(57)【要約】  １３種の異なる多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物に関する。各接合体は、運搬体タンパク質に接合された異なる血清型の肺炎連鎖球菌、すなわち、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型と、血清型２２Ｆまたは３３Ｆとから製造された莢膜多糖類を含む。アルミニウム系アジュバントを含むワクチンに製剤化された免疫原性組成物は、乳児及び小児において、肺炎球菌疾患に対する適用範囲を拡大させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的に許容される溶媒と共に１３種の異なる多糖類−タンパク質接合体を含み、それぞれの接合体が、運搬体タンパク質に接合された異なる血清型の肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖類を含み、前記莢膜多糖類が、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型と、血清型２２Ｆまたは３３Ｆとから製造される多価免疫原性組成物。
【請求項２】
前記運搬体タンパク質が、ＣＲＭ１９７であることを特徴とする、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項３】
さらにアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントが、アルミニウム系アジュバントであることを特徴とする、請求項３に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウムであることを特徴とする、請求項５に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多価免疫原性組成物を免疫学的有効量含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物。
【請求項８】
前記多価免疫原性組成物が、２μｇの各多糖類、ただし、血清型６Ｂの場合は４μｇ；約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；並びに賦形剤として、塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウム緩衝液を含むように製剤化された０．５ｍＬの単一用量であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１３種の肺炎球菌血清型（すなわち、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型、及び血清型２２Ｆまたは３３Ｆ）に由来する莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を、ＣＲＭ１９７などの運搬体タンパク質に接合して製造された多価免疫原性組成物に関する。本発明に係る接合体組成物は、医学分野、特に、微生物学、免疫学、ワクチンに関し、免疫接種により、乳児、小児、及び成人の肺炎球菌による疾患の予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、肺炎の主な原因菌である。統計庁「２０１０年主要死亡原因別死亡率推移」によれば、２０１０年、肺炎による死亡率は、１０万人当たり１４．９人であり、１０大死亡原因の一つであり、２０００年対比で、８２．９％上昇したとのことである。また、２０１２年、ＷＨＯによれば、２００８年度に、全世界的にＨＩＶ陰性である５歳以下の子供４７６，０００人が肺炎連鎖球菌による感染で死亡し、５歳以下の子供の全体死亡者のうち５％が、この菌による疾患で死亡した。
【０００３】
肺炎球菌による疾患を予防するために、１９７７年、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｕｓｔｒｉａｎによって、１４価多糖類ワクチンが開発され、その後、２３価多糖類ワクチンに発展した。多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、老人及びハイリスク患者において、肺炎球菌疾患の予防において有用であると立証された。しかし、乳児及び小児は、ほとんどの肺炎球菌多糖類に対して免疫反応が良好に起こらないが、これは、Ｔ−ｃｅｌｌ非依存的免疫反応現象のためである。７価肺炎球菌接合体ワクチン（プレベナー（Ｐｒｅｖｅｎａｒ）（登録商標））は、最も発生頻度が高い７種の血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖類を含む。２０００年、米国で最初に承認されて以来、乳児及び小児における浸襲性疾患及び中耳炎に対して、免疫原性が高くて効果的であると立証された。このワクチンは、現在全世界約８０ヵ国余りで承認されている。プレベナーは、米国、ヨーロッパ及び全世界の他の地域において、浸襲性肺炎球菌疾患の８０〜９０％、６０〜８０％、及び４０〜８０％にそれぞれ適用されている。プレベナーの導入以後、数年間蓄積されたサーベイランスデータでは、予想されたように、米国において、プレベナーに含まれる血清型による浸襲性肺炎球菌疾患が明確に減少した。しかし、一部地域では、血清型の適用範囲に限界があり、プレベナーに含まれていない血清型、特に、１９Ａによる浸襲性肺炎球菌疾患は増加した。
【０００４】
２０１０年２月、ＡＣＩＰ（Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）は、新たに許可された１３価肺炎球菌接合ワクチン（ＰＣＶ−１３）の使用勧告を発表した。ＰＣＶ−１３は、プレベナーに含まれる７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ）以外に、６種の追加血清型（１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ）を含有する肺炎球菌接合体ワクチンである。米国・ＡＢＣｓ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｒｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）の調査によれば、５歳以下の子供の病原血清型と知られたＩＰＤ症例のうち、全６４％がＰＣＶ１３に含まれており、２００７年の場合、５歳以下の子供において発病した４，６００のＩＰＤ症例のうち、ＰＣＶ７による適用が７０症例であるのに比べ、ＰＣＶ１３による適用は２，９００症例と過半数以上を占めている。また、血清型交替に伴って発生数が増加している他の血清型を適用範囲に入れた１５価肺炎球菌接合体ワクチンも、開発中である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、免疫接種において、乳児、小児、及び成人の肺炎球菌による疾患の予防に有用な多価免疫原性組成物であって、血清型２２Ｆまたは３３Ｆを含んだ１３種の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖類を含む多価免疫原性組成物を提供する。
【０００６】
すなわち、本発明は、血清型２２Ｆまたは３３Ｆと共に、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆのうち１２種の血清型を含む１３価肺炎球菌接合体（ＰＣＶ−１３）組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある様態によれば、生理学的に許容される溶媒と共に、１３種の異なる多糖類−タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、それぞれの接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型の肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖類を含み、前記莢膜多糖類が、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型と、血清型２２Ｆまたは３３Ｆとから製造される多価免疫原性組成物が提供される。
【０００８】
本発明に係る多価免疫原性組成物において、前記運搬体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であってもよい。本発明に係る多価免疫原性組成物は、さらにアジュバントを含んでいてもよく、例えば、アジュバントが、アルミニウム系アジュバントを含んでいてもよい。前記アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群から選択され、望ましくは、リン酸アルミニウムである。
【０００９】
本発明の他の様態によれば、前記免疫原性組成物を免疫学的有効量含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物が提供される。
【００１０】
ある実施形態では、前記薬学組成物は、２μｇの各多糖類、ただし、６Ｂの場合は４μｇ；約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；並びに賦形剤として、塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウムの緩衝液を含むように製剤化された免疫原性組成物であってもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る多価免疫原性組成物は、血清型２２Ｆまたは３３Ｆを含んだ１３種の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖類を含むことにより、高い血清ＩｇＧ力価と機能的抗体活性とを誘導することができる。従って、本発明に係る多価免疫原性組成物は、乳児、小児、及び成人の肺炎球菌による疾患の予防に有用に使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
抗生物質耐性及び多剤耐性を示す一部の血清型によって、血清型交替（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が示された。また、血清型分布の地域差によって、プレベナー（Ｐｒｅｖｅｎａｒ）（登録商標）の適用範囲が、地域によって異なるという限界が提起された（Ｈａｒｂｏｅ  ＺＢ，Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  ＴＬ，Ｖａｌｅｎｔｉｎｅｒ−Ｂｒａｎｔｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｖｅｒ  ７  Ｄｅｃａｄｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１０；５０：３２９−３７）。従って、既存の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）接合体ワクチンから、いかなる血清型も除去する理由がなく、むしろ血清型を追加し、適用範囲をさらに広げなければならないという必要性がある。
【００１３】
Ｌａｕｒｉ  Ａ．  Ｈｉｃｋｓらが、１９９８年から２００４年までの米国内ＩＰＤデータを収集して発表した論文によれば、プレベナーに含まれる血清型によるＩＰＤは減少した一方、５歳以下の子供の集団において、血清型３、１５、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆによる疾患の発生頻度は高くなったとのことである（Ｌａｕｒｉ  Ａ．Ｈｉｃｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄｕｅ  ｔｏ  Ｎｏｎ−Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＣＶ７）Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｒａ  ｏｆ  Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ＰＣＶ７  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，１９９８−２００４．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００７；１９６：１３４６−５４）。また、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｊａｃｏｂｓらは、プレベナー接種後、米国・オハイオ州・クリーブランドにおいて、血清型１９Ａ、６Ｃ、２２Ｆ及び１５の発生頻度が上昇したと報告した（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  １９Ａ，６Ｃ，ａｎｄ  ２２Ｆ  ａｎｄ  Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  １５  ｉｎ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ｉｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９８−２００４．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００８；４７：１３８８−９５）。米国・ＣＤＣにおいて、５歳以下の幼児でＩＰＤを起こす肺炎球菌血清型を調査して発表したデータでも、１９９８年〜１９９９年、及び２００８年の血清型分布を比較したとき、血清型２２Ｆと３３Ｆとの増加が明らかであった。従って、血清型２２Ｆまたは３３Ｆを含めれば、肺炎球菌疾患の数が減少するだけではなく、今後ＰＣＶ−１３接種により起こり得る血清型交替現象にも備えることができるであろう。
【００１４】
本発明は、プレベナー１３価ワクチンに含まれる血清型のうち１つの血清型を、血清型２２Ｆまたは３３Ｆで交替させた１３種の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖類を含む多価免疫原性組成物を提供する。すなわち、本発明は、生理学的に許容される溶媒と共に、１３種の異なる多糖類−タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であり、それぞれの接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型の肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含み、前記莢膜多糖類が、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型と、血清型２２Ｆまたは３３Ｆとから製造される多価免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
莢膜多糖類は、当業者に公知の標準技術によって製造される。莢膜多糖類は、粘度を低下させるため、または活性化された莢膜多糖類の溶解度を上昇させるために、大きさを小さくする。本発明において、莢膜多糖類は、肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型と、血清型２２Ｆまたは３３Ｆとから製造される。この肺炎球菌接合体は、別個の過程によって製造され、単一投与剤形に製剤化される。例えば、各血清型の肺炎球菌を大豆ベースの培地で増殖させ、次に、個々の多糖類を遠心分離、沈澱、限外濾過を介して精製する。
【００１６】
運搬体タンパク質は、望ましくは、無毒性であって非反応源性であり、十分な量及び純度で得ることができるタンパク質である。前記運搬体タンパク質は、標準接合方法に適していなければならない。本発明に係る多価免疫原性組成物において、前記運搬体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であってもよい。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸及び酵母抽出物ベースの培地で増殖させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）菌株Ｃ７（β１９７）の培養物から分離されたジフテリア毒素の無毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈澱及びイオン交換クロマトグラフィを介して精製される。あるいは、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号明細書にしたがって、組み換え式によって製造される。
【００１７】
他のジフテリアトキソイドもまた、運搬体タンパク質として使用される。他の適切な運搬体タンパク質には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（国際公開第２００４／０８３２５１号）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌ＳＴ、及ビ緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどの不活性化された細菌毒素が含まれる。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ）タンパク質（ＰｓａＡ）、グループＡまたはグループＢの連鎖球菌由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄも使用される。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質もまた、運搬体タンパク質として使用される。ＣＲＭ１７３、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５などのジフテリア毒素の変異体も、運搬体タンパク質として使用することができる。
【００１８】
運搬体タンパク質と反応する糖類を製造するために、精製された多糖類を化学的に活性化させる。活性化後、各莢膜多糖類を運搬体タンパク質に別個に接合させ、糖接合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成する。ある実施形態では、各莢膜多糖類を、同一の運搬体タンパク質に接合させる。多糖類の化学的活性化、及びそれに続く運搬体タンパク質への接合は、公知の方法によって行われる（米国特許第４，６７３，５７４号明細書、同第４，９０２，５０６号明細書など）。過ヨード酸塩（過ヨード酸ナトリウム、過ヨード酸カリウムまたは過ヨード酸を含む）などの酸化剤で、莢膜多糖類の末端ヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化させる。化学的活性化反応は、不規則な互いに隣接したヒドロキシル基の酸化的分解を起こす。接合は、還元的アミノ化によって達成される。例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と共に活性化された莢膜多糖類と、運搬体タンパク質とを反応させる。未反応のアルデヒド基は、強力な酸化剤を添加して除去することができる。
【００１９】
得られた多糖類−タンパク質接合体は、種々の方法によって精製することができる（すなわち、多糖類−タンパク質接合体を濃縮することができる）。それら方法の例は、濃縮／透析濾過工程、カラムクロマトグラフィ及び多層濾過を含む。精製された多糖類−タンパク質接合体は、それぞれを混合し、本発明の免疫原性組成物に製剤化し、それをワクチンとして使用することができる。当技術分野で認められた方法を使用して、本発明の免疫原性組成物の製剤化を行うことができる。例えば、１３種の個々の肺炎球菌接合体を、生理学的に許容される溶媒と共に剤形化し、組成物を製造することができる。このような溶媒の例としては、水、緩衝食塩水、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びデキストロース溶液が含まれるが、これらに制限されるものではない。
【００２０】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１または複数のアジュバントを含む。本明細書で定義される「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増大させるために使用される物質である。従って、アジュバントは、多くの場合、免疫反応をブーストするために提供され、当業者に周知である。組成物の有効性の増大に適したアジュバントは、以下を含むが、これらに制限されるものではない。
【００２１】
（１）アルミニウム塩（明礬）（例：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；
【００２２】
（２）水中油型エマルジョン剤形（ムラミルペプチド（以下で定義される）、または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤を含むもの、または含まないもの）、例えば（ａ）ＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）：５％スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．５％スパン（Ｓｐａｎ）８５を含み（任意に種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（必要ではないが、以下を参照）を含む）、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）［Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ］などのマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロン粒子に剤形化される、（ｂ）ＳＡＦ：１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−ブロック重合体Ｌ１２１及びｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照）を含み、サブミクロンエマルジョンに微細流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）されるか、あるいは渦動させ、大きい粒子サイズのエマルジョンを形成させる、及び（ｃ）Ｒｉｂｉ（登録商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）［Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ］：２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、及び米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記述された３−Ｏ−脱アシル化されたモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））［Ｃｏｒｉｘａ］、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１または複数の細菌細胞壁成分、望ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（デトックス（Ｄｅｔｏｘ）（登録商標））を含む；
【００２３】
（３）クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）またはスティミュロン（ＳＴＩＭＵＬＯＮ）（登録商標）ＱＳ−２１［Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ］（米国特許第５，０５７，５４０号明細書）などのサポニンアジュバントが使用されるか、あるいはそこから生成された粒子（例：ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；
【００２４】
（４）細菌脂質多糖類、合成リピドＡ同族体（例：アミノアルキルグルコースアミンホスフェート化合物（ＡＧＰ））、あるいはその誘導体または同族体［Ｃｏｒｉｘａから購入可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号明細書に記述されている；ＡＧＰの一例は、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、それはまた５２９としても知られており（以前には、ＲＣ５２９として知られていた）、それは、水性型または安定したエマルジョンとして剤形化される］；
【００２５】
（５）合成ポリヌクレオチド（例：ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号明細書））；
【００２６】
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例：ガンマインターフェロン）、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、大食細胞コロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、同時刺激分子Ｂ７−１及びＢ７−２など；
【００２７】
（７）野生型コレラ毒素（ＣＴ）、または、例えば、国際公開第００／１８４３４号による、アミノ酸２９番位置にあるグルタミン酸が、他のアミノ酸、望ましくは、ヒスチジンで置換された、突然変異型コレラ毒素（国際公開第０２／０９８３６８号及び国際公開第０２／０９８３６９号）、百日咳毒素（ＰＴ）または大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（国際公開第９３／１３３０２号及び国際公開第９２／１９２６５号）などの細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化された突然変異体；及び
【００２８】
（８）補体成分Ｃ３ｄの三量体などの補体成分。
【００２９】
ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれるが、これらに制限されるものではない。
【００３０】
ある実施形態では、アルミニウム塩がアジュバントとして使用される。アルミニウム塩アジュバントは、アルミニウム沈殿ワクチン（ａｌｕｍ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）やアルミニウム吸着ワクチン（ａｌｕｍ−ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）であってもよい。アルミニウム塩には、水和されたアルミナ、アルミナ水和物、アルミナ３水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム３水和物、アルハイドロゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｊｅｌ、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩（ＡＰＡ（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ））、無定形アルミナなどが含まれるが、これらに制限されるものではない。ＡＰＡは、アルミニウムヒドロキシホスフェートの懸濁液である。塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の比率で混合すれば、アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩が沈殿される。Ｈｉｇｈ  ｓｈｅａｒ  ｍｉｘｅｒを利用して、沈殿物の大きさが２〜８μｍになるようにした後、生理食塩水で透析して滅菌して製造する。ある実施形態では、商業的に利用可能なＡｌ（ＯＨ）３（例えば、アルハイドロゲルまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用して、タンパク質を吸着させる。水酸化アルミニウム１ｍｇ当たり５０〜２００ｇのタンパク質が吸着され、この比率は、タンパク質のｐＩと溶媒のｐＨとに依存的である。低いｐＩのタンパク質は、高いｐＩを有するタンパク質に比べ、強く結合する。アルミニウム塩は、２〜３週間徐々に抗原を放出する抗原徐放性製剤を形成し、非特異的に貪食細胞、補体、先天性免疫メカニズムを活性化させる。
【００３１】
本発明は、前記免疫原性組成物を免疫学的有効量含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物（例えば、ワクチン製剤）を提供する。
【００３２】
本発明に係るワクチン製剤は、全身または粘膜経路で投与することにより、肺炎球菌に感染されやすい人を保護または治療するために使用される。本明細書で定義される「有効量」とは、肺炎連鎖球菌に感染される確率または感染の深刻性をかなり低下させることができるほどの抗体を誘発するために必要な投与量をいう。投与には、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介した注射；または口腔／消化管、気道管または泌尿生殖管への粘膜投与が含まれる。ある実施形態では、肺炎または中耳炎の治療のために、鼻内投与が使用され、それは、肺炎球菌の鼻咽頭保菌をさらに効果的に予防し、初期段階での感染を弱化させることができるからである。各ワクチン用量において、前記接合体の量は、顕著な副作用なしに、免疫保護反応を誘導する量が選択される。この量は、肺炎球菌の血清型によって異なる。一般的に、各用量は、０．１〜１００μｇ、望ましくは、０．１〜１０μｇ、さらに望ましくは、１〜５μｇの多糖類を含む。特定ワクチンに対する成分の最適量は、被験者において適切な免疫反応の観察を含む標準研究によって確認される。例えば、動物実験結果を外挿し、人を対象にしたワクチン接種用量を決定することができる。また、経験的に用量を決定することができる。
【００３３】
本発明のある実施形態では、本発明のワクチン組成物は、それぞれＣＲＭ１９７に接合された血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２種の血清型と、血清型２２Ｆまたは３３Ｆとの肺炎球菌莢膜多糖類の滅菌液体剤形である。それぞれ０．５ｍＬ用量に、２μｇの各多糖類、ただし、６Ｂの場合は４μｇ；約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント；並びに賦形剤として、塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウムの緩衝液が含有されるように製剤化される。前記液体は、保存剤なしに、単一用量注射器内に充填される。振盪すれば、直ちに筋肉内投与が可能である均質の白色懸濁液のワクチンになる。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、本発明の組成物は、単回接種で投与される。例えば、本発明のワクチン組成物は、適切な間隔で、２回、３回、４回またはそれ以上投与され、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月または６ヵ月の間隔、あるいはこれらのいかなる組み合わせによっても投与される。免疫接種計画は、プレベナーについて明示されているところによる。例えば、肺炎連鎖球菌によって発生する浸襲性疾患に対して、乳幼児を対象にした定期接種計画は、生後２ヵ月、４ヵ月、６ヵ月、及び１２ヵ月〜１５ヵ月である。従って、本様態において、組成物を生後２ヵ月、４ヵ月、６ヵ月、及び１２ヵ月〜１５ヵ月に４回接種する。
【００３５】
本発明の組成物は、また、肺炎連鎖球菌由来の１または複数のタンパク質を含んでいてもよい。含めるのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０５３７６１号に記述されたタンパク質だけではなく、国際公開第０２／０８３８５５号で同定されたタンパク質も含まれる。
【００３６】
本発明の組成物は、当業者に公知の１または複数の投与経路、非経口、経皮または粘膜、鼻内、筋肉内、腹腔内、皮内、静脈または皮下経路などで被験者に投与され、それによって製剤化することができる。ある実施形態では、本発明の組成物は、液状製剤であって、筋肉内、腹腔内、表皮、静脈、動脈または皮下経路を介した注射；または呼吸器粘膜注射で投与することができる。注射用液状製剤は、溶液などを含む。
【００３７】
本発明の組成物は、単回投与用量バイアル、多回投与用量バイアル、または充填済みシリンジの形態に製剤化することができる。液状製剤に使用される、薬剤学的に許容される運搬体には、水性または非水性の溶媒、懸濁液、エマルジョン、オイルがある。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オレイン酸エチルがある。水性運搬体は、水、アルコール／水性溶媒、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水、バッファ溶液を含む。オイルの例としては、植物性または動物性のオイル、ピーナッツオイル、大豆油、オリーブオイル、ひまわりオイル、肝油、水産油脂（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌ）などの合成オイル、牛乳や卵から得た脂質がある。薬剤学的組成物は、等張性、高張性または低張性であってもよい。しかし、注入剤（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）や注射で投与される薬剤学的組成物は、基本的に等張性が望ましい。従って、等張性や高張性が組成物の保存に有利である。薬剤学的組成物が高張性である場合、投与前に、等張性になるように希釈する。等張化剤は、塩などのイオン性等張化剤であるか、あるいは炭水化物などの非イオン性等張化剤であってもよい。イオン性等張化剤には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどが含まれるが、これらに制限されるものではない。非イオン性等張化剤には、ソルビトール、グリセロールなどが含まれるが、これらに制限されるものではない。望ましくは、少なくとも１種の薬剤学的に許容される緩衝液を含む。例えば、薬剤学的組成物が注入剤や注射剤である場合、ｐＨ４〜１０、例えば、ｐＨ５〜９、ｐＨ６〜８で緩衝能を有する緩衝液から構成されることが望ましい。緩衝液は、ＴＲＩＳ、アセテート、グルタメート、ラクテート、マレエート、タルトレート、ホスフェート、シトレート、カーボネート、グリシネート、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、トリエチルアルコールアミン緩衝液からなる群から選択することができる。
【００３８】
特に、薬剤学的組成物が非経口投与を目的とする場合、緩衝液は、ＵＳＰに適した緩衝液から選択することができる。例えば、緩衝液は、酢酸、ベンゾ酸、グルコン酸、グリセリン酸、乳酸などの一塩基酸；アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸（ｃａｒｂｏｎｉｃ）、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸などの二塩基酸；クエン酸、リン酸などの多塩基酸；アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳなどの塩基からなる群から選択することができる。非経口的投与時、溶媒（皮下、静脈内、動脈内、筋肉内の注射）には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース溶液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー溶液及び不揮発性油（ｆｉｘｅｄ  ｏｉｌｓ）が含まれる。静脈内投与用溶媒には、リンガーデキストロース溶液、またはそのような溶液をベースにした輸液、栄養補充剤及び電解質補充剤が含まれる。界面活性剤と薬剤学的に適切なアジュバントが添加されるか、あるいは添加されていない水やオイルなどの滅菌された液体がその例である。一般的に、水；生理食塩水；デキストロース溶液；関連糖溶液；プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのグリコール；ポリソルベート８０が、特に、注射液に適している。オイルの例としては、動物性及び植物性のオイル、ピーナッツオイル、大豆油、オリーブオイル、ひまわりオイル、肝油、水産油脂などの合成オイル、牛乳や卵から得た脂質がある。
【００３９】
本発明の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、界面活性剤を含んでもよい。望ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（一般的に、Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）のうち、特に、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；酸化エチレン（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、酸化ブチレン（ＢＯ）の共重合体（例：ＤＯＷＦＡＸ（登録商標））；エトキシ（ｏｘｙ−１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ）基の反復数が互いに異なるオクトキシノール類、特に、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ−１００）；エチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；レシチンなどのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェニルエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリル、オレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪酸エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤）、特に、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ＳＰＡＮｓとして知られたソルビタンエーテル、特に、ソルビタントリオレート（Ｓｐａｎ８５）やソルビタンモノラウレートなどの界面活性剤を含むが、これらに限定されない。Ｔｗｅｅｎ８０は、エマルジョンに含まれることが望ましい。
【００４０】
Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５などの界面活性剤の混合物も使用することができる。Ｔｗｅｅｎ８０などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などのオクトシノールとの組み合わせも適する。Ｌａｕｒｅｔｈ９及びＴｗｅｅｎ、並びに／またはオクトシノールの組み合わせも有用である。望ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例：Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）、特に、０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）は、０．００１％〜０．１％、特に、０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例：ｌａｕｒｅｔｈ９）は、０．１％〜２０％、可能な限り０．１％〜１０％、特に、０．１％〜１％または約０．５％を含む。ある実施形態では、薬剤学的組成物は、放出調節システムによって伝達される。例えば、静脈内注入、経皮パッチ（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｐａｔｃｈ）、リポソーム、または他の経路によって投与される。ある様態よれば、マイクロスフェアまたはインプラントなどの高分子物質が使用される。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の説明のためのものであり、それら実施例によって本発明が制限されるものであると解釈されてはならない。
【００４２】
実施例１．肺炎連鎖球菌莢膜多糖類の製造
肺炎連鎖球菌培養と、莢膜多糖類の精製は、当業者に公知の方法によって行った。肺炎連鎖球菌の各血清型は、受託機関［ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］から入手可能である。莢膜、非運動性、グラム陽性、ランセット型双球菌、血液寒天培地でのアルファ溶血現象によって肺炎連鎖球菌を同定した。血清型は、特定の抗血清を利用したＱｕｅｌｌｕｎｇ  ｔｅｓｔにより確認した（米国特許第５，８４７，１１２号明細書）。
【００４３】
細胞バンクの製造
菌株を増殖させ、動物性起源の成分を除去するために、原種菌（ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）を何代か培養した（Ｆ１、Ｆ２及びＦ３世代）。原種菌を２世代追加培養した。追加第１世代は、Ｆ３バイアルから培養し、後続世代は、追加第１世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保存した（−７０℃以下）。細胞バンク製造のために、全ての培養物を大豆ベースの培地で増殖させた。凍結前に、遠心分離によって細胞を濃縮し、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤（例：合成グリセロール）を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁した。
【００４４】
接種
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆ベースの培地を含む種菌ビンに接種した。種菌ビンを使用して、大豆ベースの培地を含む種菌発酵器に接種した。
【００４５】
種菌培養
温度及びｐＨを調節しながら、種菌発酵器で発酵させた。目標吸光度に到逹した後、大豆ベースの培地を含む生産発酵器に接種した。
【００４６】
生産培養
生産培養は、醗酵の最後の段階である。温度、ｐＨ及び撹拌速度を調節した。
【００４７】
不活性化
成長を中断した後、不活性化剤を添加して醗酵を終結させた。不活性化後、発酵器の内容物を冷却してｐＨを調節した。
【００４８】
精製
培養物ブロスを遠心分離して濾過し、細菌細胞残骸を除去した。数回の濃縮／透析濾過作業、沈澱／溶出及び多層濾過を使用して、不純物を除去して莢膜多糖類を精製した。
【００４９】
実施例２．肺炎連鎖球菌莢膜多糖類とＣＲＭ１９７との接合体製造
異なる血清型の多糖類は、異なる経路に沿って活性化させた後、ＣＲＭ１９７に接合させた。活性化工程は、目標分子量になるように、莢膜多糖類の大きさを小さくし、化学的に活性化し、限外濾過を介したバッファ交換を含む。精製ＣＲＭ１９７は、活性化された莢膜多糖類と接合され、接合体は、限外濾過を利用して精製し、最終的に０．２２μｍフィルタで濾過する。ｐＨ、温度、濃度及び時間などの工程パラメータは、下記に記載された通りである。
【００５０】
（１）活性化工程
段階１
最終濃度範囲が、１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬになるように、それぞれの血清型の多糖類を、注射用水、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムで希釈した。血清型１の場合、水酸化ナトリウム（０．０５Ｍ最終塩基濃度）を添加し、５０℃±２℃で溶液をインキュベートした。２１〜２５℃に冷却し、６．０±０．１の目標ｐＨで塩酸を添加することにより、加水分解を中止させた。血清型３の場合、塩酸（０．０１Ｍ最終酸濃度）を添加し、５０℃±２℃で溶液をインキュベートした。２１〜２５℃に冷却し、６．０±０．１の目標ｐＨで１Ｍリン酸ナトリウムを添加することにより、加水分解を中止させた。血清型４の場合、塩酸（０．１Ｍ最終酸濃度）を添加し、４５℃±２℃で溶液をインキュベートした。２１〜２５℃に冷却し、６．０±０．１の目標ｐＨで１Ｍリン酸ナトリウムを添加することにより、加水分解を中止させた。血清型６Ａの場合、氷酢酸（０．２Ｍ最終酸濃度）を添加し、６０℃±２℃で溶液をインキュベートした。次に、温度を２１〜２５℃に下げ、６．０±０．１の目標ｐＨになるように、１Ｍ水酸化ナトリウムを添加した。血清型１４、１８Ｃの場合、氷酢酸（０．２Ｍ最終酸濃度）を添加し、９４℃±２℃で溶液をインキュベートした。次に、温度を２１〜２５℃に下げ、６．０±０．１の目標ｐＨになるように１Ｍリン酸ナトリウムを添加した。
【００５１】
段階２：過ヨード酸塩反応
肺炎球菌糖類の活性化に必要な過ヨード酸ナトリウムのモル当量を、全糖類含量を使用して測定した。完全に混合しながら、全ての血清型に対して、２１〜２５℃で、１６〜２０時間酸化反応を進めた。ただし、血清型１、７Ｆ、１９Ｆの場合、温度を１０℃以下にした。
【００５２】
段階３：限外濾過
酸化された糖類を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過フィルタ（血清型１の場合、３０ｋＤａの限外濾過フィルタ、血清型１８Ｃの場合、５ｋＤａの限外濾過フィルタ）に、注射用水で濃縮及び透析濾過した。血清型１の場合、０．９％塩化ナトリウム溶液で透析濾過し、血清型７Ｆの場合、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で透析濾過し、血清型１９Ｆの場合０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析濾過した。透過液を廃棄し、残留液を０．２２μｍフィルタを介して濾過した。
【００５３】
段階４：凍結乾燥
血清型３、４、５、９Ｖ及び１４の場合、濃縮された糖類を、ＣＲＭ１９７運搬体タンパク質と混合し、ガラスビン内に充填し、凍結乾燥した後、−２５℃±５℃で保存した。血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの場合、５％±３％スクロース濃度に到逹するように計算された特定量のスクロースを添加した。血清型１、１８Ｃは、スクロース添加の必要はなかった。濃縮された糖類を、ガラスビン内に充填して凍結乾燥した後、−２５℃±５℃で保存した。
【００５４】
（２）接合工程
血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４及び１８Ｃの場合、水性接合を使用し、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの場合、ＤＭＳＯ接合を使用した。
【００５５】
段階１：溶解
水性接合
血清型３、４、５、９Ｖ及び１４の場合、凍結乾燥された活性化糖類−ＣＲＭ１９７混合物を解凍し、室温で平衡化した。次に、凍結乾燥された活性化糖類−ＣＲＭ１９７を血清型によって定められた比率で、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で再構成した。血清型１、１８Ｃの場合、凍結乾燥された糖類を、ＣＲＭ１９７溶液１Ｌ当たりリン酸ナトリウム０．１１Ｌの一般的な比率で、１Ｍの２塩基性リン酸ナトリウム中のＣＲＭ１９７溶液で再構成した。
【００５６】
ＤＭＳＯ接合
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの凍結乾燥された活性化糖類、及び凍結乾燥されたＣＲＭ１９７運搬体タンパク質を室温で平衡化し、ＤＭＳＯで再構成した。
【００５７】
段階２：接合反応
水性接合
血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４及び１８Ｃの場合、糖類１モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０〜１．２モルになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより、接合反応を開始させた。反応混合物を、２３℃〜３７℃で、４４〜９６時間インキュベートした。温度及び反応時間は、血清型に基づいて調節した。次に、温度を２３℃±２℃に下げ、塩化ナトリウム０．９％を反応器に添加した。糖類１モル当たり水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量になるように、水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合物を２３℃±２℃で、３〜６時間インキュベートした。この過程を介して、糖類に存在する未反応の任意のアルデヒドを還元した。塩化ナトリウム０．９％を使用して混合物を希釈し、希釈された接合混合物を１．２μｍ予備フィルタを使用して濾過した。
【００５８】
ＤＭＳＯ接合
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの場合、活性化された糖類及びＣＲＭ１９７運搬体タンパク質を、ＣＲＭ１９７１ｇあたり糖類０．８〜１．２５ｇの範囲の比率で混合した。活性化された糖類１モルに対して、シアノ水素化ホウ素ナトリウム０．８〜１．２モル当量の比率で、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより、接合反応を開始させた。１％（ｖ／ｖ）の目標濃度で注射用水を反応混合物に添加し、混合物を２３℃±２℃で、１１〜２７時間インキュベートした。１００ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（活性化された糖類１モル当たり、一般的に、水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量）及び注射用水（目標濃度５％ｖ／ｖ）を反応物に添加し、混合物を２３℃±２℃で、３〜６時間インキュベートした。この過程を介して、糖類に存在する未反応の任意のアルデヒドを還元した。次に、反応混合物を０．９％塩化ナトリウムで希釈し、希釈された接合体混合物を、１．２μｍフィルタを介して濾過した。
【００５９】
段階３：限外濾過
希釈された接合混合物を、少なくとも２０容量の０．９％塩化ナトリウムまたは緩衝液を使用して、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過フィルタで濃縮及び透析濾過した。透過液を廃棄した。
【００６０】
段階４：滅菌濾過
１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析濾過後の残留液を、０．２２μｍフィルタを介して濾過した。濾過した産物に対して、工程内管理（糖類含量、遊離タンパク質、遊離糖類及び残余シアニドを確認；ＤＭＳＯ接合の場合は、残余ＤＭＳＯをさらに確認）を実施した。濾過させた残留液に対して、工程内管理を実施し、濃縮、透析濾過及び／または希釈がさらに必要であるか否かを決定した。必要な場合、濾過した接合体を、最終濃度が０．５５ｇ／Ｌ未満になるように、０．９％塩化ナトリウムを使用して希釈した。この段階において、糖類含量、タンパク質含量、及び糖類とタンパク質の比率に関する遊離試験を実施した。接合体を濾過し（０．２２μｍ）、遊離試験（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、内毒素、分子サイズ決定、残余シアニド、残余ＤＭＳＯ、糖類同一性及びＣＲＭ１９７同一性）を実施した。最終バルク濃縮液を、２〜８℃で冷蔵保存した。
【００６１】
実施例３．多価肺炎球菌接合体ワクチンの製剤化
バッチ容積（ｂａｔｃｈ  ｖｏｌｕｍｅ）及びバルク糖類濃度を基準にして、最終バルク濃縮液の必要量を計算した。必要量の０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０及びコハク酸塩緩衝液を、事前にラベリングした製剤化容器に添加した後、バルク濃縮液を添加した。十分に混合し、０．２２μｍフィルタを介して濾過した。バルクリン酸アルミニウムの添加中及びその後に、製剤化されたバルク液を徐々に混合した。ｐＨを確認し、必要な場合に調節した。製剤化されたバルク製品を、２〜８℃で保存した。得られたワクチン組成物は、全０．５ｍＬ中に２μｇの各多糖類、ただし、血清型６Ｂの場合は４μｇ；約３２μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント；塩化ナトリウム約４．２５ｍｇ；コハク酸塩緩衝液約２９５μｇ；及びポリソルベート８０約１００μｇを含んでいた。
【国際調査報告】
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