(57)【要約】本発明は、例えば生殖補助医療における卵母細胞および胚の評価において用いられ得る、蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて卵母細胞および/または胚の代謝状態を評価するための新規な非侵襲的インビトロ方法を提供する。2016505263.tif 000006
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞または胚の質を評価するための方法であって、
（a）卵母細胞もしくは卵母細胞に付随した卵丘細胞または胚もしくは胚由来細胞より選択される試験細胞について内因性NADHまたはFADの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを取得するために、該試験細胞を蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）に曝露する工程；
（b）試験細胞全体または試験細胞の細胞質または試験細胞のミトコンドリアにわたり、NADH自家蛍光またはFAD自家蛍光またはその両方の蛍光寿命ヒストグラムを平均化する工程；
（c）試験細胞由来の測定された平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値の平均化蛍光寿命ヒストグラムと統計的に異なるかどうかを判定するために、試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムを平均化蛍光寿命ヒストグラム参照値と比較する工程；ならびに
（d）試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異ならない場合には、該卵母細胞を体外受精用に選択するまたは該胚を着床用に選択する工程、および試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異なる場合には、該卵母細胞を体外受精から除外するまたは該胚を着床から除外する工程
を含む、方法。
【請求項２】
寿命ヒストグラムを2つの指数関数の合計に適合させることによって統計的有意性を確立する工程を含み、かつ測定された細胞のパラメーターが、健常細胞に見出されるパラメーターの範囲内に入るまたは該範囲内に入らないと判断される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
測定結果と健常細胞との間で比較されるパラメーターが、2つの指数関数の振幅の比として定義されるα、および、より長い指数関数の寿命として定義されるβである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
健常細胞由来のαの最大値が1.0〜4.0の範囲内の特定の値であり、かつ健常細胞のβの対応する最大値が2000ps〜3000psの範囲にある、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
FLIMが、2光子蛍光励起において約740nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
FLIMが、1光子蛍光励起において約340nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
FLIMが時間領域で実施される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
FLIMが周波数領域で実施される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
FLIMが、2光子蛍光励起において約900nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
FLIMが、1光子蛍光励起において約450nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）の下で、2013年1月8日に提出された米国仮出願第61/750,061号の恩典を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、卵母細胞および/または胚の代謝状態を評価するための方法に関し、例えば生殖補助医療における卵母細胞および胚の評価において用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
生殖補助医療（ART）は、過去30年でヒト不妊症の治療に革命をもたらし、広く普及するようになった。ARTは、現在、米国における出産の1％超を占める（SART, 2005）。しかしながら、ARTの成功率は低く、サイクルの10％〜35％しか出生成功とはならず、高コスト、および結果として高い確率の多胎妊娠を引き起こす多数の胚の使用につながる。多胎妊娠は、乳児および母親の両方の死亡率および苦痛を大幅に増加させ、かつ実質的な金銭的コストを生じさせる。ARTによる多胎妊娠に由来する合併症は、米国において年間およそ10億ドルの医療費を占めると見積もられている（Bromer and Seli, 2008）。
【０００４】
ARTの成功率が低い主な理由の1つは、移植用の最も質の良い胚を選択するための確実な方法がないことである。胚の質を評価するための方法がないことが、胚の生存能力についての改善されたアッセイを開発しようとする実質的な試みにつながっている。胚の質を予測するための現在最も確実な方法は、標準的な透過型光学顕微鏡システムを用いて移植前に胚の形態を調べることであり、一部のクリニックは、UnisenseによるEmbryoScopeまたはAuxogynによるEPICなど、特殊顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングの実用性を検証している。しかしながら、選択基準は概して、主観的なままであり、上記で引用された約35％の成功率しかもたらしていない。ゲノム、トランスクリプトーム、またはプロテオームベースのアッセイを用いた、新たに提案された顕微鏡を使用しない方法（Uyar, et al, 2012）は、胚の生検を必要とし、ゆえに侵襲的でありかつ胚の生存率を著しく低下させる（Scott et al., 2006）。当初有望であったメタボロミックアプローチは、胚培養培地中の代謝物の変化を測定することによって、胚の代謝状態をアッセイすることであった（Botros, et al. 2008）。しかしながら、前向き無作為化試験では最近、そのようなメタボロミック評価の利用が形態学的評価単独と比べて選択を改善させなかったことを示した（Vergouw et al, 2012）。
【０００５】
生殖補助医療のための胚または卵母細胞の生存能力を評価するための、最小限に侵襲的で、簡易で、かつ確実な方法は、妊娠するために着床を試みなければならない回数を低下させることによって、およびまた多胎妊娠を減少させることによって、母親および胎児の安全性を改善する著しい進歩を提供し、かつまた生殖補助医療のコストを低減させるであろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、卵母細胞および胚の質を迅速に決定するための統合自動化システムを提供する。記載される方法は、最小限に侵襲的である。本発明者らは、これらの細胞または細胞培養培地をさらに操作することなしに、該細胞の代謝状態の直接解析が、インビトロアッセイにおけるNADHおよび/またはFADについての蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）を用いて確実にかつ迅速に、かつほとんどの場合には最小限の侵襲性で、実施され得ることを発見した。
【０００７】
ゆえに、本発明者らは、卵母細胞または完全胚を用いて、あるいは卵母細胞に付随した顆粒膜細胞もしくは卵丘細胞、または胚から生検された1個もしくは複数個の細胞を用いて、それらの代謝状態をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）および/またはフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）由来の自家蛍光を用いてFLIMで解析することによる、卵母細胞および胚を評価するための方法を提供する。タンパク質に結合したおよび/もしくは遊離のNAHDまたはタンパク質に結合したおよび/もしくは遊離のFADの蛍光寿命によって表される、客観的に測定された十分な代謝状態を有する細胞は、体外受精または着床用に選択され得る卵母細胞または胚を表し、代謝状態が不十分である場合、卵母細胞/胚は、体外受精または着床から排除され得る。
【０００８】
例えば、本発明者らは、非摂動卵母細胞がある範囲のαおよびβの値を呈することを示した（図1、丸）。図1に示されるように、卵母細胞の質は、卵母細胞の代謝状態に依存する。卵母細胞の代謝状態は、NADまたはNADHの蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）によって、迅速に、非侵襲的に、かつ定量的に測定され得る。2つのパラメーター（αおよびβ）は、卵母細胞におけるNADH（またはNAD）のFLIM測定結果から抽出される。実施例において、本発明者らはマウス卵母細胞を用いたが、マウスおよびヒト細胞などの哺乳類細胞は、この段階において、とくにそれらの代謝状態に関して比較的類似しているため、ヒト卵母細胞に対して類似の推定が機能すると予想される。それぞれの点は、１個の卵母細胞由来のデータに相当する。特異的代謝阻害剤（黒色の十字）または非特異的損傷（三角）によって卵母細胞を摂動させると、両パラメーターが増加する。非摂動卵母細胞（丸）は、ある範囲のαおよびβの値を呈する。これらのパラメーターは、卵母細胞の質の指標である。
【０００９】
NADH/FAD自家蛍光寿命を参照分布と比較することができ、これにより生存能力のある卵母細胞/胚および生存能力のない卵母細胞/胚を選択する簡便な手段が提供される。
【００１０】
NADH/FADの寿命分布は、2つの指数関数の合計として概算され得る。パラメーターαは2つの指数関数の振幅の比であり、パラメーターβはより長い指数関数の寿命である。NADHについてのαおよびβの両方の増加は、胚/卵母細胞における損傷の指標であることが見出された。ゆえに、典型的に、参照値と比較して増加したαおよびβの値を有する細胞は、それらが損傷していると見なされるため、ART手法から排除され、かつ参照値未満のαおよびβを有する細胞は、それらの代謝活性が健常な活性であることを示しているため、ART手法に選択される。
【００１１】
本発明の方法に従ったFLIM測定は、卵母細胞および胚の形態を判定するために体外受精クリニックで現在用いられているものよりもはるかに低い、極めて低レベルの照明で実施され得る。したがって、本発明の方法に従って実施されるFLIM測定は、卵母細胞および胚を摂動させないと考えられ、ゆえに可能な限り非侵襲的である。
【００１２】
したがって、本発明者らは、卵母細胞または胚の質を評価するための方法を提供し、該方法は、（a）卵母細胞もしくは卵母細胞に付随した卵丘細胞または胚もしくは胚由来細胞より選択される試験細胞について内因性NADHまたはFADの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを取得するために、該試験細胞を蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）に曝露する工程；（b）試験細胞全体または試験細胞の細胞質または試験細胞のミトコンドリアにわたり、NADH自家蛍光またはFAD自家蛍光またはその両方の蛍光寿命ヒストグラムを平均化する工程；（c）試験細胞由来の測定された平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値の平均化蛍光寿命ヒストグラムと統計的に異なるかどうかを判定するために、試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムを平均化蛍光寿命ヒストグラム参照値と比較する工程；ならびに（d）試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異ならない場合には、該卵母細胞を体外受精用に選択するまたは該胚を着床用に選択する工程、および試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異なる場合には、該卵母細胞を体外受精から除外するまたは該胚を着床から除外する工程を含む。
【００１３】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、方法は、寿命ヒストグラムを2つの指数関数の合計に適合させることによって統計的有意性を確立する工程を含み、測定された細胞のパラメーターは、健常細胞に見出されるパラメーターの範囲内に入るまたは範囲内に入らないと判断される。
【００１４】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、測定結果と健常細胞との間で比較されるパラメーターは、2つの指数関数の振幅の比として定義されるα、およびより長い指数関数の寿命として定義されるβである。
【００１５】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、健常細胞由来のαの最大値は1.0〜4.0の範囲内の特定の値であり、かつ健常細胞のβの対応する最大値は2000ps〜3000psの範囲にある。
【００１６】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、FLIMは、2光子蛍光励起において約740nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される。
【００１７】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、FLIMは、1光子蛍光励起において約340nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される。
【００１８】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、FLIMは、時間領域の代わりに周波数領域で実施される。
【００１９】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、FLIMは、2光子蛍光励起において約900nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される。
【００２０】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、FLIMは、1光子蛍光励起において約450nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される。
【００２１】
本発明のすべての局面において、方法はインビトロで実施される。該方法の非侵襲的な性質は、胚または卵母細胞に悪影響を及ぼすことなく方法を実施することを可能にする。
【００２２】
本発明のこれらのおよび他の局面、ならびに様々な利点および実用性は、好ましい態様についての詳細な説明および添付の図面を参照してより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】マウス卵母細胞におけるNADHについてのFLIMイメージング由来のデータを示している。非線形顕微鏡を用いて、生きた卵母細胞および胚の質を評価した。個々の卵母細胞由来のFLIM曲線を、2つの指数関数の合計に適合させた。パラメーターαは2つの指数関数の振幅の比であり、パラメーターβは、ピコ秒単位の、より長い指数関数の寿命である。それぞれの点は、１個の卵母細胞由来のデータに相当する。非摂動卵母細胞は、ある範囲のαおよびβの値を呈する。特異的代謝阻害剤（丸）または非特異的損傷（三角）によって卵母細胞を摂動させることは、両パラメーターを増加させる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明者らは、卵母細胞もしくは胚の内部の細胞内代謝物の自家蛍光についてのFLIMイメージングを用いて、あるいは卵母細胞を取り囲む1個もしくは複数個の卵丘細胞、または胚から生検された細胞を用いて、卵母細胞または胚の代謝状態を直接評価し得ることを見出した。次いで、許容される代謝状態を有する卵母細胞および胚を、体外受精または着床用に選択し得、かつ異常な代謝状態を有する卵母細胞および胚を、さらなる生殖補助手法から排除し得る。方法は、本発明者らが承知しているいかなる方法よりもはるかに侵襲性が低い過程で、胚/卵母細胞を解析する手段を提供する。
【００２５】
胚の質を評価するための方法は、（i）生殖補助医療による妊娠率を増加させるために；（ii）１個の「最良の」胚を移植することを妥当なものにすることによって多胎妊娠率を減少させるために；かつ（iii）凍結保存用に適した胚を適切に選択するために；かつ（iv）遺伝子導入的介入による子孫の効率を増加させるために、着床の可能性が最大なのはどの胚であるのかを予測するのに有用である。胚の質を評価するための方法は、（i）卵細胞質内精子注入法；および（ii）着床前細胞遺伝学的診断のための割球生検を含む、現在の侵襲的手順の卵母細胞および胚に対する影響または作用を評価するのにも有用である。
【００２６】
本方法において、本発明者らは、胚もしくは卵母細胞についての直接解析、または胚由来細胞についての解析、または卵母細胞を取り囲む卵丘細胞もしくは顆粒膜細胞についての解析による、胚および/または卵母細胞の代謝状態の検出にFLIMを適用する。
【００２７】
本明細書において使用するとき、「卵母細胞」とは、雌性生殖細胞を指す。本発明の方法に従って解析される卵母細胞は受精前に得られ、かつ解析はインビトロで実施される。
【００２８】
「着床前胚」または「胚」は、2個の前核を有する（胚盤胞に至るまで、および胚盤胞を含む）が、雌性生殖管の内膜に着床していない、体外受精を受けた卵母細胞を典型的に指すために本明細書において用いられる。一般的に、一態様において、着床前胚は、約2〜約8個の細胞を含有する（すなわち、胚は、受精後約18〜約70時間で評価される）が、とはいえこれらの範囲は種間で変動し得る。典型的に、ヒトまたはマウス胚に対する質評価は、2〜8個の細胞を含有する胚に対して実施される。
【００２９】
「胚由来細胞」とは、胚から生検された1個の細胞を指す。胚生検とは、胚を母親の子宮に移植する前に該胚から1個または複数個の細胞を取り出す工程を伴う手順である。それは、典型的に、特定の遺伝性疾患について胚を検査するために実施される。本発明の方法は、遺伝子解析を実施する前に、細胞に対して実施され得る。
【００３０】
卵丘顆粒膜細胞と卵母細胞との間の密接な物理的および代謝的な接触を考慮して、これら異種細胞についてのFLIM取得データは、卵母細胞の健常性と相関することが示されている。そのような手法は、照明による卵母細胞への悪影響の可能性を一切回避し、かつ安全性を証明するための臨床試験の必要も一切ない。本明細書において用いられる「卵丘細胞」および「顆粒膜細胞」という用語は、卵母細胞を取り囲みかつ卵母細胞に栄養分を与える特化した顆粒膜細胞である卵丘細胞を指す。これらの細胞は、十分に成長した卵母細胞を取り囲んで、卵丘−卵母細胞複合体（「COC」）を形成する。卵丘細胞（cumulus oophorus cell）、卵丘顆粒膜細胞（cumulus granulosa cell）、卵丘顆粒膜細胞（cumulus oophorous granulosa cell）、顆粒膜−卵丘細胞（granulosa-cumulus cell）という用語は、これらの細胞と、グラーフ卵胞の壁における機能的に異なる他の顆粒膜細胞の亜集団とを区別するために用いられる。卵丘細胞は、発生能の獲得のための重要な産物を提供し、かつそれらのホルモン応答およびそれらが産生する成長因子の点で、顆粒膜細胞とは異なる。卵丘細胞の欠如または不十分な数の卵丘細胞は、胚産生を損なう。培養下における裸化卵母細胞は、標準的授精による正常な受精を受けることができない。卵丘細胞は、卵母細胞の成熟の成功に必要とされる。これらの細胞は豊富な粘液弾性細胞外マトリックスを合成し、該粘液弾性細胞外マトリックスは卵胞からの卵母細胞の押出を促進し、卵丘塊（cumulus mass）の容積を20〜40倍に増大させ、かつおそらく精子に対する選択的バリアとしても機能する（Salustri, 2000）。卵母細胞成熟の間の細胞事象および分子事象、ならびに卵丘−卵母細胞複合体の細胞外マトリックスの形成に関して、Russel and Salustry（2006）およびKimura et al（2007）も参照されたい。卵丘細胞は、解糖経路の多くの酵素、およびまた中性アミノ酸輸送体の高い発現を示す。それらの発現は、卵母細胞によって分泌されるパラクリン因子によって促進され（Eppig et al, 2005；Sugiura et al, 2005）、卵母細胞自体はL-アラニンを取り込むことができず、かつエネルギー産生のためのグルコース代謝が乏しく、ゆえに卵丘細胞の供給に依存している（Biggers et al, 1967；Colonna and Mangia, 1983；Donahue and Stern, 1968；Eppig et al, 2005；Haghighat and Van Winkle, 1990；Leese and Barton, 1984, 1985）。卵丘細胞は卵母細胞に成長環境を提供するため、それらの代謝状態を、それらが支持する卵母細胞の代謝状態の代理として用いることができる。したがって、本発明のすべての態様の一局面において、方法は、体外受精用の卵母細胞を選択するためにまたは卵母細胞を体外受精から除外するために、1個または複数個の卵丘細胞を用いる。卵丘細胞は、授精またはICSI前に卵母細胞周辺から得られ、かつ解析はインビトロで実施される。
【００３１】
細胞は、典型的に、イメージングに適しておりかつ細胞培養培地を含むウェル中に、37℃で置かれる。
【００３２】
本明細書において言及される「参照値」は、典型的に、通常の健常卵母細胞、通常の健常胚、通常の健常卵母細胞周辺の卵丘細胞、または通常の健常胚由来の細胞など、同等の起源の通常の健常細胞を用いて評価される。類似した起源の健常な参照細胞を含むアッセイも提供されるが、参照値は、典型的に、平均化された実験由来の範囲であり、かつ典型的に事前に定められる。
【００３３】
本発明の方法は、典型的に内蔵型顕微鏡環境である装置、例えば体外受精クリニックにおいて受精用の卵母細胞および移植用の胚を選択するために典型的に用いられる、卓上顕微鏡ボックスなどのボックスを用いる。
【００３４】
方法は、卵母細胞または胚の代謝状態についての蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）の使用に基づく。装置の内部は、顕微鏡およびすべての周辺機器、ならびに顕微鏡ステージを包囲する環境チャンバーを含む、またはそれらから本質的になる。顕微鏡外面における小さなスロットは、顆粒膜細胞、卵母細胞もしくは胚、または胚から生検された細胞を含有する特注マルチウェルプレートを、顕微鏡ステージ上に挿入することを可能にする。例えば装置の外面に位置する、タッチスクリーン式モニターなどのスクリーンモニターは、制御装置を含有しかつ取得データを提示する。
【００３５】
任意の手順によって取得され得かつ任意の培地中に置かれ得る、卵母細胞および胚ならびに卵丘細胞および胚から単離された細胞に対して、装置を用いることができる。ゆえに、方法は、体外受精クリニックおよび胚または卵母細胞の評価が実施される他の環境における現在の実践に容易に適合する。
【００３６】
生細胞は、複雑に調節されたシステムである、エネルギー産生およびエネルギー利用のための化学反応を包含する。エネルギー生成に関与する代謝反応は、炭水化物、脂質、またはタンパク質などの高分子を分解する。細胞のエネルギー生成代謝経路のほとんどは、最終的に、アセチル補酵素A（アセチルCoA）の産生をもたらす。例えば、炭水化物はピルビン酸（pyruvate）へと代謝され、それはピルビン酸デヒドロゲナーゼシステムによってアセチルCoAへと酸化される。
【００３７】
アセチルCoAは、トリカルボン酸（TCA）回路、クレブス回路、またはクエン酸回路と代替的に呼ばれる一連の環状の酸化反応で完全に酸化される。ある特定のTCA回路酵素はサイトゾルにも見出され、そこでは該酵素は他の代謝経路で機能しているが、TCA回路酵素のすべてはミトコンドリア内に位置する。1回の完全なTCA回路におけるアセチルCoAの酸化により、2個のCO2分子、1つの高エネルギーリン酸結合（GTPに存在しているものなど）、および4つの還元等価物、すなわち3個のNAD＋および1個のFADからそれぞれ3個のNADHおよび1個のFADH2の産生がもたらされる。
【００３８】
NAHDおよびFADの測定は、細胞培養物においておよび前癌性上皮の解析においてこれまで用いられてきた（Skala et al., PNAS 104(49):19494-19499, 2007）。Skalaらは、タンパク質に結合したNADHの蛍光寿命の減少、およびタンパク質に結合したNADの蛍光寿命の増加が上皮癌の種々の状態と関連していることを示した。遊離のNADHおよびタンパク質に結合したNADHの蛍光寿命は、低酸素状態とともに減少し（Bird et al. Cancer Res. 65:8766-8773, 2005；Schneckenburger et al., J. Fluorescence 14:649-654, 2004）、かつインビボでの口腔癌のハムスター頬袋モデルの前癌状態において減少する（Skala et al. J. Biomed. Opt. 12:024014, 2007）ことも示されている。
【００３９】
代謝活性を評価する手段として卵母細胞/胚の培養培地中のピルビン酸レベルを測定することはいくつかの理由から不十分であることが、示唆されている。例えば、卵母細胞を取り囲む卵丘細胞から培地へのピルビン酸の寄与を予測することができない。加えて、卵母細胞/胚の代謝プロフィールは、未成熟卵母細胞から胚盤胞への胚の発生に関する栄養（例えば、基質）要件が変化することによって、複雑化する。卵母細胞および初期段階の胚において、細胞によって取り込まれるピルビン酸の大部分は、アセチルCoAを介して、ミトコンドリアTCA回路および酸化的リン酸化へと導かれる（Wales, R. et al, (1970) Aust. J. Biol. Sci. 23, 877-887）。ピルビン酸は、培養下における胚の第1および第2の卵割を補助するために必要とされ（Biggers, J. et al, (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58(2), 560-567）、一方でグルコースは、4細胞期までの発生は補助し得ない。グルコースは、胚盤胞によって必要とされる主要な栄養である（Brinster, R. et al, (1966) Exp. Cell Res. 42, 303-315）。培養下における細胞は、経時的に異なる栄養要件を呈する。例えば、培養細胞の酸化的代謝は経時的に減退し、そのような細胞は、同時に起こる乳酸（lactate）産生を伴う嫌気的解糖に次第に依存するようになる（Morgan, M. et al, (1981) Biosci. Rep. 1, 669-686）。ゆえに、例えば、インビトロで培養されてきたマウス胚盤胞は、新たに採取された胚盤胞のほぼ2倍の乳酸を産生する（Gardner, D. et al, (1990) J. Reprod. Fertil. 88, 361-368）。したがって、培養培地中のピルビン酸（栄養素）の単純な測定は、必ずしも卵母細胞/胚のミトコンドリアまたは代謝状態についての確実なまたは正確な測定法ではない。
【００４０】
卵母細胞/胚は、ミトコンドリアにおいて生じる代謝反応（例えば、トリカルボン酸回路および電子伝達）およびサイトゾルにおいて生じる代謝反応（例えば、解糖）の結果として細胞内に存在している定常状態濃度のNADHを含有する。代謝活性と卵母細胞/胚の生存能力との間の相関関係を見出すことが期待され得るが、過去の試みは、そのような直接的な相関関係を何も確立し得なかった。例えば、Conaghan et al, J. Assist. Reprod. Genet 10(1):21-30, 1993による研究では、ヒト胚によるピルビン酸の取り込みは着床に成功した胚を予測しないと報告された。
【００４１】
米国特許第5,541,081号における知見では、NADHを用いて胚/卵母細胞の代謝状態についての情報を得るために、卵母細胞/胚を対照培地中に置いて少なくとも1つの対照NAHD蛍光測定結果を得ることによって、卵母細胞/胚の内因性NADH濃度をまず低下させなければならないことが示唆された。対照の測定後、次いで、卵母細胞/胚を、栄養素を含む種々の培地にある期間供し、NADH濃度の変化を観察した。この解析は、時間がかかるだけでなく、胚/卵母細胞を特別な培地から別のものへ移動させる際に、胚/卵母細胞をさらなる不要なストレスに供する。
【００４２】
胚評価のための以前に報告された方法に反して、本発明の方法は、胚/卵母細胞/卵丘細胞/胚由来細胞をその培養培地の変化に供することなく、胚/卵母細胞/卵丘細胞/胚由来細胞の内部のNADHおよび/またはFADについての直接解析を可能にする。本発明者らは、FLIMの特異性により、胚/卵母細胞の代謝活性の指標でありかつ例えば着床の成功を予測するものであることを本発明者らが見出した、タンパク質に結合したおよび遊離のNADHおよび/またはFADの蛍光寿命を本発明者らが観察し得ることを示した。
【００４３】
蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）は、蛍光性サンプル由来の蛍光の指数関数的減衰率の差に基づいて画像を作成するためのイメージング技術である。FLIMは、共焦点顕微鏡法、2光子励起顕微鏡法、および多光子断層撮影法におけるイメージング技術として用いられ得る。
【００４４】
FLIMでは、その強度よりもむしろフルオロフォアシグナルの寿命を用いて、画像を創出する。これは、サンプルの厚い層の中で光子が散乱する影響を最小限に抑える利点を有する。
【００４５】
光子によって励起されたフルオロフォアは、いくつかの異なる（放射性および/または非放射性）減衰経路を介した減衰率に基づき、ある特定の確率で基底状態まで降下すると考えられる。蛍光を観察するために、これらの経路のうちの1つは、光子の自然放出によるものでなければならない。これは、化学センシングにおいて強度に基づかない測定を行うために利用され得る。
【００４６】
蛍光寿命は、パルス線源を用いることによって時間領域で決定され得る。
【００４７】
時間相関単一光子計数法（TCSPC）が通常採用される。より具体的には、TCSPCは、単一パルス後に、光電子増倍管（PMT）またはアバランシェフォトダイオード（APD）のようなものによって個々の光子が検出される時間を記録する。さらなるパルスに対して記録が繰り返され、十分に記録された事象後に、これらの記録された時点のすべてにわたる事象の数についてのヒストグラムを構築することができる。次いで、このヒストグラムを、関心対象のパラメーターを含有する関数に適合させることができ、ゆえにその結果パラメーターを抽出することができる。16〜64マルチチャンネルPMTシステムが市販されており、一方で最近実証されたCMOS単一光子アバランシェダイオード（SPAD）-TCSPC FLIMシステムは、さらなる低コストの選択肢を与え得る。
【００４８】
パルス励起は、ゲーティング法においてなおも用いられる。パルスがサンプルに達する前に、光の一部がダイクロイックミラーに反射して、CCD検出器の前に置かれているゲート光増強器（GOI）を制御する遅延発生器を活性化するフォトダイオードによって検出される。GOIは、遅延後にそれが開いている時間の画分に対する検出のみを可能にする。ゆえに、調整可能な遅延発生器を用いて、サンプルの蛍光減衰の時間範囲を包含する複数の遅延時間後の蛍光発光を回収することができる。
【００４９】
あるいは、蛍光寿命は、位相変調法によって周波数領域で決定され得る。連続的波源の強度は、例えば蛍光を変調させる音響光学変調器によって、高周波で変調する。励起状態は寿命を有するため、蛍光は励起シグナル毎に遅延し、寿命は位相シフトから決定され得る。また、励起および蛍光の正弦波のy成分は変調し、寿命はこれらy成分の変調比から決定され得る。それゆえ、位相変調法から、寿命に関する2つの値が決定され得る。その結果として、y成分および位相から抽出される寿命が一致しない場合、それは、サンプル中に1種を上回る寿命種を有することを意味する。
【００５０】
FLIMは、細胞および腫瘍における光感受性物質を検出するための方法として、ならびに比率計量（ratiometric）イメージングが難しい場合におけるFRETとして、生物学において主に用いられている。技術は、1980年代後期および1990年代初期に開発され（Bugiel et al. 1989、Konig 1989）、その後、1990年代後期により広く適用された（Oida T, Sako Y, Kusumi A（1993年3月）、「Fluorescence lifetime imaging microscopy (flimscopy). Methodology development and application to studies of endosome fusion in single cells」、Biophys. J. 64(3):676-85）。細胞培養において、それを用いて、EGF受容体シグナル伝達（Wouters FS, Bastiaens PI（1999年10月）、「Fluorescence lifetime imaging of receptor tyrosine kinase activity in cells」、Curr. Biol. 9(19):1127-30）、およびErbB1受容体輸送（Verveer PJ, Wouters FS, Reynolds AR, Bastiaens PI（2000年11月）、「Quantitative imaging of lateral ErbB1 receptor signal propagation in the plasma membrane」、Science 290(5496):1567-70）が研究されている。FLIMイメージングは、脳組織によって散乱する光が比率計量イメージングにとって問題となるニューロンにおいてとくに有用である（Yasuda R（2006年10月）、「Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy」、Curr. Opin. Neurobiol. 16(5):551-61）。ニューロンにおいて、パルス照射を用いたFLIMイメージングが、Ras（Harvey CD, Yasuda R, Zhong H, Svoboda K（2008年7月）、「The spread of ras activity triggered by activation of a single dendritic spine」、Science 321(5885):136-40）、CaMKII、Rac、およびRan（The design of Forester (fluorescence) resonance energy transfer (FRET)-based molecular sensors for Ran GTPase, in press P. Kalab, J. Soderholm, Methods（2010）ファミリータンパク質）の研究に使用されている。FLIMは、皮内癌細胞ならびに薬学的および化粧品用の化合物を検出するための臨床的多光子断層撮影法において用いられている。
【００５１】
本方法における細胞は、胚/卵母細胞/卵丘細胞/胚由来細胞に用いられる任意の適した細胞培養培地中で解析され得る。ゆえに、本方法は、細胞をいかなる異常な培地変化に供することも回避する。さらに、例えば081号特許におけるように、細胞の代謝状態を変化させる必要がないため、解析のためのさらなる時間を必要とせず、解析を高速かつ簡便にする。
【００５２】
測定は、1個の細胞あたり１つのFLIM画像を取得する工程からなり、これは、迅速かつ非侵襲的にまたは最小限に侵襲的に取得され得る。典型的には、調査される細胞を含有するサンプルをロードするのに、約1〜5分間、ときには30秒間〜2分間を要し、かつ、解析された卵母細胞/胚が、さらなる受精もしくは着床用に選択されるかまたはこれらの手順に最適に適合しないとして排除された後にデータを取得するのに、数秒間しか要さない。
【００５３】
FLIM測定は、ともに細胞内代謝に関与する分子であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）の自家蛍光を用いて、胚の内部で直接行われる。
【００５４】
本発明の方法において、細胞内情報は不要であるため、取得データは、典型的にその後細胞全体にわたって平均化され、1個の細胞あたり1つのFLIM曲線が作成される。
【００５５】
本発明者らは、本明細書において提供される本発明者らの実施例において、マウスの胚および卵母細胞を用いたが、ヒト細胞を解析する場合に、アッセイを変更する必要はないと考えられる。これらの発生段階の間、ヒトおよびマウスの胚および卵母細胞の代謝状態は類似しており、ゆえに、マウス卵母細胞/胚に関して得られた結果を、同様にヒト細胞に直接適用することができる。
【００５６】
本質的に、本発明の方法は、試験細胞について内因性NADHおよび/またはFADの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを取得するために、試験細胞を蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）に曝露する工程を含む。試験細胞は、卵母細胞もしくは卵母細胞に付随した卵丘細胞または胚もしくは胚由来細胞であってよい。
【００５７】
曝露前に、試験細胞は、クリニックで胚/卵母細胞を維持するのに用いられる任意の通常の細胞培養培地中に存在していてもよく、または置かれてもよい。胚発生のための培養培地は、胚の特定の発生段階に基づくアミノ酸およびエネルギーの要件に応えることによって、着床前胚の代謝要求を満たすであろう。
【００５８】
様々な培養培地がART手法において用いられかつ用いられてきており、それらのいずれかを本発明の方法において用いることができる。以下は、培養培地のいくつかの例を提供する。Earle、Ham's F10、TyrodeのT6、およびWhittenのWM1のような培養培地は異なる塩に基づき、培養下における体細胞および細胞株の発達を補助するように構成された。生理学的塩溶液として知られるこれらの培養培地は、Robert Edwardsが初めて成功させた体外受精（IVF）に用いられた。これらの培地は、培養されている細胞タイプに応じて、血清補給有りまたは無しで使用するために配合された。Ham's Nutrient Mixturesは、もともと、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のいくつかのクローン、ならびにHeLaおよびマウスL細胞のクローンの成長を補助するために開発された。
【００５９】
Menezo et al., 1984では、アミノ酸の供給源として血清アルブミンを添加することが示唆された。血清タンパク質により、卵母細胞および胚が、それらを操作するために用いられるピペットのガラス表面に付着しないことが確実になる。B2と称される培地は、今日まで使用され続けている。1985年にQuinnらは、Fertility and Sterilityという雑誌において、胚が曝露されるインビボ環境を模倣したHuman Tubal Fluid（HTF）と称される配合を発表した。HTFの配合は、当時知られていたヒト輸卵管中の流体の公知の化学組成に基づいていた。この培地は、アミノ酸を含まない単純な平衡塩溶液に基づくが、カリウムの濃度は、ヒト雌性生殖管において測定されるものに調整されていた。この培地は、開発されたそれまでの培地と比較してより良好であることが見出された。
【００６０】
HTF培地への全血清または血清アルブミンのいずれかの添加は、培養の2日目または3日目に、例えば培養下1〜4日間、培養下2〜3日間、培養下2〜4日間で移植されるヒト胚のための培養培地の作製の至適基準になった。
【００６１】
典型的に、胚を培養する工程は、胚の発生段階に応じた特定の要求に応えることを伴うと考えられる。エネルギー源要件は、8細胞期までの胚が母性遺伝子制御下にある間のピルビン酸−乳酸選好性から、8細胞から胚盤胞へのそれらの発生を補助する胚性ゲノムの活性化後のグルコースベースの代謝へと変化する。この観察結果が、最初の市販の培地の開発につながる。開発された培養培地はHTFに基づき、両培地は、無機リン酸塩、グルコース、およびアミノ酸を含んでいなかった。Poolおよび彼の同僚らは、グルコースおよびリン酸塩を含んでいないHTFを配合した。胚を分割する工程は、エネルギー源としてピルビン酸および乳酸、ならびにタンパク質代謝のために非必須アミノ酸（NEAA）を用いる。8細胞期から主要なエネルギー源はグルコースであり、かつタンパク質代謝のために胚は必須アミノ酸（EAA）を用いる。これらの知見が、逐次的に用いられる2種の培養培地G1およびG2の組成の開発につながる。G1は、接合体である受精卵母細胞のインビトロ発生を8細胞期まで補助し、かつG2は、8細胞から胚盤胞まで補助する。これらの培地のいくつかの改変型も存在し、当業者に周知である。現在、Sequential mediaが、世界中でIVF治療において用いられ成功している。
【００６２】
上記で考察された培地のいずれも、本発明の方法に従って試験細胞を撮像する際に用いることができる。
【００６３】
典型的組成の胚培養培地には、リン酸塩緩衝液またはHepes有機緩衝液を含有する培養培地が含まれ、これは、インキュベーターの外部での配偶子の取り扱い、卵胞のフラッシング、および顕微操作を伴う手順に用いられる。ほとんどの培養培地についてのpHおよび浸透圧は、pHを7.2〜7.4の範囲に維持するために重炭酸塩/CO2緩衝系を利用する。培養培地の浸透圧は、275〜290ミリオスモル/kgの範囲にあるべきである。本発明の方法に従って細胞を撮像する間、同様の条件が最適に維持されるべきである。
【００６４】
加えて、ヒト卵母細胞は温度感受性であり、卵母細胞の受精および胚の培養には、37.0〜37.5℃の温度設定を備えた加湿インキュベーターが用いられるべきである。本発明の方法に従って細胞を撮像する間、同様の温度が最適に維持されるべきである。
【００６５】
胚は、培地の蒸発を防ぐパラフィンオイル下で培養されるべきであり、これにより一定の浸透圧が保たれる。オイルは、胚を顕微鏡による評価のためにインキュベーターから取り出す際のpHおよび温度の変動も最小限に抑える。パラフィンオイルは、配偶子および胚に対する毒性を有する可能性があり、したがって、ヒト胚の培養における使用の前に、オイルのバッチをマウス胚に対してスクリーニングしかつ試験しなければならない。本発明のFLIM解析を実施するために、オイルを除去する必要はない。
【００６６】
培地は、99％水からも構成される。水の純度は重要であり、典型的に限外濾過によって達成される。
【００６７】
アルブミンまたは人工血清は、典型的に、5〜20％（それぞれ、w/vまたはv/v）の濃度で添加される。市販培地は、典型的に、組成が周知である人工血清を含む。
【００６８】
市販のIVF培地は、典型的に、例えば以下の成分のうちの1種または複数種を含む：人工血清、組換えアルブミン、MTF中の塩溶液、NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl22H2O、MgSO47H2O、NaHCO3、および炭水化物。
【００６９】
炭水化物は雌性生殖管内に存在している。それらの濃度は、卵管の全長にわたっておよび子宮内で変動し、サイクルの時期にも依存する。
【００７０】
アミノ酸とともに、炭水化物は胚の主要なエネルギー源である。接合体の発生を8細胞まで補助する培養培地は、ピルビン酸および乳酸を含有する。一部の市販培地はグルコース不含であり、一方それ以外は、通常の受精の間の精子の要求を満たすために、非常に低濃度のグルコースが添加される。
【００７１】
8細胞胚の胚盤胞期までの発生を補助する培地は、低濃度でのピルビン酸および乳酸、ならびに高濃度のグルコースを含有する。
【００７２】
アミノ酸による培養培地のアミノ酸補給は、胚発生に不可欠である。接合体の8細胞までの発生を補助する培地は、しばしば、非必須アミノ酸をさらに補給される。プロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸。8細胞胚の胚盤胞期までの発生を補助する培地は、典型的に、必須アミノ酸：シスチン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、バリン、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンを補給される。
【００７３】
ART研究室の大多数は、微生物の増殖の危険性を最小限に抑えるために、抗生物質を含有する培養培地を用いる。最もよく用いられる抗生物質は、ペニシリン（β-ラクタム系グラム陽性菌が細胞壁の完全性を乱す）およびストレプトマイシン（アミノグリコシド系グラム陰性菌がタンパク質合成を乱す）である。ペニシリンの抗菌作用は、これが、細菌細胞壁の固有の糖タンパク質であるペプチドグリカンの合成を阻害できることに起因する。ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンは、細菌のタンパク質合成を阻害することによってそれらの抗菌作用を発揮する、アミノグリコシド群の抗生物質に属する。ゲンタマイシンの使用は依然として賛否が分かれており、それはすべての研究室によって用いられているわけではない。
【００７４】
培養培地はまた、接合体期から8細胞までの胚を補助しかつ異常な解糖を防ぐ、培地中のキレート剤として用いられるEDTAも含むことが多い。
【００７５】
前述のように、本発明の方法は、培地のタイプに依存しない。細胞は、FLIM解析中にそれらに対するさらなるストレスを避けるために、それらが培養された培地および条件で存続させるべきである。
【００７６】
方法は、試験細胞全体または試験細胞の細胞質または試験細胞のミトコンドリアにわたり、NADH自家蛍光またはFAD自家蛍光またはその両方の蛍光寿命ヒストグラムを平均化する工程をさらに含む。
【００７７】
さらなる生殖補助手法用の健常細胞を選択可能にするために、方法は、試験細胞由来の測定された平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値の平均化蛍光寿命ヒストグラムと統計的に異なるかどうかを判定するために、試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムを平均化蛍光寿命ヒストグラム参照値と比較する工程も含む。比較する工程は典型的に、コンピューター実行可能ソフトウェアを典型的に用いた非人間的機械を用いて行われ、参照値とそれぞれ個々の細胞FLIM解析由来の値との間の比較を含む。
【００７８】
NADHと同様に、FADの自家蛍光も、本発明の方法においてFLIMを用いて解析され得る。
【００７９】
細胞由来のNADHについてのFLIM曲線は、タンパク質に結合したNADHに相当する長寿命（約2.5ナノ秒（ns））および遊離のNADHに相当する短寿命（約0.4ns）を有する、二重指数関数的減衰を呈する。ゆえに、FLIM曲線は、タンパク質に結合したNADHおよび遊離のNADHの相対画分を反映する長寿命および短寿命の相対画分を有する二重指数関数である。これは、細胞の代謝状態についての直接読み出しを提供する（Lacowciz et al., 1992）。長寿命は1〜3（ナノ秒）nsで変動し得、かつ短寿命は0.2〜0.7nsで変動し得る。
【００８０】
遊離状態および結合状態におけるこれらの寿命の正確な値は、pHなどの多様な細胞内要因に依存する（Ogikubo et al., 2011）。長寿命および短寿命の相対画分、ならびにこれら寿命の正確な値は、典型的に、最小二乗適合を用いて決定される。しかしながら、ベイズ推論手法は、より少ない数の光子でさらにより正確なパラメーター概算および参照概算を可能にし得、さらに少ない光を用いてさらなる信頼性を得ることが可能となり、かつサンプル曝露をさらに最小限に抑える。
【００８１】
NADH（還元型）の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルは、種々のレベルの組織において、すなわち溶液中、ミトコンドリアおよび細胞の懸濁液中、組織切片内、ならびにインビトロおよびインビボの器官内で、十分に特徴付けされている。NADHは、約300〜380nmに光吸収帯、および420〜480nmに蛍光発光帯を有する。異なる環境および測定条件ごとに、スペクトルの形状および最大値にわずかな差はあるものの、スペクトルは同じと見なされる。しかしながら、とくに組織からインビボで測定された場合に、蛍光帯の強度は環境の組織レベルとは無関係にミトコンドリアNADH（還元型）の濃度に比例するという共通の合意がある（例えば、Avraham Mayevsky and Gennady G. Rogatsky, Am J Physiol Cell Physiol February 2007 vol.292 no.2 C615-C640による総説を参照されたい）。
【００８２】
したがって、本発明のすべての態様のいくつかの局面において、NADHの直接自家蛍光は、2光子蛍光励起において約740nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いるFLIMで解析され得る。
【００８３】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、NADHの直接自家蛍光は、1光子蛍光励起において約340nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いるFLIMでも解析され得る。
【００８４】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、FADの直接自家蛍光は、2光子蛍光励起において約900nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いるFLIMで解析され得る。
【００８５】
FADの直接自家蛍光は、1光子蛍光励起において約450nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いるFLIMで解析され得る。
【００８６】
本発明の方法に従って解析される胚は着床前胚であり、かつ解析はインビトロで実施される。同様に、胚から得られる細胞は着床前胚から得られ、かつ細胞生検はインビトロで実施される。
【００８７】
細胞を単に、NADHに適した波長次いでFADに適した波長に、またはFADの蛍光寿命を撮像するのに適した波長次いでNAHDの蛍光寿命を撮像するのに適した波長に、逐次的に曝露することによって、NAHDおよびFADのFLIMを用いた解析を組み合わせることができる。したがって、本発明のすべての態様のいくつかの局面において、方法は、FADおよびNADHの逐次的解析を含む。
【００８８】
解析は、典型的に、30秒間〜5分間という短時間しか要さず、かつ多重化および自動化され得る。
【００８９】
ゆえに、本発明者らは、卵母細胞または胚の質を評価するための方法を提供し、該方法は、（a）顆粒膜細胞、卵母細胞、胚、または胚由来細胞におけるNADHの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを取得するために、培地中で、顆粒膜細胞、卵母細胞、胚、または胚由来細胞を蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）に曝露する工程；（b）顆粒膜細胞、卵母細胞、胚、または胚由来細胞の全体にわたり、NADHの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを平均化する工程；（c）NADHの自家蛍光の平均化蛍光寿命ヒストグラムを2つの指数関数の合計に適合させる工程；および（d）顆粒膜細胞、卵母細胞、胚、もしくは胚由来細胞であるかにかかわらず、αがα参照値未満でありかつβがβ参照値未満である細胞が検出された場合、該卵母細胞もしくは該胚を体外受精もしくは着床用に選択する工程、または、顆粒膜細胞、卵母細胞、胚、もしくは胚由来細胞であるかにかかわらず、αがα参照値に等しいかもしくはそれより大きくかつβがβ参照値に等しいかもしくはそれよりも大きい細胞が検出された場合、該卵母細胞もしくは該胚を体外受精から排除する工程を含む。細胞は、胚、卵母細胞、または胚から抽出された細胞、または卵母細胞を取り囲む卵丘細胞であってよい。いくつかの局面において、方法は、αがα参照値未満であり、かつβがβ参照値未満である、卵母細胞または卵母細胞周辺由来の1個もしくは複数個の卵丘細胞のいずれかの細胞が検出された場合、該卵母細胞を体外受精する工程、あるいはαがα参照値未満でありかつβがβ参照値未満である胚由来細胞または胚が検出された場合、該胚を着床させる工程をさらに含む。
【００９０】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、α参照値は1と4との間、例えば、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、または2〜3、または2〜4、または1〜2、または1〜3である。本発明のすべての態様のいくつかの局面において、α参照値は1.7である。
【００９１】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、β参照値は、2000ps〜3000ps、または2000〜2500、または2500〜3000、または2000〜2250、または2000〜2750である。すべての態様のいくつかの局面において、β参照値は2250ps（ピコ秒）である。図1は、卵母細胞の評価のための適切なαおよびβの値の例を提供している。
【００９２】
本発明者らの予備的解析は、モデルとしてマウス卵母細胞を用いて実施されたが、ヒトおよびマウスの両方における卵母細胞および胚の代謝状態は、ほとんど同一である。したがって、マウスの卵丘細胞、卵母細胞、および/または胚における代謝状態のFLIM解析から得られた参照値を、ヒトの卵母細胞および胚の解析に直接適用することができる。参照値は、ヒトの卵丘細胞、卵母細胞、および/または胚からも取得され得る。
【００９３】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、NADHのFLIMは、2光子蛍光励起において約740nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される。
【００９４】
本発明のすべての態様のいくつかの局面において、１つの画像を取得するだけでなく、異なる時点における複数のFLIM画像を獲得する。この種類のタイムラプスデータがより豊富であると、その結果細胞についてのより多くの情報を提供し得る。しかしながら、それは細胞がより長い時間装置内にあることを必要とし、それらはより多くの光に曝露され、それによって、方法の侵襲性をわずかに増加させる。
【００９５】
記載される方法は、典型的に、伝統的顕微鏡の成分のほぼすべてを含有するシステムを用いて実施される。ゆえに、該方法を、同様に形態学的タイムラプスデータについての解析と組み合わせることができる。
【００９６】
FLIM測定を実施するための以下の考え得る3つの選択肢が存在し、それらのすべてが本発明の方法において用いられ得る：ポイント検出器を備えた2光子励起、ポイント検出器を備えた1光子励起、またはエリア検出器（すなわち、カメラ）を備えた1光子検出。下記の表は、該選択肢のそれぞれについての利点を示している。本発明者らは、本発明者らの実施例において2光子法を用いた。
2016505263.tif 000003
【実施例】
【００９７】
本発明者らは、マウス卵母細胞におけるNADHのFLIMに関する予備データを取得した。予備データは、FLIMシステムで取得された。顕微鏡は、チタン-サファイアフェムト秒レーザー（Spectra-Physics）、倒立顕微鏡土台（Nikon）、走査ヘッド（Becker & Hickl）、ハイブリッド型PMT検出器（Hamamatsu）、および時間相関単一光子計数法のための電子機器（Becker & Hickl）からなる。この顕微鏡を組み立てて、予備データを取得した。
【００９８】
卵母細胞を、顕微鏡ステージ上の培地中に置いて撮像した。各卵母細胞の１つの画像を、卵母細胞全体にわたりFLIMデータを平均化することによって解析した。卵母細胞全体にわたって平均化された、NADH由来の取得された蛍光寿命ヒストグラムを、2つの指数関数の合計に適合させた。パラメーターαは2つの指数関数の振幅の比であり、パラメーターβはより長い指数関数の寿命（ピコ秒単位）である。
【００９９】
非摂動卵母細胞は、ある範囲のαおよびβの値を呈することを示した（図1、丸）。図1に示されるように、卵母細胞の質は、卵母細胞の代謝状態に依存する。卵母細胞の代謝状態は、NADまたはNADHの蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）によって、迅速に、非侵襲的に、かつ定量的に測定され得る。2つのパラメーター（αおよびβ）は、卵母細胞におけるNADH（またはNAD）のFLIM測定結果から抽出される。実施例において、本発明者らはマウス卵母細胞を用いたが、マウスおよびヒト細胞などの哺乳類細胞は、この段階において、とくにそれらの代謝状態に関して比較的類似しているため、ヒト卵母細胞に対して類似の推定が役立つと予想される。それぞれの点は、１個の卵母細胞由来のデータに相当する。特異的代謝阻害剤（黒色の十字）または非特異的損傷（三角）によって卵母細胞を摂動させることは、両パラメーターを増加させる。非摂動卵母細胞（丸）は、ある範囲のαおよびβの値を呈する。これらのパラメーターは、卵母細胞の質の指標である。
【０１００】
代謝阻害剤を適用することによって（図1、黒色の丸）、または卵母細胞を意図的に損傷させるためにレーザー出力を大幅に増加させることによって（図1、三角）、卵母細胞が摂動した場合に、αおよびβは両方とも増加する。そのような損傷は、イメージングに用いられる低いレーザー出力では生じない。
【０１０１】
本発明者らの結果は、αおよびβの低い値が、卵母細胞および胚の健常性の指標であることを示している。全ての摂動卵母細胞は、1.7より大きいαおよび2250より大きいβを有する上部四分円中に見出される。このことは、αおよびβについてのこれらの値がカットオフとして用いられ得、これらの値を上回る卵母細胞は非健常であり得るとして拒絶され、かつこれらの値を下回る卵母細胞は健常であると判断されかつ使用に選択されることを示している。
【０１０２】
ヒトおよびマウスの卵母細胞の代謝は非常に類似しており、ゆえに、マウスに対して確立されたαおよびβのカットオフ値を、同様にヒト解析に用いることができる。
【０１０３】
αおよびβの値は、定量的に、迅速に、かつ客観的に取得される。ゆえに、記載される手法は、体外受精クリニックにおいて大いに有用である。
【０１０４】
参考文献
本明細書においておよび本明細書を通して引用される参考文献は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2016505263.tif 000004
2016505263.tif 000005
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月25日(2015.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞または胚の質を評価するための方法であって、
（a）卵母細胞もしくは卵母細胞に付随した卵丘細胞または胚もしくは胚由来細胞より選択される試験細胞について内因性NADHまたはFADの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを取得するために、該試験細胞を蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）に曝露する工程；
（b）試験細胞全体または試験細胞の細胞質または試験細胞のミトコンドリアにわたり、NADH自家蛍光またはFAD自家蛍光またはその両方の蛍光寿命ヒストグラムを平均化する工程；
（c）試験細胞由来の測定された平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値の平均化蛍光寿命ヒストグラムと統計的に異なるかどうかを判定するために、試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムを平均化蛍光寿命ヒストグラム参照値と比較する工程；ならびに
（d）試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異ならない場合には、該卵母細胞を体外受精用に選択するまたは該胚を着床用に選択する工程、および試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異なる場合には、該卵母細胞を体外受精から除外するまたは該胚を着床から除外する工程
を含む、方法。
【請求項２】
寿命ヒストグラムを2つの指数関数の合計に適合させることによって統計的有意性を確立する工程を含み、かつ測定された細胞のパラメーターが、健常細胞に見出されるパラメーターの範囲内に入るまたは該範囲内に入らないと判断される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
測定結果と健常細胞との間で比較されるパラメーターが、2つの指数関数の振幅の比として定義されるα、および、より長い指数関数の寿命として定義されるβである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
健常細胞由来のαの最大値が1.0〜4.0の範囲内の特定の値であり、かつ健常細胞のβの対応する最大値が2000ps〜3000psの範囲にある、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
FLIMが、2光子蛍光励起において約740nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
FLIMが、1光子蛍光励起において約340nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
FLIMが時間領域で実施される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
FLIMが周波数領域で実施される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
FLIMが、2光子蛍光励起において約900nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
FLIMが、1光子蛍光励起において約450nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
[本発明1001]
卵母細胞または胚の質を評価するための方法であって、
（a）卵母細胞もしくは卵母細胞に付随した卵丘細胞または胚もしくは胚由来細胞より選択される試験細胞について内因性NADHまたはFADの自家蛍光の蛍光寿命ヒストグラムを取得するために、該試験細胞を蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）に曝露する工程；
（b）試験細胞全体または試験細胞の細胞質または試験細胞のミトコンドリアにわたり、NADH自家蛍光またはFAD自家蛍光またはその両方の蛍光寿命ヒストグラムを平均化する工程；
（c）試験細胞由来の測定された平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値の平均化蛍光寿命ヒストグラムと統計的に異なるかどうかを判定するために、試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムを平均化蛍光寿命ヒストグラム参照値と比較する工程；ならびに
（d）試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異ならない場合には、該卵母細胞を体外受精用に選択するまたは該胚を着床用に選択する工程、および試験細胞由来の平均化蛍光寿命ヒストグラムが参照値と統計的に異なる場合には、該卵母細胞を体外受精から除外するまたは該胚を着床から除外する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
寿命ヒストグラムを2つの指数関数の合計に適合させることによって統計的有意性を確立する工程を含み、かつ測定された細胞のパラメーターが、健常細胞に見出されるパラメーターの範囲内に入るまたは該範囲内に入らないと判断される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
測定結果と健常細胞との間で比較されるパラメーターが、2つの指数関数の振幅の比として定義されるα、および、より長い指数関数の寿命として定義されるβである、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
健常細胞由来のαの最大値が1.0〜4.0の範囲内の特定の値であり、かつ健常細胞のβの対応する最大値が2000ps〜3000psの範囲にある、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
FLIMが、2光子蛍光励起において約740nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
FLIMが、1光子蛍光励起において約340nmの波長を用い、かつ約460nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
FLIMが時間領域で実施される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
FLIMが周波数領域で実施される、本発明1006の方法。
[本発明1009]
FLIMが、2光子蛍光励起において約900nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1010]
FLIMが、1光子蛍光励起において約450nmの波長を用い、かつ約550nmを中心とした発光バンドパスフィルターを用いて実施される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
本発明のこれらのおよび他の局面、ならびに様々な利点および実用性は、好ましい態様についての詳細な説明および添付の図面を参照してより明らかになるであろう。
【国際調査報告】
2016505263.tif 000008