(57)【要約】  パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）ユビキチン遺伝子から単離されたプロモーターおよび／または３’−ＵＴＲを含む調節エレメントを用いて、植物細胞および／または植物組織中で導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が提供される。
2016531575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ポリリンカー配列；
ｉｉ）非ユビキチン導入遺伝子または
ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ
と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、前記プロモーターは配列番号３５または配列番号３５と９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸ベクター。
【請求項２】
前記プロモーターが長さ３ｋｂ未満である、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが配列番号３５または配列番号３５と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項４】
選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
【請求項５】
前記プロモーターが導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項４に記載の核酸ベクター。
【請求項６】
前記導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコードする、請求項５に記載の核酸ベクター。
【請求項７】
配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記ポリリンカーまたは前記導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１から３または５のいずれかに記載の核酸ベクター。
【請求項８】
配列番号３８または配列番号３８と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、前記５’非翻訳配列が前記プロモーター配列と前記ポリリンカーまたは導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している、請求項１から３または５のいずれかに記載の核酸ベクター。
【請求項９】
前記５’非翻訳配列の後に挿入されたイントロン配列をさらに含む、請求項８に記載の核酸ベクター。
【請求項１０】
前記イントロン配列が配列番号３７を含む、請求項９に記載の核酸ベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが配列番号４０または配列番号４０と９０％の配列同一性を有する配列からなり、前記プロモーターが導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項１２】
前記プロモーターが配列番号３９または配列番号３９と９０％の配列同一性を有する配列からなり、前記プロモーターが導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１に記載の核酸ベクター。
【請求項１３】
配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１１または１２に記載の核酸ベクター。
【請求項１４】
導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３５または配列番号３５と９０％の配列同一性を有する配列を含む非パニクム属（Panicum）植物。
【請求項１５】
トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される、請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
トウモロコシ（Zea mays）である、請求項１４に記載の植物。
【請求項１７】
前記導入遺伝子が前記植物のゲノムに挿入されている、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１８】
配列番号３８または配列番号３８と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、前記５’非翻訳配列が前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している、請求項１４に記載の植物。
【請求項１９】
前記５’非翻訳配列の後に挿入されたイントロン配列をさらに含む、請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
前記イントロン配列が配列番号３７を含む、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１８に記載の植物。
【請求項２２】
前記プロモーターが配列番号４０または配列番号４０と９０％の配列同一性を有する配列からなり、前記プロモーターが導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１４に記載の植物。
【請求項２３】
前記プロモーターが配列番号３９または配列番号３９と９０％の配列同一性を有する配列からなり、前記プロモーターが導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１４に記載の植物。
【請求項２４】
配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項２２または２３に記載の植物。
【請求項２５】
ｉ）ポリリンカー配列；
ｉｉ）非ユビキチン導入遺伝子または
ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ
と作動可能に連結している転写ターミネーターを含む核酸ベクターであって、前記転写ターミネーターは配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸ベクター。
【請求項２６】
前記転写ターミネーターが長さ１ｋｂ未満である、請求項２５に記載の核酸ベクター。
【請求項２７】
前記転写ターミネーターが配列番号３６の３’ＵＴＲ配列からなる、請求項２６に記載の核酸ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年８月３０日出願の米国仮出願第６１／８７２１３４号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
電子的に提出される材料の参照による組み込み
これと同時に提出され、以下のように特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０１４年８月１５日に作成された１つの６４ＫＢ  ＡＣＩＩ（テキスト）「Ｐａｎｉｃｕｍ＿ＵＢＩ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５」という名前付きファイル。
【背景技術】
【０００３】
植物の形質転換は、農学的に望ましい形質または特性を異なる作物植物種に導入するのに使用するための魅力的な技術である。特定の望ましい形質を有するよう植物種が開発および／または改変されている。一般的に、望ましい形質には、例えば、栄養価の改善、収量増加、耐有害生物性または耐病性の付与、耐乾燥性およびストレス耐性の増加、園芸品質（例えば、着色および成長）の改善、除草剤耐性の付与、植物からの産業的に有用な化合物および／または材料の製造の可能化、ならびに／あるいは医薬品の製造の可能化が含まれる。
【０００４】
単一ゲノム遺伝子座に積み重なった複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物は、植物の形質転換技術を介して作製される。植物の形質転換技術によって、導入遺伝子の植物細胞への導入、植物ゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子のコピーを含む稔性トランスジェニック植物の回収がもたらされ、導入遺伝子（複数可）の転写および翻訳を介したその後の導入遺伝子発現によって、望ましい形質および表現型を有するトランスジェニック植物が得られる。スタック中の各導入遺伝子は、典型的には遺伝子発現のために独立したプロモーターを要するので、複数のプロモーターが導入遺伝子スタックに使用される。
【０００５】
同じ形質を調節するために複数の導入遺伝子の同時発現が必要となることにより、しばしば複数の導入遺伝子の発現を駆動するために同じプロモーターを繰り返し使用することになる。しかしながら、高レベルの配列同一性を共有する配列を含むプロモーターを繰り返し使用することは、相同性ベースの遺伝子サイレンシング（homology-based gene silencing）（ＨＢＧＳ）をもたらし得る。反復ＤＮＡ配列を導入遺伝子に使用すると、ＨＢＧＳがトランスジェニック植物で頻繁に起こることが確認された（Peremarti et al., 2010）。さらに、導入遺伝子構築物に類似ＤＮＡ配列を繰り返し使用することは、プラスミドの組換えおよび不安定性のために、アグロバクテリウム（Agrobacterium）では困難と分かった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
トウモロコシユビキチン１プロモーターと低レベルの配列同一性または相同性を共有するユビキチン調節エレメント（例えば、プロモーターおよび３’−ＵＴＲ）が本明細書で記載される。さらに、ユビキチン調節エレメントを利用する構築物および方法が記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
植物細胞および／または植物組織中で導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が本明細書で開示される。一実施形態では、ユビキチン遺伝子の調節エレメントを、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ゲノムから精製し、前記調節エレメントと自然では連結していない配列と組み換えて、ユビキチン調節配列に生まれつき備わっていない導入遺伝子を植物細胞中で発現させるための発現ベクターを創製する。一実施形態では、ユビキチン遺伝子の調節エレメントがポリリンカー配列と作動可能に連結している発現ベクターが提供される。このような発現ベクターは、ユビキチン遺伝子調節配列と作動可能に連結した状態で遺伝子または遺伝子カセットをベクターに挿入することを容易にする。
【０００８】
実施形態では、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターを含む構築物が提供される。実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子と作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン５’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、プロモーターと作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン５’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子と作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンイントロンを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、プロモーターと作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンイントロンを含む。実施形態では、構築物が、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子と作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、少なくとも１、２、３、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の導入遺伝子を含む。
【０００９】
実施形態では、遺伝子発現カセットが、独立に、ａ）パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、ｂ）パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンイントロン、ｃ）パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン５’−ＵＴＲ、およびｄ）パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲを含む。
【００１０】
一実施形態によると、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、プロモーターが配列番号３９、または配列番号３９と９０％の配列同一性を有する配列からなる、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、核酸ベクターが遺伝子カセットを含み、遺伝子カセットがプロモーター、非ユビキチン導入遺伝子および３’非翻訳領域を含み、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結している配列番号３９からなり、導入遺伝子の第２の末端が配列番号３６からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。
【００１１】
パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）プロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロンおよび３’−ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物を育てる方法が本明細書で開示される。パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）プロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロンおよび３’−ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法も本明細書で開示される。
【００１２】
一実施形態によると、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号３５を含む、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３５または配列番号３５と９０％の配列同一性を有する配列を含む非キビ属（Panicum）植物または植物細胞が提供される。一実施形態では、植物がトウモロコシ変種である。一実施形態では、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号３９または４０からなる、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、遺伝子カセットを含む非キビ属（Panicum）植物または植物細胞であって、遺伝子カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、さらにプロモーターが配列番号３９からなる、非キビ属（Panicum）植物または植物細胞が提供される。さらなる実施形態では、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結しており、導入遺伝子の第２の末端が配列番号３６からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プロモーター同定に使用されるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）ユビキチン配列に対するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン（ＺＭ  Ｕｂｉ１）タンパク質配列のタンパク質アラインメントを示す図である。Ｚｍ  Ｕｂｉ１タンパク質配列は、配列番号２２として本明細書で開示される。アワ（S. italica）Ｕｂｉ２タンパク質配列は、配列番号２３として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１プロモーター配列は、配列番号２４として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１Ｃタンパク質配列は、配列番号２５として本明細書で開示される。コンセンサス配列は、配列番号２６として本明細書で開示される。
【図２−１】本明細書で同定されるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターポリヌクレオチドに対するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン（ＺＭ  Ｕｂｉ１）プロモーターポリヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。トウモロコシ（Zea may）ユビキチン１（Ｚｍ−Ｕｂｉ）プロモーター配列は、配列番号２７として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１プロモーター配列は、配列番号１６として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１−Ｃプロモーター配列は、配列番号１５として本明細書で開示される。アワ（S. italica）Ｕｂｉ２プロモーター配列は、配列番号１７として本明細書で開示される。
【図２−２】本明細書で同定されるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターポリヌクレオチドに対するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン（ＺＭ  Ｕｂｉ１）プロモーターポリヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。トウモロコシ（Zea may）ユビキチン１（Ｚｍ−Ｕｂｉ）プロモーター配列は、配列番号２７として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１プロモーター配列は、配列番号１６として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１−Ｃプロモーター配列は、配列番号１５として本明細書で開示される。アワ（S. italica）Ｕｂｉ２プロモーター配列は、配列番号１７として本明細書で開示される。
【図２−３】本明細書で同定されるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターポリヌクレオチドに対するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン（ＺＭ  Ｕｂｉ１）プロモーターポリヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。トウモロコシ（Zea may）ユビキチン１（Ｚｍ−Ｕｂｉ）プロモーター配列は、配列番号２７として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１プロモーター配列は、配列番号１６として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１−Ｃプロモーター配列は、配列番号１５として本明細書で開示される。アワ（S. italica）Ｕｂｉ２プロモーター配列は、配列番号１７として本明細書で開示される。
【図２−４】本明細書で同定されるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターポリヌクレオチドに対するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン（ＺＭ  Ｕｂｉ１）プロモーターポリヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。トウモロコシ（Zea may）ユビキチン１（Ｚｍ−Ｕｂｉ）プロモーター配列は、配列番号２７として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１プロモーター配列は、配列番号１６として本明細書で開示される。ミナトカモジグサ（B. distachyon）Ｕｂｉ１−Ｃプロモーター配列は、配列番号１５として本明細書で開示される。アワ（S. italica）Ｕｂｉ２プロモーター配列は、配列番号１７として本明細書で開示される。
【図３】合成したアワ（Setaria italica）ユビキチン２プロモーター遺伝エレメントを示すプラスミドマップを示す図である。
【図４】合成したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃプロモーター遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハング（seamless cloning overhang）の場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図５】合成したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１プロモーター遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハングの場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図６】ＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合したアワ（Setaria italica）ユビキチン２（ＳＩ−Ｕｂｉ２）プロモーターを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図７】ＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃプロモーターを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図８】ＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１プロモーターを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図９】ＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合したＯＳ  Ａｃｔ１（イネアクチン１）プロモーターを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１０】ＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合したＺＭ  Ｕｂｉ１プロモーターを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１１】Ｇａｔｅｗａｙテクノロジーを用いてバイナリー発現ベクターを構築するために使用されるバイナリーデスティネーションベクター（binary destination vector）を示すプラスミドマップを示す図である。
【図１２】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したアワ（Setaria italica）ユビキチン２（ＳＩ−Ｕｂｉ２）プロモーター、引き続いてジャガイモのＳｔＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１３】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃプロモーター、引き続いてジャガイモのＳｔＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１４】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１プロモーター、引き続いてジャガイモのＳｔＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１５】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したＯＳ  Ａｃｔ１プロモーター、引き続いてジャガイモのＳｔＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１６】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したＺＭ  Ｕｂｉ１プロモーター、引き続いてジャガイモのＳｔＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図１７】図１２、図１３、図１４、図１５および図１６に示されるように、ＹＦＰが異種間ユビキチンおよびＯｓ  Ａｃｔ１プロモーターによって駆動される、Ｔ０葉におけるＹＦＰ発現を示す図である。
【図１８】図１２、図１３、図１４、図１５および図１６に示されるように、ＡＡＤ１がＺｍ  Ｕｂｉ１プロモーターによって駆動される、Ｔ０葉におけるＡＡＤ１発現を示す図である。
【図１９】ＺＭ  Ｕｂｉ１およびＯＳ  Ａｃｔ１プロモーターによって駆動されるＹＦＰ発現と比べた、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）の新規なプロモーターによって駆動される一過性ＹＦＰ発現を示す図である。
【図２０】ＺＭ  Ｕｂｉ１およびＯＳ  Ａｃｔ１プロモーターによって駆動されるＹＦＰ発現と比べた、新規なミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）のプロモーターによって駆動されるカルス組織中のＹＦＰ発現を示す図である。
【図２１】ＺＭ  Ｕｂｉ１およびＯＳ  Ａｃｔ１プロモーターによって駆動されるＹＦＰ発現と比べた、新規なミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）のプロモーターによって駆動される根組織中のＹＦＰ発現を示す図である。
【図２２】合成したパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）ユビキチン１プロモーター遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハングの場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図２３】合成したパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）ユビキチン１  ３’ＵＴＲ遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハングの場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図２４】合成したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ  ３’ＵＴＲ遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハングの場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図２５】合成したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１  ３’ＵＴＲ遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハングの場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図２６】合成したアワ（Setaria italica）ユビキチン２（ＳＩ−Ｕｂｉ２）  ３’ＵＴＲ遺伝エレメントおよび隣接するシームレスクローニングオーバーハングの場所を示すプラスミドマップを示す図である。
【図２７】パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）ユビキチン１プロモーターおよびＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合した３’ＵＴＲを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図２８】ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１ＣプロモーターおよびＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合した３’ＵＴＲを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図２９】アワ（Setaria italica）ユビキチン２プロモーターおよびＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合した３’ＵＴＲを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図３０】ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１プロモーターおよびＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子と融合した３’ＵＴＲを含む発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図３１】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃプロモーター、引き続いてミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図３２】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）ユビキチン１プロモーター、引き続いてパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）ユビキチン１  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図３３】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したアワ（Setaria italica）ユビキチン２プロモーター、引き続いてアワ（Setaria italica）ユビキチン２  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図３４】ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ  ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域と融合したミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１プロモーター、引き続いてミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１  ３’ＵＴＲを含むフラグメントを含むバイナリー発現ベクターを示すプラスミドマップを示す図である。
【図３５−１】ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃコード配列および推定プロモーター（ＡＴＧの上流配列）を表す図である。上流プロモーター配列に下線を施し、５’−ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、Ｕｂｉ１  ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３５−２】ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃコード配列および推定プロモーター（ＡＴＧの上流配列）を表す図である。上流プロモーター配列に下線を施し、５’−ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、Ｕｂｉ１  ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３６−１】ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１コード配列および推定プロモーターを表す図である。上流プロモーター配列に下線を施し、５’ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３６−２】ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１コード配列および推定プロモーターを表す図である。上流プロモーター配列に下線を施し、５’ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３７−１】アワ（Setaria italica）ユビキチン２コード配列および推定プロモーターを表す図である。上流プロモーターに下線を施し、５’ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３７−２】アワ（Setaria italica）ユビキチン２コード配列および推定プロモーターを表す図である。上流プロモーターに下線を施し、５’ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３８−１】パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチン１コード配列および推定プロモーターを表す図である。上流プロモーターに下線を施し、５’ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【図３８−２】パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチン１コード配列および推定プロモーターを表す図である。上流プロモーターに下線を施し、５’ＵＴＲ配列を大文字で示し、イントロンを枠で囲み、ＣＤＳをイタリックで示し、３’−ＵＴＲ（下線）および転写終結配列はＴＡＡ（翻訳終止コドン）の下流にある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本発明を記載および主張する際、以下に示される定義にしたがって以下の専門用語を使用する。
【００１５】
本明細書で使用される「約」という用語は、表示されている値または値の範囲より１０％大きいまたは小さいことを意味するが、値または値の範囲をこのより広い定義のみに指定することを意図していない。「約」という用語が前にある各値または値の範囲は、表示されている絶対値または値の範囲の実施形態を包含することも意図している。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「戻し交配」という用語は、育種家が雑種子孫を親の片方と交配する、例えば、第一世代雑種Ｆ１をＦ１雑種の親遺伝子型の片方と交配する過程を指す。
【００１７】
「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含み得る。これらの因子は、プロモーターＤＮＡ配列に結合することができ、これによってＲＮＡポリメラーゼの動員がもたらされる。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端に、転写開始部位が結合し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むよう上流（５’方向）に広がる。プロモーター配列中には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって好都合に定義される）転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と作動可能に結合していてもよい。
【００１８】
本開示の目的で、「遺伝子」は、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するかどうかは問わない。したがって、遺伝子は、必ずしもこれに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域を含む。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「天然」または「自然」という用語は、自然に見られる状態を定義する。「天然ＤＮＡ配列」は、自然な手段または伝統的な育種技術によって作製され、（例えば、分子生物学／形質転換技術を用いて）遺伝子工学によって生成されていない自然に存在するＤＮＡ配列である。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」は、例えば、それだけに限らないが、ｍＲＮＡを含む遺伝子産物をコードする核酸配列と定義される。一実施形態では、導入遺伝子が外因性核酸であり、ここでは導入遺伝子配列が、遺伝子工学によって、導入遺伝子が通常では見られない宿主細胞（またはその子孫）に導入されている。一例では、導入遺伝子が、産業的もしくは薬学的に有用な化合物、または所望の農業形質をコードする遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）をコードしている。さらに別の例では、導入遺伝子がアンチセンス核酸配列であり、アンチセンス核酸配列の発現によって標的核酸配列の発現が阻害される。一実施形態では、導入遺伝子が、内因性核酸の追加のゲノムコピーが望まれる内因性核酸、または宿主生物中の標的核酸の配列に対してアンチセンスの配向にある核酸である。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「非ユビキチン導入遺伝子」という用語は、トウモロコシ（Zea may）ユビキチン１コード配列（配列番号２７）と８０％未満の配列同一性を有する任意の導入遺伝子である。
【００２２】
本明細書で定義される「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換である。
【００２３】
本明細書で定義される「遺伝子産物」は、遺伝子によって産生される任意の産物である。例えば、遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などの工程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、細胞、組織または生物の、遺伝子発現を増加または低下させる因子への曝露によって影響を受け得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質までの経路のどこでも調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシングに作用する制御、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、または特定のタンパク質分子が産生された後のその分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解、あるいはこれらの組み合わせによって起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、またはインビトロ、インサイチュもしくはインビボタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む当技術分野で既知の任意の方法によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、転写されるが翻訳されない遺伝子（または対象となる発現したヌクレオチド配列）中に含まれる任意の核酸配列と定義される。イントロンは、ＤＮＡの発現した配列中の非翻訳核酸配列、ならびにそこから転写されたＲＮＡ分子の対応する配列を含む。本明細書に記載される構築物は、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列も含むことができる。１つのこのようなイントロンの例には、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンまたは任意の他の一般的に知られているイントロン配列がある。イントロンをプロモーター配列と組み合わせて使用して翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強することができる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「５’非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、５’−ＵＴＲは、典型的にはその５’末端に７−メチルグアノシンキャップを持ち、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質に向けたｍＲＮＡ輸送、翻訳装置によるｍＲＮＡの５’末端の同定、および分解からのｍＲＮＡの保護などの多くの過程に関与している。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「転写ターミネーター」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端の転写セグメントと定義される。例えば、「ポリアデニル化シグナル」部位を越えたより長い長さのＤＮＡがプレｍＲＮＡとして転写される。このＤＮＡ配列は通常、プレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの適切なプロセシングのための１つまたは複数の転写終結シグナルを含む。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「３’非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、この領域はポリ（Ａ）テールを持ち、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始およびｍＲＮＡ輸送において多くの役割を有することが知られている。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼが存在する場合、転写産物が、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位でポリアデニル化されることを可能にする、ｍＲＮＡ転写産物中に存在する核酸配列を示す。多くのポリアデニル化シグナルが当技術分野で知られており、本発明に有用である。例示的な配列には、Loke J., et al.,(2005) Plant Physiology 138 (3); 1457-1468に記載されているＡＡＵＡＡＡおよびその変異形が含まれる。
【００２９】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然環境から取り出されたまたは化合物が最初に形成された時に存在する他の化合物から取り出されたことを意味する。「単離された」という用語は、自然源から単離された材料ならびに宿主細胞中での組換え発現による調製後に回収された材料（例えば、核酸およびタンパク質）または核酸分子、タンパク質およびペプチドなどの化学的に合成された化合物を包含する。
【００３０】
本明細書で使用される「精製された」という用語は、天然または自然環境で分子または化合物と通常は会合している汚染物質を実質的に含まない、あるいは化合物が最初に形成された際に存在する他の化合物に対して実質的に高濃度の形態の分子または化合物の単離に関し、元の組成物の他の成分から分離された結果として純度が増加していることを意味する。「精製された核酸」という用語は、本明細書において、成分中の化学的または機能的変化をもたらしながら、それだけに限らないが、ポリペプチド、脂質および炭水化物を含む他の生物学的化合物から分離された、とは別に産生された、またはから精製された核酸配列を記載するために使用される（例えば、核酸は、タンパク質汚染物質を除去し、核酸と染色体中に残っているＤＮＡを結合している化学結合を破壊することによって、染色体から精製され得る）。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写型遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称用語である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、それぞれ、プロモーターまたは転写配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生による転写阻害（転写型遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）から生じ得る。各工程に別個の細胞成分が関与していることは、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳがおそらく古代の共通の機構の多様化から生じていることを示唆している。しかしながら、ＴＧＳとＰＴＧＳの厳密な比較は、一般的に別個のサイレンシング遺伝子座の分析によるので、達成が困難であった。単一の導入遺伝子座が、異なる標的遺伝子のプロモーターおよび転写配列に対応するｄｓＲＮＡの産生により、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を誘因すると記載され得る。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語（全３つの用語は互いに同義である）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成型ならびにこれらの混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー型を指す。「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を指し得る。核酸分子は、特に指定しない限り、通常少なくとも１０塩基長である。これらの用語は不定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指し得る。これらの用語はＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型を含む。核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド連結によって連結した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。
【００３３】
核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然ヌクレオチドの１個または複数の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電連結：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート（carbamate）等；荷電連結：例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）等；ペンダント部分：例えばペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレン等；キレート剤；アルキル化剤；および修飾連結：例えば、αアノマー核酸等）が含まれる。「核酸分子」という用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン型、円形、およびパドロック型（padlocked）立体配座を含む任意のトポロジー立体配座を含む。
【００３４】
転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、（ピロリン酸の必須の除去とともに）リボヌクレオチド−５’−三リン酸が成長している鎖の３’末端に逐次付加することによってＲＮＡが作製されることを意味する。鎖状または円形核酸分子のいずれにおいても、別個のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）が、さらなるエレメントから５’方向に同核酸に結合しているまたは結合する場合に、別個のエレメントをさらなるエレメントに対して「上流」と呼ぶことができる。同様に、別個のエレメントが、さらなるエレメントから３’方向に同核酸に結合しているまたは結合する場合に、さらなるエレメントに対して「下流」となり得る。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「塩基位置」という用語は、指定された核酸中の所与の塩基またはヌクレオチド残基の場所を指す。指定された核酸は、基準核酸とのアラインメントによって定義され得る。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によってオリゴヌクレオチドおよびその類似体がハイブリダイズする過程を指す。一般的に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかの窒素塩基からなる。これらの窒素塩基は、ピリミジンとプリンとの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンの結合を「塩基対形成」と呼ぶ。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの別個の核酸配列または同じ核酸配列の２つの別個の領域間で生じる塩基対形成を指す。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で、安定で特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性を指す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、特異的結合が望まれる条件下、例えば、インビボアッセイまたは系の場合に生理学的条件下で、オリゴヌクレオチドと非標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合を特異的ハイブリダイゼーションと呼ぶ。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに要するハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11に論じられている。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間でのミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらなる特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で使用する場合、「中等度のストリンジェンシー」条件とは、５０％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件とは、２０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「極めて高いストリンジェンシー」の条件とは、１０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。特定の実施形態では、ストリンジェントな条件が、６５℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて６５℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる４０分間の洗浄を含むことができる。以下が代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
・極めて高いストリンジェンシー：５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中室温でそれぞれ１５分間の２回の洗浄；および０．５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃でそれぞれ２０分間の２回の洗浄。
・高いストリンジェンシー：５〜６×ＳＳＣ緩衝液中６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中室温でそれぞれ５〜２０分間の２回の洗浄；および１×ＳＳＣ緩衝液中５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の２回の洗浄。
・中等度のストリンジェンシー：６×ＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の少なくとも２回の洗浄。
実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、極めて高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの切断によって、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することによって形成され得る。自動化合成装置によって、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡで構成されたオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）を、ＰＣＲ、小型ＤＮＡ配列の増幅のための技術に使用することができる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドを典型的には「プライマー」と呼び、プライマーによってＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長し、相補鎖を複製することが可能になる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、１９８７年７月２８日に付与された米国特許第４６８３１９５号に記載されているように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅する手順または技術を定義する。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、対象となる領域の末端からのまたはこれを超えた配列情報が入手可能である必要があり、これらのプライマーは増幅される鋳型の逆ストランドと配列が同一または類似である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅される材料の末端と一致し得る。ＰＣＲを使用して特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列等を増幅することができる。一般的に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) を参照されたい。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「プライマー」という用語は、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合に、相補鎖に沿って合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。合成条件は、４つの異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸と逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１種の重合誘導剤の存在を含む。これらは、補助因子であるまたは種々の適当な温度でｐＨなどの条件に影響を及ぼす構成成分を含んでもよい適当な緩衝液中に存在する。プライマーは、好ましくは増幅効率が最適化されるような一本鎖配列であるが、二本鎖配列を利用することもできる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「プローブ」という用語は、標的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）−スタイルアッセイ手順では、プローブが２つのプライマーのアニーリング部位間に位置する標的の部分にハイブリダイズする。プローブは、約８個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチド、約４０個のヌクレオチドまたは約５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブが約８個のヌクレオチド〜約１５個のヌクレオチドを含む。プローブは、検出可能な標識、例えば、蛍光体（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート等）をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えば、プローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置するプローブオリゴヌクレオチドに直接共有結合することができる。蛍光体を含むプローブは、消光剤、例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）等をさらに含んでもよい。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」または「同一性」という用語は、互換的に使用され、指定された比較窓にわたって最大一致で整列させると同じである２つの配列中の核酸残基を指すことができる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「配列同一性の百分率」という用語は、比較窓にわたって２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することによって決定される値を指し、比較窓中の配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、同一核酸またはアミノ酸残基が両配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。比較のために配列を整列する方法は周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8: 155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-50に記載されている。
【００４５】
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10）は、いくつかの配列解析プログラムと合わせて使用するために、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源からおよびインターネットで入手可能である。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するのかについての説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」節においてインターネット上で入手可能である。核酸配列を比較するために、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」関数を使用することができる。基準配列とのさらに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法で評価すると、増加する同一性百分率を示す。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結している」という用語は、互いに機能的関係になっている２つの成分を指す。調節配列およびコード配列に関して使用する場合、「作動可能に連結している」という用語は、調節配列が、連結しているコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」、「調節エレメント」または「制御エレメント」は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳のタイミングおよびレベル／量に影響を及ぼす核酸配列を指す。調節配列には、プロモーター；翻訳リーダー配列；５’および３’非翻訳領域、イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；リプレッサー結合配列；終結配列；ポリアデニル化認識配列等が含まれ得る。特定の調節配列は、これと作動可能に連結しているコード配列の上流および／または下流に位置し得る。また、コード配列と作動可能に連結している特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置し得る。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成され得る。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用的実務にしたがって使用する。しかしながら、エレメントが作動可能に連結するように連続している必要はない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「形質転換」という用語は、核酸分子をこのような細胞に導入することができる全ての技術を包含する。例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；電気穿孔；リポフェクション；微量注入（Mueller et al. (1978) Cell 15: 579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入；直接ＤＮＡ取り込み；ウィスカー媒介形質転換；および微粒子銃が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「形質導入する」という用語は、ウイルスが核酸を細胞内に移入する過程を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「ポリリンカー」または「マルチクローニング部位」という用語は、核酸配列上の互いに１０ヌクレオチド以内に位置する３つ以上の２型制限酵素部位のクラスターを定義する。ポリリンカーを含む構築物は、遺伝子のコード領域などの核酸配列の挿入および／または切除に利用される。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、その各々が特異的ヌクレオチド配列でまたはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。２型制限酵素は、同部位でＤＮＡを認識および切断し、これらの酵素には、それだけに限らないが、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、ＡｖａＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩが含まれる。
【００５１】
「ベクター」という用語は、「構築物」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語と互換的に使用され、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。「非ウイルスベクター」は、ウイルスまたはレトロウイルスを含まないベクターを意味することを意図している。いくつかの実施形態では、「ベクター」が、少なくとも１つのＤＮＡ複製起点と少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子とを含むＤＮＡの配列である。例としては、それだけに限らないが、外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスが挙げられる。ベクターは１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択マーカー遺伝子ならびに当技術分野で既知の他の遺伝エレメントを含むこともできる。ベクターは、細胞に形質導入、細胞を形質転換または細胞に感染し、それによって細胞に、ベクターによってコードされた核酸分子および／またはタンパク質を発現させることができる。
【００５２】
「プラスミド」という用語は、原核または真核宿主細胞中のいずれかで常染色体複製が可能な核酸の円形鎖を定義する。この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい核酸を含む。定義のプラスミドは、細菌複製起点に相当する配列も含み得る。
【００５３】
本明細書で使用される「選択マーカー遺伝子」という用語は、選択マーカー遺伝子が挿入された細胞の同定を容易にするタンパク質をコードする遺伝子または他の発現カセットを定義する。例えば、「選択マーカー遺伝子」は、レポーター遺伝子ならびに例えば、植物細胞を選択剤から保護するまたは選択剤に対する耐性／許容性を与えるために植物形質転換に使用される遺伝子を包含する。一実施形態では、機能的な選択マーカーを受容している細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびハイグロマイシンを含む抗生物質が挙げられる。これらの選択マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、ならびに関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびＧ４１８に関する遺伝子、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するハイグロマイシントランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子には、ｂａｒまたはｐａｔを含む除草剤耐性（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する耐性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）および分岐鎖アミノ酸の合成の最初のステップを妨げるスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する耐性）、グリホサート、２，４−Ｄおよび金属耐性または感受性をコードする遺伝子が含まれ得る。選択マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするタンパク質などの発現したレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が挙げられる。「マーカー陽性」という句は、選択マーカー遺伝子を含むよう形質転換された植物を指す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「検出可能なマーカー」という用語は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出を可能にする標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、それだけに限らないが、以下が挙げられる：蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。実施形態では、検出可能なマーカーを種々の長さのスペーサーアームによって結合して潜在的な立体障害を減少させることができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「検出する」という用語は、特異的分子の定性的測定と定量的測定の両方、例えば、特異的ポリペプチドの測定を含むよう最も広義に使用される。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特異的制限部位でまたは相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。本明細書で使用する場合、ＤＮＡのセグメントは、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位が、確実にカセットを転写および翻訳のための適切な読み枠に挿入するよう設計される。実施形態では、発現カセットが、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有することができる。実施形態では、遺伝子発現カセットが、宿主細胞中での対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現増強を可能にするエレメントも含み得る。これらのエレメントには、それだけに限らないが、プロモーター、ミニマルプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが含まれ得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「リンカー」または「スペーサー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子または分子の群である。リンカーおよびスペーサーは、２つの実態の最適間隔を提供する、または２つの実態が互いに離れていることを可能にする不安定な連結をさらに提供することができる。不安定な連結には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分および酵素切断可能な基が含まれる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「対照」という用語は、比較目的で分析手順に使用される試料を指す。対照は「陽性」であっても「陰性」であってもよい。例えば、分析手順の目的が、細胞または組織中で差次的に発現した転写産物またはポリペプチドを検出することである場合、所望の発現を示している既知の植物からの試料などの陽性対照、および所望の発現を欠いている既知の植物からの試料などの陰性対照を含めることが一般的に好ましい。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「植物」という用語は、全植物および植物の任意の子孫、細胞、組織または部分を含む。本発明に使用することができる植物のクラスは、一般的に被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダおよび多細胞藻類を含む突然変異誘発で修正可能な高等および下等植物のクラスと同じくらい広い。したがって、「植物」には双子葉および単子葉植物が含まれる。「植物部分」という用語には、例えば、限定されないが、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）；植物挿穂；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、シュート、葉、根、茎および外植片）を含む植物の任意の部分（複数可）が含まれる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造もしくは機能単位に組織化される植物細胞の任意の他の群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織を得た植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、その植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるだろう。対照的に、いくつかの植物細胞は、植物を作製するために再生することができない。植物細胞または組織培養物に再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、ひげ、花、仁、穂、穂軸、殻または柄であり得る。
【００６０】
植物部分には、収穫可能な部分および子孫植物の繁殖に有用な部分が含まれる。繁殖に有用な植物部分には、例えば、限定されないが、種子；果実；挿穂；実生；塊茎および根茎が含まれる。植物の収穫可能な部分は、例えば、限定されないが、花；花粉；実生；塊茎；葉；茎；果実；種子；および根を含む植物の任意の有用な部分であり得る。
【００６１】
植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一細胞であってもまたは細胞の集合体（例えば、もろいカルスおよび培養細胞）であってもよく、高次組織単位の一部（例えば、植物組織、植物器官および植物）であってもよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または全植物に再生することができる細胞もしくは細胞の集合であり得る。したがって、複数の植物細胞を含み、全植物に再生することができる種子は、本明細書の実施形態では「植物細胞」とみなされる。
【００６２】
本明細書で使用される「プロトプラスト」という用語は、その細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、その脂質二重層膜がむき出しになっている植物細胞を指し、したがって、その細胞壁が完全に除去されたプロトプラスト、およびその細胞壁が部分的にのみ除去されたスフェロプラストを含むが、これらに限定されない。典型的には、プロトプラストは、細胞培養物または全植物に再生する能力を有する、細胞壁を有さない単離植物細胞である。
【００６３】
具体的に説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の共通語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) に見出すことができる。
【００６４】
実施形態
本明細書で開示されるように、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）のユビキチン遺伝子の調節配列を用いて非ユビキチン導入遺伝子を発現させるための新規な組換え構築物が提供される。これらの構築物を使用して植物細胞を含む細胞を形質転換し、その細胞内で導入遺伝子産物を発現する完全な生物を作製することができる。
【００６５】
調節エレメント
基礎研究または生物工学用途に使用される植物プロモーターは、一般的に一方向性であり、融合したただ１つの遺伝子をその３’末端（下流）に向ける。代謝工学および形質スタッキングのためには、通常、複数の遺伝子を植物に導入することが必要であるので、複数の遺伝子の発現を駆動するために、典型的には、複数のプロモーターがトランスジェニック作物に必要である。
【００６６】
トランスジェニック産物の開発は、ますます複雑になっており、複数の導入遺伝子を単一遺伝子座に積み重ねることが要求されている。伝統的には、各導入遺伝子が通常は発現のためのプロモーターを要し、１つの遺伝子スタック内で異なる導入遺伝子を発現させるために複数のプロモーターが要求される。これは、しばしば単一のポリジーン形質の発現のために類似のレベルの異なる遺伝子の発現パターンを得るために１つの導入遺伝子スタック内で同じプロモーターを繰り返し使用することにつながる。同じプロモーターによって駆動される多重遺伝子構築物は、この分野であまり有効でないトランスジェニック産物をもたらす遺伝子サイレンシングを引き起こすことが知られている。プロモーター反復による過剰な転写因子（ＴＦ）−結合部位のために、転写不活性化につながる内因性ＴＦの欠乏が引き起こされ得る。導入遺伝子のサイレンシングは、導入遺伝子を発現させるために作製されたトランスジェニック植物の性能におそらく望ましくない影響を及ぼす。導入遺伝子中の反復配列は、ポリヌクレオチド再配列をもたらす遺伝子の遺伝子座内相同組換えにつながり得る。
【００６７】
遺伝子スタック内での異なる導入遺伝子の発現に様々なプロモーターを使用することが望ましい。実施形態では、異なる植物種から得られた様々な構成的ユビキチンが、ＲＮＡｉ、人工ｍｉＲＮＡまたはヘアピン−ループＲＮＡ配列を含む複数の転写単位の転写を駆動することができる。
【００６８】
植物中で非ユビキチン導入遺伝子を発現させるために構成的ユビキチン（Ｕｂｉ１）プロモーターを使用する方法および構築物が提供される。実施形態では、プロモーターがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ（Ｕｂｉ１Ｃ）プロモーターであり得る。
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実施形態では、プロモーターがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１（Ｕｂｉ１）プロモーターであり得る。
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実施形態では、プロモーターがアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）プロモーターであり得る。
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実施形態では、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチン１プロモーターであり得る。
ＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＡＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＧＡＴＣＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＧＴＧＴＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡ（配列番号３５）
【００６９】
実施形態では、ユビキチンプロモーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ユビキチンプロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターである。実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ポリリンカーと作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、プロモーターが配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３５からなる。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【００７０】
転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化のために、プロモーターに加えて、３’−非翻訳遺伝子領域（すなわち、３’ＵＴＲ）またはターミネーターが必要である。適切な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化が導入遺伝子の安定な発現にとって重要である。多重遺伝子スタックが次の導入遺伝子への転写リードスルーを回避するために、転写終結がより重要となる。同様に、非ポリアデニル化異常ＲＮＡ（ａＲＮＡ）は、小型ＲＮＡ産生および導入遺伝子サイレンシングにつながる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）にａＲＮＡを変換する植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）にとっての基質となる。そのため、強い転写ターミネーターが、単一遺伝子と複数遺伝子スタックの両方にとって極めて有用である。転写を駆動するためにプロモーターが必要である一方で、３’−ＵＴＲ遺伝子領域が転写を終結し、翻訳およびタンパク質合成のための得られたｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を開始することができる。３’−ＵＴＲ遺伝子領域は、導入遺伝子の安定な発現を助ける。
【００７１】
一実施形態によると、ユビキチン転写ターミネーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ユビキチン転写ターミネーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン転写ターミネーターである。実施形態では、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である転写ターミネーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ポリリンカーと作動可能に連結しているユビキチン転写ターミネーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、非ユビキチン導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結しているユビキチン転写ターミネーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、転写ターミネーターが配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン転写ターミネーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、ポリリンカー配列、非ユビキチン導入遺伝子、または両方の組み合わせのいずれかと作動可能に連結している転写ターミネーターを含む核酸ベクターであって、転写ターミネーターが配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸ベクターが提供される。一実施形態では、転写ターミネーターが長さ１ｋｂ未満であり、さらなる実施形態では、転写ターミネーターが配列番号３６の３’ＵＴＲ配列からなる。
【００７２】
実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと３’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、核酸構築物がユビキチン３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、ユビキチン３’−ＵＴＲがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲである。実施形態では、３’−ＵＴＲがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ（Ｕｂｉ１Ｃ）３’−ＵＴＲであり得る。
ＧＴＴＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＣＣＣＧＴＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＴＡＴＴＧＣＡＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＡＡＡＣＧＣＡＡＴＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＴＡＣＣＧＣＡＣＡＴＡＡＡＧＡＴＴＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＣＧＴＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＴＧＴＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＣＴＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＴＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＣＧＣＡＴＧＡＣＡＴＣＣＧＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＴＣＧＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＴＡＴＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＡＡＣＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＧＡＴＡＡＴＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＧＧＧＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＧＴＡＣＡＡＣ（配列番号４）
実施形態では、３’−ＵＴＲがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１（Ｕｂｉ１）３’−ＵＴＲであり得る。
ＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＡＧＴＧＧＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＣＧＴＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＡＴＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＧＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＡＡＡＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＣＧＴＡＡＣＡＴＴＴＡＡＧＣＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＡＣＡＡＴＡＧＴＣＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＴＣＴＡＴＴＴＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＡＴＡＴＴＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＡＧＧＡＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＴＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧ（配列番号５）
実施形態では、３’−ＵＴＲがアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）３’−ＵＴＲであり得る。
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実施形態では、３’−ＵＴＲがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチン１  ３’−ＵＴＲであり得る。
ＧＣＣＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＴＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＧＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＴＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＧＴＧＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＧＴＴＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＧＡＣＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＡＣＧＴＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＴ（配列番号３６）
【００７３】
実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む核酸構築物であって、ユビキチンプロモーターおよび３’−ＵＴＲが共にポリリンカーの逆末端と作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットであって、ユビキチンプロモーターおよび３’−ＵＴＲが共に非ユビキチン導入遺伝子の逆末端と作動可能に連結している、遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、３’−ＵＴＲが配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる。一実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットであって、ユビキチンプロモーターが配列番号３５を含み、３’−ＵＴＲが配列番号３６を含み、プロモーターおよび３’−ＵＴＲが非ユビキチン導入遺伝子の逆末端と作動可能に連結している、遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、３’−ＵＴＲが配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる。一実施形態では、プロモーターが配列番号３５、３９または４０からなり、３’−ＵＴＲが配列番号３６からなる。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。さらなる実施形態では、導入遺伝子が、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）から単離された同じユビキチン遺伝子からのユビキチンプロモーターおよび３’−ＵＴＲと作動可能に連結している。
【００７４】
一実施形態では、第１の導入遺伝子および／またはポリリンカーと、第２の導入遺伝子および／またはポリリンカーとを含むベクターであって、第１の導入遺伝子および／またはポリリンカーが配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号３５からなる群から選択される配列を含むプロモーターと作動可能に連結しており、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる群から選択される配列を含む３’−ＵＴＲと作動可能に連結しており、第２の導入遺伝子および／またはポリリンカーが配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号３５からなる群から選択される配列を含むプロモーターと作動可能に連結しており、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる群から選択される配列を含む３’−ＵＴＲと作動可能に連結しており、さらに第１の導入遺伝子および／またはポリリンカーならびに第２の導入遺伝子および／またはポリリンカーのプロモーターが異なる植物種のＵｂｉ遺伝子に由来する、ベクターが提供される。さらなる実施形態では、第３の導入遺伝子および／またはポリリンカーを含むベクターであって、第３の導入遺伝子および／またはポリリンカーが配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号３５からなる群から選択される配列を含むプロモーターと作動可能に連結しており、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる群から選択される配列を含む３’−ＵＴＲと作動可能に連結しており、さらに第３の導入遺伝子および／またはポリリンカーのプロモーターが、第１および第２の導入遺伝子および／またはポリリンカーのプロモーターとは異なる植物種のＵｂｉ遺伝子に由来する、ベクターが提供される。
【００７５】
導入遺伝子発現を、プロモーター配列の下流に位置するイントロン領域によって調節することもできる。プロモーターとイントロンの両方が導入遺伝子発現を調節することができる。転写を駆動するためにプロモーターが必要である一方で、イントロンの存在によって、翻訳およびタンパク質合成のためのｍＲＮＡ転写産物をもたらす発現レベルを増加させることができる。イントロン遺伝子領域は導入遺伝子の安定な発現を助ける。
【００７６】
実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、イントロンとを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、イントロンがプロモーターの３’末端と作動可能に連結している。実施形態では、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）から単離したユビキチンプロモーターまたはこのようなプロモーター配列の誘導体の３’末端と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ユビキチンイントロンがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンイントロン、またはこのようなイントロン配列の誘導体である。
【００７７】
実施形態では、イントロンがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃイントロンであり得る。
ＧＴＡＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＡＧＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＡＴＴＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＡＴＣＴＡＣＴＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣＧＣＡＴＧＴＴＡＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＡＴＡＣＧＣＴＣＴＣＧＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＣＡＴＡＧＴＴＧＴＴＣＧＴＴＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＡＡＴＴＧＧＡＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＣＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＡＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＡＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＧＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＴＴＡＴＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＡＡＴＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＡＴＴＡＧＡＴＡＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣＴＴＴＡＣＣＴＡＣＴＣＧＧＴＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＴＡＴＧＣＡＧ（配列番号７）
実施形態では、イントロンがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１（Ｕｂｉ１）イントロンであり得る。
ＧＴＡＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＧＧＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＧＡＧＴＧＴＣＧＧＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧ（配列番号８）
実施形態では、イントロンがアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）イントロン１であり得る。
ＧＴＣＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＴＡＡＡＴＡＧ（配列番号９）
実施形態では、イントロンがアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）イントロン２であり得る。
ＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＴＣＣＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＧＴＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＴＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＣＴＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＡＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＣＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＡＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＣＴＡＧＧＴＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＣＧＡＴＣＧＡＴＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＴＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＴＧＣＴＴＡＧＴＴＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＴＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＡＣＴＴＧＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴＡＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧ（配列番号１０）
実施形態では、イントロンがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチンイントロンであり得る。
ＧＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＧＴＴＧＧＴＡＡＴＣＴＴＣＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＣＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧＧＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＡＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＡＣＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＧＡＴＴＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＡＧＣＴＴＴＡＴＡＧＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＡＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧ（配列番号３７）
【００７８】
実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるイントロンとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、イントロン配列と、ポリリンカーとを含む核酸構築物であって、プロモーターおよびイントロンがポリリンカーと作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、イントロン配列と、非ユビキチン導入遺伝子とを含む遺伝子発現カセットであって、プロモーターおよびイントロンが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結している、遺伝子発現カセットが提供される。場合により、構築物が非ユビキチン導入遺伝子の３’末端またはポリリンカーと作動可能に連結している３’−ＵＴＲをさらに含む。一実施形態では、プロモーターおよび３’−ＵＴＲ配列が本明細書に記載されるものから選択され、イントロン配列が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号３７からなる。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含み、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来するプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【００７９】
導入遺伝子発現を、プロモーター配列の下流に位置する５’−ＵＴＲ領域によって調節することもできる。プロモーターと５’−ＵＴＲの両方が導入遺伝子発現を調節することができる。転写を駆動するためにプロモーターが必要である一方で、５’−ＵＴＲの存在によって、翻訳およびタンパク質合成のためのｍＲＮＡ転写産物をもたらす発現レベルを増加させることができる。５’−ＵＴＲ遺伝子領域は導入遺伝子の安定な発現を助ける。
【００８０】
実施形態では、本明細書に記載されるユビキチンプロモーターと、５’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、５’−ＵＴＲがプロモーターの３’末端と作動可能に連結している。実施形態では、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）から単離されたユビキチンプロモーターまたはこのようなプロモーター配列の誘導体の３’末端と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む核酸構築物が提供される。さらなる実施形態では、５’−ＵＴＲの３’末端が、本明細書に記載されるパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）のユビキチンイントロンの５’末端と作動可能に連結している。
【００８１】
実施形態では、５’−ＵＴＲがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ（Ｕｂｉ１Ｃ）５’−ＵＴＲであり得る。
ＣＣＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧ（配列番号１１）
【００８２】
実施形態では、５’−ＵＴＲがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１（Ｕｂｉ１）５’−ＵＴＲであり得る。
ＣＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡＴＣＴＡＧＣＧＡＡＴＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧ（配列番号１２）
【００８３】
実施形態では、５’−ＵＴＲがアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）５’−ＵＴＲ１であり得る。
ＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＧＣＴＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＴＣＧＴＣＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＡＧＡＣ（配列番号１３）
【００８４】
実施形態では、５’−ＵＴＲがアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）５’−ＵＴＲ２であり得る。
ＣＣＧＡＣＣＣＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＧ（配列番号１４）
【００８５】
実施形態では、５’−ＵＴＲがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチン５’−ＵＴＲであり得る。
ＣＡＡＧＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧ（配列番号３８）。
【００８６】
実施形態では、本明細書に開示されるユビキチンプロモーターと、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である５’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるユビキチンプロモーターと、ポリリンカーと作動可能に連結している５’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるユビキチンプロモーターと、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している５’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットが提供される。場合により、構築物が５’−ＵＴＲの３’末端および非ユビキチン導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、場合により非ユビキチン導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している３’−ＵＴＲをさらに含む本明細書に開示されるユビキチンイントロンをさらに含むことができる。一実施形態では、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲ配列が本明細書に記載されるものから選択され、５’−ＵＴＲ配列が配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号３８からなる。一実施形態では、３’−ＵＴＲが配列番号３８からなる。
【００８７】
実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含み、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来するプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【００８８】
一実施形態では、プロモーターと、ポリリンカーと、場合により、以下のエレメント：
ａ）５’非翻訳領域；
ｂ）イントロン；および
ｃ）３’非翻訳領域
の１つまたは複数とを含む核酸構築物であって、
プロモーターが配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号３５または配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号３５と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
５’非翻訳領域が配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号３８または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号３８と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
イントロンが配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号３７または配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号３７と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
３’非翻訳領域が配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号３６または配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号３６と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
さらに前記プロモーターが前記ポリリンカーと作動可能に連結しており、存在する場合、各任意のエレメントもプロモーターとポリリンカーの両方と作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。
【００８９】
一実施形態では、プロモーターと、非ユビキチン導入遺伝子と、場合により、以下のエレメント：
ａ）５’非翻訳領域；
ｂ）イントロン；および
ｃ）３’非翻訳領域
の１つまたは複数とを含む核酸構築物であって、
プロモーターが配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号３５または配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号３５と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
５’非翻訳領域が配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号３８または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号３８と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
イントロンが配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号３７または配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号３７と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
３’非翻訳領域が配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号３６または配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号３６と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
さらに前記プロモーターが前記導入遺伝子と作動可能に連結しており、存在する場合、各任意のエレメントもプロモーターと導入遺伝子の両方と作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。さらなる実施形態では、真上に開示される核酸構築物を含むトランスジェニック細胞が提供される。一実施形態では、トランスジェニック細胞が植物細胞であり、さらなる実施形態では、前記トランスジェニック細胞を含む植物が提供される。
【００９０】
一実施形態によると、導入遺伝子発現が、イントロンおよび５’−ＵＴＲ領域と作動可能に連結しているプロモーターによって調節され、イントロンおよび５’−ＵＴＲ領域がプロモーター配列の下流に位置している。イントロンおよび５’−ＵＴＲ領域と作動可能に連結しているプロモーターを使用して導入遺伝子発現を駆動することができる。転写を駆動するためにプロモーターが必要である一方で、イントロンおよび５’−ＵＴＲの存在によって、翻訳およびタンパク質合成のためのｍＲＮＡ転写産物をもたらす発現レベルを増加させることができる。
【００９１】
実施形態では、遺伝子発現カセットが、５’−ＵＴＲおよびイントロン領域と作動可能に連結しているプロモーターを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチンイントロンと作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む。実施形態では、５’−ＵＴＲおよびイントロン領域と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターが、イントロンおよび５’−ＵＴＲと作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターである。
【００９２】
実施形態では、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているプロモーターが、イントロンおよび５’−ＵＴＲと作動可能に連結しているミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ（Ｕｂｉ１Ｃ）プロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターが配列番号１５：
ＣＴＧＣＴＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＴＣＡＡＣＧＴＣＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＣＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＴＡＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧＣＣＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＡＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＡＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＡＣＡＡＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴＴＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＡＣＴＣＧＣＣＧＴＴＣＧＣＡＴＣＴＧＧＴＡＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＴＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＧＴＡＡＣＡＧＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＡＧＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＡＴＴＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＡＴＣＴＡＣＴＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣＧＣＡＴＧＴＴＡＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＡＴＡＣＧＣＴＣＴＣＧＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＣＡＴＡＧＴＴＧＴＴＣＧＴＴＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＡＡＴＴＧＧＡＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＣＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＡＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＡＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＧＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＴＴＡＴＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＡＡＴＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＡＴＴＡＧＡＴＡＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣＴＴＴＡＣＣＴＡＣＴＣＧＧＴＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＴＡＴＧＣＡＧ（配列番号１５）
の配列を含むまたはからなる。
【００９３】
実施形態では、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているプロモーターが、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１（Ｕｂｉ１）プロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターが配列番号１６：
ＧＧＣＧＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＡＴＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＡＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＧＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＧＡＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＧＣＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＧＧＣＴＣＧＣＧＣＧＴＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＴＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡＴＣＴＡＧＣＧＡＡＴＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＡＧＡＴＧＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＧＧＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＧＡＧＴＧＴＣＧＧＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧ（配列番号１６）
の配列を含むまたはからなる。
【００９４】
実施形態では、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているプロモーターが、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているアワ（Setaria italica）ユビキチン２（Ｕｂｉ２）プロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターが配列番号１７：
ＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＴＧＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＴＴＡＧＧＡＧＴＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＧＣＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＧＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＧＴＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＴＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＴＡＧＴＡＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＡＧＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＴＣＴＡＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＧＡＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＣＧＴＴＴＡＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＡＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＴＣＴＡＣＧＴＴＴＡＡＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＴＡＧＴＡＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＧＴＣＣＣＣＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＴＣＧＣＡＡＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＧＣＴＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＴＣＧＴＣＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＡＧＡＣＧＴＣＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＴＡＡＡＴＡＧＣＣＧＡＣＣＣＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＴＣＣＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＧＴＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＴＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＣＴＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＡＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＣＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＡＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＣＴＡＧＧＴＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＣＧＡＴＣＧＡＴＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＴＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＡＴＧＣＴＴＡＧＴＴＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＴＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＡＣＴＴＧＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＴＣＡＴＴＣＴＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴＡＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧ（配列番号１７）
の配列を含むまたはからなる。
【００９５】
実施形態では、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているプロモーターが、５’−ＵＴＲおよびイントロンと作動可能に連結しているパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）（スイッチグラス）ユビキチンプロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターが配列番号３９：
ＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＡＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＧＡＴＣＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＧＴＧＴＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＧＴＴＧＧＴＡＡＴＣＴＴＣＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＣＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧＧＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＡＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＡＣＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＧＡＴＴＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＡＧＣＴＴＴＡＴＡＧＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＡＴＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧ（配列番号３９）
の配列を含むまたはからなる。
【００９６】
実施形態では、イントロンおよび５’−ＵＴＲと作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、構築物が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である配列を含む。一実施形態では、ポリリンカーと作動可能に連結している配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である配列を含むまたはからなるユビキチンプロモーター配列を含む核酸構築物が提供される。場合により、構築物がポリリンカーの３’末端と作動可能に連結している３’−ＵＴＲをさらに含むことができる。実施形態では、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である配列を含むまたはからなるユビキチンプロモーター配列を含む遺伝子発現カセットが提供される。場合により、構築物が非ユビキチン導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している３’−ＵＴＲをさらに含むことができる。一実施形態では、３’−ＵＴＲ配列が配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる。例示的実施形態では、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、導入遺伝子が除草剤耐性遺伝子である。一実施形態では、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６からなる群から独立に選択される１個、２個、３個または４個のプロモーター配列を含むベクターが提供される。
【００９７】
実施形態では、遺伝子発現カセットがユビキチンプロモーターと、ユビキチン５’−ＵＴＲと、ユビキチンイントロンと、ユビキチン３’−ＵＴＲとを含む。実施形態では、ユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲ、ユビキチンイントロンおよびユビキチン３’−ＵＴＲがそれぞれ独立に、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター；パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン５’−ＵＴＲ；パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンイントロン；およびパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲであり得る。実施形態では、遺伝子発現カセットがａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターと；ｂ）配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲと；ｃ）配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である５’−ＵＴＲと；ｄ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるイントロンとを含む。
【００９８】
例えば、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号３７のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号３８のポリヌクレオチドである。同様に、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号２のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号８のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号１２のポリヌクレオチドである。さらに、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号３のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号９および／または配列番号１０のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号１３のポリヌクレオチドである。さらに、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号３７のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号３８のポリヌクレオチドである。
【００９９】
例えば、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号３７のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号３８のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号３６のポリヌクレオチドである。同様に、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号２のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号８のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号１２のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドである。さらに、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号３のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号９および／または配列番号１０のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号１３または１４のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号６のポリヌクレオチドである。さらに、遺伝子発現カセットがプロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、イントロンが配列番号３７のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号３８のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号３６のポリヌクレオチドである。
【０１００】
さらに、遺伝子発現カセットがプロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号６のポリヌクレオチドである。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドである。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号３６のポリヌクレオチドである。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、プロモーターが配列番号３５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号３６のポリヌクレオチドである。
【０１０１】
実施形態では、遺伝子発現カセットが、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチン３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチンイントロン、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチン３’−ＵＴＲを含む。
【０１０２】
遺伝子発現カセットが１つまたは複数の導入遺伝子を含む場合、プロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子と作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率、栄養価またはこれらの組み合わせを増強する遺伝子産物をコードする。
【０１０３】
ユビキチンイントロンおよび５’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なるプロモーターと作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、プロモーターが植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）または細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来する。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１０４】
実施形態では、ベクターが本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーＤＮＡなどの直接形質転換もしくは遺伝子標的化に使用するための切除ポリヌクレオチドフラグメントであり得る。
【０１０５】
一実施形態によると、組換え遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、組換え遺伝子カセットがポリリンカー配列、非ユビキチン導入遺伝子またはこれらの組み合わせと作動可能に連結しているユビキチンベースプロモーターを含む、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、組換え遺伝子カセットが非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンベースプロモーターを含む。一実施形態では、組換え遺伝子カセットがポリリンカー配列と作動可能に連結している本明細書に開示されるユビキチンベースプロモーターを含む。コード配列をポリリンカーの制限部位の１つに挿入することによって、コード配列を作動可能に連結して、ベクターを宿主細胞にトランスフェクトした場合にコード配列の発現を可能にするように、ポリリンカーがユビキチンベースプロモーターと作動可能に連結している。
【０１０６】
一実施形態によると、ユビキチンベースプロモーターが配列番号３５または配列番号３５と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター配列が１．５、２、２．５、３または４ｋｂ以下の全長を有する。一実施形態によると、ユビキチンベースプロモーターが配列番号３５または配列番号３５と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０２５ｂｐ配列からなる。
【０１０７】
一実施形態によると、配列番号３９と、非ユビキチン導入遺伝子と、３’−ＵＴＲとからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、配列番号３９が非ユビキチン導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、３’−ＵＴＲが非ユビキチン導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５、９９もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、配列番号３９または配列番号３９と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する２０８７ｂｐ配列と、非ユビキチン導入遺伝子と、３’−ＵＴＲとからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、配列番号３９が非ユビキチン導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、３’−ＵＴＲが非ユビキチン導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５、９９もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０００ｂｐ配列からなる。
【０１０８】
一実施形態によると、核酸ベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。一実施形態によると、組換え遺伝子カセットがアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界と作動可能に連結している。一実施形態によると、組換え遺伝子カセットが第１および第２のＴ−ＤＮＡ境界をさらに含み、第１のＴ−ＤＮＡ境界が遺伝子構築物の一端と作動可能に連結しており、前記第２のＴ−ＤＮＡ境界が遺伝子構築物の他端と作動可能に連結している。第１および第２のアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界は、ノパリン合成アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界、オクトピン合成アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界、スクシナモピン合成アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細菌株に由来するＴ−ＤＮＡ境界配列から独立に選択され得る。一実施形態では、ノパリン合成株、マンノピン合成株、スクシナモピン合成株またはオクトピン合成株からなる群から選択されるアグロバクテリウム（Agrobacterium）株であって、配列番号３５、配列番号３９、または配列番号３５もしくは配列番号３９と９０、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列から選択される配列と作動可能に連結している導入遺伝子を含むプラスミドを含む株が提供される。
【０１０９】
対象となるおよび本開示の構築物に使用するのに適した導入遺伝子には、それだけに限らないが、（１）耐有害生物性または耐病性、（２）除草剤耐性、ならびに（３）その開示が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３１１６７００（ＤＧＴ−２８）、ＵＳ２０１１０１０７４５５（ＤＳＭ−２）、米国特許第８２８３５２２号（ＡＡＤ−１２）；第７８３８７３３号（ＡＡＤ−１）；第５１８８９６０号；第５６９１３０８号；第６０９６７０８号；および第６５７３２４０号（Ｃｒｙ１Ｆ）；米国特許第６１１４１３８号；第５７１００２０号；および第６２５１６５６号（Ｃｒｙ１Ａｃ）；米国特許第６１２７１８０号；第６６２４１４５号および第６３４０５９３号（Ｃｒｙ３４Ａｂ１）；米国特許第６０８３４９９号；第６５４８２９１号および第６３４０５９３号（Ｃｒｙ３５Ａｂ１）に開示されている価値付加形質を付与するコード配列が含まれる。一実施形態によると、導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコードする。
【０１１０】
一実施形態によると、遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、遺伝子カセットが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しているプロモーター領域を含み、導入遺伝子の３’末端が３’非翻訳領域と連結している、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号３５または配列番号３５と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号３５または配列番号３９からなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み、一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０００ｂｐ配列からなる。
【０１１１】
一実施形態によると、遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、遺伝子カセットが５’非翻訳配列の５’末端と作動可能に連結しているプロモーター領域を含み、５’非翻訳配列の３’末端が導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、導入遺伝子の３’末端が３’非翻訳領域と連結している、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号３５または配列番号３５と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号３５または配列番号３５と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０２５ｂｐ配列からなる。一実施形態によると、５’非翻訳配列が配列番号３８または配列番号３８と９０％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態によると、５’非翻訳配列が配列番号３８または配列番号３８と９０％の配列同一性を有する７７ｂｐ配列からなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０００ｂｐ配列からなる。さらなる実施形態では、核酸ベクターが、５’非翻訳領域と導入遺伝子との間に挿入され、プロモーターおよび導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンをさらに含む。一実施形態では、ユビキチンイントロンが配列番号３７、または配列番号３７と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、ユビキチンイントロンが配列番号３７または配列番号３７と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０８５ｂｐ配列からなる。
【０１１２】
一実施形態によると、遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、遺伝子カセットが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しているプロモーター領域を含み、導入遺伝子の３’末端が３’非翻訳領域と連結している、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号４０または配列番号４０と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。
ＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＡＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＧＡＴＣＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＧＴＧＴＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧ（配列番号４０）
【０１１３】
一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号４０または配列番号４０と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１１０２ｂｐ配列からなる。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号４０からなる。一実施形態によると、３’非翻訳配列が配列番号３６または配列番号３６と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０００ｂｐ配列からなり、一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３６からなる。
【０１１４】
実施形態では、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物が提供される。実施形態では、細胞または植物が本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。それによって、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物がそれぞれ、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物となる。実施形態では、トランスジェニック植物が単子葉植物であり得る。実施形態では、トランスジェニック単子葉植物が、それだけに限らないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビおよびキビであり得る。実施形態では、トランスジェニック植物が双子葉植物であり得る。実施形態では、トランスジェニック双子葉植物が、それだけに限らないが、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナであり得る。実施形態には、本明細書に開示されるトランスジェニック植物のトランスジェニック種子も含まれる。
【０１１５】
実施形態では、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む。２つ以上の導入遺伝子は、本明細書に開示される同じプロモーター、イントロンまたは５’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲと作動可能に連結していなくてもよい。実施形態では、遺伝子発現カセットが１つまたは複数の導入遺伝子を含む。１つまたは複数の導入遺伝子の実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子がプロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲもしくは３’−ＵＴＲまたは本開示と作動可能に連結している。
【０１１６】
選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載されている種々の選択マーカーを、選択された発現ベクターに組み込んで形質転換した植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にすることができる。例えば、ＤＮＡ配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロット法、ＲＮＡブロット法、ベクターから発現したタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン耐性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察を含む多くの方法が、形質転換した植物中の選択マーカーの発現を確認するために利用可能である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N. Y., 2001参照）。
【０１１７】
選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。選択マーカー遺伝子には、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。除草剤耐性遺伝子は、一般的に除草剤に非感受性の修飾標的タンパク質または除草剤が作用し得る前に植物中の除草剤を分解もしくは解毒する酵素をコードする。例えば、グリホサート耐性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を用いることによって得られた。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および変異体は周知であり、以下にさらに記載される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニルおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性は、それぞれの除草剤を解毒するｐａｔもしくはＤＳＭ−２をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を用いることによって得られた。
【０１１８】
実施形態では、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤が成長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤のためのアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の耐性／許容性の遺伝子は周知である。グリホサート耐性遺伝子には、変異５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（ＥＰＳＰ）およびｄｇｔ−２８遺伝子（組換え核酸の導入および／または天然ＥＰＳＰ遺伝子のインビボ突然変異誘発の種々の形態を介して）、ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ含まれる。他のホスホノ化合物の耐性遺伝子には、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属（Streptomyces）の種のｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）が含まれる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対する耐性を付与する例示的な遺伝子には、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）−−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３の遺伝子が含まれる。実施形態では、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む除草剤が光合成を阻害することができる。
【０１１９】
実施形態では、選択マーカー遺伝子には、それだけに限らないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；シアナミドヒドラターゼ；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ；トリプロファンデカルボキシラーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作アスパラギン酸キナーゼ；ｂａｒ遺伝子；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ；アセトヒドロキシ酸シンターゼ；５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンターゼ（ａｒｏＡ）；ハロアリールニトリラーゼ；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ）；および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）をコードする遺伝子が含まれる。
【０１２０】
実施形態には、クロラムフェニコール；メトトレキサート；ハイグロマイシン；スペクチノマイシン；ブロモキシニル；グリホサート；およびホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。
【０１２１】
選択マーカー遺伝子の上記リストは限定的であることを意図していない。いずれのレポーターまたは選択マーカー遺伝子も本発明に包含される。
【０１２２】
選択マーカー遺伝子は、植物中での最適発現のために合成される。例えば、実施形態では、遺伝子のコード配列が、植物中での発現を増強するためのコドン最適化によって修飾されている。選択マーカー遺伝子を、特定の植物種中での発現のために最適化することができる、あるいは双子葉または単子葉植物中での最適発現のために修飾することができる。植物に好ましいコドンは、対象となる特定の植物種中で、最大量で発現しているタンパク質中の最高頻度のコドンから決定することができる。実施形態では、選択マーカー遺伝子を、植物中最高レベルで発現してより高い形質転換効率をもたらすよう設計する。植物遺伝子最適化の方法は周知である。合成ＤＮＡ配列の最適化および作製に関する手引きは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０１６５４６、ＷＯ２０１１１４６５２４、ＷＯ１９９７０１３４０２、米国特許第６１６６３０２号および米国特許第５３８０８３１号に見出すことができる。
【０１２３】
形質転換
適当な植物の形質転換方法には、ＤＮＡを細胞に導入することができる任意の方法、例えば、限定されないが、電気穿孔（例えば、米国特許第５３８４２５３号参照）；微粒子銃（例えば、米国特許第５０１５５８０号、第５５５０３１８号、第５５３８８８０号、第６１６０２０８号、第６３９９８６１号および第６４０３８６５号参照）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５６３５０５５号、第５８２４８７７号、第５５９１６１６号、第５９８１８４０号および第６３８４３０１号参照）；およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５５０８１８４号参照）が含まれる。
【０１２４】
ＤＮＡ構築物を、炭化ケイ素繊維による攪拌などの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができる（例えば、米国特許第５３０２５２３号および第５４６４７６５号参照）、またはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子銃などの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物を、ナノ粒子形質転換を介して植物に導入することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９０１０４７００号参照）。
【０１２５】
さらに、根粒菌属（Rhizobium）の種ＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム属（Agrobacterium）細菌またはウイルスを用いて遺伝子導入を達成することができる。例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11 (1): 1-4を参照されたい。
【０１２６】
形質転換技術の適用を通して、事実上いかなる植物種の細胞も安定に形質転換することができ、これらの細胞を周知の技術によってトランスジェニック植物に発達させることができる。例えば、ワタ形質転換の文脈で特に有用となり得る技術は、米国特許第５８４６７９７号、第５１５９１３５号、第５００４８６３号および第６６２４３４４号に記載されており；アブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技術は特に、例えば、米国特許第５７５０８７１号に記載されており；ダイズを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第６３８４３０１号に記載されており；トウモロコシを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第７０６０８７６号および第５５９１６１６号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。
【０１２７】
外因性核酸のレシピエント細胞への送達を行った後、一般的には形質転換細胞をさらなる培養および植物再生のために同定する。形質転換を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用した形質転換ベクターと共に選択マーカー遺伝子を使用することが望ましいだろう。例示的実施形態では、形質転換細胞集団を選択剤（複数可）に曝露することによってアッセイすることができる、または細胞を所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
【０１２８】
選択剤への曝露に生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア化された細胞を、植物の再生を支持する培地で培養することができる。実施形態では、成長調節剤などのさらなる物質を含めることによって任意の適当な植物組織培養培地を修飾することができる。組織を、植物再生の努力を開始するために十分な組織が利用可能となるまで成長調節剤を含めた基礎培地で維持し、または組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）の繰り返しの手動選択後、シュート形成を招く培地に移すことができる。十分なシュート形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。いったんシュートが形成したら、これらを、根形成を招く培地に移す。いったん十分な根が形成したら、植物をさらなる成長および成熟のために土壌に移すことができる。
【０１２９】
再生植物中に提供される構築物を含む所望の核酸の存在を確認するために、種々のアッセイを行うことができる。このようなアッセイには、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロット法ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法および／またはＬＣ−ＭＳ  ＭＳ分光光度法）または酵素機能によって、タンパク質産物の存在を検出する；植物部分アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；ならびに／あるいは全再生植物の表現型の分析が含まれ得る。
【０１３０】
トランスジェニックイベントを、例えば、対象となる核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれる対象となる核酸分子を含むことが予想される単離宿主細胞カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いて標準的なクローニングおよびＰＣＲ増幅産物の配列解析を含むと理解される。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に記載されており（例えば、Rios et al. (2002) Plant J. 32: 243-53参照）、細胞培養物を含む、任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。標的配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを順次使用する、またはＰＣＲ増幅反応で多重化することができる。標的部位、導入された核酸配列および／または２つの組み合わせにアニーリングするよう設計したオリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略は、例えば、限定されないが、植物ゲノム中の特異的配列の増幅；植物ゲノム中の複数の特異的配列の増幅；植物ゲノム中の非特異的配列の増幅；および前記のいずれかの組み合わせを含み得る。当業者であれば、ゲノムを調べるためのプライマーおよび増幅反応のさらなる組み合わせを考案することができるだろう。例えば、順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列（複数可能）にアニーリングするように設計することができる。
【０１３１】
順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを、導入された核酸分子に、例えば、そこに含まれる対象となるヌクレオチド配列中のコード領域に相当する配列で、または核酸分子の他の部分に特異的にアニーリングするよう設計することができる。プライマーを本明細書に記載されるプライマーと合わせて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、所望の配列にしたがって合成することができ、商業的に入手可能である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ製）。増幅に、クローニングもしくは配列決定、または増幅産物の直接配列解析が続くことができる。実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅に使用する。
【０１３２】
導入遺伝子を発現させる方法
実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチンイントロンを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチンイントロンを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。
【０１３３】
実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。一実施形態では、ユビキチンプロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３５、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号３９から選択される配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３５、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号３９から選択される配列と９０、９５もしくは９９．５％の配列同一性を有する配列からなる。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチンイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲおよびユビキチンイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。
【０１３４】
トランスジェニック植物
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がユビキチンプロモーターを含む。実施形態では、ユビキチンプロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターであり得る。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、プロモーターが配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であり、プロモーターが非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３５、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号３９から選択される配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号３５、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号３９から選択される配列と９０、９５もしくは９９．５％の配列同一性を有する配列を含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１３５】
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がユビキチン３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、ユビキチン３’−ＵＴＲがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲである。実施形態では、３’−ＵＴＲがミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ（Ｕｂｉ１Ｃ）３’−ＵＴＲ、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１  ３’−ＵＴＲまたはアワ（Setaria italica）ユビキチン３’−ＵＴＲであり得る。
【０１３６】
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がイントロンを含む遺伝子発現カセットを含み、イントロンが配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含み、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来するプロモーターである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１３７】
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、５’−ＵＴＲが配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含み、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来するプロモーターである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１３８】
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がユビキチンプロモーターおよびユビキチン３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、それぞれ独立に、パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターおよびパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーターであり得るユビキチンプロモーターおよび３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターと、ｂ）配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットを含む。
【０１３９】
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーター、ユビキチン５’−ＵＴＲ、ユビキチンイントロンおよびユビキチン３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、プロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子と作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンプロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているユビキチンイントロンを含み、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来するプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているユビキチン５’−ＵＴＲを含み、プロモーターがパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）もしくはアワ（Setaria italica）ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ  ｍａｓ）に由来するプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているユビキチン３’−ＵＴＲを含み、３’−ＵＴＲが殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１４０】
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、本明細書に開示されるユビキチンプロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロンおよび／または３’−ＵＴＲを含むベクターを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している本明細書に開示されるユビキチンプロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロンおよび／または３’−ＵＴＲを含むベクターを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。
【０１４１】
一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している非内因性ユビキチン由来プロモーター配列を含む植物、植物組織または植物細胞であって、ユビキチン由来プロモーター配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号３５の配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号３５と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３５または配列番号３５と９０％の配列同一性を有する配列を含む植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が双子葉もしくは単子葉植物、または双子葉もしくは単子葉植物に由来する細胞もしくは組織である。一実施形態では、植物がトウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。一実施形態では、植物がトウモロコシ（Zea mays）である。一実施形態によると、植物、植物組織または植物細胞が、非ユビキチン導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３５、配列番号３９、または配列番号３５もしくは配列番号３９と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、プロモーターが配列番号３５、配列番号３９、または配列番号３５もしくは配列番号３９と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列からなる。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している非内因性ユビキチン由来プロモーター配列を含む遺伝子構築物が植物、植物組織または植物細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１４２】
一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３５、または配列番号３５と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む非パニクム属（Panicum）植物（すなわち、Panicum科の一員ではない）、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、非パニクム属（Panicum）植物、植物組織または植物細胞が双子葉もしくは単子葉植物、または双子葉もしくは単子葉植物に由来する植物細胞もしくは組織である。一実施形態では、植物がトウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。一実施形態では、植物がトウモロコシ（Zea mays）である。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーター配列が植物、植物組織または植物細胞のゲノムに組み込まれる。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、配列番号３８または配列番号３８と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、５’非翻訳配列が前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している。さらなる実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、５’非翻訳配列の後に挿入されたイントロン配列をさらに含む。一実施形態では、イントロン配列がパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）のユビキチン遺伝子から単離されたイントロン配列である。一実施形態では、配列が配列番号３７を含むまたはからなる。
【０１４３】
一実施形態では、導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結している配列番号３５、または配列番号３５と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列とを含む非パニクム属（Panicum）植物、植物組織または植物細胞であって、３’非翻訳配列が前記導入遺伝子と作動可能に連結している植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、非パニクム属（Panicum）植物、植物組織または植物細胞が双子葉もしくは単子葉植物である、または双子葉もしくは単子葉植物に由来する植物組織もしくは細胞である。一実施形態では、植物がトウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。一実施形態では、植物がトウモロコシ（Zea mays）である。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーター配列が植物、植物組織または植物細胞のゲノムに組み込まれる。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、配列番号３８または配列番号３８と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、５’非翻訳配列が前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している。さらなる実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が５’非翻訳配列の後に挿入されたイントロン配列をさらに含む。一実施形態では、イントロン配列がパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）のユビキチン遺伝子から単離されたイントロン配列である。一実施形態では、５’非翻訳配列が配列番号３８からなる。
【０１４４】
一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３９または配列番号３９と９０％の配列同一性を有する配列を含む非パニクム属（Panicum）植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む非パニクム属（Panicum）植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号３９または配列番号３９と９０％の配列同一性を有する配列からなる植物、植物組織または植物細胞が提供される。さらなる実施形態では、非パニクム属（Panicum）植物、植物組織または植物細胞がパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）またはアワ（Setaria italica）のユビキチン遺伝子の３’非翻訳配列をさらに含む。一実施形態では、３’非翻訳配列が、配列番号３６または配列番号３６と９０％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなり、３’非翻訳配列が導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している。
【０１４５】
実施形態では、本明細書に開示される方法による植物、植物組織または植物細胞が単子葉植物であり得る。単子葉植物、植物組織または植物細胞は、それだけに限らないが、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、エンバク、タマネギ、キビおよびライコムギであり得る。
【０１４６】
実施形態では、本明細書に開示される方法による植物、植物組織または植物細胞が双子葉植物であり得る。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、それだけに限らないが、ナタネ、セイヨウアブラナ、カラシナ、エチオピアマスタード（ethiopian mustard）、ダイズ、ヒマワリおよびワタであり得る。
【０１４７】
遺伝子組換え植物の作製に関しては、植物の遺伝子工学の方法が当技術分野で周知である。例えば、双子葉植物ならびに単子葉植物のための生物学的および物理学的形質転換プロトコルを含む多数の植物形質転換方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17: 282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993) 参照）。さらに、植物細胞もしくは組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993) で入手可能である。
【０１４８】
当業者であれば、外因性配列がトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、作動可能であることが確認された後、これを有性交雑によって他の植物に導入することができることを認識するだろう。交雑する種に応じて、いくつかの標準的な育種技術のいずれかを使用することができる。
【０１４９】
形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について操作した植物材料を選択またはスクリーニングすることによって同定および単離することができる。例えば、操作した植物材料を、形質転換遺伝子構築物が耐性を付与する阻害量の抗生物質または除草剤を含む培地で成長させることによって、選択を行うことができる。さらに、組換え核酸構築物上に存在し得る任意の目に見えるマーカー遺伝子（例えば、ｙｆｐ、ｇｆｐ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはＢもしくはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって、形質転換細胞を同定することもできる。このような選択およびスクリーニング方法論は当業者に周知である。
【０１５０】
物理的および生化学的方法を使用して挿入された遺伝子構築物を含む植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法には、それだけに限らないが、１）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および決定するためのサザン解析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出および調査するためのノーザンブロット法、Ｓ１  ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長または逆転写酵素ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性（このような遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされている）を検出するための酵素的アッセイ；４）次世代シーケンシング解析；５）遺伝子構築物産物がタンパク質である、タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット技術、免疫沈降法または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などのさらなる技術を使用して、特定の植物器官および組織中の組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これら全てのアッセイを行う方法は当業者に周知である。
【０１５１】
本明細書に開示される方法を用いた遺伝子操作の効果は、例えば、対象となる組織から単離したＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロット法によって観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するまたはｍＲＮＡの量が増加した場合、対応する導入遺伝子が発現していると仮定することができる。遺伝子および／またはコードされるポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用する基質、および反応産物もしくは副産物の増加もしくは減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素的アッセイを使用することができる。さらに、発現しているポリペプチドのレベルを、免疫化学的に、すなわち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび当業者に周知の他の抗体ベースのアッセイ、例えば、電気泳動検出アッセイ（染色またはウエスタンブロット法のいずれかを用いる）によって測定することができる。１つの非限定的な例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＷＯ２００５／１０７４３７参照）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）、ＥＣ２．３．１．１８３）タンパク質の検出が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９００９３３６６号に記載されている。導入遺伝子は植物のいくつかの細胞型もしくは組織中でまたはいくつかの発育段階で選択的に発現され得る、または導入遺伝子は実質的にその全ての生活環に沿って実質的に全ての植物組織中で発現され得る。しかしながら、いずれの組み合わせ発現様式も適用可能である。
【０１５２】
本開示は、上記トランスジェニック植物の種子であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する種子も包含する。本開示は、上記トランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する子孫、クローン、細胞株または細胞をさらに包含する。
【０１５３】
本発明を具体的な方法および実施形態を参照して記載してきたが、本発明から逸脱することなく種々の修正および変更を行うことができることが認識されるだろう。
【実施例１】
【０１５４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換
バイナリー発現ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株ＤＡｔ１３１９２（ＲｅｃＡマイナス三元菌株）（国際特許公開番号ＷＯ２０１２０１６２２２）に形質転換した。細菌コロニーを単離し、バイナリープラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化を介して確認した。
【０１５５】
トウモロコシの形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始。アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液をグリセロールストックからアグロバクテリウム（ＡＢ）最少培地（その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０９０７３４に開示されている）上に面線接種し、暗所中２０℃で３日間インキュベートした。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液をＹＥＰ（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）培地のプレート上に面線接種し、暗所中２０℃で１日間インキュベートした。
【０１５６】
実験日に、接種培地（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）とアセトシリンゴンの混合物を、実験において植物形質転換構築物を含む細菌株の数に適した体積で調製した。接種培地を滅菌使い捨て２５０ｍｌフラスコにピペットで入れた。次に、アセトシリンゴンの１００％ジメチルスルホキシド中１Ｍストック溶液を、２００μＭの最終アセトシリンゴン濃度を作るのに適した体積で接種培地を含むフラスコに添加した。接種培地および１Ｍアセトシリンゴンストック溶液の要求される体積を表１に列挙する。
【０１５７】
【表１】
2016531575.tif 000003
【０１５８】
各構築物について、ＹＥＰプレートからの１〜２ループのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を滅菌使い捨て５０ｍｌ遠心管の内側の接種培地／アセトシリンゴン混合物１５ｍｌに懸濁し、６００ｎｍでの溶液の光学濃度（ＯＤ６００）を分光光度計で測定した。次いで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて、懸濁液を０．２５〜０．３５ＯＤ６００に希釈した。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットホームシェーカー上に水平に置き、使用前に１〜４時間の間インキュベートした。
【０１５９】
穂殺菌および胚単離。トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４の穂を受粉１０〜１２日後に収穫した。収穫した穂から殻を取り（de-husk）、市販の漂白剤（Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ  Ｂｌｅａｃｈ、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム）の２０％溶液およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０  ２滴に２０分間浸漬し、引き続いてラミナーフローフード中滅菌脱イオン水で３回すすいで表面殺菌した。未熟な接合体胚（１．８〜２．２ｍｍ長）を各穂から無菌的に切除し、１０％Ｂｒｅａｋ−Ｔｈｒｕ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤２μｌを添加したアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液２．０ｍｌを含む１本または複数の微量遠心管に分配した。
【０１６０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養。胚単離活動が完了したら、胚の管を閉じて、ロッカープラットホームに５分間置いた。次いで、管の内容物を共培養培地のプレートに注ぎ出し、液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を滅菌使い捨てホールピペットで取り出した。胚を含む共培養プレートを３０分間、蓋を半開きにしてラミナーフローフードの後ろに置き、この時間の後、顕微鏡を用いて、胚を胚盤が上を向くように配向した。次いで、胚を含む共培養プレートをさらに１５分間、蓋を半開きにしてラミナーフローフードの後ろに戻した。次いで、プレートを閉じ、３Ｍ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ（登録商標）テープで密閉し、２４時間／昼光の約６０μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度を用いる２５℃のインキュベーターに入れた。
【０１６１】
トランスジェニックイベントのカルス選択および再生。共培養期間後、胚を静止培地（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）に移した。３６個以下の胚を各プレートに移動させた。プレートを透明な箱に入れ、２４時間／昼光の約５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度を用いて２７℃で７〜１０日間インキュベートした。次いで、カルス化した胚を選択Ｉ培地（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）に移した。１８個以下のカルス化した胚を選択Ｉの各プレートに移動させた。プレートを透明な箱に入れ、２４時間／昼光の約５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度を用いて２７℃で７日間インキュベートした。次いで、カルス化した胚を選択ＩＩ培地（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）に移した。１２個以下のカルス化した胚を選択ＩＩ培地の各プレートに移動させた。プレートを透明な箱に入れ、２４時間／昼光の約５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度を用いて２７℃で１４日間インキュベートした。
【０１６２】
この段階で、耐性カルスをプレ再生培地（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）に移動させた。９個以下のカルスをプレ再生培地の各プレートに移動させた。プレートを透明な箱に入れ、２４時間／昼光の約５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度を用いて２７℃で７日間インキュベートした。次いで、再生カルスをＰｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）中の再生培地に移し（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）、１日当たり１６時間光／８時間暗の約１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度を用いて２８℃で７〜１４日間またはシュートが発達するまでインキュベートした。５個以下のカルスを各Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）に入れた。次いで、一次根を有する小さなシュートを単離し、シュート伸長培地（ＷＯ２０１３０９０７３４参照）に移した。約６ｃｍ以上の根づいた小植物を土壌に移植し、慣れさせるために生育チャンバーに移転させた。
【０１６３】
ＹＦＰ一過性発現。一過性ＹＦＰ発現が、形質転換胚およびグロバクテリウム（Agrobacterium）との共培養の３日後で観察された。胚をＹＦＰフィルタおよび５００ｎｍ光源を用いて実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）で観察した。
【０１６４】
温室内でのＴ０植物の移動および確立。トランスジェニック植物を温室に定期的に移した。植物を、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）から成長培地（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｅｃｈ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ＰｒｏＭｉｘ  ＢＸ、０５８１Ｐ）を充填した小型ポット（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ、３．５’’ＳＶＤ、７０００２２Ｃ）へ移植し、ヒュミドーム（humidome）で覆って植物を順応させるのを助けた。植物を、Ｖ３〜Ｖ４期に達するまで、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ生育チャンバー（２８℃／２４℃、１６時間光周期、５０〜７０％相対湿度、２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１光強度）に入れた。これは、植物を土壌およびより厳しい温度に順応させるのを助けた。次いで、植物を温室（露光型：光または同化；ハイライト限界：１２００μｍｏｌｍ−２ｓ−１光合成有効放射（ＰＡＲ）；１６時間日長；２７℃昼／２４℃夜）に移動させ、小型ポットから５．５インチのポットへ移植した。大きなポットに移植した約１〜２週間後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。１イベント当たり１つの植物を分析した。
【実施例２】
【０１６５】
プロモーターの同定
トウモロコシユビキチンコード配列を、標的ゲノムとしてミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）を用いて、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ（Goodstein et al., 2012）データベースでＢＬＡＳＴｘ検索した。
トウモロコシユビキチン（ＺＭ  Ｕｂｉ１）コード配列
ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＴＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＴＧＣＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＧＧＡＴＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＣＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＣＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＴＣＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＡＡ（配列番号１８）
【０１６６】
タンパク質アラインメントを図１に示す。トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１タンパク質と整列した２つの配列をミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）から同定した。トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１タンパク質と整列したただ１つの配列をアワ（Setaria italica）およびパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）からそれぞれ同定した。予想された翻訳開始部位（ＡＴＧ）から上流の約２ｋｂ  ＤＮＡ配列を推定プロモーター配列の始まりと決定し、発現特性評価に使用した。パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）から単離された新規なプロモーターのポリヌクレオチド配列アラインメントを、ＺＭ  Ｕｂｉ１プロモーターに整列し、２ｋｂ  ＤＮＡ領域にわたって低レベルの配列類似性を共有していることを見出した（図２Ａ〜図２Ｃ）。
【０１６７】
パニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）およびアワ（Setaria italica）ユビキチン遺伝子についてのＵＢＩコード配列および推定プロモーターを図３５〜図３８に示す。
【実施例３】
【０１６８】
ベクター構築
４つのプロモーター配列を商業的に合成し、図３（ｐＤＡＢ１１３０９１）、図４（ｐＤＡＢ１１３０９２）、図５（ｐＤＡＢ１１３０６６）および図２２（ｐＤＡＢ１１８２３８）に示されるプラスミドベクターに組み込んだ。同様に、４つの３’ＵＴＲ／転写終結配列を商業的に合成し、図２３（ｐＤＡＢ１１８２３７）、図２４（ｐＤＡＢ１１８２０７）、図２５（ｐＤＡＢ１１８２０８）および図２６（ｐＤＡＢ１１８２０９）に示されるプラスミドベクターに組み込んだ。配列に、シームレスクローニング（seamless cloning）（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびプロモーターフラグメントの単離用に挿入されるＩＩ型制限酵素部位のために、両端に１５〜１８個のヌクレオチド相同フラグメントを隣接させた。シームレスクローニング適合性トウモロコシ（Zea mays）Ｕｂｉ１プロモーター（Christensen and Quail (1996) Transgenic Research. 5; 213-218; Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology. 18; 675-689）またはイネ（Oryzae sativa）アクチンプロモーター（McElroy et al., (1990) Plant Cell. 2; 163-71）、およびＳＴ−ＬＳ１イントロン（Vancanneyt et al., (1990) Mol Gen Genet. 220; 245-50）を含むＰｈｉＹＦＰ（Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol. 21; 841-50）コード配列、およびＳｔＰｉｎＩＩまたは天然３’−ＵＴＲ（An et al., 1989 Plant Cell. 1; 115-22.）フラグメントを、ＰＣＲまたはＩＩ型制限酵素を用いて得た。最後に、プロモーター：：ＰｈｉＹＦＰ：：ＳｔＰｉｎＩＩ  ３’−ＵＴＲフラグメントを、シームレスクローニングを用いて組み立てて、一過性発現試験のための一過性発現ベクター（図６、ｐＤＡＢ１１３１０３；図７、ｐＤＡＢ１１３１０４；図８、ｐＤＡＢ１１３１０５；図９、ｐＤＡＢ１１３１０６；および図１０、ｐＤＡＢ１１３１０７；図２７、ｐＤＡＢ１２０４３；図２８、ｐＤＡＢ１１８２３４、図２９、ｐＤＡＢ１１８２３５；および図３０、ｐＤＡＢ１１８２３６）を創製した。これらの一過性発現ベクターを、Ｚｍ  Ｕｂｉ１プロモーターおよびＡＡＤ−１コード配列（国際特許公開第２００５１０７４３７号）ならびにＺｍ  Ｌｉｐ  ３’ＵＴＲ（Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342）を含むバイナリーベクターに組み込んだ。得られたバイナリーを、制限酵素消化および配列決定反応を介して確認した（図１２、ｐＤＡＢ１１３１１７；図１３、ｐＤＡＢ１１３１１８；図１４、ｐＤＡＢ１１３１１９；図１５、ｐＤＡＢ１１３１２０；図１６、ｐＤＡＢ１１３１２１；図３１、ｐＤＡＢ１２０４００；図３２、ｐＤＡＢ１２０４０４；図３３、ｐＤＡＢ１２０４０１；および図３４、ｐＤＡＢ１２０４０２）。
【実施例４】
【０１６９】
一過性発現試験
未成熟トウモロコシ（Ｂ１０４）胚の微粒子銃を用いて一過性発現を試験した。銃のために、ペトリ皿で１処理当たり、４０個の胚を使用した。微粒子銃の一晩のインキュベーションの後、ＹＦＰ像分析を行った。図１９は、新規なプロモーターから得られたＹＦＰ発現レベルを示している。データは、新規なプロモーター（ｐＤＡＢ１１３１０３、ｐＤＡＢ１１３１０４およびｐＤＡＢ１１３１０５）から得られたＹＦＰ発現レベルが、顕微鏡下で目視により観察されるようにＺＭ  Ｕｂｉ１プロモーター（ｐＤＡＢ１１３１０６）およびＯＳ  Ａｃｔ１プロモーター（ｐＤＡＢ１１３１０７）から得られたＹＦＰ発現レベルに匹敵することを示している。植物組織をＬｅｉｃａ  ＥＬ６０００−水銀メタルハライド（商標）顕微鏡で画像化した。共焦点および微分干渉（ＤＩＣ）像をＣｈｒｏｍａ  ４２００３−ＺｓＹｅｌｌｏｗ  １（商標）フィルタを用いて取り込んだ。
【実施例５】
【０１７０】
リアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを用いた導入遺伝子コピー数推定
加水分解プローブアッセイを介して、トランスジェニックトウモロコシ（Z. mays）植物のゲノム内へのｙｆｐ導入遺伝子の安定な取り込みを確認した。カルスから発達した安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ（Z. mays）小植物を得て、分析して低コピー数（１〜２コピー）の全長Ｔ鎖インサートを含むイベントを同定した。同定した小植物を温室に進め、成長させた。
【０１７１】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（商標）システムを使用して導入遺伝子コピー数を測定した。この方法は、単一アッセイでｙｆｐ遺伝子および内因性トウモロコシ（Z. mays）参照遺伝子、インベルターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１６１２３．１）に特異的なオリゴヌクレオチドを使用する二重ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を利用した。既知のコピー数標準物質と比べて、インベルターゼ特異的蛍光に対するｙｆｐ特異的蛍光の強度を測定することによって、コピー数および接合状態を決定した。
【０１７２】
ｙｆｐ遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを、ＦＡＭ（商標）蛍光色素で標識したプローブを含む１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅し、インベルターゼを、ＨＥＸ（商標）蛍光で標識したプローブを含む第２のＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅した（表２）。ＰＣＲ反応混合物を表３に示されるように調製し、遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを表４に示される条件にしたがって増幅した。既知のコピー数標準物質と比べて、参照遺伝子、インベルターゼに特異的な蛍光に対するレポーター遺伝子、ｙｆｐに特異的な蛍光の相対強度を測定することによって、試料のコピー数および接合状態を決定した。
【０１７３】
【表２】
2016531575.tif 000004
【０１７４】
【表３】
2016531575.tif 000005
【０１７５】
【表４】
2016531575.tif 000006
【０１７６】
ベクター、ｐＤＡＢ１０８７０６をトウモロコシ（Z. mays）Ｂ１０４ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に希釈して既知の関係のｐＤＡＢ１０８７０６：ｇＤＮＡを有する標準物質を得ることによって標準物質を創製した。例えば、トウモロコシ（Z. mays）Ｂ１０４  ｇＤＮＡ１コピー当たり１、２および４コピーのベクターＤＮＡを有する試料を調製した。トウモロコシ（Z. mays）Ｂ１０４  ｇＤＮＡ標準物質と混合したｐＤＡＢ１０８７０６の１および２コピー希釈を、半接合性であることが知られている対照トウモロコシ（Z. mays）イベントおよびホモ接合性であることが知られている対照トウモロコシ（Z. mays）イベント（トウモロコシ（Z. mays）イベント２７８；ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ２０１１／０２２４６９Ａ２参照）に対して検証した。ＡＡＤ１についてはＦＡＭ蛍光色素で標識したプローブを含む１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを増幅および検出することによって、またインベルターゼについてはＨＥＸ（商標）蛍光で標識したプローブを含む第２のＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを増幅および検出することによって、ＡＡＤ１遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドおよび内因性トウモロコシ（Z. mays）参照遺伝子、インベルターゼに特異的なオリゴヌクレオチドを利用するＴａｑＭａｎ（登録商標）二重アッセイを行った（表２）。ＡＡＤ１  ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応混合物を表３に示されるように調製し、特異的フラグメントを表４に示される条件にしたがって増幅した。
【０１７７】
各反応について生成した蛍光レベルを、製造業者の指示にしたがってＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０サーモサイクラーを用いて分析した。ＦＡＭ（商標）蛍光部分を４６５／５１０ｎｍの光学濃度で励起し、ＨＥＸ（商標）蛍光部分を５３３／５８０ｎｍの光学濃度で励起した。未知の試料についての標的／基準値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０による出力）を、４つの既知のコピー数標準物質の標的／基準値（ゼロ、１コピー（半）、２コピー（ホモ）および４コピー）と比較することによって、コピー数を決定した。異なるプロモーター構築物による形質転換を介して得られたトランスジェニック植物の導入遺伝子コピー数分析の結果を表５に示す。１〜２コピーのｙｆｐ導入遺伝子を有する植物のみをさらなる発現解析のために温室に移した。
【０１７８】
【表５】
2016531575.tif 000007
【実施例６】
【０１７９】
ユビキチンプロモーターと作動可能に連結している遺伝子の発現
タンパク質抽出
葉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｔ０植物をＶ４〜５でサンプリングした。試料を９６ウェル収集管プレートに回収し、４枚の葉ディスク（紙の穴あけ器のサイズ）を各試料について取った。２つの４．５ｍｍ  ＢＢおよび２００μＬ抽出緩衝液［０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０および０．０５％ＢＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を補充した１×ＰＢＳ］を各管に添加した。ＡＡＤ１抽出のために、ＢＳＡの濃度を０．５％に増加させた。プレートを、全速力で３分間、ＫＬＥＣＯビーズミルで処理した。抽出緩衝液をさらに２００μＬを各管に添加し、引き続いて反転させて混合した。プレートを３０００ｒｐｍで５分間回転させた。上清を氷上で保管したディープウェル９６の対応するウェルに移した。
【０１８０】
ＹＦＰおよびＡＡＤ１  ＥＬＩＳＡ手順
Ｎｕｎｃ（登録商標）９６ウェルＭａｘｉ−Ｓｏｒｐ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をＥＬＩＳＡに使用した。プレートをマウスモノクローナル抗ＹＦＰ捕捉抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で被覆した。抗体をＰＢＳに希釈し（１μｇ／ｍＬ）、１ウェル当たり希釈ＰＢＳ  １５０μＬを添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液［０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充した１×ＰＢＳ］３５０μＬで４回洗浄する前に、一晩プレートを室温で２０〜３０分間維持した。プレートを１ウェル当たりブロッキング緩衝液［０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０＋０．５％ＢＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））を補充した１×ＰＢＳ］２００μＬを用いて＋３７℃で最小１時間ブロッキングし、引き続いて洗浄緩衝液（Ｔｏｍｔｅｃ  ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２、Ｔｏｍｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）３５０μＬで４回洗浄した。
【０１８１】
ＹＦＰ  ＥＬＩＳＡのために、Ｅｖｒｏｇｅｎ組換えＰｈｉ−ＹＦＰ  １ｍｇ／ｍＬ（Ａｘｘｏｒａ  ＬＬＣ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）を標準物質として使用した。５パラメータ当てはめ標準曲線（１ｎｇ／ｍｌ〜０．１２５ｎｇ／ｍｌの間の標準物質）を使用して全てのデータが曲線の直線部に入ることを保証した。標準物質または試料１００μＬをウェルに添加した。試料のアッセイ緩衝液への最小１：４希釈を使用した。プレートをプレートシェーカー（２５０ｒｐｍ；Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅシェーカー）上室温で１時間インキュベートし、引き続いて洗浄緩衝液（Ｔｏｍｔｅｃ  ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）３５０μＬで４回洗浄した。１μｇ／ｍＬのＥｖｒｏｇｅｎウサギポリクローナル抗ＰｈｉＹＦＰ一次抗体（Ａｘｘｏｒａ）約１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを２５０ｒｐｍのプレートシェーカー上室温で１時間インキュベートし、引き続いて洗浄緩衝液（Ｔｏｍｔｅｃ  ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）３５０μＬで４回洗浄した。次に、ブロッキング／アッセイ緩衝液に１：５０００希釈した抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを２５０ｒｐｍのプレートシェーカー上室温で１時間インキュベートし、引き続いて洗浄緩衝液（Ｔｏｍｔｅｃ  ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）３５０μＬで４回洗浄した。Ｐｉｅｒｃｅ１ステップＵｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）基質１００μＬを穏やかに振盪しながら１０分間ウェルに添加した。０．４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを添加することによって、反応を停止した。６５０ｎｍ基準フィルタを用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１８２】
Ａｃａｄｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）のキットを用いて、ＥＬＩＳＡによってＡＡＤ１発現レベルを測定した。抽出物の複数希釈を用いて、また供給業者によって提供される試薬および指示を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって供給された６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬を用いておよび供給業者の指示にしたがって行った全可溶性タンパク質アッセイを用いて、タンパク質レベルを正規化した。
【実施例７】
【０１８３】
ユビキチンプロモーターと作動可能に連結している遺伝子の安定発現を例示する全植物ＹＦＰ画像解析
低コピー数のバイナリープラスミドを含む全植物を温室で育てた。植物組織をＬｅｉｃａ  ＥＬ６０００−水銀メタルハライド（商標）顕微鏡で画像化した。共焦点および微分干渉（ＤＩＣ）像をＣｈｒｏｍａ  ４２００３−ＺｓＹｅｌｌｏｗ  １（商標）フィルタを用いて取り込んだ。本明細書に記載されるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１Ｃ、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）ユビキチン１およびアワ（Setaria italica）ユビキチン２プロモーターで形質転換したトウモロコシ（Z. mays）胚から得たトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物のカルスおよび根組織中でのＹＦＰの安定な発現の代表的な例を、図２０および図２１にそれぞれ提示する。プロモーターは、カルス（図２０）と根（図２１）植物組織の両方でｙｆｐコード配列の強い発現を駆動した。
【実施例８】
【０１８４】
ユビキチンプロモーターと作動可能に連結している遺伝子の全植物Ｔ０安定発現
発現したＹＦＰタンパク質のＥＬＩＳＡ解析から、追加のデータを作成した。ＥＬＩＳＡ解析により、新規なプロモーターが導入遺伝子の強い発現を駆動することがさらに確認された。新規なプロモーター構築物を含むトランスジェニック植物から得られたＹＦＰタンパク質の定量的測定を図１７および表６に示す。データは、新規なプロモーター（ｐＤＡＢ１１３１１７、ｐＤＡＢ１１３１１８およびｐＤＡＢ１１３１１９）を含む植物中でのＹＦＰタンパク質の発現が、Ｏｓ  Ａｃｔ１（イネアクチン１）プロモーター（ｐＤＡＢ１１３１２０）から得られたＹＦＰ発現よりも数倍高いことを示している。比較してみると、図１８および表７は、類似のレベルのＡＡＤ１発現が全ての構築物から得られたことを示している。これは、ＡＡＤ１が構築物の全てについてＺｍ  Ｕｂｉ１プロモーターによって駆動されているためと予想される。
【０１８５】
【表６】
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【０１８６】
【表７】
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【実施例９】
【０１８７】
ユビキチンプロモーターおよび３’ＵＴＲと作動可能に連結している遺伝子の全植物Ｔ１安定発現
Ｔ０単一導入遺伝子コピー植物を、野生型Ｂ１０４トウモロコシ植物と戻し交雑してＴ１種子を得た。半接合性Ｔ１植物を分析に使用した。Ｖ４およびＶ１２葉発現について１構築物当たり５つのイベントおよび１イベント当たり５〜１０個の植物を使用した。他の組織型発現については、１構築物当たり３つのイベントおよび１イベント当たり３個の植物を使用した。接合状態分析をＡＡＤ１／ＹＦＰについて行った。
【０１８８】
新規なプロモーター構築物を含むＴ１トランスジェニック植物の葉組織から得られたＹＦＰタンパク質の定量的測定を表８に示す。データにより、Ｔ０葉発現結果が確認され、ＹＦＰタンパク質の一貫して高い発現が新規なプロモーター（ｐＤＡＢ１１３１１７、ｐＤＡＢ１１３１１８およびｐＤＡＢ１１３１１９）を含む植物のＶ４、Ｖ１２およびＲ３葉組織で得られることがさらに示された。表８はまた、この新規なプロモーターを、ＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ（ｐＤＡＢ１１３１１７、ｐＤＡＢ１１３１１８およびｐＤＡＢ１１３１１９）の代わりに、その天然３’ＵＴＲ（ｐＤＡＢ１２０４００、ｐＤＡＢ１２４０１およびｐＤＡＢ１２０４０２）と組み合わせて使用すると、ＹＦＰタンパク質の発現が数倍増加したことを示している。ＹＦＰタンパク質発現は、構築物ｐＤＡＢ１２０４０４を含む植物から検出され、この構築物に使用されている新規なプロモーターおよび３’ＵＴＲが導入遺伝子の発現を駆動することを確認している。
【０１８９】
【表８】
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【０１９０】
ＹＦＰを駆動する新規なユビキチンプロモーターを含むトランスジェニックトウモロコシ植物から採取した穂軸、殻、仁、花粉、根、ひげおよび茎を含む種々の組織型で、高いＹＦＰタンパク質発現が見られた（表９）。これらのデータは、ここで請求される新規なプロモーターおよび３’ＵＴＲが植物における導入遺伝子の高い構成的発現を駆動し、生物工学用途に有用となることを証明している。
【０１９１】
【表９】
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【０１９２】
本明細書で引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、本開示の明示的詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、そのため、あたかも各参考文献が個別的かつ具体的に参照により組み込まれることが示されており、本明細書に全体が示されているのと同程度に組み込まれる。本明細書に論じられる参考文献は、本出願の出願日前より前のその開示についてのみ提供される。本明細書中のいずれも、本発明者らが先行発明によってこのような開示に先立つ権利がないことの自認と解釈すべきでない。以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供されるものである。実施例は、本開示を例示される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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