(57)【要約】  本発明は、内部空間を画成する容器と、攪拌手段と、１以上の添加管とを備えており、添加管の送出オリフィスが、内部空間内に位置しており、逆止弁が、添加管から内部空間の方向に流体を流すが、逆方向の流れは阻止するように、送出オリフィスの近傍に配置されている、バイオリアクターを開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部空間（３；２３）を画成する容器（２；２２）と、攪拌手段（４；２４）と、１以上の添加管（５；２５）とを備えるバイオリアクターであって、添加管の送出オリフィス（６；２６）が内部空間内に位置しており、逆止弁（７；２７）が、添加管から内部空間（３；２３）の方向に流体を流すが、逆方向の流れは阻止するように、送出オリフィスの近傍に配置されている、バイオリアクター（１；１１；２１）。
【請求項２】
逆止弁（７；２７）が送出オリフィス（６；２６）から所定の距離に位置しており、その距離が、添加管（５；２５）の直径の１０倍以下、例えば２倍以下である、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
添加管の送出オリフィス（６；２６）が、当該バイオリアクターの使用時に液体中に浸漬されるように配置されている、請求項１又は請求項２に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
送出オリフィス（６；２６）が、逆止弁（７；２７）で覆われている、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項５】
逆止弁の開きの圧力が１０ｋＰａ以下、例えば１０Ｐａ〜１０ｋＰａ又は１００Ｐａ〜１０ｋＰａである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
逆止弁が、弾性閉鎖部材（３８、４８、５８、６８）を備える、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項７】
弾性閉鎖部材が、管、リップ、フラップ及びスプリットディスクからなる群から選択される、請求項６に記載のバイオリアクター。
【請求項８】
容器が、可撓性プラスチックバッグ（２；２２）を備える、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項９】
可撓性プラスチックバッグ（２）が、使用時に剛性支持構造（１８）で支持されるように構成されている、請求項８に記載のバイオリアクター（１１）。
【請求項１０】
攪拌手段がインペラ（４）を備える、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のバイオリアクター（１、１１）。
【請求項１１】
可撓性プラスチックバッグ（２２）が膨張可能であり、攪拌手段が可撓性プラスチックバッグのための可動支持プラットフォーム（２４）を備える、請求項８に記載のバイオリアクター（２１）。
【請求項１２】
放射線滅菌される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項１３】
添加管が、ｐＨ調節剤、栄養剤及び／又は成長因子を含む液状溶液を収容している供給容器と流体接続される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
容器の内部空間内に位置する細胞培養の培地などの液体をさらに含み、添加管の送出オリフィスが液体中に浸漬されている、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
細胞培養の方法であって、
ａ）請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のバイオリアクターを用意するステップと、
ｂ）細胞培養の培地及び細胞を内部空間に添加するステップと、
ｃ）攪拌手段によって攪拌をもたらすステップと、
ｄ）液状溶液及び／又はガスを、添加管を介して内部空間へと添加するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
ステップｂ）において、細胞培養の培地の量は、添加管の送出オリフィスを浸漬するのに充分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
液状溶液が、ｐＨ調節剤、栄養剤及び／又は成長因子を含む、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクターに関し、より具体的には、バイオリアクター用の添加管に関する。さらに本発明は、添加管を備えるバイオリアクターにおける細胞の培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品及び生命科学の業界において、たんぱく質やワクチン成分などの細胞が発現させる生成物を回収する、又は例えば治療用の幹細胞を回収する目的で、細胞が一般的に培養されている。培養条件を注意深く制御する必要があり、培養の最中に培養物へとｐＨ調節剤、ガス、栄養剤、消泡剤、などの試薬を添加することが一般的に行われている。これは、添加管による送り込みによって行われ、添加管は、細胞培養の培地に沈められる、又は細胞培養の培地の上方にぶら下げられる送出オリフィス（通常は、管の端部）を有することができる。ポンプが、典型的には、フィードバックループによって制御される、又は所定の添加プログラムによって制御されることで、間欠的に動作する。したがって、１つの問題は、たとえポンプが停止させられているときでも試薬が滴下又は拡散によって送出される可能性があり、試薬の供給の制御が不充分になりかねない点にある。さらに、送出オリフィスが沈められる場合、さらなる問題は、細胞培養の培地及び細胞が管へと進入し、細胞の死亡及び有害な信号物質の放出につながる強毒の条件に曝されかねない点にある。送出オリフィスが培地の上方にぶら下げられる場合には、試薬がもっぱら培地の上部の泡層へと向かい、培養物への適切な分配が妨げられる可能性がある。
【０００３】
したがって、細胞が過度に高い局所的な試薬の濃度に曝される恐れがない細胞培養物への試薬の良好に制御された添加の方法について、ニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０００５０１０号明細書
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、細胞培養物への試薬の良好に制御された添加のための手段を提供することである。これは、請求項１に記載のバイオリアクターによって達成される。
【０００６】
１つの利点は、試薬が意図されるときにだけ、意図される量にてもたらされる点にある。さらなる利点は、試薬が一様に分配され、細胞が高い一時的な試薬濃度に局所的に曝されることがない点にある。
【０００７】
本発明の別の態様は、良好に制御された試薬の添加にて細胞を培養する方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に定められるとおりの細胞培養の方法によって達成される。
【０００８】
本発明のさらなる適切な実施形態が、従属請求項に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係るバイオリアクターを示す。
【図２】本発明に係るバイオリアクターを示しており、プラスチックバッグが剛性構造で支持されている。
【図３】本発明に係るバイオリアクターを示しており、膨張性バッグが可動なプラットフォーム上に載せられている。
【図４】スプリットディスク逆止弁を備える本発明の添加管の詳細図を示す。
【図５】リップ（カモノハシ）逆止弁を備える本発明の添加管の詳細図を示す。
【図６】管状逆止弁を備える本発明の添加管の詳細図を示す。
【図７】フラップ逆止弁を備える本発明の添加管の詳細図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一態様において、本発明は、内部空間３；２３を画成する容器２；２２を備えるバイオリアクター１；１１；２１を開示する。バイオリアクターは、攪拌手段４；２４及び１以上の添加管５；２５をさらに備え、添加管の送出オリフィス６；２６が、容器の内部空間内に位置し、逆止弁７；２７が、添加管から内部空間３；２３の方向に流体を流すが、逆方向の流れは阻止するように、送出オリフィスの近傍に、又は送出オリフィスに隣接して配置されている。逆止弁７；２７が送出オリフィス６；２６の近傍に配置される場合、逆止弁とオリフィスとの間の距離は、管５；２５の直径（又は、直径が管５；２５の長さに沿って変化する場合には、平均径）の１０倍以下、５倍以下、又は２倍以下、など、例えば管５；２５の直径の２０倍以下であってよい。短い距離は、デッドボリュームが小さくなるがゆえに有利であるが、或る程度の距離が許容されるならば、逆止弁を管内に収容することがより容易になりうる。ｐＨ調節液、栄養液、成長因子の溶液、又はガスなどの流体が添加管及び送出オリフィスを介して内部空間へと供給されるとき、逆止弁が開き、流体が供給されないとき、弁が閉じ、流体が内部空間から添加管へと対流又は拡散によって進入することを防止する。容器は、典型的には、０．１リットル〜数千リットルの容積を有することができ、添加管の直径は、これに対応して、約１ｍｍ〜数ｃｍまでであってよい。添加管を、容器の壁のポートに接続することができ、このポートを、バイオリアクターの使用時に、例えば流体供給容器及び圧力を生み出す送出手段への配管に接続することができる。送出手段は、例えばポンプ、加圧された流体供給容器、又は静水圧を生むようにバイオリアクターの上方に配置された流体供給容器であってよい。流体の送出を、例えばポンプのオン／オフ又は調節、又は配管内の調節弁の開閉によって、制御することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、添加管の送出オリフィス６；２６は、バイオリアクターの使用時に液体中に浸漬されるように配置される。これは、流体が細胞培養の液体へと直接添加され、流体が培養の最中に液体の上部に形成される泡層に捕らえられる恐れがないという利点を有する。添加管を、例えば容器の上壁のポートに接続することができ、添加管は、送出オリフィスを添加管の下端又は下端付近に位置させつつ、上壁から底壁までの距離の少なくとも８０％又は少なくとも９０％など、容器の底壁へと少なくとも中ほどまで達するために充分な長さを有することができる。バイオリアクターは、これらの場合、使用時に容器を送出オリフィスを浸漬するような充分な液体で満たすようにとの指示を伴って供給されるべきである。代案として、添加管を、容器の側壁又は底壁のポートに接続することもでき、それらの場合でも、容器は使用時に送出オリフィスを浸漬するための充分な液体で満たされるべきである。
【００１２】
特定の実施形態ではは、容器内での送出オリフィスの位置が、調節可能である。これは、例えば、伸縮式の添加管、添加管が接続される容器の壁のポートの蛇腹、などによって達成でき、容器がどの程度満たされているかにかかわらず送出オリフィスを乱流の大きい地点に沈めて位置させることができるという利点を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態ではは、添加管の送出オリフィス６；２６が、逆止弁７；２７で覆われる。これの利点は、細胞培養の液体が逆止弁に直接接触し、逆止弁の外側によどんだ領域が形成されない点にある。逆止弁そのものを、その外側によどんだ領域が形成されないように適切に構成することができる。そのような逆止弁の例が、図４〜７に示されている。
【００１４】
いくつかの実施形態では、逆止弁は、例えば送出オリフィスに近い位置において添加管に挿入される。
【００１５】
特定の実施形態ではは、この逆止弁の開きの圧力が、１０Ｐａ〜１０ｋＰａ、１００Ｐａ〜１０ｋＰａ、又は１ｋＰａ〜１０ｋＰａなど、１０ｋＰａ以下である。開きの圧力が高すぎると、流体の圧力の高まり及び制御されない噴出が生じる可能性がある一方で、開きの圧力が低すぎると、例えば攪拌によって引き起こされる圧力変動によって弁が開く可能性がある。開きの圧力は、逆止弁の開きを引き起こす逆止弁の両側（入り口側及び出口側）の間の最小の圧力差である。標準的な方法で、例えば入り口側の圧力を次第に高め、どの圧力で弁が開くかを観察することによって、容易に決定することが可能である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、逆止弁は、弾性閉鎖部材３８、４８、５８、６８を備える。弾性閉鎖部材は、よどみの領域のない逆止弁の構成を用意にし、１回限りの使用のバイオリアクター容器に良好に適合する。また、弁の部品の別途の組み立てが不要であるように、一体形成の弾性逆止弁閉鎖部材を備える添加管を有することも可能である。
【００１７】
特定の実施形態では、弾性閉鎖部材は、管、リップ、フラップ及びスプリットディスクからなる群から選択される。管状の閉鎖部材５８の例が図６に、リップ４８の例が図５に、フラップ６８が図７に、スプリットディスク３８が図４に示されている。これらの構成はすべて、外側のよどみの領域が存在せず、又は最小限であるように製作でき、バイオリアクターにおける使用に適している。
【００１８】
いくつかの実施形態では、容器は、可撓性プラスチックバッグ２；２２を備える。これは、１回限りの使用のバイオリアクターを可能にする。可撓性プラスチックバッグ２を、使用時に、例えば剛性支持構造１８で支持することができる。剛性支持構造を、例えばステンレス鋼から製作することができる。
【００１９】
特定の実施形態では、攪拌手段は、インペラ４を備える。インペラは、容器の内部空間に適切に配置され、例えば外部の磁気駆動装置の作用によって回転又は振動するように構成されてよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、可撓性プラスチックバッグ２２は膨張可能であり、攪拌手段は、可撓性プラスチックバッグのための可動支持プラットフォーム２４を備える。図３に示されるように、膨張後のバッグは、自立可能であってよく、揺動による攪拌を生じさせるように軸２８を中心にして可動であってよいプラットフォーム２４上に載せられてよい。
【００２１】
特定の実施形態では、添加管を含み、随意により攪拌手段を含むバイオリアクター又は容器は、放射線によって滅菌される。これは、１回限りの使用のバイオリアクターにとって便利であり、すべての構成要素が放射線に対して安定な材料から作られる場合に実現可能である。容器及び添加管に適した材料が、例えばポリエチレン及びエチレンの共重合体でありうる一方で、逆止弁の閉鎖部材に適したエラストマは、例えば放射線に対して安定なシリコーンであってよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、添加管は、ｐＨ調節剤、栄養剤及び／又は成長因子を含む液状溶液を収容している供給容器と流体接続される。液状溶液は、例えばｐＨ制御のためのアンモニア水であってよいが、より複雑な培地成分の溶液であってもよい。
【００２３】
一態様において、本発明は、
ａ）上述のバイオリアクターを用意するステップと、
ｂ）細胞培養の培地及び細胞を容器の内部空間に添加するステップと、
ｃ）攪拌手段によって攪拌をもたらすステップと、
ｄ）液状溶液及び／又はガスを添加管を介して内部空間へと添加するステップとを含む細胞培養の方法を開示する。
【００２４】
細胞は、例えば、ｉ）哺乳類又は昆虫細胞などの動物細胞、ｉｉ）細菌又は酵母細胞などの微生物、或いはｉｉｉ）植物細胞であってよい。
【００２５】
特定の実施形態では、ステップｂ）における細胞培養の培地の量は、添加管の送出オリフィスを浸漬するために充分である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、液状溶液は、ｐＨ調節剤、栄養剤及び／又は成長因子を含む。
【００２７】
本明細書では、本発明を最良の形態を含めて開示するとともに、装置又はシステムの製造・使用及び方法の実施を始め、本発明を当業者が実施できるようにするため、例を用いて説明してきた。本発明の特許性を有する範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者に自明な他の例も包含する。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言上の差のない構成要素を有しているか、或いは特許請求の範囲の文言と実質的な差のない均等な構成要素を有していれば、特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。様々な実施形態からの特徴を組合せて、新たな実施形態を形成することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年8月2日(2016.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部空間（３；２３）を画成する容器（２；２２）と、攪拌手段（４；２４）と、１以上の添加管（５；２５）とを備えるバイオリアクターであって、添加管の送出オリフィス（６；２６）が内部空間内に位置しており、逆止弁（７；２７）が、添加管から内部空間（３；２３）の方向に流体を流すが、逆方向の流れは阻止するように、送出オリフィスの近傍に配置されている、バイオリアクター（１；１１；２１）。
【請求項２】
逆止弁（７；２７）が送出オリフィス（６；２６）から所定の距離に位置しており、その距離が添加管（５；２５）の直径の１０倍以下、例えば２倍以下である、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
ａ）添加管の送出オリフィス（６；２６）が当該バイオリアクターの使用時に液体中に浸漬されるように配置されている、
ｂ）送出オリフィス（６；２６）が逆止弁（７；２７）で覆われている、
ｃ）逆止弁の開きの圧力が１０ｋＰａ以下、例えば１０Ｐａ〜１０ｋＰａ又は１００Ｐａ〜１０ｋＰａである、及び／又は
ｄ）添加管が、ｐＨ調節剤、栄養剤及び／又は成長因子を含む液状溶液を収容している供給容器と流体接続される、
請求項１又は請求項２に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
逆止弁が弾性閉鎖部材（３８、４８、５８、６８）を備えており、例えば弾性閉鎖部材が、管、リップ、フラップ及びスプリットディスクからなる群から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項５】
容器が可撓性プラスチックバッグ（２；２２）を備える、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
可撓性プラスチックバッグ（２）が、使用時に剛性支持構造（１８）で支持されるように構成されており、攪拌手段が任意にはインペラ（４）を備える、請求項５に記載のバイオリアクター（１１）。
【請求項７】
可撓性プラスチックバッグ（２２）が膨張可能であり、攪拌手段が可撓性プラスチックバッグのための可動支持プラットフォーム（２４）を備える、請求項５に記載のバイオリアクター（２１）。
【請求項８】
放射線滅菌される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項９】
容器の内部空間内に位置する細胞培養の培地などの液体をさらに含み、添加管の送出オリフィスが液体中に浸漬されている、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
細胞培養の方法であって、
ａ）請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のバイオリアクターを用意するステップと、
ｂ）細胞培養の培地及び細胞を内部空間に添加するステップであって、例えば細胞培養の培地の量が添加管の送出オリフィスを浸漬するのに充分である、ステップと、
ｃ）攪拌手段によって攪拌をもたらすステップと、
ｄ）液状溶液及び／又はガスを、添加管を介して内部空間へと添加するステップと
を含む方法。
【国際調査報告】
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