(57)【要約】本発明は、ヒトCD134と特異的に結合する抗体を提供する。抗ヒトCD134抗体は、例えば、活性化された従来のヒトエフェクターCD4および／またはCD8 Tリンパ球（Teff）上、ならびに活性化されたヒト抑制性調節性CD4 Tリンパ球（Treg）上に発現されるヒトCD134上の非OX40リガンド（OX40L）結合性ドメインを含む、ヒトCD134の細胞外ドメインと特異的に結合する。ヒト化抗ヒトCD134抗体は、癌治療のために（例えば、Teffに抗癌エフェクター機能を与えるため、および／またはTregの抑制機能を阻害するために）有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：100の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：100のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。
【請求項２】
VHがSEQ ID NO：152のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：152のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
VHがSEQ ID NO：99のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：99のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項2記載の抗体。
【請求項４】
HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含む、請求項4記載の抗体。
【請求項６】
HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む、請求項5記載の抗体。
【請求項７】
a．VLがSEQ ID NO：67もしくは68のアミノ酸配列を含み；かつ
VHが、SEQ ID NO：69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147もしくは148のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、55もしくは99に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有する；または
b．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：67および69；
ii．それぞれSEQ ID NO：67および70；
iii．それぞれSEQ ID NO：67および71；
iv．それぞれSEQ ID NO：68および69；
v．それぞれSEQ ID NO：68および70；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：68および71
のアミノ酸配列を含む、請求項2記載の抗体。
【請求項８】
VH直鎖状アミノ酸残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換が、V11L、N55Q、N55A、N55E、M99LまたはM99Iである、請求項7記載の抗体。
【請求項９】
結合性分子が、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、請求項8記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、請求項1記載の抗体。
【請求項１１】
CD134のアゴニストである、請求項1記載の抗体。
【請求項１２】
IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、請求項11記載の抗体。
【請求項１３】
Fc領域に置換を含む、請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、請求項13記載の抗体。
【請求項１５】
置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、請求項14記載の抗体。
【請求項１６】
請求項2記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項16記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
請求項17記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
対象における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項2記載の抗体を、免疫応答を強化するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。
【請求項２０】
対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項2記載の抗体を、癌を治療するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。
【請求項２１】
癌が、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
請求項2記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項２３】
ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：98の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：98のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。
【請求項２４】
VHがSEQ ID NO：134のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：134のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項23記載の抗体。
【請求項２５】
VHがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：97のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項24記載の抗体。
【請求項２６】
HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含む、請求項23記載の抗体。
【請求項２７】
HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含む、請求項26記載の抗体。
【請求項２８】
HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む、請求項27記載の抗体。
【請求項２９】
a．VLがSEQ ID NO：62もしくは63のアミノ酸配列を含み；かつ
VHが、SEQ ID NO：64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150もしくは151のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、56もしくは106に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有する；または
b．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：62および64；
ii．それぞれSEQ ID NO：62および65；
iii．それぞれSEQ ID NO：62および66；
iv．それぞれSEQ ID NO：63および64；
v．それぞれSEQ ID NO：63および65；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：63および66
のアミノ酸配列を含む、請求項24記載の抗体。
【請求項３０】
VH直鎖状アミノ酸残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換が、V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106LまたはM106Iである、請求項29記載の抗体。
【請求項３１】
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、請求項30記載の抗体。
【請求項３２】
ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、請求項23記載の抗体。
【請求項３３】
CD134のアゴニストである、請求項23記載の抗体。
【請求項３４】
IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、請求項33記載の抗体。
【請求項３５】
Fc領域に置換を含む、請求項34記載の抗体。
【請求項３６】
置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、請求項35記載の抗体。
【請求項３７】
置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、請求項36記載の抗体。
【請求項３８】
請求項24記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３９】
請求項38記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４０】
請求項39記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４１】
対象における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項24記載の抗体を、免疫応答を強化するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。
【請求項４２】
対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項24記載の抗体を、癌を治療するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。
【請求項４３】
癌が、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
請求項24記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項４５】
ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含み、
e．LCDR2がSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含み；
ただし、SEQ ID NO：14、15および16のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：17、18および19のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。
【請求項４６】
a．それぞれSEQ ID NO：14、15、144；
b．それぞれSEQ ID NO：14、141、16；
c．それぞれSEQ ID NO：14、142、16；
d．それぞれSEQ ID NO：14、141、144；または
e．それぞれSEQ ID NO：14、142、144
である、HCDR1、HCDR2およびHCDR3配列を含む、請求項45記載の単離された抗体。
【請求項４７】
ヒト化、DeImmunized（商標）されているか、またはヒト型である、請求項45記載の単離された抗体。
【請求項４８】
IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、請求項47記載の単離された抗体。
【請求項４９】
Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする置換をFc領域に含み、置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、請求項48記載の単離された抗体。
【請求項５０】
請求項45記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
【請求項５１】
請求項50記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５２】
請求項51記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５３】
個体における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする個体に対して、請求項45記載の抗体を、免疫応答を強化するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。
【請求項５４】
個体における癌を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、請求項45記載の抗体を、癌を治療するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。
【請求項５５】
癌が、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含み；
e．LCDR2がSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含み；
g．ただし、SEQ ID NO：6、7および8のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：9、10および11のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2013年3月18日に出願されたEP13159794.0の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌の治療のための抗体、その抗体の使用、および特にCD134と結合するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗腫瘍T細胞の機能を強化することは、癌を治療するための独特なアプローチの1つである。調節性Tリンパ球によって主として媒介される能動的な免疫寛容の誘導によって、腫瘍細胞が免疫系を「回避する」ことについては、かなりの証拠がある（Tregs; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104-118（非特許文献1））。このため、エフェクター性（すなわち、腫瘍細胞の直接的または間接的な根絶）Tリンパ球（Teff）と、寛容原性（すなわち、Teffエフェクター機能および生存の抑制）Tregとのバランスが、有効な抗腫瘍免疫療法のためには極めて重要であるように思われる。言い換えれば、腫瘍特異的Teffのエフェクター機能を強化することによって、および／または腫瘍特異的Tregの抑制機能を弱めることによって、有効な抗腫瘍免疫応答を得ることができる。これらの応答を媒介することが示されている重要な受容体の1つは、CD134（OX40）受容体である。（Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431（非特許文献2））。
【０００４】
CD134（OX40、TNFRSF4およびACT35としても知られる）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。このCD134表面共刺激受容体は、活性化されたTリンパ球上で発現され、それらの生存および機能に重要な役割を果たす。CD134を発現するTリンパ球の存在は、さまざまなヒト悪性腫瘍、および癌患者の流入領域リンパ節において実証されている（Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406（非特許文献3）；Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265（非特許文献4））。
【０００５】
担癌マウスにおけるマウスCD134受容体のインビボ連結（可溶性マウスOX40リガンド（OX40L）-免疫グロブリン融合タンパク質、または抗マウスCD134特異的抗体などのマウスOX40L模倣体のいずれかによる）は、抗腫瘍免疫を強化して、例えばリンパ腫、黒色腫、肉腫、結腸癌、乳癌および神経膠腫といった、さまざまなマウス悪性腫瘍細胞株のマウスモデルにおいて無腫瘍での生存を導く（Sugamura et al. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-31（非特許文献2））。
【０００６】
OX40R結合剤の使用を通じてOX40Rを係合させることによって、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を強化させることが提唱されている（国際公開公報第WO99/42585号（特許文献１））。ここではOX40結合剤全般に言及しているが、重点はOX40Lまたはその一部の使用に置かれている；抗OX40抗体の開示は、それらがOX40Lと同等であるという状況にある。事実、このWeinbergのチームは、この研究を非ヒト霊長動物による試験へと進める際にもやはり、OX40L結合部位と結合し、かつ全体的にOX40Lによく似ている抗体を計画的に選んでいる（Weinberg et al. J Immunther 2006; 29: 575-585（非特許文献5））。
【０００７】
Al-Shamkhani et al. （Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699（非特許文献6））は、活性化されたマウスT細胞上でのOX40の発現の差異について探る目的で、OX40L結合を遮断しないOX86と呼ばれる抗OX40抗体を用いた；Hirschhorn-Cymerman et al.（J Exp Med 2009; 206: 1103-1116（非特許文献7））は、可能性のある化学免疫療法として、マウスモデルにおいてOX86をシクロホスファミドとともに用いた。しかし、OX86はヒトOX40と結合しないと予想され、ヒトにおいて有効と考えられる抗体を選択する場合には、Weinbergの業績に鑑みて、OX40L結合部位で結合する抗体が選択されると考えられる。
【０００８】
重症複合免疫不全（SCID）マウスにおけるヒトCD134受容体のインビボ連結（ヒトCD134上のOX40L結合ドメインと相互作用する抗ヒトCD134特異的抗体による；US 2009/0214560 A1（特許文献2））は、抗腫瘍免疫を強化させ、それは、例えばリンパ腫、前立腺癌、結腸癌および乳癌といった、さまざまなヒト悪性腫瘍細胞株の腫瘍成長の阻害を導く。
【０００９】
ヒトにおけるヒトCD134連結媒介性の抗腫瘍免疫応答の正確な機序はまだ解明されていないが、OX40Lとの相互作用によって刺激されるCD134膜貫通シグナル伝達経路を介して媒介されると考えられている。この相互作用は、三量体OX40LのCD134との結合によって媒介される。最近の抗癌療法では、三量体化したOX40リガンドの使用が、抗OX40抗体よりも有効な薬剤であると提唱されている（Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121（非特許文献7））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO99/42585
【特許文献２】US 2009/0214560 A1
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tregs; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104-118
【非特許文献２】Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431
【非特許文献３】Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406
【非特許文献４】Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265
【非特許文献５】Weinberg et al. J Immunther 2006; 29: 575-585
【非特許文献６】Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699
【非特許文献７】J Exp Med 2009; 206: 1103-1116
【非特許文献８】Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、
（a）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、
（a）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、単離された結合性分子はヒトCD134と結合する。本発明の結合性分子は、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げないと考えられる。
【００１５】
そのような結合性分子には、適した抗CD134抗体、抗CD134抗体の抗原結合性断片、および抗CD134抗体の誘導体が含まれる。いくつかの態様において、結合性分子はヒトCD134と1×10-7Mまたはそれ未満のKdで結合する。結合性分子は、エフェクターT細胞上のヒトCD134に対するアゴニスト活性および／または調節性T細胞上のヒトCD134に対するアンタゴニスト活性を有する。いくつかのさらなる態様において、結合性分子は、ヒトCD134と100nMまたはそれ未満の、例えば50nM未満の、または20nM未満のKdで特異的に結合するヒトモノクローナル抗体である。
【００１６】
本発明はまた、1つまたは複数の結合性分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。いくつかの態様において、結合性分子はヒトモノクローナル抗CD134抗体またはその抗原結合性断片である。組成物が、追加的な薬学的な剤、例えば免疫療法剤、化学療法剤およびホルモン療法剤をさらに含んでもよい。
【００１７】
本発明はさらに、結合性分子を用いる診断方法および治療方法を提供する。いくつかの態様においては、哺乳動物における癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示された結合性分子または結合性分子を含む組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。いくつかの他の態様において、本開示は、哺乳動物における免疫応答を強化する方法であって、結合性分子または結合性分子を含む組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本方法に用いられる結合性分子は、ヒトモノクローナル抗CD134抗体、またはヒトCD134と結合するその抗原結合性断片であり、ここで抗体はOX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げない。
【００１８】
本発明はさらに、結合性分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子、そのような核酸を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、および結合性分子を調製する方法も提供する。
【００１９】
本開示はまた他の局面も提供するが、それらは特許請求の範囲を含む本開示の全体から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒトTリンパ球の表面ヒトCD134発現に対する、PHA-Mへの曝露の経時的推移および用量効果。
【図２】休止状態の、およびPHA-Mで活性化されたヒトCD4 Tリンパ球上でのヒトCD134発現。
【図３】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35、クローン12H3およびクローン20E5の結合特性。
【図４】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性CD4 Tリンパ球およびCD8 Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5の結合。
【図５】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3またはクローン20E5と、市販のPE結合マウス抗CD134抗体クローンACT35またはクローンL106との交差競合。
【図６】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3またはクローン20E5の、ヒトOX40Lとの同時結合。
【図７】ヒトエフェクターTリンパ球（Teff）および調節性Tリンパ球（Treg）の表面ヒトCD134発現に対する、抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激薬（stimulator）ビーズへの曝露の効果の経時的推移。
【図８】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の用量効果。
【図９】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3とヒトOX40Lとの組み合わせ、またはマウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5とヒトOX40Lとの組み合わせの効果。
【図１０−１】抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。
【図１０−２】抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。
【図１１】抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒト調節性Tリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。
【図１２】抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球（A）および調節性Tリンパ球（B）のヒトOX40L媒介性増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の効果。
【図１３】ヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球増殖のヒトCD134発現性ヒト調節性Tリンパ球媒介性抑制に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。
【図１４】（IL-2を加えないか、または加えた）CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性CD4 Tリンパ球およびCD8 Tリンパ球上での、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5の結合。
【図１５−１】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。
【図１５−２】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。
【図１５−３】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。
【図１６】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の用量効果。
【図１７】PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5とヒトOX40Lとの組み合わせの効果。
【図１８】（IL-2を加えないか、または加えた）CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。
【図１９Ａ】マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合。（A）検討した非還元性条件（a、b）および還元性条件（c、d）。
【図１９Ｂ】マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合。（B）クーマシーブリリアントブルー染色を用いた、非還元性条件下（a、b）および還元性条件下（c、d）での組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質（rhuCD134）の電気泳動移動パターン。
【図１９Ｃ】マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合。（C）マウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（mIgG1）に、またはマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5（それぞれm12H3およびm20E5）に曝露させた非還元性（a、b）および還元性（c、d）組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質のウエスタンブロット。
【図２０】完全長ヒトCD134（「CRD1」と表記）における、およびさまざまな短縮型ヒトCD134形態（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）における、システインリッチドメイン（CRD）の略図。
【図２１−１】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。
【図２１−２】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。
【図２２−１】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、キメラ型ヒトIgG4κならびに／またはIgG1κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。
【図２２−２】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、キメラ型ヒトIgG4κならびに／またはIgG1κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。
【図２３Ａ】マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3（A）の、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドとの結合。
【図２３Ｂ】キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3（B）の、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドとの結合。
【図２４】モノクローナル抗体20E5の可変領域。マウス可変領域（m20E5VHおよびm20E5VL）；ヒト化20E5可変重鎖（hu20E5_h1、hu20E5_h2およびhu20E5_h3）ならびにヒト化20E5可変軽鎖（hu20E5_l1およびhu20E5_l2）。m20E5VH：SEQ ID NO：4；m20E5VL：SEQ ID NO 5。
【図２５】モノクローナル抗体12H3の可変領域。マウス可変領域（m12H3VHおよびm12H3VL）；ヒト化12H3可変重鎖（hu12H3_h1、hu12H3_h2およびhu12H3_h3）ならびにヒト化12H3可変軽鎖（hu12H3_l1およびhu12H3_l2）。m12H3VH：SEQ ID NO：12；m12H3VL：SEQ ID NO：13。
【図２６】ヒト化20E5可変領域。
【図２７】ヒト化12H3可変領域。
【図２８】プレートに結合した組換えヒトCD134に対するヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。
【図２９】プレートに結合した組換えヒトCD134に対するヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。
【図３０】プレートに結合した組換えヒトCD134に対するビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合特性。
【図３１】プレートに結合した組換えヒトCD134との結合に関する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3（EC50である20ng／mLで）との競合特性。
【図３２】安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5（A）およびクローンno.23（B）上でのヒト完全長CD134の発現レベル。
【図３３】安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134に対する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。
【図３４】安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134に対する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。
【図３５】安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.23上の表面ヒトCD134に対する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。
【図３６−１】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3の結合。
【図３６−２】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3の結合。
【図３６−３】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3の結合。
【図３７】完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンVL1H1の結合。
【図３８】安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134に対する、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合特性。
【図３９】安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134との結合に関する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3（EC50である700ng／mLで）との競合特性。
【図４０】表記濃度の可溶性OX40Lおよび可溶性マウス抗ヒトCD134 12H3 IgG1抗体による、増大させたTreg（CD4+ CD25+ CD127 dim/-）におけるFOXP3発現のダウンレギュレーション。Y軸は、PEと連結させた抗FOX3P抗体を用いて検出したFOXP3幾何平均蛍光強度（GeoMFI）を示している。m12H3＝マウス12H3 IgG1。データは、1人のドナーからの三重反復試料を表している。
【図４１】プレートに結合したヒト化抗ヒトCD134 12H3 VL1VH1抗体により、Teff増殖に対するTregの阻害効果がアイソタイプ対照と比較して弱められたことを示しているFACS分析のヒストグラム。Teff細胞は、Celltrace（商標）Violet色素によって検出した。Treg：Teffector比は1：2であった。
【図４２Ａ】複製指数の関数としてプロットした、ドナー7015から単離されたTreg：Teff比0：1（Tregなし）におけるTeff細胞の増殖に対する、記載されたプレートに結合した抗ヒトCD134抗体の効果。M＝マウス；ch＝キメラ型；h＝ヒト。mIgG1アイソタイプ対照との比較で、*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。ヒトOX40Lを、抗His抗体を伴うか（OX40L）または伴わずに（OX40L no His）用いた。
【図４２Ｂ】複製指数の関数としてプロットした、ドナー7015から単離されたTreg：Teff比1：4におけるTeff細胞の増殖に対する、記載されたプレートに結合した抗ヒトCD134抗体の効果。M＝マウス；ch＝キメラ型；h＝ヒト。mIgG1アイソタイプ対照との比較で、*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。ヒトOX40Lを、抗His抗体を伴うか（OX40L）または伴わずに（OX40L no His）用いた。
【図４３−１】親マウス抗ヒトCD134 20E5抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（20E5_VH1_64＝SEQ ID NO：64のアミノ酸配列、など）。
【図４３−２】親マウス抗ヒトCD134 20E5抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（20E5_VH1_64＝SEQ ID NO：64のアミノ酸配列、など）。
【図４４−１】親マウス抗ヒトCD134 12H3抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（12H3_VH1_69＝SEQ ID NO：69のアミノ酸配列、など）。
【図４４−２】親マウス抗ヒトCD134 12H3抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（12H3_VH1_69＝SEQ ID NO：69のアミノ酸配列、など）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の説明
T細胞活性化は、T細胞受容体を通じた抗原刺激によってだけではなく、共刺激分子を介した共刺激シグナルによっても媒介される。いくつかある共刺激分子のうち、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーであるOX40（CD134）は、エフェクターT細胞およびメモリーT細胞の生存およびホメオスタシスにおいて鍵となる役割を果たしている。OX40共刺激に関する従来の理解によれば、OX40とOX40リガンド（OX40L）との相互作用は、活性化されたT細胞が、特化した抗原提示細胞（APC）と結合した時に起こる。続いて、サイトカイン産生、増量および生存を含むT細胞機能が、OX40共刺激シグナルによって強化される。OX40とOX40Lとの相互作用は、抗原認識から2〜3日後のT細胞-樹状細胞（DC）相互作用の際に起こる。OX40を発現するT細胞は、DC以外のOX40L発現細胞とも相互作用して、細胞からOX40シグナルを受け取ることができ、それはメモリーT細胞の生成、Th2応答の強化、および炎症反応の長期化のために必須なシグナルをもたらしうる。このため、OX40とOX40Lとの最適な相互作用は、二段階で形成されると考えられる：活性化されたCD4 T細胞上に発現されたOX40Lが、他のレスポンダーCD4 T細胞上に発現されたOX40と相互作用して、メモリーCD4 T細胞の最適な生成を導く（Soroosh et al., J Immunol 2006; 176: 5975-87）、または、CD4+補助細胞上に発現されたOX40Lが、Th2細胞上のOX40との相互作用を通じてTh2細胞の生存性を向上させる可能性もある（Kim et al. Immunity 2003; 18: 643-54）。加えて、Th1発生についてはそうではないが、インビボTh2発生のためにはB細胞上のOX40L発現が必要であり（Linton et al. J Exp Med 2003; 197: 875-83）、OX40Lを発現するマスト細胞は、T細胞上のOX40とマスト細胞上のOX40Lとの相互作用を通じて、エフェクターT細胞の機能を直接的に強化する（Kashiwakura et al. J Immunol 2004; 173: 5247-5257；Nakae et al. J Immunol 2006; 176: 2238-2248）。加えて、内皮細胞もOX40Lを発現することから（Imura et al. J Exp Med 1996; 183: 2185-95）、OX40の内皮細胞との結合が血管炎症に関与している可能性もある。レスポンダーT細胞および調節性T細胞のいずれに対しても、過剰なOX40シグナルは、Treg媒介性の免疫抑制を抑制する。レスポンダーT細胞内に移行したOX40シグナルは、それらをTreg媒介性の抑制に対して抵抗性にする。一方、Treg細胞内に移行したOX40シグナルはTreg抑制機能を直接的に阻害するものの、OX40シグナルがTreg細胞におけるFoxp3発現レベルを制御しうるか否かについては議論がある。加えて、故意でのOX40刺激により、iTreg細胞（誘導性Treg細胞）のTGF-β依存性分化が阻害される。阻害は一部には、OX40で刺激されたエフェクターT細胞によって産生されるIL-4およびIFN-γなどのエフェクター性サイトカインによって媒介されうる。重要なこととして、OX40Lの遮断によってiTreg分化が顕著に促進されて移植免疫寛容が誘導されるが、これはTreg細胞によって媒介される可能性がある。このため、OX40は、T細胞媒介性の自己免疫を制御するための分子標的として有望である。その上、最近の諸研究から、マスト細胞によって発現されるOX40LとTreg細胞によって発現されるOX40との相互作用により、マスト細胞の機能およびTreg細胞の抑制機能が相互に抑制される可能性が報告されている（Gri et al. Immunity 2008; 29: 771-81；Piconese et al. Blood 2009; 114: 2639-48）。
【００２２】
マウスは免疫学者によって選ばれる実験ツールであり、その免疫応答の研究により、ヒト免疫系の働きに関して多大な識見が得られている。マウスおよびヒトの系の一般的な構造は極めて類似しているように思われる；しかし、重要な相違点も存在する。例えば、マウスでは、CD134は、Teffが活性化された際にその上に発現され、一方、TregはCD134を構成性に発現する（Piconese et al. J Exp Med 2008; 205: 825-839）。ヒトでは、CD134はTeffおよびTregのいずれの上でも発現されるが、それは活性化された際のみであり（例えば、以下の実施例2（g）、「抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズによる刺激後のヒトエフェクターTリンパ球および調節性Tリンパ球上でのCD134発現」を参照）。さらに、マウスTregはマウスTeffのアポトーシスを誘導することで抑制を実現するが（Pandiyan et al. Nat Immunol 2007; 8: 1353; Scheffold et al. Nat Immunol 2007; 8: 1285-1287）、一方、ヒトTregはヒトTeffにおけるアポトーシスを誘導して抑制を達成することはない（Vercoulen et al. Plos ONE 2009; 4: e7183）。以上を総合すると、これらのデータは、ヒトの免疫系とマウスの免疫系ではTreg抑制機能におけるCD134の役割が異なることを示している。
【００２３】
「結合性分子」という用語は、（1）抗体、（2）抗体の抗原結合性断片、および（3）抗体の誘導体を範囲に含み、それぞれは本明細書に定義した通りである。「CD134と結合する」または「CD134との結合」という用語は、BIAcoreアッセイなどのインビトロアッセイにおける、またはOctet（表面プラズモン共鳴）による、本明細書に定義した結合性分子とCD134受容体との結合のことを指す。結合性分子は、約1×10-6Mまたはそれ未満の、例えば、約5×10-7Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10-7Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10-8Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10-9Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10-10Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10-11Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10-12Mまたはそれ未満の、結合親和性（Kd）を有する。
【００２４】
「単離された抗体」または「単離された結合性分子」という用語は、（1）その天然の状態で付随している天然の随伴構成要素を伴っていない；（2）同じ種に由来する他のタンパク質を含んでいない；（3）異なる種に由来する細胞によって発現される；または（4）自然界には存在しない、抗体または結合性分子のことを指す。単離された抗体の例には、CD134を用いてアフィニティー精製された抗CD134抗体、インビトロでハイブリドーマまたは他の細胞株によって生成された抗CD134抗体、ヒト化抗CD134抗体、およびトランスジェニック動物に由来するヒト抗CD134抗体が含まれる。
【００２５】
「アゴニスト」という用語は、CD134と結合した際に、（1）CD134を刺激または活性化する、（2）CD134の活性、存在もしくは機能を強化する、促進する、誘導する、増大させる、もしくは延長する、または（3）CD134の発現を強化する、促進する、増大させる、もしくは誘導する、本明細書に定義した結合性分子のことを指す。「アンタゴニスト」という用語は、CD134と結合した際に、（1）CD134を阻害もしくは抑制する、（2） CD134の活性、存在または機能を阻害もしくは抑制する、または（3）CD134の発現を阻害もしくは抑制する、本明細書に定義した結合性分子のことを指す。
【００２６】
「抗体」という用語は、典型的には2つの同一なポリペプチド鎖の対で構成され、それぞれの対が1つの「重」（H）鎖および1つの「軽」（L）鎖を有する、免疫グロブリン分子のことを指す。ヒト軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、これによってそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEという抗体のアイソタイプが規定される。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではHCVRまたはVHと略記）および重鎖定常領域で構成される。IgD、IgGおよびIgAの重鎖定常領域はCH1、CH2およびCH3という3つのドメインで構成され、IgMおよびIgEの重鎖定常領域はCH1、CH2、CH3およびCH4という4つのドメインで構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではLCVRまたはVLと略記）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域はCLという1つのドメインで構成される。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。VH領域およびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と名づけられた超可変性領域と、その間に散在する、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存性の高い領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各重鎖／軽鎖対（VHおよびVL）の可変領域がそれぞれ、典型的には抗体結合部位を形成する。各領域またはドメインに対するアミノ酸の指定は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991)）の定義、またはChothia et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (Nature 1989; 342(6252):877-83）の定義に従う。「抗体」という用語は、マウス、ヒト化、ヒト、およびキメラ抗体、ならびに、単量体抗体の二量体、三量体またはより高次の多量体といった、多量体型の抗体である抗体を範囲に含む。抗体はまた、単一特異的、二重特異的、または多特異的な抗体、および所望の特異性用の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変形態を含む。また、非抗体性部分と連結されるかまたは結びつけられた抗体も範囲に含む。さらに、「抗体」という用語は、いかなる特定の抗体生産法にも限定されない。例えば、それには、モノクローナル抗体、組換え抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。
【００２７】
「抗体誘導体」または抗体の「誘導体」という用語は、その抗体が結合するのと同じ抗原（すなわち、ヒトCD134）と結合することができて、かつ追加的な分子的実体が連結した抗体のアミノ酸配列を含む分子のことを指す。抗体誘導体の中に含まれる抗体のアミノ酸配列は、完全長抗体であってよく、または完全長抗体の任意の部分であってもよい。追加的な分子的実体は、生体分子または化学分子であってよい。追加的な分子的実体の例には、化学基、ペプチド、タンパク質（酵素、抗体など）、アミノ酸および化合物が含まれる。追加的な分子的実体は、検出薬、マーカー標識、治療剤または薬学的な剤として用いるためであってよい。抗体のアミノ酸配列は、非共有結合性の会合、化学的カップリング、遺伝子融合によって、または他の様式で、抗体と結びつけるかまたは連結させることができる。「抗体誘導体」という用語はまた、CD134抗体のアミノ酸配列の改変に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体および分子、例えば保存的なアミノ酸置換物、挿入物および付加物も範囲に含む。
【００２８】
抗体の「抗原結合性断片」という用語は、抗体が結合するのと同じ抗原（すなわち、ヒトCD134）と結合する能力を保っている、完全長抗体の1つまたは複数の部分のことを指す。「抗原結合性断片」という用語はまた、非共有結合性もしくは共有結合性会合によって形成されたより大型の分子の一部である抗体の一部分、または1つもしくは複数の追加的な分子的実体を伴う抗体部分も範囲に含む。追加的な分子的実体の例には、四量体scFv分子を作るために用いうる、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質、例えばストレプトアビジンのコア領域などが含まれる（Kipriyanov et al. Hum Antibodies Hybridomas 1995; 6(3): 93-101）。例示的な抗原結合断片は、抗体のVHおよび／またはVLである。
【００２９】
「キメラ抗体」という用語は、ヒトおよびマウス、典型的にはマウス（重鎖および軽鎖由来）可変領域およびヒト（重鎖および軽鎖由来）定常領域などの、2つの異なる種に由来するアミノ酸配列を含む抗体のことを指す。
【００３０】
「エピトープ」という用語は、抗体、またはT細胞と特異的結合を行うこと、または他の様式で分子と相互作用することのできる、抗原の一部のことを指す。「エピトープ」はまた、当技術分野において、「抗原決定基」のことも指す。エピトープは一般に、アミノ酸または糖質または糖側鎖といった、化学的活性のある表面分子群からなる。エピトープは「直鎖状」であってもよく、または「非直鎖状／高次構造性」であってもよい。ひとたび所望のエピトープが決定されれば（例えば、エピトープマッピングによって）、そのエピトープに対する抗体を作製することができる。抗体の作製および特性決定により、望ましいエピトープに関する情報も得られる。続いて、この情報から、例えば、互いに競合的に結合する抗体、すなわち、その抗原に対する結合に関して競合する抗体を見いだすための交差競合試験を実施することによって、抗体を同じエピトープと結合するものに関してスクリーニングすることも可能である。
【００３１】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞のことを指す。この用語は、特定の対象細胞のみではなく、そのような細胞の子孫も範囲に含む。環境的影響または突然変異のいずれかが原因で、後続世代にある種の改変が起こることがあるため、そのような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも「宿主細胞」という用語の範囲には含まれる。
【００３２】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列のアミノ酸配列のみからなる抗体のことを指す。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞またはマウス細胞に由来するハイブリドーマで産生される場合には、マウス糖鎖を含んでもよい。ヒト抗体は、当技術分野において周知の種々のやり方で調製することができる。
【００３３】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト動物抗体由来のCDRの一部またはすべてを含む抗体であって、フレームワーク領域および定常領域がヒト抗体配列由来のアミノ酸残基を含む抗体のことを指す。ヒト化抗体は典型的には、マウス抗体由来のCDRをヒトフレームワーク配列中に移植し、その後に特定のヒトフレームワーク残基を供給源抗体由来の対応するマウス残基により、復帰置換（back substitution）することによって作製される。「ヒト化抗体」という用語はまた、典型的には1つまたは複数の可変領域において、ヒトのT細胞および／またはB細胞エピトープを構成する傾向が強い1つまたは複数のエピトープが、免疫原性を低下させる目的で除去されている非ヒト起源の抗体のことも指す。エピトープのアミノ酸配列は全体または一部を除去することができる。しかし、典型的には、アミノ酸配列は、エピトープを構成するアミノ酸の1つまたは複数を1つまたは複数の他のアミノ酸で置換し、それにより、アミノ酸配列を、ヒトのT細胞および／またはB細胞エピトープを構成しない配列に変化させることによって改変される。アミノ酸は、状況次第で、対応するヒト可変重鎖または可変軽鎖において対応する位置に存在するアミノ酸によって置換される。
【００３４】
「哺乳動物」という用語は、哺乳類のあらゆる動物種のことを指す。哺乳動物の例には、以下が含まれる：ヒト；ラット、マウス、サルおよびモルモットなどの実験動物；ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマおよびブタなどの飼育動物。
【００３５】
「単離された核酸」という用語は、その核酸の天然の供給源の中に存在する他の核酸分子から分離されている、cDNAもしくは合成物に由来する核酸分子、またはそれらの組み合わせのことを指す。
【００３６】
「Kd」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数のことを指し、リガンド（抗体など）とタンパク質（CD134など）との間の結合親和性を記述するために用いられる。平衡解離定数が小さいほど、リガンドの結合はより強固である、またはリガンドとタンパク質との間の親和性は高い。Kdは、例えばBIACORE 1またはOctetシステムを用いる表面プラズモン共鳴によって測定することができる。「抗CD134抗体」という用語は、ヒトCD134と結合しうる、本明細書で定義した抗体のことを指す。
【００３７】
「OX40受容体」、「CD134受容体」および「CD134」という用語は、本出願において互換的に用いられ、ヒトCD134、ならびにその変異体、アイソフォームおよび種相同体を含む。したがって、本明細書で開示されるヒトCD134結合性分子は、場合によっては、ヒト以外の種に由来するCD134とも結合しうる。例えば、本発明の結合性分子は、他の関連する抗原、例えば他の種、例えばヒト、またはカニクイザル（Macaca fascicularis）（カニクイザル（cynomolgus）、cyno）、もしくはチンパンジー（Pan troglodytes）（チンパンジー（chimpanzee）、chimp）などのサル、に由来するCD134と交差反応性を有していてもよい。また別の場合には、結合性分子がヒトCD134に対して完全に特異的であって、種交差反応性も他の種類の交差反応性も示さなくてもよい。例えば、それらはマウスまたはラットのCD134と結合しないと考えられる。
【００３８】
「ヒトCD134と特異的に結合する」という用語は、ヒトCD134との結合に関する結合性分子のKdが、本明細書に記載の、または当業者に公知のアッセイ（例えば、BIAcoreアッセイ）を用いた判定で、例えばヒトCD40に対するその結合に関するKdの、約10倍未満、50倍未満、または100倍未満であることを意味する。
【００３９】
または、特定の作用物質がOX40受容体と特異的に結合するという判定を、慣行的な手順を用いること、または適合化することによって容易に行うこともできる。適したインビトロアッセイの1つでは、ウエスタンブロット手順（Harlow and Laneによる"Antibodies, A Laboratory Manual"を含む、多くの標準的な教科書に記載されている）を利用する。ある所与のOX40受容体結合剤がヒトOX40タンパク質と特異的に結合することを判定するためには、全細胞タンパク質を、OX40抗原を発現しない哺乳動物細胞、例えば非リンパ球性細胞（例えば、COS細胞またはCHO細胞）などを、OX40をコードする核酸分子によって形質転換させたものから抽出する。陰性対照として、全細胞タンパク質を、対応する非形質転換細胞からも抽出する。続いて、これらのタンパク質調製物を、非変性または変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（PAGE）にかける。その後に、タンパク質をウエスタンブロット法によって膜（例えば、ニトロセルロース）に移行させ、試験しようとする作用物質を膜とともにインキュベートする。非特異的に結合した作用物質を除去するために膜を洗浄した後に、結合した作用物質の存在を、被験作用物質に対して産生させた抗体に酵素アルカリホスファターゼなどの検出薬をコンジュゲートさせたものを用いることによって検出する；基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムの適用により、免疫局在性のアルカリホスファターゼによって濃青色の化合物の生成がもたらされる。ヒトOX40と特異的に結合する作用物質は、この手法によって、OX40形質転換細胞からの抽出物では、ヒトOX40バンド（その分子質量によって決まるゲル上の所定の位置に局在すると考えられる）と結合することが示されると考えられ、一方、非形質転換細胞からの抽出物では結合がほとんどまたは全く観察されないと考えられる。作用物質の他のタンパク質との非特異的結合も起こる可能性があり、これはウエスタンブロット上で弱いシグナルとして検出されると考えられる。この結合が非特異的な性質であることは、ウエスタンブロット上で得られたシグナルが、特異的な作用物質／ヒトOX40タンパク質の結合によって生じる強い主シグナルよりも弱いことによって、当業者には認識されるであろう。理想的には、OX40受容体結合剤は、非形質転換細胞から抽出されたタンパク質とは結合しないと考えられる。抽出されたタンパク質を用いる結合アッセイに加えて、OX40受容体結合剤と推定されるものを、作用物質を蛍光性タグ（FITCなど）とコンジュゲートさせて、抗原で活性化されたCD4+ T細胞および非活性化T細胞の集団に対するその結合を蛍光活性化細胞分取法（FACS）によって分析することにより、それらがインビボで実質的にOX40受容体のみと結合しうることを確認するために試験することもできる。実質的にOX40受容体のみと結合する作用物質は、活性化されたCD4+ T細胞のみを染色すると考えられる。
【００４０】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を宿主細胞内に輸送することのできる核酸分子のことを指す。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドもしくはファージベクター、および裸のDNAまたはRNA発現ベクターが含まれる。いくつかのベクターは、それが導入された宿主細胞内で自律複製を行うことができる。いくつかのベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、その結果、宿主ゲノムとともに複製されることが可能である。ある種のベクターは、それと機能的に連結された遺伝子の発現を導くことができ、それ故に「発現ベクター」と称することができる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、従来の20種のアミノ酸およびそれらの略号は、従来の用法に従う。
【００４２】
本発明は、ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：100の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：100のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体を提供する。
【００４３】
SEQ ID NO：100：
2016515544.tif 000002
；
ここで、X11はDまたはSであり；かつ
X12はGまたはSである。
【００４４】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：152のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：152のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。
【００４５】
SEQ ID NO：152：
2016515544.tif 000003
；
ここで、X1はVまたはLであり；
X2はMまたはIであり；
X3はN、Q、AまたはEであり；
X4はVまたはAであり；
X5はIまたはLであり；
X6はAまたはVであり；かつ
X7はM、LまたはIである。
【００４６】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：99のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：99のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。
【００４７】
SEQ ID NO：99：
2016515544.tif 000004
；
ここで、X7はIまたはMであり；
X8はAまたはVであり；
X9はLまたはIであり；かつ
X10はVまたはAである。
【００４８】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：100のVLおよびSEQ ID NO：152のVHを含む。
【００４９】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む。
【００５０】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含むHCDR2を含む。本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含むHCDR1を含む。
【００５１】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、
a）SEQ ID NO：67もしくは68のアミノ酸配列を含むVL；および、SEQ ID NO：69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147もしくは148のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、55もしくは99に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するVH；または
b）以下のアミノ酸配列を含むVLおよびVH：
i．それぞれSEQ ID NO：67および69；
ii．それぞれSEQ ID NO：67および70；
iii．それぞれSEQ ID NO：67および71；
iv．それぞれSEQ ID NO：68および69；
v．それぞれSEQ ID NO：68および70；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：68および71
を含む。
【００５２】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、それぞれSEQ ID NO：67および119、67および120、67および121、67および122、67および123、67および124、67および125、67および126、67および127、67および128、67および129、67および130、67および131、67および132、67および133、67および146、67および147、67および148、68および119、68および120、68および121、68および122、68および123、68および124、68および125、68および126、68および127、68および128、68および129、68および130、68および131、68および132、68および133、68および146、68および147、または68および148の、VLおよびVHを含む。
【００５３】
本明細書に記載のいくつかの態様において、抗体はCD134のアゴニストである。
【００５４】
本明細書に記載のいくつかの態様において、抗体はFc領域に置換を含む。
【００５５】
本明細書に記載のいくつかの態様において、置換は、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、ここで残基の番号付けはEUインデックスによる。
【００５６】
重鎖、軽鎖、VHまたはVLのアミノ酸配列が、本明細書に記載されるものと実質的でない程度に異なる抗体は、本発明の範囲に含まれる。実質的でない違いとは、抗体特性に悪影響を及ぼさない、抗体可変領域配列における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸の置換のことである。本明細書に開示される可変領域配列と実質的に同一なアミノ酸配列は、本発明の範囲に含まれる。いくつかの態様において、配列同一性は、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるか、またはそれよりも高い。パーセントの同一性は、例えば、ベクターNTI v.9.0.0（Invitrogen, Carlsbad, CA）のAlignXモジュールのデフォルト設定を用いるペアワイズアラインメントによって決定することができる。本発明のタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために、公開データベースまたは特許データベースに対して検索を行うためのクエリー配列として用いることができる。そのような検索を行うために用いられる例示的なプログラムには、デフォルトの設定を用いる、XBLASTもしくはBLASTPプログラム（http_//www_ncbi_nlm/nih_gov）、またはGenomeQuest（商標）（GenomeQuest, Westborough, MA）スイートがある。
【００５７】
典型的には、これは、抗体の特性を悪い方向に改変することのない、抗原結合部位またはフレームワークにおける、類似の電荷、疎水性、または立体化学特性を有するアミノ酸による1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。また、保存的置換が、抗体特性、例えば、安定性または親和性を向上させるためになされてもよい。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸置換が、VH配列またはVL配列に対してなされうる。いくつかの態様においては、1つ、2つまたは3つの置換が、本明細書に記載の抗体のVHまたはVLに対してなされる。例示的な保存的アミノ酸置換を表1に示している。その上、ポリペプチド中の任意の未変異残基を、アラニンスキャニング突然変異誘発に関して以前に記載されているように、アラニンで置換することもできる（MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al (l998) Adv. Biopsy's. 35:1-24）。
【００５８】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性または他の望ましい生物学的もしくは生物物理学的な特性を向上させるために改変された本明細書に記載の抗CD134抗体は、本発明の範囲内にある。抗体の安定性は、（1）個々のドメインの固有安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（2）HCおよびLCの対合に強い影響を与えるタンパク質／タンパク質境界面相互作用、（3）極性残基および荷電残基の埋没、（4）極性残基および荷電残基の水素結合ネットワーク；ならびに（5）他の分子内力および分子間力の中での表面電荷および極性残基の分布（Worn et al., J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001）を含む、いくつかの要因によって影響される。可能性のある構造不安定化残基を抗体の結晶構造に基づいて同定し、抗体安定性に対する残基の影響を、同定された残基に突然変異を有する変異体を作製して評価することによって試験することができる。
【００５９】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、VH直鎖状残基位置11、55または99に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を含む。
【００６０】
本明細書に記載のいくつかの態様において、VH直鎖状残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、V11L、N55Q、N55A、N55E、M99LまたはM99Iである。
【００６１】
VH直鎖状残基位置11、55または99での置換は、抗体の安定性を向上させ、かつ／またはそのアゴニスト活性を強化することができる。
【００６２】
アミノ酸置換は、例えば、PCR突然変異誘発（米国特許第4,683,195号）によって行うことができる。変異体のライブラリーを、周知の方法を用いて、例えば、ランダムコドン（NNK）または非ランダムコドン、例えば、11個のアミノ酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp）をコードするDVKコドンを用いて作製し、そのライブラリーを所望の特性を有する変異体に関してスクリーニングすることができる。
【００６３】
実施例において例証されている態様は、一方が重鎖由来でもう一方が軽鎖由来である可変領域の対を含むものの、当業者は、代替的な態様が単一の重鎖または軽鎖可変領域を含みうることを認識しているであろう。単一の可変領域は、例えば、SEQ ID NO：1の配列を有するヒトCD134と結合することができる、2ドメイン特異的な抗原結合性断片を形成しうる可変ドメインをスクリーニングするために用いることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開公報第WO1992／01047号に開示された段階的二重コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法によって実現することができる。このアプローチでは、H鎖またはL鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖（LまたはH）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、その結果得られた2鎖特異的抗原結合ドメインを、記載された通りのファージディスプレイ手法に従って選択する。このように、個々のVHおよびVLポリペプチド鎖は、国際公開公報第WO1992／01047号に開示された方法を用いて、SEQ ID NO：1の配列を有する、ヒトCD134と特異的に結合するさらなる抗体を同定する上で有用である。
【００６４】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、
a．それぞれSEQ ID NO：14、15および144；
b．それぞれSEQ ID NO：14、15および145；
c．それぞれSEQ ID NO：14、141および16；
d．それぞれSEQ ID NO：14、141および144；
e．それぞれSEQ ID NO：14、141および145；
f．それぞれSEQ ID NO：14、142および16；
g．それぞれSEQ ID NO：14、142および144；
h．それぞれSEQ ID NO：14、142および145；
i．それぞれSEQ ID NO：14、143および16；
j．それぞれSEQ ID NO：14、143および144；または
k．それぞれSEQ ID NO：14、143および145
である、HCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含む。
【００６５】
本明細書に記載のいくつかの態様において、本明細書に記載される通りの重鎖および軽鎖CDR配列を含む抗体は、ヒト化抗体、ヒト抗体またはDeImmunized（商標）抗体である。
【００６６】
ヒト抗体またはdeImmunized（商標）抗体は、本明細書に記載される通りに作製することができる。ヒト化抗体とは、典型的には、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体のことを指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域に置換を含んでもよく、その結果、フレームワークは、発現されるヒト免疫グロブリンまたは生殖細胞系列遺伝子配列の正確なコピーでなくてもよい。CD134に対するヒト化抗体は、例えば、Balb／cマウスにおいて、標準的な方法を用いて作製することができる。Balb／cマウスまたは他の非ヒト動物において作られた抗体を、さらなるヒト様配列を作製するために、さまざまな技術を用いてヒト化することができる。ヒトアクセプターフレームワークの選択を含む例示的なヒト化手法は当業者に公知であり、これには、CDRグラフティング（米国特許第5,225,539号）、SDRグラフティング（米国特許第6,818,749号）、リサーフェイシング（Palin, Mol Immunol 28:489-499, 1991）、特異性決定残基のリサーフェイシング（米国特許出願公開第2010／0261620号）、ヒトへの適合化（またはヒトフレームワークの適合化）（米国特許出願公開第US2009／0118127号）、スーパーヒト化（米国特許第7,709,226号）およびガイド下選択（Osborn et al., Methods 36:61-68, 2005；米国特許第5,565,332号）が含まれる。
【００６７】
ヒト化抗体は、国際特許出願第WO1990／007861号および国際特許出願第WO1992／22653号に記載された通りに開示されたものなどの手法によって、結合親和性を保つために改変されたフレームワーク支持残基を組み入れること（復帰突然変異）により、所望の抗原に対するその選択性または親和性が向上するようにさらに最適化することができる。
【００６８】
本発明の抗体の免疫エフェクター特性は、当業者に公知の手法によるFc改変を通じてモジュレートすることができる。例えば、C1q結合、補体依存性細胞傷害作用（CDC）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）、食作用、細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、B細胞受容体；BCR）などのFcエフェクター機能を、これらの活性の原因となるFc内の残基を活性化Fcγ受容体（FcγR）FcγRI、FcγRIIaもしくはFcγRIII、または抑制性受容体FcγRIIbとの結合を通じて改変することによってモジュレートすることができる。また、Fcドメイン内の残基を突然変異させて、新生児Fc受容体FcRnに対するFc結合親和性をモジュレートすることによって抗体半減期を延長させることにより、薬物動態学的特性を強化することもできる。例示的なFc改変には、IgG4 S228P／L234A／L235A、IgG2 M252Y／S254T／T256E（Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006）；またはIgG2 V234A／G237A／P238S、V234A／G237A／H268Q、H268A／V309L／A330S／P331またはV234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S（国際公開公報第WO2011／066501号）、または米国特許第6,737,056号に記載されたものが含まれる（残基の番号付けはEUインデックスによる）。抑制性FcγRIIbに対する抗体Fc親和性を、抗体架橋およびアゴニスト性シグナルを強化するために増強することもできる。FcγRIIbに対するFc結合を強化する例示的なFc改変には、S267E／L328FおよびE233D／G237D／H268D／P271G／A330Rがある（残基の番号付けはEUインデックスによる）。
【００６９】
本発明のもう1つの態様は、ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：98の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：98のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体である。
【００７０】
SEQ ID NO：98：
2016515544.tif 000005
；
ここで、X5はVまたはPであり；かつ
X6はFまたはYである。
【００７１】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：134のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：134のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。
【００７２】
SEQ ID NO：134
2016515544.tif 000006
；
ここで、X1はVまたはLであり；
X2はMまたはIであり；
X3はD、G、A、SまたはEであり；
X4はVまたはAであり；
X5はLまたはIであり；
X6はTまたはKであり；かつ
X7はM、LまたはIである。
【００７３】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：97のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：97のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。
【００７４】
SEQ ID NO：97：
2016515544.tif 000007
；
ここで、X1はIまたはMであり；
X2はAまたはVであり；
X3はLまたはIであり；かつ
X4はKまたはTである。
【００７５】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：99のVLおよびSEQ ID NO：134のVHを含む。
【００７６】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む。
【００７７】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含むHCDR2を含む。
【００７８】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むHCDR1を含む。
【００７９】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、
a．SEQ ID NO：62もしくは63のアミノ酸配列を含むVL；および
SEQ ID NO：64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150もしくは151のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、56もしくは106に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するVH；または
b．i．それぞれSEQ ID NO：62および64；
ii．それぞれSEQ ID NO：62および65；
iii．それぞれSEQ ID NO：62および66；
iv．それぞれSEQ ID NO：63および64；
v．それぞれSEQ ID NO：63および65；または
vi．それぞれSEQ ID NO：63および66
のアミノ酸配列を含むVLおよびVH
を含む。
【００８０】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：62および64、62および65、62および66、62および101、62および102、62および103、62および104、62および105、62および106、62および107、62および108、62および109、62および110、62および111、62および112、62および113、62および114、62および115、62および116、62および117、62および118、62および149、62および150、62および151、63および64、63および65、63および66、63および101、63および102、63および103、63および104、63および105、63および106、63および107、63および108、63および109、63および110、63および111、63および112、63および113、63および114、63および115、63および116、63および117、63および118、63および149、63および150、63および151のVLおよびVHを含む。
【００８１】
本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、VH直鎖状残基位置11、56または106に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を含む。
【００８２】
本明細書に記載のいくつかの態様において、VH直鎖状残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106LまたはM106Iである。
【００８３】
VH直鎖状残基位置11、55または99にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、抗体の安定性および／またはそのアゴニスト活性を強化しうる可能性がある。
【００８４】
本発明は、
（a）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：99）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：100）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。
【００８５】
本発明はまた、
（a）図26のアミノ酸配列（SEQ ID NO：97）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図26のアミノ酸配列（SEQ ID NO：98）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子も提供する。
【００８６】
いくつかの態様において、結合性分子はヒトCD134と結合する。いくつかの態様において、結合性分子は、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げない。
【００８７】
いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、前記CD134分子との結合が飽和する濃度またはそれを上回る濃度で、50％を超えては低下しない。
【００８８】
いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、結合性分子の濃度が70nMで、70％を超えては低下しない。
【００８９】
いくつかの態様において、結合性分子は、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38および／またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する。
【００９０】
いくつかの態様において、結合性分子は、Fab断片、単鎖Fv（scFv）断片、または抗体である。
【００９１】
いくつかの態様において、抗体は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgM抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体などである。いくつかの態様において、抗体はIgG1またはIgG4抗体である。
【００９２】
本発明はさらに、本発明による結合性分子または抗体をコードする核酸分子を提供する。さらに、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域、重鎖、軽鎖可変領域、または軽鎖をコードする核酸分子も提供される。例示的なヒト化抗体には、本発明のヒト化12H3抗体またはヒト化20E5抗体がある。
【００９３】
いくつかの態様において、核酸分子は、
（a）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：99）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：100）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
をコードする。
【００９４】
もう1つの態様において、核酸分子は、12H3親マウス抗体のヒト化抗体の可変領域をコードする。可変領域は、抗体12H3_VL1VH1；12H3_VL1VH2；12H3_VL1VH3；12H3_VL2VH1；12H3_VL2VH2；または12H3_VL2VH3の可変領域から選択される。例示的な可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：67、68、69、70および71に示されている。
【００９５】
もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：69、70および71に示されたヒト化12H3重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：67および68に示されたヒト化12H3軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。
【００９６】
もう1つの態様において、核酸分子は、20E5親マウス抗体のヒト化抗体の可変領域をコードする。例示的な可変領域には、抗体20E5_VL1VH1；20E5_VL1VH2；20E5_VL1VH3；20E5_VL2VH1；20E5_VL2VH2；および20E_VL2VH3の可変領域が含まれる。例示的な可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：62、63、64、65および66に示されている。
【００９７】
もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：64、65および66に示されたヒト化20E5重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：62または63に示されたヒト化20E5軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。
【００９８】
本発明はまた、抗体12H3_VL1VH1；12H3_VL1VH2；12H3_VL1VH3；12H3_VL2VH1；12H3_VL2VH2；12H3_VL2VH3；20E5_VL1VH1；20E5_VL1VH2；20E5_VL1VH3；20E5_VL2VH1；20E5_VL2VH2；または20E_VL2VH3のヒト化可変領域（前の段落および実施例に示された通り）から選択されるヒト化可変領域を含む、抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする核酸分子も提供する。
【００９９】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：90のヒト化12H3抗体軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000008
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：87のヒト化重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000009
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１００】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：90のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000010
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：88のヒト化重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000011
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０１】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：90のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000012
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000013
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０２】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：91のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000014
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：87の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000015
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０３】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：91のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000016
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：88の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000017
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０４】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：91のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000018
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000019
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０５】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：85のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000020
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000021
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０６】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：85のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000022
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000023
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０７】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：85のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000024
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000025
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０８】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：86のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000026
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000027
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１０９】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：86のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000028
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000029
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１１０】
いくつかの態様において、ヒト化重鎖または軽鎖またはヒト化抗体重鎖または軽鎖可変領域抗体をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：86のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000030
を除いたもの）、またはSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000031
を除いたもの）をコードする核酸分子である。
【０１１１】
SEQ ID NO：62〜71および／またはSEQ ID NO：82〜91に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：72〜81に示された配列を有する核酸分子である。
【０１１２】
SEQ ID NO：72に示された核酸配列は、SEQ ID NO：82に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：72の核酸58〜414は、SEQ ID NO：64に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１３】
SEQ ID NO：73に示された核酸配列は、SEQ ID NO：83に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：73の核酸58〜414は、SEQ ID NO：65に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１４】
SEQ ID NO：74に示された核酸配列は、SEQ ID NO：84に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：74の核酸58〜414は、SEQ ID NO：66に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１５】
SEQ ID NO：75に示された核酸配列は、SEQ ID NO：85に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：75の核酸58〜381は、SEQ ID NO：62に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１６】
SEQ ID NO：76に示された核酸配列は、SEQ ID NO：86に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：76の核酸58〜381は、SEQ ID NO：63に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１７】
SEQ ID NO：77に示された核酸配列は、SEQ ID NO：87に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：77の核酸58〜420は、SEQ ID NO：69に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１８】
SEQ ID NO：78に示された核酸配列は、SEQ ID NO：88に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：78の核酸58〜420は、SEQ ID NO：70に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１１９】
SEQ ID NO：79に示された核酸配列は、SEQ ID NO：89に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：79の核酸58〜420は、SEQ ID NO：71に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１２０】
SEQ ID NO：80に示された核酸配列は、SEQ ID NO：90に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：80の核酸67〜390は、SEQ ID NO：67に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１２１】
SEQ ID NO：81に示された核酸配列は、SEQ ID NO：91に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：81の核酸67〜390は、SEQ ID NO：68に示されたアミノ酸配列をコードする。
【０１２２】
本発明のいくつかの態様は、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、および／またはSEQ ID NO：81に示された核酸配列を含む核酸分子を提供する。1つの好ましい態様において、核酸分子は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を伴わない配列を含む。これは、多くの異なるシグナルペプチドを用いうることが理由である。本発明はしたがって、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、および／またはSEQ ID NO：81に示された核酸配列を含む核酸分子であって、シグナルペプチドをコードする核酸配列が、存在しないかまたはコードされるポリペプチドの分泌を導くのに適した異なるシグナルペプチドをコードする核酸配列によって置き換えられている核酸分子を提供する。
【０１２３】
いくつかの態様において、本発明は、
SEQ ID NO：72の核酸残基58〜414；
SEQ ID NO：73の核酸残基58〜414；
SEQ ID NO：74の核酸残基58〜414；
SEQ ID NO：75の核酸残基58〜381；
SEQ ID NO：76の核酸残基58〜381；
SEQ ID NO：77の核酸残基58〜420；
SEQ ID NO：78の核酸残基58〜420；
SEQ ID NO：79の核酸残基58〜420；
SEQ ID NO：80の核酸残基67〜390；または
SEQ ID NO：81の核酸残基67〜390
を含む核酸分子を提供する。
【０１２４】
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO：101〜133または146〜148のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。
【０１２５】
本発明はさらに、本発明による核酸を含む遺伝子送達媒体またはベクターを提供する。
【０１２６】
さらに、本発明による核酸またはベクターを含む、単離された細胞もしくは組換え細胞、またはインビトロ細胞培養細胞も提供される。細胞は好ましくは、本明細書において定義される通りの宿主細胞である。いくつかの態様において、細胞は、抗体の産生のために一般的に用いられる細胞、例えば、CHO細胞、CHO-K1SV細胞（Lonza Biologics, Walkersville, MD）、CHO-K1細胞（ATCC CRL-61）、NSO細胞（European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wilthsire, UK, ECACC N. 85110503）、SP2／0細胞（American Type Culture Collection（ATCC）, Manassas, VA, CRL-1581） HEK 293-F細胞、PER.C6細胞、FO細胞（ATCC CRL-1646）Ag653細胞（ATCC CRL-1580）、またはハイブリドーマなどである。もう1つの態様において、細胞は昆虫細胞である。
【０１２７】
本発明はさらに、添付の特許請求の範囲に記載の結合性分子または特許請求の範囲に記載の抗体が作製されることを特徴とする、結合性分子を作製するための方法を提供する。産生された抗体を、細胞培養物、細胞培養上清／培地またはそれらの組み合わせから収集する。収集された抗体を精製して、容器、好ましくは貯蔵用または出荷用容器にパッケージングする。
【０１２８】
本発明はさらに、免疫応答の強化を必要とする個体の治療に用いるための、本発明による結合性分子または抗体を提供する。
【０１２９】
また、それを必要とする個体において癌の予防または治療に用いるための、本発明による結合性分子または抗体も提供される。
【０１３０】
さらに、慢性ウイルス感染症および／または細胞内細菌感染症に罹患しているかまたは罹患するリスクのある個体の治療に用いるための、本発明による結合性分子または抗体も提供される。
【０１３１】
本発明はさらに、本発明による結合性分子または抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【０１３２】
本発明は、抗CD134抗体、抗CD134抗体の抗原結合性断片、および抗CD134抗体の誘導体を含む、ヒトCD134と結合する、単離された結合性分子を提供する。結合性分子は、以下の機能的特性のうち少なくとも1つによって特徴づけられる：（a）ヒトCD134と1×10-6Mまたはそれ未満のKdで結合する、ならびに（b）ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を妨げない；（c）エフェクターT細胞上のヒトCD134に対するアゴニスト活性、および／または調節性T細胞上のヒトCD134に対するアンタゴニスト活性を有する；（d）最大500nMまでの濃度でCD40受容体と結合しない；（e）最大500nMまでの濃度でCD137受容体と結合しない；（f）最大500nMまでの濃度でCD271受容体と結合しない；（g）単離されたヒトT細胞によるIL-2産生を強化することができる；（h）免疫応答を強化することができる；（i）腫瘍細胞増殖を阻害することができる；ならびに（j）癌に対する治療効果を有する。いくつかの態様において、結合性分子は、ヒトCD134と、1×10-7Mもしくはそれ未満の、または1×10-8Mもしくはそれ未満の、または5×1×10-9Mもしくはそれ未満のKdで結合する。
【０１３３】
本発明の抗体および他の結合性分子は、従来の手法によって調製した上で、続いて、OX40LのCD134との結合を妨げない結合性分子を同定および入手する目的でスクリーニングすることができる。例えば、CD134を飽和濃度のOX40Lに曝露させた場合にもCD134と結合する結合性分子を選別することができる。
【０１３４】
本発明のいくつかの態様は、ヒトCD134と結合するマウス抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体を提供する。いくつかの態様において、マウス抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体は、100nMもしくはそれ未満、または10nMもしくはそれ未満のKdでヒトCD134と特異的に結合する、かつ／またはヒトCD134に対するアゴニスト活性を有し、その結果、エフェクターT細胞の刺激および／または調節性T細胞の抑制をもたらすモノクローナル抗体である。そのような例示的な抗体の1つは、モノクローナル抗体クローン12H3である。抗体クローン12H3の重鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および重鎖（VH）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：12および14〜16に示されている。抗体クローン12H3の軽鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および軽鎖（VL）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：13および17〜19に示されている。もう1つの例示的な抗体は、モノクローナル抗体クローン20E5である。抗体クローン20E5の重鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および重鎖（VH）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：4および6〜8に示されている。抗体クローン20E5の軽鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および軽鎖（VL）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：5および9〜11に示されている。さらに他の例示的な抗体には、ヒト化抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3、およびヒト化抗体20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2、20E5_VL2VH3、ならびに実施例14に記載されている通りの重鎖可変領域を含むものの最適化された変異体がある。これらの抗体は、SEQ ID NO：67（12H3_VL1）、SEQ ID NO：68（12H3_VL2）、SEQ ID NO：69（12H3_VH1）、SEQ ID NO：70（12H3_VH2）、SEQ ID NO：71（12H3_VH3）、SEQ ID NO：62（20E5_VL1）、SEQ ID NO：63（20E5_VL2）、SEQ ID NO：64（20E5_VH1）、SEQ ID NO：65（20E5_VH2）、SEQ ID NO：66（20E5_VH3）の可変領域配列、ならびにSEQ ID NO：101〜133および146〜151に示されたアミノ酸配列を有する、表6および9に示された可変領域を含む。
【０１３５】
本発明はまた、抗体12H3_VL1VH1；12H3_VL1VH2；12H3_VL1VH3；12H3_VL2VH1；12H3_VL2VH2；12H3_VL2VH3；20E5_VL1VH1；20E5_VL1VH2；20E5_VL1VH3；20E5_VL2VH1；20E5_VL2VH2；または20E_VL2VH3のヒト化可変領域（前の段落および実施例に示された通り）から選択されるヒト化可変領域、またはSEQ ID NO：101〜133および146〜151の重鎖可変領域を含む抗体も提供する。
【０１３６】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：90の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000032
を除いたもの）およびSEQ ID NO：87の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000033
を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。
【０１３７】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：90の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000034
を除いたもの）およびSEQ ID NO：88の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000035
を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。
【０１３８】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：90の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000036
を除いたもの）およびSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000037
を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。
【０１３９】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：91の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000038
を除いたもの）およびSEQ ID NO：87の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000039
を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。
【０１４０】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：91の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000040
を除いたもの）およびSEQ ID NO：88の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000041
を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。
【０１４１】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：91の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000042
を除いたもの）およびSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000043
を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。
【０１４２】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：85の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000044
を除いたもの）およびSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000045
を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。
【０１４３】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：85の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000046
を除いたもの）およびSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000047
を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。
【０１４４】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：85の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000048
を除いたもの）およびSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000049
を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。
【０１４５】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：86の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000050
を除いたもの）およびSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000051
を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。
【０１４６】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：86の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000052
を除いたもの）およびSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000053
を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。
【０１４７】
いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：86の軽鎖（からN末端シグナル配列
2016515544.tif 000054
を除いたもの）およびSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列
2016515544.tif 000055
を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。
【０１４８】
本発明の抗体は、これらのCDRの1つもしくは複数、または1CDR当たり1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するこれらのCDRの1つもしくは複数を含みうる。置換は「保存的」置換であってよい。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2010／019702号の表1に記載されている。例示的な保存的置換は表1に示されている。アミノ酸は周知の3文字コードを用いて表される。
【０１４９】
（表１）
2016515544.tif 000056
【０１５０】
クローン12H3およびクローン20E5がヒトCD134と結合することを考えれば、それらのそれぞれのVH配列およびVL配列を、他の抗CD134抗体と「混合および適合させて」、さらなる抗体を作り出すことができる。そのような「混合および適合させた」抗体のヒトCD134との結合は、実施例に記載したアッセイを含む、当技術分野において公知の結合アッセイを用いて試験することができる。1つのケースでは、VH領域およびVL領域を混合および適合させる際に、特定のVH／VL対合によるVH配列を、構造的に類似したVH配列によって置き換える。同様に、別のケースでは、特定のVH／VL対合によるVL配列を、構造的に類似したVL配列によって置き換える。
【０１５１】
1つまたは2つのCDR領域のみを含む分子（場合によっては、さらに単一のCDRまたはその一部のみ、特にCDR3）は、そのCDRの由来となった抗体の抗原結合活性を保つことができる。例えば、Laune et al. JBC 1997; 272: 30937-44；Monnet et al. JBC 1999; 274:3789-96；Qiu et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 921-9；Ladner et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 875-7；Heap et al. J Gen Virol 2005; 86: 1791-1800；Nicaise et al. Protein Science 2004; 13: 1882-91；Vaughan and Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2001; 4:417-430；Quiocho Nature 1993; 362: 293-4；Pessi et al. Nature 1993; 362: 367-9；Bianchi et al. J Mol Biol 1994; 236: 649-59；およびGao et al. J Biol Chem 1994; 269: 32389-93を参照。
【０１５２】
したがって、本発明の1つの態様は、以下のものを含む、単離された抗ヒトCD134抗体である：（a）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（b）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【０１５３】
本発明によるさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3。
【０１５４】
本発明によるさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。
【０１５５】
したがって、本発明の1つの態様は、以下のものを含む単離された抗ヒトCD134抗体である：（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（b）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【０１５６】
本発明によるさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3。
【０１５７】
本発明による1つのさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。
【０１５８】
クローン12H3およびクローン20E5がヒトCD134と結合すること、ならびに抗原結合特異性が主としてCDR1、CDR2およびCDR3領域によって与えられることを考えれば、VH CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにVL CDR1、CDR2およびCDR3配列を「混合および適合させて」、さらなる抗CD134抗体を作り出すことができる。例えば、複数の異なる抗CD134抗体に由来するCDRを混合および適合させることができるが、各抗体は典型的にはVH CDR1、CDR2およびCDR3ならびにVL CDR1、CDR2およびCDR3を含むと考えられる。そのような「混合および適合させた」抗体のCD134との結合は、上記の、および実施例に記載した結合アッセイ（例えば、ELISA、Biacore分析）を用いて試験することができる。1つのケースでは、VH CDR配列を混合および適合させる際に、特定のVH配列に由来するCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を、構造的に類似したCDR配列によって置き換える。同様に、VL CDR配列を混合および適合させる際に、特定のVL配列に由来するCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を、典型的には、構造的に類似したCDR配列によって置き換える。1つまたは複数のVHおよび／またはVL CDR領域配列を、本明細書に開示されたCDR配列由来の構造的に類似した配列によって置き換えることにより、新規なVH配列およびVL配列を作り出しうることは、当業者には容易に明らかであろう。
【０１５９】
抗CD134抗体のクラス（例えば、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgD）およびサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）は、ELISAまたはウエスタンブロット法ならびに他の手法などによる、任意の適した方法によって判定することができる。または、クラスおよびサブクラスを、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全体または一部分の配列を決定して、それらのアミノ酸配列をさまざまなクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列と比較して、抗体のクラスおよびサブクラスを判定することによって判定することもできる。抗CD134抗体は、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgD分子であってよい。例えば、抗CD134抗体は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブクラスであるIgGであってよい。したがって、本発明の別の局面は、抗CD134抗体のクラスまたはサブクラスを別のクラスまたはサブクラスに転換させるための方法を提供する。
【０１６０】
いくつかの態様において、抗CD134抗体はIgG4アイソタイプのものである。本発明の態様による結合性分子には、モノクローナル抗体、その断片、ペプチドおよび他の化学的実体が含まれる。モノクローナル抗体は、哺乳動物に免疫処置を行って、その後に関心対象のモノクローナル抗体を産生するプラズマB細胞の単離、および骨髄腫細胞との融合を行う、従来の方法によって作製することができる。
【０１６１】
さまざまな態様において、結合部分は、実際の抗体である代わりに、抗体模倣物（例えば、非抗体性スキャフォールドに基づくもの）、RNAアプタマー、小分子またはCovX-bodyであってよい。
【０１６２】
抗体模倣物（例えば、高度の安定性を有しながらも、特定の位置に可変性を導入することを可能にする非抗体性スキャフォールド構造）を用いて、分子ライブラリーを作り出し、それを結合部分の由来としうることが理解されるであろう。生化学の当業者は、多くのそのような分子に精通しているであろう。そのような分子は、本発明の作用物質における結合部分として用いることができる。
【０１６３】
例示的な抗体模倣物は、Skerra et al.（2007, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304）で考察されており、これには以下のものが含まれる:アフィボディ（affibody）（トリネクチン（Trinectin）とも呼ばれる; Nygren et al., 2008, FEBS J, 275, 2668-2676）；CTLD（テトラネクチン（Tetranectin）とも呼ばれる；Thogersen st al., Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30）；アドネクチン（adnectin）（モノボディ（monobody）とも呼ばれる；Koide et al., Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109）；アンチカリン（anticalin）（Schlehuber et al., Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33）；DARPin（アンキリン；Binz et al., Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582）；アヴィマー（avimer）（Silverman et al., Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561）；ミクロボディ（microbody）（Krause et al., FEBS J, (2007), 274, 86-95）；ペプチドアプタマー（Borghouts et al., Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797）；Kunitzドメイン（Attucci et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809）；アフィリン（affilin）（Hey et al., Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522）。
【０１６４】
従って、以下を含む群または以下からなる群より選択される抗体模倣体が好ましい：アフィボディ、テトラネクチン（CTLD）、アドネクチン（モノボディ）、アンチカリン、DARPin（アンキリン）、アヴィマー、iMab、ミクロボディ、ペプチドアプタマー、Kunitzドメイン、アプタマー、およびアフィリン。
【０１６５】
「小分子」とは、900ダルトンまたはそれ未満の低分子量有機化合物のことを意味する。核酸、タンパク質および多糖類（デンプンまたはセルロース）などの大型の生体高分子は、「小分子」としては含まれないが、それらの構成要素である単量体（それぞれ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、アミノ酸および単糖類）およびオリゴマー（すなわち、ジヌクレオチドなどの短い重合体、抗酸化物質グルタチオンなどのペプチド、およびスクロースなどの二糖類）は含まれる。小分子の生成については、Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57.1742-78およびRoot-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14:55-62に記載されている。
【０１６６】
CovX-Bodyは、ファルマコフォアを、リンカーを介して、特別に設計された抗体の結合部位と共有結合性に接合させて、抗体を効果的にリプログラミングすることによって作り出される（Tryder et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17:501-6）。 その結果得られるのは、各構成要素が無傷のCovX-Bodyの望ましい特色に寄与する、新たなクラスの化学的実体であり、特に、この実体は、ペプチドの生物学的作用および長期間にわたる抗体半減期を有する。
【０１６７】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー（Stratagene Corp., La Jolla, California；Cambridge Antibody Technology Ltd., London, England）を用いてヒト抗体断片（VH、VL、Fv、Fd、Fab、または(Fab')2）を作製した上で、キメラ抗体を作製するためのものに類似した手法を用いて、これらの断片をそれらに対する適切な部分の融合によってヒト抗体全体を構築するために用いることを含む、いくつかの異なる方法によって作製することができる。例えば、ヒト抗体を、Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96およびPCT国際公開公報第WO09／085462号）に記載されたように、抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域をバクテリオファージpIXコートタンパク質との融合タンパク質として発現するファージディスプレイライブラリーから単離することもできる。また、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウスにおいて産生させることもできる。そのようなマウスは、例えば、Abgenix, Inc., Fremont, Regeneron（http://_www_regeneron_com）、Harbour Antibodies（http://_www_harbourantibodies_com）、Open Monoclonal Technology, Inc.（OMT）（http://_www_omtinc_net）、KyMab（http://_www_kymab_com）、Trianni（http://_www.trianni_com）およびAblexis（http:_//_www_ablexis.com）から入手可能である。重鎖および軽鎖のFv領域を連結して単鎖ペプチドを形成することに加えて、類似の手段によってFabを構築して発現させることもできる（M.J. Evans et al. J Immunol Meth 1995；184：123-138）。
【０１６８】
DeImmunized（商標）抗体は、国際特許出願PCT/GB98/01473号に記載されているように、免疫原性の可能性のあるT細胞エピトープが削除された抗体である。このため、それらがインビボで適用された際に、ヒトにおける免疫原性は消失しているかまたは大幅に低下していると予想される。本発明の免疫グロブリンを基にした結合性分子で、それらの免疫原性T細胞エピトープ（存在すれば）が、そのような方法によって削除されていてもよい。
【０１６９】
上記の完全ヒト抗体および部分的ヒト抗体はすべて、完全マウス抗体または非ヒト由来抗体よりも免疫原性が低い。断片および単鎖抗体についても同様である。このため、これらの分子（またはそれらの誘導体）はすべて、免疫応答またはアレルギー性応答を誘発する可能性が低いと考えられる。その結果として、それらは完全非ヒト抗体よりもヒトにおけるインビボ投与により好適であり、反復投与または長期投与が必要な場合には特にそうである。
【０１７０】
二重特異性抗体は、同一のヒト標的細胞のヒトCD134の間の、または2種類のヒト標的細胞上のヒトCD134の間の架橋剤として用いることができる。そのような二重特異性抗体は、ヒトCD134上の2種類のエピトープのそれぞれに対して1つの特異性を有する。これらの抗体およびそれらを作製する方法は、米国特許第5,534,254号（Creative Biomolecules, Inc.）に記載されている。この特許に記載された二重特異性抗体の種々の態様は、単鎖Fvを、Ser-Cys、(Gly)4-Cys、(His)6-(Gly)4-Cysを含むペプチド連結剤（peptide coupler）、キレート剤、ならびにビスマレイミドヘキサンおよびビスマレイミドカプロイルを含む化学的またはジスルフィド性連結物によって連結させることを含む。
【０１７１】
本発明の抗体のVL領域および／またはVH領域は、各抗体アームが別個の抗原またはエピトープと結合する二重特異性完全長抗体の他の態様の中に人工的に組み込むことができる。そのような二重特異性抗体は、例えば、米国特許第7,695,936号；国際公開公報第WO2004／111233号；米国特許出願公開第US2010／0015133号；米国特許出願公開第US2007／0287170号；国際公開公報第WO2008／119353号；米国特許出願公開第US2009／0182127号；米国特許出願公開第US2010／0286374号；米国特許出願公開第US2011／0123532号；国際特許出願公開第WO2011／131746号；国際公開公報第WO2011／143545号；または米国特許出願公開第US2012／0149876号などに記載されたものなどの技術を用いて、2つの抗体重鎖間のCH3相互作用をモジュレートして二重特異性抗体を形成させることによって作製することができる。本発明の抗体のVL領域および／またはVH領域を組み入れることができる、そのほかの二重特異性構造には、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン（国際公開公報第WO2009／134776号）、または特異性の異なる2つの抗体アームを接続するさまざまな二量体化ドメイン、例えばロイシンジッパードメインもしくはコラーゲン二量体化ドメインなどを含む構造がある（国際公開公報第WO2012／022811号、米国特許第5,932,448号；米国特許第6,833,441号）。
【０１７２】
非抗体分子は、化合物ライブラリーから従来の手段によって単離またはスクリーニングすることができる。化合物ライブラリーの作製およびスクリーニングのための自動システムは、米国特許第5,901,069号および第5,463,564号に記載されている。目標をより明確にした1つのアプローチは、結合部位を三次元モデル化し、続いてそのモデルに適合する分子のファミリーを作製することを伴う。続いて、最適な結合特性を有するものに関して、それらをスクリーニングする。
【０１７３】
別のアプローチは、組換えペプチドライブラリーを作製し、続いて、関心対象のヒトCD134のエピトープと結合するものに関してそれらをスクリーニングすることである。例えば、米国特許第5,723,322号を参照。このエピトープは、以下の実施例に記載したモノクローナル抗体による結合を受けるものと同一である。ひとたびエピトープが判明すれば、当技術分野において周知の手法に従って、分子を、比較的容易に作製または単離することができる。
【０１７４】
さらなる態様は、上記の抗CD134抗体のいずれかの誘導体を提供する。1つの特定の局面において、抗体誘導体は、クローン12H3および／またはクローン20E5のアミノ酸配列の改変によって導き出される。フレームワーク領域、CDR領域または定常領域といった、抗体鎖の任意の領域のアミノ酸配列を改変することができる。改変は、当技術分野において公知の標準的な手法、例えば部位指定突然変異誘発およびランダムPCR媒介性突然変異誘発などによって導入することができ、天然アミノ酸のほかに非天然アミノ酸を含めることもできる。改変の種類には、抗CD134抗体の1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、抗体誘導体は、重鎖CDRにおける1つ、2つ、3つもしくは4つのアミノ酸置換、および／または軽鎖CDRにおける1つのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、抗CD134抗体の誘導体は、ヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列と比して1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。特定の態様において、生殖系列由来のそのような置換の1つまたは複数は、重鎖のCDR2領域にある。別の特定の態様において、生殖系列と比してのアミノ酸置換は、抗体クローン12H3およびクローン20E5における生殖系列と比しての置換と同じ位置のうち1つまたは複数にある。別の態様において、アミノ酸置換は、抗体における1つまたは複数のシステインを別の残基、例えば、限定的ではないがアラニンまたはセリンなどに変化させるものである。システインは標準（canonical）システインでも非標準システインでもよい。置換は、抗体の可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域内に、または定常ドメイン内に作製することができる。別の種類のアミノ酸置換は、脱アミド部位となる可能性のある部位を形成するアスパラギン酸-グリシン対を、残基の一方または両方を変更することによって消失させるものである。さらに他の態様において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。1つの態様において、抗体誘導体は、クローン12H3および／またはクローン20E5のアミノ酸配列と比して、重鎖CDR領域における1つ、2つ、3つまたは4つの保存的アミノ酸置換を有する。抗CD134抗体の別の種類の改変は、抗体の元のグリコシル化パターンの変更である。「変更」という用語は、抗体に認められる1つもしくは複数の糖質部分の欠失、および／または抗体に存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを指す。
【０１７５】
抗体のグリコシル化は、典型的にはN結合型である。N結合型とは、アスパラギン酸残基の側鎖に対する糖質部分の結びつきのことを指す。他の改変の例には、アシル化、アミド化、アセチル化、架橋、環化、ホルミル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合性架橋の形成、システインの形成、酸化、リン酸化、プレニル化、ペグ化、タンパク質分解性プロセシングおよび硫酸化が含まれる。
【０１７６】
さらなる態様は、本明細書に記載の抗CD134抗体またはその抗原結合性断片に、追加的な分子的実体が連結されたものを含む抗体誘導体を提供する。追加的な分子的実体の例には、薬学的な剤、ペプチドまたはタンパク質、および検出薬または標識が含まれる。抗CD134抗体と連結させうる薬学的な剤の具体的な例には、細胞傷害性薬剤または他の癌療法薬、および放射性同位体が含まれる。抗CD134抗体と連結させうるペプチドまたはタンパク質の具体的な例には抗体が含まれ、それは同一の抗CD134抗体であっても異なる抗体であってもよい。抗CD134抗体と連結させうる検出薬または標識の具体的な例には、（1）蛍光性化合物、例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルフォニルクロリドおよびランタニド蛍光体など；（2）酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびグルコース酸化酵素など；（3）ビオチン；（4）ロイシンジッパー対配列、金属結合ドメイン、エピトープタグおよび二次抗体の結合部位といった二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープが含まれる。さらなる態様は、単量体抗体の抗体二量体、三量体またはより高次の多量体といった、抗CD134抗体の多量体形態である抗体誘導体を提供する。抗体多量体の中の個々の単量体は同一であっても異なってもよく、すなわち、それらはヘテロマー性またはホモマー性の抗体多量体であってよい。抗体の多量体化は自然凝集によって実現させうる。例えば、精製された抗体調製物（例えば、精製IgG1分子）のある程度の割合は、抗体ホモ二量体および他のより高次の抗体多量体を含むタンパク質凝集物を自然発生的に形成する。または、抗体ホモ二量体を、当技術分野において公知の化学連結手法を通じて形成させることもできる。適した架橋剤には、ヘテロ二機能性であるもの、例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-スクシンイミジルS-アセチルチオ-アセテート、およびスクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート）など、またはホモ二機能性であるもの（ジスクシンイミジルスベレートなど）が含まれる。そのようなリンカーは市販されている。また、当技術分野において公知の組換えDNA手法を通じて抗体を多量体化することもできる。
【０１７７】
さらなる態様は、本明細書において上述した抗ヒトCD134抗体のアミノ酸配列を含むキメラ抗体である抗体誘導体も提供する。別の例では、キメラ抗体のCDRはすべて、抗ヒトCD134抗体に由来する。別の例では、複数の抗ヒトCD134抗体由来のCDRがキメラ抗体の中で組み合わされる。さらに、キメラ抗体が、1つの抗ヒトCD134抗体に由来するフレームワーク領域、および1つまたは複数の異なるヒト抗体由来の1つまたは複数のCDRを含んでもよい。キメラ抗体は、当技術分野において公知の従来の方法を用いて作製することができる。いくつかの特定の態様において、キメラ抗体は、抗体クローン12H3および／またはクローン20E5から選択される抗体の重鎖可変領域由来の、または軽鎖可変領域由来の、1つ、2つもしくは3つのCDRを含む。
【０１７８】
本発明によって提供される他の抗体誘導体の例には、単鎖抗体、ダイアボディ、ドメイン抗体、ナノボディおよびユニボディ（unibody）が含まれる。いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、DeImmunized（商標）抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、Fab、F(ab')2、Fv、または親抗体の抗原結合機能を保っている他の断片を含む断片であってよい。単鎖抗体（「ScFv」）およびそれらの構築の方法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。
【０１７９】
「単鎖抗体」（scFv）は、VLドメインがVHドメインと連結したものを含む単一のポリペプチド鎖からなり、VLドメインおよびVHドメインが対合して一価分子を形成している。単鎖抗体は、当技術分野において公知の方法（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）によって調製することができる。「ダイアボディ」は2つの鎖からなり、各鎖は短いペプチドリンカーによって接続された同一のポリペプチド鎖上で重鎖可変領域に軽鎖可変領域が接続されたものを含み、同一鎖上の2つの領域は互いに対合せず、もう一方の鎖上の相補的ドメインと対合して二重特異性分子を形成する。ダイアボディを調製する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、およびPoljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123）。ドメイン抗体（dAb）は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に対応する、抗体の小型の機能的結合単位である。ドメイン抗体は、細菌細胞系、酵母細胞系および哺乳動物細胞系において良好に発現される。ドメイン抗体およびその作製方法のさらなる詳細は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第6,291,158号；第6,582,915号；第6,593,081号；WO04/003019およびWO03/002609を参照）。ナノボディは抗体の重鎖に由来する。ナノボディは典型的には、単一の可変ドメインおよび2つの定常ドメイン（CH2およびCH3）を含み、元の抗体の抗原結合能力を保っている。ナノボディは、当技術分野において公知の方法によって調製することができる（例えば、米国特許第6,765,087号、米国特許第6,838,254号、WO 06/079372を参照）。ユニボディは、IgG4抗体の1つの軽鎖および1つの重鎖からなる。ユニボディは、IgG4抗体のヒンジ領域の除去によって作製しうる。ユニボディおよびそれらの調製の方法のさらなる詳細は、WO2007/059782に記載がある。
【０１８０】
本発明の分子は、結合部分に加えて、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランなどの、ただしこれらには限定されない、分子のインビボ半減期を延長させるための部分をさらに含むことができる。そのようなさらなる部分は、当技術分野において周知の方法を用いて、結合部分とコンジュゲートさせるか、または他の様式で組み合わせることができる。
【０１８１】
本発明のさらなる局面は、本発明の第1の局面によるCD134結合性の結合性分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。核酸分子によってコードされるアミノ酸配列は、無傷の抗体の任意の部分、例えばCDR、1つ、2つもしくは3つのCDRを含む配列、または重鎖もしくは軽鎖の可変領域であってもよく、または完全長重鎖もしくは軽鎖であってもよい。いくつかの態様において、核酸分子は、以下のものを含むアミノ酸配列をコードする：（1）抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5のCDR3領域、特に重鎖CDR3領域；（2）抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域；または（3）抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5の重鎖もしくは軽鎖。他の態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18もしくは19からなる群より選択される、またはSEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10もしくは11からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【０１８２】
本開示によって提供される核酸分子は、本発明によるCD134抗体を産生する任意の供給源から入手しうる。抗CD134抗体産生細胞からのmRNAを標準的な手法によって単離し、クローニングして、かつ／または、PCRおよびライブラリー構築手法を用いて増幅した上で、標準的なプロトコールを用いてスクリーニングして、抗CD134抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を入手する。mRNAを、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはcDNAクローニングに用いるためのcDNAを作製するために用いてもよい。1つの態様において、核酸分子は、上記の抗CD134抗体を発現するハイブリドーマ、好ましくは、その融合パートナーの一方がヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物細胞であるハイブリドーマから入手しうる。別の態様において、ハイブリドーマは、非ヒト非トランスジェニック動物に由来する。
【０１８３】
抗CD134抗体の重鎖をコードする核酸分子は、重鎖可変領域をコードする核酸分子を、重鎖の定常領域をコードする核酸分子と融合させることによって構築しうる。同様に、抗CD134抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、軽鎖可変領域をコードする核酸分子を、軽鎖の定常領域をコードする核酸分子と融合させることによって構築しうる。VH鎖およびVL鎖をコードする核酸分子は、それぞれ重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にそれらを挿入して、VHセグメントをベクター内部の重鎖定常領域（CH）セグメントと機能的に結合させ、VLセグメントをベクター内部の軽鎖定常領域（CL）セグメントと機能的に結合させることにより、完全長抗体遺伝子へと転換させうる。または、標準的な分子生物学の手法を用いて、VH鎖をコードする核酸分子をCH鎖をコードする核酸分子と連結させること、例えばライゲートすることにより、VH鎖またはVL鎖をコードする核酸分子を完全長抗体遺伝子へと転換させる。同じことを、VL鎖およびCL鎖をコードする核酸分子を用いて達成することもできる。続いて、完全長重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を、それらが導入された細胞から発現させて、抗CD134抗体を単離することができる。
【０１８４】
本核酸分子は、以下に述べるように、大量の抗CD134抗体を組換え法によって発現させるために用いることができる。また、本明細書の他所に記載したように、核酸分子を、本開示によって提供される他の結合性分子、例えばキメラ抗体、単鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、突然変異型抗体、二重特異性抗体、および抗体誘導体などを作製するために用いることもできる。1つの態様において、核酸分子は、特定の抗体配列に対するプローブまたはPCRプライマーとして用いられる。例えば、核酸分子プローブを診断方法に用いてもよく、または核酸分子PCRプライマーを、とりわけ、抗CD134抗体の可変領域の作製に用いるための核酸配列を単離するために用いうると考えられるDNAの領域を増幅するために用いることもできる。
【０１８５】
抗CD134抗体のVHセグメントおよびVLセグメントをコードするDNA分子をひとたび入手すれば、これらのDNA分子を、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子、scFv遺伝子に転換させるために、あるいは二重特異性抗体に組み込むことが出来るように、組換えDNA手法によってさらに操作することができる。
【０１８６】
本発明のさらなる局面は、本明細書に上述した核酸分子を含むベクターを提供する。核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖の一部分（CDRもしくは可変領域など）、完全長軽鎖もしくは重鎖、重鎖もしくは軽鎖の一部分もしくは完全長を含むポリペプチド、または抗体誘導体もしくは抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードすることができる。
【０１８７】
適した発現ベクターの一例は、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードし、任意のVH配列またはVL配列を挿入して発現させることが可能なように操作された適切な制限部位を備えたものである。発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖のアミノ酸配列の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖のアミノ酸配列をコードするDNAを、シグナルペプチドが抗体鎖のアミノ酸配列のアミノ末端に対してインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングするとよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドでもよく、または異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリンでないタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。発現ベクターは、抗CD134抗体（抗体のVH、VL、全長重鎖、および／または全長軽鎖遺伝子）のアミノ酸配列をコードする核酸配列に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列も保有する。発現調節配列の選択を含め、ベクターのデザインは、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルなどの要因に依存しうる。哺乳動物宿主細胞での発現のための調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルス因子、例えば、レトロウイルスLTR、サイトメガロウイルス（CMV）（CMVプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス40（SV40）（SV40プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））、ポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーターなどの強力な哺乳動物プロモーターが含まれる。
【０１８８】
宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞または酵母細胞であってよい。宿主細胞として適している哺乳動物細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、NSO細胞、PER-C6細胞、SP2/0細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Hep G2）、ヒト肺細胞、A549細胞、および他の多くの細胞株が含まれる。昆虫細胞株の例には、Sf9細胞またはSf21細胞が含まれる。
【０１８９】
植物宿主細胞の例には、タバコ属（Nicotiana）、アラビドプシス属（Arabidopsis）、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌（E. coli）およびストレプトミセス属（Streptomyces）種が含まれる。
【０１９０】
酵母宿主細胞の例には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）が含まれる。
【０１９１】
種々の細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現される結合性分子のアミノ酸配列は、異なるグリコシル化を有する可能性がある。しかし、本明細書で提供される核酸分子によってコードされるか、または本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む結合性分子はすべて、結合性分子のグリコシル化にかかわらず、本発明の一部である。
【０１９２】
本発明の別の局面は、上記に定義したCD134結合性分子を、ファージディスプレイを用いて作製するための方法を提供する。本方法は、（a）ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成する段階、（b）ライブラリーをCD134またはその一部分によってスクリーニングする段階、（c）CD134またはその一部分と結合するファージを単離する段階、および（d）ファージから抗体を入手する段階を含む。抗体のライブラリーを調製するための1つの例示的な方法は、以下の段階を含む：（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物に対して、CD134またはその抗原性部分による免疫処置を行って、免疫応答を生じさせる段階；（b）免疫処置を受けた動物から抗体産生細胞を抽出する段階；（c）抽出した細胞から、抗CD134抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを単離する段階；（d）RNAを逆転写させてcDNAを生成させる段階；（e）cDNAを増幅する段階；ならびに（f）cDNAをファージディスプレイベクターに挿入して、抗体をファージ上で発現させる段階。組換え抗ヒトCD134抗体またはその抗原結合性断片は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。ライブラリーは、B細胞から単離したmRNAから調製したヒトVLおよびVHのcDNAを用いて作製したscFvファージディスプレイライブラリーであってよい。そのようなライブラリーの調製およびスクリーニングのための方法は、当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットは市販されている。
【０１９３】
本発明のいくつかの態様においては、本明細書に記載の結合性分子の1つまたは組み合わせと、任意で薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば、薬学的組成物が提供される。組成物は、当技術分野において公知の従来の方法によって調製することができる。いくつかの態様において、組成物は、抗CD134抗体またはその抗原結合性断片を含む。特定の態様において、組成物は、抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、またはいずれかの抗体の抗原結合性断片を含む。さらに他の態様において、組成物は、抗体クローン12H3および／またはクローン20E5の誘導体を含む。他の態様においては、薬学的組成物は，ヒト化抗体12H3_VL1VH1、 12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3、20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2、または 20E5_VL2VH3を含む。他の態様においては、薬学的組成物は、SEQ ID NO: 101〜133、または146〜151の重鎖可変領域を含む上述のヒト化抗体の変異体を含む。「薬学的に許容される担体」という用語は、結合性分子の送達のための製剤中に用いるのに適している任意の不活性物質のことを指す。担体は、抗付着剤（antiadherent）、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、増量剤または希釈剤、保存料（酸化防止剤、抗菌薬または抗真菌薬）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などであってよい。
【０１９４】
本発明の非ペプチド分子は、懸濁剤、錠剤などを含め、経口的に投与しうると考えられる。液体製剤は、凍結乾燥またはエアロゾル化されたマイクロカプセルの吸入によって投与しうると考えられる。坐薬を用いることもできると考えられる。そのほかの薬学的媒体を、本発明の分子の作用持続時間を制御するために用いることもできると考えられる。製剤に関して選択される投与量およびスケジュールは、当技術分野において周知の標準的な手順によって決定しうる。そのような手順は、動物モデルから推定された投薬スケジュールを外挿し、続いてヒトの臨床用量設定試験において最適な投与量を決定することを伴う。
【０１９５】
組成物は、液体、半固体および固体の剤形といった、任意の適した形態にあってよい。組成物のさまざまな剤形は、当技術分野において公知の従来の手法によって調製することができる。
【０１９６】
組成物中に含められる結合性分子の相対量は、所望の放出特性および薬力学的特性、用いる具体的な結合性分子および担体、ならびに剤形といった、いくつかの要因に応じて異なると考えられる。単一の剤形中の結合性分子の量は一般に、治療効果を生じる量であると考えられるが、それよりも少ない量であってもよい。一般に、この量は剤形の総重量に対し約0.001％〜約99％、約0.1％〜約70％、または約1％〜約30％であると考えられる。
【０１９７】
結合性分子に加えて、1つまたは複数の追加的な治療剤を、組成物中に、または同一の治療レジメンの一部として別に含めることもできる。追加的な治療剤の例は、本明細書で以下に記載されている。組成物中に含める追加的な治療剤の適した量は、当業者によって容易に選択され、用いる具体的な作用物質および担体、剤形、ならびに所望の放出特性および薬力学特性といった、いくつかの要因に応じて異なると考えられる。単一の剤形中に含められる追加的な治療剤の量は一般に、治療効果を生じる量であると考えられるが、それよりも少ない量であってもよい。
【０１９８】
本開示によって提供される結合性分子および結合性分子を含む薬学的組成物は、治療目的、診断目的、または免疫応答の強化、癌の治療、他の癌治療法の有効性の強化もしくはワクチン有効性の強化といった他の目的に有用であり、医薬または診断薬として用いるといった、いくつかの用途がある。したがって、本発明の好ましい局面においては、結合性分子または薬学的組成物を用いる方法が提供される。
【０１９９】
本発明のさらなる局面は、ヒトCD134媒介性の抗腫瘍免疫応答のモジュレーションのための方法であって、（1）天然型ヒトOX40LのヒトCD134受容体との相互作用を回避させる、かつ／または（2）ヒトCD134媒介性の細胞シグナル伝達を、天然型ヒトOX40Lによるその占有後に遮断しない、抗ヒトCD134抗体を含む、ヒトCD134と結合する結合性分子を用いた、ヒトCD134発現性ヒトTeffエフェクター機能の強化および／またはヒトCD134発現性ヒトTreg抑制機能の減弱化を含む方法を提供する。
【０２００】
本発明のさらなる局面は、CD134媒介性の抗腫瘍免疫応答のモジュレーションのための方法であって、ヒトCD134と結合する結合性分子を用いた、ヒトCD134発現性ヒトTeffエフェクター機能の強化および／またはヒトCD134発現性ヒトTreg抑制機能の減弱化を含む方法を提供する。
【０２０１】
本発明の別の局面は、ヒトCD134媒介性の抗腫瘍免疫応答のモジュレーションの方法であって、ヒトCD134受容体上のヒトOX40L結合ドメインと相互作用する、かつ／またはヒトOX40L-ヒトCD134細胞シグナル伝達を遮断する、ヒトOX40L模倣体などの抗ヒトCD134抗体を含む、ヒトCD134と結合する結合性分子を含まない方法を提供する。
【０２０２】
本発明は、抗腫瘍治療を目的とする、抗ヒトCD134抗体を含む、ヒトCD134と結合する結合性分子を開示する。この抗ヒトCD134抗体は、ヒトCD134の細胞外ドメインと結合する。いくつかの態様において、抗ヒトCD134抗体は、活性化されたヒトTeffおよびヒトTreg上のヒトCD134の細胞外ドメイン上の、OX40L結合領域でない領域と結合する（すなわち、抗ヒトCD134抗体は、ヒトOX40LのヒトCD134との結合を完全には遮断しない）。
【０２０３】
1つの特定の局面においては、哺乳動物における免疫応答の強化のための方法であって、本明細書に記載された結合性分子の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。いくつかの態様において、結合性分子は抗CD134抗体またはその抗原結合性断片であり、哺乳動物はヒトである。さらなる態様において、結合性分子は抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、またはヒト化12H3抗体もしくはヒト化20E5抗体のいずれかの抗体の抗原結合性断片である。「免疫応答の強化」という用語は、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激すること、誘発すること、増大させること、向上させること、または増強させることを意味する。免疫応答は細胞性応答（すなわち、細胞媒介性の、例えば細胞傷害性Tリンパ球媒介性の）であっても体液性応答（すなわち、抗体媒介性応答）であってもよく、一次免疫応答であっても二次免疫応答であってもよい。免疫応答の強化の例には、CD4+ ヘルパーT細胞活性の増大および細胞溶解性T細胞の生成が含まれる。免疫応答の強化は、細胞傷害性Tリンパ球アッセイ、サイトカインの放出（例えばIL-2産生）、腫瘍の退縮、担癌動物の生存、抗体産生、免疫細胞の増殖、細胞表面マーカーの発現、および細胞傷害作用を非限定的に含む、当業者に公知のいくつかのインビトロまたはインビボ測定を用いて評価することができる。1つの態様において、本方法は、細胞性免疫応答、特に細胞傷害性T細胞応答を強化する。
【０２０４】
本発明の1つの局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、該結合性分子の飽和濃度またはそれを上回る濃度で、実施例2（f）に記載したように、蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによる測定で、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を70％を超えては低下させない結合性分子を提供する。より好ましくは、OX40LのCD134との結合作用は約60％、または約50％、または約40％、または約30％、または約20％、または約10％を超えては低下しないか、またはそれ未満しか低下せず、または好ましくは結合の低下は全くない。
【０２０５】
本発明の別の局面は、該結合性分子の70nMの濃度で、実施例2（f）に記載したように、蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによる測定で、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を70％を超えては低下させない結合性分子を提供する。より好ましくは、OX40LのCD134との結合作用は、約60％、または約50％、または約40％、または約30％、または約20％、または約10％を超えては低下しないか、またはそれ未満しか低下せず、または好ましくは結合の低下は全くない。
【０２０６】
本発明の別の局面は、フローサイトメトリーによる測定で（実施例2（e）にさらに記載）、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での非標識前記結合性分子と蛍光標識された前記抗体との間の交差競合によって示されるように、ヒトCD134結合との結合に関して、（1）SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列、および（2）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する結合性分子を提供する。前記抗体の結合は、前記結合性分子に対する交差競合によってアッセイした際に、その飽和濃度またはそれを上回る濃度で、少なくとも約50％または約60％または約70％または約80％または約90％またはそれ以上低下するか、あるいは消失する。
【０２０７】
本発明の別の局面は、フローサイトメトリーによる測定で（実施例2（e）にさらに記載）、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での非標識前記結合性分子と蛍光標識された前記抗体との間の交差競合によって示されるように、ヒトCD134結合との結合に関して、（1）SEQ ID NO：4を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列、および（2）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する結合性分子を提供する。前記抗体の結合は、前記結合性分子に対する交差競合によってアッセイした際に、その飽和濃度またはそれを上回る濃度で、少なくとも約50％または約60％または約70％または約80％または約90％またはそれ以上低下するか、あるいは消失する。
【０２０８】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、さらにヒトCD134発現性エフェクターT細胞上でのヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２０９】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつ、さらにヒトCD134発現性エフェクターT細胞上でのヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２１０】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、ヒトCD134発現性エフェクターT細胞上のヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を強化する結合性分子を提供する。
【０２１１】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつヒトCD134発現性エフェクターT細胞上でのヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を強化する結合性分子を提供する。
【０２１２】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性ヒトT細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、さらにヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２１３】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつ、さらにヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２１４】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性ヒトT細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、ヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を強化する結合性分子を提供する。
【０２１５】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を強化する結合性分子を提供する。
【０２１６】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、さらにヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２１７】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を阻害も阻止もせず、かつ、さらにヒトCD134発現性T調節細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２１８】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上のCD134に対するOX40Lの結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、ヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を阻害する結合性分子を提供する。
【０２１９】
本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を阻害も阻止もせず、かつ、ヒトCD134発現性T調節細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を阻害する結合性分子を提供する。
【０２２０】
OX40Lと抗CD134抗体との同時結合を測定するために適した方法について以下に述べる。抗ヒトCD134抗体の非存在下における、PHAで刺激されたヒトCD134発現性PBMC上でのヒトOX40L結合のFITC蛍光性シグナル（幾何平均（geomean）または平均蛍光強度（MFI））を100％に設定する。ヒトOX40Lの非存在下における、PHAで刺激されたヒトCD134発現性PBMC上での抗ヒトCD134抗体結合のPE蛍光シグナル（MFI）を100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、PHAで刺激されたヒトCD134発現性PBMCに対して同時に添加した時の、このFITC蛍光シグナルおよびPE蛍光シグナルの減少は、好ましくは約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えず、またはそれ未満である。
【０２２１】
TeffのOX40L媒介性の増殖性応答の妨害がないことを測定するために適した方法は、以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdUの取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激された、または抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの変化（すなわち、減分または増分）は、好ましくは約30％または約20％または約10％を超えないか、またはそれ未満である。
【０２２２】
TeffのOX40L媒介性の増殖性応答に対する強化を測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの強化は、好ましくは約30％または約40％または約50％または約60％または約70％を上回るか、またはそれ以上である。
【０２２３】
TregのOX40L媒介性の抑制機能の妨害がないことを測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後にヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）ヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、ヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの変化（すなわち、減分または増分）は、好ましくは約30％または約20％または約10％を超えないか、またはそれ未満である。
【０２２４】
TregのOX40L媒介性の抑制機能に対する強化を測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後にヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）、ヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、ヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの強化は、好ましくは約30％または約40％または約50％または約60％または約70％を上回るか、またはそれ以上である。
【０２２５】
TregのOX40L媒介性の増殖性応答に対する妨害がないことを測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Tregにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Tregに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの変化（すなわち、減分または増分）は、好ましくは約30％または約20％または約10％を超えないか、またはそれ未満である。
【０２２６】
TregのOX40L媒介性の増殖性応答の阻害を測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Tregにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Tregに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの減少は、好ましくは約30％または約40％または約50％または約60％または約70％を上回る、またはそれ以上である。
【０２２７】
本発明の別の局面は、哺乳動物における癌を治療する方法であって、本明細書に記載された結合性分子の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。
【０２２８】
本発明のいくつかの態様において、結合性分子は、抗体クローン12H3および/もしくはクローン20E5、またはいずれかの抗体の抗原結合性断片である。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
【０２２９】
本発明のいくつかの態様において、結合性分子は、SEQ ID NO：69のVHおよびSEQ ID NO：67のVLを有する抗体12H3_VL1VH1である。
【０２３０】
本発明のいくつかの態様において、結合性分子は、SEQ ID NO：70のVHおよびSEQ ID NO：67のVLを有する抗体12H3_VL1VH2である。
【０２３１】
本発明のもう1つの好ましい態様においては、哺乳動物における癌を予防する方法であって、本明細書に記載の通りの結合性分子の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。
【０２３２】
「癌を予防する」または「癌の予防」という用語は、発癌または腫瘍発生の開始が立証されてはいないものの、癌の素因が例えば遺伝子スクリーニングによる判定で、または他の様式で特定されている哺乳動物における癌の発生を遅らせる、阻害する、または予防することを指す。この用語はまた、前悪性状態を有する哺乳動物を、前悪性状態の悪性腫瘍への進行を停止させるか、またはその退縮を引き起こすために治療することも範囲に含む。前悪性状態の例には、過形成、異形成および化生が含まれる。いくつかの態様において、結合性分子は本明細書に記載された抗CD134抗体またはその断片である。本発明のさらなる態様においては、抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、またはいずれかの抗体の抗原結合性断片から選択される結合性分子が提供される。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
【０２３３】
「治療する」または「治療」という用語は、その目的が、望まれない生理的変化または障害、例えば、腫瘍または腫瘍細胞の発生または広がりなどを予防すること、または緩徐にすること（少なくすること）である、治療的処置および予防処置的または予防的な手段の両方のことを指す。有益な、または所望の臨床的結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらない、症状の軽減、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全な）が含まれる。「治療」はまた、対象が治療を受けなかった場合の予想生存期間と比較して生存期間が延長することも意味しうる。治療を必要とするものには、病状もしくは障害をすでに有するもののほかに、病状もしくは障害を有しやすいもの、または病状もしくは障害を予防しようとするものが含まれる。任意の本発明の抗体を、本発明の方法に用いうる。
【０２３４】
本発明のもう1つの態様は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に対して、SEQ ID NO：152のVHおよびSEQ ID NO：100のVLを含む抗CD134抗体を、癌を治療するのに十分な期間にわたって投与する段階を含む方法である。
【０２３５】
本発明のもう1つの態様は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に対して、SEQ ID NO：134のVHおよびSEQ ID NO：98のVLを含む抗CD134抗体を、癌を治療するのに十分な期間にわたって投与する段階を含む方法である。
【０２３６】
本発明のもう1つの態様は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に対して、
SEQ ID NO：67のVHおよびSEQ ID NO：69のVL；
SEQ ID NO：67のVHおよびSEQ ID NO：70のVL；
SEQ ID NO：67のVHおよびSEQ ID NO：71のVL；
SEQ ID NO：68のVHおよびSEQ ID NO：69のVL；
SEQ ID NO：68のVHおよびSEQ ID NO：70のVL；または
SEQ ID NO：68のVHおよびSEQ ID NO：71のVL
を含む抗CD134抗体を、癌を治療するのに十分な期間にわたって投与する段階を含む方法である。
【０２３７】
悪性もしくは良性および／または原発性もしくは続発性を含む種々の癌を、本発明による方法によって治療または予防することができる。そのような癌の例は当業者に公知であり、Merck Manual of Diagnosis and Therapy（Merckにより刊行）などの標準的な教科書に列記されている。いくつかの態様において、癌は、典型的には免疫療法に反応する癌であるが、これまで免疫療法と結びつけられていない癌でもよい。例示的な癌は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および他の新生物性悪性腫瘍がある。癌が、不応性または再発性の悪性癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（gastric or stomach cancer）（消化器癌を含む）、膵癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、およびさまざまな種類の頭頸部癌、ならびにB細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）；小リンパ球性（SL）NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小非分割細胞NHL；巨大病変NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS関連リンパ腫；およびワルデンストローム・マクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（CLL）；急性リンパ芽球性白血病（ALL）；毛様細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫、および移植後リンパ増殖性障害（PTLD）である。
【０２３８】
本発明の別の態様において、結合性分子は単剤療法として単独で投与することもでき、または1つもしくは複数の追加的な治療剤もしくは治療法と組み合わせて投与することもできる。したがって、本発明の別の態様においては、併用療法によって癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示された結合性分子を1つまたは複数の追加的な治療法または治療剤と組み合わせて投与する段階を含む方法が提供される。「追加的な治療法」という用語は、本開示によって提供される結合性分子を治療剤として使用しない治療法のことを指す。「追加的な治療剤」という用語は、本開示によって提供される結合性分子以外の任意の治療剤のことを指す。いくつかの態様において、結合性分子は、抗ヒトCD134抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、いずれかの抗体の抗原結合性断片、またはヒト化12H3抗体もしくはヒト化20E5抗体である。1つの特定の局面において、本開示は、哺乳動物に対して本開示によって提供される結合性分子の治療的有効量を1つまたは複数の追加的な治療剤と組み合わせて投与する段階を含む、哺乳動物における癌を治療するための併用療法を提供する。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。
【０２３９】
いくつかの態様において、癌は、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である。
【０２４０】
いくつかの態様において、癌は前立腺癌である。
【０２４１】
いくつかの態様において、癌は結腸癌である。
【０２４２】
いくつかの態様において、癌は肺癌である。
【０２４３】
いくつかの態様において、癌は血液悪性腫瘍である。
【０２４４】
いくつかの態様において、癌は黒色腫である。
【０２４５】
いくつかの態様において、癌は膀胱癌である。
【０２４６】
いくつかの態様において、肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、または肺扁平上皮癌である。
【０２４７】
非常にさまざまな癌治療剤を、結合性分子と組み合わせて用いることができる。当業者は、本開示の方法および結合性分子と組み合わせて用いうる他の癌治療法の存在および開発について認識していると考えられ、それらは本明細書に明記された形態の治療法には限定されないと考えられる。癌を治療するための併用療法に用いうる追加的な治療剤のカテゴリーの例には、（1）化学療法剤、（2）免疫治療剤、および（3）ホルモン治療剤が含まれる。
【０２４８】
「化学療法剤」という用語は、癌細胞の死滅を引き起こしうる、または癌細胞の分裂、修復、増殖および／もしくは機能に干渉しうる、化学物質または生体物質のことを指す。化学療法剤の例には、WO2006/088639、WO2006/129163およびUS 20060153808号に開示されたものが含まれ、それらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４９】
「免疫治療剤」という用語は、哺乳動物の免疫応答を強化しうる化学物質または生体物質のことを指す。免疫治療剤の例には以下のものが含まれる：カルメット・ゲラン菌（bacillus Calmette-Guerin）（BCG）；インターフェロンなどのサイトカイン；ワクチン、例えば、MyVax個別化免疫療法、Onyvax-P、オンコファージ（Oncophage）、GRNVACI、Favld、プロベンジ（Provenge）、GVAX、Lovaxin C、BiovaxID、GMXXおよびNeuVaxなど；ならびに抗体、例えばアレムツズマブ（キャンパス（CAMPATH）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（AVASTIN）（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（ERBITUX）（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzunab ozogamicin）（マイロターグ（MYLOTARG）（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（ZEVALIN）（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（VECTIBIX）（登録商標））、リツキシマブ（リツキサン（RITUXAN）（登録商標）、マブセラ（MABTHERA）（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（HERCEPTIN）（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（BEXXAR）（登録商標））、トレメリムマブ、CAT-3888、およびWO2003/040170に開示されているCD40受容体に対するアゴニスト抗体など。
【０２５０】
「ホルモン治療剤」という用語は、ホルモンの産生を阻害するかもしくは消失させる、または癌性細胞の増殖および／もしくは生存に対するホルモンの効果を阻害するかもしくはそれに拮抗する、化学物質または生体物質のことを指す。本明細書における方法に適している、そのような作用物質の例には、US20070117809に開示されているものが含まれる。具体的なホルモン治療剤の例には、タモキシフェン（ノルバデックス（NOLVADEX）（登録商標））、トレミフェン（フェアストン（Fareston））、フルベストラント（ファスロデックス（FASLODEX）（登録商標））、アナストロゾール（アリミデックス（ARIMIDEX）（登録商標））、エキセメスタン（アロマシン（AROMASIN）（登録商標））、レトロゾール（フェマーラ（FEMARA）（登録商標））、酢酸メゲストロール（メゲース（MEGACE）（登録商標））、ゴセレリン（ゾラデックス（ZOLADEX）（登録商標））およびリュープロリド（リュープロン（LUPRON）（登録商標））が含まれる。また、本開示の結合性分子を、（1）ホルモンの産生に関与する臓器または腺、例えば卵巣、睾丸、副腎および下垂体などの全体または一部を除去する外科的方法、ならびに（2）患者の臓器または腺に対して、標的とするホルモンの産生を阻害するかまたは消失させるのに十分な量の放射線照射を行う放射線治療といった、非薬物性ホルモン療法と組み合わせて用いることもできる。
【０２５１】
本発明の別の態様においては、併用療法によって癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示された結合性分子を投与する段階、および腫瘍を除去するための外科手術を含む方法が提供される。結合性分子は、前記外科手術の前、最中または後に、哺乳動物に対して投与することができる。
【０２５２】
癌を治療するための併用療法は、本開示によって提供される結合性分子と、電離（電磁）放射線療法（例えば、X線またはγ線）および粒子線放射線療法（例えば、直線型高エネルギー放射線）などの放射線療法との組み合わせも範囲に含む。放射線源は、哺乳動物の外部にあっても内部にあってもよい。結合性分子は、放射線療法の前、最中または後に、哺乳動物に対して投与することができる。
【０２５３】
本開示によって提供される結合性分子および組成物は、任意の適した、投与の経腸的経路または非経口的経路を介して投与することができる。投与の「経腸的経路」という用語は、胃腸管のいずれかの部分を介した投与のことを指す。経腸的経路の例には、経口経路、粘膜経路、頬側経路および経直腸経路、または胃内経路が含まれる。投与の「非経口的経路」とは、経腸的経路以外の投与経路のことを指す。投与の適した経路および方法は、用いる具体的な抗体、所望の吸収速度、用いる具体的な製剤または剤形、治療される障害の種類または重症度、具体的な作用部位、および患者の病状といったいくつかの要因に応じて異なると考えられ、当業者によって容易に選択されうる。
【０２５４】
結合性分子の「治療的有効量」という用語は、意図する治療目的にとって有効な量のことを指す。例えば、免疫応答の強化という状況において、「治療的有効量」とは、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激する、誘発する、増大させる、向上させる、または増強させるのに有効な任意の量のことである。癌を治療するという状況において、「治療的有効量」とは、治療される哺乳動物において任意の望ましいまたは有益な効果、例えば、癌細胞のさらなる増殖もしくは伝播の阻害、癌細胞の死滅、癌の再発の阻害、癌に伴う疼痛の軽減、または哺乳動物の生存性の改善などを引き起こすのに十分な任意の量のことである。癌を予防する方法において、「治療的有効量」とは、結合性分子が投与された哺乳動物における癌の発生を遅らせる、阻害する、または予防するのに有効な任意の量のことである。
【０２５５】
結合性分子の治療的有効量は通常、哺乳動物の体重当たりで、約0.001〜約500mg／kg、より一般的には約0.05〜約100mg／kgの範囲にわたる。例えば、量は、哺乳動物の体重当たりで、約0.3mg／kg、1mg／kg、3mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、50mg／kgまたは100mg／kgであってよい。いくつかの態様において、抗ヒトCD134抗体の治療的有効量は、哺乳動物の体重当たりで約0.1〜30mg／kgの範囲にある。投与すべき正確な投与量レベルは当業者によって容易に決定可能であり、それは、治療しようとする障害の種類および重症度、使用する具体的な結合性分子、投与経路、投与の時間、治療の持続時間、使用する具体的な追加的治療法、治療される患者の年齢、性別、体重、病状、全般的健康状態および病歴、ならびに当技術分野において周知の同様の要因といった、いくつかの要因に依存すると考えられる。
【０２５６】
結合性分子または組成物は通常、複数の機会に投与される。個々の投薬間の間隔は、例えば、毎週、毎月、3カ月毎または毎年であってよい。例示的な治療レジメンは、毎週1回、2週毎に1回、3週毎に1回、4週毎に1回、毎月1回、3カ月毎に1回、または3カ月〜6カ月毎に1回の投与を必要とする。抗ヒトCD134抗体の典型的な投薬レジメンは、以下の投薬スケジュールのうち1つを用いた、1mg／kg体重または3mg／kg体重での静脈内投与を介するものを含む：（i）4週毎に6回投薬し、その後は3カ月毎とする；（ii）3週毎；（iii）3mg／kg体重を1回、その後は3週毎に1mg／kg体重とする。
【０２５７】
本発明は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134（OX40）受容体とのOX40リガンド（OX40L）の結合を妨げない結合性分子を提供する。いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、該分子の飽和濃度またはそれを上回る濃度で、50％を超えては低下しない。いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、結合性分子の濃度が70nMで、70％を超えては低下しない。本発明はさらに、
（a）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。
【０２５８】
いくつかの態様において、結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：16のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR3
を含む。
【０２５９】
1つの好ましい態様において、結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR3
を含む。
【０２６０】
本発明はさらに、ヒトCD134との結合に関して、
（a）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体と競合する結合性分子を提供する。
【０２６１】
また、
（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体；および／または
（b）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体
を含む結合性分子も提供される。
【０２６２】
1つの態様において、本発明による結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR3
を含む。
【０２６３】
1つの態様において、本発明による結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR3
を含む。
【０２６４】
1つの態様において、結合性分子は、ヒトCD134との結合に関して、
（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体と競合する。
【０２６５】
1つの態様において、結合性分子は、ヒトCD134の細胞外ドメインのアミノ酸配列中のエピトープと特異的に結合する。いくつかの態様において、結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：34；
（b）SEQ ID NO：35
（c）SEQ ID NO：36；
（d）SEQ ID NO：38；および／または
（d）SEQ ID NO：92
のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する。
【０２６６】
いくつかの態様において、結合性分子は、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するのに関与する、ヒトCD134発現性ヒト免疫担当細胞（例えば、活性化Teffおよび／または活性化Treg）上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134受容体の結合を妨げない。
【０２６７】
いくつかの態様において、結合性分子は、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するのに関与するヒトCD134発現性ヒト免疫担当細胞（例えば、活性化Teffおよび／または活性化Treg）上での、ヒトOX40リガンド（OX40L）の結合性および／または免疫賦活性応答を強化する。
【０２６８】
いくつかの態様において、結合性分子は、ヒトCD134発現性エフェクターT細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を妨害しない。
【０２６９】
本発明はまた、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性エフェクターT細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を強化する結合性分子も提供する。
【０２７０】
本発明はさらに、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を妨害しない結合性分子を提供する。
【０２７１】
また、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を強化する結合性分子も提供される。
【０２７２】
また、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げないが、ヒトOX40Lの増殖性応答を妨害しない結合性分子も提供される。
【０２７３】
さらにまた、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げないが、ヒトOX40Lの増殖性応答は阻害する結合性分子も提供される。
【０２７４】
本発明の結合性分子は、好ましくは、該分子の飽和濃度またはそれを上回る濃度で、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用を50％を超えては低下させない結合性分子である。
【０２７５】
本発明の結合性分子は、好ましくは、結合性分子の濃度が70nMで、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用を70％を超えては低下させない結合性分子である。
【０２７６】
1つの態様において、本発明による結合性分子はヒト化抗体である。もう1つの態様において、本発明による結合性分子はキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはDeImmunized（商標）抗体、またはそれらの断片である。
【０２７７】
さらにもう1つの態様において、本発明による結合性分子は、抗体、抗体模倣物（例えば、非抗体性スキャフォールドに基づくもの）、RNAアプタマー、小分子またはCovX-bodyである。
【０２７８】
いくつかの態様において、本発明による結合性分子は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgM抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体などである。
【０２７９】
いくつかの態様において、結合性分子はIgG4抗体である。
【０２８０】
いくつかの態様において、抗体は、例えば以下のものからなる群より選択される、抗体の抗原結合性断片である：Fv断片（例えば、単鎖Fvおよびジスルフィド結合したFv）；Fab様断片（例えば、Fab断片、Fab'断片およびF(ab')2断片）；ならびにドメイン抗体。いくつかの態様において、抗原結合性断片または結合部分はscFvである。いくつかの態様において、結合モイエティーは組換え抗体である。いくつかの態様において、結合部分はモノクローナル抗体である。
【０２８１】
本発明はまた、結合部分がポリペプチドであることを条件とする、前記の特許請求の範囲のいずれか1つに記載の結合性分子をコードする核酸分子も提供する。
【０２８２】
また、本発明による少なくとも1つの核酸分子を含むベクターも提供される。
【０２８３】
さらに、本発明によるベクターまたは核酸を含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は好ましくは、哺乳動物または昆虫に由来する。
【０２８４】
本発明はさらに、本発明による結合性分子を調製するための方法であって、（i）CD134結合性分子を調製する段階、および（ii）OX40LのCD134との結合を妨げない結合性分子の同定および入手のために該分子をスクリーニングする段階を含む方法を提供する。段階（ii）は、好ましくは、飽和濃度のOX40LへのCD134の曝露後に、CD134と結合する結合性分子を同定する段階を含む。結合性分子がモノクローナル抗体である場合には、結合性分子を調製するための方法は、動物にヒトCD134による免疫処置を行う段階、抗CD134抗体を分泌するハイブリドーマを調製する段階、および抗CD134抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする段階を含む。本発明はさらに、必要とする対象において癌の予防または治療に用いるための、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子も提供する。いくつかの態様において、癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、血液のがん、黒色腫、または制御不能な細胞増殖によって特徴づけられる他の任意の疾患もしくは障害である。
【０２８５】
さらに、ヒト対象における免疫応答を強化する方法であって、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子の治療的有効量、および任意で薬学的に許容される担体を、ヒト対象に投与する段階を含む方法も提供される。強化される免疫応答には、エフェクターT細胞の、任意でそれらの細胞の増殖の結果としての、免疫賦活／エフェクター機能の増大、および／または調節性T細胞の、任意でそれらの細胞の数の増大を伴わない、免疫抑制機能のダウンレギュレーションが含まれうる。
【０２８６】
また、癌の治療を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子の治療的有効量をヒト対象に投与する段階を含む方法も提供される。いくつかの態様において、癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、血液のがん、黒色腫、または制御不能な細胞増殖によって特徴づけられる他の任意の疾患もしくは障害である。
【０２８７】
また、対象における腫瘍のサイズを縮小させるか、もしくは癌細胞の増殖を阻害する、または癌に罹患した対象における転移性癌の発症を減少させるかもしくは阻害する方法であって、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子をヒト対象に投与する段階を含む方法も提供される。
【０２８８】
本発明はさらに、癌の治療または予防のための医薬の調製における、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子の使用を提供する。
【０２８９】
また、本発明による、または本発明に従って作製された結合部分を、1種または複数種の薬学的に許容される希釈剤または添加剤とともに含む、薬学的組成物も提供される。組成物は好ましくは、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、経気管的、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内または皮下投与による、ヒト体内への非経口的投与に適している。
【０２９０】
発明のさらなる態様
以下に示されるのは、本明細書中の他所での開示による、本発明のいくつかの特定のさらなる番号付きの態様である。本明細書において開示される発明に関係すると上記に示された本発明の態様による特徴は、これらのさらなる番号付きの態様のあらゆるそれぞれのものにも関する。
1．ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：100の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：100のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。
2．VHがSEQ ID NO：152のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：152のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様1記載の抗体。
3．VHがSEQ ID NO：99のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：99のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様1または2記載の抗体。
4．HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含む、態様1〜3のいずれか1つに記載の抗体。
5．HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含む、態様4記載の抗体。
6．HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む、態様5記載の抗体。
7．a．VLがSEQ ID NO：67もしくは68のアミノ酸配列を含み；かつ
b．VHが、SEQ ID NO：69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147もしくは148のアミノ酸配列を含み、任意で直鎖状アミノ酸残基位置11、55もしくは99に置換を有する；または
c．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：67および69；
ii．それぞれSEQ ID NO：67および70；
iii．それぞれSEQ ID NO：67および71；
iv．それぞれSEQ ID NO：68および69；
v．それぞれSEQ ID NO：68および70；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：68および71
のアミノ酸配列を含む、態様1〜6のいずれか1つに記載の抗体。
8．直鎖状アミノ酸残基位置にある置換がV11L、N55Q、N55A、N55E、M99LまたはM99Iである、態様1〜7のいずれか1つに記載の抗体。
9．結合性分子が、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、態様1〜8のいずれか1つに記載の抗体。
10．ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、態様1〜9のいずれか1つに記載の抗体。
11．CD134のアゴニストである、態様1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
12．IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、態様1〜11のいずれか1つに記載の抗体。
13．Fc領域に置換を含む、態様1〜12のいずれか1つに記載の抗体。
14．置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、態様13記載の抗体。
15．置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、態様14記載の抗体。
16．態様1〜3または7のいずれか1つに記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
17．態様16記載の核酸分子を含むベクター。
18．態様17記載のベクターを含む宿主細胞。
19．免疫応答の強化を必要とする対象の治療に用いるための、態様1〜15、23〜37、41〜45または49のいずれか1つに記載の抗体。
20．癌の治療に用いるための、態様1〜15、23〜37、41〜45または49のいずれか1つに記載の抗体。
21．癌が前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、癌の治療に用いるための態様20記載の抗体。
22．態様1〜15、23〜37または41〜45のいずれか1つに記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
23．ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：98の軽鎖可変領域（VL）ならびに鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：98のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。
24．VHがSEQ ID NO：134のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：134のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様23記載の抗体。
25．VHがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：97のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様23または24記載の抗体。
26．HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含む、態様23〜25のいずれか1つに記載の抗体。
27．HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含む、態様26記載の抗体。
28．HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む、態様27記載の抗体。
29．a．VLがSEQ ID NO：62もしくは63のアミノ酸配列を含み；かつ
b．VHが、SEQ ID NO：64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150もしくは151のアミノ酸配列を含み、任意で直鎖状アミノ酸残基位置11、56もしくは106に置換を有する；または
c．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：62および64；
ii．それぞれSEQ ID NO：62および65；
iii．それぞれSEQ ID NO：62および66；
iv．それぞれSEQ ID NO：63および64；
v．それぞれSEQ ID NO：63および65；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：63および66
のアミノ酸配列を含む、態様23〜29のいずれか1つに記載の抗体。
30．直鎖状アミノ酸残基位置にある置換が、V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106LまたはM106Iである、態様23〜29のいずれか1つに記載の抗体。
31．SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、態様23〜30のいずれか1つに記載の抗体。
32．ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、態様23〜31のいずれか1つに記載の抗体。
33．CD134のアゴニストである、態様23〜32のいずれか1つに記載の抗体。
34．IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、態様23〜33のいずれか1つに記載の抗体。
35．Fc領域に置換を含む、態様23〜34のいずれか1つに記載の抗体。
36．置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、態様35記載の抗体。
37．置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、態様36記載の抗体。
38．態様23〜37のいずれか1つに記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
39．態様38記載の核酸分子を含むベクター。
40．態様39記載のベクターを含む宿主細胞。
41．ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含み；
e．LCDR2がSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含み；
ただし、SEQ ID NO：14、15および16のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：17、18および19のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。
42．a．それぞれSEQ ID NO：14、15、144；
b．それぞれSEQ ID NO：14、141、16；
c．それぞれSEQ ID NO：14、142、16；
d．それぞれSEQ ID NO：14、141、144；または
e．それぞれSEQ ID NO：14、142、144
である、HCDR1、HCDR2およびHCDR3配列を含む、態様41記載の単離された抗体。
43．ヒト化、DeImmunized（商標）されているか、またはヒト型である、態様41または42記載の単離された抗体。
44．IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、態様41〜43のいずれか1つに記載の単離された抗体。
45．Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする置換をFc領域に含み、置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、態様41〜44のいずれか1つに記載の単離された抗体。
46．態様41記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
47．態様46記載の核酸分子を含むベクター。
48．態様47記載のベクターを含む宿主細胞。
49．ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含み；
e．LCDR2がSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含み；
g．ただし、SEQ ID NO：6、7および8のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：9、10および11のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。
【０２９１】
本発明はさらに、諸態様を提供する。
Z1．（a）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子。
Z2．（a）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子。
Z3．ヒトCD134と結合する、態様Z1または態様Z2記載の結合性分子。
Z4．ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を妨げない、態様Z1〜Z3のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z5．前記CD134分子に対する結合が飽和する濃度またはそれを上回る濃度で、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用を50％を超えては低下させない、態様Z1〜Z4のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z6．結合性分子の濃度が70nMで、ヒトCD134発現性T細胞上でのCD134に対するOX40Lの結合作用を70％を超えては低下させない、態様Z1〜Z5のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z7．SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38および／またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、態様Z1〜Z6のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z8．Fab断片、単鎖Fv（scFv）断片または抗体である、態様Z1〜Z7のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z9．ヒト化またはDeImmunized（商標）されたIgG、IgA、IgD、IgEまたはIgM抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体などである、態様Z8記載の抗体。
Z10．態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体をコードする核酸分子。
Z11．態様Z10記載の核酸を含む、遺伝子送達媒体またはベクター。
Z12．態様Z10またはZ11記載の核酸またはベクターを含む、単離された細胞もしくは組換え細胞、またはインビトロ細胞培養細胞。
Z13．態様Z1〜Z8のいずれか1つに記載の結合性分子、または態様Z9記載の抗体が作製されることを特徴とする、結合性分子を作製するための方法。
Z14．免疫応答の強化を必要とする個体の治療に用いるための、態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体。
Z15．それを必要とする個体において癌の予防または治療に用いるための、態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体。
Z16．態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【０２９２】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それらはその範囲に限定を課すものとは全く見なされるべきでない。その反対に、本明細書中の説明を読んだ後に、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく当業者に想起されるであろう、本発明のさまざまな他の態様、改変物および同等物も使用しうることが明確に理解されるべきである。
【実施例】
【０２９３】
実施例1．マウス抗ヒトCD134（＝OX40）モノクローナル抗体の作製
（a）．表面CD134を発現するSf9昆虫細胞の作製
ヒトCD134タンパク質をコードするcDNA（GenBank ref CAB96543.1；SEQ ID NO.1参照）を、Sf9昆虫細胞（ヨトウガ（Spodotera frugiperda））での発現用に最適化した上で、GENEART（Regensburg, Germany）によって合成した（SEQ ID NO.2参照；カタログ番号0904551(BC internal code V076)）。このcDNAを、バキュロウイルス移入プラスミドpVL1393（BDトランスフェクションキット、カタログ番号560129；BD Biosciences）中にサブクローニングした。その後に、Sf9昆虫細胞（ATCC）に対して、ヒトCD134をコードするcDNAを含む移入プラスミドpVL1393をBaculoGold Baculovirus DNA（BDトランスフェクションキット）とともに同時形質移入し、続いて27℃で4〜5日間インキュベートした。この同時形質移入段階の後に、上清を収集し、4℃で貯蔵した上で、ウイルス増幅のためにさらに多くのSf9昆虫細胞を感染させるために用いた。これを目的として、Sf9昆虫細胞に対して増幅した組換えバキュロウイルスを形質移入し、続いて27℃で3〜5日間インキュベートした。これらのSf9昆虫細胞を採取し、滅菌PBSで洗浄して、PBS中、細胞約2×106個／250μlのアリコートとし、-80℃で貯蔵して、細胞溶解物を調製した。貯蔵の前に、形質移入されたSf9昆虫細胞上でのヒトCD134表面発現を、1：10フィコエリトリン（PE）結合マウス抗ヒトCD134（クローンACT35；BD Biosciences）およびフローサイトメトリーを用いて確認した。
【０２９４】
（b）．免疫処置およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体の作製
BALB／cマウス（雌性、6週齡；Charles River Laboratories）に対して、第0日に、ヒトCD134を形質移入したSf9昆虫細胞溶解物の約400μL（250μlの細胞溶解物アリコート＋250μlの完全フロイントアジュバント；Sigma）を皮下注射した。ヒトCD134を形質移入したSf9昆虫細胞溶解物および不完全フロイントアジュバント（Sigma）を用いる同様の皮下注射を第21日および第42日に行った。ヒトCD134を形質移入したSf9昆虫細胞溶解物（250μl／匹）をアジュバントなしに、第61日および第62日に腹腔内への追加免疫注射を行った。第65日に、Kohler and Milstein (Nature 1975; 256: p495-497）によって最初に記載された標準的なハイブリドーマ技術を用いて、免疫処置マウスからの脾細胞をSP2／0骨髄腫細胞（DSMZ）と融合させた。手短に述べると、免疫処置マウスを屠殺した。脾臓を切り裂いて脾細胞を取り出し、GlutaMax培地を含むOpti-MEM I（SF培地；Invitrogen）中で洗浄した。対数増殖期にあるSP2／0-Ag14骨髄腫細胞をSF培地中で洗浄し、脾細胞に添加して、脾細胞と骨髄腫細胞との比を5：1とした。続いて細胞をペレット化し、上清を除去した。続いて、ポリエチレングリコール4000（Merck）の37％（v／v）溶液の1mlを60秒の期間をかけて滴加し、その後に細胞を37℃でさらに60秒間インキュベートした。続いて、8mlのSF培地、その後にGlutaMax／10％（v／v）ウシ胎仔血清（FCS；Bodinco）を含む5mlのopti-MEM Iを、穏やかに撹拌しながらゆっくりと添加した。室温で30分おいた後、細胞をペレット化し、GlutaMax／10％ FCSを含むopti-MEM I中で洗浄して残留ポリエチレングリコールを除去し、最後に、1ウェル当たり細胞105個／200μlの濃度で、GlutaMax／10％ FCS／50×Hybri-Max（商標）アミノプテリン（デノボDNA合成阻害薬；Sigma）を含むopti-MEM I中にてプレーティングした。第7日以後は、アミノプテリン選択培地を2〜3日毎に補充し、第14日にGlutaMax／10％ FCSを含むopti-MEM Iと入れ替えた。ヒトCD134に対する抗体（マウスIgGクラス）を産生するハイブリドーマ（組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質（R&D Systems；以下の実施例11（a）参照）およびヒトCD134発現性PHA（Roche）で刺激したCD4 T細胞芽球（以下の実施例2（a）参照）をそれぞれ標的として用いる従来のELISAおよびフローサイトメトリー手法によってスクリーニングした）を増殖させ、凍結保存して、限界希釈によってサブクローニングを行った。プロテインGカラム（GE Healthcare）を用いて抗ヒトCD134特異的モノクローナル抗体を精製し、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびクローン20E5を得た。
【０２９５】
実施例2．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5のフローサイトメトリーによる特性決定
（a）．PHAで刺激されたヒトTリンパ球上でのCD134発現
健常ドナー（インフォームドコンセントを得た）由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（1.077g／mL；Nycomed）での密度勾配遠心法によって単離した。その後、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI-1640培地（Gibco）中の1〜2×106個のPBMC／mLを、0、0.1、1.0または10.0μg／mLのフィトヘマグルチニン-M（PHA-M；Roche）で刺激し、37℃、5％ CO2にて1〜3日おいた。培養後にPBMCを採取し、10％ヒトプール血清（HPS；Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた0.1％ウシ血清アルブミン（Sigma）／0.05％ NaN3を含む氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS／BSA／NaN3）中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、10μg／mLの市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35（マウスIgG1アイソタイプ；BD Biosciences, Alphen aan de Rijn, Netherlands）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、続いて細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、Tリンパ球の検出用の1：20希釈したフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合マウス抗ヒトCD3抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中に4℃で30分間おいて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０２９６】
図1に示されているように（n＝各ドナーから1件）、末梢血由来の非刺激／休止ヒトTリンパ球はCD134を全く発現しなかったが、PHAは表面CD134を発現するようにヒトCD3陽性 Tリンパ球を用量依存的に刺激した。10μg／mL PHAに曝露させた場合に、活性化されたヒトCD3陽性 Tリンパ球上のCD134発現レベルは「第1日」と「第2日」との間にプラトーに達したと考えられたが、ヒトCD134陽性／CD3陽性Tリンパ球のパーセンテージは実験の間に時間依存的に増加した。
【０２９７】
（b）．PHAで刺激されたヒトCD4 Tリンパ球部分集団でのCD134発現
PHAで刺激された（0および10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）とともに、1：10希釈した市販のPE結合マウス抗ヒトCD134クローンACT35（BD Biosciences）と組み合わせて、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中に4℃で30分間おいて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０２９８】
図2に示されているように、CD134発現は、PHAで刺激されたヒトCD4陽性 Tリンパ球で観察され、休止ヒトCD4陽性 Tリンパ球では観察されなかった。PHAで活性化されたヒトCD8陽性 Tリンパ球では低度のCD134発現が見いだされたが、休止ヒトCD8陽性 Tリンパ球では見いだされなかった（データは提示せず）。
【０２９９】
（c）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の結合
PHAで刺激された（10μg／mLで2日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg／mLの市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35（マウスIgG1アイソタイプ；BD Biosciences）およびマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3またはクローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、Tリンパ球を検出するための1：20希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD3抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３００】
図3に示されているように（平均±SD；2件のドナーで観察された結果）、マウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35、クローン12H3およびクローン20H5は、PHAで刺激されたCD3陽性 Tリンパ球上のヒトCD134表面分子をおよそ5.0〜10.0μg／mLで飽和させた。これらの2件のドナーを用いたところ、結合の最大半量は、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3では約0.5μg／mLであり、マウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35およびクローン20E5では約2.5μg／mLであった。
【０３０１】
（d）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の結合
PHAで刺激された（20μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLマウスIgG1κアイソタイプ対照（BD Biosciences）または20.0μg／mLマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはクローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：100希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、Tリンパ球部分集団を検出するために、細胞を、1：20希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：20希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）ともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中に4℃で30分間おいて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３０２】
図4に示されているように、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびクローン20E5は、活性化されたヒトCD4陽性 Tリンパ球部分集団では明らかな陽性染色が示され、活性化されたヒトCD8陽性 Tリンパ球部分集団では軽度の陽性染色が示された。
【０３０３】
（e）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、市販のPE結合マウス抗CD134抗体との交差競合
PHA（10μg／mLまたは20μg／mLでそれぞれ4日間または1日間；上記参照）で刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を20μg／mLの非標識マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または10μg／mLの非標識クローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。細胞をその後、1：20希釈したPE結合市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35（BD Biosciences）またはクローンL106（BD Biosciences；Godfrey特許も参照）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。市販のPE結合抗CD134抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３０４】
図5に示されているように、非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3とのプレインキュベーションにより、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134に対する市販のPE結合マウス抗ヒトCD134抗体クローンL106の結合は部分的に遮断された。非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5とのプレインキュベーションにより、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134に対する市販のPE結合マウス抗ヒトCD134抗体クローンL106の結合はわずかに遮断された。非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5とのプレインキュベーションでは、ACT35 PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134に対する市販のPE結合マウス抗ヒトCD134抗体クローンの結合作用は示されなかった。
【０３０５】
これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3が、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134を特異的に認識し（クローンL106の結合を部分的に遮断）、かつ（ii）市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンL106によって認識されるものとは同一ではないヒトCD134のエピトープと結合することが実証された。また、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5が（i）PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134を特異的に認識し（クローンL106結合を軽微に遮断）、かつ（ii）市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンL106によって認識される非同一エピトープと結合することも実証された。さらに、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5が、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134エピトープを認識していると考えられ、それは市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35によって認識されるエピトープとは異なることも実証された。加えて、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5が、PHAで刺激されたTリンパ球上の類似性のないヒトCD134エピトープ（L106結合の部分的遮断と軽微な遮断の対比により立証）を認識していると考えられることも実証された。
【０３０６】
（f）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、組換えヒトOX40リガンドとマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5との同時結合
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、10.0μg／mLポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40リガンド（OX40L；R&D Systems）と50.0μg／mL抗ポリヒスチジン抗体（マウスIgG1、クローンAD1.1.10；R&D Systems）との組み合わせとともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：100希釈したFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を10.0μg／mLのビオチン化（PierceによるN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチンを使用）マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはクローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：100希釈したPE結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３０７】
図6に示されているように、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5はいずれも、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上でヒトOX40Lと同時に結合した。このことから、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびクローン20E5が、ヒトCD134受容体上のOX40L結合領域内部のエピトープとは相互作用しないことが示された。この所見は、ヒトCD134受容体のヒトOX40L結合領域内部のエピトープを認識した市販のマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローンL106（Stanford University／Godfrey特許EP 0 726 952 B1）とは対照的である（Taylor and Schwarz. J Immunol Methods 2001; 255: 67-72；Kirin & La Jolla Institute/Croft特許WO 2007/062235 A2）。
【０３０８】
（g）．抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズによる刺激後のヒトエフェクターTリンパ球および調節性Tリンパ球上でのCD134発現
ヒトCD4 Tリンパ球を、マイクロビーズ結合マウス抗ヒトCD4抗体（Miltenyi Biotec）を用いる陽性選択およびVarioMACS（商標）Magnet／LSカラム（Miltenyi Biotec）によって、PBMCから精製した。その後に、これらのCD4 Tリンパ球をFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（Dako）およびPE結合マウス抗ヒトCD25抗体（BD Biosciences）によって染色した。CD4陽性／CD25陰性の従来のエフェクターTリンパ球（Teff）およびCD4陽性／CD25highの調節性Tリンパ球（Treg）を、Altraフローサイトメトリー細胞分取装置（Beckman-Coulter）を用いて分取した。これにより、95％超のTeffおよび95％超のTregの濃縮物が得られた。TeffおよびTregを、0.02mMピルビン酸塩（Gibco）、100U／mL ペニシリン（Gibco）、100μg／mLストレプトマイシン（Gibco）および10％非働化HPS（HPSi；LMIによる）を加えたRPMI-1640／glutamax培地（Gibco）中に2.5×105個／mLで入れた。続いて、細胞を96ウェル丸底プレート（Greiner）に2.5×104個／200μL／ウェルで播種した上で、25U／mL組換えヒトインターロイキン-2（Novartis Pharmaceuticals UK LtdによるProleukin（登録商標））の存在下で、マウス抗ヒトCD3／マウス抗ヒトCD28抗体刺激ビーズ（CD3／CD28ビーズ；Invitrogen）により、ビーズ1個／細胞2個として37℃、5％ CO2で2〜8日間刺激した。培養後に、細胞を採取して、氷冷PBS／0.2％BSA中に1〜2×106個／mLで入れ、1：50希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（Dako）、1：10希釈したPE結合マウス抗ヒトCD25抗体（BD Biosciences）、1：50希釈したECD（商標）結合マウス抗ヒトCD3抗体（Beckman-Coulter）、1：10希釈したPE-Cy（商標）5結合マウス抗ヒトCD134抗体（クローンATC35；BD Biosciences）および1：10希釈したPE-Cy（商標）7結合マウス抗ヒトCD127抗体（eBiosciences）により同時に染色した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３０９】
図7に示されているように（n＝各ドナーから1件）、末梢血で精製した非刺激／休止（第0日）ヒトTeffおよびヒトTregはCD134を全く発現しなかったが、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトTeffおよびヒトTregは表面CD134を発現した。活性化されたヒトTeffおよびヒトTreg上でのCD134発現は培養下で2日後にピークに達し、培養下で5日後および8日後には減弱した。
【０３１０】
実施例3．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の生物学的特性決定
（a）．マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後の、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
PHAで刺激された（0および10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取して、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中に2×106個／mLで懸濁させた。細胞を96ウェル平底プレート（Corning）中に0.1×106個／100μL／ウェル（すなわち、1×106個／mL）で播種した上で、0、0.025、0.25、2.5もしくは25.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3もしくはマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5に対して、または／および、0、0.01、0.1もしくは1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体；R&D Systemsの存在下）との組み合わせに対して、37℃、5％ CO2で6日間曝露させた。6日後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISAリーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。
【０３１１】
図8に示されているように（平均±SD、n＝4、1件のドナーを使用）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を用量依存的に誘導した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3は、0.25、2.5および25μg／mLで増殖を誘導した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3は、2.5および25μg／mLで増殖を誘導した。加えて、ヒトOX40Lも、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を用量依存的に誘導した。ヒトOX40Lは、0.1および1.0μg／mLで増殖を誘導した。休止（PHA刺激を伴わない）ヒトCD134陰性 Tリンパ球は、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5またはヒトOX40Lによる処置後に、増殖性応答を全く示さなかった（データは提示せず）。
【０３１２】
図9に示されているように（平均±SD、n＝2、1件のドナーを使用）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3（2.5および25μg／mL）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5（2.5および25μg／mL）およびヒトOX40L（1.0μg／mL）は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を誘導した。非処置（媒質のみ）またはマウスIgG1κアイソタイプ対照（2.5および25μg／mL；BD Biosciences）による処置は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球増殖に対して何ら効果を示さなかった。2.5および25μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず））でのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、または2.5および25μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）でのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5と、1.0μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）でのヒトOX40Lとの組み合わせは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対して、いかなる相互的（すなわち、相乗的もしくは相加的な、またはさらには阻害的な）効果も示さなかった。
【０３１３】
（b）．マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後の、抗ヒトCD3／抗CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性エフェクターTリンパ球および調節性Tリンパ球の増殖
ヒトCD4 Tリンパ球を、ヒトCD8（クローンRPA-T8）、CD14（クローンM5E2）、CD16（クローン3G8）、CD19（クローン4G7）、CD33（クローンP67.6）、CD56（クローンB159）およびCD235a（HIR2）を対象とするマウス抗体の混合物（BD BioSciences）を用いる陰性選択によって、PBMCから精製した。Dynabeads（登録商標）結合ヒツジ抗マウスIgG（Invitrogen）とのインキュベーション後に、非結合CD4 Tリンパ球を、Dynal Magnetic Particle Concentrator、MPC（商標）-6（Invitrogen）によって収集した。これらの濃縮されたCD4 Tリンパ球から、CD25high TregおよびCD25陰性 Teffを、10μlのマイクロビーズ結合マウス抗ヒトCD25抗体（Miltenyi Biotec）／細胞107個およびMiniMACS（商標）Magnet／MSカラム（Miltenyi Biotec VarioMACS（商標）Magnet／LSカラム（Miltenyi Biotec）を用いるMACS分取法によって分離した。これにより、90％超のTeffおよび90％超のTregの濃縮物が得られた。TeffおよびTregを、0.02mMピルビン酸塩（Gibco）、100U／mLペニシリン（Gibco）、100μg／mLストレプトマイシン（Gibco）および10％ HPSiを加えたRPMI-1640／glutamax培地（Gibco）中に、0.25×106個／mLで入れた。続いて、TeffおよびTregを、96ウェル丸底プレート（Greiner）中に2.5×104個／200μL／ウェル（すなわち、0.125×106個／mL）で播種した上で、5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5、1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体；R&D Systemsの存在下）、5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3と1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下）の組み合わせ、または5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5と1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下）の組み合わせを伴うかまたは伴わずに、ビーズ1個／細胞5個のCD3／CD28ビーズ（Invitrogen）により、37℃／5％ CO2で4日間または5日間刺激した。4日後または5日後に、細胞増殖を、0.5μCiのトリチウム標識チミジン（Perkin & Elmer）の取込みおよびβ-計数器（Canberra-Packard）を用いて測定した。
【０３１４】
図10に示されているように（平均±SD）、CD3／CD28刺激ビーズは単独でも、ヒトCD134発現性Teffのかなりの増殖を誘導したが（すなわち、「培地」）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはヒトOX40Lは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおけるさらなる増殖を誘導した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおけるさらなる増殖を誘導しなかった。
【０３１５】
図11に示されているように（5件のドナーによる平均±SEM）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tregにおける増殖を誘導しないか、わずかな増殖しか誘導しなかったが、一方、ヒトOX40LはCD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tregにおける極めて強い増殖を誘導した。
【０３１６】
図12Aに示されているように（平均±SD）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3とヒトOX40Lとの組み合わせは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおけるいかなる相互的（すなわち、阻害的、相乗的または相加的）効果も示さなかった。その上、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5とヒトOX40Lとの組み合わせは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおいても、いかなる相互的（すなわち、阻害的、相乗的または相加的）効果も示さなかった（データは提示せず）。
【０３１７】
図12Bに示されているように（平均±SD）、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性TeffにおいてヒトOX40L媒介性の増殖性応答での効果（が認められなかったこと）とは対照的に、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3は、 CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性TregにおけるヒトOX40L媒介性の増殖性応答を強く抑制した。
【０３１８】
（c）．マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後の、抗ヒトCD3／抗CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性調節性Tリンパ球の抑制機能
ヒトCD4 Tリンパ球をPBMCから精製し、上記の実施例3（b）に記載した通りにTeffおよびTregを濃縮した。TeffおよびTregを、0.02mMピルビン酸塩（Gibco）、100U／mLペニシリン（Gibco）、100μg／mLストレプトマイシン（Gibco）および10％ HPSiを加えたRPMI-1640／glutamax培地（Gibco）中に、0.25×106個／mLで入れた。続いて、Teffを96ウェル丸底プレート（Greiner）に2.5×104個／200μL／ウェル（すなわち、0.125×106個のTeff／mL）で播種し、2.5×104個の抑制性Treg／200μL／ウェル（すなわち、0.125×106個のTreg／mL；Teff／Treg比＝1：1）と共培養した。これらのTeff／Treg共培養物を、5.0μg／mLマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、5.0μg／mLマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および1.0μg／mLポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体；R&D Systems）を伴うかまたは伴わずに、ビーズ1個／細胞10個のCD3／CD28ビーズ（Invitrogen）により、37℃、5％ CO2で5日間刺激した。5日後に、0.5μCiトリチウム標識チミジン（Perkin & Elmer）取込みおよびβ-計数器（Canberra-Packard）を用いて細胞増殖を測定した。
【０３１９】
図13に示されているように（平均±SD）、ヒトTregは、CD3／CD28ビーズ誘導性のヒトTeff増殖性応答を抑制した（すなわち、「培地」）。ヒトTregのこの抑制機能は、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の存在下またはヒトOX40Lの存在下では弱まった。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、ヒトTreg抑制機能に対して何ら効果を示さなかった。
【０３２０】
実施例4．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の分子遺伝学的特性決定
（a）．アイソタイプ判定およびエドマン分解
プロテインGで精製したマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3のマウス免疫グロブリンのクラス、アイソタイプおよび軽鎖の型を、IsoStrip（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイプキット（Roche）を用いて判定したところ、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3はいずれも、重鎖およびκ軽鎖を有するIgG1からなった。
【０３２１】
プレキャストゲルNuPage（登録商標）Novex（登録商標）システム（Invitrogen）を還元（DTTおよび70℃加熱）条件下で用いる標準的なSDS-PAGE電気泳動の後に、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5を、ポリビニリデンフロリド（PDVF／Immobilon-P）転写膜（Millipore）に対してエレクトロブロットし、クーマシーブリリアントブルー（BioRad）で染色した。続いて、重鎖バンドおよび軽鎖バンド（それぞれ50kDaおよび25kDa）をPVDF膜から切り出して、N末端アミノ酸配列を決定するためのエドマン分解分析に用いた（EuroSequence, Groningen, Netherlandsにより実施）。その結果は、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5についてSEQ ID NO.3およびSEQ ID NO.61に示されている。重鎖からのN末端の11個のアミノ酸、および軽鎖からのN末端の11個のアミノ酸を決定した。
【０３２２】
（b）．RT PCR
クローン20E5および12H3のハイブリドーマ細胞を細胞培養物から採取した。細胞をPBSで洗浄し、細胞5×106個を含むようにバイアルに分注した上で、ペレットとして-80℃で貯蔵した。細胞ペレットを、RNeasy Mini Isolation Kit（QIAGEN）を用いることによってRNAを単離するために用いた。RNA濃度を決定し（A260nm）、RNAを-80℃で貯蔵した。単離されたRNAの総収量は、クローン20E5およびクローン12H3についてそれぞれ27.3μgおよび58.4μgであった（A260／A280比はいずれも1.9）。逆転写酵素により、RevertAid（商標）H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）を用いて1μgのRNAからcDNAを合成し、-20℃で貯蔵した。
【０３２３】
マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5のアイソタイプ（マウスκ／IgG1）およびエドマン分解分析に基づき、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5のV領域を増幅するための以下のプライマーを設計した。
2016515544.tif 000057
* 番号はBioceros社の内部符号方式による
** 縮重プライマー：N＝A、C、GまたはT、Y＝CまたはT、R＝AまたはG、W＝AまたはT、およびS＝GまたはC。
【０３２４】
マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のアイソタイプ（マウスκ／IgG1）、およびマウスシグナルペプチド（Antibody Engineering Volume 1 Kontermann, Roland E.; Dubel, Stefan (Eds.), Springer Lab Manuals, 2nd ed., 2010に一部基づく）をコードするcDNAとのセンスプライマーのアニーリングに基づき、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のV領域を増幅するための以下のプライマーを設計した。
2016515544.tif 000058
* 番号はBioceros社の内部符号方式による
** 縮重プライマー：N＝A、C、GまたはT、Y＝CまたはT、R＝AまたはG、W＝AまたはT、およびS＝GまたはC、M＝CまたはA、およびK＝GまたはT。
【０３２５】
プライマー201および266は、それぞれマウスκ遺伝子の定常領域内の位置214〜232および236〜255でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号V00807［バージョンV00807.1］に基づく）。
【０３２６】
プライマー203および204は、それぞれマウスIgG1の定常領域内の位置115〜134および221〜240でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号J00453［バージョンJ00453.1］に基づく）。
【０３２７】
プライマー259および260は、エドマン分解に基づく、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5の重鎖のN末端（それぞれアミノ酸1〜8および2〜9）でアニーリングするセンス縮重プライマー（縮重はそれぞれ512および256種類）である。
【０３２８】
プライマー265は、エドマン分解に基づく、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5の軽鎖のN末端（アミノ酸1〜7）でアニーリングするセンス縮重プライマー（縮重は16種類）である。
【０３２９】
プライマー416は、マウスIgG1の定常領域内の位置111〜131でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号J00453［バージョンJ00453.1］に基づく）。
【０３３０】
プライマー394は、マウスκ遺伝子の定常領域内の位置235〜254でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号V00807［バージョンV00807.1］に基づく）。
【０３３１】
プライマー389、405および410は、マウス抗体のシグナルペプチド配列とアニーリングする縮重プライマー（縮重はそれぞれ2、8および8種類）である。プライマー389は軽鎖用に、プライマー405および410は重鎖用に設計されている。
【０３３２】
プライマー201、266、203、204、259、260および265を、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5の可変領域を増幅するためにさまざまな組み合わせで用い、プライマー416、394、405、410および389を、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の可変領域を増幅するためにさまざまな組み合わせで用いた。生成された両方のクローンのcDNAをテンプレートとして用いて、種々のさまざまなPCRを行った。
【０３３３】
Accuprime（商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5およびクローン12H3の両方の重鎖および軽鎖の可変領域を増幅した。PCR産物を1％アガロースゲルにて分析した。PCR反応の産物をゲル精製して、配列分析のためにpCR-Blunt II-TOPO（登録商標）ベクター中にクローニングした。PCRインサートを含むプラスミドから、クローニングされたインサートを、T7を用いるDNAシークエンシングによって分析して（ServicXS B.V., Leiden, NetherlandsまたはMacrogen, Amsterdam, Netherlandsにより実施）、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5および12H3のV領域に関するコンセンサス配列を入手した。マウス抗CD134抗体クローン20E5については、情報的価値のある11種の配列重鎖反応および情報的価値のある3種の軽鎖配列反応が得られた。マウス抗CD134抗体クローン12H3については、情報的価値のある5種の配列重鎖反応および情報的価値のある3種の軽鎖配列反応が得られた。この情報に基づき、両方の抗体のV領域のコンセンサス配列を決定した（SEQ ID NO. 4、5、12および13を参照）。
【０３３４】
実施例5．キメラ型ヒトIgG4／κおよび／またはヒトIgG1／κ（すなわち、定常ヒトIgG／κドメインによるマウス定常ドメインの入れ替え）抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の作製
マウス抗CD134抗体クローン20E5および12H3の決定されたマウスV領域（上記の実施例4（b）を参照）に基づき、キメラ型ヒト抗体バージョンを作製するための設計を行った。この目的に向けて、CHO細胞に最適化されたcDNA配列（SEQ ID NO. 20（キメラ型ヒトIgG4重鎖クローン20E5をコード）、SEQ ID NO. 21（キメラ型ヒトκ軽鎖クローン20E5をコード）、SEQ ID NO. 22（キメラ型ヒトIgG1重鎖クローン20E5をコード）、SEQ ID NO. 23（キメラ型ヒトIgG4重鎖クローン12H3をコード）およびSEQ ID NO. 24（キメラ型ヒトκ軽鎖クローン12H3をコード）を参照）をGENEART（Regensburg, Germany）に対して発注し、マウスシグナルペプチドの後に、ヒトκ定常領域と連結した可変軽鎖、またはヒトIgG定常領域と連結した可変重鎖のいずれかが続くようにコード化を行った。この設計を両方の抗体に対して行った；クローン20E5については、可変重鎖をヒトIgG4またはヒトIgG1定常領域と連結させた；クローン12H3については、可変重鎖領域をヒトIgG4定常領域と連結させた。適した制限酵素を用いて、作製されたcDNAをpcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。キメラ抗体は、FreeStyle（商標）MAX CHO（CHO-S細胞）Expression System（Invitrogen）を用いて発現させた。発現された抗体を、プロテインAカラム（GE Healthcare）によるアフィニィークロマトグラフィーを用いて精製した。キメラ型アミノ酸配列については、SEQ ID NO. 25、26、27、28および29を参照。
【０３３５】
実施例6．キメラ型ヒトIgG4／κおよび／またはIgG1／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合特性決定
（a）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性Tリンパ球上でのヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合特性
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取して、氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：50希釈したFITC結合マウス抗ヒトIgG4抗体（Sigma）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：10希釈したPE結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中で、4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３３６】
キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、PHAで刺激されたCD4陽性 Tリンパ球上のヒトCD134表面分子を、およそ5.0〜10.0μg／mLで飽和させた（データは提示せず）。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5について、結合の最大半量は約1.0μg／mLであった（データは提示せず）。
【０３３７】
（b）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上でのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取して、氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5を伴うかまたは伴わずに、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、Tリンパ球部分集団を検出するために、細胞を、1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）とともにインキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３３８】
キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、PHAで活性化されたヒトCD4陽性 Tリンパ球部分集団では明らかな陽性染色が示され、PHAで活性化されたヒトCD8陽性 Tリンパ球部分集団では軽度の陽性染色が示された（データは提示せず）。
【０３３９】
（c）．抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上での、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合
健常ドナー（インフォームドコンセントを得た）由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（1.077g／mL；Nycomed）での密度勾配遠心法によって単離した。その後に、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI-1640培地（Gibco）中の1×106個のPBMC／mLを、ビーズ1個／細胞4個でのマウス抗ヒトCD3／マウス抗ヒトCD28抗体刺激ビーズ（CD3／CD28ビーズ；Invitrogen）により、25U／mL組換えヒトインターロイキン-2（PeproTech）の非存在下または存在下において、37℃、5％ CO2で1日間刺激した。培養後にPBMCを採取して、氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5を伴うかまたは伴わずに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、Tリンパ球部分集団を検出するために、細胞を、1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３４０】
図14に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、CD3／CD28ビーズで活性化されたヒトCD4陽性 Tリンパ球部分集団では明らかな陽性染色が示され、CD3／CD28ビーズで活性化されたヒトCD8陽性 Tリンパ球部分集団では軽度の陽性染色が示された。組換えヒトIL-2の補充による明らかな効果は観察されなかった。
【０３４１】
実施例7．キメラ型ヒトIgG4／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の生物学的特性決定
（a）．キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5による処置後の、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中に2×106個／mLで懸濁させた。細胞を96ウェル平底プレート（Corning）に0.1×106個／100μL／ウェル（すなわち、1×106個／mL）で播種した上で、25.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または25.0μg／mLの対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体（PG102；Pangenetics）または1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下；R&D Systems）に対して、37℃、5％ CO2で6日間曝露させた。6日後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISAリーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。
【０３４２】
図15に示されているように（平均±SD）、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）およびヒトOX40Lは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を誘導した。非処置（媒質のみ）または対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体（huIgG4）による処置では、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球増殖に対する効果は示されなかった。
【０３４３】
（b）．キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5と組換えヒトOX40Lとの組み合わせによる処置後の、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中に2×106個／mLで懸濁させた。細胞を96ウェル平底プレート（Corning）に0.1×106個／100μL／ウェル（すなわち、1×106個／mL）で播種した上で、0、0.025、0.25、2.5もしくは25.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、および／または0、0.01、0.1または1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下；R&D Systems）との組み合わせに対して、37℃、5％ CO2で6日間曝露させた。6日後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISAリーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。
【０３４４】
図16に示されているように（平均±SD）、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）およびヒトOX40Lは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球における増殖を用量依存的に誘導した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、2.5および25μg／mL（ドナー1）、または0.25、2.5および25μg／mL（ドナー2）のいずれかとしてドナー依存的に増殖を誘導した。さらに、ヒトOX40Lも、0.1および1.0μg／mL（ドナー1）または0.01、0.1および1.0μg／mL（ドナー2）のいずれかとしてドナー依存的に増殖を誘導した。
【０３４５】
図17に示されているように（平均±SD）、2.5および25μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）のキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）と、0.1および1.0μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）のヒトOX40Lとの組み合わせは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球における増殖に対して、相互の（すなわち、相乗的または相加的、またはさらには阻害性）効果を示さなかった。
【０３４６】
（c）．キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5による処置後の、抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
健常ドナー（インフォームドコンセントを得た）由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（1.077g／mL；Nycomed）での密度勾配遠心法によって単離した。その後に、PBMCを、96ウェル平底プレート（Corning）に、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI-1640培地（Gibco）中にて0.1×106個／100μL／ウェル（すなわち、1×106個／mL）として播種した上で、ビーズ1個／細胞2個のマウス抗ヒトCD3／マウス抗ヒトCD28抗体刺激ビーズ（CD3／CD28ビーズ；Invitrogen）により、25U／mLの組換えヒトインターロイキン-2（PeproTech）の非存在下または存在下において、37℃、5％ CO2で刺激した。1日後または2日後に、これらの（インターロイキン-2を加えないか、または加えた）CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球を、25.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下；R&D Systems）に対して、37℃、5％ CO2でそれぞれ6日間または5日間曝露させた。CD3／CD28ビーズ＋組換えヒトインターロイキン-2の組み合わせによって最初に刺激した細胞を、細胞増殖測定の1日前に、25U／mLの組換えヒトインターロイキン-2で再び刺激した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lに対する6日間または5日間の曝露後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISA（商標）リーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。
【０３４７】
図18に示されているように（平均±SD、n＝3、1件のドナーを使用）、CD3／CD28刺激ビーズは単独で、ヒトCD134発現性Tリンパ球におけるかなりの増殖を誘導したが（すなわち、「培地」）、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）およびヒトOX40Lは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球におけるさらなる増殖を誘導した。インターロイキン-2のみの添加は、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球における基礎的（すなわち、「培地」での）増殖を強化すると考えられた。
【０３４８】
（d）．ヒト（キメラ型）抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後のアカゲザルにおける免疫賦活性応答
非ヒト霊長動物であるアカゲザルに対して、Weinberg et al.（J Immunother 2006; 29: 575-585）に記載されたように、サル免疫不全ウイルスタンパク質gp130による免疫処置を行うことができる。
【０３４９】
ヒト（例えば、キメラ型またはヒト化または免疫原性低下型（deimmunized）；例えば、サブクラスヒトIgG1またはIgG4）抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置を行った免疫処置サルの流入領域リンパ節は、対照免疫処置サルと比較して、肥大したリンパ節を示すと予想される。マウスまたはヒト化12H3抗体または20E5抗体による処置を受けた動物は、対照と比較して、gp130特異的抗体価の増大および持続的なT細胞応答を示すと予想される。処置を受けたサルでは、顕性な毒性徴候はみられないはずである。
【０３５０】
実施例8．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるヒトCD134ドメインおよびエピトープの特性決定
（a）．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合（ウエスタンブロット法）
プレキャストLDS-PAGE変性電気泳動NuPage（登録商標）Novex（登録商標）システムにて、1300または650ng／レーン（クーマシーブリリアントブルー染色用）または250ng／レーン（ウエスタンブロット法用）の組換えヒトCD134：ヒトFcγ（IgG1）融合タンパク質（R&D Systems）を、種々の非還元条件下および還元条件下（図19-A参照）で、4〜12％ Tris-BisゲルおよびMOPS泳動緩衝液（Invitrogen）を用いて電気泳動した。続いて、組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質をクーマシーブリリアントブルー（BioRad）で染色するか、またはポリビニリデンフロリド（PDVF）転写膜（Millipore）に対してエレクトロブロットした。PBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で20分間ブロックした後に、PDVF膜を100ng／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または20E5とともに室温で1時間インキュベートした。並行して、100ng／mLのマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences）を陰性対照として用いた。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または20E5の結合を、1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスFcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Sigma）の使用準備済み溶液によって判定した。
【０３５１】
図19-Bに示されているように、非還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件aおよびb）条件下での組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質は、約130〜140kDaの分子質量を示した。加熱を伴わない非還元（条件a）では、近接する2本のバンドが示され、このことから組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質の画分が不完全に変性／アンフォールディングしていることが示唆された。加熱を伴う非還元（条件b）では1本のバンドが示され、このことから組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質が完全に変性／アンフォールディングしていることが示唆された。還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件cおよびd）条件下での組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質では、約110kDa（条件c）および約60〜65kDa（条件d）のバンドが得られた。前者の観察所見からは組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質の不完全な還元が示唆され、後者の観察所見からは、完全な還元／各組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質分子における2つのヒトIgG1由来Fcγ断片を接続するジスルフィド架橋の分断が示唆された。
【０３５２】
図19-Cに示されているように、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5はいずれも、非還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件aおよびb）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質を、主として約130kDaで認識した。対照的に、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件cおよびd）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質とはごくわずかな結合しか示さなかったが、一方、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件cおよびd）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との強い結合を示した。
【０３５３】
これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5はヒトCD134を認識することが実証された。その上、これらの結果から、還元（かつ熱変性を伴うかまたは伴わないLDS変性）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質に対するそれぞれの軽微な結合（クローン12H3）および強い結合（クローン20E5）によって立証されたように、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5は類似性のないヒトCD134エピトープも認識していると考えられることも実証された。これらの結果から、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3が、変性（LDSおよび熱処理）に対する感受性はないが還元（すなわち、DTTによる、システインリッチドメイン（CRD）関連のジスルフィド架橋の分断による可能性が高い）に対しては感受性のある、ヒトCD134上のエピトープを認識したことが示唆された。これらの結果から、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、変性（LDSおよび熱処理）に対する感受性がなく、しかも還元（すなわち、DTTによる、CRD関連のジスルフィド架橋の分断による可能性が高い）に対しても感受性のない、ヒトCD134上のエピトープを認識したことが示唆された。
【０３５４】
（b）．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、293-F細胞株上で発現される完全長ヒトCD134構築物およびさまざまな短縮型ヒトCD134構築物との結合（ドメインマッピング）
マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の詳細な特異性を分析する目的で、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの位置を、ドメインマッピングによって決定した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5が、（HEK由来）297-F細胞の表面上に発現された短縮型ヒトCD134構築物と結合する能力を、FACS分析によって判定した。
【０３５５】
文献（Swiss-Prot: P43489.1；Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683；Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26；Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330；米国特許出願第2011/0028688 A1号）に基づき、ヒトCD134の細胞外領域におけるシステインリッチドメイン（CRD）およびヒンジ様構造を同定した。CRDは、CRD1、CRD2、（短縮型）CRD3、（短縮型）CRD4と符号化されている（図20参照）。CRDは、A-モジュールおよびB-モジュールと呼ばれる、位相幾何学的に異なる種類のモジュールを有する（図20も参照）。A-モジュールはC字状構造であり、B-モジュールはS字状構造である。典型的なCRDは通常、6個の保存的なシステイン残基を有するA1-B2-モジュールまたはA2-B1-モジュール（または、頻度は低いが、A1-B1のような異なるモジュールの対）で構成され、ここで数字は各モジュール内のジスルフィド架橋の数を表している（図20も参照）。図20に示されているように、5種の異なるヒトCD134構築物を作製して、発現させた：（1）完全長ヒトCD134構築物、これはN末端CRD1に始まり（すなわち、CRD1 A1-B2-モジュールはアミノ酸29〜65をカバーする）、このため「CRD1」と表記され、アミノ酸1〜277で構成される（SEQ ID NO. 1参照）、（2）「CRD2」構築物、これはN末端CRD2で始まり（すなわち、CRD2 A1-B2-モジュールはアミノ酸66〜107をカバーする）、アミノ酸66〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 30参照）、（3）「CRD3」構築物、これはN末端CRD3で始まり（すなわち、CRD3 A1-B1-モジュールはアミノ酸108〜146をカバーする（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330による）か、または短縮型CRD3 A1-モジュールはアミノ酸108〜126をカバーし（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）による）、アミノ酸108〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 31参照）、（4）「CRD4」構築物、これはN末端CRD4またはCRD3サブドメインB1-モジュール／短縮型CRD4 A1-モジュールからなる（すなわち、CRD4 A1-B1-モジュールはアミノ酸127〜167をカバーする（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）か、またはCRD3サブドメインB1-モジュールと短縮型CRD4 A1-モジュールとの組み合わせ（図20には示されていない）がそれぞれアミノ酸127〜146およびアミノ酸147〜167をカバーし（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330））、アミノ酸127〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 32参照）、および（5）「短縮型（tc）CRD4」構築物、これはN末端短縮型CRD4またはCRD4サブドメインB1-モジュール（すなわち、短縮型CRD4 A1-モジュールがアミノ酸147〜167をカバーする（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330）またはCRD4サブドメインB1-モジュール（図20には示されていない；Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）がアミノ酸147〜167をカバーする）からなり、アミノ酸147〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 33参照）。Accuprime（商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を用いたアセンブリPCRにより、これらの5種のヒトCD134構築物を、以下の表に示したプライマーを用いて作製した。
2016515544.tif 000059
* プライマー番号はBioceros社の内部符号方式による
【０３５６】
手短に述べると、シグナルペプチドのアミノ酸1〜28をコードするcDNAおよびヒトCD134のアミノ酸66〜277をコードするcDNAを、それぞれプライマー対362／365および364／363を用い、完全長ヒトCD134をテンプレートとして用いるPCR反応において増幅させた。その後に、これらの2種のPCR産物を、プライマー対362／363を用いるアセンブリPCRにおいて、「CRD2」構築物を作製した。「CRD2」構築物をコードするcDNAを、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に、適した制限部位を用いてサブクローニングした。同様に、「CRD3」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にヒトCD134のアミノ酸108〜277が連結されたもの）、「CRD4」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にアミノ酸127〜277が連結されたもの）および「短縮型CRD4」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にアミノ酸147〜277が連結されたもの）を作製し、上述の表に示された対応するプライマーを用いて、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。さらに、完全長ヒトCD134（SEQ ID NO. 1）も、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に再びクローニングした。
【０３５７】
FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Invitrogen）に対して、作製したヒトCD134の5種類の変異体を一過性に形質移入した。48〜72時間後に、形質移入細胞上での表面ヒトCD134発現をFACS分析によって分析した。この目的に向けて、形質移入細胞を採取し、氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を20.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。並行して、20.0μg／mLのマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences）を陰性対照として用いた。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３５８】
図21に示されているように、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は両方とも、形質移入された293-F細胞上の完全長（「CRD1」構築物と表記）ヒトCD134を認識したが、一方、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は両方とも、モックプラスミドを形質移入した293-F細胞上では結合を示さなかった。さらに、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は、形質移入した293-F細胞上の、CRD1およびCRD1-CRD2を欠く短縮型ヒトCD134変異体（それぞれ「CRD2」構築物および「CRD3」構築物と表記）も認識した。対照的に、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）に対するマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合は極めて弱く、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）を欠くか、または代替的にCRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による；「tcCRD4」構築物と表記）を欠く短縮型ヒトCD134変異体に対するマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合は全く存在しなかったが、一方、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）、およびCRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）または代替的にCRD 1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による；「tcCRD4」構築物と表記）を欠く短縮型ヒトCD134変異体に対して強い結合を示した。
【０３５９】
これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5が、ヒトCD134を特異的に認識することが実証された（完全長ヒトCD134形質移入とモックプラスミド形質移入との比較）。さらに、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）を欠くか、または代替的にCRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による；「tcCRD4」構築物と表記）を欠く短縮型ヒトCD134変異体に対する、それぞれの結合の欠如（クローン12H3を用いた場合）と強い結合（クローン20E5を用いた場合）との対比によって立証されるように、類似性のないヒトCD134エピトープを認識していると考えられることも実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3がCRD1およびCRD2におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられること、ならびにマウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5が、CRD1、CRD2および短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）または代替的にCRD 1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による）におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられることも実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜126（すなわち、19-merペプチド
2016515544.tif 000060
；SEQ ID NO. 34参照）有する短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状もしくは非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられること、あるいは、アミノ酸配列108〜126（すなわち、19-merペプチド
2016515544.tif 000061
；SEQ ID NO. 34参照）が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108-214（SEQ ID NO. 35参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール／CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における非直鎖状／高次構造性エピトープとの結合のための一部を形成していることが実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列147-214（SEQ ID NO. 36）を有する、短縮型CRD4 A1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられることが実証された。
【０３６０】
最近、Compaan et al.（Structure 2006; 14: 1321-1330）は、結晶学を利用して、OX40リガンド（CD252）／CD134（＝OX40）相互作用に際しての、ヒトCD134上のCRD1、CRD2（特にA1ループおよびその直後の残基）およびCRD3（主としてA1ループ）の決定的な関与を明らかにした。この発見は、（1、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、細胞外ヒトCD134上の、CRD1、CRD2および短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）におけるヒトCD134エピトープも、または代替的にCRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による）も認識しないと考えられること、ならびに（2、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上でヒトOX40Lと同時に結合したという、本発明者らの知見とよく一致する。このことにより、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、ヒトCD134とヒトOX40Lとの相互作用に決定的には関与しないヒトCD134上のエピトープを認識することが示唆された。さらに、（1、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108-126（すなわち、19-merペプチド
2016515544.tif 000062
；SEQ ID NO. 34参照）を有する短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられること、あるいは、アミノ酸配列108〜126（すなわち、19-merペプチド
2016515544.tif 000063
；SEQ ID NO. 34参照）が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108-214（SEQ ID NO. 35参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール／CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における、非直鎖状／高次構造性エピトープとの結合のための一部を形成していること、ならびに（2、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上でヒトOX40Lと同時に結合したという本発明者らの知見は、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3によって認識されるヒトCD134上のエピトープ（上記の通り）が、ヒトCD134とヒトOX40Lとの相互作用に決定的には関与しないという考え方を裏づけるものである。
【０３６１】
（c）．ヒトCD134由来ペプチドELISAを用いたマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のエピトープマッピング（1）
マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の詳細な特異性をさらに分析する目的で、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3によって認識されるエピトープの位置をエピトープマッピングによって決定した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3が、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドと結合する能力を、ELISAによって判定した。
【０３６２】
96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュールのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 38参照）に対応するヒトCD134由来ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、またはエキストラIII型構造ドメインのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 37参照）に対応するヒトフィブロネクチン由来対照ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、PBS中にて4℃で終夜コーティングした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.00005〜50.0（ブロック用緩衝液中での10倍希釈系列）μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences）とともに室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、抗体の結合を、1：5000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG Fcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって判定した。1M H2SO4を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度を、マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。
【０３６３】
図23-A（n＝1）に示されているように、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3はヒトCD134由来ペプチドと用量依存的かつ特異的に結合したが、一方、マウスIgG1κアイソタイプ対照抗体はヒトCD134由来ペプチドとの結合を示さなかった。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびIgG1κアイソタイプ対照抗体はいずれも、ヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの結合を示さなかった。
【０３６４】
これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3がヒトCD134上のエピトープを特異的に認識したことが実証された（ヒトCD134由来ペプチドとヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの比較）。さらに、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜146（すなわち、39-merペプチド
2016515544.tif 000064
；SEQ ID NO. 38参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられることも実証された。
【０３６５】
（d）．PepscanによるCLIPSエピトープマッピング技術を用いたマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5のエピトープマッピング（2）
Pepscan（Lelystad, Netherlands）によるCLIPSエピトープマッピング技術を、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの決定に用いることができる。このCLIPS技術は、二量体性または多量体性タンパク質複合体に含まれる直鎖状の、高次構造性の、不連続的な、および複雑なエピトープの決定を可能にする。これを目的として、ヒトCD134の直鎖状アミノ酸配列＝OX40（SEQ ID NO. 1）を標的タンパク質として用いた。
【０３６６】
実施例9．キメラ型ヒトIgG4／κおよび／またはIgG1／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるヒトCD134ドメインおよびエピトープの特性決定
（a）．キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、293-F細胞株上で発現される完全長ヒトCD134構築物およびさまざまな短縮型ヒトCD134構築物との結合（ドメインマッピング）
キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の詳細な特異性を分析する目的で、キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの位置を、ドメインマッピングによって決定した。キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5が、（HEK由来）297-F細胞の表面上に発現された短縮型ヒトCD134構築物（上記の実施例8（b）参照）と結合する能力を、FACS分析によって判定した。
【０３６７】
FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Invitrogen）に対して、作製したヒトCD134の5種類の変異体を一過性に形質移入した（上記参照）。48〜72時間後に、形質移入細胞上での表面ヒトCD134発現をFACS分析によって分析した。この目的に向けて、形質移入細胞を採取し、氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κならびに／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5を伴うかまたは伴わずに、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３６８】
図22に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κおよびIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3ならびにキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、形質移入細胞上のさまざまな短縮型ヒトCD134構築物に対する結合特性を示し、それらの結合特性はそれらの対応する親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5対応物と同一であった（上記の実施例8（b）参照；比較については、図22と図21と対比して参照されたい）。
【０３６９】
（b）．ヒトCD134由来ペプチドELISAを用いたキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のエピトープマッピング
キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の詳細な特異性をさらに分析する目的で、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3によって認識されるエピトープの位置をエピトープマッピングによって決定した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3が、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドと結合する能力を、ELISAによって判定した。
【０３７０】
96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュールのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 38参照）に対応するヒトCD134由来ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、またはエキストラIII型構造ドメインのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 37参照）に対応するヒトフィブロネクチン由来対照ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、PBS中にて4℃で終夜コーティングした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.00005〜50.0（ブロック用緩衝液中での10倍希釈系列）μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体（Biocult）とともに室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、抗体の結合を、1：5000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG Fcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって判定した。1M H2SO4を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度をマイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。
【０３７１】
図23B（n＝1）に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3はヒトCD134由来ペプチドと用量依存的かつ特異的に結合したが、一方、対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体はヒトCD134由来ペプチドとの結合を示さなかった。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体はいずれも、ヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの結合を示さなかった。
【０３７２】
これらの結果により、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3がヒトCD134上のエピトープを特異的に認識したことが実証された（ヒトCD134由来ペプチドとヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの比較）。さらに、これらの結果により、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜146（すなわち、39-merペプチド
2016515544.tif 000065
；SEQ ID NO. 38参照）を有する短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられることも実証された。
【０３７３】
実施例10．ヒト化IgG4／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の作製
マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5および12H3の決定されたマウスV領域（上記の実施例2（b）参照）に基づき、ヒト化抗体バージョンを作製した。
【０３７４】
マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5および12H3のヒト化可変軽鎖配列およびヒト化可変重鎖配列を、PDL技術（Panaroma ResearchInstitute, Sunnyvale, CA, USAにより実施）を用いて入手した。ヒト化可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列については、SEQ ID NO：62（20E5-VL1）、63（20E5-VL2）、64（20E5-VH1）、65（20E5-VH2）、66（20E5-VH3）、およびSEQ ID NO. 67（12H3-VL1）、68（12H3-VL2）、69（12H3-VH1）、70（12H3-VH2）、71（12H3-VH3）を参照されたい。
【０３７５】
この設計の後に、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）用に最適化されたcDNA配列（SEQ ID NO：72、73、74（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、SEQ ID NO. 75、76（完全長ヒト化κ軽鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれ20E5_VL1、20E5_VL2をコードする）、SEQ ID NO：77、78、79（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、およびSEQ ID NO. 80、81（完全長ヒト化κ軽鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVL1、VL2をコードする）を参照）を、GENEART（Regensburg, Germany）に発注した。これは、シグナルペプチドの後に続くヒトIgG4定常領域と連結されたヒト化可変重鎖またはヒトκ定常領域と連結されたヒト化可変軽鎖のいずれかをコードした：（1）ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンの発現用には、マウス免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドをヒト化重鎖および軽鎖の両方のために用い、ならびに（2）ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンの発現用には、ヒト免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドをヒト化重鎖のために用い、ヒト免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをヒト化軽鎖のために用いた。さらに、ヒト化抗体はすべて、Angal et al.（Mol. Immunol., Vol. 30, No. 1, pp. 105-108, 1993）に従って、安定化されたヒトIgG4分子として発現させた。適した制限酵素を用いて、作製されたcDNAをpcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。
【０３７６】
ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンは、FreeStyle（商標）MAX CHO Expression System（Life Technologies）を用いて発現させた。ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンは、FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて発現させた。作製されたヒト化抗体を、プロテインAカラム（GE Healthcare）によるアフィニィークロマトグラフィーを用いて精製した。このようにして、抗体クローン20E5の6種の精製ヒト化バージョン、すなわち、20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、2-E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2および20E5_VL2VH3、ならびに抗体クローン12H3の6種の精製ヒト化バージョン、すなわち、12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3を作製した。
【０３７７】
ヒト化アミノ酸配列については、SEQ ID NO：82、83、84（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、SEQ ID NO. 85、86（完全長ヒト化κ軽鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれVL1、VL2をコードする）、SEQ ID NO. 87、88、89（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、およびSEQ ID NO. 90、91（完全長ヒト化κ軽鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVL1、VL2をコードする）を参照されたい。
【０３７８】
実施例11．ヒト化IgG4／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の結合特性決定
（a）．ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合（ELISA）
96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、50ng／ウェルの組換えヒトCD134：ヒトFcγ（IgG1）融合タンパク質（R&D Systems）をPBS中にて、4℃で一晩かけてコーティングした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.0003〜20.0（ブロック用緩衝液中での3倍希釈系列）μg／mLの親マウス抗ヒトCD134抗体クローン120E5または12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3の6種のバージョンとともに、室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、抗体の結合を、1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）または1：4000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトκ特異的抗体（Southern Biotech）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって測定した。1M H2SO4を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度を、マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。
【０３７９】
図28（n＝2）に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5の6種のバージョンのすべてが、組換えヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2および20E5_VL2VH3は、同一の滴定曲線を示し、このことからそれらのCD134抗原結合親和性が同一であることが示された（最大半値結合EC50がほぼ100ng／mL）が、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のバージョン20E5_VL1H1および20E5_VL1H2は、幾分低い結合親和性（EC50がほぼ150ng／mL）を示すと考えられた。異なる免疫グロブリン鎖特異的二次抗体を用いた（すなわち、マウス抗体は抗Fcγ鎖特異的抗体を用いて検出し、一方、キメラ型ヒト抗体およびヒト化抗体は抗κ鎖特異的抗体を用いて検出した）ため、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5による滴定曲線（データは提示せず）と、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンによる滴定曲線との比較は行えなかった。
【０３８０】
図29（n＝2）に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3の6種のバージョンのすべてが、組換えヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3‐6種のバージョン12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3のすべて‐は、同一でない滴定曲線を示し、このことから、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3（EC50がほぼ100ng／mL）よりも幾分高いCD134抗原結合親和性（EC50がほぼ50ng／mL）を示すことが示された。異なる免疫グロブリン鎖特異的二次抗体を用いた（すなわち、マウス抗体は抗Fcγ鎖特異的抗体を用いて検出し、一方、キメラ型ヒト抗体およびヒト化抗体は抗κ鎖特異的抗体を用いて検出した）ため、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3による滴定曲線（データは提示せず）と、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンによる滴定曲線との比較は行えなかった。
【０３８１】
（b）．組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合に関する、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3とビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3との競合（ELISA）
競合ELISA測定を行う前に、ビオチン化（PierceによるN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチンを使用）親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のEC50を決定し（方法については以下を参照）、それが約20ng／mLであることを同定した（図30、n＝3を参照）。非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3による、同定されたEC50濃度でのビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の置換について、その後に調べた。
【０３８２】
96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、50ng／ウェルの組換えヒトCD134：ヒトFcγ（IgG1）融合タンパク質（R&D Systems）をPBS中にて、4℃で一晩かけてコーティングした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.001〜60.0（ブロック緩衝液中での3倍希釈系列）μg／mLの非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3とともに、20ng／mL（EC50）のビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3と組み合わせて、室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の結合を、1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって測定した。1M H2SO4を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度を、マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。
【０３８３】
図31（n＝2）に示されているように、非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および非標識キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同一の置換が実証され、このことから、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3が同一のCD134抗原結合親和性（ほぼ750ng／mLでのビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の最大半値置換または阻害（IC50））を呈することが示された。6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべて‐12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3‐により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同程度の置換が実証され、このことから、6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、同程度のCD134抗原結合親和性（IC50がほぼ250〜300ng／mL）を呈することが示された。
【０３８４】
これらの結果により、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3よりも高いCD134抗原結合親和性を示すことが実証された。
【０３８５】
（c）．ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3と、293-F細胞株上で発現された完全長ヒトCD134構築物との結合（FACS）
ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の結合を詳細に分析する目的で、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の、（安定なトランスフェクト体である）293-F細胞株上の表面ヒト完全長CD134との結合能をフローサイトメトリーによって判定し、さらに、それらの対応する親マウス抗ヒトCD134抗体対応物の結合特性と比較した。
【０３８６】
完全長ヒトCD134（SEQ ID NO. 1）を、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に再クローニングした（以下の実施例11（d）を参照）。この完全長ヒトCD134プラスミドを、FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Life Technologies）に形質移入した。安定なヒト完全長CD134形質移入細胞（表面CD134発現レベルが高いクローンno.5、および表面CD134発現レベルが中程度であるクローンno.23；図32参照）を、125μg／mLのG418（Gibco）を用いて選択し、採取した上で、50μg／mLの精製ヒトIgG（Sigma；Fcγ受容体をブロックする）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、0、0.005〜50μg／mL（PBS／BSA／NaN3中での10倍希釈系列；すべてのクローン20E5バージョン）または0.002〜20μg／mL（PBS／BSA／NaN3中での10倍希釈系列；すべてのクローン12H3バージョン）の親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3の6種のバージョンとともに4℃で30分間インキュベートした。並行して、マウスIgG1κアイソタイプ対照（BD Biosciences；50.0または20.0μg／mL）およびキメラ型ヒトIgG4κアイソタイプ対照（PanGeneticsによるクローンch5D12；50.0または20.0μg／mL）を陰性対照として用いた。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後、細胞を続いて、1：200に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）または1：200に希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（JacksonImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後に、細胞を、2％ホルムアルデヒドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３８７】
図33（ヒト完全長CD134を形質移入した、表面CD134発現レベルが高い細胞クローンno.5；n＝1）に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のすべてが、細胞表面に発現されたヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のバージョン20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2および20E5_VL2VH3は、類似した滴定曲線を示し、このことから、それらのCD134抗原結合親和性は極めて類似しているが、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のバージョンVL1H1およびVL1H2は、幾分低い結合親和性を示していると考えられたことが示された。
【０３８８】
図34（ヒト完全長CD134を形質移入した、表面CD134発現レベルが高い細胞クローンno.5；n＝2）、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、細胞表面に発現されたヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のバージョン12H3_VL2H1および12H3_VL2VH3は、同一の滴定曲線を示し、このことから、それらのCD134抗原結合親和性は同一であるが、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のバージョン12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3および12H3_VL2H2は幾分高い結合親和性を示していると考えられたことが示された。
【０３８９】
図35（ヒト完全長CD134を形質移入した、表面CD134発現レベルが中程度である細胞クローンno.23；n＝2）に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、細胞表面に発現されたヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3は類似した滴定曲線を示し、このことから、それらのCD134抗原結合親和性は同程度である（EC50が200ng／mLを上回る）が、一方、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべて‐12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3‐が、より高い結合親和性（EC50が200ng／mL未満）を示していると考えられたことが示された。
【０３９０】
以上を総合すると、これらのフローサイトメトリー結果により、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2、20E5_VL2VH3、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は同程度のCD134抗原結合親和性を示すが、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1H1および20E5_VL1H2は幾分低いCD134抗原結合親和性を示すことが実証された。加えて、これらの結果により、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3よりも高いCD134抗原結合親和性を示すことも実証された。
【０３９１】
（d）．ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、293-F細胞株上に発現された完全長ヒトCD134構築物およびさまざまな短縮型ヒトCD134構築物との結合（FACSドメインマッピング）
ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の微細特異性を分析する目的で、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの位置を、ドメインマッピングによって決定した。ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5が、（HEK由来）297-F細胞の表面上に発現された短縮型ヒトCD134構築物と結合する能力を、フローサイトメトリー分析によって判定した。
【０３９２】
文献（Swiss-Prot：P43489.1；Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683；Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26；Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330；米国特許出願公開第2011／0028688号）に基づき、ヒトCD134の細胞外領域におけるシステインリッチドメイン（CRD）およびヒンジ様構造を同定した。CRDは、CRD1、CRD2、（短縮型）CRD3、（短縮型）CRD4と符号化されている（図20参照）。CRDは、A-モジュールおよびB-モジュールと称される位相幾何学的に異なる種類のモジュールを含む（図20も参照）。A-モジュールはC字状構造であり、B-モジュールはS字状構造である。典型的なCRDは通常、6個の保存的なシステイン残基を有するA1-B2-モジュールまたはA2-B1-モジュール（または、頻度は低いが、A1-B1のような異なるモジュールの対）で構成され、ここで数字は各モジュール内のジスルフィド架橋の数を表している（図20も参照）。図20に示されているように、3種の異なるヒトCD134構築物を作製して発現させた：（1）完全長ヒトCD134構築物、これはN末端CRD1に始まり（すなわち、CRD1 A1-B2-モジュールはアミノ酸29〜65をカバーする）、このため「CRD1」と表わされ、アミノ酸1〜277で構成される（SEQ ID NO. 1参照）、（2）「CRD3」構築物、これはN末端CRD3で始まり（すなわち、CRD3 A1-B1-モジュールはアミノ酸108〜146をカバーする（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330による）か、または短縮型CRD3 A1-モジュールはアミノ酸108〜126をカバーし（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）による）、アミノ酸108〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO：31参照）、（3）「CRD4」構築物、これはN末端CRD4またはCRD3サブドメインB1-モジュール／短縮型CRD4 A1-モジュールからなる（すなわち、CRD4 A1-B1-モジュールはアミノ酸127〜167をカバーする（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）か、またはCRD3サブドメインB1-モジュールと短縮型CRD4 A1-モジュールとの組み合わせ（図20には示されていない）がそれぞれアミノ酸127〜146およびアミノ酸147〜167をカバーし（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330））、アミノ酸127〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO：32参照）。Accuprime（商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を用いるアセンブリPCRにより、これらの3種のヒトCD134構築物を、以下の表2に示したプライマーを用いて作製した。
【０３９３】
（表２）
2016515544.tif 000066
* プライマー番号はBioceros社の内部符号方式による
【０３９４】
手短に述べると、シグナルペプチドのアミノ酸1〜28をコードするcDNAおよびヒトCD134のアミノ酸66〜277をコードするcDNAを、それぞれプライマー対362／367および366／363を用い、完全長ヒトCD134をテンプレートとして用いるPCR反応において増幅させた。その後に、これらの2種のPCR産物を、プライマー対362／363を用いるアセンブリPCRに用いることによって、「CRD3」構築物を作製した。「CRD3」構築物をコードするcDNAを、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に、適した制限部位を用いてサブクローニングした。同様に、「CRD4」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にアミノ酸127〜277が連結されたもの）を作製し、上述の表に示された対応するプライマーを用いて、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。さらに、完全長ヒトCD134（SEQ ID NO：1）は、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中にも再びクローニングした。
【０３９５】
FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Life Technologies）に対して、作製したヒトCD134の3種の変異体を一過性に形質移入した。48時間後に、形質移入細胞上での表面ヒトCD134発現をFACS分析によって分析した。この目的に向けて、形質移入細胞を採取し、50μg／mLの精製ヒトIgG（Sigma；Fcγ受容体をブロックする）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLの親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5、20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5、20.0μg／mLの6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、ならびに20.0μg／mLのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1VH1とともに、4℃で30分間インキュベートした。並行して、20.0μg／mLのマウスIgG1κアイソタイプ対照（BD Biosciences）および20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κアイソタイプ対照（PanGeneticsによるクローンch5D12）を陰性対照として用いた。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後、細胞を続いて、1：200に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）または1：200に希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後、細胞を続いて、1：200に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後に、細胞を、2％ホルムアルデヒドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０３９６】
図36に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、形質移入した293-F細胞上の、完全長（「CRD1」構築物と表記）ヒトCD134、およびCRD1-CRD2を欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD3」構築物と表記）を認識し、一方、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、モックプラスミドを形質移入した293-F細胞上での結合を示さなかった。対照的に、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）に対する、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3すべての結合は極めて弱いかまたは陰性であるが、一方、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、形質移入した293-F細胞上の、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール（「CRD4」構築物と表記）を欠くこの短縮型ヒトCD134変異体に対して強い結合を示し、このことからこれらの後者の293-F細胞がこの表面短縮型CD134バージョンを発現したことが裏づけられた。
【０３９７】
図37に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1VH1は、トランスフェクトされた293-F細胞上の、完全長（「CRD1」構築物と表記）ヒトCD134、CRD1-CRD2を欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD3」構築物と表記）、およびCRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）を認識し、一方、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_ VL1VH1は、モックプラスミドを形質移入した293-F細胞上での結合を全く示さなかった。
【０３９８】
これらの結果により、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべて、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5_VL1VH1が、ヒトCD134を特異的に認識することが実証された（完全長ヒトCD134形質移入とモックプラスミド形質移入との比較）。さらに、これらの結果により、抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5が、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）に対する、それぞれの結合の欠如（クローン12H3を用いた場合）と強い結合（クローン20E5を用いた場合）との対比によって立証されるように、類似性のないヒトCD134エピトープを認識していると考えられたことも実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、CRD1およびCRD2におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられたことが実証された。マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5 VL1VH1は、CRD1、CRD2および短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられたことが実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜126（すなわち、19-mericペプチド
2016515544.tif 000067
；SEQ ID NO：34を参照）を有する短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられること、あるいは、アミノ酸配列108〜126（すなわち、19-mericペプチド
2016515544.tif 000068
；SEQ ID NO：34を参照）が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜214（SEQ ID NO：35を参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール／CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における非直鎖状／高次構造性エピトープとの結合のための一部を形成していることが実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5_VL1VH1が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列127〜214（SEQ ID NO：92）を有する、CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における、直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識すると考えられることが実証された。
【０３９９】
（e）．安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134との結合に関する、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3とビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3との競合（FACS）
競合フローサイトメトリー測定を行う前に、ビオチン化（PierceによるN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチンを使用）親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のEC50を決定し（方法については以下を参照）、それが約700ng／mLであることを同定した（図38、n＝2を参照）。非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3による、同定されたEC50濃度でのビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の置換について、その後に調べた。
【０４００】
完全長ヒトCD134（SEQ ID NO1）を、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に再クローニングした（上記の実施例11（c）を参照）。この完全長ヒトCD134プラスミドを、FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Life Technologies）に形質移入した。安定なヒト完全長CD134形質移入細胞（表面CD134発現レベルが高いクローンno.5、図32参照）を、125μg／mLのG418（Gibco）を用いて選択し、採取した上で、50μg／mLの精製ヒトIgG（Sigma；Fcγ受容体をブロックする）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN3中に1〜2×106個／mLで入れた。細胞を、0.003〜50.0（PBS／BSA／NaN3中での5倍希釈系列）の非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3とともに、700ng／mL（EC50）のビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3と組み合わせて、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後に、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の結合を、1：200に希釈したPE結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間おいた後に判定した。PBS／BSA／NaN3中で十分に洗浄した後に、細胞を、2％ホルムアルデヒドを含むPBS／BSA／NaN3中にて4℃で30分間かけて固定した。ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。
【０４０１】
図39（n＝2）に示されているように、非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および非標識キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同一の置換が実証され、このことから、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3が同一のCD134抗原結合親和性（ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の最大半値置換または阻害（IC50）がほぼ3.5μg／mL）を呈することが示された。6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべて‐12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3‐により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同一の置換が実証され、このことから、6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、同一のCD134抗原結合親和性（IC50がほぼ1.5μg／mL）を呈することが示された。
【０４０２】
これらの結果により、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3よりも高いCD134抗原結合親和性を示すことが実証された。
【０４０３】
実施例12．抗CD134抗体はTreg細胞におけるFOX3P発現を抑制する
Tregの単離および増大：白血球パック（leukopack）をBiological Specialties（Colamar, PA）から購入し、赤血球をACK緩衝液（Stemcell technologies, Vancouver, BC, Canada）により氷上で溶解させた。細胞を洗浄し、AutoMACS泳動緩衝液中に再懸濁させた。Tregは、いずれもMiltenyi Biotech（San Diego, CA）による、AutoMACS Proおよび／またはLDカラムとQuadroMACSとの両方にて、製造元の指示に従って、CD4+ CD25+ CD127dim/- Tregキットを用いて単離した。Tregを計数し、24ウェルプレート中にて、1×106個のTreg／ウェルを、TexMACS培地中で、Treg増殖用ビーズ（CD3抗体およびCD28抗体をあらかじめ負荷したMACSiBead粒子；Miltenyi Biotech）を用いて製造元の指示に従って増殖させた。細胞を、ほぼ500IU／mLのIL-2およびラパマイシン（100nM）の存在下で、ビーズ4個／細胞1個の比率で培養した。単離から5日後に、細胞を6ウェル／プレートに移し、ビーズ40μl／ウェル、ならびにIL-2（500IU／ml）およびラパマイシン（100nM）を添加した。IL-2を含有する培地を必要に応じて添加し、細胞を10mm丸底ディッシュプレートに移して、さらに増殖させた。30日後に、MACSiMAGを用いてビーズを取り出し、その後に下流での用途に用いた。
【０４０４】
Tregの活性化：増殖させたTregを、Celltrace Violetにより、製造元の指示（Life Technologies, Grand Island, NY）に従って標識した。1.5×105個の増殖させたTregおよび3×105個のTreg増殖用ビーズ（CD3抗体およびCD28抗体をあらかじめ添加したMACSiBead粒子；Miltenyi Biotech）を丸底96ウェルプレートにプレーティングし、5％血清、1％ Pen-Strepおよびほぼ500IU／mLのIL-2を加えたX-VIVO 15培地中で、12H3（0.5および5μg／ml）および／またはヒトOX40L（1μg／ml、R&D Systems）および抗His mAb（1μg／ml、R&D Systems）を伴うかまたは伴わずに、37℃でインキュベートした。3日後に、細胞を白血球活性化カクテルおよびBD GolgiPlug（2μl／ml、BD Biosciences, San Jose, CA）で5時間にわたり再刺激し、洗浄した上で、LIVE／DEAD（登録商標）Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit（Life Technologies）を用いて製造元の指示に従って染色した。細胞を1回洗浄し、細胞内染色を、Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience, San Diego, CA）を製造元のプロトコールに従って用いる固定／透過処理後に行った。以下の抗体を用いた：CD3 V500（クローンSP34-2、BD Biosciences）；FOXP3 PE（クローン206D、Biolegend）；CD4 PerCP（クローンOKT4、Biolegend）；およびOX40（クローンACT35、eBioscience）。細胞を4℃で30分間インキュベートして、洗浄した。細胞をBD Cantoフローサイトメーター（BD Biosciences）に投入し、生存状態のシングレットCD3+ CD4+に対するゲーティングを行った上で、FlowJo（Ashland、OR）を用いて分析した。抗FOXP3 PE（R-フィコエリトリン）に由来する幾何平均蛍光強度（geoMFI）を記録した。
【０４０５】
図40は、マウス抗ヒトCD134抗体12H3（IgG1）およびヒトOX40Lの両方が、増殖させたTreg（CD4+ CD25-CD127 dim/-）におけるFOXP3発現を低下させたことを示している。12H3およびOX40Lを併用したところ、FOXP3発現抑制に対する効果は相加的であった。これらの結果は、マウス抗ヒト抗体12H3が、エフェクターT細胞に対するその役割を通じてだけではなく、Treg機能に直接的に影響を及ぼすことを示唆する。データは、1人のドナーからの三重反復試料を表している。
【０４０６】
実施例13．プレートに結合したヒト化抗CD134抗体は、Teff細胞のTreg抑制を改善する
Teff機能のTreg抑制に対する、ヒト化抗CD134抗体12H3 VL1VH1または12H3 VL1VH2（いずれもIgG4／κ）の効果を評価した。
【０４０７】
実施例12に記載した通りに、Tregを単離し、増殖させて、活性化させた。指定のある場合は、丸底96ウェルプレートに、PBS中に希釈した12H3 VL1VH1抗体または12H3 VL1VH2抗体またはアイソタイプ対照（10μg／ml）をコーティングした。プレートを37℃で2時間でインキュベートし、続いてすすぎ洗いして、抑制アッセイに用いた。 Tregと同じドナーから単離したCD4+ エフェクターT細胞（Teff）を、Miltenyi BiotechによるAutoMACS ProおよびCD4+ 単離キットを製造元の明細書に従って用いて、凍結PBMCから精製した。Teff細胞を続いて、Celltrace（商標）Violet色素を製造元の指示（Life Technologies, Grand Island, NY）に従って用いて標識した。Teff細胞を、5％血清、1％ Pen-Strepを加えたX-VIVO15培地中に再懸濁させた。1×105個の細胞を各ウェルに添加した。Tregは、Treg：Teff比が0：1（Teffのみ）、1：2、1：4および1：8となるように添加した。Treg Suppression Inspectorビーズ（Miltenyi Biotech）を洗浄して、細胞（TeffまたはTreg）1個当たりビーズ1個の比率となるようにウェルに添加した。各ウェルの最終容量は200μlに調整した。プレートを37℃で4日間インキュベートした。細胞を、白血球活性化カクテルおよびBD GolgiPlug（2μl／ml、BD Biosciences, San Jose, CA）によって5時間かけて再刺激し、洗浄した上で、LIVE／DEAD（登録商標）Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit（Life Technologies）を製造元の指示に従って用いて染色した。細胞を洗浄し、表面染色をAPC結合抗OX40（アロフィコシアニン）（クローンACT35、eBioscience）で行い、その後に細胞内染色を行った。Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience, San Diego, CA）による固定／透過処理は、製造元のプロトコールに従って行った。以下の抗体を用いた：CD3 V500（クローンSP34-2、BD Biosciences）；CD4 FITC（クローンRPA-T4、BioLegend）。細胞を4℃で30分間インキュベートして洗浄した。細胞をBD Cantoフローサイトメーター（BD Biosciences）に投入し、生存状態のシングレットCD3+ CD4+ Celltrace+に対するゲーティングを行った上で、FlowJo（Ashland、OR）を用いて分析した。
【０４０８】
プレートに結合したヒト化12H3抗体は、Teff増殖に対するTregの阻害を弱めた。図41は、Treg抑制inspectorビーズ（Miltenyi, San Diego, CA）で刺激して、プレートに結合した12H3 VL1VH1またはアイソタイプ対照IgG4で処理したTeff細胞の増殖を、Treg／Teff比1：2のTregの存在下で比較したFACS分析のヒストグラムを示している。アイソタイプ対照（hIgG4）と比較して、12H3 VL1VH1は、Celltrace（商標）Violet色素によって検出されるその後の細胞分裂を表す、後続ピーク（より低い蛍光強度）中の細胞数の増加によって示されるように、Teff増殖に対するTregの阻害効果を弱めた。Celltrace（商標）Violet色素は、細胞内の活性化アミン基と結合する。
【０４０９】
図42は、1人のドナーから単離された細胞に対する、Treg：Teff比が0：1（図42A）または1：4（図42B）でのTeff細胞の複製に対する、キメラ型12H3（ヒトIgG4／κ）、ヒト化12H3 VL1VH1または12H3 VL1VH2（いずれもIgG4／κ）の単独での効果、またはOX40L（5μg／mL）／抗His mAb（5μg／mL）と組み合わせた効果を示している。Tregの非存在下（図42A）において、CD2／CD3／CD28刺激薬ビーズは単独で、ヒトCD134を発現するTeffにおける増殖を誘導した（すなわち、アイソタイプ対照）。キメラ抗CD134抗体およびヒト化抗CD134抗体ならびにOX40Lは、アイソタイプ対照と比較して、CD4+ T細胞の増殖を刺激した。増殖は、2H3 VL1VH2（SF2）とOX40Lの組み合わせを用いると幾分増加した。Tregの存在下において（図42B）、CD2／CD3／CD28刺激薬ビーズのみでは、Treg抑制を伴わないCD4 T細胞の増殖と比較して、誘導されるCD4 T細胞増殖は少なかった（複製指数が約3に対して約5）。Treg抑制は、キメラ型12H3、ヒト化12H3 VL1VH1および12H3 VL1VH2ならびにOX40Lの存在下では弱められた。12H3 VL1VH1または12H3 VL1VH2とOX40Lとの組み合わせの存在により、幾分の相乗効果が実証された。図中には、Teff細胞の増殖を、刺激に応答して少なくとも1回分裂したTeff細胞の増殖倍数の尺度である複製指数として表現している（例えば、少なくとも1つの分裂を経た培養の終了時の、100万個単位での細胞数）。
【０４１０】
表3は、5人のドナーから入手した細胞における、12H3 VL1VH2（IgG4κ）に関する、Treg／Teff比が0：1、1：2および1：4のTregの存在下での、Teff増殖に対する効果に対する12H3 VH1VH2 IgG4／κ）の効果をまとめている。増殖の度合いは、複製指数として表現している。Tregの非存在下では、12H3 VL1VH2は全ドナー由来細胞において、アイソタイプ対照（CD2／CD3／CD28ビーズを用いるTeff活性化を伴うもの）と比較して、Teff細胞増殖を刺激した。Treg／Teff比が1：2または1：4のいずれかであるTregの存在下では、12H3 VL1VH2の存在により、全ドナー由来細胞においてTreg抑制が弱められた。
【０４１１】
これらの結果は、12H3 VL1VH1および12H3 VL1VH2が、CD4エフェクターT細胞に対してそれらの増殖を誘導する効果を有すること、ならびにこれらの抗体がTeffをTregに対してある程度耐性化すること、またはTregそれ自体が抗体の存在下では抑制性が弱くなることを指し示している。
【０４１２】
（表３）
2016515544.tif 000069
【０４１３】
実施例14．ヒト化抗体の最適化
ヒト化20E5抗体の最適化
ヒト化重鎖可変領域（VH）20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3のHCDR2は、VH残基位置56〜57に異性化モチーフを含有する（DG、D56G57）。位置56での置換の効果を検討するために、アスパラギン酸（D）残基を、グリシン（G）、アラニン（A）、セリン（S）またはグルタミン酸（E）に突然変異させる。
【０４１４】
ヒト化重鎖可変領域20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3のHCDR3は、位置106にメチオニン（M）を含有する（M106）。このメチオニンは大部分が埋没している可能性が高いが、酸化リスクを減少させるために、位置106のメチオニンをロイシン（L）またはイソロイシン（I）に突然変異させる。
【０４１５】
ヒト化重鎖可変領域20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3における位置11は、バリン（V）を含有する。この位置での置換は抗体に対して強い構造的影響を及ぼす可能性があり、それ故にその機能にも強い影響を及ぼす可能性がある（Klein et al mAbs 5:22-33, 2013）。位置11での置換の効果を検討するために、バリン（V）残基をロイシン（L）に突然変異させる。
【０４１６】
突然変異は、標準的な方法を用いて、各重鎖可変領域20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3に組み入れる。突然変異型HCDR2配列は表4に示されており、突然変異型HCDR3配列は表5に示されている。単一の置換を含有する最適化されたヒト化20E5可変領域は、表6に示されている。親VH領域および最適化されたVH領域のアラインメントは、図43Aおよび図43Bに示されている。最適化されたVH領域の名称は、親VHおよび加えられた置換を示している。そのほかの最適化された可変領域は、標準的な方法を用いて、位置11、56および／または106に同時に置換を加えることによって作製することができる。
【０４１７】
標準的な方法を用いて、得られたVH領域を軽鎖可変領域20E5_VL1または20E5 VL2と対合させ、得られた抗体をIgG4／κとして発現させる。実施例11Aに記載されたプロトコールに従うELISAを用いて、抗体をCD134に対するその結合に関して試験する。実施例13に記載されたプロトコールを用いて、抗体を、Teff細胞の増殖を誘導するその能力、およびTeff増殖に対するTregの阻害効果を弱める能力に関してさらに試験する。親ヒト化20E5抗体に匹敵する特性を有する抗体を、さらなる試験のために選択する。
【０４１８】
（表４）
2016515544.tif 000070
【０４１９】
（表５）
2016515544.tif 000071
【０４２０】
（表６）
2016515544.tif 000072
【０４２１】
ヒト化12H3抗体の最適化
ヒト化重鎖可変領域（VH）12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3のHCDR2は、残基54〜56に脱アミドモチーフ（NNG）を含有する（N54N55G56）。脱アミドのリスクを最小限に抑えるために、位置55のアスパラギン（N55）を、グルタミン（Q）、アラニン（A）またはグルタミン酸（E）に突然変異させる。
【０４２２】
ヒト化重鎖可変領域12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3のHCDR3は、位置99にメチオニン（M）を含有する（M99）。このメチオニンは大部分が埋没している可能性が高いが、酸化リスクを減少させるために、位置99のメチオニンをロイシン（L）またはイソロイシン（I）に突然変異させる。
【０４２３】
ヒト化重鎖可変領域12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3における位置11は、バリン（V）を含有する。この位置での置換は抗体に対して強い構造的影響を及ぼす可能性があり、それ故にその機能にも強い影響を及ぼす可能性がある（Klein et al mAbs 5:22-33, 2013）。位置11での置換の効果を検討するために、バリン（V）残基をロイシン（L）に突然変異させる。
【０４２４】
突然変異は、標準的な方法を用いて、各重鎖可変領域12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3に組み入れる。突然変異型HCDR2配列は表7に示されており、突然変異型HCDR3配列は表8に示されている。単一の置換を含有する最適化されたヒト化12H3可変領域は表9に示されている。親VH領域および最適化されたVH領域のアラインメントは、図44に示されている。最適化されたVH領域の名称は、親VHおよび加えられた置換を示している。そのほかの最適化された可変領域は、標準的な方法を用いて、位置11、55および／または99に同時に置換を加えることによって作製することができる。
【０４２５】
標準的な方法を用いて、得られたVH領域を軽鎖可変領域12H3_VL1または12H3 VL2と対合させ、得られた抗体をIgG4／κとして発現させる。実施例11Aに記載されたプロトコールに従うELISAを用いて、抗体をCD134に対するその結合に関して試験する。実施例13に記載されたプロトコールを用いて、抗体を、Teff細胞の増殖を誘導するその能力、およびTeff増殖に対するTregの阻害効果を弱める能力に関してさらに試験する。親ヒト化12H3抗体に匹敵する特性を有する抗体を、さらなる試験のために選択する。
【０４２６】
（表７）
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【０４２７】
（表８）
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【０４２８】
（表９）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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