(57)【要約】  ある側面に従い、複数のマイクロチャネルを定めたミクロ流体凝固装置が提供され、血液サンプルは、マイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で駆動され、コントローラは、タイマーおよび圧力検知装置と組合されて、流れ始めたときの第１の圧力値（または流量値）、第２の圧力値が求めた第１の圧力値の約２倍となる第１の時間（Ｔｐｇ）、および第３の圧力値が求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍となる第２の時間（Ｔｐｆ）を求め、そこからチャネル閉塞を予測する被験者凝固モデルを定めるように構成される。別の側面において、血液サンプルはマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で駆動され、コントローラは、タイマーおよび流量検知装置と組合されて流量に基づいて上記判断を行なうように構成される。
2016534714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロ流体凝固装置であって、
複数のマイクロチャネルを定める少なくとも１つの基板と、
前記基板の第１の端部にある第１のポートとを備え、前記第１のポートは前記複数のマイクロチャネルそれぞれの第１の端部に接続し、
前記基板の第２の端部にある第２のポートを備え、前記第２のポートは前記複数のマイクロチャネルそれぞれの第２の端部に接続し、
前記複数のマイクロチャネル内の圧力値または前記複数のマイクロチャネル全体の圧力に関連する圧力値を求めるように構成された第１の検知装置と、
タイマーと、
前記第１の検知装置および前記タイマーと組合されて、流れ始めたときの第１の圧力値、第２の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間、および、第３の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍となる第２の時間を求めるように構成され、かつさらに、以下の関係に従ってチャネル閉塞を予測する被験者凝固モデルを定めるように構成された、コントローラとを備え、
【数１】
2016534714.tif 000023
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間であり、
前記第１のポートを通して与えられる差圧または流量／せん断が、血液サンプルを、前記複数のマイクロチャネルを通して、実質的に一定の流量で駆動する、ミクロ流体凝固装置。
【請求項２】
前記第１のポートを通して与えられる差圧または流量／せん断によって、血液サンプルを前記複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で駆動させる装置をさらに備え、
前記差圧または流量を発生する前記装置はポンプである、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項３】
前記装置はシリンジポンプである、請求項２に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項４】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかの断面表面積は、約１２５μｍ２〜１．７５ｍｍ２の間である、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項５】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかの最大水力直径は、約２５μｍ〜５ｍｍの間である、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項６】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかの最大寸法は、約７５μｍ〜２００μｍの間である、請求項５に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項７】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の断面積を有し、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記第１の断面積と異なる第２の断面積を有する、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項８】
第１のマイクロチャネルの少なくとも一部分は第１の表面処理を有する、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項９】
第２のマイクロチャネルの少なくとも一部分は前記第１の表面処理と異なる第２の表面処理を有する、請求項８に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１０】
前記第１の表面処理および前記第２の表面処理のうちの少なくとも一方は、自然発生または合成試薬、コラーゲン、血栓形成誘発材料、血栓形成阻害材料、血小板活性化材料、血小板阻害材料、フィブリンネットワーク形成材料、フィブリンネットワーク破壊材料、細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、セグメント化ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、またはポリメタクリル酸メチルのうちの１つを含む、請求項９に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１１】
前記せん断の速度は７５ｓｅｃ−１と５０００ｓｅｃ−１の間である、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１２】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を撮像するように構成された撮像システムをさらに備える、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１３】
前記撮像システムは自動撮像プロトコルを含む、請求項１２に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１４】
前記撮像システムは共焦撮像またはオンチップフローサイトメトリを含む、請求項１３に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１５】
前記撮像システムは、血小板凝集体を測定するように、または、凝固に対する、血小板アクティベータ、血液の細胞成分、または細胞の効果を撮像するように、構成される、請求項１３に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１６】
前記第１のポートを通して与えられて血液サンプルを前記複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で駆動する前記差圧は、患者の血圧を含む、請求項１に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１７】
ミクロ流体凝固装置であって、
複数のマイクロチャネルを定める少なくとも１つの基板と、
前記基板の第１の端部にある第１のポートとを備え、前記第１のポートは前記複数のマイクロチャネルそれぞれの第１の端部に接続し、
前記基板の第２の端部にある第２のポートを備え、前記第２のポートは前記複数のマイクロチャネルそれぞれの第２の端部に接続し、
前記複数のマイクロチャネル内の流量または前記複数のマイクロチャネルに関連する流量を求めるように構成された第１の検知装置と、
タイマーと、
前記第１の検知装置および前記タイマーと組合されて、（ｉ）流れ始めたときに対応する第１の時間における第１の流量値、（ｉｉ）第２の流量値が求めた前記第１の流量値の約二分の一と判断される第２の時間、（ｉｉｉ）第３の流量値が求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）分の１と判断される第３の時間、および、（ｉｖ）以下の関係によって支配されるチャネル閉塞を予測する血液凝固モデルを求めるように構成された、コントローラとを備え、
【数２】
2016534714.tif 000024
式中、Ｔｑｆは前記第３の時間、Ｔｑｇは前記第２の時間であり、
差圧が前記第１のポートに与えられて血液サンプルを前記複数のマイクロチャネルを通して駆動する、ミクロ流体凝固装置。
【請求項１８】
差圧を前記第１のポートに与えるように構成され、かつ、血液サンプルを前記複数のマイクロチャネルを通して駆動するように構成された装置をさらに備え、
前記差圧はポンプによって生成される、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項１９】
前記ポンプは、シリンジポンプ、または蠕動ポンプ、またはその他の一定流量送達ポンプである、請求項１８に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２０】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかの断面表面積は、約１２５μｍ２〜１．７５ｍｍ２の間である、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２１】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかの最大寸法は、約２５μｍ〜５ｍｍの間である、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２２】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかの最大寸法は、約７５μｍ〜２００μｍの間である、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２３】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の断面積を有し、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記第１の断面積と異なる第２の断面積を有する、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２４】
前記複数のマイクロチャネルのうちの１つのマイクロチャネルの少なくとも一部分は第１の表面処理を有する、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２５】
前記複数のマイクロチャネルのうちの別の１つのマイクロチャネルの少なくとも一部分は前記第１の表面処理と異なる第２の表面処理を有する、請求項２４に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２６】
前記第１の表面処理および前記第２の表面処理のうちの少なくとも一方は、自然発生または合成試薬、コラーゲン、血栓形成誘発材料、血栓形成阻害材料、血小板活性化材料、血小板阻害材料、フィブリンネットワーク形成材料、フィブリンネットワーク破壊材料、細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、セグメント化ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、またはポリメタクリル酸メチルのうちの１つを含む、請求項２５に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２７】
前記せん断の速度は７５ｓｅｃ−１と５０００ｓｅｃ−１の間である、請求項１８に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２８】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を撮像するように構成された撮像システムをさらに備える、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項２９】
前記撮像システムは自動撮像プロトコルを含む、請求項２８に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項３０】
前記撮像システムは共焦撮像またはオンチップフローサイトメトリを含む、請求項２９に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項３１】
前記撮像システムは、血小板凝集体を測定するように、または、凝固に対する、血小板アクティベータ、血液の細胞成分、または細胞の効果を撮像するように、構成される、請求項２９に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項３２】
前記第１のポートに与えられて血液サンプルを前記複数のマイクロチャネルを通して駆動する前記差圧は、患者の血圧を含む、請求項１７に記載のミクロ流体凝固装置。
【請求項３３】
被験者から採取した血液サンプルから被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法であって、
ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で被験者からの血液サンプルを駆動することと、
前記実質的に一定の流量で前記複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルが移動している間に、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、
流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、
第２の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
第３の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、以下の関係によって、前記被験者のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含み、
【数３】
2016534714.tif 000025
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間であり、
被験者特有の前記定めた凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む、方法。
【請求項３４】
前記被験者からの血液サンプルを、直接接続を通して、カテーテルまたは体外装置を通して、患者から前記ミクロ流体装置に駆動することをさらに含む、請求項３３に記載の被験者の血液の凝固を評価する方法。
【請求項３５】
被験者特有の前記定めた凝固モデルに応じて、前記被験者に対する治療薬の投与量、前記被験者に対する治療薬の濃度、または前記被験者に対する治療薬の投与の頻度のうちの少なくとも１つを決定することをさらに含む、請求項３３に記載の被験者の血液の凝固を評価する方法。
【請求項３６】
凝固の過程の間に前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を撮像して前記凝固の過程に関連する情報を提供することをさらに含む、請求項３３に記載の被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法。
【請求項３７】
被験者から採取した血液サンプルから被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法であって、
ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルを駆動することと、
前記実質的に一定の圧力で前記複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルが移動している間に、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、
流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、
第２の流量値が求めた前記第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
第３の流量値が求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、以下の関係によって、前記被験者のチャネル閉塞を予測する被験者特有の凝固モデルを定めることとを含み、
【数４】
2016534714.tif 000026
式中、Ｔｑｆは前記第２の時間、Ｔｑｇは前記第１の時間であり、
前記定めた被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む、方法。
【請求項３８】
前記定めた被験者特有の凝固モデルに応じて、前記被験者に対する治療薬の、投与量、濃度、または投与の頻度のうちの少なくとも１つを調整することをさらに含む、請求項３７に記載の被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法。
【請求項３９】
前記定めた被験者特有の凝固モデルに応じて、前記被験者に対する治療薬の投与量、前記被験者に対する治療薬の濃度、または前記被験者に対する治療薬の投与の頻度のうちの少なくとも１つを決定することをさらに含む、請求項３７に記載の被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法。
【請求項４０】
凝固の過程の間に前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を撮像して前記凝固の過程に関連する情報を提供することをさらに含む、請求項３６に記載の被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法。
【請求項４１】
被験者からの血液サンプルから被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法であって、
第１のミクロ流体装置の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で被験者からの血液サンプルの第１の部分を駆動することと、
前記実質的に一定の流量で前記第１の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの前記第１の部分が移動している間に、前記第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、
流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、
第２の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
第３の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、以下の関係によって、チャネル閉塞を予測する第１の被験者特有の凝固モデルを定めることとを含み、
【数５】
2016534714.tif 000027
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間であり、
前記定めた第１の被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することと、
前記第１のミクロ流体装置の基板内にまたは第２のミクロ流体装置の基板内に形成された複数の第２のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で前記被験者の血液サンプルの第２の部分を駆動することと、
前記実質的に一定の圧力で前記複数の第２のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの第２の部分が移動している間に、前記複数の第２のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、
流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、
第２の流量値が求めた前記第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
第３の流量値が求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、以下の関係によって、チャネル閉塞を予測する第２の被験者特有の凝固モデルを定めることとを含み、
【数６】
2016534714.tif 000028
式中、Ｔｑｆは前記第２の時間、Ｔｑｇは前記第１の時間であり、
前記定めた第２の被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む、方法。
【請求項４２】
被験者からの血液サンプルから被験者の凝固の少なくともいくつかの側面を評価する方法であって、
ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で血液サンプルを駆動することと、
前記実質的に一定の流量で前記複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルが移動している間に、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、
流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、
第２の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
第３の圧力値が求めた前記第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
チャネル閉塞を予測する被験者特有の凝固モデルを定めることと、
以下の関係を用いて前記被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することとを含み、
【数７】
2016534714.tif 000029
式中、Ａ、ＢおよびＣは、以下の関係をカーブフィッティングすることによって実験的に求められる血液の特性に関連する被験者特有の変数であり、
【数８】
2016534714.tif 000030
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間である、方法。
【請求項４３】
被験者の血液サンプルの凝固を評価する方法であって、
ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルを駆動することと、
前記実質的に一定の圧力で前記複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルが移動している間に、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、
流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、
第２の流量値が求めた前記第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
第３の流量値が求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
以下の関係を用いて被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することとを含み、
【数９】
2016534714.tif 000031
式中、Ａ、Ｂ、およびＣは、以下の関係をカーブフィッティングすることによって実験的に求められる血液の特性に関連する被験者特有の変数であり、
【数１０】
2016534714.tif 000032
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間である、方法。
【請求項４４】
血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法であって、
ミクロ流体装置の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で血液サンプルの第１の部分を駆動することと、
前記実質的に一定の流量で前記第１の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの前記第１の部分が移動している間に、前記第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、
前記血液サンプルの前記第１の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、
前記血液サンプルの前記第１の部分の第２の圧力値が前記血液サンプルの前記第１の部分の求めた前記第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
前記血液サンプルの前記第１の部分の第３の圧力値が前記血液サンプルの前記第１の部分の求めた前記第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、前記血液サンプルの前記第１の部分についての以下の関係によって、前記血液サンプルの前記第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含み、
【数１１】
2016534714.tif 000033
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間であり、
前記ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第２の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で血液サンプルの第２の部分を駆動することと、
モディファイアを前記血液サンプルの前記第２の部分または前記第２の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することと、
前記実質的に一定の流量で前記第２の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの前記第２の部分が移動している間に、前記第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、
前記血液サンプルの前記第２の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、  前記血液サンプルの前記第２の部分の第２の圧力値が前記血液サンプルの前記第２の部分の求めた前記第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
前記血液サンプルの前記第２の部分の第３の圧力値が前記血液サンプルの前記第２の部分の求めた前記第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、  前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、前記血液サンプルの前記第２の部分についての以下の関係によって、前記血液サンプルの前記第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含み、
【数１２】
2016534714.tif 000034
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間であり、
前記血液サンプルの前記第１の部分のチャネル閉塞を予測する前記凝固モデルを、前記血液サンプルの前記第２の部分のチャネル閉塞を予測する前記凝固モデルと比較することにより、前記モディファイアの効果を判断することを含む、方法。
【請求項４５】
前記モディファイアは抗凝固剤を含む、請求項４４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項４６】
前記モディファイアは、ヘパリン、低分子量ヘパリン、直接要因阻害剤、直接トロンビン阻害剤、アンチトロンビンタンパク質、リバーロキサバン、アピキサバン、ダビガトラン、クマリン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、バトロキソビン、ヘメンチンのうちの１つを含む、請求項４５に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項４７】
前記モディファイアは補助食品誘導体を含む、請求項４４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項４８】
前記モディファイアは抗血小板薬を含む、請求項４４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項４９】
前記モディファイアは、不可逆性シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アデノシン再取込み阻害剤、またはトロンボキサン阻害剤を含む、請求項４８に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５０】
前記血液サンプルの前記第１の部分および前記血液サンプルの前記第２の部分各々から凝固成分を除去することによって凝固反応の特定の側面の分離性を高めることをさらに含む、請求項４４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５１】
前記血液サンプルの前記第１の部分および前記血液サンプルの前記第２の部分各々から血小板を除去することによってフィブリン形成の分離性を高めることをさらに含む、請求項５０に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５２】
前記ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第３の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で前記血液サンプルの第３の部分を駆動することと、
第２のモディファイアを前記血液サンプルの第３の部分または前記第３の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することと、
前記実質的に一定の流量で前記第３の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの第３の部分が移動している間に、前記第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、
前記血液サンプルの第３の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、
前記血液サンプルの第２の部分の第２の圧力値が求めた前記血液サンプルの第３の部分の第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
前記血液サンプルの第２の部分の第３の圧力値が求めた前記血液サンプルの第３の部分の第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、前記血液サンプルの前記第３の部分についての以下の関係によって、前記血液サンプルの前記第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含み、
【数１３】
2016534714.tif 000035
式中、Ｔｐｆは前記第２の時間、Ｔｐｇは前記第１の時間であり、
前記血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを、前記血液サンプルの第３の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルと比較することにより、前記第２のモディファイアの効果を判断することとを含み、
前記第２のモディファイアは前記モディファイアと異なる、請求項４６に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５３】
前記第２のモディファイアは、前記モディファイアと同一の物質であるが、量または濃度が異なる、請求項５２に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５４】
血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法であって、
ミクロ流体装置の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルの第１の部分を駆動することと、
前記実質的に一定の圧力で前記第１の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの前記第１の部分が移動している間に、前記第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、
前記血液サンプルの前記第１の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、
前記血液サンプルの前記第１の部分の第２の流量値が前記血液サンプルの前記第１の部分の求めた前記第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
前記血液サンプルの前記第１の部分の第３の流量値が前記血液サンプルの前記第１の部分の求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、以下の関係によって、前記血液サンプルの前記第１の部分のチャネル閉塞を予測する第１の凝固モデルを定めることとを含み、
【数１４】
2016534714.tif 000036
式中、Ｔｑｆは前記第２の時間、Ｔｑｇは前記第１の時間であり、
前記ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第２の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルの第２の部分を駆動することと、
モディファイアを前記血液サンプルの前記第２の部分または前記第２の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することと、
前記実質的に一定の圧力で前記第２の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの前記第２の部分が移動している間に、前記第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、
前記血液サンプルの前記第２の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、  前記血液サンプルの前記第２の部分の第２の流量値が前記血液サンプルの前記第２の部分の求めた前記第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
前記血液サンプルの前記第２の部分の第３の流量値が前記血液サンプルの前記第２の部分の求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、  前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、前記血液サンプルの前記第２の部分についての以下の関係によって、前記血液サンプルの前記第２の部分のチャネル閉塞を予測する第２の凝固モデルを定めることとを含み、
【数１５】
2016534714.tif 000037
式中、Ｔｑｆは前記第２の時間、Ｔｑｇは前記第１の時間であり、
前記血液サンプルの前記第１の部分のチャネル閉塞を予測する前記凝固モデルを、前記血液サンプルの前記第２の部分のチャネル閉塞を予測する前記凝固モデルと比較することにより、前記モディファイアの効果を判断することを含む、方法。
【請求項５５】
前記モディファイアは抗凝固剤を含む、請求項５４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５６】
前記モディファイアは、ヘパリン、低分子量ヘパリン、直接要因阻害剤、直接トロンビン阻害剤、アンチトロンビンタンパク質、リバーロキサバン、アピキサバン、ダビガトラン、クマリン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、バトロキソビン、ヘメンチンのうちの１つを含む、請求項５５に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５７】
前記モディファイアは補助食品誘導体を含む、請求項５５に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５８】
前記モディファイアは抗血小板薬を含む、請求項５４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項５９】
前記モディファイアは、不可逆性シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アデノシン再取込み阻害剤、またはトロンボキサン阻害剤を含む、請求項５８に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項６０】
前記ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第３の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で前記血液サンプルの第３の部分を駆動することと、
第２のモディファイアを前記血液サンプルの第３の部分または前記第３の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することと、
前記実質的に一定の圧力で前記第３の複数のマイクロチャネルを通して前記血液サンプルの第３の部分が移動している間に、前記第３の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、
前記血液サンプルの第３の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、
前記血液サンプルの第３の部分の第２の流量値が求めた前記血液サンプルの第３の部分の第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、
前記血液サンプルの第３の部分の第３の流量値が前記血液サンプルの第３の部分の求めた前記第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、
前記第１の時間と前記第２の時間を用いて、前記血液サンプルの前記第３の部分についての以下の関係によって、前記血液サンプルの第３の部分のチャネル閉塞を予測する第３の凝固モデルを定めることとを含み、
【数１６】
2016534714.tif 000038
式中、Ｔｑｆは前記第２の時間、Ｔｑｇは前記第１の時間であり、
前記血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを、前記血液サンプルの第３の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルと比較することにより、前記第２のモディファイアの効果を判断することとを含み、
前記第２のモディファイアは前記モディファイアと異なる、請求項５４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項６１】
前記第２のモディファイアは、前記モディファイアと同一の物質であるが、量または濃度が異なる、請求項６０に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項６２】
前記血液サンプルの前記第１の部分および前記血液サンプルの前記第２の部分各々から凝固成分を除去することによって凝固反応の特定の側面の分離性を高めることをさらに含む、請求項５４に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項６３】
前記血液サンプルの前記第１の部分および前記血液サンプルの前記第２の部分各々から血小板を除去することによってフィブリン形成の分離性を高めることをさらに含む、請求項６２に記載の血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法。
【請求項６４】
インビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置であって、
入口端と出口端を有する複数のマイクロチャネルを定める少なくとも１つの基板を備え、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは少なくとも第１の部分と第２の部分と第３の部分とを含み、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記第１の部分において収束部分を含み、前記第１の部分において前記マイクロチャネルの断面積は、第１の断面積から、より小さい第２の断面積に減少し、前記マイクロチャネルの断面積は前記第２の部分において少なくとも実質的に維持され、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記第３の部分において発散部分を含み、前記発散部分は、前記マイクロチャネルの断面積の、前記第２の断面積からより大きな第３の断面積への移行を定め、前記第３の断面積は前記第１の断面積と同一でも異なっていてもよく、前記装置は、
前記基板の第１の端部における第１のポートを備え、前記第１のポートは前記複数のマイクロチャネルのそれぞれの入口端に接続し、
前記基板の第２の端部における第２のポートを備え、前記第２のポートは前記複数のマイクロチャネルのそれぞれの出口端に接続し、
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記収束部分において第１の壁せん断勾配を生じさせるように構成され、
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記発散部分において第２の壁せん断勾配を生じさせるように構成され、
前記第１の壁せん断勾配および前記第２の壁せん断勾配は、任意のマイクロチャネル血栓形成促進もしくは抗血栓形成アンタゴニストまたは任意のマイクロチャネル表面処理と組合わせて、インビトロ凝固時間が約２〜６０分の間になるように選択される、インビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項６５】
前記インビトロ凝固時間は２〜２０分の間である、請求項６４に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項６６】
前記収束部分における前記第１の壁せん断勾配または前記発散部分における前記第２の壁せん断勾配のうちの少なくとも一方は、平均壁せん断の倍数の最大壁せん断勾配をもたらす、請求項６４に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項６７】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つはヒトコラーゲンＩでコーティングされる、請求項６４に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項６８】
前記ヒトコラーゲンＩの濃度は約１０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲に含まれる、請求項６７に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項６９】
前記第２の部分における前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つのチャネル幅は約２００μｍである、請求項６４に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７０】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を撮像するように構成された撮像システムをさらに備える、請求項６４に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７１】
前記撮像システムは自動撮像プロトコルを含む、請求項７０に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７２】
前記撮像システムは共焦撮像またはオンチップフローサイトメトリを含む、請求項７１に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７３】
前記撮像システムは、血小板凝集体を測定するように、または、凝固に対する、血小板アクティベータ、血液の細胞成分、または細胞の効果を撮像するように、構成される、請求項７１に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７４】
前記第１のポートと前記第２のポートのうちの一方は、カテーテルまたは体外装置を介して患者に接続される、請求項６４に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７５】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは複数のマイクロチャネルを含む、請求項６４〜７４のいずれか一項に記載のインビトロ血液分析アッセイミクロ流体凝固装置。
【請求項７６】
インビトロ血液分析アッセイの方法であって、
入口端と出口端を有する複数のマイクロチャネルを定める少なくとも１つの基板を備えたミクロ流体凝固装置を与えることを含み、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の部分と第２の部分と第３の部分とを含み、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記第１の部分において収束部分を含み、前記第１の部分において前記マイクロチャネルの断面積は、第１の断面積から、より小さい第２の断面積に減少し、前記マイクロチャネルの断面積は前記第２の部分において少なくとも実質的に維持され、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記第３の部分において発散部分を含み、前記発散部分は、前記マイクロチャネルの断面積の、前記第２の断面積からより大きな第３の断面積への移行を定め、前記第３の断面積は前記第１の断面積と同一でも異なっていてもよく、前記ミクロ流体装置はさらに、前記基板の第１の端部における第１のポートを備え、前記第１のポートは前記複数のマイクロチャネルそれぞれの入口端に接続し、前記基板の第２の端部における第２のポートを備え、前記第２のポートは前記複数のマイクロチャネルのそれぞれの出口端に接続し、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記収束部分において第１の壁せん断勾配を生じさせるように構成され、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは前記発散部分において第２の壁せん断勾配を生じさせるように構成され、
前記方法はさらに、
患者の血管を、カテーテルまたは体外装置を介して前記ミクロ流体凝固装置の第１のポートと第２のポートのうちの一方に接続することと、
患者から前記ミクロ流体凝固装置を通して血液を送ることと、
前記ミクロ流体凝固装置において前記患者からの血液の血液学的挙動を分析することとを含み、
前記第１の壁せん断勾配および前記第２の壁せん断勾配は、任意のマイクロチャネル血栓形成促進もしくは抗血栓形成アンタゴニストまたは任意のマイクロチャネル表面処理と組合わせて、インビトロ凝固時間が約２〜６０分の間になるように選択される、方法。
【請求項７７】
前記インビトロ凝固時間は２〜２０分の間である、請求項７６に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項７８】
前記収束部分における前記第１の壁せん断勾配または前記発散部分における前記第２の壁せん断勾配のうちの少なくとも一方は、平均壁せん断の倍数の最大壁せん断勾配をもたらす、請求項７６に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項７９】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つはヒトコラーゲンＩでコーティングされる、請求項７６に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８０】
前記ヒトコラーゲンＩの濃度は約１０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲に含まれる、請求項７９に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８１】
前記第２の部分における前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つのチャネル幅は約２００μｍである、請求項７６に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８２】
撮像システムを用いて前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの少なくとも一部分を撮像することをさらに含む、請求項７６に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８３】
前記撮像システムは自動撮像プロトコルを含む、請求項８２に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８４】
前記撮像システムは共焦撮像またはオンチップフローサイトメトリを含む、請求項８３に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８５】
前記撮像システムは、血小板凝集体を測定するように、または、凝固に対する、血小板アクティベータ、血液の細胞成分、または細胞の効果を撮像するように、構成される、請求項８３に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【請求項８６】
前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは複数のマイクロチャネルを含む、請求項７６〜８５のいずれか一項に記載のインビトロ血液分析アッセイの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／８９１，７３２号に基づく利益を主張し、その内容全体を本明細書に引用により援用する。
【０００２】
合衆国政府の助成による研究に関する陳述
本開示のいくつかの側面は、国防高等研究計画局（Defence Advanced Research Projects Agency（ＤＡＲＰＡ））から授与された助成金Ｎｏ．Ｎ６６００１−１１−１−４１８０およびＨＲ００１１−１３−Ｃ−００２５を受けて政府の支援の下でなされ、政府は本開示のこのような側面に対する権利を共有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の分野
本発明は、概してミクロ流体診断装置、システム、および方法に関し、より具体的には、全血凝固のリアルタイム評価のためのミクロ流体診断装置、システム、および方法に関する。
【０００４】
発明の背景
ヘパリンまたはクマジン等の抗凝固剤による血栓症の予防は、多くの病気および症状（たとえば、心房細動、敗血症、外傷、人工弁、さまざまな凝固障害、またはその他の出血障害）の治療にとって重要であり、また、透析、血液濾過、体外酸素化（ＥＣＭＯ）、血管形成術、静脈内流体送達、アフェレーシス、および解析または培養のための血液サンプルの収集を含む、多くの救命処置にとって重要である。血栓症は、血小板の活性化および凝固カスケードが原因である可能性があるので、抗凝固療法は一般的に抗血小板療法によって補われる。したがって、診療室において包括的な抗凝固をリアルタイムでモニタリングできることが、極めて有用であろう。なぜなら、抗凝固剤レベルおよび血小板数の変動に対する凝固の反応は、患者によって大きく異なる可能性があり、同じ患者でも時間が異なれば大きく異なる可能性があるからである。しかしながら、現在、血液の抗凝固および抗血小板療法全体の程度および効率を迅速に定量的に確認することは困難であり、それを、患者本人の血液を使用することが可能な臨床で素早く行なう確実な方法はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、出血および血液の凝固に問題がある患者は、プロトロンビン時間（Prothrombin Time（ＰＴ））および活性化全凝固時間（Activated Clotting Time（ＡＣＴ））／活性化部分凝固時間（Activated Partial Clotting Time（ＡＰＴＴ））を使用して定期的にモニタリングされており、これは、外因系または内因系の凝固経路の半定量的な測定値をそれぞれ提供する。しかしながら、これらアッセイによって得られた結果は、サンプルの調製、抗凝固管、アクティベータの追加、機器、およびユーザの能力によって、大きなばらつきがある。結果として、異なる部位でまたは異なる日に行なわれた同一サンプルに対する測定が、異なる結果をもたらすことが多い。また、これらテストの特異度および感度が良くないので、診療所において陽性症例または陰性症例が間違いであることが多い。加えて、ＰＴ、ＡＣＴ、およびＡＰＴＴアッセイは、血小板機能に関する情報は提供しないので、包括的な凝固テストとして機能しない。従来の血液凝固時間テストには限界があるので、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ）および回転トロンボエラストメトリ（ＲＯＴＥＭ）装置等の新たなポイントオブケアモニタリングシステムを臨床研究室に統合することが開始されている。これら装置は、止血に関するより多くの情報を提供できる。なぜなら、これら装置は、凝固反応に対する、血漿、血小板、白血球、および赤血球の累積的な寄与を測定するからである。しかしながら、これらテストは、静止条件（流れなし）下で凝固特性を測定するので、圧力および流量を含む物理的な力に対する感度が高い血小板および内皮細胞機能に対する臨床的有用性に限界がある。たとえば、血液における流体せん断応力およびせん断応力の勾配は、血小板活性化および血栓症に対して大きな影響力があるので、流体力学と取入れていない凝固モニタは、生体患者の脈管構造内で血液凝固生理機能が生じるときにこれを正確に評価できない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
関連する血行力学の力学的作用（せん断応力および勾配）を取入れ、サンプル調製またはオペレータの訓練を最小に（またはなしに）してインビボまたはエクスビボで実施することができ、体外血液かん流システム（たとえば透析、血液濾過、ＥＣＭＯ）と統合された、凝固モニタリング技術は、止血評価を大幅に向上させるとともに、診療所または研究室における患者または被験者の治療（たとえばヒト患者／被験者、動物患者／被験者）能力を大幅に向上させるであろう。本明細書に開示されるミクロ流体装置、システム、および方法は、血栓症の力学の解明と、生理学的流体せん断応力条件および病理学的流体せん断応力条件双方の下でのクロット形成の定量分析の支援双方に役立ち得る、生理学的に関連するベッドサイドまたラボベンチテストを開発することにより、このまだ満たされていない臨床要求を満たす機会を提供し、装置は患者の血管に直接装着することができる。
【０００７】
一例として、以下でより詳細に説明するように、このコンセプトのうちの少なくともいくつかの一実施形態は、矩形マイクロチャネル（７５×２００μｍ）のネットワークが中に確定されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むミクロ流体装置を含み、これらマイクロチャネルのサイズは、直径１２５μｍの生体小動脈（図１）にほぼ等しい。このミクロ流体装置およびシステムは、臨床またはポイントオブケア用途（たとえばベッドサイド対応）に適しており、全血液（たとえばヒトの血液、動物の血液）の血栓の可能性および血小板凝集をリアルタイムで測定するように構成される。
【０００８】
このコンセプトに従い、クロット形成を原因とする装置内のマイクロチャネルの全閉塞を、たとえば、動的に測定し、その一方で、抗凝固剤（たとえば未分画ヘパリン）の濃度または加えられる壁せん断応力およびせん断応力の勾配を独立して制御する。
【０００９】
インビボにおける血管の血栓症が、血流が血液の循環においてどのように維持されるかに依存する（たとえば、ヒトの心臓は動脈循環において比較的一定の流量が維持されるように血液を送出し、一方、静脈循環ではほぼ一定の圧力が維持される）ことを無視する現在の静止凝固評価装置とは異なり、開示されている凝固モニタリングミクロ流体装置の少なくともいくつかの側面は、シリンジポンプまたは一定圧力ポンプいずれかを用いて、実質的に一定の流量の動作モードおよび／または実質的に一定の圧力の動作モードにおいて、血液を送出するように構成される。実質的に一定の流量または実質的に一定の圧力のパラメータはまた、必要に応じて独立して変化させることができる。
【００１０】
このコンセプトの少なくともいくつかの側面に従い、ミクロ流体チャンネル内の凝固は、圧力上昇（流量が一定流量の動作モードにおいて実質的に一定のとき）、または、流量低下（圧力が一定圧力の動作モードにおいて実質的に一定のとき）を記録することによって特徴付けられ、実験によって実証された本明細書に記載の現象論的数学的モデルを用いて、特定患者用または特定被験者用の、全血液凝固の時間的な力学についての１つ以上の予測モデルを開発する。これらのモデルそれぞれの特徴的な時定数は、せん断流の下での血液の凝固時間を表わす。これら時定数は、患者特有または被験者特有のものなので、臨床医が、生理学的に関連する条件下で、血栓形成性、血小板機能、出血障害、および抗凝固治療を、定量、モニタリング、および追跡する、通常の診断テストとして、求めることができる。
【００１１】
現在の凝固モニタリング機器は、ばらつきが大きく、信頼性を欠いた非生理学的な凝固時間を報告することが多い。本発明者らは、これら現在の凝固モニタリング機器の精度は低いと判断した。なぜなら、これら機器は、患者ごとに異なり得るものであって、かつ日によっても異なり得る、血液流動学および流体力学的せん断応力とその勾配の、止血および血栓症に対する寄与を測定しないからである。したがって、本コンセプトは、関連する流動血行力学を取入れた、ミクロ流体装置、システム、および方法に関連し、血液凝固の臨床評価を著しく改善することができる凝固作用の定量測定を提供する。これは、体外血液かん流装置等のその他のシステムと好都合に統合することができる。
【００１２】
本コンセプトのある側面に従う、ミクロ流体凝固装置は、複数のマイクロチャネルを定める少なくとも１つの基板と、基板の第１の端部にある第１のポートとを備え、第１のポートは複数のマイクロチャネルそれぞれの入口端部に接続する。ミクロ流体凝固装置は、基板の第２の端部にある第２のポートを備え、第２のポートは複数のマイクロチャネルそれぞれの出口端部に接続する。差圧または流量／せん断が第１のポートを通して与えられるようにする装置が設けられて血液サンプルを複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で駆動する。第１の検知装置が、複数のマイクロチャネル内の圧力値または複数のマイクロチャネル全体の圧力に関連する圧力値を求めるように構成され、時間を計測するタイマーが設けられる。さらに、ローカルおよび／またはリモートプロセッサでもよい１つ以上のプロセッサを含み得るコントローラが、第１の検知装置およびタイマーと組合されて、流れ始めたときの第１の圧力値、第２の圧力値が求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間、および、第３の圧力値が求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍となる第２の時間を求めるように構成され、かつさらに、以下の関係に従ってチャネル閉塞を予測する被験者凝固モデルを定めるように構成される。
【００１３】
【数１】
2016534714.tif 000003
【００１４】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。
本コンセプトの別の側面において、ミクロ流体凝固装置は、複数のマイクロチャネルを定める少なくとも１つの基板と、基板の第１の端部にある第１のポートとを備え、第１のポートは複数のマイクロチャネルそれぞれの入口端部に接続する。ミクロ流体凝固装置は、基板の第２の端部にある第２のポートを備え、第２のポートは複数のマイクロチャネルそれぞれの出口端部に接続する。差圧を第１のポートを通して与える装置が第１のポートに装着されて血液サンプルを複数のマイクロチャネルを通して駆動する。第１の検知装置は、複数のマイクロチャネル内の流量または複数のマイクロチャネルに関連する流量を求めるように構成され、時間を計測するタイマーが設けられる。ローカルおよび／またはリモートプロセッサでもよい１つ以上のプロセッサを含み得るコントローラが、第１の検知装置およびタイマーと組合されて、（ｉ）流れ始めたときに対応する第１の時間における第１の流量値、（ｉｉ）第２の流量値が求めた第１の流量値の約二分の一と判断される第２の時間、（ｉｉｉ）第３の流量値が求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）分の１と判断される第３の時間、および、（ｉｖ）以下の関係によって支配されるチャネル閉塞を予測する患者血液凝固モデルを求めるように構成される。
【００１５】
【数２】
2016534714.tif 000004
【００１６】
式中、Ｔｑｆは第３の時間、Ｔｑｇは第２の時間である。
本コンセプトの他の側面において、被験者の血液の凝固を評価する方法は、ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で被験者からの血液サンプルを駆動することと、実質的に一定の流量で複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルが移動している間に、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することとを含む。この方法はまた、流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、第２の圧力値が求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、第３の圧力値が求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、第１の時間と第２の時間を用いて、以下の関係によって、被験者のチャネル閉塞を予測する被験者特有の凝固モデルを定めることとを含む。
【００１７】
【数３】
2016534714.tif 000005
【００１８】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。この方法はさらに、定めた被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む。
【００１９】
本コンセプトのさらに他の側面において、被験者の血液の凝固を評価する方法は、ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で被験者の血液サンプルを駆動することと、実質的に一定の圧力で複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルが移動している間に、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、第２の流量値が求めた第１の流量値の約二分の一と判断される第１の時間を求めることと、第３の流量値が求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）分の一と判断される第２の時間を求めることと、第１の時間と第２の時間を用いて、以下の関係によって、被験者のチャネル閉塞を予測する被験者特有の凝固モデルを定めることとを含む。
【００２０】
【数４】
2016534714.tif 000006
【００２１】
式中、Ｔｑｆは第２の時間、Ｔｑｇは第１の時間である。この方法はまた、定めた被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む。
【００２２】
本コンセプトのさらに他の側面において、被験者の血液の凝固を評価する方法は、第１のミクロ流体装置の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で被験者の第１の血液サンプルを駆動することと、実質的に一定の流量で第１の複数のマイクロチャネルを通して第１の血液サンプルが移動している間に、第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することとを含む。この方法はまた、流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、第２の圧力値が求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、第３の圧力値が求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、第１の時間と第２の時間を用いて、以下の関係によって、チャネル閉塞を予測する第１の被験者凝固モデルを定めることを含む。
【００２３】
【数５】
2016534714.tif 000007
【００２４】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。この方法はさらに、定めた第１の被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む。加えて、この方法は、第１のミクロ流体装置の基板内にまたは第２のミクロ流体装置の基板内に形成された複数の第２のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で被験者の第２の血液サンプルを駆動することと、実質的に一定の圧力で複数の第２のマイクロチャネルを通して血液サンプルが移動している間に、複数の第２のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、第２の流量値が求めた第１の流量値の約二分の一と判断される第１の時間を求めることと、第３の流量値が求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）分の一と判断される第２の時間を求めることと、第１の時間と第２の時間を用いて、以下の関係によって、チャネル閉塞を予測する第２の被験者特有の凝固モデルを定めることとを含む。
【００２５】
【数６】
2016534714.tif 000008
【００２６】
式中、Ｔｑｆは第２の時間、Ｔｑｇは第１の時間である。この方法はさらに、定めた第２の被験者特有の凝固モデルを物理記憶媒体に記録することを含む。
【００２７】
本コンセプトのさらに他の側面において、被験者の血液の凝固を評価する方法は、ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で血液サンプルを駆動することと、実質的に一定の流量で複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルが移動している間に、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、第２の圧力値が求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、第３の圧力値が求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はまた、チャネル閉塞を予測する被験者の凝固モデルを定めることと、以下の関係を用いて凝固時間を物理記憶媒体に記録することとを含む。
【００２８】
【数７】
2016534714.tif 000009
【００２９】
式中、Ａ、ＢおよびＣは、以下の関係をカーブフィッティングすることによって実験的に求められる血液の特性に関連する被験者特有の変数であり、
【００３０】
【数８】
2016534714.tif 000010
【００３１】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。
本コンセプトのさらに他の側面において、被験者の血液の凝固を評価する方法は、ミクロ流体装置の基板内に形成された複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルを駆動することと、実質的に一定の圧力で複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルが移動している間に、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することとを含む。この方法はまた、流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、第２の流量値が求めた第１の流量値の約二分の一と判断される第１の時間を求めることと、第３の流量値が求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）分の一と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はまた、以下の関係を用いて凝固時間を物理記憶媒体に記録することを含む。
【００３２】
【数９】
2016534714.tif 000011
【００３３】
式中、Ａ、Ｂ、Ｃおよびωは、以下の関係をカーブフィッティングすることによって実験的に求められる血液の特性に関連する被験者特有の変数であり、
【００３４】
【数１０】
2016534714.tif 000012
【００３５】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。
本コンセプトのさらに他の側面において、血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法は、ミクロ流体装置の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で血液サンプルの第１の部分を駆動することと、実質的に一定の流量で第１の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第１の部分が移動している間に、第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、血液サンプルの第１の部分の第２の圧力値が血液サンプルの第１の部分の求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分の第３の圧力値が血液サンプルの第１の部分の求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、第１の時間と第２の時間を用いて、血液サンプルの第１の部分についての以下の関係によって、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含む。
【００３６】
【数１１】
2016534714.tif 000013
【００３７】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。この方法はさらに、ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第２の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の流量で血液サンプルの第２の部分を駆動することと、モディファイアを血液サンプルの第２の部分または第２の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することとを含む。この方法はさらに、実質的に一定の流量で第２の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第２の部分が移動している間に、第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、血液サンプルの第２の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、血液サンプルの第２の部分の第２の圧力値が血液サンプルの第２の部分の求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第２の部分の第３の圧力値が血液サンプルの第２の部分の求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、第１の時間と第２の時間を用いて血液サンプルの第２の部分についての以下の関係によって、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含む。
【００３８】
【数１２】
2016534714.tif 000014
【００３９】
式中、Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルと比較することにより、モディファイアの効果を判断することを含む。
【００４０】
本コンセプトの別の側面において、血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する方法は、ミクロ流体装置の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルの第１の部分を駆動することと、実質的に一定の圧力で第１の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第１の部分が移動している間に、第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、血液サンプルの第１の部分の第２の流量値が求めた第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、血液サンプルの第１の部分の第３の流量値が求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、第１の時間と第２の時間を用いて、以下の関係によって、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する第１の凝固モデルを定めることとを含む。
【００４１】
【数１３】
2016534714.tif 000015
【００４２】
式中、Ｔｑｆは第２の時間、Ｔｑｇは第１の時間である。この方法はさらに、ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第２の複数のマイクロチャネルを通して実質的に一定の圧力で血液サンプルの第２の部分を駆動することと、モディファイアを血液サンプルの第２の部分または第２の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することとを含む。この方法はさらに、実質的に一定の圧力で第２の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第２の部分が移動している間に、第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の流量または流量に関連する変数を測定することと、血液サンプルの第２の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第２の部分の第２の流量値が血液サンプルの第２の部分の求めた第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、血液サンプルの第２の部分の第３の流量値が血液サンプルの第２の部分の求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、第１の時間と第２の時間を用いて、血液サンプルの第２の部分についての以下の関係によって、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する第２の凝固モデルを定めることを含む。
【００４３】
【数１４】
2016534714.tif 000016
【００４４】
式中、Ｔｑｆは第２の時間、Ｔｑｇは第１の時間である。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルと比較することにより、モディファイアの効果を判断することを含む。
【００４５】
本発明の他の側面は、当業者にとって、さまざまな実施形態の詳細な説明に鑑みれば明らかであろう。詳細な説明は図面を参照しながらなされ、図面の簡単な説明は次の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従うミクロ流体凝固装置の図を示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、図１のミクロ流体凝固装置を利用した、標識フィブリノゲンの蛍光タイムラプス顕微鏡検査法を用いた血栓形成の力学を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、注入または圧力ポンプモード下で動作させる図１に従うミクロ流体装置における全血液凝固の定量的評価を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、未分画ヘパリン濃度およびせん断速度の関数としての現象論的解析モデルから得られた凝固時間を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、ミクロ流体凝固測定装置を用いた血小板凝集の解析を示す。
【図６】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、装置動作の注入モードおよび圧力モード双方について、さまざまなせん断速度およびヘパリン濃度で、凝固力学の数学的関係である式（１）および式（２）から得られた、それぞれのカーブフィットの適合度パラメータＲ２を示す表である。
【図７】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、装置動作の注入モードおよび圧力モード双方について、さまざまなせん断速度およびヘパリン濃度で、凝固時間の数学的関係から得られた、それぞれのカーブフィットの適合度パラメータＲ２を示す表である。
【図８】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、凝固時間対ヘパリン濃度の数学的モデルのパラメータの平均最良適合値を示す表である。
【図９】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、凝固時間対せん断速度の数学的モデルのパラメータの平均最良適合値を示す表である。
【図１０】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、注入ポンプモードまたは圧力ポンプモードで動作するミクロ流体装置における全血液凝固の定量的評価の解析モデルを示し、注入モードでは流量の減衰はＳ字傾向を示し、圧力モードでは圧力の増加は指数関数的であり、凝固時間は、解析モデルの等式をそれぞれの測定値に適合させることによって得ることができる。
【図１１】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、図１のミクロ流体装置を通してかん流させた、クエン酸ナトリウムに入れられた全血液を示し、動作の注入モードおよび圧力モードそれぞれにおけるΔＰ（０）およびＱ（０）を予測するためのΔＰ−Ｑ応答曲線が示される。
【図１２】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、せん断速度／応力の関数として凝固モニタリングミクロ流体装置における全血液の凝固時間を予測するための解析モデルを示す。
【図１３Ａ】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、せん断速度とせん断速度の勾配を示す、バイオミメティック血管網における血流の計算モデリングを示す。
【図１３Ｂ】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、せん断速度とせん断速度の勾配を示す、バイオミメティック血管網における血流の計算モデリングを示す。
【図１３Ｃ】本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、せん断速度とせん断速度の勾配を示す、バイオミメティック血管網における血流の計算モデリングを示す。
【図１４】フィブリンおよび血小板付着に対するせん断およびせん断勾配の効果を示し、図１３Ａ〜図１３Ｃに示されるミクロ流体装置の狭窄後／発散部分においてフィブリンおよび血小板付着が最大であることが示される。
【図１５】図１３Ａ〜図１３Ｃに示されるミクロ流体装置で利用されるコラーゲンコーティングが、凝固モニタリングアッセイ時間を２〜２０分以内に短縮することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明では多くの異なる形態の実施形態が可能であるが、図面に示され本明細書で詳細に説明されるのは、本発明の好ましい実施形態であり、本開示は本発明の原理を例示するものとみなされるべきものであって本発明の広い側面を示されている実施形態に限定することは意図されていないことが理解される。
【００４８】
発明の詳細な説明
本明細書に記載のように、発明者らは凝固力学がＳ字状であることを見出し、この観察に基づいて、発明者らは、抗凝固剤（ヘパリン）濃度または適用するせん断速度のいずれかを変化させたときの、注入モード双方における、全血凝固の時間的力学を正確に予測する、現象論的数学的モデルを開発し実験によって検証した。開発したモデルは２つの凝固時間を示す。一方は、凝固が始まる時間を示し、他方は、全血管閉塞が発生する時間を決定する。これらモデルはまた、フィブリノゲンの拡散的運搬および血小板凝集の生物物理学的効果を取入れる。発明者らはさらに、ミクロ流体装置を、たとえば、自動蛍光撮像と統合することにより、凝固および血小板凝集の定量を同時に行なえることを示した。したがって、本明細書に記載の多機能凝固解析システムは、ベッドサイドであっても研究室内であっても、患者または被験者（たとえば動物またはヒト）における凝固をモニタリングするための、定量的基準を提供することができる。
【００４９】
本明細書に記載の、本コンセプトの一実施形態は、例として図１に示されるミクロ流体装置１００である。この装置は、複数の平行なマイクロチャネル１１０を含み、これらマイクロチャネルは、直径１２５μｍの血管を模倣したものであり、一定の流量でまたは一定の圧力でヒトの全血のうち少量（２〜５ｍＬ）を注入したときの凝固力学をリアルタイムで解析できるようにする。本明細書に記載のデータを取得するために使用されるミクロ流体装置１００は、図１に示されるように、幅２００μｍ高さ７５μｍの１２個の平行なレーンを含む。これらのレーンは、５０ｍｍの長さに亘って繰り返し６０°曲げられ、高い流体力学抵抗をもたらすが、層流を維持する。
【００５０】
以下で述べるように、このテスト構成において、ヒト全血のうちの２〜５ｍｌを、注入または圧力ポンプを通して、次に、適切な医療グレードの管（たとえば１．６ｍｍＩＤ）を介してミクロ流体装置１００のポート１２０ａ、１２０ｂに接続されているインライン圧力センサを通して、送出した。注入モードにおいて、クロットが形成されると、結果として圧力が増す。一方、一定圧力モードでは、流量が時間とともに低下する。これら結果を解析する際、現象論的数学的モデルとフィット回帰曲線を、それぞれ圧力または流量の変化に適用した。これらモデルの特徴的な定数は、２つの段階における凝固時間を示す。それは、クロット形成が加速するときと、クロットがチャネルを完全に閉塞したときである。凝固時間は、抗凝固剤（たとえばヘパリン）の濃度と加えられたせん断によって決まる。フィブリノゲンおよび血小板の蛍光顕微鏡検査により、フィブリン形成と血小板凝集を同時にリアルタイムでモニタリングすることができる。
【００５１】
図１のミクロ流体装置１００を用いて実施したテストにおいて、５ｍｌのシリンジ（slip-tip Plastipak, BD, Franklin Lakes, NJ）に入れられた新鮮なヒトの血液を、インラインの使い捨て可能な圧力センサ（PREPS-N-000, PendoTECH, Princeton, NJ）を通し、次にＰＤＭＳ装置を通して、血液を入れてから１５分以内に、シリンジポンプ（PHD Ultra CP, Harvard Apparatus, Holliston, MA）を介して押出した。流量を一定に保ったとき、シリンジポンプは「注入」モードで動作し、チャネル閉塞を、データ取得および解析ソフトウェア（Winwedge Pro, TALtech, Philadelphia, PA）を用いて、時間の経過に伴なう圧力の上昇を記録することによって測定した。一定圧力動作モードにおいて、シリンジポンプを、圧力センサからのフィードバックを処理しモータ速度および流量を調節して設定圧力を維持する「圧力」モードで使用した。２．５インチおよび６インチの、３．２ｍｍ  ＯＤ、１．５８ｍｍ  ＩＤの、医療グレード管（Tygon S-50-HL, Saint Gobain Plastics, Merrimack, NH）を、装置のポート１２０ａ、１２０ｂに接続した。構成された、入口側の管１２５の一端は圧力センサに接続され、この管の出力側は３．８％クエン酸ナトリウムに浸される。シリンジ、センサ、および管の内部でのクロット形成をさらに減じるために、血液に接触する面を、必要に応じて、滑りやすい液体を含浸した多孔質表面（slippery liquid-infused porous surface）（ＳＬＩＰＳ）技術で処理した。低圧高周波プラズマ露出を用いて表面を活性化し、続いて、不活性シラン層の共有結合と、血液代用品で使用される医療グレードの液体パーフルオロカーボンの追加があった。シリンジポンプ内のシリンジは、２〜３分ごとに手動で動かして、血中の赤血球が沈殿しないようにした。蛍光標識されたフィブリノゲン（１５０ｍｇ／ｍｌ、Alexa Fluor 488, Invitrogen, Grand Island, NY）の撮像装置１３０のタイムラプス撮影を用いて、血栓形成を観察した。テスト機構において、使用した撮像装置１３０は蛍光撮像構成のCarl ZeissのAxio 3 Observer顕微鏡（１０倍、ＮＡ０．３の対物レンズ）であったが、本コンセプトに従い他の撮像装置を容易に使用することができる。
【００５２】
血小板を、２つの遠心分離（２００ｇ、次に５００ｇ）によって全血から単離し、１０分間、カルセインオレンジ（２μＭ、Invitrogen, Grand island, NY）で標識した。複数の蛍光顕微鏡画像を、近傍領域から、自動スキャンを用いて記録し、つなぎ合わせて大領域パノラマを形成した。次に、大きな蛍光血小板凝集体の存在とサイズを、自動画像取込および画像解析プロトコルを用いて解析した。これらの実験において、ヘパリン濃度と壁せん断速度は独立して変化した。壁せん断応力／速度は、矩形マイクロチャネル１１０について得られた解析公式から求めた。
【００５３】
本明細書に記載のテストで使用するミクロ流体装置１００（図１）は、フォトリソグラフィ、より具体的にはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のソフトリソグラフィを用いてＳｉウェハ（University Wafer Corp., Boston, MA）上に作成されたＳＵ８  ２０７５（MicroChem. Corp., Newton, MA）マスターテンプレートを含む。２７  Slygard  １８４  ＰＤＭＳプレポリマー（Dow Corning, Midland, MI）を、シラン処理されたマスタ上に与え、これは、ＳＵ−８フォトレジストによって形成されたチャネル特徴のポジ型レリーフを有していた。次に、ＰＤＭＳを、対流オーブン内で６０℃で１２０分間硬化させた。硬化したＰＤＭＳをマスタから剥がし、いずれも酸素プラズマ（Plasma Etch, Carson City, NV）で処理した後に、５００μｍの高ＰＤＭＳコートガラススライドに結合した。ミクロ流体装置１００は、使用前に、医学的に許容されている潤滑剤であるパーフルオロデカリン（PFD, Sigma-Aldrich）で満たした。
【００５４】
説明を受け、Partners HealthcareおよびHarvard Universityの治験審査委員会（Institutional Review Board）（ＩＲＢ）の倫理ガイドラインに基づいた同意書を作成した、非喫煙者で健康なボランティアから、血液サンプルを、標準的な６ｍｌの無添加血液バキュテナー（BD and Company, Franklin Lakes, NJ, USA）に採取し、直後に１０００Ｕ／ｍｌの未分画ヘパリンを必要な濃度になるように加えた。血液を取ってから１５分以内に凝固実験を開始した。実験において、ヘパリン濃度は０．２５Ｕ／ｍｌ未満であり、血液は最初に３．２％の５ｍｌのクエン酸ナトリウムバキュテナー（BD and Company, Franklin Lakes, NJ, USA）に入れた。クエン酸塩添加血（Research Blood Components, Brighton, MA, USA）も、いくつかの研究のために購入し、これらサンプルの凝固作用を、７５μｌ／ｍｌの１００ｍＭ塩化カルシウム／７５ｍＭ塩化カルシウム溶液を加えることによって復元した。アスピリン（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を濃度を２０ｍＭになるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶かし、最終濃度が５００μＭになるように血液に加えた。プラスグレル（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を１ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、最終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように血液に加えた。
【００５５】
本明細書に記載の統計解析では、特に指定しない限り、すべてのデータは平均±ＳＤで示される。両側のＰ値は、平均を比較するために統計ｔ‐テストから得た。データ解析およびカーブフィッティングは、Graphpad Prism V6（Graphpad Software, San Diego, CA）を用いて行なった。
【００５６】
図２Ａ〜図２Ｂは、図１のミクロ流体凝固装置１００を用いる本コンセプトの一側面に従う標識フィブリノゲンの蛍光タイムラプス顕微鏡検査を使用した、血栓形成の力学を示す。図２Ａにおいて、最大値によって正規化された蛍光強度は、マイクロチャネル１１０内において時間の経過とともにＳ字状傾向を示し、マイクロチャネルは結果として閉塞する。データは、３パラメータＳ字状方程式を用いてフィットさせることができる。点線とシェーディングされたグレー領域は、フィットさせた曲線の９５％の信頼区間を示し、ｎ＝３、Ｒ２＝０．９９である。図２Ｂは、０．７５Ｕ／ｍｌのヘパリン抗凝固剤を含み与えられたせん断速度が１２５０ｓｅｃ−１である全血流について、蛍光フィブリノゲンのタイムラプス撮影から得られた、異なる４つの期間における標識フィブリノゲンの蛍光顕微鏡写真を、積重ねて示す。各図は、４×１タイル（１０倍対物レンズ）をつなぎ合わせてスキャンしたものである。一番下の顕微鏡写真の右下にある白いスケールバーは５００μｍである。
【００５７】
図３Ａ〜図３Ｄは、注入または圧力ポンプモードで動作させた図１に従うミクロ流体装置１００における全血凝固の定量的評価を示す。所与のせん断速度／応力３５０ｓｅｃ−１（１４ダイン／ｃｍ２）としてヘパリン濃度を変化させたとき、注入モードでは、圧力が時間とともに指数関数的に増し（図３Ａ）、圧力モードでは、流量が時間とともにＳ字状に低下している（図３Ｂ）。図３Ａ〜図３Ｂにおいて、参照番号３００ａは流量０Ｕ／ｍｌに対応するプロットを示し、参照番号３００ｂは流量０．２５Ｕ／ｍｌに対応するプロットを示し、参照番号３００ｃは流量０．５Ｕ／ｍｌに対応するプロットを示し、参照番号３００ｄは流量１Ｕ／ｍｌに対応するプロットを示す。同様に、ヘパリン濃度０．５Ｕ／ｍｌとしてせん断速度／応力を変化させたとき、注入モードでは、圧力が時間とともに指数関数的に増し（図３Ｃ）、圧力モードでは、流量が時間とともにＳ字状に低下している（図３Ｄ）。図３Ｃ〜図３Ｄにおいて、参照番号３１０ａは流量１５０ｓｅｃ−１に対応するプロットを示し、参照番号３１０ｂは流量３５０ｓｅｃ−１に対応するプロットを示し、参照番号３１０ｃは流量７５０ｓｅｃ−１に対応するプロットを示し、参照番号３１０ｄは流量１５００ｓｅｃ−１に対応するプロットを示す。図３Ａ〜図３Ｄにおいて、実線は測定した量であり、点線は、本明細書で説明する解析モデルの式（１）および式（２）を用いた回帰曲線フィットの９５％の信頼空間を示す。適合度パラメータＲ２は図６の表に示されている。
【００５８】
図４Ａ〜図４Ｄは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、未分画ヘパリン濃度およびせん断速度の関数としての現象論的解析モデルから得られた凝固時間を示す。ヘパリン濃度を０〜１Ｕ／ｍｌの範囲で変化させ、せん断速度を３５０ｓｅｃ−１（１４ダイン／ｃｍ２）と１２５０ｓｅｃ−１（５０ダイン／ｃｍ２）に設定したとき、注入モード（図４Ａ）における凝固時間（ＴｐｇおよびＴｐｆ）と、圧力モード（図４Ｂ）における凝固時間（ＴｑｇおよびＴｑｆ）は、ヘパリン濃度とともに指数関数的に増加している。図４Ａ〜図４Ｂにおいて、参照番号４００ａは３５０ｓｅｃ−１におけるＴｐｇ、Ｔｑｇに対応するプロットを示し、参照番号４００ｂは３５０ｓｅｃ−１におけるＴｐｆ、Ｔｑｆに対応するプロットを示し、参照番号４００ｃは１２５０ｓｅｃ−１におけるＴｐｇ、Ｔｑｇに対応するプロットを示し、参照番号４００ｄは１２５０ｓｅｃ−１におけるＴｐｆ、Ｔｑｆに対応するプロットを示す。せん断速度を７５〜２５００ｓｅｃ−１（３〜１００ダイン／ｃｍ２）の範囲で変化させ、ヘパリン濃度を０．２５と０．５Ｕ／ｍｌに設定したとき、注入モード（図４Ｃ）における凝固時間（ＴｐｇおよびＴｐｆ）は指数関数的に減衰し、圧力モード（図４Ｄ）における凝固時間（ＴｑｇおよびＴｑｆ）は、せん断速度／応力に対して次の関係、凝固時間＝Ｚ０γωｅ−φγに従っている。図４Ｃ〜図４Ｄにおいて、参照番号４１０ａは０．２５Ｕ／ｍｌのときのＴｐｇ、Ｔｑｇに対応するプロットを示し、参照番号４１０ｂは０．２５Ｕ／ｍｌのときのＴｐｆ、Ｔｑｆに対応するプロットを示し、参照番号４１０ｃは０．５Ｕ／ｍｌのときのＴｐｇ、Ｔｑｇに対応するプロットを示し、参照番号４１０ｄは０．５Ｕ／ｍｌのときのＴｐｆ、Ｔｑｆに対応するプロットを示す。点線は解析関係にフィットさせた回帰曲線であり、ｎ＝３の実験を各ケースにおいて実施した。各ケースのＲ２適合度パラメータは図７のグラフに示されている。
【００５９】
図５Ａ〜図５Ｃは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従うミクロ流体凝固測定装置１００を用いた血小板凝集の解析を示す。図５Ａにおいて、ミクロ流体装置１００の蛍光画像を積重ねたものは、５００μＭのアスピリンと２５μｇ／ｍｌのプラスグレルなしで（対照）、または５００μＭのアスピリンと２５μｇ／ｍｌのプラスグレルを用いて（薬剤）、図１のミクロ流体装置にヒトの全血を流したときの、蛍光標識された血小板の凝集体の形成を示す。図５Ａの中央の画像は、上下の画像よりも倍率設定が高い。スケールバー（図５の最も上のスライドの右上）は５ｍｍである。図５Ｂは、血小板抑制薬剤の組合わせ（薬剤）を加えたことにより、装置を一定のせん断速度１２５０ｓｅｃ−１（ｎ＝４）で動作させた時と比較して凝固時間が延びることを示している。黒丸は対照を表わし、白丸は（線分の右側）は薬剤を表わす。図５Ｃにおいて、薬剤の組合わせを追加することにより、対照の非処理のサンプルと比較して血液中の血小板凝集体の数が大幅に減少している（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。
【００６０】
ミクロ流体凝固装置１００は、約７５ｓｅｃ−１〜２５００ｓｅｃ−１（３〜１００ダイン／ｃｍ２）の範囲のせん断速度で、対応する流量を約５〜１５０μｌ／ｍｉｎの範囲に維持できるように、設計された。望ましくは、せん断速度は、設定されたせん断速度から所定の量を超えて変化しないように（たとえば設定値から１０％以内、より好ましくは設定値から約５％以内、さらに好ましくは設定値から２％以内）実質的に一定に保たれる。使用される特定のミクロ流体凝固装置１００について、上記範囲の外の流量は、結果として赤血球が頻繁に沈降することになるか、またはヒトの血液が大量に必要となるので、望ましくないことが分かった。しかしながら、異なるマイクロチャネル１１０の構成（たとえば異なる断面積）および／または異なる臨床パラメータ（たとえば患者のより多くの量の血液）の場合、確かに、約７５ｓｅｃ−１〜５０００ｓｅｃ−１（３〜２００ダイン／ｃｍ２）の範囲のせん断速度で動作するために上記範囲外の流量となる可能性がある。一例として、図１３Ａおよび図１４のミクロ流体装置１００におけるマイクロチャネル１１０の構成は、湾曲部分と直線部分を有し実質的に一定の断面積５２０のマイクロチャネルからなる複数のレーンに、流体を、収束ゾーン５００（流速加速、狭窄前）を通して流入させる形状を与える。この流体は次に、発散部５４０（流速減速、狭窄後）を通って出て共通の出口に入る。ミクロ流体装置１００の直線部のマイクロチャネル１１０のサイズは、低倍率（１０倍、０．３Ｎ．Ａ．）の対物レンズを用いてリアルタイムで光学顕微鏡撮影を行なえるサイズとした。これらの実用上の理由から、図１のミクロ流体装置１００は、各々が幅が約２００μｍで高さが約７５μｍの１２の平行なマイクロチャネル１１０を含む。マイクロチャネル１１０の矩形の断面表面積は直径１２５μｍの円形の小動脈に匹敵する。図１の構成で利用される圧力センサから良好な信号対雑音比を得るために、チャネル長を、可能な最大流体力学抵抗に対して最適化する一方で、ミクロ流体装置１０の全長を制限して標準的なガラスの顕微鏡スライド（５０ｍｍ×７５ｍｍ）に合うようにした。これは、チャネルに、光学撮像を実施する装置の中心の１ｃｍの直線部分を除いて、一連の６０°の屈曲部を取入れることによって実現した（図１）。マイクロチャネル１１０の特定の曲線構造は、標準のガラススライドを使用するという任意の形状の制約を想定して、使用するセンサ（たとえば圧力測定に使用する圧力センサ）から最良の信号対雑音比が得られるように、設計した。すなわち、これは流体力学抵抗のより小さな変化を測定できる。より高額のまたはより高感度の圧力センサを用いる場合は、たとえば、マイクロチャネル１１０についての設計−エンベロープが変わり、適切な信号対雑音比で異なる形状（たとえば直線状）を使用できるようになる。
【００６１】
標準のガラスの顕微鏡スライド、低レイノルズ数の流れの所望の制約、および高い信号対雑音比に合うようにミクロ流体装置１００のサイズを定める（たとえばマイクロチャネルの最小寸法を約１５μｍ最大寸法を約１．５〜２．０ｍｍに限定する）ことをただ優先するのでなければ、ミクロ流体装置１００および／またはマイクロチャネル１１０のサイズの決定に制限はない。よって、ミクロ流体装置１００は、本明細書に記載のものよりも寸法が大きくてもまたは小さくてもよく、さらに、マイクロチャネル１１０の数および／またはマイクロチャネルの構成を、自由に変化させてもよい（たとえば、マイクロチャネル１１０を直線状にしてもよく、立体形状で規定してもよい、等）。さらに、図示されていないが、マイクロチャネル１１０のうちの１つ以上は、任意で、この１つ以上のマイクロチャネルのうちのいずれかにさらに流体を導入できるよう、１つ以上のさらに他のマイクロチャネル入口を有していてもよい。さらに導入される流体とは、たとえばマイクロチャネル内の流れに混入される薬剤である）。加えて、示されているミクロ流体装置１００は、本明細書に記載のテストおよび解析を支援するように設計されたものであり、顕微鏡または撮像装置（たとえば図１の１３０）の使用は本明細書に記載のミクロ流体装置に基づいた凝固システムに必要な側面ではないことを、強調しておかねばならない。本明細書に記載の、本発明者らによって導き出された関係のため、凝固の力学は圧力または流量の測定のみによって判断可能である。したがって、開示されている図１のミクロ流体装置１００は凝固を撮像し易くするために透明基板を含むが、代わりに不透明の基板を用いてもよい。血小板の凝集が同時に測定される場合に限り、顕微鏡検査が必要である。
【００６２】
インビボの血管またはインビトロの中空チャネルにおけるフィブリンクロット形成の力学は、次の３つの段階で構成される。すなわち、安定した反応時間、成長相、および飽和（完全な狭窄）−結果としてＳ字状曲線になる−である。矩形のチャネルを含む図１のミクロ流体装置１００におけるクロット形成のＳ字状力学を検証するために、ヒトの全血に、蛍光標識されたフィブリノゲンと中間レベルの治療用量（０．７５Ｕ／ｍＬ）のヘパリン抗凝固剤を加えたものに対する、タイムラプス顕微鏡解析を実施し、一方、一定流量モードにおいてせん断速度を１２５０ｓｅｃ−１（５０ダイン／ｃｍ２）に限定した。完全に閉塞した領域の強度（Ｉｍａｘ）によって正規化された平均蛍光強度Ｉ（ｔ）を時間に対してグラフに表わしたときに、発明者らは、ミクロ流体チャネルの線形部分内の固定部位で、凝固が、クロット形成の３段階を示すＳ字状傾向に従っていると判断した（図２Ａ、図２Ｂ）。
【００６３】
過去の研究は、インビトロで測定された成長する血栓の大きさが、測定された光の強度と線形的な相関関係があることを示している。このため、ミクロ流体装置１００においては、Ｉ（ｔ）／Ｉｍａｘ≒Ａｍａｘ／Ａ（ｔ）であると想定した。Ａ（ｔ）は所与の時間において閉塞しているチャネルを通る血流のための断面積であり、Ａｍａｘはマイクロチャネル１１０の最初の断面積である。
【００６４】
閉塞しているマイクロチャネル１１０の流体力学抵抗（Ｒｈ）の大きさはおよそ次の通りである。
【００６５】
【数１５】
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【００６６】
図１のミクロ流体装置１００は平行なマイクロチャネル１１０を有し各マイクロチャネルが同時に等しく閉塞することはないので、装置全体の流体力学抵抗の大きさは次の通りである。
【００６７】
【数１６】
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【００６８】
単純にするために、ｋは単位元であると想定する。そうすると、結論として、閉塞しているマイクロチャネル１１０のＲｈ（ｔ）は単純なＳ字状になる。層流のハーゲン・ポアズイユの法則（Ｑ＝ΔＰ／Ｒｈ、Ｑは流量、ΔＰは圧力降下）に基づくと、動作の注入モードを用いて標準的なシリンジポンプで一定の流量を与えたとき（Ｑ＝一定）、本発明者らは、閉塞時間および閉塞力学（たとえばチャネルの閉塞）を予測するための以下のモデルを提案した。ΔＰの増加は以下の関係に従う（図Ｓ１）。
【００６９】
【数１７】
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【００７０】
式中、ＴｐｇおよびＴｐｆは、フィットさせた指数成長曲線の特徴パラメータであり、それぞれ、圧力がその初期値の二倍および（１＋ｅ）倍になる時間を表わす。生理学的に、これらの時間は、それぞれ、一定の流量下での凝固の成長相と飽和相を表わし、これはインビボの動脈における高血圧の進展に類似する。
【００７１】
これに代えて、圧力ポンプによる血液注入（ΔＰ＝一定）に対する凝固時間と凝固力学を予測するための解析モデルを拡張し、本発明者らは、閉塞しているチャネルの流量（Ｑ）の低下が、逆Ｓ字状の以下の関係に従うと予測した（図Ｓ１）。
【００７２】
【数１８】
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【００７３】
式中、ＴｑｇおよびＴｑｆは、フィットさせたＳ字状減衰曲線の特徴パラメータであり、それぞれ、流量がその初期値の二分の一および（１＋ｅ）分の１に低下する時間を表わす。生理学的に、これらの時間は、それぞれ、凝固の成長相と飽和相を表わし、これは、結果として、たとえば、インビボにおける静脈循環の血管内で生じ得る血行停止につながる可能性がある。
【００７４】
数学的モデルの初期値ΔＰ（０）およびＱ（０）を求めるために、本発明者らは、血液の物理的パラメータが凝固モニタリングの開始時は一定でありしたがって異なる流量で装置にかん流したクエン酸血のΔＰ−Ｑ較正曲線から得られると、想定した。実際得られたデータは、層流である抗凝固血流について、圧力変化と適用した流量との間に線形の関係があることを明らかにし、したがって、線形回帰の線はΔＰ−Ｑ較正曲線を表わす（図１１）。流量一定のときの圧力上昇（図３Ａ）および圧力一定のときの流量減衰（図３Ｂ）は、一定の生理学的せん断速度３５０ｓｅｃ−１（１４ダイン／ｃｍ２）で異なるヘパリン濃度にして実験で求めた。また、数学的モデル（１）および（２）に基づく回帰曲線が高レベルの精度でデータとフィットすることがわかった（図６）。同様に、ヘパリン濃度が一定（０．５Ｕ／ｍＬ）で流体せん断応力を変化させたとき、上記解析モデルを、一定流量における圧力上昇（図３Ｃ）または一定圧力における流量減衰（図３Ｄ）の実験測定値にフィットさせると、フィットさせた曲線が極めて正確であることがわかった（図６）。全回帰曲線フィットから得た、図６に示される適合度パラメータ（Ｒ２）によっても、上記数学的モデルが非常に信頼性が高いことが確認された。したがって、モデルパラメータの最適値、すなわち、凝固時間（ＴｐｇおよびＴｐｆ、ＴｑｇおよびＴｑｆ）は、０〜１Ｕ／ｍｌの範囲のヘパリン濃度で７５〜２５００ｓｅｃ−１（６〜１００ダイン／ｃｍ２）の範囲のせん断速度のときの、このバイオミメティックなミクロ流体装置１００におけるヒトの全血の凝固力学を表わす。
【００７５】
次に発明者らが着手したのは、血液凝固時間（注入の場合のＴｐｇおよびＴｐｆ、圧力の場合のＴｑｇおよびＴｑｆ）の診断上および臨床上の有用性のテストであった。これらの時間は、上記回帰モデルから、未分画ヘパリン濃度および加えられたせん断の変化に対するこれらの反応を検証し、これらの結果を既知のシステムからの結果と比較することによって、求められた。標準凝固テストは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）および活性化全凝固時間（ＡＣＴ）を含み、臨床的に関連する濃度（０〜１Ｕ／ｍＬ）でテストしたときの凝固時間と未分画ヘパリンの濃度との指数関数的関係を示した。この関係は、凝固時間＝Ｔ０ｅτＣｈとして説明できる。式中、Ｔ０はヘパリンなしの血液の凝固時間であり、τはヘパリン感受性の値である。この指数関数的関係を検証し診療所での抗凝固治療を解析するためのミクロ流体装置１００の有用性を評価するために、関連する濃度範囲（０〜１Ｕ／ｍＬ）におけるヘパリン感受性を測定し、特徴凝固パラメータＴｐｇおよびＴｐｆ（注入モード）とＴｑｇおよびＴｑｆ（圧力モード）を評価した。これは、上記のようにミクロ流体装置１００内でヒトの全血流を凝固させるための、式（１）および（２）にそれぞれ基づく回帰曲線をフィッティングすることにより、求められた。注入モードでは、ＴｐｇおよびＴｐｆのいずれも、適合度パラメータ（図４Ａ、図７）によって報告されるように、生理学的（３５０ｓｅｃ−１、１４ダイン／ｃｍ２）および病理学的（１２５０ｓｅｃ−１、５０ダイン／ｃｍ２）な流体せん断レベルで、ヘパリン濃度を０から１Ｕ／ｍＬに高めたとき、指数関数的な増加を正確に示した。一定圧力モードを使用する指数関数的傾向も検証した。ＴｑｇおよびＴｑｆはいずれも、同じ２つのせん断速度（図４Ｂ、図７）を用いてヘパリン濃度を上昇させたときに、指数関数的に増大し、すべてのケースにおいて、凝固時間は、高せん断対低せん断として低減された（図４Ａ、図４Ｂ）。加えて、このモデルは、抗凝固剤なし（Ｔ０）の健康な患者からの血液の凝固時間をおよそ２〜１２分と予測し、ヘパリン感受性の値（τ）を１．７５〜３．５（Ｕ／ｍｌ）−１の範囲と予測し、これは、図８に示される、標準凝固テストによって報告されている典型的な値に一致する。
【００７６】
診療所で適用される現在の凝固テストは、血行力学的せん断応力の生理学的寄与を取入れていない。これは結果として、たとえば、低せん断応力（生理学との比較）での静脈の凝固の増加、および、高せん断応力での小動脈となる。加えて、標準的な凝固時間の機器は、血流が可変でありかつ凝固の主要な決定因子でもある体外回路（たとえばＥＣＭＯ、透析、血液濾過）を採用した処置を受ける患者では、不正確になり得る、血行停止時の凝固時間の１つの値しか報告しない。よって、本発明者らは、ミクロ流体装置１００を用いて数学的モデルを開発してテストし、せん断が変動する時の凝固時間を予測することに、着手した。低せん断での凝固は、フィブリノゲン等の凝固因子の拡散−反応による運搬に支配されるので、べき乗則の動力学のモデル（γω）が使用され、ωはべき乗則定数である。高せん断での凝固は血小板活性化によって支配され、血液凝固時間に対するその影響を、指数関数的関係（ｅ−φω）を用いてモデル化した。φは減衰定数である。単純にするために、フィブリノゲン拡散と血小板凝集は互いに独立していると想定し、発明者らは、凝固時間の数学的モデルを開発した。それは、凝固時間＝Ｚ０γωｅ−φγであり、Ｚ０はモデル定数である（この解析モデルのべき乗則項および指数項の個別および結合挙動は図８に示される）。
【００７７】
注入モードを用いて血液凝固を測定したとき、凝固時間（ＴｐｇおよびＴｐｆ）の減少は、せん断速度を約１５０ｓｅｃ−１から約２５００ｓｅｃ−１（約６〜１００ダイン／ｃｍ２）に増加させたときにのみ、観察された（図４Ｃ）。注入モードでは、せん断速度を７５ｓｅｃ−１に低下させたとき、血液は凝固しなかった。６０分の注入時間の間圧力上昇は観察されなかったからである。したがって、ミクロ流体装置１００（図１）とテスト条件のこの組合わせについて、発明者らは、数学的モデルを正確にフィットさせることができなかった、または、凝固時間を抽出できなかった。テスト構成に適用できる最低せん断速度において凝固時間の減少が観察されなかったので、この数学的モデルにおいて提案される凝固酵素の拡散的運搬の寄与は、この装置においてせん断速度が７５ｓｅｃ−１を上回るときには無視できると思われる。よって、べき条定数（ω≒０）を想定することにより、凝固時間を、より単純な指数関数的減衰関係、すなわち凝固時間＝Ｚ０ｅ−φγに、正確にフィットさせることができる（図７、図９）。
【００７８】
しかしながら、同様の測定を一定圧力モードで行ったとき、凝固時間（ＴｑｇおよびＴｑｆ）は、２つの異なるヘパリン濃度（０．２５Ｕ／ｍｌおよび０．５Ｕ／ｍｌ、図４Ｄ）おいて、せん断速度が３５０ｓｅｃ−１（１４ダイン／ｃｍ２）を下回ったとき、減少した。３５０ｓｅｃ−１を超えるせん断で、指数関数的な減少が観察され、我々の数学的モデルはべき条定数、ω＞０と、正確にフィットした（図７および図９）。興味深いことに、このモデルはまた、最大凝固時間が、せん断速度が２００〜５００ｓｅｃ−１（８〜２０ダイン／ｃｍ２）のときに生じると予測した。これは、小さな（〜１００μｍ）血管について予想される生理学的せん断範囲に十分対応する。これらの結果は、動作の一定圧力モードで研究したとき、ミクロ流体装置１００内の血液凝固を、低せん断での凝固タンパク質の拡散によって判断できることを示唆している。加えて、このモデルは、血小板凝集が、いずれの動作モードにおいても、高せん断での血栓症に大きく寄与し得ると予測する（図９）。
【００７９】
血小板は血栓形成において重要な役割を果たし、このミクロ流体装置１００の利点の１つは、これを自動光学顕微鏡と任意で一体化して、研究室での診断のために血小板凝集を定量化し、診療所において抗血小板療法を案内することも、可能であることである。概念の実証として、２つの血小板活性化阻害剤として、アスピリン（５００μＭ）とプラスグレル（２５μｇ／ｍｌ）を、蛍光標識した自己血小板とともに、ヒトの再石灰化クエン酸塩添加血に加えた。これら２つの薬剤は、急性冠症候群の治療に臨床使用される。次に、この血液を、ミクロ流体装置１００のマイクロチャネル１１０を通して、一定のせん断速度１２５０ｓｅｃ−１（５０ダイン／ｃｍ２）で送出し、閉塞が検出された直後に、１つのマイクロチャネル１１０の領域（２４．８×７．５ｍｍ）をスキャンした（図５Ａ、図５Ｂ）。実施した各実験（ｎ＝４）において、この薬剤の組合わせによる治療により、凝固時間ＴｐｇおよびＴｐｆが増した。これは、他の凝固アッセイを用いた過去の研究と一致する。平均で、凝固時間は、ミクロ流体装置１００において、それぞれ１３．０２％と６．７９％増加した（図５Ｃ）。これらの研究から、この薬剤の組合わせを加えたことにより、大きな血小板凝集体の数が約４５％減少したことも明らかになった（ｐ＜０．０５、ｎ＝５）（図５Ｄ）。
【００８０】
周知のように、血液凝固の病態生理学は、現在ウィルヒョウの三要素（Virchow’s triad）として良く知られている、血液成分、付着面、および流体力学間の、相互作用に関係がある。明らかに、止血は、血液表面の相互作用の結果血栓症が生じフィブリン溶解現象が血流の存在下で発生するという点において、動的な性質のものである。より具体的には、可溶性の凝固アゴニストとは無関係に、血栓形成および血小板凝集は、狭窄領域の流量の加速および減速から生じるせん断勾配が原因で増加し、凝固は、流量が減速する狭窄後に最も顕著である。しかしながら、コラーゲンまたはヴォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand factor）（ｖＷｆ）等のアゴニストは、クロットの安定化にも寄与し得る。
【００８１】
このミクロ流体装置１００を用いて、明確なせん断速度、せん断の勾配、および関連する血行力学を作り出すことができ、これにより、より多くの生理学的条件下で正常なおよび異常な凝固反応を測定することが可能になり、これは潜在的に、血液学研究室またはそれ以外の診療所、医師の診察室、または患者のベッドサイド等で行なうことができる。この装置は動作に柔軟性がある。なぜなら、せん断速度、マイクロチャネルのトポロジ（たとえば固定されたどのせん断速度でも表面積と体積の所望の比率が得られるようにする、幅と高さと長さの組合わせ）、および使用する独立したマイクロチャネルの数を左右する、血液添加剤（抗凝固剤、薬剤、アクティベータ等）の重要なパラメータを、医師または臨床医が予め選択できるようにしているからである。これらの判断は、調査中に、病状、疾病、または症状（いずれかがわかっている場合）に基づいて行なうことができる。（たとえば、血小板の機能不全は、より高いせん断での動作を有利に示すであろう。なぜならその場合に血小板が最も反応するからである。疑われる静脈の血栓症は、結果に対する血小板の影響を最小にするより低いせん断で有利に作用するであろう。）本コンセプトに従い、血液凝固のリアルタイムの進展を記録し定量化することができる。これは現在の代表的なテストでは不可能である。血液は、２つの動作モードのうちの１つ（一定圧力または一定流量）で送出することができ、この動作モードを選択することによって、インビボでの脈管構造の機能を模倣することができる。一定の流量すなわち注入の場合、圧力の指数関数的増加が記録され、これに代わる一定の圧力の場合、流量のＳ字状の減衰が記録される。さらに他の側面において、一定圧力モードと一定流量モードを互いに関連付けて機能させることも可能であろう。
【００８２】
このバイオミメティックな手法を凝固の測定に適用することにより、本発明者らは、血液注入のいずれの動作モードにおいても、血栓形成の力学を予測する包括的な現象論的数学的モデルを示し経験的に検証した（図１、図２）。凝固生物学は、複雑でまだ完全には説明されていないが、血小板とともに、複数の凝固前およびフィブリン溶解因子間の非線形の相互作用に関係がある。この複雑さが血行力学のせん断力の影響と組み合わさるので、凝集する血栓は時折、インビボにおいて壊れて塞栓を形成することがある。これは、ミクロ流体装置１００において、血液凝固時に圧力上昇または流量減衰が時折変動することに基づいて測定できる（図２）。しかしながら、本明細書に示す、包括的である解析モデルは、凝固プロセス全体のデータが記録されている場合は経験的観察を正確に予測し（図６）、これらの異なる生理学的条件下での血液の凝固時間を定量的に定める関連の特徴的なパラメータをユーザが抽出できるようにする（図３）。最終的な凝固時間として出力を１つしか提供しない現在の診断テストと異なり、本コンセプトは、凝固カスケードの２つの特徴的な凝固時間を提供する。すなわち、凝固が能動的に加速している時間とクロットが流れを完全に閉塞した時間である（図３）。
【００８３】
抗凝固剤の濃度とせん断速度（および勾配）は、血栓形成性を測定しモニタリングするときの、これら凝固時間の２つの主要な決定要因である。本発明者らは、凝固時間が未分画ヘパリンの濃度とともに指数関数的に増加すること、およびその感受性の値が他の標準テストで決定されるものに一致することを見出した（図４Ａ〜図４Ｂ、図８）。よって、このデータは、抗凝固モニタリングのための代替のより定量的な機器としてミクロ流体装置１００を診療所で使用できることを強く示唆している。
【００８４】
変化するせん断に反応する凝固時間を解析したときに、開示されているべき数−指数関数の数学的モデルの正確性を確認した（図７）。しかしながら、血液注入において一定流量モードおよび一定圧力モードを使用したときに異なる凝固挙動が観察された（図４Ｃ〜図４Ｄ）。これらの原因は、一定流量の下では、局所的せん断およびレイノルズ数が、クロットが形成される部位においてより高いレベルまで増す可能性があり、インビボにおいて部分的に閉塞する血管で生じるように、チャネルの管腔の閉塞が始まる可能性がある。これらの異常に高いせん断応力によって、血栓および血小板凝集が破壊されて塞栓として放出される可能性もある。凝固時間が、生理学上のものを下回るせん断法における圧力モードと比較して注入モードの方が長いという発見はしたがって、血小板の活性化および凝集が低せん断時の塞栓を支配しないのであれば、説明できる。また、一定圧力モードにおける低せん断時に、モデルが予測する静脈の血管におけるようにフィブリノゲン拡散が重要になる可能性がある（図９）。重要なのは、これが、静脈の血栓症と動脈の血栓症を区別することができないインビトロの凝固アッセイと異なる点であるということである。これらの観察に基づくと、低いせん断速度におけるインビボの血栓症をより上手く模倣する圧力によって駆動される全血の流れは、深部静脈血栓症（deep vein thrombosis）（ＤＶＴ）のモニタリングに特に適していると考えられる。一方、標準的な注入に基づくシリンジポンプは、動脈血栓症（arterial thrombosis）（ＡＴ）のモニタリングに特に適していると考えられる。これは、さらに他のテストで（たとえば、ＤＶＴの顕著な特徴である、Ｄダイマーおよび好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps）（ＮＥＴ）等の、これらの状態の特定のバイオマーカを解析することにより）、検証してもよい。
【００８５】
本明細書に開示される結果に基づいて、ヘパリン濃度およびせん断に対する凝固時間の関係を組合わせることによって、血液を送出するときの注入モードにおける凝固時間の解析的関係を得ることができる。
【００８６】
【数１９】
2016534714.tif 000021
【００８７】
同様に、圧力モードにおける関係は次の通りである。
【００８８】
【数２０】
2016534714.tif 000022
【００８９】
モデル式（３）および（４）をそれぞれ式（１）および（２）に組込むことにより、システム特性とは無関係に、抗凝固剤とせん断に依存する時間的力学を求めることができる。これらの式に見られる定数（Ａ、Ｂ、Ｃおよびω）は、患者特有のものであり、解析式（１）および／または（２）のカーブフィッティングによって経験的に求めることができる血液の特性に依存し得る。よって、式（３）および（４）における患者特有の定数は、患者の血液サンプルを凝固させたときに得た圧力曲線および／または流量曲線から得られ、結果としての圧力上昇および／または流量の減衰は、適用できるのであれば、式（１）および／または（２）に組込むことによって、凝固時間を抽出する。これら凝固時間は、たとえば、せん断およびヘパリン濃度の関数であり、実施するテストにおいてわかっているこれらパラメータにより、抽出された凝固時間を、標準的な較正された凝固時間曲線（たとえば患者のベースライン曲線、標準母集団曲線等）と比較することができる。診療所では、臨床医がこれら定数を定期的にモニタリングして、抗凝固治療を受けている患者の、または通常の健康診断を受けている患者であっても、その凝固状態を判断すればよい。たとえば、患者の体内の変化に応じて、これら患者特有の定数を、時間の経過とともに増加または減少させることができる。なぜなら、これら患者特有の定数は、他の患者特有のマーカー（たとえば運動、コレステロール、食習慣等）の影響を受けるまたはこのマーカーに依存する可能性があるからである。よって、本コンセプトに従い、臨床医は、このような患者特有の定数の変化を、診断ツールとして利用して、このような変化を、たとえば、疾病（たとえば動脈硬化症等）の臨床症状、特定の罹病性の示唆、および／または追加のテストが望まれることと関連付けて、結果をより良く特徴付けてもよい。一例として、３５歳の女性患者の「Ａ」定数値が、その患者において（または３５歳の女性を含む選択された母集団サンプルにおいて）通常観察されるであろうものと比較して、遥かに低いか高い（たとえば５０％低いまたは高い）場合、このような偏差は何らかの疾患または罹病性と関連があるかもしれず、フォローアップテストを提案および／またはこのような偏差に応じて治療を決定してもよい。健康な患者の場合、ヘパリン濃度またはせん断速度を変化させたとき、クロット形成の成長および飽和を表わすいずれの凝固パラメータも、同様の傾向を示す。しかしながら、新規の抗凝固剤および抗血小板薬が、凝固力学において異なる挙動を生じさせる可能性があり、２つの凝固パラメータが、診断および治療の感度と特異性を高めるであろう。
【００９０】
自動撮像プロトコルを追加することによってミクロ流体装置１００を拡張して大きな血小板凝集体を同時に測定することができ、そうすれば、ミクロ流体装置１００を補助抗血小板治療のモニタリングに使用することができる。また、この方法を、共焦撮像またはオンチップフローサイトメトリ（flow cytometry）等の他の顕微鏡技術と組合わせることもでき、そうすることによって、血小板の活動の、より高感度の解析を行なうことができ、かつ、他の血小板アクティベータ（たとえばコラーゲン、組織因子）の効果を調査することができる。そうすれば、フィブリノゲン−トロンビンによる血栓症から独立して、血小板の活性化による血栓症を解析することができる。これら現象論的解析モデルは、白血球および赤血球といった血液の他の細胞成分の、凝固時間に対する影響も取入れて、さらに進化させることができる。包括的で定量的な凝固テストなので、ミクロ流体装置１００および本明細書に開示する関係（式（１）〜式（４））は、敗血症およびかま状赤血球貧血症等のより複雑な疾病に取組むための可能な方法を提供する。この場合は他の細胞（たとえば細菌および鎌状赤血球）も凝固反応に寄与する。さらに、血栓モニタリング装置を、エクスビボで、カテーテルまたは体外装置に直に装着して、患者本人の血液を何らかの形態の抗凝固剤に入れない場合の解析を行なえるように、操作することができる。
【００９１】
上記説明に鑑みると、本明細書に示すミクロ流体凝固装置１００は、操作が簡単で自動化されており、本明細書に開示される関係（式（１）〜式（４））と組合わせて血小板凝集を解析するのにも使用することができ、かつ、患者のベッドサイドや臨床研究室内でまたは在宅治療ベースの評価ツールとしてでも、全血血栓形成性をモニタリングするための向上したリアルタイムの定量的アッセイを提供できるという点において、多機能である。
【００９２】
本コンセプトの別の側面に従うと、血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する（たとえば図４Ａ〜図４Ｄ等に示されるようにヘパリンレベルを変えることによってヘパリン感受性を判断する）（インビボまたはインビトロで実行される）方法は、ミクロ流体装置１００の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネル１１０を通して一定の流量で血液サンプルの第１の部分を駆動することと、上記一定の流量で第１の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第１の部分が移動している間に、第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中または全体の圧力または圧力に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、血液サンプルの第１の部分の第２の圧力値が求めた血液サンプルの第１の部分の第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分の第３の圧力値が求めた血液サンプルの第１の部分の第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、血液サンプルの第１の部分について、式（１）における関係に従い、第１の時間と第２の時間を用いて、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含む。上記式中Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。この方法はさらに、上記ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第２の複数のマイクロチャネルを通して一定の流量で血液サンプルの第２の部分を駆動することと、モディファイアを血液サンプルの第２の部分と第２の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することとを含む。この方法はさらに、上記一定の流量で第２の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第２の部分が移動している間に、第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中の圧力または圧力に関連する変数を測定することと、血液サンプルの第２の部分が流れ始めたときの第１の圧力値を求めることと、血液サンプルの第２の部分の第２の圧力値が求めた血液サンプルの第２の部分の第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第２の部分の第３の圧力値が求めた血液サンプルの第２の部分の第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることと、血液サンプルの第２の部分について、式（１）における関係に従い、第１の時間と第２の時間を用いて、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることとを含む。上記式中Ｔｐｆは第２の時間、Ｔｐｇは第１の時間である。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルと比較することにより、モディファイアの効果（たとえば、全体的な凝固時間に対する効果、凝固について特定の構成要素に対する効果等）を判断することを含む。
【００９３】
本コンセプトのさらに別の側面において、血液凝固に対するモディファイアの効果を評価する（たとえば図４Ａ〜図４Ｄ等に示されるようにヘパリンレベルを変えることによってヘパリン感受性を判断する）（インビボまたはインビトロで実行される）方法は、ミクロ流体装置１００の基板内に形成された第１の複数のマイクロチャネル１１０を通して一定の圧力で血液サンプルの第１の部分を駆動することと、上記一定の圧力で第１の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第１の部分が移動している間に、第１の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中または全体の流量または流量に関連する変数を測定することとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることと、血液サンプルの第１の部分の第２の流量値が求めた血液サンプルの第１の部分の第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、血液サンプルの第１の部分の第３の流量値が求めた血液サンプルの第１の部分の第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、式（２）の関係に従い、第１の時間と第２の時間を用いて、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する第１の凝固モデルを定めることを含み、上記式中Ｔｑｆは第２の時間、Ｔｑｇは第１の時間である。この方法はさらに、上記ミクロ流体装置の基板または別のミクロ流体装置の基板内に形成された第２の複数のマイクロチャネルを通して一定の圧力で血液サンプルの第２の部分を駆動することと、モディファイアを血液サンプルの第２の部分と第２の複数のマイクロチャネルのうちの一方に追加することとを含む。
【００９４】
モディファイアは、例として、抗凝固剤（たとえば、ヘパリン、低分子量ヘパリン、直接要因阻害剤、アンチトロンビンタンパク質、リバーロキサバン、アピキサバン、ダビガトラン、クマリン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン等）、補助食品誘導体、抗血小板薬（たとえば、不可逆性シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アデノシン再取込み阻害剤、トロンボキサン阻害剤等）、または血栓溶解薬（組織プラスミノーゲンアクティベータ（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ等）を含み得る。本コンセプトに従うと、モディファイアは、凝固カスケードの１つ以上の側面に影響し得る、または、実際に凝固カスケードの１つ以上の側面に影響する、何らかの物質または複数の物質の組合わせであればよい。本コンセプトに従うと、モディファイアはまた、凝固カスケードの１つ以上の側面に影響し得る、または、実際に凝固カスケードの１つ以上の側面に影響する、何らかの物質または複数の物質の組合わせを除去するという変形を含み得る。本コンセプトのさらに他の側面に従うと、モディファイアはまた、凝固カスケードの１つ以上の側面に影響し得る、または、実際に凝固カスケードの１つ以上の側面に影響する、１つ以上の物質（たとえばテスト中の薬剤）の追加と、凝固カスケードの１つ以上の側面に影響し得る、または、実際に凝固カスケードの１つ以上の側面に影響する、別の１つ以上の物質（たとえば細胞、細胞成分、タンパク質等）の除去（たとえば、血小板を除去してフィブリンに潜在的に影響する薬剤のテストにおけるフィブリンに集中する）双方を、含み得る。
【００９５】
この方法はさらに、上記一定の圧力で第２の複数のマイクロチャネルを通して血液サンプルの第２の部分が移動している間に、第２の複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つの中または全体の流量または流量に関連する変数を測定することと、血液サンプルの第２の部分が流れ始めたときの第１の流量値を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第２の部分の第２の流量値が求めた血液サンプルの第２の部分の第１の流量値の約２倍と判断される第１の時間を求めることと、血液サンプルの第２の部分の第３の流量値が求めた血液サンプルの第２の部分の第１の流量値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることとを含む。この方法はさらに、血液サンプルの第２の部分について、式（２）における関係に従い、第１の時間と第２の時間を用いて、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを定めることを含み、上記式中Ｔｑｆは第２の時間、Ｔｑｇは第１の時間である。この方法はさらに、血液サンプルの第１の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルを、血液サンプルの第２の部分のチャネル閉塞を予測する凝固モデルと比較することにより、モディファイアの効果（たとえば、全体的な凝固時間に対する効果、凝固について特定の構成要素に対する効果等）を判断することを含む。
【００９６】
より一般的に、ミクロ流体凝固装置１００は、複数のマイクロチャネル１１０（たとえば２つのマイクロチャネル、３つのマイクロチャネル等）を定める少なくとも１つの基板を含む。マイクロチャネル１１０は任意で平行に配置され、２次元または３次元で形成されてもよい。各マイクロチャネル１１０の幅と高さを変えて、マイクロチャネルの断面の表面積が１２５μｍ２〜１．７５ｍｍ２の範囲になるようにしてもよく、この面積は、複数のマイクロチャネル間で均一であってもよく、または、マイクロチャネルのうちの１つ以上の間で異なっていてもよく、または、同一のマイクロチャネルに沿っていながら変動してもよい。したがって、せん断勾配（流量の加速および減速）を生じさせる急な拡張を変えることもできる。加えて、各マイクロチャネル１１０の長さ、形状、表面処理および／または経路を均一にする必要はなく、１つ以上のマイクロチャネルの長さ、形状、表面処理および／または経路が、それ以外の１つ以上のマイクロチャネルのものと異なっていてもよい。例として、複数のマイクロチャネルのうちの１つのマイクロチャネルの断面形状は高さ７５μｍ幅２００μｍであり、一方、複数のマイクロチャネルのうちの別の１つのマイクロチャネル（または場合によっては同じマイクロチャネルの異なる部分）の断面形状は高さ１５０μｍ幅４００μｍである。このように、ミクロ流体装置１００の一側面に従うと、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の断面積を有し、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の断面積と異なる第２の断面積を有する。別の例として、ミクロ流体凝固装置１００の別の側面において、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の表面処理（たとえば自然発生または合成試薬、コラーゲン、血栓形成誘発材料、血栓形成阻害材料、細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、セグメント化ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル等）を有し、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つは第１の表面処理と異なる第２の表面処理を有する。
【００９７】
開示されているミクロ流体装置１００に従うと、第１のポートが基板の第１の端部（たとえば基板の近位端または遠位端）に設けられ、第１のポートは、複数のマイクロチャネルの入口端に、または、複数のマイクロチャネルの第１の端部に至るチャネルまたはマイクロチャネルに接続される。第２のポートが基板の第２の端部（たとえば基板の近位端または遠位端のうちの他方）に設けられ、第２のポートは、複数のマイクロチャネルの他方の端部に、または、複数のマイクロチャネルの第２の端部に至るチャネルまたはマイクロチャネルに接続される。図１に示されるシステムに基づくと、ポンプ（たとえばシリンジポンプ）が、ポート（たとえば第１のポート１２０ａ）に装着され、第１のポートを通して差圧を加えて血液サンプルを実質的に一定の流量または一定の圧力で複数のマイクロチャネルを通して駆動するように構成される。この実験機構において、ポンプをミクロ流体装置１００に接続する管１２５はミクロ流体装置１００に接着された。他の構成において、ポートおよび筒１２５は、限定されないが押して接続する部品またはLuer-Lock（登録商標）接続具等のクイックロックコネクタを含むのが有利であろう。
【００９８】
第１の検知装置が、複数のマイクロチャネル内の圧力値または複数のマイクロチャネル全体の圧力に関連する圧力値を求めるように構成される。たとえば、この第１の検知装置は１つ以上の圧力検知装置を含み得る。別の例において、第１の検知装置は、複数のマイクロチャネル全体の圧力に関連する値（たとえばポンプのアンペア数）を求めるように構成されたセンサを含む。さらに別の例において、圧力検知装置は、ポンプが真空圧を与えている間の負圧を検知する。
【００９９】
先に述べたように、図１０は、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従い注入ポンプモードまたは圧力ポンプモードで動作するミクロ流体装置１００に対する全血凝固の定量的評価のための解析モデルを示す。注入モードでは圧力が指数関数的に増大し、圧力モードでは流量の減衰がＳ字状傾向を示し、凝固時間は解析モデルの式をこれら測定値にそれぞれフィットさせることによって抽出できる。また、ほぼ３０分の位置に縦方向の点線で示されているのは時間Ｔｐｇ、Ｔｑｇであり、これらはそれぞれ、一定流量下および一定圧力下での凝固の成長相を生理学的に表わす。また、ほぼ５０分の位置に縦方向の点線で示されているのは時間Ｔｐｆ、Ｔｑｆであり、これらはそれぞれ、一定流量下および一定圧力下での凝固の飽和相を生理学的に表わす。図１０に重ね合されているのは、Ｔ＝０（凝固なし）のときのマイクロチャネル１１０の断面、Ｔ＝Ｔｐｇ，Ｔｑｇのときのマイクロチャネル１１０の断面（成長相、部分的に閉塞した断面を示す）、およびＴ＝Ｔｐｆ，Ｔｑｆのときのマイクロチャネル１１０の断面（少なくとも実質的に完全な閉塞）を示す。
【０１００】
図１１は、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、図１のミクロ流体装置１００を通してかん流させた、クエン酸ナトリウムに入れられた全血液を示し、動作の注入モードおよび圧力モードそれぞれにおけるΔＰ（０）およびＱ（０）を予測するためのΔＰ−Ｑ応答曲線が示される。
【０１０１】
図１２は、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、せん断速度／応力の関数として凝固モニタリングミクロ流体装置における全血液の凝固時間を予測するための解析モデルを示す。
【０１０２】
図１に示されるミクロ流体凝固装置１００は、１つ以上のプロセッサを含むコントローラと、この１つ以上のプロセッサに結合され情報を伝達するためのバスまたはその他の通信機構と、このバスに結合され情報とプロセッサが実行する命令を格納するためのメインメモリ（たとえばＲＡＭ）および／またはその他の動的記憶装置とを含む、付随コンピュータシステムを備えるのが好都合である。このコンピュータシステムはポンプおよび制御システムと一体化されてポンプ動作およびセンサデータ収集を制御できるようにするのがさらに好都合である。また、メインメモリは、一時的な変数（たとえば圧力、流量、時間等）を格納するために、または、コントローラが実行する命令の実行中の他の中間情報を格納するために使用されてもよい。このようなコンピュータシステムはまた、バスに結合されプロセッサのための静的情報および命令を格納するためのＲＯＭまたはその他の静的記憶装置を含む。固体状態記憶装置等の物理的なコンピュータ読取可能な記憶装置が、情報を格納するために設けられバスに結合される。コンピュータシステムはまた、バスを介して１つ以上の表示装置（たとえばフラットスクリーンディスプレイ、タッチスクリーン等）および１つ以上の入力装置（キーパッド、キー、マウス等）に結合される。開示されている方法に従うと、少なくともいくつかの側面において、この方法は、メインメモリ等のバスに装着された物理的記憶装置に含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをコントローラが実行するのに応じてコンピュータシステムを利用して実現される。この命令のシーケンスを実行することにより、コントローラは本明細書に記載のプロセスステップのうちの少なくともいくつかを実行する。例として、記憶装置は、検知装置およびタイマーからの入力を組合わせて、流れ始めたときの第１の圧力値を求めること、第２の圧力値が求めた第１の圧力値の約２倍と判断される第１の時間を求めること、および、第３の圧力値が求めた第１の圧力値の約（１＋ｅ）倍と判断される第２の時間を求めることを、コントローラに実行させるように構成された命令を有する。記憶装置はまた、上記式（１）における関係に従いチャネル閉塞を予測する患者凝固モデルを定めることをコントローラに判断させるように構成された命令を有する。同様に、別の側面において、記憶装置は、検知装置およびタイマーからの入力に基づいて、流れ始めたときに対応する第１の時間における第１の流量値を求めること、第２の流量値が求めた第１の流量値の約二分の一と判断される第２の時間を求めること、第３の流量値が求めた第１の流量値の約（１＋ｅ）分の一と判断される第３の時間を求めること、および、上記式（２）における関係によって支配されるチャネル閉塞を予測する患者凝固モデルを決定することを、コントローラに実行させるように構成された命令を有する。
【０１０３】
本明細書で使用される「コンピュータ読取可能媒体」という用語は、実行する命令をプロセッサに提供することに関係する物理媒体（たとえば不揮発性媒体、揮発性媒体、磁気媒体、光媒体、固体状態媒体等）を指す。ミクロ流体装置１００と組合わせて使用されるコンピュータシステムはまた、好都合であるが任意で、バスに結合された通信インターフェイスを含む。このような通信インターフェイスは、ネットワークリンクに対する両方向データ通信結合を提供する（たとえば統合サービスデジタル通信網（ＩＳＤＮ）カード、モデム、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）カード、無線リンク等）。ネットワークリンクは、他のデータ装置に対して１つ以上のネットワークを通してデータ通信を提供する（たとえば、ネットワークリンクは、インターネットサービスプロバイダ（ＩＳＰ）によって操作されるホストコンピュータまたはデータ装置に対してローカルネットワークを通して接続を提供し得る）。コンピュータシステムは、ネットワーク、ネットワークリンク、および通信インターフェイスを通してデータを送受信するように構成される。
【０１０４】
さらに、本コンセプトが、所与の患者の治療（たとえば自己点滴、在宅治療、臨床所での治療、遠隔健康モニタリング等）をリアルタイムで修正することを可能にする点が注目される。医師、医療提供者、看護師（または場合によっては訓練された患者）は、開示されているミクロ流体凝固装置１００および開発された式（１）〜（４）を用いて治療の進行を追跡することができる。たとえば、患者が、特定の疾患（たとえば血友病Ｂ等）に対して治療効果をもたらす点滴（BeneFIX（登録商標）、Rixubis等）を受けている間、医師または看護師（または患者）は、正確度の低い母集団推定に頼るのではなく、点滴中の治療の進行を追跡することにより、その特定の患者について特定の時間における有効性を判断することができる。特に高額治療プロトコル（たとえば因子ＩＸの置換等）の場合、本コンセプトに従い提供されるリアルタイムの凝固評価は、潜在的に、必要な点滴量の大まかな推定（または過大推定）に頼るのではなく、実際に適切な止血バランスに達したときに治療を停止できるようにするので、治療コストを削減し（たとえば５００ｉＵは必要でなく２５０ｉＵが治療上十分であると判断できる）、付随し得る副作用のリスクを下げることができる。引続き因子ＩＸが欠損する患者の例において、（たとえば食事療法、摂取した栄養補助食品、薬剤等に反応して生じた）患者の因子ＩＸのレベルのリアルタイムの変化によって、一般化された投与量の基準は不十分になる可能性がある、または、逆に、診療所において、（たとえば食事療法、摂取した栄養補助食品、薬剤等に反応して）患者の因子ＩＸのレベルが典型的なベースラインから抑制されているときに患者の一般化された投与量の基準が決定された場合、処方された投与量は所望の治療効果を得るのに必要なものよりも多い場合がある。よって、本コンセプトは、特定の患者（たとえばヒトまたは動物）に合わせて治療をリアルタイムで調整できるようにする。
【０１０５】
これらのコンセプトには潜在的に多くの用途がある。一般的に、さまざまな種類の凝固モニタを、トロンボゲン異常（たとえば、アテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、出血異常等）の診断、直接血管内凝固（たとえば敗血症、鎌状赤血球疾患、障害等）、輸血、血液濾過、心臓治療（たとえばステント、血管形成術等）、および上記病状のいずれかに対する抗凝固治療の服用量のモニタリングにおいて、使用できる。加えて、凝固モニタリング装置は、血小板機能等を判断するための薬剤開発研究およびアッセイにおいて使用される。本明細書に開示されるミクロ流体装置１００は、上記用途または状況のうちのいずれにおいても使用し得る。加えて、開示されているミクロ流体装置１００ならびにそれに関連するシステムおよび方法を、このような用途または状況において、一定流量または一定圧力駆動流量で、または一定流量と一定圧力駆動流量双方で、実施することができる。
【０１０６】
例として、開示されているミクロ流体装置１００ならびにそれに関連するシステムおよび方法は、（１）抗凝固治療、（２）抗血小板治療、（３）血小板機能テスト、（４）表面血栓形成性の判断、および（５）せん断応力反応という用途において、有利に利用し得る。抗凝固治療について、本コンセプトを、たとえば、ヘパリンおよびワルファリン等の従来の抗凝固剤と、限定されないがダビガトラン、レピルジン、アピキサバン、および／またはリバーロキサバン等の新たなまたは開発薬双方の、投与量と有効性のモニタリングに適用してもよい。抗血小板治療について、本コンセプトを、たとえば、アスピリン、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、クロピドグレル、プラスグレル、および／またはアブシキシマブ等の抗血小板薬の、投与量および／または有効性のモニタリングに適用してもよい。上記のように、ミクロ流体装置１００ならびにそれに関連するシステムおよび方法により、投与量を、治療中に（たとえば、この装置および制御システムを体外治療に組込むことによって、この装置および制御システムをベッドサイドテスト装置において使用することによって等）、または、治療と実質的に同時に（たとえばテストを短い時間間隔で行なえばよい）、リアルタイムで調整し最適化することができる。
【０１０７】
血小板機能テストについて、開示されているミクロ流体装置１００ならびにそれに関連するシステムおよび方法は、血小板の活性化および凝集の生物学および生物物理学を解明することができる。血小板のインテグリンは、コラーゲン、ラミニン、およびフィブリノゲンを接着できる。血小板の活性化は、ＡＤＰおよびセロトニンの放出、トロンボキサンの合成、およびホスファチジルセリンの露出にも関連があり、これはトロンビンを生成し易くする。フィブリノゲン、コラーゲン（Ｉ−ＶＩＩＩ）、ｖＷＦ、および脂質化組織因子等の止血活性タンパク質のマイクロパターニングされた表面を、選択的に、直列または並列に、装置の一部のまたは全部の面の上にコーティングすることができ、多重アッセイを行なうことができる。これは内皮細胞も含み得る。血小板凝集を、ＡＤＰ、エピネフリン、コラーゲン、アラキドン酸、トロンビン、リストセチン等を含み得る、さまざまな血小板アゴニストを、血液サンプルに加えることによってテストすることもできる。使用される表面パターンおよび／またはアゴニストは、症状に応じて何らかの形態の抗凝固薬剤を摂取する患者の投薬の判断に役立ち得る。
【０１０８】
開示されているミクロ流体装置１００およびそれに関連するシステムおよび方法はさらに、表面血栓形成性の判断に使用することもできる。血小板は、生物医学装置の血液適合性を決定し得る、自然発生物質（内皮細胞、コラーゲン）または合成物質（たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＯ、ＰＯＥ、ポリ（１，８−オクタンジオールクエン酸塩）（ＰＯＣ）等）と相互作用し得る。ミクロ流体装置１００を、さまざまなこのような天然および／または合成物質でコーティングすることができ、これら物質の血液適合性をこの装置を用いて判断することができる。
【０１０９】
さらに、上記説明に鑑みると、ミクロ流体装置１００のマイクロチャネル１１０のうちの１つ以上またはその一部を、さまざまなこのような天然および／または合成物質でコーティングすることができ、これら物質の血液適合性をこの装置を用いて判断できることが、理解されるはずである。たとえば、ミクロ流体装置１００の１つ以上のマイクロチャネル１１０またはその一部を、第１の自然発生物質（たとえばタイプ１コラーゲン）でコーティングすることができ、ミクロ流体装置の１つ以上のマイクロチャネルまたはその一部を、第２の自然発生物質（たとえばタイプ２コラーゲン）でコーティングすることができ、ミクロ流体装置の１つ以上のマイクロチャネルまたはその一部を、第３の自然発生物質（たとえばコラーゲンα１（ＩＩＩ）鎖）でコーティングすることができ、ミクロ流体装置の１つ以上のマイクロチャネルまたはその一部を、合成物質（たとえばＰＥＧ）でコーティングすることができる。別の例として、１つのマイクロチャネル１１０またはその一部をコラーゲンでコーティングし、別のマイクロチャネルまたはその一部をエピネフリンでコーティングし、さらに別のマイクロチャネルまたはその一部をトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）でコーティングすることにより、アッセイの特異性と感度を高める。本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従うと、１つ以上のマイクロチャネル１１０を制御として使用できる。これは既知のまたは標準化された結果をもたらす。この結果と、その他１つ以上のマイクロチャネル１１０の挙動を、容易に比較することができる。さらに他の側面において、ミクロ流体装置１００のマイクロチャネルのうちの少なくともいくつかを、たとえば静脈血栓塞栓症（たとえば深部静脈血栓症（ＤＶＴ）および／または肺塞栓症（ＰＥ））の存在を除外するためのマーカーとしてのＤ−ダイマーを検出するための診断ツールの提供、または、たとえば細胞外基質（ＥＣＭ）により生じるクロット形成を研究するための研究ツールの提供に、適したものにする。
【０１１０】
したがって、ミクロ流体装置１００は、たとえば、１つ以上の天然物質、１つ以上の合成物質、または１つ以上の天然物質（たとえば細胞、タンパク質、分子、酵素、受容体等）と１つ以上の合成物質との組合わせを含み得る、１つ以上の異なるコーティングおよび／または表面処理を有する。
【０１１１】
加えて、開示されているミクロ流体装置１００ならびにそれに関連するシステムおよび方法は、せん断応力反応の判断に使用することができる。凝固はせん断応力の関数であり、開示されているミクロ流体装置１００により、７５〜２５００ｓｅｃ−１の範囲で関連するせん断応力を加えて血栓形成性を定量的に評価することができる。
【０１１２】
最近の反応機構研究は、インビボにおける血管損傷またはアテローム性動脈硬化病変の部位における血栓形成および血小板凝集が、血流の流体力学の変化によって生じることを示している。より具体的には、可溶性の凝固アゴニストとは無関係に、血栓形成および血小板凝集は、狭窄領域における流れの加速と減速から生じるせん断勾配（せん断応力の変化率）が原因で増加し、凝固は、流れが減速する狭窄後において最も顕著である。しかしながら、コラーゲンおよびヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）等のアゴニストは、クロットの安定化にも寄与し得る。図１３Ａは、本コンセプトの少なくともいくつかの側面に従う、ミクロ流体装置１００の別の例を示し、このミクロ流体装置１００に含まれるマイクロチャネル１１０の形状により、流体は、入口近くの収束ゾーン５００（流れが加速、狭窄前）を通り、一定の幅を有し湾曲部分と直線部分を有するチャネルからなる複数のレーン５２０に入る。次に、流体は、発散部分５４０（流れが減速、狭窄後）を通って共通の出口に入る。
【０１１３】
図１３Ａ〜図１３Ｃに示されるように、COMSOL Multiphysics（登録商標）ソフトウェアを用いる非ニュートン血流の有限要素計算モデリングは、収束部分５００で壁せん断速度が著しく増加すると予測する（図１３Ａの壁せん断速度γ［ｓｅｃ−１］対距離ｘ［ｍｍ］の参照番号６００、および、図１３Ｂの参照番号６００の対応する拡大図参照）。この計算モデリングはまた、壁せん断速度が、幅が一定の部分５２０では安定した状態を保ち、発散部分５４０において著しく減少すると予測する。この計算モデルにおいて、課される入口境界条件はＰ＝０（圧力なし）であり、出口境界条件は、特定された法線速度（チャネルを横断する流れはなく流れは長手方向／鉛直方向に沿う流れのみ）。
【０１１４】
図１３Ａの下部分および図１３Ｂの壁せん断速度γ［ｓｅｃ−１］対距離ｘ［ｍｍ］のグラフに示されるプロットは（上から下に向かって）それぞれ、法線速度の値、ｕ＝０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、および０．０１［ｍｍ／ｓｅｃ］に対応する。
【０１１５】
したがって、図１３Ａに示されるミクロ流体装置１００の実施形態では、外部血液ポンプから与えられ制御される平均壁せん断に応じて、せん断速度の勾配が発生する。しかしながら、血液に基づく解析装置を改善するために、アテローム性動脈硬化の病態生理学を模倣するまたは悪化させる所望の血行力学環境になるよう、形状を変更してもよい。
【０１１６】
図１３Ａのミクロ流体装置１００について、図１４は、フィブリン形成６１０および血小板付着６２０が、ミクロ流体装置の収束（上流）および発散（下流）部分５００、５４０において増すことを示している。これら収束および発散領域では、装置の残りの一定幅部分５２０と比較して、せん断勾配が非常に高い（図１３Ｃに示される）。興味深いことに、図１３Ｃおよび図１４に示されるように、血液凝固は、アテローム性動脈硬化の狭窄後形状を模倣した発散（下流）部分５４０において最大になる。したがって、開示しているミクロ流体装置１００により、ヒトの血管のサイズを模倣したマイクロチャネル１１０の内側で、生理学または病理学のせん断およびせん断勾配の存在下において血液の凝固を発生させ容易に視覚化することができる。
【０１１７】
上述の通り、ミクロ流体装置１００は、血栓形成促進材料でも抗血栓形成材料でもよい、さまざまな材料で作ることができる。たとえば、ＰＤＭＳで作られ、マイクロチャネル１１０の表面変化がないミクロ流体装置１００の内部における、達する最大勾配が平均壁勾配の３．５倍になるようにせん断勾配のみで活性化したときの、血栓形成の結果、凝固時間は、抗凝固剤の濃度、加えられるせん断等のパラメータに応じて、１５〜６０分の範囲になる。しかしながら、ミクロ流体装置１００のマイクロチャネル１１０を濃度１００μｇ／ｍｌのヒトコラーゲンＩでコーティングしたときは、凝固時間を２〜２０分に減じることができ、したがって、必要に応じて図１５に示されるようにより高速の解析にこのツールを用いることができることがわかった。
【０１１８】
血栓モニタリング装置を、エクスビボで、これをカテーテルまたは体外装置に直に装着して、患者本人の血液を何らかの形態の抗凝固剤に入れない場合の解析を行なえるように、操作することができる。
【０１１９】
血液を流すために使用され、何らかの種類の抗凝固管（ＥＤＴＡ、ヘパリン、ＰＰＡＣＫ等）を主として含む装置は、凝固時間テストを含む多くのインビトロ血液解析アッセイに影響し得る血液の化学的性質を変えることがわかっている。たとえば図１３Ａおよび１４Ａに示される、必要な血液量が非常に少なく装置の下流の機器が比較的単純な、開示されているミクロ流体装置１００は、潜在的に、患者の血管に（たとえば標準カテーテルを介して）直接装着する、または、体外装置（たとえば心臓ポンプ、ＥＣＭＯ装置、透析機器等）と一体化することにより、血液の機能を変える、抗凝固管およびその他の解析前変数の影響を、最小にすることができる。よって、患者本人の全血を、外部ポンプ、中間保存または処理を必要とすることなく（たとえば抗血栓性コーティングは不要であり好都合に省略される）、ミクロ流体装置１００に直接通すことができる。
【０１２０】
上記コンセプトに従うと、ミクロ流体装置１００内の血液サンプルの凝固特性を、（たとえばせん断応力勾配等を変化させる）マイクロチャネル１１０の形状の選択、および／または任意のアゴニストの選択によって、調整することができる。一例として、図１３Ａのミクロ流体装置１００は複数のマイクロチャネル（たとえば２つ以上のマイクロチャネル）を含み、複数のマイクロチャネルは各々、近位第１端（入口部分を含む）と、中央部分と、遠位第２端（出口部分を含む）とを定める。図１３Ａの例におけるマイクロチャネル１１０は各々、収束部分（たとえば、好ましくは第１の長さにわたって緩やかに収束する断面積を有するが場合によっては段階的に減少する）を含む。収束部分では、マイクロチャネルの断面積が、第１の断面積から、それよりも小さい第２の断面積に減少する。中央部分は、マイクロチャネル１１０の長さの相当部分を占めていてもよく、実質的に一定の断面積を維持する。発散部分（たとえば、好ましくは第３の長さにわたって緩やかに発散する断面積を有するが場合によっては段階的に増加する）も設けられ、発散部分では、マイクロチャネルの断面積が、第２の断面積から、それよりも大きい第３の断面積に増大する。第３の断面積は、第１の断面積と同一であっても異なっていてもよい。本明細書に記載のミクロ流体装置の他の実施形態と同様、複数のマイクロチャネル１１０は、その長さの少なくとも一部分にわたって第１の形状を有する１つ以上のマイクロチャネルからなる第１の組のマイクロチャネルと、その長さの少なくとも一部分にわたって第２の形状を有する１つ以上のマイクロチャネルからなる第２の組のマイクロチャネルとを含むことが好都合である。本明細書の他の場所で説明されているように、これらの、１つ以上のマイクロチャネルからなる第１の組および第２の組はさらに、任意で、同一のアゴニストおよび／または表面処理、または、異なるアゴニストおよび／または表面処理を含んでいてもよい。
【０１２１】
本コンセプトの他の側面において、複数のマイクロチャネル１１０のうちの少なくとも一部において、収束部分または発散部分いずれかが省略されてもよく、壁せん断勾配は、収束部分または発散部分それぞれについて選択されるか、または、マイクロチャネル全体に対して一括して選択されて、所望の血行力学環境が得られるようにする。さらに、本明細書に示される例では、収束部分がマイクロチャネルの入口領域にあり発散部分がマイクロチャネルの出口領域にあるが、このような収束部分および発散部分はマイクロチャネルの周縁部に限定される訳ではなく、マイクロチャネルのどの場所に配置されてもよく（たとえばマイクロチャネルの中間部分）、含まれるこのような収束部分および発散部分の数はどのような数であってもよい（たとえば二組または三組の収束部分と発散部分）。
【０１２２】
本明細書に開示される、実質的に一定の流量および実質的に一定の圧力は、流量または圧力がそれぞれ、この実質的に一定の流量または圧力を設定するために使用される装置／設備の使用に応じて、＋／−１０％、＋／−５％、＋／−２％または＋／−１％等の、平均または中間流量値または圧力値を中心とする範囲内で、変動し得ることを、意味する。
【０１２３】
開示された実施形態各々とその明らかな変形はクレームされている発明の精神および範囲に含まれることが意図され、その実施形態の局面が以下の請求項に記載される。
【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月28日(2016.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【数１４】
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【国際調査報告】
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2016534714.tif 000058
2016534714.tif 000059