(57)【要約】  本発明は、マグネシウムイオンに結合することができるセンサ層、及び、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的にカルシウムイオンと結合する捕捉層を含むデバイスに関する。センサ層は、既知又は新規の発光団−イオノフォアを含むことができる。本発明はさらに、選択的に、カルシウムイオンの存在下で、マグネシウムイオン濃度を検出する方法に関する。【選択図】図２
2016505824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的にマグネシウムイオンの存在を測定するためのデバイスであって、
基板と、
マグネシウムイオンに結合することが可能であり、任意に、固体支持体上に固定化される発光団−イオノフォアを含むセンサ層と、
マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的に、カルシウムイオンと結合する捕捉層と、を含み、
上記の発光団−イオノフォアは、第１強度で発光し、上記デバイスを、マグネシウムイオンを含む溶液と接触させると、上記の発光団−イオノフォアは、上記の溶液に存在するマグネシウムイオンの濃度に比例する量で上記第１強度とは異なる第２強度で発光する、デバイス。
【請求項２】
上記の発光団−イオノフォアは、マグネシウムに結合することが可能である１つ以上のキレート化部分を有するイオノフォア、及び、発光団部分を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
上記の発光団−イオノフォアは、下記式（Ｉ）に従う、請求項１に記載のデバイス。
【化１】
2016505824.tif 000030
式中、
Ａ、Ｂ、及びＣは、独立に、水素、−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’、及び−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ａ、Ｂ及びＣの１つ以上は、独立に、−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’及び−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ｒ’は、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンからなる群から選択され、
Ｘ及びＹは、存在するそれぞれの場合、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲ’からなる群から選択され、
ｖは、０、１、２、３及び４から選択された整数であり、
Ｚは、発光団部分である。
【請求項４】
Ｚは、式（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）からなる群から選択される、請求項３に記載のデバイス。
【化２】
2016505824.tif 000031
式中、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択され、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、−ＮＨ−基である。
【化３】
2016505824.tif 000032
式中、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、独立に、−ＯＨ、−ＯＲ１８、及び−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、
ここで、Ｒ１８は、親水性基、親油性基、−Ｏ−Ｒ１９−Ｇからなる群から選択され、Ｒ１９は、親水性基、又は、親油性基であり、Ｇは、ポリマーとカップリングするための反応基であり、ｗは、０と１７との間の整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７の少なくとも１つは、Ｚが、イオノフォア部分に直接結合される、１つの結合を表す。
【化４】
2016505824.tif 000033
式中、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマー又は生体分子とカップリングするための反応基からなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｒ２２と一緒に、芳香族環系を形成してもよく、Ｒ２５は、Ｒ２６と一緒に、任意に芳香族環系を形成し、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、１つの化学結合を表す。
【請求項５】
Ｚは、一般式（ａ）を有し、Ｒ５及びＲ６の一方は、−ＮＨであり、他方は、水素、親油性基、親水性基、及び、ポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
Ｚは、一般式（ｂ）を有し、Ｒ１４は、１つの結合である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項７】
Ｚは、一般式（ｃ）を有し、Ｒ２３は、１つの結合であり、Ｒ２２及びＲ２４は、独立に、水素及びメチルから選択される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項８】
上記のセンサ層は、式（ＩＩ）の発光団−イオノフォアを含む、請求項１に記載のデバイス。
【化５】
2016505824.tif 000034
式中、
各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンからなる群から選択され、
Ａは、（ＣＸＹ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３及び４から選択される整数であり、Ｘ及びＹは、それらが存在するそれぞれの場合、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲ’からなる群から選択され、
ＺはＮＨ又はＯであり、
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【請求項９】
上記のセンサ層は、式（ＩＩＩ）の発光団−イオノフォアを含む、請求項８に記載のデバイス。
【化６】
2016505824.tif 000035
式中、
各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンであり、
Ａは、−（ＣＨＯＨ）−又は１つの結合であり、
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【請求項１０】
上記の発光団−イオノフォアは、２、２’−（４−（３−カルボキシラト−４−（２、７−ジクロロ−６−オキシド−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−（カルボキシラトメトキシ）フェニルアザンジイル）二酢酸カリウム、及びこれらの混合物である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
上記の発光団−イオノフォアは、２、２’−（４−（３−カルボキシラト−４−（２、７−ジクロロ−６−オキシド−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２−（カルボキシラトメトキシ）フェニルアザンジイル）二酢酸カリウムである、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
上記の基板は、高透明性ポリマーを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
上記の基板は、接着を促進するために前処理された高透明性ポリエステルフィルムを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
上記の捕捉層は、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの混合物の存在下で、選択的にカルシウムイオンと結合することが可能である、１つ以上のキレート化部分を有する化合物を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
上記の捕捉層は、１、２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、エチレングリコール四酢酸、シュウ酸ナトリウム、それらの塩及び／又は混合物の群から選択される化合物を含む、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
上記の捕捉層は、一般式（ＩＶ）で表される１、２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸の混合物を含む、請求項１５に記載のデバイス。
【化７】
2016505824.tif 000036
式中、Ｒは、Ｈ又は陽イオンから選択される。
【請求項１７】
一般式（Ｉ）の発光団−イオノフォア。
【化８】
2016505824.tif 000037
式中、
Ａ、Ｂ、及びＣは、独立に、水素、−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’、及び−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ａ、Ｂ及びＣの１つ以上は、独立に、−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’及び−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ｒ’は、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンからなる群から選択され、
Ｘ及びＹは、存在するそれぞれの場合、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲ’からなる群から選択され、
ｖは、０、１、２、３及び４から選択された整数であり、
Ｚは、発光団部分である。
【請求項１８】
Ｚは、式（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の発光団−イオノフォア。
【化９】
2016505824.tif 000038
式中、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択され、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、−ＮＨ−基である。
【化１０】
2016505824.tif 000039
式中、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、独立に、−ＯＨ、−ＯＲ１８、及び−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、
ここで、Ｒ１８は、親水性基、親油性基、−Ｏ−Ｒ１９−Ｇからなる群から選択され、Ｒ１９は、親水性基、又は、親油性基であり、Ｇは、ポリマーとカップリングするための反応基であり、ｗは、０と１７との間の整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７の少なくとも１つは、Ｚが、イオノフォア部分に直接結合される、１つの結合を表す。
【化１１】
2016505824.tif 000040
式中、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマー又は生体分子とカップリングするための反応基からなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｒ２２と一緒に、芳香族環系を形成してもよく、Ｒ２５は、Ｒ２６と一緒に、任意に芳香族環系を形成し、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、１つの化学結合を表す。
【請求項１９】
Ｚは、一般式（ａ）を有し、Ｒ５及びＲ６の一方は、−ＮＨであり、他方は、水素、親油性基、親水性基、及び、ポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択される、請求項１８に記載の発光団−イオノフォア。
【請求項２０】
Ｚは、一般式（ｂ）を有し、Ｒ１４は１つの結合である、請求項１８に記載の発光団−イオノフォア。
【請求項２１】
Ｚは、一般式（ｃ）を有し、Ｒ２３は１つの結合であり、Ｒ２２及びＲ２４は、独立に、水素及びメチルから選択される、請求項１８に記載の発光団−イオノフォア。
【請求項２２】
上記の発光団−イオノフォアは、式（ＩＩ）の構造を有する、請求項１７に記載の発光団−イオノフォア。
【化１２】
2016505824.tif 000041
式中、
各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンであり、
Ａは、（ＣＸＹ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３及び４から選択される整数であり、
Ｘ及びＹは、それらが存在するそれぞれの場合、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲ’からなる群から選択され、
Ｚは、ＮＨ又はＯであり、
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【請求項２３】
試料中のマグネシウムイオンの濃度を決定する方法であって、
（ａ）第１強度を得るために、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンが存在する場合、カルシウムイオンに対する優先的結合親和性を示す化合物、及び、マグネシウムイオンと結合することが可能である発光団−イオノフォアを含む混合物の蛍光放出を測定する工程と、
（ｂ）第１強度が変化するように、工程（ａ）の上記の混合物を、上記の試料と接触させる工程と、
（ｃ）第２強度を得るために少なくとも１つの蛍光放出の強度を測定する工程と、
（ｄ）部分的には、第１強度と第２強度との差に基づいて、上記の試料中のマグネシウムイオンの濃度を導出する工程と、を含む、マグネシウムイオンの濃度を決定する方法。
【請求項２４】
上記の発光団−イオノフォアは、一般式（Ｉ）を有する、請求項２３に記載の方法。
【化１３】
2016505824.tif 000042
式中、
Ａ、Ｂ、及びＣは、独立に、水素、−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’、及び−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ａ、Ｂ及びＣの１つ以上は、独立に、−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’及び−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ｒ’は、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンからなる群から選択され、
Ｘ及びＹは、存在するそれぞれの場合、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲからなる群から選択され、
ｖは、０、１、２、３及び４から選択された整数であり、
Ｚは、発光団部分である。
【請求項２５】
Ｚは、式（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【化１４】
2016505824.tif 000043
式中、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択され、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、−ＮＨ−基である。
【化１５】
2016505824.tif 000044
式中、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、独立に、−ＯＨ、−ＯＲ１８、及び−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、
ここでＲ１８は、親水性基、親油性基、−Ｏ−Ｒ１９−Ｇからなる群から選択され、Ｒ１９は、親水性基、又は、親油性基であり、Ｇは、ポリマーとカップリングするための反応基であり、ｗは、０と１７との間の整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７の少なくとも１つは、Ｚが、イオノフォア部分に直接結合される、１つの結合を表す。
【化１６】
2016505824.tif 000045
式中、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマー又は生体分子とカップリングするための反応基からなる群から選択され、
Ｒ２１は、Ｒ２２と一緒に、芳香族環系を形成してもよく、Ｒ２５は、Ｒ２６と一緒に、任意に芳香族環系を形成し、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、１つの化学結合を表す。
【請求項２６】
Ｚは、一般式（ａ）を有し、Ｒ１２及びＲ１３の一方は、−ＮＨであり、他方は、水素、親油性基、親水性基、及び、ポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｚは、一般式（ｂ）を有し、Ｒ２１は１つの結合である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｚは、一般式（ｃ）を有し、Ｒ３０は１つの結合であり、Ｒ２９及びＲ３１は、独立に、水素又はメチルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
上記の発光団−イオノフォアは、式（ＩＩ）の化合物である、請求項２３に記載の方法。
【化１７】
2016505824.tif 000046
式中、
各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンであり、
Ａは、（ＣＸＹ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３及び４から選択される整数であり、各々の場合のＸ及びＹは、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲからなる群から選択され、
ＺはＮＨ又はＯであり、
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【請求項３０】
上記の発光団−イオノフォアは、式（ＩＩＩ）の化合物である、請求項２３に記載の方法。
【化１８】
2016505824.tif 000047
式中、
各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンであり、
Ａは、−（ＣＨＯＨ）−又は１つの結合であり、
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【請求項３１】
上記の試料は、体液である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
上記の体液が、全血、血漿、血清、及び尿からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月２９日に出願された米国特許出願第１３／６８９，３５０号の優先日の利益を主張し、その全体が本明細書に参照として含まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、基板、マグネシウムイオンに結合することができるセンサ層、及び、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的にカルシウムイオンと結合する捕捉層を含むデバイスに関する。また、本発明は、試料中のマグネシウムイオンの濃度を決定する方法であって、発光団−イオノフォア（ｌｕｍｉｎｏｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）を、試料中のマグネシウムイオンと接触させ、少なくとも１つの蛍光放出の強度が変化し、蛍光放出の強度の変化に基づいてマグネシウムイオンの濃度を算出する方法に関する。また、本発明は、マグネシウムと結合することができる、発光団部分及びイオノフォア部分を含む、新規発光団−イオノフォアに関する。
【０００３】
臨床診断において、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、及びマグネシウムなどの生理的陽イオンの正確な測定は、必要不可欠である。伝統的に、イオン選択性電極（ＩＳＥ）を使用して、血漿又は血清中のこれらのイオンを決定する方法が使用されているが、その利用は非常に面倒で、維持するために費用がかかる。電気化学的測定構造の重大な欠点は、電位と電磁障害に対する感度を基準要素の条件とすることである。
【０００４】
その他の酵素法は、陽イオンによるβガラクトシダーゼの活性化に基づいている（ベリー他、クリニカルケミストリ、３４／１１、１９８８、２２９５−２２９８）。しかし、酵素は、コストが高く、不安定で、臨床検査室における広範囲の応用を困難にする。したがって、体液中のこれらのイオンを臨床的に決定するための実用的かつ安価な比色試薬の開発は、研究の重要な領域として残されている。
【０００５】
米国特許第４，３６７，０７２号は、イオン結合単位として単純なクラウンエーテルを使用して金属イオンを決定する方法を記載している。しかし、このような結合は、非常に類似した性質を有するイオン、例えば、ナトリウムとカリウム、あるいはマグネシウムとカルシウムを識別するためのインジケータが利用される、臨床応用のような多くの実用的な応用で使用するための十分な特異性を欠いている。
【０００６】
米国特許第６，２１１，３５９号、同第５，９５２，４９１号、及び同第６，１７１，８６６号（それぞれは、その全体が本明細書に個別に参考として含まれる）には、それぞれ、カリウム、ナトリウム、及びカルシウムのイオノフォア（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）が報告されている。これらのイオノフォアは、π電子共役窒素を有し、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）又は発光団（ｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）にカップリングされて、蛍光又は発光の放出を測定することによって各イオンを検出する、フルオロフォアーイオノフォア又は発光団−イオノフォアセンサを作る。すべての３つのイオノフォアは、それぞれ、非常に選択的に、全血中のカリウム、ナトリウム、及びカルシウムを決定することが示されていて（ヒー他、アナリティカルケミストリ、７５巻、２００３、４４９−５５５；及び米国化学会誌、１２５巻、２００３、１４６８−１４６９参照）、従ってイオノフォアは生理的ｐＨで効果的であることを示す。しかし、これらの公報には、選択的にマグネシウムと結合するイオノフォアが提供されていない。
【０００７】
本発明は、陽イオン選択的イオノフォアに可逆的に結合する陽イオンに基づく発光法、イオノフォア部分と発光団部分との間のいわゆる「ＰＥＴ効果」（光誘起電子移動）によるイオンの決定に関する。同様の方法による、他のイオンの決定は、米国特許第６，２１１，３５９号、同第６，１７１，８６６号、及び同第５，９５２，４９１号に記載されていて、それぞれその全体が本明細書に参考として含まれる。いくつかの例で、陽イオン選択的イオノフォアは、２つ以上の陽イオンに対して選択的であり得るが、イオンが、ＰＥＴ効果を発揮する、イオノフォア及び発光団部分と接触する前に、選択的濾過イオノフォアに接触するように、結合されないイオンについて選択的である、付加的に選択的イオノフォアを提供することにより、１つ以上の陽イオンが、イオノフォア部分に結合されることを防ぐことができる。
【０００８】
いわゆる「ＰＥＴ効果」は、光子によって誘発される、電子がイオノフォア部分から発光団部分へ移動することを示し、この移動によって、（相対）発光強度、及び、発光団の発光減衰時間（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｃａｙ  ｔｉｍｅ）が減少する。しかし、吸収及び放出波長は、基本的に、そのプロセスおいて影響を受けない（Ｊ．Ｒ．ラコウィッツ、「蛍光分光法におけるトピック（Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」、４巻、プローブの設計及び化学センシング、プレナム・プレス、ニューヨーク＆ロンドン）（１９９４）。
【０００９】
イオンがイオノフォアと結合すると、ＰＥＴ効果が、部分的に又は完全に抑制されて、相対発光強度が増加し、発光団部分の発光減衰時間が増加する。したがって、発光特性、例えば、相対発光強度及び／又は発光減衰時間を測定して、所望のイオンの活量又は濃度を推測することができる。活量は、公知のデバイ・ヒュッケルの式を用いて、濃度と関連させることができる。
【００１０】
米国特許第５，５１６，９１１号によると、フッ素化ＢＡＰＴＡ誘導体に基づく蛍光インジケータが知られている。このようなインジケータは、一般に、ミリモルの範囲のＫｄ値を有する。しかしながら、このようなインジケータは、フッ素化ＢＡＰＴＡ誘導体を合成することが比較的複雑である。
【００１１】
また、ＢＡＰＴＡ又はその誘導体に基づく公知のイオノフォアは、水性環境、及び通常の周囲温度で、少し化学的に不安定性を示すことが、既に示されている（例えば、米国特許第４，６０３，２０９号、２６段、４０〜４６行参照）。このことは、光学センサが監視目的のために長期間測定で使用される場合、又はセンサの高い貯蔵寿命（耐久性）を必要とする測定状況において、光学センサを用いる決定手順で特に不利な点がある。多くの場合、これらの化合物は、マグネシウム以外の陽イオン（例えば、カルシウム）のＫｄ値が、より小さいことを示す。
【００１２】
本発明は、従来技術の欠点及び問題を回避し、克服する。本発明は、イオノフォアが、より容易に合成可能であり、電子的に分離された際、適した発光団に共有結合させることができる、マグネシウムイオンを光学的に決定するための発光団−イオノフォア及びデバイスを提供することを目的とする。また、優先的に、代替の競合陽イオン（例えば、カルシウム）と結合するイオノフォアを含むブロッキング層を、発光団−イオノフォアと陽イオン含有溶液との間に設置することができるため、イオノフォアが、マグネシウムイオンに対する高い選択性を発揮する必要はない。
【００１３】
また、発光団−イオノフォアは、光学センサで使用するために、化学基によって、親水性ポリマー材料に結合させてもよい。
【００１４】
発光団−イオノフォアは、試料の予想ｐＨ範囲で固有のｐＨ依存性を示すことなく、例えば、＞４２０ｎｍの波長で、市販のＬＥＤの光によって励起することができる必要がある。また、これら発光団−イオノフォアは、高い周囲温度でも、長期間にわたって水性環境中で化学的に安定する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、基板、マグネシウムイオンに結合することができるセンサ層、及び、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的にカルシウムイオンと結合する捕捉層を含むデバイスを提供する。本発明はまた、試料中のマグネシウムイオンの濃度を決定する方法を提供し、この方法では、発光団−イオノフォアを、試料中のマグネシウムイオンと接触させ、少なくとも１つの蛍光放出の強度が変化し、蛍光放出の強度の変化に基づいてマグネシウムイオンの濃度を算出する。また、本発明は、マグネシウムと結合することができる、発光団部分及びイオノフォア部分を含む、新規発光団−イオノフォアに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一実施形態において、本発明のマグネシウムイオンの存在を選択的に測定するためのデバイスは、基板と、マグネシウムイオンと結合することが可能であり、任意に、固体支持体上に固定化される発光団−イオノフォアを含むセンサ層と、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的にカルシウムイオンと結合する捕捉層と、を含み、上記の発光団−イオノフォアは、第１強度で発光し、上記デバイスを、マグネシウムイオンを含む溶液と接触させると、上記の発光団−イオノフォアは、上記の溶液に存在するマグネシウムイオンの濃度に比例する量で第１強度とは異なる第２強度で発光する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、発光団−イオノフォアは、公知の化合物である。他の実施形態において、発光団−イオノフォアは、本明細書に開示される、新規化合物である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明の新規発光団−イオノフォアは、式（Ｉ）に従う化合物である。
【化１】
2016505824.tif 000003
式中、
Ａ、Ｂ、及びＣは、独立に、水素、-ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’、及び-Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、Ａ、Ｂ及びＣの１つ以上は、独立に、-ＯＣＨ２ＣＯＯＲ’及び-Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲ’）２からなる群から選択され、
Ｒ’は、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンからなる群から選択される。
【００１９】
Ｘ及びＹは、存在するそれぞれの場合、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲ’からなる群から選択される。
【００２０】
ｖは、０、１、２、３及び４から選択された整数である。
【００２１】
Ｚは、発光団部分である。
【００２２】
本発明は、試料中のマグネシウムイオンの濃度を決定する方法であって、（ａ）第１強度を得るために、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンが存在する場合、カルシウムイオンに対する優先的結合親和性を示す化合物、及び、マグネシウムイオンと結合することができる発光団−イオノフォアを含む混合物の蛍光放出を測定する工程と、（ｂ）第１強度が変化するように、工程（ａ）の上記の混合物を、上記の試料と接触させる工程と、（ｃ）第２強度を得るために少なくとも１つの蛍光放出の強度を測定する工程と、（ｄ）部分的には、第１強度と第２強度との差に基づいて、上記の試料中のマグネシウムイオンの濃度を導出する工程と、を含む方法をさらに提供する。
【００２３】
他の実施形態において、本発明の新規発光団−イオノフォアは、式（ＩＩ）に従う化合物である。
【化２】
2016505824.tif 000004
式中、
各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、または陽イオンである。
【００２４】
Ａは、（ＣＸＹ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３及び４から選択される整数であり、各々の場合のＸ及びＹは、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲからなる群から選択される。
【００２５】
Ｚは、ＮＨ又はＯである。
【００２６】
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【００２７】
他の実施形態において、本発明の新規発光団−イオノフォアは、式（ＩＩＩ）に従う化合物である。
【化３】
2016505824.tif 000005
式中、各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、又は陽イオンである。
【００２８】
Ａは、−（ＣＨＯＨ）−又は１つの結合である。
【００２９】
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】新規なマグネシウム発光団−イオノフォアのための合成経路を示す。
【図２】Ｍｇ２＋の五つの濃度及びＣａ２＋の２つの濃度でＨ−バッファを用いたＭｇセンサの応答を示すグラフである。
【図３】Ｍｇセンサで測定された血液試料の比を示す。
【図４】本明細書中で具体化されたデバイスの層の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書中で使用される用語は以下の意味を有する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「アルキル」は、表示された炭素原子数を有する、直鎖又は分枝鎖の、飽和炭化水素を意味する。例えば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、及びネオヘキシルを含むことを意味するが、これらに限定されるものではない。アルキル基は、非置換であるか、又は、任意に１つ以上の置換基で置換されることができる。
【００３３】
本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、表示された炭素原子数を有する−Ｏ−アルキル基を意味する。例えば、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基は、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−プロピル、−Ｏ−イソプロピル、−Ｏ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル、−Ｏ−ペンチル、−Ｏ−イソペンチル、−Ｏ−ネオペンチル、−Ｏ−ヘキシル、−Ｏ−イソヘキシル、及び−Ｏ−ネオヘキシルを含む。
【００３４】
本明細書で使用する用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ及び／又は−Ｉを意味する。
【００３５】
本明細書で使用する用語「発光団−イオノフォア」は、少なくとも１つのイオノフォア及び少なくとも１つの発光団を含む化合物を意味する。本明細書で使用されたように、発光団−イオノフォアは、少なくとも１つのイオノフォア及び少なくとも１つのフルオロフォアを含むフルオロイオノフォアを含んでもよい。
【００３６】
親油性基の例には、置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル基、置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ基、非置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル基、及び非置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルコキシ基が挙げられる。
【００３７】
親水性基の例には、測定溶液のｐＨで解離されていた、少なくとも１つのヒドロキシル基及び／又は官能基を有する（Ｃ１−Ｃ１７）アルキル基が挙げられる。このような官能基の例には、カルボン酸、スルホン酸、及びリン酸が挙げられる。
【００３８】
アミノ官能化されたポリマー、例えば、アミノセルロース及びアミノ官能性ポリアクリルアミドとカップリングするための反応基の例は、例えば、米国特許第４，７７４，３３９号、表４で知られていて、これは本明細書に参照として含まれる。
【００３９】
発光団部分又は発光団は、イオノフォア部分と組み合わせて、ＰＥＴ効果を得ることができる、任意の部分でもよい。多数の発光団部分は、イオノフォアと組み合わせて、ＰＥＴ効果を与えるか、又は、原理的には、その目的に適していることが、文献から知られている。更なる発光団部分の例には、発光金属配位子錯体が挙げられる。発光長寿命遷移金属配位子錯体は、２、２’−ビピリジン、１、１０−フェナントロリン、及び４、７−ジフェニル−１、２０−フェナントロリンの群から選択されたα−ジイミン配位子を有し、このような配位子は、例えば、ルテニウム（ＩＩ）、オスミウム（ＩＩ）、イリジウム（ＩＩＩ）及びロジウム（ＩＩＩ）からなる群の中心原子を含む。
【００４０】
Ｍｇ色素又はマグネシウム色素は、マグネシウムに対する結合親和性を示し、本発明の実施形態のデバイスに組み込まれるか、又は組み込まれてもよい、発光団−イオノフォアを指すことができる。
【００４１】
以下の略語が本明細書中で使用され、次のように定義される。ＮＭＲ：核磁気共鳴、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、ＥＡ：酢酸エチル、ＤＢＵ：１、８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン、ＤＩＰＥＡ：Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン。
［本発明のデバイス］
【００４２】
本発明は、基板、マグネシウムイオンに結合されることができるセンサ層、及び、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的にカルシウムイオンと結合する捕捉層を含むデバイスを提供する。
【００４３】
基板は、その上へのデバイスの他の層の蒸着を助けるのに適している固体材料を含む。いくつかの実施形態において、基板は、センサ層によって放出された少なくとも１つの蛍光スペクトルに対して不透明ではない。いくつかの実施形態において、基板は、高透明性ポリマー、例えば、メリネックス（登録商標）５０５の商標で販売されているポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態において、基板は、デバイスの更なる少なくとも１つの層（例えばセンサ層）の接着を促進するために前処理される。前処理には、基板とセンサ層との良好な接着のために、これらの間にＤ４ヒドロゲル層を適用する工程を含んでもよい。
【００４４】
マグネシウムイオンと結合することができるセンサ層は、マグネシウムイオンと接触されたときのスペクトル発光の変化を提供する少なくとも１つの化合物を含む。この化合物は、イオノフォア部分がマグネシウムイオンと結合する発光団−イオノフォアであってもよい。いくつかの実施形態において、センサ層は、マグネシウムイオンに対する高い親和性を示し、マグネシウムイオンと接触されたとき、蛍光放出強度の増加を示す公知の化合物を含む。一実施形態において、センサ層は、公知の化合物の２、２’（４−（３−カルボキシラト−４−（２、７−ジクロロ−６−オキシド−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンズアミド）−２（カルボキシラトメトキシ）フェニルアザンジイル）二酢酸を含み、これは、商標であるマグネシウムグリーン（商標）、又はマグ‐フラ−２（商標）、マグ‐インド−１（商標）、及び、マグ−フルオ−４（商標）として販売されている。他の実施形態において、センサ層は、本明細書に開示された式の発光団−イオノフォアを含む。例えば、センサ層は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び／又は式（ＩＩＩ）から選択される少なくとも１つの化合物を含む。
【００４５】
センサ層は、基板上の蒸着を助けるために発光団−イオノフォアと共に、化合物を含んでもよい。一実施形態において、センサ層の発光団−イオノフォアは、基板上に直接蒸着される。別の実施形態において、センサ層の発光団−イオノフォアは、アミノ官能化ポリマーのような固体支持体に共有結合された後、基板上に蒸着させることができる。非限定的な例として、固体支持体は、アミノセルロース、及びアミノ官能性ポリアクリルアミドのように当該技術分野で知られている材料であってもよい。例示の実施形態において、固体支持体は、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルセルロース（ＡＨＰＣ）繊維を含む。いくつかの実施形態において、結合又は非結合発光団−イオノフォアは、基板上の均一な蒸着を助けるために、Ｄ４又はＤ６ヒドロゲルなどの公知の化合物中に分散されてもよい。
【００４６】
具現化されたデバイスの捕捉層は、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの両方の存在下で、優先的にカルシウムイオンと結合する。層は、マグネシウムイオンとの解離定数（Ｋｄ）よりも小さい、カルシウムイオンとの解離定数（Ｋｄ）を示す少なくとも１つの化合物を優先的に含み、さらに、デバイスに組み込まれた場合、構造的安定性及びカルシウムイオンの高速の錯化反応速度を有する。いくつかの実施形態において、捕捉層は、ＢＡＰＴＡ又は既知ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ（エチレングリコール４酢酸）、シュウ酸ナトリウムのようなシュウ酸誘導体、又はホモログを含む。
【００４７】
具現化されたデバイスは、任意に更なる１つ以上の層を含んでもよい。いくつかの実施形態において、デバイスは、更なる不透明な光学分離層（例えば、カーボンブラック）を含む。いくつかの実施形態において、更なる光学分離層は、カーボンブラックのような光学分離基板を含む捕捉層が一回のみ蒸着されるように、捕捉層に組み込まれる。いくつかの実施形態において、更なる、光学分離層のような層は、例えば、Ｄ４又はＤ６ヒドロゲルなどの、基板上の蒸着を助けるために、化合物中に分散されてもよい。
【００４８】
このような層の蒸着後、デバイスは、室温で貯蔵されているか、又は硬化されるため、一般的に水を除去して、水蒸気による汚染を防止した後、室温未満の温度で貯蔵することに適する。
【００４９】
別の実施形態において、デバイスは、公知の薬学的デバイス（例えば、オプティライオン（ＯＰＴｉ  ＬＩＯＮ）カセット）に組み込まれている。
［本発明の化合物］
【００５０】
本発明は、「発光団−イオノフォア」という式（Ｉ）の新規化合物を提供する。
【化４】
2016505824.tif 000006
式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、ｖ及びＺは上記に定義されている。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明の発光団−イオノフォアは、その発光特性を、マグネシウムイオン及び発光団−イオノフォアを含む混合物中に存在するマグネシウムイオンの濃度に比例する量で、変化させ、この発光特性には、相対的発光強度、時間依存の発光強度、又は位相シフトが挙げられる
【００５２】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）中の発光団−イオノフォア部分Ｚは、下記に記載された、式（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、Ｚは、式（ａ）の基であり、
【化５】
2016505824.tif 000007
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、独立に、水素、親油性基、親水性基及びポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択され、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、−ＮＨ−基である。
【００５４】
他の実施形態において、Ｚは、式（ｂ）の基であり、
【化６】
2016505824.tif 000008
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、独立に、−ＯＨ、−ＯＲ１８、及び−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、ここで、Ｒ１８は、親水性基、親油性基、−Ｏ−Ｒ１９−Ｇからなる群から選択され、Ｒ１９は、親水性基、又は、親油性基であり、Ｇは、ポリマーとカップリングするための反応基であり、ｗは、０と１７との間の整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７の少なくとも１つは、Ｚが、イオノフォア部分に直接結合される、１つの結合を表す。
【００５５】
他の実施形態において、Ｚは、式（ｃ）の基であることができる。
【化７】
2016505824.tif 000009
式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６は、独立に、水素、親油性基、親水性基、及びポリマー又は生体分子とカップリングするための反応基からなる群から選択され、Ｒ２１は、Ｒ２２と一緒に、芳香族環系を形成してもよく、Ｒ２５は、Ｒ２６と一緒に、任意に芳香族環系を形成し、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、１つの化学結合を表す。
【００５６】
式（ｃ）において、Ｒ２１は、Ｒ２２と一緒に芳香族環系を形成してもよく、Ｒ２５は、Ｒ２６と一緒に芳香族環系を形成してもよい。
【００５７】
式（ｃ）において、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５及びＲ２６の少なくとも１つは、Ｚが−（ＣＸＹ）Ｖ−基に結合される、１つの化学結合を表す。
【００５８】
他の実施形態において、Ｚは、一般式（ａ）を有し、Ｒ５及びＲ６の一方が、−ＮＨであり、他方は、水素、親油性基、親水性基、及びポリマーとカップリングするための反応基からなる群から選択される。
【００５９】
さらに他の実施形態において、Ｚは、一般式（ｂ）を有し、Ｒ１４は１つの結合である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、Ｚは、一般式（ｃ）を有し、Ｒ２３は１つの結合であり、Ｒ２２及びＲ２４は、独立に、水素又はメチルである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、発光団−イオノフォアは、式（ＩＩ）の化合物である。
【化８】
2016505824.tif 000010
式中、各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、及び陽イオンであり、Ａは、（ＣＸＹ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３及び４から選択される整数であり、各々の場合のＸ及びＹは、独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、エトキシ、メトキシ、アミン及び−ＣＯＯＲからなる群から選択される。
【００６２】
Ｚは、ＮＨ又はＯである。
【００６３】
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、発光団−イオノフォアは、式（ＩＩＩ）の化合物である。
【化９】
2016505824.tif 000011
式中、各々の場合のＲは、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、又は陽イオンである。
【００６５】
Ａは、−（ＣＨＯＨ）−又は１つの結合である。
【００６６】
Ｑは、水素、Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、陽イオン又は固体支持体である。
【００６７】
式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物の具体例は、以下に提供される。
【化１０】
2016505824.tif 000012
【化１１】
2016505824.tif 000013
【化１２】
2016505824.tif 000014
【化１３】
2016505824.tif 000015
【００６８】
Ｂｏｃ保護基は、ポリマー支持体に化合物を固定又は固着するために除去することができること、又は、イオノフォアの酸のアルキル基及び／又はヒドロキシル基は、脱保護又は脱プロトン化され、マグネシウムのような陽イオンにキレート化されることができることが、当業者によって認識される。
［本発明の方法］
【００６９】
また、本発明は、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む試料中のマグネシウムイオンを決定する方法を提供する。一実施形態において、試料中にマグネシウムイオンの濃度を決定する方法は、（ａ）第１強度を得るために、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンが存在する場合、カルシウムイオンに対する優先的結合親和性を示す化合物、及び、マグネシウムイオンと結合することができる発光団−イオノフォアを含む混合物の蛍光放出を測定する工程と、（ｂ）第１強度が変化するように、（ａ）工程の上記の混合物を、上記の試料と接触させる工程と、（ｃ）第２強度を得るために少なくとも１つの蛍光放出の強度を測定する工程と、（ｄ）部分的には、第１強度と第２強度との差に基づいて、上記の試料中のマグネシウムイオンの濃度を導出する工程と、を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む試料中のマグネシウムイオンの決定方法は、本明細書に具現化されたデバイスを、マグネシウム及びカルシウムイオンを含む水溶液、例えば、緩衝溶液、及び／又は、体液（例えば、全血、血漿、血清、及び／又は尿）と、接触させる工程を含む。別の実施形態において、本発明は、本明細書に具現化された、式（Ｉ）に従う発光団−イオノフォアを含むデバイス、及びマグネシウムイオン、カルシウムイオンを含む試料中のマグネシウムイオンを決定する方法を提供する。
【００７１】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に具現化された、式（ＩＩ）に従う発光団−イオノフォアを含むデバイス、及びマグネシウムイオン、カルシウムイオンを含む試料中のマグネシウムイオンを決定する方法を提供する。
【００７２】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に具現化された、式（ＩＩＩ）に従う発光団−イオノフォアを含むデバイス、及びマグネシウムイオン、カルシウムイオンを含む試料中のマグネシウムイオンを決定する方法を提供する。
【００７３】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に具現化された、例えばマグネシウムグリーンのよう公知の発光団−イオノフォアを含むデバイス、及びマグネシウムイオン、カルシウムイオンを含む試料中のマグネシウムイオンを決定する方法を提供する。
［本発明の化合物の製造］
【００７４】
当業者は、特許請求の範囲に示される分子を合成するために利用可能な種々の方法があることを認識する。１つの一般的な戦略は、本明細書に概説するが、特許請求の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
【００７５】
［Ｍｇ２合成］
【化１４】
2016505824.tif 000016
【００７６】
ＴＨＦ（１Ｌ）中のＭｇ１（１００ｇ、０．７２ｍｏｌ）とＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（１０ｇ、１０％）との混合物を、１６時間、常圧で、５０℃で水素化した後、（ＰｄＯＨ）２／Ｃを濾過し、熱ＴＨＦ（２００ｍＬ）で洗浄し、ろ液を蒸発乾燥して、白色固体としての７９ｇのＭｇ２を得た（収率１００％）。
［実施例２］
【００７７】
［Ｍｇ３合成］
【化１５】
2016505824.tif 000017
【００７８】
Ｍｇ２（７９ｇ、０．７２ｍｏｌ）、ＮａＯＨ（５０ｇ、１．２５ｍｏｌ）及びクロロ酢酸ナトリウム（３１３ｇ、２．６９ｍｏｌ）を、水（２９０ｍＬ）に溶解し、混合物を９０℃に加熱した。水（１００ｍＬ）中のＮａＯＨ（１００ｇ、２．５ｍｏｌ）の溶液を３０分かけて滴下させて添加した。添加後、この混合物を２時間加熱還流した後、氷浴により１５℃に冷却した。この混合物を４Ｎ塩酸（約１．１Ｌ）でｐＨ＝２に酸性化した。この混合物をＥＡ（４×２００ｍＬ）で抽出し、ＥＡ層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、蒸発乾燥した。残渣をＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）で結晶化して、白色固体として１５８ｇのＭｇ３を得た（収率７７％）。
［実施例３］
【００７９】
［Ｍｇ４合成］
【化１６】
2016505824.tif 000018
【００８０】
ＥｔＯＨ（２６００ｍＬ）中のＭｇ３（１３０ｇ、０．４６ｍｏｌ）の混合物に、ＳＯＣｌ２（２７３ｇ、２．２９ｍｏｌ）をゆっくりと加えた。添加後、この混合物を還流で一晩加熱した。この混合物を蒸発乾燥した後、残渣をＥＡ（２Ｌ）に溶解した。ＥＡ層を、飽和Ｎａ２ＣＯ３（水溶液）（２００ｍＬ）、次いで塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾燥させ、油として１６０ｇのＭｇ４を得た（収率９５％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝２：１、Ｒｆ＝０．３）。
［実施例４］
【００８１】
［Ｍｇ５合成］
【化１７】
2016505824.tif 000019
【００８２】
ＡｃＯＨ（２５０ｍＬ）中のＭｇ４（５０ｇ）とウロトロピン（２１ｇ）の混合物に、ＴＦＡ（５０ｍｌ）を加えた後、この混合物をＮ２ガス雰囲気下で、６時間、９０℃で撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＥＡ（６００ｍＬ）に溶解した。ＥＡ層を、飽和Ｎａ２ＣＯ３（水溶液）（１００ｍＬ）、次いで塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾燥させた。残渣をカラムクロマトグラフィーによって分離して、オフ・ホワイトの固体として１７ｇのＭｇ５を得た（収率３２％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝２：１、Ｒｆ＝０．６、Ｍｇ４のないＴＬＣ上のクリーンスポット）。
［実施例５］
【００８３】
［Ｍｇ６合成］
【化１８】
2016505824.tif 000020
【００８４】
ＭｅＮＯ２（３０ｍＬ）中のＭｇ５（５ｇ、１２．６４ｍｍｏｌ）の混合物に、２５℃でＤＢＵ（０．２ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を添加した。添加後、この混合物を３０分間撹拌した。過剰ＭｅＮＯ２を減圧下で蒸発させた。残渣に１００ｍＬのトルエンを添加し、再び蒸発乾燥した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって分離して、黄色固体として３．２ｇのＭｇ６を得た（収率５５％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝２：１、Ｒｆ＝０．３、Ｍｇ５のないＴＬＣ上のクリーンスポット）。
［実施例６］
【００８５】
［Ｍｇ７合成］
【化１９】
2016505824.tif 000021
【００８６】
ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中のＭｇ６（１．５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ２Ｏ（３．９６ｍｍｏｌ）、ラネーニッケル（０．５ｇ）の混合物を、１５℃未満で、一晩水素化した。触媒を濾過し、残渣を蒸発乾燥し、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、透明な油として１．５ｇのＭｇ７を得た（収率８６％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝１：１、Ｒｆ＝０．４、Ｍｇ６のないＴＬＣ上のクリーンスポット）。
［実施例７］
【００８７】
［Ｍｇ８合成］
【化２０】
2016505824.tif 000022
【００８８】
ジクロロメタン（１８０ｍＬ）中のＭｇ７（１８ｇ、３４．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５．２ｇ、５１．３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．９ｇ）の溶液に、０℃で無水酢酸（１０２ｇ、３４．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。その後、５０ｍＬの水でクエンチし、ジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で抽出した。その後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾燥させた。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、透明な油として７．６ｇのＭｇ８を得た（収率３９．２％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝２：１、Ｒｆ＝０．４、Ｍｇ７のないＴＬＣ上のクリーンスポット）。
［実施例８］
【００８９】
［Ｍｇ９合成］
【化２１】
2016505824.tif 000023
【００９０】
ＥｔＯＨ（７５ｍＬ）中のＭｇ８（７．５ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｐｄ／Ｃ（１．５ｇ）で、一晩水素化した。触媒を濾去し、残渣を蒸発乾燥して、透明な油として６．７ｇのＭｇ９を得た（収率１００％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝２：１、Ｒｆ＝０．３、Ｍｇ８のないＴＬＣ上のクリーンスポット）。
［実施例９］
【００９１】
［Ｍｇ１０合成］
【化２２】
2016505824.tif 000024
【００９２】
４０ｍＬのジクロロメタン中のＭｇ９（６．６ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（４０ｍＬ）の溶液を、一晩攪拌し、蒸発して、５．５ｇのＭｇ１０を得た（Ｍｇ９のないＴＬＣ上のクリーンスポット）。
［実施例１０］
【００９３】
［Ｏｐｔｉ−Ｔａｒｇｅｔ−５合成］
【化２３】
2016505824.tif 000025
【００９４】
ＮＭＰ（３３ｍＬ）中のＭｇ１０（４．４ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、化合物１０Ａ（３．６ｇ、８．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１３．３ｍＬ）の混合物を、Ｎ２下で、３日間、１００℃で撹拌した。この混合物を、水（１０ｍＬ）中に注ぎ、ＥＡ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせたＥＡ層を、飽和Ｎａ２ＣＯ３（水溶液）（３×１０ｍＬ）で洗浄した後、次に塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾燥させた。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、黄色固体として１．１ｇのＯｐｔｉ−ＴＡＲＧＥＴ−５を得た（収率１７％）（ＴＬＣ：石油エーテル：ＥＡ＝１：１、Ｒｆ＝０．３）。
［発光特性の決定］
【００９５】
本発明の文脈で、「発光を測定する」という表現は、発光強度の測定、減衰発光強度の時間分解測定、及び位相変調測定を含む、任意の発光特性の測定を意味する。
【００９６】
測定した発光を利用して、試料中のイオンを決定することは、発光強度や発光減衰時間に基づいていることができる。
【００９７】
様々な発光団−イオノフォアの発光を測定することにより、イオンを決定する方法は、例えば、米国特許第６，２１１，３５９号、同第５，９５９，４９１号、同第６，１７１，８６６号に記載されていて、各々は、本明細書中に参照として含まれる。
［センサの作製］
【００９８】
発光団−イオノフォア（マグネシウム色素）を、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルセルロース（ＡＨＰＣ）繊維に、ＤＣＣカップリングにより共有結合させた。次に、繊維は、遊離色素を除去するために洗浄し、次いで乾燥し、２５μｍの篩にかける。その後、マグネシウム繊維を、Ｄ４ヒドロゲルと混合し、均一な分散を得るために、室温（ＲＴ）で、少なくとも２０時間撹拌し続けた。上塗り懸濁液は、１、２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’四ナトリウム塩（ＢＡＰＴＡ）及びカーボンブラックを、Ｄ６ヒドロゲルと混合し、室温で、少なくとも２０時間攪拌して、均一な分散を達成することによって調製した。
【００９９】
上塗り懸濁液を、１２５μｍの乾燥厚さを有するポリエステル系メリネックス（登録商標）５０５のシート上に塗布した。インジケータ懸濁液を、この湿潤厚さが１００μｍになるように、メリネックス（登録商標）に、均一に塗った。インジケータ層を、この乾燥膜厚が、約７μｍ乃至８μｍとなるように、少なくとも３０分間乾燥させて、ヒドロゲル中の水とエタノールを蒸発させた。次に、上塗り懸濁液を、同一の装置を用いて塗布し、少なくとも３０分間乾燥させて、約７乃至８μｍの乾燥厚さを有する上塗りを形成した。
【０１００】
ＰＳＡ（粘着剤）のシートを、メリネックス（登録商標）５０５シートの背面に貼った。センサは、その後、メリネックスから打ち抜き、オプティライオンカセットのチャンネル５のウェルに直接設けたあと、センサの背面に接着剤で固定した。次いて、カバーをカセット上に溶接した。その後、カセットを、０．５ｇの分子篩と共に、袋状に包み、１週間、４１℃で焼成した。焼成後、ｉＭｇカセットを、試験するまでに、冷蔵庫（約４℃）に貯蔵した。
［試料調製］
［Ｈ−バッファの調製］
【０１０１】
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）は、両性イオン性有機化学緩衝剤で、１２個のグッドの緩衝液の１つであり、ＨＥＰＥＳは、主に、生理的ｐＨを一定に維持させるという理由で、細胞培養で広く用いられる。この研究で、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、ストック溶液として、ｐＨ７．４で、次のイオン濃度を有するように調製した：［Ｎａ＋］１４６ｍＭ、［Ｋ＋］５ｍＭ及び［Ｃｌ−］１０４ｍＭ。ナトリウム、カリウム、塩化物は、ヒトの血液中の主要なイオンの分析物であり、上記の濃度は、健康な人間における正常な水準である。その後、緩衝液に、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び２ｍＭの一連のＭｇ２＋の濃度を得るために、ＭｇＣｌ２を添加した。五つのバッファは、各々、２つの部分に分離され、一方の部分には、１．２ｍＭのＣａ２＋の濃度に到達するようにＣａＣｌ２を添加し、他方の部分には、０ｍＭのＣａ２＋濃度を維持する。ヒト血液中のＣａ２＋の濃度は、通常、１．２ｍＭである。各種［Ｍｇ２＋］でのＭｇセンサの応答は、各センサの感度及び直線性を決定するために測定した。ＢＡＰＴＡの遮断効果は、様々なＣａ２＋の濃度でのＭｇセンサの応答を比較することにより検討した。
［全血試料］
【０１０２】
新鮮な全血試料は、健康なヒト被験者から得た。全血試料は、全て、試料中のＭｇ２＋の濃度を低下させるためにＭｇ２＋を含まないＨ−緩衝液で希釈するか、又は試料中のＭｇ２＋の濃度を高めるためにＭｇＣｌ２を添加した。［Ｍｇ２＋］の４つの水準の試料は、血液試料中のＭｇ２＋の濃度に対するＭｇセンサの応答を観察し証明するために準備した。上記の４つ試料は、各々、２つの部分に分離され、一方の部分には、２．４ｍＭの［Ｃａ２＋］に到達するために、その後ＣａＣｌ２を添加し、他方の部分はそのまま維持する。したがって、［Ｃａ２＋］の２つの水準の試料を調製した。
［試料調製］
【０１０３】
ｉＭｇカセットは、オプティライオン（商標）スタット電解質分析機を用いて試験した。まず、カセットを冷蔵庫から取り出し、少なくとも１時間、室温に温めた。次に、このカセットは、この分析機内に配置し、試料吸引用シッパーをカセット上に取り付けた。この分析機が、青色発光ダイオード（ＬＥＤ）を点灯し、６０秒間発光団−イオノフォアの乾燥強度を測定する、試験プログラムを開始した。次に、試料をシッパーに取り付け、分析機内に装着されたペリポンプ（ＰＥＲＩＰＵＭＰ）は、試料をカセット内に吸引した。試料は、最初に上塗りと接触し、上塗りを通って拡散して、インジケータに到達する。Ｍｇ２＋は、発光団−イオノフォアを結合し、蛍光のクエンチを「オフ」する。蛍光強度は、発光団−イオノフォアに結合されたＭｇ２＋の量に依存する。Ｍｇ２＋濃度が高いと、より高い蛍光強度が得られる。分析機は、１２０秒間ウェット強度を測定し、記録する。分析機は、２秒ごとに、１つの強度の測定値を出力する。だから、全体で３０個の乾燥強度の測定値であり、６０個のウェット強度の測定値が記録される。
［データ分析］
【０１０４】
測定の結果は、３０個の乾燥強度の測定値の後に、６０個のウェット強度の測定値を続けて、スプレッドシートに表した。最後の１０個の乾燥強度の測定値を平均し、この平均値を、次の計算のために「乾燥強度」として使用した。正規化強度を計算するために、６０個のウェット強度を「乾燥強度」で除した。次に、センサの性能評価に用いる湿潤／乾燥比を決定するために、５６から６４秒までの平均正規化強度を計算した。この比が高いと、試料中のＭｇ２＋の濃度が高いことを示している。
［センサの感度及び精度試験］
【０１０５】
Ｍｇセンサは、前述の手順に従って製造し、各水準で、Ｈ−バッファを用いて、１０回試験を繰り返した。図１は、［Ｍｇ２＋］に対して上記データ解析方法に基づいて計算された割合を示した。０．１から２ｍＭまで、異なるＭｇ２＋の濃度での比率が、非常に良好に分離されている。一方、Ｒ２が０．９９９である良好な直線性が達成される。［Ｃａ２＋］の２水準で、Ｍｇセンサの応答は、非常に類似し、これは、Ｃａ２＋の拡散が、ＢＡＰＴＡによって効率的に遮断されることを示唆する。［Ｍｇ２＋］の５つの水準と［Ｃａ２＋］の２つの水準で、Ｈ−バッファを用いたＭｇセンサの応答を示す、図２を参照のこと。
【０１０６】
変動係数（ＣＶ）は、この比の平均を標準偏差で除することによって計算した。小さいＣＶは、より均一なコーティングと高い精度を意味する。表１は、［Ｍｇ２＋］の５つの水準と［Ｃａ２＋］の２つの水準でＨ−バッファを用いて測定されたｉＭｇセンサの比のＣＶを示す。本研究でのすべての１０個のＣＶは、４％未満で、これは、Ｍｇセンサの精度が良好なことを示す。図２には、別のＭｇ＋とＣａ２＋濃度について湿潤／乾燥強度の比が、プロットされている。
【表１】
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［センサ加速貯蔵安定性試験］
【０１０７】
ｉＭｇカセットは、２週間、４１℃で貯蔵し、安定性を測定するために、Ｔ＝０、Ｔ＝１週間、及びＴ＝２週間で試験した。５つの水準の［Ｍｇ２＋］と２つの水準の［Ｃａ２＋］でのＨ−バッファが、この実験に使用された。各バッファを用いて、少なくとも５回繰り返した。表２及び表３は、それぞれ、１．２ｍＭのＣａ２＋及び０ｍＭのＣａ２＋でのＨ−バッファを用いて測定された比を示す。この比の有意差は、Ｔ＝０、Ｔ＝１週間及びＴ＝２週間からは観察されなかった。Ｍｇ色素及びＢＡＰＴＡの両方は、貯蔵期間中安定すると判明された。
【表２】
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【表３】
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＊は、全血試料を用いて試験されたｉＭｇセンサ
【０１０８】
血液試料は、放散タンパク質、ブドウ糖、ミネラルイオン、ホルモン、血小板及び血液細胞などを含んでいて、バッファに比べて相当に複雑な流体を形成する。新鮮な全血試料を、上述の手順に従って調製した。血液試料中のＣａ２＋及びＭｇ２＋の濃度は、ノバ（登録商標）クリチィカルケアエクスプレス分析機によって測定した。表４は、ノバ（登録商標）により測定された［Ｍｇ２＋］及び［Ｃａ２＋］を示す。試料１と試料２、試料３と試料４、試料５と試料６、及び試料７と試料８は、試料２、４、６及び８を得るために、ＣａＣｌ２を、試料１、３、５、及び７に添加したため、同じ［Ｍｇ２＋］と異なる［Ｃａ２＋］を有するべきである。
【表４】
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【０１０９】
図３は、異なる［Ｍｇ２＋］で、応答曲線が非常によく分離されたことを示しており、これは、全血試料で測定した場合ｉＭｇセンサの良好な感度を示す。また、この結果によると、同じ［Ｍｇ２＋］と異なる［Ｃａ２＋］を有する試料の測定比は、お互い非常に類似することで、ＢＡＰＴＡが、効率的に血液試料中のＣａ２＋を遮断したことを示す。これは、さらに図３に示されていて、図３は、Ｍｇセンサで測定された、血液試料の比を示す。
【図１】
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【図２】
2016505824.tif 000049
【図３】
2016505824.tif 000050
【図４】
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【国際調査報告】
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