(57)【要約】  本発明は、組織におけるアミロイド沈着を含む疾患、特に、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成に罹患しているヒト患者の（ａ）血漿または他の体液のＣＦＩ生物活性；および（ｂ）血漿または他の体液中のＣＦＩの生物活性を定量的に測定するように設計されたＣＦＩ生物活性アッセイに関する。
2016529482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト体液のＣＦＩ生物活性またはヒト体液中のＣＦＩの生物活性を定量的に測定する方法であって、体液またはＣＦＩのＣ３ｂからｉＣ３ｂへの変換能を測定する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
ヒト体液のＣＦＩ生物活性またはヒト体液中のＣＦＩの生物活性を定量的に測定する方法であって、
（ａ）ヒト体液を希釈剤で希釈する工程；
（ｂ）前記希釈ヒト体液にＣＦＨおよびＣ３ｂを加える工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた溶液をインキュベートする工程；および
（ｄ）生じたｉＣ３ｂの量を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項３】
ヒト体液が血漿であり、希釈剤がＰＢＳである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）血漿をＰＢＳ中に約２００〜２５０倍で希釈した後、さらにＰＢＳ中に２倍連続希釈し；
（ｂ）６μＬのＣＦＨおよびＣ３ｂを、各終濃度８０μｇ／ｍＬとなるように前記血漿に加え；かつ
（ｃ）請求項１の工程（ｃ）のインキュベーションを３７℃で２時間行い；さらに
（ｄ）ＥＬＩＳＡを用いてｉＣ３ｂの量を測定する、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒト血漿のＣＦＩ生物活性がｍＵ／容量で測定され、ｍＵが５０％のＣ３ｂをｉＣ３ｂへ変換するのに必要な血漿容量ｎＬ（ＥＣ５０）の逆数として定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
血漿中のＣＦＩの生物活性が、式」１／（ＥＣ５０（ｎＬ）×［ＣＦＩμｇ／ｍｌ］）×１０００を用いて（ＥＣ５０は請求項５で定義される通り）、ＣＦＩのμｇ量当たりの単位で導き出される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
抗ＢＡＭ抗体のバッチ間の効力を測定する方法であって、
（ａ）抗ＢＡＭ抗体の第１バッチをＢＡＭとともにインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＢＡＭをＣＦＩとともにインキュベートする工程；
（ｃ）ＣＦＨおよびＣ３ｂを工程（ｂ）の混合物に加える工程；
（ｄ）生じたｉＣ３ｂの量を測定する工程；
（ｅ）生じたｉＣ３ｂの量を用いて、第１バッチのＣＦＩ生物活性を決定する工程；
（ｆ）抗ＢＡＭ抗体の第２バッチに対してａ）〜ｅ）の工程を繰り返す工程；および
（ｇ）抗ＢＡＭ抗体バッチ間の効力を決定するために、抗ＢＡＭ抗体の第１バッチと抗ＳＡＭ抗体の第２バッチのＣＦＩ生物活性を比較する工程であって、第１バッチの決定に用いる抗ＢＡＭ抗体およびＢＡＭの量は、第２バッチの決定に用いる量とそれぞれ同じである、
を含んでなる、方法。
【請求項８】
ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患を治療する方法であって、
ａ）請求項２に記載の方法によって患者の体液のＣＦＩ生物活性または体液中のＣＦＩの生物活性を測定する工程；および
ｂ）ＣＦＩ生物活性を測定した後、所定量よりも低いＣＦＩ生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗ＢＡＭ抗体を提供する工程
を含んでなる、方法。
【請求項９】
前記疾患が、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組織におけるアミロイド沈着を含む疾患を有するヒト対象の治療で使用するための抗ＢＡＭ抗体であって、所定量より低いＣＦＩ生物活性を有するヒト対象に投与される、抗体。
【請求項１１】
前記疾患が、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である、請求項１０に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織におけるアミロイド沈着を含む疾患、特に、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成に罹患しているヒト患者の（ａ）血漿または他の体液のＣＦＩ生物活性；および（ｂ）血漿または他の体液中のＣＦＩの生物活性を定量的に測定するように設計されたＣＦＩ生物活性アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
補体の活性化、特に、補体カスケードの第二経路は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の病因の中心であると考えられている。補体因子Ｉ（ＣＦＩ）およびＨ因子（ＣＦＨ）は、第二経路の活性化および増幅の制御に重要な役割を果たす。
【０００３】
Ｈ因子は、豊富に存在する１５０ｋＤａの糖タンパク質であり、循環中の平均濃度は５００μｇ／ｍＬである(Rodriguez de Cordoba et al., 2004)。Ｉ因子は、８８ｋＤａのヘテロ二量体セリンプロテアーゼであり、血清濃度はおよそ３９〜１００μｇ／ｍｌである(De Paula et al., 2003)。補体Ｈ因子の重要な機能は、様々な機構による液相および表面における第二経路の主要な阻害剤である。Ｉ因子の役割は、適当な補因子の存在下でＣ３ｂおよびＣ４ｂのタンパク質分解切断によるＣ３およびＣ５コンベルターゼの活性化を調節することである。Ｈ因子の１つの重要な機能は、液相中で、Ｃ３ｂを不活性化するためにＩ因子の必須補因子として働いて、不活性型のＣ３ｂ、すなわちｉＣ３ｂの形成をもたらすことである。ゆえに、Ｃ３ｂに対するそれらの作用を通じて、両因子は第二経路におけるＣ３コンベルターゼ形成を阻害する。Ｃ３ｂの存在下での液相中でＨ因子またはＩ因子のいずれかの活性を測定するためには、ウエスタンブロットを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイが使用されてきた(Brandstatter et al., 2012)。
【０００４】
ＡＭＤの最初期臨床ホールマークおよびリスク因子の１つは、ドルーゼンとして知られる網膜下細胞外タンパク質沈着の形成である。ドルーゼン中の多くの他のタンパク質の中でも、β−アミロイドタンパク質は、ＡＭＤの発症を招く主要な刺激の１つであると考えられている。しかしながら、ドルーゼンからのＡＭＤの発症の機序は、厳密に決定されていない。
【０００５】
β−アミロイドペプチド（ＢＡＭまたはＡβ）による補体の活性化は、疾患の進行の基礎にある重要な機序の１つであることが提案されている。Bradt et al. (1998)は、血清または補体タンパク質混合物などの補体供給源への線維性ＢＡＭ１−４０およびＢＡＭ１−４２の添加が、ＢＡＭとＣ３活性化フラグメントとの共有エステル結合複合体の生成をもたらすことを見出し、ＢＡＭによる補体の活性化の第１の直接的証拠となる。より最近では、補体の活性化におけるＢＡＭの関与は、Wang et al (2008)による試験でさらに実証され、そこでは、ＢＡＭ１−４０は、ＣＦＩおよびＣＦＨと結合して、補因子アッセイにおいてＣＦＩがＣ３ｂを切断してｉＣ３ｂを生じる能力を阻害したことが示され、これはウエスタンブロットにおいて可視的なｉＣ３ｂシグナルの欠如により明らかになった。
【発明の概要】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、ヒト体液のＣＦＩ生物活性またはヒト体液中のＣＦＩの生物活性を定量的に測定する方法であって、体液またはＣＦＩのＣ３ｂからｉＣ３ｂへの変換能を定量的に測定する工程を含んでなる方法に関する。さらに、本発明はまた、精製または組換え型のＣＦＩのいずれかのＣＦＩ生物活性を定量的に測定することを可能とし、精製または組換え型のＣＦＩのＣ３ｂからｉＣ３ｂへの変換能を定量的に測定することを含んでなる。
【０００７】
第２の実施形態では、本発明は、ヒト体液のＣＦＩ生物活性またはヒト体液中のＣＦＩの生物活性を定量的に測定する方法であって、
（ａ）ヒト体液を希釈剤（例えば、ＰＢＳ）で希釈する工程；
（ｂ）前記希釈ヒト体液にＣＦＨおよびＣ３ｂを加える工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた溶液をインキュベートする工程；および
（ｄ）生じたｉＣ３ｂの量を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
【０００８】
第３の実施形態では、前記ヒト体液は血漿である。
【０００９】
第４の実施形態では、
（ａ）血漿をＰＢＳ中に約２００〜２５０倍で希釈した後、ＰＢＳ中に２倍連続希釈し；
（ｂ）６μＬのＣＦＨおよびＣ３ｂを、各終濃度８０μｇ／ｍＬとなるように前記血漿に加え；かつ
（ｃ）第２の実施形態の工程（ｃ）のインキュベーションを３７℃で２時間行い；さらに
（ｄ）ＥＬＩＳＡを用いてｉＣ３ｂの量を測定する。
【００１０】
第５の実施形態では、ヒト血漿または体液のＣＦＩ生物活性は、５０％のＣ３ｂをｉＣ３ｂへ変換するのに必要な血漿または体液の容量であるＥＣ５０で測定される。
【００１１】
第６の実施形態では、ヒト血漿または体液のＣＦＩ生物活性は、ｍＵ／容量で測定され、ｍＵが、５０％のＣ３ｂをｉＣ３ｂへ変換するのに必要な血漿または体液の容量ｎＬ（ＥＣ５０）の逆数として定義される。
【００１２】
第７の実施形態では、血漿または体液中のＣＦＩの生物活性は、式：１０００／（ＥＣ５０（ｎＬ）×［ＣＦＩμｇ／ｍｌ］）を用いて、ＣＦＩのμｇ量当たりの単位で導き出される。
【００１３】
第８の実施形態では、本発明は、抗ＢＡＭ抗体のバッチ間の効力を測定する方法であって、
（ａ）抗ＢＡＭ抗体の第１バッチをＢＡＭとともにインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＢＡＭをＣＦＩとともにインキュベートする工程；
（ｃ）ＣＦＨおよびＣ３ｂを工程（ｂ）の混合物に加える工程；
（ｄ）生じたｉＣ３ｂの量を測定する工程；
（ｅ）生じたｉＣ３ｂの量を用いて、第１バッチのＣＦＩ生物活性を決定する工程；
（ｆ）抗ＢＡＭ抗体の第２バッチに対してａ〜ｅ）の工程を繰り返す工程；および
（ｇ）抗ＢＡＭ抗体バッチ間の効力を決定するために、抗ＢＡＭ抗体の第１バッチと抗ＳＡＭ抗体の第２バッチのＣＦＩ生物活性を比較する工程（ここで、第１バッチの決定に用いる試薬の量は、第２バッチの決定に用いる量とそれぞれ同じである）
を含んでなる方法に関する。
【００１４】
第９の実施形態では、本発明は、ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患を治療する方法であって、
ａ）患者の体液のＣＦＩ生物活性または体液中のＣＦＩの生物活性を測定する工程；および
ｂ）ＣＦＩ生物活性を測定した後、所定量よりも低いＣＦＩ生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗ＢＡＭ抗体を提供する工程
を含んでなる方法に関する。
【００１５】
第１０の実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である。
【００１６】
第１１の実施形態では、本発明は、
ａ）患者の体液のＣＦＩ生物活性または体液中のＣＦＩの生物活性を測定する工程；および
ｂ）ＣＦＩ生物活性を測定した後、所定量よりも低いＣＦＩ生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗ＢＡＭ抗体を提供する工程
を含んでなる、ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患の治療において使用するための抗ＢＡＭ抗体に関する。
【００１７】
第１２の実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である。
【００１８】
第１２の実施形態では、本発明は、精製または組換え型のＣＦＩのいずれかのＣＦＩ生物活性を定量的に測定する方法であって、
（ａ）精製または組換え型のＣＦＩを希釈剤で希釈する工程；
（ｂ）ＣＦＨおよびＣ３ｂを、工程ａ）で作製したＣＦＩ溶液に加える工程；
（ｃ）得られた工程（ｂ）の溶液をインキュベートする工程；および
（ｄ）生じたｉＣ３ｂの量を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＢＡＭ１−４０の煮沸増進阻害活性(Boiling Promoted Inhibitory Activity)。８日間エージングを行ったＢＡＭ１−４０溶液を１５分間煮沸し、補因子アッセイで試験した。
【図２】８日間エージングを行ったＢＡＭ１−４２、同様のエージングのないＢＡＭ１−４０または新たに作製したＢＡＭ１−４２の強力なＣＦＩ阻害活性。８日間エージングを行ったＢＡＭ１−４０およびＢＡＭ１−４２（ロット１）溶液の両方を、補因子アッセイにおいて、新たに作製したＢＡＭ１−４２（ロット２）溶液とともに試験した。
【図３】ＢＡＭ１−４２の音波処理増進阻害活性。ＢＡＭ１−４２溶液（ロット２）に９日目に音波処理を行い、さらに８日間エージングを行い、補因子アッセイで試験した（１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＩ、１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨ、および８０μｇ／ｍＬ  Ｃ３ｂを使用した）。音波処理無しのＢＡＭ１−４２（ロット２）および２５日目のＢＡＭ１−４０も試験した。
【図４】ＢＡＭ１−４２によるＣＦＩ生物活性阻害曲線。
【図５】ヒト血漿中のＣＦＩ生物活性（サンプルＨＰＬ８の第１試験）。ヒト血漿サンプルをＰＢＳ中に２００倍で希釈した後、さらにＰＢＳ中に２倍連続希釈した。次に、３マイクロリットルの希釈血漿を６μＬのＣＦＨおよびＣ３ｂ混合物とそれぞれ終濃度８０μｇ／ｍＬで混合した。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、この反応物中のｉＣ３ｂをｉＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡキットで評価した。対照として、外因性Ｃ３ｂおよびＣＦＨを含まない同量の血漿をｉＣ３ｂ量に関して試験した。各反応−ｉＣ３ｂ曲線に使用した血漿容量（ｎＬ）を、再パラメーター化４−パラメーターロジスティック方程式を用いて分析した(Ghosh et al, 1998)。血漿サンプル中、ＣＦＩ生物活性は、ＣＦＩタンパク質の容量および量の両方で示した。
【図６】ヒト血漿中のＣＦＩ生物活性（サンプルＨＰＬ８の第２試験）。ヒト血漿サンプルＨＰＬ８をＰＢＳ中に２５０倍で希釈した後、さらにＰＢＳ中に２倍連続希釈した。次に、５マイクロリットルの希釈血漿を５μＬのＣＦＨおよびＣ３ｂ混合物とそれぞれ終濃度８０μｇ／ｍＬで混合した。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、この反応物中のｉＣ３ｂをｉＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡキットで評価した。各反応−ｉＣ３ｂ曲線に使用した血漿容量（ｎＬ）を、再パラメーター化４−パラメーターロジスティック方程式を用いて分析した(Ghosh et al, 1998)。血漿サンプル中のＣＦＩ生物活性は、ＣＦＩタンパク質の容量および量の両方で示した（３．２ｎｌおよび３．４Ｕ／μｇ  ＣＦＩ）。
【図７】ヒトＣＦＨおよびＣ３ｂを使用する補因子アッセイにおけるマウス血漿中のＣＦＩ生物活性。四角の記号は、アッセイ前に２時間６０℃に加熱した１０ｎＬの血漿の生物活性を表す。これは、ＣＦＩ生物活性が温度感受性であることを示した。
【図８】補因子アッセイにおけるＣＦＩの阻害の典型的なＢＡＭ１−４２用量応答。ＢＡＭ１−４２、ロット３を、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＣＦＩとともに３７℃で１時間、プレインキュベートした。次に、この混合物に８０μｇ／ｍＬのＣ３ｂおよび８０μｇ／ｍＬのＣＦＨを加え、さらに３０分間インキュベートした。生成したｉＣ３ｂの量をＥＬＩＳＡ法で定量した。Ｅｘｃｅｌ  ＸＬｆｉｔプログラムを用い、ＢＡＭ−ｉＣ３ｂ曲線を、Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ阻害モデルに当てはめた。このアッセイにおけるＢＡＭのＩＣ５０は２．０６μＭであった。
【図９】ＣＦＩのＢＡＭ阻害の６Ｅ１０および４Ｇ８遮断（第１セット）。抗ＢＡＭ抗体の２つのクローン６Ｅ１０（ｍＩｇＧ１アイソタイプ）および４Ｇ８（ｍＩｇＧ２ｂアイソタイプ）を、補因子アッセイにおいてＣＦＩ生物活性の阻害に関して試験した。２０μＭのＢＡＭを抗ＢＡＭ抗体、ならびにアイソタイプ対照であるｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ｂ  ３００μｇ／ｍＬとともに室温で３０分間プレインキュベートした後、１μｇ／ｍＬのＣＦＩを加え、混合した。Ａｂ／ＢＡＭ／ＣＦＩ混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。８０μｇ／ｍｌのＣＦＨおよび８０μｇ／ｍＬのＣ３ｂを加え、インキュベーションを６０分間続けた。生成したｉＣ３ｂの量をＥＬＩＳＡ法により検出した。これらの反応は３反復で設定した。抗体−ｉＣ３ｂ濃度曲線を、再パラメーター化４−パラメーターロジスティック方程式(Ghosh et al, 1998)を用いて分析した。
【図１０】ＣＦＩのＢＡＭ阻害の６Ｅ１０および４Ｇ８遮断（第２セット）。抗ＢＡＭ抗体である６Ｅ１０（ｍＩｇＧ１アイソタイプ）および４Ｇ８（ｍＩｇＧ２ｂアイソタイプ）を、補因子アッセイにおいてＣＦＩ生物活性の阻害に関して試験した。２０μＭのＢＡＭを、抗ＢＡＭ抗体、ならびに２００μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照１１Ａ５０−Ｂ１０およびｍＩｇＧ２ｂを室温で５〜１０分間、プレインキュベートした。１１Ａ５０−Ｂ１０のクローンもまた抗ＢＡＭ抗体であるが、ＣＦＩを阻害しない（図２参照）。従って、それを本試験で６Ｅ１０のマウスアイソタイプ対照として用いた。次に、１μｇ／ｍＬのＣＦＩをＢＡＭ／Ａｂ混合物に加え、混合した。Ａｂ／ＢＡＭ／ＣＦＩ混合物を３７℃で３０〜４０分間インキュベートした。８０μｇ／ｍｌのＣＦＨおよび８０μｇ／ｍＬのＣ３ｂを加え、インキュベーションを４０〜５０分間続けた。生成したｉＣ３ｂの量をＥＬＩＳＡ法により検出した。総ての反応を３反復で設定した。抗体−ｉＣ３ｂ濃度曲線を、Ｅｘｃｅｌ  ＸＬｆｉｔ  Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅモデルを用いて分析した。
【図１１】ＢＡＭ活性に及ぼすＴｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびグアニジンの影響。ＢＡＭの活性に及ぼすＴｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびグアニジンの影響を補因子アッセイにおいて試験し、この場合、１μｇ／ｍＬのＣＦＩおよび１０μＭのＢＡＭを処理薬剤の存在下、３７℃で４０分間インキュベートした後、８０μｇ／ｍＬのＣＦＨおよび８０μｇ／ｍＬのＣ３ｂを加え、反応を３７℃で１時間２０分継続した。その後、反応物のｉＣ３ｂ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【図１２】ＡＭＤ患者の硝子体液におけるＣＦＩ生物活性曲線は、ＡＭＤを有さない患者のＣＦＩ生物活性曲線に比べて右へシフトする。希釈硝子体液サンプル（５μＬ）を１６０ｍｇ／ｍＬ  ＣＦＨと１６０ｍｇ／ｍＬ  Ｃ３ｂの混合物５μＬと混合し、３７℃で２時間インキュベートした。ｉＣ３ｂ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。加えて、ＣＦＩの量に関して補正するために、ＣＦＩのサンプルレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。これらのレベルは、ＡＭＤ（ＡＭＤ）および２つの非ＡＭＤサンプル対照（ＣＯＮＴ１およびＣＯＮＴ２）に関して３６４．６５、１，３６３．７５および８１７．３６ｎｇ／ｍｌであった。括弧の中の数字は、推定値ＥＣ５０の９５％信頼限界を示す。
【図１３】精製（ＣｏｍｐＴｅｃｈ）および組換え（ＧＳＫ）ＣＦＩを評価する３回の実行からのＥＬＩＳＡ。
【図１４】精製（ＣｏｍｐＴｅｃｈ）および組換え（ＧＳＫ）ＣＦＩの生物活性の評価。
【図１５】抗ＢＡＭ（化合物Ａ）で処理したアルツハイマー病患者由来のサンプルにおけるＣＦＩ生物活性。
【発明の具体的説明】
【００２０】
補体Ｉ因子（ＣＦＩ）およびβ−アミロイドペプチド（ＢＡＭ）は加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の病因に関与する２つの重要な因子であることが知られている。ＢＡＭとＣＦＩの生物活性との間の関係をさらに定義するために、まず、ＣＦＩの生物活性を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイを確立した。このアッセイは、背景の節に言及したウエスタンブロットの代わりに、ｉＣ３ｂの定量的検出のためにＥＬＩＳＡ法を用いる。この研究で、本発明者らは、ＢＡＭ１−４０およびＢＡＭ１−４２が補因子アッセイにおいてＣＦＩの酵素的生物活性に影響を及ぼすかどうか、ならびにＢＡＭとＣＦＩの生物活性との間の関係が定量的に測定可能かどうかを検討するために一連の試験を行った。ＢＡＭとＣＦＩはＡＭＤの発症の重要な寄与因子であるということを考えると、それらの関係を正確に定量するためのアッセイがあれば、そのアッセイの潜在的適用が意味あるものとなると考えられる。例えば、そのアッセイは、治療的介入の過程で、ＣＦＩ生物活性の変化を測定するためのバイオマーカーアッセイとなり得る。
【００２１】
本発明者らの同時係属特許出願ＷＯ２００９／０４０３３６号およびＷＯ２００７／１１３１７２号は、とりわけ、ＡＭＤ、緑内障、β−アミロイド白内障形成、アルツハイマー病を治療する抗体を教示している。ＷＯ２００２／０４０３３６号およびＷＯ２００７／１１３１７２号は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。特に注目されるものとして、以下のＣＤＲを含んでなるＷＯ２００９／０４０３３６に記載されている抗体がある。
【００２２】
ＶＨ３遺伝子ファミリーに由来するヒト重鎖可変領域内の
ＣＤＲＨ１：  ＤＮＧＭＡ（配列番号１）
ＣＤＲＨ２：  ＦＩＳＮＬＡＹＳＩ  ＤＹＡＤＴＶＴＧ（配列番号２）
ＣＤＲＨ３：  ＧＴＷＦＡＹ（配列番号３）：
【００２３】
ＧｅｎＰｅｐｔエントリーＣＡＡ５１  １３５（配列番号７）に開示されているアミノ酸配列に由来するヒト軽鎖可変領域内の
ＣＤＲＬ１：  ＲＶＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＴＹＬＨ（配列番号４）
ＣＤＲＬ２：  ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）
ＣＤＲＬ３：  ＳＱＴＲＨＶＰＹＴ（配列番号６）
【００２４】
また、特に注目されるものとして、配列番号８で示される配列セットを有する重鎖可変領域と配列番号９で示される配列セットを有する軽鎖可変領域とを有する抗体がある。
【００２５】
特に注目されるさらなるものとして、配列番号１０で示される配列セットを有する重鎖と配列番号１１で示される配列セットを有する軽鎖とを含んでなる抗体（本明細書では化合物Ａと定義される）がある。本発明のアッセイは、上記抗体を用いる過程で、ＣＦＩ生物活性の変化を測定するための生物マーカーアッセイとして有用であることが示される。さらに、本アッセイは、ＷＯ２００９／０４０３３６号およびＷＯ２２０７／１１３１７２号に開示されている抗体に等しく限定されず、その機序がＢＡＭにより抑制されるＣＦＩ生物活性の回復により組織におけるアミロイド沈着を含む疾患（特に、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成）を治療するいずれの抗体に適用することもできる。
【００２６】
本発明者らは、今般、ＢＡＭ１−４２が、補因子アッセイにおいてＣＦＩが、Ｃ３ｂをｉＣ３ｂに変換する能力の低下により示されるようにＣＦＩ生物活性を低下させることを示した。その後、本発明者らは、（ａ）抗ＢＡＭ抗体がＢＡＭにより阻害されたＣＦＩ生物活性を逆転または回復させることができることを実証し；かつ（ｂ）本発明者らは、抗ＢＡＭ療法中または療法後にヒトおよびマウス血漿におけるＣＦＩ生物活性の変化を定量するためのバイオマーカーアッセイを開発した。言い換えれば、本ＣＦＩ定量的生物活性アッセイは、組織におけるアミロイド沈着を含む疾患（特に、アルツハイマー病、ＡＭＤ、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成）に罹患したヒト患者が、まず、患者の体液中のＣＦＩ生物活性または体液中のＣＦＩのレベルを決定することにより、抗ＢＡＭ抗体の受容から利益を受け得るかどうかを確認するために使用することができる。また、このアッセイは、抗ＢＡＭ抗体療法を受けた患者が、抗ＢＡＭ抗体が投与される前と投与された後を比較することにより、患者の体液中のＣＦＩ生物活性または体液中のＣＦＩのレベルを決定することによってプラスの効果を有したかどうか決定するために使用することもできる。本ＣＦＩバイオマーカーアッセイは、好ましくは、本明細書に記載のようにヒト体液（例えば、血漿）サンプルを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００２７】
一般に、本ＣＦＩ生物活性アッセイは、
（ａ）ヒト体液を希釈剤（例えば、ＰＢＳ）で希釈する工程；
（ｂ）前記希釈ヒト体液にＣＦＨおよびＣ３ｂを加える工程；
（ｃ）得られた工程（ｂ）の溶液をインキュベートする工程；および
（ｄ）生じたｉＣ３ｂの量を測定する工程
を含んでなる方法により達成することができる。
【００２８】
本発明者らはまた、本ＣＦＩ生物活性アッセイが、
（ａ）抗ＢＡＭ抗体をＢＡＭとともにインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＢＡＭをＣＦＩとともにインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物にＣＦＨおよびＣ３ｂを加える工程；
（ｄ）変換されたｉＣ３ｂの量を測定してＣＦＩ生物活性を測定する工程；および
（ｅ）バッチ間の抗ＢＡＭ抗体の効力を相関させるために抗ＢＡＭ抗体のバッチ間のＣＦＩ生物活性を比較する工程
を含んでなる方法により抗ＢＡＭ抗体のバッチ間バッチ効力を測定するために使用することができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「ＣＦＩ生物活性」および「ＣＦＩの生物活性」は、同じものを意味し、次のようにして得られる。
【００３０】
一実施形態では、ヒト血漿または体液のＣＦＩ生物活性は、５０％のＣ３ｂをｉＣ３ｂへ変換するのに必要な血漿または体液の容量であるＥＣ５０として測定される。
【００３１】
別の実施形態では、ヒト血漿または体液のＣＦＩ生物活性は、ＥＣ５０の逆数として測定される。例えば、１つの方法では、それは容量当たりのｍＵとして測定することができ、ｍＵは、５０％のＣ３ｂをｉＣ３ｂへ変換するのに必要な血漿または体液の容量ｎＬ（ＥＣ５０）の逆数として測定される。
【００３２】
別の実施形態では、血漿または体液中のＣＦＩの生物活性は、式：１０００／（ＥＣ５０（ｎＬ）×［ＣＦＩμｇ／ｍｌ］）を用いて、ＣＦＩのμｇ量当たりの単位で導き出される。
【実施例】
【００３３】
パートＩ−ＣＦＩ生物活性を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを確立するための実行可能性試験
材料の供給源
Ｉ因子、Ｈ因子、Ｃ３ｂ、およびｉＣ３ｂタンパク質は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（タイラー、テキサス州）から購入した。ＭｉｃｒｏＶｕｅ  ｉＣ３ｂ  ＥＩＡキット（ＥＬＩＳＡキット）は、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ（サンタ・クララ、ＣＡ）から購入した。アミロイドβ−タンパク質（１−４０）（ＨＣｌ型）およびアミロイドβ−タンパク質（１−４２）（ＴＦＡ型）をＰｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ルイビル、ＫＹ）から購入した。
【００３４】
１．１  標品の調製
参照標品ｉＣ３ｂ（１．１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、アッセイマトリックスとして、アッセイバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２）中、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、および１０μｇ／ｍＬの公称濃度で標品を調製した。
【００３５】
１．２．  ＢＡＭ溶液の調製
１ｍＭのＢＡＭ１−４０：  ０．５５ｍｇを含有するＨＣｌ形態のアミロイド−β−タンパク質（１−４０）のバイアル全部を、１５分間、Ｂｒａｎｓｏｎ  １２１０ソニケーターでの音波処理により１２７μＬのＰＢＳに溶かした。この溶液を４℃で保存した。
【００３６】
１ｍＭのＴＦＡ形態のＢＡＭ１−４２（ロット１）：  ０．５６ｍｇを含有するアミロイド−β−タンパク質（１−４２）のバイアル全部を、１５分間、音波処理により、１２４μＬのＰＢＳに懸濁させた。懸濁液中、ＢＡＭ１−４２の溶解を、１／１０容量のＤＭＳＯを用いて試みたが、これは成功しなかった。この懸濁液を最終的に、ＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて（全９０μＬのＢＡＭに対して、６μＬ  ０．５Ｎ  ＮａＯＨ、２μＬ  １Ｎ  ＨＣｌを使用した）ｐＨを約７に調製することにより溶かした。最終１ｍＭの溶液を４℃で保存した。ＢＡＭ  １−４２の別のバイアル（ロット２）を、そのまま１１２μＬの１ｍＭ  ＮａＯＨに溶かした後、１２μＬの１０×ＰＢＳを加えて最終的な１×ＰＢＳ溶液を作製することにより１ｍＭの溶液を作製した。ロット２  ＢＡＭ１−４２溶液のアリコートに、４℃で９日間の保存の後、ソニケーターにて１５分間音波処理を施した。音波処理済みおよび非音波処理の両方のＢＡＭ１−４２溶液（ロット２）を４℃で保存した。
【００３７】
１．３．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイ
ＢＡＭ１−４０またはＢＡＭ１−４２（０〜４００μＭ）をＣＦＩ（０〜３０μｇ／ｍＬ）と混合し、３７℃で３０〜６０分間プレインキュベートした。ＣＦＨ（１０〜８０μｇ／ｍＬ）およびＣ３ｂ（８０〜１５０μｇ／ｍＬ）の混合物を、ＣＦＩまたはＢＡＭ／ＣＦＩ混合物を含有する試験管に加えた。３７℃で３０分のインキュベーション後、反応混合物をそのままアッセイバッファーで希釈し、ｉＣ３ｂのＥＬＩＳＡ検出に使用した。
【００３８】
１．４．  ｉＣ３ｂのＥＬＩＳＡ検出
以下に示したもの以外の詳細な手順は、ＥＬＩＳＡキットとともに提供された説明書に従って行った。希釈した反応混合物および標品を８ウェルストリップにウェル当たり６０μＬで適用し、室温で３０分間インキュベートした。プレート洗浄機にてインハウス洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２）で５分洗浄した後、８ウェルストリップにウェル当たり５０μＬのＨＲＰ抗ヒトｉＣ３ｂコンジュゲートを添加し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、８ウェルストリップをプレート洗浄機で５回洗浄し、キットに提供されている１００μＬのＨＲＰ基質とともにさらに３０分間インキュベートした。反応を５０μＬの停止バッファーの添加により停止した。４０５ｎｍでの吸光度を１０分以内に測定した。
【００３９】
１．５．  主要コンピューターシステムおよびデータ処理
ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ８００マイクロプレートリーダー（ウィーヌースキー、ＶＴ）を用いて吸光度データを取得し、これはＤｅｌｌ  ＰＣワークステーションによりＧｅｎ５（商標）ソフトウエア（ＢｉｏＴｅｋ）で制御した。取得したデータは、Ｇｅｎ５ソフトウエア（ＢｉｏＴｅｋ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３を用いて処理した。ｉＣ３ｂ定量のための標準曲線は、標品の濃度をそれらの対応する４０５ｎｍでの吸光度（Ｙ軸、ＯＤ４０５）に対して対数スケール（Ｘ軸）でプロットすることにより作成し、４−パラメーターロジスティックアルゴリズムを用いて当てはめを行った。サンプル中のｉＣ３ｂ濃度をこの標準曲線に基づいて決定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＸＬｆｉｔを用いてＢＡＭまたはＣＦＩの濃度に対するｉＣ３ｂの濃度の曲線をグラフ化した。
【００４０】
２．実行可能性試験の結果および考察
２．２  補因子アッセイの最終産物ｉＣ３ｂの測定
ＥＬＩＳＡ法を用い、補因子アッセイにおいて、ＣＦＩにより切断されたＣ３ｂの最終産物ｉＣ３ｂの濃度を定量し、これがＣＦＩの生物活性の測定でもあった。ＥＬＩＳＡ検出の直接的な読み取り値はＯＤ４０５であり、次にこれを、同じＥＬＩＳＡプレート中で用いたｉＣ３ｂ標品に基づき、ｉＣ３ｂの濃度に変換した。ＣＦＩ生物活性の質的評価のために、ＯＤ４０５を、ＯＤ４０５とｉＣ３ｂ濃度の間の関係が非線形であったとしても相関がある場合には、ｉＣ３ｂ濃度に変換せずにそのまま使用した場合があった。ｉＣ３ｂ標品を用いた場合、０．０３〜３μｇ／ｍＬの範囲の典型的なｉＣ３ｂ標準曲線を得た。
【００４１】
２．２  補因子アッセイにおけるＣＦＩの滴定
ＣＦＩの生物活性に及ぼすＢＡＭの影響を試験するために、ＣＦＩの濃度の適当な範囲が必要であった。１ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬにわたる濃度のＣＦＩをまず、１ログ刻みで合計８ログ試験した。この８ログ試験の結果に基づき、０．３ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＣＦＩを、補因子アッセイにおいて、半ログ刻みでさらに試験した。次の一連の実験においてＢＡＭの影響を試験するために、３〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの間のＣＦＩの最適濃度範囲を選択した。
【００４２】
２．３．  ＣＦＩの生物活性に及ぼす０日目のＢＡＭの影響
Wang et al. (2008)に記載された方法に基づき、ＨＣｌ形態のＢＡＭ１−４０を用い、ＰＢＳ中での音波処理により溶かした。同様に、ＰＢＳ中の音波処理で最初ＢＡＭ１−４２の溶解を試みたが、失敗した。ＢＡＭ１−４２は最終的に、ｐＨを調整することにより溶解させた。新たに作製したＢＡＭ１−４０溶液およびＢＡＭ１−４２懸濁液（０日目）を、従前の実験から示唆された濃度範囲でのＣＦＩの生物活性に関する補因子アッセイで試験した。ＢＡＭはＣＦＩ用量応答曲線をシフトさせなかったことから、０日目の両ＢＡＭは、ＰＢＳ対照と比較してより高濃度でのＢＡＭ処理ＣＦＩにおいて、ｉＣ３ｂ生産の低下にもかかわらず、ＣＦＩ生物活性の阻害において不活性であると結論づけられた。このような低下は、おそらく、高い希釈倍率および一試験点などの技術的理由によるものであった。
【００４３】
２．４  ＣＦＩの生物活性に及ぼすエージングを行ったＢＡＭの影響
極めて多くの文献が、ＢＡＭが凝集して、高い活性を有するオリゴマーとなることを示している(Uversky, 2010; Bertoncini and Celej, 2011, Straub and Thirumalai, 2011)。従って、その活性が０日目に検出できないＢＡＭ溶液は、経時的にその活性を高め得ると推論された。従前の試験から４℃で保存した両ＢＡＭ溶液を補因子アッセイにおいて２日間および３日間エージングを行った後に再び試験した。補因子アッセイにおけるＣＦＩおよびＣＦＨの濃度は、Ｃ３ｂからｉＣ３ｂの切断効率に有意に寄与したことが知られている(Brandstaetter et al., 2012)。ＢＡＭの広範囲の潜在的阻害効果を、特に低活性終端において検出するために、異なるｉＣ３ｂ変換効率を有する５つの異なる補因子アッセイを用いた：
・１μｇ／ｍＬ  ＣＦＩ、１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨ（低ｉＣ３ｂ変換効率）
・１μｇ／ｍＬ  ＣＦＩ、３０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨ（中−低ｉＣ３ｂ変換効率）
・１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＩ、１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨ（中ｉＣ３ｂ変換効率）
・１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＩ、３０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨ（中−高ｉＣ３ｂ変換効率）
・１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＩ、８０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨ（高ｉＣ３ｂ変換効率）
【００４４】
３回の独立した実験からの結果は、２日間または３日間エージングを行ったＢＡＭ１−４０溶液および１−４２溶液は、エージング無しのものよりも有意に高いＣＦＩ阻害活性を有することを一貫して示した。（１）ＢＡＭ１−４２はＣＦＩ生物活性の阻害においてＢＡＭ１−４０よりもはるかに活性が高く（表１）、かつ、（２）補因子アッセイ条件は、ＢＡＭを介したＣＦＩ生物活性の阻害効率に実際に影響を及ぼしたと結論づけられる。従って、低、中および高ｉＣ３ｂ変換効率条件下でそのＩＣ５０を特定するために、３日目のＢＡＭ１−４２を選択した。低、中および高ｉＣ３ｂ変換効率条件下でのＢＡＭ１−４２のＩＣ５０および高効率条件は、それぞれ１．５μＭ、３１．２μＭ、および６０．１μであった。
【００４５】
２．５  ＢＡＭ１−４２はＣＦＩ生物活性の真の阻害剤か。
ＢＡＭ１−４２がＣＦＩ生物活性の真の阻害剤かどうかに答えるために、特異性を実証するための補因子アッセイでの陰性対照を試験する必要がある。陰性対照を探すために、２つのアプローチを使用した。まず、ＢＡＭ１−４２およびＢＡＭ１−４０を処理するために煮沸を選択したが、これは、煮沸が通常、高分子の生物活性を破壊するからである。次に、エージングにより促進されたＢＡＭ阻害活性および新たに作製したＢＡＭは従前の実験で検出可能な活性を示さなかったことを示したので、新たなＢＡＭ１−４２溶液（ロット２）を作製し、新鮮なうちに、８日間エージングを行ったＢＡＭ１−４２（ロット１）とともに陰性対照として用いた。
【００４６】
予期しないことに、１５分間の煮沸はＣＦＩに対するＢＡＭ１−４０の阻害活性を有意に高め（図１）、一方、煮沸はＢＡＭ１−４２の活性を有意に変化させなかった（示されていない）。ＢＡＭの煮沸がＢＡＭの活性を増強する手段として記載されていなくても、それは、高温がＢＡＭのβシート形成を促進する(Jiang et al., 2012)という事実と一致する。従って、煮沸はまたＢＡＭ１−４２活性も増強し得るとの仮説に至ることが論理的である。ＢＡＭ１−４２の活性は、ほぼ反応プラトーに達したことから、この実験で煮沸はそれに影響を及ぼすとは思われないことは驚くことではなかった。要約すると、本発明者らは、思いがけないことに、煮沸がＣＦＩに対するＢＡＭの阻害活性を促進したことを見出した。
【００４７】
ＢＡＭの陰性対照を探すための第２のアプローチは予想された結果をもたらした。新たに作製したＢＡＭ１−４２（ロット２）は認め得るほどの活性を有さないことが示され、一方、８日目のＢＡＭ１−４２（ロット１）はやはり、２日目または３日目に示されるものよりも強い阻害活性を持っていた（図２）。よって、ＢＡＭ１−４２は、ＣＦＩ生物活性の阻害剤と考えることができる。
【００４８】
２．６  音波処理はＢＡＭ１−４２の活性を増強した。
ＢＡＭ１−４２（ロット２）は、新たに作製した場合には活性は無かった。さらに、このロット２  ＢＡＭ１−４２を、７日間エージングを行った後に試験したところ、それは１０μｇ／ｍＬのＣＦＩに関して約２５％だけＣＦＩ生物活性を阻害し、一方、ロット１  ＢＡＭ１−４２は、３日目および８日目（４２）に試験したところ、ほぼ１００％ＣＦＩ生物活性を阻害した。ＢＡＭ  １−４２（ロット２）は、ロット２には音波処理を適用しなかったこと以外は、ロット１溶液を作製するための主要な手段に基づいて溶液とした。音波処理が活性の増強に役割を果たしたかどうかを試験するために、ＢＡＭ１−４２（９日間エージングを行ったロット２）溶液を２つのアリコートに分けた。１アリコートをＢｒａｎｓｏｎ  １２１０ソニケーターで１５分間音波処理し、もう１つのアリコートはそのままとした。音波処理済みと非音波処理の両方のＢＡＭ１−４２溶液を、ＢＡＭ１−４０とともに、補因子アッセイで試験した。結果は明白に、ＢＡＭがＣＦＩ生物活性を阻害する活性構造を形成するためには音波処理が重要であったことを示す（図３）。
【００４９】
２．７  ＢＡＭ１−４２の存在下でのＣＦＩ用量応答
本発明者らは、ＢＡＭ１−４２が、ＣＦＩがＣ３ｂを切断してｉＣ３ｂを生じる能力を阻害することを実証した。取り組むべき重要な問題は、ＣＦＩ生物活性がどれほどＢＡＭ１−４２により影響を受けるか、および生物活性の見かけの低下をどのように定量するかということであろう。これらの問題に応えるために、ＣＦＩ用量応答試験を行い、補因子アッセイにおいて、２００μＭ  ＢＡＭ１−４２（ロット２、音波処理無しで７日間エージング）の存在下または不在下、ＣＦＩを１０ｎｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬの範囲で試験した。ＢＡＭ１−４２は、ＣＦＩの生物活性を、ＰＢＳ対照に比べてＥＣ５０で約５分の１に低下させた（ＢＡＭ１−４２のＥＣ５０：３３２４．５ｎｇ／ｍＬ；ＰＢＳのＥＣ５０：６８６ｎｇ／ｍＬ）。
【００５０】
本発明者らは、Ghosh et al, 1998に記載されているような再パラメーター化４−パラメーターロジスティック方程式を用いて、同じデータのさらなる分析を行った。上記で既に述べたように、Ｃ３ｂからｉＣ３ｂへの濃度依存変換は、ＣＦＩを２００μＭ  ＢＡＭ１−４２とともにプレインキュベートすることによって低下した（図４）。５０％の利用可能Ｃ３ｂを切断するのに必要なＣＦＩの量はおよそ６３２ｎｇ／ｍｌであった。これに対し、ＢＡＭ１−４２とともにプレインキュベートした後では、同じ切断率を達成するために、およそ３２００ｎｇ／ｍｌ  ＣＦＩ当量が必要とされた。これはＣＦＩ生物活性に５分の１へのＢＡＭ１−４２依存性の正味の低下をもたらし、これは、推定ＥＣ５０の９５％信頼限界にオーバーラップは無かったことから、統計学的に有意であると思われる（図４、括弧の中の数字）。
【００５１】
実行可能性試験の結果
本試験で、本発明者らは、ＢＡＭ１−４０とＢＡＭ１−４２の両方が、調製して適切なエージングを行った場合、ＣＦＨを補因子として加えている間は、Ｃ３ｂを切断してｉＣ３ｂを生じるＣＦＩの生物活性を阻害することができることを確認した。加えて、この一連の試験は、ＣＦＩの生物活性（本レポートで評価）、おそらくはまたＣＦＨの生物活性も、効果的に測定することができる定量的補因子アッセイの基礎を確立する。
【００５２】
ＣＦＩ生物活性のＢＡＭ依存的低下は、反応の最終産物を検出するために用いたＥＬＩＳＡ法の定量的性質のために、本方法を用いて迅速かつ正確に定量することができる。これは、文献に報告されている最良の定性的方法、すなわち、ウエスタンブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術とは対照的である。本発明者らはまた、ＢＡＭ１−４２の阻害活性がＢＡＭ１−４０に関して見られたものよりもはるかに大きかったことを示した。音波処理、煮沸、および４℃でのエージングなどの種々の処理は、ＣＦＩ生物活性の遮断に関して測定した場合、ＢＡＭの活性に有意に影響を及ぼす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイ条件は、Ｃ３ｂの切断が異なる効率で制御できるように微調整されており、これは、種々の適用のために特殊なアッセイ構成を確立しようとする本発明者らの試みを前進させる極度の柔軟性を与える。
【００５３】
【表１】
2016529482.tif 000003
【００５４】
パートＩＩ−本発明者らのＥＬＩＳＡアッセイは、抗ＢＡＭ抗体の投与前後で、硝子体液中のＡＭＤ患者のＣＦＩ生物活性、およびアルツハイマー患者の血漿のＣＦＩ生物活性を測定することができることの証明
材料の供給先
Ｉ因子、Ｈ因子、Ｃ３ｂ、およびｉＣ３ｂは、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（タイラー、テキサス州）から購入した。ＭｉｃｒｏＶｕｅ  ｉＣ３ｂ  ＥＩＡキット（ＥＬＩＳＡキット）は、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ（サンタクララ、ＣＡ）から購入した。補体因子Ｉ用のＥＬＩＳＡキットは、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（武漢、中国）から購入した。βアミロイド組換えペプチド（１−４２）（Ｕｌｔｒａ  Ｐｕｒｅ、ＴＦＡ  Ｆｏｒｍ）は、Ｃｏｖａｎｃｅから購入した。
【００５５】
以下の抗アミロイド抗体および対照抗体を本試験に用いた。
【００５６】
【表２】
2016529482.tif 000004
【００５７】
３．１．  標品の調製
２．１と同様に、参照標品ｉＣ３ｂ（１．１ｍｇ／ｍＬ）を用い、アッセイマトリックスとして、アッセイバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２）中、５ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬの間の公称濃度で標品を調製した。
【００５８】
３．２．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血漿補因子アッセイ
２．４でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイと同様に、ＣＦＨ（８０μｇ／ｍＬ）およびＣ３ｂ（８０μｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳで希釈した血漿と混合し、これをＣＦＩ源として使用した。この混合物を３７℃で１〜２時間インキュベートした。陰性対照として、ＰＢＳで予め１０倍希釈した後に６０℃で２時間処理した血漿サンプルを一部のアッセイに含めた。インキュベーション後、この反応混合物を２．７に記載した手順に従って、ｉＣ３ｂの定量に用いた。
【００５９】
３．３．  ｉＣ３ｂのＥＬＩＳＡ検出
試験の過程で、２つのＥＬＩＳＡ法を使用した。試験の第１の半分では、Ｑｕｉｄｅｌからの市販キットを用い、そのキット手順に従った。本発明者らは、ｉＣ３ｂの検出のためのインハウスＥＬＩＳＡ法を開発した。簡単に述べれば、９６ウェルプレートをモノクローナル抗ヒトｉＣ３ｂ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ  カタログ番号：Ａ２０９）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次に、このプレートを、プレート洗浄機を用いて１ウェル当たり３００μＬの洗浄バッファーで５回洗浄し、各ウェルに２００μＬのブロッキングバッファーを充填した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートし、５回洗浄した。アッセイバッファーで希釈した１００マイクロリットルの標品およびサンプルを適当なウェルに加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。その後、このプレートを５回洗浄した。１００マイクロリットルのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＣ３ｃ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  カタログ番号：２２２２−６６０４Ｐ）を各ウェルに加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。その後、このプレートを５回洗浄した。１００マイクロリットルのＵｌｔｒａ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  カタログ番号：３４０２８）を加え、振盪しながら室温で１０〜３０分間インキュベートし、１ウェル当たり１００μＬの２Ｍ硫酸を加えることにより反応を停止させた。その後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。データは、Ｇｅｎ  ５（商標）ソフトウエアを用いて処理した。
【００６０】
３．４．  ＣＦＩのＥＬＩＳＡ検出
ヒト血漿中のＣＦＩタンパク質濃度は、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅからのヒトＣＦＩ用の市販ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。８つのヒト血漿サンプル（このうち４つは補体グレートであった）は個々のドナーに由来し、採血後すぐに血液サンプルから調製されたものである（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから入手）。これらの血漿サンプル中のヒトＣＦＩ濃度は、ＥＬＩＳＡキットを用い、キット中に提供されている手順に従って測定した。対照として、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（タイラー、テキサス州）から購入した精製ヒト血清ＣＦＩタンパク質もまた試験に含めた。
【００６１】
３．５．  主要なコンピューターシステムおよびデータ処理
ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ８００マイクロプレートリーダー（ウィヌースキ、ＶＴ）を用いて吸収データを取得し、これはソフトウエア（ＢｉｏＴｅｋ）を介してＤｅｌｌ  ＰＣワークステーションにより制御した。取得したデータは、Ｇｅｎ５ソフトウエア（ＢｉｏＴｅｋ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３を用いて処理した。ｉＣ３ｂ定量のための標準曲線は、標品の濃度をそれらの対応する４０５ｎｍまたは４５０ｎｍでの吸光度（Ｙ軸）に対して対数スケール（Ｘ軸）でプロットすることにより作成し、４−パラメーターロジスティックアルゴリズムを用いて当てはめを行った。サンプル中のｉＣ３ｂ濃度をこの標準曲線に基づいて決定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＸＬｆｉｔを用いて、抗体ＢＡＭまたはＣＦＩの濃度に対するｉＣ３ｂの濃度の曲線をグラフ化した。
【００６２】
３．６  ＣＦＩ用量および経時的応答
パートＩに示されるように、補因子ＣＦＨの存在下でＣＦＩが基質Ｃ３ｂをｉＣ３ｂに変換する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイが確立されている。このアッセイにおけるＣＦＩの生物活性を十分特徴付けるために、３０、１００、３００、および１０００ｎｇ／ｍＬのＣＦＩを８０μｇ／ｍＬのＣＦＨおよび８０μｇ／ｍＬのＣ３ｂとともに３７℃で０．５、１、２、４および２２時間インキュベートした。最終産物ｉＣ３ｂの濃度は、ｉＣ３ｂ  ＥＬＩＳＡキットを用いて決定した。２時間のインキュベーション時間内で、産生されたｉＣ３ｂは、一貫して、試験した範囲内でＣＦＩの濃度に比例していた。この結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿補因子アッセイを開発するに至らせた。
【００６３】
３．７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血漿補因子アッセイの確立
血漿中のＣＦＩの生物活性は、特定の疾患の重要なバイオマーカーであると考えられている。しかしながら、血漿中のＣＦＩの生物活性を正確に測定するアッセイは存在しない。本発明者らは、純粋なタンパク質形態でＣＦＩまたはＣＦＨ生物活性を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ補因子アッセイを開発するために、本発明者らは、既存の方法の改変により、血漿ＣＦＩの生物活性を測定するための別のアッセイを開発するのにより良い状況にいた。血漿は、高分子と小分子の複合物である。ＣＦＩは循環中におよそ３９〜１００μｇ／ｍｌ(De Paula et al., 2003)の濃度で、ＣＦＨはおよそ５００μｇ／ｍＬ(Rodriguez de Cordoba et al., 2004)の濃度で存在することが報告されている。血漿中のＣＦＩの生物活性を測定するためには、血漿源のＣＦＨおよび他の分子の作用を最小限にしなければならない。本発明者らは、希釈血漿中のＣＦＨ（＜１μｇ／ｍＬ）が反応の外的ＣＦＨ（８０μｇ／ｍＬ）と比べて無視できるようにするために、血漿を少なくとも５００倍に希釈することによってこの実施を計画する。このように、上記の補因子アッセイはＣＦＩの極めて高感度のアッセイであることから、希釈血漿中のＣＦＩは、ＣＦＩ源として使用した場合、なお検出の範囲内にある。
【００６４】
同じドナーＨＰＬ８由来のヒト血漿サンプルは、２．７に記載の方法に従って２回の独立した実験で試験した。このアッセイでは、１ｍＵのＣＦＩ生物活性は、補因子アッセイで５０％のＣ３ｂをｉＣ３ｂへ変換するのに必要なＣＦＩの量または血漿容量ｎＬの逆数として定義される。２回の実験で同じドナー由来の血漿ＣＦＩ生物活性は、作成された曲線によればそれぞれ２．９ｎＬおよび３．２ｎＬであった（図５および図６）。血漿中のＣＦＩタンパク質濃度は９２．９５μｇ／ｍＬであったので、ＣＦＩの量当たりの単位として定義すれば、それらはそれぞれ３．７Ｕ／μｇ  ＣＦＩおよび３．４Ｕ／μｇ  ＣＦＩであった（次節参照）。他のドナーの血漿サンプルもまた試験したところ、ＣＦＩ生物活性は２．３ｎＬまたは３．６Ｕ／μｇ  ＣＦＩであった（血漿中のＣＦＩ濃度は１２３．４μｇ／ｍＬであった）（次節参照）。これらの結果は、血漿ＣＦＩ生物活性を測定するための方法は高感度で実行可能性があることを示す。
【００６５】
同様に、血漿中、マウスＣＦＩ生物活性を、ヒト血漿ＣＦＩ生物活性に用いたものと同じ方法に従って試験した。マウスＣＦＨおよびＣ３ｂタンパク質は利用できないので、真正なマウス補因子アッセイは確立できない。マウスタンパク質とヒトタンパク質の間の有意な相同性のために、マウスＣＦＩは、ヒトＣＦＨおよびＣ３ｂとともに働き得る。仮説を立てると、マウス血漿ＣＦＩは実際に、たとえ１０分の１の活性であったとしても、ヒトＣＦＨの存在下でヒトＣ３ｂをｉＣ３ｂに変換することができる（図７）。
【００６６】
３．８．  ヒト血漿中のＣＦＩ濃度の測定
ヒト血漿サンプル中に存在するＣＦＩタンパク質の量に換算したヒト血漿中のＣＦＩ生物活性を定義するために、血漿中のＣＦＩ濃度を決定する必要がある。ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅからのヒトＣＦＩ用の市販ＥＬＩＳＡキットを使用した。８つのヒト血漿サンプルで、製造者の説明書に従ってＣＦＩ濃度を決定した。これらのサンプル中のＣＦＩの濃度は、報告されているＣＦＩ濃度範囲内に入る。しかしながら、補因子アッセイで使用して上手くいった精製血清ＣＦＩタンパク質は、このキットによっては検出できなかった。このことは、ヒト血漿サンプルにおいて、このキットにより検出されたＣＦＩ濃度の精度についての疑問を浮上させた。
【００６７】
製造者によれば、このキットは、大腸菌(E Coli)で発現させた組換えＣＦＩペプチドに対して生じたモノクローナル抗体を使用しており、このことが上記の矛盾を説明するかもしれない。ヒト血漿サンプル中のＣＦＩを正確に定量するためには、ヒト血清ＣＦＩタンパク質を検出する信頼性のあるＣＦＩ  ＥＬＩＳＡ法が望ましいと思われる。
【００６８】
３．９．  活性ＢＡＭ溶液の調製
本研究では、若干異なる手順および処理を用いて３ロットのＢＡＭ１−４２溶液を調製した。まず、ＢＡＭ溶液を作製し、４℃で数日エージングを行った場合には、次にそれを補因子アッセイでＣＦＩの阻害活性に関して試験した。所望の活性まででなければ、それを再びエージングするか、または３７℃で数時間から最大一晩激しく振盪しながら処理し、その後、活性を再び試験した。ＩＣ５０が１〜１０μＭに達した際にのみ、そのＢＡＭ溶液を活性と見なし、アッセイに使用するものとした。試験の後期ほど、ＢＡＭ活性を一貫したものに保持するために、活性なＢＡＭ溶液を小アリコートに分割し、−７０℃で保存した。典型的なＢＡＭ用量応答曲線を（図８）に示し、ＩＣ５０は２．０６μＭである。
【００６９】
３．１０．  補因子アッセイにおいてＢＡＭの活性に及ぼす抗ＢＡＭ抗体の効果
ＢＡＭにより媒介されるＣＦＩ生物活性の阻害に及ぼす抗ＢＡＭ抗体の効果を調べるために、ＢＡＭの異なるエピトープに標的化された数種の市販マウスモノクローナル抗体を選択した。まず、１００μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの単回用量抗体を、手順に記載されているように試験した。試験した抗体の中で、６Ｅ１０は、ＢＡＭの活性を逆転させ、ＣＦＩの生物活性を回復させ得る最も強力な抗体であった。マウスアイソタイプ対照抗体ＩｇＧ２ｂもまたＣＦＩの生物活性を増強することができ、顕著なバックグラウンドを生じ、真の特異的な抗ＢＡＭの効果を識別することを困難とする。このことはマウスＩｇＧ２ｂである４Ｇ８にとっては問題である。この効果はｍＩｇＧ１ではあまり明確でないが、このアイソタイプはいくらかのバックグラウンドを生じることがある。しかしながら、ｍＩｇＧ１の効果はそれほど頻繁には見られず、ｍＩｇＧ２ｂに関して見られたものよりもずっと小規模でしか見られなかった。ＢＡＭは、ＩｇＧを含め、血中の複数の分子と結合することが報告されている(Huang et al., 1993)。この問題のため、真の阻害活性を確認するために、抗ＢＡＭ抗体の複数のクローンを、異なるアッセイ条件にて、単回用量応答または８用量応答で試験した。選択した結果を図９および図１０に示す。
【００７０】
３．１１．  ＢＡＭとの非特異的抗体結合を最小化するための抗体補因子アッセイの至適化
３．１０に示されるように、マウスアイソタイプ対照ＩｇＧｓ、特にｍＩｇＧ２ｂは、ヒンジのレベルでのＢＡＭとの潜在的相互作用によりＣＦＩ生物活性を増強するという点で、顕著なバックグラウンドを生じた。このような効果を軽減するために、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、グアニジンおよびヒト血清アルブミンなどの複数の薬剤を補因子アッセイで試験し、それらがＣＦＩ生物活性またはＢＡＭ活性に干渉するかどうかを最初に調べた。Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、ＣＦＩ生物活性に影響を及ぼさなかったが、ＢＡＭの阻害活性を完全に無効した。他方、グアニジンは、ＣＦＩの生物活性とＢＡＭの阻害活性の両方を有意に低下させた。しかしながら、この効果は差異的であるとは思われなかった（図１１）。考え合わせると、これまでに試験した薬剤の中にＩｇＧ  ＢＡＭ結合の問題を解決できるものは無かった。最後に、試薬の添加順序を逆にすることによって別の戦略を試験した。通常、最初にＢＡＭおよび抗ＢＡＭ抗体をインキュベートし、次に、この混合物にＣＦＩを加え、最後にＣＦＨおよびＣ３ｂを加えた。この試験では、最初にＢＡＭおよびＣＦＩをインキュベートし、次に、抗ＢＡＭ抗体を加えて、それがＣＦＩ生物活性に及ぼすＢＡＭの作用を逆転させることができるかどうかを調べた。それは可能であったが、ずっと低い活性であり、産生されたｉＣ３ｂの量は５μｇ／ｍＬより低かったであった。しかしながら、これがさらなる至適化の出発点となり得た。
【００７１】
３．１２  硝子体液サンプルにおけるＡＭＤとＣＦＩ生物活性との間の関係
追加試験を行い、１名のＡＭＤ患者および２名の非ＡＭＤ対象からの硝子体液サンプルにおいて、ＣＦＩ濃度とその分子の生物活性の両方を決定した。ＣＦＩの濃度は、ＡＭＤ患者と２名の非ＡＭＤ患者に関して、それぞれ３６４．６５、１３６３．９５および８１７．３６ｎｇ／ｍｌであった。補因子アッセイを用いたこの分子の生物活性の評価は、ＡＭＤ患者の生物活性応答曲線により、２名のＡＭＤ患者に関しては右側へシフトしたことが明らかになった（それぞれ、ＡＭＤに関して約１６４ｎＬ  ＥＣ５０、２名の非ＡＭＤ対象に関してそれぞれ約１７ｎＬおよび３５ｎＬ  ＥＣ５０）。活性に関しては、これらの値は、ＡＭＤサンプルでは約６．１Ｕ  ＣＦＩ生物活性／硝子体液ｍｌ、非ＡＭＤ対象では５８．８および２８．６Ｕ  ＣＦＩ生物活性／硝子体液ｍｌに換算される。ＣＦＩの生物活性をサンプル中に存在するタンパク質の量に対して補正すると以下の値となった：ＡＭＤおよび２名の非ＡＭＤ患者について、１６．８、４４．４および３４．７Ｕ／μｇ（図１２）。これらのデータは、ＡＭＤでは、非ＡＭＤ対象に見られるものに比べてＣＦＩの生物活性が低下することを示唆し、この機構がこの疾患の病因に関与する可能性があることを示す。
【００７２】
３．１５．  ＣＦＩ生物活性が量よりもむしろ生物学的関連がより大きいことをさらに確認する、得られた供給源によってＣＦＩの生物活性が異なるかどうかのさらなる確認
精製されたＣＦＩと組換え手段によって作製したＣＦＩに相当する２つのサンプルで、ＣＦＩ生物活性の測定を行った。
【００７３】
両調製物が同等の濃度であったことを確認するために、本発明者らはＣＦＩ  ＥＬＩＳＡを用いて、免疫反応性の観点から、精製調製物と組換え調製物の濃度が等しいかどうかを決定した。精製材料と組換え材料の両方を複数の濃度について、２反復でＣＦＩ  ＥＬＩＳＡにかけたところ、これらの試験は３つの異なる時機に行った（図では実験＃１〜＃３と表示）。これらの試験の結果を図１３に示す。図１３は、組換え材料に対する生成材料のＥＣ５０比はおよそ１であること、この差は統計学的に有意ではないことを示す。これらのデータは、精製材料および組換え材料の量はほぼ同じであることを示す。
【００７４】
この概念のさらなる裏付けは、標品として精製材料および未知品として種々の濃度の組換え材料を使用する回収試験から得られる。この試験からの結果を下表にまとめる。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
表のデータは、組換え材料を用いた場合、本発明者らがこのアッセイで、本発明者らが加えた標品として精製ＣＦＩを使用するものの１００％を回収していることを示し、両調製物のタンパク質濃度が等しいという見解が強調される。
【００７７】
生物活性の測定は３回行い、３つの時機に実行した。両ＣＦＩ保存溶液を、６０ｍｇ／ｍＬ  ＣＦＩで始めて１／３ログ連続希釈して８つのサブストックとした。ＣＦＩ生物活性を低濃度に維持するために、１０μｇ／ｍＬ  ＣＦＨを使用した。補因子アッセイは、各反応に関して、５ｍＬの２倍ＣＦＩサブストックを、５ｍＬのＣＦＨおよびＣ３ｂ  ２倍混合物と、終濃度８０ｍｇ／ｍＬで混合することにより設定した。この反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、反応におけるｉＣ３ｂ産生は、特殊なＥＬＩＳＡにより評価した。
【００７８】
アッセイでは、１ｍＵのＣＦＩ生物活性は、生産され得る最大濃度の半分のｉＣ３ｂを生成するＣＦＩの量（ＥＣ５０）の逆数として定義される。サンプルのＣＦＩ生物活性を得るためには、以下の計算が適用される：１／（ＣＦＩのＥＣ５０（μｇ））。この式から、Ｕ／μｇのＣＦＩとして表されるＣＦＩ生物活性レベルが得られる。３つの実験からの推定ＥＣ５０は、精製材料および組換え材料でそれぞれ３２．６（９．３〜１０８．８）および６０．８（２１．６〜１６８．０）ｎｇ／ｍｌであった。データに当てはめたモデルもＥＣ５０組換え／精製比を推定した。この値は１．８（１．５〜２．２）であり、この比は１とは有意に異なった（Ｐ＜０．００１）（図１４）。
【００７９】
反応容量は１０μＬであることから、反応物中に存在するＣＦＩの量は、推定ＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）の１００分の１であった。この値から最大１／２量のｉＣ３ｂを生成するＣＦＩの量（ｎｇ）が得られる。これらの量を１０００で割ることで、数値をμｇに変換する。ＣＦＩの推定ＥＣ５０（μｇ）を逆数にすることにより、両サンプルの推定生物活性が得られる：精製ＣＦＩ生物活性＝３，０６７．５（９１９．１〜１０，７５２．７）；組換えＣＦＩ生物活性＝１，６４４．７（５８５．２〜４，６２９．６）Ｕ／μｇのＣＦＩ。
【００８０】
これらのデータは、同じ濃度のタンパク質は取得可能であるが、そのタンパク質の生物活性は変わり得ることを証明する。全体的に見れば、これらの結果は、組換えＣＦＩ生物活性が血清から精製された材料のおよそ２分の１であるが、タンパク質濃度は等しいことを示す。
【００８１】
３．１４．  抗ＢＡＭ抗体はアルツハイマー患者においてＣＦＩ生物活性を調節することができることに証拠の提供
最後に、化合物Ａで処置したアルツハイマー病患者由来のヒトサンプルのセットを、一回のアッセイでＣＦＩ生物活性に関して評価した。アッセイ条件を以下に示す。
・８０μｇ／ｍｌ  ＣＦＨおよびＣ３ｂ
・０．０１〜２５ｎＬの血漿（ハーフログ希釈）
・インキュベーション２時間
・ＥＬＩＳＡによるｉＣ３ｂの測定
・１名の患者からのサンプルを１回のアッセイで測定する。
・各アッセイは１回行う。
・アッセイ間の変動を制御するために、各アッセイで共通の血漿サンプルを測定した。
【００８２】
図１５は、この評価の結果を示す。化合物Ａは、６９５および１３６７の時点で単回用量（６ｍｇ／ｋｇ）として静脈内投与した場合、この薬剤のそれぞれ２回目および３回目の投与後に１０％および２８％のＣＦＩ生物活性の全体的上昇を誘導した。このデータは、抗ＢＡＭ処置がアルツハイマー病患者においてＣＦＩ生物活性を調節することを示唆する。
【００８３】
結論
本研究のパートＩで、本発明者らは、ヒトおよびマウス血漿においてＣＦＩ生物活性を測定するための方法を確立した。パートＩＩで、本発明者らは、数種の抗ＢＡＭ抗体が、ＣＦＩ生物活性を元の生物活性に戻すことによりＢＡＭ活性を阻害し得ることを証明した。さらに、ＡＭＤ患者および非ＡＭＤ患者由来の種々のサンプルからのデータは、ＡＭＤでは、ＣＦＩの生物活性が低下し、この低下がＡＭＤ眼に見られる択一的補体カスケードの活性化の一因であり得るという見解に裏付けを与える。最後に、本発明者らは、抗ＢＡＭ抗体は、アルツハイマー病などのβ−アミロイド関連疾患において血漿中のＣＦＩ生物活性を回復させることを証明した。
【００８４】
略語リスト
【表４】
2016529482.tif 000006
【００８５】
参照文献
【表５】
2016529482.tif 000007
【００８６】
本明細書に引用される付加的タンパク質配列
ＣＡＡ５１１３５軽鎖アクセプターフレームワークＶ領域アミノ酸配列（配列番号７）
【化１】
2016529482.tif 000008
【００８７】
ヒト化重鎖Ｖ領域変異体Ｈ２アミノ酸配列（配列番号８）
【化２】
2016529482.tif 000009
【００８８】
ヒト化軽鎖Ｖ領域変異体Ｌ１アミノ酸配列（配列番号９）
【化３】
2016529482.tif 000010
【００８９】
成熟Ｈ２重鎖アミノ酸配列（Ｆｃ変異型二重突然変異  太字）（配列番号１０）
【化４】
2016529482.tif 000011
【００９０】
成熟軽鎖アミノ酸配列（配列番号１１）
【化５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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