(57)【要約】  本発明は、一般的に、多分化能を示す細胞を作製する方法、およびそれにより作製された細胞に関する。より具体的には、本発明は、CD14+単核細胞から哺乳類幹細胞を作製するインビトロ方法、およびそれにより作製された細胞を対象とする。この所見は、現在、様々な種類の臨床および研究の場で用いる幹細胞などの多分化能細胞の集団を確実かつ効率的に作製するための手段の設計を促進している。これらの使用には、とりわけ、対象の多分化能細胞のインビトロかインビボのいずれかでの定方向分化、および本発明の多分化能細胞の投与か、またはそれらに由来したより完全に分化した細胞集団の投与のいずれかによる、様々な範囲の状態の治療的または予防的処置が挙げられる。これらの細胞が曝され得る潜在的な処理または培養方式の治療的影響および/または毒性を試験するためのインビトロに基づいたスクリーニング系の設計もまた促進される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)10%〜20%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(ii)10%〜20%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)60%〜80%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単核細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法。
【請求項２】
前記10%〜20%v/vが15%v/vであり、前記60%〜80%v/vが70%v/vである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記CD14+単核細胞懸濁液がCD14+単球細胞懸濁液である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記CD14+単球細胞懸濁液が末梢血に由来している、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記多分化能細胞が造血系および/または間葉系分化能を示す、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多分化能細胞がCD14+、CD34+、CD105+、CD44+、およびCD45+である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記多分化能細胞が追加としてCD14+、CD31+、およびCD59+である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記造血系分化能が、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、または血小板へ分化する潜在能力である、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉系分化能が、骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、髄、真皮、または脂肪の細胞へ分化する潜在能力である、請求項5に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルブミン溶液が、5%〜85%、5%〜80%、5%〜75%、5%〜70%、5%〜65%、5%〜60%、5%〜50%、5%〜45%、5%〜40%、5%〜35%、5%〜30%、5%〜25%、5%〜20%、5%〜15%、5%〜10%の濃度である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルブミン濃度が5%〜20%である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルブミン濃度が、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、または20%である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養が、10mg/Lインスリンまたはその機能性断片もしくは等価物を追加として含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が4〜7日間、培養される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、多系列分化能を示す細胞(MLPC)を刺激に接触させて、前記MLPCのMLPC由来表現型への分化を方向づける追加の工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記MLPC由来表現型が造血系または間葉系表現型である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記造血系幹細胞由来細胞が、赤血球、血小板、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、または好酸球である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記間葉系幹細胞由来細胞が、骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、髄、真皮、または脂肪の細胞などの結合組織細胞である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類において状態を治療的に、および/または予防的に処置する方法であって、前記方法が、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従って作製されている有効数のMLPC、または部分的に、もしくは完全に分化したMLPC由来細胞を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
哺乳類における状態の処置のための薬物の製造における、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従って作製されているMLPCまたはMLPC由来細胞の集団の使用。
【請求項２２】
前記状態が異常な造血系または間葉系機能により特徴づけられる、請求項20または21に記載の方法または使用。
【請求項２３】
前記状態が、造血障害、循環障害、脳卒中、心筋梗塞、高血圧、骨障害、II型糖尿病、損傷した、または形態異常の軟骨または他の組織、ヘルニア、骨盤底脱出症の手術、筋骨格障害、または老化、手術、もしくは外傷の関連における欠損した支持組織の交換である、請求項22に記載の方法または使用。
【請求項２４】
請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従って作製されたMLPCまたはMLPC由来細胞の集団。
【請求項２５】
MLPCまたはMLPC由来細胞の表現型様式または機能様式への処理または培養方式の効果を評価する方法であって、前記方法が、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従って作製されている前記MLPCまたはMLPC由来細胞を前記処理方式に供する工程、および変化した機能様式または表現型様式についてスクリーニングする工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、多分化能を示す細胞を作製する方法、およびそれにより作製された細胞に関する。より具体的には、本発明は、CD14+単核細胞から哺乳類幹細胞を作製するインビトロ方法、およびそれにより作製された細胞を対象とする。この所見は、現在、様々な種類の臨床および研究の場で用いる幹細胞などの多分化能細胞の集団を確実かつ効率的に作製するための手段の設計を促進している。これらの使用には、とりわけ、対象の多分化能細胞のインビトロかインビボのいずれかでの定方向分化、および本発明の多分化能細胞の投与か、またはそれらに由来したより完全に分化した細胞集団の投与のいずれかによる、様々な範囲の状態の治療的または予防的処置が挙げられる。これらの細胞が曝され得る潜在的な処理または培養方式(regime)の治療的影響および/または毒性を試験するためのインビトロに基づいたスクリーニング系の設計もまた促進される。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において著者により参照された刊行物の書誌的詳細は、本記述の終わりにアルファベット順に集められている。
【０００３】
任意の先行の刊行物(またはそれに由来する情報)または知られている任意の事項への本明細書における参照は、その先行の刊行物(またはそれに由来する情報)または既知の事項が、本明細書が関係する努力傾注分野における共通の一般的知識の一部を形成するということの承認または容認またはいかなる型の示唆でもなく、かつそれとして解釈されるべきではない。
【０００４】
哺乳類の幹細胞および前駆(progenitor)細胞の同定、単離、および作製にかなり関心が高い。「幹細胞」および「前駆細胞」への言及は、一般的に、(生殖細胞を含む)いかなる細胞型も作製することができる全能性細胞、およびより限定された種類の成熟細胞系列を作製する能力がある多能性前駆体(precursor)細胞の両方を含む、様々な種類の細胞型を包含すると理解される。いくつかの前駆体細胞型はさらにより分化しており、特定の細胞系列の細胞を作製する能力がある前駆体に対応する。これらの能力は、完全な器官および組織の発生に必要な細胞分化および特殊分化の全ての基礎としての役割を果たす。
【０００５】
この発生経路の選択された側面をインビトロで再現することに関して、幹細胞の単離および培養に大きく重点が置かれている。例えば、胚性幹細胞は、胚盤胞内部細胞塊由来細胞を培養し、解離と継代を頻繁に繰り返すことにより確立することができる。適切な条件下で、インビトロの培養は、幹細胞の正常な核型と全能性の両方を維持しながら、維持され得る。特定の系列に沿っての幹細胞の分化を促進することに関しても、著しい進展を遂げている。ES細胞はヒトから単離されているが、研究および治療におけるそれらの使用は、倫理規定により妨げられている。
【０００６】
成体組織もまた、自己複製して、不可逆性最終分化を起こす娘細胞を生じることができる幹細胞の集団を含有する(Science、287、1442〜1446頁、2000年)。最も良く特徴づけられているのは、造血系幹細胞およびそれらの子孫であるが、間葉系細胞、ニューロン、および造血系細胞を含む組織の大部分において、幹細胞が同定されている(Science、284、143〜147頁、1999年; Science、287、1433〜1438頁、2000年; J. Hepatol.、29、676〜682頁、1998年)。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、および骨髄間質を含む間葉系組織への分化能を有する骨髄において接着性線維芽細胞様細胞として同定されている(Science、284、143〜147頁、1999年)。形態的および表現型特徴、ならびに間葉系幹細胞に類似した分化能を有する間葉系前駆細胞は、臍帯血(Br. J. Haematol.、109、235〜242頁、2000年)、胎児血(Blood、98、2396〜2402頁、2001年)、および成体末梢血(Arthritis Res.、2、477〜488頁、2000年)において極まれに報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,763,194号
【特許文献２】米国特許第5,985,653号
【特許文献３】米国特許第6,238,908号
【特許文献４】米国特許第5,512,480号
【特許文献５】米国特許第5,459,069号
【特許文献６】米国特許第5,763,266号
【特許文献７】米国特許第5,888,807号
【特許文献８】米国特許第5,688,687号
【特許文献９】米国特許第6,387,369号
【特許文献１０】米国特許出願第20020094573(A1)号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Science、287、1442〜1446頁、2000年
【非特許文献２】Science、284、143〜147頁、1999年
【非特許文献３】Science、287、1433〜1438頁、2000年
【非特許文献４】J. Hepatol.、29、676〜682頁、1998年
【非特許文献５】Br. J. Haematol.、109、235〜242頁、2000年
【非特許文献６】Blood、98、2396〜2402頁、2001年
【非特許文献７】Arthritis Res.、2、477〜488頁、2000年
【非特許文献８】Kim S.S.およびVacanti J.P.、1999年、Semin Pediatr Surg. 8: 119頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この目的を達成するために、分化は、機能が明確に定義され、かつ寿命が限定されている最終分化した体細胞の表現型に最終的に達するために、多くの遺伝子の制御を通して幹細胞の線形的進行の形をとると常に想定されている。そのような細胞の例には、赤血球、破骨細胞、島細胞、および血小板が挙げられる。幹細胞は、特定の体細胞系列へのコミットメントのために、分裂し、自分自身を再生し、娘細胞を産生すると考えられる(非対称性分裂)。適切な環境条件下で、幹細胞は、対称的に分裂して、幹細胞プールの倍加を生じることができるとも考えられている。
【００１０】
それにも関わらず、幹細胞の効率的かつ確実な単離、維持、特に、増殖は困難なままであるという事実は依然として残っている。したがって、幹細胞の単離、維持、および分化を効率的で、かつ再現性良く促進するための新しい手段を開発する必要性が継続して残っている。
【００１１】
本発明に繋がる研究において、幹細胞再生と、最終分化まで特定の系列に沿った関連娘細胞の線形的分化の両方を提供する非対称性幹細胞分裂のおかげで、幹細胞増殖が、必ずしも起こる必要はないことは決定されている。むしろ、成熟細胞を、多分化能をもつ細胞へと戻す移行のおかげで、増殖は達成することができる。この所見は、多分化能を示す細胞を確実かつ効率的に作製するための手段の開発を現在、促進しており、それにより、幹細胞集団および/またはそれらから分化した体細胞を臨床および研究用途に利用可能にすることができる価値ある機構を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書、および後に続く特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語「含む(comprise)」、ならびに「含む(comprises)」および「含むこと(comprising)」などの変化形は、述べられた完全体もしくは工程または完全体群もしくは工程群の包含を意味するが、任意の他の完全体もしくは工程または完全体群もしくは工程群の排除を意味するものではないと理解される。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、用語「に由来する」とは、特定の完全体または完全体群が、特定された種から生じているが、必ずしもその特定された源から直接得られたとは限らないことを示すように解釈されるべきである。さらに、本明細書で用いられる場合、「1つの(a)」および「その(the)」の単数形は、文脈上明らかに他の意味が示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００１４】
他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。
【００１５】
本発明の一態様は、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単核細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法を対象とする。
【００１６】
別の態様において、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単球細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法が提供される。
【００１７】
さらに別の態様において、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+末梢血由来単球懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法が提供される。
【００１８】
したがって、本発明のまだなお別の態様は、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単球細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持され、前記多分化能細胞が造血系および/または間葉系分化能を示す、哺乳類多分化能細胞を作製する方法を対象とする。
【００１９】
さらにまだなお別の態様において、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+ヒト末梢血単球細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単核細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、ヒト多分化能細胞を作製する方法が提供される。
【００２０】
まだなおさらに別の態様において、
(i) (a)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(b)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(c)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程であって、前記細胞培養が、前記単核細胞のMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、工程;ならびに任意で
(ii)工程(i)のMLPCを刺激に接触させて、前記MLPCのMLPC由来表現型への分化を方向づける工程
を含む、哺乳類MLPC由来細胞の作製を促進する方法が提供される。
【００２１】
さらなる態様において、
(i)(a)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(b)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(c)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程であって、前記細胞培養が、前記単核細胞のMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、工程;ならびに任意で
(ii)工程(i)のMLPCを刺激に接触させて、前記MLPCの造血系または間葉系表現型への分化を方向づける工程
を含む、哺乳類MLPC由来細胞の作製を促進する方法が提供される。
【００２２】
本発明の別のさらなる態様は、哺乳類において状態を治療的に、および/または予防的に処置する方法であって、前記方法が、本発明の方法に従って作製されている有効数のMLPC、または部分的に、もしくは完全に分化したMLPC由来細胞を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法を対象とする。
【００２３】
さらに別のさらなる態様において、哺乳類において異常な造血系または間葉系機能により特徴づけられる状態を治療的に、および/または予防的に処置する方法であって、前記方法が、
(i)本発明の方法に従って作製されている有効数の造血系幹細胞、または部分的に、もしくは完全に分化した造血系幹細胞由来細胞;または
(ii)本発明の方法に従って作製されている有効数の間葉系幹細胞、または部分的に、もしくは完全に分化した間葉系幹細胞由来細胞
を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様は、哺乳類における状態の処置のための薬物の製造における、本発明の方法に従って作製されているMLPCまたはMLPC由来細胞の集団の使用を対象とする。
【００２５】
本発明のまだなお別の態様は、本発明の方法に従って作製されているMLPCまたはMLPC由来細胞を対象とする。
【００２６】
本発明のまだなお別の態様において、MLPCまたはMLPC由来細胞の表現型様式または機能様式への処理または培養方式の効果を評価する方法であって、前記方法が、上記で定義された方法に従って作製されている前記MLPCまたはMLPC由来細胞を処理方式に供する工程、および変化した機能様式または表現型様式についてスクリーニングする工程を含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で1日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞試料のフローサイトメトリー分析の図である。PBMCを閉鎖型バッグにおいて培養し、接着細胞を1日目に採取した。M2領域は、アイソタイプの一致した対照抗体-FITC(対照-FITC)で染色された表面マーカー集団オーバーレイである。水平軸は、発現強度を示す。
【図２】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で3日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞試料のフローサイトメトリー分析の図である。PBMCを閉鎖型バッグにおいて培養し、接着細胞を3日目に採取した。M2領域は、アイソタイプの一致した対照抗体-FITC(対照-FITC)で染色された表面マーカー集団オーバーレイである。水平軸は、発現強度を示す。
【図３】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で6日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞試料のフローサイトメトリー分析の図である。PBMCを閉鎖型バッグにおいて培養し、接着細胞を6日目に採取した。M2領域は、アイソタイプの一致した対照抗体-FITC(対照-FITC)で染色された表面マーカー集団オーバーレイである。水平軸は、発現強度を示す。
【図４】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で7日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞試料のフローサイトメトリー分析の図である。PBMCを閉鎖型バッグにおいて培養し、接着細胞を7日目に採取した。M2領域は、アイソタイプの一致した対照抗体-FITC(対照-FITC)で染色された表面マーカー集団オーバーレイである。水平軸は、発現強度を示す。
【図５】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で1日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。細胞は、接着し、卵形を示し始めている。
【図６】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で2日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。細胞は、紡錘体様および線維芽細胞様の形を示し始めている。
【図７】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で3日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。細胞は、卵形または紡錘体様の形を示している。
【図８】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で4日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。
【図９】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で4日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。
【図１０】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で5日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。
【図１１】本発明の方法に従ってCO2インキュベーターにおいて37℃で6日間、インキュベートされた細胞培養物由来の細胞を見るために顕微鏡を用いて撮影された写真である。
【図１２Ａ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｂ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｃ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｄ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｅ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｆ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｇ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｈ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｉ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｊ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｋ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｌ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｍ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｎ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｏ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｐ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｑ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｒ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｓ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｔ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｕ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１３Ａ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｂ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｃ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｄ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｅ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｆ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｇ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｈ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｉ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｊ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【図１３Ｋ】CD14+ PBMCフローサイトメトリー分析を表形式で提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、成体幹細胞増殖が、幹細胞再生と特定の体細胞系列に沿っての分化の両方をもたらすために非対称性幹細胞分裂の発生に必ずしも基づいていないという決定に一部、基礎を置いている。特に、複能性幹細胞は、多分化能の様式への移行へと誘導される、より成熟したCD14+単核細胞から供給することができ、これの後に、適切な刺激下で対称性分裂および分化が続く。幹細胞再生および増殖をインビトロで効率的に誘導する方法が実現化されていないことが、当技術分野において格別に困難であったため、この所見の重要性は意義深い。それゆえに、本発明は、多分化能を示す幹細胞表現型への成熟哺乳類細胞の脱分化を誘導することに基づいた哺乳類幹細胞の日常的なインビトロでの作製のための手段を提供する。したがって、これらの所見の潜在的インビボおよびインビトロでの適用は極めて幅広く、それには、幹細胞集団のインビトロでの作製、インビトロまたはインビボのいずれかでの本幹細胞の定方向分化、それらに基づいた治療的または予防的処理方式、ならびに本発明の細胞が曝され得る潜在的な処理または培養方式の有効性および/または毒性のインビトロ評価が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２９】
したがって、本発明の一態様は、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単核細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法を対象とする。
【００３０】
CD14+単核細胞への言及は、細胞表面分子CD14を発現する単核細胞への言及として理解されるべきである。本発明をいずれの1つの理論または作用機序にも限定することはないが、CD14は、細菌リポ多糖の検出のための(Toll様受容体TLR4およびMD-2と共の)共受容体として働く。CD14は、リポ多糖結合タンパク質の存在下においてのみリポ多糖を結合することができる。リポ多糖は、それの主要なリガンドと考えられるが、CD14はまた、他の病原体関連分子パターンを認識する。CD14は、主にマクロファージおよび単球によって、より少ない程度で好中性顆粒球によって発現する。それはまた樹状細胞によっても発現する。可溶型sCD14は、肝臓および単球によって分泌され、そうでなければCD14を発現しない細胞にLPS応答性を与えるのに、低濃度で十分である。この目的を達成するために、「CD14」への言及は、全ての型のCD14、およびCD14mRNAの選択的スプライシングから生じ得る異性体型を含む、この分子の機能的な突然変異体または多型の型への言及として理解されるべきである。「CD14」への言及はまた、細胞表面上に発現し得る全ての前駆体型、プロタンパク質型、または中間体型を含む、この分子の全ての型への言及を含むと理解されるべきである。「CD14」への言及はまた、二量体として、多量体として、または融合タンパク質として存在しようがしまいが、いかなるCD14細胞表面分子にも広げて理解されるべきである。
【００３１】
一実施形態において、前記CD14単核細胞は単球である。
【００３２】
この実施形態によれば、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単球細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法が提供される。
【００３３】
まだなお、本発明をいずれの1つの理論または作用機序にも限定することはないが、単球は、白血球の一種であり、全ての哺乳類、鳥類、爬虫類、および魚類を含む脊椎動物の自然免疫系の一部である。単球は、免疫機能において複数の役割を果たす。そのような役割には、正常様式下で常在性マクロファージおよび樹状細胞を補充することが挙げられる。炎症シグナルに応答して、単球は、組織における感染の部位へ迅速に移動し、マクロファージおよび樹状細胞へ分化して、免疫応答を誘発することができる。単球は、単芽球として知られた造血系幹細胞前駆体から骨髄によって産生される。それらは、1〜3日間、血流中を循環し、その後、典型的には、身体中の組織へ移動する。単球は、血液中の白血球の3〜8パーセントの間を占める。およそ半分は、脾臓中の赤色髄のビルロート索においてクラスターとなって予備として貯蔵される。その組織において、単球は、異なる解剖学的位置で異なる型のマクロファージへ成熟する。ヒト血液中に以下の少なくとも3つの型の単球がある:
(a)古典的単球は、CD14細胞表面受容体(CD14++ CD16-単球)の高レベル発現によって特徴づけられる
(b)非古典的単球は、CD14の低レベル発現を示し、CD16受容体の追加の同時発現を有する(CD14+ CD16++単球)。
(c)中間体単球は、CD14の高レベル発現およびCD16の低レベル発現を示す(CD14++ CD16+単球)。
【００３４】
古典的単球は中間体単球へと発生して、その後、非古典的CD14+ CD16++単球になるという発生的関係であると思われる。これゆえに、非古典的単球は、より成熟したバージョンを表す可能性がある。したがって、「単球」への言及は、それの分化の発生段階またはCD14の発現のレベルに関わらず、任意のCD14+単球細胞型への言及として理解されるべきである。前記単球は、末梢血および脾臓を含む任意の適切な組織から供給されてもよい。
【００３５】
一実施形態において、前記単球は、末梢血に由来している。
【００３６】
この実施形態によれば、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+末梢血由来単球懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法が提供される。
【００３７】
上記で詳述されているように、成熟体細胞、具体的には、単球は、多系列分化能の様式への移行へ誘導することができることが決定されている。したがって、「多系列分化能」または「多分化能」を示す細胞への言及は、1つより多い体細胞の分化経路に沿って発生する潜在能力を示す細胞への言及として理解されるべきである。例えば、細胞は、様々な体細胞型を作製する能力があり得、そのような細胞は通常、多能性または複能性と呼ばれている。これらの細胞は、全能性細胞より限定された範囲の系列へのコミットメントを示し、その全能性細胞とは、全ての体細胞系列および配偶子を含む、本質的に可能な分化方向のいずれにおいても発生することができる細胞である。本発明をいずれの1つの理論または作用機序にも限定することはないが、幹細胞が出生後組織に由来している範囲内において、それはまた「成体幹細胞」と呼ばれることが多い。「前駆」細胞または「前駆体」細胞と古典的に名付けられている多数の細胞もまた、適切な刺激条件下で、それらが1つより多い体細胞系列の細胞を生じることができるという点に基づいて、「多系列分化能」の定義の範囲内に入り得る。「幹細胞」への言及が、本発明の方法により作製された細胞に関して本明細書においてなされる限り、これは、本明細書で定義されているような多系列分化能を示す細胞への言及として理解されるべきである。
【００３８】
本発明の一実施形態において、CD14+単球が、造血系列かまたは間葉系列のいずれかに沿って分化する潜在能力を示す多系列分化能表現型への移行へと誘導することができることは決定されている。例えば、適切な刺激下で、本複能性細胞は、(リンパ球または単球などの)単核造血細胞、(好中球、好塩基球、または好酸球などの)多形核造血細胞、赤血球、もしくは血小板を含む造血系列に、または骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、髄、真皮、および脂肪などの結合組織などの間葉系列に沿って分化するように方向づけることができる。
【００３９】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単球細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持され、前記多分化能細胞が造血系および/または間葉系分化能を示す、哺乳類多分化能細胞を作製する方法を対象とする。
【００４０】
別の実施形態において、前記多分化能細胞は、CD14+、CD34+、CD105+、CD44+、CD45+、およびCD24+である。
【００４１】
さらに別の実施形態において、前記多分化能細胞は、CD14+、CD34+、CD105+、CD44+、CD45+、CD38+、CD31+、およびCD59+である。
【００４２】
より好ましくは、前記造血系分化能は、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、または血小板に分化する潜在能力であり、前記間葉系分化能は、骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、髄、真皮、または脂肪の細胞へ分化する潜在能力である。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、用語「哺乳類」および「哺乳類の」は、ヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、および捕獲された野生動物(例えば、カンガルー、シカ、キツネ)を含む。好ましくは、哺乳類は、ヒトまたは実験動物である。さらにより好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００４４】
単球などのCD14+単核細胞の、多分化能表現型への「移行」を誘導することへの言及は、体細胞表現型を、本明細書で定義された型の多分化能表現型へ変化させるのに必要とされる遺伝的、形態的、および/または機能的変化を誘導することへの言及として理解されるべきである。
【００４５】
CD14+単核細胞の、多分化能細胞へのインビトロ脱分化を誘導することに関して、これは、スモールスケールのインビトロ組織培養という状況かまたはラージスケールのバイオリアクター製造という状況かのいずれかで達成することができる。
【００４６】
上記で詳述されているように、CD14+単核細胞の、多分化能の細胞への移行は、前記細胞を独特な細胞培養方式に供することによりインビトロで達成し得ることが決定されている。具体的には、単核細胞の出発試料を、特定の割合でアルブミンおよび細胞培地と共に培養する。たいていの細胞培養系と違って、本培養の確立は、細胞数の決定および細胞濃度の適切な調整を必要とする特定の濃度の細胞を培養することに基づいているのではなく、体積割合を中心として、その体積内の細胞の実際の数とは関係なく、培養を設計することに基づいているため、これは、本方法の特定の利点である。これは、本方法を非常に単純かつ日常的にして、利用できるかまたは扱うのに都合が良いCD14+単核細胞の出発体積がどれだけであっても、それに基づいて実施できるようにする。
【００４７】
したがって、本発明のインビトロ培養系は、CD14+単核細胞懸濁液の出発体積を中心として確立される。「懸濁液」への言及は、非接着細胞の試料への言及として理解されるべきである。これらの細胞は、細胞を生存可能な様式で維持するだろう等張液(例えば、PBS、食塩水、ハンクス平衡塩類溶液、または他の平衡塩類溶液バリエーション)、細胞培地、体液(例えば、血清)などの任意の適切な媒体中に含有され得る。本明細書に例示されているように、末梢血単核細胞試料を、標準密度勾配遠心分離を用いて分離し、それにより得られた細胞集団を、本発明の方法に従って培養した。しかしながら、本細胞は、ポジティブまたはネガティブ磁気ビーズ分離などの他の方法による濃縮または処理を受けていてもよく、その方法は、利用される方法の性質によって様々な異なる等張液のいずれか1つに含有されるCD14+単核細胞の最終懸濁液を生じるだろう。得られる細胞の実際の濃度に関係なく、この懸濁液の任意の適切な体積が、本発明の培養を確立するために用いることができる。この体積は、用いようとしている培養系の型に基づいて選択される。例えば、フラスコに基づいた系、バッグに基づいた系、またはローラーボトルに基づいた系において培養しようとする場合には、約1リットルまでのより小さい体積が細胞培養の全体を形成する可能性が高い。しかしながら、バイオリアクターの関連においては、細胞培養の著しくより大きい体積を収容することができ、それにより、より大きい出発体積を用いることができる。利用されるだろう特定の細胞培養系の関連において、用いる適切な最終細胞培養体積を決定することは、十分、当業者の能力の範囲内である。
【００４８】
本発明の細胞培養を最初に確立することに関して、培養工程を受けるだろう細胞培養の最終体積は、約15%v/vのCD14+単核細胞懸濁液を、約15%v/vの5%〜85%アルブミン溶液および約70%v/vの細胞培地と共に含む。本明細書に詳述されているように、これらのパーセンテージ値への言及は、これらの特定のパーセンテージからいくらかの偏差が許容できる程度まで近似であり、機能的等価の割合を提供する。上記のパーセンテージ値からのいくらかの偏差がどの程度まで可能となるのかを、例示された培養系の非常に単純かつ日常的な性質に基づいて、決定することは、十分、当業者の能力の範囲内である。例えば、単核細胞懸濁液の約10%から20%v/vまで、および5%〜85%アルブミン溶液が有効であり得、特に、11%〜19%、12%〜18%、13%〜17%、または14%〜16%であり得ることが予想される。本アルブミン溶液に関して、約4%から90%まで、または5%〜86%、または好ましくは5%〜7%の溶液が等しく有効であり得る。
【００４９】
本発明を決して限定するものではないが、非常に幅広い範囲にわたるアルブミン濃度が本発明の方法において有効であることが決定されている。したがって、5%〜85%、5%〜80%、5%〜75%、5%〜70%、5%〜65%、5%〜60%、5%〜50%、5%〜45%、5%〜40%、5%〜35%、5%〜30%、5%〜25%、5%〜20%、5%〜15%、5%〜10%の濃度範囲を用いてもよい。一実施形態において、前記濃度は5%〜20%である。
【００５０】
したがって、それゆえに、本発明の一実施形態は、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単球細胞懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5〜20%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単球の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、哺乳類多分化能細胞を作製する方法を対象とする。
【００５１】
別の実施形態において、前記アルブミン濃度は、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、または20%である。
【００５２】
本発明は、例えば、本明細書においてわかるように、15%v/v細胞、5%〜20%v/vアルブミン、または70%細胞培地への言及への厳守によって限定されるべきではなく、本発明の機能を保持し、かつ当業者によって日常的かつ容易に評価することができるこれらのパーセンテージの変動をそれの範囲内に含む。
【００５３】
上記で詳述されているように、出発細胞懸濁液内のCD14+単核細胞の濃度は、任意の数の細胞であり得る。その細胞数が相対的に低かろうが、相対的に高かろうが、本発明の重要な態様は、出発細胞懸濁液が、その懸濁液内の細胞の濃度に関係なく、出発細胞培養物の全体積の15%v/vであることのみである。とはいえ、好ましい実施形態において、出発細胞濃度の下限も上限もないが、これらの単核細胞が培養中に付着する、培養容器内に十分な表面積がないほど細胞数が高くあるべきではないことは示唆される。それでもなお、方法は、出発細胞濃度が、これらの細胞が付着するのに十分な表面積がないほど高い範囲において、多系列分化能を示す細胞を産生することに成功するだろうが、付着することができない細胞が幹細胞へ脱分化しないことを単に観察し得るだけであり、それにより、その方法は有効であるが、最適に効率的ではない。したがって、この点において、効率を最大にするという観点からすれば、出発細胞培養の一部を形成する細胞濃度は、存在する細胞の全部が、使用に選択されている特定の組織培養容器に付着することができる環境内で培養されることを確実にすることが望まれ得る。例えば、培養バッグ容器を用いることになっている場合、最高で106細胞/mlまでの細胞濃度が適している。
【００５４】
用いられるアルブミン溶液に関して、6%アルブミン溶液は、一般的に市販されているが、そうでなければ、食塩水などの任意の適切な等張液において作製されてもよい。「アルブミン」への言及は、蒸留水および半飽和硫酸アンモニウムの溶液中では可溶性であるが、完全飽和硫酸アンモニウム溶液中では不溶性である球状タンパク質の群への言及として意図されることは理解されるべきである。例えば、血清の主要なタンパク質である血清アルブミンが、本発明の方法に関して用いられてもよい。しかしながら、ラクトアルブミンまたはオボアルブミンなどの任意のアルブミン分子が利用されてもよいことは理解されるべきである。アルブミンの任意の合成の組換え型または誘導型もまた、本発明の方法に用いられてもよいこともまた理解されるべきである。例えば本発明の出発培養体積の15%v/vの割合で6%アルブミン溶液を用いることにより、0.9%アルブミンの有効濃度が達成されることは当業者により認識されているだろう。
【００５５】
出発培養体積の残りは、細胞培地で構成され、これは、出発細胞培養体積の70%v/vを形成する。「細胞培地」への言及は、哺乳類細胞の成長を援助するように設計される液体またはゲル、特に、幹細胞培養を援助する培地への言及として理解されるべきである。この目的を達成するために、細胞成長に必要とされる最少栄養素を供給する最少培地、または哺乳類細胞の生存能および成長の維持を促進するために追加の栄養素を含有し得る富栄養培地を含む任意の適切な細胞培地が用いられてもよい。用いるのに適した培地の例には、DMEMおよびRPMIが挙げられる。細胞生存能および成長の維持を促進するためのアミノ酸または糖などの追加の選択された作用物質を含有する補充の最少培地を用いてもよい。培地はまた、任意の他の適切な作用物質、例えば、抗生物質をさらに追加されてもよい。別の例において、細胞培地は、細胞生存能および成長をさらに援助するためにインスリンを追加される。70%v/v細胞培地への言及は、それらが、出発CD14+単核細胞またはアルブミンが懸濁する食塩水または最少培地などの等張液であろうとなかろうと、溶液の性質によって影響されない独立型必要条件であることは理解されるべきである。単核細胞が、本発明の培養系へのそれらの導入前に、最初に懸濁される溶液、またはアルブミンが溶解される溶液の性質に関係なく、出発細胞培養集団の全体積に占めるパーセンテージとしての70%v/v細胞培地についての必要条件は変化しないままであることは、実際、本発明の特定の利点である。
【００５６】
一実施形態において、前記細胞培養は、10mg/Lインスリンを追加として含む。
【００５７】
上記で詳述されているように、本発明の方法は、CD14+単核細胞の集団を、単核細胞の間葉系/造血系幹細胞表現型への脱分化を誘導するために細胞培地および5%〜85%アルブミン溶液と共に特定の割合で培養することに基礎を置いている。前記CD14+単核細胞は、本幹細胞表現型が達成されるような時点までインビトロで培養される。一実施形態において、3〜8日間、特に4〜7日間の培養期間が、本幹細胞を生じるのに適切であると決定されている。脱分化の必要な程度が生じたかどうかを決定するためにインビトロで培養された細胞をサンプリングすることは、十分、当業者の能力の範囲内であると認識されているだろう。温度およびCO2パーセンテージの両方に関して、細胞を培養するための最も適切な条件を決定することもまた、十分、当業者の能力の範囲内である。本発明をいずれの一つの理論または作用機序にも限定することはないが、ヒトCD14+単核細胞を培養する場合、4〜5日間のインキュベーションが特に適していることが決定されている。別の好ましい実施形態において、培養されることになっているのがヒトCD14+単核細胞である限りにおいては、細胞培養懸濁液が、単核細胞の細胞培養容器への付着を促進するために最初、5%CO2/37℃で60〜120分間、インキュベートされる場合、本発明の方法が特に効果的であることが決定されている。その後、培養工程は、数日間の培養期間にわたって良い細胞生存能および成長を維持するのに適切と考えられるような条件下で進行することができる。この目的を達成するために、適切な細胞培養条件を確立することは、当業者にとって日常的手順の事柄であると認識されているだろう。
【００５８】
したがって、一実施形態において、
(i)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+ヒト末梢血単球懸濁液;
(ii)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(iii)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程を含み、前記細胞培養が、前記単核細胞の、多系列分化能を示す細胞への移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、ヒト多分化能細胞を作製する方法が提供される。
【００５９】
一実施形態において、前記アルブミン溶液は、5%〜20%、好ましくは5%〜15%である。
【００６０】
一実施形態において、前記細胞培養は、10mg/Lヒトインスリンまたはその機能性断片もしくは等価物を追加として含む。
【００６１】
別の実施形態において、前記細胞は、4〜7日間、特に4〜5日間、培養される。
【００６２】
上記で詳述されているように、本発明は、CD14+単核細胞の単離された集団にインビトロで実施される。この目的を達成するために、本細胞は、個体(例えば、処置の対象であり得る個体)から新鮮に単離されていてもよいし、またはそれらは、個体かもしくは別の源のいずれかからいくらか早い時点で単離されている、細胞(例えば、確立された単球細胞株)の培養物(例えば、細胞数を増大し、および/または細胞を分化シグナルに対して受容性にするように培養された場合)もしくは凍結ストックからなどの新鮮ではない源から供給されていてもよいことは理解されるべきである。本細胞が、非限定的に、濃縮もしくは精製などのいくつかの他の型式の処理もしくは操作、細胞周期状態の改変、または細胞株の形成を受けていてもよいこともまた理解されるべきである。したがって、本細胞は、一次細胞または二次細胞でもよい。一次細胞は、個体から単離されている細胞である。二次細胞は、それの単離後、本発明の方法の適用前に、細胞株の調製などのある形式のインビトロ操作を受けている細胞である。出発CD14+単核細胞集団が相対的に純粋であってよいし、またはそれが、末梢血細胞の集団など、異種性細胞集団の一部であってもよいこともまた理解されるべきである。これは、以下でさらに論じられる。
【００６３】
関連態様において、本発明の方法は、本発明の方法により産生される多分化能細胞(MLPC)の、より成熟した表現型への分化を誘導するのにも適応することができることは理解されるべきである。例えば、本発明の好ましい実施形態の関連において、造血系幹細胞は、全ての血液細胞(例えば、赤血球、血小板、リンパ球、単球、および顆粒球)を生じ、一方、間葉系幹細胞は、骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、髄、真皮、および脂肪を含む様々な種類の結合組織を生じる。本発明の方法が、間葉系分化能と造血系分化能の両方を有するMLPCを産生する範囲内において、本発明の方法は、関心対象となる系列に沿っての部分的または完全な分化をもたらすのに必要とされる特定の刺激に本MLPC集団を導入するさらなる工程を含むように、インビトロかインビボのいずれかで適応することができる。
【００６４】
この追加の定方向分化事象は、好都合には、インビトロで実施されるが、それはインビボでも実施することができることもまた理解されるべきである。これは、以下でより詳細に論じられる。しかしながら、特定のインサイチュー環境もまた好都合には、MLPCの特定の系列に沿っての分化を方向づけるのに必要とされる様々な範囲のシグナルを提供してもよい。
【００６５】
したがって、「MLPC由来細胞」への言及は、MLPCより分化し、かつ前記MLPCから生じている細胞型への言及として理解されるべきである。これらの細胞は、造血系幹細胞の関連における血液細胞および間葉系幹細胞の関連における結合組織などの、MLPCが生じることが知られている系列の細胞に対応する。本MLPC由来細胞が、造血系幹細胞もしくは間葉系幹細胞などの細胞系列の特定のサブグループに沿って分化することに不可逆的にコミットされている、より分化した前駆体細胞であってもよいし、またはそれが、赤血球、リンパ球などの特定の細胞系列の部分的もしくは最終的に分化した型式に対応してもよいことは、理解されるべきである。したがって、本発明のこの態様の範囲内に入る細胞は、発生の任意のMLPC分化段階後であってもよいことは理解されるべきである。上記で詳述されているように、このさらなる分化が構成的に起こってもよいし、またはそれが、1つもしくは複数のさらなるシグナルを必要としてもよい。これらのシグナルは、スモールスケールのインビトロ組織培養もしくはラージスケールのバイオリアクター製造の関連においてなどのインビトロか、または前駆体細胞が、適切な組織微小環境へ移植されて、それのさらなる分化を可能にする場合などのインビボ微小環境においてのいずれかで提供され得る。
【００６６】
したがって、本発明の関連態様において、
(i) (a)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(b)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(c)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程であって、前記細胞培養が、前記単核細胞のMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、工程;ならびに任意で
(ii)工程(i)のMLPCを刺激に接触させて、前記MLPCのMLPC由来表現型への分化を方向づける工程
を含む、哺乳類MLPC由来細胞の作製を促進する方法が提供される。
【００６７】
一実施形態において、前記CD14+単核細胞は単球、より好ましくは末梢血由来単球である。
【００６８】
別の実施形態において、前記アルブミンは5%〜20%である。
【００６９】
まだなお別の実施形態において、前記MLPCは、造血系分化能と間葉系分化能の両方を示す。
【００７０】
この実施形態によれば、したがって、好ましくは、
(i)(a)15%v/vまたはその機能的等価の割合のCD14+単核細胞懸濁液;
(b)15%v/vまたはその機能的等価の割合のおよそ5%〜85%アルブミン溶液;および
(c)70%v/vまたはその機能的等価の割合の細胞培地
を比例的に含むインビトロ細胞培養を確立する工程であって、前記細胞培養が、前記単核細胞のMLPCへの移行を誘導するのに十分な時間と条件下で維持される、工程;ならびに任意で
(ii)工程(i)のMLPCを刺激に接触させて、前記MLPCの造血系または間葉系表現型への分化を方向づける工程
を含む、哺乳類MLPC由来細胞の作製を促進する方法が提供される。
【００７１】
さらにより好ましくは、前記造血系幹細胞由来細胞は、赤血球、血小板、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、または好酸球である。
【００７２】
別の好ましい実施形態において、前記間葉系幹細胞由来細胞は、骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、髄、真皮、または脂肪の細胞などの結合組織細胞である。
【００７３】
本発明のこの態様の関連において、組織(例えば、筋肉組織または皮膚組織)などの細胞凝集物または細胞懸濁液(例えば、造血系細胞懸濁液)の両方が産生されてもよいことは理解されるべきである。
【００７４】
上記で詳述されているように、本発明は、幹細胞がCD14+単核細胞から作製することができるという決定に基礎を置いている。この目的を達成するために、出発集団のCD14+細胞の全部の移行を方向づけることの関連か、またはこれらの成熟体細胞の出発集団の副次集団の移行を方向づけることの関連のいずれかにおいてこれが達成され得ることは理解されるべきである。これは、例えば、出発細胞集団の純度および/または異種性に依存する可能性が高い。なおさらに、本発明の培養系は、異種性細胞集団の産生を生じる場合がある。これは、例えば、出発集団の細胞の全部がMLPC表現型へ移行するとは限らない場合、またはMLPC細胞の全部がその後、より成熟し、かつ均質の表現型へ分化するように誘導されるとは限らない場合には、起こり得る。そういう状況であれば、出発集団の細胞の全部が、必ずしも、MLPC表現型またはMLPC由来表現型へ分化するとは限らない可能性があり、および得られるMLPC由来細胞のアウトプットがそれ自体、異種性である可能性があるため、本発明の方法は、所望の表現型を示す細胞を同定し、かつ単離するスクリーニングおよび選択工程の適用を必要とする場合がある。同定方法は、当業者に良く知られており、それには、以下が挙げられるが、それらに限定されない:
(i)細胞系列特異的構造の検出。
細胞系列特異的構造の検出は、例えば、同定されるべき構造の型に依存して、光学顕微鏡法、蛍光親和標識、蛍光顕微鏡法、または電子顕微鏡法によって実施することができる。光学顕微鏡法は、リンパ球対多形核対赤血球核の特性、または多核骨格筋細胞などの形態的特性を検出するために用いることができる。別の例において、直径が約10〜30μmであり、未熟心筋細胞に特徴的な円形または桿状形態をもつ単核細胞を同定することができる。電子顕微鏡法は、筋節、Xバンド、Z体、介在板、ギャップ結合、またはデスモソームなどの構造を検出するために用いることができる。蛍光親和標識および蛍光顕微鏡法は、問題の構造に特異的に結合し、かつフルオロフォアに直接的かまたは間接的にかのいずれかで連結される、分子、一般的には抗体を蛍光標識することにより、細胞系列特異的構造を検出するために用いることができる。そのような構造の自動定量化は、適切な検出および計算システムを用いて実施することができる。
(ii)細胞系列特異的タンパク質の検出。
細胞表面タンパク質または細胞内タンパク質などの細胞系列特異的タンパク質の検出は、好都合には、例えば、蛍光親和標識および蛍光顕微鏡法によって実行され得る。特異的タンパク質は、細胞全体と組織全体の両方において検出することができる。簡単に述べれば、蛍光標識抗体を固定細胞上でインキュベートして、特異的な心臓マーカーを検出する。あるいは、ウェスタンイムノブロッティングまたはハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「タンパク質チップ」)などの技術を用いてもよい。この方法によって検出することができるタンパク質は、特定の細胞集団に特徴的である任意のタンパク質であり得る。例えば、前駆体/前駆細胞型のクラスは、1つまたは複数の細胞表面分子の発現の存在または非存在によって区別することができる。この点において、この方法は、任意の1つまたは複数の分子の発現に基づいた、ポジティブ選択工程かまたはネガティブ選択工程のいずれかにより細胞型を同定するために利用することができる。より成熟した細胞は、通常、文献において十分定義されている様々な範囲の特異的細胞表面または細胞内タンパク質の発現によって特徴づけることができる。例えば、造血系細胞型の全部の分化段階は、細胞表面分子発現パターンに関して十分定義されている。同様に、筋肉細胞および他の間葉系由来細胞型もまた、発生の様々な分化段階を通してのタンパク質発現プロファイルに関して十分、実証されている。この目的を達成するために、本発明のMLPCは、典型的には、CD14、CD34、CD105、CD44、CD45、CD38、CD31、およびCD59を発現し、これらは、単球幹細胞、一般的には、間葉系幹細胞および造血系幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーである。
(iii)細胞系列特異的RNAまたはDNAの検出。
この方法は、好ましくは、RT-PCRまたはリアルタイム(qRT-PCR)を用いて実行される。あるいは、用いることができる他の方法には、ハイブリダイゼーションマイクロアレイ(「RNAチップ」)またはノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングが挙げられる。RT-PCRは、上記のポイント(ii)で詳述されたタンパク質、またはポイント(ii)で詳述された方法論によっては都合良くは検出できない、分泌され、もしくはそうでなければタンパク質などの、本質的に任意のタンパク質をコードする特異的RNAを検出するために用いることができる。例えば、初期B細胞分化の関連において、免疫グロブリン遺伝子再編成は、再編成された免疫グロブリン分子の細胞表面発現の前にDNAレベルで検出できる。
(iv)細胞系列特異的機能活性の検出。
細胞集団の機能に関しての分析は一般的に、ポイント(i)〜(iii)のスクリーニング方法より好都合でない方法としてみなされているが、場合によっては、これは事実ではない可能性がある。例えば、心臓細胞を作製しようとしている限りでは、単に、光学顕微鏡法下で、心臓特異的機械的収縮についてスクリーニングするだけであり得る。
【００７５】
本発明の方法の適用によって得られた細胞集団を特徴づけることに関して、上記で詳述された技術の任意の1つまたは複数が利用され得ることは理解されるべきである。
【００７６】
本発明の方法に従って培養する前にCD14+単核細胞について成熟体細胞集団を濃縮することか、またはそれらに由来するMLPC細胞集団を単離もしくは濃縮することのいずれかに関して、この場合もやはり、実施することができる様々な良く知られた技術がある。上記で詳述されているように、抗体、およびレクチンなどの他の細胞表面結合分子は、特定の細胞系列および/または分化の段階に関連したマーカーを同定するために特に有用である。抗体を、固体支持体に付着させて、分離を可能にしてもよい。しかしながら、他の細胞分離技術には、物理的特性(密度勾配遠心分離および向流遠心水簸)および生体染色性(ミトコンドリア結合色素ローダミン123およびDNA結合色素Hoechst33342)の違いに基づいたものが挙げられる。
【００７７】
分離のための手順には、抗体またはレクチンコーティング化磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに付着した抗体での「パニング」、または任意の他の好都合な技術が挙げられ得る。特に正確な分離を提供する他の技術には、蛍光活性化セルソーティングが挙げられ、この技術もまた、前方対側方の光散乱によって識別可能である形態的特性に基づいた細胞の分離に当てはまる。これらの技術は、ポジティブ選択またはネガティブ選択のいずれの関連においても適用することができるが、追加のネガティブ選択技術には、細胞溶解性、アポトーシス性、またはそうでなければ毒性の作用物質の部位特異的投与が挙げられるが、それらに限定されない。これは、そのような作用物質のモノクローナル抗体への連結によって、それの定方向送達を促進するのに、最も便利に達成され得る。別の例において、抗体でのオプソニン化、続いて補体投与が、同じ結果を達成し得る。
【００７８】
これらの技術は、所望のレベルの精製または濃縮を達成するために一段階または多段階のいずれのプロトコールとしても実施することができる。
【００７９】
本発明の細胞および組織の増殖能力は、例えば、損傷組織を修復するための、または治療的処置方式の効果を試験するための所定の使用に必須である場合があるので、増殖能力の十分なレベルを示している細胞についてスクリーニングすることが望ましい場合がある。細胞の増殖能力を決定することは、多数の標準技術によって実施することができる。好ましくは、増殖の決定は、3[H]-チミジンまたは125I-ヨードデオキシウリジン取り込みアッセイによってもたらされる。あるいは、XTTなどの代謝性色素を用いる比色アッセイ、または直接的な細胞カウンティングが、増殖能力を確認するために用いられてもよい。増殖能力はまた、Ki-67などの細胞周期マーカーの発現によっても評価することができる。
【００８０】
上記で詳述されているように、本発明の方法は、インビトロで実施される。したがって、インビトロテクノロジーに関して、スモールスケールかまたはラージスケールのいずれかでMLPCまたはLPC由来細胞を日常的かつ確実に産生する手段が、ここで提供されている。例えば組織培養フラスコまたはバッグにおいて実行され得るスモールスケール産生に関して、これは、所定の個体について、および特定の条件の関連において、細胞集団を産生するのに特に適し得る。ラージスケール産生に関して、本発明の方法は、ラージスケールのニーズを満たす実行可能な手段を提供する。本発明の方法に従ってラージスケール産生を達成する一つの手段は、バイオリアクターの使用による。
【００８１】
バイオリアクターは、インビボでの栄養素濃度および比率を模倣する管理された濃度および比率で培地および酸素を送達することができる培養プロセスを提供するように設計される。バイオリアクターは、長年、市販されており、様々な型の培養テクノロジーを利用している。哺乳類細胞培養に用いられる種々のバイオリアクターのうち、大部分は、単細胞型の高密度培養の産生を可能にするように設計されており、それとして、本発明に用いることができる。これらの高密度系の典型的な適用は、最終生成物として、細胞によって産生される馴化培地を産出することである。これは、例えば、モノクローナル抗体のハイブリドーマ産出、およびウイルスベクター産出のためのパッケージング細胞株に関する場合である。しかしながら、これらの適用は、本発明においてのように治療用最終生成物が、採取された細胞自体である場合の適用とは異なる。
【００８２】
いったん運転されたならば、バイオリアクターは、自動制御された培地の流れ、酸素送達、および温度とpHの管理を提供し、それらは、一般的に、多数の細胞の産生を可能にする。したがって、バイオリアクターは、労力の節約およびプロセス中の汚染の可能性の最小化を提供し、最も洗練されたバイオリアクターは、最低限の手作業の要求およびオープン処理工程を伴う設定、成長、選択、および採取の手順を可能にする。そのようなバイオリアクターは、最適には、本発明によって企図されているように、均質の細胞混合物または凝集した細胞集団での使用のために設計される。本発明に用いられる適切なバイオリアクターには、米国特許第5,763,194号、米国特許第5,985,653号および第6,238,908号、米国特許第5,512,480号、米国特許第5,459,069号、第5,763,266号、第5,888,807号、および第5,688,687号に記載されたものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００８３】
MLPCのインビトロの定方向分化が望まれる場合などの任意の大量の長期細胞培養に関して、いくつかの基本パラメーターは調節を必要とする。培養物は、細胞生存能維持、増殖、および(おそらく、いくつかの別々の分化培養および条件の関連における)分化、加えて最終の細胞培養保存を可能にする培地と共に提供されなければならない。典型的には、様々な培地が、バイオリアクターにおけるパンピング機構により細胞へ送達され、定期的に培地を送り込み、交換する。交換プロセスは、副生成物を培養物から除去することを可能にする。成長中の細胞または組織はまた、酸素源を必要とする。異なる細胞型は、異なる酸素要求量を有し得る。したがって、酸素を細胞へ供給するための柔軟かつ調節可能な手段が望ましいコンポーネントである。
【００８４】
特定の培養に依存して、培養チャンバーにおける細胞集団および培地供給の分配でさえも重要なプロセス管理であり得る。そのような管理は、懸濁培養設計の使用により達成される場合が多く、その設計は、細胞間相互作用が重要ではない場合、有効であり得る。懸濁培養系の例には、様々なタンクリアクター設計およびガス透過性プラスチックバッグが挙げられる。三次元構造への集合を必要とせず、または間質細胞層もしくは支持細胞層への近接を必要とする細胞(例えば、たいていの血液細胞前駆体または成熟血液細胞)について、そのような懸濁設計が用いられ得る。
【００８５】
培養プロセスの完了時点での細胞の効率的な収集は、効果的な細胞培養システムの重要な特徴である。生成物としての細胞の産生のための一つのアプローチは、回収のための物理的な障壁なしに、限定されたスペースで細胞を培養することであり、細胞生成物の単純な溶出により、その目的のために設計された市販の閉鎖系細胞洗浄器における最終洗浄を受け入れられる細胞の管理しやすい濃縮された体積の細胞が生じる。最適には、そのシステムは、保存剤または細胞貯蔵化合物を含み、または含まない、薬学的に許容される担体の添加を可能にし、加えて、適切な無菌パッケージングへの効率的な採取を提供する。最適には、採取およびパッケージングプロセスは、培養チャンバーの流体管路の無菌バリアを壊すことなく完了し得る。
【００８６】
任意の細胞培養手順に関して、主要な懸案事項は、無菌性である。生成物である細胞が、患者へ(しばしば、患者が病気であり、または免疫低下している時点で)移植されることになっている場合、微生物が存在しないことが要求されている。
【００８７】
本発明の開発は、現在、対象を治療的に、または予防的に処置するための手段の開発を促進している。特に、本発明の好ましい実施形態の関連においては、不適切な、不十分な、または異常な造血系または間葉系細胞機能を示す患者を処置するための手段は、本発明の方法に従って作製されているMLPC、または部分的もしくは完全に分化したMLPC由来細胞(例えば、造血系または間葉系由来細胞など)をこれらの対象に投与することに基づいて、提供される。
【００８８】
この方法は、幅広い範囲の状態に適用することができ、その状態には、造血障害、循環障害、脳卒中、心筋梗塞、高血圧、骨障害、II型糖尿病、不妊症、損傷した、または形態異常の軟骨または他の組織、ヘルニアの修復、支持メッシュおよび生物学的スキャフォールドを用いる骨盤底脱出症の手術、他の筋骨格障害についての細胞治療、ならびに老化、手術、または外傷の関連における欠損した支持組織の交換が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８９】
「異常な造血系または間葉系細胞機能」によって特徴づけられる状態への言及は、造血系列または間葉系列の細胞の機能または発生に関する欠陥または好ましくない、もしくは望ましくない結果に、少なくとも一部、起因する任意の状態への言及として理解されるべきである。これは、均質または異種性のいずれの細胞集団にも対応し得る。「造血系幹細胞」、「造血系幹細胞由来細胞」、「間葉系幹細胞」、または「間葉系幹細胞由来細胞」への言及は、上記で定義されているのと同じ意味をもつと理解されるべきである。本欠陥は、正常ではなく、またはそうでなければ、望ましくない細胞の任意の構造的または機能的特徴への言及として理解されるべきであり、それには、これらの細胞の不十分な数の産生が挙げられる。
【００９０】
したがって、本発明の別の態様は、哺乳類において状態を治療的に、および/または予防的に処置する方法であって、前記方法が、本発明の方法に従って作製されている有効数のMLPC、または部分的に、もしくは完全に分化したMLPC由来細胞を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法を対象とする。
【００９１】
より具体的には、哺乳類において異常な造血系または間葉系機能により特徴づけられる状態を治療的に、および/または予防的に処置する方法であって、前記方法が、
(i)本発明の方法に従って作製されている有効数の造血系幹細胞、または部分的に、もしくは完全に分化した造血系幹細胞由来細胞;または
(ii)本発明の方法に従って作製されている有効数の間葉系幹細胞、または部分的に、もしくは完全に分化した間葉系幹細胞由来細胞
を前記哺乳類に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００９２】
有効数の、本発明の細胞を個体に「投与すること」への言及は、本発明の方法に従って作製されているエクスビボの細胞集団を哺乳類へ導入することへの言及として理解されるべきである。「作用物質」を「投与すること」への言及は、インビボで導入されているMLPCに作用するだろう有効量の1つまたは複数の刺激を哺乳類へ導入して、MLPC由来細胞を作製することへの言及として理解されるべきである。
【００９３】
本発明に従って、本MLPCまたはMLPC由来細胞は、好ましくは、エクスビボで、同定され、単離され、および/または必要な表現型へ分化し、それらが最初に採取された個体へ移植されて戻される、自己細胞である。しかしながら、そうは言うものの、本発明は、本細胞が、処置の対象である個体と同じ主要組織適合性プロファイルを示す、任意の他の適切な源に由来する細胞の使用に及ぶことは理解されるべきである。したがって、そのような細胞は、それらが外来MHCプロファイルを示す細胞の移植に通常伴う組織適合性問題を生じないだろう点において、事実上、自己性である。そのような細胞は、「自己性」の定義の範囲内に入ると理解されるべきである。例えば、ある特定の状況下において、本細胞が遺伝学的に同一の双子から単離されることは、望ましく、必要であり、または実際的意義があり得る。細胞はまた、望ましい主要組織適合性プロファイルを示すように操作されていてもよい。そのような細胞の使用は、組織および臓器移植の関連において本質的に遭遇される困難を克服する。しかしながら、自己細胞を単離または作製することが不可能または実行不可能である場合、同種異系幹細胞を利用することが必要であり得る。「同種異系」細胞は、処置されることになっている対象と同じ種から単離されているが、異なるMHCプロファイルを示すものである。治療用物質の関連におけるそのような細胞の使用は、免疫抑制処置の使用を必要とする可能性が高いが、とは言っても、この問題は、同胞、親、または子どもなどの親族から単離/作製されている細胞集団などの、処置されることになっている対象のMHCプロファイルとの類似性を示すMHCプロファイルを示す細胞の使用により最小にすることができる。本発明はまた、異種間移植にまで及ぶと理解されるべきである。すなわち、本発明の方法に従って作製され、患者へ導入される細胞は、処置されることになっている対象の種以外の哺乳類種から単離される。
【００９４】
本発明をいずれの一つの理論または作用機序にも限定するものではないが、異常な細胞集団によっては与えられていない機能の部分的な回復でさえ、多くの状態の症状を改善させるように働くだろう。したがって、「有効数」への言及は、望ましい効果を少なくとも部分的に達成するのに、または処置されることになっている特定の状態の発症を遅らせ、その進行を阻止し、もしくはその発症もしくは進行を完全に停止させるのに必要な細胞の数を意味する。そのような量は、当然のことながら、処置されることになっている特定の状態、その状態の重症度、および年齢、身体的状態、サイズ、体重、生理的状態、併用処置、病歴を含む個々の患者のパラメーター、および問題の障害に関係したパラメーターに依存する。当業者は、有効用量を構成する本発明の細胞および組織の数、ならびにそれの最適な投与方式を過度の実験なしに決定することができるだろうし、この後者の問題は下記でさらに論じられている。これらの因子は当業者に良く知られており、日常的実験だけで取り組むことができる。最高細胞数、すなわち、妥当な医学的判断による最も高い安全な数が用いられることは、一般的に好ましい。しかしながら、医学的理由、心理的理由のために、または任意の他の理由のために、より低い細胞数が投与される場合があることは当業者により理解されているだろう。
【００９５】
上記で論じられているように、本発明の方法はその範囲内に、移行した、または完全に、もしくは部分的に分化した細胞の、本明細書で定義されているような状態を患う個体への導入を包含するが、個体に導入される集団のあらゆる細胞が、関心対象となるMLPCまたはMLPC由来表現型を獲得しているだろうという場合であるとは必ずしも限らないこともまた理解されるべきである。例えば、CD14+単球集団はMLPCへの移行を起こしており、全部が投与される場合、必要な表現型を示す細胞への移行を起こしていないある割合の細胞が存在する可能性がある。同じ問題は、特定の造血系または間葉系集団などのMLPC由来細胞の集団を投与することの関連において、起こり得る。したがって、それにより導入された細胞の関連性のある部分が、上記で定義されているような「有効数」を構成するとの条件で、本発明は達成される。しかしながら、特に好ましい実施形態において、分化を起こしている細胞の集団が、成功裏に分化した細胞の同定、それらの単離、および対象個体への導入に供されるだろう。これは、間葉系由来結合組織が発生するように誘導される場合に起こり得るようなMLPC由来細胞の異種性集団を選択するための手段か、または赤血球などの、投与のための細胞の特定の副次集団を選択するための手段のいずれかを提供する。適用のために選択される方法の型は、処置されることになっている状態の性質に依存する。しかしながら、奇形腫形成などの潜在的な副作用を回避するために細胞の純粋な集団を投与することが一般的に望ましいだろうことが予想される。あるいは、場合によっては、MLPC集団を分化に供することが実行可能であり得、この集団が、全体として、必要な機能活性を示すことが示されているとの条件で、全体としてのこの集団は、無関係の細胞型を前もって除去することなく、対象個体に導入されてもよい。したがって、この場合における「有効数」への言及は、分化した細胞の数が、対象状態の処置である本発明の目的を達成する活性のレベルを生じるのに十分であるような、導入されるのに必要とされる細胞の総数への言及として理解されるべきである。
【００９６】
上記で詳述されているように、MLPC移行は、インビトロで実施される。この状況において、対象細胞は、その後、個体への導入を必要とする。例えば、細胞懸濁液を、直接的注射または血塊の内部へ(その場合により、細胞は、血塊に固定化され、それにより移植を促進する)導入してもよい。細胞はまた、移植前にカプセル化されてもよい。カプセル化は、増殖し続ける可能性がある(すなわち、不死の特性を示す)細胞の転移を防ぐために、または組織不適合性拒絶問題を最小にするために有用である技術である。しかしながら、カプセル化の有用性は、移植される細胞が、提供することを必要とされる機能に依存する。例えば、移植される細胞が、主に、可溶性因子を分泌するために必要とされる場合には、カプセル化細胞の集団は、この目的を達成する可能性が高い。しかしながら、移植される細胞が、例えばそれらの収縮性のために必要とされる場合には、細胞は、筋肉の既存の組織スキャフォールドと統合されることを必要とされる可能性が高い。カプセル化細胞は、これを効率的に行うことができないだろう。
【００９７】
患者に投与される細胞は、任意の適切な経路により単一または複数の用量として投与することができる。好ましく、かつ可能な場合、単回投与が利用される。注射による投与は、必要とされる修復の型に依存して、組織または器官の様々な領域に向けることができる。
【００９８】
本発明のこれらの態様に従って、患者に投与される細胞が、細胞懸濁液中にあり(例えば、血液細胞)、または組織移植片の形をとる(例えば、結合組織)など、任意の適切な形をとり得ることは認識されているだろう。単細胞懸濁液を作製することに関して、分化プロトコールは、それが細胞懸濁液の維持を促すように設計され得る。あるいは、細胞が凝集し、または組織が形成する場合には、これらは、細胞懸濁液へと分散されてもよい。細胞懸濁液を利用することに関して、特定の単核造血系細胞などの、患者への投与のための細胞の特定の副次集団を選択することも望ましい場合がある。組織が患者へ移植されることが望ましい範囲内おいて、これは、通常、(針またはカテーテルによる投与と対立するものとして)外科的インプラントを必要とする。あるいは、この組織の一部だけを移植することができる。別の例において、操作された組織が、標準組織操作技術によって、例えば、本発明の細胞および組織と共に、設計された形を有する組織操作スキャフォールドを播種し、播種された細胞および組織によりスキャフォールドのコロニー形成を可能にする条件下で播種されたスキャフォールドを培養し、それにより、形成される組織の作製を可能にすることにより、作製することができる。その後、形成された組織は、例えば、標準外科的インプラント技術を用いて、レシピエントへ投与される。適切なスキャフォールドは、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスコンポーネントを含む生体適合性生分解性ポリマー繊維または発泡体を用いて、作製され得る。適切なスキャフォールドを作製し、または入手し、そのようなスキャフォールドを培養し、そのようなスキャフォールドを治療的にインプラントするための詳細なガイドラインは、文献において入手できる(例えば、Kim S.S.およびVacanti J.P.、1999年、Semin Pediatr Surg. 8: 119頁、Osiris, Therapeutics, Inc.社の米国特許第6,387,369号; Bell E.の米国特許出願第20020094573(A1)号を参照されたい)。
【００９９】
本発明の方法に従って、他のタンパク質性または非タンパク質性分子が、対象細胞の導入と共に、またはそれの前に、もしくは後に同時投与されてもよい。「同時投与される」とは、同じもしくは異なる経路により、同じ製剤中で、もしくは異なる製剤中での同時の投与、または同じもしくは異なる経路による連続的な投与を意味する。「連続的な」投与とは、これらの細胞の導入とタンパク質性もしくは非タンパク質性分子の投与との間に、またはこれらの細胞の機能活性の開始とタンパク質性もしくは非タンパク質性分子の投与との間に、数秒間、数分間、数時間、または数日間からの時間差を意味する。そのような同時投与が必要とされ得る状況の例には、以下が挙げられるが、それらに限定されない:
(i)非同系細胞または組織を対象に投与する場合、通常、対象によるそのような細胞または組織の免疫拒絶が起こる。この状況において、そのような拒絶を最小化にするために、好ましくはそのような投与前に開始する、免疫抑制レジメンで患者を処置することも必要とされるだろう。例えばシクロスポリンA、免疫抑制抗体などの投与による、同種異系移植片拒絶を阻止するための免疫抑制プロトコールは、広く行き渡った標準的技法である。
(ii)処置されることになっている状態の性質に依存して、移植された細胞が組み込まれ、かつ完全に機能するようになるような時間まで、患者を状態の症状を軽減するための薬物療法のコースに維持することが必要な場合がある。あるいは、状態が処置される時点において、損傷の再発を防止するために薬物の長期使用を開始することが必要な場合がある。例えば、(関節リウマチの関連において起こるような)対象損傷が自己免疫状態によって引き起こされた場合、免疫抑制薬の継続使用は、同系幹細胞が軟骨を交換し、または修復するために用いられている場合でさえも必要とされる可能性がある。
【０１００】
本発明の方法は、問題の状態を処置するために単独で実施することができ、またはそれは、対象処置を促進もしくは増強するように設計された1つもしくは複数の追加の技術と共に実施することができることもまた、理解されるべきである。これらの追加の技術は、上記で詳述されているように、他のタンパク質性または非タンパク質性分子の同時投与の形をとってもよい。
【０１０１】
本発明の別の態様は、哺乳類における状態の処置のための薬物の製造における、本発明の方法に従って作製されているMLPCまたはMLPC由来細胞の集団の使用を対象とする。
【０１０２】
本発明のまだなお別の態様は、本発明の方法に従って作製されているMLPCまたはMLPC由来細胞を対象とする。
【０１０３】
好ましくは、前記MLPCは造血系または間葉系幹細胞である。
【０１０４】
本発明の関連態様において、処置または予防を受ける対象は、治療的または予防的処置を必要としている任意のヒトまたは動物であり得る。この点において、「処置」および「予防」への本明細書における言及は、それの最も広い情況において考えられるべきである。用語「処置」は、哺乳類が完全回復まで処置されることを必ずしも含意するとは限らない。同様に、「予防」は、対象が、最終的に疾患状態に罹ることはないだろうことを必ずしも意味するとは限らない。したがって、処置および予防は、特定の状態の症状の軽減、または特定の状態を発生することを防止し、もしくはそうでなければ、そのリスクを低減することを含む。用語「予防」は、特定の状態の発症について重症度を低減するとみなされ得る。「処置」もまた、存在する状態の重症度を低減し得る。
【０１０５】
インビトロでMLPCまたはMLPC由来細胞を作製するための方法の開発は、現在、既存の、または有望な処理または培養方式の有効性および毒性を試験するためのインビトロに基づいたスクリーニング系の開発を促進している。
【０１０６】
したがって、本発明のまだなお別の態様によれば、MLPCまたはMLPC由来細胞の表現型様式または機能様式への処理または培養方式の効果を評価する方法であって、前記方法が、上記で定義された方法に従って作製されている前記MLPCまたはMLPC由来細胞を前記処理方式に供する工程、および変化した機能様式または表現型様式についてスクリーニングする工程を含む、方法が提供される。
【０１０７】
好ましくは、前記MLPCは造血系または間葉系幹細胞である。
【０１０８】
「変化した」とは、分析の対象である機能または表現型パラメーターの1つまたは複数が未処理の細胞と比較して変化していることを意味する。これは、問題の処理方式が、細胞機能を向上させるように設計されている場合、望ましい結果である可能性がある。しかしながら、処理方式が、有害な結果を伴う場合、これは、毒性、およびしたがって、処理方式の使用についての不適切を示す可能性がある。特定の薬剤に対する個体の応答に関して観察される違いは、その個体の固有の遺伝子構造に関連づけられる場合が多いことは、現在、良く知られている。したがって、本発明の方法は、問題の個体に由来する核物質を利用して作製される細胞への、既存か、または新しいかのいずれかの処理方式を試験する、価値ある手段を提供する。これは、インビボで薬剤を投与する前に、個体の細胞系への薬剤の起こりそうな効果を評価するための独特な手段を提供する。患者が極めて具合が悪い場合、好ましくない結果を引き起こす処理方式によって引き起こされ得る生理学的ストレスは、回避され、または少なくとも最小化され得る。
【０１０９】
したがって、本発明のこの態様は、細胞機能を正常化するように設計される処理を最適化する手段を提供する。しかしながら、その方法はまた、処理、特に化合物での処理の毒性を評価するために用いることができる。したがって、例えば、化合物での処理に応答して、本発明の細胞および組織において、造血系または間葉系表現型に関連した特性を生じることができないことは、そのような化合物の毒性を評価するために用いることができる。
【０１１０】
このように、本発明の方法は、薬剤、他の処理方式、または培養条件をスクリーニングおよび/または試験するために用いることができる。表現型の変化を評価することに関して、本発明のこの態様は、対象細胞および組織の遺伝子発現プロファイルへの変化についてモニターするために利用することができる。したがって、本発明のこの態様による方法は、例えば、処理に応答した遺伝子発現パターン変化を決定するために用いることができる。
【０１１１】
好ましくは、本発明の細胞または組織が供される処理は、化合物への曝露である。好ましくは、化合物は、薬剤または生理学的イオンである。あるいは、化合物は、成長因子または分化因子であり得る。この目的を達成するために、薬剤を投与する前に細胞集団へのそのような副作用を予測する能力がある利用可能な方法を有することは大いに望ましい。
【０１１２】
本発明は、以下の非限定的例を参照することにより、さらに記載される。
【実施例１】
【０１１３】
MLPCの産生
標準技術を用いて、健康なヒト成人から静脈血を抽出し、密度勾配遠心分離を用いて末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。
【０１１４】
CD14+ PBMCの試料をFEP血液バッグに入れた。CD14+ PBMC試料と等しい体積の6%ヒト血清アルブミン溶液を加えた。
【０１１５】
幹細胞培養に適した細胞培地を加えた。最終混合物は、およそ、15%のCD14+ PBMC、15%の6%ヒト血清アルブミン溶液、および70%の細胞培地で構成された。
【０１１６】
細胞成長を促進するために、任意で体積の10mg/Lインスリンを加えることができる。
【０１１７】
その後、細胞培養物は、5%CO2インキュベーターにおいて37℃で90分間、インキュベートされ、PBMCがバッグの内側に付着した。付着後、細胞は、1〜7日間、インキュベートされ、その場合、この期間を通してMLPCが導き出されるだろう。7日目において、細胞培養物をバッグ壁から取り出し、0.9%無菌生理食塩水で洗浄した。結果として得られたMLPCは調べられ、自己ドナーへの再導入に利用可能であった。
【実施例２】
【０１１８】
MLPCの特徴づけ
1.MLPCの形態学的観察
37℃でのCO2インキュベーター内でのインキュベーション後1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、および7日目からの細胞培養物の試料でスライドを調製した。MLPCの生物学的特性を研究するために、接着細胞表現型を、細胞培養期間中、倒立顕微鏡により分析した(図1〜図8)。
【０１１９】
2.フローサイトメトリー分析
MLPC幹細胞発現を同定するために、表面マーカーを、フローサイトメトリーにより分析した。MLPCを閉鎖バッグ系から採取し、PBSで洗浄し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離し、細胞ペレットを保持した。細胞密度をチューブあたり1×106細胞に調整し、細胞を、100マイクロリットルPBS緩衝液中に再懸濁し、1.5mLバイアルへ移した。MLPCを、CD14-FITC、CD29-PE、C31-PE、CD34-PE、IgG-PEアイソタイプ対照(MACS、Germany)、CD38-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD105-PE(BD PharMingen社、CA)を含む5〜20μl蛍光色素標識抗体と共に4℃で20〜30分間、インキュベートし、その後、4℃で5分間、2000rpmで遠心分離した。PBS洗浄工程後、細胞ペレットを保持し、細胞ペレットに、固定化緩衝液(eBioscience)を100マイクロリットルで、4℃で30分間、加えた。最後に、固定化されたMLPC試料を、4℃で5分間、2000rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをPBS緩衝液で再懸濁し、4℃で保存した。生細胞を、CellQuestソフトウェアを用いることにより同定し、その日付は、対数ヒストグラムとして示されている。
【０１２０】
3.結果の分析
顕微鏡観察の結果について、図1は、培養バッグの内側に付着したCD14陽性PBMCを示し、大部分は、90分間のインキュベーション後、丸く見える。1〜2日目、細胞は、卵形になる(図2〜図3)。その後、これらの接着細胞は、3日目から5日目まで、はっきりした尾と同時に、顕著な紡錘体および線維芽細胞様形態を示す(図4〜図6)。6日目および7日目、細胞は、卵形表現型に戻るが、尾は残存する。このように、MLPC作製は完了する(図7〜図8)。
【０１２１】
フローサイトメトリー分析の結果について、1日間のインキュベーション後、MLPC試料を分析し、以下のプロファイル:CD14+、CD34low、CD45+、CD29+、CD44+を発現することを見出した(図1)。
【０１２２】
3日間のインキュベーション後、MLPC試料を分析し、以下の表現型:CD31+、CD38+、CD90-、CD105+を発現することを見出した(図2)。
【０１２３】
6日間のインキュベーション後、MLPC試料を分析し、以下の表現型:CD14+、CD29+、CD34low、CD44+、CD45+を発現することを見出した(図3)。
【０１２４】
7日間のインキュベーション後、MLPC試料を分析し、以下の表現型:CD14+、CD34low、CD44+、CD45+を発現することを見出した(図4)。
【実施例３】
【０１２５】
CD14+多分化能細胞のタンパク質発現
2DEおよびMALDI-TOF/MS/MS分析によるタンパク質発現
細胞抽出物の調製
4人の健康のボランティアのCD14陽性のPBMCプールから4〜7日間の培養後、細胞タンパク質を収集した。簡単に述べれば、細胞のタンパク質抽出を、尿素溶解緩衝液およびアセトン精製により得た。
【０１２６】
各群由来の試料を、タンパク質量に従って等しく混合し、その後、2DEを、IPGphor IEFシステムおよびEttan DALTSixシステム(Amersham Biosciences社、USA)を用いて2連で3回、IPGストリップ(18cm、pH 3〜11、線形(L);GE Healthcare、Amersham社、USA)および12.5%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて実施した。
【０１２７】
ゲルをCyproRuby(GIBCO)で染色し、タンパク質スポット同定のためにイメージスキャナ(Amersham Biosciences社、USA)でスキャンした。タンパク質をゲル内消化により得た;ゲルスポットを50%アセトニトリル(ACN)および25% 50mM NH4HCO3中で脱染し、その後、100%ACNで脱水し、窒素ガス流中で乾燥させた。乾燥したゲル小片を、25mM NH4HCO3およびトリプシン(Promega社、USA)からなる消化溶液中、37℃で一晩、インキュベートした。トリプシンペプチド混合物を脱塩し、ZipチップC18マイクロカラム(Millipore社、USA)で精製した。精製されたペプチド混合物を、質量スペクトル分析のためにマトリックスα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)と混合した。質量スペクトル結果を、Bruker-Daltonic Autoflex TOF LIFT質量分析計を以下の通り設定されたパラメーターで用いて得た:パーフレクトメーターモード、陽イオン、フライトチューブの長さ2.7m、イオン源の電圧の加速20,000V、および反射電圧23,000V。情報のMASCOT検索エンジンでのNCBIデータベースにおけるトリプシン断片サイズからのタンパク質同定のために、質量フィンガープリンティングを用いた。
【０１２８】
2DEおよびMALDI-TOF/MS/MS分析によるCD14+-PBMCのタンパク質発現
1. MYL9
2. RASF6
3. SYMPK
4. ATPB
5. CALR
6. UBFL6
7. ACTB
8. TPM4
9. APOA1
10. TPA4A
11. SODM
【０１２９】
ウェスタンブロッティング分析によるタンパク質発現
細胞抽出物の調製
4人の健康のボランティアのCD14陽性のPBMCプールから4〜7日間の培養後、細胞タンパク質を収集した。簡単に述べれば、細胞の抽出を、RIPA溶解緩衝液(Millipore社、Temecula. CA 92590)により得た。抽出された懸濁液を、氷上で20分間、インキュベートし、その後、13000gで5分間、遠心分離した。上清(可溶性画分)を収集し、様々なタンパク質発現を検出するために用いた。
【０１３０】
ウェスタンブロット分析
市販の製品から購入された様々なタンパク質に対する抗体には、以下のものが含まれる:コラーゲンI型、HLAクラス1、TAZ、インスリン様成長因子結合タンパク質3(IGFBP3)、アルカリフォスファターゼ、およびパーフォリンに対する抗体は、Abcam Inc.社(Boston、USA)により入手され、CDX2、フィブロネクチン、インターフェロンガンマ誘導タンパク質10(IP-10)、マクロファージ-1抗原(MAC-1)、Mカドヘリン、MyoD(MYOD1)、核転写因子Yサブユニットアルファ(NF-YA)、ノッチ1、ペアードボックス-5(PAX-5)、P-糖タンパク質、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質(WASP)に対する抗体はEpitomic Inc.社により入手され、α-アクチニン、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼIV)、細胞性レチノイン酸結合タンパク質(CRABP II)、GATA結合因子-4(GATA4)、低酸素誘導因子1α(HIF-1α)、Achaete-scute homolog 1(MASH1)、ミオゲニン、およびRunt関連転写因子3(Runx3)に対する抗体はMerck Millipore Headquarters社(Billerica、MA、USA)により入手され、アネキシンVI(G-10)、ニューロゲニン3(E-8)、グランザイムB、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD2、D5G2)、およびグラニュリシン(F-9)に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology社(Santa Cruz、CA、USA)により入手された。
【０１３１】
細胞可溶化物の上清を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に用いた。100マイクログラムの各細胞試料をPierce 4〜20% Tris-グリシンゲル(Thermo SCIENTIFIC社、Rockford USA)上に負荷した。電気泳動後、ゲルを、PVDF膜(Millpore社、Temecula. CA 92590)上にブロットした。PVDF膜を、Tris緩衝食塩水Tween-20緩衝液(10mM Tris、pH 8.0、150mM NaCl)中5%スキムミルクでのブロッキングに供し、その後、膜を、新鮮な5%スキムミルクTris緩衝食塩水Tween-20緩衝液中、様々な一次抗体と4℃で一晩、インキュベートした。膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ連結二次抗体とインキュベートした。Amersham社製増強ケミルミネセンスシステムで可視化を行った。応答バンドを、CCDカメラおよびMulti Gaugeソフトウェアにより決定した。
【０１３２】
ウェスタンブロット分析によるPBMC-CD14+のタンパク質発現
1.コラーゲンI型
2.HLAクラス1
3.TAZ 
4.インスリン様成長因子結合タンパク質3(IGFBP3)
5.アルカリフォスファターゼ
6.パーフォリン
7.CDX2
8.フィブロネクチン
9.インターフェロンガンマ誘導タンパク質10(IP-10、CXCL-1)
10.マクロファージ-1抗原(MAC-1)
11.Mカドヘリン
12.MyoD(MYOD1) 
13.核転写因子Yサブユニットアルファ(NF-YA)
14.ノッチ1
15.ペアードボックス-5(PAX-5)
16.P-糖タンパク質
17.ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質(WASP)
18.α-アクチニン
19.Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼIV)
20.細胞性レチノイン酸結合タンパク質(CRABP II)
21.GATA結合因子-4(GATA4)
22.低酸素誘導因子1アルファ(HIF-1アルファ)
23.Achaete-scute homolog 1(MASH1)
24.ミオゲニン
25.Runt関連転写因子3(Runx3)
26.アネキシンVI(G-10)
27.ニューロゲニン3(E-8)
28.グランザイムB
29.グラニュリシン(F-9)
30.GAD2
【０１３３】
フローサイトメトリー分析によるタンパク質発現
CD14+-PBMCを閉鎖型バッグから採取し、(2%FBSを含有した)PBSで洗浄し、4℃で5分間、1500rpmで遠心分離し、細胞ペレットを保持した。フローサイトメトリーアッセイのために細胞密度をアッセイあたり2.5〜3×106細胞に調整する。抗体を蛍光標識することによる蛍光色素標識抗体でCD14+-PBMCを標識し、実験手順は、手書き原稿の標準操作に従う。最後に、細胞ペレットに固定化緩衝液(BD)100マイクロリットルを加え、4℃で20分間、静置し、その後、フローサイトメトリー分析(Becton Dickinson)まで4℃で保存し、光を防ぐ。生細胞を、CellQuestソフトウェアを用いることにより同定し、その日付は、対数ヒストグラムとして示されている。
【０１３４】
【表１】
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【実施例４】
【０１３５】
症例研究  -  癌
症例研究:35歳の末期症状の胸腺癌患者における末梢血採取による自己幹細胞処置
この症例研究は、病期4期転移性胸腺癌の末期症状である35歳の男性についてである。彼は、実施例1に従って調製された、3ラウンドの自己幹細胞を注射された。
【０１３６】
到着時、彼は、車椅子に束縛され、重度のアナミック(anamic)かつニュートラペリック(neutraperic)であった。彼は以前、腫瘍の外科的切除、化学療法(および放射線療法?)を受けていた。彼の左肺は完全に崩壊しており、心エコーで心臓への転移が認められた。
【０１３７】
250mlの彼の血液を、16ゲージのカテーテルでの静脈穿刺により2013年4月8日に採血し、その後、それを、幹細胞の自己転換のためにAutologous Stem Cell Technologyの研究室へ輸送した。
【０１３８】
2.3×108個の患者の幹細胞の再注入が、2013年4月13日に行われた。この処置の目的は、彼の骨髄を回復させ、数ラウンドの化学療法後、ほとんど存在しないところまで枯渇していた彼の免疫系を強化することであった。処置後、有害事象は認められなかった。
【０１３９】
十分に骨髄が回復すると、2013年4月23日に、2回目の250mlの血液をその患者から採取し、2013年4月29日に再注入が行われた。この自己幹細胞処置の目的は、自己幹細胞転換のために十分な量の単球が採取できるように、彼の白血球カウントを後押しすることであった。処置後、患者は、助けなしに歩くことができ、食欲の増加およびエネルギーレベルの増加が報告されている。
【０１４０】
2013年5月27日に、3回目で最後の250mlの血液が患者から採血され、2013年5月31日に3.6×108個の幹細胞の再注入が行われた。この処置の目的は、彼の癌を特異的に標的にすることである。
【０１４１】
3回の幹細胞処置後、彼のヘモグロビンは、日常的な濃厚赤血球輸血を受ける必要がないところまで改善した。彼の全体的な体力および活力は、彼が助けなしに歩くことができるところまで改善した。彼の酸素飽和度が、幹細胞処置後、著しく改善したことが注目された。彼は、全ての病理学パラメーターにおいて改善し続け、処置後、彼の台湾人の医師からの画像診断報告により、心臓および大血管の周囲の腫瘍退縮が示されている。彼の悪性腹水からの腹部膨満は、処置後、改善した。続いて、腎臓および肝臓機能が改善するにつれて、彼の末梢性浮腫も減少した。彼は良くなり続けた。
【実施例５】
【０１４２】
症例研究  -  顔の若返り
症例研究:顔の若返りおよび再生目的のための70歳の女性における末梢血採取による自己幹細胞処置
この症例研究は、2013年5月23日に自己幹細胞の末梢注入を受けた70歳の女性についてである。
【０１４３】
250mlの彼女の末梢血を、実施例1の方法に供した16ゲージのカテーテルでの静脈穿刺により採取した。
【０１４４】
2013年5月27日、1.5×108個の、以下のCDマーカーを有する彼女の転換された幹細胞を、2時間にわたって彼女の前腕におけるIV注入により注入した。
CDマーカー
・  CD38、CD90 (造血系/リンパ系幹細胞)
・  CD11b、CD31、CD44、CD105 (間葉系幹細胞)
・  CD7、CD59、CD84 (造血系幹細胞)
・  CD49d (神経幹細胞)
・  CD45 (造血系前駆体細胞)
・  CD9、CD30
・  CD7 (多能性幹細胞)
【０１４５】
彼女の静脈内幹細胞注入と同時に顔の若返りを実施した。幹細胞を、直線的逆行性技術(linear retro-grade technique)において、彼女の顔の全ての領域へ皮内注射した。数層の幹細胞充填を、鼻唇、口囲、眼周囲、額眉間領域へ実施した。合計でおよそ20ml〜40mlを、顔全部の若返り手順に用いた。患者は健康で退院した。手順の直後、患者は、手順後の24時間、極小の挫傷と腫れを認めた。
【０１４６】
患者は、6週間という間隔にわたって経過観察され、以下の効果を認めた:
・皮膚弛緩の改善
・質感の改善
・色素沈着の減少
・鼻唇溝の減少
・眉間しわの減少
・眼周囲しわの改善
・新たなコラーゲン形成
・細孔の大きさの低下
・しわの縮小
【実施例６】
【０１４７】
再生目的のための68歳の男性における末梢血採取による自己幹細胞移植
この症例研究は、再生目的のために、2013年4月25日に自己幹細胞の末梢注入を受けた68歳の男性についてである。幹細胞は、患者からの末梢血収集だけで集められ、実施例1の方法に従って処理された。
【０１４８】
彼の最新の重要な病歴は、虚血性心疾患および全身性骨減少症と共に、高血圧性2型糖尿病の病歴であり、最近、L3/4椎間板切除術を受けた。彼の既往歴は、2004年におけるCVA、および血管疾患の強い家族歴を含む。再生に基づいた移植についての患者の主要な目的は、彼の健康および活力を改善することだけでなく、特に、長年、彼の骨減少症の一因となり、かつ現在、頚椎と腰椎の併発の一因となっているステロイド薬物療法の低減を可能にすることであった。
【０１４９】
移植プロトコールによるベースライン血液を取得し、目立ったことはなかった。2013年4月25日、104.3ml、すなわち、1mlが1.5×105個の幹細胞を含有し、合計1.56×107個の幹細胞を再注入した。
【０１５０】
幹細胞は以下のマーカーを有した:
CD38、CD90(造血系/リンパ系幹細胞)
CD11b、CD31、CD44、CD105 (間葉系幹細胞)
CD7、CD59、CD84 (造血系幹細胞)
CD49d (神経幹細胞)
CD45(造血系前駆体細胞)
CD9、CD30
CD7(多能性幹細胞)
【０１５１】
全ての観察および生命徴候は、合併症もなく、移植を通じて安定しており、患者は、健康で退院した。診察時、患者は、著しく制限されたRO Minの徴候および症状を示したので、頸椎の定期的なエンドーン(endone)を必要とした。
【０１５２】
移植後、患者は、以下における著しい改善を報告している:
健康な状態の増加
および疲労の減少
行動の範囲の増加
疼痛スコアの減少
睡眠パターンの改善
【０１５３】
患者はまた、プレドニゾン用量を10mgから現在、6mgまで次第に減らすことができている。彼は、今まで、この用量に達し得ることは決してなかった。彼はまた、麻薬性鎮痛が少なくて済み、臨床的に改善し続けている。
【実施例７】
【０１５４】
症例研究
患者は、結果として著しい右側の半側無視および重度の構音障害を生じる、過去の重大なCVAを臨床的に患っていることが診察時に見出された。彼は、移植前、述べたように、座りながら体幹支持を必要とし、右脚の伸展が限定されていた。幹細胞移植の前と後のどちらにおいても、全ての観察および生命徴候は安定していた。
【０１５５】
患者は、実施例1の方法に従って調製された細胞の自己幹細胞移植を受けた。合併症はなく、彼は、同日、担当の公認看護師と共に自宅へ戻った。彼の病態は、陽性マイコプラズマ培養を認めたが、彼は十分、臨床的に健康であり、検査での両側肺底は、クリアであり、発熱または熱もなかった。酸素飽和度は全て、正常であった。
【０１５６】
彼は、予防的に、継続される分を網羅する、1日2回、Rulide150mgについての薬剤注文書をもらって、退院した。
【０１５７】
幹細胞治療以後、患者に関して観察された経過:
1.彼は、4分もの間、体幹支持なしに椅子に座位バランスを保つことができる。これは、治療前には観察されなかった。
2.右肩周囲の筋肉の緊張状態が改善している。現在、彼は、能動的に右肩を断続的にすくめ、かつこれをより水平位に維持することができる。
3.右膝:車椅子に座りながら、右膝伸展のフリッカーもまた、認められている。この運動は、物理療法士からの手での促進なしでは以前は不可能であった。
4.左手で手すりをもつことにより、はるかにずっと良くコントロールしながら、車椅子から立ち上がることができ、この座る-立つという運動を、ほとんど手での支持なしで、3回も繰り返すことができる。
5.彼の発話能力もまた、ある程度まで改善しているように思われ、英語とギリシャ語のどちらも、より明瞭な発音になっている。
6.気分および情動の向上が言語療法士によって認められた。ランダムな単一の書き言葉、および技能を示す絵を読むことにおいて、言語療法士により、わずかな変化が認められた。
【０１５８】
本明細書に記載された本発明が、具体的に記載されたもの以外のバリエーションおよび改変を受けやすいことを当業者は認識しているだろう。本発明が、そのようなバリエーションおよび改変の全てを含むことは理解されるべきである。本発明はまた、この明細書に個々に、または集合的に言及され、または示された工程、特徴、組成物、および化合物の全部、ならびに前記工程または特徴の任意の2つ以上のありとあらゆる組み合わせを含む。
【実施例８】
【０１５９】
症例研究
2013年6月における幹細胞治療についての、精子の完全な欠如および男性不妊症を示した45歳の男性。
【０１６０】
彼は、彼の不妊症の原因を明らかにするだろう、子どもの頃の病気も事故もなく、つい最近、2012年に診断された。
【０１６１】
彼は、以前は健康であり、受精能を助けようとして、数回のIVFの試みおよび手術を受けていた。
【０１６２】
彼は、顕著な染色体異常も有し、FISH研究により33%という非常に高い異数性率が示された。
【０１６３】
2012年からの彼の本来の精子数はゼロであった。
【０１６４】
彼は、それ以来、幹細胞治療を受けており、1万個の精子/mlを有し、顕著には、2万個の精子/mlの精子数であり、添付された報告書も参照されたい。
【０１６５】
彼の染色体異常率もまた、2013年7月からの結果において、33%から21.9%へ降下した。
【０１６６】
彼が現在、精子を成功裏に産生しているため、幹細胞治療によって、この患者がIVF治療を受けるのに適するようになっている。
【０１６７】
彼はまた、幹細胞治療以来、彼の毛髪の成長およびエネルギーレベルが著しく増加していることもまた認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１２Ｋ】
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【図１２Ｌ】
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【図１２Ｍ】
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【図１２Ｎ】
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【図１２Ｏ】
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【図１２Ｐ】
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【図１２Ｑ】
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【図１２Ｒ】
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【図１２Ｓ】
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【図１２Ｔ】
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【図１２Ｕ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
2016505249.tif 000042
【図１３Ｉ】
2016505249.tif 000043
【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【国際調査報告】
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