(57)【要約】本発明は、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する株の培養液上清の作用によるダイズグリシニンの加水分解にて得られる特定のペプチドに関する。これらのペプチド、これらを含有する抽出物、およびこれらを含有する食品は、肥満症および酸化ストレスの治療および／または予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＬ（膵リパーゼ）阻害活性および／またはＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）阻害活性を有するペプチドであり、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−２７７６、および／またはストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−１６３０、および／またはラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−４２７０を用いた、ダイズグリシニンの加水分解により得られる、肥満症および／または酸化ストレスの治療または予防に使用するためのペプチド。
【請求項２】
肥満症および／または酸化ストレスの治療または予防に使用するために、以下の群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、
配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、
配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、
配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、
配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、
配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴ、
配列番号７：ＱＤＥＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、
配列番号８：ＤＥＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、
配列番号９：ＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、
配列番号１０：ＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰＳＱＧ、
配列番号１１：ＧＫＲＥＱＤＥＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、
配列番号１２：ＨＱＱＥＥＥＮＥＧＧＳＩＬＳＧ、
配列番号１３：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴＶＫ、
配列番号１４：ＳＶＩＫＰＰＴＤＥ、
配列番号１５：ＩＫＰＰＴＤＥ、
配列番号１６：ＮＥＧＤＶＬＶ、
配列番号１７：ＹＮＴＧＤＥＰＶＶＡ、
配列番号１８：ＨＧＫＨＥＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、
配列番号１９：ＧＫＨＥＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、
配列番号２０：ＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、
配列番号２１：ＨＥＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、および、
配列番号２２：ＳＧＰＬＶＮＰ
【請求項３】
肥満症および／または酸化ストレスの治療または予防に使用するために、以下の群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、
配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、
配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、
配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、
配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、および、
配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴ
【請求項４】
請求項１から３に記載のペプチドを１つ以上含むことを特徴とする肥満症および／または酸化ストレスの治療に適した食品。
【請求項５】
前記ペプチドは抽出物の形態であることを特徴とする請求項４に記載の食品。
【請求項６】
前記ペプチドは単離された形態であることを特徴とする請求項４に記載の食品。
【請求項７】
前記食品の一人分の合計量当たりの前記ペプチドの量は０．０１〜１ｇであることを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の食品。
【請求項８】
前記ペプチドを少なくとも０．０１ｇ／ｋｇ含むことを特徴とする請求項４から７のいずれか１項に記載の食品。
【請求項９】
請求項１から３に記載のペプチドおよび抽出物の製造のための処理における、ダイズグリシニンの存在下でのストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−２７７６、および／またはストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−１６３０、および／またはラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−４２７０の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する株（菌株）の培養液上清の作用によるダイズグリシニンの加水分解にて得られる特定のペプチドに関連する。
【０００２】
これらのペプチド、これらを含有する抽出物およびこれらを含有する食品は、肥満症および酸化ストレスの治療および／または予防に有用である。
【０００３】
〔背景技術〕
肥満症は、複数の有害な病状の進行につながる現代社会における深刻な疫病である。肥満に関連する障害は、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、いくつかの種類の癌、および他の多くの疾病と言った多数の長期的な合併症を引き起こし得る。食生活およびエネルギー消費における行動修正は、体重の減少をもたらし得るか、エネルギー摂取がエネルギー消費を越えた場合に肥満の原因となるか、は明らかである。これまでに、肥満症に対する潜在的な薬剤治療に多くの焦点が当てられており、特に、新しいアプローチとして、食物中の脂肪の消化を阻害することができる官能性化合物の調査に基づくものがある（Shi Y, Burn P; 2004; Lipid metabolic enzymes: emerging drug targets for the treatment of obesity; Nat. Rev. Drug Discover. 3: 695-710）。
【０００４】
過去数十年間において、脂質代謝に関与する酵素の大多数は、精製され、特徴付けられてきた。トリアシルグリセロールおよびリン脂質の両方の脂肪を消化するリパーゼが、肥満についての主要な関心事である。最も重要なリパーゼの１つは、食事性脂肪の加水分解の５０〜７０％を占める膵リパーゼ（ＰＬ）である（Mukherjee M; 2003; Human digestive and metabolic lipases: a brief review; J. Mol. Catal. Enzym. B 22: 369-376）。抗肥満化合物の調査においては、ＰＬ阻害が最も広く研究されているターゲット機構の１つとなっている（Birari RB, Bhutani KK; 2007; Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential; Drug Discover. Today 12: 879-889）。今日まで、オルリスタットがヨーロッパで認可されている唯一の薬剤であり、末梢機構の作用によって脂肪の吸収を減少させる（Lunder M, Bratkovic, T, Kreft, S and Strukelj, B; 2005; Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display using different elution strategies; Journal of Lipid Research 46: 1512-1516）。
【０００５】
さらに、脂質の消化および吸収における膵ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の重要性を示唆する細胞および動物の研究からの注目に値する証拠がある。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）ファミリーは、膜リン脂質の加水分解を触媒し、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、および他の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を放出する。放出されたＰＵＦＡは、エイコサノイドの種々の前駆体、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンを含む２０の炭素化合物、および炎症反応に応答可能なリポキシンである。ＰＬＡ２およびその下流生成物が、脂肪組織中の重要な生物学的媒介物質として作用し得ることが実証されており、いくつかのサイトカインによるＰＬＡ２の活性化は、この酵素が、それによって肥満における重要な標的となる炎症経路と脂質代謝との間の細胞リンクとして機能する、ことを示唆している（Abbott M, Tang T mad Sul H; 2010; The role of phospholipase A2-derived mediators in obesity; Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 7:3-4）。
【０００６】
一方、脂質代謝の酵素をコードする遺伝子の大部分は、クローン化され、ヒトを含む様々な生物から配列が決定された。系統学的研究により、脂質代謝は、抗肥満薬の研究におけるモデル生物の使用に道を開く非常によく保存された酵母からヒトまでの経路である、ことが明らかになった。この意味で、線虫カエノラブディティスエレガンスは、肥満の研究のための完璧なモデル生物である（Chiang SH, MacDougald OA; 2003; Will fatty worms help cure human obesity; Trends Genet. 19: 523-525）。実際に、干渉ＲＮＡを用いた脂肪減少遺伝子の不活性化についてのＣ．エレガンスでの分析により、体脂肪の減少に関与する３０５の遺伝子と増加した脂肪の蓄積に関連する１１２の遺伝子とが同定され、それらの多くは、哺乳類と相同していた（Ashrafi K et al.; 2003; Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes; Nature 421: 268-272）。また、Ｃ．エレガンスでは、リパーゼは肥満症に重要な因子である。Ｃ．エレガンスのリパーゼの研究グループの最近の報告では、この生物の脂肪代謝が、肥満症と、再生と、老化との間を予期せずリンクしていることを示唆している（Wang MC et al.; 2008; Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans; Science 232: 957-960; Xie T; 2008; Burn fat, live longer; Science 232: 865-866）。
【０００７】
肥満と関連する代謝性疾患との発症を予防する可能性のある天然化合物が研究されている。Gargouriと共同研究者は、いくつかのダイズタンパク質に膵リパーゼ阻害作用があることを報告した（Gragouri et al ; 1984; Studies on the inhibition of pancreatic and microbial lipases by soybean proteins; J Lipid Res., 25:1214-1221）。これらの分子は、酵素における直接的な影響を有しておらず、これらは、酵素と基質との間の接触を避けながら、脂肪エマルジョンを変更する。同様に、何人かの著者等は、リパーゼ活性の阻害特性を有するいくつかの種に存在する基本的なタンパク質を説明している。後に、宮崎等は、米国特許第５，４１１，９５６号において、肥満症の治療においてリパーゼの阻害剤として使用されるいくつかのタンパク質を開示した（Wang and Huang; 1984; Inhibitors of lipase activities in soybean and other oil seeds; Plant Physiol., 76:929-934; Tani et al ; 1994; Purification and characterization of proteinous inhibitor of lipase from wheat flour ; J Agri Food Chem., 42:2382-2385; Tsujita et al; 1996; Studies of the inhibition of pancreatic and carboxylester lipases by protamine; J Lipid Res., 37:1481-1487; Gragouri et al; 1984; Inhibition of pancreatic and microbial lipases by proteins; Biochim. Biophys. Acta., 795:326-331）。
【０００８】
同様に、これらおよび他の著者は、腸脂質吸収が、インビボでの消化リパーゼの阻害作用を引き起こすフェノール性物質（すなわち、クロロゲン酸、（＋）カテキン、エピカテキン、フロリジン、ルチンおよびプロシアニジン（縮合型タンニン））によって減少したことを証明した（Wang et al; 2006; Green tea catechins inhibit pancreatic phospholipase A2 and intestinal absorption of lipids in ovariectomized rats; J Nutr Bioch., 17:492-498), Juhel et al (Juhel et al; 2000; Green tea extract (AR25) inhibits lipolysis of triglycerides in gastric and duodenal medium in vitro; J Nutr.Biochem., 11:45-51), Sugiyama et al (Sugiyama et al; 2007; Oligomeric Procyanidins in Apple Polyphenol Are Main Active Components for Inhibition of Pancreatic Lipase and Triglyceride Absorption; J Agric Food Chem., 55:4604-4609) and Rahul et al (Rahul et al; 2007; Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential “Drug Discovery” today., 12:19-20）。
【０００９】
化学的、生物工学的、またはタンパク質の酵素処理の手法により達成される、肥満症に関連する機能性ペプチドの研究について、関心が益々高まっているが、探究する領域は残されている。そこで、本発明は、乳酸菌株を用いたグリシニンの微生物消化から得られる、肥満および酸化的ストレスの治療に有用な機能性ペプチドに焦点を当てる。
【００１０】
〔発明の概要〕
第１の態様によれば、本発明は、ダイズのグリシニンの加水分解により取得可能な、ＰＬ（膵リパーゼ）および／またはＰＬ２（膵臓のホスホリパーゼ）阻害活性を備えたペプチドに関する。
【００１１】
好ましい態様において、本発明は、ＰＬ（膵リパーゼ）および／またはＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）阻害活性を有するペプチドであり、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−２７７６、および／またはストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−１６３０、および／またはラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−４２７０を用いた、ダイズグリシニンの加水分解により得られた、肥満症および／または酸化ストレスの治療または予防に使用するためのペプチド、に関する。
【００１２】
第２の態様によれば、本発明は、次の群から選択される、ＰＬおよび／またはＰＬ２阻害活性を備えたペプチドに関連する。すなわち、配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴ、配列番号７：ＱＤＥＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、配列番号８：ＤＥＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、配列番号９：ＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、配列番号１０：ＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰＳＱＧ、配列番号１１：ＧＫＲＥＱＤＥＤＥＤＥＤＥＤＫＰＲＰＳＲＰ、配列番号１２：ＨＱＱＥＥＥＮＥＧＧＳＩＬＳＧ、配列番号１３：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴＶＫ、配列番号１４：ＳＶＩＫＰＰＴＤＥ、配列番号１５：ＩＫＰＰＴＤＥ、配列番号１６：ＮＥＧＤＶＬＶ、配列番号１７：ＹＮＴＧＤＥＰＶＶＡ、配列番号１８：ＨＧＫＨＥＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号１９：ＧＫＨＥＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号２０：ＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号２１：ＨＥＤＤＥＤＥＤＥＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、および配列番号２２：ＳＧＰＬＶＮＰから選択される。
【００１３】
好ましい態様において、上記ペプチドは、配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、および配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴからなる群から選択され、単離された形態および／または抽出物の形態のいずれかにて、肥満症並びに酸化ストレスの治療および/または予防のために使用され得る。
【００１４】
第３の態様において、本発明は、ＰＬ（膵リパーゼ）および／またはＰＬＡ２（膵臓のホスホリパーゼ）阻害活性を有する以下の群から選択されるペプチドの少なくとも１つを含む食品に関する。このペプチドは、配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、および配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴからなる群から選択される。または、本発明は、肥満症および酸化ストレスの治療および／または予防に有用な上記したペプチドの少なくとも１つを含む抽出物を含む食品に関する。
【００１５】
第４の態様において、本発明は、ＰＬ（膵リパーゼ）および／またはＰＬＡ２（膵臓のホスホリパーゼ）阻害活性を有する以下の群から選択されるペプチドの少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。このペプチドは、配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、および配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴからなる群から選択される。または、本発明は、肥満症および酸化ストレスの治療および／または予防に有用な上記したペプチドの少なくとも１つを含む抽出物を含む医薬組成物に関する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ラクトバチルス属及びストレプトコッカス属由来のある種の細菌、特に、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−２７７６、および／またはストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−１６３０、および／またはラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−４２７０、の使用に関し、また、上記ペプチドおよび／または、ＰＬ（膵リパーゼ）および／またはＰＬＡ２（膵臓のホスホリパーゼ）の阻害活性を有する以下の群から選択されるペプチド、を含有する抽出物を得るための上記株のプロテアーゼを含む上清または細胞、の使用に関する。このペプチドは、配列番号１：ＥＥＥＧＧＳＶＬＳＧ、配列番号２：ＳＤＮＦＥＹ、配列番号３：ＥＥＤＱＰＲＰＤＨＰＰＱＲＰ、配列番号４：ＳＶＩＫＰＰＴＤ、配列番号５：ＱＧＥＮＥＥＥＤＳＧＡＩＶＴＶＫ、および配列番号６：ＱＧＥＮＥＧＥＤＫＧＡＩＶＴから選択される。
【００１７】
〔図面〕
図１は、ダイズグリシニンから得られ、ＰＬＡ２阻害アッセイから選択された、ペプチド抽出物の、Ｃ．エレガンスでの体脂肪の減少における効果を表している。
【００１８】
図２は、Ｃ．エレガンスにおける異なるペプチド抽出物による急性の酸化ストレスに対する保護効果を表している。
【００１９】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、肥満障害および酸化ストレスの治療および／または予防に使用するために、乳酸菌の異なる株を用いた加水分解によって得られる異なるグリシニンペプチドを提供する。これらのペプチドは、インビトロにて脂肪分解酵素（ＰＬおよびＰＬＡ２）を阻害することができ、カエノラブディティスエレガンスを用いたインビボモデルにて、脂肪の蓄積を減少し、急性酸化ストレスから保護することができる。
【００２０】
ダイズグリシニンから肥満障害に関連する酵素活性を阻害することが可能なペプチドを取り出すことができる乳酸菌のいくつかの株を選択するために、インビトロでの研究を実施した。ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する１０の異なる株の上清培養によりダイズグリシニンを加水分解した７２時間後に、ペプチド抽出物を得た。生成した抽出物を、ＰＬ酵素およびＰＬＡ２酵素を阻害するインビトロでの能力についてスクリーニングした。最後に、選択されたペプチド抽出物を、カエノラブディティスエレガンスのインビボモデルを使用して、脂肪蓄積を減少させる能力についてスクリーニングし、続いて、選択されたペプチド抽出物を、同じ動物系を使用して、急性酸化ストレスに対する保護能力についても試験した。
【００２１】
この研究の結果、いくつかの株の上清からのプロテアーゼを用いたグリシニンの加水分解後に得られたペプチド抽出物は、インビトロにてＰＬおよびＰＬＡ２を阻害することができ、Ｃ．エレガンスのインビボモデルを用いると、脂肪蓄積を減少させ、酸化的ストレスから保護することができることが判明した。インビトロでのＰＬおよびＰＬＡ２の阻害とインビボでの脂肪減少とを引き起こす抗酸化ペプチドを、その後、同定した。
【００２２】
これらの特定のペプチド抽出物の消費は、肥満症を患っている人において、または肥満症の家系の人や脂質代謝に問題を持つ人などの肥満に罹患するリスクのある人において、有益に働く。
【００２３】
（株の選択）
グリシニンに対するプロテアーゼ活性を有する最も効率的な乳酸菌を選択するために、ラクトバチルス属およびストレプトコッカス属の異なる株を、以下の加水分解アッセイに供した。
【００２４】
加水分解のプロセスを行うための基質として、ダイズグリシニンを用いた。Ｔｈａｎｈ  Ｖ．Ｈ．等（Major proteins of soybean seeds: a straightforward fractionation and their characterization. 1976. J Agric Food Chem 24: 1117-1121）が述べているように、グリシニンは、メルカプトエタノールで処理した後に続く２回の遠心分離工程により大豆粉から抽出されるダイズの主要タンパク質である。グリシニンを分解するのに使用する酵素の供給源のうち１０株を試験した。うち分けは、ストレプトコッカス属が６株（株２、３、４、５、６、７）およびラクトバチルス属が４株（株８、９、１０および１１）である。これらの株の全てを３７℃で１７時間、適切な培地（ラクトバチルス株に対してはＭＲＳ、および、ストレプトコッカス株にはＢＨＩ）にて培養し、両方の上清および細胞で約１０ＫＤａの分子量のプロテアーゼを、グリシニンの加水分解アッセイにおける酵素の供給源として使用するために、濃縮した。一方で、上清からのプロテアーゼを、４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離して得た。それから、上清を１０ｋＤａごとに限外濾過し、その上部を５０ｍＭのクエン酸リン酸バッファ（ｐＨ７）２ｍｌに再懸濁した。他方で、異なる培養物から得られた細胞を、４０００ｒｐｍで１５分間、食塩水で洗浄し、細胞および上清中のプロテアーゼ活性を評価するために、５０ｍＭのクエン酸リン酸バッファ（ｐＨ７）に再懸濁した（表１）。
【００２５】
【表１】
2016508510.tif 000002
【００２６】
上記により、乳酸菌株の培養上清が、最も高いプロテアーゼ活性を提供するには、そしてそれゆえ、肥満症における機能性ペプチドを製造するには、最も効率的であるということが見出された、と考察される。
【００２７】
（ペプチド抽出物の取得）
５０ｍＭのクエン酸リン酸バッファ（ｐＨ７）および研究下で濃縮した各１０ｋＤの培養上清１．５ｍｌ中に、１％のグリシニン１３．５ｍｌを用いて、酵素加水分解を３７℃で７２時間実施した。反応を、３ＫＤａのフィルターおよび低い画分にて限外濾過することにより停止させ、加水分解後に抽出された含有ペプチドについて、インビトロでＰＬやＰＬＡ２などの脂肪分解酵素を阻害する能力を試験するため、そして、Ｃ．エレガンスモデルにおける脂肪蓄積を減少させるインビボでの能力を研究するため、評価を行った。
【００２８】
（インビトロでのＰＬおよびＰＬＡ２の酵素活性を阻害する能力を対象としたペプチド抽出物のスクリーニング）
Ｓｕｇｉｙａｍａ等（Oligomeric procyanidins in apple polyphenol are main active components for inhibition of pancreatic lipase and triglyceride absorption. J Agric Food Chem (2007); 55: 4604-4609）の記載のように基質として４−メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭＵＯ）を用いて、いくつかの変更を加えて、ＰＬ阻害を決定した。各ペプチド抽出物の２５μｌのアリコートを２５μｌのＰＬ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートし、５００ｒｐｍで攪拌しながら２６℃で１０分間プレインキュベートした。反応を、ダルベッコバッファに溶解した５０μｌの４ＭＵＯ（０．１ｍＭ）を添加することによって開始した。２６℃にて一定の撹拌（５００ｒｐｍ）で２０分間インキュベーションした後、反応を０．１Ｍのクエン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ４．２）を１００μｌ添加することによって停止させた。酵素により放出された４−メチルウンベリフェロンの量を蛍光によって測定した。ペプチド抽出物を酵素アッセイでの阻害剤として使用したが、蛍光とおよびペプチドを含むバッファとの間の干渉により、１／２０または１／５０に希釈する必要があった。
【００２９】
Ｓｈｉｎｇｈ等（A rapid isocratic high-performance liquid chromatography method for determination of cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Journal of Chromatography (2005); 1073:347-353）によって記載されるように、基質として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＯＰＣ）を用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ＰＬＡ２酵素阻害を決定した。ウォーターズ２９９６フォトダイオード検出器アレイとＣ８カラムハイパーシルＢＤＳ（２５０×４．ｍｍ、５ ｕＭ）とを用いたウォーターズ２９９６（ＨＰＬＣ）を、５０ｍＭのアンモニウムリン酸バッファ（ｐＨ２．７）：メタノール（１５:８５、ｖ／ｖ）の混合物により形成された溶離液アイソクラティック法を実施するのに使用した。表２は、大豆グリシニンから得られたペプチドを抽出物によるＰＬ阻害値を示している。表３は、ダイズグリシニンから得られたペプチドを抽出物によるＰＬＡ２阻害値を示している。
【００３０】
【表２】
2016508510.tif 000003
【００３１】
【表３】
2016508510.tif 000004
【００３２】
ダイズグリシニン由来の最も阻害能の高いペプチド抽出物を、Ｃ．エレガンスモデルを用いてインビボで試験するために選択した。これらのペプチド抽出物および割り当てられたコードを、表４に要約する。
【００３３】
【表４】
2016508510.tif 000005
【００３４】
（インビボでの脂肪の蓄積を減少させる能力を対象とするペプチド抽出物のスクリーニング）
線虫Ｃ．エレガンスでの体脂肪量の減少能力を、グリシニンから得られる上記５ペプチド抽出物のグループにおいて分析した（表４参照）。これらのサンプルは、ＰＬおよびＰＬＡ２のインビトロでの阻害に対する高い効果によって選択した。具体的には、５つのペプチド抽出物は、ＰＬＡ２阻害アッセイ（Ｍ２０Ｇ、Ｍ５Ｇ、Ｍ３１Ｇ、Ｍ２７ＧおよびＭ２９Ｇ）から選択した。体脂肪量を、Ｃ．エレガンスの野生型株Ｎ２において生きた線虫のナイルレッド染色により分析した。実験は、卵期から若齢成虫期（３日成虫）まで、年齢の同期集団で実施した。実験の間、線虫は、ＮＧＭ寒天プレートにて培養した。制御条件として、対応するペプチド抽出物（１００μＬ／プレート）を含有するＮＧＭ、および陽性対照としてオルリスタットを６μｇ／ｍＬ含有するＮＧＭを用いた。ナイルレッドを０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度になるように大腸菌ＯＰ５０株を用いて播種ＮＧＭプレート上に既に添加していた。２０℃でのインキュベーションの後、若齢成虫（１条件当たり６０の線虫）を採取し、ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ（登録商標）蛍光光度計システムを用いてインビボでの蛍光を測定した。処理した線虫にて得られた蛍光を、対照条件（参照サンプル）に供給され線虫の蛍光から算出した。実験は重複して実施した。
【００３５】
５つのペプチド抽出物の評価から得られた全体的な結果として、ＰＬＡ２阻害能を有する抽出物では体脂肪減少に高い効果を示した（表５および図１）。
【００３６】
そのＰＬＡ２阻害効果から選択されるペプチド抽出物は、全体的に、Ｃ．エレガンスにおける脂肪減少（表５）においてより有効であった。図１に示すように、蛍光の減少率は、１６．２から３７．７％であった。蛍光減少がそれぞれ３７．７％３１．６％および２８．６％であったＭ５Ｇ、Ｍ２７ＧおよびＭ３１ Ｇでの効果が注目に値する際立った点である。
【００３７】
要約すると、インビトロでのＰＬＡ２阻害効果において有意なペプチド抽出物のグループは、インビボでの体脂肪減少の効果においても重要であることが見出された。
【００３８】
【表５】
2016508510.tif 000006
【００３９】
（急性酸化ストレスに対する保護能力を対象としたペプチド抽出物のスクリーニング）
選択した５つのペプチド抽出物の急性酸化ストレスに対する保護能力について、Ｃ．エレガンスのインビボモデルにて分析した。
【００４０】
実験は、Ｃ．エレガンスの野生型株Ｎ２の年齢同期集団を用いて行った。線虫に、異なるペプチド抽出物（１００μＬ／プレート）を卵段階から５日成虫段階まで供給した。対照供給条件（ＮＧＭ）、および陽性対照（ビタミンＣを０．１μｇ／ｍＬ）を用いた。２０℃でのインキュベーション後、線虫を、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ）の新しいプレートに移すことで、酸化ストレスにさらした。線虫集団の生存率を、それぞれの培養条件でのインキュベーションの５時間後に決定した。実験は重複して実施した。
【００４１】
５つの選択されたペプチド抽出物は、二つの異なる試験で分析した。１つ目は（図２参照）、インビトロでＰＬＡ２の最も高い阻害を引き起こすサンプル（これらは２８．６〜３９．１％の間のインビボでの体脂肪を減少する）を含んでいた。サンプルＭ５Ｇ、Ｍ３１Ｇ、Ｍ２７Ｇをグリシニン基質から取得し、それらのすべては、線虫において酸化ストレスに対する高い保護性を示した。我々は、対照条件（３９．５％）と比較して、酸化ストレス後の高い生存率（５３〜６４％の間）を観測した。結果として、ペプチド抽出物Ｍ５Ｇ、Ｍ３１Ｇｙ、Ｍ２７Ｇについて、線虫での酸化ストレスに対する高い保護性および脂肪含有量の減少能力が示された（図２）。
【００４２】
要するに、Ｓｔ．サーモフィラスの６、Ｌ．パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの１０、およびＳｔ．サーモフィラスの７を用いた加水分解によりグリシニンから得られたペプチド抽出物の３つのグループ、Ｍ５Ｇ、Ｍ３１Ｇ、Ｍ２７Ｇは、Ｃ．エレガンスのインビボモデルにおける脂肪減少における高い効果と酸化ストレスに対する有意な保護性とを有し、両方の機能における有益な効果を示す（表６）。
【００４３】
【表６】
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【００４４】
以下の株
株６：ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−２７７６
株７：ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＣＭ  Ｉ−１６３０
株１０：ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−４２７０
を、本発明の目的のために好適なものとして選択した。
【００４５】
本発明はまた、上記の株だけでなく、変異体株、または既にグリシニンに対するプロテアーゼ活性を有し、本発明の機能性ペプチドを産生するいずれかの親株由来の遺伝的形質転換株、の使用を含む。これらの変異株または遺伝的形質転換株は、例えば、その代謝特性の一部を変更するため、親株の１つ以上の内因性遺伝子（単数または複数）が変異されている株であってもよい。また、これらは、上記株に追加の生理学的特徴を与えることを目的として、例えば１つ以上の関連遺伝子（単数または複数）による親株の遺伝的形質転換から得られた株であってもよい。
【００４６】
（インビトロでのＰＬＡ２阻害能力、Ｃ．エレガンスモデルにおける脂肪減少能力および酸化ストレスからの保護能力を有する機能性ペプチドの同定）
インビトロでＰＬＡ２を阻害でき、インビボで脂肪を減少し、酸化的ストレスから保護できる３つのペプチド抽出物を選択し、それらに存在する機能性ペプチド配列を同定した。機能性ペプチドの同定は、サンプルＭ５Ｇ、Ｍ２７ＧおよびＭ３１Ｇを用いて実施し、ｎＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって行った。
【００４７】
表７には、グリシニン由来の同定されたペプチド配列および各評価試料中の出現回数が含まれている。表７に示される全てのペプチドは、Ｓｔ．サーモフィラスの株６、及びラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの株１０を用いて処理された試料中に存在し、加水分解処理の無い対照試料中では同定されていない。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
Ｓｔ．サーモフィラスの株６、およびラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの株１０由来の加水分解物Ｍ５ＧおよびＭ２７Ｇを選択し、さらにインビトロにて脂肪減少を引き起こすペプチドを同定するために、ＲＰＣ（逆相クロマトグラフィー）によって精製した。ＲＰＣ画分を、脂肪減少を研究し、Ｓｔ．サーモフィラスの株６、及びラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの株１０由来の陽性のものに存在するペプチドを同定するために、Ｃ．エレガンスについて分析した（表８）。
【００５０】
【表８】
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【００５１】
これらの精製画分から、ペプチドの総量は、インビボにてＣ．エレガンスの肥満モデルを用いて合成して評価するために、１１のペプチドを選択した（表９）。全てのペプチドは、最終濃度1μｇ／ｍＬにて評価した。
【００５２】
【表９】
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【００５３】
これらのうち３０％以上の脂肪蓄積を減少させる能力を有するペプチドを、膵リパーゼ（ＰＬ）及びホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）に関して、インビトロにて評価した。ＰＬの場合には、IＣ５０値を決定し（表１０）、ＰＬＡ２の研究では、各ペプチドの３つの異なる濃度について試験を行った（表１１）。
【００５４】
【表１０】
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【００５５】
【表１１】
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【００５６】
（脂肪減少を潜在的に引き起こす最も耐性のあるペプチドの同定）
インビボでの消化管のインビトロでの酵素消化モデルを、生理学的条件を模倣するために開発し、選択した各ペプチドが、消化プロセスによって胃腸管全体を通して異なって消化されることを確認し証明した。ペプシン、パンクレアチン、および胆汁の濃度は、公開された実験計画（Granado-Lorencio et al(2007). J.Agri. Food. Chem., 55, 6387-6394）を使用して最適化した。
【００５７】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、  ペプチドＰ１４ｃおよびＰ１６ｆは、腸内段階の開始時に完全に分解し、一方で、Ｐ８ａおよびＰ１４ｂは、プロセスの終了時まで耐えていたが最終的には分解した、ということが観察された（表１２）。
【００５８】
【表１２】
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【００５９】
本発明のペプチドは、単離された形態でまたは抽出物の形態で食品マトリックスに添加することができる。本発明のペプチドは、単独でまたは混合物の形態で食品マトリックスに添加することができる。
【００６０】
好ましい実施形態において、上記ペプチドを当技術分野で公知の任意の方法によって取得しても製造してもよい。当技術分野で公知の任意の方法には、純粋ペプチドおよび本明細書に記載のように加水分解または発酵によって生成されたタンパク質画分（から単離された）の合成を含む。
【００６１】
本発明のペプチドは、自らのペプチド（例えば、純粋ペプチドの合成から）として、またはタンパク質画分（例えば、加水分解タンパク質または発酵タンパク質）の一部として、食品中に存在してもよい。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ダイズグリシニンを含む食品マトリックス中に本発明の菌株を添加した結果として、食品中に存在してもよい。
【００６３】
好ましくは、上記食品は発酵製品である。発酵製品は、液体の形状であっても、発酵液を乾燥して得られた乾燥粉末の形態であってもよい。
【００６４】
上記発酵製品は、好ましくは新鮮な酪農製品であり、より好ましくは発酵乳および／または発酵大豆である。好ましくは、上記栄養組成物は、以下のような、低温殺菌および滅菌された、ミルク、ヨーグルト、および発酵乳である。
【００６５】
滅菌および／または低温殺菌された、ミルク、ヨーグルト、発酵乳、ミルクベースのデザートなどの乳製品。乳幼児およびそれに続く子供のための調乳およびベビーフード。新鮮なおよび／または低温殺菌されたチーズ。フルーツジュース製品、シロップおよび／またはフルーツエッセンス、マーマレード、コンポートおよび／またはジャムなどの、青果製品。豆乳および／または抽出物、タイガーナッツ、穀類、ナッツやドライフルーツ、大豆、果物、ナッツ、ドライフルーツや穀物を基にするミルクおよび発酵抽出物。ミルク、ミルク製品、果物、穀物、米、ベビーフード等を基にする乳幼児用調製乳。重量に問題があったり肥満症である一般の集団や人々のための食品および特別に用意されたものを、直接または間接的に供する、新鮮な、乾燥された、および／または冷凍された、栄養補助食品。濃縮されたおよび／または添加物を入れた水や飲料。発酵製品に由来する機能性ペプチドおよび／または機能性ペプチドの抽出物で機能強化される可能性のある、活性成分として食品マトリックスに添加される可能性のある、一般的な、主食および／または機能製品。
【００６６】
食品中の本発明のペプチドの量は、上記ペプチドの、好ましくは少なくとも０．０１ｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは１〜７ｇ／ｋｇ、最も好ましくは３〜７ｇ／ｋｇ、例えば５ｇ／ｋｇといった量である。好ましくは、これらの食品中のペプチドの量は、次のように選択される。食品一食の合計量当たりのペプチドの量が、０．０１〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１ｇ、より好ましくは０．１〜０．７ｇ、最も好ましくは０．２〜０．５ｇであるように選択される。
【００６７】
（実施例）
（１）ペプチドを用いた食品の構築および脂肪減少効果
本研究の目的は、食品マトリックスへの添加後の、グリシニンから得られたより効果的なペプチドの抗肥満効果を評価することであった。我々は、６つの株を用いたグリシニンの加水分解から得られた５つのペプチド（Ｐ８ａ、Ｐ６ａ、Ｐ１４ｃ、Ｐ１６ｆ、Ｐ１４ｂ）を選択した。このグリニシン由来のペプチドを、最終濃度１μg／ｍＬにて単独でまたは混合で大豆発酵物（ダノン社のサビア（Ｓａｖｉａ）（登録商標））に添加した。線虫にこれらの生成物を与え、次いで、総脂質をナイルレッド染色によって定量した。
【００６８】
表１３は、異なるグリシニンペプチドまたはそれらの組み合わせを含有する大豆発酵物を与えた線虫における蛍光の減少レベルを示している。結果は、大豆発酵物に追加された場合の、全てのグリシニンのペプチドのインビボでの有効性を示唆している。食品マトリックス中のこれらの５つのペプチドの組合せはまた、蛍光の有意な減少をもたらした。
【００６９】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ダイズグリシニンから得られ、ＰＬＡ２阻害アッセイから選択された、ペプチド抽出物の、Ｃ．エレガンスでの体脂肪の減少における効果を表す図である。
【図２】Ｃ．エレガンスにおける異なるペプチド抽出物による急性の酸化ストレスに対する保護効果を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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