(57)【要約】本発明は、分子サイトメトリーの方法及び装置に関連する。分子サイトメーターは、分子タグで標識された粒子の分析に用いられる。分子サイトメーターでは、細胞のような粒子に付着した揮発性分子タグは、分子タグのグループとして放出され、分子イオンの対応するグループを生成するためにソフトイオン化法でイオン化される。分子サイトメーターは、２つの検出器を有し、一方の検出器は分子イオンのグループの存在を検出し、他方の検出器は移動度分離された分子イオンを検出する。移動度分離された分子イオンは、分子イオンのグループに対応するように同期される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子タグで標識された粒子の分析のための分子サイトメーターであって、
前記分子タグで標識された粒子を受け取り、前記粒子から放出された分子タグのグループを送出するために適合された試料送出システムと、
前記試料送出システムに結合され、前記分子タグのグループに対応する分子イオンのグループを生成するために構成されたイオン化源と、
分析器と、を備え、
前記分析器は、
前記分子イオンのグループのフローを導くためのイオンインターフェースと、
前記イオンインターフェースから前記分子イオンのグループの前記フローを受け取るよう配置された上流部を有し、前記分子イオンの各グループにおける前記分子イオンの移動度分離のために構成されたドリフトチューブと、
前記ドリフトチューブが受け取った前記分子イオンの各グループの存在を検出するために配置された第１の検出器と、
前記分子イオンの各グループの存在に関連する、前記移動度分離された分子イオンを検出するために構成された第２の検出器と、
を備える、分子サイトメーター。
【請求項２】
前記フローにおける前記分子イオンのグループは連続して導かれる、請求項１に記載の分子サイトメーター。
【請求項３】
前記イオンインターフェースは、前記分子イオンのグループの前記フローを前記ドリフトチューブに連続して導く、請求項２に記載の分子サイトメーター。
【請求項４】
前記第１の検出器と前記第２の検出器とを調整するために適合されたシンクロナイザーをさらに備える、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の分子サイトメーター。
【請求項５】
前記試料送出システムは、前記粒子それぞれからの前記分子タグを、分子タグの対応するグループに放出するための活性化領域をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の分子サイトメーター。
【請求項６】
前記活性化領域は、前記粒子それぞれから分子タグを放出するための活性化剤を受け取るために適合され、前記活性化剤は、光子、熱、化学物質、天然物、またはそれらの組み合わせから選択される活性化特性を有する、請求項５に記載の分子サイトメーター。
【請求項７】
前記第２の検出器は、前記第１の検出器の下流に配置される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の分子サイトメーター。
【請求項８】
前記イオン化源はソフトイオン化源である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の分子サイトメーター。
【請求項９】
前記イオン化源は、エレクトロスプレーイオン化源、化学イオン化源、電子イオン化源、レーザー脱離イオン化源、及び電界イオン化源から選択される、請求項８に記載の分子サイトメーター。
【請求項１０】
試料送出システムと、
前記送出システムに結合され、分子イオンのグループを生成するために構成されたイオン化源と、
分析器とを備え、
前記分析器は、
前記分子イオンのグループのフローを導くためのイオンインターフェースと、
前記分子イオンのグループのフローを受け取るために、前記イオンインターフェースの下流に配置される上流部を有し、前記分子イオンの移動度分離のために構成されたドリフトチューブと、
前記ドリフトチューブの前記上流部に配置され、前記ドリフトチューブによって受け取られる前記分子イオンの各グループの存在を検出する第１の検出器と、
前記第１の検出器の下流に配置され、前記分子イオンの各グループの存在に関連する、前記移動度分離された分子イオンを検出するために構成された第２の検出器と、
を備える、分子サイトメーター。
【請求項１１】
前記第１の検出器と前記第２の検出器とを調整するために適合されたシンクロナイザーをさらに備える、請求項１０に記載の分子サイトメーター。
【請求項１２】
前記イオン化源はソフトイオン化源である、請求項１１に記載の分子サイトメーター。
【請求項１３】
前記イオン化源は、エレクトロスプレーイオン化源、化学イオン化源、電子イオン化源、レーザー脱離イオン化源、及び電界イオン化源から選択される、請求項１２に記載の分子サイトメーター。
【請求項１４】
分子タグで標識された粒子の分析のための分子サイトメトリー法であって、
前記分子タグで標識された粒子を受け取るステップと、
対応する分子タグのグループを生成するために前記粒子それぞれから前記分子タグを放出するステップと、
対応する分子タグのグループを生成するために、前記分子タグの各グループ内の分子タグをイオン化するステップと、
前記分子イオンの各グループ内の分子イオンを衝突断面積の関数として分離するステップと、
前記分子イオンの各グループに対応する、前記分離した分子イオンを検出するステップと、
を含む、分子サイトメトリー法。
【請求項１５】
前記分子タグで標識された粒子は連続形成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分子タグの各グループに対応する前記分子イオンの各グループの存在を検出するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記放出した分子イオンを検出するステップは、前記分子イオンの各グループの存在を検出することによってトリガーされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分子タグを放出するために、活性化剤を前記分子タグで標識された粒子のフローに向けるステップをさらに含む、請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性化剤は、光子、熱、化学物質、天然物、またはそれらの組み合わせから選択される活性化特性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記イオン化するステップは、ソフトイオン化法によって達成される、請求項１４乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ソフトイオン化法は、エレクトロスプレーイオン化源、化学イオン化源、電子イオン化源、レーザー脱離イオン化源、及び電界イオン化源から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
粒子を標識するため、及び分子サイトメトリーによる分析のための分子タグであって、
移動度分離によって識別可能な衝突断面積を有する揮発性分子化合物と、
前記揮発性分子化合物に付着する放出可能なリンカーと、
前記放出可能なリンカーを前記粒子に結合するための親和性試薬と、
を含む、分子タグ。
【請求項２３】
前記放出可能なリンカーは、光子、熱、化学物質、天然物、又はそれらの組み合わせから選択される活性化特性によって放出可能である、請求項２２に記載の分子タグ。
【請求項２４】
前記放出可能なリンカーは、前記活性化特性の関数として時限遅延放出用に設定される、請求項２３に記載の分子タグ。
【請求項２５】
粒子を標識するため、及び分子サイトメトリーによる分析のための分子タグであって、
揮発性分子化合物と、
前記揮発性分子化合物に同時に付着する２つ以上の異なる放出可能なリンカーと、を含み、
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーそれぞれは異なる放出特性で設定される分子タグ。
【請求項２６】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーは、前記揮発性分子化合物を前記粒子に結合する、請求項２５に記載の分子タグ。
【請求項２７】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーそれぞれを前記粒子に結合するための親和性試薬をさらに含む、請求項２６に記載の分子タグ。
【請求項２８】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーそれぞれは、光子、熱、化学物質、天然物、またはそれらの組み合わせから選択される活性化特性によって放出可能である、請求項２７に記載の分子タグ。
【請求項２９】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーそれぞれは、前記異なる放出特性の関数としての時限遅延放出のために設定される、請求項２８に記載の分子タグ。
【請求項３０】
前記揮発性分子化合物は、移動度分離によって識別可能な個別の衝突断面積を有する、請求項２５乃至２９のいずれか一項に記載の分子タグ。
【請求項３１】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーは、２つの異なる放出可能なリンカーからなる、請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載の分子タグ。
【請求項３２】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーは、３つの異なる放出可能なリンカーからなる、請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載の分子タグ。
【請求項３３】
前記２つ以上の異なる放出可能なリンカーは、ホスホトリエステル、フェナシルエステル、ジスルフィド架橋、及びリン脂質を含む開裂可能な基から選択される、請求項３１又は３２に記載の分子タグ。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月２８日出願の米国仮特許出願第61/827,850号、２０１３年５月２８日出願の米国仮特許出願第61/827,854号、及び２０１３年５月２８日出願の米国仮特許出願第61/827,856号の利益を主張し、これらの出願における開示全体は参照によって本出願に組み入れられる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子サイトメトリーによる標識された細胞分析のための装置に関連する。
【背景技術】
【０００３】
マスサイトメトリーは、金属結合抗体及びメタロインターカレーターで標識された細胞を個別に誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）イオン化源に導入し、誘導結合プラズマイオン化源では、細胞を、同時元素分析のために蒸発させ、噴霧化し、イオン化する、単一細胞分析のための技術である。元素タグは一般に生体、天然物には存在しないため、遷移金属から選択される。そのため、区別できるタグの数は、利用可能な遷移元素、及び関連する金属同位元素の数に限られる。しかし、増加しつつあるマルチパラメータの粒子分析の要求を満たす、必要な多くの異なるタグの数は、遷移金属から利用可能な元素タグの数を超えることが予想される。
【発明の概要】
【０００４】
上記の観点から、及び本教示に基づいて、出願人は、分子化合物は、例えば生体細胞のような粒子を標識するために設計することができ、その対応する無傷の分子イオンを調べることによって、それらの物理的な特性を、分子ベースのタグを区別するために用いることができることを認識した。この技術では、分子タグのそれぞれ別個のグループが、そのグループ内で分子イオンの特性を維持するイオン化プロセスを受けることができるように、分子タグのグループは各粒子から放出することができる。連続形成の分子イオンそれぞれ別個のグループのフローを調べることができ、各グループの分子イオンは、各分子イオンの特性に応じて空間的に分離することができる。分析器では、分子イオンの各個別のグループの存在を第１の検出器によって検出してから、ドリフトチューブ内を横切る間に各グループ内の分子イオンを空間的に分離させる。第１の検出器に同期する第２の検出器は、分子イオンのそれぞれ別個のグループにそれぞれ対応する、分離した分子イオンを検出する。分子タグは、異なる放出特性を有するように構成して、異なる分子タグを、放出特性の関数として粒子から選択的に放出することができる
【０００５】
当業者は、以下に記載される図面が例示のみの目的であることを理解するだろう。図面は、出願人の教示の範囲を限定することを何ら意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】分子サイトメーターの概略図である。
【図２】図１の分子サイトメーターを通る、分子タグで標識された粒子が受ける事象を示す分子サイトメトリーの図的表示である。
【図３】本教示による第１の検出器及び第２の検出器からの信号を含む分析の例示的表示である。
【図４】本教示による分子サイトメトリーで用いるのに好適な分子タグで標識された粒子の図的表示である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本教示に関連して様々な要素につき用いられる句「１つの（“a”）」または「１つの（“an”）」は、文脈上、明確な指示がない限り「１つ以上の」または「少なくとも１つの」を含むことを理解されたい。まず、参照番号１０によって総称する分子サイトメーターの概略表示を示す図１を参照する。分子サイトメーター１０は、分析器４０の上流に位置するイオン化源３４に結合された試料送出システム２０を備える。試料送出システム２０は、活性化領域２４内へ移行する入口部２２を有するよう構成することができる。活性化領域２４は、概ね大気圧で動作するイオン化源３４に結合するための出口部２６に接続することができる。イオン化源３４は、図１に示すように分析器４０に近接して配置して、以降で説明するように、分子イオンをイオン化源出口３６から連続して分析器４０内に導くことができる。分析器４０は、イオンインターフェース４６に結合された上流部４４を有するドリフトチューブ４２を備える構成を有している、一般に移動度放出器といわれている形式のものとすることができる。典型的に、分析器４０は、ドリフトガス又はバッファガスの存在下において、大気圧より低い圧力、例えば、約１〜１０Ｔｏｒｒで動作し、イオンインターフェース４６は、イオン化源の大気圧からつながる、通常、差動ポンプシステムによって規定される差動圧を提供するよう構成される。さらに、分析器４０は、分子イオンの移動度分離の前に分子イオンの存在を検出するための第１の検出器４８、及び移動度分離された分子イオンを検出する第２の検出器５０を備えることができる。
【０００８】
分析器４０と、イオン化源３４と、試料送出システム２０との本組み合わせが、本教示で具体化される分子タグで標識された粒子の分析をどのように可能とするかの理解を助けるために、矢印２８，３０，３２によって示す、フローパス又はイオン移動の方向を参照する。各矢印２８，３０，及び３２は、試料送出システム２０、イオン化源３４、及び分析器４０それぞれの内部の経路セグメントを表し、さらにここでは、図２を参照して説明するように様々な事象を例示する目的で示している。便宜上、参照番号５２は、粒子に付着した様々な分子タグを記号化するために用語ＭＴｎと併せて、分子タグで標識された粒子を示すために用いられる。ＭＴｎにおける表記「ｎ」は、異なる分子タグまたは化合物を意味する変数とすることができる。例えば、生体細胞からなる粒子５２は、１つ以上の異なる分子化合物ＭＴ１、ＭＴ２、ＭＴ３、・・・に結合することができ、各分子化合物ＭＴｎは、対象となる細胞分析のための、特定の抗体・抗原親和性機能を有するよう構成することができる。マルチパラメータ分析においては、１つ以上の粒子を多くの一意の分子タグＭＴｎで標識することができ、各粒子に対応する各分子タグＭＴｎは、最初に各粒子から分子タグＭＴｎを１つのグループとして放出し、次に、集合体（assemblage）として放出された分子タグＭＴｎの各グループを調べることによって識別することができる。これは、標識された粒子５２を、最初に入口部２２を経て試料送出システム２０内に連続して導入することによって達成することができる。通常、標識された粒子５２は、流体中で懸濁され、隣接粒子間の空間的放出を維持するのに適切なフローストリームによって送出される。試料送出システム２０の入口部２２は、粒子が層流状態を提供するよう構成して、粒子の流れが連続形成されるように仕向けることができる。試料送出システム２０の内部では、各標識された粒子５２は活性化領域２４を通過し、分子タグＭＴｎは、以下に説明するような様々な活性化手段にしたがって各粒子から放出される。図２の数字５４で示す、標識された各粒子から放出された分子タグＭＴｎのグループは、空間的に別々に留まり、経路２８に沿って連続形成で流し続けることができる。したがって、概ね、Ｄ１及びＤ２により規定される試料送出システムの内部寸法は、分子タグ５４の各グループ間のかさなりを最小化するように層流条件をサポートするよう設定することができる。例えば、様々な実施形態において、Ｄ１及びＤ２のうちの一方又は両方の値は、分子タグ５４のグループの、連続的なフローの形成又は方向づけを維持するために、入口部２２と出口部２６との間に内部テーパーを有するように試料送出システム２０を規定するよう変えることができる。
【０００９】
その後、イオン化源３４は、分子タグ５４のグループが連続して出現するので、これらの分子タグのグループを受け取り、次々に対応する分子イオン５４のグループを生成することができる。イオン化源３４内の連続するフローストリーム又はパターンは、必要に応じて維持することができる。いくつかの条件下で、イオン化源３４は、イオンの形成がその化学結合構造を保持することのできるソフトイオン化法を達成するよう構成して、分子イオンを分子タグから生成することができる。その結果、粒子５２に前もって付着した分子タグ５４のグループは、分子イオン５６の別のグループとは空間的に異なる、対応する分子イオン５６のグループによって表すことができる。簡潔にするために、イオンという用語は分子イオンのことをいい、これらの用語は本教示では同義的に用いることができる。イオン化に続いて、イオン５６のグループは、ガス相内に放出され、静電集束電界の影響下で分析器４０の方へと向けられる。イオン化源３４と分析器４０との相対位置は、イオン５６の各グループの空間的独自性を保持しながら、分析器４０内へのイオンの送出を促進するために整列させることができる。様々な実施形態において、例えば、図１に示す経路方向２８，３０，３２は、イオン５６のグループを分析器４０に、直接、送出し得るように、試料送出システム２０、イオン化源３４、及び分析器４０を軸方向に整列させることができることを例示している。
【００１０】
イオン５６のグループは分析器４０の方へ集束されるものの、イオンインターフェース４６におけるアパーチャ３８は、イオン化源３４とドリフトチューブ４２との間にイオン５６のグループのフローを導くよう構成することができる。アパーチャ３８の寸法は、上述したように分析器４０内に差動圧を維持するために選択することができる。様々な実施形態において、イオンインターフェース４６は真空圧の異なる段階を提供するための複数のアパーチャを有するか、アパーチャ３８の形状をイオン化源３４と分析器４０との間の圧力差を可能とするような伝導通路又はチャネルの形とすることができる。一般に、イオンインターフェース４６の構成によって、イオン５６のフローを中断させずにドリフトチューブ４２内に通して、連続フロー中のイオン５６の各グループを、集合体として分析器４０によって調べることができる。
【００１１】
イオン５６のグループが一旦、イオンインターフェース４６を通過したら、例えば、光学又は近接センサのような第１の検出器４８を用いて、ドリフトチューブ４２に入るイオン５６のグループの存在を下流の移動度放出分析の前に検出又は検知することができる。経路３２に対する第１の検出器４８の位置は、イオンの動きとの非干渉性を維持しながら、非侵襲的な検出を提供するように選定し、分子タグ５４のグループに対応する分子イオン５６のグループの連続フローを保持することができる。様々な実施形態において、例えば、第１の検出器４８は、イオンターフェース４６の構造に組み入れることができるか、イオンインターフェース４６を近接検出器として機能するよう構成することができる。イオン５６のグループの存在を検出すると、第１の検出器は、図３に示すような、パルス又は信号６０を発生するよう構成することができる。各信号６０の時間的な間隔は、イオン５６の各グループの存在を表すのに用いることができ、移動度分離した分子イオンの各集合体は、イオン５６のその対応するグループに関連付けることができる。例えば、イオン５６のグループの存在が検出され、それらのイオンがドリフトチューブ内でバックグラウンドガスと衝突した後、分子イオン５６は、第２の検出器５０に到達するのに要するドリフト時間に従って放出される。一般に、ドリフト時間は、典型的には分子の衝突断面積の大きさ及び形状に基づく分子イオンの移動度（ドリフト速度）に依存する。第１の検出器４８の下流に配置された第２の検出器５０は、放出した分子イオン５８の到着を検出し、到着する分離したイオン５８に対する時間的信号６２を発生する。第１の検出器４８からの信号６０は、信号６２の集合体６４として表される移動度分離されたイオン５８のグループの到着時刻を、例えばシンクロナイザー５１で同期させ、イオン５６のそのグループの存在と関連付けるような方法で、第２の検出器５０のためのトリガーとして用いることができる。一般的にいえば、シンクロナイザーは、信号６２の集合体６４が前もって検出されたイオン５６のグループに関連付けられるように、第２の検出器５０を第１の検出器４８と同期させるために用いることができる。そのため、移動度分離された分子イオン５８の各グループは、各粒子に標識された分子タグ５４のグループを表す分子イオン５６の各グループと対応して関連付けられる。
【００１２】
本教示を、様々な実施形態とともに説明するが、本教示はこのような実施形態に限定されることを意図したものではない。反対に、本教示は、当業者によって認識されるように様々な変形例、変更例、及び均等物を含む。例えば、本出願人は、放出した各分子イオンがドリフトチューブを通ってドリフト時間に基づいて出現すると、フェデラーカップ型検出器のような第２の検出器５０は、放出した各分子イオンの到着を記録するための連続取得モードで動作し得ることを認識した。これは、いくつかの実施形態において、フェデラーカップ（またはプレート）に当たるイオンから生じる電流をモニタリングし、各電流のスパイク又はピークの時間的な存在を観測することによって達成できる。トリガー信号６０の関数としてのドリフト時間の記録は、分子イオン５６の対応するグループとともに、放出した分子イオン５８のグループを識別するために、取得中か、又はその後のオフライン中のいずれかに、例えばプロセッサで評価することができる。また、第２の検出器５０は、この検出器が第１の検出器４８からの信号６０を受信している特定の期間中、作動するように、断続的にトリガーされることができる。特定の期間は、分子の予想衝突断面積に相当する分子タグの範囲に依存する。
【００１３】
さらに、図３に示す時間的信号６２は同じ高さの垂直線で表されているが、時間的信号６２は様々な強度のピークによって特徴付けることができる。同一の移動度を有する、したがって同時に到着する放出した分子イオン５８の数は、第２の検出器５０によって検出することができ、検出器５０は、この分子イオンの数を表す対応する強度のピークを生成する。様々な実施形態において、変化する強度を有する時間的信号６２の集合体６４は、第１の検出器によって識別された分子イオンの各グループの定量分析のために用いることができる。粒子５２は、強度及び／又は移動度の校正手段として用いる参照基準を表すために用いることができる、予め選択された分子タグＭＴｎで標識するか、分子タグＭＴｎと共存することができる。校正機能は定性及び定量分析に有利である。さらに、図３に示すように、連続する信号６０及び対応する集合体６４間の時間間隔は、規則的にも不規則にもなり、標識された粒子５２間、分子タグ５４間、及び分子イオン５６間の空間的分離に概ね依存する。
【００１４】
様々な実施形態において、分子タグＭＴｎ内に用いることのできる分子化合物は、一般に既知の錯体から選択された揮発性化合物とするか、移動度分離による分析の可能な、識別可能な分子イオンを有するタグの配列を提供する小粒子の構成要素から合成することができる。一般に、周囲温度でガス相に遷移することのできる、又は高温で気化する揮発性分子化合物が用いられる。いくつかの例では、揮発性分子化合物は、分子金属クラスター、有機性ポリマー、及びポリマー系元素合成物等を含む様々な族から選択することができる。さらに、二原子ランタニド、ベンゼン誘導体、及び他の炭化水素のような無機及び有機化合物が分子タグＭＴｎ内に用いられるとみなされる。典型的には、分子タグＭＴｎは、錯体に付着するためのリンカーを含むことができる。リンカーは、例えば、関心のある粒子に直接、又は抗体・抗原親和性或いは様々な親和性試薬による他の結合親和性を示す生体分子を介して結合させるのに適している特性を有するものを選択することができる。
【００１５】
さらに、リンカーは、分子タグＭＴｎを放出するために、その付着の安定性にしたがって、及びリンカー自体と分子タグＭＴｎとの間、又はリンカー自体と標識された粒子５２との間の結合を切断するのに必要とされる条件にしたがって選択することができる。一般に、分子タグ５４を粒子に結合させる放出可能な放出したリンカーは多数考えられ、活性化剤によってもたらされる所定の反応条件下では、リンカーを開裂させることができる。例えば、放出可能なリンカーは、リン酸トリエステル、フェナシルエステル、ジスルフィド架橋、及びリン脂質等を含む、開裂可能な基から選択することができる。本教示のためには、他の適切な開裂可能基及びそれらに対応する開裂条件も考慮し得る。例えば、様々な実施形態において、リンカーは、感光性結合の切断を特定波長の光の存在下で活性化することができる、リンカーは光放出可能リンカーとすることができる。本例では、特定波長の光の光子活性化特性は、活性化剤とみなすことができる。代わりに、酵素、還元剤、酸化剤のような化学活性化による、伝導、対流、又は放射を介する熱エネルギー活性化による、あるいは直接的又は間接的なエネルギー波伝導を用いる他の物理的な活性化による、他の活性化特性を、標識された粒子５２からの分子タグＭＴｎの放出のために考慮し得る。しかし、分子タグＭＴｎを放出するプロセスは、細胞から開裂させるためのリンカーに関連する結合を切断するプロセスに限られない。例えば、生体細胞に標識されていた分子タグＭＴｎは、洗剤ベースの緩衝剤の導入を介しての化学的活性化によって放出することができる。洗剤は、分子タグＭＴｎを有効に放出する細胞破壊を引き起こす。その後、放出された分子タグ５４のグループを含むセルライセートは、分子イオン５６のグループを生成するためにイオン化源に全て送出することができる。以降で説明するように、セルライセートから又は開裂された細胞から放出されたタグを分離することを含む追加のステップをイオン化の前に行うことができるが、分析は、一般に分子タグＭＴｎに関連する分子イオンを対象とするため、おそらく不要である。さらに、本教示の移動度放出分析は、二重の検出器４８，５０で設定されるため、検出されたイオン５６のグループと、移動度分離された分子イオン５８との間の特異性により、非分子タグからの寄与をバックグラウンドノイズとしてみなすことができる。しかし、様々な実施形態において、知覚されるバックグラウンドノイズは、セルライセートの中身に関連する情報を得るためにさらなる解読又は分析をすることができる。
【００１６】
様々な実施形態において、標識された粒子から分子タグＭＴｎを放出した後には、イオン化の前に粒子又はライセートを放出するのにいくつかの利点がある。この例では、液相放出法が考えられる。例えば、分子タグ５４の分析中に細胞又はライセートを保持するために、クロマトグラフカラムを試料送出システム２０の出口部２６とイオン化源３４との間に配置することができる。あるいは、粒子用及び放出した分子タグＭＴｎ用の２つの別の流れ経路を提供するために、分流器を試料送出システム２０に接続するか、それと一体化することができる。粒子用の経路は、排出又はさらなる粒子分析のために構成することができる一方、タグ用の経路はイオン化源に接続することができる。必要に応じ、更なる粒子又はライセートの放出を提供するために、追加のフロー経路を用いることができる。
【００１７】
さらに、様々な実施形態において、粒子は、ガス相内で放出した分子タグから分離することができる。例えば、イオン化源３４は、粒子を含む放出、分子タグ５４のグループを受け取ることができ、かつその後に、分子イオン５６及び荷電粒子のグループを生成することができる。さらに、ガス相内では、例えば静電界や動的ガスフロー、又はそれらの組み合わせを用いて、荷電粒子を、引きつけたり、逸らしたりすることができる。それた荷電粒子は破棄するか、荷電粒子分析にとって知られている追加の技術により分析することもできる。
【００１８】
また、様々な実施形態において、分子タグＭＴｎは、例えば熱熱応答性ミクロゲル系物質のポリ（Ｎ?イソプロピルアクリルアミド）のような水素微粒子からなる構造中にカプセル化することができる。ミクロゲル物質は、必要に応じて粒子に結合させるために感応性をもたせることができる。分子タグＭＴｎは、ミクロゲル物質の一部又は全部を気化するために高温面との熱接触又は照射伝導／対流により、粒子からガス相内に直接放出することができる。粒子及びミクロゲルに関連する残留物とともに、ガス相内に放出された分子タグＭＴｎは、排出するか、又は以降に説明するようにガス相ソフトイオン化に適するイオン化源３４によってイオン化することもできる。
【００１９】
一般に、活性化剤は、標識された粒子５２に触れさせるために、様々な手段で活性化領域２４内に導入することができる。例えば、溶解する緩衝剤を含む化学的活性化剤は、放出される分子タグ５４のグループの連続形成を妨げる影響を最小に抑えながら、細胞の相互作用を最適化するために設定されたフローダイナミクスで液体として活性化領域内に送出することができる。この例では、液体活性化剤のフローは、標識された粒子５２のフローに接触させるために同心円状又は平行なパターンで導入される。代わりに、ＵＶ光又は熱エネルギー放射のような、非接触の活性化剤を、試料送出システム２０における光学ポートを経て活性化領域内に透過させることができる。物理的又は放射性の活性化剤としては、超音波放射のような音波伝播又はマイクロ波等のような他の非イオン化放射も考えられる。標識された粒子５２が活性化領域２４を通過するときに、粒子は活性化剤に暴露され、その相互作用によって分子タグ５４を放出させることができる。様々な実施形態において、活性化剤への暴露時に、分子タグの放出は早急に発生させるか、又は必要に応じ、分子タグ５４の時限遅延放出を可能にするために、所定の期間に発生させることができる。典型的には、時限遅延放出は、リンカーの放出特性の関数とするか、活性化剤の濃度又は組成の関数とすることができる。活性化領域２４の形状、例えば長さは、必要に応じて時限遅延放出に適合するために構成することができる。
【００２０】
さらに、様々な実施形態において、標識された粒子５２からの分子タグ５４の放出は、活性化領域内に限られず、入口部２２とイオン化源３４の出口３６との間の経路２８，３０に沿った様々な領域で発生させることができる。例えば、いくつかの例において考慮中の種々のタイプの粒子は、フローダイナミクスを乱したり、システム２０内の隣接する粒子間の空間的な放出を維持するために設定されたフローストリームに影響されたりしないか、又はその影響は限られたものであるという物理特性を有する。これによって、不連続形成で流れる標識された粒子５２の一部が、重なっている分子イオン５６のグループ内で放出した分子イオン５８を分離するための分析器４０の性能を低下させ得る、誤ったデータに帰着する。その結果、標識された粒子間に十分な空間を得るために、試料送出システム２０内か、又はイオン化源３４内のフローストリーム内で粒子が移動する追加の時間が必要となる。この例では、標識された粒子が試料送出システム２０のさらに下流で連続形成されるまで、分子タグのいくつかを放出させるのを遅らせるのが有利となり得る。したがって、上述したような時限遅延放出は、異なる放出特性を有する、異なる放出可能なリンカーの複数の放出のうちの１つとして組み入れることができる。さらに、異なるリンカーに特有の異なる活性化剤は、経路２８，３０に沿った様々な位置で標識された粒子のフローに向けることができる。この配置では、粒子は、異なる放出可能なリンカーとともに分子タグで標識して、異なるタイプの分子タグは、検討中の粒子のタイプにしたがって放出させることができる。様々な実施形態において、放出活性化剤の導入位置は、放出した分子イオン５８のグループ間の分解度を調節する手段として調整することができる。
【００２１】
単一のタイプの放出可能リンカーは、各分子タグ５４を粒子５２に結合するために選択することができるものの、様々な実施形態では、異なるタイプの２つ以上の放出可能リンカー（複数リンカー）を分子タグ５４に同時に付着させて、図４に示すような複数リンカー分子タグ６６で標識された粒子を形成することができる。この例では、各放出可能リンカー７０，７２，７４が同じ分子タグＭＴｎを同じタイプの粒子７６に結合させることができるように、異なるタイプの放出可能なリンカー７０，７２，７４を同じ分子タグＭＴｎに取り付けることができる。前述した、放出可能な異なるリンカー７０，７２，７４は粒子７６に、直接、あるいは関心のあるタイプの各粒子に特有の抗体又は他の親和性試薬のような媒介を介して結合させることができる。放出可能な異なる各リンカー７０，７２，７４は、それらの異なる放出特性、したがってそれらの異なる活性化要件により特徴付けられる。したがって、標識された粒子６６からの分子タグの放出には、異なる各リンカーに感応する異なる活性化剤の組み合わせが必要である。この例では、分子タグは３つの異なるタイプの放出可能なリンカーを有するとしているが、複数の置換を提供するために、放出可能な異なるリンカーの数は典型的には２つ以上とすることができる。このやり方では分子タグＭＴｎは、放出可能な異なるリンカーの組み合わせにしたがってエンコードし、その後、図１に示す分子サイトメーター１０により異なる組み合わせの放出剤によって選択的に放出させ、分析することができる。
【００２２】
分子タグＭＴｎの大きさと組成は、上記のように、その揮発性と、ソフトイオン化法による対応する分子イオン５８の生成能力にしたがって選択することができる。当然の結果、ソフトイオン化法の選択は、分子タグの性質及び分析器のマスレンジに依存し、移動度分離を有効に達成することができる。様々な実施形態において、例えば、高速原子衝撃（ＦＡＢ）のソフトイオン化法は、典型的には３００〜６０００Ｄａの分子量を有する多種の化合物に適用することができ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、約２０，０００Ｄａまでの分子タグに適しており、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）及び電界イオン化（ＦＩ）はＥＳＩによってイオン化することのできない２，０００Ｄａまでの化合物に有効であり、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）は１００，０００Ｄａまでの大きい分子を潜在的に扱うことができる。したがって、様々な実施形態において、分析器は、約１００〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量の分子イオンを分離する能力を有する移動度分離器として構成することができる。代わりに、移動度分離器は、１０００〜１０，０００Ｄａの分子量範囲を有する特定の分子イオンを放出するよう構成することができる。
【００２３】
分析器は、１〜１０Ｔｏｒrの典型的な圧力で動作する移動度分離器について説明してきたが、いくつかの例では、本教示は、より高い圧力で動作する移動度分離器を組み入れることができる。様々な実施形態において、例えば、移動度分離器は、大気圧状態、ほぼ７６０Ｔｏｒｒ及び、必要とされる高温度に設定することができる。異なる移動度のイオンが異なる軌跡を経るようにするガスダイナミクスを利用する、微分型移動度スペクトロメトリー（ＤＭＳ）又は微分型移動度分析器（ＤＭＡ）によって規定されるような他のタイプの移動ベースのシステムも考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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