(57)【要約】本発明は、ポリマー包埋成分を含む細胞培養培地に関する。ある成分は、乾燥粉末細胞培養培地中での安定性が不十分である。他の成分は、吸湿性である。このような成分をポリマーに包埋すると、安定性を向上させ、塊状化を低減することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のポリマー包埋成分を含む乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項２】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ブロックコポリマー、ポリビニルピロリドン、またはポリビニルカプロラクタム−ポリ酢酸ビニル−ポリエチレングリコールグラフトコポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
前記ポリマーが、ポロキサマーであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の細胞培養培地。
【請求項４】
前記成分が、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ、塩化コリン、硝酸第二鉄・９Ｈ２Ｏ、硫酸第一鉄・７Ｈ２Ｏ、リン酸ナトリウム、またはリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）一水和物であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項５】
前記細胞培養培地が、２種以上のポリマー包埋成分を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項６】
前記細胞培養培地が、哺乳動物細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項７】
前記細胞培養培地が、化学的に明確な細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項８】
前記ポリマー包埋成分が、ホットメルト押出によって調製されていることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項９】
前記ポリマー包埋成分が、湿式造粒によって調製されていることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
ａ）１種または複数のポリマー包埋成分を用意するステップと、
ｂ）細胞培養培地の他の成分を用意し、それらを混合し、それらを粉砕にかけるステップと、
ｃ）ポリマー包埋成分を、ステップｂ）の粉砕された混合物と混合するステップと
によって、細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１１】
ステップｂ）を、ボールミル、ピンミル、フィッツミル、またはジェットミルで実施することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップａ）からの混合物を、粉砕の前に０℃未満の温度に冷却することを特徴とする、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）バイオリアクターを用意するステップと、
ｂ）請求項１のいずれかに記載の細胞培養培地を、水または水性緩衝液に溶解させるステップと、
ｃ）培養すべき細胞を、ステップｂ）の結果として得られる培地と混合するステップと、
ｄ）ステップｃ）の混合物をインキュベートするステップと
によって細胞を培養するプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー包埋(embedded)成分を含む乾燥細胞培養培地に関する。乾燥粉末細胞培養培地中で安定性が不十分な成分がある一方で、吸湿性である成分もある。完全に溶解するのに多大な時間のかかる成分もある。このような成分をポリマーに包埋すると、安定性を向上させ、塊状化(clumping)を低減することができる。
【背景技術】
【０００２】
水溶液の細胞培養培地は、細胞の成長を維持および保全し、かつ／または特定の産物のターゲット化産生に付随的な所望の生理学的細胞条件を保全する環境を提供し得る。
【０００３】
細胞培養培地は、その成長および／またはターゲットとされる生理学的状態が維持されることになる有機体のタイプに応じて、成分、時に１００種を超える異なる成分からなる、複雑な混合物を含む。
【０００４】
哺乳動物、昆虫または植物細胞の増殖に必要となる細胞培養培地は、通常、細菌、酵母または真菌の成長を維持する培地よりはるかに複雑である。
【０００５】
開発された最初の細胞培養培地は、血漿、血清、胚抽出物および／または他の生物学的抽出物、ペプトンなどの、化学的な明確さが非常に不十分であり、特徴付けが不十分であり、一定の品質での製造が困難であった成分の多様な混合物からなる複雑な培地であった。化学的に明確な(chemically defined)培地の開発と共に、こうして大きな進歩が遂げられた。化学的に明確な培地は、多くの場合、排他的に限定はしないが、アミノ酸、ビタミン、糖、金属塩、抗酸化物質、キレート剤、成長因子、緩衝液、ホルモン、および当業者に公知であるさらに多くの物質を含む。
【０００６】
一部の細胞培養培地は無菌の水性液体として提供される。液体細胞培養培地の不利点は、その貯蔵寿命が短縮され、輸送および貯蔵が難しいことである。結果として、多くの細胞培養培地は、現在、微粉砕(mill)された乾燥粉末混合物として提供されている。これらは、水および／または水溶液に溶解させる目的で製造され、溶解した状態で、多くの場合、他の補充物と共に、細胞に成長および／もしくは前記細胞からのバイオ医薬品の産生のための実質的な栄養基盤を供給するように設計され、かつ／または特定の栄養素に制限されるとき、細胞に供給するための供給材料として使用される。
【０００７】
乾燥粉末からの細胞培養培地の調製および使用の制限要因は、一部の成分の安定性が不十分であり、そのため、乾燥粉末培地の貯蔵中に分解および／または酸化する傾向があることである。一部の成分は、吸湿性であり、その結果、多くの場合、培地の塊状化が起こり、その産業適用分野を限定する、安定性および／または他の品質の問題につながる。加えて、吸湿性化合物によって誘引された水が、微生物の成長の増加だけでなく、近隣の成分の分解をもたらす可能性もある。
【０００８】
結果として、敏感な培地成分の安定性を向上させ、吸湿性成分のマイナスの影響を軽減するための手段を見出すことが有利となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第３，５７９，４６５号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａｇｅｒｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ  Ｐｒａｘｉｓ、第９巻、「Ｓｔｏｆｆｅ  Ｐ−Ｚ」、１９９４、２８２〜２８４頁
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＣＨＯ  Ｓ性能試験の結果を示すグラフである。
【図２】ＣＨＯ  Ｓ性能試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
敏感および／または吸湿性培地成分は、ポリマー基材に包埋することにより安定化できることがわかった。不安定性および／または品質の低下が、酸化および／または吸湿性、および／またはファンデルワールス力および／もしくは静電気力による凝塊形成のいずれによって引き起こされていようが、敏感および／または吸湿性培地成分を前記成分の安定性を向上させる他の成分に包埋し、かつ／またはそれでコーティングし、かつ／またはそれと接触させることにより、吸湿性成分による水の誘引は減少し、酸化または分解に敏感な成分は、安定性の向上を示し、したがって、そのような酸化した成分および／またはぬれ／湿り／粘りのある成分が近隣成分に及ぼし得る影響も軽減される。
【００１３】
したがって、本発明は、少なくとも１種のポリマー包埋成分を含む乾燥粉末細胞培養培地を対象とする。
【００１４】
好ましい実施形態では、ポリマーは、ポロキサマーである。
別の好ましい実施形態では、成分は、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ、塩化コリン、硝酸第二鉄・９Ｈ２Ｏ、硫酸第一鉄・７Ｈ２Ｏ、リン酸ナトリウムまたはリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）一水和物である。
一実施形態では、細胞培養培地は、２種以上のポリマー包埋成分を含む。
一実施形態では、ポリマー包埋成分は、ホットメルト押出によって調製されている。
別の実施形態では、ポリマー包埋成分は、湿式造粒によって調製されている。
一実施形態では、細胞培養培地は、哺乳動物細胞培養培地である。
別の実施形態では、細胞培養培地は、化学的に明確な細胞培養培地である。
【００１５】
本発明はさらに、
ａ）１種または複数のポリマー包埋成分を用意するステップと、
ｂ）細胞培養培地の他の成分を用意し、それらを混合し、それらを粉砕にかけるステップと、
ｃ）ステップａ）のポリマー包埋成分を、ステップｂ）の結果として得られる粉砕された混合物に加えるステップと
によって、本発明による細胞培養培地を製造する方法を対象とする。
【００１６】
好ましい実施形態では、ステップｂ）は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミル、最も好ましくは、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルで実施される。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、ステップａ）からの混合物は、粉砕の前に０℃未満の温度に冷却される。
【００１８】
本発明はさらに、
ａ）バイオリアクターを用意するステップと、
ｂ）本発明による細胞培養培地を水または水性緩衝液に溶解させ、培養すべき細胞をそれと混合するステップと、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートするステップと
によって細胞を培養するプロセスを対象とする。
【００１９】
図１および２は、ＣＨＯ  Ｓ性能試験を示す。これ以上の細目は、例２において見ることができる。
【００２０】
本発明による細胞培養培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を保全および／もしくは維持し、かつ／または特定の生理学的状態を維持する成分のいずれの混合物である。培地は、複雑な培地でも、化学的に明確な培地でもよいことになる。細胞培養培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長の保全および／または維持に必要なすべての成分を含む場合も、またはさらなる成分が別途加えられるように一部の成分だけを含む場合もある。本発明による細胞培養培地の例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長の保全および／または維持に必要なすべての成分、ならびに培地補充物または供給材料、を含む完全培地(full  media)である。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、完全培地またはいくつかの成分を含まない培地である。
【００２１】
通常、本発明による細胞培養培地は、細胞の成長を保全および／もしくは維持し、かつ／またはバイオリアクターにおいて特定の生理学的状態を維持するのに使用される。
【００２２】
哺乳動物細胞培養培地とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞の成長を保全および／または維持する成分の混合物である。哺乳動物細胞の例は、ヒトまたは動物細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｉ  ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ−１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞またはヒト細胞である。
【００２３】
化学的に明確な細胞培養培地とは、化学的に不明確ないかなる物質も含まない細胞培養培地である。これは、培地に使用されるすべての化学物質の化学組成がわかっていることを意味する。化学的に明確な培地は、いかなる酵母、動物または植物組織も含まず、支持細胞、血清、抽出物もしくは消化物、または化学的な明確さが不十分なタンパク質および／もしくはペプチドおよび／もしくは加水分解物を培地に与えかねない他の成分を含まない。化学的に不明確、または明確さが不十分な成分とは、その化学組成および構造が、十分にわかっていない、明確さに乏しく変動する組成で存在する、またはアルブミンやカゼインのようなタンパク質の化学組成および構造の評価に匹敵する膨大な実験作業でしか明確にすることができない成分である。
【００２４】
粉末状細胞培養培地または乾燥粉末培地とは、通常は粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスの結果として得られる細胞培養培地である。その意味は、粉末状細胞培養培地が、液体培地でなく、粒状の微粒子培地であるということである。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と区別なく使用してよいが、しかし、本明細書で使用する「乾燥粉末」は、別段指摘しない限り、単に、顆粒状材料の大まかな外観を指し、その物質が、複合化または凝塊形成した溶媒を完全に含まないことを意味するものではない。
【００２５】
本発明による培地で培養される細胞は、細菌細胞のような原核細胞、または酵母、真菌、植物、もしくは動物細胞のような真核細胞でよい。細胞は、正常細胞、不死化細胞、疾患細胞、形質転換細胞、突然変異体細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞が可能であり、これらはいずれも、樹立細胞系もしくは形質転換細胞系でよく、または自然供給源から得てもよい。
【００２６】
粒子の大きさとは、粒径平均値を意味する。粒径は、シリコーン油中でのレーザー光散乱によって求める。
【００２７】
それぞれの容器または装置を不活性ガスで満たすことにより、不活性雰囲気を生成する。適切な不活性ガスは、アルゴン、好ましくは窒素などの希ガスである。こうした不活性ガスは、反応性が最小限に抑えられ、望ましくない化学反応が起こることを防ぐ。本発明によるプロセスにおいて、不活性雰囲気を生成するとは、たとえば、液体窒素または窒素ガスを導入することにより、酸素の濃度を１０％絶対（ｖ／ｖ）未満に低下させることを意味する。
【００２８】
異なるタイプのミルが、当業者に公知である。
【００２９】
遠心衝撃ミルとも呼ばれるピンミルは、高速回転盤上に突き出ているピンが破壊エネルギーをもたらすことにより、固体を微粉砕する。ピンミルは、たとえば、Ｍｕｎｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ（米国）、Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｐｕｌｍａｎ（インド国）、またはＳｔｕｒｔｅｖａｎｔ（米国）が販売している。
【００３０】
ジェットミルでは、圧縮ガスを使用して、プロセスチャンバーにおける粒子同士の衝突の誘発を加速させる。ジェットミルは、たとえば、Ｓｔｕｒｔｅｖａｎｔ（米国）またはＰＭＴ（オーストリア国）が販売している。
【００３１】
Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ（米国）によって商品化されたフィッツミルでは、羽根の付いたローターが粉砕に使用される。
【００３２】
連続的に行われるプロセスは、バッチ式では行われないプロセスである。粉砕プロセスが連続的に行われる場合、培地原材料が、一定の時間にかけて永続的かつ絶え間なくミルに供給されることを意味する。
【００３３】
本発明による細胞培養培地は、通常、少なくとも、１種または複数の糖成分、１種または複数のアミノ酸、１種または複数のビタミンまたはビタミン前駆体、１種または複数の塩、１種または複数の緩衝液成分、１種または複数の補因子、および１種または複数の核酸成分を含む。
【００３４】
培地は、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、消化物もしくは抽出物、脂肪酸および／もしくは脂肪酸誘導体、および／またはｐｌｕｒｏｎｉｃ製品成分（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドを主体とするブロックコポリマー）、詳細には、時にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８もしくはＫｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ１８８もしくはＬｕｔｒｏｌ  Ｆ６８と呼ばれるＰｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤のような界面活性成分も含んでよい。適切な非イオン性界面活性剤の一例は、たとえばドイツ国のＢＡＳＦからｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名で入手可能な、ポロキサマーとも呼ばれる、第一ヒドロキシル基を終端とする二官能性ブロックコポリマー界面活性剤である。
【００３５】
糖成分は、グルコース、ガラクトース、リボースもしくはフルクトース（単糖の例）、またはスクロース、ラクトースもしくはマルトース（二糖の例）のような、すべての単糖または二糖である。糖成分はオリゴ糖または多糖でもよい。
【００３６】
本発明に従うアミノ酸の例は、タンパク新生アミノ酸であるチロシン、特に、必須アミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびにＤ−アミノ酸のような非タンパク新生アミノ酸である。
【００３７】
チロシンとはＬ−またはＤ−チロシンを意味し、Ｌ−チロシンが好ましい。
【００３８】
システインとはＬ−またはＤ−システインを意味し、Ｌ−システインが好ましい。
【００３９】
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、種々のレチノイド、および４種のカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）、およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体および類似体も含まれる。
【００４０】
塩の例は、炭酸水素塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸、カリウム、ナトリウムなどの無機イオン、またはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、Ｖ、Ｚｎなどの微量元素を含む成分である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、無水リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、無水リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
【００４１】
緩衝液の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸）、リン酸、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
【００４２】
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、ビタミンＢ１２、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン、ヘム、ヌクレオチドリン酸(nucleotide phophates)および誘導体である。
【００４３】
本発明に従う核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸のようなヌクレオチドである。
【００４４】
本発明に従う凍結とは、０℃未満の温度に冷却することを意味する。
【００４５】
本発明の要旨は、貯蔵に対して安定であり、塊状化または成分の分解なしに容易に加工処理することのできる、粉末状細胞培養培地を提供することである。粉末と溶媒を混合することにより、乾燥粉末培地を適切な溶媒に溶解させると、粉末は溶解し、培地成分の濃度が望ましく均等である、完全培地、培地補充物、培地サブグループ、供給材料などの液体細胞培養培地を生じる。
【００４６】
原則として、すべての細胞培養培地成分をポリマーに包埋することができる。通常、分解、酸化、または他の化学修飾に敏感である成分、溶解性を向上させたい成分、および／または吸湿性成分を、ポリマーに包埋する。このような培地成分の例は、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ、塩化コリン、硝酸第二鉄・９Ｈ２Ｏ、硫酸第一鉄・７Ｈ２Ｏ、リン酸ナトリウム、またはリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）一水和物である。
【００４７】
表１に、ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地の成分の一覧を示す。全成分について、ポリマー包埋の効果を示す。
表１において、「Ｓｏｌｕ」とは、成分が本発明に従って包埋され、その包埋された形態で培地組成物中に使用される場合、包埋されていない形態に比べて、前記成分の溶解性が向上することを意味する。
表１において、「Ｓｔａｂ」とは、成分が本発明に従って包埋され、その包埋された形態で培地組成物中に使用される場合、包埋されていない形態に比べて、前記成分の安定性が向上することを意味する。
表１において、「Ｏｘｉｄ」とは、成分が本発明に従って包埋され、その包埋された形態で培地組成物中に使用される場合、包埋されていない形態に比べて、前記成分の酸化に対する安定性が向上することを意味する。
表１において、「Ｈｙｇｒｏｓ」とは、成分が本発明に従って包埋され、その包埋された形態で培地組成物中に使用される場合、前記物質が周囲の環境から水分子を誘引し、保持し得る能力が、包埋されていない形態に比べて低下することを意味する。言い換えれば、包埋された成分は、吸湿性がより低い。
表１において、「ＮＡ」とは、「該当なし」を意味する。その意味は、表にＮＡと記されている成分について、本発明に従う包埋によって、明らかな効果が得られないということである。
【００４８】
ポリマーに包埋されるとは、成分が、ポリマーによって部分的もしくは完全にコーティングされ、またはポリマー基材中に分散していることを意味する。成分は、ポリマー基材中に、粒子として、または分子レベルで分散し、したがって、固溶体を形成する可能性もある。
【００４９】
本発明に従って成分を包埋するのに適するポリマーは、水溶性ポリマーである。
適切なポリマーの例は、可溶性セルロース誘導体、たとえば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース；ポリ（ビニルアルコール）、一部加水分解されたポリビニルアルコール、酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリト酸セルロース、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール（たとえば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ(商標)）、カルボマー、ポリカルボフィル、キトサン；天然ゴム、たとえば、グアーガム、アカシアガム、トラガカントゴムまたはキサンタンガム、およびポビドン；ポリエチレングリコールなどのワックス；Ｅｕｄｒａｇｉｔ(登録商標)ＲＬやＥｕｄｒａｇｉｔ(登録商標)ＲＳなどのメタクリル酸ポリマー；またはポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファジン、ポリオキサゾリジン、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）、カラゲネート(carrageenate) アルギネート、カルボマー、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸ナトリウム、またはこれらの混合物である。
【００５０】
好ましい実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)／ポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)ブロックコポリマー、ポリビニルピロリドン、またはポリビニルカプロラクタム−ポリ酢酸ビニル−ポリエチレングリコールグラフトコポリマーである。
【００５１】
ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)／ポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)ブロックコポリマーは、ポロキサマーとも呼ばれる。本発明に従ってポリマーとして好ましく使用されるＣＡＳ番号９００３−１１−６のポロキサマーは、一般式Ｉを有し、
【００５２】
【化１】
2016526391.tif 000002
【００５３】
ｘおよびｚは、独立に、２〜１３０であることが好ましく、ｙは、１５〜６７であることが好ましい。
【００５４】
これらは市販品として入手可能である（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ(登録商標)またはＬｕｔｒｏｌｅ(登録商標)、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(登録商標)溶液、ゲル、または固体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(登録商標)Ｆ−１２７）。あるいは、ポロキサマーは、原料から、当技術分野で公知である方法に従って製造することができる（例えば、米国特許第３，５７９，４６５号(特許文献１)および第３，７４０，４２１号を参照）。
【００５５】
ポロキサマーについてのこれ以上の情報は、Ｈａｇｅｒｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ  Ｐｒａｘｉｓ、第９巻、「Ｓｔｏｆｆｅ  Ｐ−Ｚ」、１９９４、２８２〜２８４頁（非特許文献１）において見ることができる。
【００５６】
ポリビニルピロリドンポリマーは、ドイツ国のＢＡＳＦから、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）として市販品が入手可能である。
【００５７】
ポリビニルカプロラクタム−ポリ酢酸ビニル−ポリエチレングリコールグラフトコポリマーは、ドイツ国のＢＡＳＦから、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ（登録商標）として市販品が入手可能である。
【００５８】
培地成分のポリマーへの包埋は、いくつかの方法によってなされ得ることになる。
【００５９】
ポリマーをコーティングの形で適用しようとする場合、コーティングは、安定剤などの追加原材料を加えまたは加えない、溶液／懸濁液としての皮膜形成ポリマーを、従来のコーティングパンもしくは流動床加工処理装置でのスプレーコーティング、ディップコーティング、または圧縮コーティングなどの当技術分野で公知である従来のいずれかのコーティング技術を使用して適用することにより実施できる。
【００６０】
好ましい実施形態では、培地成分は、ポリマーによって形成された基剤中に分散している。
【００６１】
このような分散体は、ホットメルト押出、噴霧乾燥、固体分散、流動床造粒、固体分散、または同時凍結乾燥(co-lyophilisation)のような手順によって作製することができる。
【００６２】
押出は、温度、混合、供給量、圧力などの制御された条件下でオリフィスまたはダイに押し通すことにより、新たな材料（押出品）を形成するプロセスであると簡潔に定義することができる。ホットメルト押出では、ポリマーは融解した状態である。押出後、ホットメルト押出品は、ポリマーと分散した培地成分とを含む固体である。
【００６３】
成分をホットメルト押出によってポリマーに包埋する場合、ポリマーは２００℃未満の融点を有するべきである。ポリマーは、好ましくは１５０℃未満、最も好ましくは７５℃未満の融点を有する。
【００６４】
ホットメルト押出（ＨＭＥ）手法は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８）のようなポロキサマーをポリマーとして使用するとき、適切に適用できることがわかった。
【００６５】
同時凍結乾燥については、最初のステップにおいて、同時凍結乾燥すべきすべての成分を溶媒に溶解させる。
【００６６】
成分は、１種の溶媒に可溶化することもできる。別法として、各成分を別個の溶媒に溶解させることもでき、得られる、成分の異なる２種以上の溶液を、次いで混合することができる。通常、混合するすべての溶液が同じ溶媒を有する。
【００６７】
適切な溶媒は、すべての成分がそれに可溶性であるものである。適切な溶媒の例は、有機溶媒もしくは水、またはその混合物である。好ましくは水である。
【００６８】
溶媒を選択し、成分を溶解させたなら、得られる混合物を凍結させ、凍結乾燥して乾燥させる。時には、混合物に追加の溶媒を加えて、凍結乾燥を促進する。通常、凍結乾燥は、−２０℃未満の温度、好ましくは−８０℃前後で実施する。液体は通常、減圧の適用によって除去される。
【００６９】
噴霧乾燥については、培地成分およびポリマーを溶媒に溶解させる。適切な溶媒の例は、有機溶媒もしくは水、またはその混合物である。好ましくは水である。次いで、溶液を噴霧乾燥装置に入れ、その結果、溶液は、制御された温度および湿度などの、粉末の生成に適した条件下で、粉末が形成されるまで、装置の中のチャンバーに噴霧されることにより、その対応する粉末に変換される。
【００７０】
典型的な噴霧乾燥手法では、溶液は、装置に吸入され、ロータリー型またはノズル型アトマイザーで微粒化されてしぶきになる。得られる、微粒化された液体のしぶきを、次いで、気体（たとえば、窒素、またはより好ましくは空気）と混合し、粉末状製品の製造を促進するのに十分な条件下で乾燥チャンバーへと噴霧する。
【００７１】
固体分散については、培地成分とポリマーを混合し、少なくともポリマーが融解するように加熱する。十分に混合した後、混合物を再び冷却して、ポリマーと培地成分とを含む固体を得る。
【００７２】
ホットメルト押出、凍結乾燥、噴霧乾燥、固体分散、流動床造粒または他の包埋手順の後に得られた固体は、次いで、たとえばボールミルにおいて粉砕して、均等な大きさの粒子を生成することが好ましい。得られるポリマーに包埋された少なくとも１種の培地成分を含む粒子は、通常、粒径が２００μｍ未満である。好ましいのは１００μｍ未満の粒径である。好都合な粒径は１５μｍ〜１００μｍの間である。
【００７３】
ポリマー包埋成分は、単一の種類の成分でもまたは２種以上の成分の混合物でもよいと理解される。さらに、ポリマー包埋成分のポリマーは、単一の種類のポリマーまたは２種以上のポリマーの混合物でよいことになると理解される。好ましい実施形態では、各ポリマー包埋成分は、１種の培地成分と１種のポリマーだけを含有する。ポリマー包埋成分は、安定剤または可塑剤をさらに含んでもよいことになるが、好ましい実施形態では、ポリマー包埋成分は、培地成分とポリマーだけを含有する。
【００７４】
通常、ポリマー包埋成分は、０．０１重量％〜９９重量％の間の培地成分と、９９．９９重量％〜１重量％の間のポリマーとを含む。ポリマー包埋成分は、１０重量％〜９０重量％の間の培地成分と、９０重量％〜１０重量％の間のポリマーとを含むことが好ましい。
【００７５】
本発明の粉末状細胞培養培地は、ポリマー包埋成分を除くすべての成分を混合し、それらを粉砕することにより製造することが好ましい。成分の混合は、粉末状乾燥細胞培養培地を粉砕によって製造する当業者に公知である。混合物の全域がほぼ同じ組成を有するように、粉砕前にすべての成分を十分に混合することが好ましい。組成物の均質性が高いほど、均等な細胞成長に関して、得られる培地の品質はより良好になる。特に、ポリマー包埋成分がコーティングされた成分である場合、ポリマー包埋成分は、粉砕後に混合物に加えることが好ましい。成分がポリマー基材中に分散している場合、ポリマー包埋成分は、粉砕の前に他の成分と混合し、他の成分と一緒に粉砕してもよい。
【００７６】
粉砕は、粉末状細胞培養培地の製造に適する任意のタイプのミルで行うことができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルである。好ましくは、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルであり、大いに好ましいのはピンミルである。
【００７７】
当業者は、このようなミルを運転する方法を知っている。
【００７８】
円盤直径が約４０ｃｍである大規模設備ミルは、たとえば、ピンミルの場合では、通常、毎分１〜６５００回転で運転され、好ましくは毎分１〜３０００回転である。
【００７９】
粉砕は、粒径が１０μｍ〜３００μｍの間、最も好ましくは２５μｍ〜１００μｍの間である粉末が結果として得られる、標準の粉砕条件下で行うことができる。
【００８０】
粉砕にかける混合物のすべての成分が乾燥していることが好ましい。これは、水を含むとしても結晶水だけを含み、非結合または非配位水分子は、１０重量％を超えない、好ましくは５重量％を超えない、最も好ましくは２重量％を超えないことを意味する。
【００８１】
好ましい実施形態では、粉砕は不活性雰囲気中で行う。好ましい不活性保護ガスは窒素である。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、混合物のすべての成分を粉砕の前に凍結させる。粉砕に先だった原材料の凍結は、原材料を０℃未満、最も好ましくは−２０℃未満の温度に確実に冷却するどんな手段で行ってもよい。好ましい実施形態では、凍結は液体窒素を用いて行う。これは、ミルに導入する前に、原材料を、たとえば原材料を収めた容器に液体窒素を注ぐことにより、液体窒素で処理することを意味する。好ましい実施形態では、容器はフィーダーである。容器がフィーダーである場合、液体窒素は、フィーダーの、原材料を導入した側面に、またはその側面の近くに導入することが好ましい。
【００８３】
通常、原材料は、液体窒素で２秒〜２０秒かけて処理する。
【００８４】
原材料の冷却は、ミルに入るすべての原材料が０℃未満、最も好ましくは−２０℃未満の温度になるように行うことが好ましい。
【００８５】
好ましい実施形態では、すべての原材料を容器に入れ、そこから混合物をフィーダー、最も好ましくは計量スクリューフィーダーに移す。フィーダーにおいて、原材料は、時に、フィーダーの種類に応じてさらに混合され、またさらに冷却される。次いで、凍結した混合物をフィーダーからミルに移すが、その結果、ミルの中で粉砕される混合物は、依然として温度が０℃未満、より好ましくは−２０℃未満であることが好ましい。
【００８６】
通常、原材料の混合物のフィーダーにおける滞在時間を意味する混和時間は、１分を超え、１５分〜６０分の間であることが好ましい。
【００８７】
ドーセージスネイル(dosage  snail)とも呼ばれる計量スクリューフィーダーは、通常、毎分１０〜２００回転のスピードで運転され、毎分４０〜６０回転で運転されることが好ましい。
【００８８】
通常、ミルの温度は−５０℃〜＋３０℃の間に保たれる。好ましい実施形態では、温度は１０℃前後に保たれる。
【００８９】
粉砕の際の酸素レベルは１０％（ｖ／ｖ）未満であることが好ましい。
【００９０】
プロセスは、たとえば、バッチ式でまたは連続的に行うことができる。好ましい実施形態では、本発明によるプロセスは、一定の時間にかけて、原材料の混合物を冷却用のフィーダーに永続的に補充し、フィーダーからの冷却された混合物をミルに永続的に補充することにより、連続的に実施される。
【００９１】
粉砕された粉末状培地を使用するには、溶媒、好ましくは、水（最も詳細には、蒸留水および／もしくは脱イオン水、精製水、または注射用水）または水性緩衝液を培地に加え、培地が溶媒に完全に溶解するまで、成分を混合する。
【００９２】
水または水性緩衝液は、食塩水、（通常はｐＨ１．０〜ｐＨ１０．０の間の範囲の）適切なｐＨ範囲をもたらす可溶性の酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存剤、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含んでもよい。
【００９３】
細胞培養培地と溶媒の混合物に、ｐＨ調整のための緩衝物質、ウシ胎児血清、糖などの、さらなる物質を加えることも可能である。次いで、得られる液体細胞培養培地を、成長または保全すべき細胞と接触させる。
【００９４】
本発明はさらに、
ａ）バイオリアクターを用意するステップと、
ｂ）培養すべき細胞を、水または水性緩衝液に溶解させてある、本発明による細胞培養培地と混合するステップと、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートするステップと、
によって、細胞を培養するプロセスを対象とする。
【００９５】
バイオリアクターは、中で細胞を培養することのできる、容器、器またはタンクのような、細胞の培養に適するいずれのユニットである。バイオリアクターは、通常、使用前に滅菌される。インキュベートは、通常、適切な温度などの適切な条件下で行われる。当業者は、細胞の成長／培養を維持または保全するのに適するインキュベート条件を承知している。
【００９６】
１種または複数のポリマー包埋成分を含む本発明の細胞培養培地は、貯蔵したときに標準の培地に比べてより良好な安定性を示す。
【００９７】
加えて、１種または複数のポリマー包埋成分を含む本発明の細胞培養培地の流動特性は、吸湿性成分が覆われているので、比較に値する標準の培地より良好である。
【００９８】
本発明は、以下の図面および例によってさらに例示されるが、これらに限定されることはない。
【００９９】
上文および下文で引用するすべての出願、特許および刊行物、ならびに対応する２０１３年７月１１日出願のＥＰ出願１３００３５１４．０の開示全体を、参照により本明細書に援用する。
【０１００】
【表１−１】
2016526391.tif 000003
【０１０１】
【表１−２】
2016526391.tif 000004
【実施例】
【０１０２】
以下の例は、本発明の実際の適用例である。
【０１０３】
１．ポロキサマーに包埋した炭酸水素ナトリウムの調製
ポロキサマー包埋炭酸水素ナトリウムは、Ｕｎｉｌａｂ  Ｈ００５３３  Ｈｏｔｍｅｌｔを使用して、ホットメルト押出によって調製する。
出発材料（Ｅｄｕｃｔ）：
約１００μｍ〜２００μｍの間の粒子の形の炭酸水素ナトリウム  ２５００ｇ
噴霧液としての融成物の形のポロキサマー（ＢＡＳＦ、ドイツ国）  １０００ｇ
明細：
２つのＨｕｔｔｌｉｎ−３成分ノズル、直径１．２ｍｍ
４×１ｍｍ  テフロン管
噴霧空気フラップ：２．３ｍｍ
小気候：定常４０℃
管：１００℃
器：１３０℃
噴霧空気：１３０℃。
【０１０４】
２．ポロキサマーに包埋した炭酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｒｏｇｅｎ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）およびＬ−グルタミンのＣＨＯ  Ｓ性能試験
ポロキサマー包埋成分は、例１の手順に従って調製する。
ＣＨＯ  Ｓ細胞を、未処理および包埋炭酸水素ナトリウムおよびＬ−グルタミンを加えたＣｅｌｌｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  １００（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に播き、４℃で４週間にわたり保管する。
図１および２は、ＣＨＯ  Ｓ性能試験を示すものである。
【図１】
2016526391.tif 000005
【図２】
2016526391.tif 000006
【国際調査報告】
2016526391.tif 000007
2016526391.tif 000008
2016526391.tif 000009