(57)【要約】  ナンセンス変異又は中途終止コドンにより引き起こされる、又はそれらと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患のマクロライドを使用する治療を開示する。ナンセンス変異及び中途終止コドンのリードスルーを誘導する作用剤を同定する方法、並びにその使用を更に開示する。【選択図】図１Ａ
2016503051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物。
【請求項２】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物であって、前記組成物を非全身的に投与する、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物。
【請求項３】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物であって、前記組成物を非全身的に投与し、前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が前記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）から選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）前記上流核酸配列と前記下流核酸配列との間に挿入された前記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、前記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
前記核酸コンストラクトを含有し、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させた前記核酸コンストラクトを含有する細胞における前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、前記候補マクロライド系抗生物質が前記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
治療的に有効な用量でＣＮＳに直接投与するための、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復することよる、少なくとも１つのナンセンス変異に起因する非機能性形態の前記細胞内又は亜細胞タンパク質産生と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１種の症状又は状態の治療に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物。
【請求項７】
前記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して少なくとも７％の機能性タンパク質の産生である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して約７％〜約２５％の機能性タンパク質の産生である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種のマクロライドが、エリスロマイシン、アジスロマイシン及びクラリスロマイシン、又はそれらの少なくとも２種の任意の組合せからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
髄腔内投与する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患が、脊髄性筋委縮症、毛細血管拡張性運動失調症、レット症候群、アッシャー症候群、ペルオキシソーム生合成障害、活性化タンパク質欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−小児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病、脊髄小脳失調症、シャルルボア−サグネ型常染色体劣性痙性運動失調症、周期性失調症（Ｅａｓ）、常染色体劣性小脳失調症（ＡＲＣＡ）、パーキンソン病、タウオパチー、早老症候群、ウェルナー症候群、多発ニューロパチー−難聴−運動失調−網膜色素変性−白内障（ＰＨＡＲＣ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、プリオン病、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ニューロセルピン封入体を伴う家族性脳症、ダリエー病、ラミノパチー、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、１Ｂ型肢帯筋ジストロフィー、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー、バラッケ−シモンズ症候群、ブシュケ−オレンドルフ症候群、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー（ＦＰＬＤ）、成人発症型常染色体優性脱髄性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、ペリツェウス−メルツバッヘル病、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
治療を必要とする患者の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が全長ＳＭＮ２の産生を増加する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
非全身的に投与する、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が前記ＳＭＮ２遺伝子に存在する停止コドンのリードスルーを誘導する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）前記上流核酸配列と前記下流核酸配列との間に挿入された前記ＳＭＮ２遺伝子に存在する停止コドンを含む該ＳＭＮ２遺伝子のフラグメントに対応する少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列とを含み、前記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
前記核酸コンストラクトを含有し、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させた前記核酸コンストラクトを含有する細胞における前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、前記候補マクロライド系抗生物質が前記停止コドンのリードスルーを誘導する指標である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＣＮＳに直接投与するための、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与するための、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
髄腔内投与するための、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、前記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含む、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法。
【請求項２２】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、前記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含み、前記組成物を非全身的に投与する、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法。
【請求項２３】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、前記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含み、前記組成物を非全身的に投与し、前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が前記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）前記上流核酸配列と前記下流核酸配列との間に挿入された前記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、前記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
前記核酸コンストラクトを含有し、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させた前記核酸コンストラクトを含有する細胞における前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、前記候補マクロライド系抗生物質が前記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物を治療的に有効な用量でＣＮＳに直接投与する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復する方法であって、前記方法が少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含み、それにより少なくとも１つのナンセンス変異に起因する非機能性形態の前記細胞内又は亜細胞タンパク質の産生と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１つの症状又は状態を治療する、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復する方法。
【請求項２７】
前記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して少なくとも７％の機能性タンパク質の産生である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して約７％〜約２５％の機能性タンパク質の産生である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種のマクロライドが、エリスロマイシン、アジスロマイシン及びクラリスロマイシン、又はそれらの少なくとも２種の任意の組合せからなる群から選択される、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物を、髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与する、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物を髄腔内投与する、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患が、脊髄性筋委縮症、毛細血管拡張性運動失調症、レット症候群、アッシャー症候群、ペルオキシソーム生合成障害、ハーラー症候群、リソソーム蓄積症、活性化タンパク質欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−小児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病、脊髄小脳失調症、シャルルボア−サグネ型常染色体劣性痙性運動失調症、周期性失調症（Ｅａｓ）、常染色体劣性小脳失調症（ＡＲＣＡ）、パーキンソン病、タウオパチー、早老症候群、ウェルナー症候群、多発ニューロパチー−難聴−運動失調−網膜色素変性−白内障（ＰＨＡＲＣ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、プリオン病、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ニューロセルピン封入体を伴う家族性脳症、ダリエー病、ラミノパチー、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、１Ｂ型肢帯筋ジストロフィー、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー、バラッケ−シモンズ症候群、ブシュケ−オレンドルフ症候群、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー（ＦＰＬＤ）、成人発症型常染色体優性脱髄性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、ペリツェウス−メルツバッヘル病、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法であって、前記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含む、脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が全長ＳＭＮ２の産生を増加する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物を非全身的に投与する、請求項３３又３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が前記ＳＭＮ２遺伝子に存在する停止コドンのリードスルーを誘導する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）前記上流核酸配列と前記下流核酸配列との間に挿入された前記ＳＭＮ２遺伝子に存在する停止コドンを含む該ＳＭＮ２遺伝子のフラグメントに対応する少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列とを含み、前記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
前記核酸コンストラクトを含有し、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、前記候補マクロライド系抗生物質と接触させた前記核酸コンストラクトを含有する細胞における前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、前記候補マクロライド系抗生物質が前記停止コドンのリードスルーを誘導する指標である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物をＣＮＳに直接投与する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物を、髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与する、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物を髄腔内投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
核酸コンストラクトであって、
ａ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、
ｂ．青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする第２の核酸配列と、
ｃ．ナンセンス変異を含む、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に挿入された少なくとも４５ヌクレオチドの第３の核酸配列と、
を含み、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列及び第３の核酸配列が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクト。
【請求項４２】
ＧＦＰがＢＦＰの上流にある、請求項４１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項４３】
前記第１の核酸配列、第２の核酸配列及び第３の核酸配列の間に挿入された１又は複数のリンカー核酸配列を更に含む、請求項４１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項４４】
請求項４１に記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
【請求項４５】
請求項４１に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４４に記載のベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項４７】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項４５又は４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法であって、前記方法が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）前記上流核酸配列と前記下流核酸配列との間に挿入された遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、前記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含み、
ｃ．前記核酸コンストラクトを含有し、前記候補マクロライドと接触させていない細胞と比較した、前記候補マクロライドと接触させた前記核酸コンストラクトを含有する細胞集団における前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、前記候補マクロライドがナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である、
ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法。
【請求項５０】
前記上流蛍光タンパク質がＧＦＰであり、前記下流蛍光タンパク質がＢＦＰである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ナンセンス変異を含む前記挿入された核酸配列が少なくとも４５ヌクレオチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を、前記上流蛍光タンパク質及び下流蛍光タンパク質の両方を発現する細胞においてのみ計測する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記上流蛍光タンパク質及び下流蛍光タンパク質の両方を発現する細胞を検出すること又はソーティングすることを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸コンストラクトを含有し、前記候補マクロライドと接触させていない細胞と比較した、前記候補マクロライドと接触させた前記核酸コンストラクトを含有する細胞における前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの約７％〜２５％の増加が、前記候補マクロライドが臨床適用に適したリードスルー剤であることの指標である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光の計測を、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）により行う、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記コンストラクトを含有し、候補マクロライドと接触させた細胞と、ナンセンス変異を含まない対照コンストラクトを含有する細胞との間で前記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルを比較することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記マクロライドがマクロライド系抗生物質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
ナンセンス変異に起因する又はそれと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、
（ｉ）治療を必要とする被験体を治療するためのナンセンス変異リードスルーマクロライドを、
ａ．前記被験体から得られた生体試料において、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する遺伝子中の少なくとも１つのナンセンス変異を同定することと、
ｂ．ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される２つの異なる蛍光タンパク質をコードする２つの核酸配列と隣接する、前記（ａ）の同定した変異に対応する少なくとも４５ヌクレオチドのフラグメントとその周囲のヌクレオチドとを含み、前記フラグメント及び前記２つの異なる蛍光タンパク質をコードする核酸配列が単一のＯＲＦにおいてインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを準備することと、
ｃ．（ｂ）のコンストラクトを宿主細胞に導入することと、
ｄ．（ｂ）のコンストラクトを含有する宿主細胞と候補リードスルーマクロライドとを接触させることと、
ｅ．両方の蛍光タンパク質を含有するリードスルーポリペプチドの存在を検出することと、
を含み、
ｆ．両方の蛍光タンパク質を含有するリードスルーポリペプチドの存在が、前記候補リードスルーマクロライドがナンセンス変異リードスルーマクロライドであることの指標である、
方法により選択することと、
（ｉｉ）前記ナンセンス変異リードスルーマクロライドを前記被験体に投与することと、
を含む、ナンセンス変異に起因する又はそれと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法。
【請求項５９】
前記マクロライドがマクロライド系抗生物質である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための、少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤（agent）と組み合せた、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ナンセンス変異によって引き起こされる遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患のマクロライドを使用する治療に関する。本発明は、更に、ナンセンス変異のリードスルーを誘導する作用剤（agent）を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本件で開示される主題に対し背景として関連するとされる参照文献を以下に列挙する。
［１］  Mendell et al., 2001 Cell, 107(4): 411-4.
［２］  Burke et al., 1985 Nucleic Acids Res, 13(17): 6265-72. 
［３］  Lai et al., 2004 PNAS, 101(44): 15676-15681.
［４］  Zingman et al., 2007 Clin Pharmacol Ther, 81(1): 99-103.
［５］  Malik et al., 2010 Ther Adv Neurol Disord, 3(6): 379-389.
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【０００３】
本明細書において上記参照文献の承認は、これらの文献が本件で開示される主題の特許性に何らかの関連があるという意味に推定されるものではない。
【０００４】
背景
近代のヒト遺伝学の出現は、多くの稀な、オーファン疾患が遺伝子起源であることを明らかにした（１）。特に、レット症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アッシャー症候群等の疾患及び多くの他の疾患は、多くの場合、遺伝子のコーディング配列内の単一ヌクレオチド変異であり、中途終止コドン（premature termination codon）を生じるナンセンス変異に起因することが示されている。かかる変異の存在は、切断された（truncated）非機能性のタンパク質の合成を導く。
【０００５】
過去１０年に亘り、遺伝子のコーディング配列内のナンセンス変異に起因する遺伝性疾患の治療戦略は、アミノグリコシド系抗生物質の使用に基づいて出現した。これらの分子は、中途終止コドンのリードスルーを促進することにより、全長タンパク質の合成を回復する。かかる戦略は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び嚢胞性線維症を含む様々な遺伝性疾患について試験されてきた（２〜６）。残念なことに、ゲンタマイシン等のアミノグリコシドには、重大な用量規制毒性があり、どの慢性障害でも長期治療には魅力的なものではない（７）。
【０００６】
或る特定の分子による或る特定の変異型遺伝子のリードスルーレベルは、停止コドンの特徴及び周囲のヌクレオチド状況に依存する（８）。そのため、リードスルー剤を使用する或る特定の治療に対する応答は、非常に変動しやすく、リードスルーレベル、すなわち全長タンパク質の合成レベルを支配する規則についてはほとんど知られていない。
【０００７】
原核生物系（エシェリキア・コリ（Escherichia coli））におけるタンパク質合成の間の停止コドンリードスルーに対する幾つかの抗生剤の効果が調査された（９）。さらに、アミノグリコシド及びマクロライドにより誘導される中途終止コドンのリードスルーによる大腸癌細胞における腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）遺伝子機能の回復も、Zilberberg et al.、並びに国際公開第２００７／１４４８７６（１０、１１）により報告されている。とりわけ、国際公開第２００７／１４４８７６号は、様々な癌、具体的には、変異型ＡＰＣ遺伝子を発現する癌の治療又は予防のための医薬の製造に対するマクロライド系抗生物質の使用を開示する。
【０００８】
慣習上、中途終止コドンのリードスルーを試験するために設計されたベクターは、ルシフェラーゼに基づく。しかしながら、かかるアッセイは、オフターゲット効果を持つことがわかり、これらのアッセイにより同定されたリーディング化合物は実際にはリードスルーを誘導しない可能性があることを示唆した（１２）。リードスルー剤を同定するためのスクリーニングアッセイに対する様々なアプローチが、例えばDu et al.,及びCardno et al.（１３、１４）に記載される。
【０００９】
とりわけ、国際公開第２００４／００１０１０号（１５）は、中途翻訳停止コドンを伴う任意の遺伝子の転写後発現を調節する化合物をスクリーニング及び同定することにより、中途翻訳終止及び／又はナンセンス媒介メッセンジャーリボ核酸（「ｍＲＮＡ」）の崩壊を調節する化合物をスクリーニング及び同定する方法を開示する。国際公開第２００７／０２７１０６号（１６）は、デュアルレポーター再コーディング（recoding）コンストラクト及び方法を開示する。かかるコンストラクト及び方法は、再コーディングの調節により作用する作用剤をスクリーニングするのに有用である。
【００１０】
さらに、米国特許出願公開第２００９／０３１１６９５号（１７）は、ＲＮＡ転写産物及び／又はＲＮＡ代謝の完全性に対する遺伝学的な変異の効果を判定する方法を開示する。また、米国特許出願公開第２００９／０３１１６９５号は、ＲＮＡ転写産物の完全性を調節する及び／又はＲＮＡ代謝の調節に関与する作用剤を同定するハイスループットアッセイを開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在の可能性のある治療が、主に、毒性及び全長タンパク質の合成レベルが比較的低い等の不利益に悩まされていることから、遺伝性疾患、とりわけ、ナンセンス変異又は中途停止コドンによって引き起こされる遺伝性疾患の治療に有用な治療剤がいまだ必要とされている。これまで、臨床研究において提案されたリードスルー治療が有効とされたことはなかった。さらに、ナンセンス変異によって引き起こされる遺伝性疾患に対する治療剤として使用され得る、効率的であるが、単純な、ナンセンス変異のリードスルー剤を同定する組成物及び方法が更に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
概要
本開示の一様態では、治療を必要とする患者の中途停止コドン又はナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００１３】
本開示の別の一様態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物であって、上記組成物を非全身的に投与するための、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００１４】
本開示の更に別の一様態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物であって、上記組成物を非全身的に投与し、上記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００１５】
幾つかの実施の形態では、本開示による少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である。
【００１６】
別の実施の形態では、本開示による組成物を治療的に有効な用量でＣＮＳに直接投与する。
【００１７】
本発明の更に別の一様態では、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復することよる、少なくとも１つのナンセンス変異に起因する非機能性形態の上記細胞内又は亜細胞タンパク質産生と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１種の症状又は状態の治療に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００１８】
幾つかの実施の形態では、本開示による組成物は、上記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して少なくとも７％の機能性タンパク質の産生であるものである。
【００１９】
別の実施の形態では、本開示による組成物は、上記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して約７％〜約２５％の機能性タンパク質の産生であるものである。
【００２０】
更なる実施の形態では、本開示による少なくとも１種のマクロライドが、エリスロマイシン、アジスロマイシン及びクラリスロマイシン、又はそれらの少なくとも２種の任意の組合せからなる群から選択される。
【００２１】
更なる実施の形態では、本開示による組成物を、髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与する。
【００２２】
幾つかの実施の形態では、本開示による組成物を髄腔内投与する。
【００２３】
別の実施の形態では、本開示による遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患が、脊髄性筋委縮症、毛細血管拡張性運動失調症、レット症候群、アッシャー症候群、ペルオキシソーム生合成障害、活性化タンパク質欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−小児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病、脊髄小脳失調症、シャルルボア−サグネ型常染色体劣性痙性運動失調症、周期性失調症（Ｅａｓ）、常染色体劣性小脳失調症（ＡＲＣＡ）、パーキンソン病、タウオパチー、早老症候群、ウェルナー症候群、多発ニューロパチー−難聴−運動失調−網膜色素変性−白内障（ＰＨＡＲＣ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、プリオン病、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ニューロセルピン封入体を伴う家族性脳症、ダリエー病、ラミノパチー、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、１Ｂ型肢帯筋ジストロフィー、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー、バラッケ−シモンズ症候群、ブシュケ−オレンドルフ症候群、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー（ＦＰＬＤ）、成人発症型常染色体優性脱髄性白質ジストロフィー（Leukodystrophy, demyelinating, adult-onset, autosomal dominant）（ＡＤＬＤ）、ペリツェウス−メルツバッヘル病、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００２４】
本開示の更に別の一様態では、治療を必要とする患者の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００２５】
幾つかの実施の形態では、本開示による少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が全長ＳＭＮ２の産生を増加する。
【００２６】
幾つかの実施の形態では、本開示による組成物を非全身的に投与する。
【００２７】
別の実施の形態では、本開示による少なくとも１種のマクロライド系抗生物質がＳＭＮ２遺伝子に存在する中途停止コドンのリードスルーを誘導する。
【００２８】
更なる実施の形態では、本開示による少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記ＳＭＮ２遺伝子に存在する停止コドンを含むＳＭＮ２遺伝子のフラグメントに対応する少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記停止コドンのリードスルーを誘導する指標である。
【００２９】
更なる実施の形態では、本開示による組成物をＣＮＳに直接投与する。
【００３０】
本開示の別の一様態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、上記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含む、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法が提供される。
【００３１】
本開示の更に別の一様態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、上記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含み、上記組成物を非全身的に投与する、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法が提供される。
【００３２】
本開示は、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、上記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含み、上記組成物を非全身的に投与し、上記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法を提供する。
【００３３】
本開示の別の一様態では、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復する方法であって、上記方法が少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含み、それにより少なくとも１つのナンセンス変異に起因する非機能性形態の上記細胞内又は亜細胞タンパク質の産生と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１つの症状又は状態を治療する、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復する方法が提供される。
【００３４】
幾つかの実施の形態では、本開示による方法は、上記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して少なくとも７％の機能性タンパク質の産生であるものである。
【００３５】
別の実施の形態では、本開示による方法は、上記細胞内機能性タンパク質産生の少なくとも部分的な回復が、産生される総タンパク質に対して約７％〜約２５％の機能性タンパク質の産生であるものである。
【００３６】
本開示の別の一様態では、治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法であって、上記方法が、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含む、脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法が提供される。
【００３７】
本開示の更に別の一様態では、核酸コンストラクトであって、
ａ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、
ｂ．青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする第２の核酸配列と、
ｃ．ナンセンス変異を含む、上記第１の核酸配列と上記第２の核酸配列との間に挿入された少なくとも４５ヌクレオチドの第３の核酸配列と、
を含み、上記第１の核酸配列、第２の核酸配列及び第３の核酸配列が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトが提供される。
【００３８】
幾つかの実施の形態では、本開示による核酸コンストラクトは、ＧＦＰがＢＦＰの上流にあるものである。
【００３９】
別の実施の形態では、本開示による核酸コンストラクトは、上記第１の核酸配列、第２の核酸配列及び第３の核酸配列の間に挿入された１又は複数のリンカー核酸配列を更に含む。
【００４０】
本開示は、本明細書に定義される核酸コンストラクトを含むベクターを更に提供する。
【００４１】
本開示の別の一態様では、本明細書に定義される核酸コンストラクトを含む宿主細胞が提供される。
【００４２】
本開示の更に別の一態様では、本明細書に定義されるベクターを用いてトランスフェクトした宿主細胞が提供される。
【００４３】
別の実施の形態では、本開示による細胞は真核生物細胞である。
【００４４】
別の実施の形態では、本開示による細胞は哺乳動物細胞である。
【００４５】
本開示は更に、ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法であって、上記方法が、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含み、
ｃ．上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライドと接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライドと接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞集団における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライドがナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である、
ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法を提供する。
【００４６】
幾つかの実施の形態では、本開示によれば、上記上流蛍光タンパク質がＧＦＰであり、上記下流蛍光タンパク質がＢＦＰである。
【００４７】
別の実施の形態では、ナンセンス変異を含む上記挿入された核酸配列が少なくとも４５ヌクレオチドである。
【００４８】
更なる実施の形態では、上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を、上記上流蛍光タンパク質及び下流蛍光タンパク質の両方を発現する細胞においてのみ計測する。
【００４９】
更なる実施の形態では、本開示によるナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上流蛍光タンパク質及び下流蛍光タンパク質の両方を発現する細胞を検出又はソーティングすることを含む。
【００５０】
幾つかの実施の形態では、本開示によるナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライドと接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライドと接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの約７％〜２５％の増加が、上記候補マクロライドが臨床適用に適したリードスルー剤であることの指標であるものである。
【００５１】
別の実施の形態では、本開示によるナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光の計測を、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）により行うものである。
【００５２】
更なる実施の形態では、本開示によるナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記コンストラクトを含有し、候補マクロライドと接触させた細胞と、ナンセンス変異を含まない対照コンストラクトを含有する細胞との間で上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルを比較することを更に含む。
【００５３】
幾つかの実施の形態では、本開示によるマクロライドがマクロライド系抗生物質である。
【００５４】
本開示の更に別の一様態では、ナンセンス変異に起因する又はそれと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、
（ｉ）治療を必要とする被験体を治療するためのナンセンス変異リードスルーマクロライドを、
ａ．上記被験体から得られた生体試料において、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する遺伝子中の少なくとも１つのナンセンス変異を同定することと、
ｂ．ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される２つの異なる蛍光タンパク質をコードする２つの核酸配列と隣接する、上記（ａ）の同定した変異に対応する少なくとも４５ヌクレオチドのフラグメントとその周囲のヌクレオチドとを含み、上記フラグメント及び上記２つの異なる蛍光タンパク質をコードする核酸配列が単一のＯＲＦにおいてインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを準備することと、
ｃ．（ｂ）のコンストラクトを宿主細胞に導入することと、
ｄ．（ｂ）のコンストラクトを含有する宿主細胞と候補リードスルーマクロライドとを接触させることと、
ｅ.両方の蛍光タンパク質を含有するリードスルーポリペプチドの存在を検出することと、
を含み、
ｆ．両方の蛍光タンパク質を含有するリードスルーポリペプチドの存在が、上記候補リードスルーマクロライドがナンセンス変異リードスルーマクロライドであることの指標である、
方法により選択することと、
（ｉｉ）上記ナンセンス変異リードスルーマクロライドを上記被験体に投与することと、
を含む、ナンセンス変異に起因する又はそれと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法が提供される。
【００５５】
本開示は更に、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための、少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤と組み合せた、少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００５６】
本明細書に開示される主題のよりよい理解のため、またどのように実施され得るのかを例示するため、ここで、添付の図面を参照しながら、単なる非限定的な一例として実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＧＦＰ−ＢＦＰプラスミドコンストラクト。
【図１Ａ】「ＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰ」コンストラクトと名付けられたスクリーニングプラスミドの略図である。
【図１Ｂ】左パネルにおいて青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の蛍光発光又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光発光のいずれか又はＢＦＰタンパク質とＧＦＰタンパク質との両方を発現する融合タンパク質に由来する青色と緑色との蛍光発光のマージ（右パネル）を示すＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰコンストラクトの免疫蛍光写真を提示する。
【図１Ｃ】スクリーニングプラスミドの略図、並びにＧＦＰ及びＢＦＰの発光に従ってＦＡＣＳ分析により得られた対応する細胞の分布図を提示する。
【図１Ｃ−１】ＧＦＰとＢＦＰとの両方を発現する「ＷＴ」ＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドコンストラクトである。
【図１Ｃ−２】ナンセンス変異を含み、ＧＦＰのみを発現するＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドコンストラクトである。
【図１Ｃ−３】エリスロマイシンの存在下でリードスルーされるナンセンス変異を含むＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドコンストラクトである。
【図１Ｄ】平均値のシフトがリードスルーの程度を表す、種々の濃度のマクロライド系抗生物質処理の存在下で得られたＦＡＣＳデータを重ね合わせた図を提示する。略語：ＷＴ、野生型；ｍｕｔ、変異；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＢＦＰ、青色蛍光タンパク質；Ｅｒｙ、エリスロマイシン。
【図２】ＡＴＭ変異のリードスルーに対する種々のエリスロマイシン用量の効果。ＡＴＭナンセンス変異（すなわち、ＴＧＡ停止コドン）を含むＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドでトランスフェクトし、０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ又は７００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの存在下で２４時間、３６時間又は４８時間インキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞について得られた正規化蛍光発光示度（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。
【図３】ＡＴＭタンパク質回復。
【図３Ａ】指定の抗生物質（３００μｇ／ｍｌ）の存在下で７日間インキュベートした、ヘテロ接合性のナンセンス変異Ｃ５５１５→Ｔを保有する毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）患者より得られたＢリンパ球の、ＷＴ  Ｂリンパ球と比較したウェスタンブロット分析である。細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的抗ＡＴＭ抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。
【図３Ｂ】指定の抗生物質（１００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ）の存在下で７日間インキュベートした、ヘテロ接合性のナンセンス変異Ｃ５５１５→Ｔを保有する毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）患者より得られたＢリンパ球のウェスタンブロット分析である。細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的抗ＡＴＭ抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。
【図３Ｃ】ＴＩＮＡソフトウェアにより分析した図３Ｂに示されるバンド強度を表す棒グラフである。
【図３Ｄ】指定の抗生物質で７日間に亘り処理したホモ接合性のＡ−Ｔ変異体Ｃ１０３→Ｔ細胞及びＷＴ細胞のウェスタンブロット分析である。その後、細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的抗ＡＴＭ抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。略語：０、処理なし；Ｅ、エリスロマイシン；ＡＺ、アジスロマイシン；Ｇ、硫酸ゲンタマイシン；ＷＴ、野生型。
【図４Ａ】ナンセンス変異のリードスルーに対する種々のエリスロマイシン用量の効果。対応するナンセンス変異を含むＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドでトランスフェクトし、指定のエリスロマイシン濃度の存在下で２４時間に亘るＨＥＫ２９３Ｔ細胞のインキュベーションによる、アッシャー症候群（「Ｕｓｈ」／「Ｕ」）、レット症候群（「ＲＴ」／「Ｒ」）及び毛細血管拡張性運動失調症（「ＡＴＭ」／「Ａ」）と関連する遺伝子の核酸フラグメント中のナンセンス変異のリードスルーに対する０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ又は７００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの効果を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】ナンセンス変異のリードスルーに対する種々のエリスロマイシン用量の効果。対応するナンセンス変異を含むＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドでトランスフェクトし、指定のエリスロマイシン濃度の存在下で４８時間に亘るＨＥＫ２９３Ｔ細胞のインキュベーションによる、アッシャー症候群（「Ｕｓｈ」／「Ｕ」）、レット症候群（「ＲＴ」／「Ｒ」）及び毛細血管拡張性運動失調症（「ＡＴＭ」／「Ａ」）と関連する遺伝子の核酸フラグメント中のナンセンス変異のリードスルーに対する０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ又は７００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの効果を示す棒グラフである。
【図５】全長タンパク質の発現。毛細血管拡張性運動失調症（「ＡＴＭ  ｍｕｔ．」）及びアッシャー症候群（「Ｕｓｈｅｒ  ｍｕｔ．」）と関連するナンセンス変異のリードスルーに対する、０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ又は７００μｇ／ｍｌにおけるエリスロマイシンの効果のウェスタンブロット分析である。
【図６】ＲＴＴ−Ｒ２９４Ｘ患者の線維芽細胞のウェスタンブロット分析。上部パネルは、抗ＭｅＣＰ２抗体を使用する、ゲンタマイシン（３００μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アジスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ）の存在下、又はそれらの不在下（−）で７日間インキュベートしたＲＴＴ−Ｒ２９４Ｘ患者の線維芽細胞のウェスタンブロット分析を示す。比較のためＷＴ線維芽細胞におけるＭｅＣＰ２の発現レベルを提示する（ＷＴ、左レーン）。下部パネルは、ＴＩＮＡソフトウェアにより分析した上記ブロット分析のバンド強度を表す棒グラフである。
【図７】ＭｅＣｐ２の核局在。
【図７Ａ】ＭｅＣＰ２（上部パネル）又はｄａｐｉ（下部パネル）を対象とする抗体による野生型（ＷＴ）線維芽細胞の染色を示す。
【図７Ｂ】指定されるように、ゲンタマイシン（３００μｇ／ｍｌ）若しくはエリスロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下、又はそれらの不在下（「薬剤なし」、左パネル）で７日間インキュベートした線維芽細胞のＭｅＣｐ２（上部パネル）又はｄａｐｉ（下部パネル）の染色である。矢印は、核に対するＭｅＣｐ２タンパク質の局在を示す。
【図７Ｃ】指定されるように、アジスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ）の存在下で７日間インキュベートした線維芽細胞のＭｅＣｐ２（上部パネル）又はｄａｐｉ（下部パネル）の染色である。矢印は、核に対するＭｅＣｐ２タンパク質の局在を示す。
【図７Ｄ】図７Ｂ及び図７Ｃに提示される各細胞の４０細胞〜５０細胞における核染色の割合を表す棒グラフである。略語：ＷＴ、野生型；ＲＴＴ、レット症候群；ｃｏｎｃ、濃度。
【図８】マクロライドを使用するＳＭＮ２発現の回復。
【図８Ａ】（上部パネル）は、指定されるようにゲンタマイシン（３００μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アジスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ）の存在下、又はそれらの不在下（−）で７日間に亘ってインキュベートしたＳＭＡ患者の線維芽細胞（ＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／−）の抗ＳＭＮ抗体を使用するウェスタンブロット分析である。下部パネルは、上部パネルに示される結果の定量化を示す棒グラフである。
【図８Ｂ】（上部パネル）は、指定されるようにゲンタマイシン（３００ｖｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アジスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ）の存在下、又はそれらの不在下（−）で７日間に亘ってインキュベートしたＳＭＡ患者の線維芽細胞（ＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋）の抗ＳＭＮ抗体を使用するウェスタンブロット分析である。下部パネルは、上部パネルに示される結果の定量化を示す棒グラフである。
【図８Ｃ】どの処理も行わない患者の線維芽細胞ＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／−又はＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋のＳＭＡの抗ＳＭＮ抗体を使用するウェスタンブロットである。
【図８Ｄ】ゲンタマイシン若しくはエリスロマイシン（各々５００μｇ／ｍｌ）の存在下、又は対照アッセイとしてそれらの不在下で７日間に亘ってインキュベートした、患者の線維芽細胞ＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／−又はＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋のＳＭＡの関連のないタンパク質を対象とする抗体を使用するウェスタンブロット分析である。
【図８Ｅ】アラマーブルーアッセイを使用するＳＭＡ線維芽細胞（ＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋）の（指定される）薬剤処理後の細胞生存を示すグラフである。略語：ＳＭＮ１、生存運動ニューロン１；ＳＭＮ２、生存運動ニューロン２；ｃｏｎｃ、濃度。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本開示は、中途終止コドンの形成、及びその結果として切断された非機能性タンパク質を導くナンセンス変異に起因する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療するのに有用な組成物及び方法を提供する。
【００５９】
本開示の組成物及び方法は、本明細書において下記に例示される遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する変異型核酸配列のリードスルーの誘導に驚くべきことに成功することが見出されたマクロライド系抗生物質ファミリーの分子を利用する。
【００６０】
有利には、低いレベルのリードスルーであっても、すなわち、全長機能性タンパク質の低レベルの翻訳が、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を患う患者に対して臨床的意義を持つことが期待される。換言すれば、リードスルー翻訳による全長機能性タンパク質の産生の回復がそれほど多くなくても生理学的に適切な場合があり、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する症状又は状態を大きく改善する可能性がある。
【００６１】
本開示は、非常に有効な組成物、及びナンセンス変異リードスルーを誘導することができる作用剤、例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質を同定する感度の高い方法を更に提供する。本明細書に開示される方法により同定されるリードスルー剤を、本明細書において下記に記載される疾患等のナンセンス変異に起因する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の治療に利用してもよい。
【００６２】
よって、その１つの態様では、本開示は、治療を必要とする患者におけるナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を提供する。
【００６３】
本明細書で定義される「ナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患」の用語は、或る特定の遺伝子におけるナンセンス変異、すなわち、特定の遺伝子の核酸配列中に中途停止コドン（中途終止コドンとも呼ばれる）を導入する変異に起因するか、又はそれと関連する任意の遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を包含する。
【００６４】
多くの遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患が、少なくとも部分的には、切断された（すなわち、不完全な）通常、非機能性のタンパク質産物の生産をもたらす、特定のタンパク質をコードする遺伝子の特定の位置におけるナンセンス変異又は中途停止コドンと関連することが知られている。本明細書で使用される「中途終止コドンに起因する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患」又は「ナンセンス変異に起因する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患」は、同じ意味で使用され、切断されたタンパク質の形成をもたらすナンセンス変異が疾患を引き起こす１つの基礎的要因として同定されている疾患を指す。「起因する」の用語は、ナンセンス変異が疾患を引き起こす唯一の要因であることを示すものではないことが理解される。
【００６５】
本明細書で定義される「ナンセンス変異」の用語は、中途停止コドン又は転写されたｍＲＮＡ中のナンセンスコドンをもたらし、結果的に切断された、すなわち不完全な、通常非機能性のタンパク質産物を生じる核酸配列中の変異である。換言すれば、「ナンセンス変異」は、アミノ酸に対応するコドンを停止コドンに変更する変異である。
【００６６】
「停止コドン」（終止コドンとも呼ばれる）の用語は、成長するポリペプチド鎖へのアミノ酸残基の付加に対応するメッセンジャーＲＮＡ中のほとんどのコドンとは対照的に、翻訳の終了を知らせるメッセンジャーＲＮＡ内のヌクレオチドトリプレットである。
【００６７】
よって、当該技術分野で既知の「中途終止コドン」又は「中途停止コドン」の用語は、アミノ酸残基に対応するコドンではなく、停止コドンの発生を指す。中途停止コドンは、特定の遺伝子のコーディング核酸配列の末端に通常位置する正常な停止コドンに対して上流のどこかに位置し得る。
【００６８】
中途終止コドンは、ＴＡＧ（ＵＡＧと転写される）、ＴＡＡ（ＵＡＡと転写される）及びＴＧＡ（ＵＧＡと転写される）を含む既知の停止コドンのいずれか１つであってもよい。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００６９】
幾つかの実施形態では、中途終止コドンはＴＧＡ（ＵＧＡと転写される）である。
【００７０】
下記に示されるように、タンパク質の有効なリードスルーは、例えば、１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのアジスロマイシンの存在下でインキュベートされたＲ２９４Ｘ線維芽細胞について図６で実証されるように、１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の用量のマクロライド系抗生物質で処理された細胞について得られた。
【００７１】
脳組織、ＣＳＦ及び眼房水におけるマクロライドであるアジスロマイシンの濃度を計測することにより、Jaruratanasirikul et al.（２１）は、５００ｍｇの経口投与の後、感染していないヒトのアジスロマイシンの濃度は、血清中で０．００８μｇ／ｍｌ〜０．０３１μｇ／ｍｌの範囲であり、ＣＳＦ中で０．０１５μｇ／ｍｌまで検出されなかったことを報告した。ナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の有効な治療のためには、ＣＳＦ中に約１０μｇ／ｍｌの濃度のマクロライドを目指す必要がある。ｉ．ｖ．又は経口の投与経路では、現在承認されている用量である１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．（例えば、アジスロマイシン）よりも６６６倍高い用量を必要とすることから、これらの濃度を達成することはできない。アジスロマイシンが、抗生剤として承認される最も高用量の１０ｍｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ．）投与された場合、その体内での分布により、ＣＳＦ中のアジスロマイシンの有効濃度は、約０．３μｇ／ｍｌにしかならず、明らかに上述の有効なリードスルーの範囲の外である。したがって、ＣＳＦにおいて治療的に有効な用量を達成するための唯一の安全かつ非毒性の投与経路は、マクロライド系抗生物質の非全身的投与、例えば、限定されないが、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注入であろう。
【００７２】
さらに、一般的に、抗生物質、とりわけマクロライド系抗生物質の全身投与は、様々な副作用、例えば、幾つか挙げると、消化に有益な体内細菌叢の破壊及び変異型細菌株の形成を有する。
【００７３】
よって、本開示の別の１つの態様により、治療を必要とする患者におけるナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、上記組成物は非全身的に投与される。
【００７４】
本明細書で定義される「非全身的に」の用語は、局所投与経路、すなわち、消化管によらず、また経静脈でもない（not parenterally）投与経路を指す。
【００７５】
投与は、必要とする患者に対する長期の反復投与であってもよい。本明細書で使用される「長期の反復投与」は、患者に対して定期的に分量のマクロライド抗生物質剤を与えることを意味する。定期的とは、例えば、１日１回、２日に１回、１週間に２回、１週間に１回、連続して２週間に１回、１ヶ月に１回又は連続して２ヶ月に１回とすることができる。投与及び用量は、主治医の良好な診療行為により決定され、患者の年齢、性別、体重及び全身状態による場合がある。
【００７６】
本開示は、例えば、マクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンが毛細血管拡張性運動失調症変異型（ＡＴＭ）タンパク質をコードする遺伝子中に見出される中途停止コドンのリードスルーを誘導することができた、上記疾患である毛細血管拡張性運動失調症についての下記実施例２及び実施例３で示されるように、マクロライド系抗生物質が遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する様々な遺伝子中のナンセンス変異のリードスルーを誘導することができるという驚くべき知見に基づく。
【００７７】
本明細書で使用される「リードスルー」の用語は、翻訳の過程を指す場合、「センス」コドン（すなわち、アミノ酸をコードするコドン）として停止コドン（「ナンセンス」コドン）を読むこと、又は上記停止コドンを回避することによって、全長タンパク質の合成を少なくとも部分的に回復することを意味する。
【００７８】
したがって、リードスルーを誘導することができる作用剤を同定することが重要である。
【００７９】
したがって、本開示の更に別の態様では、治療を必要とする患者におけるナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、上記組成物は、非全身的に投与され、上記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質は上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する。
【００８０】
本明細書で使用される「上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する」の用語は、ナンセンス変異（本明細書では中途停止コドンとも呼ばれる）を含む核酸配列によってコードされる全長タンパク質の翻訳の少なくとも部分的な増加、産生、増大又は上昇を指す。該全長タンパク質の翻訳の増加は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は約１００％であり得る。
【００８１】
下記に例示されるように、本開示は、核酸コンストラクトの使用、及び上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライド又はマクロライド系抗生物質等の作用剤の同定及び選択を可能とするスクリーニング方法に基づく。
【００８２】
本明細書に開示される核酸コンストラクトは、ナンセンス変異を含有するオリゴヌクレオチドにより分離される、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする核酸配列を含む。ナンセンス変異を含有するオリゴヌクレオチドは、或る特定の遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の根底にあることが知られている遺伝子の変異型フラグメントに対応する。本開示による核酸コンストラクトは、例えば、図１Ａにおいて概略図的に提示され、図中、ナンセンス変異を含有するオリゴヌクレオチドは、点線で提示される。
【００８３】
本明細書で使用される「対応する」の用語は、ナンセンス変異を含有するオリゴヌクレオチドの配列が、上記遺伝子中のナンセンス変異のため欠損していることが知られているタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントに対して相同であり、或る特定の遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の根底にあり、上記フラグメントがナンセンス変異含む、すなわち、中途停止コドンを含む遺伝子の領域に及ぶことを意味する。
【００８４】
ナンセンス変異を含む核酸配列の下流に位置する蛍光タンパク質をコードする領域の翻訳は、リードスルー剤によって、例えば、本明細書において下記に示されるようなマクロライド系抗生物質の存在下でのみ誘導され得る。
【００８５】
添付の図４Ａ及び図４Ｂで例示されるように、ナンセンス変異を含む核酸配列の下流に位置する蛍光タンパク質であるＢＦＰの蛍光強度は、エリスロマイシンの存在下で増加し、例えば、アッシャー症候群及びレット症候群と関連する遺伝子について実施例５で実証されるように、核酸配列の変化可能な構成においてＧＦＰ及びＢＦＰを含む完全な融合タンパク質のリードスルーを促進するエリスロマイシンの能力を実証する。
【００８６】
作用剤、例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質化合物のリードスルーを誘導する能力を、本明細書に記載され、本明細書の下記の実施例欄で例示されるアッセイを使用して試験することができる。
【００８７】
したがって、本件で開示される主題の一実施形態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物を非全身的に投与し、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が該ナンセンス変異のリードスルーを誘導し、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である。
【００８８】
そのように同定されたリードスルー剤は、上記組成物の有効成分を構成する。
【００８９】
上に示した通り、ＣＳＦにおいて治療的に有効な用量を達成するための安全で非毒性の唯一の投与経路は、マクロライド系抗生物質の非全身投与、例えば、限定されないが、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注入であろう。
【００９０】
したがって、本件で開示される主題の幾つかの実施形態では、本明細書に定義される組成物は、治療的に有効な用量でＣＮＳに直接投与される。
【００９１】
換言すれば、本件で開示される主題の１つの実施形態では、治療を必要とする患者におけるナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物は治療的に有効な用量でＣＮＳに直接投与され、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が該ナンセンス変異のリードスルーを誘導し、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である。
【００９２】
上に示した通り、全長機能性タンパク質の翻訳レベルが低くても、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を患う患者に対して臨床的意義を持つと期待される。
【００９３】
したがって、本開示の別の１つの態様では、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復することにより、少なくとも１つのナンセンス変異に起因する非機能性形態の上記細胞内又は亜細胞タンパク質の産生と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１つの症状又は状態の治療に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【００９４】
「産生を少なくとも部分的に回復する」又は「少なくとも部分的に産生を回復する」の用語は、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生（翻訳）、すなわち、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する全長タンパク質の翻訳の少なくとも部分的な増加、増大又は上昇を意味する。該細胞内機能性タンパク質の産生の増加、増大又は上昇は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は約１００％であり得る。
【００９５】
「細胞内又は亜細胞機能性タンパク質」の用語は、正しい生体機能を有し、細胞の内部又はそのコンパートメントにおいて産生される、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する全長タンパク質を意味する。
【００９６】
「遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１つの症状又は状態」の用語は、歩行、動作及び筋肉協調（coordination）の障害、筋力低下、知覚障害、認知及び知力の障害を意味する。
【００９７】
よって、本件で開示される主題の１つの実施形態では、細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の産生を少なくとも部分的に回復することにより、少なくとも１つのナンセンス変異に起因する非機能性形態の上記細胞内又は亜細胞タンパク質の産生と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の少なくとも１つの症状又は状態の治療に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、上記組成物は、治療的に有効な用量でＣＮＳに直接投与される。
【００９８】
本件で開示される主題の幾つかの実施形態では、上記細胞内機能性タンパク質産生の上記少なくとも部分的な回復は、産生される総タンパク質に対して少なくとも７％の機能性タンパク質の産生である。
【００９９】
本件で開示される主題の他の実施形態では、上記細胞内機能性タンパク質産生の上記少なくとも部分的な回復は、産生される総タンパク質に対して約７％〜約２５％の機能性タンパク質の産生である。
【０１００】
換言すれば、本件で開示されるマクロライド系抗生物質を含む組成物は、少なくとも部分的な、すなわち、全長の細胞内又は亜細胞機能性タンパク質の翻訳の約７％〜約２５％の範囲の回復に有効な可能性がある。
【０１０１】
本明細書で定義される「マクロライド」の用語は、その活性が、マクロライド環、すなわち、１又は複数のデオキシ糖、通常、クラジノース及びデソサミンが付着し得る大きな大環状ラクトン環の存在に由来する一群の薬剤（典型的には抗生物質）を指す。ラクトン環は、通常、１４員環、１５員環又は１６員環である。マクロライドは、ポリケチドクラスの天然産物に属する。また、本明細書で使用されるマクロライドの用語は、その塩、誘導体及び類縁体を包含する。
【０１０２】
本開示によるマクロライドとしては、アザライド、アジスロマイシン、ボロマイシン、ブレフェルジン、カンジシジン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、フィリピン、フロプリスチン、フルリスロマイシン、ジョサマイシン、キタサマイシン、マクロシン、メパルトリシン、ミデカマイシン、ミオカマイシン、ナルゲニシン、オレアンドマイシン、オリゴマイシン、ペンタマイシン、ピクロマイシン、プリスチナマイシンｉｉａ、プリスチナマイシンｉｉｂ、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、ストレプトグラミンａ、ストレプトバリシン、チルミコシン、トロレアンドマイシン、ツラスロマイシン、タイロシン及びバージニアマイシンが挙げられる。
【０１０３】
本明細で使用される「誘導体」の用語は、マクロライド化合物を指す場合、誘導体が本明細書に定義されるような親化合物と同じ又は類似する生物学的特性／活性を有するように、親化合物と１又は複数の元素、置換基及び／又は官能基が異なる、親化合物に由来する化学的に修飾された化合物を指す。
【０１０４】
下記に例示されるように、本発明者らは、マクロライドであるエリスロマイシン及びアジスロマイシンが全長タンパク質の翻訳の回復に有効である、すなわち、リードスルー剤として有効であることを示した。
【０１０５】
よって、本明細書に定義される「マクロライド系抗生物質」の用語は、抗生物質活性を有するマクロライド、例えば、限定されないが、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンＡ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン／酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、及びタイロシン／タイロシン（Tylosin/tylocine）を指す。
【０１０６】
よって、本件で開示される主題の幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、又はそれらの少なくとも２種の任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１種のマクロライドを含む。
【０１０７】
本発明の実施形態により利用されるマクロライド化合物又はその塩は、市販されており、当該技術分野で既知の方法を使用して合成することもできる。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、マクロライドはエリスロマイシンである。エリスロマイシンは、ＣＡＳ登録番号１１４−０７−８により特定され得る。エリスロマイシンの塩及び誘導体の例として、限定されないが、エリスロマイシンラクトビオネート、エリスロマイシンエチルスクシネート、エリスロマイシンステアレート、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンエストレート（estorate）、エリスロマイシンアシストレート（acistrate）、エリスロマイシングルセプテート、エリスロマイシンプロピオネート、エリスロマイシンサルナセジン、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ジリスロマイシン、フルリスロマイシン、また同じく、米国特許第６７７７５４３号、同第６８２５１７１号及び同第５，６０２，１０６号、並びに国際公開第２００２／０５００９３号に示されるような誘導体が挙げられる。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、マクロライドはアジスロマイシンである。アジスロマイシンは、ＣＡ登録番号８３９０５−０１−５により特定され得る。その構造及び抗生物質活性は、例えば、米国特許第４，４７４，７６８号及び同第４，５１７，３５９号に開示されている。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、マクロライドはクラリスロマイシンである。クラリスロマイシンは、ＣＡＳ登録番号８１１０３−１１−９により特定され得る。その構造及び抗生物質活性は、例えば、米国特許第４３３１８０３号に開示されている。
【０１１１】
上に示した通り、本開示による組成物をＣＮＳに直接投与してもよい。
【０１１２】
本明細書で定義される「中枢神経系」（ＣＮＳ）の用語は、脊椎動物では脳及び脊髄で構成され、それに向かって知覚インパルスが伝達され、それから運動インパルスが出て、神経系全体の活動を連係させる神経系の一部として定義される。
【０１１３】
ＣＮＳへの直接投与の例として、髄腔内投与（脳脊髄液に到達するように脊髄のクモ膜下腔への治療物質の導入）、及び脳内、脳室内、頭蓋内の投与経路等の脳への直接投与が挙げられる。かかる投与経路は、中枢神経系に影響を及ぼす疾患に特に有利な場合がある。
【０１１４】
そのため、上記及び他の実施形態では、本開示による組成物を、髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与する。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、本開示による組成物を髄腔内投与する。
【０１１６】
換言すれば、本件で開示される主題の一実施形態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物を治療的に有効な用量で髄腔内投与し、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が該ナンセンス変異のリードスルーを誘導し、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である。
【０１１７】
下記実施例で例示されるように、本発明者らは、レット症候群と関連する全長タンパク質ＭｅＣＰ２の翻訳、及び毛細血管拡張性運動失調症と関連する全長タンパク質ＡＴＭの翻訳が、エリスロマイシン又はアジスロマイシンの存在下でのこれらのタンパク質をコードする遺伝子中の停止コドンを持つ細胞のインキュベーションにより得られることを示した（それぞれ、例えば図６及び図３を参照されたい）。
【０１１８】
このように、本件で開示された主題の全ての実施形態及び態様では、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患は、脊髄性筋萎縮症、毛細血管拡張性運動失調症、レット症候群、アッシャー症候群、ペルオキシソーム生合成障害、ハーラー症候群、リソソーム蓄積症、活性化タンパク質欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−小児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病、脊髄小脳失調症、シャルルボア−サグネ型常染色体劣性痙性運動失調症、周期性失調症（Ｅａｓ）、常染色体劣性小脳失調症（ＡＲＣＡ）、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン病、タウオパチー、早老症候群、ウェルナー症候群、多発ニューロパチー−難聴−運動失調−網膜色素変性−白内障（ＰＨＡＲＣ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、プリオン病、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、ニューロセルピン封入体を伴う家族性脳症、ダリエー病、ラミノパチー、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、１Ｂ型肢帯筋ジストロフィー、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー、バラッケ−シモンズ症候群、ブシュケ−オレンドルフ症候群、ダニガン型家族性部分的リポジストロフィー（ＦＰＬＤ）、成人発症型常染色体優性脱髄性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、ペリツェウス−メルツバッヘル病、並びにそれらの任意の組合せであることができる。
【０１１９】
本件で開示される主題の幾つかの実施形態及び態様では、上記遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患は、レット症候群である。
【０１２０】
本明細書で定義される「レット症候群」又は「ＲＴＴ」（本来は、脳委縮性高アンモニア血症（cerebroatrophic hyperammonemia）と呼ばれる）の用語は、ほぼ女性のみに影響を及ぼす脳の灰白質の神経発生障害を指す（レット症候群は、１２歳までの出生女児の１２５００人に１人が罹患する）。臨床的特徴として、小さい手足、及び頭部成長速度が遅いこと（一部では小頭症を含む）が挙げられる。レット症候群の人は、消化器障害を生じやすく、典型的には、言語能力を欠き、約５０％の罹患個体が歩行できない。脊柱彎曲、成長阻害及び便秘が非常によく見られ、問題となる場合がある。
【０１２１】
遺伝的には、レット症候群は、Ｘ染色体上に位置する遺伝子ＭＥＣＰ２中の変異により引き起こされ、散発的に発症するか、又は生殖細胞の変異により発症し得る。レット症候群は、最初に臨床観察により診断されたが、ＭＥＣＰ２遺伝子中に遺伝子欠損がある場合に確定診断となる。約９５％のレット症候群の症例においては、その子供における新たな変異が原因である。
【０１２２】
ミスセンス、ナンセンス（翻訳したタンパク質の中途終止が起こる）、フレームシフト及び欠失を含む、影響を受けた遺伝子メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の少なくとも２００の異なる変異がレット症候群と関連することがわかっている。
【０１２３】
したがって、本件で開示される主題の一実施形態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連するレット症候群を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物は、治療的に有効な用量で髄腔内投与され、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質は該ナンセンス変異のリードスルーを誘導し、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入されたレット症候群と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である。
【０１２４】
本件で開示される主題の他の実施形態及び態様では、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患は、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ−Ｔ）である。
【０１２５】
本明細書で定義される「毛細血管拡張性運動失調症」（Ａ−Ｔ）（ルイ−バー症候群とも呼ばれる）の用語は、重度の身体障害を引き起こす、稀な神経変性の遺伝性疾患である。運動失調は、乏しい筋肉協調及び小さい拡張した血管に対する毛細血管拡張を指し、いずれも上記疾患の特徴である。Ａ−Ｔは、小脳を含む脳の或る特定の領域を損傷し、動作及び筋肉協調を困難にし、免疫系を虚弱にして感染症にかかりやすい体質を生じ、破壊されたＤＮＡの修復を妨げて癌のリスクを増加する。Ａ−Ｔは、毛細血管拡張性運動失調症変異型（ＡＴＭ）遺伝子中の欠陥により引き起こされ、その欠陥は、とりわけ中途終止コドンの可能性がある。ＡＴＭは、ＤＮＡ二本鎖の切断により動員され活性化されるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。
【０１２６】
したがって、本件で開示される主題の別の実施形態では、治療を必要とする患者のナンセンス変異と関連する毛細血管拡張性運動失調症を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物は、治療的に有効な用量で髄腔内投与され、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質は該ナンセンス変異のリードスルーを誘導し、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された毛細血管拡張性運動失調症と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記ナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である。
【０１２７】
下記に例示されるように、図４Ａ及び図４Ｂ（実施例５）に実証されるように、例えば、アッシャー症候群等のオーファン疾患と関連する遺伝子中の２つの更なるナンセンス変異のリードスルーについて、種々の用量のエリスロマイシンの効果を試験した。
【０１２８】
本件で開示される主題の他の実施形態では、治療を必要とする患者においてアッシャー症候群を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、上記組成物は治療的に有効な用量で髄腔内投与される。
【０１２９】
本明細書で定義される「アッシャー症候群」の用語は、難聴又は失聴、及び進行性の視力喪失を特徴とする状態を指す。視力喪失は、目の後ろの光感受性組織の層（網膜）を冒す、網膜色素変性症（ＲＰ）と呼ばれる眼科疾患により引き起こされる。視力喪失は、網膜の光感受性細胞が徐々に変質するにつれて起こる。夜間の視力喪失が最初に始まり、その後、側（末梢）視野において盲点が発生する。経時的に、これらの盲点が拡大し、融合してトンネル視をもたらす。アッシャー症候群の幾つかの症例では、眼のレンズの曇り（白内障）により更に視力が損なわれる。アッシャー症候群の３つの主なタイプが同定され、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と指定された。これらのタイプは、重症度、並びに兆候及び症状が現れた年齢により区別される。
【０１３０】
下記実施例９に例示されるように、本開示による組成物は、脊髄性筋委縮症患者から得られた線維芽細胞において、本明細書において下記に詳述されるＳＭＮ１タンパク質と同一である全長ＳＭＮ２タンパク質の翻訳の誘導にも有効である。
【０１３１】
したがって、本件で開示される主題の別の１つの態様では、治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供される。
【０１３２】
本明細書で定義される「脊髄性筋委縮症」（ＳＭＡ）の用語は、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子の喪失により引き起こされる遺伝性の常染色体劣性神経変性疾患である。ＳＭＡは、およそ１：６０００〜１：１００００の罹患率を伴う世界的な幼児の死亡率の主な遺伝的原因である。ＳＭＡは、骨格筋の筋力低下及び筋萎縮をもたらす脊髄前角内の運動ニューロンの変性を特徴とする。筋力低下及び筋萎縮は、対称性で進行性であり、腕よりも足により大きな影響を与えることが多く、最終的には肋間活動の低下をもたらす。呼吸不全及び合併症は、ＳＭＡ患者の早期死亡の大半を占める（１８）。
【０１３３】
全てのＳＭＡ患者は、エクソン７内の無変化の単一ヌクレオチド遷移のみが異なる、ＳＭＮ１遺伝子とほぼ同じＳＭＮ２遺伝子の１又は複数のコピーを保持する。ＳＭＮ２のエクソン７の５’末端における単一の非多形的なヌクレオチドの相違（８４０Ｃ→Ｔ）は、ＳＭＮ２由来の転写産物の大半を選択的スプライシングに供し、特有の最終コーディングエクソン（エクソン７）を欠くアイソフォームを産生する。そのため、ＳＭＮ２は、低レベルの全長ＳＭＮ及び高レベルの切断されたＳＭＮΔ７アイソフォームを産生する。ＳＭＮ２により産生される全長タンパク質は、ＳＭＮ１によって産生される機能性の欠損していないタンパク質と同一である（全長の欠損していない又は切断されていないタンパク質ＳＭＮ１及びＳＭＮ２は、本明細書においていずれもＳＭＮタンパク質と呼ばれることがある）。よって、ＳＭＡは、ＳＭＮ２遺伝子中の中途停止コドンとも関連する。
【０１３４】
切断されたＳＭＮΔ７タンパク質産物は、機能障害性であり不安定である。ＳＭＮ２遺伝子から産生される少量の機能性タンパク質は、ＳＭＮ１の喪失を完全に補填することができない。ＳＭＮ２遺伝子は、中途停止コドンを含む。
【０１３５】
したがって、幾つかの実施形態では、本開示による組成物は、上記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質が全長ＳＭＮ２の産生を増加するものである。
【０１３６】
「全長ＳＭＮの産生を増加する」の用語は、全長ＳＭＮの翻訳における少なくとも部分的な増加、増大又は上昇を意味する。該全長ＳＭＮの翻訳の増加、増大又は上昇は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は約１００％であり得る。
【０１３７】
本件で開示される主題の一実施形態では、治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、上記組成物は非全身的に投与される。
【０１３８】
本件で開示される主題の別の実施形態では、治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、上記組成物は非全身的に投与され、上記少なくとも１種のマクロライド系抗生物質は、ＳＭＮ２遺伝子中に存在する中途停止コドンのリードスルーを誘導することにより、ＳＭＮ２全長タンパク質のレベルを増加する。本件で開示される主題の更に別の実施形態では、治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物は非全身的に投与され、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質がＳＭＮ２遺伝子中の停止コドンのリードスルーを誘導し、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質は、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記ＳＭＮ２遺伝子に存在する上記停止コドンを含むＳＭＮ２遺伝子のフラグメントに対応する少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記停止コドンのリードスルーを誘導する指標である。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、停止コドンを含むＳＭＮ２遺伝子（ＳＭＮ２遺伝子は本明細書では配列番号１１で示される）のフラグメントに対応する少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列は、ＳＭＮ２遺伝子中に存在する。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、本明細書で定義される脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物は、ＣＮＳに直接投与される。
【０１４１】
他の実施形態では、本明細書で定義される脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物は、髄腔内、神経内、脳内、脳室内及び頭蓋内からなる群から選択される投与経路で投与される。
【０１４２】
更なる実施形態では、本明細書で定義される脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物は、髄腔内投与される。
【０１４３】
換言すれば、本件で開示される主題の更に別の実施形態では、治療を必要とする患者において脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物が提供され、該組成物は髄腔内投与され、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質がＳＭＮ２遺伝子に存在する停止コドンのリードスルーを誘導し、該少なくとも１種のマクロライド系抗生物質は、
ａ．候補マクロライド系抗生物質と、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された上記ＳＭＮ２遺伝子に存在する上記停止コドンを含むＳＭＮ２遺伝子のフラグメントに対応する少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含む方法によって同定され、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライド系抗生物質と接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライド系抗生物質が上記停止コドンのリードスルーを誘導する指標である。
【０１４４】
本件で開示される主題の全ての態様及び実施形態では、本明細書で定義される「組成物」は、「医薬組成物」又は「医療用組成物」とすることもできる。
【０１４５】
本明細書で使用される「医薬組成物」の用語は、好適な薬学的に許容可能な担体等の他の不活性な化学成分と共に、本明細書に記載される１又は複数の化合物（マクロライド）を調製したものを指す。医薬組成物の目的は、被験体への有効成分（マクロライド抗生物質）の投与を促進することである。
【０１４６】
薬剤の製剤化及び投与に関する技法は、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 20th ed, 2000)に見ることができる。本発明の医薬組成物は、当該技術分野で既知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣処理、ゲル化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造され得る。
【０１４７】
そのため、本発明による使用のための医薬組成物は、有効成分の、薬学的に使用可能な調製剤への加工を促進する賦形剤及び助剤を含む、１又は複数の生理学的に許容可能な担体を使用して従来の手法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路による。
【０１４８】
担体の例は、限定されないが、乳糖、ショ糖、水、有機溶媒及びポリエチレングリコールである。
【０１４９】
上記担体は、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、表面活性剤（界面活性剤）、乳化剤、保存剤及び着香剤等の追加の賦形剤を含んでもよい。
【０１５０】
本発明との関連での使用のための医薬組成物は、本明細書において下記に更に詳述される意図される目的を達成するのに有効な量で有効成分が含有される組成物を含む。
【０１５１】
本件で開示される主題は、治療を必要とする患者におけるナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法を更に提供し、上記方法は少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含む。
【０１５２】
本明細書で使用される、ナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患若しくは神経発生疾患、又はかかる疾患の症状若しくは特性を「治療する」又はその「治療」の用語は、以下、（１）疾患の予防、すなわち、その疾患に曝露されるか、又は罹患した可能性があるが（例えば、変異型遺伝子を発現する哺乳動物）、その疾患の症状若しくは兆候をまだ経験していないか、又は呈していない、哺乳動物における疾患の臨床症状若しくは兆候が発生しないようにすること、（２）疾患の阻害、すなわち、疾患又はその臨床症状若しくは兆候の発症の阻止又は減速、（３）疾患の軽減又は緩和、すなわち、疾患又はその臨床症状若しくは兆候の部分的若しくは完全な退縮の少なくとも１つを含み得る。「治療する」の用語は、機能性タンパク質の形成／産生の促進を包含する。
【０１５３】
また、さらに、本件で開示される主題は、治療を必要とする患者における脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）を治療する方法を提供し、上記方法は少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を含む組成物を投与することを含む。
【０１５４】
さらに、本件で開示される主題は、核酸コンストラクトであって、
ａ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、
ｂ．青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする第２の核酸配列と、
ｃ．ナンセンス変異を含む、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に挿入された少なくとも４５ヌクレオチドの第３の核酸配列と、
を含み、上記第１の核酸配列、第２の核酸配列及び第３の核酸配列が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを提供する。
【０１５５】
一般的に、本開示の核酸コンストラクトの構造は、５’から３’の方向に以下、（１）プロモーター、（２）第１の蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（３）ナンセンス変異（本明細書では「中途停止コドン」とも呼ばれる）を含む少なくとも４５ヌクレオチドの配列、（４）第２の蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（６）正常な終止シグナルを含む場合がある。
【０１５６】
よって、本明細書で定義されるコンストラクトは、「変異」が中途終止又は停止コドンである場合、ナンセンス変異、すなわち、既知の遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する遺伝子中の変異型配列に対応するか、又は相同な変異型配列を含む少なくとも４５ヌクレオチドの配列を含む。
【０１５７】
中途終止コドンは、任意の既知の停止コドン（ＵＡＧ、ＵＡＡ及びＵＧＡ）であってもよい。典型的には、変異又は中途停止コドンを含有する配列の長さは、少なくとも４５ヌクレオチド、例えば、少なくとも４６ヌクレオチド、少なくとも４７ヌクレオチド、少なくとも４８ヌクレオチド、少なくとも４９ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチドである。変異又は中途停止コドンは、通常、配列の中央にある。
【０１５８】
本明細書で使用される「核酸」又は「ポリヌクレオチド（複数の場合がある）」の用語は、１本鎖又は２本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーを意味する。
【０１５９】
本明細書で使用される「コンストラクト」の用語は、１又は複数の核酸配列で構成され得る人工的に会合した又は単離された核酸分子を指し、核酸配列はコーディング配列（すなわち、最終産物をコードする配列）、調節配列、非コーディング配列、又はそれらの任意の組合せであってもよい。
【０１６０】
本明細書で参照されるように、「オープンリーディングフレーム」（「ＯＲＦ」）の用語は、１つの開始コドン及び１つの停止コドンを含有するコーディング領域に関する。本発明によるオープンリーディングフレームは、「正常な」開始コドンと上述の停止コドンとの間に位置する変異型の中途停止コドンを含む場合があると理解される。リードスルーが起こらない場合、得られるタンパク質は、中途終止コドンで終了する。リードスルーが起こる場合には、ＯＲＦ全体が完全に翻訳される。
【０１６１】
本明細書で使用される「インフレーム」の用語は、１又は複数の核酸配列を指す場合、これらの配列がそれらの正しいリーディングフレームが保存されるように連結されていることを示す。
【０１６２】
本明細書で定義される「連結された」の用語は、様々な核酸配列がホスホジエステル結合で共有結合されていることを意味する。
【０１６３】
「間に挿入された」の用語は、核酸配列又はオリゴヌクレオチド、例えば、少なくとも４５ヌクレオチドの核酸配列が、他の核配列（nucleic sequences）、具体的には蛍光タンパク質をコードする核酸配列により、両方の末端（上流及び下流）で隣接することを意味する。具体的な少なくとも４５ヌクレオチドの挿入された核酸配列は、本明細書に記載されるナンセンス変異又は停止コドンを持つ変異型タンパク質のフラグメントに相同又は対応するものである。
【０１６４】
本明細書で使用される「上流」及び「下流」の用語は、例えば、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列等のヌクレオチド配列中の相対的な位置を指す。既に知られているように、ヌクレオチド配列は、いわゆるヌクレオチド骨格の糖（デオキシリボース又はリボース）環上の炭素に関して、５’末端及び３’末端を有する。したがって、ヌクレオチド配列上の位置と相対的に、下流の用語は、その配列の３’、末端に向かう配列に関する。上流の用語は、その鎖の５’末端に向かう領域に関する。
【０１６５】
本明細書で利用されるコンストラクトは、緑色及び青色蛍光タンパク質を含む。
【０１６６】
好適な青色蛍光タンパク質として、AddgeneによるＥＢＦＰ（３８０−４４０）、ＥＢＦＰ２（３８３−４４８）、及びEvrogeneによるＴａｇＢＦＰ（４０２−４５７）が挙げられる。好適な緑色蛍光タンパク質として、AddgeneによるＥＧＦＰ（４８８−５０７）、EvrogeneによるＴｕｒｂｏＧＦＰ（４８２−５０２）、ＴａｇＧＦＰ（４８２−５０５）、ＡＣＧＦＰ１（４８４−５１０）、ＴａｇＧＦＰ２（４８３−５０６）、及びInvitrogeneによるＥｍｅｒａｌｄ（４８７−５０９）が挙げられる。数字は、具体的なＦＡＣＳ機器のレーザー及びフィルターに応じて選択される各蛍光タンパク質の励起（ｎｍ）及び発光（ｎｍ）を指す。上記タンパク質の配列及びそれらをコードする配列は当該技術分野で既知である。
【０１６７】
特定の実施形態では、本明細書で使用されるＧＦＰは、配列番号９で示される核酸配列を有し、本明細書で使用されるＢＦＰは、配列番号１０で示される核酸配列を有している。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、本明細書で定義される核酸コンストラクトは、ＧＦＰがＢＦＰに対して上流にある。
【０１６９】
上記に例示されるように、本発明者らは、ＧＦＰをコードする第１の核酸配列、ＢＦＰをコードする第２の核酸配列、及びＧＦＰとＢＦＰとの間に挿入された少なくとも４５ヌクレオチドの第３の核酸配列を含む核酸コンストラクトを利用し、ここで、第３の核酸配列がナンセンス変異を有していた。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、第３の核酸配列は、毛細血管拡張性運動失調症変異型（ＡＴＭ）タンパク質をコードする遺伝子中に保有されるナンセンス変異（停止コドン）を含み、停止コドンを含む核酸配列は配列番号３で示される。かかる核酸コンストラクトを、毛細血管拡張性運動失調症と関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導する作用剤（例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質）を同定するために使用してもよく、同定された作用剤をこの疾患の治療に使用してもよい。
【０１７１】
他の実施形態では、第３の核酸配列は遺伝子カドヘリン−２３遺伝子（ＣＤＨ２３）中に保有されるナンセンス変異（停止コドン）を含み、停止コドンを含む核酸配列は配列番号６で示される。かかる核酸配列コンストラクトを、アッシャー症候群と関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導する作用剤（例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質）を同定するのに使用してもよく、同定された作用剤をこの疾患の治療に使用してもよい。
【０１７２】
他の実施形態では、第３の核酸配列はＭＥＣＰ２遺伝子中に保有されるナンセンス変異（停止コドン）を含み、停止コドンを含む核酸配列は配列番号８で示される。かかる核酸コンストラクトを、レット症候群と関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導する作用剤（例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質）を同定するのに使用してもよく、同定された作用剤をこの疾患の治療に使用してもよい。
【０１７３】
他の実施形態では、第３の核酸配列は、ＳＭＮ２タンパク質をコードするＳＭＮ２遺伝子（ＳＭＮ２遺伝子は配列番号１１で示される）中に天然に保有される停止コドンを含む。かかる核酸コンストラクトを、脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）と関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導する作用剤（例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質）を同定するのに使用してもよく、同定された作用剤をこの疾患の治療に使用してもよい。
【０１７４】
幾つかの実施形態では、本発明のコンストラクトは、第１の配列、第２の配列及び第３の配列の間に挿入された１又は複数のリンカー配列を含む。かかるリンカー配列は、例えば、オープンリーディングフレームを維持するために挿入されてもよい。
【０１７５】
他の実施形態では、本明細書で定義される核酸コンストラクトは、第１の核酸配列、第２の核酸配列及び第３の核酸配列の間に挿入された１又は複数のリンカー核酸配列を更に含む。
【０１７６】
任意のタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを使用して、標的細胞／細胞集団に直接に導入することができる、本明細書に定義される核酸コンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトを調製することができる。代替的には、所望の標的細胞に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができる。
【０１７７】
或る実施形態では、本件で開示される主題は、本明細書に定義される核酸コンストラクトを含むベクターを提供する。
【０１７８】
「ベクター」の用語は、宿主細胞へとコンストラクトを輸送し、及び／又は宿主細胞においてそのコンストラクト内に含有される核酸配列を発現するために使用される、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指す。ベクターは、Ｅ．コリ等の少なくとも１つの追加の宿主系において複製することが可能であってもよい。また、ベクターは、ベクターを含有する細胞の選択を可能とする配列を含んでもよい。多くのウイルス、真核生物及び原核生物の発現ベクターは既知であり、及び／又は市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【０１７９】
ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、アデノ随伴ウイルス、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ラブドウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ハンタウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、アレナウイルス科、コロナウイルス科、又はヘパシウイルス属（Hepaciviridae）から選択され得るが、これらに限定されない。
【０１８０】
当該技術分野で既知のように、ベクターは、その制御に必要な様々な他のポリヌクレオチド配列（例えば、調節配列、非コーディング配列、構造配列等）を更に含む場合がある。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、上記方法は、上記核酸コンストラクトで宿主細胞をトランスフェクトすることを含む。その後、トランスフェクトした細胞を、試験した作用剤と接触させる。
【０１８２】
よって、本件で開示される主題は、本明細書に定義される核酸コンストラクトを含む宿主細胞、又は本件で開示される主題の核酸コンストラクトを含む本明細書で定義されるベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０１８３】
当業者に既知の任意の種の細胞又は細胞株を本発明の方法に従って利用してもよい。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、本開示の宿主細胞は真核生物細胞である。
【０１８５】
他の実施形態では、本開示の宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【０１８６】
上記核酸分子を、核酸分子の合成について当該技術分野で既知の任意の方法により調製することができる。例えば、当該技術分野で既知の方法による市販されている試薬及び合成装置を使用して核酸分子を化学的に合成してもよい。
【０１８７】
アッセンブリングコンストラクト（assembling constructs）及びベクターを産生する方法は、当該技術分野で既知であり、Sambrook et ah, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ; Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987に一般的に記載される。
【０１８８】
本明細書で使用される「プロモーター要素」、「プロモーター」又は「プロモーター配列」の用語は、一般的にコーディング配列の５’末端（すなわち、先行する、上流に位置する）に位置し、コーディング配列の発現を活性化するスイッチとして機能するヌクレオチド配列を指す。コーディング配列が活性化されると、転写されると言われている。転写は、一般的には、コーディング配列からのＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ等）の合成を含む。したがって、プロモーターは転写調節因子としてはたらき、また、コーディング配列のｍＲＮＡへの転写を開始するための部位を提供する。プロモーターは、それらの全体が天然起源に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよく、又は合成ヌクレオチドセグメントを含んでいたとしてもよい。
【０１８９】
種々のプロモーターが、種々の組織若しくは細胞型において、又は種々の発生段階で、又は種々の環境条件に応じて、又は様々な発現レベルで遺伝子の発現を対象とし得ることが当業者に理解される。最も多くの細胞型において最も多くの回数遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成型プロモーター」と呼ばれる。特定の組織において遺伝子発現を導くプロモーターは、「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。
【０１９０】
使用され得るプロモーターの例として、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域、チミジンキナーゼ、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含有されるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、ウイルスＣＭＶプロモーター、ヒト慢性ゴナドトロピン−ベータプロモーター等が挙げられる。
【０１９１】
本明細書で使用される「導入する」及び「トランスフェクション」又は「トランスフェクトする」の用語を、同じ意味で使用することができ、例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクター等の分子を標的細胞（複数の場合がある）、より具体的には、標的細胞（複数の場合がある）の膜包囲された空間の内部へと輸送することを指す。上記分子は、当業者に既知の、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)により教示される任意の手段により標的細胞（複数の場合がある）へと「導入」され得る。細胞へと分子を「導入する」手段は、例えば、限定されないが、ヒートショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、トランスフェクション薬（複数の場合がある）、ウイルス媒介輸送等、又はそれらの組合せが挙げられる。細胞のトランスフェクションは、任意の起源、例えば、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞等の任意の細胞型に対して行われてもよい。
【０１９２】
本発明の、又は本発明のスクリーニング方法に使用される宿主細胞は、任意の細胞型であってもよい。幾つかの実施形態では、宿主細胞は真核生物細胞である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞型の例として、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＣＴ１１６が挙げられる。
【０１９３】
宿主細胞は、コンストラクト又はベクターにより一過性に形質転換されてもよい。代替的には、宿主細胞株は、本発明のコンストラクトにより安定に形質転換されるように樹立されてもよい。一過性又は安定な形質転換の方法は、当業者に既知である。
【０１９４】
本発明の一態様によれば、中途終止コドンのリードスルーを誘導することができる作用剤を同定する方法が提供される。
【０１９５】
本件で開示される主題は、下記に詳述されるナンセンス変異のリードスルーを誘導する作用剤を同定する方法を更に提供する。リードスルーを誘導する候補作用剤は、特に、マクロライド又はマクロライド系抗生物質であってもよい。
【０１９６】
したがって、本件で開示される主題の更なる態様により、ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法であって、該方法が、
ａ．候補マクロライドと、（ｉ）ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする上流核酸配列と、（ｉｉ）該上流蛍光タンパク質とは異なる、ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される蛍光タンパク質をコードする下流核酸配列と、（ｉｉｉ）上記上流核酸配列と上記下流核酸配列との間に挿入された遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連するナンセンス変異を含む核酸配列とを含み、上記上流核酸配列、下流核酸配列及び挿入された核酸配列が単一のＯＲＦ中にインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを含有する細胞集団とを接触させることと、
ｂ．上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することと、
を含み、
上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライドと接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライドと接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加が、上記候補マクロライドがナンセンス変異のリードスルーを誘導する指標である、
ナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法が提供される。
【０１９７】
上記方法は、本発明の核酸コンストラクトを含有する細胞と試験した作用剤とを接触させることを含む。核酸コンストラクトは、第１の上流蛍光タンパク質をコードする配列、及び第２の下流蛍光タンパク質をコードする配列を含む。これら２つの配列は、ナンセンス変異を含む配列により分離される。この配列は少なくとも４５ヌクレオチドであることが好ましい。
【０１９８】
「接触させる」は、上記コンストラクト内に含有される核酸配列の転写及び翻訳（発現）を可能とする条件下で行われると理解される。例えば、上記コンストラクトが誘導可能なプロモーターを含む場合、好適な誘導分子が試験試料に添加されなければならない。さらに、接触は、緩衝溶液及び塩の組合せ（ＫＣｌ、ＮａＣｌ及び／又はＭｇＣｌ２等）を含む水溶液中で行われることが好ましい。
【０１９９】
本発明の方法を、種々のインキュベーション時間を使用して行うことができる。インキュベーション時間は、蛍光発光を計測する前の少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間であってもよい。
【０２００】
上記方法は、上記作用剤の存在下でコンストラクトを発現する細胞、及び上記作用剤の不在下でコンストラクトを発現する細胞において下流蛍光タンパク質の蛍光発光を計測することを更に含む。上記作用剤（例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質）と接触しなかった細胞と比較した、上記作用剤と接触した細胞における下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの増加は、その作用剤がリードスルー剤（例えば、マクロライド又はマクロライド系抗生物質）であるという指標である。幾つかの実施形態では、少なくとも約２％〜１５％の増加が、その作用剤が臨床適用に適したリードスルー剤であることの指標となる。
【０２０１】
下流蛍光タンパク質の蛍光発光の計測を蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）により行ってもよい。現在のところ好ましい実施形態では、上流及び下流の両方の蛍光タンパク質を発現する細胞をＦＡＣＳによりソートし、下流蛍光タンパク質の蛍光強度を、ソートした細胞においてのみ計測する。
【０２０２】
典型的には、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、上記作用剤に曝露された細胞集団、及び上記作用剤に曝露されなかった細胞集団について算出し、ＭＦＩ値を比較する。
【０２０３】
幾つかの実施形態では、上記方法は、対照コンストラクトにおいては２つの蛍光タンパク質が、リードスルーを必要とすることなく常に融合タンパク質として共発現するようにナンセンス変異が存在しない（すなわち、対照コンストラクトは中途終止コドンを含まない）こと以外、本発明のコンストラクトと同様の対照コンストラクトの使用を更に含む。
【０２０４】
本発明のスクリーニング方法は、コンストラクトの発現に無傷細胞を使用し、検出にフローサイトメトリーを使用して行うことが好ましいが、上記方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して行う、及び／又は蛍光発光の検出及び計測に他の技法を利用するように変更してもよい。
【０２０５】
幾つかの実施形態では、スクリーニング方法は、候補リードスルー剤と無細胞抽出物とを接触させることにより行われる。当業者に既知の任意の技法を使用して、翻訳用の無細胞抽出物を作製してもよい。例えば、細胞を遠心分離し、上清を清澄にすることによって無細胞抽出物を作製することができる。無細胞抽出物を調製する間、例えば、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間に亘り、細胞を氷上でインキュベートしてもよい。氷上でインキュベートされていない細胞抽出物と比較して細胞抽出物の翻訳活性を改善するのに少なくとも十分長く細胞を氷上でインキュベートすることが好ましい。代替的には、細胞を約０℃〜１０℃、例えば、約４℃の温度でインキュベートしてもよい。
【０２０６】
遠心分離を低速度で行って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応のための無細胞抽出物を単離してもよい。例えば、細胞抽出物は、約２×ｇ〜２００００×ｇ、約５×ｇ〜１５０００×ｇ、約１００００×ｇで遠心分離された細胞に由来する上清であってもよい。代替的には、無細胞抽出物は、約ＳＩ〜Ｓ５０の抽出物、例えば、約Ｓ５〜Ｓ２５の抽出物、約Ｓ１０の抽出物であってもよい。
【０２０７】
無細胞翻訳抽出物を任意の種の起源の細胞から単離してもよい。例えば、無細胞翻訳抽出物は、酵母、培養マウス又はラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、網状赤血球、コムギ胚芽、又はライムギ胚から単離されてもよい（例えば、Krieg & Melton, 1984, Nature 308:203 and Dignam et al, 1990 Methods Enzymol. 182:194-203を参照されたい）。代替的には、無細胞翻訳抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽抽出物を、例えばPromega（ウィスコンシン州マディソン）から購入することができる。別の選択肢として、無細胞翻訳抽出物を、国際公開第０１／４４５１６号及び米国特許第４，６６８，６２５号に記載されるように調製する。幾つかの実施形態では、無細胞抽出物は、ヒト細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞から単離された抽出物である。
【０２０８】
幾つかの実施形態では、試験した作用剤をプールでスクリーンする。陽性プールが同定されれば、そのプールの個々の化合物を別々に試験してもよい。
【０２０９】
幾つかの実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、例えば、本明細書において下記に例示されるような上流蛍光タンパク質がＧＦＰであり、下流蛍光タンパク質がＢＦＰである。
【０２１０】
他の実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、ナンセンス変異を含む挿入された核酸配列が少なくとも４５ヌクレオチドであるものである。
【０２１１】
更なる実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光を、上記上流蛍光タンパク質及び下流蛍光タンパク質の両方を発現する細胞においてのみ計測するものである。
【０２１２】
また、更なる実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記上流蛍光タンパク質及び下流蛍光タンパク質の両方を発現する細胞を検出すること又はソーティングすることを含む。
【０２１３】
また、更なる実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記核酸コンストラクトを含有し、上記候補マクロライドと接触させていない細胞と比較した、上記候補マクロライドと接触させた上記核酸コンストラクトを含有する細胞における上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルの少なくとも約７％〜２５％の増加が、上記候補マクロライドが臨床適用に適したリードスルー剤であることの指標であるものである。
【０２１４】
幾つかの実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光の計測を、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）により行うものである。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記コンストラクトを含有し、候補マクロライドと接触させた細胞と、ナンセンス変異を含まない対照コンストラクトを含有する細胞との間で上記下流蛍光タンパク質の蛍光発光レベルを比較することを更に含む。
【０２１６】
別の実施形態では、リードスルーを誘導するマクロライドを同定する方法は、上記マクロライドがマクロライド系抗生物質であるものである。
【０２１７】
本件で開示される主題の更に別の態様では、ナンセンス変異に起因する又はそれと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法であって、
（ｉ）治療を必要とする被験体を治療するためのナンセンス変異リードスルーマクロライドを、
ａ．上記被験体から得られた生体試料において、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患と関連する遺伝子中の少なくとも１つのナンセンス変異を同定することと、
ｂ．ＧＦＰ及びＢＦＰから選択される２つの異なる蛍光タンパク質をコードする２つの核酸配列と隣接する、上記（ａ）の同定した変異に対応する少なくとも４５ヌクレオチドのフラグメントとその周囲のヌクレオチドとを含み、上記フラグメント及び上記２つの異なる蛍光タンパク質をコードする核酸配列が単一のＯＲＦにおいてインフレームで連結されている、核酸コンストラクトを準備することと、
ｃ．（ｂ）のコンストラクトを宿主細胞に導入することと、
ｄ．（ｂ）のコンストラクトを含有する宿主細胞と候補リードスルーマクロライドとを接触させることと、
ｅ．両方の蛍光タンパク質を含有するリードスルーポリペプチドの存在を検出すること、
を含み、
ｆ．両方の蛍光タンパク質を含有するリードスルーポリペプチドの存在が、上記候補リードスルーマクロライドがナンセンス変異リードスルーマクロライドであることの指標である、
方法により選択することと、
（ｉｉ）上記ナンセンス変異リードスルーマクロライドを上記被験体に投与することと、
を含む、ナンセンス変異に起因する又はそれと関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法を提供する。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、治療される被験体は、被験体が本発明の組成物による治療を受け入れられることを確認するため、特定の疾患と関連する遺伝子において被験体が有している正確な変異（複数の場合がある）を特定するために遺伝子試験を受ける。具体的な遺伝子中の具体的な変異を同定するための遺伝子試験は、当該技術分野で既知である。かかる試験は、本明細書に記載される遺伝性疾患の診断に使用されることが多い。
【０２１９】
具体的な疾患及びそれらの関連する変異に関する情報は、科学論文において入手可能である。また、かかる情報は、例えば、
ＨＧＭＤ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ、www.biobase-international.com/product/hgmd又はwww.hgmd.org/で利用可能、
ＯｒｐｈａＮｅｔ：稀な疾患及びオーファンドラッグに関する情報のための欧州リファレンスポータル、www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.phpで利用可能、
ＯＭＩＭ、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ、www.ncbi.nlm.nih.gov/omimで利用可能、
を含むデータベースにおいても見出され得る。
【０２２０】
上述及び他の実施形態では、本明細書で定義されるマクロライドは、マクロライド系抗生物質であってもよい。
【０２２１】
活性剤は、別の活性剤と共に同時に投与されてもよく、又は別の治療法と組み合わされてもよい。幾つかの実施形態では、マクロライドの組合せを投与する。
【０２２２】
「生体試料」の用語は、その最も広い意味で使用される。動物（及びヒト）を含む任意の起源から得られた検査試料又は培養物を含み、体液（例えば血液及びリンパ液）、固体及び組織を包含することを意味する。
【０２２３】
よって、本件で開示される主題の更に別の一つ態様により、治療を必要とする患者においてナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療する方法に使用するための少なくとも１種のマクロライド系抗生物質を少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤と組み合わせて含む組成物が提供される。
【０２２４】
上記少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤は、ナンセンス変異と関連する遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を治療することができる作用剤、任意の抗菌剤の１種、及び／又は上記マクロライド抗生物質の治療効果を増強することができる作用剤である。上記少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤は、最適以下の用量又は治療的用量であってもよい、好適な用量で投与される。上記マクロライド抗生剤及び上記少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤は、同時に投与されてもよい。代替的及び追加的に、上記マクロライド抗生剤及び上記少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤は、異なる時点で、異なる投与間隔で、異なる期間に亘り、異なる順番で及び／又は異なる投与経路により投与することができる。
【０２２５】
幾つかの実施形態では、本明細書で定義される「少なくとも１種の追加の治療剤」又は「少なくとも１種の追加の治療的に有効な作用剤」は、遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患の治療に有効であると知られている任意の治療剤であってもよい。例えば、少なくとも１種の追加の治療剤は、限定されないが、数例を挙げれば、ＤＮＡクロマチン圧縮を抑制することによりＳＭＮ２転写の増強を促進するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、スカベンジャーｍＲＮＡデキャッピング酵素であるＲＧ３０３９、エクソンスキッピング剤、ＲＮＡ系治療剤、スプライス調整剤等であってもよい。
【０２２６】
本発明の組成物及び方法は、中途停止コドンを抑制することができる、又は中途停止コドンのリードスルーを誘導することができる治療的に有効な量のマクロライド化合物を利用する。
【０２２７】
本明細書で使用される「抑制」又は「抑制する」の用語は、中途停止変異又は中途停止コドンに関して使用される場合、停止コドンのリードスルー過程を意味する。
【０２２８】
本明細書で定義される「治療的に有効な量」の用語は、中途停止コドンのリードスルーを誘導するのに十分な本発明のマクロライド又はマクロライド系抗生物質の量を含む。
【０２２９】
「治療的に有効な量」は、化合物、疾患、及びその状態又は重症度、治療される哺乳動物の年齢、体重、他の病状等により変化し得る。また、治療的に有効な量は、１又は複数の過去又は現在の医学的、外科的又は放射線治療の介入に応じて変化し得る。また、治療的に有効な量は、停止コドンの種類によっても変化し得る。
【０２３０】
本発明の目的に対する治療的に有効な量の決定は、本発明の分野の当業者の能力の範囲内である。
【０２３１】
或る実施形態では、本明細書で使用及び定義される「治療的に有効な量」の用語は、非全身投与、例えばＣＮＳに直接的に又は髄腔内に投与される場合、その全身レベルは殺菌レベル未満でありながら、リードスルーの誘導に有効な活性剤（マクロライド系抗生物質）の量を意味するものとする。非全身的に投与される治療的に有効な量は、全身投与される従来の殺菌剤／抗生物質の用量の１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍又は９００倍、またそれ以上であってもよい。「殺菌剤」「抗生物質」の用語は、本明細書において同義的に、同じ意味で使用される。
【０２３２】
例えば、本明細書において下記に示されるように、アジスロマイシンの投与は、１回の注射当たり１．５ｍｇ〜１５ｍｇの用量であってもよく、ＣＳＦ液１ｍｌ当たり１０μｇ〜１００μｇの濃度を導く。
【０２３３】
本明細書で定義される「治療を必要とする患者」の用語は、本明細書に定義される遺伝性の神経変性疾患又は神経発生疾患を患う被験体を指す。
【０２３４】
幾つかの実施形態では、治療を必要とする患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０２３５】
本発明の核酸、ベクター又は宿主細胞を備えたキットが更に提供される。かかるキットは、本発明の方法を実施するために使用されてもよい。かかるキットは、本発明の核酸に加えて対照コンストラクトを備えてもよい。かかるキットは、チューブ、プレート、ピペット等の開示される方法を実施するための備品を備えてもよい。
【０２３６】
開示される主題の全ての態様及び実施形態では、マクロライド系抗生物質又はそれを含む組成物は、好適な送達デバイス、具体的には薬剤送達複合デバイス（delivery drug-device combination）に含まれてもよい。薬剤輸送複合デバイスの例は浸透圧ポンプである。薬剤輸送複合デバイスは、治療的に有効な用量のマクロライド系抗生物質又はそれを含む組成物が持続的に患者へと送達されるように、被覆された埋め込み式の医療デバイスであってもよい。また、薬剤送達複合デバイスを、活性剤を定期的に放出するように設計することもできる。かかる薬剤送達複合デバイスにより、マクロライド系抗生物質又はそれを含む組成物を、制御された速度で浸透法により送達することができる。かかるシステムは、浸透圧的に活性な作用剤を速度制御性の半透過膜で被覆することにより構築されてもよい。この膜は、それを通って作用剤が送達される臨界寸法の放出口を含有してもよい。活性剤であるマクロライド系抗生物質は、水性液体と接触した後、膜の液体透過性及びコア製剤の浸透圧により決定される速度で水を吸収する。これは、膜の放出口から制御された速度で投薬される活性剤の飽和溶液の形成をもたらす。浸透圧ポンプは、好適な標的部位、例えば、患者のＣＳＮ中に埋め込まれる埋め込み式であってもよい。
【０２３７】
本明細書で使用される「約」の用語は、量、時間的な持続期間等の計測可能な値を指す場合、かかる変動が開示される方法を行うのに適切であることから、特定される値から±１０％、より好ましくは±５％、更に好ましくは±１％、より一層好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
【０２３８】
本発明の或る特定の実施形態をより完全に解説するため、以下の実施例を提示する。しかしながら、以下の実施例は、本発明の幅広い範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変形形態及び変更形態を容易に考案することができる。
【実施例】
【０２３９】
実験手法
プラスミド構築
核酸配列ＡＧＡ  ＧＧ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ（本明細書では配列番号１と示す）を有するＫｐｎＩフォワードプライマー、及び核酸配列ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＣＣ（本明細書では配列番号２と示す）を有するＢａｍＨＩリバースプライマーを使用して、ｐＥＢＦＰ２−Ｃ１プラスミドから青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を増幅した。
【０２４０】
ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を使用してｐＥＧＦＰ−Ｃ２プラスミド中にＰＣＲ産物を連結し、ＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰベクターを作製した。次に、試験用の所望の遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド（野生型及び変異型の両方の配列）をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰ中に挿入し、オープンリーディングフレームを維持した。プラスミドＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰを概略的に図１Ａに提示する。とりわけ、図１Ｃ−１は、ＧＦＰとＢＦＰとの間に挿入された野生型配列を有するプラスミドＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰを概略図的に提示し、図１Ｃ−２は、ＧＦＰとＢＦＰとの間に挿入された停止コドンを含有する変異型配列を有するプラスミドＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰを概略図的に提示する。
【０２４１】
リードスルーアッセイ
６ウェルにプレーティングしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造御者のプロトコルに従って、ポリエチレンイミン「ＭＡＸ」トランスフェクション試薬（Polysciences Inc.）を使用して２μｇのプラスミドでトランスフェクトした。各実験について、具体的な疾患と関連する遺伝子のフラグメント（野生型配列として、又は変異型配列としてのいずれか）を含有するＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰベクターを使用した。
【０２４２】
トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトした細胞を、マクロライド系抗生物質を用いた処理に供した。上記細胞を、下記に詳述されるように種々の濃度のマクロライド系抗生物質であるエリスロマイシン（Sigma）で、種々の時間に亘り処理した。処理後、上記細胞をウェルからやさしくかき取り、ＰＢＳ（Sigma）で洗浄し、ＦＡＣＳ分析用にＰＢＳ中に再懸濁した。製造業者の指示書に従い、Ｋａｌｕｚａ（商標）Ｆｌｏｗ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア−Beckman Coulterを使用してＦＡＣＳ分析を行った。一部の細胞をペレット化し、溶解してポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供した。
【０２４３】
実施例１
プラスミドコンストラクト及びそれらの予備評価
上述の通り調製したＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰに基づくプラスミドコンストラクトの基本的な特徴を図１Ａに提示する。図１Ａに示されるように「ＷＴ」は野生型配列を示し、「ｍｕｔ」は変異型配列（本明細書では中途停止コドンとも呼ばれるナンセンス変異を含む）を指す。上記に詳述されるように、これらのコンストラクトを哺乳動物細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ）にトランスフェクトし、種々のマクロライド濃度で様々な期間に亘り処理した。図１Ｂは、ＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰコンストラクトでトランスフェクトした細胞の免疫蛍光写真の例を示す。
【０２４４】
図１Ｃ−１に概略図的に提示されるように、プラスミドコンストラクトが「野生型」（ｗｔ）核酸配列を保有していた場合、すなわち、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）とに隣接する核酸配列中に停止コドンが存在なかった場合、上記プラスミドコンストラクトでトランスフェクトした細胞においてＧＦＰ及びＢＦＰを含むインフレーム融合タンパク質が翻訳された。その後、蛍光励起セルソーティングフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ及びＢＦＰの蛍光発光レベルを求めた。
【０２４５】
しかしながら、図１Ｃ−２で実証されるように、プラスミドコンストラクトが変異型核酸配列（「ｍｕｔ」）を含んだ場合、すなわち、ＧＦＰとＢＦＰとに隣接する核酸配列中に停止コドンが存在した場合（本明細書では「ナンセンス」変異とも呼ばれる）、上記プラスミドコンストラクトでトランスフェクトした細胞においてＧＦＰを含むコンストラクトの一部のみが翻訳された。
【０２４６】
上述のコンストラクトでトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析の例を、上記に詳述されるコンストラクトに対応する図１Ｃ−１及び図１Ｃ−２の下部パネルに提示する。図１Ｃ−３下部パネルで実証されるように、変異型核酸配列を含むプラスミドコンストラクトでトランスフェクトした細胞をマクロライド（例えば、マクロライドであるエリスロマイシン）の存在下でインキュベートした場合、ＧＦＰとＢＦＰとの両方を含む融合タンパク質の翻訳を回復した。図１Ｃ−３下部パネルで実証されるように、マクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンの存在下でリードスルーが可能となった結果、中央の下部パネルに示される蛍光発光と比較して蛍光発光が幾分シフトしている。
【０２４７】
ナンセンス変異を保有するプラスミドコンストラクトでトランスフェクトし、種々の濃度のエリスロマイシン（０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ及び７００μｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間インキュベートした細胞について得られたＦＡＣＳデータのオーバーレイ図を図１Ｄに示す。平均値のシフトは、リードスルーの程度を表す。
【０２４８】
実施例２
マクロライドを使用して毛細血管拡張性運動失調症変異型（ＡＴＭ）配列を含むプラスミドコンストラクトのリードスルーをアッセイする
以下の項に記載されるように、エリスロマイシンは、毛細血管拡張性運動失調症変異型（ＡＴＭ）タンパク質をコードする遺伝子に見出される中途停止コドンのリードスルーを誘導することができた。
【０２４９】
ＡＴＭタンパク質をコードする遺伝子中の中途停止コドンのリードスルーを誘導するエリスロマイシンの能力を、以下の配列：ＡＴＭ変異型核酸配列：配列番号３と示される
【０２５０】
【化１】
2016503051.tif 000003
【０２５１】
（変異したヌクレオチドを太字で示す）、及びＡＴＭ野生型核酸配列：配列番号４と示される
【０２５２】
【化２】
2016503051.tif 000004
【０２５３】
がＧＦＰとＢＦＰとの間にそれぞれ挿入された、上記に詳述されるＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰに基づく変異型及び野生型のプラスミドコンストラクトを構築することによりアッセイした。上記配列は、制限酵素認識配列（示していない）を更に含んだ。
【０２５４】
上記プラスミドを構築し、上述の通りＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＡＴＭ変異型遺伝子でトランスフェクトした細胞を３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ又は７００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンで２４時間、３６時間又は４８時間に亘り処理するか、又は処理しないままおいた（「０」エリスロマイシン）。各群について、ＢＦＰの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を算出した。ＢＦＰ示度はＧＦＰ発現細胞のみから採取された。
【０２５５】
ＡＴＭタンパク質（ＡＴＭ変異）をコードする遺伝子中の中途停止コドンのリードスルーに対する種々のエリスロマイシン用量及び様々なインキュベーション期間の効果を図２に提示し、この図は、エリスロマイシンがＡＴＭタンパク質をコードする遺伝子に見出される中途停止コドンのリードスルーを誘導し得ることを実証する。
【０２５６】
ＷＴの結果は、それらが非常に高く、分析に不適切であることから除外された。種々の用量の各々の示度の中央値を正規化し、処理なしの結果（「０」エリスロマイシン）と比較して提示する。
【０２５７】
実施例３
マクロライドを使用するＡＴＭタンパク質の回復
この実験では、ＷＴ細胞と比較して、ヘテロ接合性のナンセンス変異Ｃ５５１５→Ｔ（Ｃｏｒｉｅｌｌ、＃ＧＭ１１２６４）を保有する毛細血管拡張性運動失調症（Ａ−Ｔ）患者から得られたＢリンパ球を、３００μｇ／ｍｌの濃度（図３Ａに示される）又はそれより低い濃度（図３Ｂに示されるように、１００μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）のいずれかでマクロライド系抗生物質である、ゲンタマイシン、エリスロマイシン又はアジスロマイシンの存在下で７日間インキュベートした。その後、細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的抗ＡＴＭ抗体を使用するウェスタン分析に供した。ＴＩＮＡソフトウェアを使用して図３Ｂに示される結果についてバンド強度を分析し、図３Ｃに示す。
【０２５８】
図３Ｄは、１００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌのいずれかのエリスロマイシン（Ｅ）の存在下で７日間インキュベートした、ホモ接合性のＡ−Ｔ変異Ｃ１０３→Ｔ細胞及びＷＴ細胞（いずれもイスラエル、テルアビブ大学のYosi Shilo教授により快く寄贈された）を示す。その後、細胞を回収し、特異的抗ＡＴＭ抗体を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
【０２５９】
実施例４
マクロライドを使用する機能性ＡＴＭタンパク質の回復の確認
そのＣ’末端でＦＬＡＧエピトープによりタグ付けされたＡＴＭタンパク質（変異型又は野生型）をコードするプラスミドを使用し、好適な哺乳動物細胞において、機能性アッセイによりＡＴＭタンパク質の発現もアッセイした。
【０２６０】
部位特異的変異誘発（STRATAGENE）を使用して変異型ＡＴＭタンパク質を得ることで、病因となるナンセンス変異をＡＴＭ遺伝子中の既知の部位に挿入した。停止コドンのリードスルー剤による処理、また、任意にプロモーター活性化及び（ＮＭＤ）化合物による処理の後、これらのプラスミドでトランスフェクトした細胞を、ＡＴＭ遺伝子の活性、例えば、放射線抵抗性について調査した。追加の機能性試験も行われる。
【０２６１】
実施例５
アッシャー症候群及びレット症候群
オーファン疾患であるアッシャー症候群及びレット症候群と関連する遺伝子中の更なる３つのナンセンス変異のリードスルーに対する種々の用量のエリスロマイシンの効果を試験するため、以下の実験を行った。これらの疾患は全て、少なくとも部分的には、ナンセンス変異により引き起こされる。
【０２６２】
これらの実験について、ＧＦＰとＢＦＰとの間に挿入された以下の配列を含むＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドを、上述のように調製した。簡潔には、上記プラスミドを以下の通り構築した。
【０２６３】
（１）アッシャー症候群と関連するカドヘリン−２３遺伝子（ＣＤＨ２３）のフラグメントの野生型配列を含むプラスミドは、配列番号５で示される核酸配列：
【０２６４】
【化３】
2016503051.tif 000005
【０２６５】
を含んだ。
【０２６６】
（２）カドヘリン−２３遺伝子の上記フラグメントの変異型配列を含むプラスミドは、配列番号６で示される核酸配列：
【０２６７】
【化４】
2016503051.tif 000006
【０２６８】
を含んだ。
【０２６９】
（３）レット症候群に関連するＭＥＣＰ２遺伝子のフラグメントの野生型配列を含むプラスミドは、配列番号７で示される核酸配列：
【０２７０】
【化５】
2016503051.tif 000007
【０２７１】
を含んだ。
【０２７２】
（４）ＭＥＣＰ２遺伝子の上記フラグメントの変異型配列を含むプラスミドは、配列番号８で示される核酸配列：
【０２７３】
【化６】
2016503051.tif 000008
【０２７４】
を含んだ。
【０２７５】
上述のように、上記プラスミドは、制限酵素認識配列（示されていない）を更に含んだ。
【０２７６】
さらに、上述のＡＴＭと関連するナンセンス変異を含む核酸インサートを含むＧＦＰ−Ｃ２−ＢＦＰプラスミドもこの実験で試験した。上記プラスミドを構築し、上述の細胞にトランスフェクトした。変異型遺伝子フラグメントを含むプラスミドでトランスフェクトした細胞を、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ又は７００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンで２４時間又は４８時間処理するか、又は処理せずにおいた（「０」エリスロマイシン）。各群について、ＢＦＰの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ分析を使用してモニターし、算出した。４つの障害に対応するナンセンス変異型配列のリードスルーに対するエリスロマイシンの効果を図４に提示する（図４Ａは、２４時間のインキュベーションに関し、図４Ｂは４８時間のインキュベーションに関する）。実施例３と同様に、上記結果は、「処理なし」の結果に関して正規化した値として提示される。
【０２７７】
図４に示されるように、ＢＦＰの蛍光強度（ＭＦＩ）は、エリスロマイシンの存在下で２４時間又は４８時間（それぞれ、図４Ａ及び図４Ｂ）のいずれかのインキュベーションの後に増加し、ＧＦＰ及びＢＦＰを含む完全な融合タンパクのリードスルーを促進するエリスロマイシンの能力を実証した。
【０２７８】
上述のＦＡＣＳ分析に加えて、トランスフェクトした細胞を溶解し、α−ＧＦＰ抗体を使用するウェスタンブロットアッセイに供した。図５は、上述のＡＴＭ及びアッシャー症候群と関連するナンセンス変異を含む核酸インサートを含むプラスミドでトランスフェクトした細胞について行われたウェスタンブロットアッセイで得られた結果を提示する。
【０２７９】
図５で実証されるように、５５キロダルトン（ｋＤａ）に対応する「ＷＴ」バンドは、試験したタンパク質の短い配列に隣接するＧＦＰ及びＢＦＰの両方を含む全長融合タンパクを表す。注目すべきことに、図５からわかるように、エリスロマイシン処理によって、同様のサイズのバンドが変異型配列（「ＡＴＭ  ｍｕｔ」及び「Ｕｓｈｅｒ  ｍｕｔ」）に対しても現れた。
【０２８０】
図５に明確に示されるように、全長融合タンパクに対応する高分子サイズのバンドは、総タンパク質に対して一部のみであり（ＧＦＰ単独）、中程度のリードスルーが得られたことを示唆する。これらのタンパク質発現の結果は、マクロライドであるエリスロマイシンがナンセンス病因の変異をリードスルーし得ることを確認する。
【０２８１】
実施例６
マクロライドを使用する線維芽細胞におけるメチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣｐ２）タンパク質の回復
ＭｅＣＰ２タンパク質発現をレット症候群線維芽細胞において評価した。よく確立されたアミノグリコシドであるゲンタマイシン（Ｇ４１８）と比較して、ナンセンス変異８８０Ｃ→Ｔ（すなわち、Ｒ２９４Ｘ）を含有するレット症候群線維芽細胞（Sheba病院のBen-Zeev医師により快く寄贈された）をエリスロマイシン又はアジスロマイシンで７日間処理した。
【０２８２】
図６に明確に実証されるように、ＭｅＣＰは、処理しなかった細胞と比べて、上記化合物の存在下のみで可変レベルで発現され、アジスロマイシンの存在下では、わずかに多いＭｅＣＰ２が発現された。図６に示されるように、アジスロマイシンの用量反応分析は、１０μｇ／ｍｌの低用量であっても高い発現を実証した。この観察は、停止コドンの変異に起因するレット症候群を患う患者に推定上で低用量が投与されることを示唆する。
【０２８３】
実施例７
ＭｅＣＰ２の核局在
マクロライドの存在下でＭｅＣＰ２タンパク質の回復が実証された後、レット症候群患者から得られた線維芽細胞において発現されたＭｅＣＰ２タンパク質の機能的活性をアッセイした。
【０２８４】
野生型線維芽細胞におけるＭｅＣＰ２を対象とする抗体による染色（上部パネル）及び核のｄａｐｉ染色（下部パネル）を示す図７Ａで実証されるように、タンパク質ＭｅＣＰ２は核に局在する。
【０２８５】
興味深いことに、図７Ｂ及び図７Ｃで実証されるように、マクロライドの存在下でのインキュベート後、タンパク質ＭｅＣＰ２は細胞核へと再局在化され（ｄａｐｉ及びＭｅＣＰ２を対象とする抗体の両方により染色された細胞を指す矢印により示される）、その転写因子としての機能性を示唆する。核染色の割合の定量化である図７Ｄからわかるように、アジスロマイシンの効果は、ここでも試験した化合物のうち最も高く、５０％〜６０％の細胞に作用した。
【０２８６】
まとめると、これらの結果は、エリスロマイシン及びアジスロマイシンがＭｅＣＰ２タンパク質の翻訳をリードスルーすることを可能とし、核に局在化することからおそらくは機能性である適度に高レベルのＭｅＣＰ２を達成することを示す。
【０２８７】
実施例８
更なるモデルを使用するレット症候群における機能性タンパク質の回復の確認
レット症候群（ＲＴＴ）では、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）遺伝子中の変異が症例の大半を占め、Ｙ１４１、Ｒ１６８、Ｑ１７０、Ｒ１９８、Ｒ２５５、Ｒ２５６、Ｒ２７０及びＲ２９４を含む種々の変異が知られている。
【０２８８】
ＲＴＴと関連する停止コドンのリードスルーにおける作用剤の効果をアッセイするため、以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を使用する。
【０２８９】
１．上記変異の少なくとも１つ、例えば、上記に例示されるＲ２９４Ｘを持つＲＴＴ患者から採取された線維芽細胞のウェスタンブロット分析。上記分析は、核抽出物を使用してマクロライドにより処理した線維芽細胞に対して処理していない線維芽細胞を比較する。ＭＥＣＰ２のＲ２５５Ｘナンセンス変異を発現するレット症候群の少女に由来するリンパ球細胞株（Coriell Cell Repository、ストック番号１６４９７）に対してもウェスタンブロットアッセイを行った。
【０２９０】
２．ＭＥＣＰ２  ＲＮＡレベルを求め、未処理と処理したＲＴＴの線維芽細胞とを比較する。
【０２９１】
３．ＭＥＣＰ２標的遺伝子、すなわち、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を計測し、未処理と処理したＲＴＴの線維芽細胞とを比較する。
【０２９２】
さらに、動物モデル、例えば、ＭＥＣＰ２遺伝子にＲ１６８Ｘ変異を保有するレット症候群のモデルであるＭｅｃｐ２Ｒ１６８Ｘノックインマウスを使用して、ＲＴＴと関連する停止コドンのリードスルーにおける作用剤の効果もアッセイする。これらのマウスから採取された線維芽細胞をＭＥＣＰ２のレベル及び亜細胞局在について調査する。
【０２９３】
実施例９
マクロライドを使用する全長ＳＭＮ２タンパク質の回復
上記に詳述されるように、脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）は、ＳＭＮ１（生存運動ニューロン１）遺伝子における変異により引き起こされる遺伝性疾患である。ＳＭＮ２は、エクソンのスプライシングエンハンサ―を妨害するエクソン７内の無変化の単一ヌクレオチド遷移によってのみ区別される、ほぼ同じＳＭＮ１のコピーである。ＳＭＮ２タンパク質産物のほとんど、すなわちΔ７−ＳＭＮは、機能障害性であって不安定であり、ＳＭＮ２遺伝子から産生される少量の機能性タンパク質は、ＳＭＡ患者におけるＳＭＮ１の喪失を完全に補償することができない。
【０２９４】
全長ＳＭＮ２（ＦＬ−ＳＭＮ２）の発現を誘導するマクロライドの能力を、下記に詳述される脊髄性筋委縮症の線維芽細胞でアッセイした。リードスルーの可能性を調査するため、ＳＭＮ１欠損線維芽細胞（ＳＭＮ２遺伝子の１つ（＋／−）又は２つ（＋／＋）のいずれかのコピーを含有する）を、エリスロマイシン又はアジスロマイシンで７日間処理した。また、陽性対照としてアミノグリコシドであるゲンタマイシンで細胞を処理した。
【０２９５】
図８Ａで明確に実証されるように、アッセイした全ての化合物、すなわち、エリスロマイシン、アジスロマイシン及び陽性対照ゲンタマイシンの存在下で、全長ＳＭＮ２タンパク質（３２ｋＤａ、ＦＬ−ＳＭＮ２）は、両方のタイプの線維芽細胞で発現された。
【０２９６】
明らかに、全長ＳＭＮ２の発現は、（ＳＭＮ２＋／＋）線維芽細胞により実施された対応する実験結果を示す図８Ｂと比較して、図８Ａで観察されるように、ＳＭＮ２遺伝子の１つのアレルが同じく変異された（ＳＭＮ２＋／−）場合に減少した。
【０２９７】
アジスロマイシンは、両方の起源（すなわち、ＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／−及びＳＭＮ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋）に由来する線維芽細胞において、わずかに高いＦＬ−ＳＭＮ２レベルを実証した。さらに、用量反応分析は、１０μｇ／ｍｌの低用量のアジスロマイシンにおいて得られた最も高い発現と共に、用量が減少するにつれてリードスルーが増加することを実証する逆相関を明らかにした。この観察は、患者の投与について推定上の低用量を示唆する。
【０２９８】
図８Ｃ及び図８Ｄで実証されるように、ゲンタマイシン又はエリスロマイシンの存在下での線維芽細胞のインキュベーションが、上記化合物を５００μｇ／ｍｌの高用量で使用した場合であっても、無関係のタンパク質の発現に何らの影響も及ぼさなかったことは注目すべきことである。
【０２９９】
さらに、図８Ｅで実証されるように、上記化合物を使用する処理は、アッセイ条件下で細胞生存率がおよそ９０％を維持したことから、無害であった。
【０３００】
よって、上記結果は、エリスロマイシン及びアジスロマイシンがＦＬ−ＳＭＮタンパク質のリードスルー翻訳を可能としたことを実証する。
【０３０１】
実施例１０
動物モデルにおけるマクロライドを使用するＳＭＮ活性の回復
マクロライドを使用して患者の線維芽細胞中で全長ＳＭＮ２の翻訳を誘導し得ることを観察した後、後述されるように、マクロライドであるアジスロマイシンの全長ＳＭ２の翻訳を誘導する能力もマウスにおいてアッセイした。
【０３０２】
内因性Ｓｍｎ１を欠損するマウスは、生育不能である。この胚致死性を回避し、中間のＳＭＡ表現型を有する動物を作出するため、ヒトＳＭＮ２導入遺伝子をＳｍｎ１−／−バックグラウンド（Ｓｍｎ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋）に対して付加し、出生後第１週目に発症する（surrenders to disease）動物を得た。エクソン７を欠くヒトＳＭＮ２導入遺伝子のこのモデル（Ｓｍｎ１−／−；ＳＭＮ２＋／＋；ＳＭＮ２Δ７＋／＋）への更なる付加は、上記に詳述される神経筋接合部（ＮＭＪ）の脱神経と関連する進行性の筋力低下を呈する動物において約１４日までの平均寿命をもたらした。
【０３０３】
最初の段階として、アジスロマイシンの薬効を評価した。毒性研究を行うため、低用量及び高用量（下記に詳述される）でＳＭＡマウスのＣＮＳにアジスロマイシンを直接投与する。上記研究は、生後（ＰＮＤ）３日目又は５日目に投与された３つのマウス群（ビヒクル、低用量及び高用量のアジスロマイシン）を含む。各群は、２群に分けられ、２５匹〜３０匹の動物を含む。その後、アジスロマイシンが１０μｇ／ｍｌで有効であり、マウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）の容量がおよそ３５μｌであることから、低用量及び高用量として、それぞれ、マウス１匹当たり１μｇ及び１０μｇを投与する。
【０３０４】
第２段階として、以下のパラメーター、すなわち、マウス生存、正向反射、チューブ試験スコア（tube test score）、重力走性等を含む筋力をモニタリングすることによりアジスロマイシンの薬効を評価し、上記研究のエンドポイントは、２つの時点における終了、すなわち、期待される寿命の中間点の間であるＰＮＤ９において半分の群、またマウスが機能的な死のエンドポイントにあるか、それに近い時であるＰＤＮ１４においてもう半分の群の終了を含む。
【０３０５】
計測した追加のパラメーターは、脳、腎臓、脊髄、及び骨格筋を含む、回収した組織中のアジスロマイシン及びＳＭＮ２の含有量である。関連する組織の組織学的検査も行う。
【０３０６】
実施例１１
他の化合物と併用してマクロライドを使用するＳＭＮ活性の回復
上記に実証されるように、アジスロマイシンは、ＳＭＮ２発現の翻訳レベルで活性であり、すなわち、アジスロマイシンは、停止コドンを持つＳＭＮ２メッセンジャーＲＮＡのリードスルー翻訳によりＳＭＮ２遺伝子からＳＭＮタンパク質の発現を誘導することができる。転写及び転写後の他の２つのレベルは、以下に詳述されるようにアジスロマイシンと追加の化合物との組合せを用いる処理の標的である。
【０３０７】
具体的には、マクロライドと併用して臨床研究に使用するため以下の作用剤を選択する。
【０３０８】
（１）転写を誘導することができる作用剤−ＳＭＮ２のｐｒｅ−ｍＲＮＡは優先的にＳＭＮΔ７を産生するが、転写における全体的な増加は、ＳＭＮΔ７ｍＲＮＡと同様に全長ＳＭＮ２（ＳＭＮ２−ＦＬ）を増加して、より高レベルの全長ＳＭＮ２を生じるであろう。
【０３０９】
例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、ＤＮＡクロマチン圧縮を抑制することによりＳＭＮ２転写増強を促進する。スカベンジャーｍＲＮＡデキャッピング酵素（ＤｃｐＳ、ｍＲＮＡの５’キャップが媒介する分解に関与する酵素）阻害剤（Repligen/Pfizer）であるキナゾリン誘導体ＲＧ３０３９によるプロモーター増強。ＲＧ３０３９の経口投与は、ＳＭＡマウスにおいて用量依存的なＳＭＮの増加をもたらし、約２０％〜３０％生存を延長すると報告された（１９）。したがって、キナゾリン誘導体ＲＧ３０３９は、ＳＭＮ２−ＦＬレベルを増加するためアジスロマイシンと併用される。
【０３１０】
（２）転写後修飾（スプライシング）を誘導することができる作用剤−すなわち、ＳＭＮ２由来転写産物の大半からＳＭＮエクソン７を切除する選択的スプライシング事象を抑制することにより、ＳＭＮ２からＳＭＮ−ＦＬ／ＳＭＮΔ７の比率を増加する。
【０３１１】
そのため、アンチセンスＡＳＯ−１０−２７分子を使用する（ISIS/Biogen/Genzyme）。アンチセンスＡＳＯ−１０−２７は、軽度のＳＭＡのマウスモデルにおける耳及び尾部のネクローシスを訂正して、重症ＳＭＡマウスにおける生存期間中央値をＩＣＶ注入後に１６日から２６日に延長すると報告された（２０）。
【０３１２】
実施例１２
アッシャー症候群（ＵＳＨ）における機能性タンパク質の回復
全てのＵＳＨ症例のおよそ１２％がナンセンス変異によってもたらされる。ナンセンス変異の例は、スキャフォルドタンパク質であるハルモニンをコードするＵＳＨ１Ｃ遺伝子中のＲ３１Ｘである。
【０３１３】
ＵＳＨと関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライド系抗生物質の能力を以下の実験によりアッセイする。
１．野生型又はＲ３１Ｘ変異型のハルモニンでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の免疫蛍光法及びウェスタンブロット分析。Ｒ３１Ｘ変異体でトランスフェクトした細胞をマクロライドで処理する。ハルモニンの過剰発現を計測し、ＷＴ発現細胞、マクロライド処理を伴う及び伴わないＲ３１Ｘ変異体発現細胞を比較する。
２．グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイ。回復したハルモニンのタンパク質機能を試験するため、ＵＳＨ２ａアイソフォームｂ７の細胞質側末端におけるハルモニンＰＤＺ１ドメインとＰＢＭ（ＰＤＺ結合モチーフ）との間の特異的相互作用を計測する。
３．アクチンフィラメント束。ハルモニンのアクチンフィラメント束を誘導する能力を試験する。
４．網膜アッセイ、外植片。マウスの網膜外植片にエレクトロポレーションによって赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）に融合した変異型ハルモニンを含有するコンストラクトを導入する。マクロライドによる処理を適用し、蛍光顕微鏡検査によりＲＦＰ発現の分析を行う。
【０３１４】
実施例１３
ハーラー症候群と関連する機能性アルファ−ｌ−イズロニダーゼ遺伝子産物の回復
ハーラー症候群を伴う患者に最も頻繁に見出される２つの変異であるアルファ−ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）遺伝子のＱ７０Ｘ及びＷ４０２Ｘのナンセンス変異は、ヨーロッパ家系の患者の約７０％に存在する。
【０３１５】
ハーラー症候群と関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライド系抗生物質の能力を以下の実験によりアッセイした。
１．処理のもとでリードスルーを試験する、網状赤血球におけるアルファ−ｌ−イズロニダーゼのＷＴ及び変異型のｃＤＮＡの発現。転写／翻訳系に連結したウサギ網状赤血球溶解物（Promega）を使用する。
２．健康な被験体及びＩＤＵＡ遺伝子変異を有する患者から初代ヒト皮膚線維芽細胞を得る。線維芽細胞を以下のアッセイに使用する。
３．特異的抗体を使用する、免疫定量アッセイ及びウェスタンブロット分析。
４．蛍光発生基質である４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−イズロニド（英国チェシャー州のGlycosynth）、４−メチル−ウンベリフェロンイズロニド（ＦＭＵ）（Calbiochem OR Gold Biotech）を使用してα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を計測する。切断された遊離ＦＭＵ分子の蛍光発光を計測する。
５．高分子を放射性標識することにより、又はＢｌｙｓｃａｎキット（英国のBiocolor Ltd.）による硫酸化ＧＡＧ定量を使用することにより、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）蓄積（活性）を計測する。
６．ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（分子プローブ）を使用する細胞の染色により、正常なリソソーム存在量を検出する。
７．ホモ接合体Ｉｄｕａ−Ｗ３９２Ｘマウス及びＷＴマウスに由来するマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用する組織培養アッセイ。
８．ＣＨＯ−Ｋ１（Ｑ７０、Ｗ４０２）：変異型ＩＤＵＡ遺伝子を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを特異的に検出する免疫捕捉アッセイ（immune capture assay）により検出可能なα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を含有しない。対照的に、全長野生型ＩＤＵＡのＣＨＯ−Ｋ１発現がクローン化細胞株において１ｍｇ当たり３０ｎｍｏｌ／分超のα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を生じることが見出された。
【０３１６】
ハーラー症候群と関連するナンセンス変異のリードスルーを誘導するマクロライド系抗生物質の能力も後述の動物モデルを使用してアッセイした。
【０３１７】
Ｉｄｕａ−Ｗ３９２Ｘ変異を保有するＭＰＳ  Ｉ−Ｈのノックインマウスモデルを使用する。ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ患者に頻繁に見出されるＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ変異に対応する、この変異アレルについてホモ接合型のマウスは、ヒトＭＰＳ  Ｉ−Ｈ疾患に非常によく似た表現型を呈することがわかった。組織及び尿のＧＡＧレベルを計測する。
【０３１８】
上述の具体的な実施形態の説明は、他者が現在の知識を適用することによって、不要な実験をすることなく、また一般的な概念から逸脱することなく、かかる具体的な実施形態を容易に変更することができ、及び／又はそれらを様々な用途に適合できる、本発明の一般的な特徴を完全に明らかにするものであり、したがって、かかる適合及び変更は、開示される実施形態と均等の意味及び範囲の内に包含されるべきであり、またそのように意図される。本明細書で採用される表現法又は用語法は説明の目的であって、限定を目的とするものではないことが理解される。様々な開示される機能を実施するための手段、材料及び工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替的な形態をとり得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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