(57)【要約】  ５Ｔ４標的化治療に有用な免疫融合分子。該免疫融合分子は、単鎖形態に操作され、ヒト膵臓ＲＮａｓｅ（「ＨＰＲＮ」）などの細胞毒性ペイロードに融合された、抗５Ｔ４抗体の５Ｔ４抗原結合性部分を含む。単一の免疫融合ペプチドのＲＮａｓｅ部分は、ポリグルタミン酸（ポリＥ）テールに融合されていてもよい。医薬組成物は、５Ｔ４抗原結合性部分およびＨＰＲＮを含む免疫融合分子を含み、該組成物を必要とする動物に投与する方法を含む。
2016531088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単鎖ペプチド中に抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む免疫融合分子であって、
ａ）前記抗原結合性部分のポリペプチド配列は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号９７、または配列番号９８の配列を含み、
ｂ）前記ＲＮａｓｅ部分のポリペプチド配列は、配列番号１３から配列番号２０までのいずれか１つの配列を含む、免疫融合分子。
【請求項２】
前記抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分がポリペプチドリンカーによって融合されている、請求項１に記載の免疫融合分子。
【請求項３】
前記ポリペプチドリンカーが、配列番号９から配列番号１２までのいずれか１つのポリペプチド配列を有する、請求項２に記載の免疫融合分子。
【請求項４】
前記ＲＮａｓｅ部分のポリペプチド配列に融合されているカテプシンＢ基質配列をさらに含む、請求項１に記載の免疫融合分子。
【請求項５】
前記カテプシンＢ基質配列が、前記ＲＮａｓｅ部分のＮ末端に融合されている、請求項４に記載の免疫融合分子。
【請求項６】
前記カテプシンＢ基質配列が、前記ＲＮａｓｅ部分のＣ末端に融合されている、請求項４に記載の免疫融合分子。
【請求項７】
前記カテプシンＢ基質配列のＣ末端に融合されている、少なくとも１０個のグルタメート残基をさらに含む、請求項６に記載の免疫融合分子。
【請求項８】
前記ＲＮａｓｅ部分のＣ末端に融合されている、少なくとも１０個のグルタメート残基をさらに含む、請求項１に記載の免疫融合分子。
【請求項９】
単鎖ペプチド中に抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む免疫融合分子であって、前記単鎖ペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つのポリペプチド配列を含む、免疫融合分子。
【請求項１０】
前記単鎖ペプチドが、配列番号２として示されるＮ末端シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載の免疫融合分子。
【請求項１１】
前記単鎖ペプチドが、細胞で発現されると、二量体のうちの単量体を形成する、請求項１に記載の免疫融合分子。
【請求項１２】
前記単鎖ペプチドが、細胞で発現されると、四量体のうちの単量体を形成する、請求項１に記載の免疫融合分子。
【請求項１３】
単鎖ペプチド中に抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む免疫融合分子であって、前記単鎖ペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つのポリペプチド配列を含み、任意選択的に、前記単鎖ペプチドのポリペプチド配列のアミノ酸のうちの１つまたは複数はペプチドミメティックで置換されており、かつ前記免疫融合分子は５Ｔ４抗原に結合する、免疫融合分子。
【請求項１４】
単鎖ペプチド中に抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む免疫融合分子であって、前記単鎖ペプチドのポリペプチド配列は、配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つのポリペプチド配列を含み、任意選択的に、前記単鎖ペプチドのポリペプチド配列は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、置換、または欠失によって修飾され、かつ前記免疫融合分子は５Ｔ４抗原に結合する、免疫融合分子。
【請求項１５】
配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つのポリペプチド配列を含む単鎖ペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つのポリペプチド配列を含む単鎖ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列はコドン最適化のために修飾されている、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、または昆虫細胞における発現のためのコドン最適化のために修飾されている、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド配列が、アオウキクサ（Ｌｅｍｎａ）属の生物およびＣＨＯ由来の細胞における発現のためのコドン最適化のために修飾されている、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
免疫融合分子を合成するための方法であって、
ａ）単鎖ペプチドを発現可能な発現ベクターの制御領域に作動可能に連結された、配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つのポリペプチド配列を含む前記単鎖ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用意するステップと、
ｂ）前記発現ベクターで細胞を形質転換するステップと、
ｃ）前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
細胞培養物から前記免疫融合分子を精製するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、または昆虫細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、アオウキクサ属細胞およびＣＨＯ細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ウキクサ植物およびウキクサ根粒培養物において免疫融合分子を合成するための方法であって、
ａ）ウキクサ植物またはウキクサ根粒を用意するステップと、
ｂ）前記ウキクサ植物またはウキクサ根粒を、配列番号３２から配列番号９５までのいずれか１つの配列を含むポリペプチド配列をコードする核酸分子と、作動可能に連結されたポリペプチドの分泌を指示可能なシグナルペプチドのコード配列とで安定に形質転換するステップと、
ｃ）前記ウキクサ植物またはウキクサ根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
前記ウキクサ植物またはウキクサ根粒培養物から前記ポリペプチドを精製するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
５Ｔ４抗原の発現が関与する疾患または障害を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする動物に、単鎖ペプチド中に抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む治療有効量の免疫融合分子を投与するステップを含み、前記抗原結合性部分のポリペプチド配列は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号９７、または配列番号９８の配列を含み、前記ＲＮａｓｅ部分のポリペプチド配列は、配列番号１３から配列番号２０までのいずれか１つの配列を含む方法。
【請求項２７】
前記疾患または障害が癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、肺癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫融合分子が全身投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫融合分子が膀胱内点滴により投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの化学療法剤の投与をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン、シタラビン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ベンダムスチン、パクリタキセル、ドシタキセル、およびこれらの類似体からなる群から、またはデュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチン、およびこれらの類似体を含む標的化治療薬からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号２１、２２、９７、または９８で示される配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号１０１、１０２、または１０３で示される配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号１０３で示される配列を含む、免疫融合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その開示を参照により本明細書に援用する、５Ｔ４標的化免疫融合分子および方法という表題の、２０１３年６月１７日出願の、米国仮出願第６１／８３５，８５８号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
［発明の分野］
本開示は、５Ｔ４抗原結合性部分および細胞毒性部分を含む５Ｔ４標的化免疫融合分子に関する。本開示は、５Ｔ４抗原関連疾患を処置するための免疫融合分子を合成および使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
癌などのいくつかの疾患では、病的細胞は１つまたは複数の表面抗原の発現の変更を示すことがある。ある状況では、この細胞の乱れは、健常細胞に比べて罹患細胞におけるある種の抗原の発現レベルの著しい変化をもたらし得る。したがって、ある疾患は、罹患細胞が、免疫の認識、排除、および疾患の制御において決定的であり得る特定の抗原発現プロファイルに関連づけられることがある。疾患に特に関連する抗原は、罹患細胞を同定するマーカーとして機能することができ、標的化治療の開発では価値がある。
【０００４】
癌に関連する抗原の一例には、５Ｔ４癌胎児性抗原としても知られるヒト５Ｔ４抗原がある。ヒト５Ｔ４抗原は、胎盤などの胚組織においても、前立腺癌、胃癌、および結腸直腸癌を含めた多様なタイプの固形腫瘍および癌腫においても発現される、７２ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質である。例えば、米国特許第７，０７４，９０９号または米国特許第７，５１４，５４６号を参照されたい。しかし、５Ｔ４抗原は、低レベルで発現されるか、または最も健康な成体上皮組織では発現されないかのいずれかである。Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００２）３６６，３５３−３６５を参照されたい。
【０００５】
多様な腫瘍型、特に卵巣、胃、および結腸直腸の腫瘍における５Ｔ４抗原の発現または過剰発現は、より悪い臨床成績に関連する（同著）。加えて、過剰発現は、腫瘍の浸潤と一致する細胞の形態および運動性の変化に関連する。よって、５Ｔ４抗原は、いくつかの固形腫瘍の進行または悪性度において役割を果たすと考えられている（同著）。５Ｔ４抗原発現は、細胞の特徴に対して効果があり、劣悪な臨床成績に関連するため、５Ｔ４抗原はさらなる研究および特徴付けに興味を引いている。
【０００６】
ある種の抗原は癌または他の疾患に関連があることで、免疫融合分子を作成する上での抗原の使用に対する潜在性が生じる。免疫融合分子は、抗原特異的な細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤として有効であり、医薬組成物の製造において用いるために開発されている。例えば、ＷＯ２００７／１２２５１１を参照されたい。免疫融合分子は、生物学的に活性なタンパク質のペイロードに融合している抗体に由来する抗原結合性部分を含む、遺伝子操作されたタンパク質である。治療応用において、免疫融合分子の抗原結合性部分は、癌または他の疾患に関連する細胞表面抗原に選択的な抗体に由来し得る。このデザインにより、罹患細胞に対する生物学的に活性なペイロードの標的化送達がもたらされ、抗原の標的を発現しない健常細胞に対する影響が低減する。
【０００７】
生物学的に活性な分子の一例にリボヌクレアーゼ（「ＲＮａｓｅ（ＲＮアーゼ）」）があるが、リボヌクレアーゼは細胞毒性または細胞分裂停止のペイロードとして免疫融合分子に組み入れるのに有用であることが知られている。例えば、ＵＳ５，８４０，８４０、ＵＳ５，９５５，０７３、ＵＳ６，０４５，７９３、ＵＳ６，６５３，１０４、およびＵＳ６，８６９，６０４、ＵＳ２０１０／００１５６６１を参照されたい。ＲＮａｓｅはＲＮＡを分解するように働き、それによって細胞の翻訳機構を無能にし、分裂細胞の優先的な死滅をもたらす。例えば、ヒト膵臓ＲＮａｓｅ（「ＨＰＲＮ」）は、細胞の内部に導入すると、細胞死の誘導および伝統的な化学療法に対する細胞の感受性の増大の両方において役割を果たすと考えられている、１つのＲＮａｓｅである。例えば、Ｌｅｌａｎｄ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｎｄｏｗｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６（４６）：４３０９５−４３１０２を参照されたい。しかし、研究により、免疫融合分子の活性のレベルは、ＲＮａｓｅおよびそれに対して結合する標的化部分に応じて大幅に変動することが示されている。ＵＳ２００５／０２４９７３８を参照されたい。例えば、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（ランピルナーゼとしても知られる、カエルのＲＮａｓｅ）は、抗ＣＤ２２抗体であるＬＬ２抗体にコンジュゲートした場合、ＨＰＲＮまたは好酸球由来の神経毒のＲＮａｓｅのいずれかにコンジュゲートした同じ抗体よりも劇的に有効である（同著）。したがって、免疫融合分子の細胞毒性部分としてのＲＮａｓｅの使用に関連する、認められる程度の予測不可能性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、５Ｔ４標的化癌治療に有用な免疫融合分子を提供する。免疫融合分子は、単鎖形態に操作され、ヒト膵臓ＲＮａｓｅ（「ＨＰＲＮ」）などの生物学的に活性なペイロードに融合している、抗５Ｔ４抗体の５Ｔ４抗原結合性部分を含むことが好ましい。本発明は、最も広い態様において、単一ペプチド鎖中に５Ｔ４抗原結合性部分および細胞毒性ペイロード（例えば、ＲＮａｓｅ）部分を含む、免疫融合分子を対象とする。いくつかの例において、単一の免疫融合ペプチドのＲＮａｓｅ部分は、ポリグルタミン酸（ポリＥ）テールに融合して、融合タンパク質に負の電荷を付与してもよい。
【０００９】
本発明者らは、５Ｔ４抗原結合性部分およびＨＰＲＮを含む、免疫融合分子を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１０】
加えて、本発明者らは、５Ｔ４抗原の発現が関与する疾患または障害を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする動物に、単一ペプチド鎖中に５Ｔ４抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む免疫融合分子を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】単鎖形態に操作され、ＨＰＲＮに融合している抗５Ｔ４抗体の抗原結合性部分を含む、例示的な免疫融合分子を示す模式図である。
【図２】単鎖形態に操作され、ＨＰＲＮに融合している抗５Ｔ４抗体の抗原結合性部分を含む、免疫融合分子の例示的なポリペプチド配列を示す模式図である。アミノ酸一文字表記ではなくアステリスク（＊）によって表される残基は、任意選択により変異されてもよく、またはポリペプチド配列中に挿入されてもよい残基である。
【図３】例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物のデザインを示す模式図である。
【図４】例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ構築物のデザインを示す模式図である。
【図５】例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ−ポリＥ構築物のデザインを示す模式図である。
【図６】ＨＰＲＮ免疫融合タンパク質の、５Ｔ４過剰発現性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対する濃度依存的な結合を示すグラフである。
【図７Ａ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＭＤＡＭＢ３６１乳癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＰＣ３前立腺癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｃ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＰＡ１子宮内膜癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｄ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、Ａ４３１子宮頸癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｅ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｆ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＨＴ２９結腸癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｇ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＤＬＤ１結腸癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｈ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｉ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｊ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ヒト５Ｔ４形質転換Ｒｅｃ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−５Ｔ４乳癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図７Ｋ】プローブとして抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（丸）を用いた、ＭＢＡ−ＭＢ−２３１癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。
【図８Ａ】非結合性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（三角）に比べた、組換えＭＤＡ−ＭＢ−２３１−５Ｔ４細胞に対する抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の細胞毒性の用量反応を示すグラフである。
【図８Ｂ】非結合性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（三角）に比べた、ＰＣ３細胞に対する抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の細胞毒性の用量反応を示すグラフである。
【図８Ｃ】非結合性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（四角）に比べた、ＤＬＤ１細胞に対する抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の細胞毒性の用量反応を示すグラフである。
【図８Ｄ】ＰＡ１細胞に対する抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の細胞毒性の用量反応を示すグラフである。
【図８Ｅ】ＳＫＯＶ３細胞に対する抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の細胞毒性の用量反応を示すグラフである。
【図８Ｆ】Ａ４３１細胞に対する抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の細胞毒性の用量反応を示すグラフである。
【図９Ａ】５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣａｔＢ−ＨＰＲＮ−ＣａｔＢ−ポリＥ免疫融合分子をコードし、チャイニーズハムスター卵巣細胞における発現に最適化された、例示的なポリヌクレオチドを示す模式図である。
【図９Ｂ】図９Ａに示す例示的なポリヌクレオチドの模式図の続きを示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｂに示す例示的なポリヌクレオチドの模式図の続きを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、５Ｔ４抗原に特異的な抗５Ｔ４抗体に由来する５Ｔ４標的化免疫融合分子を提供する。本明細書で用いる、「免疫融合分子」は、２つ以上の遺伝子の部分をコードするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現させるなどにより、２つのタンパク質の遺伝子融合により産生されるタンパク質またはポリペプチドを意味する。好ましい例において、免疫融合分子は、「５Ｔ４抗原結合性部分」および「ＲＮａｓｅ部分」を含むことができ、ＲＮａｓｅ部分のＮ末端は、一般的にリンカーペプチドにより、５Ｔ４抗原結合性部分のＣ末端に連結している。この配置は、図１および図２に図示し、以下に詳しく記載する、単鎖融合タンパク質によって例示される。
【００１３】
抗原結合性部分
本明細書で用いる、「５Ｔ４抗原結合性部分」の語は、５Ｔ４抗原に選択的に結合することができるポリペプチド配列を意味する。例示的な免疫融合分子では、５Ｔ４抗原結合性部分は、抗５Ｔ４抗体から操作された単鎖ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態を一般的に含む。単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖＦｃ）は、リンカーペプチドで接続され、ＩｇＧのヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＦｃ領域にさらに接続されている、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。このようなｓｃＦｖＦｃ分子内で、ｓｃＦｖ部分は、リンカーペプチドによってＩｇＧのＦｃセクションのＮ末端に対して、Ｃ末端が連結していてもよい。
【００１４】
一般的に、単鎖抗体フラグメントは、親のモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメントと同じモノマー結合親和性を有するが、細菌、酵母、および植物を含めた多様なホストにおいて便利に発現させることができる。Ｗｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３０５，９８９−１０１０を参照されたい。抗体のｓｃＦｖＦｃ形態を操作するのに多様な技術が知られている。米国特許第７１８９，３９３号、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１０  Ｍａｒ  １９；２８５（１２）：９０５４−６６を参照されたい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）も参照されたい。簡潔に述べると、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）遺伝子の可変領域をコードするｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅してもよい。重鎖および軽鎖に対して増幅した配列を、相互に、ならびに適切なヒンジ部分およびヒトＩｇＧ１の定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３に接続して、単一のポリペプチド鎖をコードする配列を形成してもよい。加えて、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸を、適切な生物物理学的性質を有するアクセプタフレームワークまたは骨格上にグラフト化してもよい（同著）。
【００１５】
本発明者らの免疫融合分子の５Ｔ４抗原結合性部分の少なくとも一部分は、マウス供給源を起源としてもよい。例えば、配列番号４によるポリペプチド配列を有する少なくとも１つのマウス抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ領域をコードするように操作されたポリヌクレオチドを発現させることにより、免疫融合分子を得てもよい。加えて、５Ｔ４抗原結合性部分の少なくとも一部分を、よく知られている方法に従ってキメラまたはヒト化であるように産生してもよい。Ｂｏｒｒａｓら、上述を参照されたい。よって、少なくとも配列番号５によるポリペプチド配列をコードするように操作されたポリヌクレオチドを発現させることにより、ヒト化ｓｃＦｖ部分として５Ｔ４抗原結合性部分を有する免疫融合分子を得てもよい。
【００１６】
いくつかの例において、５Ｔ４抗原結合性部分のＦｖ部分を、ＶＨ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように、分子技術によって操作してもよい。ｓｃＦｖ部分のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＶＨ領域の１つまたは複数のグルタミン残基がグルタミン酸残基で置換されている配列をコードするように修飾することが好ましい。例えば、配列番号５の１３位、３９位、８２位、および／または１１２位のグルタミン残基をグルタミン酸残基で置換して、配列番号９６を得てもよい。グルタミン残基のグルタミン酸残基での置換により、免疫融合分子の正の電荷が低減する。理論に拘泥しようとするものではないが、正の電荷の低減は、免疫融合分子の可溶性の増大、ならびに発現、薬物動態、およびおそらくは腫瘍内浸透の改善に寄与すると考えられている。
【００１７】
５Ｔ４抗原結合性部分のＦｃ部分が、ヒトヒンジ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインから操作されたポリペプチド配列を含むことが好ましい。例えば、配列番号８によるポリペプチド配列を有する少なくともＦｃ部分をコードするようにポリヌクレオチドを操作することが可能である。
【００１８】
ＡＳＴＣ（配列番号６）またはＡＳＴＸ（配列番号７）（「Ｘ」は、あらゆるアミノ酸、または隣接するアミノ酸間の直接的なペプチド結合を意味する）のポリペプチド配列を有するものなどのポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖ部分のＣ末端を、５Ｔ４抗原結合性部分のＦｃ部分のＮ末端に融合し得る。よって、ポリヌクレオチドを、配列番号６または７によるポリペプチド配列を有する少なくともリンカーをコードするように操作することが可能である。配列番号６または７のいずれかをリンカーとして用いてもよいが、配列番号６によるペプチドリンカーを有する免疫融合分子は、システイン残基が存在するため、部位特異的コンジュゲーションに対する潜在性および機会の恩恵を受ける。
【００１９】
単鎖ＦｖおよびＦｃ領域が一緒に連結されているペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１によるポリペプチド配列を有する免疫融合分子の少なくともキメラ５Ｔ４抗原結合性部分をコードしていてもよく、または配列番号２２もしくは２３によるポリペプチド配列を有するヒト化５Ｔ４抗原結合性部分をコードしていてもよい。ヒト化５Ｔ４抗原結合性部分はまた、１３位、３９位、８２位、および／または１１２位のグルタミン残基の１つまたは複数の置換を有し、配列番号９７または９８によるポリペプチド配列を有してもよい。
【００２０】
加えて、配列番号２によるマウスＩｇＶＨに対するＮ末端ペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列が、免疫融合分子のｓｃＦｖ−Ｆｃ５Ｔ４抗原結合性部分をコードするポリヌクレオチドに含まれていてもよい。しかし、シグナルペプチドは翻訳後に切断され、機能的な免疫融合分子の一部ではない。
【００２１】
リンカー
免疫融合分子をコードするポリヌクレオチドを、５Ｔ４抗原結合性部分をＲＮａｓｅ部分に連結する少なくとも１つのポリペプチドリンカー配列をコードするように操作してもよい。ポリペプチドリンカーが、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合性部分のＣ末端を、ＲＮａｓｅ部分のＮ末端に融合していることが好ましい。
【００２２】
リンカーペプチドは知られており、１個から２０個の間のアミノ酸を一般的に含み得る。例示的な免疫融合分子では、ポリペプチドリンカーは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２によるポリペプチド配列であってもよい。これらのポリペプチドリンカーでは、第２のアミノ酸残基は、システインまたはセリンのいずれかであってもよい。
【００２３】
加えて、リンカーを、配列番号１１および１２に示すものなどのＣ末端終端上に、アミノ酸４個のカテプシンＢ（「ＣａｔＢ」）基質配列を有するように操作してもよい。配列番号１１および１２に示す通り、ＣａｔＢ配列は、グリシン−ロイシン−フェニルアラニン−アルギニン（ＧＬＦＲ）と表すことができるＣ末端ポリペプチド配列である。あるいは、ＣａｔＢ配列は、ＧＬＶＲ（配列番号１０４）、ＧＬＦＲＦＦＧ（配列番号１０５）、ＧＬＶＲＡＦＧ（配列番号１０６）、ＧＬＦＲＡＦＧ（配列番号１０７）、またはＬＬＶＲＦＦＧ（配列番号１０８）のいずれか１つによるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２４】
ＣａｔＢ配列は、免疫融合分子が５Ｔ４媒介性内部移行によって内部移行した後、カテプシンＢによる切断に対する標的である。ＣａｔＢ配列を、ＲＮａｓｅ部分に対してＮ末端に、またはＲＮａｓｅ部分に対してＮ末端およびＣ末端の両方に、免疫融合分子中に導入してもよい。よって、免疫融合分子が細胞によって内部移行した後、５Ｔ４抗原結合性部分からＲＮａｓｅ部分を切断できるように、免疫融合分子を操作してもよい。加えて、免疫融合分子が細胞によって内部移行した後、Ｃ末端ペプチドからＲＮａｓｅ部分を切断できるように、免疫融合分子を操作してもよい。
【００２５】
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）
選択された、例示的な例では、免疫融合分子を、ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドを少なくとも発現させることにより得てもよい。好ましくは、ＲＮａｓｅ部分のＮ末端を、５Ｔ４抗原結合性部分に融合しているリンカーペプチドのＣ末端に融合してもよい。好ましいＲＮａｓｅは、配列番号１３のポリペプチド配列によるアミノ酸残基を１２８個有するタンパク質である、ＨＰＲＮである。
【００２６】
いくつかのＨＰＲＮムテインは同定されており（Ｌｅｌａｎｄら、上述を参照されたい）、部位特異的変異を操作するための知られている技術を利用するなどにより、本開示の免疫融合分子で用いることができる。例えば、Ｑ２８ＬおよびＥ１１１Ｇは、ＨＰＲＮの細胞毒性を増大すると同定されている。これらＨＰＲＮムテインのポリペプチド配列を、それぞれ配列番号１４および１６に示す。配列番号１４に示す通り、配列番号１３の２８位のグルタミン残基（Ｑ）はグルタミン酸残基（Ｅ）で置き換えられている。配列番号１６に示す通り、配列番号１３の１１１位のグルタミン酸残基（Ｅ）はグリシン残基（Ｇ）で置き換えられている。加えて、またはあるいは、ＨＰＲＮタンパク質のポリペプチド配列は、配列番号１５に示す通り、Ｒ３１ＣおよびＲ３２Ｃの二重変異によって修飾されていてもよい。よって、配列番号１３の３１位および３２位のアルギニン残基（Ｒ）はシステイン残基（Ｃ）で置き換えられている。
【００２７】
免疫融合分子のＲＮａｓｅ部分を、これらの変異のうちの１つまたは複数の組合せを含むように操作してもよい。例えば、免疫融合分子のＲＮａｓｅ部分は、配列番号１３から配列番号２０のいずれか１つによるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、免疫融合分子のＲＮａｓｅ部分は、
１．野生型ＨＰＲＮ（配列番号１３）
２．Ｑ２８Ｌ（配列番号１４）
３．Ｅ１１１Ｇ（配列番号１６）
４．Ｒ３１Ｃ／Ｒ３２Ｃ（配列番号１５）
５．Ｑ２８Ｌ／Ｒ３１Ｃ／Ｒ３２Ｃ（配列番号１７）
６．Ｒ３１Ｃ／Ｒ３２Ｃ／Ｅ１１１Ｇ（配列番号１８）
７．Ｑ２８Ｌ／Ｅ１１１Ｇ（配列番号１９）、または
８．Ｑ２８Ｌ／Ｒ３１Ｃ／Ｒ３２Ｃ／Ｅ１１１Ｇ（配列番号２０）
のいずれか１つであってもよい。
【００２８】
免疫融合分子は、細胞で発現されると二量体化し得る。あるいは、免疫融合分子は、四量体構造を形成し得る。理論に拘泥しようとするものではないが、Ｒ３１ＣおよびＲ３２Ｃの二重変異は、細胞で免疫融合分子が発現されるとき、二量体または四量体の複合体の形成に寄与すると考えられている。
【００２９】
いくつかの例において、免疫融合分子のＲＮａｓｅ部分を、融合タンパク質に負の電荷を付与する、ポリグルタミン酸（「ポリＥ」）の付加的なＣ末端テールに融合してもよい。グルタミン酸残基の数は、５以上および１５０以下であってもよい。１０以上および１００以下、または１５以上および５０以下が好ましい。ポリグルタミン化した免疫融合タンパク質はｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣａｔＢ−ＲＮａｓｅ−ＣａｔＢ−ポリＥの機構を有することができる。
【００３０】
しばしば、ＲＮａｓｅなど、密集した正に荷電した分子を有するタンパク質は、血管内皮細胞を取り囲むヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に保持される。いくつかの場合において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンも、同じ機能を務めることができる。これらの硫酸化した（負に荷電した）マトリクスは、密集した正の電荷を有するタンパク質を、血液中の循環から吸い出すのを助ける。したがって、ＲＮａｓｅなどの正に荷電した分子の全身送達は、分子の少なくとも部分的な隔絶、および好ましくない薬物動態をもたらし得る。
【００３１】
ポリＥテールなどの負の電荷を導入すると、肝臓、脾臓、および骨髄など、灌流した臓器の血管における静電気の保持が低減し、または回避され、それにより腫瘍内に蓄積するための循環中のポリＥテールの巨大分子治療の存在が増大する。よって、ポリグルタミン化したｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＲＮａｓｅ免疫融合分子は、ポリＥテールのないｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＲＮａｓｅ免疫融合分子よりも薬物動態プロファイルが改善されると考えられている。
【００３２】
例示的な免疫融合分子は、配列番号３２から配列番号９５のいずれか１つのポリペプチド配列を有し、これらの配列は上記に論じた５Ｔ４抗原結合性部分、リンカー、およびＲＮａｓｅタンパク質のポリペプチド配列における変動を組み入れる。他の例示的な免疫融合分子は、配列番号２４から配列番号３１として指定されるポリペプチド配列を有する。これらの配列は、５Ｔ４抗原結合性部分、リンカー、および任意選択によりカテプシンＢ（ＣａｔＢ）基質配列のポリペプチド配列における変動を組み入れる。
【００３３】
上記に記載した例に加えて、免疫融合分子は、５Ｔ４抗原結合性部分および／またはＲＮａｓｅ部分のポリペプチド配列に１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの例において、アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、同様の構造上および／または化学的性質を有する別の１つのアミノ酸で置き換えた、すなわち保存的なアミノ酸置換の結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、無極性の（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００３４】
他の例において、５Ｔ４抗原結合性部分および／またはＲＮａｓｅ部分のポリペプチド配列に１つまたは複数のアミノ酸挿入または欠失があってもよい。「挿入」または「欠失」は、アミノ酸約１個から５個、またはそれを超えてもよい。許容される変動は、組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失、または置換を組織的に行い、結果として得られた組換えバリアントを活性に対してアッセイすることにより実験的に決定することができる。これは、当業者に対してルーチンの実験を超えるものを必要としない。
【００３５】
いくつかの例において、５Ｔ４抗原結合性部分および／またはＲＮａｓｅ部分をコードするポリペプチド配列における１つまたは複数のアミノ酸を、ペプチドミメティックで置き換えてもよい。ペプチドミメティックは、天然のペプチドの生物学的作用（複数可）を擬し、または拮抗することができる非ペプチド性の構造エレメントを含む化合物である。一般的に、ペプチドミメティックは２つの範疇に分類することができる。第１は、その上にファルマコフォア群が付着している骨格であることがしばしばある、非ペプチド様の構造を有する化合物を含む。よって、これらは低分子量の化合物であり、天然のペプチドに対して構造上の類似点を持たず、タンパク質分解酵素に対する安定性の増大をもたらす。第２の主なクラスのペプチドミメティックには、このペプチドに匹敵するモジュラー構築（ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の化合物が含まれる。これらの化合物は、ペプチド側鎖またはペプチド主鎖のいずれかを修飾することにより得ることができる。後者の範疇のペプチドミメティックは、アミド結合を他の部分で置き換えることによりペプチドに由来すると考えることができる。その結果、化合物は、プロテアーゼによる分解に感受性が低いことが予想される。アミド結合の修飾はまた、親油性、水素結合能力、および立体構造の柔軟性などの他の特徴に影響を及ぼし、これらは好ましい場合には、化合物の薬理学的および／または製薬上のプロファイルの全体的な改善をもたらし得る。
【００３６】
免疫融合分子において用いるのに適するペプチドミメティックは、オリゴ−β−ペプチド（Ｊｕａｒｉｓｔｉ，Ｅ．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ；Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）、ビニロガスペプチド（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（Ｈａｇｉｈａｒｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，１０６７２−１０６７４）、ペプトイド（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２，８９，９３６７−９３７１；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，２６７８−２６８５；Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｗ．＆Ｌｉｓｋａｍｐ，Ｒ．Ｍ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，６９６９−６９７２）；Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｗ．Ｔｈｅｓｉｓ；Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９６；Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１９９８，４，１５７０−１５８０）、オリゴスルホン（Ｓｏｍｍｅｒｆｉｅｌｄ，Ｔ．＆Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．１９９５，３４，５５３−５５４）、ホスホジエステル（Ｌｉｎ，Ｐ．Ｓ．；Ｇａｎｅｓａｎ，Ａ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９８，８，５１１−５１４）、オリゴスルホンアミド（Ｍｏｒｅｅ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１，３２，４０９−４１２；Ｍｏｒｅｅ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，６３８９−６３９２；Ｍｏｒｅｅ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９３，４９，１１３３−１１５０；Ｍｏｒｅｅ，Ｗ．Ｊ．Ｔｈｅｓｉｓ；Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９４；Ｍｏｒｅｅ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，５１５７−５１６９；ｄｅ  Ｂｏｎｔ，Ｄ．Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９６，６，３０３５−３０４０；ｄｅ  Ｂｏｎｔ，Ｄ．Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，４，６６７−６７２；Ｌｏｗｉｋ，Ｄ．Ｗ．Ｐ．Ｍ．Ｔｈｅｓｉｓ；Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９８）、ペプトイドスルホンアミド（ｖａｎ  Ａｍｅｉｊｄｅ，Ｊ．＆Ｌｉｓｋａｍｐ，Ｒ．Ｍ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２０００，４１，１１０３−１１０６）、ビニロガススルホンアミド（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ  ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）（Ｇｅｎｎａｒｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２４３７−２４４９）、アザチド（ａｚａｔｉｄｅ）（またはヒドラジノペプチド）（Ｈａｎ，Ｈ．＆Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，２５３９−２５４４）、オリゴカーバメート（Ｐａｉｋｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，５６５３−５６５６；Ｃｈｏ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６１，１３０３−１３０５）、��レアペプトイド（ｕｒｅａｐｅｐｔｏｉｄ）（Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９７，３８，５３３５−５３３８；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．＆Ｎｏｗｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，６６１３−６６１６）、およびオリゴピロリノン（Ｓｍｉｔｈ  ＩＩＩ，Ａ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，１０６７２−１０６７４）などのアミド結合代用物である。しかし、他のペプチドミメティックを用いてもよいことが理解される。
【００３７】
いかなるアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失、またはペプチドミメティックの使用も、５Ｔ４抗原結合性部分の親和性もしくは特異性、またはＲＮａｓｅ部分の細胞毒性を実質的に低減しないことが好ましい。アミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有する免疫融合分子、または５Ｔ４抗原結合性部分におけるペプチドミメティックが、非修飾の５Ｔ４抗原結合性部分を有する免疫融合分子に比べて、５Ｔ４抗原に結合する親和性または特異性の、７５％を超え、好ましくは８０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは９０％を超え、または好ましくは９５％を超えて保持することが好ましい。加えて、アミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有する免疫融合分子、またはＲＮａｓｅ部分におけるペプチドミメティックが、非修飾のＲＮａｓｅ部分を有する免疫融合分子に比べて、細胞毒性活性の、７５％を超え、好ましくは８０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは９０％を超え、または好ましくは９５％を超えて保持することが好ましい。
【００３８】
本発明者らは、抗５Ｔ４免疫融合分子をコードする核酸配列を発現させるための発現系をさらに提供する。この発現系が１つまたは複数の制御配列を含むことが好ましい。発現系は、（１）「制御領域」、または遺伝エレメント、または遺伝子発現において制御的役割を有するエレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造上の、またはコード配列、ならびに（３）適切な転写開始配列および終結配列、のアセンブリを含む転写単位を含むことができる。真核生物の発現系における使用を意図する構造単位は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列またはシグナル配列を含むことができる。当業者であれば、免疫融合分子をコードするポリヌクレオチド配列は、選ばれた発現系または生物体において成熟タンパク質を発現させるように改変することができることをさらに理解されよう。
【００３９】
発現系が、選択マーカー（例えば、抗生物質、抗真菌薬、または除草剤に対する抵抗性）、ＤＮＡの挿入に適する制限酵素の部位を含む複数のクローニング部位をコードするポリヌクレオチド配列を含むことが好ましく、細胞／宿主系が誘導系であることが好ましいＣｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４９，４７３−４８０；Ｐａｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３４９（１）：２３−８）。発現ベクターはプラスミドであってもよい。
【００４０】
本発明者らは、免疫融合分子をコードするポリヌクレオチドを含むように形質転換された宿主細胞をさらに提供する。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物もしくは植物細胞などの高級真核生物の宿主細胞、酵母細胞などの下級真核生物宿主細胞であってよく、または昆虫細胞であってよく、または宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞などの原核細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＨＥＨ、またはＢＨＫ細胞であってもよい。「形質転換」の語は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）によって記載される方法などのあらゆる適切な方法に従って、ＤＮＡが染色体外のエレメントとして、または染色体組込みによってのいずれかで複製できるように、ＤＮＡを適切な宿主細胞中に導入することを意味する。加えて、宿主細胞を、導入されたポリヌクレオチドがコードするペプチドを発現するように遺伝子操作してもよく、ポリヌクレオチドは、細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞に異種性である制御配列に作動的に関連している。
【００４１】
好ましい宿主細胞および発現系は、「ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）」と通例呼ばれる、単子葉植物のウキクサ（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）科のメンバーを利用する。ウキクサ植物またはウキクサ根粒培養物は、アグロバクテリウム媒介性遺伝子移入、衝撃照射（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、または電気穿孔を含めた数々の方法のいずれか１つによって、５Ｔ４標的化免疫融合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットで、効率的に形質転換することができる。安定なウキクサの形質転換体は、対象のヌクレオチド配列および選択剤に対する抵抗性を付与する遺伝子の両方で、ウキクサ細胞を形質転換し、引き続き形質転換した細胞を、選択剤を含む培地中で培養することにより、単離することができる。米国特許第７，６３２，９８３号、第６，８１５，１８４号、および米国特許公開第２０１０／００４３０９９号を参照されたい。
【００４２】
ウキクサ植物培養物またはウキクサ根粒培養物において免疫融合分子を生成する方法は、（ａ）ウキクサ培養培地内でウキクサ植物培養物またはウキクサ根粒培養物を培養するステップであって、ウキクサ植物培養物またはウキクサ根粒培養物が１つまたは複数の免疫融合ペプチド配列を発現するように安定に形質転換されている、ステップと、（ｂ）免疫融合ペプチドをウキクサ培養培地から回収するステップとを含むことができる。いくつかの例において、免疫融合分子は、免疫融合分子のコード配列と、作動可能に連結している、培養培地中への免疫融合ペプチドの分泌を指示するシグナルペプチドのコード配列とを含むヌクレオチド配列から発現される。安定に形質転換されるウキクサ植物培養物またはウキクサ根粒培養物は、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ）、ヒメウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｉｓｃｕｌａ）、ナンゴクアアオウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ）、およびイボウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｇｉｂｂａ）からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。
【００４３】
ウキクサ培養物において免疫融合分子を生成する方法のいくつかの例において、５Ｔ４標的化免疫融合分子のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、（ａ）前記ポリペプチドのコード配列の、ウキクサ優先の（ｄｕｃｋｗｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドン、（ｂ）シグナルペプチドのコード配列の、ウキクサ優先のコドン、（ｃ）植物優先の翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列が隣接する翻訳開始コドン、（ｄ）コード配列の上流に挿入される植物のイントロンを含む、作動可能に連結されたヌクレオチド配列、および（ｅ）イボウキクサの、リブロース−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小型サブユニット５Ｂ遺伝子を含む、作動可能に連結しているヌクレオチド配列からなる群から選択される１つまたは複数の属性を有することができる。
【００４４】
安定に形質転換されたウキクサは、発現カセット内に含まれる、本発明者らの免疫融合分子をコードするヌクレオチド配列などの対象のヌクレオチド配列で形質転換することにより得ることができる。発現カセットが、免疫融合分子のペプチド配列をコードする核酸に連結している、転写開始領域を含むことが好ましい。このような発現カセットには、免疫融合分子をコードするポリヌクレオチドの挿入が制御領域の転写制御下にある、複数の制限部位が提供され得る。特定の例において、形質転換しようとする核酸は、その各々が少なくとも１つの免疫融合分子をコードする、２つ以上の発現カセットに含まれてもよい。例えば、１つの発現カセットは、５Ｔ４抗原結合性部分、および免疫融合分子のＲＮａｓｅ部分をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、第２の発現カセットは、免疫融合分子の発現において助けとなるタンパク質をコードする遺伝子を含む。このようなタンパク質の一例は、免疫融合分子の酵素切断を阻害する一方、宿主細胞中に存在するタンパク質であってもよい。あるいは、複数の発現カセットを提供してもよい。
【００４５】
ウキクサおよび他の発現系における発現に、あらゆる適切な、知られているプロモーター（細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、植物のプロモーターなどを含む）を用いることができる。例えば、ウキクサのプロモーターを含めた植物のプロモーターを用いてもよい。例示的なプロモーターには、それだけには限定されないが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オパイン合成酵素プロモーター（例えば、ｎｏｓ、ｍａｓ、ｏｃｓなど）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスリン酸（ＲｕｂＰ）カルボキシラーゼ小型サブユニットプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが含まれる。ウキクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小型サブユニットプロモーターは、当技術分野では知られている（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９）。限定はされないが、タロイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えば、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５）、トマト黄化壊疽ウイルス（ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）、タバコ茎壊疽ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｒａｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、タバコ壊死ウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ラッカセイスタンプウイルス（ｐｅａｎｕｔ  ｓｔｕｍｐ  ｖｉｒｕｓ）、アルファルファモザイクウイルス、サトウキビ桿状バドナウイルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｂａｃｉｌｉｆｏｒｍ  ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）などから単離されるプロモーターを含めた、植物、好ましくはウキクサに感染するウイルスからの他のプロモーターも適切である。
【００４６】
プロモーターは、所望のレベルの制御を与えるように選択することもできる。例えば、いくつかの場合には、構成的発現を授けるプロモーターを使用することが有利であり得る（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのマンノピンシンターゼプロモーター）。あるいは、他の場合には、特定の環境刺激に応答して活性化されるプロモーター（例えば、熱ショック遺伝子プロモーター、乾燥誘導性遺伝子プロモーター（ｄｒｏｕｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、病原体誘導性遺伝子プロモーター（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、傷誘導性遺伝子プロモーター（ｗｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、および明／暗誘導性遺伝子プロモーター（ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）、または植物成長調節物質（例えば、アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｓｉｃ  ａｃｉｄ）、オーキシン、サイトカイニン、およびジベレリン酸によって誘発される遺伝子からのプロモーター）の使用が有利であり得る。さらなる代替として、組織特異的発現を与えるプロモーター（例えば、根、葉、および花に特異的なプロモーター）を選ぶことができる。
【００４７】
概して、転写カセットには、植物において機能的な、５’−３’方向の転写、転写および翻訳の開始領域、対象のヌクレオチド配列、ならびに転写および翻訳の終結領域が含まれ得る。あらゆる適切な、知られている終結配列を用いることができる。終結領域は、転写開始領域に固有であってよく、対象のヌクレオチド配列に固有であってよく、または別の供給源に由来してもよい。例示的な終結領域は、オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終結領域など、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉ−プラスミドから入手できる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１；およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９６２７も参照されたい。付加的な、例示的な終結配列には、エンドウマメのＲｕｂＰカルボキシラーゼ小型サブユニット終結配列およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ終結配列がある。他の適切な終結配列は当業者であれば明らかである。
【００４８】
一般的に、発現カセットは、形質転換した細胞または組織を選択するための選択マーカー遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質の抵抗性をコードする遺伝子、ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は一般的に、除草剤に対して非感受性の修飾された標的タンパク質をコードし、または植物で除草剤が作用することができる前に除草剤を分解または解毒する酵素をコードする。ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３；ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９１；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３；およびＦｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：４０５−９を参照されたい。例えば、グリホスフェート（ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはスルホニル尿素の除草剤に対する抵抗性は、変異の標的酵素である５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）およびアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子を用いて得られている。グルホシネートアンモニウム、ボロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒する、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を用いることによって得られている。
【００４９】
免疫融合分子をコードするヌクレオチド配列を修飾して、ウキクサまたは他の宿主細胞におけるその発現を増強してもよい。上記に述べた通り、このような修飾の１つは、ウキクサ優先のコドンを用いた対象のヌクレオチド配列の合成である。植物優先のコドンでヌクレオチド配列を合成するための方法を利用できる。例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号；Ｐｅｒｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １５：３３２４；Ｉａｎｎａｃｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４８５；およびＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：４７７を参照されたい。優先の（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンは、ウキクサで発現されるタンパク質において最高頻度のコドンから決定してもよい。ウキクサおよび他の単子葉植物で発現するために修飾されている遺伝子を、本発明者らの方法で用いることができることが認められる。例えば、参照により本明細書に援用される、ＥＰ０３５９４７２、ＥＰ０３８５９６２、ＷＯ９１／１６４３２；Ｐｅｒｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３２４；Ｉａｎｎａｃｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：４８５；およびＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７などを参照されたい。ヌクレオチド配列の全てまたはあらゆる部分を修飾してもよく、または合成でもよいことがさらに認められる。換言すると、完全に修飾された、または部分的に修飾された配列も用いることができる。例えば、コドンの、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの間のあらゆる量が修飾されたコドンであってもよい。一例において、コドンの９０％から９６％の間が修飾されたコドンである。
【００５０】
本開示の免疫融合分子をコードする適切なＣＨＯ修飾されているポリヌクレオチド配列は、配列番号１０９によるものであってもよい。図９Ａから図９Ｃは、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ−ポリＥ構築物（配列番号１０９）をコードするポリヌクレオチドの模式図を示す。図に示す通り、ポリヌクレオチド１からポリヌクレオチド６２はシグナル配列をコードし、ポリヌクレオチド６３からポリヌクレオチド８３３（灰色背景で示す）は５Ｔ４  ｓｃＦｖをコードし、ポリヌクレオチド８３４からポリヌクレオチド８４０はリンカー配列をコードし、ポリヌクレオチド８４１からポリヌクレオチド１５３６（灰色背景で示す）はＦｃ領域をコードし、ポリヌクレオチド１５７２からポリヌクレオチド１５８３（灰色背景で示す）は第１のＣａｔＢ配列をコードし、ポリヌクレオチド１５８４からポリヌクレオチド１９６０はＨＰＲＮ  ＲＮａｓｅをコードし、ポリヌクレオチド１９６３からポリヌクレオチド１９７４（灰色背景で示す）は第２のＣａｔＢ配列をコードし、ポリヌクレオチド１９７５からポリヌクレオチド２１１８はポリＥテールをコードする。コードされたタンパク質を配列番号１１３に示す。
【００５１】
コドン修飾された配列は、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）などのソフトウエアプログラムの使用を含めた、当技術分野では知られているあらゆる方法によってデザインすることができる。適切なポリヌクレオチドは、配列番号１１０から配列番号１１２によるポリヌクレオチドも含む。
【００５２】
加えて、細胞からの免疫融合タンパク質の分泌を促進するために、免疫融合ペプチドをコードするヌクレオチドは「シグナルペプチド」をコードしてもよく、シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）の膜上の受容体タンパク質と相互作用して、細胞から分泌されるように、膜を横切って、小胞体中へのポリペプチド鎖の転位置を指示する。このシグナルペプチドは、前駆物質のポリペプチドから切断されて、シグナルペプチドを欠く「成熟」ポリペプチドを生成することが好ましい。よって、一例において、生物学的に活性なポリペプチドは、ウキクサにおいて、培養培地中へのポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結しているヌクレオチド配列から発現される。（細胞の外に分泌されるように）小胞体へのタンパク質の転位置を標的化する、植物のシグナルペプチドは、当技術分野では知られている。例えば、Ｌｅｅらへの米国特許第６，０２０，１６９号を参照されたい。あらゆる植物のシグナルペプチドを用いて、ＥＲへのポリペプチド発現を標的化することができる。いくつかの例において、シグナルペプチドは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）塩基性エンドキチナーゼシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＢＡＡ８２８２３のアミノ酸１４〜３４）、エクステンシンシグナルペプチド（Ｓｔｉｅｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：７８５−７９３）、またはイネのアルファ−アミラーゼシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＡＡＡ３３８８５のアミノ酸１〜３１）である。別の一例において、シグナルペプチドは、分泌されたウキクサタンパク質のシグナルペプチドに対応してもよい。あるいは、哺乳動物のシグナルペプチドを用いて、分泌用に遺伝子操作された宿主細胞で発現された組換えポリペプチドを標的化することができる。シグナルペプチドの一例（例えば、ＥＲ局在化シグナル）はＫＥＤＬ（配列番号３）である。
【００５３】
安定に形質転換されたウキクサは、参照により本明細書に援用される、Ｓｔｏｍｐらへの米国特許第６，０４０，４９８号に開示されている遺伝子移入法などのあらゆる知られている方法によって得ることができる。これらの方法には、対象のヌクレオチド配列を含む核酸でコーティングした微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）での衝撃照射による遺伝子移入、電気穿孔による遺伝子移入、および対象のヌクレオチド配列を含むベクターを含むアグロバクテリウムが媒介する遺伝子移入が含まれる。一例において、安定に形質転換されたウキクサは、Ｓｔｏｍｐらへの米国特許第６，０４０，４９８号に開示されているアグロバクテリウム媒介性の方法のいずれか１つによって得られる。用いるアグロバクテリウムは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）であってもよい。
【００５４】
安定に形質転換されたウキクサ植物はまた、葉緑体の形質転換によって得てもよい。例えば、「ウキクサの葉緑体形質転換」という表題の、２００３年８月１日出願の米国仮特許出願第６０／４９２，１７９号を参照されたい。安定に形質転換されたウキクサ株はまた、植物ウイルス発現ベクターを用いて生成してもよい。例えば、米国特許第６，６３２，９８０号ならびにＫｏｐｒｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｙｕｓｉｂｏｖ（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７３５−２７４１を参照されたい。
【００５５】
実質的に純粋な免疫融合タンパク質を生成する方法は、適切な培養培地中で細胞の培養物を増殖させるステップと、培養物からタンパク質を精製するステップとを含むことができる。例えば、本方法には、ポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを含む宿主細胞を、コードしたポリペプチドを発現させる条件下で培養する、ポリペプチドを生成するプロセスが含まれる。ポリペプチドは、培養物から、便利にはタンパク質が宿主細胞から引き続き培養培地中に分泌される場合は培養培地から、回収することができ、さらに精製することができる。結果として得られた、発現されたタンパク質は、例えば、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの知られている精製プロセスを用いて、このような培養物から（すなわち、培養培地または細胞抽出物から）精製してもよい。
【００５６】
本発明者らは、５Ｔ４抗原の発現が関与する疾患または障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者または動物に、単一のペプチド鎖中に５Ｔ４抗原結合性部分およびＲＮａｓｅ部分を含む免疫融合分子の治療有効量を含む治療用組成物を投与するステップを含む方法も提供する。５Ｔ４抗原の発現に関連する疾患には、それだけには限定されないが、例えば、乳房、膀胱、子宮頸部、結腸直腸、子宮内膜、胃、頭部および首、肝臓、肺、卵巣、膵臓、腎臓、および前立腺の癌腫などの、癌腫および固形腫瘍の癌が含まれる。好ましい例には、本開示の免疫融合分子を膀胱癌または前立腺癌に罹患している患者に投与することにより、膀胱癌および前立腺癌を処置する方法が含まれる。
【００５７】
このような免疫融合タンパク質を含む治療用組成物の投与は、例えば、皮下、皮内、腹腔内、または静脈内の経路により、吸入、腫瘍内注射、膀胱内点滴、またはあらゆる他の適切な経路により実行することができる。
【００５８】
このような治療用組成物は、（成分および担体に加えて）希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定化剤、可溶化剤、および他のよく知られている材料も含むことができる。「薬学的に許容される」の語は、有効成分（複数可）の生物学的活性の有効性を妨害しない、非毒性の材料を意味する。担体の特徴は、投与経路に依存する。治療用組成物は、処置における活性または使用のいずれかを増強する他の薬剤をさらに含むことができる。このような付加的な因子および／または薬剤が、相乗効果を生成し、または副作用を最小にするために、治療用組成物に含まれてもよい。
【００５９】
医薬組成物は無菌であることが好ましい。医薬組成物は、少なくとも１つの免疫融合分子に加えて、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有することが好ましい。適切な薬学的に許容される担体には、水（例えば、注射用無菌水）、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの食塩水溶液、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、または他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張度を調整するための薬剤、安定化剤または保存剤、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびクエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピルパラベンクロロブタノール、ならびにこれらの組合せが含まれる。
【００６０】
本発明者らの化合物を調合および投与するための技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。組成物は、それぞれの成分の治療有効量または用量を含む。治療有効用量は、症状の改善、例えば、このような症状の処置、治癒、または改善をもたらすのに十分な化合物の量を意味する。用量は、医師の技術の十分な範囲内であるように、使用する免疫融合分子の性質、例えば、免疫融合分子の活性および生物学的半減期、免疫融合分子の製剤中の濃度、投与の部位および速度、関与する患者の臨床上の認容性、患者が罹患している癌の程度などに依存する。医師は、個々の患者に最も適し、年齢、体重、および特定の患者の応答で変動する、実際の投与量を決定することができる。もちろん、より高投与量または低投与量の範囲が値する、個々の場合が存在し得る。単一の日または数日のいずれかにわたって治療有効用量の、免疫融合分子を含む治療用組成物を投与してもよい。一般的に、免疫融合分子を含む治療用組成物をホストに直接、または全身的に投与する場合は、ホストの体重あたり、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より通常的に約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の注入を投与することができる。
【００６１】
加えて、本発明者らは、免疫融合分子を含む治療用組成物を膀胱内点滴する方法を提供する。膀胱内点滴は、免疫融合分子を含む治療用組成物を、一般的には尿道カテーテルによって、膀胱中に直接投与することを含む。治療用組成物が一般的に、「滞留時間（ｄｗｅｌｌ  ｔｉｍｅ）」の間、膀胱に維持された後、膀胱を排水し、または空にする。この手順により、膀胱壁を高濃度の免疫融合分子で直接処置できるようになる。膀胱点滴技術は知られている。ＵＳ７，０２５，７５３、ＵＳ７，６７１，０２６、ＵＳ６，６３０，５１５、およびＵＳ４，８７１，５４２を参照されたい。
【００６２】
本発明者らは、併用治療の方法をさらに提供する。このような方法では、免疫融合分子を、化学療法剤と併用して患者に投与することができる。例えば、本発明者らの免疫融合分子を、１つまたは複数の化学療法剤と同時に、またはこれと同じ注入もしくは点滴で投与することができる。あるいは、本発明者らの免疫融合分子を、化学療法剤が患者の身体中で活性である間に、化学療法剤と別々に、または別々の投与技術によって投与してもよい。併用治療に適する化学療法剤には、それだけには限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、シタラビン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ベンダムスチン、パクリタキセル、ドシタキセル（ｄｏｃｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル、フルオロウラシル、イマチニブメシレート、デュオカルミシン、イリノテカン、ビンブラスチン、スニチニブ、トポテカン、カリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチン、チューブリシン、およびこれらの類似体からなる群から選択される少なくとも１つ、ならびに癌患者における使用に認可された多様な他の標的化治療が含まれ得る。化学療法剤は、抗体薬物コンジュゲートにおいて、または当技術分野において知られている他の標的化治療によって投与することができる。
【００６３】
細胞毒性薬剤として働くことに加えて、ＨＰＲＮは、癌細胞の化学療法に対する感受性を増大することが見出されている。したがって、ＨＰＲＮおよび化学療法剤を併用治療として含む免疫融合分子の投与により、免疫融合分子または化学療法剤のいずれかを単独で投与するよりも、癌性腫瘍の増殖またはサイズを低減し得る。
【実施例】
【００６４】
以下の非限定的な実施例は、本発明者らの免疫融合分子を作成および使用するための方法を記載するものである。
【００６５】
実施例１：合成構築物の産生（抗原および免疫融合分子）
全てのタンパク質をコードする遺伝子を、ＣＨＯ細胞における発現を増強するためにコドン修飾した。合成のコード配列を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国の、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）遺伝子合成プラットホームを用いて、標準的な分子生物学方法によって組み立てた。表１は、発現用に合成した遺伝子を列挙するものである。
【００６６】
【表１】
2016531088.tif 000003
【００６７】
ｐＯｐｔｉＶＥＣ  ＴＯＰＯ  ＴＡおよびｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国から入手した。ｐＴＴ５およびｐＴＴ２２発現ベクターは、カナダの国立学術研究会議（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）（ＮＲＣ）から認可されたものであった。試験で使用した制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ  Ｇｅｎｅｉ、インドから入手した。構築物の配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国からのＢｉｇ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１サイクルシーケンシングキットを用いて行った。Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ、米国）、およびＰｌａｓｍｉｄ  ｍｅｇａキット、およびｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を、様々なスケールのプラスミド調製に用いた。Ｇｅｎ  ｅｌｕｔｅ  ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｓｉｇｍａ、米国）を、ＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製するのに用いた。クローニングに用いた大腸菌Ｏｍｎｉｍａｘ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国から入手した。遺伝子のクローニングに用いた方法は全て、製造元の指針に基づくものであった。特に言及しなければ、標準的な分子生物学のプロトコール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．）に従った。
【００６８】
ＨＥＫ２９３細胞における一過性の発現にはｐＴＴ５、および安定なＣＨＯ細胞株の産生にはｐＯｐｔｉＶＥＣ  ＴＯＰＯの、２つのベクターにおける細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｆｃ融合形態として、コドン修飾した抗原の配列をクローニングした。５Ｔ４をコードする遺伝子を、安定な細胞株を産生するために、ｐＴＴ２２およびｐＣＤＮＡ３ベクター中にクローニングした。コドン修飾した免疫融合分子を、一過性の、安定な発現のために、それぞれｐＴＴ５およびｐＯｐｔｉＶＥＣ  ＴＯＰＯベクターにクローニングした。
【００６９】
クローニングベクター（複数可）を、所望により、および必要に応じ、大腸菌ＤＨ５αまたはＯｍｎｉｍａｘ細胞中で繁殖させた。ｐＴＴ５ベクターを、Ｘｂａ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限酵素を用いて消化し、ベクターの骨格を、製造元のプロトコールに従ってゲル溶出カラム（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて精製し、抗原ＥＣＤ−Ｆｃ遺伝子および免疫融合分子の両方を引き続きクローニングするのに用いた。構築物を全て、大腸菌ＤＨ５α株またはＯｍｎｉｍａｘ株において形質転換し、ＬＢアンピシリン寒天平板上に塗抹し、引き続き３７℃で１６時間インキュベートした。陽性のコロニーを、遺伝子特異的なプライマーを用いてコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。無作為に選択したＰＣＲ陽性のコロニーをＬＢアンピシリンブロスに接種し、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐカラム（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いてプラスミドＤＮＡ単離を行った。単離した組換えプラスミドを、Ｘｂａ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ酵素での制限消化にかけた。制限陽性のクローンを、双方向配列決定（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。
【００７０】
全長（ＦＬ）の５Ｔ４（５Ｔ４−ＦＬ）抗原の遺伝子を、制限酵素Ｘｂａ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉを用いて、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ベクターからｐＯｐｔｉＶＥＣベクターまでサブクローニングした。陽性のクローンを、制限消化分析によって検証し、上記に記載した通りに配列決定した。
【００７１】
ｐＴＴ２２ベクター中にサブクローニングするために、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／５Ｔ４−ＦＬをＸｂａＩ−ＮｏｔＩ制限酵素を用いて消化し、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ消化したｐＴＴ２２にライゲーションした。ｐＣＤＮＡ３．１ベクター中にサブクローニングするために、ｐＴＴ２２／ＦＬ  ５Ｔ４をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、遊離インサートを、同一の酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１にライゲーションした。構築物を全て配列決定し、あらゆる変異の非存在を確認した。
【００７２】
実施例２：Ｃ末端Ｇｌｕリッチ（ポリＥ）テールの産生
ポリグルタメートテール（ポリＥ）を、タンパク質のＣ末端に加えた。Ｇｌｕリッチテールは以下の通りにデザインされていた。
ＶＨＦＤＡＳＶＥＤＳＴＧＬＦＲＥＥＥＥＥＥＡＳＳＳＳＳＥＥＡＥＥＡＳＳＳＳＳＡＥＥＥＥＧＡＳＳＳＥＥＥＡＳＳＳＳＡＥＥＥＥＥＧ（配列番号９９）
【００７３】
構築物に細胞内のタンパク質分解性のプロセシングを受けさせてポリＥタグを放出させるために、ＣａｔＢアミノ酸配列ＧＬＦＲ（配列番号１００）をＨＰＲＮおよびポリＥタグの接合部に挿入した。
【００７４】
オーバーラッピングプライマーを用いたアセンブリＰＣＲ法によって、ポリＥフラグメントをコードするＤＮＡを合成した。精製したＰＣＲ生成物をＴ／Ａベクター中にクローニングし、引き続き配列を確認した。このフラグメントを、オーバーラッピングＰＣＲ法によって免疫融合分子のＣ末端に付着させた。ポリＥテールを有する免疫融合分子の最終的なＰＣＲ生成物を、上記に記載した制限消化およびライゲーションベースの方法によって、ｐＴＴ５またはｐＯｐｔｉＶＥＣベクター中のＸｂａＩ／ＮｏｔＩ部位の間にクローニングした。
【００７５】
図３から図５は、以下の実施例で作成および試験した抗５Ｔ４免疫融合構築物のデザインの模式図である。図３は、例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ構築物のデザイン（配列番号１０１）の模式図である。図４は、例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ構築物のデザイン（配列番号１０２）の模式図である。図５は、例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ−ポリＥ構築物のデザイン（配列番号１０３）の模式図である。
【００７６】
実施例３：タンパク質発現のための一過性トランスフェクション
ｐＴＴは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のｏｒｉＰを、改善されたサイトメガロウイルスベースの発現カセットと一緒に含んでいる。発現ホストとして用いたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞株は、多コピーのエピソームとしてトランスフェクトしたプラスミドの維持を助けるＥＢＮＡ−１タンパク質の切断されたバージョンを抱え持つ。
【００７７】
ＥＢＮＡベースの一過性タンパク質発現系は、カナダのＮＲＣ（国立学術研究会議）から認可されたものであった。ＰＥＩは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、米国から入手した。他の試薬および培地は全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国から入手した。
【００７８】
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の効率を、トランスフェクション剤としてＰＥＩとともにＧＦＰ発現ベクターを用いたトランスフェクションによって決定した。試験の結果に基づき、抗原および抗体−Ｆｃ融合タンパク質の両方を、ＤＮＡ：ＰＥＩ比１：３を用いて細胞密度１．５×１０６細胞／ｍｌのＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞株において、トランスフェクトした。フラスコを、軌道を描く振盪速度１００ＲＰＭで、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションを生存性に対してモニタリングし、タンパク質発現を、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００  ＨＰＬＣに装着したＰＡ免疫検出センサーカートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、分析用プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いて決定した。
【００７９】
実施例３：タンパク質の精製
高流動性アガロースのベースマトリクスを有するＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）培地を用いて、アフィニティクロマトグラフィーによりＦｃ融合タンパク質を精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔマトリクスを、充填層（ｐａｃｋｅｄ  ｂｅｄ）体積１０ｍｌのＸＫ１６／２０ＣＯＬＵＭＮ（ＧＥ）に充填した。カラムを、予め冷却したバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡にした。カラムに適用する前に、収集した培養物上清のｐＨを７．４（すなわち、バッファーＡのｐＨ）に調整した。培養物上清を、予め平衡にしたカラムを通過させ、通過した流動物（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を別々に回収した。カラムをバッファーＡで洗浄して、非結合のタンパク質および他のゆるく結合している不純物を除去した。
【００８０】
結合しているタンパク質を８０ｍＭ酢酸で溶出し、溶出した分画を、溶出後直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＞１０）で中和した。溶出したタンパク質を濃縮し、バッファーを、カットオフ３０ｋＤａのａｍｉｃｏｎコンセントレータ（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて、バッファーＡ＋１０％グリセロールに交換した。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ、およびＢＩＡｃｏｒｅによって分析した。
【００８１】
実施例４：安定な細胞株の産生
安定な細胞株を２タイプ産生した。抗原および抗体−Ｆｃ融合タンパク質を、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞において作成した。全長の５Ｔ４を用いて、癌細胞株ＭＤＡ  ＭＢ２３１において安定な細胞株を産生した。
【００８２】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国から入手したｃＧＭＰ保存（ｂａｎｋｅｄ）ＤＧ４４細胞（８継代、バイアル２５３）をトランスフェクションに用いた。ＤＧ４４細胞のトランスフェクションの前に、抗原および抗体構築物を、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ、米国）を用いて直線化し、精製した。ＤＧ４４細胞を、完全ＤＧ４４培地１００ｍｌ中３×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で新たに播種し、Ｅｒｌｅｎ  Ｍｅｙｅｒフラスコを、軌道を描く振盪速度１３０〜１３５ＲＰＭで、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００８３】
トランスフェクションの１日前、ＤＧ４４細胞を、播種密度３×１０５細胞／ｍｌで分割した。トランスフェクション当日、生存細胞数を決定し、生存細胞１．５×１０７を、ＣＤ  ＤＧ４４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）３０ｍｌを含む新鮮なＥｒｌｅｎ  Ｍｅｙｅｒフラスコにおける各々のトランスフェクションに用いた。ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国からの無血清の、動物起源を含まない培養培地）１．２ｍｌに、直線化した組換えプラスミドＤＮＡ１８μｇおよびＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国からのトランスフェクション試薬）１５μｌを加え、穏やかに混和した。ＤＮＡ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ混合物を室温で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ試薬複合体を形成させた。次いで、この複合体を、ＤＧ４４細胞を含む１２５ｍｌ  Ｅｒｌｅｎ  Ｍｅｙｅｒフラスコ中にゆっくりと加えた。トランスフェクトした細胞を、１３０〜１３５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカープラットホーム上、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間後、細胞を、ＨＴを欠くＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ培地中に通した。２日ごとに新鮮な培地の交換を行い、培養物を２０日間、ＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  ＨＴ欠損培地で増殖させた。細胞を毎日、生存性に対してモニタリングした。
【００８４】
組換え細胞の遺伝子増幅を、メトトレキセートを用いて行った。１ｍＭメトトレキセート水和物保存物（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて、ＨＴを欠くＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ培地中で増殖させたＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。細胞を遠心沈殿し、２５０ｎＭ  ＭＴＸを含むＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ培地３０ｍｌ中Ｅｒｌｅｎ  Ｍｅｙｅｒフラスコ中３×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。フラスコを、軌道を描く振盪速度１３０〜１３５ＲＰＭで、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、増殖および生存性に対して毎日モニタリングし、週に少なくとも２〜３回培地の交換を行った。ＭＴＸ抵抗性細胞集団の選別を２１日間行い、タンパク質の発現を、最終日に分析用プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いて分析した。２５０ｎＭ  ＭＴＸで選択した細胞を、製造元の指示に従って、濃度５００ｎＭの次ラウンドのメトトレキセート媒介性増幅に継代した。
【００８５】
５Ｔ４−ＦＬを発現する組換え癌細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのバイオアッセイおよび異種移植試験に陽性対照として用いるために開発した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、通常のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で固有の低レベルの５Ｔ４を発現するため、組換え５Ｔ４−ＦＬクローンを産生するために選択した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ、米国）を、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補ったＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００８６】
選択した濃度の２つの抗生物質選択マーカー（Ｇ４１８およびピューロマイシン）を、死滅曲線（ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ）アッセイによって別々に同定した。Ｇ４１８およびピューロマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国から入手した。
【００８７】
ｐｃＤＮＡ３．１（Ｇ４１８）中５Ｔ４−ＦＬおよびｐＴＴ２２（ピューロマイシン）中５Ｔ４−ＦＬをコードする２つの組換えプラスミドを、ｍａｘｉ  ｐｒｅｐプラスミド抽出キット（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて産生した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、別々の６ウエルプレート中５×１０５細胞／ウエルの播種密度で播種し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。トランスフェクションを、製造元のプロトコールを用いて、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ、米国）を用いて行った。平行のトランスフェクションを、ＤＮＡ：Ｆｕｇｅｎｅ６比それぞれ１：３および５：２を用いて各５Ｔ４−ＦＬ構築物に対して行った。４８時間後、細胞を、８００μｇ／ｍｌ（Ｇ４１８）または０．３μｇ／ｍｌ（ピューロマイシン）いずれかで処理した。培地を２〜３日ごとに交換して、抗生物質の選択を１５〜２０日間行った。クローニングディスク（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて単一のクローンを拾い、徐々に拡大した。５Ｔ４−ＦＬの発現を、フローサイトメトリーによって確認した。
【００８８】
実施例５：フローサイトメトリー
様々な癌細胞株からの細胞懸濁液のマルチパラメータ解析を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｒｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗５Ｔ４ヒト化ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）融合タンパク質をプローブとして用いて行った。免疫融合タンパク質の滴定を行って、ＭＤＡＭＢ２３１過剰発現性５Ｔ４抗原における細胞表面上の５Ｔ４抗原を飽和するのに必要とされる免疫融合タンパク質の濃度を決定した。
【００８９】
５Ｔ４過剰発現性組換えＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、抗５Ｔ４  ＨＰＲＮ免疫融合タンパク質および抗５Ｔ４  ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫融合タンパク質を滴定するのに用いた。指数関数的に増殖する細胞を、０．５ｍＭ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーを用いて培養フラスコから剥離した。細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間、１％ＢＳＡ−１×ＰＢＳ中抗５Ｔ４  ｈｕ  ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは非関連のＦｃ融合タンパク質（０．０００５から１００μｇ／ｍｌ）のいずれかとインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、抗Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ抗体と４０℃で４５分間インキュベートした。抗Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ抗体をインキュベートした後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｒｅ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。試料に対する蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を決定した。野生型の癌細胞を分析するために、５μｇ／ｍｌ抗５Ｔ４  ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃを用い、上記の通り細胞を処理加工した。各試料に対する蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を決定し、比較した。
【００９０】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性
様々な腫瘍細胞株を用いて、９６ウエルプレートにおいて細胞毒性アッセイを行った。指数関数的に増殖している細胞５０００個を、９６ウエルプレートの各ウエル中、培地１００μｌ中に播種した。２４時間後、細胞を異なる濃度の抗５Ｔ４  ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮまたは抗ＣＤ２２  ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（非結合性の陰性対照）のいずれかで別々に処理した。処理９６時間後、免疫融合タンパク質を含む培地をウエルから除き、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（ＰｒｏｍｅｇａからのＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）５０μｌおよび培地５０μｌを各ウエルに加えた。プレートを２０分間インキュベートし、各ウエルにおける発光を、Ｈｉｄｅｘ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーを用いて読み取った。
【００９１】
実施例７：５Ｔ４の細胞表面発現
細胞表面５Ｔ４抗原を過剰発現する組換えＭＤＡ−ＭＢ−２３１−５Ｔ４  ＦＬを用いて、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃの飽和濃度を決定した。様々な濃度の抗５Ｔ４  ＳｃＦｖＦｃの蛍光強度の中央値に対して、７点の用量反応曲線をプロットした。曲線を図６に示す。特異的な用量依存的な細胞表面結合が、抗５Ｔ４  ｈｕｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮに対して得られ、これは抗５Ｔ４  ｈｕｓｃＦｖ−Ｆｃの細胞表面結合に匹敵した。結合は５μｇ／ｍｌ濃度で飽和した。非関連のＦｃ融合タンパク質の結合は、５μｇ／ｍｌで２００倍低かった（図６）。
【００９２】
様々なタイプの腫瘍に由来する癌細胞株１１個を、５Ｔ４の細胞表面発現に対して評価した（図７Ａ〜７Ｋ）。細胞株は、ＭＤＡＭＢ３６１（図７Ａ）、ＰＣ３（図７Ｂ）、ＰＡ１（図７Ｃ）、Ａ４３１（図７Ｄ）、ＳＫＯＶ３（図７Ｅ）、ＨＴ２９（図７Ｆ）、ＤＬＤ１（図７Ｇ）、ＢｘＰＣ３（図７Ｈ）、ＬｎＣａＰ（図７Ｉ）、Ｒｅｃ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−５Ｔ４（図７Ｊ）、およびＭＢＡ−ＭＢ−２３１（図７Ｋ）であった。癌細胞株における５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を、抗５Ｔ４−ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（灰色線と三角）および非関連の（対照）Ｆｃ融合タンパク質（黒線と丸）をプローブとして用いて得た蛍光のプロファイルを表すヒストグラムによって示す。各株に対する蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を表２に概要する。
【００９３】
【表２】
2016531088.tif 000004
【００９４】
細胞株は全て、５Ｔ４抗原を様々な程度で発現した。ＭＤＡＭＢ３６１、ＢＸＰＣ３、およびＡ４３１が５Ｔ４抗原の最高の発現を示した一方、ＬＮＣａＰおよびＨＴ２９は弱く陽性であった。
【００９５】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性
遺伝毒性を決定するための細胞増殖の検出、および抗癌薬または抗体の評価は、細胞の健康度を評価するための根本的な方法である。存在するＡＴＰ（代謝的に活性な細胞の存在）を定量する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存性アッセイを用いて、培養物中の生存細胞数を決定した。１パネルのヒト癌腫細胞株に対するＨＰＲＮ免疫融合タンパク質の増殖阻害効果に対して調べる場合、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮではなく抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮは、ヒト腫瘍細胞の増殖の用量依存的な阻害を引き起こした（図８Ａ〜８Ｆ）。
【００９６】
組換えＭＤＡ−ＭＢ−２３１−５Ｔ４（図８Ａ）、ＰＣ３（図８Ｂ）、ＤＬＤ１（図８Ｃ）、ＰＡ１（図８Ｄ）、ＳＫＯＶ３（図８Ｅ）、Ａ４３１（図８Ｆ）に対して腫瘍細胞を試験した。フローサイトメトリーによって決定して、これらの腫瘍細胞は各々、その表面上に５Ｔ４を発現することが示された（上記の図７Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＪ）。抗５Ｔ４−ヒト化ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮ（丸）の用量依存的な細胞毒性を、ＡＴＰ  Ｇｌｏ法によって決定した。抗ＣＤ−２２ヒト化ｓｃＦｖ−Ｆｃ（三角または四角）を、陰性対照として用いた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、４パラメータの非線形回帰分析により曲線を産生した。表３は、抗５Ｔ４  ｈｕ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＨＰＲＮの細胞毒性に対する結果を概要するものである。
【００９７】
【表３】
2016531088.tif 000005
【００９８】
実施例８：抗５Ｔ４−ＨＰＲＮ免疫融合タンパク質の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるマウスにおける薬物動態の推定
抗５Ｔ４免疫融合タンパク質の薬物動態学的性質を、ヌードマウスに静脈内注射した後、様々な時間点の血中免疫融合タンパク質濃度を測定することによって推定した。血中抗５Ｔ４  ｓｃＦｖＦｃタンパク質濃度をＢＩＡｃｏｒｅによって推定し、免疫融合タンパク質（抗５Ｔ４  ｓｃＦｖＦｃ  ＨＰＲＮおよびそのバリアント）の濃度を、間接的ＥＬＩＳＡを用いて推定した。これは、免疫融合タンパク質は、抗原結合性ドメインおよびＲＮＡｓｅドメインの２つの機能的なドメインを含む単位であり、ＢＩＡｃｏｒｅ法は抗原結合性ドメインを検出するにすぎないからである。あらゆるＢＩＡｃｏｒｅ検出は抗原結合性ドメインの検出のみを制限するが、薬物動態を正確に推定するには血中のインタクトなＩｍｍｕｎｏＲＮＡｓｅを検出することが望ましい。
【００９９】
ＢＩＡｃｏｒｅ手順では、抗５Ｔ４免疫融合タンパク質の５Ｔ４に対する親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳＰＲ分析によって決定した。簡潔に述べると、製造元が提供する試薬および指示を用いて、精製した５Ｔ４細胞外ドメイン−ヒトＦｃ融合タンパク質を、アミンカップリング法によって、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ上に共有結合性に固定化した。結合試験では、抗５Ｔ４免疫融合タンパク質を、段階希釈して濃度段階にし、固定された期間、固定化した抗原上を流し、引き続きバッファーを流して抗原を解離させた。解離サイクルの終わりに、低ｐＨでチップ表面の再生を行った。得られたセンサーグラムを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させ、会合速度、解離速度、および親和性などの動態学パラメータを推定した。
【０１００】
様々な時間点からのマウス血液を希釈したもの（４０倍が典型的）を表面上に流し、応答を記録した。センサーチップ上を流した、４０倍希釈した非免疫化マウス血液中の濃度段階のタンパク質を用いて、標準曲線を構築した。標準曲線からの内挿によって、未知濃度を計算した。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡ法では、５Ｔ４−ＥＣＤ−Ｆｃ抗原を用いて、希釈したマウス血液（４０倍が典型的）から免疫融合タンパク質を捕捉し、引き続き抗ＲＮＡｓｅ抗体を捕捉した免疫融合タンパク質に結合させる。次いで、抗ＲＮＡｓｅ抗体に反応性である市販の２次抗体を用いて、複合体を検出する。試料と同じＥＬＩＳＡにおける非免疫化マウス血液中の濃度段階の免疫融合タンパク質を用いて、標準曲線を構築する。未知濃度を、標準曲線からの内挿によって計算した。
【０１０２】
非コンパートメントモデルを用いて血中濃度対時間のプロファイルを分析し、半減期、バイオアベイラビリティ、および排出速度などの薬物動態学的パラメータを計算した。
【０１０３】
抗５Ｔ４  ｓｃＦｖＦｃ、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖＦｃ−ＨＰＲＮ、および抗５Ｔ４  ｓｃＦｖＦｃ−ＨＰＲＮポリＥ免疫融合タンパク質を、１０ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇまでの範囲の用量をヌードマウスに（ｎ＝３）静脈内注射した。上記に言及した通り、血中濃度を測定した。
【０１０４】
これらの免疫融合物の薬物動態学的評価の結果を表４に概要する。
【０１０５】
【表４】
2016531088.tif 000006
【０１０６】
実施例９：異種移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の評価
材料
ＢＤ１ｍｌシリンジ（２７  １／２ゲージ）、滅菌培養培地、滅菌リン酸緩衝食塩水、マトリゲル−ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号３５４２４８）、滅菌綿栓、滅菌エッペンドルフ管（１．５ｍＬ、２ｍＬ）、ピペット、ろ紙、７０％アルコール／イソプロピルアルコール、ノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）。使用した他の不可欠なアイテムは全て分析グレードのものであった。
【０１０７】
動物
５〜６週齢の体重２０〜２２ｇのオスおよびメスの胸腺欠損ヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ  Ｆｏｘｎ１ｎｕ）をＨａｒｌａｎ、オランダから得た。動物実験のコントロールおよび監督を目的とする委員会の規則（ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）（ＣＰＣＳＥＡ）、インド政府および国際実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）（ＡＡＡＬＡＣ）のコンプライアンスに従って、動物の世話をした。動物実験を行うための「フォームＢ（ＦｏｒｍＢ）」は、機関動物倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＥＣプロトコール認可第：ＳＹＮＧＥＮＥ／ＩＡＥＣ／１６０／０９、２０１０）により再考および認可されたものであった。
【０１０８】
収容および給餌
動物を、温度２２±３℃、湿度５０±２０％の、各１２時間の明／暗サイクルの制御された環境に維持し、１時間あたり１５〜２０回新鮮な空気に交換した。動物は群ごとに収容し、高圧滅菌したトウモロコシの軸穂を敷き藁材料として用いた。動物に、試験期間の間、認可された照射実験室用齧歯動物食（Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ）を適宜摂食させた。
【０１０９】
動物の準備および動物の識別
動物を、少なくとも５日の期間、実験室中の環境順化下に維持した。動物に個々に番号をつけ、実験、試験番号、腫瘍を移植した日、無作為化した日、腫瘍タイプ、マウス系統、性別、および個々のマウス番号を示すケージカードを、対応するケージに表示した。無作為化後、群の識別、試験化合物、投与量、スケジュール、および投与経路を加えた。
【０１１０】
腫瘍細胞の準備
手順は全て、滅菌技術に従って層流フード中で行った。コンフルエント７０〜８０％および生存率＞９０％の癌細胞（Ａ４３１（類表皮）、ＰＡ−１（卵巣）、ＰＣ−３（前立腺）、およびＬＬＣ（ルイス肺癌細胞））を試験に選択した。理想的には、細胞５×１０６個（Ａ４３１、ＰＡ−１、ＰＣ−３、およびＬＬＣ）を、氷中に維持した５０％マトリゲルを含むＰＢＳまたは無血清培地２００μｌ中に再懸濁した。
【０１１１】
細胞の皮下注射
個別換気ケージ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ  Ｃａｇｅｓ）（ＩＶＣ）に収容したヌードマウス（Ｈｓｄ：胸腺欠損ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を調査に使用した。動物の側腹部または背部に癌細胞を皮下注射することにより、癌細胞株（Ａ４３１、ＰＡ−１、ＰＣ−３、およびＬＬＣ）を動物に繁殖させた。移植したエリアを、腫瘍の増殖に対してモニタリングした。腫瘍が、触知できる必要とされる体積（ＴＶ≒１００〜１５０ｍｍ３）を達成した後、腫瘍体積に基づいて動物を無作為化し、投薬を開始した。無作為化日（０日目）、次いで３日ごとに１回（すなわち、マウスの体重測定をするのと同じ日に）、ノギスで２次元測定することにより腫瘍体積を決定した。ノギスを用いて、腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗまたはｂ）を測定した。腫瘍体積（ＴＶ）を、以下の式を用いて計算した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｌ・Ｗ２／２、
式中、ｌ＝長さ（ｍｍ）、Ｗ＝幅（ｍｍ）。
【０１１２】
一般的に、免疫融合抗体を全て滅菌１×ＰＢＳ中に溶解し、調製した全ての濃度で澄明な溶液が生じた。試験アイテムは投与日に新たに調製し、用量体積を１０ｍｌ／ｋｇ体重に維持した。各群に対して、別個の新しいシリンジおよび針を用いた。
【０１１３】
体重
ケージサイドの観察、体重を、試験期間の間、３日ごとに１回測定した。個々のマウスの体重における％変化を計算した。
【０１１４】
採血
適用０分（適用前）、５分、１５分、３０分、６０分、１８０分、３６０分、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、および１６８時間後に、血液試料およそ５μＬを回収した。各時間点に、尾静脈穿刺により試料を回収し、希釈バッファー（ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ、２ｍｇ／ｍｌ血液）１９５μＬを含む遠心管に直ちに移した。試料を、砕氷を含む箱に直ちに移した。血液試料を４℃で５分間、２５００×ｇで遠心した。得られた上清を新たな管に移しＰＫ分析にかけた。
【０１１５】
抗腫瘍活性
抗腫瘍活性を、最大腫瘍体積阻害対ビヒクル対照群として評価した。Ｇｒａｐｈ  ｐａｄバージョン５統計学的ソフトウエアを用いて、データの評価を行った。
【０１１６】
％における試験／対照値（％Ｔ／Ｃ）
特定日の腫瘍阻害（％におけるＴ／Ｃ）を、試験群対対照群の平均ＴＶ値の比に１００％を乗じたものから計算した。
【数１】
2016531088.tif 000007
【０１１７】
実験の間、特定の試験群に記録された最小の（または最適の）Ｔ／Ｃ％値は、それぞれの処置に対する最大抗腫瘍活性を表す。
【０１１８】
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）
以下の式を用いてＴＧＩを計算した。
ＴＧＩ＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００
式中、Ｔ＝処置群における平均腫瘍体積、Ｃ＝所与の日のビヒクル対照群における平均腫瘍体積。
【０１１９】
臨床徴候：罹患率および死亡率
試験期間の間、３日ごとに１回、目に見える全般的な臨床徴候に対して動物を個々に観察した。動物を全て、罹患率および死亡率に対してチェックした。
【０１２０】
統計学的分析
腫瘍阻害の統計学的有意性を評価するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５を用いて、二元配置のＡＮＯＶＡ、引き続きボンフェローニの事後検定を行った。ｐ値＜０．０５であれば、群間の統計学的有意差が指摘される。
【０１２１】
結果
Ａ４３１皮下異種移植片
抗腫瘍活性
Ａ４３１異種移植片を有するマウスを、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮで処置した（負荷用量：０、２、４、６、および９日目に３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ、引き続き１１、１３、１６、１８、および２０日目に維持用量１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ）。ＩｍｍｕｎｏＲＮａｓｅ治療により、Ａ４３１異種移植片腫瘍モデルに対する中等度の抗腫瘍活性が実証された。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮまたは抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃいずれかの処置により、最適Ｔ／Ｃ値は２０日目にそれぞれ５２．７％および８５．４％となった。試験した用量レベルでの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ群に対する腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）％は４７．３％であることが見出された（２０日目、ｐ＜０．００１）。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ群に対する％ＴＧＩは１４．６４％（２０日目）であり、これは統計学的に有意ではなかった。
【０１２２】
死亡率および体重変化
実験期間の間、ビヒクル対照および抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ処置群に体重の減少は存在しなかった。動物は全て活動的で健康だった。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ治療は、試験した用量レベルで比較的良好に認容され、死亡はなかった。さらに、処置の間、異常行動の目に見える徴候、またはいかなる有害な臨床症状も存在しなかった。
【０１２３】
付加的なＡ４３１皮下異種移植片
抗腫瘍活性
Ａ４３１細胞株での引き続きの異種移植片において、用量３０ｍｇ／ｋｇの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮを、皮下の類表皮癌腫（Ａ４３１）腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにｉ．ｖ；ＱＤｘ１１投与した。第２の試験で使用した投薬レジメンは、より良好な腫瘍増殖阻害をもたらした。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮでの処置により、最適Ｔ／Ｃは１８日目に３６．９％となった。
【０１２４】
死亡率および体重変化
抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮは、試験した用量レベルで比較的良好に認容され、死亡はなかった。実験期間の間、ビヒクル対照および抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に著しい体重の減少は存在しなかった。動物は全て活動的で健康だった。ケージサイドの観察に基づくと、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に、異常行動の目に見える徴候、または臨床症状は存在しなかった。
【０１２５】
ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）皮下異種移植片
抗腫瘍活性
マウスルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）異種移植片を用いて、抗体の特異性を調べた。用量３０ｍｇ／ｋｇの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮを、皮下のＬＬＣ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにｉ．ｖ；ＱＤｘ１０投与した。試験用量の抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮを１日１回１０日間、皮下ＬＬＣ腫瘍を有するヌードマウスに投与しても、ＬＬＣ異種移植片の腫瘍体積におけるいかなる著しい％低下も引き起こさなかった。１８日目の％Ｔ／Ｃ値は９２．４％であることが見出された。対照群と処置群との間の腫瘍サイズにおける差は統計学的に有意ではなく、この用量の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）％は７．６％であることが見出された（１８日目）。
【０１２６】
死亡率および体重変化
抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮは、試験した用量レベルでは比較的良好に認容され、死亡はなかった。実験期間の間、ビヒクル対照に体重の減少は存在せず、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に一過性の体重減少があった。動物は全て活動的で健康だった。ケージサイドの観察に基づくと、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に、異常行動の目に見える徴候、または臨床症状は存在しなかった。
【０１２７】
卵巣奇形癌腫（ＰＡ−１）皮下異種移植片
抗腫瘍活性
ＰＡ−１細胞株での異種移植片実験において、用量３０ｍｇ／ｋｇの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮを、皮下の卵巣奇形癌腫（ＰＡ−１）腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにｉ．ｖ；ＱＤｘ１０投与した。ＩｍｍｕｎｏＲＮａｓｅ治療は、ＰＡ−１異種移植片腫瘍モデルに対して中等度の抗腫瘍活性を実証した。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮまたは抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃいずれかの処置により、最適Ｔ／Ｃ値は２１日目にそれぞれ５３．３％および８７．５％となった。試験した用量レベルの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ群に対する腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）％は、４６．６８％であることが見出された（２１日目、ｐ＜０．００１）。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ群に対する％ＴＧＩは１２．４９％（２１日目）であり、統計学的に有意ではなかった。
【０１２８】
死亡率および体重変化
抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮは試験した用量レベルでは比較的良好に認容され、死亡はなかった。実験期間の間、ビヒクル対照に体重の減少は存在せず、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に一過性の体重減少があった。動物は全て活動的で健康だった。ケージサイドの観察に基づくと、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に、異常行動の目に見える徴候、または臨床症状は存在しなかった。
【０１２９】
前立腺癌（ＰＣ−３）皮下異種移植片
抗腫瘍活性
ＰＣ−３細胞株での異種移植片実験において、用量１５ｍｇ／ｋｇの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮを、皮下の前立腺癌（ＰＣ−３）腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにｉ．ｖ；ＱＤｘ９投与した。ＩｍｍｕｎｏＲＮａｓｅ治療は、ＰＣ３異種移植片腫瘍モデルに対して中等度の抗腫瘍活性を実証した。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮまたは抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃいずれかの処置により、最適Ｔ／Ｃ値は２１日目にそれぞれ６４．３％および８８．２％となった。試験した用量レベルの抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ群に対する腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）％は、３５．７４％であることが見出された（２１日目、ｐ＜０．００１）。抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ群に対する％ＴＧＩは１１．７５％（２１日目）であり、統計学的に有意ではなかった。
【０１３０】
死亡率および体重変化
抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮは試験した用量レベルでは比較的良好に認容され、死亡はなかった。実験期間の間、ビヒクル対照に体重の減少は存在せず、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に軽度の体重減少があった。動物は全て活動的で健康だった。ケージサイドの観察に基づくと、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＨＰＲＮ処置群に、異常行動の目に見える徴候、または臨床症状は存在しなかった。
【０１３１】
ＩＨＣ材料および方法
腫瘍組織を様々な段階で収集し、１０％緩衝中性ホルマリン中、２４時間から４８時間固定した（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、米国、カタログ番号Ｔ２２３４２００）。ヒト胎盤子宮の生検組織を地域の病院から得、パラフィン包埋用に同時に処理加工した。これらの組織から得た切片を、５Ｔ４抗原の免疫組織化学的局在化において、それぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。腫瘍組織をパラフィン包埋用に処理加工し、パラフィン包埋した組織を厚さ５μｍの切片にし、スライドガラス上に搭載した。
【０１３２】
搭載した切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコールのグレードの低下を用いて徐々に水和し、引き続き蒸留水およびＰＢＳ中で洗浄した。５Ｔ４の免疫組織化学的局在化を、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍキットを用いて行った。１セットの組織切片も、組織学的試験用に、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【０１３３】
様々な腫瘍およびヒト胎盤組織における５Ｔ４抗原の免疫組織化学的局在化を、製造元の指示に従って行った（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）。
【０１３４】
簡潔に述べると、脱パラフィンし、水和した組織切片を、スライドを抗原回復試薬（カタログ番号Ｓ０１３、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）中９５℃で１０分インキュベートすることによって、抗原を回復するために処理加工した。内因性のペルオキシダーゼ活性を、Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ染色キット（カタログ番号ＣＴＳ０１９、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）からのペルオキシダーゼブロッキング試薬でブロックした。引き続き、切片を、血清ブロッキング、アビジンブロッキング、およびビオチンブロッキング試薬でのステップにおいてインキュベートした。これらブロックした切片を、１次抗体［ヒツジポリクローナル抗ヒト５Ｔ４抗体（カタログ番号：ＡＦ４９７５、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）］と４℃で１夜、インキュベートし、引き続きＰＢＳで洗浄し、ロバ抗ヒツジ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）とインキュベートした。組織切片を、高感度ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（ＨＳＳ−ＨＲＰ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ）とインキュベートした。ＤＡＢ色原体基質を用いてＨＲＰ標識を発色させ、引き続きヘマトキシリンを用いて対比染色した。スライドを、ＤＰＸ包埋剤を用いて搭載した。
【０１３５】
胎盤組織を用いてＩＨＣ手順を最適化した。濃度２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの１次抗体を用いて、最適強度の５Ｔ４局在化を得た。ゼロ対照（１次抗体なし）も、ＩＨＣプロトコールを標準化するときの陰性対照として用いた。
【０１３６】
濃度５μｇ／ｍｌの１次抗体が、５Ｔ４抗原の最適な染色を示した。濃度２．５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌは、それぞれ軽度および重度の染色強度を示した。陰性対照のヒト子宮組織切片は、５Ｔ４抗原に相当するいかなる染色も示さなかった。
【０１３７】
これらの腫瘍組織における５Ｔ４の免疫局在化を、軽度（＋）、中等度（＋＋）、顕著（＋＋＋）および重度（＋＋＋＋）として定量的に評価し、その分布を、限局的（ｆｏｃａｌ）、多巣性（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）、および散在性（ｄｉｆｆｕｓｅ）と分類した。表５は、Ａ４３１、ＤＬＤ１、ＢＸＰＣ３、およびＰＡ１細胞株の異種移植片腫瘍における５Ｔ４発現の免疫局在化の結果を示す。
【０１３８】
【表５】
2016531088.tif 000008
【０１３９】
実施例１０：膀胱点滴手順
免疫融合分子を含む医薬組成物を、最終溶液の抗５Ｔ４免疫融合分子の濃度が約５μＭ、１μＭ、０．１μＭ、または０．０５μＭであるように、食塩水で調製してもよい。
【０１４０】
１８Ｆまたは２０Ｆのスリーウェイフォーリーカテーテルを、膀胱癌に罹患している患者の尿道を介し、膀胱中に挿入してもよく、カテーテルバルーンを膨張させてもよい。残尿を空にしてもよい。体温の食塩水の注入を用いて膀胱を潅注してもよく、食塩水を排水してもよい。
【０１４１】
医薬組成物最高１００ｍＬを空にした膀胱に導入し、膀胱内で３０分間維持してもよく、次いで膀胱を空にし、通常の食塩水ですすいでもよい。あるいは、医薬組成物を膀胱中に導入し、患者が排尿するまでそこに放置してもよい。
【０１４２】
上記に列挙した、出版物、特許出願出版物、および発行されている特許は全て、参照によって本明細書に援用される。
【０１４３】
特定の例を本明細書に説明および例示の目的で示し、記載してきたが、当業者には、示し、記載した特定の例は、本発明者らの方法、分子、および組成物の範囲から逸脱せずに、広範囲の代替および／または等価の実行に置換してもよいことが理解される。本開示は、本明細書に論じる例のあらゆる改変または変形を網羅するものとされる。
【図１】
2016531088.tif 000009
【図２】
2016531088.tif 000010
【図３】
2016531088.tif 000011
【図４】
2016531088.tif 000012
【図５】
2016531088.tif 000013
【図６】
2016531088.tif 000014
【図７】
2016531088.tif 000015
【図８】
2016531088.tif 000016
【図９Ａ】
2016531088.tif 000017
【図９Ｂ】
2016531088.tif 000018
【図９Ｃ】
2016531088.tif 000019
【配列表】
2016531088000001.xml
【国際調査報告】
2016531088.tif 000072
2016531088.tif 000073
2016531088.tif 000074
2016531088.tif 000075
2016531088.tif 000076