(57)【要約】  本発明は、電荷変異体の所望のプロファイルを有するモノクローナル抗体の相当量を得るための、改良された方法を提供する。  本方法は、最初に適切な温度で哺乳動物細胞を培養し、その後、温度を低下させ、必要に応じて、所望の分子の産生の間、適切なアミノ酸を同時添加することを含む。  本発明はまた、上記の改良された方法で産生された、グリカンの所望のプロファイルを有する抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修正された細胞培養法を用いて、所望のグリカンおよび／または電荷変異体プロファイルを有する抗体を生産する方法であって、当該方法は以下の：
ａ）一定の間隔で適切な温度条件での細胞培養条件を維持し、
ｂ）当該方法の間において、一定の間隔で、同時にまたは連続的に、培地に特定のアミノ酸を添加する
を含む、前記方法。
【請求項２】
細胞培養法が、細胞培養の産生条件を適切な温度、すなわち細胞培養プロセスの間に固定された温度で又は段階的に低下された温度、で維持することにより特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
適切な温度条件は、第１の温度条件で対数期までの細胞成長、それに続き第二温度で、そして場合により当該方法の終わりまで第３温度条件で細胞培養条件を維持することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の温度条件は、第２の温度よりも、場合により第３の温度条件よりも高い温度に維持される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の温度条件は約３７℃であり、第２の温度条件、必要に応じて第３の温度条件は、３５℃〜３０℃の範囲である、請求項２〜５に記載の方法。
【請求項６】
細胞培養法の間に、アミノ酸を、所定の濃度および所定の時間間隔で、細胞培養培地に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸の添加は、細胞培養法の間に、少なくとも２つの異なる時間間隔で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養培地へのアミノ酸の添加を、毎回１０ｍＭ未満の濃度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸は、アミド基含有および塩基性のアミノ酸、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
グルコースの濃度を０．５ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌの範囲で維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
重炭酸塩、炭酸ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝液から選ばれる適切な緩衝剤を用いて、ｐＨをｐＨ６〜ｐＨ７．５の範囲で維持する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞の生産性は、０．５ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは１〜４ｇ／Ｌである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞生存率は少なくとも３０％以上、好ましくは約８０％、より好ましくは９５％を超えて維持される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗体は、抗ＨＥＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体および抗ＣＤ２０抗体から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよびリツキシマブから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電荷変異体の所望のプロファイルを有するモノクローナル抗体の相当量を得るための、改良された方法に関する。一実施形態では、この方法はまた、グリカンの所望のプロファイルを有する抗体を提供する。本方法は、最初に適切な温度で、哺乳動物細胞を培養し、その後、温度を低下させることを含む。必要に応じて、所望の分子の産生の間に、適切なアミノ酸を同時に添加する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、大きく複雑な分子である。これらは、生物学的活性を維持するために、それらの未変性コンホメーションであることが要求される。さらに、溶液中の高濃度タンパク質分子は、保管中に経時的に凝集または分解または特定の修飾を受けやすい。一態様において、本発明は、所望の品質の生成物、好ましくは、モノクローナル抗体をより多く得るための、改良された方法を提供する。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、標的抗原に結合するという高度の特異性、標的抗原に対する免疫応答を開始する能力および長い血清持続性により、治療薬として大きな注目を集めている。多くのモノクローナル抗体が腫瘍特異抗原に対して指向されている。帯電性およびグリカン構造のような、各々の免疫グロブリンのいくつかの固有の特徴は、作用機構に重要かつ特異的であることが見出されている。多くの他のタンパク質のようなモノクローナル抗体は、電荷の不均一性を有しており、この不均一性は、静電相互作用を最適化し、それらの構造、安定性、化学的および生物学的特性を調節する。産生中、分解、修飾または様々な酵素プロセスにより、さまざまな形態の微小不均一性が発生する。化学的不安定性または物理的不安定性により、タンパク質が分解する。化学的不安定性は、主に、脱アミド、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離またはジスルフィド交換の結果、生じうる。化学的不安定性は、さまざまな電荷変異体の形成を引き起こし、そして生体分子の性質を改変する。脱アミド化およびシアリル化のような化学修飾は、それぞれ、ｍＡｂ上での正味の負電荷の増加をもたらし、ｐｉ値の減少を引き起こす。酸性変異体の生成の他の機構が、従来技術において知られている。脱アミド化されたアイソフォームは、活性の損失ととともに劣化の影響を受けやすく、したがって、それは、モノクローナル抗体タンパク質の安定性だけではなく、活性にも大きな影響を与える。
【０００３】
同様に、Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシル化は、免疫グロブリンおよび他のＦｃ含有分子の抗体のエフェクター機能を調節する。Ｆｃグリカンは、抗体の機能に影響を与える末端糖のいくつかの異なるタイプを含むことができる。末端ガラクトシル化の効果は、当業者に知られている。異なる免疫グロブリンのガラクトシル化パターンは、このような免疫グロブリンにおいて製品固有の多様性を示している。末端ガラクトシル化のばらつきが、抗原に結合する抗体に影響を与え、分子のＣＤＣ活性に大きな影響を与えることに注意することが重要である。一方、アフコシル化がＡＤＣＣ活性に非常に重要であるのに対し、ガラクトシル化の様々な程度は、ＡＤＣＣ活性にはあまり影響を与えないことが知られている。
【０００４】
モノクローナル抗体のいくつかの産生方法が従来知られている。このような方法は、温度の低下などと共に、オスモル濃度の維持、塩の添加を含む。
【０００５】
ＵＳ５７０５３６４には、培地のオスモル濃度を約２５０〜約６００ｍＯｓｍで維持し、培地の温度を約３０℃〜３５℃の間で維持しながら、培養物に、アルカン酸またはその塩を、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で添加することによって、糖タンパク質のオリゴ糖側鎖上に存在するシアル酸の量を制御する、細胞培養方法が開示されている。
【０００６】
ＵＳ５９７６８３３は、動物細胞による有用物質の産生において生産性を向上させるための方法を提供する。これは、所望の物質を生成するための、動物細胞の培養方法を開示しており、以下のステップを含む。（１）動物細胞が成長することができる温度で、動物細胞を培養し、そして、（２）より低温で動物細胞を培養する。
【０００７】
ＷＯ２０１４０３５４７５には、組み換え−発現タンパク質のオリゴ糖分布を制御するための方法が開示されている。この方法は、酵母加水分解物の補充や植物加水分解物の補充とともに、前記タンパク質の組換え発現に使用される細胞培養培地を補充することを含む。それはまた、細胞培養培地のアスパラギンアミノ酸の濃度を調節することにより、抗体のオリゴ糖の分布を制御する方法を開示している。これに対し、本発明では、培養培地中で、このような加水分解物の補充を必要としない。
【０００８】
モノクローナル抗体の産生のための種々の方法の利用可能性があるが、それでも、モノクローナル抗体産生のための細胞培養方法を確立する必要がある。それは、有意なバッチ間の変動なしに、電荷変異体およびグリカンプロファイルの所望のレベルを一定に生成する。このような方法は、また、所望の電荷および／またはグリカンプロファイルを有するモノクローナル抗体タンパク質を得るのに役立つ。本発明は、修正された細胞培養法を用いたモノクローナル抗体の産生方法のような、改良された方法を提供する。本発明による方法では、塩の添加または適切な浸透圧濃度の維持のいずれかが含まれていない。本発明は、グリカンおよび帯電変異体の所望のプロファイルを有するモノクローナル抗体の産生のための新規な方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、修正された細胞培養法を用いて、グリカンおよび電荷変異体の所望のプロファイルを有する、相当量のモノクローナル抗体を得るための、改良された方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、細胞培養方法は、細胞培養プロセスの間に、一度にまたは段階的のいずれかで、種々の温度での細胞培養の生産条件を維持することを特徴とする。
【００１１】
他の態様において、本発明は、増殖期で初期高温とし、続いて、中期対数期から後期対数期の間または静止期の間のいずれかで、培養系の温度をより低い第２の温度まで低下させる産生工程を実施することにより、モノクローナル抗体の改良された産生方法を提供する。
【００１２】
他の態様において、本発明は、中期対数期から後期対数期の間または静止期の間のいずれかで、培養系中に適切なアミノ酸を供給することにより、モノクローナル抗体の産生のための当技術分野の改良された産生方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明のアミノ酸は、細胞培養プロセス中に、特定の濃度および特定の時間間隔で、細胞培養培地に添加される。
【００１４】
好ましい実施形態において、アミノ酸は、グルタミンおよびアスパラギンまたはそれらの組み合わせから選択される。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、増殖期の初期高温で処理を行い、その後、中期対数期から後期対数期の間または静止期の間のいずれかで、培養系の温度を、初期温度よりも低い第２の温度に低下させるとともに、培養培地にアミノ酸を同時供給することにより、グリカンおよび電荷変異体の所望のプロファイルを有する相当量のモノクローナル抗体を得るための、改良された上流の方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明のアミノ酸は、アミド基含有および塩基性アミノ酸、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００１７】
好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、抗ＨＥＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体および抗ＣＤ２０抗体から選択される。
【００１８】
より好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよびリツキシマブから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＨＰ−ＩＥＣによる、精製アダリムマブタンパク質の電荷変異体プロファイルを示す。
【図２】ＣＥ−ＬＩＦによる、精製アダリムマブタンパク質のグリカンプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一実施形態において、増殖期に初期高温で産生工程を行い、その後、中期対数期から後期対数期の間または静止期の間のいずれかで、一度にまたは段階的に培養系の温度を低下させることにより、本発明は、タンパク質の所望のグリカンプロファイルを維持しながら、電荷変異体の所望のプロファイルを有するモノクローナル抗体の産生方法を提供する。
【００２１】
さらなる実施形態において、細胞培養方法は、細胞培養プロセスの間に、一度にまたは段階的に、のいずれかで、種々の温度で細胞培養の生産条件を維持することを特徴とする。
【００２２】
他の実施形態において、好ましくは、アミド基含有アミノ酸および／または塩基性アミノ酸のような、適切なアミノ酸を培養系に供給することによって、本発明は、所望のグリカンプロファイルを有する、相当量のモノクローナル抗体の産生方法を提供する。このようなアミノ酸は、中期対数期から静止期の間、任意の段階で供給することができる。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明では、アミノ酸は、細胞培養プロセス中に、特定の濃度および特定の時間間隔で、細胞培養培地に添加される。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明では、アミノ酸の添加は、細胞培養プロセス中に、少なくとも２つの異なる時間間隔で行われる。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明では、細胞培養培地へのアミノ酸の添加は、各回、２０ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ未満の濃度で行われる。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明は、増殖期に初期高温で処理を行い、その後、中期対数期から後期対数期の間または静止期の間のいずれかで、培養系の温度を、初期温度よりも低い第２の温度に低下させ、同時に、培養系へのアミノ酸を供給することより、グリカンおよび電荷変異体の所望のプロファイルを有する相当量のモノクローナル抗体を提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明のアミノ酸は、アミド基含有および塩基性アミノ酸、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００２８】
一般的に、培養系の初期高温は３７℃に維持される。本発明の培養系の温度は、中期対数期から静止期の間のいずれかの段階で、一度に又は特定の時間間隔で段階的に３０℃まで低下させることができる。本発明による方法は、グリカンと電荷変異体の所望のプロファイルを有するモノクローナル抗体の相当量を提供する。さらに、この方法では、モノクローナル抗体の所望のグリカンプロファイルを維持する。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、中期対数期から静止期の間に、任意の段階で、培養系にグルタミン及び／又はアスパラギンのような適切なアミノ酸を供給することにより、タンパク質、好ましくはモノクローナル抗体の所望のグリカンプロファイルを提供する。
アミノ酸の添加量は、１〜４ｍＭ、好ましくは２〜３ｍＭの範囲である。本発明では、産生中の細胞培地へのグルタミンおよび／またはアスパラギンを供給することによって、モノクローナル抗体のタンパク質構造における製品固有の方法で、所望のグリカン部分の形成を増強することが見出された。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明は、増殖期に初期高温で処理を行い、そしてその後、中期対数期から後期対数期の間または静止期に、培養系の温度をより低い第２の温度まで低下させ、そして、所望のタンパク質の産生時に、適切なアミノ酸（グルタミン及び／又はアスパラギン）を添加することにより、所望のグリカンプロファイルおよび電荷変異体を有するモノクローナル抗体の相当量の生成物を提供する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、所望のグリカンプロファイルおよび電荷変異体を有する抗体の産生方法を提供する。ここでグルコース濃度は０．５ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは約２．５ｇ／Ｌに維持されている。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、グリカンおよび電荷変異体の所望のプロファイルを有する抗体の産生方法を提供する。ここで、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝液から選択される適切な緩衝液を用いて、産生中のｐＨをｐＨ６〜ｐＨ７．５の範囲内に維持する。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明は、グリカンおよび電荷変異体の所望のプロファイルを有する抗体の産生方法を提供する。ここで細胞の生産性は、０．５ｇ／Ｌ以上、好ましくは１〜４ｇ／Ｌに維持される。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、グリカンおよび電荷変異体の所望のプロファイルを有する抗体の産生方法を提供する。ここで、細胞生存率は３０％以上、好ましくは約８０％、より好ましくは９５％より大きく維持される。
【００３５】
より好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよびリツキシマブから選択される。
【００３６】
定義
●グリカン−用語グリカンは、多糖又はオリゴ糖を指す。グリカンは、単糖残基のホモまたはヘテロポリマーであってもよく、直鎖状または分枝状であってもよい。グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を参照するために使用されてもよい。
【００３７】
●所望のグリカンプロファイル−これは、その生物学的活性に必須であるタンパク質に結合する、様々なグリカン分子の分布パターンとして定義することができる。
【００３８】
●中期対数期−これは、細胞集団が指数関数的に増加する間、培養培地中の細胞の増殖期と定義される。この期は、細胞集団の対数値を時間に対してプロットしたときに、成長曲線のうち直線部分によって表され、対数増殖期と呼ばれる。また、その中間点は、中期対数期と呼ばれている。
【００３９】
●後期対数期−これは、前の静止期への転移に先立ち、後期対数期における細胞の増殖期と定義される。この期は、細胞集団の対数値を時間に対してプロットしたとき、成長曲線の直線部分として表示される対数期と呼ばれ、およびその最終期は後期対数期と呼ばれている。
【００４０】
●静止期−培養培地中の細胞の増殖対数期の後に成長曲線が安定し、その時点での細胞集団が一定のままで、静止期と呼ばれる。古い細胞が死滅するのと同じ速さで新しい細胞が産生されている。
【００４１】
●電荷変異体−これは、静電相互作用を最適化し、それらの構造、安定性、化学的および生物学的特性を調節するタンパク質の特異的な特性である。これは、タンパク質分子上に帯電したアミノ酸の特定の分布に起因して、タンパク質によって異なる。
【００４２】
本発明で使用される分析方法：
高圧イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰ−ＩＥＣ）：
精製したモノクローナル抗体、例えばアダリムマブの異なる電荷変異体の分離は、分析ＨＰ−弱陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる。カラムは、ｐＨ６．９（移動相Ａ）のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化される。前記タンパク質の電荷変異体の溶出は、０．５ｍＬ／分で、移動相Ａにおける塩濃度（塩化ナトリウム）を増加することによって行われる。
【００４３】
キャピラリー電気泳動−レーザ誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）：
精製したモノクローナル抗体（例えばアダリムマブ）調製物のグリカン分析（グリコシル化変異体）は、ＰＮＧアーゼ処理により前記タンパク質の炭水化物部分を単離した後に、ＣＥ−ＬＩＦ法によって行われる。
酵素処理に続いて、炭水化物（グリカン）部分がＡＰＴＳ（８−アミノピレン１，２，６−トリスルホネート）により標識され、そして誘導体化されたグリカンは、その後、毛細管システム（Ｎ−ＣＨＯで被覆；５０ｃｍ×５０μｍ）によって、流体力学的サイズに基づいて分離される。
グリカンは、４８８ｎｍでの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を有するＬＩＦ検出器により検出された標識グルコースラダー標準に対して、識別される。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体の産生方法の好ましい方法は、以下の実施例により以下に例示されるが、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４５】
実施例１
抗−ＴＮＦα抗体アダリムマブを発現する哺乳動物細胞を、標準的な分子生物学技術によって生成した。均質な集団由来の単一細胞を得るために、クローンの限界希釈を行った。細胞は、細胞バンクの形で凍結保存し、さらなる成長のために使用した。細胞を復活させ、接種材料開発の一連の工程を用いて増殖し、適切な増殖培地を含む生物反応器に接種した。細胞培養は、必要に応じて、ＣＯ2ガスおよび／または重炭酸ナトリウムを使用してｐＨ７．２±０．４に維持制御された環境で行った。空気および／または酸素ガスを噴霧し、生物反応器の撹拌速度を制御することによって、溶存酸素濃度を４０±２０％飽和で維持した。温度を３７℃に制御した。増殖培地には、次のコンポーネントが含まれている。
【００４６】
成分 濃度
ＣＨＯ増殖粉末培地                      １９．８ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム                      ２．２  ｇ／Ｌ
Pluronic F-6t8                          １．２  ｇ／Ｌ
【００４７】
細胞を２日間、上記の条件の下で成長させた。３日目からは、供給を開始し、バッチの終わりまで続けた。次の培地コンポーネントは、共通の供給として細胞培養培地に供給した。
【００４８】
成分 １Lあたりの濃度
ＣＨＯ基礎粉末培地                      １３８．９ｇ
インスリン                                  ５０ｍｇ
液体添加液                                  １×濃度
クエン酸酸化鉄                              １×濃度
ポリエチレングリコール                    ２２０ｍｇ
炭酸水素ナトリウム                        １０．８ｇ
【００４９】
培養の１３及び１８日目の間にバッチを採取した。細胞を浄化した後、アダリムマブを含む上澄みを、次の精製カラム平衡条件と実質的に一致するように再調整した。所望のタンパク質を十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。ここで例示した方法は、任意の所望の抗体のために使用することができる。
【００５０】
実施例２
アダリムマブについて、３７℃から３５℃まで温度を低下させることの効果：
実験は３０Ｌの生物反応器内で行った。成長条件は、培養系の温度条件を除いて、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。後期対数期において、培養系の温度を３７℃から３５℃に低下させた。アダリムマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００５１】
実施例３
アダリムマブについて、グルタミン供給の効果：
実験は３０Ｌの生物反応器内で行った。成長条件は、培養系にグルタミンアミノ酸を供給することを除いて、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。２ｍＭのグルタミンを、細胞増殖の中期対数期で供給を開始し、産生が終了するまで、特定の間隔で続けた。
【００５２】
アダリムマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００５３】
実施例４
アダリムマブについて、温度の低下およびグルタミン供給の効果：
実験は３０Ｌの生物反応器内で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。中期対数期の間に、培養系の温度を３７℃から３５℃に低下させた。その後さらに、対数期から静止期への移行中に、培養系の温度を３３℃まで低下させた、３ｍＭグルタミンの供給は、中期対数期で開始し、所望のモノクローナル抗体の産生が終了するまで、特定の間隔で継続した。
【００５４】
アダリムマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００５５】
実施例５
トラスツズマブについて、グルタミンの供給なしで、温度３７℃での培養の効果：
実験は、生物反応器中で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。培養系の温度は、バッチ全体を通して３７℃に維持した。最初のバッチ培地にグルタミンを供給し、それ以外の追加供給はしなかった。
【００５６】
トラスツズマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００５７】
実施例６
トラスツズマブについて、３７℃から３３℃まで温度を低下させることの効果：
実験は、生物反応器中で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。対数期から静止期への移行の間に、培養系の温度を３７℃から３３℃に低下させた。２ｍＭグルタミンの供給は、中期対数期で開始し、所望のモノクローナル抗体の産生が終了するまで特定の間隔で継続した。
【００５８】
トラスツズマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００５９】
実施例７
ベバシズマブについて、グルタミンを供給せずに３７℃から３５℃に温度を低下させることの効果：
実験は、３０Ｌの生物反応器（培養フラスコ）中で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。対数期から静止期への移行の間に、培養系の温度を３７℃から３５℃に低下させた。最初のバッチ培地にグルタミンを供給し、それ以外の追加供給はしなかった。
【００６０】
ベバシズマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００６１】
実施例８
ベバシズマブについて、グルタミンを供給し、および、バッチを通して３７℃での培養の効果：
実験は、生物反応器中で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。培養系の温度は、バッチ全体を通して３７℃に維持した。４ｍＭグルタミンの供給は、中期対数期で開始し、所望のモノクローナル抗体の産生が終了するまで特定の間隔で継続した。
【００６２】
ベバシズマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００６３】
実施例９
リツキシマブについて、グルタミンを供給せずに、バッチを通して３７℃での培養の効果：
実験は、生物反応器中で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。培養系の温度は、バッチ全体を通して３７℃に維持した。最初のバッチ培地にグルタミンを供給し、それ以外の追加供給はしなかった。
リツキシマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００６４】
実施例１０
リツキシマブについて、グルタミンを供給し、バッチを通して３７℃での培養の効果：
実験は、生物反応器中で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。培養系の温度は、バッチ全体を通して３７℃に維持した。４ｍＭグルタミンの供給は、中期対数期で開始し、所望のモノクローナル抗体の産生が終了するまで特定の間隔で継続した。
【００６５】
リツキシマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表Ｉ及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００６６】
実施例１１
トラスツズマブについて、グルタミンを供給し、バッチ全体を通して３７℃での培養の効果：
実験は、３０Ｌの生物反応器（２００Ｌの生物反応器）で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。培養系の温度は、バッチ全体を通して３７℃に維持した。２ｍＭグルタミンの供給は、中期対数期で開始し、所望のモノクローナル抗体の産生が終了するまで特定の間隔で継続した。
【００６７】
トラスツズマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
【００６８】
実施例１２
トラスツズマブについて、グルタミンを供給せずに、３７℃から３５℃まで温度を低下させることの効果：
実験は、３０Ｌの生物反応器（培養フラスコ）で行った。成長条件は、温度条件及びグルタミンを培養系に供給したこと以外は、共通の供給培地および他のプロセスパラメータを含んで実施例１と同様であった。対数期から静止期への移行の間に、培養系の温度を３７℃から３５℃に低下させた。最初のバッチ培地にグルタミンを供給し、それ以外の追加供給はしなかった。
【００６９】
トラスツズマブを十分なレベルまで精製し、それぞれ表１及び表２に示すように、電荷変異体およびグリカンプロファイルを、ＨＰ−ＩＥＣおよびＣＥ−ＬＩＦにより分析した。
（結果）
【００７０】
【表１】
2016526385.tif 000002
【００７１】
【表２】
2016526385.tif 000003
【００７２】
得られた生成物は、続いて精製され、当技術分野で公知の技術により適切に製剤化される。
【図１】
2016526385.tif 000004
【図２】
2016526385.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月6日(2015.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修正された細胞培養法を用いて、生物活性に必須であるグリカンおよび／または電荷変異体プロファイルを有する抗体を生産する方法であって、当該方法は以下の：
ａ）増殖フェーズから定常フェーズの間、３０℃〜３７℃の温度条件で、細胞培養条件を維持し、
ｂ）当該方法の間において、増殖フェーズから定常フェーズの間、同時にまたは連続的に、培地にアミノ酸を添加すること
を含み、ここで、抗体は、抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体及び抗CD20抗体から選ばれる、前記方法。
【請求項２】
細胞培養法が、細胞培養の産生条件を、細胞培養法の間、３０〜３７℃の間の温度で、固定された温度で又は段階的に低下された温度で、維持することにより特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
適切な温度条件は、第１の温度条件で対数期までの細胞増殖、それに続き第二温度で、そして場合により当該方法の終わりまで第３温度条件で細胞培養条件を維持することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の温度条件は、第２の温度よりも、場合により第３の温度条件よりも高い温度に維持される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の温度条件は約３７℃であり、第２の温度条件、必要に応じて第３の温度条件は、３５℃〜３０℃の範囲である、請求項２〜５に記載の方法。
【請求項６】
細胞培養法の間に、アミノ酸添加を、少なくとも２の異なる間隔で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞培養培地へのアミノ酸の添加を、毎回１０ｍＭ未満の濃度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸は、アミド基含有塩基性アミノ酸、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
グルコースの濃度を０．５ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌの範囲で維持する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝液から選ばれる適切な緩衝剤を用いて、ｐＨをｐＨ６〜ｐＨ７．５の範囲で維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の生産性は、０．５ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは１〜４ｇ／Ｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞生存率は少なくとも３０％以上、好ましくは約８０％、より好ましくは９５％を超えて維持される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブおよびリツキシマブから選択される、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2016526385.tif 000006
2016526385.tif 000007
2016526385.tif 000008