(57)【要約】  本発明は、ＡＢＡ受容体を活性化するアゴニスト化合物、およびこのアゴニスト化合物を含む農業用製剤を提供する。農業用製剤は、植物栄養組織におけるＡＢＡ応答を誘発し、植物における非生物的ストレスを軽減し、および植物種子の発芽を抑制するのに有用である。この化合物はまた、内因性または異種ＡＢＡ受容体を発現する細胞におけるＡＢＡ応答性遺伝子の発現を誘発するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2016531091.tif 000043
（式中、
Ｒ１が、Ｃ２〜６アルケニル、およびＣ２〜６アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、少なくとも１つのＲ３またはＲ４がメチルであり、
Ｌが、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付き文字ｍが、０〜４の整数であり、
下付き文字ｎが、０〜３の整数であり、
ｍ＋ｎが、１以上である）
の化合物、またはその塩もしくは異性体。
【請求項２】
下式：
【化２】
2016531091.tif 000044
で表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下式：
【化３】
2016531091.tif 000045
で表される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲンおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、フェニル、ナフチル、チオフェン、フラン、ピロール、およびピリジルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が、１つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、フェニルおよびチオフェンからなる群から選択され；
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メチル、およびエチルからなる群から選択され；
Ｌが、結合およびメチレンからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
下式：
【化４】
2016531091.tif 000046
で表される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
下式：
【化５】
2016531091.tif 000047
で表される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
ＬがＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ５がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３がＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ３がＣＨ３であり、かつＲ４がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ３がＨであり、かつＲ４がＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
ｍが２であり、かつ両方のＲ３基がＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
表１のいずれか１つの行に示される置換基の組合せを有する構造１〜５９のうちの１つに記載される化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物のいずれかを含む農業用製剤。
【請求項１８】
殺真菌剤、除草剤、有害生物防除剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物活性化剤、共力剤、除草剤毒性緩和剤、植物成長調節剤、防虫剤、殺ダニ剤、殺軟体動物剤、または肥料のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
界面活性剤をさらに含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２０】
担体をさらに含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２１】
植物における非生物的ストレス耐性を増加させる方法であって、植物を前記製剤と接触させない場合と比較して、前記植物における非生物的ストレス耐性を増加させるのに十分な量の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物または製剤と植物を接触させる工程を含む方法。
【請求項２２】
前記植物が単子葉植物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物が双子葉植物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記非生物的ストレス耐性が、乾燥耐性を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触工程が、航空機または灌水によって、前記製剤を前記植物に供給することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
植物における種子発芽を抑制する方法であって、発芽を抑制するのに十分な量の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物または製剤と種子を接触させる工程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物または製剤と接触している植物。
【請求項２８】
種子である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２９】
ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する方法であって、前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物または製剤と接触させる工程を含む方法。
【請求項３０】
前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が、細胞によって発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が植物細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が、内因性タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質が、異種タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）をさらに発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記２型タンパク質ホスファターゼが、ＨＡＢ１（ＡＢＩ１と相同）、ＡＢＩ１（アブシジン酸非感受性１）、またはＡＢＩ２（アブシジン酸非感受性２）である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本特許出願は、参照により援用される、２０１３年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８４０，９６７号に対する優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アブシジン酸（ＡＢＡ）は、非生物的ストレス反応に関連するシグナル伝達を調節する植物ホルモンである（Cutler et al, 2010, Abscisic Acid: Emergence of a Core Signaling Network. Annual Review of Plant Biology 61: 651-679）。ＡＢＡシグナル伝達経路は、多くの手法によって、植物ストレス反応および関連する収量形質を改善するのに利用されている（Yang et al, 2010）。植物へのＡＢＡの直接の施用により、それらの水利用効率が改善され（Raedmacher et al, 1987）；この理由から、ＡＢＡアゴニストの発見（Park et al, 2009; Melcher et al, 2010, Identification and mechanism of ABA receptor antagonism. Nature Structural & Molecular Biology 17(9): 1102-1110）は、このような分子が作物収量を改善するのに有益であり得るため、ますます注目を集めている（Notman et al., 2009）。最初に特定された合成ＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンと名付けられたナフタレンスルホンアミドであり（Park et al., 2009）、それは、種子におけるＡＢＡシグナル伝達を効率的に活性化するが、非生物的ストレス耐性の最も重大な局面が発生する栄養組織における限られた活性を有する。ピラバクチンに非常に類似したスルホンアミドは、ＡＢＡアゴニスト（米国特許出願公開第２０１３００４５９５２号を参照）および非生物的ストレス調節化合物（米国特許出願公開第２０１１０２３０３５０号を参照）として開示されており；非スルホンアミドＡＢＡアゴニストも説明されている（米国特許出願公開第２０１３００４５９５２号および同第２０１１０２７１４０８号を参照）。ＡＢＡ経路を活性化するための補完的な手法は、遺伝的方法によって、ＡＢＡに対する植物の感受性を増加させることを含む。例えば、植物のＡＢＡ感受性を増加させる、ファルネシルトランスフェラーゼβサブユニット遺伝子の条件的アンチセンスにより、アブラナおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）の両方において、穏やかな乾燥下での収量が改善される（Wang et al, 2005）。したがって、収量に寄与する形質を改善するためのＡＢＡシグナル伝達の操作は、現在十分に確立されている。
【０００３】
最近、ＡＢＡが、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質と呼ばれる受容体の可溶性ファミリーへの結合によって、その細胞応答の多くを引き起こすことが発見された。ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、ＳＴＡＲＴスーパーファミリーと呼ばれるリガンド結合タンパク質の大きなファミリーに属する（Iyer et al., 2001）；Ponting et al, 1999）。これらのタンパク質は、「螺旋グリップ（helix-grip）」モチーフを形成するように中心のαへリックスを囲む７つの逆平行βシートからなる保存された３次元構造を含み；これらの構造要素は、一緒に、ＡＢＡまたは他のアゴニストを結合するためのリガンド結合ポケットを形成する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な概要
本発明は、小分子ＡＢＡアゴニスト、すなわち、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する化合物を提供する。一態様において、本発明は、本明細書に記載されるＡＢＡアゴニスト化合物ならびにこのような化合物を含む農業用製剤を提供する。ある実施形態において、式Ｉ：
【化１】
2016531091.tif 000002
（式中、
Ｒ１が、Ｃ２〜６アルケニル、およびＣ２〜６アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、少なくとも１つのＲ３またはＲ４がメチルであり、
Ｌが、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付き文字ｍが、０〜４の整数であり、
下付き文字ｎが、０〜３の整数であり、
ｍ＋ｎが、１以上である）
の化合物、またはその塩もしくは異性体が提供される。
【０００５】
ある実施形態において、農業用製剤は、植物成長を促進し、雑草を減少させ、または有害生物を減少させるのに有用な農薬をさらに含む。ある実施形態において、農業用製剤は、殺真菌剤、除草剤、有害生物防除剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物活性化剤、共力剤、除草剤毒性緩和剤、植物成長調節剤、防虫剤、殺ダニ剤、殺軟体動物剤、または肥料のうちの少なくとも１つをさらに含む。ある実施形態において、農業用製剤は、界面活性剤をさらに含む。ある実施形態において、農業用製剤は、担体をさらに含む。
【０００６】
別の態様において、本発明は、植物における非生物的ストレス耐性を増加させるための方法であって、製剤と接触していない場合の植物における非生物的ストレス耐性と比較して、植物における非生物的ストレス耐性を増加させるのに十分な量の上記の製剤と植物を接触させる工程を含む方法を提供する。ある実施形態において、植物は単子葉植物である。ある実施形態において、植物は双子葉植物である。ある実施形態において、非生物的ストレス耐性は、乾燥耐性を含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、植物における種子発芽を抑制する方法であって、発芽を抑制するのに十分な量の上記の製剤と植物、植物部位、または植物種子を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、上記の製剤と接触している植物または植物部位を提供する。ある実施形態において、植物は種子である。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する方法を提供する。本方法のある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質がアゴニスト化合物ＬＣ６６Ｃ６（本明細書においてキナバクチンとも呼ばれる）と結合するとき、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドと結合する。ある実施形態において、本方法は、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を、本明細書に記載される化合物のいずれかと接触させる工程を含む。ある実施形態において、活性化されるＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、配列番号１〜１１９のいずれか１つと実質的に同一である。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、細胞によって発現される。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、植物細胞によって発現される。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、内因性タンパク質である。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、異種タンパク質である。ある実施形態において、細胞は、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）をさらに発現する。ある実施形態において、２型タンパク質ホスファターゼは、ＨＡＢ１（ＡＢＩ１と相同）、ＡＢＩ１（アブシジン酸非感受性１）、またはＡＢＩ２（アブシジン酸非感受性２）である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】新規なＡＢＡアゴニストは、複数のＰＹＲ／ＰＹＬに結合する。天然型（＋）−ＡＢＡ、その（−）類似体および選択されるＡＢＡアゴニストの化学構造。
【図１Ｂ】新規なＡＢＡアゴニストは、複数のＰＹＲ／ＰＹＬに結合する。５μΜの試験薬品に対するＰＹＲ／ＰＹＬ受容体感受性の酵母ツーハイブリッドアゴニストアッセイ。特定のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体およびＰＰ２Ｃ  ＨＡＢ１は、本文に記載されるように、それぞれＧａｌ４  ＢＤまたはＡＤ融合タンパク質として発現される。
【図２Ａ】新規なＡＢＡアゴニストは、複数のＰＹＲ／ＰＹＬによってＰＰＣ２活性を抑制する。天然型（＋）−ＡＢＡおよび選択されるＡＢＡアゴニストの化学構造。
【図２Ｂ】新規なＡＢＡアゴニストは、複数のＰＹＲ／ＰＹＬによってＰＰＣ２活性を抑制する。１０μΜの各試験薬品の存在下または非存在下における様々な受容体についてのＨＡＢ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２  ＰＰ２Ｃ酵素活性に基づくＡＢＡ−アゴニストアッセイ。
【図２Ｃ】新規なＡＢＡアゴニストは、複数のＰＹＲ／ＰＹＬによってＰＰＣ２活性を抑制する。１０μΜの各試験薬品の存在下または非存在下における様々な受容体についてのＨＡＢ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２  ＰＰ２Ｃ酵素活性に基づくＡＢＡ−アゴニストアッセイ。
【図３Ａ−１】ＡＢＡアゴニストおよび類似体によるＰＰ２Ｃ酵素活性の受容体に媒介される用量依存的抑制。
【図３Ａ−２】ＡＢＡアゴニストおよび類似体によるＰＰ２Ｃ酵素活性の受容体に媒介される用量依存的抑制。
【図３Ｂ】酵素的ＨＡＢ１  ＰＰ２Ｃに基づくＡＢＡ−アゴニストアッセイにおいて観察された化合物ＩＣ５０値。
【図４Ａ】キナバクチンは、複数のＡＢＡ受容体を活性化する。ＡＢＡ、ピラバクチンおよびキナバクチンの化学構造。
【図４Ｂ】キナバクチンは、複数のＡＢＡ受容体を活性化する。ＡＢＡ受容体によるＨＡＢ１の薬品依存的抑制。５０ｎＭのＨＡＢ１、５０ｎＭおよび複数の濃度の化合物を用いて、方法に記載されるようにＩＣ５０値（ｎＭ）を決定した。総量反応曲線が、図３と同様に示される。（ｎｄ）は、活性タンパク質として産生されなかった受容体に対応する。系統樹は、ＭＥＧＡ５中のＪＴＴ距離行列を用いて作成された近隣結合樹である（Tamura K, et al.(2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28(10): 2731-2739）。
【図５Ａ】新規なＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンより強力にシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子の発芽を抑制する。ＡＢＡアゴニストによる種子発芽抑制の比較。種子を、薬品を含む１／２倍のＭＳ寒天プレートに蒔き、４℃で４日間貯蔵し、次に、２２±２℃に移した。写真を、連続照明下での４日間のインキュベーションの後、評価した。
【図５Ｂ】新規なＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンより強力にシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子の発芽を抑制する。ＡＢＡアゴニストによる種子発芽抑制の比較。種子を、薬品を含む１／２倍のＭＳ寒天プレートに蒔き、４℃で４日間貯蔵し、次に、２２±２℃に移した。発芽スコアを、連続照明下での４日間のインキュベーションの後、評価した。
【図５Ｃ】新規なＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンより強力にシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子の発芽を抑制する。発芽におけるシロイヌナズナ（Arabidopsis）ＡＢＡシグナル伝達欠損変異体および生合成欠損変異体に対するＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６（キナバクチンとも呼ばれる）の効果。種子を、薬品を含む１／２倍のＭＳ寒天プレートに蒔き、４℃で４日間貯蔵し、次に、２２±２℃に移した。写真を、連続照明下での４日間のインキュベーションの後、評価した。パネルＣは、５μΜのＡＢＡまたはＬＣ６６Ｃ６における発芽アッセイを示す。
【図５Ｄ】新規なＡＢＡアゴニストは、ピラバクチンより強力にシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子の発芽を抑制する。苗立ち（seedling establishment）におけるシロイヌナズナ（Arabidopsis）ＡＢＡシグナル伝達欠損変異体および生合成欠損変異体に対するＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６（キナバクチンとも呼ばれる）の効果。種子を、薬品を含む１／２倍のＭＳ寒天プレートに蒔き、４℃で４日間貯蔵し、次に、２２±２℃に移した。緑化子葉スコアを、連続照明下での４日間のインキュベーションの後、評価した。
【図６Ａ】ＬＣ６６Ｃ６は、植物成長を抑制する。野生型、ａｂｉ１−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ四重変異体シロイヌナズナ（Arabidopsis）遺伝子型に対するＡＢＡ、ピラバクチンおよびＬＣ６６Ｃ６の効果を示す写真。
【図６Ｂ】ＬＣ６６Ｃ６は、植物成長を抑制する。ＡＢＡ、ＬＣ６６Ｃ６およびピラバクチンによる根成長抑制。
【図６Ｃ】ＬＣ６６Ｃ６は、植物成長を抑制する。ＡＢＡ、ＬＣ６６Ｃ６およびピラバクチンによる植物成長抑制。２日齢の苗を、薬品を含む１／２倍のＭＳプレート上に移し、試験化合物における５日間のインキュベーションの後、表現型をスコア化し、または撮影した。
【図７Ａ】ＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を高める。ＬＣ６６Ｃ６は、野生型における脱離した葉の蒸散による水分損失を抑制する。
【図７Ｂ】ＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を高める。ＬＣ６６Ｃ６は、ａｂａ２変異体遺伝子型における脱離した葉の蒸散による水分損失を抑制する。
【図７Ｃ】ＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を高める。ＬＣ６６Ｃ６は、ＡＢＡ非感受性遺伝子型ａｂｉ１−１の表現型を助けることができない。
【図７Ｄ】ＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を高める。ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびａｂａ２における気孔閉鎖を誘発するが、ａｂｉ１−１遺伝子型では誘発しない。
【図７Ｅ】ＬＣ６６Ｃ６は、乾燥ストレス耐性を高める。ダイズにおける乾燥処理中の土壌水分量に対する化合物の効果。土壌水分量を、実施例に記載されるように測定した。
【図８Ａ】キナバクチンは、野生型植物に乾燥ストレス耐性を与える。シロイヌナズナ（Arabidopsis）乾燥耐性に対するキナバクチンの効果。２週齢の植物に、水を控えることによって乾燥ストレスを与え、１２日後に撮影した。乾燥期間中、植物を、３日ごとに２５μΜの化合物で処理した。２週間の乾燥処理後、植物に水分補給し；各処理についての（試験される総数における）生存植物の数が、各画像の隣に示される。
【図８Ｂ】キナバクチンは、野生型植物に乾燥ストレス耐性を与える。ダイズに対するキナバクチンの効果。２週齢の植物に、水を控えることによって乾燥ストレスを与え、８日間の乾燥処理の後に撮影した。全ての乾燥ストレス処理について、化合物（シロイヌナズナ（Arabidopsis）については２５μΜおよびダイズについては５０μΜで試験される）を、０．０５％のTween-20を含有する溶液中で施用し、乾燥期間にわたって３日ごとにエアロゾルとして施用した。全ての実験についての値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝６、実験当たり３つの植物が使用される）。
【図９Ａ】ＬＣ６６Ｃ６は、多くのＡＢＡ応答性遺伝子を誘発する。ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、または（＋）−ＡＢＡのいずれかで処理されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）苗の野生型、ａｂｉ１−１、ｐｙｒ１／ｐｙｌ１／ｐｙｌ２／ｐｙｌ４四重受容体変異体遺伝子型におけるＡＢＡ応答性レポーター遺伝子ＲＤ２９ＢおよびＭＡＰＫＫＫ１８の化学的に誘発されたｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図９Ｂ】ＬＣ６６Ｃ６は、多くのＡＢＡ応答性遺伝子を誘発する。ＬＣ６６Ｃ６は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）苗におけるＡＢＡ応答性遺伝子を効率的に誘発する一方、ピラバクチンは誘発しない。１０日齢の苗を、担体溶媒（ＤＭＳＯ）または２５μΜのＡＢＡ、ピラバクチンまたはＬＣ６６Ｃ６のいずれかで、８時間にわたって処理した。次に、全ＲＮＡを、調製し、標識し、ＡＴＨ１マイクロアレイにハイブリダイズした。プロットされたデータは、全ての実験にわたって検出可能な約１３Ｋのプローブについてのlog2変換された平均発現値である。示されるデータは、３回の生物学的反復から決定された平均である。
【図９Ｃ】ＬＣ６６Ｃ６は、多くのＡＢＡ応答性遺伝子を誘発する。ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、または（＋）−ＡＢＡによる処理後の異なる植物組織におけるレポーター遺伝子の発現を示す。
【図９Ｄ】ＬＣ６６Ｃ６は、多くのＡＢＡ応答性遺伝子を誘発する。ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、または（＋）−ＡＢＡによる処理後の異なる植物組織におけるレポーター遺伝子の発現を示す。
【図１０】ＰＹＲ／ＰＹＬ単一変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現。ＬＣ６６Ｃ６、ＡＢＡおよびピラバクチンに対するＡＢＡ応答性ＭＡＰＫＫＫ１８、ＲＤ２９Ａ、およびＲＤ２９Ｂ  ｍＲＮＡの応答を、ＣｏｌおよびＬｅｒ生態型およびｐｙｒ１、ｐｙｌ１、ｐｌｙ２、ｐｙｌ３およびｐｙｌ４単一変異体遺伝子型において特性評価した。
【図１１】ＬＣ６６Ｃ６は、野生型植物、ａｂｉ１−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ四重変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を誘発する。ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡは、Ｃｏｌ野生型植物において用量依存的にＡＢＦ３、ＧＢＦ３、ＮＣＥＤ３、およびＲＤ２９Ａの発現を誘発した一方、ピラバクチンは誘発しない。
【図１２Ａ】ＬＣ６６Ｃ６感受性は、ＣＹＰ７０７Ａ  ＡＢＡ−水酸化酵素によって影響されない。ＤＭＳＯ、４０μΜの（＋）−ＡＢＡ、および４０μΜのＬＣ６６Ｃ６で処理された、野生型植物、ＣＹＰ７０７Ａ（ＣＹＰ７０７ＡＯＸ）を過剰発現する植物、およびｃｙｐ７０７ａについての二重変異体である植物の写真を示す。
【図１２Ｂ】ＬＣ６６Ｃ６感受性は、ＣＹＰ７０７Ａ  ＡＢＡ−水酸化酵素によって影響されない。ＤＭＳＯ、４０μΜの（＋）−ＡＢＡ、および４０μΜのＬＣ６６Ｃ６で処理された、野生型植物、ＣＹＰ７０７Ａ（ＣＹＰ７０７ＡＯＸ）を過剰発現する植物、およびｃｙｐ７０７ａについての二重変異体である植物における一次根長さの定量化を示す。
【図１２Ｃ】ＬＣ６６Ｃ６感受性は、ＣＹＰ７０７Ａ  ＡＢＡ−水酸化酵素によって影響されない。（Ａ）にあるように処理された植物の生体重を示す。
【図１２Ｄ】ＬＣ６６Ｃ６感受性は、ＣＹＰ７０７Ａ  ＡＢＡ−水酸化酵素によって影響されない。（Ａ）にあるように処理された植物における緑化子葉を有する植物のパーセントを示す。
【図１３Ａ】ＬＣ６６Ｃ６は、多様な種におけるＡＢＡ応答を調節する。示される化合物に応答した、発芽抑制。
【図１３Ｂ】ＬＣ６６Ｃ６は、多様な種におけるＡＢＡ応答を調節する。示される化合物に応答した、脱離の２時間後の脱離した葉における蒸散による水分損失。
【図１３Ｃ】ＬＣ６６Ｃ６は、多様な種におけるＡＢＡ応答を調節する。薬品の施用後のダイズにおけるＡＢＡ応答性マーカー遺伝子の発現。Ｄ、Ｐ、ＬおよびＡはそれぞれ、ＤＭＳＯ、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡを示す。
【図１３Ｄ】ＬＣ６６Ｃ６は、多様な種におけるＡＢＡ応答を調節する。薬品の施用後のオオムギにおけるＡＢＡ応答性マーカー遺伝子の発現。
【図１３Ｅ】ＬＣ６６Ｃ６は、多様な種におけるＡＢＡ応答を調節する。薬品の施用後のトウモロコシにおけるＡＢＡ応答性マーカー遺伝子の発現。
【図１４】ＡＢＡおよびアゴニストの化学構造。
【図１５Ａ】酵母アッセイおよび種子発芽におけるＡＢＡおよびアゴニストの効果。図１４に示されるアゴニストのそれぞれに対する応答を試験するための、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、およびＰＹＬ４を用いた酵母ツーハイブリッドアッセイの結果を示す。
【図１５Ｂ】酵母アッセイおよび種子発芽におけるＡＢＡおよびアゴニストの効果。野生型種子の発芽における図１４中のアゴニストの試験の結果を示す。
【図１５Ｃ】酵母アッセイおよび種子発芽におけるＡＢＡおよびアゴニストの効果。ＡＢＡ誘発性シロイヌナズナ（Arabidopsis）遺伝子ＭＡＰＫＫＫ１８の制御下で、グルクロニダーゼを発現する遺伝子導入系統におけるグルクロニダーゼアッセイを用いて測定した際のＡＢＡレポーター系統に対する化合物の効果を示す。
【図１６Ａ】ＬＣ６６Ｃ６の施用により、ＡＢＡ欠損変異体ａｂａ２において観察される成長異常を助けることができる。薬品溶液（２５μΜ）を、１４日齢の植物に、１日２回、２週間にわたって噴霧した。画像を４週の植物から得た。
【図１６Ｂ】ＬＣ６６Ｃ６の施用により、ＡＢＡ欠損変異体ａｂａ２において観察される成長異常を助けることができる。薬品溶液（２５μΜ）を、１４日齢の植物に、１日２回、２週間にわたって噴霧した。生体重を４週の植物から得た。
【図１７Ａ】ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）およびクラミドモナス属（Chlamydomonas）におけるＡＢＡおよびそのアゴニストの効果。ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）に対するＡＢＡおよびアゴニストの効果の原糸体成長画像。原糸体を、１０日間にわたって、２００μΜの特定の試験薬品上で成長させた。ＬＣ６６Ｃ６の効果は弱かったが、原糸体成長を著しく抑制した。ピラバクチンは、原糸体を脱色した。
【図１７Ｂ】ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）およびクラミドモナス属（Chlamydomonas）におけるＡＢＡおよびそのアゴニストの効果。ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）に対するＡＢＡおよびアゴニストの効果の定量分析。
【図１７Ｃ】ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）およびクラミドモナス属（Chlamydomonas）におけるＡＢＡおよびそのアゴニストの効果。ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）のＡＢＡ応答性遺伝子の発現。原糸体を、３時間にわたって、２００μΜの薬品溶液で処理した。
【図１７Ｄ】ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）およびクラミドモナス属（Chlamydomonas）におけるＡＢＡおよびそのアゴニストの効果。塩分ストレスおよび浸透圧ストレスを伴う薬品におけるクラミドモナス属（Chlamydomonas）のコロニー成長。ストレスを伴う場合および伴わない場合の、クラミドモナス属（Chlamydomonas）成長に対するＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６の効果はなかった。ピラバクチンは、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）およびクラミドモナス属（Chlamydomonas）を脱色し、このことは、この化合物が、そのＡＢＡアゴニスト活性と関係なく、これらの種における毒性を有し得ることを示唆している。
【図１８】発芽およびｐＭＡＰＫＫ１８：Ｇｕｓレポーター発現の抑制に対するそれらの効果について試験されるアゴニスト化合物の概要を示す。＋＋＋＋＋＋が、強い活性を示す一方、単一の＋は、弱い活性を示し、ダッシュ（−）は、活性がないことを示し、ｎ．ｄ．は、測定されていないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
「アゴニスト」は、例えば、記載される標的タンパク質の発現を誘発または活性化し、または１つまたは複数の植物ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質（またはコードするポリヌクレオチド）に結合し、それらを刺激し、増加させ、開放し、活性化し、促進し、活性化を促進し、感作し、またはそれらの活性を上方制御する作用物質である。アゴニストは、天然分子および合成分子を含み得る。ある実施形態において、アゴニストは、農業用製剤を製造するために農薬と組み合わされる。好適な農薬の例としては、殺真菌剤、除草剤、有害生物防除剤、肥料、および／または界面活性剤が挙げられる。アゴニストがＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質に「作用する（agonizes）」かまたは「作用しない（does not agonize）」かを決定するためのアッセイとしては、例えば、本明細書に記載されるように、推定アゴニストを、精製されたＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質に接触させ、次に、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質活性に対する機能的効果を決定すること、または本明細書に記載されるように、推定アゴニストを、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を発現する細胞に接触させ、次に、記載される標的タンパク質活性に対する機能的効果を決定することが挙げられる。当業者は、アゴニストがＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質に作用するかまたは作用しないかを決定するために、アッセイが好適であるかどうかを決定することができるであろう。推定アゴニストで処理されるＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を含む試料またはアッセイは、効果の程度を調べるために、アゴニストなしでの対照試料と比較される。対照試料（アゴニストで処理されていない）には、１００％の相対的活性値が割り当てられる。ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質のアゴニズムは、対照に対する活性値が、１１０％、任意選択的に１５０％、任意選択的に２００、３００％、４００％、５００％、または１０００〜３０００％またはそれを超えるときに達成される。
【００１２】
「ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチド」という用語は、野生型形態において、アブシジン酸（ＡＢＡ）およびＡＢＡ類似体のシグナル伝達を媒介する、ポリケチドシクラーゼドメイン２（ＰＦ１０６０４）、ポリケチドシクラーゼドメイン１（ＰＦ０３３６４）、およびＢｅｔ  Ｖ  Ｉドメイン（ＰＦ０３３６４）のうちの１つまたは複数または全ての存在によって部分的に特徴付けられるタンパク質を指す。様々なＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチド配列が、当該技術分野において公知である。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号１〜１１９のいずれか１つと実質的に同一であるポリペプチドを含む。例えば、公開されたＰＣＴ出願である国際公開第２０１１／１３９７９８号を参照されたい。
【００１３】
「活性アッセイ」という用語は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドの活性を測定または検出する任意のアッセイを指す。ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体の活性を測定するための例示的なアッセイは、実施例に記載されるように、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドへのＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの結合を検出する酵母ツーハイブリッドアッセイである。
【００１４】
２つの核酸配列またはポリペプチドは、後述されるように、最大に一致するように整列されるとき、２つの配列中のそれぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が同じである場合、「同一である」と記載される。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、「同一である」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いてまたは手動の整列および目視検査によって測定した際に、比較ウィンドウ上で最大に一致するように比較または整列されるとき、同じであるかまたは特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性のパーセンテージが、タンパク質またはペプチドに関して使用されるとき、同一でない残基の位置は、多くの場合、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させない、保存アミノ酸置換によって異なることが認識される。配列の保存置換が異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するように上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的に、これは、完全な不一致ではなく部分的な不一致として保存置換をスコア化し、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が、１のスコアを与えられ、非保存置換が、０のスコアを与えられる場合、保存置換は、０〜１のスコアを与えられる。保存置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Intelligenetics, Mountain View, California, USA）において実施されるように、例えば、Meyers & Miller, Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)のアルゴリズムにしたがって計算される。
【００１５】
２つの核酸またはポリペプチドに関連して使用される「実質的に同一」という語句は、参照配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。あるいは、同一性パーセントは、６０％〜１００％の任意の整数であり得る。ある実施形態は、本明細書に記載されるプログラム；好ましくは、後述されるように、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴを用いて、参照配列と比較して、少なくとも：６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明の実施形態は、配列番号１〜１１９のいずれかと実質的に同一のポリペプチド、およびポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１６】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が、参照配列として働き、試験配列がそれと比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験および参照配列が、コンピュータに入力され、部分配列座標が、必要に応じて指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。初期設定のプログラムパラメータが使用され得るか、または代替的なパラメータが指定され得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００１７】
本明細書において使用される際の「比較ウィンドウ」は、２０〜６００個、通常、約５０〜約２００個、より通常は、約１００〜約１５０個からなる群から選択される隣接位置の数のいずれか１つの部分の参照を含み、ここで、２つの配列が最適に整列された後、配列が、同じ番号の隣接位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列の整列の方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv.Appl.Math.2: 482(1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J.Mol.Biol.48: 443(1970)の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85: 2444(1988)の類似法の探求によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動の整列および目視検査によって、行われ得る。
【００１８】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムは、それぞれ、Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215: 403-410およびAltschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25: 3389-3402に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを介して公的に入手可能である。アルゴリズムは、まず、データベース配列中で同じ長さのワードと整列されるとき、ある正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、上掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして働く。次に、累積整列スコアが増加され得る限り、ワードヒットを、各配列に沿って両方向に延長させる。ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対の一致する残基についての報酬スコア；常に０を超える）およびＮ（不一致残基についてのペナルティスコア；常に０未満）を用いて、累積スコアを計算する。アミノ酸配列に関して、スコア行列を用いて、累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの延長は、累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ外れたとき；累積スコアが、１つまたは複数の負のスコアの残基整列の累積によって０以下になったとき；またはいずれかの配列の末端に達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列に関する）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期設定として、２８のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 10915(1989)を参照）。
【００１９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析も行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90: 5873-5787(1993)を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然起こる確率の指標を与える最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸との試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．０１未満、より好ましくは、約１０−５未満、最も好ましくは、約１０−２０未満である場合、核酸は、参照配列に類似するとみなされる。
【００２０】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって規定される全ての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを改変せずに、記載される対応するコドンのいずれかに改変され得る。このような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を表す。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧを除く）が機能的に同一の分子を生じるように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、それぞれの記載される配列中にある。
【００２１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を改変する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列における個々の置換が、改変が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存置換表は、当該技術分野において周知である。
【００２２】
以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照）。
【００２３】
「植物」という用語は、植物全体、シュート栄養器官および／または構造（例えば、葉、幹、および塊茎）、根、花および花器官（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄しべ、心皮、葯）、胚珠（卵細胞および中心細胞を含む）、種子（受精卵、胚、内胚乳、および種皮を含む）、果実（例えば、成熟子房）、苗、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）、細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、トリコームなど）、およびそれらの子孫を含む。本発明の方法に使用され得る植物の種類は、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ植物、コケ植物、ならびに多細胞藻および単細胞藻を含む。それは、異数体、倍数体、２倍体、半数体、および半接合体を含む、様々な倍数性レベルの植物を含む。
【００２４】
本明細書において使用される際、「トランスジェニック」という用語は、人間によって修飾されたゲノムを含有する非天然植物を表し、この植物は、そのゲノム中に、同じかまたは異なる植物種に由来し得る外因性核酸分子を含む。外因性核酸分子は、プロモーター、エンハンサー、または他の調節要素などの遺伝子調節要素であり得、または異種遺伝子調節要素に結合され得るコード配列を含有し得る。有性交雑からまたは自殖によって生じるトランスジェニック植物は、このような植物の子孫であり、同様に「トランスジェニック」であるとみなされる。
【００２５】
本明細書において使用される際、それらの変異のいずれかを含む、「乾燥抵抗性」または「乾燥耐性」という用語は、乾燥ストレス（すなわち、数日間にわたってほとんどまたは全く水を与えられない）の期間から回復する植物の能力を指す。典型的に、乾燥ストレスは、少なくとも５日間であり、例えば、植物種に応じて、例えば、１８〜２０日間以上（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間）もの長さであり得る。
【００２６】
本明細書において使用される際、「非生物的ストレス」、「ストレス」、または「ストレス条件」という用語は、植物の代謝、成長、発達、繁殖、または生存（まとめて、「成長」）に対する悪影響を与える生物でない（「非生物」）物理的または化学的要因への植物、植物細胞などの曝露を指す。ストレスは、例えば、水（例えば、湛水、乾燥、または脱水）、嫌気性条件（例えば、より低レベルの酸素または高レベルのＣＯ２）、異常な浸透圧条件、塩分、または温度（例えば、高温／熱、低温、凍結、または霜）、栄養不足または汚染物質への曝露などの環境要因に起因して、またはホルモン、二次メッセンジャー、または他の分子によって、植物に与えられ得る。嫌気ストレスは、例えば、ストレス反応を生じるのに十分な酸素レベルの低下（低酸素または無酸素）に起因する。湛水ストレスは、モンスーン、雨季、鉄砲水、または植物の過剰な灌水などの際に発生するような、液体媒体中における植物、植物部位、組織、または単離細胞の長期または一時的な浸漬に起因し得る。低温ストレスまたは熱ストレスは、特定の植物種の成長温度の最適な範囲からの温度の低下または上昇に起因し得る。このような最適な成長温度範囲は、容易に決定され、当業者に公知である。脱水ストレスは、細胞、組織、器官または植物全体の水分の損失、低下した膨圧、または減少した水分含量によって誘発され得る。乾燥ストレスは、細胞、組織、器官または生物に対する水分の欠乏また水の供給減少によって誘発されるかまたはそれに関連付けられ得る。塩分に誘発されるストレス（塩ストレス）は、細胞の細胞内または細胞外環境の浸透ポテンシャルの混乱に関連付けられるかまたはそれによって誘発され得る。本明細書において使用される際、「非生物的ストレス耐性」または「ストレス耐性」という用語は、通常の条件下の植物と比較した、非生物的ストレスに対する植物の増加した抵抗性または耐性、および非生物的ストレス条件下にある場合に比較的優れた態様で機能する能力を指す。
【００２７】
ポリペプチド配列は、それが外来種に由来する場合、または、同種に由来する場合は元の形態から改変されている場合、生物または第２のポリペプチド配列に対して「異種」である。
【００２８】
発明の詳細な説明
Ｉ．導入
本発明は、一部には、選択的アブシジン酸（ＡＢＡ）アゴニストの発見に基づくものである。これまでのＡＢＡアゴニストと異なり、本明細書に記載されるアゴニストは、植物栄養組織内のＡＢＡ経路を強力に活性化し、非生物的ストレス耐性を誘発する。新規なアゴニストは、植物の作物種におけるストレス耐性を誘発するのに使用され得る。アゴニストは、ブロッコリー、ハツカダイコン、アルファルファ、ダイズ、オオムギ、およびコーン（トウモロコシ）を含むがそれらに限定されない、単子葉植物種および双子葉植物種におけるストレス耐性を誘発するのに使用され得る。
【００２９】
アブシジン酸は、芽の休眠、種子の休眠および／または成熟、葉および果実の落下、および様々な生物学的ストレス（例えば低温、熱、塩分、および乾燥）に対する応答を含む様々な植物保護機能に関与する多機能の植物ホルモンである。ＡＢＡは、ＣＯ２濃度と無関係の機構による気孔閉鎖の調節にも関与する。ＡＢＡ受容体タンパク質のＰＹＲ／ＰＹＬファミリーは、ＡＢＡシグナル伝達を媒介する。これまでに調べられた植物は、２つ以上のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質ファミリーメンバーを発現し、これは、少なくともいくらかの余剰の活性を有する。ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質は、例えば、種子発芽、発芽後成長、気孔の動きおよび乾燥を含むがそれに限定されないストレスに対する植物の耐性における正の調節因子として、ＡＢＡシグナル伝達を媒介する。
【００３０】
様々な野生型（天然型）ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチド配列が、当該技術分野において公知である。ＰＹＲ１は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）におけるアブシジン酸（ＡＢＡ）受容体として最初は同定されたが、実際には、ＰＹＲ１は、同様にＡＢＡシグナル伝達を媒介するシロイヌナズナ（Arabidopsis）における同じタンパク質ファミリーの少なくとも１４のタンパク質（ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質）の群のメンバーである。このタンパク質ファミリーは、他の植物中にも存在し（例えば、配列リストを参照）、ポリケチドシクラーゼドメイン２（ＰＦ１０６０４）、ポリケチドシクラーゼドメイン１（ＰＦ０３３６４）、およびＢｅｔ  Ｖ  Ｉドメイン（ＰＦ０３３６４）のうちの１つまたは複数または全ての存在によって部分的に特徴付けられる。ＳＴＡＲＴ／Ｂｅｔ  ｖ  １スーパーファミリードメインは、例えば、Radauer, BMC Evol.Biol.8: 286(2008)に記載されている。ある実施形態において、野生型ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号１〜１１９のいずれかを含む。ある実施形態において、野生型ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号１〜１１９のいずれかと実質的に同一である（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、または１１９のいずれかと実質的に同一である（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）。
【００３１】
ＩＩ．ＡＢＡアゴニスト
本発明は、小分子ＡＢＡアゴニスト、すなわち、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を活性化する化合物を提供する。例示的なＡＢＡアゴニストとしては、例えば、以下から選択される化合物が挙げられる。
【００３２】
式（Ｉ）：
【化２】
2016531091.tif 000003
（式中、
Ｒ１が、Ｃ２〜６アルケニル、およびＣ２〜６アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、少なくとも１つのＲ３またはＲ４がメチルであり、
Ｌが、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付き文字ｍが、０〜４の整数であり、
下付き文字ｎが、０〜３の整数であり、
ｍ＋ｎが、１以上である）
の化合物、またはその塩もしくは異性体。
【００３３】
ある実施形態において、ＬがＣＨ２である。ある実施形態において、Ｒ３がＣＨ３である。ある実施形態において、Ｒ３がＣＨ３であり、かつＲ４がＨである。ある実施形態において、Ｒ３がＨであり、かつＲ４がＣＨ３である。ある実施形態において、Ｒ５がＨである。ある実施形態において、ｍが２であり、かつ両方のＲ３基がＣＨ３である。
【００３４】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−Ａ）：
【化３】
2016531091.tif 000004
で表される。
【００３５】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−Ｂ）：
【化４】
2016531091.tif 000005
で表される。
【００３６】
ある実施形態において、Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される。
【００３７】
ある実施形態において、各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲンおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される。
【００３８】
ある実施形態において、Ｒ２が、フェニル、ナフチル、チオフェン、フラン、ピロール、およびピリジルからなる群から選択される。
【００３９】
ある実施形態において、Ｒ２が、１つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、フェニルおよびチオフェンからなる群から選択され；各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、メチル、およびエチルからなる群から選択され；Ｌが、結合およびメチレンからなる群から選択される。
【００４０】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−Ｃ）：
【化５】
2016531091.tif 000006
で表される。
【００４１】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ−Ｄ）：
【化６】
2016531091.tif 000007
で表される。
【００４２】
ある実施形態において、ｍが４であり、ｎが３である。任意選択的に、式Ｉ（式中、ｍが４であり、ｎが３である）の化合物は、以下に示される式Ｉ−Ｅの化合物によって表され得る。
【化７】
2016531091.tif 000008
式Ｉ−Ｅ中、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、およびＲ３ｄがそれぞれ、独立して、式ＩについてＲ３に関して定義されるとおりである。同様に、式Ｉ−Ｅ中、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｂがそれぞれ、独立して、式ＩについてＲ４に関して定義されるとおりである。
【００４３】
ある実施形態において、式Ｉ−Ｅは、以下に示される構造１〜５９のうちの１つとして表され得る。
【化８】
2016531091.tif 000009
【化９】
2016531091.tif 000010
【化１０】
2016531091.tif 000011
【化１１】
2016531091.tif 000012
【化１２】
2016531091.tif 000013
【化１３】
2016531091.tif 000014
【化１４】
2016531091.tif 000015
【００４４】
構造１、構造２、構造３、構造４、構造５、構造６、構造７、構造８、構造９、構造１０、構造１１、構造１２、構造１３、構造１４、構造１５、構造１６、構造１７、構造１８、構造１９、構造２０、構造２１、構造２２、構造２３、構造２４、構造２５、構造２６、構造２７、構造２８、構造２９、構造３０、構造３１、構造３２、構造３３、構造３４、構造３５、構造３６、構造３７、構造３８、構造３９、構造４０、構造４１、構造４２、構造４３、構造４４、構造４５、構造４６、構造４７、構造４８、構造４９、構造５０、構造５１、構造５２、構造５３、構造５４、構造５５、構造５６、構造５７、構造５８、および構造５９で表される例示的な化合物が、表１中で以下に示される。表１中、置換基Ｒ１、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｂが、各化合物について列挙される。表１に列挙される置換基の各組合せが、構造１〜５９のそれぞれに使用され得る。
【００４５】
参照の目的のために、それぞれの個々の化合物が、表１に示される構造番号および置換基識別番号にしたがって識別される。例えば、構造１（式中、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり、Ｒ３ａがメチルであり、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｃがそれぞれＨである）の化合物は、化合物１．００１と表示される。別の例では、構造２４（式中、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ３（Ｅ）であり、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｃがそれぞれＨである）の化合物が、化合物２４．０１６と表示される。
【００４６】
【表１】
2016531091.tif 000016
【００４７】
【表２】
2016531091.tif 000017
【００４８】
【表３】
2016531091.tif 000018
【００４９】
【表４】
2016531091.tif 000019
【００５０】
【表５】
2016531091.tif 000020
【００５１】
【表６】
2016531091.tif 000021
【００５２】
【表７】
2016531091.tif 000022
【００５３】
【表８】
2016531091.tif 000023
【００５４】
【表９】
2016531091.tif 000024
【００５５】
【表１０】
2016531091.tif 000025
【００５６】
【表１１】
2016531091.tif 000026
【００５７】
【表１２】
2016531091.tif 000027
【００５８】
【表１３】
2016531091.tif 000028
【００５９】
【表１４】
2016531091.tif 000029
【００６０】
【表１５】
2016531091.tif 000030
【００６１】
ある実施形態において、化合物は、表１に示される置換基の組合せを有する、構造１〜５９のうちの１つである。
【００６２】
さらなる例示的なＡＢＡアゴニストとしては、例えば、以下から選択される化合物が挙げられる：
式ＩＩ：
【化１５】
2016531091.tif 000031
（式中、
Ｒ１が、ｎ−プロピルからなる群から選択され、
Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、少なくとも１つのＲ３またはＲ４がメチルであり、
Ｌが、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付き文字ｍが、０〜４の整数であり、
下付き文字ｎが、０〜３の整数であり、
ｍ＋ｎが、１以上である）
の化合物、またはその塩もしくは異性体。
【００６３】
式ＩＩＩ：
【化１６】
2016531091.tif 000032
（式中、
Ｒ１が、Ｃ２〜６アルケニル、およびＣ２〜６アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ２が、１〜４つのＲ２ａ基でそれぞれ任意選択的に置換される、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、
各Ｒ２ａが、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６ハロアルコキシ、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキルヒドロキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２ｂＲ２ｃ、−ＮＲ２ｂＣ（Ｏ）Ｒ２ｃ、−ＳＯ２Ｒ２ｂ、−ＳＯ２ＯＲ２ｂ、−ＳＯ２ＮＲ２ｂＲ２ｃ、および−ＮＲ２ｂＳＯ２Ｒ２ｃからなる群から選択され、
Ｒ２ｂおよびＲ２ｃのそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれが、独立して、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、少なくとも１つのＲ３またはＲ４がアルキルであり、
Ｌが、結合およびＣ１〜６アルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
下付き文字ｍが、０〜４の整数であり、
下付き文字ｎが、０〜３の整数であり、
ｍ＋ｎが、１以上である）
の化合物、またはその塩もしくは異性体。
【００６４】
一実施形態において、少なくとも１つのＲ３またはＲ４がエチルである。
【００６５】
上述される化合物は、当該技術分野において周知の方法を用いて合成され得る。例えば、同じ化学的骨格構造に基づく化合物を、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第５，４９８，７５５号および米国特許第６，１２７，３８２号に記載されるように合成した。
【００６６】
ＩＩＩ．ＡＢＡアゴニスト製剤
本発明は、植物に接触させるように製剤化される農業用化学製剤であって、本発明のＡＢＡアゴニストを含む製剤を提供する。ある実施形態において、アゴニストと接触される植物は、内因性ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを含むかまたは発現する。ある実施形態において、アゴニストと接触される植物は、異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを含まないかまたは発現しない（例えば、植物は、トランスジェニックでないか、またはトランスジェニックであるが、異種ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質以外の異種タンパク質を発現する）。ある実施形態において、アゴニストと接触される植物は、本明細書に記載される異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを含むかまたは発現する。
【００６７】
製剤は、例えば、担体中で、本発明にしたがって、植物または種子などの植物繁殖材料を処理するのに好適であり得る。好適な添加剤としては、緩衝剤、湿潤剤、コーティング剤、多糖類、および研磨剤が挙げられる。例示的な担体としては、水、水溶液、スラリー、固体および乾燥粉末が挙げられる（例えば、泥炭、コムギ、フスマ、バーミキュライト、粘土、低温殺菌土壌、多くの形態の炭酸カルシウム、ドロマイト、様々なグレードの石こう、ベントナイトおよび他の粘土鉱物、リン鉱石および他のリン化合物、二酸化チタン、腐植土、タルク、アルギン酸塩および活性炭。当業者に公知の任意の農業的に好適な担体が、許容可能であり、本発明に使用するように想定される）。任意選択的に、製剤は、少なくとも１つの界面活性剤、除草剤、殺真菌剤、有害生物防除剤、または肥料も含み得る。
【００６８】
ある実施形態において、農業用化学製剤は、界面活性剤、除草剤、以下に限定はされないが、殺真菌剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、および殺線虫剤などの有害生物防除剤、植物活性化剤、共力剤、除草剤毒性緩和剤、植物成長調節剤、防虫剤、または肥料のうちの少なくとも１つを含む。
【００６９】
ある実施形態において、農業用化学製剤は、パラコート（５９２）、メソトリオン（５００）、スルコトリオン（７１０）、クロマゾン（１５９）、フェントラザミド（３４０）、メフェナセット（４９１）、オキサジクロメホン（５８３）、インダノファン（４５０）、グリホサート（４０７）、プロスルホカルブ（６５６）、モリネート（５４２）、トリアスルフロン（７７３）、ハロスルフロン−メチル（４１４）、プレチラクロール（６３２）、トプラメゾン、テンボトリオン、イソキサフルトール、ホメサフェン、クロジナホップ−プロパルギル、フルアジホップ−Ｐ−ブチル、ジカンバ、２，４−Ｄ、ピノキサデン、ビシクロピロン、メトラクロール、およびピロキサスルホンからなる群から選択される有効量の１つまたは複数の除草剤を含む。上記の除草活性成分は、例えば、“The Pesticide Manual”, Editor C.D.S.Tomlin, 12th Edition, British Crop Protection Council, 2000において、括弧内で加えられた項目番号で記載されており；例えば、メソトリオン（５００）が、項目番号５００でその中に記載されている。上記の化合物は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，３３８，９２０号に記載されている。
【００７０】
ある実施形態において、農業用化学製剤は、セダキサン、フルジオキソニル、ペンチオピラド、プロチオコナゾール、フルトリアホル、ジフェノコナゾール、アゾキシストロビン、キャプタン、シプロコナゾール、シプロジニル、ボスカリド、ジニコナゾール、エポキシコナゾール、フルオキサストロビン、トリフロキシストロビン、メタラキシル、メタラキシル−Ｍ（メフェノキサム）、フルキンコナゾール、フェナリモール、ヌアリモール、ピリフェノックス、ピラクロストロビン、チアベンダゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、ベナラキシル、ベナラキシル−Ｍ、ベノミル、カルベンダジム、カルボキシン、フルトラニル、フベリザドール、グアザチン、ミクロブタニル、テトラコナゾール、イマザリル、メトコナゾール、ビテルタノール、シモキサニル、イプコナゾール、イプロジオン、プロクロラズ、ペンシクロン、プロパモカルブ、シルチオファム、チラム、トリアゾキシド、トリチコナゾール、トリルフルアニド、イソピラザム、マンジプロパミド、チアベンダゾール、フルキサピロキサド、およびマンガン化合物（マンコゼブ、マネブなど）からなる群から選択される有効量の１つまたは複数の殺真菌剤を含む。ある実施形態において、農業用化学製剤は、チアメトキサム、イミダクロプリド、クロチアニジン、λ−シハロトリン、テフルトリン、β−シフルトリン、ペルメトリン、アバメクチン、フィプロニル、シアントラニリプロール、クロラントラニリプロール、およびスピノサドからなる群から選択される、有効量の殺虫剤、殺ダニ剤および／または殺線虫剤のうちの１つまたは複数を含む。一般名を有する上記の有害生物防除剤のそれぞれの詳細（例えば、構造、化学名、商品名など）は、e-Pesticide Manual, version 3.1, 13th Edition, Ed.CDC Tomlin, British Crop Protection Council, 2004-05に見られる。上記の化合物は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，１２４，５６５号に記載されている。
【００７１】
ある実施形態において、農業用化学製剤は、シプロジニル（（４−シクロプロピル−６−メチル−ピリミジン−２−イル）−フェニル−アミン）（２０８）、ドジン（２８９）；クロロタロニル（１４２）；ホルペット（４００）；プロチオコナゾール（６８５）；ボスカリド（８８）；プロキナジド（６８２）；ジチアノン（２７９）；フルアジナム（３６３）；イプコナゾール（４６８）；およびメトラフェノンからなる群から選択される有効量の１つまたは複数の殺真菌剤を含む。上記の化合物のいくつかが、例えば、“The Pesticide Manual”[The Pesticide Manual--A World Compendium; Thirteenth Edition; Editor: C.D.S.Tomlin; the British Crop Protection Council, 2003]において、括弧内で加えられた項目番号で記載されている。上記の化合物は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，３４９，３４５号に記載されている。
【００７２】
ある実施形態において、農業用化学製剤は、フルジオキソニル、メタラキシル、およびストロビルリン殺真菌剤、またはそれらの混合物からなる群から選択される有効量の１つまたは複数の殺真菌剤を含む。ある実施形態において、ストロビルリン殺真菌剤は、アゾキシストロビン、ピコキシストロビン、クレソキシム−メチル、またはトリフロキシストロビンである。ある実施形態において、農業用化学製剤は、有効量の、フェニルピラゾールおよびネオニコチノイドから選択される殺虫剤のうちの１つまたは複数を含む。ある実施形態において、フェニルピラゾールは、フィプロニルであり、ネオニコチノイドは、チアメトキサム、イミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、ニテンピラムおよびアセタミプリドから選択される。上記の化合物は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，０７１，１８８号に記載されている。ある実施形態において、農業用化学製剤は、パスツーリア属（Pasteuria spp.）、ペシロマイセス属（Paeciliomyces）、ポコニア・クラミドスポリア（Pochonia chlamydosporia）、ミロテシウム属（Myrothecium）代謝産物、ムスコドル属（Muscodor）揮発性物質、タゲテス属（Tagetes spp.）、バチルス・フィルムス（bacillus firmus）ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８２を含むバチルス・フィルムス（bacillus firmus）を含むがそれらに限定されない有効量の１つまたは複数の生物学的な有害生物防除剤を含む。
【００７３】
ＩＶ．植物への施用
ＡＢＡアゴニスト製剤および組成物は、様々な公知の方法を用いて、例えば、繁殖材料上に組成物を噴霧する、霧化する、浸漬する、注入する、潅水する、散粉するまたは散布すること、または植物上に組成物をはけで塗る、または注ぐ、または他の方法で接触させることによって、または、種子の場合、種子を液体組成物中にコーティングする、封入する、噴霧する、浸漬する、浸すまたは他の方法で種子を処理することによって、植物に施用され得る。植え付けの前に植物または種子を直接処理する代わりに、本発明の製剤はまた、種子が植え付けられる土壌または他の媒体中に導入され得る。例えば、製剤は、噴霧、散布、注入、潅水または他の方法で土壌を処理することによって、土壌中に導入され得る。ある実施形態において、担体も、この実施形態において使用される。担体は、上述されるように、固体または液体であり得る。ある実施形態において、泥炭が、ＡＢＡアゴニストの担体として水中で懸濁され、この混合物が、土壌または植え付け媒体中におよび／または種子上に植え付け時に噴霧される。
【００７４】
本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストで処理され得る植物の種類は、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ライコムギ、オートムギ、イネ、コムギ、ダイズおよびトウモロコシなどの穀物；ビート（例えばテンサイおよび飼料用ビート）；キュウリ、マスクメロン、カンタロープ、カボチャおよびスイカを含むウリ科植物；ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、チンゲンサイ、および他の葉菜類を含むケール作物、トマト、コショウ、レタス、インゲンマメ、エンドウマメ、タマネギ、ニンニクおよびピーナッツを含む他の野菜；アブラナ、ピーナッツ、ヒマワリ、セイヨウアブラナ、およびダイズを含む油糧作物；タバコを含むナス科植物；ジャガイモ、ヤム、ハツカダイコン、ビート、ニンジンおよびサツマイモを含む塊茎および根作物；イチゴを含む果物；綿および麻を含む繊維作物；コーヒー、花壇用の植物、多年生植物、観葉植物、芝生ならびにカーネーションおよびバラを含む切り花を含む他の植物；サトウキビ；コンテナ栽培樹木作物；モミおよびマツを含む常緑樹；カエデおよびオークを含む落葉樹；ならびにサクランボ、リンゴ、西洋ナシ、アーモンド、モモ、クルミ、および柑橘類を含む果実および堅果のなる樹木を含む、単子葉植物種および双子葉植物種の両方を含む。本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストで処理され得る植物のさらなる種類としては、除草剤または殺真菌剤などの特定の薬品に耐性のある作物が挙げられる。例えば、除草剤耐性のために改変された遺伝子組み換え作物が、本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストで処理され得る。
【００７５】
本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストは、細胞におけるＡＢＡの機能を模倣することが理解されるであろう。したがって、細胞をＡＢＡと接触させることによって引き起こされる１つまたは複数の細胞応答はまた、細胞を本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストと接触させることによって、引き起こされることが予測される。本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストは、ＡＢＡの機能を模倣し、有用な製剤中で提供される。
【００７６】
ある実施形態において、本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストの施用は、植物の非生物的ストレス抵抗性を増加させる。
【００７７】
ある実施形態において、種子への本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストの施用は、種子の発芽を抑制する。
【００７８】
本発明は、本明細書に記載されるＡＢＡ製剤と接触している植物も提供する。ＡＢＡ製剤と接触している植物は、植物部位および／または種子を含み得る。
【００７９】
Ｖ．新規なＡＢＡアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニング
本発明の実施形態は、推定アゴニストがＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドに接触されるとき、推定アゴニストがＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドに作用するかどうかを決定するために、推定化学的アゴニストをスクリーニングする方法も提供する。本明細書において使用される際、作用物質の存在が、例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体からの下流のシグナル伝達を増大させるように、受容体の活性の活性化または上方制御をもたらす場合、作用物質は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質に「作用する」。本発明に関して、作用物質が２００μΜ以下の濃度で存在するとき、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体への作用物質の接触が、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体の活性の活性化または上方制御をもたらす場合、作用物質は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体に作用する。作用物質が２００μΜ以下の濃度で存在するとき、作用物質が、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体タンパク質の活性の活性化または上方制御を含まない場合、作用物質は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体に実質的に作用しない。本明細書において使用される際、「活性化」は、活性の最小閾値が作用物質によって誘発されることを必要とする。活性のこの最小閾値が満たされたかどうかの決定は、例えば、誘発されるべき酵素活性のレベルの最小値を設定する酵素的ホスファターゼアッセイを用いて、または色の変化が観察される場合に活性の最小閾値が満たされる、比色検出試薬（例えば、パラニトロフェニルリン酸）の存在下における酵素的ホスファターゼアッセイを用いて達成され得る。
【００８０】
本発明は、アゴニストの場合、ＰＹＲ／ＰＹＬ−ＰＰ２Ｃ結合を誘発する分子の能力、またはアンタゴニストの場合、ＰＹＲ／ＰＹＬ−ＰＰ２Ｃ結合を促進するＡＢＡおよび他のアゴニストの能力を妨げる分子の能力についてスクリーニングすることによって、ＡＢＡアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法も提供する。いくつかの異なるスクリーニングプロトコルが、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドに作用または拮抗する作用物質を同定するのに用いられ得る。
【００８１】
スクリーニングは、単離された、精製されたまたは部分的に精製された試薬を用いて行われ得る。ある実施形態において、精製されたまたは部分的に精製されたＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドが使用され得る。
【００８２】
あるいは、細胞に基づくスクリーニング方法が使用され得る。例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを自然に発現するかまたはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを組み換え技術によって発現する細胞が使用され得る。ある実施形態において、使用される細胞は、植物細胞、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞を含むがそれに限定されない真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である。一般的に述べると、スクリーニング方法は、例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドに結合するか、またはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを活性化するか、またはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの発現、もしくはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドをコードする転写産物を増加させることによって、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの活性を調節する作用物質を同定するために、複数の作用物質をスクリーニングすることを含む。
【００８３】
１．ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチド結合アッセイ
任意選択的に、ＰＹＲ／ＰＲＬポリペプチドを結合することが可能な作用物質をスクリーニングすることによって、予備スクリーニングを行うことができ、そのように同定された作用物質の少なくとも一部が、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチド調節物質である可能性が高い。
【００８４】
結合アッセイは、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを、１つまたは複数の試験作用物質と接触させ、タンパク質および試験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間を許容することを含み得る。形成される任意の結合複合体は、いくつかの確立された分析技術のいずれかを用いて検出され得る。タンパク質結合アッセイとしては、以下に限定はされないが、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける共沈または共遊走、およびウエスタンブロットにおける共遊走を測定する方法が挙げられる（例えば、Bennet, J.P.and Yamamura, H.I.(1985)“Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods”, in Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura, H.I., et al, eds.), pp.61-89を参照）。他の結合アッセイは、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドに結合された分子または標識された基質（例えば、標識されたＡＢＡ）の置換を同定するための質量分析法またはＮＭＲ技術の使用を含む。このようなアッセイに用いられるＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドタンパク質は、自然に発現され、クローニングされ、または合成され得る。
【００８５】
２．活性
ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドアゴニストは、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの活性を活性化するかまたは増加させる作用物質をスクリーニングすることによって同定され得る。アンタゴニストは、活性の減少によって同定され得る。
【００８６】
１つの活性アッセイは、候補アゴニストが、アゴニスト特異的に、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドへのＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質の結合を誘発し得るかどうかを試験することを含む。哺乳動物または酵母ツーハイブリッド手法（例えば、Bartel, P.L.et.al.Methods Enzymol, 254: 241(1995)を参照）は、細胞内で一緒に発現される場合、相互作用または結合するポリペプチドまたは他の分子を同定するのに使用され得る。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドに作用する作用物質は、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドと２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）ポリペプチドとの間のツーハイブリッドアッセイにおいて同定され（例えば、ＡＢＩ１もしくは２または、例えば、ＰＰ２ＣのグループＡサブファミリーからのその相同分子種）、ＡＢＡアゴニストが、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドおよびＰＰ２Ｃポリペプチドの結合を活性化するかまたは可能にする作用物質として同定される。したがって、２つのポリペプチドは、作用物質の存在下で結合するが、非存在下で結合しない。ある実施形態において、酵母細胞が、酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて青色になる場合、化学的化合物または作用物質が、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質のアゴニストとして同定される。
【００８７】
ＰＹＲ１、およびＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質の生化学的機能は、一般に、ＰＰ２Ｃ活性を抑制することである。これは、酵母ツーハイブリッドまたは他の細胞に基づく方法を用いて、生細胞内で測定され得る。それはまた、比色検出試薬（例えば、パラニトロフェニルリン酸）の存在下で、酵素的ホスファターゼアッセイを用いて、インビトロで測定され得る。上記で使用される酵母に基づくアッセイは、リガンド結合の間接的な指標を提供する。この潜在的な限界に対処するために、インビトロでの競合アッセイ、または、弱い結合の標的化合物を同定するための代替的な手法として、他の生物を用いた細胞に基づくアッセイを使用することができる。
【００８８】
３．発現アッセイ
ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドの発現を増加させる化合物のスクリーニングも提供される。スクリーニング方法は、一般に、試験化合物を、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する１つまたは複数の細胞と接触させ、次に、ＰＹＲ／ＰＹＬ発現（転写産物または翻訳産物のいずれか）の増加を検出する、細胞に基づくまたは植物に基づくアッセイを行うことを含む。アッセイは、ＰＹＲ／ＰＹＬを自然に発現する細胞を用いて、またはＰＹＲ／ＰＹＬを発現するように組み換え技術によって改変された細胞内で、またはＰＹＲ／ＰＹＬプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現するように組み換え技術によって改変された細胞内で、行われ得る。
【００８９】
観察された活性を確実に信頼性のあるものにするために、レポーター構築体が欠失した細胞との並行反応を行うことを含むか、またはレポーター構築体を有する細胞を、試験化合物と接触させないことによる、様々な対照を行うことができる。
【００９０】
４．検証
上記のスクリーニング方法のいずれかによって最初に同定された作用物質は、見かけの活性を検証し、および／または作用物質の他の生物学的効果を決定するために、さらに試験され得る。場合によっては、同定された作用物質は、植物ストレス（例えば、乾燥耐性）、種子発芽、またはＡＢＡによって影響される別の表現型をもたらす能力について試験される。いくつかのこのようなアッセイおよび表現型は、当該技術分野において公知であり、本発明の方法にしたがって用いられ得る。
【００９１】
５．固相および可溶性ハイスループットアッセイ
本発明のハイスループットアッセイでは、１日で最大で数千の異なる調節物質またはリガンドをスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルが、選択された可能性のある調節物質に対する別個のアッセイを行うように使用可能であり、または、濃度またはインキュベーション時間の影響が観察されるべきである場合、５〜１０ウェル全てが、単一の調節物質を試験することができる。したがって、単一の標準マイクロタイタープレートが、約１００（例えば、９６）の調節物質を分析することができる。１５３６ウェルプレートが使用される場合、単一のプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易に分析することができる。１日当たりいくつかの異なるプレートを分析することが可能であり；最大で約６，０００〜２０，０００またはそれを超える異なる化合物のためのアッセイスクリーニングが、本発明の統合システムを用いて可能である。さらに、試薬の操作に対するマイクロ流体手法が使用され得る。
【００９２】
該当する分子（例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬまたはＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する細胞）が、共有結合または非共有結合を介して、直接または間接的に、固体状態の構成要素に結合され得る。
【００９３】
本発明は、ＰＹＲ／ＰＹＬの発現または活性を調節することができる化合物を、ハイスループットフォーマットで同定するためのインビトロアッセイを提供する。
【００９４】
非生物的ストレス抵抗性が、いくつかの周知の技術のいずれかにしたがって分析され得る。例えば、乾燥耐性に関して、植物は、最適より少ない水が植物に与えられる条件下で成長され得る。乾燥抵抗性は、膨圧、成長、収量などを含むいくつかの標準的な測定値のいずれかによって決定され得る。
【００９５】
ＶＩ．植物における非生物的ストレス耐性を増加させる方法
本発明は、植物における非生物的ストレス耐性を増加させる方法も提供する。したがって、ある実施形態において、植物は、植物における非生物的ストレス耐性を増加させるのに十分な量で、本明細書に記載されるＡＢＡアゴニスト、またはＡＢＡアゴニスト製剤と接触される。植物に施用されるＡＢＡアゴニスト製剤の量は、植物をＡＢＡアゴニスト製剤と接触させない場合と比較して、非生物的ストレス耐性を増加させるのに十分であり得る。植物は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、ＡＢＡ製剤と接触され得る。非生物的ストレス耐性の増加は、植物の成長または生存に悪影響を及ぼす非生物的ストレス条件に対する植物の成長および／または生存を改善することができる。非生物的ストレスは、本明細書に記載される物理的または化学的条件を含む。
【００９６】
ＶＩＩ．植物における種子発芽を抑制する方法
本発明は、種子発芽を抑制する方法も提供する。したがって、ある実施形態において、植物、植物部位、または種子が、種子発芽を抑制するのに十分な量で、ＡＢＡアゴニスト製剤と接触される。種子は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、ＡＢＡ製剤と接触され得る。ある実施形態において、種子は、ＡＢＡアゴニスト製剤と直接接触される。ある実施形態において、地面または土壌は、植え付けまたは種子の播種の前または後のいずれかに、ＡＢＡアゴニスト製剤と接触される。ある実施形態において、植物は、後に植物から成長する種子の発芽を抑制するのに十分なＡＢＡアゴニスト製剤と接触される。
【００９７】
ＶＩＩＩ．ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドを活性化する方法
本発明は、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ポリペプチドを活性化する方法も提供する。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドが、上述される化合物と接触され、活性化されたＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、ＰＰ２Ｃポリペプチドに結合する。ある実施形態において、ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、アゴニスト化合物ＬＣ６６Ｃ６によって活性化することが可能である。ある実施形態において、活性化されるＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質は、配列番号１〜１１９のいずれか１つと実質的に同一である。様々な植物に由来するＡＢＡ受容体の配列の例が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０２７１４０８号において提供されている。
【００９８】
ある実施形態において、本方法は、細胞を含まないインビトロアッセイにおいてＰＹＲ／ＰＹＬ受容体を活性化する。ある実施形態において、本方法は、細胞内で発現されるＰＹＲ／ＰＹＬ受容体を活性化する。ある実施形態において、細胞は、ＰＰ２Ｃポリペプチドも発現する。ある実施形態において、細胞は、植物細胞である。ある実施形態において、細胞は、動物または哺乳動物細胞である。ある実施形態において、細胞は、内因性ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を発現する。ある実施形態において、細胞は、異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現するように改変される。ある実施形態において、細胞は、異種ＰＰ２Ｃポリペプチドを発現する。ある実施形態において、細胞は、ＨＡＢ１（ＡＢＩ１と相同）、ＡＢＩ１、またはＡＢＩ２から選択されるＰＰ２Ｃポリペプチドを発現する。
【００９９】
ある実施形態において、活性化されたＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドは、異種遺伝子の発現を誘発する。ある実施形態において、異種遺伝子は、ＡＢＡ応答性遺伝子である。ある実施形態において、誘発された遺伝子発現は、内因性ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する細胞内で起こる。ある実施形態において、誘発された遺伝子発現は、異種ＰＹＲ／ＰＹＬポリペプチドを発現する細胞内で起こる。
【実施例】
【０１００】
実施例１
この実施例は、本明細書に記載される新規なＡＢＡアゴニストが、複数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体に結合し、それを活性化することを実証する。
【０１０１】
方法
化学的スクリーニング
上述される酵母ツーハイブリッドシステムを、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に用いて、ＡＢＡアゴニストを同定した（Peterson FC, et al.(2010)Structural basis for selective activation of ABA receptors. Nature Structural & Molecular Biology 17(9): 1109-1111を参照）。このシステムでは、アゴニストに促進される受容体−ＰＰ２Ｃ相互作用は、ＵＲＡ３またはＨＩＳ３レポーター遺伝子の発現を引き起こし、親株のウラシルまたはヒスチジン要求性を助ける（Peterson FC, et al.(2010); Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, & Boeke JD(1996)Reverse two-hydrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(19): 10315-10320）。ＨＴＳを、ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３またはＰＹＬ４に対する結合ドメイン（ＢＤ）融合を発現する５つの異なるレポーター株を用いて行い；これらは、ＨＡＢ１（ｐＡＣＴ−ＨＡＢ１）に対する活性化ドメイン（ＡＤ）融合と共発現され；使用される構築体は、上述されている（Park et al.2009）。本発明者らは、これらの株を２つの別個のスクリーニングに用いた。第１のスクリーニングでは、Chembridge(San Diego, USA)から入手した約６５，０００の化合物を、本質的に、Gassner NC, et al.(2007)(Accelerating the discovery of biologically active small molecules using a high-throughput yeast halo assay. Journal of Natural Products 70(3): 383-390)によって記載されるように、ハロアッセイを用いて、アゴニスト活性について分析した。この方法では、酵母株を、選択的寒天に埋め込み、化合物を、１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵液からアッセイプレート上にピンで移動し（pin transferred）；ヒットは、活性化合物の近傍の増加した細胞密度によって明らかである。ハロアッセイを用いた実験は、酵母株ＰＪ６９−４Ａおよび選択を向上させるために１０ｍＭの３−アミノトリアゾールが補充された培地を用いた。ハロスクリーニングを、自動化マイクロプレートホテル（Thermo Cytomat）および化合物をアッセイプレート上に配置するために使用した３８４−ピンツール（V & P Scientific）を備えたBiomek FXを用いて設置した。各薬品の移動の前に、ピンを、ＤＭＳＯ／水の１：１混合物で洗浄し、続いて、９５％のエタノールで洗浄した。薬品の移動の後、プレートを２８℃でインキュベートし、候補アゴニストは、手動の検査によって明らかであった。
【０１０２】
ハロスクリーニング方法は、スループットの観点から強力であるが、本発明者らは、その後、Life Chemicals(Ukraine)から得られる１２，０００メンバーライブラリーの第２のスクリーニングのためにより従来的なスクリーニング方法を用いた。この変更は、アッセイ濃度をより良好に制御したいという要望によって生じた。本発明者らの第２のスクリーニングでは、レポーター構築体が、酵母株ＭＡＶ９９内で発現され、これは、ＧＡＬ１プロモーターに促進されるＵＲＡ３導入遺伝子を介した、ウラシルに基づく選択を可能にする（Peterson FC, et al.(2010)）。スクリーニング化合物を、２５Ｍの最終濃度で、９６ウェルプレートフォーマット中で、レポーター株が播種された選択的ウラシル−培地に加え；酵母成長を、約３日後に手動で検査した。Biomek FX液体ハンドラ（liquid handler）を用いて、化合物を、２．５ｍＭの貯蔵液からスクリーニングウェルに移動した。
【０１０３】
第３のスクリーニング手法として、Life Chemicalsライブラリーも、０．５倍のＭＳ塩、０．５％のスクロースおよび２５μΜの試験化合物を含有する固化した寒天培地中で、シロイヌナズナ（Arabidopsis）発芽抑制剤についてスクリーニングした。その後、発芽アッセイからのヒットを、酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて試験した。ヒット化合物を、それらの元の供給業者から補充し、二次スクリーニングおよび化合物の特性評価に使用した。キナバクチンおよびその類似体は、Life Chemicalsから購入した。
【０１０４】
ＰＰ２Ｃ活性アッセイ
若干の修正を加えて、既に記載されるように、ＨＡＢ１およびＰＹＬタンパク質を、発現させ、精製した（Park SY, et al.(2009)Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324(5930): 1068-1071）。ＧＳＴ−ＨＡＢ１、−ＡＢＩ１および−ＡＢＩ２融合タンパク質を得るために、ＨＡＢ１  ｃＤＮＡを、ｐＧｅｘ−２Ｔへクローニングした一方、ＡＢＩ１およびＡＢＩ２  ｃＤＮＡを、ベクターｐＧｅｘ−４Ｔ−１へクローニングした。発現は、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ宿主細胞内で行われた。形質転換された細胞を、一晩前培養し、ＬＢ培地に移し、培養物のＡ６００が約０．５になるまで３０℃で培養した。次に、培養物を氷上で冷却し、ＭｎＣｌ２を４ｍＭまで加え、ＩＰＴＧを０．３ｍＭまで加えた。１５℃で１６時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、既に記載されるように、組み換えタンパク質を、グルタチオンアガロース上で精製した（Park SY, et al.(2009)。６ＸＨｉｓ−ＰＹＬ受容体融合タンパク質を得るために、全１３のＡＢＡ受容体についての受容体ｃＤＮＡを、ベクターｐＥＴ２８へクローニングし、既に記載されるように、発現させ、精製し（Mosquna A, et al.(2011)Potent and selective activation of abscisic acid receptors in vivo by mutational stabilization of their agonist-bound conformation. PNAS 108(51): 20838-20843）；これにより、ＰＹＬ７、ＰＹＬ１１およびＰＹＬ１２以外の全ての受容体についての可溶性および機能性タンパク質が生成された（受容体に媒介されるＰＰ２Ｃ抑制アッセイを用いて評価される）。したがって、これらの３つの受容体は、ベクターｐＭＡＬ−ｃを用いて、マルトース結合（ＭＢＰ）融合タンパク質として代わりに発現され；これらの構築体の発現は、ＧＳＴ−ＨＡＢ１に使用されるのと同じ誘発条件で、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ宿主株内で行われた。組み換えＭＢＰ−ＰＹＬ融合タンパク質を、製造業者の精製説明書を用いて、アミロース樹脂（New England Biolab, Inc.）を用いて、超音波分解および清浄化された溶解物から精製した。この試みにより、活性ＭＢＰ−ＰＹＬ１１融合タンパク質が生成されたが、ＰＹＬ７およびＰＹＬ１２は生成されなかった。
【０１０５】
組み換え受容体およびＰＰ２Ｃを用いたＰＰ２Ｃ活性アッセイを、以下のように行った：精製されたタンパク質を、ＡＢＡまたはＡＢＡアゴニストとともに、１０ｍＭのΜｎＣｌ２、３μｇのウシ血清アルブミンおよび０．１％の２−メルカプトエタノールを含有する８０μｌのアッセイ緩衝液中で、２２℃で３０分間にわたってプレインキュベートした。１５６ｍＭのトリス−ＯＡｃ、ｐＨ７．９、３３０ｍＭのＫＯＡｃおよび５ｍＭのリン酸４−メチルウンベリフェリルを含有する２０μｌの反応溶液を加えることによって、反応を開始させ、その後、Wallacプレートリーダー上で励起フィルタ３５５ｎｍおよび発光フィルタ４６０ｎｍを用いて、蛍光測定をすぐに収集した。反応は、５０ｎＭのＰＰ２Ｃおよび１００ｎＭのＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質をそれぞれ含有していた。
【０１０６】
図１Ａは、ＡＢＡアゴニストの代表的な群を示す。図１Ｂに示されるように、複数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体が、酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、ＬＣ６６Ｃ６を含むいくつかのアゴニストによって活性化される。このアッセイは、既に記載されるように、特定の受容体およびＰＰ２Ｃがそれぞれ、ＧＡＬ４活性化およびＤＮＡ結合ドメインに融合されるときの、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質およびクレードＡ  ＰＰ２Ｃタンパク質のアゴニストに促進される物理的相互作用を報告している（Park et al.2009）。これらの酵母に基づくアッセイは、ＬＣ６６Ｃ６が、ＡＢＡまたは新規なアゴニストＬＣ６６Ｃ６よりはるかに高い受容体選択性を有する既に記載されるアゴニストピラバクチンと異なり、複数のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体のアゴニストであることを示す。既に記載されるように、クレードＡ  ＰＰ２Ｃへの受容体のアゴニストに促進される結合は、ＰＰ２Ｃのホスファターゼ活性を抑制する。シロイヌナズナ（Arabidopsis）には、１４のＰＹＲ／ＰＹＬ受容体があり、そのうちの１３は、プロトプラストに基づくアッセイシステムにおいてＡＢＡ応答を媒介することができる（Fujii et al.2009）。ＬＣ６６Ｃ６の選択性をより詳細に調べるために、本発明者らは、全１４のメンバーについて組み換え６Ｘ−Ｈｉｓ−ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質を発現させ、精製しようとし、技術的な理由で、活性形態で産生することができなかったＰＹＬ７、１２および１３以外の全ての受容体についてのＡＢＡ応答性受容体を回収した。組み換え受容体のこのパネルは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ファミリーのメンバーにおけるＡＢＡ−アゴニスト活性のほぼ完全な説明を可能にする。図２に示されるように、ＨＢＡ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２のＰＰＣ２酵素活性は、試験される全てのＡＢＡ受容体の存在下で、１０μΜのＡＢＡによって９０％超だけ抑制される（図２Ｂ）。ＬＣ６６Ｃ６（キナバクチン）に応答して、ＨＢＡ１、ＡＢＩ１、およびＡＢＩ２の７０％超のＰＰ２Ｃ抑制が、受容体ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３およびＰＹＬ５を用いて観察された。
【０１０７】
キナバクチンの活性をさらに特性評価し、その受容体選択性を規定するために、ＰＰ２Ｃ  ＨＡＢ１、ＡＢＩ１またはＡＢＩ２と組み合わせて１０の組み換え受容体を用いて、受容体に媒介されるＰＰ２Ｃ抑制アッセイを行った。これらの実験は、キナバクチンが、マイクロモル以下のＩＣ５０値でＰＹＲ１、ＰＹＬ１〜３およびＰＹＬ５を活性化し、二量体受容体部位において実質的により高い活性を示すことを示した（図２、３および４）。結果は、キナバクチンが、ＡＢＡより強力なＰＹＲ１またはＰＹＬ１アゴニストであることも示す（図２および３）。さらに、キナバクチンによって観察される最大ＰＰ２Ｃ抑制は、試験される全ての受容体で、ピラバクチンを用いて観察されたものより高かった。ピラバクチンは、０．９０μΜのＩＣ５０でＰＹＬ５を活性化することができるが、約４０％のＰＰ２Ｃ抑制で飽和し、このことは、それが不完全な／部分的なＰＹＬ５アゴニストであることを示唆している。したがって、この実施例は、ピラバクチンと比べてより広い受容体スペクトル活性および増加した生物活性を有する新規なスルホンアミドアゴニストの同定を実証する。
【０１０８】
実施例２
この実施例は、新規なＡＢＡアゴニストが、発芽および植物成長を抑制することを実証する。
【０１０９】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の発芽および胚軸成長の抑制分析
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の発芽および胚軸成長の抑制分析のために、約４週間追熟した種子を、１０分間にわたって、５％のＮａＣｌＯおよび０．０５％のTween-20を含有する溶液で表面殺菌し、水で４回すすいだ。殺菌された種子を、０．１％の寒天で懸濁させ、薬品の存在下で、１／２ムラシゲスクーグ（ＭＳ）塩（Sigma-Aldrich）を含有する０．８％の固化した寒天培地上に播種し、４℃で４日間貯蔵し、次に、暗条件または明条件下で、２２℃に移した。発芽を、４日間のインキュベーションの後に決定した一方、胚軸成長を、６日間のインキュベーションの後に撮影した。
【０１１０】
植物材料
以下の対立遺伝子／変異体株を使用した：ａｂａ２−１（Leon-Kloosterziel KM, et al.(1996)Isolation and characterization of abscisic acid-deficient Arabidopsis mutants at two new loci. Plant J 10(4): 655-661）、ａｂｉ１−１（Umezawa T, et al.(2009)Type 2C protein phosphatases directly regulate abscisic acid-activated protein kinases in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(41): 17588-17593）、ａｂｉ３−９、ａｂｉ４−１１（Nambara E, et al.(2002)A screen for genes that function in abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana. Genetics 161(3): 1247-1255)、およびｐｒｙ１ｐｙｌ１ｐｙｌ２ｐｌｙ４四重体（Park SY, et al.(2009)Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science 324(5930): 1068-1071）；これらの株の全ては、Columbiaバックグラウンドである。用いられるｐｒｙ１ｐｙｌ１ｐｙｌ２ｐｌｙ４四重変異体株は、Columbiaに３回戻し交配した。オオムギおよびダイズ種子は、Living Whole Foods, Inc.から購入した一方、トウモロコシ種子は、W.Atlee Burpee & Co.から入手した。これらの材料を用いた生理学的実験に使用される詳細な方法は、裏付け情報として提供される。
【０１１１】
ＬＣ６６Ｃの独特なアゴニスト特性の生理学的影響を検証するために、本発明者らは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の種子、苗および成植物に対するその効果を特性評価した。図５に示されるように、本明細書に記載されるＡＢＡアゴニストは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）における種子発芽を強く抑制する。図５Ａおよび５Ｂは、ＬＣ６６Ｃ６を含むいくつかのアゴニストが、用量依存的に種子の発芽を抑制することを示す。特に、ＬＣ６６Ｃ６は、１モル当たりの基準で、発芽を抑制するのに、（＋）−ＡＢＡとほぼ同程度に有効であり、試験される他のアゴニストより有効であった。
【０１１２】
図５Ｃおよび５Ｄは、様々なＡＢＡ非感受性変異体からの種子の発芽の抑制に対するアゴニスト（＋）−ＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６の効果を示す。図５Ｃに示されるように、５μΜの濃度で、ＬＣ６６Ｃ６は、ＰＹＲ／ＰＹＬ四重変異体（ｐｙｒ１／ｐｙｌ１／ｐｙｌ２／ｐｙｌ４）およびｐｙｒ１単一変異体を除く試験される全ての変異体に関して、（＋）−ＡＢＡが示すのと同様の発芽抑制パターンを示した。図４において上に示されるＩＣ５０データと組み合わせて、この遺伝的データは、ＬＣ６６Ｃ６の発芽−阻害活性が、ＰＹＲ１、ＰＹＬ１およびＰＹＬ２に作用するその能力によって概ね説明されることを示唆する。四重変異体における発芽を抑制するＡＢＡの能力は、他の受容体におけるそのアゴニスト活性によって説明されそうである。本発明者らの遺伝データは、ｐｙｒ１変異体が、５μΜのＬＣ６６Ｃ６またはピラバクチンの存在下で発芽するため（Park et al.2009）、ＰＹＲ１が、ＡＢＡに応答して種子発芽における重要であるが重複した役割を果たすという仮説と一致している。
【０１１３】
図６に示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、発芽後の植物成長も抑制する。図６Ａおよび６Ｂは、ＬＣ６６Ｃ６が、野生型、ａｂｉ１、および四重変異体における根の伸長を抑制し、試験される全ての濃度で、その抑制効果において（＋）−ＡＢＡと同等またはわずかにより有効であることを示す。さらに、図６Ｃは、ＬＣ６６Ｃ６が、濃度依存的に、野生型および変異体植物の両方の成長を抑制することを実証する。ＬＣ６６Ｃ６による植物成長の抑制は、ピラバクチンによる抑制よりかなり大きく、（＋）−ＡＢＡのものと同等である。
【０１１４】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、野生型およびＡＢＡ非感受性変異体植物の両方の種子発芽および成長の強力な抑制剤であることを実証する。
【０１１５】
実施例３
この実施例は、アゴニストＬＣ６６Ｃ６が、乾燥ストレス耐性を誘発することを実証する。
【０１１６】
生理学的アッセイ
生理学的アッセイを、１６／８時間の明／暗サイクルで、２２±２℃および相対湿度（ＲＨ）４５±１０％で成長されたシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物において行った。シロイヌナズナ（Arabidopsis）における蒸散による水分損失分析のため、植物を、２５μΜの化合物および０．０５％のTween-20を含有する４ｍｌの溶液のエアロゾルスプレーによって前処理した。分析される化合物または対照当たり１２の４週齢の植物に噴霧した。化合物による一晩の前処理の後、地上部分を根から脱離し、それらの生体重を、２時間の期間にわたって２０分間隔で測定した。気孔開口を測定するために、植物を、上記の化合物で前処理し、高ＲＨを維持するためにプラスチック蓋で覆い、一晩の前処理の後、鈴木式万能顕微鏡印画法（Suzuki’s Universal Micro-Printing(SUMP)method）を用いて、ＳＵＭＰ  Ｂプレート（SUMP Laboratory）とともにＳＵＭＰインプレッション溶液（SUMP impression solution）を用いて、葉表皮の模様を得た。葉の模様を、光学顕微鏡法によって分析し、ImageJ 1.43vソフトウェア（National Institutes of Health, USA）を用いて、気孔開口を孔幅から決定した。シロイヌナズナ（Arabidopsis）乾燥ストレスアッセイに関して、約１．５ｍｌの２５μΜの薬品溶液を、３日間の期間にわたって１日ごとにエアロゾルによって植物に施用した。植物を、ポット当たり１００ｇの土壌を含む四角の６×６×５ｃｍのポット中で成長させた。ダイズの乾燥ストレスアッセイを、１６／８時間の明／暗サイクルで、２５±２℃、６５±１０％のＲＨで成長された植物において行った。０．０５％のTween-20を含有する約２０ｍｌの５０μΜの薬品溶液を、ポット当たり４回（ポット当たり３つの植物）、それぞれ３日間噴霧した。使用されるポットは、２５０ｍｌの大きさであり、ポット当たり２００ｇの土壌を含んでいた。測定される水分損失が蒸散によるものであるように、ポットをパラフィルムで覆った。土壌水分量％を、ポット重量を測定することによって決定し、総重量から乾燥土壌重量を除くことによって計算した。
【０１１７】
ダイズ、オオムギおよびトウモロコシにおける水分損失分析
ダイズ、オオムギおよびトウモロコシを用いた水分損失分析に関して、０．０５％のTween-20を含有する１００μΜの薬品溶液を、植物の地上部分に噴霧した。使用されるダイズ、オオムギおよびトウモロコシ植物はそれぞれ、約４週齢、２週齢および２週齢であった。化合物を、水分損失アッセイを行う１６時間前に施用した。水分損失を測定するために、シュート全体を脱離し、それらの生体重を監視した。
【０１１８】
図７は、乾燥ストレスに関連する様々なパラメータに対するＬＣ６６Ｃ６の効果を示す。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型およびａｂａ２（ＡＢＡ欠損変異体２）変異体植物から脱離した葉における蒸散による水分損失の量を減少させた。しかしながら、図７Ｃに示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、ａｂｉ１−１変異体から脱離した葉における蒸散による水分損失を減少させなかった。図７Ｄは、ＬＣ６６Ｃ６が、野生型およびａｂａ２変異体における気孔閉鎖を誘発するが、ａｂｉ１−１変異体では誘発しないことを示す。図７Ｅは、ダイズ植物の乾燥処理中の土壌水分量に対するアゴニスト化合物の効果を示す。
【０１１９】
図８Ａは、キナバクチンによる植物の処理が、（＋）−ＡＢＡによる処理によって与えられるものと同様の乾燥ストレス耐性をシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物に与えることを示す。この実施例では、２週齢の植物に、水を控えることによって乾燥ストレスを与え、１２日後に撮影した。２週間の乾燥処理後、植物に水分補給した。試験される植物の総数当たりの生存植物の数が、写真の隣に示される。図８Ｂは、キナバクチンによるダイズ植物の処理が、（＋）−ＡＢＡによる処理によって与えられるものと同様の乾燥ストレス耐性を与えることを示す。この実施例では、２週齢の植物に、水を控えることによって乾燥ストレスを与え、８日間の乾燥処理の後に撮影した。全ての乾燥ストレス処理について、化合物（シロイヌナズナ（Arabidopsis）については２５μΜおよびダイズについては５０μΜで試験される）を、０．０５％のTween-20を含有する溶液中で施用し、乾燥期間にわたって３日ごとにエアロゾルとして施用した。全ての実験についての値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝６、実験当たり３つの植物が使用される）。
【０１２０】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、野生型およびａｂａ２変異体シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物および野生型ダイズ植物において、（＋）−ＡＢＡによって与えられるものと同様の乾燥ストレス耐性を誘発することを示す。
【０１２１】
実施例４
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、（＋）−ＡＢＡによって誘発されるのと同様に、ＡＢＡ応答性遺伝子を誘発することを実証する。
【０１２２】
マイクロアレイ分析
全ＲＮＡを、RNAeasy Plant Mini Kit(Qiagen, USA)を用いて、製造業者の説明書にしたがって単離した。ｃＤＮＡ合成、標識およびシロイヌナズナ（Arabidopsis）ＡＴＨ１チップ（Affymetrix, USA）に対するハイブリダイゼーションを、Affymetrixプロトコルを用いて、カリフォルニア大学リバーサイド校（University of California at Riverside）のIIGB Core Instrumentation Facilityによって行った。３つ組の生物学的試料を、ＤＭＳＯ対照、ＡＢＡ、ピラバクチンおよびキナバクチン処理のためにハイブリダイズし；化合物を、２５μΜの最終濃度で施用し、ＲＮＡを、化合物または対照への６時間の曝露の後、凍結した組織から調製した。プローブセットの発現シグナルを、MAS5 Statistical Algorithm(Affymetrix, USA)によって計算し、正規化した。配列データの実験的フィルタリングを、全ての実験におけるシグナルの存在について行った。各化学処理における平均転写レベルを、対照実験における平均転写レベルと比較し、それを用いて倍率変化値を計算した。log2変換された倍率変化値を用いて、実験条件間のピアソン相関係数を計算した。
【０１２３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、植物ＲＮＡ精製試薬（Invitrogen, USA）を用いて、製造業者の説明書にしたがって単離した。ｃＤＮＡを、QantiTec逆転写キット（Qiagen, USA）を用いて、１μｇの全ＲＮＡから合成した。Maxima（登録商標）SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(Fermentas)を用いたリアルタイムＰＣＲを、ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ検出システム（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて行った。標的ｍＲＮＡの相対量を、相対的標準曲線法を用いて決定し、内部対照ｍＲＮＡの相対量によって正規化した。３回の生物学的実験を行った。これらの実験に使用されるプライマー配列が、表２に示される。
【０１２４】
【表１６】
2016531091.tif 000033
【０１２５】
ＡＢＡ応答性レポーター遺伝子アッセイ
既存のＡＢＡ応答性プロモーター−ＧＵＳ融合は、本発明者らの実験において、高いバックグラウンドレベルまたはＡＢＡに応答した比較的低い誘発レベルのいずれかのため、理想的ではない。低いバックグラウンドレベルを有する高度にＡＢＡ誘発性の遺伝子としてのＭＡＰＫＫＫ１８（Matsui A, et al, Plant Cell Physiol 49(8): 1135-1149(2008)）；ＭＡＰＫＫＫ１８はまた、乾燥および塩ストレスによって強く誘発される。したがって、本発明者らは、ＭＡＰＫＫＫ１８プロモーター：：ＧＵＳレポータートランスジェニック植物に対するアゴニストの効果を特性評価した。ＧＵＳ染色を、以下の組成：５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ７．０、０．０５％のTween-20、２．５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２．５ｍＭのフェリシアン化カリウム、１ｍＭのX-glucの反応緩衝液中で行った。反応緩衝液を、１０分間にわたって２回、試験試料中に減圧浸潤させ、次に、３７℃で５時間インキュベートした。試料を７０％のエタノールで洗浄することによって、反応を停止し、６５℃でのインキュベーションによって、クロロフィル色素を脱色した。
【０１２６】
図９は、ピラバクチン、ＬＣ６６Ｃ６、および（＋）−ＡＢＡに応答して誘発される遺伝子発現変化を示す。図９Ａに示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、野生型植物において、用量依存的にＲＤ２９ＢおよびＭＡＰＫＫＫ１８  ｍＲＮＡの発現を誘発した一方、それらの誘発レベルは、ａｂｉ１−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ四重変異体植物の両方において低下した。ＬＣ６６Ｃ６による遺伝子発現の誘発は、（＋）−ＡＢＡで観察されるものと類似している。（＋）−ＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６と対照的に、ピラバクチンは、野生型植物における遺伝子発現を誘発しなかったが、より高い濃度が処理の際に用いられるとき、苗における適度なＡＢＡ関連遺伝子発現を誘発する（Park et al, 2009）。
【０１２７】
図９Ｂは、ＡＴＨ１マイクロアレイに対する標識ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって測定した際の、対照処理と比較した、野生型の苗に対するＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃまたはピラバクチンの効果のゲノム規模での比較を示す。図９Ｂに示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、マイクロアレイ実験においてＡＢＡによって誘発されるものと同様の遺伝子群を誘発する。対照的に、ピラバクチンは、ＡＢＡのものと同様の発現パターンを誘発しなかった。
【０１２８】
図９Ｃおよび９Ｄは、ＬＣ６６Ｃ６が、（＋）−ＡＢＡと同じ組織におけるレポーター遺伝子の発現を誘発することを示す。レポーター遺伝子の発現は、葉および根の孔辺細胞および維管束組織、ならびに吸収された種子の幼根先端において観察された。
【０１２９】
図１０は、ＰＹＲ／ＰＹＬ単一変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を示す。図１０に示されるように、ＡＢＡ応答性ＭＡＰＫＫＫ１８、ＲＤ２９Ａ、およびＲＤ２９Ｂ  ｍＲＮＡは、ＣｏｌおよびＬｅｒ生態型ならびにｐｙｒ１、ｐｙｌ１、ｐｌｙ２、ｐｙｌ３およびｐｙｌ４単一変異体遺伝子型において、ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡの両方によって誘発された。対照的に、ピラバクチンは、単一変異体または野生型生態型のいずれかにおいて分析される遺伝子のいずれかの発現をそれほど誘発しなかった。
【０１３０】
図１１は、野生型植物、ａｂｉ１−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ四重変異体におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を示す。図１１に示されるように、ＬＣ６６Ｃ６および（＋）−ＡＢＡは両方とも、Ｃｏｌ野生型植物において用量依存的にＡＢＦ３、ＧＢＦ３、ＮＣＥＤ３、およびＲＤ２９Ａの発現を誘発した一方、誘発レベルは、ａｂｉ１−１およびＰＹＲ／ＰＹＬ四重変異体植物の両方において低下した。上記の結果と一致して、ピラバクチンは、野生型植物において分析される任意の遺伝子の著しい発現を誘発しなかった。
【０１３１】
実施例５
この実施例は、ＡＢＡ異化のための鍵酵素が、ＬＣ６６Ｃ６によって誘発される応答に影響しないことを実証する。
【０１３２】
図１２に示されるように、ＡＢＡによる植物成長および発芽の抑制は、ＡＢＡ異化のための鍵酵素であるｃｙｐ７０７ａの二重変異体である植物において強化されるが、ＣＹＰ７０７Ａを過剰発現する植物において低下される（ＣＹＰ７０７ＡＯＸ；図１２Ａ〜Ｄを参照）。対照的に、ＬＣ６６Ｃ６による植物成長および発芽に対する効果は、ｃｙｐ７０７ａの二重変異体である植物、野生型植物、またはＣＹＰ７０７ＡＯＸを過剰発現する植物において、それほど異ならない（図１２Ａ〜Ｄを参照）。
【０１３３】
この実施例は、ＡＢＡの分解に関与する酵素が、ＬＣ６６Ｃ６によって調節される表現型に影響しないことを示す。
【０１３４】
実施例６
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、単子葉植物および双子葉植物を含む多様な植物種において生物活性であることを示す。
【０１３５】
図１３Ａは、ＬＣ６６Ｃ６が、ブロッコリー、ハツカダイコン、アルファルファ、ダイズ、オオムギ、コムギ、モロコシおよびトウモロコシ種子の発芽を抑制することを示す。ＬＣ６６Ｃ６による発芽の抑制のレベルは、ピラバクチンより高い。図１３Ｂに示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、上記の種の脱離した葉において、２時間の期間にわたって蒸散による水分損失を減少させる。さらに、ＬＣ６６Ｃ６は、ダイズにおけるＡＢＡ応答性遺伝子ＧｍＮＡＣ４およびＧｍｂＺＩＰ１の発現を強く誘発し（図１３Ｃ）、オオムギにおけるＡＢＡ応答性遺伝子ＨＶＡ１およびＨｖＤＲＦ１の発現を適度に誘発し（図１３Ｄ）、トウモロコシにおけるＡＢＡ応答性遺伝子ＺｍＲａｂ１７およびＺｍＬＥＡの発現を弱く誘発する（図１３Ｅ）。
【０１３６】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、農業的に重要な種の多様な群において、発芽を抑制し、蒸散による水分損失を減少させることを実証し、このことは、ＬＣ６６Ｃ６が、複数の種における乾燥ストレスを軽減するのに有用であることを示す。
【０１３７】
実施例７
この実施例は、本明細書に記載されるＡＢＡおよびアゴニストの化学構造、ならびにインビトロおよびインビボでのアゴニストの効果を示す。
【０１３８】
図１４および１８は、試験されるＡＢＡおよびアゴニストの化学構造を示す。図１５Ａは、図１４に示されるアゴニストのそれぞれに対する応答を試験するための、ＰＹＲ／ＰＹＬ受容体ＰＹＲ１、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、およびＰＹＬ４を用いた酵母ツーハイブリッドアッセイの結果を示す。図１５Ｂは、野生型種子の発芽における図１４中のアゴニストの試験の結果を示し、ＬＣ６６Ｃ６が、野生型種子の発芽の抑制において、（＋）−ＡＢＡに次いで最も有効なアゴニストの１つであることを実証する。図１５Ｃは、ＡＢＡ誘発性シロイヌナズナ（Arabidopsis）遺伝子ＭＡＰＫＫＫ１８の制御下で、グルクロニダーゼを発現する遺伝子導入系統におけるグルクロニダーゼアッセイを用いて測定した際のＡＢＡレポーター系統に対する化合物の効果を示す。
【０１３９】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、インビトロおよびインビボの両方で、最も有効な試験されるアゴニストの１つであることを実証する。
【０１４０】
実施例８
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、ＡＢＡ欠損変異体植物の大きさを増加させ得ることを示す。
【０１４１】
この実施例では、１４日齢の野生型およびａｂａ２変異体植物に、２５μΜのアゴニストを含有する溶液を、１日２回、２週間にわたって噴霧した。画像および生体重を、４週齢の植物から得た。図１６に示されるように、ａｂａ２変異体植物へのＬＣ６６Ｃ６の施用により、担体ＤＭＳＯのみで処理される対照植物と比較して、変異体植物の大きさがかなり増加された。
【０１４２】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、ａｂａ２変異において観察される成長表現型を、（＋）−ＡＢＡのものと同様に補完し得ることを実証する。
【０１４３】
実施例９
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、コケにおける原糸体成長を弱く抑制し得るが、単細胞性緑藻類クラミドモナス属（Chlamydomonas）の成長には効果がないことを示す。
【０１４４】
図１７Ａおよび１７Ｂに示されるように、ＬＣ６６Ｃ６は、コケヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）の原糸体の成長に対する弱いが有意な抑制を示した。ピラバクチンは、原糸体を脱色し、このことは、ピラバクチンがこの種に対して毒性であり得ることを示唆している。
【０１４５】
図１７Ｃは、ＬＣ６６Ｃ６が、コケにおけるＡＢＡ応答性遺伝子の発現を誘発し得ることを示す。しかしながら、これらの誘発レベルは、ＡＢＡの誘発レベルより弱かった。
【０１４６】
図１７Ｄに示されるように、（＋）−ＡＢＡおよびＬＣ６６Ｃ６は両方とも、塩分および浸透圧ストレスを伴う場合および伴わない場合の、クラミドモナス属（Chlamydomonas）の成長に対する効果がなかった。ここでも、ピラバクチンは、クラミドモナス属（Chlamydomonas）を脱色し、このことは、ピラバクチンが同様にこの種に対して毒性であることを示唆している。
【０１４７】
この実施例は、ＬＣ６６Ｃ６が、原糸体成長を弱く抑制し、コケヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）におけるＡＢＡ応答性遺伝子発現を弱く誘発し得るが、単細胞性藻類クラミドモナス属（Chlamydomonas）の成長には効果がないことを示す。
【０１４８】
実施例１０：化合物の合成
１０．１  化合物１．００１の調製
１）１−アリル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（１９．２ｇ）を、ＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解させ、５℃に冷却し、Ｋ２ＣＯ３（１８．２ｇ）を加えた。３−ブロモプロペン（１５．７ｇ）を滴下して加え、反応物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を氷／水に注ぎ、沈殿した生成物をろ過し、水で洗浄した。得られた湿潤した結晶を、エタノール（６０ｍｌ）中で撹拌し、ジエチルエーテルを加え、懸濁液を再度ろ過し、得られたろ過ケーキをジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、２１．７ｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．１０（ｍ，２Ｈ）、７．０８（ｄ，１Ｈ）、５．８５（ｍ，１Ｈ）、５．２５（ｄ，１Ｈ）、５．１２（ｄ，１Ｈ）、４．６０（ｍ，２Ｈ）、３．０５（ｄｄ，２Ｈ）、２．７３（ｄｄ，２Ｈ）。
【０１４９】
２）１−アリル−３−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
１−アリル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン（９２９ｍｇ）を、乾燥ＴＨＦ（３２ｍｌ）に溶解させ、脱気し、−１５℃に冷却した。ＭｅＩ（１．１４ｇ）を加え、次に、ＬｉＨＭＤＳ（４．４ｍｌの、ＴＨＦ中の１Ｍの溶液）を滴下して加えた。反応物を２０分間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌ（水溶液）に注ぎ、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、クロマトグラフィーによって精製したところ、８８６ｍｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．１０（ｍ，２Ｈ）、７．０３（ｄ，１Ｈ）、５．８５（ｍ，１Ｈ）、５．２２（ｄ，１Ｈ）、５．１２（ｄ，１Ｈ）、４．６０（ｍ，２Ｈ）、３．０５（ｄｄ，１Ｈ）、２．７５（ｍ，２Ｈ）、１．３０（ｄ，３Ｈ）。
【０１５０】
３）１−アリル−６−アミノ−３−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
１−アリル−３−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン（８８０ｍｇ）を、エタノール（８．８ｍｌ）および水（４．４ｍｌ）に懸濁させた。ＮＨ４Ｃｌ（１．９１ｇ）およびＦｅ（還元粉）（６００ｍｇ）を加え、反応物を加熱還流させた。１．５時間後、ＮＨ４Ｃｌ（８５０ｍｇ）およびＦｅ（還元粉）（３００ｍｇ）を加え、さらに１．５時間還流を続けた。反応混合物を冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトに通してろ過した。ろ液を、ＣＨ２Ｃｌ２および水で洗浄した。溶液を、ＨＣｌ（水溶液）で酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄した。酸性の水相をＫ２ＣＯ３の水溶液に注ぎ、得られた中性の水溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。有機層を濃縮したところ、６２７ｍｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝６．２５（ｄ，１Ｈ）、６．５（ｍ，２Ｈ）、５．８５（ｍ，１Ｈ）、５．１０（ｍ，２Ｈ）、４．４９（ｍ，２Ｈ）、３．５（ｂｓ，２Ｈ）、２．９〜２．５（ｍ，３Ｈ）、１．２２（ｄ，３Ｈ）。
【０１５１】
４）化合物１．００１
１−アリル−６−アミノ−３−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン（１３０ｍｇ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）に溶解させ、０℃に冷却した。ｉＰｒ２ＮＥｔ（１１７ｍｇ）およびｐ−トリルメタンスルホニルクロリド（１２９ｍｇ）を加えた。室温に温めながら、反応物を７時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ＮａＨＣＯ３（水溶液）およびＨＣｌ（水溶液）で洗浄した。有機層を濃縮し、クロマトグラフィーによって精製したところ、１４０ｍｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．１７（ｍ，４Ｈ）、６．９０（ｍ，２Ｈ）、６．３０（ｓ，１Ｈ）、５．８５（ｍ，１Ｈ）、５．１０（ｍ，２Ｈ）、４．５０（ｍ，２Ｈ）、４．２８（ｓ，２Ｈ）、２．９〜２．６（ｍ，３Ｈ）、２．３３（ｓ，３Ｈ）、１．２２（ｄ，３Ｈ）。
【０１５２】
１０．２  化合物１５．００１の調製
化合物１５．００１を、化合物１．００１と同様に調製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．４〜７．３（ｍ，４Ｈ）、６．９０（ｍ，２Ｈ）、６．２８（ｓ，１Ｈ）、５．８５（ｍ，１Ｈ）、５．１５（ｍ，２Ｈ）、４．５０（ｍ，２Ｈ）、４．３（ｓ，２Ｈ）、２．９〜２．６（ｍ，３Ｈ）、１．２３（ｄ，３Ｈ）。
【０１５３】
１０．３  構成単位の調製
以下の化合物は、本発明の化合物の調製における構成単位として使用され得る。
Ａ．１−アリル−６−アミノ−８−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
【化１７】
2016531091.tif 000034
【０１５４】
１）Ｎ−（ｏ−トリル）−３−フェニル−プロパ−２−エナミド
アセトン（２００ｍｌ）中の塩化シンナモイル（１８１ｇ）の溶液を、アセトン（１Ｌ）および氷（１ｋｇ）およびＫ２ＣＯ３（１５３ｇ）中のｏ−トルイジン（１０７．７ｇ）の冷却された（−２０℃）溶液に滴下して加えた。添加後、反応混合物を１時間撹拌し、氷／水に注ぎ、沈殿物をろ過し、水で洗浄し、減圧下で、１００℃で乾燥させたところ、２３９ｇまたは生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．０〜７．１（ｍ，９Ｈ）、６．６（ｂｄ，１Ｈ）、４．８（ｓ，２Ｈ）、２．３（ｓ，３Ｈ）
【０１５５】
２）８−メチル−１Ｈ−キノリン−２−オン
Ｎ−（ｏ−トリル）−３−フェニル−プロパ−２−エナミド（９．５ｇ）およびＡｌＣｌ３（１７．８ｇ）を、１８０℃で融解させ、次に、１００℃で１時間加熱した。得られた混合物を水／氷（２Ｌ）に注ぎ、沈殿している褐色がかった固体をろ過し、水、ＨＣｌ（水溶液）、水で連続して洗浄し、１００℃で、減圧下で乾燥させたところ、５．０ｇまたは生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝９．２（ｂｓ，１Ｈ）、７．７６（ｄ，１Ｈ）、７．４３（ｄ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ）、７．１３（ｄｄ，１Ｈ）、６．６５（ｄ，１Ｈ）、２．４５（ｓ，３Ｈ）
【０１５６】
３）８−メチル−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン
８−メチル−１Ｈ−キノリン−２−オン（１０８ｇ）を、ＡｃＯＨ（８００ｍｌ）に溶解させ、脱気した。アルゴン雰囲気下で、１０％のＰｄ／Ｃ（１０．８ｇ）を加え、得られた混合物を、水素雰囲気（１気圧）下に置き、９０℃で１０時間撹拌した。水素雰囲気を、アルゴンと交換し、反応混合物をセライトに通してろ過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。Ｐｄ−廃棄物を適切に廃棄した。得られた溶液を濃縮した。粗材料の再結晶化により、５１ｇの生成物が得られた。残りの母液をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄し、濃縮したところ、さらなる３０ｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．５５（ｂｓ，１Ｈ）、７．０５（ｍ，２Ｈ）、６．９０（ｄｄ，１Ｈ）、２．９５（ｍ，２Ｈ）、２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．２１（ｓ，３Ｈ）
【０１５７】
４）８−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン
８−メチル−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（１０ｇ）および硫酸（１８６ｍｌ）を、メカニカルスターラーを備えたフラスコ中で混合した。透明な溶液を０℃に冷却し、ＨＮＯ３（６．０ｇ）を、反応物を激しく撹拌しながら、１５分間の間、滴下して加えた。０．５時間撹拌を続け、反応混合物を氷／水に注ぎ、懸濁液をろ過した。ＥｔＯＡｃからの粗材料の再結晶化により、９．１ｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．０（ｍ，２Ｈ）、７．８５（ｂｓ，１Ｈ）、３．０５（ｍ，２Ｈ）、２．７０（ｍ，２Ｈ）、２．３１（ｓ，３Ｈ）。
【０１５８】
５）１−アリル−８−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
８−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（３．０ｇ）を、室温でＤＭＦ（５８ｍｌ）中のＮａＨ（１．４５ｇ）の懸濁液に加えた。この混合物を２０分間撹拌した後、臭化アリル（１０．９ｇ）を滴下して加え、得られた混合物を４８時間撹拌し、水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、クロマトグラフィーによって精製したところ、２．５９の生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．９５（ｄ，１Ｈ）、７．９（ｄ，１Ｈ）、５．７（ｍ，１Ｈ）、５．１（ｍ，２Ｈ）、４．５８（ｍ，２Ｈ）、２．９４（ｍ，２Ｈ、２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．４１（ｓ，３Ｈ）。
【０１５９】
６）１−アリル−６−アミノ−８−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
８−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（２．６ｇ）を、エタノール（２６ｍｌ）および水（１３ｍｌ）に懸濁させた。ＮＨ４Ｃｌ（８．４４ｇ）および反応物を加熱還流させた。Ｆｅ（還元粉）（２．９４ｇ）を、１時間の期間にわたって少しずつ加えた。１．５時間後、反応混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、セライトに通してろ過し、有機層を濃縮し、クロマトグラフィーによって精製したところ、２．１ｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝６．３９（ｓ，２Ｈ）、５．７２（ｍ，１Ｈ）、５．１（ｍ，２Ｈ）、４．４８（ｍ，２Ｈ）、３．５（ｂｓ，２Ｈ）、２．７０（ｍ，２Ｈ）、２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．２３（ｓ，３Ｈ）。
【０１６０】
Ｂ．６−アミノ−８−メチル−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
【化１８】
2016531091.tif 000035
１）８−メチル−６−ニトロ−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
８−メチル−６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（２．０ｇ）を、室温でＤＭＦ（３８ｍｌ）中のＮａＨ（９７０ｍｇ）の懸濁液に加えた。この混合物を２０分間撹拌した後、臭化プロパルギル（６．４８ｍｌの、トルエン中８０％の溶液）を滴下して加え、得られた混合物を１６時間撹拌し、水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、クロマトグラフィーによって精製したところ、２．０７ｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．０３（ｄ，１Ｈ）、７．９３（ｄ，１Ｈ）、４．７２（ｓ，２Ｈ）、２．９５（ｍ，２Ｈ）、２．６５（ｍ，２Ｈ）、２．５６（ｓ，３Ｈ）、２．２０（ｔ，１Ｈ）。
【０１６１】
２）６−アミノ−８−メチル−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン
８−メチル−６−ニトロ−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン（２．０７ｇ）を、エタノール（２１ｍｌ）および水（１０．５ｍｌ）に懸濁させた。ＮＨ４Ｃｌ（６．８ｇ）および反応物を加熱還流させた。Ｆｅ（還元粉）（２．３７ｇ）を、１時間の期間にわたって少しずつ加えた。１．５時間後、反応混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、セライトに通してろ過し、有機層を濃縮し、クロマトグラフィーによって精製したところ、１．３２ｇの生成物が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝６．３５（ｍ，２Ｈ）、４．５５（ｓ，２Ｈ）、３．５５（ｓ，２Ｈ）、２．７３（ｍ，２Ｈ）、２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、２．１８（ｔ，１Ｈ）。
【０１６２】
１０．４  化合物１．０７９（Ｎ−（８−メチル−２−オキソ−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−６−イル）−１−（ｐ−トリル）メタンスルホンアミド）を調製するための構成単位Ａのカップリング
酢酸エチル（０．５ｍｌ）中の６−アミノ−８−メチル−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オン（０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、氷−エタノール浴中で、０℃に冷却した。酢酸エチル（０．７５ｍｌ）中のｐ−トリルメタンスルホニルクロリド（０．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下して加え、反応混合物を周囲温度で４時間撹拌した。反応混合物を濃縮した。残りの混合物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（０．３ｍｌ）およびメタノール（１．２５ｍｌ）で希釈し、ＨＰＬＣによって精製したところ、Ｎ−（８−メチル−２−オキソ−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−６−イル）−１−（ｐ−トリル）メタンスルホンアミド、化合物１．０７９が得られた。
【０１６３】
化合物を、ＵＰＬＣ−ＭＳによって同定した：保持時間（ＲＴ）＝１．３３分間；Ｍ（計算値）：３８２．１４；（Ｍ＋Ｈ）（実測値）：３８３．０６。
【０１６４】
ＵＰＬＣ−ＭＳ条件
Waters SQD2質量分析計（シングル四重極質量分析計）
イオン化法：エレクトロスプレー
極性：正イオン
キャピラリー（ｋＶ）３．５０、コーン（Ｖ）３０．００、抽出装置（Ｖ）３．００、イオン源温度（℃）１５０、脱溶媒和温度（℃）４００  コーンガス流（Ｌ／時）６０、脱溶媒和ガス流（Ｌ／時）７００
質量範囲：１４０〜８００Ｄａ
ＤＡＤ波長範囲（ｎｍ）：２１０〜４００
以下のＨＰＬＣ勾配条件を用いたWaters ACQUITY UPLCによる方法
（溶媒Ａ：水／メタノール９：１、０．１％のギ酸および溶媒Ｂ：アセトニトリル、０．１％のギ酸）
【０１６５】
【表１７】
2016531091.tif 000036
【０１６６】
１０．５  他の化合物を調製するための構成単位ＡまたはＢのカップリング
６−アミノ−８−メチル−１−プロパ−２−イニル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オンおよび１−アリル−６−アミノ−８−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−２−オンを用いて、上述される方法を用いて、以下の表３に示される並行した合成において、化合物６．００７、１．０７９、４．００７、１．００７、１５．００７、６．０７９および１５．０７９を調製した。
【０１６７】
【表１８】
2016531091.tif 000037
【０１６８】
【表１９】
2016531091.tif 000038
【０１６９】
実施例１１：ＰＰ２Ｃ活性アッセイ
タンパク質ＨＡＢ１、２型タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）は、アブシジン酸または他のアンタゴニストに依存して、ＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質によって抑制される。アンタゴニストの有効性は、ＰＰ２Ｃの抑制のレベルと相関するため、ＩＣ５０（ＰＹＲ１−ＨＡＢ１）が、異なる化学的類似体の相対的な活性を比較するのに使用され得る。ＰＰ２Ｃの抑制が、種子−発芽の抑制および植物の水利用効率の向上に相関するため、アブシジン酸の類似体として働く薬品の生物学的潜在力を定量化することは、強力な手段として役立つ。
【０１７０】
若干の修正を加えて、Park et al.((2009)Science 324(5930): 1068-1071)に記載されているように、ＨＡＢ１およびＰＹＬタンパク質を、発現させ、精製した。ＧＳＴ−ＨＡＢ１、−ＡＢＩ１および−ＡＢＩ２融合タンパク質を得るために、ＨＡＢ１  ｃＤＮＡを、ｐＧｅｘ−２Ｔへクローニングした一方、ＡＢＩ１およびＡＢＩ２  ｃＤＮＡを、ベクターｐＧｅｘ−４Ｔ−１へクローニングした。発現は、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ宿主細胞内で行われた。形質転換された細胞を、一晩前培養し、ＬＢ培地に移し、培養物のＡ６００が約０．５になるまで３０℃で培養した。
【０１７１】
次に、培養物を氷上で冷却し、ＭｎＣｌ２を４ｍＭまで加え、ＩＰＴＧを０．３ｍＭまで加えた。１５℃で１６時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、Park et al.に記載されているように、組み換えタンパク質を、グルタチオンアガロース上で精製した。６ＸＨｉｓ−ＰＹＬ受容体融合タンパク質を得るために、全１３のＡＢＡ受容体についての受容体ｃＤＮＡを、ベクターｐＥＴ２８へクローニングし、Mosquna et al.((2011)PNAS 108(51): 20838-20843)に記載されているように、発現させ、精製し；これにより、ＰＹＬ７、ＰＹＬ１１およびＰＹＬ１２以外の全ての受容体についての可溶性および機能性タンパク質が生成された（受容体に媒介されるＰＰ２Ｃ抑制アッセイを用いて評価される）。したがって、これらの３つの受容体は、ベクターｐＭＡＬ−ｃを用いて、マルトース結合（ＭＢＰ）融合タンパク質として代わりに発現され；これらの構築体の発現は、ＧＳＴ−ＨＡＢ１に使用されるのと同じ誘発条件で、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ宿主株内で行われた。組み換えＭＢＰ−ＰＹＬ融合タンパク質を、製造業者の精製説明書を用いて、アミロース樹脂（New England Biolab, Inc.）を用いて、超音波分解および清浄化された溶解物から精製した。この試みにより、活性ＭＢＰ−ＰＹＬ１１融合タンパク質が生成されたが、ＰＹＬ７およびＰＹＬ１２は生成されなかった。
【０１７２】
組み換え受容体およびＰＰ２Ｃを用いたＰＰ２Ｃ活性アッセイを、以下のように行った：精製されたタンパク質を、ＡＢＡまたはＡＢＡアゴニスト（本発明の化合物）とともに、１０ｍＭのＭｎＣ１２、３μｇのウシ血清アルブミンおよび０．１％の２−メルカプトエタノールを含有する８０μｌのアッセイ緩衝液中で、２２℃で３０分間にわたってプレインキュベートした。１５６ｍＭのトリス−ＯＡｃ、ｐＨ７．９、３３０ｍＭのＫＯＡｃおよび５ｍＭのリン酸４−メチルウンベリフェリルを含有する２０μｌの反応溶液を加えることによって、反応を開始させ、その後、Wallacプレートリーダー上の励起フィルタ３５５ｎｍおよび発光フィルタ４６０ｎｍを用いて、蛍光測定をすぐに収集した。反応は、５０ｎＭのＰＰ２Ｃおよび１００ｎＭのＰＹＲ／ＰＹＬタンパク質をそれぞれ含有していた。結果が、表４に表される。
【０１７３】
【表２０】
2016531091.tif 000039
【０１７４】
【表２１】
2016531091.tif 000040
【０１７５】
結果は、本発明の化合物が、キナバクチンと同等のレベルで、ＰＰ２Ｃを抑制することを示す。
【０１７６】
実施例１２：シロイヌナズナ（Arabidopsis）の発芽の抑制分析
発芽の抑制に対する化合物の効果を分析するために、約４週間追熟したシロイヌナズナ（Arabidopsis）種子を、１０分間にわたって、５％のＮａＣｌＯおよび０．０５％のTween-20を含有する溶液で表面殺菌し、水で４回すすいだ。殺菌された種子を、０．１％の寒天で懸濁させ、関連する処理の存在下で、１／２ムラシゲスクーグ（ＭＳ）塩（Sigma-Aldrich）を含有する０．８％の固化した寒天培地上に播種し、４℃で４日間貯蔵し、次に、暗条件下で２２℃に移した。発芽を、３日後に評価した。
【０１７７】
【表２２】
2016531091.tif 000041
【０１７８】
【表２３】
2016531091.tif 000042
【０１７９】
結果は、本発明の化合物が、シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子の発芽を抑制することを示す。
【０１８０】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、あくまでも例示のためのものであり、それを考慮した様々な変更形態または変形形態が、当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、配列受託番号、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
【図１Ｂ】
2016531091.tif 000048
【図９Ｃ】
2016531091.tif 000049
【図９Ｄ】
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【図１４−１】
2016531091.tif 000051
【図１４−２】
2016531091.tif 000052
【図１５Ａ】
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【図１５Ｃ】
2016531091.tif 000054
【図１７Ａ】
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【図１Ａ】
2016531091.tif 000056
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2016531091.tif 000059
【図３Ａ−１】
2016531091.tif 000060
【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2016531091.tif 000063
【図４Ｂ】
2016531091.tif 000064
【図５Ａ】
2016531091.tif 000065
【図５Ｂ】
2016531091.tif 000066
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2016531091.tif 000068
【図６Ａ】
2016531091.tif 000069
【図６Ｂ】
2016531091.tif 000070
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2016531091.tif 000100
2016531091.tif 000101
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