(57)【要約】  本発明は、治療上、代謝上、化粧上、または構造上、関心のある作用物質（「ＡＯＩ」）の局所投与で使用するためのベシクル製剤、及びＡＯＩの投与方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質と界面活性剤と関心のある作用物質（ＡＯＩ）とを含むベシクル製剤であって、
各ＡＯＩ分子の一部がベシクルの外側にあり、ベシクル膜の外にあるよう前記ＡＯＩがベシクルの成分に結合される、前記ベシクル製剤。
【請求項２】
前記ＡＯＩが前記ベシクルの界面活性剤成分に結合する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ＡＯＩが前記ベシクルの脂質成分に結合する、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
ベシクルの界面活性剤成分及び脂質成分双方が、それらに結合するＡＯＩを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
単一のＡＯＩがベシクル成分に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
複数のＡＯＩがベシクル成分に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
前記結合が共有結合である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
前記ＡＯＩが均質である、請求項６に記載の製剤。
【請求項９】
前記ＡＯＩが不均質である、請求項６に記載の製剤。
【請求項１０】
前記ＡＯＩが元素、イオン、無機塩、小分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、微量栄養素、高分子または大環状分子から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ＡＯＩが、皮膚の構造タンパク質（たとえば、エラスチンまたはコラーゲン）、治療用タンパク質、炭水化物、発色団含有の高分子（たとえば、ポルフィリン）、ビタミン、金属または金属塩、非金属元素または非金属塩、メラニンまたはメラニン類似体、または抗炎症剤（たとえば、ＮＳＡＩＤ）から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
患者の皮膚を介してＡＯＩを送達するのに使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１３】
前記製剤が局所に塗布される、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
患者の皮膚を介したＡＯＩの送達方法であって、前記方法が、皮膚に浸透してＡＯＩを送達するのに十分な量にて請求項１〜１１のいずれか１項に記載のベシクル製剤を患者の皮膚に局所で塗布することを含む、前記送達方法。
【請求項１５】
前記ベシクル製剤が、それぞれ異なるＡＯＩを伴った、請求項８〜１１に記載のものであり、または請求項１〜６または１０または１１に記載のベシクルの混合物を含む製剤である、請求項１４に記載のＡＯＩの送達方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製剤の作製方法であって、前記方法が、ＡＯＩの一部がベシクルの外側にあり、ベシクル膜の外にあるようにＡＯＩをベシクル成分に連結することを含む、前記作製方法。
【請求項１７】
疾患を治療するのに使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のベシクル製剤。
【請求項１８】
スキンケアまたは化粧品で使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のベシクル製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療上、代謝上、化粧上または構造上関心のある作用物質（「ＡＯＩ」）の局所投与での使用のためのベシクル製剤及びＡＯＩの投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＳ６，１６５，５００は、特に皮膚及び類似の物質のような天然のバリアの中に及びそれを通って作用物質を輸送するための、両親媒性分子または両親媒性キャリア物質の一層または数層から成る膜様構造が提供される作用物質の塗布にための調製を記載している。これらのＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ（商標）（トランスファーサム）は、１または幾つかの成分、最も一般的には基本物質と１または幾つかの末端活性物質と作用物質との混合物から成る。
【０００３】
ＵＳ２００４／００７１７６７は、薬学上許容可能な媒体に懸濁された少なくとも３つの両親媒性成分を伴った複雑な凝集体に基づいた非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の製剤を記載している。
【０００４】
ＵＳ２００４／０１０５８８１は、特に、凝集体によるバリア浸透によって生体内で非侵襲性の薬剤を適用するための、好適な液状媒体に懸濁可能であり、少なくとも３つの両親媒性物質（両親媒性成分）を含み、皮膚のような半透過性バリアを通る活性物質の輸送を改善することが可能である拡張表面凝集体を記載している。ＷＯ２０１０／１４００６１は深部組織疼痛の治療のための「空の」ベシクル製剤の使用を記載している。ＷＯ２０１１／０２２７０７は脂肪酸欠乏に関連する障害、及びとりわけ、炎症に関連する障害を治療するための「空の」ベシクルの他の製剤の使用を記載している。治療実体を連結することができるベシクル製剤はＷＯ２０１１／０２２７０７及びＷＯ２０１０／１４００６１にて記載されている。
【０００５】
これらの文書は、ＡＯＩの局所投与における使用のためのベシクル製剤を開示または教示していないし、ＡＯＩの大半がベシクルの外にあるようにＡＯＩがベシクルの成分に共有結合され得ることも開示または教示していない。本出願のこの節における参考文献の引用は、参考文献が本発明にとって従来技術であるという承認ではない。上記で言及した出版物はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００６】
リポソームベシクルは、生体に有効成分（ＡＯＩ）を送達する試みでこれまで使用されている。
【０００７】
リポソームの柔軟形態（「Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ（登録商標）」）は、皮膚表面を通過することができる脂肪（たとえば、大豆のホスファチジルコリン）と脂肪酸または界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ）との組み合わせから作製されたベシクルである。これらのベシクルの界面活性剤におけるポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は吸湿性であり、水の勾配に沿って毛穴に浸透する。これらのベシクルは、膜成分の１つとしてベシクルの内腔の中に輸送されるＡＯＩを入れることまたはベシクルの膜にＡＯＩを組み込むことによって経皮経路を介して生体に他のＡＯＩを輸送するためのベシクルとして調べられている。
【０００８】
これらの方法のいずれかは、ＡＯＩを解放するためにベシクルの崩壊の何らかの形態を当てにしなければならない。
【０００９】
さらに、この方法でＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅに組み込むには大きすぎるまたはこれらのベシクルの通常の化学的性質とは不適合である化学的性質を持つ、皮膚を通って輸送したい成品がある。
【００１０】
さらに、ＰＥＧを含有する界面活性剤成分の一部をＡＯＩで置き換える場合、これがベシクルの柔軟性に影響を与え、原動力の一部を排除する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＡＯＩをベシクルに物理的に連結するので、ベシクルは純粋に機械的装置として作用し、所望のＡＯＩを皮膚表面の下に引き寄せることによってこれらの課題を回避する。
【００１２】
本発明のベシクルは、他の部分またはＡＯＩをベシクルの成分に連結するのでＡＯＩがベシクルの外側にあることによって経皮経路を介してそのような部分／ＡＯＩを生体に輸送するのに使用することができる。
【００１３】
従って、本発明は、第１の態様にて、液体と界面活性剤とＡＯＩとを含むベシクル製剤を提供し、その際、ＡＯＩの少なくとも一部はベシクルの外表面上にあり、ベシクル膜の外にあるようにＡＯＩはベシクルの成分に結合される。好ましくは、ＡＯＩが結合する成分は液体及び／または界面活性剤成分である。少なくとも一部は、ベシクルの外にあるＡＯＩ全体のうちの各分子の少なくとも５％、１０％または２０％、好適には４０％がまたは５０％を超えるものが（分子のサイズまたは容積という点で）、Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの膜の外にあることを意味する。好ましくは、ＡＯＩの大半が、さらに好ましくはＡＯＩ全体の分子がベシクルの外にある。ＡＯＩはそれがベシクルの外表面に存在するように成分に共有結合され得る。
【００１４】
ベシクルの外にあるＡＯＩによって、「外側を向いている」それらＡＯＩを意味する。ＡＯＩに結合する界面活性剤成分または液体成分が未修飾の成分と混合される、ベシクルの製造の間に、修飾された分子の配向は制御することができない。従って、ＡＯＩが連結される分子のおよそ５０％が「正しくない」配向にあるだろうということは、ＡＯＩの一部がベシクルの内腔に存在するであろうことを意味する。ＡＯＩがベシクルに対して外にあるように「正しい配向」にある修飾された分子のうちで、少なくとも５０％のＡＯＩ分子自体が物理的なサイズ／容積という点でベシクル膜の外にある。製造工程は、ベシクルの外にあるＡＯＩの低い比率を生じ得る、すなわち、ＡＯＩの外側濃度は、製剤におけるＡＯＩ全体の１％〜１０％（２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％を含む）、１０％〜５０％、１５％〜４５％、２０％〜４０％または２５％〜３０％（重量／容積）の間であり得る。外側濃度によって、ベシクルがいったん皮膚に浸透すると解放に利用できる及び／または治療活性を発揮すべきであるＡＯＩの濃度を意味する。
【００１５】
本発明のベシクル製剤の恩恵は、ＡＯＩをベシクルに結合し、局所で塗布した場合、皮膚に浸透するＡＯＩの速度、深さ及び量並びにそのＡＯＩのサイズ及び性質に関係する。
【００１６】
製剤は、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、溶液、スプレー、ヘアスプレー、ムースまたは成膜溶液であってもよい。
【００１７】
ベシクル製剤は、ベシクルに結合させたＡＯＩ以外の既知の治療剤を含有してもよいし、または含有しなくてもよい。ＡＯＩを含むベシクル製剤は、さらに生物学的に活性のあるまたは薬学上活性のある製品を含まなくてもよいし、または含んでもよい。生物学的に活性のあるまたは薬学上活性のある作用物質はここでは、薬学上、代謝上または免疫的な活性を有する作用物質として定義される。
【００１８】
本発明は、ＡＯＩの送達に有効であるリン脂質またはスルホ脂質と１以上の界面活性剤とを含むベシクル製剤を包含する。界面活性剤は非イオン性であってもよい。
【００１９】
本発明のベシクル製剤は（理論によって束縛されるのを望まないで）、界面活性剤と大豆ホスファチジルコリンのような脂質とで構成される二重層ベシクルであるベシクルの独特の特性を介してその機能を達成することができる。ベシクルの独特性は、得られるベシクルが永続性の液状結晶状態であるような程度にリン脂質膜を修飾する特定の量の非イオン性界面活性剤の製剤における包含に由来し、界面活性剤は膜安定性も付与するので、ベシクルは超可変形であり、且つ安定である（破損することなく低下した剛性を有する）。
【００２０】
ベシクル製剤は、たとえば、局所塗布される水性緩衝液に懸濁されたベシクルを含む／を成す。ベシクル製剤のベシクルは、空のコアを取り囲む二重層または単層の膜を含む。それらは直径６０ｎｍから直径２００ｎｍのサイズ範囲であり、直径１００ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲であってもよい。ベシクルは高度に親水性であり、この特性は超可変形性と一緒に、皮膚を横切って輸送されるその能力にとって重要である。本発明の製剤を皮膚に塗布し、乾燥させると、その可変形性と合わせたベシクルの再水和駆動力が皮膚透過性バリアの上下での高水分の領域へのベシクルの動きを生じさせる。これは毛穴及び細胞内間隙を介したその動きを駆動する。界面活性剤の非イオン性界面活性剤に対する特定の比はベシクルの経皮送達を促進する。ベシクルの孔及び細胞内間隙を介した動きはＡＯＩを運び、またはそれと共にＡＯＩを引き寄せる。
【００２１】
それらがいったん皮膚を通過すると、本発明のベシクル製剤は最終的にはインタクトなベシクルとして存在する。ベシクルの効率的なクリアランスはその相対的に大きなサイズの故に皮膚の血液微細血管構造（毛細血管）を介しては起きないが、それらは、皮膚塗布の部位の下の他の及び／または深部の組織に間質液と共に輸送されると仮定されている。マーカー分子（ケトプロフェン）で標識した本発明のベシクルで行った前臨床試験は、局所塗布に続いて高濃度のマーカー分子が低い全身性吸収と共に局所的に観察されたので、ベシクルは血管構造に入らないことを示した。
【００２２】
ＡＯＩはベシクルの界面活性剤成分または脂質成分に結合させてもよい。或いは、ベシクルの脂質成分及び界面活性剤成分の双方がそれに結合したＡＯＩを有してもよい。
【００２３】
製剤のベシクルは、その外表面に結合した単一のまたは複数のＡＯＩを有してもよい。複数のＡＯＩが結合される場合、ＡＯＩはすべて同一であってもよく、すなわち、均質であってもよく、またはＡＯＩは異なってもよく、すなわち、非均質であってもよい。
【００２４】
ＡＯＩは元素、イオン、小分子、炭水化物、脂質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、高分子または大環状分子であってもよい。ＡＯＩは微量栄養素であってもよい。
【００２５】
ＡＯＩは、皮膚の構造タンパク質（たとえば、エラスチンまたはコラーゲン）、治療用タンパク質、ポルフィリンまたは発色団含有の高分子、ビタミン、二酸化チタン、酸化亜鉛、メラニンまたはメラニン類似体であってもよい。ＡＯＩはペプチドまたはＮＳＡＩＤのような抗炎症薬であってもよい。具体的には、ＡＯＩはテトラペプチド−７、トリペプチド−１、アスコルビン酸、ナプロキセンまたはジクロフェナクであってもよい。
【００２６】
結合されるＡＯＩは、ベシクルのリン脂質成分若しくは界面活性剤成分のいずれかまたはベシクルの脂質成分に共有結合してもよいし、またはさもなければ直接結合してもよい。脂肪酸成分、界面活性剤成分または脂質成分とＡＯＩとの双方に共有結合するまたはさもなければ結合する連結または架橋を使用することが望ましくてもよい。一例では、無機ＡＯＩが付加されるべきであったなら（たとえば、金属塩または酸化物）、追加のリンカー、たとえば、ＥＤＴＡのような金属キレート剤が先ずベシクル成分に抱合されてもよい。別の例では、長い分子、たとえば、ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）を用いて結合過程の有効性及び／または結合したＡＯＩの有効性を高めることが望まれてもよい。そのようなリンカー／長い架橋分子は、それが膜自体を干渉するのを防ぐためにベシクルからのそのような距離でＡＯＩを保持することが望ましい場合、特に有効であろう。ＡＯＩが特に疎水性であるならばこれが生じ得る。
【００２７】
大きな分子または高分子をベシクル成分に共有結合させてもよい。例には、たとえば、コラーゲンやエラスチンのような皮膚の構造タンパク質、治療用タンパク質；及び酵素が挙げられる。
【００２８】
複数のＡＯＩが脂質成分または界面活性剤成分に結合されて、いったん皮膚を通過するとそれらがベシクルの表面に存在し続けるようにベシクルの外表面に存在してもよい。例には、抗酸化剤、ビタミン、ＴｉＯ２やＺｎＯのような無機化合物、光線力学療法で使用するためのポルフィリン分子が挙げられる。
【００２９】
皮膚を介して体内にビタミンを輸送することは、失われたビタミン生成能（たとえば、ビタミンＤ）を置き換え、それ自体を保護し、修復する皮膚（または他の臓器）の能力を高め（たとえば、ビタミンＣ及びＥ）、または脂漏性皮膚炎のような皮膚の病気若しくは他の病気を治療し得る（たとえば、ビタミンＢ７）。皮膚への参照には、生体の一般的な皮膚並びに眼の強膜及び膣や肛門／直腸のような他の粘膜を含む耳、鼻、喉及び眼の上皮のような他の外皮が含まれる。
【００３０】
ビタミンＤは実際、カルシウム及びリン酸塩の腸内吸収を高めることに関与する脂溶性化合物の群である。この群の最も重要なのはＤ３（コレカルシフェロール）及びＤ２（エルゴカルシフェロール）である。ビタミンＤ欠乏は骨軟化症（子供のくる病）の原因となり、低レベルは低い骨塩密度に関連している。
【００３１】
哺乳類の皮膚は、その前駆体、７−デヒドロコレステロールにてＵＶ照射の作用を介してビタミンＤ３を作り、我々のビタミンＤの約９０パーセントを供給する。日焼け止め剤は紫外線を吸収し、それが皮膚に達するのを妨げる。ＵＶＢスペクトルに基づく８の太陽光保護指数（ＳＰＦ）を持つ日焼け止め剤はビタミンＤ合成能を９５％低下させることができるのに対して１５のＳＰＦを持つ日焼け止め剤は合成能を９８％低下させることができることが報告されている。
【００３２】
さらに最近、さらに高いＳＰＦの日焼け止め剤（２５ＳＰＦ〜５０ＳＰＦの間）の使用が増える傾向があり、日焼けの脅威の社会認識として完全な日焼け止め製品が育っている。加えて、化粧品スキンケア及びカラー化粧品の双方がその製剤に加えた１５、２０及び２５ＳＰＦの日焼け止め剤を有してある程度の日焼け止めを提供している。
【００３３】
製剤がビタミンＤ３を含む場合（ビタミンＣ及び／またはＥ及び／またはＢ７を含まないというわけではない）、製剤は、日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または低ビタミンＤレベルを補完する他のスキンケア若しくは化粧品に組み込まれてもよい。低ビタミンＤレベルは低い光条件または日焼け止め剤の使用が原因で生じてもよく、それは体内でのビタミンＤの製造を妨げることができる。
【００３４】
従って、本発明は、ビタミンをその外表面につなぎ止めることによって、ビタミンＤ３／コレカルシフェロールを柔軟性の経皮ベシクル、すなわち、脂質及び界面活性剤を含む製剤に関連付けてもよい。次いで得られる製剤が日焼け止め剤、日焼け後製剤及び日焼け止め剤を含む化粧品に含まれ得る。この「ベシクル／ビタミンＤの併用」は皮膚に浸透し、そのペイロードを表皮における基底層及び有棘層に送達する。
【００３５】
体内では、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）は肝臓で先ずカルシジオールに変換される。次いで循環するカルシジオールは腎臓でビタミンＤの生物学的に活性のある形態であるカルシトリオールに変換される。血中の低いカルシジオール（２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ）は太陽を避けることから生じ得る。従って、本発明はベシクル成分に結合するまたはつなぎ止めることによってカルシジオールまたはカルシトリオールを経皮ベシクルに関連付けることを含む。
【００３６】
特定の他のビタミン、たとえば、ビタミンＣ及びビタミンＥは重要な抗酸化特性を有し、これは、加齢の兆候及び皮膚の損傷を減らすためにそれらがスキンケア製品に組み込まれていることで分かっている。
【００３７】
ビタミンＥの最も生物学的に活性のある形態は脂溶性のα−トコフェロールであり、本発明の一実施形態は、日焼け止め剤及び日焼け後製品を含むスキンケア調製物に組み込むためにα−トコフェロールをベシクル成分に関連付けることを期待する。
【００３８】
ビタミンＣ（水溶性のアスコルビン酸塩）は、幾つかのコラーゲン合成反応を含む多数の酵素反応における補因子である。これらの反応は創傷治癒及び毛細血管からの出血を防ぐことで重要である。従って、本発明には、コラーゲンへの損傷を改善するようにスキンケア及びスキンケア調製物双方に組み込むために、及び創傷ケア製品に組み込むために、アスコルビン酸塩をベシクル成分に関連付けることが含まれる。
【００３９】
従って、微量栄養素がビタミンＣ及び／またはビタミンＥを含む場合、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品または他のスキンケアまたは化粧品に組み込まれて上皮及び真皮のビタミンＣ及び／またはビタミンＥを補完し、日焼けで損傷した皮膚または加齢の皮膚を防ぐまたはその修復を助けてもよい。
【００４０】
ビタミンＢ７（水溶性ビオチン）はカルボキシラーゼ酵素の補酵素である。ビオチンの欠乏は皮疹の形態での皮膚炎の原因になり得る。加えて、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンを分解することができない）の患者は、食物のビオチンを増やすことによって改善することができる湿疹及び脂漏性皮膚炎の形態を呈する。
【００４１】
従って、微量栄養素がビタミンＢ７を含む場合、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品または他のスキンケアまたは化粧品に組み込まれて上皮及び真皮のビタミンＢ７を補完し、このビタミンの欠乏に関連する皮膚病を改善してもよい。
【００４２】
ペプチド、たとえば、テトラペプチド−７またはトリペプチド−１はベシクル膜の脂肪酸または界面活性剤の成分に結合されてもよい。テトラペプチド−７は感染症と闘うのに有用であってもよく、コラーゲン産生を手段として皮膚再生を刺激するように作用する。これは、それがスキンケア及び老化防止の製品で特に有用であることを意味する。トリペプチド−１は同様の作用を有する。皮膚の外層を介した効率的な送達は低レベル／濃度で高い効果を提供するので、インターロイキンの抑制から生じる考えられる副作用を出来るだけ抑える。
【００４３】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、変形性関節症、スポーツ関連の関節痛、背痛、頭痛及び歯痛の症状を和らげるのに一般的に使用される鎮痛剤である。ＮＳＡＩＤの例は、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク及びナプロキセンである。再び、疼痛及び炎症の部位への直接的なそのような薬剤の有効で且つ効率的な送達は、低い投与量及び／または標的化された投与量の使用を生じるので、たとえば、消化管の問題、腎臓の問題及び心臓の問題のような副作用の軽減または排除を生じる。
【００４４】
本発明は、多数の小さな不活性のＡＯＩをベシクル表面に結合することを含んでもよいので、いったん皮膚の下にあると、それが係留されるようになり、ベシクル自体の存在の恩恵の寿命、たとえば、水の保持、構造の支持が延長され得る。
【００４５】
ＡＯＩはベシクルの界面活性剤成分に結合されてもよい（または連結されまたはつなぎ止められてもよい）。界面活性剤への結合は、分子がヒドロキシル基を有するのであればエステル結合によって界面活性剤に直接的であってもよい。結合の代替の方法は、界面活性剤の原子または官能基（たとえば、Ｔｗｅｅｎの場合、ポリエチレングリコールポリマー）をＡＯＩで置換することである。結合の第３の方法は任意でエステル結合を介した脂肪酸への直接的なものである。ＡＯＩが無機分子である場合、そのときは、さらなる連結分子が先ずベシクル成分に抱合され得る、たとえば、金属塩の場合におけるＥＤＴＡのような金属キレート剤。その効率（たとえば、酵素であるＡＯＩ上の活性部位を暴露するために）を最大化するためにベシクルから若干の距離でＡＯＩを保持することが望まれるのであれば、そのときは、連結分子、たとえば、ポリマー鎖（たとえば、ポリエチレングリコール）をベシクルの成分とＡＯＩの双方に結合させてもよい。
【００４６】
ＡＯＩはベシクルの脂質成分に連結され（結合されまたはつなぎ止められ）てもよい。脂質への結合は、たとえば、脂肪酸を排除し、ＡＯＩで置き換えることによってエステル結合によりグリセロールのヒドロキシル基のいずれかを介して達成され得る。或いは、連結の方法は、最終的な分子がつなぎ止められたＡＯＩと一緒に２つの脂肪酸鎖を有するようにホスファチジル部分の置き換えによってもよい。修飾された脂質が、いつものように且つグリセロール鋳型で利用可能な自由回転で脂肪族領域に挿入し、つなぎ止められたＡＯＩはベシクルの外側に位置することになる。ＡＯＩがベシクルに長い間つなぎ止められることが求められるのであれば、さらに安定な代替にはアミド結合が使用され得る。たとえば、ＡＯＩの標的が深部組織、たとえば、上部真皮層ではなく関節であるならば、これが望ましくてもよい。あまり安定ではない結合とさらに安定な結合の組み合わせを用いて（たとえば、それぞれエステル及びアミド）、ＡＯＩの交互の解放を達成してもよい。
【００４７】
任意の成分に結合する方法は加水分解性または非加水分解性であってもよい。ＡＯＩが皮膚内でまたは皮下で一度脱離すべきであることが望ましいのであれば、連結は加水分解性であるべきである。結合したＡＯＩが皮膚内でまたは皮下でいったんベシクルに結合したままであることが望ましいのであれば、連結は非加水分解性であるべきである。
【００４８】
ＡＯＩは膜成分に共有結合で結合または抱合されてもよく；結合は親水性または疎水性または静水圧であってもよく；結合は水素結合、イオン結合であってもよい。
【００４９】
用語「結合」、「連結」及び「つなぎ止め」は本明細書にて至る所で相互交換可能に使用されて上記で言及された結合すべてを包含する。
【００５０】
本発明を用いてＡＯＩを哺乳類の皮膚に投与することができる。ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、家畜及びペットを含むどんな哺乳類も含むことができる。ＡＯＩは治療実体または化粧実体または非治療実体または非化粧実体であってもよく、代わりにまたは加えて、ＡＯＩは代謝性及び／または構造的であってもよい。
【００５１】
従って、本発明の第２の態様は脂質と界面活性剤とＡＯＩとを含むベシクル製剤を提供し、その際、ＡＯＩは、対象の皮膚を介してＡＯＩを送達するのに使用するために、ＡＯＩの大半がベシクルの外にあるようにベシクルの成分に結合されまたは連結され、製剤は局所に塗布される。
【００５２】
本発明の第３の態様は、対象の皮膚を介してＡＯＩを送達する方法を提供し、該方法は、皮膚に浸透してＡＯＩを送達するのに十分な量で本発明のベシクル製剤を患者の皮膚に局所塗布することを含む。
【００５３】
本発明は患者の皮膚を介して１を超えるＡＯＩを送達する方法も提供し、該方法は、ベシクルがそれに結合させた不均質な複数のＡＯＩを有する本発明のベシクル製剤のいずれかを局所塗布すること及び／または製剤がベシクルの混合物であり、各製剤がそれに結合させた異なる単一のまたは均質な複数のＡＯＩを有するベシクルを有する本発明のベシクル製剤を塗布することを含む。
【００５４】
ベシクル製剤における脂質はリン脂質であってもよい。リゾリン脂質であってもよい第２の脂質が存在してもよい。脂質はスルホ脂質であってもよい。界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。
【００５５】
本発明の製剤はベシクルまたは他の拡張表面凝集体（ＥＳＡ）を形成し、その際、ベシクル調製物は皮膚のような半透過性バリアを介した改善された透過能を有する。ベシクルのサイズは血管系への浸透を妨げ、その結果、全身性の送達を妨げる。作用のどんなメカニズムにも限定されない一方で、本発明の製剤はその可変形性及び／または適応性を特徴とするベシクルを形成することができる。
【００５６】
ベシクル製剤の特定の組成は、皮膚のどの層にＡＯＩを送達することができるかを決定するであろう。特定の製剤は皮膚の上部層のみに浸透する一方で、他の製剤は深部層に移動するであろう。送達されるＡＯＩに応じてベシクル製剤が選択されるであろう。たとえば、コラーゲンが皮膚に深く送達されるＡＯＩであるならば、それは皮膚の深部層に浸透することができるベシクル製剤に連結されるであろう。
【００５７】
第４の態様として、本発明は本発明の第１〜第３の態様に従ってベシクル製剤を作製する方法を提供する。該方法は、ＡＯＩをベシクル成分に連結することと、ＡＯＩ／成分を未修飾のリン脂質及び界面活性剤と混合して本発明のベシクル製剤を形成することとを含む。
【００５８】
本発明の第５の態様は、疾患を治療するのに使用するための第１の態様のベシクル製剤に関する。治療される疾患はベシクルにつなぎ止められるＡＯＩによって決まるであろう。
【００５９】
本発明は第１の態様に従ってベシクル製剤を提供し、その際、ＡＯＩは、スキンケア製品で使用するための、老化防止製品で使用するための、または日焼け止め（ＵＶ保護）製品で使用するための、ビタミン、たとえば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤまたはビタミンＡである。
【００６０】
提供されるのはまた、本発明に係るベシクル製剤であり、その際、ＡＯＩは、老化防止製品で使用するための、コラーゲン産生を促すまたは強化するのに使用するための、または化粧品で使用するためのペプチド、たとえば、テトラペプチド−７またはトリペプチド−１である。
【００６１】
提供されるのはまた、本発明に係るベシクル製剤であり、その際、ＡＯＩは、変形性関節炎を治療するのに使用するための、関節炎の関節痛を治療するのに使用するための、筋肉痛を治療するのに使用するための、肉離れを治療するのに使用するための、または炎症を治療するのに使用するための、ＮＳＡＩＤ、たとえば、ナプロキセンまたはジクロフェナクである。
【００６２】
十分に理解されるであろうように、他のＡＯＩが、多種多様な疾患を治療するために本発明のベシクルにつなぎ止められてもよい。
【００６３】
本発明の第１の態様の特徴すべては変更するところは変更して第２〜第５の態様に適用される。
【００６４】
ベシクルの製造の間に、修飾された成分（すなわち、連結されたＡＯＩを伴った）の未修飾の成分（すなわち、連結されたＡＯＩを伴わない）に対する比を調整して、複数の修飾された成分（従ってＡＯＩ）がベシクルに組み込まれる程度及び少なくとも１つのＡＯＩを含有するベシクルの数の双方を制御する。未修飾のベシクルの比率が最終調製物にてそのままである場合、これらは、これらに続いて毛穴に入り、後から「押す」ことによって修飾された形態の「引き寄せ」作用を補完するであろう。最終調製物における修飾されたベシクルの比率（ベシクル全部の比率として）０．１％〜１００％または１％〜１００％、１０％〜９０％、２５％〜７５％、または５０％の範囲であってもよい。
【００６５】
高い比率のベシクルが確実に、連結された所望のＡＯＩを有するまたは連結された複数のＡＯＩを有するように、１００％修飾された界面活性剤を用いて脂質と混合してもよい（逆もまた同様）。尺度の反対側では、さらに薄い効果について、２、３のベシクルのみが連結されたＡＯＩを有するまたは単一のＡＯＩのみがベシクルに連結される場合、５％の修飾された界面活性剤から９５％の未修飾の界面活性剤までの混合物が使用される。しかしながら、一般に、８０％〜１０％の間の脂質または界面活性剤は修飾された脂質または界面活性剤の成分で置き換えられる。７５％〜１５％の間の脂質成分または界面活性剤成分が置き換えられてもよい。好適には、脂質成分または界面活性剤成分のいずれかの約７０％、６５％、６０％、５０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％の間またはこれらの間の範囲が、それぞれＡＯＩに結合された修飾された脂質成分または修飾された界面活性剤成分で置き換えられてもよい。脂質成分及び界面活性剤成分双方の比率が置き換えられてもよい。修飾されたベシクルを抽出し、純粋な未修飾のベシクルとそれらを正確な「用量」に混合することによって、または修飾されたベシクルを異なるＡＯＩと混合することによってさらなる改良を行うことができる。一般に、本明細書で使用される命名法並びに本明細書で記載される有機化学、医化学及び薬理学における実験手順は周知のものであり、当該技術で一般的に採用される。特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は一般に本開示が属する技術の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、特定の成績を達成するのに「十分な量」、「に有効な量」または「に十分な量」は、任意で治療効果である所望の効果を生じる（すなわち、治療上有効な量の投与によって）のに有効である本発明の製剤の量を指す。代わりに言及すれば、「治療上有効な」量は、少なくとも１つの臨床症状で何らかの緩和、軽減及び／または低下を提供する量である。本発明の方法によって治療することができる障害に関連する臨床症状は当業者に周知である。さらに、当業者は、治療効果は、何らかの利益が対象に提供される限り、完全であるまたは治癒する必要はないことを十分に理解するであろう。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、対象の状態の重症度が低下するまたは少なくとも部分的に改善される若しくは改良される、及び／または少なくとも１つの臨床症状の何らかの緩和、軽減または低下が達成される、及び／または状態の進行に抑制または遅延がある、及び／または疾患若しくは病気の発症の進行における遅延を意味する。用語「治療する」、「治療すること」または「治療」はまた、病状を管理することも意味する。「予防」は予防的な治療を意味する。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学上許容可能な」は本発明の製剤を参照するのに使用される場合、製剤が、製剤を投与される対象にて許容できないレベルの刺激を生じないことを意味する。好ましくは、そのようなレベルは規制当局による認可に好適な製剤を提供するために十分に低いであろう。
【００６９】
数値に関して本明細書で使用されるとき、用語「約」は、測定を行うことにおける正常な実験誤差から生じると予想されるものを含む特定の数値を取り囲む範囲を意味する。たとえば、特定の実施形態では、用語「約」は、特定の数値と関連して使用される場合、数値の±２０％、特に言及されない限り、数値の±１％、±２％、±３％、±４％、±５％、±１０％、±１５％、または±２０％を意味する。
【００７０】
本明細書で提供される本発明の製剤は、任意で、薬学上許容可能な媒体、好ましくは３．５〜９．０に及ぶｐＨ、好ましくは４〜７．５のｐＨを有する好ましくは水溶液に懸濁される、少なくとも１つの脂質、好ましくはリン脂質またはスルホ脂質と、少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤とを含む。本発明の製剤は任意で、緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、抗菌剤、皮膚軟化剤、共溶媒及び／または増粘剤を含有してもよい。本発明の製剤は１を超える脂質、好ましくは１を超えるリン脂質の混合物を含んでもよい。本発明の製剤は、少なくとも１つの脂質、好ましくはリン脂質と少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と薬学上許容可能なキャリアと、任意で緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、抗菌剤、皮膚軟化剤、共溶媒及び／または増粘剤から本質的に成ってもよい。本発明の製剤は、少なくとも１つの脂質、好ましくはリン脂質と少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤と薬学上許容可能なキャリアと、以下：緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、抗菌剤、皮膚軟化剤、共溶媒及び増粘剤の１以上とから成ってもよい。
表１は、本発明に係る好まれるリン脂質を列挙している。
【表１】
2016529242.tif 000003
【００７１】
本開示の文脈で好まれる脂質は、非荷電であり、安定なよく水和される二重層を形成し；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンはそのような脂質の最も優れた代表である。これらのいずれかが表１でリストにしたような鎖を有することができ；脂質鎖が無秩序な状態にある流体相の二重層を形成するものが好まれる。
【００７２】
異なる負に荷電する、すなわち、アニオン性脂質もベシクルの脂質二重層に組み込むことができる。そのような荷電脂質の魅力的な例はホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールであり、やや好ましさの低いのは、ホスファチジン酸（及びそのアルキルエステル）またはホスファチジルセリンである。電気的に中性の二重層成分との組み合わせでそれらを使用することよりも荷電した脂質だけでベシクルを作ることがあまり称賛されることではないことが当業者によって実感されるであろう。荷電した脂質を使用する場合、脂質頭基のイオン化の所望の程度及び／または反対に荷電した薬剤と脂質分子の間での静電相互作用の所望の程度を確保するように緩衝液組成及びｐＨ調整を選択しなければならない。さらに、中性脂質と同様に、荷電した二重層脂質成分は表１でリストにしたようなリン脂質の鎖のいずれかを原則として有することができる。しかしながら、脂肪鎖の流動性を高める役割を高めるベシクルの適応性の故に且つ互いに混合する流体相における脂質のさらに良好な能力の故に、流体相の脂質二重層を形成する鎖が明らかに好まれる。
【００７３】
脂質の脂肪酸または脂肪アルコールに由来する鎖は通常、以下の塩基性の脂肪族鎖の型の間で選択される。
【表１−２】
2016529242.tif 000004
【００７４】
他の二重結合の組み合わせまたは位置も同様に可能である。
【００７５】
本発明の好まれる脂質は、たとえば、以前はレシチンと呼ばれていた天然のホスファチジルコリンである。それは、卵（パルミチン酸、Ｃ１６：０、及びオレイン酸、Ｃ１８：１が豊富であるが、ステアリン酸、Ｃ１８：０、パルミトレイン酸、Ｃ１６：１、リノレン酸、Ｃ１８：２、及びアラキドン酸、Ｃ２０：４（Ｍ、ラジカル）も含む）、大豆（不飽和Ｃ１８鎖が豊富であるが、２、３のその他の間で一部のパルミチン酸ラジカルも含有する）、ココナッツ（飽和鎖が豊富）、オリーブ（モノ不飽和鎖が豊富）、サフラン（ベニバナ）及びヒマワリ（ｎ６のリノレン酸が豊富）、亜麻仁（ｎ３のリノレン酸が豊富）から、クジラ脂肪（モノ不飽和ｎ３鎖が豊富）から、プリムローズまたはサクラソウ（ｎ３鎖が豊富）から得ることができる。好まれる天然のホスファチジルエタノールアミン（以前セファリンと呼ばれていた）は卵または大豆を起源とすることが多い。生物起源の好まれるスフィンゴミエリンは通常、卵または脳組織から調製される。好まれるホスファチジルセリンは通常脳物質を起源とするのに対して、ホスファチジルグリセロールは大腸菌のような細菌から優先的に抽出され、または天然のホスファチジルコリンから出発してホスホリパーゼＤを用いてトランスホスファチジル化によって調製される。好ましく使用されるホスファチジルイノシトールは市販の大豆リン脂質またはウシ肝臓抽出物から単離される。好まれるホスファチジン酸は、言及された供給源のいずれかから抽出されるまたは好適なホスファチジルコリンからホスホリパーゼＤを用いて調製される。
【００７６】
さらに、合成のホスファチジルコリンを使用してもよい。
【００７７】
製剤における脂質の量は、重量で約１％〜約１２％、約１％〜約１０％、約１％〜約４％、約４％〜約７％または約７％〜約１０％である。脂質はリン脂質であってもよい。リン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。
【００７８】
製剤における脂質はアルキル−リゾリン脂質を含まなくてもよい。製剤における脂質はポリエネイルホスファチジルコリンを含まなくてもよい。
【００７９】
用語「界面活性剤」はその普通の意味を有する。関連する界面活性剤のリスト及び界面活性剤に関連する定義は、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＥＰ  ０  ４７５  １６０  Ａｌ（たとえば、ｐ．６，１．５〜ｐ．１４．１．１７を参照）及びＵＳ６，１６５，５００（たとえば、ｃｏｌ．７，１．６０〜ｃｏｌ．１９，１．６４を参照）にて、及び、たとえば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ＳｕｒｆａｃｔａｎｔｓまたはＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｐｈａｒｍ．Ｅｕのような適当な界面活性剤または医薬の教科書にて提供されている。一部の実施形態では、界面活性剤は、その開示が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２００２年１月３１日に公開されたＵＳ２００２／００１２６８０の表１〜１８に記載されたものである。従って、以下のリストは、本特許出願と併せて特に一般的であるまたは有用である幾つかの界面活性剤の部類の、決して完全ではないまたは排他的ではない選択を提供するだけである。本開示に従って使用される好まれる界面活性剤は１２を超えるＨＬＢを持つものが挙げられる。リストには、イオン化された長鎖脂肪酸または長鎖脂肪アルコール、長鎖脂肪アンモニウム塩、たとえば、アルキル−またはアルケノイル−トリメチル−、−ジメチル−及び−メチル−アンモニウム塩、アルキル−またはアルケノイル−硫酸塩、長い脂肪鎖ジメチル−アミノオキシド、たとえば、アルキル−またはアルケノイル−ジメチル−アミノオキシド、長い脂肪鎖、たとえば、アルカノイル、ジメチル−アミノオキシド及び特に、ドデシルジメチル−アミノオキシド、長い脂肪鎖、たとえば、アルキル−Ｎ−メチルグルカミド及びアルカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、たとえば、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９及びＭＥＧＡ−ＩＯ、Ｎ−長い脂肪鎖−Ｎ、Ｎ−ジメチルグリシン、たとえば、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、３−（長い脂肪鎖−ジメチルアンモニオ）−アルカン−スルホネート、たとえば、３−（アシルジメチルアンモニオ）−アルカンスルホネート、スルホコハク酸塩の長い脂肪鎖誘導体、たとえば、ビス（２−エチルアルキル）スルホコハク酸塩、長い脂肪鎖−スルホベタイン、たとえば、アシル−スルホベタイン、長い脂肪鎖ベタイン、たとえば、ＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢまたはＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ−３−１６、−３−１４、−３−１２、−３−１０、または−３−８、またはポリエチレン−グリコール−アシルフェニルエーテル、特に、ノナエチレン−グリコール−オクチル−フェニルエーテル、ポリエチレン−長い脂肪鎖−エーテル、特に、ポリエチレン−アシルエーテル、たとえば、ノナエチレン−デシルエーテル、ノナエチレン−ドデシルエーテルまたはオクタエチレン−ドデシルエーテル、ポリエチレングリコール−イソアシルエーテル、たとえば、オクタエチレングリコール−イソトリデシルエーテル、ポリエチレングリコール−ソルビタン−長い脂肪鎖エステル、たとえば、ポリエチレングリコール−ソルビタン−アシルエステル及び特に、ポリオキシエチレン−モノラウレート（たとえば、ポリソルベート２０またはＴｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノオレエート（たとえば、ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウロレイレート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノペトロセリネート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノエライデート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−ミリストレイレート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−パルミトレイニレート、ポリオキシエチレン−ソルビタン−ｐ−エトロセリニデート、ポリヒドロキシエチレン−長い脂肪鎖エーテル、たとえば、ポリヒドロキシエチレン−アシルエーテル、たとえば、ポリヒドロキシエチレン−ラウリルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−ミリストイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−セチルスト−エアリル、ポリヒドロキシエチレン−パルミチルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−オレオイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−パルミトオレオイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−リノレイル、ポリヒドロキシエチレン−４、または６、または８、または１０、または１２−ラウリル、ミリストイル、パルミトイル、パルミトレイル、オレオイルまたはリノエイルエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ）、または相当するエステルにおける、ポリヒドロキシエチレン−ラウレート、−ミリステート、−パルミテート、−ステアレートまたは−オレエート、特に、ポリヒドロキシエチレン−８−ステアレート（Ｍｙｒｊ４５）及びポリヒドロキシエチレン−８−オレエート、ポリエトキシ化ヒマシ油４０（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ）、ソルビタン−モノ長い脂肪鎖、たとえば、アルキレート（ＡｒｌａｃｅｌまたはＳｐａｎシリーズ）、特に、ソルビタン−モノラウレート（Ａｒｌａｃｅｌ２０、Ｓｐａｎ２０）として、長い脂肪鎖、たとえば、アシル−Ｎ−メチルグルカミド、アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、特に、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、長い脂肪鎖サルフェート、たとえば、アルキル−サルフェート、アルキル硫酸塩、たとえば、ラウリル−硫酸塩（ＳＤＳ）、オレオイル−硫酸塩：長い脂肪鎖チオグルコシド、たとえば、アルキルチオグルコシド及び特に、ヘプチル−、オクチル−及びノニル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；種々の炭水化物の長い脂肪鎖誘導体、たとえば、ペントース、ヘキソース、二糖類、特に、アルキル−グルコシド及びマルトシド、たとえば、ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−、ノニル−及びデシル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたはＤ−マルトピラノシド；さらに塩、特に、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロコール酸のナトリウム塩、脂肪酸塩、特に、最も多くはナトリウム塩の形態でのオレエート、エライデート、リノレート、ラウレート、またはミリステート、リゾリン脂質、ｎ−オクタデシレングリセロホスファチジン酸、オクタデシレン−ホスホリルグリセロール、オクタデシレン−ホスホリルセリン、ｎ−長い脂肪鎖−グリセロ−ホスファチジン酸、たとえば、ｎ−アシル−グリセロ−ホスファチジン酸、特に、ラウリルグリセロ−ホスファチジン酸、オレオイル−グリセロ−ホスファチジン酸、ｎ−長い脂肪鎖−ホスホリルグリセロール、たとえば、ｎ−アシル−ホスホリルグリセ��ール、特に、ラウリル−、ミリストイル−、オレオイル−またはパルミトエロイル−ホスホリルグリセロール、ｎ−長い脂肪鎖−ホスホリルセリン、たとえば、ｎ−アシル−ホスホリルセリン、特に、ラウリル−、ミリストイル−、オレオイル−またはパルミトエロイル−ホスホリルセリン、ｎ−テトラデシル−グリセロ−ホスファチジン酸、ｎ−テトラデシル−ホスホリルグリセロール、ｎ−テトラデシル−ホスホリルセリン、相当する−、エライドイル−、バクセニル−リゾリン脂質、相当する短鎖リン脂質、と同様に、すべての表面活性のある、従って、膜不安定化ポリペプチドが含まれる。界面活性剤の鎖は通常、流体状態であるように、またはキャリア凝集体における流体鎖状態の維持に少なくとも適合性であるように選択される。
【００８０】
界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。界面活性剤は重量で約０．２〜１０％、約１％〜約１０％、約１％〜約７％または約２％〜５％にて製剤に存在してもよい。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート界面活性剤）、ステアリン酸ポリヒドロキシエチレンまたはポリヒドロキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤）から選択されてもよい。界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノオレエート（たとえば、ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０）またはＴｗｅｅｎ２０、４０、または６０であってもよい。ポリソルベートは１２〜２０の炭素原子を持つ任意の鎖を有してもよい。ポリソルベートは製剤にて流体であってもよく、それは１以上の二重結合、分岐または環状基を含有してもよい。
【００８１】
界面活性剤は、追加のＰＥＧ分子または他の親水性部分で修飾されてもよい。
【００８２】
本発明の製剤は、修飾された脂質または界面活性剤に加えて、たった１つの脂質及びたった１つの界面活性剤を含んでもよい。或いは、本発明の製剤は、１を超える脂質とたった１つの界面活性剤を、たとえば、２、３、４以上の脂質と１つの界面活性剤を含んでもよい。或いは、本発明の製剤は、１つの脂質と１を超える界面活性剤を、たとえば、２、３、４以上の界面活性剤と１つの脂質を含んでもよい。本発明の製剤は、１を超える脂質と１を超える界面活性剤を、たとえば、２、３、４以上の脂質と２、３、４以上の界面活性剤を含んでもよい。
【００８３】
本発明の製剤は、様々な脂質の界面活性剤に対する比（ＡＯＩに結合される脂質及び／または界面活性剤を含む）を有してもよい。比はモル表現（脂質のモル／界面活性剤のモル）という点で表現されてもよい。製剤における脂質の界面活性剤に対するモル比は、約１：３〜約３０：１、約１：２〜約３０：１、約１：１〜約３０：１、約２：１〜約２０：１、約５：１〜約３０：１、約１０：１〜約３０：１、約１５：１〜約３０：１、または約２０：１〜約３０：１であってもよい。本発明の製剤における脂質の界面活性剤に対するモル比は約１：２〜約１０：１であってもよい。比は、約１：１〜約２：１、約２：１〜約３：１、約３：１〜約４：１、約４：１〜約５：１または約５：１〜約１０：１であってもよい。モル比は、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１及び約２０：１〜約２５：１であってもよい。脂質の界面活性剤に対する比は約１．０：１．０、約１．２５：１．０、約１．５／１．０、約１．７５／１．０、約２．０／１．０、約２．５／１．０、約３．０／１．０または約４、０／１．０であってもよい。本発明の製剤は、種々の量の以下の成分：組み合わせた脂質と界面活性剤の総量（ＴＡ）も有してもよい。ＴＡ量は、組成物全体の重量パーセントという点で述べられてもよい。ＴＡは、約１％〜約４０％、約５％〜約３０％、約７．５％〜約１５％、約６％〜約１４％、約８％〜約１２％、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％または約２０％〜約３０％であってもよい。ＴＡは６％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１５％または２０％であってもよい。
【００８４】
本発明の製剤についての脂質総量及び脂質／界面活性剤の比（モル／モル）の選択された範囲を以下の表に記載する。
表２．総量及び脂質の界面活性剤に対する比
【表２】
2016529242.tif 000005
【００８５】
本発明の製剤は任意で１以上の以下の成分：共溶媒、キレート剤、緩衝液、抗酸化剤、保存剤、殺菌剤、皮膚柔軟剤、保湿剤、潤滑剤及び増粘剤を含有してもよい。任意の成分の好まれる量は以下のように記載される。
【表２−２】
2016529242.tif 000006
*脂質総量の比率として
【００８６】
本発明の製剤は、ｐＨ３．５〜ｐＨ９、ｐＨ４〜ｐＨ７．５またはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲に水溶液のｐＨを合わせるための緩衝液を含んでもよい。緩衝液の例には、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液及びプロピオン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明の製剤は通常、水性媒体で製剤化される。製剤は、低級アルコールのような共溶媒と共にまたはそれを伴わずに製剤化されてもよい。本発明の製剤は少なくとも２０重量％の水を含んでもよい。本発明の製剤は、重量で約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％の水を含んでもよい。製剤は約７０〜約８０重量％の水を含んでもよい。
【００８８】
「殺菌」剤または「抗菌」剤は一般に医薬製剤における細菌数を減らすために添加される。殺菌剤の一部の例は、エチルアルコール及びプロピルアルコールを含む短鎖アルコール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、クロロベンジルアルコール、ジクロロベンジルアルコール、ヘキサクロロフェン；フェノール化合物、たとえば、クレゾール、４−クロロ−ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−キシレノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、ポビドン−ヨウ素；パラベン、特に、アルキル−パラベン、たとえば、メチル−、エチル−、プロピル−、またはブチル−パラベン、ベンジルパラベン；酸、たとえば、ソルビン酸、安息香酸及びそれらの塩；四級アンモニウム化合物、たとえば、アルコニウム塩、たとえば、臭化物、ベンザルコニウム塩、たとえば、塩化物または臭化物、セトリモニウム塩、たとえば、臭化物、フェノアルケシニウム塩、たとえば、臭化フェノドデシニウム、塩化セチルピリジニウム及び他の塩；さらに、水銀化合物、たとえば、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀または硝酸フェニル水銀、チオメサール、クロロヘキシジンまたはそのグルコン酸塩、または生物起源の抗生剤活性のある化合物、またはそれらの好適な混合物である。
【００８９】
「抗酸化剤」の例は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール（ＬＹ１７８００２、ＬＹ２５６５４８、ＨＷＡ−１３１、ＢＦ−３８９、ＣＩ−９８６、ＰＤ−１２７４４３、Ｅ−５１または１９、ＢＩ−Ｌ−２３９ＸＸ、等）、３級ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、没食子酸プロピル（ＰＧ）、ｌ−Ｏ−ヘキシル−２，３，５−トリメチルヒドロキノン（ＨＴＨＱ）；芳香族アミン（ジフェニルアミン、ｐ−アルキルチオ−ｏ−アニシジン、エチレンジアミン誘導体、カルバゾール、テトラヒドロインデノインドール）；フェノール及びフェノール酸（グアイアコール、ヒドロキノン、バニリン、没食子酸及びそのエステル、フォトカテク酸、キナ酸、シリング酸、エラグ酸、サリチル酸、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、ユーゲノール）；トコフェロール（トコフェロール（α、β、γ、δ）及びその誘導体、たとえば、トコフェリル−アシレート（たとえば、−アセテート、−ラウレート、ミリステート、−パルミテート、−オレエート、−リノレエート等、または他の好適なトコフェリル−リポエートを含む）、トコフェリル−ＰＯＥ−コハク酸；トロロックス及び相当するアミド及びチオカルボキサミド類似体；アスコルビン酸及びその塩、イソアスコルビン酸塩、（２または３または６）−ｏ−アルキルパルミチン酸アスコルビルエステル（たとえば、６−ｏ−ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル−、オレイル、またはリノレオイル−Ｌ−アスコルビン酸等）である。有用なのはまた、優先的に酸化される化合物、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、チオ尿素；キレート剤、たとえば、ＥＤＴＡ、ＧＤＴＡ、デスフェラール：種々雑多な内在性の防御系、たとえば、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェリチン、セアルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモペキアイン、アルブミン、グルコース、ユビキノール−１０）；酵素性抗酸化剤、たとえば、スーパーオキシドジスムターゼ及び類似の活性を持つ金属錯体、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、及びあまり複雑ではない分子、たとえば、β−カロテン、ビリルビン、尿酸を含む；フラボノイド（フラボン、フラボノール、フラボノン、フラバノナール、カコン、アントシアニン）、Ｎ−アセチルシステイン、メスナ、グルタチオン、チオヒスチジン誘導体、トリアゾール；タンニン、桂皮酸、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル（クマル酸及びエステル、コーヒー酸及びそのエステル、フェルラ酸、（イソ−）クロロゲン酸、シナプ酸）；香辛料抽出物（たとえば、丁子、シナモン、セージ、ローズマリー、ナツメグ、オレガノ、オールスパイス、ナツメグから）；カルノシン酸、カルノソール、カルソリン酸；ロスマリン酸、ロスマリンジフェノール、ゲンチジン酸、フェルラ酸；エンバク粉の抽出物、たとえば、アベナンスラマイド１及び２；チオエーテル、ジチオエーテル、スルホキシド、テトラアルキルチウラムジスルフィド；フィチン酸、ステロイド誘導体（たとえば、Ｕ７４００６Ｆ）；トリプトファン代謝産物（たとえば、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸)、及びオルガノカル���ゲニドである。
【００９０】
「増粘剤」を用いて医薬製剤の粘度を高めるが、増粘剤は、薬学上許容可能な親水性ポリマー、たとえば、カルボキシムエチル−、ヒドロキシエチル−、ヒドロキシプロピル−、ヒドロキシプロピルメチル−またはメチル−セルロースを含む部分的にエーテル化したセルロース誘導体；ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ヒドロキシエチル）−、ポリ（ヒドロキシプロピル）−、ポリ（ヒドロキシプロピルメチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、メタリル−スルホネート、ポリエチレン、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ラクチド、ポリエチレングリコール−ジアクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（プロピルメタクリルアミド）、ポリ（プロピレンフマレート−ｃｏ−エチレングリコール）、ポロキサマー、ポリアスパルトアミド（ヒドラジン架橋した）ヒアルロン酸、シリコーンを含む完全に合成の親水性ポリマー；アルギネート、カラーギーナン、グアーゴム、ゼラチン、トラガカント、（アミド化した）ペクチン、キサンタン、キトサンコラーゲン、アガロースを含む天然ゴム；それらの混合物及びさらなる誘導体またはコポリマー及び／または他の薬学上許容可能な若しくは少なくとも生物学的に許容可能なポリマーから選択される。
【００９１】
本発明の製剤は、極性の液状媒体も含んでもよい。本発明の製剤は、水性媒体で投与されてもよい。本発明の製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、スプレー、成膜溶液またはヘアスプレーの形態であってもよい。
【００９２】
作用のメカニズムまたは理論に限定されない一方で、本発明の製剤は、その適応性、可変形性または浸透性を特徴とするベシクルまたはＥＳＡを形成してもよい。類似のベシクル（結合した治療上の実体を伴わない）はＷＯ２０１０／１４００６１及びＷＯ２０１１／０２２７０７の双方にて記載されている。
【００９３】
本発明の製剤は、上記で言及されたようなＡＯＩに応じて種々の疾患または病気の予防または治療にて有用である。
【００９４】
たとえば、本発明のベシクル製剤は、ビタミンＤ３、Ｃ、ＥまたはＢ７の１つ、２つまたは３つを含んでもよい。製剤は単独で使用してもよく、またはさらに複雑なスキンケア製品、たとえば、日焼け止め、日焼け阻止、保湿剤、美容液または化粧品の構成成分または成分として使用してもよい。製剤または最終的なスキンケア製品はクリーム、ジェル、ローション、ムースまたはスプレーの形態であってもよい。
【００９５】
本発明によって提供されるのは、上記で定義されたような用途のためのベシクル製剤であり、その際、微量栄養素がビタミンＤ３であり、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または他のスキンケアまたは化粧品製品に組み込まれて低レベルのビタミンＤを補完してもよく；微量栄養素がビタミンＣまたはビタミンＥであり、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または他のスキンケアまたは化粧品製品に組み込まれて表皮及び真皮のビタミンＣまたはビタミンＥを補完し、太陽で損傷された皮膚または加齢皮膚の保護または修復を支援してもよく；微量栄養素がビタミンＢ７であり、製剤は日焼け止め製品、日焼け阻止製品、日焼け後製品、または他のスキンケアまたは化粧品製品に組み込まれてこの微量栄養素の欠如に関連する皮膚病を軽減または排除してもよい。
【００９６】
本発明のベシクル製剤は、局所に塗布される創傷治癒製品で提供されてもよい。従って、本発明は皮膚の創傷を治療するのに使用するための第１の態様の製剤を提供し、ＡＯＩはアスコルビン酸（ビタミンＣ）である。
【００９７】
以下の非限定の実施例及び図面を参照して本発明を以下で記載する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ナプロキセンまたはジクロフェナクにつなぎ止められたベシクルについての反応の速度に対してプロットしたアラキドン酸基質の濃度を示す図である。
【図２】図１の逆数（ラインウィーバー・バーク）プロットの図である。
【図３】ＣＭＡアッセイの後のナプロキセンまたはジクロフェナクにつなぎ止められたベシクルについての反応の速度に対してプロットしたアラキドン酸基質の濃度を示す図である。
【図４】図３の逆数（ラインウィーバー・バーク）プロットの図である。
【実施例】
【００９９】
実施例製剤
実施例ベシクル製剤
実施例製剤１
製剤１は、脂質としてのスフィンゴミエリン（脳）（４７．９４４ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（４２．０５ｍｇ／ｇ）、乳酸緩衝液（ｐＨ４）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３０．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１００】
実施例製剤２
製剤２は、脂質としてのスフィンゴミエリン（脳）（５３．７５０ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（３１．２５０ｍｇ／ｇ）、乳酸緩衝液（ｐＨ４）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（１５．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０１】
実施例製剤３
製剤３は、脂質としてのスフィンゴミエリン（脳）（９０．５６１ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（７９．４３９ｍｇ／ｇ）、乳酸緩衝液（ｐＨ４）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３０．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０２】
実施例製剤４
製剤４は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（８．５００ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（１．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３６．５１ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０３】
実施例製剤５
製剤５は、脂質としてのホスファチジルコリン（７１．４６０ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（４．７２０ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、抗酸化剤としてのＢＨＡ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（１５．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３５．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０４】
実施例製剤６
製剤６は、脂質としてのホスファチジルコリン（７１．４６０ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（４．７２０ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、抗酸化剤としてのＢＨＡ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（５０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（１５．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０５】
実施例製剤７
製剤８は、脂質としてのホスファチジルコリン（７１．４６００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（４．７２０ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、抗酸化剤としてのＢＨＡ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（５０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３５．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０６】
実施例製剤８
製剤８は、脂質としてのホスファチジルコリン（６４．５１６ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（３５．４８４ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）、抗酸化剤としてのＢＨＡ（０．２００ｍｇ／ｇ）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（４．２００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３０．０００ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１０７】
実施例製剤９
脂質としてのホスファチジルコリン（６４．５１６ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（３５．４８４ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）、抗酸化剤としてのＢＨＡ（０．２００ｍｇ／ｇ）、溶媒としてのベンジルアルコール（５．２５０ｍｇ／ｇ）またはパラベン（４．２００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３０．０００ｍｇ／ｇ）。
【０１０８】
実施例製剤１０
脂質としてのホスファチジルコリン（７１．４６０ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（４．７２０ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．７）、抗酸化剤としてのＢＨＡ（０．２００ｍｇ／ｇ）、溶媒としてのベンジルアルコールまたはパラベン（１０．０００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（５０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（３．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３０．０００ｍｇ／ｇ）。
【０１０９】
連結したＡＯＩを伴った実施例ベシクル製剤
実施例製剤１１
製剤９は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（８．５００ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのコラーゲニルホスファチジルコリン（１ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（１．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３６．５１ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１１０】
実施例製剤１２
製剤１０は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（８．５００ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのコラーゲニルホスファチジルコリン（０．５ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（１．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３６．５１ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１１１】
実施例製剤１３
製剤１１は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（８．５００ｍｇ／ｇ）、コラーゲニルＴｗｅｅｎ（０．５ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、抗菌剤としてのベンジルアルコールまたはパラベン（５．０００ｍｇ／ｇ）、グリセロール（３０．０００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（１．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（３６．５１ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１１２】
実施例１４及びその製造及び試験
製剤１４は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ））、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（６．８００ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのパルミチン酸アスコルビル（０．５３０ｍｇ／ｇ）、クエン酸リン酸（ｐＨ５．４）緩衝液、抗酸化剤としてのＢＨＴ（０．２００ｍｇ／ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（０.５００ｍｇ／ｇ）、キレート剤としてのＥＤＴＡ（１．０００ｍｇ／ｇ）及びエタノール（４８．８７ｍｇ／ｇ）を含む。
【０１１３】
要約
２０％のポリソルベート８０のモル置換で共有結合したアスコルビン酸を含有するようにＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物を上手く製造した。試験結果は、アスコルビン酸の包含によってｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのサイズ分布、可変形特性及び電荷は影響されないこと、パルミチン酸Ｌ−アスコルビルエステルは、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面でカルボキシルエステラーゼにアクセス可能であること、パルミチン酸アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはＦｅ３＋還元アッセイで活性があること、及びその平均サイズより小さな孔を通って変形した後、それらはその還元活性を保持することを示した。
【０１１４】
製造
パルミチン酸Ｌ−アスコルビル（Ｓｉｇｍａ７６１８）を含有する、大豆ホスファチジルコリン（Ｌｉｐｏｉｄ  ＳＰＣ  Ｓ−１００）とポリソルベート８０を用いてＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの対照バッチも作製した。ブチルヒドロキシトルエン、ＥＤＴＡ及びメタ亜硫酸水素ナトリウムをｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅに加えてパルミチン酸Ｌ−アスコルビルの酸化を出来るだけ抑えた。
【０１１５】
パルミチン酸Ｌ−アスコルビルＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ（登録商標）の調製
大豆ホスファチジルコリン：ポリソルベート８０：パルミチン酸Ｌ−アスコルビルの１３．３：０．８：０．２のモル比で５０ｇバッチのパルミチン酸Ｌ−アスコルビルｔＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。
【０１１６】
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン（３．４４ｇ）とポリソルベート８０（０．３４ｇ）とブチルヒドロキシトルエン（０．０１ｇ）とパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（０．０２６５ｇ）をエタノールに溶解して６．２６ｇの総重量を得た。
【０１１７】
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、０．１％ＥＤＴＡと０．０５％メタ亜硫酸水素ナトリウムを伴った２５ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．４）（４３．７４ｇ）を３５℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ１５分間撹拌した。
【０１１８】
４バール圧の窒素によって３５℃にてＳａｒｔｏｒｉｕｓ４７ｍｍフィルターシステムを用いて、０．２μｍのフィルター、その後０．１μｍのフィルター、さらに０．１μｍのフィルターを介して押し出すことによりｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。各フィルターは上にグラスファイバーのプレフィルターを有した。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを暗所にて＋５℃で保存した。
【０１１９】
対照Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの調製
大豆ホスファチジルコリン：ポリソルベート８０の１３．３：１のモル比で５０ｇバッチの対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。
【０１２０】
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン（３．４４ｇ）とポリソルベート８０（０．４２５ｇ）とブチルヒドロキシトルエン（０．０１ｇ）をエタノールに溶解して６．２６ｇの総重量を得た。
【０１２１】
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、０．１％ＥＤＴＡと０．０５％メタ亜硫酸水素ナトリウムを伴った２５ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．４）（４３．７４ｇ）を３５℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ１５分間撹拌した。
【０１２２】
パルミチン酸Ｌ−アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅバッチＰＤ−１４−００３５について記載したように対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを押し出した。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを暗所にて＋５℃で保存した。
【０１２３】
分析方法
粒度の測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
【０１２４】
ＡＬＶ−５０００／Ｅ光子相関分光計を用いて各試料の平均粒度及び粒度分布を測定した。試料を脱イオン水で希釈して５０〜５００ｋＨｚの範囲内で検出可能なシグナルを得、次いで各３０秒の持続時間で６回の測定にわたって分析した。温度は２５℃で制御した。正規化適合累積二次分析にデータを供して試料の粒度分布（ｗまたは幅として報告された）と同様に平均粒度（ｒまたは平均半径として報告された）を得た。平均半径に２を乗じて平均直径（ｎｍ）を得た。
【０１２５】
各試料についての多分散指数（ＰＤＩ）は以下の方程式：
【数１】
2016529242.tif 000007
（式中、ｗ＝幅、ｒ＝平均半径）
に従って算出した。
【０１２６】
連続膜適応性アッセイ
連続膜適応性（ＣＭＡ）アッセイは印加された圧力を用いてｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
【０１２７】
濾過装置の基底部における濾過サポートにＡｎｏｄｉｓｃ１３膜フィルター（孔サイズ２０ｎｍ）を装填し、上部のステンレススチールのバレルを連結した。２５℃で予備平衡化した３ｍｌのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ試料をバレルに入れ、熱循環装置（２５℃）に接続した熱伝導チューブがその周りに巻き付けられた。窒素シリンダーに接続した圧力チューブにバレルを接続した。一連の弁を用いて、９．５バール圧の設定点でシステムの事前準備を行って７．５バールの出発圧を得た。エクセルコンピュータプログラムに接続した正確な秤量バランス上に置かれた回収容器上に濾過装置を置いた。Ｂｒｏｎｋｈｕｒｓｔ圧力コントローラを用いて圧力を制御し、モニターし、且つ、システムの弁が開放され、計時が開始した場合、バランス上で回収されたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ濾液の増加する質量を低下する圧力と増加する時間に対して記録した。
【０１２８】
ＭａｔｈＣＡＤプログラムで時間、圧力、質量データを評価してＰ*値を決定した。Ｐ*は、孔の浸透に必要とされる活性化圧力の基準なので、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ膜の剛性及び可変形性の基準である。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの平均粒度はＣＭＡ濾過の前後で光子相関分光計によって測定した。
【０１２９】
アスコルビン酸アッセイ
アスコルビン酸アッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５６５６）を用いてパルミチン酸アスコルビル及びアスコルビン酸の濃度を測定した。このアッセイでは、アスコルビン酸のような抗酸化剤の存在下でＦｅ３＋がＦｅ２＋に還元される。Ｆｅ２＋は比色分析プローブによってキレートされて５９３ｎｍにて吸収を持つ生成物を生じる。
【０１３０】
パルミチン酸アスコルビルの総濃度を決定するために、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅをエタノールと５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって１：７：２ｖ／ｖに希釈することにより可溶化した。濃度範囲０．０１２５〜０．２５ｍＭへのエタノールにおける当初の希釈、次いで０．０１〜０．１７５ｍＭの最終濃度範囲への水及び５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００における７：１：２ｖ／ｖの希釈によってパルミチン酸アスコルビルの検量線を作成した。０ｍＭのパルミチン酸アスコルビルのブランクも含めた。標準と試料をマイクロタイタープレートに負荷し、キットの緩衝液とＦｅ３＋と比色分析プローブとを含有する反応混合物と１：１ｖ／ｖで混合した。室温での１分間のインキュベート後、プレートを５９３ｎｍで読み取った。標準及び試料のすべてから０ｍＭのパルミチン酸アスコルビルのブランクを差し引き、対照の「空の」ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについての吸光度をパルミチン酸アスコルビルのそれから差し引いた。最終的な吸光度をパルミチン酸アスコルビルの検量線に対して比較し、パルミチン酸アスコルビル（アスコルビン酸）の総濃度（ｍＭ）を得た。
【０１３１】
外部アスコルビン酸濃度を決定するために、アスコルビン酸を水で０．０２５〜０．２ｍＭの濃度範囲に希釈することによってアスコルビン酸の検量線を作成した。標準及びｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ試料をマイクロタイタープレートに負荷し、キット緩衝液、Ｆｅ３＋、比色分析プローブを含有する反応混合物と１：１ｖ／ｖで混合した。室温での１分間のインキュベートの後、プレートを５９３ｎｍで読み取った。プレートのブランクを標準及び試料すべてから差し引き、対照の「空の」ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの吸光度をパルミチン酸アスコルビルのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの吸光度から差し引いた。最終的な吸光度をアスコルビン酸の検量線と比較してアスコルビン酸の濃度を得た。濃度をパルミチン酸アスコルビル（アスコルビン酸）の総濃度と比べて、パルミチン酸アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面につなぎ止められた％アスコルビン酸を算出した。
【０１３２】
カルボキシルエステラーゼ消化及びＲＰ−ＨＰＬＣ
パルミチン酸アスコルビルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅからのアスコルビン酸の解放は、カルボキシルエステラーゼ１アイソフォームＢ（ＳｉｇｍａＥ０２８７）を用いたエステルの酵素的消化によって行った。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのｍｌ当たり９６０単位の酵素を加え、その後、＋３７℃にてインキュベートした。試料を２時間及び４時間で採取し、解放されたアスコルビン酸を、１容量のアセトニトリル／メタノール／ギ酸（８０ｖ／２０ｖ／０．２ｖ）を加えることによって抽出し、その後、５分間の超音波処理及び遠心分離を行って不溶性成分を沈殿させた。次いで０．２μｍの膜を介して上清試料を濾過し、その後、超純水によって１／１０に希釈した。
【０１３３】
＋２５℃にてＬｕｎａＣ１８（２）１００Ａ、５μｍ、４．６×２５０ｍｍのカラムとＷａｔｅｒｓ２６９５分離モジュールを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及び溶離液Ａが２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ３．０及び溶離液Ｂがアセトニトリルである以下の表のような勾配法によって試料を分析した。Ｗａｔｅｒｓ２４８７検出器を用いて２６０ｎｍの波長にて検出を行った。
【表３】
2016529242.tif 000008
【０１３４】
加えて、同じＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて０．４〜１００μｇ／ｍｌの範囲でアスコルビン酸の検量線を分析した。アスコルビン酸のピークは試料及び標準について得られたクロマト図において積分した。標準のピーク面積を線形回帰によって解析して検量線のための方程式を作出した。次いで試料のピーク面積を用いて、抽出法からの希釈を考慮に入れる検量線の方程式からアスコルビン酸の濃度を決定した。濃度をアスコルビン酸の総濃度と比較して、パルミチン酸アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面から解放された％アスコルビン酸を算出した。
【０１３５】
濾紙電気泳動
２つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のｐＨでの粒子の正味電荷によって決定される。
【０１３６】
各試験試料の容量（１００μｌ）を個々の２×２０ｃｍのＷｈａｔｍａｎ濾紙片（ｐＨ５．７５での泳動緩衝液：２．３ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、１．５ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウム、１．３ｍｇ／ｍｌのグリシルグリシン、２５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニンによって事前に濡らした）の中央の載せ、１３０Ｖで２時間泳動した。ＰＥＧ（ポリソルベート８０の成分）について５％ｗ／ｖの塩化バリウム及び０．０５Ｍのヨウ素によって各濾紙片を染色し、その後乾燥させた。各試料の中心点から離れたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの移動の程度を濾紙片の陽極側及び陰極側の双方で測定し、ベシクルの正味電荷を決定した。
【０１３７】
結果及び考察
結果を表４にて要約する。パルミチン酸アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの試料は、情報のための試料の完全性を再チェックするために０．２μｍの無菌フィルターで濾過し、濾過後再試験した。
表４対照及びパルミチン酸アスコルビルのＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの分析
【表４】
2016529242.tif 000009
【０１３８】
粒度測定
対照のｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びパルミチン酸アスコルビルを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるポリソルベート８０のエステルによる２０％の置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。０．２μｍの無菌フィルターで濾過した後、サイズに有意な変化はなかった。
【０１３９】
連続膜適応性アッセイ
可変形性Ｐ＊値がパルミチン酸アスコルビルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及び対照のｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅで実際上同じであったということは、ポリソルベート８０のエステルによる２０％の置換がｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの可変形性特性に有意には影響しなかったことを示している。濾過の％回収は対照のｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅでやや高かったが、それはパルミチン酸アスコルビルの包含がベシクル膜に対してごくわずかな硬直効果を有したことを示し得る。
【０１４０】
対照のｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びパルミチン酸アスコルビルエステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについての双方で、ＣＭＡ濾過後の平均粒径は濾過前に比べてほぼ５０％低下した。多分散指数がやや高かったことは、広いサイズ分布を示している。これらの特性はＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅベシクルについて予想されたとおりである。
【０１４１】
アスコルビン酸アッセイ
パルミチン酸アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるパルミチン酸アスコルビルの総濃度は０．６１ｍＭと測定された。これは２５３μｇ／ｍｌのパルミチン酸アスコルビル及び１０７μｇ／ｍｌのアスコルビン酸と同じである。濃度が製造工程の出発での濃度のおよそ５０％だったということは、たぶん、濾過とアスコルビン酸の酸化の組み合わせを介して損失が生じたことを示している。しかしながら、結果は、Ｆｅ３＋を還元することができる活性のあるアスコルビン酸が最終的なｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物に存在することを示した。
【０１４２】
パルミチン酸アスコルビルｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面で反応したアスコルビン酸の濃度は０．１３ｍＭと測定された。これは、外部につなぎ止められているアスコルビン酸の２３μｇ／ｍｌまたは総濃度の２１％と同じである。
【０１４３】
０．２μｍの無菌フィルターで濾過した後のアスコルビン酸の総濃度または外部濃度に有意な変化はなかった。
【０１４４】
連続膜適応性アッセイ（ＣＭＡ）に供されたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのパルミチン酸アスコルビルの総濃度はＣＭＡ前よりもやや高かった。アスコルビン酸の外部濃度は実際上、ＣＭＡ前後で同じだった。これは、その平均径より小さい孔サイズを変形して通過したｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅがその還元活性を失っていないことを示していた。
【０１４５】
カルボキシルエステラーゼ消化及びＲＰ−ＨＰＬＣ
パルミチン酸アスコルビルエステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのカルボキシルエステラーゼ１酵素とのインキュベートは、３７℃での２時間のインキュベート後１５％（１６μｇ／ｍｌ）の、及び３７℃での４時間のインキュベート後３６％（３８μｇ／ｍｌ）の総アスコルビン酸の解放を生じた。従って、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面につなぎ止められたアスコルビン酸は酵素にアクセス可能だった。外部アスコルビン酸について得られた濃度はアスコルビン酸アッセイで得られたものに類似していた。
【０１４６】
ＣＭＡ可変形性濾過アッセイに供されたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅをカルボキシルエステラーゼＩ酵素ともインキュベートして３７℃での２時間のインキュベート後９％（１３μｇ／ｍｌ）の、及び３７℃での４時間のインキュベート後１９％（２６μｇ／ｍｌ）の総アスコルビン酸の解放を生じた。ＣＭＡ後、解放の比率が何故低いのかは不明瞭であるが、たぶん、ベシクルサイズの変化が酵素へのパルミチン酸アスコルビルのアクセス性を低下させた。
【０１４７】
濾紙電気泳動
対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及びパルミチン酸アスコルビルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅが双方とも電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは、正の正味電荷を明らかにしている。従って、パルミチン酸アスコルビルの存在はｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの電荷特性を変えなかった。
【０１４８】
実施例製剤１５及びその製造と試験
製剤１５は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（７．６６ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのパルミトイルトリペプチド１（０．３７０ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）、及びエタノール（４８．１０ｍｇ／ｇ）；または脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（７．６６ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのパルミトイルテトラペプチド７（０．４５０ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）、及びエタノール（４８．４０ｍｇ／ｇ）のいずれかを含む。
【０１４９】
要約
１０％のポリソルベート８０のモル置換にて共有結合したペプチド：テトラペプチド−７及びトリペプチド−１を含有するようにＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物を上手く製造した。試験結果は、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのサイズ分布、可変形性特性及び電荷がペプチドの包含によって影響を受けないことを示した。
【０１５０】
製造
大豆ホスファチジルコリン（Ｌｉｐｏｉｄ  ＳＰＣ  Ｓ−１００）とパルミトイルテトラペプチド−７（ＰＡＬ−ＧＱＰＲ）またはパルミトイルトリペプチド−１（ＰＡＬ−ＧＨＫ）（Ｓｉｎｏｗａｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ社）を含有するポリソルベート８０を用いてＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの対照バッチも作製した。
【０１５１】
パルミトイルペプチドＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの調製
１３．３：０．９：０．１の大豆ホスファチジルコリン：ポリソルベート８０：パルミトイルペプチドのモル比で５０ｇバッチのパルミトイルテトラペプチド−７ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及び５０ｇバッチのパルミトイルトリペプチド−１ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。
【０１５２】
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン（３．４４ｇ）とポリソルベート８０（０．３８３ｇ）とＥＩＴＨＥＲパルミトイルテトラペプチド−７（０．０２２４ｇ）またはパルミトイルトリペプチド−１（０．０１８６ｇ）のいずれかとをエタノールに溶解して６．２６ｇの総重量を得た。
【０１５３】
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液ｐＨ７．７（４３．７４ｇ）を３５℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ１５分間撹拌した。
【０１５４】
４バール圧の窒素によって３５℃にてＳａｒｔｏｒｉｕｓ４７ｍｍフィルターシステムを用いて、０．２μｍのフィルター、その後０．１μｍのフィルター、さらに０．１μｍのフィルターを介して押し出すことによりｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。各フィルターは上にグラスファイバーのプレフィルターを有した。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを暗所にて＋５℃で保存した。
【０１５５】
対照Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの調製
大豆ホスファチジルコリン：ポリソルベート８０の１３．３：１のモル比で５０ｇバッチの対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。
【０１５６】
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン（３．４４ｇ）とポリソルベート８０（０．４２５ｇ）をエタノールに溶解して６．２６ｇの総重量を得た。
【０１５７】
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）（４３．７４ｇ）を３５℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ１５分間撹拌した。
【０１５８】
パルミトイルペプチドｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのバッチについて記載したように対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを押し出した。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを＋５℃で暗所に保存した。
【０１５９】
分析方法
粒度測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
【０１６０】
ＡＬＶ−５０００／Ｅ光子相関分光計を用いて各試料の平均粒度及び粒度分布を測定した。試料を脱イオン水で希釈して５０〜５００ｋＨｚの範囲内で検出可能なシグナルを得、次いで各３０秒の持続時間で６回の測定にわたって分析した。温度は２５℃で制御した。正規化適合累積二次分析にデータを供して試料の粒度分布（ｗまたは幅として報告された）と同様に平均粒度（ｒまたは平均半径として報告された）を得た。平均半径に２を乗じて平均直径（ｎｍ）を得た。
【０１６１】
各試料についての多分散指数（ＰＤＩ）は以下の方程式：
【数２】
2016529242.tif 000010
（式中、ｗ＝幅、ｒ＝平均半径）
に従って算出した。
【０１６２】
連続膜適応性アッセイ
連続膜適応性（ＣＭＡ）アッセイは印加された圧力を用いてｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
【０１６３】
濾過装置の基底部における濾過サポートにＡｎｏｄｉｓｃ１３膜フィルター（孔サイズ２０ｎｍ）を装填し、上部のステンレススチールのバレルを連結した。２５℃で予備平衡化した３ｍｌのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ試料をバレルに入れ、熱循環装置（２５℃）に接続した熱伝導チューブがその周りに巻き付けられた。窒素シリンダーに接続した圧力チューブにバレルを接続した。一連の弁を用いて、９．５バール圧の設定点でシステムの事前準備を行って７．５バールの出発圧を得た。エクセルコンピュータプログラムに接続した正確な秤量バランス上に置かれた回収容器上に濾過装置を置いた。Ｂｒｏｎｋｈｕｒｓｔ圧力コントローラを用いて圧力を制御し、モニターし、且つ、システムの弁が開放され、計時が開始した場合、バランス上で回収されたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ濾液の増加する質量を低下する圧力と増加する時間に対して記録した。
【０１６４】
ＭａｔｈＣＡＤプログラムで時間、圧力、質量データを評価してＰ*値を決定した。Ｐ*は、孔の浸透に必要とされる活性化圧力の基準なので、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの膜の剛性の基準である。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの平均粒度はＣＭＡ濾過の前後で光子相関分光測定によって測定した。
【０１６５】
ペプチド濃度（ＣＢＱＣＡ）アッセイ
アミノ酸配列、グリシン−ヒスチジン−グリシンを伴ったパルミトイルトリペプチド−１のペプチド部分の濃度は、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノロン−２−カルボキシアルデヒド（ＣＢＱＣＡ）によってリジンアミノ酸の１級アミノ基を誘導体化して蛍光生成物を得ることにより測定した。
【０１６６】
パルミトイルトリペプチド−１ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及び対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの試料を０．１ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．３にて１／４００〜１／３２００の範囲で希釈した。このアッセイに適合した水性条件にパルミトイルトリペプチド−１を可溶化することは可能ではないので；ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるトリペプチド−１の濃度の測定はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の検量線に対して行った。既知の濃度のＢＳＡを調製して６．７μｇ／ｍｌ〜０．３３μｇ／ｍｌＬの範囲を得るように調製した。標準及び試料の一次アミンの誘導体化は、シアン化カリウムの存在下で１時間室温にてＣＢＱＣＡ試薬によるマイクロプレート方式で行った。測定は、励起波長４８５ｎｍ及び蛍光放射波長５２０ｎｍによるＢＭＧ  Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ蛍光計で読み取ることによって行った。
【０１６７】
０．１ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．３のブランク試料の蛍光読み取りをデータすべてから差し引いた。ＢＳＡ標準から得られた蛍光測定を線形回帰によって分析して検量線のための方程式を作出した。次いで、同等の希釈での対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの蛍光を差し引いた後、ＢＳＡ曲線と比べたパルミトイルトリペプチド−１ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるペプチドの量を決定した。
【０１６８】
濾紙電気泳動
２つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のｐＨでの粒子の正味電荷によって決定される。
【０１６９】
各試験試料の容量（１００μｌ）を個々の２×２０ｃｍのＷｈａｔｍａｎ濾紙片（ｐＨ５．７５での泳動緩衝液：２．３ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、１．５ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウム、１．３ｍｇ／ｍｌのグリシルグリシン、２５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニンによって事前に濡らした）の中央の載せ、１３０Ｖで２時間泳動した。ＰＥＧ（ポリソルベート８０の成分）について５％ｗ／ｖの塩化バリウム及び０．０５Ｍのヨウ素によって各濾紙片を染色し、その後乾燥させた。各試料の中心点から離れたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの移動の程度を濾紙片の陽極側及び陰極側の双方で測定し、ベシクルの正味電荷を決定した。
【０１７０】
結果及び考察
結果を表５にて要約する。
表５パルミトイルペプチドＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの分析
【表５】
2016529242.tif 000011
【０１７１】
粒度測定
対照のｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びパルミトイルペプチドを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるポリソルベート８０のパルミトイルペプチドによる１０％の置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。
【０１７２】
連続膜適応性アッセイ
可変形性Ｐ＊値は、対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びパルミトイルペプチドを含有するものについて類似していた。パルミトイルテトラペプチド−７ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについての値がやや低かったということは、ポリソルベート８０のエステルによる１０％の置換がベシクルをさらに可変形にする膜に対する軽い軟化効果を有し得たことを示している。しかしながら、これは、対照に比べてパルミトイルペプチドｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて類似していた濾過％回収では明らかにされなかったので、低いＰ＊はたぶん有意ではない。
【０１７３】
ＣＭＡ濾過後の平均粒径は対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びパルミトイルペプチドを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについての双方で濾過前に比べて約５０％低下した。多分散指数がやや高かったということは、広いサイズ分布を示している。これらの特性はｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅベシクルについて予想された通りである。
【０１７４】
ペプチド濃度（ＣＢＱＣＡ）アッセイ
パルミトイルテトラペプチド−７は、試薬と反応する配列にてリジン残基を欠如するためにＣＢＱＣＡアッセイにおける結果を生じなかった。しかしながら、パルミトイルトリペプチド−１はリジンを含有するので検出可能だった。アッセイに適合した水性条件にてパルミトイルトリペプチド−１を可溶化することはできなかったので、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるトリペプチド−１の濃度の測定はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準に対して行わなければならなかった。ＢＳＡは５８のリジン残基を伴った６６ｋＤａのタンパク質で１１３８Ｄａのペプチド当たり約１個のリジンである。当該ペプチドは３４０Ｄａにて１つのリジンを含有する。ＢＳＡとペプチドの間でのリジンの濃度の差異を補正することによって量を提供する試みを行ったが、総ペプチドは依然として過剰見積もりされると思われ、理論上の２２１μｇ／ｍｌに比べて４２４μｇ／ｍｌだった。
【０１７５】
濾紙電気泳動
対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及びパルミトイルペプチドを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはすべて電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは正の正味電荷を明らかにしている。従って、パルミトイルテトラペプチド−７またはパルミトイルトリペプチド−１の存在はｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの電荷特性を変えなかった。
実施例製剤１６及びその製造と試験
【０１７６】
製剤１６は、脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ）、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（６．５５ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのナプロキセン／ポリソルベート（２．１９５ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）、及びエタノール（４７．５６ｍｇ／ｇ）；または脂質としてのホスファチジルコリン（６８．７００ｍｇ／ｇ））、界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０（５．８０ｍｇ／ｇ）、ＡＯＩとしてのジクロフェナク／ポリソルベート（２．９６ｍｇ／ｇ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）、及びエタノール（４７．５４ｍｇ／ｇ）のいずれかを含む。
【０１７７】
要約
２０％のポリソルベート８０のモル置換で共有結合した非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）：ナプロキセン及びジクロフェナクを含有するようにＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物を上手く製造した。試験結果は、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのサイズ分布、可変形性特性及び電荷はＮＳＡＩＤの包含によって影響されないこと、ＮＳＡＩＤエステルはｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面上でカルボキシルエステラーゼ酵素にアクセス可能であること、及びＮＳＡＩＤｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ単独よりもＣＯＸ−１酵素阻害アッセイにて大きな阻害効果を有することを示した。ＮＳＡＩＤｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは、変形してその平均サイズよりも小さい孔を通った後、その阻害活性を保持した。
【０１７８】
製造
大豆ホスファチジルコリン（Ｌｉｐｏｉｄ  ＳＰＣ  Ｓ−１００）と、ナプロキセン／ポリソルベート８０（Ｋｅｙ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  ＤＫ−００３５−３）またはジクロフェナク／ポリソルベート８０（Ｋｅｙ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  ＤＫ−００３６−３）のいずれかを含有するポリソルベート８０とを用いてＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの対照バッチも作製した。
【０１７９】
ＮＳＡＩＤのＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの調製
１３．３：０．８：０．２の大豆ホスファチジルコリン：ポリソルベート８０：ＮＳＡＩＤ／ポリソルベート８０のモル比（ＮＳＡＩＤ／ポリソルベート８０エステルの純度を構成する）で２０ｇバッチのナプロキセン／ポリソルベートｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及び２０ｇバッチのジクロフェナク／ポリソルベートｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。
【０１８０】
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン（１．３７４ｇ）をポリソルベート８０（０．１３１ｇ）とナプロキセン／ポリソルベート（０．０４３９ｇ）またはポリソルベート８０（０．１１６ｇ）とジクロフェナク／ポリソルベート（０．０５９２ｇ）と共にエタノールに溶解し、２．５０ｇの総重量を得た。
【０１８１】
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）（１７．５０ｇ）を３５℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ１５分間撹拌した。
【０１８２】
４バール圧の窒素によって３５℃にてＳａｒｔｏｒｉｕｓ４７ｍｍフィルターシステムを用いて、０．２μｍのフィルター、その後０．１μｍのフィルター、さらに０．１μｍのフィルターを介して押し出すことによりｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。各フィルターは上にグラスファイバーのプレフィルターを有した。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを暗所にて＋５℃で保存した。
【０１８３】
対照Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの調製
１３．３：１の大豆ホスファチジルコリン：ポリソルベート８０のモル比で５０ｇバッチの対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを調製した。
【０１８４】
穏やかな加熱及び撹拌を用いて、大豆ホスファチジルコリン（３．４４ｇ）とポリソルベート８０（０．４２５ｇ）をエタノールに溶解し、６．２６ｇの総重量を得た。
【０１８５】
広いゲージの針を嵌めた注射器から大豆ホスファチジルコリン調製物を添加しながら、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）（４３．７４ｇ）を３５℃で激しく撹拌した。混合物をおよそ１５分間撹拌した。
【０１８６】
ＮＳＡＩＤのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて記載されたように対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを押し出した。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを暗所にて＋５℃で保存した。
【０１８７】
分析法
粒度測定
光子相関分光計を用いた動的光散乱によってｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物の平均粒度及び粒度分布を測定した。干渉性の光が粒子の懸濁液を通過する場合、光はあらゆる方向に散乱する。粒子懸濁液の散乱光強度を測定し、相関させることによって、懸濁液における粒子のサイズ及びサイズ分布を測定することが可能である。
【０１８８】
ＡＬＶ−５０００／Ｅ光子相関分光計を用いて各試料の平均粒度及び粒度分布を測定した。試料を脱イオン水で希釈して５０〜５００ｋＨｚの範囲内で検出可能なシグナルを得、次いで各３０秒の持続時間で６回の測定にわたって分析した。温度は２５℃で制御した。正規化適合累積二次分析にデータを供して試料の粒度分布（ｗまたは幅として報告された）と同様に平均粒度（ｒまたは平均半径として報告された）を得た。平均半径に２を乗じて平均直径（ｎｍ）を得た。
【０１８９】
各試料についての多分散指数（ＰＤＩ）は以下の方程式：
【数３】
2016529242.tif 000012
（式中、ｗ＝幅、ｒ＝平均半径）
に従って算出した。
【０１９０】
連続膜適応性アッセイ
連続膜適応性（ＣＭＡ）アッセイは印加された圧力を用いてｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅに活性化エネルギーを提供して、それらが変形し、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの平均サイズよりも小さいフィルター孔を通過するのを可能にした。
【０１９１】
濾過装置の基底部における濾過サポートにＡｎｏｄｉｓｃ１３膜フィルター（孔サイズ２０ｎｍ）を装填し、上部のステンレススチールのバレルを連結した。２５℃で予備平衡化した３ｍｌのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ試料をバレルに入れ、熱循環装置（２５℃）に接続した熱伝導チューブがその周りに巻き付けられた。窒素シリンダーに接続した圧力チューブにバレルを接続した。一連の弁を用いて、９．５バール圧の設定点でシステムの事前準備を行って７．５バールの出発圧を得た。エクセルコンピュータプログラムに接続した正確な秤量バランス上に置かれた回収容器上に濾過装置を置いた。Ｂｒｏｎｋｈｕｒｓｔ圧力コントローラを用いて圧力を制御し、モニターし、且つ、システムの弁が開放され、計時が開始した場合、バランス上で回収されたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ濾液の増加する質量を低下する圧力と増加する時間に対して記録した。
【０１９２】
ＭａｔｈＣＡＤプログラムで時間、圧力、質量データを評価してＰ*値を決定した。Ｐ*は、孔の浸透に必要とされる活性化圧力の基準なので、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの膜の剛性及び可変形性の基準である。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの平均粒度はＣＭＡ濾過の前後で光子相関分光計によって測定した。
【０１９３】
カルボキシルエステラーゼ消化及びＲＰ−ＨＰＬＣ
カルボキシルエステラーゼ１アイソフォームＢ（ＳｉｇｍａＥ０２８７）を用いたエステルの酵素消化によって、２つの化合物のいずれかのポリソルベート８０エステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面から、つなぎ止められた非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）：ジクロフェナクまたはナプロキセンの解放を行った。ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのｍｌ当たり９６０単位の酵素を添加し、その後＋３７℃でインキュベートした。４時間で試料を採取し、１容量のアセトニトリル／メタノール／ギ酸（８０ｖ／２０ｖ／０．２ｖ）を加えることによって、解放されたＮＳＡＩＤを抽出し、その後、５分間の超音波処理と遠心分離を行って不溶性成分を沈殿させた。次いで、上清試料を０．２μｍの膜を介して濾過し、その後、超純水で１／１０に希釈した。
【０１９４】
＋２５℃でのＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８  ５μｍ、１００Ａ、４．６×１５０ｍｍカラム及びＷａｔｅｒｓ２６９５分離モジュールと、溶離液Ａが超純水における０．１％トリフルオロ酢酸であり、溶離液Ｂがアセトニトリルにおける０．１％トリフルオロ酢酸である以下の表のような勾配法とを用いた逆相高圧クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法によって試料をアッセイした。ＮＳＡＩＤ双方の検出は、Ｗａｔｅｒｓ２４８７検出器を用いて２５４ｎｍの波長で行った。
【表５−２】
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【０１９５】
加えて、同じＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて０．４〜９１μｇ／ｍｌの範囲でのＮＳＡＩＤそれぞれの検量線を分析した。試料及び標準について得られたクロマト図にてＮＳＡＩＤのピークをまとめた。標準のピーク面積を線形回帰によって解析し、検量線のための方程式を作出した。次いで試料のピーク面積を用いて、抽出法からの希釈を考慮に入れる各検量線の方程式から、解放されたＮＳＡＩＤの濃度を決定した。その濃度を理論上のＮＳＡＩＤの総濃度と比較してＮＳＡＩＤのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面から解放された％ＮＳＡＩＤを算出した。
【０１９６】
シクロオキシゲナーゼ−１阻害アッセイ
シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ−１）阻害アッセイは、ＣＯＸ−１酵素の活性を阻害するＮＳＡＩＤのような薬剤の能力を測定する。ＣＯＸ−１はアラキドン酸のプロスタグランジンＨ２への変換を触媒する。反応の間に酵素は酸素を消費する。酸素消費の速度（ナノモル／分）は反応速度の基準であり、阻害剤の存在下で低下する。
【０１９７】
Ｏｘｙｇｒａｐｈプラスソフトウエアに接続された較正したＣｌａｒｋ酸素電極を含むＨａｎｓａｔｅｃｈ  Ｏｘｙｇｒａｐｈシステムを用いてＣＯＸ阻害アッセイを設定した。０．１ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．２、２．０ｍＭのフェノール、１μＭのヘマチンを含有する反応混合物を３７℃の反応チャンバーにて安定な酸素のベースラインが達成されるまで撹拌した。３４０単位のＣＯＸ−１酵素（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＣＡＹ６０１００）を加え１分間平衡化させた後、アラキドン酸基質を加えた。最終濃度８、１６、３２及び６４μＭのにてアラキドン酸を用いて一連の対照反応を行った。各反応について、Ｏｘｙｇｒａｐｈの酸素曲線上で最大反応速度を測定した。
【０１９８】
ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ試料の阻害効果を測定するために、対照、ナプロキセンまたはジクロフェナクのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを室温で１０分間アラキドン酸と事前混合し、その後、アラキドン酸混合物を反応に加えた。反応におけるアラキドン酸の最終濃度が８、１６、３２及び６４μＭになるように濃度を選択した。
【０１９９】
対照、対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及びＮＳＡＩＤｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの反応の反応速度（酸素のナノモル／ｍｌ／分）に対してアラキドン酸の濃度をプロットし、４つの基質濃度での反応速度を比較し、速度の低下を平均することによって％阻害について値を算出した。ラインウィーバー・バークの逆数プロット（１／反応速度に対する１／アラキドン酸濃度）もプロットした。
【０２００】
ベシクルが変形してその平均径より小さい孔を通過するのを可能にする活性化エネルギーを提供する印加圧を用いる連続膜適応性（ＣＭＡ）アッセイで処理されたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの試料においてもＣＯＸ−１阻害アッセイを行った。
【０２０１】
濾紙電気泳動
２つの緩衝液を満たしたリザーバ間で濾紙片を浮かせ、試験試料を濾紙片に載せ、濾紙片を横切って電流を印加する濾紙電気泳動を用いてｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物の電荷特性を検討した。荷電した粒子は濾紙片を横切って移動し、移動した方向及び距離は緩衝液のｐＨでの粒子の正味電荷によって決定される。
【０２０２】
各試験試料の容量（１００μｌ）を個々の２×２０ｃｍのＷｈａｔｍａｎ濾紙片（ｐＨ５．７５での泳動緩衝液：２．３ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、１．５ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウム、１．３ｍｇ／ｍｌのグリシルグリシン、２５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニンによって事前に濡らした）の中央の載せ、１３０Ｖで２時間泳動した。ＰＥＧ（ポリソルベート８０の成分）について５％ｗ／ｖの塩化バリウム及び０．０５Ｍのヨウ素によって各濾紙片を染色し、その後乾燥させた。各試料の中心点から離れたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの移動の程度を濾紙片の陽極側及び陰極側の双方で測定し、ベシクルの正味電荷を決定した。
【０２０３】
結果及び考察
結果を表６にて要約する。
表６対照及びＮＳＡＩＤのＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの分析
【表６】
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【０２０４】
粒度測定
対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びＮＳＡＩＤ／ポリソルベート８０エステルを含有するものについて平均粒径及び多分散指数は類似していた。このことは、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅにおけるナプロキセン／ポリソルベート８０またはジクロフェナク／ポリソルベート８０のいずれかによるポリソルベート８０の２０％置換はサイズ特性に影響しなかったことを示していた。
【０２０５】
連続膜適応性アッセイ
可変形性Ｐ＊値は、対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅよりもＮＳＡＩＤ／ポリソルベートエステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの方がやや低かったということは、ナプロキセン／ポリソルベート８０またはジクロフェナク／ポリソルベートのいずれかによるポリソルベート８０の２０％置換が、ベシクルをさらに可変形にする軽い軟化効果を膜に対して有していたことを示している。このことは、対照に比べてナプロキセンまたはジクロフェナクのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについての方が増加していた濾過％回収においても明らかだった。
【０２０６】
ＣＭＡ濾過後の平均粒径は、濾過前にくらべて対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて及びＮＳＡＩＤ−ポリソルベートエステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについての双方でほぼ５０％低下した。多分散指数がやや高かったということは広いサイズ分布を示している。これらの特性はｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅベシクルについて予想どおりである。
【０２０７】
カルボキシルエステラーゼ消化及びＲＰ−ＨＰＬＣ
ＮＳＡＩＤ／ポリソルベートエステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅのカルボキシルエステラーゼ１酵素とのインキュベートはＮＳＡＩＤ総濃度の３〜６％の間の解放を生じたということは、ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面につなぎ止められたナプロキセンまたはジクロフェナクの少ない割合が酵素にアクセス可能であることを示している。
【０２０８】
シクロオキシゲナーゼ−１阻害アッセイ
ＮＳＡＩＤ／ポリソルベートエステルを含有するＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは、対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅよりも大きな比率でシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）酵素の反応の速度を阻害した。対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはＣＯＸ−１酵素を阻害すると予想されたが、既知のＣＯＸ−１阻害剤であるナプロキセンまたはジクロフェナクをｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの外表面につなぎ止めることはその阻害効果をさらに高めた。
【０２０９】
図１及び図２はそれぞれ、反応の速度に対してプロットしたアラキドン酸基質の濃度及び逆数（ラインウィーバー・バーク）プロットを示す。
【０２１０】
連続膜適応性（ＣＭＡ）アッセイにてその平均サイズよりも小さい穴を通過するように変形したＴｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはＣＯＸ−１酵素を阻害する能力を保持していた。
【０２１１】
図３及び図４はＣＭＡ後の試料についてそれぞれ、反応の速度に対してプロットしたアラキドン酸基質の濃度及び逆数（ラインウィーバー・バーク）プロットを示す。
【０２１２】
ＣＯＸ−１酵素の％阻害は３種のｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ調製物すべてについてＣＭＡアッセイ後やや低かった。このことは、ＮＳＡＩＤの活性の損失ではなく濾過によって生じたｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅと会合したＮＳＡＩＤの濃度の低下によるものであると仮定された。匹敵するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの濃度の指示は光子相関分光分析から得られた。ＣＭＡ後の試料についての周波数シグナルの強度はＣＭＡ前に比べて低下していたが、ＣＭＡ後の様々な濾過回収にもかかわらず、対照とＮＳＡＩＤのｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅについて類似することが見いだされた。
【０２１３】
濾紙電気泳動
対照ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ及びＮＳＡＩＤ／ポリソルベートエステルを含有するｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはすべて電気泳動装置の陰極に向かって移動したということは、正の正味電荷を明らかにしている。従って、ナプロキセンまたはジクロフェナクの存在はｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅの電荷特性を変えなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月22日(2016.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質と界面活性剤と関心のある作用物質（ＡＯＩ）とを含むベシクル製剤であって、
各ＡＯＩ分子の一部がベシクルの外側にあり、ベシクル膜の外にあるよう前記ＡＯＩがベシクルの成分に結合される、前記ベシクル製剤。
【請求項２】
前記ＡＯＩが前記ベシクルの界面活性剤成分に結合する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ＡＯＩが前記ベシクルの脂質成分に結合する、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
ベシクルの界面活性剤成分及び脂質成分双方が、それらに結合するＡＯＩを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
単一のＡＯＩがベシクル成分に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
複数のＡＯＩがベシクル成分に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
前記結合が共有結合である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
前記ＡＯＩが均質である、請求項６に記載の製剤。
【請求項９】
前記ＡＯＩが不均質である、請求項６に記載の製剤。
【請求項１０】
前記ＡＯＩが元素、イオン、無機塩、小分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、微量栄養素、高分子または大環状分子から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ＡＯＩが、皮膚の構造タンパク質、治療用タンパク質、炭水化物、発色団含有の高分子、ビタミン、金属または金属塩、非金属元素または非金属塩、メラニンまたはメラニン類似体、または抗炎症剤から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記皮膚の構造タンパク質がエラスチンまたはコラーゲンである、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記発色団含有の高分子がポルフィリンである、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
前記抗炎症剤がＮＳＡＩＤである、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１５】
患者の皮膚を介してＡＯＩを送達するのに使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記製剤が局所に塗布される、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記製剤が、それぞれ異なるＡＯＩを伴った、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のものであり、または請求項１〜６または１０〜１４のいずれか１項に記載のベシクルの混合物を含む製剤である、請求項１５または１６に記載の製剤。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の作製方法であって、前記方法が、ＡＯＩの一部がベシクルの外側にあり、ベシクル膜の外にあるようにＡＯＩをベシクル成分に連結することを含む、前記作製方法。
【請求項１９】
疾患を治療するのに使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のベシクル製剤。
【請求項２０】
スキンケアまたは化粧品で使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のベシクル製剤。
【国際調査報告】
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