(57)【要約】  本発明は、サンプル中、例えば大量飼育サンプル又は環境サンプル中の特定のダニ種を同定する新規な方法に関する。本発明は更に、構造的リボソームRNAエレメント(rRNA)をコードする核酸分子、及び、特定のダニ種の当該構造的リボソームRNA間に位置する非機能的RNAに関し、本方法に使用するプライマーの設計についてのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ)サンプルからDNAを取得する工程；
ｂ)以下のプライマー：
i．各プライマーが同定すべきダニ種の各々のrDNAのITS1配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする、１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の第１のプライマー、及び
ii．同定すべきダニ種のrDNAの18S、5.8S若しくは28S配列のいずれかから選択される配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする１又はそれより多い、例えば１つの第２のプライマー
を用いて、例えばPCRにより、同定すべきダニ種の各々のrDNAの領域を増幅して、同定すべきダニ種に特異的なアンプリコンを生成する工程；及び
ｃ)アンプリコンの特徴を評価することによりダニ種を同定する工程
を含んでなる、サンプル中の１又はそれより多い異なるコナダニ亜目ダニ種の同定方法。
【請求項２】
工程ｂ)において、生成したアンプリコンが同定すべき特定のダニ種に特徴的な分子サイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｃ)において、ダニ種が、同定すべきダニ種に特徴的であるアンプリコンの分子サイズを評価することによって同定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
13未満、例えば10、例えば８、例えば６、例えば５、例えば３の異なるコナダニ亜目ダニが同定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ)において、同定すべきダニ種に特異的な２又はそれより多いアンプリコンが生成され、該アンプリコンは長さが少なくとも15bp、例えば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30bp異なる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第２のプライマーが同定すべきコナダニ亜目ダニ種のいずれかの前記配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドに90％、例えば91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ)i.で使用する１又はそれより多い第１のプライマーが、3'末端に、同定すべきダニ種のいずれかのITS1配列に対して正確な相補性を有する少なくとも３、例えば４、５又は６の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ)i.で使用する１又はそれより多い第１のプライマーが、同定すべきダニ種のITS1配列のいずれかの対応部分又はその相補部分の配列に少なくとも約70％、例えば76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、10、11若しくは12又はそれより多い異なるコナダニ亜目ダニ種の同定のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ)がアンプリコンの分子サイズを分子マーカー組成物の参照ヌクレオチドの分子サイズと比較することにより行われ、該参照ヌクレオチドのサイズが該当する塩基対間隔にわたる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
参照ヌクレオチドのサイズが同定すべきダニ種に特徴的なアンプリコンのサイズに相当する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
例えばPCRによる、予備増幅工程が工程ｂ)に先行し、該予備増幅工程において、サンプル中のいずれかのコナダニ亜目ダニ種のITS1領域を含有するrDNAが、該rDNAの18S配列に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー及び該rDNAの5.8S及び28S配列から選択される配列に特異的にハイブリダイズする第２のプライマーを用いて増幅される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが環境サンプルである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが大量飼育培地又はその精製画分に由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルが大量飼育培地又はその精製画分に由来し、予備増幅工程が行われない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
２又はそれより多い第１のプライマーが使用され、各プライマーは同定すべきダニ種の１つのITS1配列に特異的にハイブリダイズし、他の同定すべきダニ種には交差ハイブリダイズしない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のプライマーが配列番号１〜10、配列番号11〜20、配列番号21〜30、配列番号31〜40、配列番号41〜50、配列番号51〜60、配列番号61〜70、配列番号71〜80、配列番号81〜90及び配列番号91〜100のいずれか１つにより特定される２群又はそれより多い、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は10群の配列又はそれらの相補配列に基づいて設計される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程ｂ)i.で言及される前記第１のプライマーが、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列のITS1若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である配列を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のプライマーが少なくとも約６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25の連続ヌクレオチド長である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のプライマーがせいぜい約70、60、50、40、30、25、23、20の連続ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のプライマーが、配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそのフラグメント若しくは該フラグメントの相補配列に少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である配列を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のプライマーが、配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である配列からなる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のプライマーが、配列番号１〜100のいずれか１つより選択される配列中の5.8Sのフラグメント又はその相補配列に少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である核酸配列、例えばRast5.8、例えば配列番号111により規定される核酸配列、又はその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のプライマーが、配列番号１〜100のいずれか１つより選択される配列中の18Sのフラグメント又はその相補配列に少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である核酸配列、例えばFRibNav、例えば配列番号121により規定される核酸配列、又はその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１又はそれより多い異なるコナダニ亜目種が、チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエからなる群より選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である単離された核酸分子。
【請求項２７】
少なくとも約６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25の連続ヌクレオチド長である、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
せいぜい約1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30又は20の連続ヌクレオチド長である、請求項２６又は２７に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列のITS1若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約80％同一である配列を含んでなる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124若しくはその相補配列からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である配列を含んでなる、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約80％同一である配列からなる請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１〜100のいずれか１つより選択される配列中の5.8S又はその相補配列に少なくとも約80％同一である核酸配列、例えばRast5.8、例えば配列番号111により規定される核酸配列、又はその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
配列番号１〜100のいずれか１つより選択される配列中の18S又はその相補配列に少なくとも約80％同一である核酸配列、例えばFRibNav、例えば配列番号121により規定される核酸配列又はその相補配列又はそのフラグメントを含んでなる、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
請求項２６〜３３のいずれか１項に特定される、異なるコナダニ亜目種の１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる核酸分子を含んでなる、組成物。
【請求項３５】
チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエからなるリストより選択される２又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる種を検出、識別又は同定するための配列を含んでなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
配列番号１〜100のいずれか１つより選択される配列中の5.8S又はその相補配列に少なくとも約80％同一である核酸分子、例えばRast5.8、例えば配列番号111により規定される核酸配列、又はその相補配列又はそれらのフラグメントを更に含んでなる、請求項３４又は３５に記載の組成物。
【請求項３７】
１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なるコナダニ亜目ダニ種の同定のための、配列番号１〜111からなるリストより独立して選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である１又はそれより多い核酸分子の使用。
【請求項３８】
前記核酸分子が請求項２６〜３３のいずれか１項に規定されるとおりのものであるか、又は請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の組成物の一部である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
請求項３７又は３８に規定されるとおりであってITS1を含む単離された核酸分子の、特定のコナダニ亜目ダニ種に独特なプライマーを設計するための使用。
【請求項４０】
請求項３７〜３９のいずれか１項に規定されるとおりであって5.8S又は18Sを含んでなる単離された核酸分子の、チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエのコナダニ亜目ダニ種のrDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーを設計するための使用。
【請求項４１】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのアンプリコン。
【請求項４２】
１又はそれより多いポリヌクレオチド、例えば請求項４１に記載の１又はそれより多いアンプリコンに相当するサイズのDNAを含んでなる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法において使用するための分子サイズマーカー組成物。
【請求項４３】
以下：
ａ)請求項３４〜３６のいずれか１項に規定されるとおりの組成物；及び
ｂ)分子サイズマーカー、例えば請求項４２に規定されるとおりの組成物
を含んでなるキット。
【請求項４４】
例えばPCRによる、サンプル中の任意のrDNA成分の増幅に適切な18S、5.8S又は28S配列に特異的な一対のプライマーを更に含んでなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
抽出溶液及び/又は指示マニュアルを更に含んでなる請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４６】
以下の工程：
ａ)サンプル中、例えば環境サンプル中のコナダニ亜目の１又はそれより多い特定種の個体からDNAを抽出し取得する工程；
ｂ)前記種に特異的な核酸分子を検出する工程であって、前記配列が配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である核酸配列と同一である、工程；
ｃ)前記種に特異的な核酸分子の検出に基づいてコナダニ亜目の前記特定種を同定する工程；
ｄ)前記サンプルを取得する工程であって、前記サンプル中のコナダニ亜目の１又はそれより多い特定種の正体が工程ｃ)から既知である工程
を含んでなる、サンプル中のコナダニ亜目の１又はそれより多い特定種の正体が既知であるサンプルの調製方法。
【請求項４７】
工程ｂ)が１又はそれより多いフォワード及びリバースプライマーセットを用いrDNAについてPCRを使用して行われ、１セットの前記プライマーのうちの少なくとも一方が前記種に特異的であり、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である配列と同一である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記PCRが請求項３２〜３４のいずれか１項に規定されるとおりの組成物のプライマーを用いて行われる、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
例えばPCRによる、予備増幅工程が工程ｂ)に先行し、該予備増幅工程において、サンプル中のいずれかのコナダニ亜目ダニ種のrDNAが、該rDNAの18S配列に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー及び該rDNAの5.8S及び28S配列から選択される配列に特異的にハイブリダイズする第２のプライマーを用いて増幅される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記１又はそれより多いコナダニ亜目の特定種が、チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエからなるリストより選択される、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の方法に従って調製されるダニ培養物又はその精製画分、例えば保証されたダニ培養物又は保証された精製画分の調製物。
【請求項５２】
以下の工程：
ａ)以下のプライマー：
i．各プライマーが同定すべき唯一のダニ種のDNA配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする、１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の第１のプライマー、及び
ii．同定すべきダニ種の定常配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする１又はそれより多い、例えば１つの第２のプライマー
を用いて、例えばPCRにより、同定すべきダニ種に特異的なDNAの領域を増幅して、同定すべきダニ種に特異的であり、他のダニ種と識別可能なアンプリコンを生成する工程であって、DNAの該領域が１又はそれより多いコナダニ亜目ダニ種のサンプル中に存在する、工程
ｂ)アンプリコンの特徴を評価することによりダニ種を同定する工程
を含んでなる、サンプル中の１又はそれより多いコナダニ亜目ダニ種を同定する方法。
【請求項５３】
増幅工程の前に、サンプルからダニDNAを単離する工程を更に含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
同定すべきダニ種に特異的な配列が少なくとも１つの同定すべきダニ種のrDNAのITS1配列又はそのフラグメントを含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
同定すべきダニ種の定常配列が少なくとも１つの同定すべきダニ種のrDNAの18S、5.8S若しくは28S配列又はそれらのフラグメントである、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
検出可能な標識を更に含んでなる、請求項４１に記載の少なくとも１つのアンプリコン。
【請求項５７】
検出可能な標識を更に含んでなる、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、特定のコナダニ亜目[Astigmata]ダニ種の、リボソームRNAをコードする核リボソームDNA(rDNA)に相当する新規核酸配列に関する。本発明は更に、生物学的サンプル中、例えば大量飼育培養物、該培養物の精製画分、ハウスダスト及び他の環境サンプル中の特定のダニ種の同定方法における当該配列又はそのフラグメントの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
コナダニ亜目のダニは、呼吸器系アレルギーの重要な原因要素と認識されている。最も関連する種は、フィログリフィダエ科[チリダニ科；Pyroglyphidae](ダーマトファゴイデス属[ヒョウダニ属；Dermatophagoides]及びユーログリフス属[Euroglyphus])、アカリダエ科[コナダニ科；Acaridae](アカルス属[コナダニ属；Acarus]及びチロファグス属[ケナガコナダニ属；Tyrophagus])及びグリシファギダエ科[ニクダニ科；Glycyphagidae](ブロミア属[Blomia]、グリシファグス属[Glycyphagus]及びレピドグリフス属[Lepidoglyphus])に属する。アレルゲン回避、薬物療法及び免疫療法は、ダニにより引き起こされるアレルギー疾患を低減させるために現在行なわれている主要なストラテジであり、免疫療法が唯一の疾患改変アプローチであり、アレルギーの防止に最も見込みがある。現状の免疫療法には、適切な送達形態のアレルゲン抽出物の患者への投与が含まれる。ダニの場合、抽出物は、該当するダニの大量飼育培養物から作製する。ダニ培養物における種の同定及び交差汚染の回避が、アレルゲン製造の標準化における重要な因子である。更に、医療用等級のアレルゲン抽出物の製造について、ダニ培養物の同一性/純度/交差汚染なしを証明する規制上の要件が存在する。
また、患者の家の環境サンプルにおけるダニ集団の同定は、アレルゲン曝露のリスクをモニターするため及び診断目的に有用である。
【０００３】
大量飼育培養物及び環境サンプルにおけるダニ種の同定は、従来、例えばSpieksma(1990)に記載されるような、形態学的同定に基づくものであった。この方法は、信頼できるが、成虫段階のインタクトなダニのサンプルについてのみ実施可能であり、高い熟練度を要する。形態学的同定は時間がかかり、産業化には費用が増大し、製造プロセス下流の精製ダニ画分には適用できない。存在するインタクトなダニの数が相当少ないか又は全く存在しないこともあるので、環境サンプル中のダニ種の形態学的同定は、困難であり得る。
系統発生学的類縁関係を、微生物、真菌、ダニ及びマダニの系統学による目の範囲内で分析するための種々の分子的方法が示唆されている。系統発生学の研究を行なうためには、１又はそれより多い適切な分子マーカーを同定しなければならない。Cruickshank 2002は、概説論文で分子マーカーの適切な性質を記載し、ミトコンドリア遺伝子(mtDNA)及び核リボソーム遺伝子(rDNA)の中から主に選択された９つの可能性のある分子マーカーを示唆する。したがって、リボソームDNAの高度保存領域(18S rDNA、5.8S rDNA及び28S rDNA)、ミトコンドリア遺伝子(シトクロムオキシダーゼ、12S及び16S rDNA)及びrDNAの内部転写スペーサー領域(ITS1及びITS2)が系統発生学的研究について提案されている。
【０００４】
Navajas 1999は、フィトセイイダエ科[カブリダニ科；Phytoseiidae]の中のダニ種の系統発生学的分析及び同定について、分子マーカー rDNAのITS1、ITS2及び5.8S遺伝子の有用性を評価した。ITS1-5.8S-ITS2領域全体を、rDNAの18S及び28S領域から作製したユニバーサルプライマーを用いるPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)で増幅させた。各PCR産物を配列決定し、整列させて系統発生学的類縁関係を決定した。Navajasは、新たな群内のDNA変動レベルは予想不可能であり、したがって種又は一群の種に適切な分子マーカーを同定するには予備的評価が必要であると結論付けた。フィトセイイダエ科ダニに関しては、ITS1はITS2より長く、より多くの配列変動を有していた。ITS2は分類学的研究で何らかの価値を有するには短すぎると考えられており、ITS1は変動しすぎると考えられており、5.8Sは、ITS2との組合せでは、当該群の中で妥当な特異性をもたらすとは考えられていなかった。
Noge 2005は、rDNAのITS2領域を分子マーカーとして使用して、73のダニ種の系統発生学的分析を行なった。PCR増幅用プライマーは、ITS2領域に隣接する高度保存領域(１つは5.8S領域中、１つは28S領域中)から作製した。各PCR産物の３つのクローンを配列決定し、整列させて、系統発生学的類縁関係を決定した。
【０００５】
Suarez-Martinez 2005は、ミトコンドリア12S rRNAを分子マーカーとして使用して、４つの代表的なコナダニ亜目ダニたるダーマトファゴイデス プテロニシヌス[ヤケヒョウダニ；Dermatophagoides pteronyssinus]、グリシファグス プリバツス[チリニクダニ；Glycyphagus privatus]、アレウログリフス オバツス[ムギコナダニ；Aleuroglyphus ovatus]及びブロミア トロピカリス[ネッタイタマニクダニ；Blomia tropicalis]を同定した。全ての種を、rRNA 12Sマーカーから作製した１つのユニバーサルフォワードプライマー及び１つのユニバーサルリバースプライマーを用いて増幅させた。各PCR産物を配列決定し、整列させて、系統発生学的類縁関係を決定し、変異型を同定した。
環境サンプル中のダニ種の分子同定のために幾つかの技法、例えば、PCR法((制限フラグメント長多形(RFLP)、増幅フラグメント長多形(AFLP)、マルチプレックスPCR))及びアレイが提案されている。
Wong 2011は、rDNAのITS2領域をRFLP PCRにおける分子マーカーとして用いて、ハウスダスト中のダーマトファゴイデス プテロニシヌス、ダーマトファゴイデス ファリナエ[コナヒョウダニ；Dermatophagoides farinae]、ブロミア トロピカリス、チロファグス プトレセンチアエ[ケナガコナダニ；Tyrophagus putrescentiae]、アレウログリフス オバツス及びグリシコメツス マライシエンシス[Glycycometus malaysiensis]の同定に成功した。プライマーは、ITS2領域に隣接する高度保存領域(１つは5.8S領域中、１つは28S領域中)から作製した。増幅後、同定すべきダニに特異的な制限酵素の組合せでPCR産物を消化し、SDS-PAGEで制限フラグメントを分離することにより同定を行なった。制限フラグメントのサイズパターンを利用して、問題のダニ種を同定した。Wongは、同一ダストサンプルに幾つかの異なるダニが存在する場合には、単一のダニの単離を示唆している。
【０００６】
JP2007-202462、JP2008-35773及びJP2009-171986はいずれも、同一発明の種々の観点を開示する。この発明は、ハウスダストサンプル中のダニ及び真菌の検出又は弁別のための核酸ハイブリダイゼーションに基づくアレイシステム並びに該マイクロアレイに使用するための核酸プローブに関する。簡潔には、ダニ及び真菌のITS1-5.8S-ITS2領域全体を、いずれもrDNAの18S及び28S領域から作製したダニ-特異的プライマー(配列番号56及び57)及び真菌-特異的プライマー(配列番号58及び59)を用いてダストサンプルから増幅させた。ダニ及び真菌の増幅は、同一チューブにダニ-特異的プライマー及び真菌-特異的プライマーの両方を加える「１チューブPCR」で行ない得る。検出すべき各々のダニ及び真菌について、核酸プローブを、ITS1の各末端部又はITS2の各末端部から作製したプライマーを用いて、問題のダニ又は真菌の純粋サンプルから増幅させた。よって、得られる当該発明のプローブは、問題の種のITS1若しくはITS2又はそのフラグメント又はそれらの相補体に相当する。このマイクロアレイでは、各ウェルが１つの種のITS1領域又はその種のITS2領域又はそれらの相補体を同定するので、１つの種の検出に４つのウェルを使用する。
Thet-em 2012は、ITS2及びCox Iを分子マーカーとして用いるマルチプレックスPCRを設計して、ハウスダスト中のダーマトファゴイデス プテロニシヌス、ダーマトファゴイデス ファリナエ及びブロミア トロピカリスを同定した。ダーマトファゴイデス プテロニシヌス及びダーマトファゴイデス ファリナエについての種特異的プライマーは、rDNAのITS2領域から作製した。ブロミア トロピカリスについての種特異的プライマーは、ミトコンドリアDNAのCox I遺伝子から作製した。
【０００７】
これら方法はいずれも、ITS1領域に基づいて設計されたダニ種同定用プライマーを利用しない。更に、これら方法は全て、増幅に、DNA配列あたり１セットのプライマーを必要とする。アンプリコンが大きい場合、アンプリコンの分子サイズで正確な種を同定するためには、アンプリコンを種々の制限酵素消化に供し、得られたフラグメントのサイズ分布のパターン結果を分析する必要がある。これら方法のほとんどは、サンプル中の単一種の同定にのみ適切である。したがって、これら方法を用いてサンプル中の幾つかの種を同定するためには、かなり大量のサンプルが依然として必要である。最後に、これら方法のほとんどには、ダニ特異的プライマーを用いる非特異的増幅の第１工程及び種の同定を可能とするアンプリコンの相当複雑な処理(RFLP-PCRにおける制限酵素消化、配列決定又はアレイでのプローブへの結合)の第２工程が含まれる。
Kumarら 1999は、rDNA ITS-1配列の種特異的な相違を利用してケキドフィオプシス属[Cecidophyopsis]ダニを同定するためのPCRマルチプレックス技法を開発した。ITS-1由来の４つのPCRプライマーを、種間変動単純配列反復[interspecifically variable simple sequence repeat：vSSR]の同時増幅(マルチプレックスPCR)に使用した。プライマーは、ITS1のそれぞれ18S(M1)及び最初の保存領域(M3)に設計した２つのフォワードプライマー並びにITS1のそれぞれ5.8S(M4)及び２番目の保存領域(M2)に設計した２つのリバースプライマーからなる。いずれのプライマーも種特異的ではない。これらは全て、ダニ特異的(又は全てのダニに共通)であり、全てのダニ種においてアンプリコンS1、S2及びS3を増幅する。ダニ種間の弁別は、S1＋S2＋S3のパターンを既知のダニ種パターンと比較することにより行なう。幾つかのアンプリコンは１bpだけ異なるので、ポリアクリルアミドゲルを使用する必要がある。ダニは、PCR産物を、既知のダニ種のITSコピーを含むプラスミドから得られたPCR産物と並行してポリアクリルアミドゲルで電気泳動することで同定された。同文献は、「このパターンはアガロースゲルでは識別可能ではなかった」と述べている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
診断、予防及び治療目的のアレルゲン抽出物の製造用ダニ培養物における及びハウスダストにおける１又はそれより多いダニ種のより単純で強力な同定方法に関する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の目的
本発明の発明者らは、大量飼育ダニ培養物若しくはその精製ダニ画分又は環境サンプル中のダニ種の同定又は証明/保証を容易とする分子マーカーに基づく方法を考案した。DNAマーカーは、形態学的分析のための所定の発生段階の個体もインタクトな個体も必要とせず、スタッフの特別な訓練も必要としないという利点を有する。更に、本方法は、多数のサンプルのダニ種の同定又は証明/保証をルーチンで行なうことに関して有利である。なぜならば、本方法は、サンプルの質及び量についての要件が緩く、本発明により、形態学的同定に比してダニ種同定の実施に必要な時間及び技術が低減されるからである。アレルゲン抽出物の製造におけるダニ種の証明/保証に適切なDNAマーカーは、全ダニ培養物又はダニ虫体若しくはダニ糞便の精製画分のいずれかでダニ種を同定すべきである。
【００１０】
本発明者らは、ダーマトファゴイデス属[ヒョウダニ属]、ユーログリフス属、アカルス属[コナダニ属]、チロファグス属[ケナガコナダニ属]、グリシファグス属、レピドグリフス属及びブロミア属(フィログリフィダエ科[チリダニ科]、アカリダエ科[コナダニ科]、グリシファギダエ科[ニクダニ科]及びエキモピディダエ科[Echymopididae])に属する13のコナダニ亜目の種からrDNAの全長ITS1、5.8Sサブユニット及びITS2配列を見出した。得られた配列に基づいて、シングルプレックス-PCR法及びマルチプレックス-PCR法を開発して、重要な呼吸器アレルギー原因物質として認識される種のうち10種を同定した。ITS1領域における多形性及び高変動性にもかかわらず、本発明者らは、コナダニ亜目のダニ種のITS1領域に基づいて設計したプライマーを用いるシングルプレックス又はマルチプレックスPCR法が単純で強力な信頼性のあるコナダニ亜目ダニ種の同定法を提供することを示した。マルチプレックスPCR法では、複数のコナダニ亜目ダニ種の同時同定のためにプライマーを組み合わせてもよい。このシステムは、アレルゲン抽出物の工業的生産に使用するダニ培養物及びその精製画分(虫体及び糞便)におけるダニ種の証明/保証に使用することが可能である。最後に、このシステムは、任意工程である予備増幅工程を導入することにより、環境サンプル中のコナダニ亜目のダニ種の検出に最適化される。
【００１１】
ダニ種の同定又は証明/保証のための新たな分子マーカー及び１又はそれより多い異なるコナダニ亜目ダニ種の同定、検出、識別又は弁別方法を提供するために、特定のコナダニ亜目の種について全長ITS1、5.8Sサブユニット及びITS2配列の配列情報を提供することが本発明の１つの目的である。当該配列情報を用いて、特定の種に独特である(種特異的)プライマーを設計こと及び全てのコナダニ亜目のダニ種に特異的である(ダニ特異的)プライマーを設計することもまた本発明の１つの目的である。実施が単純であり、強力であり、その上高度に正確であるシングルプレックス法及びマルチプレックス法を提供することも本発明の１つの更なる目的である。
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、コナダニ亜目の特定のダニ種に由来するrDNAの全長ITS1、5.8Sサブユニット及びITS2配列を、当該特定のダニ種の同定、検出又は識別に使用し得ることを見出した。
よって、第１の観点において、本発明は、サンプル中の１又はそれより多い異なるコナダニ亜目ダニ種の同定方法に関し、当該方法は、以下の工程：
a)該サンプルからDNAを取得する工程；
b)以下のプライマー：
i．各プライマーが同定すべきダニ種の各々のrDNAのITS1配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする、１又はそれより多い、例えば1、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の第１のプライマー、及び
ii．同定すべきダニ種のrDNAの18S、5.8S若しくは28S配列のいずれかから選択される配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする１又はそれより多い、例えば１つの第２のプライマー
を用いて、例えばPCRにより、同定すべきダニ種の各々のrDNAの領域を増幅して、同定すべきダニ種に特異的なアンプリコンを生成する工程、及び；
c)アンプリコンの特徴を評価することによりダニ種を同定する工程
を含んでなる。
【００１３】
b)i.において、「各(第１の)プライマーが同定すべきダニ種の各々のrDNAのITS1配列に特異的にハイブリダイズする」とは、各(第１の)プライマーが同定すべき特定のコナダニ亜目ダニ種の１つの配列にのみハイブリダイズすることを意味すると理解すべきである。したがって、サンプル中に異なる種が存在する場合には、各第１のプライマーは１つの特定種にのみハイブリダイズし、その他にはハイブリダイズしない。１つの特定の実施形態において、第１のプライマーは、同定すべき異なるコナダニ亜目ダニ種の１つにのみハイブリダイズすることに加えて、他のいかなる既知のコナダニ亜目ダニ種のITS1にもハイブリダイズしないように設計される。したがって、第１のプライマーは、特定の１つの既知のコナダニ亜目ダニ種のITS1にのみハイブリダイズし、サンプルに存在するか又はそんざいしない他のいかなる既知のコナダニ亜目ダニ種ともハイブリダイズして同定することができない。
c)においては、数種のダニ種が存在するときには、各々が特定の１つの同定すべきダニ種に特異的である数種の異なるアンプリコンが生成されることを理解すべきである。
サンプルは、任意のコナダニ亜目ダニ含有サンプル、例えば大量飼育ダニ培養物のサンプル、その精製画分又は環境サンプルであり得る。具体的には、本方法により、大量飼育ダニ培養物の精製画分におけるダニ種の同定が可能になる。
サンプルからのDNAの取得は、当該分野において公知の方法(例えば、実施例に記載されるもの)に従う、後の増幅工程に適切な形態のDNAの抽出として理解されるべきである。
第１のプライマーはフォワードプライマーであり、第２のプライマーはリバースプライマーであってもよく、その逆でもあってもよい。
【００１４】
本方法は、高感度で、実施が単純で、強力であり、サンプル中のダニ種同定において高度な正確性を提供する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNA片の単一又は数個のコピーを大幅に増幅させて特定のDNA配列の数千〜数百万のコピーを生じさせる、分子生物学における生化学的技術である。この技術は当業者に周知である。
簡潔には、PCR方法は、DNA融解及び酵素的DNA複製反応の加温・冷却反復サイクルからなる温度サイクルに依拠する。標的領域に相補的な配列を含むプライマー(短いDNAフラグメント)及びDNAポリメラーゼ(この酵素に因んでPCR法と名付けられた)が、選択的な反復増幅を可能にする鍵となる成分である。PCRが進行するにつれ、生成したDNA自体が複製用テンプレートとして使用され、連鎖反応が生じ、DNAテンプレートが指数関数的に増幅する。PCRは、多様な遺伝子操作を実行するために広範に改変することが可能である。
【００１５】
ほとんど全てのPCR適用例では、熱安定DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼ(細菌Thermus aquaticusから最初に単離された酵素)が用いられる。このDNAポリメラーゼは、テンプレートとしての一本鎖DNA及び(DNA合成の開始に必要である)DNAオリゴヌクレオチド(DNAプライマーとも呼ぶ)を用いることにより、DNA構築ブロック(ヌクレオチド)から新たなDNA鎖を酵素反応により組み立てる。大多数のPCR法は、温度サイクル、すなわち、規定された一連の温度ステップによるPCRサンプルの交互の加温及び冷却を利用する。第１の工程では、DNA二重螺旋の２つの鎖が、高温にて、DNA融解と呼ばれるプロセスで物理的に分離する。第２の工程では、温度が下げられ、２つのDNA鎖がDNAポリメラーゼのテンプレートとなって標的DNAが選択的に増幅する。PCRの選択性は、特定の温度サイクル条件下での、増幅の標的とされたDNA領域に相補的なプライマーの使用により達成される。
プライマーの設計及びPCR条件の最適化は、当業者が理解するように、PCRの特異性及び効率の鍵となる要因である。PCRの温度は、プライマーの融解温度(Tm、プライマーとその相補配列とのハイブリダイゼーションにより形成される二重鎖の安定性の尺度)に従って最適化されるべきである。
標的DNAについての理論的プライマーを提案する種々のソフトウェアツールが利用可能である。教科書のガイドラインに従ってもよい。プライマーの組成は、該プライマーの融解温度及び該プライマーが標的DNAにハイブリダイズする能力に影響する。特に、プライマーの3'末端は、標的DNAに対して正確な相補性を有するべきである。
【００１６】
１つの実施形態において、１つの(又は２若しくはそれより多い)第１のプライマーは、種特異的プライマーである。１つの更なる実施形態において、１つの(又は２若しくはそれより多い)第２のプライマーは、コナダニ亜目のダニに特異的な１つの共通プライマーである。１つの好適な実施形態において、１つの(又は２若しくはそれより多い)第１のプライマーは種特異的であり、１つの(又は２若しくはそれより多い)第２のプライマーはコナダニ亜目ダニに特異的な１つの共通プライマである。このような実施形態は、単一アッセイ(例えば、マルチプレックス-PCR)において数種のコナダニ亜目ダニ種を同定すべき場合に、使用する異なるプライマーの数を低減させ得るという利点を有する。更に、第２のプライマーが同定すべき数種のダニ種に共通する１つのプライマーであり、その結果、生成するアンプリコンが１つの共通の出発点又は終点を有するときには、他端のプライマーは、各々の種について顕著に異なるサイズのアンプリコンを生じるように設計することがより単純である。顕著に異なるとは、サイズが少なくとも15bpは異なることを意味する。このサイズ差により、アガロースゲルを用いて電気泳動によりアンプリコンを分離することが確実に可能になる。アガロースゲルは、アンプリコンの配列により影響されず、したがってアンプリコン内の多形性に対して非感受性であるという利点を有する。アガロースゲルは、bpサイズによってのみアンプリコンを区別する。これに対して、ポリアクリルアミドゲルは、配列変動、例えば(ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の分解能に影響を与え得る)多形性に対して感受性である。よって、ポリアクリルアミドゲルでの分離は、配列の性質及び長さの両方に依存する。
マルチプレックス-PCRは、サンプル中、例えば環境サンプル中の異なるコナダニ亜目ダニ種の存在を同定すること、並びに単一種の培養物において純度及び交差汚染なしを証明/保証することにおいて有用であり得る。
幾つかの実施形態において、予備増幅工程が本方法に先行してもよい。サンプル、例えば環境サンプルのrDNA含量が低い場合に有利である。
【００１７】
第２の観点において、本発明は、配列番号１〜100若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列からなるリストより選択される核酸配列に少なくとも約80％同一である単離された核酸分子に関する。
幾つかの実施形態において、核酸分子はポリヌクレオチドである。
これら配列は、サンプル中の異なるダニ種の同定、検出、識別又は弁別用の新たなプライマー又はプローブの設計に有用である新たな配列情報を提供する。また、提供する配列情報により、同定されたコナダニ亜目ダニの系統発生学的類縁関係が確証される。
本明細書で、幾つかの実施形態に使用する場合、句「〜に少なくとも約80％同一である」とは、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約81％同一である、例えば少なくとも約82％同一である、例えば少なくとも約83％同一である、例えば少なくとも約84％同一である、例えば少なくとも約85％同一である、例えば少なくとも約86％同一である、例えば少なくとも約87％同一である、例えば少なくとも約88％同一である、例えば少なくとも約89％同一である、例えば少なくとも約90％同一である、例えば少なくとも約91％同一である、例えば少なくとも約92％同一である、例えば少なくとも約93％同一である、例えば少なくとも約94％同一である、例えば少なくとも約95％同一である、例えば少なくとも約96％同一である、例えば少なくとも約97％同一である、例えば少なくとも約98％同一である、例えば少なくとも約99％同一である、例えば約100％同一である配列をいう。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列又はそのフラグメントに少なくとも約80％同一である。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列又はそのフラグメントの相補鎖に少なくとも約80％同一である。
【００１８】
１つの更なる観点において、本発明は、コナダニ亜目の１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる種の核酸分子を含んでなる組成物に関し、当該核酸分子は、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である。
幾つかの実施形態において、本発明に従う組成物は、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である、コナダニ亜目の少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば10の異なる種の核酸配列を含んでなる。
幾つかの実施形態において、本発明に従う組成物は、チロファグス ファネツハンゴルム[Tyrophagus fanetzhangorum]、レピドグリフス デストルクター[サヤアシニクダニ；Lepidoglyphus destructor]、グリシファグス ドメスティクス[イエニクダニ；Glycyphagus domesticus]、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ[Euroglyphus maynei]、ダーマトファゴイデス ミクロセラス[Dermatophagoides microceras]、アカルス シロ[アシブトコナダニ；Acarus siro]及びダーマトファゴイデス ファリナエからなるリストより選択される２又はそれより多い、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる種を検出、識別又は同定するための配列を含んでなる。
【００１９】
幾つかの実施形態において、本発明に従う組成物は、配列番号１〜100のいずれか１つ選択される配列中の5.8S若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約80％同一である核酸分子、例えばRast5.8(例えば、配列番号111により特定される核酸配列)又はその相補配列を更に含んでなる。
したがって、組成物は、１つの実施形態において、同定すべきコナダニ亜目ダニ種のITS1配列に基づいて設計された第１及び第２のプライマーを含んでなってもよい。１つの特定の実施形態において、第１のプライマーはITS1配列に基づいて設計され、第２のプライマーは5.8S配列に基づいて設計される。このような組成物は、単一アッセイにおいて数種のコナダニ亜目ダニ種を同定すべき場合に、使用する異なるプライマーの数を低減させ得るという利点を有する。当業者に明らかなように、フォワードプライマーの総量は リバースプライマーの総量と等しくなければならない。
【００２０】
１つの更なる観点において、本発明は、 コナダニ亜目の１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる特定種の検出、識別又は同定のための、配列番号１〜111からなるリストより独立して選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である１又はそれより多い核酸分子の使用に関する。幾つかの実施形態において、１又はそれより多い核酸分子は本発明に従う核酸分子である。幾つかの実施形態において、核酸分子は本明細書で規定するとおりであるか、又は本発明に従う組成物の一部である。
幾つかの実施形態において、使用は、ITS1を含んでなる本明細書で規定するとおりの単離された核酸分子の、特定のコナダニ亜目ダニ種に独特であるプライマーを設計するための使用である。幾つかの実施形態において、使用は、5.8S又は18Sを含んでなる本明細書で規定するとおりの単離された核酸分子の、チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエのコナダニ亜目ダニ種のrDNAのいずれかに特異的にハイブリダイズするプライマーを設計するための使用である。
【００２１】
種の同定に有用である、ITS1の配列に基づく種特異的プライマーを設計するためには、以下の工程を行なってもよい：
１．コナダニ亜目ダニ種由来の既知のITS1配列を全て整列させる。個体内及び種内多形性を考慮して、天然の多形性を代表し得る各々の種に由来する１より多い配列を分析に含めることが推奨される。
２．上記整列から以下の２つの要件を満たす領域を選択する：高い種内保存性及び低い種間保存性(この領域を「種特異的」と規定することができる)
３．プライマー設計のための標準的役割(例えば、A/Tに対して、40％を超えるG/Cを含む18〜32の連続ヌクレオチド；自己相補性がない など)に従って、上記２の領域の中からプライマーの設計に適切であり得る配列を含むものを選択する。
４．(例えば、「塩基スタッキング法」を用いて)比較的高いTm(Tmは52〜56であり得る)を有し、18〜30bp(18〜23が推奨される)であり、GC組成、複雑性(ポリＸ及びトリプレット反復)、3'安定性及び自己二量体を考慮した良質のプライマーを設計する(プライマー設計には、ソフトウェアAmplifX v1.4.4([Nicolas Jullien 2001-2007]又は任意の他のソフトウェアを使用してもよい)。
５．プライマーの設計後、他の生物の既知配列に対して(主に3'末端で)高度類似性を示さないプライマーを選択する(この分析は公開データベースに対してBLASTNにより行なってもよい)。この時点で選択されたプライマーはPCRに関して良好な候補であるが、PCRに適切であり得るプライマーを選択するためには、選択を続けなければならない。
【００２２】
種特異的な直接センスプライマーは、適切なリバースセンスプライマーと組み合わされるべきであり、rDNAの保存領域に基づいているべきである。好ましくは、コナダニ亜目に特異的なプライマーであるべきである。よって、プライマーは、
i．PCR反応において使用されるリバースプライマーと相補性を示さない
ii．マルチプレックスPCRにおいて使用される他のプライマーと相補性を示さない
ように選択すべきである。
最後に、PCRにおけるフォワード-リバースプライマーの組合せは、異なる種のDNAを増幅するときに、異なるサイズのアンプリコンが得られるように設計すべきである。
【００２３】
１つの更なる観点において、本発明は、本発明に従う方法により得られたアンプリコンに関する。
１つの更なる観点において、本発明は、本発明に従う方法により得られる１又はそれより多いアンプリコンに対応する(塩基対での)サイズの１又はそれより多いポリヌクレオチド(例えば、DNA)を含んでなる、本発明に従う方法における使用のための分子サイズマーカー組成物に関する。アンプリコンのサイズに対応するサイズは、アンプリコンの正確なサイズ±30、20又は10塩基対を意味する。
このような組成物は、検出すべきダニのアンプリコンのサイズを分子マーカーと比較するときに有用であり得る。参照ヌクレオチドが評価すべきアンプリコンとほぼ同じサイズを有しているときには、肉眼で比較し、種を同定することがより容易である。
【００２４】
１つの更なる観点において、本発明は、サンプル中の１又はそれより多い異なるコナダニ亜目ダニ種の同定方法に関し、この方法は、以下の工程：
ａ)サンプルからDNAを取得する工程；
ｂ)以下のプライマー：
i．各プライマーが同定すべきダニ種の各々のrDNAのITS1配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー、及び
ii．同定すべきダニ種のrDNAの18S、5.8S及び28S配列から選択される配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする第２のプライマー
を用いて、同定すべきダニ種の各々のrDNAの領域を増幅して、同定すべきダニ種に特異的なアンプリコンを生成する工程；及び
ｃ)アンプリコンの分子サイズを評価することによりダニ種を同定する工程
を含んでなる。
【００２５】
幾つかの実施形態において、本発明に従う方法は、１セット又はそれより多いフォワードプライマー及びリバースプライマーセットを用いて実施され、ここで、１つのプライマーセットの少なくとも一方が前記種に特異的であり、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である配列と同一である。
幾つかの実施形態において、本発明に従う方法は、本発明に従う組成物のプライマーを用いて実施される。
幾つかの実施形態において、本発明に従う方法は、工程ａ)の後に、(例えば、18S、5.8S又は28S配列に特異的なプライマー対を使用する)前記サンプル中の任意のrDNA成分の(例えば、PCRによる)増幅工程を更に含んでなる。
このような予備増幅は、サンプルの同定すべきrDNA材料の含量が低い場合、例えば僅か２、３匹のダニ更には僅か１匹のダニが(例えば、環境サンプル中に)存在するときに有用であり得る。
【００２６】
１つの更なる観点において、本発明は、
ａ)本発明に従う組成物；及び
ｂ)分子サイズマーカー、例えば本明細書に規定されるとおりの分子サイズマーカー組成物
を含んでなるキットに関する。
幾つかの実施形態において、本キットは、サンプル中の任意のrDNA成分の(例えば、PCRによる)増幅に適切な18S、5.8S又は28S配列に特異的な一対のプライマーを含んでなる。幾つかの実施形態において、本キットは、抽出溶液及び/又は指示マニュアルを更に含んでなる。
【００２７】
１つの更なる観点において、本発明は、コナダニ亜目ダニ培養物又はその精製画分の保証標本[certified specimen]であって、該サンプル中の１又はそれより多い特定のコナダニ亜目ダニ種の正体が既知である保証標本の製造方法に関し、当該方法は、以下の工程：
ａ)培養物又は精製画分のサンプルからDNAを取得する工程；
ｂ)前記種に特異的な核酸分子を検出する工程であって、前記配列が配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である核酸配列と同一である、工程；
ｃ)前記種に特異的な核酸分子の検出に基づいてコナダニ亜目の前記特定種を同定する工程；
ｄ)前記標本を取得する工程であって、該標本中のコナダニ亜目の１又はそれより多い特定種の正体が工程ｃ)から既知である、工程
を含んでなる。
【００２８】
幾つかの実施形態において、工程ｂ)は、１セット又はそれより多いセットのフォワード及びリバースプライマーを用いるrDNAに対するPCRを利用して行ない、ここで、１つのプライマーセットの少なくとも一方が前記種に特異的であり、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である配列と同一である。
幾つかの実施形態において、PCRは、本明細書に規定されるとおりの組成物のプライマーを用いて実施される。
幾つかの実施形態において、(例えば、PCRによる)予備増幅工程が工程ｂ)に先行し、該予備増幅工程では、サンプル中の全てのコナダニ亜目ダニ種のrDNAが、rDNAの18S配列に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー及びrDNAの5.8S又は28S配列から選択される配列に特異的にハイブリダイズする第２のプライマーを用いて増幅される。
幾つかの実施形態において、コナダニ亜目の１又はそれより多い特定種は、チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエからなるリストより選択される。
【００２９】
１つの更なる観点において、本発明は、本方法に従って製造されたダニ培養物又は精製画分、例えば、保証ダニ培養物又は保証精製画分の調製物に関する。
工程ｂ)i.において種-特異的ITS1由来の第１のプライマーを用いることに代えてか又は加えて、上記第１のプライマーと同じハイブリダイゼーション特性を有する(すなわち、コナダニ亜目の単一種のITS1配列の一部(又はその相補配列)と特異的にハイブリダイズする)検出可能なプローブを含む分子増幅を行なうことも同様に可能である；自明なことであるが、プローブは、得られるアンプリコンの一部と適合する核酸配列を有さなければならない。このようなプローブは、(当該分野において周知なように、各増幅サイクルの終了後に、特異的プローブからのシグナルを検出/記録することができる)qPCR又はリアルタイムPCRの実施形態において特に有用である。このようなプローブは、例えば、蛍光プローブ及び適合するクエンチャーを備える核酸配列の形態であることができる(クエンチャーは、DNAポリメラーゼによりプローブがアンプリコンに組み込まれたときに放出される)。したがって、アンプリコン中に最終的に存在するプローブのみが蛍光を発し、当該分野において周知の方法により、各サイクルのアンプリコン量の正確な量的尺度が提供される。第１のプライマー及びこのプローブの両方が本明細書に規定された第１のプライマーについてのハイブリダイゼーション要件を満たす場合には、特に高い特異性を得ることができるが、上記のように、特異的プローブが含まれている場合には、第１のプライマーとしてより一般的なプライマーを使用することができる。決定されるべき種が数種である実施形態において、各々の種を検出するために使用する蛍光プローブは、各々が異なる波長の蛍光を発するように独自に標識可能である；したがって、マルチプレックス増幅において、該当する波長の相対的蛍光強度に相関させることにより、異なるアンプリコンの相対量を決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ALK-ABELLOから提供されたダニ培養物から抽出したDNAの１ステップマルチプレックス-PCR分析。各レーンは、左から、M.(100bp DNA Ladder (Promega))、Ma(アレルギーを引き起こすダニの同定に採用したマーカー)、T.ファネツハンゴルム(Tf)、レピドグリフス デストルクター(Ld)、グリシファグスドメスティクス(Gd)、D.プテロニシヌス(Dp)、チロファグス プトレセンチアエ(Tp)、Ma、ブロミア トロピカリス(Bt)、ユーログリフス マイネイ(Em)、ダーマトファゴイデス ミクロセラス(Dm)、アカルス シロ(As)、D.ファリナエ(Df)、Ma及びM.である(実施例４を参照)。
【図２】ALK-ABELLOから提供されたダニ培養物から抽出したDNAの２ステップマルチプレックス-PCR分析。各レーンは、左から、M.(100bp DNA Ladder (Promega))、Ma(アレルギーを引き起こすダニの同定に適応したマーカー)、T.ファネツハンゴルム(Tf)、レピドグリフス デストルクター(Ld)、グリシファグスドメスティクス(Gd)、D.プテロニシヌス(Dp)、チロファグス プトレセンチアエ(Tp)、Ma、ブロミア トロピカリス(Bt)、ユーログリフス マイネイ(Em)、ダーマトファゴイデス ミクロセラス(Dm)、アカルス シロ(As)、D.ファリナエ(Df)、Ma及びM.である(実施例４を参照)。
【図３】Maマーカー。チロファグス ファネツハンゴルム(Tf)、レピドグリフス デストルクター(Ld)、グリシファグス ドメスティクス(Gd)、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス(Dp)、チロファグス プトレセンチアエ(Tp)、ブロミア トロピカリス(Bt)、ユーログリフス マイネイ(Em)、ダーマトファゴイデス ミクロセラス(Dm)、アカルス シロ(As)、ダーマトファゴイデス ファリナエ(Df)について実施例２で生成したアンプリコンに対応するbpサイズのヌクレオチドから調製したDNAラダー。
【図４】実施例２及び実施例３の工程３のプライマーの説明。
【図５】実施例３の工程２(予備増幅)のプライマーの説明。
【図６】ALK-ABELLOから提供されたダニ培養物から抽出したDNAの１ステップマルチプレックス-PCR分析。各レーンは、左から、100bp DNA Ladder(Promega)、T.ファネツハンゴルム(Tf)、レピドグリフス デストルクター(Ld)、グリシファグスドメスティクス(Gd)、D.プテロニシヌス(Dp)、チロファグス プトレセンチアエ(Tp)、ブロミア トロピカリス(Bt)、ユーログリフス マイネイ(Em)、ダーマトファゴイデス ミクロセラス(Dm)、アカルス シロ(As)、D.ファリナエ(Df)、及び100bp DNA Ladder(Promega)である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な開示
定義
本開示で使用する場合、「１(つ)」は、特に示さない限り、「少なくとも１つ」又は「１又はそれより多い」を意味する。更に、用語「含んでなる」は「含む」を意味するものとし、よって明示されたもの以外のその他の構成要素、特徴、条件又は工程の存在を許容する。
用語 大量飼育培養物の「精製画分」とは、ダニ起源、例えばダニ虫体(虫体画分)又はダニ糞便(糞便画分)である培養物の画分をいう。精製画分は、ダニ培養物から、任意の分画法により、例えばサンプルの篩い分け又はその他の分離法により取得し得る。精製画分の主要な含有物は、培養物の他の構成成分(例えば、栄養素及び消費物)とは対照的な、１又はそれより多い特定のダニ種の虫体又は糞便である。
用語「同定」とは、本明細書で使用する場合、サンプル中の１又はそれより多い特定のコナダニ亜目ダニ種の存在の単なる検出又は決定、特定のコナダニ亜目ダニ種の同定、及びサンプル中の１又はそれより多い異なる特定のコナダニ亜目ダニ種を識別する能力をいう。例えば、ダニ種の同定とは、個々のダニがとの系統発生学的な属、種又は亜種に属するかを決定することをいうことがある。
【００３２】
用語「リボソームDNA」又は「rDNA」とは、本明細書で使用する場合、リボソームRNA(例えば、コナダニ亜目ダニ種のリボソームRNA)をコードするDNA配列をいう。リボソームは、タンパク質と、mRNA分子を翻訳してタンパク質を産生するrRNA分子との組立体である。ダニを含む真核生物のrDNAは、エレメント18S、ITS1、5.8S、ITS2及び28Sを含む単位セグメント(オペロン)の縦列反復からなる。
用語「内部転写スペーサー１(ITS1)」又はITS1とは、本明細書で使用する場合、構造的リボソームRNAである18S rRNA及び5.8S rRNAをコードする核酸配列間に位置する(例えば、配列番号１〜100のいずれか１つの中の)核酸配列をいう。したがって、ITS1は、18S及び5.8Sとの境界(それぞれ、5' AGGATCATTA 3'及び5' CTGYYAGTGG 3')を有することにより規定される。
用語「内部転写スペーサー２(ITS2)」又はITS2とは、本明細書で使用する場合、構造的リボソームRNAである5.8S rRNA及び28S rRNAをコードする核酸配列間に位置する(例えば、配列番号１〜100のいずれか１つの中の)核酸配列をいう。したがって、ITS2は、5.8S及び28Sとの境界(それぞれ、5' TGAGCGTCGT 3'及び5' CGACCTCAG 3')を有することにより規定される。
用語「5.8S」とは、本明細書で使用する場合、ITS1とITS2との間に位置する(例えば、配列番号１〜100のいずれか１つの中の)核酸配列(例えば、配列番号１〜100の、境界5' CTGYYAGTGG 3'及び5' TGAGCGTCGT 3'を有する構造的リボソームRNAをコードする核酸配列)をいう。
用語「28S」とは、本明細書で使用する場合、配列番号１〜100の、境界(5' CGACCTCAG 3')を有する、ITS2の直ぐ下流の構造的リボソーム28S RNAをコードする核酸配列をいう。
用語「18S」とは、本明細書で使用する場合、配列番号１〜100の、境界(5' AGGATCATTA 3')を有する、ITS1の直ぐ上流の構造的リボソーム18S RNAをコードする核酸配列をいう。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「第１のプライマー」とは、rDNAフラグメントの(例えば、PCRによる)増幅において使用するプライマーセット中のプライマーをいう。第１のプライマーは、「第２のプライマー」との関係で、フォワードプライマーであってもよいし、又はリバースプライマーであってもよい。また、用語「第２のプライマー」とは、リボソームDNAの(例えば、PCRによる)増幅において使用するプライマーセット中のプライマーをいう。
「単離(された)」分子は、当該分子が見出される組成物中で、当該分子が属する分子クラスに関して優勢な種である分子である(すなわち、該分子は、当該組成物中で分子タイプの少なくとも約50％を構成し、代表的には当該組成物中の分子種(例えば、ヌクレオチド又はペプチド)の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又はそれより多くを構成する)。通常、核酸分子の組成物は、該組成物中に存在する全ての核酸種との関連では、核酸分子に関して、又は提案される使用との関連では、少なくとも実質的に活性な核酸種に関して、98％〜99％の同質性を示す。
【００３４】
用語「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、適切な条件下で、該当する核酸と特異的にハイブリダイズするプライマー又はプローブをいう。前記適切な条件は、好ましくは、下記のとおりのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。１つの好適な実施形態において、プローブは、或る１つの核酸(例えば、特定の１つのダニ種クローンのrDNA)とのみハイブリダイズする。例えば、ITS1配列に「特異的にハイブリダイズする」プライマー又は「特異的プライマー」とは、複数のダニ種のサンプル中の１つのダニ種にのみハイブリダイズするプライマーをいう。同様に、所定のダニ種に「特異的な」アンプリコンとは、複数のダニ種を含んでなるサンプル中の１つの同定すべきダニ種にのみ存在する(又は該ダニ種のみから増幅される)アンプリコンをいう。或いは、プローブは、同じタイプのダニ種の数種の核酸クローンとハイブリダイズすることが好ましい。
【００３５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」として、例えば、以下を含む条件が挙げられる：４×SSC(600mM塩化ナトリウム、60mMクエン酸ナトリウム)中65℃で一晩のインキュベーション、続いて0.1×SSC中65℃で１時間の洗浄工程。或いは、50％ホルムアミド、５×SSC(750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×デンハート溶液、10％リン酸デキストラン及び20μg/mlサケ精子由来変性剪断DNAを含む溶液中42℃でのインキュベーション、続いて0.1×SSC中約65℃で５〜20分間の洗浄工程も可能である。これらハイブリダイゼーション条件は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として当業者に公知である。特に断らない限り、ヌクレオチドについて、用語「配列同一性」とは、本明細書で使用する場合、100−(nref−ndif)×100/nref (式中、ndifは、２つの配列を整列させたときに、非同一であるヌクレオチドの総数であり、nrefは一方の配列の残基数である)として算出される配列同一性をいう。
特に断らない限り、残基数nrefは最も短い配列のものであり、整列は最も短い配列の長さに対してのみ行なう。したがって、短いプライマーをより長いDNA配列と比較する場合には、重複部分又はその対応領域の配列のみを比較する。よって、核酸配列GCATACCGTGTTGAAGCAGGは、配列AAATACCGTGTTGAAGCAAAと80％の配列同一性を有する(ndif＝４、nref＝20)。整列は正順方向に行なってもよいし、又は逆方向に行なってもよい。最大の類似性を示す整列を用いるべきである。
【００３６】
幾つかの実施形態において、配列同一性は、伝統的な方法、例えば、Smith and Waterman(1981, Adv. Appl. Math. 2:482)により、Pearson & Lipman(1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)の類似性についての検索方法により、Thompsonら(1994, Nucleic Acids Res 22:467380)のCLUSTAL Wアルゴリズムを用いて、これらアルゴリズムのコンピュータ実行(Wisconsin Genetics Software Package[Genetics Computer Group]のBLASTN、BLASTX及びTBLASTX、GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)により決定される。また、National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/)よりソフトウェアが得られるBLASTアルゴリズム(Altschulら，1990, Mol. Biol. 215:403-10)を用いてもよい。前記アルゴリズムのいずれかを用いる場合には、「ウィンドー」長、ギャップペナルティなどについてデフォルトパラメータを用いる。
配列同一性分析にはデータベース検索及び整列が含まれる。公開データベースの例としては、DNA Database of Japan (DDBJ)(ウェブサイトddbj.nig.acjp/)；Genebank(ウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/Index.htlm)；及びEuropean Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database(EMBL)(ウェブサイトebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db/embl-db.html)が挙げられる。他の適切なデータベースとしては、dbEST(ウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)、Swissprot(ウェブサイトebi.ac.uk/ebi_docs/swisprot db/swisshome.html)、PIR(ウェブサイトnbrt.georgetown.edu/pir/)及びThe Institute for Genome Research(ウェブサイトtigr.org/tdb/tdb.html)が挙げられる。
【００３７】
幾つかの異なる検索アルゴリズムが開発されており、その一例がBLASTプログラムと呼ばれる一式のプログラム群である。BLASTには５種の実行形態が存在し、３つはヌクレオチド配列クエリー用であり(BLASTN、BLASTX及びTBLASTX)、２つはタンパク質配列クエリー用(BLASTP及びTBLASTN)である(Coulson, Trends in Biotechnology 12:76-80 (1994)；Birrenら，Genome Analysis 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 543-559 (1997))。
BLASTNは、ヌクレオチド配列(クエリー配列)及びその逆相補鎖を受け取り、それらをヌクレオチド配列データベースに対して検索する。BLASTNは最大感度のためではなく、速度のために設計されたので、遠縁のコーディング配列を見出し得ないこともある。BLASTXは、ヌクレオチド配列を受け取り、３つのフォワードリーディングフレーム及び３つの逆相補リーディングフレームで翻訳し、６つの翻訳物をタンパク質配列データベースと比較する。BLASTXは、予備的な(シングルパス)配列データの高感度分析に有用であり、シーケンシングエラーに対して寛容である(Gish and States, Nature Genetics 3:266-272 (1993)；この全体が引用により本明細書に組み込まれる)。BLASTN及びBLASTXはESTデータの分析に一緒に使用され得る(Coulson, Trends in Biotechnology 12:76-80 (1994)；Birrenら，Genome Analysis 1:543-559 (1997))。
【００３８】
コーディングヌクレオチド配列及びそれがコードするタンパク質が与えられたならば、タンパク質をクエリー配列として用いてデータベースを検索することが好ましいことが多い。なぜならば、より微かな類縁関係を検出する感度が極めて高いからである。これは、核酸配列の文字(４塩基；偶然による一致が遥かに容易い)と比較してタンパク質の文字(20アミノ酸)が多いことに起因する。加えて、ヌクレオチドの整列では一致(プラススコア)か不一致(マイナススコア)しか得られないが、タンパク質では保存的アミノ酸置換の存在を考慮することができる。よって、不一致は、非同一の残基がそれと置き換わった残基に類似する物理的/化学的特性を有する場合には、プラススコアを与え得る。全ての可能なアミノ酸対の置換スコアを提供するための種々の採点マトリクスを用いる。一般的な目的の採点システムはBLOSUM62マトリクスであり(Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61 (1993)；この全体が引用により本明細書に組み込まれる)、これは、現在、BLASTプログラムのデフォルトの選択肢である。BLOSUM62は、中程度の多様化配列の整列のために作成されたものであり、よって全ての条件下で最良の結果を得ることはできない。Altschul(J. Mol. Biol. 36:290-300 (1993)；この全体が引用により本明細書に組み込まれる)は、全ての偶発性(contingency)をカバーする３つのマトリクスの組合せを記載する。これは、感度を向上させ得るが、検索速度は遅い。実際には、BLOSUM62マトリクスを単独で用いることが多いが、更なる分析が必要な場合にはその他のもの(PAM40及びPAM250)を試みてもよい。低PAMマトリクスは、非常に強力であるが限局された配列類似性の検出を指向するものである一方、高PAMマトリクスは、非常に遠縁の配列同士の長いが弱い整列の検出を指向するものである。
【００３９】
比較配列分析に使用することができる他の生物のホモログが利用可能である。複数の整列を行い、関連配列群における類似性及び相違性を調べる。CLUSTAL Wは、Feng and Doolittle(J. Mol. Evol. 25:351-360 (1987)；この全体が引用により本明細書に組み込まれる)の方法に基づいて順繰り複数配列整列を行なう複数配列整列パッケージである。配列の各対を整列させ、各対間の距離を算出する；この距離マトリクスから、ガイドツリー(guide tree)を算出し、このツリーに基づいて全ての配列を順繰りに整列させる。このプログラムの１つの特徴は、整列に対するギャップの影響に対する感度である；構造化領域の中央に代えて推定のループ領域へのギャップ挿入を推奨するように、ギャップペナルティーを変化させる。ユーザは、２つ一組の整列及び複数整列の両方について、ギャップペナルティーを指定し、或る数の採点マトリクスから選択し、又は独自の採点マトリクスを提供することができる。UNIX及びVMSシステム用のCLUSTAL Wは、ftb.ebi.ac.ukから入手可能である。別の１つのプログラムはMACAW(Schulerら，Proteins Struct. Func. Genet. 9:180-190 (1991)；この全体が引用により本明細書に組み込まれる)であり、Macintoshバージョン及びMicrosoft Windowsバージョンの両方が入手可能である。MACAWはグラフィカルインターフェースを利用し、数種の整列アルゴリズムの選択を提供し、ncbi.nlm.nih.gov (directory/pub/macaw)から匿名FTPにより入手可能である。
【００４０】
発明の具体的実施形態
上記のとおり、本発明は、サンプル中の１又はそれより多い異なるコナダニ亜目ダニ種の同定方法に関し、当該方法は、以下の工程:
ａ)該サンプルからDNAを取得する工程；
ｂ)以下のプライマー：
i．同定すべきダニ種のrDNAのITS1配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする１又はそれより多い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の第１のプライマー、及び
ii．同定すべきダニ種のrDNAの18S、5.8S若しくは28S配列のいずれかから選択される配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする１又はそれより多い、例えば１つの第２のプライマー
を用いて、例えばPCRにより、同定すべきダニ種の各々のrDNAの領域を増幅して、同定すべきダニ種に特異的なアンプリコンを作成する工程、及び；
ｃ)アンプリコンの特徴を評価することによりダニ種を同定する工程
を含んでなる。
【００４１】
幾つかの実施形態において、工程ｂ)では、生成したアンプリコンは同定すべき特定のダニ種に特徴的な分子サイズを有する。
幾つかの実施形態において、工程ｃ)では、ダニ種は、同定すべきダニ種に特徴的であるアンプリコンの分子サイズを評価することにより特定される。
しかし、アンプリコンは、アンプリコンを配列決定し、配列番号１〜100と比較してダニ種を特定することにより特徴付けてもよい。
幾つかの実施形態において、13未満、例えば10、例えば８、例えば６、例えば５、例えば３つの異なるコナダニ亜目ダニが同定される。
幾つかの実施形態において、工程ｂ)では、同定すべきダニ種に特異的な２又はそれより多いアンプリコンが生成され、該アンプリコンは、長さが、少なくとも15bp、例えば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30bp異なる。
幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、同定すべきコナダニ亜目ダニ種のいずれかの前記配列の少なくとも15の連続ヌクレオチドに90％、例えば91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である。
【００４２】
幾つかの実施形態において、工程ｂ)i.で使用する１又はそれより多い第１のプライマーは、3'末端に、同定すべきダニ種のいずれかのITS1配列に対して正確な相補性を有する少なくとも３、例えば４、５又は６の連続ヌクレオチドを含む。
幾つかの実施形態において、工程ｂ)i.で使用する１又はそれより多い第１のプライマーは、同定すべきダニ種のITS1配列のいずれかの対応部分又はその相補部分の配列に少なくとも約70％、例えば76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一である。
幾つかの実施形態において、本方法は、サンプル中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、10、11若しくは12又はそれより多くの異なるコナダニ亜目ダニ種の同定のための方法である。
幾つかの実施形態において、工程ｃ)は、アンプリコンの分子サイズを、分子マーカー組成物の参照ヌクレオチドの分子サイズと比較することにより行なわれ、ここで、該参照ヌクレオチドのサイズは該当する塩基対間隔にわたるサイズである。
【００４３】
参照ヌクレオチド組成物は商業的に入手可能である。一例は、Thermo Scientific GeneRuler 100bp DNA Ladderである。これは、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bpの参照ヌクレオチドを含む。これは、アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルの両方に適切である。別のDNAラダーはPromegaから入手可能である。このラダーは緩衝液に溶解されており、分析されるべきDNAサンプルとともに電気泳動される。このような古典的なDNAラダーを用いてアンプリコンサイズを読み取るときには、アンプリコンサイズは、従来、アンプリコンが移動した距離と、ラダーの(100bpごと増えるサイズを有する)参照ヌクレオチドが移動した距離とを肉眼で比較することにより評価される。
幾つかの実施形態において、参照ヌクレオチドのサイズは、同定すべきダニ種に特徴的なアンプリコンのサイズに相当する。同定すべきアンプリコンのサイズの参照ヌクレオチドを用いる利点は、アンプリコンのサイズと参照ヌクレオチドのサイズとの(特に、肉眼による)比較がより容易になるということである。
参照ヌクレオチド組成物をサンプルと共にゲル上で電気泳動することで、サンプルの結果を参照ヌクレオチド組成物と比較することにより、電気泳動の結果から直接、サンプル中に存在する各コナダニ亜目ダニ種の同定が可能になる。同定工程は必要ない。例えば、同定すべきダニ種につき、アンプリコンを配列決定することも、複数のアンプリコンのバンドパターンを評価することも必要ない。
【００４４】
幾つかの実施形態において、(例えば、PCRによる)予備増幅工程が工程ｂ)に先行する。該予備増幅工程において、サンプル中の全てのコナダニ亜目ダニ種のITS1領域を含むrDNAは、該rDNAの18S配列に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー及び該rDNAの5.8S及び28S配列から選択される配列に特異的にハイブリダイズする第２のプライマーを用いて増幅される。
幾つかの実施形態において、サンプルは環境サンプルである。
幾つかの実施形態において、サンプルは大量飼育培養物又はその精製画分に由来する。
幾つかの実施形態において、サンプルは大量飼育培養物又はその精製画分に由来し、請求項10に記載の予備増幅工程は行なわれない。
【００４５】
幾つかの実施形態において、各プライマーが同定すべき１つのダニ種のITS1配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズし、同定すべき他のダニ種にはハイブリダイズしない２又はそれより多い第１のプライマーが使用される。
幾つかの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号１〜10、配列番号11〜20、配列番号21〜30、配列番号31〜40、配列番号41〜50、配列番号51〜60、配列番号61〜70、配列番号71〜80、配列番号81〜90及び配列番号91〜100のいずれか１つにより特定される２群又はそれより多い、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は10群の配列に基づいて設計される。
幾つかの実施形態において、ｂ)i.で言及される第１のプライマーは、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列のITS1若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である配列を含んでなる。
幾つかの実施形態において、第１のプライマーは、少なくとも約６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25の連続ヌクレオチド長である。
幾つかの実施形態において、第１のプライマーは、せいぜい約70、60、50、40、30、25、23、20の連続ヌクレオチド長である。
【００４６】
幾つかの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそのフラグメント若しくは該フラグメントの相補配列に少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である配列を含んでなる。
幾つかの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である配列からなる。
【００４７】
幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、配列番号１〜100のいずれか１つより選択される配列中の5.8Sのフラグメント又はその相補配列に少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である核酸配列、例えばRast5.8(例えば、配列番号111により特定される核酸配列)若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる。
幾つかの実施形態において、第２のプライマーは、配列番号１〜100の１ずれか１つより選択される配列中の18Sのフラグメント又はその相補配列に少なくとも約70％、例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一である核酸配列、例えばFRibNav(例えば、配列番号121により規定される核酸配列)若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる。
幾つかの実施形態において、コナダニ亜目の１又はそれより多い異なる種は、チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ及びダーマトファゴイデス ファリナエからなる群より選択される。
【００４８】
上記のとおり、本発明は、配列番号１〜100からなるリストより選択される核酸配列若しくはそのフラグメント又はそれらの相補配列に少なくとも約80％同一である単離された核酸分子に関する。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、少なくとも約６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25の連続ヌクレオチド長である。
【００４９】
幾つかの実施形態において、本発明に従う単離された核酸分子は、少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも10、例えば少なくとも11、例えば少なくとも12、例えば少なくとも13、例えば少なくとも14、例えば少なくとも15、例えば少なくとも16、例えば少なくとも17、例えば少なくとも18、例えば少なくとも19、例えば少なくとも20、例えば少なくとも21、例えば少なくとも22、例えば少なくとも23、例えば少なくとも24、例えば少なくとも25、例えば少なくとも26、例えば少なくとも27、例えば少なくとも28、例えば少なくとも29、例えば少なくとも30、例えば少なくとも31、例えば少なくとも32、例えば少なくとも33、例えば少なくとも34、例えば少なくとも35、例えば少なくとも36、例えば少なくとも37、例えば少なくとも38、例えば少なくとも39、例えば少なくとも40、例えば少なくとも41、例えば少なくとも42、例えば少なくとも43、例えば少なくとも44、例えば少なくとも45、例えば少なくとも46、例えば少なくとも47、例えば少なくとも48、例えば少なくとも49、例えば少なくとも50、例えば少なくとも51、例えば少なくとも52、例えば少なくとも53、例えば少なくとも54、例えば少なくとも55、例えば少なくとも56、例えば少なくとも57、例えば少なくとも58、例えば少なくとも59、例えば少なくとも60、例えば少なくとも61、例えば少なくとも62、例えば少なくとも63、例えば少なくとも64、例えば少なくとも65、例えば少なくとも66、例えば少なくとも67、例えば少なくとも68、例えば少なくとも69、例えば少なくとも70、例えば少なくとも71、例えば少なくとも72、例えば少なくとも73、例えば少なくとも74、例えば少なくとも75、例えば少なくとも76、例えば少なくとも77、例えば少なくとも78、例えば少なくとも79、例えば少なくとも80、例えば少なくとも81、例えば少なくとも82、例えば少なくとも83、例えば少なくとも84、例えば少なくとも85、例えば少なくとも86、例えば少なくとも87、例えば少なくとも88、例えば少なくとも89、例えば少なくとも90、例えば少なくとも91、例えば少なくとも92、例えば少なくとも93、例えば少なくとも94、例えば少なくとも95、例えば少なくとも96、例えば少なくとも97、例えば少なくとも98、例えば少なくとも99、例えば少なくとも100、例えば少なくとも101、例えば少なくとも102、例えば少なくとも103、例えば少なくとも104、例えば少なくとも105、例えば少なくとも106、例えば少なくとも107、例えば少なくとも108、例えば少なくとも109、例えば少なくとも110、例えば少なくとも111、例えば少なくとも112、例えば少なくとも113、例えば少なくとも114、例えば少なくとも115、例えば少なくとも116、例えば少なくとも117、例えば少なくとも118、例えば少なくとも119、例えば少なくとも120、例えば少なくとも121、例えば少なくとも122、例えば少なくとも123、例えば少なくとも124、例えば少なくとも125、例えば少なくとも126、例えば少なくとも127、例えば少なくとも128、例えば少なくとも129、例えば少なくとも130、例えば少なくとも131、例えば少なくとも132、例えば少なくとも133、例えば少なくとも134、例えば少なくとも135、例えば少なくとも136、例えば少なくとも137、例えば少なくとも138、例えば少なくとも139、例えば少なくとも140、例えば少なくとも141、例えば少なくとも142、例えば少なくとも143、例えば少なくとも144、例えば少なくとも145、例えば少なくとも146、例えば少なくとも147、例えば少なくとも148、例えば少なくとも149、例えば少なくとも150、例えば少なくとも151、例えば少なくとも152、例えば少なくとも153、例えば少なくとも154、例えば少なくとも155、例えば少なくとも156、例えば少なくとも157、例えば少なくとも158、例えば少なくとも159、例えば少なくとも160、例えば少なくとも161、例えば少なくとも162、例えば少なくとも163、例えば少なくとも164、例えば少なくとも165、例えば少なくとも166、例えば少なくとも167、例えば少なくとも168、例えば少なくとも169、例えば少なくとも170、例えば少なくとも171、例えば少なくとも172、例えば少なくとも173、例えば少なくとも174、例えば少なくとも175、例えば少なくとも176、例えば少なくとも177、例えば少なくとも178、例えば少なくとも179、例えば少なくとも180、例えば少なくとも181、例えば少なくとも182、例えば少なくとも183、例えば少なくとも184、例えば少なくとも185、例えば少なくとも186、例えば少なくとも187、例えば少なくとも188、例えば少なくとも189、例えば少なくとも190、例えば少なくとも191、例えば少なくとも192、例えば少なくとも193、例えば少なくとも194、例えば少なくとも195、例えば少なくとも196、例えば少なくとも197、例えば少なくとも198、例えば少なくとも199、例えば少なくとも200、例えば少なくとも201、例えば少なくとも202、例えば少なくとも203、例えば少なくとも204、例えば少なくとも205、例えば少なくとも206、例えば少なくとも207、例えば少なくとも208、例えば少なくとも209、例えば少なくとも210、例えば少なくとも211、例えば少なくとも212、例えば少なくとも213、例えば少なくとも214、例えば少なくとも215、例えば少なくとも216、例えば少なくとも217、例えば少なくとも218、例えば少なくとも219、例えば少なくとも220、例えば少なくとも221、例えば少なくとも222、例えば少なくとも223、例えば少なくとも224、例えば少なくとも225、例えば少なくとも226、例えば少なくとも227、例えば少なくとも228、例えば少なくとも229、例えば少なくとも230、例えば少なくとも231、例えば少なくとも232、例えば少なくとも233、例えば少なくとも234、例えば少なくとも235、例えば少なくとも236、例えば少なくとも237、例えば少なくとも238、例えば少なくとも239、例えば少なくとも240、例えば少なくとも241、例えば少なくとも242、例えば少なくとも243、例えば少なくとも244、例えば少なくとも245、例えば少なくとも246、例えば少なくとも247、例えば少なくとも248、例えば少なくとも249、例えば少なくとも250、例えば少なくとも251、例えば少なくとも252、例えば少なくとも253、例えば少なくとも254、例えば少なくとも255、例えば少なくとも256、例えば少なくとも257、例えば少なくとも258、例えば少なくとも259、例えば少なくとも260、例えば少なくとも261、例えば少なくとも262、例えば少なくとも263、例えば少なくとも264、例えば少なくとも265、例えば少なくとも266、例えば少なくとも267、例えば少なくとも268、例えば少なくとも269、例えば少なくとも270、例えば少なくとも271、例えば少なくとも272,、例えば少なくとも273、例えば少なくとも274、例えば少なくとも275、例えば少なくとも276、例えば少なくとも277、例えば少なくとも278、例えば少なくとも279、例え��少なくとも280、例えば少なくとも281、例えば少なくとも282、例えば少なくとも283、例えば少なくとも284、例えば少なくとも285、例えば少なくとも286、例えば少なくとも287、例えば少なくとも288、例えば少なくとも289、例えば少なくとも290、例えば少なくとも291、例えば少なくとも292、例えば少なくとも293、例えば少なくとも294、例えば少なくとも295、例えば少なくとも296、例えば少なくとも297、例えば少なくとも298、例えば少なくとも299、例えば少なくとも300、例えば少なくとも301、例えば少なくとも302、例えば少なくとも303、例えば少なくとも304、例えば少なくとも305、例えば少なくとも306、例えば少なくとも307、例えば少なくとも308、例えば少なくとも309、例えば少なくとも310、例えば少なくとも311、例えば少なくとも312、例えば少なくとも313、例えば少なくとも314、例えば少なくとも315、例えば少なくとも316、例えば少なくとも317、例えば少なくとも318、例えば少なくとも319、例えば少なくとも320、例えば少なくとも321、例えば少なくとも322、例えば少なくとも323、例えば少なくとも324、例えば少なくとも325、例えば少なくとも326、例えば少なくとも327、例えば少なくとも328、例えば少なくとも329、例えば少なくとも330、例えば少なくとも331、例えば少なくとも332、例えば少なくとも333、例えば少なくとも334、例えば少なくとも335、例えば少なくとも336、例えば少なくとも337、例えば少なくとも338、例えば少なくとも339、例えば少なくとも340、例えば少なくとも341、例えば少なくとも342、例えば少なくとも343、例えば少なくとも344、例えば少なくとも345、例えば少なくとも346、例えば少なくとも347、例えば少なくとも348、例えば少なくとも349、例えば少なくとも350、例えば少なくとも351、例えば少なくとも352、例えば少なくとも353、例えば少なくとも354、例えば少なくとも355、例えば少なくとも356、例えば少なくとも357、例えば少なくとも358、例えば少なくとも359、例えば少なくとも360、例えば少なくとも361、例えば少なくとも362、例えば少なくとも363、例えば少なくとも364、例えば少なくとも365、例えば少なくとも366、例えば少なくとも367、例えば少なくとも368、例えば少なくとも369、例えば少なくとも370、例えば少なくとも371、例えば少なくとも372、例えば少なくとも373、例えば少なくとも374、例えば少なくとも375、例えば少なくとも376、例えば少なくとも377、例えば少なくとも378、例えば少なくとも379、例えば少なくとも380、例えば少なくとも381、例えば少なくとも382、例えば少なくとも383、例えば少なくとも384、例えば少なくとも385、例えば少なくとも386、例えば少なくとも387、例えば少なくとも388、例えば少なくとも389、例えば少なくとも390、例えば少なくとも391、例えば少なくとも392、例えば少なくとも393、例えば少なくとも394、例えば少なくとも395、例えば少なくとも396、例えば少なくとも397、例えば少なくとも398、例えば少なくとも399、例えば少なくとも400、例えば少なくとも401、例えば少なくとも402、例えば少なくとも403、例えば少なくとも404、例えば少なくとも405、例えば少なくとも406、例えば少なくとも407、例えば少なくとも408、例えば少なくとも409、例えば少なくとも410、例えば少なくとも411、例えば少なくとも412、例えば少なくとも413、例えば少なくとも414、例えば少なくとも415、例えば少なくと��416、例えば少なくとも417、例えば少なくとも418、例えば少なくとも419、例えば少なくとも420、例えば少なくとも421、例えば少なくとも422、例えば少なくとも423、例えば少なくとも424、例えば少なくとも425、例えば少なくとも426、例えば少なくとも427、例えば少なくとも428、例えば少なくとも429、例えば少なくとも430、例えば少なくとも431、例えば少なくとも432、例えば少なくとも433、例えば少なくとも434、例えば少なくとも435、例えば少なくとも436、例えば少なくとも437、例えば少なくとも438、例えば少なくとも439、例えば少なくとも440、例えば少なくとも441、例えば少なくとも442、例えば少なくとも443、例えば少なくとも444、例えば少なくとも445、例えば少なくとも446、例えば少なくとも447、例えば少なくとも448、例えば少なくとも449、例えば少なくとも450、例えば少なくとも451、例えば少なくとも452、例えば少なくとも453、例えば少なくとも454、例えば少なくとも455、例えば少なくとも456、例えば少なくとも457、例えば少なくとも458、例えば少なくとも459、例えば少なくとも460、例えば少なくとも461、例えば少なくとも462、例えば少なくとも463、例えば少なくとも464、例えば少なくとも465、例えば少なくとも466、例えば少なくとも467、例えば少なくとも468、例えば少なくとも469、例えば少なくとも470、例えば少なくとも471、例えば少なくとも472、例えば少なくとも473、例えば少なくとも474、例えば少なくとも475、例えば少なくとも476、例えば少なくとも477、例えば少なくとも478、例えば少なくとも479、例えば少なくとも480、例えば少なくとも481、例えば少なくとも482、例えば少なくとも483、例えば少なくとも484、例えば少なくとも485、例えば少なくとも486、例えば少なくとも487、例えば少なくとも488、例えば少なくとも489、例えば少なくとも490、例えば少なくとも491、例えば少なくとも492、例えば少なくとも493、例えば少なくとも494、例えば少なくとも495、例えば少
なくとも496、例えば少なくとも497、例えば少なくとも498、例えば少なくとも499、例えば少なくとも500、例えば少なくとも501、例えば少なくとも502、例えば少なくとも503、例えば少なくとも504、例えば少なくとも505、例えば少なくとも506、例えば少なくとも507、例えば少なくとも508、例えば少なくとも509、例えば少なくとも510、例えば少なくとも511、例えば少なくとも512、例えば少なくとも513、例えば少なくとも514、例えば少なくとも515、例えば少なくとも516、例えば少なくとも517、例えば少なくとも518、例えば少なくとも519、例えば少なくとも520、例えば少なくとも521、例えば少なくとも522、例えば少なくとも523、例えば少なくとも524、例えば少なくとも525、例えば少なくとも526、例えば少なくとも527、例えば少なくとも528、例えば少なくとも529、例えば少なくとも530、例えば少なくとも531、例えば少なくとも532、例えば少なくとも533、例えば少なくとも534、例えば少なくとも535、例えば少なくとも536、例えば少なくとも537、例えば少なくとも538、例えば少なくとも539、例えば少なくとも540、例えば少なくとも541、例えば少なくとも542、例えば少なくとも543、例えば少なくとも544、例えば少なくとも545、例えば少なくとも546、例えば少なくとも547、例えば少なくとも548、例えば少なくとも549、例えば少なくとも550、例えば少なくとも551、例えば少なくとも552、例えば少なくとも553、例えば少なくとも554、例えば少なくとも555、例えば少なくとも556、例えば少なくとも557、例えば少なくとも558、例えば少なくとも559、例えば少なくとも560、例えば少なくとも561、例えば少なくとも562、例えば少なくとも563、例えば少なくとも564、例えば少なくとも565、例えば少なくとも566、例えば少なくとも567、例えば少なくとも568、例えば少なくとも569、例えば少なくとも570、例えば少なくとも571、例えば少なくとも572、例えば少なくとも573、例えば少なくとも574、例えば少なくとも575、例えば少なくとも576、例えば少なくとも577、例えば少なくとも578、例えば少なくとも579、例えば少なくとも580、例えば少なくとも581、例えば少なくとも582、例えば少なくとも583、例えば少なくとも584、例えば少なくとも585、例えば少なくとも586、例えば少なくとも587、例えば少なくとも588、例えば少なくとも589、例えば少なくとも590、例えば少なくとも591の連続ヌクレオチド長である。
【００５０】
幾つかの実施形態において、本発明に従う単離された核酸分子は、せいぜい999の連続ヌクレオチド、例えばせいぜい998、例えばせいぜい997、例えばせいぜい996、例えばせいぜい995、例えばせいぜい994、例えばせいぜい993、例えばせいぜい992、例えばせいぜい991、例えばせいぜい990、例えばせいぜい989、例えばせいぜい988、例えばせいぜい987、例えばせいぜい986、例えばせいぜい985、例えばせいぜい984、例えばせいぜい983、例えばせいぜい982、例えばせいぜい981、例えばせいぜい980、例えばせいぜい979、例えばせいぜい978、例えばせいぜい977、例えばせいぜい976、例えばせいぜい975、例えばせいぜい974、例えばせいぜい973、例えばせいぜい972、例えばせいぜい971、例えばせいぜい970、例えばせいぜい969、例えばせいぜい968、例えばせいぜい967、例えばせいぜい966、例えばせいぜい965、例えばせいぜい964、例えばせいぜい963、例えばせいぜい962、例えばせいぜい961、例えばせいぜい960、例えばせいぜい959、例えばせいぜい958、例えばせいぜい957、例えばせいぜい956、例えばせいぜい955、例えばせいぜい954、例えばせいぜい953、例えばせいぜい952、例えばせいぜい951、例えばせいぜい950、例えばせいぜい949、例えばせいぜい948、例えばせいぜい947、例えばせいぜい946、例えばせいぜい945、例えばせいぜい944、例えばせいぜい943、例えばせいぜい942、例えばせいぜい941、例えばせいぜい940、例えばせいぜい939、例えばせいぜい938、例えばせいぜい937、例えばせいぜい936、例えばせいぜい935、例えばせいぜい934、例えばせいぜい933、例えばせいぜい932、例えばせいぜい931、例えばせいぜい930、例えばせいぜい929、例えばせいぜい928、例えばせいぜい927、例えばせいぜい926、例えばせいぜい925、例えばせいぜい924、例えばせいぜい923、例えばせいぜい922、例えばせいぜい921、例えばせいぜい920、例えばせいぜい919、例えばせいぜい918、例えばせいぜい917、例えばせいぜい916、例えばせいぜい915、例えばせいぜい914、例えばせいぜい913、例えばせいぜい912、例えばせいぜい911、例えばせいぜい910、例えばせいぜい909、例えばせいぜい908、例えばせいぜい907、例えばせいぜい906、例えばせいぜい905、例えばせいぜい904、例えばせいぜい903、例えばせいぜい902、例えばせいぜい901、例えばせいぜい900、例えばせいぜい899、例えばせいぜい898、例えばせいぜい897、例えばせいぜい896、例えばせいぜい895、例えばせいぜい894、例えばせいぜい893、例えばせいぜい892、例えばせいぜい891、例えばせいぜい890、例えばせいぜい889、例えばせいぜい888、例えばせいぜい887、例えばせいぜい886、例えばせいぜい885、例えばせいぜい884、例えばせいぜい883、例えばせいぜい882、例えばせいぜい881、例えばせいぜい880、例えばせいぜい879、例えばせいぜい878、例えばせいぜい877、例えばせいぜい876、例えばせいぜい875、例えばせいぜい874、例えばせいぜい873、例えばせいぜい872、例えばせいぜい871、例えばせいぜい870、例えばせいぜい869、例えばせいぜい868、例えばせいぜい867、例えばせいぜい866、例えばせいぜい865、例えばせいぜい864、例えばせいぜい863、例えばせいぜい862、例えばせいぜい861、例えばせいぜい860、例えばせいぜい859、例えばせいぜい858、例えばせいぜい857、例えばせいぜい856、例えばせいぜい855、例えばせいぜい854、例えばせいぜい853、例えばせいぜい852、例えばせいぜい851、例えばせいぜい850、例えばせいぜい849、例えばせいぜい848、例えばせいぜい847、例えばせいぜい846、例えばせいぜい845、例えばせいぜい844、例えばせいぜい843、例えばせいぜい842、例えばせいぜい841、例えばせいぜい840、例えばせいぜい839、例えばせいぜい838、例えばせいぜい837、例えばせいぜい836、例えばせいぜい835、例えばせいぜい834、例えばせいぜい833、例えばせいぜい832、例えばせいぜい831、例えばせいぜい830、例えばせいぜい829、例えばせいぜい828、例えばせいぜい827、例えばせいぜい826、例えばせいぜい825、例えばせいぜい824、例えばせいぜい823、例えばせいぜい822、例えばせいぜい821、例えばせいぜい820、例えばせいぜい819、例えばせいぜい818、例えばせいぜい817、例えばせいぜい816、例えばせいぜい815、例えばせいぜい814、例えばせいぜい813、例えばせいぜい812、例えばせいぜい811、例えばせいぜい810、例えばせいぜい809、例えばせいぜい808、例えばせいぜい807、例えばせいぜい806、例えばせいぜい805、例えばせいぜい804、例えばせいぜい803、例えばせいぜい802、例えばせいぜい801、例えばせいぜい800、例えばせいぜい799、例えばせいぜい798、例えばせいぜい797、例えばせいぜい796、例えばせいぜい795、例えばせいぜい794、例えばせいぜい793、例えばせいぜい792、例えばせいぜい791、例えばせいぜい790、例えばせいぜい789、例えばせいぜい788、例えばせいぜい787、例えばせいぜい786、例えばせいぜい785、例えばせいぜい784、例えばせいぜい783、例えばせいぜい782、例えばせいぜい781、例えばせいぜい780、例えばせいぜい779、例えばせいぜい778、例えばせいぜい777、例えばせいぜい776、例えばせいぜい775、例えばせいぜい774、例えばせいぜい773、例えばせいぜい772、例えばせいぜい771、例えばせいぜい770、例えばせいぜい769、例えばせいぜい768、例えばせいぜい767、例えばせいぜい766、例えばせいぜい765、例えばせいぜい764、例えばせいぜい763、例えばせいぜい762、例えばせいぜい761、例えばせいぜい760、例えばせいぜい759、例えばせいぜい758、例えばせいぜい757、例えばせいぜい756、例えばせいぜい755、例えばせいぜい754、例えばせいぜい753、例えばせいぜい752、例えばせいぜい751、例えばせいぜい750、例えばせいぜい749、例えばせいぜい748、例えばせいぜい747、例えばせいぜい746、例えばせいぜい745、例えばせいぜい744、例えばせいぜい743、例えばせいぜい742、例えばせいぜい741、例えばせいぜい740、例えばせいぜい739、例えばせいぜい738、例えばせいぜい737、例えばせいぜい736、例えばせいぜい735、例えばせいぜい734、例えばせいぜい733、例えばせいぜい732、例えばせいぜい731、例えばせいぜい730、例えばせいぜい729、例えばせいぜい728、例えばせいぜい727、例えばせいぜい726、例えばせいぜい725、例えばせいぜい724、例えばせいぜい723、例えばせいぜい722、例えばせいぜい721、例えばせいぜい720、例えばせいぜい719、例えばせいぜい718、例えばせいぜい717、例えばせいぜい716、例えばせいぜい715、例えばせいぜい714、例えばせいぜい713、例えばせいぜい712、例えばせいぜい711、例えばせいぜい710、例えばせいぜい709、例えばせいぜい708、例えばせいぜい707、例えばせいぜい706、例えばせいぜい705、例えばせいぜい704、例えばせいぜい703、例えばせいぜい702、例えばせいぜい701、例えばせいぜい700、例えばせいぜい699、例えばせいぜい698、例えばせいぜい697、例えばせいぜい696、例えばせいぜい695、例えばせいぜい694、例えばせいぜい693、例えばせいぜい692、例えばせいぜい691、例えばせいぜい690、例えばせいぜい689、例えばせいぜい688、例えばせいぜい687、例えばせいぜい686、例えばせいぜい685、例えばせいぜい684、例えばせいぜい683、例えばせいぜい682、例えばせいぜい681、例えばせいぜい680、例えばせいぜい679、例えばせいぜい678、例えばせいぜい677、例えばせいぜい676、例えばせいぜい675、例えばせいぜい674、例えばせいぜい673、例えばせいぜい672、例えばせいぜい671、例えばせいぜい670、例えばせいぜい669、例えばせいぜい668、例えばせいぜい667、例えばせいぜい666、例えばせいぜい665、例えばせいぜい664、例えばせいぜい663、例えばせいぜい662、例えばせいぜい661、例えばせいぜい660、例えばせいぜい659、例えばせいぜい658、例えばせいぜい657、例えばせいぜい656、例えばせいぜい655、例えばせいぜい654、例えばせいぜい653、例えばせいぜい652、例えばせいぜい651、例えばせいぜい650、例えばせいぜい649、例えばせいぜい648、例えばせいぜい647、例えばせいぜい646、例えばせいぜい645、例えばせいぜい644、例えばせいぜい643、例えばせいぜい642、例えばせいぜい641、例えばせいぜい640、例えばせいぜい639、例えばせいぜい638、例えばせいぜい637、例えばせいぜい636、例えばせいぜい635、例えばせいぜい634、例えばせいぜい633、例えばせいぜい632、例えばせいぜい631、例えばせいぜい630、例えばせいぜい629、例えばせいぜい628、例えばせいぜい627、例えばせいぜい626、例えばせいぜい625、例えばせいぜい624、例えばせいぜい623、例えばせいぜい622、例えばせいぜい621、例えばせいぜい620、例えばせいぜい619、例えばせいぜい618、例えばせいぜい617、例えばせいぜい616、例えばせいぜい615、例えばせいぜい614、例えばせいぜい613、例えばせいぜい612、例えばせいぜい611、例えばせいぜい610、例えばせいぜい609、例えばせいぜい608、例えばせいぜい607、例えばせいぜい606、例えばせいぜい605、例えばせいぜい604、例えばせいぜい603、例えばせいぜい602、例えばせいぜい601、例えばせいぜい600、例えばせいぜい599、例えばせいぜい598、例えばせいぜい597、例えばせいぜい596、例えばせいぜい595、例えばせいぜい594、例えばせいぜい593、例えばせいぜい592、例えばせいぜい591、例えばせいぜい590、例えばせいぜい589、例えばせいぜい588、例えばせいぜい587、例えばせいぜい586、例えばせいぜい585、例えばせいぜい584、例えばせいぜい583、例えばせいぜい582、例えばせいぜい581、例えばせいぜい580、例えばせいぜい579、例えばせいぜい578、例えばせいぜい577、例えばせいぜい576、例えばせいぜい575、例えばせいぜい574、例えばせいぜい573、例えばせいぜい572、例えばせいぜい571、例えばせいぜい570、例えばせいぜい569、例えばせいぜい568、例えばせいぜい567、例えばせいぜい566、例えばせいぜい565、例えばせいぜい564、例えばせいぜい563、例えばせいぜい562、例えばせいぜい561、例えばせいぜい560、例えばせいぜい559、例えばせいぜい558、例えばせいぜい557、例えばせいぜい556、例えばせいぜい555、例えばせいぜい554、例えばせいぜい553、例えばせいぜい552、例えばせいぜい551、例えばせいぜい550、例えばせいぜい549、例えばせいぜい548、例えばせいぜい547、例えばせいぜい546、例えばせいぜい545、例えばせいぜい544、例えばせいぜい543、例えばせいぜい542、例えばせいぜい541、例えばせいぜい540、例えばせいぜい539、例えばせいぜい538、例えばせいぜい537、例えばせいぜい536、例えばせいぜい535、例えばせいぜい534、例えばせいぜい533、例えばせいぜい532、例えばせいぜい531、例えばせいぜい530、例えばせいぜい529、例えばせいぜい528、例えばせいぜい527、例えばせいぜい526、例えばせいぜい525、例えばせいぜい524、例えばせいぜい523、例えばせいぜい522、例えばせいぜい521、例えばせいぜい520、例えばせいぜい519、例えばせいぜい518、例えばせいぜい517、例えばせいぜい516、例えばせいぜい515、例えばせいぜい514、例えばせいぜい513、例えばせいぜい512、例えばせいぜい511、例えばせいぜい510、例えばせいぜい509、例えばせいぜい508、例えばせいぜい507、例えばせいぜい506、例えばせいぜい505、例えばせいぜい504、例えばせいぜい503、例えばせいぜい502、例えばせいぜい501、例えばせいぜい500、例えばせいぜい499、例えばせいぜい498、例えばせいぜい497、例えばせいぜい496、例えばせいぜい495、例えばせいぜい494、例えばせいぜい493、例えばせいぜい492、例えばせいぜい491、例えばせいぜい490、例えばせいぜい489、例えばせいぜい488、例えばせいぜい487、例えばせいぜい486、例えばせいぜい485、例えばせいぜい484、例えばせいぜい483、例えばせいぜい482、例えばせいぜい481、例えばせいぜい480、例えばせいぜい479、例えばせいぜい478、例えばせいぜい477、例えばせいぜい476、例えばせいぜい475、例えばせいぜい474、例えばせいぜい473、例えばせいぜい472、例えばせいぜい471、例えばせいぜい470、例えばせいぜい469、例えばせいぜい468、例えばせいぜい467、例えばせいぜい466、例えばせいぜい465、例
えばせいぜい464、例えばせいぜい463、例えばせいぜい462、例えばせいぜい461、例えばせいぜい460、例えばせいぜい459、例えばせいぜい458、例えばせいぜい457、例えばせいぜい456、例えばせいぜい455、例えばせいぜい454、例えばせいぜい453、例えばせいぜい452、例えばせいぜい451、例えばせいぜい450、例えばせいぜい449、例えばせいぜい448、例えばせいぜい447、例えばせいぜい446、例えばせいぜい445、例えばせいぜい444、例えばせいぜい443、例えばせいぜい442、例えばせいぜい441、例えばせいぜい440、例えばせいぜい439、例えばせいぜい438、例えばせいぜい437、例えばせいぜい436、例えばせいぜい435、例えばせいぜい434、例えばせいぜい433、例えばせいぜい432、例えばせいぜい431、例えばせいぜい430、例えばせいぜい429、例えばせいぜい428、例えばせいぜい427、例えばせいぜい426、例えばせいぜい425、例えばせいぜい424、例えばせいぜい423、例えばせいぜい422、例えばせいぜい421、例えばせいぜい420、例えばせいぜい419、例えばせいぜい418、例えばせいぜい417、例えばせいぜい416、例えばせいぜい415、例えばせいぜい414、例えばせいぜい413、例えばせいぜい412、例えばせいぜい411、例えばせいぜい410、例えばせいぜい409、例えばせいぜい408、例えばせいぜい407、例えばせいぜい406、例えばせいぜい405、例えばせいぜい404、例えばせいぜい403、例えばせいぜい402、例えばせいぜい401、例えばせいぜい400、例えばせいぜい399、例えばせいぜい398、例えばせいぜい397、例えばせいぜい396、例えばせいぜい395、例えばせいぜい394、例えばせいぜい393、例えばせいぜい392、例えばせいぜい391、例えばせいぜい390、例えばせいぜい389、例えばせいぜい388、例えばせいぜい387、例えばせいぜい386、例えばせいぜい385、例えばせいぜい384、例えばせいぜい383、例えばせいぜい382、例えばせいぜい381、例えばせいぜい380、例えばせいぜい379、例えばせいぜい378、例えばせいぜい377、例えばせいぜい376、例えばせいぜい375、例えばせいぜい374、例えばせいぜい373、例えばせいぜい372、例えばせいぜい371、例えばせいぜい370、例えばせいぜい369、例えばせいぜい368、例えばせいぜい367、例えばせいぜい366、例えばせいぜい365、例えばせいぜい364、例えばせいぜい363、例えばせいぜい362、例えばせいぜい361、例えばせいぜい360、例えばせいぜい359、例えばせいぜい358、例えばせいぜい357、例えばせいぜい356、例えばせいぜい355、例えばせいぜい354、例えばせいぜい353、例えばせいぜい352、例えばせいぜい351、例えばせいぜい350、例えばせいぜい349、例えばせいぜい348、例えばせいぜい347、例えばせいぜい346、例えばせいぜい345、例えばせいぜい344、例えばせいぜい343、例えばせいぜい342、例えばせいぜい341、例えばせいぜい340、例えばせいぜい339、例えばせいぜい338、例えばせいぜい337、例えばせいぜい336、例えばせいぜい335、例えばせいぜい334、例えばせいぜい333、例えばせいぜい332、例えばせいぜい331、例えばせいぜい330、例えばせいぜい329、例えばせいぜい328、例えばせいぜい327、例えばせいぜい326、例えばせいぜい325、例えばせいぜい324、例えばせいぜい323、例えばせいぜい322、例えばせいぜい321、例えばせいぜい320、例えばせいぜい319、例えばせいぜい318、例えばせいぜい317、例えばせいぜい316、例えばせいぜい315、例えばせいぜい314、例えばせいぜい313、例えばせいぜい312、例えばせいぜい311、例えばせいぜい310、例えばせいぜい309、例えばせいぜい308、例えばせいぜい307、例えばせいぜい306、例えばせいぜい305、例えばせいぜい304、例えばせいぜい303、例えばせいぜい302、例えばせいぜい301、例えばせいぜい300、例えばせいぜい299、例えばせいぜい298、例えばせいぜい297、例えばせいぜい296、例えばせいぜい295、例えばせいぜい294、例えばせいぜい293、例えばせいぜい292、例えばせいぜい291、例えばせいぜい290、例えばせいぜい289、例えばせいぜい288、例えばせいぜい287、例えばせいぜい286、例えばせいぜい285、例えばせいぜい284、例えばせいぜい283、例えばせいぜい282、例えばせいぜい281、例えばせいぜい280、例えばせいぜい279、例えばせいぜい278、例えばせいぜい277、例えばせいぜい276、例えばせいぜい275、例えばせいぜい274、例えばせいぜい273、例えばせいぜい272、例えばせいぜい271、例えばせいぜい270、例えばせいぜい269、例えばせいぜい268、例えばせいぜい267、例えばせいぜい266、例えばせいぜい265、例えばせいぜい264、例えばせいぜい263、例えばせいぜい262、例えばせいぜい261、例えばせいぜい260、例えばせいぜい259、例えばせいぜい258、例えばせいぜい257、例えばせいぜい256、例えばせいぜい255、例えばせいぜい254、例えばせいぜい253、例えばせいぜい252、例えばせいぜい251、例えばせいぜい250、例えばせいぜい249、例えばせいぜい248、例えばせいぜい247、例えばせいぜい246、例えばせいぜい245、例えばせいぜい244、例えばせいぜい243、例えばせいぜい242、例えばせいぜい241、例えばせいぜい240、例えばせいぜい239、例えばせいぜい238、例えばせいぜい237、例えばせいぜい236、例えばせいぜい235、例えばせいぜい234、例えばせいぜい233、例えばせいぜい232、例えばせいぜい231、例えばせいぜい230、例えばせいぜい229、例えばせいぜい228、例えばせいぜい227、例えばせいぜい226、例えばせいぜい225、例えばせいぜい224、例えばせいぜい223、例えばせいぜい222、例えばせいぜい221、例えばせいぜい220、例えばせいぜい219、例えばせいぜい218、例えばせいぜい217、例えばせいぜい216、例えばせいぜい215、例えばせいぜい214、例えばせいぜい213、例えばせいぜい212、例えばせいぜい211、例えばせいぜい210、例えばせいぜい209、例えばせいぜい208、例えばせいぜい207、例えばせいぜい206、例えばせいぜい205、例えばせいぜい204、例えばせいぜい203、例えばせいぜい202、例えばせいぜい201、例えばせいぜい200、例えばせいぜい199、例えばせいぜい198、例えばせいぜい197、例えばせいぜい196、例えばせいぜい195、例えばせいぜい194、例えばせいぜい193、例えばせいぜい192、例えばせいぜい191、例えばせいぜい190、例えばせいぜい189、例えばせいぜい188、例えばせいぜい187、例えばせいぜい186、例えばせいぜい185、例えばせいぜい184、例えばせいぜい183、例えばせいぜい182、例えばせいぜい181、例えばせいぜい180、例えばせいぜい179、例えばせいぜい178、例えばせいぜい177、例えばせいぜい176、例えばせいぜい175、例えばせいぜい174、例えばせいぜい173、例えばせいぜい172、例えばせいぜい171、例えばせいぜい170、例えばせいぜい169、例えばせいぜい168、例えばせいぜい167、例えばせいぜい166、例えばせいぜい165、例えばせいぜい164、例えばせいぜい163、例えばせいぜい162、例えばせいぜい161、例えばせいぜい160、例えばせいぜい159、例えばせいぜい158、例えばせいぜい157、例えばせいぜい156、例えばせいぜい155、例えばせいぜい154、例えばせいぜい153、例えばせいぜい152、例えばせいぜい151、例えばせいぜい150、例えばせいぜい149、例えばせいぜい148、例えばせいぜい147、例えばせいぜい146、例えばせいぜい145、例えばせいぜい144、例えばせいぜい143、例えばせいぜい142、例えばせいぜい141、例えばせいぜい140、例えばせいぜい139、例えばせいぜい138、例えばせいぜい137、例えばせいぜい136、例えばせいぜい135、例えばせいぜい134、例えばせいぜい133、例えばせいぜい132、例えばせいぜい131、例えばせいぜい130、例えばせいぜい129、例えばせいぜい128、例えばせいぜい127、例えばせいぜい126、例えばせいぜい125、例えばせいぜい124、例えばせいぜい123、例えばせいぜい122、例えばせいぜい121、例えばせいぜい120、例えばせいぜい119、例えばせいぜい118、例えばせいぜい117、例えばせいぜい116、例えばせいぜい115、例えばせいぜい114、例えばせいぜい113、例えばせいぜい112、例えばせいぜい111、例えばせいぜい110、例えばせいぜい109、例えばせいぜい108、例えばせいぜい107、例えばせいぜい106、例えばせいぜい105、例えばせいぜい104、例えばせいぜい103、例えばせいぜい102、例えばせいぜい101、例えばせいぜい100、例えばせいぜい99、例えばせいぜい98、例えばせいぜい97、例えばせいぜい96、例えばせいぜい95、例えばせいぜい94、例えばせいぜい93、例えばせいぜい92、例えばせいぜい91、例えばせいぜい90、例えばせいぜい89、例えばせいぜい88、例えばせいぜい87、例えばせいぜい86、例えばせいぜい85、例えばせいぜい84、例えばせいぜい83、例えばせいぜい82、例えばせいぜい81、例えばせいぜい80、例えばせいぜい79、例えばせいぜい78、例えばせいぜい77、例えばせいぜい76、例えばせいぜい75、例えばせいぜい74、例えばせいぜい73、例えばせいぜい72、例えばせいぜい71、例えばせいぜい70、例えばせいぜい69、例えばせいぜい68、例えばせいぜい67、例えばせいぜい66、例えばせいぜい65、例えばせいぜい64、例えばせいぜい63、例えばせいぜい62、例えばせいぜい61、例えばせいぜい60、例えばせいぜい59、例えばせいぜい58、例えばせいぜい57、例えばせいぜい56、例えばせいぜい55、例えばせいぜい54、例えばせいぜい53、例えばせいぜい52、例えばせいぜい51、例えばせいぜい50、例えばせいぜい49、例えばせいぜい48、例えばせいぜい47、例えばせいぜい46、例えばせいぜい45、例えばせいぜい44、例えばせいぜい43、例えばせいぜい42、例えばせいぜい41、例えばせいぜい40、例えばせいぜい39、例えばせいぜい38、例えばせいぜい37、例えばせいぜい36、例えばせいぜい35、例えばせいぜい34、例えばせいぜい33、例えばせいぜい32、例えばせいぜい31、例えばせいぜい30、例えばせいぜい29、例えばせいぜい28、例えばせいぜい27、例えばせいぜい26、例えばせいぜい25の連続ヌクレオチド長である。
【００５１】
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、せいぜい約1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、又は20の連続ヌクレオチド長である。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はチロファグス ファネツハンゴルムに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はレピドグリフス デストルクターに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はグリシファグス ドメスティクスに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はダーマトファゴイデス プテロニシヌスに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はチロファグス プトレセンチアエに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はブロミア トロピカリスに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はユーログリフス マイネイに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はダーマトファゴイデス ミクロセラスに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はアカルス シロに特異的である。幾つかの実施形態において、単離された核酸分子はダーマトファゴイデス ファリナエに特異的である。
【００５２】
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列の内部転写スペーサー１(ITS1)若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約80％同一である配列を含んでなる。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列の内部転写スペーサー２(ITS2)若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約80％同一である配列を含んでなる。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される同じ配列の内部転写スペーサー１(ITS1)及び内部転写スペーサー２(ITS2)若しくはそれらの相補配列又はそれらのフラグメントに少なくとも約80％同一である配列を含んでなる。
【００５３】
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそれらのフラグメント若しくは該フラグメントの相補配列に少なくとも約80％同一である配列を含んでなる。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、122、123及び124からなるリストより選択される核酸配列若しくはその相補配列又はそれらのフラグメント若しくは該フラグメントの相補配列に少なくとも約80％同一である配列からなる。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列中の5.8S又はその相補配列に少なくとも約80％同一である核酸配列、例えばRast5.8(例えば、配列番号111により規定される核酸配列)若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる。
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜100のいずれか１つから選択される配列中の18S又はその相補配列に少なくとも約80％同一である核酸配列、例えばFRibNav(例えば、配列番号121により規定される核酸配列)若しくはその相補配列又はそれらのフラグメントを含んでなる。
【００５４】
配列：
Clon_DM1 (配列番号１)
Clon_DM21 (配列番号２)
Clon_DM6 (配列番号３)
Clon_DM20 (配列番号４)
Clon_DM9 (配列番号５)
Clon_DM12 (配列番号６)
Clon_DM7 (配列番号７)
Clon_DM11 (配列番号８)
Clon_DM14 (配列番号８)
Clon_DMA (配列番号10)
Clon_DF1 (配列番号11)
Clon_DF6 (配列番号12)
Clon_DF4 (配列番号13)
Clon_DF26 (配列番号14)
Clon_DF4_50 (配列番号15)
Clon_DF19 (配列番号16)
Clon_DF3 (配列番号17)
Clon_DF5 (配列番号18)
Clon_DF2 (配列番号19)
Clon_DF7 (配列番号20)
Clon_AS15 (配列番号21)
Clon_AS14 (配列番号22)
Clon_AS20 (配列番号23)
Clon_AS13 (配列番号24)
Clon_AS10 (配列番号25)
Clon_AS11 (配列番号26)
Clon_AS2 (配列番号27)
Clon_AS12 (配列番号28)
Clon_AS1 (配列番号29)
Clon_AS16 (配列番号30)
Clon_BT8 (配列番号31)
Clon_BT9 (配列番号32)
Clon_BT16 (配列番号33)
Clon_BT3 (配列番号34)
Clon_BT14 (配列番号35)
Clon_BT17 (配列番号36)
Clon_BT13 (配列番号37)
Clon_BT1 (配列番号38)
Clon_BT10 (配列番号39)
Clon_BT15 (配列番号40)
Clon_TPA1_20 (配列番号41)
Clon_TPA1_22 (配列番号42)
Clon_TPA1_29 (配列番号43)
Clon_TPA1_28 (配列番号44)
Clon_TPA1_26 (配列番号45)
Clon_TPA1_21 (配列番号46)
Clon_TPA1_36 (配列番号47)
Clon_TPA1_27 (配列番号48)
Clon_TPA1_23 (配列番号49)
Clon_TPA1_1 (配列番号50)
Clon_TF22 (配列番号51)
Clon_TF24 (配列番号52)
Clon_TF3 (配列番号53)
Clon_TF2 (配列番号54)
Clon_TF23  (配列番号55)
Clon_TF1  (配列番号56)
Clon_TF4  (配列番号57)
Clon_TF7  (配列番号58)
Clon_TF15  (配列番号59)
Clon_TF14  (配列番号60)
Clon_DP8  (配列番号61)
Clon_DP1  (配列番号62)
Clon_DP7  (配列番号63)
Clon_DP3  (配列番号64)
Clon_DP6  (配列番号65)
Clon_DP9  (配列番号66)
Clon_DP2  (配列番号67)
Clon_DP4  (配列番号68)
Clon_DP10  (配列番号69)
Clon_DP5  (配列番号70)
Clon_EM4  (配列番号71)
Clon_EM21  (配列番号72)
Clon_EM2  (配列番号73)
Clon_EM23  (配列番号74)
Clon_EM3  (配列番号75)
Clon_EM24  (配列番号76)
Clon_EM22  (配列番号77)
Clon_EM1  (配列番号78)
Clon_EM6  (配列番号79)
Clon_EM5  (配列番号80)
Clon_GD1  (配列番号81)
Clon_GD10  (配列番号82)
Clon_GD2  (配列番号83)
Clon_GD5  (配列番号84)
Clon_GD3  (配列番号85)
Clon_GD12  (配列番号86)
Clon_GD7  (配列番号87)
Clon_GD9  (配列番号88)
Clon_GD8  (配列番号89)
Clon_GD13  (配列番号90)
Clon_LD5  (配列番号91)
Clon_LD13  (配列番号92)
Clon_LD14  (配列番号93)
Clon_LD1  (配列番号94)
Clon_LD11  (配列番号95)
Clon_LD3  (配列番号96)
Clon_LD2  (配列番号97)
Clon_LD12  (配列番号98)
Clon_LD8  (配列番号99)
Clon_LD15  (配列番号100)
【００５５】
プライマー配列(5'-3')：
フォワード(第１)プライマー：
F1Tf_824 (配列番号101) GACAGAAGCTGAAAGCCGT (チロファグス ファネツハンゴルム)
F1Ld_608 (配列番号102) GATGTTCGAATCAATTGCTAGTG (レピドグリフス デストルクター)
F1Gd_567 (配列番号103) GCATACCGTGTTGAAGCAGG (グリシファグス ドメスティクス)
F1Dp_501 (配列番号104) GATCGACTGGCAATTGTTGAC (ダーマトファゴイデス プテロニシヌス)
F1Tp_474 (配列番号105) CGCCATTTGACACAGTACC (チロファグス プトレセンチアエ)
F1Bt_419 (配列番号106) TGTGTGTGGGGGATTTTGC (ブロミア トロピカリス)
F1Em_384 (配列番号107) GAGCCTGACAATTATCAATGTGC (ユーログリフス マイネイ)
F1Dm_304 (配列番号108) CGGGATGAACGTGTGGATG (ダーマトファゴイデス ミクロセラス)
F1As_234 (配列番号109) GTCGGTTACGGTCAAACG (アカルス シロ)
F1Df_159 (配列番号110) GAAACAATTGAATTGTGATTCTGC (ダーマトファゴイデス ファリナエ)
【００５６】
リバースユニバーサル(第２)プライマー：
RAst5.8S (配列番号111) 5'-TGCGTTCGAAWGTCGAGT-3', W= T 又は A
フォワードユニバーサル(第２)プライマー：
FRibNav (配列番号121) 5'- AGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAG -3'
リバース(第１)プライマー：
R1Dp_181 (配列番号122) GCTTTCAATAACCTCATCAGTGTC (ダーマトファゴイデス プテロニシヌス)
R1Bt_347 (配列番号123) CCATCACTAAAGGACAGAACCGC (ブロミア トロピカリス)
R1Df_419 (配列番号124) CTCCAGCAATCGAATTATGCTC (ダーマトファゴイデス ファリナエ)
【００５７】
配列及びCLUSTAL W 2.1複数配列の整列
ITS1及びITS2は、本明細書においては、ITS1及びITS2と18s(太字)、5.8s(太字での２番目の配列)及び28s(太字での３番目の配列)の保存配列との境界によって規定される。したがって、ITS1は、ITS1の5'末端に18sの配列5'-AGGATCATTA-3'を、ITS1の3'末端に5.8sの配列5'-CTGYYAGTGG-3'を有する配列により規定される(18s及び5.8sの配列は含まれない)。ITS2は、ITS2の5'末端に5.8sの配列5' TGAGCGTCGT 3'を、ITS2の3'末端に28sの配列5' CGACCTCAG 3'を有する配列により規定される(5.8s及び28sの配列は含まれない)。ITS1は18Sサブユニットの下流であり、ITS2は5.8Sサブユニットの下流である。
【００５８】
【表１−１】
2016524906.tif 000002
【表１−２】
2016524906.tif 000003
【表１−３】
2016524906.tif 000004
【表１−４】
2016524906.tif 000005
【表１−５】
2016524906.tif 000006
【表１−６】
2016524906.tif 000007
【表１−７】
2016524906.tif 000008
【表１−８】
2016524906.tif 000009
【表１−９】
2016524906.tif 000010
【表１−１０】
2016524906.tif 000011
【表１−１１】
2016524906.tif 000012
【表１−１２】
2016524906.tif 000013
【表１−１３】
2016524906.tif 000014
【表１−１４】
2016524906.tif 000015
【表１−１５】
2016524906.tif 000016
【表１−１６】
2016524906.tif 000017
【表１−１７】
2016524906.tif 000018
【表１−１８】
2016524906.tif 000019
【表１−１９】
2016524906.tif 000020
【表１−２０】
2016524906.tif 000021
【表１−２１】
2016524906.tif 000022
【表１−２２】
2016524906.tif 000023
【表１−２３】
2016524906.tif 000024
【表１−２４】
2016524906.tif 000025
【表１−２５】
2016524906.tif 000026
【表１−２６】
2016524906.tif 000027
【表１−２７】
2016524906.tif 000028
【表１−２８】
2016524906.tif 000029
【表１−２９】
2016524906.tif 000030
【表１−３０】
2016524906.tif 000031
【表１−３１】
2016524906.tif 000032
【表１−３２】
2016524906.tif 000033
【表１−３３】
2016524906.tif 000034
【表１−３４】
2016524906.tif 000035
【表１−３５】
2016524906.tif 000036
【表１−３６】
2016524906.tif 000037
【表１−３７】
2016524906.tif 000038
【表１−３８】
2016524906.tif 000039
【表１−３９】
2016524906.tif 000040
【表１−４０】
2016524906.tif 000041
【表１−４１】
2016524906.tif 000042
【表１−４２】
2016524906.tif 000043
【表１−４３】
2016524906.tif 000044
【表１−４４】
2016524906.tif 000045
【表１−４５】
2016524906.tif 000046
【表１−４６】
2016524906.tif 000047
【表１−４７】
2016524906.tif 000048
【実施例】
【００５９】
実施例１
単一個体からのDNA抽出：実体顕微鏡下に個体を昆虫針を用いて注意深く単離する。個体がエタノール中に保存したプールに由来する場合には、清浄なエタノール70％溶液中で１回洗浄する。各個体を氷上に配置した1.5mlマイクロチューブに入れる。
このプロトコルは、70％エタノール中の10〜50の個体からのDNA抽出への適用にも成功している。この場合、遠心分離(14000ｇ、５秒間)後にエタノールを除去する。
【００６０】
１．100μlの抽出緩衝液(Tris-HCl 10mM(pH8.0)、EDTA 25mM(pH8.0)及びNaCl 100mM)を加え、マイクロチューブに適合させたペレット乳棒(例えば、Pellet pestle, Sigma)を用いてホモジナイズする。良好な同質性が重要である。
２．10μlのSDS 10％を加え(最終的に１％)、穏やかに混合する。
３．10μlのプロテイナーゼＫ(ストック：10mg/ml)を加え(最終的に１mg/ml)、穏やかに混合し、37℃で２時間インキュベートする。
４．20μlのNaCl ５Ｍを加え(最終的に約0.5M NaCl)、穏やかに混合する。
５．15μlのセチルトリメチルアンモニウム ブロミド(CTAB)(ストック：NaCl 0.5Ｍ中CTAB 10％、62℃)を加え、62℃で10分間インキュベートする。インキュベーションの間、数回穏やかに混合する。
６．0.5容量の平衡化フェノール及び0.5容量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)を加える。２分間穏やかに混合し、11000ｇで３分間遠心分離する。
７．約110μlの水相を注意深く取り出し、清浄なマイクロチューブに移す。0.5容量の蒸留水(〜55μl)を加え、１容量のイソプロパノール(〜170μl)を加え、穏やかに混合し、２分間待ち、18000ｇで15分間遠心分離する。
８．遠心分離の直後にチューブを倒立させてイソプロパノールを除去する。700μlの70％エタノールを加えて、ペレット(一般には、視認不可)を洗浄し、18000ｇで15分間遠心分離する。
９．遠心分離の直後にチューブを倒立させてエタノールを除去し、ペレットを含むチューブをベンチ上又は層流キャビネット内において乾燥させる(乾燥は１時間前に完了させるべきである)(必要以上に乾燥させない)。
10．20μlのTE 0.1×(ストックTE １×：Tris-HCl 10mM(pH8.0)及びEDTA 10 mM(pH8.0)を加える。
11．定量する。
【００６１】
ダニ培養物からのDNA抽出：上記１、２、３、４、５、７、８において４×容量を加え、上記10においてRNAase(0.1μg/μl)を加えること以外は同じプロトコルを、20mgの凍結ダニ培養物からのDNA抽出に適用する。
環境サンプル又は精製ダニ画分からのDNA抽出：精製画分(虫体又は糞便、20mg)及び環境サンプル(50mg)からのトータルDNAの精製には、DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)を製造業者の指示に従って用いる。
【００６２】
実施例２
１又はそれより多い第１の(フォワード) プライマー及び5.8Sにハイブリダイズする単一の第２の(リバース)プライマーを用いる１ステップマルチプレックス-PCR
全ての種の培養物並びにダーマトファゴイデス プテロニシヌス及びD.ファリナエの精製画分における種の同定について試験した。
以下の種：チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ、ダーマトファゴイデス ファリナエのDNAを同定する。
【００６３】
１．DNA抽出。実施例１を参照。
３．マルチプレックス-PCR
プライマー：反応は以下の組合せを用いて行なってもよい：
ａ)10のフォワード(第１)プライマー(表１を参照)とリバース(第２)プライマーRAst5.8S(5'-TGCGTTCGAAWGTCGAGT-3'；Ｗ＝Ａ又はＴ)との組合せセット
ｂ)２又はそれより多いプライマー(リバース(第２)プライマーはそのうちの１つ)の任意の組合せ。
PCR反応：最終容量25μLは以下のものを含む：
50〜150ngのDNAテンプレート
１×PCR緩衝液II
200μMのdNTPミックス
0.6μMのフォワードプライマーミックス[10全てを用いるこの場合、各0.06μM](表１)
0.6μMのリバースプライマー(RAst5.8S)
1.5mMのMgCl2
0.6mg/mLの精製BSA(New England Biolabs, ref. B9001S)
１ＵのAmpliTaq Gold DNＡポリメラーゼ(Applied Biosystems)
PCRサイクル：95℃で10分間保持、40サイクル[30秒間、95℃；30秒間、58℃；２分間、72℃]、72℃で10分間保持。PCR産物を３％のアガロースゲル[NuSieve低融解アガロース(Lonza)：D-2アガロース(Pronadisa)、比率1:1]中で可視化する。得られた結果を図１に示す。
【００６４】
表１．マルチプレックス-PCR用フォワードプライマー。リバースプライマーRAst5.8Sとの組合せで各フォワードプライマーにより生成されたアンプリコンの凡そのサイズを、フォワードプライマーの名称中に示す。
プライマー配列(種)
F1Tf_824 GACAGAAGCTGAAAGCCGT (チロファグス ファネツハンゴルム)
F1Ld_608 GATGTTCGAATCAATTGCTAGTG (レピドグリフス デストルクター)
F1Gd_567 GCATACCGTGTTGAAGCAGG (グリシファグス ドメスティクス)
F1Dp_501 GATCGACTGGCAATTGTTGAC (ダーマトファゴイデス プテロニシヌス)
F1Tp_474 CGCCATTTGACACAGTACC (チロファグス プトレセンチアエ)
F1Bt_419 TGTGTGTGGGGGATTTTGC (ブロミア トロピカリス)
F1Em_384 GAGCCTGACAATTATCAATGTGC (ユーログリフス マイネイ)
F1Dm_304 CGGGATGAACGTGTGGATG (ダーマトファゴイデス ミクロセラス)
F1As_234 GTCGGTTACGGTCAAACG (アカルス シロ)
F1Df_159 GAAACAATTGAATTGTGATTCTGC (ダーマトファゴイデス ファリナエ)
【００６５】
実施例３
２ステップマルチプレックス-PCR
実施例２を行なった後にPCRにおいて低効率を示した環境サンプルの分析又は培養物の混入の分析に必要とされる。以下の種：チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ, ダーマトファゴイデス ファリナエのDNAを同定する。
【００６６】
１．DNA抽出。(実施例１を参照)
２．ITS1-ITS2増幅。
プライマー：FNav(5'-AGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3')及びRNav2(5'-ATATGCTTAAATTCAGCGGG-3')
PCR反応：最終容量25μLは以下のものを含む：
50〜150ngのDNAテンプレート
１×PCR緩衝液II
200μMのdNTPミックス
0.4μMの各プライマー(FNav及びRNav2)
1.5mMのMgCl2
１ＵのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)
PCRサイクル：95℃で10分間保持、40サイクル[30秒間、95℃；30秒間、58℃；２分間、72℃]、72℃で10分間の保持。PCR産物はゲル電気泳動後に可視化してはならない。
【００６７】
３．マルチプレックス-PCR増幅。
プライマー：反応は以下の組合せを用いて行なってもよい：
ａ)10のフォワードプライマー(表２を参照)とリバースプライマーRAst5.8S(5'-TGCGTTCGAAWGTCGAGT-3'；Ｗ＝Ｔ又はＡ)との組合せセット、
ｂ)２又はそれより多いプライマー(リバース(第２)プライマーはそのうちの１つ)の任意の組合せ。
PCR反応：最終容量25μLは以下のものを含む：
工程２で得られるPCR産物５μl(MQ水中希釈率1/500)
１×PCR緩衝液II
200μMのdNTPミックス
0.6μMのフォワードプライマーミックス[各々0.06μM](表２)
0.6μMのリバースプライマー(RAst5.8S)
1.5mMのMgCl2
0.6mg/mLの精製BSA(New England Biolabs, ref. B9001S)
１ＵのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)
PCRサイクル：95℃で10分間保持、35サイクル[30秒間、95℃；60秒間、62℃]、72℃で10分間保持。PCR産物を３％のアガロースゲル[NuSieve低融解アガロース(Lonza)：D-2アガロース(Pronadisa)、比率1:1]中で可視化する。得られた結果を図２に示す。
【００６８】
表２．マルチプレックス-PCR用フォワードプライマー。リバースプライマーRAst5.8Sとの組合せで各フォワードプライマーにより生成されたアンプリコンのサイズを、フォワードプライマーの名称中に示す。
プライマー配列(括弧内は種)
F1Tf_824 GACAGAAGCTGAAAGCCGT (チロファグス ファネツハンゴルム)
F1Ld_608 GATGTTCGAATCAATTGCTAGTG (レピドグリフス デストルクター)
F1Gd_567 GCATACCGTGTTGAAGCAGG (グリシファグス ドメスティクス)
F1Dp_501 GATCGACTGGCAATTGTTGAC (ダーマトファゴイデス プテロニシヌス)
F1Tp_474 CGCCATTTGACACAGTACC (チロファグス プトレセンチアエ)
F1Bt_419 TGTGTGTGGGGGATTTTGC (ブロミア トロピカリス)
F1Em_384 GAGCCTGACAATTATCAATGTGC (ユーログリフス マイネイ)
F1Dm_304 CGGGATGAACGTGTGGATG (ダーマトファゴイデス ミクロセラス)
F1As_234 GTCGGTTACGGTCAAACG (アカルス シロ)
F1Df_159 GAAACAATTGAATTGTGATTCTGC (ダーマトファゴイデス ファリナエ)
【００６９】
実施例４
アレルギー原因ダニの同定用に適合させたマーカー(Maマーカー)。
(Maマーカー)
１．マーカーバンドのPCR増幅。
実施例３に従うが、PCRの総量を100μLに増大させた(テンプレート及びポリメラーゼの単位を比例して増大させる)PCR増幅により、各々の種のITS1マーカーバンドを得る。
PCR産物の正確なサイズを検証するために、ゲル電気泳動を行なう。
２．マーカーバンドミックス
ａ．標準の市販キットを用いてPCR産物を精製する。
ｂ．標準的方法によりDNAを定量して濃度(ng/μL)を得る。最小でも濃度100ng/μLを得るべきである。
ｃ．濃度に基づいて、５μgのDNAを含有するであろう各PCR産物の容量(μL)を算出する。
ｄ．工程ｃで算出した容量に、表３に示す対応する補正因子(アンプリコンのサイズに基づいて容量を補正)を乗じ、得られた容量を清浄なマイクロチューブ中に導入する(各PCR産物につき１つのマイクロチューブ)。
ｅ．総容量50μLまでMQ水を各マイクロチューブに加え、ボルテックスにより混合する。
ｆ．全ての計算が正しいことを検証するために、アガロースゲルの異なるレーンに、工程ｅで調製した各PCR産物を１μl負荷し、電気泳動させる。全てのPCR産物について類似する強度の正味バンドが観察されるべきである。
ｇ．全てのバンドが同じ強度を示す場合には、工程ｈを行なう。
ｈ．幾つかのバンドの強度が低ければ、対応するマイクロチューブに１〜10μLの精製PCR産物を加えてDNA含量を増やす。再び、工程ｆを行なう。
ｉ．工程ｅで準備した10のマイクロチューブの内容物を単一容器内で混合し、50μLの標準10×ブルーサンプル緩衝液を加える。
ｊ．このマーカーをアガロースゲルに５〜10μLに負荷して使用する。
【００７０】
表３．２ステップマルチプレックス-PCRによる異なる種由来DNAの増幅によって得られたPCR産物の凡そのサイズ(実施例３)及びMaマーカーを製造するための補正因子。
種    PCR産物の凡そのサイズ(bp    補正因子(下線)
チロファグス ファネツハンゴルム (Tf)  824；0.19
レピドグリフス デストルクター (Ld)  608；0.26
グリシファグス ドメスティクス (Gd)  567；0.28
ダーマトファゴイデス プテロニシヌス (Dp)  501；0.32
チロファグス プトレセンチアエ (Tp)  474；0.34
ブロミア トロピカリス (Bt)  419；0.38
ユーログリフス マイネイ (Em)  384；0.41
ダーマトファゴイデス ミクロセラス (Dm)  304；0.52
アカルス シロ (As)  234；0.68
ダーマトファゴイデス ファリナエ (Df)  159；1.00
【００７１】
実施例５
１又はそれより多い第１(リバース)プライマー及び18Sにハイブリダイズする１つの第２(フォワード)プライマーを用いる１ステップマルチプレックス-PCR
以下の10種：チロファグス ファネツハンゴルム、レピドグリフス デストルクター、グリシファグス ドメスティクス、ダーマトファゴイデス プテロニシヌス、チロファグス プトレセンチアエ、ブロミア トロピカリス、ユーログリフス マイネイ、ダーマトファゴイデス ミクロセラス、アカルス シロ、ダーマトファゴイデス ファリナエの培養物中のD. テロニシヌス、D.ファリナエ及び/又はB.トロピカリスの種同定について試験した。
【００７２】
１．DNA抽出。実施例１を参照。
３．マルチプレックス-PCR。
プライマー：反応は以下の組合せを用いて行なってもよい：
ａ)３つのリバース(第１)プライマー(下記表４を参照)とフォワード(第２)プライマーFRibNav(5'-AGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3')との組合せセット、
ｂ)２又はそれより多いプライマー(フォワード(第２)プライマーはそのうちの１つ)の任意の組合せ。
PCR反応：最終容量25μLは以下のものを含む：
50〜150ngのDNAテンプレート
１×PCR緩衝液II
200μMのdNTPミックス
0.6μMのリバースプライマーミックス[３つ全てを用いるこの場合、各0.2μM](表４)
0.6μMのフォワードプライマー(FRibNav)
1.5mMのMgCl2
0.6mg/mLの精製BSA(New England Biolabs, ref. B9001S)
1.5ＵのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)
PCRサイクル：95℃で10分間保持、40サイクル[30秒間、95℃；30秒間、58℃；２分間、72℃]、72℃で７分間保持。PCR産物を３％のアガロースゲル[NuSieve低融解アガロース(Lonza)：D-2アガロース(Pronadisa)、比率1:1]中で可視化する。得られた結果を図６に示す。
【００７３】
表４．マルチプレックス-PCR用のリバース(第１)プライマー。フォワードプライマーFRibNavとの組合せで各リバースプライマーにより生成されたアンプリコンの凡そのサイズを、リバースプライマーの名称中に示す。
プライマー配列(種)
R1Dp_181 GCTTTCAATAACCTCATCAGTGTC (ダーマトファゴイデス プテロニシヌス)
R1Bt_347 CCATCACTAAAGGACAGAACCGC (ブロミア トロピカリス)
R1Df_419 CTCCAGCAATCGAATTATGCTC (ダーマトファゴイデス ファリナエ) 
【００７４】
参考文献
Cruickshank RH (2002) "Molecular markers for the phylogenetics of mites and ticks". System Appl Acarol 7:3-14.
Lava Kumar, P., Fenton, B., Jones,  A. T. (1999) Identification of Cecidophyopsis mites (Acari: Eriophyidae) based on variable simple sequence repeats of ribosomal DNA internal transcribed spacer-1 sequences via multiplex PCR. Insect Molecular Biology. 1999;8(3);347-357
Navajas, M., Lagnel, J., Fauvel, G. & de Moraes, G. (1999) Sequence variation of ribosomal internal transcribed spacers (ITS) in commercially important Phytoseiidae mite. Experimental and Applied Acarology, 23, 851-859. 
Noge K, Mori N, Tanaka C, Nishida R, Tsuda M, Kuwahara Y. Identification of astigmatid mites using the second internal transcribed spacer (ITS2) region and its application for phylogenetic study. Exp Appl Acarol. 2005;35:29-46.
Spieksma FTM, "Identification of house-dust mites", Aerobiologia 1990; 187-192.
Suarez-Martinez EB, Montealegre F, Sierra-Montes JM. Molecular identification of pathogenic house dust mites using 12S rRNA sequences. Electrophoresis. 2005;26:2927-34.
Thet-Em T, Tungtrongchitr A, Tiewcharoen S, Malainual N., "Multiplex PCR for identifying common dust mites species (D. pteronyssinus, D. farinae and B. tropicalis)", Asian Pac J Allergy Immunol 2012;30:224-30.
Wong SF, Chong AL, Mak JW, Tan J, Ling SJ, Ho TM. "Molecular identification of house dust mites and storage mites". Exp Appl Acarol. 2011;55:123-33.
【図１】
2016524906.tif 000049
【図２】
2016524906.tif 000050
【図３】
2016524906.tif 000051
【図４】
2016524906.tif 000052
【図５】
2016524906.tif 000053
【図６】
2016524906.tif 000054
【配列表】
2016524906000001.app
【国際調査報告】
2016524906.tif 000055
2016524906.tif 000056
2016524906.tif 000057
2016524906.tif 000058
2016524906.tif 000059