(57)【要約】癌の成長及び転移の阻害に使用するためのパパイヤモザイクウイルス及びｓｓＲＮＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、単独で、または例えば、化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法などの別の癌療法と併用して使用してもよい。
2016531927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、それを必要とする対象における癌治療で使用するための前記組成物。
【請求項２】
前記組成物は腫瘍内投与用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は別の癌治療と併用して使用するためのものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記治療は、前記癌の成長を阻害することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記治療は、前記癌の転移を阻害することを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記癌治療は、放射線療法、化学療法及び免疫療法のうちの１つ以上を含む、請求項３または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は免疫療法剤と併用して使用するためのものである、請求項３または５に記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫療法剤は細胞系癌免疫療法剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞系癌免疫療法剤は樹状細胞系癌免疫療法剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、それを必要とする対象における癌治療において癌免疫療法の改善に使用するための前記組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、癌免疫療法的投与が行われる前に前記対象に投与するためのものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記癌免疫療法は、癌特異抗原含有樹状細胞を含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記治療は、前記癌の成長を阻害することを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記治療は、前記癌の転移を阻害することを含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
それを必要とする対象における癌治療で使用するための、ｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、前記組成物は腫瘍内投与用であり、前記組成物が癌の成長を阻害する、前記組成物。
【請求項１７】
それを必要とする対象における癌治療において樹状細胞系免疫療法の改善に使用するための、ｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、前記樹状細胞系免疫療法的投与が行われる前に前記対象に投与するためのものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記癌は固形癌である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎癌、肺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫または黒色腫である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰに含まれる前記ｓｓＲＮＡは、長さ約５０ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチドである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰに含まれる前記ｓｓＲＮＡは、長さ約１０００ヌクレオチド〜約３０００ヌクレオチドである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰに含まれる前記ｓｓＲＮＡは合成ｓｓＲＮＡである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記合成ｓｓＲＮＡはいかなるＡＵＧも含まない、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記合成ｓｓＲＮＡは配列番号１の１７〜５４番のヌクレオチドに対応する配列を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記合成ｓｓＲＮＡは配列番号１若しくは６の核酸配列に対応する配列またはその断片を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記対象はヒトである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
対象における癌治療方法であって、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記組成物は腫瘍内投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物は別の癌療法と組み合わせて腫瘍内投与される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療は、前記癌の成長を阻害することを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療は、前記癌の転移を阻害することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌治療は、放射線療法、化学療法及び免疫療法のうちの１つ以上を含む、請求項３０または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物は免疫療法剤と併用投与される、請求項３０または３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫療法剤は細胞系癌免疫療法剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞系癌免疫療法剤は樹状細胞系癌免疫療法剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
対象における癌治療における癌免疫療法の改善方法であって、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３８】
前記組成物は、癌免疫療法的投与が行われる前に前記対象に投与するためのものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌免疫療法は、癌特異抗原含有樹状細胞を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療は、前記癌の成長を阻害することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療は、前記癌の転移を阻害することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物は、前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
対象における癌治療方法であって、前記方法は、ｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記組成物は腫瘍内投与用であり、前記組成物が前記癌の成長を阻害する、前記方法。
【請求項４４】
対象における癌治療での樹状細胞系免疫療法の改善方法であって、ｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
前記組成物は、樹状細胞系免疫療法的投与が行われる前に前記対象に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌は固形癌である、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎癌、肺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫または黒色腫である、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰに含まれる前記ｓｓＲＮＡは、長さ約５０ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチドである、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰに含まれる前記ｓｓＲＮＡは、長さ約１０００ヌクレオチド〜約３０００ヌクレオチドである、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＰａｐＭＶ  ＶＬＰに含まれる前記ｓｓＲＮＡは、合成ｓｓＲＮＡである、請求項２８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記合成ｓｓＲＮＡはいかなるＡＵＧコドンも含まない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記合成ｓｓＲＮＡは配列番号１の１７〜５４番のヌクレオチドに対応する配列を含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記合成ｓｓＲＮＡは配列番号１若しくは６の核酸配列に対応する配列またはその断片を含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象はヒトである、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療剤分野、特に、癌治療でのパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系が、癌において及び従来の治療法に対する腫瘍の応答において重要な役割を担っていることは公知である。癌治療のための免疫治療学的アプローチがこれまでも開発されてきており、現在もなお開発中である。モノクローナル抗体による受動免疫療法は重要な方法であるが、受動免疫療法対象の患者は、多くの場合再発患者であり、治療に応じて漸進的な減少を示す。このため、疾患と闘うために患者自身の免疫系を刺激する癌ワクチン（例えばＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））、及び非特異的免疫療法（例えば、小分子化合物イミキモドなど）などの代替法が開発中である。
【０００３】
イミキモド（Ａｌｄａｒａ（登録商標））は、妊娠前及び初期皮膚癌の局所治療用の５％クリーム製剤の形態で承認されているＴｏｌｌ様レセプター７（ＴＬＲ７）アゴニスト及び強力な免疫賦活剤である。類似のイミダゾキノリン小分子８５２Ａ（これもＴＬＲ７アゴニストである）の全身投与により、ステージＩＶの転移性黒色腫の一部の患者において持続性疾患の安定化がもたらされることがわかった（非特許文献１）。Ｔ細胞及びＢ細胞リンパ腫担持マウスにおいて、放射線療法と組み合わせて、別のイミダゾキノリンＴＬＲ７アゴニストＲ８４８（レジキモド（Ｒｅｓｑｕｉｍｏｄ））を全身投与したところ、長期にわたって腫瘍が存在していないことがわかった（非特許文献２）。皮膚乳癌マウスモデルにおいて、局所投与イミキモドと局所放射線療法とシクロホスファミドの全身投与とを組み合わせることにより、腫瘍成長及び再発の減少において相乗的作用を示すことがわかった（非特許文献３）。
【０００４】
抗原の免疫原性を向上させるパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）及びＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の能力が報告されている（特許文献１〜４）。
加えて、特許文献５には、自然免疫応答を刺激するためのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む組成物の使用について記載されている。ＰａｐＭＶ組成物を使用して、その後の病原体の問題に対する保護を提供することができるか、または確立された感染の処置を行うことができる。対象を病原体による潜在的感染から保護するためにＰａｐＭＶ組成物を使用すること及び鼻腔内経路または肺経路を介して組成物を投与することによって、粘膜及び／または呼吸器系内での影響を誘導することについても記述されている。
【０００５】
特許文献６には、組換え型パパイヤモザイクウイルスコートタンパク質及びｓｓＲＮＡからＶＬＰを調製するためのインビトロプロセスについて記述されている。ＶＬＰはアジュバントとして使用することができ、抗原に融合すると、ワクチンとして使用することができる。自然免疫応答を刺激するためにＶＬＰを使用することについても記述されている。
【０００６】
この背景情報は、おそらく本発明に関連のある出願者が考えている情報を周知させることを目的として提供される。必ずしも承認されることを意図するものではないか、または任意のこれまでの情報が本発明に対して先行技術を構成していると解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，６４１，８９６号明細書
【特許文献２】米国特許第８，１０１，１８９号明細書
【特許文献３】カナダ国特許発明第２，４３４，０００号明細書
【特許文献４】国際公開第２００４／００４７６１号
【特許文献５】国際公開第２０１２／１５５２６１号
【特許文献６】国際公開第２０１２／１５５２６２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１３（２３）：７１１９〜７１２５
【非特許文献２】Ｄｏｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｂｌｏｏｄ，１２１（２）：２５１〜２５９
【非特許文献３】Ｄｅｗａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１８（２４）：６６６８〜６６７８
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、癌治療におけるパパイヤモザイクウイルス及びウイルス様粒子に関する。一態様では、本発明は、それを必要とする対象における癌治療において使用するためにパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物に関する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における癌治療で癌免疫療法を改善するために使用するためにパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物に関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における癌治療方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、または、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における癌治療での癌免疫療法の改善方法に関する。
【００１３】
ある実施形態では、本組成物は、ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における癌治療で使用するためにｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物に関し、本組成物は腫瘍内投与用であり、本組成物が癌の成長を阻害する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における癌治療において、樹状細胞系免疫療法を改善するために使用するためにｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、ｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における癌治療方法に関し、本組成物は腫瘍内投与用であり、本組成物が癌の成長を阻害する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における癌治療において樹状細胞系免疫療法の改善方法に関する。
【００１７】
ある実施形態では、癌治療は、放射線療法、化学療法及び免疫療法のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、癌治療は、細胞系癌免疫療法剤などの免疫療法剤を含む。いくつかの実施形態では、癌治療は、樹状細胞系癌免疫療法剤を含む。
【００１８】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴は、添付図面が参照されている以下の詳細な説明において、更に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（Ａ）本発明の一実施形態において、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの調製に使用できる合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）（配列番号１）の配列、（Ｂ）本発明の一実施形態において使用できる別の合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）（配列番号６）の配列を示し、ＴＡＡ停止コドン（太字）については、すべてのＡＴＧコドンが変異しており、最初の１６ヌクレオチドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの発現ベクター内のＴ７の転写開始部位由来であり、この配列は、ｒＶＬＰ集合体でのＰａｐＭＶ核生成部位を含む（（Ａ）四角で囲まれている）。
【図２】（Ａ）野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列及び（Ｂ）野生型ＰａｐＭＶコート−タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図３】（Ａ）変性ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５（配列番号４）のアミノ酸配列及び（Ｂ）変性ＰａｐＭＶコート−タンパク質ＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図４】Ａ及びＢは、腫瘍内でＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる免疫付与により、免疫付与６時間後にＩＦＮ−αが産生されることを示すグラフを示す。腫瘍（Ａ）及び脾臓（Ｂ）内でのＩＦＮ−αの反応速度をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ及びＤは、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる免疫付与により、腫瘍内で免疫細胞の浸潤を誘導することを示すグラフである：（Ｃ）ＣＤ４５＋細胞部分のフローサイトメトリー解析結果、並びに（Ｄ）免疫付与２４時間後の腫瘍中におけるＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂリンパ球及び形質細胞様樹状細胞の割合。
【図５】ＯＶＡ含有ＢＭＤＣ（ＢＭＤＣ−ＯＶＡ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射及び静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、脾臓及び血清においてほとんどのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生が誘導されたことを示すグラフである。ＢＭＤＣ−ＯＶＡ免疫付与後７日目の脾臓（Ａ）、血清（Ｂ）及びリンパ液（Ｃ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞中のＫｂ−ＯＶＡ＋細胞のフローサイトメトリー解析結果。
【図６】Ａ、Ｂ及びＣは、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腫瘍内注射により、ＢＭＤＣ−ＯＶＡ免疫付与による治療的効果の増大（（Ａ）Ｂ１６−ＯＶＡ−ｏｆｌ及び（Ｂ）Ｂ１６−ＯＶＡの成長速度）を示す。腫瘍は、キャリパーを使用して測定し、腫瘍細胞の播種から７日及び１２日後に処置を行った。（Ｃ）播種１６日後の脾臓内でのＣＤ４４＋Ｋｂ−ＯＶＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。Ｄは、マウス中での補体の枯渇により、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腫瘍内投与が皮下黒色腫Ｂ１６−ＯＶＡの成長速度（７日目及び１２日目の治療後、厚さ、キャリパーによって測定される）に及ぼす治療効果の改善が認められないことを示すグラフである。
【図７】補体の枯渇により、Ｂ１６−ＯＶＡ静注播種マウスの肺においてＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な産生が誘導されなかったことを示すグラフである。免疫付与７日後の肺における（Ａ）Ｋｂ−ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及び（Ｂ）ＩＬ−２産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析結果。
【図８】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる前処理により、Ｂ１６−ＯＶＡ転移に及ぼすＢＭＤＣ−ＯＶＡ免疫付与の治療効果の増大を示すグラフである。マウスには、静注によりＢ１６−ＯＶＡ−ｏｆｌ及びＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを播種し、播種後７日目にＢＭＤＣ−ＯＶＡを注入した。マウスは１２日目に屠殺し、肺を採取した。（Ａ）ルシフェリンを肺ホモジネート上清に添加し、照度計を用いてルミネセンスを測定した。肺（Ｂ）及び脾臓（Ｃ）でのＣＤ４４＋Ｋｂ−ＯＶＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７）によるインビトロ再刺激後の脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞産生ＩＦＮ−γ（Ｄ）またはＴＮＦ−α（Ｅ）の割合。
【図９】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる処置により、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫の成長速度が低下し、免疫細胞の浸潤が増大することを示す結果を示す。（Ａ）腫瘍成長後にキャリパーを用いて腫瘍径を測定し、腫瘍面積を算出した。（Ｂ）免疫細胞の浸潤は、フローサイトメトリーによる腫瘍内のＣＤ４５＋細胞の割合で決定した。（Ｃ）腫瘍ホモジネートのＣＤ４５＋集団中のＣＤ４４＋Ｋｂ−ＯＶＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。（Ｄ）ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７）によるインビトロ再刺激後のＩＦＮ−γを産生する腫瘍中でのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。＊：Ｐ＜０．０５。
【図１０−１】ＰａｐＭＶｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ（６０μｇ）の１つ若しくは２つまたは対照緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣ１  １０ｍＭ  ｐＨ８）により鼻腔内処置を受けたＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中の（Ａ）ＭＩＰ−１α、（Ｂ）ＭＩＰ−１β、（Ｃ）ＭＩＰ−２、（Ｄ）ＫＣ、（Ｅ）ＴＮＦ−α、及び（Ｆ）ＲＡＮＴＥＳの存在を示すグラフを示す。各ポイントは、それぞれのマウスで検出されるサイトカインレベルに対応している。
【図１０−２】ＰａｐＭＶｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ（６０μｇ）の１つ若しくは２つまたは対照緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣ１  １０ｍＭ  ｐＨ８）により鼻腔内処置を受けたＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中の（Ｇ）ＶＥＧＦ、（Ｈ）ＭＣＰ−１、（Ｉ）ＩＰ−１０、（Ｊ）ＩＬ−１７、（Ｋ）ＩＬ−１３、及び（Ｌ）ＩＬ−１２（ｐ７０）の存在を示すグラフを示す。各ポイントは、それぞれのマウスで検出されるサイトカインレベルに対応している。
【図１０−３】ＰａｐＭＶｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ（６０μｇ）の１つ若しくは２つまたは対照緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣ１  １０ｍＭ  ｐＨ８）により鼻腔内処置を受けたＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中の（Ｍ）ＩＬ−９、（Ｎ）ＩＬ−６、（Ｏ）ＩＬ−１α、（Ｐ）ＩＬ−１β、（Ｑ）ＧＭ−ＣＳＦ、及び（Ｒ）Ｇ−ＣＳＦの存在を示すグラフを示す。各ポイントは、それぞれのマウスで検出されるサイトカインレベルに対応している。
【図１１】１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる静脈内免疫付与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの血清（Ａ）及び脾臓（Ｂ）中におけるＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−αの産生速度の評価及び（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス及び異なるノックアウトマウスでの１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる免疫付与またはＰＢＳ投与の６時間後のＥＬＩＳＡによる血清ＩＦＮ−αの定量化を示すグラフを示す。
【図１２】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腹腔内投与により、マウスの脾臓においてサイトカイン及びケモカイン（Ａ）ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）、（Ｂ）ＩＬ−６、（Ｃ）ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦα）、（Ｄ）ＫＣ及び（Ｅ）ケモカインＭＩＰ−１アルファ（ＭｌＰ−ｌα）の産生が誘導されることを示す結果を示す。
【図１３】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腹腔内投与により、マウスの血清での（Ａ）ＫＣ、（Ｂ）ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）、（Ｃ）ＩＬ−６、（Ｄ）ケモカインＭＩＰ−１α（ＭＩＰ−１α）及び（Ｅ）ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−α）においてサイトカイン及びケモカインの産生が誘導されることを示す結果を示す。
【図１４】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腹腔内投与により、マウスの脾臓（Ａ）及び血清（Ｂ）内でのＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）の産生が誘導され、また、処置５時間後のマウスの血清中での（Ｃ）ＫＣ及び（Ｄ）ＭＩＰｌ−αの分泌の誘導（ポリＣ  ＤＮＡにより自己組織化されたポリＣ＝ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ；ＰａｐＭＶ及びＥＮＧ＝ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ；Ｄｅｎａｔ＝変性ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ；低アジュバント活性を有する５７１５＝ＰａｐＭＶ  ＶＬＰバッチ）を示す結果を示す。
【図１５】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ処置により、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫の成長速度が低下し、免疫細胞の浸潤が増大することを示す結果を示す。（Ａ）腫瘍成長後にキャリパーを用いて腫瘍径を測定し、腫瘍面積を算出した（ｍｍ２）。（Ｂ）マウスの生存率。腫瘍が直径１７ｍｍに到達したとき、マウスを安楽死させた。ＬｕｍｉｎｅｘによるＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ注入６時間後の腫瘍内の（Ｃ）ＩＰ−１０、（Ｄ）ＭＣＰ−１及び（Ｅ）ＩＬ−６の定量化。（Ｆ）免疫細胞の浸潤は、フローサイトメトリーによる腫瘍内のＣＤ４５＋細胞の割合で決定した。腫瘍ホモジネート播種１５日後のＣＤ４５＋集団中の（Ｇ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｈ）骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ、ＣＤｌｌｂｈｉＧｒ１＋）（Ｉ）Ｋｂ−ＯＶＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｊ）Ｄｂ−ｇｐ１００＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及び（Ｋ）Ｋｂ−ＴＲＰ２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図１６】ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる前処理により、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫腫瘍でのＤＣ−ＯＶＡ免疫付与の治療効果が増大することを示すグラフである。（Ａ）腫瘍成長は、時間の経過と共にキャリパーを用いて監視した。（Ｂ）マウスの生存率。腫瘍が直径１７ｍｍに到達したとき、マウスを安楽死させた。＊：ｐ＜０．０５。
【図１７】高用量シクロホスファミド（ＣＴＸ；１００ｍｇ／ｋｇ）と併用したＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰが腫瘍成長に及ぼす影響を示す結果を示す。（Ａ）ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを静脈内投与した。（Ｂ）ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを腫瘍内投与した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、概して、癌治療でのパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）及びｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ）の使用に関し、抗原に対して新たに引き起こされた免疫応答を向上するにあたって、アジュバントとして作用するその能力に加えて、ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、抗癌効果を提供するのに十分なレベルまでの癌を有する対象において既存の免疫応答を増強し得るという所見に基づく。
【００２１】
本明細書に示すとおり、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、単独投与時に腫瘍成長を阻害することができ、また、他の癌治療、特に癌免疫療法の腫瘍成長の減少効果及び／または抗転移性効果を促進することができる。特定の理論に束縛されるものではないが、ＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによりｔｏｌｌ様レセプターＴＬＲ７が活性化され、これらを免疫賦活剤として機能させることができ、腫瘍に対する患者の免疫細胞の活性を増強させることができると考えられている。また、ＰａｐＭＶは、内因性ｓｓＲＮＡを含有するため、腫瘍に対して類似の免疫賦活効果を示すと予測される。
【００２２】
したがって、ある実施形態では、本発明は、癌治療における免疫賦活剤としてのＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。いくつかの実施形態は、腫瘍の成長を阻害するためのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの単独使用方法に関する。
【００２３】
ある実施形態では、別の癌治療を受けている患者において、抗癌免疫応答を補助し、この治療の有効性を改善するためのＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用も企図される。このため、本発明のいくつかの実施形態は、例えば、腫瘍の成長を阻害するか、かつ／または腫瘍の転移を阻害する癌治療のための併用療法の一部としてのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。さまざまな実施形態において企図される併用療法としては、例えば、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと免疫療法剤、化学療法剤、放射線療法またはウイルス療法を１つ以上組み合わせたものが挙げられる。
【００２４】
このため、本発明のいくつかの実施形態は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び別の癌治療剤（例えば、免疫療法剤または化学療法剤）から構成される治療的併用に関する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、治療用癌ワクチンまたは他の癌免疫療法剤と併用投与することで、腫瘍成長または転移を阻害し得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、癌免疫療法剤と併用投与することで、腫瘍成長または転移を阻害し得ると考えられる。ある実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、細胞系癌免疫療法剤（樹状細胞（ＤＣ）系癌免疫療法剤など）と併用投与され得る。本発明のある実施形態は、腫瘍の転移を阻害する１つ以上の治療用癌ワクチンまたは他の癌免疫療法剤と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。
【００２６】
本発明のある実施形態は、癌特異抗原含有樹状細胞を含む免疫療法を改善するために、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。本文脈中、例えば、樹状細胞療法の有効性を向上させるために、担持樹状細胞の投与前に患者の先天性免疫の刺激を介する抗原担持樹状細胞の投与前の前処理として、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰが使用されてもよいか、または、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰが抗原含有樹状細胞と同時にまたは抗原含有樹状細胞の後に投与されてもよい。
【００２７】
定義
別に定義されていない限り、本発明の属する当業者によって一般的に理解されるとおり、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、同一の意味を有する。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「約」とは、提示された値からのほぼ±１０％の変動を示す。具体的に言及されているか否かに関わらず、本明細書に記載される任意の提示された値には、必ずこのような変動を含むことを理解すべきである。
【００２９】
ＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの「注射」または「投与」は、ＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを対象の身体に導入するのに効果的な任意の技術を包含することを目的としている。ある実施形態では、ＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、皮下投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、鼻孔内投与または筋肉内投与によって対象の身体に導入される。
【００３０】
更に１種以上の治療剤「と併用して」ＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを投与することは、同時（同時発生）投与及び逐次的投与を含むことを意図している。場合によっては、同時投与は、ＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと治療剤（複数可）との予混合を伴う。場合によっては、同時投与は、予混合を行わないＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと治療剤（複数可）との同時発生投与を伴う。逐次的投与は、短くてもよい（例えば、分または更には秒にて）または長くてもよい（例えば、時間、日、週にて）規定された期間によって分けて、ＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び治療剤（複数可）の投与と共に、対象にＰａｐＭＶまたはｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び治療剤（複数可）を投与するさまざまな順序を包含することを意図している。
【００３１】
用語「阻害する」及びその文法的変形は、本明細書で使用するとき、測定可能な所与のパラメータまたは事象の減少を意味する。
用語「治療」及び「処置」は、本明細書で同義的に使用されるとき、疾患若しくは関連症状（複数可）に関連する症状の緩和、疾患若しくは関連症状（複数可）の発現の防止若しくは遅延または疾患若しくは関連症状（複数可）の病理学的変換によって行われる介入を意味する。したがって、用語、治療及び処置は広義に使用され、さまざまな実施形態では、種々のステージでの疾患または関連症状（複数可）の１つ以上の予防（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））、緩和、減少及び／または治癒が挙げられる。
【００３２】
用語「対象」及び「患者」は、本明細書で使用するとき、処置の必要のある動物を意味する。
用語「動物」とは、本明細書で使用するとき、これらに限定されないが哺乳類、鳥類、及び魚類などのヒト及び非ヒト動物の両方を意味し、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、動物園の動物、実験動物及び野生動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及び他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、カモ、非ヒト霊長類、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター及びマウスなどを包含する。
【００３３】
用語「ａ」または「ａｎ」の使用は、本明細書で用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と連動して使用するとき、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つの」及び「１つまたは２つ以上の」の意味とも一致する。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」並びにそれらの文法的変形は包括的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）または非限定的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、追加の非引用要素及び／または方法ステップを排除するものではない。本明細書で使用するとき、組成物、使用または方法と関連して用語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、追加の要素及び／または方法ステップが存在し得るが、これらの追加は、実質的に引用された組成物、方法または使用が機能を果たす方法に実質的に影響を及ぼさないことを意味する。本明細書で使用するとき、組成物、使用または方法と関連して用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、追加の要素及び／または方法ステップの存在を含まない。また、特定の要素及び／またはステップを含むように本明細書に記載されている組成物、使用または方法は、ある実施形態では、本質的にこれらの要素及び／またはステップからなってもよく、他の実施形態では、これらの実施形態が具体的に引用されているか否かに関わらず、これらの要素及び／またはステップからなる。
【００３５】
本明細書で検討されているいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法または組成物に関して実行することができ、逆もまた同様であると考えられている。更に本発明の組成物及びキットを使用して、本発明の方法を達成することができる。
【００３６】
パパイヤモザイクウイルス及びウイルス様粒子
ＰａｐＭＶ
ＰａｐＭＶは、当該技術分野において公知であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＶ−２０４（商標）として得ることができる。ウイルスは、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）及びキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）などの宿主植物上で保持すること並びにパパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）及びキンギョソウから精製することが可能である（例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．＆Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｂ．，１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９０：３６〜４６を参照されたい）。
【００３７】
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、ウイルス様粒子を形成するために、ｓｓＲＮＡ分子周囲で組織化された複数のＰａｐＭＶコートタンパク質を含む。
【００３８】
ＰａｐＭＶコートタンパク質
ＶＬＰの調製に使用されるＰａｐＭＶコートタンパク質は、完全なＰａｐＭＶコートタンパク質であっても、その一部であってもよいか、または、コートタンパク質が自己組織化してＶＬＰとなる能力を保持する場合、例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換などを含む野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質の遺伝学的に修飾されたものであってもよい。野生型ＰａｐＭＶコート（またはカプシド）タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり（Ｓｉｔ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７０：２３２５〜２３３１，  ａｎｄ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０４４３３４．１を参照されたい）、また、本明細書では配列番号２として提供される（図２Ａを参照されたい）。この配列の変異型（例えば、Ｎｏａ−Ｃａｒｒａｚａｎａ  ＆  Ｓｉｌｖａ−  Ｒｏｓａｌｅｓ（２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８５：５５８）によって記述されたＰａｐＭＶのメキシコ分離株のコートタンパク質の配列など）は公知であり、配列番号２と８８％の同一性を有し、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。また、ＰａｐＭＶコートタンパク質のヌクレオチド配列も当該技術分野において公知である（Ｓｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，同上、及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００１７４８（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ５８８９〜６５３６を参照されたい）（図２Ｂ、配列番号３を参照されたい）。
【００３９】
上記のとおり、ＰａｐＭＶコートタンパク質のアミノ酸配列は、親（野生型）配列に正確に対応している必要はなく、すなわち「変異型配列」であってもよい。例えば、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、その部位の残基が親（標準物質）配列に対応しないように、１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失によって、突然変異で誘導されてもよい。しかし、当業者は、こうした突然変異は、広範囲にわたるものではなく、組換え型ＰａｐＭＶ  ＣＰが組織化してＶＬＰとなる能力に劇的に影響を及ぼすものではないことを理解するであろう。
【００４０】
このため、ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを調製するために、多量体化し、組織化してＶＬＰとなる能力を保持する野生型コートタンパク質の断片（すなわち、「官能性」断片）を用いて調製された組換え型ＰａｐＭＶ  ＣＰも、本発明によって企図される。例えば、断片は、Ｎ末端、Ｃ末端若しくはタンパク質内部、またはそれらの組み合わせからの１つ以上のアミノ酸の欠失を含んでもよい。一般に、感応性断片は、長さ少なくとも１００のアミノ酸、例えば、長さ少なくとも１５０のアミノ酸、少なくとも１６０のアミノ酸、少なくとも１７０のアミノ酸、少なくとも１８０のアミノ酸または少なくとも１９０のアミノ酸である。野生型タンパク質のＮ末端で生じる欠失により、タンパク質が自己組織化する能力を保持するために１３未満のアミノ酸、例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１のアミノ酸が欠失するものとする。
【００４１】
ある実施形態では、組換え型コートタンパク質が変異型配列を含む場合、標準配列と少なくとも約７０％、例えば、標準配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれらの間の任意の量が同一である。ある実施形態では、標準アミノ酸配列は配列番号２である。
【００４２】
ある実施形態では、組換え型ＰａｐＭＶ  ＶＬＰを調製するために使用されるＰａｐＭＶコートタンパク質は、ＰａｐＭＶコートタンパク質が遺伝学的に修飾されたもの（すなわち、変異型）である。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質を遺伝学的に修飾させて、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からアミノ酸を消失させる、かつ／または１つ以上のアミノ酸置換基を含む。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質を遺伝学的に修飾させて、タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１から約１０のアミノ酸（例えば、約１〜約５のアミノ酸）を消失させる。
【００４３】
ある実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は遺伝学的に修飾させて、野生型タンパク質のＮ末端近位（すなわち配列番号２の１位及び６位）に発生する２つのメチオニンコドンのうちの１つを除去して、翻訳を開始することができる。翻訳開始コドンの１つを除去することにより、タンパク質の均質集団を作製することができる。選択されたメチオニンコドンは、例えば、コドンがメチオニン以外のアミノ酸をコードするか、またはコドンがノンセンスコドンになるかのように、コドンを構成する１つ以上のヌクレオチドを置換することによって、除去することができる。あるいは、コドンのすべて若しくは一部または選択されたコドンを含むタンパク質をコードする核酸の５’領域を検出することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質を遺伝学的に修飾させて、タンパク質のＮ末端から１から５のアミノ酸を消失させる。いくつかの実施形態では、遺伝学的に修飾させたＰａｐＭＶコートタンパク質は、配列番号４（図３Ａ）と実質的に同一であるアミノ酸配列を有し、任意により、６以下のヒスチジン残基のヒスチジンタグを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質を遺伝学的に修飾させて、１つ以上の特定の制限酵素部位がコードヌクレオチド配列に含まれる結果生じるＣ末端にて追加のアミノ酸（例えば、約１〜約８のアミノ酸）を含む。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質は、ヒスチジンタグを含むか否かに関係なく、配列番号５（図３Ｂ）と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
１つ以上のアミノ酸置換基を含む変異型ＰａｐＭＶコートタンパク質配列を用いてＰａｐＭＶ  ＶＬＰを調製した場合、これらは、「同類」置換基または「非同類」置換基であってもよい。同類置換は、１つのアミノ酸残基と同様の側鎖性質を有する別の残基との置換を含む。従来技術で公知のように、２０の天然アミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的性質に従って分類することができる。好適な分類としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、トレオニン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性無電荷側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）及びリジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）が挙げられる。アミノ酸の別の基は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。同類置換は、アミノ酸の同じ基の別のアミノ酸との置換を含む。非同類置換は、例えば、酸性残基と中性または塩基性残基との置換、中性残基と酸性または塩基性残基との置換、疎水性残基と親水性残基との置換など、１つのアミノ酸残基と異なる側鎖特性を有する別の残基との置換を含む。
【００４５】
ある実施形態では、ＰａｐＭＶコートタンパク質変異型配列は、１つ以上の非同類置換を含む。１つのアミノ酸と異なる性質を有する別のアミノ酸との置換により、コートタンパク質の特性が向上し得る。例えば、前述のように、コートタンパク質の１２８の残基の突然変異型により、タンパク質のＶＬＰへの組織化が改善される（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ、２００６，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７３：１４〜２５）。このため、本発明のいくつかの実施形態では、コートタンパク質は、この位置のグルタミン酸残基が中性残基によって置換されるコートタンパク質の残基１２８での突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１２８の位置のグルタミン酸残基は、アラニン残基によって置換される。
【００４６】
組換え型タンパク質が発現するとき、野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質のＦ１３位でのフェニルアラニン残基と別の疎水性残基との置換により、形成されるＶＬＰの割合が、野生型タンパク質配列を使用する場合よりも更に高くなることがわかった（Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ−Ｇａｇｎｅ，ｅｔ  ａｌ，２００８，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７５：１４７４〜１４８４）。本発明の文脈において、次のアミノ酸残基（Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＴｙｒ）は、Ｆ１３位での置換に好適な疎水性残基であると見なされる。本発明のいくつかの実施形態では、コートタンパク質は、１３位でのＰｈｅとＩｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＴｙｒによる置換を含む。いくつかの実施形態では、コートタンパク質は、１３位でのＰｈｅとＬｅｕまたはＴｙｒによる置換を含む。
【００４７】
ある実施形態では、コートタンパク質のＦ１３位の突然変異は、Ｅ１２８位の突然変異、Ｎ末端の欠失またはそれらの組み合わせと混在してもよい。
同様に、組換え型ＰａｐＭＶコートタンパク質の調製に使用されるＰａｐＭＶコートタンパク質をコードする核酸配列は、親標準物質配列に正確に対応している必要はないが、遺伝コードの縮重によって異なってもよく、かつ／または上記のように、変異型アミノ酸配列をコードするように異なってもよい。このため、本発明のある実施形態では、変異型コートタンパク質をコードする核酸配列は、標準配列と少なくとも約７０％、例えば、標準配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％またはそれらの間の任意の量が同一である。ある実施形態では、標準核酸配列は配列番号３（図１０Ｂ）である。
【００４８】
組換え型コートタンパク質の調製
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰを調製するための組換え型ＰａｐＭＶコートタンパク質は、当業者が標準的遺伝子工学技術により容易に調製することができる。遺伝子工学によるタンパク質の方法は当該分野において既知であり（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４＆ｕｐｄａｔｅｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）かつ野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質の配列である（例えば、配列番号２及び３を参照されたい）。
【００４９】
例えば、標準技術を使用して野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニングを得ることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、同上を参照されたい）。例えば、核酸配列は、標準技術を用いて、直接ＰａｐＭＶからＲＮＡを抽出して、次にＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成すること（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって得ることができる。ＰａｐＭＶは、標準技術によりモザイク症状を示す感染した植物の葉から精製することができる。
【００５０】
次に、コートタンパク質をコードする核酸配列を直接または１つ以上のサブクローニングステップ後に好適な発現ベクターに挿入する。当業者は、本発明には使用されるベクターの詳細は重要でないことを理解するであろう。好適なベクターの例としては、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウィルス、レトロウイルスまたはＤＮＡウイルスが挙げられる。次に、コートタンパク質は、前述のとおり、発現し精製することができる（例えば、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，同上を参照されたい）。一般に、ベクター及び対応する宿主細胞は、ＶＬＰとしてではなく、低分子量種として、組換え型コートタンパク質が細胞内に発現するように選択される。この点で、ベクターと宿主細胞との適切な組み合わせの選択は、十分に当該技術分野の当業者の範囲内である。
【００５１】
あるいは、コートタンパク質をコードする核酸配列は、更に遺伝子操作を行い、当該技術分野において既知の標準インビトロ部位特異的突然変異誘導技術により上述のものなど１つ以上の突然変異を導入することができる。突然変異は、コード配列を構成する１つ以上の適切なヌクレオチドの欠失、挿入、置換、転化、またはそれらの組み合わせによって導入することができる。これは、プライマーが１つ以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入または欠失を組み込むようにデザインされる、例えば、ＰＣＲをベースとした技術によって達成することができる。突然変異の存在は、いくつかの標準技術、例えば、限定解析またはＤＮＡ塩基配列決定法によって検証することができる。
【００５２】
当業者は、コートタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の活性に影響を及ぼすことなく、さまざまな方法で変化し得ることを理解するであろう。例えば、ＤＮＡ配列の変形形態を使用して、タンパク質の発現に使用される宿主細胞においてコドン選択を最適化することができるか、または、発現を促進する他の配列変化を含むことができる。
【００５３】
当業者は、発現ベクターがコートタンパク質をコードするＤＮＡ配列を効率良く転写するために必要な転写要素などの調節要素を更に含んでもよいことを理解するであろう。ベクターに導入可能な調節要素の例としては、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。当業者は、好適な調節要素の選択は、遺伝子の組換えが行われたコートタンパク質の発現のために選択された宿主細胞に依存し、こうした調節要素は、細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝子、哺乳類遺伝子または昆虫遺伝子などのさまざまな供給源から誘導され得ることを理解するであろう。
【００５４】
ある実施形態では、発現ベクターは、発現したタンパク質の精製を促進する異種の核酸配列を更に含んでもよい。こうした異種の核酸配列の例としては、これらに限定されないが、金属親和性タグなどの親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンコード配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列及びビオチンコード配列が挙げられる。異種核酸配列によってコードされるアミノ酸は、当該技術分野において既知の方法で使用する前に、発現したコートタンパク質から除去することができる。あるいは、異種の核酸配列の発現に対応するアミノ酸は、その後のＶＬＰへの組織化に干渉しない場合、コートタンパク質上に保持することができる。
【００５５】
本発明の一実施態様では、コートタンパク質はヒスチジンタグタンパク質として発現する。ヒスチジンタグは、コートタンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端に配置してもよい。ある実施形態では、コートタンパク質は、Ｃ末端にヒスチジンタグまたは類似のタグを含む。
【００５６】
発現ベクターは、当該技術分野において公知の種々の方法のうちの１つにより、好適な宿主細胞または組織に導入することができる。このような方法は、概して、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（同上）に記載されており、例えば、安定または一過性トランストランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法及び組換え型ウイルスベクターによる感染が挙げられる。当業者は、コートタンパク質の発現に適切な宿主細胞の選択が、選択されたベクターに依存することは理解するであろう。宿主細胞内の例としては、これらに限定されないが、細菌由来細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞が挙げられる。使用した宿主細胞の詳細は、本発明にとって重要ではない。コートタンパク質は、原核宿主（例えば、大腸菌、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または真核宿主（例えば、サッカロマイセスまたはピチア）、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、若しくはＨｅＬａ細胞、昆虫細胞若しくは植物細胞）において産生され得る。ある実施形態では、コートタンパク質は大腸菌またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現する。
【００５７】
所望する場合、コートタンパク質は、当該技術分野において既知の技術により宿主細胞から精製することができ（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｅｄ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）、無傷タンパク質またはそれらのタンパク質分解断片のいずれかを用いて、標準ペプチド配列決定技術により配列を決定し、タンパク質の同一性を確認することができる。
【００５８】
ｓｓＲＮＡ鋳型
ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの調製に使用するｓｓＲＮＡ鋳型は、例えば、合成ｓｓＲＮＡ、天然ｓｓＲＮＡ、変性天然ｓｓＲＮＡ、天然または合成ｓｓＲＮＡの断片などであってもよい。
【００５９】
典型的には、インビトロ組織化用ｓｓＲＮＡは、長さ少なくとも約５０ヌクレオチド及び長さ約５０００ヌクレオチド以下、例えば、長さ少なくとも約１００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ヌクレオチド及び長さ５０００、４５００、４０００または３５００ヌクレオチド以下、またはそれらの間の任意の長さである。ある実施形態では、インビトロ組織化用のｓｓＲＮＡは、長さ約５００〜約３０００ヌクレオチド、例えば、長さ約８００〜約３０００ヌクレオチド、長さ約１０００〜約３０００ヌクレオチド、長さ約１２００〜約３０００ヌクレオチド、長さ約１２００〜約２８００ヌクレオチドである。
【００６０】
ある実施形態では、ｓｓＲＮＡ鋳型は、配列のインビボ転写の機会を最小限に抑えるためにいかなるＡＴＧ（ＡＵＧ）開始コドンも含まないようにデザインされる。しかし、ｓｓＲＮＡがキャップされていない場合、依然としてインビボ転写の可能性がないため、ＡＴＧ開始コドンを含むｓｓＲＮＡ鋳型の使用が除外されることはない。
【００６１】
ある実施形態では、インビトロ組織化用のｓｓＲＮＡとしては、天然ＰａｐＭＶ  ＲＮＡの５’末端の約３８〜約１００ヌクレオチドが挙げられ、これは推定上のパッケージングシグナルの少なくとも一部を含有する。ある実施形態において、推定上のパッケージングシグナルを含まないｓｓＲＮＡ鋳型を使用してもよい。図１にｓｓＲＮＡ鋳型の作製に使用してもよいＰａｐＭＶゲノムをベースにした配列の非限定的例を示す（配列番号１及び６）。また、本発明のある実施形態では、これらの配列の断片並びに細長い約５０００以下のヌクレオチドも、ｓｓＲＮＡ鋳型の作製への使用が企図される。ある実施形態では、インビトロ組織化用のｓｓＲＮＡは配列番号１の１７〜５４番のヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列を含む。ある実施形態では、インビトロ組織化用のｓｓＲＮＡは配列番号１の１７〜６３番のヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列を含む。ある実施形態では、インビトロ組織化用のｓｓＲＮＡは配列番号１に対応するＲＮＡ配列を含む。
【００６２】
また、ヌクレオチドＡ及びヌクレオチドＣに豊富に含まれるｓｓＲＮＡ配列は、ＰａｐＭＶコートタンパク質と組織化できることは公知である（Ｓｉｔ，  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９：２３８〜２４２）。したがって、ある実施形態では、ｓｓＲＮＡ鋳型はポリ−Ａ及びポリ−Ｃ  ｓｓＲＮＡ鋳型を含むＡ及び／またはＣ富化配列である。いくつかの実施形態では、他のポテクスウイルス（ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、クローバー黄化モザイクウイルス（ＣＹＭＶ）、ジャガイモ黄斑モザイクウイルス（ＰＡＭＶ）及びマルバモザイクウイルス（ＭａＭＶ）など）の配列のすべてまたは一部に基づくｓｓＲＮＡ鋳型が、プロセスに使用するために企図される。
【００６３】
ｓｓＲＮＡ鋳型の調製
ｓｓＲＮＡ鋳型は、当該技術分野において既知の標準的な技術によって単離及び／または調製することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４＆ｕｐｄａｔｅｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【００６４】
例えば、合成ｓｓＲＮＡについては、ｓｓＲＮＡ鋳型をコードする配列は、適切な宿主細胞に形質転換するために使用され得る好適なプラスミドに挿入することができる。適切な細胞培養条件下での形質転換した宿主細胞の培養後、プラスミドＤＮＡは標準分子生物学技術によって細胞培養物から精製することができ、かつ、制限酵素の消化によって直鎖状にすることができる。
【００６５】
その後、好適なＲＮＡポリメラーゼを用いてｓｓＲＮＡを転写し、転写生成物は、標準プロトコールによって精製する。
当業者は、所望の目的を達成できる場合に、本発明にはプラスミドの詳細は重要でないことを理解するであろう。同様に、選択されたプラスミドを伝搬することができる限り、使用される特定の宿主細胞は重要ではない。
【００６６】
標準的な技術を用いて、より短いｓｓＲＮＡ鋳型を化学合成してもよい。いくつかの市販のＲＮＡ合成サービスも利用可能である。
最終ｓｓＲＮＡ鋳型は、任意により使用前に滅菌してもよい。
【００６７】
ＶＬＰのインビトロ組織化
調製された組換え型コートタンパク質及びｓｓＲＮＡ鋳型を使用して、インビトロで組織化反応を行う。組換え型コートタンパク質及びｓｓＲＮＡ鋳型の両者を典型的には組織化する前に精製し、いくつかの実施形態では、粗調製物または部分的に精製されたコートタンパク質及び／またはｓｓＲＮＡ鋳型の使用も企図される。
【００６８】
一般に、組織化したときに、最終ＶＬＰが同一のコートタンパク質サブユニットを含むように、同一のアミノ酸配列を有する組換え型コートタンパク質の調製物を組織化反応に用いる。いくつかの実施形態では、組織化するとき最終ＶＬＰがそのコートタンパク質サブユニット内に変化形態を含むように、異なるアミノ酸配列を有する複数の組換え型コートタンパク質を含む調製物を使用することも企図される。
【００６９】
組織化反応に使用される組換え型コートタンパク質は、大部分がモノマー及び二量体から構成されるが、２０ｍｅｒ未満の他の低分子量種なども含む低分子量種の形態において優勢である。本発明の文脈において、組換え型コートタンパク質調製物は、調製物によって構成されるコートタンパク質の少なくとも約７０％が低分子量種として存在する場合、低分子量種の形態において優勢であると考えられる。ある実施形態では、組織化反応に使用される組換え型コートタンパク質調製物中に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％またはそれらの間の任意の量のコートタンパク質が低分子量種として存在する。本発明のある実施形態では、組換え型コートタンパク質調製物は、少なくとも約５０％の単量体及び二量体、例えば、６０％、７０％、７５％若しくは８０％の単量体及び二量体またはそれらの間の任意の量から構成される。
【００７０】
組織化反応は、中性水溶液中で行われ、他のいかなる特定イオンも必要としない。典型的には、緩衝液を使用する。ｐＨは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ９．０の範囲、例えば、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ９．０、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ９．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５であるものとする。本発明では、ｐＨを上述の範囲に維持することができる場合には、緩衝液の性質は重要ではない。上述のｐＨ範囲内で使用するための緩衝液の例としては、これらに限定されないが、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。
【００７１】
高濃度塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在がＰａｐＭＶコートタンパク質の組織化に影響を与え得る。このため、ある実施形態では、実質的にＮａＣｌを含まない、例えば約０．０５Ｍ未満のＮａＣｌを含有する溶液中で組織化反応が行われる。
【００７２】
組織化反応は、さまざまなタンパク質対ｓｓＲＮＡの比率を用いて、実施することができる。一般に、重量当たり約１：１〜約５０：１のタンパク質対ｓｓＲＮＡの比率、例えば、重量当たり少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１または５：１及び重量当たり約５０：１以下、４０：１または３０：１を使用してもよい。ある実施形態では、組織化反応において使用されるタンパク質対ｓｓＲＮＡの比率は、重量当たり約５：１〜約４０：１、または約１０：１〜約４０：１、またはそれらの間の任意の範囲である。
【００７３】
組織化反応は、約２℃〜約３７℃、例えば、少なくとも約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃〜約３７℃、３５℃、３０℃または２８℃で変動する温度で実施することができる。ある実施形態では、組織化反応は、約１５℃〜約３７℃、例えば、約２０℃〜約３７℃、または約２２℃〜約３７℃、またはそれらの間の任意の範囲の温度で実施される。
【００７４】
ＶＬＰが形成され得るのに十分な時間、これらの組織化反応を進行させることができる。時間は、組換え型コートタンパク質及び使用されるｓｓＲＮＡの濃度、並びに反応温度に依存して変化し、熟練の作業者によって容易に測定することができる。典型的には、少なくとも約６０分の時間が用いられる。静的光散乱法またはエレクトロン顕微鏡検査などの標準的な技術によって必要とされる場合、コートタンパク質のＶＬＰへの組織化を監視することができる。
【００７５】
適切な時間、組織化反応を進行させることができた後、ＶＬＰに対して「平滑末端化」ステップを行い、粒子から突出しているＲＮＡを除去してもよい。平滑末端化反応はＲＮＡを切断できるヌクレアーゼを使用して行う。さまざまなヌクレアーゼが市販され、これらの使用条件は当技術分野において既知である。
【００７６】
一旦組織化されたＶＬＰは、透析、膜分離精製法またはクロマトグラフィーなどの標準的な技術によって他の反応成分から精製することができる。
ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ調製物を、精製ステップ（複数可）前または精製ステップ（複数可）後のいずれかに、任意により、例えば、超遠心または膜分離精製法によって濃縮（または富化）することができ、所望する場合、標準的な技術、例えばエレクトロン顕微鏡検査によって、ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを可視化することができる。
【００７７】
医薬組成物
ある実施形態では、本発明は有効量のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。所望する場合、他の活性成分は、例えば、追加の免疫療法剤、化学療法剤、治療用癌ワクチンなどの組成物中に含まれてよい。本発明のいくつかの実施形態は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと本明細書に記載のとおり、例えば、免疫療法剤または化学療法剤などの他の癌治療剤を含む治療的併用に関し、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと他の癌治療剤を別個の組成物として配合させるが、併用して使用するためのものである。
【００７８】
医薬組成物は、種々の経路で投与するために製剤化することができる。例えば、組成物は、経口投与、局所投与、直腸投与、経鼻投与若しくは非経口的投与または吸入若しくはスプレーによる投与用に製剤化することができる。本明細書に使用される用語、非経口としては、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、胸骨内注射法または注入法が挙げられる。対象への経鼻投与としては、組成物を対象の鼻経路の粘膜または鼻腔に投与することが挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍内投与も企図される。
【００７９】
水性懸濁液として配合された組成物は、１つ以上の好適な賦形剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ハイドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカントゴム及びアラビアゴムなどの懸濁剤、例えばレシチンなどの天然リン脂質の分散剤若しくは湿潤剤、または例えば、ポリオキシエチレンステアレートなどの脂肪酸を有するアルキレンオキシドの縮合生成物、または例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの長鎖脂肪族アルコールを有するエチレンオキシドの縮合生成物、または例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルを有するエチレンオキシドの縮合生成物、または例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなど、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルを有するエチレンオキシドの縮合生成物、との混合剤中にＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを含んでもよい。また、水性懸濁液は、１種以上の防腐剤（例えば、エチル若しくはｎ−プロピル  ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエートなど）、１種以上の着色剤、１種以上の着香剤、または１種以上の甘味剤（例えばスクロースまたはサッカリン）を含有してもよい。
【００８０】
ある実施形態では、医薬組成物は、分散性粉剤または粒剤として配合してもよく、その後、水を添加することによって水性懸濁液の調製に使用され得る。このような分散性粉剤または粒剤は、１種以上の分散剤若しくは湿潤剤、沈殿防止剤及び／または防腐剤との混合剤中にＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを提供する。好適な分散剤若しくは湿潤剤及び沈殿防止剤は、上記に例示されている。これらの組成物に追加の賦形剤、例えば、着色剤を含むこともできる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は水中油型乳化剤として製剤化されてもよい。油相は、例えば、オリーブ油若しくは落花生油などの植物油、または例えば流動パラフィンなどの鉱油であってもよく、またはこれらの油の混合物であってもよい。これらの組成物に封入される好適な乳化剤としては、例えば、アラビアゴム若しくはトラガカントゴムなどの天然ゴム、例えば、ダイズ、レシチンなどの天然リン脂質、例えば、ソルビタンモノオレアートなどの脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導されたエステルまたは部分エステル、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートなどのエチレンオキシドを有する部分エステルの縮合生成物が挙げられる。
【００８２】
ある実施形態では、医薬組成物は、当該技術分野において既知の方法に従って、例えば前述のものなど好適な１種以上の分散剤若しくは湿潤剤及び／または沈殿防止剤を使用して滅菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液として配合してもよい。また、滅菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール溶液として、非毒性の非経口的（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用することができる許容可能なビヒクル及び溶媒としては、これに限定されないが、水、リンガー溶液、乳酸加リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。他の例としては、従来は溶媒または懸濁媒として使用されている滅菌凝固油及び例えば合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどのさまざまな無菌油が挙げられる。また、注射用製剤中にオレイン酸などの脂肪酸を使用してもよい。
【００８３】
任意により医薬組成物は、好適な緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝液）と共に抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどの保存剤、及び／または炭水化物（例えば、ソルビトール，マンニトール、スターチ、スクロース、グルコースまたはデキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）、またはタンパク質含有剤（例えば、ウシ血清または脱脂乳）などの安定化剤を含有してもよい。組成物のさまざまな成分のｐＨ及び正確な濃度は、既知のパラメータによって調節することができる。
【００８４】
滅菌組成物は、例えば、必要に応じて上記に列挙したさまざまな他の成分と共に必要量のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを適切な溶媒に入れ、続いて滅菌ろ過することによって調製可能である。概して、分散剤は、さまざまな滅菌活性成分を塩基性分散媒及び上に列挙した成分由来の必要な他の成分を含有する滅菌ヒビクルに入れることによって調製される。滅菌組成物を調製するための滅菌散剤では、いくつかの代表的調製方法は、粉末活性成分及びあらかじめ滅菌ろ過したそれらの溶液の任意の追加の所望の成分を作製する真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。
【００８５】
本発明のある実施形態における使用が企図されているのは、これらに限定されないが、ネブライザー、定量吸入器、粉末吸入器及び鼻内噴霧器など、当業者に周知のすべての治療用製剤の肺送達用または経鼻送達用にデザインされたさまざまな機械装置である。
【００８６】
こうした装置はいずれも、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投薬に適した製剤を使用する必要がある。典型的には、各製剤は、使用する装置の種類に特有のものであり、当業者によって理解されるように、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント及び／または担体に加えて、適切な噴射剤の使用を伴うこともある。また、ある実施形態では、リポソーム、マイクロカプセルまたは微粒子、包接錯体または他の種類の担体の使用も企図される。
【００８７】
医薬組成物を調製する他の医薬組成物及び方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（公式には「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
【００８８】
また、本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の市販の化学療法剤または免疫療法剤と併用する、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを含む医薬組成物を包含する。
【００８９】
使用
本発明は、概して、癌治療において、単独または１種以上の他の癌療法と組み合わせるＰａｐＭＶ及びＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの方法及び使用に関する。本文脈中では、癌治療により、例えば、１つ以上の腫瘍経の減少、腫瘍経の増大の緩徐または防止、腫瘍の消失または腫瘍の除去から再発までの間の無病生存期間の延長、初期発生の腫瘍または引き続き発生する癌（例えば、転移）の予防、進行までの時間の延長、腫瘍に関連した１つ以上の有害症状の低減、または癌を有する対象の全生存期間の延長を招き得る。
【００９０】
特定の理論または機能に束縛されるものではないが、癌患者へのＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与により、癌との戦いに伴う免疫細胞のプールが増大すると考えられている。癌患者は、抗癌免疫応答を備えることが知られているが、この応答は、通常、癌成長または進行への影響が不十分である。このため、既存の免疫細胞プールを増大させるかつ／または抗癌免疫応答を刺激することを目的として、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを投与することによって、癌に対するこの応答の有効性が増大するものとする。また、同様の理由のために、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、既知の抗癌療法の効果の改善に有効性を有するものとする。選択された抗癌治療（例えば、化学療法剤）に細胞障害性がある場合、または別の方法で免疫細胞の減少となる場合、この薬剤を減量させて、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと併用して使用し、化学療法剤がＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの免疫賦活効果を妨害する可能性を回避する必要があってもよい。
【００９１】
併用療法では、ほとんどの実施形態において、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰにより、他の療法または併用療法の効果を向上させると考えられる。さまざまな実施形態では、特定の組み合わせに依存して、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと他の療法（複数可）との効果は、相加効果であってもよく、相加効果または相乗効果にとどまらない。
【００９２】
本発明のある実施形態により処置または安定化され得る癌の実施例は、これらに限定されないが、血液学的新生物（白血病、骨髄腫及びリンパ腫など）、癌腫（腺癌及び扁平上皮細胞癌）、黒色腫及び肉腫が挙げられる。癌腫及び肉腫は、多くの場合「固形癌」とも称される。一般に発生する固形癌の例としては、これらに限定されないが、脳腫瘍、乳癌、頸癌、大腸癌、頭頸部癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、及び子宮癌、非小細胞肺癌及び結腸癌が挙げられる。また、リンパ腫のさまざまな形態により、固形癌の形成をもたらす可能性があり、このため、特定の文脈では、固形癌であるとも考えられる。
【００９３】
ある実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを固形癌の治療に使用してもよい。ある実施形態では、免疫療法が、例えば、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎癌、肺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫及び黒色腫で特に効果的であることが知られている癌治療において、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを使用することができる。ある実施形態では、本発明は、肺癌以外の癌治療におけるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用に関する。
【００９４】
処置対象の癌は、無痛性または侵襲性であってもよい。さまざまな実施形態では、本発明は、難治性癌、進行癌、再発癌、転移癌の治療におけるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用が企図される。当業者は、この分類の多くは重複する場合もあり、例えば、侵襲性癌は典型的に転移性であることを理解するであろう。
【００９５】
ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰのさまざまな投与様式は、全身投与及び局所投与など、処置対象の癌に依存すると考えられる。適切な投与経路は、処置対象となる癌に関して、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態は、癌処置において、例えば、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、または鼻孔内投与などのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの全身投与を含む。ある実施形態では、本発明は、例えば、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与などの癌治療におけるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの局所投与に関する。ある実施形態では、本発明は、肺経路以外の経路によるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの局所投与に関する。
【００９６】
ある実施形態では、本発明は、癌を処置するために、単回剤としてのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。いくつかの実施形態は、腫瘍の成長を阻害するためのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ単独の使用に関する。いくつかの実施形態は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腫瘍内投与を含む腫瘍の成長を阻害する方法に関する。
【００９７】
ある実施形態では、本発明は、癌を処置するために、１つ以上の他の癌療法と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。いくつかの実施形態は、腫瘍の成長及び／または転移を阻害するための１つ以上の他の癌治療と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰＶＬＰの使用に関する。他の癌治療剤としては、例えば、免疫療法剤、化学療法剤、放射線療法及びウイルス療法を挙げることもできる。
【００９８】
併用療法の一部として使用する場合、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと他の癌治療（複数可）とのさまざまな投与順序が考えられる。本発明のある種の実施形態は、他の治療的投与（複数可）前または他の治療（複数可）に付随するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与に関する。この文脈における付随投与としては、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び他の治療との同時投与並びに他の治療的投与（複数可）の短い時間（前または後）、例えば、他の治療（複数可）の投与の２時間以内、９０分以内、６０分以内または３０分以内でのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与が挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態は、他の治療的投与（複数可）前または他の治療（複数可）後のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与に関する。
また、いくつかの実施形態では、投与順序に関係なく、他の治療的投与（複数可）後の１つ以上のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの「ブースター」の投与が企図される。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上の他の抗癌治療的投与前のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与に関する。別の治療前のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ投与は、その後に投与された治療剤の効果を向上させるように、例えば、免疫系を「活性化」させる。本文脈中では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び治療剤（複数可）の投与は、短くてもよい（例えば、分または秒にて）または長くてもよい（例えば、時間、日、週にて）規定された期間によって分けられる。
【０１０１】
典型的には、別の治療前または別の治療後にＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰが投与されるとき、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与から他の治療までの時間は、少なくとも３０分、例えば、少なくとも６０分、少なくとも９０分または１２０分となる。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与から他の治療までの時間は、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間または少なくとも６時間であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与から他の治療までの時間は、約２時間〜約４８時間、例えば、約２時間〜約３６時間、約２時間〜約２４時間、または約２時間〜約１８時間であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与から他の治療までの時間は、約３時間〜約２４時間、例えば、約４時間〜約２４時間、または約５時間〜約２４時間であってもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態は、補助療法として、例えば、放射線療法または手術の補助療法として、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用に関する。本文脈では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる自然免疫系の刺激により、放射線療法または手術後に残存している任意の腫瘍細胞の消失を補助し得るか、または放射線療法前の腫瘍細胞を弱体化し得ることが考えられる。このような補助療法により、放射線療法及び外科的介入の奏功率の上昇を補助し得る。
【０１０３】
ある実施形態では、本発明は、癌の成長を阻害するために、１つ以上の癌免疫療法剤と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。本発明のいくつかの実施形態は、癌の成長を阻害するために、１つ以上の癌免疫療法剤と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。さまざまな癌免疫療法剤は、当技術分野において既知であり、例えば、モノクローナル抗体（アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、リツキシマブ（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））及びイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））など）、癌ワクチン（シプリューセル−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））及び他の樹状細胞ワクチン、腫瘍細胞ワクチン、ＰＢＭＣワクチン及びウイルスベクター系ワクチンなど）及び非特異的免疫療法剤（インターロイキン−２など（例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、インターフェロン（ＩＦＮ）−α及び他のサイトカイン；サリドマイド、イミキモド及びレナリドミド）が挙げられる。また、いくつかの実施形態では、養子細胞療法（ＡＣＴ）などの他の免疫療法と組み合わせたＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用も企図される。ある実施形態では、本発明は、樹状細胞、ＰＢＭＣ、腫瘍細胞などの１つ以上の細胞系癌免疫療法剤と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。ある実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、樹状細胞系癌治療と併用して投与され得る。
【０１０４】
従来技術で公知なように、樹状細胞系癌療法は、典型的に、患者から得て、その後に、１つ以上の腫瘍関連抗原含有単核細胞誘導前駆体のインビトロ拡張から誘導される樹状細胞に基づく。抗原は、例えば、ペプチド、組換え型タンパク質類、プラスミドＤＮＡ、配合ＲＮＡまたは組換え型ウイルスなどさまざまな形態の樹状細胞と共にインキュベートし得る。未処置樹状細胞を利用した癌ワクチンも、腫瘍内投与するため及び放射線療法など他の治療法と組み合わせて使用するために開発されている。
【０１０５】
本発明のある実施形態は、対象において癌免疫療法を改善するために、癌免疫療法前、癌免疫療法に付随して、または癌免疫療法後に有効量のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを対象に投与することによるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用に関する。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、癌特異抗原を含有する樹状細胞を含む癌免疫療法を改善するために使用される。いくつかの実施形態では、抗原含有樹状細胞の投与前に、患者の先天性免疫の刺激を介して樹状細胞療法の有効性を向上させるために、前処理としてＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰが患者に投与される。代替実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの併用投与及びその後のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与も企図される。
【０１０６】
ある実施形態は、本発明は、癌の成長及び／または転移を阻害するために、１つ以上の癌化学療法剤と併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用方法に関する。さまざまな化学療法剤は、当技術分野において既知であり、特定の型の癌の治療に特異的である並びに癌の範囲に適用可能である広域化学療法剤のようなものが挙げられる。化学療法剤の例としては、これ限定されないが、アミホスチン（例えば、Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ、カペシタビン（例えば、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル（例えば、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、ドキサゾシン（例えば、Ｃａｒｄｕｒａ（登録商標）、ドキソルビシン（例えば、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、エダトレキセート（１０−エチル−１０−デアザ−アミノプテリン）、エピ−ドキソルビシン（エピルビシン）、エストラムスチン、エトポシド、フィナステリド（例えば、Ｐｒｏｓｃａｒ（登録商標）、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ（登録商標）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド（例えば、Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン（例えば、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）、ゴセレリンアセテート（例えば、Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標）、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン（ＣＰＴ−１１，（例えば、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）、レバミゾール、ロイコボリン、リアロゾール、ロペラミド（例えば、Ｉｍｏｄｉｕｍ（登録商標）、メルファラン、メトトレキサート、メチルークロロエチルーシクロヘキシル−ニトロソウレア、ミトキサントロン（例えば、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）、ニルタミド（例えば、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（登録商標）、ニトロソウレア、オキサリプラチン、パクリタキセル（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ペグアスパルガーゼ（例えば、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）、白金類縁体、プレドニゾン（例えば、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標））、プロカルバジン（例えば、Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標）、ポルフィマーナトリウム（例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）、タモキシフェン、テモゾロマイド、テラゾシン（例えば、Ｈｙｔｒｉｎ（登録商標）、トポテカン（例えば、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標）、トレチノイン（例えば、Ｖｅｓａｎｏｉｄ（登録商標）、ビンクリスチン及びビノレルビンタータラート（例えば、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
【０１０７】
ある実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、免疫賦活効果も有する化学療法剤と併用投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、免疫賦活効果も有する化学療法剤と併用投与されてもよく、化学療法剤の投与量は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの非存在下での通常の投与量と比較して減少する。例えば、シクロホスファミドは、投与量に依存して免疫賦活効果を示すことが既知である（Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１６：１４１〜１４６）。このため、ある実施形態では、癌の治療に低用量シクロホスファミドと併用してＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを使用することが企図される。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを他の低用量の化学療法剤と併用して使用することも企図される。
【０１０８】
本発明のある実施形態は、癌治療のために、放射線療法と組み合わせるＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの方法及び使用に関する。本文脈では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる自然免疫系の刺激により、放射線療法の効果が向上され、かつ／または治療後に残存している任意の腫瘍細胞の消失を補助し得ると考えられる。
【０１０９】
本発明のある実施形態では、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの使用を意図し、例えば、化学療法剤との併用、化学療法剤（複数可）と免疫療法剤（複数可）との併用、放射線療法と化学療法剤（複数可）との併用、放射線療法と免疫療法剤（複数可）との併用など、公知の併用療法を改良する。さまざまなステージで特異的癌の治療でのこうした併用は当業者に周知である。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態は、放射線療法と別の癌治療剤（化学療法剤または免疫療法剤など）とを併用するＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの方法及び使用に関する。例えば、リンパ腫などの特定の癌の治療において、放射線療法と低用量シクロホスファミドとを組み合わせることが有用であることがわかっており、更にＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと組み合わせることで、この併用療法の効果を向上させ得る。
【０１１１】
ある実施形態では、ウイルス療法と組み合わせてＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを使用することが企図される。現在、癌治療のための標的アプローチとして、腫瘍崩壊性ウイルス療法が開発されている。いくつかの腫瘍崩壊性ウイルスをベースとした治療では、臨床試験が行われ、この治療としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス，ワクシニアウイルス（ＶＶ）、アデノウイルス、麻疹ウイルス及び水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ）をベースにした治療が挙げられる。腫瘍成長及び／または転移を減少させるにあたって、ウイルス療法の有効性を向上させる手段として、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰとウイルス療法アプローチとを組み合わせることが企図される。
【０１１２】
ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与量は、例えば、動物モデル（通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類など）において最初に推定することができる。また、動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用される。次いで、このような情報は、処置対象の患者に投与するための有用な用量及び経路を決定するために使用することもできる。ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの例示的用量としては、約１０μｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、例えば、約１０μｇ〜約５ｍｇのタンパク質、約４０μｇ〜約５ｍｇのタンパク質、約８０μｇ〜約５ｍｇのタンパク質、約４０μｇ〜約２ｍｇのタンパク質または約８０μｇ〜約２ｍｇのタンパク質の用量が挙げられる。
【０１１３】
薬剤パック＆キット
本発明のある実施形態は、癌治療に使用するためのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを含む薬剤パックまたはキットを提供する。ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰが別の癌治療剤、例えば、化学療法剤または免疫療法剤と併用して使用するためのものであるとき、薬剤パックまたはキットには、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び癌療法を含む癌治療に使用するために治療法を組み合わせたものを含んでもよい。
【０１１４】
パックまたはキットの個々の構成要素は、別個の容器にパッケージ化されるか、こうした容器に関連付けられ、薬剤類または生物学的製剤の製造、使用または販売を規定する行政機関によって規定された形態であり、製造、使用または販売代理店による承認を示す点に留意のこと。本キットには、任意により、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ及び存在する場合には他の癌療法の使用方法または投与レジメンを示す説明書または指示書を備える場合もある。
【０１１５】
パックまたはキットの１つ以上の構成要素は、任意により、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供されてもよく、キットは、凍結乾燥成分（複数可）の再形成のために、更に好適な溶媒を含んでもよい。
【０１１６】
１つ以上の成分が溶液（例えば、水溶液または滅菌水溶液など）として提供されるこれらの実施形態では、容器手段は、それ自体が吸入器、注射器、ピペット、点眼瓶または他のこうした器具であってもよく、そこから溶液が対象に投与されるか、または本キットの他の構成要素に備わるか、または混在してもよい。
【０１１７】
容器の数または型に関係なく、本発明のキットは、患者へのＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与を補助する器具を含んでもよい。このような器具は、吸入器、鼻内噴霧器、ネブライザー、注射器、ピペット、点眼器または類似の医学的に承認されている送達ヒビクルであってもよい。
【０１１８】
本明細書に記載の本発明を更に理解するために、以下の実施例を記述する。これらの実施例は、本発明の例示的実施形態を示すことを目的とし、いかなる場合も本発明の範囲を限定することを意図するものではないことは理解されるであろう。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：インビボにおけるＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる腫瘍成長の阻害及び樹状細胞の抗癌効果の増大
本実施例に使用されるｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ）は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１５５２６２号に記載されているように（実施例２も参照されたい）調製した。ＶＬＰのコートタンパク質は、変性ＰａｐＭＶコート−タンパク質ＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍ（配列番号５、図３を参照されたい）であった。
【０１２０】
概要
ワクチン接種は、特に、リンパ球に対して抗原を提示する役割を担う樹状細胞に関連する場合の有望な癌療法である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｐａｌｕｃｋａ  ２００５，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ５（４）：２９６〜３０６）。しかし、本方法では、腫瘍の処置の効果は十分ではない。ＩＦＮ−αの産生を導くＴＬＲ７リガンドを付加することにより、この種類のワクチンによって発生する抗腫瘍応答の改善が補助され得る。ＴＬＲ７リガンドであり、ＩＦＮ−αの産生を誘導するＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、免疫賦活剤として機能することができる。ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、樹状細胞によって取り込まれ、細胞傷害性細胞免疫応答が誘導されることが周知である。本研究の目的は、皮下モデル並びに肺転移モデルにおいてマウス黒色腫Ｂ１６  ＯＶＡに対する抗癌応答に及ぼすＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの影響の特性を決定することであった。この研究の結果として、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる腫瘍内免疫付与により、樹状細胞での免疫付与による腫瘍成長の遅延が増大し、さらに、ＯＶＡ含有樹状細胞の前に注入すると、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰにより、肺転移が減少したと判断した。したがって、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、抗腫瘍応答において免疫賦活剤として作用する有望な能力を有する。
【０１２１】
序論
現在、癌治療として開発されているワクチンは、抗原提示細胞の活性化、炎症環境の発生並びに腫瘍細胞の免疫原性の増大に基づく。樹状細胞を用いる免疫付与は、完全に効果的であるとは言えないが、若干の腫瘍の退縮が認められる。ＩＦＮ−αの産生を誘導するＴＬＲ７リガンドは、樹状細胞の影響の増大に役立ち得る。ＩＦＮ−αは樹状細胞の成熟並びに細胞障害性抗腫瘍応答の活性化に関与している（Ｄｉａｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０８（１０）：１９８９〜２００３）。
【０１２２】
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、食作用により樹状細胞に取り込まれ、ＴＬＲ７によってｓｓＲＮＡが認識され、ＩＦＮ−αの産生をもたらす。その後、防御細胞障害性媒介免疫が誘導される。
【０１２３】
材料と方法
実験には、Ｂ１６マウス黒色腫細胞株発現ＯＶＡ（Ｂ１６−ＯＶＡ）及びこの細胞株発現ルシフェラーゼの別の変異型（Ｂ１６−ＯＶＡ−ｏｆｌ）を用いた。
【０１２４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で６日間インキュベートした後、雄マウス骨髄から骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を作製した。次に、ＢＭＤＣをＬＰＳで刺激し、ＯＶＡペプチドを添加した。
【０１２５】
ｏＦＬ遺伝子を含有するプラスミドＳＲαをリン酸カルシウム法によりＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞に形質移入させた。Ｂ１６−ＯＶＡ−ｏｆＬ腫瘍は、肉眼で検出され得る前に発光によって検出することができ、続いて腫瘍が皮下成長し得る。
【０１２６】
インビボの腫瘍成長の反応速度は、キャリパーによって測定し、２０μルシフェリンを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、その後、  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて分析した。
【０１２７】
ＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡを輸注して、肺の免疫反応分析を行い、ＦＡＣＳによって分析を行った。マウスにおいて２０μｇ  コブラ毒因子の腹腔内投与によって、補体の枯渇が達成された。
【０１２８】
ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーを実施し、Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてデータを解析した。
【０１２９】
皮下腫瘍モデル
局所腫瘍成長モデルについては、１ｘ１０５または５ｘ１０５Ｂ１６−ＯＶＡ細胞をマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。注射後７日目あたりに、腫瘍は肉眼で確認できるようになった。腫瘍細胞播種の７日及び／または１２日後に処置を行った。播種１６日後にフローサイトメトリーで免疫応答を分析した。
【０１３０】
試験対象の処置としては：
−１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ静脈内（ｉ．ｖ．）投与、
−１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ腫瘍内（ｉ．ｔ）投与、
−６時間後、反対側の隣接部において、１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを腫瘍内投与し、１．２５ｘ１０６のＯＶＡ含有骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ−ＯＶＡ）を皮下投与した。
【０１３１】
これらの処置群を対照群と比較した。
−１００μｌ  ＰＢＳ静脈内投与、
−１００μｌ  ＰＢＳ腫瘍内投与
−６時間後、１００μｌ  ＰＢＳ＋１．２５ｘ１０６ＢＭＤＣ−ＯＶＡ。
【０１３２】
転移モデル
肺において転移を誘導するために、５ｘ１０５Ｂ１６−ＯＶＡまたはＢ１６−ＯＶＡ−ｏｆｌを静注した。腫瘍細胞播種の７日後に処置を行った。播種１４日後にフローサイトメトリーで免疫応答を分析した。
【０１３３】
試験対象の処置としては：
１００  μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ静脈内投与、
６時間後、１００  μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを静脈内投与し、１．２５ｘ１０６  ＢＭＤＣ−ＯＶＡを静脈内投与した。
【０１３４】
これらの処置群を対照群と比較した。
−１００μｌ  ＰＢＳ静脈内投与、
−６時間後、１００μｌ  ＰＢＳ静脈内投与＋１．２５ｘ１０６ＢＭＤＣ−ＯＶＡ静脈内投与。
【０１３５】
結果及び考察
皮下黒色腫に対する抗腫瘍応答でのＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの効果
その結果は、図４〜８に示す。
【０１３６】
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫付与により、免疫付与６時間後（ｐ．ｉ．）にＩＦＮ−αの産生が誘導された（図４Ａ及び図４Ｂ）。Ｌｕｍｉｎｅｘにより、更なるサイトカインの産生を確認した。
【０１３７】
腫瘍細胞播種の１２日後に、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを腫瘍内注射したとき、２４時間後に腫瘍内への免疫細胞（ＣＤ４５＋）の浸潤の増大が観察された（図４Ｃ、図４Ｄ）。また、異なる型の免疫細胞の割合は、処置により変化し得ると考えられていた。
【０１３８】
第７日目及び第１２日目のＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの静脈内注射では、腫瘍成長反応速度へ有意な影響は認められなかった。しかし、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腫瘍内注射により、Ｂ１６−ＯＶＡの増殖速度が低下し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は上昇した（図８）。
【０１３９】
ＯＶＡを含む樹状細胞による皮下（ｓ．ｃ．）免疫付与により、ＣＤ８＋ＯＶＡ特異的Ｔリンパ球が産生され、腫瘍成長の阻害がもたらされた（図５）。また、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰより、ＢＭＤＣ−ＯＶＡ処置の治療的効果が増大した（成長速度の低下及びＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の上昇）（図６Ａ〜Ｃ）。最終的に、これらの状況での補体が枯渇することにより、ＰａｐＭＶ処置の有益な効果が増大することはなかった（図６Ｄ）。
【０１４０】
肺転移に対する抗癌応答でのＰａｐＭＶの効果
この結果を図７及び図８に示す。
第７日目のＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの静脈内注射により、肺、リンパ節または脾臓において、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生が誘導されることはなかった（図７）。補体の枯渇により、この結果が変わることはなかった。しかし、ＢＭＤＣ−ＯＶＡ免疫付与６時間前にＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ静注を行ったところ、肺及び脾臓においてＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が上昇し、ルシフェリン添加後、肺ホモジネートによって発光生成物が減少し、このことから、生腫瘍細胞数の低減が示唆される（図８）。
【０１４１】
結論
この研究により、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ単独では、皮膚黒色腫腫瘍の成長に影響を有することがわかる。ＯＶＡを含む樹状細胞での免疫付与と組み合わせる場合、樹状細胞単独の場合よりも、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰにより抗腫瘍応答が向上する。肺転移モデルでは、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ単独では効果が認められなかったが、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの投与により、ＯＶＡを含む樹状細胞での免疫付与の抗腫瘍効果は実質的に向上した。ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの鼻孔内免疫付与では、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの肺への分布を促進することにより、これらの結果の更なる向上を補助する場合がある。
【０１４２】
実施例２：例示的ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ調製プロセス
組換え型コートタンパク質（ｒＣＰ）の産生
簡潔に述べると、６ｘＨｉｓ−タグを含むＰａｐＭＶ  ＣＰ（配列番号５、図３（Ｂ）を参照されたい）を、Ｔ５プロモーターの制御下で、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩに隣接するｐＱＥ８０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングした。大腸菌ＢＤ−７９２をプラスミドで形質転換し、標準培養培地で成長させた。ＩＰＴＧ（０．７〜１ｍＭ  ＩＰＴＧ、６〜９時間、２２〜２５℃）を培養培地に添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。誘導期間の最後に、細胞を採取して、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、フレンチプレス、ホモジナイザーまたはソニケーターを使用して機械的に破壊した。細胞溶解産物は、標準ＤＮａｓｅ処置によるゲノムＤＮＡの除去及び遠心分離またはクロスフローろ過（３００  ｋＤａ〜０．４５μｍ  ＭＷＣＯメンブレン）による大型細胞断片及びメンブレンの除去により清澄化した。ｒＣＰをイオン−マトリックス親和性樹脂上で捕捉し、イミダゾールを使用して標準的な手順により溶出した。ＰａｐＭＶコートタンパク質は、２５０ｍＭ〜１Ｍイミダゾールにより溶出することができる。溶出も、ｐＨ勾配を用いて得ることができた。その後陰イオン交換クロマトグラフィー／ろ過を用いてエンドトキシンにより及びクロスフローろ過（０〜３０ｋＤａ  ＭＷＣＯメンブレン）を用いて低ＭＷ分子によりｒＣＰを精製した。ｒＣＰ溶液中に存在する夾雑イミダゾールはいずれも透析またはクロスフローろ過（５〜３０ｋＤａＭＷＣＯメンブレン）により除去した。最終ｒＣＰタンパク質溶液はろ過により滅菌した。
【０１４３】
ｓｓＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）の作製
ＳＲＴをコードするＤＮＡ配列は図１に示す［配列番号１］。ＳＲＴは、ＰａｐＭＶのゲノムを基準にして、５’末端部にＰａｐＭＶコートタンパク質核生成シグナルを含む（図１の四角で囲んだ部分）。残りのヌクレオチド配列は、ＴＡＡ停止コドンのためにすべてのＡＴＧコドンが変異している多変異である。配列の最初の１６ヌクレオチド（図１の下線部分）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの発現ベクター内に位置するＴ７の転写開始部位を含み、ＲＮＡ転写物中に存在する。五量体繰り返し部分は、図１に下線で示す。全転写物は長さ１５２２のヌクレオチドである。
【０１４４】
ＳＲＴに対応するＤＮＡは、標準的な手順により原核ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどのＤＮＡプラスミドに挿入した。組換え型プラスミドを使用して大腸菌細胞を形質転換させ、その後、形質転換させた細菌を標準培養培地で成長させた。標準技術によりプラスミドＤＮＡを回収し、細胞培養物から精製し、その後、ＳＲＴ配列の最後のヌクレオチド直後のＤＮＡ配列内の点で制限酵素ＭｌｕＩにより切断して直鎖状にした。
【０１４５】
製造業者推奨プロトコールに従って、ＲｉｂｏＭＡＸキット（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳＡ）を用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりＳＲＴの転写を行った。発現ベクターは、ＤＮＡ切断点でＲＮＡポリメラーゼプロモーター由来の転写物がＤＮＡ鋳型から放出されるようにデザインした。ＳＲＴを精製して、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯメンブレンを用いて、ＤＮＡ、タンパク質及び遊離ヌクレオチドをクロスフローろ過により除去した。最終ＲＮＡ溶液はろ過により滅菌した。
【０１４６】
ｒＶＬＰの作製
ｒＣＰとＳＲＴとを組み合わせてｒＶＬＰをインビトロで組織化した。中性緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８）で、タンパク質対ＲＮＡの比率をＲＮＡ１ｍｇ当たりタンパク質１５〜３０ｍｇとして、組織化反応を行った。新規組織化ｒＶＬＰｓを低用量ＲＮａｓｅ（ＲＮＡ１μｇ当たりＲＮＡ０．０００１μｇ）でインキュベートし、ｒＶＬＰから突出したＲＮＡをいずれも除去した。次いで、１０から１００ｋＤａ  ＭＷＣＯメンブレンを用いて膜分離精製法により平滑末端化ｒＶＬＰを夾雑及び遊離ｒＣＰ（非組織化モノマーｒＣＰ）から精製した。最終ｒＶＬＰ液体懸濁液はろ過により滅菌した。
【０１４７】
実施例３：さまざまな経路を介するＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ投与による自然免疫系の刺激
鼻孔内投与
マウス（５匹／群）に１回または２回（７日毎）６０μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰまたは対照緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８）を鼻孔内投与した。処置６時間後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ３２−ｐｌｅｘ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、サイトカインの存在をスクリーニングした。
【０１４８】
その結果は、図１０（Ａ）〜（Ｒ）に示す。いずれの治療レジメンもサイトカイン及びケモカインの産生を誘導し、２つの処置群が１つの処置群よりも効果的であった。
静脈内投与
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２つの群並びにＴＬＲ−７ノックアウト（ＫＯ）マウス群及びＭＹＤ８８Ｋマウス群（４匹／群）を１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰまたは１００μｌ  ＰＢＳの静注により免疫付与を行った。ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ  ＶＬＰ免疫付与の４８時間前及び２４時間前に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの１つの群を対象に、５００μｇ  抗ＢＳＴ２抗体（ｍＡｂ  ９２７）を腹腔内投与することによって処置した。免疫付与与６時間後、１２時間後、２４時間後及び４８時間後（図１１Ａ）または免疫付与与６時間後（図１１Ｂ）に、血清及び脾臓中でのＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡ（ＶｅｒｉＫｉｎｅＴＭ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ；  ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）によって監視した。
【０１４９】
これらの結果は図１１に示し、ＩＦＮ−α生成物は、静脈内投与した場合、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰにより効率良く刺激させ得ること及びこの刺激は、ＭＹＤ８８、ＴＬＲ７及びＢＳＴ２＋細胞に依存していることがわかる。
【０１５０】
腹腔内投与
実施例１：Ｂａｌｂ／ＣマウスにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１０  ｍＭ（ｐＨ８．０）、１５μｇイミキモドまたは１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰのいずれかを含む容積２００μＬを腹腔内投与した。注射６時間後、手術により動物の脾臓を採取し、溶解させた。溶解産物をろ過し、遠心分離にかけた。（ｉ）サイトカイン、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−（ｇ）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−α）、（ｉｉ）ケラチノサイト化学誘引物質（ＫＣ）、及び（ｉｉｉ）ケモカインＭＩＰ−１アルファ（ＭＩＰ−１α）の存在に関して、ＬＵＭＩＮＥＸにより上清を分析した。その結果は、図１２に示す。
【０１５１】
手術中、脾臓を各動物から抽出するとき、血液も採取し、サイトカイン及びケモカインの存在に関して、ＬＵＭＩＮＥＸにより血清も分析した。その結果は、図１３に示す。
実施例２：Ｂａｌｂ／Ｃマウス（２匹／群）にＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ８．０）、１５μｇイミキモドまたは１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰのいずれかを含む容積２００μＬを腹腔内投与した。注射４時間、５時間または６時間後、手術により動物の脾臓を採取し、溶解させた。溶解産物をろ過し、遠心分離にかけた。インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）の存在に関して、ＬＵＭＩＮＥＸにて上清を分析した。その結果は、図１４（Ａ）に示す。
【０１５２】
実施例１に記載されたものと類似のプロトコールを使用して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８  １０ｍＭ、１５μｇイミキモドまたは１００μｇ  ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰのいずれかを腹腔内投与６時間後血清を採取し、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）の存在を分析した。その結果は、図１４（Ｂ）に示す。
【０１５３】
実施例３：上記実施例１及び実施例２の結果を検証するために、「エンジニアリングラン」（「ＥＮＧ」と称する）において作製したＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ、ｓｓＲＮＡとではなく、ポリＲＮＡ  Ｃにより自己組織化させたＰａｐＭＶ  ＶＬＰ「ロット５７１５ＰａｐＭＶＶＬＰ」ＣｐＧ（５０μｇ）及び６０℃にて３０分間加熱して変性させたＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ（「Ｄｅｎａｔ」）を用いて、第３の実験を行った。陰性対照として、ポリＲＮＡ−ＶＬＰ「ロット５７１５ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ」及び変性ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを含めた。ポリＣ  ＲＮＡ−ＶＬＰがわずかに弱いアジュバント特性を有することは公知である。「ロット５７１５ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ」は、産生中に酸化されたＶＬＰであり、極端に短く、かつ、非常に不十分な免疫原性及びアジュバント活性を示すＶＬＰにより異常な自己組織化をもたらす。ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの熱処理により、粒子の構造が破壊されることは公知であり、これらは免疫賦活効果にとって重要である。その結果は、図１４（Ｃ）＆（Ｄ）に示す。
【０１５４】
要するに、本実施例の実験から、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの鼻腔内注射、静脈注射及び腹腔内注射を介して、先天性免疫が効率良く引き起こされることがわかる。図１０から、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの鼻孔内投与を介して早ければ注射後６時間に肺において先天性免疫が引き起こされる可能性があり、いくつかのサイトカイン及びケモカイン（ＭＩＰ−ｌα、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＫＣ）が誘導されたことがわかる。図１１は、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰにより、静注により先天性免疫が引き起こされ得ることを示す。この免疫付与経路を使用し、注射６時間後に免疫付与動物において脾臓及び血清中でＩＦＮ−αの分泌を検出することができた。図１２〜１４から、腹腔内投与のＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰにより、早ければ注射５時間後に効率良く自然免疫応答が引き起こされることがわかる。
【０１５５】
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの抗癌活性は、先天性免疫を引き起こすその能力に基づくと予測される。上記の結果に基づき、癌患者では鼻腔内注射、腹腔内注射、静脈注射免疫付与経路を用いて、先天性免疫を誘導できることが予測され得る。これにより、癌細胞に対する免疫応答が改善され、患者の病態の改善となる。
【０１５６】
実施例４：インビボにおけるＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによる腫瘍成長の阻害及び樹状細胞の抗癌効果の増大＃２
次の修飾により、実施例１に記述の皮下黒色腫に対する抗腫瘍応答でのＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの効果を示す実験を繰り返し行った。５ｘ１０５Ｂ１６−ＯＶＡ細胞をマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍細胞接種の７日、１２日及び１７日後に処置を行った。一部のマウスは、サイトカイン及びケモカイン分析のために、２回目のＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ注射の６時間後に安楽死させた。その他のマウスは、フローサイトメトリーにより免疫応答を分析するために、腫瘍接種の１５日後または１６日後に安楽死させた。最終的に、腫瘍が直径１７ｍｍに到達したとき、腫瘍の成長及び生存を監視するために、マウスを安楽死させた。
【０１５７】
それらの結果を図１５及び図１６に示し、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの腫瘍内単独投与により、Ｂ１６−ＯＶＡの成長速度が低下したことが確認される（図１５Ａ）。加えて、この処置によりマウスの生存が延長されることが観察された（図１５Ｂ）。腫瘍細胞接種の７日及び１２日後に、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを腫瘍内注射したとき、１５日目に腫瘍内への免疫細胞（ＣＤ４５＋）の浸潤の増大が観察された（図１５Ｆ）。また、異なる型の免疫細胞の割合は、処置により変化し得ると考えられる。特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の上昇及び骨髄誘導抑制剤細胞（ＭＤＳＣ）の減少が観察された（図１５Ｇ、Ｈ）。腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合がより高いことも観察された（図１５Ｉ〜Ｋ）。
【０１５８】
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰによっても、ＢＭＤＣ−ＯＶＡ処置の治療的効果が増大し、マウスの生存が延長された（図１６）。これらの状況下で補体が枯渇（（２０μｇ  コブラ毒因子、腹腔内投与）することにより、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ処置の有益な効果が増大することはなかった。
【０１５９】
実施例５：ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと高用量シクロホスファミドとの併用が腫瘍成長に及ぼす影響
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ（静注投与）を２５０ｍｇ／ｍＬシクロホスファミド（ＣＴＸ）と併用した最初の実験から、併用療法とＣＴＸ単独療法との間において、効果の差が認められなかった。その後、低用量のＣＴＸ（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いて２つの実験を実施した。この用量は、一般に、高用量ＣＴＸであると考えられている（例えば、Ｖｅｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ７９８４６７を参照されたい）。
【０１６０】
実験１
デザイン：４つの群の雌Ｃ５７ＢＬ６マウス（６〜８週齢）（１０匹）を対象に、第０日目に６ｘ１０５  Ｂ１６黒色腫細胞含有ＰＢＳを注射した。第９日目に半数のマウスに（１００μｇＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを静注し、他の半数に対して２００μＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  １０ｍＭを注射した。第１１日目に、腫瘍を測定し、半数のマウスに２ｍｇ（１００ｍｇ／ｋｇ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）を腹腔内投与し、他の半数に２００μＬリン酸緩衝生理食塩水を投与した。その後、２日に１回腫瘍を測定した。腫瘍注射後第１４日目及び第１８日目に、１つのＣＴＸ投与群及び１つのＰＢＳ投与群には、１００μｇＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを静脈内投与した。他のマウスには、対照としてＴｒｉｓ−ＨＣＬ  １０ｍＭを投与した。第２５日目にプロトコールを完了した。
【０１６１】
結果：結果は、表１７Ａに示す。予想通り、緩衝液対照と比較して、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの単独静脈内投与により、腫瘍成長が緩徐になるか、または加速することはない。ＣＴＸと併用して、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを静注した場合は、ＣＴＸの単独投与よりも効果は低かった。
【０１６２】
実験２
デザイン：４つの群の雌Ｃ５７ＢＬ６マウス（６〜８週齢）（１０匹）を対象に、第９日目に６ｘ１０５  Ｂ１６黒色腫細胞含有ＰＢＳを注射した。第０日目に、腫瘍を測定し、半数のマウスに２ｍｇ（１００ｍｇ／ｋｇ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）を腹腔内投与し、他の半数に２００μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。その後、２日に１回腫瘍を測定した。ＣＴＸ注射後第２日目、第７日目及び第１２日目に、１つのＣＴＸ投与群及び１つのＰＢＳ投与群には、１００μｇＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰを腫瘍内投与（ＩＴ）した。他のマウスには、対照としてＴｒｉｓ−ＨＣＬ１０ｍＭを投与した。
【０１６３】
結果：結果は、表１７Ｂに示す。腫瘍内投与ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは、緩衝対照と比較して、腫瘍成長が緩徐になる傾向を示した。高用量ＣＴＸとＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰとの併用により、これらの効果が更に改善された。他方では、ＣＴＸ単独投与群は、腫瘍成長がかなり緩徐になった。これは、一部、治療の開始時にＣＴＸ群の腫瘍は、ＣＴＸ＋ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰ群の腫瘍と比較して、より小さいためでもある。実験により、腫瘍内に送達されたＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰは若干の効果を有し、この効果が化学療法と併用することによって向上され得ることが確認された。
【０１６４】
上記の実験はいずれも、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと高用量ＣＴＸとの併用により、ＣＴＸ単独投与による抗腫瘍効果を超える改善は得られないことがわかった。この結果は、処置動物におけるＴ細胞サブセットに対する高用量ＣＴＸの周知の効果（例えば、Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６，同上を参照されたい）により、概して、免疫系の効力が損なわれ、結果的に、抗腫瘍応答の増大にあたって、ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰの効力に影響を与えるため、予想外のものではなかった。
【０１６５】
ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと低用量ＣＴＸ（すなわち、１００ｍｇ／ｋｇ未満）との併用により、低用量ＣＴＸの抗腫瘍効果が改善され、Ｔ細胞集団に対する影響がより少ないことが示されると予測される。特に、マウスを対象として用量１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸでは、細胞媒介免疫の刺激に効果的であり（Ｏｔｔｅｒｎｅｓｓ＆Ｃｈａｎｇ，１９７６，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２６：３４６〜３５４）、このため有用であり得ることがわかっている。ＰａｐＭＶ  ｓｓＲＮＡ−ＶＬＰと、シクロホスファミドに対して異なる作用機序を有する他の化学療法剤を併用することにより、ＰａｐＭＶの腫瘍内投与とのより良い相乗作用が得られ、腫瘍成長が抑制されることが予期される。
【０１６６】
個々の特許、特許出願、公開及びデータベースエントリーが具体的に及び個々に参照によって援用されることが示されるように、本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、特許公開及びデータベースエントリーの開示により、特に、その全体が同じ範囲まで参照によって援用される。
【０１６７】
本発明は、ある特定の実施形態への参照と共に記述されたが、これらのさまざまな変化形態は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者に明らかである。当業者にとって明らかであるこうしたすべての変化形態は、以下の請求項の範囲内に包含されることが意図される。
【図２Ａ】
2016531927.tif 000003
【図２Ｂ】
2016531927.tif 000004
【図３Ａ】
2016531927.tif 000005
【図３Ｂ】
2016531927.tif 000006
【図１】
2016531927.tif 000007
【図４】
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【図５】
2016531927.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016531927.tif 000013
【図１０−１】
2016531927.tif 000014
【図１０−２】
2016531927.tif 000015
【図１０−３】
2016531927.tif 000016
【図１１】
2016531927.tif 000017
【図１２】
2016531927.tif 000018
【図１３】
2016531927.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2016531927000001.app
【国際調査報告】
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2016531927.tif 000025
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