(57)【要約】  本発明は、画期的プロバイオティクス細菌に基づく毒性試験方法により検出可能な、プロバイオティクス細菌に対する毒性を避けた、食品および医薬品業界用であることが意図される原材料および最終製品を産生する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無毒食品または医薬品原材料を産生する方法であって、該原材料を予め確立された細菌負荷のプロバイオティクス細菌株と接触させて置く第一工程および該プロバイオティクス細菌株に対して該原材料が発揮する毒性による該細菌負荷の減少を決定する第二工程を含む、方法。
【請求項２】
該第一工程が
− 予め確立された濃度、好ましくは１×１０６〜１×１０９CFU／ｇに入る濃度のプロバイオティクス細菌株マーカー、該プロバイオティクス細菌株の増殖用の最適培養基質および試験する食品または医薬品原材料を含む第一試験サンプルおよび
− 該第一サンプルと同じ予め確立された濃度の同じプロバイオティクス細菌株、該プロバイオティクス細菌株の増殖用の最適培養基質および試験する食品または医薬品原材料を含む第二試験サンプル(内部標準)
の調製を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該第二工程が該第一および該第二試験サンプルの細菌数計数の実施を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該細菌数計数を、初期サンプルを再懸濁する工程、適当な希釈剤での連続希釈を製造する工程、寒天培地に播種する工程および最適条件下でインキュベーション後にコロニーを計数する工程を含む方法により実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該第一試験サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)対該第二試験サンプル(内部標準)の細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)の比を決定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プロバイオティクス細菌に対する毒性のマーカーとして使用するプロバイオティクス細菌株をラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属から選択する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該食品または医薬品原材料が香味料、抽出物、有機および／または無機起源の補助剤、科学技術添加物、ビタミン類、タンパク質、アミノ酸類、ペプトン類、天然および／または合成ポリマー類およびその他からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の無毒食品または医薬品原材料の製造方法を使用して、選択したプロバイオティクス細菌に対して毒性がない原材料を含む、食品または栄養補助食品または医療用品または医薬製品を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクス細菌に対する毒性を分析するための  −  プロバイオティクス細菌に基づく  −  画期的方法により検出可能な、食品および医薬品業界向けであり、毒性を欠く原材料および最終製品を製造するための方法に関する。
【０００２】
所望の最終製品を得ることを可能にする適切な加工および工業的処理の適用により他の製品の製造および生産をする基礎である全ての材料または物質は、原材料と考えられる。
【背景技術】
【０００３】
食品または栄養補助食品または医療用器具または医薬品の生産に使用される原材料は、例として、香味料、抽出物、有機および／または無機起源の補助剤(co-formulants)、技術的添加物(technological additives)、ビタミン類、タンパク質、アミノ酸類、ペプトン類、天然および／または合成ポリマー類およびその他のものを含む。
【０００４】
説明として、したがって、非網羅的例として、香味料および／または抽出物は植物および／またはその果実から製造できる。
果樹植物および果実自体は、今日では、例えば、果実が熟すまで成長し、その後収穫および消費されることが可能となるように、微生物、真菌または昆虫による攻撃から保護するために化学物質で処理されているのは周知のとおりである。
【０００５】
該処理後、使用した化学物質の一部が、一般に皮または外皮と呼ばれる果実の外表面に吸着されたままであることも周知のとおりである。吸着された化学物質は、水で果実を繰り返し洗浄した後にも存在し続ける。
【０００６】
皮(外果皮)は、果実または植物の分離可能な保護的外層(表皮は、順次、上皮および厚壁組織からなる)である。保護的外層は、不正確であるが、外皮とも呼ばれる。
さらに、果実の外表面に吸着した化学物質の一部が、該化学物質の果実外部から内部への吸収により果実自体に(果肉内に)浸透する可能性も無視できない。
【０００７】
収穫された果実の一部は、今日、食品業界、医薬業界および機能性食品業界で利用される天然植物抽出物および／または香味料(原材料)の生産に使用されている。
通常、天然植物抽出物および／または香味料は、当業者に知られる装置および／または方法により、果実全体(皮および果肉)からまたは別々に処理された皮および／または果肉から機械的および／または化学的抽出により得る。
【０００８】
例えば、溶媒で抽出することにより得る香味料および／または抽出物および／または有機化合物の場合、水および／または化学溶媒での数回の洗浄工程を実施しても、使用した全ての溶媒の完全な除去ができていない場合があり、そのため、微量の残留物でも、プロバイオティクス細菌に対する毒性を引き起こし得る。
【０００９】
それゆえに、原材料からプロバイオティクス細菌に対する毒性を無くすために使用する精製または洗浄または沈殿工程を設定するために、ある物質または原材料に残留毒性が存在する限り、高感度で、かつ残留毒物の同定が可能な方法を得ることが望まれる。
【００１０】
タンパク質抽出物に関してまたはアミノ酸類の調製に関しても同様である。この場合も同様に、残留物として残り、プロバイオティクス細菌に毒性を引き起こし得る化学物質および／または溶媒が使用される。
【００１１】
最終製品の調製に広く使用される、例えば二酸化ケイ素のような無機原材料に関しても、同様な問題それ自体が存在し得る。
【００１２】
天然植物抽出物および／または機械的および／または化学的抽出により得た香味料の両者に関して、さらにまた合成および／または抽出の工程により製造された原材料に関しても、原材料中に、原材料に一定の内因性毒性を付与する“毒性”性質を与える微量の物質または化合物が残留し得るということも無視できない。
【００１３】
それゆえに、天然植物抽出物に関しておよび／または上記他の原材料に関して、果実に採用される栽培のタイプおよび／または機械的および／または化学的抽出の実施に際して採用される操作条件によって、種々の量の毒性物質が含まれることを回避できない。
【００１４】
いずれの場合も、天然植物抽出物および／または香味料および／または原材料に存在する何らかの毒性物質は、一般に、間接的および直接的の２タイプの問題を引き起こし得る。
【００１５】
前者、すなわち間接的な問題は、該毒性物質の摂取が、ビタミン類、生理活性ペプチド類および代謝物の吸収が影響を受けるようなほど腸プロバイオティクス微生物相を、そして、それゆえに、消化系の生理機構を変化させる可能性があり、同様に腸における吸収性を変え、一連の非常に多くの健康問題を起こすことが知られる有害な生物起源アミン類(該生物起源アミン類は、この変更により利益を受ける株から産生される)の生産を可能にし、周知の発癌物質であるニトロソアミンの生産にも及び得ることに関する。
【００１６】
この点に関し、プロバイオティクス細菌微生物叢が、カルボキシル基の除去によりアミノ酸のアミンへの変換を可能にする脱炭酸特性を有する、例えばエシェリキア・コリのような大腸菌型病原性細菌のコロニー形成の結果として変更されるのであれば、異常な量の有害な生物起源アミン類が産生されることになることが注目されるべきである。
【００１７】
さらに、腸微生物相の不均衡が、糖尿病および自己免疫性疾患の種々の病態の発生に寄与し、または、そのような仮説立てられ、ある種の食物アレルゲンに対する局所性および全身性の免疫不均衡応答に関与すると考えられる。
【００１８】
第二の、直接的な問題は、既にプロバイオティクス細菌の細胞を殺すことができる該毒性物質の影響が、細菌に対するだけでなく、分化および増殖段階で特に感受性である真核生物細胞に対しても、即時のおよび／または蓄積された毒性作用があるために、小児年齢層のまたは発育段階にある個体にも及ぶことを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
それゆえに、確実に無毒な方法で原材料および最終製品を製造できることおよび抽出物および／または香味料および／または原材料の毒性を決定するための、一般に確実、単純かつ現実的、経済的および反復可能である方法についてのニーズがある。
【００２０】
特に、食品、栄養補助食品または医療器具もしくは薬物のような最終製品を構成する個々の成分についてプロバイオティクス細菌に対する毒性を決定するための方法に対するニーズがある。
【００２１】
出願人は、抽出物および／または香味料および／または原材料を一般にプロバイオティクス細菌に対する毒性を決定するための新規毒性試験に付すことにより、無毒な原材料および最終製品を製造する画期的方法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の対象は、画期的方法(これは同様に本発明の対象を構成する)により、出願人により提供された、該原材料および最終製品に存在するプロバイオティクス細菌に対する毒性を決定する可能性、およびその結果としての無毒な原材料および最終製品を製造する方法である。
【００２３】
出願人は、本発明の方法を用いて決定された毒性は、使用する原材料自体だけでなく、さらに、該原材料の製造に使用された機械的および／または化学的抽出のタイプによることを発見した。実際、原材料の化学的抽出は化学溶媒の使用および原材料それ自体の残留毒性を除去し得る数工程の洗浄または沈殿を含む。
【００２４】
本方法は、プロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)を、調合物に通常使用されるのと同量の原材料を使用して、試験する原材料と接触させる工程を含む。
実施に際しては、プロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株に最適の培養基質および試験する原材料を含む、第一サンプルを調製する。
【００２５】
次いで、該第一サンプルに使用したのと同じプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)および最適の培養基質のみ(試験する原材料を加えない)を含む、第二サンプル(内部標準)を調製する。
【００２６】
決定は、該第一サンプルおよび該第二サンプルの細菌生菌数計数を用いて行う。
該第一サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)対該第二サンプルの細菌数(プレート上の細胞の数)の比が、１未満の数値となるならば、これは、パーセンテージで表したならば、原材料と接触して生存している細菌数を提供し、そして、それゆえに、またマーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株の該原材料により誘発された殺菌率％も表す。
【００２７】
第一の態様は、一般に、例えば、天然植物抽出物および／または香味料および／または原材料のような素材の毒性の決定に関する。
この場合、プロバイオティクス細菌に対する毒性の試験は、上記のような、実験室での２種の試験の設定を必要とする。
【００２８】
実施の観点から、第一サンプルを調製し、これはプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株のための最適培養基質および試験する原材料を含む。
ついで、第二サンプル(内部標準)を調製し、これは該第一サンプルに使用したのと同じプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)および最適培養基質(試験する原材料を含まない)のみを含む。
【００２９】
下記のような、該第一サンプルおよび該第二サンプルの細菌生菌数計数により、決定を行う。
好ましくは、該第一および第二試験を、同一操作条件下に並行して行う。
【００３０】
該第一サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)対該第二サンプルの細菌数(プレート上の細胞の数)の比が１未満の数値となるならば、これは、パーセンテージで表したならば、原材料と接触して生存している細菌数を提供し、そして、それゆえに、またマーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株の該原材料により誘発された殺菌率％も表す。
【００３１】
該第一試験で行った細菌数計数と該第二試験で行った細菌数計数の差が殺菌率のパーセンテージを提供し、これは、該原材料に付随するプロバイオティクス細菌に対する毒性の指標を提供する。
【００３２】
出願人は、非網羅的例として、最終製品の製造にも使用される、例えば、レモンおよびブルーベリー香味料のような市販されている数種の香味料および抽出物を試験した。これらの試験の目的は該食品または原材料(レモンおよびブルーベリー香味料)がプロバイオティクス細菌に対する内因性毒性を有するか否かの確認であった。
【００３３】
この理由で、該原材料(レモンおよびブルーベリー香味料)を、特定の操作条件下、プロバイオティクス乳酸菌またはビフィドバクテリウム属のある株と接触させた。
本発明の方法において毒性マーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株は、好ましくはプロバイオティクスである、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属を含む群から選択される種に属する。
【００３４】
好ましい態様は、表１に挙げる細菌株の使用を企図する。
【表１】
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【表２】
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【００３５】
【表３】
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【表４】
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【００３６】
【表５】
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【表６】
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【００３７】
【表７】
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【表８】
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【００３８】
【表９】
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【表１０】
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【００３９】
【表１１】
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【表１２】
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【００４０】
【表１３】
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【表１４】
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【００４１】
【表１５】
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【表１６】
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【００４２】
【表１７】
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【表１８】
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【００４３】
【表１９】
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【００４４】
該食品または原材料(レモンおよびブルーベリー香味料)で実施した試験は、毒性マーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株に対する急性毒性を示した。実施に際しては、異なる納入業者からの２種のレモン抽出物(原材料)および２種のブルーベリー抽出物(原材料)を試験した。第一レモン抽出物および第二ブルーベリー抽出物が、初期理論負荷６×１０９CFU／ｇを有する使用したプロバイオティクス細菌株に対してそれぞれ殺菌率５７％および５８％の急性毒性を惹起するものであると確認できた。本試験は、２００２年１月３１日にAnidral Srl社により寄託されたプロバイオティクス細菌株ラクトバチルス・アシドフィルスLA02 LMG P-21381および２００２年１月３１日にAnidral Srl社により寄託されたプロバイオティクス細菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01 LMG P-21384であった。
【００４５】
この時点で、出願人は、上記試験を市販のブルーベリー香味料およびレモン香味料の代わりに、果実(レモンおよびブルーベリー)の果肉を単に軽く絞ることによって得た香味料を使用して繰り返した。実施に際しては、レモンおよびブルーベリーのいずれの場合も、予め皮を果肉から離し、後者のみを当業者に知られる設備および方法を使用する、穏やかな条件下の機械的抽出に付した。この場合、穏やかな条件下の果肉の抽出によって得た抽出物／原材料を用いて、プロバイオティクス細菌に対する毒性が存在しないことが判明し、実際、プロバイオティクス細菌株の６.７×１０９CFU／ｇに等しい初期負荷を使用して、ブルーベリー果汁で６.５×１０９CFU／ｇおよびレモン果汁で６.４×１０９CFU／ｇが得られ、それゆえに、０に近い極めて低い毒性および殺菌率で先の場合よりはるかに良好な値であった。
【００４６】
他の原材料を、下記のようにレモンおよびブルーベリー抽出物と同様の方法で試験した。
出願人は、プロバイオティクス細菌に対する毒性の程度を決定する目的で、市販の数種の最終製品を試験し、該最終製品に使用されている原材料の中で、使用されるどの原材料が最も毒性に貢献するかを同定した。
【００４７】
好ましい態様において、プロバイオティクス細菌に対する原材料の毒性を決定し、原材料は、例えば、計５成分を有する最終製品の調合物内の、例えば抽出物および／または香味料である。
この場合、毒性試験は、成分の数と同じ数  −  この事例の場合には５成分に加えて、分析対照の試験を実験室で設定することを含む。
【００４８】
本発明の潜在力を示すために、出願人は、最終製品、例えばＰ１の調製に使用されるクランベリー抽出物の一連のサンプルを試験した。
最終製品(Ｐ１)内に他の要素／成分と共に存在している原材料であるクランベリー抽出物(４つの異なる納入業者からのロットＬ１、ロットＬ２)の毒性を決定した。
【００４９】
この場合、２個の試験を設定した。第一試験において、プロバイオティクス細菌株、例えばＬＳ０１(毒性マーカーとして使用)からなる混合物を調製した。この第一試験は、内部分析対照  −  Ref. 1を表す。予測される理論的細菌数は２５MLD／用量(内部標準)であった。
【００５０】
第二試験において、プロバイオティクス細菌株ＬＳ０１(毒性マーカーとして使用)を、異なる納入業者からの、該最終製品における第一クランベリー抽出物  −  Ｌ１およびＬ２と共に含む混合物を調製した。
【００５１】
該第一および第二細菌数計数を並行して同じ操作条件下で、該最終製品に存在するのと同量を用いて実施した。
続いて、該第一試験  −  Ref. 1の実際の細菌数と該第二試験の細菌数を決定した。細菌数計数は、同じ操作条件を適用して実施した。
【００５２】
納入業者Ｖ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｖａｒクランベリー
納入業者Ｖ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｖａｒクランベリー
納入業者Ｋ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｋｅｍクランベリー
納入業者Ｋ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｋｅｍクランベリー
納入業者Ｐ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｐａｃクランベリー
納入業者Ｐ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｐａｃクランベリー
納入業者Ｎ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｎｕｔクランベリー
納入業者Ｎ：ロット１(Ｌ１)およびロット２(Ｌ２)−Ｎｕｔクランベリー
【００５３】
原材料であるクランベリーの種々の供給品(ロット)を、プロアントシアニジン含量(少なくとも１.５％(ＨＰＬＣ))に基づき毒性試験用混合物に導入し、それにより最終製品Ｐ１におけるその成分が同濃度であることを確実にした。
【表２０】
2016526903.tif 000021
【００５４】
表２の試験を表１に番号９、３３、３９、４６、５４、５９、７３、８４、９５、１０１、１１６、１３０、１３８、１４３、１６９および１８５として示すプロバイオティクス細菌株を用いて行い、得られた結果は表２に示すものと極めて類似した。
【００５５】
該第一試験で行った細菌数  −Ref. 1と該第二試験で行った細菌数の差異は、プロバイオティクス細菌株ＬＳ０１の殺菌率パーセンテージを提供し、これは、該株に対する該クランベリー抽出物の毒性の指標を提供する。
【００５６】
該第一試験および該第二試験において決定した細菌数から得られる生存細胞負荷により、試験した原材料が該最終製品Ｐ１に存在するプロバイオティクス細菌株ＬＳ０１の細胞に対する毒性作用を発揮するか否かを確立することが可能である。
【００５７】
対照  −  Ref. 1と比較した細菌数減少パーセンテージを、本発明の毒性試験に付した原材料により誘発された殺菌率％として表す。
【００５８】
出願人は、さらに、上記方法を最終製品に存在するレモンおよびブルーベリー抽出物に適用し、クランベリーを用いて得た上記結果と同等の結果を得た。
【００５９】
表２は、最終製品に、結果的にまた該最終製品を使用する個体の体にも毒性を与える、最終製品の調合に一般的に使用される抽出物、例えばクランベリー抽出物  −  しかし、他の原材料に関しても同等のことが懸念される  −  が存在することを示す。
【００６０】
それゆえに、本発明を用いて、使用する原材料がプロバイオティクス細菌に対して毒性を与えるか否かの決定が可能であるため、毒性がないまたは毒性が大幅に低下した、栄養補助食品または医療用品または医薬製品のような最終製品の調合物の開発が可能である。
【００６１】
本発明の状況で、原材料により誘発される内部標準と比較した細菌負荷の減少パーセンテージ[(試験サンプルの細菌数)／(内部標準の細菌数)]＝殺菌率％が１〜５％であるのは殺菌がないことを示し；５％を超え、１５％以下である値は、まだ許容される低殺菌率を示し；１５％を超え、２５％以下の値は、中〜高殺菌率を意味し、一方我々は、２５％超では急性殺菌率に遭遇した。
【００６２】
本発明の方法は、例えば、オレンジ香味料、ベニバナ、黒ニンジン、ブルーベリー抽出物などのような栄養補助食品および医療用品(最終製品)の調合物に使用される、例えば、毒性添加物または原材料の存在の試験などにおける、有効な用途がある。
【００６３】
本発明の方法を例として下記に説明し、それゆえに本発明の範囲を限定しない。
好ましい態様において、例えば、下記成分Ａ、Ｂ、Ｃ(完全調合物Ａ＋Ｂ＋Ｃ)を含む最終製品の場合、本発明の方法を最終製品が、全体として(Ａ＋Ｂ＋Ｃ)、プロバイオティクス細菌株に対する毒性を発揮するか否かの決定のために使用できる。
【００６４】
この場合、プロバイオティクス細菌に対する毒性の試験は、実験室における２個の試験の設定を含む。
実施の観点から、第一サンプルを調製し、これはプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株のための最適培養基質および試験する原材料、この場合調合物Ａ＋Ｂ＋Ｃを含む。
【００６５】
ついで第二サンプル(内部標準)を調製し、これは該第一サンプルに使用したのと同じプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)および最適培養基質(試験する原材料無し)のみを含む。
【００６６】
該第一サンプルおよび該第二サンプルの細菌生菌数計数により決定を行う。
好ましくは、該第一試験と第二試験を並行して同じ操作条件下で行う。
【００６７】
該第一サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)対該第二サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)の比が１より小さい、例えば０.５５(または５５％)の値となるならば、原材料と接触して生存した細菌の数が５５％であり、それゆえに、マーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株においてＡ＋Ｂ＋Ｃにより誘発された殺菌率％は４５％であることを意味する。
【００６８】
正確に、マーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株に対する毒性が導かれたならば、次工程に入るべきであり、最終製品(Ａ＋Ｂ＋Ｃ)を構成する成分Ａ、ＢおよびＣのどれが検出された毒性を発揮するかを決定する。
【００６９】
この場合、方法は、下に明示する３個の試験(試験１、試験２および試験３)の調製を含む。
例えば、試験１を原材料Ａで実施し、次のサンプルの調製を含む。
(ｉ)  第一サンプルを調製し、これはプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株のための最適培養基質および試験する原材料、この場合Ａを含む。
(ii)  第二サンプル(内部標準)を調製し、これは該第一サンプルに使用したのと同じプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)および最適培養基質(試験する原材料無し)のみを含む。
(iii) 細菌生菌数計数を該第一サンプルおよび該第二サンプルで実施する。
(iv)  殺菌率のパーセンテージを決定する。
【００７０】
類似して、原材料Ｂでの試験２および原材料Ｃでの試験３を同じ方法で調製する。
この方法で、調合物Ａ＋Ｂ＋Ｃに存在する成分Ａ、ＢおよびＣのどれが、プロバイオティクス細菌株に対する毒性を発揮する成分であるかを同定することが可能である。毒性試験を、同じ操作条件下、最終製品−逐次的方法において示される濃度で実施する。
【００７１】
生菌数計数について、サンプルの初期再懸濁、適当な希釈剤での連続希釈、寒天培地への播種および最適条件下でのインキュベーション後のコロニー計数を用いる、古典的微生物数計数を含む、試験方法の非限定的例により記載する方法により従う。対照サンプルと同等の平板殺菌率であることが決定された添加物／原材料は適合と見なす(何であれ、低毒性または無毒性)。
【００７２】
上記のとおり、生きている、生存可能細胞の濃度の決定の対象であるサンプルに単独でまたは混合して存在する、プロバイオティクス使用のための乳酸菌およびビフィドバクテリウム属の合計の、差示的なおよび／または選択的な(寒天培地中)計数を実施する。
【００７３】
培養培地の調合物は、上記微生物群に属するプロバイオティクス細菌の雑多な種の全ての増殖を確実にするものであり、必要であれば、選択剤(一般に抗生物質および／または糖類)または差別的試薬(一般にｐＨおよび／または酸化還元色変化指示薬)の添加により区別を可能にする。
【００７４】
本方法は、その調合が２種の異なる窒素源、炭素源としての一種の糖ならびにビタミンＢ群および増殖因子の源として酵母抽出物のみの存在下である、寒天培地ＬＡＰＴｇの使用を提供する。有機塩類および無機塩類ならびに選択的作用を有する物質が存在しないため、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌の多様な種の全ての盛大な増殖を可能にする。
【００７５】
ＬＡＰＴｇ寒天への選択剤および／または差別的試薬の添加により、複合混合物に存在するプロバイオティクスの差別的計数が可能となる。選択剤(一般に抗生物質および／または糖類)または差別的試薬(一般にｐＨおよび／または酸化還元色変化指示薬)は、混合物を構成する株の特異的遺伝子型および表現型特徴に基づき、個々に選択する。
【００７６】
分析するサンプルが、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の２種以上の株の混合物からなるならば、ＬＡＰＴｇでの選択的計数を、ＨＨＤ培地を使用する混合物を構成する株の定性的評価と組み合わせることが推奨される。さらなる詳細について、次の科学論文を参照のこと。
- Molecular Cloning a Laboratory Manual (Sambrook, Fritsch, Maniatis);
- Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. M. Danielsen A. Wind. 2002;
- Antibiotic Susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from Human Gastrointestinal tract, S. Delgrado A.B. Florez B. Mayo, 2005;
- ISO 6887-1:2000
- Preparation of LAPTg medium: FONT DE VALDEZ, G, and coll.: Influence of the recovery medium on the viability of injured freeze-dried lactic acid bacteria Milchwissenschaft 40 (9) 518-520 (1985).
- UNI EN ISO 6887-1:2000 “Buffered Peptone Water”
- A differential medium for the enumeration of homofermentative and heterofermentative lactic acid bacteria. LC. McDonald R.F. McFeeters, M.A. Daeschel and HP Felming. Applied and Environmental Microbiology. June 1987: 1382-1384
【００７７】
頭文字および略語：
−  生存している、生存可能細胞の濃度＝培養培地で増殖でき、明瞭なコロニー(CFU／ｇまたはml)を形成できる、細胞数／単位(ｇまたはml)
−CFU／ｇまたはml＝コロニー形成単位、すなわち生存している、生存可能細胞の濃度の測定単位
−  ＭＩＣ＝最小阻止濃度
【実施例】
【００７８】
本方法は、その調合が２種の異なる窒素源、炭素源としての一種の糖ならびにビタミンＢ群および増殖因子の源として酵母抽出物のみの存在下である、寒天培地ＬＡＰＴｇの使用を提供する。有機塩類および無機塩類ならびに選択的作用を有する物質が存在しないため、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌の多様な種の全ての盛大な増殖を可能にする。ＬＡＰＴｇ寒天への選択剤および／または差別的試薬の添加により、複合混合物に存在するプロバイオティクスの差別的計数が可能となる。選択剤(一般に抗生物質および／または糖類)または差別的試薬(一般にｐＨおよび／または酸化還元色変化指示薬)は、混合物を構成する株の特異的遺伝子型および表現型特徴に基づき、個々に選択する(８.２参照)。分析するサンプルが、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の２種以上の株の混合物からなるならば、ＬＡＰＴｇでの選択的計数を、ＨＨＤ培地を使用する混合物を構成する株の定性的評価と組み合わせることが推奨される。
【００７９】
材料および試薬：
ＬＡＰＴｇ培地、基底培地：
− バクトペプトン(動物タンパク質の酵素加水分解物)    １５ｇ
− トリプトン(カゼインの膵臓加水分解物)              １０ｇ
− 酵母抽出物                                        １０ｇ
− Ｔｗｅｅｎ  ８０                                    １ml
− 寒天                                              １５ｇ
− 蒸留水                                  ９００mlまで適量
註：上記の重量の精度は±５％であると解釈すべきである
【００８０】
寒天以外の成分を蒸留水に溶解。ｐＨを確認し、必要に応じて６.５５±０.０５に合わせ、その後寒天を添加し、水浴で溶解。培地を温かい間にBibbyビーカーに分配し、オートクレーブで１２１℃で１５分滅菌し、滅菌後ｐＨは２５℃±１で６.５±０.５でなければならない。
【００８１】
完全培地：
使用時、溶解(８.１)後、１体積の１０％グルコース溶液(濾過により滅菌)を基底培地に添加し、最終グルコース濃度１０ｇ／リットルとする。
【００８２】
ＨＨＤ培地：
− フルクトース                          ２.５０ｇ
− ＫＨ２ＰＯ４                          ２.５０ｇ
− バクトトリプトン                    １０.００ｇ
− ソイトンペプトン                      １.５０ｇ
− カザミノ酸類                          ３.００ｇ
− 酵母抽出物                          １０.００ｇ
− Ｔｗｅｅｎ  ８０                      １.００ｇ
− ブロモクレゾールグリーン            ２０.００ml
− 寒天                                ２０.００ｇ
− 蒸留水                              １０００ml
最終ｐＨ＝６.９０＋０.１０。
【００８３】
エタノール、ミニザルト一回用滅菌０.４５μmシリンジフィルター、サンプル再構成用希釈剤：
液体細菌培養の再構成および連続的１０進希釈  −  ペプトン食塩水溶液
− バクトペプトン                          １.０ｇ
− 塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)                ８.５ｇ
− 蒸留水                        １０００mlまで適量
【００８４】
無水(凍結乾燥)細菌培養および遊離形態のプロバイオティクス(マイクロカプセル封入されていない)を伴う最終製品の再構成。
(凍結乾燥)細菌培養は複数用量または複数単位で調製しない。
リン酸緩衝液ｐＨ６.８
− 塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)              ５.００ｇ
− ＫＨ２ＰＯ４                          ３.７８ｇ
− Ｎａ２ＨＰＯ４                        ４.７７ｇ
− 蒸留水                        １０００mlまで適量
【００８５】
小袋、カプセル、丸薬、錠剤、坐薬およびビンのアンダーキャップ：
リン酸緩衝液ｐＨ６.８
− 塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)              ５.００ｇ
− ＫＨ２ＰＯ４                          ３.７８ｇ
− Ｎａ２ＨＰＯ４                          ４.７７ｇ
− 蒸留水                        １０００mlまで適量
【００８６】
成分を蒸留水に溶解、必要に応じ加熱。ｐＨが６.８±０.１０であることを確認。希釈物をBibbyビーカーに分配、オートクレーブで１２１℃で１５分滅菌、そして暗所で４〜５℃の温度で１ヶ月未満保存。
最終製品が油分および／または脂質物質を含むならば、１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を緩衝液ｐＨ６.８に添加する必要がある(５.５.２.１)。
【００８７】
嫌気性キット(AnaeroGen - Oxoid)：酸素と化学的に結合し、ＣＯ２を産生；小１０ml非滅菌シリンジも薬局で購入可能；５％ｆｉｎ  Ｌ−システインＨＣｌ溶液：５ｇのＬ−システイン塩酸塩一水和物(BDH 370553)を量り取り、ＭＱ水で１００mlとする；次いで、０.４５μmフィルターを備えた滅菌ファルコンチューブに濾過して入れ、＋４℃±２で最長１年まで保存(最終濃度０.０５％とするために、ＬＡＰＴｇ培地に溶液を添加する必要がある)。
【００８８】
方法
８.１ 各プレート約１２±１mlの培地が必要であることを考慮して、調製すべきプレートの数に十分な量のＬＡＰＴｇ培地(５.１)を溶解(パラグラフ８.５.５の注参照)。
サンプルの同じ希釈物上での計数の実施を計画しているならば、ＬＡＰＴｇ培地自体だけでなく、１種以上の選択剤(Ｎ)を添加した同培地を、Ｎ倍した(プレートの数)を考慮すべきである。培地を恒温水浴に４５℃±０.５の温度で少なくとも３時間置く；
【００８９】
８.２ 選択剤および各腸生物の一覧
８.２.１ 抗生物質
・ バンコマイシン
原液        １mg／ml(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      水
使用濃度    １μg／ml
正の選択    偏性のおよび通性のヘテロ発酵生物ラクトバチルス属(例えばラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイなど)。
負の選択    感受性ホモ発酵生物ラクトバチルス属(例えばラクトバチルス・アシドフィルス群)およびビフィドバクテリウム属のような株。
保存：１.５ml量を＋４℃で１５日または−２０℃で最長４ヶ月まで。
【００９０】
・ クロラムフェニコール
原液        １０mg／ml(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      エタノール
使用濃度    ７μg／ml
正の選択    ＭＩＣ＞４μg／mlの株(例えばＬＰＣ００)
負の選択    高感受性の株(ＭＩＣ＜２μg／ml)。
保存：２ml量で−２０℃で最長４ヶ月まで。
【００９１】
・ クリンダマイシン＋シプロフロキサシン
原液        １mg／ml  クリンダマイシン＋１０mg／ml  シプロフロキサシン(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      水(シプロフロキサシンがあまり溶けない場合、１〜２滴の濃乳酸添加)。
使用濃度    ０.１μg／ml  クリンダマイシンおよび１０μg／ml  シプロフロキサシン
正の選択    ラクトバチルス・アシドフィルス群
負の選択    ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属およびストレプトコッカス・サーモフィルス。
保存：シプロフロキサシンについて１.５ml量を−２０℃で最長６ヶ月まで(クリンダマイシンは測定せず)。
【００９２】
・ セフロキシム
原液        １mg／ml(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      水
使用濃度    ０.１μg／ml
正の選択    ＭＩＣ＞１の株(例えばビフィドバクテリウム・ロングムＰＣＢ１３３)
負の選択    ストレプトコッカス・サーモフィルス(例えばＹＯ８)およびＭＩＣ≦０.０１６の他の株。
保存：１.５ml量を−２０℃で最長２年まで。
【００９３】
・ セフォキシチン
原液      １０mg／ml(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      水
使用濃度    １００μg／ml
正の選択    ＭＩＣ＞２５６の株(例えばＬＧＧ、ＬＰＣ０８、ＬＣ０１)
負の選択    ＬＰ０１、ＬＰ０２、ラクトバチルス・アシドフィルス群およびＭＩＣ＜２４の他の感受性株。
保存：１.５ml量を−２０℃で最長２年まで。
【００９４】
・ ムピロシン
原液      １０mg／ml(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      水
使用濃度    ５０μg／ml
正の選択    ビフィドバクテリウム属
負の選択    ラクトバチルス属。
保存：１.５ml量を−２０℃で最長６ヶ月まで
【００９５】
・ シプロフロキサシン(正の選択ＬＰ０２をＬＦ１０と混合して)。
原液      １０mg／ml(０.４５μm濾過で滅菌)
希釈剤      水(シプロフロキサシンがあまり溶けない場合、１〜２滴の濃乳酸添加)
使用濃度    ５μg／ml
正の選択    ＬＰ０２
負の選択    ＬＦ１０。
保存：１.５ml量を−２０℃で最長６ヶ月まで
【００９６】
８.２.２ 他の選択条件
【００９７】
８.３ 分析するサンプルがラクトバチルス属および／またはビフィドバクテリウム属の２種以上の株の混合物からなるとき、ＬＡＰＴｇでの選択的計数を、ＨＨＤ培地を使用する混合物を構成する株の定性的評価と組み合わせることが推奨される。ＬＡＰＴｇ培地について記載したように、上記培地を溶解し、それを恒温浴に置く。次いで、該培地を１２±１ml量でペトリ皿に分配し、固化させる；
【００９８】
８.４ １種以上の選択剤の使用が計画されるならば、サンプルを構成する株の区別に必要な抗生物質溶液または他の選択剤を、滅菌ビン中、一定量(例えば約８プレートに対し１００ml)の溶解したＬＡＰＴｇ培地に、指示される最終濃度で添加する；
【００９９】
８.５ サンプルの連続的１０進希釈の調製(セクションIa ISO 6887-1:2000パラグラフ9.2.)
８.５.１ 滅菌ピペットを使用して１mlの一次希釈をまたは液体であるならばサンプル培養から直接１mlを、９mlの無菌希釈剤を含む試験管に移す；
８.５.２ ピペットを初期懸濁液に１cmより深く入れない；
８.５.３ 各希釈後にピペットを交換；
８.５.４ 希釈物をメカニカル・シェーカーで徹底的に均質化し、試験管を３回、５秒以上の時間ボルテックス処理し、１０−２の希釈を得る；
８.５.５ 希釈１０−２を使用してこれらの工程を反復し、プレートで培養したとき、相当数のコロニーを生じる微生物の濃度が得られるまでさらに希釈する；
２連続１０進希釈(例えば：１０−８、１０−９)の播種は、１０〜３００の間の細胞数を含む２個の連続的希釈が見られることを可能にしなければならない。サンプルに含まれる細胞数について明確に理解していないならば、２連続を超える１０進希釈(例えば：１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０)を播種し、１０〜３００の間に入る数のコロニーを生じるもののみを考慮する。
【０１００】
８.６ 適切であると判断された(８.５.５)サンプルの希釈から採った１mlをペトリ皿に分配する；
【０１０１】
８.７ １２±１mlの量で、培地ＬＡＰＴｇを第一シリーズのプレートに添加し、選択剤を添加したＬＡＰＴｇを第二シリーズに添加する；
サンプル再構成から、連続希釈がペトリ皿上の培養培地と接触する時(８.６)までの時間は３０分を超えてはならないことに注意すべきである
【０１０２】
８.８ 培地およびサンプルを、最初は回転運動、続いて水平および垂直直線運動で均一に混合する；
【０１０３】
８.９ １５〜２０分固化させる；
【０１０４】
８.１０ ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の２種以上の株の混合物からなるおよび／またはＨＨＤ培地の使用が推奨されるサンプルの場合、１００μlの適切な希釈物をＨＨＤの調製済プレート(８.３)に添加し、サンプルをスパーテルで均一に広げる；
【０１０５】
８.１１ プレートを倒置して３７±１℃で７２時間、嫌気性条件(Gas-Pak+嫌気性キット)でインキュベートする。嫌気性システムの使用法については、キットに添付された指示書に従う。
【０１０６】
結果の計算：コロニーの存在を、プレート・ビュワーのレンズ下でそれらを観察することにより確認し、１０〜３００の間の数のコロニーを含むプレートを排他的に計数する。結果をＣＦＵ、すなわちコロニー形成単位として示す。結果を次の式を使用して表す。
【数１】
2016526903.tif 000022
式中、
ΣＣは全プレート上で計数されたコロニーの合計であり
ｎ１は第一希釈で計数されたプレートの数であり
ｎ２は第二希釈で計数されたプレートの数であり
ｄは第一の計数をした希釈である
【０１０７】
例：
希釈１０−８のプレート：２５０
希釈１０−９のプレート：  ２３
結果：
【数２】
2016526903.tif 000023
【０１０８】
得られた結果を２桁の有効数字に丸める。したがって、特定のタイプに基づく結果の表現の数値について、例の結果は２５０  １０−８CFU／ｇまたは液体サンプルであればmlとなる。ＨＨＤに広げられたサンプルについて、混合して存在するラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の雑多な株を見分ける培養コロニーの異なる形態学を目視により試験する。
【０１０９】
プレート培養コロニーの計数および試験の実施後(工程９)、単株サンプルであるならば、ＬＡＰＴｇのみを含むプレートから得た数はサンプルを構成するプロバイオティクス負荷の総負荷を表す。
【０１１０】
ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の２種以上の株の混合物からなるサンプルの場合：
ａ) ＬＡＰＴｇ培地のみを用いて調製したこのシリーズのプレートから得られた数は分析に付したサンプル中のプロバイオティクス細菌の総負荷を表し；
ｂ) 選択剤を添加したＬＡＰＴｇ培地を用いて調製したシリーズのプレートから得られた数は、選択剤として該培地に添加された特定の物質の存在下で複製できる株の負荷を表し；
ｃ) 選択的培地を用いて得た個々のプロバイオティクス株に関する数から、ＬＡＰＴｇでの総数(ａ参照)との差異を計算することにより、選択剤存在下で発育しなかった残りの株の数を導くことが可能であり；
ｄ) ＨＨＤ培地への播種により、混合してサンプルに存在する異なる株を目視により区別し、ＬＡＰＴｇ培地で選択的に数えることが可能となる。
【０１１１】
出願人は、表１に番号１７、２２、４１、６０、７４、９８、１２１、１４５、１７４および１８２として示されるプロバイオティクス細菌株を毒性マーカーとして使用して、次の原材料を数試験で本発明の方法を用いて試験した。
【０１１２】
実験データは、多くの場合、毒性は、予期せぬことに相当な殺菌率％と共に、常に多様なレベルで見られることを示す。
アロエ試験：殺菌率は５％に等しいと判明した。
クエン酸試験：殺菌率は２％に等しいと判明した。
アラビノガラクタン試験：判明した殺菌率は６％に等しい。
ラズベリー香味料試験：判明した殺菌率は２％に等しい。
ラズベリー香味料試験：判明した殺菌率は２６％に等しい。
ブルーベリー試験：判明した殺菌率は５％に等しい。
二酸化ケイ素試験：判明した殺菌率は５０％に等しい。
二酸化ケイ素試験：判明した殺菌率は２８％に等しい。
二酸化ケイ素試験：判明した殺菌率は２３％に等しい。
タラガム試験：判明した殺菌率は１４％に等しい。
ビタミンＢ１、Ｂ２およびＢ６試験：判明した殺菌率は３３％に等しい。
ゼオライト試験：判明した殺菌率は２％に等しい。
【国際調査報告】
2016526903.tif 000024
2016526903.tif 000025
2016526903.tif 000026
2016526903.tif 000027