(57)【要約】特に、本発明は、トリプルネガティブ乳ガンを患っている患者における再発及び遠隔転移のリスクを予測するための方法であって、ｉ）該患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも高い場合、該患者が再発及び遠隔転移のリスク増加を示すと結論する工程、又は工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも低い場合、該患者が再発及び遠隔転移のリスク減少を示すと結論する工程を含む方法に関する。本発明はまた、トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防するための方法であって、ｉ）本発明の方法によって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示すと結論した場合、治療有効量のＣＤ９５アンタゴニストを該被験体に投与することからなる工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプルネガティブ乳ガンを患っている患者における再発及び遠隔転移のリスクを予測するための方法であって、ｉ）該患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも高い場合、該患者が再発及び遠隔転移のリスク増加を示すと結論する工程、又は工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも低い場合、該患者が再発及び遠隔転移のリスク減少を示すと結論する工程を含む、方法。
【請求項２】
トリプルネガティブ乳ガンを患っている患者における無病生存を予測するための方法であって、ｉ）該患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも高い場合、該患者が予後不良であると結論する工程、又は工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも低い場合、該患者が予後良好であると結論する工程を含む、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法を実施するためのキットであって、患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定するための手段を含む、キット。
【請求項４】
可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定するための前記手段が、可溶性ＣＤ９５Ｌと特異的に相互作用する抗体である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
それを必要とする被験体におけるトリプルネガティブ乳ガンを治療するための方法であって、治療有効量のＣＤ９５アンタゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項６】
トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防するための方法であって、治療有効量のＣＤ９５アンタゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項７】
トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防する方法であって、ｉ）請求項１に記載の方法を実施することによって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示すと結論した場合、治療有効量のＣＤ９５アンタゴニストを該被験体に投与することからなる工程を含む、方法。
【請求項８】
ＣＤ９５アンタゴニストが、抗可溶性ＣＤ９５Ｌ抗体及び抗ＣＤ９５抗体からなる群より選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗ＣＤ９５抗体が、ＣＤ９５（配列番号１）の４３位のアミノ酸と６６位のアミノ酸との間で区切られた領域に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ９５アンタゴニストが、ＣＤ９５レセプターの細胞外ドメインと、ＩｇＧ抗体のＦｃドメインとからなる完全ヒト融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ９５アンタゴニストが、ＣＤ９５発現阻害剤又はＣＤ９５Ｌ発現阻害剤である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防する方法であって、ｉ）本発明の方法によって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示す（すなわち、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルが所定の基準値よりも高い）と結論した場合、治療有効量のＥＧＦＲアンタゴニストを該被験体に投与することからなる工程を含む、方法。
【請求項１３】
トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防する方法であって、ｉ）請求項１に記載の方法を実施することによって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示すと結論した場合、治療有効量のＰＩ３Ｋ阻害剤を該被験体に投与することからなる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、トリプルネガティブ乳ガンの転移を予測及び予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ガンでは、原発性腫瘍細胞が周囲組織への浸潤能を獲得して、転移と称される新たな腫瘍を形成し得るが、これは依然としてガン関連死亡率（９０％）の主な原因である。現在のところ、転移を有効に予防するための治療法は存在しない（Christofori, 2006）。ヒト乳房腫瘍は、病態及び分子プロファイルの両方の点で異種性である。トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）は、エストロゲンレセプター及びプロゲステロンレセプター並びにヒト上皮成長因子レセプター−２（ＨＥＲ２）に関する免疫組織化学的染色がネガティブであることによって区別され、全ての乳ガンの１５％に相当する。最近の研究では、乳ガンは、その遺伝子発現プロファイルに基づいて、管腔Ａ／Ｂ、ＨＥＲ−２、基底様及び正常乳房様腫瘍として分類された（Sotiriou and Pusztai, 2009）。この分析に基づいて、基底様乳ガンは、トリプルネガティブ乳ガンの近縁として判定された（Perou et al., 2000）。トリプルネガティブ（ＴＮ）乳房腫瘍は、侵襲性であり、有効な治療処置選択肢がないので、患者の死亡の相当数を占めている。ＴＮ腫瘍を有する女性は、内分泌療法からもトラスツズマブ治療（抗ＨＥＲ２ｍＡｂ）からも利益を得られず、現在のところ、この種のガンに関する好ましい標準化学療法は存在しない（Foulkes et al., 2010）。予後最悪の最も侵襲性のガン種であるＴＮ／基底様乳ガンは、他の悪性細胞と比較して最大の転移程度を示す（Sorlie et al., 2001）。
【０００３】
したがって、ＴＮ乳ガン細胞の遊走を促進する分子因子及び経路に関する知見が得られると、ＴＮＢＣ患者における転移性播種を予防するための潜在的な治療戦略が明らかになって、実質的な治療利益が得られ得る。
【０００４】
ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬとしても公知である）はＴＮＦ（腫瘍壊死因子）ファミリーに属し、「デスレセプター」ＣＤ９５（Ｆａｓとしても公知である）のリガンドである。遍在的に発現しているそのレセプターとは対照的に、ＣＤ９５Ｌは、限定的な発現パターンを示すと報告されており、活性化Ｔリンパ球及びＮＫ細胞の表面（ＣＤ９５Ｌが、感染細胞及びトランスフォーメーション細胞の排除において重要な役割を果たす場所）で主に観察される。ＣＤ９５Ｌはまた、炎症症状下では、上皮細胞、マクロファージ及び樹状細胞の表面上で発現している（Tauzin et al., 2012）。ＣＤ９５Ｌは膜貫通「サイトカイン」であり、その細胞外ドメインは、ＭＭＰ３（Matsuno et al., 2001）、ＭＭＰ７（Vargo-Gogola et al., 2002）、ＭＭＰ９（Kiaei et al., 2007）又はＡＤＡＭ−１０（A Disintegrin And Metalloproteinase 10）（Kirkin et al., 2007; Schulte et al., 2007）などのメタロプロテアーゼによって切断されて、可溶性リガンドが生成され得る。最初、この可溶性リガンドは、ＣＤ９５に対する結合について、その膜結合型カウンターパートと競合して、死シグナルのアンタゴニストとして作用する不活性リガンドとして説明されていた（Schneider et al., 1998; Suda et al., 1997）。しかしながら、より最近の知見では、メタロプロテアーゼによって切断されたＣＤ９５Ｌは、全身性エリテマトーデスなどの慢性炎症性障害における炎症の悪化に積極的に関与することが実証された（O' Reilly et al., 2009; Tauzin et al., 2011）。また、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ系には、未解明の分子機構を介して卵巣ガン及び肝臓ガンの増殖（Chen et al., 2010）、神経膠芽腫の浸潤（Kleber et al., 2008）並びに肺ガンの化学療法耐性（Bivona et al., 2011）を促進することによる発ガン促進機能があった。
【０００５】
分子的な観点からすれば、膜結合型ＣＤ９５Ｌ（Ｍ−ＣＤ９５Ｌ）がＣＤ９５に結合すると、デスドメイン（ＤＤ）と称されるＣＤ９５細胞内領域においてアダプタータンパク質Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）がリクルートされる。次に、ＦＡＤＤは、カスパーゼ８及び１０に結合して一体となる。死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）（Kischkel et al., 1995）と称されるこのＣＤ９５／ＦＡＤＤ／カスパーゼ複合体は、アポトーシスシグナルの開始において重要な役割を果たす。対照的に、メタロプロテアーゼによって切断されたＣＤ９５Ｌは、ＤＩＳＣの形成を誘導することができないが、その代わりに、本発明者らがＭＩＳＣ（運動誘導シグナル伝達複合体）と命名した（Tauzin et al., 2011）非定型複合体の形成を促進する。この非アポトーシス複合体は、ｓｒｃキナーゼｃ−ｙｅｓを含有し、Ｔ細胞の内皮移動を促進するカルシウム（Ｃａ２＋）／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の誘導をもたらす（Tauzin et al., 2011）。ＣＤ９５とｃｌ−ＣＤ９５Ｌの会合をＰＩ３Ｋ活性化に結び付ける機構的関連性は依然として不明である。
【０００６】
発明の概要：
本発明は、トリプルネガティブ乳ガンを患っている患者における再発及び遠隔転移のリスクを予測するための方法に関する。本発明はまた、それを必要とする患者におけるトリプルネガティブ乳ガンを治療するための方法に関する。
【０００７】
発明の詳細な説明：
アポトーシス因子であると考えられるＣＤ９５Ｌは、悪性細胞を排除する免疫細胞によって発現される。メタロプロテアーゼによる切断後、このタンパク質は血液中に放出される。ガンでは、多量の血清ＣＤ９５Ｌが検出されているが、このサイトカインが病因において役割を果たすか否かは依然として不明である。本発明者らは、トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）を有する患者では、血清ＣＤ９５Ｌの量が非ＴＮＢＣと比較して増加しており、再発のリスクに関連していることを示す。ＣＤ９５Ｌは、血管を覆う内皮細胞上で発現しており、メタロプロテアーゼによる切断後、ＴＮＢＣ細胞における運動促進ｃ−ｙｅｓ／ＥＧＦＲ／Ｃａ２＋／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を実行することが、乳房腫瘍構造の分析により明らかになる。全体的には、これらの知見により、乳ガンにおけるＣＤ９５Ｌの転移促進的役割が明らかになる。
【０００８】
ガンでは、転移は依然として主な死亡原因であり、それを予防するための治療法は存在しない。乳ガンは異種病状に相当し、治療を適応させるためには、遠隔転移の可能性について高リスク及び低リスクな患者サブセットを確実に選択するための予後マーカーを同定することが重要である。本発明者らは、ＴＮＢＣでは、血清ＣＤ９５Ｌ濃度が非ＴＮＢＣ患者と比較して増加しており、遠隔転移のリスクを予測することを実証する。ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞は、ＰＩ３Ｋシグナルの活性化及び細胞遊走につながる一連のイベント（ＮＡＤＰＨ駆動性のＲＯＳ生成、ｃ−ｙｅｓの活性化、ＥＧＦＲのリクルート、及びＣａ２＋チャネルＯｒａｉ１の開口）を受けることから、ＣＤ９５Ｌの転移促進的役割が分子的に裏付けられた。
【０００９】
予測方法：
したがって、本発明の態様は、トリプルネガティブ乳ガンを患っている患者における再発及び遠隔転移のリスクを予測するための方法であって、ｉ）該患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも高い場合、該患者が再発及び遠隔転移のリスク増加を示すと結論する工程、又は工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも低い場合、該患者が再発及び遠隔転移のリスク減少を示すと結論する工程を含む方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、トリプルネガティブ乳ガンを患っている患者における無病生存を予測するための方法であって、ｉ）該患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも高い場合、該患者が予後不良であると結論する工程、又は工程ｉ）で決定したレベルが該所定の基準値よりも低い場合、該患者が予後良好であると結論する工程を含む方法に関する。
【００１１】
本明細書で使用される表現「トリプルネガティブ乳ガン」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、前記乳ガンが、ホルモンエストロゲン（ＥＲ陰性）及びプロゲステロン（ＰＲ陰性）並びにタンパク質ＨＥＲ２のレセプターを欠くことを意味する。
【００１２】
「血液サンプル」は、一定量の全血又はその画分、例えば血清、血漿などを意味する
【００１３】
本明細書で使用される用語「ＣＤ９５」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、哺乳動物細胞表面上に存在するレセプターＣＤ９５を指し、その同族リガンドＣＤ９５Ｌの三量体型が結合すると、アポトーシス誘導能を有することが最初に示されている（Krammer,P.H. (2000). CD95's deadly mission in the immune system. Nature 407, 789-795）。ＣＤ９５は、ＦａｓＲ又はＡｐｏ−１としても公知である。ＣＤ９５の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッションナンバー：Ｐ２５４４５）として示されている。
【００１４】
配列番号１
【化１】
2016508606.tif 000002
【００１５】
本明細書で使用される用語ＣＤ９５Ｌは、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膜貫通タンパク質であるＣＤ９５の同族リガンドを指す。
【００１６】
本明細書で使用される用語「可溶性ＣＤ９５Ｌ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膜貫通ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬとしても公知である）の切断によって生成される可溶性リガンドを指す（Matsuno et al., 2001; Vargo-Gogola et al., 2002; Kiaei et al., 2007; Kirkin et al., 2007;又はSchulte et al., 2007）。用語「血清ＣＤ９５Ｌ」、「可溶性ＣＤ９５Ｌ」、「メタロプロテアーゼによって切断されたＣＤ９５Ｌ」及び「ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ」は、本明細書を通じて同じ意味を有する。ＣＤ９Ｌ５の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッションナンバー：Ｐ４８０２３）として示されている。
【００１７】
配列番号２
【化２】
2016508606.tif 000003
【００１８】
所定の基準値は、当技術分野における任意の周知の方法によって決定され得る。例えば、所定の基準値は、典型的には、
ａ）トリプルネガティブ乳ガン患者由来の血液サンプルコレクションを提供する工程；
ｂ）工程ａ）で提供した各血液サンプルについて、対応するトリプルネガティブ乳ガン患者の実際の臨床転帰に関係する情報（すなわち、再発及び遠隔転移のリスク、無病生存期間（ＤＦＳ）並びに／又は全生存期間（ＯＳ））を提供する工程；
ｃ）一連の任意定量値を提供する工程；
ｄ）工程ａ）で提供したコレクションに含まれる各血液サンプルの可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを決定する工程；
ｅ）工程ｃ）で提供した１つの特定の任意定量値について、前記血液サンプルをそれぞれ２つのグループ（（ｉ）前記一連の定量値に含まれる前記任意定量値よりも低レベルな定量値を示す血液サンプルを含む第１のグループ；（ｉｉ）前記一連の定量値に含まれる前記任意定量値よりも高レベルな定量値を示す血液サンプルを含む第２のグループ）に分類し、それにより、前記特定の定量値について２つの血液サンプルグループを得、各グループの血液サンプルを別個に計数する工程；
ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と、（ｉｉ）工程ｆ）で定義した第１のグループ及び第２のグループに含まれる血液サンプルが由来する患者の実際の臨床転帰との間の統計的有意性を計算する工程；
ｇ）工程ｄ）で提供した全ての任意定量値を試験するまで、工程ｆ）及びｇ）を反復する工程；
ｈ）工程ｇ）において、最高の統計的有意性（最も有意）が計算された任意定量値からなるものとして前記所定の基準値を設定する工程
を含む方法を行うことによって決定され得る。
【００１９】
例えば、１００人の患者の１００個の血液サンプルについて、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを評価した。可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルにしたがって、１００個のサンプルをランク付けする。サンプル１は最高レベルを有し、サンプル１００は最低レベルを有する。最初のグルーピングにより、２つのサブセットが得られる：一方はサンプルＮｒ１、他方は９９個の他のサンプル。次のグルーピングにより、一方はサンプル１及び２が得られ、他方は９８個の残りのサンプルが得られる、など。最後のグルーピングまでに、一方はサンプル１〜９９、他方はサンプルＮｒ１００。対応するガン患者の実際の臨床転帰に関係する情報にしたがって、２つのサブセットの９９個の各グループについて、Kaplan Meier曲線を作成する。また、９９個の各グループについて、両サブセット間のｐ値を計算した。次いで、最小のｐ値の基準に基づく識別が最も強くなるように、所定の基準値を選択する。他の点では、ｐ値が最小となる両サブセット間の境界に対応する可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを所定の基準値とみなす。所定の基準値は、必ずしも可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルの中央値ではないことに留意すべきである。
【００２０】
したがって、シングル「カットオフ」値の設定は、再発及び遠隔転移のリスク増加と、再発及び遠隔転移のリスク減少との（又は、患者のＤＦＳ及びＯＳに関して予後不良と予後良好との）間の識別を可能にする。特に、単一の任意定量値だけではなく、一定範囲の連続する任意定量値について、高い統計的有意値（例えば、低いＰ値）が一般的に得られる。したがって、本発明の代替的な一実施態様では、明確な所定の基準値を使用することに代えて、一定範囲の値が提供される。
【００２１】
したがって、最小の統計的有意値（有意性の最小閾値、例えば最大閾値のＰ値）を任意に設定し、一定範囲の定量値が提供されるように、工程ｇ）で計算した統計的有意値がより高い（より有意、例えばより低いＰ値）一定範囲の複数の任意定量値を保持する。この範囲の定量値は、上記「カットオフ」値を含む。
【００２２】
例えば、「カットオフ」値のこの特定の実施態様にしたがって、判定する値の範囲と可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを比較することによって、転帰を決定し得る。したがって、特定の実施態様では、カットオフ値は、例えば、最高の統計的有意値が見られる定量値（例えば、一般的には、見られる最小のＰ値）を中心とした一定範囲の定量値からなる。例えば、１〜１０の仮想スケールにおいて、理想的なカットオフ値（最高の統計的有意性を有する値）が５である場合、適切な（例示的な）範囲は４〜６であり得る。したがって、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定することによって得られた値を比較することによって、患者を評価することができ、この場合、５超の値は、再発及び遠隔転移のリスク増加（又は予後不良）を示し、５未満の値は、再発及び遠隔転移のリスク減少（又は予後良好）を示す。別の実施態様では、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定することによって得られた値を比較し、スケールの値を比較することによって、患者を評価することができ、この場合、４〜６の範囲を上回る値は、再発及び遠隔転移のリスク増加（又は予後不良）を示し、４〜６の範囲を下回る値は、再発及び遠隔転移のリスク減少（又は予後良好）を示し、４〜６の範囲内に入る値は、中間の転帰（又は予後）を示す。
【００２３】
典型的には、所定の基準値は、８０pg/ml又は１２０pg/mlであり得る（図１を参照のこと）。
【００２４】
本発明によれば、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルの測定は、様々な技術によって実施され得る。典型的には、前記方法は、サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌと選択的に相互作用することができる結合パートナーとサンプルを接触させることを含み得る。いくつかの態様では、結合パートナーは、例えば、モノクローナル抗体などの抗体又はアプタマーである。
【００２５】
上記アッセイは、一般的に、パートナー（すなわち、抗体又はアプタマー）を固体支持体に結合させることを含む。本発明の実施に使用され得る固体支持体としては、基材、例えばニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェル形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどが挙げられる。
【００２６】
可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルは、例えば、競合アッセイ、直接反応アッセイ又はサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む標準的な免疫診断技術を使用することによって測定され得る。このようなアッセイとしては、限定されないが、凝集試験、酵素標識及び媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降が挙げられる。
【００２７】
特定のタンパク質を同定するための例示的な生化学的試験は、ＥＬＩＳＡ試験などの標準的な試験フォーマットを用いるが、本明細書で提供される情報は、他の生化学的試験又は診断試験の開発に適用することができ、ＥＬＩＳＡ試験の開発に限定されない（例えば、ＥＬＩＳＡ試験の説明については、Molecular Immunology: A Textbook, edited by Atassi et al. Marcel Dekker Inc., New York and Basel 1984を参照のこと）。様々な血漿成分用の市販のアッセイ酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbant assay）（ＥＬＩＳＡ）キットが利用可能であると理解される。したがって、可溶性ＣＤ９５Ｌを認識する抗体のセットでマイクロタイタープレートのウェルをコーティングするＥＬＩＳＡ法を使用し得る。次いで、可溶性ＣＤ９５Ｌを含有するサンプル、又は可溶性ＣＤ９５Ｌを含有すると疑われるサンプルをコーティングウェルに追加する。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して未結合の部分を除去し、検出可能に標識された二次結合分子を追加する。二次結合分子を任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出する。
【００２８】
（イムノアッセイベースの方法にかかわらず）可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルの測定はまた、化合物の分離；化合物の分子量に基づく遠心分離；質量及び電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；並びに、使用される特定の固相に対する化合物の親和性に基づく固相アフィニティーを含み得る。分離したら、前記１つ又は２つのバイオマーカータンパク質を、その化合物の公知の「分離プロファイル」（例えば、保持時間）に基づいて同定し、標準的な技術を使用して測定し得る。
【００２９】
あるいは、例えば、質量分析計によって、分離した化合物を検出及び測定し得る。
【００３０】
典型的には、サンプル中の免疫反応性可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルは、可溶性ＣＤ９５Ｌに対して特異的なモノクローナル抗体（Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan）を用いて、二重抗体「サンドイッチ」技術に基づくイムノメトリックアッセイによって測定され得る。前記実施態様によれば、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定するための前記手段は、例えば、ｉ）可溶性ＣＤ９５Ｌバッファー、ｉｉ）可溶性ＣＤ９５Ｌと特異的に相互作用するモノクローナル抗体、ｉｉｉ）可溶性ＣＤ９５Ｌに対して特異的な酵素標識抗体及び可溶性ＣＤ９５Ｌの所定の基準値である。
【００３１】
キット：
本発明のさらなる目的は、上記方法を実施するためのキットであって、患者から得られた血液サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定するための手段を含むキットに関する。
【００３２】
特定の実施態様では、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定するための前記手段は、可溶性ＣＤ９５Ｌと特異的に相互作用する抗体である。別の実施態様では、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルを測定するための前記手段は、可溶性ＣＤ９５Ｌを特異的に認識するアプタマー又は任意の他の結合パートナーであり得る。
【００３３】
より容易な検出のために、前記結合パートナーにタグを付けることができる。それを基質表面（例えば、ビーズ、アレイなど）上に固定化してもよいし、又は固定化しなくてもよい。例えば、本発明のキットは、本明細書で提供されるように、心血管イベントを有するリスクを予測するためのアレイを含み得る。あるいは、（例えば、ゲル電気泳動及び膜転写を介して）結合パートナーを固定化するために、基質表面（例えば、膜）を本発明のキットに含め得る。
【００３４】
加えて、本発明のキットはまた、一般的に、キットに含まれる結合パートナーと本発明のバイオマーカーとの間の複合体を検出するための少なくとも１つの試薬を含む。
【００３５】
手順に応じて、キットは、抽出バッファー及び／又は試薬、ウエスタンブロッティングバッファー及び／又は試薬、並びに検出手段の１つ以上をさらに含み得る。手順の様々な工程を実施するためのこれらのバッファー及び試薬を使用するためのプロトコールは、キットに含まれ得る。
【００３６】
本発明のキットに含まれる様々な試薬は、（例えば、凍結乾燥された）固体又は液体の形態で供給され得る。本発明のキットは、場合により、個々の各バッファー及び／又は試薬のための様々な容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル）を含み得る。各成分は、一般的に、その各容器に分注されるか、又は濃縮形態で提供されるのに適切であろう。開示される方法の特定の工程を行うのに適切な他の容器も提供され得る。市販の場合、キットの個々の容器は、好ましくは、厳重な管理下で管理される。
【００３７】
特定の実施態様では、キットは、本発明の方法にしたがって患者における心血管イベントを予測するためのその構成要素の使用説明書を含む。本発明の方法のキットの使用説明書は、患者から得られた生物学的サンプルを処理するための説明書、及び／又は試験を実施するための説明書、又は結果を解釈するための説明書を含み得る。キットはまた、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定される形式の通知書を含有し得る。
【００３８】
治療方法：
本発明はまた、それを必要とする被験体におけるトリプルネガティブ乳ガンを治療するのに使用するためのＣＤ９５アンタゴニストに関する。
【００３９】
本発明はまた、トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防するのに使用するためのＣＤ９５アンタゴニストに関する。
【００４０】
本発明はまた、トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防する方法であって、ｉ）本発明の方法によって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示す（すなわち、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルが所定の基準値よりも高い）と結論した場合、治療有効量のＣＤ９５アンタゴニストを該被験体に投与することからなる工程を含む方法に関する。
【００４１】
用語「ＣＤ９５アンタゴニスト」は、可溶性ＣＤ９５Ｌに対するＣＤ９５の結合によって媒介されるシグナル伝達を減弱させる任意の分子を意味する。特に、ＣＤ９５アンタゴニストは、可溶性ＣＤ９５Ｌによって誘導される運動誘導シグナル伝達複合体の形成を阻害、低減、抑制又は別の方法で低減する分子である。他の点では、ＣＤ９５アンタゴニストは、ＴＮＢＣ細胞において可溶性ＣＤ９５Ｌによってトリガーされる運動促進ｃ−ｙｅｓ／ＥＧＦＲ／Ｃａ２＋／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を阻害、低減、抑制又は別の方法で低減する分子である。（ｉ）本発明のＣＤ９５アンタゴニストがシグナル伝達をトリガーせずにＣＤ９５に結合して、可溶性ＣＤ９５Ｌによって媒介されるシグナル伝達を低減又は遮断した場合；（ｉｉ）ＣＤ９５アンタゴニストが可溶性ＣＤ９５Ｌに結合して、ＣＤ９５に対するその結合を防止した場合；（ｉｉｉ）調節鎖の一部である分子にＣＤ９５アンタゴニストが結合した場合、又は前記分子の活性をＣＤ９５アンタゴニストが別の方法で阻害した場合（これは、阻害されなければ、可溶性ＣＤ９５Ｌによって媒介されるＣＤ９５シグナル伝達を刺激又は別の方法で促進する結果となる）；又は、（ｉｖ）ＣＤ９５アンタゴニストが、特に、ＣＤ９５又はＣＤ９５Ｌをコードする遺伝子の１つ以上の発現を低減又は抑制することによって、ＣＤ９５発現又はＣＤ９５Ｌ発現を阻害した場合、このような阻害が起こり得る。
【００４２】
典型的には、ＣＤ９５アンタゴニストとしては、限定されないが、抗体、小有機分子、ポリペプチド及びアプタマーが挙げられる。
【００４３】
一実施態様では、薬剤は抗体である。本発明は、抗体又は抗体フラグメントを包含する。典型的には、本発明の抗体は、可溶性ＣＤ９５ＬとＣＤ９５との間の相互作用を遮断する能力を有するか、又は（例えば、ＣＤ９５のオリゴマー化を阻害することによって）可溶性ＣＤ９５Ｌによって媒介されるシグナル伝達の誘導を遮断する能力を有する。抗体は、可溶性ＣＤ９５Ｌ又はＣＤ９５に対する特異性を有し得る。
【００４４】
一実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤ９５の細胞外ドメインの全部又は一部に対するものである。一実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤ９５の細胞外ドメインに対するものである。より具体的には、本発明は、可溶性ＣＤ９５Ｌに対するＣＤ９５の結合を阻害することができる抗体又はその部分であって、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合するＣＤ９５の領域内に位置するエピトープに結合する抗体又はその部分を提供する。さらにより具体的には、本発明は、レセプターのオリゴマー化に関与するＣＤ９５の領域内に位置するエピトープに結合することができる抗体又はその部分を提供する。典型的には、抗体は、プレリガンドアセンブリドメイン（ＰＬＡＤ）（Edmond V, Ghali B, Penna A, Taupin JL, Daburon S, Moreau JF, Legembre P. Precise mapping of the CD95 pre-ligand assembly domain. PLoS One. 2012;7(9):e46236. doi: 10.1371/journal.pone.0046236. Epub 2012 Sep 25.）と称されるＣＤ９５のシステインリッチドメイン１に結合する。特に、本発明の抗体は、４３位のアミノ酸と６６位のアミノ酸との間で区切られた領域に結合する。
【００４５】
本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【００４６】
本明細書で使用される「抗体」は、天然に存在する抗体及び天然に存在しない抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその一価フラグメント及び二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体及びそれらのフラグメントを含む。抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるためのリコンビナント方法によってヒト化され得る。
【００４７】
抗体は、従来の方法にしたがって調製される。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Nature, 256:495, 1975)の方法を使用して作製され得る。本発明で有用なモノクローナル抗体を調製するために、抗原型可溶性ＣＤ９５Ｌ又はＣＤ９５でマウス又は他の適切な宿主動物を適切な間隔で（例えば、週２回、週１回、月２回又は月１回）免疫する。屠殺の１週間以内に、最終「追加免疫」の抗原を動物に投与し得る。免疫中に免疫学的アジュバントを使用することが望ましいことが多い。適切な免疫学的アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter's Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはＱｕｉｌＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野で周知である。皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって、動物を免疫し得る。複数の経路によって、複数の形態の抗原で所定の動物を免疫し得る。
【００４８】
簡潔に言えば、リコンビナント可溶性ＣＤ９５Ｌは、リコンビナント細胞株による発現によって提供され得る。ＣＤ９５は、その表面にＣＤ９５を発現するヒト細胞の形態で提供され得る。リコンビナント型ＣＤ９５又は可溶性ＣＤ９５Ｌは、任意の前記方法を使用して提供され得る。免疫レジメンの後、動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器からリンパ球を単離し、次いでポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、記載されているように（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）、標準的な方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマが成長可能な培地中に細胞を置く。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性の（すなわち、抗原に選択的に結合する）抗体の存在について、細胞上清を分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウエスタンブロッティングが挙げられる。他のスクリーニング技術は当技術分野で周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトな抗原であって、ネイティブにフォールディングされた抗原に対する抗体の結合を確認するもの、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【００４９】
重要なことに、当技術分野で周知であるように、抗体分子のごく一部（パラトープ）のみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般的に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。Ｆｃ’領域及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された抗体、又はｐＦｃ’領域なしで生産された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体、又はＦｃ領域なしで生産された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに進めて、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と、抗体重鎖の一部（Ｆｄと称される）とからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させずに、最大１０個の異なる軽鎖に結合され得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００５０】
当技術分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが存在する（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より具体的には重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性に大きく関与する。
【００５１】
元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を同種抗体又は異種特異的抗体の類似領域で置換し得ることは、現在では当技術分野で十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して機能的抗体を生産する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に具現されている。
【００５２】
特定の実施態様では、本発明は、ヒト化型抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書で使用される「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を表す。ヒト化の方法としては、限定されないが、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号及び米国特許第５，８５９，２０５号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。また、上記米国特許第５，５８５，０８９及び米国特許第５，６９３，７６１並びに国際公開第９０／０７８６１号では、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの可能な基準が提案されている。第１案は、アクセプターの場合、ヒト化すべきドナー免疫グロブリンと通常は相同的な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が通常のものではなく、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なのものである場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第３案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第４案は、抗体の三次元モデルにおいて、アミノ酸がＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置にドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記方法は、当業者がヒト化抗体の作製に用いることができるいくつかの方法の単なる例示である。当業者であれば、他の抗体ヒト化方法を熟知しているであろう。
【００５３】
ヒト化型抗体の一実施態様では、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部は不変である。アミノ酸のわずかな付加、欠失、挿入、置換又は改変は、それらが、所定の抗原に対する抗体の結合能を抑制しない限り許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかしながら、特定ヒト化の方法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されている「指向性進化」方法を使用して増加させ得る。
【００５４】
また、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することによって、完全ヒトモノクローナル抗体を調製し得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５９８，３６９号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第６，１５０，５８４号及びそこで引用されている参考文献（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。これらの動物を免疫すると目的の抗原に対する完全ヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するように前記動物をさらに改変する。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Abgenix）、ＨｕＭＡｂマウス（Medarex/GenPharm））の免疫後、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって、モノクローナル抗体を調製し得る。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しない。
【００５５】
ヒト抗体を生産するためのin vitro方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のin vitro刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び米国特許第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
したがって、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；並びに、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００５７】
様々な抗体分子及びフラグメントは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００５８】
別の実施態様では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」は、軽鎖を本来的に欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも称される。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００５９】
本明細書に記載される薬剤の一実施態様では、薬剤はポリペプチドである。特定の実施態様では、ポリペプチドは、ＣＤ９５の機能的等価物である。本明細書で使用される「ＣＤ９５の機能的等価物」は、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合し、それにより、ＣＤ９５との相互作用を防止することができる化合物である。用語「機能的等価物」は、ＣＤ９５のフラグメント、突然変異体及び変異タンパク質を含む。したがって、用語「機能的等価物」は、可溶性ＣＤ９５Ｌに対する結合能をタンパク質類似体が保持するようにアミノ酸配列を変化させることによって（例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によって）得られたＣＤ９５の任意の等価物を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点変異によって行われ得る。機能的等価物は、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合する分子であって、ＣＤ９５の細胞外ドメインの全部又は一部を含む分子を含む。
【００６０】
機能的等価物は、可溶型ＣＤ９５を含む。これらのタンパク質又はその機能的等価物の適切な可溶型は、例えば、化学的方法、タンパク質分解方法又はリコンビナント方法によって膜貫通ドメインが除去された短縮型タンパク質を含み得る。
【００６１】
好ましくは、機能的等価物は、対応するタンパク質と少なくとも８０％相同である。好ましい実施態様では、機能的等価物は、例えば、Pileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）などの任意の通常の分析アルゴリズムによって評価した場合に、少なくとも９０％相同である。
【００６２】
また、本明細書で使用される用語「機能的に等価なフラグメント」は、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合する任意のＣＤ９５フラグメント又はＣＤ９５フラグメントのアセンブリを意味し得る。したがって、本発明は、可溶性ＣＤ９５Ｌに対するＣＤ９５の結合を阻害することができるポリペプチドであって、可溶性ＣＤ９５Ｌに結合するＣＤ９５の細胞外ドメインの少なくとも一部の配列に対応する配列を有する連続アミノ酸を含むポリペプチドを提供する。一実施態様では、ポリペプチドは、ＣＤ９５の細胞外ドメインに対応する。
【００６３】
機能的に等価なフラグメントは、本明細書で同定されたヒトＣＤ９５と同じタンパク質ファミリーに属し得る。「タンパク質ファミリー」は、共通の機能を共有し、共通の配列相同性を示すタンパク質群を意味する。相同タンパク質は、非ヒト種に由来し得る。好ましくは、機能的に等価なタンパク質配列間の相同性は、完全タンパク質のアミノ酸配列全体にわたって少なくとも２５％である。より好ましくは、相同性は、タンパク質又はタンパク質フラグメントのアミノ酸配列全体にわたって少なくとも５０％、さらにより好ましくは７５％である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって８０％超である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって９０％超である。より好ましくは、相同性は、配列全体にわたって９５％超である。
【００６４】
当業者には明らかであるように、本発明のポリペプチドは、任意の適切な手段によって生産され得る。本発明にしたがって使用するのに十分な量のＣＤ９５又はその機能的等価物を生産するために、適切な条件下で、本発明のポリペプチドを含有するリコンビナント宿主細胞を培養することによって、発現を有利に達成し得る。好ましくは、ポリペプチドは、リコンビナント手段によって、コード核酸分子からの発現によって生産される。様々な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングして発現させるための系は周知である。
【００６５】
リコンビナント型で発現させる場合、好ましくは、宿主細胞においてコード核酸を発現させることによって、ポリペプチドを作製する。特定の系の個々の要件に応じて、任意の宿主細胞が使用され得る。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドを発現させるための当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞などが挙げられる。細菌は容易に操作及び成長させ得るので、細菌は、リコンビナントタンパク質の生産に好ましい宿主である。一般的な好ましい細菌宿主は、E coliである。
【００６６】
特定の実施態様では、その治療効果を改善するために、本発明の治療方法に使用されるポリペプチドを改変し得ることが企図される。治療化合物のこのような改変を使用して、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、又は体内分布を改変し得る。例えば、体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルとの組み合わせによって、潜在的に重要な治療化合物の毒性を有意に減少させ得る。例えば、ジペプチドの追加は、循環剤が、内因性トランスポーターを使用することによって血液網膜関門を通って眼内に浸透するのを改善し得る。
【００６７】
薬物のバイアビリティを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーが、体内分布を改変し、細胞取り込みの様式を改善し、生理学的障壁を通る浸透性を変化させ、体内からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング効果又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００６８】
生体適合性が高度であり改変容易であることから、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームに付加すると、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されている。鎖の末端のヒドロキシル基を通して、および他の化学的方法を介して、ＰＥＧを活性薬剤にカップリングし得る；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２つの活性薬剤に制限される。ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子当たりの付着点が多いというさらなる利点を有し（より大きな薬物ローディングを提供する）、様々な用途に適するように合成設計することができる新規生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーが様々なアプローチで検討された。
【００６９】
当業者であれば、薬物の有効な改変のためのＰＥＧ化技術を把握している。例えば、ＰＥＧと三官能性モノマー（例えば、リジン）との交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーがVectraMed（Plainsboro, N.J.）によって使用されている。安定なウレタン結合によって、ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン以下）をリジンのａ−アミノ基及びｅ−アミノ基に連結する。このようなコポリマーは、ＰＥＧの所望の特性を保持する一方で、ポリマー鎖に沿って厳密にコントロールされた所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋、又は他の分子とのコンジュゲーションに使用され得る。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の切断可能な連結を変化させることによって、安定な長期循環型プロドラッグを生産するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔、及びコンジュゲートの分子量当たりの薬物の量（ＰＥＧセグメントが小さいほど、薬物ローディングがより大きい）に影響を及ぼす。一般的に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量を増加させると、コンジュゲートの循環半減期が増加するだろう。それにもかかわらず、コンジュゲートは易分解性でなければならないか、又は糸球体ろ過限界値未満（例えば、６０kDa未満）の分子量を有しなければならない。
【００７０】
循環半減期及び体内分布の維持に重要なポリマー骨格に加えて、ターゲット組織内の特定のトリガー（典型的には、酵素活性）によって骨格ポリマーから放出されるまで治療剤をプロドラッグ形態に維持するために、リンカーを使用し得る。例えば、体内分布の特定部位への送達が必要であり、治療剤が病変部位又はその付近に放出される場合、この種の組織活性化薬物送達が特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは当業者には公知であり、酵素動態、活性酵素の普及、及び選択される疾患特異的酵素の切断特異性に基づくものであり得る。このようなリンカーは、治療送達のために本明細書に記載されるタンパク質又はタンパク質フラグメントを改変するのに使用され得る。
【００７１】
さらに別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、無関係のタンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質に由来するポリペプチド）に融合され得る。
【００７２】
本明細書で使用される用語「融合された」及び「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーション又はリコンビナント手段を含む何らかの手段によって、２つ以上の要素又は成分を一緒に連結することを指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持するように、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連結して、連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、リコンビナント融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（通常、このセグメントは、天然ではそのように連結されない）を含有する単一のタンパク質である。したがって、リーディングフレームは、融合セグメント全体にわたって連続的であるが、このセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に離れていてもよい。
【００７３】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、ペプチド結合を介して第２のポリペプチドに直鎖状に連結された第１のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。
【００７４】
本明細書で使用される用語「ＣＤ９５融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合されたＣＤ９５の機能的等価物であるポリペプチドを指す。ＣＤ９５融合タンパク質は、一般的に、（上記）ＣＤ９５ポリペプチドと共通の少なくとも１つの生物学的特性を共有するであろう。ＣＤ９５融合タンパク質の例は、ＣＤ９５イムノアドヘシンである。
【００７５】
本明細書で使用される用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を表す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列であって、抗体（すなわち、「異種」である）の抗原認識結合部位以外のアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には、少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む連続アミノ酸配列である。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得る。
【００７６】
免疫グロブリン配列は、必ずしも必要ではないが、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有益な化学的特性及び生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性は、完全ヒト成分を使用して達成され得る。このようなイムノアドヘシンは、患者に対する免疫原性が最小限であり、慢性使用又は反復使用に安全である。一実施態様では、Ｆｃ領域は、ネイティブな配列のＦｃ領域である。別の実施態様では、Ｆｃ領域は、変異Ｆｃ領域である。さらに別の実施態様では、Ｆｃ領域は、機能的なＦｃ領域である。ＣＤ９５イムノアドヘシンのＣＤ９５部分及び免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーによって連結され得る。免疫グロブリン配列は、必ずしも必要ではないが、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ、しかし好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得られ得る。
【００７７】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端に広がると定義される。
【００７８】
ＣＤ９５融合タンパク質の別の例は、ＣＤ９５ポリペプチドと、Konterman et al. 2012 AlbudAb（商標）Technology Platform-Versatile Albumin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Livesに記載されているようなAlbudAb（商標）Technology Platformのヒト血清アルブミン結合ドメイン抗体（AlbudAbs）との融合体である。
【００７９】
典型的には、本発明のＣＤ９５融合体は、Apogenix（商標）が開発したＡＰＧ１０１であり得る。ＡＰＧ１０１は、ＣＤ９５レセプターの細胞外ドメインと、ＩｇＧ抗体のＦｃドメインとからなる完全ヒト融合タンパク質である。
【００８０】
一実施態様では、薬剤はアプタマーである。分子認識の点において、アプタマーは、抗体代替物を代表する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、実質的には任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得られる。このライブラリーでは、各メンバーは、ユニーク配列の最終的には化学的に改変される直鎖状オリゴマーである。ペプチドアプタマーは、E coliチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって提示される立体配座的に制限された抗体可変領域からなり、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される。
【００８１】
特定の実施態様では、ＣＤ９５アンタゴニストは、ＣＤ９５発現（又はＣＤ９５Ｌ発現）阻害剤である。
【００８２】
「発現阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。したがって、「ＣＤ９５発現阻害剤」は、ＣＤ９５遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を表す。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様では、前記遺伝子発現阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【００８４】
本発明で使用するための遺伝子発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとするものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ９５  ｍＲＮＡに結合してタンパク質翻訳を防止するか、又はｍＲＮＡ分解を増加させることによって、ＣＤ９５  ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、それにより、細胞内のＣＤ９５のレベル及び活性を低下させるように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＣＤ９５をコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば通常のホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射又は静脈内注入によって投与し得る。その配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；米国特許第６，５６６，１３１号；米国特許第６，３６５，３５４号；米国特許第６，４１０，３２３号；米国特許第６，１０７，０９１号；米国特許第６，０４６，３２１号；及び米国特許第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００８５】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明で使用するための遺伝子発現阻害剤として機能し得る。遺伝子発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物と腫瘍、被験体又は細胞を接触させることによって遺伝子発現を減少させ得る（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。その配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); 米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号；並びに国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号及び国際公開第０１／６８８３６号を参照のこと）。
【００８６】
リボザイムもまた、本発明で使用するための遺伝子発現阻害剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。それにより、ＣＤ９５  ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。リボザイム切断部位（これらとしては、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣが挙げられる）についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意のＲＮＡターゲット候補内の特異的リボザイム切断部位を最初に同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価し得る。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適切性を評価し得る。
【００８７】
遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは両方とも、公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば、固相ホスホラミダイト（phosphoramadite）化学合成などによるによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた様々なベクターに組み込まれ得る。細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変を導入し得る。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルをオリゴヌクレオチド骨格内で使用することが挙げられる。
【００８８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターに結合してin vivo送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の運搬を促進することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在で起こり得る分解程度と比べて低減した分解で、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターとしては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスに由来する核酸配列が挙げられる。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターも容易に用いることができる。
【００８９】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとするものである。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に承認されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける高効率な遺伝子トランスダクションについて全般的な有用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990) and in MURRY ("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に示されている。
【００９０】
特定の用途に好ましいウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性となるように操作することができ、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それはさらに、熱安定性及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重複感染阻害がないので複数回のトランスダクションが可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことにより、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子の発現の変動性を最小限にし得る。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代回以上にわたって組織培養液中で観察されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能し得る。
【００９１】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。ここ数年間では、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念がないので、特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者に周知である。加えて、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用して、プラスミドをカスタム設計し得る。プラスミドは、様々な非経口経路、粘膜経路及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加えてもよいし、金粒子上に乾燥してもよいし、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用してもよい。
【００９２】
「治療有効量」の上記ＣＤ９５アンタゴニストは、十分な量のＣＤ９５アンタゴニストを意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の被験体の具体的な治療有効用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般健康、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；治療期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低レベルで化合物の投与を開始して、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当業者の範囲内である。しかしながら、生成物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲で変動し得る。好ましくは、治療される被験体への投与量を対症的に調整するために、組成物は、有効成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは有効成分１mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００９３】
本発明のＣＤ９５アンタゴニストを薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療組成物を形成し得る。
【００９４】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入剤又は任意の種類の製剤化助剤を指す。
【００９５】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は、単独で又は別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与形態としては、経口投与形態、例えば、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与形態及び直腸投与形態が挙げられる。
【００９６】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得、これは場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水が追加されると、注射液の構成が可能となる。
【００９７】
注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
【００９８】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００９９】
本発明のＣＤ９５アンタゴニストは、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０１００】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０１０１】
必要に応じて上に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性ポリペプチドを適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般的に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１０２】
製剤化したら、投与製剤と適合性の方法によって治療有効量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【０１０３】
水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下液１０００mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る。治療される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【０１０４】
本発明のＣＤ９５アンタゴニストは、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０又はさらには約１０ミリグラムほどを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
【０１０５】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【０１０６】
本発明はまた、トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防する方法であって、ｉ）本発明の方法を実施することによって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示す（すなわち、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルが所定の基準値よりも高い）と結論した場合、治療有効量のＥＧＦＲアンタゴニストを該被験体に投与することからなる工程を含む方法に関する。
【０１０７】
本発明はまた、トリプルネガティブ乳ガンを患っている被験体における転移を予防する方法であって、ｉ）本発明の方法を実施することによって、再発及び遠隔転移のリスクを予測すること、並びにｉｉ）工程ｉ）において、該被験体が再発及び遠隔転移のリスク増加を示す（すなわち、可溶性ＣＤ９５Ｌのレベルが所定の基準値よりも高い）と結論した場合、治療有効量のＰＩ３Ｋ阻害剤を該被験体に投与することからなる工程を含む方法に関する。典型的には、ＰＩＫ３阻害剤は、ＰＩＫ３α及び／又はＰＩ３Ｋβ阻害剤である。
【０１０８】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】可溶性ＣＤ９５ＬはＴＮ乳ガンで増加しており、転移性播種に関連する。Ａ．ＴＮＢＣ又は非ＴＮＢＣと診断された乳ガン患者の血清中の可溶性ＣＤ９５ＬをＥＬＩＳＡによって測定した（ｎは、１群当たりの患者数を示す）。＊＊＊、＊＊は、両側student t検定によるＰ≦０．０００１及び０．０１を示す。
【図１Ｂ】可溶性ＣＤ９５ＬはＴＮ乳ガンで増加しており、転移性播種に関連する。Ｂ．８０pg/mlよりも高い（太線）又は低い（点線）ＣＤ９５Ｌ濃度を示す患者を比較するKaplan-Meier無再発生存曲線。
【図１Ｃ】可溶性ＣＤ９５ＬはＴＮ乳ガンで増加しており、転移性播種に関連する。Ｃ．上のパネル：８０pg/mlよりも高い（太線）又は低い（点線）ＣＤ９５Ｌ濃度を有する患者間の遠隔転移のKaplan-Meier分析。下のパネル：１２０pg/mlよりも高い（太線）又は低い（点線）ＣＤ９５Ｌ濃度を示す患者間の遠隔転移のKaplan-Meier分析。
【０１１０】
実施例：自然にプロセシングされたＣＤ９５Ｌは、トリプルネガティブ乳ガンの転移促進因子である。
材料および方法
倫理に関する記述。ヘルシンキ宣言に概説されている理念にしたがって、全ての臨床試験を行った。書面による同意を各個人から得た後、乳ガンと診断された患者から血液を採取した。本試験は、Centre Hospitalier Universitaire de Nantesの治験審査委員会によって承認された。
【０１１１】
統計分析。定性的パラメータについてはPearsonカイ二乗検定（又は必要な場合にはFisherの直接確率検定）によって、及び連続パラメータについてはＡＮＯＶＡ若しくはStudent t検定（必要な場合にはKruskal-Wallis又はMann-Whitney検定）によって、群間の比較を行った。診断日から最初の転移日まで、又は転移の再発がなければ最後の経過観察まで、無転移生存期間を計算した。生存データは、１４２人の患者について利用可能であった。Kaplan-Meier法によって生存曲線を計算し、ログランク検定によって群を比較した。Stata10.1 special edition (Statacorp, Texas USA)を用いて、全ての分析を行った。全ての検定を両側で行った（ｐは５％未満の場合に有意である）。
【０１１２】
細胞株及びｓｈＲＮＡｍｉｒレンチウイルストランスダクション。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内において、８％v/v熱不活性化ＦＣＳ及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、ヒト乳腺ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ及びＺＲ７５−１を維持した。ｃ−ｙｅｓ（ＲＨＳ４４３０−９８８４３９５５、−９９１６１５１６、−９８８４３９５５）、Ｏｒａｉ１（ＲＨＳ４４３０−９８７１５８８１、−１０１０６７８４２）、ｐ１１０α（ＲＨＳ４４３０−９９８８２０４５及びＲＨＳ４５３１−ＮＭ＿００６２１８）、ｐ１１０β（ＲＨＳ４４３０−１０１０７４６１０及びＲＨＳ４４３０−１０１５１９７２９）、ＥＧＦ−Ｒ（ＲＨＳ４４３０−９９２９１７３５、ＲＨＳ４４３０−９８８９５４９５及びＲＨＳ４４３０−１０１５１７９０５）及びｐ２２ｐｈｏｘ（ＲＨＳ４４３０−９８５２００５１、ＲＨＳ４４３０−９８８４２０９５及びＲＨＳ４４３０−１０１０７１４６５）の有効なｓｈＲＮＡｍｉｒ−ｐＧＩＰＺベクター（OpenBiosystems, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）、又はネガティブコントロールとしてスクランブルｓｈＲＮＡｍｉｒベクターを使用して、乳ガン細胞株のレンチウイルストランスダクションによって、サイレンシング実験を実施した。トランスダクション乳ガン細胞の割合を改善するために、トランスダクションの７２時間後に生細胞を回収し、FACSAria（BD Bioscience）を使用してフローサイトメトリーによって緑色細胞（ｐＧＩＰＺはＧＦＰをコードする）を選別した。
【０１１３】
切断型ＣＤ９５Ｌの生産。８％ＦＣＳ含有培地中で維持した２９３細胞を、カルシウム／リン酸沈殿法を使用して空のプラスミド又は野生型ＣＤ９５Ｌ含有ベクター３μgでトランスフェクションした。トランスフェクションの１６時間後、２mM Ｌ−グルタミンを補充したＯＰＴＩ−ＭＥＭと培地を交換した。５日後、切断型ＣＤ９５Ｌ及びエキソソーム結合型全長ＣＤ９５Ｌを含有する培地を回収した。２ラウンドの遠心分離（４５００rpm／１５分）によって死細胞及び残屑を除去し、超遠心分離（１０００００×ｇ／２時間）によってエキソソームを排除した。切断型ＣＤ９５Ｌを含有する上清を４℃に維持した。
【０１１４】
抗体、プラスミド及び他の試薬。ＢＴＰ２、ＬＹ２９４００２、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（［１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラ−（アセトキシメチル）エステル］）及びｚＶＡＤ−ｆｍｋ（カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）は、Calbiochem (Merck Chemicals Ltd., Nottingham, UK)から入手した。ＤＰＸ封入剤、抗β−アクチン、抗チューブリン、ＤＡＰＩ、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）、アポシニン、Ｎ−アセチルＬ−システイン（ＮＡＣ）及び抗ｃ−ｙｅｓは、Sigma-Aldrich (L'Isle-d'Abeau-Chesnes, France)から購入した。Ｆｕｒａ−２−ＰＥ３／ＡＭ及びＦｌｕｏ８−ＡＭは、Tefflabs (Euromedex, Mundolsheim, France)製であった。抗ヒトＣＤ３１及びＤ２−４０、Ｈ２ＦＤＡ（ジヒドロフルオレセイン）は、Invitrogen (Saint Aubin, France)製であった。エルロチニブ、抗ｐ２２Ｐｈｏｘ、抗ｄｕｏｘ１及び抗ｎｏｘ４は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)から購入した。セツキシマブは、Centre Hospitalier de Rennes (Dr. Florence Godey, France)から入手した。抗カスパーゼ−８（Ｃ１５）は、Axxora (Coger S.A., Paris, France)から購入した。抗ヒトＣＤ９５ｍＡｂ（ＤＸ２）及びＣＤ９５ＬｍＡｂ（Ｇ２４７−４）は、BD Biosciences (Le Pont de Claix, France)製であった。抗ヒトＯｒａｉ１、抗Ａｋｔ、抗ホスホＳ４７３Ａｋｔ（Ａｋｔ−Ｐ４７３）、抗ホスホＳｒｃファミリーメンバー（Ｐ−Ｓｒｃ）、抗ｐ１１０α、抗ｐ１１０β、抗ＥＧＦ−Ｒ、抗ホスホＹ８４５ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲＹ８４５）及び抗ホスホＹ４１６Ｓｒｃ抗体は、Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)製であった。抗ｎｏｘ１、抗ｎｏｘ２、抗ｎｏｘ３、抗ｎｏｘ５は、Abcam (Abcam, Paris, France)から購入した。
【０１１５】
免疫組織化学。乳ガン（非トリプルネガティブ患者及びトリプルネガティブ患者）及び良性乳房疾患のHollande固定腫瘍組織（免疫組織化学染色当たり患者２人）をパラフィン包埋し、３μm切片に切断した。ＣＤ９５Ｌ染色の場合、キシレン中で組織切片を３分間脱パラフィン処理し、段階的なアルコール処理によって再水和した。ホルマリン固定によって形成されたタンパク質架橋をリバースし（ターゲット回復溶液、ｐＨ９）、３％w/v過酸化水素メタノール溶液を使用して内因性ペルオキシダーゼを１５分間ブロッキングした。５％ＢＳＡ中で、スライドを室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションし、次いで、マウス抗ＣＤ９５Ｌ（１：３００）又はマウス抗ＣＤ３１（１：１００）又はマウス抗Ｄ２４０（１：１００）によって４℃で一晩染色した。組織切片をEnvision+システムＨＲＰ標識二次抗体と共に室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションし、液体ＤＡＢ＋を追加することによって標識を可視化した。ＴＮＢＣ乳房サンプルの３μm連続切片を使用して、ＣＤ３１又はＤ２−４０陽性の内皮細胞におけるＣＤ９５Ｌ発現を評価した。切片を対比染色し（ヘマトキシリン）、ＤＰＸ封入剤でマウントした。非特異的染色のネガティブコントロールでは、一次抗体を追加せずに、これを正常マウスＩｇＧに換えた。
【０１１６】
ＣＤ９５Ｌ  ＥＬＩＳＡ。製造業者の推奨にしたがって抗ＣＤ９５Ｌ  ＥＬＩＳＡ（Diaclone, Besancon, France）を実施して、血清中に存在する切断型ＣＤ９５Ｌの量を正確に定量した。
【０１１７】
フローサイトメトリー分析。ＰＢＳに再懸濁した３μM Ｈ２ＦＤＡと共に細胞を３７℃で３０分間プレインキュベーションした。次いで、ＲＯＳ阻害剤の有無の下で細胞をさらに３０分間プレインキュベーションしてから、指示時間にわたって１００ng/ml ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激した。次いで、細胞を洗浄し、FACScalibur（BD Bioscience）によって分析した。
【０１１８】
イムノブロット分析。溶解バッファー［プロテアーゼ阻害剤（Sigma-Aldrich）の混合物を補充した２５mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１％v/v ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５０mM ＮａＣｌ及び２mM ＥＧＴＡ］中で、細胞を４℃で３０分間溶解した。製造業者のプロトコールにしたがってビシンコニン酸法（PIERCE, Rockford, IL, USA）によって、タンパク質濃度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare, Buckinghamshire, England）に転写した。５％w/v乾燥スキムミルク（ＴＢＳＴＭ）を含有するＴＢＳＴ（５０mM Ｔｒｉｓ、１６０mM ＮａＣｌ、０．０５％v/v Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．８）で膜を１５分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳＴＭ中で一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。膜を十分に洗浄し（ＴＢＳＴ）、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ又は抗マウス（SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, US）を４５分間追加した。増強化学発光基質キット（ECL, GE Healthcare）を用いて、タンパク質を可視化した。
【０１１９】
ＭＩＳＣの免疫沈降。乳ガン細胞（１条件当たり細胞２０×１０６個）を、指示時間にわたって１００ng/ml ｃｌ−ＣＤ９５Ｌと共にインキュベーションした。次いで、細胞を溶解し、Ａｐｏ１−３ １μgを細胞溶解物に追加し、プロテインＡセファロースビーズ（Sigma-Aldrich）を追加することによってＣＤ９５を免疫沈降した。ＥＧＦ−Ｒの免疫沈降の場合、マウス抗ＥＧＦ−Ｒ（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）１μgを細胞溶解物に追加し、プロテインＡセファロースビーズ（Sigma-Aldrich）を用いてＥＧＦ−Ｒを免疫沈降した。十分に洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、免疫複合体を分離した。
【０１２０】
in vitro運動アッセイ。８μm孔膜を含有するボイデンチャンバー（Millipore, Molsheim, France）を２４ウェルプレート中で培養した。膜の水和後、低血清（１％）含有培地中で、１０５個の細胞を上部チャンバーに追加した。１００ng/ml ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下又は非存在下で、低血清（１％）含有培地を下部チャンバーに充填した。５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、細胞を３７℃で２４時間培養した。浸潤を定量するために、メタノールで細胞を固定し、ギムザ染色した。次いで、綿棒を使用して染色細胞を膜の上面から採取し、裏面からの浸潤細胞について、各インサートの５つの代表的な写真を撮影した。各実験について、細胞を溶解し、５６０nmの吸光度を測定した。
【０１２１】
免疫蛍光イメージング。細胞をカバースリップ上に２４時間付着させてから、指示時間にわたって１００ng/ml ｃｌ−ＣＤ９５Ｌによって３７℃で処理した。十分に洗浄した後、４％w/vパラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で細胞を１５分間固定した。５％ＦＣＳを補充したＰＢＳ中で、アルデヒド基を１０分間クエンチした。次いで、固定した細胞を５μg/ml抗ＣＤ９５ｍＡｂ（ＤＸ２）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。最後に、ＰＢＳで希釈したAlexa488標識ヤギ抗マウス抗体（Invitrogen）を４℃で３０分間使用して、ＣＤ９５を可視化した。細胞を２μg/ml Alexa555標識抗ＥＧＦ−ＲｍＡｂ（Millipore）と共に４℃で３０分間インキュベーションすることによって、ＥＧＦ−Ｒを染色した。遠赤色蛍光ＤＮＡ色素ＤＲＡＱ５（商標）（Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA）で核を染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、乾燥し、蛍光封入剤（Dako, Carpinteria, CA, USA）でマウントした。６３×対物レンズを備えるTSC SP5共焦点顕微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）を使用して、画像を取得した。
【０１２２】
Ｃａ２＋のモニタリング。親細胞株の実験では、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で、Ｆｕｒａ２−ＰＥ３−ＡＭ（１μM）を乳ガン細胞に室温で３０分間ロードした。ＨＢＳＳで洗浄した後、Ｆｕｒａ２−ＡＭの非存在下で細胞を１５分間インキュベーションして、色素の脱エステル化を行った。×40 UApo/340-1.15 W水浸対物レンズ（Olympus）を備える倒立落射蛍光顕微鏡（Olympus IX70）の温度コントロールチャンバー（３７℃）内に細胞を置き、高速スキャンカメラ（CoolSNAP fxMonochrome, Photometrics）によって、蛍光顕微鏡写真の画像を５１０nm及び解像度１２ビットでキャプチャした。ＵＶ光曝露を最小限にするために、４×４ビニング機能を使用した。Ｆｕｒａ２−ＡＭを３４０及び３８０nmで交互に励起し、得られた画像の比（励起３４０及び３８０nm並びに発光フィルタ５２０nm）を一定間隔（１０秒間）で生成した。Ｆｕｒａ−２比（Ｆｒａｔｉｏ３４０／３８０）の画像を表示し、個々の細胞について作成した関心領域（ＲＯＩ）のＦ−比値を実験中にモニタリングし、汎用的なイメージングソフトウェア（Metafluor及びMetamorphを含む）を用いてオフラインで分析した。Ｆｒａｔｉｏは、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を反映している。各実験を３回繰り返し、各実験条件について、２０超の単細胞トレースの平均を使用した。
【０１２３】
ＧＦＰ発現細胞株の実験では、ＧＦＰ蛍光は、Ｆｕｒａ２−ＰＥ３によるＣａ２＋測定を妨げるので、（ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させた）ＧＦＰ発現細胞を用いる実験では、Ｆｕｒａ２−ＰＥ３−ＡＭの代わりにＦｌｕｏ８−ＡＭを使用した。効率的にトランスダクションされた細胞（ＧＦＰ発現細胞）の位置を、４８５±２２nmの光励起による５３０±３０nmの蛍光発光によって決定した。Ｆｌｕｏ８−ＡＭロード細胞を５３５±３５nmで励起することによって、Ｃａ２＋の変化を評価した。各細胞の放出蛍光（６０５±５０nm）の値（Ｆ）を初期蛍光（Ｆ０）に対して標準化し、Ｆ／Ｆ０（相対Ｃａ２＋［ＣＹＴ］）として報告した。ＧＦＰ陽性細胞のみを考慮した。Ｆｕｒａ２−ＰＥ３−ＡＭについては、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で、Ｆｌｕｏ８−ＡＭ（１μM）をＴ細胞に３０分間ロードし、次いで、Ｆｕｒａ２−ＡＭフリーのＨＢＳＳ中で１５分間インキュベーションして、色素の脱エステル化を行った。
【０１２４】
結果
血清ＣＤ９５Ｌレベルは、ＴＮＢＣを有する女性における転移を予測する。乳ガン組織では、多量のＣＤ９５Ｌが検出され、病状の進行に関連付けられているが（１６）、発ガンにおけるこのリガンドの生物学的役割は依然として不明である。メタロプロテアーゼによる切断後に血清中に放出されたＣＤ９５Ｌには運動促進効果があることを示す本発明者らのデータにしたがって、本発明者らは、乳ガンを有する女性では血清ＣＤ９５Ｌ濃度が増加しており、転移のリスクに関連するのかについて疑問に思った。これに関して、ＴＮＢＣ、非ＴＮＢＣ患者、及び良性乳腺過形成に罹患している女性（健常被験者）の血清中のＣＤ９５Ｌのレベルを定量した。ＴＮＢＣを有する患者は、非ＴＮＢＣに罹患している患者（平均で９８．９４±４５．３７、ｎ＝３９対５２．７９±２６．２、ｎ＝１０３、Ｐ＜０．０００１）及び良性乳房疾患を有する被験者（９８．９４±４５．３７、ｎ＝３９対３０．０４±２８．５２、ｎ＝８、Ｐ＜０．０００１、図１Ａ）と比較して増加した量の血清ＣＤ９５Ｌを示した。注目すべきことに、非ＴＮＢＣに罹患している患者におけるＣＤ９５Ｌの量は、不均一な分布を示した（図１Ａ）；しかしながら、再発の発生に基づいてこの患者コホートを再分類したところ、再発患者では、ＣＤ９５Ｌレベルが有意に高かった（平均で６２．７２±３１．３１、ｎ＝３５対４７．６８±２１．７７、ｎ＝６８、Ｐ＝０．００５３、図１Ａ）。Kaplan-Meier分析により、８０pg/ml以上のＣＤ９５Ｌ濃度を有するＴＮＢＣ患者及び非ＴＮＢＣ患者は両方とも、無病生存率の有意な減少（図１Ｂ）及び転移発生の増加（図１Ｃ）を示したことが示された。１２０pg/ml以上の血清ＣＤ９５Ｌ濃度を有する患者では、転移に対するこの素因がさらに顕著であった。
【０１２５】
乳ガンではＣＤ９５Ｌの量が多いことから、この膜貫通リガンドを産生する細胞は何であるかという疑問が生じる。この点に取り組むために、健常患者、非トリプルネガティブ患者及びＴＮＢＣ患者由来の乳房組織切片の免疫組織化学によって、ＣＤ９５Ｌ発現を評価した。健常被験者では、ＣＤ９５Ｌ染色はほとんど検出不可能であったが、非ＴＮＢＣ患者及びＴＮＢＣ患者では、その発現レベルが上昇していた。血清レベルと関連付けたところ、ＣＤ９５Ｌ発現は、健常被験者からＴＮＢＣ患者に向かって上昇する発現勾配を示した。注目すべきことに、小さな腫瘍塊の周囲の腫瘍血管を覆う内皮細胞（ＣＤ３１＋）では、ＣＤ９５Ｌ発現が観察されたが、リンパ内皮（Ｄ２−４０＋；（１７））では観察されなかった。総合すると、これらの知見は、血清ＣＤ９５Ｌが、乳ガンにおける再発及び遠隔転移のリスクの予後不良因子であり、乳ガン細胞周囲の血管によって主に産生されることを示している。
【０１２６】
切断型ＣＤ９５Ｌは、ＴＮＢＣ細胞においてｐ１１０β駆動性の運動促進シグナルを誘導する
次に、メタロプロテアーゼによって切断された可溶性ＣＤ９５Ｌ（ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ）が乳ガン細胞の遊走を促進する能力を調査した。精製ｃｌ−ＣＤ９５Ｌを生産するために、本発明者らは、野生型ＣＤ９５ＬをコードするｃＤＮＡで上皮腎臓細胞２９３をトランスフェクションした。これらの細胞は、全長ＣＤ９５Ｌを含有するエキソソームも分泌したので、上清がコンタミネーションされた。この混入物質を排除するために、超遠心分離工程を上清に行って、分泌小胞をペレット化した（８）。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、エキソソームフリーの上清中に残っており、膜貫通リガンド（約４０kDa）よりも低分子量（約３０kDa）であった（データは示さず（１１））。次いで、ＴＮＢＣ乳ガン細胞株（Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８）をｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露し、ボイデンチャンバーを使用して細胞遊走をモニタリングした。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激した全てのＴＮＢＣ細胞が、運動の劇的な増加を示した。注目すべきことに、乳ガン患者で測定したものと同等のＣＤ９５Ｌレベルへの曝露は、細胞運動をトリガーするのに十分であった。実際、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの滴定により、１００pg/mlのｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（これは、ＴＮＢＣ患者で測定した平均濃度（９８．９４±４５．３７pg/ml）に対応する用量である。それに対して、健常ドナーでは３０．０４±２８．５２pg/ml）は、ＴＮＢＣ細胞の遊走を誘導したことが示された。
【０１２７】
クラスＩ  ＰＩ３Ｋは４つの触媒アイソフォーム（α、β、δ及びγ）から構成され、その脂質キナーゼ活性は、最終的には様々なシグナル伝達因子のドッキング部位として機能するセカンドメッセンジャーＰＩＰ３を生成する。例えば、セリン−スレオニンキナーゼＡｋｔは、そのプレクストリン相同ドメインを介してＰＩＰ３に結合すると原形質膜に再分配され、そこで、ＰＤＫ−１によってＴｈｒ３０８のリン酸化を受け、ｍＴＯＲ複合体−２によってＳｅｒ４７３のリン酸化を受ける（総説については、（１８）を参照のこと）。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性化は、転移につながる様々な段階（細胞運動及び血管内侵入／血管外遊出を含む）を促進すると報告されている（１９）。したがって、本発明者らは、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露した乳房悪性細胞では、このシグナルがトリガーされたのかについて疑問に思った。試験した全てのＴＮＢＣ細胞株において、ＣＤ９５Ｌは、Ｓｅｒ４７３におけるＡｋｔの迅速なリン酸化（これは、ＰＩ３Ｋ活性化の顕著な特徴である）を誘導した。さらに、非細胞毒性濃度の薬理学的阻害剤ＬＹ２９４００２を使用してＰＩ３Ｋシグナルを阻害すると、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞の遊走が抑制されたが、これは、メタロプロテアーゼによってプロセシングされたＣＤ９５Ｌが、ＰＩ３Ｋ活性化を介して、乳房悪性細胞の走化性因子として作用することを示している。クラスＩ  ＰＩ３Ｋの触媒アイソフォームｐ１１０α及びβは遍在的に発現しているが、ｐ１１０δ及びγの発現は血液細胞に限定されている。ＣＤ９５媒介性の細胞運動に対するｐ１１０α及びβの寄与を調査するために、ＲＮＡ干渉を使用してそれらの発現をサイレンシングした。ｐ１１０αのダウンレギュレーションは、ＣＤ９５媒介性のＰＩ３Ｋ活性化及び細胞遊走を変化させなかったのに対して、ｐ１１０βのサイレンシングは、Ａｋｔリン酸化及び細胞運動を抑制した。これらの知見により、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、ＴＮＢＣ細胞の細胞遊走を促進するＰＩ３Ｋ触媒サブユニットｐ１１０βを選択的に活性化することが実証された。
【０１２８】
ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、ＴＮＢＣ細胞におけるＭＩＳＣ形成をトリガーする。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下において、Ｔリンパ球では、ｓｒｃキナーゼｃ−ｙｅｓを含有するレセプトソーム（ＭＩＳＣと称される）が形成される（１１）。ＴＮＢＣ細胞においてもこの複合体が形成するかを評価するために、ｃｌ−ＣＤ９５ＬでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を刺激し、続いて、ＣＤ９５を免疫沈降した。得られた免疫複合体の分析により、ＣＤ９５は、ＤＩＳＣ構成要素のＦＡＤＤ及びカスパーゼ−８に結合しなかったが、ｃ−ｙｅｓをリクルートしたことが明らかになった。加えて、ｃ−ｙｅｓターゲティングｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスをＴＮＢＣ細胞に感染させると、ｃ−ｙｅｓの発現レベルがダウンモデュレーションされ、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞におけるＡｋｔリン酸化及び細胞遊走の両方が抑制された。これらのデータにより、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、乳ガン細胞におけるＭＩＳＣ形成を誘導することが示された。
【０１２９】
カルシウム（Ｃａ２＋）は、細胞運動において重要な役割を果たすので（２０）、乳ガン細胞においてＣＬ−ＣＤ９５によって誘導される非オーソドックスなシグナル伝達に対するその影響を分析した。非興奮性細胞では、ストア感受性カルシウム（ＳＯＣ）の流入が主なＣａ２＋侵入機構であり（２１、２２）、最近の研究では、ＳＯＣチャネルの孔形成成分としてＯｒａｉ１が同定された（２３、２４）。Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭ又はＳＯＣチャネルの薬理学的阻害剤ＢＴＰ２（２５）で乳ガン細胞を前処理すると、ＣＤ９５媒介性のＰＩ３Ｋ活性化及び細胞遊走の両方が阻害された。次に、Ｏｒａｉ１が乳ガン細胞におけるＣＤ９５シグナル伝達に関与したかを決定するために、ｓｈＲＮＡによってＯｒａｉ１発現を抑制した。Ｏｒａｉ１のダウンレギュレーションは、ＣＤ９５媒介性のＣａ２＋応答（小胞体からの動員）の初期段階を変化させなかったが、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激したＴＮＢＣ細胞で観察されたその後のＣａ２＋侵入を抑制した。注目すべきことに、Ｏｒａｉ１駆動性のＣａ２＋侵入は、ＰＩ３Ｋ活性化及び細胞遊走を誘導するのに必須であった。乳房腫瘍細胞におけるＣＤ９５とｃｌ−ＣＤ９５Ｌの会合と、Ｃａ２＋シグナル伝達との間の機構的関連性をさらに特性決定するために、ＣＤ９５媒介性のＣａ２＋応答に対するｃ−ｙｅｓ及びｐ１１０βの寄与を研究した。ｃ−ｙｅｓのサイレンシングは、ＣＤ９５媒介性のＣａ２＋シグナル伝達を抑制した。一方、Ｃａ２＋シグナル伝達はＰＩ３Ｋ活性化に寄与したが、ｐ１１０βノックダウンはＣＤ９５媒介性のＣａ２＋応答に影響を与えなかったことから、その逆は真ではなかった。これらの知見は、ｃ−ｙｅｓが、ＰＩ３Ｋ／Ｃａ２＋シグナル伝達経路の活性化及び乳房腫瘍細胞の細胞遊走につながる分子イベントのプロキシマルな位置を占めることを明らかにしている。
【０１３０】
ＣＤ９５は、ＥＧＦＲをＭＩＳＣにリクルートする。真核生物の線形モチーフデータベース（２６）を使用した、ＣＤ９５の細胞内領域内の短い線形モチーフのin silico分析では、ｐ１１０β又はその調節サブユニットＰ８５のリクルートを説明するいかなるコンセンサス配列も明らかにならなかったが、これは、少なくとも第３の因子がＣＤ９５をＰＩ３Ｋシグナル伝達に結び付けることを示唆している。ＴＮＢＣ細胞の約７２％はＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）を発現し（２７）、この発現は細胞遊走と相関しており（２８）、ＥＧＦＲは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の強力な誘導因子である（２９）。したがって、本発明者らは、ＥＧＦＲが、非オーソドックスなＣＤ９５シグナル伝達に寄与したのかについて疑問に思った。ＥＧＦＲ発現は、非ＴＮＢＣ細胞（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ及びＺＲ−７５−１）と比較して、ＴＮＢＣＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＨｓ５７８Ｔ）で主に発現していた。ｓｒｃキナーゼファミリーは、ＥＧＦＲのＴｙｒ８４５をリン酸化する（これは、活性化ループを安定化し、レセプターを活性状態に維持する改変である）と報告されている（３０）。また、ｃ−ｓｒｃもＥＧＦＲに結合して、ＴＮＢＣ細胞においてヘテロ複合体を形成し得る（３１）。ＣＤ９５とｃ−ｙｅｓとの間の相互作用を明らかにした本発明者らの免疫沈降実験に基づいて、ｃ−ｙｅｓのＭＩＳＣへのリクルートはＥＧＦＲの活性化を指揮し得、今度はこれが分子プラットフォームとして機能して、ＰＩ３Ｋ（ｐ１１０β）シグナル伝達経路を誘導し得ると仮説した。この仮説を検討するために、Ｔｙｒ８４５におけるＥＧＦＲのリン酸化状態を調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳ガン細胞をｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露すると、ＥＧＦＲのＴｙｒ８４５がリン酸化され、２分の時点でピークに達し、刺激の１０分後に消失した。このＥＧＦＲリン酸化は、Ａｋｔ活性化に先行した。加えて、ｃ−ｙｅｓ発現を抑制したＴＮＢＣ細胞では、ＥＧＦＲリン酸化が観察されなかったので、ＥＧＦＲリン酸化はｃ−ｙｅｓ依存性であった。次に、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露した乳ガン細胞で形成されたＭＩＳＣでは、ＥＧＦＲがリクルートされたかを分析するために、生化学的方法及びイメージング方法を行った。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露した乳房腫瘍細胞からのＣＤ９５又はＥＧＦＲの免疫沈降により、ＣＤ９５／ｃ−ｙｅｓ／ＥＧＦＲ／ｐ１１０βを含有する免疫複合体の迅速な形成が明らかになった。これらの生化学的観察結果を裏付けるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＨｓ５７８Ｔ  ＴＮＢＣ細胞では、発光している仮足の先端において、ＥＧＦＲ及びＣＤ９５が共局在していた。総合すると、これらの知見により、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下では、ＣＤ９５、ｃ−ｙｅｓ、ＥＧＦＲ及びｐ１１０βを包含する非定型レセプトソームが乳房腫瘍細胞内で形成することが実証された。
【０１３１】
ＥＧＦＲは、乳ガン細胞のｃｌ−ＣＤ９５Ｌ媒介性遊走に必須である。ＣＤ９５シグナル伝達経路におけるＥＧＦＲの生物学的役割をさらに調査するために、エルロチニブでＥＧＦＲ活性を阻害した。注目すべきことに、この合成化合物の臨床効果は、アントラサイクリン又はタキサンで前処理された転移性乳ガンの治療において調査中である（http://clinicaltrials.gov/を参照のこと）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の両方において、エルロチニブは、セリン４７３におけるＡｋｔのＣＤ９５媒介性リン酸化を防止したが、これは、乳房腫瘍細胞では、ＥＧＦＲ活性がＣＤ９５媒介性のＰＩ３Ｋ活性化に寄与することを示唆している。加えて、非細胞毒性量のエルロチニブは、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞の遊走を抑制した。ＣＤ９５媒介性の細胞シグナル伝達におけるＥＧＦＲの役割を実証するために、本発明者らは次に、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの様々な領域をターゲティングするｓｈＲＮＡを使用して、このレセプターチロシンキナーゼをサイレンシングした。ＥＧＦＲ発現のダウンモデュレーションは、ＴＮＢＣ細胞におけるＣＤ９５媒介性のＰＩ３Ｋ活性化及び細胞遊走の両方を阻害した。次に、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ誘導性のＣａ２＋応答におけるＥＧＦＲの役割を調べた。驚くべきことに、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合はＣａ２＋応答（これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ではエルロチニブによって遮断される）を誘発したが、エルロチニブ処理もＥＧＦＲサイレンシングも、ＣＤ９５媒介性のＣａ２＋応答を変化させなかった。この後者の観察結果により、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激した乳ガン細胞におけるＥＧＦＲのリクルート及び活性化におけるＥＧＦの関与についての疑問が呈された。ＥＧＦがこのプロセスに関与したか否かについて取り組むために、セツキシマブ（これは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合して、ＥＧＦとの相互作用を防止する抗体である（３２））と共にプレインキュベーションしたＴＮＢＣ細胞において、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ媒介性のシグナル伝達を調べた。驚くべきことに、ＥＧＦ誘導性のＣａ２＋応答を抑制した高濃度のこの遮断抗体は、ＣＤ９５媒介性のＰＩ３Ｋ活性化及び細胞運動を変化させなかったが、これは、ＴＮＢＣ細胞では、ＣＤ９５駆動性のＥＧＦＲリクルートがＥＧＦ非依存性機構を介して起こるという考えを支持している。
【０１３２】
ＲＯＳ産生は、ＣＤ９５媒介性の非アポトーシスシグナルを開始する。本発明者らの知見に基づくと、ｃ−ｙｅｓ活性化は、ＴＮＢＣ細胞においてｃｌ−ＣＤ９５Ｌによってトリガーされる非オーソドックスなシグナル伝達経路の最もプロキシマルなイベントに対応する。最近の報告では、ｓｒｃキナーゼは、白血球における細胞遊走を促進するレドックスセンサーとして作用し得ることが示されているので（３３）、本発明者らは次に、ＴＮＢＣ細胞におけるＣＤ９５が、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を介してｃ−ｙｅｓを活性化したのかについて疑問に思った。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露した乳ガン細胞では、細胞内ＲＯＳが急速に増加したが、これは、ジフェニレンヨードニウムクロライド（ＤＰＩ）及びアポシニン（３４）などの還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ（ＮＡＤＰＨｏｘ）阻害剤による前処理によって遮断された。ｃ−ｙｅｓ活性化に対するＲＯＳの影響に取り組むために、本発明者らは、ｃ−ｙｅｓの活性化状態と、それに続くチロシン４２６におけるその自己リン酸化を評価した。重要なことに、非細胞毒性量のＤＰＩ又はアポシニンで乳ガン細胞を前処理すると、ＣＤ９５媒介性のｃ−ｙｅｓ及びＡｋｔ活性化が損なわれ、細胞遊走が阻害された。Ｎｏｘファミリーは、この酵素の基礎を形成する７つの異なる膜貫通触媒サブユニット（Ｎｏｘ−１〜５並びにＤｕｏｘ−１及びＤｕｏｘ−２）によって定義される。ＮＯＸ−１〜４は、それらの適切な膜ターゲティング及び活性に関与するｐ２２Ｐｈｏｘと結合するが、Ｎｏｘ−５、Ｄｕｏｘ−１及びＤｕｏｘ−２は、それらの活性にｐ２２ｐｈｏｘを必要としない（３５）。ＭＩＳＣの分析により、ｐ２２ｐｈｏｘのリクルートが明らかになった。加えて、ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを使用してｐ２２Ｐｈｏｘ発現をダウンモデュレーションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＴＮＢＣ細胞は、ｃ−ｙｅｓ及びＡｋｔのリン酸化を誘導することができず、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露しても遊走しなかったが、これは、ｐ２２ＰｈｏｘとＮｏｘ１、２、３又は４との結合が、ＣＤ９５媒介性のＲＯＳ産生を引き起こし得ることを示唆している。本発明者らは次に、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞において形成されたＭＩＳＣ内にリクルートされたＮｏｘサブユニットを調査した。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激したＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、Ｎｏｘ−１、２及び４は、ＣＤ９５との結合で検出されなかったが、Ｎｏｘ３が急速にリクルートされた。さらに、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌで刺激したＴＮＢＣ細胞では、Ｎｏｘ３のダウンモデュレーションは、ＰＩ３Ｋ活性化及び細胞遊走を防止した。
【０１３３】
これらの知見は、ＴＮＢＣ細胞では、ＣＤ９５とｃｌ−ＣＤ９５Ｌとの相互作用がＮＡＤＰＨｏｘ駆動性の迅速なＲＯＳ産生をトリガーして、ｃ−ｙｅｓ及びその下流シグナル伝達経路の活性化を引き起こすことを開示している。注目すべきことに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害はＣＤ９５媒介性のＣａ２＋応答を完全に抑制したが、これは、ＴＮＢＣ細胞では、ＣＤ９５によってトリガーされるＲＯＳ生成は、メタロプロテアーゼによって切断されたＣＤ９５Ｌによって誘導されるシグナル伝達カスケードのプロキシマルなイベントであることを裏付けている。
【０１３４】
考察：
本研究は、乳ガンと診断された女性における高い血清ＣＤ９５Ｌ濃度が予後不良及び遠隔転移の大きなリスクに関連することを強調している。印象的なことに、ＣＤ９５Ｌは、乳房腫瘍塊の周囲の血管の内皮細胞によって主に発現されており、リンパ管を覆う内皮細胞では検出されない。腫瘍構造におけるこのＣＤ９５Ｌ分布は、依然として未知のメタロプロテアーゼによるその切断が、乳房腫瘍細胞の血管内侵入及びガンの遠隔転移を促進するのに必要な濃度勾配を作り出し得ることを示唆している。また、多変量分析では、ＣＤ９５Ｌ濃度（８０pg/ml以上又は１２０pg/ml以上）とリンパ節陽性疾患との間の相関関係は明らかになっておらず、これは、ＣＤ９５Ｌが、遠隔転移（血行性）につながる悪性細胞の血管通過を促進し得、ＣＤ９５Ｌ非依存性機構が腫瘍細胞（リンパ行性）の局所的拡散をコントロールすることを裏付けている。
【０１３５】
「デスレセプター」ＣＤ９５を、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞における下流ＰＩ３Ｋシグナル伝達に結び付ける分子経路のさらなる分析により、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）のリクルート及び活性化が明らかになった。驚くべきことに、ＥＧＦＲは、ＣＤ９５媒介性のＰＩ３Ｋ活性化に必須であるが、Ｃａ２＋応答には不要であり、これは、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌによってトリガーされる非定型シグナル伝達よりも前に、これら２つの経路が分岐することを示している。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露したＴＮＢＣ細胞では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害及びｃ−ｙｅｓ発現のサイレンシングは、ＰＩ３Ｋ活性化及びＣａ２＋シグナル伝達の両方を抑制するので、この分岐は、ＲＯＳ生成とそれに続くｃ−ｙｅｓ活性化の下流及びＥＧＦＲ活性化の上流で起こる。ＥＧＦの存在下では、ＴＮＢＣ細胞は、チロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブによる前処理によって抑制されるＣａ２＋応答を誘発する。エルロチニブ及びＥＧＦＲダウンレギュレーションは、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌに曝露した乳ガン細胞で観察されたＣａ２＋シグナルを変化させないと仮定して、本発明者らは、ＣＤ９５によるＥＧＦＲのリクルート及び活性化が、ＥＧＦ非依存性の非定型機構を介して起こると推測する。この仮定を裏付けるように、ＥＧＦＲ中和抗体セツキシマブは、乳ガン細胞におけるＣＤ９５駆動性のＥＧＦＲ活性化を損なわない。通常、ＥＧＦリガンドがＥＧＦＲに結合すると、レセプターが二量体化し、その固有のチロシンキナーゼ活性が活性化し、続いて、下流のシグナル伝達分子がリン酸化される（３６）。しかしながら、ＲＯＳの存在下では、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達の活性化はリガンド非依存的に起こり得るという発見（３７）がこの定説に挑んでいる。加えて、Ｇタンパク質共役レセプターの活性化は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性化を介してＥＧＦＲのトランス活性化を媒介し得（３８）、ｃ−Ｓｒｃそれ自体が、Ｔｙｒ８４５のリン酸化によってＥＧＦＲ活性化を促進することができる（３１）。本発明者らの結果は、メタロプロテアーゼによって切断されたＣＤ９５Ｌで刺激したＴＮＢＣ細胞における新規のＥＧＦＲ活性化機構を明らかにする。機構的な観点からすれば、ＣＤ９５駆動性のＥＧＦＲ活性化は、Ｎｏｘ３によるＲＯＳ生成がｃ−ｙｅｓを活性化し、今度はこれがＥＧＦＲをリクルート及び活性化することに依拠している。ＥＧＦＲと同様に、ｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のレセプターチロシンキナーゼである（３９）。デスレセプターを隔離し、肝細胞におけるアポトーシスシグナル伝達経路の誘導を妨げる膜貫通レセプターｃ−Ｍｅｔによって、ＣＤ９５シグナル伝達経路がモデュレーションされ得ることは注目に値する（４０）。ｃ−Ｍｅｔ中のアミノ酸残基ＹＬＧＡはＣＤ９５と相互作用し（４０）、そのホモ三量体の自己凝集を破壊する。重要なことに、ＣＤ９５Ｌにおいても見られるこの最小アミノ酸配列は、ＥＧＦＲ配列では検出されない。加えて、ＣＤ９５に対するｃｌ−ＣＤ９５Ｌの結合はＥＧＦＲのリクルートを助けるが、ＣＤ９５Ｌは、ＣＤ９５／ｃ−Ｍｅｔ結合を破壊する（４１）。総合すると、これらの知見は、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲなどのレセプターチロシンキナーゼが、様々な分子機構によってＣＤ９５と相互作用し得ることを強く示唆している。より重要なことに、これらの結果は、ＰＩ３Ｋ及びＰＬＣγを含むいくつかのタンパク質のドッキング部位として作用するチロシンキナーゼレセプターのリクルートを介して、ＣＤ９５媒介性の非アポトーシスシグナルの実行が起こり得ることを明らかにしている。
【０１３６】
血清ＣＤ９５Ｌのレベルは、乳ガンにおける再発及び遠隔転移に関連するので、ＭＩＳＣの構成要素を包括的に同定して、ＣＤ９５媒介性の非アポトーシスシグナル伝達の誘導につながる分子経路を特性決定することは、この「デスレセプター」が、それが相互作用するリガンドに応じて非死シグナルをどのように伝達し得るかを理解するのに重要である。本発明者らの知見は、ｓｒｃキナーゼｃ−ｙｅｓが活性化されると、Ｏｒａｉ１媒介性のストア感受性カルシウム（Ｃａ２＋）侵入（ＳＯＣＥ）が実行され、ＥＧＦＲがリクルートされ、ＰＩ３Ｋのｐ１１０β触媒アイソフォームの下流活性化が誘導されることを示している。ＩＰ３レセプターが活性化されると小胞体（ＥＲ）からＣａ２＋が放出され、続いて、原形質膜全体にわたって持続的なＳＯＣＥが生じることによる二相的な様式で、Ｃａ２＋応答は主に起こる（４２）。ＴＮＢＣ細胞では、Ｏｒａｉ１は主なＳＯＣＥ寄与因子であり（４３）、ＥＲストアの補充及び細胞シグナル伝達の両方において重要な役割を果たす（４４）。注目すべきことに、Ｏｒａｉ１発現のサイレンシングは、ＥＲストアからの初期Ｃａ２＋動員を変化させなかったが、ＴＮＢＣ細胞におけるＣＤ９５媒介性の運動を完全に抑制したことから、ＳＯＣＥは、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ媒介性の乳ガン細胞遊走を助けることが明らかになった。
【０１３７】
多くのＰＩ３Ｋ阻害剤が、様々な段階の臨床試験で試験されている（４５）。ＰＩ３Ｋ阻害剤治療レジメンは患者にとって比較的耐容性良好であるが、それらの臨床的ターゲティングは望ましくない副作用（例えば、インスリンシグナル伝達におけるｐ１１０αの重要な役割に関係する高血糖（４５））をもたらし得るので、様々な生物学的プロセスに関与する特定のアイソフォームを決定することが重要である。乳ガン転移を治療するためのＰＩ３Ｋ  ｐ１１０α及びβアイソフォームの選択的阻害を調べるために、いくつかの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が現在設けられている。本発明者らのデータに基づいて、本発明者らは、ＰＩ３Ｋβアイソフォームの選択的阻害が、ＴＮＢＣの治療及び転移の予防により有効であり得ると予測する。
【０１３８】
要約すると、本研究は、血清ＣＤ９５Ｌレベルが、乳ガンを有する女性における転移性播種の新たな予後マーカーであると同定している。この知見は、高レベルのｃｌ−ＣＤ９５Ｌを有する患者であって、低濃度を示す者は回避すべき強力な治療処置を受けるべき患者に最も適切な治療レジメンの選択において、臨床医の指針として役立ち得る。加えて、この非定型ＣＤ９５媒介性シグナル伝達は、ＴＮＢＣにおける転移性播種を予防するための新たな治療ターゲットを提示する。ＥＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤は魅力的であり得るが、特に、ゲフィチニブ及びエルロチニブは非小細胞肺ガンの治療に既に使用されていることから、ゲフィチニブ及びエルロチニブによる長期治療中のほとんどの患者は、薬物結合を遮断するＥＧＦＲキナーゼドメインの二次突然変異（これは、臨床的耐性につながる）を発症する（Kobayashi et al., 2005; Kwak et al., 2005; Pao et al., 2005）。したがって、このような阻害剤は既に存在し、患者にとって耐容性良好であるので（４６）、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ相互作用の阻害はより適切な治療方法であり得る。
【０１３９】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する分野の技術水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
【０１４０】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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