(57)【要約】本発明は、植物供給源由来のベータ-クリプトキサンチン結晶およびその調製方法を提供する。本発明は特に、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンであり、残りはベータ-カロテンならびに微量のtrans-カプサンチンおよびトウガラシ果実などといった植物供給源に由来する他のカロテノイドを含む、高純度ベータ-クリプトキサンチン結晶を調製するための方法に関する。trans-ベータ-クリプトキサンチンの含量が高いベータ-クリプトキサンチン結晶を生産することにより、このベータ-クリプトキサンチン結晶は、プロビタミンA源としての使用に理想的で好適なものとなり、骨の健康を改善し骨吸収を阻害することにも潜在的効果を有する。2016505066.tif 000008
2016505066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）キサントフィルエステルを含む植物材料のオレオレジンを鹸化し、酸性化水で洗浄し、乾燥することで、カロテノイド集塊を得る工程;
（b）前記カロテノイド集塊を非極性溶媒と共に撹拌し、濾過し、濃縮することで、集塊を得る工程;
（c）前記集塊をシリカゲルクロマトグラフィーに供し、非極性溶媒で溶出させることで、ベータ-カロテンを除去する工程;
（d）約2％極性溶媒を含む非極性溶媒で前記カラムを溶出させ、溶出液を濃縮することで、約10重量％の総カロテノイドを含み、そのうちの約75重量％をtrans-ベータ-クリプトキサンチンが構成する濃縮物を得る工程;
（e）前記濃縮物をエタノールと共に撹拌し、冷却し、濾過することで、約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの約98重量％をtrans-ベータ-クリプトキサンチンが構成する半精製結晶性集塊を得る工程;および
（f）前記結晶性集塊を、約20％酢酸エチルを含むヘキサンで洗浄し、冷却し、濾過することで、約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの約98.5重量％をtrans-ベータ-クリプトキサンチンが構成する高純度結晶性物質を得る工程
を含む、植物材料から高純度trans-ベータ-クリプトキサンチンを得るための方法。
【請求項２】
（a）キサントフィルエステルを含む植物材料のオレオレジンを脂肪族アルコール系溶媒と混合する工程;
（b）前記オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルをアルカリにより高温で鹸化する工程;
（c）前記脂肪族アルコール系溶媒を除去し、その後、水を添加することで、希釈された結果混合物を得る工程;
（d）希釈された有機酸を、前記希釈された結果混合物に加えることで、水層と沈殿したキサントフィル集塊とを形成させる工程;
（e）水層を除去し、沈殿したキサントフィル集塊を極性溶媒で洗浄する工程;
（f）沈殿したキサントフィル集塊を乾燥することで、粗キサントフィル集塊を得る工程;
（g）前記粗キサントフィル集塊を非極性溶媒で洗浄し、非極性溶媒洗浄液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得る工程;
（h）前記濃縮粗キサントフィル集塊をシリカゲルカラムに移し、非極性溶媒で洗浄する工程;
（i）前記カラムを非極性溶媒と極性溶媒との混合物で溶出させ、溶出物を濃縮することで、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を得る工程;
（j）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を脂肪族アルコールと混合し、その後、冷却する工程;および
（k）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を濾過し、乾燥することで、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程
を含む、約10〜80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの約75〜98重量％がtrans-ベータ-クリプトキサンチンであるベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を植物材料から調製するための方法。
【請求項３】
工程（a）における植物材料のオレオレジン中のキサントフィルエステルが約6〜8重量％存在する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
工程（a）または（j）の脂肪族アルコールが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項2または3記載の方法。
【請求項５】
工程（a）におけるオレオレジン対アルコールの比が、重量/体積で約1:0.25から約1:1までの範囲にある、請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程（b）のアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
工程（b）におけるオレオレジン対アルカリの比が、重量/重量で約1:0.25から1:0.5までの範囲にある、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
工程（b）の高温が、約75℃から約85℃までの範囲にある、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程（c）における水の添加が、オレオレジンの約5倍（重量/重量）である、請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程（d）の希釈された有機酸が酢酸またはリン酸である、請求項2〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
工程（d）の希釈された有機酸が、約20％〜約50％有機酸の溶液である、請求項2〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
工程（e）の極性溶媒が水である、請求項2〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
工程（g）、（h）、および（i）の非極性溶媒が、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項2〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
工程（g）の粗キサントフィル集塊と非極性溶媒とが、重量/体積で約1:10〜1:15の比である、請求項2〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
工程（g）の濃縮粗キサントフィル集塊が、ベータ-カロテン、trans-ベータ-クリプトキサンチン、trans-カプサンチン、ゼアキサンチン、および微量の他のカロテノイドを含む、請求項2〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
工程（h）の濃縮粗キサントフィル集塊と非極性溶媒とが、重量/体積で約1:5〜1:8の比である、請求項2〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
工程（h）の非極性溶媒洗浄液を蒸留することによって、カロテン濃縮物が得られる、請求項2〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
カロテン濃縮物がベータ-カロテンである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
工程（i）の極性溶媒が、プロパノン、ペンタノン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項2〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
工程（i）の非極性溶媒と極性溶媒とが、約95:5〜約98:2の比である、請求項2〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
工程（i）のtrans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約75重量％である、請求項2〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
工程（j）における冷却が約10℃の温度で実施される、請求項2〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
工程（k）の精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が、少なくとも約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約90重量％である、請求項2〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
非極性溶媒とエステル溶媒との混合物で精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を洗浄し、沈殿させるために冷却することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶を得る工程（l）をさらに含む、請求項2〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
工程（l）の高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶が、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約98重量％である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
工程（l）のエステル溶媒が酢酸エチルであり、かつ工程（l）の非極性溶媒がヘキサンである、請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
工程（l）の非極性溶媒とエステル溶媒とが、約80:20〜約90:10の比である、請求項24〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
工程（l）における冷却が約-10℃の温度で実施される、請求項24〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
総キサントフィルが、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される副産物を含む、請求項2〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
植物材料が、果実、野菜、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
植物材料がトウガラシ（capsicum）由来である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
請求項2〜31のいずれか一項記載の方法によって得られるベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項３３】
（a）キサントフィルエステルを含む植物材料のオレオレジンをエタノールと混合する工程であって、オレオレジン対エタノールの比が、重量/体積で約1:1である、工程;
（b）前記オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルを水を添加せずに水酸化カリウムで鹸化する工程であって、オレオレジン対水酸化カリウムの比が、重量/重量で約1:0.25である、工程;
（c）前記オレオレジンに熱を加えることで、約80〜85℃で還流するまで温度を上昇させる工程;
（d）前記オレオレジンを約80〜85℃で約3〜5時間撹拌する工程;
（e）前記エタノールを減圧下で留去し、その後、水をオレオレジンの約5倍（重量/重量）添加することで、希釈された結果混合物を得、そして約1時間撹拌する工程;
（f）前記希釈された結果混合物を約25％酢酸で中和することで、水層と沈殿したキサントフィル集塊とを形成させる工程;
（g）前記沈殿したキサントフィル集塊から水層を分離し、前記集塊を水で洗浄することで、石鹸および他の極性可溶性物質を除去する工程;
（h）前記沈殿したキサントフィル集塊を減圧下で乾燥することで、粗キサントフィル集塊を得る工程;
（i）前記粗キサントフィル集塊を約1:10のヘキサン（重量/体積）で洗浄し、ヘキサン洗浄液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得る工程;
（j）前記濃縮粗キサントフィル集塊をシリカゲルカラムに約1:5（重量/重量）の比で移し、ヘキサンで溶出させることで、カロテン画分を得る工程;
（k）前記カラムを約98:2のヘキサン対アセトンで洗浄し、洗浄液を濃縮することで、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を得る工程;
（l）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を約1:2のエタノールと撹拌しながら混合し、続いて、約10℃で約8時間冷却する工程;
（m）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を減圧下で濾過し乾燥することで、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程;および
（n）前記精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を約80:20のヘキサン:酢酸エチルで洗浄し、沈殿させるために約-10℃に約18時間冷却することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶を得る工程
を含む、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約98重量％がtrans-ベータ-クリプトキサンチンであるベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を、植物材料から調製するための方法。
【請求項３４】
少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項３５】
約10〜80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの約75〜98重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、請求項34記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項３６】
少なくとも約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約90重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、請求項34記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項３７】
少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約98重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、請求項34記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項３８】
植物材料が、果実、野菜、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項34〜37のいずれか一項記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項３９】
植物材料がトウガラシ由来である、請求項38記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項４０】
ビードレット（beadlet）、マイクロカプセル化粉末、油懸濁液、分散液、カプセル剤、ペレット、軟膏、ソフトゲルカプセル剤、錠剤、咀嚼錠またはローション/液状調製物から選択される剤形にある、請求項34〜39のいずれか一項記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項４１】
組成物に添加される、請求項34〜40のいずれか一項記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項４２】
総キサントフィルが、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される副産物を含む、請求項34〜41のいずれか一項記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項４３】
リウマチ様炎症性関節炎の発症を防ぐための健康補助食品に使用される、請求項2〜41のいずれか一項記載のベータ-クリプトキサンチン濃縮物。
【請求項４４】
植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を含む組成物であって、該濃縮物が少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、組成物。
【請求項４５】
総キサントフィルが、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、例えばカプソルビンまたはビオラキサンチン、およびそれらの組み合わせから選択される副産物を含む、請求項44記載の組成物。
【請求項４６】
薬学的に許容される成分または食品用成分をさらに含む、請求項44または45記載の組成物。
【請求項４７】
その必要がある患者に治療有効量の植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を投与する工程を含む、リウマチ様炎症性関節炎または骨疾患の発症を予防するための方法であって、該濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、方法。
【請求項４８】
その必要がある患者に治療有効量の植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を投与する工程を含む、骨を強化するための方法であって、該濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、方法。
【請求項４９】
その必要がある患者に治療有効量の植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を投与する工程を含む、骨吸収を阻害するための方法であって、該濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである、方法。
【請求項５０】
ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が約0.0001mg/kg〜約10m/kgの量で投与される、請求項47〜49のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は高純度の天然ベータ-クリプトキサンチン濃縮物およびその調製方法に関する。より具体的には、本発明は、約10〜80重量％の総キサントフィル（総カロテノイド）を含有し、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量が約75〜98重量％であり、残りはゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテンおよび微量の他のカロテノイドを含む、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を提供する。本濃縮物は、栄養摂取および健康増進上の利益のための健康補助食品として、特に有用である。
【０００２】
本発明は、植物オレオレジンから、とりわけトウガラシ（Capsicum）オレオレジンから、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を調製するための方法も提供する。本方法は、オレオレジンをアルコール溶媒と混合する工程、キサントフィルエステルを鹸化する工程、洗浄する工程、粗キサントフィル粘稠濃縮物をシリカゲルカラムで溶出させることによって精製する工程、洗浄によってさらに精製することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物結晶を得る工程を含む。
【背景技術】
【０００３】
背景
カロテノイドは、植物ならびに動物に黄色、赤色および橙色を付与する最も広範に存在する天然型脂溶性色素群の一つである。これらは可視スペクトルの400〜500nm領域の光を吸収し、共通する化学的特徴、ポリ-イソプレノイド構造、分子の中央部分にある二重結合の長い共役鎖、および中央の二重結合を中心とするほぼ対称性の構造を有する。この基本構造は、末端基の環化や酸素官能基（O-H、C=O）の導入などといったいくつかのやり方で修飾を受けて、cis異性体とtrans異性体を別にしても、600種類を超える大きな化合物ファミリーを生じうる。哺乳動物種はカロテノイドを合成しないので、哺乳動物種の場合はカロテノイドを果実、野菜および/または健康補助食品などの食物源から取得する必要がある。
【０００４】
カロテノイドは、リコペンやベータ-カロテンを重要なメンバーとする炭化水素カロテノイドと、オキシカロテノイド（キサントフィル）とに分類され、オキシカロテノイドには、モノヒドロキシル化されたベータ-クリプトキサンチンが属し、また、ルテイン、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンはジヒドロキシル化されている。対称的なベータ-カロテン（ベータ,ベータ-カロテン）の酵素的ヒドロキシル化の生合成経路がベータ-クリプトキサンチン（ベータ,ベータ-カロテン-3-オール）の形成をもたらすのに対し、非対称的なアルファ-カロテン（ベータ,イプシロン-カロテン）から出発すると、同じ反応が2つの反応生成物、すなわちアルファ-クリプトキサンチン（ベータ,イプシロン-カロテン-3'-オール）およびゼイノキサンチン（ベータ,イプシロン-カロテン-3-オール）を生じる。アルファ-クリプトキサンチンとゼイノキサンチンはスペクトル構造が似ているので、メチル化や塩基触媒異性化などの化学反応を行わない限り、それらの同定は困難で紛らわしいことが多い。さらに、これらの化学構造（図1参照）は、多くの刊行物で、間違って記載されている。
【０００５】
哺乳動物の血漿および組織に検出される20種類のカロテノイドのうち、ベータ-クリプトキサンチンは、ルテイン、ゼアキサンチン、ベータカロテンおよびリコペンと共に検出される主要カロテノイドの一つであり、これらを合わせるとカロテノイドの90％近くを占める（J. G. Bieri, E. D. Brown and J. C. Smith「Determination of individual carotenoids in human plasma by HPLC」J. Liq. Chromatogr. 8, 473-484, 1985）。プロビタミンAであるベータ-クリプトキサンチンは食事において重要な役割を果たし、人体では最終的に、視力、免疫機能、ならびに皮膚および骨の健康にとって重要な栄養素である活性型のビタミンA（レチノール）に
変換される。ベータ-クリプトキサンチンのビタミンA活性は、主要ビタミン前駆体であるベータ-カロテンの約半分である。加えて、ベータ-クリプトキサンチンは体内で抗酸化剤としても作用する。Wingerathら（1995）は、ベータ-クリプトキサンチンエステルに富むタンジェリン果汁濃縮物を摂取した後のベータ-クリプトキサンチンの取り込みを研究した。ヒトカイロミクロンにも血清にも、相当量のベータ-クリプトキサンチンが検出された（T. Wingerath, W. Stahl and H. Sies「Beta-cryptoxanthin selectively increases in human chylomicrons upon ingestion of tangerine concentrate rich in beta-cryptoxanthin」Arch. Biochem. and Biophys., 324, 385-390, 1995）。パプリカオレオレジンからのカロテノイドの生物学的利用能は、ボランティアにおいては、カイロミクロンに、ベータ-カロテンおよびベータ-クリプトキサンチンがゼアキサンチンより多量に存在することを示した（A. Perez-Galvez, H. D. Martin, H. Sies and W. Stahl「Incorporation of carotenoids from paprika oleoresin into human chylomicrons」J. Nutrition, 89, 787-793, 2003）。Burriら（2011）は、ベータ-クリプトキサンチンの生物学的利用能が、類似する条件下では、ベータ-カロテンより7倍大きいようであると報告している。したがって、ベータ-クリプトキサンチンは、ビタミンAの有益な潜在的供給源となりうる可能性があるが、それにはさらなる研究と確証が必要である（B. J. Burri, S. Jasmine, T. Chang and T. R. Neidlinger「Beta-cryptoxanthin- and alpha-carotene-rich foods have greater apparent bioavailability than beta-carotene-rich foods in Western diets」Brit. J. Nutrition, 105, 212-219, 2011）。
【０００６】
他のカロテノイドとは異なり、ベータ-クリプトキサンチンは、大半の果実または野菜に見いだされないが、トウガラシ種、柑橘類果実、マンゴ、パパイヤ、およびカボチャなど、一定の特別な食品には、少量（例えばこれらの果実および野菜では約10〜20mg/100gの量で）存在する。パプリカおよびマンダリン果実では、ベータ-クリプトキサンチンは、大部分が、エステル型で存在する。BreithauptおよびBamedi（2001）は、多数の果実および野菜を分析して、ベータ-クリプトキサンチンエステル濃度レベルを報告した。最も高いエステル濃度は、レッドチリ（red chilli）（17.1mg/100g）、タンジェリンおよびオレンジに見いだされた（「Carotenoid esters in vegetables and fruits: A screening with emphasis on beta-cryptoxanthin esters」J. Agric. 49, 2064-2070, 2001）。その後、Breithauptらは、等量のエステル化ベータ-クリプトキサンチンまたは非エステル化ベータ-クリプトキサンチンの単回投与を用いる無作為化単純盲検クロスオーバー研究において、12人のボランティアで、結果として生じる血漿応答に差がないことを見いだしたことから、生物学的利用能は同等であることが示唆される（D. E. Breithaupt, P. Weller, M. Wolters and A. Hahn「Plasma response to a single dose of dietary Beta-cryptoxanthin ester from papaya, Carica papaya, or non-esterified beta-cryptoxanthin in adult human subjects: a comparative study」Brit. J. Nutr. 90, 795-801, 2003）。TakayanagiおよびMukai（2009）は、酵素方法を利用し、食物繊維と組み合わせて、ウンシュウミカン（citrus unshiu Marc）由来のベータ-クリプトキサンチンの生物学的に利用可能な組成物を開発した（米国特許出願公開第2009/0258111号「Highly bioavailable oral administration composition of cryptoxanthin」）。
【０００７】
西洋諸国の大半と日本では、ベータ-クリプトキサンチンの食事供給源は柑橘類果実とそれらの製品に由来し、したがって、血漿中ベータ-クリプトキサンチンレベルは、果実消費量の良い指標と見なすことができる。また、多くの熱帯諸国（例えばラテンアメリカ）で広く消費されているパパイヤなどの果実では、血漿中ベータ-クリプトキサンチンの高い相関関係が報告されている（M. S. Irwig, A. El-Sohemy, A. Baylin, N. Rifai and H. Campos「Frequent intake of tropical fruits that are rich in beta-cryptoxanthin is associated with higher plasma beta-cryptoxanthin concentrations in Costa Rican adolescents」J. Nutr. 132, 3161-3167, 2002）。
【０００８】
海藻抽出物の水溶性エキス、具体的にはアカモク（Sargassum horneri）は、インビボおよびインビトロで、若齢ラットおよび老齢ラットの大腿骨幹端（femoral-metaphysical）組織における骨石灰化に対して同化効果を示したことから、骨粗鬆症の防止におけるその役割が示唆される（Yamaguchi et al「Effect of marine algae extract on bone calcification in the femoral-metaphysical tissues of rats: Anabolic effect of Sargassum horneri」J. Health Sci., 47, 533-538, 2001;Uchiyama and Yamaguchi「Anabolic effect of marine alga Sargassum horneri, Effect on bone components in the femoral-diaphyseal and metaphyseal tissues of young and old rats in vivo」J. Health Sci. 48, 325-330, 2002）。その後、さまざまなカロテノイドの効果の研究において、ベータ-クリプトキサンチンは、大腿骨幹（皮質骨）組織および大腿骨幹端（海綿骨）組織におけるカルシウム含量およびアルカリホスファターゼ活性の有意な増加を示したことから、ベータ-クリプトキサンチンはインビトロで骨石灰化に対してユニークな同化効果を有することが示唆される（Yamaguchi and Uchiyama「Effect of carotenoid on calcium content and alkaline phosphatase activity in rat femoral tissues in vitro: The unique anabolic effect of beta-cryptoxanthin」Biol. Pharma. Bull. 26, 1188-1191, 2003）。もう一つの研究では、インビトロのラット骨組織において、骨組織中のDNA含量が有意に増加することが見いだされ、骨吸収因子が誘発する骨吸収に対して阻害効果を示した（Uchiyama et al.「Anabolic effect of beta-cryptoxanthin on bone components in the femoral tissues of aged rats in vivo and in vitro」J. Health Sci. 50, 491-496, 2004;Yamaguchi and Uchiyama「Beta-cryptoxanthin stimulates bone formation and inhibits bone resorption in tissue culture in vitro」Mol. Cell. Biochem. 258, 137-144, 2004）。
【０００９】
したがって、ベータ-クリプトキサンチンは、骨の健康を維持し骨粗鬆症を防止する上で、潜在的な役割と効果を有する。Yamaguchiら（2004、2005、2006および2008）が行ったさまざまな研究は、サツママンダリン（Satsuma mandarin）果汁（ウンシュウミカン）および/またはベータ-クリプトキサンチンが補充されたものを規則正しく毎日摂取すると（3〜6mg以上/日）、例えば老化に伴う骨量減少に対する防止効果、骨形成に対する刺激効果、ならびに正常健常個体および閉経期女性における骨吸収に対する阻害効果などといった、有益な効果があることを示している（「Prolonged intake of juice, Citrus unshiu, reinforced with beta-cryptoxanthin  has an effect on circulating bone biomarkers in normal individuals」J. Health Sci., 50, 619-624, 2004;「Relationship between serum beta-cryptoxanthin and circulating bone metabolic markers in healthy individuals with the intake of juice (Citrus unshiu) containing beta-cryptoxanthin」J. Health Sci., 51, 738-743, 2005;「Effect of beta-cryptoxanthin on circulating bone biomarkers intake of juice (Citrus unshiu) supplemented with beta-cryptoxanthin has effect in menopausal women」J. Health Sci., 52, 758-768, 2006;「Beta-Cryptoxanthin and bone metabolism: The prevention role in osteoporosis」J. Health Sci., 54, 356-369, 2008）。UchiyamaおよびYamaguchi（2005および2006）は、インビボ研究において、サツママンダリンから単離されたベータ-クリプトキサンチンの経口投与には、ストレプトゾトシン（糖尿病）ラットおよび卵巣切除ラットにおける骨量減少に、予防効果があったことを報告している（「Oral administration of beta-cryptoxanthin prevents bone loss in streptozotocin rats in vivo」Biol. Pharm. Bull. 28, 1766-1769, 2005;「Oral administration of beta-cryptoxanthin prevents bone loss in ovariectomized rats」Int. J. Mol. Med. 17, 15-20, 2006）。欧州特許出願第058060229号、2007/35公開（EP公開番号EP1825858として公開）は、骨形成を促進し、骨塩含量を増加させ、よって変形性関節症などの骨疾患を防止するための、ベータ-クリプトキサンチンと亜鉛とを含む組成物に言及している（M. Yamaguchi「Composition for promoting osteogenesis and increasing bone mineral content」）。米国特許第8,148,431号（B2）（2012年4月3日）では、ベータ-クリプトキサンチンが骨形成促進効果、骨吸収阻害効果および骨疾患に対する治療効果を有することが確認されている（M. Yamaguchi「Osteogenesis promoter containing beta-cryptoxanthin as the active ingredient」）。
【００１０】
一般に、骨粗鬆症、変形性関節症および関節リウマチなどといった、さまざまな骨関節障害が、高齢者にはよく見られ、骨折をもたらす重大な健康問題の原因になる。加齢に伴って、さまざまな食事上の理由から、骨量の減少と骨吸収の増加が起こる。最近の刊行物において、Yamaguchiは、骨ホメオスタシスの調節および骨粗鬆症の防止におけるベータ-クリプトキサンチンの役割に関する最近の進歩、とりわけベータ-クリプトキサンチンが骨芽細胞による骨形成を刺激し、破骨細胞による骨吸収を阻害する細胞機序および分子機序を概説している（「Beta-cryptoxanthin and bone metabolism: The preventive role in osteoporosis」J. Health Sci., 54, 356-369, 2008;「Role of carotenoid beta-cryptoxanthin in bone homeostasis」J. Biomed. Sci., 19, 1-13, 2012）。
【００１１】
高濃度のベータ-クリプトキサンチンの食事による摂取は、喫煙者集団における肺がんリスクの低減と関連することが見いだされたことから、肺がんの化学抗がん剤としてのキサントフィルが示唆される（Yuan et al.「Dietary cryptoxanthin and reduced risk of lung cancer: the Singapore Chinese health study」Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 12, 890-898, 2003）。Craftら（2004）は、脳の前頭皮質にアルツハイマー病と関連すると考えられるベータ-クリプトキサンチンを見いだしたが、ベータ-クリプトキサンチンの正確な役割は説明していない（N. E. Craft, T. B. Haitema, K. M. Garnett, K. A. Fitch and C. K. Dorey「Carotenoids, tocopherol and retinol concentrations in elderly human brain」J. Nutr. Health Ageing, 8, 156-162, 2004）。ベータ-クリプトキサンチンの高い血漿中レベルは、関節リウマチからの保護効果と関連付けられている。Pattisonら（2005）は、88人の被験者における炎症性関節炎の発生を、ベータ-クリプトキサンチンの食事摂取レベルが低いことに原因があるとした（D. J. Pattison, D. P. Symmons, M. Lunt, A. Welch, S. A. Bingham, N. E. Day and A. J. Silman「Dietary beta-cryptoxanthin and inflammatory polyarthritis: results from a population based prospective study」Am. J. Clin. Nutri. 82, 451-455, 2005）。米国特許出願公開第2008/0070980号には、ヒトおよび動物におけるタンパク質形成を増加させかつ/またはタンパク質の喪失を防止し、よってスポーツおよびトレーニング活動における成績を向上させるための組成物の製造に、ベータ-クリプトキサンチンおよびそのエステルを使用する方法が記載されている（E. Anne, G. Resina, W. Karin and W. Adrian「Use of beta-cryptoxanthin」2008年3月20日）。「Method of improving cardiovascular health」と題する最近の米国特許出願には、精製ベータ-クリプトキサンチン（0.1〜20mg/日）を含有する栄養補助食品が、高い血圧を低下させるのにも、健康な血圧および心血管の健康を維持するのにも有効であるという知見が記載されている。ただし、使用されたベータ-クリプトキサンチンは、アルファ-クリプトキサンチン、アンヒドロルテイン、ゼアキサンチン、および他の不純物の混合物から、分析用HPLCによって精製されている（米国特許出願公開第2012/0053247号、2012年3月1日公開、H. Showalter, Z. DefretasおよびL. Mortensen）。
【００１２】
ベータ-クリプトキサンチンのさまざまな健康上の利益に関して研究上の関心が高まっていることから、このカロテノイドを、（1）ベータ-クリプトキサンチンに富む抽出物として天然供給源から、（2）生物工学的経路によって、ならびに（3）全合成および半合成によって、商業的に生産するためのアプローチがいくつか存在する。さまざまな臨床研究では、合成ベータ-クリプトキサンチンか、またはベータ-クリプトキサンチンに富む天然果実抽出物のいずれかが使用されてきた。
【００１３】
天然供給源抽出物
Yamaguchi（2006）は、加水分解とそれに続くシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使って色素を抽出することにより、ベータ-クリプトキサンチンをサツマオレンジ（Satsuma orange）から分離するための方法に言及した。ベータ-クリプトキサンチン画分をオクタデシルシリケートシリカによってさらに精製することで、95％ベータ-クリプトキサンチンが得られた（M. Yamaguchi「Osteogenesis promoter containing beta-cryptoxanthin as an active ingredient」米国特許出願公開第2006/0106115号、2006年5月18日公開）。TakahashiおよびInada（2007）は、柿抽出物を、果肉/果汁および果皮から、溶媒抽出とベータ-クリプトキサンチン（遊離型）を遊離させるための加水分解とによって調製した。果肉および果皮から調製された抽出物は、それぞれ1mg/100gおよび8mg/100gのベータ-クリプトキサンチンを示し、機能性食品への応用に有用であることがわかった（H. TakahashiおよびY. Inada、米国特許出願公開第2007/0116818号（A）、2007年5月24日公開「Extract containing beta-cryptoxanthin from Persimmon fruit」）。Shirakuraら（2008）ならびにTakayanagiおよびMukai（2008）は、それぞれ0.2％および0.05％のベータ-クリプトキサンチンを含有する酵素処理サツママンダリン（EPSM）および乳化マンダリン抽出物（EME）の商業的方法を開発した。彼らは、プラセボ対照二重盲試験としてデザインされたヒト比較試験において、抽出物が内臓脂肪および血漿中グルコースの低減を引き起こすと報告した(Y.S. Hirakura, K. Takayanagi and K. Mukai「Reducing effect of beta-cryptoxanthin extracted from Satsuma mandarin on human body fat」Abstract, page 161; K. Takayanang and K. Mukai, Abstract「Beta-cryptoxanthin and Satsuma mandarin: Industrial production and health promoting benefits」page 73, Carotenoid Science, 12 June 2008、第15回国際カロテノイドシンポジウム（日本国沖縄県、2008年6月22〜27日）で発表された論文の要旨）。
【００１４】
生物工学的生産
Serrato-Joyaら（2006）は、フラボバクテリウム・ルテセンス（Flavobacterium lutescens）ITC B 008を使った実験室規模のバッチ生産で、ベータ-クリプトキサンチンを生成させた（O. Serrato-Joya, H. Jimenez-Islas, E. Botello-Alvarez, R. Nicomartinez, and J.L. Navarrete-Bolans「Process of beta-cryptoxanthin, a provitamin A precursor by Flavobacterium Lutescens」J. Food Sci. 71, E314-E319, 2006）。LouieおよびFuerst（2008）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のベータ-カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子で形質転換された微生物から、その形質転換体を培養し、ベータ-クリプトキサンチンを回収することによって、ベータ-クリプトキサンチンを調製するための方法を開示した（米国特許出願公開第2008/0124755号、2008年5月29日公開「Biosynthesis of beta-cryptoxanthin in microbial hosts using Arabidopsis thaliana beta-carotene hydroxylase gene」）。また、LouieおよびFuerst（2009）は、リコペンベータ-モノシクラーゼを利用してリコペンをガンマ-カロテンおよび3-ヒドロキシ-ガンマ-カロテン経由でベータ-クリプトキサンチンに変換することによる、ベータ-クリプトキサンチン生産方法を開示した（M.Y. Louie and E.J. Fuerst、米国特許出願公開第2009/093015号、2009年4月9日公開「Beta-cryptoxanthin production using a novel lycopene beta-monocyclase gene」）。Hoshinoら（2006）は、ベータ-カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する組換え微生物（ファフィア（Phaffia））を、水性栄養培地中、好気条件下で培養すること、およびその結果生じたカロテノイドを組換え微生物の細胞からまたはブロスから単離することを含む、ゼアキサンチンおよびベータ-クリプトキサンチンを生産するための方法を開示している（T. Hoshino, K. Ojima and Y. Setoguchi、米国特許出願公開第2006/0121557号、2006年6月8日公開「Process for producing zeaxanthin and beta-cryptoxanthin」）。
【００１５】
ベータ-クリプトキサンチンを最終産物として天然に生産することができる微生物はないと思われるので、発酵技術は商業的生産には適さない。さらに発酵方法では、生産されるカロテノイドは濃度が低く、さまざまな成分が加わった生成物の複雑な混合物の形態にある。大規模な精製工程には、大量の溶媒が必要となり、かなりの量の副産物が生成する。
【００１６】
合成による生産
Khachikとその共同研究者らは、ベータ-クリプトキサンチンを調製するための方法を3つ開発した。2つの方法では、ルテインまたはルテインエステルを出発材料として使用し、それが酸の存在下で3つの形態のアンヒドロルテイン、すなわち3-ヒドロキシ-3',4'-ジデヒドロ-ベータ-ガンマ-カロテン（I）、3-ヒドロキシ-2',3'-ジデヒドロ-ベータ-イプシロン-カロテン（II）および3-ヒドロキシ-3',4'-ジデヒドロ-ベータ-ベータ-カロテン（III）に変換される。アルファ-およびベータ-クリプトキサンチンを生産するために、アンヒドロルテイン（III）に富むアンヒドロルテインの混合物が酸および塩素化溶媒の存在下でイオン的水素化に付された。精製された生成物は85％の総カロテノイド量を示し、そのうち、ベータ-クリプトキサンチンは55〜61％、アルファ-クリプトキサンチンは18〜30％、残りの3〜8％はR,R-ゼアキサンチンおよび未反応のアンヒドロルテインであった（F. Khachik、米国特許第7,115,786号（B2）、2006年10月3日「Method for production of beta-cryptoxanthin and alpha-cryptoxanthin from commercially available lutein」;F. Khachik, A.N. Chang, A. Gana and E. Mazzola「Partial synthesis of (3R,6'R)-alpha-cryptoxanthin and (3R)-beta-cryptoxanthin from (3R,3'R,6'R)-lutein」(J. Nat. Products 70, 220-226, 2007））。
【００１７】
第2の方法では、アンヒドロルテインの混合物が、アルミナに担持された白金を用いる接触水素化によって、アルファ-およびベータ-クリプトキサンチンに変換された。最終生成物は総カロテノイド量が60％の帯赤色結晶であり、HPLC組成は、3:1、7:3、または5:1の比のベータ-クリプトキサンチンおよびアルファ-クリプトキサンチンと、未反応のアンヒドロルテインIおよびIIならびにR,R-ゼアキサンチンの存在とを示した。
【００１８】
第3の方法では、方法は、光学活性な3-ヒドロキシ-ベータ-イオノンの合成と、Wittigカップリング反応を用いるベータ-クリプトキサンチンへの転換とのための方法である。この合成アプローチでは、多段階の反応と精製を経て、ベータ-クリプトキサンチンとR,R-ゼアキサンチンの混合物が得られる（F. Khachik and A.N. Chang、米国特許出願公開第2009/0311761号、2009年12月17日公開「Process for synthesis of 3(S)- and (3R)-3-hydroxy-beta-ionone and their transformation to zeaxanthin and beta-cryptoxanthin」;「Synthesis of (3S)- and (3R)-hydroxy-beta-ionone and their transformation into (3S)- and (3R)-beta-cryptoxanthin」Synthesis 3, 509-516, 2011）。
【００１９】
本発明
上記の論述で示されるとおり、ベータ-クリプトキサンチンを生産するための先行方法にはいくつかの制約がある。ベータ-クリプトキサンチンの天然供給源は利用できるものの、抽出物は、今までのところ、タンジェリン、サツマオレンジおよび柿などの果実飲料中に富化された形態でしか生産されていない。ベータ-クリプトキサンチンを生産するための生物工学的経路の使用はまだ予備開発段階にあり、今までのところ、収率の低い実験室規模での生産に限定されてきた。合成アプローチは、ベータ-クリプトキサンチンと、かなりの量の不純物、例えばアルファ-クリプトキサンチンとの混合物をもたらし、これは、未反応のアンヒドロルテインおよびゼアキサンチンと共に、ゼイノキサンチン（非プロビタミンA）がほとんどであるだろう。Khachikとその共同研究者らの方法を応用した場合、ベータ-クリプトキサンチンの分離は複雑であって多段階を必要とし、商業的には実行不可能である。したがって、高純度の天然ベータ-クリプトキサンチン濃縮物と、その生産方法が必要とされている。
【００２０】
アンヒドロルテインII（3-ヒドロキシ-2',3'-ジデヒドロ-ベータ,イプシロン-カロテン）の化学構造によれば、2',3'-二重結合の水素化はゼイノキサンチン（ベータ,イプシロン-カロテン-3-オール）を形成させると予想されるであろう。加えて、アルカリ異性化によるゼイノキサンチンからベータ-クリプトキサンチンへの変換は、アリル位ヒドロキシル基が存在しないので起こらないと予想されるであろう。このことは、10％のゼイノキサンチン（HPLCによる）を含有するベータ-クリプトキサンチンの高温（110℃）でのフェニルカルビノールアルカリ触媒反応によって確認され、この反応では、結果として生じる生成物が対照と比較して、HPLCプロファイルに変化を示さなかった。実際、いわゆるアルファ-クリプトキサンチンの塩基触媒反応は、ベータ-クリプトキサンチンに到達することができなかった（F. Khachik, A.N. Chang, A. Gana and E. Mazzola「Partial synthesis of 3(R,6'R)-alpha-cryptoxanthin and (3R)-beta-cryptoxanthin from (3R,3R',6'R)-lutein」J. Nat. Prod. 70, 220-226, 2007）。
【００２１】
当技術分野を精査すると、栄養成分として使用するために、また健康補助食品に使用するために、天然供給源に由来する主要成分として、十分な量で生産される高純度ベータ-クリプトキサンチンを入手することは、一般に不可能であることがわかる。天然供給源（特に果実および野菜）からのベータ-クリプトキサンチンを利用することができない主な理由は、天然供給源におけるその濃度が低いことにあり、それが伝統的な溶媒ベースの抽出法によるこの分子の商業化を妨げている。商業的に利用できる高純度のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を提供するための供給源および方法を同定すれば、この製品のニーズを満たすのに役立ち、臨床試験において、また健康補助食品として、ベータ-クリプトキサンチンの潜在的な健康上の利益を確立するのに役立つであろう。トウガラシ抽出物はベータ-クリプトキサンチンの含量がかなり高いが、ベータ-クリプトキサンチン含有材料には他にも数多くの有望な選択肢がある。本発明は当技術分野におけるニーズを満たし、植物オレオレジンからの、特にトウガラシオレオレジンからの、高純度な天然ベータ-クリプトキサンチン濃縮物と、その調製方法とを提供する。加えて、これらの天然ベータ-クリプトキサンチン濃縮物は、例えば骨量減少および骨粗鬆症において、いくつかの健康上の利益を得るためにも使用することができる。
【００２２】
骨量は加齢と共に減少する。この減少は、骨吸収の増加と骨形成の低減によるものである。骨量の減少は骨粗鬆症を誘発する（M. Yamaguchi, S. Uchiyama, K. Ishiyama, and K. Hashimoto「Oral Administration in Combination with Zinc Enhances Beta-cryptoxanthin-Induced Anabolic Effects on Bone Components in the Femoral Tissues of Rats In Vivo」Biol. Pharm. Bull. 29(2) 371-374 (2006)）。骨ホメオスタシスは、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とのバランスによって維持されている（M. Yamaguchi「Role of Carotenoid Beta-Cryptoxanthin in Bone Homeostasis」Journal of Biomedical Science 19-36 (2012)）。閉経期にはエストロゲンの生産量が減少して代謝の不均衡を引き起こす（「Citrus unshiu extract. Health Ingredient for prevention of osteoporosis health ingredient for whitening and aesthetic ingredient for cosmetic」Product monograph, Ver.3.0HS、オリザ油化株式会社）。ベータ-クリプトキサンチンは、骨芽細胞による骨形成を刺激し、破骨細胞による骨吸収を阻害することにより、骨に対して潜在的同化効果を有することが見いだされている。ベータ-クリプトキサンチンの経口投与は、加齢に伴う骨量減少および骨粗鬆症に対して、予防効果を有しうる。例えば、骨の強化および骨吸収の阻害におけるトウガラシ供給源から得られるベータ-クリプトキサンチンの役割を、下記実施例4において、卵巣切除雌Wistarラットを使って実証する。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の目的は、ヒトによる消費にとって安全であり、栄養摂取および骨の健康を含む健康管理に有用である、高純度の天然ベータ-クリプトキサンチン濃縮物と、天然供給源材料からそれらを調製するための方法とを提供することである。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも約80重量％の総キサントフィル（総カロテノイド）を遊離型で含有し、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約98.5重量％であり、残りは微量のゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテンならびにトウガラシ供給源などの植物材料のオレオレジンおよび抽出物に由来する他のカロテノイドを含む、ベータ-クリプトキサンチン結晶を単離するための方法を提供する。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも約40重量％の総カロテノイドを含有し、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチンは少なくとも約90重量％であり、残りは微量のゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、ならびにトウガラシ供給源などの植物材料のオレオレジンおよび抽出物に由来する他のカロテノイドを含む、ベータ-クリプトキサンチン結晶を調製するための方法を提供する。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも約10重量％の総カロテノイドを含有し、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチンは少なくとも約75重量％であり、残りはゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、ならびにトウガラシ供給源などの植物材料のオレオレジンおよび抽出物に由来する微量の他のカロテノイドを含む、ベータ-クリプトキサンチン結晶を調製するための方法を提供する。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、約10〜80重量％の総カロテノイドを含有し、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は約75〜98重量％の範囲にあり、残りはゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、および鹸化トウガラシ抽出物のような出発材料に由来する微量の他のカロテノイドを含む、ベータ-クリプトキサンチン結晶を調製するための方法を提供する。
【００２８】
一定の局面において、本発明は、トウガラシオレオレジンまたは鹸化トウガラシ抽出物から高純度ベータ-クリプトキサンチンを調製するための簡単で便利な方法を提供する。いくつかの局面において、本発明は、trans-ベータ-クリプトキサンチンが総カロテノイドの主成分を形成している、残留溶媒を含まないベータ-クリプトキサンチン結晶を提供する。本発明の特徴の一つは、本明細書に記載する方法からの、ベータ-カロテンに富むカロテン炭化水素画分の回収を提供する。別の局面において、本発明は、主として、高い抗酸化性を有するゼアキサンチンおよびtrans-カプサンチンを含む、キサントフィル画分の回収を提供する。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明に記載する高純度trans-ベータ-クリプトキサンチンを得るための方法は、
・トウガラシ抽出物中のエステル化キサントフィルの鹸化、これにより、遊離のキサントフィルがもたらされ、それを、酸性化した水による洗浄とそれに続く乾燥とによって精製することで、カロテノイド集塊を得ること;
・前記カロテノイド集塊を撹拌しながら非極性溶媒で処理し、その後、濾過し、濃縮することで、集塊を得ること;
・前記集塊を、シリカゲルを使ったカラムクロマトグラフィーと、非極性溶媒を使った溶出とに供することで、ベータ-カロテンを除去すること;
・約2％の極性溶媒を含有する非極性溶媒でカラムを溶出させ、濃縮物の濃縮後に、重量で約10％の総カロテノイドを示し、そのうちの約75重量％をtrans-ベータ-クリプトキサンチンが構成する溶出液を得ること;
・上記濃縮物を撹拌しながらエタノールで処理し、その後、約10℃に冷却し、濾過することで、約40重量％の総キサントフィルを示し、そのうちの約98重量％をtrans-ベータ-クリプトキサンチンが構成する半精製結晶性集塊を得ること;および
・約20％の酢酸エチルを含有するヘキサンで前記結晶性集塊を洗浄し、約-10℃に冷却し、濾過することで、重量で約80％の総キサントフィルを示し、そのうちの約98.5重量％をtrans-ベータ-クリプトキサンチンが構成する高純度結晶性物質を得ること
によって達成される。
【００３０】
いくつかの局面において、本発明は、以下の工程を含む、約10〜80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの約75〜98重量％がtrans-ベータ-クリプトキサンチンであるベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を、植物材料から調製するための方法を提供する:（a）キサントフィルエステルを含む植物材料のオレオレジンを脂肪族アルコール系溶媒と混合する工程;（b）オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルをアルカリにより高温で鹸化する工程;（c）前記脂肪族アルコール系溶媒を除去し、その後、水を添加することで、希釈された結果混合物を得る工程;（d）希釈された有機酸を、前記希釈された結果混合物に加えることで、水層と沈殿したキサントフィル集塊とを形成させる工程;（e）水層を除去し、沈殿したキサントフィル集塊を極性溶媒で洗浄する工程;（f）沈殿したキサントフィル集塊を乾燥することで、粗キサントフィル集塊を得る工程;（g）前記粗キサントフィル集塊を非極性溶媒で洗浄し、非極性溶媒洗浄液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得る工程;（h）前記濃縮粗キサントフィル集塊をシリカゲルカラムに移し、非極性溶媒で洗浄する工程;（i）前記カラムを非極性溶媒と極性溶媒との混合物で溶出させ、溶出物を濃縮することで、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を得る工程;（j）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を脂肪族アルコールと混合し、その後、冷却する工程;および（k）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を濾過し、乾燥することで、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程。
【００３１】
いくつかの態様では、工程（a）における植物材料のオレオレジン中のキサントフィルエステルが約6〜8重量％存在する。いくつかの態様では、工程（a）または（j）の脂肪族アルコールが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、工程（a）におけるオレオレジン対アルコールの比が、重量/体積で約1:0.25から約1:1までの範囲にある。いくつかの態様では、工程（b）のアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、工程（b）におけるオレオレジン対アルカリの比が、重量/重量で約1:0.25から1:0.5までの範囲にある。いくつかの態様では、工程（b）の高温が、約75℃から約85℃までの範囲にある。いくつかの態様では、工程（c）における水の添加が、オレオレジンの約5倍（重量/重量）である。いくつかの態様では、工程（d）の希釈された有機酸が酢酸またはリン酸である。いくつかの態様では、工程（d）の希釈された有機酸が、約20％〜約50％有機酸の溶液である。いくつかの態様では、工程（e）の極性溶媒が水である。いくつかの態様では、工程（g）、（h）、および（i）の非極性溶媒が、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、工程（g）の粗キサントフィル集塊と非極性溶媒とが、重量/体積で約1:10〜1:15の比である。
【００３２】
いくつかの態様では、工程（g）の濃縮粗キサントフィル集塊が、ベータ-カロテン、trans-ベータ-クリプトキサンチン、trans-カプサンチン、ゼアキサンチン、および微量の他のカロテノイド、例えばカプソルビンまたはビオラキサンチンを含む。
【００３３】
いくつかの態様では、工程（h）の濃縮粗キサントフィル集塊と非極性溶媒とが、重量/体積で約1:5〜1:8の比である。いくつかの態様では、工程（h）の非極性溶媒洗浄液を蒸留することによって、カロテン濃縮物が得られる。さらなる態様では、カロテン濃縮物がベータ-カロテンである。
【００３４】
いくつかの態様では、工程（i）の極性溶媒が、プロパノン、ペンタノン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、工程（i）の非極性溶媒と極性溶媒とが、約95:5〜約98:2の比である。いくつかの態様では、工程（i）のtrans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約75重量％である。いくつかの態様では、工程（j）における冷却が約10℃で実施される。いくつかの態様では、工程（k）の精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が、少なくとも約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約90重量％である。
【００３５】
いくつかの態様では、上記方法はさらに、非極性溶媒とエステル溶媒との混合物で精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を洗浄し、沈殿させるために冷却することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶を得る工程（l）を含む。いくつかの態様では、工程（l）の高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶が、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約98重量％である。いくつかの態様では、工程（l）のエステル溶媒が酢酸エチルであり、工程（l）の非極性溶媒がヘキサンである。いくつかの態様では、工程（l）の非極性溶媒とエステル溶媒とが、約80:20〜約90:10の比である。いくつかの態様では、工程（l）における冷却のための温度が約-10℃である。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明は、以下の工程を含む、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約98重量％がtrans-ベータ-クリプトキサンチンであるベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を、植物材料から調製するための方法を提供する:（a）キサントフィルエステルを含む植物材料のオレオレジンをエタノールと混合する工程であって、オレオレジン対エタノールの比は、重量/体積で約1:1である、工程;（b）前記オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルを水を添加せずに水酸化カリウムで鹸化する工程であって、オレオレジン対水酸化カリウムの比は、重量/重量で約1:0.25である、工程;（c）前記オレオレジンに熱を加えることで、約80〜85℃で還流するまで温度を上昇させる工程;（d）前記オレオレジンを約80〜85℃で約3〜5時間撹拌する工程;（e）前記エタノールを減圧下で留去し、その後、水をオレオレジンの約5倍（重量/重量）添加することで、希釈された結果混合物を得て、約1時間撹拌する工程;（f）前記希釈された結果混合物を約25％酢酸で中和することで、水層と沈殿したキサントフィル集塊とを形成させる工程;（g）前記沈殿したキサントフィル集塊から水層を分離し、前記集塊を水で洗浄することで、石鹸および他の極性可溶性物質を除去する工程;（h）前記沈殿したキサントフィル集塊を減圧下で乾燥することで、粗キサントフィル集塊を得る工程;（i）前記粗キサントフィル集塊を約1:10のヘキサン（重量/体積）で洗浄し、ヘキサン洗浄液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得る工程;（j）前記濃縮粗キサントフィル集塊をシリカゲルカラムに約1:5（重量/重量）の比で移し、ヘキサンで溶出させることで、カロテン画分を得る工程;（k）前記カラムを約98:2のヘキサン対アセトンで洗浄し、洗浄液を濃縮することで、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を得る工程;（l）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を約1:2のエタノールと撹拌しながら混合し、続いて、約10℃で約8時間冷却する工程;（m）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を減圧下で濾過し乾燥することで、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程;および（n）前記精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を約80:20のヘキサン:酢酸エチルで洗浄し、沈殿させるために約-10℃に約18時間冷却することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶を得る工程。
【００３７】
いくつかの態様では、上記方法の総キサントフィルが、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、およびそれらの組み合わせから選択される副産物を含む。
【００３８】
本発明の諸局面では、上記方法において使用される植物材料、またはベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得るために使用される植物材料が、果実、野菜、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、植物材料はトウガラシに由来する。
【００３９】
本発明の諸局面では、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が、本発明の方法によって得られる。
【００４０】
本発明の一定の局面において、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物は、ビードレット（beadlet）、マイクロカプセル化粉末、油懸濁液、分散液、カプセル剤、ペレット、軟膏、ソフトゲルカプセル剤、錠剤、咀嚼錠またはローション/液状調製物から選択される剤形にある。諸局面では、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が組成物に添加される。
【００４１】
一定の局面において、本発明は、植物材料に由来するベータ-クリプトキサンチン濃縮物を含む組成物であって、該濃縮物は少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである組成物を提供する。いくつかの態様では、総キサントフィルが、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、例えばカプソルビンまたはビオラキサンチン、およびそれらの組み合わせから選択される副産物を含む。いくつかの態様において、本組成物はさらに、薬学的に許容される成分または食品用成分を含む。
【００４２】
いくつかの態様では、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物の総キサントフィルが、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、例えばカプソルビンまたはビオラキサンチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される副産物を含む。
【００４３】
本発明の諸局面において、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物は、リウマチ様炎症性関節炎（rheumatoid, inflammatory arthritis）の発症を防ぐための健康補助食品に使用される。
【００４４】
一定の局面において、本発明は、本発明のベータ-クリプトキサンチン濃縮物で処置することができる状態を患っている個体を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、リウマチ様炎症性関節炎または骨疾患の発症を予防するための方法であって、その必要がある患者に治療有効量の植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を投与する工程を含み、該濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、骨を強化するための方法であって、その必要がある患者に治療有効量の植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を投与する工程を含み、該濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、骨吸収を阻害するための方法であって、その必要がある患者に治療有効量の植物材料由来のベータ-クリプトキサンチン濃縮物を投与する工程を含み、該濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである方法を提供する。いくつかの態様では、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が約0.0001mg/kg〜約10m/kgの量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】アルファ-クリプトキサンチン、ベータ-クリプトキサンチンおよびゼイノキサンチンの化学構造を表す。
【図２】シャム対照、OVX対照、ならびにBCX-A、BCX-B、およびBCX-C群におけるピリジノリン架橋の決定を表すグラフである。
【図３】シャム対照、OVX対照、ならびにBCX-A、BCX-B、およびBCX-C群における骨密度の決定を表すグラフである。
【図４】シャム対照、OVX対照、ならびにBCX-A、BCX-B、およびBCX-C群における骨の破壊荷重を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
本明細書では本発明の生産物と方法を以下に説明するが、それらは実施例に示すように例示であって、いかなる形でも決して本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【００４７】
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合は、定義を含む本願が優先されることになる。また、文脈上別段の必要がある場合を除き、単数形は複数を包含し、複数の用語は単数を包含するものとする。本明細書において言及する刊行物、特許、および他の参考文献は全て、あらゆる目的で参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【００４８】
本明細書において使用する用語「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」、「有している」、「含有する」もしくは「含有している」、またはそれらの他の任意の変形は、明記した整数または整数の群の包含を含意するが、他の任意の整数または整数の群の排除を含意するわけではないことは理解されるであろう。例えば、列挙された一連の要素を含む組成物、混合物、方法、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるのではなく、明示的には列挙されていない他の要素または当該組成物、混合物、方法、方法、物品または装置に固有の要素も含むことができる。
【００４９】
また、本発明の要素または構成要素に前置された不定冠詞「a」および「an」は、事例の数、すなわちその要素または構成要素の存在数に関して非限定的であるものとする。したがって「a」または「an」は、1つまたは少なくとも1つを包含すると解釈すべきであり、当該要素または当該構成要素の単数語形は、その数字が単数を意図していることが自明である場合を除き、複数も包含する。
【００５０】
本明細書において使用する「発明」または「本発明」という用語は、非限定的用語であり、その特定発明の何らかの単一態様を指すのではなく、本願に記載する考えうる態様の全てを包含するものとする。
【００５１】
本明細書において使用する場合、本発明の成分または反応物の使用量を修飾する「約」という用語は、例えば現実の世界で濃縮物または溶液を作るために使用される典型的な測定手法および液体取り扱い手法や、これらの手法における偶発的な誤りや、組成物を作るために使用される、または当該方法を実行するために使用される成分の製造、供給源、または純度の相違などによって起こりうる、数量の変動を指す。「約」という用語は、ある特定初期混合物から生じる組成物については、平衡化条件が異なるせいで相違する量も包含する。例えば、使用する計器の正確さのレベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に依存して、「約」という用語は±10％を包含するが、それに限定されるわけではない。
【００５２】
単位、接頭部、および記号は、それぞれの国際単位系（SI）が容認する形態で示されている。数値範囲は範囲を画定する数字を含む。本明細書において記載する見出しは、本明細書全体を参照することによって理解することができる本開示のさまざまな局面を限定するものではない。したがって、以下に定義する用語は、本明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。
【００５３】
ベータ-クリプトキサンチン濃縮物
本発明は、約10〜80重量％の総キサントフィルを含有し、そのうちの約75〜98重量％がtrans-ベータ-クリプトキサンチンであり、残りはゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、および植物材料のオレオレジンまたは抽出物に由来する微量の他のカロテノイドを含む、栄養摂取および健康管理に有用な、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を提供する。
【００５４】
一定の態様では、濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約75重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである。
【００５５】
一定の態様では、濃縮物が、少なくとも約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約90重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである。
【００５６】
一定の態様では、濃縮物が、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約98重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンである。
【００５７】
天然供給源
植物材料は、限定するわけではないが、果実および野菜を含む供給源に由来する。本発明のいくつかの態様では、植物材料はトウガラシに由来する。トウガラシ属（Capsicum）は、例えば限定するわけではないがレッドペッパー（red pepper）など、ペッパー（pepper）のいくつかの品種を含む顕花植物の一属であり、「トウガラシ（capsicum）」という単語は、ペッパーを指す場合に、世界のいくつかの地域において可換的に使用されている。本明細書に記載するトウガラシオレオレジンは、パプリカオレオレジンも包含する。
【００５８】
投薬量および投与
本発明のベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物は、限定するわけではないが、ビードレット、マイクロカプセル化粉末、油懸濁液、分散液、カプセル剤、ペレット、軟膏、ソフトゲルカプセル剤、錠剤、咀嚼錠またはローション/液状調製物などといった剤形に製剤化することができる。本発明のベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物は、食品または飼料（液状または固形を含む）組成物に入れて提供することもできる。したがって、適切な送達方法には、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、頭蓋内投与、または頬側投与が含まれるが、それらに限定されるわけではないと考えられる。
【００５９】
本発明のtrans-ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を含む組成物は、1つまたは複数の適切な薬学的に許容される成分または食品用成分、例えば限定するわけではないが、担体、結合剤、安定剤、賦形剤、希釈剤、pH緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤および等張化剤などを含む。
【００６０】
本発明の組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」のtrans-ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を含みうる。「治療有効量」は、例えば処置の方法において、またはそのような方法で使用される薬学的組成物において、所望の治療結果を達成するのに（必要な投薬量および期間で）有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などといった因子に応じて変動しうる。治療有効量は、当該組成物のあらゆる毒性効果または有害効果を治療上有益な効果が上回るような量でもある。「予防有効量」は、所望の予防結果または防止結果を達成するのに（必要な投薬量および期間で）有効な量を指す。予防用量は、処置を必要とする疾患または状態が同定される前に、またはその初期段階において、対象に使用されるので、予防有効量は、典型的には、治療有効量より少ないであろう。
【００６１】
本発明のtrans-ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物の投与に有用な投薬量は、例えば宿主の体重に対して約0.0001mg/kg〜約10mg/kg、約0.001mg/kg〜約1.0mg/kg、より通常は約0.01mg/kg〜約0.5mg/kg、約0.01mg/kg〜約0.1mg/kg、約0.01mg/kg〜約0.05mg/kg、約0.01mg/kg〜約0.025mg/kg、約0.01mg/kg〜約0.2mg/kg、または約0.05mg/kg〜約5mg/kg、約0.05mg/kg〜約1.0mg/kg、または約0.05mg/kg〜約0.1mg/kgの範囲におよびうる。例えば投薬量は、約0.005mg/kg体重、約0.01mg/kg体重、約0.05mg/kg体重、約0.1mg/kg体重、約1.0mg/kg体重、または約10mg/kg体重であるか、約0.001〜1.0mg/kgの範囲内にあるか、好ましくは少なくとも0.005mg/kgであることができる。上記の範囲の中間にある用量も、本発明の範囲内であるものとする（例えば約0.002mg/kg、約0.025mg/kg、約0.05mg/kg、約0.075mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約2mg/kgなど）。対象は、毎日服用するか、毎日、または1日おき、または週に1回、または実験的分析によって決定される他の任意のスケジュールに従って、投薬を受けうる。例示的な処置は、長期間にわたって、例えば少なくとも6ヶ月にわたって、複数回の投薬を必要とする。
【００６２】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療的応答または予防的応答）が得られるように調節することができる。例えば、単回ボーラス投与するか、時間をかけていくつかに分割した用量を投与するか、または用量を、治療状況の要求に応じて、用量を比例的に増減することができる。投与が容易になり、投薬量の均一性が高まるように、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することはとりわけ有利であり、本明細書にいう投与単位形態とは、処置されるべき哺乳動物対象への単位投薬量として適当な物理的に離散した単位を指し、各単位は、所望の治療効果が生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を、必要な医薬担体と共に含有する。本発明の投薬単位形態の仕様は、（a）本発明のtrans-ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物のユニークな特徴および達成されるべきその治療効果または予防効果、および（b）哺乳動物対象において処置感受性が得られるように本発明の当該trans-ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を調剤する技術に固有の制約によって規定され、それらに直接的に依存する。本発明の個体または哺乳動物対象には、ヒト対象も、家畜、ペットおよび養殖魚を含む動物対象も含めることができる。
【００６３】
方法
本発明は、以下の工程を含む、約10〜80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの約75〜98重量％がtrans-ベータ-クリプトキサンチンであり、残りはゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテンおよび微量の他のカロテノイドを含む、栄養補助食品としてのヒトによる消費に適した、ベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を、植物材料から調製するための方法を提供する:
a）オレオレジン中のキサントフィルエステルを脂肪族アルコール溶媒と混合する工程;
b）植物材料のオレオレジン中に存在するキサントフィルエステルをアルカリにより高温で鹸化する工程;
c）前記脂肪族アルコール系溶媒を除去し、その後、水を添加することで、希釈された結果混合物を得る工程;
d）希釈された有機酸を、前記希釈された結果混合物に加えることで、水層と沈殿したキサントフィル集塊とを形成させる工程;
e）水層を除去し、沈殿したキサントフィル集塊を極性溶媒で洗浄する工程;
f）沈殿したキサントフィル集塊を乾燥することで、粗キサントフィル集塊を得る工程;
g）前記粗キサントフィル集塊を非極性溶媒で洗浄し、非極性溶媒洗浄液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得る工程;
h）前記濃縮粗キサントフィル集塊をシリカゲルカラムに移し、非極性溶媒で洗浄する工程;
i）カラムを非極性溶媒と極性溶媒との混合物で溶出させ、溶出物を濃縮することで、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を得る工程;
j）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富む濃縮物を脂肪族アルコールと混合し、その後、冷却する工程;および
k）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を濾過し、乾燥することで、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程。
【００６４】
一定の態様では、植物材料のオレオレジン中のキサントフィルエステルは、約2〜12重量％、約4〜10重量％、または約6〜8重量％存在する。
【００６５】
一定の態様では、脂肪族アルコールは、脂肪族非芳香族炭化水素に由来する炭化水素フラグメントを含み、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、脂肪族アルコールはエタノールである。
【００６６】
一定の態様では、オレオレジン対アルコールの比が、重量/体積で約1:0.25〜約1:1の範囲である。いくつかの態様では、この比が約1:1、約1:0.75、または約1:50である。
【００６７】
一定の態様では、アルカリは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、またはセシウムを含むアルカリ金属の可溶性水酸化物であり、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、アルカリは水酸化ナトリウムである。別の態様では、アルカリは水酸化カリウムである。
【００６８】
一定の態様では、オレオレジン対アルカリの比が、重量/重量で約1:0.25〜約1:0.5の範囲である。いくつかの態様では、この比が約1:0.25である。
【００６９】
一定の態様では、鹸化のための高温が室温を上回る。いくつかの態様では、この高温は、約65〜約95℃、約70〜約90℃、約75〜約85℃、約75〜約80℃、または約80〜約85℃の範囲である。
【００７０】
一定の態様では、上記工程（c）において、希釈された結果混合物を形成させるために加えられる水が、オレオレジンの約2〜約10倍、約3〜約9倍、約4〜約8倍、または約5〜約7倍（重量/重量）である。いくつかの態様では、加えられる水が、オレオレジンの約4倍、約5倍、または約6倍（重量/重量）である。いくつかの態様では、加えられる水が、オレオレジンの約5倍（重量/重量）である。
【００７１】
一定の態様では、上記方法において使用される希釈された有機酸が、酢酸またはリン酸である。一定の態様では、希釈された有機酸が、有機酸の約20％〜約50％の溶液である。いくつかの態様では、希釈された有機酸が、約20％〜約30％、約30％〜約40％、約40％〜約50％、約20％〜約40％、約30％〜約50％の有機酸である。いくつかの態様では、希釈された有機酸が、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、または約50％の有機酸である。
【００７２】
一定の態様では、沈殿したキサントフィル集塊を洗浄するために使用される極性溶媒が水である。
【００７３】
一定の態様では、上記方法において使用される非極性溶媒が、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００７４】
一定の態様では、粗キサントフィル集塊と非極性溶媒とが、重量/体積で約1:5〜約1:20、重量/体積で約7.5〜約17.5、または重量/体積で約1:10〜約1:15の比である。
【００７５】
一定の態様では、濃縮粗キサントフィル集塊と非極性溶媒とが、重量/体積で約1:2〜約1:14、重量/体積で約1:3〜約1:12、重量/体積で約1:4〜約1:10、または重量/体積で約1:5〜約1:8の比である。
【００７６】
一定の態様では、上記工程（h）における非極性溶媒洗浄液を蒸留することによって、カロテン濃縮物が得られる。一定の態様では、カロテン濃縮物はベータ-カロテンである。
【００７７】
一定の態様では、上記の方法において使用される極性溶媒が、プロパノン、ペンタノン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００７８】
一定の態様では、上記工程（i）における非極性溶媒と極性溶媒とが、約90:10〜約99:1、約92.5〜約99:1、約94:6〜約98:2、または約95:5〜約98:2（体積/体積）の比である。
【００７９】
一定の態様では、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を冷却するために使用される温度が、約5℃〜約15℃または約7.5℃〜約12.5℃である。いくつかの態様では、この温度が、約7℃、約8℃、約9℃、約10℃、約11℃、または約12℃である。
【００８０】
一定の態様では、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物が、少なくとも約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約75重量％である。
【００８１】
一定の態様では、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物が、少なくとも約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約90重量％である。
【００８２】
一定の態様において、上記の方法はさらに、非極性溶媒とエステル溶媒との混合物で精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を洗浄し、沈殿させるために冷却することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶を得る工程（l）を含む。
【００８３】
一定の態様では、工程（l）の高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶が、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約98重量％である。
【００８４】
一定の態様では、工程（l）のエステル溶媒が酢酸エチルであり、工程（l）の非極性溶媒がヘキサンである。
【００８５】
一定の態様では、工程（l）の非極性溶媒とエステル溶媒とが、約70:30〜約90:10、約80:20〜約90:10、約75:25〜約95:5、または約85:15〜約95:5（体積/体積）の比である。
【００８６】
一定の態様では、上記工程（l）における冷却のための温度が、約-5℃〜約-15℃または約-7.5℃〜約-12.5℃である。いくつかの態様では、上記工程（l）における冷却のための温度が、約-7℃、約-8℃、約-9℃、約-10℃、約-11℃、約-12℃である。
【００８７】
一定の態様では、総キサントフィルは、ゼアキサンチン、trans-カプサンチン、ベータ-カロテン、微量の他のカロテノイド、およびそれらの組み合わせから選択される副産物を含む。いくつかの態様では、微量の他のカロテノイドは、カプソルビンまたはビオラキサンチンを含む。
【００８８】
一定の態様では、植物材料は、果実、野菜、およびそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、植物材料はトウガラシに由来する。
【００８９】
一定の態様では、上記方法において使用される溶媒が、限定するわけではないが、減圧下での留去などといった方法によって除去される。一定の態様では、キサントフィルエステルの鹸化が、撹拌しながら少なくとも2時間は行われる。いくつかの態様では、鹸化が約2〜約20時間、約2〜約15時間、約2〜約10時間、約3〜約8時間、約3〜約6時間、または約3〜5時間行われる。
【００９０】
いくつかの態様では、上記の方法において使用される非極性炭化水素溶媒はヘキサンであるか、またはペンタンもしくはヘプタンなどの低沸点炭化水素の混合物である。いくつかの態様では、鹸化のために選択される脂肪族アルコールはエタノールであり、使用されるアルカリは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムから選択される。
【００９１】
いくつかの態様では、キサントフィル濃縮物が入っているシリカゲルカラムを、カロテンを除去するために非極性溶媒で溶出させることで、ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る。
【００９２】
いくつかの態様では、上記の方法が、非極性溶媒:極性溶媒でカラムを洗浄し、洗浄液を濃縮することで、約10重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約75重量％であり、残りはベータ-カロテン、trans-カプサンチン、ゼアキサンチンおよび痕跡量の他のカロテノイドであるベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程を、さらに含む。精製ベータ-クリプトキサンチン濃縮物は、少なくとも約40重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約90重量％である。また、精製ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を非極性溶媒:エステル溶媒の混合物で洗浄し、沈殿のために冷却することによって得られる高純度ベータ-クリプトキサンチン濃縮物は、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうち、trans-ベータ-クリプトキサンチン含量は少なくとも約98重量％であり、残りはベータ-カロテン、ゼアキサンチン、trans-カプサンチンおよび痕跡量の他のカロテノイドである濃縮物をもたらす。
【００９３】
一態様において、本発明は、以下の工程を含む、少なくとも約80重量％の総キサントフィルを含み、そのうちの少なくとも約98重量％はtrans-ベータ-クリプトキサンチンであるベータ-クリプトキサンチン富化濃縮物を植物材料から調製するための方法を提供する:
（a）キサントフィルエステルを含む植物材料のオレオレジンをエタノールと混合する工程であって、オレオレジン対エタノールの比は、重量/体積で約1:1である、工程;
（b）前記オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルを水を添加せずに水酸化カリウムで鹸化する工程であって、オレオレジン対水酸化カリウムの比は、重量/重量で約1:0.25である、工程;
（c）前記オレオレジンに熱を加えることで、約80〜85℃で還流するまで温度を上昇させる工程;
（d）前記オレオレジンを約80〜85℃で約3〜5時間撹拌する工程;
（e）前記エタノールを減圧下で留去し、その後、水をオレオレジンの約5倍（重量/重量）添加することで、希釈された結果混合物を得て、約1時間撹拌する工程;
（f）前記希釈された結果混合物を約25％酢酸で中和することで、水層と沈殿したキサントフィル集塊とを形成させる工程;
（g）前記沈殿したキサントフィル集塊から水層を分離し、前記集塊を水で洗浄することで、石鹸および他の極性可溶性物質を除去する工程;
（h）前記沈殿したキサントフィル集塊を減圧下で乾燥することで、粗キサントフィル集塊を得る工程;
（i）前記粗キサントフィル集塊を約1:10のヘキサン（重量/体積）で洗浄し、ヘキサン洗浄液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得る工程;
（j）前記濃縮粗キサントフィル集塊をシリカゲルカラムに約1:5（重量/重量）の比で移し、ヘキサンで溶出させることで、カロテン画分を得る工程;
（k）前記カラムを約98:2のヘキサン対アセトンで洗浄し、洗浄液を濃縮することで、trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を得る工程;
（l）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を約1:2のエタノールと撹拌しながら混合し、続いて、約10℃で約8時間冷却する工程;
（m）前記trans-ベータ-クリプトキサンチンに富むキサントフィル濃縮物を減圧下で濾過し乾燥することで、精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を得る工程;および
（n）前記精製trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物を約80:20のヘキサン:酢酸エチルで洗浄し、沈殿させるために約-10℃に約18時間冷却することで、高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン結晶を得る工程。
【００９４】
方法副産物には、ベータ-カロテン、trans-カプサンチン、ゼアキサンチン、またはそれらの混合物が含まれる。
【００９５】
本方法の新規な特徴は、当技術分野において報告されたことがなかったトウガラシ抽出物などの天然供給源からの高純度trans-ベータ-クリプトキサンチン濃縮物結晶の調製である。
【００９６】
以下の実施例は本発明を例証するために記載するものであるので、それらが本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【００９７】
実施例1
7.72％の総キサントフィルを含有し、色価（color value）が1,23,515ユニットであるパプリカオレオレジン（オレオレジンのHPLCプロファイル:15.36％ベータ-カロテン;10％trans-ベータ-クリプトキサンチン;7.6％ゼアキサンチン;および31.50％trans-カプサンチン）100gを秤量し、それを100mlのエタノールおよび25gの水酸化カリウムペレットと混合した。その反応混合物を撹拌しながら80〜85℃の温度に加熱した。この鹸化方法を穏やかに撹拌しながら80〜85℃で3〜5時間維持した。反応混合物を冷却してからエタノールを集塊から留去した。計り取った水（700ml）を反応混合物に加え、1時間撹拌した。その溶液を25％酢酸溶液で中和した。水層を集塊から分離し、集塊を水で3回洗浄した。集塊を収集し,減圧下で乾燥した。得られた鹸化集塊濃縮物は124gで、総キサントフィル含量は3.73重量％であった（鹸化集塊濃縮物のHPLCプロファイル:22.53％ベータ-カロテン;12.32％trans-ベータ-クリプトキサンチン;11％ゼアキサンチン;および29.3％trans-カプサンチン）。
【００９８】
前記鹸化集塊濃縮物を室温で撹拌しながら1:10ヘキサン（wt/vol）で2回洗浄し、濾過し、合わせた濾液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得た。得られた濃縮粗キサントフィル集塊（ヘキサン濃縮物）は72gで、総キサントフィル含量は3.2％であった（濃縮粗キサントフィル集塊のHPLCプロファイル:39.01％ベータ-カロテン;21.78％trans-ベータ-クリプトキサンチン;5.70％ゼアキサンチン;および9.86％trans-カプサンチン）。
【００９９】
ヘキサン洗浄後に残った残渣（鹸化キサントフィル）は22gで、これを分析したところ、総キサントフィル含量は10％であることがわかった（残渣のHPLCプロファイル:0.7％ベータ-カロテン;3.43％trans-ベータ-クリプトキサンチン;15.32％ゼアキサンチン;および52.84％trans-カプサンチン）。
【０１００】
前記ヘキサン濃縮物を最少量のヘキサンに溶解し、カラムクロマトグラフィー分離に供した。カラムには1:5の濃縮物対シリカ100〜200メッシュ（wt/wt）を充填した。そのカラムをヘキサンで洗浄し、分離したバンドを収集し、濃縮した（収量55gで総キサントフィル含量は2.3％、HPLCプロファイル:99.8％ベータ-カロテン）。次に、そのカラムを98:2ヘキサン:アセトン(v/v)で溶出させ、溶出液を収集し、濃縮した。この濃縮物層はベータ-クリプトキサンチンが富化されていた（収量5.2gで総キサントフィル含量は10.26％、HPLCプロファイル:75.56％trans-ベータ-クリプトキサンチン）。最後に、カラムをアセトンで洗浄し、洗浄液を濃縮することで、trans-カプサンチン富化残渣を得た。
【０１０１】
実施例2
6.50％の総キサントフィルを含有し、色価が1,05,457ユニットであるパプリカオレオレジン（オレオレジンのHPLCプロファイル:15.73％ベータ-カロテン;9.07％trans-ベータ-クリプトキサンチン;10.54％ゼアキサンチンおよび31.38％trans-カプサンチン）100gを秤量し、それを100mlのエタノールおよび25gの水酸化カリウムペレットと混合した。その反応混合物を撹拌しながら80〜85℃の温度に加熱した。この鹸化方法を穏やかに撹拌しながら80〜85℃の温度で3〜5時間維持した。反応混合物を冷却してからエタノールを集塊から留去した。計り取った水（700ml）を反応混合物に加え、1時間撹拌した。その溶液を40％酢酸溶液で中和した。水層を集塊から分離し、集塊を水で3回洗浄した。集塊を集め、減圧下で乾燥した。得られた鹸化集塊濃縮物は126gで、総キサントフィル含量は3.73重量％であった（鹸化集塊濃縮物のHPLCプロファイル:16.34％ベータ-カロテン;9.41％trans-ベータ-クリプトキサンチン;8.57％ゼアキサンチン;および24.35％trans-カプサンチン）。
【０１０２】
前記鹸化集塊濃縮物を室温で撹拌しながら1:10ヘキサン（wt/vol）で2回洗浄し、濾過し、合わせた濾液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得た。得られた濃縮粗キサントフィル集塊（ヘキサン濃縮物）は76.15gで、総キサントフィル含量は3.26％であった（濃縮粗キサントフィル集塊のHPLCプロファイル:31.80％ベータ-カロテン;14.04％trans-ベータ-クリプトキサンチン;4.35％ゼアキサンチン;および8.70％trans-カプサンチン）。
【０１０３】
ヘキサン洗浄後に残った残渣（鹸化キサントフィル）は16gで、これを分析したところ、総キサントフィル含量は11％であることがわかった（残渣のHPLC分析:1.22％ベータ-カロテン;0.75％trans-ベータ-クリプトキサンチン;33.29％ゼアキサンチン;および29.99％trans-カプサンチン）。
【０１０４】
前記ヘキサン濃縮物を最少量のヘキサンに溶解し、カラムクロマトグラフィー分離に供した。カラムには1:5の濃縮物対シリカ100〜200メッシュ（wt/wt）を充填し、ヘキサンで溶出させ、分離された最初のバンドを収集し、濃縮した（収量54.72gで総キサントフィル含量は1.08％、HPLCプロファイル:85.88％ベータ-カロテン）。次に、そのカラムを、溶出液画分を収集しながら98:2ヘキサン:アセトン(v/v)で溶出させ、濃縮した。この画分はベータ-クリプトキサンチンが富化されており、収量は4.02gで総キサントフィル含量は9％であった（富化ベータ-クリプトキサンチン濃縮物のHPLCプロファイル:76.04％trans-ベータ-クリプトキサンチン）。最後に、カラムをアセトンで洗浄した。
【０１０５】
4.02gの画分濃縮物を1:2のエタノール（wt/vol）と共に1時間撹拌し、10℃で8時間冷却し、濾過し、沈殿物を減圧下で乾燥した。得られた収量は0.42gの結晶性沈殿物で、総キサントフィル含量は42.45％であった。結晶性沈殿物のHPLCプロファイルは98.3％のtrans-ベータ-クリプトキサンチンを示した。
【０１０６】
実施例3
6〜8重量％の総キサントフィルを含有し、色価が1,00,000ユニットであるパプリカオレオレジン（100g）（オレオレジンのHPLCプロファイル:15.36％ベータ-カロテン;10％trans-ベータ-クリプトキサンチン;7.6％ゼアキサンチン;および31.50％trans-カプサンチン）を秤量し、それを100 mlのエタノールおよび25gの水酸化カリウムペレットと混合した。その反応混合物を撹拌しながら80〜85℃の温度に加熱した。この鹸化方法を穏やかに撹拌しながら80〜85℃の温度で3〜5時間維持した。反応混合物を冷却してから減圧下でエタノールを集塊から留去した。計り取った水（700ml）を反応混合物に加え、1時間撹拌した。その溶液を25％酢酸溶液で中和した。水層を集塊から除去し、集塊を水で3回洗浄した。集塊を集め、減圧下で乾燥した。得られた鹸化集塊濃縮物は121.75gで、総キサントフィル含量は4.92重量％であった（鹸化集塊濃縮物のHPLCプロファイル:21.76％ベータ-カロテン;12.74％trans-ベータ-クリプトキサンチン;10.13％ゼアキサンチン;および38.25％trans-カプサンチン）。
【０１０７】
前記鹸化集塊濃縮物を室温で撹拌しながら1:10ヘキサン（wt/vol）で2回洗浄し、濾過し、合わせた濾液を濃縮することで、濃縮粗キサントフィル集塊を得た。得られた濃縮粗キサントフィル集塊（ヘキサン濃縮物）は85.81gで、総キサントフィル含量は3.21重量％であった（濃縮粗キサントフィル集塊のHPLCプロファイル:35.28％ベータ-カロテン;19.65％trans-ベータ-クリプトキサンチン;3.99％ゼアキサンチン;および13.88％trans-カプサンチン）。
【０１０８】
ヘキサン洗浄後に残った残渣（鹸化キサントフィル）は25.65gで、これを分析したところ、総キサントフィル含量は10.42重量％であることがわかった（残渣のHPLC分析:0.7％ベータ-カロテン;1.24％trans-ベータ-クリプトキサンチン;18.98％ゼアキサンチン;および52.32％trans-カプサンチン）。
【０１０９】
前記ヘキサン濃縮物を最少量のヘキサンに溶解し、カラムクロマトグラフィー分離に供した。カラムには1:5の濃縮物対シリカ100〜200メッシュ（wt/wt）を充填し、5〜8体積のヘキサンで溶出させ、分離された最初のバンドを溶出させ、濃縮した（収量55gで、総キサントフィル含量は2.29重量％、HPLCプロファイル:99％ベータ-カロテン）。次に、そのカラムを、溶出液画分を収集しながら98:2ヘキサン:アセトン(vol/vol)で溶出させ、濃縮した。この濃縮物はベータ-クリプトキサンチンが富化されており、収量は9.06gで総キサントフィル含量は6.12重量％であった（富化ベータ-クリプトキサンチン濃縮物のHPLCプロファイル:71.80％trans-ベータ-クリプトキサンチン）。最後に、カラムをアセトンで溶出させた。
【０１１０】
9.06gのベータ-クリプトキサンチン濃縮物を1:2のエタノール（wt/vol）と共に1時間撹拌し、10℃で8時間冷却し、濾過し、沈殿物を減圧下で乾燥した。得られた収量は0.5gで、総キサントフィル含量は42.35重量％であった。結晶のHPLCプロファイルは98.3％のtrans-ベータ-クリプトキサンチン含量を示した。
【０１１１】
この0.5gのベータ-クリプトキサンチン沈殿物を最少量の80:20ヘキサン:酢酸エチル（vol/vol）に溶解し、-10℃で18時間冷却し、濾過し、沈殿物を減圧下で乾燥した。得られた収量は0.03gで、総キサントフィル含量は80％、trans-ベータ-クリプトキサンチンに関するHPLCプロファイルは98.50％であった。
【０１１２】
実施例4
β-クリプトキサンチンの骨吸収抑制性と、骨の機械的強度に対するその効果
試験材料の説明:
2016505066.tif 000003
＊実験のために試料を1％に希釈した。
【０１１３】
試験系:
8〜10週齢で体重180〜230gのWistarラット。
【０１１４】
動物の収容:
動物を各群6匹の5群に分割した。各ケージに群の名称、プロトコール番号、動物の種/系統および性別をラベル表示した。使用したケージの総数は30匹に対して10個だった。温度（25℃±2）および相対湿度50〜70％、12時間の明/暗周期で、各ケージに3匹を収容した。全ての動物に水を自由に摂取させた。ケージ中の敷料として籾殻を使用した。ケージは毎日掃除した。
【０１１５】
両側卵巣切除術:
外科器具は全て使用前に滅菌した。ラットの背面の皮膚を剃毛し、ポピドンヨウ素溶液を使って消毒した。卵巣の上、約1cm長の2つの背外側切開によって、卵巣切除を実施した。鋭利な解剖用剪刀を使って、腹膜腔にアクセスするために、皮膚を背筋とほとんど一緒に切断した。さまざまな量の脂肪に取り囲まれた卵巣を見いだした。失血を防ぐために血管を結紮した。ファロピウス管と子宮角の間の接続を切り、卵巣を取り出し、皮膚に3針のシングルカットグートステッチ（single catgut stitch）を施した。
【０１１６】
グループ分け:
2016505066.tif 000004
【０１１７】
試験手順:
第1群のラットは、ケタミン（70mg/kg）＋キシラジン（10mg/kg）（腹腔内）麻酔下で、シャム手術を施行した。第2、第3、第4および第5群のラットには、ケタミン＋キシラジン（i.p.）麻酔下で両側卵巣切除（OVX）を施行した。OVX術を施行した動物には、シャム手術を施行した群に合致する量の標準的市販実験用飼料を与えた。手術した動物は個別に収容し、2週間回復させた。
【０１１８】
試験化合物をトウモロコシ油に溶解した。20μg/100g体重の濃度を各群のラットに経口胃管栄養ニードルを通して1日1回3週間にわたって投与した。対照ラットにはトウモロコシ油（0.5ml/100g体重）を経口投与した。
【０１１９】
処置の最終日に、終夜絶食させた動物から徒手圧迫で誘発した排尿によって尿試料を収集し、さらなる分析まで-20℃で保存した。
【０１２０】
統計的解析:
結果は全て一元配置ANOVAとそれに続くDunnettの多重比較検定を使って解析した。P＜0.05の信頼区間を考慮する。
【０１２１】
尿中の骨コラーゲン代謝産物（ピリジノリン架橋）の見積もり:
ピリジノリン架橋は骨吸収方法が加速されている時に尿中に現れる骨コラーゲン代謝産物であり、骨粗鬆症の重要な初期マーカーと見なされている。
【０１２２】
OVX対照動物は尿中のピリジノリン架橋に有意な増加を示し、これにより、卵巣切除術後の骨粗鬆症の誘発に成功していることが確認される。下記表1に示すように、BCX-C処置は、ピリジノリン架橋の尿排泄をかなりの程度まで中等度に低減し、BCX-AおよびBCX-Bも同様であった。これは、エストロゲン欠乏に関係する骨粗鬆症におけるBCX処置の治療的有用性を裏付けている。
【０１２３】
（表１）ピリジノリン架橋の決定
2016505066.tif 000005
【０１２４】
骨（大腿骨）密度の決定:
ヒトにおける卵巣機能の停止は、骨代謝回転の増加、負の骨バランス、および骨密度の正味の減少につながり、これらの変化は外科的卵巣切除ラットにおいても明白である。
【０１２５】
第2群では、有意なOVX誘発性骨密度減少が観察された。BCX-A、BCX-BおよびBCX-C処置はOVXに関連する骨密度の減少を防止した。下記表2に示すように、BCX-Cは、骨密度のOVX誘発性喪失の防止に関して、BCX-AおよびBCX-Bよりも良い活性を示した。
【０１２６】
（表２）骨密度の決定
2016505066.tif 000006
【０１２７】
上記の実験から得られた結果は、パプリカ供給源から得られるベータ-クリプトキサンチン（BCX-C）が、マリーゴールド供給源およびオレンジ供給源から得られるベータ-クリプトキサンチンよりも良い骨吸収抑制性を示すことを裏付けている。
【０１２８】
骨（脛骨）の極限破壊荷重の決定:
骨の脆さは、骨折のしやすさであると、広く定義することができる。骨の機能の一つは荷重を担うことである。骨折は、荷重が骨の強さを超えた時に起こるので、弱くなった骨は脆いと見なすべきである。転倒などの外傷的負荷では、骨が吸収できる機械的エネルギーを転倒からのエネルギーが上回ると、骨折が起こる。骨粗鬆症の骨は、破損する前に吸収するエネルギー（破壊荷重）が極めて小さいので、外傷に起因する骨折を起こしやすい。この研究では、三点曲げ試験を使って破壊荷重を測定した。
【０１２９】
卵巣切除動物では、脛骨中央骨幹の最大荷重値が有意に減少していたことから、海綿骨の有意な喪失が示された。下記表3に示す結果から、BCX-C処置が海綿骨の機械的強度の喪失を有意に防止したことは明白である。
【０１３０】
（表３）骨の破壊荷重の決定
2016505066.tif 000007
【０１３１】
本明細書に添付する図面に示すように、表1、表2および表3に示すデータは、それぞれ図2、図3および図4にプロットされている。
【０１３２】
結論:
trans-ベータ-クリプトキサンチンは、OVXラットモデルにおいて、有意な抗骨粗鬆症活性を有する。BCX-C（パプリカ供給源）は、BCX-A（マリーゴールド供給源）およびBCX-B（オレンジ供給源）と比較して、卵巣切除ラットにおける骨の質量および機械的強度を有意に改善した。
【０１３３】
上述した具体的態様の説明により、本発明の一般的性質は完全に明らかになるので、他者は、当技術分野の技量の範囲内の知識を応用することにより、過度の実験を行わなくても、本発明の一般概念から逸脱することなく、上記具体的態様を容易に変更しかつ/またはさまざまな応用に適合させることができる。したがって、そのような適合および変更は、本明細書に記載した教示と指針に基づいて、開示した態様の等価物の意味および範囲内にあるものとする。本明細書における表現および術語は、説明を目的とし、限定を目的とはしていないことを理解すべきであり、したがって、当業者は本明細書の教示および指針に照らして本明細書における術語および表現を解釈すべきである。
【０１３４】
本発明の広さと範囲は、上述の例示的態様のいずれかによって限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義されるべきである。
【図１】
2016505066.tif 000009
【図２】
2016505066.tif 000010
【図３】
2016505066.tif 000011
【図４】
2016505066.tif 000012
【国際調査報告】
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