(57)【要約】  本発明は、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）又は質量分析（ＭＳ）を接続した親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）を用いて、フォンダパリヌクスナトリウムを含むポリ硫酸化オリゴ糖を検出及び定量するための分析方法を開示する。この分析方法は、分離、定量及び質量同定により、高度に硫酸化されたオリゴ糖の全合成におけるインプロセス制御を提供する。そのような方法を利用するシステム及び条件もまた提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１以上のポリ硫酸化オリゴ糖を検出及び定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）又は質量分析計（ＭＳ）を接続した親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）上のクロマトグラフィーに該試料を供し、ここで、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される固定相はアミド結合した固定相であり；及び
（ｂ）試料中のポリ硫酸化オリゴ糖の量を決定する
ことを含む上記方法。
【請求項２】
ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される移動相が塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩が、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム及び酢酸アンモニウムから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
塩がギ酸アンモニウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
塩がギ酸アンモニウムであり、約５０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で移動相に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
移動相中のギ酸アンモニウムの濃度が約１００ｍＭ〜２００ｍＭである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される移動相の溶媒が、アセトニトリル、アセトン、又はアセトニトリルとアセトンの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される移動相がアセトニトリルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリ硫酸化オリゴ糖が、以下の構造：
【化１】
2016524166.tif 000007
を有するフォンダパリヌクスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）又は質量分析計（ＭＳ）を接続した親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）上のクロマトグラフィーに該試料を供し、ここで、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される固定相はアミド結合した固定相であり、該クロマトグラフィーにおいて使用される移動相はアセトニトリルであり、該移動相は、約１００ｍＭから約２００ｍＭの濃度のギ酸アンモニウムを含み；及び
（ｂ）試料中のフォンダパリヌクスの量を決定する
ことを含む、試料中のフォンダパリヌクスを検出及び定量するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
適用なし。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリノイド（ヘパリン及びヘパラン硫酸）は、多数の重要な生物学的プロセスにおいて周知の調節メディエーターである。ヘパリノイド及びその誘導体、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、手術及び腎臓透析中の臨床的な抗凝固剤として使用されてきた。例えば、フォンダパリヌクスナトリウム（ＣＡＳ１１４８７０−０３−０）は、Ｏ−［２−デオキシ−６−Ｏ−スルホ−２−（スルホアミノ）−アルファ−Ｄ−グルコピラノシル］−（１−−４）−Ｏ−（ベータ−Ｄ−グルコピラヌロソニル）−（１−−４）−Ｏ−［２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−スルホ−２−（スルホアミノ）−アルファ−Ｄ−グルコピラノシル］−（１−−４）−Ｏ−（２−Ｏ−スルホ−アルファ−Ｌ−イドピラヌロソニル）−（１−−４）−Ｏ−［２−デオキシ−１−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホ−２−（スルホアミノ）−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド］デカナトリム塩の化学名を有するオリゴ糖／ヘパリンのメンバーであり、Ｃｈｏａｙ，Ｓ．Ａ．によって開発された（米国特許第４，８１８，８１６号参照）。化合物は、整形外科を受けた患者における深部静脈血栓症の予防、並びに深部静脈血栓症と肺塞栓症の治療用の抗凝固剤として使用される合成五糖類である第Ｘａ因子阻害剤である。フォンダパリヌクスナトリウムは、２００１年に米国食品医薬品局によって承認され、商品名Ａｒｉｘｔｒａ（商標）で販売されている。フォンダパリヌクスナトリウムは、皮下に投与される。
【０００３】
ヘパリン及びヘパラン硫酸の分析方法は、伝統的には、逆相クロマトグラフィー及び質量分析（ＭＳ）技術を伴うが、ヘパラン硫酸の高い極性、構造多様性、及び硫酸基の不安定性に起因して制限がある。例えば、ポリ硫酸化オリゴ糖のイオン化が、様々な種類の断片、及び硫酸基が喪失した金属カチオン結合付加物を形成する傾向にあるため、ＭＳを用いた合成のポリ硫酸化オリゴ糖の定量は制限される。これは、より大きなスペクトルの複雑さとシグナル分離をもたらす。さらに、硫酸化オリゴ糖の濃度及び帯電状態に依存するため、分析中に硫酸基の喪失程度を実証することは困難である。ポリ硫酸化オリゴ糖についての改善された分析法は、多数の研究グループの目標となっている。
【０００４】
Ｃａｔａｌｉｎら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，８１，３４８５）及びＴａｔｉａｎａら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，１７７４）は、それぞれ、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いたポリ硫酸化オリゴ糖の特徴付けを報告している。しかしながら、液体クロマトグラフ（ＬＣ）と質量分析法の接続を用いる現在の方法は、ピークのオンライン工程内分解能／分離を提供しない。したがって、ポリ硫酸化オリゴ糖の構造関連の不純物の同定及び／又は定量は、合成ポリ硫酸化オリゴ糖の製造中に確立し得ない。
【０００５】
Ｉｍａｎａｒｉら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａ  １９９６，７２０，２７５）及びＲｉｃｅら（Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５，１５０，３２５）は、強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）によるポリ硫酸化オリゴ糖の分析法を例証する。この方法は、電荷密度の差を介して、高硫酸化オリゴ糖を分離するようであるが、移動相組成物中の非揮発性塩に起因して、ＭＳのような検出方法とＳＡＸを直接接続することが困難である。
【０００６】
ポリ硫酸化オリゴ糖の分析方法に関連したさらに他の問題は、従来のＵＶ検出器の使用を制限し得る、ポリ硫酸化オリゴ糖の非発色団特性（非常に低いＵＶ吸収）によるものである。屈折率（ＲＩ）及び蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）などの他の汎用の検出器はまた、ポリ硫酸オリゴ糖のための十分な検出感度を欠いている。
【０００７】
ポリ硫酸化オリゴ糖を検出するためのいくつかの方法が開示されているが、多くの制限が残されている。したがって、ポリ硫酸化オリゴ糖の分離、定量及び質量を同定するための改善された方法が引き続き必要である。本明細書に開示されている安定した、高感度の工程管理（ＩＰＣ）法はこの必要性及び他の必要性に対応する。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書において、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）又は質量分析（ＭＳ）を接続した親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）を用いて、ポリ硫酸化オリゴ糖を検出するための方法が提供される。本明細書において提供される方法は、改善されたピーク分解能を可能にし、それにより、試料中のポリ硫酸化オリゴ糖及び／又は不純物のその後の定量を可能にする。
【０００９】
ＨＩＬＩＣの使用は、非常に極性のオリゴ糖を保持及び分離するという課題を克服する。ＨＩＬＩＣ用の保持機構は非常に複雑であり、液−液分割、吸着、イオン性相互作用及び疎水性相互作用の多様な組み合わせである。したがって、ＨＩＬＩＣは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）と比較して、固有の選択性及び保持特性を提供する。
【００１０】
本明細書で提供するとき、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される固定相は、実施形態の一グループにおいて、アミド結合した固定相である。
【００１１】
別の実施形態において、ＨＩＬＩＣカラムで使用される移動相は塩を含む。実施態様の１つのグループにおいて、塩はギ酸アンモニウムである。ギ酸アンモニウムの使用は、酢酸ピリジニウム及び酢酸アンモニウムと比較して、ギ酸アンモニウムの使用は、保持、選択性及び低ノイズレベルのベースラインに関して良好な性能を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、塩の濃度は５０ｍＭより高い。いくつかの選択された実施形態において、濃度は１００ｍＭより高い。典型的には、移動相組成物中の塩添加物のモル強度は、クロマトグラフィーの保持、選択性及び感度に大きな影響を与え得る。塩添加物のモル濃度が増加するにつれて、移動相と溶質のイオン強度は、イオン交換作用というよりはむしろ保持機構を支配する液−液分割相互作用によって圧倒される。しかしながら、現在、ポリ硫酸化オリゴ糖などの酸性分析物の場合には、塩添加物のモル濃度が増加するにつれて、保持が増強されることが見出されている。特に、塩濃度が約５０ｍＭから２００ｍＭに増加するにつれて、ピークの分解能がさらに向上する。
【００１３】
実施形態の１つのグループにおいて、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される移動相の溶媒はアセトニトリルである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ポリ硫酸化オリゴ糖の定量に使用される検出器は、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）である。ＣＡＤを用いた分析中に、エアロゾル粒子は、イオン化ガス（典型的には、窒素）で帯電される。高移動度粒子（主に、過剰なＮ2イオン）を除去した後、エアロゾル粒子は、その後、電気的に測定される。最も重要なことは、この方法は、その性質とは無関係に、不揮発性分析物に対して均一な応答を提供することが実証されている。このように、（１）ＨＩＬＩＣ又はＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣを利用する分離技術、及び（２）ＭＳ又はＣＡＤなどの検出技術の組み合わせは、ポリ硫酸化の検出、同定及び／又は定量を可能にし、それにより、合成ポリ硫酸化オリゴ糖を分析するための効果的な方法を提供する。
【００１５】
本発明の１つの選択された実施形態に従って、本明細書に記載されている方法によって検出及び／又は定量されるポリ硫酸化オリゴ糖はフォンダパリヌクスナトリウムである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】図１ａは、Ｍｅｒｃｋ，Ｓｅｑｕａｎｔ  Ｚｉｎ（登録商標）−Ｈｉｌｉｃ（３．５μｍ  ２．１×２５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｂ】図１ｂは、Ｍｅｒｃｋ，Ｓｅｑｕａｎｔ  Ｚｉｎ（登録商標）−Ｈｉｌｉｃ（５μｍ  ４．６×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｃ】図１ｃは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（４μｍ  ４．６×２５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｄ】図１ｄは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（登（４μｍ  ４．６×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｅ】図１ｅは、Ｓｅｐａｘ  Ｐｏｌａｒ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１．８μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｆ】図１ｆは、ＥＳ，Ｅｐｉｃ  Ｄｉｏｌ（１．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｇ】図１ｇは、Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣ（１．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｈ】図１ｈは、Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ（１．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図２】図２は、Ｗａｔｅｒｓ，ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅカラム（ａ）フルスケール及び（ｂ）延長スケールを用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのクロマトグラムを与える。
【図３】図３は、様々な種類の塩：（ａ）５０ｍＭギ酸アンモニウム、（ｂ）１００ｍＭギ酸アンモニウム、（ｃ）１００ｍＭギ酸ピリジニウム、及び（ｄ）５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて分析された製剤原料の伸長スケールにおけるクロマトグラムを与える。
【図４】図４は、様々な濃度のギ酸アンモニウム（伸長スケールにおける）：（ａ）５０ｍＭ、（ｂ）１００ｍＭ、（ｃ）１２５ｍＭ、（ｄ）１５０ｍＭ、（ｅ）１７５ｍＭ、及び（ｆ）２００ｍＭを用いて分析された製剤原料の伸長スケールにおけるクロマトグラムを与える。
【図５】移動相（ａ）移動相Ａ：２００ｍＭギ酸アンモニウム；移動相Ｂ：アセトン及びアセトニトリル、１／１、（ｂ）移動相Ａ：２００ｍＭギ酸アンモニウム；移動相Ｂ：アセトニトリルである異なる有機溶媒を用いて分析された製剤原料の伸長スケールにおけるクロマトグラムを与える。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．一般
本明細書において、それぞれ分離、定量及び質量分析のためのＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ、ＣＡＤ及びＭＳの適用を伴うポリ硫酸化オリゴ糖に関して開発された容易な工程内の分析法が提供される。製造中の工程内管理（ＩＰＣ）は、非常に硫酸化されたオリゴ糖の全合成における質の品質管理を確保するためのキーである。本明細書に記載される分析法は、ＩＰＣ法として使用可能である。有利には、本明細書に記載される分析法は、安定し、使い易く、高感度であり、予期された収率内で質の高い化学物質の生産を確実にする。
【００１８】
ＩＩ．本発明の実施形態
上記に照らして、本明細書において、試料中の１つ以上のポリ硫酸化オリゴ糖を検出及び定量するための方法が提供され、該方法は、
（ａ）荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）又は質量分析計（ＭＳ）を接続した親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）上のクロマトグラフィーに該試料を供し、ここで、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される固定相はアミド結合した固定相であり；及び
（ｂ）試料中のポリ硫酸化オリゴ糖の量を決定する
ことを含む。
【００１９】
本発明の方法において使用される試料は、典型的には、ポリ硫酸化オリゴ糖の合成製造方法の生産物である。結果として、合成手順の最終工程の試料は、反応混合物のアリコートを選択することによって、本発明の方法に従って分析することができる。反応混合物の試料は、不純物及び／又はポリ硫酸化オリゴ糖の検出及び／又は同定及び／又は定量を可能にする。また、反応混合物の試料は、反応の完了の程度を決定することを可能する。あるいは、最終生成物は、さらなる精製が必要であるかどうかを決定するために、本発明の方法に供することができる。
【００２０】
親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィーのための条件は、一般的に、当業者に知られている条件を伴い、限定されないが、カラム選択（サイズ、長さ及び固定相）、並びに移動相及び／又は移動相のｐＨが挙げられる。
【００２１】
カラムの選択は、一般的に、Ｗａｔｅｒｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍｅｒｃｋ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｓｈｏｄｅｘ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ、及びＳｅｐａｘから利用可能であるカラムなどの市販されている調製用カラムからの選択を伴う。実施態様の１つのグループにおいて、カラムは、中性電荷の固定相（例えば、ジオール相又はアミド相）、荷電固定相（例えば、シリカ相、アミノプロピル相）、又は両性イオン性固定相を有する。実施形態の１つの選択されたグループにおいて、固定相は、アミド結合した固定相である。実施例１〜１０は、本明細書に記載される方法を用いて様々な固定相を使用することから得られた結果を示す。
【００２２】
当業者は、流速が、得られる分離及び分解能に影響を及ぼすことを理解する。
【００２３】
移動相において使用される溶媒は、一般的に、極性の非プロトン性有機溶媒、又は複数の極性の非プロトン性有機溶媒の混合物である。実施態様の１つのグループにおいて、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される移動相の溶媒は、アセトニトリル、アセトン、又はアセトニトリルとアセトンの混合物である。実施例１３ａ〜１３ｄは、本明細書に記載されている方法を用いたポリ硫酸化オリゴ糖の検出及び／又は定量における様々な溶媒及び／又は溶媒の混合物の効果を例証する。
【００２４】
他の実施形態において、移動相はまた、塩、一般的には、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、及び酢酸アンモニウム、及びそれらの混合物から選択される塩を含む。特定の選択された実施形態において、移動相は、ギ酸アンモニウムを含む。実施形態のさらなるグループにおいて、移動相は、クエン酸アンモニウム及び／又はシュウ酸アンモニウムから選択される塩を含む。実施例１１ａ〜１１ｄは、本明細書に記載されている方法を用いたポリ硫酸化オリゴ糖の検出及び／又は定量における移動相中の様々な塩の効果を例証する。
【００２５】
移動相において使用される塩の濃度は、一般的に２５〜約４００ｍＭであるが、いくつかの最適な結果が、塩が５０〜約２００ｍＭの濃度で移動相に存在する場合に見出される。いくつかの実施形態において、塩は、約５０〜１００ｍＭ、約１００〜２００ｍＭ、及び約７５〜１７５ｍＭの濃度で移動相に存在する。実施例１２ａ〜１２ｄは、本明細書に記載されている方法を用いた場合、塩としてギ酸アンモニウムを用いることによって、ポリ硫酸化オリゴ糖の検出及び／又は定量中に、ピーク分解能及びピーク幅における様々な塩濃度の効果を例証する。
【００２６】
特定の実施形態において、上記される方法は、下記の構造：
【００２７】
【化１】
2016524166.tif 000003
【００２８】
を有するポリ硫酸化オリゴ糖であるフォンダパリヌクスの検出及び／又は定量に有用である。
【００２９】
別の態様において、本明細書において、試料中のフォンダパリヌクスを検出及び定量するための方法が提供され、該方法は、
（ａ）荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）又は質量分析計（ＭＳ）を接続した親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）上のクロマトグラフィーに該試料を供し、ここで、ＨＩＬＩＣカラムにおいて使用される固定相はアミド結合した固定相であり、クロマトグラフィーにおいて使用される移動相はアセトニトリルであり、移動相は、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度におけるギ酸アンモニウムを含み；及び
（ｂ）試料中のフォンダパリヌクスの量を決定する
ことを含む。
【００３０】
上記及び本明細書で使用するとき、試料中のフォンダパリヌクスの量の「決定」、すなわち、「フォンダパリヌクスの定量」は、当業者に容易に入手可能である１つ以上の方法において達成される。一般的に、ＵＰＬＣ−ＭＳ−及び／又はＣＡＤの装置が販売され、試料中の物質の相対量を（例えば、ピーク下面積を計算し及び／又はピークの相対強度を測定することによって）計算し得る、予めインストールされたプログラム及び／又はアルゴリズムを有する。装置の反応及び一連の外部標準濃度に従って、外部較正曲線は、従来の回帰分析を使用することによって得ることができる。次に、試料濃度は、外部較正曲線によって決定することができる。上記及び本明細書で使用するとき、試料における（例えば、フォンダパリヌク及び／又は不純物の）「検出」は、例示的な実施形態において、本明細書に記載されている方法を用いた（例えば、ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣの使用による）クロマトグラムの記録、及びＣＡＤ又はＭＳなどの結合させた技術を用いたピーク同定を含み、それにより、試料中のフォンダパリヌク及び／又は不純物の存在又は不存在を確認（検出）する。
【実施例】
【００３１】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、さらに詳細に本発明を説明するために提示される。しかしながら、本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態に限定されるものではない。
【００３２】
装置
ＵＰＬＣ−ＭＳ研究に関わる装置は、それぞれＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄｉｏｎｅｘ及びＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓによって製造されたＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（ＵＰＬＣ）及びｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ  ＩＩ（商標）（ＭＳ）である。ＵＰＬＣ−ＣＡＤに関わる装置は、それぞれＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄｉｏｎｅｘによって製造されたＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｒａ  ＣＡＤである。
【００３３】
パラメータ
分析のための条件を以下に記載する。
【００３４】
１．アミド−ＨＩＬＩＣタイプカラムは、ポリ硫酸化オリゴ糖を分析するための分析用カラムとして使用される。
【００３５】
２．移動相において使用されるギ酸アンモニウムの濃度は１００ｍＭ又は１００ｍＭより高い。
【００３６】
３．移動相組成におけるギ酸アンモニウム：アセトニトリルの体積比は９５％〜５％：５％〜９５％の範囲である。
【００３７】
４．以下の実施例において使用される流速の範囲は０．４ｍＬ／分〜１ｍＬ／分である。
【００３８】
５．本明細書において記載されている方法において使用されるカラム温度の範囲は１０℃〜７０℃である。
【００３９】
６．この方法において使用される荷電エアロゾル検出器の噴霧温度の範囲は１０℃〜３０℃である。
【００４０】
７．検査試料の濃度は１５μｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬである。
【００４１】
８．検査試料の注入体積は１μＬから５μＬである。
【００４２】
試料調製
試料は、水とアセトニトリルの混合物（１：１；３０ｍｇ／ｍＬ）に溶解される。
【００４３】
実施例１〜１０  様々なタイプのＨＩＬＩＣカラムの比較及び一般的なＬＣ条件
上述されるように調製された試料は、表１に示されるように様々なタイプのＨＩＬＩＣカラムによって分析される。様々なカラムを用いて記録されたクロマトグラムは図１（ａ）〜（ｈ）に示され、フォンダパリヌクスのピーク同定はＬＣ−ＭＳによって確認された。
【００４４】
【表１】
2016524166.tif 000004
【００４５】
実施例１〜１０の大部分において、フォンダパリヌクスのピークは、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨアミド列の場合の１つの例外を除いて、不純物からの乏しい分離を伴う非対称であることが判明した。Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨアミドについてのＬＣ条件を最適化し、典型的なクロマトグラムを図２に示す。この研究は、アミドタイプのＨＩＬＩＣカラムが、様々なタイプのＨＩＬＩＣカラムのうち、この合成ポリ硫酸化五糖類を分析するために比較的より良好な選択を与えることを実証する。
【００４６】
実施例１１ａ〜１１ｄ  様々な塩の効果
３つの異なる塩であるギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム及び酢酸アンモニウムを比較した。分析条件を表２に示す。結果を図３に示す。
【００４７】
【表２】
2016524166.tif 000005
【００４８】
保持、選択性及び低ノイズレベルのベースラインとの関連で最良のクロマトグラフィー性能は、５０ｍＭと１００ｍＭの濃度レベルの両方でギ酸アンモニウム塩を含む移動相であった（それぞれ図３ａ及び図３ｂ）。ギ酸ピリジニウム（図３ｃ）及び酢酸アンモニウム（図３ｄ）は、目的の分析物についてより高いベースラインノイズとより少ない保持を示した。この研究に基づいて、ギ酸アンモニウムが、移動相組成物中の塩添加物となるように選択された。
【００４９】
実施例１２ａ〜１２ｆ  塩濃度の効果
種々の濃度のギ酸アンモニウム塩を含有する移動相組成物は、ＬＣ条件を最適化するために研究された。実施例１２ａ〜１２ｆについてのギ酸アンモニウムの濃度を表３に提供する。代表的なクロマトグラムを図４に示す。
【００５０】
【表３】
2016524166.tif 000006
【００５１】
不純物プロファイルは、５０ｍＭ及び１００ｍＭの塩濃度を用いて得られたクロマトグラムについて非常に類似していることが判明した（図４ａ及び４ｂ）。塩濃度が増加するにつれて、小さなピーク（暗い三角形で印される、図４ｄに、４ｅ及び４ｆ参照）であり、主要ピークの直前のフォンダパリヌクスが観察された。主要ピークからのこの新しいピークの分解能は、塩濃度が１５０ｍＭから２００ｍＭのギ酸アンモニウムに増加するにつれてさらに改善された。さらに、塩濃度が１７５ｍＭに増加するにつれて、主要ピークの帯域幅が狭くなることは明らかであり；塩濃度が１７５ｍＭを超えて増加した場合、解像度及びピーク形状においてさらなる改善は観察されなかった。
【００５２】
実施例１３ａ〜１３ｂ  溶媒の効果
実施例１３ａ及び１３ｂは、本発明に係るフォンダパリヌクスナトリウムを分析するための移動相の溶媒として、それぞれアセトニトリルとアセトンの混合物及びアセトニトリルを使用する。図５に示される結果は、アセトニトリル系と混合物（アセトニトリル及びアセトン）系の間の選択性に明らかな差異を示していないが、より高い背圧がアセトニトリル系に比べてアセトン／アセトニトリルの混合物を含む系で観察された。
【００５３】
前述の発明は理解を明確にするために例示及び実施例によっていくらか詳細に記載してきたが、当業者は、特定の変更及び改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを理解するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、各々の参考文献が個別に参照により組み込まれたかのように、同程度まで全体として参照により組み込まれる。競合が本出願と本明細書中に提供されている参考文献の間に存在する場合、本出願が支配するものとする。
【図１ａ】
2016524166.tif 000008
【図１ｂ】
2016524166.tif 000009
【図１ｃ】
2016524166.tif 000010
【図１ｄ】
2016524166.tif 000011
【図１ｅ】
2016524166.tif 000012
【図１ｆ】
2016524166.tif 000013
【図１ｇ】
2016524166.tif 000014
【図１ｈ】
2016524166.tif 000015
【図２】
2016524166.tif 000016
【図３】
2016524166.tif 000017
【図４】
2016524166.tif 000018
【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月8日(2016.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図１ａ】図１ａは、Ｍｅｒｃｋ，Ｓｅｑｕａｎｔ  Ｚｉｎ（登録商標）−Ｈｉｌｉｃ（３．５μｍ  ２．１×２５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｂ】図１ｂは、Ｍｅｒｃｋ，Ｓｅｑｕａｎｔ  Ｚｉｎ（登録商標）−Ｈｉｌｉｃ（５μｍ  ４．６×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｃ】図１ｃは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（４μｍ  ４．６×２５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｄ】図１ｄは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（登（４μｍ  ４．６×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｅ】図１ｅは、Ｓｅｐａｘ  Ｐｏｌａｒ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１．８μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｆ】図１ｆは、ＥＳ，Ｅｐｉｃ  Ｄｉｏｌ（１．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｇ】図１ｇは、Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣ（１．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図１ｈ】図１ｈは、Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ（１．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのＨＩＬＩＣ−ＣＡＤのクロマトグラムを与える。
【図２ａ】図２は、Ｗａｔｅｒｓ，ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅカラム（ａ）フルスケールを用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのクロマトグラムを与える。
【図２ｂ】図２は、Ｗａｔｅｒｓ，ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅカラム（ｂ）延長スケールを用いたフォンダパリヌクスナトリウムについてのクロマトグラムを与える。
【図３】図３は、様々な種類の塩：（ａ）５０ｍＭギ酸アンモニウム、（ｂ）１００ｍＭギ酸アンモニウム、（ｃ）１００ｍＭギ酸ピリジニウム、及び（ｄ）５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて分析された製剤原料の伸長スケールにおけるクロマトグラムを与える。
【図４】図４は、様々な濃度のギ酸アンモニウム（伸長スケールにおける）：（ａ）５０ｍＭ、（ｂ）１００ｍＭ、（ｃ）１２５ｍＭ、（ｄ）１５０ｍＭ、（ｅ）１７５ｍＭ、及び（ｆ）２００ｍＭを用いて分析された製剤原料の伸長スケールにおけるクロマトグラムを与える。
【図５】移動相（ａ）移動相Ａ：２００ｍＭギ酸アンモニウム；移動相Ｂ：アセトン及びアセトニトリル、１／１、（ｂ）移動相Ａ：２００ｍＭギ酸アンモニウム；移動相Ｂ：アセトニトリルである異なる有機溶媒を用いて分析された製剤原料の伸長スケールにおけるクロマトグラムを与える。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１ａ】
2016524166.tif 000020
【図１ｂ】
2016524166.tif 000021
【図１ｃ】
2016524166.tif 000022
【図１ｄ】
2016524166.tif 000023
【図１ｅ】
2016524166.tif 000024
【図１ｆ】
2016524166.tif 000025
【図１ｇ】
2016524166.tif 000026
【図１ｈ】
2016524166.tif 000027
【図２ａ】
2016524166.tif 000028
【図２ｂ】
2016524166.tif 000029
【図３】
2016524166.tif 000030
【図４】
2016524166.tif 000031
【図５】
2016524166.tif 000032
【国際調査報告】
2016524166.tif 000033
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