(57)【要約】  【解決手段】  インスリン類似体は、Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏する短縮型Ｂ鎖ポリペプチドを含有し、かつＢ鎖のＣ末端Ｂ２３−Ｂ３０区域においてさらなる置換を任意で含有する。Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏するそのインスリン類似体は、速効作用を付与するＢ２８及び／またはＢ２９における置換を、並びにＢ２４における非標準型置換を任意で含有しても良い。その類似体は、ヒトインスリンなどの哺乳類インスリンの類似体であっても良い。そのようなインスリン類似体をコードする核酸もまた、提供される。患者を治療する方法は、生理的に有効な量のインスリン類似体または生理的に許容可能なその塩を患者に投与する工程を有する。半合成の方法は、非標準型アミノ酸置換による内因性トリプシン感受性部位の改変を用いて、無保護のオクタペプチドを使用して提供される。  【選択図】      図２Ｂ
2016506927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン類似体であって、Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏する短縮型インスリンＢ鎖ポリペプチドを有し、かつＢ鎖Ｂ２３−Ｂ３０区域内に少なくとも１つの他のアミノ酸置換または改変を選択的に含有する、インスリン類似体。
【請求項２】
請求項１記載のインスリン類似体であって、さらに、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇの群から選択されるＡ８置換を有する、インスリン類似体。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項記載のインスリン類似体であって、ＧｌｕＢ２９置換を有する、インスリン類似体。
【請求項４】
請求項１〜２のいずれか１項記載のインスリン類似体であって、ＯｒｎＢ２９置換を有する、インスリン類似体。
【請求項５】
請求項１記載のインスリン類似体において、前記類似体が哺乳類インスリンの類似体である、インスリン類似体。
【請求項６】
請求項１記載のインスリン類似体において、前記類似体が哺乳類プロインスリンの類似体である、インスリン類似体。
【請求項７】
請求項１記載のインスリン類似体であって、配列ＩＤ番号：５のポリペプチド配列を有する、インスリン類似体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のインスリン類似体をコードする核酸。
【請求項９】
請求項７記載の核酸配列を有する発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
患者の血糖を低下させる方法であって、生理的に有効な量のインスリン類似体または生理的に許容可能なその塩を患者に投与する工程を有し、前記インスリン類似体または生理的に許容可能なその塩がＢ１−Ｂ３残基を欠乏するＢ鎖ポリペプチドを含有するものである、方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法において、前記インスリン類似体または生理的に許容可能なその塩が、さらに、Ｂ鎖Ｂ２３−Ｂ３０区域内に少なくとも１つの他のアミノ酸置換または改変を有するものである、方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、前記インスリン類似体または生理的に許容可能なその塩が、さらに、オルニチン置換及びグルタミン酸置換から選択されるＢ２９位における置換を有するものである、方法。
【請求項１４】
Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏するインスリン類似体を調製する方法であって、Ｂ３位においてＡｒｇまたはＬｙｓを含有する折り畳まれた単鎖または二本鎖インスリン関連前駆ポリペプチドをトリプシン消化する工程であって、中間生成物ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−ペンタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリンを生成する、前記トリプシン消化する工程を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法であって、さらに、トリプシン触媒性半合成によって前記ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−ペンタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリンにＢ２３−Ｂ３０ペプチド区域を付加する工程であって、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］インスリン類似体を生成する、前記付加する工程を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の方法において、前記折り畳まれた単鎖または二本鎖インスリン関連前駆ポリペプチドが配列ＩＤ番号：９のポリペプチドを有する、方法。
【請求項１７】
配列ＩＤ番号：４の配列を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により後援された研究または開発に関する供述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより助成金第ＤＫ４０９４９号及び第ＤＫ０７４１７６号のもと授与された、共同契約下の政府支援でなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、より速い薬物動態、及び／または室温より高温の熱フィブリル化に対する強化された耐性などの、増強された薬学的特性を示すポリペプチドホルモン類似体に関する。とりわけ、本発明は、Ｂ１−Ｂ３残基の欠損、並びにＡ鎖もしくはＢ鎖の他の改変により改変されたインスリン類似体に関係する。そのような非標準型配列は、インスリン類似体のＡもしくはＢ鎖中の他の部位において標準型アミノ酸置換を任意で含有しうる。
【０００３】
治療薬及びワクチンを含む短縮型及び／または非標準型タンパク質の工学的操作は、幅広い医学的及び社会的有益性を有しうる。医学的有益性の例は、タンパク質の薬物動態特性の最適化であろう。さらなる社会的有益性の例は、電気及び冷却が一貫しては手に入らない開発途上世界の地域における利用のための、室温またはそれより高温における分解に関して標準的なタンパク質よりも抵抗性のあるタンパク質の工学的操作であろう。治療用タンパク質の例は、インスリンにより提供される。非標準型アミノ酸置換を含有するインスリンの類似体は、原理的には、薬物動態または熱分解に対する耐性に関して優れた特性を示しうる。皮下注射後のインスリン吸収の薬物動態により引き起こされる難題は、患者の厳格な血糖管理を実現させる能力に影響し、またインスリンポンプの安全性及び性能を制限する。物理的分解により引き起こされる難題は、アフリカ及びアジアにおける差し迫る糖尿病の流行によってより深刻となる。これらの問題点は、しばしば、皮下注射後の吸収を加速させることが当技術分野において既知である改変を伴うが、それは一般にインスリンの化学的及び／または物理的分解に対する耐性を悪化させる。フィブリル化は室温より高温での分解の主要な経路を提供するため、フィブリル化耐性製剤の設計は、そのような難題を抱える地域におけるインスリン補充療法の安全性及び有効性を向上させうる。本発明は、インスリンの特有の特性を改変しかつ向上させるための、Ａ鎖またはＢ鎖中の至る所における標準型または非標準型置換と組み合わせた、Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏する短縮型Ｂ鎖の利用に関係する。過去１０年の間に、目的の応用を容易にするためにタンパク質の何らかの特定の特性を選択的に改変する、インスリン分子に対する特定の化学的改変が開示されてきた。組換えＤＮＡ時代の初期（１９８０）には野生型ヒトインスリンは多様な治療環境における使用に最適であると想像されていたが、過去１０年におけるインスリン類似体の幅広い臨床利用は、未だ対処されぬ特定の需要に取り組むようにそれぞれ作製された類似体一式が、著しい医学的及び社会的有益性を提供するであろうことを示唆する。
【０００４】
インスリンの投与は、糖尿病のための治療法として長く確立されてきた。インスリンは、脊椎動物での代謝における中心的な役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンは、２１残基を含有するＡ鎖、及び３０残基を含有するＢ鎖の２鎖を含有する。本ホルモンは、膵β細胞中にＺｎ２＋安定化六量体として貯蔵されているが、血流中ではＺｎ２＋なし単量体として機能する。インスリンは、単鎖前駆体であるプロインスリンの産物であり、プロインスリンにおいては、連結領域（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（Ｂ３０残基）をＡ鎖のＮ末端残基へと連結させる（図１Ａ）。様々な証拠が、プロインスリンはインスリン様コアと無秩序な連結ペプチドとから構成されることを示す（図１Ｂ）。３つの特定のジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、及びＡ２０−Ｂ１９、図１Ａ及び１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的折り畳みと共役すると考えられている。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ体への輸出の直後、可溶性Ｚｎ２＋配位六量体を形成するように集合する。エンド型タンパク質分解性消化、及びインスリンへの変換は、未熟な分泌顆粒中で起こり、続いて形態学的濃縮が起こる。成熟貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン六量体の結晶配列は、電子顕微鏡法（ＥＭ）により可視化されてきた。インスリンの配列は、図１Ｃにおいて略図形式で示される。個々の残基は、アミノ酸（一般に標準型の３文字コードを用いて）、鎖、及び配列位置（一般に上付き文字として）の識別により示される。
【０００５】
皮下注射後のインスリン吸収の薬物動態特性は、インスリン六量体の解体速度と相関することが分かっている。本発明が理論により制約されることを望まないが、インスリン六量体解体の加速をもたらすインスリン分子への改変は、皮下デポから血流へのインスリン単量体及び二量体のより迅速な吸収を促進すると考えられている。糖尿病を有する患者におけるインスリン補充療法の主な目標は、ヒト健常者特有の正常範囲より上または下への変動を防止するための、血糖濃度の厳格な管理である。正常範囲より下への変動は、即座に現れるアドレナリン様または神経低糖症の症状と関連付けられ、それは重い発作では痙攣、昏睡状態、及び死に至らしめる。正常範囲より上への変動は、網膜症、失明、及び腎不全を含む微小血管障害の長期的危険性の上昇と関連付けられている。皮下注射後の野生型ヒトインスリン吸収の薬物動態は、食後の代謝ホメオスタシスの生理的要求と比較してしばしば遅すぎかつ長すぎるため、作用発現がより迅速で持続期間はより短い薬力学的効果を伴う、より迅速な吸収を示すインスリン類似体を開発するために、過去２０年のあいだ相当な努力が費やされてきた。当技術分野で公知のそのような速効性類似体の例は、［ＬｙｓＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インスリン（ＫＰ−インスリン、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の有効成分）、［ＡｓｐＢ２８］−インスリン（Ｎｏｖａｌｏｇ（登録商標））、及び［ＬｙｓＢ３，ＧｌｕＢ２９］−インスリン（Ａｐｉｄｒａ（登録商標））である。臨床診療において幅広く使用されているが、これらの類似体は２つの主な限界を示す。第一に、これらの類似体の薬物動態及び薬力学的特性は野生型インスリンのそれよりも迅速ではあるものの、多くの患者において、血糖管理を最適化し、またはアルゴリズムベースのインスリンポンプ（閉鎖型ループシステム）の安全かつ効果的な使用を可能にするには十分に迅速ではない。第二に、これらの類似体中のアミノ酸置換は、インスリンの熱力学的安定性を害し、また室温より高い温度でのフィブリル化に対する感受性を悪化させる。従って、これらの製品の安全性、有効性、及び実体面での利便性は、吸収加速と分解加速との間のトレードオフにより制限されてきた。
【０００６】
フィブリル化は、糖尿病治療のためのインスリン及びインスリン類似体の製造、貯蔵、並びに使用における深刻な懸念点であり、より高い温度、より低いｐＨ、攪拌、または、尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、もしくは疎水性表面の存在に伴って増強される。現在の米国薬剤規定は、１％またはそれより高いレベルでフィブリル化が起こる場合はインスリンが処分されることを要求する。フィブリル化はより高い温度で亢進するため、糖尿病を有する患者は、使用前はインスリンを最適に冷蔵保存しなければならない。インスリンまたはインスリン類似体のフィブリル化は、外部インスリンポンプを利用しているそのような患者にとっては格別な懸念点となりうる。外部インスリンポンプでは、一定間隔で少量のインスリンまたはインスリン類似体が患者の体内へと注射される。そのような使用法においては、インスリンまたはインスリン類似体はポンプ装置内では冷蔵保存されず、インスリンのフィブリル化は体内にインスリンまたはインスリン類似体を注射するのに用いられるカテーテルの遮断をもたらすかもしれず、潜在的にはその結果、血液グルコースレベルの予測不能な変動または危険な高血糖症さえも起こしうる。少なくとも１つの最近の報告が、インスリンＬｉｓｐｒｏ（ＫＰ−インスリン、Ｂ２８及びＢ２９残基が野生型ヒトインスリン中のその位置と比較して置き換えられている類似体、商標Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））は、線維化及びその結果生じるインスリンポンプのカテーテルの閉塞に特に敏感であるかもしれないと指摘している。インスリンは、２５℃より高い温度において１０℃上昇する毎に１０倍またはそれより大きい分解速度の上昇を示す。従って、指針は、<３０℃の温度でのかつ好ましくは冷蔵での貯蔵を要求している。
【０００７】
タンパク質フィブリル化の本理論は、フィブリル化の仕組みは部分的に折り畳まれた中間状態を介して進行することを仮定している。その中間状態は次々に凝集し、アミロイド形成核を形成する。本理論においては、天然状態を安定化させるアミノ酸置換が、部分的に折り畳まれた中間状態を安定化させるまたはさせないかもしれず、また天然状態と中間状態の間の自由エネルギー障壁を増加（または減少）させるまたはさせないかもしれない可能性がある。従って、本理論は、インスリン分子中の与えられたアミノ酸置換がフィブリル化の危険性を増大または減少させる傾向は、非常に予測不能であることを示している。
【０００８】
アミロイド形成核の形成における初期段階は、天然型インスリン表面上に露出した、あるいは部分的なタンパク質折り畳みゆえに一過性に露出した非極性側鎖間の、非天然型疎水性相互作用を伴いうる。Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３（ＰｈｅＢ１−ＶａｌＢ２−ＡｓｎＢ３）残基は、野生型インスリンの結晶構造において顕著な露出を、またその配置において相当な変動性を示す（図２Ａ）。１Ｈ−ＮＭＲ共鳴線幅、１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフト、及び長距離残基間核オーバーハウザー効果（ＮＯＥｓ）の欠乏により示されるように、溶液中の工学的操作されたインスリン単量体のＮＭＲ実験において、Ｂ１−Ｂ３残基はまた秩序度がより低くもある（図２Ｂ）。哺乳類インスリン配列間でこれらの残基が保存されているにも関わらず、合成類似体の研究は、インスリン受容体への結合を顕著に低下させることなく、また生物学的活性を顕著に低下させることなく、Ｂ鎖から残基Ｂ１−Ｂ５が除去されうることを示した。しかしながら、野生型及び変異型プロインスリンの折り畳み及び分泌の研究は、Ｂ１−Ｂ５残基が、単独でまたは組み合わせで、小胞体中でのジスルフィド対形成の効率及び忠実性に貢献することを示した（Ｌｉｕ，  Ｍ．，Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｑ．，Ｊｉａ，  Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｓａｉｔｈ，Ｓ．Ｅ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，Ａｒｖａｎ，  Ｐ．&Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２０１０））。Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｉｄｄｅｎ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  ｆｏｌｄａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｈｉｎｇｅｓ  ｏｎ  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｒｍ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，３０９８９−３１００１）。特に、位置Ｂ１における様々な極性または荷電アミノ酸置換は、ヒト培養細胞株においてプロインスリンの細胞折り畳み及び分泌を損なうことが分かった。従って残基ＰｈｅＢ１は、折り畳み過程において「疎水性アンカー」とみなされうる。Ｂ鎖のＢ１−Ｂ５アームは、膵β細胞内の重要な折り畳み要素を意味する。
【０００９】
従って、迅速な六量体解体を維持しつつ、また対応する野生型インスリンの活性の少なくとも一部を示しかつその化学的及び／または物理的安定性の少なくとも一部を維持しつつ、室温より高温でのフィブリル化に対するより高い耐性を示すインスリン類似体への需要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、迅速な六量体解体及びゆえに皮下注射後の吸収の加速を維持しながら、室温より高温でのフィブリル化に対する強化された耐性を提供するインスリン類似体を提供することは、本発明の一態様である。本発明は、速効性インスリン類似体についてのこれまでの限界、すなわちそれらのインスリン類似体が野生型インスリンと比べフィブリル化により敏感であるということを扱う。特許請求の範囲に係る発明は、製造過程でジスルフィド対形成及びタンパク質折り畳みが一度実現してしまえば、Ｂ１−Ｂ３残基がなくても構わないという性質を活用する。Ｂ１−Ｂ３残基の除去は、野生型ＡｓｎＢ３残基に代わって位置Ｂ３においてＬｙｓまたはＡｒｇを含有する前駆体に対するトリプシンの作用により実現する。そのような前駆体の例は、製品Ａｐｉｄｒａ（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）の有効成分である、類似体インスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅである。ＰｈｅＢ１−ＶａｌＢ２−ＡｓｎＢ３残基を欠乏する類似体は、ゆえに、短縮型Ｂ鎖（２７残基）を含有する。短縮型Ｂ鎖は、インスリン受容体への天然型様の結合を可能にしつつ、室温より高温でのフィブリル化に対する耐性を付与する。
【００１１】
本発明の本質は、Ｂ１−Ｂ３残基のＮ末端除去によるＢ鎖の短縮化が、室温より高温でのフィブリル化からタンパク質を保護し、また新しいトリプシン感受性部位を導入するようにＰｈｅＢ１、ＶａｌＢ２、及び位置Ｂ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇのいずれかの残基を含有する前駆体ポリペプチドの効率良い折り畳み及びジスルフィド対形成後に実現されうることである。トリプシン産物ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリン類似体は、代わりに、Ｃ末端Ｂ２３−Ｂ３０区域中に１つまたはそれより多い置換または非標準型改変を含有するインスリン類似体のトリプシン媒介性半合成のための前駆体を提供する。重要なことには、トリプシン媒介性半合成は、Ｂ２３−Ｂ３０残基のＣ末端欠損を「修復」するが、Ｂ１−Ｂ３区域は復元しない。このステップの順序（つまり、トリプシン消化の前に折り畳み）は、さもなければジスルフィド対形成前のＢ１−Ｂ３残基除去により導入されたはずの折り畳み欠陥を回避する。出発物質は、位置Ｂ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇを含有する成熟インスリン類似体、位置Ｂ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇかつ位置Ａ８において追加の置換を含有するインスリン類似体、位置Ｂ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇを含有するプロインスリン類似体、位置Ｂ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇかつ位置Ａ８において追加の置換を含有するプロインスリン類似体、または位置Ｂ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇを含有しかつその折り畳み後のトリプシン消化がｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−インスリン類似体を提供する半合成を受けることができるｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリン類似体を生じる対応する単鎖生合成前駆体であってもよい。
【００１２】
一般に、本発明は、Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏する短縮型Ｂ鎖ポリペプチド、並びにＡーもしくはＢ鎖中に１つまたはそれより多い追加の置換を有する、インスリン類似体を提供する。別に規定されない限り、アミノ酸の位置は、野生型インスリンとの比較での位置であると理解されるべきである。従って、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−インスリン類似体においては、例えばＢ鎖中の７番目のアミノ酸は位置Ｂ１０にあるとして表わされる。１つの実施例においては、短縮型Ｂ鎖ポリペプチドは、位置Ｂ２９においてオルニチン（Ｏｒｎ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）を組み込む。別の実施形態においては、短縮型Ｂ鎖ポリペプチドは、位置Ｂ２８においてリシン（Ｌｙｓ）、及び位置Ｂ２９においてプロリン（Ｐｒｏ）を含有する。また別の実施形態においては、短縮型Ｂ鎖ポリペプチドは、位置Ｂ２８においてアスパラギン酸（Ａｓｐ）、及び位置Ｂ２９においてＮｌｅまたはＯｒｎのいずれか含有する。さらに別の実施形態においては、インスリン類似体は、ヒトインスリンの類似体などの哺乳類インスリン類似体である。実施形態の特定の一組においては、Ｂ鎖ポリペプチドは、トリプシン処理前に配列ＩＤ番号：４のアミノ酸配列を有し、ポリペプチドは３つまたはそれより少ない追加のアミノ酸置換を有する。実施形態の別の特定の一組においては、トリプシンを用いた消化及び半合成後、生成するポリペプチドは配列ＩＤ番号：５〜７から構成される群から選択される配列を有しうる。実施形態のさらに別の特定の一組においては、それは単鎖インスリン類似体と呼ばれ、Ｂ鎖ポリペプチドは配列ＩＤ番号：９に提供されるアミノ酸配列を有する長さ５１−８６の長い単一ポリペプチドの一部であり、ポリペプチドは３つまたはそれより少ない追加のアミノ酸置換を有する。
【００１３】
さらにもしくは代わりに、インスリン類似体は、Ｂ鎖の位置２４において非標準型アミノ酸置換を含有しうる。１つの特定の実施例においては、Ｂ２４における非標準型アミノ酸はシクロヘキサニルアラニン（Ｃｈａ）である。また別の特定の実施例においては、Ｂ２４における非標準型アミノ酸はハロゲン化芳香環を含有する。例えば、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２−Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４−Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅなどであり、ここで「２」はＰｈｅの芳香環のオルト位における単一のハロゲン置換を意味し、「４」はＰｈｅの芳香環のパラ位を意味する。さらにもしくは代わりに、インスリン類似体は位置Ａ８においてアミノ酸置換を含有してもよく、これにより野生型インスリンにおけるβ−分岐側鎖（ＴｈｒＡ８）が非β−分岐極性または荷電側鎖により置換される。Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓなどである。
【００１４】
Ｂ２４もしくはＢ２９またはその両方において非標準型アミノ酸を組み込むＢ鎖ポリペプチドを有するインスリン類似体をコードする、核酸もまた提供される。１つの実施例においては、非標準型アミノ酸は、核酸配列ＴＡＧなどの終止コドンによりコードされる。発現ベクターはそのような核酸を有してもよく、また宿主細胞はそのような発現ベクターを含有してもよい。
【００１５】
位置Ａ３においてリシン（Ｌｙｓ）もしくはアルギニン（Ａｒｇ）置換を組み込むＡ鎖ポリペプチド、及び位置Ｂ２９においてはグルタミン酸置換もしくは位置Ａ８においてはＴｈｒ以外のアミノ酸を生じる置換などの他の置換を任意で有する、インスリン類似体をコードする、核酸もまた提供される。発現ベクターはそのような核酸を有してもよく、また宿主細胞はそのような発現ベクターを含有してもよい。
【００１６】
本発明はまた、患者を治療する方法も提供する。その方法は、生理的に有効な量のインスリン類似体または生理的に許容可能なその塩を患者に投与する工程を有し、そのインスリン類似体または生理的に許容可能なその塩は、上記で開示のように、Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏する短縮型Ｂ鎖ポリペプチド、並びにＢ２４、Ｂ２８、Ｂ２９、またはＡ８部位において１つまたはそれより多い追加の置換を含有する。１つの実施形態においては、患者に投与されるインスリン類似体中の短縮型Ｂ鎖は、位置Ｂ２９においてＧｌｕを含有する。さらに別の実施形態においては、インスリン類似体は、ヒトインスリンの類似体などの哺乳類インスリン類似体である。実施形態の特定の一組においては、Ｂ鎖ポリペプチドは配列ＩＤ番号：５〜７から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有し、ポリペプチドは３つまたはそれより少ない追加のアミノ酸置換を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、Ａ及びＢ鎖、並びに、隣接する二塩基性切断部位（黒円）及びＣ−ペプチド（白円）と共に示された連結領域を含む、ヒトプロインスリンの配列（配列ＩＤ番号：１）の概略図である。    図１Ｂは、インスリン様部分及び無秩序な連結ペプチド（破線）から構成される、プロインスリンの構造モデルである。    図１Ｃは、Ｂ鎖中のＢ２４残基の位置を示す、ヒトインスリンの配列（配列ＩＤ番号：２及び３）の概略図である。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、インスリンＢ鎖のＮ末端アームの潜在的な立体構造の可変性を示す、分子モデルを提供する。Ｂ１−Ｂ６残基が、結晶学的Ｔ−状態のプロトマー（図２Ａ）、及びＮＭＲ由来溶液構造の集合（図２Ｂ）において示される。それぞれの場合においてアームは、１つの代表的な構造の空間充填モデルに対して棒で示される。グレースケールのコードが、図２Ａの右上部に示される。図２Ａにおける構造は、ＰＤＢ登録４ＩＮＳ、１ＡＰＨ、１ＢＰＨ、１ＣＰＨ、１ＤＰＨ、１Ｇ７Ａ、１ＴＲＺ、１ＴＹＬ、１ＴＹＭ、及び１ＺＮＩから得られた。図２Ｂにおける構造は、ＰＤＢ登録１ＴＹＬ及び１Ｇ７Ａから得られた。
【図３】図３は、インスリン類似体の受容体結合実験の結果を示す、一組のグラフである。図２Ａにおいては、インスリン受容体のＢアイソフォーム（ＩＲ−Ｂ）に対する相対活性が、受容体に結合した１２５Ｉ−標識ヒトインスリンが、増加する濃度のヒトインスリン（■）またはその類似体であるＯｒｎＢ２９−インスリン（▲）及びｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ＯｒｎＢ２９−インスリン（▼）により置き換えられる、競合的結合測定法により測定される。図２Ｂにおいては、Ｉ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する相対活性が、受容体に結合した１２５Ｉ−標識ＩＧＦ−Ｉが、増加する濃度のヒトインスリン（■）またはその類似体であるＯｒｎＢ２９−インスリン（▲）及びｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ＯｒｎＢ２９−インスリン（▼）により置き換えられる、競合的結合測定法により測定される。
【図４】図４は、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］Ａｐｉｄｒａ（登録商標）インスリン（ＧｌｕＢ２９、■）対完全長のＡｐｉｄｒａ（登録商標）インスリン（ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９）（◆）の用量反応を示すグラフである。グラフは、ラット３００ｇあたりのナノモルで表わされるインスリン用量に対する、投与後初めの１時間における血糖レベルの減少速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、室温より高温でのフィブリル化に対する耐性を提供するインスリン類似体を対象とする。その類似体は、迅速な六量体解体を保持し、かつ対応する非改変型インスリンまたはインスリン類似体の生物学的活性の少なくとも一部を維持する。
【００１９】
本発明は、フィブリル化開始前の時間差に関するインスリン類似体の特性を向上させるための、前駆体分子の折り畳み及びジスルフィド対形成後における、残基Ｂ１−Ｂ３の除去に関する。１つの事例においては、残基Ｂ１−Ｂ３の除去は、Ｂ２３−Ｂ３０区域における、とくに位置Ｂ２４、Ｂ２８、及び／またはＢ２９における、１つまたはそれより多いアミノ酸置換または改変と組み合わせられる。
【００２０】
１つの実施形態においては、本発明は、シクロヘキサニルアラニン（Ｃｈａ）、または芳香環の４位においてハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒ）を含有するフェニルアラニン誘導体などの非標準型アミノ酸による位置Ｂ２４におけるフェニルアラニン置換によって、より迅速な六量体解体を提供する、インスリン類似体を提供する。別の特定の実施形態においては、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］類似体は、  芳香環の２位においてハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒ）を含有する誘導体によるＰｈｅＢ２４の置換により、熱力学的安定性に関して強化される。さらに別の実施形態においては、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］類似体は、より迅速な六量体の解体速度を付与するために、位置Ｂ２８及び／またはＢ２９において置換を含有する。当技術分野で既知の例は、（Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標）における）ＡｓｐＢ２８、（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）における）ＬｙｓＢ２８−ＰｒｏＢ２９、及び（Ａｐｉｄｒａ（登録商標）における）ＧｌｕＢ２９である。ゆえに本発明は、これらの類似体のｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］型を提供する。しかしながら、本発明はヒトインスリン及びその類似体に限定されない。これらの置換は、非限定的な例として、ブタ、ウシ、ウマ、及びイヌのインスリンなどの、動物インスリンにおいてもなされることもまた想定される。さらにもしくは代わりに、本発明のインスリン類似体は、野生型インスリンにおいてはリシン（Ｌｙｓ）であるＢ鎖の位置２９において非標準型アミノ酸置換を含有しうる。１つの特定の実施例においては、Ｂ２９における非標準型アミノ酸はオルニチン（Ｏｒｎ）である。Ｂ２９における非標準型アミノ酸は、ノルロイシン（Ｎｌｅ）であってもまたよい。Ｂ１−Ｂ３残基の除去は、単独でまたは位置Ｂ２４、Ｂ２８、もしくはＢ２９における上記改変との組み合わせで、位置Ａ８における非β分岐側鎖によるＡ鎖置換と組み合わせられてもまたよい。
【００２１】
ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ＯｒｎＢ２９−インスリンが、インスリン受容体への結合を損ねることなく、野生型インスリンまたはＯｒｎＢ２９−インスリンと比較して、フィブリル化からの保護を付与することもまた発見された。
【００２２】
さらに、ヒト及び動物インスリン間の類似性、並びに糖尿病を有するヒト患者における動物インスリンの過去の使用をふまえると、インスリン配列中のマイナーな改変、とくに「保存的」とみなされる置換が導入されうることもまた想定される。例えば、本発明から逸脱することなく、類似する側鎖を有するアミノ酸群内で追加のアミノ酸置換がなされうる。これらは、中性疎水性アミノ酸である、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、及びメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、及びアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群内でそれぞれお互いと置換されうる。塩基性アミノ酸は、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、及びヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、及びグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別に特筆されない限り、または文脈から明らかである箇所では、本明細書で言及されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるとみなされるべきである。標準型アミノ酸は、同じ化学的分類に属する非標準型アミノ酸により置換されてもまたよい。非制限的例として、塩基性側鎖Ｌｙｓは、より短い側鎖長の塩基性アミノ酸（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）により置き換えられてもよい。Ｌｙｓは中性の脂肪族同配体であるノルロイシン（Ｎｌｅ）により置き換えられてもまた良く、それが今度はより短い脂肪族側鎖を含有する類似体（アミノ酪酸またはアミノプロピオン酸）により置換されてもよい。
【００２３】
１つの実施例においては、本発明のインスリン類似体は、本発明のＢ１−Ｂ３残基の除去の他に、３つまたはそれより少ない保存的置換を含有する。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において用いられるように、インスリンまたはインスリン類似体中の様々なアミノ酸は、当該アミノ酸残基、続いて任意で上付き文字で表されるアミノ酸の位置により記述されうる。当該アミノ酸の位置は、置換が位置するインスリンのＡまたはＢ鎖を含む。ゆえに、ＰｈｅＢ１は野生型インスリンのＢ鎖の１番目のアミノ酸としてのフェニルアラニンを意味し、ＶａｌＢ２は、野生型インスリンのＢ鎖の２番目のアミノ酸を意味し、そしてＣ末端位置におけるＴｈｒＢ３０まで同様である。Ｂ１−Ｂ３残基の除去（ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］と呼ばれる）の際は、ＧｌｕＢ４がｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］Ｂ鎖の１番目のアミノ酸となり、ＰｈｅＢ２４がｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］Ｂ鎖の２１番目のアミノ酸となり、以下同様となるように、この番号付けが維持される。
【００２５】
理論により拘束されることを望まないが、本発明は、Ｂ１−Ｂ３残基がアミロイド形成核の形成メカニズムにおける非天然型分子間相互作用に携わる非極性アームを定義し、ゆえにその除去は室温より高温でのフィブリル化開始を遅らせるまたは防止することを想定する。塩基性側鎖（ＬｙｓまたはＡｒｇ）による野生型Ｂ３残基（Ｇｌｕ）の置換は、前駆インスリン類似体のＢ鎖中に、または前駆単鎖ポリペプチドのＢ−ドメイン中に、新規のトリプシン感受性部位を付与する。本発明は、前駆ポリペプチドの折り畳み及び天然型ジスルフィド対形成が完遂された後のみにＢ１−Ｂ３残基のトリプシン性除去が起こると特定するため、これら折り畳み及び対形成の工程におけるＢ１−Ｂ３残基の重要な役割は保持される。さらに、このアームは受容体結合または生物学的活性には必要とされないため、皮下注射によるまたは外部もしくは内部ポンプを用いる継続的注入による糖尿病の治療法として意図される成熟類似体産物からは除去されてもよい。
【００２６】
我々は、Ｂ１−Ｂ３区域がトリプシン消化によりインスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅ（［ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９］−インスリン、Ａｐｉｄｒａ（登録商標）の有効成分）から容易に除去され、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリンを生成しうることを発見した。後者の種は、過剰量のオクタペプチドＧＦＦＹＴＰＯＴ（配列ＩＤ番号：１０）の存在下でのトリプシン媒介性半合成による、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ＯｒｎＢ２９−インスリンの半合成のための出発物質を提供することが分かった。Ｏはオルニチン（Ｏｒｎ）を表わす。存在するいくつかのインスリン類似体のいずれにおいても、本発明のＮ末端Ｂ鎖欠損がなされうることもまた想定される。例えば、Ｂ１−Ｂ３区域が、インスリンｌｉｓｐｒｏ（［ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９］−インスリン、本明細書ではＫＰ−インスリンと略される）、インスリンａｓｐａｒｔ（ＡｓｐＢ２８−インスリン）から、これらの製品の類似体またはＢ３においてＬｙｓもしくはＡｒｇを含有する対応する単鎖前駆体を介して、除去されうる。これらの類似体は米国特許第５，１４９，７７７号、及び第５，４７４，９７８号において開示される。これらの類似体はそれぞれ、速効性インスリンとして既知である。
【００２７】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列が、比較目的で配列ＩＤ番号：１として提供される。
【００２８】
配列ＩＤ番号：１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：２として提供される。
【００２９】
配列ＩＤ番号：２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：３として提供される。
【００３０】
配列ＩＤ番号：３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
ヒトインスリンの前駆Ｂ鎖のアミノ酸配列は、位置Ｂ３においてリシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）、及び位置Ｂ２９においては任意でグルタミン酸（Ｇｌｕ）の置換によって、改変されうる。そのような配列の例が、配列ＩＤ番号：４として提供される。
【００３１】
配列ＩＤ番号：４
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１はＡｒｇまたはＬｙｓ。Ｘａａ２はＬｙｓまたはＧｌｕ。］
位置Ｂ３においてＡｒｇまたはＬｙｓを含有する前駆体類似体または前駆単鎖インスリン類似体の折り畳み及びトリプシン消化の後、並びに改変型オクタペプチドを用いたトリプシン媒介性半合成の後、生じるｄｅｓ−（Ｂ１−Ｂ３）改変は、配列ＩＤ番号：５〜７に提供されるように、Ｂ２４などの他の位置における非標準型置換と任意で組み合わされてもよい。
【００３２】
配列ＩＤ番号：５
Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ３−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１はＰｈｅ、Ｃｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。Ｘａａ２はＧｌｕ、Ｌｙｓ、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、ノルロイシン、アミノ酪酸、またはアミノプロピオン酸。Ｘａａ３はＨｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、またはＧｌｕ。］
【００３３】
配列ＩＤ番号：６
Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ３−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１はＰｈｅ、Ｃｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。Ｘａａ２はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＶａｌ。Ｘａａ３はＨｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、またはＧｌｕ。］
【００３４】
配列ＩＤ番号：７
Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ２−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
［Ｘａａ１はＰｈｅ、Ｃｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。Ｘａａ２はＨｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、またはＧｌｕ。］
配列ＩＤ番号：５〜７により特定された変異型Ｂ鎖は、配列ＩＤ番号：８に示される、位置Ａ８における置換を任意で含有するＡ鎖と組み合わせられてもよい。
【００３５】
配列ＩＤ番号：８（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
［Ｘａａ４はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＴｈｒ。］
同時係属中の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００３２０及び号及び米国出願第１２／１６０，１８７号により十分に開示されるように、Ｂ１−Ｂ３残基の欠損は、Ａ４、Ａ８、及び／またはＢ１残基においてＨｉｓ置換を含有するヒトインスリンの類似体との関連においても、また実行されうる。これらの出願の開示内容は、本参照により本明細書に組み込まれる。例えば、位置Ｂ３におけるＡｒｇまたはＬｙｓのトリプシン感受性置換は、配列ＩＤ番号：９により表わされるアミノ酸配列を有する単鎖インスリン類似体またはプロインスリン類似体中に、ＨｉｓＡ８及び／またはＨｉｓＢ１置換とともに存在しうる。
【００３６】
配列ＩＤ番号：９
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ６−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
配列中、Ｘａａ１はＡｒｇまたはＬｙｓ。配列中、Ｘａａ２はＰｈｅ、Ｃｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。配列中、Ｘａａ３はＰｒｏ、Ｌｙｓ、またはＡｓｐ。配列中、Ｘａａ４はＬｙｓまたはＰｒｏ。配列中、Ｘａａ６はＨｉｓまたはＧｌｕ。配列中、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒ。配列中、Ｘａａ５は、０−３４のあらゆるアミノ酸であり、あるいは、Ｃ末端残基がＴｈｒとなるようにアミノ酸鎖の中断である。また、配列中、Ｘａａ６はＧｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＬｙｓである。
【００３７】
トリプシン媒介性半合成は、配列ＩＤ番号：１０〜１５の合成オクタペプチドを利用する。それらは、完全なインスリンの重要な受容体結合決定因子を含有し、トリプシン消化部位を含有しない特性を共有する。
【００３８】
配列ＩＤ番号：１０
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｔｈｒ
［配列中、Ｏｒｎはオルニチンを表す］
【００３９】
配列ＩＤ番号：１１
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
【００４０】
配列ＩＤ番号：１２
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
【００４１】
配列ＩＤ番号：１３
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
［配列中、Ｘａａ１はＣｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。］
【００４２】
配列ＩＤ番号：１４
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｔｈｒ
［配列中、Ｘａａ１はＣｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。］
【００４３】
配列ＩＤ番号：１５
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
［配列中、Ｘａａ１はＣｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。］
【００４４】
配列ＩＤ番号：１６
Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ
［配列中、Ｘａａ１はＣｈａ、ペンタ−フルオロ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、２−Ｃｌ−Ｐｈｅ、２−Ｂｒ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、または４−Ｂｒ−Ｐｈｅ。また配列中、Ｘａａ１は、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、ノルロイシン、アミノ酪酸、またはアミノプロピオン酸。］
【００４５】
Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏するインスリンの類似体は、インスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅ（配列ＩＤ番号：２及び配列ＩＤ番号：４、ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９）を出発物質として用いて調製された。この類似体の完全なトリプシン消化はｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリンを生成し、これは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。野生型インスリンの３つの天然型ジスルフィド架橋を含有するこの断片から、改変Ｂ２３−Ｂ３０ペプチド区域がトリプシン触媒性半合成により接合され、また高速液クロマトグラフィーにより精製された（Ｍｉｒｍｉｒａ，  Ｒ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔａｇｅｒ，  Ｈ．Ｓ．，  １９８９．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  ６３４９−６３５４．）。本プロトコルは、（ｉ）（Ｎ）−ＧＦＦＹＴＰＯＴまたは（Ｎ）−ＧＦＦＹＴＰＥＴ残基（置換は下線、それぞれ配列ＩＤ番号：１０及び１１）を表わす合成オクタペプチド、及び（ｉｉ）短縮型類似体ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−オクタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリン、またはＧｌｕＡ８−インスリン類似体の場合はＧｌｕＡ８−ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−オクタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリンを用いる。トリプシンは、Ｏｒｎの後は切断しない。簡潔には、ｄｅｓ−オクタペプチド（１５ｍｇ）及びオクタペプチド（１５ｍｇ）が、１０ｍＭ酢酸カルシウム及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍ酢酸トリス（ｐＨ８）の混合物（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、０．４ｍＬ）に溶解された。最終ｐＨ値は、１０μＬのＮ−メチルモルホリンを用いて７．０に調節された。その溶液は１２℃にまで冷却され、１．５ｍｇのＴＰＣＫ−トリプシンが加えられ１２℃で２日間放置された。２４時間後、１．５ｍｇのさらなるトリプシンが加えられた。反応は、０．１％トリフルオロ酢酸で酸性化され、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）で精製された。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いた質量分析は、それぞれの事例において予想された値を与えた（表示は無し）。固相合成用の概ねのプロトコルは、開示されている通りである（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：  ５０２０−５０３１）。９−フルオレン−９−イル−メトキシ−カルボニル（Ｆ−ｍｏｃ）で保護されたフェニルアラニン類似体は、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，  ＩＬ）から購入された。
【００４６】
上記のプロトコルは、位置Ｂ２９においてオルニチンまたはグルタミン酸を含有する、ヒトインスリンのｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］類似体を調整するためにもまた用いられた。これらの類似体の調製方法は、位置２８におけるプロリンを維持しつつ、Ｂ鎖のＣ末端オクタペプチド内に普通は存在するトリプシン感受性部位（つまり、ＬｙｓＢ２９とＴｈｒＢ３０との間）を除去するために、位置２９において非標準型アミノ酸置換を活用する。ＰｒｏＢ２８はインスリン六量体内の二量体境界面の安定性に貢献し、このため調製の本方法は、厄介な側鎖保護の必要なくその他の改変が簡便に組み込まれうる野生型インスリンの近同配体モデルを提供する。
【００４７】
円二色性（ＣＤ）スペクトルは、４℃及び／または２５℃においてＡｖｉｖ分光偏光計を用いて得られた（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：  １５４２９−１５４４０）。試料は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中に約２５μＭのＤＫＰ−インスリンまたは類似体を含有した。試料は、２５℃におけるグアニジン誘発性の変性実験のために、５μＭまで希釈された。変性の自由エネルギーを取り出すため、Ｓｏｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１７：  ３９３−４０９により開示されているように、変性の変遷は、非線形最小二乗法により二状態モデルに当てはめられた。簡潔には、ｘが変性剤の濃度を表わすとして、ＣＤデータΘ（ｘ）が
【数１】
2016506927.tif 000003
に従い非線形最小二乗法プログラムにより当てはめられた。式中、ｘはグアニジンの濃度であり、ΘＡ及びΘＢは天然型及び変性型状態におけるベースライン値である。ベースラインは、前−及び後−転移線、ΘＡ（ｘ）＝ΘＡＨ２Ｏ＋ｍＡｘ及びΘＢ（ｘ）＝ΘＢＨ２Ｏ＋ｍＢｘに接近した。変異型変性転移を当てはめて得られたｍ値は、野生型変性曲線を当てはめて得られたｍ値よりも低い。完全に変性した状態からＣＤシグナルを測定することが不可能であることからこの差及びΔＧｕの見かけの変化が生じるのかを調べるため、より高濃度のグアニジンにおけるプラトーＣＤ値にデータが外挿されたシミュレーションが行われた。本質的には同一のΔＧｕ及びｍの推定値が得られた。
【００４８】
相対活性は、１２５Ｉ−ヒトインスリンを用いた競合的置換測定法より測定される、野生型ヒトインスリンに対する類似体のホルモン−受容体解離定数の比として定義される。マイクロタイターストリッププレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）は、４℃においてＡＵ５  ＩｇＧ（４０ｍｇ／リン酸緩衝生理食塩水中ｍｌが１００μｌ／ウェル）とともに一晩放置された。結合データは、二点逐次モデルにより解析された。データは、非特異的結合（ヒトインスリン１μＭの存在下での、膜に結合したままの放射能量）について補正がなされた。すべての分析において、競合するリガンドの非存在下で結合したトレーサーの百分率は、リガンド枯渇の人為的結果を回避するべく１５％より低かった。代表的なデータは、図３Ａに提供されている。Ｉ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を用いて行われた対応する分析は、図３Ｂに示される。
【００４９】
ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］類似体の遠紫外円二色性（ＣＤ）スペクトルは、親類似体のそれに類似する。２５℃における変性の自由エネルギー（ΔＧｕ）は、二状態モデルに基づき、変性剤濃度ゼロに外挿して推定された。時間差は、無亜鉛のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で３０℃において穏やかな攪拌とともに起こる、タンパク質フィブリル化の開始に必要とされる時間（日数）を表わす。
【００５０】
野生型インスリン及びＯｒｎＢ２９−インスリンのベースライン熱力学的安定性は、２５℃での変性の二状態モデルから推測されるように、区別不可能である。それぞれ、３．５±０．１ｋｃａｌ／モル及び３．５±０．１ｋｃａｌ／モルである。ＣＤ検出性グアニジン変性実験は、ＯｒｎＢ２９−インスリンでは、Ｂ１−Ｂ３残基の欠損は熱力学的安定性の小さな減少と関連することを示す。ΔＧｕ３．２±０．１ｋｃａｌ／モルで、ΔΔＧｕ０．３±０．２ｋｃａｌ／モルを示唆する。けれども、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］類似体の物理的安定性は、穏やかな攪拌下３０℃におけるｐＨ７．４の３００μｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での温置の間にトリプリケートで評価すると、野生型インスリンまたはＯｒｎＢ２９−インスリンのそれよりも大きいことが分かった。試料は、１０日間、または沈殿の兆候もしくはガラス瓶の着霜が観察されるまで、観察された。野生型インスリンの３チューブ及びＯｒｎＢ２９−インスリンの３チューブは４日より早く曇ったが、ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ＯｒｎＢ２９−インスリンの３チューブは少なくとも７日は澄んだままだった。ｄｅｓ−［Ｂ１−Ｂ３］−ＧｌｕＢ２９−インスリンと［ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９］−インスリン（Ａｐｉｄｒａ（登録商標）の有効成分）との間のフィブリル化の時間差の似たような比較は、Ｂ１−Ｂ３残基の除去が時間差を少なくとも２倍長くすることを示した。
【００５１】
解離定数（Ｋｄ）は、小さな改変を加えたマイクロタイタープレート抗体捕捉測定法において１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４−インスリン（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋにより好意で提供を受けた）及び精製可溶化インスリン受容体（アイソフォームＢまたはＡ）を用いて、競合的置換測定法により、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ及びＷｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２０９３２−２０９３６）により開示されるように決定された。トランスフェクションされた受容体は、そのＣ末端においてＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）のトリプルリピートによりタグ付けされ、マイクロタイタープレートは抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）によりコーティングされた。競合するリガンドの非存在下で結合したトレーサーの百分率は、リガンド枯渇の人為的結果を回避するべく１５％より低かった。結合データは、解離定数を得るため、異種競合モデルを用いて非線形回帰により解析された（Ｗａｎｇ，  １９９５．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０：  １１１−１１４）。結果は表１に提供される。解離定数は、ナノモル濃度の単位で提供される。興味深いことに、Ｂ１−Ｂ３残基の除去は、受容体結合を少なくとも２倍増強させるようだ。
【００５２】
【表１】
2016506927.tif 000004
【００５３】
図４を参照して、Ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ−インスリン（Ａｐｉｄｒａ（登録商標）、配列ＩＤ番号：２及び４、◆）及びｄｅｓ−［Ｂ１−３］ｇｌｕｌｉｓｉｎｅインスリン（配列ＩＤ番号：２及び５、■）が、ＨＰＬＣにより精製され、粉末へと凍結乾燥され、それからインスリン希釈剤中に溶解された。雄Ｌｅｗｉｓラットに、時刻＝０において、希釈剤１００μｌ中０．８７５、３．５、または８．７５ｍＭのいずれかのｇｌｕｌｉｓｉｎｅまたはｄｅｓ−［Ｂ１−３］ｇｌｕｌｉｓｉｎｅが皮下注射された。高い方の用量は野生型インスリン用量反応曲線のプラトーにあり、低い方の用量は最大初期グルコース消失速度の約４０％に相当する。ネガティブコントロールとしては、希釈剤単独の注射が行われた。各グループにおいて６匹のラットが実験に用いられた。血液は、時刻０から１２０分まで定期的な間隔で、切断された尾の先端から得られた。血糖は、Ｈｙｐｏｇｕａｒｄ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメータを用いて測定された。血糖濃度は減少することが観察された。初期速度または持続期間のいかなる差も統計学的には有意でなかった。
【００５４】
患者を治療する方法は、当技術分野で既知であるまたは本明細書において開示される、短縮型ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］Ｂ鎖を含有するインスリン類似体を投与する工程を有する。天然型ジスルフィド対形成を実現させるための二本鎖または単鎖前駆ポリペプチドの折り畳みに続くそのトリプシン消化により、ｄｅｓ−トリペプチド［Ｂ１−Ｂ３］−ｄｅｓ−ペンタペプチド［Ｂ２３−Ｂ３０］−インスリンが容易に得られうることは、本発明のまた別の態様である。非標準型アミノ酸置換の利用が、無保護のオクタペプチドを用いるトリプシン媒介性半合成による迅速で効率の良いインスリン類似体の調製方法を可能にすることは、本発明のさらに別の態様である。
【００５５】
さらに別の実施例においては、インスリン類似体は外部または埋め込み型インスリンポンプにより投与される。本発明のインスリン類似体は、同時係属中の米国特許出願第１２／４１９，１６９号においてより十分に開示されるＢ鎖のＣ末端とＡ鎖のＮ末端との間のなどのテザーなどの、他の改変を含有してもよい。その出願の開示内容は、本参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
医薬組成物は、そのようなインスリン類似体を有してもよく、任意で亜鉛を含んでもよい。亜鉛イオンは、インスリン類似体の六量体あたり２．２から３．０の間のモル濃度比レベルで、そのような組成物に含まれてもよい。そのような製剤においては、インスリン類似体の濃度は一般に約０．１から約３ｍＭの間であろう。インスリンポンプのリザーバーにおいては、最大３ｍＭの濃度が使用されうる。摂食時インスリン類似体の改変型は、（ａ）Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｎｏｖａｌｉｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｏｖａｌｏｇ（登録商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びヒトでの使用が現在承認されている他の速効性インスリン製剤の「標準」製剤、（ｂ）上記及び他のインスリン類似体の「ＮＰＨ」製剤、並びに（ｃ）そのような製剤の混合物に対して開示されるように製剤化されうる。Ｂ１−Ｂ３残基を欠乏しかつＧｌｕＢ２９を含有するインスリンの類似体は、当技術分野においてはインスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅの製剤に対して既知であるように、亜鉛イオン無しで製剤化されてもまたよい。
【００５７】
賦形剤は、グリセロール、グリシン、アルギニン、Ｔｒｉｓ、他の緩衝液及び塩、並びにフェノール及びメタクレゾールなどの抗微生物性保存剤を含みうる。後者の保存剤は、インスリン六量体の安定性を増大させることが知られている。そのような医薬組成物は、当該患者に生理学的に有効な量の組成物を投与することにより、糖尿病または他の医学的状態を有する患者を治療するのに用いられうる。
【００５８】
位置Ｂ３におけるＡｒｇまたはＬｙｓを位置Ｂ２４における非標準型アミノ酸と共に伴うインスリンの少なくともＢ鎖をコードする配列を含有する、インスリン類似体をコードするポリペプチドをコードする配列を有する核酸もまた想定される。後者は、位置Ｂ２４における終止コドン（アンバーコドンＴＡＧなど）の導入、それと共に、サプレッサーｔＲＮＡ（アンバーコドンが使用される場合のアンバーサプレッサー）及び対応するｔＲＮＡ合成酵素により、実現しうる。以前に開示されたように、終止コドンに応答してポリペプチド中に非標準型アミノ酸を組み込むのである（Ｆｕｒｔｅｒ，１９９８．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：４１９−４２６、Ｘｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６：２２７−２３８）。具体的な配列は、核酸配列が導入されることになる種の、好んで用いられるコドン使用法に依存しうる。核酸はまた、野生型インスリンの他の改変をコードしてもよい。核酸配列は、ポリペプチドまたは改変プロインスリン類似体の至る所に無関係の置換または伸長を含有する、改変型ＡまたはＢ鎖配列をコードしてもよい。核酸はまた発現ベクターの一部であってもよく、またそのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株のような原核生物宿主細胞などの宿主細胞、あるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ系統もしくは細胞株などの真核生物細胞株に挿入されても良い。
【００５９】
例えば、合成遺伝子は、酵母菌Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ及び他の微生物においてＢ鎖ポリペプチドの発現を指揮するように合成されうることが想定される。位置Ｂ２４においてその位置でシクロヘキサニルアラニンまたはＰｈｅのハロゲン誘導体を組み込むことを目的として終止コドンを用いるＢ鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列は、以下のものまたはその変異型のいずれかでありうる。
【００６０】
（ａ）ヒトで好まれるコドンを用いて
ＴＴＴＧＴＧＸＸＸＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣ
（配列ＩＤ番号：１７）
［配列中、ＸＸＸは、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧもしくはＣＧＣ（Ａｒｇをコードする）、またはＡＡＧもしくはＡＡＡ（Ｌｙｓをコードする）。］
（ｂ）Ｐｉｃｈｉａで好まれるコドンを用いて
ＴＴＴＧＴＴＸＸＸＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＴ
（配列ＩＤ番号：１８）
［配列中、ＸＸＸは、ＡＧＡ、ＣＧＵ、もしくはＡＧＧ（Ａｒｇをコードする）、またはＡＡＧもしくはＡＡＡ（Ｌｙｓをコードする）。］
同様に、位置Ｂ３においてＡｒｇまたはＬｙｓをコードし、かつ位置Ｂ２４においてその位置でシクロヘキサニルアラニンまたはＰｈｅのハロゲン化誘導体を組み込むことを目的として終止コドンを用いる、ヒトで好まれるコドンを有する完全長のプロインスリンｃＤＮＡは、配列ＩＤ番号：１９の配列を有しうる。
ＴＴＴＧＴＸＸＸＣＣ  ＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧ  ＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣ  ＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧ  ＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴ  ＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧ  ＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴ  ＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣ  ＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣ  ＣＧＣＣＧＧＧＡＧＧ  ＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴ  ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ  ＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣ  ＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧ  ＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡ  ＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣ  ＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣ  ＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧ  ＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡ  ＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴ  ＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡ  ＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡ  ＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧ  ＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴ  ＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡ  Ｇ  （配列ＩＤ番号：１９）
［配列中、ＸＸＸは、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧもしくはＣＧＣ（Ａｒｇをコードする）、またはＡＡＧもしくはＡＡＡ（Ｌｙｓをコードする）。］
【００６１】
同様に、位置Ｂ２４においてその位置でシクロヘキサニルアラニンまたはＰｈｅのハロゲン化誘導体を組み込むことを目的として終止コドンを用い、かつＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓにより好まれるコドンを有する、完全長のヒトプロインスリンｃＤＮＡは、配列ＩＤ番号：２０の配列を有しうる。
ＴＴＴＧＴＴＸＸＸＣ  ＡＡＣＡＴＴＴＧＴＧ  ＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴ  ＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧ  ＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴ  ＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴ  ＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴ  ＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣ  ＴＣＣＡＡＡＧＡＣＴ  ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧ  ＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴ  ＧＣＡＡＧＴＴＧＧＴ  ＣＡＡＧＴＴＧＡＡＴ  ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧ  ＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴ  ＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣ  ＡＡＣＣＡＴＴＧＧＣ  ＴＴＴＧＧＡＡＧＧＴ  ＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡ  ＡＧＡＧＡＧＧＴＡＴ  ＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡ  ＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴ  ＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣ  ＴＴＴＧＴＡＣＣＡＡ  ＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴ  ＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡ  Ａ  （配列ＩＤ番号：２０）
［配列中、ＸＸＸは、ＡＧＡ、ＣＧＵもしくはＡＧＧ（Ａｒｇをコードする）、またはＡＡＧもしくはＡＡＡ（Ｌｙｓをコードする）。］
【００６２】
遺伝コードにおいて同義であるならば、同じポリペプチド配列をコードするこれらの配列の他の変異型も可能である。
【００６３】
前述の開示に基づけば、今となっては、提供されたインスリン類似体が、本明細書で先に述べられた目的を成し遂げるであろうことが明らかであるはずだ。つまり、これらのインスリン類似体は、六量体解体による速効作用を保持し、かつ野生型インスリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持しつつ、フィブリル化に対する増強された耐性を示す。従って、特許請求の範囲に係る発明の範囲内に明らかに入るいかなる変化、またゆえに特定の成分要素の選択は、本明細書で開示及び記述された本発明の真髄から逸れることなく決定されうると理解されるべきである。
【００６４】
本明細書において開示される試験及び分析法が当業者により理解されるであろうことを示すために、以下の文献が引用される。  
Ｆｕｒｔｅｒ，  Ｒ．，  １９９８．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐ−ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：４１９−４２６．
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｖｉｚｉｏｌｉ，  Ｌ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｂｏｍａｎ，  Ｈ．Ｇ．  １９８２．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ａ  （１−３３）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：  ５０２０−５０３１．
Ｍｉｒｍｉｒａ，  Ｒ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔａｇｅｒ，  Ｈ．Ｓ．，  １９８９．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ｂ２４  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６４：  ６３４９−６３５４．
Ｓｏｓｎｉｃｋ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｆａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｔｏｎ，  Ｖ．Ｍ．  ２０００．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ＲＮＡ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１７：  ３９３−４０９．
Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｘ．，  １９９５．  Ａｎ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６０：  １１１−１１４．
Ｗｅｉｓｓ，  Ｍ．Ａ．，  Ｈｕａ，  Ｑ．Ｘ．，  Ｊｉａ，  Ｗ．，  Ｃｈｕ，  Ｙ．Ｃ．，  Ｗａｎｇ，  Ｒ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，  Ｐ．Ｇ．  ２０００．  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  "ｕｎ−ｄｅｓｉｇｎ"：  ｉｎｓｕｌｉｎ‘ｓ  ｉｎｔｒａｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｔｅｔｈｅｒｓ  ａ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  α−ｈｅｌｉｘ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：  １５４２９−１５４４０．
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｌ．  ２００５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２０９３２−２０９３６．
Ｘｉｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．２００５．  Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３６：  ２２７−２３８．
【図１Ａ】
2016506927.tif 000005
【図１Ｂ】
2016506927.tif 000006
【図１Ｃ】
2016506927.tif 000007
【図２Ａ】
2016506927.tif 000008
【図２Ｂ】
2016506927.tif 000009
【図３】
2016506927.tif 000010
【図４】
2016506927.tif 000011
【配列表】
2016506927000001.xml
【国際調査報告】
2016506927.tif 000020
2016506927.tif 000021
2016506927.tif 000022