(57)【要約】本発明は、活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列と融合したＯＰＡ１プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質（polydactyl zinc finger protein）を含む人工転写因子に関する。ＯＰＡ１プロモーターに対して指向される人工転写因子は、常染色体優性視神経萎縮症、症候性常染色体優性視神経萎縮プラス（syndromic autosomal dominant optic atrophy plus）、および正常眼圧緑内障などのＯＰＡ１ハプロ不全に伴う疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列と融合したポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、ＯＰＡ１遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む、人工転写因子。
【請求項２】
タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、請求項１に記載の人工転写因子。
【請求項３】
六量体ジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１または２に記載の人工転写因子。
【請求項４】
前記活性化タンパク質ドメインが、配列番号１のＶＰ１６、配列番号２のＶＰ６４、配列番号３のＣＪ７、配列番号４のｐ６５ＴＡ１、配列番号５のＳＡＤ、配列番号６のＮＦ−１、配列番号７のＡＰ−２、配列番号８のＳＰ１−Ａ、配列番号９のＳＰ１−Ｂ、配列番号１０のＯｃｔ−１、配列番号１１のＯｃｔ−２、配列番号１２のＯｃｔ２−５ｘ、配列番号１３のＭＴＦ−１、配列番号１４のＢＴＥＢ−２、または配列番号１５のＬＫＬＦである、請求項１から３のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項５】
前記核局在化配列が、Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列を含有する塩基性アミノ酸クラスターまたは配列番号６２のＳＶ４０  ＮＬＳである、請求項１から４のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項６】
前記タンパク質形質導入ドメインが、配列番号１６のＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、配列番号１８の合成ペプチドｍＴ０２、配列番号１９の合成ペプチドｍＴ０３、配列番号２０のＲ９ペプチド、または配列番号２１のＡＮＴＰドメインである、請求項２から５のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項７】
配列番号２６から４３までから成る群より選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項８】
ポリエチレングリコール残基をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の人工転写因子を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の人工転写因子をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
ウィルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号８３から８９の発現コンストラクトを含有する、請求項１３に記載の大腸菌宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０に記載の核酸を含むウィルスキャリア。
【請求項１６】
アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、シュードタイプアデノ随伴ウィルス、シュードタイプレトロウィルス、シュードタイプレンチウィルス、およびシュードタイプアデノウィルスから成る群より選択される、請求項１５に記載のウィルスキャリア。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のウィルスキャリアを含む医薬組成物。
【請求項１８】
ＯＰＡ１遺伝子プロモーターからの発現の増加に用いるための、請求項１から８のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項１９】
ＯＰＡ１遺伝子プロモーターからの発現の増加に用いるための、請求項１０に記載の核酸。
【請求項２０】
常染色体優性萎縮症、常染色体優性萎縮症プラス、および緑内障の治療に用いるための、請求項１から８のいずれか一項に記載の人工転写因子。
【請求項２１】
常染色体優性萎縮症、常染色体優性萎縮症プラス、および緑内障の治療に用いるための、請求項１０に記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１から８のいずれか一項に記載の人工転写因子または請求項１０に記載の核酸の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、常染色体優性萎縮症、常染色体優性萎縮症プラス、または緑内障の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化ドメインおよび核局在化配列と融合したＯＰＡ１遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質（複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質）（polydactyl zinc finger protein）を含む、人工転写因子、ならびにハプロ不全に繋がるＯＰＡ１での変異に起因する常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）または症候性ＡＤＯＡプラス（syndromic ADOA plus）などの疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工転写因子（ＡＴＦ）が、遺伝子発現の調節に有用なツールであるとして提案されている（Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526）。遺伝子転写の抑制または活性化のいずれかを通して遺伝子発現に影響を与える多くの天然転写因子は、特定のＤＮＡ配列を認識するための複雑な特異的ドメインを持っている。このために、その特異性および（１もしくは複数の）標的遺伝子を改変することを意図する場合、それらは、操作の対象として魅力的なものとならない。しかし、転写因子の特定のクラスは、いくつかのいわゆるジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含有しており、それは、モジュラー構造であることから、遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、ほとんど独立して３つのＤＮＡ塩基対を標的とする短鎖（３０アミノ酸）ＤＮＡ結合モチーフである。そのようないくつかのジンクフィンガーを一緒に融合して含有するタンパク質は、従って、より長いＤＮＡ配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、全ヒトゲノムの中でほとんど唯一である１８塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ標的を認識する。最初は、完全に状況非依存的（context independent）であると考えられていたが、より詳細な分析により、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性（context specificity）が明らかとなった（Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231）。ジンクフィンガー認識表面の特定のアミノ酸を変異させてＺＦモジュールの結合特異性を変化させることにより、５’−ＧＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＡＮＮ−３’コドンのほとんど、およびいくつかの５’−ＴＮＮ−３’コドンに対する確定されたＺＦ構成要素が得られた（いわゆるＢａｒｂａｓモジュール、Dreier B., Barbas C.F. 3rd et al., 2005, J Biol Chem 280, 35588-35597参照）。人工転写因子に関する初期の研究は、予め選択されたジンクフィンガーを既知の３ｂｐ標的配列と組み合わせることに基づく合理的な設計に集中していたが、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性が認識されたことで、細菌もしくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、区画化リボソームディスプレイ（compartmentalized ribosome display）、またはＦＡＣＳ分析を用いた生体内選別などの高度な方法を用いて情報が得られる大規模ジンクフィンガーライブラリーの作製が必要となった。
【０００３】
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いることで、ヒトゲノムのＤＮＡ座位を、高い特異性で標的とすることができる。従って、このようなジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性を持つタンパク質ドメインを特定のプロモーター配列へ運搬し、その結果として目的の遺伝子の発現を調節するための理想的なツールである。遺伝子転写の活性化に適するドメインは、単純ヘルペスウィルスＶＰ１６（配列番号１）またはＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体リピート、配列番号２）ドメインである（Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）。転写活性化を付与すると考えられるさらなるドメインは、ＣＪ７（配列番号３）、ｐ６５−ＴＡ１（配列番号４）、ＳＡＤ（配列番号５）、ＮＦ−１（配列番号６）、ＡＰ−２（配列番号７）、ＳＰ１−Ａ（配列番号８）、ＳＰ１−Ｂ（配列番号９）、Ｏｃｔ−１（配列番号１０）、Ｏｃｔ−２（配列番号１１）、Ｏｃｔ−２＿５ｘ（配列番号１２）、ＭＴＦ−１（配列番号１３）、ＢＴＥＢ−２（配列番号１４）、およびＬＫＬＦ（配列番号１５）である。加えて、ジーンオントロジーＧＯ：０００１０７１（http://amigo.geneontology.org/cgibin/amigo/term_details?term=GO:0001071）によって定められるタンパク質の転写活性ドメインは、標的タンパク質の転写制御を達成するものと考えられる。
【０００４】
小分子薬物は、特定の特徴の高い保存性のために、あるタンパク質ファミリーの特定のメンバーを必ずしも選択的に標的とすることはできないが、生物学的製剤は、抗体をベースとする新規薬物で示されるように、強い特異性を提供する。しかし、現在のところ、実質的にすべての生物学的製剤は、細胞外で作用する。特に、上述した人工転写因子は、治療的に有用な方法で遺伝子転写に影響を与えるのに適している。しかし、そのような因子を作用部位である核へ送達することは容易には達成されず、このため、治療人工転写因子による手法の有用性が、例えば免疫原性および細胞トランスフォーメーションの可能性などのこの方法のすべての欠点を持つレトロウィルスによる送達に依存することによって妨げられる（Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082-9091）。
【０００５】
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、細胞膜を通してのサイトゾル／核細胞質へのタンパク質の転位を促進することが示された。ＨＩＶ誘導ＴＡＴペプチド（配列番号１６）などの短鎖ペプチドは、細胞型に依存しないカーゴタンパク質のマクロ飲作用による取り込みを誘発することが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。サイトゾルに到達後、そのような融合タンパク質は、生物学的活性を有することが示された。興味深いことに、ミスフォールドタンパク質であっても、恐らくは細胞内シャペロンの作用により、タンパク質形質導入後に機能性となることができる。
【０００６】
遺伝子変異は、多くの遺伝性障害の主因である。一般的に、そのような変異は、その遺伝のモードに関して優性または劣性に分類することができ、優性変異は、母性または父性であってよい一方のみの遺伝子コピーが影響を受けた場合であっても、疾患表現型を引き起こすことができるものであり、一方劣性変異の場合、疾患を引き起こすには、母性および父性の両方の遺伝子コピーが変異される必要がある。優性変異が疾患を引き起こすことができるのは、ドミナントネガティブ型作用またはハプロ不全という、２つの一般的機構のうちの１つによる。ドミナントネガティブ変異の場合、遺伝子産物は、毒性であり、疾患表現型を引き起こす新しい異常な機能を獲得する。例えば、多量体タンパク質複合体のサブユニットであり、それは、変異によって、前記タンパク質複合体の適切な機能を阻害する。優性遺伝によって遺伝する疾患はまた、ハプロ不全によっても発生可能であり、この場合、疾患を引き起こす変異は、影響を受けた遺伝子を不活性化し、それによって有効遺伝子数を低下させる。このような状況下では、二番目の完全な遺伝子コピーは、正常な機能のための充分な遺伝子産物を提供することができない。約１２０００のヒト遺伝子がハプロ不全であると推定されており（Huang et al., 2010, PLoS Genet. 6(10), e1001154）、そのうち約３００の遺伝子が、疾患に関連していることが知られている。
【０００７】
神経生存は、ミトコンドリア機能に決定的に依存し、ミトコンドリア機能不全は、多くの神経変性障害の主因である（Karbowski M., Neutzner A., 2012, Acta Neuropathol 123(2), 157-71）。ＡＴＰの形態でエネルギーを提供するというその必須機能に加えて、ミトコンドリアは、カルシウム緩衝作用、多様な異化さらには代謝のプロセス、およびプログラム細胞死にも決定的に関与している。ミトコンドリアのこの重要な機能は、ミトコンドリアを維持するために、ならびにミトコンドリア機能不全およびそれに続く細胞死を防ぐために、多くの細胞機構に反映されている（Neutzner A. et al., 2012, Semin Cell Dev Biol 23, 499-508）。これらのプロセスの中でも中心的な役割は、バランスの取れたミトコンドリア形態で動的ミトコンドリアネットワークを維持することである。これは、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１、Ｍｆｆ、ＭｉＤ４９、およびＭｉＤ５１の場合はミトコンドリアの分裂を、またはＭｆｎ１、Ｍｆｎ２、およびＯＰＡ１の場合はミトコンドリア細管（mitochondrial tubules）の融合を促進するいわゆるミトコンドリアモルフォゲンによって達成される。ミトコンドリア融合の喪失は、ＡＴＰ産生の喪失を促進することが知られており、神経変性障害に伴う神経細胞死にこのプロセスを繋げるアポトーシス刺激に対して細胞を感受性とすることから、ミトコンドリア形態のバランスを取ることは不可欠である。
【発明の概要】
【０００８】
ミトコンドリア融合のプロセスにおける重要なプレーヤーは、視神経萎縮１またはＯＰＡ１である。ＯＰＡ１は、ＯＰＡ１遺伝子によってコードされ、ミトコンドリア融合に必須である大型のＧＴＰアーゼである。加えて、ＯＰＡ１は、構成要素であるクリステとしてのミトコンドリアの内部構造の維持において重要な役割を担っている。ＯＰＡ１の遺伝子発現の下方制御が、融合の喪失に起因するミトコンドリア断片化を引き起こし、細胞をアポトーシス刺激に対して感受性とすることが示された。ＯＰＡ１の変異は、ケジェール視神経症（Kjer's optic neuropathy）または常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）の約７０％の原因であることが識別された。ほとんどの集団において、ＡＤＯＡの罹患率は、１／１００００から３／１０００００であり、幼児期の初期から開始してゆっくり進行する視力の低下を特徴とする。視力障害は、緩やかなものから法律上の失明までの範囲にわたり、不可逆的であり、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のゆっくりした変性に起因する。ほとんどの場合、ＡＤＯＡは非症候性であるが、患者のうちの１５％は、感音難聴などの眼球外の神経筋症状を起こす。現時点まで、この疾患の実行可能な治療法は存在しない。興味深いことに、特定のＯＰＡ１対立遺伝子は、高眼圧ではなく正常眼圧緑内障と関連付けられており、ここでも、正常なミトコンドリア生理機能を維持するためのＯＰＡ１の重要性が強調される。
【０００９】
本発明は、活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列と融合した、ＯＰＡ１プロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質、を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合したＯＰＡ１プロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＯＰＡ１遺伝子の発現の増加における、およびＯＰＡ１遺伝子産物の産生の向上のためのそのような人工転写因子の使用にも関する。
【００１２】
さらに、本発明は、低ＯＰＡ１レベルによって引き起こされる、または修飾される疾患の治療における、特には、ＡＤＯＡおよびＡＤＯＡプラスなどの眼疾患の治療に用いるためのそのような人工転写因子の使用に関する。同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、低ＯＰＡ１レベルによって影響を受ける疾患の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[形質導入可能人工転写因子を用いてハプロ不全を緩和するための治療手法]  [Ａ]ハプロ不全変異（ＨＭ）は、野生型状況（ＷＴ）と比較して、プロモーター（Ｐ）の支配下遺伝子（Ｇ）からの遺伝子産物産生（ＧＰ）の減少を引き起こす。 [Ｂ]活性化ドメイン（ＲＤ）、さらには核局在化配列（ＮＬＳ）と融合されたハプロ不全遺伝子（Ｇ）のプロモーター（Ｐ）領域を特異的に標的とする六量体ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質を含有する人工転写因子が、ＴＡＴなどのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の作用によって細胞内に輸送される。変異（ＨＭ）および野生型の遺伝子（Ｇ）のプロモーターと結合すると、変異遺伝子コピーからの遺伝子産物の喪失を埋め合わせるように、野生型遺伝子コピーからの遺伝子産物の産生が増加される。  [Ｃ]活性化ドメイン（ＲＤ）、さらには核局在化配列（ＮＬＳ）と融合されたハプロ不全遺伝子（Ｇ）のプロモーター（Ｐ）領域を特異的に標的とする六量体ジンクフィンガー（ＺＦ）を含有する人工転写因子は、そのような人工転写因子をコードするｃＤＮＡのウィルス形質導入後に、細胞によって発現される。変異（ＨＭ）および野生型の遺伝子（Ｇ）のプロモーターと結合すると、変異遺伝子コピーからの遺伝子産物の喪失を埋め合わせるように、野生型遺伝子コピーからの遺伝子産物の産生が増加される。
【図２】[ＯＰＡ１プロモーター領域]  ＯＰＡ１プロモーター（配列番号１７）を含有するＯＰＡ１の５’非翻訳領域を示す。強調部分は、本発明の人工転写因子のための結合部位（下線部、８５位から１０２位および９１位から１０８位のオーバーラップ部位、８３４位から８５３位、ならびに９８３位から１０００位）、および転写開始のための８４６位（太字）である。
【図３】[ＯＰＡ１特異的人工転写因子の活性を評価するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ]  ＨｅＬａ細胞を、ＯＰＡ１＿ａｋｔ１からＯＰＡ１＿ａｋｔ５（パネルＡ、Ａ１からＡ５と表示）またはＯＰＡ１＿ａｋｔ６からＯＰＡ１＿ａｋｔ１０（パネルＢ、Ａ６からＡ１０と表示）のための発現プラスミド、ならびにヒトＯＰＡ１プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼおよびＣＭＶプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを含有するレポータープラスミドで共トランスフェクトした。ジンクフィンガータンパク質中のすべての亜鉛配位システイン残基がセリン残基に交換されている不活性（修飾）ＯＰＡ１＿ａｋｔ１（パネルＡ）または不活性（修飾）ＯＰＡ１＿ａｋｔ６（パネルＢ）によるトランスフェクションを、コントロールとして用いた（Ｃと表示）。ルシフェラーゼおよび分泌型アルカリホスファターゼ活性を、共トランスフェクションの４８時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性は、分泌型アルカリホスファターゼ活性に対して標準化し、コントロールに対するパーセントとして表した（相対ルシフェラーゼ活性−ＲＬＡ）。３つの独立した実験の平均を、ＳＤを示すエラーバーと共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列（ＮＬＳ）、および所望に応じてタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）と融合したＯＰＡ１プロモーター（配列番号１７）を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む人工転写因子（ＡＴＦ）、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する（図１）。
【００１５】
本発明の文脈において、プロモーターは、遺伝子の制御領域として定義される。この定義は、本技術分野における一般的定義に対応する。やはり本発明の文脈において、ハプロ不全プロモーターは、ゲノム中に２つの機能的遺伝子コピーが存在する場合にのみ、あらゆる状況下ですべての細胞型において充分な遺伝子産物の産生を引き起こすことができるプロモーターとして定義される。従って、ハプロ不全遺伝子の１つの遺伝子コピーの変異は、一部のまたはすべての生理学的状況下で、生物の一部のまたはすべての細胞において不充分な遺伝子産物の産生を引き起こす。本発明の文脈において、遺伝子は、制御配列、さらにはタンパク質またはＲＮＡの産生をもたらす遺伝子産物のための配列を含有するゲノム領域として定義される。この定義もやはり、本技術分野における一般的定義に対応する。
【００１６】
人工転写因子のタンパク質形質導入ドメインの媒介による細胞内送達は、病態生理学的に該当する分子を標的とする生物学的製剤の高い選択性を新規な様式で利用する新しい方法である。ＡＤＯＡまたはＡＤＯＡプラスなどＯＰＡ１のハプロ不全によって引き起こされる疾患の場合、不充分な遺伝子発現がそのような障害の根本原因であることから、小分子薬物を例とする現行の手法を用いた治療は考えられない。しかし、人工転写因子技術を、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の形態の高度な薬物標的化と組み合わせることで、活性化人工転写因子を輸送し、残りの機能性遺伝子コピーの転写を高めて両方の遺伝子コピーが機能性であれば到達されることになるレベルとすることによって、ＯＰＡ１のハプロ不全を分子レベルで直接扱うことができる。
【００１７】
考慮されるタンパク質形質導入ドメインは、ＨＩＶ  ＴＡＴ、ペプチドｍＴ０２（配列番号１８）、ペプチドｍＴ０３（配列番号１９）、Ｒ９ペプチド（配列番号２０）、ＡＮＴＰドメイン（配列番号２１）、または細胞膜を通してカーゴを輸送することができるその他のペプチドである。
【００１８】
さらに、免疫原性を低下させるために、本発明の人工転写因子をポリエチレングリコールで修飾することも考慮される。加えて、本発明の人工転写因子を眼および脳などの免疫特権器官に適用することは、いずれの免疫反応をも回避し、人工転写因子に対する全身寛容を誘導する。免疫特権器官以外での慢性疾患の治療の場合、予め眼内注射を行うことによる免疫寛容の誘導が考慮される。
【００１９】
優性視神経萎縮症は、ハプロ不全に繋がるＯＰＡ１遺伝子の変異によって引き起こされる。優性視神経萎縮症の患者は、視神経を形成する網膜神経節細胞の進行的な喪失に起因して、最終的には失明をもたらす進行的な視力喪失を患う。興味深いことに、ほとんどの優性視神経萎縮症患者は、眼球外の症状を提示しない。患者のうちの小さいサブセットのみが、痙性対麻痺および難聴などのさらなる眼球外神経症状を示すいわゆる優性視神経萎縮症プラスの表現型に罹患する。ＯＰＡ１は、ミトコンドリア内部のクリステの構造を安定化すること、およびミトコンドリア細管同士の融合を促進することにより、構造的レベルでのミトコンドリア機能の維持に関与している。ミトコンドリアは、ＡＴＰの形態での細胞エネルギーの主たる生産者であることから、ＯＰＡ１は、細胞エネルギーレベルを維持するために必要である。ＯＰＡ１機能の喪失は、アポトーシス機構を介する細胞死を促進することが知られている。ヒトの身体のほとんどすべての細胞において、ミトコンドリア機能を充分なレベルに維持するための充分なＯＰＡ１タンパク質を産生するには、ＯＰＡ１遺伝子の１つの機能性コピーで充分である。しかし、特にエネルギーを必要とする網膜神経節細胞は、そのミトコンドリアの状態に関して特別な必要性を有しているため、１つのＯＰＡ１遺伝子コピーでは産生することのできないＯＰＡ１のレベルに依存しており、このため、ハプロ不全ＯＰＡ１変異は、網膜神経節細胞死を伴い、視力喪失および失明をもたらす結果となる。本発明の人工転写因子を用いることにより、残った機能性ＯＰＡ１遺伝子からのＯＰＡ１タンパク質の産生を正常レベル以上にまで高めることによって、網膜神経節細胞中のＯＰＡ１タンパク質レベルを上昇させることができ、それによって、ミトコンドリア機能が回復され、網膜神経節細胞死および付随する視力喪失が予防される。
【００２０】
ＯＰＡ１のハプロ不全は、理論的には、ウィルス導入によって変異ＯＰＡ１遺伝子の追加の機能性コピーを供給し、それによって遺伝子量を増加させることを通して、従来の遺伝子療法の手法によって治療することが可能である。しかし、遺伝子療法において安全であると考えられている現在利用可能なウィルスベクターは、約５から８キロ塩基よりも大きい遺伝子を輸送することができない。いくつかの遺伝子の場合はこれで充分であるが、ＯＰＡ１遺伝子は、８キロ塩基よりも大きいと考えられ、従って、現在利用可能なベクターを用いた遺伝子療法の候補ではない。加えて、遺伝子発現の厳密な制御は、送達された遺伝子の甚だしい過剰発現およびそれに伴う毒性副作用の可能性を持つ遺伝子療法を用いては達成されない。
【００２１】
ウィルス導入のこの制限は、本発明の人工転写因子には適用されない。ハプロ不全遺伝子のサイズは、本発明で述べる治療手法にとって無関係であり（図１）、最も大きな遺伝子であっても、人工転写因子による調節の対象となる。加えて、本発明の人工転写因子によって遺伝子発現が増加される度合いは、状況に応じた人工転写因子の投与によって、または転写調節という意味での活性がより高いもしくは低い代替的な活性化ドメインの使用によって調節される。加えて、ＯＰＡ１  ｍＲＮＡは、広範な選択的スプライシングを受けることによって、複数のＯＰＡ１アイソフォームの産生を引き起こし、それらはすべて、ＯＰＡ１がその機能を実行するために必要である。特に、種々のＯＰＡ１アイソフォームの異なるタンパク質プロセッシングは、ＯＰＡ１がその機能を実行するために必須である機構上の必要条件である。
【００２２】
機能性遺伝子コピーにおけるＯＰＡ１  ｍＲＮＡ産生を増加させるために本発明の人工転写因子のウィルス送達を用いることによって、この必須プロセスを起こすことができ、それによって、ＯＰＡ１ハプロ不全に起因する疾患の機能的治癒が提供される。
【００２３】
治療剤のためのプールとして従来から用いられる小分子のクラスは、遺伝子発現の標的化調節に適さない。従って、多くの有望な薬物標的および関連する疾患は、従来の医薬的手法の対象とならない。対照的に、本発明の人工転写因子はすべて、高度に確定された全体組成を有する同じ物質クラスに属している。２つの非常に多様なプロモーター配列を標的とする２つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づく人工転写因子は、それでも、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を持ち、全体として類似する三次構造であり、迅速かつ経済的に、標準化された方法（以下で述べるように）を介して作製することができる。従って、本発明の人工転写因子は、１つの分子クラスにおいて、非常に広く多様な一式の標的に対する極めて高い特異性と、類似する全体組成とを併せ持つものである。加えて、本発明の人工転写因子の薬物への製剤は、過去の経験に頼ることが可能であり、それによって創薬プロセスがさらに加速される。
【００２４】
本発明はまた、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質がＯＰＡ１プロモーター領域を特異的に標的としているＯＰＡ１のハプロ不全に繋がるＯＰＡ１における変異によって引き起こされる疾患の治療における、そのような人工転写因子の使用にも関する。同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患を治療する方法に関し、ここで、治療されるべき疾患は、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質がＯＰＡ１プロモーターを特異的に標的とし、ＯＰＡ１遺伝子のハプロ不全によって引き起こされる。
【００２５】
考慮されるポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質である。「四量体」、「五量体」、「六量体」、「七量体」、および「八量体」は、ジンクフィンガータンパク質が、それぞれ、４、５、６、７、および８個の部分タンパク質構造から成ることを意味しており、その各々は、特定のヌクレオチドトリプレットに対する結合特異性を有する。好ましくは、人工転写因子は、六量体ジンクフィンガータンパク質を含む。
【００２６】
ＯＰＡ１プロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は、機能的人工転写因子作製の成功のために極めて重要である。人工転写因子がＯＰＡ１遺伝子発現を生体内で調節するためには、ＯＰＡ１遺伝子のゲノム状況（genomic context）におけるその標的部位と結合する必要がある。これには、ＤＮＡ標的部位へのアクセス性が必要であり、それは、この領域中の染色体ＤＮＡがヒストンの周囲に密に充填されたヌクレオソームとなっていないこと、およびメチル化などのＤＮＡ修飾が人工転写因子の結合に干渉しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は、密に充填され、転写不活性であるが、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍（−１０００から＋２００ｂｐ）は、内在性転写因子およびＲＮＡポリメラーゼなどの転写装置にとってアクセス可能である必要がある。従って、いずれの任意の標的遺伝子においても、この領域中の標的部位を選択することにより、生体内での所望される機能を有する人工転写因子を良好に作製することが可能となる。
【００２７】
ヒトＯＰＡ１遺伝子プロモーター内の標的部位選択
ヒトＯＰＡ１オープンリーディングフレーム（図２）の開始コドンの１０００ｂｐ上流の領域を、（Ｇ／Ｃ／ＡＮＮ）6の一般組成を有する潜在的１８ｂｐ標的部位の存在について分析し、ここで、Ｇはヌクレオチドのグアニンであり、Ｃはヌクレオチドのシトシン、Ａはヌクレオチドのアデニン、ならびにＮは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの４つのヌクレオチドの各々を表す。４つの標的部位、ＯＰＡ＿ＴＳ１（配列番号２２）、ＯＰＡ＿ＴＳ２（配列番号２３）、ＯＰＡ＿ＴＳ３（配列番号２４）、およびＯＰＡ＿ＴＳ４（配列番号２５）を選択した。
【００２８】
ＯＰＡ１遺伝子プロモーターを標的とする形質導入可能人工転写因子
具体的な六量体ジンクフィンガータンパク質は、ＺｉＦｉｔソフトウェアｖ３．３（Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605）を用いたいわゆるＢａｒｂａｓジンクフィンガーモジュールセット（Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810）から成るか、または酵母ワンハイブリッド技術を用いてジンクフィンガータンパク質ライブラリーから選択した。ＯＰＡ１遺伝子プロモーターを標的とする活性化形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１（配列番号２６）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿２（配列番号２７）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿３（配列番号２８）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿４（配列番号２９）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿５（配列番号３０）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿６（配列番号３１）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿７（配列番号３２）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿８（配列番号３３）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿９（配列番号３４）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１０（配列番号３５）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１１（配列番号３６）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１２（配列番号３７）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１３（配列番号３８）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１４（配列番号３９）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１５（配列番号４０）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１６（配列番号４１）、ＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１７（配列番号４２）、およびＺＦＰ＿ＯＰＡ１＿１８（配列番号４３）を、転写活性化ドメインＶＰ６４と融合して、ＮＬＳおよび３×  ｍｙｃエピトープタグも含有する人工転写因子ＯＰＡ＿ａｋｔ１（配列番号４４）、ＯＰＡ＿ａｋｔ２（配列番号４５）、ＯＰＡ＿ａｋｔ３（配列番号４６）、ＯＰＡ＿ａｋｔ４（配列番号４７）、ＯＰＡ＿ａｋｔ５（配列番号４８）、ＯＰＡ＿ａｋｔ６（配列番号４９）、ＯＰＡ＿ａｋｔ７（配列番号５０）、ＯＰＡ＿ａｋｔ８（配列番号５１）、ＯＰＡ＿ａｋｔ９（配列番号５２）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１０（配列番号５３）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１１（配列番号５４）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１２（配列番号５５）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１３（配列番号５６）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１４（配列番号５７）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１５（配列番号５８）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１６（配列番号５９）、ＯＰＡ＿ａｋｔ１７（配列番号６０）、およびＯＰＡ＿ａｋｔ１８（配列番号６１）を得た。
【００２９】
また、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質を含有する本発明の人工転写因子も考慮され、ここで、ＯＰＡ１プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和性を改善するために、または寛容性改善のためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的プロファイルを改変するために、個々のジンクフィンガーモジュールが交換される。
【００３０】
本発明に従うＯＰＡ１プロモーターを標的とする人工転写因子はまた、配列番号２６および４３で開示されるジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質も含み、ここで、個々のアミノ酸が、意図する標的部位への結合親和性は維持すると同時に考え得る免疫原性を最小限に抑える目的で、交換される。
【００３１】
本発明の人工転写因子はまた、ジーンオントロジーＧＯ：０００１０７１によって定められる遺伝子転写を増加させることのできるその他のタンパク質ドメインも含有してよく、ＶＰ１６、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体リピート）、ＣＪ７、ｐ６５−ＴＡ１、ＳＡＤ、ＮＦ−１、ＡＰ−２、ＳＰ１−Ａ、ＳＰ１−Ｂ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−２＿５ｘ、ＭＴＦ−１、ＢＴＥＢ−２、ＬＫＬＦなどであり、ＶＰ６４またはＡＰ−２が好ましい。
【００３２】
さらに、本発明の人工転写因子は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。考慮される核局在化配列は、ジーンオントロジーＧＯ：０００８１３９によって定められるタンパク質との結合を通して核内移行を付与するアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基（Ｋ）、続いてリジン（Ｋ）またはアルギニン残基（Ｒ）、続いて任意のアミノ酸（Ｘ）、続いてリジンまたはアルギニン残基を含有する塩基性アミノ酸のクラスター（Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492）、またはＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号６２）であり、ＳＶ４０  ＮＬＳが好ましい。
【００３３】
ＯＰＡ１遺伝子のプロモーター領域に指向されるが、タンパク質形質導入ドメインを持たない人工転写因子も、本発明の主題である。それらは、上記で定められる本発明の人工転写因子のための中間体であるか、またはそのまま用いられてもよい。
【００３４】
トランスフェクションによって、またはヘルペスウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルス系のベクターなどのウィルスベクターを介して導入される核酸の形態としての、本発明の人工転写因子のための別の選択肢としての送達方法も考慮される。
【００３５】
本発明の人工転写因子のドメインは、短鎖フレキシブルリンカー（short flexible linkers）で連結されていてよい。短鎖フレキシブルリンカーは、２から８個のアミノ酸を有し、好ましくは、グリシンおよびセリンである。考慮される特定のリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号６３）である。人工転写因子はさらに、その検出および処理を容易とするために、マーカーを含有してもよい。
【００３６】
ＯＰＡ１プロモーターを標的とする人工転写因子による処理後におけるＯＰＡ１上方制御およびミトコンドリア活性改善の評価
ＯＰＡ１プロモーター特異的人工転写因子で処理したＨｅＬａ細胞が、バッファーコントロールで処理した細胞と比較され、ＯＰＡ１のタンパク質レベルが、特異的抗ＯＰＡ１抗体を用いた定量的赤外−蛍光ウェスタンブロットによって評価される。ＯＰＡ１タンパク質レベルの増加は、人工転写因子での処理後にＯＰＡ１の産生が増加したことを示す。ＯＰＡ１特異的人工転写因子での処理の有益な効果を測定するために、ミトコンドリアの忠実性（mitochondrial fidelity）および細胞生存率が評価されている。このために、ＯＰＡ１特異的人工転写因子で処理した細胞が、ミトコンドリアの毒ロテノンによる処理を通して引き起こされる酸化的傷害後のミトコンドリア反応性酸素産生に関して、コントロール処理細胞と比較される。ミトコンドリア反応性酸素産生は、フローサイトメトリーおよび活性酸素特異的染料ＭｉｔｏＳｏｘを用いて測定される。加えて、ミトコンドリア健全性のパラメーターとしてのミトコンドリア膜電位が、電位感受性ＴＭＲＥ蛍光のフローサイトメトリー検出によって測定される。コントロール細胞と比較した人工転写因子処理細胞における反応性酸素種産生の低下、またはミトコンドリア膜電位の上昇は、ＯＰＡ１標的化人工転写因子の有益な活性を示すものである。さらに、ＯＰＡ１標的化人工転写因子で処理した細胞またはコントロール処理細胞のスタウロスポリン、ロテノン、およびアクチノマイシンＤによるアポトーシス誘導に対する感受性も測定される。このために、アポトーシス細胞死の指標としてのチトクロムｃの放出が、処理細胞の蛍光顕微鏡観察を用いて測定され、コントロール細胞と比較される。
【００３７】
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合による結合（ＰＥＧ化）が、人工転写因子の溶解性向上、その腎クリアランスの低減、およびその免疫原性の制御のために考慮される。考慮されるのは、サイズが１から４０キロダルトンの範囲であるアミンさらにはチオール反応性ポリエチレングリコールである。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いることで、人工転写因子の部位特異的ＰＥＧ化が達成される。本発明の人工転写因子中の唯一の必須チオール基含有アミノ酸は、亜鉛配位に必須であるジンクフィンガーモジュール中に位置するシステイン残基である。このようなチオール基は、その亜鉛配位に起因してＰＥＧ化のためにアクセス可能ではなく、従って、１もしくは複数のシステイン残基を本発明の人工転写因子に含めることで、チオール特異的ポリエチレングリコール試薬を用いたＰＥＧ化のための遊離チオール基が提供される。
【００３８】
医薬組成物
本発明はまた、上記で定める人工転写因子を含む医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、特にはヒトに対する注射全身投与、特に静脈内投与用の組成物、吸入投与用の組成物、および局所投与、特に点眼剤を例とする経眼局所投与、または硝子体内、結膜下、テノン嚢下（parabulbar）、もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼剤、および硝子体内、結膜下、テノン嚢下、もしくは眼球後投与用組成物が特に好ましい。組成物は、活性成分を単独で含むか、または、好ましくは、薬理学的に許容されるキャリアと一緒に含む。さらに、徐放性製剤も考慮される。活性成分の用量は、治療されるべき疾患に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。
【００３９】
さらに、経口送達に有用である医薬組成物、特に、適切にカプセル化された活性成分を含む組成物、またはそれ以外で胃での分解に対して保護された組成物も考慮される。例えば、そのような医薬組成物は、膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含有してよく、腸溶コーティングで覆われてもよい。
【００４０】
医薬組成物は、およそ１％からおよそ９５％の活性成分を含む。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤などである。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法で作製され、例えば、従来の混合、溶解、または凍結乾燥プロセスである。
【００４２】
活性成分の溶液の使用、ならびに懸濁液または分散液、特には等張性水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましく、これらは、例えば、活性成分を単独で、またはマンニトールを例とするキャリアと共に含む凍結乾燥組成物の場合、使用前に作製されてよい。医薬組成物は、滅菌されてよく、ならびに／または保存剤、安定化剤、湿潤剤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧制御のための塩、および／もしくはバッファーを例とする賦形剤を含んでよく、例えば従来の溶解および凍結乾燥プロセスによるなど、それ自体公知である方法で作製される。前記溶液または懸濁液は、典型的にはカルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、もしくはゼラチンである増粘剤、またはＴｗｅｅｎ  ８０（商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン  モノオレエート）を例とする可溶化剤も含んでよい。
【００４３】
油中の懸濁液は、油成分として、注射目的として慣習的である植物油、合成油、または半合成油を含む。それに関して、８から２２個、特には１２から２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含有する液体脂肪酸エステルが特に言及されてよい。このような脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大で６個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコールであり、特には、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油が特に有用である。
【００４４】
注射用製剤の製造は、通常、滅菌条件下で行われ、例えばアンプルまたはバイアルへの充填、および容器のシールも同様である。
【００４５】
非経口投与の場合、水溶性形態、例えば水溶性塩である活性成分の水溶液、または、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／もしくはデキストランを例とする増粘剤、ならびに所望される場合は安定化剤を含有する水性注射用懸濁液が特に適している。活性成分は、所望に応じて賦形剤と一緒に、凍結乾燥剤の形態であってもよく、非経口投与の前に、適切な溶媒を添加することによって溶液とされてもよい。
【００４６】
吸入用組成物は、スプレー、ミストとしてのエアロゾルの形態で、または液滴の形態で投与されてよい。エアロゾルは、定量噴霧式吸入器またはネビュライザーで、すなわち、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを例とする適切な噴射剤を用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された医薬の短い噴出の形態で気道または肺へ特定量の医薬を送達する装置で送達することができる溶液または懸濁液から作製される。また、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースと共に、吸入用粉末スプレーを提供することも可能である。
【００４７】
点眼剤は、好ましくは、組成物を涙液と等張性（２９５〜３０５ｍＯｓｍ／Ｌ）とする適切な剤を含む活性成分の等張性水溶液である。考慮される剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに、組成物は、ｐＨを５から８、好ましくは７．０から７．４に維持するために、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはＴｒｉｓバッファー（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）を例とするバッファーも含む。組成物はさらに、パラベン、塩化ベンザルコニウムなどの四級アンモニウム塩、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）などを例とする抗微生物保存剤を含有してよい。点眼剤はさらに、ゲル様点眼剤を作製するためにキサンタンガムを、および／またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、もしくはポリビニルピロリドンなどのその他の増粘剤を含有してもよい。
【００４８】
治療方法における人工転写因子の使用
さらに、本発明は、ＯＰＡ１産生の増加に使用するための、およびＯＰＡ１によって影響を受ける疾患の治療に用いるための、特に、そのような眼疾患の治療に用いるための、上述したＯＰＡ１プロモーターに指向される人工転写因子に関する。ＯＰＡ１によって調節される疾患は、常染色体優性視神経萎縮症、常染色体優性視神経萎縮症プラス、ならびに正常眼圧緑内障である。
【００４９】
同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＯＰＡ１によって影響を受ける疾患の治療方法に関する。特に、本発明は、正常眼圧緑内障または優性視神経萎縮症と関連する神経変性を治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療されるべき特定の疾患の種類に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。眼への投与の場合、月１回の０．５から１ｍｇの硝子体内注射が好ましい。全身投与の場合、月１回の１０ｍｇ／ｋｇの注射が好ましい。加えて、眼の硝子体内に徐放性デポジット剤（slow release deposits）を埋め込むことも好ましい。
【００５０】
人工転写因子の動物での使用
さらに、本発明は、遺伝子産物産生を高めるための、動物のＯＰＡ１プロモーターを標的とする人工転写因子の使用にも関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要とする動物に、局所投与に適する組成物で直接投与される。
【実施例】
【００５１】
ＤＮＡプラスミドのクローニング
すべてのクローニング工程において、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）から購入する。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）は、プロメガ（Promega）からである。高正確性Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン（Invitrogen））を、すべての標準的ＰＣＲ反応に適用する。ＤＮＡ断片およびプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ、またはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（マッハライ・ナーゲル（Macherey-Nagel））を用い、製造元の説明書に従って単離する。オリゴヌクレオチドは、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入する。新たに作製されたプラスミドのすべての該当するＤＮＡ配列は、配列決定によって確認した（マイクロシンス（Microsynth））。
【００５２】
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
ＧＮＮおよび／またはＣＮＮおよび／またはＡＮＮ結合ジンクフィンガー（ＺＦ）モジュールを含有する六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改良を加えたGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。ＧＮＮ、ＣＮＮ、およびＡＮＮ  ＺＦモジュールをコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＵＣ５７（ゲンスクリプト（GenScript））に挿入することで、それぞれ、ｐＡＮ１０４９（配列番号６４）、ｐＡＮ１０７３（配列番号６５）、およびｐＡＮ１６７０（配列番号６６）を得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター中に、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ライブラリーを段階的に組み立てる。各個別のクローニング工程の過程で複数のＺＦモジュールが挿入されて非機能性タンパク質が得られることを回避するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（および１ＺＦＰ、２ＺＦＰ、または３ＺＦＰを含有するその誘導産物）、およびｐＡＮ１０４９、ｐＡＮ１０７３、またはｐＡＮ１６７０を、まず１つの制限酵素でインキュベートし、その後、ＳＡＰで処理する。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔを用いて酵素を除去し、その後、第二の制限エンドヌクレアーゼを添加する。
【００５３】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬのクローニングは、５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを、ＸｈｏＩ、ＳＡＰ、および続いてＳｐｅＩで処理することによって行う。インサートは、１０μｇのｐＡＮ１０４９（１６の異なるＧＮＮ  ＺＦモジュールを放出）またはｐＡＮ１０７３（１５の異なるＣＮＮ  ＺＦモジュールを放出）またはｐＡＮ１６７０（１５の異なるＡＮＮ  ＺＦモジュールを放出）を、ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｈｏＩと共にインキュベートすることによって作製する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬの作製の場合、７μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬを、ＡｇｅＩで切断し、脱リン酸化し、ＳｐｅＩで切断する。インサートは、それぞれ１０μｇのｐＡＮ１０４９またはｐＡＮ１０７３またはｐＡＮ１６７０に、ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｍａｌを適用することによって得る。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬのクローニングは、１４μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬを、ＡｇｅＩ、ＳＡＰ、およびその後ＳｐｅＩで処理することによって行い、切断ベクターを得た。３ＺＦＰＬインサートは、ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｍａＩと共にインキュベートすることにより、２０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬから放出された。
【００５４】
１、２、および３つのＺＦＰを含有するライブラリーにおける連結反応は、インサート：ベクターのモル比３：１で設定し、２００ｎｇの切断ベクター、４００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを合計体積２０μＬで用い、室温で一晩行った。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーの連結反応は、２０００ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬ、５００ｎｇの３ＺＦＰＬインサート、４０００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを合計体積２００μＬ中に含有させ、これを、１０の２０μＬに分割し、別々に室温で一晩インキュベートした。連結反応の一部を、各ライブラリーに対して必要とされるクローンの数に応じたいくつかの方法によって大腸菌中にトランスフォームした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬの作製の場合、３μＬの連結反応を、大腸菌ＮＥＢ５−アルファのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬの連結反応のプラスミドＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌ＮＥＢ５−アルファにトランスフォームした（エクイバイオ（EquiBio）製ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓエレクトロポレーターまたはエッペンドルフ（Eppendorf）製Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶおよび２５μＦ、バイオラッド（Bio-Rad）製２ｍｍ  エレクトロポレーションキュベット）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーの連結反応は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔに適用し、ＤＮＡを１５μＬの脱イオン水で溶出した。約６０ｎｇの脱塩ＤＮＡを、５０μＬのＮＥＢ  １０−ベータ  エレクトロコンピテント大腸菌（ニューイングランドバイオラボズ）と混合し、ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰｌｕｓまたはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶ、２５μＦ、および２ｍｍ  エレクトロポレーションキュベットを用い、製造元の推奨に従ってエレクトロポレーションを行った。各ライブラリーに対して複数のエレクトロポレーションを行い、その後、細胞を直接プールしてライブラリーのサイズを拡張した。ヒートショックトランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションの後、ＳＯＣ媒体をこの細菌に適用し、３７℃および２５０ｒｐｍでの１時間のインキュベーションの後、３０μＬのＳＯＣ培養物を段階希釈に用い、アンピシリンを含有するＬＢプレートに播種した。翌日、得られたライブラリークローンの総数を特定した。加えて、各ライブラリーの１０のクローンを選択して、プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドのうちの少なくとも３つを配列決定し、ライブラリーの多様性を確認した。残りのＳＯＣ培養物を、アンピシリンを含有する１００ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩培養した。これらの細胞を用いて、各ライブラリーに対するプラスミドＭｉｄｉ  ＤＮＡを作製した。
【００５５】
酵母ワンハイブリッドスクリーンのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、互換性プレイベクター（compatible prey vector）に導入する。この目的のために、ｐＧＡＤ１０（クロンテック（Clontech））の多重クローニング部位を、ベクターをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＯＡＮ９７１（ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣ、配列番号６７）およびＯＡＮ９７２（ＡＡＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧ、配列番号６８）を挿入することによって修飾した。得られたベクターｐＡＮ１０２５（配列番号６９）を切断し、脱リン酸化し、６ＺＦＰライブラリーインサートを、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬから放出させる。連結反応、およびＮＥＢ  １０−ベータ  エレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーについて上述した通りに行った。
【００５６】
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターｐＡＮ１３７５（配列番号７０）にも導入する。このプレイベクターは、以下のようにして構築した：ｐＲＳ３１５（配列番号７１）を、ＡｐａＩ／ＮａｒＩで切断し、アニーリングしたＯＡＮ１１４３（ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣ、配列番号７２）およびＯＡＮ１１４４（ＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧ、配列番号７３）を挿入して、ｐＡＮ１３７３（配列番号７４）を得た。ｐＡＮ１０２５からのＳｐｈＩインサートを、ＳｐｈＩで切断したｐＡＮ１３７３に連結して、ｐＡＮ１３７５を得た。
【００５７】
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターｐＡＮ１９２０（配列番号７５）にも導入する。
【００５８】
なおさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、プレイベクターｐＡＮ１９９２（配列番号７６）にも挿入する。
【００５９】
酵母ワンハイブリッド用のベイトプラスミドのクローニング
各ベイトプラスミドにおいて、中心部に１８ｂｐの潜在的人工転写因子標的部位を持つ６０ｂｐの配列を選択し、制限分析のためにＮｃｏＩ部位を含める。オリゴヌクレオチドの設計およびアニーリングは、５’ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’ＸｈｏＩ部位が生成されるように行い、それによって、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断されたｐＡｂＡｉ（クロンテック）に直接連結可能となる。産物のＮｃｏＩによる消化および配列決定を用いて、ベイトプラスミドの組み立てを確認する。
【００６０】
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｙ１Ｈ  Ｇｏｌｄを、クロンテックから、ＹＰＤ培地およびＹＰＤカンテンをカールロス（Carl Roth）から購入した。合成ドロップアウト（ＳＤ）培地は、２０ｇ／Ｌ  グルコース、６．８ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、９．７ｇ／Ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（すべてカールロスより）、１．４ｇ／Ｌ  酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、６．７ｇ／Ｌ  酵母窒素ベース、０．１ｇ／Ｌ  Ｌ−トリプトファン、０．１ｇ／Ｌ  Ｌ−ロイシン、０．０５ｇ／Ｌ  Ｌ−アデニン、０．０５ｇ／Ｌ  Ｌ−ヒスチジン、０．０５ｇ／Ｌ  ウラシル（すべてシグマアルドリッチより）を含有していた。ＳＤ−Ｕ培地は、ウラシル以外のすべての成分を含有し、ＳＤ−Ｌは、Ｌ−ロイシンなしで作製した。ＳＤカンテンプレートは、リン酸ナトリウムを含有していないが、１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（ＢＤ）を含有していた。オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）は、クロンテックから購入した。
【００６１】
ベイト酵母株の調製
約５μｇの各ベイトプラスミドを、全体積２０μＬ中、ＢｓｔＢＩで線状化し、反応ミックスの半分を、Ｓ・セレビシエ  Ｙ１Ｈ  Ｇｏｌｄのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いる。トランスフォーメーションの前日に、酵母細胞を用いて５ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、室温にてローラー上で一晩増殖させる。このプレ培養物の１ミリリットルを、新しいＹＰＤ培地で１：２０に希釈し、３０℃、２２５ｒｐｍで２〜３時間インキュベートする。各トランスフォーメーション反応において、１ＯＤ600の細胞を遠心分離で回収し、酵母細胞を、１ｍＬの滅菌水で１回、１ｍＬのＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム）で１回洗浄する。最後に、酵母細胞を、５０μＬのＴＥ／ＬｉＡｃに再懸濁し、５０μｇのサケ精子由来一本鎖ＤＮＡ（シグマアルドリッチ）、１０μＬのＢｓｔＢＩ線状化ベイトプラスミド（上記参照）、および３００μＬのＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  酢酸リチウム、５０％（重量／体積）ＰＥＧ３３５０）と混合する。細胞およびＤＮＡを、ローラー上、室温にて２０分間インキュベートし、その後、４２℃のウォーターバス中に１５分間配置する。最後に、酵母細胞を遠心分離で回収し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＳＤ−Ｕカンテンプレート上に広げる。３０℃での３日間のインキュベーションの後、各トランスフォーメーション反応からのＳＤ−Ｕ上で増殖する８つのクローンを選択して、オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する感受性を分析する。プレ培養物を、ローラー上、室温にて一晩増殖させた。各培養物において、ＯＤ600を測定し、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調節した。この第一の希釈物から、滅菌水を用いて、さらに５つの１／１０の段階希釈物を作製した。各クローンにおいて、各段階希釈物からの５μＬを、ＳＤ−Ｕ、ＳＤ−Ｕ  １００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｕ  １５０ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｕ  ２００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡを含有するカンテンプレート上にスポッティングした。３０℃で３日間のインキュベーションの後、ＳＤ−Ｕ上で良好に増殖し、ＡｂＡに対して最も感受性の高い３つのクローンを選択して、さらなる分析を行う。ベイトプラスミドの酵母ゲノム中への安定な組み込みは、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃｈｅｃｋ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ  １（クロンテック）によって、製造元の説明に従って確認する。３つのクローンのうちの１つを、続いてのＹ１Ｈスクリーニングに用いる。
【００６２】
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質導入
約５００μＬの酵母ベイト菌株プレ培養物を、１ＬのＹＰＤ培地中に希釈し、ＯＤ600＝１．６〜２．０まで（およそ２０時間）、３０℃および２２５ｒｐｍでインキュベートする。細胞を、スイングアウトローターによる遠心分離で回収する（５分間、１５００×ｇ、４℃）。エレクトロコンピテント細胞の作製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各トランスフォーメーション反応において、４００μＬのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を、１μｇの６ＺＦＰライブラリーをコードするプレイプラスミドと混合し、氷上にて３分間インキュベートする。細胞−ＤＮＡ懸濁液を、予め冷却しておいた２ｍｍ  エレクトロポレーションキュベットに移す。複数のエレクトロポレーション反応を（ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰｌｕｓエレクトロポレーターまたはＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ、２．５ｋＶ、および２５μＦ）、すべての酵母細胞懸濁液がトランスフォームされるまで行う。エレクトロポレーションの後、酵母細胞を、１００ｍＬのＹＰＤ：１Ｍ  ソルビトール  １：１ミックスに移し、３０℃、２２５ｒｐｍで６０分間インキュベートする。細胞を遠心分離で回収し、１〜２ｍＬのＳＤ−Ｌ培地に再懸濁する。２００μＬのアリコートを、１０００〜４０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡを含有する１５ｃｍ  ＳＤ−Ｌカンテンプレート上に広げる。さらに、５０μＬの細胞懸濁液を用いて、１／１００および１／１０００希釈物を作製し、５０μＬの未希釈および希釈細胞を、ＳＤ−Ｌ上に播種する。すべてのプレートを、３０℃で３日間インキュベートする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体のプレートから算出する。未希釈細胞のＳＤ−Ｌプレートは、すべての形質転換体の増殖を示しているが、ＡｂＡ含有ＳＤ−Ｌプレートは、プレイ６ＺＦＰがそのベイト標的部位と良好に結合した場合にのみ、コロニー形成が見られた。
【００６３】
正の相互作用の検証と６ＺＦＰをコードするプレイプラスミドの回復
初期分析において、４０の良好なサイズのコロニーを、最も高い濃度のＡｂＡを含有するＳＤ−Ｌプレートから取り出し、酵母細胞を、１０００〜４０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡのＳＤ−Ｌ上に２回再度画線し、単一コロニーを得た。各クローンにおいて、１つのコロニーを用いて、５ｍＬ  ＳＤ−Ｌ培地に播種し、細胞を室温で一晩増殖させる。翌日、滅菌水でＯＤ600＝０．３に調節し、さらに５つの１／１０希釈物を作製し、各段階希釈物の５μＬを、ＳＤ−Ｌ、ＳＤ−Ｌ  ５００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、１０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  １５００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ２５００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ  ３０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｌ  ４０００ｎｇ／ｍＬ  ＡｂＡプレート上にスポッティングする。クローンを、高ＡｂＡ濃度で増殖する能力に従ってランク付けする。最も良好に増殖したクローンから、５ｍＬの初期ＳＤ−Ｌプレ培養物を用いて細胞の遠心沈殿を行い、それらを１００μＬの水または残りの培地に再懸濁する。５０Ｕのリチカーゼ（lyticase）（シグマアルドリッチ、Ｌ２５２４）を添加後、細胞を３７℃、３００ｒｐｍにて、水平振とう機上で数時間インキュベートする。生成されたスフェロブラスト（spheroblasts）を、１０μＬの２０％（重量／体積）ＳＤＳ溶液を添加することで溶解し、１分間のボルテックス撹拌によって激しく混合し、−２０℃で少なくとも１時間凍結させる。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔからの２５０μＬのＡ１バッファー、およびスパチュラ１杯分のガラスビーズ（シグマアルドリッチ、Ｇ８７７２）を添加し、チューブを、１分間のボルテックス撹拌によって激しく混合する。プラスミドの単離は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔからの２５０μＬのＡ２バッファーを添加し、室温で少なくとも１５分間インキュベートし、その後標準ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔプロトコルを継続することによってさらに改善される。３０μＬの溶出バッファーによる溶出後、５μＬのプラスミドＤＮＡを、ヒートショックトランスフォーメーションによって大腸菌ＤＨ５アルファにトランスフォームする。２つの別々のコロニーを、アンピシリン含有ＬＢプレートから取り出し、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートを配列決定する。得られた結果を、各標的部位に対する６ＺＦＰ間のコンセンサス配列について分析する。
【００６４】
分泌型ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼの組み合わせアッセイのためのＯＰＡ１遺伝子プロモーター領域のクローニング
ＯＰＡ１プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片を、ｐＡＮ１４８５（ＮＥＧ−ＰＧ０４、ジーンコペイア（GeneCopeia））中にクローニングし、ＯＰＡ１遺伝子プロモーターの支配下の分泌型ガウシアルシフェラーゼおよび構成的ＣＭＶプロモーターの支配下の分泌型胚性アルカリホスファターゼを含有するレポータープラスミドｐＡＮ１６８０（配列番号７７）が得られ、ルシフェラーゼのアルカリホスファターゼシグナルに対する標準化が可能となった。
【００６５】
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
Ｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ゲンスクリプト（GenScript））を通して作製したかまたは酵母ワンハイブリッドで選択したポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩによる標準的な手順を用いて、目的のジンクフィンガーレイ、ＳＶ４０  ＮＬＳ、３×  ｍｙｃエピトープタグ、およびＮ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５５−配列番号７８）、Ｃ末端ＫＲＡＢドメイン（ｐＡＮ１２５８−配列番号７９）、ＳＩＤドメイン（ｐＡＮ１２５７−配列番号８０）、またはＶＰ６４活性化ドメイン（ｐＡＮ１５１０−配列番号８１）の融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現するための哺乳類発現ベクター中にクローニングする。
【００６６】
安定にトランスフェクトされたテトラサイクリン誘導性細胞を作製するためのプラスミドを、以下のようにして作製した：ポリダクチルジンクフィンガードメイン、制御ドメイン（Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＶＰ６４）、ＳＶ４０  ＮＬＳ、および３×  ｍｙｃエピトープタグを含む人工転写因子をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩを用いてｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（インビトロジェン）中にクローニングする。
【００６７】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、４．５ｇ／Ｌ  グルコース、１０％  熱失活ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（すべてシグマアルドリッチから）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％  ＣＯ2、３７℃で増殖させる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、７０００ＨｅＬａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種する。翌日、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（キアゲン）を製造元の説明書に従って用いて、共トランスフェクションを行う。人工転写因子を、およびルシフェラーゼをコードするプラスミドｍｉｄｉ製剤（Plasmid midi preparations）を、３：１の比率で用いる。トランスフェクションの６時間後および２４時間後に、ウェルあたり１００μＬの新しいＤＭＥＭで培地を入れ替える。
【００６８】
Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株の作製および維持
安定なテトラサイクリン誘導性Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）２９３発現細胞株を、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔを用い、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ標的部位ベクターおよびｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターをトランスフェクトすることによって、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株を作製する。誘導性２９３発現細胞株を作製するために、目的の遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ発現ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）宿主細胞株のＦＲＴ部位に、Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組換えを介して組み込む。安定なＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−Ｒｅｘ（商標）発現細胞株を、（ＤＭＥＭ；１０％  Ｔｅｔ−ＦＢＳ；２ｍＭ  グルタミン；１５μｇ／ｍＬ  ブラストサイジン、および１００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシン）を含有する選択培地で維持する。遺伝子発現の誘導のために、テトラサイクリンを最終濃度１μｇ／ｍＬまで添加する。
【００６９】
ルシフェラーゼ／ＳＥＡＰプロモーター活性組み合せアッセイ
ＨｅＬａ細胞を、人工転写因子発現コンストラクト、ならびにＯＰＡ１プロモーターの支配下の分泌型ガウシアルシフェラーゼおよび構成的ＣＭＶプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを持つプラスミドで共トランスフェクトする（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ピアース（Pierce）；ＳＥＡＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ、ロシュ（Roche））。トランスフェクションの２日後、細胞培養物上澄を回収し、ルシフェラーゼ活性およびＳＥＡＰ活性を、Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））およびＳＥＡＰ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ（ロシュ）をそれぞれ用いて測定した。ジンクフィンガードメイン中のすべてのシステイン残基がセリン残基に交換されている不活性人工転写因子のための発現プラスミドの共トランスフェクションを、コントロールとして用いた。ルシフェラーゼ活性は、ＳＥＡＰ活性に対して標準化し、コントロールに対するパーセントとして表した。
【００７０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現レベルの決定
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Qiagen）、ヒルデン、ドイツ）を製造元の説明書に従って用いて、全ＲＮＡを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを、１０μＬ／ｍＬ  β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴ  Ｐｌｕｓ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させる。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを用いた均質化後、すべてのライセートをｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに移し、ゲノムＤＮＡを除去する。同容量の７０％エタノールを添加し、すべてのライセートをＲＮｅａｓｙスピンカラムに移す。複数回の洗浄工程の後、ＲＮＡを、最終体積３０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶出する。ＲＮＡは、次に使用するまで−８０℃で保存する。ｃＤＮＡの合成は、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国）を製造元の説明書に従って用いて行う。ｃＤＮＡの合成は、２μＬ  １０×バッファー、０．８μＬ  ２５×ｄＮＴＰミックス、２μＬ  １０×ＲＴ  ランダムプライマー、１μＬ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、および４．２μＬ  Ｈ2Ｏを含有する２０μＬの合計反応体積中で行う。最終体積１０μＬのＲＮＡを添加し、反応を、以下の条件下で行う：２５℃にて１０分間、続いて３７℃で２時間、および最終工程として８５℃で５分間。定量的ＰＣＲは、１μＬ  ２０×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１０．０μＬ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（いずれも、アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国）、および８μＬ  Ｈ2Ｏを含有する２０μＬの合計反応体積中で行う。各反応において、１μＬのｃＤＮＡを添加する。ｑＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国）を以下の条件で用いて行う：５０℃で２分間の初期工程、続いて９５℃で１０分間の第一の変性、ならびに９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルから成るさらなる工程。
【００７１】
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
人工転写因子とＴＡＴタンパク質形質導入ドメインとの間のＨｉｓ6タグ融合タンパク質としての大腸菌での発現ために、人工転写因子をコードするＤＮＡ断片を、標準的な手順を用い、ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩにより、ｐＥＴ４１ａ＋（ノバゲン（Novagen））をベースとする細菌発現ベクターｐＡＮ９８３（配列番号８２）中にクローニングする。
【００７２】
ＢＬ２１（ＤＥ３）などの適切な大腸菌宿主細胞中におけるＯＰＡ１を標的とする形質導入可能人工転写因子の細菌産生のための発現コンストラクトは、ｐＡＮ１９６４（配列番号８３）、ｐＡＮ２０５３（配列番号８４）、ｐＡＮ２０５５（配列番号８５）、ｐＡＮ２０５７（配列番号８６）、ｐＡＮ２０５９（配列番号８７）、ｐＡＮ２０６１（配列番号８８）、およびｐＡＮ２０６３（配列番号８９）である。
【００７３】
人工転写因子タンパク質の作製
ある人工転写因子の発現プラスミドでトランスフォームされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１００μＭ  ＺｎＣｌ2を添加した１Ｌ  ＬＢ培地中、ＯＤ600が０．８から１の間に到達するまで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧで２時間誘導した。細菌を遠心分離で回収し、細菌ライセートを超音波処理によって作製し、封入体（inclusion bodies）を精製した。このために、封入体を遠心分離で回収し（５０００ｇ、４℃、１５分間）、２０ｍＬの結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ７．５）で３回洗浄した。精製した封入体を、３０ｍＬの結合バッファーＡ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）中にて１時間、氷上で可溶化した。可溶化した封入体を、４℃および１３０００ｇで４０分間遠心分離し、０．４５μｍ  ＰＶＤＦフィルターを通してろ過した。Ｈｉｓタグ人工転写因子を、結合バッファーＡおよび溶出バッファーＢ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）を用いて、Ａｋｔａｐｒｉｍｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））上のＨｉｓ−トラップカラムを用いて精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、人工転写因子がＳＩＤドメインを含有している場合は、バッファーＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ７．５）に対して、またはＫＲＡＢドメイン含有人工転写因子の場合は、バッファーＫ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＧＳＨ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、５０％  グリセロール；ｐＨ８．５）に対して、４℃で一晩透析した。透析の後、タンパク質サンプルを、１４０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離し、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターチップ（ミリポア（Millipore））を用いて滅菌ろ過した。ＶＰ６４活性化ドメインを含有する人工転写因子の場合、タンパク質は、Ｈｉｓ−Ｂｏｎｄ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ノバゲン）を製造元の推奨に従って用いて、可溶性画分（結合バッファー：５０ｍＭ  ＮａＰＯ4  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール；溶出バッファー  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）から作製した。タンパク質を、ＶＰ６４バッファー（５５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．４、４００ｍＭ  アルギニン、１００μＭ  ＺｎＣｌ2）に対して透析した。
【００７４】
ＥＬＤＩＡ（酵素結合ＤＮＡ相互作用アッセイ）を用いた人工転写因子のＤＮＡ結合活性の決定
ＢＳＡで予めブロッキングしたニッケルコーティングプレート（ピアース）を、洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。プレートを、保存バッファー中の飽和条件下（５０ｐｍｏｌ／ウェル）、精製人工転写因子でコーティングし、軽く振とうしながら室温で１時間インキュベートする。３回の洗浄工程後、１×１０-12から５×１０-7Ｍの６０ｂｐプロモーター配列を含有するアニーリングしたビオチン化オリゴを、結合バッファー中（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２％  グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１００μＭ  ＺｎＣｌ2）、非特異的競合相手（０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子由来ｓｓＤＮＡ、シグマ）の存在下、結合した人工転写因子と共に室温で１時間インキュベートする。洗浄後（５回）、ウェルを、３％  ＢＳＡを用いて室温で３０分間ブロッキングする。抗ストレプトアビジン−ＨＲＰを、結合バッファーに室温で１時間添加する。５回の洗浄工程後、ＴＭＢ基質（シグマ）を添加し、２から３０分間室温でインキュベートする。ＴＭＢ停止溶液（シグマ）を添加して反応を停止し、サンプル吸光を、４５０ｎｍで読み取る。リガンド結合動態のデータ分析を、ヒルに従ってＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  Ｖ８．１を用いて行う。
【００７５】
タンパク質形質導入
約８０％のコンフルエンシーまで増殖した細胞を、３７℃のＯｐｔｉＭＥＭまたは増殖培地中、２時間から１２０時間にわたって、０．０１から１μＭの人工転写因子で処理するか、または疑似処理し、所望に応じて、２４時間ごとに人工転写因子を添加する。所望に応じて、１０〜５００μＭ  ＺｎＣｌ2を増殖培地に添加してよい。免疫蛍光のために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン処理し、カバーガラス上に播種してさらに試験する。
【００７６】
免疫蛍光
細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間処理し、１０％  ＢＳＡ  ＰＢＳでブロッキングし、マウス抗ＨＡ抗体（１：５００、Ｈ９６５８、シグマ）またはマウス抗ｍｙｃ（１：５００、Ｍ５５４６、シグマ）で一晩インキュベートする。サンプルを、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（１：１０００、インビトロジェン）と結合したヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、ＤＡＰＩ（１ｍｇ／ｍＬの１：１０００で３分間、シグマ）を用いて対比染色する。サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて分析する。
【００７７】
ウェスタンブロッティング
タンパク質レベルを測定するために、ＲＩＰＡバッファー（ピアース）を用いて細胞を溶解し、タンパク質ライセートを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーと混合する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質をそのサイズに従って分離し、エレクトロブロッティングを用いてニトロセルロース膜に転写させる。タンパク質の検出は、マウスまたはラビットで産生された特異的一次抗体を用いて行う。一次抗体の検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体および発光に基づく検出（ＥＣＬプラス、ピアース）によるか、または赤外レーザースキャナを用いて蛍光検出および定量されるＤｙＬｉｇｈｔ７００もしくはＤｙＬｉｇｈｔ８００と結合した二次抗体によって行う。
【００７８】
ミトコンドリア機能の測定
フローサイトメトリー分析のために、処理細胞を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで回収する。偽処理細胞をコントロールとして用いる。ミトコンドリア膜電位の測定のために、分析前に、細胞をＦＡＣＳバッファーＰ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（重量／体積）  ＢＳＡ、１μｇ／ｍＬ  ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、シグマ）、１０ｎＭ  テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、シグマ））中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートする。ミトコンドリア膜電位消失のための５０μＭ  カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ、シグマ）での処理をコントロールとして用いる。ミトコンドリア質量の測定のために、分析前に、細胞をＦＡＣＳバッファーＭ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（重量／体積）  ＢＳＡ、１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ、および１００ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（インビトロジェン））中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートする。ミトコンドリアＲＯＳ測定のために、細胞をＦＡＣＳバッファーＲ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ、１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ、および５μＭ  ＭｉｔｏＳＯＸ（インビトロジェン））中に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーＲ２（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（重量／体積）  ＢＳＡ）中に再懸濁する。フローサイトメトリー分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター社（Tree Star Inc.））を用い、ＣｙＡｎADP（ダコ（Dako））で行う。
【００７９】
アポトーシス誘導の測定
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％  ＥＭグレードのパラホルムアルデヒド（ピアース、２８９０８）を用い、室温で３０分間固定する。次に、細胞を、ＰＢＳ中の０．１５％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用い、室温で１５分間透過処理し、続いてＰＢＳ中の１０％（重量／体積）ＢＳＡを用い、室温で１時間ブロッキングする。サンプルを、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗チトクロムｃ抗体（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、５５６４３２、１：１０００）を用い、４℃で一晩インキュベートする。細胞を、ブロッキングバッファーで１５分間３回洗浄し、次にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン）と共に室温で１時間インキュベートする。アポトーシスの尺度としてのチトクロムｃ放出を、盲検観察者により、蛍光顕微鏡で分析する。偽処理細胞をコントロールとして用いる。
【図１】
2016515596.tif 000002
【図２】
2016515596.tif 000003
【図３】
2016515596.tif 000004
【配列表】
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【国際調査報告】
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