(57)【要約】  本発明は、腸内毒素症の原因となる微生物のサンプルを取ることによって、哺乳動物、好ましくはヒトにおける腸内毒素症を治療する方法に関する。それは、サンプルが置換された後に、サンプルが健康な細菌のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで濃縮された後に行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象由来のサンプルであって、腸内毒素症状態の部位から得られ、微生物を含む、サンプルを得る工程と、
（ｂ）有益な微生物に有利な条件下で前記サンプルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する工程と、
（ｃ）培養された前記微生物のサンプルを前記対象に再導入する工程と、
を含む対象における腸内毒素症状態を治療する方法。
【請求項２】
有益な微生物に有利な条件下で、対象由来の腸内毒素症状態の部位由来の微生物を含むサンプルを培養することによって得られた、
対象における腸内毒素症状態の治療に使用するためのプロバイオティック組成物。
【請求項３】
賦形剤をさらに含む、
ことを特徴とする請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項４】
前記組成物は、腸内毒素症状態の部位への投与に適している、
ことを特徴とする請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項５】
前記対象は、ヒトである、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項６】
前記対象は、動物、好ましくは、畜牛、ウマ、家禽、ブタ、イヌ及びネコからなる群より選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項７】
前記腸内毒素症状態の部位は、腸、膣、口腔、気道及び皮膚から選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項８】
前記サンプルにおける前記微生物は、細菌である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項９】
前記有益な微生物は、乳酸桿菌、ビフィズス桿菌及びアッカーマンシアからなる群より選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの前記培養は、２日間を超えて維持される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１１】
前記再導入は、経口投与又は局所投与によって行われる、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１２】
培養され、濃縮された前記サンプルは、保存され、保存された前記サンプルからなるサンプルは、再発感染症といった再発腸内毒素症状態の症例の前記対象に投与するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）分娩時又は分娩の直前若しくは直後に、母体由来の膣微生物叢サンプルを採取する工程と、
（ｂ）培養中に有益な微生物のために前記サンプルが任意に濃縮され得るように、前記サンプルを任意に培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）又は工程（ｂ）から得られた前記サンプルの少なくとも一部を新生児に、好ましくは経口投与により投与する工程と、
を含む帝王切開で産まれた子どもにおける自己免疫疾患の発生を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物、医薬品、細菌学及び健康科学の分野に関する。より具体的には、細菌培養物の投与による細菌ベースの健康食品及び／又は治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、ＦＡＯおよびＷＨＯによって、十分な量で投与されたときに、宿主に有益な健康効果を与える、生きた微生物として定義されている。ほとんどの場合、経口投与されているが、該定義は、他の投与様式を除外するものではない。食品へのプロバイオティック細菌の添加は、腸内の有益な細菌の存在を促進することによって、個々のヒトまたは動物の健康を向上させるためのアプローチである。
【０００３】
微生物−微生物の相互作用においてプロバイオティクスが有する役割は、クロストリジウムディフィシル、ウェルシュ菌、大腸菌などといった病原性細菌を含む有害な微生物との栄養分および定着に対する他の競争を含む。プ酸性化を含むロバイオティクスは、例えば、乳酸およびその他の発酵によって引き起こされる、バクテリオシンといった抗菌物質の産生および／または制限された生理学的状態の作成によって機能し得る（非特許文献１）。
【０００４】
食事介入としてのプロバイオティクスの使用は部分的には、健康な腸内細菌叢から選択された特定の株が強力な抗病原性および抗炎症性を有し得、それゆえに腸の疾患に対する抵抗性をもたらし得るという概念に基づいている（非特許文献２）。ヒトを含む単胃動物では、共生微生物叢は、栄養素および病原体の結合部位に対する競争および／または免疫応答の調節によって病原体に対する腸の保護に貢献する。
【０００５】
多くのプロバイオティクス組成物は、歴史上の初期の頃から知られている。最古のプロバイオティクスは、ヨーグルト、テンペ、ジュースおよび大豆飲料といった通常の」発酵食品として我々が現在認識している製品の構成要素である。医学的に使用されるプロバイオティクスの概要は、非特許文献３によってもたらされてきた。
【０００６】
通常プロバイオティクスは、特定の微生物またはせいぜい特定の微生物の混合物を培養することによって提供される。これらが腸内毒素症の条件に対抗するために投与される場合は、これらのプロバイオティクスは、微生物叢を「正常化」し得る。近年、患者自身の種の微生物の１つ（またはそれ以上）を提供することが可能であり、おそらく、より好ましいことが見出された。このような方式は、「個別化された治療薬」の今日の発展に収まるであろう。一例が、特許文献１に記載され、微生物がヒトのサンプルから単離され、培養され、十分な培養後、同一のヒトに提供されている。その同じ文書において、微生物叢の回復、特に泌尿生殖器の微生物叢の回復は、患者から単離された細菌種で達成され得ることも提案されている。このために、細菌叢の修復またはメンテナンスを必要とする患者が健康であるときに、泌尿生殖生物が回収され、培養され、主な健康的な種が単離され、保存される。ヒトが、妊娠中または泌尿生殖器感染の間といった、人生のいくつかの後の時点で激減した泌尿生殖器微生物を有する場合、元々単離された生物を培養し、そして膣再移植または経口投与される。このようなアプローチは、治療を個別化し、かつ生物を利用し、それは、ヒトの健康と関連することが知られ、人生における一つの段階での免疫系による「自己」生物として認識される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／１１８，５７１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅ−  ａｎｄ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ａｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２２：１０７−１３８
【非特許文献２】Ｉｓｏｌａｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ？  Ｇｕｔ  ５０：５４−５９）
【非特許文献３】Ｂｌａｎｄｉｎｏ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｔｈｅｒ．  ６：４９７−５０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、この方法の一つの不利な点は、ヒトが（まだ）健康である間に、微生物をサンプリングし、単離し、及び保存する必要があるということである。
【００１０】
したがって、個別のプロバイオティクス治療を提供するための他の方法に対するニーズが今もなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（ａ）対象由来のサンプルであって、腸内毒素症状態の部位から得られ、微生物を含むサンプルを得る工程と、
（ｂ）有益な微生物に有利な条件下で前記サンプルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する工程と、
（ｃ）培養された前記微生物のサンプルを前記対象に再導入する工程と、
を含む対象における腸内毒素症状態を治療する方法に関する。
【００１２】
あるいは、本発明は、対象における腸内毒素症状態の治療に使用するためのプロバイオティック組成物を含み、組成物は、有益な微生物に有利な条件下で、対象由来の腸内毒素症状態の部位由来の微生物を含むサンプルを培養することによって得られた。好ましくは、このような組成物は、賦形剤をさらに含む。さらに好ましくは、このような組成物は、腸内毒素症状態の部位への投与に適している。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様において、対象は、ヒトである。他の好ましい実施態様において、対象は、動物、好ましくは、畜牛、ウマ、家禽、ブタ、イヌ及びネコからなる群より選択される。
【００１４】
さらに好ましい実施態様において、腸内毒素症状態の部位は、腸、膣、口腔、気道及び皮膚から選択される。
【００１５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、対象から採取されて培養されるサンプルにおける微生物は、細菌である。さらに好ましくは、有益な微生物は、乳酸桿菌、アッカーマンシア属及びバクテロイデス属からなる群より選択される。
【００１６】
また、好ましい実施態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの前記培養は、２日間を超えて維持される。
【００１７】
さらに好ましい実施態様において、培養された細胞は、経口投与又は局所投与される。
【００１８】
他の好ましい実施態様において、工程ｂ）において得られた、培養され、濃縮されたサンプルは、保存され、保存された前記サンプルのサンプルは、再発感染症といった再発腸内毒素症状態の場合の前記対象に投与するために用いられる。
【００１９】
本発明の他の実施態様は、帝王切開で産まれた子どもにおける自己免疫疾患の発生を抑制する方法であり、
（ａ）分娩時又は分娩の直前若しくは直後に、母体由来の膣微生物叢サンプルを採取する工程と、
（ｂ）培養中に有益な微生物のために前記サンプルが任意に濃縮され得るように、前記サンプルを任意に培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）又は工程（ｂ）から得られた前記サンプルの少なくとも一部を新生児に、好ましくは経口投与により投与する工程と、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】１６Ｓ  ｒＲＮＡの培養−独立４５４パイロシーケンシングによる種に関連した細菌性膣炎陰性（ＢＶ−）（ニュージェントスコア０−３）およびＢＶ＋（ニュージェントスコア８−１０）の同定。行は、対象における豊富な属および種を表し、この研究のために、２０名のＢＶ−および２０名のＢＶ＋の対象が選ばれた。
【図２】細菌性膣炎に関連した典型的な属は、健康な女性において主に存在することが知られている微生物叢に置換された。データは２名の個人由来のもので、左側はｔ＝０でのサンプル中の細菌種の概要を示し、右側は改変されたＣＤＭ培地中で２４時間培養した後に見つけられた細菌種を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（定義）
本明細書で使用される用語「プロバイオティック組成物」は、一つ以上のプロバイオティック生物と哺乳動物への適用に適した一つ以上の許容される賦形剤を含む組成物を指す。許容される賦形剤は、プロバイオティック組成物の調製の技術分野における当業者によく知られているであろうことが理解される。プロバイオティクス組成物の経口投与のためのそのような許容される賦形剤としては、例えば、ショ糖、異性化糖、ブドウ糖、果糖、パラチノース、トレハロース、ラクトース及びキシロース等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチノール（ｐａｌａｔｉｎｏｌ）、還元餅水飴、還元餅麦芽糖水飴などの糖アルコール、マルトデキストリン、トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、小麦デンプンのようなデンプン、などの多糖類、脂肪酸のスクロースエステルなどの乳化剤、脂肪酸のグリセリンエステルおよびレシチン、カラギーナン、キサンタンガム、グアーガム、ペクチンおよびローカストビーンガム等の増粘剤（安定剤）、クエン酸、乳酸、リンゴ酸などの酸性化剤、レモンジュース、オレンジジュース、ベリージュースなどのフルーツジュース、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、およびビタミンＥ等のビタミン類、カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛などのミネラルが含まれる。プロバイオティクス組成物の局所投与のための組成物は、さらに、または代替的に、例えば、ゼイン、修飾ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、およびコラーゲンなどのタンパク質を含む天然ポリマー、セルロース、デキストラン、およびポリヒアルロン酸などの多糖類、又はポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそれらの共重合体を含む合成ポリマーといったポリマーを含む。適切なポリアクリレートの例としては、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルをメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含む。合成的に修飾された天然ポリマーは、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースなどのセルロース誘導体を含む。適切なセルロース誘導体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート及び硫酸セルロースのナトリウム塩を含む。アルギネート、デキストラン、セルロース、コラーゲン、およびその化学的誘導体（アルキル、アルキレンといった化学基による置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および本技術分野の当業者によりごく普通になされる他の修飾）といった多糖類等の分解性ポリマー、およびアルブミン、ゼインといったタンパク質、並びにその共重合体および混合物、それら単独又は合成ポリマーとの組み合わせもまた、使用可能である。プロバイオティクスは、ヒドロゲルの形態で投与することも可能である。適切なヒドロゲルは、上述のようなセルロースおよびアルギン酸塩アルギネートといった天然ポリマーに加えて、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、並びにそれらの共重合体および混合物などの合成ポリマーから形成され得る。
【００２２】
経口使用のためのプロバイオティクス組成物は、ヨーグルトやカードなどの乳製品の形態で有利に提供されてもよい。
【００２３】
局所投与のためのプロバイオティック組成物は、クリームまたは軟膏の形態で適用され得る。このように、それらは、理想的には、植物、海産物または動物源由来の油性物質を含む。適切な液体油は、飽和、不飽和または多価不飽和油を含む。一例として、任意の割合での、不飽和油は、オリーブ油、コーン油、大豆油、キャノーラ油、綿実油、ヤシ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ルリジサ種子油、チョウジノキ油、麻実油、ニシン油、タラ肝油、サケ油、アマニ油、小麦胚芽油、月見草油またはそれらの混合物であってもよい。これらのクリームまたは軟膏はさらに、多価不飽和脂肪酸を含み得る。一以上の実施態様において、不飽和脂肪酸は、ω−３およびω−６脂肪酸の群から選択される。このような多価不飽和脂肪酸の例としては、リノール酸およびリノレン酸、γ−リノール酸（ＧＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。このような不飽和脂肪酸は、組成物の治療的利益に貢献する、皮膚コンディショニング効果が知られている。したがって、組成物は、ω−３油、ω−６油、及びそれらの混合物から選択された油を少なくとも６％を含み得る。エッセンシャルオイルもまた使用可能であり、それは治療上の活性な油とも考えられ、生物学的に発生する活性分子を含み、局所適用において、治療効果を発揮し、組成物においてプロバイオティクス混合物の有益な効果を、場合によっては相乗的に発揮する。治療上活性な油の別の部類は、局所的に適用された場合に治療効果を有することが知られている、液体の疎水性植物由来の油を含む。シリコーン油もまた使用され、それらの既知の皮膚保護及び閉塞特性に起因して所望される。適切なシリコーン油は、ポリアルキルシロキサン、ポリアリールシロキサン、ポリアルキルアリールシロキサン、ポリエーテルシロキサン共重合体、ポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリ（ジメチルシロキサン）−（ジフェニル−シロキサン）共重合体のような非揮発性シリコーンを含む。これらは、約３個から約９個、好ましくは約４個から約５個のケイ素原子を含む環状または直鎖状ポリジメチルシロキサンから選択される。シクロメチコンなどの揮発性シリコーンを使用することもできる。シリコーン油はまた、それらのバリア保持及び保護特性に起因して、治療的に活性な油と考えられる。
【００２４】
用語「腸内毒素症」は、微生物が、（ａ）微生物自体の内容又は量における定性的および定量的変化、（ｂ）それらの代謝活性の変化、および／または（ｃ）それらの局所分布の変化によって、有害な影響を作り出す状態と定義される。具体的には、膣の腸内毒素症は、健康な状態の逸脱として定義される。健康な状態は、性感染症に比較的低い感受性を有する状態として、この場合には定義される。ラクトバチルス属の活性は、乳酸を生成してその結果低いｐＨとすることによる病原体に対する膣環境の保護によって、この状態を維持するのに寄与することが広く受け入れられてきた。したがって、膣の腸内毒素症は、とりわけ、比較的高いｐＨ値の存在によって特徴付けられる。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「微生物」は、膣、口腔、皮膚、食品摂取に伴い肺または胃腸管といった宿主の器官に、（部分的に）定着する共生微生物、あるいは一過性の微生物のコミュニティをいう。しかしながら、これらの一過性の（訪問）菌は、いわゆる「常在微生物叢」の一部とはみなされていない。
【００２６】
本明細書で使用される「上皮」または「上皮細胞または組織」は、結合組織、筋肉組織、および神経組織とともに存在する、動物組織の４つの基本型の一つである。上皮組織は、身体全体の構造の空洞および表面を裏打ち（ｌｉｎｅ）し、また多くの腺を形成する。上皮細胞の機能は、分泌、選択吸収、保護、経細胞輸送及び感覚の検出を含む。
【００２７】
本明細書で使用する「粘膜」は、粘膜を示すために使用される用語である。粘液（形容詞フォーム：「粘液の」）は、粘膜により生成され、粘膜を覆う滑りやすい分泌物である。粘液の流体は典型的には、粘液腺に見られる細胞から産生される。粘液細胞は糖タンパク質及び水に富む生成物を分泌する。粘液はまた、漿液性細胞及び粘液細胞の両方が含まれている混合腺に由来していてもよい。これは、防腐性酵素（例えば、リゾチームなど）、免疫グロブリン、無機塩類、ラクトフェリンのようなタンパク質、粘膜及び粘膜下腺で杯細胞によって産生されるムチンとして知られているようなおよび糖タンパク質を含む粘性のコロイドである。この粘液は、哺乳動物における呼吸器、消化器、泌尿生殖器、視覚及び聴覚系における上皮細胞（管を裏打ちする）を保護するのに役立っている。
【００２８】
健康的な動物では、内部組織、例えば、血液、脳、筋肉などには通常、微生物存在しない。しかしながら、表面の組織、すなわち、皮膚および粘膜は、周囲の生物と常に接触しており、様々な微生物種が容易に定着するようになる。任意の解剖学的部位で通常見つけられる生物の混合物は、正常細菌叢、または好ましくは「常在微生物叢」と呼ばれる。ヒトの正常細菌叢は、いくつかの真核性の真菌及び原生生物からなるが、細菌は最も多く正常細菌叢の明白な微生物成分である。ヒトは生活を通して多種多様の微生物に晒されているが、限られた数の種だけは、利用可能な様々な身体部位に永久に定着することが可能であり、各身体部位は、ある特性の種から成る微生物コミュニティを保有する。身体部位の定住生物は、その部位で起こるコンディション下で成長及び繁殖し、一方で、そうすることができない生物は、一過性のものとしてみなされる。ほとんどの場合、定住生物は、身体部位内の基体に付着する−これは、（１）宿主の上皮細胞、（２）細胞外マトリックスの成分（粘液）、（３）別の微生物、または（４）宿主により生成された構造体（例えば歯）である。
【００２９】
（発明の実施態様の詳細な説明）
患者が腸内毒素症の症状を抱えている症例では、治療は、局所細菌叢のバランスの回復に注目されるべきである。既知の治療法は、培養された微生物の種の投与が中心となっており、単一の微生物がバランスを回復するために調製されるものである。いくつかの症例では、プロバイオティクスの混合物が利用可能であるが、大部分では単一培養物が適用されてきた。
【００３０】
近年では、特に、微生物の完全なサンプルを健常者から採取し、それを必要としている患者の腸の中にそれを移植する、腸内細菌叢の腸内毒素症のための治療が、次第に一般的になっている。しかしながら、細菌叢の組成において、対象から対象へときわめて大きな変化が存在すると考えられる。微生物の個別化は、いくつかの最近の研究で証明されている（例えば、Ｆａｉｔｈ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１２３７４３９）。これらの研究では、ゲノムの内容の＞９６％を共有して単離されたものとして定義された株は、無関係な個人間ではなく、個人内及び家族間で時間をかけて維持されてきたと考えられた。したがって、私たちの親及び兄弟から取得したものといった、早期の腸定着は、私たちの生活の大部分、もしかしたらすべてに対する生理学的、代謝学的及び免疫学的効果を発揮する可能性を有する。
【００３１】
免疫系およびそれと粘膜組織との関係は、この系の調節において重要であると考えられる。これは、微生物による定着に対する腸バリアの機能を研究したＳｈａｒｍａらによって実証されてきた（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，３０５８７９）。彼らは、この機能の複雑な統合および誌遂行が見事に腸管粘膜（ＩＭ）表面によって行われていると結論付けた。何兆もの管腔微生物にさらされ、ＩＭは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を通じて、自然免疫系へのシグナリングによる脅威を回避し、共生細菌への寛容（低応答性）を発展させることで共生細菌に応答する。系はまた、保護ペプチド、サイトカイン、ケモカインおよび食細胞を産生及び放出することによる病原体への保護によって作用する。ＩＭは常に管腔内容をサンプリングし、その辺境での分子調整を行っている。
【００３２】
このような変化は、対象間で見つけられるべきではないだけでなく、同一の対象を経時的に、微生物の大きな変動を経験し得る。これは、一例として、膣の微生物叢で証明され得る。出生時には無菌である膣は、数日以内に母体の乳酸菌が定着する。これは、正常なヒトの細菌叢は主に母親に由来するという説に同意する。ほとんどの場合、この微生物は、生涯を通して高頻度である。膣内において、その存在は、主にホルモンレベルにより影響を受ける。乳酸菌の存在は、グリコーゲンの利用可能性により強く影響を受け、そのレベルは、エストロゲンによって調節される。生後数週間、乳酸菌の集団の減少がみられ、それは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌および他の腸内細菌に有利である。その後、思春期に、乳酸菌の増殖のための理想的な条件が復元される（エストロゲンレベルの増加および膣粘膜の肥厚）。乳酸菌は、このように、成人女性の優勢な膣細菌叢となる。この期間中、膣分泌物における微生物集団は、約１０７−１０８ＣＦＵ／ｇとなる。この微生物集団は、閉経まで実質的に不変のままであり、より多様な微生物によって置き換えられた場合、思春期前の期間のそれと異なることはないが、マイコプラズマ及びより少ない程度での嫌気性細菌（例えば、ガードネレラバジナリス）のかなりの量の存在によるものである。
【００３３】
様々な研究は、種レベルで膣の乳酸菌を特徴づけることを試みてきた。これらの研究は、膣の微生物叢の組成の地理的な違いがあることを示す。しかし、多くの場合、アシドフィルス菌複合体と呼ばれるものに属する細菌は、妊娠可能年齢で優勢な種を構成しているようである。
【００３４】
細菌性膣炎は、膣微生物叢の異常な状態であり、それは、膣のｐＨの上昇、ラクトバチルス属の減少および膣内嫌気性細菌の多様性の増加によって特徴付けられ、腸内毒素症の例として特徴付けられ得る。細菌性膣炎は、有害な妊娠結果、上部生殖管の感染症および性感染症のリスク増加と関連している。
【００３５】
現在、対象における腸内毒素症を治療するための方法は、腸内毒素症が存在する部位から微生物のサンプルを採取し、有益な細菌種の成長に有利であり、および／または有益ではないまたは病原性種の成長に不利である条件下で、これらの微生物を培養し、培養物が微生物の存在下でより健全なバランスを取り戻すように十分に培養されたときに、前記の培養物のサンプルを同一対象に再導入することにより有利に実施されることが見出されている。もちろん、どの微生物が健康に有益であると考えられ、どの微生物が健康ではないと考えられるかは、サンプルが採取された身体の部位に依存する。膣を例とした場合、最も豊富な細菌属は、ラクトバチルス（ラクトバチルスクリスパータス、ラクトバチルスガセリ、ラクトバチルスイナーズ、ラクトバチルスジェンセニーおよび／またはラクトバチルスバジナリス）のそれであり、それは乳酸生産に関与し、膣の環境のために特徴付けられる。発酵によって膣の酸の生産に貢献する他の乳酸産生菌、すなわち、アトポビウム属、レプトトリキア属、ロイコノストック属、メガスフェラ属、ペディオコッカス属、ストレプトコッカス属およびウェイセラ属由来の種はまた、存在していてもよい。しかしながら、いくつかの嫌気性細菌種もまた、しばしば膣内にて発見されており、例えば、アトポビウムバジャイナ、ペプトストレプトコッカス属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、及びバクテロイデス属、フソバクテリウム属、ガードネレラバジャイナ、モビルンカス属、プレボテラ属などのグラム陽性球菌、および大腸菌などのグラム陰性腸内生物である。
【００３６】
膣の常在微生物叢は、皮膚において遭遇され得る常在微生物叢とは大きく異なる。そこでは、表皮ブドウ球菌、コリネバクテリウム、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカスワーネリ、アクネ菌、緑膿菌、ミクロ属、ペプトストレプトコッカス属及びマイコバクテリアが豊富であるが、その存在は、皮膚上の正確な位置に応じて異なり得る（例えば、手の甲の微生物叢は、足裏で見つけられた細菌叢とは大きく異なり得る）。
【００３７】
近年、プロバイオティクスの投与により利益を得ることが言及されている一つの部位は、肺、またはより一般的に気道である。内在性微生物叢が上部気道に存在しているだけでなく、内因性肺胞および細気管支に定着していることが、近年、確立されてきた（Ｃｈａｒｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １８４：９５７−９６３，  ２０１１）。そのようなものとして、それらは安定した環境を形成し、それらは病原性で感染を引き起こす細菌によって妨害され得る。
【００３８】
宿主の器官の一部に定着している共生細菌のコミュニティは、粘液層および上皮細胞に定着し、それはいわゆる脱落する表面を形成する（例えば、哺乳動物の腸は、４〜５日毎に更新される上皮細胞の単層で覆われている）。言い換えれば、私たちの体中の微生物によって定着された細胞の一定のターンオーバーが存在する。したがって、内腔に付着する微生物は、常に内腔に放出され、痰、唾液、糞便などから回収され得る。常在微生物叢のサンプルはまた、上皮表面（例えば膣スワブ）を採取することによって得られ得る。
【００３９】
細菌性膣炎の現在の治療に関しては、これは現在、ほとんどの場合、メトロニダゾールまたはクリンダマイシンのような抗生物質の投与によって達成される。しかしながら、これらの抗生物質は、多くの場合、効果がなく、有益な細菌（例えば、乳酸桿菌など）に有害であり、広い範囲の副作用および感染の再発に関連する。したがって、細菌性膣炎に起因する腸内毒素症の、本発明による方法での治療は、細菌性膣炎の治療における主要な改善である。
【００４０】
関連する実施形態において、帝王切開での新生児の接種のための母親の膣微生物叢の培養及び導入は、有利であるようである。帝王切開を介して産まれた新生児は、後の年齢で、１型糖尿病、クローン病、多発性硬化症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎および乾癬といった自己免疫疾患になりやすいことが知られている（Ｎｅｕ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｈｉｎｇ，  Ｊ．，  ２０１１，  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．  ３８（２）：３２１−３３１）。これらの自己免疫疾患が進展するための理由の一つは、特に幼児期に、過度にクリーンな環境がいくつかの子どもの時期の病気の進展に寄与し得ることを示唆する「衛生仮説」で説明される。最新の文献は、正常な胎児の消化管は無菌であることを示唆している。出産中およびその直後、母親および周囲の環境由来の細菌が、乳児の腸に定着する。帝王切開によって産まれた乳児は、母乳で育てた場合であっても、特に細菌が少なくその多様性も乏しいことが見出された。バクテロイデス種は、このような乳児において、不足していた（Ａｚａｄ，  Ｍ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｃａｎａｄ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓ．  Ｊ．  ＤＯＩ：  １０．１５０３／ｃｍａｊ．１２１１８９）。本発明の実施態様は、出生時に母親の膣微生物叢を採取し、任意にこのサンプルを培養し、任意にこの培養物においてサンプルを濃縮、乳児に（任意に培養され、任意に濃縮された）前記サンプル（の部分）を経口投与することである。
【００４１】
サンプルが、腸内毒素症がある身体内または身体上の部位から採取された場合、サンプルはいまだ有利な細菌種が含むが、それらは少数派であり、健康に有利ではないと考えられる種により圧倒されている（例えば、図２、左の２つの測定値）。本発明によれば、このようなサンプルはその後、有益な微生物の成長に有利な条件下で培養される。有益な微生物の増殖を支持する条件の決定は、身体の特定の部位に対して有益であると考えられている細菌の種類に依存することが理解されるであろう。上記から分かるように、膣サンプルについて、乳酸産生細菌、特にラクトバチルスの存在は、健康であると考えられ、したがってこれらは、有益な細菌の候補となるであろう。これは、膣サンプルの培養にとって乳酸産生細菌に有利な培養条件は、本発明の使用に適しているであろうことを意味する。
【００４２】
当業者は、ヒトまたは動物の身体の任意の部位から採取したサンプルにおける有益な細菌の培養に適しているであろう培養培地を選択することができるであろうことが考えられる。そのような培地の一つは、一般に「健康な細菌」であると考えられているラクトバチルス種の成長に有利な培地であろう。
【００４３】
ラクトバチルスＭＲＳ寒天（Ｄｅ  Ｍａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．２３：１３０−１３５，１９６０により導入された）（ＬＭＲＳ  ＡＧＡＲ）は、臨床検体ならびに乳製品および食品に見られるラクトバチルスの単離および培養のために意図された濃縮選択培地である。ＬＭＲＳ  ＡＧＡＲは、臨床検体ならびに乳製品および食品由来のラクトバチルスの培養に有用な濃縮選択培地である。この培地の主成分は、ペプトン酵母エキスおよびグルコースからなる。この培地は、ソルビタンモノオレエート複合体（脂肪酸の供給源）及び追加の成長に必要なマグネシウムが添加される。酢酸ナトリウム及びクエン酸アンモニウムは、グラム陰性菌、口腔細菌叢および真菌などの通常の細菌叢を阻害するために添加される。これらの阻害剤の両方を添加して、培地はラクトバチルスの増殖を選択的に改善することが示されている。ｐＨは、ラクトバチルスの増殖に有利であるように６．３−６．７に調整される。この媒地は、使用前の酸化生成物の形成を防止するために、無酸素条件下で調製され、分配され、貯蔵され、および包装される。
【００４４】
また、膣内細菌叢のラクトバチルスの増殖のために、我々は、Ｇｅｓｈｎｉｚｇａｎｉ  Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ  Ａ．Ｂ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９２  Ｍａｙ；３０（５）：１３２３−６に記載されるような、いわゆるＣＤＭ培地を使用した。この研究では、女性の生殖器分泌物をシミュレートした、化学的に定義された培地が、膣微生物叢の増殖のために開発された。膣の微生物叢の主要な成分の増殖の定性的および定量的な研究は、試験したすべての膣分離物が、この定義された培地中で増殖することができたことを示した。培地の濁度を減少させるために、ＣＤＭ培地を等モル量のＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏによりヘミン（鉄イオンの供給源）を置換することによって適合させた。
【００４５】
実験の部に示されているように、私たちは、２４時間、膣内細菌叢とのインキュベーションの間、乳酸産生に由来する培地の酸性化の結果としての、乳酸桿菌に対する増殖を確立した（乳酸桿菌は非常に酸耐性がある）。
【００４６】
ラクトバチルス種の次に、サンプルが採取された身体の部位に依存して、他の細菌が有益であると考えられ得、選択的な培養培地が、このような細菌の培養のために開発され得る。このような他の微生物の一例は、アッカーマンシア（例えば、アッカーマンシアムシニフィラ）であり、それは、消化管に優勢的および豊富に存在することが近年確立され、肥満の予防に有益である（Ｄｅｒｒｉｅｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌｕｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４：１４６９−１４７６，  ２００４；  Ｅｖｅｒａｒｄ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ｅａｒｌｙ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １３  Ｍａｙ  ２０１３，  １２１９４５１１１０）。アッカーマンシアムシニフィラを増殖させるために特別に開発された培地は、Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４に記載されている。
【００４７】
微生物のサンプルの起源に依存して、培養物は、いくつかのまたは多数の一過性の微生物を含み得る。これらの一過性の微生物は、「常在微生物叢」の一部ではなく、好ましくは除外されるべきである。場合によっては、多数の一過性の微生物を含む身体の部位（例えば、消化管）に対して、一過性の微生物と常在微生物を区別するのは複雑である。これらの一過性の微生物と常在微生物とを区別する（および分離する）のに役立ち得る基準の一つは、ヒトの組織に付着不可能であることである。
【００４８】
したがって、したがって、一過性の細菌の排除は、以下の方法の単独またそれらの組み合わせによって達成され得る。これらの方法は、微生物サンプルを培養する上述の方法への追加又は代替において用いられ得る。
（ｉ）サンプルの起源となる身体の部位の条件に非常に類似する培地の使用。常在微生物叢のための通常の環境に類似する条件が、一過的にのみ存在する微生物と比較して、それらの増殖を有利であることが提示される。局所的な身体の条件に類似する特定の培養条件が、常在微生物叢の利益になるといういくつかのエビデンスが、動的な腸モデルで近年確立されており、そこでは、粘膜環境を組み込むことが乳酸桿菌のためのサンプルの濃縮をもたらすことが実証された（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ａｂｂｅｅｌｅ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１２  Ｊａｎ；５（１）：１０６−１５．  ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊ．１７５１−７９１５．２０１１．００３０８．ｘ．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｏｃｔ  １２）。
（ｉｉ）粘膜および／または上皮への結合能をアッセイすることにより、一過性の微生物から常在微生物を分離すること。このような方法は、ラクトバチルスアシドフィルス菌の培養を扱うＥＰ１９９５３５に記載されている。 それらの種類の細菌を検出するためのアッセイは、Ｆａｋｈｒｙ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００９  Ｄｅｃ；１６０（１０）：８１７−２３．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｒｅｓｍｉｃ．２００９．０９．００９．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｓｅｐ  ２４）に記載されている。
（ｉｉｉ）項目（ｉｉ）で上述したように、粘膜または上皮への結合能をスクリーニングするのと同様に、粘液結合タンパク質のような、アドヘシンをコードする（または利用可能な抗体の使用により可能となる）遺伝子に対するハイブリダイゼーションまたはＰＣＲをベースとした実験による存在のスクリーニングが用いられ得る。多くの遺伝子およびタンパク質が知られており、それらはコンセンサス配列、特にタンパク質の機能的部分を有することで特徴付けられる多くのファミリーの遺伝子およびタンパク質の一部であり、それはすなわち粘膜組織又は上皮に結合する部分である。例えば、最も豊富なコンセンサス配列の一つは、細胞アンカーに特徴的であるいわゆるＬＰＸＴＧドメインである。
【００４９】
十分な培養の後に、培養物（の一部）は患者への再導入のために調製され得るが、培養物またはそれの残りの部分は、保存されてもよい。好ましい保存条件は、非常に低い温度（−８０℃）での保存である。このような場合、凍結保護剤が、当技術分野で一般的であるように、培地に（例えば、１５％グリセロールが）加えられるべきである。培養物の保存は、細菌ストック培養物の維持を可能とし、該ストック培養物からは、サンプルが何度も解凍され、新しい培養のための接種材料として使用され得る細菌ストック培養物の維持を可能にする。これにより、培養物の長期間の供給が可能となり、複数回の再導入が可能となる
【００５０】
サンプルが十分培養されている場合、すなわち有益ではない細菌に対して培養物中で使用可能な十分量の有益な細菌が存在する場合、サンプルは、元々由来していた身体の部位に再導入される。この再導入は、任意の利用可能な方法で、または培養したサンプルの任意の利用可能な製剤を用いて行われ得る。
【００５１】
培養されたサンプルは、プロバイオティック組成物としてそれを製剤化することによって再導入されてもよい。本明細書で定義されるプロバイオティック組成物は、任意の形態をとることができる。適切な場合（例えば、腸内細菌叢の場合）、それは経口投与され得、好ましくは局所適用され得る。局所適用されるとき、それは純粋な形態であってもよいが、それはまた、クリーム、フォーム、ローションまたは軟膏の形態で適用され得る。局所適用は、吸入による適用を含んでもよく、それは、例えば培養サンプルを口腔内に再導入する、あるいは肺を含む気道へ適用する場合に有利であり得る。口腔内への再導入のために、口腔内で崩壊する他の経口投与形態、例えば唾液中のアミラーゼの活性を介して適用され得る。
【００５２】
当業者に理解されるように、再導入されるプロバイオティクス組成物は、細菌培養物の投与のために必要または有利であろう賦形剤を含有していてもよい。多くの賦形剤は、既に本発明のプロバイオティクス組成物の定義に記載されているが、このリストは、医薬組成物または栄養補助食品組成物において使用される任意の賦形剤、担体又は添加剤により拡張され得る。しばしば古典的なプロバイオティクスのための媒材として使用される非常に有用な乳製品は、本発明のプロバイオティック組成物の口腔または消化管への送達のために使用され得る。
【００５３】
本発明の第２の実施形態は、腸疾患、具体的にはクロストリジウム・ディフィシレ感染症の再発の治療を含む。また、この症例では、バンコマイシンおよびメトロニダゾールを含む抗生物質を用いる治療が高頻度の再発と関連する。これはおそらく、結腸微生物叢の保護作用および再感染を引き起こすクロストリジウム・ディフィシル胞子の持続性の減少の結果として生じる。別の戦略としては、糞便細菌叢移植（ＦＭＴ）が、患者の感染結腸において健康な腸内細菌叢を復元するために良好に適用された。すでに背景技術の項目で示したように、この治療戦略は、微生物叢のドナーが患者の近親である場合、有益な細菌の宿主に定着する能力から利益を受ける。感染の再発に先行して採取された患者からの糞便細菌叢の培養および保存は、コストおよび糞便の移植に関連する複雑なロジスティック克服するため、現行の方法に勝る利点を提供する。また、サンプリングは、感染の時点でのみ行われ、それは治療が必要とされた時点で行われることを意味する。培養された（および濃縮された）サンプルは、感染の再発の時点で新たな接種物として保存および使用され得るという事実は無視されるべきではない利点である。多くの場合、最初の抗感染症の治療は部分的でしか有効でなく、本発明の方法は、感染症の克服に役立つ歓迎されるべき追加療法であろう。しかし、このような追加療法を行っても再発の危険性があり、その後は、濃縮された微生物の保存されたサンプルが有用となるであろう。
【００５４】
本発明の方法は、真に個別化されていることに留意すべきであるが、使用される方法は、それぞれの医療用途のための一般的なものである。原理は、特定の身体部位からの細菌のコレクションに由来する個体自身の有益な細菌の選択的濃縮に基づいている。濃縮された培養物のその後の投与は、今日利用可能なプロバイオティクスサプリメントに比べて、健全な微生物叢を回復させるのにはるかに効果的であると仮定される。
【００５５】
しかしながら、向上した一般化を有することも可能である。このような場合には、複数の被験者の（濃縮された）サンプルが収集され、すべての対象に対して比較的典型的な微生物を増殖させるためにさらに共培養される。このような「一般化された」増殖した微生物集団は、上述の方法により得られた培養物よりも個別化の程度が低いが、それは大多数の人々に対して十分に有効である。特に、腸内毒素症が急性であり急激に進展している場合には、すなわち前述したようにサンプルを得て培養する時間が十分にない場合には、遅滞なく投与され得るこのような「一般化された」サンプルを有する可能性は、非常に価値があり、特に腸内毒素症によって引き起こされる症状を少なくとも最小限に抑えることができる。
【００５６】
上記は、ヒトの状況に特に重点を置いて記述されているが、本発明はまた、獣医学的用途に有利に使用可能であることが提起される。特に興味深いのは、ウシ、ウマ、家禽、ブタ、イヌ、ネコ等といった経済的に重要なすべての種における腸の健康、口腔の健康及び膣の健康への適用である。このような適用の二つの具体例は、ブロイラー（産卵メンドリおよび卵における胚をも含む）における腸の健康への適用ならびに豚および子豚における腸の健康への適用である。両方の場合において、乳酸菌が腸内細菌叢を支配し、健康にプラスの方向に関連すると考えられる。また、ほんの数種の乳酸菌種が関与し、このことは、これらの例が、上記（および実施例に）に記載されているようなヒトの膣の状況に非常に類似していることを意味する。
【００５７】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１：膣微生物叢の濃縮）
（サンプリング）
ハイリスクな性行動を行う女性において、診療所での性感染症（ＳＴＤ）のためのごく普通のスクリーニングは、標準的な子宮頸検査を含む。ごく普通のサンプリングの間、綿棒を用いて粘液を採取し、ＡＭＩＥＳ輸送媒剤（これにさらに１５％グリセロールおよびシステイン溶液が追加された）でスクリューキャップの符号を付けたチューブ内に再懸濁した。その直後に、管を液体窒素に入れ、−８０℃で保存のために移した。グラム染色、Ａｍｓｅｌ基準、およびＳＴＤの状態は、通常の目的のためにいつものように診療所で得られる。細菌性膣炎（ＢＶ）の有病率は、通常、ハイリスクな性行動を行う女性のサンプリングされた集団において５０％観察された。
【００５９】
ニュージェントスコアリングを、保存前にすべてのサンプルで行った。ニュージェントスコアリングは、グラム染色スコアリングシステムであり、ＢＶを診断するパパニコロー検査のためにＲ．Ｐ  Ｎｕｇｅｎｔにより１９９１年に初めて記載された（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２９：２９７−３０１，  １９９１）。ニュージェントスコアは、大きいグラム陽性杆菌（ラクトバチルス形態型；ラクトバシラスの減少は０から４としてスコア化）、小さいグラム不定性桿菌（ガードネレラ膣形態型；０〜４としてスコア化）、および湾曲したグラム不定性桿菌（モビルンカス属形態型は；０〜２としてスコア化）の存在に対して評価することで算出され、０〜１０の範囲を取り得る。７〜１０のスコアは、ＢＶと一致する。
【００６０】
本研究では、８〜１０の範囲のニュージェントスコアを有するサンプルを選択した。そして、対照として、０〜３のニュージェントスコアの「健康状態」のサンプルが含まれた。
【００６１】
（濃縮）
再懸濁された膣スワブを含むスクリューキャップのチューブを、−８０℃の冷凍庫から取り出し、嫌気性条件下で、室温で解凍した。容量１３０μＬの懸濁液を、５０ｍＬのコーニングチューブ（培地の濁度を低減するために等モル量のＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏによるヘミン（鉄イオンの供給源）の置換によって変性）中の１３ｍＬの変性されたＣＤＭ培地（Ｇｅｓｈｎｉｚｇａｎｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０（５）：１３２３−１３２６，  １９９２）に移した。その後、嫌気条件下で、１００ｒｐｍ、３７°Ｃで２４時間培養した。
【００６２】
（バーコード１６Ｓによる（濃縮された）微生物の種の決定−アンプリコンシーケンシング）
可変領域Ｖ５−Ｖ７にわたる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンライブラリー作製の前に（Ｂｏｇａｅｒｔ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：  ：ｅ１７０３５，  ２０１１）、定量的１６Ｓ−ＰＣＲを行って、単離されたＤＮＡサンプル中の細菌テンプレートの相対量を決定した（Ｂｉｅｓｂｒｏｅｋ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７：ｅ３２９４２，  ２０１２）。アンプリコンライブラリーの配列分析を、４５４  ＧＳ−ＦＬＸ−チタンシーケンサー（ライフサイエンス社（ロシュ社）、ブランフォード、ＣＴ）で行った。ＦＡＳＴＡ−フォーマット配列および対応する品質スコアを、ＧＳアンプリコンソフトウェアパッケージ（Ｒｏｃｈｅ社、ブランフォード、ＣＴ）を用いて、ＧＳ−ＦＬＸチタンシーケンサーによって作製された．ｓｆｆデータファイルから抽出し、Ｍｏｔｈｕｒ  Ｖ．１．２２．２ソフトウェアプラットフォーム実装されたモジュールを使用して処理した（Ｓｃｈｌｏｓｓ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７５：  ７５３７−４１，  ２００９）。配列は、パイロシーケンシングエラー（「ｐｒｅ．ｃｌｕｓｔｅｒ」コマンド）に起因する傾向がある配列を除去する目的で、擬似単連鎖アルゴリズムを使用してノイズ除去を行った（Ｈｕｓｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２：１８８９−１８９８，  ２０１０）。潜在的キメラ配列が検出され、「ｃｈｉｍｅｒａ．ｕｃｈｉｍｅ」コマンドを使用して除去された（Ｅｄｇａｒ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７：２１９４−２２００，  ２０１１）。高品質の整列された配列は、ＲＤＰ−ＩＩナイーブベイズ分類を使用して分類された（Ｗａｎｇ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：５２６１−５２６７，  ２００７）。整列された配列は、平均リンケージクラスタリング手法を用いて、ＯＴＵｓ（１００％の類似性によって定義される）にクラスター化された。
【００６３】
（結果）
４５４の配列分析によって、８−１０のニュージェントスコアを有するサンプルにおけるＢＶに関連した属（ガードネレラ、バクテロイデス、パルビモナス、アトポビウム、スネアチア、プレボテラ、ジアリスタ、およびメガスフェラ含む）の存在、ならびに０−３のニュージェントスコアを有する過去に「健康状態」に関連した種（ラクトバチルスクリスパータス、ラクトバチルスガセリおよびラクトバチルスイエンセニーを含む）の存在が確認された。これは、過去に記載された調査結果を確認したものであった（Ｒａｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １０８：４６８０−４６８７  ２０１０）。
【００６４】
ＢＶ微生物叢の濃縮方法は、ＢＶ関連微生物叢の抑制および乳酸桿菌の蓄積をもたらした。例えば、ある症例では、１８％から９６％のトータルの乳酸菌の増加が得られた（最も豊富な種の表の概要について下記参照；すべての表は、ｔ＝０およびｔ＝２４の２つの複製を含む）。
【００６５】
【表１】
2016531131.tif 000002
【００６６】
（付記）
（付記１）
（ａ）対象由来のサンプルであって、腸内毒素症状態の部位から得られ、微生物を含む、サンプルを得る工程と、
（ｂ）有益な微生物に有利な条件下で前記サンプルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する工程と、
（ｃ）培養された前記微生物のサンプルを前記対象に再導入する工程と、
を含む対象における腸内毒素症状態を治療する方法。
（付記２）
有益な微生物に有利な条件下で、対象由来の腸内毒素症状態の部位由来の微生物を含むサンプルを培養することによって得られた、
対象における腸内毒素症状態の治療に使用するためのプロバイオティック組成物。
（付記３）
賦形剤をさらに含む、
ことを特徴とする付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記４）
前記組成物は、腸内毒素症状態の部位への投与に適している、
ことを特徴とする付記３に記載のプロバイオティック組成物。
（付記５）
前記対象は、ヒトである、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記６）
前記対象は、動物、好ましくは、畜牛、ウマ、家禽、ブタ、イヌ及びネコからなる群より選択される、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記７）
前記腸内毒素症状態の部位は、腸、膣、口腔、気道及び皮膚から選択される、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記８）
前記サンプルにおける前記微生物は、細菌である、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記９）
前記有益な微生物は、乳酸桿菌、ビフィズス桿菌及びアッカーマンシアからなる群より選択される、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記１０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの前記培養は、２日間を超えて維持される、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記１１）
前記再導入は、経口投与又は局所投与によって行われる、
ことを特徴とする付記１に記載の方法又は付記２に記載のプロバイオティック組成物。
（付記１２）
培養され、濃縮された前記サンプルは、保存され、保存された前記サンプルからなるサンプルは、再発感染症といった再発腸内毒素症状態の症例の前記対象に投与するために用いられる、付記１に記載の方法。
（付記１３）
（ａ）分娩時又は分娩の直前若しくは直後に、母体由来の膣微生物叢サンプルを採取する工程と、
（ｂ）培養中に有益な微生物のために前記サンプルが任意に濃縮され得るように、前記サンプルを任意に培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）又は工程（ｂ）から得られた前記サンプルの少なくとも一部を新生児に、好ましくは経口投与により投与する工程と、
を含む帝王切開で産まれた子どもにおける自己免疫疾患の発生を抑制する方法。
【図１】
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【図２】
2016531131.tif 000004
【国際調査報告】
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2016531131.tif 000006
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