(57)【要約】ＡＭＬ芽球の表面に結合し、ＡＭＬ芽球への結合後に内部移行される、ポリペプチド。
2016534051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＬ芽球の表面に結合し、前記ＡＭＬ芽球への結合後に内部移行される、アミノ酸配列を含む抗体または抗体断片を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
連続した２個の極性中性アミノ酸、それに続く２個の非極性中性アミノ酸、およびそれに続く極性中性アミノ酸を含む、ＣＤＲ１；
それぞれが正の側鎖を有する２個の極性アミノ酸、負の側鎖を有する１個の極性アミノ酸、および１個のプロリンを含む連続した１０個のアミノ酸を含み、
前記連続したアミノ酸が、極性中性アミノ酸、それに続く非極性中性アミノ酸、それに続く負に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸、それに続く極性中性アミノ酸、それに続く非極性中性アミノ酸、それに続く正に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸、それに続く非極性中性アミノ酸を含む別の連続したアミノ酸に連結している、ＣＤＲ２；
５番目のアミノ酸が非極性中性アミノ酸であり、負に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸がそれに続き、極性中性である７番目のアミノ酸がそれに続く連続した７個のアミノ酸を含む、ＣＤＲ３
のアミノ酸配列を有する、抗体可変領域重鎖ＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのＮ末端がＣＤＲ１に連結した２０〜３５個のアミノ酸を含み、連続した８〜１５個のアミノ酸がそれに続き、ＣＤＲ２がそれに続き、ＣＤＲ３に連結した連続した２０〜３５個のアミノ酸がそれに続き、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する連続した５〜１５個のアミノ酸がそれに続く、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列を含む抗体または抗体断片を含み、前記ポリペプチドが、
正に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸、それに続く中性アミノ酸、それに続く連続した３個の極性中性アミノ酸、それに続く非極性アミノ酸、それに続く別の連続した３個の極性アミノ酸、それに続く非極性アミノ酸、およびそれに続く極性アミノ酸を含む、ＣＤＲ１；
２個の極性アミノ酸を含む連続した４個のアミノ酸を含み、前記連続した４個のアミノ酸に非極性中性アミノ酸が続き、２個の極性中性アミノ酸がそれに続く、ＣＤＲ２；および
２個の極性中性アミノ酸、それに続く連続した４個のアミノ酸、それに続くプロリン、それに続く８番目のアミノ酸としての中性アミノ酸、およびそれに続く極性中性アミノ酸からなる連続した９個のアミノ酸を含む、ＣＤＲ３
のアミノ酸配列を有する、抗体可変領域軽鎖ＶＬの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する、請求項１〜請求項２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドのＮ末端がＣＤＲ１に連結した１５〜３０個のアミノ酸を含み、連続した１０〜２０個のアミノ酸がそれに続き、ＣＤＲ２がそれに続き、ＣＤＲ３に連結した連続した２０〜３５個のアミノ酸がそれに続き、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する連続した７〜１８個のアミノ酸がそれに続き、特に、前記抗体可変領域軽鎖ＶＬに相当するポリペプチドが、配列番号３４〜４０のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２〜７のうちの１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号８〜１２のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＣＤＲ１が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１４〜１９のうちの１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号２０〜２６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、
あるいは、前記抗体可変領域重鎖ＶＨに相当するポリペプチドが、配列番号２７〜３３のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記抗体可変領域重鎖ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに前記抗体可変領域軽鎖ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３が、リンカー構造を介して互いに連結されている、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記リンカー構造が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項６〜請求項８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、特に９５％の相同性を有するポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、組換え抗体、特に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０の少なくとも一項に記載のポリペプチドを含むドメイン、及び細胞傷害性ドメインまたは検出可能な標識を含む化合物。
【請求項１２】
前記細胞傷害性ドメインが、細胞傷害活性を示す、分子の構造的要素の少なくとも１つを含み、
特に、前記細胞傷害性ドメインが、
緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素、もしくは百日咳毒素、ボツリヌス毒素などのＡＤＰリボシル化酵素、またはジアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ブリオジン（Ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、アブリン（Ａｂｒｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）、もしくはレストリクトシン（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）などのリボソーム不活性化タンパク質のメンバーからなる群から選択されるか、
ウシ精液ＲＮａｓｅ、ウシＲＮａｓｅ  Ａ、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ、アンジオゲニン、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）、またはウシガエルレクチンなどのＲＮａｓｅ（ホスホジエステラーゼ）のメンバーであるか、
カリチアマイシン、グルコースオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、シトシンデアミナーゼ、βグルコシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼ、またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼなどのプロドラッグ活性化酵素のメンバーであるか、
セリンプロテアーゼファミリー、セリン／スレオニンプロテアーゼファミリー、またはカテプシンプロテアーゼファミリーのメンバーであるか、
カルパインのメンバーであるか、
グランザイムのメンバー、特にグランザイムＢおよびグランザイムＭ、腫瘍抑制因子様キナーゼ、特にＤＡＰＫ１およびＤＡＰＫ２を含む細胞死関連プロテインキナーゼであるか、
微小管結合タンパク質（ＭＡＰ  Ｔａｕ）であるか、
上記タンパク質の任意の誘導体であるか、もしくは
これらの組合せである、分子そのもの又は前記分子に由来する細胞傷害性要素である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記検出可能な標識が、
フルオレセイン、ローダミン、クマリン、およびシアニン、およびその誘導体などの蛍光色素、；
ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、イットリウム９０、または診断に適切な任意の他の同位体などのガンマ線放射ラジオアイソトープ；
重金属、特にＣｄＳｅまたはＩｎＧａＰで構成される量子ドット；
少数（８〜１２個）の金原子もしくは銀原子で構成される貴金属ナノクラスター、または二酸化ケイ素製のナノ粒子中に捕捉された合成フルオロフォア；
ＭＲＩに基づく分子イメージングのための超常磁性酸化鉄粒子；
ＧＦＰもしくはｄｓＲＥＤまたはその誘導体などの蛍光タンパク質；
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびガラクトシダーゼなどの酵素
からなる群から選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
前記細胞傷害性ドメインと前記ポリペプチドドメインとの間、または前記検出可能な標識と前記ポリペプチドドメインとの間に、化学的連結基が配置されている、請求項１１〜請求項１３の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が、配列番号４３のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドである、請求項１１〜請求項１４の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１０の少なくとも一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ＡＭＬの診断および処置に使用するための、請求項１１〜請求項１５のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、ポリペプチド、本発明のポリペプチドを含む化合物、本発明の化合物を含む医薬組成物、本発明の化合物またはポリペプチドの治療的および診断的使用、ならびに本発明のポリペプチドの製造方法である。
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、末梢血および骨髄中への蓄積をもたらすアポトーシスプログラムの非効率な活性化を伴う、造血前駆細胞の無制御な過剰生産を特徴とする不均一な血液疾患群である１。米国癌学会は、２０１３年に新規に診断されるＡＭＬが１４，５９０例、ＡＭＬに関連する死亡が１０，３７０例であると推定した２。診断時の年齢の中央値は６５歳であり、これは、平均余命の上昇によるＡＭＬ発症の今後何年もの劇的な増加、およびその結果としての人口構成の変化を意味する３。現在の予後は、５年相対生存率がわずか２４％と不良である２。治療関連死および完全寛解を生き延びた芽球により生じる再発の両方の理由により、患者の大部分は依然として疾患のために死亡する１。この微小残存病変を制御するために、現在の研究では、モノクローナル抗体を用いた特異的標的化に利用され得る、ＡＭＬ細胞上の細胞系列特異的な抗原発現が分析されている４。ＣＤ４５５、汎白血球抗原、および成熟骨髄系細胞上に見られる糖タンパク質であるＣＤ６６６などの白血病関連抗原に対して、複数の特異的バインダーが開発されている。単剤は、ごくわずかな効果しか示さないため、それらを放射性核種と結合させて放射性免疫複合体が作成されている。放射性免疫複合体の使用は現在、第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験で開発中であり、同種幹細胞移植に先立って放射性免疫複合体が投与される。これらの開発の他には、ほとんどの注意は依然として、カリチアマイシン結合ＣＤ３３標的化抗体であるＧｅｍｔｕｚｕｍａｂ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）に集中している。この免疫複合体は、標準的な化学療法の候補と見なされなかった６０歳以上の再発性ＡＭＬ患者の処置のために２０００年にＦＤＡに認可され７、処置された患者が多数死亡したことにより２０１０年に撤回された８。前述した標的抗原の主な欠点は、それらがＡＭＬ細胞の表面ではなく、むしろ正常細胞上でもっぱら発現しており９、これにより重度の副作用を伴う望ましくない毒性プロファイルがもたらされることである。
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の現在の標準処置は、シタラビンおよびダウノルビシン（７＋３）に基づく高用量化学療法であるが、これは、悪性細胞と良性細胞の区別が不十分である。用量制限的なオフターゲット作用および内因的薬物耐性により、白血病芽球の根絶が非効率的となり、寛解後までそれらが生存することになる。この微小残存病変は、再発の主な原因であり、最終的に５年生存率がわずか２４％となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、健康な細胞に影響を与えずに、悪性細胞を高度に特異的、且つ効率的に根絶することが真に求められている。したがって、本発明の目的の１つは、前述の目標を達成可能であり、今日まで用いられている処置方法の欠点を回避可能である医薬を提供することである。
【０００５】
国際公開第２０１３／００６４９０（Ａ２）号は、癌細胞、特に癌幹細胞を検出するために使用することができるＴＩＭ３に特異的な抗体を開示する。抗体は、癌を処置するための治療組成物および炎症を軽減するための治療組成物に使用することもできる。
【０００６】
国際公開第２０１３／００３６５２（Ａ２）号は、ＡＤＰリボシルシクラーゼ２に結合する抗体を開示する。抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および抗体を発現させる方法も提供される。抗体は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、および膵臓癌を含むヒトの癌、ならびに喘息、痛風、クローン病、ループス、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、糖尿病、およびアテローム硬化性を含むヒト炎症性疾患の処置に用いられ得る。
【０００７】
国際公開第２００７／０４９０４４（Ａ１）号は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）に結合可能な薬剤、ならびに細胞増殖障害および細胞分化障害の処置におけるその使用を開示する。さらに、本発明は、関連する医薬製剤および方法を提供する。
【０００８】
本発明は、切断型の緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ’）と融合したｓｃＦｖにより組換え免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ、ＩＴ）が得られ、ＡＭＬ選択的な細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導を引き起こすという発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、ＡＭＬ芽球の表面に結合し、ＡＭＬ芽球への結合後に内部移行されるポリペプチドによって達成される。
【００１０】
ポリペプチドはアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片を含み、このポリペプチドは、
連続した２個の極性中性アミノ酸、それに続く２個の非極性中性アミノ酸、およびそれに続く極性中性アミノ酸を含む、ＣＤＲ１；
それぞれが正の側鎖を有する２個の極性アミノ酸、負の側鎖を有する１個の極性アミノ酸、および１個のプロリンを含む連続した１０アミノ酸を含み、
前記連続したアミノ酸が、極性中性アミノ酸、それに続く非極性中性アミノ酸、それに続く負に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸、それに続く極性中性アミノ酸、それに続く非極性中性アミノ酸、それに続く正に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸、それに続く非極性中性アミノ酸を含む別の連続したアミノ酸に連結している、ＣＤＲ２；
５番目のアミノ酸が非極性中性アミノ酸であり、負に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸がそれに続き、極性中性である７番目のアミノ酸がそれに続く連続した７個のアミノ酸を含む、ＣＤＲ３
のアミノ酸配列を有する、抗体可変領域重鎖ＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドのＮ末端がＣＤＲ１に連結した２０〜３５個のアミノ酸を含み、連続した８〜１５個のアミノ酸がそれに続き、ＣＤＲ２がそれに続き、ＣＤＲ３に連結した連続した２０〜３５個のアミノ酸がそれに続き、ポリペプチドのＣ末端に位置する連続した５〜１５個のアミノ酸がそれに続く。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態では、ポリペプチドがアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片を含み、このポリペプチドは、
正に荷電した側鎖を有する極性アミノ酸、それに続く中性アミノ酸、それに続く連続した３個の極性中性アミノ酸、それに続く非極性アミノ酸、それに続く別の連続した３個の極性アミノ酸、それに続く非極性アミノ酸、およびそれに続く極性アミノ酸を含む、ＣＤＲ１；
２個の極性アミノ酸を含む連続した４個のアミノ酸を含み、前記連続した４個のアミノ酸に非極性中性アミノ酸が続き、２個の極性中性アミノ酸がそれに続く、ＣＤＲ２；および
２個の極性中性アミノ酸、それに続く連続した４個のアミノ酸、それに続くプロリン、それに続く８番目のアミノ酸としての中性アミノ酸、およびそれに続く極性中性アミノ酸からなる連続した９個のアミノ酸を含む、ＣＤＲ３
のアミノ酸配列を有する、抗体可変領域軽鎖ＶＬの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態では、ポリペプチドのＮ末端がＣＤＲ１に連結した１５〜３０個のアミノ酸を含み、連続した１０〜２０個のアミノ酸がそれに続き、ＣＤＲ２がそれに続き、ＣＤＲ３に連結した連続した２０〜３５個のアミノ酸がそれに続き、ポリペプチドのＣ末端に位置する連続した７〜１８個のアミノ酸がそれに続く。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、抗体構造の重鎖に相当するポリペプチドは、ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２〜７のうちの１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号８〜１２のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドのＣＤＲ１が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１４〜１９のうちの１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号２０〜２６のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
さらに別の実施形態では、抗体可変領域重鎖ＶＨに相当する本発明のポリペプチドは、配列番号２７〜３３のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
さらに別の実施形態では、抗体可変領域軽鎖ＶＬに相当する本発明のポリペプチドは、配列番号３４〜４０のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明のポリペプチドの別の実施形態では、抗体可変領域重鎖ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに抗体可変領域軽鎖ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、リンカー構造を介して互いに連結されている。通常、本発明では、リンカー構造は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。
【００１９】
本発明のポリペプチドはさらに、本発明のポリペプチドを定義するアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に９５％の相同性を示し得る。
【００２０】
特に、本発明のポリペプチドは、組換え抗体、より具体的には単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００２１】
本発明のポリペプチドを含むドメインおよび細胞傷害性ドメインを含む化合物もまた、本発明の主題である。
【００２２】
特に、本発明の化合物の細胞傷害性ドメインは、細胞傷害活性または細胞死滅活性を示す、分子の構造的要素の少なくとも１つを含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、本発明の化合物の細胞傷害性ドメインは、
緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素、もしくは百日咳毒素、ボツリヌス毒素などのＡＤＰリボシル化酵素、またはジアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ブリオジン（Ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、アブリン（Ａｂｒｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）、もしくはレストリクトシン（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）などのリボソーム不活性化タンパク質のメンバーからなる群から選択されるか、
ウシ精液ＲＮａｓｅ、ウシＲＮａｓｅ  Ａ、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ、アンジオゲニン、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）、またはウシガエルレクチンなどのＲＮａｓｅ（ホスホジエステラーゼ）のメンバーであるか、
カリチアマイシン、グルコースオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、シトシンデアミナーゼ、βグルコシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼ、またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼなどのプロドラッグ活性化酵素のメンバーであるか、
セリンプロテアーゼファミリー、セリン／スレオニンプロテアーゼファミリー、またはカテプシンプロテアーゼファミリーのメンバーであるか、
カルパインのメンバーであるか、
グランザイムのメンバー、特にグランザイムＢおよびグランザイムＭ、腫瘍抑制因子様キナーゼ、特にＤＡＰＫ１およびＤＡＰＫ２を含む細胞死関連プロテインキナーゼであるか、
微小管結合タンパク質（ＭＡＰ  Ｔａｕ）であるか、
上記タンパク質の任意の誘導体であるか、もしくは
これらの組合せである、分子そのものまたは前記分子に由来する細胞傷害性要素である。
【００２４】
細胞傷害性ドメインとポリペプチドドメインの結合のために、細胞傷害性ドメインと本発明のポリペプチドを含むドメインとの間に化学的連結基が配置されていてもよい。細胞傷害性ドメインまたは検出可能な標識の連結は、それぞれの部分と本発明のペプチドとを結合することにより行うことができる。さらに、参照により援用する国際公開第２００９／０１３３５９号に開示される技術を用いることもできる。
【００２５】
ＳＮＡＰ−ｔａｇ技術は、幅広いインビトロおよびインビボでの応用に大きな可能性がある。ＳＮＡＰ−ｔａｇ技術は、可溶性分子または表面へのタンパク質の結合、イメージング技術、マウスにおけるタンパク質間相互作用または薬物動態の分析に用いることができる。その多用途性のため、ＳＮＡＰ−ｔａｇは新規治療法および診断法の開発分野における今後の研究に大きな影響を与えることが当然予想され得る。
【００２６】
診断用の標識もまた、本発明の主題である。本発明では、検出可能な標識は、
フルオレセイン、ローダミン、クマリン、およびシアニン、およびその誘導体などの蛍光色素、；
ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、イットリウム９０、または診断に適切な任意の他の同位体などのガンマ線放射ラジオアイソトープ；
重金属、特にＣｄＳｅまたはＩｎＧａＰで構成される量子ドット；
少数（８〜１２）の金原子もしくは銀原子で構成される貴金属ナノクラスター、または二酸化ケイ素製のナノ粒子中に捕捉された合成フルオロフォア；
ＭＲＩによる分子イメージングのための超常磁性酸化鉄粒子；
ＧＦＰもしくはｄｓＲＥＤまたはその誘導体などの蛍光タンパク質；
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびガラクトシダーゼなどの酵素
からなる群から選択される。
【００２７】
本発明の化合物を含む医薬組成物もまた、本発明の主題である。本発明の化合物は、ＡＭＬの診断および処置に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ａ．ｓｃＦｖ−４０５の二次構造の模式図である。Ｂ．選択されたｓｃＦｖ抗体断片の軽鎖（ＶＬ、左）および重鎖（ＶＨ、右）の近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）に基づく系統樹を示す図である。
【図２】精製ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質のコンストラクトおよび結合分析を示す図である。
【図３】ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の内部移行を示す図である。
【図４】共焦点顕微鏡法によるｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の結合および内部移行を示す図である。
【図５】ＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’融合タンパク質のコンストラクトおよび細胞生存率への影響を示す図である。
【図６】組換えＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’免疫毒素融合タンパク質のアポトーシス分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
「内部移行する」という用語は、標的細胞構造の特異的結合後の細胞内への取込みを指す。
【００３０】
本明細書において、「免疫毒素」という用語は、細胞結合性モノクローナル抗体またはその断片が、毒素またはそのサブユニットと化学的に結合または遺伝子的に融合しているキメラ分子を指す。免疫毒素の毒素部分は、細菌、真菌、植物、または動物などの種々の供給源に由来してもよい。ヒト起源の毒素または合成毒素（薬物）を同様に用いることもできる。免疫毒素およびその構築は、上記に概説した通りであり、当業者に周知である。
【００３１】
本明細書において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびその他の断片など、親抗体の抗原結合機能および特異性を保持しているその断片を指す。
【００３２】
本明細書において、「モノクローナル抗体」という用語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、その製造方法によっても限定されない。この用語は、全免疫グロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびその他など、抗体の抗原結合機能および特異性を保持している断片を包含する。本発明では、任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体が使用され得る。しかし、実際、モノクローナル抗体の作製に必要なハイブリッド細胞株またはハイブリドーマの作製に使用するためのラット細胞株またはマウス細胞株の入手し易さのため、抗体は通常ラット起源またはマウス起源である。
【００３３】
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、免疫グロブリンのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００３４】
本明細書において、「単鎖抗体断片」（ｓｃＦｖ）という用語は、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能の保存を可能にする連結部分を付加することにより作製された抗体を指す。これは、基本的には、可変ドメインの抗原への結合に必要な部分のみを有する、徹底的に短縮された抗体を形成する。単鎖抗体の決定および構築は、Ｌａｄｎｅｒ他の米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００３５】
「細胞傷害性ドメイン」または「細胞死滅ドメイン」という用語は、当該技術分野で公知の任意の毒素であってもよく、好ましくは以下の群から選択される：緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素、百日咳毒素、ボツリヌス毒素などのＡＤＰリボシル化酵素（Carroll SF, Collier RJ, Meth. Enzymol. 235, 1994, 631-639参照）、ジアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ブリオジン（Ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、アブリン（Ａｂｒｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）、レストリクトシン（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）などのリボソーム不活性化タンパク質（Barbieri L et al. Biochem Biophys. Acta 1154, 1993, 237-282参照）、ウシ精液ＲＮａｓｅ、ウシＲＮａｓｅ  Ａ、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ、アンジオゲニン、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）、ウシガエルレクチンなどを含むホスホジエステラーゼなどのＲｎａｓｅ（Youle RJ et al. Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 10, 1993, 1-28参照）、カリチアマイシン、グルコースオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、シトシンデアミナーゼ、βグルコシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼなどのプロドラッグ活性化酵素（Deonarain MP, Epenetos AA, Br. J. Cancer 70, 1994, 786-794も参照）、カテプシンプロテアーゼファミリーのメンバー、カルパインのメンバー、グランザイム、特にグランザイムＢおよびグランザイムＭ、腫瘍抑制因子様キナーゼ、特にＤＡＰＫ１およびＤＡＰＫ２を含む細胞死関連プロテインキナーゼ、または微小管結合タンパク質（ＭＡＰ  Ｔａｕ）、または上記タンパク質の任意の誘導体、またはその組合せ。
【００３６】
配列番号４３のアミノ酸配列の緑膿菌外毒素Ａを含む細胞傷害性ドメインを有する融合ポリペプチドである本発明の化合物が特に有用である。
【００３７】
「検出可能な標識」という用語は、例えば、放射線の放射（放射能）または相互作用によって内因的に、測定可能なパラメーターを示し得る任意の構造的要素であってもよい。検出可能な標識は、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、およびシアニン、およびその誘導体などの蛍光色素である。好ましいフルオロフォアは、６８０〜９５０ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）範囲で発光する。この波長は、バックグラウンドの蛍光が非常に低く、組織透過性が優れているので、インビボでの蛍光検出に理想的である。具体的な実施形態では、Ｓｎａｐ−ｔａｇと融合した腫瘍特異的抗体または他のリガンドが、ＮＩＲ色素のＢＧ誘導体で標識される。標識された抗体またはリガンドは、インビボで腫瘍の成長および／または処置を可視化するために用いることができるイメージングツールとして機能する。
【００３８】
具体例では、７８２ｎｍで発光するＮＩＲ色素のＢＧ誘導体を、ＥＧＦＲを標的化する単鎖抗体断片ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質と結合した。得られたインビボイメージングプローブを用いて、膵癌異種移植モデルにおけるＥＧＦＲ発現を検出した。別の具体例では、複数のフルオロフォア結合複合体ＡＢをフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡への応用に使用した。さらに、検出可能な標識は、通常はＤＯＴＡまたはＤＴＡＰなどの錯化剤と組み合わされる、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、イットリウム９０、または診断に適切な任意の他の同位体などのガンマ放射ラジオアイソトープであってもよい。
【００３９】
さらに、検出可能な標識は、ＣｄＳｅまたはＩｎＧａＰなどの重金属で構成される量子ドットであってもよい。量子ドットは、量子収率および光安定性が高いため、好ましい光学イメージング剤である。成分Ｃで表される蛍光標識の別の可能性は、少数（８〜１２）の金原子もしくは銀原子で構成される貴金属ナノクラスター、または二酸化ケイ素製のナノ粒子中に捕捉された合成フルオロフォアであってもよい。
【００４０】
さらに、検出可能な標識は、ＭＲＩを用いた分子イメージングのための超常磁性酸化鉄である。
【００４１】
ＧＦＰもしくはｄｓＲＥＤまたはこれらの誘導体などの蛍光タンパク質、複合体ＡＢと結合した検出可能な標識として機能し得る。蛍光タンパク質は今日、幅広い可視スペクトルおよび近赤外スペクトルをカバーしている。
【００４２】
さらに、検出可能な標識は、種々の免疫測定法で一般的に利用されるアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびガラクトシダーゼなどの酵素であってもよい。
【００４３】
「非極性アミノ酸」、「極性アミノ酸」、「中性アミノ酸」、「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）アミノ酸」、および「陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）アミノ酸」という用語は、必須アミノ酸および他のアミノ酸の周知の特性を示す。タンパク質を構成するアミノ酸について、表１にこれらの特性を要約する。
【００４４】
【表１】
2016534051.tif 000003
【００４５】
ポリペプチドは、単一のアミノ酸を生体高分子へと重合させるために用いられるペプチド結合を示す。ペプチド結合は、エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼによる酵素分解を受けやすい。中性条件下でポリペプチドの安定性を増大させるために、例えば、特にｒｅｔｒｏ／ｉｎｖｅｒｓｏ配向として、Ｄ−アミノ酸で形成されるペプチド結合を導入することによって、Ｎ末端もしくはＣ末端をブロックおよび／またはポリペプチド骨格を改変することが可能である。
【実施例】
【００４６】
細胞および培養
ヒト急性骨髄性白血病Ｍ２由来細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１をＧｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ、ドイツ、ブラウンシュワイク）から購入し、選択抗原として用いた。２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充した８０％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ、エッゲンシュタイン）中、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を培養し、３〜４日毎に１：２の比率で継代した。陰性対照として、Ｆｉｃｏｌｌ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ドイツ、ミュンヘン）を用いてヘパリン処理した全血から新たに単離したヒトＰＢＭＣの他に、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ドイツ、ヴェーゼル）から入手したヒト胎児由来腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ、およびＫＧ−１細胞株（ＤＳＭＺ）を用いた。１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１ｍｌあたり１０，０００単位ペニシリンおよび１０，０００μｇストレプトマイシンのストック溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ）を含む９０％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地中で上記と同じ条件を用いて細胞を増殖させた。さらにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の遺伝子導入および発現のために用いた。そのために、細胞を２４ウェル培養プレートに１ウェルあたり６×１０４細胞の密度で播種し、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡおよび３μｌのＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社、ドイツ、マンハイム）と共に４８時間インキュベートした。機能性タンパク質の発現およびＳＮＡＰ−ｔａｇ活性を以前に記載１０されるように試験した。遺伝子導入に成功した細胞を、標準培地に１００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を加えることにより、ゼオシン選択圧下で培養した。タンパク質の大量生産のために、２００ｍｌの培地を用いてトリプルフラスコ（Ｎｕｎｃ社、ドイツ、ランゲンゼルボルト）中で遺伝子導入した細胞を培養した。７〜８日毎に培地を交換した。
【００４７】
ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによる可溶性ｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の分析
変異導入に成功したｓｃＦｖを、可溶性ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質を真核生物で生産させるためのｐＭＳ発現ベクターにクローニングした１３。クローニング手順、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子導入および培養、ならびに真核生物ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇタンパク質の発現、精製、およびベンジルグアニン（ＢＧ）修飾フルオロフォアへの結合は、以前に記載１０されるように行った。ＥＬＩＳＡ実験において粗細胞培養上清および精製タンパク質を用いて、ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ融合タンパク質の機能性を実証した。そのために、Ｋａｓｕｍｉ−１およびＰＢＭＣの膜断片の１：１００希釈物１００μｌで９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃、一晩コーティングした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％ＭＰＢＳで２時間ブロッキングし、１ウェルあたり１００μｌのｓｃＦｖ含有細胞上清を、室温（ＲＴ）、４００ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベートした。非結合タンパク質を０．０５％ＰＢＳＴで洗い流し、結合ｓｃＦｖは、一次抗体として０．２μｇ／ｍｌ濃度のウサギ抗ＳＮＡＰ−ｔａｇポリクローナル抗体（Ａ００６８４、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）、および二次抗体としてポリクローナルヤギ抗ウサギＨＲＰ標識抗体（ａｂ６７２１、Ａｂｃａｍ社、英国、ケンブリッジ）の１：５，０００希釈物を用いて検出した。最後に、１００μｌの新たに調製したＡＢＴＳ基質を各ウェルに加え、前述のように陽性の結合を評価した。ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の結合強度を定量的に比較するために、２％ＭＰＢＳでプレブロッキングした１μｇのＩＭＡＣ精製タンパク質を総体積１００μｌで各マイクロタイタープレートのウェルに添加し、前述のようにＥＬＩＳＡ法を行った。前述のようにＳＮＡＰ−ｔａｇを用いて、結合ｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質を検出した。直接標識されたｓｃＦｖクローンの細胞全体上での結合活性を定性的に調べるために、１μｇの溶出されたｓｃＦｖタンパク質を、ブロッキングバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ）中で３回洗浄した、新たに回収した５×１０５個のＰＢＭＣまたはＫａｓｕｍｉ−１細胞とともに、氷上で、光から保護して、１時間インキュベートした。細胞洗浄機中でのＰＢＳを用いた２回の洗浄ステップの後、細胞を３００μｌのブロッキングバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーでの結合分析および内部移行分析にそのまま使用した。前方散乱および側方散乱における物理的特徴またはＦＬ−３におけるトリパンブルー染色に従ってゲーティングを行い、死細胞および細胞片を排除した。
【００４８】
選択されたｓｃＦｖ抗体の機能的親和定数の決定
Ｂｅｎｅｄｉｃｔ他１４に記載の方法を改変して用いて、選択された各ｓｃＦｖ抗体の親和定数を決定した。各Ｖｉｓｔａ  Ｇｒｅｅｎ標識ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰタンパク質の種々のＰＢＳ希釈物とＫａｓｕｍｉ−１細胞のインキュベーションを前述のように行った。０．５ｎＭ〜２０００ｎＭの種々の濃度でｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ量を増加させて飽和レベルに到達させた。内因的細胞蛍光およびｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇタンパク質の非特異的結合により生じるバックグラウンド蛍光シグナルを差し引いた後、各ｓｃＦｖの蛍光強度および適用された濃度の幾何平均を計算した。特異性の証明と並行して、ＰＢＭＣへの機能的親和性を試験した。
【００４９】
フローサイトメトリーによる内部移行分析
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質を用いて、フローサイトメトリーに基づくアッセイにより内部移行の挙動を試験した。５×１０５個のＫａｓｕｍｉ−１細胞をＰＢＳで３回洗浄し、標準培養液に再懸濁し、１μｇのｓｃＦｖタンパク質と共に３７℃で１時間インキュベートして内部移行させた。並行して、非内部移行の基準として、１％ＮａＮ３中、４℃でインキュベーションを行った。追加の洗浄ステップの後、０．５ｍｌの０．０５％トリプシンを３７℃で１０分間添加することにより、表面に結合したｓｃＦｖ  ＳＮＡＰタンパク質を剥離した。０．５ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳの添加により反応を停止し、ＰＢＳを用いて２回、過剰なトリプシンを洗い流した。細胞ペレットをブロッキングバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ドイツ、ハイデルベルク）を用いてサンプルを分析した。非内部移行対照（０％）およびトリプシン処理前の陽性結合シグナル（１００％）を基準にして各サンプルを標準化した。細胞表面上の残留ｓｃＦｖ融合タンパク質を検出するために、一次抗体として０．５μｌのウサギ抗ＳＮＡＰ−ｔａｇポリクローナル抗体、および二次抗体として０．５μｌのヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ポリクローナル抗体（Ａ−１１００９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ、ダルムシュタット）を添加した。
【００５０】
共焦点顕微鏡法による内部移行の分析
選択されたｓｃＦｖの内部移行の挙動を共焦点画像解析により確認するために、細胞を前述のように処理し、ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡（ＬＥＩＣＡ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ社、ドイツ、ヴェッツラー）でモニタリングした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識タンパク質を６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザーを用いて励起した。ＬＥＩＣＡソフトウェアを用いて、フルオロフォアおよび透過光の画像をマージした。細胞内部移行動態を評価するために、選択されたｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ融合タンパク質をＯＰＥＲＡ生細胞イメージングシステムに導入した。そのために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ｓｃＦｖを標的細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１と共に４℃でインキュベートした。最適な細胞密度にするために、１ウェルあたり５０〜１００μｌの各サンプルを、透明底の黒色９６ウェルマイクロタイタープレート（μＣｌｅａｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社、ドイツ、フリッケンハウゼン）にピペッティングし、細胞を４℃で定着させた。Ｏｐｅｒａ（登録商標）マイクロタイタープレートイメージングリーダー（Ｅｖｏｔｅｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ドイツ、ハンブルク）を用いて１２時間にわたり動態測定を行った。
【００５１】
ｓｃＦｖ  ＥＴＡ’ 免疫毒素の構築、発現、および精製
ＥＬＩＳＡ陽性ファージミドクローンから得たｓｃＦｖ遺伝子を用いて組換え免疫毒素を構築した。復帰変異ｓｃＦｖ挿入断片をｐＭＴ  ＥＴＡ’原核生物発現ベクター１５にクローニングし、ｓｃＦｖ−ＥＴＡ’融合タンパク質の高収率発現のために大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）中に形質転換した。以前に記載されるように１６、適合する溶質の存在下、ストレス条件下でｓｃＦｖ−ＥＴＡ’免疫毒素の発現を行った。周辺質画分を回収するために、細菌細胞を沈降させ、バッファー（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５０ｍｌ当たり１錠のプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、７０％の強度で１分間の超音波処理を９回行った。３０，０００×ｇで３０分の遠心分離により周辺質画分を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡセファロース（ＱＩＡＧＥＮ社、ドイツ、ヒルデン）を用いてバッチ法で組換え免疫毒素を精製した。最初のインキュベーション後の通過画分を回収し、再度２回インキュベートした。樹脂を、バッファー１（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で１回、バッファー２（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）で２回洗浄し、溶出バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で結合タンパク質を剥がした。溶出したタンパク質を最終的に、記載されるように１６、分子ふるいクロマトグラフィーを用いて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析および定量した。抗ＥＴＡ’モノクローナル抗体ＴＣ−１（Ｇａｌｌｏｗａｙ博士の厚意による提供、米国、オハイオ州）を用いて、フローサイトメトリーで機能的結合活性を確認した。
【００５２】
ｓｃＦｖ−ＥＴＡ’コンストラクトの細胞傷害性効果
以前に記載されるように１３、１７、１８、細胞増殖の阻害を行った。組換え免疫毒素の段階希釈物を３０ｎｇ／μｌから始めて９６ウェルマイクロタイタープレートに分注した。４×１０４個のＫａｓｕｍｉ−１細胞を完全培地に添加した後、プレートを標準的な培養条件下で７２時間インキュベートした。テトラゾリウム塩（ＸＴＴ）から橙色のホルマザン色素への代謝として、細胞増殖をアッセイし、ホルマザン色素の吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。全ての測定は、３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。ＤＭＳＯ処理陽性対照（０％）および非処理細胞（１００％）に対して各サンプルを標準化し、ＩＣ５０を決定した。
【００５３】
カスパーゼ３／７活性検出キット（Ａｐｏ−Ｏｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ドイツ、マンハイム）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、アポトーシスの誘導を検出した。そのために、濃度５×１０５個のＫａｓｕｍｉ−１細胞の０．５ｍｌのアリコートを２４ウェルマイクロタイタープレートに播種し、標準的な培養条件下で１μｇの免疫毒素と共に２４時間インキュベートした。サンプルを２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で分析し、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。さらに、以前に記載されるように１９、アネキシンＡ５染色によりアポトーシスを分析した。前述のように細胞を処理し、アネキシンＡ５  ｅＧＦＰ融合タンパク質含有ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清でアポトーシス細胞を染色した１９。ヨウ化プロピジウムで壊死細胞を対比染色した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いたフローサイトメトリーでサンプルを測定した。
【００５４】
抗体可変領域の生物情報学的分析
一般に利用可能なバイオインフォマティクスのツールおよび技術を用いて、抗ＡＭＬ  ｓｃＦｖ抗体中の相補性決定領域（ＣＤＲ）の同定および解明を行った。最初に、記載１１されるように、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、ドイツ、デューレン）を用いてプラスミドベクターを抽出し、続いてプライマーＬＭＢ３（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣ−３’）およびｆｄＳＥＱ１（５’−ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＧＧ−３’）を用いてインサートＰＣＲを行うことにより、モノクローナルファージＥＬＩＳＡにおける陽性バインダーをシークエンシングのために調製した。ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＡｌｉｇｎＸアルゴリズム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて分析した。その後、Ｋａｂａｔナンバリングシステム２０を用い、Ｖ−ＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）およびＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）でユニーク配列を分析して、フレームワークならびに可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲを決定した。ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）２１〜２３を用いてＶＨ鎖およびＶＬ鎖をモデリングし、ＰｙＭＯＬ  ｖ１．５をコンピューターグラフィックモデリングに用いた。近隣結合アルゴリズムを用いて、選択されたｓｃＦｖ抗体の相同性から系統樹を作成した。
【００５５】
データ分析
可溶性ｓｃＦｖタンパク質の定量分析は、クーマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルをデジタルスキャンした後、ＡＩＤＡイメージアナライザー４．２７ソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ社、ドイツ、シュトラウベンハルト）を用いて行った。フルオロフォア標識ｓｃＦｖは、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ  Ｂａｓｉｃ  １−Ｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア  ｖ４．２．１（ＢＩＯ−Ｒａｄ社）を用いたＶｅｒｓａＤｏｃ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−Ｒａｄ社、ドイツ、オッフェンバッハ）で検出した。フローサイトメトリー分析から得られたデータを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ドイツ、ハイデルベルク）およびＷｉｎｄｏｗｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙバージョン２．８（ＷｉｎＭＤＩ、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔｒｏｔｔｅｒ、米国）を用いて評価した。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を用いて行った。データは平均値±標準偏差（ＳＤ）として記載した。両側ｔ検定を用いて、独立した実験の有意性を決定した。基準ｐ＜０．０５を有意（＊）、ｐ＜０．０１を非常に有意（＊＊）、ｐ＜０．００１を極めて有意（＊＊＊）と見なした。飽和結合曲線は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（レーベンバーグ・マーカート）アルゴリズムを用いた非線形回帰分析により作成した。免疫毒素のＩＣ５０は、シグモイド型用量反応式を用いて非線形回帰分析により計算した。
【００５６】
結果
無処理細胞上での選択されたＡＭＬ特異的抗体断片の結合
【００５７】
【表２】
2016534051.tif 000004
【００５８】
図１：Ａ．ｓｃＦｖ−４０５の二次構造の模式図である。示されているｓｃＦｖの方向は、ＶＨ−リンカー−ＶＬである。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を灰色で示し、ＶＨのＣＤＲを暖色で強調し（Ｈ１：赤色、Ｈ２：黄色、Ｈ３：橙色）、ＶＬのＣＤＲを寒色で強調する（Ｌ１：濃青色、Ｌ２：緑色、Ｌ３：薄青色）。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って規定される。連結する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを黒色で示す。Ｂ．選択されたｓｃＦｖ抗体断片の軽鎖（ＶＬ、左）および重鎖（ＶＨ、右）の近隣結合法に基づく系統樹を示す図である。横方向の距離（スケールバー）はそれらの配列相同性に比例している。
【００５９】
可溶性ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇタンパク質の結合親和性
復帰変異したｓｃＦｖ挿入断片をバイシストロニックなｐＭＳ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ真核生物発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に遺伝子導入して、選択されたバインダーのｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質を作製した（図２のＡ）。蛍光顕微鏡法におけるＺｅｏｃｉｎおよび高感度緑色蛍光（ｅＧＦＰ）タンパク質活性を用いた選択により、効果的な遺伝子導入が実現された。ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質は上清中に分泌され、ＩＭＡＣにより精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより分析された。精製タンパク質は、そのまま、またはＢＧ−ＳＮＡＰ基質を用いてフルオロフォアであるＶｉｓｔａ  ＧｒｅｅｎまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合後に使用した。最初に、モノクローナルｓｃＦｖ−ＥＬＩＳＡにおいて測定された吸収値に基づいて結合強度の分類を行った。そのために、１μｇの精製ｓｃＦｖタンパク質のそれぞれを、Ｋａｓｕｍｉ−１および陰性対照としてのＰＢＭＣの固定化膜断片とインキュベートした。陽性結合は、ウサギ抗ＳＮＡＰ−ｔａｇ一次抗体およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて検出し、ＡＢＴＳ添加後に可視化した。陰性対照と比べて吸光値が少なくとも２．５倍高い選択されたクローンを中程度の結合性として分類し、吸光値が５倍以上高いクローンを強い結合性とした。この分類に従い、選択された内部移行バインダーのうちの１つ、すなわちＥＭＩ４０４は、Ｋａｓｕｍｉ−１膜断片への強い結合活性を示し、残りの３つ、すなわちＥＭＩ４０５、ＥＭＩ４０６、およびＥＭＩ４０７は中程度の活性を示した（図２のＢ）。さらに、本発明者らは、フローサイトメトリー分析に基づいて、生きた標的細胞への結合強度を評価し、１μｇのＶｉｓｔａ  Ｇｒｅｅｎ標識タンパク質と共にインキュベートした場合、ＦＬ−１においてシフトしたＫａｓｕｍｉ−１細胞が、クローンＥＭＩ４０４で最も低い６７．３％、クローンＥＭＩ４０６で最も高い８０．２であることを見出した（図２のＣ）。ＰＢＭＣ、またはＨＥＫ２９３Ｔなどの他の陰性対照への非特異的結合は、どの時点でも観察されなかった。ＫＤ値は、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞を最大２０００ｎＭの各バインダーと共にインキュベートして飽和レベルに到達させることにより決定した。細胞に結合したｓｃＦｖのＭＦＩの上昇を測定し、バックグランドの蛍光に対して標準化し、添加ｓｃＦｖ濃度に対して飽和−結合曲線にプロットした。各サンプルについて非線形回帰分析によって計算されたＫＤ値は、クローンＥＭＩ４０４の６２．９±２６．８ｎＭからクローンＥＭＩ４０７の４０４．４±１８３．０ｎＭの範囲であった（表Ｉ）。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。
【００６０】
図２：精製ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質のコンストラクトおよび結合分析。Ａ．組換えＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質のバイシストロニックな真核生物発現カセットの模式図を示す図である。サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ  ｐｒｏ）の制御下、ｐＭＳ  ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰベクターは、ＳＮＡＰ−ｔａｇにインフレームで連結された抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）をコードする。ｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合物の上流の免疫グロブリンκリーダー配列（Ｉｇκ）により融合タンパク質が上清中に分泌され、ＴＧＡ終止コドンがＣ末端Ｈｉｓ６−ｔａｇの直後に配置される。付加的に転写される配列内リボソーム進入部位（ＩＶＳ−ＩＲＥＳ）は、高感度蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の共翻訳的な発現を媒介する。Ｂ．機能的膜断片上でのモノクローナルｓｃＦｖ  ＥＬＩＳＡにおけるｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の結合分析を示す図である。ＡＭＬ由来Ｋａｓｕｍｉ−１細胞（灰色のバー）への腫瘍結合活性を、健康な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、白色のバー）と比較した。Ｃ．Ｋａｓｕｍｉ−１細胞（灰色のバー）およびＰＢＭＣ（白色のバー）上のフルオロフォア標識ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇタンパク質のフローサイトメトリー結合分析を示す図である。バックグランド蛍光を差し引いた後、融合タンパク質の結合の割合をＦＬ−１チャンネル（４８８ｎｍ）で検出した。ＮＣ：陰性対照。星印は、ＰＢＭＣ対照に対する有意な差を示す。
【００６１】
内部移行の挙動
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質を標的細胞と共に３７℃で１時間インキュベートして内部移行させた。フローサイトメトリーで機能的結合活性を確認した後、トリプシン溶出により表面に結合したｓｃＦｖタンパク質を取り除き、蛍光プロファイルをもう一度チェックした。クローンＥＭＩ４０４、４０５、４０６、および４０７は依然として、エンドサイトーシスされたｓｃＦｖ融合タンパク質により生じるＦＬ−４で有意な蛍光シグナルを示した。対照的に、インキュベーションを４℃で行った場合、および標的細胞を非特異的４２５（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰ融合タンパク質とインキュベートした場合はいずれも、トリプシン溶出後にシグナルが検出されなかった（図３のＡ）。トリプシン処理後のシグナルを、表面結合ｓｃＦｖを溶出させる前のシグナルに対して標準化したところ、クローンＥＭＩ４０４の６８．７±３．５％、クローンＥＭＩ４０５の６６．２±９．９％、クローンＥＭＩ４０６の６５．５±２０．４％、およびクローンＥＭＩ４０７の１１．８±６．３％が、３７℃で１時間インキュベーション後に内部移行していた（図３のＢ）。分析は３回繰り返した。トリプシン溶出後、二次抗ＳＮＡＰ−ｔａｇ抗体で表面結合ｓｃＦｖ  ＳＮＡＰ−ｔａｇタンパク質は検出されなかった。本発明者らは、このアプローチを用いて、表面結合ｓｃＦｖが効率的に溶出されたこと、および検出された蛍光シグナルが内部移行したｓｃＦｖタンパク質によるものに間違いないことを確認した。
【００６２】
図３：ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の内部移行を示す図である。Ａ．フローサイトメトリーに基づくｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ内部移行アッセイ。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素標識ｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質をＫａｓｕｍｉ−１細胞とインキュベートし、ＦＬ−４チャンネルで蛍光シグナルを測定した（灰色のバー）。表面結合タンパク質のトリプシン溶出後、インキュベーションを３７℃で行った場合に蛍光シグナルの維持が観察され（黒色のバー）、ｓｃＦｖ融合タンパク質の内部移行が示された。４℃でインキュベートした場合、トリプシン溶出後に蛍光シグナルは検出されなかった（白色のバー）。Ｂ．３７℃で６０分間インキュベートした後の内部移行したｓｃＦｖ融合タンパク質の相対量。表面結合ｓｃＦｖコンストラクトの溶出後の蛍光シグナルは、トリプシン溶出前のシグナルに関連していた。星印は、４℃でのインキュベーションに対する有意な差を示す。
【００６３】
例として、クローンＥＭＩ４０５の内部移行パターンを共焦点顕微鏡でモニタリングした。標識ｓｃＦｖタンパク質は、上記と同じ条件下で、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞に特異的に結合して内部移行したが、一方、非特異的４２５（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰは蛍光シグナルを示さなかった。しかし、４℃でのインキュベーションにより、細胞質ゾル中への内部移行が阻害された（図４のＡ）。さらに、ＦＡＣＳ分析で内部移行の挙動を示すクローンを、Ｏｐｅｒａ生細胞撮像装置（ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｅｒ）で内部移行の動態について調べ、３７℃での最初の１５分間のインキュベーションにおける細胞内への取込みを観察した（図４のＢ）。
【００６４】
図４：共焦点顕微鏡によるｓｃＦｖ−ＳＮＡＰ−ｔａｇ融合タンパク質の結合および内部移行を示す図である。
Ａ．Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株について、共焦点画像を得た。細胞を１μｇのＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰ−６４７と共に、３７℃（ａ＋ｂ）または４℃（ｃ）で６０分間インキュベートした。表面結合タンパク質をトリプシンで溶出して、内部移行したｓｃＦｖタンパク質を検出した。陰性対照として、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞を、無関係の４２５（ｓｃＦｖ）−ＳＮＡＰと共に３７℃でインキュベートした（ｄ）。拡大率を白色のスケールバーで示す。
Ｂ：内部移行動態を生細胞撮像装置で観察した。Ｋａｓｕｍｉ−１細胞は、ＥＭＩ４０５、ＥＭＩ４０６、およびＥＭＩ４０７とインキュベートした場合、０分の時点でコロナ形（ｃｏｒｏｎａ‐ｓｈａｐｅｄ）の蛍光シグナルを示した（ａ）。細胞内蛍光小胞（白色の矢印）に示されるように、生理学的条件下で１５分間のインキュベーション後に細胞内への取込みが観察された（ｂ）。
【００６５】
組換え免疫毒素の細胞傷害性
フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法でｓｃＦｖ  ＥＭＩ４０５  ＳＮＡＰ融合タンパク質の内部移行の挙動を検証した後、ｓｃＦｖ挿入断片をｐＭＴ  ＥＴＡ’原核生物発現ベクターに導入してｓｃＦｖ−ＥＴＡ’融合タンパク質を作製した（図５のＡ）。免疫毒素の生産に成功し、これを９０％まで精製し、フローサイトメトリーで機能的結合活性について分析した（データ未掲載）。免疫毒素の量を増加させて標的細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１をインキュベート後、フローサイトメトリーによりその特異的結合を確認した（図５のＢ）。標的細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１および陰性対照としてのＫＧ−１を用いた比色ＸＴＴ細胞増殖アッセイに基づきその細胞傷害性効果を評価し、両細胞に対する非特異的４２５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’の効果と比較した。用量依存的な細胞成長阻害が観察され、ＩＣ５０値はＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’で２６５．２±０．２ｎＭであった（図５のＣ）。対照的に、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞の細胞生存率は、非特異的４２５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’および非内部移行性ｓｃＦｖ  ＥＭＩ４０８のいずれにも影響されなかった。さらに、ｓｃＦｖ  ＥＭＩ４０５は陰性対照細胞ＫＧ−１の細胞生存率に影響せず、これにより、標的細胞への限定的傷害性が実証された。
【００６６】
図５：ＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’融合タンパク質（配列番号４３）のコンストラクトおよび細胞生存率への影響を示す図である。
Ａ．ｐＥＴ由来発現カセットの模式図である。Ｔ７プロモーター（Ｔ７ｐ）およびＴ７転写終結配列（Ｔ７ｔ）の転写制御下で、ｐＭＴ−ｓｃＦｖベクターは、緑膿菌外毒素Ａの切断形変異体（ＥＴＡ’）にインフレームで連結された、ファージディスプレイにより選択されたｓｃＦｖをコードする。融合タンパク質は、Ｎ末端デカヒスチジンタグ（Ｈｉｓ１０）と共に発現され、ペクチン酸リアーゼＢ（ｐｅｌＢ）シグナルペプチドにより大腸菌の細胞膜周辺腔中に移動される。終止コドンＴＡＡがＣ末端ＥＴＡ’ドメインの直後に生じる。
【００６７】
Ｂ．用量依存的結合活性のフローサイトメトリーに基づく決定を示す図である。ＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’融合タンパク質の量を増加させて（１４ｆＭ〜４２０ｎＭ）Ｋａｓｕｍｉ−１細胞をインキュベートした。抗ＥＴＡ’モノクローナル抗体ＴＣ−１により表面結合分子を検出し（ＦＬ−１）、３回の独立した実験により、それらの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＬ−１チャンネルで測定した。
【００６８】
Ｃ．ＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’を用いてＸＴＴ細胞増殖アッセイを行った。Ｋａｓｕｍｉ−１細胞に対する融合タンパク質ＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’の細胞傷害性を決定した（■）。非結合ＫＧ−１細胞株を陰性対照として用いた（○）。ＰＢＳ（生存率１００％）およびＤＭＳＯ（生存率０％）とのインキュベーション後に生存細胞の割合を計算した。非線形回帰分析（シグモイド型用量反応）により半数阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。
【００６９】
アポトーシスの検出
アポトーシスは、アネキシンＡ５−ｅＧＦＰおよびヨウ化プロピジウムを用いて細胞を標識することにより分析した。本発明者らは、免疫毒素であるＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’に２４時間暴露した後のＫａｓｕｍｉ−１細胞上でのみ、結合アネキシンＡ５が時間依存的に増加することを示すことができた。非特異的４２５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’コンストラクトは、Ｋａｓｕｍｉ−１に影響を与えなかった（図６のＡ）。さらに、免疫毒素とのインキュベーション後のカスパーゼ３／７活性を２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間について調べた。Ｋａｓｕｍｉ−１サンプル中の代謝された前蛍光（ｐｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）カスパーゼ基質のシグナルを測定し、ＫＧ−１陰性対照細胞と比較した。９６時間後、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞では３３．０±１．４％が、陰性細胞株ＫＧ−１ではわずか０．６±０．１％がアポトーシス性であることが見出された（ｐ＜０．０００１）。アポトーシス性Ｋａｓｕｍｉ−１細胞の割合は、７２時間後に１５．９±０．６％、４８時間後に４．２±２．１％であり、同量の免疫毒素とインキュベートした場合の時間依存的増加が示された（図６のＢ）。ＰＢＳまたは非特異的４２５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡの添加は、細胞生存率に影響を与えなかった（未掲載データ）。実験は２回繰り返した。
【００７０】
図６：組換えＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’免疫毒素融合タンパク質のアポトーシス分析を示す図である。
（Ａ）アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ二重染色を用いたフローサイトメトリーに基づくアポトーシス細胞の検出。Ｋａｓｕｍｉ−１細胞を１μｇのＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’（ａ）、非結合性４２５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’（ｂ）、およびＰＢＳ（ｃ）で処理し、２４時間のインキュベート後に分析した。生存細胞が左下の四分画（Ｑｕａｄｒａｎｔ）に、初期アポトーシス細胞が右下の四分画（Ｑｕａｄｒａｎｔ）に、後期アポトーシス／壊死細胞が右上の四分画（Ｑｕａｄｒａｎｔ）に示される。
【００７１】
（Ｂ）棒グラフは、Ｋａｓｕｍｉ−１標的細胞（灰色のバー）およびＫＧ−１対照細胞（白色のバー）における、カスパーゼ３／７活性化に基づくアポトーシスの割合を示す。細胞を１μｇのＥＭＩ４０５（ｓｃＦｖ）−ＥＴＡ’で最大９６時間処理した。ＰＢＳとインキュベートした場合のバックグランドレベルを引いた後の結果を示す。＊＊＊：極めて有意。
【００７２】
参考文献
(1)  Abutalib, S. A., and Tallman, M. S. (2006) Monoclonal antibodies for the treatment of acute myeloid leukemia. Curr Pharm Biotechnol 7, 343-69.
(2)  American Cancer Society Cancer Facts & Figures 2013. http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-036845.pdf. Accession date: 2013
(3)  Stone, R. M. (2002) The difficult problem of acute myeloid leukemia in the older adult. CA Cancer J Clin 52, 363-71.
(4)  Mulford, D. (2008) Antibody therapy for acute myeloid leukemia. Semin Hematol 45, 104-9.
(5)  Pagel, J. M., Gooley, T. A., Rajendran, J., Fisher, D. R., Wilson, W. A., Sandmaier, B. M., Matthews, D. C., Deeg, H. J, Gopal, A. K., Martin, P. J., Storb, R. F., Press, O. W., and Appelbaum, F. R. (2009) Allogeneic hematopoietic cell transplantation after conditioning with 131I-anti-CD45 antibody plus fludarabine and low-dose total body irradiation for elderly patients with advanced acute myeloid leukemia or high-risk myelodysplastic syndrome. Blood 114, 5444-53.
(6)  Bunjes, D., Buchmann, I., Duncker, C., Seitz, U., Kotzerke, J., Wiesneth,
M., Dohr, D., Stefanic, M., Buck, A., Harsdorf, S. V., Glatting,, G., Grimminger, W., Karakas, T., Munzert, G., Dohner, H., Bergmann, L., and Reske, S. N. (2001) Rhenium 188-labeled anti-CD66 (a, b, c, e) monoclonal antibody to intensify the conditioning regimen prior to stem cell transplantation for patients with high-risk acute myeloid leukemia or myelodysplastic syndrome: results of a phase I-II study. Blood 98, 565-72.
(7)  ten Cate, B., Bremer, E., de Bruyn, M., Bijma, T., Samplonius, D., Schwemmlein, M., Huls, G., Fey, G., and Helfrich, W. (2009) A novel AML-selective TRAIL fusion protein that is superior to Gemtuzumab Ozogamicin in terms of in vitro selectivity, activity and stability. Leukemia 23, 1389-97.
(8)  Pfizer Voluntarily Withdraws Cancer Treatment Mylotarg from U.S. Market. http ://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm216448.htm. Accession date: 11.10.2011
(9)  Frankel, A. E., Sievers, E. L., and Scheinberg, D. A. (2000) Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review. Cancer Blather Radiopharm 15, 459-76.
(10)  Kampmeier, F., Ribbert, M., Nachreiner, T., Dembski, S., Beaufils, F., Brecht, A., and Barth, S. (2009) Site-Specific, Covalent Labeling of Recombinant Antibody Fragments via Fusion to an Engineered Version of 6-O-Alkylguanine DNA Alkyltransferase. Bioconjug Chem 20, 1010-5.
(11)  Fitting, J., Killian, D., Junghanss, C., Willenbrock, S., Murua Escobar, H., Lange, S., Nolte, I., Barth, S., and Tur, M. K. (2011) Generation of recombinant antibody fragments that target canine dendritic cells by phage display technology. Vet Comp Oncol 9, 183-95.
(12)  Tur, M. K., Rothe, A., Huhn, M., Goerres, U., Klimka, A., Stocker, M., Engert, A., Fischer, R., Finner, R., and Barth, S. (2003) A novel approach for immunization, screening and characterization of selected scFv libraries using membrane fractions of tumor cells. Int J Mol Med 11, 523-7.
(13)  Stocker, M., Tur, M. K., Sasse, S., Krussmann, A., Barth, S., and Engert, A. (2003) Secretion of functional anti-CD30-angiogenin immunotoxins into the supernatant of transfected 293T-cells. Protein Expr Purif 28, 211-9.
(14)  Benedict, C. A., MacKrell, A. J., and Anderson, W. F. (1997) Determination of the binding affinity of an anti-CD34 single-chain antibody using a novel, flow cytometry based assay. J Immunol Methods 201, 223-31.
(15)  Tur, M. K., Huhn, M., Thepen, T., Stocker, M., Krohn, R., Vogel, S., Jost, E., Osieka, R., van de Winkel, J. G., Fischer, R., Finnern, R., and Barth, S. (2003) Recombinant CD64-specific single chain immunotoxin exhibits specific cytotoxicity against acute myeloid leukemia cells. Cancer Res 63, 8414-9.
(16)  Tur, M. K., Huhn, M., Jost, E., Thepen, T., Brummendorf, T. H., and Barth, S. (2011) In vivo efficacy of the recombinant anti-CD64 immunotoxin H22(scFv)ETA' in a human acute myeloid leukemia xenograft tumor model. Int J Cancer 129, 1277-82.
(17)  Barth, S., Huhn, M., Matthey, B., Klimka, A., Galinski, E. A., and Engert, A. (2000) Compatible-solute-supported periplasmic expression of functional recombinant proteins under stress conditions. Appl Environ Microbiol 66, 1572-9.
(18)  Barth, S., Huhn, M., Matthey, B., Tawadros, S., Schnell, R., Schinkothe, T., Diehl, V., and Engert, A. (2000) Ki-4(scFv)-ETA', a new recombinant anti-CD30 immunotoxin with highly specific cytotoxic activity against disseminated Hodgkin tumors in SCID mice. Blood 95, 3909-14.
(19)  Tur, M. K., Neef, I., Jager, G., Teubner, A., Stocker, M., Melmer, G., and Barth, S. (2009) Immunokinases, a novel class of immunotherapeutics for targeted cancer therapy. Curr Pharm Des 15, 2693-9.
(20)  Kabat, E. A., and Wu, T. T. (1991) Identical V region amino acid sequences and segments of sequences in antibodies of different specificities. Relative contributions of VH and VL genes, minigenes, and complementarity-determining regions to binding of antibody-combining sites. J Immunol 147, 1709-19.
(21)  Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., and Schwede, T. (2006) The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 22, 195-201.
(22)  Schwede, T., Kopp, J., Guex, N., and Peitsch, M. C. (2003) SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res 31, 3381-5.
(23)  Guex, N., and Peitsch, M. C. (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18, 2714-23.
(24)  Chothia, C., and Lesk, A. M. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol 196, 901-17.
(25)  Chothia, C., Lesk, A. M., Tramontano, A., Levitt, M., Smith-Gill, S. J., Air, G., Sheriff, S., Padlan, E. A., Davies, D., Tulip, W. R., and et al. (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-83.
(26)  Stone, R. M., O'Donnell, M. R., and Sekeres, M. A. (2004) Acute myeloid leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 98-117.
(27)  Tallman, M. S. (2005) New strategies for the treatment of acute myeloid leukemia including antibodies and other novel agents. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 143-50.
(28)  Khandare, J. J., and Minko, T. (2006) Antibodies and peptides in cancer therapy. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 23, 401-35.
(29)  Becerril, B., Poul, M. A., and Marks, J. D. (1999) Toward selection of internalizing antibodies from phage libraries. Biochem Biophys Res Commun 255, 386-93.
(30)  Barth, S., Winkler, U., Diehl, V., and Engert, A. (1997) [Immunotoxins. Mechanism of action and applications in malignant diseases]. Internist (Berl) 38, 1063-9.
(31)  Hetzel, C., Bachran, C., Tur, M. K., Fuchs, H., and Stocker, M. (2009) Improved immunotoxins with novel functional elements. Curr Pharm Des 15, 2700-11.
(32)  Stish, B. J., Chen, H., Shu, Y., Panoskaltsis-Mortari, A., and Vallera, D. A. (2007) Increasing anticarcinoma activity of an anti-erbB2 recombinant immunotoxin by the addition of an anti-EpCAM sFv. Clin Cancer Res 13, 3058-67.
(33)  Schmidt, M. M., Thurber, G. M., and Wittrup, K. D. (2008) Kinetics of anticarcinoembryonic antigen antibody internalization: effects of affinity, bivalency, and stability. Cancer Immunol Immunother 57, 1879-90.
(34)  Hetzel, C., Bachran, C., Fischer, R., Fuchs, H., Barth, S., and Stocker, M. (2008) Small cleavable adapters enhance the specific cytotoxicity of a humanized immunotoxin directed against CD64-positive cells. J Immunother 31, 370-6.
(35)  Stahnke, B., Thepen, T., Stocker, M., Rosinke, R., Jost, E., Fischer, R., Tur, M. K., and Barth, S. (2008) Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther 7, 2924-32.
【図１】
2016534051.tif 000005
【図２】
2016534051.tif 000006
【図３】
2016534051.tif 000007
【図４】
2016534051.tif 000008
【図５−１】
2016534051.tif 000009
【図５−２】
2016534051.tif 000010
【図６】
2016534051.tif 000011
【配列表】
2016534051000001.app
【国際調査報告】
2016534051.tif 000012
2016534051.tif 000013
2016534051.tif 000014