(57)【要約】  本発明は、ＣＸ３ＣＲ１標的化イメージング剤、並びに疾病の処置及び診断におけるその使用に関する。検出標識に連結された単一ドメインＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド及び動脈硬化プラークのインビボでのイメージングにおけるその使用が説明される。前記ＣＸ３ＣＲ１標的化イメージング剤は、アテローム性動脈硬化症をはじめとするＣＸ３ＣＲ１により媒介される疾病の処置及び診断に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出標識に連結されたＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドを含む、イメージング剤。
【請求項２】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドはＶＨＨドメインである、請求項１又は２記載のイメージング剤。
【請求項４】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは、
−それぞれ、配列番号１４１、１６２及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６３及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６６及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６７及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６７及び１８９；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６８及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６８及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６９及び１９０；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７０及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７１及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７５及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４２、１６５及び１８８；又は
−それぞれ、配列番号１４２、１７３及び１８８；又は
−それぞれ、配列番号１４３、１６４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４４、１７２及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４５、１７２及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１５及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１６及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１７及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１８及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１９及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２２０及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２２１及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４６、１７６及び１９１；又は
−それぞれ、配列番号１４６、１７７及び１９１；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７８及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７９及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１４８、１７９及び１９３；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１７９及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８０及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８１及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８３及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８５及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１５０、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５０、１８２及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５１、１７９及び１９３；又は
−それぞれ、配列番号１５１、１８２及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５１、１８４及び１９６；又は
−それぞれ、配列番号１５２、１７９及び１９５；又は
−それぞれ、配列番号１５３、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５４、１８２及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５５、１７９及び１９５；又は
−それぞれ、配列番号１５６、１８１及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１５７、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５８、１７９及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１５９、１７８及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１６０、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１６１、１７９及び１９４
から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む、請求項１〜３のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項５】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは、
−それぞれ、配列番号１４１、１６２及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１５及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１６及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１７及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１８及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１９及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２２０及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２２１及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７８及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４６、１７６及び１９１
から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む、請求項１〜４のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項６】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは、配列番号１〜１４０又は１９７〜２０２のいずれか１つから選択された配列を有するＶＨＨドメインである、請求項１〜３のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項７】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは、配列番号１、１１、４９、５３、１２１〜１４０、又は１９７〜２０２のいずれか１つから選択された配列を有するＶＨＨドメインである、請求項１〜３又は６のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項８】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは二価であり、リンカーペプチドによって共有結合で連結された２つのＶＨＨドメインを含み、前記二価ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは配列番号２０３〜２１２、２２２又は２２３のいずれか１つから選択され、前記２つのＶＨＨドメインは同一であっても異なっていてもよい、請求項１又は２記載のイメージング剤。
【請求項９】
前記二価ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドの配列は配列番号２０８、２２２又は２２３のいずれか１つから選択される、請求項１、２又は８のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項１０】
前記検出標識は、放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択される、請求項１〜９のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項１１】
前記検出標識は放射性同位体である、請求項１〜１０のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項１２】
前記検出標識は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅ、１１Ｃ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、８２Ｒｂ、１２４Ｉ及び８９Ｚｒから選択される、請求項１〜１１のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項１３】
前記検出標識は９９ｍＴｃ及び６８Ｇａから選択される、請求項１〜１２のいずれか記載のイメージング剤。
【請求項１４】
前記ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは、配列番号２２４、２２５、２２６、２２７又は２２８のいずれか１つから選択されたＶＨＨドメインと、ＣＸ３ＣＲ１への結合について競合する免疫グロブリンである、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項１５】
ａ）請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤を被験者に投与する工程；及び
ｂ）被験者の非罹患組織と比較して、罹患組織においてより高いレベルのイメージング剤の結合を検出する工程
を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法。
【請求項１６】
前記疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、ＣＯＰＤ、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病がアテローム性動脈硬化症である、請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
前記イメージング剤の結合を検出するための方法は、
ａ）単一光子放射型コンピュータ断層撮影法；
ｂ）陽電子放出断層撮影法；
ｃ）近赤外線蛍光イメージング；
ｄ）超音波イメージング；及び
ｅ）磁気共鳴イメージング
から選択される、請求項１５〜１７のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
前記イメージング剤の結合を検出するための方法は陽電子放出断層撮影法である、請求項１５〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
被験者がヒトである、請求項１５〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
１）被験者の組織試料を、請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤と接触させる工程；及び
２）試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法。
【請求項２２】
ａ）非罹患組織と比較して罹患組織において請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤のより高いレベルの結合を有するとして患者を同定する工程；
ｂ）治療剤を患者に投与する工程
を含む、ＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を有する患者を処置するための方法。
【請求項２３】
前記疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、ＣＯＰＤ、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記疾病はアテローム性動脈硬化症である、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
効果的な治療剤はＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストである、請求項２２〜２４のいずれか記載の方法。
【請求項２６】
ａ）ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドの生成
ｂ）検出標識の結合、及び
ｃ）場合によりさらなる賦形剤の混合
の工程を含む、請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤の製造法。
【請求項２７】
請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤の製造のための放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択された検出標識の使用。
【請求項２８】
被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するための請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤を含む組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１４のいずれか記載のイメージング剤を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するためのキット。
【請求項３０】
被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法の使用説明書をさらに含む、請求項２９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＸ３ＣＲ１結合ポリペプチド、並びに、アテローム性動脈硬化症をはじめとする疾病の診断及び処置のためのインビボでのイメージングにおけるその使用に関する。
【０００２】
背景
心臓血管疾患は、米国及び他の先進国において主要な死因である。アテローム性動脈硬化症は進行性の動脈壁の疾病であり、脂質沈着及び慢性炎症によりプラークが発達する。大半のプラークは無症候性のままであるが、いくつかは血栓症（不安定）及び破裂が起こりやすく、その結果、心筋梗塞又は心臓発作が起こり得る。血管壁を見るために様々な画像診断法が開発されている（Verjans, 2013; J. of Cardiovasc. Trans. Res. ePub June, 2013）。光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）及び血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）などのいくつかの技術がプラークの組成及び安定性に関する情報を与えることができるが、それらは侵襲的な手順を必要とする。別の技術は、プラーク中のマクロファージなどの活発に代謝している細胞によって取り込まれ、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出することができる基質である１８Ｆ−フルオロデオキシグルコースを利用する。１８Ｆ−ＦＤＧ ＰＥＴは、プラークの炎症をモニタリングするための臨床的有用性を示したが、それはまた多くの組織にも非選択的に取り込まれる可能性がある。動脈硬化性疾患の進行及び不安定プラークの発達を駆り立てる活発な細胞プロセス及び分子プロセスへの洞察を提供するために、新規な分子イメージングツールが必要とされる。高度な炎症を有する及び／又は破裂しがちな病変の検出を支援するツールは、リスクのある患者の同定のための及び新規療法の効力の評価のための価値ある機序を提供するだろう。
【０００３】
発明の要約
本発明は、新規なＣＸ３ＣＲ１標的化イメージング剤を提供する。別の態様では、これらのイメージング剤は、動脈硬化性疾患を診断するのに有用である。別の態様では、これらのイメージング剤は、ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト治療薬による処置又は動脈硬化性疾患のための他の公知の処置によって恩恵を受けるであろうアテローム性動脈硬化症患者を選択又は層別化するのに有用である。さらなる態様では、これらのイメージング剤は、組織におけるＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病の診断において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１及びＣＨＯ−ＷＴ細胞に対する９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメイン（１nM）の標準化された結合。
【図２】静脈内注射から３時間後に得られたＣ５７ＢＬ／６マウス及びｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスにおける一価ＶＨＨドメイン９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２及び二価ＶＨＨドメイン９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８の体内分布の代表的なインビボでのＳＰＥＣＴ／ＣＴ全身最大値投影像。Ｌ＝肝臓、Ｋｄ＝腎臓、Ｂｌ＝膀胱、ＬＮ＝リンパ節、Ｓｔ＝胃、Ｂ＝骨、Ｉｎｔ＝腸、Ｓｐｌ＝脾臓、i.s.＝注射部位。
【図３】高脂肪、高コレステロールの食餌を１６週間与えられたｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおける９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２及び９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８の体内分布の全身ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。横断面図、冠状面図、及び矢状面図は、大動脈の底部にある動脈硬化性病変（白い矢印）への９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインの取り込みの可視化を可能とする。過剰な標識されていないＶＨＨドメインを共投与して特異性（＋遮断）を実証した。
【図４Ａ】病変スコアに従って順位付けられた、ＡｐｏＥ−／−マウスと、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−/−マウスと、過剰な標識されていないＶＨＨドメインを共投与されたｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスとの大動脈セグメントへの９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の取り込みのエクスビボでの定量化。
【図４Ｂ】病変スコアに従って順位付けられた、ＡｐｏＥ−／−マウスと、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−/−マウスと、過剰な標識されていないＶＨＨドメインを共投与されたｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスとの大動脈セグメントへの９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８の取り込みのエクスビボでの定量化。
【図５】９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の注射されたｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩＡｐｏＥ−／−マウスから単離された大動脈セグメントの代表的なカラースケールオートラジオグラフ画像。白い矢印は、病変スコア１を有するセグメントにおける小さな個々のプラークを指し示す。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＸ３ＣＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドに基づいたイメージング用トレーサーとしても知られるイメージング剤、及び診断用ツールとしてのその使用に関する。イメージング剤は、検出標識に連結されたＣＸ３ＣＲ１標的化単一可変ドメインポリペプチドからなる。本発明のイメージング剤を含む単一可変ドメインポリペプチドは好ましくは、本明細書において以後定義されているような、ラクダに由来するＶＨＨドメイン（又は単に「ＶＨＨ」）であるが、これに限定されない。
【０００６】
ＣＸ３ＣＲ１は、Ｇタンパク質共役膜内在性タンパク質で、ケモカイン受容体ファミリーの一員である。それは、膜内在性タンパク質として産生される、フラクタルカインという独特なリガンドを有する。それはまた、タンパク質分解切断によって循環中へと放出され得る。ヒトにおいて活性の低下したＣＸ３ＣＲ１変異体（Ｖ２４９Ｉ／Ｔ２８０Ｍ）は、低リスクの心臓血管疾患（冠動脈心疾患、脳血管疾患、又は末梢血管疾患）（McDermott, 2001; Circ. Res.89:401）、冠動脈疾患（血管造影による狭窄のエビデンス）（McDermott, 2003; J. Clin. Invest.111:1241）、及び頸動脈閉塞疾患（Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276）に関連することが示された。いくつかの独立したマウス遺伝子研究は、アテローム性動脈硬化症に対するＣＸ３ＣＲ１欠損症の有益な効果を示した。高脂肪食餌を与えられた２つの独立に由来したＣＸ３ＣＲ１−／−ａｐｏＥ−／−マウス系統において、大動脈弓及び胸部大動脈における病変領域の減少、並びにプラークにおける単球／マクロファージ蓄積の減少が見られた（Combadiere, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin. Invest. 111:333）。
【０００７】
ＣＸ３ＣＲ１は、動脈硬化プラークの発症及び進行に関連している単球、樹状細胞及びＴ細胞などの細胞タイプに主に発現される。それは、循環中のヒト中間型単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）及び非古典的な単球（ＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋）上に高度に発現されている（Cros, 2010; Immunity 33:375）。血管内ＯＣＴによって決定される破裂したプラークのエビデンスを有する不安定狭心症患者において、循環中に増加した数のＣＤ１６＋ＣＸ３ＣＲ１＋単球が観察された（Ikejima, 2010; Circ. J. 74:337）。同様に、循環中の上昇したＣＤ１６＋単球レベルは、不安定狭心症患者において多検出器コンピュータ断層撮影法によって測定されるような不安定プラークに相関し（Kashiwagii, 2010; Atherosclerosis 212:71）、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球レベルは独立して、待機的冠動脈造影を受けている患者における心血管イベントを予測した（Ragacev, 2012; J. Am. Coll. Cardiol. 60:1512）。免疫組織化学検査によって、ＣＸ３ＣＲ１はまた、ヒト頸動脈プラークにおいても発現されていることが示され、ＣＸ３ＣＲ１＋細胞数は病変の発生と共に増加した（Stolla, 2012; PLOS One 7:e43572）。ＣＸ３ＣＲ１は、炎症レベルが上昇したプラークについてのマーカーであるようである。
【０００８】
免疫グロブリン単一可変（ＶＨＨ）ドメインは、イメージング剤としての使用に十分に適している（De Vos, 2013; Expert Opin. Biol. Ther. 8:1149）。ある種のＶＨＨは、ラクダ一本鎖抗体の抗原結合ドメインに由来する。血液からの急速なクリアランスをもたらすその小さなサイズ（１５kDa未満）と、特異的な標的の結合を可能とするその高い親和性のために、バックグラウンドに対する良好なシグナルを用いての、患者への曝露を最小限にする短寿命の放射性同位体の使用を可能とするイメージングを、投与直後に実施することができる。ＶＨＨドメインはまた良好な物理化学的特性を有し、そして、様々な画像診断法での使用のために、血中及び標識に必要とされる条件下で安定である。ＣＸ３ＣＲ１に特異的なＶＨＨドメインは、炎症性又は不安定性プラークを同定する価値ある非侵襲的なイメージングツールを提供し得、かつ、患者の選択、層別化、診断、予後予測、又は新規なアテローム性動脈硬化症療法についての処置の成功のモニタリングに使用され得る。それはまた、組織での上昇したＣＸ３ＣＲ１の発現によって特徴付けられる他の疾病におけるインビボでのイメージングのために使用され得る。
【０００９】
特に指定又は定義されていない限り、使用される全ての用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al,、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, 「Genes IV」, Oxford University Press, New York, (1990)、及びRoitt et al., 「Immunology」(2nd  Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、並びに、そこに引用された一般的な背景技術について言及する。さらに、特記しない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術、及び操作を実施することができ、かつそれらは当業者には明らかであろうように、それ自体公知の方法で実施される。例えば、再び、標準的なハンドブック、上記に参照した一般的な背景技術、及び、そこに引用されているさらに他の参考文献も言及する。
【００１０】
特記しない限り、「免疫グロブリン」及び「免疫グロブリン配列」という用語は、（本明細書において、重鎖抗体又は慣用的な４本鎖抗体を指すために使用される）完全サイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、ドメイン又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインを含むがこれらに限定されない）の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに、本明細書において使用される「配列」という用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語における）は一般的に、脈絡からより限定された解釈が必要とされない限り、関連アミノ酸配列並びにそれをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
【００１１】
本明細書において使用される（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは独立してその３次構造を保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的には、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性に関与し、かつ、多くの場合、タンパク質の残りの部分及び／又はドメインの機能を消失することなく、他のタンパク質に添加、除去、又は移行され得る。
【００１２】
本明細書において使用される「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖（例えば、慣用的な４本鎖抗体又は重鎖抗体の鎖）の球状領域、又は、このような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、保存されたジスルフィド結合によって場合により安定化された、２枚のβ−シートに並べられた２層の約７個の逆平行β鎖のサンドイッチからなる、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持することで特徴付けられる。
【００１３】
本明細書において使用される「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、当技術分野及び本明細書の下記において、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」とそれぞれ称される、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し；これらのフレームワーク領域は、当技術分野及び本明細書の下記において、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」とそれぞれ称される、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」によって分断されている。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下のように示すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。それは、抗原結合部位を有することによって抗原に対する特異性を抗体に付与する免疫グロブリン可変ドメイン（群）である。
【００１４】
本明細書において使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「単一可変ドメイン」という用語は、さらなる免疫グロブリン可変ドメインと対を形成することなく、抗原のエピトープに特異的に結合することのできる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、「ドメイン抗体」、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨ及びＶＬ（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、本明細書において以後定義されているような、ラクダ由来の「ＶＨＨドメイン」（又は単に「ＶＨＨ」）である。
【００１５】
上記の定義の観点から、慣用的な４本鎖抗体（例えば、当技術分野において公知であるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子）又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィドに連結したＦｖ若しくはｓｃＦｖフラグメント、又はこのような慣用的な４本鎖抗体から導かれたディアボディ（全て当技術分野において公知である）の抗原結合ドメインは通常、免疫グロブリン単一可変ドメインと捉えられないだろう。なぜなら、これらの場合、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによってではなく、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する一対の（会合している）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖及び重鎖可変ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対によって起こるからである。
【００１６】
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体としても知られる「ＶＨＨドメイン」は当初、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖の欠失した抗体」；C. Hamers-Casterman et al., 1993;  Nature363: 446）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されている。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、慣用的な４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」と称される）から、及び慣用的な４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」と称される）から区別するために選択された。ＶＨＨドメインは、追加の抗原結合ドメインを有することなく、エピトープに特異的に結合することができる（慣用的な４本鎖抗体におけるＶＨ又はＶＬドメインとは逆で、慣用的な４本鎖抗体の場合には、エピトープはＶＨドメインと共にＶＬドメインによって認識される）。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインによって形成された小さく、頑強で、効率的な抗原認識単位である。
【００１７】
本発明の脈絡において、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、ＶＨＨ抗体、並びに「ナノボディ（登録商標）」及び「ナノボディ（登録商標）ドメイン」（「ナノボディ」はAblynx N.V.社；ヘント；ベルギーの商標名である）という用語は同義語として使用され、かつ、免疫グロブリン単一可変ドメイン（構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、第二の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要とすることなくエピトープに特異的に結合する）を示し、例えば国際公開公報第２００９／１０９６３５号、図１に定義されているような、いわゆる「特徴的な残基」によってＶＨドメインから区別される。
【００１８】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、例えばRiechmann and Muyldermans, 1999; J. Immunol. Methods, 231: 25の図２に示されているようなラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されるような、Kabat et al.（「Sequence of proteins of immunological interest」、米国公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベテスダ、ＭＤ、出版番号９１）によって示されるＶＨドメインについての一般的な番号付けに従って番号付けされる。この番号付けによると、
−ＦＲ１は、１〜３０位のアミノ酸残基を含み、
−ＣＤＲ１は、３１〜３５位のアミノ酸残基を含み、
−ＦＲ２は、３６〜４９位のアミノ酸を含み、
−ＣＤＲ２は、５０〜６５位のアミノ酸残基を含み、
−ＦＲ３は、６６〜９４位のアミノ酸残基を含み、
−ＣＤＲ３は、９５〜１０２位のアミノ酸残基を含み、及び
−ＦＲ４は、１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含む。
【００１９】
しかし、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知であるように、各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は変更されてもよく、Kabat番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しなくてもよい（すなわち、Kabat番号付けによる１つ以上の位置は実際の配列において占有されていなくてもよいか、又は、実際の配列は、Kabat番号付けによって許容される数よりも多いアミノ酸残基を含んでいてもよい）。このことは、一般的に、Kabatによる番号付けは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応していても対応していなくてもよいことを意味する。
【００２０】
ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けするための代替的な方法（この方法を、ＶＨＨドメインにも同じように適用することができる）は当技術分野において公知である。しかし、本明細書、特許請求の範囲、及び図面において、Kabatによるかつ上記のようにＶＨＨドメインに適用された番号付けが、特記しない限り行なわれるだろう。
【００２１】
ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は通常、１１０〜１２０、しばしば１１２〜１１５の範囲内である。しかし、より短い及びより長い配列も、本明細書に記載の目的に適切であり得ることが認識されるべきである。
【００２２】
ＣＤＲ領域の決定はまた、様々な方法に従って実施され得る。KabatによるＣＤＲの決定において、ＶＨＨのＦＲ１は、１〜３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は３１〜３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は３６〜４９位のアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は５０〜６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は６６〜９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は９５〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含む。
【００２３】
しかし、本明細書において、ＣＤＲ配列は、Kontermann及びDubel（Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010）に従って決定された。この方法によると、ＦＲ１は、１〜２５位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は２６〜３５位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は３６〜４９位のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は５０〜５８位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は５９〜９４位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は９５〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含む。
【００２４】
ＶＨＨドメイン及びそれを含有するポリペプチドのさらなる構造的特徴及び機能的特性を以下のように要約することができる：
【００２５】
（軽鎖可変ドメインが存在しなくても、及び軽鎖可変ドメインと全く相互作用しなくても、抗原に機能的に結合するように自然界で「設計」された）ＶＨＨドメインは、単一の、比較的小さい、機能的な抗原結合構造単位、ドメイン、又はポリペプチドとして機能することができる。これにより、単独では一般的に、単一抗原結合タンパク質又は免疫グロブリン単一可変ドメインとして実際的な適用には適しておらず、何らかの形又は別の形で合体させて、機能的な抗原結合単位（例えば、Ｆａｂフラグメントなどの慣用的な抗体フラグメント；ＶＬドメインに共有結合で連結されたＶＨドメインからなるｓｃＦｖにおけるような）をもたらす必要がある、慣用的な４本鎖抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインからＶＨＨドメインが区別される。
【００２６】
これらの独特な特性のために、単独で又はより大きなポリペプチドの一部としてのいずれかでの、ＶＨＨドメインの使用は、慣用的なＶＨ及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又は慣用的な抗体フラグメント（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメント）の使用を上回る多くの有意な利点を与える：
−高い親和性及び高い選択性で抗原に結合するために、僅か１つのドメインだけが必要とされるので、２つの別々のドメインが存在することは必要なく、また、これらの２つのドメインが正しい空間的コンフォメーション及び立体配置で存在することを確保する（すなわち、ｓｃＦｖのように、特別に設計されたリンカーの使用を通して）必要もない；
−ＶＨＨドメインは、単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後折り畳み又は修飾を必要としない；
−ＶＨＨドメインは、（本明細書においてさらに考察されているように）多価及び多重特異的フォーマットへと容易に工学操作することができる；
−ＶＨＨドメインは溶解度が高く、（Ward et al., 1989; Nature, 341: 544によって記載されたマウス由来抗原結合ドメインのように）凝集する傾向を有さない；
−ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び他の変性剤、又は条件に対して非常に安定であり、したがって、冷凍設備を使用することなく調製、保存、又は輸送され得、費用、時間、及び環境保全をもたらす；
−ＶＨＨドメインは、生産に必要とされる規模でさえ、調製が容易で比較的安価である。例えば、ＶＨＨドメイン及びそれを含有するポリペプチドは、（例えば以下にさらに記載されているような）微生物発酵を使用して生成することができ、例えば慣用的な抗体フラグメントのように、哺乳動物発現系の使用を必要としない；
−ＶＨＨドメインは、慣用的な４本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して比較的小さく（約１５kDa、すなわち慣用的なＩｇＧより１０倍小さい）、それ故、
――組織への（より）高い透過性を示し、かつ
――このような慣用的な４本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントよりも高用量で投与することができ；
−ＶＨＨドメインは、いわゆる空洞結合特性を示し得（とりわけ、慣用的なＶＨドメインと比較して、その伸張したＣＤＲ３ループに因り）、それ故、慣用的な４本鎖抗体及び抗原結合フラグメントが近づけない標的及びエピトープにも近づくことができる。
【００２７】
特異的抗原又はエピトープに結合するＶＨＨドメインを得る方法は以前に、例えば、国際公開公報第２００６／０４０１５３号及び第２００６／１２２７８６号に記載されている。これもまたそこに詳細に記載されているように、ラクダに由来するＶＨＨドメインは、元来のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の慣用的な４本鎖抗体由来のＶＨドメイン中の対応する位置（群）に存在する１つ以上のアミノ酸残基によって置換することによって「ヒト化」することができる。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ以上の部分的又は完全なヒトフレームワーク領域配列を含有し得、さらにより特定の実施態様では、場合によりＪＨ５などのＪＨ配列と合体させた、ＤＰ−２９、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１、又はその一部に由来するヒトフレームワーク領域配列を含有し得る。
【００２８】
同義語として使用され得る「エピトープ」及び「抗原性決定基」という用語は、本発明の慣用的な抗体又はポリペプチドなどの抗原結合分子によって、より特定すると該分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドなどの巨大分子の一部を指す。エピトープは、免疫グロブリンに結合する最小部位を定義し、したがって、免疫グロブリンに特異的な標的を示す。
【００２９】
特定のエピトープ、抗原又はタンパク質（又は少なくともその一部分、そのフラグメント、又はそのエピトープ）に「結合する」又は「特異的に結合する」ことができる、「標的化」する又は「に対して標的化する」、「に対する親和性を有する」及び／又は「に対する特異性を有する」、ポリペプチド（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は一般的には抗原結合分子若しくはそのフラグメント）は、該エピトープ、抗原、又はタンパク質に「対する」又は「対して指向される」と言われるか、あるいは、このようなエピトープ、抗原又はタンパク質に対して「結合する」分子であるか、あるいは、「抗」−エピトープ、「抗」−抗原、又は「抗」−タンパク質（例えば抗ＣＸ３ＣＲ１）と言われる。
【００３０】
一般的に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド）が結合することのできる、様々な種類の抗原又はエピトープの数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、その親和性及び／又は結合力に基づいて決定することができる。抗原と抗原結合タンパク質との解離についての平衡定数（ＫＤ）によって示される親和性は、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり：ＫＤの数値が低いほど、エピトープと抗原結合分子との間の結合強度は強くなる（あるいは、親和性はまた、親和性定数（ＫＡ）として表現され得、これは１／ＫＤである）。当業者には（例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて）明らかであろうとおり、親和性は、それ自体公知の方法で、関心対象の具体的な抗原に依存して決定することができる。結合力は、抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合の強度の尺度である。結合力は、エピトープと、抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。
【００３１】
アミノ酸残基は、一般的に当技術分野において公知でありかつ認められているように、標準的な３文字又は１文字アミノ酸コードに従って示されるだろう。２つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸の差異」という用語は、第二配列と比較して、基準配列の位置における指定された番号のアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す。置換（群）の場合、このような置換（群）は好ましくは、保存的アミノ酸の置換（群）であり、これは、アミノ酸残基が、類似した化学的構造で、該ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対して殆ど又は全く影響を及ぼさない、別のアミノ酸残基で置換されることを意味する。このような保存的アミノ酸置換は、当技術分野において、例えば国際公開公報第９８／４９１８５号から周知であり、保存的アミノ酸置換は好ましくは、以下の群（ｉ）〜（ｖ）内の１つのアミノ酸が、同じ群：（ｉ）小さな脂肪族であるか非極性であるか又は僅かに極性である残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；（ｉｉ）極性で負に荷電した残基及びその（荷電していない）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；（ｉｉｉ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；（ｉｖ）大きな脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；並びに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ内の別のアミノ酸残基によって置換されている、置換である。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下の通りである：
ＡｌａからＧｌｙ又はＳｅｒへ；
ＡｒｇからＬｙｓへ；
ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓへ：
ＡｓｐからＧｌｕへ；
ＣｙｓからＳｅｒへ；
ＧｌｎからＡｓｎへ；
ＧｌｎからＡｓｐへ；
ＧｌｙからＡｌａ又はＰｒｏへ；
ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎへ；
ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌへ；
ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌへ；
ＬｙｓからＡｒｇへ、Ｇｌｎへ、又はＧｌｕへ；
ＭｅｔからＬｅｕへ、Ｔｙｒへ、又はＩｌｅへ；
ＰｈｅからＭｅｔへ、Ｌｅｕへ、又はＴｙｒへ；
ＳｅｒからＴｈｒへ；
ＴｈｒからＳｅｒへ；
ＴｒｐからＴｙｒへ；
ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅへ；
ＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕへ。
【００３２】
例えば２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン配列間の「配列同一率」は、これらの２つの配列間で同一であるアミノ酸の比率を示す。それは、国際公開公報第０８／０２００７９号の４９頁及び５０頁の段落ｆ）に記載のように計算又は決定され得る。「配列同一率」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を示すかのいずれかである、アミノ酸の比率を示す。
【００３３】
標的特異性
本発明のＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドは、ヒトＣＸ３ＣＲ１に対する特異性を有する。したがって、ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド及び検出標識を含む本発明のイメージング剤は好ましくはヒトＣＸ３ＣＲ１（配列番号２３０）に結合する。
【００３４】
本明細書に記載のイメージング剤のＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド部分は、ＶＨＨドメインから構成される。代表的なＶＨＨドメインは、表１、２、３（それぞれファミリー１０１、９、及び１３の代表的なポリペプチド）及び４（ファミリー１０１の最適化変異体の代表的なポリペプチド）に示されたＣＤＲ配列を有する。最適化変異体は、ヒト化されている、並びに／又は、安定性、効力、製造可能性、及び／若しくはヒトフレームワーク領域に対する類似性のために最適化されている。
【００３５】
【表１】
2016534114.tif 000002
2016534114.tif 000003
2016534114.tif 000004
2016534114.tif 000005
2016534114.tif 000006
2016534114.tif 000007
【００３６】
【表２】
2016534114.tif 000008
【００３７】
＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering第２巻に従って決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本出願の配列表中の配列を指す。
【００３８】
【表３】
2016534114.tif 000009
2016534114.tif 000010
2016534114.tif 000011
2016534114.tif 000012
2016534114.tif 000013
2016534114.tif 000014
2016534114.tif 000015
【００３９】
＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering第２巻に従って決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本出願の配列表中の配列を指す。
【００４０】
【表４】
2016534114.tif 000016
2016534114.tif 000017
【００４１】
＊ＣＤＲ配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering第２巻に従って決定された。表中の配列番号（ＳＥＱ）は、本出願の配列表中の配列を指す。
【００４２】
本明細書に記載のイメージング剤のＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド部分を含み得るＶＨＨドメインの代表的な配列を以下の表５及び６に示す：
【００４３】
【表５】
2016534114.tif 000018
2016534114.tif 000019
2016534114.tif 000020
2016534114.tif 000021
2016534114.tif 000022
2016534114.tif 000023
2016534114.tif 000024
2016534114.tif 000025
2016534114.tif 000026
2016534114.tif 000027
2016534114.tif 000028
2016534114.tif 000029
2016534114.tif 000030
2016534114.tif 000031
2016534114.tif 000032
【００４４】
【表６】
2016534114.tif 000033
2016534114.tif 000034
2016534114.tif 000035
2016534114.tif 000036
【００４５】
本明細書に記載のイメージング剤のＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド部分を含み得る、ＣＸ３ＣＲ１に結合する二価ＶＨＨドメインの代表的な配列を以下の表７に示す。配列に見られるように、２つのＶＨＨドメインはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーによって接続されている：
【００４６】
【表７】
2016534114.tif 000037
2016534114.tif 000038
2016534114.tif 000039
2016534114.tif 000040
【００４７】
イメージング剤のＣＸ３ＣＲ１標的化部分を含む、ＶＨＨドメイン又は二価ＶＨＨドメインは、当技術分野において公知の方法によってさらに改変され、本明細書の以下に記載のとおり検出標識への連結を可能とし得る。例えば、トリカルボニル法（下記）による９９ｍＴｃ検出標識への連結を可能とするために、ヘキサヒスチジン又はｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを、所望のＶＨＨドメイン又は二価ＶＨＨドメインのＣ末端に付加し得る。このような改変された一価又は二価のＶＨＨドメインの代表例を以下の表８に示す。
【００４８】
【表８】
2016534114.tif 000041
2016534114.tif 000042
【００４９】
本明細書に記載のイメージング剤のＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド成分は、当技術分野において公知の方法によって調製され得、例えば、参照により本明細書に組み入れられた米国出願番号第１３／７７５，３０７号を参照されたい。このような方法は一般的に以下の工程を含む：
−本発明のポリペプチドの発現を可能とする条件下で所望のポリペプチドをコードすることのできる核酸を含む宿主細胞を培養する工程；及び
−宿主細胞によって発現されたポリペプチドを培養液から回収又は単離する工程；及び
−場合により本発明のポリペプチドをさらに精製及び／又は改変及び／又は製剤化する工程。
【００５０】
本発明の１つの態様では、これらのイメージング剤を、例えば動脈硬化性疾患を診断するために、アテローム性動脈硬化症の非侵襲的なイメージングに使用し得る。別の態様では、本発明のイメージング剤は、ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト治療の診断に用いる用品として有用であろう。すなわち、それらは患者の層別化のために使用され得、すなわち、ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト治療に好ましく応答する可能性のあるアテローム性動脈硬化症患者を予め選択するために使用され得る。イメージング剤はまた、動脈硬化病変の進行又は減退を評価することによってあらゆる治療薬を用いての処置の効果をモニタリングするために使用され得る。
【００５１】
本発明の別の態様では、イメージング剤は、ＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる他の疾病を診断するための非侵襲的イメージングに使用され得る。ＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現はまた、複数の炎症性疾患状態、又は、容態、例えば、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、血管炎、例えばヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、肺疾患、例えばＣＯＰＤ、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌にも関連していることが知られている。
【００５２】
単一可変ドメインポリペプチド、例えばＶＨＨドメインは、イメージング剤に使用するための好ましい特性を有する。それらは、その標的に対する高い親和性及び特異性、並びに、良好な物理化学的特性、例えば血清中での安定性を有する。それらは、糸球体濾過の腎のカットオフ値より低い分子量を有し、それ故、急速にクリアランスされ、特異的結合が起こる組織のインビボでのイメージングが可能となる。１つの実施態様では、イメージング剤を含むＣＸ３ＣＲ１に結合する単一可変ドメインは、一価ＶＨＨドメインである。別の実施態様では、それは二価であり、リンカーペプチドによって共有結合で連結された、同一であっても異なっていてもよい、２つのＶＨＨドメインを含む。リンカーペプチドは、天然の配列であっても非天然の配列であってもよいが、好ましくは非免疫原性である。リンカー配列の非限定的な例は、様々な長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚリンカー、例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）、ｇｌｙ３、及び（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３である。
【００５３】
イメージング剤としての使用のために、単一可変ドメインポリペプチドは検出標識に連結されている。様々な検出標識及び連結法が当技術分野において公知である。例えば、検出標識の非限定的な例としては、蛍光、化学発光、生物発光、リン光の標識、常磁性標識、放射性同位体、又は放射性トレーサー標識、微小気泡、又はイメージング用色素が挙げられ得る。検出標識は、所望の用途及びイメージング適用に従って選択され得る。
【００５４】
様々なイメージング技術が当技術分野において周知であり、かつ現在使用されている。使用され得るイメージング適用又は技術の非限定的な例としては以下が挙げられ得る：
【００５５】
単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）。ＳＰＥＣＴイメージングのための検出標識に使用され得る放射性同位体の非限定的な例としては、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、及び１３３Ｘｅが挙げられる。
【００５６】
陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）。ＰＥＴイメージングのための検出標識に使用され得る放射性同位体の非限定的な例としては、１１Ｃ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、８２Ｒｂ、１２４Ｉ、及び８９Ｚｒが挙げられる。
【００５７】
近赤外線蛍光イメージング（ＮＩＲ又はＮＩＲＦ）。ＮＩＲＦのための検出標識に使用され得るイメージング用色素の非限定的な例としては、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷが挙げられる。
【００５８】
超音波イメージング。超音波イメージングに適した検出標識の非限定的な例は微小気泡である。
【００５９】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）。ＭＲＩイメージングに適した常磁性体の非限定的な例としては、酸化鉄又は炭素でコーティングされた鉄−コバルトナノ粒子及びガドリニウムキレートが挙げられる。
【００６０】
標的化抗体フラグメント、例えばＣＸ３ＣＲ１標的化単一ドメインポリペプチドに検出標識を連結させるための方法は当技術分野において周知である。検出標識を、別の連結用分子を介して、直接的に又は間接的に、標的化ポリペプチドに連結させ得る。検出標識は、例えば、アミノ酸とのアミド結合の形成によって共有結合的に、又は、例えば連結用のキレート分子とのイオン性相互作用によって非共有結合的に接続され得る。
【００６１】
共有結合的な連結法の非限定的な例としては以下が挙げられる：
トリカルボニル法による９９ｍＴｃの連結。９９ｍＴｃ−トリカルボニルをヘキサヒスチジンでタグ化された標的化ポリペプチドと反応させ、その後、精製する（例えば、V. Cortez-Retamozo, 2008; Curr Radiopharm 1:37参照）。
【００６２】
ＮＨＳ−エステル法によるＩＲＤｙｅ８００ＣＷの連結。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを標的化ポリペプチドと反応させ、その後、精製する（例えば、S. Oliveira, 2012; Mol. Imaging, 7:254-264参照）。
【００６３】
ビオチン−ストレプトアビジン橋による微小気泡の連結。標的化ポリペプチドをビオチニル化する。ビオチニル化標的化ポリペプチドをビオチン−ストレプトアビジン橋によってビオチニル化微小気泡に結合させる（例えば、S. Hernot, 2012; J. Control. Release 158:346-353参照）。
【００６４】
キレート連結法の非限定的な例としては以下が挙げられる：
【００６５】
標的化ポリペプチドをＤｆ−Ｂｚ−ＮＣＳと反応させキレートリンカーを形成する。その後、改変された標的化ポリペプチドを６８Ｇａを用いて放射性標識する（例えば、M.J.W.D. Vosjan, 2011; Eur J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 38:753-763参照）。
【００６６】
標的化ポリペプチドをＳ−２−（４−イソチオシアネートベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン―１，４，７−トリ酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ）とコンジュゲートさせ、その後、６８Ｇａを用いて放射標識する（例えば、C. Xavier, 2013; J. Nucl. Med., 54: 776-784参照）。
【００６７】
インビボでのイメージングに使用するために、本発明のイメージング剤は、（ｉ）本発明の少なくとも１つのイメージング剤、及び（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、及び／又は安定化剤を含む、医薬調製物として製剤化され得る。「薬学的に許容される」とは、それぞれの材料が、個体に投与された場合に、全く生物学的作用又は他の望ましくない作用を及ぼさず、かつ、それが含まれている医薬組成物（例えばイメージング剤）の他のどの成分とも有害な様式で相互作用しないことを意味する。具体例は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第１８巻、Mack Publishing Company、米国（1990）などの標準的なハンドブックに見られ得る。例えば、本発明のイメージング剤は、慣用的な抗体及び抗体フラグメント及び他の薬学的に活性なタンパク質についてそれ自体公知の任意の方法で製剤化及び投与され得る。したがって、さらなる実施態様によると、本発明は、本発明の少なくとも１つのイメージング剤及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、及び／又は安定化剤を含有する、医薬組成物又は調製物に関する。
【００６８】
このような製剤は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、陰茎海綿体内、又は腹腔内注射、又は静脈内注入による）に適した剤形であり得る。このような適した剤形（これは投与法に応じて、固体、半固体、又は液体であり得る）並びにその調製に使用するための方法及び担体は、当業者には明らかであろう。好ましい製剤及び投与経路は当業者には公知であり、一部には使用されるイメージング法及び調べる組織に依存するだろう。
【００６９】
非経口投与のための調製物は、例えば、活性成分を含み、かつ、場合によりさらなる溶解工程又は希釈工程の後の注入又は注射に適した、無菌溶液、懸濁液、分散液、乳液、又は粉末であり得る。このような調製物のために適した担体又は希釈剤としては、例えば、滅菌水及び薬学的に許容される水性緩衝液及び溶液、例えば生理的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及びハンク溶液；水油；グリセロール；エタノール；グリコール、例えばプロピレングリコール、並びに、鉱油、動物油、及び植物油、例えばピーナッツ油、大豆油、並びにその適切な混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７０】
インビボでのイメージングに使用するために、イメージング剤を含有する検出可能な量の組成物を被験者に投与する。検出可能な量は、イメージング剤、投与経路、イメージング法、並びに検査する被験者及び組織をはじめとする多くの因子に依存して変化し得、そしてこれは当業者によって決定され得る。
【００７１】
本発明は、
１）本発明のイメージング剤を被験者に投与する工程；及び
２）検査する脈管構造に結合したイメージング剤の存在を検出する工程
を含む、インビボでＣＸ３ＣＲ１を含有する動脈硬化プラークを検出するための方法を提供し、結合したイメージング剤の存在は、動脈硬化プラークの存在を示す。
【００７２】
動脈硬化プラークを検出するためにインビボでのイメージングによって検査され得る脈管構造としては、例えば、頸動脈、冠動脈、大腿動脈、腹部動脈、及び胸部動脈が挙げられる。
【００７３】
本発明はまた、
１）動脈硬化プラークを含有すると疑われる組織の試料を準備する工程、
２）該組織を本発明のイメージング剤と接触させる工程；
３）結合していないイメージング剤を除去する工程；及び
４）試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、動脈硬化性疾患のエクスビボでの検出のための方法を提供し、結合したイメージング剤の存在は、動脈硬化プラークの存在を示す。
【００７４】
さらなる態様では、本発明は、以下を提供する：
【００７５】
実施態様１：検出標識に連結されたＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドを含むイメージング剤。
【００７６】
実施態様２：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが免疫グロブリン単一可変ドメインである、実施態様１記載のイメージング剤。
【００７７】
実施態様３：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドがＶＨＨドメインである、実施態様１又は２記載のイメージング剤。
【００７８】
実施態様４：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが
−それぞれ、配列番号１４１、１６２及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６３及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６６及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６７及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６７及び１８９；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６８及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６８及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１６９及び１９０；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７０及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７１及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、１７５及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４２、１６５及び１８８；又は
−それぞれ、配列番号１４２、１７３及び１８８；又は
−それぞれ、配列番号１４３、１６４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４４、１７２及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４５、１７２及び１８７；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１５及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１６及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１７及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１８及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１９及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２２０及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２２１及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４６、１７６及び１９１；又は
−それぞれ、配列番号１４６、１７７及び１９１；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７８及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７９及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１４８、１７９及び１９３；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１７９及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８０及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８１及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８３及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４９、１８５及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１５０、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５０、１８２及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５１、１７９及び１９３；又は
−それぞれ、配列番号１５１、１８２及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５１、１８４及び１９６；又は
−それぞれ、配列番号１５２、１７９及び１９５；又は
−それぞれ、配列番号１５３、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５４、１８２及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５５、１７９及び１９５；又は
−それぞれ、配列番号１５６、１８１及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１５７、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１５８、１７９及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１５９、１７８及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１６０、１７９及び１９４；又は
−それぞれ、配列番号１６１、１７９及び１９４
から選択された、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む、実施態様１〜３のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００７９】
実施態様５：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが、
−それぞれ、配列番号１４１、１６２及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１５及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１６及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１７及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１８及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２１９及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４１、２２０及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２２１及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号２１３、２１４及び１８６；又は
−それぞれ、配列番号１４７、１７８及び１９２；又は
−それぞれ、配列番号１４６、１７６及び１９１
から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む、実施態様１〜４のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８０】
実施態様６：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが、配列番号１〜１４０又は１９７〜２０２のいずれか１つから選択された配列を有するＶＨＨドメインである、実施態様１〜３のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８１】
実施態様７：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが、配列番号１、１１、４９、５３、１２１〜１４０、又は１９７〜２０２のいずれか１つから選択された配列を有するＶＨＨドメインである、実施態様６記載のイメージング剤。
【００８２】
実施態様８：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが二価であり、リンカーペプチドによって共有結合で連結された同一であっても異なっていてもよい２つのＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインの配列は、配列番号２０３〜２１２、２２２又は２２３のいずれか１つ
から選択される、実施態様１又は２記載のイメージング剤。
【００８３】
実施態様９：二価ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチド配列が、配列番号２０８、２２２又は２２３のいずれか１つから選択される、実施態様１、２又は８のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８４】
実施態様１０：検出標識が、放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択される、実施態様１〜９のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８５】
実施態様１１：検出標識が放射性同位体である、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８６】
実施態様１２：検出標識が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅ、１１Ｃ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、８２Ｒｂ、１２４Ｉ、及び８９Ｚｒから選択される、実施態様１〜１１のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８７】
実施態様１３：検出標識が９９ｍＴｃ及び６８Ｇａから選択される、実施態様１〜１２のいずれか１つに記載のイメージング剤。
【００８８】
実施態様１４：ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドが、配列番号２２４、２２５、２２６、２２７又は２２８のいずれか１つから選択されたＶＨＨドメインと、ＣＸ３ＣＲ１への結合に関して競合する免疫グロブリンである、実施態様１記載のイメージング剤。
【００８９】
実施態様１５：ａ）実施態様１〜１４のいずれか１つに記載のイメージング剤を投与する工程、
ｂ）イメージング剤の結合を検出する工程
を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法であって、前記イメージング剤は、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のＣＸ３ＣＲ１に特異的に結合し、観察された結合は該疾病の指標となる。
【００９０】
実施態様１６：被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法であって、該方法は、
ａ）被験者に、実施態様１〜１４のいずれかに記載のイメージング剤を投与する工程；及び
ｂ）被験者の非罹患組織と比較して、罹患組織においてより高いレベルのイメージング剤の結合を検出する工程を含む。
【００９１】
実施態様１７：前記疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、ＣＯＰＤ、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、実施態様１５又は１６記載の方法。
【００９２】
実施態様１８：該疾病がアテローム性動脈硬化症である、実施態様１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
実施態様１９：イメージング剤の結合を検出するための方法が、
ａ）単一光子放射型コンピュータ断層撮影法；
ｂ）陽電子放出断層撮影法；
ｃ）近赤外線蛍光イメージング；
ｄ）超音波イメージング；及び
ｅ）磁気共鳴イメージング
から選択される、実施態様１５〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【００９４】
実施態様２０：イメージング剤の結合を検出するための方法が陽電子放出断層撮影法である、実施態様１５〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【００９５】
実施態様２１：被験者がヒトである、実施態様１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【００９６】
実施態様２２：１）被験者から疾病に罹患していることが疑われる組織を、実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤と接触させる工程；
２）結合していないイメージング剤を除去する工程；及び
３）試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法であって、
イメージング剤は、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のＣＸ３ＣＲ１に特異的に結合し、観察された結合はＣＸ３ＣＲ１により媒介される疾病の指標となる。
【００９７】
実施態様２３：１）被験者の組織試料を、実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤と接触させる工程；及び
２）試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法。
【００９８】
実施態様２４：ａ）実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤を投与する工程；
ｂ）イメージング剤の結合を検出し、
イメージング剤が、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のＣＸ３ＣＲ１に特異的に結合するならば、該疾病に対して有効であることが知られている治療剤の治療有効量を用いて患者を処置する工程
を含む、ＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を患う患者を同定及び処置するための方法。
【００９９】
実施態様２５：ａ）非罹患組織と比較して、罹患組織において、実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤のより高いレベルの結合を有するとして患者を同定する工程；
ｂ）治療剤を患者に投与する工程
を含む、ＣＸ３ＣＲ１の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を有する患者を処置するための方法。
【０１００】
実施態様２６：該疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、ＣＯＰＤ、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、実施態様２４又は２５記載の方法。
【０１０１】
実施態様２７：該疾病がアテローム性動脈硬化症である、実施態様２５又は２６記載の方法。
【０１０２】
実施態様２８：有効な治療剤がＣＸ３ＣＲ１アンタゴニストである、実施態様２４〜２７のいずれか記載の方法。
【０１０３】
実施態様２９：ａ）ＣＸ３ＣＲ１標的化ポリペプチドの作製、
ｂ）検出標識の結合、及び
ｃ）場合によりさらなる賦形剤の混合
の工程を含む、実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤の製造法。
【０１０４】
実施態様３０：実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤の製造のための、放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択された検出標識の使用。
【０１０５】
実施態様３１：被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断用の組成物の調製のための、実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤の使用。
【０１０６】
実施態様３２：被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するための、実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤を含む組成物。
【０１０７】
実施態様３３：実施態様１〜１４のいずれか記載のイメージング剤を含む、被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するためのキット。
【０１０８】
実施態様３４：被験者におけるＣＸ３ＣＲ１の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法の使用説明書をさらに含む、実施態様３３記載のキット。
【０１０９】
実施態様３５：抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトＣＸ３ＣＲ１へのヒトフラクタルカインの結合を遮断することができ、該抗ＣＸ３ＣＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号２００〜２０２のいずれか１つに示される配列を含むＶＨＨドメインである。
【０１１０】
実施態様３６：実施態様３５記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【０１１１】
実施態様３７：（ｉ）実施態様３５記載のポリペプチド、並びに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、並びに場合により（ｉｉｉ）希釈剤、賦形剤、補助剤及び／又は安定化剤を含む、医薬組成物。
【０１１２】
実施態様３８：治療量の実施態様３５記載の化合物をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＣＸ３ＣＲ１関連疾病、疾患、又は容態の処置法。
【０１１３】
実施態様３９：該疾病、疾患、又は容態が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、ＣＯＰＤ、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌から選択される、実施態様３８記載の方法。
【０１１４】
実施態様４０：該疾病、疾患、又は容態がアテローム性動脈硬化症である、実施態様３９記載の方法。
【０１１５】
実施例
実施例１：抗ヒトＣＸ３ＣＲ１ ＶＨＨドメインの作製
ラマを、ｐＶＡＸ１−ｈＣＸ３ＣＲ１プラスミドベクター（Invitrogen、カールズバッド、ＣＡ、米国）、ヒトＣＸ３ＣＲ１を過剰発現しているラクダ腎臓（Ｃａｋｉ）細胞、及び／又はＢＳＡに結合させたＣＸ３ＣＲ１のＮ末端及び第３細胞外ループから導かれた組換えペプチドを用いて標準的なプロトコールに従って免疫化した。ペプチドをNeo MPS （Polypeptidegroup、ストラスブール、フランス）に注文し、標準的なプロトコールに従ってＢＳＡに結合させた。免疫化の期間中の様々な時点と、最後の免疫原の注射の後とに、重鎖抗体を産生するＢ細胞源としての役目を果たす血液試料及びリンパ節生検材料をラマから回収した。血液試料から、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、製造業者の説明書（Amersham Biosciences、ピスカタウェイ、ＮＪ、米国）に従ってフィコールハイパックを使用して調製した。ＰＢＬ及びリンパ節生検材料（ＬＮ）から全ＲＮＡを抽出し、これをＲＴ−ＰＣＲのための出発物質として使用して、ＶＨＨをコードするＤＮＡセグメントを増幅した。
【０１１６】
免疫化されたラマ各個体から、免疫化計画の特定のサブセット由来の、すなわち１つの種類の免疫化抗原の後の試料から単離された全ＲＮＡをプールすることによってライブラリーを構築し、一部のラマについては、異なる個体からの試料を１つのライブラリーにプールした。要するに、ＰＣＲにより増幅されたＶＨＨレパートリーを、特定の制限酵素部位を介して、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを容易にするように設計されたベクターにクローニングした。ベクターはｐＵＣ１１９から導かれ、かつＬａｃＺプロモーター、Ｍ１３ファージｇＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子、マルチクローニングサイト、及びハイブリッドｇＩＩＩ−ｐｅｌＢリーダー配列（ｐＡＸ０５０）を含有する。ＶＨＨコード配列のインフレームで、ベクターはＣ末端ｃ−ｍｙｃタグ及びヘキサヒスチジンタグをコードする。ファージを標準的なプロトコールに従って調製し、そして滅菌濾過した後にさらなる使用のために４℃又は−８０℃で２０％グリセロール中で保存した。
【０１１７】
全てのラマから得られかつファージライブラリーとしてクローニングされたＶＨＨレパートリーを、非常に多数の選択条件を適用して、様々な選択戦略に使用した。全てのコーティングされた固相での選択をMaxisorp９６ウェルプレート（Nunc、ウィースバーデン、ドイツ）において実施した。選択は以下のように実施された：固相（リポソーム／ＶＬＰ上に発現されたＣＸ３ＣＲ１、Integral Molecular、フィラデルフィア、ＰＡ、米国）及び液相（ＣＸ３ＣＲ１を組換え発現している細胞）の選択フォーマットのためのＣＸ３ＣＲ１抗原調製物を、複数の濃度で提示した。ファージライブラリーと共に２時間インキュベートし、その後、十分に洗浄した後、結合したファージをトリプシン（１mg/mL）を用いて１５分間かけて溶出した。トリプシンがファージ溶出のために使用された場合、０．８mMのプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することによってプロテアーゼ活性を直ちに中和した。対照として、抗原を含まない選択を平行して実施した。
【０１１８】
ファージ作出物を使用して大腸菌に感染させ、これをその後、今度は次の選択ラウンド（ファージレスキュー）のためのファージの調製に使用した。２回目の選択後、ファージの作出物を使用して大腸菌に感染させ、これをその後、寒天プレート（ＬＢ＋カルベニシリン＋ブドウ糖２％）上に個々のＶＨＨクローンの分析のために播種した。特異的な結合物質について選択作出物をスクリーニングするために、単一のコロニーを寒天プレートから拾い上げ、９６ウェル深型プレート１mL中で増殖させた。ＬａｃＺで制御されたＶＨＨ発現を、ブドウ糖の非存在下でＩＰＴＧ（最終１mM）を添加することによって誘導した。ペリプラズムペリプラズム抽出物（約８０μLの容量）を標準的なプロトコールに従って調製した。
【０１１９】
ペリプラズムペリプラズム抽出物を、ヒトＣＸ３ＣＲ１／ヒトフラクタルカインＦＡＣＳ競合アッセイにおいてスクリーニングして、発現されたＶＨＨが、独特なＣＸ３ＣＲ１リガンドの受容体への結合を遮断する能力を評価した。ヒトＣＸ３ＣＲ１をＣＨＯ細胞上に提示した。検出試薬として、１の標識度でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａ６４７−フラクタルカイン）で標識されたフラクタルカイン（R&D Systems、ミネアポリス、ＭＮ、米国）を使用した。簡潔には、ペリプラズム抽出物５０μlを６nMの標識されたフラクタルカイン（５０μl）及び２×１０５個のＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１細胞に加えた。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を３回洗浄し、その後、ＦＡＣＳアレイ（Becton Dickinson）で分析した。まずゲートを、散乱プロファイルから決定されたインタクトな細胞上に設定した。次に、死滅細胞を、ＰＩ染色（Sigma、セントルイス、米国）に由来するその蛍光プロファイルによってゲートアウトした。各試料についてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識からの蛍光プロファイルを決定し、これを遮断能の計算のために使用した。対照として、条件は、ペリプラズム抽出物に全くＶＨＨが存在しなかった、又は、公知の非関連ＶＨＨ及び試料を過剰の冷却フラクタルカインと共に含めたものとした。各試料について遮断率を、対照試料を使用して決定して、アッセイ窓を決定した。
【０１２０】
このスクリーニングからＶＨＨを選択し、そして配列分析により、ファミリー９、１３及び１０１と称される３つの異なるＢ細胞系統に属する独特なＶＨＨが判明した。一価ＶＨＨを二価分子としてフォーマット化することにより、作用強度及び／又は効力は高まるかどうかを決定するために、二価分子を遺伝子工学操作によって構築した。２つのＶＨＨを、２つの構築ブロック間に３５ＧＳリンカーを用いて互いに遺伝子的に連結させた。
【０１２１】
抗ＣＸ３ＣＲ１ ＶＨＨをさらなる特徴付けのために発現させかつ精製した。一価及び二価ＶＨＨを大腸菌ＴＧ１において、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６でタグ化されたタンパク質として発現させた。発現を、１mM ＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして３７℃で４時間継続させた。細胞培養液を回転させた後、ペレットを凍結解凍することによってペリプラズム抽出物を調製した。これらの抽出物を出発物質として使用し、ＶＨＨをＩＭＡＣを介して精製し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して評価したところ９５％の純度が得られた。
【０１２２】
様々なファミリーに由来し、かつ多様な予測された電荷及びｐＩを有する、代表的なエピトープでタグ化された一価及び二価ＶＨＨドメインを、イメージング試薬としての評価のために選択した。これらの全てのＶＨＨドメインが、上記に概略が示されている競合ＦＡＣＳアッセイにおいて受容体へのフラクタルカインの結合を遮断することが示された。ＢＡ／Ｆ３−ｈＣＸ３ＣＲ１細胞、ＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１細胞、又は一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のいずれかを使用した。様々な競合設定において使用された標識リガンドの量も変化させた。ヒトＣＸ３ＣＲ１へのヒトフラクタルカインの相互作用を遮断するＶＨＨのＩＣ５０値を表９に示す。
【０１２３】
ヒトＣＣＲ２、ヒトＣＣＲ５、又はマウスＣＸ３ＣＲ１を発現しているＣＨＯ−Ｋ１親細胞又はＣＨＯ細胞上でＦＡＣＳ結合実験を実施することによって、ｈＣＸ３ＣＲ１受容体に対する特異性を評価した。ＶＨＨを、４℃で３０分間それぞれの細胞株と共にインキュベートし、その後、３回の洗浄工程を行ない、続いて、検出試薬と共にインキュベートした。検出として、マウス抗ｃｍｙｃ抗体（Serotec, MCA2200）、その後、ＰＥに結合させたヤギ抗マウス抗体（Jackson 115-116-071）を使用し、各インキュベーションは４℃で３０分間であり、その後、３回の洗浄工程を行なった。各細胞株について、受容体特異的抗体を用いての品質対照が含まれた。さらに、最高濃度の各ＶＨＨも、陽性対照としてｈＣＸ３ＣＲ１を発現しているＣＨＯ細胞と共にインキュベートした。マウスＣＸ３ＣＲ１、ヒトＣＣＲ２、又はヒトＣＣＲ５への結合は全く観察できなかった。
【０１２４】
【表９】
2016534114.tif 000043
【０１２５】
実施例２：ＶＨＨドメインの標識
ＶＨＨドメインの放射性標識
ＶＨＨドメインを、９９ｍＴｃ−トリカルボニル法を使用して９９ｍＴｃを用いて部位特異的にそのヘキサヒスチジンタグ上に放射性標識した。９９ｍＴｃＯ４−溶液（９９Ｍｏ／９９ｍＴｃ発生溶出液；０．７４〜３．７GBq；Drytec；GE Healthcare、ピスカタウェイ、ＮＪ）をIsolinkキット（Covidien、セントルイス、ＭＯ）に加えることによって、［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋（９９ｍＴｃ−トリカルボニル）を合成した。バイアルを１００℃で２０分間インキュベートした。冷却後、９９ｍＴｃ−トリカルボニル溶液を１M ＨＣｌを用いてｐＨ７．４へと中和した。その後、９９ｍＴｃ−トリカルボニル５００μlをＶＨＨドメイン５０μl（一価ＶＨＨドメインについては１mg/ml、二価ＶＨＨドメインについては２mg/ml）に加え、５０℃で９０分間インキュベートした。遊離標識からの標識分子の分離、及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への緩衝液の交換を、セファデックスＧ２５使い捨てカラム（NAP-5; GE Healthcare、ピスカタウェイ、ＮＪ）を使用してゲル濾過によって実施した。その後、標識されたＶＨＨドメインを０．２２μmのフィルター（Millipore、ベッドフォード、ＭＡ）に通し凝集物を除去した。
【０１２６】
全てのＶＨＨドメインを９９ｍＴｃを用いて成功裡に標識した。放射化学純度は、移動相としてアセトンを使用して即時薄層クロマトグラフィーによって９５％超であることが示された。放射化学純度はまたＲＰ−ＨＰＬＣによっても評価され、分析用Ｃ４カラム２１４ＴＰ５３（Grace Vydac、ディアフィールド、ＩＬ）を、移動相としてＨ２Ｏ中０．１％トリフルオロ酢酸（溶媒Ａ）／アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸（溶媒Ｂ）と共に使用して、８９％超であることが示された。
【０１２７】
実施例３：インビトロでの、細胞と、標識されたＶＨＨドメインの結合
標識されたＶＨＨドメイン分子がＣＸ３ＣＲ１へのその結合を保持したかどうかを確認するために、ＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１細胞を使用して結合研究を実施した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＷＴ）を対照として含めた。ＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１又はＣＨＯ−ＷＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、５００μg/ml Ｇ４１８及び１００μg/mlゼオシンの補充されたＦ１２培地（ＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１）、又は１０％ＦＢＳ、１００U/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトアビジン及び２mM Ｌ−グルタミンの補充されたＲＰＭＩ培地（ＣＨＯ−ＷＴ）を含有する２４ウェルプレート中２×１０５個の細胞／ウェルで播種し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆ１２培地中０．５％ＨＳＡを用いて非特異的結合を遮断した後、０．５mlのＦ１２培地＋０．５％ＨＳＡ中１nMの９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインを３枚のウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ＋０．５％ＨＳＡで３回洗浄することによって、結合していない９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインを除去した。細胞を１M ＮａＯＨを用いて可溶化し、９９ｍＴｃをガンマウェルカウンター（Cobra II Inspector 5003, Canberra-Packard）で定量した。結果を図１に示す。ＣＨＯ−ｈＣＸ３ＣＲ１細胞への特異的結合を、ＣＸ３ＣＲ１陰性ＣＨＯ−ＷＴ細胞への結合に対して標準化した（結合／ＣＨＯ−ＷＴ細胞上での結合）。統計分析のために、独立スチューデントｔ検定を使用した（SPSS Statistics 20）。０．０５未満のＰ値が有意と判断された。
【０１２８】
ＣＸ３ＣＲ１陽性ＣＨＯ細胞への結合は、６つ全ての９９ｍＴｃ標識ＶＨＨドメインについて、トランスフェクトされていない細胞よりも有意に高く（＊ｐ≦０．００１）、ＣＸ３ＣＲ１への特異的結合が、９９ｍＴｃによるＶＨＨドメインの標識で保存されたことを実証した。強力な結合及び大きな窓が、６中５個のＶＨＨドメインで観察されたが、より弱い結合がＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１５で見られた。
【０１２９】
実施例４：健康なｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスにおける標識ＶＨＨドメインの体内分布
健康な（疾病を有さない）マウスにおける標識ＶＨＨドメインの体内分布を調べるために実験を行なった。同定されたＶＨＨドメインはマウスＣＸ３ＣＲ１とは交差反応しなかったので、ヒトＣＸ３ＣＲ１ノックインマウス系統（ｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ）をTaconicArtemis（ケルン、ドイツ）で作製し、マウス疾病モデルにおけるこれらの分子の試験を可能とした。内因性マウスタンパク質の発現を破壊しつつ、対応するマウスプロモーターの制御下でヒトケモカイン受容体の発現を可能とする戦略を実施した。簡潔には、エキソン２内のマウスＣＸ３ＣＲ１コード領域を、完全ヒトＣＸ３ＣＲ１オープンリーディングフレームで置き換え、かつ選択マーカー及びｌｏｘＰ部位によってフランキングされた、標的化ベクターを構築した。標的化ベクターをマウスＥＳ細胞に導入し、そして相同的組換えを成功裡に受けたクローンを使用してキメラマウスを作製した。これらのマウスを高度に効率的なＦｌｐ欠失マウスと交雑して、選択マーカーの除去及び生殖細胞系列伝達が成し遂げられた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用して、非特異的な標的とは独立した結合を評価した。
【０１３０】
１７週令の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３５）及びｈＣＸＣＲ３ ＫＩマウス（ｎ＝３５）に通常の固形飼料食餌が与えられた。各ＶＨＨドメインを、９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１５マウス（２×ｎ＝５）を除く、６匹のＣ５７ＢＬ／６マウス及び６匹のｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスにおいて評価した。９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメイン溶液（５３±１０MBq）１００μlを、尾静脈を介して静脈内注射した。注射から３時間後、麻酔した動物をうつ伏せにして動物のベッドに６匹の５７Ｃｏランドマークと共に置き、順次、ピンホールＳＰＥＣＴ及びマイクロＣＴにかけた。ピンホールＳＰＥＣＴ収集は、３個から構成される１．５mmのピンホールコリメーターの装備された、デュアルヘッドガンマカメラ（e.cam180Siemens Medical Solutions、ホイートン、ＩＬ、米国）を使用して実施した。各１０秒間の６４回の投影を、３６０°回転させながら、ズーム比１で１２８×１２８のマトリクスに収集した。マイクロＣＴイメージングを以下の収集パラメーターを使用してSkyscan 1178（Skyscan、コンティフ、ベルギー）で実施した：５０kV、６１５μA、及び８３μm解像度。再構成後、両方のデータセットを６匹の５７Ｃｏランドマークに基づいて自動的に融合させた。画像をソフトウェアAmide（http://amide.sourceforge.net）及びOsirix（Pixmeo SARL、ベルネ、スイス）を用いて分析した。ＳＰＥＣＴ画像のカラースケールをＩＡ／cm3％に標準化することにより、動物間の直接的な目視による比較が可能となった（図２）。
【０１３１】
イメージング後、動物を、ペントバルビタールナトリウム（CEVA、リブルヌ、フランス）の過剰投与によって安楽死させた。全ての主要な臓器及び組織を収集し、秤量し、その放射能をガンマウェルカウンターで定量した。計数をバックグラウンド及び崩壊に対して修正し、組織１ｇあたりに注射された放射能比（ＩＡ／ｇ％）として表現された。統計分析をパラメトリック検定（分散分析）及びノンパラメトリック検定（マンホイットニーＵ検定）（SPSS Statistics 20）の両方を使用して実施した。０．０５未満のＰ値を有意と判断した。
【０１３２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスにおける９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインの体内分布データを表１０に要約する。
【０１３３】
【表１０】
2016534114.tif 000044
2016534114.tif 000045
【０１３４】
データは、組織１ｇあたりに注射された放射能比として示される（ＩＡ／ｇ％；＊ｐ＜０．０５ 各ＶＨＨドメインについてＣ５７ＢＬ／６マウス対ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウス（分散分析及びマンホイットニーＵ検定（同じ結果））；§分散分析ではｐ＜０．０５であるが、マンホイットニーＵ検定ではそうではない；†マンホイットニーＵ検定ではｐ＜０．０５であるが、分散分析ではそうではない）。
【０１３５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、全てのＶＨＨドメインが、６０kDa未満の分子量を有する分子の典型的な体内分布：高度な腎からの排出と迅速な血中クリアランスを示した（表１０、図２）。注射から３時間後、腎臓の数値は、２００ ＩＡ／ｇ％より高く、血液の数値は０．２１〜０．９２ ＩＡ／ｇ％の範囲であった。肝臓を除く、全ての他の臓器及び組織において、数値はその時点で１ ＩＡ／ｇ％より低かった。肝臓では、数値は、９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ１８Ｅ０６についての１．３１ ＩＡ／ｇ％から９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１７についての３．２１ ＩＡ／ｇ％の範囲であった。ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスでは、殆ど全ての臓器及び組織において、９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１５（表１０）を除いて（そのより弱い細胞への結合と一致する）、９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインのより高度な取り込みが観察された。
【０１３６】
有意であるが、これらの差異は、以下の臓器：心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、脳、大動脈、及び筋肉について小さかった。差異は脾臓、胃、腸、骨、及びリンパ節についてより顕著であったが、おそらく、マクロファージ及び樹状細胞などの、これらの臓器における組織に常在する免疫細胞への結合を反映している。最も高い特異的な標的化が、一価９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２及び二価９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８で観察された。
【０１３７】
実施例５：高脂肪食餌を与えられたＡｐｏＥ−／−マウスの動脈硬化プラークに結合しているＣＸ３ＣＲ１ ＶＨＨドメインの同定
動脈硬化性疾患を有するマウスにおけるインビボでの競合実験
動脈硬化プラークへの抗ＣＸ３ＣＲ１ ＶＨＨドメインの特異的標的化を示すために、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスをＡｐｏＥ−／−マウス（The Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン、米国）と交雑させて、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスを作製した。ＡｐｏＥ−／−マウスモデルは、部位特異的なプラーク形成の局在化、組織学的組成、及び公知のリスク因子（コレステロール、炎症、高血圧など）に関してヒト疾病と著しく類似している、広範囲に及ぶ動脈硬化プラーク形成を誘起する頑強な方法を提供する。
【０１３８】
４週令の雌ＡｐｏＥ−／−マウス及びｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスに、１．５％コレステロールを含有する高脂肪／高コレステロール食餌を１６週間与えた。各々の９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインを、６匹のＡｐｏＥ−／−マウス及び６匹のｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて評価した（一価９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１５を、インビトロでの細胞への結合によって観察された９９ｍＴｃ−標識後の機能の低下、及び疾病を有さないマウスにおける体内分布研究に基づいて除外した）。細菌酵素に対して作製された対照９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインｃＡｂＢＣＩＩ１０（Conrath, 2001; Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2807）を６匹のｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて評価した。９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメイン溶液（６１±１６MBq）１００μlを尾静脈経由で静脈内に注射した。１群のマウスには、１００倍過剰の等価な標識されていないＶＨＨ分子（「遮断」とも呼ばれる）も共注射した。注射から３時間後、麻酔した動物をうつ伏せにして動物のベッドに６匹の５７Ｃｏランドマークと共に置き、実施例４に記載のようにピンホールＳＰＥＣＴ及びマイクロＣＴに順次かけた。イメージング後、動物を過剰な投与量のペントバルビタールナトリウムによって安楽死させ、組織及び臓器をさらなるエクスビボでの分析のために収集した。
【０１３９】
ＡｐｏＥ−／−マウス及びｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウス（遮断あり及び遮断なし）における９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２及び９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８の体内分布の代表的な画像を図３に示す。注射から３時間後、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩＡｐｏＥ−／−マウスにおける大動脈の底部及び大動脈弓にある大動脈病変において（白い矢印）、抗ｈＣＸ３ＣＲ１ ９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインの高いシグナルが全身ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像において検出された。大動脈病変及び全ての他の臓器への特異的な取り込みが競合によって抑制された。ＡｐｏＥ−／−マウスには特異的な蓄積は全く観察されなかった。同様に、疾病を有さないｈＣＸ３ＣＲ１マウスにも蓄積は全く観察されなかった（実施例４及び図２）。
【０１４０】
各ＶＨＨドメインのエクスビボでの体内分布を、ＡｐｏＥ−／−マウス及びｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおいてだけでなく、過剰な標識されていないＶＨＨドメインの存在下のｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおいても評価した。ｈＣＸＣＲ１特異的ＶＨＨドメインの取り込みは、上記に提示したＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像に関連し、そしてＡｐｏＥ−／−マウスよりも、ｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおいてより高く、これはＣＸ３ＣＲ１の標的発現に一致した（表１１）。ＶＨＨドメインの取り込みは、標識されていないＶＨＨドメインとの競合によって遮断された。対照である９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインｃＡｂＢｃＩＩ１０は、哺乳動物細胞におけるどの標的も認識しないので、腎臓を通したクリアランスが全てのＶＨＨドメインと同じように観察されたが、９９ｍＴｃ−ｃＡｂＢＣＩＩ１０はどの他の臓器によっても取り込まれなかった。結果は主に、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスにおいて得られた体内分布データに対応し、このことは、健康なマウスと動脈硬化性疾患を有するマウスとの間の抗ｈＣＸ３ＣＲ１標的化ＶＨＨドメインの体内分布において大きな差がなかったことを実証する。
【０１４１】
【表１１】
2016534114.tif 000046
2016534114.tif 000047
2016534114.tif 000048
【０１４２】
ＳＰＥＣＴ／ＣＴを介した生存動物におけるアテローム性動脈硬化症の主要な部位の同定
患部と心臓の比を、心筋に近い冠動脈における動脈硬化病変を定量するための解読値として計算した。アテローム硬化性マウスにおける主要なプラーク形成部位が、大動脈根及び大動脈弓であり、これらの部位は最も高い９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の蓄積を伴うことが、解剖分析及びオートラジオグラフィーから明らかである。上記に考察されかつ図３に示されているように、この領域への９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の取り込みがＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像において観察される。これらのシグナルはさらに、大動脈根／大動脈弓部位での関心対象の領域（関心領域）を描き、かつ注射された放射能比／ｃｍ３（ＩＡ／ｃｍ３％）としてそれらを表現することによって定量した（表１２）。
【０１４３】
【表１２】
2016534114.tif 000049
【０１４４】
標的化群（ｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおける９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２）と比較して、トレーサー結合が標識されていない６６Ｂ０２の注射によって遮断された場合には、大動脈弓シグナルは６〜８倍低く、分子標的の非存在下では２〜３倍低かった（ＡｐｏＥ−／−マウス）。ｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおける対照ＶＨＨドメイン９９ｍＴｃ−ｃＡｂＢｃＩＩ１０の大動脈弓シグナルは、標的化群より約４倍低かった。ＣＴ画像を使用して、関心対象の等サイズの領域（関心領域）を、大動脈弓／根上及び心臓左心室（血液プール活性の尺度としての）上に描いた。これらの関心領域におけるＳＰＥＣＴシグナルを計算し、注射された放射能比／体積（ＩＡ／cm３％）として表現した。これらの数値を使用して、大動脈弓と血液の比率を計算した。統計分析を、パラメトリック検定（分散分析）を使用して実施した。０．０５未満のＰ値を有意と判断した。
【０１４５】
大動脈弓と血液の比を、血液プールの測定値としての心臓左心室（ＬＶ）における関心領域を描くことによって計算した（表１２）。アテローム硬化症マウスにおける大動脈弓と血液の比は、９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の取り込みが、過剰の未標識６６Ｂ０２の注射によって遮断された場合、又はｈＣＸ３ＣＲ１発現の非存在下において、２〜３倍低かった。動脈硬化性疾患を有さないマウスにおいて９９ｍＴｃ−ｃＡｂＢｃＩＩ１０又は９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２について類似した有意差が観察された。アテローム硬化性大動脈弓及び大動脈根への９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２及び９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８の特異的取り込みがＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像において明瞭に視認でき、生存動物個体における動脈硬化病変の非侵襲的イメージングの放射性トレーサーとしてのＣＸ３ＣＲ１ ＶＨＨドメインの有用性を実証する。
【０１４６】
大動脈セグメントのエクスビボでの分析
試験における各マウスの大動脈を注意深く切り出し、接着組織から離して洗浄し、１０個のセグメントに切断した。目視による検査時に、各セグメントに０〜３のスコアを与えた（０：０％、１：１〜５０％、２：５１〜７５％、３：７６〜１００％の領域が動脈硬化病変で覆われている）。他の臓器及び組織と共に全てのセグメントを収集し、秤量し、その放射能を定量した。計数をバックグラウンド及び崩壊について修正し、組織１ｇあたりに注射された放射能比（ＩＡ／ｇ％）として表現した。統計分析をパラメトリック検定（分散分析）を使用して実施した。０．０５未満のＰ値を有意と判断した。各動物について、専用の蛍光面（Typhoon FLA 7000, GE Healthcare）に全ての大動脈セグメントを一晩曝した後にオートラジオグラフ画像が得られた。画像をImageQuant（GE Healthcare Biosciences、ピッツバーグ、ＰＡ）を用いて分析した。
【０１４７】
全大動脈の目視による検査に基づいて、動脈硬化病変は、大動脈根及び大動脈弓において最も多いことが認められた。これらのセグメントは一般的に３又は２の病変スコアを有していた。大動脈の腹部切片では、小さな個々の病変を有するセグメントと、病変を有さないセグメントとが交互に存在した。これらのセグメントはそれぞれ１及び０とスコア付けされた。大動脈セグメントのスコアは、０〜２の間で変動した。全てのマウスにおいて及び全ての条件について、セグメントへの９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインの取り込みは、ｈＣＸ３ＣＲ１ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるｈＣＸ３ＣＲ１特異的９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインについて有意に増加していた（表１３）。
【０１４８】
【表１３】
2016534114.tif 000050
2016534114.tif 000051
【０１４９】
スコア３のセグメントにおける最も高い数値が、一価ＶＨＨドメイン９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２及び二価ＶＨＨドメイン９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ３１８について得られ、それぞれ平均値は２．６８及び２．３７ ＩＡ／ｇ％であった（表１４）。過剰の未標識ＶＨＨドメインの添加は、抗ｈＣＸ３ＣＲ１９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメインの取り込みを、対照条件（ＡｐｏＥ−／−マウスにおける抗ｈＣＸ３ＣＲ１９９ｍＴｃ−ＶＨＨドメイン又はｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおける９９ｍＴｃ−ｃＡｂＢＣＩＩ１０、図４Ａ及び４Ｂ）の取り込みレベルまで減少させ、これにより結合特異性が確認された。図４Ａ及び４Ｂにおいて、各スコアについて、左、中央及び右の棒グラフは、ＡｐｏＥ−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウス、及び遮断されているＡｐｏＥ−／−ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩマウスについてそれぞれ見いだされたＩＡ／ｇ％を示す。
【０１５０】
【表１４】
2016534114.tif 000052
【０１５１】
病変重量の定量及び放射能の計数によって個々の大動脈セグメントへのトレーサーの取り込みを評価する他に、これらのセグメントをまた放射線感受性蛍光面に曝して、放射性シグナルの空間的分布を可視化した。ＡｐｏＥ−／−マウスのセグメント、又はｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスに９９ｍＴｃ−ｃＡｂＢｃＩＩ１０を有するセグメントと比較して、ｈＣＸ３ＣＲ１ ＫＩ ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて増加した病変の負荷を有するセグメントにおいて、９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２の増加した取り込みが観察された。９９ｍＴｃ−ＣＸ３ＣＲ１ＢＩＩ６６Ｂ０２は、低い病変スコアを有するセグメント中の小さなプラークに限局的に結合することが示された（図５の白い矢印）。
【図１】
2016534114.tif 000053
【図２】
2016534114.tif 000054
【図３】
2016534114.tif 000055
【図４Ａ】
2016534114.tif 000056
【図４Ｂ】
2016534114.tif 000057
【図５】
2016534114.tif 000058
【配列表】
2016534114000001.app
【国際調査報告】
2016534114.tif 000059
2016534114.tif 000060
2016534114.tif 000061