(57)【要約】【課題】非免疫原性及び/又は核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイスを提供する。【解決手段】  核酸折り紙デバイスは、リガンド、ブドウ糖濃度、又は電電磁場等の１つ以上の外部刺激により活性化し得、又は細胞表面受容体の細胞内移行の減弱又は防止、又は活性物質の貯蔵寿命を延長するのに用いられる。また、糖尿病の治療方法及び核酸折り紙デバイスの製造方法も提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造A,B,C又はDを有する長鎖と複数の短鎖とを含む核酸折り紙デバイスであって、
前記構造Aにおいて、
（i）前記短鎖の１つが、結合相手に結合可能な(a)アプタマー領域、DNA結合タンパク質を結合可能な(b)オリゴヌクレオチド、又は電磁場を受けることが可能なナノアンテナに付着された(c)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、又は前記短鎖の１つが、アプタマー領域(a)を含み、他の前記短鎖が、(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドを含み、    
(ii) 前記他の短鎖が、ハイブリダイズ又は前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、前記ラッチ領域配列は、前記結合領域が前記ラッチ領域を置換するように、前記(a)のアプタマー領域が、前記結合相手に結合可能なように選択されるか、又は前記ラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能で、前記ラッチ領域が、第１の条件下で第１の構成を有し、別の第２の条件下で別の第２の構成を有するように選択された結合相手に結合され、前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)オリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記結合相手に結合可能であるが、前記結合相手が、前記第１の構成から前記第２の構成に遷移したとき、前記ラッチ領域が、前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)のオリゴヌクレオチドから解離されるように、前記第２の構成を有する前記結合相手に結合不可能であり、又は前記(c)のオリゴヌクレオチドに付着した前記ナノアンテナが、前記電磁場を受けると、誘導結合され、その後加熱され、これにより前記(c)のオリゴヌクレオチドから前記ラッチ領域を解離し、
(iii)
前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)又は(c)のオリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスを閉構成に保持し、前記アプタマー領域又は前記オリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
前記構造Bにおいて、
（i）前記短鎖の１つが、第１の結合相手に結合可能な第１のアプタマー領域を含み、
(ii) 他の前記短鎖が、第２の結合相手に結合可能な第２のアプタマー領域を含み、
(iii) さらに他の前記短鎖が、前記第１のアプタマー領域にハイブリダイズされた第１のラッチ領域を含み、前記第１のラッチ領域配列が、前記第１の結合相手が前記第１のラッチ領域を置換するように、前記第１のアプタマー領域が前記第１の結合相手に結合可能なように選択され、又は前記第１のラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、
(iv) さらに他の前記短鎖が、前記第２のアプタマー領域にハイブリダイズされた第２のラッチ領域を含み、前記第２のラッチ領域配列が、前記第２の結合相手が前記第２のラッチ領域を置換するように、前記第２のアプタマー領域が、前記第２の結合相手に結合可能なように選択され、又は前記第２のラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、
(v) 前記第１のアプタマー領域が、前記第１のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、及び/又は前記第２のアプタマー領域が、前記第２のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成になっており、及び前記第１のアプタマー領域が、前記第１のラッチ領域にハイブリダイズされておらず、前記第２のアプタマー領域が、前記第２のラッチ領域にハイブリダイズされていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
前記構造Cにおいて、
(i) 前記短鎖の２つが、各々外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、
外部オリゴヌクレオチドにハイブリタイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、前記外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成になっており、外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの両方が、前記外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
前記構造Dにおいて、
(i) 他の前記短鎖が、外部可溶性オリゴヌクレオチド及びラッチ領域と結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、
(ii)２つの前記短鎖が、各々互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、
(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドが前記内在性オリゴヌクレオチド、及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドを置換するように、前記外部内在性オリゴヌクレオチドが、前記可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、
(iv) 互いに及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成になっており、互いに及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされておらず、代わりに互いにハイブリダイズされるとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列を欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性である核酸折り紙デバイス。
【請求項２】
前記核酸折り紙デバイスが、非免疫原性であることを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項３】
前記核酸折り紙デバイスが、核酸分解酵素に耐性があることを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項４】
前記核酸折り紙デバイスが、非免疫原性であり、かつ核酸分解酵素に耐性があることを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項５】
前記核酸がDNAであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項６】
前記核酸折り紙デバイスが、メチル化、好適にはCpGジヌクレオチドであることを特徴とする請求項５に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項７】
二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な前記化合物が、ネトロプシン、ジスタマイシン、オリゴアミド、砂糖オリゴアミド接合体、又はビスアミジンから選択されることを特徴とする請求項５に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項８】
前記化合物が、ネトロプシンであり、前記ネトロプシンが、任意にリンカーを介して、その末端アミノ基により前記二本鎖核酸にさらに共有結合されることを特徴とする請求項７に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項９】
１つ以上のさらなる短鎖が、任意に各々リンカーを介して、ペイロードに結合されたハンドル領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１０】
前記リンカーが、前記ハンドル領域の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、任意に酵素切断の認識部位を含むさらなる領域を含み、前記ペイロードが、前記ハンドル領域への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより結合されていることを特徴とする請求項９に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１１】
前記さらなる領域が、マトリックスメタロプロテアーゼ等のプロテアーゼによる切断のためのプロテアーゼ認識部位を含むリンカーペプチドを含むことを特徴とする請求項１０に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１２】
前記リンカーが、パラセタモールを結合可能なシクロオキシゲナーゼタンパク質、テトロドトキシンを結合可能なナトリウムチャンネルサブユニット、及びジゴキシンを結合可能な抗ジゴキシン抗体等の小分子を結合可能なタンパク質を含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１３】
前記ペイロードが各々独立して、インスリン、抗体又はその断片、細胞表面受容体リガンド又はその細胞学的に活性な断片、小分子、オリゴヌクレオチド等の核酸、核酸分解酵素、アプタマー、脂質、多糖、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ナノ粒子、フルオロフォア、放射性化合物、ナノアンテナ、又はリポソーム等の薬物であることを特徴とする請求項９に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１４】
前記ナノアンテナが各々独立して、金属量子ドット、金属ナノ粒子、又は金属ナノ結晶を含み、前記金属が好適には金であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１５】
前記核酸折り紙デバイスが閉構成にあるとき、前記複数の短鎖が、少なくとも１つの前記ペイロードが前記核酸折り紙デバイスの内面に位置するように選択され、前記開構成への遷移により、前記ペイロードを前記核酸折り紙デバイスの外面に位置させることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１６】
前記複数の短鎖の１つが、前記核酸折り紙デバイスが閉構成にあるとき、前記核酸折り紙デバイスの外面に位置するハンドル領域を含み、前記開構造への遷移により、前記ペイロードを前記核酸折り紙デバイスの内面に位置させることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１７】
前記ハンドル領域が、オリゴヌクレオチド又はリポソームから選択されたペイロードに結合されていることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１８】
前記複数の短鎖は、前記核酸折り紙デバイスがほぼ樽形であるように選択され、ほぼ六角形チューブ形であり、又は２つ以上の開放端を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１９】
(i)
構造Ａ又はＢを有する前記核酸折り紙デバイスにおいて、前記複数の短鎖は、前記核酸折り紙デバイスが第１の領域と第２の領域を含むように選択され、前記第１の領域が、各々結合相手に結合可能な前記(a)のアプタマー領域、各々DNA結合タンパク質に結合可能な前記(b)のオリゴヌクレオチド、又は各々ナノアンテナに付着された前記(c)のオリゴヌクレオチドを含み、前記第２の領域が、前記ラッチ領域を含み、
前記第１の領域の第１の端部が、少なくとも１つの一本鎖核酸ヒンジにより前記第２の領域の第１の端部に付着され、前記第１の領域の前記第２の端部が、ハイブリダイゼーション、又は前記ラッチ領域への前記アプタマー領域又はオリゴヌクレオチドの各々１つの結合により前記第２の領域の前記第２の端部に付着され、又は
(ii) 構造C又はDを有する前記核酸折り紙デバイスにおいて、前記複数の短鎖は、前記核酸折り紙デバイスが第１の領域と第２の領域を含むように選択され、前記第１の領域と前記第２の領域の各々１つが、互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチド又は外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合された前記ラッチ領域の１つを含み、
前記第１の領域の第１の端部が、少なくとも１つの一本鎖核酸ヒンジにより前記第２の領域の第１の端部に付着され、前記第１の領域の前記第２の端部が前記第２の領域の前記第２の端部に付着されていないことを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２０】
(i) 前記構造A又は構造Bを有する前記核酸折り紙デバイスの前記複数の短鎖は、前記アプタマー領域の各々１つが、その各々結合相手により結合及びその各々の結合相手に結合された場合、及び/又は前記ナノアンテナの各々１つが、電磁場を受け、誘導結合され、その後加熱される場合、前記第１の領域の前記第２の端部が、前記第２の領域の前記第２の端部へ付着しないように選択され、
(ii)
前記構造Cを有する前記核酸折り紙デバイスの前記複数の短鎖は、前記ラッチ領域の各々１つが、前記外部オリゴヌクオチドの他の１つにハイブリダイズされた場合、前記第１の領域の前記第２の端部が、前記第２の領域の前記第２の端部へ付着するように選択され、又は
(iii)
前記構造Dを有する前記核酸折り紙デバイスの前記複数の短鎖は、前記ラッチ領域が互いにハイブリダイズされた場合、前記第１の領域の前記第２の端部が前記第２の領域の前記第２の端部へ結合されるように選択されることを特徴とする請求項１９に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２１】
前記結合相手が、腫瘍関連抗原、細胞膜受容体、分泌又は膜結合成長因子、ホルモン、サイトカイン、リガンド、ケモカイン、細菌、ウィルス又は寄生虫抗原、脂質、オリゴヌクレオチド、糖、酵素、又はDNA結合タンパク質から選択される抗原であることを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２２】
前記酵素が、グルコキナーゼであり、前記(a)のアプタマー領域が、前記第１の構成を有する前記グルコキナーゼに結合可能であるが、前記第２の構成を有する前記グルコキナーゼに結合不可能であり、又は前記DNA結合タンパク質が、グルコース反応因子であり、前記(b)のオリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記グルコース反応因子に結合可能であるが、前記第２構造を有する前記グルコース反応因子に結合不可能なグルコース応答調節配列であることを特徴とする請求項２１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２３】
前記第１の条件は、0〜4.5mMの範囲のグルコース濃度であり、前記第２の条件は、5〜10mMの範囲のグルコース濃度であることを特徴とする請求項２２に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２４】
前記構造A を有する長鎖と複数の短鎖とを含み、
(i) 前記複数の短鎖の１つが、第１の構成を有するグルコキナーゼに結合可能であるが、第２の構成を有する前記グルコキナーゼに結合不可能な(a)アプタマー領域、又は第１の構成を有するグルコース反応因子に結合可能であるが、第２の構成を有する前記グルコース反応因子に結合不可能であるグルコース応答調節配列のヌクレオチド配列を含む(b)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、
(ii) 他の前記短鎖が、前記グルコキナーゼに結合したラッチ領域を含み、前記(a)のアプタマーが、前記第１の構成を有する前記グルコキナーゼに結合可能であるが、前記結合相手が、前記第１の構成から前記第２の構成に遷移するとき、前記ラッチ領域が、前記(a)のアプタマーから置換されるように前記第２の構成を有する前記グルコキナーゼへ結合不可能であり、又は他の前記短鎖が、前記グルコース反応因子に結合されたラッチ領域を含み、前記(b)のオリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記グルコース反応因子に結合可能であるが、前記グルコース反応因子が、前記第１の構成から前記第２の構成に遷移するとき、前記ラッチ領域が前記(b)のオリゴヌクレオチドから解離されるように、前記第２の構成を有する前記グルコース反応因子に結合不可能であり、
(iii) 互いに結合したとき、前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)のオリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、前記核酸折り紙デバイスを閉構成に保持し、前記(a)のアプタマー領域、又は前記(b)のオリゴヌクレオチド及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズされていないか、又は互いに結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
(iv) さらなる短鎖が、任意にリンカーを介して、インスリンに結合されたハンドル領域を備え、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化のいずれかであり、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列が欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性である請求項１，２２及び２３に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２５】
前記構造Dを有する長鎖と複数の短鎖とを含む核酸折り紙デバイスであって、
(i) 前記複数の短鎖の１つが、外部可溶性オリゴヌクレオチド及びラッチ領域に結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、
(ii) 前記短鎖の２つが、各々互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合したラッチ領域を含み、
(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドが、前記内在性オリゴヌクレオチド及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドを置換するように、前記内在性オリゴヌクレオチドが、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、
(iv) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが、開構成になっており、互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされず、その代わりに互いにハイブリダイズされているとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
(v) さらなる短鎖が、任意にリンカーを介して、薬剤に結合したハンドル領域を含み、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列の欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性である核酸折り紙デバイス。
【請求項２６】
各々独立して請求項１〜２３のいずれか１項に記載された少なくとも２つの相互接続された核酸折り紙デバイスを含む多様式核酸折り紙デバイス。
【請求項２７】
結合相手に結合可能な前記アプタマー領域の各々１つが、少なくとも１つの他のアプタマー領域と同じ又は異なることを特徴とする請求項２４に記載の多様式核酸折り紙デバイス。
【請求項２８】
前記少なくとも２つの相互接続された核酸折り紙デバイスの１つ以上のさらなる短鎖が各々、任意にリンカーを介して、ペイロードに結合されたハンドル領域を含むことを特徴とする請求項２４又は２５に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項２９】
前記ペイロードが各々独立して、インスリン、抗体又はその断片、細胞表面受容体リガンド又はその細胞学的に活性な断片、小分子、核酸、核酸分解酵素、アプタマー、脂質、多糖、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ナノ粒子、フルオロフォア、放射性化合物、ナノアンテナ、又はリポソーム等の薬物であることを特徴とする請求項２６に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項３０】
前記少なくとも２つの相互結合された核酸折り紙デバイスの２つ以上の前記さらなる短鎖が各々、ペイロードに結合されたハンドル領域を含み、前記ペイロードが、同じ又は異なることを特徴とする請求項２６に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれ１項に記載の核酸折り紙デバイス及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
長鎖と複数の短鎖とから成り、前記複数の短鎖の１つが、細胞膜受容体を結合可能なアプタマー又は前記アプタマーに結合可能なリガンドのいずれかを含む核酸折り紙デバイスであって、
(i)
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
(ii)
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列を欠如又は前記核酸折り紙デバイスのTLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性であり、
細胞表面で前記受容体に結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスが、前記細胞への前記受容体の細胞内移行を減弱又は防止することを特徴とする核酸折り紙デバイス。
【請求項３３】
前記核酸折り紙デバイスが、たった１つの構成を有することを特徴とする請求項３０に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項３４】
請求項３０又は３１に記載の核酸折り紙デバイス及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３０又は３１に記載の核酸折り紙デバイス又は細胞への細胞膜受容体の細胞内移行を減弱又は防止する請求項３２に記載の医薬組成物の使用法。
【請求項３６】
２つの開放端を有する中空核酸折り紙デバイスであって、前記中空核酸折り紙デバイスが、長鎖と複数の短鎖とから成り、前記中空核酸折り紙デバイスが、たった１つの構成を有し、前記短鎖は、中空核酸折り紙デバイスが、前記中空核酸折り紙デバイスの内部断面よりも小さな最大断面を有する生理活性物質の前記中空核酸折り紙デバイスの内部空間への出入りを可能にするように選択され、
前記短鎖は、前記生理活性物質が前記中空核酸折り紙デバイスの前記内部空間に存在する期間が、前記生理活性物質が前記中空核酸折り紙デバイスの前記内部空間の外部に存在する期間との間で所定の平衡状態が確立されるようにさらに選択されることを特徴とする中空核酸折り紙デバイス。
【請求項３７】
前記所定の平衡状態は、前記生理活性物質が前記中空核酸折り紙デバイスの前記内部空間に存在する期間が、前記生理活性物質が前記中空核酸折り紙デバイスの前記内部空間の外部に存在する期間よりも長くなるように確立されることを特徴とする請求項３４に記載の中空核酸折り紙デバイス。
【請求項３８】
樽形又は六角形を有することを特徴とする請求項３５に記載の中空核酸折り紙デバイス。
【請求項３９】
生理活性物質及び請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の中空核酸折り紙デバイスを含む貯蔵期間延長剤形であって、前記中空核酸折り紙デバイスの前記内部空間が、前記生理活性物質の不活性化を減弱させる高密度の負電荷を含むことを特徴とする貯蔵期間延長剤形。
【請求項４０】
前記生理活性物質の前記不活性化が、前記生理活性物質の加水分解又は酸化の結果として生じることを特徴とする請求項３７に記載の貯蔵期間延長剤形。
【請求項４１】
非免疫原性である請求項１、２４又は３０に記載の核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、
(i) 前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式中空核酸折り紙デバイス上に(a)CpGアイランドを形成せずに、非免疫原性になるように、又は前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式中空核酸折り紙デバイス上に(b)CpGアイランドを形成するように、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式中空核酸折り紙デバイスの長鎖と複数の短鎖とを構成する核酸配列を設計し、
(ii) 前記長鎖と複数の短鎖を取得し、
(iii) 前記長鎖と複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、
(iv) 存在すれば、メチル化により前記ＣpGアイランドをマスクし、これにより前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを非免疫原性にすること、
を含む核酸折り紙デバイスを作成する方法。
【請求項４２】
核酸分解酵素に耐性がある請求項１、２４又は３０に記載の核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、
(i) 前記核酸配列が、任意に前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイス上にCpGアイランドを形成しないように、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスの前記長鎖と前記複数の短鎖とから成る核酸配列を設計し、
(ii) 前記長鎖と前記複数の短鎖を取得し、
(iii) 前記長鎖と前記複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、
(iv)
存在するならば、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意にアデニン残基をメチル化によりマスクし、
(v) 前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と任意に相互作用させ、
これにより、核酸分解酵素に耐性がある前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを取得すること、
を含む核酸折り紙デバイスを作成する方法。
【請求項４３】
非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性がある請求項１、２４又は３０に記載の核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、
(i) 前記核酸配列が、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイス上に(a)CpGアイランドを形成しないように、又は前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイス上に(b)CpGアイランドを形成するように、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスの前記長鎖と前記複数の短鎖短鎖とから成る核酸配列を設計し、
(ii)
前記長鎖と前記複数の短鎖を取得し、
(iii)
前記長鎖と前記複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを形成し、
(iv)存在するならば、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意ではアデニン残基をメチル化によりマスクし、
(v)前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを、二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と任意に相互作用させ、
これにより非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性がある前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを取得すること、
を特徴とする核酸折り紙デバイスを作成する方法。
【請求項４４】
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記核酸折り紙デバイスをメチルトランスフェラーゼ及びS-アデノシルメチオニン等のメチル供与体に接触させて、前記メチル化を行うことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、前記メチルトランスフェラーゼが、damメチルトランスフェラーゼ、Taqlメチルトランスフェラーゼ、Alulメチルトランスフェラーゼ、BamHIメチルトランスフェラーゼ、CpGメチルトランスフェラーゼ(M.Sssl)、EcoRIメチルトランスフェラーゼ、G9aメチルトランスフェラーゼ、CpGメチルトランスフェラーゼ（M.CviPI）、HaeIIIメチルトランスフェラーゼ、Hhalメチルトランスフェラーゼ、HpaIIメチルトランスフェラーゼ、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ（Dnmtl）アミノ末端Ab、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ（Dnmtl）、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ、（Dnmt3A）アミノ末端Ab、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ（Dnmt3B）カルボキシ末端Ab、ヒトPRMT1メチルトランスフェラーゼ、MspIメチルトランスフェラーゼ、SET7メチルトランスフェラーゼ、又はラットの肝臓メチラーゼから選択されることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項２４に記載の核酸折り紙デバイスの薬学的有効量を必要とする個体に投与することを含むI型糖尿病、II型糖尿病、又は高血糖の治療方法。
【請求項４７】
I型糖尿病、II型糖尿病、又は高血糖の治療に用いられる請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の核酸折り紙デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に非免疫原性、核酸分解酵素耐性核酸折り紙デバイス及びその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数年前に導入されて以来（Rothemund  2006）、長いDNA折り紙が、ナノスケールでの複雑な形状の上昇型製造への強力で洗練された手法として現れてきている。Shih, Douglasらが、DNA折り紙デバイスを２次元から３次元に拡張し、オープンソースコンピュータ支援設計（CAD）ツール、caDNAno (Dietz et al., 2009; Douglas et al., 2009a; Douglas et al., 2009b)によりそれを向上させ、イメージング（Jungmann et al., 2012; Jungmann et al., 2010; Steinhuaer et al., 2009）、可能性のある治療法（Douglas et al., 2012; Schuller et al., 2011）、及びメタマテリアル（Kuzyk et al., 2012; Bell et al., 2012; Schreibe et al., 2011）といった各種応用に用いられている著しく多種多様な形状を製造することができる。
【０００３】
ここで詳しく述べたように参照として援用したWO2012/061719及び Douglas et al (2012) は、特定の細胞集団への生物学的活性実体を標的とした送達に有用なDNA折り紙デバイスを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明において、機能的で、安定し、安全で、非免疫原性でかつ遠隔制御可能な治療ナノデバイスを提供する改良された核酸折り紙プラットフォームを記載する。このプラットフォームは、リガンドの濃度に応じた送達物を提供し、所定の条件でナノデバイスを閉じることでナノデバイスの活性を制御し、複数種類の送達物を個別に制御し、薬物、ワクチン、タンパク質、成長因子、サイトカイン、RNA分子等の分子の貯蔵寿命を延長する手段及び細胞表面から薬物関連受容体の細胞内取り込みを抑制することで薬物タキフィラキシーを防止する調整可能システムも提供する。このプラットフォームは、小分子化学物質、ペプチド、又は巨大タンパク質、追加核酸分子、無機量子ドット、ナノ結晶又はナノ粒子、リポソーム、多糖類、高分子、カーボンナノチューブ、及び追加材料を追加してDNA折り紙デバイスを修飾する方法に基づいている。この方法は、組成物の酵素的又は非酵素的修飾、及び化学的手段や被覆等によるメチル化、アセチル化、ヒドロキシル化、凝固等により製造されたDNAの構造も含むことができる。最後に、このプラットフォームは、CpGやATが豊富な領域等のある種のモチーフを含まないDNAから成るDNA折り紙デバイスを設計することで達成できる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、構造A,B,C又はDを有する長鎖と複数の短鎖とを含む核酸折り紙デバイスであって、
構造Aにおいて、（i）前記短鎖の１つが結合相手に結合可能な(a)アプタマー領域、DNA結合タンパク質を結合可能な(b)オリゴヌクレオチド、又は電磁場を受けることが可能なナノアンテナに付着された(c)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、又は前記短鎖の１つがアプタマー領域(a)を含み、他の前記短鎖が(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドを含み、(ii) 他の前記短鎖がハイブリダイズ又は(a)の前記アプタマー領域又は(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、前記ラッチ領域配列は前記結合領域が前記ラッチ領域を置換するように、前記(a)のアプタマー領域が、前記結合相手に結合可能なように選択されるか、又は前記ラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能で、前記ラッチ領域が、第１の条件下で第１の構成を有し、別の第２の条件下で別の第２の構成を有するように選択された結合相手に結合され、(a)の前記アプタマー領域又は(b)の前記オリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記結合相手に結合可能であるが、前記結合相手が第１の構成から第２の構成に遷移するとき、前記ラッチ領域が(a)の前記アプタマー領域又は(b)の前記オリゴヌクレオチドから解離されるように前記第２の構成を有する前記結合相手に結合不可能であり、又は(c)の前記ナノアンテナが、前記電磁場を受けると、誘導結合され、その後加熱され、これにより(c)の前記オリゴヌクレオチドから前記ラッチ領域を解離し、(iii) (a)の前記アプタマー領域又は(b)又は(c)の前記オリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスを閉構成に保持し、前記アプタマー領域又はオリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
構造Bにおいて、（i）短鎖の１つが第１の結合相手に結合可能な第１のアプタマー領域を含み、(ii)他の短鎖が第２の結合相手に結合可能な第２のアプタマー領域を含み、(iii) さらに他の短鎖が前記第１のアプタマー領域にハイブリダイズされた第１のラッチ領域を含み、前記第１のラッチ領域配列が前記第１の結合相手が前記第１のラッチ領域を置換するように前記第１のアプタマー領域が前記第１の結合相手に結合可能なように選択され、又は前記第１のラッチ領域が前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、(iv) さらに他の前記短鎖が前記第２のアプタマー領域にハイブリダイズされた第２のラッチ領域を含み、前記第２のラッチ領域配列が前記第２の結合相手が前記第２のラッチ領域を置換するように前記第２のアプタマー領域が前記第２の結合相手に結合可能なように選択され、又は前記第２のラッチ領域が前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、(v) 前記第１のアプタマー領域が、前記第１のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、及び/又は前記第２のアプタマー領域が前記第２のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成になっており、及び前記第１のアプタマー領域が前記第１のラッチ領域にハイブリダイズされておらず、前記第２のアプタマー領域が前記第２のラッチ領域にハイブリダイズされていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
構造Cにおいて、(i) 前記短鎖の２つが、各々外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、外部オリゴヌクレオチドにハイブリタイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが前記外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成になっており、外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの両方が前記外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされたとき前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
構造Dにおいて、(i) 他の短鎖が、外部可溶性オリゴヌクレオチド及びラッチ領域と結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、(ii)２つの前記短鎖が各々、互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドが前記内在性オリゴヌクレオチド、及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドを置換するように、前記外部内在性オリゴヌクレオチドが、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、(iv) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるとき前記核酸折り紙デバイスが開構成になっており、互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされておらず、代わりに互いにハイブリダイズされるとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の前記大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列を欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性である核酸折り紙デバイスを提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの相互接続された核酸折り紙デバイスを含む多様式核酸折り紙デバイスに関する。
【０００７】
さらに他の態様において、本発明は、長鎖と複数の短鎖とを含み、前記短鎖の１つが細胞膜受容体を結合可能なアプタマー又はアプタマーに結合可能なリガンドのいずれかを含む核酸折り紙デバイスであって、(i) 前記核酸折り紙デバイスがアルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の前記大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は (ii) 前記核酸折り紙デバイスがTLR9認識配列を欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性であり、細胞の表面で前記受容体に結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスが前記細胞への前記受容体の細胞内移行を減弱又は防止する核酸折り紙デバイスを提供する。
【０００８】
本発明は、上記で定義したように、前記短鎖の１つが細胞膜受容体又はリガンドを前記受容体に結合可能なアプタマー領域、又はその医薬組成物のいずれかを含み、細胞への細胞膜受容体の細胞内移行を減弱又は防止する核酸折り紙デバイスの使用法をさらに提供する。
【０００９】
さらになお他の態様において、本発明は、２つの開放端を有する中空核酸折り紙デバイスであって、前記中空核酸折り紙デバイスが長鎖と複数の短鎖とを含み、前記中空核酸折り紙デバイスがたった１つの構成を有し、前記短鎖は前記中空核酸折り紙デバイスが前記中空核酸折り紙デバイスの内部断面よりも小さな最大断面を有する生理活性物質の前記中空核酸折り紙デバイスの内部空間への出入りを可能にするように選択され、前記短鎖は前記生理活性物質が前記中空核酸折り紙デバイスの内部空間に存在する期間が前記生理活性物質が中空核酸折り紙デバイスの前記内部空間の外部に存在する期間との間で所定の平衡状態が確立されるようにさらに選択される中空核酸折り紙デバイスに関する。
【００１０】
さらに他の態様において、本発明は、上記で定義したいずれか１つの構成を有する核酸折り紙デバイス及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
ある態様において、本発明は、以下に定義するグルコースレベルに反応して、核酸折り紙デバイスの薬学的有効量を必要とする個体に投与することを含むI型糖尿病、II型糖尿病、又は高血糖の治療方法を提供する。
【００１２】
さらにまた、本発明は、以下に定義する非免疫原性又は核酸分解酵素に耐性があるか、又は非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性があるかのいずれかである核酸折り紙デバイスの作成方法を提供する。
【００１３】
従って、そのような１つの特殊な態様において、本発明は、以下に定義する非免疫原性である核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、(i) 前記核酸折り紙デバイス又は多様式中空核酸折り紙デバイス上に(a)CpGアイランドを形成せずに非免疫原性になるように、又は前記核酸折り紙デバイス又は多様式中空核酸折り紙デバイス上に(b)CpGアイランドを形成するように、前記核酸折り紙デバイス又は多様式中空核酸折り紙デバイスの前記長鎖と短鎖とを構成する核酸配列を設計し、(ii) 前記長鎖と短鎖を取得し、(iii) 前記長鎖と短鎖を接触させ、これにより前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、(iv) 存在すれば、メチル化によりCpGアイランドをマスクし、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを非免疫原性にする方法を提供する。
【００１４】
そのような他の特殊な態様において、本発明は、以下に定義する核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、(i) 前記核酸配列が任意に前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上にCpGアイランドを形成しないように前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスの前記長鎖と短鎖とを含む核酸配列を設計し、(ii) 前記長鎖と短鎖を取得し、(iii) 前記長鎖と短鎖を接触させ、これにより前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、(iv) 存在するならば、前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意にアデニン残基をメチル化によりマスクし、 (v) 任意に前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを二本鎖核酸の前記大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用させ、これにより、核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを作成する方法を提供する。
【００１５】
そのようなさらに他の特殊な態様において、本発明は、以下に定義する非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、(i) 前記核酸配列が、前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上に(a)CpGアイランドを形成しないように、又は前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上に(b)CpGアイランドを形成するように、前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスの前記長鎖と短鎖とを含む核酸配列を設計し、(ii) 前記長鎖と短鎖を取得し、(iii) 前記長鎖と短鎖を接触させ、これにより前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、(iv) 存在するならば、前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意にアデニン残基をメチル化によりマスクし、(v) 任意に前記核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを二本鎖核酸の前記大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用させ、これにより非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを作成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Aは、異なる折り畳み期間で取得したナノロボットのアガロースゲル（左側の写真）及び透過型電子顕微鏡（TEM）顕微鏡写真（右側の写真）によりナノロボットを可視化した図である。試料は、20nMの長鎖濃度、200nMの短鎖濃度、1X, トリス/酢酸/EDTA (TAE)緩衝液, 10mM MgCL2で折り畳まれた。折り畳まれた後、余分な短鎖は、micon Ultra-0.5 mL 100K遠心濾過機（Millipore）を用いて除去された。折り畳み期間は2 分/℃で80〜60℃、150分/℃で60〜10℃である。
【００１７】
【図１Ｂ】図１Bは、異なる折り畳み期間で取得したナノロボットのアガロースゲル（左側の写真）及び透過型電子顕微鏡（TEM）顕微鏡写真（右側の写真）によりナノロボットを可視化した図である。試料は、20nMの長鎖濃度、200nMの短鎖濃度、1X, トリス/酢酸/EDTA (TAE)緩衝液, 10mM MgCL2で折り畳まれた。折り畳まれた後、余分な短鎖は、micon Ultra-0.5 mL 100K遠心濾過機（Millipore）を用いて除去された。折り畳み期間は5分/℃で80〜60℃、75分/℃で60〜10℃である。
【００１８】
【図２】図２は、不活性状態（正面図の左側の写真と側面図の中間の写真）及び活性開状態（右側の写真）にあるナノロボットの３次元表現を示す。
【００１９】
【図３Ａ】図３Aは、Takai及びJones (ヒト染色体21及び22におけるCpGアイランドの総合的分析; Proc Natl Acad Sci USA.99(6):3470-5(2002)に記載されたCpGアイランドマップを示す（CpG発見者の研究結果:http//cpgislands.usc.edu）。
【００２０】
【図３Ｂ】図３B は、Takai及びJones (ヒト染色体21及び22におけるCpGアイランドの総合的分析; Proc Natl Acad Sci USA.99(6):3470-5(2002)に記載されたCpGアイランドマップを示す（CpG発見者の研究結果:http//cpgislands.usc.edu）。
【００２１】
【図３Ｃ】図３Cは、Takai及びJones (ヒト染色体21及び22におけるCpGアイランドの総合的分析; Proc Natl Acad Sci USA.99(6):3470-5(2002)に記載されたCpGアイランドマップを示す（CpG発見者の研究結果:http//cpgislands.usc.edu）。
【００２２】
【図４】図４は、メチル化DNA折り紙デバイスがバクテリア制限酵素に耐性があるアガロースゲルを示す。この図はEcoRIに対するメチル化対非メチル化DNA折り紙デバイスの応答を示す。一方、非メチル化DNA折り紙デバイスでは、制限パターンは見えるが、メチル化DNA折り紙デバイスでは保護されている。EcoRIに触れたDNAを示す左側と右側のレーンに対する無標識レーンには対照群及び切断されてはならない他の酵素がある。左側の第１のレーンは1Kbマーカーである。
【００２３】
【図５】図５は、ロボットのメチル化が刺激への応答に対するその機能に影響を与えないことを示す。この実験において、非メチル及びメチル化ロボットが、ビオチンを装填され、蛍光標識され、ストレプトアビジン被覆微粒子の存在下で、刺激（ヒトPDGF）濃度増大により培養した。
【００２４】
【図６】図６は、V3（ネトロプシン）によりDNase Iから保護されたDNA折り紙デバイスの応答を示すアガロースゲルを示す。ネプトロプシンの濃度が増大すると、DNase IからDNA折り紙デバイスを保護（143nMにおいて、DNase Iが無い試料に匹敵する）する。一方、非保護ロボットは完全に消化されてしまう（右端のレーン）。
【００２５】
【図７】図７は、リアルタイムPCRの出力を示すグラフである。上４つの線はDNaseとネプトロプシン（ネトロ）両方の存在下のDNA（y軸）量を示す。一方、下１番目の線はネトロプシン存在下のDNA量を示す。このグラフは、ネトロプシンをDNA折り紙デバイスに付加したとき、ネトロプシンが、DNA折り紙デバイスのDNase I消化を抑制することを示す。
【００２６】
【図８】図８は、アミノ反応性官能基を有するソラレンをネトロプシンの末端に付着させて、DNAへのネトロプシンの共有結合を可能にする方法を示す。
【００２７】
【図９Ａ】図９Ａは、ソラレンの使用を含む（中間の方法）、アミノ基を有する化合物をDNAに共有結合する３つの方法を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ソラレンの使用を含む（中間の方法）、アミノ基を有する化合物をDNAに共有結合する３つの方法を示す。
【００２８】
【図１０】図１０は、一次性昆虫（Blaberusdiscoidalis）血球と非メチル化ナノロボット、メチル化ナノロボット、及び生理的食塩水に触れたヒトマクロファージのTLR9下流エフェクターの生体外リン酸化の蛍光活性化セルソーター（FACS）解析を示す。左側の２つの重なりピークは、非メチル化ナノロボットと生理的食塩水を示し、右側のピークは、メチル化ナノロボットを示す。
【００２９】
【図１１Ａ】図１１Aは、非メチル化であるが、メチル化されていないDNA折り紙デバイスがマウス免疫細胞を活性化する様子を示す。メチル化又は非メチル化DNA折り紙デバイスが細胞に付加され、ELISAによりサイトカインとケモカイン放出を測定することで応答を検査した。KC (CXCL-1)を示し、X軸はDNA折り紙デバイス濃度を示す。
【００３０】
【図１１Ｂ】図１１Bは、非メチル化であるが、メチル化されていないDNA折り紙デバイスがマウス免疫細胞を活性化する様子を示す。メチル化又は非メチル化DNA折り紙デバイスが細胞に付加され、ELISAによりサイトカインとケモカイン放出を測定することで応答を検査した。CCL2を示し、X軸はDNA折り紙デバイス濃度を示す。
【００３１】
【図１１Ｃ】図１１Cは、非メチル化であるが、メチル化されていないDNA折り紙デバイスがマウス免疫細胞を活性化する様子を示す。メチル化又は非メチル化DNA折り紙デバイスが細胞に付加され、ELISAによりサイトカインとケモカイン放出を測定することで応答を検査した。IL-6を示し、X軸はDNA折り紙デバイス濃度を示す。
【００３２】
【図１２Ａ】図１２Aは、非メチル化であるが、メチル化されていないDNA折り紙デバイスが、マウス免疫細胞を活性化するのを確認する様子を示す。メチル化及び非メチル化DNA折り紙デバイスが、細胞に付加され、ELISAによりサイトカインCCL２放出を測定することで応答を検査した。
【００３３】
【図１２Ｂ】図１２Bは、非メチル化であるが、メチル化されていないDNA折り紙デバイスが、マウス免疫細胞を活性化するのを確認する様子を示す。メチル化及び非メチル化DNA折り紙デバイスが、細胞に付加され、ELISAによりサイトカインKC(CXCL-1)放出を測定することで応答を検査した。
【００３４】
【図１３Ａ】図１３Aは、生後６〜８週のC57/BL6マウスの腹腔への100μgのナノロボット注入後、２４時間分離した単球の細胞数を示す。メチル化及び非メチル化ナノロボット（各々MとNMと称す）をマウスの腹腔内に注入した後、腹腔液中の総細胞数は、フローサイトメトリーにより計測した。
【００３５】
【図１３Ｂ】図１３Bは、生後６〜８週のC57/BL6マウスの腹腔への100μgのナノロボット注入後、２４時間分離したマクロファージの細胞数を示す。メチル化及び非メチル化ナノロボット（各々MとNMと称す）をマウスの腹腔内に注入した後、腹腔液中の総細胞数は、フローサイトメトリーにより計測した。
【００３６】
【図１４】図１４は、電磁場（EMF）によりアンテナ標識ナノロボットを制御する構成を示す。左下の写真は、ゲート鎖を介して金のアンテナに接合されたナノロボットの方式を示す。右下の写真は、電磁場の発生に用いられた銅コイルを示す。右上の写真は、1GHzの無線周波数(RF)をコイルへ供給する RF信号発生器であり、この信号発生器は、左上のコンピュータにより制御される。UIは、ユーザインタフェースである。
【００３７】
【図１５】図１５は、アンテナ標識DNA折り紙デバイスにより培養された細胞のリアルタイムフローサイトメトリー解析を示す。時間=2038で、EMFがオンになり、DNA折り紙デバイスが、オン状態に切り替わり、細胞を蛍光抗体と結合した。カラースケールは細胞密度を意味する。X軸は10-1秒単位の時間を示す。
【００３８】
【図１６】図１６は、抗体が折り紙構造（ひし形）に結合してないとき、又は50 (正方形)又は100 (三角形)nm幅構造に結合したとき、標的細胞による蛍光抗体の細胞内移行を示す。X軸は分単位の時間を示す。Y軸は蛍光を示す（任意の単位）。
【００３９】
【図１７Ａ】図１７Aは、化学反応がDNA折り紙構造内部で防止される様子を示す。相補的な短鎖（ひし形）でハイブリダイジングさせるか、又はアミン修飾された短鎖（正方形）とのカルボキシル基のカルボジイミド支援接合のいずれかにより、ペイロード（DNA鎖又はその表面のカルボキシル基のいずれかにより官能化された、5nmの金のナノ粒子）が、DNA折り紙構造の内部に注入された様子を示す。前者は通常発生するが後者は発生しない。
【００４０】
【図１７Ｂ】図１７Bは、化学反応がDNA折り紙構造内部で防止される様子を示す。その構造は透過型電子顕微鏡TEMにより計数した。
【００４１】
【図１８】図１８は、区画に折り曲げられ、各区画がdsDNAゲート（外側に突出している小さな着色されたアーム）により個別に制御される2次元シート（青い長い折り畳まれた連続線）から成る多様式DNA折り紙デバイスの概略図を示す。別のペイロード（薬物、タンパク質、核酸、微粒子等）が、全ての区画（着色スター）内部に付着される。
【００４２】
【図１９Ａ】図１９Aは、グルコース感受性ナノロボットとその機能を示す。送達物としてインスリンを有し、グルコース結合タンパク質とオリゴヌクレオチドを含むゲートを有するグルコース感受性ナノロボット構造方式を示す。前者は、あるグルコース濃度でのみ後者に結合可能なゲートの模式図を示す。グルコース結合タンパク質は、グルコース反応抑制因子、ある種の配列（ゲートの一部）のDNAオペレーター部位を、低いが高くはないグルコース濃度で結合するDNA結合タンパク質かも知れない。その代わりに、グルコース結合タンパク質は、低いが高くはないグルコース濃度で結合するアイソ選択性アプタマー（ゲートの一部）により結合されたグルコキナーゼ（ベータ細胞Glck）かも知れない。高いグルコース濃度でゲートが開くとき、ナノロボットが開きインスリンが放出される。
【００４３】
【図１９Ｂ】図１９Bは、グルコース感受性ナノロボットの機能を示す。アガロースゲルは、DNAロボットに結合されたインスリンが、肝細胞上のインスリン受容体を連続的に活性化することを示す。pAkt (リン酸化セリン/スレオニンキナーゼakt)。アクチンを（安定した）参考に示す。３つの一番左側のレーン、インスリンが不足している空のロボット、３つの中間のレーン、常時開いているインスリンを装填されたロボット、３つの一番右側のレーン、外部DNAキーにより開いたインスリンを装填されたロボット。
【００４４】
【図２０Ａ】図２０Aは、外部刺激に反応して閉じることが可能なナノロボットの概念を示す。外部オリゴヌクレオチド（ミクロRNA,miR16）が、ラッチ領域に結合したオリゴヌクレオチドを置換し、オリゴヌクレオチドを遊離して、互いにハイブリダイズし、これによりナノロボットを閉じる。
【００４５】
【図２０Ｂ】図２０Bは、外部刺激に反応して閉じることが可能なナノロボットの概念を示す。外部オリゴヌクレオチド（ミクロRNA,miR16）が、ラッチ領域に結合したオリゴヌクレオチドを置換し、オリゴヌクレオチドを遊離して、互いにハイブリダイズし、これによりナノロボットを閉じる。「r」はリボ核酸を示し、「*」はホスホロチオエート結合を意味する。
【００４６】
【図２０Ｃ】図２０Cは、外部刺激に反応して閉じることが可能なナノロボットの活動を示す。FACS（蛍光活性化セルソーター）解析が、8ntのトーホールド(toehold)を有するナノロボットが、刺激に反応して閉じるので、時間と共に蛍光が減少する様子を示す。Aは5μM miR16を、Bは10μm miR16を示す。
【００４７】
【図２０Ｄ】図２０Dは、外部刺激に反応して閉じることが可能なナノロボットの活動を示す。FACS解析が、11ntのトーホールドを有するナノロボットが、刺激に応答して閉じるので、時間と共に蛍光が減少する様子を示す。Aは1μm miR16を、Bは5μM miR16を、Cは10μm miR16を示す。X軸は10-1秒単位の時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
メチル化は、DNA活性のエピジェネティック調節と広範囲の生物の遺伝子発現の中枢機構である（Jones,2012）。バクテリアにおいて、DNAメチル化により、それ自身の制限酵素から宿主DNAを保護し、これによりバクテリオファージDNAを認識して破壊する。興味深い類推において、脊椎動物のDNAのメチル化により、Toll様受容体9 (TLR9)を介した自身の免疫系及び自己抗体生成により認識されるのを防いでいる（Christensen
et al., 2005; Hemmi et al., 2000）。従って、メチル化は、免疫メカニズムによりDNAがどのように解釈されるか修飾しているように思える。
【００４９】
本発明の発明者等は、WO2012/061719に開示されたＤＮＡ折り紙デバイスが、非常に大きなサイズとこのデバイスに現れる異常なDNA構造にも拘わらず、効率的にメチル化でき、これにより非免疫原性及び/又は核酸分解酵素に耐性ができることを思いがけなく発見した。また、本発明によれば、DNAの小さな溝に結合したネトロプシンに結合することで、デバイスが核酸分解酵素に耐え得ることも発見した。
【００５０】
本発明に基づき、本明細書中で定義されるデバイスは、電磁場を受けると、電磁誘導を引き起こし、その結果発熱することが可能な金属ナノアンテナを付着することで、遠方から制御可能で、これによりデバイスの立体配座が開構成から閉構成へ変化することも発見された。本発明によるさらなる発見は、核酸折り紙デバイスが、例えば、周囲グルコース濃度に応じてデバイスの開閉を制御するグルコキナーゼ等のリガンド濃度感受性タンパク質を有し得るということであり、またインスリンを放出するそのようなデバイスが、グルコース濃度に依存してインスリン感受性細胞を活性化できることである。本発明によるさらなる発見は、細胞傷害性薬物を装填されたデバイスが意図しない損傷を受けた正常細胞から漏出する損傷刺激に応じて抑制されるように、デバイスを設計できることである。
【００５１】
一態様において、本発明は、構造A,B,C又はDを有する長鎖と複数の短鎖とを含む核酸折り紙デバイスであって、
構造Aにおいて（この構造は、アプタマー、ナノアプタマー、又は「リガンド-センシング分子」型キーのいずれかのキーを有する）、（i）短鎖の１つが、結合相手に結合可能な(a)アプタマー領域、DNA結合タンパク質を結合可能な(b)オリゴヌクレオチド、又は電磁場を受けることが可能なナノアンテナに付着された(c)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、又は短鎖の１つが、アプタマー領域(a)を含み、他の短鎖が、(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドを含み、(ii)他の短鎖が、ハイブリダイズ又は(a)のアプタマー領域又は(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、ラッチ領域配列は、結合領域がラッチ領域を置換するように、(a)のアプタマー領域が、結合相手に結合可能なように選択されるか、又はラッチ領域が、アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能で、ラッチ領域が、第１の条件下で第１の構成を有し、別の第２の条件下で別の第２の構成を有するように選択された結合相手に結合され、(a)のアプタマー領域又は(b)のオリゴヌクレオチドが、第１の構成を有する結合相手に結合可能であるが、結合相手が、第１の構成から第２の構成に遷移したとき、ラッチ領域が、(a)のアプタマー領域又は(b)のオリゴヌクレオチドから解離されるように、第２の構成を有する結合相手に結合不可能であり、又は(c)のオリゴヌクレオチドに付着したナノアンテナが、電磁場を受けると、誘導結合され、その後加熱され、これにより(c)のオリゴヌクレオチドからラッチ領域を解離し、(iii) (a)のアプタマー領域又は(b)又は(c)のオリゴヌクレオチド、及びラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されたとき、デバイスを閉構成に保持し、アプタマー領域又はオリゴヌクレオチド、及びラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されていないとき、デバイスが開構成に遷移し、
構造Bにおいて（この構造は、２つの異なるアプタマーキーを有する）、（i）短鎖の１つが、第１の結合相手に結合可能な第１のアプタマー領域を含み、(ii)他の短鎖が、第２の結合相手に結合可能な第２のアプタマー領域を含み、(iii) さらに他の短鎖が、第１のアプタマー領域にハイブリダイズされた第１のラッチ領域を含み、第１のラッチ領域配列が、第１の結合相手が第１のラッチ領域を置換するように、第１のアプタマー領域が、第１の結合相手に結合可能なように選択され、又は第１のラッチ領域が、アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、(iv) さらに他の短鎖が、第２のアプタマー領域にハイブリダイズされた第２のラッチ領域を含み、第２のラッチ領域配列が第２の結合相手が第２のラッチ領域を置換するように、第２のアプタマー領域が第２の結合相手に結合可能なように選択され、又は第２のラッチ領域が、アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、(v) 第１のアプタマー領域が第１のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、及び/又は第２のアプタマー領域が第２のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、核酸折り紙デバイスが閉構成になっており、及び第１のアプタマー領域が第１のラッチ領域にハイブリダイズされておらず、第２のアプタマー領域が第２のラッチ領域にハイブリダイズされていないとき、デバイスが開構成に遷移し、
構造Cにおいて（この構造は、最初に開いており、外部オリゴヌクレオチド、例えば、他のナノロボット上で閉じる）、(i) 短鎖の２つが、各々外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、外部オリゴヌクレオチドにハイブリタイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていないとき、核酸折り紙デバイスが開構成になっており、外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能なオリゴヌクレオチドの両方が、外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされたとき、デバイスが閉構成に遷移し、
構造Dにおいて(この構造は、最初に開き、損傷指標等の外部刺激に応じて閉じることができるナノロボットを表す)、(i)他の短鎖が、外部可溶性オリゴヌクレオチド及びラッチ領域と結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、(ii)２つの短鎖が、各々互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、外部可溶性オリゴヌクレオチドが内在性オリゴヌクレオチド、及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドを置換するように、外部内在性オリゴヌクレオチドが、可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、(iv) 互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたとき、核酸折り紙デバイスが開構成になっており、互いに及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされておらず、代わりに互いにハイブリダイズされるとき、核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列を欠如又は核酸折り紙デバイスのTLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、核酸折り紙デバイスが非免疫原性である核酸折り紙デバイスを提供する。
【００５２】
本明細書中で用いる用語「核酸折り紙デバイス」、「ナノロボット」、「ナノボット」、及び単に「デバイス」は、以下に説明する構造のいずれか１つにおいて、上記で定義したように、ほとんど同じ意味で核酸、例えば、DNA折り紙デバイスを指す。
【００５３】
本明細書中で用いる用語「長鎖」は、長鎖核酸、例えば約7250塩基長のDNA鎖を指し、複数の合理的に設計された「相補的」DNA鎖を用いて特定の形状に折り曲げることができる。しかし、長鎖の長さに原則的に制限はない。全て構築しようとする核酸折り紙デバイスの大きさに拠っている。そうであるから、長鎖は、15〜1013塩基の任意の長さを有しうる。短鎖の配列は、長鎖の特定部位にハイブリダイズされるよう設計され、そうすることで、長鎖を強制的に特定形状にする。DNA折り紙構造を作製するのに有用な方法は、例えば、Rothemund, P.W., Nature 440:297-302 (2006); Douglas et al., Nature 459; 414-418 (2009); Dietz et al., Science 325; 725-730 (2009); and US Patent Publication Nos.2007/0117109, 2008/0287668, 20100069621, and 2010/0216978に記載されており、その各々を全体として参照として援用する。短鎖の設計は、例えば、http://www.cadnano.orgから入手可能なCADnanoソフトウェアにより容易にすることができる。
【００５４】
本明細書中で用いる用語「ラッチ領域」は、対向するアプタマー領域にハイブリダイジング可能な核酸領域、又は他の核酸（例えば、ナノアンテナに付着）を指し、これにより核酸折り紙デバイスを閉構成に保持する。
【００５５】
本明細書中で用いる用語「アプタマー領域」は、標的分子に特異的に結合可能、つまり良く似た抗体が抗原に特異的に結合可能なように選択された核酸分子を指す。アプタマーは、当該技術分野で周知の方法を用いた対象となる本質的に任意の抗原を標的に設計できる。例えば、対象となる標的に特異的なアプタタマーを設計する方法は、US Patent Nos. 5,582,981, 5,756,291, 5,840,867, and 7,745,607, Tang et al., Anal Chem. 79-4900-4907(2007)に記載されており、その各々を全体を参照して援用する。
【００５６】
本明細書中で用いる用語「ハイブリダイズド」又は「ハイブリダイジング」は、核酸分子の２つの鎖を互いに結合することを指し、２つの鎖が互いにハイブリダジング可能であることを含むか、又は２つの鎖が互いに相補的であることを意味し、２つの鎖の相補性は、２つの鎖の間の親和性を較正するために変化し得る。例えば、２つの鎖の各々１つは、他の鎖の配列に相補的な100,99,98,96,94,92,90,85,80,75,70,65, 又は60%である塩基対配列を有し得る。
【００５７】
アプタマー領域は、結合相手がラッチ領域を置換するように結合相手に結合可能である。アプタマー領域の構造的変化を誘発して、リガンドに結合可能にすることで、アプタマーに結合する標的抗原等のリガンドである場合、リガンドが、ラッチ領域より高い親和性でアプタマー領域に結合して、ラッチ領域とハイブリダイズ可能にする線形構成をアプタマーに喪失させるためラッチ領域を解放する。結合相手が核酸分子である場合、核酸分子は、ラッチ領域よりもアプタマー領域とより高い相補性を有し得るため、ラッチ領域を置換する。概念的に、核酸分子は、ラッチ領域に対しおそらく相補的であり、ラッチ領域に結合するため、これによりアプタマー領域を置換できる。双方の場合において、置換することで核酸折り紙デバイスが、閉構成から開構成に遷移することになる。全ての実施形態において、結合相手がラッチ領域を置換するように、結合相手がアプタマー領域に結合すると定義されており、結合相手がオリゴヌクレオチドである場合、オリゴヌクレオチドがラッチ領域を置換するように、結合相手は、代わりにラッチ領域に結合し得ると理解すべきである。
【００５８】
本明細書中で用いる用語「外部オリゴヌクレオチド」は、定義される特定の核酸折り紙デバイスに含まれないが、例えば、隣接する同じ又は他の核酸折り紙デバイスに見られるオリゴヌクレオチドを指す。
【００５９】
本明細書中で用いる用語「内在性オリゴヌクレオチド」は、定義された特定の核酸折り紙デバイスに含まれるオリゴヌクレオチドを指す。
【００６０】
本明細書中で用いる用語「損傷刺激」又は「損傷指標」は、非差別的に細胞損傷を識別する、ATP、リボソーム断片、rRNA、核膜孔構成要素、ヒストン等の必須細胞間分子、又は特定種類の細胞、正常細胞、又は腫瘍細胞に他と違って存在する糖鎖形成又はリン酸化変異体等のミクロRNA又はある種の異性体、或いは上述した刺激の類似物である。
【００６１】
これに関して、ある実施形態において、外部可溶性オリゴヌクレオチドは、ミクロRNA又はミクロRNA内に含まれるオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００６２】
「DNA結合タンパク質を結合可能なオリゴヌクレオチド」の非限定例は、元々遺伝子プロモーター中に見られる単離した応答配列である。具体的な例は、グルコース感受性調節要素である。
【００６３】
本明細書中で用いる用語「核酸分解酵素」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断可能な酵素を指す。酵素の一部がエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの両方のカテゴリに分類し得るとしても、核酸分解酵素は通常これらの分解酵素にさらに分類される。周知の核酸分解酵素はDNA分解酵素とRNA分解酵素である。
【００６４】
本明細書中で用いる用語「核酸分解酵素耐性」は、核酸分解酵素存在下で無修飾分子よりもより安定なように修飾されている核酸分子を指す。
【００６５】
本明細書中で用いる用語「TLR9認識配列」は、核酸分子上の要素、例えば、抗原提示細胞の細胞質中に存在するToll様受容体(TLR)9により認識されたDNA分子である。TLR9は樹状細胞、Bリンパ球、単核球、及びナチュラルキラー(NK)細胞等の免疫系の多数の細胞で表される。TLR9はエンドソーム区画内の細胞内部で表され、CpGモチーフが豊富なDNAに結合することで、ウィルス及び細菌感染を免疫系に警告するように機能する。TLR9シグナルは、炎症促進性反応を開始する細胞の活性化につながり、I型インターフェロン又はIL-12等のサイトカインが生成されることになる。
【００６６】
用語「CpGモチーフ」と「CpGアイランド」は、ここでは、ほとんど同じ意味で用いられ、三リン酸グアニジンデオキシリボ核酸(「G」)が後続するシチジン三リン酸デオキシリボ核酸（「C」）を含む短い一本鎖合成核酸分子を指す。「P」は、DNA核酸の一部が、代わりに修飾ホスホロチオエート(PS)骨格長鎖を有するが、連続したヌクオチド間のリン酸ジエステル結合を指す。
【００６７】
用語「マスク核酸折り紙デバイス」は、領域をカバー可能、さもなければCgPアイランド等の環境にアクセス可能な分子に結合され、これによりこれらの領域を環境に近付けないようにするマスク可能な核酸折り紙デバイスを指す。
【００６８】
本明細書中で用いる用語「非免疫原性」は、哺乳類の免疫系により分子に対して応答を誘導しない、又はマスクも修飾もされていないTLR9認識配列を有する点においてのみ異なる同じ分子により誘導されたであろう反応よりも弱い反応を誘導する分子を指す。
【００６９】
非共有結合の例としては、イオン結合、静電気相互作用、疎水性相互作用、水素結合、又はファンデルワールス力を含む結合が挙げられる。
【００７０】
ある実施形態における構造Aを有する核酸折り紙デバイスにおいて、（i）短鎖の１つが第１のアプタマー領域を含み、他の短鎖が第２のアプタマー領域を含み、両方のアプタマー領域が同じ結合相手に結合可能であり、(ii) さらに他の短鎖が、第１のアプタマー領域とハイブリダイズされた第１のラッチ領域を含み、結合相手が第１のラッチ領域を置換するように、第１のアプタマー領域が第１の結合相手に結合可能なように選択され、(iii) さらに他の短鎖が、結合相手が第２のラッチ領域を置換するように、第２のアプタマー領域が結合相手に結合可能なように選択された第２のアプタマー領域にハイブリダイズされた第２のラッチ領域を含み、(iv) 第１のアプタマー領域が、第１のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、及び/又は第２のアプタマー領域が第２のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、核酸折り紙デバイスが閉構成にあり、第１のアプタマー領域が第１のラッチ領域にハイブリダイズされていないとき、及び第２のアプタマー領域が第２のラッチ領域にハイブリダイズされていないとき、デバイスが開構成に遷移する。
【００７１】
ある実施形態において、核酸折り紙デバイスは、非免疫原性、核酸分解酵素耐性、又は非免疫原性及び核酸分解酵素耐性の両方がある。
【００７２】
ある実施形態において、上記で定義した核酸折り紙デバイスの核酸はDNAである。
【００７３】
ある実施形態において、TLR9認識配列は、CgPアイランドであり、核酸折り紙デバイスは、メチル化、好適にはCpGジヌクレオチドであってもよい。
【００７４】
用語「メチル化」は、メチル基が付加された、具体的には、シトシン又はアデニンヌクレオチドに付加された核酸分子を指す。
【００７５】
ある実施形態において、核酸折り紙デバイスは、シトシン残基の位置５の炭素原子、シトシン残基の位置４の炭素原子に結合したアミノ基、又はアデニン残基の位置６の炭素原子に結合したアミノ基でのメチル化であり、例えば、核酸折り紙デバイスは、CpGジオヌクレオチドのシトシン残基の位置５の炭素原子でのメチル化である。
【００７６】
ある実施形態において、核酸折り紙デバイスは、CpGジオヌクレオチドのシトシン又はグアニン残基いずれかで修飾される。例えば、シトシン又はグアニン残基は、リンカーを介して官能基を有する高分子に共有結合することで修飾され、この高分子は、ポリ（エチレン）グリコール、ポリスチレン、ポリ（塩化）ビニル、ペクチン、ポリガラクッロ酸、及び乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ペプチド、脂質、又は多糖類等の高分子から選択される。官能基でも構わないが、アミノ、メルカプト、及びカルボキシル基に制限されない。
【００７７】
ある実施形態において、二重核酸の大きな溝又は小さな溝に共有結合可能な化合物は、ネトロプシン、ジスタマイシン、オリゴアミド、糖オリゴアミド接合体、又はビスアミジンから選択される。特定の実施形態において、この化合物は、ネトロプシンであり、ネトロプシンは、その２つの末端アミノ基を介して、任意にリンカーを介して、例えば、図７及び図８に示すような、二重核酸に共有結合可能である。
【００７８】
ある実施形態において、本明細書中で定義される核酸折り紙デバイスの１つ以上のさらなる短鎖は、各々ペイロードに結合、より詳しくは、任意にリンカーを介して、ペイロード部分に結合されたハンドル領域を備えている。
【００７９】
一実施形態において、リンカーは、ハンドル領域の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、酵素切断の認識部位を有するさらなる領域を任意に備え、ペイロードは、ハンドル領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりハンドル領域に結合されている。このさらなる領域は、細胞外マトリックス分解酵素等のタンパク質分解酵素による切断のためのタンパク質分解酵素認識部位を有するリンカーペプチドを備えても良い。あるいは、リンカーは、限定されないが、パラセタモールを結合可能なシクロキシゲナーゼタンパク質、テトロドキンを結合可能なナトリウムチャネルサブユニット、及びジゴキシンを結合可能な抗ジゴキシン抗体等の小分子を結合可能なタンパク質を備えても良い。
【００８０】
用語「タンパク質分解酵素認識部位」は、限定されないが、プロリンが後続しない限り、アルギニン又はリシンの後のトリプシン切断；プロリンが後続しない限り、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンの後のキモトリプシン切断；プロリンが後続しない限り、アラニン、グリシン、セリン、又はバリンの後のエラスターゼ切断；プロリンが先行しない限り、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンの前のサーモリシン切断；プロリンが先行しない限り、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はチロシンの前のペプシン切断；及びグルタミン酸の後のエンドペプチダーゼV8（グルコースとしても知られている）切断等のエンドペプチダーゼにより認識されるアミノ酸配列を指す。
【００８１】
ある実施形態において、ペイロードは、各々独立してインスリン、抗体又はその断片、細胞表面受容体リガンド又はその生物学的に活性な断片、小分子、オリゴヌクレオチド等の核酸、核酸分解酵素、アプタマー、脂質、多糖、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ナノ粒子、フルオロフォア、放射性化合物、ナノアンテナ、又はリポソーム等の薬剤である。オリゴヌクレオチドであるペイロードは、他の核酸折り紙デバイスに対して「外部オリゴヌクレオチド」として機能する。
【００８２】
用語「ペイロード」及び用語「ペイロード部分」は、本明細書中で交換可能に用いられ、その生物学的活性を維持しつつ、ハンドル領域又はリンカーに直接共有結合されたとき、遊離ペイロードと前記ペイロード双方を指す。
【００８３】
ある実施形態において、上記で定義したように、核酸折り紙デバイスナノアンテナは、例えば、構造Aを有する場合、又は任意にリンカーを介して、ハンドル領域に結合されたときペイロードとして用いられ、各々独立して、金属量子ドット、金属ナノ粒子、又は金属ナノ結晶を備え、この金属が好適には金である。
【００８４】
他の実施形態において、複数の短鎖は、核酸折り紙デバイスが閉構成にあるとき、少なくとも１つのペイロードが、核酸折り紙デバイスの内面上に位置するように短鎖が選択され、開構成に遷移すると核酸折り紙デバイスの外面にペイロードを位置させる。
【００８５】
本明細書中で定義される構成のいずれか１つにおける本発明の核酸折り紙デバイスに対する用語「内面」は、細胞表面等の核酸折り紙デバイスを取り囲む近接した環境の構成要素と立体的に相互作用できない核酸折り紙デバイスの任意の表面領域を指し、一方、「外面」は、細胞表面の核酸折り紙デバイスを取り囲む近接した環境の要素と立体的に相互作用できない核酸折り紙デバイスの任意の表面領域を指す。
【００８６】
さらに他の実施形態において、短鎖は、核酸折り紙デバイスが閉構成にあるとき、核酸折り紙デバイスの外面上に位置するハンドル領域を備え、この場合、ハンドル領域は、オリゴヌクレオチド又はリポソームから好適に選択されたペイロードに結合されている。
【００８７】
ある実施形態において、デバイスが閉構成にあるとき、デバイスの外面上に位置するハンドル領域は、デバイスが開構成にあるとき、デバイスの内面に位置するようになる。
【００８８】
デバイスの形状は、デバイスの目的に応じて選択し得、http//wwwcadnano.orgから入手可能なCADnanoソフトウェア等のDNA折り紙の従来技術で周知の特殊なコンピュータプログラムで形状を定義して容易に得られる。
【００８９】
ある実施形態において、複数の短鎖は、折り紙デバイスがほぼ樽形であるように選択され、他の実施形態では、複数の短鎖は、核酸折り紙デバイスがほぼ六角チューブ形状を持つように選択される。複数の短鎖は、核酸折り紙デバイスが開放端を有するように選択して良いし、複数の短鎖は、核酸折り紙デバイスが２つの開放端を有するように選択しても良い。
【００９０】
ある実施形態における(i) 構造A又はBを有する核酸折り紙デバイスにおいて、複数の短鎖は、核酸折り紙デバイスが第１の領域と第２の領域を含むように選択され、第１の領域が、各々結合相手に結合可能な(a)のアプタマー領域、各々DNA結合タンパク質に結合可能な(b)のオリゴヌクレオチド、又は各々ナノアンテナに付着された(c)のオリゴヌクレオチドを含み、第２の領域が、ラッチ領域を含み、
第１の領域の第１の端部が、少なくとも１つの一本鎖核酸ヒンジにより第２の領域の第１の端部に付着され、第１の領域の第２の端部が、ハイブリダイゼーション、又はラッチ領域へのアプタマー領域又はオリゴヌクレオチドの各々１つの結合により第２の領域の第２の端部に付着され、又は
(ii) 構造C又はDを有する核酸折り紙デバイスにおいて、複数の短鎖は、核酸折り紙デバイスが第１の領域と第２の領域を含むように選択され、
第１の領域と第２の領域の各々１つが、互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチド又は外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域の１つを含み、第１の領域の第１の端部が、少なくとも１つの一本鎖核酸ヒンジにより第２の領域の第１の端部に付着され、第１の領域の第２の端部が第２の領域の第２の端部に付着されていない。
【００９１】
ある実施形態において、(i) 構造A又は構造Bを有する核酸折り紙デバイスの複数の短鎖は、アプタマー領域の各々１つが、その各々結合相手により結合及びその各々の結合相手に結合された場合、及び/又はナノアンテナの各々１つが、電磁場を受け、誘導結合され、その後加熱される場合、第１の領域の第２の端部が、第２の領域の第２の端部へ付着しないように選択され、(ii) 構造Cを有する核酸折り紙デバイスの複数の短鎖は、ラッチ領域の各々１つが、外部オリゴヌクオチドの他の１つにハイブリダイズされた場合、第１の領域の第２の端部が、第２の領域の第２の端部へ付着するように選択され、又は(iii) 構造Dを有する核酸折り紙デバイスの複数の短鎖は、ラッチ領域が互いにハイブリダイズされた場合、第１の領域の第２の端部が第２の領域の第２の端部へ結合されるように選択される。
【００９２】
ある実施形態において、上記で定義したように、結合相手は、腫瘍関連抗原、細胞膜受容体、分泌された又は膜結合成長因子、ホルモン、サイトカイン、リガンド、ケモカイン、細菌、ウィルス又は寄生虫抗原、脂質、オリゴヌクレオチド、糖、酵素、DNA結合タンパク質、又は損傷刺激から選択される抗原である。
【００９３】
ナノデバイスは、高いグルコース濃度で、その表面上にインスリンを放出するグルコース検出デバイスであっても良い。この目的のために、上述したように、ナノデバイスは、第１の条件で第１の構成を有し、別の第２の条件で異なる第２の構成を有するように選択された結合相手を備え、アプタマー(a)又はオリゴヌクレオチド(b)は、第１の構成を有する結合相手に結合可能であるが、結合相手が第１の構成から第２の構成に遷移したとき、ラッチ領域がアプタマー(a)又はオリゴヌクレオチド(b)から置換されるように、第２の構成を有する結合相手に結合不可能であり、これによりデバイスを開き、インスリンを放出することできる。特に、この結合相手は、酵素、例えば、グルコキナーゼであっても良い（実施例６参照）。
【００９４】
従って、ある実施形態において、酵素はグルコキナーゼであり、アプタマー領域(a)は、第１の構成を有するグルコキナーゼに結合可能であるが、第２の構成を有するグルコキナーゼに結合不可能であるか、又はDNA結合タンパク質は、グルコース反応因子であり、オリゴヌクレオチド(b)は、第１の構成を有するグルコース反応因子に結合可能であるが、第２の構成を有するグルコース反応因子に結合不可能であるグルコース応答調節配列である。グルコキナーゼは、ヒト、マウス、又はラットベータ細胞グルコキナーゼ等であるがこれらに限定されない哺乳類のグルコキナーゼであっても良い。
【００９５】
ある実施形態において、第１の条件は、0〜4.5mMの範囲のグルコース濃度であり、第２の条件は、4.5mM以上、例えば、5〜10mMの範囲のグルコース濃度である。
【００９６】
ある実施形態において、核酸折り紙デバイスは、構造A を有する長鎖と複数の短鎖とから成り、(i) 複数の短鎖の１つが、第１の構成を有するグルコキナーゼに結合可能であるが、第２の構成を有するグルコキナーゼに結合不可能な(a)アプタマー領域、又は第１の構成を有するグルコース反応因子に結合可能であるが、第２の構成を有するグルコース反応因子に結合不可能であるグルコース応答調節配列のヌクレオチド配列を含む(b)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、(ii) 他の短鎖が、グルコキナーゼに結合したラッチ領域を含み、(a)のアプタマーが、第１の構成を有するグルコキナーゼに結合可能であるが、結合相手が、第１の構成から第２の構成に遷移するとき、ラッチ領域が、(a)のアプタマーから置換されるように第２の構成を有するグルコキナーゼへ結合不可能であり、又は他の短鎖が、グルコース反応因子に結合されたラッチ領域を含み、(b)のオリゴヌクレオチドが、第１の構成を有するグルコース反応因子に結合可能であるが、グルコース反応因子が、第１の構成から第２の構成に遷移するとき、ラッチ領域が(b)のオリゴヌクレオチドから解離されるように、第２の構成を有するグルコース反応因子に結合不可能であり、(iii) 互いに結合したとき、(a)のアプタマー領域又は(b)のオリゴヌクレオチド、及びラッチ領域が、デバイスを閉構成に保持し、(a)のアプタマー領域、又は(b)のオリゴヌクレオチド及びラッチ領域が、ハイブリダイズされていないか、又は互いに結合されたとき、デバイスが開構成に遷移し、(iv) さらなる短鎖が、任意にリンカーを介して、インスリンに結合されたハンドル領域を備え、デバイスが閉構成にあるとき、インスリンはデバイスの内面に位置しており、開構成に遷移すると、インスリンを核酸折り紙デバイスの外面に位置させ、核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化のいずれかであり、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列が欠如又は核酸折り紙デバイスのTLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、核酸折り紙デバイスが非免疫原性である。
【００９７】
一態様において、本発明は、上述したような、グルコキナーゼ又はグルコース反応因子を有する、核酸折り紙デバイスの薬剤的有効量を必要とする個体に投与することを含むI型糖尿病、II型糖尿病、又は高血糖の治療方法に関する。
【００９８】
他の実施態様において、本発明は、I型糖尿病、II型糖尿病、又は高血糖の治療に用いられる本明細書中で記載されるグルコキナーゼ又はグルコース反応因子を含む核酸折り紙デバイスを提供する。
【００９９】
ある実施形態において、I型糖尿病、II型糖尿病、又は高血糖の治療は、グルコース耐性試験結果を向上させることを含む。
【０１００】
ナノデバイスは、非標的細胞、例えば、正常な健康な細胞を維持しつつ、特に標的細胞を殺すのに用いられる。このことは、ナノデバイスを用いて、標的細胞を優先的に殺す毒素を投与して、及び苦痛又はこのプロセス中に損傷を受けた正常な健康な細胞から放出された損傷刺激を検出したとき、ナノデバイスの動作を停止することで達成される。この目的のために、核酸折り紙デバイスのある構造は、構造Dを有する長鎖と複数の短鎖とを含み、(i) 複数の短鎖の１つが外部可溶性オリゴヌクレオチドとラッチ領域に結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、(ii) 短鎖の２つが各々互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合したラッチ領域を含み、(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、外部可溶性オリゴヌクレオチドが内在性オリゴヌクレオチド及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドを置換するように、内在性オリゴヌクレオチドが外部可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、(iv)互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたとき、核酸折り紙デバイスが開構成になっており、互いにハイブリダイジング可能及び内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされず、その代わりに互いにハイブリダイズされているとき、核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、(v) さらなる短鎖が、任意にリンカーを介して、薬剤に結合したハンドル領域を備え、核酸折り紙デバイスがアルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は核酸折り紙デバイスがTLR9認識配列の欠如又は核酸折り紙デバイスのTLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、核酸折り紙デバイスが非免疫原性である。
【０１０１】
さらなる態様において、本発明は、非標的細胞に隣接した標的細胞を殺す方法を提供し、標的細胞を殺すことは、非標的細胞が損傷を受けた場合中止されるが、当該方法は、構造Dを有する核酸折り紙デバイスの薬剤的有効量を必要とする個体へ投与することも含む。標的細胞を殺すことは、非標的細胞から漏れた外部可溶性オリゴヌクレオチドが内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、核酸折り紙デバイスを閉じさせるとき、中止される。
【０１０２】
他の態様において、本発明は、各々個別に上述した実施形態のいずれか１つによる少なくとも２つの相互接続した核酸折り紙デバイスを含む多様式核酸折り紙デバイスを提供する。
【０１０３】
ある実施形態の多様式核酸折り紙デバイスにおいて、結合相手に結合可能なアプタマー領域の各々１つは、少なくとも１つの他のアプタマー領域と同じ又は異なる。
【０１０４】
ある実施形態において、少なくとも２つの相互接続した核酸折り紙デバイスの少なくとも１つの１つ以上のさらなる複数の短鎖は、各々任意にリンカーを介して、ペイロードに結合されたハンドル領域を備えている。ペイロードが各々独立して、インスリン、抗体又はその断片、細胞表面受容体リガンド又はその細胞学的に活性な断片、小分子、オリゴヌクレオチド等の核酸、核酸分解酵素、アプタマー、脂質、多糖、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ナノ粒子、フルオロフォア、放射性化合物、ナノアンテナ、又はリポソーム等の薬物である。
【０１０５】
ある実施形態において、少なくとも２つの相互接続した核酸折り紙デバイスの１つ以上のさらなる複数の短鎖は、各々ペイロードに結合され、ペイロードが同じ又は異なるハンドル領域を備えている。
【０１０６】
さらに他の態様において、本発明は、上述した実施形態のいずれか１つによる核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス、及び薬学的に許容可能な担体に関する。
【０１０７】
本発明に係わる医薬化合物は、生理学的に許容可能な担体又は賦形剤を用いて、従来と同じ方法で処方される。担体は、組成物の他の成分と親和性がある意味で「許容可能」で、その受容者に対し有毒であってはならない。
【０１０８】
担体、投与方式、剤形等の以下の例証を周知の可能性として掲載した。この表から、担体、投与方式、剤形等が、本発明と一緒に用いるために選択し得る。しかし、当業者であれば、選択した任意の所定の剤形と投与方式を最初に試験して、所望の結果が得られるか否か判断すべきことを理解する。
【０１０９】
投与方法は、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻腔内、舌下、膣、直腸、眼球内）、髄腔内、局所的、及び皮内経路を含むがこれらに限定されない。投与は全身的又は局所的の場合がある。ある実施形態において、医薬組成物は、間脳投与のために適合されている。
【０１１０】
用語「担体」は、希釈剤、免疫賦活剤、賦形剤、又は生理活性物質と一緒に投与される媒体を指す。医薬組成物中の担体は、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドン又はポビドン）、ゴム、トラガカント、ゼラチン、澱粉、乳糖、又はラクトース水和物等の結合剤；アルギン酸、トウモロコシ澱粉等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、又はドデシル硫酸ナトリウム等の潤滑剤又は表面活性剤、及びコロイド状二酸化ケイ素等の滑剤を含み得る。
【０１１１】
医薬組成物は、注射による非経口投与、例えば、ボーラス注射又は連続注入により処方し得る。注射のための剤形は、単位剤形、例えば、防腐剤を添加したアンプル又は反復投与容器で提供し得る。医薬組成物は、懸濁液、溶液、又は油性又は水性媒体中で乳剤の形状を取り得、懸濁剤、安定剤及び/又は分散剤等の調合剤を含み得る。あるいは、有効成分は、例えば、使用前の発熱性物質除去蒸留水等の適切な媒体を用いた構成のために粉末状であっても良い。
【０１１２】
例えば、鼻噴投与用の吸入投与の場合は、本発明に係わる医薬組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切なガスを用いた、与圧パック又は噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で従来法で送達される。与圧エアロゾルの場合は、単位剤形は、計量した量を送達する弁を設けることで測定し得る。吸入器又は注入器で用いる、例えば、ゼラチンのカプセル又はカートリッジは、化合物の混合粉体及び乳糖又は澱粉等の適切な粉末系を含むように処方し得る。
【０１１３】
ある実施形態において、医薬組成物は、上述した任意の周知の方法により投与のために処方し得る。
【０１１４】
本発明により分かるように、細胞表面で受容体に結合したとき、核酸折り紙デバイスは、細胞内への受容体の細胞内移行を減弱し得る。
【０１１５】
さらに別の態様において、本発明は、長鎖と複数の短鎖とを含み、複数の短鎖の１つが、細胞膜受容体を結合可能なアプタマー又はアプタマーに結合可能なリガンドのいずれかを含む核酸折り紙デバイスであって、(i) 核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は (ii) 核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列を欠如又は核酸折り紙デバイスのTLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、核酸折り紙デバイスが非免疫原性であり、細胞表面で受容体に結合されたとき、核酸折り紙デバイスが、細胞への受容体の細胞内移行を減弱又は防止する核酸折り紙デバイスに関する。
【０１１６】
本明細書中で用いる用語「細胞内移行」は、細胞内取り込みとも呼ばれるプロセス、すなわち、それらを飲み込むことで細胞が分子（タンパク質等）を吸収するプロセスを指す。細胞内取り込み経路は、４つのカテゴリ、すなわち、クラスリン媒介細胞内取り込み、半小胞、マクロ飲作用、及び食作用に細分できる。細胞内移行を防止するのに用いる核酸折り紙デバイスの大きさは、抑制する特定の経路に応じて調整できる。
【０１１７】
ある実施形態において、細胞内への受容体の細胞内移行を減弱又は防止する核酸折り紙デバイスは、たった１つの構成を有している。
【０１１８】
追加態様において、本発明は、細胞内への受容体の細胞内移行を減弱又は防止できる核酸折り紙デバイス、薬学的に許容可能な担体、及び核酸折り紙デバイスの使用法、又は細胞内への細胞膜受容体の細胞内移行を減弱又は防止する医薬組成物を提供する。
【０１１９】
DNA折り紙は、ナノスケールで複雑な形状を有する３次元形状を製造する強力な方法である。この方法は、サブナノメーターの解像度で、物質をパターン形成する空間テンプレートとして用いる多様な物体を構成するのに用いられている。しかし、基本的に１次元分子である、大量のDNAを103〜104倍小さい空間に詰めることで、折り畳まれた形状の内部又は近傍の化学的ナノ環境に重大な変化を引き起こす可能性があり、これは自然には絶対に起こり得ず、進化の過程で決して遭遇し得ない。本発明の発明者等は、水溶液中で自然に起こる化学反応は、デバイスの内部では起こり得ず、これは十中八九デバイスの内部空間の負電荷の高い密度によるものであり、加水分解又は酸化等の化学反応を減弱させる。従って、本発明のデバイスは、様々な化学反応により非活性化し易い活性剤の安定性を向上させるのに用い、これによりこれらの活性剤の貯蔵寿命を延長できる。
【０１２０】
上記に鑑み、さらになお他の態様において、本発明は、２つの開放端を有する中空核酸折り紙デバイスであって、中空核酸折り紙デバイスが、長鎖と複数の短鎖とを含み、中空核酸折り紙デバイスが、たった１つの構成を有し、短鎖は、中空核酸折り紙デバイスが、中空核酸折り紙デバイスの内部交差部よりも小さな最大交差部を有する生理活性物質を中空核酸折り紙デバイスの内部空間への出入りを可能にするように選択され、短鎖は、生理活性物質が中空核酸折り紙デバイスの内部空間に存在する期間と、生理活性物質が中空核酸折り紙デバイスの内部空間の外部に存在する期間との間で所定の平衡状態が成立するようにさらに選択される中空核酸折り紙デバイスを提供する。
【０１２１】
ある実施形態において、所定の平衡状態は、生理活性物質が中空核酸折り紙デバイスの内部空間に存在する期間が、生理活性物質が中空核酸折り紙デバイスの内部空間の外部に存在する期間よりも長くなるように設定される。
【０１２２】
ある実施形態において、中空核酸折り紙デバイスは、樽形状又は六角形状を有する。
【０１２３】
さらなる態様において、本出願は、生理活性物質と上記実施形態のいずれか１つの中空核酸折り紙デバイスとを含む貯蔵寿命延長剤形に関し、中空核酸折り紙デバイスの内部空間が、生理活性物質の非活性化を減弱する高密度の負電荷を含み、これは、例えば、生理活性物質の加水分解又は酸化によるものかもしれない。高密度の負電荷は、約10,100,1000,104,105,106の範囲、又は展開したDNAより高いかも知れない。
【０１２４】
またさらなる態様において、本発明は、上述した構造A，B又はCを有する基本核酸折り紙デバイス、多様式核酸折り紙デバイス、及び非免疫原性、細胞内への細胞膜受容体の細胞内移行を減弱又は防止可能な核酸折り紙デバイスを含み、非免疫原性、核酸分解酵素耐性、又は両方である核酸折り紙デバイスの製造方法を提供する。
【０１２５】
これらの態様の１つにおいて、本発明は、非免疫原性である核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、(i)核酸折り紙デバイス又は多様式中空核酸折り紙デバイス上に(a)CpGアイランドを形成せずに、非免疫原性になるように、又は核酸折り紙デバイス又は多様式中空核酸折り紙デバイス上に(b)CpGアイランドを形成するように、核酸折り紙デバイス又は多様式中空核酸折り紙デバイスの長鎖と複数の短鎖とを構成する核酸配列を設計し、(ii) 長鎖と複数の短鎖を合成又は取得し、(iii) 長鎖と複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、(iv) 存在すれば、メチル化によりCpGアイランドをマスクし、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを非免疫原性にする方法を提供する。
【０１２６】
これらの態様の１つにおいて、本発明は、核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、(i) 核酸配列が、核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上にCpGアイランドを任意に形成しないように、核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスの長鎖と複数の短鎖とから成る核酸配列を設計し、(ii) 長鎖と複数の短鎖を合成又は取得し、(iii) 長鎖と複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、(iv) 存在するならば、核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意ではアデニン残基をメチル化によりマスクし、(v)核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを、二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と任意に相互作用させ、これにより、核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを取得する方法を提供する。
【０１２７】
これらのさらなる態様において、本発明は、非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、(i) 核酸配列が、核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上にCpGアイランドを(a)形成しないように、又は核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上にCpGアイランドを(b)形成するように、核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスの長鎖と複数の短鎖とから成る核酸配列を設計し、(ii)長鎖と複数の短鎖を合成又は取得し、(iii) 長鎖と複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、(iv) 存在するならば、核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意にアデニン残基をメチル化によりマスクし、(v) 核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と任意に相互作用させ、これにより非免疫原性でかつ核酸分解酵素に耐性がある核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを製造する方法を提供する。
【０１２８】
ある実施形態において、メチル化は、核酸折り紙デバイスをS-アデノシルメチオニン等のメチルトランスフェラーゼ及びメチル供与体と接触させて行われる。メチルトランスフェラーゼの非限定実施例として、Simon D,Grunert F.von Acken U, Doering HP, Kroeger H., 1978 DNA-methylase from regenerating rat liver; purification and characterization, Nucleic Acids Res. 1978 Jun; 5(6) 2153-67に開示されているように、damメチルトランスフェラーゼ、Taqlメチルトランスフェラーゼ、Alulメチルトランスフェラーゼ、BamHIメチルトランスフェラーゼ、CpGメチルトランスフェラーゼ(M.Sssl)、EcoRIメチルトランスフェラーゼ、G9aメチルトランスフェラーゼ、CpGメチルトランスフェラーゼ（M.CviPI）、HaeIIIメチルトランスフェラーゼ、Hhalメチルトランスフェラーゼ、HpaIIメチルトランスフェラーゼ、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ（Dnmtl）アミノ末端Ab、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ（Dnmtl）、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ、（Dnmt3A）アミノ末端Ab、ヒトDNA(シトシン-5) メチルトランスフェラーゼ（Dnmt3B）カルボキシ末端Ab、ヒトPRMT1メチルトランスフェラーゼ、MspIメチルトランスフェラーゼ、SET7メチルトランスフェラーゼ、又はラットの肝臓メチラーゼが挙げられる。
【０１２９】
本発明を以下の非限定実施例により説明する。
【実施例】
【０１３０】
材料及び方法
長鎖
7249bp環状単一鎖DNA分子を以下の実施例において用いた（M13mp18DNA;New
England Biolabs; NEB #N4040; SEQ ID NO:1）。
【０１３１】
短鎖
Integrated DNA
Technologiesから購入した(SEQ ID
NOs:2-279)。全ての配列は5’〜3’の方向である。オリゴヌクレオチドは、超高純度のDNase/RNaseを含まない水中で100μM濃度まで元に戻し、-20℃で貯蔵した。
方法：
【０１３２】
ロボット作成
長鎖（20nMの最終濃度）と短鎖（各鎖が200nMの最終濃度）として、MI13mp18ssDNAを混合してロボットを最初に製造した。緩衝液と塩溶液は、5mM Tris, 1mM EDTA
(20℃でpH 8.0)と10mM MgCL2を含む。折り畳むために、混合物の熱アニーリングを行った。最初に、以下のプログラムを用いた。2分/℃で80℃〜60℃、150分/℃で60℃〜20℃。
【０１３３】
折り畳まれたロボットの精製
折り畳んだ後、Amicon Ultra-0.5 mL, 100K centrifugal filters(Millipore)を用いて、遠心濾過により余分な短鎖を除去した。折り畳み緩衝液を、総量が500μLに達するまで付加した。その後、10分間12,000gで試料を遠心分離した。これを３回繰り返した。分光光度計(Thermo Sci. NanoDrop 2000c) によりDNA濃度を測定した。
【０１３４】
折り畳まれた試料のゲル精製
主要な単量体バンドが紫外線テーブル上で可視化され、1.5%〜2%アガロースゲルから切除し（ランニングバッファは、10mM MgCl2が追加された0.5X TBEである）、-20℃で５分間凍結し、小さな断片に切って、Quantum Prep Freeze N’Squeeze DNA Gel Extraction spin column (Bio-Rad)内部で3分間13,000gで遠心分離した。回収した溶液のDNA濃度を分光光度計(Thermo Sci. NanoDrop 2000c)により測定し、透過型電子顕微鏡（TEM）によりイメージングするために作製した（図１A及び図１B）。 
【０１３５】
TEM陰性染色法
手短に言えば、5μLの0.5M NaOHを、100μL 2%ウラニル蟻酸溶液（Polysciences,
24762）の作り置凍結一定分量に付加し、続いて、３分間厳密にボルテックスし、その後、溶液を18,000gで5分間遠心分離し、沈殿物を除去した。グロー放電処置（Emitech K100X）の直後に、1〜5nMの濃度でロボット試料をTEMグリッド（Science Services,
EFCF400-Cu-50）上に注入し、続いて、0.1%ウラニル蟻酸溶液で２回連続して洗浄した。３回目の洗浄中、ウラニル蟻酸溶液で30秒間グリッドを培養した。試料は、陰性染色法後、TEM顕微鏡（JEM-1400,JEOL）を用いて、1時間から１週間可視化した。図１Ａは、2分/℃で80〜60℃及び150分/℃で60〜10℃の間折り畳んだロボットを示す。図1Ｂは、5分/℃で80〜60℃及び75分/℃で60〜10℃の間折り畳んだロボットを示す。実施例で用いたナノロボットの図式表現を図２に示す。
【０１３６】
ペイロード作成
４時間、37℃の水槽を振り動かして、25mMシステインを含むマウスのIgG分解緩衝液中で固定したフィシンによる市販のキット（Thermo）を用いて抗体を分解した。抗体Fab’断片を遠心濾過（Amicon, 10K MWCO Millipore）により精製し、分光光度計（Thermo Sci, NanoDrop 2000c）により評価した。抗体Fab’断片をpH8.5の0.05Mホウ酸ナトリウム緩衝液で緩衝液交換し、回転式振蕩機上にて室温で１時間DyLight
Amino-Reactive Dye (Thermo)を用いて培養した。余分な染料は、Amicon 10K MWCO (Millipone)を用いて完全に除去した。抗体Fab’断片をpH4.7(Pierce #28390)の0.1M MES緩衝食塩水中で、1〜10のモル比で抗体5’-アミン修飾リンカーオリゴヌクレオチド（5AmMC6/GAACTGGAGTAGCAC(SEQ ID NO;280),Integrated DNA Technologies）を用いて１分間培養した。EDC(Thermo, #22980)を5000〜1のモル比で抗体Fab’断片に付加し、回転振蕩機上において、室温で１時間培養した。その後、Trisを10mMの最終濃度に付加し、Amicon column 30K MWCO (Millipore)を用いて溶液を濾過した。
ロボットの装填
オリゴヌクレオチドFab’濃度を、260,280nmでの吸収により評価した。折り畳み緩衝液(10mM MgCl2 in 1X TAE)中において、ペイロードの２倍のモル過剰で、回転振蕩機上において、室温で２時間装填部位への装填を行った。最後に、上述したように、装填したロボットを100K MWCO Amicon column (Millipore)を用いて洗浄した。
【０１３７】
グルコース濃度感応性ロボットの製造
ベータ細胞Glckを商業供給源から購入した。ロボットゲートにタンパク質を付着させるために、3’アミン修飾したゲート相補的短鎖（アプタマーDNA鎖に対向）をIntegrated DNA Technologiesから取り寄せた。そして、EDC/Sulfo-NHS接合（Pierce-Thermo Scientificから購入した試薬）を用いてGlcKをこのオリゴヌクレオチドに接合し、遠心分離ゲル濾過を用いてDNAタンパク質雑種を洗浄した。4mMグルコースの存在下で、異性体選択的アプタマーをDNA配列（1015）の開始ランダムライブリから選択し、適切な配座異性体のみがプロセス中に存在可能なようにした。
実施例1:DNA折り紙デバイスを非免疫原性及びDNase I耐性にできた。
【０１３８】
DNA折り紙デバイスを以下のように組み立てた。つまり、New England Biolabs (NEB #N4040)から購入した、7249bp 環状１本鎖DNA分子（SEQ ID NO:1; M13mp 18 DNA）である長鎖と、その数例がSEQ ID NOs:2-279として開示された複数の短鎖を1:4〜1:100の範囲の比で、0.5〜20mMの間のマグネシウムで補足したTris-Acetate-EDTA緩衝液中で混合した。混合物を以下の順序で温度アニーリングを行った。1) 30分/℃で85℃〜61℃、2) 150分/℃で60℃〜25℃。その他の焼還灯も用いることができる。アガロースゲル抽出又は遠心カラム濾過のいずれかより、折り畳んだナノロボットを最終的に洗浄した。ゲル電気泳動及び原子間力顕微鏡（AFM）により解析を行った。
【０１３９】
この研究において、治療装置の妥当なプロトタイプとして、他の場所で実演された（Douglas et al., 20012）DNA折り紙ナノロボットに多少変更を加えたバージョンを用いた。ナノロボットの胴体(chassis)は、324 CpG モチーフを含む（図３Ａ）。図３Ｃに示すように、８つの領域が>100bpCpGアイランドとして特定された。
【０１４０】
(i)
核酸分解酵素に対する耐性
ナノロボットを構成しているDNAは、小分子、ペプチド、核酸、タンパク質、脂質、多糖、又は大きな溝又は小さな溝を介してDNAを結合する任意の分子に結合することで修飾又はマスクしても良い。そのような分子を付着させることで、核酸折り紙デバイスへの核酸分解酵素の進入を阻止する。
【０１４１】
75%までメチル化された（Jabbari, K., Bernardi, 2004）、哺乳類ゲノムと対照的に、長鎖として用いられる単一鎖M13mp18ゲノムも、合成された短鎖も、折り畳まれる前にメチル化される。そのため、折り畳まれたナノロボットを、試験管内で細菌CpGをメチルトランスフェラーゼでメチル化した（Cherepanova et al., 2011）。一方、予想通り、非メチル化ナノロボットは、細菌制限エンドヌクレアーゼにより切断され、メチル化したロボットはこの処理に対して耐性があった（図４）。 
【０１４２】
図５は、ロボットのメチル化が、刺激に対する応答機能に影響を与えないことを示す。この実験において、非メチル及びメチル化したロボットは、ビオチンを装填され、蛍光標識され、ストレプトアビジン被覆ミクロ粒子存在下で、刺激（ヒトPDGF）が増大する濃度で培養した。２時間後、フローサイトメトリーでミクロ粒子を解析した。蛍光強度は、定常(at plateau)で85%までの個体数に等しい最大信号で、全個体数のうちの開くロボットの%を示す。
【０１４３】
他の実施例において、DNA折り紙デバイスにネトロプシンを付加し、デバイスのDNase I分解が抑制されることを示した(図６及び図７)。
【０１４４】
ネトルプシンがDNAの小さな溝から離れるのを防ぐために、ネトロプシンペプチド上のアミノ基及びDNAのヌクレオシド塩基双方と反応可能な試薬をその末端に付加して修飾した。この特殊な場合において、図８及び図９に示すように、ソラレンを用いた。
【０１４５】
(ii) ナノロボットの免疫原性
非メチル化CpG DNAに対する動物の免疫応答システムは、多様な脊椎動物及び無脊椎動物で観察されている（Hemmi et al., 2000; Sung et al., 2009; Sun et al., 2012; Kim et al., 2004; Silveira et al., 2012; krieg et al., 1995）。DNA折り紙に対する免疫システム細胞の応答を検査するために、ヒトマクロファージ、マウスマクロファージ、及び一次性昆虫（Blaberus discoidalis）血球の3つの異なる由来からの細胞を折り畳まれたナノロボットに触れさせた。非メチル化ナノロボットに触れさせることで、p42/44 ERK, IKK-α/β/ε,SARK/JNKがリン酸化反応することになり、全てTLR9依存活性化を示す（Lee et al., 2008; Lee et al;2004）(図１０)。これに対して、メチル化ナノロボットへ触れさせた後、活性化は観察されなかった。
【０１４６】
非メチル化ナノロボットに触れさせた細胞は、炎症性サイトカインIL-6、ケモカインCXCL-1(KC)及びCCL-2を分泌した、一方、メチル化ナノロボットは、これらの媒介物を誘導しなかった（図１１）。
【０１４７】
生体内でナノロボットにより引き起こされた免疫反応を評価するため、100μｇのナノロボットを生後6〜8週目のC57/BL6マウスの腹腔に局所的に注射し、注射後24時間応答を追跡した。メチル化ナノロボットを注射したマウスは、単球（図１３A）又はマクロファージ（図１３B）の何の漸増もサイトカイン放出も示さなかった。
【０１４８】
例えば、多量体、ペプチド、脂質、又は多糖等の高分子を付着させるDNAの修飾により、ナノロボットも非免疫原性にし得る。この目的のために用いた化学反応は、当該技術分野において周知であり、図９に例示した。
実施例２：遠隔操作DNA折り紙デバイス
【０１４９】
本発明のナノロボットは、電子遠隔制御によりNA折り紙デバイスを制御する方法で用い得る。ナノロボットは、金属量子ドット、ナノ粒子、又はナノ結晶アンテナに接合されている（Hamad-Schifferli et al., 2002）(図１４)。アンテナ標識されたナノロボットは、デバイスゲートとして役割を果たすアミノ修飾オリゴへの金ナノ結晶反応により、N-ヒドロキシスクシンイミジル基で官能化された1.4nmの大きさの金ナノ結晶とナノロボットを結合して製造された。反応自身は、室温で１時間PBS中で行われた。
【０１５０】
より具体的には、開く代わりに、ある分子を検知しているとき、アンテナの誘導結合と、溶けるまで行われるその後のゲートの加熱により、電磁場(EMF)が印加されたとき、デバイスが開くように、デバイスの状態を制御するゲートDNA鎖に接合される（すなわち、互いに解離するロボットを開状態に保持する２つのハイブリダイズされたDNA鎖）。ゲートの溶解は、EMFがオフになったとき、デバイスがオフ状態に戻るように可逆的である（すなわち、２つのDNA鎖が再ハイブリダイズする）。
【０１５１】
上述のように構成されたDNA折り紙デバイスで培養された細胞のリアルタイムフローサイトメトリー解析により、EMFがオンになったとき、DNA折り紙デバイスがオン状態になり、細胞を蛍光抗体と結合することが分かった（図１５）。この細胞はごく最近分離された昆虫細胞である。ロボット（0.1 pmol）は0.5ml量の細胞と混合され、活性化セルソーター(FACS)マシーンでリアルタイムでデータが取得された。指定した時点において、EMFが活性化され、これにより、ナノロボットを開かせ、注入された抗体を細胞に付着させる。その結果、FACSで測定した蛍光が増加した。
実施例３：細胞表面結合分子の細胞内移行のプログラム可能な防止方法
【０１５２】
細胞表面受容体に結合する分子の細胞内移行を防止又は阻害するシステムを提示する。これは、大きな2次元シート、2次元バンド又はDNA折り紙デバイスの3次元形状（１方向に１ミクロンまで）を細胞表面受容体に結合する分子に付着させることで影響を受ける。DNA構造の大きさは、細胞内取込み（25〜180nmの範囲)のクラスリン被覆窪みの大きさに関する周知のデータに基づき、細胞型に応じて変化する可能性がある。細胞表面受容体は、通常、細胞内取込みによる細胞内移行を受けるが、このプロセスは起こることはないか、又はDNA分子を付加することで劇的に阻止される。
【０１５３】
DNA折り紙付着物体の大きさは、付着される分子の細胞内移行の比速度を生成するようプログラム可能である。DNA折り紙付着物体は、細胞内移行を防止/阻害する機能をさらに修飾する分子で装飾することができる（例えば、負帯電した多糖、負帯電タンパク質、高分子、ナノ粒子等）。
【０１５４】
この実験において、抗体がどの折り紙構造にも結合されていないか、又は50nm又は100nm幅構造に結合されたとき、標的細胞による蛍光抗体の細胞内移行を実証した（図１５）。蛍光標識された抗体は、アミン修飾ステイプルオリゴヌクレオチドを介してDNA折り紙構造に連結された。この構造は、閉ロボット（50nm）又は開ロボット（100nm）のいずれかである。この実験のために、ロボット状態を予め決定したが、ロボット状態（つまり、その細胞内移行修飾作用）は、環境刺激により決定できると理解されている。細胞を洗浄後、抗体の食作用を表す細胞内移行した分子のみ残して表面結合分子から細胞蛍光を取得した。細胞はU937マクロファージ細胞株であった。未修飾抗体は、U937細胞により非常に効率的に細胞内移行されたが、この細胞内移行が抑制されたDNA折り紙構造に付着した（閉状態で88%まで、開状態で96%まであり、状態駆動作用の間に著しい差は見られなかった）。このことから、DNA折り紙デバイスを、細胞に結合して（化学的、生物学的、及び無機成分）、どのように生きた細胞により取り込まれるのか調節する修飾として用いることができることが分かった。
実施例４：ワクチン貯蔵期間の延長方法
【０１５５】
我々の研究所で行った予備実験により、カルボキシルアミン凝縮等のある種の化学反応は、通常外部で反応が進行している間に、この反応が中空DNA折り紙構造内部で調節されたとき起こらないことが分かった（図１６Ａ及び１６Ｂ）。これにより、大量のDNAが、約103〜104倍小さい非常に限られた３次元空間へ折り畳むことで、その空間内に極めて異常な化学ナノ環境を生成するという仮説に至った。
【０１５６】
この異常な化学ナノ環境の結果が、脱水（例えば、カルボジイミドによる）、酸化、加水分解等の化学反応による分解から高分子を保護することである。
【０１５７】
周囲条件における溶液中での自発的又は触媒化学分解に対するその耐性を向上させることで活性剤の貯蔵期間を延長する方法を提示する。これらの活性剤は、薬剤、小分子化学薬品、ワクチン、タンパク質、抗体、RNA、又はその他の核酸治療薬でありうる。貯蔵期間が極端に短いワクチンの例を表１に掲載する。
【０１５８】
この方法は、中空DNA折り紙チューブ状構造をワクチンへ付加することに基づく。ワクチン分子はこの構造に付着又は付着できない。
【０１５９】
この構造へのワクチンの付着は、構造の中間部、構造の縁部、又はその間のどこでも起こり得る。
【０１６０】
この構造は、500nmまでの任意の長さと、2〜100nmの間の内部直径を有することができる。
表１．安定性が限られたワクチン
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【０１６１】
この構造は、内部的又は外部的に追加分子又は粒子（タンパク質、ナノ粒子、脂質等）により装飾され、これにより、DNA折り紙構造の自然電荷密度を変化させるかも知れない。
【０１６２】
折り畳み及び非常に小さな空間への多くの負電荷の詰め込みにより、この構造の内部である化学反応が起こらないように、DNA折り紙構造が活性剤に付加される。
【０１６３】
DNA折り紙構造は、非対称分岐を最小にする結晶成長アルゴリズムを用いて設計できる。
実施例５：多様式DNA折り紙デバイス
【０１６４】
１分子をオン又はオフにするのでなく、別の出力を生成して異なる刺激に応答できるDNA折り紙デバイスの新しい設計を提示する。このDNA折り紙デバイスは、各室が分離し、他から独立した多室として設計することで複数のペイロードを別々に制御できる。
【０１６５】
このデバイスは、図１８に示す一般的設計を有している。
【０１６６】
このデバイスは、複数の区画に折り畳まれた２次元シート（青）から構成され、各区画はdsDNAゲートにより別々に制御される。異なるペイロード（薬物、タンパク質、核酸、ナノ粒子等）は、全ての区画の内部に付着される。
【０１６７】
このデバイスの設計は、特定の区画を制御するゲートが開いたときのみ、この区画が展開して、その特定のペイロードを放出するようになっている。またさらに、ゲートは、各ゲートが特定の刺激（分子、化学又は物理的条件、RF信号等）を認識し、可逆的であるようになっている。それらのゲートを開く刺激が、同時に存在するとき、２つ以上の区画を同時に開くことができる。
実施例６：グルコース感受性DNA折り紙デバイス
【０１６８】
上述したように、生理的に関連するグルコース濃度で開く又は閉じるナノロボット、すなわち、１つ以上の短鎖が、第１の構成、つまり0〜4.5mMの間の範囲のグルコース濃度でグルコキナーゼを結合可能であるが、第２の構成、つまり5〜10mMの間の範囲のグルコース濃度を有するグルコキナーゼに結合不可能であるアプタマー領域を含むナノロボットを作製した。他の短鎖は、グルコキナーゼに連結したラッチ領域を含む。
【０１６９】
ナノロボットが異なるグルコース濃度にどのように反応するかの概念を図１９Ａに示す。本発明のナノロボットは、フルオロフォア-クエンチャ対が、ロボットの状態を報告、つまりナノロボットが閉じたとき、信号を消し、蛍光を放出しないが、ロボットが開いたとき、蛍光を放出するように位置するフルオロフォア-クエンチャ対（鮮やかなtCyt5又はCy5.5染料、及びこれらの波長と一致する暗いクエンチャを用いて）も送達する。
【０１７０】
生体内試験により、DNAロボットに結合したインスリンが肝細胞上のインスリン受容体を連続的に活性化することが分かった（図１９B）。インスリン（第２の末端リシン残基を介する注入配列と相補的なDNAに結合したインスリン）を装填されたロボットは、常時開く又は閉じるが、それらのゲートを開く外部DNAキーで活性化される。両方のロボット型で活性化された肝細胞中で測定されたAktリン酸化反応は、インスリン依存活性化を示した。この実験の目的は、DNA折り紙の胴体に結合したインスリンが、なおインスリン受容体を活性化し、標的細胞において適切な信号になることを立証するためであった。
実施例７：糖尿病の治療
【０１７１】
受け付けられたＩ型糖尿病動物を、例えば、Buschard (1996) Acta Pathologia, Mcicrobiologica Et Immunologica Scandinavia 104; 609-604に記載されたように用いた。例えば、自然発症糖尿病BBラット、NODマウス、又はウィルス誘導糖尿病マウスを用いても良い。
【０１７２】
グルコース濃度に感受性がある、実施例６に記載した本発明のナノロボットは、疾患の様々な段階で及び様々なレジメンで実験動物に投与された。
【０１７３】
グルコースを動物に投与し、後で血液サンプルを採取して、本発明のグルコース感受性ナノロボットの存在下又は非存在下で、グルコースがどれくらい早く血液から除去されたか判定するグルコース耐性試験を実施した。
【０１７４】
上述したように、本発明のナノロボットは、フルオロフォア-クエンチャ対が、ロボットの状態を報告、つまりロボットが閉じたとき、信号を消し、蛍光を放出しないが、ロボットが開いたとき、蛍光を放出するように位置するフルオロフォア-クエンチャ対を送達する。従って、グルコース測定に付加して、血液内のロボット生成蛍光を測定し、グルコースレベルの変化をロボットの応答に相関付けた。
【０１７５】
インスリンを装填されたロボットがＩ型糖尿病の齧歯動物モデルにおいて生体内で細胞を活性化させることが予想される。インスリンを投与しないレジメンと比べ、インスリンを装填されたロボットの投与の頻度は低くてよいこと、及びロボットは適切なグルコースレベルで細胞にインスリンを内在的に供給するため、投与レジメンは動物の給餌スケジュールに依存しないことが予想される。
実施例８：アシモフ単型ナノロボット‐外部刺激に応答しての活性ナノロボットの閉止
【０１７６】
図２０Ａ及び図２０Ｂに示すスキームを用いてロボットを折り畳んだ。ゲート鎖（破線；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２８１  ａｎｄ  ２８２）をＣｙ５蛍光染料でタグ付けした。相補鎖（一点鎖線；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３）を、損傷指標分子（点線）とハイブリダイズする８−ｎｔ又は１１−ｎｔのいずれかのトーホールドレジメンを含むように設計した。本実験において、マイクロＲＮＡ−１６（miR-16；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４）を選択した。miR-16は損傷細胞から漏出し、それにより損傷した細胞のタイプの特定が可能になる（miR-16濃度は細胞のタイプに依るので）。
【０１７７】
開いたロボットがストレプトアビジンでコーティングしたマイクロビーズを係合し、染色するように、ビオチンを装填した。高ビード蛍光は開いたロボットを示す。低蛍光は閉じたロボットを示す。したがって、蛍光の減少はロボットの閉止過程を表す。
【０１７８】
濃度を変化させることにおけるmiR-16の存在は、（上に示すように）オレンジの鎖から黒い鎖をうまく変位させ、マイクロビーズ蛍光の減少を誘発した。このロボットの閉止は破線及び一点鎖線のハイブリダイゼーションから生じた（一点鎖線はここでは示されていないがその過程はロボットの下側（一点鎖線鎖はちょうど上側）で対称的に起こる）。
【０１７９】
図２０Ｃに、濃度を変化させる際のmiR-16に応じて閉止するロボットを示す。開いたロボットはビオチンを放出し、よってストレプトアビジンでコーティングされたマイクロビーズを付着しタグ付けする。閉じたロボットはビーズに付着できない。miR-16に応答して、蛍光の減少が見られる。このことは、完全に開いているロボットよりもむしろ閉じられているロボットとうまく競合する溶液中の遊離ビオチンから生じる。８ｎｔ又は１１ｎｔのトーホールドを有するロボットの動態を比較することにより、反応速度を調整することが可能であり、それは、ある用途ではより許容的であってほしいと思われ、他の用途ではより制限的であってほしいと思われるので、重要であることが示される。
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2016524462.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ】
2016524462.tif 000009
【図３Ｂ】
2016524462.tif 000010
【図３Ｃ】
2016524462.tif 000011
【図４】
2016524462.tif 000012
【図５】
2016524462.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
2016524462.tif 000016
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年1月20日(2016.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造A,B,C又はDを有する長鎖と複数の短鎖とを含む核酸折り紙デバイスであって、
前記構造Aにおいて、
（i）前記短鎖の１つが、結合相手に結合可能な(a)アプタマー領域、DNA結合タンパク質を結合可能な(b)オリゴヌクレオチド、又は電磁場を受けることが可能なナノアンテナに付着された(c)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、又は前記短鎖の１つが、アプタマー領域(a)を含み、他の前記短鎖が、(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドを含み、
(ii) 前記他の短鎖が、ハイブリダイズ又は前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)又は(c)のオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、前記ラッチ領域配列は、前記結合領域が前記ラッチ領域を置換するように、前記(a)のアプタマー領域が、前記結合相手に結合可能なように選択されるか、又は前記ラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能で、前記ラッチ領域が、第１の条件下で第１の構成を有し、別の第２の条件下で別の第２の構成を有するように選択された結合相手に結合され、前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)オリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記結合相手に結合可能であるが、前記結合相手が、前記第１の構成から前記第２の構成に遷移したとき、前記ラッチ領域が、前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)のオリゴヌクレオチドから解離されるように、前記第２の構成を有する前記結合相手に結合不可能であり、又は前記(c)のオリゴヌクレオチドに付着した前記ナノアンテナが、前記電磁場を受けると、誘導結合され、その後加熱され、これにより前記(c)のオリゴヌクレオチドから前記ラッチ領域を解離し、
(iii) 前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)又は(c)のオリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスを閉構成に保持し、前記アプタマー領域又は前記オリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズ又は互いに結合されていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
前記構造Bにおいて、
（i）前記短鎖の１つが、第１の結合相手に結合可能な第１のアプタマー領域を含み、
(ii) 他の前記短鎖が、第２の結合相手に結合可能な第２のアプタマー領域を含み、
(iii) さらに他の前記短鎖が、前記第１のアプタマー領域にハイブリダイズされた第１のラッチ領域を含み、前記第１のラッチ領域配列が、前記第１の結合相手が前記第１のラッチ領域を置換するように、前記第１のアプタマー領域が前記第１の結合相手に結合可能なように選択され、又は前記第１のラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、
(iv) さらに他の前記短鎖が、前記第２のアプタマー領域にハイブリダイズされた第２のラッチ領域を含み、前記第２のラッチ領域配列が、前記第２の結合相手が前記第２のラッチ領域を置換するように、前記第２のアプタマー領域が、前記第２の結合相手に結合可能なように選択され、又は前記第２のラッチ領域が、前記アプタマー領域を置換するように選択された外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能であり、
(v) 前記第１のアプタマー領域が、前記第１のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、及び/又は前記第２のアプタマー領域が、前記第２のラッチ領域にハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成になっており、及び前記第１のアプタマー領域が、前記第１のラッチ領域にハイブリダイズされておらず、前記第２のアプタマー領域が、前記第２のラッチ領域にハイブリダイズされていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
前記構造Cにおいて、
(i) 前記短鎖の２つが、各々外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、
外部オリゴヌクレオチドにハイブリタイジング可能なオリゴヌクレオチドの各々１つが、前記外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていないとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成になっており、外部オリゴヌクレオチドとハイブリタイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの両方が、前記外部オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
前記構造Dにおいて、
(i) 他の前記短鎖が、外部可溶性オリゴヌクレオチド及びラッチ領域と結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、
(ii)２つの前記短鎖が、各々互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合されたラッチ領域を含み、
(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドが前記内在性オリゴヌクレオチド、及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドを置換するように、前記外部内在性オリゴヌクレオチドが、前記可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、
(iv) 互いに及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成になっており、互いに及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされておらず、代わりに互いにハイブリダイズされるとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列を欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性である核酸折り紙デバイス。
【請求項２】
前記核酸折り紙デバイスが、非免疫原性及び/又は核酸分解酵素に耐性があることを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項３】
前記核酸折り紙デバイスが、メチル化ＤＮＡ、好適にはCpGジヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項４】
二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な前記化合物が、ネトロプシン、ジスタマイシン、オリゴアミド、砂糖オリゴアミド接合体、又はビスアミジンから選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項５】
１つ以上のさらなる短鎖が、任意に各々リンカーを介して、ペイロードに結合されたハンドル領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項６】
前記リンカーが、前記ハンドル領域の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、任意に酵素切断の認識部位を含むさらなる領域を含み、前記ペイロードが、前記ハンドル領域への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより結合され、又は前記リンカーが、パラセタモールを結合可能なシクロオキシゲナーゼタンパク質、テトロドトキシンを結合可能なナトリウムチャンネルサブユニット、及びジゴキシンを結合可能な抗ジゴキシン抗体等の小分子を結合可能なタンパク質を含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項７】
前記さらなる領域が、マトリックスメタロプロテアーゼ等のプロテアーゼによる切断のためのプロテアーゼ認識部位を含むリンカーペプチドを含むことを特徴とする請求項５又は６に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項８】
前記ペイロードが各々独立して、インスリン、抗体又はその断片、細胞表面受容体リガンド又はその細胞学的に活性な断片、小分子、オリゴヌクレオチド等の核酸、核酸分解酵素、アプタマー、脂質、多糖、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、ナノ粒子、フルオロフォア、放射性化合物、ナノアンテナ、又はリポソーム等の薬物であることを特徴とする請求項５に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項９】
前記核酸折り紙デバイスが閉構成にあるとき、前記複数の短鎖が、少なくとも１つの前記ペイロードが前記核酸折り紙デバイスの内面に位置するように選択され、前記開構成への遷移により、前記ペイロードを前記核酸折り紙デバイスの外面に位置させ、又は前記複数の短鎖の１つが、前記核酸折り紙デバイスが閉構成にあるとき、前記核酸折り紙デバイスの外面に位置するハンドル領域を含み、前記開構造への遷移により、前記ペイロードを前記核酸折り紙デバイスの内面に位置させ、好ましくは前記ハンドル領域が、オリゴヌクレオチド又はリポソームから選択されたペイロードに結合されていることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１０】
(i) 構造Ａ又はＢを有する前記核酸折り紙デバイスにおいて、前記複数の短鎖は、前記核酸折り紙デバイスが第１の領域と第２の領域を含むように選択され、前記第１の領域が、各々結合相手に結合可能な前記(a)のアプタマー領域、各々DNA結合タンパク質に結合可能な前記(b)のオリゴヌクレオチド、又は各々ナノアンテナに付着された前記(c)のオリゴヌクレオチドを含み、前記第２の領域が、前記ラッチ領域を含み、
前記第１の領域の第１の端部が、少なくとも１つの一本鎖核酸ヒンジにより前記第２の領域の第１の端部に付着され、前記第１の領域の前記第２の端部が、ハイブリダイゼーション、又は前記ラッチ領域への前記アプタマー領域又はオリゴヌクレオチドの各々１つの結合により前記第２の領域の前記第２の端部に付着され、又は
(ii) 構造C又はDを有する前記核酸折り紙デバイスにおいて、前記複数の短鎖は、前記核酸折り紙デバイスが第１の領域と第２の領域を含むように選択され、前記第１の領域と前記第２の領域の各々１つが、互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチド又は外部オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合された前記ラッチ領域の１つを含み、
前記第１の領域の第１の端部が、少なくとも１つの一本鎖核酸ヒンジにより前記第２の領域の第１の端部に付着され、前記第１の領域の前記第２の端部が前記第２の領域の前記第２の端部に付着されていないことを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１１】
(i) 前記構造A又は構造Bを有する前記核酸折り紙デバイスの前記複数の短鎖は、前記アプタマー領域の各々１つが、その各々結合相手により結合及びその各々の結合相手に結合された場合、及び/又は前記ナノアンテナの各々１つが、電磁場を受け、誘導結合され、その後加熱される場合、前記第１の領域の前記第２の端部が、前記第２の領域の前記第２の端部へ付着しないように選択され、
(ii) 前記構造Cを有する前記核酸折り紙デバイスの前記複数の短鎖は、前記ラッチ領域の各々１つが、前記外部オリゴヌクオチドの他の１つにハイブリダイズされた場合、前記第１の領域の前記第２の端部が、前記第２の領域の前記第２の端部へ付着するように選択され、又は
(iii) 前記構造Dを有する前記核酸折り紙デバイスの前記複数の短鎖は、前記ラッチ領域が互いにハイブリダイズされた場合、前記第１の領域の前記第２の端部が前記第２の領域の前記第２の端部へ結合されるように選択されることを特徴とする請求項１０に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１２】
前記結合相手が、腫瘍関連抗原、細胞膜受容体、分泌又は膜結合成長因子、ホルモン、サイトカイン、リガンド、ケモカイン、細菌、ウィルス又は寄生虫抗原、脂質、オリゴヌクレオチド、糖、酵素、又はDNA結合タンパク質から選択される抗原であり、好ましくは前記酵素が、グルコキナーゼであり、前記(a)のアプタマー領域が、前記第１の構成を有する前記グルコキナーゼに結合可能であるが、前記第２の構成を有する前記グルコキナーゼに結合不可能であり、又は前記DNA結合タンパク質が、グルコース反応因子であり、前記(b)のオリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記グルコース反応因子に結合可能であるが、前記第２構造を有する前記グルコース反応因子に結合不可能なグルコース応答調節配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１３】
前記構造A又はDを有する長鎖と複数の短鎖とを含み、構造Aにおいて、
(i) 前記複数の短鎖の１つが、第１の構成を有するグルコキナーゼに結合可能であるが、第２の構成を有する前記グルコキナーゼに結合不可能な(a)アプタマー領域、又は第１の構成を有するグルコース反応因子に結合可能であるが、第２の構成を有する前記グルコース反応因子に結合不可能であるグルコース応答調節配列のヌクレオチド配列を含む(b)オリゴヌクレオチドのいずれかを含み、
(ii) 他の前記短鎖が、前記グルコキナーゼに結合したラッチ領域を含み、前記(a)のアプタマーが、前記第１の構成を有する前記グルコキナーゼに結合可能であるが、前記結合相手が、前記第１の構成から前記第２の構成に遷移するとき、前記ラッチ領域が、前記(a)のアプタマーから置換されるように前記第２の構成を有する前記グルコキナーゼへ結合不可能であり、又は他の前記短鎖が、前記グルコース反応因子に結合されたラッチ領域を含み、前記(b)のオリゴヌクレオチドが、前記第１の構成を有する前記グルコース反応因子に結合可能であるが、前記グルコース反応因子が、前記第１の構成から前記第２の構成に遷移するとき、前記ラッチ領域が前記(b)のオリゴヌクレオチドから解離されるように、前記第２の構成を有する前記グルコース反応因子に結合不可能であり、
(iii) 互いに結合したとき、前記(a)のアプタマー領域又は前記(b)のオリゴヌクレオチド、及び前記ラッチ領域が、前記核酸折り紙デバイスを閉構成に保持し、前記(a)のアプタマー領域、又は前記(b)のオリゴヌクレオチド及び前記ラッチ領域が、ハイブリダイズされていないか、又は互いに結合されたとき、前記核酸折り紙デバイスが開構成に遷移し、
(iv) さらなる短鎖が、任意にリンカーを介して、インスリンに結合されたハンドル領域を備え、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化のいずれかであり、又は二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列が欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性であり、
構造Dにおいて、
(i) 前記複数の短鎖の１つが、外部可溶性オリゴヌクレオチド及びラッチ領域に結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイジング可能な内在性オリゴヌクレオチドを含み、
(ii) 前記短鎖の２つが、各々互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なオリゴヌクレオチドに結合したラッチ領域を含み、
(iii) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、１つの内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドが、前記内在性オリゴヌクレオチド及び互いにハイブリダイジング可能及び互いにハイブリダイズされた前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドを置換するように、前記内在性オリゴヌクレオチドが、前記外部可溶性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能なように選択され、
(iv) 互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたとき、前記核酸折り紙デバイスが、開構成になっており、互いにハイブリダイジング可能及び前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイジング可能な前記オリゴヌクレオチドの各々１つが、前記内在性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされず、その代わりに互いにハイブリダイズされているとき、前記核酸折り紙デバイスが閉構成に遷移し、
(v) さらなる短鎖が、任意にリンカーを介して、薬剤に結合したハンドル領域を含み、
前記核酸折り紙デバイスが、アルキル化、アシル化、又はヒドロキシル化され、二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と相互作用するため、核酸分解酵素に耐性があり、及び/又は
前記核酸折り紙デバイスが、TLR9認識配列の欠如又は前記核酸折り紙デバイスの前記TLR9認識配列がマスク又は修飾されるため、前記核酸折り紙デバイスが非免疫原性である請求項１に記載の核酸折り紙デバイス。
【請求項１４】
各々独立して請求項１〜１３のいずれか１項に記載された少なくとも２つの相互接続された核酸折り紙デバイスを含む多様式核酸折り紙デバイス。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれ１項に記載の核酸折り紙デバイス及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
非免疫原性及び/又は核酸分解酵素に耐性がある請求項１、１３又は１４に記載の核酸折り紙デバイスを作成する方法であって、
(i) 前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式中空核酸折り紙デバイス上に(a)CpGアイランドを形成せずに、非免疫原性になるように、又は前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式中空核酸折り紙デバイス上に(b)CpGアイランドを形成するように、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式中空核酸折り紙デバイスの長鎖と複数の短鎖とを構成する核酸配列を設計し、
(ii) 前記長鎖と複数の短鎖を取得し、
(iii) 前記長鎖と複数の短鎖を接触させ、これにより核酸折り紙デバイス又は多様式核酸折り紙デバイスを形成し、
(iv)存在するならば、前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイス上のCpGアイランド及び任意ではアデニン残基をメチル化によりマスクし、
(v)前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを、二本鎖核酸の大きな溝又は小さな溝に非共有結合可能な化合物と任意に相互作用させ、
これにより非免疫原性及び/又は核酸分解酵素に耐性がある前記核酸折り紙デバイス又は前記多様式核酸折り紙デバイスを取得すること、
を特徴とする核酸折り紙デバイスを作成する方法。
【国際調査報告】
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