当該分野では単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「無修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換グアニン、５−ハロウラシル、特に、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシルおよび他の５−置換ウラシル、５−ハロシトシン、特に、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルシトシンおよび他の５−置換シトシン、７−メチルグアニン（ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）および７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン）が含まれる。
【０１６６】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、“Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３頁によって開示されたもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されたものを含む。これらの核酸塩基のうちのある特定のものが、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２＜０＞Ｃ高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉら、ｅｄｓ，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、より詳細には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされるとき、現在、好ましい塩基置換である。修飾された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，７５０，６９２号および同第５，６８１，９４１号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１つまたはそれを超える部分または結合体に化学的に連結される。例えば、同じまたは異なるタイプの１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドが、互いに結合体化され得るか；またはオリゴヌクレオチドは、ある細胞型もしくは組織型に対して高い特異性を有する標的化部分に結合体化され得る。そのような部分としては、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；���第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）も参照のこと。
【０１６８】
これらの部分または結合体には、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合体基が含まれ得る。本発明の結合体基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基が含まれる。代表的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、ホレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。本発明の文脈における薬力学的特性を増強する基としては、取り込みを改善する基、分解に対する抵抗性を増強する基および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明の文脈における薬物動態学的特性を増強する基としては、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基が挙げられる。代表的な結合体基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６および米国特許第６，２８７，８６０号（これらは、参照により本明細書中に援用される）に開示されている。結合体部分しては、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号を参照のこと。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの修飾には、そのオリゴヌクレオチドの５’または３’末端の修飾が含まれる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヒドロキシル基またはチオホスフェートを含む。さらなる分子（例えば、ビオチン部分またはフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ））が、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に結合体化され得ることが認識されるべきである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレオチドに結合体化されたビオチン部分を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡ修飾ヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとロックト核酸ヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ロックト核酸ヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ロックト核酸ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’および３’末端の各々おいて少なくとも１つのロックト核酸ヌクレオチドに隣接したデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基または３’チオホスフェートを有する。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【０１７３】
オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるような任意の組み合わせの修飾を有し得ることが認識されるべきである。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、ミックスマーであり得るか、またはミックスマー配列パターンを含み得る。用語「ミックスマー」とは、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含むかまたは２つの異なるタイプの天然に存在しないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのことを指す。ミックスマーは、無修飾のオリゴヌクレオチドよりも高い結合親和性を有することが当該分野で広く知られており、標的分子に特異的に結合するため、例えば、標的分子上の結合部位を遮断するために使用され得る。一般に、ミックスマーは、標的分子にＲＮＡｓｅをリクルートしないので、標的分子の切断を促進しない。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、ヌクレオチドアナログと天然に存在するヌクレオチドとの反復パターン、または１つのタイプのヌクレオチドアナログと第２のタイプのヌクレオチドアナログとの反復パターンを含むか、またはそれらからなる。しかしながら、ミックスマーは、反復パターンを含む必要はなく、その代わりに、ヌクレオチドアナログと天然に存在するヌクレオチドとの任意の配置、または１つのタイプのヌクレオチドアナログと第２のタイプのヌクレオチドアナログとの任意の配置を含み得ることが理解されるべきである。反復パターンは、例えば、２つ目または３つ目のヌクレオチド毎がＬＮＡなどのヌクレオチドアナログであり、残りのヌクレオチドが、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるかまたは２’置換ヌクレオチドアナログ（例えば、２’ＭＯＥまたは２’フルオロアナログ）もしくは本明細書中に記載される他の任意のヌクレオチドアナログであり得る。ＬＮＡ単位などのヌクレオチドアナログの反復パターンは、固定の位置、例えば、５’または３’末端においてヌクレオチドアナログと組み合され得ることが認識される。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、５個より多く、４個より多く、３個より多く、または２個より多く連続した天然に存在するヌクレオチド、例えば、ＤＮＡヌクレオチドの領域を含まない。いくつかの実施形態において、ミックスマーは、少なくとも２個連続したヌクレオチドアナログ、例えば、少なくとも２個連続したＬＮＡからなる少なくとも１つの領域を含む。いくつかの実施形態において、ミックスマーは、少なくとも３個連続したヌクレオチドアナログ単位、例えば、少なくとも３個連続したＬＮＡからなる少なくとも１つの領域を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、７個より多く、６個より多く、５個より多く、４個より多く、３個より多く、または２個より多く連続したヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡの領域を含まない。それらのＬＮＡ単位は、他のヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書中で言及されたもので置き換えられ得ることが理解されるべきである。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、１つまたはそれを超える６個連続したヌクレオチドの中に少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、Ｘｘｘｘｘｘ、ｘＸｘｘｘｘ、ｘｘＸｘｘｘ、ｘｘｘＸｘｘ、ｘｘｘｘＸｘおよびｘｘｘｘｘＸからなる群より選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドを表す。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、１つまたはそれを超える６個連続したヌクレオチドの中に少なくとも２つのヌクレオチドアナログを含む。それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ＸＸｘｘｘｘ、ＸｘＸｘｘｘ、ＸｘｘＸｘｘ、ＸｘｘｘＸｘ、ＸｘｘｘｘＸ、ｘＸＸｘｘｘ、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸＸｘｘ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸ、ｘｘｘＸＸｘ、ｘｘｘＸｘＸおよびｘｘｘｘＸＸからなる群より選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ＸｘＸｘｘｘ、ＸｘｘＸｘｘ、ＸｘｘｘＸｘ、ＸｘｘｘｘＸ、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸおよびｘｘｘＸｘＸからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、置換パターンは、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸおよびｘｘｘＸｘＸからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、置換パターンは、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘおよびｘｘＸｘＸｘからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ｘＸｘＸｘｘである。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、１つまたはそれを超える６個連続したヌクレオチドの中に少なくとも３つのヌクレオチドアナログを含む。それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ＸＸＸｘｘｘ、ｘＸＸＸｘｘ、ｘｘＸＸＸｘ、ｘｘｘＸＸＸ、ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘ、ＸＸｘｘｘＸ、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸｘｘ、ＸｘｘＸＸｘ、ＸｘｘｘＸＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸ、ｘＸｘＸｘＸおよびＸｘＸｘＸｘからなる群より選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘ、ＸＸｘｘｘＸ、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸｘｘ、ＸｘｘＸＸｘ、ＸｘｘｘＸＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸ、ｘＸｘＸｘＸおよびＸｘＸｘＸｘからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸおよびｘＸｘＸｘＸからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ｘＸｘＸｘＸまたはＸｘＸｘＸｘである。いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ｘＸｘＸｘＸである。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、１つまたはそれを超える６個連続したヌクレオチドの中に少なくとも４つのヌクレオチドアナログを含む。それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ｘＸＸＸＸ、ｘＸｘＸＸＸ、ｘＸＸｘＸＸ、ｘＸＸＸｘＸ、ｘＸＸＸＸｘ、ＸｘｘＸＸＸ、ＸｘＸｘＸＸ、ＸｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸＸｘ、ＸＸｘｘＸＸ、ＸＸｘＸｘＸ、ＸＸｘＸＸｘ、ＸＸＸｘｘＸ、ＸＸＸｘＸｘおよびＸＸＸＸｘｘからなる群より選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドを表す。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、１つまたはそれを超える６個連続したヌクレオチドの中に少なくとも５つのヌクレオチドアナログを含む。それらのヌクレオチドに対する置換パターンは、ｘＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸｘＸおよびＸＸＸＸＸｘからなる群より選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドを表す。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンのうちの１つまたはそれを超えるパターンを有するヌクレオチド配列を含み得る。
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘおよび（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸおよび（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸおよび（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘおよび（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸおよび（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、ならびに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸおよびＸＸＸＸＸＸｘ（ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチドアナログを表し、（Ｘ）は、任意選択のヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド単位を表す）。上に列挙されたパターンの各々は、単独で、または他の開示された修飾パターンのいずれかと組み合わせて、オリゴヌクレオチド内に１回またはそれを超える回数だけ出現し得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、５’末端に修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ミックスマーは、５’末端から数えて最初の２つの位置に修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ミックスマーは、ＲＮＡｓｅＨをリクルートする能力がない。ＲＮＡｓｅＨをリクルートする能力がないオリゴヌクレオチドは、文献において周知であり、例えば（ｉｎ  ｅｘａｍｐｌｅ）ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００７／１１２７５３またはＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４を参照のこと。ミックスマーは、親和性を高めるヌクレオチドアナログ、例えば、非限定的な例において、ＬＮＡヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの混合物を含むようにデザインされ得る。いくつかの実施形態において、ミックスマーは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはそれを超えるヌクレオチドの間に、修飾されたヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合または他の結合）を含む。
【０１８６】
ミックスマーは、当該分野で公知のまたは本明細書中に記載される任意の方法を用いて生成され得る。ミックスマーの調製を教示している代表的な米国特許、米国特許公開およびＰＣＴ公開としては、米国特許公開番号ＵＳ２００６０１２８６４６、ＵＳ２００９０２０９７４８、ＵＳ２００９０２９８９１６、ＵＳ２０１１００７７２８８およびＵＳ２０１２０３２２８５１ならびに米国特許第７６８７６１７号が挙げられる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、一般に、式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’を有し、ここで、ＸおよびＺは、隣接領域としてギャップ領域Ｙを取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、Ｙ領域は、連続したひと続きのヌクレオチド、例えば、ＲＮＡｓｅＨなどのＲＮＡｓｅをリクルートすることができる少なくとも６つのＤＮＡヌクレオチドの領域である。理論に拘束されることを望むものではないが、ギャップマーは、標的核酸に結合し、その点において、ＲＮＡｓｅがリクルートされ、次いで、標的核酸を切断し得ると考えられている。いくつかの実施形態において、Ｙ領域は、高親和性の修飾ヌクレオチド、例えば、１〜６個の修飾ヌクレオチドを含む領域ＸおよびＺによって、５’と３’の両方に隣接される。例示的な修飾オリゴヌクレオチドとしては、２’ＭＯＥもしくは２’ＯＭｅまたはロックト核酸塩基（ＬＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。側面（ｆｌａｎｋｓ）ＸおよびＺは、１〜２０ヌクレオチド、好ましくは１〜８ヌクレオチド、なおもより好ましくは１〜５ヌクレオチドの長さを有し得る。側面ＸおよびＺは、同様の長さまたは異なる長さであり得る。ギャップセグメントＹは、５〜２０ヌクレオチド、好ましくは６〜１２ヌクレオチド、なおもより好ましくは６〜１０ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列であり得る。いくつかの態様において、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、ＤＮＡヌクレオチドに加えて、効率的なＲＮａｓｅＨの作用のために許容され得ることが知られている修飾ヌクレオチド（例えば、Ｃ４’置換ヌクレオチド、非環式ヌクレオチドおよびアラビノ型（ａｒａｂｉｎｏ−ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ）ヌクレオチド）を含み得る。いくつかの実施形態において、ギャップ領域は、１つまたはそれを超える無修飾のヌクレオシド間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）を含む。いくつかの実施形態において、一方または両方の隣接領域は、各々独立して、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはそれを超えるヌクレオチドの間に１つまたはそれを超えるホスホロチオエートヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合または他の結合）を含む。いくつかの実施形態において、ギャップ領域および２つの隣接領域は、各々独立して、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはそれを超えるヌクレオチドの間に修飾されたヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合または他の結合）を含む。
【０１８８】
ギャップマーは、当該分野で公知のまたは本明細書中に記載される任意の方法を用いて生成され得る。ギャップマーの調製を教示している代表的な米国特許、米国特許公開およびＰＣＴ公開としては、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；同第５，７００，９２２号；同第５，８９８，０３１号；同第７，４３２，２５０号；および同第７，６８３，０３６号；米国特許公開番号ＵＳ２００９０２８６９６９、ＵＳ２０１００１９７７６２およびＵＳ２０１１０１１２１７０；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８０４９０８５およびＷＯ２００９０９０１８２（これらの各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＳｉＲＮＡは、細胞においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して分解するために核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的とする、代表的には約２０〜２５塩基対長の、あるクラスの二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡ分子の特異性は、その分子のアンチセンス鎖とその標的ＲＮＡとの結合によって決定され得る。効果的なｓｉＲＮＡ分子は、一般に、その細胞におけるインターフェロン応答を介した非特異的なＲＮＡ干渉経路の惹起を妨げるために３０〜３５塩基対長未満であるが、それより長いｓｉＲＮＡも有効であり得る。
【０１９０】
適切な標的ＲＮＡ配列を選択した後、標的配列の全部または一部に相補的なヌクレオチド配列、すなわち、アンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ分子が、当該分野で公知の任意の方法を用いてデザインされ、調製され得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０８１２４９２７Ａ１およびＷＯ２００４／０１６７３５；ならびに米国特許公開番号２００４／００７７５７４および同２００８／００８１７９１を参照のこと）。ｓｉＲＮＡ分子の調製のために使用するのに適したいくつかの商業的なパッケージおよびサービスが利用可能である。これらとしては、上に記載されたようなＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手可能なインビトロ転写キット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から商業的に入手可能なウイルスｓｉＲＮＡ構築キット、ならびにＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）およびＳｅｑｕｉｔｕｒ，Ｉｎｃ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）が提供するカスタムｓｉＲＮＡ構築サービスが挙げられる。標的配列は、商業的に入手可能なコンピュータソフトウェア（例えば、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ（商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）；Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）製のＴａｒｇｅｔ  ＦｉｎｄｅｒおよびＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）製のｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ）を使用して選択され得る（およびｓｉＲＮＡ配列がデザインされ得る）。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉアトラス（ＲＮＡｉＡｔｌａｓのウェブサイトにおいて利用可能）、ｓｉＲＮＡデータベース（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｗｅｂｓｉｔｅにおいて利用可能）またはＤｅｓｉＲＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウェブサイトにおいて利用可能）を使用してデザインされ得るか、または得られ得る。
【０１９１】
ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖（すなわち、アンチセンス鎖および相補的なセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ分子）または一本鎖（すなわち、アンチセンス鎖だけを含むｓｓＲＮＡ分子）であり得る。ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称性の二重鎖、ヘアピンまたは非対称性のヘアピン二次構造を含み得る。
【０１９２】
二本鎖ｓｉＲＮＡは、同じ長さまたは異なる長さであるＲＮＡ鎖を含み得る。二本鎖ｓｉＲＮＡ分子はまた、ステムループ構造の単一のオリゴヌクレオチド（ここで、そのｓｉＲＮＡ分子の自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域は、核酸に基づくリンカー(複数可)または核酸に基づかないリンカー(複数可)によって連結されている）、ならびに２つまたはそれを超えるループ構造および自己相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むステムを有する環状一本鎖ＲＮＡ（ここで、その環状ＲＮＡは、インビボまたはインビトロにおいてプロセシングされて、ＲＮＡｉを媒介することができる活性なｓｉＲＮＡ分子を生成し得る）からアセンブルされ得る。したがって、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本明細書中で企図される。これらの分子は、代表的にはスペーサー配列またはループ配列によって分断された特定のアンチセンス配列を、逆相補（センス）配列に加えて、含む。そのスペーサーまたはループが切断されると、一本鎖ＲＮＡ分子およびその逆相補鎖が提供され、それらは、アニールして、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得る（必要に応じて、１つ、２つ、３つもしくはそれを超えるヌクレオチドの付加、またはいずれかの鎖もしくは両方の鎖の３’末端および／もしくは５’末端からの１つ、２つ、３つもしくはそれを超えるヌクレオチドの除去をもたらし得るさらなるプロセシング工程とともに）。スペーサーは、スペーサーの切断（および必要に応じて、１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれを超えるヌクレオチドの付加、またはいずれかの鎖もしくは両方の鎖の３’末端および／もしくは５’末端からの１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれを超えるヌクレオチドの除去をもたらし得るその後のプロセシング工程）の前に、アンチセンス配列およびセンス配列がアニールして二本鎖構造（またはステム）を形成することを可能にするのに十分な長さのものであり得る。スペーサー配列は、アニールして二本鎖核酸になったときｓｈＲＮＡを構成する、２つの相補的なヌクレオチド配列領域の間に位置する無関係なヌクレオチド配列であり得る。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡ分子の全長は、デザインされるｓｉＲＮＡ分子のタイプに応じて、約１４〜約２００ヌクレオチドで変動し得る。一般に、これらのヌクレオチドの約１４〜約５０ヌクレオチドが、ＲＮＡ標的配列と相補的であり、すなわち、ｓｉＲＮＡ分子の特異的なアンチセンス配列を構成する。例えば、ｓｉＲＮＡが、二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡであるとき、その長さは、約１４〜約５０ヌクレオチドで変動し得るのに対し、ｓｉＲＮＡが、ｓｈＲＮＡまたは環状分子であるとき、その長さは、約４０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドで変動し得る。
【０１９４】
ｓｉＲＮＡ分子は、その分子の一方の端に３’オーバーハングを含み得る。もう一方の端は、平滑末端化され得るか、オーバーハング（５’または３’）を有し得る。ｓｉＲＮＡ分子が、その分子の両端にオーバーハングを含むとき、そのオーバーハングの長さは、同じであってもよいし、異なってもよい。１つの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、その分子の両端に約１〜約３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」と称される）は、標的ＲＮＡ転写物上の相補的な部位に結合することによって遺伝子発現をコントロールする、植物および動物に見出される制御性分子の１クラスに属する低分子非コードＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）である。大きなＲＮＡ前駆体（プリｍｉＲＮＡと呼ばれる）が、核においてプロセシングされておよそ７０ヌクレオチドのプレｍｉＲＮＡ（不完全なステムループ構造に折り畳まれる）となり、そこからｍｉＲＮＡが生成される（Ｌｅｅ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２５（６９５６）：４１５−９）。プレｍｉＲＮＡは、細胞質内でさらなるプロセシング処理を受け、そこで、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であるＤｉｃｅｒによってプレｍｉＲＮＡヘアピンの片側から１８〜２５ヌクレオチド長の成熟ｍｉＲＮＡが切り出される（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）１２：１２およびＧｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（２００１）１０６（１）：２３−３４）。
【０１９６】
本明細書中で使用されるとき、ｍｉＲＮＡには、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、または成熟ｍｉＲＮＡの生物学的活性を保持するそれらのバリアントのフラグメントが含まれる。１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡのサイズの範囲は、２１ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチドであり得るが、最大２０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡも使用され得る。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡのサイズの範囲は、７０〜１７０ヌクレオチド長である。別の好ましい実施形態では、２１〜２５ヌクレオチド長の成熟ｍｉＲＮＡが使用され得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０前駆体であり得る。本明細書中で使用されるとき、ｍｉＲ−３０ヘアピンとも呼ばれる「ｍｉＲ−３０前駆体」は、文献（例えば、Ｚｅｎｇ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，２００３；Ｚｅｎｇ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，２００５；Ｚｅｎｇら、２００５；米国特許出願公開番号ＵＳ２００４／００５３４１）において理解されているように、ヒトマイクロＲＮＡｍｉＲ−３０の前駆体であり、ここで、その前駆体は、ｍｉＲＮＡにプロセシングされる能力を保持しつつ、その文献に記載されているかまたは暗に示されている任意の様式で野生型ｍｉＲ−３０前駆体から改変され得る。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３０前駆体は、少なくとも８０ヌクレオチド長であり、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−３０前駆体は、第１の標的配列（例えば、本明細書中に開示される標的遺伝子のユークロマチン領域内の配列）の一部に相補的な２０〜２２ヌクレオチドの第１のｍｉＲＮＡ配列をステムループ構造のステム上にさらに含む。
【０１９８】
ｍｉＲＮＡは、種々の供給源から単離され得るか、または当該分野で周知の方法に従って合成され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ；米国特許第８３５４３８４号；およびＷａｈｉｄら、ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０；１８０３（１１）：１２３１−４３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、当該分野で公知のまたは本明細書中に記載されるようなベクターから発現される。いくつかの実施形態において、そのベクターは、成熟ｍｉＲＮＡをコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのベクターは、プレｍｉＲＮＡが細胞内で発現され、プロセシングされて成熟ｍｉＲＮＡになるように、プレｍｉＲＮＡをコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのベクターは、プリｍｉＲＮＡをコードする配列を含み得る。この実施形態において、一次転写産物が、まずプロセシングされて、ステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ分子が生成される。次いで、そのステムループ前駆体がプロセシングされて、成熟マイクロＲＮＡが生成される。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、アプタマーの形態で存在し得る。「アプタマー」は、標的（例えば、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織または生物）に特異的に結合する任意の核酸である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーである。いくつかの実施形態において、核酸アプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）である。一本鎖核酸アプタマーは、ヘリックス構造および／またはループ構造を形成し得ることが理解されるべきである。核酸アプタマーを形成する核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー（例えば、アルキレン）もしくはポリエーテルリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）が１つもしくはそれを超えるヌクレオチドの間に挿入された天然に存在するヌクレオチド、炭化水素リンカーもしくはＰＥＧリンカーが１つもしくはそれを超えるヌクレオチドの間に挿入された修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０２００】
核酸アプタマーの選択は、当該分野で公知の任意の好適な方法によって達成され得、その方法には、ＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））として知られる、インビトロ選択のために最適化されたプロトコルが含まれる。多くの因子が、アプタマー選択の成功に重要である。ＳＥＬＥＸプロセスは、核酸分子を富化するために、複数ラウンドの結合、選択および増幅を含むので、例えば、標的分子は、安定であるべきであり、ＳＥＬＥＸの各ラウンドに対して容易に再現されるべきである。さらに、標的分子に対して特異的結合を示す核酸が、最初のライブラリー中に存在しなければならない。したがって、高度に多様な核酸プールを生成することが有益である。開始時のライブラリーは、標的分子に対するアプタマーを含むと保証されていないので、単一の標的に対するＳＥＬＥＸプロセスは、種々の出発ライブラリーを用いて繰り返される必要がある場合がある。アプタマーおよびアプタマーを生成する方法を記載している例示的な刊行物および特許としては、例えば、Ｌｏｒｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９６；Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９９；米国特許第５，２７０，１６３号；同第５，５６７，５８８号；同第５，６５０，２７５号；同第５，６７０，６３７号；同第５，６８３，８６７号；同第５，６９６，２４９号；同第５，７８９，１５７号；同第５，８４３，６５３号；同第５，８６４，０２６号；同第５，９８９，８２３号；同第６，５６９，６３０号；同第８，３１８，４３８号およびＰＣＴ出願ＷＯ９９／３１２７５（各々が参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、リボザイムの形態で存在し得る。リボザイム（リボ核酸酵素）は、タンパク質酵素の作用と類似した特異的な生化学反応を行うことができる分子、代表的には、ＲＮＡ分子である。リボザイムは、リボザイムにハイブリダイズされたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ含有基質、ｌｎｃＲＮＡおよびリボザイム自体）において特定のホスホジエステル結合を切断する能力を含む触媒活性を有する分子である。
【０２０２】
リボザイムは、いくつかの物理的構造のうちの１つを想定し得る（その構造のうちの１つは、「ハンマーヘッド」と呼ばれる）。ハンマーヘッド型リボザイムは、９つの保存された塩基を含む触媒コア、二本鎖ステムおよびループ構造（ステムループＩＩ）ならびに標的ＲＮＡに相補的な２つの領域であって触媒コアに隣接する領域（two  regions  complementary  to  the  target  RNA  flanking  regions  the  catalytic  core）から構成される。それらの隣接領域は、二本鎖ステムＩおよびＩＩＩを形成することによって、リボザイムが標的ＲＮＡに特異的に結合するのを可能にする。切断は、３’，５’−リン酸ジエステルから２’，３’−環状リン酸ジエステルへのエステル交換反応によって、特異的なリボヌクレオチドトリプレットの隣に、シスで生じる（すなわち、ハンマーヘッドモチーフを含む同じＲＮＡ分子の切断）か、またはトランスで生じる（そのリボザイムを含むもの以外のＲＮＡ基質の切断）。理論に拘束されることを望むものではないが、この触媒活性には、高度に保存された特定の配列がリボザイムの触媒領域に存在することが必要であると考えられている。
【０２０３】
リボザイム構造における修飾には、その分子の様々な非コア部分を非ヌクレオチド分子で置換することまたはそれで置き換えることも含まれた。例えば、Ｂｅｎｓｅｌｅｒら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９３）１１５：８４８３−８４８４）は、ステムＩＩの２つの塩基対およびループＩＩの４つすべてのヌクレオチドを、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、ビス（トリエチレングリコール）ホスフェート、トリス（プロパンジオール）ビスホスフェートまたはビス（プロパンジオール）ホスフェートに基づく非ヌクレオシドリンカーで置き換えたハンマーヘッド様分子を開示した。Ｍａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３）３２：１７５１−１７５８；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２５８５−２５８９）は、ＴＡＲリボザイムヘアピンの６ヌクレオチドループを非ヌクレオチドのエチレングリコール関連リンカーで置き換えた。Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９３）２１：５６００−５６０３）は、ループＩＩを、１３、１７および１９原子長の直鎖状の非ヌクレオチドリンカーで置き換えた。
【０２０４】
リボザイムオリゴヌクレオチドは、周知の方法を用いて調製され得る（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９１１８６２４；ＷＯ９４１３６８８；ＷＯ９２０１８０６；およびＷＯ９２／０７０６５；ならびに米国特許第５４３６１４３号および同第５６５０５０２号を参照のこと）か、または商業的供給源（例えば、ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入することができ、所望であれば、細胞内でのヌクレアーゼによる分解に対するそのオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるためにヌクレオチドアナログを組み込むことができる。リボザイムは、任意の公知の様式で、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．またはＭｉｌｌｉｇｅｎが製造した商業的に入手可能な合成装置を使用することによって、合成され得る。リボザイムは、従来の手段によって組換えベクターにおいても生成され得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（現行版）を参照のこと。リボザイムＲＮＡ配列は、慣例的に、例えば、Ｔ７またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼを使用することによって合成され得る。
製剤、送達および投与
【０２０５】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、低レベルの標的遺伝子に関連する状態を処置するために被験体への投与に向けて製剤化され得る。製剤、組成物および方法が、本明細書中に開示される任意のオリゴヌクレオチドを用いて実施され得ることが理解されるべきである。
【０２０６】
製剤は、単位剤形で提供されることが便利である場合があり、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。単一の剤形を作製するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドまたは化合物）の量は、処置される宿主、特定の投与様式、例えば、皮内または吸入に応じて、変動する。単一の剤形を作製するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば、腫瘍退縮をもたらす化合物の量であり得る。
【０２０７】
本発明の薬学的製剤は、医薬の製造のために当該分野で公知の任意の方法に従って調製され得る。そのような製剤は、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含み得る。製剤は、製造に適した薬学的に許容され得る無毒性の添加剤と混ぜ合わされ得る。製剤は、１つまたはそれを超える賦形剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、添加剤などを含んでよく、液体、粉末、エマルジョン、凍結乾燥粉末、噴霧剤、クリーム、ローション、放出制御製剤、錠剤、丸剤、ゲル、パッチ、埋没物（implant）などのような形態で提供され得る。
【０２０８】
製剤化されたオリゴヌクレオチド組成物は、種々の状態を想定し得る。いくつかの例では、その組成物は、少なくとも部分的に結晶性、均一に結晶性、および／または無水（例えば、８０、５０、３０、２０または１０％未満の水）である。別の例では、そのオリゴヌクレオチドは、水相中、例えば、水を含む溶液中に存在する。水相または結晶性の組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相のための）または粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得るような微小粒子）内に組み込まれ得る。通常、オリゴヌクレオチド組成物は、意図された投与方法と適合した様式で製剤化される。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、組成物は、以下の方法のうちの少なくとも１つによって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥もしくはこれらの技法の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己集合。
【０２１０】
オリゴヌクレオチド調製物は、別の作用物質、例えば、別の治療薬、またはオリゴヌクレオチドを安定させる作用物質、例えば、オリゴヌクレオチドと複合体を形成するタンパク質と組み合わせて製剤化され得るかまたは投与され得る（共にまたは別々に）。なおも他の作用物質としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、広範な特異性のＲＮＡｓｅ阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
【０２１１】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド調製物は、別のオリゴヌクレオチド、例えば、第２の遺伝子の発現を調節する第２のオリゴヌクレオチドまたは第１の遺伝子の発現を調節する第２のオリゴヌクレオチドを含む。なおも他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０もしくは１００個またはそれを超える異なるオリゴヌクレオチド種を含み得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、同様の数の異なる遺伝子に対する遺伝子発現を媒介し得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド調製物は、少なくとも第２の治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド以外の作用物質）を含む。
送達経路
【０２１２】
オリゴヌクレオチドを含む組成物は、種々の経路によって被験体に送達され得る。例示的な経路としては、髄腔内（intrathecal）、神経内、脳内、筋肉内、経口、静脈内、皮内、局所、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻腔内、肺または眼が挙げられる。用語「治療有効量」は、期待される生理反応をもたらすように処置される被験体において所望の遺伝子発現レベルを提供するために必要な、組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量である。用語「生理的に有効な量」は、所望の緩和効果または治癒効果をもたらすために被験体に送達される量である。用語「薬学的に許容され得るキャリア」は、そのキャリアが、被験体に対して有意な毒物学的有害作用なしにその被験体に投与され得ることを意味する。
【０２１３】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、代表的には、１つまたはそれを超える種のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む。本明細書中で使用されるとき、術語「薬学的に許容され得るキャリア」は、薬学的投与と適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が、活性な化合物と適合しない場合を除いて、その組成物でのそれらの使用が企図される。補助的な活性な化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【０２１４】
本発明の薬学的組成物は、局所処置が望まれるのか全身処置が望まれるのかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口であり得る。非経口投与には、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射もしくは筋肉内注射、または髄腔内もしくは室内（intraventricular）投与が含まれる。
【０２１５】
投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択され得る。例えば、筋細胞を標的とするためには、目的の筋肉への筋肉内注射が、当然の選択である。肺細胞は、オリゴヌクレオチドをエアロゾル形態で投与することによって標的とし得る。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをオリゴヌクレオチドでコーティングすることおよびオリゴヌクレオチドを機械的に導入することによって、標的化とし得る。ニューロン細胞の標的化は、髄腔内、神経内、脳内投与によって達成され得る。
【０２１６】
局所投与とは、被験体の表面に製剤を直接接触させることによって被験体に送達することを指す。局所送達の最も一般的な形態は、皮膚への送達であるが、本明細書中に開示される組成物は、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面または内部の表面にも直接適用され得る。上で述べたように、最も一般的な局所送達は、皮膚への送達である。その用語は、局所および経皮を含むがこれらに限定されないいくつかの投与経路を包含する。これらの投与様式としては、代表的には、皮膚の浸透性障壁の浸透および標的組織または標的層への効率的な送達が挙げられる。局所投与は、表皮および真皮に浸透し、最終的には組成物の全身性送達を達成する手段として使用され得る。局所投与は、オリゴヌクレオチドを被験体の表皮もしくは真皮またはその特定の層あるいはその下にある組織に選択的に送達する手段としても使用され得る。
【０２１７】
局所投与用の製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であり得るか、または所望され得る。
【０２１８】
経皮送達は、脂溶性治療剤を投与するための有益な経路である。真皮は、表皮よりも浸透性であるので、擦過した、熱傷したまたは剥皮された皮膚を通じた吸収がはるかにより迅速である。炎症、および皮膚への血流を増加させる他の生理学的状態もまた、経皮吸着を増強する。この経路を介した吸収は、油性ビヒクル（塗膏）を使用することまたは１つもしくはそれを超える浸透促進剤を使用することによって増強され得る。経皮経路を通じて本明細書中に開示される組成物を送達する他の有効な方法としては、皮膚の水和および放出制御局所パッチの使用が挙げられる。経皮経路は、全身治療および／または局所治療のために本明細書中に開示される組成物を送達する潜在的に有効な手段を提供する。さらに、イオン導入（電場の影響下での生体膜を通ったイオン性溶質の移入）、フォノフォレーシスまたはソノフォレーシス（生体膜、特に皮膚および角膜を越えた様々な治療薬の吸収を増強するための超音波の使用）ならびに投与位置および投与部位における保持に関するビヒクルの特色の最適化は、局所に適用された組成物を、皮膚および粘膜部位を越えて輸送するのを増強するために有用な方法であり得る。
【０２１９】
口腔粘膜（oral  membrane）と鼻粘膜の両方が、他の投与経路よりも利点を提供する。例えば、これらの膜を通って投与されるオリゴヌクレオチドは、迅速に作用を発生し得、治療的な血漿レベルを提供し得、肝臓代謝の初回通過効果を回避し得、適さない胃腸管（ＧＩ）環境へのオリゴヌクレオチドの曝露を回避し得る。さらなる利点としては、その膜部位に容易に接近できることが挙げられ、その結果、オリゴヌクレオチドは、容易に適用され、局在化し、除去され得る。
【０２２０】
経口送達では、組成物は、口腔の表面、例えば、舌の腹側表面の膜を含む舌下粘膜、および口腔底、または頬の裏打ちを構成する頬側粘膜に標的化され得る。舌下粘膜は、比較的浸透性であるので、多くの作用物質の迅速な吸収および許容され得るバイオアベイラビリティをもたらす。さらに、舌下粘膜は、好都合であり、許容可能であり、容易に接近可能である。
【０２２１】
オリゴヌクレオチドの薬学的組成物は、定量噴霧ディスペンサー、上に記載されたような混合ミセルの薬学的製剤および噴射剤から、吸入なしで、人間の頬腔に噴霧することによっても、頬腔へ投与され得る。１つの実施形態では、まずディスペンサーを振った後、薬学的製剤および噴射剤を頬腔に噴霧する。
【０２２２】
経口投与用の組成物には、散剤もしくは顆粒剤、水の懸濁液もしくは溶液、シロップ剤、スラリー、エマルジョン、エリキシル剤もしくは非水性媒体、錠剤、カプセル剤、舐剤またはトローチ剤が含まれる。錠剤の場合、使用され得るキャリアとしては、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸の塩が挙げられる。様々な崩壊剤（例えば、デンプン）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク）が、錠剤において通常使用される。カプセルの形態での経口投与のための、有用な賦形剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用のために必要とされるとき、核酸組成物は、乳化剤および懸濁化剤と混和され得る。所望であれば、ある特定の甘味剤および／または香味剤を加えることができる。
【０２２３】
非経口投与には、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射もしくは筋肉内注射、髄腔内投与または室内投与が含まれる。いくつかの実施形態において、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与は、疾患部位への直接的な投与（例えば、腫瘍内への注射）を含む。
【０２２４】
非経口投与用の製剤には、緩衝剤、賦形剤および他の好適な添加物も含み得る滅菌された水性液剤が含まれ得る。室内注射は、例えば、レザバーに取り付けられた、室内カテーテルによって促進され得る。静脈内で使用する場合、溶質の総濃度は、調製物を等張性にするようにコントロールされるべきである。
【０２２５】
本明細書中に記載されるいずれのオリゴヌクレオチドも、眼組織に投与され得る。例えば、組成物は、眼または周辺組織の表面、例えば、眼瞼の内側に適用され得る。眼に投与する場合、軟膏または滴下可能な液体が、塗布器または点眼器などの当該分野で公知の眼送達システムによって送達され得る。そのような組成物は、粘膜模倣物（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール））、保存剤（例えば、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロニウム（ｂｅｎｚｙｌｃｈｒｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））ならびに通常量の賦形剤および／またはキャリアを含み得る。オリゴヌクレオチドは、眼の内部にも投与され得、選択された領域または構造物にそれを導入することができる針または他の送達デバイスによって導入され得る。
【０２２６】
肺送達組成物は、ある分散液（dispersion）を患者が吸入することによって送達され得、その組成物、好ましくは、その分散液中のオリゴヌクレオチドは、肺に到達でき、肺でそれは肺胞領域を通って血液循環中に直接、容易に吸収され得る。肺送達は、全身送達と、肺の疾患を処置するための局所送達の両方にとって有効であり得る。
【０２２７】
肺送達は、噴霧吸入される製剤、エアロゾル化された製剤、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｕｌａｒ）製剤および乾燥粉末に基づく製剤の使用をはじめとした種々のアプローチによって達成され得る。送達は、液体噴霧吸入器、エアロゾルに基づく吸入器および乾燥粉末分散デバイスを用いて達成され得る。定量デバイスが好ましい。アトマイザまたは吸入器を使用する利点の１つは、それらのデバイスが自己充足型（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）であるので、汚染のおそれが最小になる点である。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、容易に製剤化され得る作用物質を乾燥粉末として送達する。オリゴヌクレオチド組成物は、凍結乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末として単独で、または好適な粉末キャリアと組み合わせて、安定に保管され得る。吸入用の組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、計時デバイスまたは時間表示器（time  indicator）を備え得る投与タイミングエレメント（dosing  timing  element）によって媒介され得、該デバイスに組み込んだとき、エアロゾル薬の投与中の患者に対して用量の追跡、コンプライアンスのモニタリングおよび／または投与の始動（dose  triggering）を可能にする。
【０２２８】
用語「粉末」は、自由流動性であって、吸入デバイスにおいて容易に分散されることが可能であって、続いて被験体によって吸入されることが可能であり、その結果、それらの粒子が肺に到達して肺胞内への浸透が可能である、細かく分散した固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、その粉末は、「呼吸に適する」と言われる。好ましくは、平均粒径は、直径約１０μｍ未満であり、好ましくは、比較的均一な球形の形状の分布を有する。より好ましくは、直径は、約７．５μｍ未満であり、最も好ましくは、約５．０μｍ未満である。通常、粒径分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍであり、特に、約０．３μｍ〜約５μｍである。
【０２２９】
用語「乾燥（した）」は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）より少ない水、通常、約５％ｗより少ない、好ましくは、約３％ｗ未満である水分含有量を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、吸入デバイスにおいて容易に分散可能であり、それによりエアロゾルが形成されるようなものであり得る。
【０２３０】
キャリアとして有用な薬学的添加剤のタイプとしては、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、増量剤（例えば、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチド）；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩（例えば、塩化ナトリウム）などが挙げられる。これらのキャリアは、結晶性もしくは非晶質の形態で存在し得るか、またはそれら２つの混合物であり得る。
【０２３１】
好適なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、有機酸および有機塩基から調製される有機塩（例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム）などが挙げられ；クエン酸ナトリウムが好ましい。オリゴヌクレオチドのミセル製剤の肺投与は、噴射剤（例えば、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテルならびに他の非ＣＦＣ噴射剤およびＣＦＣ噴射剤）を用いる定量噴霧デバイスを通じて達成され得る。
【０２３２】
例示的なデバイスとしては、脈管構造内に導入されるデバイス、例えば、脈管組織の内腔に挿入されるデバイス、またはそのデバイス自体が脈管構造の一部を形成するデバイス（ステント、カテーテル、心臓弁および他の脈管デバイスを含む）が挙げられる。これらのデバイス、例えば、カテーテルまたはステントは、肺、心臓または脚の脈管構造に留置され得る。
【０２３３】
他のデバイスとしては、非脈管デバイス、例えば、腹膜または臓器もしくは腺組織に埋め込まれるデバイス、例えば、人工臓器が挙げられる。そのデバイスは、オリゴヌクレオチドに加えて治療用物質を放出することができ、例えば、あるデバイスは、インスリンを放出できる。
【０２３４】
１つの実施形態において、単位用量のまたは計量された用量の、オリゴヌクレオチドを含む組成物が、埋め込みデバイスによって分配される。そのデバイスは、被験体内のパラメータをモニターするセンサーを備え得る。例えば、そのデバイスは、例えばポンプ、および必要に応じて、関連する電子機器を備え得る。
【０２３５】
組織、例えば、細胞または臓器が、エキソビボにおいてオリゴヌクレオチドで処理され得、次いで、被験体に投与され得るかまたは移植され得る。その組織は、自己組織、同種異系組織または異種組織であり得る。例えば、組織は、移植片対宿主病を減少させるために処理され得る。他の実施形態において、その組織は、同種異系であり、その組織は、その組織における望まれない遺伝子発現を特徴とする障害を処置するために処理される。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞が、望まれない細胞増殖を阻害するために処理され得る。処理された組織の導入は、自己のものであるかまたは移植片であるかに関係なく、他の治療と併用され得る。いくつかの実施において、オリゴヌクレオチドで処理された細胞は、例えば、それらの細胞が埋没物を離れるのを妨げるが、身体からの分子がそれらの細胞に到達することを可能にし、それらの細胞によって産生される分子が身体に入ることを可能にする、半透性の多孔性隔膜によって、他の細胞から隔離される。１つの実施形態において、その多孔性隔膜は、アルギネートから形成されている。
投与量
【０２３６】
１つの態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを（例えば、化合物として、または組成物の構成要素として）被験体（例えば、ヒト被験体）に投与する方法を特徴とする。１つの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ〜２５ｍｇである。１つの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜１００ｍｇである。１つの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜５００ｍｇである。いくつかの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、２５、５０または１００ｍｇより多い。
【０２３７】
規定の量は、疾患または障害、例えば、低レベルの標的遺伝子に関連する疾患または障害を処置するためまたは予防するために有効な量であり得る。例えば、単位用量は、注射（例えば、静脈内または筋肉内）、吸入投与（ｉｎｈａｌｅｄ  ｄｏｓｅ）または局所適用によって投与され得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、単位用量は、毎日投与される。いくつかの実施形態において、１日１回よりも低い頻度、例えば、２、４、８または３０日毎未満。別の実施形態において、単位用量は、ある頻度で投与されない（例えば、定期的な頻度で投与されない）。例えば、単位用量は、一度投与され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、１日１回よりも多く、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間に１回などで投与される。
【０２３９】
１つの実施形態において、被験体は、初回用量および１つまたはそれを超える維持用量のオリゴヌクレオチドを投与される。維持用量（単数または複数）は、一般に、初回用量より少なく、例えば、初回用量の２分の１より少ない。維持レジメンは、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０００１〜１００ｍｇの範囲の用量（単数または複数）、例えば、１日あたり体重１ｋｇあたり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１または０．０００１ｍｇで被験体を処置することを含み得る。維持用量は、１、５、１０または３０日毎に１回以下、投与され得る。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的な状態に応じて変動する期間にわたって続き得る。いくつかの実施形態において、投与量は、１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間またはそれを超える時間ごとに１回以下、例えば、５または８日毎に１回以下、送達され得る。処置の後、患者は、状態の変化および疾患状態に関する症候の軽減についてモニターされ得る。その患者が現在の投与量レベルに有意に反応しない場合は、オリゴヌクレオチドの投与量を増加させてもよいし、疾患状態に関する症候の軽減が観察された場合、疾患状態が除去された場合、または望まれない副作用が観察された場合は、その用量を減少させてもよい。
【０２４０】
有効用量は、所望されるとき、または特定の状況下において適切であると見なされるとき、単回用量または２回もしくまたはそれ超の用量で投与され得る。繰り返しのまたは頻繁な注入を容易にすることが所望される場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、槽内または嚢内）またはレザバーの埋め込みが得策であり得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの薬学的組成物が提供される。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子配列に関して、複数の他のオリゴヌクレオチドと重複せず、隣接しない配列を有する。いくつかの実施形態において、その複数のものは、異なる標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、その複数のものは、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを含む。
【０２４２】
場合によっては、患者は、他の治療様式と併せてオリゴヌクレオチドで処置される。
【０２４３】
処置が成功した後、その疾患状態の再発を防ぐために患者に維持療法を施すことが望ましい場合があり、その維持療法では、本発明の化合物は、体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の維持用量で投与される。
【０２４４】
オリゴヌクレオチド組成物の濃度は、障害の処置または予防において有効であるのに十分な量またはヒトの生理学的状態を制御するのに十分な量である。投与されるオリゴヌクレオチドの濃度または量は、その作用物質に対して測定されるパラメータおよび投与の方法、例えば、経鼻、頬側、肺投与に依存する。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激作用または灼熱感（ｂｕｒｎｉｎｇ）を回避するために、いくつかの成分をより低い濃度にする必要がある傾向があり得る。好適な経鼻製剤を提供するために経口製剤を最大１０〜１００倍希釈することが時折望ましい。
【０２４５】
ある特定の因子は、被験体を効果的に処置するために必要とされる投与量に影響し得、その因子としては、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、治療有効量のオリゴヌクレオチドでの被験体の処置には、単回の処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。処置のために使用されるオリゴヌクレオチドの有効な投与量は、特定の処置の経過にわたって増加させてもよいし、減少させてもよいことも認識される。例えば、被験体は、オリゴヌクレオチド組成物を投与した後にモニターされ得る。モニタリングからの情報に基づいて、さらなる量のオリゴヌクレオチド組成物が、投与され得る。
【０２４６】
投与は、数日間から数ヶ月間続くかまたは治癒がもたらされるまでもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く処置の経過にわたる、処置される疾患状態の重症度および応答性に依存する。最適な投与スケジュールは、患者の体内の遺伝子発現レベルの測定値から計算され得る。当業者は、最適な投与量、投与方法および反復の割合を容易に決定できる。最適な投与量は、個々の化合物の相対的な効力に応じて変動し得、一般に、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。いくつかの実施形態において、動物モデルには、ヒト遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニック動物が含まれる。別の実施形態において、試験するための組成物は、少なくとも内部の領域において、動物モデルにおける遺伝子とヒトにおける対応する遺伝子との間で保存された配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【０２４７】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとしてまたは拡散可能な注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡的、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻腔内、尿道または眼である。投与は、被験体または別の人間、例えば、医療提供者によって提供され得る。組成物は、測定された用量でまたは計量された用量を送達するディスペンサーにおいて提供され得る。選択される送達様式は、下記で詳細に述べられる。
キット
【０２４８】
本発明のある特定の態様において、オリゴヌクレオチドを含む組成物が収容されている容器を備えるキットが提供される。いくつかの実施形態において、その組成物は、オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物である。いくつかの実施形態において、その薬学的組成物の個々の構成要素は、１つの容器の中に提供され得る。あるいは、薬学的組成物の構成要素を、２つまたはそれを超える容器の中に別々に提供すること、例えば、オリゴヌクレオチドに対して１つの容器およびキャリア化合物に対して少なくとも別の容器の中に提供することが望ましい場合がある。そのキットは、いくつかの異なる構成で包装され得る（例えば、単一の箱の中の１つまたはそれを超える容器）。それらの異なる構成要素は、例えば、そのキットとともに提供される指示に従って、混和され得る。それらの構成要素は、例えば、薬学的組成物を調製し、投与するために、本明細書中に記載される方法に従って混和され得る。そのキットは、送達デバイスも備え得る。
【０２４９】
本発明は、さらなる限定と決して解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例証される。
【実施例】
【０２５０】
実施例１．例示的な標的ユークロマチン領域およびその領域に相補的であるようにデザインされたオリゴヌクレオチド
諸言
例示的な標的ユークロマチン領域は、図１に示されているようにマイナス鎖ＲＮＡ転写物Ｉおよびユークロマチン領域ＩＩＩの重複を包含する領域である。次いで、ＦＸＮの標的ユークロマチン領域のプラス鎖またはマイナス鎖の一部に相補的であるようにオリゴヌクレオチドをデザインした（図１）。理論に拘束されることを望むものではないが、これらのオリゴヌクレオチドは、（ａ）標的ユークロマチン領域のＤＮＡに結合し、それによりアンチセンスＲＮＡの転写を調節することによって、（ｂ）そのアンチセンスＲＮＡに結合して、そのアンチセンスＲＮＡの分解および／もしくはそのアンチセンスＲＮＡの機能の阻害をもたらすことによって（例えば、アンチセンスＲＮＡ転写物とセンスＲＮＡ転写物とのハイブリダイゼーションを阻止することによって）、または（ｃ）ＤＮＡとアンチセンスＲＮＡとの両方に結合することによって、機能し得ると仮定した。
材料および方法：
ＦＸＮの標的ユークロマチン領域の同定
【０２５１】
ＦＡＩＲＥまたはＤＮＡｓｅＩ高感受性によって示されるように、アンチセンスＲＮＡの転写が生じオープンクロマチンが存在するＦＸＮ遺伝子内の領域として、標的ユークロマチン領域を同定した。キャップ解析遺伝子発現（ｃａｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＣＡＧＥ）を使用して、低レベルのアンチセンスＲＮＡ転写を同定した。特に、ＥＮＣＯＤＥ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎからのデジタルＤＮａｓｅＩによるＤＮａｓｅＩ高感受性、ＥＮＣＯＤＥ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎからのＤＮａｓｅＩデジタルゲノムフットプリンティング、ＥＮＣＯＤＥ／ＯｐｅｎＣｈｒｏｍ（ＵＮＣ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）からのＦＡＩＲＥによるオープンクロマチン、およびＥＮＣＯＤＥ／ＡｎａｌｙｓｉｓデータベースからのＤＮａｓｅＩ高感受性均一ピークを調べた。ＤＮＡｓｅＩ感受性位置におけるＲＮＡの証拠を調べるために、ＣＳＨＬ  Ｌｏｎｇ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ、Ｃａｌｔｅｃｈ  ＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲＩＫＥＮ  ＣＡＧＥデータを調べた。ＲＮＡの境界は、決定されていたので、生ＣＡＧＥリードとＲＮＡｓｅｑリードとが重複している領域をオリゴの標的化に使用した。
リアルタイムＰＣＲ
【０２５２】
ＲＮＡ解析、ｃＤＮＡ合成およびＱＲＴ−ＰＣＲを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｔキットおよびＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ装置を用いて行った。構成的に発現される様々なハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡに対するベースラインレベルも測定した。標的遺伝子とほぼ同じレベルのベースライン発現を有する「コントロール」ハウスキーピング遺伝子を、比較目的のために選択した。
ＥＬＩＳＡ
【０２５３】
ＥＬＩＳＡアッセイは、Ａｂｃａｍ  Ｆｒａｔａｘｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１１５３４６）を使用して、以前に記載されたように行った。
細胞株
【０２５４】
当該分野で公知の条件を用いて、およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙが提唱するように、細胞を培養した（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。本明細書中に記載される実験において使用した細胞株の詳細を表２に提供する。
【表２】
2016531570.tif 000011
オリゴヌクレオチドデザイン
【０２５５】
ＦＸＮの標的ユークロマチン領域に相補的であるようにオリゴヌクレオチドをデザインした。各オリゴヌクレオチドの配列および構造を表３および表４に示す。表５は、表３および表４および表６に記載されているある特定のオリゴヌクレオチドに対して使用したヌクレオチドアナログ、修飾およびヌクレオシド間結合の記載を提供している。
【表３−１】
2016531570.tif 000012
【表３−２】
2016531570.tif 000013
【表３−３】
2016531570.tif 000014
【表３−４】
2016531570.tif 000015
【表３−５】
2016531570.tif 000016
【表４−１】
2016531570.tif 000017
【表４−２】
2016531570.tif 000018
【表５−１】
2016531570.tif 000019
【表５−２】
2016531570.tif 000020
オリゴヌクレオチドによる細胞のインビトロトランスフェクション
【０２５６】
細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに２５，０００細胞／５００μＬの密度で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび上記オリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクションを行った。コントロールウェルには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅだけを含めた。トランスフェクション後の時点において、およそ２００μＬの細胞培養上清をＥＬＩＳＡ用に−８０Ｃで保管し、別の細胞アリコートからＲＮＡを回収し、上で概要を述べたように定量的ＰＣＲを行った。各オリゴヌクレオチドによるＦＸＮ  ｍＲＮＡ発現のパーセント誘導を、オリゴヌクレオチドの存在下のｍＲＮＡレベルをコントロールの存在下（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ）のｍＲＮＡレベルに対して正規化することによって、決定した。
結果：
【０２５７】
ＦＸＮは、アップレギュレートしづらいハウスキーピング遺伝子であり、ＦＸＮのダウンレギュレーションは、破壊的な疾患であるフリードライヒ（Ｆｒｅｄｒｉｅｃｈ’ｓ）運動失調症（ＦＲＤＡ）に関連するので、ＦＸＮを、オリゴヌクレオチドをデザインするための例示的な遺伝子として選択した。第１に、ＦＸＮ遺伝子内の標的ユークロマチン領域を同定した。これらの標的ユークロマチン領域は、アンチセンスＲＮＡが転写されるオープンクロマチンの領域であると決定される。ＤＮＡｓｅＩ高感受性データおよびＣＡＧＥデータを、上記方法に記載されているように組み合わせることにより、ＦＸＮの標的ユークロマチン領域を同定した（図２および３）。
【０２５８】
ＦＲＤＡを有する患者から得られた細胞株において上記オリゴヌクレオチドを試験した。いくつかのオリゴヌクレオチドが、その細胞株においてＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションをもたらすことが見出された（図４）。オリゴヌクレオチド４１４、４１５および４２９は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの最も高いレベルのアップレギュレーションを示した。次いで、オリゴヌクレオチド４１４、４１５および４２９がＦＸＮタンパク質のレベルもアップレギュレートし得るかを決定するために、これらのオリゴヌクレオチドを試験した。３つすべてのオリゴが、ＦＸＮタンパク質のアップレギュレーションを引き起こした（図５）。これらの結果から、標的ユークロマチン領域に相補的なオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を調節し得ることが示される。
【０２５９】
最後に、オリゴ４１４、４１５および４２９を、ＦＸＮをアップレギュレートするようにデザインされた他のオリゴヌクレオチドと組み合わせて試験した。いくつかの場合において、オリゴヌクレオチドの組み合わせによる細胞の処理が、単一のオリゴヌクレオチドによる処理と比べて、ＦＸＮのアップレギュレーションを増加させることができることが見出された（図６）。これらの結果から、いくつかの場合において、ＦＸＮのアップレギュレーションをさらに増加させるために、ＦＸＮの異なる領域を標的とする複数の異なるオリゴを組み合わせることが有用であり得ることが示された。
実施例２．オリゴ４２９を用いたさらなる実験
【０２６０】
ＦＸＮ−４２９オリゴを、１００ｎＭ、６０ｎＭ、３０ｎＭ、１５ｎＭおよび７．５ｎＭにおいて、ＧＭ０３８１６細胞にトランスフェクトした。タンパク質溶解産物を４日目に回収し、Ａｂｃａｍ  ａｂ４８２８１抗体を用いてＦＸＮタンパク質のレベルを測定した。アクチンをローディングコントロールとして使用した。４２９オリゴが、用量依存的様式でＦＸＮタンパク質のアップレギュレーションを引き起こすことが見出された（図７）。
実施例３．オリゴ４１４を用いたさらなる実験
【０２６１】
ＦＸＮ−４１４オリゴを、Ｃｙｎｏ（カニクイザル）由来の肝細胞に裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）トランスフェクトした。処理濃度は、２０μＭ、１０μＭおよび５μＭだった。ＦＸＮ  ＲＮＡの測定を処理後の１および２日目に行った。用量反応性のＦＸＮ  ｍＲＮＡアップレギュレーションが、オリゴ４１４を用いて観察された（図９）。
実施例４．他のオリゴを用いたさらなる実験
【０２６２】
さらなるオリゴヌクレオチドを、様々なオリゴをオリゴｄＴリンカーと組み合わせることによってデザインしたか、または他の高感受性領域に対してデザインした。オリゴの起源は、ＦＸＮ−５１７ｍ０８：ＦＸＮ４１５／４２９、ＦＸＮ−５１８ｍ０２：ＦＸＮ４１５／４２９だった。ＦＸＮ−５１９ｍ０８および５２１ｍ０２は、３’ＵＴＲにおける別のＤＮＡｓｅ１高感受性部位を標的とする（アンチセンス方向で）。それらのオリゴヌクレオチドの配列を下記の表に示す。
【表６】
2016531570.tif 000021
【０２６３】
オリゴ５１７ｍ０８、５１８、５１９および５２１ｍ０８オリゴを、２０および６０ナノモル濃度において、ＧＭ０３８１６細胞にトランスフェクトした。タンパク質溶解産物を４日目に回収し、Ａｂｃａｍ  ａｂ４８２８１抗体を用いてＦＸＮタンパク質のレベルを測定した。チューブリンをローディングコントロールとして使用した。最も強いレベルのＦＸＮアップレギュレーションが、オリゴ５１８および５１９を用いて観察された（図８）。
【０２６４】
さらなる詳述がなくても、当業者は、本明細書中に提供される記載に基づいて、本発明をその最も十分な程度にまで利用できると考えられている。ゆえに、具体的な実施形態は、単なる例証と解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を限定すると決して解釈されるべきでない。本明細書に引用されたすべての刊行物は、本明細書中で言及された目的または主題のために参照により援用される。
【０２６５】
本明細書に開示されているすべての特徴が、任意の組み合わせで組み合され得る。本明細書に開示されている各特徴は、同じ目的、等価な目的または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられ得る。したがって、別段明確に述べられない限り、開示された各特徴は、一般的な一連の等価なまたは類似の特徴の単なる例である。
【０２６６】
上の記載から、当業者は、本発明の必須の特色を容易に確かめることができ、また、その精神および範囲から逸脱することなく、それを様々な用途および条件に適合させるために、本発明の様々な変更および改変を行うことができる。したがって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲の範囲内である。
【０２６７】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載され、例証されてきたが、当業者は、その機能を行うため、ならびに／または本明細書中に記載された結果および／もしくは１つもしくはそれを超える利点を得るために、他の種々の手段および／または構造を容易に想定し、そのようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料および配置が例示的であると意味されていること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料および／または配置が、本発明の教示が使用する具体的な用途(複数可)に依存することを容易に認識する。当業者は、本明細書中に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは単なる日常的な実験法を使用して確認することができる。ゆえに、上記の実施形態が単に例として提示されていること、ならびに本発明が、添付の特許請求の範囲およびそれに対する等価物の範囲内で、具体的に記載されたものおよび主張されるものと異なる方法で実施され得ることが理解されるべきである。本発明は、本明細書中に記載される各個別の特徴、システム、物品、材料および／または方法に関する。さらに、２つまたはそれを超えるそのような特徴、システム、物品、材料および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料および／または方法が、相互に相反しない場合、本発明の範囲内に含められる。
【０２６８】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、明らかにそれとは反対のことが示されていない限り、「少なくとも１つの」を意味していると理解されるべきである。
【０２６９】
句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、そのように結合されているエレメント、すなわち、いくつかの場合では接続的に存在し、他の場合では離接的に存在するエレメントの「いずれかまたは両方」を意味していると理解されるべきである。反対のことが明らかに示されていない限り、「および／または」節によって具体的に同定されるエレメントに関係するかまたは関係しないかにかかわらず、それらの具体的に同定されるエレメント以外の他のエレメントが、必要に応じて存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、「含む」などのオープンエンドな言語とともに使用されるとき、１つの実施形態では、ＢなしのＡ（必要に応じてＢ以外のエレメントを含む）；別の実施形態では、ＡなしのＢ（必要に応じてＡ以外のエレメントを含む）；なおも別の実施形態では、ＡとＢの両方（必要に応じて他のエレメントを含む）；などのことを言及し得る。
【０２７０】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、「または」は、上で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分けているとき、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、少なくとも１つの包含であると解釈されるものとするが、いくつかのエレメントまたはエレメントのリストのうちの１つより多いエレメント、および必要に応じて、列挙されていないさらなる項目も含むと解釈されるものとする。それとは反対のことを明らかに示す用語、例えば、「〜のうちのただ１つ」もしくは「〜のうちのまさに１つ」または請求項において使用されるときの「〜からなる」だけが、いくつかのエレメントまたはエレメントのリストのうちのまさに１つのエレメントの包含のことを指す。通常、本明細書中で使用される用語「または」は、排他的な用語、例えば、「いずれか」、「〜のうちの１つ」「〜のうちのただ１つ」また「〜のうちのまさに１つ」が前につくとき、排他的な選択肢（すなわち「一方または他方であって両方ではない」）を示すと単に解釈されるものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。
【０２７１】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、句「少なくとも１つ」は、１つまたはそれを超えるエレメントのリストに照らして、エレメントのリストの中のいずれか１つまたはそれを超えるエレメントから選択される少なくとも１つのエレメントを意味すると理解されるべきであるが、必ずしも、エレメントのリストの中に具体的に列挙された各エレメントおよび全エレメントのうちの少なくとも１つを含むわけでもないし、エレメントのリストの中の任意の組み合わせのエレメントを排除するわけでもない。この定義は、句「少なくとも１つ」が指すエレメントのリスト内に具体的に同定されるエレメント以外のエレメントが、それらの具体的に同定されるエレメントに関係するか関係しないかにかかわらず、必要に応じて存在してもよいことも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、等しく、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、等しく、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、必要に応じて、Ｂが存在せずに１つより多いＡを含む（および必要に応じてＢ以外のエレメントを含む）少なくとも１つ；別の実施形態では、必要に応じて、Ａが存在せずに１つより多いＢを含む（および必要に応じてＡ以外のエレメントを含む）少なくとも１つ；なおも別の実施形態では、必要に応じて１つより多いＡを含む少なくとも１つおよび必要に応じて１つより多いＢを含む少なくとも１つ（および必要に応じて他のエレメントを含む）；などのことを指し得る。
【０２７２】
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、すべての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」などは、オープンエンドである、すなわち、〜を含むがこれらに限定されないことを意味していると理解されるべきである。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に示されているように、移行句「〜からなる」および「〜から本質的になる」だけが、それぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとされる。
【０２７３】
請求項のエレメントを修飾するために、特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」などのような順序の用語の使用は、それ自体が、別のものに対する１つの請求項エレメントの任意の優先権、先例もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的順序を意味せず、請求項エレメントを区別するために、ある特定の名称を有する１つの請求項エレメントを、同じ名称を有する（順序の用語の使用を別にすれば）別のエレメントと区別する標示として使用されているだけである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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