(57)【要約】  本発明は、ｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメイン阻害剤の選択またはスクリーニングの方法、そのような方法に使用される酵母菌株および細胞株に関する。本発明はまた、新しい治療薬である選択されたｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメイン阻害剤と、ｈＤＩＳ３ ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌、とりわけ多発性骨髄腫の処置におけるその使用に関する。本発明はまた、新しい治療薬ｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメイン阻害剤を含む組成物と、癌細胞において合成致死を引き起こすための方法に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）好ましくは癌細胞中のｈＤＩＳ３で生じる突然変異を導入することにより、ＲＮＢドメイン中の突然変異を含むＤＩＳ３、そのフラグメント、相同体または変異体を含んでいるモデルシステムを構築する工程、
ｂ）ａ）で得られたモデルシステムを試験済みの薬剤である、想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
ｃ）モデルシステムに適切な方法によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）試験済みの薬剤と接触した際にＰＩＮドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程、
を含む、方法。
【請求項２】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）ＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン、そのフラグメント、変異体または相同体、好ましくは単離されたｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインを含む、精製タンパク質を得る工程；
ｂ）ａ）で得られたタンパク質を、試験済みの薬剤である、想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
ｃ）好ましくはＲＮＡ基質の生体外での消化によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）試験済みの薬剤と接触した際にＰＩＮドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程、
を含む、方法。
【請求項３】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）好ましくは癌細胞中でｈＤＩＳ３を生じる突然変異を導入することにより、ＲＮＢドメイン中に突然変異を備えたＤｉｓ３を含む酵母菌株を構築する工程、
ｂ）ａ）で得られた酵母菌株を、試験済みの薬剤である想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
ｃ）試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）野性型Ｄｉｓ３を含む酵母菌ではなく、ａ）で構築された酵母菌の処理後に選択的な成長遅延または細胞死（合成致死）を引き起こす、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項４】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）好ましくは癌細胞中のｈＤＩＳ３で生じる突然変異を導入することによって、ＲＮＢドメイン中に突然変異を有するｈＤＩＳ３、そのフラグメントまたは変異体を含む、改変した細胞株、好ましくはヒト細胞株を構築する工程、
ｂ）ａ）で得られた細胞株を、試験済みの薬剤である、想定されるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
ｃ）試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）野性型ｈＤＩＳ３を発現する細胞株ではなく、ａ）で構築された細胞株の処理後に選択的な成長遅延または細胞死（合成致死）を引き起こす、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
癌細胞中のｈＤＩＳ３遺伝子中の突然変異は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病で生じる少なくとも１つの突然変異である、請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
癌細胞中のｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異である、請求項１乃至５に記載の方法。
【請求項７】
ｈＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでいる、請求項１乃至６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項１乃至７に記載の方法。
【請求項９】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬であって、治療薬が請求項１乃至８のいずれか１つの方法で得られる、治療薬。
【請求項１０】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される、治療薬２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬ）、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を有する癌細胞である、請求項９または１０に記載の治療薬。
【請求項１２】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列ＡＡ  ４２７−８４３中に少なくとも１つの突然変異を有するｈＤＩＳ３  ＲＮＢである、請求項９乃至１１に記載の治療薬。
【請求項１３】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、請求項９乃至１２の治療薬、または、請求項１乃至８の方法によって得られる治療薬の使用。
【請求項１４】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項１５】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を有する癌細胞である、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢ中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される、請求項１３乃至１５に記載の使用。
【請求項１７】
ｈＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでいる、請求項１３乃至１６に記載の使用。
【請求項１８】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬を含む組成物であって、治療薬は請求項１乃至８のいずれか１つの方法で得られるか、あるいは請求項９乃至１２に記載されるように得られる、組成物。
【請求項１９】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を含む癌細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢ中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
抗癌活性を有する少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含み、追加の薬剤は、多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する抗癌活性を有している、請求項１８乃至２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む、請求項１８乃至２１に記載の組成物。
【請求項２３】
癌細胞の合成致死を引き起こす方法であって、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する薬剤で処置される、方法。
【請求項２４】
ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインの活性を阻害する薬剤は、請求項１乃至８の方法によって得られるか、あるいは、請求項９乃至１２の治療薬であるか、あるいは、請求項１８乃至２２の組成物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項２３乃至２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法で使用される酵母菌株、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株であって、酵母菌株はＤｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を含むＤＩＳ３を含み、これは癌細胞で見られる突然変異の等価物である、酵母菌株。
【請求項２８】
癌細胞は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択される、請求項２７に記載の酵母菌株。
【請求項２９】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異である、請求項２７または２８に記載の酵母菌株。
【請求項３０】
Ｄｉｓ３はそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のヒトｈＤＩＳ  ＲＮＢドメインに相同するそのＲＮＢドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、したがって、こうした突然変異は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択された癌細胞中の突然変異と等価である、請求項２７乃至２９に記載の酵母菌株。
【請求項３１】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮであるか、あるいは、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＡＡ  １−２４１）のＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項２７乃至３０に記載の酵母菌株。
【請求項３２】
該方法は請求項２７乃至３１で定義される酵母菌株の使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための請求項２７乃至３１のいずれか１つの酵母菌株の使用。
【請求項３４】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される細胞株であって、細胞株は癌細胞で見られる突然変異の等価物であるＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を有するＤＩＳ３を含む、細胞株。
【請求項３５】
細胞株は髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫から選択される、請求項３４に記載の細胞株。
【請求項３６】
細胞株は、ヒト細胞株、好ましくはＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ細胞株の誘導体である、請求項３４または３５に記載の細胞株。
【請求項３７】
ヒト細胞株は、
−内因性のｈＤＩＳ３コピーを発現停止させることができるｓｈ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ  
−ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞で見られる突然変異に対応する突然変異を有し、かつ、ｓｈ−ｍｉＲＮＡ活性に対する感受性をなくすために再コード化されたフラグメントを含む、外因性のｈＤＩＳ３変異体、
を発現する双方向に誘導可能なプロモーターを含むベクターの使用により構築される、請求項３４乃至３６のいずれか１つに記載の細胞株。
【請求項３８】
ＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異である、請求項３４乃至３７に記載の細胞株。
【請求項３９】
ＤＩＳ３  ＲＮＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列ＡＡ  ４２７−８４３中の少なくとも１つの突然変異を含むｈＤＩＳ３  ＲＮＢをコード化する、請求項３５乃至３８に記載の細胞株。
【請求項４０】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項３４乃至３９に記載の細胞株。
【請求項４１】
該方法は請求項３４乃至４０の細胞株の使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４２】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための請求項３４乃至４０のいずれか１つの細胞株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤の選択方法、およびそうした方法で使用される酵母菌株と細胞株に関する。本発明はさらに新しい治療薬である選択されたｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤と、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌、とりわけ多発性骨髄腫の処置におけるその使用に関する。本発明はさらに新しい治療薬ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を含む組成物と、癌細胞において合成致死を引き起こすための方法に関する。
【０００２】
本発明はさらに、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインの触媒的な阻害による合成致死に対する癌細胞の感受性について、多発性骨髄腫のような癌の患者のスクリーニング方法と同様にｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤の選択方法とスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
合成致死は、標的とした癌治療の発達に関して最も有望な戦略の１つとして最近台頭してきている（Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、２０１２）。こうした戦略により、形質転換していない細胞に対する効果を潜在的に低くして、癌細胞を標的とすることが可能となる。例えば、ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２に突然変異を有する乳癌細胞は、ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ１）の阻害に非常に敏感であるが、ＰＡＲＰ１の阻害は、野生型のＢＲＣＡを有する標準細胞の生存と増殖にはほとんど影響がない（Ｂｒｙａｎｔら、２００５；ファーマーら、２００５）。ＰＡＲＰ１阻害剤に基づくリード化合物は高度な臨床試験にある（バーバーら、２０１３）。
【０００４】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、すべての腫瘍の１％以上、血液の悪性腫瘍の１０−１５％、および血液と骨髄の癌に関連する死の２０％以上を占める致命的な腫瘍性疾患である（Ｌａｕｂａｃｈら、２０１１）。処置するのは難しく、今日に至るまで成功した治療は見つかっていない。
【０００５】
ＭＭの遺伝的背景は完全には理解されていない。ＭＭ患者の最大で９０％において、染色体の異常が検出されている。
【０００６】
３８人のＭＭ患者の全ゲノム配列決定を記載した最近の公報は、この癌に関連する体細胞突然変異に包括的な考察を与えている（Ｃｈａｐｍａｎら、２０１１）。患者のおよそ５０％は、ＭＭの進行の主要な前提条件として染色体転座とともに、ＮＲＡＳまたはＫＲＡＳ活性化突然変異のいずれかを有していた。思いがけないことに、癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子として以前は記載されていなかったｈＤＩＳ３遺伝子がＭＭ患者で頻繁に変異した。ｈＤＩＳ３タンパク質はよく記載されているエキソソーム複合体の触媒サブユニットであり、これは真核生物のＲＮＡプロセシングと分解において重要な役割を果たす（以下を参照）（Ｃｈａｐｍａｎら、２０１１）。ＭＭ患者における高い頻度のｈＤＩＳ３遺伝子突然変異は、別のハイスループット研究で細菌確認されている（ウォーカーら、２０１２）。
【０００７】
興味深いことに、ｈＤＩＳ３遺伝子突然変異は、髄芽腫（この場合、Ｄ４７９をＶに変化させる真の触媒による突然変異であり、これはＭｇ２＋イオンの配位を破壊し、それによってｈＤＩＳ３エキソヌクレアーゼの活性を無効にする）や急性骨髄性白血病（活性部位：Ｄ４８８Ｎにおける別のアスパラギン酸塩の置換を含む）の複数の症例のように、他のタイプの癌に専用の包括的なスクリーニングでも見つかった（パースンズら、２０１１；Ｄｉｎｇら、２０１２）。加えて、ｈＤＩＳ３は、その発現が表在拡大型黒色腫と結節性メラノーマを区別する遺伝子の１つとして、トランスクリプトーム分析で確認された（ローズら、２０１１）。さらに、それぞれのｍＲＮＡとタンパク質の上昇値が転移の発生率と正に相関しているヒトの結腸直腸癌とこの癌のマウスモデルにおいて、当初ｈＤＩＳ３過剰発現が観察された（Ｌｉｍら、１９９７；Ｌｉａｎｇら、２００７）。ごく最近になって、機能ゲノム科学研究は、結腸直腸癌細胞株の成長維持にとって必要不可欠な複数の遺伝子の１つとしてｈＤＩＳ３を定義した（キャンプスら、２０１３）。
【０００８】
真核生物のＲＮＡ分解とプロセシング経路は遺伝子発現調節の本質的な構成要素である。ＲＮＡターンオーバーは細胞ホメオスタシスの重大な部分である。
【０００９】
３’−５’エキソヌクレアーゼのＲＮＡ分解を触媒するエキソソーム複合体は、ＲＮＡターンオーバーのすべての経路に実際に基本的な役割を果たす一次の真核生物のリボヌクレアーゼである（Ｌｅｂｒｅｔｏｎ＆Ｓｅｒａｐｈｉｎ（２００８年）；Ｓｃｈｍｉｄ＆Ｊｅｎｓｅｎ、２００８年；Ｔｏｍｅｃｋｉら、２０１０ａ）。要するに、それは以下に関与する：正常なｍＲＮＡのターンオーバーと不安定なｍＲＮＡのＡＵリッチ領域によって制御された分解（Ｇｈｅｒｚｉら、２００４；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、２００２）；安定したＲＮＡクラス（ＳｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の核プロセシング（Ａｌｌｍａｎｇら、１９９９；Ｇｕｄｉｐａｔｉら、２０１２）；その存在がエキソソーム突然変異体中で発見された遺伝子間領域から発生する不安定な転写物の分解（Ｗｙｅｒｓら、２００５）；ＲＮＡ干渉経路のｓｉＲＮＡによって始められたエンドヌクレアーゼ分解性（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）の切断後のｍＲＮＡの完全な分解（ＯｒｂａｎとＩｚａｕｒｒａｌｄｅ、２００５年）。さらに、エキソソーム複合体は、核と細胞質の両方のＲＮＡの品質管理に重大な役割を果たす。これは、早熟な終止コドン（ＮＭＤ、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構）を含む、終止コドン（ＮＳＤ、ノンストップ分解機構）を欠く、または翻訳中のリボソームの停止（ＮＧＤ、Ｎｏ−Ｇｏ  Ｄｅｃａｙ）を引き起こすいくつかの立体的な障害を備えたｍＲＮＡを欠く、転写物の分解として細胞質のＲＮＡ品質管理経路に関与する（Ａｌｌｍａｎｇら、１９９９年；Ａｌｌｍａｎｇら、２０００年；Ａｓｓｅｎｈｏｌｔら、２００８年；Ｇｕｄｉｐａｔｉら、２０１２年；Ｉｓｋｅｎ＆  Ｍａｑｕａｔ、２００７年；Ｋａｄａｂａら、２００４年；Ｐａｒｋｅｒ、２０１２年；Ｗａｎｇら、２００８）。最も重要なことには、それは、不適切に処理されたプレｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡ、これらの合成の前駆体を含む、核の中の望ましくない分子の分解の原因である一次の酵素である。エキソソーム突然変異体では、遺伝子間領域とアンチセンス領域から生じる莫大な量のＲＮＡが蓄積するため、エキソソームの関心機能は転写の浸透を抑える際にある（Ｐｒｅｋｅｒら、２００８；ルバら、２０１１）。こうした転写物のいくつかは制御的機能を持っており、これらが生じる部位の近くにある遺伝子の染色質のサイレンシングに関与する（Ｃａｍｂｌｏｎｇら、２００７）。
【００１０】
ｈＤＩＳ３タンパク質はＲＮＡエキソソーム複合体の触媒サブユニットであり、これはＲＮＡプロセシングと分解に重大な役割を果たす。エキソソーム複合体は進化的に保存された構造を有する。それは９つのサブユニット環からできており、古細菌および細菌の加リン酸分解リボヌクレアーゼに対して相同であるにもかかわらず任意の検知できる触媒活性が欠けている（Ｌｉｕら、２００６；Ｄｚｉｅｍｂｏｗｓｋｉら、２００７）。該環サブユニットによって形成された触媒現象的に不活性な中央のエキソソームチャネルは、関連する触媒サブユニットによって完全に供給される複合体（Ｗａｓｍｕｔｈ＆Ｌｉｍａ、２０１２年；Ｄｒａｚｋｏｗｓｋａら、２０１３）のリボヌクレアーゼ活性の制御において重要な機能を有している。エキソソームの酵素活性の原因であるリボヌクレアーゼは２つの異なるファミリーに属する：Ｄｉｓ３様のタンパク質はバクテリアのリボヌクレアーゼＩＩ／Ｒに似ており、その一方でＲｒｐ６様のサブユニットはリボヌクレアーゼＤファミリーのメンバーである（Ｔｏｍｅｃｋｉら、２０１０ａで概説されている）。エキソソームは酵母菌中で発見され、研究作業の大部分はこのモデルシステムを用いて行われてきた（ミッチェルら、１９９７）。酵母菌ゲノムでは、Ｄｉｓ３とＲｒｐ６のタンパク質をコードする単一遺伝子がある。Ｄｉｓ３は、核と細胞質の両方に存在する唯一の必要不可欠な触媒サブユニットである。この多ドメインタンパク質には２つの異なる触媒活性：ＲＮＢドメインに存在する３’−５’のエキソヌクレアーゼ活性と、Ｎ末端基ＰＩＮドメインから生じるエンドヌクレアーゼ分解性の活性（Ｄｚｉｅｍｂｏｗｓｋｉら、２００７年；Ｌｅｂｒｅｔｏｎら；２００８年、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、２００９年；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ら；２００９）がある。Ｄｉｓ３エキソヌクレアーゼ活性部位は、基質が送達される際に通る、９つのサブユニット環の中央のチャネルの底の近くにある（Ｂｏｎｎｅａｕら、２００９；Ｍａｌｅｔら、２０１０）。両方の活性は互いに協力し合うが、エキソの活性の方が細胞生理学にとってはより重要である（Ｌｅｂｒｅｔｏｎら、２００８；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、２００９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００９）。Ｒｒｐ６は核に制限され、核のエキソソーム機能のサブセットにのみ関与している。エキソソームは独力で機能せず、その完全な活性と複数基質の効率的な認識のために適切な補助因子を必要とする。すべての補助因子の中央の成分はＲＮＡヘリカーゼであり、これは基質を環の中央のチャネルに伝達すると考えられており、それはその後Ｄｉｓ３のエキソヌクレアーゼ活性部位にＲＮＡを送達する。
【００１１】
よく保存された構造にもかかわらず、ヒトと酵母菌のエキソソームの間には、とりわけ触媒サブユニットの特性には重要な違いがある。ヒトゲノムは２つのタンパク質−ｈＤＩＳ３とｈＤＩＳ３Ｌをコード化する。これらは、新しく発見されたＣＲ３モチーフと、９つのサブユニット環との相互作用に必要とされる構造上無傷なＰＩＮドメインを含むすべてのＤｉｓ３元素を含んでいる（Ｔｏｍｅｃｋｉら、２０１０ｂ；Ｓｔａａｌｓら、２０１０；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、２０１２）。プロテオミクス解析は、ｈＤＩＳ３とｈＤＩＳ３Ｌの両方が最も可能性が高いのは相互に排他的な方法でヒトのエキソソーム環と相互に作用することを確認した。顕著なことに、両方のヒトＤｉｓ３相同体は進行性の３’−５’加水分解のエキソヌクレアーゼであるが、ｈＤＩＳ３だけはそのＰＩＮドメイン中でエンドヌクレアーゼ活性も保持した。生体内の局在化研究と基質特異性の分析によると、ｈＤＩＳ３Ｌが細胞質のエキソソームに制限され、一方で、ｈＤＩＳ３は、主として細胞質にある小さな画分を備えた核質のタンパク質であることが明らかになった（Ｔｏｍｅｃｋｉら、２０１０ｂ、Ｓｔａａｌｓら、２０１０）。加えて、ヒトＲＲＰ６は主として核であり、細胞質中の小さな画分とともに、核小体中で著しく豊かである。したがって、ヒトＲＮＡエキソソームは、そのＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）相当物と同じ構造的なスキャフォールドに基づくが、核の異なる領域と細胞質において機能的かつ組成的に別々の変異体として存在する（Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２０１１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
不十分なパフォーマンス、重篤な副作用の発生、および現在使用されている治療薬に対する耐性が骨髄細胞のような癌（腫瘍）細胞中ですぐに進行するという事実のため、とりわけ癌細胞に影響を及ぼす新しい専用の治療法が大いに必要とされている。
【００１３】
上に示された情報はエキソソーム複合体の機能と様々な癌の進行の間の分子リンクの存在を示唆する。
【００１４】
本発明は、ＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の癌患者で見られる突然変異に対応する突然変異を有するＤＩＳ３におけるエンドヌクレアーゼ分解性のＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン活性の阻害が、こうした突然変異を有する細胞において合成致死の効果を与えるという予期しない発見に基づいている。
【００１５】
上に記載されるように、往々にしてｈＤＩＳ３遺伝子中の突然変異によるｈＤＩＳ３活性の変化は、黒色腫、結腸直腸癌、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫（ＭＭ）患者などの癌患者で見られることが多い。細胞ホメオスタシスについてのＲＮＡ代謝の重要性ゆえに、こうした突然変異を保護する癌細胞はエキソソーム複合体の活性に対するさらなる損傷に潜在的により脆弱なことがある。しかしながら、当該技術では、これを開発することができる成功した治療方法も有効な治療薬もない。こうした処置のための潜在的に新しい治療薬の選択し、スクリーニングし、および効率的に試験する方法もなく、特に、新しい治療薬の有効な選択とスクリーニングに利用可能な方法はなく、ＲＮＢドメイン中に存在する突然変異とｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解性のエンドヌクレアーゼ分解性の活性の阻害との間の合成致死に基づく癌の処置で使用することができる治療薬はない。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤の選択およびスクリーニング方法、こうした方法で使用される酵母菌株、および細胞株を提供することである。本発明の目的は、新しい治療薬−選択されたｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤と、ＲＮＢドメイン中に存在する突然変異とｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解性の活性の阻害との間の合成致死に基づいて、癌、とりわけ、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する多発性骨髄腫の処置におけるその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）好ましくは癌細胞中のｈＤＩＳ３で生じる突然変異を導入することにより、ＲＮＢドメイン中の突然変異を含むＤＩＳ３、そのフラグメント、相同体または変異体を含んでいるモデルシステムを構築する工程、
ｂ）ａ）で得られたモデルシステムを試験済みの薬剤である、想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
ｃ）モデルシステムに適切な方法によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）試験済みの薬剤と接触した際にＰＩＮドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程。
【００１８】
本発明はさらにｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）ＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン、そのフラグメント、変異体または相同体、好ましくは単離されたｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインを含む、精製タンパク質を得る工程；
ｂ）ａ）で得られたタンパク質を、試験済みの薬剤である、想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
ｃ）好ましくはＲＮＡ基質の生体外での消化によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）試験済みの薬剤と接触した際にＰＩＮドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程。
【００１９】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を含む精製されたｈＤＩＳ３変異体の使用に関する方法は、生体外でｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を選択し、スクリーニングするための適切なモデルシステムである。
【００２０】
本発明はさらにｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）好ましくは癌細胞中でｈＤＩＳ３を生じる突然変異と等価な突然変異を導入することにより、ＲＮＢドメイン中に突然変異を備えたＤｉｓ３を含む酵母菌株を構築する工程、
ｂ）ａ）で得られた酵母菌株を、試験済みの薬剤である想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
ｃ）試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）野性型Ｄｉｓ３を含む酵母菌ではなく、ａ）で構築された酵母菌の処理後に選択的な成長遅延または細胞死（合成致死）を引き起こす、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程。
【００２１】
Ｄｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を含む酵母菌株の使用に関する方法は、生体内でＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を選択し、スクリーニングするのに適切なモデルシステムである。
【００２２】
本発明は、さらにｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）好ましくは癌細胞中のｈＤＩＳ３で生じる突然変異を導入することによって、ＲＮＢドメイン中に突然変異を有するｈＤＩＳ３、そのフラグメントまたは変異体を含む、改変した細胞株、好ましくはヒト細胞株を構築する工程、
ｂ）ａ）で得られた細胞株を、試験済みの薬剤である、想定されるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
ｃ）試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）野性型ｈＤＩＳ３を発現する細胞株ではなく、ａ）で構築された細胞株の処理後に選択的な成長遅延または細胞死（合成致死）を引き起こす、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程。
【００２３】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する改変されたヒト細胞株の使用を含む方法は、生体内でｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を選択し、スクリーニングするための適切なモデルシステムである。
【００２４】
本発明に係るＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、癌細胞中のｈＤＩＳ３遺伝子中の突然変異は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病で生じる少なくとも１つの突然変異である。
【００２５】
本発明に係るＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、癌細胞中のｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異である。
【００２６】
本発明に係るＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、ｈＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでいる。
【００２７】
ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択の好ましい方法では、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである。
【００２８】
本発明はさらにｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬に関し、治療薬は本発明に係るＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で得られる。
【００２９】
本発明はさらに、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される、治療薬である２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬとしても知られている）、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩に関する。好ましい治療薬は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を有する癌細胞中のｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインに突然変異を有する癌細胞に使用される。好ましい治療薬は、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列ＡＡ  ４２７−８４３中に少なくとも１つの突然変異を有するｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインである癌細胞に使用される。
【００３０】
治療薬が化合物である場合、本発明はさらにこうした化合物の溶媒和物、薬学的に許容可能なプロドラッグ、薬学的に活性代謝物、および薬学的に許容可能な塩を含む。治療薬である２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンに関して、本発明はさらにＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性の阻害剤活性を有している、誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩を含んでいる。
【００３１】
本発明はさらに、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、本発明の治療薬、あるいは、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法によって得られる治療薬の使用に関する。
【００３２】
本発明はさらにｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩の使用に関する。治療薬は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を備えたｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインに突然変異を有する癌細胞に使用されるのが好ましい。好ましくは、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢ中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される。治療薬の好ましい使用では、ｈＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでいる。
【００３３】
本発明はさらに、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬を含む組成物に関し、治療薬は本発明のＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で得られるか、あるいは本発明の治療薬である。好ましい実施形態では、組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を含む癌細胞のｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞に使用される。組成物の好ましい使用では、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢ中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される。組成物は好ましくは、抗癌活性を有する少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含み、追加の薬剤は、多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する抗癌活性を有している。好ましくは、追加の薬剤は、骨髄腫用のボルテゾミブ、カーフィルゾミブクラフェン（ｃｌａｆｅｎ）（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、ｄｏｘ−ＳＬ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エバセト（ｅｖａｃｅｔ）（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、カイプロリス（ｋｙｐｒｏｌｉｓ）（カーフィルゾミブ）、レナリドミド、ＬｉｐｏＤｏｘ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサホル）、ネオサル（ｎｅｏｓａｒ）（シクロホスファミド）、プレリキサホル、ポマリドミド（ポマリスト）、ポマリスト、レブラミド（レナリドミド）、シノビール（ｓｙｎｏｖｉｒ）（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）用のアドリアマイシンＰＦＳ（塩酸ドキソルビシン）、アドリアマイシンＲＤＦ（塩酸ドキソルビシン）、三酸化ヒ素、セルビジン（塩酸ダウノルビシン）、クラフェン（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シタラビン、シトサール（ｃｙｔｏｓａｒ）−Ｕ（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、ネオサル（シクロホスファミド）、ルビドマイシン（ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ）（塩酸ダウノルビシン）、タラビン（ｔａｒａｂｉｎｅ）ＰＦＳ（シタラビン）、トリセノックス（三酸化ヒ素）、ビンカサール（ｖｉｎｃａｓａｒ）ＰＦＳ（硫酸ビンクリスチン）、硫酸ビンクリスチン；髄芽腫用のロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、またはシクロホスファミドから選択される。
【００３４】
組成物の好ましい使用では、癌細胞中のＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む。
【００３５】
本発明はさらに治療薬、その調製物、または本発明の治療薬を含む組成物、あるいは薬学的に許容可能な担体中の本発明の組成物に関する。薬学的に許容可能な担体の選択は、投与経路だけでなく、治療薬の溶解度、および、細胞、組織、または有機体に入る前にそれが不活性化または分解することを防ぐ必要性に依存する。薬学的に許容可能な担体は、溶媒、分散剤、および添加剤（コーティング、界面活性剤、香料添加剤、酸化防止剤など）を含んでもよい。
【００３６】
本発明の組成物はさらに抗癌活性を有する少なくとも１つの追加の薬剤、好ましくは多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する活性を含む薬剤を含んでもよい。本発明の治療薬と追加の抗癌剤（複数の抗癌剤）は同時に投与されるか、あるいは、共に、または連続して、または、任意の適切な順序で投与されることもある。
【００３７】
本発明の組成物と治療薬は、経口または局所の注入を含む様々な経路によって投与されることがある。経口投与用の調製物は、溶液、懸濁、エマルジョン、カプセル剤、錠剤、または散剤の形をしていることがある。経口の液状製剤は、随意に界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を加えて、水やアルコールのような希釈剤を含むこともある。カプセル剤はゼラチンタイプであってもよく、錠剤は当該技術で知られている賦形剤を含むこともある。注入可能な調製物は、酸化防止剤、バッファー、等張性の薬剤などを随意に含む水性および非水性の等張性の無菌液を含んでいる。典型的な担体は水または生理食塩水である。組成物は一般に、活性成分を担体で希釈または混合するか、あるいは、担体中にそれを密封することによって得られる。治療薬が核酸である場合、治療薬は細胞または組織のタイプを認識する特別のリポソーム系に投与可能である。別の実施形態では、核酸は所望の阻害剤、例えば、ミクロのＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコード化する配列を含む発現ベクターを使用して導入可能である。
【００３８】
治療薬の用量は、投与経路、疾患の進行、および患者の年齢や体重のような他の重要な状況を考慮して決定される。
【００３９】
本発明はさらに癌細胞の合成致死を引き起こす方法に関し、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する薬剤で処置される。癌細胞の合成致死を引き起こす好ましい方法では、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインの活性を阻害する薬剤は、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法によって得られるか、あるいは本発明の治療薬であるか、あるいは、本発明の組成物である。癌細胞の合成致死を引き起こす好ましい方法では、ＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む。癌細胞の合成致死を引き起こす好ましい方法では、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである。
【００４０】
本発明はさらに、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される酵母菌株、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に関し、酵母菌株はＤｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を含むＤＩＳ３を含み、これは癌細胞で見られる突然変異、好ましくは髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫細胞で見られる突然変異の等価物である。Ｄｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の酵母菌株の突然変異において、好ましくは少なくとも１つの突然変異が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、ヒト等価物Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択される。酵母菌株において、Ｄｉｓ３は好ましくは、そのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のヒトｈＤＩＳ  ＲＮＢドメインに相同するそのＲＮＢドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、したがって、こうした突然変異は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択された癌細胞中の突然変異と等価である。好ましい酵母菌株では、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮであるか、あるいは、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＡＡ  １−２４１）のＤＩＳ３  ＰＩＮである。好ましい酵母菌株は、ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ、ｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ、ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ、ｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ、ｄｉｓ３−Ｄ５５１Ｎから選択される。
【００４１】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の好ましい選択方法において、該方法は、本発明の酵母菌株の使用を含む。
【００４２】
本発明はさらに、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための本発明の酵母菌株の使用に関する。
【００４３】
本発明はさらに、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される細胞株に関し、細胞株は癌細胞で見られる突然変異の等価物であるＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を有するＤＩＳ３を含む。細胞株は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫から選択される癌細胞に関して、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用されるのが好ましい。好ましい細胞株は、ヒト細胞株、好ましくはＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ細胞株の誘導体である。本発明の好ましいヒト細胞株は、以下を発現する双方向に誘導可能なプロモーターを含むベクターの使用により構築される：
−内因性のｈＤＩＳ３コピーを発現停止させることができるｓｈ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ  
−ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞で見られる突然変異に対応する突然変異を有し、かつ、ｓｈ−ｍｉＲＮＡ活性に対する感受性をなくすために再コード化されたフラグメントを含む、外因性のｈＤＩＳ３変異体。
【００４４】
本発明はさらに本発明に係る改変された細胞株の構築方法と、こうした方法で使用されるベクターを提供する。
【００４５】
好ましい細胞株において、ＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異が存在する。
【００４６】
好ましい細胞株において、ＤＩＳ３  ＲＮＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列ＡＡ  ４２７−８４３中の少なくとも１つの突然変異を含むｈＤＩＳ３  ＲＮＢをコード化する。好ましい細胞株では、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである。
【００４７】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の好ましい選択方法では、方法は本発明の細胞株の使用を含む。
【００４８】
本発明はさらに、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための本発明の細胞株の使用に関する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン活性の阻害剤に対する癌細胞の感受性のために、ｈＤＩＳ３突然変異を有する癌細胞を有する癌患者、とりわけ髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫の患者をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、その突然変異を有する、精製されたｈＤＩＳ３タンパク質、そのフラグメント、または相同体を用いる生体外アッセイである。
【００５０】
別の態様では、本発明は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン活性の阻害剤に対する癌細胞の感受性のために、ｈＤＩＳ３突然変異を有する細胞を有する癌患者、とりわけ、髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫の患者をスクリーニングする方法を提供し、該方法はＤｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の対応する突然変異を含む酵母菌株の使用を含んでいる。本発明はさらに癌患者のスクリーニングのこうした方法で使用される酵母菌株を提供する。こうした方法で使用される本発明に係る酵母菌株は、ヒト患者で見られる突然変異に対応する致命的でないＤｉｓ３  ＲＮＢドメイン突然変異を有する。
【００５１】
また別の態様では、本発明は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン活性の阻害剤に対する癌細胞の感受性のために、癌患者、とりわけ髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫の患者のスクリーニングのための、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を含む改変されたヒト細胞株の使用に関する方法を提供する。本発明はさらに癌患者のスクリーニングのためのこうした方法で使用される改変されたヒト細胞株を提供する。こうした方法で使用される改変されたヒト細胞株は、患者に見られる突然変異に対応する致命的ではないＤｉｓ３  ＲＮＢドメイン突然変異を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の保存されたアミノ酸の置換はタンパク質の酵素活性を減少させる。（Ａ）ヒトと酵母菌のＤｉｓ３タンパク質のドメイン構成の概略図。多発性骨髄腫で置換されたアミノ酸は薄いグレーで示されており、Ｄｉｓ３ドメインに対するその位置は矢印で印をつけられている。星印はＤ４８７の位置を示しており、これは、ｈＤＩＳ３のエキソリボヌクレアーゼ分解（ｅｘｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性に必要不可欠であることが以前から示されていた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｄｉｓ３ｐの中の対応するアミノ酸はイタリック体で印をつけている。（Ｂ）２段階式のアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、その後、ゲルろ過された完全長のｈＤＩＳ３タンパク質の異なる変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ｈＤＩＳ３タンパク質の位置は実線の矢印で印をつけられている。細菌のＤｎａＫシャペロンを含む共通する汚染とｈＤＩＳ３のタンパク質分解性の分解産物はそれぞれ、星印と開いた矢印で示されている。示された分子量を含むＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）は、最左端のレーンのマーカーとして使用された。（Ｃ）（Ｂ）で示される、完全長のｈＤＩＳ３タンパク質の異なる組み換え変異体用のＲＮＡ分解効率のＴＬＣ分析。［α−３２Ｐ］ＵＴＰの存在下で生体外の転写によって合成された内部で放射性標識されたＲＮＡは、等量の様々なｈＤＩＳ３バージョンで、あるいはタンパク質のない状態でインキュベートされた。サンプルアリコートが指定された時点に採取され、ＰＥＩセルロースＴＬＣプレート上に置かれた。これをその後、垂直の灰色の矢印で示された方向に伸ばした。基質と製品（ＵＭＰ）の位置はそれぞれ実線と開いた矢印で示されている。Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、およびＲ７８０Ｋ突然変異はリボヌクレアーゼ分解を阻害する。
【図２Ａ】ｈＤＩＳ３突然変異は不定形のＲＮＡ基質の分解パターンの変化をもたらし、構造化した基質の分解ができない。（Ａ）５’標識されたｓｓ１７−（Ａ）１４基質は、等量のｈＤＩＳ３の異なるバージョンを含む１００μＭのマグネシウムを含んでいるバッファー中で、あるいはタンパク質のない状態でインキュベートされた。反応を指定された時点で終了させ、その後、ＰＡＧＥを変性させ、ホスホルイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）を行った。基質と３−５−ｎｔ−長の分解産物の位置はそれぞれ実線と開いた矢印で印を付けられている。Ｒ７８０Ｋ突然変異はＤ４８７Ｎと同様に活性を消失させたが、Ｓ４７７ＲとＧ７６６Ｒの置換は５ｎｔ／４ｎｔ製品の比率を変化させた。
【図２Ｂ】ｈＤＩＳ３突然変異は不定形のＲＮＡ基質の分解パターンの変化をもたらし、構造化した基質の分解ができない。（Ｂ）実験は（Ａ）のように行なわれたが、５’標識されたｓｓ４４オリゴヌクレオチドを使用した。Ｓ４７７ＲとＲ７８０Ｋの突然変異はｈＤＩＳ３  エキソリボヌクレアーゼ分解（ｅｘｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を著しく減少させた。Ｇ７６６Ｒアミノ酸変化は処理能力の喪失をもたらした。
【図２Ｃ】ｈＤＩＳ３突然変異は不定形のＲＮＡ基質の分解パターンの変化をもたらし、構造化した基質の分解ができない。（Ｃ）実験は（Ａ）のように行なわれたが、部分的な二重のｄｓ１７−（Ａ）１４を形成する５’標識されたＲＮＡ基質を使用した。ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒ、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ、およびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋ突然変異タンパク質は、二重らせん構造領域に遭遇後、基質の分解を継続することができなかった。
【図３】多発性骨髄腫で見られる突然変異に類似する位置における酵母菌ＤＩＳ３中の突然変異により、増殖異常とエキソソームの機能不全を示す分子の表現型が生じる。（Ａ）示された酵母菌株の連続希釈物はＹＰＤプレート上に置かれ、６０時間にわたって２５°Ｃ、３０°Ｃ、および３７°Ｃでインキュベートされた。Ｖ５６８ＧとＡ５２４Ｐの突然変異は温度感受性をもたらし、その一方でＧ８３３ＲとＲ８４７Ｋの置換によりすべての試験された温度で成長の阻害が生じた。２つのＧ８３３ＲとＲ８４７Ｋの点突然変異は、ｒｒｐ６Δ背景において相乗効果を与えているように思われた。（Ｂ）（Ａ）の場合と同じ株から単離された総ＲＮＡが、典型的なエキソソーム基質に特異的なプローブを用いて、ノーザンブロット解析にかけられた。ＤＩＳ３突然変異（とりわけＧ８３３ＲとＲ８４７Ｋ）により、５’−ＥＴＳ、ＮＥＬ０２５の原因不明の（ｃｒｙｐｔｉｃ）不安定な転写物、および、５．８ＳｒＲＮＡ合成の７Ｓ前駆体（その分解中間物と同様に）の蓄積をもたらした。（Ｃ）構築された単一の突然変異体酵母菌株中の様々なタンパク質Ａをタグ付けされた外因性のＤｉｓ３タンパク質の発現のウェスタンブロット解析。全タンパク質サンプルを様々な酵母菌株から単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離させ、ニトロセルロース膜上に移した。これをその後、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ抗体で調べた。分子量タンパク質ラダーの個々のバンドの質量を左側に示す。Ｄｉｓ３変異体はすべて効率的に発現された。（Ｄ）Ｄｉｓ３  ＰＩＮドメイン中の触媒突然変異は、ＭＭに関連する突然変異に対応するＲＮＢドメイン中の突然変異により合成的に致命的である。１つのＤＩＳ３対立遺伝子がＤ１７１Ｎ突然変異を含み、Ｄｉｓ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性とＧ８３３Ｒ（上）またはＲ８４７Ｋ（下）のいずれかのアミノ酸変化を不活性化している二倍体酵母菌株を胞子にし、胞子を解剖された。各四分子から２つの胞子だけが生存可能だった。数字１−４は個々の四分子に対応している。
【図４】構築されたヒトモデル細胞株の特性付け。（Ａ）構築されたヒト細胞モデルの一般的な原則。ともに双方向テトラサイクリン制御されたプロモーターの管理下にある、１）再コード化された領域を含むＦＬＡＧタグ付けされたｈＤＩＳ３  ＯＲＦの野生型または突然変異バージョン、および、２）ｅＧＦＰ−ｓｈ−ｍｉＲＮＡ融合物を含む、ＢＩ−１６ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ系に対応する）の誘導体が、ＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ細胞株のゲノムに組み込まれた。ドキシサイクリンによる誘発後、生成された安定した細胞株の各々は、内因性のｈＤＩＳ３コピー（ｈＤＩＳ３−ＦＬＡＧをコード化し、ＯＲＦ内にｓｈ−ｍｉＲＮＡ−非感受性の再コード化されたフラグメントを包含する外因性の配列ではない）の発現だけが確実に停止されるような方法で設計された、ｈＤＩＳ３−ＦＬＡＧ融合物とｓｈ−ｍｉＲＮＡの所定の変異体を生成した。ｓｈ−ｍｉＲＮＡの生成はｅＧＦＰ同時発現によってモニターされた。（Ｂ）ｈＤＩＳ３発現のノーザンブロット解析。野生型または突然変異したｈＤＩＳ３バージョンをコード化する外因性の配列を含む細胞株から総ＲＮＡを単離し、誘導しない（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ）（「−ｄｏｘ」のレーン）か、あるいはドキシサイクリン処置にかけた（「＋ｄｏｘ」レーン）。変性アガロースゲル中での電気泳動による分離後に、ＲＮＡを膜上に移し、その後、これを、ｈＤＩＳ３  ＯＲＦ５’−末端部分、またはＧＡＰＤＨ（負荷対照）に相補的なプローブで連続してハイブリダイズした。（Ｃ）ＦＬＡＧタグ付けしたｈＤＩＳ３変異体とｅＧＦＰ−ｓｈ−ｍｉＲ融合物の発現のウェスタンブロット解析；タンパク質サンプルを（Ｂ）と同じ細胞株から調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離させ、ニトロセルロース膜上に移し、その後、これを抗ＦＬＡＧまたは抗ｅＧＦＰ抗体で調べた。ポンソー  Ｓ  Ｒｅｄによる膜の染色を負荷対照として利用した。（Ｄ）３’−５’エキソリボヌクレアーゼ分解活性を示す他のヒトのタンパク質の発現のウェスタンブロット解析。タンパク質サンプルを（Ｃ）のように分析したが、ｈＤＩＳ３Ｌ、ｈＲＲＰ６、またはｈＤＩＳ３Ｌ２に特異的な抗体を使用した。
【図５Ａ】過剰発現された外因性のｈＤＩＳ３変異体は適切な細胞内局在性を示す。（Ａ）ｈＤＩＳ３の様々なＦＬＡＧタグ付けされたバージョンをコード化する外因性の配列を有するモデル細胞株を誘発させ、その後、核のＤＡＰＩ染色と組み合わせて、抗ＦＬＡＧおよび抗フィブリラリン（核小体マーカー）抗体（それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３５および５５５蛍光染料とともに、第２の抗体で検知される）を使用する免疫蛍光検査法にかけた。ｅＧＦＰ蛍光はｅＧＦＰ−ｓｈ−ｍｉＲ融合物の発現をモニターするために使用された。ｈＤＩＳ３−ＦＬＡＧ融合物は核質に集中するように見えたが、核小体からはっきりと除去された。薄い細胞質染色も目に見えた。
【図５Ｂ】過剰発現された外因性のｈＤＩＳ３変異体は適切な細胞内局在性を示す。（Ｂ）細胞を上記のように免疫蛍光検査法によって分析したが、抗ｈＤＩＳ３抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５とともに第２の抗体で検知される）のみを用いた。内因性と外因性の両方のｈＤＩＳ３に対応する信号が核質からのみ生じたが、核小体にはなかった。
【図６Ａ】突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成するモデル細胞株は、様々なＲＮＡクラスを表す転写物を蓄積させる。（Ａ）様々なＲＮＡポリメラーゼによって合成された定常状態レベルのＲＮＡ分子の低分解能ノーザンブロット解析。野生型または突然変異したｈＤＩＳ３バージョンをコード化する外因性の配列を含む細胞株から総ＲＮＡを単離し、誘導しない（「−ｄｏｘ」レーン）か、あるいはドキシサイクリン処置（「＋ｄｏｘ」レーン）にかけた。変性アガロースゲル中での電気泳動分離後に、ＲＮＡを膜上に移した。その後、これをＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ（５．８ＳｒＲＮＡ前駆体）、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ（ヒストンＨ２Ａ  ｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ転写物（ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ、ＲＮａｓｅ  ＭＲＰ  ＲＮＡ、７ＳＬ  ＲＮＡ）を識別するプローブで連続してハイブリダイズした。信号はホスホルイメージングによって視覚化された。誘発後、５．８ＳｒＲＮＡ  ３’−拡張前駆体のレベルの大幅な増加が目に見えたが、その一方でＲＮａｓｅ  Ｐと７ＳＬ  ＲＮＡの場合と同様にヒストンＨ２Ａ転写物では適度な蓄積が見られた。
【図６Ｂ】突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成するモデル細胞株は、様々なＲＮＡクラスを表す転写物を蓄積させる。（Ｂ）５．８ＳｒＲＮＡとその前駆体の高分解能ノーザンブロット解析。（Ａ）の場合と同じＲＮＡサンプルを１時間または２時間、変性ポリアクリルアミドゲル中に分解させた（図の上部の「長時間の実行」）；移動させた後、成熟した５．８ＳｒＲＮＡに、または、その３’縁（前駆体プローブ）の下流にある領域に相補的なプローブで幕をハイブリダイズした。５ＳｒＲＮＡは負荷対照として利用した。成熟した５．８ＳｒＲＮＡレベルの付随する減少を伴うことなく生成された突然変異によるｈＤＩＳ３変異体次第では、わずかに異なる前駆体の蓄積を観察することができた。
【図６Ｃ】突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成するモデル細胞株は、様々なＲＮＡクラスを表す転写物を蓄積させる。（Ｃ）ｔＲＮＡの高分解能ノーザンブロット解析；（Ａ）のものと類似したＲＮＡサンプルを変性ポリアクリルアミドゲル中に分離し、様々なｔＲＮＡに相補的なプローブを使用して、上記のようにさらに分析した。分析されたｔＲＮＡ、およびｔＲＮＡＴｙｒとｔＲＮＡＣｙｓの前駆体の大部分で、とりわけ、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮとｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋのタンパク質を生成する細胞中で、誘発に依存した蓄積が観察された。５．８ＳｒＲＮＡに特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションは、実験の陽性対照として機能した。
【図６Ｄ】突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成するモデル細胞株は、様々なＲＮＡクラスを表す転写物を蓄積させる。（Ｄ）選択されたｓｎ／ｓｎｏＲＮＡｓの高分解能ノーザンブロット解析；（Ａ）のものと類似したＲＮＡサンプルを、３つの異なるＳｎＲＮＡとＵ３  ｓｎｏＲＮＡに特異的なプローブを使用して、上記のように分析した。Ｕ５  ＳｎＲＮＡの場合に誘発に依存した蓄積が顕著であった。７ＳＬ  ＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡに特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションは、実験の陽性対照として機能した。
【図６Ｅ】突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成するモデル細胞株は、様々なＲＮＡクラスを表す転写物を蓄積させる。（Ｅ）様々なｈＤＩＳ３突然変異を有する細胞株中の様々なＰＲＯＭＰＴ領域と対応するタンパク質をコード化する転写物の定量ＰＣＲ分析。グラフは３つの独立した実験の定量化の結果を示す。左側の値はドキシサイクリンで処置した細胞と処置していない細胞中の転写物の倍増を表す。ノーザンブロット解析でｈＤＩＳ３突然変異に対して比較的低感受性であると分かったＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（一例として（Ａ）と呼ぶ）は、正規化目的のために利用された。野生型の対照と比較すると、すべての分析されたＰＲＯＭＰＴの存在量は、Ｄ４８７ＮとＲ７８０Ｋの置換を含むｈＤＩＳ３変異体を生成する細胞で著しく多かった。この効果は、分析されたＰＲＯＭＰＴ領域の３つの下流に位置するそれぞれのプロモーターの制御下で合成されたｍＲＮＡでは見られず、陰性対照として使用された無関係なミトコンドリア転写物−ＡＴＰ６／８でも見られなかった。
【図７】モデル細胞株のポリソームプロファイルの分析。（Ａ）天然の細胞質の抽出物を、外因性のｈＤＩＳ３変異体の発現の誘発にさらされた安定した細胞株から調製し、スクロース勾配の遠心分離によって分離した。グラフは勾配の上（左）から下（右）まで２５４ｎｍの吸収度の分布を示している。個々のリボソームのサブユニット（４０Ｓと６０Ｓ）、モノソーム（８０Ｓ）、およびポリソームに対応するピークが示されている。各勾配から６つの画分を採取した（１−６の番号を付ける）−その縁に垂直な線で印をつける。ポリソームプロファイルは、ｈＤＩＳ３の様々な変異体を生成する細胞株間で変化するようには見えない。（Ｂ）（Ａ）で採取した画分から調製されたＲＮＡサンプルのノーザンブロット解析は、５．８ＳｒＲＮＡ、３’拡張前駆体と、成熟した５．８Ｓおよび５ＳｒＲＮＡ分子（対照）に特異的なプローブを用いて行われた。突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成する細胞株において著しく蓄積する５．８ＳｒＲＮＡ前駆体は、ポリソーム中に存在していた。
【図８】ｈＲＲＰ６発現のｓｉＲＮＡ媒介性の発現停止は、突然変異したｈＤＩＳ３変異体の生成を含む、５．８ＳｒＲＮＡ前駆体の蓄積に対しては重要な相乗効果を有していない。（Ａ）モデル細胞株からのタンパク質サンプルについてウェスタンブロット解析が行なわれた。これらは、ドキシサイクリンでは誘発されず、またはドキシサイクリンで処置され（それぞれドキシサイクリン：「−」または「＋」）、ｈＲＲＰ６に対するｓｉＲＮＡ（抗ｈＲＲＰ６：「＋」）で、または対照の無関係なｓｉＲＮＡ（抗ｈＲＲＰ６：「−」）でトランスフェクトされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した後、これをｈＲＲＰ６に特異的な抗体で調べ、ＦＬＡＧエピトープまたポンソー  Ｓ  Ｒｅｄによる膜のｅＧＦＰ染色を負荷対照として用いた。（Ｂ）５．８ＳｒＲＮＡ前駆体のノーザンブロット解析。（Ａ）と同じ細胞株から総ＲＮＡを単離し、変性アガロースゲル中に分離してナイロン膜上に移した。これをその後、５．８ＳｒＲＮＡ  ３’拡張前駆体（上）または成熟した分子（下）を認識するプローブでハイブリダイズした。
【図９】ＭＭに関連するｈＤＩＳ３突然変異は、ヒト細胞のモデル中の細胞成長と代謝活性に悪影響を及ぼす。（Ａ）細胞成長アッセイ。等量の各細胞株を培養皿上に播種し、ドキシサイクリン媒介性の誘発に晒し（４８時間＋４８時間）、顕微鏡検査法によって分析した。突然変異したｈＤＩＳ３バージョンを有する細胞は野生型のタンパク質を生成するその相当物よりも生育が悪く、成長表現型の強さは以下の通りであった：ｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎ＞ｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋ＞ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ。（Ｂ）細胞競争アッセイ。等量のそれぞれの安定したモデル細胞株と「空の」ＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘを混合し、ドキシサイクリン−媒介性の誘発に晒し、落射蛍光顕微鏡を用いて分析した。蛍光性の／非蛍光性の細胞の比率は、所定のモデル細胞株の生存可能性を反映し、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６ＲまたはｈＤＩＳ３ＷＴのバージョンを合成するその相当物の場合よりも、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮとｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの変異体を生成する細胞の方がはるかに低いことが分かった。（Ｃ）代謝活性アッセイ。それぞれの安定した細胞株を表すほぼ等しい数細胞を９６ウェルプレート中で三通り生育した（ドキシサイクリンで誘発されない：「−ｄｏｘ」、またはドキシサイクリンで処置される：「＋ｄｏｘ」）。指定された期間の後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を細胞に加え、代謝状態の変化を比色定量の測定によって反映した。（Ａ）の結果に一致して、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮとｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒの突然変異体はそれぞれ最も強い表現型と最も弱い表現型をもたらした。
【図１０Ａ】エンドヌクレアーゼ分解活性の原因であるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン中の触媒突然変異は、ＲＮＢドメイン内のＭＭ関連突然変異を含む相乗効果をもたらした。（Ａ）細胞成長アッセイ。等量の各細胞株を培養皿上に播種し、ドキシサイクリンの不在下（−ｄｏｘ）または存在下（＋ｄｏｘ）で成長させ、顕微鏡検査法によって分析した。ｈＤＩＳ３の両方の触媒ドメイン中の突然変異を有するｈＤＩＳ３変異体を生成する細胞株は、ＲＮＢドメイン内でのみ突然変異したアミノ酸を含むｈＤＩＳ３バージョンを生成するそれぞれの細胞株よりも、成長が著しく悪化した。
【図１０Ｂ】エンドヌクレアーゼ分解活性の原因であるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン中の触媒突然変異は、ＲＮＢドメイン内のＭＭ関連突然変異を含む相乗効果をもたらした。（Ｂ）代謝活性アッセイ。それぞれの安定した細胞株を表すほぼ等しい数の細胞を９６ウェルプレートで三通り成長させた（誘発されなかった：「−ｄｏｘ」、またはドキシサイクリンで処置された：「＋ｄｏｘ」）。７２時間にＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を細胞に加え、代謝の状態を比色定量の測定によって評価した。（Ａ）の結果に一致して、ｈＤＩＳ３二重突然変異体を生成する細胞は、完全なＰＩＮドメインを含むタンパク質変異体を表現するその相当物よりも低い代謝活性を示す。
【図１０Ｃ】エンドヌクレアーゼ分解活性の原因であるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン中の触媒突然変異は、ＲＮＢドメイン内のＭＭ関連突然変異を含む相乗効果をもたらした。（Ｃ）ＰＩＮドメインの触媒突然変異は、３’拡張５．８ＳｒＲＮＡ前駆体分子の蓄積を増強しない。５．８ＳｒＲＮＡとその前駆体の高分解能ノーザンブロット解析。ドキシサイクリン処置にすべてさらした、ＰＩＮまたは／およびＲＮＢドメイン中の突然変異を有する、野生型ｈＤＩＳ３またはその変異体を生成する細胞株から、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルを２時間、変性ポリアクリルアミドゲル中に分解させた。ＲＮＡの移動後、ナイロン膜は  成熟した５．８ＳｒＲＮＡに、またはその３’縁の下流にある領域に相補的なプローブでハイブリダイズした（前駆体プローブ）。５ＳｒＲＮＡを負荷対照として利用した。
【図１０Ｄ】エンドヌクレアーゼ分解活性の原因であるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン中の触媒突然変異は、ＲＮＢドメイン内のＭＭ関連突然変異を含む相乗効果をもたらした。（Ｄ）および（Ｅ）様々なｈＤＩＳ３変異体を生成する細胞株中の様々なＰＲＯＭＰＴ領域（Ｄ）と対応するタンパク質をコード化する転写物（Ｅ）の定量ＰＣＲ分析。グラフは３つの独立した実験の定量化の結果を示す。左側の値は突然変異したｈＤＩＳ３対野生型のｈＤＩＳ３を発現している細胞中の転写物の倍増を表す。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡは正規化目的のために利用された。すべての分析されたＰＲＯＭＰＴの存在量は、ＲＮＢドメイン内でのみ突然変異を有するそれぞれのタンパク質（Ｄ）と比較すると、ｈＤＩＳ３二重突然変異体を生成する細胞中で大幅に増加した。分析されたＰＲＯＭＰＴ領域の３つの下流に位置するそれぞれのプロモーターの制御下で合成されたｍＲＮＡについても同じ傾向を観察することができたが、陰性対照（Ｅ）として利用された無関係なミトコンドリア転写物−ＡＴＰ６／８については観察されなかった。
【図１０Ｅ】エンドヌクレアーゼ分解活性の原因であるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン中の触媒突然変異は、ＲＮＢドメイン内のＭＭ関連突然変異を含む相乗効果をもたらした。（Ｄ）および（Ｅ）様々なｈＤＩＳ３変異体を生成する細胞株中の様々なＰＲＯＭＰＴ領域（Ｄ）と対応するタンパク質をコード化する転写物（Ｅ）の定量ＰＣＲ分析。グラフは３つの独立した実験の定量化の結果を示す。左側の値は突然変異したｈＤＩＳ３対野生型のｈＤＩＳ３を発現している細胞中の転写物の倍増を表す。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡは正規化目的のために利用された。すべての分析されたＰＲＯＭＰＴの存在量は、ＲＮＢドメイン内でのみ突然変異を有するそれぞれのタンパク質（Ｄ）と比較すると、ｈＤＩＳ３二重突然変異体を生成する細胞中で大幅に増加した。分析されたＰＲＯＭＰＴ領域の３つの下流に位置するそれぞれのプロモーターの制御下で合成されたｍＲＮＡについても同じ傾向を観察することができたが、陰性対照（Ｅ）として利用された無関係なミトコンドリア転写物−ＡＴＰ６／８については観察されなかった。
【図１１】２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬ）は、ｈＤＩＳ３の単離ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する。Ａ）組み換えｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ）活性アッセイ。２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンの存在下または不在下で、組み換えｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインを有する１ｍＭのマンガンを含んでいるバッファー中で、５’フルオレセイン標識したｓｓ１７−（Ａ）３４基質をインキュベートした。阻害剤を含んでいるが、追加のタンパク質を欠いた制御反応も行なわれた。反応を指定された時点で終了させ、その後、ＰＡＧＥの変性とフルオロイメージング（ｆｌｕｏｒｉｍａｇｉｎｇ）を行った。
【図１２】ＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン活性の阻害剤である２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬ）により、ＷＴ酵母菌ではなく、Ｇ８３３ＲとＲ８４７Ｋの突然変異を有する酵母菌の成長が完全に阻害される。示された酵母菌株の連続希釈物をＹＰＤプレートと、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（１ｍＭ濃度）を含むＹＰＤプレートとに置いて、６０時間３０°Ｃでインキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本明細書で議論されるように、本発明は、ｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌の処置のための治療薬としてもさらに使用することが可能な、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤であるエキソソーム複合体阻害剤の新規な選択方法に関する。好ましくは、ｈＤＩＳ３のＲＮＢドメインは、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４２７−８４３）であり、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−２１７）である。ｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中の突然変異は、好ましくは、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫のような癌で生じる突然変異と同じである。ｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、突然変異Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖから選択されるのが好ましい。本発明はさらに、本発明の方法によって選択される新規なｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤と、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫のようなｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌の処置のための治療薬としてのその使用に関する。ｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中の突然変異は、好ましくは、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病のような癌で生じる突然変異と同じである。ｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、突然変異Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖから選択される。ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤であるエキソソーム複合体組成物の治療薬としての使用は、ＲＮＢドメイン中に既に存在している突然変異と、新規なエキソソーム複合体阻害剤であるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤によるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性の外部によって誘発された阻害との間の合成致死に基づく。
【００５４】
本明細書で使用されるように、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質フラグメント」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指すために区別なく使用される。ポリマーは線形でも分岐してもよく、修飾されたアミノ酸またはアミノ酸アナログを含むこともあり、アミノ酸以外の化学部分によって中断されることがある。こうした用語は、天然に、または介在によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは、標識成分または生物活性成分を含む共役などの他の操作または修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００５５】
本明細書で使用されるような「タンパク質ドメイン」は、タンパク質鎖の残りとは無関係に進化し、機能し、存在することができる、所定のタンパク質配列および構造の保存された部分である。それぞれのドメインはコンパクトな三次元構造を形成し、独立して安定しており、折り畳むことが可能であることが多い。
【００５６】
本明細書で使用されるような「ＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン」はＤＩＳ３リボヌクレアーゼ、好ましくは、エキソリボヌクレアーゼ分解活性を備える酵母菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはヒトの一部である。ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインは、ｈＤＩＳ３タンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３）中のアミノ酸４２７−８４３を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｄｉｓ３  ＲＮＢドメインは、酵母菌Ｄｉｓ３タンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＡＡ  ４７８−９１０）中にアミノ酸４７８−９１０を含む。
【００５７】
本明細書で使用されるような「ＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン」は、ＤＩＳ３リボヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ分解（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を含む、酵母菌（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはヒトの一部である。ヒト細胞のＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは、ＤＩＳ３タンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−１２７）のアミノ酸１−２１７を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｄｉｓ３  ＰＩＮドメインは、酵母菌Ｄｉｓ３タンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＡＡ  １−２４１）中にアミノ酸１−２４１を含む。
【００５８】
「単離した」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その天然環境で関連している材料をほとんど含んでいないものである。
【００５９】
用語「相同」または「同一性」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、２つの配列間の相同の定量的尺度を示す。相同体は基準配列と比較して少なくとも５０％の同一性を有する。好ましくは、相同体は基準配列に対して８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有している。「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」またはその変種は、上に定義されるようなヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性によって特徴づけられる配列を指す。ポリペプチドの配列類似性は配列同一性とも呼ばれ、一般に配列分析ソフトウェアを使用して測定される。本発明では、相同タンパク質配列は、限定されないが、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むヒト以外の種のポリペプチドのタンパク質配列を含んでいる。
【００６０】
本明細書で使用されるように、用語「等価な突然変異」は、ほぼ等価な配列、例えば、互いに異なる位置にあるが互いに対応している、上に定義されるような相同体中の突然変異を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「合成致死」は、遺伝子事象の同時発生と薬剤（治療薬、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤、または薬物のような）の活性が生命体または細胞の死、あるいは選択的な成長の遅れ、とりわけ癌細胞の死をもたらす一種の相互作用を指すことを意図している。
【００６２】
「ベクター」は、生体外か生体内で、標的細胞に送達される異種のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡまたはＲＮＡのプラスミドまたはウイルスを指す。
【００６３】
「組み換え」との用語は、自然には発生しない、あるいは、自然では見られない配置の別のポリヌクレオチドに関連付けられる、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【００６４】
「癌」または「癌性の」という用語は、一般に無秩序な細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物の生理状態を指す、または記載したものである。「腫瘍」は１つ以上の癌細胞を含む。癌の例としては、限定されないが、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病が挙げられる。したがって、本明細書で使用される癌との用語によって、癌と腫瘍の両方を指すものと理解されたい。
【００６５】
「薬学的に許容可能な」との句は、物質または組成物が製剤を含む他の成分と化学的におよび／または毒物学的に適合しなければならないこと、および／または、哺乳動物がそれによって処置されることを示している。
【００６６】
本明細書で使用されるように、「処置する」または「処置」との用語は、治療処置と予防的または再発防止手段の両方を指し、目的は、癌の進行または拡大といった望ましくない生理学的変化または疾患を防ぐまたは遅らせることである。この発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、限定されないが、検知可能であっても検知可能でなくても、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（つまり、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および、緩解（部分的であれ全体的であれ）を含む。「処置」は、処置を受けない際の予想される生存期間と比較して、長期間の生存のことを意味し得ることもある。処置を必要とする者は、すでに疾患または障害を抱えている者だけでなく、疾患または障害を有する傾向にある者、あるいは疾患または障害を防がれる者を含んでいる。癌の場合では、処置は癌細胞の数を減らすこと、癌（腫瘍）サイズを縮小すること、癌細胞または腫瘍の増殖を阻害すること（つまり、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止させること）、および／または、癌に関連した症状の１つ以上をある程度まで和らげることであると理解されなければならない。
【００６７】
化合物に関する用語「誘導体」とは、いくつかの化学的または物理的なプロセスによって同様の化合物に由来する化合物であると理解されるものとする。
【００６８】
ＭＭや他の癌でみられる変異のほとんどはｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の保存された残留物に影響を与え、このことはそれらがこの酵素のエキソヌクレアーゼ分解活性に対して影響を及ぼすことがあるという事実を指摘している（図１Ａ）。これに反して、これらの突然変異のいずれもＰＩＮドメイン内にはなく、ｈＤＩＳ３の第２のエンドリボヌクレアーゼ分解活性にはまったく関与しない（図１Ａ）。
【００６９】
本出願人らは、ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒ、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ、およびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋ変異体のようにＭＭ患者で観察されたｈＤＩＳ３遺伝子中の複数の突然変異が、ｈＤＩＳ３タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ分解活性を著しく減少させることを発見した（図１のＣと図２）。Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、およびＲ７８０Ｋ突然変異と、５’−末端標識されたＲＮＡ基質（以下の実施例１で使用されるように）を有する、ｈＤＩＳ３の組み換え変異体を使用して行なわれた生化学的アッセイにより、全体的な活性が減少するだけでなく、ＭＭ患者で見られる突然変異が最終的な分解産物のパターン、酵素の処理能力、およびＲＮＡ分子の構造化した領域を分解する能力が変化したことが示されている。
【００７０】
これを支持して、本出願人らは、導入されたアミノ酸を含む内因性のＤｉｓ３を発現する酵母菌株がＭＭ患者で見られるもの（ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ（ヒトにおけるＧ７６６Ｒ）、ｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ（ヒトにおけるＲ７８０Ｋ）、ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ（ヒトにおけるＶ５０４Ｇ）、およびｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ（ヒトにおけるＡ５２４Ｐ）など）の等価物に変化することをさらに実証しており、様々な強度の成長欠陥を示している。これはエキソソーム機能不全に典型的な分子表現型を伴う（図３Ａ、３Ｂ）。さらに、酵母菌中のＮ末端基ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性のさらなる不活性化が、ＲＮＢドメイン中のＭＭのようなＤｉｓ３突然変異で合成致死性であり、タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ分解活性に悪影響を及ぼすことが思いがけず示されている（図３Ｄ）。ヒトと酵母菌のエキソソームには違いがあるため、十分に保存された構造であるにもかかわらず、ヒトモデルも出願人によって構築された。ＭＭ患者で観察されたｈＤＩＳ３突然変異を有するヒト細胞が野生型のｈＤＩＳ３バージョンを発現するその相当物よりも成長が遅く、低い代謝活性を示すことが思いがけずに分かった（図９）。成長障害は３つのヒトＲＮＡポリメラーゼすべてによって合成されたＲＮＡ分子の蓄積とよく相関する。５．８ＳｒＲＮＡ前駆体と不安定な非コード化転写物−ＰＲＯＭＰＴの場合に、最も強力な蓄積が観察される（図６）。
【００７１】
ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ分解活性の不活性化は、ＲＮＢドメイン内のＭＭに関連する突然変異で相乗的に作用し、成長異常の増大とＰＲＯＭＰＴのさらなる蓄積を引き起こすこと分かった（図１０）。この発見は、酵母菌の場合に得られる同様の結果とあわせて、ＰＩＮドメインが、髄芽腫、急性骨髄性白血病、および、とりわけ多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるｈＤＩＳ３のＲＮＢドメインで生じる変化などのｈＤＩＳ３リボヌクレアーゼのＲＮＢドメイン中の突然変異を好ましくは有する、改変したｈＤＩＳ３活性を有する癌の治療で使用され得る新規な治療薬を設計するための非常に有効なターゲットであることが思いがけず実証した。
【００７２】
さらに、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬ）がｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン活性の阻害剤として作用し、かつ、ＤＩＳ３  ＭＭに関連する突然変異を備えた細胞の成長を選択的に阻害することができることが出願人によって示された。
【００７３】
したがって、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤、とりわけ、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬ）、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩は、ｈＤＩＳ３突然変異を有する、髄芽腫、急性骨髄性白血病、とりわけ多発性骨髄腫細胞のような癌細胞を特異的に標的とするために使用されてもよい。これらの癌中のｈＤＩＳ３のＲＮＢドメインの突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、突然変異Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖから選択されるのが好ましい。
【００７４】
本明細書に記載されるＲＮＡ基質の生体外消化に基づいた生体外アッセイは、精製ｈＤＩＳ３タンパク質、そのフラグメント（単離したＰＩＮドメインの組み換えバージョンなど）または相同体と使用とあわせて、新規なｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングする際にも使用されることがある。精製ｈＤＩＳ３タンパク質またはその単離させたＰＩＮドメインは、異種発現後に細菌、好ましくは大腸菌から得られたり精製されたりすることがある。好ましくは、単離ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−２１７で開示された配列を含む。ＲＮＡ基質は例えば５’フルオレセイン標識されたｓｓ１７−（Ａ）−３４であってもよい。試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性の評価は、変性ＰＡＧＥとフルオロイメージングなどの当業者に周知の任意の手段によって評価されてもよい。本方法を用いて発見された治療薬は、ｈＤＩＳ３突然変異、好ましくは多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病のようなｈＤＩＳ３のＲＮＢドメイン中の突然変異を有する癌の癌治療で使用されるのが好ましい。
【００７５】
本明細書で記載されるように、ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ（ヒトにおけるＧ７６６Ｒ）、ｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ（ヒトにおけるＲ７８０Ｋ）、ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ（ヒトにおけるＶ５０４Ｇ）、ｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ（ヒトにおけるＡ５２４Ｐ）のようなＭＭ患者で見られるものと等価のアミノ酸変化を導入された内因性のＤｉｓ３を発現する酵母菌株は、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤である新規な治療薬をスクリーニングする際にも適用されてもよい。こうした薬剤は、酵母菌増殖培地に加えられると前述の酵母菌株の成長を阻害する能力によって検知されることがある。エキソソーム機能はこうした酵母菌株について評価され、試験済みの薬剤の存在下と不在下で育てられた酵母菌と比較されることがある。エキソソーム機能の評価は、当業者に知られている任意の手段によって、例えば、全ＲＮＡの単離、さらには、５’−ＥＴＳ、ＮＥＬ０２５の原因不明の不安定な転写物、および、５．８ＳｒＲＮＡ合成の７Ｓ前駆体（その分解中間物と同様に）などの典型的なエキソソーム基質に特異的なプローブを使用するノーザンブロット解析によって行われてもよい。この方法で発見された治療薬は、好ましくは、ｈＤＩＳ３突然変異、好ましくは多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病のようなｈＤＩＳ３のＲＮＢドメイン中の突然変異を有する癌の癌治療で使用されてもよい。
【００７６】
本明細書に記載される改変されたヒト細胞株アッセイは、新しいＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングする際にも使用されることがある。例えば、ＭＭのような突然変異を有するｈＤＩＳ３変異体を生成するヒトモデルの安定した細胞株は、トランスフェクションのためのベクターを用いて得られることがあり、ベクターは、以下を発現する双方向誘導可能なプロモーターを含む：
−内因性のｈＤＩＳ３コピーを発現停止させることができるｓｈ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および、
−突然変異を匿い、癌患者で見られる突然変異に対応し、および、ｓｈ−ｍｉＲＮＡ活性に対する感受性をなくさせるために再コードされたフラグメントを含んでいる、外因性のｈＤＩＳ３変異体。
【００７７】
ベクターはさらにｅＧＦＰのようなマーカー遺伝子を含むことがある。本発明のベクターはｐＭＭ９またはｐＭＭ１０のヌクレオチド配列を含むことがある。
【００７８】
この種のベクターは所望のｈＤＩＳ３変異体を発現するヒト細胞株の構築を可能にする。本発明のこうした改変されたヒト細胞株は当業者に知られている任意の手段によってエキソソーム機能の評価のために使用されてもよい。
こうした方法は、例えば、ｈＤＩＳ３の内因性のコピーを発現停止させるｍｉＲＮＡの発現の誘発と、外因性のｈＤＩＳ３変異体の発現の誘発の後に、細胞の細胞成長を評価する工程を含むこともある。これは顕微鏡検査法（好ましくは蛍光顕微鏡検査法）および／またはフローサイトメトリーによって行われることもある。さらに、これに、細胞の生存率評価（好ましくは細胞代謝活性に高感度なアッセイ、例えば、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））を組み合わせることもある。エキソソーム機能の評価は、５．８Ｓ処理中間物、ｔＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、およびＰＲＯＭＰＴのようなエキソソーム基質を調べることを含んでもよい。これは、例えば、内因性のｈＤＩＳ３コピーのｓｈ−ｍｉＲＮＡサイレンシングの発現の誘発と、外因性のｈＤＩＳ３変異体の発現の同時誘発の後に、全ＲＮＡの単離によって達成されてもよい。これは低または高分解能のノーザンプロットを伴うこともある。単離ＲＮＡはＤＮＡに逆転写されてもよく、ＰＣＲまたはＲｅａｌＴｉｍｅ  ＰＣＲなどの方法を用いてさらに分析されてもよい。
【００７９】
特定の癌患者で見られる突然変異を有するＲＮＡ基質と精製されたｈＤＩＳ３タンパク質に基づく本明細書で開示された生体外アッセイは、癌患者で見られる新しいｈＤＩＳ３突然変異のエキソソーム機能に対する効果を評価するために、および、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を用いる将来の治療に対する特定の突然変異を備えた癌細胞の潜在的な感受性を評価するために使用されてもよい。特定の癌患者で見られる突然変異を有する精製されたｈＤＩＳ３タンパク質は、野性型ｈＤＩＳ３配列の組み換え変異体として調製され、かつ、異種発現後に細菌、好ましくは大腸菌から精製されることもある。ＲＮＡ基質は、例えば、ＵＴＰで均一に標識された生体外の転写ＲＮＡ基質であってもよく、あるいは、別の例として、５’−末端標識されたＲＮＡ基質（以下の実施例１で使用されるように）であってもよい。
【００８０】
試験済みの薬剤の存在下と不在下で特定の癌患者で見られる突然変異を有するｈＤＩＳ３タンパク質の活性の評価は、ＲＮＡ基質の標識化に依存して、ＴＬＣ、あるいは変性ＰＡＧＥおよびホスホルイメージングなどの当業者に周知の任意の手段によって評価されてもよい。
【００８１】
癌患者で見られるものと選択的に等価なアミノ酸変化を導入された内因性のＤｉｓ３を発現する酵母菌株に基づく本明細書に記載された酵母菌方法は、癌患者で見られる新規なｈＤＩＳ３突然変異のエキソソーム機能に対する効果を評価するために、および、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を用いる将来の治療に対する特定の突然変異を備えた癌細胞の潜在的な感受性を評価するために、使用されてもよい。こうした突然変異体の酵母菌株中のエキソソーム機能の評価は、当業者に知られている任意の手段によって、例えば、全ＲＮＡの単離によって、さらに、５’−ＥＴＳ、ＮＥＬ０２５の原因不明の不安定な転写物、および、５．８ＳｒＲＮＡ合成の７Ｓ前駆体（その分解中間物と同様に）などの典型的なエキソソーム基質に特異的なプローブを使用するノーザンブロット解析によって行われてもよい。
【００８２】
本発明のベクターは、特定の変異体についてｈＤＩＳ３タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ分解活性を評価するべく患者の癌細胞で見られる特定の突然変異のために改変されたヒト細胞株を得るために、および、さらに、エキソソーム複合体阻害剤、好ましくはｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン阻害剤を使用する治療に対する特定の突然変異を備えた癌細胞の潜在的な感受性を評価するためにも用いられてもよい。こうした改変されたヒト細胞株は、当業者に知られている任意の手段によってエキソソーム機能の評価に使用されてもよい。こうした方法は、例えば、ｈＤＩＳ３の内因性のコピーを発現停止させるｍｉＲＮＡの発現の誘発と、外因性のｈＤＩＳ３変異体の発現の誘発後に、細胞の細胞成長を評価する工程を含むことがある。これは顕微鏡検査法（好ましくは、蛍光顕微鏡検査法）および／またはフローサイトメトリーによって実行されてもよい。これに、細胞の生存率評価（好ましくは細胞代謝活性に高感度なアッセイ、例えば、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））を組み合わせることもある。エキソソーム機能の評価は、５．８ＳｒＲＮＡ処理中間物、ｔＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、およびＰＲＯＭＰＴのようなエキソソーム基質を検査することを含んでもよい。これは、例えば、内因性のｈＤＩＳ３コピーのｓｈ−ｍｉＲＮＡサイレンシングの発現の誘発と、外因性のｈＤＩＳ３変異体の発現の同時誘発の後に、全ＲＮＡの単離によって実行されてもよい。これは低または高分解能のノーザンプロットを伴うこともある。単離ＲＮＡはＤＮＡに逆転写されてもよく、ＰＣＲまたはＲｅａｌＴｉｍｅ  ＰＣＲなどの方法を用いてさらに分析されてもよい。
【００８３】
本発明とその利点が詳細に記載されてきたが、添付の請求項で定義されるような本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変化、置換、および変更を本明細書で行うことができることが理解されよう。
【００８４】
本発明は以下の実施例でさらに記載されるが、実施例は実例目的のためだけに与えられるもので、いかなる方法でも本発明を制限することを意図していない。
【実施例】
【００８５】
以下の例において、特に指定のない限り、標準的な材料と方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．らの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ」に記載されるように使用されるか、あるいは、メーカーの推奨する特定の材料と方法に従って行われる。
【００８６】
（菌種）
以下の大腸菌株が使用された：ＭＨ１（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ａｒａＤ  ｌａｃＸ７４  ｇａｌＵ  ｈｓｄＲ  ｈｓｄＭ  ｒｐｓＬ）、ｄａｍ−／ｄｃｍ−  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ａｒａ−１４  ｌｅｕＢ６  ｆｈｕＡ３１  ｌａｃＹ１  ｔｓｘ７８  ｇｌｎＶ４４  ｇａｌＫ２  ｇａｌＴ２２  ｍｃｒＡ  ｄｃｍ−６  ｈｉｓＧ４  ｒｆｂＤ１  Ｒ（ｚｇｂ２１０：：Ｔｎ１０）  ＴｅｔＳ  ｅｎｄＡ１  ｒｓｐＬ１３６  （ＳｔｒＲ）  ｄａｍ１３：：Ｔｎ９  （ＣａｍＲ）  ｘｙｌＡ−５  ｍｔｌ−１  ｔｈｉ−１  ｍｃｒＢ１  ｈｓｄＲ２），  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｂ  Ｆ−  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ（ｒＢ−  ｍＢ−）  ｄｃｍ＋  Ｔｅｔｒ  ｇａｌ  ｅｎｄＡ  Ｈｔｅ  ［ａｒｇＵ  ｉｌｅＹ  ｌｅｕＷ  Ｃａｍｒ］）．
【００８７】
（酵母菌株）
野生型のＤｉｓ３ｐと、タンパク質Ａタグ−ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位およびＴＲＰ選択マーカー（ＡＤＺＹ５３２；ｗｔとも呼ばれる）との融合をコード化するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、相同遺伝子組換えによって作成された、半数体のＢＭＡ６４（ＭＡＴａ  ａｄｅ  ２−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｌｅｕ２−３，１１２  ｔｒｐ１＊  ｕｒａ３−１  ｃａｎ１−１００）の誘導体であった（Ｐｕｉｇら、２００１）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ｄｉｓ３−Ｄ５５１Ｎ突然変異体は事前に構築された（Ｄｚｉｅｍｂｏｗｓｋｉら、２００７）。ｒｒｐ６Δ株は、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆからのものであった（ａｃｃ．  ｎｏ．：  Ｙ１１７７７；  ＢＹ４７４２  ＭＡＴα  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ＹＯＲ００１ｗ：：ｋａｎＭＸ４）。
【００８８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ、ｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ、ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ、およびｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ突然変異体は実施例ＩＩで指定されるように構築された。
【００８９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤＺＹ５３１は以下のように構築された。Ｄ１７１Ｎ突然変異は、生体内の組み換えによってＢＭＡ６４野性型の半数体株中のＤＩＳ３遺伝子に導入された。最初に、Ｄ１７１Ｎ突然変異を有するＤＩＳ３遺伝子のフラグメントが、テンプレートとして、ＡＤＺＫＤ１０６（ＣＧＧＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＴＴＧＣＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）とＡＤＺＫＤ１１０プライマー（ＧＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）とｐＢＳ３２７８ベクター（Ｌｅｂｒｅｔｏｎら、２００８）を使用して増幅された。ＤＩＳ３遺伝子の残りの部分は、タンパク質Ａタグ−プロテアーゼＴＥＶ開裂部位とＴＲＰ選択マーカーとともに、テンプレートとして、ＡＤＺＫＤ１１１（ＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＴＣＴＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）とＡＤＺＫＤ１０７（ＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＴＧＧＧＣＣＣＣＣＧＧＴＴＣＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）プライマーと、ＡＤＺＹ５３２から単離させたゲノムＤＮＡを用いて増幅された。最後の工程では、オーバーラップＰＣＲは、ＡＤＺＫＤ１０６とＡＤＺＫＤ１０７プライマーと、両方のフラグメントを結合するために上記の反応で得られた両方の増幅産物を用いて行われた。最終的なＰＣＲ生成物を用いた半数体のＢＭＡ６４株の形質転換により、株ＡＤＺＹ５３１が得られた。
【００９０】
すべての制限酵素とＴ４  ＤＮＡリガーゼはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのものであった。ＣＩＰはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのものであった。すべてのＤＮＡ精製キット：ＤＮＡプラスミドミニ、ＤＮＡプラスミドＭｉｄｉ、およびＧｅｌ−ＯｕｔはＡ＆Ａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのものであった。Ｔ４  ＰＮＫはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからのものであった。ＰＣＲ反応はＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行われた。
【００９１】
表６では、以下の実施例で得られるｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン突然変異、酵母菌株または細胞株中のそれの等価物、そのような突然変異体に関して観察された効果が集められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００９２】
【特許文献１】米国特許５，３５９，６１８号
【特許文献２】米国特許５，１６４，９４９号
【特許文献３】米国特許５，３２５，３８６号
【特許文献４】米国特許５，０７３，０４１号
【特許文献５】米国特許５，８１２，５７１号
【００９３】
実施例Ｉ
ＭＭ関連突然変異を有する幾つかのｈＤＩＳ３遺伝子バージョンによってコード化されたタンパク質は、異なるＲＮＡ基質の分解において様々な欠損を示す。
オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびクローニング。
大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ株を使用した。テンプレートとして（野生型ｈＤＩＳ３；Ｔｏｍｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ｂをコード化する）ｐＨＥＸ１構築物を使用して、表１に示されるオリゴヌクレオチド対との部位特異的変異誘発によって、（大腸菌中の様々なｈＤＩＳ３バージョンの異種発現のための）プラスミドｐＭＭ１、ｐＭＭ２、ｐＭＭ３、ｐＭＭ４、ｐＭＭ５およびｐＭＭ６を生成した。
【００９４】
【表１】
2016526877.tif 000003
【００９５】
ＰｓｔＩ、ＭｌｓＩ、ＸｍａＪＩ、ＢｓｈＴＩ、Ｐｓｐ１４０６ＩおよびＥｃｏ１４７Ｉの制限酵素での消化、およびプライマーを使用するｈＤＩＳ３挿入物の配列決定によって、それぞれ、Ｓ４７７Ｒ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０ＫおよびＩ８４５Ｖの突然変異の存在を確認した（表２）。
【００９６】
【表２】
2016526877.tif 000004
【００９７】
Ｄ４８７Ｎ突然変異を有するｈＤＩＳ３をコード化する、ｐＨＥＸ８構築物 − ＲＮＢドメインの純種の触媒性の突然変異体（Ｔｏｍｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ｂ）も比較に使用した。
【００９８】
ｈＤＩＳ３タンパク質の異種発現および精製。
異なるｈＤＩＳ３バージョンの精製のために、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、適切なプラスミド（ｐＨＥＸ１、ｐＨＥＸ８、ｐＭＭ１、ｐＭＭ２、ｐＭＭ３、ｐＭＭ４、ｐＭＭ５、ｐＭＭ６）で形質転換した。形質転換体の成長および更なるタンパク質の分離を、標準手続に従って行った。タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のニッケル親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過によって天然の抽出液から精製した。すべての工程を、ＡＥＫＴＡｘｐｒｅｓｓの装置を使用して自動的に行った。タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の電気泳動によって評価した。標準としてＢＳＡの連続希釈液を使用してＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色したゲルの濃度測定分析によって、タンパク質量を推測した。ＭＭ患者に見られる野生型の、触媒性の突然変異体および変異体に対応する得られた精製したｈＤＩＳ３変異体を、生体外の生化学アッセイにおいてさらに使用した。
【００９９】
生体外の生化学アッセイの基質の調製。
オリゴリボヌクレオチド：
ｓｓ１７−Ａ１４， ｒ（ＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＵＣＡＣＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）， ｓｓ４４， ｒ（ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）およびｃｏｍｐｌ， ｒ（ＡＡＧＵＧＡＵＧＧＵＧＧＵＧＧＧＧ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）を、電気泳動、切除および溶出によって精製した。基質の５’−末端標識化を、Ｔ４ ＰＮＫ（ＮＥＢ）および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。すべての標識化した一本鎖ＲＮＡ基質を、電気泳動に従ってさらに精製した。ｄｓ１７−（Ａ）１４の部分的ＲＮＡ二本鎖を、１：１．２モル比で非放射性の一本鎖のオリゴリボヌクレオチドｓｓ１７−（Ａ）１４とｃｏｍｐｌを混合することによって調製し、標準状態で放射性標識したｓｓ１７−（Ａ）１４オリゴを加えた。［α−３２Ｐ］ＵＴＰおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）の存在下で、テンプレートとしてＳａｌＩで消化されたｐＬｓｍ１プラスミドを使用して行われた生体外の転写によって、内部標識したＲＮＡを得た。放射性標識した転写物を、抽出し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えたＳｐｉｎ Ｍｏｄｕｌｅｓ （ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）において遠心分離によってさらに精製した。
【０１００】
Ｐｒｏｆ． Ｊｏａｎｎａ Ｋｕｆｅｌ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｒｓａｗ）によって快く提供された、内部標識したＲＮＡを調製するために使用される、ｐＬｓｍ１プラスミドは、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ Ｌｓｍ１タンパク質に対応するオープン・リーディング・フレームの挿入物を包含するヌクレオチド（ｉｎｓｅｒｔ ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）１−３８７を備えるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙである。
【０１０１】
エキソリボヌクレアーゼアッセイ。
ｈＤＩＳ３ エキソリボヌクレアーゼ分解活性の生体外の酵素アッセイを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；７５ｍｍのＮａＣｌ；１ｍＭの２−メルカプトエタノール，１００μＭのＭｇＣｌ２中で行った。タンパク濃度は０．１μＭであったが、一方で、基質濃度は、二本鎖ＲＮＡ分子および非構造化（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）ＲＮＡ分子に対して、それぞれ、０．２μＭまたは２μＭであった。ゲルベースの分析に関して、反応を、示された時間の間３７℃で実行し、その後、ホルムアミド充填色素（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）によって終了した。反応生成物を、変性の２０％のポリアクリルアミド、８Ｍの尿素、１ｘＴＢＥのゲル中に溶解した。ＴＬＣベースの実験の場合には、サンプルを、分割量の反応混合物と０．５ＭのＥＤＴＡ、１μｌとを混合することによって収集し、続いて、マーカーとして非放射性のＵＭＰを使用して、０．５ＭのＬｉＣｌ／１Ｍのギ酸中のＰＥＩセルロースプレート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にそれらを流す（ｒｕｎｎｉｎｇ）ことによって分析した。両方のタイプの分析に関して、反応生成物を、ＦＵＪＩ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して視覚化した。
【０１０２】
エキソヌクレアーゼ分解活性を分析するために、ｈＤＩＳ３タンパク質の組み換えバージョン（野生型またはＭＭで検出された異なる突然変異を有するもののいずれか）を、異種過剰発現に従って大腸菌から精製した。ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒ、ｈＤＩＳ３Ｖ５０４Ｇ、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ、ｈＤＩＳ３Ｒ７８０ＫおよびｈＤＩＳ３Ｉ８４５Ｖの突然変異タンパク質は、うまく精製された（図１のＢ）が、ｈＤＩＳ３Ａ５２４Ｐの組み換えバージョンを得ることが困難であると証明され、これは、利用された発現条件にかかわらず不溶性であった。平行して、２つの対照ｈＤＩＳ３変異体を精製した：強力なエキソリボヌクレアーゼ分解活性を以前に示した、ｈＤＩＳ３ＷＴ、およびｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎ − そのアミドで置換されたＲＮＢドメインの活性部位においてマグネシウムを調整するアスパラギン酸残基の１つを有する触媒不活性突然変異体（Ｔｏｍｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０ｂ；ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮがｈＤＩＳ３ＲＮＢ ＭＵＴとして言及される、補足の図Ｓ６を参照）。上に言及されたタンパク質バージョンはすべて、類似した効率とともに得られ、すべての場合において、比較可能な程度の純度を達成することが可能であった − 質量分析によって特定された唯一の顕著な汚染物質は、細菌性のＤｎａＫのシャペロンであって、そのレベルは、この特定の変異体のより低い溶解性が恐らく原因で（図１のＢ）、ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒに対してわずかに増加した。
【０１０３】
その後、事前の生化学的実験を、すべての精製したｈＤＩＳ３変異体およびＵＴＰで一様に標識化された生体外で転写したＲＮＡ基質を使用して行った。標準的なＴＬＣ方法によるそのようなＲＮＡ基質の分解の時間経過ベースの分析によって、エキソリボヌクレアーゼ分解活性に対する個々の突然変異の影響を一時的に評価することが可能となった。タンパク質の分解の可能性が、ｈＤＩＳ３Ｖ５０４ＧおよびｈＤＩＳ３Ｉ８４５Ｖの場合にはほぼ不変であった（すなわち、ＲＮＡ分解の速度が、ｈＤＩＳ３ＷＴと比較可能であった）一方で、ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒ、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６ＲおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの変異体に対する活性が深刻に減少した（図１のＣ）ことが留意された。ｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋに関して、表現型は、ＲＮＢドメインの純種の触媒性の突然変異体−ｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎに対して観察されたものに非常によく類似していた（図１のＣ）。
【０１０４】
より質的に野生型のタンパク質に関連する異なるｈＤＩＳ３突然変異によって引き起こされたＲＮＡ分解の欠損を評価するために、生化学アッセイを、様々な５’−末端標識化オリゴリボヌクレオチド基質、すなわち、１）１７−ｍｅｒの包括的な（ｇｅｎｅｒｉｃ）配列に続いて、１４−ヌクレオチド長のオリゴ（Ａ）テイル（５’Ｐ＊−ｓｓ１７−（Ａ）１４）から構成される、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド；２）４４−ｍｅｒの、欠乏（ｌａｃｋｉｎｇ）オリゴ（Ａ）伸長（５’Ｐ＊−ｓｓ４４）および３）１７−ヌクレオチド二本鎖に続いて、１４−ｎｔ長のオリゴ（Ａ）テイル（５’Ｐ＊−ｄｓ１７−（Ａ）１４）を含有している構造化基質、の上で行い、崩壊生成物を、変性のポリアクリルアミドゲルにおいて分析した（図２）。ｈＤＩＳ３Ｉ８４５ＶおよびｈＤＩＳ３Ｖ５０４Ｇの突然変異体の場合には、最終分解生成物のパターンが、すべての基質に対するｈＤＩＳ３ＷＴ対照について全く同じであったことが認識された（図２Ａ−Ｃ）。しかしながら、分解速度は、ｈＤＩＳ３ＷＴおよびｈＤＩＳ３Ｉ８４５Ｖの対照物と比較したときに、ｈＤＩＳ３Ｖ５０４Ｇ変異体に対してわずかによりゆっくりであった。これに反して、残りの突然変異は、ｈＤＩＳ３機能に対して明白な影響があった。最も顕著だったのは、Ｒ７８０Ｋであり、これは、触媒性のＤ４８７Ｎ突然変異に類似した、両方の一本鎖基質のエキソヌクレアーゼ分解の実質的に完全な阻害につながり（図２Ａ、Ｂ）、これは、図１のＣに示される、ＴＬＣ分析の結果をうまく確証していた。一方、ｈＤＩＳ３Ｓ４７７ＲおよびｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒの変異体は、ｈＤＩＳ３ＷＴと比較して、最終分解生成物の比率の変化に存在する、５’Ｐ＊−ｓｓ１７−（Ａ）１４基質上のわずかにより軽度の欠損を示し：ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒについては、４−ｎｔ長の崩壊生成物のレベルは減少し、一方でｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒの場合には、５−ｎｔ長の分解生成物の量の減少を犠牲にして、それは増加した（図２Ａ）。その上に、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ突然変異体は、処理能力を失ったようであり、５’Ｐ＊−ｓｓ４４基質の存在下で離散性になった（図２Ｂ）。重要なことに、部分的に二本鎖の５’Ｐ＊−ｄｓ１７−（Ａ）１４の基質の場合には、ｈＤＩＳ３Ｓ４７７Ｒ、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６ＲおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋは、一本鎖伸長を消化するように見えたが、一方で、それらはすべて、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎの触媒性の突然変異体の場合のように、たとえ部分的な二本鎖の分解が完全には止められなくても、基質における二次構造との遭遇で停止した（この効果は、Ｒ７８０Ｋ突然変異を有するｈＤＩＳ３変異体に対して顕著であった）（図２Ｃ）。
【０１０５】
結論として、異なる技術を利用して及び様々なＲＮＡ基質を使用して実行された生化学アッセイの結果は、以下のアミノ酸置換基：Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６ＲおよびＲ７８０ＫにつながるｈＤＩＳ３遺伝子中の突然変異が、ｈＤＩＳ３エキソリボヌクレアーゼ分解活性の著しい異常を引き起こす一方で、Ｖ５０４ＧおよびＩ８４５Ｖの場合には、効果が、あったとしても、よりわずかなものであることを強く示した。
【０１０６】
実施例ＩＩ
ＭＭ患者に見られる突然変異に対応する酵母ＤＩＳ３遺伝子の突然変異は、細胞成長の欠損および分子表現型を引き起こし、エキソソーム機能の障害につながる。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（酵母菌株）および突然変異体の構成。
ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ、ｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ、ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒおよびｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋの突然変異体（対応するヒトのアミノ酸変化についての図１のＡを参照）を、以下のように構築した。二倍体ＢＭＡ６４株を、それぞれの突然変異を有するＤＩＳ３遺伝子、タグ（ＴＥＶプロテアーゼ切断部位および配列コード化プロテインＡを包含する）およびＴＲＰ選択マーカーを含有しているＤＮＡフラグメントで形質転換した。最初に、ＤＩＳ３遺伝子の２部位（ｐａｒｔｓ）を、２つの独立した増幅において生成した：Ｄｉｓ３ｐコード化配列の上流に位置する配列に相補的な、ＡＤＺＫＤ１０６フォワードプライマーおよび突然変異した部位を包含する適切なリバースプライマーＡＤＺＫＤ１３４、ＡＤＺＫＤ１３６、ＡＤＺＫＤ１３８、ＡＤＺＫＤ１４０を使用する５’；および突然変異した部位を包含する適切なフォワードプライマーＡＤＺＫＤ１３３、ＡＤＺＫＤ１３５、ＡＤＺＫＤ１３７、ＡＤＺＫＤ１３９、およびＴＲＰ選択マーカーの下流の配列に相補的なＡＤＺＫＤ１０７リバースプライマーを用いる３’。プライマー、それらの配列および突然変異体の構成は、以下の表３に明記される。
【０１０７】
【表３】
2016526877.tif 000005
【０１０８】
ＡＤＺＹ５３２（ｗｔ）株から単離された総ゲノムＤＮＡは、すべての前述の増幅におけるテンプレートとして作用した。所望の突然変異を有する全長アンプリコンを、重複ＰＣＲ（ここで、５’および３’の増幅の生成物はテンプレートとして作用した）におけるＡＤＺＫＤ１０６およびＡＤＺＫＤ１０７のプライマーとともに得て、続いて、形質転換に使用した。選択した形質転換体を、胞子形成し、胞子を切開した。ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ突然変異を有する胞子は、株ＡＤＺＹ６７９、ｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ−ＡＤＺＹ６８１、ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ−ＡＤＺＹ７８３およびｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ−株ＡＤＺＹ６８５を与えた。Ｖ５６８Ｇ、Ａ５８８Ｐ、Ｇ８３３ＲおよびＲ８４７Ｋの突然変異の存在は、ＡＤＺＫＤ１４５（ＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７）−ＡＤＺＫＤ１４６（ＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８）のプライマー対を使用するゲノムＤＮＡフラグメントの増幅に続いて、それぞれ、ＭｌｓＩ、ＡｐａＩ、ＢｓｈＴＩおよびＰｓｐ１４０６Ｉの制限酵素でのＰＣＲ生成物の消化によって確認された。最終的に、ＯＲＦ配列の精度は、プライマーを使用して、得られたＰＣＲ生成物の配列決定によって確証された：
ＲＴＡＤＺ−９：ＧＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＡＧＧＧＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９）、
ＲＴＡＤＺ−２７：ＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０）、
ＡＤＺＫＤ１５１：ＣＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１）、
ＡＤＺＫＤ１５２：ＣＡＣＣＧＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＣＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２）、
ＡＤＺ１６０１：ＧＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＡＴＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３）、
ＲＴＡＤＺ−６８：ＡＧＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４４）、および
ＡＤＺ１６０３：ＧＡＣＡＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５）。
ｒｒｐ６Δｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒおよびｒｒｐ６Δｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ株を、ＡＤＺＹ７８３またはＡＤＺＹ６８５のいずれかでのｒｒｐ６Δ株の交雑を介して得た。胞子を切開し、二重突然変異体を選択した。ＤＩＳ３ Ｇ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋの突然変異のいずれかと一緒にＲＲＰ６欠失を有する胞子は、それぞれ、株ＡＤＺＹ７３２およびＡＤＺＹ７４２を与えた。
【０１０９】
Ｄｉｓ３−ｄｉｓ３−Ｄ１７１Ｎ Ｇ８３３Ｒ−ｐＡ／ＤＩＳ３ ＷＴ（ＡＤＺＹ７１３）およびｄｉｓ３−Ｄ１７１Ｎ Ｒ８４７Ｋ−ｐＡ／ＤＩＳ３ ＷＴ（ＡＤＺＹ７１６）のＰＩＮおよびＲＮＢのドメインの両方における突然変異を有する二倍体株を、以下のように得た。
二倍体ＢＭＡ６４株を、Ｄ１７１Ｎ突然変異（ＰＩＮドメインにおける突然変異）、Ｇ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋ突然変異（ＲＮＢドメインにおける突然変異）をそれぞれ有するＤＩＳ３遺伝子、タグ（ＴＥＶプロテアーゼ切断部位および配列コード化プロテインＡを包含する）およびＴＲＰ選択マーカーを含有しているＤＮＡフラグメントで形質転換した。最初に、ＤＩＳ３遺伝子の２部位を増幅した：テンプレートとしてＡＤＺＫＤ１０６−ＡＤＺＫＤ１４１（ＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＧＣＡＴＴＣＡＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６）プライマー対およびＡＤＺＹ５３１株から単離された総ゲノムＤＮＡ（ＤＩＳ３遺伝子座はＰＩＮドメインにおいてＤ１７１Ｎ突然変異を含有している）を使用する、５’；およびテンプレートとしてＡＤＺＫＤ１４２（ＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＴＡＧＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７）−ＡＤＺＫＤ１０７プライマー対を用い、それぞれ、ＡＤＺＹ７８３またはＡＤＺＹ６８５（ＤＩＳ３遺伝子座はＧ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋの突然変異を含有している）から単離された総ゲノムＤＮＡを利用する、３’。所望の突然変異を有する全長アンプリコンを、重複ＰＣＲ（ここで、５’および３’の増幅の生成物はテンプレートとして作用した）におけるＡＤＺＫＤ１０６およびＡＤＺＫＤ１０７のプライマーとともに得て、続いて、形質転換に使用した。選択した形質転換体は、所望の菌株を与えた。
【０１１０】
酵母成長アッセイ。
ＹＰＤプレート上に連続希釈液を入れる前にＯＤ６００が０．２に達するまで、上に記載された酵母菌株を、一晩３０℃で完全なＹＰＤ培地中で成長させた。細胞成長を、２５℃、３０℃または３７℃での６０時間のインキュベーション後に分析した。Ｄｉｓ３のＰＩＮおよびＲＮＢのドメインの両方において突然変異を有する菌株に対する生存率の分析を、ＡＤＺＹ７１３およびＡＤＺＹ７１６の二倍体株の胞子形成に続いて、四分子切開によって実行した。
【０１１１】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット解析。
ＲＮＡを、標準的なホット・アシッド・フェノール手順（ｈｏｔ ａｃｉｄ ｐｈｅｎｏｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用して酵母培養液から単離した。ノーザンブロットを、標準手続に従って処理し、４２℃（５’−標識化オリゴヌクレオチドプローブ）、または６３℃（ランダムプライミングによって標識化されたＤＮＡフラグメント）のいずれかで調べた。
【０１１２】
酵母５’−ＥＴＳおよびＮＥＬ０２５ ＣＵＴの検出のために、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００８に記載されるような、α−３２Ｐ［ｄＡＴＰ］およびＤｅｃａＬａｂｅｌ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのランダムプライミングによって、ＰＣＲプローブを標識化した。他の転写物については、３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下であった：酵母７Ｓアンチセンスオリゴ−ＧＧＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４８）、酵母５．８Ｓアンチセンスのオリゴ−ＧＣＧＴＴＧＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９）、酵母５Ｓアンチセンスオリゴ−ＣＴＡＣＴＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５０）。ハイブリダイゼーション後、膜を、洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーン（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）にさらした後に、ＦＬＡ ７０００スキャナー（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）を使用してスキャンした。
【０１１３】
ウェスタンブロッティング
酵母培養液からのタンパク質サンプルを、１０−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ）上に固定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａタグを、ウサギのＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ａｎｔｉ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｐ１２９１）（１：３０００）の使用によって直接検出した。最終的に、ブロットを、Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（商標） ＷｅｓｔｅｒｎＣ（商標） キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅ（商標） フィルム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｃｕｒｉｘ ６０マシーン（ＡＧＦＡ）において発達させた。
【０１１４】
ｈＤＩＳ３ ＭＭ突然変異の機能解析を、導入された同等のアミノ酸変化で内因性のＤｉｓ３を発現する酵母菌株の構築とともに始めた。ｄｉｓ３−Ｓ５４１Ｒ（ヒトにおけるＳ４７７Ｒ）を除く突然変異体のすべてを生成することが可能であった。最初に、塩基性成長試験を行い、ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ（ヒトにおけるＧ７６６Ｒ）およびｄｉｓ３−Ｒ８４７Ｋ（ヒトにおけるＲ７８０Ｋ）の株が、生理的温度であっても、野生型の対照と比較して、強い成長遅延の表現型を示すことが認識された（図３Ａ）。ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒの場合には、突然変異体の成長欠陥は、ｄｉｓ３−Ｄ５５１Ｎ（ヒトにおけるＤ４８７Ｎ）の触媒性の突然変異体に対して観察されたものよりさらに強力であった。一方、２つの残りの突然変異株−ｄｉｓ３−Ｖ５６８Ｇ（ヒトにおけるＶ５０４Ｇ）およびｄｉｓ３−Ａ５８８Ｐ（ヒトにおけるＡ５２４Ｐ）は、３０℃で正常には成長したが、それらの成長が高温で実質的には完全に止められたため、それらは極端に温度感受性であるように見えた（図３Ａ）。酵母ＤＩＳ３突然変異体の成長試験の結果は、ＭＭ患者で変化されたアミノ酸がエキソソーム機能にとって重要であることの第１の生体内でのサポートを提供した。その上、前の生体外での分析で上に観察されるように、Ｖ５６８（ｈＤＩＳ３中のＶ５０４）の置換は、Ｇ８３３（ｈＤＩＳ３中のＧ７６６）またはＲ８４７（ｈＤＩＳ３中のＲ７８０）の変化よりも軽度の欠損につながった（図３Ａ）。また、ｒｒｐ６ΔバックグラウンドにおけるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の２つのＧ８３３およびＲ８４７の突然変異の表現型を試験し、そのような組み合わせが、結果として、わずかに相乗的な成長阻害をもたらすことがわかった（図３Ａ）。
【０１１５】
その後、酵母中のＤＩＳ３遺伝子突然変異の分子の効果を、典型的なエキソソーム基質：リボソームＲＮＡプロセシングの５’−ＥＴＳ副産物、ＮＥＬ０２５ ＣＵＴ（潜在性の不安定転写物（ｃｒｙｐｔｉｃ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ））および５．８Ｓ ｒＲＮＡ成熟経路における７Ｓ前駆体、を検出するプローブを使用して、突然変異体および対照株から単離された総ＲＮＡサンプルに関するノーザンブロット解析によって試験した。すべてのＤＩＳ３突然変異（ＭＭ患者に見られた突然変異に対応する純種のＤ５５１Ｎ触媒性の１つの突然変異および４つの突然変異）が、野生型菌株中のそれらの量に関して全長５’−ＥＴＳおよび７Ｓ ｒＲＮＡの比較可能な蓄積を引き起こすことが観察された（図３Ｂ）。一方、ＮＥＬ０２５ ＣＵＴと同様に、７Ｓおよび５’−ＥＴＳ分解中間物のレベルを慎重に観察すると、ＤＩＳ３突然変異は、２つのクラスに分類され得、その１つは、Ｖ５６８ＧおよびＡ５８８Ｐの置換基によって表わされる、別のものよりもすべての前述の種の重要な蓄積につながった、Ｄ５５１Ｎ、Ｇ８３３ＲおよびＲ８４７Ｋのアミノ酸変化を包含する（図３Ｂ）。また、これは以下の事実と一致している：１）それぞれの突然変異体ｈＤＩＳ３タンパク質は、生体外の生化学アッセイ中の異なる表現型を示した（図２）；２）突然変異体の酵母菌株は、可変的な成長欠陥を実証した（図３Ａ）。
【０１１６】
菌株の生成中に利用されたすべての挿入物の３’−末端で導入されたプロテインＡタグに対するウェスタンブロットによって確証されるように、観察された表現型は、それぞれのＤＩＳ３突然変異体の発現の欠如が原因ではない（図３Ｃ）。
【０１１７】
ＤＩＳ３ Ｇ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋ突然変異をＲＲＰ６遺伝子の欠失と組み合わせることによって、分析された分子表現型（恐らくｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒの単一の突然変異体と比較したｒｒｐ６Δ ｄｉｓ３−Ｇ８３３Ｒ中のＮＥＬ０２５ ＣＵＴのさらなる蓄積は除く）が著しく増強されるようには見えなかった（図３Ｂ）。一方、Ｄ１７１ＮのバックグラウンドにおいてＧ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋ突然変異を有するであろう菌株は単離されず（図３Ｄ）、Ｄ１７１Ｎは、ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を止めると以前に示された（Ｌｅｂｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００８）。それは、ヒトにおけるＭＭ関連突然変異に類似したＲＮＢドメイン突然変異が、純種の触媒性のＲＮＢドメイン突然変異、Ｄ４８７Ｎに関して観察されたものと同様に（Ｌｅｂｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００８）、エンドヌクレアーゼの同時の不活性化で合成的に致死的な酵母にあることを示す。
【０１１８】
要するに、酵母モデルを使用して行われた実験は、特に多発性骨髄腫の患者で観察された突然変異と同等であるＲＮＢドメインにおける突然変異において、ｈＤＩＳ３活性が変化させられるこれらの癌と類似したＤｉｓ３位置でアミノ酸を変化させることが、その生理的基質をエキソヌクレアーゼによって分解する（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｇｒａｄｅ）エキソソームの能力の障害を介してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの成長を阻害することを示した。
【０１１９】
実施例ＩＩＩ
ＭＭ関連ｈＤＩＳ３突然変異は、結果として、ヒトの細胞モデル中の異なるＲＮＡ種の蓄積をもたらす。
内因性のｈＤＩＳ３ ｍＲＮＡに対するＣ末端およびｓｈ−ｍｉＲＮＡｓでのＦＬＡＧエピトープでの再コード化されたｈＤＩＳ３の異なるバージョンの同時発現のためのベクターの生成に関する多段階のクローニング手順は、以下であった。最初に、ｈＤＩＳ３のＷＴ、ＲＮＢ ＭＵＴ（Ｄ４８７Ｎ）、Ｇ７６６ＲおよびＲ７８０Ｋの変異体をコード化するオープン・リーディング・フレームを包含する挿入物を、Ｄ３ＦＭｌｕＩ：（ＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５１）およびＤ３ＲＢ１２０Ｉ：（ＧＣＧＣＧＧＧＣＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＴＡＴ ＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５２）プライマー対によって、およびそれぞれのテンプレートとしてｐＨＥＸ１、ｐＨＥＸ８、ｐＭＭ４またはｐＭＭ５の構築物を使用して、増幅した。次に、挿入物を、ＢＩ−１６ベクターのＭｌｕＩおよびＢｓｐ１２０Ｉの部位へとクローン化し（Ｓａｍｍａｒｃｏ ａｎｄ Ｇｒａｂｃｚｙｋ， ２００５）、それ故、その中に存在するｈＲＬＵＣ ＯＲＦを、大腸菌ＭＨ１株の使用と置き換えた。このように、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ ＷＴ、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ ＲＮＢ ＭＵＴ、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ Ｇ７６６Ｒおよび［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ Ｒ７８０Ｋの一過性ベクターを構築した。ｈＤＩＳ３挿入物を以下のように配列決定した。
【０１２０】
平行して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（「ｍｉＲ ＲＮＡｉ」オプションを有する）からのＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒツールを使用して、内因性のｈＤＩＳ３ ｍＲＮＡを特異的に及び効率的に標的とするべきであるｍｉＲＮＡ配列のために、調査を実行した（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ）。候補配列を、選択し、ｈＤＩＳ３ ＯＲＦの位置４９５．、８９８．、１１５９．、１２７３．、および１４０４．で始まる、それぞれ、１．３．、５．、６．、および７．としてランク付けした（最も高いスコアはプログラムによって戻され；２．および４．とランク付けされた配列は、１．および３．と部分的に重複したため拒絶された）。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔｓの概念に基づいて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ａｎｄ−Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ／Ｖｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ−ＲＮＡｉ／Ｐｏｌ−ＩＩ−ｍｉＲ−ＲＮＡｉ−Ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍｌ）、合成ＤＮＡフラグメントを設計し、これは、上にリストされたｍｉＲＮＡ配列の組み合わせ、ｍｉＲ１１５９−ｍｉＲ１２７３−ｍｉＲ１４０４（ｔｒｉ−ｍｉＲ２）を包含しており、これは、さらなる実験に利用された。それは、予め設計されたｍｉＲＮＡに対応する３つの直列に位置するｓｈＲＮＡ、いわゆる、ｓｈ−ｍｉＲをコード化し、ここで、センスおよびアンチセンスのｍｉＲＮＡ配列は、ループ要素によって分離され、ヘアピンの形成が可能となる。ｓｈ−ｍｉＲ配列の各々を、ヒト細胞において活性な天然のｍｉＲＮＡ生合成経路に従って、モチーフを有する両方の末端で隣接させて（ｆｌａｎｋｅｄ）、人工のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ前駆体からの正確なｍｉＲＮＡプロセシングを確かなものとした。さらに、単純性疱疹ウィルス・チミジル酸キナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ−ｐＡ）をコード化する遺伝子に由来するポリアデニル化シグナルを、この合成カセットの３’−末端に置き、ヒト細胞における転写の正確な完了を可能にした。カセットは、５’および３’の末端（ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ）に、それぞれ、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩおよびＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の組み合わせを包含し、これを、続くクローニング工程に使用した。これを、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏによって合成し、ｐＵＣＡｍｐＭｉｎｕｓＭＣＳベクターのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。次に、（人工のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含有しているカセットの発現のモニタリングを可能にする）配列コード化ｅＧＦＰを、テンプレートとして、ｅＧＦＰＦｏｒ（ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＣＣＴＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５３）、ｅＧＦＰＲｅｖ（ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５４）プライマー対およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＰＣＲにおいて増幅���、提供された［ｐＵＣＡｍｐＭｉｎｕｓＭＣＳ］ｔｒｉ−ｍｉＲ ２プラスミドのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩの部位に挿入し、それ故、［ｐＵＣＡｍｐＭｉｎｕｓＭＣＳ］ｅＧＦＰ−ｔｒｉ−ｍｉＲ ２の一過性の構築物を与えた。
さらに、ＸｍａＪＩ制限エンドヌクレアーゼによって認識された部位を、ｅＧＦＰ ＯＲＦの５’−末端の上流のｅＧＦＰＦｏｒオリゴヌクレオチドに導入し、これをさらなるクローニング段階で使用した。
【０１２１】
構築物の生成の次の相において、外因性のｈＤＩＳ３ ＯＲＦをｍｉＲＮＡ作用に対して非感受性にするために、その配列を変化させる必要があった。この目的のために、オープン・リーディング・フレームのヌクレオチド４５１．−１４５７．を包含する再コード化されたｈＤＩＳ３フラグメントの合成が要求された。このフラグメントが、最初はｍｉＲＮＡとの標的とされる目的であった５つの部位をすべて包含し、一方で、それが、Ｄ４８７Ｎ（ＲＮＢ ＭＵＴ）、Ｇ７６６ＲおよびＲ７８０Ｋの突然変異が初期段階で導入された領域の外に位置したことを留意する価値はある。再コード化の考えは、ｍｉＲＮＡによって認識された部位を包含しているフラグメント内の（遺伝コードの変性を利用され得るそれらの位置での）あらゆる考えられ得るコドンへと同義突然変異を導入し、コドン利用の頻度を考慮に入れることであって、その結果、配列は、できるだけ最初の配列から分岐するだろう。再コード化されたｈＤＩＳ３ ＯＲＦフラグメントを、ｐＵＣＡｍｐＭｉｎｕｓＭＣＳベクター中の挿入物としても、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏによって合成し、最初の配列に完全に相補的な〜３０−４５のｎｔ長の隣接領域で囲み、およびＳｃｈＩ制限酵素（ＤＮＡをその部位からのいくらかの距離で開裂し、開裂後に平滑末端を残す、エンドヌクレアーゼ）によって認識された部位を有する両末端で終端した。そのような末端の存在のために、挿入物は、ＳｃｈＩを用いて提供された［ｐＵＣＡｍｐＭｉｎｕｓＭＣＳ］ｒｅｃ＿ｈＤＩＳ３プラスミド（大腸菌ＭＨ１株で増殖した）から切除され得、その後、テンプレートとして第一工程（上記参照）で生成された、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ ＷＴ、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ ＲＮＢ ＭＵＴ、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ Ｇ７６６Ｒおよび［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ Ｒ７８０Ｋプラスミドを利用して、重複伸長ＰＣＲにおいて「メガプライマー」として利用され得る（Ｂｒｙｋｓｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， ２０１０）。生成物を、ＤｐｎＩ制限酵素で消化し、形質転換によって大腸菌ＭＨ１株に導入した。これによって、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ｒｅｃ ＷＴ、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ｒｅｃ ＲＮＢ ＭＵＴ、［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ｒｅｃ Ｇ７６６Ｒおよび［ＢＩ−１６’］ｈＤＩＳ３ｒｅｃ Ｒ７８０Ｋの一過性の構築物がそれぞれ生じた。再コード化されたフラグメントの存在を、以下のプライマーを使用して、ＡｄｅＩ制限酵素での消化および配列決定によって確認した：ＨＤ３Ｆ１８４８、ＨＤ３Ｆ２４２９、ｈＤ３ｒ８１９Ｒ−ＣＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＡＡＴＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５５）、ＨＤ３Ｒ１５９２およびＨＤ３Ｒ２４４３。
【０１２２】
最終的なクローニング段階の目標は、［ｐＵＣＡｍｐＭｉｎｕｓＭＣＳ］ｅＧＦＰ−ｔｒｉ−ｍｉＲ ２からのｅＧＦＰコード化配列およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ＨＳＶ−ＴＫ−ｐＡの共シストロン（ｃｏ−ｃｉｓｔｒｏｎ）を含有しているＤＮＡフラグメントを、後者に存在するＦＬＵＣ ＯＲＦの置換によって、以前の工程からの４つのＢＩ−１６ベクター誘導体の各々に移すことであった。この目的のために、すべてのプラスミドを、ＸｍａＪＩおよびＣｌａＩの制限部位を利用して、標準的なクローニング手順の前に大腸菌ｄａｍ−／ｄｃｍ−菌株において増殖させ、その後、ライゲーション生成物を大腸菌ＭＨ１株へと形質転換した。これは、結局、最終構築物：ｐＭＭ７、ｐＭＭ８、ＰＭＭ９、ｐＭＭ１０の生成につながった。ｈＤＩＳ３ｒｅｃおよびｅＧＦＰ−ｔｒｉ−ｍｉＲ ２の挿入物の両方を、以下のプライマーを使用して配列決定した：ＨＤ３Ｆ１８４８、ＨＤ３Ｆ２４２９、ｈＤ３ｒ８１９Ｒ、ＨＤ３Ｒ１５９２およびＨＤ３Ｒ２４４３、ＢＩ１６ｓｅｑ１−ＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＧＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５６）およびＢＩ１６ｓｅｑ２−ＴＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５７）。
【０１２３】
安定した細胞株の細胞培養および生成。
ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞を、５％のＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で、１０％のテトラサイクリン遊離の胎児ウシ血清（ＴＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ＦＢＳ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および抗生物質（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補足された、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中の単層として培養した。安定した誘導可能なＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ細胞株を、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するこの研究で得て、ｐＭＭ７、ｐＭＭ８、ＰＭＭ９、ｐＭＭ１０の構築物（プラスミドＤＮＡの非常に純粋なＭｉｄｉ ｐｒｅｐｓ）の使用とともに、ヒグロマイシンＢ（１００μｇ／ｍｌ）およびブラストサイジン（１０−１５μｇ／ｍｌ）（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）が補足された、上記と同じ条件で成長させた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションを行った。外因性の遺伝子の発現を、１００ｎｇ／ｍｌの終末濃度で培地にドキシサイクリンを加えることによって誘発した。
【０１２４】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット解析。
ＲＮＡを、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ヒト細胞株から単離した。膜へのＲＮＡ固定に続いて、ノーザンブロットを標準手続に従って処理した。
【０１２５】
以下のプライマー対の使用で得られた、無作為に初回刺激を受けた（ｐｒｉｍｅｄ）ＰＣＲ生成物を、それぞれ、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡおよび７ＳＬ ＲＮＡの検出のためのプローブとして使用した：ＧＡＰＤＨ＿Ｆ（ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５８）−ＧＡＰＤＨ＿Ｒ（ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５９）、および７ＳＬ＿Ｆ（ＴＣＧＧＧＴＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＡＧＴＴ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６０）−７ＳＬ−Ｒ（ＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＣＡＧＧＣＧＣＧＡＴ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６１）。（Ｔｏｍｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０ｂ； Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に記載されるように生成された、無作為に初回刺激を受けたプローブを、ｈＤＩＳ３転写物の検出に使用した。ヒストンＨ２Ａ ｍＲＮＡに特異的な無作為に初回刺激を受けたＤＮＡプローブを、ｐＵＣ１９のそれぞれの部位間でクローン化された、その全長ＣＤＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＹ１３１９７１．１）に対応する配列のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ媒介性の切除によって生成し、構築物は、Ｐｒｏｆ． Ｚｂｉｇｎｉｅｗ Ｄｏｍｉｎｓｋｉによって快く提供された。他の転写物については、３２Ｐ標識化オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、表４に従った。
【０１２６】
【表４】
2016526877.tif 000006
【０１２７】
ハイブリダイゼーション後、膜を、洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーン（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）にさらした後に、ＦＬＡ ７０００スキャナー（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）を使用してスキャンした。
【０１２８】
ウェスタンブロッティング
ヒト細胞株からのタンパク質サンプルを、ウェスタンブロッティング用に実施例ＩＩに記載されるように処置し、以下の一次抗体の１つでインキュベートした：マウスのモノクローナル抗ｅＧＦＰ（Ｂ２）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｓｃ−９９９６）（１：１０００）、ウサギのポリクローナル抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｆ−７４２５）（１：３０００）、ウサギのポリクローナル抗ｈＤＩＳ３Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； ＨＰＡ０４１８０５，ｌｏｔ：Ｒ３８５９１）（１：５００）、ウサギのポリクローナル抗ｈＲＲＰ６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｐ４１２４）（１：３０００）、ウサギのポリクローナル抗ｈＤＩＳ３Ｌ２（手製；Ｌｕｂａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１３を参照）（１：２０００）、ヤギのポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ（Ｖ−１８）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｓｃ−２０３５７）（１：２０００）。その後、膜を、ＴＢＳＴで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合させた適切な二次抗体（ヤギ抗マウス、ヤギ抗ウサギ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；それぞれ、４０１２１５、４０１３９３）またはウサギ抗ヤギ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ａ５４２０））でインキュベートした。最終的に、ブロットを、Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（商標）ＷｅｓｔｅｒｎＣ（商標）Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅ（商標）Ｆｉｌｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｃｕｒｉｘ ６０マシーン（ＡＧＦＡ）において発達させた。
【０１２９】
免疫局在性分析
ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥＸ由来の安定した細胞株の２ｘ１０４細胞を、ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を有する培地中で、チャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に蒔き、タンパク質発現を誘発した。細胞を、固定し、透過処理し、遮断した。細胞を、まず一次抗体、その後フルオロフォアに連結された二次抗体でインキュベートした。最終的に、細胞を、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。最後の洗剤後、カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄの褪色防止用試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のチャンバースライド上に取り付け、２５℃に一晩暗所に置き、その後、顕微鏡分析まで４℃で保存した。以下の抗体を使用した（括弧中の希釈液）：１）一次 − マウスのモノクローナル抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｆ３１６５）（１：２００）；ウサギのポリクローナル抗ｈＤＩＳ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ＨＰＡ０３９２８１，ｌｏｔ：Ｒ３７３４８）（１：１００）；ウサギのポリクローナル抗フィブリラリン（Ａｂｃａｍ；ａｂ５８２１）（１：１５０）；２）二次 − Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５結合したヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（両方ともＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから）（１：８００）。イメージングを、適切な発光フィルターおよび６０ｘ／１．４０油浸対物レンズを使用して、分光検出装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を有するＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０００システム上で実行した。画像を、ＦｌｕｏＶｉｅｗソフトウェアを使用して処理した。
【０１３０】
ポリソーム勾配およびＲＮＡ単離。
安定した細胞株を、〜９５％のコンフルエンスに達するまで、１枚のプレート上のドキシサイクリンを含有している培地中で一晩成長させた。細胞を、１５分間３７℃でシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；２００μｇ／ｍｌ）で処置し、トリプシン処理によって採取し、５００ｘｇ；４℃で１分間遠心沈殿し、その後、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有している氷冷のＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗剤およびＰＢＳの完全除去後、細胞を、０．５ｍｌの溶解バッファー中で懸濁し（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ＝７．５；１００ｍＭのＫＣｌ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＤＴＴ；１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド；１ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；１％還元のＩｇｅｐａｌ−ＣＡ６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；８０ｕ／μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋ（商標）ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１ｘＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ遊離（Ｒｏｃｈｅ））、回転輪上で４℃で１５分間、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）およびインキュベーションを介して溶解した。その後、溶解液を、１００００ｘｇ；４℃で１０分間遠心分離にかけ、収集した上清中のＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。５００μｌの溶解バッファー中の細胞質溶解液の８のＯＤ２６０ユニットを、（洗浄剤およびリボヌクレアーゼ阻害剤を欠く、溶解バッファー中のろ過した蔗糖液を使用して調製した）７−４７％の蔗糖勾配上へと層状にし、ＳＷ−４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において３９０００ｘｇ；４℃で２時間超遠心分離にかけた。続いて、（上述のように調製した）６０％の蔗糖液をチューブの底部に注入することによって、０．５ｍｌの画分を各勾配から採取し、ＯＤ２６０を、ＡＥＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ上でモニタリングした。ポリソーム勾配からのＲＮＡ単離のために、採取した画分を、ボルテックスによって、６５０μｌのフェノール：グアニジンチオシアナート（１：１）と徹底的に混合し、８分間６５℃でインキュベートした。その後、３２０μｌのクロロホルムおよび３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．２）、１２０μｌを加え、その後、１３２００ｒｐｍで５分間、ボルテックスおよび遠心分離が続いた。サンプルを、クロロホルムで２回抽出し、ＲＮＡを、イソプロパノールを用いて水相から沈殿させ、７５％のエタノールで洗浄して、２０μｌｎｏＲＮａｓｅ遊離水で懸濁した。続いて、ＲＮＡサンプルを、プールして、ノーザンブロッティングによって分析した。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション。
ｓｉＲＮＡ媒介性のノックダウンを、ｓｔｅａｌｔｈＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ｈＲＲＰ６（ＩＤ ＨＳＳ１８２４２０）に対するｓｔｅａｌｔｈＲＮＡオリゴまたは陰性対照（ｓｔｅａｌｔｈ（商標）ＲＮＡｉ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｌｏｗ ＧＣ）（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を、２０ｎＭの終末濃度で使用した。細胞を、採取前の更なる６０時間の間、ドキシサイクリンが欠如下または存在下で成長させた。
【０１３２】
逆転写および定量ＰＣＲ。
安定したヒト細胞株から抽出された１０μｇの合計のＲＮＡを、ＲｉｂｏＬｏｃｋ（商標）ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で、６ユニットのＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処置した。抽出後、２μｇのＤＮａｓｅ処置したＲＮＡを、５０ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）プライマーと２５０ｎｇのランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物の使用によって逆転写し、ｃＤＮＡ反応のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商標）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１／１００を、ＢＳＡ、１０μｌの最終容量で、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
２．５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．３μｇのＢＳＡを３回繰り返して混合し、５８℃のアニール温度を使用して、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システムにおいてリアルタイムＰＣＲ分析に適用した。逆転写酵素を欠く陰性対照は、無視できるバックグラウンドを示した。すべてのデータをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した。以下の表５に明記したプライマー対を、増幅に使用した。
【０１３３】
【表５】
2016526877.tif 000007
【０１３４】
酵母細胞を使用して実行した生化学的解析および実験の結果がかなり有望であったため、適切な細胞モデルを使用するヒトにおけるｈＤＩＳ３突然変異の影響の試験を促進した。最も適切なものは、明白に、異なるｈＤＩＳ３変異体を有する複数の骨髄腫細胞株であろう。しかし、患者からの幾つかの市販のＭＭ細胞株のために行われた配列分析は、ｈＤＩＳ３遺伝子中の突然変異の存在を明らかにしなかった（データは示されず）。一方、Ｉ８４５Ｖ突然変異はＳＫＭＭ１細胞株（データは示されず）中に存在したが、突然変異が酵素のエキソリボヌクレアーゼ分解活性に影響しないため、この株を使用することに利点はなかった（図１のＣおよび図２）。それ故、新しい細胞モデルを構築することが必要であり、これによって、細胞生理およびＲＮＡ代謝に対するｈＤＩＳ３突然変異の影響を分析することが可能となるだろう。この目標を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）システムと、双方向テトラサイクリン誘導性プロモーターを含有している適合性ベクターの使用を組み合わせることによって達成した（Ｓａｍｍａｒｃｏ ＆ Ｇｒａｂｃｚｙｋ， ２００５）（図４のＡ）。この実験準備によって、以下を安定して同時発現するＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ細胞株を生成することが可能となった：１）内因性のｈＤＩＳ３コピーを発現停止したｓｈ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および２）ＦＬＡＧエピトープで標識化され、ｍｉＲＮＡ作用に対して非感受性にするために再コード化されたフラグメントを含有している、外因性のｈＤＩＳ３変異体（図４のＡ）。ｈＤＩＳ３ＷＴ、純種の触媒性の突然変異体ｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎ、またはすべての前の実験で検査されてきた多発性骨髄腫に関係する２つのｈＤＩＳ３変異体の１つを外因的に過剰産生する、４つのそのような細胞株を樹立し、それは、特に酵母モデル−ｈＤＩＳ３Ｇ７６６ＲおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋにおいて最も強力な表現型を与えた。ノーザンブロット解析およびウェスタンブロット解析は、両方の挿入物が、すべての４つの細胞株中は効率的に発現されたことを確証した（図４のＢ、Ｃ）。モデル細胞株での実験を始める前に、両方がエキソソームコア−ｈＤＩＳ３ＬおよびｈＲＲＰ６と協働し、複合体（ｈＤＩＳ３Ｌ２）とは無関係に機能する、ＲＮＡ代謝に関係する他の既知のヒト３’−５’エキソヌクレアーゼの発現が、この実験システムにおいて変わらないままであることが確証された（図４のＤ）。さらに、ｈＤＩＳ３または導入された突然変異のいずれの過剰発現もタンパク質の細胞内局在性に影響を与えないことを確認するために、これらの細胞株に関する免疫局在性実験を行った（図５のＡ、Ｂ）。
【０１３５】
モデル細胞株を用いて、ｈＤＩＳ３タンパク質の突然変異したバージョンの発現が、様々なクラスを表わすＲＮＡ分子の代謝中の異常につながるか否かを検査した。この目的のために、細胞株からの合計のＲＮＡを単離し、その細胞株を、いずれか未処置のままにするか、４８時間のドキシサイクリン媒介性の誘発にさらした。そのような誘発期間後、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの突然変異タンパク質を発現する細胞株が、ｈＤＩＳ３ＷＴまたはｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒの変異体を生成する細胞株よりわずかに悪化したことに留意することは重要である。
【０１３６】
最初に、低分解能の（ｌｏｗ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ノーザンブロット解析を、異なるＲＮＡポリメラーゼによって合成された選択された転写物に適用した。とりわけ、未処理の５．８ＳリボソームＲＮＡ前駆体（ＲＮＡポリメラーゼＩ転写物）の大量蓄積が、突然変異したｈＤＩＳ３変異体（しかし野生型の対照物ではない）を有する細胞株中のドキシサイクリン媒介性の誘発後に認識された（図６Ａ）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物の場合には、正規化に使用された、ＧＡＰＤＨ ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡのレベルは、（誘発に関係なく）すべての細胞株において一定のままであったが、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎ、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６ＲおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの突然変異タンパク質を発現する細胞におけるヒストンＨ２Ａ ｐｏｌｙＡ−ｍＲＮＡの量の明らかな増加が観察された（図６Ａ）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物に関して、ｈＤＩＳ３突然変異体の発現は、ＲＮａｓｅ ＭＲＰ ＲＮＡに大きな影響を与えるようには見えなかったが（図６Ａ）、この酵素によって合成された２つの他の代表的なＲＮＡ種（すなわち、ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡおよび７ＳＬ ＲＮＡ）のレベルは、特にｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの変異体を生成する細胞株において増加した（図６Ａ）。７ＳＬ ＲＮＡに対して観察された表現型も、高分解能のノーザンブロット解析によって確証された（図６Ｄ）。
【０１３７】
蓄積の度合いが、５．８Ｓ ｒＲＮＡ前駆体に対して最も強かったために、それを、ローディングコントロールとして５Ｓ ｒＲＮＡを使用して、高分解能のノーザンブロットによってより詳しく分析した（図６Ｂ）。一般に、これらの種のレベルが、ｈＤＩＳ３突然変異を有する細胞株で実行された誘発後に独占的に高められたことが確証された（図６Ｂ）。しかしながら、この実験によって、以下をさらに実証することが可能であった：１）観察された前駆体のパターンは、個々の突然変異体の各々の間で異なっており、２）蓄積する前駆体は、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒタンパク質を発現する細胞株中で検出されたものよりｈＤＩＳ３ Ｄ４８７ＮおよびＲ７８０Ｋの突然変異体間で類似していた（図６Ｂ）。さらに、明らかに大きなプロセシングの欠陥（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ）にもかかわらず、成熟した５．８Ｓ ｒＲＮＡのレベルは、著しく低下することがなかったことが示された（図６Ｂ）。最終的に、リボソーム生合成もポリソーム形成も、著しく妨げられるようには見えなかった（図７のＡ）。興味深いことに、観察された５．８Ｓ ｒＲＮＡ前駆体は、ポリソームに組み込まれた（図７のＢ）。それらの蓄積が、ｈＲＲＰ６発現のｓｉＲＮＡ媒介性のサイレンシングよってさらに増大されることがなかったことに留意する価値もある（図８）。
【０１３８】
２刊の最近の公報は、特に酵母（シュナイダーら、２０１２；Ｇｕｄｉｐａｔｉら、２０１２）中の非コード化ＲＮＡの全体的な分解における、エキソソームおよび触媒性Ｄｉｓ３の活性の重要性を強調した。両方の高スループット解析において、ｔＲＮＡおよびそれらの前駆体の蓄積は、Ｄｉｓ３不活性化から結果として生じる最も顕著な表現型の１つとして報告された。これは、幾つかの他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物のレベルがｈＤＩＳ３の突然変異体を生成する細胞中で増大されるという結果（図６Ａ）とともに、選択されたｔＲＮＡ分子に対するｈＤＩＳ３突然変異の影響をより注意深く分析することを促した。ｔＲＮＡＴｙｒおよびｔＲＮＡＣｙｓの前駆体と同様に、ほぼすべての検査された成熟したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＴｙｒおよびｔＲＮＡＰｈｅを除く）が、ドキシサイクリン処置後にＤ４８７ＮまたはＲ７８０Ｋの突然変異を有する外因性のｈＤＩＳ３バージョンを有する細胞株において蓄積することが留意された（図６Ｃ）。その効果は、５．８Ｓ ｒＲＮＡ前駆体に関してそれほど顕著ではなかったが（図６Ａ−Ｃ）、極端に再生可能であった。位置４８７および７８０のアミノ酸置換基が、Ｇ７６６Ｒ変化より強力な分子の表現型を示したことを強調することも価値がある（図６Ｃ）。
【０１３９】
Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡおよび３つの異なるｓｎＲＮＡの蓄積に対するｈＤＩＳ３突然変異の影響も検査されたが、Ｕ５ ｓｎＲＮＡに対してのみ、ｔＲＮＡの場合に以前に観察された表現型に類似している表現型が認識された（図６Ｄ）。これに反して、すべての分析されたＰＲＯＭＰＴ−不安定な転写物（これらは以前にヒトのエキソソームサブユニットのｓｉＲＮＡ媒介性の欠失にさらされた細胞において蓄積すると示された（Ｐｒｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００８； Ｔｏｍｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０ｂ； Ｌｕｂａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１））については、それらのレベルが、突然変異したｈＤＩＳ３変異体を生成するすべての細胞株において増大したことがわかった（図６Ｅ）。他の分析に一致して、ＰＲＯＭＰＴの蓄積は、Ｇ７６６Ｒ置換の場合よりもｈＤＩＳ３ Ｄ４８７ＮまたはＲ７８０Ｋの突然変異を有する細胞においてはるかに顕著であった（図６Ｅ）。さらに、４つのＰＲＯＭＰＴのうちの３つの下流に局在化したプロモーターから合成された対応するタンパク質をコード化する転写物を分析し、それらが、全く無関係のミトコンドリアの転写物−ＡＴＰ６／８と同様に、ｈＤＩＳ３突然変異による影響を受けなかったことが実証された（図６Ｅ）。
【０１４０】
要約すると、モデル細胞株におけるｈＤＩＳ３突然変異は、５．８Ｓプロセシング中間体、ｔＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物およびＰＲＯＭＰＴを含む、大多数の分析されたエキソソーム基質の蓄積を結果としてもたらした。蓄積の程度は、異なるエキソソームターゲット間で可変的であったが、ほとんどの場合、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ変異体よりｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋを生成する細胞においてより大きかったことが明白に観察された。
【０１４１】
実施例ＩＶ
ＭＭ関連ｈＤＩＳ３突然変異は、ヒトのモデル細胞株の成長阻害につながる。
細胞成長分析。
実施例ＩＩＩで得られた安定した誘導可能なＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ細胞株を、９０％のコンフルエンスに達するまで、実施例ＩＩＩに記載されるように成長させた。４８時間の誘発モードで、２ｘ１０５細胞を、ドキシサイクリンを欠いている又は含有している培地中でプレート上に直接蒔き、さらに４８時間成長させた。４８時間＋４８時間の誘発モードで、細胞を、最初に、４０％のコンフルエンスで、ドキシサイクリンを欠いている又は含有している培地中で、新しいプレート上に再び蒔き、４８時間後、２ｘ１０５細胞を、それぞれの培地中でプレート上に蒔き、さらに４８時間成長させた。細胞成長およびｅＧＦＰ蛍光を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１の顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して分析した。
【０１４２】
「細胞間競争アッセイ」を、等量（５ｘ１０５）の「空の（ｅｍｐｔｙ）」ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘと樹立された安定した細胞株を混合し、それらをプレート上に蒔き、その後ドキシサイクリンでの発現の誘発によって実行した。最終的に、顕微鏡観察を上に記載されるように行った。
【０１４３】
細胞株の代謝活性に関するアッセイを、以下のように行った。５０００の細胞を、９６ウェルのプレート上に（各々の細胞株、条件および測定の時間のために）３回繰り返して蒔いた。細胞を、ドキシサイクリンを欠いている培地中で維持するか、または誘発因子での処置にさらした。誘発の２４時間、７２時間または１２０時間後、１０μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液に加えた。減少した試薬の量を、ＤＴＸ８８０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１２０分後に定量化した。ＲＮＡ単離のための細胞の成長中に、Ｄ４８７ＮまたはＲ７８０Ｋの置換基を有するｈＤＩＳ３変異体を発現する細胞株が、２つの他の細胞株よりも４８時間の間のドキシサイクリン媒介性の誘発後にわずかに悪化したことが認識された。ｈＤＩＳ３突然変異が細胞生理に影響を与えたかどうかをしっかりと確認するために、樹立細胞株のためのさらなる成長分析を、蛍光顕微鏡を使用して、持続性の誘発（即ち：４８時間、その後ドキシサイクリンを含有している新鮮な培地への細胞の継代、およびさらなる４８時間の培養が続いた）にさらされた誘発されていない細胞およびそれらの対照物についての観察を介して行った。それらはすべて、正常に及び比較的ドキシサイクリンを欠いている培地中で成長したが（データは示されず）、内因性のｈＤＩＳ３の長期的なｓｈ−ｍｉＲＮＡ媒介性の抑制およびｓｈ−ｍｉＲＮＡ非感受性の外因性のｈＤＩＳ３変異体の同時発現後に、４つの細胞株は、異なって作用した（図９のＡ）。細胞のゲノムへと統合された構築物から生成されたｈＤＩＳ３ＷＴは、内因性のｈＤＩＳ３発現のレベルの減少を明確に補足し、その結果、細胞成長は妨げられなかった。これに反して、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮおよびｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの変異体を発現する細胞株の場合には、成長阻害が観察され（図９のＡ）、一方で、ｈＤＩＳ３中のＧ７６６Ｒ突然変異は、細胞成長に対して単に適度な効果を発揮した（図９のＡ）。これらの結果は、Ｇ７６６Ｒが、Ｄ４８７ＮまたはＲ７８０Ｋのアミノ酸変化と比較したときに（特に一本鎖基質を使用するときに）、分解のより軽度な阻害につながることを示唆した、生化学的データと（図１のＣおよび図２を参照）、２つのＤ４８７ＮまたはＲ７８０Ｋの突然変異が、Ｇ７６６Ｒ突然変異の場合におけるよりも様々なＲＮＡ分子のより顕著な蓄積を結果としてもたらすという発見（図６）の両方に一致していた。
【０１４４】
視野（ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ）内の実質的にすべての細胞が、ｅＧＦＰ蛍光を示し（図９のＡ）、そのため、これらの細胞が、ｈＤＩＳ３−ＦＬＡＧ融合をコード化する、第２の挿入物も発現したと仮定され得ることに留意する価値はある。遍在性のｅＧＦＰ発現も、ＦＡＣＳ分析によって確証された（データは示されず）。その上、別の簡潔な成長試験においてモデル細胞株のｅＧＦＰ発現を活用することが可能であり、これは「細胞間競争アッセイ」と称された。この実験では、等数の４つの安定した細胞株の各々と対照ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ細胞（ｅＧＦＰを欠いている）を混合し、発現の誘発後に、そのような「雑種（ｈｙｂｒｉｄ）」細胞株を、蛍光顕微鏡で観察した。Ｔ−ＲＥｘ＋ｈＤＩＳ３ＷＴとＴ−ＲＥｘ＋ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒの混合物の場合には、蛍光性の細胞の非蛍光性の細胞に対する１：１の比率を維持し、これは、樹立細胞株が、対照株より著しく遅く成長することがないことを意味している（図９のＢ）。対照的に、Ｔ−ＲＥｘ＋ｈＤＩＳ３Ｄ４８７ＮとＴ−ＲＥｘ＋ｈＤＩＳ３Ｒ７８０Ｋの混合物に対する蛍光性の細胞の数は、蛍光を欠いている細胞と比較して、はるかに少なく（図９のＢ）、これは、「空の」ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ細胞が、これらの２つの特定のｈＤＩＳ３突然変異体を安定して発現する細胞株との競合で優っていたことを示している。これは、それらが、細胞の死亡率の増加によって反映される、内因性の野生型ｈＤＩＳ３タンパク質のレベルの減少を補足するのに欠損していることを示唆している。
【０１４５】
細胞生存率のより詳細な比較分析を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して、モデル細胞株に対して行った。この化合物に基づくアッセイは、それが、細胞培養液への追加後に代謝的に活性な細胞によって還元され、これが分光特性を変化させるという事実に依存している。化合物の還元形の量は、細胞および（間接的に）その生存率（増殖および死亡の両方の結果）の代謝活性を反映している。それ故、異なるｈＤＩＳ３変異体をコード化する導入遺伝子を有する細胞株における減少したＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の量の比色測定を実行し、細胞は、誘発されていなかったか、またはドキシサイクリン処置にさらされていた。すべての細胞株に対して結果が著しく類似していたことがわかったが、但し、ｓｈ−ｍｉＲＮＡおよび外因性のｈＤＩＳ３の同時発現は誘発されなかった（図９のＣ）。一方、ドキシサイクリン媒介性の誘発後に、モデル株の著しく異なる行動が観察され、外因性のｈＤＩＳ３ＷＴを発現する細胞株の代謝活性は、誘発の欠如と比較して、実質的に不変であったが、それは、突然変異したｈＤＩＳ３バージョンを生成する、３つの残りの細胞株中で異なる程度まで還元された（図９のＣ）。事前の成長試験に一致して、表現型は、ｈＤＩＳ３Ｄ４８７Ｎ突然変異体に対して最も強力で、ｈＤＩＳ３Ｇ７６６Ｒ変異体の場合に最も弱かった（図９のＣ）。
【０１４６】
要約すると、実験システムを用いることで、多発性骨髄腫患者で見られたＧ７６６ＲおよびＲ７８０Ｋの置換基と同様に、ｈＤＩＳ３ Ｄ４８７Ｎの触媒性の突然変異が、ヒト細胞の増大した死亡率および代謝活性の阻害につながることが実証された。成長欠陥は、ＲＮＡ代謝における異常の最終的な結果かもしれない。
【０１４７】
実施例Ｖ
ｈＤＩＳ３ ＲＮＢドメインnにおけるＭＭ関連突然変異は、ヒト細胞中のＰＩＮドメインの触媒性の突然変異により合成的に致死的である。
オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびクローニング。
それぞれのテンプレートとして、ｐＭＭ１１、ｐＭＭ１２、ＰＭＭ１３、ｐＭＭ１４の構築物を、Ｄ３ＰＩＮＦ（ＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＧＧＧＣＧＡＴＴＣＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＡＴＧ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９７）−Ｄ３ＰＩＮＲ（ＴＣＧＡＡＴＣＧＣＣＣＧＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＴ ＴＣＴＣＣＣＴＧ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９８）−実施例ＩＩＩで構築されたオリゴヌクレオチド対およびｐＭＭ７、ｐＭＭ８、ｐＭＭ９、ｐＭＭ１０のプラスミドを使用して、部位特異的変異誘発によって生成した。ＰＩＮおよびＲＮＢのドメインで同時に生じる突然変異の影響を検査するために、これらの構築物を生成した。
【０１４８】
細胞培養、安定した細胞株の生成および細胞成長分析。
細胞株を、実施例ＩＩＩに記載されているように得たが、ｐＭＭ１１、ｐＭＭ１２、ｐＭＭ１３、ｐＭＭ１４の構成物を使用した。細胞を、実施例ＩＩＩに記載される条件で成長させた。細胞成長を、実施例ＩＶに記載されるように分析した。
【０１４９】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット解析。
ＲＮＡ単離および高分解能のノーザンブロットを、実施例ＩＩＩに記載されているように実行した。
【０１５０】
逆転写および定量ＰＣＲ。
逆転写および定量ＰＣＲを、実施例ＩＩＩに記載されるように実行した。
【０１５１】
次に、異なるｈＤＩＳ３ ＲＮＢドメイン突然変異のバックグラウンドにｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ活性の効果があるかどうかを評価することが重要であった。この目的のために、類似した安定した細胞株を構築し、これは、生体外でのアッセイにおいてｈＤＩＳ３のエンドヌクレアーゼ分解活性を止めると以前に示された、ＰＩＮドメイン（Ｄ１４６Ｎ）の触媒部位において更なる突然変異を有していた。実施例ＩＶに記載されているように実行された細胞成長アッセイは、Ｄ１４６Ｎ突然変異を有する異なるｈＤＩＳ３バージョンを発現する細胞株の成長が、ドキシサイクリンの欠如下でむしろ影響を受けなかったことを明らかにした（図１０Ａ）。一方、ｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎの単一の突然変異体を発現する細胞株のみが、誘発後に比較的正常に及びｈＤＩＳ３ＷＴを生成するその対照物と比較可能に成長し、これは、エンドヌクレアーゼ活性単独では、細胞生理にほとんど影響がないことを示している（図１０Ａ）。対照的に、ＰＩＮドメイン触媒性の突然変異とＲＮＢドメイン内のアミノ酸置換基（Ｄ４８７Ｎ、Ｇ７６６ＲまたはＲ７８０Ｋ）を組み合わせることで、結果として、劇的な成長欠陥につながった（図１０Ａ）。Ｇ７６６Ｒ突然変異単独を有するｈＤＩＳ３を生成するそれぞれの細胞株が、ＷＴ対照と比較して、非常に軽度の成長阻害を示したことを考慮に入れると、ｈＤＩＳ３の両方のヌクレアーゼ分解活性の不活性化の相乗効果は、ｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｇ７６６Ｒの二重突然変異体を発現する細胞の場合に最も明白であった（図１０Ａ）。重要なことに、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して行われたアッセイは、ＲＮＢドメイン内で突然変異を有する細胞の代謝活性もまた、ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼの不活性化を伴った後にさらに減少されることを開示した（図１０Ｂ）。
【０１５２】
その後、ＲＮＢドメイン内のＭＭ関連ｈＤＩＳ３突然変異とＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性の破壊との組み合わせから結果として生じる分子の表現型の分析を、細胞とそれぞれの単一の突然変異体との比較によって実行した。図１０Ｃ示されるように、ＰＩＮドメイン触媒活性単独の不活性化は、５．８Ｓ ｒＲＮＡ前駆体の蓄積にはつながらなかった。興味深いことに、ＲＮＢドメイン突然変異のバックグラウンドにおけるＤ１４６Ｎ置換の相乗効果は観察されず、これは、前駆体分子のレベルが、無傷のＰＩＮドメイン活性中心を有するそれぞれのｈＤＩＳ３バージョンを生成する細胞株と比較してｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｄ４８７Ｎ、ｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｇ７６６ＲおよびｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｒ７８０Ｋを発現する細胞株において高められなかったためである（図１０Ｃ）。これは、そのような３’−伸長の５．８Ｓ ｒＲＮＡ種が、主にｈＤＩＳ３ エキソリボヌクレアーゼ分解活性によって正常に分解されることを示している。同様に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物またはＵ５ ｓｎＲＮＡに対するＤ１４６Ｎ突然変異の更なる効果が検知されず、すなわち、ＲＮＡ種は、ＲＮＢドメイン内で突然変異を有するｈＤＩＳ３変異体を生成する細胞株において蓄積されることがわかった（データは示されず）。これに反して、結果は、異なるＰＲＯＭＰＴのレベルが、Ｄ１４６Ｎ置換を有するｈＤＩＳ３またはそのＷＴ対照物のいずれかを生成する細胞株間で比較可能であるが、ｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｄ４８７Ｎ、ｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｇ７６６ＲおよびｈＤＩＳ３Ｄ１４６Ｎ Ｒ７８０Ｋの二重突然変異体を発現する細胞株が、それぞれの単一の突然変異体よりもはるかに多い両のＰＲＯＭＰＴを蓄積することを明確に実証している（図１０Ｄ）。これは、そのような非コー化ＲＮＡ分子が、ｈＤＩＳ３の両方のヌクレアーゼ分解活性の協働作用によって分解されることを強く示唆している。興味深いことに、４つの試験したＰＲＯＭＰＴのうちの３つに対応するタンパク質をコード化する転写物に対して非常に類似した傾向が見つけられたが（しかし、エキソソーム機能不全によって影響されることが予期されなかった、ミトコンドリアのＡＴＰ６／８ ｍＲＮＡに対してはそうではなかった）、二重および単一の突然変異体間の倍差（ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）は、ＰＲＯＭＰＴの場合でのように劇的なものではなかった（図１０Ｅ）。
【０１５３】
実施例ＶＩ
２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンは、生体外でｈＤＩＳ３の単離したＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する。
２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンの合成。
２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンの合成を、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ． ２０ （（２０１２）４６７−４７９）に記載される方法に従って行った。
【０１５４】
【化１】
2016526877.tif 000008
【０１５５】
トルエン中のホモフタル酸無水物１（０．５ｇ；３．０８ｍｍｏｌ）、塩酸ベンジルヒドロキシルアミン（０．５９ｇ；３．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．５ｍｌ；３．７ｍｍｏｌ）の混合物を、４時間Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋの装置によって加熱マントル上で加熱した。基質がまだＬＣＭＳ上で可視であり、アミンを加えて、加熱しても何も変化せず、そのため、反応を止めた。白色固形物を、ろ過によって除去した。ろ液を、濃縮乾固し、ＤＣＭ中に溶解し、カラムクロマトグラフイーＡｃＯＥｔ／ヘキサン１／８によって精製した。Ｅｔ２Ｏからの結晶化によって、白色固形物として０．３９ｇ（４８％）の２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ８．２３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）；７．６６−７．２６（ｍ、８Ｈ）；５．１５（ｓ、２Ｈ）；４．１５（ｓ、２Ｈ）。
ＤＣＭ中の２（０．３６ｇ；１．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＢｒ３（０．２５ｍｌ；２．６６ｍｍｏｌ）を、一度で加え、反応を室温で１示間撹拌した。反応を水で慎重にクエンチした。１５分後、黄色固形物を、ろ過によって除去した。ろ液を、ＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ４によって乾燥させ、濃縮した。Ｅｔ２Ｏからの結晶化によって、ベージュ色固形物として０．０８８ｇの３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、２００ＭＨｚ）：δ１０．３９（ｂｒｓ、１Ｈ）；８．０１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８Ｈｚ）；７．６８−７．３６（ｍ、３Ｈ）；４．２５（ｓ、２Ｈ）。
【０１５６】
活性アッセイ。
組み換えタンパク質を、実施例Ｉに記載される方法によって得た。生体外での生化学アッセイのための基質は、実施例Ｉに記載される基質と同様に調製された、５’フルオレセイン標識化ｓｓ１７−（Ａ）３４であった。活性アッセイを、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンの存在下または欠如下で実施例Ｉに記載されるように行った。
【０１５７】
ｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメインの不活性化が、ＲＮＢドメインにおけるＭＭ関連突然変異によって合成的に致死的であることを確立した後に、推定上の阻害剤の検索を行った。ＲＮＡｓｅ Ｈの周知の阻害剤である、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４）を合成した。ヒトのＤＩＳ３ ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性のめの活性アッセイを行うために、単離したＰＩＮドメインの組み換えバージョンを生成した（図１１のＡ）。次に、活性アッセイを、推定上の阻害剤の存在下また欠如下で行った（図１１のＢ）。２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンは、８０μＭの濃度でヒトのＤＩＳ３ ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を効率的に阻害した。
【０１５８】
実施例ＶＩＩ
２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンは、具体的にはＭＭ患者において見られる突然変異に対応する酵母ＤＩＳ３遺伝子中の突然変異を有する酵母菌株の成長を阻害する。
酵母成長アッセイ。
実施例ＩＩで得た、Ｇ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋの突然変異を有する酵母菌株を、成長アッセイに使用した。示された酵母菌株の連続希釈液を、（１ｍＭの濃度で）ＹＰＤプレートおよび２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンを有するＹＰＤプレート上に入れ、６０時間３０℃でインキュベートした。
【０１５９】
２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンが、ＤＩＳ３ ＰＩＮドメイン活性を阻害することを認識して、生体内での分析を、実施例ＩＩ（図１２）で得た、Ｇ８３３ＲまたはＲ８４７Ｋの突然変異を有する酵母菌株を使用して行った。２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオンは、ＷＴ酵母ではなくＧ８３３ＲおよびＲ８４７Ｋの突然変異を有する酵母の完全な成長阻害につながる。これは、ｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメイン活性の阻害剤が、実際、ＤＩＳ３ ＭＭ関連突然変異を有する細胞の成長を特異的に阻害することを示している。
【０１６０】
以下の表６では、酵母または細胞株における集められたｈＤＩＳ３ ＲＮＢドメイン突然変異（その位置は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１に関連している）およびその同等物が示される。
【０１６１】
【表６−１】
2016526877.tif 000009
【０１６２】
【表６−２】
2016526877.tif 000010
【０１６３】
上述の実施例によって、ｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメイン活性を阻害する化合物の生体内でのその適用は、それはそれを確認された、ｈＤＩＳ３活性において妨害のある細胞の成長阻害、特にｈＲＮＢ Ｄｉｓ３ドメインの突然変異につながることが確認された。これらは、ｈＤＩＳ３ ＰＩＮドメインの阻害剤である化合物が、ｈＤＩＳ３ ＲＮＢドメイン内に突然変異がある癌の処置用の有効な治療薬でもあることを確証している。ｈＤＩＳ３ ＲＮＢドメイン内に突然変異がある癌は、多発性骨髄腫、髄芽細胞腫および急性骨髄性白血病から選択され得る。ｈＤＩＳ３のＲＮＢドメインにおける突然変異は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１に関連している、突然変異Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖから選択される。
【０１６４】
明細書で引用される文献：
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１０． Ｄｉｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｎａｔｕｒｅ ４８１： ５０６−５１０．
１１． Ｄｒａｚｋｏｗｓｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ． ２０１３． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１： ３８４５−３８５８．
１２． Ｄｚｉｅｍｂｏｗｓｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ． ２００７． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４： １５−２２．
１３． Ｆａｒｍｅｒ Ｈ ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｎａｔｕｒｅ ４３４： ９１７−９２１．
１４． Ｇｈｅｒｚｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １４： ５７１−５８３．
１５． Ｇｕｄｉｐａｔｉ ＲＫ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４８： ４０９−４２１．
１６． Ｈａｎｇ ＪＱ ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１７： ３２１−３２９．
１７． Ｉｓｋｅｎ Ｏ ＆ Ｍａｑｕａｔ ＬＥ． ２００７． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２１： １８３３−１８５６．
１８． Ｋａｄａｂａ Ｓ ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８： １２２７−１２４０．
１９． Ｌａｕｂａｃｈ Ｊ ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ６２： ２４９−２６４．
２０． Ｌｅｂｒｅｔｏｎ Ａ ＆ Ｓｅｒａｐｈｉｎ Ｂ． ２００８． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７７９： ５５８−５６５．
２１． Ｌｅｂｒｅｔｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ． ２０１０． Ｎａｔｕｒｅ ４５６： ９９３−９９６．
２２． Ｌｉａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ． ２００７． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ ２５： ４２７−４３４．
２３． Ｌｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ． １９９７． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７： ９２１−９２５．
２４． Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ． ２００６． Ｃｅｌｌ １２７： １２２３−１２３７．
２５． Ｌｕｂａｓ Ｍ ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４３： ６２４−６３７．
２６． Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１． ＲＮＡ Ｂｉｏｌ ８： ６１−６６．
２７． Ｍａｌｅｔ Ｈ ｅｔ ａｌ． ２０１０． ＥＭＢＯ Ｒｅｐ １１： ９３６−９４２．
２８． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｐ ｅｔ ａｌ． １９９７． Ｃｅｌｌ ９１： ４５７−４６６．
２９． Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｄ ｅｔ ａｌ． ２００２． ＥＭＢＯ Ｊ ２１： １６５−１７４．
３０． Ｏｒｂａｎ ＴＩ ＆ Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅ Ｅ． ２００５． ＲＮＡ １１： ４５９−４６９．
３１． Ｐａｒｋｅｒ Ｒ． ２０１２． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９１： ６７１−７０２．
３２． Ｐａｒｓｏｎｓ ＤＷ ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３１： ４３５−４３９．
３３． Ｐｏｒｃｅｌｌｉ Ｌ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９： ３８５８−３８７３．
３４． Ｐｒｅｋｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ． ２００８． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： １８５１−１８５４．
３５． Ｒｏｓｅ ＡＥ ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７１： ２５６１−２５７１．
３６． Ｓａｍｍａｒｃｏ ＭＣ ＆ Ｇｒａｂｃｚｙｋ Ｅ． ２００５． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４６： ２１０−２１６．
３７． Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ． ２００９． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６： ５６−６２．
３８． Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０： ９２９８−９３０７．
３９． Ｓｃｈｍｉｄ Ｍ ＆ Ｊｅｎｓｅｎ ＴＨ． ２００８． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３３： ５０１−５１０．
４０． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ． ２００９． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７： １１２７−１１４０．
４１． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４８： ４２２−４３３．
４２． Ｓｔａａｌｓ ＲＨ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ ２９： ２３５８−２３６７．
４３． Ｔｏｍｅｃｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． ２０１０ａ． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ １１： ９３８−９４５．
４４． Ｔｏｍｅｃｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ ２９： ２３４２−２３５７．
４５． Ｗａｌｋｅｒ ＢＡ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｂｌｏｏｄ １２０： １０７７−１０８６．
４６． Ｗａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ． ２００８． ＲＮＡ １４： １０７−１１６．
４７． Ｗａｓｍｕｔｈ ＥＶ ＆ Ｌｉｍａ ＣＤ． ２０１２． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４８： １３３−１４４．
４８． Ｗｙｅｒｓ Ｆ ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｃｅｌｌ １２１： ７２５−７３７．
【０１６５】
配列表のフリーテキスト（配列Ｓｅｑ Ｉｄ Ｎｏ ３−９８は明細書内に与えられる）：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ｗｔ ヒトＤｉｓ３アミノ酸配列である
ＭＬＫＳＫＴＦＬＫＫＴＲＡＧＧＶＭＫＩＶＲＥＨＹＬＲＤＤＩＧＣＧＡＰＧＣＡＡＣＧＧＡＨＥＧＰＡＬＥＰＱＰＱＤＰＡＳＳＶＣＰＱＰＨＹＬＬＰＤＴＮＶＬＬＨＱＩＤＶＬＥＤＰＡＩＲＮＶＩＶＬＱＴＶＬＱＥＶＲＮＲＳＡＰＶＹＫＲＩＲＤＶＴＮＮＱＥＫＨＦＹＴＦＴＮＥＨＨＲＥＴＹＶＥＱＥＱＧＥＮＡＮＤＲＮＤＲＡＩＲＶＡＡＫＷＹＮＥＨＬＫＫＭＳＡＤＮＱＬＱＶＩＦＩＴＮＤＲＲＮＫＥＫＡＩＥＥＧＩＰＡＦＴＣＥＥＹＶＫＳＬＴＡＮＰＥＬＩＤＲＬＡＣＬＳＥＥＧＮＥＩＥＳＧＫＩＩＦＳＥＨＬＰＬＳＫＬＱＱＧＩＫＳＧＴＹＬＱＧＴＦＲＡＳＲＥＮＹＬＥＡＴＶＷＩＨＧＤＳＥＥＮＫＥＩＩＬＱＧＬＫＨＬＮＲＡＶＨＥＤＩＶＡＶＥＬＬＰＫＳＱＷＶＡＰＳＳＶＶＬＨＤＥＧＱＮＥＥＤＶＥＫＥＥＥＴＥＲＭＬＫＴＡＶＳＥＫＭＬＫＰＴＧＲＶＶＧＩＩＫＲＮＷＲＰＹＣＧＭＬＳＫＳＤＩＫＥＳＲＲＨＬＦＴＰＡＤＫＲＩＰＲＩＲＩＥＴＲＱＡＳＴＬＥＧＲＲＩＩＶＡＩＤＧＷＰＲＮＳＲＹＰＮＧＨＦＶＲＮＬＧＤＶＧＥＫＥＴＥＴＥＶＬＬＬＥＨＤＶＰＨＱＰＦＳＱＡＶＬＳＦＬＰＫＭＰＷＳＩＴＥＫＤＭＫＮＲＥＤＬＲＨＬＣＩＣＳＶＤＰＰＧＣＴＤＩＤＤＡＬＨＣＲＥＬＥＮＧＮＬＥＶＧＶＨＩＡＤＶＳＨＦＩＲＰＧＮＡＬなＤＱＥＳＡＲＲＧＴＴＶＹＬＣＥＫＲＩＤＭＶＰＥＬＬＳＳＮＬＣＳＬＫＣＤＶＤＲＬＡＦＳＣＩＷＥＭＮＨＮＡＥＩＬＫＴＫＦＴＫＳＶＩＮＳＫＡＳＬＴＹＡＥＡＱＬＲＩＤＳＡＮＭＮＤＤＩＴＴＳＬＲＧＬＮＫＬＡＫＩＬＫＫＲＲＩＥＫＧＡＬＴＬＳＳＰＥＶＲＦＨＭＤＳＥＴＨＤＰＩＤＬＱＴＫＥＬＲＥＴＮＳＭＶＥＥＦＭＬＬＡＮＩＳＶＡＫＫＩＨＥＥＦＳＥＨＡＬＬＲＫＨＰＡＰＰＰＳＮＹＥＩＬＶＫＡＡＲＳＲＮＬＥＩＫＴＤＴＡＫＳＬＡＥＳＬＤＱＡＥＳＰＴＦＰＹＬＮＴＬＬＲＩＬＡＴＲＣＭＭＱＡＶＹＦＣＳＧＭＤＮＤＦＨＨＹＧＬＡＳＰＩＹＴＨＦＴＳＰＩＲＲＹＡＤＶＩＶＨＲＬＬＡＶＡＩＧＡＤＣＴＹＰＥＬＴＤＫＨＫＬＡＤＩＣＫＮＬＮＦＲＨＫＭＡＱＹＡＱＲＡＳＶＡＦＨＴＱＬＦＦＫＳＫＧＩＶＳＥＥＡＹＩＬＦＶＲＫＮＡＩＶＶＬＩＰＫＹＧＬＥＧＴＶＦＦＥＥＫＤＫＰＮＰＱＬＩＹＤＤＥＩＰＳＬＫＩＥＤＴＶＦＨＶＦＤＫＶＫＶＫＩＭＬＤＳＳＮＬＱＨＱＫＩＲＭＳＬＶＥＰＱＩＰＧＩＳＩＰＴＤＴＳＮＭＤＬＮＧＰＫＫＫＫＭＫＬＧＫ
【０１６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ｗｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄｉｓ３アミノ酸配列である
ＭＳＶＰＡＩＡＰＲＲＫＲＬＡＤＧＬＳＶＴＱＫＶＦＶＲＳＲＮＧＧＡＴＫＩＶＲＥＨＹＬＲＳＤＩＰＣＬＳＲＳＣＴＫＣＰＱＩＶＶＰＤＡＱＮＥＬＰＫＦＩＬＳＤＳＰＬＥＬＳＡＰＩＧＫＨＹＶＶＬＤＴＮＶＶＬＱＡＩＤＬＬＥＮＰＮＣＦＦＤＶＩＶＰＱＩＶＬＤＥＶＲＮＫＳＹＰＶＹＴＲＬＲＴＬＣＲＤＳＤＤＨＫＲＦＩＶＦＨＮＥＦＳＥＨＴＦＶＥＲＬＰＮＥＴＩＮＤＲＮＤＲＡＩＲＫＴＣＱＷＹＳＥＨＬＫＰＹＤＩＮＶＶＬＶＴＮＤＲＬＮＲＥＡＡＴＫＥＶＥＳＮＩＩＴＫＳＬＶＱＹＩＥＬＬＰＮＡＤＤＩＲＤＳＩＰＱＭＤＳＦＤＫＤＬＥＲＤＴＦＳＤＦＴＦＰＥＹＹＳＴＡＲＶＭＧＧＬＫＮＧＶＬＹＱＧＮＩＱＩＳＥＹＮＦＬＥＧＳＶＳＬＰＲＦＳＫＰＶＬＩＶＧＱＫＮＬＮＲＡＦＮＧＤＱＶＩＶＥＬＬＰＱＳＥＷＫＡＰＳＳＩＶＬＤＳＥＨＦＤＶＮＤＮＰＤＩＥＡＧＤＤＤＤＮＮＥＳＳＳＮＴＴＶＩＳＤＫＱＲＲＬＬＡＫＤＡＭＩＡＱＲＳＫＫＩＱＰＴＡＫＶＶＹＩＱＲＲＳＷＲＱＹＶＧＱＬＡＰＳＳＶＤＰＱＳＳＳＴＱＮＶＦＶＩＬＭＤＫＣＬＰＫＶＲＩＲＴＲＲＡＡＥＬＬＤＫＲＩＶＩＳＩＤＳＷＰＴＴＨＫＹＰＬＧＨＦＶＲＤＬＧＴＩＥＳＡＱＡＥＴＥＡＬＬＬＥＨＤＶＥＹＲＰＦＳＫＫＶＬＥＣＬＰＡＥＧＨＤＷＫＡＰＴＫＬＤＤＰＥＡＶＳＫＤＰＬＬＴＫＲＫＤＬＲＤＫＬＩＣＳＩＤＰＰＧＣＶＤＩＤＤＡＬＨＡＫＫＬＰＮＧＮＷＥＶＧＶＨＩＡＤＶＴＨＦＶＫＰＧＴＡＬＤＡＥＧＡＡＲＧＴＳＶＹＬＶＤＫＲＩＤＭＬＰＭＬＬＧＴＤＬＣＳＬＫＰＹＶＤＲＦＡＦＳＶＩＷＥＬＤＤＳＡＮＩＶＮＶＮＦＭＫＳＶＩＲＳＲＥＡＦＳＹＥＱＡＱＬＲＩＤＤＫＴＱＮＤＥＬＴＭＧＭＲＡＬＬＫＬＳＶＫＬＫＱＫＲＬＥＡＧＡＬＮＬＡＳＰＥＶＫＶＨＭＤＳＥＴＳＤＰＮＥＶＥＩＫＫＬＬＡＴＮＳＬＶＥＥＦＭＬＬＡＮＩＳＶＡＲＫＩＹＤＡＦＰＱＴＡＭＬＲＲＨＡＡＰＰＳＴＮＦＥＩＬＮＥＭＬＮＴＲＫＮＭＳＩＳＬＥＳＳＫＡＬＡＤＳＬＤＲＣＶＤＰＥＤＰＹＦＮＴＬＶＲＩＭＳＴＲＣＭＭＡＡＱＹＦＹＳＧＡＹＳＹＰＤＦＲＨＹＧＬＡＶＤＩＹＴＨＦＴＳＰＩＲＲＹＣＤＶＶＡＨＲＱＬＡＧＡＩＧＹＥＰＬＳＬＴＨＲＤＫＮＫＭＤＭＩＣＲＮＩＮＲＫＨＲＮＡＱＦＡＧＲＡＳＩＥＹＹＶＧＱＶＭＲＮＮＥＳＴＥＴＧＹＶＩＫＶＦＮＮＧＩＶＶＬＶＰＫＦＧＶＥＧＬＩＲＬＤＮＬＴＥＤＰＮＳＡＡＦＤＥＶＥＹＫＬＴＦＶＰＴＮＳＤＫＰＲＤＶＹＶＦＤＫＶＥＶＱＶＲＳＶＭＤＰＩＴＳＫＲＫＡＥＬＬＬＫ
【図１】
2016526877.tif 000011
【図２Ａ】
2016526877.tif 000012
【図２Ｂ】
2016526877.tif 000013
【図２Ｃ】
2016526877.tif 000014
【図３】
2016526877.tif 000015
【図４】
2016526877.tif 000016
【図５Ａ】
2016526877.tif 000017
【図５Ｂ】
2016526877.tif 000018
【図６Ａ】
2016526877.tif 000019
【図６Ｂ】
2016526877.tif 000020
【図６Ｃ】
2016526877.tif 000021
【図６Ｄ】
2016526877.tif 000022
【図６Ｅ】
2016526877.tif 000023
【図７】
2016526877.tif 000024
【図８】
2016526877.tif 000025
【図９】
2016526877.tif 000026
【図１０Ａ】
2016526877.tif 000027
【図１０Ｂ】
2016526877.tif 000028
【図１０Ｃ】
2016526877.tif 000029
【図１０Ｄ】
2016526877.tif 000030
【図１０Ｅ】
2016526877.tif 000031
【図１１】
2016526877.tif 000032
【図１２】
2016526877.tif 000033
【配列表】
2016526877000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月19日(2015.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）好ましくは癌細胞中のｈＤＩＳ３で生じる突然変異を導入することにより、ＲＮＢドメイン中の突然変異を含むＤＩＳ３、そのフラグメント、相同体または変異体を含んでいるモデルシステムを構築する工程、
ｂ）ａ）で得られたモデルシステムを試験済みの薬剤である、想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
ｃ）モデルシステムに適切な方法によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）試験済みの薬剤と接触した際にＰＩＮドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程、
を含む、方法。
【請求項２】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）ＤＩＳ３  ＰＩＮドメイン、そのフラグメント、変異体または相同体、好ましくは単離されたｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインを含む、精製タンパク質を得る工程；
ｂ）ａ）で得られたタンパク質を、試験済みの薬剤である、想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤に接触させる工程、
ｃ）好ましくはＲＮＡ基質の生体外での消化によって、試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）試験済みの薬剤と接触した際にＰＩＮドメインの活性を変化させる試験済みの薬剤を選択する工程であって、これによってＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を得る、工程、
を含む、方法。
【請求項３】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）好ましくは癌細胞中でｈＤＩＳ３を生じる突然変異を導入することにより、ＲＮＢドメイン中に突然変異を備えたＤｉｓ３を含む酵母菌株を構築する工程、
ｂ）ａ）で得られた酵母菌株を、試験済みの薬剤である想定されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
ｃ）試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）野性型Ｄｉｓ３を含む酵母菌ではなく、ａ）で構築された酵母菌の処理後に選択的な成長遅延または細胞死（合成致死）を引き起こす、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項４】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法であって、
ａ）好ましくは癌細胞中のｈＤＩＳ３で生じる突然変異を導入することによって、ＲＮＢドメイン中に突然変異を有するｈＤＩＳ３、そのフラグメントまたは変異体を含む、改変した細胞株、好ましくはヒト細胞株を構築する工程、
ｂ）ａ）で得られた細胞株を、試験済みの薬剤である、想定されるｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤と接触させる工程、
ｃ）試験済みの薬剤の存在下と不在下でＰＩＮドメインの活性を評価する工程、
ｄ）野性型ｈＤＩＳ３を発現する細胞株ではなく、ａ）で構築された細胞株の処理後に選択的な成長遅延または細胞死（合成致死）を引き起こす、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤として試験済みの薬剤を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
癌細胞中のｈＤＩＳ３遺伝子中の突然変異は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病で生じる少なくとも１つの突然変異である、請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
癌細胞中のｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異である、請求項１乃至５に記載の方法。
【請求項７】
ｈＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでいる、請求項１乃至６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項１乃至７に記載の方法。
【請求項９】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬であって、治療薬が請求項１乃至８のいずれか１つの方法で得られるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤である、治療薬。
【請求項１０】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される、治療薬２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン（ＡＣ１ＬＡＨＹＬ）、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を有する癌細胞である、請求項９または１０に記載の治療薬。
【請求項１２】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列ＡＡ  ４２７−８４３中に少なくとも１つの突然変異を有するｈＤＩＳ３  ＲＮＢである、請求項９乃至１１に記載の治療薬。
【請求項１３】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、請求項９乃至１２の治療薬、または、請求項１乃至８の方法によって得られる治療薬の使用。
【請求項１４】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞を処置するための薬物の調製のための、２−ヒドロキシ−（４Ｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン、その誘導体、分解されたエナンチオマー、ジアステレオ異性体、溶媒和物、およびその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項１５】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を有する癌細胞である、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢ中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される、請求項１３乃至１５に記載の使用。
【請求項１７】
ｈＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでいる、請求項１３乃至１６に記載の使用。
【請求項１８】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の処置で使用される治療薬を含む組成物であって、治療薬は請求項１乃至８のいずれか１つの方法で得られるか、あるいは請求項９乃至１２に記載されるように得られる、組成物。
【請求項１９】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異を含む癌細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢ中に突然変異を有する癌細胞は、多発性骨髄腫、髄芽腫、急性骨髄性白血病から選択される、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
抗癌活性を有する少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含み、追加の薬剤は、多発性骨髄腫、髄芽腫、または急性骨髄性白血病に対する抗癌活性を有している、請求項１８乃至２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む、請求項１８乃至２１に記載の組成物。
【請求項２３】
癌細胞の合成致死を引き起こす方法であって、ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞は、ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインのエンドヌクレアーゼ分解活性を阻害する薬剤で処置される、方法。
【請求項２４】
ｈＤＩＳ３  ＰＩＮドメインの活性を阻害する薬剤は、請求項１乃至８の方法によって得られるか、あるいは、請求項９乃至１２の治療薬であるか、あるいは、請求項１８乃至２２の組成物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＤＩＳ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のそのＲＮＢドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項２３乃至２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を選択する方法で使用される酵母菌株、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株であって、酵母菌株はＤｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を含むＤＩＳ３を含み、これは癌細胞で見られる突然変異の等価物であり、Ｄｉｓ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択される少なくとも１つの突然変異である、酵母菌株。
【請求項２８】
Ｄｉｓ３はそのＲＮＢドメイン内のコード配列中に少なくとも１つの突然変異を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  ４２７−８４３のヒトｈＤＩＳ  ＲＮＢドメインに相同するそのＲＮＢドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、したがって、こうした突然変異は、髄芽腫、急性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫から選択された癌細胞中の突然変異と等価である、請求項２７に記載の酵母菌株。
【請求項２９】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮであるか、あるいは、ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインは（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＡＡ  １−２４１）のＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項２７に記載の酵母菌株。
【請求項３０】
該方法は請求項２７乃至２９で定義される酵母菌株の使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための請求項２７乃至３０のいずれか１つの酵母菌株の使用。
【請求項３２】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の選択方法で使用される細胞株であって、細胞株は癌細胞で見られる突然変異の等価物であるＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異を有するＤＩＳ３を含む、細胞株。
【請求項３３】
細胞株は髄芽腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫から選択される、請求項３２に記載の細胞株。
【請求項３４】
細胞株は、ヒト細胞株、好ましくはＨＥＫ２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ細胞株の誘導体である、請求項３２または３３に記載の細胞株。
【請求項３５】
ヒト細胞株は、
−内因性のｈＤＩＳ３コピーを発現停止させることができるｓｈ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ  
−ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞で見られる突然変異に対応する突然変異を有し、かつ、ｓｈ−ｍｉＲＮＡ活性に対する感受性をなくすために再コード化されたフラグメントを含む、外因性のｈＤＩＳ３変異体、
を発現する双方向に誘導可能なプロモーターを含むベクターの使用により構築される、請求項３２乃至３４のいずれか１つに記載の細胞株。
【請求項３６】
ＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中の突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関して、Ｓ４７７Ｒ、Ｇ７６６Ｒ、Ｒ７８０Ｋ、Ｖ５０４Ｇ、Ａ５２４Ｐ、Ｉ８４５Ｖ、Ｄ４８７Ｎから選択された少なくとも１つの突然変異である、請求項３２乃至３５に記載の細胞株。
【請求項３７】
ＤＩＳ３  ＲＮＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列ＡＡ  ４２７−８４３中の少なくとも１つの突然変異を含むｈＤＩＳ３  ＲＮＢをコード化する、請求項３３乃至３６に記載の細胞株。
【請求項３８】
ＤＩＳ３  ＰＩＮドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＡ  １−２１７のｈＤＩＳ３  ＰＩＮである、請求項３２乃至３７に記載の細胞株。
【請求項３９】
該方法は請求項３２乃至３８の細胞株の使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４０】
ｈＤＩＳ３  ＲＮＢドメイン中に突然変異を有する癌細胞の治療で使用されるＤＩＳ３  ＰＩＮドメインエンドヌクレアーゼ活性阻害剤をスクリーニングするための請求項３２乃至３８のいずれか１つの細胞株の使用。
【国際調査報告】
2016526877.tif 000034
2016526877.tif 000035