(57)【要約】本発明は、ヒト血清アルブミンに結合し、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）（式中、（Ｘ１）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ２）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ３）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ４）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ５）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ６）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ７）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ９）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１０）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１１）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１２）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１３）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１４）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１５）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１６）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１７）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１９）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなるポリペプチドに関し、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミンに結合し、
（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）であって、式中、
（Ｘ１）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥであり；
（Ｘ２）が、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；
（Ｘ３）が、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ４）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ又はＥであり；
（Ｘ５）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ６）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；
（Ｘ７）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ８）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；
（Ｘ９）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；
（Ｘ１０）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１１）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ１２）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；
（Ｘ１３）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１４）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１５）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１６）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１７）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ１８）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１９）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣである、アミノ酸配列と、
（ｂ）（ａ）の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなるポリペプチドであって、
前記同一性の決定が、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号２）であり、式中、
（Ｘ１）が、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｇ又はＭであり；
（Ｘ２）が、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｌ又はＴであり；
（Ｘ３）が、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｋ又はＶであり；
（Ｘ４）が、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＥであり；
（Ｘ５）が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｗ、Ｌ、Ｒ又はＫであり；
（Ｘ６）が、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｒ又はＱであり；
（Ｘ７）が、Ｌ又はＲであり；
（Ｘ８）が、Ｑ又はＤであり；
（Ｘ９）が、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＳであり；
（Ｘ１０）が、Ｌ、Ｉ又はＶであり；
（Ｘ１１）が、Ｗ又はＲであり；
（Ｘ１２）が、Ｔ又はＦであり；
（Ｘ１３）が、Ｄ、Ｗ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＡであり；
（Ｘ１４）が、Ｗ又はＧであり；
（Ｘ１５）が、Ｅ又はＶであり；
（Ｘ１６）が、Ａ又はＶであり；
（Ｘ１７）が、Ｅ、Ｌ又はＲであり；
（Ｘ１８）が、Ｔ、Ｓ又はＭであり；
（Ｘ１９）が、Ｙ又はＳである、アミノ酸配列と、
（ｂ）（ａ）の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、
前記同一性の決定が、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、齧歯類血清アルブミンにさらに結合し、
（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号４１）であり、式中、
（Ｘ１）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥであり；
（Ｘ２）が、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；
（Ｘ３）が、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ４）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；
（Ｘ５）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ６）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；
（Ｘ７）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ８）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；
（Ｘ９）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；
（Ｘ１０）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１１）が、Ｆ、Ｙ又はＷであり；
（Ｘ１２）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；
（Ｘ１３）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１４）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１５）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１６）が、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１７）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
（Ｘ１８）が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；
（Ｘ１９）が、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであるアミノ酸配列と、
（ｂ）（ａ）の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、
前記同一性の決定が、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、齧歯類血清アルブミンにさらに結合し、
（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号４２）であり、式中、
（Ｘ１）が、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｇ又はＭであり；
（Ｘ２）が、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｌ又はＴであり；
（Ｘ３）が、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｋ又はＶであり；
（Ｘ４）が、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｗ又はＭであり；
（Ｘ５）が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｗ、Ｌ又はＲであり；
（Ｘ６）が、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｒ又はＱであり；
（Ｘ７）が、Ｌ又はＲであり；
（Ｘ８）が、Ｑ又はＤであり；
（Ｘ９）が、Ｎ又はＤであり；
（Ｘ１０）が、Ｌ又はＩであり；
（Ｘ１１）が、Ｗであり；
（Ｘ１２）が、Ｔであり；
（Ｘ１３）が、Ｄ、Ｗ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＡであり；
（Ｘ１４）が、Ｗ又はＧであり；
（Ｘ１５）が、Ｅ又はＶであり；
（Ｘ１６）が、Ａ又はＶであり；
（Ｘ１７）が、Ｅ、Ｌ又はＲであり；
（Ｘ１８）が、Ｔ、Ｓ又はＭであり；
（Ｘ１９）が、Ｙ又はＳである、アミノ酸配列と、
（ｂ）（ａ）の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、
前記同一性の決定が、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号５、４又は６〜３２のアミノ酸配列から選択される、ポリペプチド。
【請求項６】
薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドに融合された、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の融合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、前記薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドに直接融合される、融合タンパク質。
【請求項８】
請求項６に記載の融合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、リンカーを介して、前記薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドに融合される、融合タンパク質。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、前記薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドが、組換えタンパク質、抗体、血液因子、ホルモン、抗凝血剤、血清溶解剤、サイトカイン、ケモカイン、及びインターフェロンからなる群から選択される、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合タンパク質であって、前記抗体が、二重特性Ｔ細胞動員抗体である、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド又は請求項６〜１０のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質をコード化する、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の前記核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の前記核酸分子又は請求項１２に記載の前記ベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記ポリペプチド又は請求項６〜１０のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）請求項１３に記載の前記単離された細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記産生されたポリペプチド又は融合タンパク質を単離する工程と、を含む、方法。
【請求項１５】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質を含む、医薬組成物及び／又は診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清アルブミンに結合し、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）（式中、（Ｘ１）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ２）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ３）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ４）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ５）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ６）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ７）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ９）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１０）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１１）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１２）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１３）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１４）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１５）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１６）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１７）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１９）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなるポリペプチドに関し、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【０００２】
本明細書においては、特許出願及び製造業者の取扱説明書を含む多数の文書が記載されている。これら文書の開示は、本発明の特許要件に関連するとみなされなくとも、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参照された文書は、あたかもそれぞれの個々の文書が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを指示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
多くの治療薬及び診断薬、特に生物学的製剤（すなわち、ペプチド又はポリペプチド製剤、ポリヌクレオチド等）は、インビボでの不適切な血清半減期という問題を抱えている。このことは、治療効果に必要とされる血清レベルを維持するために、このような治療薬の持続注入、高頻度及び／又は高用量における投与、又は徐放性製剤の使用を必要とする。薬剤の頻繁な全身投与は、大きなネガティブな副作用に関連する。例えば、毎日など、頻繁な全身注射は、特に治療薬が静脈内投与されることになる場合、対象にとってかなりの不快となり、投与に関連する感染の高いリスクを生じ、入院又は頻繁な通院を必要とすることもある。さらに、長期間の治療においては、毎日の静脈内投与は、組織瘢痕化及び血管の穿刺の繰り返しによって引き起こされる血管病変の無視できない副作用にも繋がり得る。同様な問題は、例えば、糖尿病患者へのインスリンの投与、又は多発性硬化症を患う患者におけるインターフェロン薬の投与のような、全ての治療薬の頻繁な全身投与について知られている。全てのこれらの因子は、患者のコンプライアンスの低下及び医療制度に対するコストの増加を招く。
【０００４】
通常は短寿命であるタンパク質治療薬及び分子のインビボ半減期を延長させる１つの手段は、これらの化合物のヒト血清アルブミンに結合するポリペプチドへの融合を示す。血清アルブミンに結合することができるポリペプチド、及び治療に関連するタンパク質並びにポリペプチドの半減期を増加させるためのポリペプチド構築物におけるその使用は、当該技術分野において既知である（Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＳら著、（２００２）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７（３８）ｐ．３５０３５−３５０４３；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ａ．ら著（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２１（８）、ｐ．５１５−５２７）。さらに、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、同第０１／４５７４６号パンフレット及び同第０２／０７６４８９号パンフレットは、半減期を増加させるための、治療用タンパク質及び他の治療的化合物並びに実体に融合することができる血清アルブミンに結合するペプチド部分を記載している。しかしながら、これらのペプチド部分は、細菌起源又は合成起源のペプチド部分であり、これは治療薬中の使用にあまり好ましくない。アルブミンへの他の結合ドメインは、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（登録商標）（ラクダ科に由来）（国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット）及びシングルドメイン抗体（ヒト抗体由来）（Ｈｏｌｔ  Ｌ．Ｊ．ら著、（２００８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２１、ｐ．２８３−２８８及びＷａｌｋｅｒ，Ａら著、（２０１０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３、ｐ．２７１−２７８）を含む。
【０００５】
望まれる薬物動態学的特性並びに薬力学的特性で血清アルブミンに対して高親和性で特異的に結合するタンパク質を得るための１つの手段は、抗体及び別の結合技術（後者は「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれる）の使用を示す。これらの非免疫グロブリン由来の結合試薬は当該技術分野において既知であり、総じて「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれる（Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．著、（２０００）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３、１６７−１８７）。５０を超える異なるタンパク質足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が、過去１０〜１５年にわたって提案されていて、この分野における最も先進的な取り組みは（Ｇｅｂａｕｅｒ  Ｍ及びＳｋｅｒｒａ  Ａ．著、（２００９），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５で要約されるような）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）（登録商標）（ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）タンパク質ＡのＺ−ドメインに基づく）、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、アドネクチン（ヒトフィブロネクチンの第１０番目のドメインに基づく）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）（登録商標）（リポカリンに由来）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質に由来）、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）（マルチマーとしたＬＤＬＲ−Ａに基づく）、及びフィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）（登録商標）（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  Ｊ．ら著、（２００７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２０（２）、ｐ．５７−６８並びに欧州特許出願公開第２０５４４３２号明細書）（これはヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する）である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記から明らかなように、薬学的及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドのインビボ半減期を延長させるためのさらなる手段に対する不断の要望が存在している。この要望は本発明によって対処される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、第１の実施形態においては、本発明は、ヒト血清アルブミンに結合し、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）（式中、（Ｘ１）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ２）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ３）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ４）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ５）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ６）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ７）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ９）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１０）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１１）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１２）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１３）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１４）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１５）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１６）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１７）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１９）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなるポリペプチドに関し、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態によると、ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号２）（式中、（Ｘ１）は、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｇ又はＭであり；（Ｘ２）は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｌ又はＴであり；（Ｘ３）は、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｋ又はＶであり；（Ｘ４）は、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＥであり；（Ｘ５）は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｗ、Ｌ、Ｒ又はＫであり；（Ｘ６）は、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｒ又はＱであり；（Ｘ７）は、Ｌ又はＲであり；（Ｘ８）は、Ｑ又はＤであり；（Ｘ９）は、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＳであり；（Ｘ１０）は、Ｌ、Ｉ又はＶであり；（Ｘ１１）は、Ｗ又はＲであり；（Ｘ１２）は、Ｔ又はＦであり；（Ｘ１３）は、Ｄ、Ｗ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＡであり；（Ｘ１４）は、Ｗ又はＧであり；（Ｘ１５）は、Ｅ又はＶであり；（Ｘ１６）は、Ａ又はＶであり；（Ｘ１７）は、Ｅ、Ｌ又はＲであり；（Ｘ１８）は、Ｔ、Ｓ又はＭであり；（Ｘ１９）は、Ｙ又はＳである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のアルブミン結合ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性評価を示す：レーンＭは分子量標準であり、レーンＡはＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１（配列番号４）であり、レーンＢはＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈ（配列番号５）であり、レーンＣはＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３（配列番号３）である。
【図２】図２は、非修飾ＢＩＴＥ（登録商標）ポリペプチド（配列番号５３、レーン１）及びアルブミン結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７ＨとＢＩＴＥ（登録商標）分子とからなるＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−ＢＩＴＥ（登録商標）融合タンパク質ＣＯＶＡ４０６（配列番号５４、レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性評価を示す。分子量標準は、レーンＭに示されている。
【図３】図３は、ＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）のサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す。
【図４】図４は、ＣＤ３を発現する細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｅ６−１）、ＰＳＭＡを発現する細胞（２２Ｒｖ１細胞）及びＣＤ３もＰＳＭＡも発現しない無関係な細胞系（ＬＳ１７４Ｔ細胞）を使用するＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）とのＦＡＣＳ結合実験を示す。結合は、平均蛍光強度で表わされる。ＣＤ３＋はＣＤ３−陽性細胞であり、ＣＤ３−はＣＤ３陰性細胞であり、ＰＳＭＡ＋はＰＳＭＡ陽性細胞であり、ＰＳＭＡ−はＰＳＭＡ陰性細胞であり、ＣＯＶＡ４０６は、結合試薬として使用され、ＰＢＳは陰性対照であり、ＣＯＶＡ４０６の代わりにリン酸塩緩衝生理食塩水が添加される。ＣＯＶＡ４０６は、細胞上で発現された抗原ＣＤ３及びＰＳＭＡの両方を認識する。
【図５】図５は、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する、ＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）によるＰＳＭＡ陽性細胞（２２Ｒｖ１細胞）又はＰＳＭＡ陰性細胞（ＨＴ２９細胞）の再指向細胞溶解の分析を示す。標的細胞２２Ｒｖ１及びＨＴ２９は、予めカルセインＡＭで標識し、次いでヒトＰＢＭＣ（２５：１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）及び異なる濃度のＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）と５時間インキュベートした。上澄みへのカルセイン放出の検出によって、特異的な腫瘍細胞溶解の百分率を測定した。３つのウェルの３セットを±ＳＥＭで示す。
【図６】図６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの単回静脈内注射後の異なる時点におけるＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）及びＢＩＴＥ（登録商標）タンパク質（配列番号５３）の血清濃度を示す。血清中の濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定した。５匹のマウスの平均値を±ＳＤで示す。
【図７】図７は、親和性選択後に単離された先行技術のＦｙｎ  ＳＨ３変異体の交差性ＥＬＩＳＡを示す。ＭＳＡはマウス血清アルブミンであり、ＨＳＡはヒト血清アルブミンであり、ＲＳＡはラット血清アルブミンであり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである。
【図８−１】図８は、配列番号４〜４０の配列アライメントである。
【図８−２】図８は、配列番号４〜４０の配列アライメントである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、約５０個を超えるアミノ酸を含有する、単鎖タンパク質又はその断片を含むアミノ酸の線状の分子鎖を示す。ポリペプチドは、少なくとも２つの同一又は異なる分子からなるオリゴマーをさらに形成してもよい。このようなマルチマーの、対応するより高次の構造は、これに対応して、ホモ−若しくはヘテロダイマー、ホモ−若しくはヘテロトリマー等と呼ばれる。ホモダイマー、トリマー等もまた、用語「ポリペプチド」の定義の範囲内に入る。さらに、アミノ酸及び／又はペプチド結合が機能的類似体によって置き換えられているこのようなポリペプチドのペプチド疑似体もまた、本発明により包含される。このような機能的類似体は、セレノシステインなどの２０個の遺伝子にコード化されたアミノ酸以外の全ての既知のアミノ酸を含む。用語「ポリペプチド」はまた、自然に修飾されたポリペプチドも指し、この修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化によって行われるもの及び当該技術分野において周知である類似の修飾である。
【００１１】
ヒト血清アルブミンへの結合を実質的に保持する本発明のポリペプチドの断片もまた、本発明に含まれる。この点に関しては、断片（いかなる場合も５０個未満のアミノ酸を含有する）が、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、又は少なくとも４５個（この順で選好が増大する）のアミノ酸を含むことは、好ましい。断片においてはＲＴ−及びｎ−Ｓｒｃ−ループに対応するアミノ酸位置及び以下に本発明で定義されるようなこれらのループに隣接しているアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の隣接するアミノ酸位置）が保持されていることがさらに好ましい。
【００１２】
用語「ヒト血清アルブミンへの結合」は、本発明のポリペプチドが、ヒト血清アルブミンに対して、より好ましくは、配列番号４６のヒト血清アルブミンに対して特異的な（インビボ及び／又はインビトロの）結合親和性を有することを必要とする。このようなポリペプチドは、５０００ｎＭ未満、２５００ｎＭ未満、及び１５００ｎＭ未満（この順で選好が増大する）のヒト血清アルブミンに対する解離定数（ＫＤ）を有する。また、このようなポリペプチドはまた、５００００ｎＭを超える、１０００００ｎＭを超える、及び５０００００ｎＭを超える（この順で選好が増大する）、哺乳動物血清アルブミン以外の任意のタンパク質に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００１３】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験などの当該技術分野において周知の実験を使用して検出することができる。このようなアッセイは、好ましくは、以下の本明細書の実施例において概説された通りに実行することができる。
【００１４】
本発明によると、用語「配列同一性の百分率（％）」は、鋳型核酸又はアミノ酸配列の全体長さを作り上げているヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の数と比較した、２つ以上の整列させた核酸若しくはアミノ酸配列の同一のヌクレオチド／アミノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、サブ（配列）が比較用のウィンドウ全体にわたって、若しくは当該技術分野において既知である配列比較アルゴリズムを使用して測定されるような指定された領域全体にわたって最大限の一致に対して比較され整列させる場合、又は手動で整列させ視覚的に評価される場合、アライメントを使用して、２つ以上の配列若しくはサブ配列について、同一のものである（例えば、９０％又は９５％の同一性）アミノ酸残基若しくはヌクレオチドの百分率が決定されてもよい。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、ヌクレオチド若しくはアミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なってもよい。この定義は、試験配列の補体にも適用する。
【００１５】
当業者であれば、核酸配列を整列させるために、適切なプログラムも認識する。ポリペプチド配列の配列同一性の百分率は、例えば、上記で説明したプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴなどのプログラムで決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラム、すなわち、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することが好ましい（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ、及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ著、（１９９７）、“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【００１６】
本明細書の項目（ｂ）で記載した配列同一性に関して、配列同一性は、少なくとも９５％又は少なくとも９８％（この順で選好が増大する）であることが好ましい。
【００１７】
本明細書で使用されるフレーズ「同一性の決定はアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する」とは、配列番号１並びに２（又は配列番号４１、４２並びに４９）に関する配列同一性の計算が、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を考慮に入れないが、配列番号１並びに２（又は配列番号４１、４２及び４９）のアミノ酸配列の残部に限定されることを明記している。
【００１８】
上記項目（ｂ）に従う配列計算が、（Ｘ６）と（Ｘ７）との間のアミノ酸位置Ｄ及び（Ｘ１４）と（Ｘ１５）との間のアミノ酸位置Ｗを更に除外することが、本発明に関しては好ましく、なぜなら、これらアミノ酸位置は、ＲＴ及びｎ−Ｓｒｃループ内にあるか、又はこれらのループに隣接しているためである。
【００１９】
用語「血清アルブミン」（当該技術分野においては簡略的にアルブミンとも呼ばれる）は、ヒトでは、ＡＬＢ遺伝子によってコード化される球状タンパク質を指す。血清アルブミンは、哺乳動物においては最も豊富にある血漿タンパク質である。血清アルブミンは、血管内コンパートメントと体組織との間の体液の適切な分布に必要とされる膠質浸透圧を維持するために必須である。これはまた、いくつかの疎水性ステロイドホルモンに非特異的に結合することによって血漿担体としても作用し、ヘミン及び脂肪酸のための輸送タンパク質としても作用する。さらに、血清アルブミンは、約１９日間の非常に長い半減期を有し、その代謝が周知である。アルブミンは、市販の医薬品中でタンパク質安定剤としても広く使用されている（Ｓａｎｇａｓｔｉｎｏら著、（２０１２）、Ｂｌｏｏｄ、１２０（１２）２４０５−２４１１）。
【００２０】
上記の本明細書に記載される配列番号１及び２は、ヒトＦｙｎキナーゼ（配列番号３）のＳＨ３ドメインのアミノ酸配列から誘導される。より詳細には、配列番号４〜４０は、ヒトＦｙｎキナーゼ（配列番号３）の誘導体であり、配列番号２は、配列番号４〜４０のアライメントから生じる配列である（図８参照）。図８及び以下の本発明の実施例における配列番号４〜４０の配列アライメントは、配列番号２のコンテキスト内のアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）について列挙されたアミノ酸が、ヒト血清アルブミンに、特に配列番号４６を有するヒト血清アルブミンに対して結合特異性を付与することを示している。より詳細には、図８中の本発明の配列番号４〜４０の配列アライメントは、配列番号２のコンテキスト内のアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）が、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｇ又はＭである（Ｘ１）；Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｌ又はＴである（Ｘ２）；Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｋ又はＶである（Ｘ３）；Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＥである（Ｘ４）；Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｗ、Ｌ、Ｒ又はＫである（Ｘ５）；Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｒ又はＱである（Ｘ６）；Ｌ、又はＲである（Ｘ７）；Ｑ、又はＤである（Ｘ８）；Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＳである（Ｘ９）；Ｌ、Ｉ又はＶである（Ｘ１０）；Ｗ又はＲである（Ｘ１１）；Ｔ又はＦである（Ｘ１２）；Ｄ、Ｗ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＡである（Ｘ１３）；Ｗ又はＧである（Ｘ１４）；Ｅ又はＶである（Ｘ１５）；Ａ又はＶである（Ｘ１６）；Ｅ、Ｌ又はＲである（Ｘ１７）；Ｔ、Ｓ又はＭである（Ｘ１８）；Ｙ又はＳである（Ｘ１９）から選択することができることを示している。したがって、配列番号２中のアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）について列挙されたアミノ酸の全ての可能な組み合わせが、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を付与することを予想することができる。
【００２１】
本発明の配列番号１内の変異体アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）について列挙されたさらなるアミノ酸は、配列番号４〜４０中で位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）にて見出されるコンクリートアミノ酸と比べると保存的な置換である。以下にさらに詳細に述べられるように、保存的な置換は、その側鎖が類似する生化学的特性を有する、別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。したがって、保存的アミノ酸置換は、本発明のポリペプチドの全体的な結合特性を変更することはないと予想される。
【００２２】
例えば、本発明の特徴（ｂ）に従い、配列番号１若しくは２（又は配列番号４１、４２、若しくは４９）のポリペプチドにおいて、ＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインのＲＴ−及び／又はｎ−Ｓｒｃ−ループの外側にある、及びアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）の外側のこれらループに隣接するアミノ酸位置の外側にある追加のアミノ酸位置は、ヒト血清アルブミンに対する結合特性を実質的に妨害することなく、交換若しくは欠失されてもよく、又は更なるアミノ酸が付加されてもよい。アミノ酸が交換される場合、保存的交換が好ましい。
【００２３】
保存的置換は、置換されるアミノ酸に類似した化学的特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。好ましくは、保存的置換は、（ｉ）塩基性アミノ酸の異なる塩基性アミノ酸による置換、（ｉｉ）酸性アミノ酸の異なる酸性アミノ酸による置換、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸の異なる芳香族アミノ酸による置換、（ｉｖ）非極性の、脂肪族アミノ酸の異なる非極性の、脂肪族アミノ酸の置換、及び（ｖ）極性の、非荷電アミノ酸の異なる極性の、非荷電アミノ酸による置換からなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸から選択される。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択される。非極性の、脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択される。極性の、非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択される。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の上記で概略した保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に入らない任意のアミノ酸による交換である。
【００２４】
したがって、配列番号１若しくは２（又は配列番号４１、４２若しくは４９）のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％（この順で選好が増大する）の同一であるアミノ酸配列もまた本発明によって包含され、式中、（Ｘ１）〜（Ｘ１９）は、上記に示した別個のアミノ酸、あるいは配列番号１若しくは２（又は配列番号４１、４２若しくは４９）と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％（この順で選好が増大する）の同一であるアミノ酸から選択され、式中、（Ｘ１）〜（Ｘ１９）は、上記に示した別個のアミノ酸から選択され、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【００２５】
配列番号３は、ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインのアミノ酸配列（Ｋａｗａｋａｍｉら及びＳｅｍｂａらによって、１９８６年に報告されたＦｙｎキナーゼのａａ８３−１４５）である。Ｆｙｎ  ＳＨ３のアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラット及びサル（テナガザル）の中で完全に保存されている。ニワトリのＦｙｎ  ＳＨ３は、一カ所、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の１種は、２カ所のアミノ酸位置において対応するヒトドメインと異なっている。他のＳＨ３ドメインと同様に、Ｆｙｎ  ＳＨ３は、２つの逆平行βシートで構成されており、他のタンパク質と相互作用するための２つの可動性ループ（ＲＴ及びｎ−Ｓｒｃ−ループと称される）を含む。一般的に、ＳＨ３ドメインは、細胞内シグナル伝達に関与している多種多様なタンパク質中に存在している（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏら著、（１９９４）、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６１；２８３−２９７）。これらのドメインは、タンパク質内で固定された位置を占有せず、個別に発現かつ精製され得る。このドメインの１０００を超える存在が、約３００のヒトＳＨ３ドメインと共に既知である（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  Ａ著、（２００３）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６１；２１１−２６８）。ＳＨ３ドメインの間には大きな配列多様性が存在するが、これらはすべて保存された折りたたみ（ｆｏｌｄ）：２つの逆平行βシートによって形成されたコンパクトなβバレルを共有する（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  Ａ著、（２００３）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６１；２１１−２６８）。典型的には、ＳＨ３ドメインは、ＰＸＸＰコア結合モチーフを含有する高プロリンタンパク質に結合する（Ｒｅｎら著、（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９；１１５７−１１６１）が、非通常型のＳＨ３結合部位の例もまた記述されている（Ｋａｒｋｋａｉｎｅｎら著、（２００６）、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ７；１８６−１９１）。配列決定されたＳＨ３ドメインの大部分は、今のところ、約６０〜６５個のアミノ酸の全体長さを有するが、これらのいくつかは、二次構造の主な保存的構成要素に連結するループへの挿入物のために、８５個ものアミノ酸を有することに特徴がある（Ｋｏｙａｍａら著、（１９９３）、Ｃｅｌｌ  ７２（６）；９４５−９５２）。異なるＳＨ３ドメインのアライメントは、適切な構造形成の並びに規範的高プロリンモチーフ認識の要因となる保存されたアミノ酸残基を明らかにした（Ｌａｒｓｏｎら著、（２０００）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９；２１７０−２１８０）。配列番号３を示す。
【００２６】
【化１】
2016508143.tif 000002
【００２７】
上記に示した配列番号３において、ＲＴ及びｎ−Ｓｒｃループの配列に、それぞれ下線及び二重下線を付けている。Ｅｒｐｅｌら(“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｒｃ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｒｆａｓｅ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａ−  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｅｍｂｏ  Ｊ．１４（５）：９６３−７５，１９９５)は、Ｓｒｃ  ＳＨ３ドメインのＲＴ及びｎ−Ｓｒｃループ中の突然変異の影響を検討し、疎水性表面に隣接している両方のループ中の突然変異が、天然のＳＨ３リガンドとの分子間会合又は分子内会合に関与するために、このドメインの能力に影響を及ぼすことができることを立証した。更に欧州特許出願公開第２０５４４３２号明細書は、ＲＴ−及び／又はｎ−Ｓｒｃループ内の又はこれらに隣接する突然変異が、ＳＨ３ドメインの結合特異性を決定することを示している。より詳細には、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインが、結合タンパク質の生成に魅力的な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）（「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」）であることが立証された。その理由は、これが（ｉ）可溶性形態で大量に細菌中で発現させることができ、（ｉｉ）単量体型であり、溶液中で保存される場合に凝集せず、（ｉｉｉ）非常に安定であり（７０．５℃の温度で）、（ｉｖ）システイン残基を欠き、及び（ｖ）マウスからヒトに完全に保存されたアミノ酸配列を特徴とするヒト起源であり、したがって、本質的に非免疫原性である（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら著、（２００７）、ＪＢＣ、２８２、ｐ．３１９６−３２０４；欧州特許出願公開第２０５４４３２号明細書）ためである。用語「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」と本明細書で互換的に使用される用語「Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチド」は、一般的に、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合（ポリ）ペプチド（例えば、上記記載のいわゆる足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ））を指す。
【００２８】
過去において、マウスの血清アルブミンに結合するＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）の単離が記述されている（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  Ｊら著、（２００７年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２０（２）、ｐ．５７−６８及び欧州特許出願公開第２０５４４３２号明細書）。しかしながら、本発明者らの知る限りでは、ヒト血清アルブミンに結合し、オボアルブミンなどの無関係なタンパク質には結合しない、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）をベースとした結合剤は、当該技術分野において今のところ記載されていない（実施例４を参照）。加えて、本発明者らの知る限りでは、ヒト血清アルブミン及び齧歯類血清アルブミンに結合し、オボアルブミンなどの無関係なタンパク質には結合しない、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）をベースとした結合剤は、当該技術分野において今のところ記載されていない（実施例４を参照）。
【００２９】
したがって、別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、齧歯類血清アルブミンにさらに結合し、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号４１）（式中、（Ｘ１）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ２）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ３）は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ４）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ５）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ６）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ７）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ９）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ又はＥであり；（Ｘ１０）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１１）は、Ｆ、Ｙ又はＷであり；（Ｘ１２）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣであり；（Ｘ１３）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１４）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１５）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１６）は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１７）は、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；（Ｘ１８）は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｇ又はＰであり；（Ｘ１９）は、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ又はＣである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態によると、本発明のポリペプチドは、齧歯類血清アルブミンにさらに結合し、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号４２）（式中、（Ｘ１）は、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｇ又はＭであり；（Ｘ２）は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｌ又はＴであり；（Ｘ３）は、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｋ又はＶであり；（Ｘ４）は、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｗ又はＭであり；（Ｘ５）は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｗ、Ｌ又はＲであり；（Ｘ６）は、Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｒ又はＱであり；（Ｘ７）は、Ｌ又はＲであり；（Ｘ８）は、Ｑ又はＤであり；（Ｘ９）は、Ｎ又はＤであり；（Ｘ１０）は、Ｌ又はＩであり；（Ｘ１１）は、Ｗであり；（Ｘ１２）は、Ｔであり；（Ｘ１３）は、Ｄ、Ｗ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＡであり；（Ｘ１４）は、Ｗ又はＧであり；（Ｘ１５）は、Ｅ又はＶであり；（Ｘ１６）は、Ａ又はＶであり；（Ｘ１７）は、Ｅ、Ｌ又はＲであり；（Ｘ１８）は、Ｔ、Ｓ又はＭであり；（Ｘ１９）は、Ｙ又はＳである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【００３１】
この好ましい及びより好ましい実施形態によると、位置（Ｘ８）〜（Ｘ１２）は、「ＱＤＬＷＴ」（配列番号４３）又は「ＱＮＬＷＴ」（配列番号４４）又は「ＤＤＩＷＴ」（配列番号４５）のいずれかであることが好ましい。位置（Ｘ８）〜（Ｘ１２）は、配列番号２のＦｙｎ  ＳＨ３ドメインのｎ−Ｓｒｃ−ループに相当する。図８の配列番号４〜３２の配列アライメントから明らかなように、全てのこれらポリペプチドは、「ＱＤＬＷＴ」（配列番号４３）又は「ＱＮＬＷＴ」（配列番号４４）又は「ＤＤＩＷＴ」（配列番号４５）のいずれかのｎ−Ｓｒｃ−ループを有する。したがって、特にこのようなｎ−Ｓｒｃ−ループは、ヒト及び齧歯類の血清アルブミンに結合特異性を付与する。
【００３２】
齧歯類の非限定的な例は、マウス、ラット、リス、ヤマアラシ、ビーバー、モルモット、及びハムスターである。別の好ましい実施形態では、齧歯類はラットである。他の好ましい実施形態では、齧歯類はマウスである。異なる好ましい実施形態では、齧歯類はマウス及びラットを含む。
【００３３】
さらにより好ましい実施形態によると、本発明のポリペプチドは、齧歯類血清アルブミンにさらに結合し、このアミノ酸配列は、配列番号４〜３２のアミノ酸配列から選択される。
【００３４】
図８の本発明の配列番号４〜３２の配列アライメントは、配列番号４２のコンテキスト内のアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）が、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｇ又はＭである（Ｘ１）；Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｌ又はＴである（Ｘ２）；Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｋ又はＶである（Ｘ３）；Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｗ又はＭである（Ｘ４）；Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｗ、Ｌ又はＲである（Ｘ５）；Ｆ、Ｙ、Ｐ、Ｗ、Ｒ又はＱである（Ｘ６）；Ｌ又はＲである（Ｘ７）；Ｑ又はＤである（Ｘ８）；Ｎ又はＤである（Ｘ９）；Ｌ又はＩである（Ｘ１０）；Ｗである（Ｘ１１）；Ｔである（Ｘ１２）；Ｄ、Ｗ、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＡである（Ｘ１３）；Ｗ又はＧである（Ｘ１４）；Ｅ又はＶである（Ｘ１５）；Ａ又はＶである（Ｘ１６）；Ｅ、Ｌ又はＲである（Ｘ１７）；Ｔ、Ｓ又はＭである（Ｘ１８）；Ｙ又はＳである（Ｘ１９）から選択することができることを示している。したがって、配列番号４２中のアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）について列挙されたアミノ酸の全ての可能な組み合わせが、ヒト血清アルブミン並びに齧歯類血清アルブミンに対して結合特異性を付与することを予想することができる。
【００３５】
本発明の配列番号４１内の変異体アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）について列挙されたさらなるアミノ酸は、配列番号４〜３２中で位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）にて見出されるコンクリートアミノ酸と比べると保存的な置換である。上記にさらに詳細に述べたように、保存的な置換は、その側鎖が類似する生化学的特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。したがって、保存的アミノ酸置換は、本発明のポリペプチドの全体的な結合特性を変更することはないと予想される。
【００３６】
用語「齧歯類血清アルブミンへの結合」は、本発明のポリペプチドが、齧歯類血清アルブミン、より好ましくは、配列番号４７のマウス血清アルブミン及び配列番号４８のラット血清アルブミンに対する特異的な（インビボ及び／又はインビトロの）結合親和性を有することを必要とする。このようなポリペプチドは、５０００ｎＭ未満、２５００ｎＭ未満、及び１５００ｎＭ未満（この順で選好が増大する）の齧歯類血清アルブミンに対する解離定数（ＫＤ）を有する。また、このようなポリペプチドは、５００００ｎＭを超える、１０００００ｎＭを超える、及び５０００００ｎＭを超える（この順で選好が増大する）、哺乳動物血清アルブミン以外の任意のタンパク質に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００３７】
本明細書で前述の通りに、結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験などの当該技術分野において周知の実験を使用して検出することができる。このようなアッセイは、好ましくは、以下の本明細書の実施例において概説された通りに実行することができる。
【００３８】
本発明の全てのポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに結合するが、このことは、ヒトへの治療薬又は診断薬として適切であるための前提条件である。予てより、５０００ｎＭ（５μＭ）未満のヒト血清アルブミンに対する解離定数（ＫＤ）は、ポリペプチドが投与の際に、インビボでヒト血清アルブミンに効果的に結合することを補償するのに十分であると考えられている。例えば、Ｈｏｌｔら著、（２００８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；２１（５）２８３−２８８は、２桁のナノモル範囲並びに１桁のマイクロモル範囲でＫＤを有する血清アルブミン結合剤が、タンパク質の血清半減期を同じ程度まで増加させることの証拠を提供している。ヒト血清アルブミン並びに齧歯類血清アルブミンに交差反応性であるポリペプチドは、創薬開発が容易になるために、特に有益である。より詳細には、このポリペプチドは、マウス及びラットなどの十分に確立され、広く使用されている動物モデルにおいて、並びにヒトにおいて試験することができる。ヒト血清アルブミン（配列番号４６）及びマウス血清アルブミン（配列番号４７）は、７０％以上のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに結合することができ、齧歯類血清アルブミンに結合することができず、ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）Ｄ（Ｘ７）ＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬ（Ｘ８）（Ｘ９）（Ｘ１０）（Ｘ１１）（Ｘ１２）Ｇ（Ｘ１３）（Ｘ１４）Ｗ（Ｘ１５）（Ｘ１６）ＲＳＬＴＴＧ（Ｘ１７）（Ｘ１８）Ｇ（Ｘ１９）ＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号４９）（式中、（Ｘ１）は、Ｔ、Ｈ又はＱであり；（Ｘ２）は、Ｓ又はＡであり；（Ｘ３）は、Ｒ又はＨであり；（Ｘ４）は、Ｔ、Ｌ、Ｈ又はＥであり；（Ｘ５）は、Ｇ又はＫであり；（Ｘ６）は、Ｆ又はＹであり；（Ｘ７）は、Ｌ又はＲであり；（Ｘ８）は、Ｄであり；（Ｘ９）は、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＳであり；（Ｘ１０）は、Ｌ、Ｉ又はＶであり；（Ｘ１１）は、Ｒであり；（Ｘ１２）は、Ｆであり；（Ｘ１３）は、Ｄであり；（Ｘ１４）は、Ｗであり；（Ｘ１５）は、Ｅであり；（Ｘ１６）は、Ａであり；（Ｘ１７）は、Ｅであり；（Ｘ１８）は、Ｔであり；（Ｘ１９）は、Ｙである）と、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はこれらからなり、この同一性の決定は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）を除外する。
【００４０】
さらに、本発明のポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに結合することができ、齧歯類血清アルブミンには結合することができず、このアミノ酸配列は、配列番号３３〜４０のアミノ酸配列から選択することができる。
【００４１】
図８中の本発明の配列番号３３〜４０の配列アライメントは、配列番号４９のコンテキスト内のアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ１９）が、Ｔ、Ｈ又はＱである（Ｘ１）；Ｓ又はＡである（Ｘ２）；Ｒ又はＨである（Ｘ３）；Ｔ、Ｌ、Ｈ又はＥである（Ｘ４）；Ｇ又はＫである（Ｘ５）；Ｆ又はＹである（Ｘ６）；Ｌである（Ｘ７）；Ｄである（Ｘ８）；Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｍ又はＳである（Ｘ９）；Ｌ、Ｉ又はＶである（Ｘ１０）；Ｒである（Ｘ１１）；Ｆである（Ｘ１２）；Ｄである（Ｘ１３）；Ｗである（Ｘ１４）；Ｅである（Ｘ１５）；Ａである（Ｘ１６）；Ｅである（Ｘ１７）；Ｔである（Ｘ１８）；Ｙである（Ｘ１９）から選択することができることを示している。
【００４２】
用語「齧歯類血清アルブミンに結合しない」は、本発明のポリペプチドが、齧歯類血清アルブミン、特に配列番号４７のマウス血清アルブミン及び配列番号４８のラット血清アルブミンに対する特異的な（インビボ及び／又はインビトロの）結合親和性を有さないことを必要とする。このようなポリペプチドは、５００００ｎＭを超える、７５０００ｎＭを超える、及び１０００００ｎＭを超える（この順で選好が増大する）齧歯類血清アルブミンに対する解離定数（ＫＤ）を有する。また、このようなポリペプチドは、１０００００ｎＭを超える哺乳動物血清アルブミン以外の任意のタンパク質に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００４３】
本明細書で上述したように、結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験などの当該技術分野において周知の実験を使用して検出することができる。このようなアッセイは、好ましくは、以下の本明細書の実施例において概説された通りに実行することができる。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドに融合された本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。融合タンパク質において、本発明のポリペプチドは、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドのインビボ半減期を増強させるよう意図される。したがって、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドは、それ自体が５日間未満、２日間未満、１日間未満、１２時間未満、１０時間未満及び５時間未満（この順で選好が増大する）の半減期を有する短寿命の薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドであることが好ましい。例えば、インスリンは、４〜６分の半減期を有するに過ぎない。上述したように、血清アルブミンは、１９日間の半減期を有する（Ｄｅｎｎｉｓら著、（２００２）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７（３８）、ｐ．３５０３５−３５０４３）。
【００４５】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、別個のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子の連結及び発現を通して生成されるポリペプチド構築物に向けられる一般的な用語である。言い換えると、この融合遺伝子の翻訳は、元のポリペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドを結果としてもたらす。このポリペプチドは、直接融合されるか、リンカー、例えば短鎖ペプチド配列を介して融合されるかのどちらでもよい。一般的に、融合タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によって人工的に生成される（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｐ．５１８−５１９）。しかしながら、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質は、平易な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多くの従来的かつ周知の技術のいずれかによって、又は市販で入手できる自動合成装置によって調製されてもよい。融合タンパク質は、生物学的研究又は治療薬で使用されてもよい。
【００４６】
薬学的に活性なタンパク質又はペプチドは、対象に投与される際に、対象に対して有益な効果をもたらす、生物学的に活性を有するタンパク質又はペプチドである。この用語は、プロドラッグも包含する。プロドラッグは、不活性な（又は完全な活性よりも低い）形態で対象に投与されるタンパク質又はペプチドであり、対象の代謝プロセスを通して、薬学的に活性な又は薬学的に完全に活性なタンパク質又はペプチドに実質的に変換される。薬学的に（完全に）活性なタンパク質又はペプチドは、疾患の治療又は予防に好適なタンパク質又はペプチドであることが好ましい。
【００４７】
診断学的に活性なタンパク質又はペプチドは、対象への投与の際に、可能性のある疾患又は異常を決定し又は特定することを可能にする、活性を有するタンパク質又はペプチドである。本発明のポリペプチドに融合された診断的に活性なタンパク質又はペプチドは、特に、特異的疾患を決定又は特定するために使用することができる。例えば、体内の疾患組織の場所が、本発明の診断学的に活性なタンパク質又はペプチドに融合された本発明のポリペプチドによって検出され特定され得る。
【００４８】
１つの好ましい実施形態によると、本発明のポリペプチドは、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドに直接融合される。
【００４９】
別の好ましい実施形態によると、本発明のポリペプチドは、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドにリンカーを介して融合される。
【００５０】
融合構築物は、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドのＣ−又はＮ−末端に、より具体的には、Ｃ−末端アミノ酸のカルボキシ基とＮ−末端アミノ酸のアミノ基との間のペプチド結合の形成によって、（直接）融合されてもよく、あるいはリンカーを介して薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドのＣ−又はＮ−末端に結合されてもよい。
【００５１】
適切なリンカーは、当業者が自由に使えるものである。本発明によるリンカーは、１〜３０個の炭素原子を有するアルキル、１〜２０個のエチレン部分を有するポリエチレングリコール、１〜２０個の残基を有するポリアラニン、カプロン酸、置換された又は非置換のポリ−ｐ−フェニレン及びトリアゾールからなる群から選択されることが好ましい。ペプチド性リンカーにさらに選択が与えられ、より具体的には２〜３０個のアミノ酸の長さを有するオリゴヌクレオチドに選択が与えられる。単一アミノ酸の使用も意図的に考えられる。好ましい長さの範囲は５〜１５個のアミノ酸である。他の好ましい長さは、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸である。
【００５２】
特に好ましいものは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％の、グリシン、セリン及びアラニンなどの小さいアミノ酸からなるペプチドであるリンカーである。特に好ましいものは、グリシン及びセリンのみからなるリンカーである。最も好ましいものは、配列番号５０〜５２のリンカーであり、配列番号５２の配列からなるペプチドであるリンカーに特別な選択が与えられる。
【００５３】
好ましい実施形態によると、薬学的に及び／又は診断学的に活性なタンパク質又はペプチドは、組換えタンパク質、抗体、血液因子、ホルモン、抗凝血剤、血栓溶解剤、サイトカイン、ケモカイン、及びインターフェロンからなる群から選択される。
【００５４】
ヒト血清アルブミンに結合する本発明のポリペプチドに融合することができ、これによってそれらのインビボ半減期を延長させる薬学的に及び／又は診断学的に活性な分子の非限定的な例は、組換え血液因子（ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸ因子、トロンビン、アンチトロンビンなど）、血栓溶解剤並びに抗凝血剤（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒルジン、タンパク質Ｃなど）、インスリン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、卵胞刺激ホルモンなど）、グルカゴン、パラチロイドホルモン、カルシトニン、ルトロピン、パラチロイドホルモン、甲状腺刺激ホルモン−アルファ、絨毛性ゴナドトロピン−アルファ、増殖因子（エリスロポエチン、顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー形成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ケラチン生成細胞増殖因子など）、インターフェロン（インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマなど）、サイトカイン、ケモカイン、組換えＩＬ−１受容体拮抗薬及び二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｔ−細胞結合分子（ＢＩＴＥ（登録商標））を含む。
【００５５】
ケモカインは、ＩＬ−８、ＧＲＯアルファ、ＧＲＯベータ、ＧＲＯガンマ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１アルファ／ベータ、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３アルファ、ＭＩＰ−３ベータ、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンフォタクチン及びフラクタルカインからなる群から選択されることが好ましい。
【００５６】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ  アルファ、ＩＦＮ  ベータ、ＩＦＮ  ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦ  ベータ、ＬＴ−ベータ、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１−アルファ及びＩＬ−１ベータからなる群から選択されることが好ましい。当該技術分野において周知であるように、サイトカインは、免疫系の炎症性誘発応答又は抗炎症性応答を有効化することができる。したがって、処置される疾患に応じて、炎症誘導性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインを含む融合構築物のどちらかが有効であり得る。例えば、炎症性疾患の治療に対しては、一般的に、抗炎症性サイトカインを含む融合構築物が好ましいが、一方癌の治療に対しては、一般的に炎症誘発性サイトカインを含む融合構築物が好ましい。
【００５７】
本発明により使用される用語「抗体」は、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む。更に、結合特異性を未だ保持しているその誘導体又は断片も、用語「抗体」に含まれる。抗体断片又は誘導体は、とりわけ、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’断片、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ若しくはｓｃＦｖ断片、単一ドメインＶＨ若しくはＶ様ドメイン、例えばＶｈＨ若しくはＶ−ＮＡＲ−ドメイン、並びにミニボディ、ジアボディ、トリボディ、テトラボディ又は化学的に結合されたＦａｂ’−マルチマーなどのマルチマー形態を含む（例えば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒら著、２０１０、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ著、２００５を参照）。用語「抗体」はまた、キメラ抗体（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、単鎖抗体、及びヒト化抗体（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）も包含する。
【００５８】
抗体及びその断片を産生するための様々な技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒら著、２０１０に記載されている。したがって、ポリクローナル抗体は、添加剤及びアジュヴァントとの混合物中の抗原による免疫化の後に、動物の血液から得ることができ、モノクローナル抗体は、継代細胞株培養によって産生された抗体を提供する任意の技術によって産生することができる。このような技術の例が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ著、（１９８８）及び（１９９９）に記載されていて、ハイブリドーマ技術（１９７５年にＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ著、１９８３；Ｌｉら著、２００６を参照）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら著、１９８５）を含む。更に組換え抗体は、モノクローナル抗体から得てもよく、又はファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、又は細胞ディスプレイなどの様々なディスプレイ法を使用して、新規に調製することができる。組換え（ヒト化）抗体又はその断片の発現のための適切な系は、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞系又はトランスジェニック動物若しくは植物から選択されてもよい（例えば、米国特許第６，０８０，５６０号明細書；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５を参照）。さらに、単鎖抗体の産生について記載された技術（特に、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照）は、本発明の標的に特異的な単鎖抗体を産生するために適用可能である。ＢＩＡコアシステム中で使用されるような表面プラズモン共鳴は、ファージ抗体の有効性を増加させるために使用することができる。
【００５９】
用語「モノクローナル」又は「ポリクローナル抗体」（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ著、（１９８８）、上記引用文中）は、それらの結合特異性を保持する又は本質的に保持する上記抗体の誘導体にも関する。上記誘導体の特に好ましい実施形態は、以下の本明細書にさらに特定されているが、上記抗体の他の好ましい誘導体は、例えばマウス又はラットの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラ抗体である。
【００６０】
用語「ｓｃＦｖ断片」（単鎖Ｆｖ断片）は、当該技術分野において十分に理解されており、その小さなサイズ及びこのような断片を組換え的に産生する可能性のために好ましい。
【００６１】
この抗体は、ヒト化抗体であってもよい。用語「ヒト化抗体」とは、本発明によると、非ヒト起源の抗体であり、そのタンパク質配列が、ヒトにおいて自然に産生される抗体変異体に対してその類似性を増加させるように修飾されているものを意味する。抗体の作成は、例えば、ＣＤＲ３及び好ましくは全ての６ＣＤＲなどの適切なＣＤＲコードセグメント（所望の結合特性を左右する）をヒト抗体「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」挿入することによって、達成することができる。ヒト化抗体の産生のための方法は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ１０２３９４００号明細書及び国際公開第９０／０７８６１号パンフレットに記載されている。
【００６２】
用語「抗体軽鎖」は、抗体の小さいポリペプチドサブユニットを意味し、一方用語「抗体重鎖」は、抗体の大きいポリペプチドサブユニットを意味する。典型的な抗体は、２つの免疫グログリン（Ｉｇ）重鎖及び２つのＩｇ軽鎖から構成される。各軽鎖は２つのタンデムな免疫グロブリンドメイン（１つは定常（ＣＬ）ドメインであり、もう１つは抗原への結合に重要である可変ドメイン（ＶＬ）である）から構成されている）。重鎖は抗体の部類またはイソタイプを決定する。各重鎖は、２つの領域、すなわち、定常領域（これは同一の部類の全ての免疫グロブリンに同一であるが、部類間で異なる）及び異なるＢ細胞間で異なるが、同一のＢ細胞又はＢ細胞クローンによって産生される全ての免疫グロブリンに同一である可変領域を有する。任意の重鎖の可変ドメインは、単一の免疫グロブリンドメインから構成されている。
【００６３】
抗体の「機能的Ｆｃドメイン」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。免疫グロブリンの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、部類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けられ、これらのいくつかは、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、並びにＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に更に分けられてもよい。重鎖定常領域にしたがって、免疫グロブリンの異なる部類は、それぞれ［アルファ］、［デルタ］、［イプシロン］、［ガンマ］、及び［ミュー］と呼ばれる。抗体の機能的Ｆｃドメインは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存−細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。４つのヒトＩｇＧイソタイプは、新生児Ｆｃ受容体、活性化Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、並びにＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂ、及び異なる親和性を有するＣ１ｑなどの異なる受容体と結合し、非常に異なる活性を産み出す。ヒト抗体のＦｃドメインの活性化及び阻害受容体に対する親和性は、操作されかつ修正され得る（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ．著、（２００９）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０、ｐ．６８５−６９１を参照）。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、１つ以上の機能的ＦｃドメインのＮ−若しくはＣ−末端のいずれか、又は１つ以上のＦｃドメインのＮ−並びにＣ−末端の双方に融合され得る。本発明の融合タンパク質は、１つ以上のＦｃドメイン、好ましくは１つのＦｃドメインの少なくとも片側に、好ましくはＮ末端に融合された本発明のポリペプチドのマルチマー、好ましくはテトラマー、トリマー、最も好ましくはダイマーを含むことが好ましい。
【００６５】
より好ましい実施形態によると、本発明の抗体は、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｔ−細胞結合抗体（ＢＩＴＥ（登録商標）分子とも呼ばれる）である。ＢＩＴＥ（登録商標）分子は、２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる人工的な二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）融合タンパク質であり、ｓｃＦｖの一方はＣＤ受容体を介してＴ細胞に結合するが、他方は腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ．ら著、（２００３）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、５（４）ｐ．４１３−４１９；Ｗｏｌｆ  Ｅ．ら著、（２００５）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、１０（１８）、ｐ．１２３７−１２４４）。最近、２つのＢＩＴＥ（登録商標）抗体が現在、臨床試験で試験中であることが報告された（Ｂａｕｅｒｌｅ  ＰＡ及びＲｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｃ．著、（２００９）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６９（１２）、ｐ．４９４１−４９４４）。ビリナツモマブ（ＭＴ１０３としても知られる）は、ＣＤ３及びＣＤ１９に対して二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。これは、現在、後期の再発した非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する患者の第Ｉ相臨床試験において、及び前駆Ｂ細胞型急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）を有する患者で、その脊髄中に最小残留疾患を有する患者の第ＩＩ相臨床試験で試験されている。ＣＤ１９は、広範囲のＢ細胞悪性疾患に対処するのに好適な表面抗原である。臨床開発段階にある他のＢＩＴＥ（登録商標）抗体は、ＭＴ１１０と呼ばれ、ＣＤ３及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対して二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。これは現在、肺癌及び胃腸癌患者で第Ｉ相臨床試験において試験されている最中である。ＥｐＣＡＭは、ヒト腺癌並びに一部の扁平上皮癌で、及び癌肝細胞でも非常に頻繁に発現される。文献に記載された別のＢＩＴＥ（登録商標）分子はＭＴ１１２であり、これは、ＣＤ３及びＰＳＭＡに対して二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）である（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｍ．ら著、（２０１２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、１１、ｐ．２６６４−２６７３)。優れた抗腫瘍抗力を示すと同時に、ＢＩＴＥ（登録商標）分子について頻繁に記載される主要な制限のうちの１つは、わずか数時間のそれらの短いインビボ半減期である。ビリナツモマブ及びＭＴ１１０の短い半減期は、例えば、携帯式ミニポンプによる４〜８週間にわたる持続静注を必要にする（Ｂａｕｅｒｌｅ  ＰＡ及びＲｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｃ．著、（２００９）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６９（１２）、ｐ．４９４１−４９４４）。ＢＩＴＥ（登録商標）分子のより便利な投与治療法が患者にとって有益であろう。
【００６６】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）のＢＩＴＥ（登録商標）分子（抗アルブミン−ＣＤ３−ＰＳＭＡ）への融合が、細胞傷害活性を有し非修飾ＢＩＴＥ（登録商標）（抗ＣＤ３−ＰＳＭＡ）と比べて延長されたインビボ半減期を有するＦｙｎｏｍｅｒ−ＢＩＴＥ融合タンパク質を結果としてもたらすことが、驚くべきことに見出された。
【００６７】
他の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の融合タンパク質をコード化する核酸分子に関する。本発明による核酸分子は、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、及びｍＲＮＡを含む。さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡ及びセンス鎖並びにアンチセンス鎖の両方の混合ポリマーの合成又は半合成誘導体などの当該技術分野において既知の核酸擬態分子がさらに含まれる。当業者に容易に理解されるように、これらは、追加の非天然の又は誘導化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、ＤＮＡである。本発明によるこのような核酸擬態分子又は核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ及びＣｏｒｅｙ著、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８、１−７（２００１)を参照）。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素と４’−炭素との間のメチレン結合によって拘束されているＲＮＡ誘導体である。
【００６８】
本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡ類似体のポリアミド型である。アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの対応する誘導体についてのモノマー単位が購入可能である（例えば、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）。ＰＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡの糖−ホスフェート骨格の代りにアミド骨格を有する合成ＤＮＡミミック（擬態）である。この結果として、リン、酸化リン、又はデオキシリボース誘導体などのＤＮＡの特定の構成成分は、ＰＮＡ中には存在しない。
【００６９】
本発明によるＰＮＡキメラは、１つ以上のＰＮＡ部分を含む分子である。キメラ分子の残部は、１つ以上のＤＮＡ部分を含んでもよく（ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ）、又は１つ以上の（ポリ）ペプチド部分を含んでもよい（ペプチド−ＰＮＡキメラ）。本発明によるペプチド−ＤＮＡキメラは、１つ以上の（ポリ）ペプチド部分と１つ以上のＤＮＡ部分とを含む分子である。ＰＮＡ、ペプチド及びＤＮＡ部分を含む分子もまた考えられる。キメラ分子の一部の長さは、１〜ｎ−１塩基、その均等物又はアミノ酸の範囲に及ぶことができ、式中「ｎ」は、分子全体の塩基、その均等物及びアミノ酸の総数である。
【００７０】
上記記載のＰＮＡ、（ポリ）ペプチド、ＰＮＡキメラ及びペプチド−ＤＮＡキメラと兼ね併せての用語「誘導体」は、これらの分子がＰＮＡ、（ポリ）ペプチド及びＤＮＡとは異なる１つ以上のさらなる基又は置換基を含む分子に関する。当該技術分野において既知の全ての基又は置換基、保護基などのこれらの分子の合成に使用されるもの、及び／又は標識並びに（切断可能な）リンカーなどのこれらの分子に関与する適用対象も考えられる。
【００７１】
核酸分子が記載された配列を（有するよりはむしろ）含むこれらの実施形態では、追加のヌクレオチドは、５’末端上若しくは３’末端上のいずれか又はこの両方の特異的な配列を超えて伸びている。これらの追加の配列は、異種性又は同種性であってもよく、より高い値及びより低い値が除外されないが、約５０〜５００個のヌクレオチドを含んでもよい。同種配列の場合、これらの実施形態は、完全なゲノムを含まず、一般的に、５’及び／又は３’末端における約１５００個の追加のヌクレオチドに限定される。
【００７２】
追加の異種配列は、上記分子のコード配列に作用的に結合された異種プロモーターを含んでもよい。したがって、好ましくは、核酸分子はプロモーターに作用的に結合され、より好ましくはＴ５プロモーター／ｌａｃオペレーター要素、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペレーター要素からなる原核細胞プロモーターの群から、又はｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ  ｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモーターからなる真核細胞プロモーターの群から選択されるプロモーターに結合される。
【００７３】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【００７４】
好ましくは、このベクターはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は例えば、遺伝子操作で通常使用される別のベクターである。
【００７５】
本発明の核酸分子は、いくつかの市販の入手可能なベクター中に挿入されることができる。非限定的な例としては、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、発現ベクターのｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）若しくはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの原核細胞プラスミドベクター、またはｐＲＥＰ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）並びにｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような哺乳動物細胞中の発現に適合性のあるベクターが挙げられる。植物発現ベクターは、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＣＡＭＢＩＡ  １３９１（Ｃａｍｂｉａ）、ゲートウェイ（ＧＡＴＥＷＡＹ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧｒｅｅｎ及びｐＧｒｅｅｎＩＩ（ＰＧＲＥＥＮ）を含む。例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に好適なプラスミドは、例えば、プラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９Ｋ及びｐＰＩＣ３．５Ｋ（全てがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
【００７６】
上記に示した核酸はまた、別のポリヌクレオチドとの翻訳融合が生成されるようにベクター中に挿入されてもよい。他のポリヌクレオチドは、例えば、溶解度、半減期を増加させることができる及び／又は融合タンパク質の精製を容易にすることができるタンパク質をコード化してもよい。ベクターはまた、正確なタンパク質の折りたたみを容易にするために、１つ以上のシャペロンをコードする追加の発現可能なポリヌクレオチドを含有してもよい。ベクター修飾技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ著、（２００１）（上記引用文献）を参照されたい。一般的に、ベクターは、クローニング若しくは発現のための１つ以上の複製開始点（ｏｒｉ）並びに遺伝質系、宿主における選択、例えば抗生物質耐性のための１つ以上のマーカー、及び１つ以上の発現カセットを含有することができる。好適な複製開始点（ｏｒｉ）は、例えば、Ｃｏｌ  Ｅ１、ＳＶ４０ウイルス及びＭ１３複製開始点を含む。
【００７７】
ベクター中に挿入されたコーディング配列は、例えば、ストランド法によって合成され、又は天然源から単離されることができる。コーディング配列の転写制御要素への連結及び／又は他のアミノ酸コード化配列への連結は、確立された方法を使用して実行することができる。原核細胞又は真核細胞中の発現を確実にする転写制御要素（発現カセットの一部）は、当業者には周知である。これらの要素は、転写の開始を確実にする制御配列（例えば、翻訳開始コドン、自然に結合されている若しくは異種プロモーターなどのプロモーター及び／又はインシュレータ―）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ著、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（２００１）、１４７１−１４７６）及び任意選択で転写の開始並びに転写物の安定化を確実にするポリ−Ａシグナルを含む。追加の制御要素は、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーを含んでもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞又は真核細胞中の発現を可能にするこのような発現制御配列に作用的に結合される。ベクターは、さらなる制御要素として分泌シグナルをコード化するヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。このような配列は、当業者には周知である。さらに、使用される発現系に応じて、発現されたポリペプチドを細胞区画に向けることができるリーダー配列が、本発明のポリペプチドのコーディング配列に添加されてもよい。このようなリーダー配列は、当該技術分野において周知である。
【００７８】
さらに、ベクターは選択可能なマーカーを含むことが好ましい。選択可能なマーカーの例は、ネオマイシン、アンピシリン、及びヒグロマイシン、カナマイシン耐性等を含む。特別に設計されたベクターは、細菌−真菌細胞又は細菌−動物細胞などの異なる宿主間でＤＮＡのシャトリングを可能とする（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＧａｔｅｗａｙ（登録商標）システム）。
【００７９】
本発明による発現ベクターは、複製、及び本発明のポリヌクレオチド並びにコード化された酵素の発現を方向付けることができる。記載された制御要素を含む適切な発現ベクターは、当該技術分野において既知である。
【００８０】
上記の本明細書に記載された核酸分子は、細胞への直接導入用に又はリポソーム、ファージベクター若しくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入用に設計されてもよい。加えて、バキュロウイルス系又はワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ）若しくはセムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｖｉｒｕｓ）に基づく系が、本発明の核酸分子用の真核細胞発現系として使用することができる。
【００８１】
典型的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーター要素を含有し、このプロモーター要素は、ｍＲＮＡ、タンパク質コーディング配列、及び転写の終了並びに転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルの転写の開始を媒介する。さらに、複製開始点、薬剤耐性遺伝子、レギュレーター（誘導性プロモーターの一部として）などの要素もまた含まれてもよい。ｌａｃプロモーターは、原核細胞に有用な典型的な誘導性プロモーターであり、これはラクトース類似体のイソプロピルチオール−ｂ−Ｄ−ガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を使用して誘導することができる。組換え発現及び分泌については、関心のポリヌクレオチドを、ペリプラズム中で組換えタンパク質を方向付けるＰｅｌＢリーダーシグナルと、ｐＨＥＮ４と呼ばれるファージミド中の遺伝子ＩＩＩとの間で連結されてもよい（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら著、１９９７、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５２１−５２６に記載されている）。追加の要素は、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列及びＲＮＡスプライシングのためのドナー並びにアクセプター部位に隣接した介在配列を含んでもよい。高効率の転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、レトロウイルスからの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ、及びサイトメガロウイルスからの初期プロモーター（ＣＭＶ）で達成することができる。しかしながら、細胞要素もまた使用することができる（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。あるいは、組換えポリペプチドは、染色体中に組み込まれた遺伝子構築物を含有する安定な細胞系中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ヒグロマイシンなどの選択可能なマーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定及び単離を可能にする。トランスフェクトされた核酸もまた、増幅され、大量のコード化されたポリペプチドを発現することができる。上述したように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことが好ましいであろう。このようなマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核細胞培養のためのＧ４１８若しくはネオマイシン耐性、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）並びに他の細菌中の培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン若しくはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００８２】
本発明は、本発明の核酸分子又は本発明のベクターを含む単離された細胞にさらに関する。
【００８３】
適切な原核宿主細胞は、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌及びサルモネラ・チフィムリウム（ネズミチフス菌）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。適切な真核宿主細胞は、例えば、真菌細胞、とりわけ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、又はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２並びにスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞及び植物細胞並びに哺乳動物細胞である。
【００８４】
使用することができる哺乳動物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９並びにジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３並びにＣ１２７細胞、Ｃｏｓ  １、Ｃｏｓ７並びにＣＶ１、ｑｕａｉｌ  ＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【００８５】
より好ましい実施形態では、上記細胞は、一次細胞又は一次細胞系である。一次細胞は、生物体から直接得られる細胞である。適切な一次細胞は、例えば、マウス胎性線維芽細胞、マウス一次肝細胞、心筋細胞並びに神経細胞、同様にマウス筋肝細胞（衛星細胞）及びこれらから誘導された安定な不死化細胞である。また、マウス胎性線維芽細胞（ＭＥＦ）などの一次哺乳動物細胞も本発明の範囲内に入る。あるいは、組換え（ポリ）ペプチドは、染色体中に組み込まれた遺伝子構築物を含有する安定な細胞系中で発現され得る。
【００８６】
上記記載の宿主細胞のための適切な培養基及び条件は、当該技術分野において周知である。
【００８７】
１つ以上の宿主細胞は、本発明の１つ以上の核酸分子又は１つ以上のベクターを、それらの存在時に、上記核酸分子又はベクターによってコード化されるポリペプチドの発現を媒介する１つ以上の宿主細胞に導入することによって産生されてもよい。宿主細胞は、単離された宿主細胞であることが好ましく、これは細胞が生きた生物の状況中にはないことを意味する。宿主は、原核細胞であっても又は真核細胞であってもよい。適切な真核細胞宿主は、哺乳動物細胞、両生類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、真菌細胞又は植物細胞であってもよい。真核細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞などの昆虫細胞、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞などの真核細胞、又は脊椎動物細胞であってもよい。後者に関して、細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。細胞は、細胞系の一部であってもよい。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、本発明のいずれか１つのポリペプチド、又は本発明の融合タンパク質を産生する方法に関し、方法は、（ａ）本発明の単離された細胞を培養する工程と、（ｂ）産生されたポリペプチド又は融合タンパク質を単離する工程と、を含む。
【００８９】
原核細胞又は真核細胞を培養するための適切な条件は、当業者に周知である。例えば、細菌を培養するための適切な条件は、それらをＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中において空気導入下で増殖させることである。発現生成物の収率及び溶解度を増加させるために、培地は緩衝化され、又は増強又は促進することの両方が知られている適切な添加剤で補充されることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、４〜約３７℃で培養することができ、正確な温度又は温度のシーケンスは、過発現される分子に依存する。一般的に、当業者であれば、これらの条件が宿主のニーズ及び発現されるポリペプチドの必要条件に適合せねばならない場合があることも認識している。誘導可能なプロモーターが、宿主細胞中に存在するベクター中の本発明の核酸を制御する場合には、ポリペプチドの発現は、適当な誘発剤の添加によって誘導され得る。適切な発現プロトコル及び戦略は、当業者に既知である。
【００９０】
細胞型及びその特殊な要件に応じて、哺乳動物細胞の培養は、例えば、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ又はＤＭＥＭ培地中で行うことができる。細胞は５％のＣＯ２の含水飽和雰囲気中で３７℃にて保持することができる。昆虫細胞の培養に適切な培地は、例えば、ＴＮＭ＋１０％のＦＣＳ又はＳＦ９００培地である。昆虫細胞は、通常、接着培養又は浮遊培養として２７℃で増殖される。真核細胞のための適切な発現プロトコルは、当業者には周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ著、（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから検索することができる。
【００９１】
産生されたポリペプチドの単離の方法は、当該技術分野において周知であり、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ディスクゲル電気泳動又は免疫沈降法などの方法ステップを含み、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ著、（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００９２】
本発明は、本発明の請求項のいずれか１つの融合タンパク質を含む医薬及び／又は診断用組成物にさらに関する。
【００９３】
医薬組成物は、家畜動物及び愛玩動物などの哺乳動物に投与されることが好ましい。最も好ましくは、これはヒトに投与される。本明細書に記載される医薬組成物は、適切な用量で対象に投与されるであろう。
【００９４】
本発明により使用されるための医薬組成物は、１つ以上の生理学的担体又は賦形剤を使用して、当該技術分野において認められる方法に従う通常の方法で製剤化されることができ、例えば、Ａｎｓｅｌら著、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９を参照されたい。医薬組成物は、したがって、従来の薬学的に許容される賦形剤を任意選択で含む投与単位形態で、経口的に、非経口的に、例えば、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、くも膜腔内に、経皮的に、経粘膜的に、硬膜下に、イオン導入法を介して局部若しくは局所的に、舌下に、吸入スプレーにより、エアロゾルで又は直腸から等で投与されてもよい。また本発明の診断用組成物は、任意の従来の方法で製造されてもよい。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、単独の活性成分として又は例えばアジュヴァントなどと共に、あるいは、他の薬剤、例えば免疫抑制剤若しくは免疫調節剤又は他の抗炎症剤と組み合わせて投与されてもよい。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。「薬学的に許容される担体又は賦形剤」とは、非毒性の固体、半固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル封止材料又は任意のタイプの製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、Ａｎｓｅｌら著、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９に記載されている。
【００９７】
本発明の診断用組成物は、望ましくない生理学的状態又は疾患の検出で有用である。したがって、本発明の診断用組成物は、発症又は病態、特に疾患の状態を評価するために使用してもよい。本発明の診断用組成物は、この診断用組成物が、例えば、望ましくない生理学的状態又は疾患の部位を特定するために使用される場合、単独の活性作用物質として投与されることができ、又は他の作用物質と組み合わせて投与されることができる。
【００９８】
本発明は、本発明の融合タンパク質を含むキットに関し、この融合タンパク質は、診断学的に活性なタンパク質又はペプチドを含む。
【００９９】
キットの様々な構成要素は、１つ以上のバイアル瓶などの１つ以上の容器内に包装されてもよい。バイアル瓶は、構成要素に加えて、貯蔵のための防腐剤又は緩衝剤を含んでもよい。加えて、キットは使用説明書を具備してもよい。
【実施例】
【０１００】
本実施例は、本発明を例示する。
【０１０１】
実施例１：Ｆｙｎ  ＳＨ３誘導ポリペプチドはヒト血清アルブミンに結合する
方法
１）ヒト血清アルブミンタンパク質に対するライセートＥＬＩＳＡ
Ｓｃｈｌａｔｔｅｒらに記載されている（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒら著、（２０１２）、ｍＡｂｓ、４（４）、ｐ．４９７−５０））Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ファージライブラリーを使用して、ヒト血清アルブミンに特異的なＦｙｎ−ＳＨ３由来の結合タンパク質を、抗原としてヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３７８２）並びに齧歯動物種からの血清アルブミン（ラット血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ６４１４）を使用し、及び選択技術として標準ファージディスプレイを使用して単離した（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  Ｄ．ら著、（２００７）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２、ｐ．３１９６−３２０４、Ｖｉｔｉ，Ｆ．ら著、（２０００）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６、４８０−５０５）。
【０１０２】
未処置及び親和性成熟選択の後に、濃縮Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを、ライセートＥＬＩＳＡによって、ヒト血清アルブミン及び／又は齧歯動物種（マウス／ラット）からの血清アルブミンへの結合についてスクリーニングした。Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉらに記載されているように（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら著、（２００７）、ＪＢＣ、２８２、ｐ．３１９６−３２０４）、得られる構築物がＣ末端ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを運ぶように、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来結合タンパク質をコード化するＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＱＥ１２（Ｑｉａｇｅｎ）にクローンした。ポリペプチドを、９６ウェルフォーマットにおいて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の細胞質ゾル中で発現させて、基本的にＢｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒらに記載されている通りに（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら著、（２００７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０（２）：ｐ．５７−６８）、ウェル当たり２００μｌの透明なライセートを調製した。簡単に言うと、形質転換された細菌クローンを、寒天プレートから拾い上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含有する２００μｌの２ｘＹＴ培地中で、丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１６３３２０）において増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって、３７℃及び２００ｒ．ｐ．ｍ．にて３時間の増殖の後に、タンパク質発現が誘導された。回転振蕩器（２００ｒ．ｐ．ｍ．、３０℃）中でタンパク質を一晩発現させた。引き続いて、９６ウェルプレートを１８００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨てた。細菌ペレットを、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＶＷＲ、カタログ番号７０７５０−３）を含有する６５μｌのバグバスター（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ）中に再懸濁させて、ＲＴにて３０分間インキュベートした。次に、モノクローナル細菌ライセートを遠心分離（１８００ｇで１０分間）によって清澄化し、１７０μＬのＰＢＳで希釈し、マルチスクリーンフィルタプレート（０．４５μｍの孔径；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＳＨＶＮ４５１０）を使用して濾過した。モノクローナル細菌ライセートをＥＬＩＳＡに使用した：ヒト血清アルブミンを、マキシソープ（ｍａｘｉｓｏｒｐ）Ｆ９６ウェル（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３９４５４）上に室温で一晩固定化した。次いでプレートをＰＢＳ、４％（ｗ／ｖ）のミルク（Ｒａｐｉｌａｉｔ、Ｍｉｇｒｏｓ、Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）でブロックした。引き続いて、２０μｌのＰＢＳ、２５μｇ／ｍｌの抗−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を含有する１０％のミルク及び８０μｌの細菌ライセートを加えた（５μｇ／ｍｌの抗−ｍｙｃ抗体の最終濃度を得た）。１時間のインキュベーション及び洗浄後に、結合したＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを、抗マウス−ＨＲＰ抗体結合体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、５μｇ／ｍｌの最終濃度で検出した。ウェル当たり１００μＬのＢＭブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによってペルオキシダーゼ活性の検出を行い、５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって、反応を停止させた。特異的結合剤のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決���によって確認した。齧歯動物種からの血清アルブミンに対する交差反応性を、抗原としてのマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ３１３９）及び上記記載のプロトコルを使用して、モノクローナルライセートＥＬＩＳＡによって検出した。あるいは、マウス及びラット血清アルブミンに対する交差反応性を、表面プラズモン共鳴実験によって確認した（以下を参照）。
【０１０３】
２）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドの発現及び精製
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来アルブミン結合ポリペプチドを、ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の細胞質ゾル中で発現させ、並びにＧｒａｂｕｌｏｖｓｋｉらに記載されている通りに（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら著、（２００７）、ＪＢＣ、２８２、ｐ．３１９６−３２０４）精製した。
【０１０４】
３）親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、親和性測定を行った。マウス、ラット若しくはヒトに由来する血清アルブミン、及びＦｙｎ  ＳＨ３由来アルブミン結合ポリペプチドの間の相互作用分析については、シリーズＳ  ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して固定化されたアルブミンタンパク質と共に使用した。異なる種（マウス、ラット又はヒト）からの血清アルブミンタンパク質を、チップの異なるフローセル上に固定化し（２０００〜３０００ＲＵ）、一方ブランクを固定化したフローセルは、参照フローセルとして働いた。泳動緩衝液は、ｐＨ７．４で０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳであった。相互作用を３０μｌ／分のフロー及び２５℃にて測定し、異なる濃度のＦｙｎ  ＳＨ３由来アルブミン結合ポリペプチドを注入した。相互作用の全ての動力学データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して評価した。
【０１０５】
結果
１）ＥＬＩＳＡ陽性のヒト血清アルブミンに結合するＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列表に添付されているように配列番号４〜４０で提示する。加えて、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来のポリペプチド（配列番号４〜３２）はまた、ライセートＥＬＩＳＡ及び／又はＢｉａｃｏｒｅ親和性測定によって確認されたように、マウス血清アルブミンへの結合も示した。
【０１０６】
２）振蕩フラスコ中の非最適化条件下での細菌培養から得た２つの選択された、本発明のＦｙｎ  ＳＨ３由来のアルブミン結合ポリペプチドの発現収量を表１に示す。収量は、ＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３ポリペプチドの発現収量と同様な範囲であった。高いタンパク質純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認し、そのゲルを図１に示す。
【０１０７】
【表１】
2016508143.tif 000003
【０１０８】
３）結合特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  チップ上でリアルタイム相互作用分析によって分析し、以下の選択されたアルブミン結合ポリペプチドのラット（ＲＳＡ）、マウス（ＭＳＡ）又はヒト（ＨＳＡ）のいずれかに由来するアルブミンに対する解離定数（ＫＤ）を明らかにした（表２中に示した）。
【０１０９】
【表２】
2016508143.tif 000004
【０１１０】
実施例２：アルブミンに結合するＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは、マウスにおいて延長した血清半減期を有する
方法
アルブミンに結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの薬物動態プロファイルをＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において検討し、ＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３分子と比較した。Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１（配列番号４）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈ（配列番号５）及びＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３（配列番号３）を、ヨウ素−１２５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＮＥＺ０３３Ａ００１ＭＣ）及びクロラミンＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号３１２２４）を使用して放射標識した。標識反応を室温で２分間行い、その後、ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９１８０−０７）を使用して標識試薬を除去した。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１３．５μｇの放射標識化Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１（配列番号４）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈ（配列番号５）又はＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３（配列番号３）のいずれかを静脈注射した。１０分後、２．５、４、６、９、２５、３５時間後に、血液をＥＤＴＡ被覆マイクロベット（ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に採取し、９３００ｇで１０分間遠心分離した。放射活性を、Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒシンチレーション流体との混合及び１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘシンチレーションカウンターで各試料のβ放射の定量化によって計数し、血清レベルを計算した（結果は、血液の注射された用量（ＩＤ）／ｍｌの％として表された）。異なる時点において血清中で決定されたＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈ及びＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３の血清レベル及び得られた排出相の勾配ｋ（片対数目盛でプロットされた）から、式ｔ１／２＝Ｉｎ２／−ｋを使用して半減期を計算した。
【０１１１】
結果
表３に示すように、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１（配列番号４）及びＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈ（配列番号５）は、ＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３（配列番号３）と比べると、著しく良好な終末相半減期を示した。半減期計算に使用された時間点は、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１及びＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈが２．５〜３５時間であり、ＷＴ  Ｆｙｎ−ＳＨ３が２．５〜２５時間であった。
【０１１２】
【表３】
2016508143.tif 000005
【０１１３】
実施例３：アルブミンに結合するＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは、ＢＩＴＥ（登録商標）分子の血清半減期を延長することができる
方法：
１）アルブミンに結合するＦｙｎ−ＳＨ３融合タンパク質の発現及び精製
Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）１７Ｈ（配列番号５）を、１５個のアミノ酸のリンカー（リンカー配列番号５２）を介して、ＢＩＴＥ（登録商標５３）に特異的なＣＤ３−ＰＳＭＡに遺伝子的に融合して、三重特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗アルブミン／ＰＳＭＡ／ＣＤタンパク質ＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）を産生した。ＢＩＴＥ（登録商標）タンパク質（配列番号５３）及びＣ末端ペンタ−ｈｉｓ−タグを運ぶ本発明の融合タンパク質ＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ細胞に一時的にトランスフェクトし、血清フリー／動物成分フリーの培地中で６日間発現させた。ＡＫＴＡ浄化装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたタンパク質Ｌ親和性クロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９９２８）によって、上澄み液からタンパク質を精製した。２８０ｎｍにおける吸光度測定によって濃度を決定した。収量を表４に示す。両タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥを図２に示す。
【０１１４】
精製後にサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００、３０／１００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＯＶＡ４０６で行った（図３参照）。
【０１１５】
２）本発明のＢＩＴＥ（登録商標）融合タンパク質を用いるＦＡＣＳ結合実験
ポリペプチドＣＯＶＡ４０６（配列番号５４、最終濃度３００ｎＭ）を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジドナトリウム中で、（ｉ）１×１０５個のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｅ６−１細胞（ＣＤ３陽性細胞）、（ｉｉ）１×１０５個の２２Ｒｖ１前立腺癌細胞（ＰＳＭＡ陽性細胞）又は（ｉｉｉ）１×１０５個のＬＳ１７４Ｔ結腸直腸腺癌細胞（ＰＳＭＡ及びＣＤ３陰性、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＬ−１８８）のいずれかを含有する細胞懸濁液１００μｌと混合した。陰性対照として、ＣＯＶＡ４０６の代わりに同じ細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジドナトリウム中でインキュベートした（ＰＢＳ対照）。氷上で６０分のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌのマウス抗テトラ−ＨＩＳ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３４６７０）とのインキュベーションによって、続いて、１０μｇ／ｍＬの濃度においての抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８結合体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのインキュベーションによって、結合したタンパク質を検出した。最終的に、細胞を３回洗浄し、次いで染色した細胞を、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメーターで分析した。
【０１１６】
３）再指向（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞媒介性細胞傷害分析
ポリペプチドＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）を、Ｄｒｅｉｅｒら著、（２００２）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００、６９０−６９７から採用したプロトコルを使用して、再指向Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。実験前日に、標準的手法を使用するＦｉｃｏｌｌ  Ｐｌａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び密度勾配遠心分離によって、新鮮なバッフィーコート調製物からＰＢＭＣを単離した。次いで、単離したＰＢＭＣを、１０％のＦＣＳ、ＲＰＭＩ中、４×１０６個細胞／ｍｌの細胞濃度で、３７℃、５％のＣＯ２にて一晩インキュベートした。細胞致死実験については、ＰＢＭＣを遠心分離し、１０％のＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に、２．５×１０７個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞を、１０μＭのカルセインＡＭの最終濃度で３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベートすることによって、標的細胞をカルセインＡＭで標識付けした。続いて、細胞を薬１５ｍＬの培地で洗浄することによって、過剰の染料を除去した。最後に、標的細胞の数を１×１０６個細胞／ｍｌに調整した。標的腫瘍細胞は、２２Ｒｖ１細胞（ＰＳＭＡ陽性、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２５０５）又はＨＴ２９直腸癌細胞（ＰＳＭＡ陰性、ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ−２９９）のいずれかであった。エフェクター分子を、１０％のＦＣＳ、ＲＰＭＩで希釈し、１２００ｎｇ／ｍＬの最大濃度とした。１／１０希釈の希釈系列を調製した。最後に、標的細胞懸濁液、エフェクター細胞及び異なる濃度のポリペプチドＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）を次いで等量で混合した。合計で５００００個の標的細胞を、ウェル毎に添加し、エフェクターの標的細胞に対する比は２５／１であった。エフェクター分子の最終の最大濃度は、４００ｎｇ／μｌであった。細胞溶解を、３７℃及び５％のＣＯ２における５時間のインキュベーション後に測定した。インキュベーション後に、細胞懸濁液を遠心分離し、蛍光読み取り機を使用しての細胞懸濁液中のカルセインＡＭの蛍光の検出によって細胞溶解を定量化した。再指向細胞溶解の量を最大溶解対照（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加によって溶解した細胞）及び自然溶解（エフェクター分子の不在下でＰＭＢＣとインキュベートされた標的細胞）に正規化した。細胞溶解の百分率を以下の式に従って計算した：
溶解の％＝（（（試料の蛍光）−（自然溶解対照の蛍光））／（（最大溶解対照の蛍光）−（自然溶解対照の蛍光）））×１００
【０１１７】
全ての測定は、三通りで行った。特異的な細胞溶解をＣＯＶＡ４０６の濃度に対してプロットし、Ｓ字状用量反応曲線に当てはめることによってＰｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して評価した。
【０１１８】
４）ＣＯＶＡ４０６及びＢＩＴＥ（登録商標）分子の薬物動態プロファイルの比較
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）中のＣＯＶＡ４０６の薬物動態プロファイルを検討し、親ＢＩＴＥ（登録商標）分子と比較した。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、それぞれ４８μｇのＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）又はＢＩＴＥ（登録商標）（配列番号５３）を静脈内注射した。１０分及び３０分、１、３、５、７、９、１２、２４、２８、３３及び４８時間後に、血液をＥＤＴＡ被覆マイクロベット（ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に採取し、９３００ｇで１０分間遠心分離し、ＣＯＶＡ４０６又はＢＩＴＥ（登録商標）の血清レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。簡単に言うと、ブラックマキシソープ（ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、１０μｇ／ｍｌのＣＤ３に由来するペプチド（配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ；配列番号５５）（Ｆｃ−融合と表わされる）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中４％のミルク（Ｒａｐｉｌａｉｔ、Ｍｉｇｒｏｓ、Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）でブロックした後に、血清試料を適切な希釈で加え、２％のマウス血清（Ｓｉｇｍａ）及び４％のミルクの最終緩衝液濃度を得た。１時間のインキュベーション後に、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合したＣＯＶＡ４０６又はＢＩＴＥ（登録商標）を、ペンタ−Ｈｉｓ−ビオチン（Ｑｉａｇｅｎ）続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａ）で検出した。このアッセイは、ＱｕａｎｔａＲｅｄ蛍光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で展開した。反応を３分のインキュベーション後に停止させ、蛍光強度を５４４ｎｍ（励起）及び５９０ｎｍ（放射）で測定した。ＣＯＶＡ４０６及びＢＩＴＥ（登録商標）の血清レベルを、ＣＯＶＡ４０６及びＢＩＴＥ（登録商標）（それぞれ３３３−０．５ｎｇ／ｍｌで希釈）の標準曲線を使用して決定した。異なる時点において血清中で決定されたＣＯＶＡ４０６及びＢＩＴＥ（登録商標）の濃度及び得られた排出相の勾配ｋ（片対数目盛でプロットされた）から、式ｔ１／２＝Ｉｎ２／−ｋを使用して半減期を計算した。半減期の計算で使用された時間点は、ＣＯＶＡ４０６は１〜４８時間であり、ＢＩＴＥ（登録商標）は１〜１２時間であった。
【０１１９】
結果
ＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）は、ＢＩＴＥ（登録商標）分子（配列番号５３）と同様な収量で発現した（表４）。
【０１２０】
【表４】
2016508143.tif 000006
【０１２１】
精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルは、ＣＯＶＡ４０６が、単一のモノマーピークとして溶出し、これはこの融合タンパク質が優れた生物物理学的特性を示すことを立証した（図３）。ＰＳＭＡ陽性細胞（２２Ｒｖ１細胞）及びＣＤ３陽性細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｅ６−１、ＣＤ３陽性）への特異的な結合は、ＦＡＣＳ実験で検証された。染色法の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を図４に示す。再指向Ｔ細胞媒介性細胞傷害は、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いるカルセイン放出アッセイで検証された。ＣＯＶＡ４０６によるＰＳＭＡ陽性細胞の特異的再指向細胞溶解（ＥＣ５０＝４．３５ｎｇ／ｍｌ）を図５に示す。ＰＳＭＡ発現がない細胞（ＨＴ２９細胞）は、同一の条件下で溶解されず、これはＣＯＶＡ４０６がＰＳＭＡ陽性細胞を特異的に殺傷することができることを示している。ＢＩＴＥ（登録商標）タンパク質（配列番号５３）に比べてのＣＯＶＡ４０６（配列番号５４）の改善された薬物動態プロファイルは、マウスで観察された。図６は、ＣＯＶＡ４０６並びに親ＢＩＴＥ（登録商標）の血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）並びに終端の排出相を示している。ＣＯＶＡ４０６は、ＢＩＴＥ（登録商標）（１．５時間）と比べて著しく良好な半減期（１４．３時間）を示している。この実施例は、本発明の血清アルブミン結合タンパク質が、他の短寿命の分子、特にＢＩＴＥ（登録商標）分子のインビボ半減期を延長させることができることを示している。
【０１２２】
実施例４：血清アルブミンに結合する先行技術のＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）
材料及び方法については、欧州特許出願公開第２０５４４３２号明細書及び「Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ、Ｄｒａｇａｎ、Ｔｈｅ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆｙｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥＴＨ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  Ｎｒ  １７２１６（２００７年５月）．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３９２９／ｅｔｈｚ−ａ−００５４０７８９７」を参照されたい。
【０１２３】
図７は、親和性選択後に単離されたＦｙｎ  ＳＨ３変異体の特異性ＥＬＩＳＡを示している。Ｃ３を除いて、いずれのＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）もＨＳＡ又はＨＳＡ／齧歯類血清アルブミンには結合しない。しかしながら、Ｃ３は、無関係のオボアルブミン（ニワトリ卵白アルブミン）とも交差反応する。したがってＣ３は、非特異的結合タンパク質と考えられる。
【図１】
2016508143.tif 000007
【図２】
2016508143.tif 000008
【図３】
2016508143.tif 000009
【図４】
2016508143.tif 000010
【図５】
2016508143.tif 000011
【図６】
2016508143.tif 000012
【図７】
2016508143.tif 000013
【図８−１】
2016508143.tif 000014
【図８−２】
2016508143.tif 000015
【配列表】
2016508143000001.app
【国際調査報告】
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2016508143.tif 000018