(57)【要約】【課題】非標準的ＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化により特徴づけられる炎症が付随する疾病を引き起こす炎症性経路の緩和。【解決手段】本発明は、アレルギー疾患、自己免疫疾患、またはアレルギーもしくは自己免疫とは異なる機構に基づく他の炎症性疾患のような、非標準的ＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化によって特徴づけられる炎症を付随する疾患の治療のために使用される、活性成分ピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非標準的ＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化によって特徴づけられる、炎症を付随する疾患の治療における使用のための、ピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項２】
前記疾患が、アレルギー疾患、自己免疫疾患、または、アレルギーおよび自己免疫とは異なる機構に基づく炎症性疾患である、請求項１に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項３】
前記アレルギー疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹、および／またはアレルギー性脈管炎から選択される、請求項２に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項４】
前記自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性心筋疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性腸疾病、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多腺性症候群、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、小児脂肪便症、慢性疲労症候群、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、突発性肺血鉄症、突発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性突発性関節炎（または若年性関節リウマチ、またはスティル病）、川崎病、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、脊椎関節症、側頭動脈炎（または巨細胞性動脈炎）、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹様血管炎、白斑から選択される、請求項２に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項５】
前記アレルギーおよび自己免疫とは異なる機構に基づく炎症性疾患が、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、慢性肝不全、慢性腎症、胃炎、糸球体腎炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、汗腺膿瘍、低ガンマグロブリン血症、間質性膀胱炎、硬化性苔癬、肝脂肪症、メタボリックシンドローム、肥満症、パーキンソン病、尋常性天疱瘡、虚血後炎症、乾癬、乾癬性関節炎、レーノー現象、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、血小板減少症から選択される、請求項２に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項６】
ヒトに投与される、請求項１から５のいずれかに記載のピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項７】
全身的に投与される、請求項１から５のいずれかに記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項８】
非経口的（筋肉内または静脈内）経路または経腸（経口または直腸）経路によって投与される、請求項７に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項９】
固体調合物または液体調合物を用いて投与される、請求項７に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記固体調合物が、５０％〜９０％、より好ましくは６５％〜８０％、最も好ましくは７０％〜７５％のｗ／ｗ濃度のピドチモドまたはその生理学的に許容される塩を有する、請求項９に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記液体調合物が、０．５％〜２０％、より好ましくは１％〜１０％、最も好ましくは２％〜８％のｗ／ｗ濃度のピドチモドまたはその生理学的に許容される塩を有する、請求項９に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１２】
前記固体調合物が、１回の服用量あたり１０から１０００ｍｇまで、より好ましくは１回の服用量あたり５０から８００ｍｇまでの量のピドチモドまたはその生理学的に許容される塩を有する、請求項９に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１３】
局所的に投与される、請求項１から５のいずれかに記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１４】
皮膚、眼、耳、鼻、口腔、髄腔、気管内、膣、膀胱内、直腸の経路で投与される、請求項１３に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１５】
固体調合物、半固体調合物または液体調合物を用いて投与される、請求項１３に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１６】
前記固体調合物が、５０％〜９０％、より好ましくは６５％〜８０％、最も好ましくは７０％〜７５％のｗ／ｗ濃度のピドチモドまたはその生理学的に許容される塩を有する、請求項１５に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１７】
前記半固体調合物または前記液体調合物が、０．１％〜３０％、より好ましくは１％〜２０％、最も好ましくは５％〜１５％のｗ／ｗ濃度のピドチモドまたはその生理学的に許容される塩を有する、請求項１５に記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【請求項１８】
少なくとも１つの活性成分と組み合わせて投与されるか、または少なくとも１つの活性成分と時間的に接近して投与される、請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患、自己免疫疾患、またはアレルギーもしくは自己免疫とは異なる機構に基づく他の炎症性疾患のような、非標準のＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化によって特徴づけられる炎症の付随する疾患に対する、活性成分であるピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩の新規の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主の感染中の微生物成分の認識は、炎症性の遺伝子発現の誘導に引き続く生得的な免疫応答を活性化する重要な段階である。Toll様受容体（ＴＬＲｓ）に例示されるパターン認識受容体は、微生物成分、ウイルス成分および真菌成分に対する宿主の応答における重要な調節因子である。この応答の主要部は、宿主保護、生得的および順応的免疫細胞の漸増、および病原体のクリアランスに影響する遺伝子をアップレギュレートする能力である。ＴＬＲに仲介される炎症応答は、病原体に対する免疫防御を提供するのに決定的に重要であるけれども、機能不全性応答は、敗血症、炎症、自己免疫として顕在化される急性および慢性の炎症状態の両方をもたらす可能性がある。したがって、ＴＬＲ応答の強度および継続時間は、しっかりと制御しなければならない（Lordら、２００９）。
【０００３】
ＴＬＲに加えて、最近の研究は、CATAPILLERまたはNOD様受容体として知られる新たな免疫遺伝子ファミリーの発見およびキャラクタリゼーションに集中している。いくつかのNLR遺伝子の変異が、自己免疫および炎症を含むヒト疾患の状態に関連してきている。NLR遺伝子ファミリーの構成員は、特異的または複数の病原体に由来する産物に対する暴露の後の細胞活性化を調節することに関与している。NLR遺伝子は、種々の宿主の防御プロセスを調節することに関与している。NLR遺伝子の関与は、免疫性障害および炎症性障害を患う患者の遺伝子分析によって、最も明瞭に明らかにされる（Lordら、２００９）。
【０００４】
「NOD様受容体、ピリンドメイン含有１２」（NLRP12)とも呼ばれるMonarch-1は、NLR群の最もよく知られる成分である。NLRP12は、ヒト細胞におけるTLR誘起NF-kBシグナル発生およびTNFR誘起NF-kBシグナル発生の負の調節因子として機能する。NLRP12は、IRAK（IL-1R関連キナーゼ）-1の過剰ホスホリル化／活性化をブロックし、NF-kB誘導キナーゼ（NIK)の分解を促進し、NF-kB活性化の減少をもたらす（Lichら、２００７）。
【０００５】
TLR-活性化されるNF-kBシグナル発生の結果は、TNF-αを含むいくつかの炎症性サイトカインの生成である。これらのサイトカインの過剰生成は、アレルギー、自己免疫疾患、および他の急性／慢性炎症性疾患のような炎症性疾患の徴候および症状をもたらす。非標準的ＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化に関連する最も重要な疾患を、以下に総括する（Imani Fooladiら、２０１３；Delunardoら、２０１３；Meneghiniら、２０１３；Lvら、２０１３；Monacoら、２００４；Zhangら、２０１３；Medeiros, Laferla、２０１３；Quら、２０１２；Wenhongら、２０１２；Qiら、２０１２；Mori Tら、２０１２より）。
【０００６】
・  アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹および／またはアレルギー性脈管炎のようなアレルギー性疾患。
【０００７】
・  円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性心筋疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性腸疾病、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多腺性症候群、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、小児脂肪便症、慢性疲労症候群、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、突発性肺血鉄症、突発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性突発性関節炎（または若年性関節リウマチ、またはスティル病）、川崎病、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、脊椎関節症、側頭動脈炎（または巨細胞性動脈炎）、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹様血管炎、白斑のような自己免疫疾患。
【０００８】
・  アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、慢性肝不全、慢性腎症、胃炎、糸球体腎炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、汗腺膿瘍、低ガンマグロブリン血症、間質性膀胱炎、硬化性苔癬、肝脂肪症、メタボリックシンドローム、肥満症、パーキンソン病、伝染性天疱瘡、虚血後炎症、乾癬、乾癬性関節炎、レーノー現象、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、血小板減少症のような、アレルギー性および自己免疫性以外の炎症性疾患。
【０００９】
化学名が（４Ｒ）−３−（５−オキソ−Ｌ−プロリル）−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸であるピドチモドは、イタリア国特許出願公開第１２３１７２３号において、初めて開示された。それは、インビトロおよびインビボの免疫調節作用を備えた合成ペプチド様分子である（Giagulliら、２００９）。免疫系は、我々の肉体とすべての異物との間の恒常性バランスを維持するのに介在し、したがって、この作用の異常は、自己抗原に対する寛容性の喪失とともに、非自己構造に対する不完全または異常な応答を起こす可能性がある。いずれの場合においても、免疫系の誤りは、疾病の徴候として臨床的に現れる。
【００１０】
ピドチモドは、実験的な微生物感染モデルおよびウィルス感染モデルにおいて確認され、かつ多くの制御された臨床実験において確認されているように、（それ自身が直接的な抗微生物作用も抗ウィルス作用も持たないとしても）感染プロセスに対する保護作用を発揮する。特に、生体外の研究が、ＮＫ細胞の細胞毒作用に加えて、食細胞刺激および相対的食細胞作用を増大させるピドチモドの能力を際立たせた。さらに、ピドチモドは、特異的刺激により誘起される抗ウィルス分子（ＩＦＮ−α）の放出を増大させることが見いだされた（Taramelliら、１９９４）。
【００１１】
経口経路でタブレットとして投薬されるピドチモドは、小児患者における再発性呼吸器感染の治療におけるより高い効率性に加えて、動物モデルにおけるウィルス感染に対してより高い抵抗性を誘起することができることを証明された。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｍｏｎｏｍａｃ６細胞ラインにおけるピドチモド処理時の特異的ＮＬＲＰ１２転写のアップモジュレーションを示す図である。
【図２】ヒト原初単球におけるピドチモド処理時の特異的ＮＬＲＰ１２転写のアップモジュレーションを示す図である。
【図３】Ｍｏｎｏｍａｃ６細胞ラインにおけるピドチモド処理時のＮＬＲＰ１２タンパク質のアップモジュレーションを示す図であり、ＮＴは非処理を意味し、ＭＷは分子量を意味する。
【図４】単球におけるピドチモド処理時の、ＴＬＲアゴニストによる細胞刺激に誘起されるＭＣＰ−１合成の減少を示す図であり、ＣＴＲは対照を意味する。
【図５】ＴＬＲエンゲージメントに誘起されるＮＬＲＰ１２のダウンレギュレーションに対抗するピドチモドを示す図であり、ＮＴは非処理を意味し、ＬＰＳはリポ多糖類を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
今回、驚くべきことには、ピドチモドが、保護的な抗微生物性免疫応答を持続することに活性であることに加えて、ＴＬＲ活性化の結果として起こる炎症の制御に関与するＮＬＲＰ１２（Ｍｏｎａｒｃｈ  １）の転写および合成を増加させることを見いだした。このピドチモドに誘起される事象は、ＴＬＲ刺激の際に免疫細胞から放出される炎症メディエーターの産生の抑制をもたらす。したがって、この新規に発見された機構により、ピドチモドは、ＮＬＲＰ１２が重大な役割を果たす、非標準的ＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化により特徴づけられる炎症が付随する疾病を引き起こす炎症性経路を緩和することができる。
【００１４】
利用可能な薬物治療は、たとえば、モノクローナル抗体のように、ＴＮＦαに結合することまたはその濃度を減少させることにより、あるいはコルチコステロイド類のように免疫系を抑制することにより、炎症カスケードの晩期のエフェクターに作用する。そのような薬物治療は、長期にわたる使用の後に多くの不適当な効果の元となる。
【００１５】
逆に、Ｍｏｎａｒｃｈ−１を活性化することにより、ピドチモドは、炎症機構の非常に早い段階で機能し、ＮＦ−ｋＢ活性化のカスケードのスイッチを切る、唯一の薬剤である。モノクローナル抗体と比較して、その効果は、遙かに一般的であり、かつ単一の炎症性サイトカインに向けられるものではない。コルチコステロイド類と比較して、ピドチモドは、きわめて安全であり、かつ、長期のコルチゾン治療のよく知られている毒性効果を誘起しない。
【００１６】
したがって、本発明の対象は、アレルギー疾患、自己免疫疾患、およびアレルギーおよび自己免疫とは異なる機構に基づく他の炎症性疾患のような、非標準的ＮＦｋＢ経路の異常な過剰活性化により特徴づけられる炎症が付随する疾病の治療における、ピドチモド、あるいはその立体異性体および／または生理学的に許容される塩の使用により象徴される。
【００１７】
本発明にしたがって治療することができるアレルギー疾患は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹、および／またはアレルギー性脈管炎から選択されてもよい。
【００１８】
本発明にしたがって治療することができる自己免疫性疾患は、円形脱毛症、強直性脊髄炎、自己免疫性心筋疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性腸疾病、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多腺性症候群、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、小児脂肪便症、慢性疲労症候群、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、突発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性突発性関節炎（または若年性関節リウマチ、またはスティル病）、川崎病、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、脊椎関節症、側頭動脈炎（または巨細胞性動脈炎）、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹様血管炎、白斑から選択されてもよい。
【００１９】
本発明にしたがって治療することができる、アレルギーおよび自己免疫とは異なる機構に基づく他の炎症性疾患は、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、慢性肝不全、慢性腎症、胃炎、糸球体腎炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、汗腺膿瘍、低ガンマグロブリン血症、間質性膀胱炎、硬化性苔癬、肝脂肪症、メタボリックシンドローム、肥満症、パーキンソン病、伝染性天疱瘡、虚血後炎症、乾癬、乾癬性関節炎、レーノー現象、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、血小板減少症から選択されてもよい。
【００２０】
本発明の治療のために、ピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩は、全身的または局所的のいずれで投与してもよい。
【００２１】
全身的に投与する際には、少なくとも薬学的に許容される賦形剤および／または補助薬と一緒に、ピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩を含有する固体または液体調合物の形態であってもよい。そのような調合物は、異なる経路による投与に適当な通例の調合物として、非経口的（すなわち、筋肉内または静脈内）経路により、または経腸（すなわち、経口または直腸）経路により投与されてもよい。
【００２２】
全身的に投与される前述の固体調合物は、５０％〜９０％、より好ましくは６５％〜８０％、最も好ましくは７０％〜７５％のｗ／ｗ濃度のピドチモドを有してもよい。
【００２３】
全身的に投与される前述の液体調合物は、０．５％〜２０％、より好ましくは１％〜１０％、最も好ましくは２％〜８％のｗ／ｗ濃度のピドチモドを有してもよい。
【００２４】
本発明の実施形態によれば、経口的に投与される際に、ピドチモド、あるいはその立体異性体および／または生理学的に許容される塩の量は、１回の服用量あたり１０から１０００ｍｇまで、より好ましくは１回の服用量あたり５０から８００ｍｇまで変化してもよい。
【００２５】
局所的に投与される場合、少なくとも薬学的に許容される賦形剤および／または補助薬と一緒に、ピドチモド、あるいはその立体異性体、および／または生理学的に許容される塩を含有する固体、半固体または液体調合物の形態であってもよい。そのような調合物は、異なる経路による投与に適当な通例の調合物として、皮膚、眼、耳、鼻、口腔、髄腔、気管内、膣、膀胱内、直腸の経路で投与されてもよい。
【００２６】
局所的に投与される前述の半固体または液体調合物は、０．１％〜３０％、より好ましくは１％〜２０％、最も好ましくは５％〜１５％のｗ／ｗ濃度のピドチモドを有してもよい。
【００２７】
局所的に投与される前述の固体調合物は、５０％〜９０％、より好ましくは６５％〜８０％、最も好ましくは７０％〜７５％のｗ／ｗ濃度のピドチモドを有してもよい。
【００２８】
本発明にしたがって用いられる固体、半固体または液体調合物は、慣用の技術にしたがって調製されてもよく、薬学的に許容される賦形剤、補助薬および／または担体を含有してもよく、ならびに、組み合わせにおいて、相補的または少なくとも有用な活性を有する１つまたは複数の活性成分をさらに含有してもよい。
【００２９】
本発明の薬学的組成物および使用は、以下の実施例においてより完全に記載されるであろう。しかしながら、以下の実施例は、例示の目的のために提供され、制限の目的で提供されるものではないことに留意すべきである。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
本発明にしたがうピドチモドの使用を正当化するピドチモドの作用は、ヒト単球細胞、末梢血単球細胞にＴＬＲに誘起される活性化および炎症を制御することができるものとして実験的に試験することで示される。
【００３１】
１．ヒト単球の培養
末梢血単球細胞（ＰＢＭＣｓ）を、末梢血（新たに引き抜いたもの、または、軟膜）から得た、ついで、（Mariniら、２００８）に記載されるように抗ＣＤ１４常磁性ビーズ（Miltenri Biotec）を用いる正の選択により、ＰＢＭＣｓから単球を誘導した。精製時に、完全培養培地（低エンドトキシンを保証されたウシ胎児血清１０％により補足されたＲＰＭＩ１６４０）中で、細胞を短時間（２４〜７２時間）培養した。いくつかの試験を、アメリカ培養細胞系統保存機関の提言にしたがって成長させたヒト単球細胞ライン（ＭｏｎｏＭａｃ  ６）にて実施した。
【００３２】
２．ピドチモドによる細胞処理
精製した原初ヒト単球またはＭｏｎｏＭａｃ  ６であるＰＭＢＣｓを、１〜２５μｇ／ｍＬの範囲内の濃度のピドチモドで、異なる時間にわたって処理した。いくつかの実験において、ピドチモド処理の開始から６〜４８時間後に、セルを洗浄し、ＴＬＲ１−９の最適リガンド（ヒトＴＬＲ１−９アゴニストキット、Invivogen）の存在下または不存在下において、６〜２４時間にわたって培養した。
【００３３】
３．ピドチモドの活性に伴う遺伝子発現の評価
刺激時に、細胞を収穫し、RNAeasyミニキット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次いで、ＲＮＡを逆転写し、増幅にかけた。製造業者のプロトコルにしたがって「ヒトＲＴ２プロファイラーＰＣＲマイクロアレイキット」（SABbiosciences、Qiagen）を用いて、実時間ＰＣＲを実施した。このキットは、免疫活性化に関連する遺伝子の発現の広範囲な分析を可能にし、炎症のメディエーターの発現に対する独特の関連性を与える。
【００３４】
４．免疫ブロットおよび免疫沈降検定
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含有する溶解緩衝液中で、細胞溶解産物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）によってタンパク質溶解産物を溶解し、５％ＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）中で１時間にわたってブロックしたニトロセルロース膜に移した。細胞質のＮＬＲＰ１２の存在を検出するため、ＮＬＲＰに対するヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いる第１の培養を行い、引き続いて、ロバ抗ヤギＨＲＰ二次抗体の添加を行った。免疫沈降研究のために、ＮＬＲＰ１２に対するウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いて、２０μｌのタンパク質Ａ／Ｇ被覆ビーズ（protein A/G plus, Santa Cruz Biotechnology）の存在下、４℃において、１２時間にわたってタンパク質を沈降させた。タンパク質複合体を４〜６回にわたって洗浄し、次いで９５℃において５分間にわたって培養し、前述のように免疫ブロットにより分割した。
【００３５】
５．転写アレイ
ＬＰＳまたは他のＰＡＭＰｓのような強大な危険の信号により誘起される炎症を減少させるピドチモドの能力を、エフェクターの炎症性分子に特異的なｍＲＮＡの濃度を評価することにより、強調した。この範囲に対して、半自動抽出システムNucliSenc Easymag（Biomerieux）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次いで、「大容量ｃＤＮＡ逆転写キット」（Applied Biosystem）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。次に、遺伝子発現研究を実施するため、処理済み細胞または非処理細胞から誘導されるｃＤＮＡを、特異的Taqmanプライマー−プローブセット（Applied Biosystem）を用いるＰＣＲにかけた。得られたデータを、Relative Quantification Study Software (Applied Biosystems)を用いる２-ΔΔCt法を用いて分析した。それぞれの遺伝子のＣｔ値を、β−アクチンのＣｔ値に対して正規化した。
【００３６】
６．ＴＬＲ刺激によって誘起される炎症促進性分子の定量のためのＥＬＩＳＡ
サイトカイン合成の増大は、ＴＬＲ刺激に対する細胞の応答である。ピドチモドは、ＴＬＲ活性化によって誘発される炎症性シグナルの増幅を減少させるＮＬＲＰ１２の発現をアップレギュレートすることによって、炎症の広がりを統制する。ＰＭＢＣｓおよび／または精製された単球は、１〜２５μｇ／ｍＬのピドチモドで前処理された際または前処理されなかった際に、それぞれのＴＬＲリガンドの最適濃度で刺激されるかまたは刺激されない。そして、セル培養物の上澄みを、刺激開始から２４時間後に収集する。ＥＬＩＳＡ検定（Endogen）により、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１βの存在を、培養培地中で定量化する。
【００３７】
結果
インビトロ研究は、ヒトＭｏｎｏｍａｃ６細胞に対するピドチモドの直接的生物活性、ならびに、宿主に対して有害である過度の炎症応答を制御するピドチモドの能力を示した。これは、ＴＬＲｓ刺激によって誘起される炎症段階をインビトロで監視し、および、ピドチモド処理によって、それら炎症段階がサイトカインおよびケモカイン放出に関してどのようにレギュレートされるかによって実施された。さらに、ピドチモド活性の監視は、化合物による処理に続くその転写および発現を増大させるピドチモドの能力を研究することによるＮＬＲＰ１２の評価によって起こる。
【００３８】
次に、パターン認識レセプターに関連する経路の活性化に関連する一団の遺伝子の発現を、転写アレイを用いて分析した。処理の１６時間後、ピドチモド（２５μｇ／ｍＬ）は、ＮＯＤ様受容体のＮＬＲＰ１２発現の著しい増加を誘起することができた。刺激されていない細胞に比較して、ピドチモドにより刺激された細胞の遺伝子配列にて観察された２倍のＮＬＲＰ１２ｍＲＮＡ増大は、特異的定量的実時間ＰＣＲ検定により確認された。異なる刺激の時点（６、１６、２４および４８時間の刺激）における異なる濃度（２５、５および１μｇ／ｍＬ）のピドチモドで処理された細胞の分析は、この結果を確認し、２５μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬの分子を用いた刺激の２４時間後にＮＬＲＰ１２発現の増大のピークを示した（図１）。
【００３９】
健康な提供者の末梢血から誘導される原初単球もまた、このピドチモド効果に感受性であった。８人の異なる対象から精製された、試験されたサンプルの全てにおいて、ＮＬＲＰ１２ｍＲＮＡ発現の増加が観察された。処理されていない細胞と比較する際に、２５μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬの濃度のピドチモドによって刺激された単球は、刺激開始後２４時間および４８時間以内により高いレベルのＮＬＲＰ１２ｍＲＮＡピークを示した（図２）。
【００４０】
ＮＬＲＰ１２タンパク質発現も、ｍＲＮＡ発現の経過に追随した。Ｍｏｎｏｍａｃ６を５μｇ／ｍＬのピドチモドで３６時間にわたって処理し、特異的タンパク質免疫沈降時の免疫ブロットによってＮＬＲＰ１２発現レベルを評価した。非処理細胞と比較する際に、ピドチモドの存在下で培養された細胞から誘導されるサンプルにおいて、より多量のＮＬＲＰ１２タンパク質が検出された（図３）。
【００４１】
ＮＬＲＰ１２は、非標準的ＮＦｋＢ活性化およびｐ５２−依存ケモカイン発現を抑制する負の調節性のタンパク質であると定義され（Allenら、２０１２）、微生物産物のようなＴＬＲアゴニストによって活性化される潜在的に有害な炎症促進性活性を減衰させることにおいて重要な役割を果たす（Williamsら、２００５）。したがって、ピドチモドの効果は、単球を炎症的に活性化された発現型にする刺激により処理された原初ヒト単球により評価された。なぜなら、それら原初ヒト単球はＴＬＲｓを通して作用するからである。ピドチモド処理は、ＴＬＲアゴニストによって誘起される炎症メディエーターの広がりに対抗する。評価されたサンプルの全て（８人の異なる提供者に由来する８個のサンプル）において、図４に代表的に示されるように、特異的ＭＣＰ−１のレベルは、一貫して消失した。これらのデータは、他の鍵となる炎症促進性分子（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１β）を評価した際にも確認され、ピドチモドが、これらのメディエーターの産生を、転写レベルで制御することを示した。
【００４２】
ｍＲＮＡレベルにおいて得られたデータは、ＥＬＩＳＡによる細胞上澄み中に存在する炎症性分子の定量によって確認された。これらの結果は、精製された単球の代わりに全ＰＢＭＣを用いた場合でも再現可能であった。
【００４３】
最後に、代表的なＴＬＲのそれらに最適なアゴニストによる刺激の状況下で、ピドチモドによる細胞の前処理が、ＴＬＲ刺激によって単球中に誘起されるＮＬＲＰ１２のダウンレギュレーション（Williamsら、２００５）を制御するか否かを評価した。図５に示す結果は、ピドチモドの存在下で培養される細胞が、メッセンジャーレベル（左図）およびタンパク質レベル（右図）の両方においてＮＬＲＰ１２発現の減少にどのように対抗することができるかを強調する。
【００４４】
これらのデータは、ピドチモドが単球におけるＮＬＲＰ１２の発現をアップレギュレートできることを示す。結果的に、単球は、ＴＬＲアゴニストによって誘起される炎症メディエーターの産生をダウンモジュレートすることによってＮＬＲＰ１２活性化に応答し、それによって、宿主に対して有害な恐れがある過剰すなわち不適切な炎症を制御する。
【００４５】
（実施例２）
以下のｗ／ｖ組成を有する鼻腔中へ注入または噴射される溶液を調製した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
調製：  成分１〜３を、注入のための水に溶解させ、６．５のｐＨを有する均一な溶液が得られるまで混合する。
【００４８】
（実施例３）
以下のｗ／ｗ％組成を有する経口投与のための溶液を調製した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
調製
容器中で、成分１〜１０を、適当な量の精製水に溶解させる。透明な溶液が得られるまで混合する。水の残量を添加し、均一な溶液が得られるまで混合し、そして濾過する。
【００５１】
（実施例４）
以下のｗ／ｗ％組成を有する経口投与のためのタブレットを調製した。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
調製
容器中で、成分１および２を混合する。別の容器中で、成分４を適当な量の水に溶解させる。透明な溶液が得られるまで混合する。得られた溶液を、均一な粒状物が得られるまで、混合された成分１および２に吹き付ける。乾燥の後、得られた粒状物に、成分３および５を添加し、均一な混合物が得られるまで混合する。次いで、タブレット形成機を用いて、混合物を圧縮する。
【００５４】
（実施例５）
以下のｗ／ｗ％組成を有する水中油クリームを調製した。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
調製
主容器中で、成分１、２、３、４、５を、水の一部の中で可溶化する。キサンタンガムを添加し、均一になるまで激しく分散させる。別途、成分７を水の一部の中で可溶化し、次いで、攪拌しながらそれを主容器に添加する。相を７０〜７５℃に加熱する。別の容器中で、成分８、９、１０、１１、１２を組み合わせ、攪拌子ながら７０〜７５℃に加熱する。同一の温度に加熱された２つの層を組み合わせ、約１０分間にわたってホモジナイズする。４０°に冷却し、成分１３および１４を順次添加し、それぞれの添加後にホモジナイズする。緩和な撹拌下で、室温まで冷却する。
【００５７】
（実施例６）
以下のｗ／ｗ％組成を有する局所用溶液を調製した。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
調製
容器中で、成分１、２、３、４、６を、水中に可溶化する。成分７を添加し、透明な溶液が得られるまで混合する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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