(57)【要約】  本発明は、満腹ホルモン放出活性（例えば、コレシストキニン（ＣＣＫ）及び／又はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）放出活性）を有する新規なポリペプチドに関する。【選択図】なし
2016505640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列又はその変種を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
変種が、配列番号：１と少なくとも約５０％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのコレシストキニン（ＣＣＫ）の放出、グルカゴン様ポリペプチド−１（ＧＬＰ−１）の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
変種が、配列番号：１と少なくとも約７５％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
変種が、配列番号：１と少なくとも約９０％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
変種が、Ｎ末端短縮、Ｃ末端短縮、又はこれらの組み合わせである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）食材；及び
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列又はその変種を含む単離されたポリペプチドを含む、製品。
【請求項７】
食品である、請求項６に記載の製品。
【請求項８】
サプリメントである、請求項６に記載の製品。
【請求項９】
変種が、配列番号：１と少なくとも約５０％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項６に記載の製品。
【請求項１０】
変種が、配列番号：１と少なくとも約７５％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
変種が、配列番号：１と少なくとも約９０％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項１０に記載の製品。
【請求項１２】
変種が、Ｎ末端短縮、Ｃ末端短縮、又はこれらの組み合わせである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発する方法であって、配列番号：１のアミノ酸配列又はその変種を含むポリペプチドに前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項１４】
変種が、配列番号：１と少なくとも約５０％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
変種が、配列番号：１と少なくとも約７５％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
変種が、配列番号：１と少なくとも約９０％同一であり、かつ前記ポリペプチドが有効量でＳＴＣ−１細胞に接触すると、前記ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
変種が、Ｎ末端短縮、Ｃ末端短縮、又はこれらの組み合わせである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月２８日に出願の米国特許仮出願第６１／７５７，５５６号明細書の優先権を主張するものであり、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、全体として、新規なポリペプチド及びその使用に関する。詳細には、本発明の新規なポリペプチドは、満腹ホルモン放出活性（例えば、コレシストキニン（ＣＣＫ）及び／又はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）放出活性）を有する。
【背景技術】
【０００３】
過体重及び肥満の人及び体重増加に関連した疾患の数及び率が、米国及び世界中で増加している。根本的な原因は１つではないが、多くの個人の座りがちな生活様式、及びこれに付随した「ファーストフード」を含む高カロリー食の消費が要因であり得る。殆どの「ファーストフード」は、脂肪分及び／又は糖分が高い傾向にある。
【０００４】
体重増加の流行に対処する１つの実行可能な目標は、ＣＣＫの誘発であり得る。ＣＣＫは、食事として摂取される栄養物、特にタンパク質又は脂質に応答して、胃腸細胞によって血液循環中に放出されるペプチドホルモンである。ＣＣＫは、神経伝達物質、及び中枢及び抹消神経系における神経調節物質として機能する。ＣＣＫは、食後に胃腸管に進入する栄養物（例えば、タンパク質及び脂肪）に応答して、十二指腸及び空腸のＩ型腸内分泌細胞から放出される。放出されると、ＣＣＫは、消化を促進し、食物摂取を調節するように協調される多数の応答を開始し、この応答には、胆嚢からの胆汁排出の媒介、膵臓からの消化酵素放出の調節、幽門括約筋の調節による胃内容物排出の制御、及び迷走神経求心性ニューロンによる中枢神経系へのニューロンシグナル伝達が含まれる。ニューロンＣＣＫは、ドーパミン作動性神経伝達及び不安惹起作用を調節すること、並びに認知及び痛覚に影響を与えることを含め、中枢神経系内の多数の事象を媒介すると考えられる（Ｊ．Ｎ．Ｃｒａｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｃｏｒｗｉｎ，１９９４，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１５：７３１−７５５；Ｎ．Ｓ．Ｂａｂｅｒ，Ｃ．Ｔ．Ｄｏｕｒｉｓｈ，ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｈｉｌｌ，Ｐａｉｎ（１９８９），３９（３），３０７−２８；ａｎｄ  Ｐ．Ｄｅ  Ｔｕｌｌｉｏ，Ｊ．Ｄｅｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｐｉｒｏｔｔｅ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ（２０００），９（１），１２９−１４６）。ＣＣＫは、２つの受容体亜型：ＣＣＫ−Ａ（ＣＣＫ−１）及びＣＣＫ−Ｂ（ＣＣＫ−２）亜型によって、その多様なホルモン及び神経調節機能を媒介することが示されている（Ｇ．Ｎ．Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９１），３１：４６９−５０１）。ＣＣＫ−１及びＣＣＫ−２受容体亜型の両方は、７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに属する。多数の研究により、ＣＣＫが、ＣＣＫ−１受容体によってその満腹効果を媒介することが示唆され、ＣＣＫ−１受容体は、満腹の「感覚」を含む食後の満腹シグナルを迷走神経求心性によって中枢神経系に伝達すると考えられている（Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３（１９８１）ｐｐ．１０３６−１０３７；ａｎｄ  Ｊ．Ｎ．Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５７（１９９１）ｐｐ．１０７６−１０８０）。
【０００５】
ＣＣＫは、胃内容排出の抑制、胃酸分泌の抑制、及び胆嚢収縮の刺激を含む、満腹感を誘発するいくつかの直接的な作用を加えることが示されている。胃内容排出及び腸内消化に対するこれらの直接的な作用を介しても、又は中枢神経系経路を介しても、ＣＣＫは、典型的には、カロリー摂取を少なくする満腹感を誘発する。
【０００６】
体重増加の流行に対処する１つの実行可能な目標は、ＧＬＰ−１の誘発であり得る。ＧＬＰ−１は、多様な効果を有するインクレチンホルモンとして説明されている。ＧＬＰ−１は、１９８４年に発見され、重要なインクレチンであることが見出された（Ｎａｕｃｋ，Ｍ．Ａ．；Ｋｌｅｉｎｅ，Ｎ．；Ｏｒｓｋｏｖ，Ｃ．；Ｈｏｉｓｔ，Ｊ．Ｊ．；Ｗｉｌｌｍｓ，Ｂ．；Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ，Ｗ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９３，３６，７４１−７４４）。ＧＬＰ−１は、グルコース及び脂肪酸に応答して回腸遠位部でＬ細胞によって放出されるが、ペプチドがＧＬＰ−１の放出を直接的に誘発及び／又は調節することが知られている（Ｈｉｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９７：Ｇ６６３−Ｇ６７１）。ＧＬＰ−１は、食後に血液循環に放出され、膵臓でのβ細胞からのインスリンの放出をグルコース依存的に強力に刺激する。ＧＬＰ−１には、インスリン生合成の刺激、膵島に対するグルコース感受性の回復、及びグルコース輸送体ＧＬＵＴ−２及びグルコキナーゼの発現増加の刺激を含む様々なさらなる効果もある。ＧＬＰ−１はまた、β細胞塊の制御、存在するβ細胞の複製及び増殖の刺激、アポトーシスの抑制、及び導管前駆細胞からの新たなβ細胞の新生に対して多数の効果を有し、肝臓でのグルコース生産の低下をもたらす。ＧＬＰ−１の有益な膵臓外の効果、例えば、肝臓脂質分の低減及び心機能の改善に対する直接的な効果も報告されている（Ａｂｕ−Ｈａｍｄａｈ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００９  Ｊｕｎ；９４（６）：１８４３−５２．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｍａｒ  ３１）。腸内では、ＧＬＰ−１は、運動性及び胃内容排出の強力なインヒビターであり、胃酸の分泌を抑制することも知られている。胃内容排出の抑制は、食物摂取の減少及び長期に亘る体重の減少をもたらす（Ｆｌｉｎｔ，Ａ．；Ｒａｂｅｎ，Ａ．；Ａｓｔｒｕｐ，Ａ．；Ｈｏｉｓｔ，Ｊ．Ｊ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖ  １９９８，１０１，５１５−５２０；Ｚａｎｄｅｒ，Ｍ．；Ｍａｄｓｂａｄ，Ｓ．；Ｍａｄｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｈｏｉｓｔ，Ｊ．Ｊ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２００２，３５９，８２４−８３０）。ＧＬＰ−１はまた、食欲を制御する視床下部中枢におけるＧＬＰ−１受容体の作用によって、食物摂取に対する中枢効果を有することも示されている（Ｍａｔｕｒｉｔａｓ．Ｂａｒｂｅｒ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｎｏｖ；６７（３）：１９７−２０２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍａｔｕｒｉｔａｓ．２０１０．０６．０１８．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｌ  ２３）。
【発明の概要】
【０００７】
体重増加の流行及びこれに対処する効果的な手段の不足を踏まえて、摂取することができて体重の減少又は制御を促進する栄養物、容易に入手可能なサプリメント、材料、及び／又は食品が必要とされている。このために、本発明は、満腹ホルモン放出活性（例えば、ＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１放出活性）を有する新規なポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明の一態様は、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出を誘発する能力を有する新規なポリペプチド、及びこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定を包含する。別の態様では、本発明は、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＧＬＰ−１の放出を誘発する能力を有する新規なポリペプチド、及びこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定を包含する。さらなる態様では、本発明は、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫ及びＧＬＰ−１の放出を誘発する能力を有する新規なポリペプチド、及びこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定を包含する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む製品（例えば、食材及び本明細書に記載されるポリペプチドを含む食品、又は本明細書に記載されるポリペプチドを含むサプリメント）を包含する。
【００１０】
さらなる他の態様では、本発明は、細胞、例えば、ＳＴＣ−１細胞と本発明のポリペプチドとの接触により、前記細胞からのＣＣＫの放出を誘発する方法を包含する。さらなる態様では、本発明は、細胞、例えば、ＳＴＣ−１細胞と本発明のポリペプチドとの接触により、前記細胞からのＧＬＰ−１の放出を誘発する方法を包含する。なおさらなる態様では、本発明は、細胞、例えば、ＳＴＣ−１細胞と本発明のポリペプチドとの接触により、前記細胞からのＣＣＫ及びＧＬＰ−１の放出を誘発する方法を包含する。特定の態様では、細胞はＳＴＣ−１細胞である。
【００１１】
なおさらなる他の態様では、本発明は、満腹感を誘発する方法を包含する。満腹感を誘発する方法のさらなる態様では、本発明のポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、細胞からのＣＣＫの放出を誘発する。満腹感を誘発する方法の他のさらなる態様では、本発明のポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、細胞からのＧＬＰ−１の放出を誘発する。満腹感を誘発する方法のなお他のさらなる態様では、本発明のポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、細胞からのＣＣＫ及びＧＬＰ−１の放出を誘発する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】配列番号：１のＣＣＫ放出用量反応曲線を示している。配列番号：１は、固相方法を用いて合成され、説明されるようにＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出を刺激するために使用される。データをロジスティック関数にフィットさせた。回帰データから、ＥＣ５０が、４３μＭであると推定された。
【図２】配列番号：１のＧＬＰ−１放出用量反応曲線を示している。配列番号：１は、固相方法を用いて合成され、説明されるようにＳＴＣ−１細胞からのＧＬＰ−１の放出を刺激するために使用される。データをロジスティック関数にフィットさせた。回帰データから、ＥＣ５０が、１８６μＭであると推定された。
【図３】切断されたペプチドのＣＣＫ放出活性を示している。完全長配列番号：１ペプチドのＮ末端及びＣ末端短縮物が、固相方法を用いて合成され、説明されるようにＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫの放出を刺激するために使用される。データは、３つの独立した実験の結果を示し、完全長ペプチドによって刺激されたＣＣＫ放出活性のパーセントとして表されている。
【図４】切断されたペプチドのＧＬＰ−１放出活性を示している。完全長配列番号：１ペプチドのＮ末端及びＣ末端短縮物が、固相方法を用いて合成され、説明されるようにＳＴＣ−１細胞からのＧＬＰ−１の放出を刺激するために使用される。データは、完全長ペプチドによって刺激されたＧＬＰ−１放出活性のパーセントとして表されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＣＣＫ及びＧＬＰ−１は、満腹感を促進し、胃内容排出を遅くするため、満腹であるという感覚を対象に与える。配列番号：１のアミノ酸配列及びその変種を含む新規なポリペプチドは、細胞、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫ及びＧＬＰ−１の放出を誘発する能力を有する。本発明の新規なポリペプチド及びその変種は、本明細書でより詳細に説明される。
【００１４】
食物の摂取は、食欲及びさらなる食物摂取に対して一過性の抑制効果を与える。食物の全ての特性の中で、全エネルギー含量及び主要栄養素成分（例えば、脂肪、炭水化物、又はタンパク質）は、このような満腹に関連した対象の感覚の主な決定要因であると思われる。膨大な証拠が、３大栄養素が、空腹感及びエネルギー摂取を抑制する程度が異なることを示唆している。タンパク質は、脂肪よりも満足させ、脂肪は、炭水化物よりも満足させることが分かっている。親食用タンパク質に由来する一部の特定のポリペプチド構造が生物学的に活性であるという研究結果により、食物摂取を制御する、従って体重に影響を与えることを目的とした満腹感を誘発する製品（例えば、食品）の開発につながり得るペプチドの研究が促進された。
【００１５】
１．新規なポリペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド
本発明の特定の態様は、配列番号：１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する、又は１００％同一である単離されたポリペプチドに関する。別の特定の態様では、配列番号：１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する、又は１００％同一である本発明のポリペプチドは、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１の放出を誘発する能力も有する。
【００１６】
別の態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列又はその変種を含む、このアミノ酸配列又はその変種から本質的になる、又はこのアミノ酸配列又はその変種からなり、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１の放出を誘発する能力も有する。本発明のポリペプチドを含むポリペプチドの場合には、これらのポリペプチドは、無制限のアミノ酸サイズとしても良いし、又は約１，０００のアミノ酸、約９７５のアミノ酸、約９５０のアミノ酸、約９２５のアミノ酸、９００のアミノ酸、約８７５のアミノ酸、約８５０のアミノ酸、約８２５のアミノ酸、約８００のアミノ酸、約７７５のアミノ酸、約７５０のアミノ酸、約７２５のアミノ酸、約７００のアミノ酸、約６７５のアミノ酸、約６５０のアミノ酸、約６２５のアミノ酸、約６００のアミノ酸、約５９０のアミノ酸、約５８０のアミノ酸、約５７０のアミノ酸、約５６０のアミノ酸、約５５０のアミノ酸、約５４０のアミノ酸、約５３０のアミノ酸、約５２０のアミノ酸、約５１０のアミノ酸、約５００のアミノ酸、約４９０のアミノ酸、約４８０のアミノ酸、約４７０のアミノ酸、約４６０のアミノ酸、約４５０のアミノ酸、約４４０のアミノ酸、約４３０のアミノ酸、約４２０のアミノ酸、約４１０のアミノ酸、約４００のアミノ酸、約３９０のアミノ酸、約３８０のアミノ酸、約３７０のアミノ酸、約３６０のアミノ酸、約３５０のアミノ酸、約３４０のアミノ酸、約３３０のアミノ酸、約３２０のアミノ酸、約３１０のアミノ酸、約３００のアミノ酸、約２９０のアミノ酸、約２８０のアミノ酸、約２７０のアミノ酸、約２６０のアミノ酸、約２５０のアミノ酸、約２４０のアミノ酸、約２３０のアミノ酸、約２２０のアミノ酸、約２１０のアミノ酸、約２００のアミノ酸、約１９０のアミノ酸、約１８０のアミノ酸、約１７０のアミノ酸、約１６０のアミノ酸、約１５０のアミノ酸、約１４０のアミノ酸、約１３０のアミノ酸、約１２０のアミノ酸、約１１０のアミノ酸、約１００のアミノ酸、約９０のアミノ酸、約８０のアミノ酸、約７０のアミノ酸、約６０のアミノ酸、約５０のアミノ酸、約４０のアミノ酸、約３０のアミノ酸、約２０のアミノ酸、又は約１５のアミノ酸を上限とするサイズに限定しても良い。
【００１７】
本発明のポリペプチドは変種に関連しているため、本ポリペプチドを基準に、これらの変種は、限定されるものではないが、配列番号：１の挿入、置換、断片化、欠失、Ｃ末端の短縮、及びＮ末端の短縮を含む。特定の態様では、アミノ酸の変化は、性質の変化が小さい、即ち、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に著しい影響を与えない挿入、置換、断片化、欠失などである（例えば、保存的な置換；典型的には、１〜約１０のアミノ酸の小さい欠失；小さいアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長、例えば、アミノ末端のメチオニン残基；小さいリンカーペプチド；又は正味電荷もしくは別の機能を変更することによって精製を促進する小さい伸長、例えば、ポリヒスチジンタグ、抗原エピトープ、もしくは結合ドメイン）。
【００１８】
他の実施形態では、変種は、ポリペプチドの物理化学的特性は変更されるが、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１の放出の誘発活性は変更されないような性質である。例えば、変種は、改善された可溶性、増加した構造特異性、又は促進された生物活性を有し得る。
【００１９】
本発明の変種に関連して、ポリペプチドが必要な活性を有するか否かを決定するために本明細書で説明されるアッセイを用いて、このポリペプチドを試験した。例えば、Ｎ末端又はＣ末端短縮の場合、これらのポリペプチドは、ＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１活性について試験される。変種及び変種を使用する試験の例は、本明細書に含まれる実施例に記載される。
【００２０】
置換によるポリペプチド変種を教示する本発明の特定の態様では、残基は、例えば、配列番号：１におけるアミノ酸を、自然に存在する又は存在しない別のアミノ酸で置換することによって変化する。自然に存在するアミノ酸として、例えば、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、及びバリン（Ｖ）が挙げられる。
【００２１】
本発明の特定の態様では、置換は保存的な置換である。他の特定の態様では、置換は、非保存的な置換である。保存的及び非保存的なアミノ酸置換は、当業者には公知である。一般に、保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸を、化学構造や電荷などが類似の別のアミノ酸で置換し、ポリペプチド機能にあまり影響を及ぼさない。これに対して、非保存的なアミノ酸置換は、あるアミノ酸を、化学構造や電荷などが類似していない別のアミノ酸で置換する。
【００２２】
さらに例示するために、保存的な置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、及びメチオニン）の群の中での置換である。例えば、塩基性アミノ酸は、別の塩基性アミノ酸で置換することができ、酸性アミノ酸は、別の酸性アミノ酸で置換することができ、極性アミノ酸は、別の極性アミノ酸で置換することができ、その他も同様である。一般に特定の活性を変更しないアミノ酸置換は、当分野で公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。非保存的置換は、自然では保存されない置換と考えることができる。
【００２３】
断片化、欠失、短縮などによるポリペプチド変種を教示する本発明の特定の態様では、アミノ酸残基が配列番号：１から除去される。このような断片化、欠失、短縮などは、得られるポリペプチドの活性に実質的に悪影響を与えない。特定の態様では、配列番号：１のＣ末端、Ｎ末端、又はＣ末端及びＮ末端の両方の短縮は、本発明の一部である。他の特定の態様では、これらの短縮されたポリペプチドは、実質的に活性（即ち、ＣＣＫ、ＧＬＰ−１、又はＣＣＫ及びＧＬＰ−１の誘発活性）に悪影響を与えることなく、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つの多くのＮ末端アミノ酸が除去され得る。さらなる他の特定の態様では、これらの短縮されたポリペプチドは、実質的に活性（即ち、ＣＣＫ、ＧＬＰ−１、又はＣＣＫ及びＧＬＰ−１の誘発活性）に悪影響を与えることなく、５つもの、４つもの、３つもの、２つもの、又は１つのＣ末端アミノ酸が除去され得る。本明細書に記載されるこれらの短縮は、驚くべきことに、予期せず活性の増大を実証する。本発明の例示的な短縮ポリペプチドは、例えば、配列番号：２〜６及び８〜１０として提供され、実施例３及び４でさらに詳細に説明される。特定の態様では、配列番号：１の短縮されたポリペプチドは、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１ｋＤａ、約１．１ｋＤａ、約１．２ｋＤａ、約１．３ｋＤａ、約１．４ｋＤａ、又は約１．５ｋＤａのサイズである。
【００２４】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関連する。当業者には公知であり、かつ理解されるように、様々な異なるポリヌクレオチドが、遺伝子コードの縮重の結果として所与のアミノ酸配列をコードする。現在のポリヌクレオチドの一例は、配列番号：１４である。遺伝子コードの縮重に関連して上で述べられたように、本発明のポリヌクレオチドは、等価のポリヌクレオチド、即ち、配列は異なるが同じポリペプチドをコードするコドン縮重配列を含む。これらのポリヌクレオチド配列は、当業者によって決定され得る。
【００２５】
本明細書に記載される本発明のポリペプチドの知識により、本発明の様々なポリペプチドをコードする多数の部分又は完全長ポリヌクレオチド配列、例えば、ｃＤＮＡ及び／又はゲノムクローンを作製することが可能である。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。これらのプライマーは、典型的には、複数の縮重位置を含む。当分野で公知の標準的な技術を使用して、本発明の様々なポリヌクレオチド配列を決定することができる。
【００２６】
ポリペプチドの生産方法は、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の時点で公知の任意のポリペプチドの生産方法を利用することができ、後に開発される方法も利用することができる。
【００２７】
例えば、本発明のペプチドは、目的のポリペプチドのコーディング配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトラスフェクトすることによって作製することができる。発現ベクター又は組換えプラスミドは、宿主細胞における複製及び発現、及び／又は宿主細胞からの分泌を制御することができる従来の調節制御配列に結合されて機能するように、本発明のポリペプチドのコーディング配列を配置することによって作製される。調節配列は、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、及び他の既知のタンパク質に由来し得るシグナル配列を含む。選択された宿主細胞を従来の技術によってベクターでトランスフェクトして、トランスフェクト宿主細胞を作製する。次いで、このトランスフェクト細胞を従来の技術によって培養して、本発明の操作されたポリペプチドを作製する。
【００２８】
本発明の方法及びポリペプチドの作製に利用されるクローニング及びサブクローニングステップに適したベクターは、当業者が選択することができる。例えば、従来のｐＵＣシリーズのクローニングベクターを使用することができる。１つのベクター、ｐＵＣ１９が市販されている。加えて、容易に複製することができ、多数のクローニング部位及び選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、操作が容易である任意のベクターを、クローニングに使用することができる。従って、クローニングベクターの選択は、本発明の限定因子ではない。
【００２９】
発現ベクターは、異種ＤＮＡ配列の発現を増幅させるのに適した遺伝子、例えば、哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）によっても特徴付けることができる。他のベクター配列として、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）及びβグロブリンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）に由来するポリＡシグナル配列が挙げられる。本明細書で有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術によって合成することができる。
【００３０】
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、及びシグナル配列などは、市販品もしくは天然の供給源から得ても良いし、又は選択された宿主での組換えＤＮＡの産物の発現及び／又は分泌を誘導するのに使用される公知の技術によって合成しても良い。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、及び真菌の発現に用いられる、様々なタイプが当分野で公知である、他の適切な発現ベクターも、このために選択することができる。
【００３１】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのコーディング配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞株も包含する。これらのクローニングベクターのクローニング及び他の操作に有用な宿主細胞も従来通りである。しかしながら、大腸菌の様々な株の細胞を、クローニングベクターの複製及び本発明のポリペプチドの作製の他のステップに使用することができる。発現に適した宿主細胞又は細胞株として、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（例えば、ＤＧ４４）、ＣＯＳ、ＨＥＫ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、及び骨髄腫細胞が挙げられる。ヒト細胞を使用することができ、従って、分子をヒト糖鎖付加パターンを用いて修飾することができる。あるいは、他の真核細胞株を利用することができる。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、並びにポリペプチドの作製及び精製に適した宿主細胞及び方法の選択は当分野で公知である。
【００３２】
細菌細胞が、本発明のポリペプチドの発現に適した宿主細胞として有用であることを証明することができる（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）を参照）。しかしながら、細菌細胞で発現されるポリペプチドが、折り畳まれていない、もしくは不適切に折り畳まれた形態、又は非グリコシル化形態になる傾向にあるため、細菌細胞で産生されるどの組み換えポリペプチドも、活性の維持についてスクリーニングしなければならないであろう。細菌細胞によって発現される分子が、適切に折り畳まれた形態で産生される場合は、その細菌細胞は、望ましい宿主であり得る、又は、代替の態様では、分子を細菌宿主で発現させ、その後に再び折り畳むことができる。例えば、発現に使用される大腸菌の様々な株は、バイオテクノロジーの分野では宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及び他の杆菌などの様々な株も、この方法に利用することができる。
【００３３】
必要に応じて、当業者に公知の酵母細胞株は、宿主細胞、及び昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ及び鱗翅目、並びにウイルス発現系としても利用可能である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８：２７７−２９８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）及びこの文献で言及される参考文献を参照されたい。
【００３４】
ベクターを作製できる一般的な方法、本発明の宿主細胞を作製するために必要なトランスフェクション法、及びこのような宿主細胞から本発明のポリペプチドを作製するために必要な培養法は全て従来の技術とすることができる。典型的には、本発明の培養法は、通常は懸濁液中での細胞の無血清培養による無血清培養法である。同様に、作製されたら、硫酸アンモニウム沈殿法、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、及びゲル電気泳動法などを含む当分野の標準的な方法に従って、本発明のポリペプチドを細胞培養内容物から精製することができる。このような技術は、当業者の技術の範囲内であり、本発明を限定するものではない。本発明のポリペプチドの発現のなお別の方法は、例えば、米国特許第４，８７３，３１６号明細書に記載されているトラスジェニック動物での発現を利用することができる。これは、哺乳動物に遺伝子組み換え的に取り込まれると、雌がその乳に所望の組換えタンパク質を産生することを可能にする動物のカゼインプロモーターを使用する発現系に関する。
【００３５】
所望の方法で発現されたら、次に、作製されたポリペプチドは、本明細書に記載される適切なアッセイの使用により活性が調べられる。
【００３６】
本発明のポリペプチドはまた、有機合成、例えば、固相合成によって高純度かつ大量に生産することもできる。ポリペプチド合成の技術は、当分野で周知である。例えば、Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ８５（１４）：２１４９−２１５４，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：１６１−２１４，Ａｔｈｅｒｔｏｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ（１９７９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．８  ３５１、米国仮特許出願第２００９／０２９２１０８号明細書及び同第２００９／０２２１７９２号明細書、並びにこれらの中の参考文献は、ポリペプチドの合成について述べている。加えて、本ポリペプチドは、自動合成機を用いて合成することができる。もちろん、ポリペプチドは、本ポリペプチドの販売業者から容易に入手することもできる。例示的な方法は、以下の節に記載される。０．２４ｍｍｏｌ／ｇの負荷の１００ｍｇのＴｅｎｔａｇｅｌ−Ｓ−ＲＡＭ（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）を、市販のポリペプチド合成装置（ＰＳＭＭ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ））に移し、そこで、本ポリペプチド配列が、カルボジイミド／ＨＯＢｔ法に従って段階的に構築される。ＦＭＯＣアミノ酸誘導体を、５倍等モル過剰のジ−イソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ−イソプロピル−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の添加により予め活性化し、反応容器に移してから、樹脂支持体と３０分間混合した。例えば、ＤＭＦの添加及び１分間の完全な混合によって洗浄ステップを行った。例えば、ＤＭＦ中のピペリジンの添加及び４分間の完全な混合によって切断ステップを行った。個々の反応液及び洗浄液の除去は、反応容器の底部フリットを介してこれらの溶液を押し出すことによって行った。アミノ酸誘導体ＦＭＯＣ−Ａｌａ、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、ＦＭＯＣ−Ｉｌｅ、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ、及びＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｏｒｐｅｇｅｎ）が利用される。合成が終了したら、樹脂を乾燥させる。次にポリペプチドアミドを、トリフルオロ酢酸／ＴＩＳ／ＥＤＴ／水（９５：２：２：１、容積）を用いて室温で２時間処理して切断する。濾過、溶液の濃度、及び氷冷ジエチルエーテルの添加による沈殿により、粗生成物が固体として得られる。次いで、本ポリペプチドを、１２ｍｌ／分の流量で４０分間、６０％アセトニトリルに対して５の勾配で、０．１％ＴＦＡ中のＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、溶離液を、ＵＶ検出器によって２１５ｎｍで評価する。個々の画分の純度を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ及び質量分析によって決定する。
【００３７】
本発明のポリペプチドはまた、タンパク質加水分解物から分画することもできる。タンパク質加水分解物を生成及び分画する方法は当分野で公知である（例えば、付与前米国特許出願公開第２０１１０２５７０８７号明細書を参照されたい）。例えば、ポリペプチドは、大豆タンパク質加水分解物から分画することができる。他の態様では、ポリペプチドは、オオムギ、アブラナ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウマメ、ジャガイモ、米、コムギ、動物、卵、又はこれらの組み合わせに由来するタンパク質加水分解物から分画することができる。代替の態様では、ポリペプチドは、異なるタンパク質加水分解物の組み合わせから分画することができる。例えば、ポリペプチドは、トウモロコシタンパク質加水分解組み合わせと組み合わせられた大豆タンパク質加水分解物から得ることができる。あるいは、大豆タンパク質加水分解物は、カノーラタンパク質加水分解物及びコムギタンパク質加水分解物と組み合わせることができる。なお他の態様では、ポリペプチドは、大豆と、オオムギ、アブラナ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウマメ、ジャガイモ、米、コムギ、動物、乳製品、及び卵からなる群から選択される少なくとも１つの他のタンパク質供給源との組み合わせに由来するタンパク質加水分解物から分画することができる。
【００３８】
ＩＩ．ＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１を誘発する方法及び満腹感を誘発する方法
特定の態様では、本発明は、細胞からのＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１の放出を誘発する方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本明細書に記載される有効量のポリペプチドに接触させるステップを含む。用意されるポリペプチドは、任意の許容可能な形態（例えば、食品、サプリメントなどの成分の一部として）とすることができる。ＣＣＫ及びＧＬＰ−１の放出の決定は、当分野で公知である。例えば、適切なサンプル（例えば、細胞培地及び血清など）を、ＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１の増加が見られるか否かを決定するために本発明のポリペプチドに曝露される前及び後で測定することができる。これらの測定は、例えば、市販のイムノアッセイを用いて行われる。
【００３９】
他の特定の態様では、本発明は、本明細書に記載される有効量のポリペプチドを用意するステップを含む、満腹感を誘発する方法を提供する。用意されるポリペプチドは、任意の許容可能な形態（例えば、食品、サプリメントなどの成分の一部として）とすることができる。満腹感が誘発されたか否かの決定は、当分野で公知である。例えば、バイオマーカー（例えば、ＣＣＫ及びＧＬＰ−１）を、満腹感を測定する手段として使用することができる。なぜなら、バイオマーカーは、ビジュアルアナログスケールを含むより主観的な評価基準であり得るためであり、このビジュアルアナログスケールは、多くの場合、各端部に両極端（例えば、「私はかつてないほど空腹である」−「私は全く空腹ではない」）を示す言葉が付された（様々な長さの）線から構成される。
【００４０】
ＩＩＩ．本発明のポリペプチドを含む製品
本発明の特定の態様は、食材及び本明細書に記載されるポリペプチドを含む食品を包含する。食材と組み合わせるための特定のポリペプチドの選択は、所望の食品によって異なり得、かつ所望の食品によって異なることになる。
【００４１】
適切な食材の選択は、所望の食品によって異なることになる。食材は、植物由来の材料（例えば、野菜ジュース、穀物製品など）、動物由来の材料（例えば、乳製品、卵製品など）、又は植物由来の材料又は動物由来の材料などから単離される生体材料（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質など）であり得る。
【００４２】
本発明の特定の食品としては、例えば、ホット又はコールドシリアル、スナックバー、焼き菓子、飲料、ヨーグルト、デザート、スナック、パスタ、及び肉（家禽及び魚介類を含む）が挙げられる。
【００４３】
本発明の一態様では、食品は、液体又は乾燥物が配合された飲料である。液体又は乾燥物が配合された飲料の非限定の例として、フルーツジュース、果汁飲料、フルーツ味の飲料、野菜飲料、健康ドリンク、栄養ドリンク、スポーツドリンク、豆乳飲料、フレーバー大豆飲料、ライスミルク系飲料、フレーバー乳飲料、ヨーグルト系飲料、特殊調製粉乳、茶系飲料、コーヒー系飲料、食事代替飲料、プロテインシェーク、サプリメント飲料、体重管理飲料、これらの組み合わせ及び乾燥物が配合された飲料が挙げられる。
【００４４】
液体又は乾燥物が配合された飲料を含む食材は、様々であり得、かつ様々となる。適切な食材の非限定の例として、フルーツジュース、野菜ジュース、スキムミルク、低脂肪乳、２％乳、全乳、クリーム、無糖練乳、ヨーグルト、バターミルク、チョコレート、ココアパウダー、コーヒー、及び茶などが挙げられる。
【００４５】
飲料製品として、天然及び人工甘味料（例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトデキストリン、スクラロース、アスパルテーム、サッカリン、ステビア、コーンシロップ、蜂蜜、メープルシロップなど）、香料（例えば、チョコレート、ココア、チョコレートフレーバー、バニラ抽出物、バニラフレーバー、フルーツフレーバーなど）、乳化剤又は増粘剤（例えば、レシチン、カラゲナン、セルロースガム、セルロースゲル、デンプン、アラビアゴム、キサンタンゴムなど）、安定剤、脂質材料（例えばキャノーラ油、ひまわり油、高オレイン酸ひまわり油、脂肪パウダーなど）、防腐剤及び抗酸化物質（例えば、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ＴＢＨＱ、ローズマリー抽出物、ビタミンＡ、Ｃ、及びＥ並びにそれらの誘導体、並びに様々な植物抽出物、例えば、カロテノイド、トコフェロール、又は抗酸化特性を有するフラボノイドを含む植物抽出物など）、着色剤、ビタミン、ミネラル、及びこれらの組み合わせをさらに挙げることができる。
【００４６】
本発明の特定の態様では、食品は、食品バー、例えば、グラノーラバー、シリアルバー、栄養バー、食事代替バー、又はエネルギーバーである。
【００４７】
本発明の他の特定の態様では、食品はシリアル系製品である。シリアル系食品の非限定の例として、朝食シリアル、朝食バー、パスタ、パン、焼き製品（例えば、ケーキ、パイ、ロール、クッキー、クラッカー）、及びスナック製品（例えば、チップス、プレッツェルなど）が挙げられる。シリアル系製品の食材は、例えば、コムギ（例えば、漂白小麦粉、全粒小麦粉、小麦胚芽、ふすまなど）、トウモロコシ（例えば、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンスターチなど）、オート麦（例えば、膨化オート麦、オートミール、エンバク粉など）、及び米（例えば、膨化米、米粉、米デンプン）などであり得る。
【００４８】
本発明の別の態様では、食品は、「固体」乳系製品である。適切な「固体」乳系食品の非限定の例として、ハードチーズ製品、ソフトチーズ製品、アイスクリーム製品、ヨーグルト製品、冷凍ヨーグルト製品、ホイップ乳様製品、シャーベットなどが挙げられる。
【００４９】
本発明のさらなる態様では、食品は、肉製品又は肉類似製品である。肉食品の例として、例えば、加工肉、ひき肉、及び全筋肉製品が挙げられる。肉の材料は、動物の肉又は魚介類の肉であり得る。肉類似品は、動物又は魚介類の肉の食感を模した食感の野菜又は乳タンパク質であり得る。肉類似品は、肉製品における肉材料の一部又は全てとすることができる。
【００５０】
本発明の別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドを含む製品はサプリメントである。
【００５１】
ＩＶ．定義
特段の記載がない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。一般的な科学技術用語の定義は、例えば、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐによって出版されたＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓによって出版されたＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；及びＷｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃによって出版されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ；及び他の同様の技術文献に見いだすことができる。
【００５２】
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語に関連して本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書で使用される「別の」という語は、少なくとも２番目以降を意味し得る。さらに、文脈に規定されない場合を除き、単数形は複数形を含むべきであり、複数形は単数形を含むべきである。
【００５３】
本明細書で使用される「約」とは、明確に示す、示さないにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値のことである。「約」という語は、一般に、当業者が、記載された値と等価物（例えば、同じ機能又は結果を有する）と見なし得る数値範囲（例えば、記載された値の±５〜１０％）のことである。場合によっては、「約」という語は、最も近い有効数字に四捨五入された数値を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」並びにその全ての形及び時制（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」を含む）は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「〜によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包括的又は非限定の語であり、かつ追加的な列挙されていない要素、ステップ、又は成分を一切排除するものではない。本明細書で使用される「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」並びにその全ての形及び時制（例えば、〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）及び〜からなった（ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ）を含む）は、限定の語であり、記載されていない全ての要素、ステップ、又は成分を排除するものである。本明細書で使用される「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」並びにその全ての形及び時制は、本発明の範囲を、既定の要素、ステップ、又は成分、及び請求される発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えないものに限定する。出願者は、特定の実施形態が、移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用することには注意を払う。出願者がこの移行句を使用する場合は必ず、移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」又は「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」も、出願者によって企図されたものであり、本発明の一部である。
【００５５】
本明細書で使用される「有効量」は、細胞（例えば、ＳＴＣ−１細胞）と接触させると細胞からのＣＣＫの放出、ＧＬＰ−１の放出、又はこれらの組み合わせを誘発することができる本発明のポリペプチドの量を意味する。例えば、有効量は、実施例で使用される配列番号：１及びその変種の量及び濃度として例示され、当業者が、状況（例えば、非常に複雑な生存している多細胞生物と比較した、単離された細胞）に応じて調整することができる。
【００５６】
本明細書で使用される「食品」は、タンパク質、炭水化物、及び／又は脂肪を含む製品を意味し、消費されることが目的であり、（例えば、成長、修復、及び生命の維持に必要なプロセスであり、かつエネルギーを供給する）栄養又は滋養物の供給源として使用される。例えば、食品として、限定されるものではないが、ホット又はコールドシリアル、バー（例えば、グラノーラバー、シリアルバー、栄養バー、食事代替バー、又はエネルギーバー）、焼き菓子、飲料（例えば、液体及び乾燥物が配合された飲料）、ヨーグルト、デザート、スナック、パスタ、家禽及び魚介類を含む肉（例えば、加工肉、ひき肉、及び全筋肉）、シリアル系製品（例えば、朝食シリアル、朝食バー、パスタ、パン、焼き製品（例えば、ケーキ、パイ、ロール、クッキー、クラッカー）、及びスナック製品（例えば、チップス、プレッツェルなど）、及び乳系製品（例えば、ハードチーズ、ソフトチーズ、アイスクリーム、ヨーグルト、フローズンヨーグルト、ホイップ乳様製品、シャーベットなど）が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用される「単離された」又は「精製された」は、天然では付随する少なくとも１つの要素から取り出されたポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる決定によると、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、又は少なくとも９５％の純度であり得、ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動法による決定によると、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、又は少なくとも９５％の純度であり得る。
【００５８】
本明細書で使用される「サプリメント」は、カロリー全体とは対照的に、特定の栄養素又は他の分子を提供することによって食事を補うことを目的とする組成物を意味する。例えば、サプリメントは、本発明のポリペプチドを提供する固体、半固体、又は液体形態（例えば、タブレット又はカプセル型）とすることができる。本発明のポリペプチドに加えて、サプリメントは、以下の品目のいずれか１つ以上を含み得る：ビタミン、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、必須脂肪酸、及び従来の他の物質又はサプリメントとして考えられ得るもしくはサプリメントに使用され得る他の物質。
【００５９】
本明細書で使用される「変種」は、配列番号：１として提供される配列と比較すると異なるが、それでも配列番号：１の一部を含む配列を意味する。本発明のポリペプチドに関連した変種は、例えば、ＳＴＣ−１細胞からのＣＣＫ及び／又はＧＬＰ−１の放出を誘発することもできる。本発明の変種は、限定されるものではないが、配列番号：１の挿入、置換、断片化、欠失、Ｃ末端短縮、及びＮ末端短縮を含む。
【実施例】
【００６０】
Ｖ．実施例
実施例１．ＣＣＫ活性
配列番号：１を化学的に合成した。ＣＣＫ放出活性をアッセイするために、配列番号：１をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。次いで、この溶液を、ｄ−ＰＢＳで０．００２〜４ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、Ｄ−ＰＢＳとダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ−高グルコース）とが１：１の比の培地にＳＴＣ−１細胞（継代２５〜２８）を添加し、細胞と共に３７℃（９９°Ｆ）、５％ＣＯ２レベルで４時間インキュベートした。配列番号：１を含む溶液を、０．００１〜２ｍｇ／ｍｌの様々な濃度で細胞に添加して用量反応曲線を作成した。
【００６１】
インキュベーション期間の後に、ＳＴＣ−１細胞によって培地に放出されたＣＣＫの濃度を、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡの市販のＣＣＫ検出用イムノアッセイキット（カタログ番号：ＥＫ−０６９−０４）を用いてアッセイした。０．４〜１０００ｐｇ／ウェルの濃度範囲をカバーする標準曲線を用いて製造者の取扱説明書に従ってアッセイを行った。４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【００６２】
図１は、配列番号：１についてのＣＣＫ放出用量応答を示している。それぞれ試験された濃度の配列番号：１から得られたＣＣＫの量を、ペプチドの対数濃度に対してプロットした。次いで、用量応答曲線を、ＯｒｉｇｉｎＬａｂグラフ化ソフトウェアを用いてデータをロジスティック関数にフィッティングすることによって作成した。ＥＣ50をフィットデータから推定し、４３μＭであることが分かった。
【００６３】
実施例２．ＧＬＰ−１活性
配列番号：１を化学的に合成した。ＧＬＰ−１放出活性をアッセイするために、配列番号：１をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。この溶液を、Ｄ−ＰＢＳで０．００２〜４ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、Ｄ−ＰＢＳとダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ−高グルコース）とが１：１の比の培地にＳＴＣ−１細胞（継代２５〜２８）を添加し、細胞と共に３７℃（９９°Ｆ）、５％ＣＯ２レベルで２時間インキュベートした。配列番号：１を含む溶液を、０．００１〜２ｍｇ／ｍｌの様々な濃度で細胞に添加して用量応答曲線を作成した。
【００６４】
インキュベーション期間の後に、ＳＴＣ−１細胞によって培地に放出されたＧＬＰ−１の濃度を、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡの市販のＧＬＰ−１検出用イムノアッセイキット（カタログ番号：ＥＫ−０２８−１１）を用いてアッセイした。０．４〜１０００ｐｇ／ウェルの濃度範囲をカバーする標準曲線を用いて製造者の取扱説明書に従ってアッセイを行った。４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【００６５】
図２は、配列番号：１についてのＧＬＰ−１用量応答曲線を示している。それぞれ試験された濃度の配列番号：１から得られたＧＬＰ−１の量を、ペプチドの対数濃度に対してプロットした。次いで、用量応答曲線を、ＯｒｉｇｉｎＬａｂグラフ化ソフトウェアを用いてデータをロジスティック関数にフィッティングすることによって作成した。ＥＣ50をフィットデータから推定し、１８６μＭであることが分かった。
【００６６】
実施例３．配列変種がＣＣＫ活性を実証する
配列番号：１のＣ末端及びＮ末端短縮変種を化学的に合成して、ＣＣＫ放出活性についてアッセイした。各変種を、実施例１に記載された方法を用いて、２ｍｇ／ｍｌでＣＣＫ活性についてアッセイした。これらのアッセイの結果は図３に示されている。ペプチド変種は表１に示されている。
【００６７】
表１
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【００６８】
いずれの場合も、ペプチド変種は、様々な量のＣＣＫ放出活性を実証した。最初の５つのＮ末端アミノ酸の順次短縮は、最初の３つのＣ末端アミノ酸の順次短縮と同様に、完全長のペプチドよりも有意に高い活性を実証した（図３を参照）。
【００６９】
実施例４．配列変種がＧＬＰ−１活性を実証する
配列番号：１のＣ末端及びＮ末端短縮変種を化学的に合成して、ＧＬＰ−１放出活性についてアッセイした。各変種は、実施例２に記載された方法を用いて、２ｍｇ／ｍｌでＧＬＰ−１活性についてアッセイした。これらのアッセイの結果は図４に示されている。ペプチド変種は表１に示されている。
【００７０】
いずれの場合も、ペプチド変種は、様々な量のＧＬＰ−１放出活性を実証した。最初の５つのＮ末端アミノ酸の順次短縮は、最初の３つのＣ末端アミノ酸の順次短縮と同様に、完全長のペプチドよりも有意に高い活性を実証した（図４を参照）。
【００７１】
参考文献
本明細書で言及及び／又は引用された全ての特許及び刊行物は、それぞれの刊行物が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられるように具体的かつ個々に記されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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