(57)【要約】  方法は、複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを少なくとも１つの微生物菌株を潜在的に含む液体試料と接触させる工程；カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分と液体試料の少なくとも一部分とを分離する工程；及び、少なくとも１つの微生物菌株が非特異的に結合する可能性において磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程；を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを少なくとも１つの微生物菌株を潜在的に含む液体試料と接触させる工程と、
前記液体試料の少なくとも一部分から前記カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分を磁気分離する工程と、
前記少なくとも１つの微生物菌株が前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記超常磁性ナノクラスターは、高温加水分解によって合成された超常磁性ナノクラスターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記超常磁性ナノクラスターは、水熱合成超常磁性ナノクラスターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分は、合成方法の結果として、前記ナノクラスター表面上に接触可能なカルボキシル官能基を本質的に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターの前記カルボキシル官能基は、カルボキシル基を含むポリマー材料によってもたらされ、前記ポリマー材料は、前記超常磁性ナノクラスターを合成するのに使用する反応混合物中でもたらされ、前記ポリマー材料は、磁気分離工程及び検定工程中、前記合成した超常磁性ナノクラスターと結合したままである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターの前記カルボキシル官能基は、カルボキシル基を含むモノマー材料又はオリゴマー材料の重合によってもたらされ、前記モノマー材料又は前記オリゴマー材料は、前記超常磁性ナノクラスターを合成するのに使用する反応混合物中でもたらされ、前記超常磁性ナノクラスターの合成中に重合してカルボキシル基を含むポリマー材料を形成し、前記磁気分離工程及び検定工程中、前記合成した超常磁性ナノクラスターと結合したままである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記カルボキシル官能基は、アクリル酸ナトリウムの重合の反応生成物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、シリカコーティングされた超常磁性ナノクラスターを含み、前記シリカコーティングの表面は、カルボキシル基で官能化されている、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボキシル基は、前記シリカコーティングの表面に共有結合している分子上にあるＥＤＴＡから誘導されたカルボキシル基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記シリカコーティングの表面に共有結合している前記分子は、Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸と前記シリカコーティングのヒドロキシル基との反応生成物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体試料は、水性試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体試料は、１つ以上の食物から誘導される複合半固体混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの微生物菌株はバクテリア菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの微生物菌株は大腸菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの微生物菌株はリステリア・モノサイトゲネス菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの微生物菌株が前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターの検定は、培地に基づいた方法、顕微鏡及び他の撮像方法、遺伝子学的検出方法、免疫学的検出方法、及びこれらの組み合わせから選択される方法によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの微生物菌株が前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターの検定は、前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターを培地に配置し、ＡＴＰの存在に関して前記培地を検査する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの微生物菌株が前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターの検定は、前記磁気分離した超常磁性ナノクラスターを増殖培地に播種する工程と、増殖培地を培養する工程と、増殖培地上で増殖するバクテリアコロニーの存在、不在、又は数を判定する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記超常磁性ナノクラスターは、任意の特定の微生物菌株に特異的に結合できるいかなる置換基をも含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記超常磁性ナノクラスターは、約５０〜約２００ナノメートルの平均直径を集合的に示し、各超常磁性ナノクラスターは、約５〜約２０ナノメートルの平均直径のマグネタイトの単一ドメインナノ粒子の集合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記超常磁性ナノクラスターを前記液体試料と接触させる工程中、及び前記液体試料の少なくとも一部分から前記超常磁性ナノクラスターを磁気分離する工程中、前記超常磁性ナノクラスターは実質的にそのままであって、それらのカルボキシル基は、前記超常磁性ナノクラスター上の適切な場所に実質的にあり続ける、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記超常磁性ナノクラスターは、いかなる高分子量非極性有機ポリマー材料によっても少なくとも部分的にコーティングされない、内部に埋め込まれない、及び／又は封入されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の前記複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを含み、請求項１に記載の前記方法を実行するための説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
様々な臨床試料、食物試料、環境試料、又は他の試料において、細菌又は微生物の存在を検定することは望ましいことが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
広範な概要において、複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを少なくとも１つの微生物菌株を潜在的に含む液体試料と接触させる工程と、液体試料の少なくとも一部分からカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部を磁気分離する工程と、少なくとも１つの微生物菌株が非特異的に結合していたことの証拠として磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程と、を含む方法が本明細書に開示される。
【発明を実施するための形態】
【０００３】
本明細書において、ある特性又は属性に対する修飾語として用いられる「概ね」という用語は、特に定めのない限り、その特性又は属性が当業者により直ちに認識されるものであるが、絶対的な精度又は完全な一致を必要としないことを意味する（例えば、定量化可能な特性の場合、＋／−２０％の範囲内）。特に定めのない限り、「実質的には」という用語は、高い程度の近似（例えば、定量化可能な特性の場合、＋／−１０％の範囲内）を意味するが、この場合もやはり絶対的な精度又は完全な一致を必要としない。同じ、等しい、均一、一定、厳密になどの用語は、絶対的な精度又は完璧な符号を要求するのではなく、特定の環境に適応する通常の許容範囲内又は測定誤差内にあることが理解される。直径とは、球体の直径を意味し、又は不規則形状体においては、その不規則形状体と同体積を有する球体の直径を意味する。（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸塩などの用語には、参照される項目のアクリル酸塩及びメタアクリル酸塩の両方が包含される。
【０００４】
微生物菌株が存在し得る液体試料から少なくとも１つの微生物菌株を分離する方法が本明細書に開示される。方法は、カルボキシル官能基を表面上に含む超常磁性ナノクラスターに依存しており、カルボキシル官能基は、存在する場合、微生物に非特異的に（例えば、個別に、及び／又は２つ、３つ、４つ又はそれ以上の群に）結合し得る。次に、超常磁性ナノクラスターは、液体試料から磁気分離され得る。超常磁性ナノクラスター（潜在的に、非特異的に結合する微生物を担持する）が液体試料から分離された後、ナノクラスターは、少なくとも１つの微生物菌株が非特異的に結合していたことの証拠として検定され得る。
【０００５】
超常磁性とは、一次粒径が単一（磁性）ドメイン制限（例えば、マグネタイトにおいておよそ３０ナノメートル）よりも小さい一次ナノ粒子で構成される強磁性材料又はフェリ磁性材料を意味する。外部印加磁場の存在下、かかる粒子は、従来の常磁性材料よりもはるかに高い磁化率を示し得る。しかしながら（これらの一次粒径が非常に小さいため）、外部印加磁場の不在下では、熱効果がいかなる磁気効果をも越えるため、粒子は、総体的に永続する磁気的特性を示さない。つまり、外部磁場を取り除くと、超常磁性材料は、いかなる永続的な磁気的特性を示さない（例えば、より大きな粒径の強磁性材料によって示されるであろう）。超常磁性体は、例えば、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、Ｆｅ３Ｓ４などの材料であり得る。
【０００６】
超常磁性ナノクラスターとは、一次ナノ粒子のクラスターとして存在する一次ナノ粒子を意味し、このクラスターは、各々がほぼ永続的な形状及び形態（つまり、ナノクラスターを液体試料と接触させること、液体試料を混合又は撹拌すること（例えば、超音波撹拌）などの作業中及び作業後にそのままである形状及び形態）を含む。したがって、超常磁性ナノクラスターは、共に付着（例えば結合）して安定した構造を形成する一次（単一ドメイン）ナノ粒子（例えば、１０、１００、１０００以上の数を含み得る）で構成される。そのため、かかる超常磁性ナノクラスターは、一次ナノ粒子から作成される材料（強磁性流体など）と識別することが可能であり、特定の条件下で一時的に凝集又は結合している場合であっても、例えば超音波撹拌などによって、個々の一次ナノ粒子に分離することが可能である。本明細書に開示される超常磁性ナノクラスター（例えば、全長５０ナノメートル〜約１０００ナノメートルの範囲であり得る）は、永久磁気粒子とも識別され得る（かかる永久磁性粒子と超常磁性ナノクラスターとの寸法が同じであるとしても）。本明細書に開示されている超常磁性ナノクラスターは、有機ポリマー材料（例えば、ポリスチレン）の層又はシェル内に少なくとも一部分が、例えば、埋め込まれる、又は封入される一次ナノ粒子とも識別され得る。いくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される超常磁性ナノクラスターは、カルボキシル官能基を送達するような有機ポリマーを除いて、いかなる有機ポリマー材料（例えば、ポリスチレン）部分（内層又は外層、部分的なコーティングなどのいずれも）も含まない。
【０００７】
特定の実施形態では、超常磁性ナノクラスターは、少なくとも約３０、６０、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００ナノメートルの直径を有し得る。更なる実施形態では、超常磁性ナノクラスターは、少なくとも約１０００、５００、４００、又は２００ナノメートルの直径を有し得る。
【０００８】
カルボキシル官能化とは、液体試料の液体成分に接触可能な（例えば、カルボキシル基が、液体試料の水分子などで溶媒化され得るように暴露されるような）配置及び状態において、超常磁性ナノクラスター（又はその上のタイ層）の表面上にカルボキシル官能基を設けることを意味する。カルボキシルとは、−ＣＯＯＨ基を意味し、かかる基は、例えば、その基が載置される水性環境のｐＨなどに応じて、中性（−ＣＯＯＨ）形態で存在するか、脱プロトン化（−ＣＯＯ−）形態で存在し得ることが理解される。定義によると、カルボキシル基は、アルデヒド、ケトン、イミド、ウレタン、アミド、又はエステルのカルボニル基を含まず（ナノクラスターが液体試料と接触する際に、かかる基（例えば、特定のエステル）が加水分解されて−ＣＯＯ−基となるものを除く）、特に、かかるカルボニル基は、ビーズを形成するのに使用され、ビーズなどの上にコーティングを設けることができる従来の高分子量の有機ポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリアミドなど）中に存在し得る。カルボキシル官能化とは、本明細書で後で議論するように、カルボキシル基が約２ｎｍ以下の厚さの薄層中に存在することを更に、意味する。
【０００９】
本明細書に開示されるように、カルボキシル基は、ナノクラスターを液体試料と接触させる工程中、及び液体試料からナノクラスターを磁気分離する工程中、超常磁性ナノクラスターの表面上の少なくとも実質的に適切な場所にあり続ける（実質的にという用語は、かかる方法において約１０％以下のカルボキシル基がナノクラスターから分離され得ることを意味する）。実際に、かかるカルボキシル官能基は、超常磁性ナノクラスターの洗浄（例えば、ナノクラスター付近の結合していない材料、試薬などを除去するために実行され得る）などの手順中、少なくとも実質的に適切な場所にあり続け得る。いくつかの実施形態では、カルボキシル基のうちの少なくとも一部分は、超常磁性ナノクラスターと共有結合し得る。しかしながら、本明細書に記載される処理の間中に、カルボキシル基が適切な場所にあり続けるのに十分なほど強力に超常磁性ナノクラスターの表面に連結するのであれば、これは厳密には必要ではない。
【００１０】
いくつかの実施形態では、超常磁性ナノクラスターは、ナノクラスターを合成する方法の結果、カルボキシル官能基を本質的に含み得る。この種類のいくつかの実施形態では、カルボキシル基は、カルボキシル基を含むポリマー材料（例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸ナトリウムなど）によってもたらされてよく、このポリマー材料は、超常磁性ナノクラスターを合成するのに使用される反応混合物中に存在し、接触工程及び磁気分離工程中、合成した超常磁性ナノクラスターと結合（及び、あるいは共有結合）したままであり続ける。この種類の他の実施形態では、カルボキシル官能基は、カルボキシル基を含むモノマー材料又はオリゴマー材料の重合化によってもたらされてよく、このモノマー材料又はオリゴマー材料は、超常磁性ナノクラスターを合成するのに使用される反応混合物中に存在し、超常磁性ナノクラスターの合成中に重合してカルボキシル基を含むポリマー材料を形成する。ポリマー材料は、接触工程及び磁気分離工程中、合成した超常磁性ナノクラスターと結合（及び、あるいは共有結合）したままであり続ける。
【００１１】
他の実施形態では、カルボキシル官能基は、ナノクラスターが形成された後、超常磁性ナノクラスターの表面に添加され得る。例えば、カルボキシル官能基は、モノマー、オリゴマー、又は高分子量のポリマー材料上で置換基として存在してよく、つまり、超常磁性ナノクラスターとその表面と結合するように接触する。いくつかの特定の実施形態では、本明細書中、後で詳しく議論されるように、かかる材料は、ナノクラスター（又は、共有結合を促進するために超常磁性ナノクラスターの表面にコーティングされる材料）と共有結合し得る。
【００１２】
超常磁性ナノクラスターは、任意好適な方法により合成され得る。いくつかの実施形態では、超常磁性ナノクラスターは、鉄（例えば、鉄（ＩＩＩ））カチオンを高温下で少なくとも部分的に還元し、溶液から析出して適切な寸法範囲の一次粒径を有するマグネタイトのナノクラスターを形成する、高温加水分解法として知られる一般的な方法によって合成され得る。かかる方法（例えば、Ｇｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００７，１３（２５），７１５３〜７１６１に記載される）は、例えば、キャッピング剤としてポリアクリル酸などを使用し得るが、このポリアクリル酸は、そのままでナノ粒子の表面と少なくとも部分的に結合し、少なくとも部分的に結合したままであり得るため、本明細書中で開示される目的において、カルボン酸官能基をもたらすために市販されている。他の実施形態では、超常磁性ナノクラスターは、水熱（ソルボサーマルと呼ぶこともある）合成として知られる一般的な方法で合成されてよく、ここで、鉄前駆体（例えば、塩化第二鉄六水和物）は、様々な試薬（例えば、エチレングリコール及び／又はジエチレングリコール及び／又は酢酸ナトリウム）を含む溶液中に溶解され、反応を続けるために高温下で加熱及び保持された後に、冷却して反応生成物が得られる。かかる方法（例えば、Ｘｕａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｏｆ  Ｍａｔ．２００９，２１，５０７９〜５０８７に記載され、本目的において、その全内容が本明細書に参照として組み込まれる）において、アクリル酸ナトリウムなどは、例えば、ナノ粒子の成長を制限及び／又は安定化し、粒度を調節するためなどに使用され得る。アクリル酸ナトリウムは、合成方法（例えば、ポリアクリル酸ナトリウムの形成）の間中、少なくともある程度が重合すると思われ、したがってこの合成方法によって、超常磁性ナノクラスターの生成方法の間中、その場で、カルボキシル官能性オリゴマー材料又はポリマー材料が生じ得る。かかるカルボキシル官能基は、本明細書で開示される目的においてこのようにして入手可能である。
【００１３】
本明細書で述べられる理由において、上記の方法は特に有用であり得るが、選択された方法が、カルボキシル官能基を提供するか、又はかかる基がナノクラスターの合成中又は合成後にナノクラスターと結合（例えば付着）する限りは、任意好適な超常磁性ナノクラスターの合成方法が使用され得る（例えば、有機金属熱分解、化学共沈、ミセル合成、レーザー熱分解）。
【００１４】
いくつかの実施形態では、カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、合成物として使用され得る（及び、任意所望の洗浄工程などの後に、試薬又は原料の除去がなされる）。他の実施形態では、超常磁性ナノクラスターの一次ナノ粒子のうちの少なくともいくつかの表面の少なくとも一部分は、ナノクラスターを含むカルボキシル官能基との連結を促進又は向上させ得る材料でコーティングされ得る。かかる材料は、ナノクラスターの安定性も向上させ（すなわち、本明細書に記載の処理の間中、ナノクラスターから容認できないほどに脱落する一次ナノ粒子の性能を向上し得る）、ナノクラスターにより球状の形状などを与え得る。これらの全ての目的をかなえることが分かっている例示的な材料の１つは、シリカであり、例えば、単純堆積方法によって超常磁性ナノクラスター上にコーティングされてよく、ここで、オルトケイ酸テトラエチルはナノクラスターのいくつか又は全ての一次ナノ粒子上で縮合（加水分解を介して）されて、所望の厚さのシリカ層を形成し得る。様々な実施形態では、かかるシリカコーティングは、少なくとも２、５、１０、２０、又は３０ナノメートルの平均厚さを有し得る。更なる実施形態では、かかるシリカコーティングは、最大で１００、５０、又は２０ナノメートルの平均厚さを有し得る。
【００１５】
かかるシリカコーティングは、任意好適な分子（例えば、カルボキシル官能基を含む）をシリカコーティングに共有結合させるタイ層として容易に機能し得る。例えば、カルボキシエチルシラントリオールなどの任意好適なシラノール含有物質は、シラン部分がシリカのヒドロキシル基表面と反応して共有結合するようにシリカ表面と接触し得るため、シリカ表面にテザーされるカルボキシル基がもたらされる。この変更例として、いわゆるシランカップリング剤（例えば、容易に反応性シラノールに変換される基を含む）は、シリカ表面と接触して同様の効果をもたらし得る。つまり、特定の実施形態では、トリメトキシシリルプロピル（エチレンジアミン三酢酸）は、トリメトキシシリル部分（水中で水和されてシラノールを形成する）を介してシリカ表面と結合し、シリカ表面にテザーされる分子１つあたり３つのカルボキシル基を残す。これによって、本明細書でＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）から誘導されたカルボキシル基を含むとされる表面がもたらされる（１つのカルボキシル基は、ＥＤＴＡ分子に結合するシランカップリング剤部分となるため、厳密に言えば、４つではなく、３つのカルボキシルのみが各分子に存在することに留意されたい）。
【００１６】
所望であれば、第１のリンカー分子（例えば、一方の端部にシランカップリング剤を含み、もう一方の端部に好適な反応基を含む）をナノクラスター（例えば、ナノクラスター上のシリカコーティングの表面）に付着させ、続けて、第２のカルボキシル含有分子をリンカーの反応基に付着させ得る。しかしながら、かかる方法は、例えば、カルボキシル含有分子とシリカ表面とを直接付着させるよりは利便性が低いであろう。
【００１７】
要約すると、かかる方法によると、例えばシリカのタイ層は、超常磁性ナノクラスターの表面の少なくとも一部分上にコーティングされることが可能であり、このコーティングされたシリカ層は、次に、上述の他の利点をもたらすとともに、カルボキシル基（一般的又は特定のＥＤＴＡから誘導されたカルボキシル基の形成のいずれにおいても）の付着を促進し得る。
【００１８】
超常磁性ナノクラスターの合成に特定の方法が使用されるにも関わらず、かかる超常磁性ナノクラスターは全て、本明細書に開示される超常磁性ナノクラスターが完全に、又は更には部分的に、任意の高分子量の有機ポリマー材料によってコーティングされない、内部に埋め込まれてない、及び／又は封入されてない点で、特定の従来型磁性又は超常磁性ビーズ製品と識別されるであろう。したがって、開示される超常磁性ナノクラスターは、例えば、ポリスチレンなどのポリマー材料中に埋め込まれたり、包入されたりする磁性、常磁性、又は超常磁性ナノ粒子（又は更にはナノクラスター）を含み得るようなビーズと識別される。更には、本明細書に開示されるカルボキシル基（例えば、シランカップリング剤により提供されるようなリンカー分子上にもたらされるか、又はポリアクリル酸などのオリゴマー又はポリマー若しくはアクリレートモノマー又はオリゴマーの反応生成物上にもたらされる）は、定義によると、約５ナノメートル以下の平均厚さの層中のナノクラスター上に（超常磁性ナノクラスターのナノ粒子の表面上又はそれらのタイ層の表面上に直接）存在する。このような薄層中でのカルボキシル基の存在によって、本明細書に開示されるカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、例えば磁性、常磁性、又は超常磁性粒子が、例えばカルボキシル含有ポリマー材料などの比較的厚いシェル内に部分的又は完全に埋め込まれるような生成物と識別されるであろう。様々な実施形態では、本明細書に開示される超常磁性ナノ粒子のカルボキシル含有層の平均厚は、約２、１．５、又は１ナノメートル未満であり得る。更なる実施形態では、本明細書に開示される超常磁性ナノ粒子のカルボキシル含有層の平均厚は、少なくとも約０．２、０．５、又は１ナノメートルであり得る。
【００１９】
様々な実施形態では、ナノクラスターは、少なくとも約５０、７０、８０、又は９０重量％の含有量（残りは、カルボキシル基（及び、例えば、オリゴマー又はポリマー材料上にカルボキシル基で構成される）及びシリカ（存在するのであれば））の超常磁性材料を含み得る。特定の実施形態では、ナノクラスターは、少なくとも約５０、７０、８０、又は９０重量％の含有量で酸化鉄を含み得る。
【００２０】
なお、更には、当該技術分野で既知の磁気ビーズ又は粒子（更には、カルボキシルで官能化されるもの）の多くは、低い非特異的結合（例えばタンパク質）を示すものと特徴付けられている。したがって、当業者は、かかるビーズ又は粒子が本明細書の実施例において記載される微生物と非特異的に結合する能力を示すことを期待しないであろう。むしろ、かかるカルボキシル基のほとんどは、例えば金属イオンのキレート化に提供されるか、又は、特定の微生物菌株と特異的に結合し得るビーズの特定部分（例えば、抗体など）との付着を促進するように見える。
【００２１】
カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、ナノクラスターを液体試料と接触させやすい任意の形状で使用され得る。例えば、ナノクラスターは、特定の形態（例えば、懸濁液又は分散液のような担体液体として）使用され得るか、又は、ディップスティック、フィルム、フィルター、チューブ、ウェル、プレート、ビーズ、膜、又はマイクロ流体デバイスのチャネルなどの支持体に適用され得る。
【００２２】
用語「液体」試料は、液体及び液体溶液だけでなく、液体中に１つ以上の固体又は半固体材料が存在する（例えば、懸濁、分散、乳化など）任意の試料も広く包含して（かかる固体材料は、液体中に安定して懸濁するのに必ずしも必要ではないことに留意）使用される。液体は、特に低粘度を必ずしも示す必要はない（つまり、本明細書に開示される方法が実行されるのに十分な液体試料が存在する限り、スラリー、フィルターケークなどであり得る）。しばしば、液体試料は、液体試料のうちの大部分を占める（例えば、少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、又は９５重量％）水性試料であってもよい。
【００２３】
本明細書に開示される方法は、医療、環境、食品、飼料、臨床、及び研究室の試料、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、様々な種類の試料に適用され得る。医療又は獣医学試料としては、例えば、生物源から得られる細胞、組織、又は流体が挙げられる。環境試料は、例えば、医療施設又は獣医学施設、工業施設、土壌、水源、食品調理領域（食品接触及び非接触領域）、研究室、又はバイオテロリズムの対象になり得る領域から得たものであり得る。食品の加工、取扱い、及び調理領域の試料は、細菌病原菌による食品供給汚染に関する懸念が特にしばしばあるためより好適である。
【００２４】
かかる試料は、方法の実行前に、直接使用され得るか、又は濃縮（例えば、遠心分離）され得るか、又は希釈（例えば、緩衝（ｐＨ調整）溶液を添加）され得る。固体又は半固体形状の試料は、直接使用するか、又は、例えば、所望であれば、流動体媒質（例えば緩衝溶液）で洗浄若しくはすすぎ、又は流動体媒質中に懸濁若しくは分散させることにより抽出され得る。試料は表面から（例えばスワビング又はすすぎにより）採取され得る。使用され得る試料の例としては、食物、飲料、飲用水、任意の生化学又は工業方法に使用される水、及び生体液（例えば、全血又は血液成分）、細胞製剤（例えば、分散組織、骨髄液、又は脊椎骨の骨髄）、細胞懸濁液、尿、唾液、及び他の体液、並びに、溶解緩衝液の使用などの既知の手順を使用して形成され得る溶解製剤などが挙げられる。好ましい試料としては、食物、飲料、飲用水、生体液、及びこれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、液体試料は、１つ以上の食物（例えば、１つ以上の固体又は半固体食物を液体中に砕入することで得られるスラリー）から誘導される複合半固体混合物であり得る。
【００２５】
用語「微生物」は、分析又は検出に好適な遺伝物質及び／又はプロテオミクス物質を有する任意の細胞を広く表すのに使用される。この用語には、液体試料中に微生物が存在する（そのまま若しくは断片）証拠をもたらし得るような微生物の任意の断片、部分、残遺物、残渣、なども包含される。かかる断片としては、細胞壁及びこれらの一部分が挙げられるが、限定されない。「菌株」とは、検出方法により識別され得る微生物（例えば、異なる属、属内の異なる種、又は種内の異なる分離株又は菌株の微生物）の特定の種類を意味する。しかしながら、本明細書に開示される方法は、液体試料から任意の微生物菌株を非特異的に分離するのにあてられ、更には、方法は、必ずしも任意の特定の菌株がそのように同定される必要はないことに留意する。
【００２６】
本明細書に開示される方法を使用して液体試料から分離され得る微生物としては、例えば、細菌、菌類、酵母、原生動物、ウイルスなど、及びこれらの組み合わせなどが挙げられる。この方法は、病原体の検出における有用性を有し、これは食品安全性又は医療、環境、若しくはテロ対策の理由から非常に重要であり得る。この方法は、病原菌（例えば、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方、又はこの組み合わせ）、並びに様々な酵母、カビ、及びマイコプラズマの検出に特に有用であり得る。
【００２７】
分離される標的微生物の属には、リステリア属、大腸菌属、サルモネラ属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、ヘリコバクター属、マイコバクテリウム属、ブドウ球菌属、シゲラ属、腸球菌属、バチルス属、ナイセリア属、シゲラ属、連鎖球菌属、ビブリオ属、エルシニア属、ボルデテラ属、ボレリア属、シュードモナス属、サッカロミケス属、カンジダ属など、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の微生物菌株としては、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・シュードツベルクローシス、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・パラヘモリチカス、ビブリオ・バルニフィカス、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・エンテリカ、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・アルビカンス、バチルス・セレウス、バチルス・アントラシス、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシルなど、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２８】
本明細書で開示される方法を使用する任意のかかる微生物の分離は、特定の菌株、種、又は微生物の種類に対して概ね非特異的であるため、液体試料から、試料内の微生物の全体的な個体群の分離を提供する。したがって、かかる微生物は液体試料中に存在する濃度から濃縮され得る。所望であれば、例えば、菌株に特異的なプローブによる任意の既知の検出方法を用いて、捕捉された微生物の集団から微生物の特定の菌株を検出することができる。したがって、本明細書に開示される方法は、例えば、臨床、食品、環境、又は他の試料中の汚染微生物又は病原体（特に、細菌などの食品によって媒介される病原体）の検出に使用され得る。
【００２９】
超常磁性ナノクラスターと液体試料との間の接触をもたらす任意好適な方法が使用され得る。例えば、超常磁性ナノクラスターは（例えば、単体で、担体液体中、若しくは、好適な担体又は支持体マトリックス上で）、液体試料に、又はその逆で添加され得る。ナノクラスターでコーティングしたディップスティックを試料溶液に浸すことができ、ナノクラスターでコーティングしたフィルムの上に液体試料を注ぐことができ、ナノクラスターでコーティングしたチューブ又はウェルに液体試料を注入できるか、又は、ナノクラスターでコーティングしたフィルタ（例えば、織布又は不織布フィルタ）に液体試料を通すことができる。超常磁性ナノクラスター及び液体試料は、様々な任意の容器（任意ではあるが好ましくは、フタが閉められた、閉じられた、封止された容器であって、より好ましくは、フタが閉められたチューブ、瓶、ジャーである）中で混和される（任意の添加順序を使用する）。好適な容器は、特定の試料によって判定され、寸法及び性質により大きく異なり得る。混合及び／又は撹拌（例えば、撹拌、振とう、ボルテックス、又は揺動台を使用する）及び／又は、液体試料中でナノクラスター及び任意の微生物を、非特異的な結合が起こるように互いに近接させるのを促進する任意の別の方法が使用されることが望ましい。所望であれば、１つ以上の添加剤（例えば溶解試薬、核酸捕捉試薬、微生物用増殖培地、緩衝液（例えば、固体試料を湿らせるため）、微生物染色試薬、洗浄用緩衝液（例えば、非結合物質を洗い流すため）、溶出剤（例えば、血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手可能なＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００非イオン系界面活性剤）、機械的研磨／溶出剤（例えば、ガラスビーズ）、など）を、ナノクラスター及び液体試料の組み合わせに添加することができる。
【００３０】
超常磁性ナノクラスターは、任意好適な時間、任意好適な条件下で、液体試料と接触したままで保持され、微生物とナノクラスターのカルボキシル基との間に非特異的結合を起こし得る。理論や機構に縛れられるつもりはないが、かかる非特異的結合は、ナノクラスターのカルボキシル基と液体試料中に存在し得る任意の微生物の細胞壁（又はそれらの断片）上に存在し得るタンパク質（又はタンパク質断片）との間の非特異的な相互作用によって、部分的、又は更には大部分で起こり得る。理論や機構に縛られるつもりはないが、例えば、ナノクラスターのカルボキシル基と微生物又はそれらの断片との間のかかる非特異的結合には、例えば、静電的相互作用（水素結合が挙げられるが限定されない）、疎水的相互作用、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。どのような形態をとろうとも、定義によると、この非特異的結合には、いかなる種類における特定の相互作用、親和性、又は結合性（例えば、抗原−抗体、酵素−基質、又は受容体−リガンド結合、相補的核酸間の結合、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの間の結合、など）が包含されない。
【００３１】
本明細書で開示される方法は、更に、ナノクラスターと非特異的に結合して微生物を含む液体試料から、ナノクラスターの少なくとも一部分を分離する工程を含む。いくらかの少量の液体は、典型的には分離したナノクラスター（存在するのであれば微生物と含む）と接触したままであることが認められるであろう。したがって、液体試料の全てから全ナノクラスターを完全に分離することが必要ではないことが重視され、つまりは、本明細書に開示される方法は、例えば、ナノクラスター（及びナノクラスターに結合する任意の微生物）を液体試料から概ね又は実質的に分離させることから、単に液体試料中の微生物の所望の濃縮効果を与えることまでに及び得る。
【００３２】
適切な接触時間及び条件によって、超常磁性ナノクラスターと微生物（存在するのであれば）との間を十分に結合させた後、磁力を適用して液体の少なくとも一部分から超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分を分離し得る。かかる磁気分離は、液体を通して超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分を移動させる磁力の形態をとり得る。又は、磁力は、超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分を適所に保持するのに使用することができるが、液体試料のうち液体の少なくとも一部分（例えば、上澄）は、ナノクラスターから取り除かれる（例えば、磁力によって容器表面付上又は付近にナノクラスターをそのまま残すようにデカントするか、又は吸上げる）。これら２つの試みのうち、任意で所望の組み合わせが使用され得る。任意好適な永久磁石又は電磁石、又は複数の磁石又はこれらの組み合わせが使用され得る。任意のかかる磁石は、分離方法中、液体試料に対して移動せずに保持されるか、液体試料に対して移動し得る。かかる方法は、手動（例えばバッチ単位による方法で）で行われるか、又は自動（例えば、連続的又は半連続的処理）で行われ得る。任意の他の分離方法（例えば、遠心分離、濾過など）も、磁気分離と組み合わせて（例えば、磁気分離の前、磁気分離の間中、又は磁気分離の後のいずれか）使用され、超常磁性ナノクラスターによって得られる分離を向上し得る。
【００３３】
本明細書に記載の実施例によって明示されるように、開示される超常磁性ナノクラスターは、驚くべきことに、例えば、ナノクラスターが、任意のかかる微生物と特異的に結合することができる任意の部分を含まない場合であっても、微生物が液体試料から分離され得るような、微生物の結合に有効であることが分かっている。つまり、開示される超常磁性ナノクラスターは、例えば、親和性結合基、抗体又は抗原などのいかなる種類をも含まないため、カルボキシル基によって、非特異的な結合が達成されることで、記載される分離を得ると考えられる。したがって、特定の実施形態では、ナノクラスターは、少なくとも１つの微生物菌株に特異的に結合する能力を有するいかなる置換基をも含まない。すなわち、かかる実施形態では、ナノクラスターは、いかなる抗体、抗原、鋳型、親和基、相補的核酸などをも含まず、つまり、特定の標的微生物又はそれらの一部分又は断片の特定基と結合するように構成されている。言い換えると、開示されるカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、ある条件下で、特定の微生物菌株を捕捉する優れた能力を示す一方で、特定の他の微生物菌株は、ナノクラスターが任意のかかる微生物の特異的結合を実行すると見なすことはできない。
【００３４】
一般的に、本明細書に開示される超常磁性ナノクラスターは、許容可能な有効性を有する微生物を捕捉する能力を失うことなく、例えば、（任意の種類の）他の磁性材料と比較して、少なくとも概ね同じか、又は更にはより短い分離時間が達成され得る。つまり、開示される超常磁性ナノクラスターは、例えば捕捉効率において、他の磁性材料と概ね同じか、又は更には優れた性能を示し得る。
【００３５】
分離方法の後に、カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、１つ以上の微生物菌株が非特異的に結合されている（又は、少なくとも磁気分離方法が終了するまで）ことの証拠を検出するため検定され得る。つまり、かかる検定によって、液体試料が検出可能な濃度の任意のかかる微生物を含有するかどうかが明らかになり得る。この方法の全施行において、検出可能な濃度の微生物が試験される液体試料中に存在することを明らかにする必要はないことが重視される。つまり、多くの試料（例えば、飲用水など）は、否定的な試験結果（つまり、試料中の微生物の濃度は特定の検出閾値を下回ると思われる結果）となり得る。
【００３６】
この検定は、任意好適な検出方法によって実行され得る。（液体試料からのナノクラスターの磁気分離の後、必要に応じて、１つ以上の洗浄工程、及び／又は他の工程を、続く検定作業の前に、又は一部として実施し得る。）好適な検出方法には、例えば、顕微鏡（例えば、透過光型顕微鏡、又は蛍光染料で標識した微生物を可視化するのに使用できるエピ蛍光顕微鏡）、及び他の撮像方法、免疫学的検出方法、及び遺伝子学的検出方法が挙げられる。免疫学的検出は、標的生物から誘導される抗原物質の検出であり、これは一般的に、細菌又はウイルス粒子の表面にあるマーカーとして作用する生物学的分子（例えばタンパク質又はプロテオグリカン）である。抗原物質の検出は、典型的には、抗体、ファージディスプレイなどの方法から選択されるポリペプチド、又はスクリーニング方法から得られたアプタマーによるものであり得る。免疫学的検出方法は周知であり、例えば、免疫沈降及び酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。抗体結合は、様々な方法で検出することができる（例えば、一次抗体又は二次抗体のいずれかを、蛍光染料により、量子ドットで、又は化学発光若しくは着色基質を生成し得る酵素により標識し、プレートリーダー又はラテラルフロー装置のいずれかを用いる）。
【００３７】
検出はまた、遺伝子学的検定法（例えば、核酸のハイブリダイゼーション又はプライマーを用いた増幅）によって行うことができ、これがしばしば好ましい方法である。捕捉又は結合された微生物は溶解され、検定に利用できる遺伝子学的物質が供給され得る。溶解方法は周知であり、例えば、音波処理、浸透性ショック、高温処理（例えば約５０℃〜約１００℃）、及びリゾチーム、グルコラーゼ、チモラーゼ（ｚｙｍｏｌｏｓｅ）、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、及びウイルスエンドリシン（ｅｎｏｌｙｓｉｎｓ）などの酵素とのインキュベーションが挙げられる。一般的に使用されている遺伝子学的検出検定法の多くは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、具体的な微生物の核酸を検出する。特に有用な遺伝子学的検出方法は、プライマー指向性核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、並びに等温方法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（及びこれらの組み合わせ、好ましくはＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）に基づく。
【００３８】
本発明に開示されるように、カルボキシル官化超常磁性粒子の使用は、菌株特異性でないため、同じ試料内で、複数の微生物菌株を検定のための標的にすることができる、一般的な捕捉システムを提供し得る。例えば、食品試料の汚染について検定する場合、同じ試料内でリステリア・モノサイトゲネス、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及びサルモネラの全部について試験を行うことが望ましいことがあり得る。捕捉工程を１回行い、次に例えば、これらの各微生物菌株の異なる核酸配列を増幅するための固有プライマーを使用して、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ検定を行うことができる。したがって、各菌株について個別の試料取扱い及び調製手順の必要性を回避し得る。
【００３９】
したがって、いくつかの実施形態では、特定の菌株の存在に関する検定よりも、任意のかかる微生物を検出し得る一般的な方法が使用され得る。かかる方法の１つには、例えば、磁気分離した超常磁性ナノクラスターを液体試料と接触させる工程、超常磁性ナノクラスターを液体試料から分離する工程、任意で、例えば溶解剤にナノクラスターに晒して、存在する任意の細胞を破壊して内容物を露出させる工程、次に、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の存在に関して、例えば、溶解試料を検査する工程を含み得る。（ナノクラスターは、必要に応じて、ＡＴＰ検査が実行される前に、溶解した試料から磁気分離されていてもされていなくてもよい。）かかる試料の検査は、例えば、生物発光によって実行され得る。かかる方法は、例えば、植物又は動物などのほとんどの任意の微生物の存在を明らかにするものと認められるため（かかる微生物の全てが、代謝機能にＡＴＰを使用するため）、かかる方法によって、一般的な微生物の存在に関して、有用であって非特異的なスクリーニング試験がもたらされ得る。かかる方法の他の方法としては、例えば、磁気分離した超常磁性ナノクラスターを増殖培地上に播種する工程、増殖培地を培養する工程、及び、増殖培地上で増殖するバクテリアコロニーの存在及び／又は数を測定する工程を含み得る、培養に基づいた方法であり得る。かかる方法は、例えば、非特異的スクリーニングにおいて再び実行され得るか、又は、１つ以上の種類の微生物、又は特定の微生物菌株は、（例えば、特定の微生物菌株のコロニーの増殖を促進するために特異的に標的化される増殖培地を提供することによって）標的化され得る。
【００４０】
本明細書に記載の方法を実行するのに使用するキットが提供され得る。かかるキットは、本明細書に開示されるような任意のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを、ナノクラスターが液体試料と接触され得る任意好適な形態で含み得る。試薬、希釈剤、容器、撹拌器具などの付属装置及び付属品は、かかるキットと共に供給されてもよい。かかるキットには、微生物培地又は微生物増殖培地、溶解試薬、緩衝剤、遺伝子学的検出用検定成分などから選択される１つ以上の成分も含まれ得る。１つ以上の磁石がキットと共に供給されてよく、かかる磁石は、使用者の手で保持され、キットと繋げて使用され得る。かかるキットは、請求項１に記載の方法を実行するための説明書（かかるキットは、説明書が紙形態ではなく電子的に提供されるバーチャルキットを本質的に含むことに留意）を含み得る。
【００４１】
代表的な実施形態の一覧
実施形態１複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを少なくとも１つの微生物菌株を潜在的に含む液体試料と接触させる工程と、液体試料の少なくとも一部分からカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分を磁気分離する工程と、少なくとも１つの微生物菌株が磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程と、を含む方法。
【００４２】
実施形態２超常磁性ナノクラスターは、高温加水分解によって合成された超常磁性ナノクラスターを含む、実施形態１に記載の方法。
【００４３】
実施形態３超常磁性ナノクラスターは、水熱合成超常磁性ナノクラスターを含む、実施形態１に記載の方法。
【００４４】
実施形態４超常磁性ナノクラスターの少なくとも一部分は、合成方法の結果として、ナノクラスターの表面上に接触可能なカルボキシル官能基を本質的に含む、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【００４５】
実施形態５カルボキシル官能化超常磁性カルボキシル官能基は、カルボキシル基を含むポリマー材料によってもたらされ、ポリマー材料は、超常磁性ナノクラスターを合成するのに使用する反応混合物中でもたらされ、ポリマー材料は、磁気分離工程及び検定工程中、合成した超常磁性ナノクラスターと結合したままである、実施形態４に記載の方法。
【００４６】
実施形態６カルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターのカルボキシル官能基は、カルボキシル基を含むモノマー材料又はオリゴマー材料の重合によってもたらされ、モノマー材料又はオリゴマー材料は、超常磁性ナノクラスターを合成するのに使用する反応混合物中でもたらされ、超常磁性ナノクラスターの合成中に重合してカルボキシル基を含むポリマー材料を形成し、磁気分離工程及び検定工程中、合成した超常磁性ナノクラスターと結合したままである、実施形態４に記載の方法。
【００４７】
実施形態７カルボキシル官能基は、アクリル酸ナトリウムの重合の反応生成物である、実施形態６に記載の方法。
【００４８】
実施形態８複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターは、シリカコーティングされた超常磁性ナノクラスターを含み、シリカコーティングの表面は、カルボキシル基で官能化されている、実施形態６〜７のいずれか一項に記載の方法。
【００４９】
実施形態９カルボキシル基は、シリカコーティングの表面に共有結合している分子上にあるＥＤＴＡから誘導されたカルボキシル基である、実施形態８に記載の方法。
【００５０】
実施形態１０シリカコーティングの表面に共有結合している分子は、Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸とシリカコーティングのヒドロキシル基との反応生成物である、実施形態９に記載の方法。
【００５１】
実施形態１１液体試料は水性試料である、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【００５２】
実施形態１２液体試料は、１つ以上の食物から誘導される複合半固体混合物である、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【００５３】
実施形態１３少なくとも１つの微生物菌株はバクテリア菌株である、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【００５４】
実施形態１４少なくとも１つの微生物菌株は大腸菌株を含む、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【００５５】
実施形態１５少なくとも１つの微生物菌株はリステリア・モノサイトゲネス菌株を含む、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【００５６】
実施形態１６少なくとも１つの微生物菌株が磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程は、培地に基づいた方法、顕微鏡及び他の撮像方法、遺伝子学的検出方法、免疫学的検出方法、及びこれらの組み合わせから選択される方法によって実行される、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【００５７】
実施形態１７少なくとも１つの微生物菌株が磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程は、磁気分離した超常磁性ナノクラスターを培地に配置し、ＡＴＰの存在に関して培地を検査する工程を含む、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【００５８】
実施形態１８少なくとも１つの微生物菌株が磁気分離した超常磁性ナノクラスターに非特異的に結合していたことの証拠として磁気分離した超常磁性ナノクラスターを検定する工程は、磁気分離した超常磁性ナノクラスターを増殖培地に播種する工程と、増殖培地を培養する工程と、増殖培地上で増殖するバクテリアコロニーの存在、不在、又は数を判定する工程とを含む、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【００５９】
実施形態１９超常磁性ナノクラスターは、任意の特定の微生物菌株に特異的に結合できるいかなる置換基をも含まない、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【００６０】
実施形態２０超常磁性ナノクラスターは、約５０〜約２００ナノメートルの平均直径を集合的に示し、各超常磁性ナノクラスターは、約５〜約２０ナノメートルの平均直径のマグネタイトの単一ドメインナノ粒子の集合を含む、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【００６１】
実施形態２１超常磁性ナノクラスターを液体試料と接触させる工程中、及び液体試料の少なくとも一部分から超常磁性ナノクラスターを磁気分離する工程中、超常磁性ナノクラスターは実質的にそのままであって、それらのカルボキシル基は、超常磁性ナノクラスター上の適切な場所に実質的にあり続ける、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【００６２】
実施形態２２超常磁性ナノクラスターは、いかなる高分子量非極性有機ポリマー材料によっても少なくとも部分的にコーティングされない、内部に埋め込まれない、及び／又は封入されない、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【００６３】
実施形態２３実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の複数のカルボキシル官能化超常磁性ナノクラスターを含み、実施形態１に記載の方法を実行するための説明書を含む、キット。
【実施例】
【００６４】
超常磁性マグネタイトナノクラスターの調製
材料：
ジエチレングリコール（ＤＥＧ、試薬等級）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）から購入した。無水塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３、９８％）をＳｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）から購入した。Ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＡＡ、分子量＝１８００）。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、９９．９％）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、９７％）、アクリル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、エチレングリコール（無水、９９．８％）、オレイン酸ナトリウム（９９％）、及びオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、９８％）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。エチルアルコール（無水）及び水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ、３０％）をＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸三ナトリウム（ＴＭＳ−ＥＤＴＡ、４５％水溶液）をＧｅｌｅｓｔ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）から購入した。
【００６５】
試料Ａ
超常磁性マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）ナノクラスターを、若干の改変を含むが、文献の手順（Ｇｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００７，１３（２５），７１５３〜７１６１）による高温加水分解法によって合成した。ＮａＯＨ／ＤＥＧ原液を、２ｇのＮａＯＨを２０ｍＬのＤＥＧに溶解することで調製した。この溶液を窒素下で１２０℃で１時間加熱した後、７０℃まで冷却した。三つ口フラスコ中、０．２８８ｇのＰＡＡ、１７ｍＬのＤＥＧ、及び０．０６５ｇの無水ＦｅＣｌ３の混合物を窒素下で激しく撹拌しながら３０分間２２０℃まで加熱した。次に、２．０ｍＬのＮａＯＨ／ＤＥＧ原液を常時期の加熱混合物に迅速に注入した。反応溶液を、２１０℃で１時間更に加熱した後、室温まで冷却した。合成したマグネタイトナノクラスターに４０ｍＬのエタノールを加えて沈殿させて、遠心分離した。沈殿物を５ｍＬの脱イオン水中に再分散させ、次に、２０ｍＬのエタノールを加えた後にナノクラスターを磁石で収集した。次に、エタノールで沈殿させ、脱イオン水で再分散することで数回ナノクラスターを洗浄した。最後に、マグネタイトナノクラスターを４ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に分散させた。
【００６６】
試料Ｂ
超常磁性マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）ナノクラスターを、若干の改変を含むが、文献の手順（Ｘｕａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｏｆ  Ｍａｔ．２００９，２１，５０７９〜５０８７）による水熱法によって合成した。０．５４ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１．５  ｇのアクリル酸ナトリウム、１．５ｇの酢酸ナトリウム、５ｍＬのエチレングリコール、及び１５ｍＬのジエチレングリコールを、磁気撹拌下で２時間混合した。得られた均質溶液をＴｅｆｌｏｎ（登録商標）加工のステンレス鋼製の反応容器に移し、１５時間２００℃で加熱した。合成したマグネタイトナノクラスターに４０ｍＬのエタノールを加えて沈殿させて、遠心分離した。沈殿物を５ｍＬの脱イオン水中に再分散させ、次に、２０ｍＬのエタノールを加えた後にナノクラスターを磁石で収集した。次に、エタノールで沈殿させ、脱イオン水で再分散することで数回ナノクラスターを洗浄した。最後に、マグネタイトナノクラスターを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に分散させた。
【００６７】
試料Ｃ
超常磁性マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）ナノクラスターを、試料Ｂのナノクラスターと概ね同じ方法で合成した。得られたナノクラスター（１５０ｍｇ）を１０ｍＬの脱イオン水中に再分散させた。２０ｍｇのオレイン酸ナトリウムを、７０℃で加熱して５ｍＬの脱イオン水に溶解した。次に、Ｆｅ３Ｏ４ナノクラスター分散液を、オレイン酸ナトリウム溶液に滴下し、３０分間撹拌した。脱イオン水を使用して粒子を２回洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に再分散させた。
【００６８】
試料Ｄ
超常磁性マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）ナノクラスターを、試料Ｂのナノクラスターと概ね同じ方法で、以下の工程を加え、合成した。１００ｍｇのＦｅ３Ｏ４ナノクラスターを１２ｍＬの脱イオン水に再分散させて、更に１２０ｍＬのエタノールで希釈した。４ｍＬのＮＨ４ＯＨを上記の溶液に加え、超音波浴中で１５分間撹拌した。次に、０．６ｍＬのＴＥＯＳ（５ｍＬのエタノール中）を加え、超音波浴中で２時間撹拌した。磁石によって溶液からコアシェル粒子を分離し、脱イオン水で２回洗浄した。１００ｍｇのＴＭＳ−ＥＤＴＡをコアシェル粒子分散液に加え、これを８５℃で１６時間加熱した。脱イオン水を使用して、ＥＤＴＡグラフト化コアシェル粒子を２回洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に再分散させた。
【００６９】
試料の特性
試料Ａ〜Ｄの超常磁性ナノクラスターの寸法は、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−９０００透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）（３００ｋＶで作動）を使用することで特性化した。試料を、２０ｍＬの水に試料を２０滴という概算比で希釈した。希釈した試料を１５分間超音波処理し、超音波処理及び希釈した試料を極薄カーボンＴＥＭグリッド上に１滴載置し、風乾した。これらのＴＥＭ画像から見積もり寸法を割り出した。これらの画像によって、各ナノクラスターが多くの一次ナノ粒子の凝集体であることも確認した。ナノクラスターは、液体媒体でのルーチン処理において、個別の一次ナノ粒子に断片化されるか、又はあるいは、著しく寸法が減少することはないように思われる。
【００７０】
これらの測定から得られる試料Ａ〜Ｄのナノクラスターの見積もり直径を、以下の２つの比較試料材料の販売業者から供給された公称寸法と共に、表１で列挙する。
【００７１】
比較試料ＣＳ−Ａ：ポリアクリル酸を含む磁性粒子（公称直径１００ｎｍ）は、ｆｌｕｉｄＭＡＧ−ＰＡＳという商品名でＣｈｅｍｉｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００７２】
比較試料ＣＳ−Ｂ：カルボン酸でコーティングされていると報告されている磁性粒子（公称直径１０００ｎｍ）は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄという商品名でＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から購入した。
【００７３】
【表１】
2016526378.tif 000002
【００７４】
試料Ａ及びＢのナノクラスター表面におけるカルボキシル基の安定性を、ＦＴＩＲスペクトルを測定することで示した。ＦＴＩＲスペクトルは、１回反射型Ｐｉｋｅ  ＳｍａｒｔＭＩＲａｃｌｅゲルマニウムＡＴＲアクセサリ及びＤＴＧＳ検出器（解像度：４ｃｍ−１）を使用するＮｉｃｏｌｅｔ  ６７００シリーズＦＴ−ＩＲ分光計を備えるものであった。比較例ＣＳ−Ａと共に、試料Ａ及びＢのＦＴＩＲスペクトルを取得した。全３種の材料は、カルボキシル基の非対称及び対称のＣ−Ｏ伸縮モードを示すと思われる約１５６０ｃｍ−１及び約１４０５ｃｍ−１の位置にピークを示していた。脱イオン水での大規模な洗浄後であっても比較的に安定してスペクトルは存続し、そのため、カルボキシル基は安定してナノ粒子表面に結合すると思われる。
【００７５】
試料の微生物的性能評価
材料
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ  ５１８１３）及びリステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ  ５１４１４の）の細菌培養原液は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）から得た。実験室のプラスチック用品及び試薬、並びに細菌培地は、特に記載のない限りＶＷＲからのものであると思われる。具体的な材料及びその供給元は、表２に列記される。
【００７６】
作業試料Ａ〜Ｄを全て、使用前にベンチトップ超音波ユニットを使用して５分間超音波処理し、材料をよく分散させた。比較試料材料ＣＳ−Ａ及びＣＳ−Ｂを、使用前にベンチトップボルテックスミキサーで約１０秒間ボルテックスした。
【００７７】
【表２】
2016526378.tif 000003
【００７８】
分離時間
牛ひき肉を地元の食料品店（Ｃｕｂ  Ｆｏｏｄｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から購入した。１１グラムの牛ひき肉（脂肪分１５％）を殺菌したストマッカーバッグに加え、９９ｍＬのバターフィールド緩衝液とＳＴＯＭＡＣＨＥＲ  ４００  ＣＩＲＣＵＬＡＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＢＬＥＮＤＥＲで３０秒サイクルで２３０ｒｐｍの速度で混合して、混合牛ひき肉試料を作製した。
【００７９】
１ｍＬの体積の牛肉試料を殺菌した１．５ｍＬのポリプロピレン微小遠心チューブに加えた。１ｍｇの試料Ｃをそのチューブに加えた。チューブのフタを閉め、約１０秒間手で反転させた。チューブを磁気スタンド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）のＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｌ）上に載置し、試料の分離時間（目視によって明らかとなるまで）を記録した。試料Ｄ、及び比較例ＣＳ−Ａ及びＣＳ−Ｂを調製し、同様に試験した。観察された分離時間を表３に示す。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
牛ひき肉からのリステリア・モノサイトゲネスの捕捉
上述したように、混合牛ひき肉試料を調製した。ＴＳＡプレート上でオーバーナイトでストリークしたプレート培養物からリステリア・モノサイトゲネスの単一コロニーを、１０ｍＬのＴＳＢに接種し、振とう培養機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｎｏｖａ４４）中で、１８〜２０時間、３７℃で培養した。得られた約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬを含有する細菌原液を、ＢＢＬで段階希釈して約１×１０５ＣＦＵ／ｍＬの接種材「リステリア微生物懸濁液」が得られ、これを混合牛ひき肉試料に接種して、１×１０３ＣＦＵ／ｍＬの「添加牛肉試料」を得た。（ここで（他所においても）、ＣＦＵとは、コロニー形成ユニットを意味する。）本材料を以下の実験において使用した。
【００８２】
実施例３：１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、１００マイクロリットルの試料Ａ（４ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブポリプロピレンチューブ（ここで（他においても）、商品名「ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ」でＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から入手）に加えた。
【００８３】
実施例４：１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、２００マイクロリットルの試料Ａ（４ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００８４】
実施例５：１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、１００マイクロリットルの試料Ｃ（１０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブポリプロピレンチューブに加えた。
【００８５】
実施例６：１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、１００マイクロリットルの試料Ｄ（１０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００８６】
比較例ＣＥ−３１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、１００マイクロリットルの比較試料ＣＳ−Ａ（５０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、実施例ＣＥ−４においては４０マイクロリットルの比較試料ＣＳ−Ａ（２５ｍｇ／ｍＬの原液から）に加え、実施例ＣＥ−５においては２００マイクロリットルの比較試料ＣＳ−Ａ（実施例ＣＥ−３及び実施例においては１００マイクロリットルである）に加える以外は、ＣＥ−３と同じ方法で比較例ＣＥ−４及びＣＥ−５を調製し、試験した。
【００８７】
比較例ＣＥ−６１．０ｍＬ容量の「添加牛肉試料」を、１００マイクロリットル／１ｍｇの比較試料ＣＳ−Ｂ（１０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００８８】
チューブのフタを閉め、揺動台（（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｏｗａ）のＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｖａｒｉ  Ｍｉｘ揺動台（１４サイクル／分））上で１０分間の接触時間中保持し、その後、磁気スタンド（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））を約２．５分間使用して、超常磁性ナノクラスター（又は比較試料ビーズ）を分離した。各チューブから上澄液を取り除き（外部磁石に最も近いチューブの表面に超常磁性ナノクラスターが（磁力によって）保持されている間に、ピペッティングする）、磁気分離した材料を１００マイクロリットルのＢＢＬに再懸濁し、ＭＯＸプレートに播種した。各上澄液試料から１００マイクロリットルのアリコートもＭＯＸプレートに播種した。（多くの場合において、磁気的に捕捉された材料が播種される際、磁性材料に捕捉される細胞数は、「数えきれない」ほど高い結果となるため、減ずることで磁性材料による捕捉％を確めることが可能になる。）
【００８９】
様々なプレートを、３７℃で１８〜２０時間培養し、手でコロニー数を分析した。上述するように、１００ＣＦＵ／ｍＬを超える密集成長（「数えきれない」としても既知）は、ＭＯＸプレート上で再懸濁した磁性材料の播種によるものであることが多い。したがって、捕捉効率は、磁性材料の除去後に生じた残りの液体試料の播種（播種された非濃縮対照試料に基づいて適切に補正）から数えたコロニー数を得る別の手順によって算出した。これらの計算は以下のように実施した。
対照％＝（播種した残りの試料のコロニー数／非濃縮対照のコロニー数）×１００
捕捉効率又は捕捉％＝１００−対照％
【００９０】
補足％の結果が表４で報告されている。（別の検定で試験を行った実施例ＣＥ−４において、非濃縮対照の平均コロニー数が２３７０ＣＦＵ／ｍＬであったことを除いて、非濃縮対照の平均コロニー数は３７６５ＣＦＵ／ｍＬであった。）
【００９１】
【表４】
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【００９２】
水からの大腸菌の捕捉（培養による検定）
ＴＳＡプレート（３７℃で培養）から一晩ストリークした大腸菌の培養物を使用して、３ｍＬの濾過した蒸留脱イオン水で０．５マクファーランド標準水溶液を作成した。生じた、１×１０８ＣＦＵ／ｍＬを含有する細菌原液を、水で段階希釈して約１×１０５ＣＦＵ／ｍＬの「大腸菌微生物懸濁液」を得て、これを以下の実験で使用した。
【００９３】
実施例７：１．０ｍＬ容量の大腸菌微生物懸濁液を、２５０マイクロリットルの試料Ａ（４ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００９４】
実施例８：１．０ｍＬ容量の大腸菌懸濁液を、１００マイクロリットルの試料Ｂ（１０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００９５】
比較例ＣＥ−７１．０ｍＬ容量の大腸菌懸濁液を、２０マイクロリットルの比較試料ＣＳ−Ａ（５０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００９６】
比較例ＣＥ−８１．０ｍＬ容量の大腸菌懸濁液を、１００マイクロリットルの比較試料ＣＳ−Ｂ（１０ｍｇ／ｍＬの原液から）を含有する、ラベル付けした、殺菌した５ｍＬのポリプロピレンチューブに加えた。
【００９７】
チューブをパラフィルムで封止し、１０秒間ボルテックスして混合した。チューブのフタを閉め、揺動台（（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｏｗａ）のＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｖａｒｉ  Ｍｉｘ揺動台（１４サイクル／分））上で１０分間の接触時間中保持し、その後、磁気スタンド（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））を約２．５分間使用して、超常磁性ナノクラスター（又は比較試料ビーズ）を分離した。試料を取り除き、磁気分離した材料を１ｍＬのＢＢＬ中で再懸濁させて、大腸菌プレートに播種した。（典型的には、上述の方法で補足％を算出することが可能であるため、上澄液も播種した。）プレートを３７℃で１８〜２０時間培養し、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を使用して製造業者の説明書に従って、コロニー数を分析した。
【００９８】
播種された残りの試料及び播種された非濃縮対照試料から得られたコロニー数を基にした捕捉効率を、以下の式を使用して算出した。
参照％＝（播種した残りの試料のコロニー数／非濃縮対照のコロニー数）×１００
捕捉効率又は捕捉％＝１００−対照％
【００９９】
結果を表５に報告する。（非濃縮対照の平均コロニー数は、１８５，０００ＣＦＵ／ｍＬであった。）
【０１００】
【表５】
2016526378.tif 000006
【０１０１】
水からの大腸菌の捕捉（ＡＴＰによる検定）
実施例７、８、及びＣＥ−７及びＣＥ−８と同様の方法で実施例９、１０及びＣＥ−９及びＣＥ−１０を調製し、上述するように、揺動台上に保持した後、磁気スタンドを使用して分離した。この後、分離した材料を５０マイクロリットルの抽出（溶解）溶液、及び試料調製キット（商品名「３Ｍ  ＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＡＴＰ  ＳＹＳＴＥＭ」で３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手）からの５００マイクロリットルの酵素溶液中で再懸濁させた。チューブの内容物を、ボルテックスミキサー（商品名「ＶＷＲ  ＦＩＸＥＤ  ＳＰＥＥＤ  ＶＯＲＴＥＸ  ＭＩＸＥＲ」でＶＷＲ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＰＡ）から入手）において３２００ｒｐｍで１５秒間ボルテックスして混合した。この後、超常磁性ナノクラスター（又は比較試料ビーズ）を磁気スタンドで分離した。すなわち、各試料において、外部磁石と最も近いチューブ表面に磁力によって磁気ビーズが保持されている間に、上澄液をピペットで除去した後、殺菌した１．５ｍＬのポリプロピレン微小遠心チューブ（ＶＷＲカタログ番号８９０００−０２８）に加えた。
【０１０２】
かかる試料の各々のＡＴＰ信号を、ベンチトップルミノメーター（商品名「２０／２０Ｎ  ＳＩＮＧＬＥ  ＴＵＢＥ  ＬＵＭＩＮＯＭＥＴＥＲ」（２０／２０ｎ  ＳＩＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ搭載）でＴｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手）を使用して、１０秒間間隔で１分間の相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。以下のように輝度値を分析した。
【０１０３】
各磁性材料のＡＴＰレベルのバックグラウンドを、試験試料と同容量の材料に同容量のＡＴＰ試薬（いかなる大腸菌をも存在しない）を加えることで判定した。試験試料のＡＴＰ信号からこれらのバックグラウンド値を引いて、表６で示すような「補正ＡＴＰ信号」値を算出した。１０５ＣＦＵを含有する１００マイクロリットルの水において測定されたＡＴＰ信号を、「１０５ＡＴＰ信号対照」として使用した。ＡＴＰ信号％は、以下の等式に従って、対照の補正ＡＴＰ信号から算出した。
ＡＴＰ信号（％）＝（補正ＲＬＵ／１０５ＣＦＵ対照のＲＬＵ）×１００
【０１０４】
結果を表６に示す。また、実施例ＣＥ−９（＊）は、ＡＴＰ信号において、他の実施例よりも非常に高い標準偏差を示したことにも留意。
【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
上記の実施例は、理解を助けるために示したものに過ぎない。したがって、これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。実施例に記載された試験及び試験結果は予測的なものではなく、あくまで例示的なものとして与えられるものであり、試験方法の変更により、得られる結果も異なるものと予想される。実施例における定量的な値は全て、用いられる手順に関連する一般的に知られる許容誤差を考慮した近似的な値であるものと理解される。
【０１０７】
本明細書で開示された具体的な代表的構造、特徴、詳細、形態などは、改変すること、及び／又は数多くの実施形態で組み合わせることができることが、当業者には明らかであろう。（特に、本明細書において、代替手段として積極的に引用される全要素は、請求項に明示的に含まれるか、請求項から除外させるか、必要に応じて任意の組み合わせであり得る。）このような変形及び組み合わせの全ては、例示的な説明の役割を果たす選択された代表的な設計のみではない、着想された本発明の領域内に含まれるとして本発明者により想定される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載される特定の例示的構造に限定されるべきではなく、特許請求の範囲の文言によって述べられる構造及びこうした構造の均等物にまで少なくとも敷衍されるものである。記載されたとおりの本明細書と、参照によって本明細書に援用されるいずれかの文書の開示内容との間に矛盾又は食い違いが存在する場合、記載されたとおりの本明細書が優先するものとする。
【国際調査報告】
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