(57)【要約】Ｂ７−Ｈ４特異的抗体並びにその組成物及び使用方法が開示される。抗体は、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、組換えＢ７−Ｈ４タンパク質及びその融合物、又はそれらの組み合わせに特異的であり得る。Ｂ７−Ｈ４特異的抗体を使用して炎症反応を低下させる方法又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害を治療する方法もまた開示される。この抗体を対象に投与することにより、対象における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを低下させ、又はＢ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４による遮断を低下させることができる。一部の実施形態では、抗体は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質と組み合わせて投与される。好ましくは抗体は、共投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質には結合することなしに、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４と結合する。診断方法、治療有効性の判定方法、及び治療する患者を選択する方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のＢ７−Ｈ４ポリペプチドのレベルを決定する方法であって、前記生体試料をイムノアッセイに供するステップを含み、前記イムノアッセイが、前記生体試料を、２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、Ｈ７４、ＨＭＨ４−５Ｇ１、そのヒト化変異体、及びその抗原結合断片からなる群から選択される少なくとも１つのＢ７−Ｈ４特異的抗体と接触させることと、前記抗体を検出することとを含む、方法。
【請求項２】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、蛍光イムノアッセイ、及び免疫組織化学からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイが、捕捉抗体と検出抗体とを含むＥＬＩＳＡであり、前記捕捉抗体及び検出抗体が、２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、Ｈ７４、ＨＭＨ４−５Ｇ１、そのヒト化変異体、及びその抗原結合断片からなる群から選択される２つの異なるＢ７−Ｈ４特異的抗体であり、
及び前記捕捉抗体及び検出抗体又は断片がＢ７−Ｈ４の非重複エピトープを認識する、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記捕捉抗体が２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２であり、且つ前記検出抗体が６Ｈ３である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉抗体が２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２であり、且つ前記検出抗体がｈＢ７−Ｈ４．ｍ１である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドがＢ７−Ｈ４融合タンパク質であり、捕捉抗体が２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２又はＨ７４であり、且つ前記検出抗体が抗Ｆｃ抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉抗体がＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインと結合し、且つ前記検出抗体がＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインと結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記検出抗体が、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、そのヒト化断片、又はその抗原結合断片である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１がビオチン化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉抗体がＢ７−Ｈ４の前記ＩｇＶドメインと結合し、且つ前記検出抗体がＢ７−Ｈ４の前記ＩｇＣドメインと結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉抗体が、２Ｈ９、ヒト化変異体、又はその抗原結合断片である、請求項７又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕捉抗体が２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片が、配列番号５５を含む軽鎖可変領域と配列番号５５を含む重鎖可変領域とを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出抗体が、６Ｈ３、そのヒト化変異体、又はその抗原結合断片である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記６Ｈ３抗体が、配列番号６１を含む軽鎖可変領域と配列番号６３を含む重鎖可変領域とを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記６Ｈ３抗体がビオチン化されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉抗体がＢ７−Ｈ４のＩｇＣドメインと結合し、且つ前記検出抗体がＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインと結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉抗体が、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、Ｈ７４、そのヒト化変異体及びその抗原結合断片からなる群から選択され、且つ前記検出抗体が、２Ｄ９、そのヒト化変異体、若しくはその抗原結合断片、又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、そのヒト化変異体、若しくはその抗原結合断片である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記捕捉抗体が、２Ｄ９、そのヒト化変異体若しくはその抗原結合断片、又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、そのヒト化変異体若しくはその抗原結合断片であり、且つ前記検出抗体が、ＨＭＨ４−５Ｇ１又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、そのヒト化変異体又はその抗原結合断片であり、前記ＥＬＩＳＡが細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出するが、アミノ酸配列の配列番号１０又は１８を含むＢ７−Ｈ４融合タンパク質は検出しない、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記イムノアッセイが、捕捉抗体と検出抗体とを含むＥＬＩＳＡであり、前記捕捉抗体が、２Ｄ９、Ｈ７４、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、そのヒト化変異体、又はその抗原結合断片であり、且つ前記検出抗体がヒトＩｇＧ１  Ｆｃに特異的であり、前記ＥＬＩＳＡが、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合したＢ７−Ｈ４細胞外ドメインを含むＢ７−Ｈ４融合タンパク質を検出するが、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は検出しない、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の薬物動態を決定する方法であって、前記融合タンパク質を投与された対象から得られた第１の生体試料のアリコート及び第２の生体試料のアリコートに対して請求項２１に記載のＥＬＩＳＡを実施するステップを含む方法。
【請求項２３】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料とが、数分、数時間、数日、又は数週間あけて前記対象から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
捕捉抗体と検出抗体とを含む第２のＥＬＩＳＡを実施するステップをさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法において、前記捕捉抗体が、２Ｄ９、そのヒト化変異体、若しくはその抗原結合断片、又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、そのヒト化変異体、若しくはその抗原結合断片であり、且つ前記検出抗体が、ＨＭＨ４−５Ｇ１、そのヒト化変異体、又はその抗原結合断片であり、前記ＥＬＩＳＡが細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出するが、配列番号１０又は１８のアミノ酸配列を含むＢ７−Ｈ４融合タンパク質は検出せず、前記第１のＥＬＩＳＡ及び第２のＥＬＩＳＡが前記第１及び第２の生体試料の異なるアリコートに対して実施される、方法。
【請求項２５】
前記生体試料が組織又は体液試料である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体試料が、尿、全血、血清、血漿、涙、唾液、脳脊髄液、リンパ液、滑液、及び喀痰からなる群から選択される体液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記体液が血清又は血漿である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に罹っている又は罹っている疑いがある対象における免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の重症度を決定する方法であって、
（ａ）請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い対象からの生体試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップと、
（ｂ）前記生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを、免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の疾患重症度と相関する基準細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルと比較するステップであって、それにより前記対象の免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の重症度を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２９】
対象における免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の診断を補助する方法、又は免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の発症傾向を評価する方法であって、
請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い対象からの生体試料における前記細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップ
を含み、
対照の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルと比べた前記生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの上昇が、免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の指標、又は免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を発症する傾向の増加の指標となる、方法。
【請求項３０】
対象における免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い、治療前又は治療の経過中に前記対象から得られた１つ以上の生体試料から細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルを決定するステップ
を含み、
前記対象から得られた試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの経時的な減少が、前記治療が有効であることの指標となる、方法。
【請求項３１】
免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を治療する対象を選択する方法であって、
（ａ）請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い、前記対象から得られた生体試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップと、
（ｂ）前記生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを対照の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルと比較するステップと、
（ｃ）前記生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルが前記対照の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルより高いとき、前記対象を治療に選択するステップと
を含む方法。
【請求項３２】
対象における免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い、第１の生体試料及び前記第１の試料より後に採取した第２の生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップ
を含み、
前記試料が前記治療の経過にわたり前記対象から得られ、及び前記第１の試料と比較した前記第２の試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの減少が、前記治療が有効であることの指標となる、方法。
【請求項３３】
対象における免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の診断を補助する方法、又は免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の発症傾向を評価する方法であって、請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い第１の生体試料及び前記第１の試料より後に採取した第２の生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップ
を含み、
前記第１の試料と比較した前記第２の試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの増加が、前記免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の発症又は悪化の指標となる、方法。
【請求項３４】
免疫応答、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を治療する対象を選択する方法であって、請求項５〜２０のいずれか一項に記載の方法に従い、第１の生体試料及び前記第１の試料より後に採取した第２の生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップと、前記第２の生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルが前記第１の試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルより高いとき、前記対象を治療に選択するステップとを含む方法。
【請求項３５】
１つ又は複数の生体試料が血清又は血漿である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記炎症性又は自己免疫性疾患／障害が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎・皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が、卵巣癌、食道癌、腎癌、胃癌、肝癌、肺癌、結腸癌、膵癌、乳癌及び前立腺癌、及び皮膚癌（メラノーマ）からなる群から選択される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象を免疫応答、炎症性又は自己免疫性疾患／障害に関して治療するステップをさらに含む、請求項２８〜３１又は３３〜３４のいずれか一項に記載の対象を治療する方法。
【請求項３９】
前記対象において免疫応答、炎症性又は自己免疫性疾患／障害が検出又は診断され、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物を前記対象に投与することにより前記対象が治療される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／７３９，２７２号明細書、２０１２年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／７３９，２８７号明細書、及び２０１２年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／７３９，３５３号明細書の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、各々が全体として参照により援用される。
【０００２】
本発明の分野は、概してＢ７−Ｈ４特異的抗体、並びに炎症性及び自己免疫性疾患及び障害の診断及び治療方法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫応答の調節は、多くの疾患及び障害の治療において重要である。例えば、癌又は感染症に罹患している患者では、免疫応答を増強することが有利であり得る。或いは、炎症性病態に罹患している患者では、免疫応答を阻害し又は低下させることが有益であり得る。
【０００４】
慢性及び持続性の炎症は、関節リウマチ（ＲＡ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの全身性自己免疫疾患が発病及び進行する主な原因である。ＲＡは高度に炎症性の多発性関節炎であり、関節の破壊、変形及び機能喪失を生じる場合が多い。末梢関節の付加的で対称性の腫脹が、この疾患の顕著な特徴である。関節外の特徴及び全身症状が見られることがよくあり、関節症状の発症に先行し得る。慢性痛、能力障害及び超過死亡が不運な続発症である。ＲＡが進行する間、滑膜の過形成が起こり、滑膜間質にＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び好中球が浸潤する結果として、炎症関節の滑膜表層がその厚さを増す（Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５：３０７−１０（１９９６）；Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３３７：１４１−７（１９９７））。ＳＬＥでは自己抗体の産生によって糸球体、皮膚、肺及び滑膜を含む多くの組織及び臓器で免疫複合体の沈着が起こり、それにより特徴的な慢性炎症及び組織損傷を伴うリウマチ性病変が生じる。
【０００５】
共シグナル伝達分子は、共刺激及び共阻害機能を有するものを含め、有効な免疫応答の誘導及び望ましくない自己免疫の防止にとって重要である。Ｂ７−ＣＤ２８ファミリーを介したシグナルがこのバランスの主要な調節因子であり、自己免疫の調節において中心的役割を果たすことが示されている。全身性自己免疫疾患における炎症反応の持続は、共阻害機能の障害又は共刺激機能の亢進のいずれかがこのバランスの喪失につながることを意味する。この点で、その受容体ＰＤ−１との結合後の主要な共阻害分子であるＢ７−Ｈ１に対する自己抗体がかなりの割合のＲＡ患者に認められ、且つその自己抗体の存在がＲＡ症状の進行に関与していることは、特に興味深い。
【０００６】
Ｂ７−Ｈ４は、最近になってＢ７ファミリーに加えられたものであり、Ｔ細胞応答の負の調節因子である。ヒト及びマウスＢ７−Ｈ４は８７％のアミノ酸同一性を共有し、進化的に保存された重要な機能が示唆される。ヒト及びマウスＢ７−Ｈ４  ｍＲＮＡはリンパ器官（脾臓及び胸腺）及び非リンパ器官（肺、肝臓、精巣、卵巣、胎盤、骨格筋、膵臓、及び小腸を含む）の両方で広範に発現する。Ｂ７−Ｈ４欠損マウスを陰性対照として用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）染色は、マウスＢ７−Ｈ４が膵島β細胞（Ｗｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０８（８）：１６８３−９４（２０１１））及び肺上皮内層（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８９（６）：３０５４−６３（２０１２））を含めた上皮性起源の細胞によって発現されることを明らかにする。Ｂ７−Ｈ４発現はまた、罹患腎の尿細管上皮細胞においても観察されている（Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，７０（１２）：２０９２−９（２００６）Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  １８．）。しかしながら、造血細胞でのＢ７−Ｈ４の発現については文献に矛盾する報告があり、議論の余地が残されている。ＩＨＣ染色は、Ｂ７−Ｈ４が乳房、腎臓、肺及び卵巣の腫瘍においても高度に発現することを明らかにし、及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析は、マウスＢ７−Ｈ４が前立腺癌、肺癌、及び結腸癌を含めた多くの腫瘍細胞株においても高度に発現することを示している。Ｂ７−Ｈ４は腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）によって高度に発現され、腫瘍血管系に存在する（Ｋｒｙｃｚｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７７（１）：４０−４（２００６）、Ｋｒｙｃｚｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３（４）：８７１−８１（２００６）、Ｋｒｙｃｚｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７（１８）：８９００−５（２００７））。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＩＬ−６及びＩＬ−１０を介してＴＡＭ上でのＢ７−Ｈ４の上方制御を誘導する；これは、Ｔｒｅｇが免疫抑制に寄与する際の機構の一つであると考えられている（Ｋｒｙｃｚｅｋ，Ｊ．Ｉ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７７（１）：４０−４４（２００６））。
【０００７】
Ｂ７−Ｈ４の受容体は同定されていない。Ｂ７−Ｈ４は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ及びＰＤ−１などの既知のＣＤ２８ファミリーメンバーに結合しないことが示されており（Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１８：８４９−８６１（２００３））、従ってこれらがＢ７−Ｈ４の受容体である見込みはない。Ｂ７−Ｈ４トランスフェクタント及びＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を使用した機能的研究は、ＴＣＲ媒介性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖、細胞周期進行及びＩＬ−２産生を阻害するシグナルがＢ７−Ｈ４によって伝達されることを実証する。Ｂ７−１共刺激はＢ７−Ｈ４−Ｉｇ誘導性阻害に打ち勝つことができない。インビトロ活性と一致して、Ｂ７−Ｈ４の異所性発現は同種移植片モデルにおいて組織寛容を促進する（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２１（１）：９９−１１１（２０１２））。Ｂ７−Ｈ４の広範な誘導性発現は、機能的研究と併せると、Ｂ７−Ｈ４が末梢組織で免疫応答を下方制御し末梢寛容を維持する働きをすることを示唆している。
【０００８】
最近の結果は、Ｂ７−Ｈ４が好中球応答の負の調節因子としても働くことを実証している。好中球は自然免疫系の鍵となる構成要素であり、病原体に対する宿主防御の最前線である。しかしながら好中球は慢性炎症及び自己免疫疾患にも寄与し得る。Ｂ７−Ｈ４ノックアウトマウスはＴｈ１応答の増加を示し、好中球依存性の免疫応答の増進に起因してリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）感染症に対する抵抗性が高くなる（Ｓｕｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２６（１７）：６４０３−１１（２００６）及びＺｈｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１３（８）：１７５９−６７（２００９）Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｄｅｃ  ２４）。単量体Ｂ７−Ｈ４  ＩｇＶドメイン又は細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を流体力学的にトランスフェクトしたマウスは、リポ多糖（ＬＰＳ）及びリステリア感染症に対する好中球応答が増加した一方、二量体Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは骨髄由来好中球前駆体の増殖を低減する（Ｚｈｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１３（８）：１７５９−６７（２００９）Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｄｅｃ  ２４）。
【０００９】
可溶性形態のＢ７−ＣＤ２８ファミリー分子もまた、リウマチ様疾患の進行に関与する。諸研究により、ＲＡ患者では可溶性ＰＤ−１を検出することができ、可溶性ＰＤ−１のレベルが滑液中のＴＮＦ−α濃度と相関することが分かっている。可溶性Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）（本明細書では細胞遊離Ｂ７−Ｈ４及び循環型のＢ７−Ｈ４とも称される）が潜在的なバイオマーカーとして卵巣癌患者に検出されており、６８人のＲＡ患者及び２４人の健常ボランティアの研究結果からは、健常者では１３％に過ぎないのに対し、６５％のＲＡ患者の血液に可溶性Ｂ７−Ｈ４が存在したことが示された（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（３）：１５７０−５（２００６）、Ａｚｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．，６（１０）：ｅ１０００１６６（２００９）．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ  ２０）。可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルは健常者（＜５ｎｇ／ｍｌ）と比較してＲＡ患者（９６．１ｎｇ／ｍｌ）で有意に高かった。
マウスモデルにおけるインビボ研究は、ｓＨ４の過剰発現及びＢ７−Ｈ４の欠失の両方が炎症を引き起こしたことを示している（Ａｚｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．，６（１０）：ｅ１０００１６６（２００９）．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ  ２０）。マウスにおける症状は対照と比べて早期に現れ、より重篤であったとともに、可溶性Ｂ７−Ｈ４の炎症効果は好中球に依存していることが分かった。Ｂ７−Ｈ４による正常なシグナル伝達を模倣するタンパク質を使用して、マウスにおける疾患の発症が予防された。
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を使用して膜貫通Ｂ７−Ｈ４を介したシグナル伝達を増加させることにより自己免疫性及び炎症性疾患／障害を治療するための組成物及び方法が、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１７７６４５号明細書及び同第２０１２／０２７６０９５号明細書に考察され；及び可溶性Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を妨げるための組成物及び方法が、例えば、米国特許第７，９３１，８９６号明細書及び同第７，９８９，１７３号明細書、及び米国特許出願公開第２００９／０１４２３４２号明細書に考察されている。しかしながら、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を介したシグナル伝達を増加させる薬剤と、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を介したシグナル伝達の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４媒介性阻害を低下させ又は遮断する薬剤とを含む併用療法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０１７７６４５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０２７６０９５号明細書
【特許文献３】米国特許第７，９３１，８９６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，９８９，１７３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０１４２３４２号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５：３０７−１０（１９９６）
【非特許文献２】Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３３７：１４１−７（１９９７）
【非特許文献３】Ｗｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０８（８）：１６８３−９４（２０１１）
【非特許文献４】Ｈｏｆｍｅｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８９（６）：３０５４−６３（２０１２）
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，７０（１２）：２０９２−９（２００６）Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  １８
【非特許文献６】Ｋｒｙｃｚｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７７（１）：４０−４（２００６）
【非特許文献７】Ｋｒｙｃｚｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３（４）：８７１−８１（２００６）
【非特許文献８】Ｋｒｙｃｚｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７（１８）：８９００−５（２００７）
【非特許文献９】Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１８：８４９−８６１（２００３）
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２１（１）：９９−１１１（２０１２）
【非特許文献１１】Ｓｕｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２６（１７）：６４０３−１１（２００６
【非特許文献１２】Ｚｈｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１３（８）：１７５９−６７（２００９）Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｄｅｃ  ２４
【非特許文献１３】Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（３）：１５７０−５（２００６）
【非特許文献１４】Ａｚｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．，６（１０）：ｅ１０００１６６（２００９）．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｏｃｔ  ２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、免疫応答、炎症性、及び自己免疫性疾患／障害を治療するための組成物及び方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を低下させ又は阻害すると同時に膜貫通Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を増加させるための組成物及び方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の産生を低下させ、阻害し、又は遮断する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、模倣タンパク質と、細胞遊離タンパク質、膜貫通タンパク質、又はそれらの組み合わせとを含有する試料において、Ｂ７−Ｈ４  Ｉｇ融合タンパク質などの、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣する可溶性タンパク質を、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４と、又は膜貫通Ｂ７−Ｈ４と、又はそれらの組み合わせと区別するための組成物及び方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４及び膜貫通Ｂ７−Ｈ４の両方を含有する試料において、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を膜貫通Ｂ７−Ｈ４と区別するための組成物及び方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、対象における自己免疫性又は炎症性疾患／障害、又は癌の診断を補助するための、又は対象が自己免疫性又は炎症性疾患／障害、又は癌を発症する傾向を評価するための組成物及び方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、自己免疫性又は炎症性疾患／障害、又は癌に罹っている又は罹っている疑いがある対象における自己免疫性又は炎症性疾患／障害、又は癌の重症度を決定するための組成物及び方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、自己免疫性又は炎症性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定するための組成物及び方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、自己免疫性又は炎症性疾患／障害、又は癌を治療する対象を選択するための組成物及び方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣する可溶性タンパク質などの、Ｂ７−Ｈ４療法の薬物動態パラメータ及び薬力学パラメータを計測するための組成物及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
Ｂ７−Ｈ４特異的抗体並びにその組成物及び使用方法が開示される。本抗体は、内因型Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、組換えＢ７−Ｈ４タンパク質及びその融合物、又はそれらの組み合わせに特異的であり得る。例えば、抗体は、タンパク質機能にとって重要な保存されたドメイン、例えばＩｇＶドメインに結合することにより、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのほとんど又は全ての種を認識することができる。或いは、抗体は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質上ではマスクされているか又は存在しない細胞遊離型のＢ７−Ｈ４上のエピトープに結合することができる。抗Ｂ７−Ｈ４抗体を含む医薬組成物もまた開示される。
【００２３】
Ｂ７−Ｈ４特異的抗体を使用して免疫応答を低下させる又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害を治療する方法もまた開示される。本抗体を、それを必要とする対象に投与することにより、対象における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを低下させ、又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４によるＢ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達の遮断を低下させることができる。好ましくは本抗体の投与によりＢ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達が増加する。一部の実施形態では、本抗体は、Ｂ７−Ｈ４シグナル伝達を誘導することにより膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質と組み合わせて投与される。好ましくは、本抗体は、共投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質には結合することなく細胞遊離Ｂ７−Ｈ４と結合する。一部の実施形態では、本抗Ｂ７−Ｈ４抗体は膜貫通Ｂ７−Ｈ４に結合して細胞外ドメインのタンパク質分解による切断を低下させ、阻害し又は防止し、それにより対象における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の形成を低下させ又は阻害することができる。従って、一部の実施形態では、本抗体の投与によりインビボでの細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の産生が低下し又は防止される。好ましい実施形態では、本抗体はインビボでの細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の産生を防止する一方、膜貫通Ｂ７−Ｈ４又は膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣する可溶性タンパク質の活性、コグネイトＢ７−Ｈ４受容体と会合するその能力、又はＢ７−Ｈ４受容体を介したシグナル伝達を惹起するその能力を妨げない。
【００２４】
Ｂ７−Ｈ４特異的抗体を使用して生体試料中のＢ７−Ｈ４ポリペプチドのレベルを決定する方法もまた開示される。例えば、一部の実施形態では、対象から得られた血清又は血漿などの生体試料がイムノアッセイに供され、ここでイムノアッセイは、生体試料を少なくとも１つのＢ７−Ｈ４特異的抗体又はＦ（ａｂ’）２断片などのその抗原結合断片と接触させることと、抗体又は断片を検出することとを含む。好ましいイムノアッセイとしては、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、蛍光イムノアッセイ、及び免疫組織化学が挙げられる。一部の実施形態では、それに加えて又は代えて、生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルは質量分析を用いて計測される。
【００２５】
特に好ましいイムノアッセイはＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡは典型的には２つの異なるＢ７−Ｈ４特異的抗体、即ち捕捉抗体及び検出抗体の使用を含む。一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４のほとんど又は全ての種、例えばＩｇＶドメイン上のエピトープを認識する抗体又はその抗原結合断片を使用して、試料中のＢ７−Ｈ４ポリペプチド種のほとんど又は全てが捕捉される。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド種のほとんど又は全てを認識することのできる検出抗体を使用して生体試料の全Ｂ７−Ｈ４レベルを決定してもよく、又は検出抗体はＢ７−Ｈ４ポリペプチドのある種に特異的であってもよい。一部の実施形態では、検出抗体は捕捉抗体と異なるドメイン又はエピトープを認識する。例えば、捕捉抗体又はその抗原（ａｎｉｔｇｅｎ）結合断片がＩｇＶドメインに結合する場合、検出抗体はＩｇＣドメインに結合し得る。一部の実施形態では、検出抗体はＢ７−Ｈ４融合タンパク質の第２のポリペプチドを認識する。例えば、融合タンパク質の第２のポリペプチドがヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である場合、その抗体は抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体であり得る。このようにして、治療的Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質を試料中の全内因性Ｂ７−Ｈ４タンパク質と区別することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質が細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のみ、膜貫通Ｂ７−Ｈ４のみ、又はそれらの組み合わせと区別され得る。
【００２６】
一部の実施形態では、検出抗体は、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質上ではマスクされているか又は存在しない細胞遊離Ｂ７−Ｈ４上のエピトープを認識する。例えば、一部の実施形態において本抗体は、融合タンパク質、例えば配列番号１０の融合タンパク質に存在しない細胞外ドメインの一部分、例えばＩｇＣドメインのその最後の数個のアミノ酸に結合する。このようにして、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量を、治療的融合タンパク質などの、生体試料中に存在し得るＢ７−Ｈ４ポリペプチドの他の種と区別することができる。好ましい実施形態では、生体試料は血漿又は血清である。他の実施形態では、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４上で認識されるエピトープは、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質上では立体構造の変化又は複合体形成によりエピトープが隠されるため認識されることができない。
【００２７】
Ｂ７−Ｈ４を検出する本開示の抗体及び方法は、複数の診断アッセイにおいて適用することができる。例えば、免疫応答、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の重症度を決定するための方法；炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害又は癌の診断を補助するための；又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の発症傾向を評価するための方法；免疫応答、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定するための方法；免疫応答、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を治療する対象を選択するための方法；及び対象における免疫応答、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定するための方法が開示される。一部の実施形態では、これらの方法は、疾患／障害について対象を治療する追加的なステップを含む。
【００２８】
開示される組成物及び方法を使用して診断及び治療され得る炎症性及び自己免疫性疾患／障害としては、限定はされないが、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、視神経炎（ＯＮ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ又はデビック病）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎・皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ−１Ｇ】図１Ａ〜図１Ｇは、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化した１μｇ／ｍｌの様々なＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２９）、（配列番号３１）、（配列番号３３）、（配列番号３５）、（配列番号３７）、及び（配列番号３９）と共にインキュベートした後の、漸増濃度（ｎｇ／ｍＬ）の酵素結合抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９（図１Ａ）、２Ｄ１（図１Ｂ）、６Ｈ３（図１Ｃ）、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１（図１Ｄ）、８Ｅ１１（図１Ｅ）、ＨＭＨ４−５Ｇ１（図１Ｆ）及びＨ７４（図１Ｇ）の検出（吸光度４５０ｎｍ）を示す一連の折れ線グラフである。
【図２】図２は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインに対する抗体結合の推定認識部位をマッピングする図である。この図はまた、３つの異なる形態のＢ７−Ｈ４の認識に用いられ得る３つの例示的なＥＬＩＳＡスキームも示す。２Ｈ９／６Ｈ３対は、完全なＩｇＶ及びＩｇＣドメインを有する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出することができる。２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１対は、完全なＩｇＶ、及びＩｇＣドメインを有する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４、及び膜近傍（ｊｕｘａｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメインを検出することができる。２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１対は、ＩｇＶドメインを有する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出することができる。
【図３】図３は、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質標準の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を増加させたときの蛍光の計測値（ＡＵ）としての捕捉（抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９を使用）及び検出（抗Ｂ７−Ｈ４  ６Ｈ３−ビオチン＋ユウロピウム標識ストレプトアビジンを使用）を示す折れ線グラフである。このサンドイッチＥＬＩＳＡ法の検出限界（ＬＯＤ）は８ｐｇ／ｍｌのＢ７−Ｈ４可溶性タンパク質である。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ標準として配列番号２５を使用した。
【図４】図４は、マウス又はヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質（配列番号１１）の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を増加させたときの吸光度（４５０ｎｍ）の計測値としての捕捉（抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９を使用）及び検出（抗Ｂ７−Ｈ４  ６Ｈ３−ビオチン＋西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使用）を比較する折れ線グラフである。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ及び図５Ｂは、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の検出に捕捉／検出対：２Ｈ９／６Ｈ３、２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１又は２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１をそれぞれ使用した３つのＥＬＩＳＡ法を比較する散布図である。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ標準として配列番号２５を使用した。
【図６】図６は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号２５）の濃度を増加させたときの蛍光の計測値（ＡＵ）としての捕捉（抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片を使用）及び検出（抗Ｂ７−Ｈ４  ６Ｈ３又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１＋抗マウスＩｇ−ビオチン＋ユウロピウム標識ストレプトアビジンを使用）を示す折れ線グラフである。
【図７】図７は、健常ドナー（ＨＤ）、関節リウマチ対象（ＲＡ）、又はシェーグレン症候群対象（ＳＳ）から採取した血清中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４（ｎｇ／ｍＬ）のドットプロットである。実線の水平線は各対象集団の中央値を示す。１ｎｇ／ｍｌをカットオフとして使用して、各対象集団の中で細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の割合が高い患者と低い患者との比較を下側のパネルに示した。点線は検出限界（ＬＯＤ）を示す。Ｂ７−Ｈ４濃度は、ＥＬＩＳＡ法により、捕捉に抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片を使用し、且つ検出に抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１を使用して計測した。標準として配列番号２５を使用した。
【図８】図８は、ＳＬＥ治療中の経時的な一連の患者の血清中細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベル（ｓＢ７−Ｈ４（ｎｇ／ｍｌ））の縦断的研究を示す折れ線グラフである。Ｂ７−Ｈ４濃度は、ＥＬＩＳＡ法により、捕捉に抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９を使用し、且つ検出に抗Ｂ７−Ｈ４抗体６Ｈ３を使用して計測した。標準として配列番号２５を使用した。
【図９】図９は、健常ドナー（ＨＤ）、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び腎細胞癌（ＲＣＣ）患者から採取した血清中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４（ｎｇ／ｍＬ）のドットプロットである。実線の水平線は各対象集団の中央値を示す。Ｂ７−Ｈ４濃度は、ＥＬＩＳＡ法により、捕捉に抗Ｂ７−Ｈ４抗体２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片を使用し、且つ検出に抗Ｂ７−Ｈ４抗体ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１を使用して計測した。標準として配列番号２５を使用した。
【図１０Ａ−１０Ｆ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、６Ｈ３、２Ｄ１、２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、ＨＭＨ４−５Ｇ１、及びＨ７４を含むＢ７−Ｈ４  ｍＡｂの濃度を増加させることによる、且つ抗マウスＩｇ  ＨＲＰによって検出した、ＩｇＶ及びＩｇＣドメインを有するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号１１）、ＥＰＫＳＣ配列を含まないＬ型を有するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号２１）及びＬ型及びＥＰＫＳＣの代わりにＨＬＱＬＬＮＳＫ配列を有するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号２５）の検出を比較する折れ線グラフである。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｃは、漸増濃度のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号１１）、ＩｇＶドメインのみを有するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号２９）、完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号３５）又は完全なＥＣＤ（配列番号３５）とＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号１１）を検出する３つのＥＬＩＳＡ法の２Ｈ９／６Ｈ３、２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１及び２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１対を比較する折れ線グラフである。２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１及び２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１対は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出することができたが、しかしＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（配列番号１１）は検出することができなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
用語「細胞遊離Ｂ７−Ｈ４」は、本明細書では循環型のＢ７−Ｈ４、可溶性Ｂ７−Ｈ４及びｓＨ４とも称され、内因性膜貫通Ｂ７−Ｈ４に由来する可溶性の単量体Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含む。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は、典型的にはＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン又はその生物学的に活性な断片を含む。ヒト及びマウスＢ７タンパク質は、短い細胞質内ドメイン、単一の膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、典型的には２つのＩｇドメイン、即ち膜近位ＩｇＣドメインと膜遠位ＩｇＶドメインとを含む。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４という用語は、インビボで細胞によって産生される膜貫通型のＢ７−Ｈ４から脱落する又は切断されるＢ７−Ｈ４の任意のポリペプチド断片を包含する。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は、ウエスタンブロット分析によるとき、変性状態の単量体Ｂ７−Ｈ４分子の細胞外ドメイン全体と等しいサイズである約５０ｋＤａであり得る。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は対象の全身を循環し得るか、組織又は微小環境に局在し得るか、又はそれらの組み合わせであり得る。例えば、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は炎症部位又は腫瘍周囲に局在し、又はそこで増加し得る。
【００３１】
用語「膜貫通Ｂ７−Ｈ４」は、膜貫通ドメインを含むＢ７−Ｈ４タンパク質を指す。膜貫通Ｂ７−Ｈ４は、典型的には細胞の細胞膜に固定されているＢ７−Ｈ４タンパク質を指す。
【００３２】
核酸又はタンパク質に関して用語「内因型」の「内因」は、通常宿主に存在するか又はそこで発現する核酸又はタンパク質を指す。この用語はまた、核酸又はタンパク質の不適切な又は異常な発現も包含するが、組換えの核酸又はタンパク質の発現は包含しない。
【００３３】
用語「異種」は、通常見出されないところに存在するエレメントを指す。例えば、あるプロモーターが異種核酸配列、例えば、通常はそのプロモーターに作動可能に連結されていることが見出されない配列に連結されてもよい。本明細書においてプロモーターエレメントの記載に使用するとき、異種とは、配列、種、又は数のいずれかが通常天然プロモーターに見出されるものと異なるプロモーターエレメントを意味する。例えば、プロモーター配列中の異種制御エレメントは、プロモーター制御を増強するために加えられた異なるプロモーターの制御／調節エレメント、又は同じプロモーターの追加の制御エレメントであってもよい。従って用語「異種」には、「外因性」及び「外来」エレメントもまた包含され得る。
【００３４】
「成熟Ｂ７−Ｈ４」ポリペプチドは、リーダー配列のないＢ７−Ｈ４ポリペプチドを指す。成熟Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドはまた、そのポリペプチドの活性に重要な、グリコシル化などのさらなる翻訳後修飾も含み得る。
【００３５】
用語「抗体」は、別段の明確な指示がない限り最も広義の意味で用いられる。従って「抗体」は、天然に存在するものであっても、又は従来のハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体などの人工のものであってもよい。抗Ｂ７−Ｈ４抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びにそれらの抗体の抗原結合ドメイン及び／又は１つ以上の相補性決定領域を含む断片が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片若しくは融合物と特異的に結合し及び／又は所望の生物学的活性を呈する任意の形態の抗体、又はその抗原結合断片を指し、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を、それがＢ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片若しくは融合物に特異的に結合し及び／又は所望の生物学的活性を呈する限りにおいて包含する。本明細書に提供される方法及び組成物においては、任意の特異的抗体を使用することができる。従って、一実施形態において用語「抗体」は、組み合わさって標的抗原に対する特異的結合部位を形成する軽鎖免疫グロブリン分子由来の少なくとも１つの可変領域と重鎖分子由来の少なくとも１つの可変領域とを含む分子を包含する。一実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。例えば、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。抗体の「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、標的、即ち抗原結合領域に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部分として定義される。一実施形態では、それは具体的には、単一の抗Ｂ７−Ｈ４抗体及びそのクローン（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む）並びに多エピトープ特異性を有する抗Ｂ７−Ｈ４抗体組成物を包含する。本方法及び組成物の抗体はモノクローナルであっても、又はポリクローナルであってもよい。抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖可変領域などを含む抗原結合抗体断片の形態であってもよい。インタクトな分子の断片は、酵素消化及び組換え手段を含む当該技術分野において周知の方法を用いて生成し得る。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、Ｂ７−Ｈ４に特異的な抗体の生成には任意の形態の「抗原」を使用することができる。従って、誘発Ｂ７−Ｈ４抗原は、単独の、若しくは当該技術分野において公知の１つ以上の免疫原性増強剤と組み合わせた、単一のエピトープ、複数のエピトープを含み得るか、又はタンパク質全体であり得る。誘発抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも一部をトランスフェクトした細胞で免疫する）、又は可溶性タンパク質（例えば、タンパク質の細胞外ドメイン部分のみで免疫する）であってもよい。抗原は遺伝子改変細胞で産生してもよい。抗原をコードするＤＮＡはゲノムＤＮＡであっても又は非ゲノムＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）であってもよく、細胞外ドメインの少なくとも一部分をコードする。本明細書で使用されるとき、用語「部分」は、目的の抗原の免疫原性エピトープを構成する最小数のアミノ酸又は核酸（適宜）を指す。目的の細胞の形質転換に好適な任意の遺伝子ベクターを、限定はされないが、アデノウイルスベクター、プラスミド、及び非ウイルスベクター、例えばカチオン性脂質などを含め、用いることができる。一実施形態では、本明細書における方法及び組成物の抗体は、目的のＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの少なくとも一部分に特異的に結合する。
【００３７】
本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片は、「生物活性剤」とコンジュゲートされてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「生物活性剤」は、抗原と結合する及び／又は所望の生物学的作用を増強若しくは媒介する任意の合成の又は天然に存在する化合物を指す。
【００３８】
一実施形態では、本発明において有用な結合断片は、生物学的に活性な断片である。本明細書で使用されるとき、用語「生物学的に活性」は、所望の抗原エピトープと結合し、且つ生物学的効果を直接的又は間接的に及ぼす能力を有する抗体又は抗体断片を指す。
【００３９】
「二重特異性」抗体もまた本方法及び組成物において有用である。本明細書で使用されるとき、用語「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体、典型的にはモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、それらのエピトープは同じ抗原のものである。別の実施形態では、それらのエピトープは２つの異なる抗原のものである。二重特異性抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。例えば、二重特異性抗体は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現を用いて組換え産生することができる。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−３９（１９８３）を参照のこと。或いは、二重特異性抗体は化学的連結を用いて調製することができる。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと。二重特異性抗体には二重特異性抗体断片が含まれる。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−４８（１９９３）、Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【００４０】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、特に「キメラ」抗体（重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である一方、残りの鎖が、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である）、並びにかかる抗体の断片が、それが標的抗原と特異的に結合し及び／又は所望の生物学的活性を呈する限りにおいて含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は同義的に使用され、抗体によって認識される構造を指す。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「立体エピトープ」は、抗原アミノ酸配列の不連続な区間を含むエピトープである。抗体は抗原の三次元表面特徴、形状、又は三次構造に基づき立体エピトープと結合する。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「線状エピトープ」は、抗原の連続的なアミノ酸配列により形成されるエピトープである。線状エピトープは、典型的には約５〜約１０個の連続するアミノ酸残基を含む。抗体は抗原の一次配列に基づき線状エピトープと結合する。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「イムノアッセイ」は、１つ又は複数の抗体を使用して抗原と特異的に結合させるアッセイを指す。イムノアッセイは、１つ又は複数の特定の抗体の特異的結合特性を用いた抗原の検出、定量化、及び／又は標的化を特徴とする。
【００４５】
結合剤、例えば抗体とタンパク質、例えばバイオマーカーとの間の「特異的結合」は、捕捉剤又は検出剤が混合物、例えば生体試料中に存在する特定の薬剤に優先的に結合する能力を指す。特異的結合はまた、約１０−６Ｍ未満；好ましくは、約１０−８Ｍ未満；及び、最も好ましくは、約１０−９Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）も意味する。
【００４６】
タンパク質又はペプチドに言及するとき、抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「〜と特異的に（又は選択的に）免疫反応する」という語句は、タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団の中でそのタンパク質の存在を決定するような結合反応を指す。従って、指定されるイムノアッセイ条件下で、その具体的な抗体は特定のタンパク質又はタンパク質複合体に少なくともバックグラウンドの２倍結合し、試料中に存在する他のタンパク質には実質的に有意な量では結合しない。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「標識」又は「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、放射線学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるとおりのもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及びタンパク質又は例えばペプチドに放射標識を組み込むことによって検出可能にすることができるか、若しくはペプチドと特異的に反応する抗体の検出に使用することができる他の実体が含まれる。標識は、核酸、タンパク質及び抗体に任意の位置で組み込み得る。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載される方法を用いるなど、抗体を標識とコンジュゲートするための当該技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「阻害薬」又は「拮抗薬」は、直接的又は間接的に、部分的又は完全に、標的とするバイオマーカーの活性を遮断し、活性化を減少させ、阻止し、遅延させ、活性又は発現を不活性化し、脱感作させ、又は下方制御する化合物又は組成物を指す。拮抗薬は、例えば、抗体などのポリペプチド、及び可溶性受容体、並びにｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡなどの核酸、並びに小化学分子を含めた天然に存在する及び合成のバイオマーカー拮抗薬である。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、その化合物が天然で存在する場合と異なる環境中にあって、例えば、ペプチドを自然中には見られない濃度に濃縮することによるなどしてその天然の環境から切り離されている目的の化合物（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれか）を指す。「単離された」には、目的の化合物が実質的に高濃度化されている及び／又は目的の化合物が部分的又は実質的に精製されている試料中にある化合物が含まれる。
【００５０】
「免疫細胞」は、限定はされないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、及びマクロファージを含む造血系起源の任意の細胞を指す。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、修飾（例えばリン酸化又はグリコシル化）に関わらず、任意の長さのアミノ酸鎖を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「共刺激ポリペプチド」又は「共刺激分子」は、Ｔ細胞上の細胞表面分子と相互作用するとＴ細胞応答を調節するポリペプチドである。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「共刺激シグナル伝達」は、抗原特異的Ｔ細胞応答の間に抗原提示細胞上の共刺激ポリペプチドとＴ細胞上のその受容体との間の相互作用により生じるシグナル伝達活性である。以下の２つのシグナルによって媒介される抗原特異的Ｔ細胞応答：１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣのコンテクストで提示される抗原ペプチドとの会合（シグナル１）、及び２）共刺激受容体／リガンドの種々の対の間の接触によって送達される第２の抗原非依存性シグナル（シグナル２）。この「第２のシグナル」は、Ｔ細胞応答のタイプ（活性化か、対して阻害か）並びに当該の応答の強度及び持続期間の決定において重要であってよく、Ｂ７タンパク質ファミリーなどの共刺激分子からの正及び負の両方のシグナルによって調節される。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｂ７ポリペプチド」は、限定はされないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６を含めた、Ｔ細胞を共刺激するタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー及びその生物学的に活性な断片及び／又は変異体を意味する。生物学的に活性な断片の代表例には、Ｔ細胞を共刺激する細胞外ドメイン又は細胞外ドメインの断片が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「炎症分子」は、限定はされないが、サイトカイン及びメタロプロテアーゼ、例えば、限定はされないが、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、及びＭＭＰなどを含めた、炎症反応をもたらす分子を指す。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製を生じさせるため別のＤＮＡセグメントが挿入され得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。本明細書に記載されるベクターは発現ベクターであってもよい。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターである。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
【００５９】
「作動可能に連結された」は、そのように記載される構成要素がその通常の又は意図された機能を果たすように構成されるエレメントの配置を指す。従って、一体に作動可能に連結された２つの異なるポリペプチドは、物理的に一体に結合されながらもそのそれぞれの生物学的機能を保持している。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「価数」は、分子当たりに利用可能な結合部位の数を指す。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、「保存」アミノ酸置換は、置換後のアミノ酸が同様の構造的又は化学的特性を有する置換である。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、組換えベクターが導入され得る原核及び真核細胞を指す。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「形質転換された」及び「トランスフェクトされた」は、当該技術分野において公知の多くの技法による細胞への核酸（例えばベクター）の導入を包含する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ）」応答、「免疫（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）」応答又は「免疫（ｉｍｍｕｎｅ）」応答は、被投与患者におけるペプチドに対する有益な体液性応答（抗体媒介性）及び／又は細胞性応答（抗原特異的Ｔ細胞又はその分泌産物によって媒介される）の発生である。かかる応答は、免疫原の投与により誘導される能動的応答であることも、又は抗体若しくはプライミングされたＴ細胞の投与により誘導される受動的応答であることもある。細胞性免疫応答は、クラスＩ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の協力によるポリペプチドエピトープの提示により抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞及び／又はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されることによって誘発される。この応答にはまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小グリア細胞、好酸球の活性化、好中球又は自然免疫の他の成分の活性化又は動員も関与する。細胞媒介性免疫応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）又はＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより決定することができる。免疫原の防御又は治療効果に対する体液性応答及び細胞性応答の相対的な寄与は、免疫した同系動物から抗体及びＴ細胞を別々に単離し、且つ第２の対象における防御又は治療効果を計測することにより区別し得る。
【００６５】
「免疫原性剤」又は「免疫原」は、哺乳動物への、場合によりアジュバントと併せた投与時に、それ自体に対する免疫応答を誘導する能力を有する。
【００６６】
用語「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」は、本明細書では同義的に使用され、限定はされないが、ヒト、マウス及びラットなどのげっ歯類、及び他の実験動物を含む哺乳動物を指す。
【００６７】
用語ポリペプチドには、タンパク質及びその断片が含まれる。ポリペプチドは「外因性」であってもよく、これは、細菌細胞により産生されるヒトポリペプチドなど、利用される宿主細胞にとってそのポリペプチドが「異種」である、即ち外来性であることを意味する。ポリペプチドは、本明細書ではアミノ酸残基配列として開示される。それらの配列はアミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右に書かれる。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基配列は以下のように指定されるとおりの三文字記号又は一文字記号のいずれかで表示される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【００６８】
「変異体」は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドと異なるものの、本質的な特性は保持しているポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の、参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。概して違いは限定的であり、参照ポリペプチド及び変異体の配列が全体的に極めて類似していて、多くの領域で同じであるようなものである。変異体と参照ポリペプチドとは、アミノ酸配列が１つ以上の修飾（例えば、置換、付加、及び／又は欠失）だけ異なり得る。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであっても又はそうでなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであってもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。
【００６９】
本開示のポリペプチドの構造に修飾及び変化を設けることができ、それでもなおそのポリペプチドと同様の特性を有する分子を得ることができる（例えば保存的アミノ酸置換）。例えば、特定のアミノ酸が、認め得る程の活性損失なしに配列中の他のアミノ酸を置換し得る。ポリペプチドの相互作用する能力及び性質が、当該のポリペプチドの生物学的機能活性を定義するものであるため、ある種のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列に設け、それでもなお同様の特性を有するポリペプチドを達成し得る。
【００７０】
かかる変化を設ける際には、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。ポリペプチドに相互作用性の生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要さは、概して当該技術分野において理解されている。ある種のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸を置換することができ、それでもなお同様の生物学的活性を有するポリペプチドをもたらし得ることが知られている。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づき疎水性親水性指標が割り当てられている。その指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００７１】
アミノ酸の相対的な疎水性親水性指標特性が、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、ひいてはそれが、そのポリペプチドと他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、抗体、抗原、及び補因子との相互作用を規定すると考えられる。当該技術分野では、あるアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標を有する別のアミノ酸に置換することができ、それでもなお機能的に同等のポリペプチドを達成し得ることは公知である。かかる変化では、アミノ酸の置換は疎水性親水性指標が±２以内であることが好ましく、±１以内のものが特に好ましく、及び±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００７２】
同様のアミノ酸の置換はまた、特にそれにより作成される生物学的機能が同等のポリペプチド又はペプチドを免疫学的実施形態で使用することが意図される場合、親水性に基づき設けることもできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（ｇｌｕｔａｍｎｉｎｅ）（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸が、同様の親水性値を有する別のアミノ酸を置換することができ、それでもなお生物学的に同等の、詳細には免疫学的に同等のポリペプチドを達成し得ることが理解される。かかる変化では、アミノ酸の置換は親水性値が±２以内であることが好ましく、±１以内のものが特に好ましく、及び±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００７３】
上記に概説したとおり、アミノ酸置換は概して、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズなど、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性に基づく。様々な前述の特性を考慮した例示的な置換が当業者に周知されており、以下が挙げられる（元の残基：例示的置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）。従ってこの開示の実施形態は、上記のとおりのポリペプチドと機能的又は生物学的に同等のものを企図する。詳細には、ポリペプチドの実施形態には、目的のポリペプチドと約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する変異体が含まれ得る。
【００７４】
用語「パーセント（％）配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性が達成されるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後の、参照核酸配列中のヌクレオチド又はアミノ酸と同一の候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。アラインメントの計測に適切なパラメータは、比較する配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、公知の方法により決定することができる。
【００７５】
本明細書の目的上、所与のヌクレオチド又はアミノ酸配列Ｃの、所与の核酸配列Ｄに対する、それとの、又はそれと比べた％配列同一性（或いはこれは、所与の配列Ｄに対して、それと、又はそれと比べてある％配列同一性を有する又は含む所与の配列Ｃと表現され得る）は、以下のとおり計算される：
１００×割合Ｗ／Ｚ、
式中、Ｗは配列アラインメントプログラムによりＣ及びＤの当該プログラムのアラインメントで同一のマッチとしてスコア化されたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、及びＺはＤのヌクレオチド又はアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの％配列同一性がＣに対するＤの％配列同一性と等しくないことは理解されるであろう。
【００７６】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用されるとき、プローブと標的配列との間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性がある場合に概してハイブリダイゼーションが起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ変性剪断担体ＤＮＡ、例えばサケ精子ＤＮＡを含む溶液中での一晩のインキュベーションと、続く約６５℃の０．１×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション支持体の洗浄である。他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知されており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）に例示されている。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水及びエマルション、例えば油／水又は水／油エマルション、及び各種の湿潤剤を包含する。
【００７８】
ＩＩ．組成物
１つ以上のＢ７−Ｈ４ポリペプチド又はＢ７−Ｈ４融合タンパク質、又はその断片若しくは変異体に結合する抗体が開示される。本明細書に開示される抗体は、典型的には、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物上に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片である。一部の実施形態では、本抗体は立体エピトープに結合する。一部の実施形態では、本抗体は線状エピトープに結合する。線状エピトープは、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸長であり得る。エピトープは、１つ以上の非アミノ酸エレメント、翻訳後修飾、又はそれらの組み合わせを含み得る。翻訳後修飾の例としては、限定はされないが、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、シトルリン化及びユビキチン化が挙げられる。例えば、抗体は、少なくとも一部において１つ以上の糖基により形成されるエピトープと結合し得る。
【００７９】
本抗体は、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド上及び組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド上、又はその断片若しくは融合物に存在するエピトープに結合し得る。一部の実施形態では、本抗体は、細胞により発現されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド上のエピトープであって、組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片若しくは融合物上ではマスクされているか又は存在しないエピトープに結合する。一部の実施形態では、本抗体は、組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片若しくは融合物上のエピトープであって、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド上ではマスクされているか又は存在しないエピトープに結合する。内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、細胞遊離型のＢ７−Ｈ４及び膜貫通Ｂ７−Ｈ４を含み得る。従って、一部の実施形態では、抗体は、組換えＢ７−Ｈ４タンパク質、例えばＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質と、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４、又は膜貫通Ｂ７−Ｈ４、又はそれらの組み合わせとを区別することができる。本抗体は、研究、診断及び治療適用で使用することができる。
【００８０】
Ａ．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド及び融合タンパク質
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、融合物、並びにＢ７−Ｈ４ポリペプチド及びその断片及び融合物を含む医薬組成物が、米国特許出願公開第２０１２／０１７７６４５号明細書及び同第２０１２／０２７６０９５号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）に開示される。
【００８１】
１．Ｂ７−Ｈ４タンパク質
好ましい実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は哺乳類種由来のＢ７−Ｈ４ポリペプチドに結合し得る。例えば、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、マウス、非ヒト霊長類（チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）又はカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））、又はヒト起源であり得る。マウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８５９４又はＡＹ２８０９７３を有する核酸によりコードされるＢ７−Ｈ４ポリペプチドと少なくとも８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有し得る。有用なマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ３２９２５．１又はＮＰ＿８４８７０９．２によるＢ７−Ｈ４ポリペプチドと少なくとも約８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０２６０７１を有する核酸によりコードされるＢ７−Ｈ４ポリペプチドと少なくとも約８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７８９０２．２又はＢＡＢ１５３４９．１によるＢ７−Ｈ４ポリペプチドと少なくとも約８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有する。
【００８２】
例えば、ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る：
【化１】
2016505843.tif 000002
（配列番号１）。
【００８３】
一部の実施形態では、ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する：
【化２】
2016505843.tif 000003
（配列番号２）。
【００８４】
シグナル配列を含まない配列番号２のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る
【化３】
2016505843.tif 000004
（配列番号３）。
【００８５】
一部の実施形態では、ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する：
【化４】
2016505843.tif 000005
（配列番号４）。
【００８６】
シグナル配列を含まない配列番号４のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る
【化５】
2016505843.tif 000006
（配列番号５）。
【００８７】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする核酸は、選択の発現宿主での発現用に最適化され得る。Ｂ７−Ｈ４核酸配列が由来する哺乳動物と発現宿主との間のコドン使用頻度の違いを考慮して、同じアミノ酸をコードする代替のコドンにコドンを置き換え得る。このようにして、核酸が発現宿主−好ましいコドンを使用して合成され得る。
【００８８】
２．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片
Ｂ７−Ｈ４タンパク質は細胞外ドメイン内に２つの免疫グロブリンドメイン、ＩｇＶドメイン（又はＶドメイン）とＩｇＣドメイン（又はＣドメイン）とを含み、これらは抗体の可変及び定常ドメインに関係している。これらのドメインは当業者によってファミリー及びドメインデータベースを検索することにより同定され得る。Ｂ７リガンドファミリーメンバーのＩｇＶドメインは、受容体結合を媒介すると考えられている。ＩｇＣドメインは、タンパク質構造を安定化させ、且つリガンド−受容体相互作用の全体的な結合親和性に寄与すると考えられている。細胞外ドメインの各Ｉｇドメインは、この折り畳みに典型的であるとおりドメイン内システイン残基間に形成された１つのジスルフィド結合を含み、構造−機能にとって重要であり得る。配列番号２及び４では、これらのシステインがＩｇＶドメインについては残基５６及び１３０に位置し、ＩｇＣドメインについては１６８及び２２５に位置する。
【００８９】
例えば、一部の実施形態では、ＩｇＶドメインは、以下のヒトアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む：
【化６】
2016505843.tif 000007
（配列番号６）、又は
【化７】
2016505843.tif 000008
（配列番号４８）、又は
【化８】
2016505843.tif 000009
（配列番号７）、又は
【化９】
2016505843.tif 000010
（配列番号４９）。
【００９０】
一部の実施形態では、ＩｇＣドメインは、以下のヒトアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む：
【化１０】
2016505843.tif 000011
（配列番号５０）、
【化１１】
2016505843.tif 000012
（配列番号５１）、
【化１２】
2016505843.tif 000013
（配列番号５２）、
【化１３】
2016505843.tif 000014
（配列番号５３）、又は
【化１４】
2016505843.tif 000015
（配列番号５４）。
【００９１】
一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４の断片はＩｇＶ及びＩｇＣドメインを含み、しかし細胞外ドメイン全体は含まない。例えば、一部の実施形態では、完全長Ｂ７−Ｈ４の断片は、以下のヒトアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む：
【化１５】
2016505843.tif 000016
（配列番号８）、又は
【化１６】
2016505843.tif 000017
（配列番号９）。
【００９２】
加えて、ＩｇＶドメインに１つの予想されるＮ−結合型グリコシル化部位があり、且つＩｇＣドメインに６つのグリコシル化部位があり、これらはマウス及びヒトのＢ７−Ｈ４配列間で保存されている。
【００９３】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片には細胞遊離断片が含まれる。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド断片は、産生細胞から脱落し、分泌され又は他の形で抜き取られ得るＢ７−Ｈ４ポリペプチドの断片である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞遊離断片は、ポリペプチドの細胞外ドメインの一部又は全てを含み、且つ細胞内及び／又は膜貫通ドメインの一部又は全てを欠いていてもよい。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド断片はＢ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメイン全体を含む。他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞遊離断片は、Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を保持している細胞外ドメインの断片を含む。細胞外ドメインは、膜貫通ドメインの１、２、３、４、又は５個の連続するアミノ酸、及び／又はシグナル配列の１、２、３、４、又は５個の連続するアミノ酸を含み得る。或いは、細胞外ドメインは、１、２、３、４、５個又はそれ以上のアミノ酸がＣ末端、Ｎ末端、又はその両方から取り除かれていてもよい。一部の実施形態では、細胞外ドメインはＩｇＶドメインのみであるか、又は完全長タンパク質の残基５６及び１３０に位置するＩｇＶドメインの保存されたシステイン間にある領域である。
【００９４】
概して、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現する。概してシグナル配列が未成熟ポリペプチドから切断されることで、シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生じる。配列番号３及び５は、各々、シグナルペプチドを欠いている。Ｂ７−Ｈ４のシグナル配列、及び場合により、ＩｇＶドメインの１、２、３、４、５個、又はそれ以上のアミノ酸を、標準的な分子生物学的技術を用いて別のポリペプチドのシグナル配列に置き換え、ポリペプチドの発現レベル、分泌、溶解度、又は他の特性に影響を与えることができる。Ｂ７−Ｈ４シグナル配列の置換に使用されるシグナル配列は、当該技術分野において公知の任意のものであってよい。配列番号２及び４は、各々、内因性Ｂ７−Ｈ４シグナルペプチド（配列番号２及び４のアミノ酸１〜約アミノ酸２４）を含み、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ７Ｚ７Ｄ３．１を参照のこと。
【００９５】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、並びにその断片及び融合物が、シグナル配列を含むもの及び含まないものの両方ともに、本明細書に提供される。成熟タンパク質、即ちシグナル配列を含まないタンパク質配列は、推定成熟タンパク質であることが理解される。正常な細胞発現では、細胞ペプチダーゼによってシグナル配列が取り除かれ、成熟タンパク質が生じ得る。シグナル配列の生体内切断後に発現する実際の成熟タンパク質は、多くが、本明細書に提供される推定成熟タンパク質より１、２、３、４、５、６、７、又は８個多い；又は１、２、３、４、５、６、７、又は８個少ないアミノ酸を含む。また、本明細書に提供される推定成熟タンパク質をコードする核酸配列を、５’末端に内在性又は異種シグナル配列をコードする核酸配列を含むように修飾することができ、これが細胞内で発現すると、本明細書に提供されるそうした推定成熟タンパク質などの成熟Ｂ７−Ｈ４タンパク質、又は断片、又はその融合物が生じることも理解される。
【００９６】
３．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの変異体
有用な変異体としては、本明細書に記載されるアッセイのいずれかにより示されるとおり、生物学的活性を増加させるもの、又はタンパク質の半減期若しくは安定性を増加させるものが挙げられる。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド及びＢ７−Ｈ４断片、又はＢ７−Ｈ４活性を有するその融合物は、生物学的活性が増加するように操作することができる。好ましい実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又は融合タンパク質は、免疫細胞、例えばＴ細胞との分子の結合を増加させ且つＴ細胞に阻害シグナルを伝達する少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は挿入によって修飾されている。
【００９７】
他の好ましい変異体は、他の免疫細胞と比べてある種類のＴ細胞に選択的に結合するように操作されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドである。例えば、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、又はＴｈ２２細胞に優先的に結合するように操作することができる。優先的結合とは、ある種類の細胞に対する結合が、別の種類の細胞と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上上回る結合を指す。
【００９８】
Ｂ７−Ｈ４のさらに他の変異体は、野生型Ｂ７−Ｈ４と比べて免疫細胞との結合が低下するように操作することができる。これらの変異体を、より強い結合特性を有する変異体と組み合わせて使用することにより、適度の影響の免疫応答を調節することができる。
【００９９】
最後に、変異体Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、野生型と比べて半減期が増加するように操作することができる。これらの変異体は、典型的には酵素分解に抵抗するように修飾される。例示的な修飾としては、酵素分解に抵抗する修飾アミノ酸残基及び修飾ペプチド結合が挙げられる。これを達成する様々な修飾が当該技術分野において公知である。例えば、Ｂ７−Ｈ４の膜近傍領域は二塩基モチーフＫＲＲＳを含み、これは潜在的に、例えばプロテアーゼのプロタンパク質転換酵素ファミリーのメンバーによって認識及び切断され得る。このモチーフ（ＫＲＲＳ）を除去、遮断、又は修飾することにより、半減期を増加させることができる。変異体は、血清及びエンドソームｐＨで受容体に対する親和性がＢ７−Ｈ４ポリペプチド、断片、又はその融合物の半減期に及ぼす効果が調整されるように修飾されてもよい。
【０１００】
４．Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、第２のポリペプチドに直接融合するか又は第２のポリペプチドに融合しているリンカーペプチド配列を介して融合した、Ｂ７−Ｈ４タンパク質の全て又は一部を含む第１の融合パートナーを有する。融合タンパク質は、２つ以上の融合タンパク質を二量体化又は多量体化する働きをするドメインを場合により含む。ペプチド／ポリペプチドリンカードメインは別個のドメインであってもよく、或いは融合タンパク質の他のドメインの一つ（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又は第２のポリペプチド）の中に含まれていてもよい。同様に、融合タンパク質を二量体化又は多量体化する働きをするドメインは、別個のドメインであってもよく、或いは融合タンパク質の他のドメインの一つ（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、第２のポリペプチド又はペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の中に含まれていてもよい。一実施形態では、二量化／多量体化ドメインとペプチド／ポリペプチドリンカードメインは同じである。
【０１０１】
本明細書に開示される融合タンパク質は、式Ｉ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
のものであり、式中、「Ｎ」は融合タンパク質のＮ末端を表し、「Ｃ」は融合タンパク質のＣ末端を表す。好ましい実施形態では、「Ｒ１」はＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ２」は、任意選択のペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、及び「Ｒ３」は第２のポリペプチドである。或いは、Ｒ３がＢ７−Ｈ４ポリペプチドであってもよく、Ｒ１が第２のポリペプチドであってもよい。
【０１０２】
二量化又は多量体化は２つ以上の融合タンパク質の間で又はそれらの中で二量化又は多量体化ドメインを介して起こり得る。或いは、融合タンパク質の二量化又は多量体化は化学的架橋によって起こり得る。形成される二量体又は多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体又はヘテロ二量体／ヘテロ多量体であり得る。
【０１０３】
一実施形態では、第１の融合パートナーはＢ７−Ｈ４の断片である。本明細書で使用されるとき、Ｂ７−Ｈ４の断片は、完全長タンパク質より短い少なくとも１つのアミノ酸であるポリペプチドの任意のサブセットを指す。有用な断片は、その天然の１つ又は複数の受容体に結合する能力を保持しているものである。完全長Ｂ７−Ｈ４の断片であるＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、典型的には完全長Ｂ７−Ｈ４と比較してその天然の受容体と結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有し、又はさらには１００パーセントを超える能力を有する。
【０１０４】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、Ｉｇ  Ｆｃ領域と融合したＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン、又はその断片を含み、且つ膜貫通ドメインを含まない。組換えＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質は、以前記載されているとおり（Ｃｈａｐｏｖａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，４５：２４７−２５５（２０００））、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメイン又はその断片のコード領域をヒトＩｇＧ１若しくはマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域、又は他の好適なＩｇドメインと融合することにより調製し得る。
【０１０５】
ａ．例示的融合タンパク質
一部の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化１７】
2016505843.tif 000018
（配列番号１０）。
【０１０６】
シグナル配列を含まない配列番号１０のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化１８】
2016505843.tif 000019
（配列番号１１）。
【０１０７】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化１９】
2016505843.tif 000020
（配列番号１２）。
【０１０８】
シグナル配列を含まない配列番号１２のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化２０】
2016505843.tif 000021
（配列番号１３）。
【０１０９】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化２１】
2016505843.tif 000022
（配列番号１４）。
【０１１０】
シグナル配列を含まない配列番号１４のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化２２】
2016505843.tif 000023
（配列番号１５）。
【０１１１】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化２３】
2016505843.tif 000024
（配列番号１６）。
【０１１２】
シグナル配列を含まない配列番号１６のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化２４】
2016505843.tif 000025
（配列番号１７）。
【０１１３】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化２５】
2016505843.tif 000026
（配列番号１８）。
【０１１４】
シグナル配列を含まない配列番号１８のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化２６】
2016505843.tif 000027
（配列番号１９）。
【０１１５】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化２７】
2016505843.tif 000028
（配列番号２０）。
【０１１６】
シグナル配列を含まない配列番号２０のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化２８】
2016505843.tif 000029
（配列番号２１）。
【０１１７】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化２９】
2016505843.tif 000030
（配列番号２２）。
【０１１８】
シグナル配列を含まない配列番号２２のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化３０】
2016505843.tif 000031
（配列番号２３）。
【０１１９】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化３１】
2016505843.tif 000032
（配列番号２４）。
【０１２０】
シグナル配列を含まない配列番号２４のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化３２】
2016505843.tif 000033
（配列番号２５）。
【０１２１】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化３３】
2016505843.tif 000034
（配列番号２６）。
【０１２２】
シグナル配列を含まない配列番号２６のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化３４】
2016505843.tif 000035
（配列番号２７）。
【０１２３】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化３５】
2016505843.tif 000036
（配列番号２８）。
【０１２４】
シグナル配列を含まない配列番号２８のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化３６】
2016505843.tif 000037
（配列番号２９）。
【０１２５】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化３７】
2016505843.tif 000038
（配列番号３０）。
【０１２６】
シグナル配列を含まない配列番号３０のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化３８】
2016505843.tif 000039
（配列番号３１）。
【０１２７】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化３９】
2016505843.tif 000040
（配列番号３２）。
【０１２８】
シグナル配列を含まない配列番号３２のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化４０】
2016505843.tif 000041
（配列番号３３）。
【０１２９】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化４１】
2016505843.tif 000042
（配列番号３４）。
【０１３０】
シグナル配列を含まない配列番号３４のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化４２】
2016505843.tif 000043
（配列番号３５）。
【０１３１】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化４３】
2016505843.tif 000044
（配列番号３６）。
【０１３２】
シグナル配列を含まない配列番号３６のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化４４】
2016505843.tif 000045
（配列番号３７）。
【０１３３】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する：
【化４５】
2016505843.tif 000046
（配列番号３８）。
【０１３４】
シグナル配列を含まない配列番号３８のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は以下となり得る：
【化４６】
2016505843.tif 000047
（配列番号３９）。
【０１３５】
前述の例示的融合タンパク質は、本明細書に記載される変異体の任意の組み合わせを取り入れることができる。別の実施形態では、前述の例示的融合タンパク質の末端リジンが欠失している。
【０１３６】
開示される融合タンパク質は標準的な分子生物学的技術を用いて単離することができる。例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターがリン酸カルシウム沈殿によって２９３細胞にトランスフェクトされ、無血清ＤＭＥＭ中で培養される。７２時間で上清が回収され、融合タンパク質が、プロテインＧ、又は好ましくはプロテインＡセファロース（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）によって精製される。
【０１３７】
ｂ．ペプチド及びポリペプチド修飾
融合タンパク質は、例えば、リン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化及びユビキチン化など、通常の細胞環境下でポリペプチドに存在し得る化学的部分により修飾されてもよい。融合タンパク質はまた、限定はされないが、放射性同位元素及び蛍光化合物を含めた、検出可能なシグナルを提供することが可能な標識で直接的に或いは間接的に修飾されてもよい。
【０１３８】
融合タンパク質はまた、通常は細胞環境下でポリペプチドに加えられることのない化学的部分により修飾されてもよい。例えば、開示される融合タンパク質はまた、限定はされないが、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）鎖（即ちペグ化）を含めた、高分子鎖の共有結合により修飾されてもよい。最近になって、巨大分子とＰＥＧとのコンジュゲーションが、種々の薬物の薬物動態（ＰＫ）プロファイルの改変、従ってその治療可能性の改善に有効な戦略として出現している。ＰＥＧコンジュゲーションは、酵素消化から保護し、腎臓によるろ過を遅延させ、且つ中和抗体の産生を低減することにより、循環中における薬物の貯留を増加させる。加えてＰＥＧコンジュゲートは、融合タンパク質を多量体化させるために使用することができる。
【０１３９】
修飾は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基との反応能を有する有機誘導体化剤と反応させることにより分子に導入され得る。別の修飾は、タンパク質の環化である。
【０１４０】
ポリペプチドの化学的誘導体の例としては、コハク酸又は他のカルボン酸無水物で誘導体化されたリシニル及びアミノ末端残基が挙げられる。環状カルボン酸無水物による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；及びグリオキシル酸によるアミノ基転移酵素触媒反応が挙げられる。カルボキシル側基のアスパルチル又はグルタミルが、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾されてもよい。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニアとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。融合タンパク質はまた、１つ以上のＬ−アミノ酸に代えて１つ以上のＤ−アミノ酸を含んでもよい。
【０１４１】
ｃ．結合特性の改良
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片及び融合物（まとめてＢ７−Ｈ４ポリペプチドと称される）の結合特性は、投与される用量及び用量レジメンに関係する。一実施形態では、開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、免疫細胞上の受容体分子の占有がその受容体分子の他のリガンドと比べてより長い期間である、又はより高い割合であることを実証するＴ細胞上の少なくとも１つの受容体に対する結合特性を有する。他の実施形態では、開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、野生型Ｂ７−Ｈ４と比べてＴ細胞上の受容体に対する結合親和性が低下しており、タンパク質が投与後３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間、２週間、１週間、又は数日未満の期間で解離することを可能にする。
【０１４２】
一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又は断片、又はその融合物は、その受容体に対して比較的高い親和性を有し、従ってオフ速度が比較的低速であり得る。他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは数日、数週間又は数ヶ月の期間にわたり間欠的に投与され、それにより免疫応答が抑えられることで次の投与前に回復させることが可能となり、これは免疫応答を完全に消すことなく免疫応答を低減する働きをし得るとともに、長期にわたる副作用を回避し得る。
【０１４３】
５．単離核酸分子
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片及び融合物をコードする単離核酸配列が本明細書に開示される。有用なマウスＢ７−Ｈ４核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８５９４又はＡＹ２８０９７３を有するＢ７−Ｈ４核酸と少なくとも約８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０２６０７１を有するＢ７−Ｈ４核酸と少なくとも約８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有する。本明細書で使用されるとき「単離核酸」は、通常哺乳類ゲノムにおいて核酸の片側又は両側に隣接する核酸（例えば、非Ｂ７−Ｈ４タンパク質をコードする核酸）を含めた、哺乳類ゲノム中に存在する他の核酸分子と切り離されている核酸を指す。用語「単離された」にはまた、本明細書で核酸に関連して使用されるとき、任意の天然に存在しない核酸配列との組み合わせも含まれ、これはかかる天然に存在しない配列が自然中に見られず、且つ天然に存在するゲノム中では直ちに隣接する配列を有しないためである。
【０１４４】
単離核酸は、例えばＤＮＡ分子であってもよいが、但し、通常天然に存在するゲノム中で当該のＤＮＡ分子に直ちに隣接して見られる核酸配列の一つが取り除かれているか又は存在しないものとする。従って、単離核酸には、限定なしに、他の配列と独立して別個の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸、又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されたｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ断片）、並びにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）に組み込まれるか、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡが含まれる。加えて、単離核酸には、ハイブリッド又は融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの操作された核酸が含まれ得る。例えばｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリ内、又はゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲル切片内の数百個乃至数百万個の他の核酸の中に存在する核酸は、単離核酸とは見なされない。
【０１４５】
ポリペプチドをコードする核酸は、選択の発現宿主での発現用に最適化され得る。Ｂ７−Ｈ４核酸配列が由来する哺乳動物と発現宿主との間のコドン使用頻度の違いを考慮して、同じアミノ酸をコードする代替のコドンにコドンを置き換え得る。このようにして、核酸が発現宿主−好ましいコドンを使用して合成され得る。
【０１４６】
核酸はセンス方向又はアンチセンス方向であってよく、又はＢ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする参照配列に相補的であってもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は核酸類似体であってもよい。核酸類似体は、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において修飾され得る。かかる修飾は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を改善し得る。塩基部分での修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、及びデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジン又は５−ブロモ−２’−デオキシシチジンが含まれ得る。糖部分の修飾には、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾による２’−Ｏ−メチル糖又は２’−Ｏ−アリル糖の形成が含まれ得る。デオキシリボースリン酸骨格の修飾は、モルホリノ核酸（各塩基部分が６員のモルホリノ環に連結されている）、又はペプチド核酸（デオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格に置き換えられ、且つ４個の塩基が保持されている）を生じ得る。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７：１８７−１９５；及びＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５−２３を参照のこと。加えて、デオキシリン酸骨格を、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルリン酸トリエステル骨格に置き換えることができる。
【０１４７】
ポリペプチドをコードする核酸は、それを必要とする対象に投与することができる。核酸送達には、「外来」核酸を細胞に、及び最終的には生きた動物に導入することが関わる。対象に核酸を送達するための組成物及び方法は、当該技術分野において公知である（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｎ．Ｒ．，ｅｄ．，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００８を参照のこと）。
【０１４８】
６．ベクター及び宿主細胞
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片及び融合物をコードするベクターもまた提供される。上記に記載されるような核酸が、細胞で発現させるためのベクターに挿入され得る。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス又はコスミドなどのレプリコンであり、そこに別のＤＮＡセグメントが挿入されることにより、挿入されたセグメントの複製がもたらされ得る。ベクターは発現ベクターであってもよい。「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
【０１４９】
ベクター中の核酸は、１つ以上の発現制御配列に作動可能に連結されてもよい。本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」は、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子コンストラクトに組み込まれていることを意味する。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、典型的には転写が始まる点（概してＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位近傍）の上流１００ヌクレオチドの範囲内の、ＤＮＡ分子のある領域から構成される発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くには、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に置くことが必要である。エンハンサーは、時間、位置、及びレベルの点で発現特異性を提供する。プロモーターと異なり、エンハンサーは転写部位から様々な距離に位置するときに機能することができる。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流にも位置し得る。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコード配列をｍＲＮＡに転写することができるとき、細胞において発現制御配列に「作動可能に連結されている」とともに、その「制御下にある」とされ、次にはこのｍＲＮＡが、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳され得る。
【０１５０】
好適な発現ベクターとしては、限定なしに、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルスに由来するプラスミド及びウイルスベクターが挙げられる。数多くのベクター及び発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの企業から市販されている。
【０１５１】
発現ベクターはタグ配列を含み得る。タグ配列は、典型的にはコードされるポリペプチドとの融合物として発現する。かかるタグは、カルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこに挿入されてもよい。有用なタグの例としては、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質及びプロテインＡが挙げられる。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドをコードする核酸分子が、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を好ましくは有するＩｇ重鎖定常領域の１つ以上のドメインをコードする核酸を含むベクター中に存在する。
【０１５２】
発現させる核酸を含むベクターは、宿主細胞に移入させることができる。用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターを導入することのできる原核細胞及び真核細胞を含むことが意図される。本明細書で使用されるとき、「形質転換された」及び「トランスフェクトされた」は、多くの技法のうちの一つによって核酸分子（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。特定の技法に限定されるものではないが、これらの技法の多くが当該技術分野で十分に確立されている。原核細胞は、例えば電気穿孔又は塩化カルシウムの媒介による形質転換により、核酸で形質転換することができる。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランの媒介によるトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、又はマイクロインジェクションを含む技法によって哺乳類細胞にトランスフェクトすることができる。宿主細胞（例えば、原核細胞又はＣＨＯ細胞などの真核細胞）を使用して、例えば、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドを産生することができる。
【０１５３】
記載されるベクターを使用して、細胞、例えば、膵島細胞などの移植用細胞においてＢ７−Ｈ４ポリペプチドを発現させることができる。例示的ベクターとしては、限定はされないが、アデノウイルスベクターが挙げられる。一つの手法には、培養下の初代細胞への核酸移入と、続く宿主に対するエキソビボ形質転換細胞の全身的な、或いは特定の臓器又は組織への自家移植が含まれる。エキソビボ方法には、例えば、対象から細胞を回収するステップ、細胞を培養するステップ、それらの細胞に発現ベクターを形質導入するステップ、及びコードされたポリペプチドの発現に好適な条件下に細胞を維持するステップが含まれ得る。これらの方法は分子生物学の技術分野において公知である。形質導入ステップは、例えば、リン酸カルシウム、リポフェクション、電気穿孔、ウイルス感染、及び微粒子銃遺伝子移入を含めた、エキソビボ遺伝子療法に使用される任意の標準的な手段によって達成することができる。或いは、リポソーム又は高分子マイクロパーティクルを使用することができる。次に形質導入が成功した細胞を、例えばコード配列の発現又は薬剤耐性遺伝子の発現で選択することができる。次に細胞は、（必要であれば）致死的放射線を照射し、対象に注入又は移植することができる。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターは、それを必要とする対象に投与される細胞にトランスフェクトされる。
【０１５４】
インビボ核酸療法は、機能的に活性なＤＮＡをインビボで哺乳類体細胞組織又は臓器に直接移入することにより達成し得る。例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸をリンパ組織又は腫瘍に直接投与することができる。或いは、リンパ組織特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）、例えば、Ｂリンパ球特異的、Ｔリンパ球特異的、又は樹状細胞特異的ＴＲＥを使用して、リンパ組織特異的ターゲティングを実現し得る。リンパ組織特異的ＴＲＥは、当該技術分野において公知である。
【０１５５】
核酸はまた、インビボでウイルス手段によって投与されてもよい。融合タンパク質をコードする核酸分子が、当該技術分野において周知されているとおり、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を使用してレトロウイルスベクターにパッケージングされ得る。組換えアデノウイルス及びワクシニアウイルスを含め、非複製性にすることのできる他のウイルスベクターもまた用いられ得る。ネイキッドＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はウイルスベクターに加え、操作された細菌をベクターとして使用することもできる。
【０１５６】
核酸はまた、リポソーム、高分子マイクロ粒子及びナノ粒子並びにポリカチオン、例えばアシアロ糖タンパク質／ポリリジンを含む他の担体によっても送達され得る。
【０１５７】
インビボでのウイルスの媒介及び担体の媒介による遺伝子移入に加え、プラスミドＤＮＡの投与及び微粒子ボンバードメントの媒介による遺伝子移入を含めた当該技術分野で周知の物理的手段を、ＤＮＡの直接移入に使用することができる。
【０１５８】
７．製造方法
ａ．ポリペプチドの作製方法
開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片及び融合物は、当該技術分野において公知の従来技術を用いて製造することができる。単離融合タンパク質は、例えば化学合成によるか、又は宿主細胞での組換え産生によって得ることができる。ポリペプチドを組換え産生するには、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を使用して細菌又は真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母、又は哺乳類細胞）が形質転換、形質導入、又はトランスフェクトされ得る。一般に、核酸コンストラクトは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む。調節配列（本明細書では発現制御配列とも称される）は、典型的には遺伝子産物をコードしな代わりに、それらが作動可能に連結されている核酸配列の発現に作用する。
【０１５９】
ポリペプチドの発現及び産生に有用な原核細胞株及び真核細胞株は、例えば、ＢＬ−２１などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株、及びＣＨＯ細胞などの培養哺乳類細胞を含め、当該技術分野において周知されている。
【０１６０】
真核生物宿主細胞では、融合タンパク質の発現に多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。ウイルスベースの発現系は当該技術分野において周知されており、限定はされないが、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルス、又はワクシニアベースのウイルスベクターが挙げられる。
【０１６１】
ポリペプチドを安定に発現する哺乳類細胞株は、適切な制御エレメント及び選択可能なマーカーを含む発現ベクターを使用して作製することができる。例えば、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐ９１０２３（Ｂ）（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：８１０−８１５を参照）が、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞、及びヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における変異ポリペプチドの発現に好適である。さらなる好適な発現系としては、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄから入手可能なＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）が挙げられる。
【０１６２】
電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム、又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、又は他の好適なトランスフェクション方法による発現ベクターの導入後、安定な細胞株を（例えば、代謝選択、又はＧ４１８、カナマイシン、若しくはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性により）選択することができる。トランスフェクト細胞を、目的のポリペプチドが発現するように培養することができ、そのポリペプチドを例えば細胞培養上清から、又は溶解細胞から回収し得る。或いは、融合タンパク質は、（ａ）増幅配列をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの哺乳類発現ベクターにライゲートし、及び（ｂ）コムギ胚芽抽出物又はウサギ網状赤血球ライセートを使用してインビトロで転写及び翻訳することにより、作製することができる。
【０１６３】
ポリペプチドは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換（ｅｘｈａｎｇｅ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過、及びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフ法を用いて単離することができる。一部の実施形態では、アフィニティーマトリックス上へのポリペプチドの捕捉を可能にするアミノ酸配列を含むさらなるドメインが含まれるようにポリペプチドを操作することができる。例えば、細胞培養上清又は細胞質抽出物中のＦｃ融合ポリペプチドは、プロテインＡカラムを使用して単離することができる。加えて、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、又はＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）などのタグを使用してポリペプチド精製を促進することができる。かかるタグは、カルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。有用であり得る他の融合物としては、アルカリホスファターゼなどの、ポリペプチドの検出に役立つ酵素が挙げられる。イムノアフィニティークロマトグラフィーもまたポリペプチドの精製に用いることができる。ポリペプチドは、さらに、それを産生する細胞によるポリペプチドの分泌を生じさせる分泌シグナルを含むように操作することができる（分泌シグナルが既に存在しない場合）。分泌されたポリペプチド、例えば融合タンパク質は、次に好都合には細胞培地から単離することができる。
【０１６４】
ｂ．単離核酸分子の作製方法
単離核酸分子は、限定なしに、一般的な分子クローニング及び化学的核酸合成技法を含めた標準的な技法により作製することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、ポリペプチドをコードする単離核酸を得ることができる。ＰＣＲは、標的核酸が酵素的に増幅される技法である。典型的には、目的の領域の末端又はその先からの配列情報を用いることにより、増幅する鋳型の逆鎖と配列が同じであるオリゴヌクレオチドプライマーが設計され得る。ＰＣＲを使用すると、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡからの配列を含め、ＤＮＡ並びにＲＮＡから特定の配列を増幅することができる。プライマーは典型的には１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長の範囲に及び得る。一般的なＰＣＲ技法については、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．ｂｙ  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載される。ＲＮＡを鋳型源として使用する場合、逆転写酵素を使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製法又は核酸配列ベースの増幅もまた、単離核酸を得るために使用することができる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２：１；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８；及びＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２−１２９３を参照のこと。
【０１６５】
単離核酸は、単一の核酸分子として、或いは一連のオリゴヌクレオチドとして（例えば、３’から５’方向の自動ＤＮＡ合成用のホスホラミダイト技法を用いて）化学的に合成することができる。例えば、所望の配列を含む長いオリゴヌクレオチド（例えば、＞１００ヌクレオチド）の１つ以上の対を合成することができ、ここでは各対が相補性の短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含み、従ってそれらのオリゴヌクレオチド対がアニールされると二重鎖が形成される。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長すると、オリゴヌクレオチド対当たり一つの二本鎖核酸分子を得ることができ、次にそれをベクターにライゲートすることができる。単離核酸はまた、突然変異誘発によって得ることもできる。ポリペプチドをコードする核酸を、ＰＣＲによるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発及び／又は部位特異的突然変異誘発を含め、標準的な技法を用いて突然変異させることができる。Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，編者Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９２を参照のこと。修飾することのできるアミノ酸位置の例としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。
【０１６６】
Ｂ．抗Ｂ７−Ｈ４抗体
１．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドに結合する抗体
１つ以上のＢ７−Ｈ４ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片が開示される。組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物が抗体によって認識されるエピトープを含むとき、抗体はまた、その組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物にも結合することができる。一部の実施形態では、抗体は、細胞により発現されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド上のエピトープであって、組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片若しくは融合物上ではマスクされているか又は存在しないエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド又はその断片若しくは融合物上のエピトープであって、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド上上ではマスクされているか又は存在しないエピトープに結合する。
【０１６７】
抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその抗原（ａｎｉｔｇｅｎ）結合断片は、検出可能なマーカーで標識するか又は第２の分子とコンジュゲートすることができる。好適な検出可能なマーカーとしては、限定はされないが、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、ビオチン、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素が挙げられる。一部の実施形態では、第２の分子は薬物である。さらに、２つ以上のＢ７−Ｈ４エピトープに特異的な二重特異的抗体を、概して当該技術分野において公知の方法を用いて生成することができる。ホモ二量体抗体もまた、当該技術分野において公知の架橋技法（例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）によって生成することができる。
【０１６８】
ａ．Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメインに結合する抗体
抗体は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのＩｇＶドメイン内にあるエピトープと結合し得る。典型的には、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメインは、ＩｇＶドメイン内部のジスルフィド結合の形成に重要であり得る保存されたシステイン残基を含む。従って、抗体は、Ｎ末端メチオニンから付番して配列番号２（即ち、配列番号６）又は配列番号４（即ち、配列番号７）の約アミノ酸５６とアミノ酸１３０との間を含むＩｇＶドメインの４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープに結合することができる。
【０１６９】
ＩｇＶドメインは、配列番号２又は配列番号４の約アミノ酸３７から約アミノ酸１５４を含み得る。従って、一部の実施形態では、抗体は、Ｎ末端メチオニンから付番して配列番号２又は配列番号４の約アミノ酸３７とアミノ酸１５４との間を含むＩｇＶドメインの４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープに結合する。
【０１７０】
抗体は、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメインの三次元表面特徴、形状、又は三次構造を含む立体エピトープと結合することができる。
【０１７１】
一部の実施形態では、抗体は、細胞により発現される膜貫通Ｂ７−Ｈ４、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４、並びにＩｇＶドメインを含むその組換え断片及び融合物と結合するが、ＩｇＶの一部又は全てを欠失させたＢ７−Ｈ４の組換え断片及び融合物には結合しない。例えば、一部の実施形態では、抗体は配列番号２、４、１０、１８、２８、３０、３２、３４、３８のポリペプチド、又はそれらの組み合わせに結合するが、配列番号３６には結合しない。従って、一部の実施形態では、抗体は、以下の範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープに結合する
【化４７】
2016505843.tif 000048
（配列番号４０）、又は
【化４８】
2016505843.tif 000049
（配列番号４１）、又は
【化４９】
2016505843.tif 000050
（配列番号４２）、又は
【化５０】
2016505843.tif 000051
（配列番号４３）。
【０１７２】
従って、この抗体は、配列番号４０、４１、４２、又は４３を含むポリペプチドとの特異的結合に使用することができる。
【０１７３】
Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメイン、例えば配列番号４０、４１、４２、又は４３の配列を含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドに結合する例示的抗体としては、クローン２Ｈ９が挙げられる。
【０１７４】
一部の実施形態では、抗体はＢ７−Ｈ４の「Ｌ」変異体に結合するが、「Ｑ」変異体には結合しない。「Ｌ」及び「Ｑ」変異体とは、完全長Ｂ７−Ｈ４の開始メチオニンから付番してアミノ酸位置番号５４にロイシン（「Ｌ」）又はグルタミン（「Ｑ」）を有するＢ７−Ｈ４ポリペプチドを指す。例えば、「Ｌ」変異体である配列番号２及び３、並びに「Ｑ」変異体である配列番号４及び５を参照のこと。従って、一部の実施形態では、抗体は、アミノ酸配列の配列番号４２又は配列番号４３の範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープに結合するが、アミノ酸配列の配列番号４０又は配列番号４１の範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープには結合しない。従って、この抗体は、配列番号４２又は４３を含むが４０又は４１は含まないポリペプチドとの特異的結合に使用することができる。Ｂ７−Ｈ４「Ｌ」変異体のＩｇＶドメインに結合するが、Ｂ７−Ｈ４「Ｑ」変異体のＩｇＶドメイン、例えば配列番号４２又は４３の配列を含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドには結合しない例示的な抗体としては、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１が挙げられる。従って、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＢ７−Ｈ４−Ｉｇに結合することができるが、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＢ７−Ｈ４−Ｉｇには結合することができない。
【０１７５】
代替的実施形態において、抗体は、アミノ酸配列の配列番号４０又は配列番号４１の範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープに結合するが、アミノ酸配列の配列番号４２又は配列番号４３の範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープには結合しない。従って、この抗体は、配列番号４０又は４１を含むが４２又は４３は含まないポリペプチドとの特異的結合に使用することができる。
【０１７６】
ｂ．Ｂ７−Ｈ４のＩｇＣドメインに結合する抗体
抗体は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのＩｇＣドメイン内にあるエピトープに結合し得る。典型的には、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＣドメインは、ＩｇＣドメイン内部のジスルフィド結合の形成に重要であり得る保存されたシステイン残基を含む。例えば、抗体は、Ｎ末端メチオニンから付番して配列番号２又は配列番号４の約アミノ酸１６８とアミノ酸２２５との間を含むＩｇＣドメインの４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープに結合することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＩｇＣドメインは、配列番号２又は配列番号４の約アミノ酸１５５から約アミノ酸２４１を含み得る。従って、一部の実施形態では、抗体は、Ｎ末端メチオニンから付番して配列番号２又は配列番号４の約アミノ酸１５５とアミノ酸２４１との間を含むＩｇＣドメインの４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープに結合する。
【０１７８】
抗体は、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＣドメインの三次元表面特徴、形状、又は三次構造を含む立体エピトープと結合することができる。
【０１７９】
一部の実施形態では、抗体は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４、並びにＩｇＣドメインを含むその組換え断片及び融合物に結合するが、ＩｇＣの一部又は全てを欠失させたＢ７−Ｈ４の組換え断片及び融合物には結合しない。例えば、一部の実施形態では、配列番号２、４、１０、１８、２８、３６、３８のポリペプチド、又はそれらの組み合わせに結合するが、配列番号２８又は３０には結合しない抗体。一部の実施形態では、抗体は、以下の範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープに結合する
【化５１】
2016505843.tif 000052
（配列番号４４）。従ってこの抗体は、配列番号４４を含むポリペプチドとの特異的結合に使用することができる。
【０１８０】
Ｂ７−Ｈ４のＩｇＣドメインに結合する例示的抗体としては、クローン２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、及びＨ７４が挙げられる。
【０１８１】
ｃ．Ｂ７−Ｈ４の他の領域と結合する抗体
抗体は、完全にはＢ７−Ｈ４ポリペプチドのＩｇＶドメイン又はＩｇＣドメインの範囲内にないエピトープに結合し得る。例えば、抗体は、ＩｇＣドメイン又はＩｇＶドメインの一部を含む三次元表面特徴、形状、又は三次構造、又はそれらの組み合わせを含む配列又は立体エピトープと結合することができる。一部の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＣドメイン又はＩｇＶドメインの外側にある三次元表面特徴、形状、又は三次構造、又はそれらの組み合わせを含む配列又は立体エピトープと結合することができる。例えば、抗体は、シグナル配列、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、細胞外ドメイン、又はそれらの組み合わせの一部を含むか、又はそれに依存する線状又は立体エピトープに結合することができる。好ましい実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶ及びＩｇＣドメイン外にあるＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの一部分に結合する。例えば、一部の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶ又はＩｇＣドメイン外にある１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープに結合する。抗体は、ＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、又はそれらの組み合わせの一部を含むが、完全にはこれらのドメインの一つの範囲内にない線状エピトープに結合することができる。従って、抗体は、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープであって、完全にはＢ７−Ｈ４のＩｇＶ又はＩｇＣドメインの範囲内にないエピトープに結合することができる。例えば、一部の実施形態では、エピトープ全体は、Ｎ末端メチオニンから付番して配列番号２又は配列番号４の酸５６からアミノ酸２２５のアミノ酸配列の範囲内にない。
【０１８２】
好ましい実施形態では、エピトープは、細胞膜に隣接したＢ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインの一部分である配列を含む。エピトープはまたＩｇＣドメインの一部も含み得る。
【０１８３】
一部の実施形態では、抗体は配列番号２４及び配列番号３４に結合するが、配列番号１０、２０、２８、３０、３２、３６、又は３８には結合しない。一部の実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＫＲＲＳＨＬＱＬＬＮＳＫ（配列番号４５）の一部又は全てを含むか又はそれにより形成されるエピトープに結合するが、抗体は、配列ＫＱＱＳＨＬＱＬＬＮＳＫ（配列番号４６）又はＫＲＲＳＥＰＫＳＣ（配列番号４７）には結合しない。従って、抗体は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合することができるが、配列番号４６、又は４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドとは結合しない。配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するが、アミノ酸配列ＫＱＱＳを含むエピトープとは結合しない例示的抗体は、ＨＭＨ４−５Ｇ１である。
【０１８４】
２．Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質に結合する抗体
組換えＢ７−Ｈ４融合タンパク質に結合する抗体もまた開示される。上記で考察したとおり、組換えＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、典型的には、第２のポリペプチドに直接融合するか又は第２のポリペプチドに融合しているリンカーペプチド配列を介して融合した、Ｂ７−Ｈ４タンパク質の全て又は一部を含む第１の融合パートナーを含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、Ｉｇ  Ｆｃ領域に融合したＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン、又はその断片を含む。例えば、組換えＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、又はマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域に融合したＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン又はその断片を含む。例示的Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質としては、例えば、配列番号１０〜３９が挙げられる。
【０１８５】
組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物が、上記で考察したようなＢ７−Ｈ４ポリペプチドのエピトープを提示するとき、抗体はまた、その組換えＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物にも結合することができる。しかしながら、一部の実施形態では、抗体は、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド上ではマスクされているか又は存在しない組換えＢ７−Ｈ４融合タンパク質上のエピトープに結合する。
【０１８６】
例えば、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質のＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの対応する配列と比較して１つ以上の突然変異を含む変異Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドであってもよい。Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質のＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと比べて１つ以上の挿入、欠失、置換、又はそれらの組み合わせを含み得る。従って、一部の実施形態では、変異Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含むＢ７−Ｈ４融合タンパク質に結合する抗体は、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと比べて１つ以上の挿入、欠失、置換、又はそれらの組み合わせを含むＢ７−Ｈ４のセグメントを含むエピトープに結合し得る。一部の実施形態では、エピトープは、融合タンパク質の二次又は三次構造における、その挿入、欠失、置換、又はそれらの組み合わせに部分的に又は完全に依存する立体構造上の変化を含む。従って、一部の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質のＢ７−Ｈ４ポリペプチドに結合するが、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドには結合しない。
【０１８７】
エピトープは、融合タンパク質の第２のポリペプチド又はリンカー配列に依存する連続的なアミノ酸配列、二次若しくは三次構造、翻訳後修飾、又はそれらの組み合わせで構成され得る。例えば、一部の実施形態では、抗体は、融合タンパク質のリンカー領域又は第２のポリペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む線状エピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと第２のポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドとリンカー配列、又はＢ７−Ｈ４ポリペプチドとリンカー配列と第２のポリペプチドからのアミノ酸を含む線状エピトープに結合する。
【０１８８】
抗体は、融合タンパク質のリンカー配列、融合タンパク質の第２のポリペプチド、又はそれらの組み合わせに部分的に、又は完全に依存する三次元表面特徴、形状、又は三次構造を含む立体エピトープと結合することができる。例えば、一部の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと第２のポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドとリンカー配列、又はＢ７−Ｈ４ポリペプチドとリンカー配列と第２のポリペプチドの組み合わせに依存する三次元表面特徴、形状、又は三次構造を含む立体エピトープに結合することができる。
【０１８９】
一部の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の第２のポリペプチド上のエピトープに結合する。方法によっては、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、融合タンパク質の第２のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｔｄｅ）に特異的な検出抗体を使用して検出することができる。例えば、第２のポリペプチドがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、又はマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域である場合、抗体は、それぞれヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、又はマウスＩｇＧ２のＦｃ領域に特異的であり得る。
【０１９０】
３．抗体組成物及び製造方法
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片又は融合物に特異的に結合する抗体の調製には、精製Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、融合物、若しくはエピトープ、又はそれらの核酸配列から発現するポリペプチドを使用することができる。精製Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、融合物、若しくはエピトープ又はそれらの核酸配列から発現するタンパク質を使用して、抗体を、当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて調製することができる。
【０１９１】
本明細書に開示される抗体は、細胞培養物、ファージ、又は限定はされないが、雌ウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿を含む様々な動物で産生させることができる。従って、一実施形態では、抗体は哺乳類抗体である。ファージ技術を使用して初期抗体を単離し、又は改変された特異性若しくはアビディティー特性を備える変異体を産生させることができる。かかる技術は当該技術分野において常法であり、周知されている。一実施形態では、抗体は、当該技術分野において公知の組換え手段によって作製される。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより、組換え抗体を作製することができる。１つ以上のベクターを使用することにより、宿主細胞において少なくとも１つのＶＬ領域と１つのＶＨ領域とを発現するＤＮＡ配列をトランスフェクトしてもよい。組換え的な抗体産生及び作製手段の例示的な説明としては、Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、最新改訂版）が挙げられる。
【０１９２】
開示される抗体は、組換え手段によって修飾することにより、所望の機能の媒介における抗体の有効性を高めることができる。従って、抗体は、組換え手段を用いた置換によって修飾することができる。典型的には、この置換は保存的置換であり得る。例えば、抗体の定常領域における少なくとも１つのアミノ酸を別の残基に置き換えることができる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９５８５７２号パンフレット；及びＡｎｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８（１９９３）を参照のこと。アミノ酸の修飾には、アミノ酸の欠失、付加、置換が含まれる。ある場合には、かかる変化は、望ましくない活性、例えば補体依存性細胞傷害を低下させるために設けられる。多くの場合に抗体は検出可能なシグナルを提供する物質を、共有結合的に、或いは非共有結合的につなぎ合わせることにより標識される。各種の標識及びコンジュゲーション技術は公知であり、科学文献及び特許文献の両方に広範に報告されている。これらの抗体は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又は断片、又はその融合物との結合についてスクリーニングすることができる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）を参照のこと。
【０１９３】
所望の生物活性を有する好適な抗体は、限定はされないが：増殖、遊走、接着、軟寒天成長、血管新生、細胞間コミュニケーション、アポトーシス、輸送、シグナル伝達を含むインビトロアッセイ、及び腫瘍成長の阻害などの以下のインビボアッセイにより同定することができる。
【０１９４】
本明細書に提供される抗体はまた、診断適用においても有用であり得る。抗体は、捕捉抗体又は非中和抗体として、抗原の受容体結合活性又は生物学的活性を阻害することなしに特異的抗原と結合する能力に関してスクリーニングされ得る。本抗体は、中和抗体として、競合的結合アッセイにおいて有用であり得る。本抗体はまた、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又はその受容体の定量化にも使用することができる。
【０１９５】
開示される組成物及び方法で使用することのできる抗体には、任意のクラスの全免疫グロブリン（即ちインタクトな抗体）、その断片、及び抗体の少なくとも抗原結合可変ドメインを含む合成タンパク質が含まれる。可変ドメインは抗体間で配列が異なり、その特定の抗原に対する特定の抗体毎の結合及び特異性において用いられる。しかしながら、可変性は通常は抗体の可変ドメインにわたって均等に分布していない。それは典型的には、軽鎖及び重鎖の両可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのなかでより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々が４つのＦＲ領域を含み、ＦＲ領域は大部分がβシート構造をとり、そのβシート構造を接続し、且つある場合にはその一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲにより接続されている。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によってごく近接して一体に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【０１９６】
また、生物活性を有する抗体の断片も開示される。この断片は、他の配列に結合しているか否かに関わらず、その断片の活性が非修飾抗体又は抗体断片と比較して著しく変化する又は損なわれることがない限り、特定の領域又は特異的なアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択された修飾を含む。
【０１９７】
本開示の抗原タンパク質に特異的な一本鎖抗体を作製するための技術もまた応用することができる。一本鎖抗体の作製方法は当業者に周知されている。一本鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して重鎖及び軽鎖の可変ドメインを併せて融合し、それにより単一の分子上に抗原結合部位を再構成することにより作成し得る。一方の可変ドメインのＣ末端が１５〜２５個のアミノ酸ペプチド又はリンカーによって他方の可変ドメインのＮ末端にテザー係留されている一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）が、抗原結合又は結合の特異性を著しく破壊することなしに開発されている。リンカーは、重鎖及び軽鎖がそれらの適切な立体構造上の配向で一体に結合することを可能にするように選択される。
【０１９８】
２つのｓｃＦｖを連結することにより、二価一本鎖可変断片（ジ−ｓｃＦｖ）を設計することができる。これは、２つのＶＨ及び２つのＶＬ領域を含む単一のペプチド鎖を作製し、タンデムｓｃＦｖを生じさせることにより実施できる。ｓｃＦｖはまた、２つの可変領域を共に折り畳むには短か過ぎるリンカーペプチド（約５アミノ酸）でｓｃＦｖを強制的に二量体化することによっても設計することができる。このタイプはダイアボディとして知られる。ダイアボディは、対応するｓｃＦｖと比べて最大４０倍低い解離定数を有することが示されており、つまりダイアボディはその標的に対してはるかに高い親和性を有するということになる。さらに短いリンカー（１又は２アミノ酸）は三量体（トリアボディ又はトリボディ）の形成をもたらす。テトラボディもまた作製されている。テトラボディはその標的に対してダイアボディよりさらに高い親和性を呈する。
【０１９９】
モノクローナル抗体が、抗体の実質的に均質な集団（即ちその集団内の個々の抗体は、ごく一部の抗体分子に存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除き同一である）から得られる。モノクローナル抗体には、「キメラ」抗体（重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分が、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である）、並びにかかる抗体の断片が、それらが所望の拮抗活性を呈する限りにおいて含まれる。
【０２００】
モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を生じる任意の手順を用いて作成することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物が典型的には免疫剤で免疫され、その免疫剤に特異的に結合し得る抗体を産生する又はその産生能を有するリンパ球が誘発される。或いは、リンパ球がインビトロで免疫されてもよい。
【０２０１】
抗体はまた、組換えＤＮＡ法によっても作成され得る。開示される抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対し特異的結合能を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離して配列決定することができる。また、ファージディスプレイ技術を用いて抗体又は活性抗体断片のライブラリを作成し、スクリーニングすることもできる。
【０２０２】
ａ．ヒト及びヒト化抗体
多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来するもの）が、ヒトにおいて天然で抗原性であり、従ってヒトに投与されると望ましくない免疫応答を引き起こし得る。従って、本方法におけるヒト抗体又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を誘発する可能性を減らすのに役立つ。
【０２０３】
免疫化時に内因性免疫グロブリンの産生なしにヒト抗体の完全なレパートリーを産生する能力を有するトランスジェニック動物（例えばマウス）が用いられ得る。例えば、キメラ及び生殖細胞系列変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖細胞系列変異マウスにおけるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジ時におけるヒト抗体の産生をもたらす。
【０２０４】
場合により、抗体は他の種で作成され、ヒトにおける投与用に「ヒト化」される。ヒト化形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、又は移入されるＣＤＲ若しくはフレームワーク配列にも見られない残基も含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、ここではＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分も含み得る。
【０２０５】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知されている。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合に「移入」残基と称され、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られる。抗体ヒト化技術には、概して、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の使用が関わる。ヒト化は、本質的には、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施し得る。従って、ヒト化形態の非ヒト抗体（又はその断片）はキメラ抗体又は断片であり、ここでは実質的にインタクトとはいえないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基及び場合により一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０２０６】
軽鎖及び重鎖の両方の、ヒト化抗体の作成に使用するヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために極めて重要である。「最良適合」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列が既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。次にげっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる。別の方法は、特定の軽鎖又は重鎖サブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に用いられ得る。
【０２０７】
さらに、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持しておきながら抗体をヒト化することが重要である。この目標を達成するため、ヒト化抗体は好ましくは、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。それらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際のそうした残基の見込まれる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択して組み合わせることができ、それにより所望の抗体特性、例えば１つ又は複数の標的抗原に対する親和性の増加が実現する。一般に、抗原結合に影響を及ぼすことにおいてはＣＤＲ残基が直接的且つ最も実質的に関与する。
【０２０８】
ｂ．一本鎖抗体
一本鎖抗体の作製方法は当業者に周知されている。一本鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して重鎖及び軽鎖の可変ドメインを併せて融合し、それにより単一の分子上に抗原結合部位を再構成することにより作成される。一方の可変ドメインのＣ末端が１５〜２５個のアミノ酸ペプチド又はリンカーによって他方の可変ドメインのＮ末端にテザー係留されている一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）が、抗原結合又は結合の特異性を著しく破壊することなしに開発されている。リンカーは、重鎖及び軽鎖がそれらの適切な立体構造上の配向で一体に結合することを可能にするように選択される。これらのＦｖは、天然抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠いている。
【０２０９】
ｃ．一価抗体
インビトロ方法は一価抗体の調製にも好適である。抗体の消化によるその断片、特にＦａｂ断片の作製は、当該技術分野において公知の常法の技法を用いて達成することができる。例えば、パパインを使用して消化を実施することができる。抗体のパパイン消化は、典型的には、単一の抗原結合部位を各々有するＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片とを生じる。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片と呼ばれる断片を生じ、この断片は２つの抗原が組み合わさった部位を有し、なおも抗原の架橋能を有する。
【０２１０】
抗体消化で作製されたＦａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメインとを含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加だけＦａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインの１つ又は複数のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。抗体断片は、当初はヒンジシステインを間に有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた公知である。
【０２１１】
ｄ．ハイブリッド抗体
抗Ｂ７−Ｈ４抗体はハイブリッド抗体であってもよい。ハイブリッド抗体では、一方の重鎖及び軽鎖対が、あるエピトープに対して産生される抗体に見られるものと相同であると同時に、他方の重鎖及び軽鎖対が、別のエピトープに対して産生される抗体に見られる対と相同である。これは多官能価の特性をもたらし、即ち二価抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに同時に結合する能力を有する。かかるハイブリッドは、それぞれの構成成分抗体を産生するハイブリドーマの融合によるか、又は組換え技術によって形成することができる。かかるハイブリッドは、当然ながら、またキメラ鎖を用いて形成してもよい。
【０２１２】
ｅ．抗体断片のコンジュゲート又は融合物
抗体又はその断片を治療剤とカップリングすることにより、抗体のターゲティング機能を治療的に用いることができる。抗体又は断片（例えば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分）と治療剤とのかかるカップリングは、抗体又は抗体断片と治療剤とを含む、イムノコンジュゲートを作成することによるか、又は融合タンパク質を作成することにより実現することができる。
【０２１３】
抗体又は断片と治療剤とのかかるカップリングは、抗体又は抗体断片と治療剤とを含む、イムノコンジュゲートを作成することによるか、又は融合タンパク質を作成することによるか、又は抗体若しくは断片をｓｉＲＮＡなどの核酸と連結することにより実現することができる。
【０２１４】
一部の実施形態では、抗体が修飾され、その半減期が改変される。一部の実施形態では、抗体が循環中又は治療部位により長い時間存在するように抗体の半減期を増加させることが望ましい。例えば、抗体の力価を循環中又は治療する部位に長時間維持することが望ましいこともある。抗体は半減期を延長させるＦｃ変異体によって、例えばＸｔｅｎｄ（商標）抗体半減期延長技術（Ｘｅｎｃｏｒ、Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）を使用して操作することができる。他の実施形態では、潜在的副作用を低下させるため抗ＤＮＡ抗体の半減期が短縮される。開示されるコンジュゲートは、所与の生物学的反応の修飾に使用することができる。薬物部分は古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。かかるタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素を挙げることができる。
【０２１５】
ｆ．タンパク質ケミストリーを用いた抗体の作成方法
抗体を含むタンパク質を作製する１つの方法は、タンパク質ケミストリー技術によって２つ以上のペプチド又はポリペプチドを共に連結することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドを、現在利用可能な実験装置を使用して、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｏｙｌ））ケミストリー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のいずれかを用いて化学的に合成することができる。当業者は、例えば抗体に対応するペプチド又はポリペプチドを標準的な化学反応によって合成し得ることを容易に理解し得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断しなくてもよく、一方、抗体の他の断片を合成し、続いて樹脂から切断することにより、その他の断片上で機能的に遮断されている末端基を曝露してもよい。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片をそれらのそれぞれカルボキシル末端及びアミノ末端でペプチド結合によって共有結合的につなぎ合わせ、抗体、又はその断片を形成することができる。或いは、ペプチド又はポリペプチドは上記に記載したとおりインビボで独立して合成される。単離後、これらの独立したペプチド又はポリペプチドを同様のペプチド縮合反応によって連結し、抗体又はその抗原（ａｎｉｔｇｅｎ）結合断片を形成し得る。
【０２１６】
例えば、クローニングし又は合成したペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片をつなぎ合わせてより大きいペプチド断片、ポリペプチド又は全タンパク質ドメインを作製することが可能である。或いは、合成ペプチドの天然の化学的ライゲーションを利用して、より短いペプチド断片から大きいペプチド又はポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は二段階の化学反応からなる。第１の段階は、非保護合成ペプチド−α−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、それにより初期共有結合生成物としてチオエステル結合中間体が得られる。反応条件を変更することなしに、この中間体が自発的な高速の分子内反応を起こし、ライゲーション部位に天然ペプチド結合が形成される。
【０２１７】
４．例示的抗Ｂ７−Ｈ４抗体
本明細書に記載される組成物及び方法で使用することのできる例示的抗体を提供する。例えば、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は、米国特許第７，８８８，４７７号明細書；同第７，７３７，２５５号明細書；同第７，６１９，０６８号明細書；同第６，９６２，９８０号明細書、及び米国特許出願公開第２００８／０１９９４６１号明細書に開示されている。抗Ｂ７−Ｈ４抗体はまた、国際公開第２０１３／０２５７７９号パンフレット（これは特に全体として参照により本明細書に援用される）にも開示されている。
【０２１８】
他の例示的抗体としては、本明細書において２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、２Ｄ１、６Ｈ３、２Ｅ１１、８Ｅ１１、Ｈ７４、ＨＭＨ４−５Ｇ１と称されるもの、並びにその断片、キメラ、変異体、特にヒト化変異体が挙げられる。一部の実施形態では、抗体は、例えばマウス又は他の非ヒト抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖及び重鎖可変領域とヒトＦｃ領域（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）とを含むキメラ抗体である。
【０２１９】
抗体Ｈ７４は市販の抗ヒトＢ７−Ｈ４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））である。
【０２２０】
抗体ＨＭＨ４−５Ｇ１は、マウスＢ７−Ｈ４ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質に対して産生される市販のアルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）である。
【０２２１】
ａ．抗ヒトＢ７−Ｈ４クローン２Ｈ９
抗Ｂ７−Ｈ４  ｍＡｂ  ２Ｈ９の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである（ＣＤＲには下線を引く）：
軽鎖可変領域：
【化５２】
2016505843.tif 000053
（配列番号５５）
重鎖可変領域：
【化５３】
2016505843.tif 000054
（配列番号５６）。
【０２２２】
ｂ．抗ヒトＢ７−Ｈ４クローン２Ｄ１
抗Ｂ７−Ｈ４  ｍＡｂ  ２Ｄ１の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである（ＣＤＲには下線を引く）：
軽鎖可変領域：
【化５４】
2016505843.tif 000055
（配列番号５７）
重鎖可変領域：
【化５５】
2016505843.tif 000056
（配列番号５８）。
【０２２３】
ｃ．抗ヒトＢ７−Ｈ４クローン２Ｅ１１
抗Ｂ７−Ｈ４  ｍＡｂ  ２Ｅ１１の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである（ＣＤＲには下線を引く）：
軽鎖可変領域：
【化５６】
2016505843.tif 000057
（配列番号５９）
重鎖可変領域：
【化５７】
2016505843.tif 000058
（配列番号６０）。
【０２２４】
ｄ．抗ヒトＢ７−Ｈ４クローン６Ｈ３
マウス抗ヒトＢ７−Ｈ４抗体６Ｈ３をコードするＤＮＡを配列決定した。軽鎖及び重鎖の可変ドメインのアミノ酸配列及びコードポリヌクレオチド配列は、以下に示すとおりである。ＣＤＲ配列は太字及び下線で示す：
軽鎖可変領域：
【化５８】
2016505843.tif 000059
（配列番号６１）
軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド：
【化５９】
2016505843.tif 000060
（配列番号６２）
重鎖可変領域：
【化６０】
2016505843.tif 000061
（配列番号６３）
軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド：
【化６１】
2016505843.tif 000062
（配列番号６４）。
【０２２５】
ＩＩＩ．検出及び診断方法
Ａ．生体試料中におけるＢ７−Ｈ４の検出方法
一部の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は、生体試料中のＢ７−Ｈ４を検出する方法において使用される。対象から得られた生体試料中のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の検出は、多くの従来方法により可能となる。好ましい方法としては、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又は断片若しくは融合物がＢ７−Ｈ４特異的抗体とのその相互作用によって検出されるイムノアッセイが挙げられる。Ｂ７−Ｈ４特異的抗体を使用して、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の存在を定性的或いは定量的な形で検出することができる。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの検出に用いることのできる例示的イムノアッセイとしては、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、蛍光イムノアッセイ、及び免疫組織化学が挙げられる。以下に記載する検出及び診断方法において用いることのできる例示的抗体としては、限定はされないが、２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、Ｈ７４、ＨＭＨ４−５Ｇ１、及びそれらの組み合わせが挙げられる。一部のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡでは、２つの異なるＢ７−Ｈ４特異的抗体が必要であり得ることは理解されるであろう。従って、本明細書に開示される抗体は、生体試料中のＢ７−Ｈ４の検出に好適な任意の組み合わせで使用することができる。しかしながら、以下でさらに詳細に考察するとおり、全Ｂ７−Ｈ４、又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４単独、又はＢ７−Ｈ４融合タンパク質（例えばＢ７−Ｈ４−Ｉｇ）単独の検出には、抗体の特定の組み合わせが好ましい。
【０２２６】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物を含み得る生体試料は、個体から得ることができる。生体試料が組織又は細胞起源である場合、その試料は、場合によりカオトロピック剤、界面活性剤、還元剤、緩衝剤、及び塩を含有する溶解緩衝液に可溶化される。試料は好ましくは、対象から採取された生体液試料である。生体試料の例としては、尿、バルボタージ、血液、血清、血漿、涙、唾液、脳脊髄液、組織、リンパ液、滑液、又は喀痰等が挙げられる。好ましい実施形態では、生体液は全血、又はより好ましくは血清若しくは血漿である。血清は、血球細胞でもなく（血清は白血球又は赤血球を含まない）、凝固因子でもない全血の成分である。血清はフィブリノゲンが取り除かれた血漿である。従って、血清は、血液凝固（凝血）に用いられない全てのタンパク質、並びに全ての電解質、抗体、抗原、ホルモン、及び任意の外因性物質（例えば薬物及び微生物）を含む。試料は、試料を抗体に接触させる前に好適な希釈剤で希釈され得る。
【０２２７】
概して、対象から得られた試料は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物と特異的に結合する抗体と接触させることができる。場合により、抗体を試料と接触させる前に、洗浄及び続く複合体の単離を促進するため抗体が固体支持体に固定化され得る。固体支持体の例としては、例えば、マイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、又はマイクロビーズの形態のガラス又はプラスチックが挙げられる。抗体はまた、プローブ基板又はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイに付着させてもよく、上記に記載したとおり気相イオン分光法によって分析し得る。
【０２２８】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物を検出するためのイムノアッセイ（ｉｍｍｕｏａｓｓａｙ）は、免疫特異的抗原−抗体相互作用が起こり得るような条件下で生体試料をＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物に特異的な抗体に接触させた後、続いてその相互作用を検出又は計測する能力を含む。抗体とＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物との結合を用いることにより、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の存在及び産生の変化を検出し得る。
【０２２９】
イムノアッセイは、試料中のマーカーを検出及び分析するステップを含み得る。例えば、方法は、（ａ）Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物に特異的に結合する抗体を提供するステップ；（ｂ）試料を抗体と接触させるステップ；及び（ｃ）試料中のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物に結合した抗体の複合体の存在を検出するステップを含み得る。抗体の提供後、当該技術分野において公知の好適な免疫学的結合アッセイのいずれかを用いてＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物を検出及び／又は定量化することができる。有用なアッセイとしては、例えば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロットアッセイ、又はスロットブロットアッセイが挙げられる。これらの方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３７（Ａｓａｉ，ｅｄ．１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．１９９１）；及びＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前掲にも記載されている。
【０２３０】
試料を抗体とインキュベートした後、混合物を洗浄し、形成された抗体−マーカー複合体を検出することができる。これは、洗浄した混合物を検出試薬とインキュベートすることにより達成し得る。この検出試薬は、例えば、検出可能標識で標識される二次抗体であってもよい。例示的な検出可能標識としては、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素、放射標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般的に用いられる他のもの）、及びカロリメトリック標識、例えばコロイド金又は着色ガラス若しくはプラスチックビーズが挙げられる。或いは、試料中のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、断片、又は融合物は、間接的アッセイを用いて検出することができ（この場合、例えば、結合したＢ７−Ｈ４特異的抗体が二次標識抗体を使用して検出される）、及び／又は競合又は阻害アッセイで検出することができる（この場合、例えば、Ｂ７−Ｈ４又はその断片若しくは融合物の個別的なエピトープに結合するモノクローナル抗体が混合物と同時にインキュベートされる）。
【０２３１】
一般的な酵素イムノアッセイは、「酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）」である。ＥＬＩＳＡは、標識された（例えば、酵素が結合した）形態の抗体を使用して抗原の濃度を検出及び計測する技法である。種々の形態のＥＬＩＳＡがあり、それらは当業者に周知されている。ＥＬＩＳＡに関する当該技術分野において公知の標準的な技法は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｂｉｇａｚｚｉ，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４；及びＯｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：８９５−９０４（１９８４）に記載されている。
【０２３２】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」では、本明細書で「捕捉」抗体として参照されるとおりの、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物に特異的な第１の抗体を固相（即ちマイクロタイタープレート）に結合させて、抗原（例えばバイオマーカータンパク質）を含む生体試料に曝露する。次に固相を洗浄して未結合の抗原を除去する。次に、本明細書で「検出」抗体と称される二次抗体を、結合済みの抗原（存在する場合）に結合させて抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成させる。好ましい実施形態では、二次抗体は標識される（例えば酵素が結合される）。一部の実施形態では、固相は洗浄により未結合の抗体が除去され、二次抗体に結合してその検出を可能にする第３の標識抗体で処理される。抗体に結合させ得る酵素の例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、及びＢ−ガラクトシダーゼである。酵素が結合した抗体は、基質と反応することにより、計測可能な色の付いた反応生成物を生じる。
【０２３３】
「競合ＥＬＩＳＡ」では、抗体を、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物（即ち抗原）を含有する試料とインキュベートする。次に抗原−抗体混合物を、抗原がコーティングされた固相（例えばマイクロタイタープレート）に接触させる。試料中に存在する抗原が多い程、固相との結合に利用可能な遊離抗体は少なくなる。次に標識された（例えば、酵素が結合した）二次抗体を固相に加え、固相に結合した一次抗体の量を決定する。
【０２３４】
実施者の選択により、且つ本開示に基づき、他の技法を用いてバイオマーカーを検出してもよい。かかる技法の一つはウエスタンブロッティングであり（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３５０（１９７９））、ここでは好適に処理された試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた後、ニトロセルロースフィルタなどの固体支持体に移す。次に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物に特異的に結合する検出可能に標識された抗体を使用してペプチドレベルを評価することができ、ここでは検出可能標識からのシグナルの強度が、存在するペプチドの量に対応する。レベルは、例えばデンシトメトリーによって定量化することができる。
【０２３５】
一部の実施形態では、アッセイは、本明細書に記載されるアッセイの感度又は基礎検出レベルを増加させるための１つ以上の方法又は試薬を取り入れる。例えば、ＭＥＳＯ−ＳＣＡＬＥ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）（ＭＳＤ（登録商標））技術を用いてアッセイの感度を増加させることができる。ＭＳＤ技術は、電気化学発光検出とパターニングされたアレイとの組み合わせを含む。ＭＳＤ（登録商標）マイクロプレートは、プレートの底面に一体化された炭素製の電極を有する。この炭素に受動的吸着によって生物学的試薬を付着させ、高レベルの生物学的活性を維持することができる。ＭＳＤ（登録商標）アッセイは検出に電気化学発光標識を使用する。こうした標識は非放射性で安定しており、特徴、異なるカップリングケミストリーである。電気化学発光標識は、電気化学的に刺激されると光を発し、その光がマイクロプレートの底面にある電極によって検出される。電極近傍の標識のみが励起及び検出され、従ってこのアッセイは洗浄ステップなしに実施することができる。アッセイに使用される緩衝液中にはさらなる共反応物が存在する。これらの共反応物もまた、マイクロプレートにおいて電極に近接しているとき刺激され、電気化学発光シグナルを増強する。
【０２３６】
対象の生体試料中におけるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の検出及び定性的又は定量的計測用の試薬を含むアッセイ及びキットもまた提供される。例えば、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の検出がＥＬＩＳＡによる場合、アッセイ又はキットの構成要素には、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の特定のエピトープに特異的な抗体が含まれることになり、ここでこの抗体は、場合により酵素、蛍光色素又は放射性標識に結合されていてもよい。
【０２３７】
Ｂ．例示的ＥＬＩＳＡアッセイ
生体試料のＢ７−Ｈ４レベルを計測するための好ましいアッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。上記で考察したとおり、サンドイッチＥＬＩＳＡは、標的タンパク質に特異的な２つの抗体、即ち捕捉抗体と検出抗体とを必要とする。従って、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＢ７−Ｈ４レベルを計測するには２つの抗Ｂ７−Ｈ４抗体が必要であり、或いは、特にＢ７−Ｈ４融合タンパク質を検出しようとする場合には、２つの抗体のうちの一方がＢ７−Ｈ４融合パートナー（例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の検出では抗Ｆｃ抗体）と結合し得る。従って、実施者は、生体試料中における特定のＢ７−Ｈ４種の検出に適切な１つ又は複数の抗体を選択することができる。「捕捉」抗体と「検出」抗体との好ましい組み合わせを以下に提供するが、一部の実施形態では、以下で考察する「捕捉」抗体が「検出」抗体として使用され、「検出」抗体が「捕捉」抗体として使用されることが理解されるであろう。
【０２３８】
１．捕捉抗体
一部の実施形態では、捕捉抗体、又はその抗原結合断片は、上記に開示したＢ７−Ｈ４ポリペプチドのほとんど又は全ての既知の種、並びにＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の多くの種に共通する領域に結合する。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、Ｂ７−Ｈ４に対する抗体のＦ（ａｂ’）２断片であり得る。最も好ましい実施形態では、捕捉抗体は２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片である。膜貫通Ｂ７−Ｈ４、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４、及び治療的Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、典型的にはＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。従って、一部の実施形態では、試料中におけるＢ７−Ｈ４ポリペプチドの総量の計測に使用することのできる抗体は、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメインに結合し得る。Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメイン、例えば配列番号４０、４１、４２、又は４３の配列を含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドに結合する例示的な抗体は、２Ｈ９又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１である。
【０２３９】
別の例において、捕捉抗体はＢ７−Ｈ４のＩｇＣドメインに結合することができ、例えば配列番号４４を含むポリペプチドに結合する抗体である。Ｂ７−Ｈ４のＩｇＣドメインに結合する例示的抗体としては、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、及びＨ７４が挙げられる。
【０２４０】
２．検出抗体
一部の実施形態では、生体試料中の全てのＢ７−Ｈ４ポリペプチドを計測することが望ましい。従って、一部の実施形態では、検出抗体は、ＩｇＶドメイン又はＩｇＣドメインなど、内因性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのほとんど又は全ての既知の種に共通する領域に結合する。好ましい実施形態では、捕捉抗体が一つのドメイン（例えばＩｇＶドメイン）に結合し、且つ検出抗体が別のドメイン（即ちＩｇＣドメイン）又は同じドメイン（即ちＩｇＶドメイン）の異なる領域若しくはエピトープに結合する。従って、一部の実施形態では、単一の生体試料中におけるＢ７−Ｈ４の複数の種を検出するための捕捉抗体及び検出抗体は、２Ｈ９、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、及びＨ７４からなる群から選択される２つの異なる抗体である。例えば、血漿又は血清などの生体試料中の全Ｂ７−Ｈ４を検出するための好ましい実施形態では、捕捉抗体が２Ｈ９であり、且つ検出抗体がｈＢ７−Ｈ４．ｍ１又は６Ｈ３である。全Ｂ７−Ｈ４の検出には６Ｈ３が好ましい。詳細な実施形態において、６Ｈ３はマウス抗ヒトＢ７−Ｈ４抗体、又はマウス重鎖及び軽鎖可変領域とマウス若しくはヒトＦｃ領域（例えば、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４等）とを含むそのキメラ抗体である。好ましい実施形態では、捕捉抗体が抗体２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片であり、且つ検出抗体がｈＢ７−Ｈ４．ｍ１又は６Ｈ３である。
【０２４１】
特定のＥＬＩＳＡアッセイでは、２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２断片を使用して、対象から得られた血清試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４が捕捉される。検出抗体はビオチン化ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１又は６Ｈ３であってもよい。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の検出にはｈＢ７−Ｈ４．ｍ１が好ましい。以下でさらに詳細に考察するとおり、このアッセイを用いることにより、高レベルの細胞遊離Ｂ７−Ｈ４に関連する疾患又は障害に関して対象を検出、診断、又は他の方法で評価することができる。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は、アビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートした検出試薬を使用して検出することができる。好ましい実施形態では、このＥＬＩＳＡアッセイを用いて関節リウマチ、多発性硬化症、又は癌の疾患重症度が検出、診断、又は決定される。
【０２４２】
一部の実施形態では、生体試料中におけるＢ７−Ｈ４ポリペプチドの１つ以上の種をＢ７−Ｈ４ポリペプチドの他の種と区別することが望ましい。従って、一部の実施形態では、検出抗体は、計測する１つ以上の種に特異的な領域に結合する。例えば、一部の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４「Ｌ」変異体のＩｇＶドメインに結合するが、Ｂ７−Ｈ４「Ｑ」変異体のＩｇＶドメインには結合しない。Ｂ７−Ｈ４「Ｌ」変異体のＩｇＶドメインの範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープ（ｅｐｉｔｐｏｐｅ）には結合するが、Ｂ７−Ｈ４「Ｑ」変異体のＩｇＶドメイン、例えば配列番号４２又は４３の配列における「Ｑ」を含むエピトープには結合しない例示的抗体は、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１である。別の実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４「Ｑ」変異体の「Ｑ」を含むＩｇＶドメインの範囲内にある又はそれにより形成されるエピトープには結合するが、Ｂ７−Ｈ４「Ｌ」変異体の「Ｌ」を含むＩｇＶドメインには結合しない。
【０２４３】
一部の実施形態では、エピトープは、ＫＲＲＳＨＬＱＬＬＮＳＫ（配列番号４５）のＢ７−Ｈ４細胞膜隣接領域の一部又は全てを含むか又はそれにより形成される。配列番号４５を含むか又はそれにより形成されるエピトープと結合する例示的抗体は、ＨＭＨ４−５Ｇ１である。従って、ＨＭＨ４−５Ｇ１は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドとの特異的結合に使用することができる。ＨＭＨ４−５Ｇ１などの、配列番号４５の細胞膜隣接エピトープに結合する抗体を使用して、完全長Ｂ７−Ｈ４、並びに、限定はされないが、配列番号１６、１７、２４、２５、３４又は３５を含むが、しかし配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３６、３７、３８又は３９は含まない、細胞膜隣接領域を含むＢ７−Ｈ４ポリペプチド及び融合タンパク質の種を検出することができる。
【０２４４】
ＨＭＨ４−５Ｇ１は、配列ＫＱＱＳＨＬＱＬＬＮＳＫ（配列番号４６）又はＫＲＲＳＥＰＫＳＣ（配列番号４７）に結合しない。ＨＭＨ４−５Ｇ１などの、配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドには結合するが、しかしアミノ酸配列ＫＱＱＳを含むエピトープとは結合しない抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットにおいて検出抗体として使用することにより、膜貫通又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３６、３７、３８又は３９など、それが結合しないＢ７−Ｈ４断片又は融合タンパク質と区別することができる。
【０２４５】
好ましい実施形態では、２Ｈ９を捕捉抗体として使用し、且つＨＭＨ４−５Ｇ１を検出抗体として使用することにより膜貫通又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４が検出され、しかし配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３６、３７、３８又は３９などのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質は検出されない。これは、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が治療的に投与され、且つ治療法に反応した内因性タンパク質レベルの変化など、内因性タンパク質レベルに対する薬力学的治療効果があるかどうかを決定するなどのために、内因性膜貫通又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルの決定が重要である場合に、特に有用である。かかるアッセイはまた、抗細胞遊離Ｂ７−Ｈ４特異的抗体などの、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を特異的に標的化するが、しかし膜貫通Ｂ７−Ｈ４は標的化しない治療法の有効性の計測にも有用である。かかるアッセイを用いて、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を発現する細胞を含まないか、又は細胞が欠損している血清などの生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４もまた特異的に計測することができる。
【０２４６】
一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、ＩｇＶ又はＩｇＣドメインに結合する捕捉抗体を、第２の融合部分又はタンパク質に結合する検出抗体と併せて使用して検出することができる。好ましい実施形態では、２Ｈ９又はＨ７４を捕捉抗体として使用し、且つ第２のポリペプチドに結合する抗体を検出抗体として使用することにより、配列番号１０などのＢ７−Ｈ４−Ｉｇが検出され、しかし細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は検出されない。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、マウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１、又はヒトＩｇＧ４などのＩｇＧであり、検出抗体は、それぞれ抗マウスＩｇＧ１、抗ヒトＩｇＧ１、又は抗ヒトＩｇＧ４などの適切な抗ＩｇＧ抗体である。このアッセイフォーマットは、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が治療的に投与され、且つ治療用タンパク質の薬物動態を決定するために、膜貫通又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出することなしにＢ７−Ｈ４融合タンパク質のレベルを決定する必要がある場合に、特に有用である。
【０２４７】
一実施形態では、捕捉抗体が２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２であり、且つ検出抗体が６Ｈ３である。このアッセイは、可溶性Ｂ７−Ｈ４及びＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を含む全Ｂ７−Ｈ４の検出に有用である。
【０２４８】
別の実施形態では、捕捉抗体が２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２であり、且つ検出抗体がｈＢ７−Ｈ４．ｍ１である。このアッセイは細胞遊離Ｂ７−Ｈ４単独の検出に有用であり、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質は検出しない。
【０２４９】
なおも別の実施形態では、捕捉抗体がＨ７４であり、且つ検出抗体が抗Ｆｃ抗体である。このアッセイは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の検出に有用である。
【０２５０】
Ｃ．生体試料中の２つのＢ７−Ｈ４種間の区別
一部の実施形態では、対象から採取された生体試料は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、又は融合物の２つ以上の種を含有する。以下でさらに詳細に考察するとおり、一部の実施形態では、免疫応答を有するか、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害を有する対象、特に高レベルの細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を有する対象に治療的Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質が投与されてもよく、これは細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の機能を遮断し得るか、Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を増加させ得るか、又はそれらの組み合わせが可能である。従って、一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる治療を受けている対象から採取された血漿又は血清などの生体試料は、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４並びに上記に開示されるような可溶性の二量体Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の両方を含有し得る。従って、全Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、及び融合物、その、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４単独、並びにＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質単独を区別するための方法及び組成物が開示される。
【０２５１】
生体試料中における特定のＢ７−Ｈ４ポリペプチド種又は全Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドからの一部のＢ７−Ｈ４ポリペプチド種の量を決定する方法は、生体試料に対して第１のＥＬＩＳＡを実施すること（ここで捕捉抗体及び検出抗体は、ＩｇＶドメイン又はＩｇＣドメインなどの、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのほとんど又は全ての既知の種に共通する領域を検出する２つの異なる抗体、例えば、２Ｈ９、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１及びＨ７４である）；生体試料に対して第２のＥＬＩＳＡを実施すること（ここで捕捉抗体は、ＩｇＶドメイン又はＩｇＣドメインなどの、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのほとんど又は全ての既知の種に共通する領域を検出し（例えば、２Ｈ９、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１及びＨ７４）、検出抗体は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの種又はＢ７−Ｈ４ポリペプチドの１つ又は複数の種の一部に特異的であるが、試料中のＢ７−Ｈ４ペプチドの全てには結合しない）を含み得る。
【０２５２】
例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質のレベルは、第２のＥＬＩＳＡ法により、Ｂ７−Ｈ４特異的捕捉抗体とｈＩｇＧ１  Ｆｃ特異的検出抗体とを使用して計測することができる。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルは、第３のＥＬＩＳＡ法により、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドのほとんど又は全ての既知の種に共通する領域を検出する捕捉抗体と、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドに特異的であるが、しかし試料中のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質ペプチドは検出しない検出抗体とを使用して計測することができる。一部の実施形態では、生体試料は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を発現する細胞を含まない血清又は血漿などの生体液である。
【０２５３】
一部の実施形態では、第２のＥＬＩＳＡは、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質の第２のポリペプチドに特異的な検出抗体で実施される。試料中のＢ７−Ｈ４融合タンパク質の量が第２のＥＬＩＳＡによって決定され、且つ試料中の内因性Ｂ７−Ｈ４の総量が第３のＥＬＩＳＡによって決定される。かかるアッセイを用いて治療的Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質の薬物動態を決定することができる。
【０２５４】
一部の実施形態では、第２のＥＬＩＳＡは、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４に特異的な検出抗体で実施される。試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量が第２のＥＬＩＳＡによって決定され、且つ試料中のＢ７−Ｈ４融合タンパク質の総量がｈＩｇＧ１  Ｆｃ特異的検出抗体を使用することにより決定される。かかるアッセイを用いて、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルに対する薬力学的治療効果を決定することができる。
【０２５５】
Ｄ．診断アッセイ
抗Ｂ７−Ｈ４抗体、及びＢ７−Ｈ４の検出方法を用いることにより、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片若しくは融合物の存在及び産生の変化を検出することができる。
【０２５６】
細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は、サンプリングした関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者及びシェーグレン症候群患者の約３分の１の血清中に見られる。個体における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の濃度は、特に自己免疫疾患において、炎症の重症度、病期及び進行と密接に相関する。ＲＡ及びＳＬＥの実験マウスモデルでは細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の効果が再現されており、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４が膜貫通Ｂ７−Ｈ４の抑制機能を遮断するデコイとして働き、全身性自己免疫疾患の増悪を引き起こすものと考えられる（Ｚｈｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１３（８）：１７５９−６７（２００９）Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｄｅｃ  ２４）。これらの結果は、全身性自己免疫疾患の発病における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の役割を実証している。
【０２５７】
様々な癌の発生、診断、及び予後における膜貫通型、及び可溶型のＢ７−Ｈ４の役割が、Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６９５８３４；８頁（２０１１））（これは特に全体として参照により援用される）においてレビューされている。例えば、多くのタイプのヒト癌においてＢ７−Ｈ４がｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで発現し、予後不良と負の相関を示すことが分かっている（以下の表１を参照のこと）。ヒト腫瘍におけるＢ７−Ｈ４の発現は、その細胞表面タンパク質発現が正常ヒト組織ではまれであることから、腫瘍における転写後の異常調節に起因すると考えられる。重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）／ベージュ異種移植片増殖モデルを含むいくつかのモデルにおいて、腫瘍細胞におけるＢ７−Ｈ４発現の増加は細胞アポトーシスの低下及び腫瘍の増殖亢進と相関したとともに、Ｂ７−Ｈ４が広範且つ可変的にＮ−グリコシル化され、それが「バリア」機構として働き免疫監視を回避し得ることが示されている。
【０２５８】
多くの研究が、限定はされないが、卵巣癌、食道癌、腎癌、胃癌、肝癌、肺癌、結腸癌、膵癌、乳癌及び前立腺癌、及び皮膚癌（メラノーマ）、及び以下の表１に示す他の癌を含む様々な癌の抗腫瘍免疫におけるＢ７−Ｈ４の役割と整合している。さらに、卵巣癌、ＲＣＣ、結腸癌、乳癌、肺癌、及び前立腺癌の患者の血液試料中に細胞遊離Ｂ７−Ｈ４が検出された。これらの研究は、血清Ｂ７−Ｈ４がそれぞれの癌の診断及び予後に有用なマーカーとなり得ることを示している。
【０２５９】
従って、一部の実施形態では、生体試料中における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの変化の検出が、疾患、又は治療に対する反応性の指標となることができ、ここでは細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定することが、薬力学的な読み取りである。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルは、対照、例えば健常な対象、例えば、免疫応答、又は自己免疫性若しくは炎症性疾患／障害、又は癌を有しない対象から得られた標準；又は異なる疾患重症度又は予後の免疫応答、又は自己免疫性又は炎症性疾患／障害又は癌と診断された対象と比較することができる。対照は、同じアッセイを用いた同様の個体の単一の値、又はより好ましくはプールされた若しくは平均化した値であってもよい。
【０２６０】
細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を妨げるための組成物及び方法が、例えば、米国特許第７，９３１，８９６号明細書及び同第７，９８９，１７３号明細書、及び米国特許出願公開第２００９／０１４２３４２号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に開示される。
【０２６１】
一実施形態では、試料中で検出され得る細胞遊離Ｂ７−Ｈ４には、Ｂ７−Ｈ４の膜遠位ＩｇＶドメイン及び膜近位ＩｇＣドメインが含まれる。別の実施形態では、検出される細胞遊離Ｂ７−Ｈ４には、配列番号８又は配列番号９と８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性であるアミノ酸配列が含まれる。
【０２６２】
別の実施形態では、検出される細胞遊離Ｂ７−Ｈ４には、配列番号６又は配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインが含まれる。
【０２６３】
さらに別の実施形態では、検出される細胞遊離Ｂ７−Ｈ４には、配列番号２又は配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＢ７−Ｈ４の断片が含まれる。
【０２６４】
対象が炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を発症する又はそれを有する傾向を、対象における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベル、好ましくは対象における血清又は血漿中細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルに基づき決定することができる。対象における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルが、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を有しない対象における平均細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルと比べて高い場合、その対象は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を発症する可能性；又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を有する可能性がより高い。
【０２６５】
以下の実施例に示すとおり、血清中細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルは、関節リウマチ（ＲＡ）及びシェーグレン症候群を含むいくつかの炎症性及び自己免疫性障害を有する対象で上昇する。これらの例はまた、１ｎｇ／ｍｌ以上の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルがヒトにおいて疾患及び重症度と相関することも示している。
【０２６６】
個体における免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を、その個体の生体試料中における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量を定量化することにより診断又は検出することができ、ここで対照と比較した個体の生体試料中における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量の増加が、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の指標となる。例えば、対象における免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の診断を補助する方法、又は免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の発症傾向を評価する方法は、対象からの生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップを含んでもよく、ここで対照の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルと比べて高い生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルが、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の指標となり、又は免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を発症する傾向の増加の指標となる。
【０２６７】
対象における免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の診断を補助する方法又はそれの発症傾向を評価する方法はまた、第１の生体試料及び第１の試料からある期間後に採取した第２の生体試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップを含んでもよく、ここで第１の試料と比較した第２の試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの増加が、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の発生又は悪化の指標となり、又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの低下が、薬力学的（ｐｈａｒｍｃｏｄｙｎａｍｉｃ）治療反応性の指標となる。
【０２６８】
免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の重症度を決定する方法もまた開示される。この方法は、（ａ）対象からの生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップ；及び（ｂ）生体試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の疾患重症度と相関する基準細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルと比較するステップであって、それにより対象の免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の重症度を決定するステップを含み得る。
【０２６９】
免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の重症度は、個体の生体試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを定量化し、且つ個体の生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量を、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の種々の病期の指標となる細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量と相関付けることにより検出又は評価し得る。免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の種々の病期又は種々の重症度レベルと相関する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量は、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の種々の病期にある、又は疾患の種々の重症度を有する患者において細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を定量化することにより予め決定し得る。
【０２７０】
例えば、ＲＡでは、典型的には以下の重症度分類が用いられる：クラスＩ：通常の活動は制限なしに行うことができる；クラスＩＩ：やや制限があるものの、日常生活のほとんどの活動は行うことができる；クラスＩＩＩ：著しく制限され、日常生活及び仕事の大半の活動を行うことができない；及びクラスＩＶ：寝たきり又は車椅子に座ったきりで、活動能力がなくなる。各分類の患者において細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定し、特定の重症度レベルと相関し得る細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の基準レベルを作成することができる。
【０２７１】
免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌を治療する対象を選択する方法もまた開示される。この方法は、（ａ）対象から得られた生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップ；（ｂ）生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを対照の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルと比較するステップ；及び（ｃ）生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルが対照の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルより高いとき、その対象を治療に選択するステップを含み得る。治療する対象を選択する方法はまた、第１の生体試料及び第１の試料の後に採取した第２の生体試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップ、及び第２の生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルが第１の試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルより高いとき、その対象を治療に選択するステップも含み得る。
【０２７２】
上記及びＨｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６９５８３４；８頁（２０１１）において考察されるとおり、一部の癌は、癌細胞上又はその中でのＢ７−Ｈ４の増加した、異常な、又は不適切な発現によって特徴付けられるが、必ずしも体液試料中における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの増加によって特徴付けられるわけではない。従って、上記で考察する癌を有する対象を検出、診断、評価、又は選択する方法は、それに代えて又は加えて、非癌性である同じ組織の細胞などの対照と比較した、癌細胞上の又は癌細胞における、限定はされないが膜貫通Ｂ７−Ｈ４を含むＢ７−Ｈ４のレベルを計測するステップを含むことができる。
【０２７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法を使用して投薬量レジームが作成、又は変更される。例えば、対象に第１の投与期間にわたり組成物の第１の用量が投与され；及び第２の投与期間にわたり組成物の第２の用量が投与され、場合により続いて１つ以上のさらなる投与期間にわたり１つ以上のさらなる用量が投与され得る。第１の投与期間は、１週間未満、１週間、又は２週間以上であり得る。
【０２７４】
一部の実施形態では、投薬量レジームは用量漸増投薬量レジームである。第１の用量は低用量であり得る。十分な生化学的又は臨床的反応、例えば対象における血清又は血漿中細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの低下が達成されるまで、用量漸増が継続され得る。次に、投薬量が維持されるか又は維持量まで徐々に減らされ得る。こうした方法を用いて用量レベル、投与頻度、又は治療期間を標準化し、最適化し、又はカスタマイズすることができる。
【０２７５】
ＩＶ．診断及び治療方法
Ａ．診断及び治療される疾患／障害
１．炎症性及び自己免疫性疾患／障害
開示される組成物を使用して検出及び治療され得る代表的な炎症性又は自己免疫性疾患／障害としては、限定はされないが、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、Ｉｇａ腎症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎・皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０２７６】
好ましい実施形態では、炎症性及び自己免疫性疾患／障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、ループス腎炎、多発性硬化症、又はＩ型糖尿病である。
【０２７７】
Ｂ７−Ｈ４は炎症経路における複数の点で、且つより高いレベルで働き、それによりＢ７−Ｈ４はＴＮＦ−αなどのエフェクターサイトカインの発現及び／又は活性に影響を及ぼすように制御する主調節因子として働く。従って、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４組成物は、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）、ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）（セルトリズマブ）及びＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）などのＴＮＦ−α遮断薬に反応しない患者の治療に、又はＴＮＦ−α遮断薬が安全若しくは有効でない場合に特に有用である。加えて、炎症経路における主調節因子としてのその活性のため、開示されるＢ７−Ｈ４組成物は慢性及び持続性炎症の治療に特に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４組成物を使用して再発寛解型多発性硬化症が治療される。
【０２７８】
２．癌
一部の実施形態では、開示される組成物及び方法を使用して癌を有する対象が診断される。従って、一部の実施形態では、開示される組成物及び方法を使用して、卵巣、食道、腎臓、胃、肝臓、肺、結腸、膵臓、乳房及び前立腺、及びメラノーマ、又は表１に掲載する、若しくはＨｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６９５８３４；８頁（２０１１））で考察される他のものを有する対象が診断及び／又は治療される。一部の実施形態では、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は、卵巣癌、ＲＣＣ、結腸癌、乳癌、肺癌、及び前立腺癌の検出、診断、及び／又は治療用バイオマーカーを提供する。好ましい実施形態では、癌は卵巣癌又は乳癌である。
【０２７９】
【表１】
2016505843.tif 000063
【０２８０】
【表２】
2016505843.tif 000064
【０２８１】
【表３】
2016505843.tif 000065
【０２８２】
Ｂ．治療方法
１．炎症性及び自己免疫性疾患／障害の治療用活性薬剤
免疫応答を低下させるため、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害を治療するためのＢ７−Ｈ４特異的抗体の使用方法もまた開示される。本方法は、限定はされないが、可溶性（ｓｏｕｂｌｅ）Ｂ７−Ｈ４の発現の増加によって特徴付けられるものを含む疾患／障害の治療に用いられ得る。本方法は、典型的には、それを必要とする対象に免疫抑制剤を投与するステップを含む。
【０２８３】
ａ．免疫抑制剤−Ｂ７−Ｈ４特異的
一部の実施形態では、治療剤はＢ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達をもたらす。治療剤は、Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達の作動薬、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の拮抗薬、又はそれらの組み合わせであってもよい。好適な治療剤としては、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の発現又は生物学的活性を阻害する化合物が挙げられる。例えば、この薬剤は、Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を増加させるのに有効な量の、膜貫通Ｂ７−Ｈ４若しくはその受容体の作動薬、又は細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の拮抗薬、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０２８４】
ｉ．抗体
本明細書に開示される抗体は、それを必要とする対象に、対象における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを低下させるため、又はＢ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４による遮断を低下させるために投与され得る。一実施形態において、抗体の投与は作動薬活性を有し、Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を増加させる。好ましい実施形態では、抗体の投与は、以下に記載するとおり、膜貫通Ｂ７−Ｈ４のタンパク質分解による切断を低減することによって血清中のｓＨ４レベルを低下させる。一部の実施形態では、抗体は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣してＢ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を誘導することにより阻害性の免疫細胞応答を生じさせるＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の有効量と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、抗体は別の活性薬剤と組み合わせて投与される。好ましくは、抗体は、共投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質に結合することなく、膜貫通Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を低下させたり又は阻害したりすることなく、又はそれらの組み合わせで、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４と結合する。従って、一部の実施形態では、抗体の投与はインビボでの細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の産生を低下させ又は阻止する。
【０２８５】
例示的抗体
細胞遊離Ｂ７−Ｈ４に特異的に結合する抗体又は抗体断片を使用して、ｓＨ４の生物学的活性を拮抗することができる。例示的抗体は、ｍＡｂ  ｈＨ４．３（Ｃｈｏｉ，Ｉ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：４６５０−４（２００３））である。他の例示的抗体としては、２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１、ＨＭＨ４−５Ｇ１及びＨ７４が挙げられる。
【０２８６】
好ましい実施形態では、抗体は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４、又は上記に開示されるようなＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質には結合することなく、又はその機能を阻害することなく、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４に結合し、その機能を阻害する。
【０２８７】
細胞遊離Ｂ７−Ｈ４はＢ７−Ｈ４の細胞外部分の酵素的切断により生じると考えられる。完全長Ｂ７−Ｈ４  ｃＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞は培養上清中に細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を放出し、この分泌は、様々なプロテアーゼ阻害薬とインキュベートすることにより阻害し得る。一部の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は膜貫通Ｂ７−Ｈ４に結合して細胞外ドメインのタンパク質分解による切断を阻止し、これにより細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の産生が阻止される。好ましい実施形態では、抗体は、Ｂ７−Ｈ４媒介性シグナル伝達を遮断又は阻害することなしに、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインの切断を阻止する。
【０２８８】
細胞外ドメインのＢ７−Ｈ４の膜隣接領域におけるＫＲＲＳ配列は、プロテアーゼがＢ７−Ｈ４細胞外ドメインに結合し又はそれを切断するのに重要であると考えられている。従って、一部の実施形態では、抗体は、細胞外ドメインのＫＲＲＳを含むエピトープに結合する。一部の実施形態では、エピトープは細胞外ドメインのＫＲＲＳに隣接する。例えば、一部の実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＫＲＲＳＨＬＱＬＬＮＳＫ（配列番号４５）に結合することができるが、この抗体は、配列ＫＱＱＳＨＬＱＬＬＮＳＫ（配列番号４６）又はＫＲＲＳＥＰＫＳＣ（配列番号４７）には結合しない。配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するが、配列番号４６又は配列番号４７には結合しない例示的抗体は、ＨＭＨ４−５Ｇ１である。従って、推定プロテアーゼ切断エピトープに結合する抗体、例えば抗体ＨＭＨ４−５Ｇ１は、膜貫通Ｂ７−Ｈ４の切断を阻害し、血清中のｓＨ４レベルを低下させ得るものと考えられる。
【０２８９】
ｉｉ．プロテアーゼ阻害薬
上記に考察したとおり、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４は膜貫通Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインのタンパク質分解による切断によって産生されると考えられ、従って、特定の実施形態では、治療剤はプロテアーゼ阻害薬である。例示的プロテアーゼ阻害薬としては、限定はされないが、セリンプロテアーゼ阻害薬、システインプロテアーゼ阻害薬、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬、及びメタロプロテアーゼ阻害薬が挙げられる。特定のプロテアーゼ阻害薬としては、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、キモスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ、３，４−ジクロロイソクマリン、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ＤＩＦＰ、アンチパイン、α２−マクログロブリン、Ｎ−エチルマレイミド、Ｅ−６４、キモスタチン、ペプスタチンＡ、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、及びベスタチンが挙げられる。
【０２９０】
ｉｉｉ．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、及び融合物
本明細書に開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、又はその断片、又は融合物は、治療剤として有用である。免疫細胞、好ましくはＴ細胞をインビボ又はエキソビボでＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドと接触させることにより、限定はされないが炎症を含めた免疫応答を低下させ又は阻害することができる。Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドと接触させるＴ細胞は、α／β及びγ／δ  Ｔ細胞受容体を含め、Ｔ細胞受容体を発現する任意の細胞であってよい。Ｔ細胞には、ＣＤ４及びＣＤ８もまた発現するＴ細胞サブセットを含め、ＣＤ３を発現するあらゆる細胞が含まれる。Ｔ細胞には、ナイーブ細胞及び記憶細胞の両方並びにＣＴＬなどのエフェクター細胞が含まれる。Ｔ細胞にはまた、Ｔｈ１、Ｔｃ１、Ｔｈ２、Ｔｃ２、Ｔｈ３、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ、及びＴｒ１細胞などの調節細胞も含まれる。Ｔ細胞にはまた、ＮＫＴ細胞及び同様のユニークなＴ細胞系統クラスも含まれる。例えば、本組成物を使用して、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、又は炎症分子、例えば、限定はされないが、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、及びＭＭＰを分泌する他の細胞、又は他の細胞によるその分泌を生じさせる他の細胞を調節することができる。また本組成物を使用して、Ｔｒｅｇの活性を増加させ又は促進し、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０などのサイトカインの産生を増加させ、Ｔｒｅｇの分化を増加させ、Ｔｒｅｇの数を増加させ、又はＴｒｅｇの生存を増加させることもできる。
【０２９１】
開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片又は融合物で治療することのできる他の免疫細胞としては、Ｔ細胞前駆体、樹状細胞及び単球若しくはそれらの前駆体などの抗原提示細胞、Ｂ細胞又はそれらの組み合わせが挙げられる。Ｂ細胞を有効量のＢ７−Ｈ４組成物と接触させて、Ｂ細胞による抗体産生を対照と比べて阻害し又は低下させることにより、Ｂ７−Ｈ４組成物を使用してＢ細胞による抗体の産生を調節することができる。Ｂ７−Ｈ４組成物はまた、Ｂ細胞によるサイトカインの産生も調節することができる。
【０２９２】
ｉｖ．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、及び融合物の遺伝子デリバリー
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、並びにその断片及び融合物又はＢ７−Ｈ４抗体をコードする核酸を、それを必要とする個体に有効な量で投与することにより、炎症反応、炎症性疾患／障害、又は自己免疫疾患／障害を治療することができる。ＤＮＡデリバリーには、典型的には、「外来性」ＤＮＡを細胞に、及び最終的には生きた動物に導入することが関わる。遺伝子デリバリーはウイルスベクター又は非ウイルスベクターを使用して実現することができる。遺伝子を対象に送達するための組成物及び方法は当該技術分野において公知である（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｎ．Ｒ．，ｅｄ．，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００８を参照）。一つの手法としては、培養下の初代細胞に対する核酸移入と、続く個体に対するエキソビボ形質転換細胞の、全身的な、或いは特定の臓器又は組織への自家移植が挙げられる。
【０２９３】
核酸療法は、機能的に活性なＤＮＡをインビボで哺乳類体細胞組織又は臓器に直接移入することにより達成し得る。ＤＮＡ移入は、以下に記載する多くの手法を用いて達成することができる。これらのシステムは、選択可能なマーカー（例えば、Ｇ４１８耐性）を使用してＤＮＡを発現するトランスフェクトされたクローンを選択し、続いてＢ７−Ｈ４発現産物の存在を、適切なイムノアッセイでその産物に対する抗体を使用して（誘導性システムの場合には誘導物質で処理した後に）検出することにより、インビトロで発現の成功について試験することができる。この手順の効率は、ＤＮＡ取り込み、プラスミドの組み込み及び組み込まれたプラスミドの安定性を含め、公知の方法を用いたプラスミドＤＮＡの線状化、及び高分子量哺乳類ＤＮＡを「担体」として使用するコトランスフェクションにより向上させることができる。
【０２９４】
レトロウイルスの介在によるヒト治療法は、アンホトロピックな（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）複製欠損レトロウイルス系を利用する（Ｗｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｃｅｌｌ，８２：５３１−５３３（１９９５））。かかるベクターを使用して機能性ＤＮＡがヒト細胞又は組織に導入されており、例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子がリンパ球に、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子及び腫瘍壊死因子遺伝子が腫瘍浸潤リンパ球に導入されている。レトロウイルスの介在による遺伝子デリバリーは、概して遺伝子移入のために標的細胞の増殖が必要である（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７０−４７５（１９９５））。この条件は、本ＤＮＡ分子を導入しようとするある種の好ましい標的細胞、即ち活発に成長する腫瘍細胞によって満たされる。多くの方法のうちのいずれかを用いるプラスミドによる及びレトロウイルスベクターによるトランスフェクションを使用した嚢胞性線維症の遺伝子療法が、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２４０，８４６号明細書により記載されている。
【０２９５】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子が、当該技術分野で周知されているとおり、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を使用してレトロウイルスベクターにパッケージングされ得る。遺伝子デリバリー用のさらなるウイルスは、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ，５：２５−３１（１９９９））に記載される。
【０２９６】
他のウイルスベクターもまた、ニューロン特異的送達及び持続のための組換えアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含め、用いられ得る。ヒト遺伝子療法に対するアデノウイルスベクターの利点としては、組換えがまれであり、かかるウイルスに関連するヒト悪性腫瘍が知られておらず、アデノウイルスゲノムが二本鎖ＤＮＡであって、最大７．５ｋｂのサイズの外来遺伝子を受け入れるように操作することができ、且つ生きているアデノウイルスが安全なヒトワクチン生命体であるという点が挙げられる。アデノ随伴ウイルスもまたヒト治療に有用である。
【０２９７】
開示されるＤＮＡ分子を発現し得るとともに、本治療状況下で、特にヒトにおいて有用な別のベクターは、非複製性にすることのできるワクシニアウイルスである。
【０２９８】
ネイキッドＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はウイルスベクターに加え、操作された細菌をベクターとして使用してもよい。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ＢＣＧ及びリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：ＬＭ）を含む多くの細菌株が使用されている。これらの生物は、ワクチンベクターとしての使用に有望な以下の２つの特徴を示す：（１）腸内感染経路（経口ワクチン送達の可能性をもたらす）；及び（２）単球／マクロファージの感染と、それによるプロフェッショナルＡＰＣに対する抗原の標的化。
【０２９９】
インビボでのウイルスの媒介による遺伝子移入に加え、プラスミドＤＮＡの投与及び微粒子ボンバードメントの媒介による遺伝子移入を含めた当該技術分野で周知の物理的手段をＤＮＡの直接移入に使用することができる。さらに、インビトロで遺伝子を細胞に移入させる周知の手段である電気穿孔を用いて、ＤＮＡ分子をインビボで組織に移入することができる。
【０３００】
「担体媒介性遺伝子移入」もまた記載されている。好ましい担体は、アシル化ｍＡｂを脂質二重層に取り込むことのできる免疫リポソームなどの標的化されたリポソーム（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１０：１３０７−１３１５（２００３））である。アシアロ糖タンパク質／ポリリジンなどのポリカチオンを使用してもよく、ここでコンジュゲートは、標的組織を認識する分子（例えば肝臓に対するアシアロオロソムコイド）と、トランスフェクトしようとするＤＮＡに結合するＤＮＡ結合化合物とを含む。ポリリジンは、ＤＮＡに損傷を与えることなくＤＮＡと結合するＤＮＡ結合分子の一例である。このコンジュゲートは、次に移入のためプラスミドＤＮＡと複合体化される。
【０３０１】
トランスフェクション又はマイクロインジェクションに使用されるプラスミドＤＮＡは、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、Ｑｉａｇｅｎ手順（Ｑｉａｇｅｎ）と、続く公知の方法、例えば本明細書に例示する方法を用いたＤＮＡ精製を用いて調製されてもよい。
【０３０２】
ｂ．免疫抑制剤−非Ｂ７−Ｈ４特異的
一部の実施形態では、免疫応答、又は炎症性／自己免疫性疾患／障害は、Ｂ７−Ｈ４シグナル伝達経路に特異的でない免疫抑制剤を対象に投与することにより治療される。Ｂ７−Ｈ４シグナル伝達経路に特異的でない免疫抑制剤は、単独で投与されても、又は上記に記載する抗体などの、Ｂ７−Ｈ４シグナル伝達経路に特異的な免疫抑制剤と組み合わせて投与されてもよい。Ｂ７−Ｈ４シグナル伝達経路に特異的でないかかる免疫抑制剤としては、限定はされないが、（例えば、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、α−４インテグリン）に対する抗体又はサイトカインに対する抗体）、他の融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）））、ＴＮＦ−α遮断薬、例えばエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シムジア（Ｃｉｍｚｉａ）及びヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）、シクロホスファミド（ＣＴＸ）（即ちＥｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、メトトレキサート（ＭＴＸ）（即ちＲｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））、ベリムマブ（即ちＢｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））、又は他の免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６様化合物、ラパマイシン化合物、又はステロイド）、抗増殖薬、細胞傷害剤、又は免疫抑制を補助し得る他の化合物が挙げられる。
【０３０３】
一部の実施形態では、薬剤は、Ｂ７−Ｈ４シグナル伝達経路と別の経路を通じたＴ細胞活性化を阻害し又は低下させる働きをする。一つのかかる実施形態において、治療剤は、ＣＴＬＡ−４融合タンパク質、例えばＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（アバタセプト）である。ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６（Ｂ７−１／Ｂ７−２）との結合に関してＴ細胞上の共刺激受容体ＣＤ２８と競合し、従ってＴ細胞活性化を阻害する働きをする。別の実施形態では、治療剤は、ベラタセプトとして知られるＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質である。ベラタセプトは、インビボでのＣＤ８６に対するそのアビディティーを顕著に増加させる２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４Ｅ及びＡ２９Ｙ）を含む。別の実施形態では、治療剤はＭａｘｙ−４である。
【０３０４】
別の実施形態では、治療剤はシクロホスファミド（ＣＴＸ）である。シクロホスファミド（ＥＮＤＯＸＡＮ（登録商標）、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標）、ＰＲＯＣＹＴＯＸ（登録商標）、ＲＥＶＩＭＭＵＮＥ（商標）の一般名）は、シトホスファンとしても知られ、オキサゾホリン（ｏｘａｚｏｐｈｏｒｉｎｅ）類のナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。シクロホスファミドは各種の癌及び一部の自己免疫障害の治療に用いられる。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、腎ループス患者において増殖性糸球体腎炎を拡散させるために使用される主要な薬物である。
【０３０５】
一部の実施形態では、治療剤は、それを必要とする患者において抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓ  ＤＮＡ）自己抗体の血中又は血清レベルを低下させる及び／又はタンパク尿を低下させるのに有効な量で投与される。
【０３０６】
別の実施形態では、治療剤は血清中のアデノシンの量を増加させる（例えば、国際公開第０８／１４７４８２号パンフレットを参照）。例えば、第２の治療剤は、ＣＤ７３−Ｉｇ、組換えＣＤ７３、又はＣＤ７３の発現を増加させる別の薬剤（例えばサイトカイン又はモノクローナル抗体又は小分子）であってもよい（例えば国際公開第０４／０８４９３３号パンフレットを参照）。別の実施形態では、治療剤はインターフェロン−βである。
【０３０７】
別の実施形態では、治療剤は、タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）又は別のＭＳ治療薬である。別の実施形態では、第２の治療剤は慢性炎症を優先的に治療し、従って治療レジメンは急性炎症及び慢性炎症の両方を標的とする。好ましい実施形態では、第２の治療薬はＴＮＦ−α遮断薬である。
【０３０８】
別の実施形態では、治療剤は、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、及び／又は炎症分子、例えば、限定はされないが、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、及びＭＭＰを分泌する他の細胞、又は他の細胞によるその分泌を生じさせる他の細胞による分化、増殖、活性、及び／又はサイトカイン産生及び／又は分泌を阻害し又は低下させる小分子である。別の実施形態では、治療剤は、Ｔｒｅｇと相互作用する、Ｔｒｅｇ活性を増強する、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０分泌を促進又は増強する、Ｔｒｅｇの数を増加させる、Ｔｒｅｇの抑制能力を増加させる、又はそれらの組み合わせの小分子である。
【０３０９】
典型的には、有用な小分子は有機分子、好ましくは、分子量が１００ダルトンより大きく且つ約２，５００ダルトンより小さい、より好ましくは１００〜２０００、より好ましくは約１００〜約１２５０、より好ましくは約１００〜約１０００、より好ましくは約１００〜約７５０、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの小型の有機化合物である。小分子は、タンパク質との構造上の相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基、好ましくはこれらの官能性化学基のうちの少なくとも２つを含む。小分子は、多くの場合に、環状炭素又は複素環式構造及び／又は上記の官能基の１つ以上で置換された芳香族又は多環芳香族構造を含む。小分子にはまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はそれらの組み合わせを含む生体分子も含まれる。一実施形態では、小分子はレチノイン酸又はその誘導体である。例えば、レチノイン酸はＴｈ１７細胞の分化及び／又は活性を阻害し又は低下させることが示されている。
【０３１０】
一部の実施形態では、組成物はＴｒｅｇ活性又は産生を増加させる。例示的Ｔｒｅｇ増強剤としては、限定はされないが、グルココルチコイドフルチカゾン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏａｌ）、抗体であって、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−４に対する抗体；ビタミンＤ３、及びデキサメタゾン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０３１１】
一部の実施形態では、治療剤は抗体、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２又はＩＬ−２１などの炎症誘発性分子に対する機能遮断抗体である。
【０３１２】
本明細書で使用されるとき、用語「ラパマイシン化合物」は、中性三環式化合物ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、及びラパマイシンと同じ作用機序（例えばサイトカイン機能の阻害）を有すると考えられる他のマクロライド化合物を含む。語句「ラパマイシン化合物」は、その治療有効性が増強するように修飾された、ラパマイシンと構造的類似性を有する化合物、例えば同様の大環状構造を有する化合物を含む。例示的ラパマイシン化合物は当該技術分野において公知である（例えば国際公開第９５１２２９７２号パンフレット、国際公開第９５１１６６９１号パンフレット、国際公開第９５１０４７３８号パンフレット、米国特許第６，０１５，８０９号明細書；同第５，９８９，５９１号明細書；米国特許第５，５６７，７０９号明細書；同第５，５５９，１１２号明細書；同第５，５３０，００６号明細書；同第５，４８４，７９０号明細書；同第５，３８５，９０８号明細書；同第５，２０２，３３２号明細書；同第５，１６２，３３３号明細書；同第５，７８０，４６２号明細書；同第５，１２０，７２７号明細書を参照）。
【０３１３】
語句「ＦＫ５０６様化合物」は、ＦＫ５０６、並びにその治療有効性が増強するように修飾されたＦＫ５０６誘導体及び類似体、例えば、ＦＫ５０６と構造的類似性を有する化合物、例えば同様の大環状構造を有する化合物を含む。ＦＫ５０６様化合物の例としては、例えば国際公開第００１０１３８５号パンフレットに記載されるものが挙げられる。好ましくは、語句「ラパマイシン化合物」は、本明細書で使用されるとき、ＦＫ５０６様化合物を含まない。
【０３１４】
ｃ．抗炎症薬
他の好適な治療剤としては、限定はされないが、抗炎症剤が挙げられる。抗炎症剤は、非ステロイド系、ステロイド系、又はそれらの組み合わせであってもよい。一実施形態は、約１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）、典型的には約２．５％（ｗ／ｗ）の抗炎症剤を含有する経口組成物を提供する。非ステロイド系抗炎症剤の代表例としては、限定なしに、オキシカム、例えば、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカム；サリチル酸塩、例えば、アスピリン、ジサルシド、ベノリラート、トリリサート、サファプリン（ｓａｆａｐｒｙｎ）、ソルプリン、ジフルニサル、及びフェンドサル；酢酸誘導体、例えば、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパク、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン（ａｃｅｍａｔａｃｉｎ）、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク（ｃｌｉｎｄａｎａｃ）、オキセピナク、フェルビナク、及びケトロラク；フェナム酸、例えば、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、及びトルフェナム酸；プロピオン酸誘導体、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン（ｉｎｄｏｐｒｏｐｆｅｎ）、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン（ｔｉｏｘａｐｒｏｆｅｎ）、スプロフェン、アルミノプロフェン、及びチアプロフェン酸；ピラゾール、例えば、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、及びトリメタゾン（ｔｒｉｍｅｔｈａｚｏｎｅ）が挙げられる。これらの非ステロイド系抗炎症剤の混合物もまた用いられ得る。
【０３１５】
ステロイド系抗炎症薬の代表例としては、限定なしに、コルチコステロイド、例えば、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシル−トリアムシノロン、α−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン（ｆｌｕａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド（ｆｌｕｏｓｉｎｏｌｏｎｅ  ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル（ｆｌｕｃｏｒｔｉｎｅ  ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド（ｆｌｕｃｅｔｏｎｉｄｅ）、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロゾン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｓｏｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、フルラドレノロン（ｆｌｕｒａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロゾン（ｄｉｆｌｕｒｏｓｏｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、フルラドレノロンアセトニド（ｆｌｕｒａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ  ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）、メドリゾン、アムシナフェル（ａｍｃｉｎａｆｅｌ）、アムシナフィド（ａｍｃｉｎａｆｉｄｅ）、ベタメタゾン及びそのエステルの残部、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン（ｃｈｌｏｒｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、クロコルテロン（ｃｌｏｃｏｒｔｅｌｏｎｅ）、クレスシノロン（ｃｌｅｓｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ジクロリゾン、ジフルプレドナート（ｄｉｆｌｕｒｐｒｅｄｎａｔｅ）、フルクロニド、フルニソリド、フルオロメタロン（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｌｏｎｅ）、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０３１６】
２．併用療法
本明細書に開示される治療剤は、単独で、又は互いに若しくは他の治療剤と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、２つの治療剤は別個に、しかし同時に投与される。２つの治療剤はまた、同じ組成物の一部として投与されてもよい。他の実施形態では、２つの治療剤は別個に、且つ異なる時点で、しかし同じ治療レジームの一部として投与される。
【０３１７】
対象には、第１の治療剤を投与してから１、２、３、４、５、６時間後、若しくはそれ以上後、又は１、２、３、４、５、６、７日後、若しくはそれ以上後に第２の治療剤を投与してもよい。一部の実施形態では、対象には１つ以上の用量の第１の薬剤が１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、又は４８日おきに投与された後、第２の薬剤の初回投与が行われ得る。
【０３１８】
治療剤は、炎症性疾患／障害又は自己免疫性疾患／障害を治療する治療レジメンの一部として投与されてもよい。例えば、第１の治療剤が対象に４日おきに投与される場合、第２の治療剤は１日目、２日目、３日目、又は４日目、又はそれらの組み合わせに投与されてもよい。第１の治療剤は治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）全体を通じて繰り返し投与されてもよい。
【０３１９】
好ましい実施形態では、１つ以上のＢ７−Ｈ４特異的抗体が、膜貫通Ｂ７−Ｈ４を模倣するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質、例えば配列番号１０と組み合わせて投与される。好ましくは、抗体は共投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質に結合することなく細胞遊離Ｂ７−Ｈ４に特異的に結合し、又は膜貫通Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインの切断を阻止する。
【０３２０】
同時治療の一例では、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ及びＣＴＸが有効量で共投与され、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの慢性自己免疫疾患／障害が予防又は治療される。別の実施形態では、第２の治療薬による投与頻度を減らすことを可能にしてＰＭＬなどの副作用のリスクを低減し、且つ第２の治療薬に対する抵抗性を防ぐため、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはタイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）とサイクル投与されるか、又は休薬期間に使用される。
【０３２１】
３．医薬組成物
本明細書に開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、断片、融合ポリペプチド、核酸、及びベクターを含む医薬組成物が提供される。ペプチド又はポリペプチドを含有する医薬組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、経皮（受動的に、或いはイオントフォレシス若しくは電気穿孔を使用）、又は経粘膜（鼻内、腟内、直腸内、又は舌下）の投与経路によるか又は生体内侵食性インサートを使用して投与されてもよく、各投与経路に適切な剤形に製剤化され得る。
【０３２２】
一部のインビボ手法では、本明細書に開示される組成物は治療有効量で対象に投与される。本明細書で使用されるとき、用語「有効量」又は「治療有効量」は、治療する障害の１つ以上の症状を治療、阻害、若しくは軽減し又は他の形で所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康等）、疾患、及び達成される治療など、様々な要因に応じて異なり得る。
【０３２３】
本明細書に開示されるポリペプチド組成物及びそれをコードする核酸については、さらなる研究が行われるに伴い、様々な患者における様々な病態の治療に適切な投薬量レベルに関する情報が出てくることになり、当業者は、治療のコンテクスト、被投与者の年齢、及び全般的な健康を考慮して適切な投薬を確かめることができるであろう。選択される投薬量は、所望の治療効果、投与経路、及び所望の治療期間に依存する。ポリペプチド組成物については、概して１日０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルが哺乳動物に投与される。概して、静脈内注射又は注入では投薬量はより低くなり得る。
【０３２４】
特定の実施形態において、ポリペプチド組成物は、例えば治療する部位に直接注射することによって局所投与される。典型的には（Ｔｙｐｃｉａｌｌｙ）、注射はポリペプチド組成物の局所濃度の増加を生じさせ、これは全身投与により実現し得るより高い。例えば、多発性硬化症などの神経障害の場合、タンパク質はＣＮＳ近傍の部位に局所投与され得る。ポリペプチド組成物を上記に記載したとおりマトリックスと組み合わせることで、治療する部位から出ていくポリペプチドの受動拡散を低下させてポリペプチド組成物の局所濃度の増加を生じさせることを補助し得る。
【０３２５】
ａ．非経口投与用製剤
好ましい実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ペプチド及びポリペプチドを含有するものを含め、水溶液中において非経口注射により投与される。製剤はまた、懸濁液又はエマルションの形態であってもよい。概して、有効量のペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物が提供され、場合により薬学的に許容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を含む。かかる組成物は、場合により以下に関して１つ以上を含む：希釈剤、滅菌水、様々な緩衝含有分（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝生理食塩水；及び添加剤、例えば、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、ツイーン２０（ＴＷＥＥＮ  ２０）（ポリソルベート２０）、ツイーン８０（ＴＷＥＥＮ  ８０）（ポリソルベート８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、及び保存剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）。非水性溶媒又は媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油及びトウモロコシ油、ゼラチン、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。製剤は凍結乾燥され、使用直前に再溶解／再懸濁されてもよい。製剤は、例えば、細菌保持フィルタでのろ過、組成物への滅菌剤の組み込み、組成物の照射、又は組成物の加熱により滅菌されてもよい。
【０３２６】
ｂ．局所投与用製剤
本明細書に開示される融合タンパク質は局所適用することができる。多くのペプチド製剤で局所投与は上手く機能しないが、それが特に肺、鼻、口（舌下、頬側）、腟、又は直腸粘膜に適用される場合には有効となり得る。
【０３２７】
組成物は、約５ミクロン未満の空気動力学的直径を有するエアロゾル或いは噴霧乾燥粒子として送達されるとき、吸入する間に肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流に至り得る。
【０３２８】
限定はされないが、ネブライザー、定量噴霧式吸入器、及び粉末吸入器を含め、治療生成物の肺送達用に設計された幅広い機械的装置を使用することができ、それらは全て、当業者が熟知している。市販の装置のいくつかの具体的な例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ及びＭａｎｎｋｉｎｄは、いずれも承認済み又は臨床試験中の吸入可能インスリン粉末製剤を有し、その技術は本明細書に記載される製剤に適用することができる。
【０３２９】
粘膜への投与用製剤は、典型的には噴霧乾燥薬物粒子であり、これは錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液又はエマルションに組み込まれ得る。標準的な医薬賦形剤は任意の製剤化業者から入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤又はロゼンジの形態であってもよい。
【０３３０】
経皮製剤もまた調製され得る。これらは典型的には軟膏、ローション、スプレー、又はパッチであり、いずれも標準的な技術を用いて調製することができる。経皮製剤は浸透促進剤を含めることが必要となり得る。
【０３３１】
ｃ．制御送達ポリマーマトリックス
本明細書に開示される融合タンパク質はまた、制御放出製剤で投与されてもよい。制御放出ポリマー装置は、ポリマー装置の植え込み後（ロッド、シリンダ、フィルム、ディスク）又は注射後（マイクロパーティクル）に全身的に長期放出されるように作製することができる。マトリックスはマイクロスフェアなどのマイクロパーティクルの形態であってもよく、ここではペプチドが固体ポリマーマトリックス又はマイクロカプセルの中に分散しており、ここでコアはポリマーシェルと異なる材料であり、液体又は固体の性質であってよいコアにペプチドが分散又は懸濁されている。本明細書で特に定義しない限り、マイクロパーティクル、マイクロスフェア、及びマイクロカプセルは同義的に使用される。或いは、ポリマーは、数ナノメートル乃至４センチメートルの範囲の薄スラブ又は薄膜か、粉砕又は他の標準的な技法によって作製される粉末か、又はさらにはハイドロゲルなどのゲルとしてキャストされてもよい。
【０３３２】
融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする核酸の送達には非生分解性又は生分解性のいずれのマトリックスも使用することができ、しかし生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーであっても、又は合成ポリマーであってもよいが、分解の特性及び放出プロファイルがより良好であるため、合成高分子が好ましい。ポリマーは、所望の放出期間に基づき選択される。ある場合には線形的な放出が最も有用であり得るが、他の場合にはパルス放出又は「バルク放出」がより効果的な結果をもたらし得る。ポリマーはハイドロゲルの形態（典型的には水の重量基準で最大約９０％まで吸収する）であってもよく、場合により多価イオン又はポリマーと架橋されてもよい。
【０３３３】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出及び当業者に公知の他の方法によって形成することができる。生体内侵食性マイクロスフェアは、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５：１３−２２（１９８７）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，６：２７５−２８３（１９８７）；及びＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．，３５：７５５−７７４（１９８８）によって記載されるとおり、薬物デリバリー用のマイクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを用いて調製することができる。
【０３３４】
これらの装置は、植え込まれた又は注射された範囲を治療するための局所放出用−これは典型的には全身治療の投薬量よりはるかに少ない投薬量を送達し得る−又は全身送達用に製剤化することができる。これらの装置は、筋肉、脂肪に植え込まれるか若しくは皮下注射されてもよく、又は嚥下されてもよい。
【０３３５】
Ｃ．治療する対象の選択方法
一部の実施形態では、上記に開示する膜貫通Ｂ７−Ｈ４、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出する方法、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４をＢ７−Ｈ４融合タンパク質と区別する方法、又は診断する方法が、検出又は診断される疾患／障害を治療する方法と組み合わされる。従って、一部の実施形態では、本開示の方法は、対象を治療する１つ以上のさらなるステップを含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、有効量の治療剤を対象に投与することにより、検出又は診断される疾患／障害の１つ以上の症状を軽減することを含む。
【０３３６】
また、治療する対象の選択方法も開示される。例えば、一部の実施形態では、対象は、対照と比較した、生体試料中における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の発現増加の検出、又は癌細胞上での又はそれからの膜貫通若しくは細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の発現若しくは発現増加に基づき治療から選択される。治療対象の選択方法は、上記で考察する検出又は診断方法の１つ以上を、治療する対象を選択すること、及び場合により対象に治療を投与することと組み合わせて含み得る。
【０３３７】
Ｖ．治療有効性の判定方法
生体試料中における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４タンパク質レベルの検出は、免疫媒介性又は炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害又は癌を有する患者の治療に使用される薬物若しくは化合物又は手順の有効性をモニタするのに有用であり得る。例えば、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の治療有効性は、治療の経過にわたる個体の生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを定量化することにより評価し得る。個体からの生体試料中に存在する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルは、治療前と、続いて治療中に様々な時間間隔で決定することができる。治療を受けている個体の生体試料中に存在する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルを、治療前の、又は治療の経過における異なる時点での同じ個体からの生体試料中に存在する細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のレベルと比較することにより、免疫応答又は病態、炎症性又は自己免疫性疾患／障害を低下させ又は阻害すること、又は癌の１つ以上の症状を治療することにおける治療の有効性を判定し得る。それに加えて又は代えて、治療を受けている個体の生体試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルは、免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌の種々の病期の指標となる細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の量と比較することができる。
【０３３８】
例えば、対象における免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定する方法は、治療前又は治療の経過中に対象から得た１つ以上の生体試料から細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップを含んでもよく、ここでは対象から得た試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの経時的な減少が、その治療が有効であることの指標となる。
【０３３９】
対象における免疫応答若しくは病態、炎症性若しくは自己免疫性疾患／障害、又は癌に対する治療の有効性を判定する方法はまた、第１の生体試料及び第１の試料より後に採取した第２の生体試料の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルを決定するステップを含んでもよく、ここでは治療の経過にわたり対象から試料が得られ、及び第１の試料と比較した第２の試料における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの減少が、その治療が有効であることの指標となる。
【実施例】
【０３４０】
実施例１：一連の抗Ｂ７−Ｈ４抗体は様々な結合特性を呈する
材料及び方法
一連の抗Ｂ７−Ｈ４モノクローナル抗体を調製し（２Ｈ９、ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、２Ｄ１、６Ｈ３、８Ｅ１１）又は購入した（Ｈ７４、ＨＭＨ４−５Ｇ１）。
【０３４１】
一連のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を、以下の配列で調製した：変異体１（配列番号２９）、変異体２（配列番号３１）、変異体３（配列番号３３）、変異体４（配列番号３５）、変異体５（配列番号３７）、及び変異体６（配列番号３９）。
【０３４２】
単離したＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質をマイクロタイタープレート上にコーティングし、漸増濃度のビオチン化抗Ｂ７−Ｈ４抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイの基質として使用し、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ二次抗体とインキュベートし、吸光度４５０ｎｍで酵素を検出した。
【０３４３】
結果
ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットアッセイを実施して、様々なＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質に対する一連の抗Ｂ７−Ｈ４モノクローナル抗体の結合特性を特徴付けた。
【０３４４】
代表的な結果を図１Ａ〜図１Ｇに示し、及び以下の表２に提供する。「＋」は融合タンパク質に結合した抗体を示し、一方、「−」は、抗体が融合タンパク質との結合をほとんど又は全く呈しなかったことを示す。
【０３４５】
図２は、一連の抗体に対するエピトープの推定位置を示す。
【０３４６】
【表４】
2016505843.tif 000066
【０３４７】
実施例２：２Ｈ９及び６Ｈ３又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１は、マウス及びヒト細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の捕捉及び検出に有効である
材料及び方法
Ｂ７−Ｈ４−細胞遊離Ｂ７−Ｈ４マウス又はヒト融合タンパク質
抗体２Ｈ９又は２Ｈ９のＦ（ａｂ’）２断片（捕捉）；６Ｈ３又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１又はＨＭＨ４−５Ｇ１（検出）
【０３４８】
結果
一連のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、２Ｈ９及び６Ｈ３又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１が細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を捕捉及び検出する能力を特徴付けた。結果を図３、図４、図５及び図６に示す。
【０３４９】
図３は、２Ｈ９／６Ｈ３による細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の捕捉／検出の濃度依存的な増加を示す。
【０３５０】
図４は、抗体の組み合わせが、マウス及びヒト細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の捕捉／検出における使用に有効であることを示す。
【０３５１】
図５は、細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の検出に使用した３つの抗体捕捉／検出の組み合わせ：２Ｈ９／６Ｈ３、２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１、及び２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１による３つのＥＬＩＳＡ法が、直線的な相関を示すことを示す。
【０３５２】
図６は、２Ｈ９のＦ（ａｂ）’２断片（捕捉）及び６Ｈ３又はｈＢ７−Ｈ４．ｍ１（検出）による細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の捕捉／検出の濃度依存的な増加を示す。
【０３５３】
実施例３：血清レベル細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の計測は、炎症性／自己免疫性障害の診断指標である
材料及び方法
健常個体（ＨＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群及び腎癌／卵巣癌／乳癌／肺癌と診断された個体から血清試料を得て、２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１を使用したＥＬＩＳＡ捕捉／検出アッセイに供した（図７、図８及び図９）。
【０３５４】
結果
結果を図７〜図９及び以下の表３に提供する。
【０３５５】
【表５】
2016505843.tif 000067
【０３５６】
表３は、全個体における＜１ｎｇ／ｍＬ及び＞１ｎｇ／ｍＬが計測された各疾患集団（又は対照）の比を示す。
【０３５７】
図７及び表３の結果は、ＲＡ及びシェーグレン症候群患者では、健常ドナーと比較して細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の有意な上昇があることを示している。１ｎｇ／ｍｌを上回るＢ７−Ｈ４の細胞遊離レベルはヒトにおける疾患及び重症度と相関し、ＲＡ及びＳＬＥのマウスモデルで疾患の増悪の発症閾値である；細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を使用して疾患を診断し、治療する患者を選択し、及び治療の進行をモニタすることができる。
【０３５８】
図８の結果は、一連のＳＬＥ治療患者における経時的な血清中細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルの縦断的研究を示している。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４濃度は治療に伴い変化し、それを利用して疾患重症度の変化の指標とし、治療の進行をモニタすることができる。
【０３５９】
図９に示す結果は、５〜２５％の癌患者（卵巣癌／乳癌／腎癌／肺癌）に細胞遊離Ｂ７−Ｈ４の上昇があることを示している。腫瘍関連Ｂ７−Ｈ４は予後不良と関連付けられ、抗腫瘍免疫応答の抑制に関係している。癌患者血清中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を使用して疾患を診断し、治療する患者を選択し、及び治療の進行をモニタすることができる。
【０３６０】
実施例４：判別的ＥＬＩＳＡアッセイの使用による治療的Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質の治療時における細胞遊離Ｂ７−Ｈ４のモニタリング
材料及び方法
種々の抗体クローンが細胞遊離Ｂ７−Ｈ４及びＢ７−Ｈ４−Ｉｇに結合する能力を、直接結合ＥＬＩＳＡによって評価した（図１０を参照のこと）。捕捉／検出の組み合わせ：２Ｈ９／６Ｈ３、２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１及び２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１を含め、種々のサンドイッチＥＬＩＳＡ法が細胞遊離Ｂ７−Ｈ４及びＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を検出する能力を評価した（図１１を参照のこと）。
【０３６１】
結果
図１０及び図１１に提供する結果は、２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１及び２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１対が細胞遊離Ｂ７−Ｈ４を検出することができたが、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは検出できなかったことを示している。従って、２Ｈ９／ＨＭＨ４−５Ｇ１及び２Ｈ９／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１対を利用して、自己免疫疾患患者におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇ治療中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベルをモニタすることができる。
【０３６２】
実施例５：血清中細胞遊離Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）レベルは関節リウマチ疾患重症度と相関する
材料及び方法
健常個体（ＨＤ）並びに関節リウマチ（ＲＡ）及びシェーグレン症候群と診断された個体から血清試料を得た。血清試料を、２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１を使用したＥＬＩＳＡ捕捉／検出アッセイに供した（図７）。
【０３６３】
結果
ＤＡＳ−２８は、関節リウマチ（ＲＡ）患者の疾患活動性を測る合成指標であり、（１）腫脹している及び／又は圧痛のある手、手首、肘、肩、及び膝の関節数；（２）炎症の程度を計測する赤血球沈降速度（ＥＳＲ）又は血中Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）；（３）当日の患者の具合を０（とても良い）から１０（とても悪い）で評価する患者のビジュアルアナログスコア（簡易スケール）に基づく。これらの結果を合わせることでＤＡＳ２８スコアが作成され、これは疾患活動性の程度と相関する：
・  ＜２．６：疾患寛解
・  ２．６〜３．２：低い疾患活動性
・  ３．２〜５．１：中程度の疾患活動性
・  ＞５．１：高い疾患活動性
（Ｆｒａｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２３（Ｓｕｐｐｌ．３９）：Ｓ９３−Ｓ９９（２００５））。
【０３６４】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｔｈｒｉｔｉｓ）患者から４８例の臨床血清試料を得て、即日臨床評価及びＤＡＳ−２８スコアに供した。結果を以下の表４に提供する。３例の最も高い細胞遊離Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）試料が３つの最も高いＤＡＳ−２８スコアも有した。５例の中程度の試料が境界域陽性であった。
【０３６５】
【表６】
2016505843.tif 000068
【０３６６】
実施例６：細胞遊離Ｂ７−Ｈ４血清レベルは多発性硬化症（ＭＳ）の疾患検出と相関する
材料及び方法
多発性硬化症（ＭＳ）と診断された健常個体から得た血清試料を、２Ｈ９  Ｆ（ａｂ’）２／ｈＢ７−Ｈ４．ｍ１を使用したＥＬＩＳＡ捕捉／検出アッセイに供した（表５及び表６を参照）。
【０３６７】
結果
多発性硬化症の臨床評価を受けている５８人の患者から得られた血清試料を、テキサス大学サウスウェスタン（ＵＴ−Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ）から入手した。血清試料中の細胞遊離Ｂ７−Ｈ４レベル（ｓＨ４）を、捕捉抗体として２Ｈ９  Ｆ（ａｂ）’２及び検出抗体として６Ｈ３を使用したＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。細胞遊離Ｂ７−Ｈ４と疾患検出及び重症度との間の相関を、以下の表５及び表６に提供する。
【０３６８】
【表７】
2016505843.tif 000069
【０３６９】
【表８】
2016505843.tif 000070
【図１Ａ−１Ｇ】
2016505843.tif 000071
【図２】
2016505843.tif 000072
【図３】
2016505843.tif 000073
【図４】
2016505843.tif 000074
【図５Ａ−５Ｂ】
2016505843.tif 000075
【図６】
2016505843.tif 000076
【図７】
2016505843.tif 000077
【図８】
2016505843.tif 000078
【図９】
2016505843.tif 000079
【図１０Ａ−１０Ｆ】
2016505843.tif 000080
【図１１Ａ−１１Ｃ】
2016505843.tif 000081
【配列表】
2016505843000001.app
【国際調査報告】
2016505843.tif 000082
2016505843.tif 000083
2016505843.tif 000084
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2016505843.tif 000087
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