(57)【要約】  底部皿構成部と上部カバー蓋とを含む環状培養皿。底部皿構成部は、底板と、底板の外周囲から上方に延びる連続側壁と、底部皿構成部の中心軸の周りに底板から上方に延びる中心円柱とを含み、底板、側壁、及び中心円柱は、環状チャンバを形成する。【選択図】図１
2016526898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
底板から上方に延びる第１の連続円形側壁と該底板から上方に延びる第２の連続円形側壁とを有する環状チャンバを形成する底部皿構成部であって、該第１の連続円形側壁の直径が、該第２の連続側壁の直径よりも大きい前記底部皿構成部と、
前記第１の連続円形側壁の上部と前記第２の連続円形側壁の上部とに同時に接触するための上部カバー蓋と、
を含むことを特徴とする環状培養皿。
【請求項２】
前記第２の連続円形側壁は、前記底板から上方に延びる材料の中実円筒体によって形成されることを特徴とする請求項１に記載の環状培養皿。
【請求項３】
前記第２の連続円形側壁は、前記底板から上方に延びる材料の中空円筒体によって形成されることを特徴とする請求項１に記載の環状培養皿。
【請求項４】
前記底部皿構成部は、２又は３以上の隣接環状チャンバを含むことを特徴とする請求項１に記載の環状培養皿。
【請求項５】
前記底部皿構成部は、２又は３以上の同心環状チャンバを含むことを特徴とする請求項１に記載の環状培養皿。
【請求項６】
少なくとも２つのウェルを含む底部皿構成部であって、各ウェルには、該ウェルの中心軸の周りに中心円柱が設けられ、該ウェルの内側面及び該中心円柱の外側面が環状チャンバを定める前記底部皿構成部と、
前記底部皿構成部の上部に接触するための上部カバー蓋と、
を含むことを特徴とする多重ウェル培養皿。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示する様々な実施形態は、一般的に培養皿に関する。より具体的には、本発明の開示は、１又は２以上の環状培養チャンバが形成された培養皿に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルスケア、産業、及び環境処理において細菌バイオフィルムへの関心は大きい。バイオフィルムは、表面から除去するのが困難である。一方、バイオフィルムの形態論的に複合的な構造は、抗生物質及び宿主免疫系に対するその脆弱性を低減するのに重要な役割を果たし、従って、バイオフィルム形成を最小にする必要がある異なる業界、特に医療において深刻な懸念を呈している。アメリカ国立衛生研究所によれば、全ての感染の８０％は、バイオフィルムによって引き起こされる。抗生物質に対するそれらの耐性に起因して、バイオフィルムは、従来の感染と比較すると遥かに取り扱いが困難であり、これは、持続的かつ再発性のデバイス関連感染、患者の生活の質の悪化、及びデバイスの頻繁な交換をもたらす。更に、バイオフィルムは、毎年数十億ドルの機器損傷、エネルギ損失、及び水系汚染の原因となっている。バイオフィルムの成長及び挙動は、それらを取り囲む特定の局所的な流体力学的条件（例えば、剪断応力）に強く依存する。これらの「スーパーバグ」を制御、防止、及び処理するために、並びにバイオフィルム細菌学の基本的理解を前進させるために、バイオフィルムの形成の基礎にある流体力学的機構を十分に理解する必要がある。
【０００３】
最近の研究は、バイオフィルムの成長、形態、及び脆弱性の変化が、異なる流体力学的条件と強く相関していることを示している。異なる環境条件下でのバイオフィルム形成、挙動、及び脆弱性のインビトロ研究に対して様々なモデル及び分析法がこれまでに開発されている。主な偏在する臨床的課題は、多くの独立した試験を短期間に並行して実施することである。これらの試験の一部は、異なるフロー条件下で菌株及びその表現型特性を識別するのに使用される。多数の微生物試験は、通常は、バイオフィルムの特定のタイプに対して有効な抗生物質濃度を識別するために行われ、これは、感染が制御できないほど発現する前、通常は２４時間以内の数百の独立試験を必要とする場合がある。平行板フローチャンバ、チューブフローセル、又はマイクロチャネルにおけるその流体力学は十分に理解されているという事実にもかかわらず、それらの使用は、一連のフロー条件にわたる多くの同時微生物試験を必要とする時に一般的に非実用的である。１つの個々の試験の設定は、高価であり、時間を消費し、かつ通常は特殊機器を必要とする。複製を同一に保つことは困難であり、それらは、通常は、密封又は製造のような問題を有する。
【０００４】
バイオフィルムの迅速な生成及び複数の試験を並行して実行するのに異なるタイプの高スループットデバイスを使用することができる。課題は、次に、閉じた系において望ましい流体力学的条件を模倣することである。これらのデバイスの一部は、Ｓａｌｅｋ他（２０１０年、「バイオフィルム研究に一般的に使用される生体医用デバイスにおける流体フローの数値シミュレーション及の流体力学的分析」、数値シミュレーション−計算流体力学における例及び応用、Ｌｕｔｚ  Ａｎｇｅｒｍａｎｎ（編集）、ＩｎＴｅｃｈ、第１０章、１９３〜２１２頁）及びＳａｌｅｋ他（２０１１年、「部分充填攪拌培養ウェル板の内側の壁剪断応力パターン及び流体フローの分析」、ＡＢＭＥ、ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１０４３９−０１１−０４４４−９）に説明かつ分析されている。これらの高スループットデバイスの主な利点は、多くの同一ウェルを備えた反復形状を有することである。板が軌道攪拌器によって平行移動される時に、それは、ウェルの全てにおいて同じフロー条件をもたらす。現存の高スループットデバイスは、実用的観点から便利であるが、それらは、特に、制御された条件を確実に生成することに関して、依然として一部の基本的欠点を有する。これらのデバイスに生じる複合的な流体力学は、通常は、デバイスに沿って不均一なフロー条件をもたらし、そのために結果は、均一な拍動波形を有するドメインにわたって解釈するのが困難であり、かつ特定の条件に関連する。剪断応力分布は、制御することが困難である。例えば、培養区域の異なる位置での壁剪断応力の時間的又は空間的分布は、ウェル表面の小さい部分にわたってのみ望ましい条件を作ることができるが、有意な偏差が、表面の残りの区域にわたって観測される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｌｅｋ他、２０１０年、「バイオフィルム研究に一般的に使用される生体医用デバイスにおける流体フローの数値シミュレーション及の流体力学的分析」、数値シミュレーション−計算流体力学における例及び応用、Ｌｕｔｚ  Ａｎｇｅｒｍａｎｎ（編集）、ＩｎＴｅｃｈ、第１０章、１９３〜２１２頁
【非特許文献２】Ｓａｌｅｋ他、２０１１年、「部分充填攪拌培養ウェル板の内側の壁剪断応力パターン及び流体フローの分析」、ＡＢＭＥ、ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１０４３９−０１１−０４４４−９
【非特許文献３】Ｓａｌｅｋ他、２０１１年、「部分充填攪拌培養ウェル板内側の流体フロー及び壁剪断応力パターンの分析」、ＢＭＥＳ  ４０：７０７〜７２８
【非特許文献４】Ｄａｒｄｉｋ他、２００５年、「内皮細胞に対する環状及び層状剪断応力の差動効果」、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ  ４１（５）：８６９−８８０
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｇｓ、Ｄ．Ｌ．、１９８２年、「大きい流体歪みを伴う時間依存多重材料フロー」、流体力学のための数値方法、Ｋ．Ｗ．Ｍｏｒｔｏｎ及びＭ．Ｊ．Ｂａｉｎｅｓ（編集）、アカデミックプレス、ニューヨーク州ニューヨーク
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この節は、本発明の開示の全体的要約を提供するものであり、その完全な範囲の網羅的な開示ではない。
【０００７】
本発明の開示は、通過する培地の連続フローのために環状チャンバを有する環状培養皿に関する。連続フローは、均一な定常フロー、又はこれに代えて規則的な拍動フロー、又はこれに代えて不規則な拍動フローを含むことができる。フローセル又は既存の高スループットデバイスと比較した時に、この新しい設計を使用する際に多くの利益がある。設定準備は、非常に迅速であり、かついずれの特殊機器も必要としない。デバイスは、製造及び密封の観点からポンプフロー、セルチューブ設定、及びそれらに関連付けられた問題なしに生理的フローと非常に類似の拍動フローを発生させることができる。それは、複製を並行して行うのに非常に迅速であり、かつそれを同一に保つのが容易である。培養区域にわたる剪断パルスは、攪拌器によって直接に制御され、一般的に、各培養ウェル内の流体フローの流量は、既存の高スループットデバイスと比較する時により良好に制御される。デバイスは、廉価で使い捨てであり、かつ光学測定、顕微鏡、及び他の分析に対して容易なアクセスを有する。このデバイスの基本形状は、「計算流体力学（ＣＦＤ）」解析を使用して設計かつ最適化されている。
【０００８】
本明細書に説明する図面は、選択した実施形態の例示目的のためだけであり、本発明の開示の範囲を制限するように意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態による例示的環状培養皿の斜視図である。
【図２】図１に示す環状培養皿からの環状チャネルの斜視図である。
【図３（Ａ）】任意の時点の環状培養板内の流体の自由表面フローの斜視図である。
【図３（Ｂ）】任意の時点の環状培養板内の流体の自由表面フローの側面図である。
【図４（Ａ）】同じ任意の時点での図３（Ａ）及び図３（Ｂ）からの環状培養板の底面上の表面剪断応力ベクトルを示す概略図である。
【図４（Ｂ）】環状培養板の底面上の壁剪断応力（Ｐａ）の大きさの輪郭を示す図である（湾曲した矢印は、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）の両方に対する回転方向を示す）。
【図５】１回転サイクル中の例示的環状培養皿の底面での変動する剪断応力を示す図表である。
【図６】３回転サイクルを通じた流体の拍動フローを示す図表である。
【図７】旋回攪拌器上の単一環状培養皿内の３つの隣接環状チャンバを通る壁剪断応力の振幅を示す図表である。
【図８】（ｉ）第１の環状培養皿内の環状チャンバの幅及び直径が図７の培養皿内の最外環状チャンバに対応し、（ｉｉ）第２の環状培養皿内の環状チャンバの幅及び直径が図８の培養皿内の中央環状チャンバに対応し、（ｉｉｉ）第３の環状培養皿内の環状チャンバの幅及び直径が図７の培養皿内の最内環状チャンバに対応する各皿が単一環状チャンバを含んで異なる周波数を有する３つの環状培養皿の各々における壁剪断応力を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の開示は、円形培養皿に関し、各培養皿は、皿の中心軸の周りに１又は２以上の対称環状チャンバを定める。各培養皿は、１又は２以上の環状チャンバを含むことができる。環状チャンバは、同心環状チャンバ又はこれに代えて非同心環状チャンバとすることができる。環状チャンバは、異なる形状、例えば、円形及び楕円形などを有することができる。
【００１１】
本発明の開示の一例示的実施形態により、適切な培養皿は、標準的なペトリ皿の寸法に近似し、底板構成部（底板構成要素）は、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍ、約１５ｍｍ〜約４０ｍｍ、約１５ｍｍ〜約３０ｍｍ、約１５ｍｍ〜約２０ｍｍの高さと共に約１００ｍｍ直径の近似寸法を有する。底板には、約８０ｍｍの直径及び底板の外壁と同じ高さを有する中心円柱が設けられ、それによって底板の周囲の周りに１０ｍｍ幅の環状チャンバが形成される。上板は、底板の外壁及び中心円柱の上部の頂部に接触し、上板の外壁は、底板の外壁の周りで下方に延びる。１００ｍｍ直径底板の内壁及び中心円柱の外径によって定められた環状チャンバの適切な幅は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間に存在する。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約５０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約６０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約７０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約８０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約９０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１１０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１２０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１３０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１４０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１５０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１６０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１７０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。望ましい場合は、培養皿は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバを定める約１８０ｍｍの外径を有する底板を有することができる。特に適切なものは、約５ｍｍ〜約２０ｍｍの範囲から選択される幅と約１０ｍｍ〜約４０ｍｍの範囲から選択された高さとを有する環状チャンバを定める培養皿である。中心円柱は、底板から上方に延びる中実円筒体とすることができることに注意されたい。これに代えて、中心円柱は、底板から上方に延びる材料のリングとすることができる。
【００１２】
例示的環状培養皿を図１及び図２に示している。環状培養皿は、標準的な上板１２（別名カバープレート）及び底板１４を含む。中心円柱１６は、底板と一体に係合し、それによって環状チャンバ１８を定める。
【００１３】
本発明の開示の別の例示的実施形態により、環状培養皿の底板は、中心円柱の周りに隣接して配置された２又は３以上の環状チャンバを有することができる。２つの環状チャンバが設けられる場合に、各チャンバの幅は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、及びその間とすることができる。３つの環状チャンバが設けられる場合に、各チャンバの幅は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、及びその間とすることができる。４つの環状チャンバが設けられる場合に、各チャンバの幅は、約５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、約４５ｍｍ、約５０ｍｍ、及びその間とすることができる。２又は３以上の環状チャンバは、同心又はこれに代えて非同心とすることができる。
【００１４】
本発明の開示の別の例示的実施形態により、複数の環状培養ウェルは、単一正方形板内に設けることができる。各環状培養ウェルは、一体中心円柱を有する円形チャンバを含み、それによって約５ｍｍ、約７．５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１２．５ｍｍ、約１５ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバが設けられる。正方形底板は、２Ｘ２フォーマットに配置された４つの環状培養ウェル、又は３Ｘ３フォーマットに配置された９つの環状培養ウェル、又は４Ｘ４フォーマットに配置された１６の環状培養ウェルを有することができる。これに代えて、正方形底板は、各環状培養ウェルの中心が底板の中心軸から等しく離間し、同じく隣接環状培養ウェルからも等しく離間するように配置された６つの環状培養ウェルを有することができる。これに代えて、正方形底板は、各環状培養ウェルの中心が底板の中心軸から等しく離間し、同じく隣接環状培養ウェルからも等しく離間するように配置された８つの環状培養ウェルを有することができる。
【００１５】
本発明の開示の別の例示的実施形態により、複数の環状培養ウェルは、単一矩形板内に設けることができる。各環状培養ウェルは、一体中心円柱を有する円形のチャンバを含み、それによって約５ｍｍ、約７．５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１２．５ｍｍ、約１５ｍｍ、及びその間の幅を有する環状チャンバが設けられる。これに代えて、矩形底板は、例えば、２Ｘ３フォーマットに配置された６つの環状培養ウェル、又は２Ｘ４フォーマットに配置された８つの環状培養ウェル、又は３Ｘ４フォーマットに配置された１２個の環状培養ウェル、又はそれよりも多くを有することができる。
【００１６】
本明細書に開示する例示的環状培養皿は、細胞を液体培養において培養するのに特に適している。一般的に、培養板及びウェル板を有する用途において、流体は、細胞培養にわたって固定の流体深さを維持するように調節される。これは、比較目的で、（大気に露出された）自由表面を通じた拡散の影響が従って複数の実験間で不変であることを保証する。実験に使用される流体の典型的な深さは、培養面より２ｍｍ及び４ｍｍ上方にある。回転攪拌器上に置かれた環状培養皿内の細胞培養の保温によって液体培養の一定フローが環状チャンバの周りにもたらされる。環状チャンバを持たない培養皿内の細胞培養成長と比較すると、本発明の環状培養皿において培養される細胞は、環状チャンバを通して同じ正確に制御可能なフロー条件を受け、それによって流体フロー環境の変動の大幅な低減、細胞間の形態学的変動の最小化、従来技術培養皿において典型的に遭遇する不均一な剪断力によって引き起こされる機械的応力の低減が得られる。例示的環状培養皿は、微生物バイオフィルム形成及び操作、哺乳類の細胞培養、植物の細胞培養、タンパク質発現、及び／又は哺乳類細胞及び植物細胞内の遺伝子発現の研究に特に適している。
【００１７】
本明細書に開示する例示的環状培養皿はまた、流体フロー力学のモデル化、例えば、血管系によって代表される生物系における流体フローのシミュレーション、哺乳類の細胞培養、及び遺伝子発現研究など、又はこれに代えて異なるタイプの流体中の材料の腐食試験における使用、又はこれに代えてコーティングの特性及び性質の試験に適している。例示的環状培養皿を旋回攪拌器上に置き、次に、旋回攪拌器の中心軸の周りの３次元運動を調整して、（ｉ）環状チャンバの周りの流体の規則的に往復するフロー、（ｉｉ）環状チャンバの周りの流体の規則的な拍動フロー、及び（ｉｉｉ）不規則なランダムパルスを含むフローのうちの１つをもたらす。これに加えて、環状チャンバ内の流体流量は、旋回攪拌器の運動の速度を調節することによって正確に調整することができる。
【００１８】
嵩張るポンプフロー、セルチューブ設定を使用することなく連続フローを発生させるために、フローを移動する適切なパワー及び連続形状（絶え間ない形状）が必要である。利用可能なパワーの供給源の１つは、重力である。例えば、連続形状に対して周期的な高さの差を適用し、この高さの差によって制御される連続フローを発生させることができる。
【００１９】
利用可能な攪拌器（環状及び旋回攪拌器）の移動を見ることにより、旋回攪拌器は、他方の攪拌器（軌道攪拌器）が平面内の移動を有するので、周期的な高さの差を与えることができるように見える。この目的のために、最初に攪拌器の運動を分析する。
【００２０】
この節において、旋回攪拌器の運動は、それが新しいデバイスを開発するために制御することができることを示すために分析される。
【００２１】
旋回攪拌器は、β攪拌器の傾斜角及びΩの回転速度によって制御される。選択された状態で、複合移動が発生され、これは、３つの独立した移動に線形分解することができる。
【００２２】
すなわち、絶対座標系内の旋回板上の局所座標系（Ｘ、Ｙ、Ｚ）内の点の位置は、以下のように時間の関数として取得することができる。
2016526898.tif 000003
式１
ここで、αang＝Ωｔ。
【００２３】
ｚ方向の絶対位置は、板上の局所的な点に対して相対高さの差を与える（この高さの差は、重力をもたらす）。ｚ方向の絶対位置に対する式は、周期的な高さの差を与えることができるように見える。
2016526898.tif 000004
望ましい形状に沿った点の絶対位置（ｚ方向の）が板上のそれらの位置に対応するように周期的に変わる場合に、この形状に対する周期的な高さの差を得る。板上に中心がある対称形状（例えば、円）は、この状態を満足することができる。
【００２４】
この目的のために、板上に中心があり、かつ式３を使用してｒ’に等しい半径を有する円上の２つの任意の点（ｘ’、ｙ’）及び（ｘ’’、ｙ’’）を考える。
2016526898.tif 000005
点（ｘ’、ｙ’）のＺ位置は、式４を使用して解かれ、
2016526898.tif 000006
かつ現時点では点（ｘ’’、ｙ’’）のＺ位置に等しい。
2016526898.tif 000007
2016526898.tif 000008
2016526898.tif 000009
【００２５】
従って、連続形状（トーラスのような）が攪拌器テーブル上に位置決めされた板の上に重ね合わされた円の同じ位置上に位置付けられた場合に、板内で重力によって駆動されるソリューションの連続フローを与えることができる。
【００２６】
細胞培養フローチャンバの追加の制約が、データ収集の必要性を考慮するために得られる。平坦面が理想的である観測及びデータ収集（例えば、顕微鏡、蛍光、又は光学密度試験）のための邪魔されない光アクセスが必要とされる。これらの制約を満足させるために、本発明の例示的実施形態のうちの１つによる環状培養板のための新しい設計形状を図１及び図２に示している。
【００２７】
環状培養板内のフローのシミュレーション及びソリューションフローパターンの流体力学的分析
別の実施形態は、軌道攪拌器によって印加された２次元回転力に応答して（ｉ）従来の丸い培養皿及び（ｉｉ）６つの同一の丸いウェルを収容する６ウェル培養皿内の流体フローパターンの数値モデル化に向けてＳａｌｅｋ他（２０１１年、「部分充填攪拌培養ウェル板内側の流体フロー及び壁剪断応力パターンの分析」、ＢＭＥＳ  ４０：７０７〜７２８）の開示を出発点として使用して培養皿上へ作用された複合３次元回転運動に応答する本発明の開示の例示的環状培養皿内の流体フローパターンの数値モデル化に有用な方法及び処理に関する。
【００２８】
２次元回転力に応答して流体フロー力学を模擬するＳａｌｅｋ他（２０１１年）数値モデルは、有限容積ベースの市販「計算流体力学（ＣＦＤ）」ソフトウエアＦＬＵＥＮＴ（登録商標）フローモデル化シミュレーションソフトウエアを使用して模擬された（ＦＬＵＥＮＴは、米国ペンシルベニア州カノンズバーグ所在のＡｎｓｙｓインコーポレーテッドの登録商標である）。軌道攪拌器の２つの回転速度、すなわち、１００ｒｐｍ及び２００ｒｐｍと２つの液体容積、すなわち、２ｍｌ及び４ｍｌとが模擬された（合計で４つのケース）。液体−空気界面内の自由表面運動、ウェル内側のフローパターン、及び平均及び瞬間壁剪断応力が分析された。Ｓａｌｅｋ他（２０１１）は、各々が６つの同一のウェルから構成された６ウェル培養板を使用した。各ウェルは、深さ１８ｍｍであり、Ｒ＝１７．５ｍｍの半径を有していた。６ウェル培養板を軌道攪拌器上に取り付けて、水平面（すなわち、ＸＺ平面）において２次元直線平行移動を受けさせた。旋回半径は、Ｒg＝９．５ｍｍであった。水の特性を使用して液相をモデル化し、空気を使用して気相をモデル化した。全ての特性は、２０℃及び１気圧：ρ＝９９８．２ｋｇ／ｍ3、μ＝０．００１００３Ｐａ．ｓ時のものであった。各ウェルは、静止時のほぼ２ｍｍ及び４ｍｍ液体高さに対応する液体媒体の２ｍｌ又は４ｍｌで満たされた。レイノルズ数は、Ｄａｒｄｉｋ他（２００５年、「内皮細胞に対する環状及び層状剪断応力の差動効果」、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ  ４１（５）：８６９−８８０）に従って以下のように定義される。
Ｒｅ＝ρΩＲg2／μ              式８
流体フローを層状レジームに維持するために、１８８６とした最大ＲｅがＳａｌｅｋ他（２０１１年）によって使用された。
【００２９】
彼らの２相フローは、２つの領域が均一な単相流体（空気及び水）に対応し、１つの領域が２相水−空気界面に対応する３つの領域にソリューションドメインを分割することによって模擬された。均一ドメイン内の３次元非定常質量及び運動量保存方程式は、それぞれ、以下のように書かれる。
2016526898.tif 000010
2016526898.tif 000011
ここで、
2016526898.tif 000012
ρ、μ、ｐ、及び
2016526898.tif 000013
は、それぞれ、対応する単相に対する速度、密度、動粘性、圧力、及び外力（単位質量当たり）である。
【００３０】
自由表面フローを捕捉するために、ＦＬＵＥＮＴ（登録商標）６．３マニュアルにおいて明らかにされるような流体容積（ＶＯＦ）方法が使用され、従って、３つのドメインは、ソリューション手順に向けて連続ドメインに組み合わされ、力学的条件（自由表面での剪断応力が、両方の相に対して等しい）が満足されることを保証することができたと考えられる。Ｓａｌｅｋ他（２０１１年）は、各流体相ドメインが単に接続されると仮定した。界面での各計算有限容積において、各位相に対する容積分率αｉは、以下を満足するように導入された。
2016526898.tif 000014
ここで、ｉは、空気又は水を表している（すなわち、ｎ＝２）。連続方程式及び運動量方程式は、以下の流体特性に対して修正された定義を使用して解かれた。
2016526898.tif 000015
ここで、ψは、密度又は動粘性とすることができる。この連立方程式は、次に、以下を満足することによって閉じたものになる。
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【００３１】
最も正確な界面追跡技術（ＦＬＵＥＮＴ（登録商標）６．３マニュアルを参照されたい）である幾何学的再構成スキームが、２相間の界面が各セルにおいて線形勾配を有すると仮定する区分的線形手法に基づく遷移ＶＯＦモデルの計算に使用された（Ｙｏｕｎｇｓ、Ｄ．Ｌ．、１９８２年、「大きい流体歪みを伴う時間依存多重材料フロー」、流体力学のための数値方法、Ｋ．Ｗ．Ｍｏｒｔｏｎ及びＭ．Ｊ．Ｂａｉｎｅｓ（編集）、アカデミックプレス、ニューヨーク州ニューヨーク）。Ｓａｌｅｋ他（２０１１年）は、表面張力（２０℃での水−空気界面に対してб＝０．０７２Ｎ／ｍ）の影響を無視することができると仮定した。この仮定は、Ｂｏｎｄ数：
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Ｗｅｂｂｅｒ数：
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を通して表現される液相に対する重力及び慣性力が毛細管力よりも有意に大きい（すなわち、Ｂｏ、Ｗｅ≫１）場合に有効である。Ｓａｌｅｋ他（２０１１）は、自らの研究においてＢｏ及びＷｅは典型的には１００程度であると決定した。
【００３２】
Ｓａｌｅｋ他（２０１１年）は、軌道攪拌器が同じ２次元平面内移動を６ウェル培養板上の全ての点に付与すること、及び従って板壁の速度が、
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であることを仮定し、ここで、Ｒg＝９．５ｍｍは、撹拌の軌道半径であり、Ωは、回転速度である。ソリューションドメインは、両方の流体相を内包し、ウェルの上側リップまで延びるが、液状層における結果のみを提示している。滑りなし境界条件が６ウェル容器の中実壁で課せられた（すなわち、流体と固体面間の相対速度なし）。運動方程式は、比較及び検証のために静止及び移動座標系の両方で解かれた。静止座標系に関して、メッシュ全体が、軌道攪拌器によって課せられた速度
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によって移動する「ダイナミックメッシュ」技術が使用された。移動ウェルの運動は、ＦＬＵＥＮＴ（登録商標）にリンクされた外部Ｃ＋＋ユーザ定義関数（ＵＤＦ）を使用して定義された。この座標系において、力ベクトルは以下の通りである。
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【００３３】
相対座標系は、非慣性であり、かつ壁が座標系に対してゼロ速度を有するように軌道攪拌器によって課せられる速度で平行移動された。板運動の影響が、力ベクトルを
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として説明することができるように、追加の（擬似）力の項を通して導入された。ここで、
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は、移動座標系内の原点から位置ベクトルであり、ωは、座標系の垂直軸の周りの回転の角速度である。
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及び
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は、それぞれ、移動座標系の加速度、角加速度効果、コリオリ、及び求心加速度である。軌道運動において、
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及び
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内の最後の３つの項は消える。
【００３４】
Ｓａｌｅｋ他（２０１１年）はまた、単一の丸い培養皿に対してシミュレーションを実行し、発生された数値グリッドは、ＧＡＭＢＩＴＲ（登録商標）において発生された（ＧＡＭＢＩＴは、米国ニューハンプシャー州レバノン所在のＦｌｕｅｎｔインコーポレーテッドの登録商標である）。この形状に発生されたグリッドは、固体境界の近くのグリッドを最適に精緻化することを可能にし、すなわち、全グリッドの９０％が、０．２未満の歪度を有し、セルのいずれも高い歪度を有していなかった。グリッドの解像度は、１．０４の幾何学的膨張係数を用いて壁において増大された。グリッド感度は、連続シミュレーションにおいてグリッド密度を名目上２倍にすることによって評価された。壁剪断応力は、グリッド密度の変化に最も敏感なパラメータであることが見出された。剪断応力の変化は、ダイナミックメッシュ技術を使用すると、６４、０００と１２１、５００セルのグリッド間では無視できるものであった。
【００３５】
従って、本発明の開示の例示的環状培養皿内の流体フローパターンに対する数値シミュレーションが、以下に説明するように、新しい境界条件を定義することにより、旋回攪拌器によって例証されるような培養皿上に作用される複合３次元回転運動に応答して開発された。
【００３６】
流体容積（ＶＯＦ）方法を使用して自由表面フローを捕捉した。固体境界上では、流体と壁間に相対速度がないことを要求する滑りなし条件が課せられた。
【００３７】
この例において、例示的環状培養皿は、深さ３０ｍｍであり、Ｒ＝４０ｍｍの内半径及びＲ＝５０ｍｍの外半径を有する。培養皿は、旋回攪拌器上に中心があり、３次元複合運動を受ける。回転速度は、１００ｒｐｍに設定され、板の傾斜角は、６°に設定される。水の特性を使用して液相をモデル化し、空気を使用して気相をモデル化した。全ての特性は、２０℃及び１気圧時のものである。環状培養板の静止時のほぼ１０ｍｍ液体の液体高さに対応する２８ｍｌの水が、例示的環状培養板に追加された。
【００３８】
旋回攪拌器は、環状培養板内の全ての点に複合３次元移動を付与する。環状培養板が板の中心に位置する時に、環状培養板内に閉じ込められた流体の運動は、
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式８
によって与えられるようなｘ及びｙ軸の周りの周期的中実体回転と考えることができ、ここで、βshakerは、板の傾斜角であり、Ωは、回転速度である。
【００３９】
運動方程式が静止座標系において解かれ、この目的のために、メッシュ全体が旋回攪拌器によって課せられた運動によって移動する「ダイナミックメッシュ」技術が使用された。移動する環状培養板の運動は、ＦＬＵＥＮＴＲ（登録商標）フローモデル化シミュレーションソフトウエアにリンクされた外部Ｃ＋＋ユーザ定義関数（ＵＤＦ）を使用して定義された。
【００４０】
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、それぞれ、任意の時点の環状培養板内の流体の自由表面フローの斜視図及び側面図である。自由表面は、環状培養板の中心軸の周りのΩの速度の中実体回転を受ける進行波によって特徴付けられる。自由表面の運動と同様に、フロー場全体は、環状培養板中心軸の周りの中実体回転を受ける。図４（Ａ）は、単一回転サイクル中の任意の時点の環状培養板の底面上の表面剪断応力ベクトルを示している。同時に、図４（Ｂ）は、環状培養板の底面上の壁剪断応力（Ｐａ）の大きさの輪郭を示している（湾曲した矢印は、図５（Ａ）及び図５（Ｂ）の両方に対する回転の方向を示す）。剪断応力場は、旋回攪拌器の方向にかつその回転式速度で環状培養板中心軸の周りで反時計周りに回転する。
【００４１】
剪断応力ベクトルは、底面上のフローの方向に向けられる。剪断ベクトルは、主として均一であり（滑りなし境界条件に起因して側壁から遠い）、ほぼ円の曲率に従う。剪断応力場の中実体回転は、攪拌器回転周波数に対応する周期で底面上のあらゆる位置に対して壁剪断応力レベルの循環変動を生じる。その結果、平均フロー及び壁応力場は軸対称であるが、瞬間フロー場は、有意なタンジェンシャル勾配を含む。
【００４２】
図５は、１回転サイクル中の例示的環状培養皿の底面での変動する剪断応力を示す図表である。ここでの流体フロー構造のトポロジーは、移動する６ウェル板内のフローと比較すると遥かに単純である。フローは、直線的なチャネルの断面でのフローのように、主として各断面の曲率に対してタンジェンシャルであるように位置合わせされる。ウェルの底面は、決して空気に露出されない。フローは、環状培養板の旋回運動及び重力によって加速され、かつ底面に沿って低い液体レベルから高い流体上昇まで誘導される。壁剪断応力は、タンジェンシャルに増加し、かつ上昇した領域（より高い流体レベル）の下でその最大値に到達する。これらのフロー構造は、図５に示すように固定点で観測した時に循環変動する剪断応力をもたらすことになる。この特定の回転速度では、より低いｒｐｍ時に起る場合があるフロー逆転はない。この事例研究において、攪拌器は、最大角度に設定された。傾斜角を低減すると、より均一な剪断応力分布を得ることができる。
【００４３】
図３〜図５に示すデータは、深さ３０ｍｍであり、かつＲ＝４０ｍｍの内半径及びＲ＝５０ｍｍの外半径を有し、２８ｍｌの水が追加される例示的環状培養皿に基づくものであることに注意されたい。この水の容積は、環状培養板の静止時のほぼ１０ｍｍ液体の液体高さに対応する。適切な例示的環状皿は、環状チャンバの内半径及び外半径に対して他の寸法を有することができ、流体の異なる容積を使用することもできる。例えば、例示的環状皿は、８０ｍｍの外径を有することができ、一方、環状チャンバの内半径及び外半径は、それぞれ３０ｍｍ及び４０ｍｍとすることができると考えられる。従って、約４．４ｍｌの流体は、環状チャンバにおいて２ｍｍの深さを与えると考えられ、一方、約８．８ｍｌの流体は、環状チャンバにおいて４ｍｍの深さを与えるであろう。別の例示的環状皿は、６０ｍｍの外径を有することができ、一方、環状チャンバの内半径及び外半径は、それぞれ２０ｍｍ及び３０ｍｍとすることができると考えられる。従って、約３．１ｍｌの流体は、環状チャンバにおいて２ｍｍの深さを与えると考えられ、一方、約６．３ｍｌの流体は、環状チャンバにおいて４ｍｍの深さを与えるであろう。
【００４４】
図６は、３回転サイクルを通じた図１及び図２に示すもののような環状チャンバを通って流れる流体の壁剪断応力プロファイルを示す図表である。与えられた旋回に対するものであることに注意されたい。
【００４５】
図７は、旋回攪拌器上の単一環状培養皿内の３つの隣接環状チャンバを通る壁剪断応力の振幅を示す図表である。与えられた旋回周波数に対して、各チャネル内の周期（すなわち、サイクル持続時間又は周波数の逆数）は同じであることになるが、壁剪断応力の振幅は、半径が増加する時に増加することになることに注意されたい。従って、最も短い振幅は、環状培養皿の中心軸に最も近い環状チャンバにおいて記録され、最大の振幅は、最外環状チャンバにおいて記録されたものである。
【００４６】
図８は、３つの環状培養皿を通る流体フローの壁剪断応力プロファイルを示す図表である。各皿は、他の２つの皿における環状チャンバとは異なる幅を有する単一環状チャンバを含む。各環状培養皿は、同じ容積の流体を受け入れ、かつ個別の旋回攪拌器上に置かれた。３つの環状培養皿内の拍動フローの振幅は、３つの環状培養皿内にほぼ同等の量の壁剪断応力を与え、かつ維持するように、３つの旋回攪拌器の各々の速度を別々に調整することによって制御された。しかし、最小径の環状チャンバを有する環状培養皿は、中間径の環状チャンバを有する培養板（青線）よりも速いサイクル時間（赤線）を有し、中間径の環状チャンバを有する培養板は、次に、最大径の環状チャンバを有する培養板（黒線）よりも速いサイクル時間を有する。
【符号の説明】
【００４７】
１０  環状培養皿
１２  上板
１４  底板
１６  中心円柱
１８  環状チャンバ
【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図７】
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【国際調査報告】
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