(57)【要約】  本開示は、様々な態様および実施形態において、稀な標的核酸を選択的に増幅し、および／または稀な標的核酸に類似の配列を有する非標的核酸の増幅を抑制するための方法および組成物を提供する。本方法および組成物は、例えば、野生型アレルの集団間で稀なアレルを検出するのに有用である。
2016524917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸および偽標的核酸のプールを、（ａ）プライミングドメインに連結された特異性ドメインおよび（ｂ）競合性ドメインを含む操作されたプライマーであって、前記特異性ドメインは、前記標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合し、前記プライミングドメインは、前記特異性ドメイン結合部位の下流にある前記標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合し、かつ前記競合性ドメインは、特異性ドメインに相補的であるか、部分的に相補的であるか、同一であるか、または類似する、前記操作されたプライマーと、接触させることと、
前記操作されたプライマーを、その３’末端で、前記標的核酸から前記操作されたプライマーの前記特異性ドメインを置換するポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させることと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｂｓｍポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｃｓａポリメラーゼ、または９６−７ポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記操作されたプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および／またはモルフォリノを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記特異性ドメインおよび前記プライミングドメインは、５’−３’連結を介して相互に連結されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記特異性ドメインおよび前記プライミングドメインは、５’−５’連結を介して相互に連結されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記特異性ドメインの３’末端が、ブロッキング部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーは、前記特異性ドメインと前記プライミングドメインとの間に伸長不可能なヌクレオチドが位置する、連続した配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記伸長不可能なヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記天然に存在しないヌクレオチドは、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、デオキシウリジン、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシグアノシン、または３’−デオキシシチジンである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記特異性ドメインおよび前記プライミングドメインは、化学的リンカーを介して連結されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学的リンカーは、ポリエチレングリコール、アルキルスペーサー、ＰＮＡ、またはＬＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
前記特異性ドメインおよび前記プライミングドメインは、相互に化学的にコンジュゲートしている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記特異性ドメインおよび前記プライミングドメインは、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加によって相互に化学的にコンジュゲートしている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記特異性ドメインおよび前記プライミングドメインは、一本鎖オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、または相互のハイブリダイゼーションにより、相互に連結されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライミングドメインは、前記特異性ドメインよりも短い、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記特異性ドメインは、ヘアピン構造を形成する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記特異性ドメインは、部分的に二本鎖である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸は、一本鎖である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸は、単一コピーまたは低コピーで存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸は、その野生型の対応物の核酸に比べて少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記操作されたプライマーに結合した前記核酸を増幅することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記操作されたプライマーに結合した前記核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸および偽標的核酸のプールを、
（ａ）前記標的核酸に結合する無差別プライマー、ならびに
（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖の核酸であって、第１および第２の核酸鎖は、
（ｉ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、
（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および
（ｉｉｉ）前記第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメイン、で構成されており、前記二本鎖偽標的非特異性ドメインは、前記偽標的核酸に結合している前記一本鎖偽標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、前記第１の核酸鎖の３’末端および前記第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である、部分的に二本鎖の核酸と、接触させることと、
（ａ）の前記無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させることと
を含む、方法。
【請求項２７】
前記第１の核酸鎖および／または前記第２の核酸鎖は、その３’末端に伸長不可能なヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記伸長不可能なヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記天然に存在しないヌクレオチドは、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、またはデオキシウリジンである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）の前記無差別プライマーは、長さが約４〜３５ヌクレオチドである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
（ｂ）の前記二本鎖偽標的非特異性ドメインは、長さが約４〜２１ヌクレオチドである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
（ｂ）の前記一本鎖偽標的特異性ドメインは、長さが約４〜２０ヌクレオチドである、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１および第２の核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および／またはモルフォリノを含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的核酸は、単一コピーまたは低コピーで存在する、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的核酸は、野生型の対応物に比べて少なくとも１つの変異を含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的核酸は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）の前記操作された一本鎖プライマーが結合した前記標的核酸を増幅することをさらに含む、請求項２６〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）の前記操作された一本鎖プライマーが結合した前記標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）プライミングドメインに連結された特異性ドメインおよび（ｂ）競合性ドメインを含む操作されたプライマーであって、前記特異性ドメインは、前記標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合し、前記プライミングドメインは、前記特異性ドメイン結合部位の下流にある前記標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合し、かつ前記競合性ドメインは、前記特異性ドメインに相補的であるか、部分的に相補的であるか、同一であるか、または類似する、前記操作されたプライマー
を含む、組成物。
【請求項４０】
プライミングドメインと、第１のシグナル調節部分が付着した第１のハイブリダイゼーションドメインとを含む第１の核酸鎖、および
特異性ドメインと、前記第１のハイブリダイゼーションドメインに相補的であり、シグナル産生部分が付着した第２のハイブリダイゼーションドメインと、を含む第２の核酸鎖であって、前記シグナル産生部分と前記特異性ドメインとの間に位置する第２のシグナル調節部分を含む、第２の核酸鎖
を含む、組成物。
【請求項４１】
前記特異性ドメインに相補的であるか、部分的に相補的であるか、同一であるか、または類似する競合性ドメインを含む核酸鎖をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記シグナル産生部分は、フルオロフォアである、請求項４０または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第１および／または第２のシグナル調節部分は、クエンチャーである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記シグナル産生部分および前記第２のシグナル調節部分は、少なくとも１つのホスホジエステル結合によって分離されている、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
標的核酸および偽標的核酸のプールを、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１３年７月１８日出願の米国仮出願第６１／８５６，０２８号の利益を主張する。
政府の支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって付与された認可番号第１ＤＰ２ＯＤ００７２９２−０１号に基づき政府の支援でなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本開示の態様および実施形態は、核酸技術の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の増幅は、殆どの核酸ベースの検出アッセイにおいて不可欠な工程である。核酸バイオマーカーの正確な検出は、標的核酸に類似の配列を有する、圧倒的に過剰な（通常１０倍から１００００００倍）非標的核酸の存在下で、標的核酸を増幅する能力に頼ることがしばしばある。ある場合には、非標的核酸は、標的核酸と１ヌクレオチド（または１ヌクレオチド塩基対）程度の差しかない。このように稀な核酸を濃縮および検出する方法はそれぞれ、稀なアレル（rare-allele）の濃縮および稀なアレルの検出としばしば呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は概ね、核酸増幅の選択性を改善するための組成物および方法に対する。実際の一部の用途では、豊富な（例えば、野生型の）核酸と異なる、稀な（例えば、変異の）核酸を選択的に増幅するのが有利な場合がある。非限定的な一例として、腫瘍細胞から（例えば、循環血液中に）放出される循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出がある。循環腫瘍ＤＮＡは、正常細胞から放出される同じ遺伝子座の正常細胞非含有ＤＮＡと、腫瘍特異的変異が存在する点で異なっている可能性がある。ｃｔＤＮＡを有する対象から得た血液（例えば、血清または血漿）試料は、ｃｔＤＮＡおよび圧倒的に過剰の同じ遺伝子座の野生型細胞非含有ＤＮＡを含んでいる。癌の初期では、血漿１ｍＬは通常、健常細胞からの断片化ゲノムを１０００から１００００コピー含んでいるが、癌細胞からの断片化したゲノムはおそらく１０コピー未満程度しか含まない。ｃｔＤＮＡの同定は、ｃｔＤＮＡを選択的に増幅し、および／または野生型細胞非含有ＤＮＡの増幅を抑制することによって助けることができる。よって、本開示は、様々な態様および実施形態において、対象の稀なアレルを選択的に増幅し、および／または豊富な（例えば、野生型の）アレルの増幅を抑制する方法を提供する。「稀な」および「豊富な」という語は、試料中の、特定の配列の核酸の相対的存在量を意味する。
【０００６】
本開示は、一部には、（例えば、少なくとも１つの）標的核酸（例えば、稀なアレルおよび／もしくは変異アレル）の増幅を増強し、ならびに／または標的核酸に類似の配列を有する非標的核酸（例えば、野生型アレル）の増幅を抑制する特異的な結合ドメインを含むように操作された核酸（例えば、長さ１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド）を提供する。本明細書で用いる、核酸の「ドメイン」は、規定された長さの連続する一続きの核酸塩基認識部分である。いくつかの実施形態において、核酸の「領域」または「ドメイン」は、あらゆる長さの連続する一続きのヌクレオチドである。「核酸塩基認識部分」という語は、制限なく、ヌクレオチド（例えば、天然に存在する、もしくは修飾されている）、修飾されているアミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のモノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）のモノマー、およびモルフォリノのモノマーを含む部分を包含するものとされることを理解されたい。「モノマー」は、ポリマーの単一の単位を意味する。例えば、ヌクレオチドはポリヌクレオチド（例えば、核酸）のモノマーであり、アミノ酸はポリペプチド（例えば、タンパク質）のモノマーである。「ヌクレオチド」は、いくつかの実施形態において、別の核酸塩基認識部分と置き換えることができることを理解されたい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物を用いて、過剰の豊富な（例えば、野生型）アレル間に存在する、（例えば、少なくとも１つの）稀な（例えば、変異）アレルを選択的に増幅してもよい。よって、稀なアレルと、例えば、単一のヌクレオチド（または、変異、挿入、または欠失の形態におけるヌクレオチド塩基対）のみ異なる豊富なアレルを、本明細書において「偽標的」アレルと呼ぶ。簡潔かつ明確に、標的核酸および偽標的核酸を本明細書でアレルと呼ぶことがあるが、本明細書に提供する方法および組成物を用いて、あらゆる核酸を増幅することができ、遺伝子のアレルに限定されないことを理解されたい。
【０００８】
いくつかの実施形態において、稀な標的アレルの偏った増幅は、稀な標的アレル（例えば、変異アレル）を、増幅を増強するプライマーとして集合的に機能する１セットの核酸を操作することによって実現される。例えば、いくつかの実施形態において、稀な標的アレルの偏った増幅は、（ａ）例えば稀な標的アレルにおける多型を有する領域などに相補的であり、結合する、特異性ドメイン（例えば、５’特異性ドメイン）および（ｂ）稀な標的アレルにおける多型に対して下流に（例えば、３’方向において）結合するプライミングドメイン（例えば、３’プライミングドメイン）（図１Ａ）である、少なくとも２つのドメインを有するプライマー（例えば、一本鎖プライマー）を操作することにより実現され得る。前述のプライマーを、本明細書では「ｓｓプライマー」と呼ぶ。いくつかの実施形態において、ｓｓプライマーは、特異性ドメインに相補的であり、または部分的に相補的であり、同一であり、または類似する競合性ドメインをさらに含む（図５、「トーホールド交換」のプライマーを示す下パネル）。よって、「ｓｓプライマー」という語は、一本鎖核酸、部分的に二本鎖のプライマー（例えば、長さの異なる２本の一本鎖核酸の塩基対形成によって形成される）、および核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の集合を包含し、これらのうちいくつかは相互に結合または連結されていないことが意図されることを理解されたい。
【０００９】
稀な標的アレルに結合するように設計されているｓｓプライマーが、稀な標的アレル（例えば、変異アレル）に接触する場合、特異性ドメインおよびプライミングドメイン両方の結合が好都合である。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）が存在する場合、プライミングドメインの３’末端は稀な標的アレルの鎖の長さに沿って伸長し、ｓｓプライマーの特異性ドメインは、いくつかの可能なメカニズムの１つまたは複数によって置換される。例えば、特異性ドメインは、伸長性のポリメラーゼによって（例えば、ポリメラーゼに鎖置換活性がある場合）、伸長性のポリメラーゼによる部分的な、または完全な分解によって（例えば、ポリメラーゼに５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性がある場合）、自発的解離によって（例えば、反応温度を、稀な標的アレルの鎖に対する特異性ドメインの結合により形成される二重鎖の融解温度に同様もしくはそれを超えた温度に維持もしくは上昇させる場合）、または前述のメカニズムの組合せによって置換され得る。特異性ドメインの置換のメカニズムは、例えば、ｓｓプライマーの設計（例えば、一本鎖対部分的に二本鎖）、およびＤＮＡポリメラーゼの活性（例えば、鎖置換活性対エキソヌクレアーゼ活性）に依存することを理解されたい。よって、伸長した（例えば、増幅された）生成物は、稀な標的アレルに存在する変異（例えば、多型）を含んでいる。
【００１０】
対照的に、ｓｓプライマーが偽標的アレル（例えば、野生型アレル）に接触する場合、特異性ドメインおよびプライミングドメインの結合は好都合ではなく、偽標的アレルが増幅される可能性は低い。
【００１１】
プライミングドメインの長さは、特異性ドメインの長さと異なってよい。例えば、プライミングドメインは特異性ドメインよりも短くてもよい。いくつかの実施形態において、プライミングドメインと特異性ドメインとの間の長さにおける違いは、約２から約３０、約５から約２０、または約１０から約２０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、プライミングドメインと特異性ドメインとの間の長さにおける違いは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはこれを超えるヌクレオチドである。よって、プライミングドメインは、特異性ドメインよりも約２から約３０、約５から約２０、または約１０から約２０ヌクレオチド短くてもよい。いくつかの実施形態において、プライミングドメインの長さは、特異性ドメインよりも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはこれを超えるヌクレオチド短い。
【００１２】
本開示のプライマーの一例を図１Ａおよび２Ａに示す。図２Ａは、３’プライミングドメインを含む一本鎖核酸に直接的または間接的に（例えば、灰色バーで示すリンカーを介して）連結されている、５’特異性ドメインを含む一本鎖核酸を示す。特異性ドメインを含む一本鎖核酸は、プライミングドメインを含む一本鎖核酸に、共有結合または非共有結合していてもよい。図２Ａの例に示す通り、プライマーは、稀な標的アレルの鎖に、点変異などを有するその特異性ドメインによって、および点変異を含む領域の下流（３’方向の）の稀な標的アレルの鎖に結合する、そのプライミングドメインによって結合するように設計される。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で、プライミングドメインは伸長し、特異性結合ドメインは置換される。
【００１３】
本開示のプライマーの別の一例を図１Ｂおよび２Ｂに示す。図１Ｂ、上パネルは、一本鎖核酸競合ドメイン（ＣＤ）、およびプライミングドメイン（ＰＤ）を含む一本鎖核酸に直接的または間接的に（例えば、リンカーを介して）連結されている特異性ドメイン（ＳＤ）を含む一本鎖核酸を示す。ＳＤを含む一本鎖核酸は、ＰＤを含む一本鎖核酸に、共有結合または非共有結合していてもよい。図１Ｂ、下パネルの例に示す通り、プライマーは、特異性ドメイン結合部位（ＳＢＳ）、およびＳＢＳの下流（３’方向の）に位置するプライマー結合部位（ＰＢＳ）を有する稀な標的アレルの鎖に結合するように設計される。ＳＤは、稀な標的アレルの鎖上のＳＢＳに相補的であり、結合するように設計され、ＰＤは、稀な標的アレルの同じ鎖上のＰＢＳに相補的であり、結合するように設計される。ＣＤは、ＳＤに相補的であり、部分的に相補的であり、同一であり（すなわち、１００％同一性）、または類似する（すなわち、１００％未満の同一性、または９９％未満、９８％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、もしくは７５％未満の同一性）ように設計される。特異性ドメインに相補的であり、または部分的に相補的である競合性ドメインは、特異性ドメインに結合する。特異性ドメインに同一であり、または類似する競合性ドメインは、核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合する。
【００１４】
よって、本発明の様々な態様および実施形態は、標的核酸および偽標的核酸のプールを、プライミングドメイン（例えば、短い３’プライミングドメイン）に連結された特異性ドメイン（例えば、５’特異性ドメイン）を含む操作されたプライマー（例えば、一本鎖プライマー）であって、特異性ドメインは、標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合し、プライミングドメインは、特異性ドメイン結合部位の下流にある標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合する、操作されたプライマーと接触させる工程と、プライミングドメインをその３’末端で、ポリメラーゼ（例えば、標的核酸から操作されたプライマーの特異性ドメインを置換するポリメラーゼ）の存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーは、特異性ドメインに相補的であるか、部分的に相補的であるか、同一であるか、または類似する競合性ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、競合性ドメインは、特異性ドメインに結合する（例えば、少なくとも一部分に結合する）。いくつかの実施形態において、競合性ドメインは特異性ドメインと競合する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｂｓｍポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｃｓａポリメラーゼ、または９６−７ポリメラーゼ）である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは逆転写酵素である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＲＮアーゼＨ活性のない逆転写酵素である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、修飾されているＲＮＡ（例えば、２’−フルオロおよび／または２’−Ｏ−メチルリボースを有するもの）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および／またはモルフォリノを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、プライマー（例えば、特異性ドメインおよびプライミングドメインを含む）は、特異性ドメインとプライミングドメインとの間に（例えば、少なくとも１つの）伸長不可能なヌクレオチドが位置する連続した配列である。本明細書で用いる「伸長不可能なヌクレオチド」は、核酸の重合をブロックする（例えば、ポリメラーゼのリードスルーをブロックする）ヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、伸長不可能なヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド、またはジデオキシヌクレオチド（例えば、２’，３’ジデオキシヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＣＴＰ）である。いくつかの実施形態において、天然に存在しないヌクレオチドは、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、デオキシウリジン、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシシチジン、および／または逆方向に挿入された他の天然に存在するヌクレオチドである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメインは、リンカーまたは連結と呼ばれる化学的部分を介して相互に連結されている。いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメインは、５’−３’連結を介して相互に連結されている。いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメインは、５’−５’連結を介して相互に連結されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、特異性ドメインの５’末端に付着している。いくつかの実施形態において、リンカーは、特異性ドメインの３’末端に付着している。いくつかの実施形態において、リンカーは、特異性ドメインの中央領域に付着している（例えば、コンジュゲーションハンドルで修飾されている核酸塩基によって）。ドメインの中央領域は、ドメインの３’または５’末端ではないあらゆる領域である。いくつかの実施形態において、リンカーは、付加的な機能的部分または非機能的部分に付着し、これが今度は特異性ドメインの５’末端、３’末端、または中央領域に付着している。他のリンカー配置が本明細書に企図される。いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメインは、ポリエチレングリコール連結、アルキルスペーサー、ＰＮＡ連結、またはＬＮＡ連結を介して相互に連結されている。
【００１９】
いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメインは化学的にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメインは、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加、またはアミン、カルボキシル、スルフヒドリル、もしくはカルボニル基に関与する他のコンジュゲーション反応、または前述の反応のあらゆる２つ以上の組合せによって化学的にコンジュゲートしている。
【００２０】
いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよびプライミングドメイン（または特異性ドメインを含む核酸およびプライミングドメインを含む核酸）は、共通のオリゴヌクレオチドもしくは共通の多量体オリゴヌクレオチド複合体へのハイブリダイゼーションによって、または相互のハイブリダイゼーションによって、相互に連結されている。
【００２１】
いくつかの実施形態において、特異性ドメインを操作してヘアピン構造を形成させる。いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよび競合性ドメインを連結（例えば、共有結合）してヘアピン構造を形成させる。いくつかの実施形態において、特異性ドメインは部分的に二本鎖である（例えば、本明細書に提供する競合性ドメインに結合している）。いくつかの実施形態において、特異性ドメインおよび競合性ドメインは、相互に、または共通の分子もしくは分子複合体と相互作用することができる部分に連結されている。いくつかの実施形態において、部分は核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド内のドメイン）である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、特異性ドメインの３’末端はブロッキング部分を含む。いくつかの実施形態において、ブロッキング部分は、特異性ドメインの３’末端が伸長するのを、および／または３’末端が核酸修飾酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼもしくはエキソヌクレアーゼ）によって分解されるのを妨げる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、標的核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一コピーまたは低コピーで存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、野生型の対応物の核酸に比べて少なくとも１つの変異（例えば、点変異、欠失、または挿入）を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、方法は、操作されたプライマーが結合している核酸を増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーが結合している核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、方法は、操作されたプライマーによって認識される核酸を増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーによって認識される核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーによって認識される核酸を、等温増幅反応によって増幅する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたプライマー（例えば、ｓｓプライマー）、標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたプライマー（例えば、ｓｓプライマー）、標的核酸、および偽標的核酸を含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたプライマー（例えば、ｓｓプライマー）、標的核酸、偽標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、複数の操作されたプライマー（例えば、ｓｓプライマー）を含む組成物を本明細書に提供する。複数の操作されたプライマーは、複数の不均一な（例えば、異なるプライマーの混合の集団）または均一な（例えば、同じプライマーの集団）、操作されたプライマーを意味すると理解されたい。いくつかの実施形態において、プライミングドメイン、および特異性ドメイン、および任意選択により競合性ドメインを含む、操作されたプライマーを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、競合性ドメインは、特異性ドメインに相補的であり、または部分的に相補的である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、稀な標的アレルの偏った増幅は、豊富な偽標的アレル（例えば、野生型アレル）の増幅をブロックするように集合的に機能する１セットの核酸を操作することにより実現される。いくつかの実施形態において、稀な標的アレルの偏った増幅は、（ａ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、（ｂ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および（ｃ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成された第１および第２の核酸鎖を有する、標的特異性が増強された熱力学的な部分的に二本鎖の核酸を操作することにより実現され、ここで二本鎖偽標的非特異性ドメインは、偽標的核酸に結合している一本鎖偽標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である。相互に、共通の分子と、または共通の分子複合体と相互作用する、２つの核酸または非核酸部分を含む、二本鎖偽標的非特異性ドメインの変形および機能的アナログが本明細書に企図される。本発明の前述の部分的に二本鎖の核酸を、本明細書で「ｄｓブロッカー」と呼ぶ。
【００２８】
いくつかの実施形態において、稀な標的アレルの偏った増幅は、（ａ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、（ｂ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および（ｃ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成された第１および第２の核酸鎖を有する、標的特異性が増強された熱力学的な部分的に二本鎖の核酸を操作することにより実現され、ここで二本鎖偽標的非特異性ドメインの解離定数は、部分的に二本鎖の核酸を用いようとする条件下で１０ｍＭ以下である。いくつかの実施形態において、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である。相互に、共通の分子と、または共通の分子複合体と相互作用する２つの核酸または非核酸部分を含む、二本鎖偽標的非特異性ドメインの変形および機能的アナログが本明細書に企図される。
【００２９】
偽標的アレル（例えば、野生型アレル）に結合するように設計されたｄｓブロッカーが偽標的アレルに接触する場合、偽標的アレルの鎖は、ｄｓブロッカーの第２の核酸鎖を置換し、ｄｓブロッカーの第１の核酸鎖（すなわち、一本鎖偽標的特異性ドメインを含む鎖）に結合し、偽標的アレルの増幅はブロックされる。対照的に、ｄｓブロッカーが稀な標的アレルの鎖（ｄｓブロッカーの第１の鎖に相補的ではない）に接触する場合、ｄｓブロッカーの第１の核酸鎖の、ｄｓブロッカーの第２の核酸鎖に対する結合は、稀な標的アレルに対するｄｓブロッカーの第１の核酸鎖の結合よりも好都合である。これは、ｄｓブロッカーの第１の核酸鎖と稀な標的アレルの鎖との間の単一のヌクレオチドの変化が、核酸二重鎖（例えば、二本鎖核酸）を不安定化し得るからである。本開示のｄｓブロッカーを、標的核酸および偽標的核酸の両方に結合する（例えば、稀な標的アレルにおける多型の下流の）汎用フォワードプライマーと組み合わせて増幅反応において用いる場合、ｄｓブロッカーは偽標的核酸に優先的に結合し（例えば、汎用プライマーの下流）、汎用プライマーの伸長をブロックする。ｄｓブロッカーがないままの標的核酸上では、汎用フォワードプライマーが結合し、伸長し、よって標的アレルが優先的に増幅される。
【００３０】
よって、本開示の様々な他の態様および実施形態は、標的核酸および偽標的核酸のプールを、（ａ）無差別プライマー（nondiscriminatory primer）（例えば、標的核酸および偽標的核酸に結合することができる）、ならびに（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖の核酸であって、第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および（ｉｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成されており、二本鎖偽標的非特異性ドメインは、偽標的核酸に結合している一本鎖偽標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である、部分的に二本鎖の核酸と接触させる工程と、（ａ）の無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で、標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む方法を提供する。本明細書で用いる「無差別プライマー」は、標的核酸および偽標的核酸の両方に結合する、「伝統的な」一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する（例えば、長さ約４から約３５、約１０から約３０、もしくは約１５から約２５ヌクレオチド、またはそれより長い）。この一本鎖プライマーは、標的核酸と偽標的核酸との間を差別しないのが典型的である。ポリメラーゼの存在下で標的核酸に結合する場合、無差別プライマーは標的に相補的な方式で伸長する。対照的に、偽標的核酸にポリメラーゼの存在下で結合する場合、無差別プライマーはｄｓブロッカーのブロッキング鎖の存在によってブロックされる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本開示は、標的核酸および偽標的核酸のプールを、（ａ）無差別プライマー（例えば、標的核酸および偽標的核酸に結合することができる）、ならびに（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖の核酸であって、第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および（ｉｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成されており、二本鎖偽標的非特異性ドメインの解離定数は、部分的に二本鎖の核酸を用いようとする条件下で１０ｍＭ以下である、部分的に二本鎖の核酸と接触させる工程と、（ａ）の無差別プライマーのその３’末端を、ポリメラーゼの存在下で、標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、第１の核酸鎖および／または第２の核酸鎖は、その３’末端に伸長不可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、伸長不可能なヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、天然に存在しないヌクレオチドは、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、デオキシウリジン、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシシチジン、および／または逆方向に挿入された他の天然に存在するヌクレオチドである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、（ａ）の無差別プライマーは長さ約４〜３５ヌクレオチドである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、（ｂ）の二本鎖偽標的非特異性ドメインは長さ約４〜１５０（例えば、４〜２１）ヌクレオチドである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、（ｂ）の二本鎖偽標的特異性ドメインは長さ約４〜１５０ヌクレオチドである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、（ｂ）の一本鎖偽標的特異性ドメインは長さ約４〜３０（例えば、４〜２０）ヌクレオチドである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、（２’−フルオロおよび／もしくは２’−Ｏ−メチルリボースなどで）修飾されているＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびに／またはモルフォリノを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、標的核酸は単一コピーまたは低コピーで存在する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、標的核酸は少なくとも１つの変異を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、標的核酸は一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の無差別プライマーが結合している核酸を増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の無差別プライマーが結合している核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、（ａ）の無差別プライマーが結合している核酸を、等温増幅反応によって増幅する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本開示のｄｓブロッカー、標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸、および偽標的核酸を含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸、偽標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸に結合する一本鎖プライマー、標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸に結合する一本鎖プライマー、標的核酸、および偽標的核酸を含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸に結合する一本鎖プライマー、標的核酸、偽標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、複数のｄｓブロッカーを含む組成物を本明細書に提供する。複数のｄｓブロッカーは、複数の不均一な（例えば、異なるプライマーの混合の集団）または均一な（例えば、同じプライマーの集団）ｄｓブロッカーを意味することを理解されたい。
【００４３】
３’プライミングドメインに連結された５’特異性ドメインを含む、操作された一本鎖プライマーに結合した核酸も本明細書に提供し、特異性ドメインは、標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合しており、プライミングドメインは、特異性結合部位の上流にある標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合している。
【００４４】
加えて、本開示は、（ａ）無差別プライマーならびに（ｂ）最初のトーホールド（initial toehold）ドメイン、分岐点移動（branch migration）ドメイン、およびバランシングトーホールド（balancing toehold）ドメインを含むブロッカー鎖に結合した核酸を提供し、この場合、または任意選択により、ブロッカー鎖の３’末端は伸長不可能である。
【００４５】
本開示は、多数の核酸増幅生成物を検出する組成物および方法も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、（１）標的配列によって制限されず、シグナル産生部分に付着している配列を有する第１のドメイン、（２）標的に相補的であり、または部分的に相補的であり、シグナル産生部分によって産生されるシグナルに影響を及ぼし得る第１のシグナル調節部分に付着している第２のドメイン、および（３）第１のドメインに相補的であり、または部分的に相補的であり、シグナル産生部分によって産生されるシグナルに影響を及ぼし得る第２のシグナル調節部分に付着している第３のドメインを含む１セットの分子を含み、シグナル産生部分および第１のシグナル調節部分は、少なくとも１つのホスホジエステル結合によって分離されている。前述のセットの分子を、本明細書では「温度バーコード化加水分解プローブ（Temperature Barcoded Hydrolysis Probe）」または「ＴＢＨＰ」と呼ぶ。
【００４６】
本開示の様々な態様および実施形態は、複数の標的核酸を複数のＴＢＨＰと接触させる方法を提供するものである。いくつかの実施形態において、方法は、複数の標的核酸を複数のＴＢＨＰと、ヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素の存在下で接触させる工程をさらに含む。
【００４７】
図は、本明細書に論じる多様な概念を全般的に説明すること配置する代わりに、必ずしも基準化し（scale）、強調するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】本開示のｓｓプライマーの例を示す図である。
【図１Ｂ】本開示のｓｓプライマーの例を示す図である
【図２Ａ】フォワードプライマーとしてｓｓプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアレル濃縮の概略を示す図である。
【図２Ｂ】フォワードプライマーとしてｓｓプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアレル濃縮の概略を示す図である。
【図２Ｃ】フォワードプライマーとしてｓｓプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアレル濃縮の概略を示す図である。
【図３】その３’末端に伸長不可能な部分を有する本開示のｓｓプライマーの一例を示す図である。
【図４Ａ】プライミングドメインと特異性ドメインとの間に様々なリンカーの１つを有する、本開示のｓｓプライマーのいくつかの例を示す図である。
【図４Ｂ】プライミングドメインと特異性ドメインとの間に様々なリンカーの１つを有する、本開示のｓｓプライマーのいくつかの例を示す図である。非共有結合性リンカーの例を示す図である。
【図４Ｃ】プライミングドメインと特異性ドメインとの間に様々なリンカーの１つを有する、本開示のｓｓプライマーのいくつかの例を示す図である。連結の立体配置の例を示す図である。
【図５】競合性ドメインを含む、「トーホールド交換」ドメインを含めた、様々な特異性ドメインの１つを有する、本発明のｓｓプライマーのいくつかの実施形態を示す図である。
【図６Ａ】本開示のｄｓブロッカーの例を示す図である。
【図６Ｂ】本開示のｄｓブロッカーの例を示す図である。
【図７】本発明のｄｓブロッカーを用いたＰＣＲ増幅を示す図である。
【図８】野生型ブロッキングＰＣＲ（左）およびｄｓブロッカーＰＣＲ（右）の選択性の理論上の上界を実証するグラフを示す図である。３５サイクル後の増幅倍率を、変異の（細実線）および野生型鋳型（細点線）の両方に対するアニーリング温度の関数としてプロットした。アニーリング温度に対する増幅の選択性を太線で示す。
【図９】ｓｓプライマーＰＣＲの実現可能性を実証する、アガロース電気泳動ゲルの画像を示す図である。レーン１：低分子量ラダー（New England Biolabs、Ipswich、MA）。レーン２から５：ｓｓプライマー（すなわち、プライミングドメイン＋リンカー＋特異性ドメイン）をフォワードプライマーとして用いたＰＣＲ反応。レーン６から９：「プライミングドメイン＋リンカー」（特異性ドメインなし）をフォワードプライマーとして用いたＰＣＲ反応。プラスミドを鋳型として用いた。
【図１０】ｐＷＴよりもｐＭｕｔの優先的な増幅を実証するグラフを示す図である。左：標準曲線。右：増幅の動力学。
【図１１】ｄｓブロッカーベースの配列特異的増幅のリアルタイムモニタリングのグラフを示す図である。
【図１２】ＰＣＲ反応においてｄｓブロッカーありまたはなしの、配列決定したＰＣＲ生成物のクロマトグラムを示す図である。
【図１３】温度バーコード化シグナル産生性ｓｓプライマーの一例を示す図である。
【図１４Ａ】温度バーコード化加水分解プローブ（ＴＢＨＰ）の一例を示す図である。
【図１４Ｂ】温度バーコード化加水分解プローブ（ＴＢＨＰ）の一例を示す図である。
【図１４Ｃ】温度バーコード化加水分解プローブ（ＴＢＨＰ）の一例を示す図である。
【図１５】ｓｓプライマーの性能を示す図である。
【図１６Ａ】ｄｓブロッカーを高忠実度ＤＮＡポリメラーゼと用いた場合の性能を示す図である。
【図１６Ｂ】ｄｓブロッカーを高忠実度ＤＮＡポリメラーゼと用いた場合の性能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
核酸増幅は、殆どの核酸検出アッセイにおいて不可欠な工程である。多くの場合、核酸バイオマーカーの正確な検出は、例えば、標的核酸に類似の配列を有する過剰な非標的核酸の存在下で、真の標的を増幅する能力に頼る。上記に論じた通り、本発明の多くの態様を用いて、過剰な野生型のアレルの間に存在する稀なアレルおよび／または変異アレルを、選択的に増幅および／または検出することができる。よって、豊富な非標的（例えば、野生型の）アレルを、本明細書では偽標的アレル／核酸と呼び、稀なアレルおよび／または変異アレルを本明細書では標的のアレル／核酸と呼ぶ。さらに、簡潔かつ明確に、対象の標的核酸を、本明細書では標的アレルと呼ぶことがあるが、本発明を用いて、対象のあらゆる核酸を増幅することができ、遺伝子／アレルに限定されないことを理解されたい。
【００５０】
多型（例えば、変異）などを検出するための典型的な増幅反応は、変異を含む稀な標的鎖上の領域に相補的であるプライマー（例えば、一本鎖プライマーまたは部分的に二本鎖のプライマー）を使用する（Newton, C.R. et al. Nucleic Acids Res., 17(7):2503-16, Apr 1989; Cha, R.S. et al. PCR Methods Appl., 2(1): 14-20, Aug 1992）。よって、プライマーは、多型（例えば、変異）を有する領域に優先的に結合し、ＤＮＡポリメラーゼは、その意図する標的に結合しているプライマーを伸長する。しかし、ある場合には、プライマーは、野生型アレルの鎖（すなわち、偽標的アレルの鎖）などの意図しない核酸に結合し、次いでＤＮＡポリメラーゼは野生型の鎖に結合しているプライマーを伸長し、その結果、稀な標的アレルの多型を含む伸長生成物がもたらされる（プライマーは稀な標的アレルの多型を含んでいるため）。よって、伸長生成物が増幅され、配列決定され、および／または多型を含む稀な標的アレルを代表するものとして同定され、この場合、実際にアレルは野生型アレルである。増幅された生成物が存在すると、稀な標的アレルが最初に存在したと誤って指摘される。このようにして、しばしば偽陽性の結果が得られる。
【００５１】
本明細書で用いる「増幅倍率」は、核酸増幅生成物の、最初の鋳型核酸に対する比を意味する。
【００５２】
【数１】
2016524917.tif 000003
【００５３】
本明細書で用いる「選択性」は、標的配列の増幅倍率の、偽標的配列の増幅倍率に対する比を意味する。
【００５４】
【数２】
2016524917.tif 000004
【００５５】
本開示の様々な態様および実施形態は、核酸ハイブリダイゼーションの熱力学的パラメータ（例えば、ΔＧ、ΔＨ、ΔＳ、および融点）、ならびに最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造、ならびに核酸分子または核酸複合体の分配関数の予測または推定を必要とする。いくつかの確立された計算上のフレームワーク、アルゴリズム、およびデータベース（SantaLucia, J., et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 33:415-440, 2004; Dirks, R.M., et al. SIAM Rev, 49(l):65-88, 2007）を用いてこれらの課題を実現することができる。いくつかの公的に入手できるソフトウエアプログラム（例えば、ＨｙＴｈｅｒ、Ｍｆｏｌｄ、ＵＮＡｆｏｌｄ、およびＮＵＰＡＣＫ）は、プロセスを促進することができる。
ｓｓプライマーおよびｓｓプライマー核酸増幅
本開示のいくつかの態様において、偽陽性の結果の問題は、一本鎖プライマーおよび増幅方法を用いて対処される。本明細書で用いる、本発明の「ｓｓプライマー」は、短いプライミングドメイン（例えば、３’プライミングドメイン）に連結された特異性ドメイン（例えば、５’特異性ドメイン）を有する、操作された一本鎖プライマーを意味する（図１）。いくつかの実施形態において、ｓｓプライマーは、特異性ドメイン（ＳＤ）、プライミングドメイン（ＰＤ）、および２つのドメインを相互に接続するリンカーを含む（図１、左）。ＳＤに相補的である核酸上の領域を、本明細書において「ＳＤ結合部位」または「ＳＢＳ」と呼ぶ。同様に、ＰＤに相補的である核酸上の領域を、本明細書において「ＰＤ結合部位」または「ＰＢＳ」と呼ぶ。ｓｓプライマーは、５’ＳＤの上流の標的アレルに結合する３’ＰＤを有するように操作され、それによって偽結び目（pseudo-knotted）構造を形成する（図１、右）。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｖｅｎｔポリメラーゼ）が存在する場合、ＰＤの３’末端は標的アレルに沿って伸長することができ、ＳＤは置換される。ある場合には、ＰＤの位置は、ＳＤに対して、および伸長した相補鎖に対して記載され得ることを理解されたい。よって、ＳＤの「上流」と記載されるＰＤは、ポリメラーゼの存在下でプライミングドメインが５’から３’の方向に伸長する場合、新たに形成した伸長がＳＤを置き換えることができるように位置付けられる。ある場合には、ＰＤの位置は、標的鎖上のＳＤ結合部位に対して記述され得る。よって、ＳＤ結合部位の「下流」と記載されるＰＤは、ポリメラーゼの存在下でプライミングドメインが５’から３’の方向に伸長する場合、新たに形成した伸長がＳＤを置き換えることができるように位置付けられる。特異性ドメインに対する結合部位は、プライミングドメインに対する結合部位の上流にある。よって、図１Ｂなどに示す通り、プライミングドメインは特異性ドメインの下流に結合する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ｓｓプライマーは、競合性ドメイン（ＣＤ）をさらに含む。よって、いくつかの実施形態において、本開示のプライマーは、（ａ）例えば稀な標的鎖に多型を有する領域などに結合する特異性ドメイン（ＳＤ）、（ｂ）多型を有する領域の下流（例えば、３’方向における）の標的鎖に結合するプライミングドメイン（ＰＤ）、および（ｃ）その配列がＳＤに相補的であるか、部分的に相補的であるか、同一であるか、または類似する競合性ドメイン（ＣＤ）の少なくとも３つのドメインを含む１セットの核酸を含み、プライミングドメイン（ＰＤ）は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し得る３’末端を含み、ＳＤおよびＰＤは、共有結合性または非共有結合性の相互作用（複数可）によって直接的または間接的に接続される。
【００５７】
図において、黒丸は核酸鎖の５’末端を表し、矢印は核酸鎖の３’末端を表す。標的鎖に結合するように設計されたｓｓプライマーが標的鎖と接触する場合、ＳＤおよびＰＤ両方の結合が好都合である。ＤＮＡポリメラーゼが存在する場合、ＰＤの３’末端が標的鎖の長さに沿って伸長し、ｓｓプライマーのＳＤは、制限なく、伸長性のポリメラーゼによる置換（例えば、ポリメラーゼに鎖置換活性がある場合）、伸長性のポリメラーゼによる部分的もしくは完全な分解（例えば、ポリメラーゼに５’から３’エキソヌクレアーゼ活性がある場合）、自然解離（spontaneous dissociation）（例えば、反応温度が、ＳＢＳおよびＳＤによって形成される二重鎖の融点同様もしくは融点より高い温度に保持され、もしくは温度を超えて上昇した場合）、または前述のメカニズムの組合せを含めたいくつかの可能なメカニズムによって置換される。よって、伸長された生成物は、標的アレルに存在する多型（例えば、変異）のバージョンを含んでいる。
【００５８】
本発明の増幅反応は、いくつかの実施形態においてｓｓプライマーを使用し、対象の稀な標的アレルを選択的に増幅する一方で偽標的アレルの増幅を抑制し、偽標的アレルは、ある場合には野生型アレルであり得る（図２）。ｓｓプライマーのＳＤは、例えば、稀な標的アレルの鎖における対象の多型に相補的である多型を含み、よって、核酸鎖における相補的な多型を「調べ」、相補的な多型を含む稀な標的アレルの鎖の領域に優先的に結合する。ＰＤは、ＳＤ結合部位の下流の稀な標的アレルの鎖にも結合し、ＰＤが伸長する場合、伸長した領域は、稀な標的アレルに存在する多型領域を含んでいる（図２Ａ、左）。ＳＤドメインが野生型鎖に結合する場合には、伸長生成物は、標的アレルに存在する多型のバージョンよりむしろ、野生型アレルの配列を含んでいる（図２Ａ、右）。この特徴により、不正確に増幅された野生型アレルが、確実に都合悪く増幅される（例えば、ＰＣＲなどの複数サイクル増幅反応およびいくつかの等温増幅反応の各サイクルにおいて（Craw and Balachandran. Lab Chip., 12(14):2469-86））のが助けられ、複合的な選択性がもたらされる。
【００５９】
本開示は、本明細書に提供するドメインの成分として、本質的にあらゆる配列特異的なＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子の使用を企図するものである（例えば、ＳＤ、ＣＤ、ＩＴ、ＢＴ、およびＢＭ）。例えば、ＳＤは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、修飾されているＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Nielsen, P.E. et al. Science 254 (5037): 1497-50, 1991）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（参照により本明細書に組み込まれる、Satoshi, O., et al. Tetrahedron Lett. 38 (50): 8735-8., 1997; Koshkin, A.A., et al. Tetrahedron 54 (14): 3607-30, 1998）、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合性リボヌクレオタンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合ペプチド、および／またはモルフォリノ（参照により本明細書に組み込まれる、Summerton, J., et al. Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7 (3): 187-95, 1997）を含むことができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＳＤおよびＣＤは、ヘアピン、または部分的に二本鎖のプローブを形成するように操作され得る（参照により本明細書に組み込まれる、Zhang, D.Y. et al. Nat. Chem., 4(3):208-14, Mar. 2012）。
【００６１】
ｓｓプライマーの特異性ドメイン（ＳＤ）は、プライミングドメイン（ＰＤ）より長いのが典型的である。いくつかの実施形態において、ＳＤの長さは約１０から約５０ヌクレオチド、またはそれより長い。例えば、ＳＤの長さは、１０から１５、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、１５から２０、１５から３０、１５から４０、２０から３０、２０から４０、２０から５０、３０から４０、または４０から５０ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、ＳＤの長さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド、またはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態において、ＰＤの長さは、約５から約２０ヌクレオチド、またはそれより長い。例えば、ＰＤの長さは、５から１０、５から１５、１０から１５、または１５から２０ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、ＰＤの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド、またはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤおよびＰＤの長さは、プライマー（例えば、ｓｓプライマー）の核酸に対する結合が、ＰＤよりもむしろＳＤの正確な結合によって制御されるような長さである。
【００６２】
ｓｓプライマードメインの長さ（例えば、ＳＤ、ＰＤ、ＣＤ、および／またはリンカー）の文脈において、「ヌクレオチド」という語は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾されているＲＮＡ、ヌクレオチド類似体、ＬＮＡ、ＰＮＡ、および／またはモルフォリノなど、ＤＮＡ結合分子のあらゆるモノマーを包含することを理解されたい。よって、「Ｘ」ヌクレオチドの長さを有するｓｓプライマードメインは、「Ｘ」ヌクレオチドにおよそ等しいプライマーの長さを意味し得る（例えば、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチド／部分を含んでいてよい）。
【００６３】
ＳＤをＰＤに接続するリンカーは、いくつかの実施形態において、１から約１５ヌクレオチドに等しい長さ、またはそれより長くてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、１から５、１から１０、５から１０、５から１５、または１０から１５ヌクレオチドに等しくても、またはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドに等しくてもよい。
【００６４】
理論に拘泥するわけではないが、ｓｓプライマーのプライミングドメイン（ＰＤ）は、特異性ドメイン（ＳＤ）によってリクルートされる場合、ＳＤドメインなしに比べて、鋳型核酸により容易に結合すると考えられる。本発明のｓｓプライマーがＳＤによって鋳型核酸に結合する場合、ＰＤの鋳型に対する結合は単分子プロセスである。対照的に、ＳＤからの寄与がなければ、ＰＤの鋳型に対する結合は二分子プロセスである。よって、ＳＤが鋳型に結合する場合、ＰＤの局所濃度は、ＰＤの全体濃度（ｓｓプライマーの濃度に等しい）よりも実質的に高い。
【００６５】
ＰＤの局所濃度のオーダーの推定は、単分子プロセスをヘアピン形成に比べることにより得ることができる。例えば、所与の温度Ｔでのヘアピン形成の自由エネルギー変化（ΔＧ°）は、以下の方法におけるいくつかのエントロピーおよびエンタルピーの因子によって支配される：
ΔＧ°＝ΔＨ°塩基スタッキング−Ｔ（ΔＳ°塩基スタッキング＋ΔＳ°ループ形成）  （１）
比較の目的で、ハイブリダイゼーションは、１本の鎖が追跡され、他の鎖の濃度が環境因子として扱われる、偽一分子反応と考えることができる。ハイブリダイゼーションの自由エネルギー変化は、以下の等式を用いて計算することができ：
ΔＧ°＝ΔＨ°塩基スタッキング−Ｔ［ΔＳ°塩基スタッキング＋ΔＳ°開始＋Ｒｌｎ（［相補鎖］／１Ｍ）  （２）
式中、Ｒは気体定数であり、０．００１９８５８７７５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋの値である。
【００６６】
等式（１）および（２）の温度依存性因子を比較すると、ΔＳ°ループ形成は、ΔＳ°開始＋Ｒｌｎ（［相補鎖］／１Ｍ）に等しいことが示される。
【００６７】
したがって、ヘアピンの一方のアームに対して、他方のアーム（相補鎖）の局所濃度は、以下の通り計算することができる：
局所濃度＝ｅ＾（ΔＳ°ループ形成−ΔＳ°開始／Ｒ）  （３）
１０ｎｔ、２０ｎｔ、および３ｎｔのヘアピンループはそれぞれ、−１４．８、−１８．７、および−２０．３ｅ．ｕ．のΔＳループ形成を有する。ΔＳ開始は−５．７ｅ．ｕ．に等しい。等式（３）を用いて、ループ長１０ｎｔ、２０ｎｔ、および３０ｎｔを有するヘアピンにおける他方のアームの局所濃度はそれぞれ、１０ｍＭ、１．５ｍＭ、および０．６５ｍＭと推定される。
【００６８】
ＰＤがおよそ１５ｎｔであり、ＳＤ結合部位とＰＤ結合部位との間のギャップがおよそ１５ｎｔであると、単分子イベントにおけるＰＤの局所濃度は、３０ｎｔのヘアピンループにおける相補的アームの局所濃度と同様であり、または局所濃度より少々低い。すなわち、単分子イベントにおけるＰＤの局所濃度は、中から高マイクロモルレベルでなければならない。対照的に、ＰＤの全体濃度は中ナノモルレベルにすぎない。したがって、局所ＰＤ濃度は、全体ＰＤ濃度よりもおよそ１００倍からおよそ１０００倍高い可能性がある。
競合性ドメインの機能および設計
多くの核酸ハイブリダイゼーション反応同様、特異性（ＳＤ）ドメインは、単独で存在する場合、狭い範囲の条件下、十分な配列特異性で特異性ドメイン結合部位（ＳＢＳ）に結合する（例えば、ＳＤは、ｐＳＢＳと呼ばれる、偽標的上の等価部位よりもより強力にＳＢＳに結合する）。いくつかの実施形態において（例えば、反応温度がＳＤ：ｐＳＢＳ二重鎖の融解温度よりも実質的に低い場合）、特異性ドメインは、稀な標的アレル上の特異性ドメイン結合部位に結合し、偽標的アレル上の匹敵する領域にも等しく結合する。このような実施形態において、標的核酸および偽標的核酸の両方とも、効率的に増幅され、標的は不十分に濃縮される。いくつかの実施形態において（例えば、反応温度がＳＤ：ＳＢＳ二重鎖の融解温度よりも実質的に高い場合）、特異性ドメインは、稀な標的アレル上の特異性ドメイン結合部位に結合し、偽標的アレル上の匹敵する領域にほぼ等しく不十分に結合する。このような実施形態において、標的核酸も偽標的核酸も効率的に増幅されず、標的核酸は不十分に濃縮される。本明細書に提供する、ｓｓプライマーの競合性ドメイン（ＣＤ）は、結合反応におけるエントロピー変化のいくらかを「キャンセルする」ことにより、特異性ドメインが標的アレルと偽標的アレルとを区別する（例えば、標的アレルに優先的に結合する）条件の範囲を拡張する。
【００６９】
図２Ｃは、競合性ドメイン（ＣＤ）と構成されたｓｓプライマーを示す。図２Ｃの上左は、特異性ドメイン（ＳＤ）のポーションに同一または類似の配列を含むＣＤを表す。よって、ＣＤは、特異性ドメイン結合部位に相補的であり、または部分的に相補的である。それに対してＣＤが結合する、標的鎖および／または偽標的鎖上の領域を、「ＣＤ結合部位」または「ＣＢＳ」と呼ぶ。図２Ｃ、下左は、特異性ドメイン結合部位（ＳＢＳ）（または、偽標的アレル上に位置する偽ＳＢＳ（ｐＳＢＳ））に隣接する、標的鎖および偽標的鎖上の領域に相補的であり、または部分的に相補的である付加的なドメインを含むＣＤ鎖を表す。標的鎖および／または偽標的鎖上のこの領域を、「ＣＤ伸長結合部位」または「ＣＥＢＳ」と呼ぶ。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＳＤおよびＣＤは、標的と偽標的（例えば、変異）との間の遺伝子（例えば、ヌクレオチド）の違いがＣＢＳ内にあるように操作される。このような実施形態において、ＣＤは偽標的鎖に相補的であるが、標的鎖には相補的でないように設計され得る。いくつかの実施形態において、ＣＤと偽標的アレルとの間の相互作用は、ＣＤと標的アレルとの間の相互作用より強力であるため、ＣＤはＳＤの配列選択性を改善することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＳＤおよびＣＤは、標的と偽標的（例えば、変異）との間の遺伝子（例えば、ヌクレオチド）の違いがＳＢＳ内にあるがＣＢＳ外にあるように操作される。いくつかの実施形態において、ＣＤは標的鎖および偽標的鎖に等しく良好に結合する。よって、ＣＤは、ＳＤの配列選択性を改善しないが、ＳＤがエントロピーのキャンセルによって標的アレルに対する十分な配列特異性を表す温度の範囲を広げ得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＳＤおよびＣＤは、標的と偽標的（例えば、変異）との間の配列（例えば、ヌクレオチド）の違いがＳＢＳ外にあるがＣＥＢＳ内にあるように操作される。いくつかの実施形態において、ＣＤは、偽標的アレルに相補的であるが、標的アレルに相補的でないように設計され得る。このような実施形態において、ＳＤは、標的アレルと偽標的アレル自体との間を区別しない。しかし、ＣＤの偽標的アレルに対する結合は、ＣＤの標的アレルに対する結合より強力であるため、いくつかの実施形態において、ＳＤは、偽標的鎖より標的鎖に優先的に結合する。
【００７３】
図２Ｃ、上右は、ＳＤに相補的であり、または部分的に相補的である、ＣＤを表す。いくつかの実施形態において、ＳＤは、標的または偽標的の配列に関連しない付加的な部分（図中「ＡＭ」と呼ぶ）に、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介して連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＤは、ＡＭと相互作用することができる部分（図中ＡＭ＊と呼ぶ）に連結されていてもよい（図２Ｃ、下右）。いくつかの実施形態において、ＡＭおよびＡＭ＊は相補的な核酸である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＣＤの長さは、約１０から約５０ヌクレオチド、またはそれより長い。例えば、ＣＤの長さは、１０から１５、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、１５から２０、１５から３０、１５から４０、２０から３０、２０から４０、２０から５０、３０から４０、または４０から５０ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、ＣＤの長さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド、またはそれより長くてもよい。
特異性ドメインとプライミングドメインとの間の連結
いくつかの実施形態において、ｓｓプライマーは、プライミングドメイン（ＰＤ）を含む核酸に連結された特異性ドメイン（ＳＤ）を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、２つの核酸は、相互に（図４Ｂ（ｉ））、共通の分子と（図４Ｂ（ｉｉｉ））、共通の分子複合体と（図４Ｂ（ｉｖ））、または前述の相互作用様式の組合せと（例えば、図４Ｂ（ｉｉ）、図４Ｂ（ｖ））相互作用する。２つの核酸は、ＤＮＡハイブリダイゼーション（図４Ｂ（ｖｉ）から４Ｂ（ｘ））、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−小分子相互作用、磁性相互作用、電荷相互作用などの非共有結合性相互作用によって相互作用し得る。いくつかの実施形態において、ｓｓプライマーの伸長生成物が増幅の後のサイクルにおいて鋳型として働く場合、ＤＮＡポリメラーゼが修飾を通り越して読み取ることができないように、ＰＤを含む核酸は少なくとも１つの化学的修飾を含む。このような修飾の例には、制限なく、ポリエチレングリコール、アルキルスペーサー、ＰＮＡ、またはＬＮＡが含まれる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ｓｓプライマーの伸長生成物が増幅の後のサイクルにおいて鋳型として働く場合、ＤＮＡポリメラーゼが修飾を通り越して読み取ることができないように、ｓｓプライマーは、ＳＤおよびＰＤの両方を含む単一の核酸を含み、少なくとも１つの化学修飾を含む。
【００７６】
ＳＤをＰＤに連結するリンカーは、化学的部分であってもよく、これは、連続的な共有結合した部分であってもよいし、またはそうでなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤがオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部である場合、リンカーはＳＤの５’末端に付着している（図４Ｃ、上）。いくつかの実施形態において、ＳＤがオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部である場合、リンカーはＳＤの３’末端に付着している（図４Ｃ、中央）。いくつかの実施形態において、リンカーはＳＤの中央領域に付着している（例えば、ビオチン−ｄＴなどのコンジュゲーションハンドルで修飾されている核酸塩基を介して）（図４Ｃ、下）。いくつかの実施形態において、リンカーは、付加的な、機能的な、または非機能的な部分に付着しており、部分は今度はＳＤの５’末端、３’末端、または中央領域に付着している。ＳＤが他のタイプの核酸塩基認識部分を含む場合（例えば、ＰＮＡおよびモルフォリノ）、ＳＤ上の付着部位に関して同様の変形が企図される（図５）。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＳＤはＰＤに対して５’から３’連結を介して連結されており（図３、上）、他の実施形態において、ＳＤはＰＤに対して５’から５’連結を介して連結されている（図３、下）。いくつかの実施形態において（例えば、５’から５’連結では）、３’末端がＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得ず、および／またはエキソヌクレアーゼによって分解され得ないように、ＳＤおよび／またはＣＤの３’末端はブロックされている（例えば、伸長を防ぐために化学的に）。いくつかの実施形態において、３’末端は伸長不可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、伸長不可能なヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドであってよい。伸長不可能なヌクレオチドの例には、制限なく、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、デオキシウリジン、ｄＰ、ｄＺ、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシシチジン、または逆方向に挿入された他の天然に存在するヌクレオチド（例えば、逆のｄＴ）、ならびに、例えば、モルフォリノ、トレオース核酸、ホスフェート、多炭素リンカー（multi-carbon linker）、アミノ基、チオール基、アジド基、および／またはアルキン基などの少なくとも１つの非ヌクレオチド部分で修飾されているヌクレオチドが含まれる。
【００７８】
リンカーの性質は変動してよい。例えば、いくつかの実施形態において、ＳＤはＰＤに対して単一のオリゴヌクレオチドを介して連結されていてもよい。このような場合、ｓｓプライマーは連続的なオリゴヌクレオチドであり、非伸長可能なヌクレオチド（例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、ｉｓｏＧ、ｉｓｏＧ、および／またはデオキシウリジン）を用いて、ポリメラーゼのリードスルーを防いでもよい（図４Ａ）。本発明にしたがって用いることができる他の核酸類似体は、本発明の他所に記載するものである。
【００７９】
いくつかの実施形態において、リンカーは化学的リンカーである。例えば、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルキルスペーサー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）であってよく、または含むことができる（図４Ａ）。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＳＤはＰＤに、化学的コンジュゲーション反応（例えば、「クリックケミストリー」）を用いて連結されている。例えば、２つのドメインが相互に、アジドアルキンヒュスゲン環化付加反応を用いて連結されていてもよい（図４）（Rostovstev, V.V., et al. Angewandte Chemie International Edition 41 (14): 2596-2599, 2002; Tornoe, C.W. et al. Journal of Organic Chemistry 67 (9): 3057-3064, 2002）。いくつかの実施形態において、ＳＤおよびＰＤは相互に、アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、もしくはカルボニル基に関与する他のコンジュゲーション反応、または前述のあらゆる反応の組合せを用いて連結されていてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＳＤを含む核酸およびＰＤを含む核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、もしくは相互のハイブリダイゼーションによって相互に、またはオリゴヌクレオチドの共通の基に対して連結されている（図４Ｂ（ｖｉ）〜４Ｂ（ｘ））。このような立体配置は、いくつかの実施形態において、有利であり得る。例えば、これらは最適化に対する時間および／または費用を低減し得る。ＳＤの多数の（例えば、ｍ個の）バージョンおよびＰＤの多数の（例えば、ｎ個の）バージョンをコンビナトリアルの形式で試験するのに必要とされる場合、ＳＤ鎖のｍバージョンおよびＰＤ鎖のｎバージョンを合成することができ、必要であれば、別々に精製することができる。次いで、これらを組み合わせて試験することができる。よって、たったｍ＋ｎ個の分子を合成（および精製）し、ｍ×ｎ個の組合せを試験することができる。これは、ｍ×ｎ個全ての組合せを合成（および精製）することを必要とするいくつかのリンカー設計と対照的である。
ｄｓブロッカーおよびｄｓブロッカー核酸増幅
本発明の他の態様において、偽陽性結果の問題は、部分的に二本鎖のプライマーおよび増幅方法を用いることによって対処される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、偽陽性の結果の問題は、偽標的の増幅を抑制することによって対処される。この取組みの一利点は、標的の正確な配列が完全に分かっていない場合でも、標的核酸を濃縮することができることである。例えば、標的核酸は遺伝子の特定の領域に多くの可能な変異のうちの１つを有し得、変異アレルが、過剰の野生型アレルの存在下で、稀なアレルとして存在し得る。いくつかの実施形態において、特定の領域の長さは１から１００塩基または塩基対であってよい。試薬が野生型配列の増幅を抑制することができ、野生型配列と１ヌクレオチド程度のみ異なる核酸全ての増幅を許す場合、増幅生成物をさらなる分析（例えば、配列決定）にかけて、変異アレルの存在および配列を同定することができる。広範囲の実験条件でこの試薬に十分な性能があるのが理想的である。例えば、所与のバッファー条件では、部分的に二本鎖のプライマーおよび増幅方法を用いて、広範囲の温度（例えば、５℃を超える）において、この試薬に十分な性能があるのが理想的である。
【００８３】
本明細書で用いる、本発明の「ｄｓブロッカー」は、第１（「ブロッカー」）および第２（「プロテクター」）の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖の核酸を意味し、ここで第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン（例えば、「ＢＴ」／「ＢＴ＊」）、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン（例えば、「ＢＭ」／「ＢＭ＊」）、および（ｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメイン（「ＩＴ」）で構成されており、二本鎖偽標的非特異性ドメインの標準自由エネルギー（ΔＧ）は稀な標的核酸に結合している一本鎖偽標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しく、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である（図６Ａ）。
【００８４】
図６Ａおよび６Ｂは、連続した核酸であるブロッカーおよびプロテクター鎖を有するｄｓブロッカーの例を示す。ブロッカー鎖は、最初のトーホールドドメイン（「ＩＴ」）、分岐点移動ドメイン（「ＢＭ」）、およびバランシングトーホールドドメイン（「ＢＴ」）の３つのドメイン（５’から３’方向）に分けることができる。プロテクター鎖は、ブロッカー鎖のバランシングトーホールドドメイン（「ＢＴ」）に相補的であるバランシングトーホールドドメイン（「ＢＴ＊」）、およびブロッカー鎖の分岐点移動ドメイン（「ＢＭ」）に相補的である分岐点移動ドメイン（「ＢＭ＊」）の２つのドメイン（５’から３’の順序）に分けることができる。いくつかの実施形態において、ブロッカー鎖は連続した核酸である。いくつかの実施形態において、プロテクター鎖は連続した核酸である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、最初のトーホールドドメインおよびバランシングトーホールドドメインの位置は、最初のトーホールドドメインがブロッカー鎖の３’末端に位置し、バランシングトーホールドドメインがブロッカー鎖の５’末端に位置するように交換することができる。このような実施形態において、ＢＴ＊ドメインはプロテクター鎖の３’末端に位置する。
【００８６】
図７に示す通り、野生型アレルに結合するように設計されたｄｓブロッカーが野生型アレルに接触する場合、野生型アレルに相補的である鎖が野生型アレルの鎖に結合すると、ｄｓブロッカーの２本の鎖は分離する。対照的に、ｄｓブロッカーが稀な標的アレルに接触する場合、ｄｓブロッカーの２本の鎖の分離は好都合ではなく、ｄｓブロッカーは稀な標的アレルに結合しない。よって、無差別プライマーが、稀な標的アレルの鎖に結合し、鎖の長さに沿って伸長し、その結果、稀な標的アレルの優先的な増幅がもたらされる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ｄｓブロッカー核酸増幅（ｄｓブロッカーを用いた核酸合成／増幅）を用いて稀な標的アレルを増幅してもよい。これは、野生型アレルの増幅をブロックすることにより実現される。このような実施形態において、ブロッカー鎖のＩＴ−ＢＭドメインを、野生型アレルに相補的であるように操作してもよい（図７）。ＢＴドメインの配列を、不要なハイブリダイゼーションを回避するように、いくつかのパラメータにしたがって設計してもよい。例えば、ｄｓブロッカーを以下のプロセスにおいて設計することができる。
工程１．反応のアニーリング温度を選択する。アニーリング温度は、偽標的鎖が広範な二次構造を形成しないよう、十分高くなければならないが、典型的なプライマーが鋳型上のプライマー結合部位に十分な親和性を有するよう、十分低くなければならない。アニーリング温度は５５℃から７０℃の範囲であるのが典型的である。
工程２．（ａ）ＩＴまたはＢＭに結合する偽標的鎖上の領域が多型部位を包含し、（ｂ）ＩＴが、アニーリング温度で偽標的鎖に弱く結合し、（ｃ）ブロッカー鎖のＩＴ−ＢＭ領域が、アニーリング温度を５℃上回って偽標的鎖に安定に結合し、（ｄ）ＢＭが、アニーリング温度を１０℃上回って偽標的鎖に弱く結合するようにＩＴおよびＢＭを設計する。
工程３．候補のＢＴが、ＩＴがその相補鎖に結合するのと同様の親和性で、相補鎖に結合するよう、ＢＴの候補としてランダム配列を産生する。例えば、ＢＴは、ＩＴと同様の長さおよびＧＣ含量であってよい。
工程４．ＢＴが、ブロッカー鎖の偽標的鎖またはＩＴ−ＢＭ領域に誤って結合するか否かをインシリコで検査する。結合する場合は、工程３から繰り返す。結合しなければ、候補のＢＴ配列を使用する。
【００８８】
ｄｓブロッカーの性能を、ＢＴおよび／またはＢＴ＊ドメインの長さおよび／またはＧＣ含量を調整することによって、さらに最適化することができる。
【００８９】
本明細書において、ＢＴとＢＴ＊との間の相互作用は、間接的ハイブリダイゼーション、直接的および間接的ハイブリダイゼーションの混合、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−小分子相互作用、磁性相互作用、電荷相互作用などを含めた、他の形態の偽標的非特異性相互作用によって置き換えることができることが企図される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＢＴドメインとＢＴ＊ドメインとの間の結合の自由エネルギー（ΔＧ）は、アニーリング温度で、ＩＴドメインから偽標的アレル（例えば、野生型アレル）の間の結合のΔＧより高い、およそ２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、またはおよそ１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅであってよい（すなわち、ＩＴドメイン：偽標的アレルの結合は、ＢＴドメイン：ＢＴ＊ドメインの結合より強力である）。その結果、ブロッカー鎖結合のプロテクター鎖に対するΔＧは、ブロッカー鎖の偽標的アレルに対する結合のΔＧより高い、およそ２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、またはおよそ１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅである（すなわち、ブロッカー：偽標的アレルの結合は、ブロッカー：プロテクターの結合より強力である）。稀な標的アレルにおける単一ヌクレオチドの変化（例えば、変異、挿入、または欠失）は、ブロッカー：標的鎖二重鎖をおよそ２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ不安定化し得る。よって、本開示のｄｓブロッカーが偽標的アレルと接触する場合、偽標的アレル（例えば、偽標的アレルの５０％を超えて）はプロテクター鎖を置換し、ブロッカー鎖に結合する（例えば、平衡時）。比較すると、ｄｓブロッカーが、ブロッカー鎖のＩＴ−ＢＭドメインに相補的な領域に変異を含んでいる稀な標的アレルと接触する場合、ブロッカー鎖がプロテクター鎖に結合する（例えば、プロテクター鎖を置換し、ブロッカー鎖に結合する）よりも不十分に標的のアレル鎖がブロッカー鎖に結合するため、少数の稀な標的アレルのみ（例えば、稀な標的アレルの５０％未満）がブロッカー鎖に結合する。稀な標的アレルにおける単一ヌクレオチド変化（例えば、変異、挿入、または欠失）は、ブロッカー：稀な標的アレル二重鎖をおよそ１からおよそ４ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ不安定するのが典型的である。よって、ブロッカー鎖とプロテクター鎖との間の相補的な結合は、ブロッカー鎖と稀な標的アレルとの間の結合より好ましいことがあり、この場合、少なくとも１つのヌクレオチドの違いが存在する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ブロッカーおよび／またはプロテクター鎖は、その３’末端に伸長不可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッカーおよび／またはプロテクター鎖は、３’末端に対するさらに多くのヌクレオチドの付加をブロックするヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッカーおよび／またはプロテクター鎖は、３’末端の分解をブロックするヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、伸長不可能なヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、天然に存在しないヌクレオチドは、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、またはデオキシウリジン、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシチミジン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシシチジンなど、または逆方向に挿入された他の天然に存在するヌクレオチドである。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、野生型アレルなど、標的アレルおよび偽標的アレルのプールを、（ａ）対象の稀な標的アレル、およびいくつかの実施形態において偽標的アレルに相補的であるように操作された一本鎖プライマー、ならびに（ｂ）ｄｓブロッカーと接触させる工程と、操作された一本鎖プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で、標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。野生型アレルに相補的であるように操作されたｄｓブロッカーのブロッカー鎖は、野生型アレルに優先的に結合し、それによって一本鎖プライマーの伸長をブロックする。同じ反応において、一本鎖プライマーは稀な標的アレルに結合し、ブロッカー鎖によってブロックされずに伸長する。よって、稀な標的アレルが優先的に増幅される。
【００９３】
上記に論じた通り、本発明のｄｓブロッカーのブロッカー鎖は、最初のトーホールド（ＩＴ）ドメイン、分岐点移動（ＢＭ）ドメイン、およびバランシングトーホールド（ＢＴ）ドメインを含めた少なくとも３つのドメインを含む。最初のトーホールドドメインおよび分岐点移動ドメインは、偽標的核酸の核酸配列に相補的である核酸配列を有する。最初のトーホールドドメインおよび分岐点移動ドメインは、したがって、ｄｓブロッカーが好適なハイブリダイゼーション条件下で偽標的核酸と接触する場合、偽標的核酸の配列と塩基対形成することができ、よって複合体を形成することができる。バランシングトーホールドドメインは合理的に設計されており、よってバランシングトーホールドの配列は、偽標的核酸配列における配列に相補的ではないように設計されている。
【００９４】
最初のトーホールドドメインは偽標的核酸における配列に相補的である（よってハイブリダイズする）が、最初のトーホールドドメインはプロテクター鎖にハイブリダイズしない。よって、ブロッカー鎖がプロテクター鎖にハイブリダイズする場合、最初のトーホールドドメインは、標的核酸および／または偽標的核酸に、やはりハイブリダイズすることができる。最初のトーホールドドメインは、ブロッカー鎖の３’末端または５’末端に位置付けられてもよい（例えば、ブロッカー鎖の３’末端または５’末端の伸長である）。
【００９５】
いくつかの実施形態において、伸長がブロッカー鎖によって停止された場合、部分的な伸長生成物が、偽標的鎖およびブロッカー鎖によって形成された複合体の融解温度より少なくとも０．１℃低い融解温度で偽標的鋳型に結合するように、ＰＣＲなどにおいてプライマーを操作し、そのため温度をより高温（例えば、伸長温度および変性温度）に上昇させるプロセスの間、部分的な伸長生成物はブロッカー鎖より早く分離する。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリング温度など、設計されている伸長温度未満の温度で鋳型上のプライマーを伸長し得ることを理解されたい。
【００９６】
いくつかの実施形態において、プライマー結合部位とブロッカー鎖結合部位との間の鋳型上にギャップは存在しない。このような実施形態において、プライマー自体を、部分的な伸長生成物とみなすことができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、鎖置換活性が弱い、またはない、かつ５’から３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼである（例えば、ＰｆｕおよびＰＨＵＳＩＯＮ）。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、鎖置換活性が報告されている、または５’から３’エキソヌクレアーゼ活性が報告されているＤＮＡポリメラーゼである。このような実施形態において、濃縮は、ポリメラーゼが、ＰＣＲの各工程の間にブロッカー鎖を完全に置換または分解しない場合に、依然として実現され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性としても知られている）のあるＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは高忠実度ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、最初のトーホールドドメインは、長さ約４ヌクレオチドから約２０ヌクレオチド、長さ約４ヌクレオチドから約１５ヌクレオチド、または長さ約４ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、最初のトーホールドドメインは、長さ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、最初のトーホールドドメインは、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれを超えるヌクレオチド以下の例を含めて、長さ２０ヌクレオチドを超える。
【０１０１】
分岐点移動ドメインは、偽標的核酸における配列に、およびプロテクター鎖における配列に相補的である。よって、ブロッカー鎖が偽標的核酸にハイブリダイズする場合、分岐点移動ドメインは偽標的核酸にハイブリダイズする。ブロッカー鎖がそのプロテクター鎖にハイブリダイズする場合、ブロッカー分岐点移動（ＢＭ）ドメインはプロテクター分岐点移動（ＢＭ＊）ドメインにハイブリダイズする。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、分岐点移動ドメインは、長さ２００、１００、７５、５０、４０、３０、２５、または２０ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態において、分岐点移動ドメインは、長さ約１０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、分岐点移動ドメインは、長さ約１０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、分岐点移動ドメインは、長さ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、分岐点移動ドメインは、偽標的核酸に応じて、長さ２００ヌクレオチドを超えてもよい。
【０１０３】
ブロッカー鎖およびプロテクター鎖のバランシングトーホールドドメインは相互に相補的である（すなわち、二本鎖核酸を形成する）が、偽標的核酸に非相補的である（すなわち、どちらも偽標的と二本鎖核酸を形成しない）。よって、ブロッカー鎖が偽標的核酸にハイブリダイズする場合、ブロッカーバランシングトーホールドドメインは、偽標的核酸にハイブリダイズしない。ブロッカー鎖がそのプロテクター鎖にハイブリダイズする場合、ブロッカーバランシングトーホールド（ＢＴ）ドメインは、プロテクターバランシングトーホールドドメイン（ＢＴ＊）にハイブリダイズする。
【０１０４】
バランシングトーホールドドメインの設計は、最初のトーホールドドメインの設計に依存する。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、バランシングトーホールドドメインの熱力学的プロファイルが、最初のトーホールドドメインの熱力学的プロファイルに匹敵するように設計される。いくつかの実施形態において、熱力学的プロファイルは、例えば、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＩ）のｂｉｏｉｎｆｏウエブサイドで入手できるＭｆｏｌｄソフトウエアを用いた、理論的なモデルに基づくものである。バランシングトーホールドドメイン内のヌクレオチドの数および／または性質は、最初のトーホールドドメインのヌクレオチドの数および／または性質に匹敵する。例えば、最初のトーホールドドメインがＡおよびＴヌクレオチド約４０％、ならびにＧおよびＣヌクレオチド６０％からなる場合、バランシングトーホールドドメインもＡおよびＴヌクレオチド約４０％、ならびにＧおよびＣヌクレオチド６０％からなっていなければならない。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、バランシングトーホールドドメインの偽標的核酸に対する結合を回避するよう、連続する３つ以下のヌクレオチドが偽標的核酸上の配列に相補的であるように設計される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインの長さは、ブロッカーおよびプロテクターが相互に自発的に解離するように十分短い。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、長さ約４ヌクレオチドから約２０ヌクレオチド、長さ約４ヌクレオチドから約１５ヌクレオチド、または長さ約４ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、長さ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、２０より多くのヌクレオチドであってもよく、例えば約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００未満のヌクレオチド、またはそれより多くである。いくつかの実施形態において、偽標的核酸内のヌクレオチド配列に相補的である連続的なヌクレオチドの数は、バランシングトーホールドドメインが偽標的核酸に結合しないのであれば、３を超えてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインの設計は、ｄｓブロッカーの濃度、またはｄｓブロッカーが形成／使用される温度に依存しない。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、プロテクター鎖がブロッカー鎖から偽標的核酸によって置換される反応に対する標準自由エネルギーがゼロｋｃａｌ／ｍｏｌに近いように設計される。本明細書で用いる、「ゼロに近い」は、反応に対する標準自由エネルギーが、０ｋｃａｌ／ｍｏｌから３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ内であることを意味する。いくつかの実施形態において、この置換反応の標準自由エネルギーは、ゼロｋｃａｌ／ｍｏｌの３．５、３．０、２．５、２．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ内である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインの設計は、ｄｓブロッカー濃度および反応温度に依存する。このような実施形態において、バランシングトーホールドドメインは、プロテクター鎖が偽標的核酸プラスＲＴｌｎ（ｃ）によりブロッカー鎖から置換される反応に対する標準自由エネルギーがゼロｋｃａｌ／ｍｏｌに近いように設計され、Ｒは普遍的な気体定数（０．００１９８５８７７５（３４）ｋｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ）であり、Ｔはｄｓブロッカーを用いる温度であり、ｃはｄｓブロッカーを用いる濃度である。いくつかの実施形態において、ｄｓブロッカーを用いる温度は約２７３Ｋ（０℃）、２７７Ｋ、２８３Ｋ、２８８Ｋ、２９３Ｋ、２９８Ｋ、３０３Ｋ、３０８Ｋ、３１３Ｋ、３１８Ｋ、３２３Ｋ、３２８Ｋ、３３３Κ、３３８Κ、３４３Κ、３４８Κ、３５３Κ、３５８Κ、または３６３Κ（９０℃）である。いくつかの実施形態において、ｄｓブロッカーを用いる濃度（ｃ）は、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、２２５ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または１μΜである。いくつかの実施形態において、この置換反応プラスＲＴｌｎ（ｃ）の標準自由エネルギーは、ゼロｋｃａｌ／ｍｏｌの３．５、３．０、２．５、２．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ｄｓブロッカーは、ブロッカー鎖をプロテクター鎖に接続するヘアピンドメインを１つまたは複数含むことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓブロッカーのヘアピンドメインはあらゆる長さであってよい。いくつかの実施形態において、ヘアピンドメインは、長さ３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３ヌクレオチドを超える。いくつかの実施形態において、ヘアピンの配列は、偽標的核酸の配列に相補的ではない。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ヘアピンドメインは、ポリアデノシン配列、ポリデオキシアデノシン配列、ポリ５’メチルウリジン配列、ポリチミジン配列、ポリグアノシン配列、ポリデオキシグアノシン配列、ポリシチジン配列、ポリデオキシシチジン配列、ポリウリジン配列、またはポリデオキシウリジン配列などの、ポリ−モノヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、化学的リンカーであり、または化学的リンカーを含む。いくつかの実施形態において、化学的リンカーは、ポリエチレングリコール、アルキルスペーサー、ＰＮＡ、またはＬＮＡである。
【０１１０】
本発明のｄｓブロッカーは、少なくとも２つの方向のうちの１つであってよい。例えば、１方向において、最初のトーホールドドメインは、ブロッカー分岐点移動ドメインにすぐ隣接する、５’末端に位置し（すなわち、２つのドメイン間に介在するヌクレオチドがない）、ブロッカーバランシングトーホールドドメインは、ブロッカー分岐点移動ドメインにすぐ隣接する、３’末端に位置する。この方向で、プロテクターバランシングトーホールドドメインは、プロテクター分岐点移動ドメインにすぐ隣接する、プロテクター鎖の５’末端にある。核酸配列、ドメイン、または領域は、２つの配列が同じ核酸の一部であり、塩基が２つの配列を分離しなければ、別の配列に対して「すぐ隣接」、「すぐ５’」、または「すぐ３’」である。別の方向では、最初のトーホールドドメインは、ブロッカー分岐点移動ドメインにすぐ隣接する、３’末端に位置し、ブロッカートーホールドバランシングドメインは、ブロッカー分岐点移動ドメインにすぐ隣接する、５’末端に位置する。この方向で、プロテクターバランシングトーホールドドメインは、プロテクター分岐点移動ドメインにすぐ隣接する、プロテクター鎖の３’末端にある。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ｄｓブロッカーは、プロテクター鎖より長いブロッカー鎖を含み、長さの違いは、ブロッカー鎖の最初のトーホールドドメインの長さによるものである。プライマーの長さは、偽標的核酸に対するブロッカー鎖のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（ΔＧ°）がゼロに近いように設計される。プロテクター鎖の放出（ｄｓブロッカーからの）により、ハイブリダイゼーション反応がエントロピー的に中性付近であり、濃縮に対して頑強であるのが確実になる。その結果、いくつかの実施形態において、室温（例えば、約２５℃または約２９８Ｋ）でのこの反応は、多くの条件にわたって融解温度付近で実現されるハイブリダイゼーションの特異性に並行する。
【０１１２】
本明細書で意図する通り、「ゼロに近い」ΔＧ°（標準自由エネルギーにおける変化）は、絶対値（量）が約１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または約３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、バランシングトーホールドドメインまたは最初のトーホールドドメインの標準自由エネルギーは、−１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、−３ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または−３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。
【０１１３】
本発明のｄｓブロッカーは、約２：１から約５：１、または１：１から約５：１のプロテクター鎖対ブロッカー鎖の比で調製することができる。いくつかの実施形態において、プロテクター鎖対ブロッカー鎖の比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。いくつかの実施形態において、プロテクター鎖対ブロッカー鎖の比は、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１である。ｄｓブロッカーはまた、本明細書に記載するあらゆるアッセイまたは反応において、過剰のプロテクター鎖と一緒に用いてもよい。プロテクター鎖は、プライマー（例えば、ブロッカー鎖）に対して、１．０１、２、５、１０、２０、５０、１００、または５００倍モル過剰におよそ等しく、またはそれを超えてもよい。
ＰＣＲにおけるｄｓブロッカーを用いた稀なアレルの濃縮のシミュレーション
核酸ハイブリダイゼーションの熱力学を予測する方法、ならびに最小自由エネルギー（ＭＦＥ）構造および分配関数を算出するためのアルゴリズムの動的プログラミングは十分に開発されている（SantaLucia, J., et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 33:415-440, 2004; Dirks, R.M., et al. SIAM Rev, 49(l):65-88, 2007）。所与のハイブリダイゼーション反応に対して、所与の温度での標準のＧｉｂｓｏｎ自由エネルギー変化は、等式ΔＧ°＝ΔＨ°−Ｔ・ΔＳ°を用いて計算することができる。これを知っていれば、公的に入手できるソフトウエアプログラムのいくつか（例えば、ＨｙＴｈｅｒ、Ｍｆｏｌｄ、ＵＮＡｆｏｌｄ、およびＮＵＰＡＣＫ）を用いて、複数の（例えば、混合物／組合せの）核酸の間の各核酸鎖のΔＧ°および平衡濃度を予測することができる。
【０１１４】
偽標的非特異性相互作用対が一対の相補的なオリゴヌクレオチドである実施形態において（図６Ａ）、ｄｓブロッカーの性能を、以下の手順を用いて推定することができる。理論に拘泥するわけではないが、バッファー条件および反応温度を仮定すると、全ての可能なハイブリダイゼーション生成物およびｄｓブロッカーに関与する核酸ハイブリダイゼーション反応に対する中間体の平衡濃度は、全ての相互作用に対して予想されるΔＧ°値を用いて計算することができる。例えば、平衡時の、偽標的鋳型核酸とブロッカー鎖との間のハイブリダイゼーションでは、
【０１１５】
【数３】
2016524917.tif 000005
【０１１６】
式中、［鋳型：ブロッカー鎖］、［鋳型］、および［ブロッカー鎖］は平衡濃度であり、Ｔはアニーリング温度（ケルビン温度）であり、ΔＧ°はハイブリダイゼーション反応の標準自由エネルギー変化である。
【０１１７】
多数の鎖を含む反応混合物では、部分的または完全に相補的な鎖の各対に対するΔＧ°値は予測することができ、よって、等式（４）など、平衡濃度間の比を指示する等式を確立することができる。このセットの等式プラス材料の保存を反映する等式が、独特の解答を有する等式のセットを確立する。解答は、分析的または数値的いずれかで算出することができる。
【０１１８】
核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））の指数関数的増殖期では、鋳型（標的または偽標的いずれか）の濃度は非常に低い（ブロッカー鎖の濃度の＜５％、またはブロッカー鎖の濃度の＜１％）。［鋳型］／［鋳型：ブロッカー］比は鋳型濃度に独立であり、核酸増幅反応の各サーマルサイクルにおいて一定である。加えて、プライマーが、ブロッカー鎖が結合する鋳型上の領域の下流の鋳型上の領域に結合するように設計される場合、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖が鋳型に結合していれば、プライマーは完全に伸長され得ない。よって、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖が結合していない鋳型鎖は、プライマーおよびポリメラーゼによって相補的な鎖にコピーされると想定されるが、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖が結合している鋳型鎖は、プライマーおよびポリメラーゼによって相補的な鎖にコピーされないと想定される。増幅サイクルの伸長効率（extension efficiency）（ＥＥ）は、指数関数的増幅反応のサイクルにおいてプライマーによってコピーされる鋳型の分数と規定され、以下の等式を用いて計算することができる：
【０１１９】
【数４】
2016524917.tif 000006
【０１２０】
ｄｓブロッカーの核酸増幅反応の成分、各成分の配列および濃度、塩分、およびアニーリング温度を特定すると、ＥＥ値（指数関数的増幅の各ラウンドに対して一定である）を計算することができる。
【０１２１】
偽標的鋳型鎖にプライムする（prime）一本鎖プライマーをフォワードプライマーと呼ぶことができ、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖が偽標的鋳型鎖に結合する場合、このフォワードプライマーはブロックされる。ｄｓブロッカーのブロッカー鎖に結合する偽標的鋳型鎖を、アンチセンス鎖と呼ぶことができる。アンチセンス鎖に結合するプライマーをフォワードプライマーと呼ぶことができ、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖がアンチセンス鎖に結合する場合、このフォワードプライマーはブロックされる。アンチセンス鎖に相補的である偽標的鋳型鎖を、センス鎖と呼ぶことができる。センス鎖上に伸長するプライマーをリバースプライマーと呼ぶことができる。ｄｓブロッカーのプロテクター鎖が偽標的鋳型のセンス鎖にハイブリダイズすることができても、このハイブリダイゼーションは、アニーリング温度または伸長温度で不安定であるように設計される。
【０１２２】
以下の定義を適用する：
（１）Ｓ（０）およびＡＳ（０）はそれぞれ、偽標的鋳型のセンス鎖およびアンチセンス鎖の開始の濃度であり。
（２）Ｓ（ｎ）およびＡＳ（ｎ）（ｎ∈Ｎ＋）は、第ｎサイクル後のセンス鎖およびアンチセンス鎖の濃度である。
よって、
Ｓ（ｎ）＝Ｓ（ｎ−１）＋ＡＳ（ｎ−１）・ＥＥ            （６ａ）
ＡＳ（ｎ）＝ＡＳ（ｎ−１）＋Ｓ（ｎ−１）・１            （６ｂ）
ｎサイクル後の「増幅倍率」を［Ｓ（ｎ）＋ＡＳ（ｎ）］／［Ｓ（０）＋ＡＳ（０）］と規定する。
【０１２３】
上記の理論を用いて、本発明のｄｓブロッカー核酸増幅の潜在的な性能と、伝統的な野生型ブロッキングＰＣＲとを比べてもよい（Dominguez, P.L. et al. Oncogene, 24(45): 6830-4, 2005）。以下のセットの配列を一例として用いる：
偽標的鋳型のアンチセンス鎖は、５’−ｔｔｃａｔｃａｇｔｇａｔｃａｃｃｇｃｃｃＡＴＣＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧ［Ａ］ＴＡＴＣＴＡＡＧＣｃｔａｔｔｇａｇｔａｔｔｔｃ−３’（配列番号ｌ）の配列を含んでいる。稀な標的鋳型のアンチセンス鎖は、５’−ｔｔｃａｔｃａｇｔｇａｔｃａｃｃｇｃｃｃＡＴＣＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧ［Ｃ］ＴＡＴＣＴＡＡＧＣｃｔａｔｔｇａｇｔａｔｔｔｃ−３’の配列（配列番号２）を含んでいる。両方の配列に対して、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖にハイブリダイズすることができる領域を大文字で示し、偽標的と標的との間で変化する塩基を大括弧で囲む。
伝統的な野生型ブロッキングＰＣＲ
一本鎖オリゴヌクレオチドブロッカー（「クランプ」としても知られる）を、フォワードプライマーの伸長をブロックする偽標的鋳型のアンチセンス鎖にハイブリダイズするように設計した。一本鎖オリゴヌクレオチドブロッカーの配列は以下の通りであり：５’−ＧＣＴＴＡＧＡＴＡ［Ｔ］ＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴ−３’（配列番号３）、偽標的と標的の鋳型とを区別するヌクレオチドを大括弧で囲む。一本鎖オリゴヌクレオチドブロッカーの濃度を１００ｎＭに設定した。塩分５０ｍＭ［Ｎａ＋］、５．７ｍＭ［Ｍｇ２＋］での、確立された熱力学的パラメータを用いて（SantaLucia, J., et al. 2004; Dirks, R.M., et al. 2007）、（ａ）偽標的鎖と一本鎖オリゴヌクレオチドとの間の（ΔＨ°＝−２３８．９０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、ΔＳ°＝−６６０．７２ｅ．ｕ．）、ならびに（ｂ）標的鎖と一本鎖オリゴヌクレオチドとの間の（ΔＨ°＝−２２２．４０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、ΔＳ°＝−６１８．９０ｅ．ｕ．）、ハイブリダイゼーション反応に対する標準のエンタルピーおよびエントロピーの変化を計算した。上記の等式を用いて、３５サイクル後の増幅倍率に対する偽標的鋳型（図８Ａ左、細点線）および標的鋳型（図１２Ａ、細実線）の両方に対するアニーリング温度をプロットした。異なるアニーリング温度に対する、「標的鋳型に対する３５サイクル後の増幅倍率」と「偽標的鋳型に対する３５サイクル後の増幅倍率」との間の比も計算した（図８Ａ左、太実線）。この比を「増幅の選択性」と規定する。アニーリング温度が、鋳型：オリゴ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）付近である場合のみ、著しい区別（選択性およそ１０５）が実現することは明らかである。アニーリング温度がこのＴｍ未満である場合、偽標的および標的鋳型の両方がブロックされ、アニーリング温度がこのＴｍを超える場合、偽標的も標的鋳型もブロックされない。いずれの場合も選択性の低下がもたらされる。一本鎖オリゴヌクレオチドブロッカーのこのような挙動の結果の一つとして、ブロッカーは非常に長いことはあり得ない（例えば、ブロッカーの化学的性質および配列に応じて、１５から２５塩基を超えて長いことはない）。例えば、Ｔｍが約８０℃を超えると、プライマーの効果的な結合およびポリメラーゼの伸長はもたらされない。よって、標的／偽標的配列の「範囲（scope）」は、野生型ブロッキングＰＣＲでは限定される。
ｄｓブロッカーの増幅
バランシングトーホールドドメインおよびプロテクター鎖の存在により、鋳型：ブロッカーハイブリダイゼーションのＴｍより実質的に低い温度での、偽標的鋳型とブロッカー鎖との間の超特異的なハイブリダイゼーションが可能になる（Zhang, D.Y., et al. Nat Chem, 4(3):208-214, 2012）。よって、ｄｓブロッカーのブロッカー鎖は、いくつかの実施形態において、伝統的な野生型ブロッキングＰＣＲの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーよりも長いように設計することができる。さらに、本発明のｄｓブロッカーにより、いくつかの実施形態において、広範囲の温度にわたる核酸増幅の高選択性が可能になる。しかし、この現象は、３７℃未満の温度で試験したものにすぎず、この温度はＰＣＲに適さない。さらに、１つの結合工程における配列特異性が指数関数的増幅の選択性にどのように転換されるか、明白ではなかった。ｄｓブロッカー増幅の性能を推定するために、本発明のｄｓブロッカーを、以下の配列を有するように設計し：５’−ＧＣＴＴＡＧＡＴＡ［Ｔ］ＣＧ｜ＧＣＡＣＡＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴ（ＧＧＧＣＧ）ｔｃｔｔｃｔｔｃａ−３’（配列番号４）、バランシングトーホールド（ＢＴ）ドメインを小文字で示し、最初のトーホールド（ＩＴ）ドメインおよび分岐点移動（ＢＭ）ドメインをそれぞれシンボル「｜」の左側と右側上に大文字で示す。偽標的と標的の鋳型とを区別する塩基を大括弧で囲む。大括弧内の配列は、上記に記載した一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーに存在しなかったが、それにもかかわらず標的配列に由来し、分岐点移動ドメインの一部である。よって、標的のこの領域における変異は本発明のｄｓブロッカーによって同定することができるが、伝統的な一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーではできない（すなわち、ｄｓブロッカーは「より広い範囲の」標的配列を有する）。
【０１２４】
ｄｓブロッカーのプロテクター鎖は、以下の配列を有するように設計され：５’−ｔｇａａｇａａｇａ（ＣＧＣＣＣ）ＡＴＣＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣ−３’（配列番号５）、バランシングトーホールドドメインおよび分岐点移動ドメインをそれぞれ小文字および大文字で示す。丸括弧内の配列は、ブロッカー鎖の丸括弧内の配列に相補的である。ブロッカー鎖およびプロテクター鎖の濃度をそれぞれ１００ｎＭおよび１５０ｎＭに設定した。上記の等式を用いて、様々なアニーリング温度での偽標的（図８、右、細点線）および標的（図８、右、細実線）の鋳型に対する３５ラウンド後の増幅倍率を計算した。増幅の選択性対アニーリング温度（図８、右、太実線）もプロットした。この分析より、エントロピーキャンセレーションの効果のため、最適の選択性を、ＰＣＲに適する驚くほど広範囲のアニーリング温度下で、本発明のｄｓブロッカーで実現することができることは明らかである。
温度バーコード化加水分解プローブ
多数のｓｓプライマーを融解温度によってバーコード化し、多重増幅および／または検出反応を行うための方法および組成物を本明細書に提供する。例えば、図１３に示す設計では、２セットの核酸を用いて２つの異なる標的を増幅する。核酸のセットは両方ともｓｓプライマーを含んでいる。各ｓｓプライマーに対して、ＳＤおよびＰＤは、それぞれＨＤおよびＨＤ＊と呼ぶハイブリダイゼーションドメインのハイブリダイゼーションによって連結されている。各ハイブリダイゼーションドメインの長さは変動し得る。いくつかの実施形態において、各ハイブリダイゼーションドメインの長さは４から１５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド塩基対）である。いくつかの実施形態において、各ハイブリダイゼーションドメインの長さは、４から１０、４から２０、４から３０、４から４０、または４から５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、各ハイブリダイゼーションドメインの長さは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれを超えるヌクレオチドである。ＳＤを含む核酸鎖を、シグナル産生部分（例えば、フルオロフォア（「Ｆ」））、および第１のシグナル調節部分（例えば、蛍光クエンチャー（「Ｑ１」））で標識化する。シグナル産生部分は、非ＳＤ領域（ＳＤではない核酸鎖の領域）において付着しており、第１のシグナル調節部分はＳＤにおいて付着している。ＰＤ鎖のＨＤ＊に付着している、付加的なシグナル調節部分（例えば、蛍光クエンチャー（「Ｑ２」））が存在する。このようなｓｓプライマーをＰＣＲにおいて、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）と用いる場合、ＰＤが伸長して鋳型をコピーすると、ＳＤの５’末端は分解される。したがって、ＳＤに付着している第１のシグナル調節部分（例えば、Ｑ１）は、シグナル産生部分（例えば、Ｆ）から物理的に分離されている。反応混合物のシグナルを、ＨＤおよびＨＤ＊によって形成される二重鎖のおよそ融解温度または融解温度を超える温度で測定する場合、この分離がシグナル（例えば、蛍光シグナル）の増大をもたらし、増幅の進行が、増幅（例えば、ＰＣＲ）反応の間（例えば、リアルタイムＰＣＲを用いて）モニタリングできるようになる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、増幅（例えば、ＰＣＲ）生成物を融解分析にかける。例えば、標的核酸を増幅する場合、ＨＤ＊はシグナル調節部分（例えば、Ｑ２）を保有するため、標的を増幅するように設計されたｓｓプライマーのＨＤおよびＨＤ＊のハイブリダイゼーションを反映する融解曲線（蛍光対温度）が観察されなければならない。融解曲線の導関数におけるピークは、ＨＤおよびＨＤ＊によって形成された二重鎖の融解温度を反映する。ＨＤおよびＨＤ＊ドメインの配列は任意に設計することができるため、２つのｓｓプライマーの２つのＨＤドメインは、異なる融解温度を有するように設計することができる（例えば、図１３に示すＴｍ１およびＴｍ２）。この方法で、例えば、標的が上首尾に増幅されると、融解曲線の導関数におけるシグナチャーピークまたは谷間が存在する結果となる。よって、１つを超える標的を、たった１色のシグナル産生部分（複数可）（例えば、フルオロフォア（複数可））を用いて区別することができる。同様に、ＨＤおよびＨＤ＊に対して特徴的な融解曲線を有する２つを超えるｓｓプライマーを、１つのＰＣＲ反応において用いることができる。いくつかの実施形態において、異なる色のシグナル産生部分（例えば、フルオロフォア）で標識したｓｓプライマーを、単一のＰＣＲ反応において用いる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、加水分解プローブを全般的に設計するために、本明細書に提供する、融解温度でのバーコード化を適用することができる。図１４Ａ〜１４Ｃは、温度バーコード化加水分解プローブ（ＴＢＨＰ）の一例を示す。このＴＢＨＰはプローブ鎖および遊離クエンチャー鎖を含む。プローブ鎖は、（１）任意に指定され（例えば、上記に記載したＨＤに類似の）、フルオロフォア（「Ｆ」）に付着している配列を有する、長さ５から６０ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヌクレオチド）を有する第１のドメイン、および（２）標的鎖のポーションに相補的であり、または部分的に相補的である配列を有し（上記に記載したＳＤに類似の）、第１のクエンチャー（図１４Ａにおける「Ｑ１」）に連結された、長さ５から６０ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヌクレオチド）を有する第２のドメインを含む。いくつかの実施形態において、遊離クエンチャー鎖は、プローブ鎖の第１のドメインに相補的であり、または部分的に相補的であるドメインを含み、第２のクエンチャー（図１３Ａにおける「Ｑ２」）に付着している。いくつかの実施形態において、プローブ鎖および対応する遊離クエンチャー鎖が異なる融解プロファイルを有する場合、複数のＴＢＨＰを用いて複数の核酸標的を検出することができる。
【０１２７】
複数のＴＢＨＰを用いて複数の核酸標的を検出する方法は、ＴＢＨＰおよび標的を、塩基対依存的ヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素の存在下で接触させる工程を含むことができる。ヌクレアーゼ活性を用いて、第１のクエンチャーをフルオロフォアから分離する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、塩基対依存的ヌクレアーゼ活性はエンドヌクレアーゼ活性である。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性はＲＮアーゼＨ活性である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、塩基対依存的ヌクレアーゼ活性はエキソヌクレアーゼ活性である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼ活性は、二本鎖特異的５’から３’エキソヌクレアーゼ活性である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼ活性は、二本鎖特異的３’から５’エキソヌクレアーゼ活性である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、塩基対依存的ヌクレアーゼ活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼである。例えば、多くのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）が二本鎖特異的５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を表し、多くのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、およびＫＯＤ）が二本鎖特異的３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を表し、これはプルーフリーディング活性としても知られている。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの（例えば、１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれを超える）ＴＢＨＰを含む組成物は、少なくとも１つの（例えば、１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれを超える）核酸標的の増幅および検出の両方を支持する。例えば、ＴＢＨＰは、従来の加水分解プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を用いるのと同様に、ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲにおいて用いることができる。いくつかの実施形態において、ＴＢＨＰは、１セットのプライマー、およびＴａｑなどの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼも含むＰＣＲ混合物において用いられ、後者はプライマーが伸長するときにＱ１保有ドメインを部分的または完全に分解することができる（図１４Ｂ）。プローブ鎖およびその対応する遊離クエンチャー鎖が別々の融解温度を有するマルチプルＴＢＨＰを、多数の標的の存在を同定するためのマルチプレックスＰＣＲなどにおいて用いることができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＴＢＨＰおよび核酸標的を、塩基対依存的ヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素の存在下で接触させた後（例えば、接触は、単一温度のインキュベート、ならびに／または好適なバッファー中好適なインキュベートおよび／もしくはサーマルサイクルプログラムでの５から１００サイクルのＰＣＲ増幅を含むことができる）、反応生成物を融解分析にかけることができ、この場合、温度を高温（例えば、８０℃から１００℃、例えば９０℃）から低温（例えば、２０℃から４０℃、例えば３０℃）まで変化させ、その間、反応の蛍光シグナルを複数の温度で測定する（図８Ｃ）。いくつかの実施形態において、温度にわたる蛍光シグナルの１次導関数（ｄＦ／ｄＴまたは−ｄＦ／ｄＴ、式中、ｄＴは温度の増大であり、ｄＦは前記温度の増大にわたる蛍光シグナルの変化である）対温度（融解曲線の導関数としても知られる）を図においてプロットすることができ、プロットのピークまたは谷が観察される温度は、プローブ鎖および対応する遊離クエンチャー鎖を含む二重鎖の融解温度を反映する。特定の標的が存在する場合、標的を検出するように設計されたＴＢＨＰに対応する前記の図においてシグナチャーピークまたは谷が観察され、ピークまたは谷が観察される温度は、前記ＴＢＨＰのプローブ鎖および遊離クエンチャー鎖によって形成される二重鎖の融解温度を反映する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、プローブ鎖は連続的なオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、プローブ鎖は、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、プローブ鎖は、非共有結合性の相互作用と相互作用する多数の分子によって形成される。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、プローブ鎖および遊離クエンチャー鎖は、共有結合性に連結されて１つの連続的な分子を形成する。いくつかの実施形態において、連続的な分子は連続的な核酸である。
【０１３５】
ＴＢＨＰは、いくつかの実施形態において、（１）標的配列によって制限されず、シグナル産生部分に付着している配列を有する第１のドメイン、（２）標的鎖のポーションに相補的であり、または部分的に相補的であり、かつ前記シグナル産生部分によって産生されるシグナルに影響を及ぼし得る第１のシグナル調節部分に付着している第２のドメイン、ならびに（３）第１のドメインに相補的であり、または部分的に相補的であり、かつ前記シグナル産生部分によって産生されるシグナルに影響を及ぼし得る第２のシグナル調節部分に付着している第３のドメインを含む１セットのオリゴヌクレオチドを意味し、シグナル産生部分および第１のシグナル調節部分は、少なくとも１つのホスホジエステル結合によって分離されている。ＴＢＨＰを、塩基対依存的ヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素と用いる場合、第２のドメインの標的鎖に対する結合は、ホスホジエステル結合の酵素による加水分解を引き起こし得、シグナル産生部分と第１のシグナル調節部分との分離がもたらされる。上記に記載した３つのドメインのうちあらゆる２つは、様々な共有結合性および非共有結合性の結合または相互作用によって連結されていてよい。いくつかの実施形態において、第３のドメインは、第１のドメイン単独と、これらの相補性によって相互作用してもよく、他の相互作用はない。シグナル調節部分およびシグナル調節部分は、いくつかの実施形態において、様々な共有結合性および非共有結合性の結合または相互作用によって、対応するドメインに付着していてもよい。
【０１３６】
「シグナル産生性部分」は、シグナルを産生するあらゆる部分を意味する。シグナル産生性部分の例には、フルオロフォア、および光励起時に光を再放射することができる他の部分が含まれる。本開示にしたがって用いるためのフルオロフォアの例には、制限なく、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオジン、およびテキサスレッド）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、およびメロシアニン）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシルおよびプロダン誘導体）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、およびベンゾオキサジアゾール）、アントラセン誘導体（例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、およびＣｙＴＲＡＫオレンジを含むアントラキノン）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、およびオキサジン１７０）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、およびアクリジンイエロー）、アリールメタン（arylmethine）誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、およびマラカイトグリーン）、ならびにテトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、およびビリルビン）が含まれる。他のシグナル産生部分が本明細書に企図される。
【０１３７】
「シグナル調節部分」は、シグナル産生部分によって産生されるシグナルを調節する（例えば、クエンチする）あらゆる部分を意味する。いくつかの実施形態において、シグナル調節部分は、蛍光シグナル強度を低減する。クエンチャーの例には、制限なく、ダーククエンチャー（例えば、ダブシル、ダークホールクエンチャー、Ｑｘ１クエンチャー、アイオワブラックＦＱ、アイオワブラックＲＱ、ＩＲＤｙｅＱＣ−１などの天然の蛍光のない色素）、分子酸素、ヨウ素イオン、塩素イオン、アクリルアミドが含まれる。他のシグナル調節部分が本明細書に企図される。
核酸増幅条件
本発明の方法は、概ね合成、よって増幅、核酸（例えば、稀な標的核酸）に対するものである。いくつかの実施形態において、反応溶液の温度は、あらかじめ決定されたサイクル数の間、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で逐次的に循環し得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマー（例えば、ｓｓプライマー、ｄｓブロッカー）、および標的／偽標的依存的であってよい。
【０１３８】
あらゆる所与の反応に対して、変性状態は、約７５℃から約１００℃までの範囲であってよい。アニーリング温度および時間は、プライマーおよび他の分子（例えば、ｓｓプライマー、ｄｓブロッカー）の、標的または偽標的核酸内の特定の遺伝子座に対する結合の特異性および有効性に影響を及ぼし得、特定の合成反応にとって重要であり得る。
【０１３９】
あらゆる所与の反応に対して、アニーリング状態は約２０℃から約７５℃、または約２０℃から約８５℃の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、アニーリング状態は、約２０℃から約２５℃、約２５℃から約３０℃、約３０℃から約３５℃、または約３５℃から約４０℃、約４０℃から約４５℃、約４５℃から約５０℃、約５０℃から約５５℃、約５５℃から約６０℃、約６０℃から約６５℃、約６５℃から約７０℃、約７０℃から約７５℃、約７５℃から約８０℃、約８０℃から約８５℃で行うことができる。いくつかの実施形態において、アニーリング状態は、室温（例えば、２０℃または２５℃）で行うことができる。いくつかの実施形態において、アニーリング状態は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、または５０℃の温度で行うことができる。
【０１４０】
伸長温度および時間は、アレル生成物の収率に影響を及ぼし得、用いる酵素の性質に固有であると理解される。所与の酵素に対して、伸長状態は、約６０℃から約７５℃の範囲であってよい。ポリメラーゼは、ＰＣＲの伸長状態以外の状態において、プライマーを伸長することができ得ることを理解されたい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、用いるポリメラーゼは、鎖置換活性を有し得る。例として、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｂｓｍポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｃｓａポリメラーゼ、および９６−７ポリメラーゼが含まれる。ｄｓブロッカーおよびｄｓブロッカー核酸増幅方法に関するあらゆる実施形態において、耐熱性ポリメラーゼおよび逆転写酵素（ＲＴアーゼ）を含めた、あらゆるＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ（ヌクレオチドの核酸鎖への重合を触媒する酵素）を用いることができる。例として、バシラスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ｐｏｌＩ、サーマスアクアティクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ｐｏｌＩ、パイロコッカスフリオサス（Pyrccoccus furiosus）（Ｐｆｕ）、パイロコッカスウォーセイ（Pyrococcus woesei）（Ｐｗｏ）、サーマスフラバス（Thermus flavus）（Ｔｆｌ）、サーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）、サーマスリトリス（Thermus litoris）（Ｔｌｉ）、およびサーモトガマリタイム（Thermotoga maritime）（Ｔｍａ）が含まれる。これらの酵素、これらの酵素の修飾されているバージョン、および酵素の組合せは、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含めた業者から市販されている。代表的な酵素には、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）（New England Biolabs、Ipswich、MA）、Ｈｏｔ  ＭａｓｔｅｒＴａｑ（商標）（Eppendorf）、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｐｘ（Finnzymes）、ＰｙｒｏＳｔａｒｔ（登録商標）（Fermentas）、ＫＯＤ（EMD Biosciences）、Ｚ−Ｔａｑ（TAKARA）、およびＣＳ３ＡＣ／ＬＡ（KlenTaq、University City、MO）が含まれる。
【０１４２】
塩およびバッファーには、それぞれＭｇＣｌ２、ならびにＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものなど、当業者にはなじみのあるものが含まれる。バッファーは、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの添加剤、ならびに当業者にはなじみのあるその他のものを含むことができる。ヌクレオチドは一般的に、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、標的核酸の増幅に十分な量を反応にやはり加える。
標的および偽標的核酸分子
「標的」および／または「偽標的」は、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｓｓ）の核酸であってよい。一本鎖の標的／偽標的、ｓｓプライマーのＳＤ／ＰＤもしくはｄｓブロッカーのＩＴ／ＢＴドメインに結合する二本鎖の標的／偽標的の鎖、またはｓｓプライマーのＳＤ／ＰＤもしくはｄｓブロッカーのＩＴ／ＢＴドメインに結合する二本鎖増幅生成物の鎖を標的／偽標的鎖と呼ぶ。いくつかの実施形態において、標的核酸は稀なアレルである。「アレル」は、同じ遺伝子または同じ遺伝子の遺伝子座の数々の代替的な形態のうちの１つである。アレルは、変更、挿入、または欠失の形態における単一のヌクレオチドが相互に異なってもよい。本明細書で用いる、「野生型アレル」は、所与の複数の核酸における主要な（よりまたは最も一般的な）アレルを意味し得る。反対に、「稀なアレル」は、同じ複数の核酸におけるマイナーな（あまりまたは最も一般的でない）アレルを意味し得る。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子Ｘをコードする複数の核酸は、アレルＸＢよりアレルＸＡを１０倍から１００００００倍、または１００倍から１００００００倍多く含み得、アレルＸＡおよびアレルＸＢは単一のヌクレオチドが異なる。アレルＸＡは「野生型アレル」であるとみなされ、アレルＸＢは「稀なアレル」であるとみなされる。「偽標的」は、標的配列に類似であり、ヌクレオチドが１、２、３、４、または５つ異なる配列を有する。よって、「野生型アレル」および「偽標的アレル」は、いくつかの実施形態において、交換可能に用いることができる。標的核酸は本明細書において、遺伝子／アレルの同定に関してしばしば言及され、本発明は遺伝子／アレルの検出に限定されない。他の核酸は、本発明の様々な態様および実施形態にしたがって検出／増幅され得る。
【０１４３】
標的および／または偽標的核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または逆転写にかけられたＲＮＡのＤＮＡ生成物であってよい。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物（キメラ）であってよい。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的は、人工的な核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（Nielsen et al. Science 254(5037): 1497-500 (1991)）またはロックド核酸（Alexei et al. Tetrahedron 54(14): 3607-30 (1998)）を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的は、天然に存在してもよく（例えば、ゲノムＤＮＡ）、または合成でもよい（例えば、ゲノムライブラリーから）。本明細書で用いる、「天然に存在する」核酸配列は、ヒトの介入なしで天然に存在する生物体またはウイルスの核酸分子に存在する配列である。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはｐｉｗｉ−ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的核酸は、生物体またはウイルスに天然に存在する核酸である。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的核酸は、病原性生物またはウイルスの核酸である。いくつかの実施形態において、対象における標的および／または偽標的核酸の存在または非存在は、対象が疾患もしくは障害を有し、または疾患もしくは障害を獲得する素因があることを指摘する。いくつかの実施形態において、対象における標的核酸の存在または非存在は、対象が、疾患もしくは障害を処置するための薬物などの処置に良好に応答するか、またはあまり応答しないかを指摘する。
【０１４４】
核酸の語は、デオキシリボヌクレオチドでも、もしくはリボヌクレオチドでも、またはこれらの類似体でも、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体形態を意味する。核酸はあらゆる三次元構造であってよく、あらゆる機能を行うことができる。以下は核酸の非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、連鎖解析から規定した遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝状核酸、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。核酸は、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されているヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合は、ポリマーの集合の前または後に与えることができる。核酸は、標識化成分とのコンジュゲートなどによって、さらに修飾することができる。
【０１４５】
操作された核酸は天然に存在しない核酸であり、組換え核酸および合成の核酸を含む。「組換え核酸」は、核酸分子を一緒にすることによって構築される分子を意味し得、いくつかの実施形態において、生存細胞中で複製することができる。「合成核酸」は、化学的に、または他の方法で修飾されるが天然に存在する核酸分子と塩基対形成することができるものを含めた、化学的に、または他の手段によって合成または増幅される分子を意味し得る。組換えおよび合成の核酸には、前述のいずれかの複製に起因する分子も含まれる。「単離された核酸」は、（１）「単離された核酸」が天然に見出される細胞と関連せず、および／または（２）天然では連結されていない核酸に作動可能に連結された、天然、組換え、もしくは合成起源の、またはこれらのいくつかの組合せの核酸を意味し得る。
【０１４６】
核酸は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに修飾された塩基、糖、およびバックボーンを含む代替の核酸のあらゆる全ての形態も包含し得る。よって、「核酸」という語には、それだけには限定されないが、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（および部分的に一本鎖または部分的に二本鎖であってよいこれらの形態）、ｃＤＮＡ、アプタマー、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、２’−５’ＤＮＡ（ＤＮＡのＡ立体配置に適合する塩基スペーシングを有する短縮されたバックボーンを有する合成材料；２’−５’ＤＮＡはＢ形態のＤＮＡと通常はハイブリダイズしないが、ＲＮＡと容易にハイブリダイズする）、およびロックド核酸（「ＬＮＡ」）が含まれることを理解されよう。「オリゴヌクレオチド」は、短い一本鎖核酸を意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの長さは、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、または５０ヌクレオチド未満である。核酸類似体には、同様の、または改善された、結合の、塩基対形成のハイブリダイゼーションの性質を有する天然のヌクレオチドの知られている類似体が含まれる。「類似の」形態のプリンおよびピリミジンは当技術分野ではよく知られており、それだけには限定されないが、アジリジニルシトシン（aziridinylcytosine）、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。本明細書に提供するＤＮＡバックボーン類似体には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カーバメート、モルホリノカーバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート連結または代替のメチルホスホネートおよびホスホジエステル連結（Strauss-Soukup, 1997, Biochemistry 36:8692-8698）、およびベンジルホスホネート連結が含まれ、米国特許第６，６６４，０５７号に論じられている通りであり、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６００巻、ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編集（ＮＹＡＳ  １９９２年）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ、１９９３年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、３６巻：１９２３〜１９３７頁；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）も参照されたい。本明細書の核酸は、細胞から抽出しても、または当業者には知られているあらゆる手段にしたがって合成的に調製してもよく、例えば、核酸を化学的合成し、または他の供給源のなかでもｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡから転写もしくは逆転写してもよい。
【０１４７】
本明細書で用いる、２つの核酸または核酸ドメインは、相互に塩基対形成して二本鎖核酸分子を形成する場合は、相互に「相補的」である。２つの核酸または核酸ドメインは、一方の核酸のあらゆるヌクレオチドが他の核酸のあらゆるヌクレオチドと塩基対形成することができる場合は、相互に「完璧に相補的」である。例えば、５’−ＡＴＴＧＣＴＧＡＣＣ−３’（配列番号５４）の配列を有するドメインは、５’−ＧＧＴＣＡＧＣＡＡＴ−３’（配列番号５５）の配列を有するドメインに対して完璧に相補的である。本明細書において、別段の指摘がなければ、相補性は完璧に相補的であることが想定される。本明細書で用いる、２つの核酸または核酸ドメインは、２つのドメインを単独で、または他の分子もしくは部分に付着させて用いるときに、２つのドメインは完全に相補的ではないが相互に結合して不完全な二重鎖を形成することができる場合、相互に「部分的に相補的」である。本明細書で用いる、不完全な二重鎖は、ミスマッチ、バルジ、および／または内部ループによって中断される核酸二重鎖である。本明細書で用いる、２つの核酸または核酸ドメインは、適切にアラインしたとき、７４％を超える（例えば、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）配列が同一である場合、「類似の」配列を有する。
【０１４８】
本明細書で利用する標的および／または偽標的核酸は、ヒト核酸、細菌核酸、またはウイルス核酸など、あらゆる核酸であってよい。標的および／または偽標的核酸の試料は、例えば、１つまたは複数の細胞、組織、または体液からの核酸試料であってよい。標的の試料は、それだけには限定されないが、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物学的供給源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検、針吸引生検、癌、腫瘍、組織、細胞、細胞可溶化物、粗製細胞可溶化物、組織可溶化物、組織培養細胞、頬側スワブ、洗口液、糞便、ミイラ化組織、法医学的供給源、剖検、考古学的供給源、感染症、院内感染、生成供給源（production source）、薬物調製物、生物学的分子生成物、タンパク質調製物、脂質調製物、炭水化物調製物、無生物物体（inanimate object）、空気、土壌、樹液、金属、化石、掘削土、ならびに／または他の地球上もしくは地球外の材料および供給源を含めたあらゆる供給源に由来してよい。試料は、１つの供給源または様々な供給源からの材料の混合物も含むことができる。例えば、このような感染した細胞または組織からの核酸を開示した方法を用いて増幅する場合、感染性の細菌またはウイルスの核酸をヒト核酸と一緒に増幅することができる。有用な標的試料のタイプには、真核生物試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚試料、哺乳動物試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、癌試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞可溶化物試料、粗製細胞可溶化物試料、組織可溶化物試料、組織培養細胞試料、頬側スワブ試料、洗口液試料、糞便試料、ミイラ化組織試料、剖検試料、考古学的試料、感染症試料、院内感染試料、生成物試料、薬物調製物試料、生物学的分子生成試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、炭水化物調製物試料、無生物物体試料、空気試料、土壌試料、樹液試料、金属試料、化石試料、掘削土試料、および／または他の地球上もしくは地球外の試料が含まれる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本明細書で利用する標的および／または偽標的核酸は、反復配列、二次構造、および／または高Ｇ／Ｃ含量を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的核酸は、長さ約１００から約１００００００ヌクレオチド（ｎｔ）または塩基対（ｂｐ）である。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的核酸は、長さ約１００から約１０００、約１０００から約１００００、約１００００から約１０００００、または約１０００００から約１００００００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的核酸は、長さ約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約３００００、約４００００、約５００００、約６００００、約７００００、約８００００、約９００００、約１０００００、約２０００００、約３０００００、約４０００００、約５０００００、約６０００００、約７０００００、約８０００００、約９０００００、または約１００００００ヌクレオチドである。標的および／または偽標的核酸は、より長い核酸の状況において（例えば、染色体または染色体フラグメント内のコード配列または遺伝子など）提供され得ることを理解されたい
いくつかの実施形態において、標的および／または偽標的核酸は直鎖状であり、他の実施形態において、標的および／または偽標的核酸は環状（例えば、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、もしくはプラスミドＤＮＡ）である。
用途
本開示は、いくつかの実施形態において、腫瘍細胞から（例えば、循環血中に）放出される、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出するのに用いてもよい。循環腫瘍ＤＮＡは、腫瘍特異的変異の存在によって、正常細胞から放出される同じ遺伝子座のＤＮＡと区別することができる。よって、いくつかの実施形態において、本発明は循環腫瘍ＤＮＡを検出する方法を提供し、方法は、（ａ）対象から得た試料を、短い３’プライミングドメイン（ＰＤ）に連結された５’特異性ドメイン（ＳＤ）を含む操作されたプライマーと接触させる工程であって、特異性ドメインは対象からの標的ｃｔＤＮＡ上のＳＤ結合部位に結合し、プライミングドメインは特異性結合部位の上流にある標的ｃｔＤＮＡ上のＰＤ部位に結合する、工程と、（ｂ）操作されたプライマーをその３’末端で、特異性ドメインを置き換えるポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、操作されたプライマーが結合している標的核酸を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーが結合している標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、本発明は循環腫瘍ＤＮＡを検出する方法を提供し、方法は、（ａ）対象から得た試料を、特異性ドメイン（ＳＤ）、プライミングドメイン（ＰＤ）、および競合性ドメイン（ＣＤ）を含む操作されたプライマーと接触させる工程であって、ＳＤはＰＤと共有結合性または非共有結合性に連結されており、ＳＤは、対象からの標的ｃｔＤＮＡ鎖上のＳＤ結合部位に結合し、プライミングドメインは、ＳＤ結合部位の下流にある標的ｃｔＤＮＡ鎖上のＰＤ部位に結合する、工程と、（ｂ）操作されたプライマーをＰＤの３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標的核酸を、操作されたプライマーを用いて増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーが結合している標的核酸を、等温核酸増幅反応によって増幅する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明は循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する方法を提供し、方法は、対象から得た試料を、（ａ）ｃｔＤＮＡに結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖のプライマーであって、第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および（ｉｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成されており、二本鎖偽標的非特異性ドメインは、偽標的核酸に結合している一本鎖偽標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である、部分的に二本鎖のプライマーと接触させる工程と、（ａ）の無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の操作された一本鎖プライマーが結合したｃｔＤＮＡを増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の操作された一方鎖プライマーが結合しているｃｔＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する方法を提供し、方法は、対象から得た試料を、（ａ）ｃｔＤＮＡに結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）１つまたは複数の分子を含む操作された分子複合体であって、１つまたは複数の分子は、（ｉ）１つの偽標的非特異性相互作用対、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性二重鎖、および（ｉｉｉ）１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成されており、偽標的非特異性相互作用対は、前述の分子複合体の残りに接続されていない場合は、分子複合体を用いようとする条件下で１０ｍＭ以下の解離定数を有する、２つの相互作用する部分を含む、操作された分子複合体と接触させる工程と、（ａ）の無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の無差別プライマーおよび（ｂ）の操作された分子複合体を用いてｃｔＤＮＡを増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、ｃｔＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、ｃｔＤＮＡを等温増幅反応によって増幅する。
【０１５４】
本発明は、いくつかの実施形態において、臓器移植レシピエントにおけるドナー細胞から放出されるＤＮＡを検出するのに用いてもよい。移植後の臓器拒絶反応のモニタリングは、レシピエント細胞から放出されたＤＮＡの過剰なバックグラウンドにおける、ドナー細胞から放出されたＤＮＡの検出および定量を必要とする。よって、いくつかの実施形態において、本発明は、ドナー対象から臓器移植した後のレシピエント対象における臓器拒絶反応をモニタリングする方法を提供し、方法は、（ａ）レシピエント対象から得た試料を、短い３’プライミングドメインに連結された５’特異性ドメインを含む操作されたプライマーと接触させる工程であって、特異性ドメインは、標的のドナーアレル上の特異性結合部位に結合し、プライミングドメインは、特異性結合部位の上流にある標的ドナーアレル上のプライミング結合部位に結合する、工程と、（ｂ）操作されたプライマーをその３’末端で、特異性ドメインを置換するポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、操作されたプライマーが結合している標的ドナーアレルを増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーが結合している標的ドナーアレルを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【０１５５】
本発明は、いくつかの実施形態において、臓器移植レシピエントにおけるドナー細胞から放出されるＤＮＡを検出するのに用いてもよい。移植後の臓器拒絶反応のモニタリングは、レシピエント細胞から放出されたＤＮＡの過剰なバックグラウンドにおける、ドナー細胞から放出されたＤＮＡの検出および定量を必要とする。よって、いくつかの実施形態において、本発明は、ドナー対象から臓器移植した後のレシピエント対象における臓器拒絶反応をモニタリングする方法を提供し、方法は、（ａ）レシピエント対象から得た試料を、特異性ドメイン（ＳＤ）、プライミングドメイン（ＰＤ）、および競合性ドメイン（ＣＤ）を含む、操作されたプライマーと接触させる工程であって、ＳＤはＰＤと共有結合性または非共有結合性に連結されており、ＳＤは、標的ドナーアレル鎖上のＳＤ部位に結合し、ＰＤは、ＰＤ結合部位の下流にある標的ドナーアレル鎖上のＰＤ結合部位に結合する、工程と、（ｂ）操作されたプライマーをＰＤの３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標的ドナーアレルを、（ａ）の操作されたプライマーを用いて増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、標的ドナーアレルをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、標的ドナーアレルを等温増幅反応によって増幅する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ドナー対象から臓器移植した後のレシピエント対象における臓器拒絶反応をモニタリングする方法を提供し、方法は、レシピエント対象から得た試料を、（ａ）標的ドナーアレルに結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖のプライマーであって、第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖レシピエントアレル非特異性ドメイン、（ｉｉ）１つの二本鎖レシピエントアレル特異性ドメイン、および（ｉｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖レシピエントアレル特異性ドメインで構成されており、二本鎖レシピエントアレル非特異性ドメインは、レシピエントアレル核酸に結合している一本鎖レシピエントアレル特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である、部分的に二本鎖のプライマーと接触させる工程と、（ａ）の操作された一本鎖プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の操作された一本鎖プライマーが結合した標的のドナーアレルを増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の操作された一本鎖プライマーが結合した標的ドナーアレルを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ドナー対象から臓器移植した後のレシピエント対象における臓器拒絶反応をモニタリングする方法を提供し、方法は、レシピエント対象から得た試料を、（ａ）標的ドナーアレルに結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）１つまたは複数の分子を含む操作された分子複合体であって、１つまたは複数の分子は、（ｉ）１つの偽標的非特異性相互作用対、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性二重鎖、および（ｉｉｉ）１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成されており、偽標的非特異性相互作用対は、前述の分子複合体の残りに接続していない場合、分子複合体を用いようとする条件下で１０ｍＭ以下の解離定数を有する２つの相互作用部分を含む、操作された分子複合体と接触させる工程と、（ａ）の無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の無差別プライマーおよび（ｂ）の操作された分子複合体を用いて標的ドナーを増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、標的ドナーアレルをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、標的ドナーアレルを等温増幅反応によって増幅する。
【０１５８】
本発明は、いくつかの実施形態において、試料中の薬物抵抗性微生物の存在を検出するのに用いてもよく、これには薬物感受性の対応物から核酸のバックグラウンドにおける薬物抵抗性微生物からの核酸の検出および定量が必要とされる。よって、いくつかの実施形態において、本発明は、薬物抵抗性微生物から核酸を検出する方法を提供し、方法は、（ａ）微生物の試料を、短い３’プライミングドメインに連結された５’特異性ドメインを含む操作されたプライマーと接触させる工程であって、特異性ドメインは、薬物抵抗性微生物からの標的核酸上の特異性結合部位に結合し、プライミングドメインは、特異性結合部位の上流にある標的核酸上のプライミング結合部位に結合する、工程と、（ｂ）操作されたプライマーをその３’末端で、特異性ドメインを置換するポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、操作されたプライマーが結合している核酸を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、操作されたプライマーが結合している標的の核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【０１５９】
本発明は、いくつかの実施形態において、試料中の薬物抵抗性微生物の存在を検出するのに用いてもよく、方法は薬物感受性の対応物からの核酸のバックグラウンドにおいて薬物抵抗性微生物からの核酸の検出および定量を必要とする。よって、いくつかの実施形態において、本発明は、薬物抵抗性微生物からの核酸を検出する方法を提供し、方法は、（ａ）微生物の試料を、特異性ドメイン（ＳＤ）、プライミングドメイン（ＰＤ）、および競合性ドメイン（ＣＤ）を含む、操作されたプライマーと接触させる工程であって、ＳＤはＰＤと共有結合性または非共有結合性に連結されており、ＳＤは、薬物抵抗性微生物からの標的核酸上のＳＤ結合部位に結合し、ＰＤは、ＳＤ結合部位の下流にある、標的核酸上のＰＤ結合部位に結合する、工程と、（ｂ）操作されたプライマーのＰＤを３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、核酸を、操作されたプライマーを用いて増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、標的核酸を、等温増幅反応によって増幅する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本発明は、薬物抵抗性微生物からの核酸を検出する方法を提供し、方法は、微生物の試料を、（ａ）薬物抵抗性微生物からの標的核酸に結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖のプライマーであって、第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖薬物感受性標的非特異性ドメイン、（ｉｉ）１つの二本鎖薬物感受性標的特異性ドメイン、および（ｉｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖薬物感受性標的特異性ドメインで構成されており、二本鎖薬物感受性標的非特異性ドメインは、薬物感受性標的核酸に結合している一本鎖薬物感受性標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端は伸長不可能である、部分的に二本鎖のプライマーと接触させる工程と、（ａ）の操作された一本鎖プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の操作された一本鎖プライマーが結合した標的核酸を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の操作された一本鎖プライマーが結合した標的核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本発明は、薬物抵抗性微生物から核酸を検出する方法を提供し、方法は、微生物の試料を、（ａ）薬物抵抗性微生物からの標的核酸に結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）（ｉ）１つの偽標的非特異性相互作用対、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性二重鎖、および（ｉｉｉ）１つの一本鎖偽標的特異性ドメインに配置した１つまたは複数の分子を含む、操作された分子複合体と接触させる工程であって、偽標的非特異性相互作用対は、前述の分子複合体の残りに接続していない場合、分子複合体を用いようとする条件下で１０ｍＭ以下の解離定数を有する２つの相互作用部分を含む、工程と、（ａ）の無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）の無差別プライマーおよび（ｂ）の操作された分子複合体を用いて標的核酸を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。いくつかの実施形態において、標的核酸を等温増幅反応によって増幅する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、試料は、組織試料、あるいは例えば、血液（例えば、血漿または血清）試料、唾液試料、もしくは尿試料などの生体液試料である。他の生物学的試料を、本発明にしたがって用いてもよく、本明細書の他所に記載する。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、微生物は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）細胞などの細菌細胞である。
組成物
様々な他の態様において、本発明は、ｓｓプライマーおよび／またはｄｓブロッカーを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、ｓｓプライマーおよび／またはｄｓブロッカー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファー、塩、または前述のあらゆる２つ以上の組合せを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、本発明のｓｓプライマー、標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｓｓプライマー、標的核酸、および偽標的核酸を含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｓｓプライマー、標的核酸、偽標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。
【０１６５】
他の実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸、および偽標的核酸を含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸、偽標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸に結合する一本鎖プライマー、標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸に結合する一本鎖プライマー、標的核酸、および偽標的核酸を含む組成物を本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓブロッカー、標的核酸に結合する一本鎖プライマー、標的核酸、偽標的核酸、およびポリメラーゼを含む組成物を本明細書に提供する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、組成物は、３’プライミングドメインに連結された５’特異性ドメインを含む、操作された一本鎖プライマーに結合した核酸を含み、特異性ドメインは標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合しており、プライミングドメインは、特異性結合部位の上流にある標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合している。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）無差別プライマー、ならびに（ｂ）最初のトーホールドドメイン、分岐点移動ドメイン、およびバランシングトーホールドドメインを含むブロッカー鎖に結合した核酸を含み、この場合、または任意選択により、ブロッカー鎖の３’末端は伸長不可能である。
【０１６８】
本発明は、本明細書に記載するあらゆる２つ以上の試薬を含む組成物も企図するものである。
キット
様々な他の態様において、本発明は、ｓｓプライマーおよび／またはｄｓブロッカーを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ｓｓプライマーおよび／またはｄｓブロッカー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、バッファー、塩、または前述のあらゆる２つ以上の組合せを含む。
【０１６９】
本発明は、任意選択により容器に梱包／包装されている、本明細書に記載するあらゆる２つ以上の試薬を含むキットも企図する。
【０１７０】
本開示のｓｓプライマーには、いくつかの実施形態において、ＳＤに対する標的鎖の結合の反応のいくらかのエントロピー変化をキャンセルするように設計された競合性ドメイン（ＣＤ）が含まれる。このようなエントロピーのキャンセルにより、驚くべきことに、反応条件の許容範囲が拡張される。その結果、ｓｓプライマーは、ｓｓプライマーがＣＤに稀な標的アレルを効果的に濃縮させることができなくても、稀な標的アレルを効果的に濃縮することができる（実施例２を参照されたい）。
【０１７１】
本開示のｄｓブロッカーには、ブロッカー鎖に対する標的鎖の結合の反応のいくらかのエントロピー変化をキャンセルするように設計されているプロテクター鎖が含まれる。このようなエントロピーのキャンセルにより、驚くべきことに、反応条件の許容範囲が拡張される。その結果、４０ｎｔほどの長さの（ＩＴ−ＢＭ）ドメインを有するｄｓブロッカーは（実施例６を参照されたい）、標的：ＩＴ−ＢＭ二重鎖のアニーリング温度より＞１０℃低いアニーリング温度で、稀な標的アレルを効果的に濃縮することができる（実施例２を参照されたい）。
追加の実施形態
以下の番号を付けた段落に記載する実施形態も本明細書に企図するものである：
１．標的核酸および偽標的核酸のプールを、３’プライミングドメインに連結された５’特異性ドメインを含む操作された一本鎖プライマーと接触させる工程であって、特異性ドメインが標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合し、プライミングドメインが特異性ドメイン結合部位の上流にある標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合する、工程と、操作された一本鎖プライマーがその３’末端で、標的核酸から操作されたプライマーの特異性ドメインを置換するポリメラーゼの存在下で標的に相補的な方式で伸長させる工程を含む方法。
２．ポリメラーゼが、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｂｓｍポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｃｓａポリメラーゼ、または９６−７ポリメラーゼである、パラグラフ２に記載の方法。
３．操作された一本鎖プライマーが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および／またはモルフォリノを含む、パラグラフ２または３に記載の方法。
４．特異性ドメインおよびプライミングドメインが、５’−３’連結を介して相互に連結されている、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．特異性ドメインおよびプライミングドメインが５’−５’連結を介して相互に連結されている、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載の方法。
６．特異性ドメインの３’末端がブロッキング部分を含む、パラグラフ５に記載の方法。
７．プライマーが、特異性ドメインとプライミングドメインとの間に伸長不可能なヌクレオチドが位置する連続した配列である、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．伸長不可能なヌクレオチドが、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、パラグラフ１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．天然に存在しないヌクレオチドが、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、またはデオキシウリジンである、パラグラフ１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．特異性ドメインおよびプライミングドメインが化学的リンカーを介して連結されている、パラグラフ１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．化学的リンカーがポリエチレングリコール、アルキルスペーサー、ＰＮＡ、またはＬＮＡである、パラグラフ１０に記載の方法。
１２．特異性ドメインおよびプライミングドメインが相互に化学的にコンジュゲートしている、パラグラフ１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１３．特異性ドメインおよびプライミングドメインが、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加によって相互に化学的にコンジュゲートしている、パラグラフ１２に記載の方法。
１４．特異性ドメインおよびプライミングドメインが、一本鎖オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより、または相互のハイブリダイゼーションにより相互に連結されている、パラグラフ１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１５．プライミングドメインが特異性ドメインよりも短い、パラグラフ１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．特異性ドメインがヘアピン構造を形成する、パラグラフ１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．特異性ドメインが部分的に二本鎖である、パラグラフ１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．標的核酸が一本鎖である、パラグラフ１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、パラグラフ１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．標的核酸が単一コピーまたは低コピーで存在する、パラグラフ１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．標的核酸が、その野生型の対応物の核酸に比べて少なくとも１つの変異を含む、パラグラフ１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．標的核酸が一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、パラグラフ２１に記載の方法。
２３．操作されたプライマーに結合した核酸を増幅する工程をさらに含む、パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．操作されたプライマーが結合している核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、パラグラフ２３に記載の方法。
２５．標的核酸および偽標的核酸のプールを、（ａ）標的核酸に結合する無差別プライマー、ならびに（ｂ）第１および第２の核酸鎖を含む操作された部分的に二本鎖の核酸であって、第１および第２の核酸鎖は、（ｉ）１つの二本鎖偽標的非特異性ドメイン、（ｉｉ）１つの二本鎖偽標的特異性ドメイン、および（ｉｉｉ）第１の核酸鎖に付与された１つの一本鎖偽標的特異性ドメインで構成されており、二本鎖偽標的非特異性ドメインが、偽標的核酸に結合している一本鎖偽標的特異性ドメインに対する標準自由エネルギーにおよそ等しい標準自由エネルギーを有し、第１の核酸鎖の３’末端および第２の核酸鎖の３’末端が伸長不可能である、部分的に二本鎖の核酸と接触させる工程と、（ａ）の無差別プライマーをその３’末端で、ポリメラーゼの存在下で、標的に相補的な方式で伸長させる工程とを含む方法。
２６．第１の核酸鎖および／または第２の核酸鎖がその３’末端に伸長不可能なヌクレオチドを含む、パラグラフ２５に記載の方法。
２７．伸長不可能なヌクレオチドが、天然に存在しないヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、パラグラフ２５に記載の方法。
２８．天然に存在しないヌクレオチドが、ｉｓｏＣ、ｉｓｏＧ、またはデオキシウリジンである、パラグラフ２５〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２８．（ａ）の無差別プライマーの長さが約４〜３５ヌクレオチドである、パラグラフ２５〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．（ｂ）の二本鎖偽標的非特異性ドメインが長さ約４〜２１ヌクレオチドである、パラグラフ２５〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．（ｂ）の一本鎖偽標的特異性ドメインが長さ約４〜２０ヌクレオチドである、パラグラフ２５〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．第１および第２の核酸鎖が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および／またはモルフォリノを含む、パラグラフ２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．標的核酸が単一コピーまたは低コピーで存在する、パラグラフ２５〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．標的核酸が、その野生型の対応物に比べて少なくとも１つの変異を含む、パラグラフ２５〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３５．標的核酸が一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、パラグラフ２５〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．（ａ）の無差別プライマーが結合している標的核酸を増幅する工程をさらに含む、パラグラフ２５〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．（ａ）の無差別プライマーが結合している標的核酸がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、パラグラフ３６に記載の方法。
３８．３’プライミングドメインに連結された５’特異性ドメインを含み、特異性ドメインは標的核酸上の特異性ドメイン結合部位に結合し、プライミングドメインは特異性ドメイン結合部位の上流にある標的核酸上のプライミングドメイン結合部位に結合している、操作された一本鎖プライマーに結合した核酸。
３９．（ａ）無差別プライマー、ならびに（ｂ）最初のトーホールドドメイン、分岐点移動ドメイン、およびバランシングトーホールドドメインを含むブロッカー鎖に結合した核酸であって、この場合、または任意選択により、ブロッカー鎖の３’末端が伸長不可能である、核酸。
４０．（ａ）標的鎖の第１の領域に結合する第１のドメイン、（ｂ）標的鎖の第２の領域に結合する第２のドメイン、（ｃ）その配列が、第１のドメインの全体の一部に相補的であるか、部分的に相補的であるか、同一であるか、または類似する第３のドメインを含む、オリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチドであって、（ｉ）前記第２の領域は標的鎖上の前記第１の領域の下流であり、（ｉｉ）前記第２のドメインは、ポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含み、（ｉｉｉ）第１のドメインおよび第２のドメインは、共有結合性または非共有結合性の相互作用によって接続されている、オリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４１．第１の領域が多型を含む、パラグラフ４０に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４２．第１のドメインおよび第２のドメインが共有結合性に連結されている、パラグラフ４０に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４３．第１のドメインおよび第２のドメインが非共有結合性に連結されている、パラグラフ４０に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４４．第１のドメインと第２のドメインとの間の非共有結合性の相互作用が核酸ハイブリダイゼーションである、パラグラフ４３に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４５．第３のドメインの配列が、第１のドメインの配列の全体の一部に同一であり、または類似する、パラグラフ４０に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４５．第３のドメインが、標的鎖の付加的な領域に相補的である付加的なドメインに接続されている、パラグラフ４０に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４６．第３のドメインが、第１のドメインの全体の一部に相補的であり、または部分的に相補的である、パラグラフ４０に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４７．第１のドメインが第１の化学的部分に付着しており、第２のドメインが第２の化学的部分に付着しており、第１の化学的部分が第２の化学的部分と相互作用する、パラグラフ４６に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４８．第１の部分と第２の部分との間の相互作用が直接的である、パラグラフ４７に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
４９．第１の部分と第２の部分との間の相互作用が間接的である、パラグラフ４７に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
５０．第１の部分と第２の部分との間の相互作用が、直接的相互作用および間接的相互作用の両方を含む、パラグラフ４７に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
５１．第１の部分および第２の部分が、相補的または部分的に相補的な核酸である、パラグラフ４７に記載のオリゴヌクレオチドまたは１セットのオリゴヌクレオチド。
【実施例】
【０１７２】
実施例１：ｓｓプライマー核酸増幅
特異性ドメイン（ＳＤ）は、鋳型に対するプライミングドメイン（ＰＤ）の結合を安定化するのを助けることができるか否かを決定するために、長さ２０ヌクレオチドのＳＤ、および長さ１５ヌクレオチドのＰＤを使用した。２つのドメイン間のリンカーは、チミジンヌクレオチド８個の後にトリエチレングリコール部分が続いたものであった。フォワード（foresght）プライマーの配列は、５’−ＧＣＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｉＳｐ９／ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣ−３’（配列番号６）であった。本発明のｓｓプライマーをＰＣＲ反応におけるフォワードプライマーとして用い、定形的なプライマー（配列：５’−ＡＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＴＣＡＣＣＧ−３’；配列番号７）をリバースプライマーとして用いた。リンカーの長さが、ｓｓプライマーを用いた増幅生成物の収率にどのように影響を及ぼすかを試験するために、３つのオリゴヌクレオチドを別々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における鋳型とした（表１）。
【０１７３】
【表１】
2016524917.tif 000007
【０１７４】
鋳型１の配列を含む８ｋｂのプラスミドを、別々のＰＣＲにおける鋳型としてやはり用いた。ＰＣＲを以下の通り設定した。各プライマーの濃度は４００ｎＭであった。鋳型の濃度は１．２５ｐＭ（オリゴヌクレオチドを鋳型として用いた場合）、または４ｐｇ／μＥ（プラスミドを鋳型として用いた場合）であった。各ＰＣＲ反応の体積は４０μＬであった。各反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Ipswich、MA）２単位（Ｕ）、および各ｄＮＴＰ２００ｎＭを補った１×Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、（New England Biolabs、Ipswich、MA）を含んでいた。以下のサーマルサイクルプログラムを反応に用いた：（１）９５℃、３分、（２）９５℃、１５秒、（３）５０℃、４５秒、（４）７２℃、１５秒、（５）（２）へ戻り、さらなる３４サイクル、および（６）４℃で維持。
【０１７５】
２群の生成物が観察された（図９における「ａ」群および「ｂ」群）。「ａ」群の上の強いバンドは、全長のｓｓプライマーを含む二本鎖生成物を表す。「ａ」群の下の弱いバンドは、ＳＤのない増幅された生成物を表し得る、というのは、このドメインはＴａｑの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解され得るからである。いくつかのプライマーは合成の間に５’から５’連結を自発的に形成するという事実により、「ｂ」群の増幅された生成物は、正しいＰＣＲ生成物のダイマーであると考えられる。
【０１７６】
対照として、ＰＤおよびリンカー（配列：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｉＳｐ９／ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣ−３’；配列番号１１）のみを含むプライマーを、同一のセットの反応においてｓｓプライマーの代わりに用いた。図９に示す通り、ｓｓプライマーが生じた予想したサイズの生成物を用いると、ＰＤおよびリンカーのみを含むプライマーは生成物を殆どまたは全く生じなかった。
【０１７７】
実施例２：ｓｓプライマーベースの稀なアレルの濃縮
ｄｓＷＴ、ｄｓＭｕｔ、およびｄｓＭｕｔＩｎｓと名付けた、３種のｄｓＤＮＡ鋳型を調製した。これらｄｓＤＮＡ鋳型の配列のポーションを表２に示す。ｄｓＷＴおよびｄｓＭｕｔは、示した配列の５０位の１塩基対が異なる。ｄｓＭｕｔＩｎｓは、示した配列の１０８位と１０９位との間に挿入された付加的な一続きの配列ＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＴＴＡ（配列番号４４）（センス鎖上）を有するｄｓＭｕｔを表す。この挿入は、電気泳動ベースの分析の際、ｄｓＷＴ／ｄｓＭｕｔおよびｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物を区別するためのマーカーとして働く。３つのｄｓＤＮＡは全て、表２に示す配列の５’および３’の短い（＜２００ｂｐ）フランキング配列を有するが、これらのフランキング配列および挿入配列ＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＴＴＡ（配列番号４５）は、反応において提供されるあらゆるオリゴヌクレオチドと著しく相互作用しないことが予想される。
【０１７８】
ＴＭ１およびＴＭ２と名付けた２つの鋳型混合物を調製した。ＴＭ１は、ｄｓＷＴを１マイクロリットルあたり約２００００コピー、およびｄｓＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり約２００コピー含んでいた。ＴＭ２は、ｄｓＭｕｔを１マイクロリットルあたり約２００００コピー、およびｄｓＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり約２００コピー含んでいた。
【０１７９】
ｓｓプライマーＡ、ｓｓプライマーＢ、およびｓｓプライマーＣと名付けた、３バージョンのｓｓプライマー（または対照としてｓｓプライマーに類似の構築物）を設計した。
【０１８０】
ｓｓプライマーＢは、図２Ｃ、下右に示す設計の一例である。ｓｓプライマーＢにおいて、ＳＤは鎖ＳＤ１７ｔ１６の一部であり、ＳＤ１７ｔ１６は以下の配列を有し：５’−ＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡｔＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＧＣｇＧＧＣＣＡＡＡＣｃｔｃｔａｃｔｔｃａｔａｃａｃｃ／３ＩｎｖｄＴ／−３’（配列番号１２）、配列「ＴＴＴＴＧＧＧＣｇＧＧＣＣＡＡＡＣ」（配列番号４６）を有するセグメントはＳＤとして機能し、配列「ｃｔｃｔａｃｔｔｃａｔａｃａｃｃ」を有するセグメントはＡＭとして機能し、配列「ＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡ」（配列番号４７）を有するセグメントはＨＤとして機能し、配列「ｔＣＴＴＴＡＴＴ」を有するセグメントはＨＤとＳＤとの間のリンカーとして機能し、部分「３ＩｎｖｄＴ／」は、ＳＤ１７ｔ１６が３’末端で伸長するのを妨げる３’逆方向（inverted）ｄＴ修飾である。ｓｓプライマーＢにおいて、ＰＤは、以下の配列５’−ＴＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡＡ／ｉＳｐｌ８／／ｉＳｐｌ８／ａａｃｇｔａｃｔｇｇｔｇａ−３’（配列番号１３）のＰＤ１３鎖の一部であり、配列「ＴＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡＡ」（配列番号４８）を有るセグメントはＨＤ＊として機能し、配列「ａａｃｇｔａｃｔｇｇｔｇａ」（配列番号５７）を有するセグメントはＰＤとして機能し、部分「／ｉＳｐｌ８／／ｉＳｐｌ８／」は、ＰＤ１３の伸長生成物がＰＣＲのサイクルを確実にする上で鋳型として働く場合、ＤＮＡポリメラーゼがＰＤを通り越してコピーするのを妨げるエチレングリコールリンカーである。ｓｓプライマーＢにおいて、ＣＤは、以下の配列：５’−ｇｔｇｔａｔｇａａｇｔａｇａｇＧＴＴＴＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／−３’（配列番号４９）である鎖ＣＤ＿Ａｔｌ５ｃ６の一部であり、配列「ＧＴＴＴＧＧ」（配列番号５０）を有するセグメントはＣＤとして働き、配列「ｇｔｇｔａｔｇａａｇｔａｇａｇ」（配列番号５１）を有するセグメントはＡＭ＊として働く。ｓｓプライマーＢの対照として、ｓｓプライマーＡにはＣＤ＿Ａｔｌ５ｃ６鎖がないが、他の点ではｓｓプライマーＢと同一である。
【０１８１】
ｓｓプライマーＣは、図２Ｃ、下左に示す設計の一例である。ｓｓプライマーＣにおいて、ＳＤは、以下の配列：５’−ＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡｔＣＴＴＴＡＴＴｔｔｔｔｇｇｇＣｇＧｇｃｃａａａ／３ＩｎｖｄＴ／−３’（配列番号１４）を有するＳＤ１６鎖の一部であり、配列「ＴＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡ」（配列番号５２）を有するセグメントはＨＤとして機能し、配列「ｔｔｔｔｇｇｇＣｇＧｇｃｃａａａ」（配列番号５６）を有するセグメントはＳＤとして機能し、部分「／３ＩｎｖｄＴ／」は、ＳＤ１６が３’末端で伸長するのを妨げる３’逆方向ｄＴ修飾である。ｓｓプライマーＣにおいて、ＰＤは、上記に記載した通り、ＰＤ１３鎖の一部である。ｓｓプライマーＣにおいて、ＣＤは以下の配列：５’−ＴＧｇｃｃａａａｃｔｇｃｔｇ／３ＩｎｖｄＴ／−３’（配列番号５３）である、鎖ＣＤ＿Ｂｃ８ｔ６の一部であり、この場合配列全体がＣＤとして機能し、（標的ではなくむしろ）偽標的に完全に相補的であり、配列「ＴＧｇｃｃａａａ」を有するセグメントは、偽標的鎖のＣＳＯＲに相補的であり、標的鎖のＣＳＯＲに部分的に相補的である。
【０１８２】
一連のＰＣＲ反応（Ａ１、Ｂ１、およびＣ１と名付ける）において、ｓｓプライマーバリアントをフォワードプライマーとして用いて、混合物ＴＭ１中ｄｓＭｕｔＩｎｓを濃縮した。鋳型としてＴＭ２を用いる同様の反応（Ａ２、Ｂ２、およびＣ２と名付ける）を行ってサイズマーカーを提供した。全反応において、リバースプライマーとして集合的に機能する、ＲＦおよびＲＱと名付けた２つの付加的なオリゴヌクレオチドもＰＣＲ反応に含まれた。ＲＦは以下の配列：５’−／５６−ＦＡＭ／ＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号１５）を有し、「／５６−ＦＡＭ／」はフルオレセインベースのフルオロフォアである。ＲＱは以下の配列：５’−ＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１６）を有し、「／３ＩＡＢｋＦＱ／」はアイオワブラッククエンチャーである。ＲＦおよびＲＱの設計により、リアルタイムで増幅の動力学が追跡できるようになる（実施例４を参照されたい）。
【０１８３】
各反応は、１単位（Ｕ）のＰｆｕ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Agilent）、ならびに各ｄＮＴＰ２００ｎＭおよび５ｍＭ  ＭｇＳ０４を補ったｌ×Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs、Ipswich、MA）を含んでいた。
【０１８４】
ｓｓプライマーＡを、反応Ａ１およびＡ２において試験した。これらの反応は以下のオリゴヌクレオチドを含んでいた：最終濃度１００ｎＭのＳＤ１７ｔ１６、最終濃度１２０ｎＭのＰＤ１３、濃度１００ｎＭのＲＦ、および最終濃度２００ｎＭのＲＱ。１マイクロリットルのＴＭ１およびＴＭ２を、鋳型混合物としてそれぞれ反応ＡｌおよびＡ２に加えた。反応Ａ１およびＡ２の最終体積は、両方とも２０マイクロリットルであった。
【０１８５】
ｓｓプライマーＢを、反応Ｂ１およびＢ２において試験した。これらの反応は以下のオリゴヌクレオチドを含んでいた：最終濃度１００ｎＭのＳＤ１７ｔ１６、最終濃度１２０ｎＭのＣＤ＿Ａｔｌ５ｃ６、最終濃度１２０ｎＭのＰＤ１３、濃度１００ｎＭのＲＦ、および最終濃度２００ｎＭのＲＱ。１マイクロリットルのＴＭ１およびＴＭ２を、鋳型混合物としてそれぞれ反応Ｂ１およびＢ２に加えた。反応Ｂ１およびＢ２の最終体積は、両方とも２０マイクロリットルであった。
【０１８６】
ｓｓプライマーＣを、反応Ｃ１およびＣ２において試験した。これらの反応は以下のオリゴヌクレオチドを含んでいた：最終濃度１００ｎＭのＳＤ１６、最終濃度１２０ｎＭのＣＤ＿Ｂｃ８ｔ６、最終濃度１２０ｎＭのＰＤ１３、濃度１００ｎＭのＲＦ、および最終濃度２００ｎＭのＲＱ。１マイクロリットルのＴＭ１およびＴＭ２を、鋳型混合物としてそれぞれ反応Ｃ１およびＣ２に加えた。反応Ｃ１およびＣ２の最終体積は、両方とも２０マイクロリットルであった。
【０１８７】
反応を氷上に設定し、以下のサーマルサイクルプログラムを反応に用いた：（１）９５℃、１分、（２）９５℃、１５秒、（３）６０℃、１分、（４）７０℃、１５秒、（５）８０℃、１５秒、（６）（２）へ戻り、さらなる５９サイクル。５マイクロリットルのＰＣＲ生成物を、１×ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（Invitrogen）で予め染色した４％アガロースゲル上で分析し、ゲルの画像を図１５に示す。
【０１８８】
バンドＡ１．１およびＡ１．３はｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物を表し、バンドＡ１．２およびＡ１．４はｄｓＷＴの増幅生成物を表す。バンドＡ２．１およびＡ２．２はｄｓＭｕｔの増幅生成物を表し、ｄｓＷＴの増幅生成物と同じ移動度でなければならない。バンドＡ１．１、Ａ１．２、およびＡ２．１はＳＤ１７ｔ１６が付着しているＰＣＲ生成物であり、バンドＡ１．３、Ａ１．４、およびＡ２．２はＳＤ１７ｔ１６が付着していないＰＣＲ生成物であり、ＰＤ１３は過剰であったため、複合体の両群ともゲル上で見られることが予想される。同様のパターンが実験の他群に対して見られる。反応Ａ１の結果から、最初に稀なｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物が可視であるとしても、大多数のＰＣＲ生成物は、依然として最初に豊富なｄｓＷＴであったことを見て取ることができ、稀なアレルの濃縮が効果的ではなかったことが指摘される。
【０１８９】
ｓｓプライマーＢに関与する結果に対して、バンドＢ１．１およびＢ１．２はｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物を表し、バンドＢ２．１およびＢ２．２はｄｓＭｕｔの増幅生成物を表し、これらはｄｓＷＴの増幅生成物と同じ移動度でなければならない。驚くべきことに、最初に稀なｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物のみが可視であるが、最初に豊富なｄｓＷＴの増幅生成物は完全に不可視であり、稀なアレルの濃縮がとりわけ効果的であったことが指摘される。反応Ａ１とＢ１との間の違いは、ＣＤの重要性を強調するものである。
【０１９０】
ｓｓプライマーＣに関与する結果に対して、バンドＣ１．１およびＣ１．２はｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物を表し、バンドＣ２．１およびＣ２．２はｄｓＭｕｔの増幅生成物を表し、これらはｄｓＷＴの増幅生成物と同じ移動度でなければならない。反応Ｃ１の結果から、最初に稀なｄｓＭｕｔＩｎｓの増幅生成物のみが可視であり、最初に豊富なｄｓＷＴの増幅生成物は不可視であり、稀なアレルの濃縮が効果的であったことが指摘される。
【０１９１】
【表２】
2016524917.tif 000008
【０１９２】
実施例３：ｄｓブロッカー核酸増幅
本発明のｄｓブロッカー核酸増幅の有効性を実証するために、１ヌクレオチド塩基対が異なる２つの８ｋｂプラスミドであるｐＷＴおよびｐＭｕｔを調製した。フォワードプライマー（５’−ｇａｇｇｃａａａａａｔｇｇａｔａａｇａａａｔａｃｔｃａａｔａｇ−３’；配列番号２０）およびリバースプライマー（５’−ｔａａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｔａｃｔｇｔｇｇｃｇｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｔｇ−３’；配列番号２１）を設計して、１５１ｂｐのＰＣＲ単位複製配列を各プラスミドから増幅した。単位複製配列は２つのプラスミド間の一塩基多型に及ぶ。ｐＷＴ由来の単位複製配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた：５’−ｔａａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｔａｃｔｇｔｇｇｃｇｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｔｇａａｃｔｔｔｔｔａｇａｃｇｇａａｃｃｔｔａｔａｔｔｃａｔｃａｇｔｇａｔｃａｃＣＧＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧＡＴＡ［Ｔ］ＣＴＡＡＧＣｃｔａｔｔｇａｇｔａｔｔｔｃｔｔａｔｃｃａｔｔｔｔｔｇｃｃｔｃ−３’（配列番号２２）。ｐＭｕｔ由来の単位複製配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた：５’−ｔａａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｔａｃｔｇｔｇｇｃｇｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｔｇａａｃｔｔｔｔｔａｇａｃｇｇａａｃｃｔｔａｔａｔｔｃａｔｃａｇｔｇａｔｃａｃＣＧＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧＡＴＡ［Ｇ］ＣＴＡＡＧＣｃｔａｔｔｇａｇｔａｔｔｔｃｔｔａｔｃｃａｔｔｔｔｔｇｃｃｔｃ−３’（配列番号２３）。２つの単位複製配列間で異なっていた塩基を大括弧で囲む。
【０１９３】
ｐＷＴ由来の単位複製配列の増幅をブロックするように、ｄｓブロッカーを設計した。ブロッカー鎖は以下の配列を有し：５’−ＧＣＴＴＡＧ［Ａ］ＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡ｜ＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＧｔｃｔｔｃｔｔｃａａａｔｃｇｇｇ−３’（配列番号２４）、バランシングトーホールドドメインを小文字で示し、最初のトーホールドドメインをシンボル「｜」の左側に大文字で示し、分岐点移動ドメインをシンボル「｜」の右側に大文字で示す。２つの単位複製配列間で異なるヌクレオチドを大括弧で囲む。プロテクター鎖は以下の配列を有し：５’−ｃｃｃｇａｔｔｔｇａａｇａａｇａＣＧＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号２５）、バランシング トーホールドドメインおよび分岐点移動ドメインをそれぞれ小文字および大文字で示す。
【０１９４】
２つの別々のＰＣＲ反応を行い、反応は、鋳型以外は同一であった（一方はｐＷＴプラスミド４ｎｇ、他方はｐＭｕｔプラスミド４ｎｇ）。反応は両方とも以下のオリゴヌクレオチドを含んでいた：１００ｎＭフォワードプライマー、１００ｎＭリバースプライマー、１５０ｎＭブロッカー鎖、および２５０ｎＭプロテクター鎖。各ＰＣＲ反応の体積は４０μＬであった。各反応は、１単位（Ｕ）のＰｆｕ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Agilient）、ならびに２００ｎＭ各ｄＮＴＰおよび５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を補った１×Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs、Ipswich、MA）を含んでいた。対照として、２つの他のＰＣＲ反応を用いた。対照にはブロッカーおよびプロテクター鎖がなかったが、他の点は他の２つの反応に同一であった。反応を氷上に設定し、以下のサーマルサイクルプログラムを反応に用いた：（１）９５℃、１分、（２）９５℃、１５秒、（３）３５℃、１分、（４）６０℃、１分、および（５）（２）へ戻り、さらなる７サイクル。
【０１９５】
各サイクルに対する３５℃のインキュベーションの終わりに、２μＬアリコートを各チューブから取り出し、氷上の別のセットのチューブに移した。これらアリコート中の単位複製配列の量を、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎキット、および以下の２つのプライマーを用いて定量した：５’−ｇａｇｇｃａａａａａｔｇｇａｔａａｇａａａｔａｃｔｃａａｔａｇ−３’（配列番号２６）および５’−ｃａｇａａｃｃｔｔｇａａｃｔｔｔｔｔａｇａｃｇｇ−３’（配列番号２７）。段階希釈により検量線を得た（図１０、左）。ｑＰＣＲの結果（図１０、右）は、ｄｓブロッカーなしで、ｐＷＴおよびｐＭｕｔの両方とも、およそ９３％のプライミング効率で増幅されることを示した。ｄｓブロッカーの存在下でｐＷＴはプライミング効率４７％で増幅され、ｐＭｕｔは効率６５％で増幅された。よって、ＰＣＲの各ラウンドでは、ｐＭｕｔは、１．６５／１．４７＝１．１２のファクターで優先的に増幅された。ｄｓブロッカー核酸増幅３０サイクル後（増幅は常に指数関数的であると仮定して）、ｐＭｕｔは１．１２３０＝３０のファクターで優先的に増幅されると予想することができる。
【０１９６】
Ａ：Ｔマッチに比べたＡ：Ｇミスマッチの弱い二重鎖破壊（duplex-disrupting）効果の結果は、中程度の選択性である。殆どのミスマッチにより、ｄｓブロッカー核酸増幅３０サイクル後、１００００から１０００００の間の選択性がもたらされなければならない。
【０１９７】
実施例４：セルフレポーティングプライマー（self-reporting primer）を用いた、ｄｓブロッカーベースの配列特異的ＰＣＲのリアルタイムモニタリング
増幅の進行をリアルタイムでモニタリングするために、以下の修飾をしたＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad）を用いて実施例２と本質的に同じ反応を行った。第１に、リバースプライマーの５’末端にフルオロフォアを付着させることにより、リバースプライマーを修飾した（５’−／ＦＡＭ／ｔａａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｔａｃｔｇｔｇｇｃｇｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｔｇ−３’；配列番号２８）。第２に、リバースプライマーの５’末端の２７ヌクレオチドに結合する付加的なクエンチャー保有鎖（５’−ＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡ／ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ／−３’；配列番号２９）を導入した。第３に、ブロッカー鎖が、ｐＷＴよりもむしろｐＭｕｔの増幅をブロックするように、ブロッカー鎖を変更した（５’−ＧＣＴＴＡＧ［Ｃ］ＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡ｜ＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＧｔｃｔｔｃｔｔｃａａａｔｃｇｇｇ−３’；配列番号３０）。第４に、反応の体積を２０μＬに低減し、鋳型プラスミドの量を１反応あたり１０ｐｇに低減し、他の試薬全ての濃度は維持した。蛍光シグナルを、サーマルサイクルプログラムの工程３（５℃、１分）の終わりに測定した。
【０１９８】
図１１に示す通り、ｄｓブロッカーを用いずに、ｐＷＴおよびｐＭｕｔを同様の効率で増幅した。ｐＭｕｔを標的化するｄｓブロッカーを加えた場合、ｐＭｕｔの増幅効率は大幅に低減し、ｐＷＴの増幅効率はわずか中程度に低減した。ｄｓブロッカーの存在下でｐＭｕｔ増幅とｐＷＴ増幅との間のΔＣｑ（蛍光シグナルが水平方向のバーに示す閾値に到達するのに必要とされるサイクル数の違い）は約１６であった。
【０１９９】
実施例５．ｄｓブロッカーを用いた稀なアレルの濃縮
１％ｐＷＴと９９％ｐＭｕｔとの混合物を作成し、混合物０．１ｎｇを、実施例３に記載した通り、ｄｓブロッカーありおよびなしでの２つのＰＣＲ反応において用いた。ＰＣＲ生成物をカラム精製し、センス鎖に結合するシーケンシングプライマーを用いてＳａｎｇｅｒシーケンシングにかけた。図１２の左パネルに示す通り、ＰＣＲ反応においてｄｓブロッカーなしでは、「Ｔ」ピークは、ｐＷＴがＳａｎｇｅｒシーケンシングのクロマトグラムに明瞭に観察されなかったことが指摘され、ｐＷＴは１％の混合物中にのみ存在し、ＰＣＲ増幅の間に濃縮されなかった事実と一致した。
【０２００】
対照的に、ｄｓ偽プライマーをＰＣＲ反応において用いた場合、ｐＷＴは明らかに濃縮され、クロマトグラムにおいて明白な「Ｔ」ピークが得られた（図１２の右パネル）。
【０２０１】
実施例６．ｄｓブロッカーおよび高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いた稀なアレルの濃縮
ｄｓブロッカーを設計して、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０のポーションの野生型配列の増幅をブロックし、Ｔ７９０Ｍ変異体などの変異アレルを濃縮した。
【０２０２】
ブロッカー鎖は以下の配列を有し：５’−ＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴｃｃｔｇａｃａｃｃｇｃａａａａ／３ＩｎｖｄＴ／−３’（配列番号３１）、配列「ｃｃｔｇａｃａｃｃｇ」（配列番号３８）を有するセグメントはＢＴドメインとして機能し、配列「ＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣ」（配列番号３９）を有するセグメントはＩＴドメインとして機能し、配列「ＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴ」（配列番号４０）を有するセグメントはＢＭドメインとして機能する。プロテクター鎖は以下の配列を有し：５’−ｃｇｇｔｇｔｃａｇｇＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡａａａａ／３ＩｎｖｄＴ／−３’（配列番号３２）、配列「ｃｇｇｔｇｔｃａｇｇ」（配列番号４１）を有するセグメントはＢＴ＊ドメインとして機能し、配列「ＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡ」（配列番号４２）を有するセグメントはＢＭ＊ドメインとして機能する。
【０２０３】
ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓと名付けたｄｓＤＮＡ鋳型を合成した。ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓのセンス鎖は以下の配列を有し：５’−ｇｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｃａｃｃｔｃｃａｃｃｇｔｇｃａｇｃｔｃａｔｃＡＴＧｃａｇｃｔｃａｔｇｃｃｃｔｔｃｇｇｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｇａｃｔａｔｇｔｃｃｇｇｇａａｃａＡＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＡＴＡｃａａａｇａｃａａｔａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｇｔａｃｃｔｇｃｔｃａａｃｔｇｇｔｇｔｇｔｇｃａｇａｔｃｇｃａａａｇｇｔａａｔｃａｇｇｇａａｇｇｇａ−３’（配列番号３３）、大文字の「ＡＴＧ」の配列を有するセグメントはＴ７９０Ｍ変異を含み、配列「ＡＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＡＴＡ」（配列番号４３）を有するセグメントは、増幅生成物ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓおよび野生型ＥＧＦＲの増幅生成物を電気泳動ベースの分析で区別することができるような、任意の配列の挿入である。この挿入は、この実施例において用いたいかなるオリゴヌクレオチドとも相互作用をしないことが予想される。
【０２０４】
細胞系ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ）からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、豊富な野生型アレルの供給源として働いた。６つの混合物を調製した：
混合物ＥＴＭ１は、ＨＴ−２９ｇＤＮＡを１マイクロリットルあたり１０００ハプロイドコピー含み、ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓは含まない。
【０２０５】
混合物ＥＴＭ２は、ＨＴ−２９ｇＤＮＡを１マイクロリットルあたり１０００ハプロイドコピー、およびｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり１０００コピー含む。
【０２０６】
混合物ＥＴＭ３は、ＨＴ−２９ｇＤＮＡを１マイクロリットルあたり１０００ハプロイドコピー、およびｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり１００コピー含む。
【０２０７】
混合物ＥＴＭ４は、ＨＴ−２９ｇＤＮＡを１マイクロリットルあたり１００００ハプロイドコピー、およびｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり１０００コピー含む。
【０２０８】
混合物ＥＴＭ５は、ＨＴ−２９ｇＤＮＡを１マイクロリットルあたり１００００ハプロイドコピー、およびｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり１００コピー含む。
【０２０９】
混合物ＥＴＭ６は、ＨＴ−２９ｇＤＮＡを１マイクロリットルあたり１００００ハプロイドコピー、およびｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを１マイクロリットルあたり１０コピー含む。
【０２１０】
一連のＰＣＲを設定して、ｇＤＮＡからの野生型ＥＧＦＲエクソン２０配列の存在下で、上記に記載した各混合物中のｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを濃縮した。以下のオリゴヌクレオチドセットを用いた：最終濃度１５０ｎＭのブロッカー鎖、最終濃度２５０ｎＭのプロテクター鎖、フォワードプライマー（５’−ＴＧＣＡＣＧ＊Ｇ／ｉＳｐｌ８／ｃｔｃａｃｃｔｃｃａＣＣＧＴＧＣ＊Ａ−３’、配列番号３４）１００ｎＭ、およびリバースプライマー（５’−ＣＴＣＡＡＣＴＧ＊Ｇ／ｉＳｐｌ８／ａｔｃｔｇｃａｃａｃａＣＣＡＧＴＴＧＡ＊Ｇ−３、配列番号３５）１００ｎＭ。フォワードおよびリバースプライマーの配列において、シンボル＊はフランキングヌクレオチド間のホスホロチオエート修飾を意味し、シンボル／ｉＳｐｌ８／はヘキサエチレングリコールリンカーを意味する。
【０２１１】
一連の対照実験において、ブロッカー鎖およびプロテクター鎖を省略し、すなわち以下のオリゴヌクレオチドセットを用いた：フォワードプライマー（５’−ＴＧＣＡＣＧ＊Ｇ／ｉＳｐｌ８／ｃｔｃａｃｃｔｃｃａＣＣＧＴＧＣ＊Ａ−３’、配列番号３６）１００ｎＭ、およびリバースプライマー（５’−ＣＴＣＡＡＣＴＧ＊Ｇ／ｉＳｐｌ８／ａｔｃｔｇｃａｃａｃａＣＣＡＧＴＴＧＡ＊Ｇ−３’、配列番号３７）１００ｎＭ。
【０２１２】
反応は全て、０．４単位（Ｕ）のＨｏｔｓｔａｒｔ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Ipswich、MA）、ならびに各ｄＮＴＰ２００ｎＭおよび２ｍＭ  ＭｇＳ０４を補った１×ＨＦバッファー（New England Biolabs、Ipswich、MA）を含んでいた。全ての反応の最終体積は２０マイクロリットルであった。
【０２１３】
以下のＰＣＲプログラムを用いた：（１）９５℃、１分、（２）９５℃、１５秒、（３）６０℃、１分、（４）８０℃、１５秒、（５）（２）へ戻り、さらなる４９サイクル、（６）７２℃、２．５分。４０回目および５０回目のサイクルの後、各反応のアリコート２．５マクロリットルを取り、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（Invitrogen）で予め染色した４％アガロースゲル上での電気泳動分析にかけた。得られたゲルの画像を図１６に示す。ｄｓブロッカーの非存在下で、ＥＴＭ２およびＥＴＭ４のみがｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓ増幅生成物を反映するバンドを生じ、全ての反応において、野生型配列の増幅生成物は、主要な、または唯一の生成物であることが分かる。しかし、ｄｓブロッカーの存在下で、ｇＤＮＡのみを含み、ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓを含まないＥＴＭ１は可視である増幅生成物を生じず、ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓの増幅生成物は、ＥＴＭ２、ＥＴＭ３、ＥＴＭ４、およびＥＴＭ５を用いた反応の主要な生成物であった。変異アレル（すなわち、ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓ）が約０．１％の分画にのみ存在するＥＴＭ６でも、ｇＥＧＦＲ＿Ｅ２０＿ＭｕｔＩｎｓの増幅生成物は依然として可視であった。これらの観察は全て、ｄｓブロッカーが野生型配列の増幅を抑制し、Ｔ７９０Ｍ変異配列を濃縮するという予想と一致した。
参照文献
[I] H. Gevensleben, I. Garcia-Murillas, M. K. Graeser, G. Schiavon, P. Osin, M. Parton, I. E. Smith, A. Ashworth, and N. C. Turner. Noninvasive Detection of HER2 Amplication with Plasma DNA Digital PCR. Clin. Cancer Res., May 2013. 
[2] C. R. Newton, A. Graham, L. E. Heptinstall, S. J. Powell, C. Summers, N. Kalsheker, J. C. Smith, and A. F. Markham. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res., 17(7):2503-2516, Apr 1989. 
[3] R. S. Cha, H. Zarbl, P. Keohavong, and W. G. Thilly. Mismatch amplification mutation assay (MAMA): application to the c-H-ras gene. PCR Methods Appl., 2(1): 14-20, Aug 1992. 
[4] J. R. Dobosy, S. D. Rose, K. R. Beltz, S. M. Rupp, K. M. Powers, M. A. Behlke, and J. A. Walder. RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers. BMC Biotechnol., 11:80, 2011. 
[5] Q. Liu and S. S. Sommer. Pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP): application to allele- specific amplification. BioTechniques, 29(5): 1072-1076, Nov 2000. 
[6] T. Seyama, T. Ito, T. Hayashi, T. Mizuno, N. Nakamura, and M. Akiyama. A novel blocker-PCR method for detection of rare mutant alleles in the presence of an excess amount of normal DNA. Nucleic Acids Res., 20(10):2493-2496, May 1992. 
[7] H. Oram, P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, and C. Stanley. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. Nucleic Acids Res., 21(23):5332-5336, Nov 1993. 
[8] L. Zhou, R. A. Palais, G. D. Smith, D. Anderson, L. R. Rowe, and C. T. Wittwer. 
Enrichment and detection of rare alleles by means of snapback primers and rapid-cycle PCR. Clin. Chem., 56(5):814-822, May 2010. 
[9] J. Li, L. Wang, H. Mamon, M. H. Kulke, R. Berbeco, and G. M. Makrigiorgos. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat. Med., 14(5):579-584, May 2008. 
[10] D. Y. Zhang, S. X. Chen, and P. Yin. Optimizing the specificity of nucleic acid hybridization. Nat Chem, 4(3):208-214, Mar 2012. 
[I I] J. SantaLucia and D. Hicks. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 33:415-440, 2004. 
[12] R.M. Dirks, Bois J.S., Schaefer J.M., Winfree E., , and N.A. Pierce. Thermodynamic analysis of interacting nucleic acid strands. SIAM Rev, 49(l):65-88, 2007. 
均等論
本明細書に発明の実施形態をいくつか記載し、説明してきたが、当業者であれば、機能を遂行し、かつ／あるいは本明細書に記載する結果および／または１つもしくは複数の利点を得るのに、様々な他の手段および／または構造を想像するのは容易であり、このような変動および／または修飾は各々、本明細書に記載する本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載する全てのパラメータ、次元、材料、および立体配置は例示的であることを意味し、実際のパラメータ、次元、材料、および／または立体配置は特定の用途、または本発明の教示がそのために用いられる用途によって決まることを容易に理解されよう。当業者であれば、ルーチンの実験程度を用いて、本明細書に記載する特定の本発明の実施形態の多くの同等物を認め、または確かめることができよう。したがって、前述の実施形態は例示によってのみ表されるものであり、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、明確に記載し、請求する以外の方法で、発明の実施形態が実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載する、個々の各特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に対するものである。加えて、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上のあらゆる組合せは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に相反しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０２１４】
本明細書において規定し、用いる定義は全て、辞書上の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または規定する語の通常の意味を規制するものと理解されたい。
【０２１５】
本明細書に開示する参考文献、特許、および特許出願は全て、それらに対して各々を列挙する主題に関して参照により組み込まれ、主題は場合により文献の全文を包含し得る。
【０２１６】
本明細書における明細書、および特許請求の範囲において用いる、不定冠詞の「１つの（a）」および「１つの（an）」は、反対を明らかに指摘しなければ、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。
【０２１７】
本明細書で用いる、本明細書および特許請求の範囲における、「および／または」の句は、「いずれかまたは両方」のエレメントがこのように結合したもの、すなわち、ある場合には結合して存在し、ある場合には分離して存在するエレメントを意味すると理解されたい。「および／または」とともに列挙する多数のエレメントは、同様に、すなわち「１つまたは複数の」エレメントがこのように結合したものと解釈されたい。「および／または」の節が特に同定するエレメント以外に、特に同定するこれらのエレメントに関連しても、または非関連でも、他のエレメントが任意選択により存在し得る。よって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」との言及は、「含む（comprising）」などのオープンエンドの言葉と組み合わせて用いられる場合、一実施形態において、Ａのみ（任意選択によりＢ以外のエレメントを含む）を、別の一実施形態において、Ｂのみ（任意選択によりＡ以外のエレメントを含む）を、さらに別の一実施形態において、ＡおよびＢの両方（任意選択により他のエレメントを含む）を意味し得るなどである。
【０２１８】
本明細書で用いる、本明細書および特許請求の範囲における、「または」は、上記に規定した「および／または」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、列挙におけるアイテムを分ける場合、「または」または「および／または」は包括的であり、すなわち、少なくとも１つを含むが、１つ以上の数または列挙のエレメント、ならびに任意選択により付加的な非列挙のアイテムも含むと解釈されたい。「たった１つの」もしくは「正確に１つの」、または特許請求の範囲において用いられる場合の「からなる」など、反対を明らかに指摘する語のみが、数々の、または列挙のエレメントのうち正確に１つのエレメントを含むことを意味する。概して、本明細書で用いる、「または」という語は、「いずれかの」、「１つの」、「たった１つの」、または「正確に１つの」などの排他的な語が先行する場合は排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を指摘するともっぱら解釈される。「本質的にからなる」は、特許請求の範囲において用いる場合、特許法の分野で用いられる通常の意味を有する。
【０２１９】
本明細書で用いる、本明細書および特許請求の範囲における、１つまたは複数のエレメントの列挙に対する「少なくとも１つの」の句は、エレメントの列挙におけるあらゆる１つまたは複数のエレメントから選択される少なくとも１つのエレメントを意味するが、エレメントの列挙内に特に列挙するありとあらゆるエレメントの少なくとも１つを必ず含むものではなく、エレメントの列挙におけるいかなる組合せのエレメントも排除しないと理解されたい。この定義はまた、特に同定するこれらのエレメントに関連しても、または非関連であっても、「少なくとも１つ」の句が言及するエレメントの列挙内で特に同定されるエレメント以外に、エレメントが任意選択により存在し得ることを許すものである。よって、非限定的な例として、「少なくとも１つのＡおよびＢ」（または等しく「少なくとも１つのＡまたはＢ」、または等しく「少なくとも１つのＡおよび／またはＢ」）は、一実施形態において、任意選択により１つを超えて含む、少なくとも１つのＡであって、Ｂは存在しない（およびＢ以外のエレメントを任意選択により含む）ことを意味し得、別の一実施形態において、任意選択により１つを超えて含む、少なくとも１つのＢであって、Ａは存在しない（およびＡ以外のエレメントを任意選択により含む）ことを意味し得、さらに別の一実施形態において、任意選択により１つを超えて含む、少なくとも１つのＡ、および任意選択により１つを超えて含む、少なくとも１つのＢ（および他のエレメントを任意選択により含む）意味し得るなどである。
【０２２０】
反対を明らかに指摘しなければ、１つを超える工程または動作を含む、本明細書に請求するあらゆる方法において、方法の工程または動作の順序は、方法の工程または動作を列挙する順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。
【０２２１】
特許請求の範囲において、および上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する」、「含む（containing）」、「関与する」、「保持する」、「からなる」などの移行句は全て、拡張可能であり、すなわち、それだけには限定しないが含むことを意味すると理解されたい。「からなる」および「から本質的になる」の移行句のみが、米国特許局特許審査官手順マニュアル（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）、セクション２１１１．０３に記載されている通り、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句である。
【図１Ａ】
2016524917.tif 000009
【図１Ｂ】
2016524917.tif 000010
【図２Ａ】
2016524917.tif 000011
【図２Ｂ】
2016524917.tif 000012
【図２Ｃ】
2016524917.tif 000013
【図３】
2016524917.tif 000014
【図４Ａ】
2016524917.tif 000015
【図４Ｂ】
2016524917.tif 000016
【図４Ｃ】
2016524917.tif 000017
【図５】
2016524917.tif 000018
【図６Ａ】
2016524917.tif 000019
【図６Ｂ】
2016524917.tif 000020
【図７】
2016524917.tif 000021
【図８】
2016524917.tif 000022
【図９】
2016524917.tif 000023
【図１０】
2016524917.tif 000024
【図１１】
2016524917.tif 000025
【図１２】
2016524917.tif 000026
【図１３】
2016524917.tif 000027
【図１４Ａ】
2016524917.tif 000028
【図１４Ｂ】
2016524917.tif 000029
【図１４Ｃ】
2016524917.tif 000030
【図１５】
2016524917.tif 000031
【図１６Ａ】
2016524917.tif 000032
【図１６Ｂ】
2016524917.tif 000033
【配列表】
2016524917000001.app
【国際調査報告】
2016524917.tif 000034
2016524917.tif 000035
2016524917.tif 000036