(57)【要約】  本発明は、オロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）に応答する、対象の細胞サンプル（例えば発育相毛）における多種多様なシグナリング経路に関する方法、薬力学バイオマーカーシグナチャーを提供する。臨床試験では、CTOは種々のゲノム変異を有するいくつかの癌における応答を示した。本発明は、CTO応答を追跡監視する診断及び予後アッセイを提供し、該応答は、腫瘍阻害に随伴するいくつかの転写シグナチャー（EGFR、MEK、HDAC、RAS、GFS、WNT、HSP90又は非電位依存カルシウムシグナリングを含む）で-100倍から+25倍の範囲の弁別的発現を示し、一方、腫瘍サプレッサーシグナチャー（例えばP53又はEGR1）は発育相毛アッセイで誘発される。
2016526908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーについてオロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）への応答を定量する方法であって、以下の工程、
a）対象から得られる細胞サンプルを入手し、該細胞サンプルを様々な用量の単独CTO、別の薬剤と組み合わせたCTO又は他の複数の薬剤に種々の時間暴露する工程、
b）該処置細胞サンプルからmRNAを単離し、前記mRNAから代表的なcDNAを調製し、CTO暴露から生じた該細胞サンプルの発現における転写変化を測定する工程、
c）複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々についてシグナチャースコアを計算し、様々な用量のCTO暴露に対する応答を定量し、表1に記載される2つの時間に過剰発現するオーバーラップ遺伝子のリストを選択する工程、及び
d）表1に記載される少なくとも3つ以上の遺伝子によって複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々を同定し、参照データセットを用いて複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々を確認する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表2に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがRASである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
RASについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがGFSである、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
GFSについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがMEKiである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
MEKiについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがHDACである、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
HDACについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがNOTCHである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
NOTCHについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがWNTβ-カテニンである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
WNTβ-カテニンについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがHSP90である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
HSP90についてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがEGFRである、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
EGFRについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがP53である、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
P53についてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で誘発される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表3に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが、IPAから同定されるカルボキシアミドトリアゾール（CAI）誘発シグナチャーである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
CAIによって誘発されるシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表4に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがex vivo でCAIによって誘発される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
CAIについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表5に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがカルシウムシグナリング経路である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがカルシウムシグナリング経路であり、CTO暴露への応答で阻害される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表6に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが全遺伝子カルシウムシグナリング経路である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアが全遺伝子カルシウムシグナリング経路であり、CTO暴露への応答で阻害される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表7に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項３４】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが非電位依存カルシウムシグナリング経路である、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアが非電位依存カルシウムシグナリング経路であり、CTO暴露への応答で阻害される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表8に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項３７】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが正規カルシウムシグナリング経路である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
正規カルシウムシグナリング経路についてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが表8に記載される、請求項1に記載の方法。
【請求項４０】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが正規カルシウムシグナリング経路である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
正規カルシウムシグナリング経路についてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で阻害される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが参照データセットに記載され、該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがEGR1である、請求項1に記載の方法。
【請求項４３】
EGR1についてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で刺激される、請求項43に記載の方法。
【請求項４４】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが参照データセットに記載され、該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがCEACAM1である、請求項1に記載の方法。
【請求項４５】
CEACAM1についてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で刺激される、請求項45に記載の方法。
【請求項４６】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが参照データセットに記載され、該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがTGFβである、請求項1に記載の方法。
【請求項４７】
TGFβについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で刺激される、請求項47に記載の方法。
【請求項４８】
該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーが少なくとも3つ以上の遺伝子を含み、当該遺伝子のための薬力学バイオマーカーが参照データセットに記載され、該シグナチャー経路の薬力学バイオマーカーがジストニンである、請求項1に記載の方法。
【請求項４９】
ジストニンについてのシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーのシグナリングスコアがCTO暴露への応答で刺激される、請求項49に記載の方法。
【請求項５０】
非電位依存カルシウムシグナリング経路の薬力学バイオマーカーについてオロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）への応答を定量する方法であって、以下の工程、
a）様々な用量の単独CTO、別の薬剤又は他の複数の薬剤と組み合わせたCTOで種々の時間処置された対象から得られる細胞サンプルを入手する工程、
b）該処置細胞サンプルからmRNAを単離し、前記mRNAから代表的なcDNAを調製し、CTO暴露から生じた該細胞サンプルの発現における転写の変化を測定する工程、
c）複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々についてシグナチャースコアを計算し、種々の用量のCTOのin vivo暴露への応答を、様々な用量の単独CTO、別の薬剤と組み合わせたCTO又は他の複数の薬剤に対して定量し、種々の時間に過剰発現するオーバーラップ遺伝子のリストを選択する工程、及び
d）表10に記載される少なくとも3つ以上の遺伝子によって複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々を同定し、複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々における種々の用量のCTOのin vivo暴露への応答を、様々な用量の単独CTO、別の薬剤又は他の複数の薬剤と組み合わせたCTOに対して定量する工程、
を含む、方法。
【請求項５１】
EGFR、MEK、HDAC、HSP90、WNTβ-カテニン、P53、EGR1、PTEN、TGFβ、RAS、GFS、CEACAM1及びジストニンから成る群から選択される転写シグナチャーの薬力学バイオマーカーについてオロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）への応答を定量する方法であって、以下の工程、
a）様々な用量の単独CTO、別の薬剤又は他の複数の薬剤と組み合わせたCTOで種々の時間処置された対象から得られる細胞サンプルを入手する工程、
b）該処置細胞サンプルからmRNAを単離し、前記mRNAから代表的なcDNAを調製し、CTO暴露から生じた該細胞サンプルの発現における転写の変化を測定する工程、
c）複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々についてシグナチャースコアを計算し、種々の用量のCTOのin vivo暴露への応答を、様々な用量の単独CTO、別の薬剤と組み合わせたCTO又は他の複数の薬剤に対して定量し、種々の時間に過剰発現するオーバーラップ遺伝子のリストを選択する工程、及び
d）表1又は参照データセットに記載される少なくとも3つ以上の遺伝子によって複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々を同定し、複数のシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々における種々の用量のCTOのin vivo暴露への応答を、様々な用量の単独CTO、別の薬剤又は他の複数の薬剤と組み合わせたCTOに対して定量する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康な対象又は種々の疾患を有する患者から得られるex vivoヒト発育相毛におけるオロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）応答分子薬力学マーカーの評価に関する。CTOは抗新形成活性を有する経口的に活性な薬剤であり、非電位作動Ca2+チャネルを阻害し、細胞内へのCa2+流入及び細胞内貯蔵所からのCa2+放出の両方を阻止してカルシウム媒介シグナルトランスダクションの崩壊及び血管内皮成長因子（VEGF）シグナリング、多角的チロシンキナーゼシグナリング（AKT、MEK-ERK又はBcr-Ablを含む）の阻害をもたらす。より具体的には、本発明は、患者に投与された或いはex vivo培養ヒト発育相毛にin vitroで添加されたときのCTOに対する応答のトランスクリプトーム査定による、包括的シグナリング発生における分子薬力学バイオマーカーの評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規な癌医薬の開発は今や悪性の駆動に必要な遺伝子の同定及びそれらが乗っ取るシグナルトランスダクション経路の解明をベースにしている。小分子キナーゼ阻害剤の分野で極めて多くの進歩が達成され、腫瘍の成長を駆動する必須分子及びシグナリング経路に干渉するように設計した標的誘導療法が開発されてきた（例えばイマチニブ（Imatinib(商標)、BCR-ABL）、ゲフィトニブ（Gefitnib(商標)、EGFR）、エルロチニブ（Erlotinib(商標)、EGFR）及び前臨床又は臨床開発下の他の多くの薬剤）。標的性能及び分子選択性と同様に薬力学特性及び代謝特性に注意を向けることは、標的誘導療法の効果を最適にするために重要である（Collin, I and Workman, Cancer Signal Transduction Therapy, 1: 3-23, 2006）。キナーゼ阻害剤の臨床開発では、強力でインフォーマティブなバイオマーカーを開発すること、並びに分子依存性を予報ししたがって個々の薬剤の個別化医療から利益を受ける患者及び薬剤耐性の発生の問題を識別するアッセイを開発することが重要である。
【０００３】
分子療法の開発が直面する別の難問は、いくつかの異常によって駆動される癌を克服するためにいくつかの腫瘍原性標的を阻害するだけでなく、薬剤耐性を予防又は無効にするという当然の要求である。いくつかの事例では、薬剤耐性は、当該薬剤の感受性及び有効性に干渉する腫瘍のミクロ環境内の分子（例えばサイトカイン、カルシウムチャネルシグナリング又は分子シグナリング）の生成増加と連関することがある。したがって、極めて合理的に考案された薬剤分子でさえも、その意図された標的より下流の突然変異による変化又は腫瘍の代謝特性（薬剤の標的への到達を不可能にするか又は薬剤に対するフィードバック機構を誘発する）のために不首尾に終わることがある。
薬剤耐性を克服するために従来いくつかの方法が存在する。１つは、具体的な癌の分子構成にしたがって設計された強い標的誘導薬剤のカクテルの使用である。別のアプローチは、多重標的誘導キナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ（Sorafenib（商標））の使用である。さらに別の手法は、悪性性において多くの腫瘍原性プレーヤー及び経路を制御するいくつかのキナーゼに対する阻害剤（例えばヒストンデアセチラーゼ（HDAC）及びHSP90分子シャペロンの阻害剤）の使用である（Garon E.B, et al, Mol Cancer Ther., 12: 890-900, 2013；及びWitt O at al, Cancer Letters 277: 8-21, 2009）。
【０００４】
固有の癌を駆動する腫瘍原性マーカーに対する標的誘導薬剤のスクリーニング及び構造依拠設計によって、今や急速に前臨床及び臨床試験のための標的誘導薬剤がデリバーされつつある。しかしながら、重要な腫瘍サプレッサータンパク質を正常な細胞機能の門番として不首尾に終わらせる因子をより一層理解するためには正常細胞におけるシグナリング経路を調べる必要がある。どのようにしてこれらの腫瘍サプレッサータンパク質は、ストレスシグナルへの応答でそれらの正常なシグナリングの低下を防ぐために調整され得るかをより一層理解する必要がある。
より具体的には、正常細胞の多種多様なシグナリング経路の統合又は成長及び増殖制御の門番としてのそれらの役割の強化を支援することができる薬剤を開発することが重要である。例えば、P53転写因子は主要な腫瘍サプレッサータンパク質であり、多細胞生物では細胞の運命の門番として働く。P53は多様なストレスシグナルに応答して活性化され、P53標的遺伝子のトランスアクチベーションを必要とする経路を介して細胞周期の進行停止、老化又はアポトーシスを開始させる（Stambolic V et al., Mol Cell: 317-325, 2001）。しかしながら遺伝子保全のこの普遍的防御は多くのヒト癌で損なわれる。新規模範例は、正常な細胞周期、成長及び増殖を維持する正確な分子シグナリングを標的とする薬剤の開発である。
【０００５】
したがって、組み合わせ治療の合理的選択及び開発は極めて難問であり、個々の癌における分子の異常に関する知識の他に、与えられた経路の阻止に適合するフィードバックループの理解とともに正常細胞及び癌細胞でのp53転写因子及びPTENの腫瘍サプレッサーシグナリング経路の強化の理解に基づく標的誘導薬及び/又は化学療法剤の組合せを開発する必要がある。
オロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）（カルボキシアミドトリアゾール（CAI）のオロト酸塩）は受容体によって作動されるカルシウムチャネル媒介カルシウム流入の阻害剤であり、抗増殖性及び抗侵襲性機能をいくつかのヒト癌細胞株（ヒト神経膠芽腫細胞を含む）で有することが示されている（Ge S et al., Clin Cancer Res 6: 1248-1254, 2000）。第二のメッセンジャーとしてカルシウムの動員を妨害することによって、CAIは以下を含むカルシウム感受性シグナルトランスダクション経路を阻害することができる：アラキドン酸及びその代謝物の放出、酸化窒素の放出、リン酸イノシトールの生成、及びチロシンリン酸化（Kohn E C et al., Cancer Res 52:3208-3212, 1992；Kohn E C et al., Proc Natl Acad Sci 92: 1307-1311, 1995；Felder CF et al., J Pharmacol Exp Therap 257: 967-971, 1990；Hupe DJ et al., J Biol Chem 266: 10136-10142, 1991；Mignen O et al., J Cell Sc 118: 5615-5623, 2005；及びEnfissi E et al., Cell Calcium 36: 459-467, 2004）。CAIは細胞タンパク質STATS及びCrkLのリン酸化を阻害し、BCR-ABLをダウンレギュレートさせることによってイマチニブメシレート耐性慢性骨髄性白血病細胞でアポトーシスを誘発する（Alessandro et al., PLOS 7:1-13, 2012）。
【０００６】
臨床試験（NCT01107522）では、単独投与CTOは安全であり、種々の腫瘍タイプを罹患し種々のゲノム変異を有する癌患者で最大耐性用量が決定されない耐性を示し、さらにCTO治療は癌の応答をもたらし、症状の安定又は腫瘍退縮を示す部分的応答を示した。したがって、種々の癌タイプの分子標的に対抗するコンビナトリアルレジメンの設計のために、CTOによるシグナリング発生における分子薬力学バイオマーカーの解明に多大な努力が向けられている。腫瘍で経路の活性化を査定する従来の方法は、薬剤標的、既知のオンコジーン又は既知の腫瘍サプレッサーの測定を必要とする。しかしながら、ある経路は多数のポイントで活性化でき、したがって単に既知の癌随伴遺伝子の評価によって経路の活性化を査定することは適切ではない。
したがって、多数のキナーゼ（チロシンキナーゼ）のシグナリング及びカルシウムシグナルトランスダクション経路におけるCTOの作用という観点からCTOの完全な分子シグナチャーを解明することが重要である。本発明は、ヒト細胞又は組織サンプル（例えば健康な対象又は患者から得られた発育相毛）でCTO治療に応答する分子薬力学マーカーのin vivo又はin vitro応答の評価に関する。
【０００７】
in vivoモデルでは、発育相毛は、患者にCTOを投与する前及び治療量のCTOの日量投与後の種々の時点で入手される。患者の臨床状況及びCAIの血液レベルはこの間ずっと追跡監視される。
in vitroモデルでは、発育相毛は未処置対象から得られ、毛は、治療有効性に必要な用量範囲を示す種々の用量のCTOによりex vivo培養で処理される。
両モデルで、RNAが発育相毛の末端球から抽出され、続いてcDNAが前記RNAから調製され、全転写レベル又は遺伝子発現レベルが、マイクロアレー分析により又は定量PCR（qPCR）により決定される。続いて、バイオインフォーマティクス分析を実施して、発育相毛におけるCTO誘導遺伝子発現変化を識別する。そのようなプロトコルはまた、健康な対象又は患者から入手される発育相毛以外の組織に適用できる。
したがって、本発明は、mRNA及びタンパク質発現レベルにおけるCTOの作用をin vitroで調べるために、抜毛バイオマーカーアッセイの使用を極めて詳細に記載する。引き抜かれた頭皮毛はCTO処理への直接応答を測定するための理想的な代用物である。高度に血管が形成された毛包は暴露から数時間以内に応答することができる。この血管形成、それらの上皮性特質及び急速な増殖速度を条件として、抜毛基部の毛球及び外側根鞘中の細胞は、高度に相関性を有する固形腫瘍のための代用マーカー組織である。高度に血管形成された毛包は暴露から数時間以内に薬剤処理に応答することができる。バイオインフォーマティクス分析を実施して毛における薬剤誘発変化を識別した。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、in vivo又はin vitro投与CTOに応答する多種多様なシグナリング経路の分子薬力学バイオマーカーのex vivo培養ヒト発育相毛での評価に関する。市場で入手できる抜毛分子プラットフォームアッセイ（Epistem Ltd, Manchester, UK）を用いて、患者で治療的に達成されるカルボキシアミドトリアゾール（CAI）のレベルと同等な種々のCTO用量による処置に対する直接応答を評価して、腫瘍学及び他の治療領域における細胞内シグナリング経路の標的照準を試験した。
したがって、本発明は対象から抜き取った頭皮毛を用い、発育相毛末端球からRNAを抽出し、当該RNAからcDNAを調製し、マイクロアレー分析又は定量PCR（qPCR）によって遺伝子発現レベルを決定し、バイオインフォーマティクス分析を実施し、CTO及び他の薬剤（例えばタルセバ(商標)（Tarceva(商標)）（EGFR阻害剤）又はBEZ235（PI3K阻害剤））による薬剤誘導遺伝子発現変化を同定した。
本発明は、癌又は他の疾患を罹患する又は罹患していないヒト対象に由来するex vivo培養ヒト発育相毛でのCTO応答トランスクリプトーム査定による、シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーの解明に関する。CTO暴露に関する分子薬力学バイオマーカーには以下が含まれる：RAS、GFS（PI3K、PI3K/MTOR）、MEK、HDAC、NOTCH、WNT-βカテニン、HSP90、EGFR、P53、CAIIPA、CAI ex vivoカルシウムシグナリング非電位依存、カルシウムシグナリング全遺伝子、カルシウムシグナリングex vivo、正規（Canonical）カルシウムシグナリング、正規カルシウムex vivo、カルシウム全遺伝子非電位依存、EGR1、PTEN、TGFβ、CEACAM1、又はジストニン。
【０００９】
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でRAS経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でGFS経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でMEK経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でHDAC経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でNOTCH経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でWNT-βカテニン経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でHSP90シグナチャーを阻害する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でEGFR経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。
【００１０】
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でP53経路シグナチャーを誘発する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答で非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子を阻害する方法を提供した。
特に、本発明は、CTO応答の薬力学マーカーとして、CAI精巧経路（CAI Ingenuity Pathway）分析、CAI ex vivo経路、カルシウムシグナリング経路及び正規シグナリング経路のためのシグナチャースコアを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でEGR1経路シグナチャーをアップレギュレートする方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でPTEN経路シグナチャーをアップレギュレートする方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でTGF-β経路シグナチャーを誘発する方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でCEACAM1経路をダウンレギュレートする方法を提供した。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でジストニン経路をダウンレギュレートする方法を提供した。
【００１１】
本発明はまたCTO及び別の薬剤を含む医薬組成物に関し、前記別の薬剤は、感受性及び有効性を改善し毒性を低下させ、一方で、処置哺乳動物由来ex vivo培養発育相毛でCTO応答シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーを追跡監視することにより、1つ以上の遺伝子シグナチャー（EGFR、MEK、VEGF、HDAC、HSP90、ERK、BCR-ABL、p53、ERG1、CEACAM1、ジストニン、又は非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子を含む）を調節するために組み合わされる。
さらにまた別の特徴では、哺乳動物のある症状を治療又は予防する方法を提供し、前記方法では、1つ以上の遺伝子シグナチャー（EGFR、MEK、VEGF、HDAC、HSP90、ERK、BCR-ABL、p53、ERG1、CEACAM1、ジストニン、又は非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子を含む）の調節が当該症状の病変又は症候を予防、阻害又は緩和する。前記方法は、単独療法として又はコンビナトリアル療法として治療的に有効な量のCTOの投与、及び処置哺乳動物由来ex vivo培養発育相毛におけるCTO応答シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーの追跡監視を含む。
【００１２】
別の特徴では、本発明は増殖性症状を対象で予防又は治療する方法を提供し、前記方法は、治療的に有効な量のCTOを単独で又は別の薬剤と組み合わせて投与する工程、及び処置哺乳動物由来ex vivo培養発育相毛でCTO応答シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーを追跡監視する工程を含む。遺伝子発現パターンは、種々の病的状態にある組織間の識別又はある疾患（例えば癌）の１つ以上の治療方法の応答に対する予後の予想のために同様に他の組織で樹立することができる。別の模範例は、薬力学マーカーのプラットフォームを開発して、遺伝子発現パターンに基づいて固有で注文誂えの処方物を設計することである。
本発明は、疾患を駆動する分子標的の持続的阻害を維持するため及びいくつかの事例ではサプレッサー遺伝子を誘導して治療成果を最適にするために、組み合わせ治療の合理的な選択及び開発のための模範例を提供する。前記組み合わせ治療は、個々の疾患又は癌の分子異常に関する知識の他に、当該疾患又は癌の分子構成に対して構築される他の標的誘導薬剤とCTOを組み合わせことができること、当該標的誘導薬剤によって阻止される与えられた経路の阻止に適合するフィードバックループ及びこれらのフィードバックループがどのようにして妨害され得るかに関する理解を土台とする。
【００１３】
本発明は、ex vivo培養発育相毛でのトランスクリプトーム査定により、CTO及び慎重に選択された組み合わせ薬剤に応答するシグナリング発生の薬力学バイオマーカーを追跡監視することによって、いくつかの異常により駆動される癌を克服するとともに薬剤耐性の発生を予防又は無効化するために、いくつかの腫瘍原性標的をCTOと一緒に阻害するコンビナトリアル薬剤レジメンを開発する方法におけるシフトを提供する。いくつかの標的誘導薬剤カクテルを用いる従来の多重薬理学的アプローチは不成功に終わり、かつカクテル中の薬剤の累積毒性による新たな問題を提起した。
本発明の重要な実施態様は、毛サンプルに由来する15−20遺伝子のmRNA発現シグナチャーのパネルの開発であり、このパネルを患者から作製したcDNAサンプル上にアフィメトリクス（Affymetrix）アレーデータによって配置し、未処置及び処置患者の頭皮毛サンプルで弁別的に発現される遺伝子を同定する。
本教示のこれらの特徴及び他の特徴は本明細書で示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】抜毛バイオマーカープラットフォーム（Epistem, Ltd, Manchester, UK）の種々のステージを示す。前記ステージは以下を含む：頭皮の発育相毛収集；種々の用量のCTOについて8及び24時間、並びに参照用量のBEZ235（PI3K阻害剤）及びタルセバ(商標)（Tarceva(商標)）（EGFR阻害剤）について24時間の毛のex vivo培養；RNAの単離及び品質制御；Epistem GentRx cDNA増幅；5HNVについて全品質コントロールを合格するcDNA選別；サンプルの標識及びマイクロアレーのハイブリダイゼーション；参照配列を使用するバイオインフォーマティクス分析。
【図１ｂ】種々の用量のCTO（18時間及び24時間）並びに1用量のBEZ235（PI3K阻害剤）及びタルセバ(商標)（EGFR阻害剤）（24時間のみ）に対する応答で全対比転写応答の結果におけるANOVA分析を示す。
【図２ａ】最強から最低の阻害を示す11の異なるシグナチャー（EGFRi、MEKi、HSP90i、非電位依存CAI関連カルシウムシグナリング、HDACi、GF及びRASを含む）について、8時間及び24時間の多変量シグナチャーにおける種々の用量のCTOの結果を示す。WNT/β-カテニンは24時間で阻害性であり、PI3Ki、PI3K/mTOR、NOTCH/GSIについて活性は認められなかった。重要なことに、P53が誘発され、P53の安定化が特に24時間で認められた。
【図２ｂ】調べた13の異なるシグナチャーを記載する。
【図３ａ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるRAS経路のシグナチャースコアを示す。
【図３ｂ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間における成長因子シグナチャー（GFS）経路のシグナチャースコアを示す。
【図３ｃ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるPI3K経路のシグナチャースコアを示す。
【図３ｄ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるPI3K/mTOR経路のシグナチャースコアを示す。
【図３ｅ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるMEK経路のシグナチャースコアを示す。
【図４ａ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるHDAC経路のシグナチャースコアを示す。
【図４ｂ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるNOTCH経路のシグナチャースコアを示す。
【図４ｃ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるWNTβ-カテニン経路のシグナチャースコアを示す。
【図４ｄ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるHSP90経路のシグナチャースコアを示す。
【図４ｅ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるEGFR経路のシグナチャースコアを示す。
【図４ｆ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるP53経路のシグナチャースコアを示す。
【図５ａ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるCAI IPA経路のシグナチャースコアを示す。CAIによって影響される遺伝子について精巧経路分析（Ingenuity Pathways Analysis（IPA）；Ingenuity Systems, Redwood City, CA）を用いたとき、10μMを除きCTO処理への応答でCAIシグナチャーのいくらかの抑制が観察された。インフォーマティブ遺伝子を選別し変化の方向を決定するために、CTOデータセットでFDA＜0.05及び1.5FCについて29遺伝子をIPAでフィルター選別したとき、14遺伝子セットが得られた。
【図５ｂ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるCAI Ex vivo経路のシグナチャースコアを示す。変化情報の組織特異的方向性とともに、IPA CAIリストの強い用量依存抑制が観察された。
【図５ｃ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるカルシウムシグナリング経路のシグナチャースコアを示す。非電位依存カルシウムシグナリング遺伝子は、調節に関する情報を提供する文献のデータセットから同定された。
【図５ｄ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間における全遺伝子経路のためのカルシウムシグナリングのシグナチャースコアを示す。全遺伝子のための概算調節方向が同定された。
【図５ｅ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるカルシウムシグナリング経路のシグナチャースコアを示す。インフォーマティブ遺伝子をフィルター選別するためにANOVAを用いた（FDR＜0.05及び1.5FC）。非電位依存カルシウム遺伝子の強い抑制が、文献決定調節及びANOVA決定セットの両方でCTO処理全体において観察された。
【図６ａ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるカルシウムシグナリングの調節を予報するためにKEGGカルシウムシグナリング及びIPAを用いた正規カルシウムシグナリングのシグナチャースコアを示す。
【図６ｂ】24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間における調節を予報するためにKEGGカルシウムシグナリング及びIPAを用いた正規カルシウムシグナリングex vivoのシグナチャースコアを示す。抑制は6/78正規経路遺伝子のみについて認められた。
【図７ａ】CAIシグナチャー（図5b）及び非電位依存（NDV）遺伝子セット（図5c）の両方のANOVAフィルター選別遺伝子セットの合体後の全シグナリング遺伝子のシグナチャースコアを示す。
【図７ｂ】シグナチャーの検分及びPCAの両方によって、種々のCTO用量を区別することができる31のCAI/カルシウム関連遺伝子パネルの結果を示す。
【図８】EGR1シグナリング経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、オロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）（抗新形成活性を有する経口的に活性な薬剤）に関する。前記は非電位作動Ca2+チャネルを阻害し、細胞内へのCa2+流入及び細胞内貯蔵所からのCa2+放出の両方を阻止してカルシウム媒介シグナルトランスダクションの崩壊及び血管内皮成長因子（VEGF）シグナリング、多角的チロシンキナーゼシグナリング（AKT、MEK-ERK又はBCR-ABLを含む）の阻害をもたらす。より具体的には、本発明は、in vivo及びex vivo培養ヒト発育相毛のin vitro培養におけるCTOに対する応答をトランスクリプトーム査定することによって、シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーを評価することに関する。発育相毛は、様々な用量のCTO処理を与えられた対象から種々の時点で入手される。これは、CTOの臨床試験の患者で用いられるアプローチである。また別には、発育相毛は未処置対象から入手され、当該毛は様々な用量のCTOで処理される（このアプローチは吸収及びデリバリーの生理学的条件に支配されず、したがって選択した）。
【００１６】
癌生物学及びヒトゲノムの理解は、腫瘍成長を駆動する必須分子及びシグナリング経路に干渉して成果を確約するように設計された新規クラスの標的誘導療法の開発をもたらした。これは、多数の承認療法、低応答率及び多くの従来治療への耐性、並びに最適で個別化された治療方法の臨床的重要性のために癌治療にとって特に重要である。細胞傷害性化学療法剤の限界を改善するために、腫瘍学における薬剤設計の従来のアプローチは、腫瘍の成長及び生存のために重要な固有の細胞シグナリング経路の調整を目標とする。癌細胞では、これらの経路は調節を脱し、異常なシグナリング、アポトーシスの阻害、転移の増加及び細胞増殖の増加をもたらす。
【００１７】
正常細胞は制御された成長及び増殖のために多種多様なシグナリング経路を統合するが、腫瘍は1つ又は2つのオンコジーン経路の活性化に大いに依存しているように思われる。あいにく、新規な抗癌療法開発の焦点は、制御下にある正常細胞で制御された成長又は増殖を維持する多種多様なシグナリング経路の誘発には存在しない。それどころか、異常なシグナリング経路の成分が新規な抗癌療法のための有望で選択的な標的である。固有の腫瘍原性経路によって駆動される腫瘍を有する患者はそのような経路を標的とする治療薬に応答するだろうということは論理的であるように思われる。しかしながら、1つの経路は多数のポイントで活性化でき、既知の癌随伴遺伝子の評価によって経路の活性化の査定が実現されるとは限らない。例えば、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）経路を介するシグナリングは、受容体チロシンキナーゼを介して多数の成長因子によって活性化され、多種多様なプロセス（細胞の成長及び生存、転移潜在能力、並びに遺伝子増幅及び/又はバイパス又は新規変異を介する薬剤耐性を含む）で作用を有する。多くの製薬企業が1つ以上のシグナリング経路に特異的な阻害剤を開発しつつあり、多数のオンコジーン経路を阻害するためにいくつかの特異的な阻害剤の組合せを提唱している。しかしながら、標的誘導療法の総合利益の主要な限界は薬剤耐性の発達である。耐性は、当該阻害剤に対して薬剤標的を非感受性にさせる変異のために生じるか、又は癌細胞が標的経路へのそれらの依存性を変化させたときに生じ得る。第一の例では、耐性は、ダサチミブ及びノイロチニブの例のように、耐性随伴変異体を効果的に阻害する新規薬剤を開発することによって克服できる（前記薬剤はイマチニブに耐性を付与するBCR-ABL変異体で有効である）。第二のアプローチは、多種多様なシグナリング経路を同時に標的とし、したがって癌が別の重要な経路にその依存性を変更することを妨げることである（例えばマイトジェン活性化タンパク質（MAP）-細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）の阻害剤をPI3キナーゼの阻害剤と組み合わせる）。第三のアプローチは、標的誘導療法の有効性を強化し腫瘍細胞をアポトーシスから防御する下流のタンパク質を同時に標的とすることである。
【００１８】
しかしながら、複数の分子（その各々が多種多様な腫瘍原性経路を調節し得る）を開発する新規なアプローチは、薬剤耐性及び重大な毒性の両方を防止するためにより良好なアプローチであろう。これは、該分子の設計のためのはるかに困難なアプローチであろうが、多種多様な腫瘍原性経路を形成できる分子を開発するこのアプローチは非効率的で許容不能な戦法と思われる。しかも、いくつかの分子異常によって駆動される癌の克服とともに薬剤耐性及び毒性の防止のためにいくつかの腫瘍原性標的を阻害する最良の方法はおそらく、多種多様な腫瘍原性経路を調整するか、及び/又は既知の腫瘍サプレッサーを誘発する分子を開発することである。
多数の遺伝子の発現を調整する分子を用いることによって、さらにこれら分子の発現データを統合することによって、遺伝子発現シグナチャーの定量的査定は可能であり得る。経路活性化及び/又は不活化のためのこれら遺伝子発現シグナチャーを、i）腫瘍における薬剤誘発経路阻害の追跡監視のための薬力学バイオマーカー又は代用マーカー（例えば発育相毛）として、ii）高レベルの特定の経路を有する腫瘍を同定する予報バイオマーカー、及び有効性又は予防の初期情報を得るための初期有効性バイオマーカーとして用いることができる。
【００１９】
オロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）（カルボキシアミドトリアゾール（CAI）のオロト酸塩）は受容体によって作動されるカルシウムチャネル媒介カルシウム流入の阻害剤であり、抗増殖性及び抗侵襲性機能をいくつかのヒト癌細胞株（ヒト神経膠芽腫細胞を含む）で有することが示されている（Fiorio Pla et al, 2008；Ge et al, 2000）。第二のメッセンジャーとしてカルシウムの動員を妨害することによって、CAIは以下を含むカルシウム感受性シグナルトランスダクション経路を阻害することができる：アラキドン酸及びその代謝物の放出、酸化窒素の放出、リン酸イノシトールの生成、及びチロシンリン酸化（Ge et al, 2000；Kohn et al, 1992）。CAIは細胞タンパク質STATS及びCrkLのリン酸化を阻害し、bcr-ablをダウンレギュレートさせることによってイマチニブメシレート耐性慢性骨髄性白血病細胞でアポトーシスを誘発する（Alessandro et al, 2008)。
したがって、種々のタイプの癌の分子標的に対抗するコンビナトリアルレジメンを設計するために、多大な努力がCTOのシグナリング発生における分子薬力学バイオマーカーの解明に向けられている。腫瘍の経路活性化を査定するための従来の方法は、薬剤標的、既知のオンコジーン又は既知の腫瘍サプレッサーの測定を必要とする。しかしながら、1つの経路は多数のポイントで活性化でき、単なる既知の癌随伴遺伝子の評価だけでは経路の活性化の査定が実現されるとは限らない。抜毛バイオマーカーアッセーは、in vitroのmRNA及びタンパク質の発現レベルにおけるCTOの作用の調査に用いられる。引き抜かれた頭皮毛はCTO処理への直接応答を測定するための理想的な代用物である。高度に血管が形成された毛包は暴露から数時間以内に応答することができる。この血管形成、それらの上皮性特質及び急速な増殖速度を条件として、抜毛基部の毛球及び外側根鞘中の細胞は、高度に相関性を有する固形腫瘍のための代用マーカー組織である。バイオインフォーマティクス分析を実施して毛における薬剤誘発変化が同定される。
【００２０】
本発明は、癌又は他の疾患を罹患する又は罹患していないヒト対象に由来するex vivo培養ヒト発育相毛で、CTOに対する応答をトランスクリプトーム査定することによってシグナリング発生における分子薬力学バイオマーカーを解明することに関する。
本発明は、オロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）に応答する、対象の細胞サンプル（例えば発育相毛）における多種多様なシグナリング経路に関する方法、薬力学バイオマーカーシグナチャーを提供する。臨床試験では、CTOは種々のゲノム変異を有するいくつかの癌の応答を示した。本発明は、CTOに対する応答を追跡監視する診断及び予後アッセイを提供し、該応答は、腫瘍阻害に随伴するいくつかの転写シグナチャー（EGFR、MEK、HDAC、RAS、GFS、WNT、HSP90又は非電位依存カルシウムシグナリングを含む）で-100倍から+25倍の範囲の弁別的発現を示し、一方、腫瘍サプレッサーシグナチャー（例えばP53又はEGR1）は発育相毛アッセイで誘発された。
【００２１】
オロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）への応答を多種多様なシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーについて定量する方法は以下の工程を含む：
a）対象から得られる細胞サンプルを入手し、該細胞サンプルを様々な用量の単独CTO、もう1つの薬剤又は他の複数の薬剤と組み合わせたCTOに種々の時間暴露する工程、
b）該処置細胞サンプルからmRNAを単離し、前記から代表的なcDNAを調製し、CTO暴露から生じた該細胞サンプルの発現における転写変化を測定する工程、
c）多種多様なシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々についてシグナチャースコアを計算し、様々な用量のCTO暴露に対する応答を定量し、表1に記載される2つの時間に過剰発現するオーバーラップ遺伝子のリストを選択する工程、及び
d）編集リストの少なくとも3つ以上の遺伝子によって多種多様なシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々を同定し、参照データセットを用いて多種多様なシグナチャー経路の薬力学バイオマーカーの各々を確認する工程。
【００２２】
RAS、成長因子、PI3Kシグナチャー：
RAS遺伝子生成物は、遺伝子の転写を制御するキナーゼシグナリング経路で必要とされ、前記は続いて細胞の成長及び分化を調節する。プロトオンコジーンからRASの変換は、通常遺伝子の点変異を介して生じ、変異した機能は種々の経路で細胞に影響を与えることができる。なぜならば、RASは細胞分割及び細胞死を制御する多くのシグナリング経路で必要とされるからである。変異体rasが、膵臓、結腸、肺臓、甲状腺、膀胱、卵巣、乳房、皮膚、肝臓、腎臓及びいくつかの白血病を含む多くの起源の癌で同定されている（Song, S et al., PLOS ONE 7: 1-11, 2012）。
GFSはホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）経路の混乱に応答し、ホスファターゼとテンシンホモローグ（PTEN）分解に関連する（Loboda A et al. Clin Pharm& Therap 1: 92-96, 2009）。
PI3Kの100αサブユニット（PI3KCAと称される）の変異はしばしばPI3K/AKTの活性化の原因であり、いくつかのヒト癌で報告されている（Janku F et al., J Clin Oncol 30:777-782, 2012）。
【００２３】
EGFR経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でEGFR経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。EGF受容体(EGFR)-細胞外ドメイン結合抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤を標的とする薬剤は、いくつかの固形腫瘍のための治療選択肢を拡大した。EFGR遺伝子はしばしば乳房、腎臓、卵巣の癌及び扁平上皮細胞癌でアップレギュレートされる。アップレギュレーションは典型的には遺伝子増幅又は過剰発現による。神経膠腫のEGFRアップレギュレーションはEGFR遺伝子の再編成に極めて頻繁に随伴しその転写物の変異をもたらし、したがってそのような神経膠腫は野生型の内因性EGFRとエピソーム系変異体の両方を発現する。EGFR遺伝子は＞50％の神経膠芽腫で増幅される。
EGFR標的に誘導されるモノクローナル抗体、セツキシマブ（Cetuximab(商標)）及びパニツムマブ（Panitumumab(商標)）は転移性結直腸癌で広範囲に調査された。しかしながらEGFR標的誘導抗体の臨床有効性は、後天的二次性耐性（典型的には治療開始より3から12か月以内に生じる）の発生によって限定される。抗EGFR抗体に対する二次性耐性に関する多数のメカニズムが報告された（例えばEGFRリガンドの発現、HER2増幅及びEGFRリサイクルプロセスの脱調節）。KRAS変異が生じ、それら変異は、最初はセツキシマブ又はパニツムマブに応答する患者の半分で後天的耐性をもたらす（Wang J et al., Mol Cancer Ther 12: 925-936, 2013）。
ここ数年間にセツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィトニブ、エルロチニブ（タルセバ）を含む4つのEGFR阻害剤が承認され、癌患者で使用される標準治療となっている。しかしながら、非選別患者で報告された活性は極めて限定的であり、典型的には耐性を生じる。EGFR阻害剤に対するこの先天的及び後天的耐性の程度は更なる抗癌剤の開発に大きな余地を残す（Gou H-F et al., PLOS ONE 8: 1-6, 2013）。
【００２４】
MEK経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でMEK経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。MAPK経路は一般的にはヒト癌で活性化され、続いてRAF-MEK-ERKキナーゼカスケードを活性化する（前記カスケードは細胞の増殖、生存、形質転換、転写制御及び骨格再編成に必要とされる基質の下流の活性化をもたらす）（Tan N et al., Mol Cancer Ther 12: 853-864, 2013）。この経路を標的とする小分子阻害剤（例えばMEKのアロステリック阻害剤）はin vitro及びin vivoで抗癌効果を示す。
【００２５】
HDAC経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でHDAC経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。ヒストンアセチル化は可逆的な改変であり、脱アセチル化はヒストンデアセチラーゼ（HDAC）によって触媒される。HDACはヒトでは18遺伝子によって表され、4つの別個のクラスに分けられる。HDAC阻害剤のいくつかのクラスが臨床研究で評価中であり、ある種のHDACファミリーメンバーはいくつかの腫瘍で異常に発現されることが示された。非選択性HDAC阻害剤は白血病及び固形腫瘍で有望な結果を示している（例えば皮膚T細胞リンパ腫のために承認されたボリノスタート（Vorinostat(商標)）（Witt O et al., Cancer Letter 277: 8-21, 2008）。しかしながら、いくつかの汎用HDAC阻害剤は多くの副作用を引き起こすことがあり、したがって癌細胞で腫瘍原性機能を有するHDACを選択的に標的とすることが必要である。
【００２６】
WNT経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でWNT経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。シグナリング分子のWNTファミリーは、動物の発生で数多のプロセスを調節し、WNTの機能異常は癌及び変性疾患を含む多様な病型に関係する。正規WNTシグナリング経路は多くのレベルで調節され、WNTシグナリングと腫瘍形成で重要な他の経路（β-カテニンに集中する）との混信のために他の経路に由来する証拠が増加している。β-カテニンは多機能タンパク質であり、形質膜における細胞接着及び核内転写で別個の分子的役割を有する。多くの研究が、神経膠芽腫（GBM）におけるWNTシグナリングの上昇は、当該疾患の種々の段階で必要ないくつかの別個のメカニズムによって開始されることを提唱している（De Robertis A et al., Mol Cancer Ther 12: 1180-1189, 2013；及びNusse R, Cell Res 15: 28-32, 2005）。したがって、WNTシグナリングの阻害はGBM治療のための治療法として適切なアプローチであり得る。
【００２７】
HSP90経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でHSP90経路シグナチャーを阻害する方法を提供した。熱ショックタンパク質は、多数のクライアントタンパク質の安定性、翻訳後改変、及び機能のために必要な分子シャペロンとして働く。HSPの発現は生理学的ストレス時に増加し、これらの作用は細胞の生存を支援すると考えられる。HSP90は多くの腫瘍タイプで過剰発現され、癌細胞の生存で役割を果たす可能性があることが示され、そのことはしたがってHSP90を抗癌剤の魅力的な標的にする。HSPの増加は非小細胞肺癌の患者で予後悪化と連関する（Garon E B et al., Mol Cancer Ther 12: 890-900, 2013）。NSCLCはいくつかの駆動変異の結果として生じる。例えばEGF受容体変異は約10％のNSCLCで認められる。HSPは、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病又はハンチントン病）で重要な役割を果たし、したがってHSP90のダウンレギュレーションは、癌細胞及び変性性疾患で潜在的に有益な作用を有する。
【００２８】
非電位依存カルシウムシグナリング：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答で非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子を阻害する方法を提供した（Kohn E C et al., Cancer Res 52:3208-3212, 1992；Kohn E C et al., Proc Natl Acad Sci 92: 1307-1311, 1995；Felder CF et al., J Phasrmacol Exp Therap 257: 967-971, 1990；Hupe DJ et al., J Biol Chem 266: 10136-10142, 1991；Mignen O et al., J Cell Sc 118: 5615-5623, 2005；及びEnfissi E et al., Cell Calcium 36: 459-467, 2004）。カルシウムシグナリング非電位依存遺伝子が同定され、強い抑制がCTO処理全体で認められた。
正規カルシウムシグナリングをKEGGカルシウムシグナリング経路及びIPAを用いて分析し、正規カルシウムシグナリングの調節を予報した。経路の顕著な抑制は認められなかった。インフォーマティブ遺伝子（FDR＜0.05＆1.5）のフィルター選別にANOVAを用いたとき、正規カルシウム遺伝子の抑制はCTO処理を通して認められたが、これは7/68正規経路遺伝子を表しただけであった。
【００２９】
TGF-β経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でTGF-βシグナリング随伴遺伝子を阻害する方法を提供した。TGF-βは構造的に関連するサイトカイン(骨形成タンパク質、成長及び分化因子、アクチビン並びにインヒビンが含まれる)の大きなファミリーの部分である。殆どすべての細胞タイプが、TGF-βを分泌する能力を、細胞表面のTGF-β受容体の存在を介してTGF-βと応答する能力と同様に有する。したがって、TGF-β経路の機能及びその成分の獲得又は喪失は多様な疾患（癌を含む）をもたらす。上皮細胞では、TGF-βは腫瘍サプレッサーとして機能し（前記は増殖を阻害する）、アポトーシスを誘発し分化を媒介する。逆に他の環境では、TGF-βは腫瘍細胞の侵襲及び転移の増加を介して腫瘍の進行を促進する（Smith A L et al., Clin Cancer Res 18: 4514-4512, 2012）。
【００３０】
CEACAM1経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でCEACAM1経路をダウンレギュレートする方法を提供した。CEACAM1は、Ig様細胞-細胞接着分子の癌胎児性抗原（CEA）遺伝子ファミリーのメンバーである。CEACAM1は上皮癌（例えば前立腺、膀胱及び結腸）でダウンレギュレートされる（Lawson EL et al., PLOS ONE 7: 1-14, 2012）。
【００３１】
ジストニン/Bpag1タンパク質シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でジストニン経路をダウンレギュレートする方法を提供した。ジストニン/Bpag1タンパク質は細胞骨格リンカーであり、マウスにおけるその機能の低下は、四肢協調の進行性低下を示す遺伝性感覚神経障害をもたらす（Young K et al., Exp Cell Res 314:2750-2761, 2008）。
【００３２】
P53経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でP53経路シグナチャーを誘発する方法を提供した。正常な細胞は多種多様なシグナリング経路を統合して成長及び増殖を制御する。例えば、p53転写因子は主要な腫瘍サプレッサータンパク質であり、前記は多細胞生物で細胞の運命の門番として働く。P53は多様なストレスシグナルに応答して活性化され、p53標的遺伝子の転写を必要とする経路を介して細胞周期の停止、老化又はアポトーシスを開始させる（Stambolic V et al., Molecular Cell 8:317-325, 2001）。遺伝的統合のこの普遍的な防御はしかしながら多くの癌で障害される。
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でP53経路シグナチャーをアップレギュレートする方法を提供した。PTENの変異は、多様な癌（脳、乳房、子宮内膜、前立腺及び腎臓の腫瘍を含む）でしばしば見出される。PTENは腫瘍サプレッサーであり、PI3K/PKB/AKT-依存細胞生存の負の調節因子である。
【００３３】
EGR1経路シグナチャー：
さらに別の特徴では、本発明は、CTO処理に対する応答でEGR1経路シグナチャーをアップレギュレートする方法を提供した。初期増殖応答1（EGR1）遺伝子生成物は、分化及び成長で役割を有する転写因子である。転写因子EGR1は、多角的腫瘍サプレッサー（TGFβ1、PTEN及びフィブロネクチンを含む）の直接的な調節因子である（Baron V et al., Cancer gene Therapy 13: 115-124, 2006）。ある種のヒト腫瘍細胞及び組織では、EGR1は突出した腫瘍サプレッサー機能を示し、多くのヒト腫瘍細胞株は、それらの正常な対応物と比較してほとんど又は全くEGR1を発現しない。EGR1は、非小細胞肺癌、乳房腫瘍及びヒト神経膠腫では低下するか又は検出不能である。ヒト腫瘍細胞株でのEGR1の再発現は形質転換を阻害する。抑制のメカニズムは、TGF-β1（フィブロネクチンの増加をもたらす）及びプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の直接的誘発を必要とする（Liu, C et al Proc Natl Acad Sci 93: 11831-11836, 1996）。
EGR1はメラノーマ細胞でP53の調節に関与してアポトーシスをもたらし、前アポトーシス性サプレッサー遺伝子PTENもまたEGR1によって直接的に調節される。
【００３４】
本発明はまたCTO及び別の薬剤を含む医薬組成物に関する。前記別の薬剤は、感受性及び有効性を改善しさらに毒性を低下させ、一方、1つ以上の遺伝子シグナチャー（EGFR、MEK、VEGF、HDAC、HSP90、ERK、BCR-ABL、p53、ERG1、CEACAM1、ジストニン、又は非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子を含む）を処置哺乳動物由来のex vivo培養発育相毛でCTO応答シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーを追跡監視することにより調節するために組み合わされる。
さらにまた別の特徴では、本発明は、哺乳動物である症状を治療又は予防する方法を提供し、前記方法では、1つ以上の遺伝子シグナチャー（EGFR、MEK、VEGF、HDAC、HSP90、ERK、BCR-ABL、p53、ERG1、CEACAM1、ジストニン、又は非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子を含む）の調節が当該症状の病変又は症候を予防、阻害又は緩和する。前記方法は、単独療法として又はコンビナトリアル療法として治療的に有効な量のCTOの投与、及び処置哺乳動物由来ex vivo培養発育相毛でのCTO応答シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーの追跡監視を含む。
【００３５】
別の特徴では、本発明は増殖性症状を対象で予防又は治療する方法を提供し、前記方法は、治療的に有効な量のCTOを単独で又は別の薬剤と組み合わせて投与する工程、及び処置哺乳動物由来ex vivo培養発育相毛でCTO応答シグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーを追跡監視する工程を含む。遺伝子発現パターンは、種々の病的状態にある組織間の識別又はある疾患（例えば癌）の１つ以上の治療方法に対する応答の予後の予想のために同様に他の組織で樹立することができる。別の模範例は、薬力学マーカーのプラットフォームを開発して、遺伝子発現パターンに基づいて固有で注文誂えの処方物を設計することである。
本発明は、疾患を駆動する分子標的の持続的阻害を維持するため及びいくつかの事例ではサプレッサー遺伝子を誘導して治療成果を最適にするために、組み合わせ治療の合理的な選択及び開発のための模範例を提供する。前記組み合わせ治療は、個々の疾患又は癌の分子異常に関する知識の他に、当該疾患又は癌の分子構成に対して構築される他の標的誘導薬剤とCTOを組み合わせことができること、当該標的誘導薬剤によって阻止される与えられた経路の阻止に適合するフィードバックループ及びこれらのフィードバックループがどのようにして妨害され得るかに関する理解を土台とする。
【００３６】
本発明は、ex vivo培養発育相毛でのトランスクリプトーム査定により、CTO及び慎重に選択された組み合わせ薬剤に応答するシグナリング発生の薬力学バイオマーカーを追跡監視することによって、いくつかの異常により駆動される癌を克服するとともに薬剤耐性の発生を予防又は無効化するために、いくつかの腫瘍原性標的をCTOと一緒に阻害するコンビナトリアル薬剤レジメンを開発する方法におけるシフトを提供する。いくつかの標的誘導薬剤カクテルを用いる従来の多重薬理学的アプローチは不成功に終わり、かつカクテル中の薬剤の累積毒性による新たな問題を提起した。本発明は、感受性及び有効性を維持するために、薬剤耐性メカニズム故に不成功に終わった標的誘導及び非標的誘導薬剤の組合せについて、最初から又は薬剤耐性が認められた後でもそれら薬剤とCTOを組み合わせることによる救済解決を提供する。
本発明の重要な実施態様は、毛サンプルに由来する15−20までの遺伝子のmRNA発現シグナチャーのパネルの開発であり、これを患者から作製したcDNAサンプル上にアフィメトリクスアレーデータによって配置し、未処置及び処置患者の頭皮毛サンプルで弁別的に発現される遺伝子を同定する。
本発明の目的は、対象から得られるex vivoヒト発育相毛でオロト酸カルボキシアミドトリアゾール（CTO）に応答する分子薬力学的バイオマーカーを評価することである。CTOは抗新形成活性を有する経口的に活性な薬剤であり、非電位作動Ca2+チャネルを阻害し、細胞内へのCa2+流入及び細胞内貯蔵所からのCa2+放出の両方を阻止してカルシウム媒介シグナルトランスダクションの崩壊及び血管内皮成長因子（VEGF）シグナリング、多角的チロシンキナーゼシグナリング（AKT、MEK-ERK又はBCR-ABLを含む）の阻害をもたらす。より具体的には、本発明は、ex vivo培養ヒト発育相毛におけるCTO応答のトランスクリプトーム査定によるシグナリング発生の分子薬力学バイオマーカーの評価に関する。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
エピステム社（Epistem Ltd; Manchester, United Kingdom）が開発した抜毛バイオマーカープラットフォームを用いて、ex vivo培養ヒト発育相毛におけるCTOトランスクリプトーム応答を査定した。図1aは全プロセスの工程を記載する。
抜き取った頭皮毛はCTO処理に対する直接的応答の測定のための理想的な代用物である。前記は非侵襲性であり、CTOで処理された患者由来のサンプル（この事例では毛はex vivoで処理する必要がない）もまた用いることができる。成長期（発育相）の頭皮成長毛（高度に血管が形成され小胞を有する）が適切である。
ドナー毛を5人の男性ドナーボランティアから抜き取り、直ちに維持培養液に移し、様々な用量のCTO（2μM、5μM及び10μMのカルボキシアミドトリアゾール（CAI）に相当する）に暴露した。培養は8時間又は24時間維持された。コントロール、例えば1μMのタルセバ(商標)（EGFR阻害剤）及び1μMのBEZ235（PI3K阻害剤）が24時間についてのみ用いられた。mRNA単離又はタンパク質分析のために指定時間に1度だけ培養毛を収集して品質コントロールを担保した。少量のRNA（約500ngまで）を発育相毛の末端球から調製した。代表的なcDNAを当該RNAから調製し、遺伝子発現レベルをマイクロアレー分析によって決定した。ビオチン標識、断片化及び048アフィメトリクスU133プラス2.0アレーとのハイブリダイゼーションを実施した。バイオインフォーマティクス分析を実施してCTO誘発遺伝子発現変化を同定した。全手順は図1に提供される。
得られた結果は全対照について強い転写応答を示す。転写物の高レベル弁別性発現が観察された。タルセバ(商標)は、この閾値のCTO又はBEZ235よりも低弁別プローブを示した。CTOについては、弁別プローブは用量相関性態様で増加した。CTOは、BEZ235又はタルセバ(商標)と比較して全ての用量において発育相毛で転写的に最も強い作用を示した。結果は図1bに詳細に提示される。-100倍から+25倍の範囲の弁別発現を示す毛球トランスクリプトームの生物学的対応変化が臨床対応レベルのCTOで観察された。
【００３８】
［実施例２］
シグナチャースコアは、成長因子遺伝子のシグナチャーについては下記文献（Loboda A., et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics 86:92-96, 2009）により、RAS経路及びPI3Kのシグナチャーについては下記文献（Loboda A et al, BMC Medical Genomics 3: 1-11, 2010）により詳細に記載されたように査定した。これらの参考文献は本明細書に含まれる。それら文献は精巧経路分析（Ingenuity Systems, Redwood City, CA）；http://www.ingenuity.comソフトウェアツールを記載している（前記は成長因子シグナチャー遺伝子の中で統計的に有意なシグナリング経路を同定する）。PAS経路は一般公開データセット及び文献データセット（例えばhttps://array.nci.nih.gov/carray/project/woost-00041）を用いて分析した。
2つの時間で観察されたプローブについて得られた結果は8時間で1440及び24時間で2961であった。高度なオーバーラップが2つのリスト間で観察された（39％、p＜0.0001）。正味の結果は558プローブであった（442の固有のアノテーション付加遺伝子、高用量CTO/24時間で-75から+33倍の範囲）。シグナチャースコアの有意な結果はグラフで表される。プローブリストは表1に提示される。
【００３９】
表1：
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【００４０】
表１のプローブリストを利用し、以下のシグナチャーを構築するために入手可能な参照を用いて種々のシグナチャーの多変量解析を実施して、種々の用量のCTO（2μM、5μM及び10μMのCAIに相当する）の8時間及び24時間における結果を分析した：RASシグナチャー；成長因子シグナチャー；PI3K/mTOR阻害；PI3K阻害；MEK阻害；HSP90阻害；HDAC阻害；EGFR阻害；P53安定化；WNT/β-カテニン阻害；カルシウムシグナリング；CAI阻害； 正規カルシウム阻害；及び非電位シグナリング。
上記分析について得られた結果は図2bに詳細にまとめられている。EGFR、MEK及びHDAC経路はVTOに応答して強力に抑制された。
対照的に、P53随伴経路はCTOに応答して安定化された。
加えて、非電位依存カルシウムシグナリング随伴遺伝子は強力に抑制された。これらの結果は下記で詳細に考察される。
【００４１】
［実施例３］
図3aは、RAS及び成長因子シグナチャーについての多変量シグナチャーの結果を示す。略記すれば、RAS及び成長因子（GFS）で控えめなダウンレギュレーションが観察され、前記阻害は8時間でもっとも明白であった。表2はRAS及びGFSシグナチャーのリストを提供する。
【００４２】
表2：GFS及びRAS：記号
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図3CはPI3KのCTO応答の結果を示す。PI3Kシグナチャーの強い抑制がコントロールBEZ235で観察されたが、CTOでは観察されなかった。
図3dはPI3K/mTORシグナチャーの結果を示す。PI3K/mTORシグナチャーの強い抑制がコントロールBEZ235で観察されたが、CTOでは観察されなかった。
図3eは、8時間及び24時間の全CTO処理におけるMEKiシグナチャーの強い阻害を示す。
【００４３】
［実施例４］
図4aは、CTO処理に対する応答でHDACシグナチャーの弱い抑制を示す結果を提供する。種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるHDAC経路のためのシグナチャースコアが24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較される。
図4bは、CTO処理に対する応答でノッチシグナチャーの抑制はないことを示す。種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるNOTCH経路のためのシグナチャースコアが24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較される。
図4cは、WNTβ-カテニンシグナチャーはCTOへの24時間暴露で控えめな抑制を示すことを提示する結果を記載する。種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるWNTβ-カテニン経路のためのシグナチャースコアが24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較される。
図4dは、CTO処理によるHSP90シグナチャーの強い抑制を示す(前記抑制は用量依存である)。種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるHSP90経路のためのシグナチャースコアが24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較される。
図4eはCTO処理によるEGFRシグナチャーの非常に強い抑制を示し、重要なことに、これは全CTO用量及び時間でタルセバ(商標)の抑制よりも強い。種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるEGFR経路のためのシグナチャースコアが24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較される。
図4fは、全用量のCTO処理によるP53シグナチャーの誘発を示し、前記誘発は24時間の時点でより高い。種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるP53経路のためのシグナチャースコアが24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較される。
【００４４】
［実施例５］
図5aは、24時間におけるBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間のCAI IPA経路のためのシグナチャースコアを示す。CAIによって影響される遺伝子について精巧経路分析（Ingenuity Pathways Analysis（IPA）（Ingenuity Systems, Redwood City, CA）を用いたとき、10μMを除きCTO処理への応答でCAIシグナチャーのいくらかの抑制が観察された。インフォーマティブ遺伝子を選別し変化の方向を決定するために、CTOデータセットでFDA＜0.05及び1.5FCについて29遺伝子をIPAでフィルター選別したとき、14遺伝子セットが得られた。表3はCAI IPAを列挙する。
表3：CAI IPA:記号
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図5bは、24時間におけるBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間のCAI ex vivo経路のためのシグナチャースコアを示す。変化情報の組織特異的方向性とともに、IPA CAIリストの強い用量依存抑制が観察された。表4は14遺伝子セットを列挙する。
【００４５】
表4：記号
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図5cは、24時間におけるBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間のカルシウムシグナリング経路のためのシグナチャースコアを示す。非電位依存カルシウムシグナリング遺伝子が、調節に関する情報を提供する文献のデータセットから同定された。このリストは表5に示される。
表5：
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図5dは、24時間におけるBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間の全遺伝子カルシウムシグナリング経路のためのシグナチャースコアを示す。全遺伝子に対する概算調節方向性が同定された。このリストは表6に提供される。
表6：記号
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図5eは、24時間におけるBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した、種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間のカルシウムシグナリング経路のためのシグナチャースコアを示す。インフォーマティブ遺伝子をフィルター選別するためにANOVAを用いた（FDR＜0.05及び1.5FC）。
非電位依存カルシウム遺伝子の強い抑制が、文献決定調節及びANOVA決定セットの両方でCTO処理を通して認められた。
表7：記号
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【００４６】
図6aは、24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間におけるカルシウムシグナリングの調節を予報するためにKEGGカルシウムシグナリング及びIPAを用いた正規カルシウムシグナリングのシグナチャースコアを示す。
【００４７】
表8：記号
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図6bは、24時間のBEZ235及びタルセバ(商標)と比較した種々の用量のCTOに応答する8時間及び24時間における調節を予報するためにKEGGカルシウムシグナリング及びIPAを用いた正規カルシウムシグナリングex vivoのシグナチャースコアを示す。抑制は6/78正規経路遺伝子のみについて認められた。
表9：遺伝子記号
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【００４８】
［実施例７］
図7aは、CAIシグナチャー（図5b）及び非電位依存（NDV）遺伝子セット（図5c）の両方のANOVAフィルター選別遺伝子セットの合体後の全シグナリング遺伝子のシグナチャースコアを示す。
図7bは、シグナチャーの検分及びPCAの両方によって、種々のCTO用量を区別することができる31のCAI/カルシウム関連遺伝子パネルの結果を示す。
表10は31遺伝子のリストを提供する。
【００４９】
表10：
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様々な用量のCTOへの8時間及び24時間における応答で得られたデータのバイオインフォーマティクス分析の結果は、初期成長応答1遺伝子生成物（EGR1）はCTO処理によって6倍アップレギュレートされたことを示している。対照的に、EGR1はBEZ235及びタルセバ(商標)によって抑制された。EGR1のアップレギュレーションは、一般的には多数の腫瘍サプレッサー経路を調節し下流のアポトーシス事象を誘発する（Liu, C et al Proc Natl Acad Sci 93: 11831-11836, 1996）。
図8はEGR1シグナリング経路を図解する。
【００５０】
［実施例８］
癌胎児性抗原関連細胞接着分子（CEACAM1）（CD66aとしても知られている）は、CTO及びタルセバ(商標)処理の両応答でダウンレギュレートされた。
ジストニンはCTO処理への応答で60倍ダウンレギュレートされた。
TGF-βシグナリングはCTO処理への応答で阻害された。
本発明は本実施例に開示された実施態様によって範囲が限定されるべきではない。当該実施例は本発明の1つの特徴の例示として意図され、機能的に等価のいずれの方法も本発明の範囲内にある。実際、本明細書に提示及び記載した方法に加えて、本発明の多様な改変が前述の記載から当業者には明らかとなろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
当業者は、本明細書に記載した具体的な実施態様と等価のいずれの実施態様も日常的実験を超えない実験を用いて理解又は確認することができよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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