(57)【要約】  特に、医薬水性ナノ懸濁液であって、(i) ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む、前記医薬水性ナノ懸濁液が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む、医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項２】
前記安定剤が、界面活性剤又は界面活性剤ポリマーである、請求項1記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項３】
前記安定剤がポリビニルピロリドンである、請求項2記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項４】
実質的にシクロデキストリンを含まない、請求項1〜3のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項５】
前記ナノ懸濁液の体積中位径（Dv(0.50)）が、約0.050 μm〜約0.600 μmである、請求項1〜4のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項６】
前記ナノ懸濁液中の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドの濃度が少なくとも20 mg/mL、例えば少なくとも30 mg/mL、少なくとも40 mg/mL、少なくとも50 mg/mL、少なくとも60 mg/mL、少なくとも70 mg/mL、又は少なくとも80 mg/mLである、請求項1〜5のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項７】
浸透圧調節剤をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項８】
前記浸透圧調節剤が、NaCl、マンニトール、及びグルコースからなる群から選択される、請求項7記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項９】
約250 mOsm/kg〜約350 mOsm/kg、例えば約280 mOsm/kg〜約320 mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項1〜8のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１０】
前記ナノ懸濁液が等張である、請求項1〜9のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１１】
前記ナノ懸濁液が最大40 kGyのガンマ線による照射に対し安定である、請求項1〜10のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１２】
前記ナノ懸濁液が25℃、相対湿度60%で最大6週間の保存に対し安定である、請求項1〜10のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１３】
非経口投与のための、請求項1〜12のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１４】
静脈内投与のための、請求項13記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１５】
1以上の追加の薬剤をさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１６】
前記追加の薬剤が、抗菌剤である、請求項15記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１７】
前記抗菌剤が、カルバペネム、アミノグリコシド、ポリミキシン、グリシルサイクリン、リファンピシン、及びスルバクタムからなる群から選択される、請求項16記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１８】
粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドの水中懸濁液を湿式ミルで粉砕することにより得ることができる、請求項1〜17のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項１９】
4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドのナノ粒子の制御沈殿により得ることができる、請求項1〜17のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項２０】
治療に使用するための、請求項1〜19のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項２１】
微生物感染症の治療に使用するための、請求項1〜19のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液。
【請求項２２】
微生物感染症の治療用薬剤を製造するための、請求項1〜19のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液の使用。
【請求項２３】
治療有効量の請求項1〜19のいずれか1項記載の医薬水性ナノ懸濁液を対象に投与することを含む、微生物感染症の治療方法。
【請求項２４】
前記微生物感染症が、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)、及びバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)株などの多剤耐性株を含む黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマニ、炭疽菌、クラミドフィラ・ニューモニエ、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎桿菌、髄膜炎菌、淋菌、S．インターメディウス、P．ムルトシダ、気管支敗血症菌、M．ヘモリチカ、及びA．プルロニューモニエ、並びにまた、ヒト結核菌などの細菌又はマラリア原虫などの他の生物による、ヒト又は動物の感染症である、請求項21記載の使用のための医薬水性ナノ懸濁液、請求項22記載の使用、又は請求項23記載の治療方法。
【請求項２５】
(a) 粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む水性懸濁液を製造する工程；及び
(b) 工程(a) の水性懸濁液をミルで粉砕し、ナノ粒子の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含む、医薬水性ナノ懸濁液の製造方法。
【請求項２６】
前記安定剤が、界面活性剤又は界面活性剤ポリマーである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記安定剤がポリビニルピロリドンである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
工程(b)が、ミル粉砕媒体を前記懸濁液に加え、続いてローラーミル上に配置する工程を含む、請求項25〜27のいずれか1項記載の方法。
【請求項２９】
前記得られるナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが、約0.050 μm〜約0.600 μmの体積中位径（Dv0.5）を有する、請求項25〜28のいずれか1項記載の方法。
【請求項３０】
前記工程(a)における4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが、実質的に実施例1又は実施例2の手順に従って製造される、請求項25〜29のいずれか1項記載の方法。
【請求項３１】
工程(a)における4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが、実質的に図1に示されているXRPDパターンを有する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
請求項25〜31のいずれか1項記載の方法により得ることができる、医薬水性懸濁液。
【請求項３３】
(i) 有機溶媒に4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを溶解する工程；
(ii) 溶液を均一に維持しながら、工程(i)の溶液を水に溶解した安定剤の溶液に加える工程；
(iii) 工程(ii)の溶液を撹拌する工程；及び
(iv) 工程(iii)の溶液をゆっくりと冷水に加え、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含む、医薬水性ナノ懸濁液の製造方法。
【請求項３４】
前記工程(i)の有機溶媒が、酢酸エチルである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記安定剤が界面活性剤又は界面活性剤ポリマーである、請求項33又は請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記安定剤がポリビニルピロリドンである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
工程(iii)が約30℃〜約50℃、適当には約40℃の温度で実施される、請求項33〜36のいずれか1項記載の方法。
【請求項３８】
工程(iv)が、約0℃〜約5℃、適当には約2℃の温度で実施される、請求項33〜37のいずれか1項記載の方法。
【請求項３９】
前記得られるナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが、約0.050 μm〜約0.600 μmの体積中位径（Dv0.5）を有する、請求項33〜38のいずれか1項記載の方法。
【請求項４０】
浸透圧調節剤を加える工程をさらに含む、請求項25〜39のいずれか1項記載の方法。
【請求項４１】
前記浸透圧調節剤が、NaCl、マンニトール、及びグルコースからなる群から選択される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記ナノ懸濁液が等張である、請求項25〜41のいずれか1項記載の方法。
【請求項４３】
前記ナノ懸濁液が、約250 mOsm/kg〜約350 mOsm/kg、例えば約280 mOsm/kg〜約320 mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項25〜41のいずれか1項記載の方法。
【請求項４４】
請求項33〜43のいずれか1項記載の方法によって得ることができる、医薬水性ナノ懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公知の抗菌剤の新規医薬ナノ懸濁液に関する。また、本発明は、そのようなナノ懸濁液を製造する方法及び微生物感染症の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質耐性病原体の出現は、重大な世界的な医療問題となっている。実際に、いくつかの感染症は、現在利用可能な治療にもはや応答しない多剤耐性生物によって現在引き起こされている。
【０００３】
細菌脂肪酸生合成(FASII系)は、新規の抗菌剤及び抗寄生虫剤の開発のために多くの関心を生み出した(Rockらの文献、J. Biol. Chem. 2006, 281, 17541；Wright及びReynoldsの文献、Curr. Opin. Microbiol. 2007, 10, 447)。一部の細菌及び寄生虫の個別の酵素に基づく細菌脂肪酸生合成経路における成分の構成は、哺乳動物に見られる多機能なFASI系とは根本的に異なるので、選択的な阻害の見込みが十分にある。細菌のFASII系の多くの酵素における全体的に高度な保存も、スペクトルの広い抗菌剤及び抗寄生虫剤の開発を可能にするはずである。
【０００４】
細菌FASII系の全ての単機能酵素の中で、FabIは、脂肪酸生合成伸長サイクルの最後の段階に関与するエノイル-ACPレダクターゼに相当する。補因子NAD(P)Hをヒドリド源として用いて、FabIは、トランス-2-エノイル-ACP中間体中の二重結合を還元して、対応するアシル-ACP生成物にする。この酵素は、大腸菌(E. Coli)(Heathらの文献、J. Biol. Chem. 1995、270、26538；Berglerらの文献、Eur. J. Biochem. 1996、242、689)、及び黄色ブドウ球菌(S. aureus)(Heathらの文献、J. Biol. Chem. 2000、275、4654、Escaichらの文献、AAC 2011、55 (10)、4692、Geruszらの文献、JMC 2012、55、9914)などの主な病原体における非常に重要な標的を構成することが示されている。しかしながら、他のアイソフォームが単離されており、例えば、FabKが肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)(Heathらの文献、Nature 2000、406、145)から、FabLが枯草菌(B. subtilis)(Heathらの文献、J. Biol. Chem. 2000、275、40128)から単離されている。FabKは、構造的にも機構的にもFabIとは関連しないが(Marrakchiらの文献、Biochem J. 2003、370、1055)、それでもFabIとFabL(枯草菌)、InhA(ヒト結核菌(M. tuberculosis))、及びPfENR(マラリア原虫(P. falciparum))との類似性は、興味深い活性スペクトルの機会を与える(Heathらの文献、Prog. Lipid Res. 2001、40、467)。
【０００５】
いくつかのFabI阻害剤が既に文献に報告されている(Tongeらの文献、Acc. Chem. Res. 2008、41、11)。そのうちのいくつか、例えば、ジアザボリン(Baldockらの文献、Science 1996、274、2107)及びその活性化形態のイソニアジド(Tongeらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003、100、13881)は、補因子NAD+を共有結合的に修飾することにより作用する。しかしながら、これらの産物には欠点がいくつかある。ジアザボリンは、その固有の毒性のために実験的にしか使用されておらず(Baldockらの文献、Biochem. Pharmacol. 1998、55、1541)、一方で、イソニアジドは、感受性のある結核の治療に限定されるプロドラッグである。イソニアジドが過酸化水素誘導性酵素による活性化を要求するという事実(Schultzらの文献、J. Am. Chem. Soc. 1995、117、5009)により、活性化の欠如又は解毒の増大による耐性の可能性が高まる(Rosnerらの文献、Antimicrob. Agents Chemother. 1993、37、2251及び同誌1994、38、1829)。
【０００６】
他の阻害剤は、酵素-補因子複合体と非共有結合的に相互作用することにより作用する。例えば、トリクロサンは、幅広いスペクトルの抗菌活性を有する広く使用されている消費財防腐剤であり、大腸菌FabIの可逆的で、結合の強い阻害剤であることが分かっている(Wardらの文献、Biochemistry 1999、38、12514)。この化合物に関する静脈内毒性試験は、ラットに対する29mg/kgというLD50を示し、これは静脈内注射が明らかに不可能であることを示した(Lymanらの文献、Ind. Med. Surg. 1969、38、42)。トリクロサンの2-ヒドロキシジフェニルエーテルコアに基づく誘導体(Tongeらの文献、J. Med. Chem. 2004、47、509、ACS Chem Biol. 2006、1、43及びBioorg. Med. Chem. Lett. 2008、18、3029；Suroliaらの文献、Bioorg. Med. Chem. 2006、14、8086及び同誌2008、16、5536；Freundlichらの文献、J. Biol. Chem. 2007、282、25436)並びに様々なクラスのハイスループットスクリーニング誘導テンプレートに基づく他の阻害剤(Seefeldらの文献、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001、11、2241及びJ. Med. Chem. 2003、46、1627；Heerdingらの文献、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001、11、2061；Millerらの文献、J. Med. Chem. 2002、45、3246；Payneらの文献、Antimicrob. Agents Chemother. 2002、46、3118；Sacchettiniらの文献、J. Biol. Chem. 2003、278、20851；Moirらの文献、Antimicrob. Agents Chemother. 2004、48、1541；Montellanoらの文献、J. Med. Chem. 2006、49、6308；Kwakらの文献、Int. J. Antimicro. Ag. 2007、30、446；Leeらの文献、Antimicrob. Agents Chemother. 2007、51、2591；Kitagawaらの文献、J. Med. Chem. 2007、50、4710、Bioorg. Med. Chem. 2007、15、1106及びBioorg. Med. Chem. Lett. 2007、17、4982；Takahataらの文献、J. Antibiot. 2007、60、123；Kozikowskiらの文献、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008、18、3565)が報告されているが、これらの阻害剤はいずれも、薬物として未だ成功を収めていない。興味深いことに、これらの阻害剤のうちのいくつかのクラスはFabIとFabKの両方に対する活性を示す：4-ピリドンのフェニルイミダゾール誘導体に基づくデュアル化合物についてはFabKが優勢であり(Kitagawaらの文献、J. Med. Chem. 2007、50、4710)、インドール誘導体についてはFabIが優勢である(Payneらの文献、Antimicrob. Agents Chemother. 2002、46、3118；Seefeldらの文献、J. Med. Chem. 2003、46、1627)。しかしながら、2つ目の酵素に対する中程度の活性は、加えられた選択圧力による耐性機構の増大につながり得るので、そのような化合物の欠点であることを証明するかも知れない(Tongeらの文献、Acc. Chem. Res. 2008、41、11)。
【０００７】
しかしながら抗菌／抗寄生虫標的としてのFabIの魅力にもかかわらず、この魅力は現時点でほとんど利用されていない。
【０００８】
国際出願WO 2007/135562(Mutabilis SA)は、トリクロサンと対照的に、FabI及び関連標的を含む種に対する選択的なスペクトルの活性を示す一連のヒドロキシフェニル誘導体を記載している。式(I)の具体的なヒドロキシフェニル化合物は、国際出願WO 2011/026529 (FAB Pharma SAS)に記載されている：
【化１】
2016529273.tif 000002
。
【０００９】
WO 2011/026529に記載されているように、式(I)の化合物（本明細書では「化合物(I)」と呼ぶ）は4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドとして化学的に知られており、インビトロで病原性メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)、及びバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)株に対する高い活性を示すことが見出されている。また、この化合物は大腸菌、及びアシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)を含む他の病原性細菌に対する活性も示す（Escaichらの文献、AAC 2011, 55 (10), 4692, Geruszらの文献、JMC 2012, 55, 9914）。さらにまた、化合物(I)はマウスモデルにおいてインビボでもMSSA及びMRSAによる感染症に対する活性を示す。化合物(I)は第I相試験で健常ヒトボランティアにおいて評価され、エクスビボで黄色ブドウ球菌に対する細菌殺傷活性を示すことが報告された。
【００１０】
化合物(I)は比較的水溶性に乏しい。WO 2011/026529の実施例3に記載されている化合物(I)を含む注射可能な医薬組成物（本明細書において「従来技術における過去の製剤」と呼ぶ）は、化合物(I)、水、浸透圧調節剤としてのグルコース一水和物、及び可溶化剤としてのヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPBCD）からなる。この製剤を用いると、化合物(I)を最大11.3 mg/mLの濃度で製剤化することができる。しかしながら、以下に論じるように潜在的な毒性リスクがあるため、製剤におけるシクロデキストリンの使用については、慎重に検討しなくてはならない。
【００１１】
シクロデキストリンは、1〜4本の結合を介して結合された、6〜8個のデキストロース単位からなる環状オリゴ糖（それぞれ、アルファ-、ベータ-、及びガンマ-の「親」シクロデキストリン）である。シクロデキストリンは食品および医薬製品において長年使用されており、その薬物分子と包接複合体を形成する能力のために、医薬組成物において特に有用である。そのような包接複合体の形成により、溶解性を向上させるなど、該薬物分子の物理化学的特性を高めることができる。
【００１２】
経口投与に際し、未加工のシクロデキストリンは、そのかさばった、かつ疎水性の特質のためにわずか少量しか胃腸管から吸収されず、全ての該親シクロデキストリンは食品添加物として受け入れられており、「一般に安全と認知されている」（GRAS）。対照的に、IV投与されたシクロデキストリンは、全身の循環から速やかに消失する。吸収に続いて、シクロデキストリンは様々な組織に分配されるが、腎臓が最も高レベルを保有し、シクロデキストリンの排出は、腎クリアランスに強く依存することが見出されている（Stellaらの文献、Toxicol. Pathol. 2008, 36, 30）。腎臓における一連の変化に明示されるように、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、又はメチル化-β-シクロデキストリンの非経口的投与は、腎毒性を引き起こすことが観察されている（Frankらの文献、Am. J. Pathol. 1976, 83, 367; Irieらの文献、J. Pharm. Sci. 1997, 86, 147）。市販の静注用製剤中のHPBCDの報告されている最大の安全一日用量は、16 g/日である（Brewsterらの文献、Advanced Drug Delivery Review 2007, 59, 645）。薬物製剤に使用する賦形剤の選択に際し、安全性は最も重要な事柄であるため、何らかの有害副作用を示す賦形剤の使用は可能な限り回避すべきである。
【００１３】
本発明の目的は、HPBCDを含まない化合物(I)の医薬として許容し得る新規製剤を提供することである。適当には、該新規製剤は潜在的に従来技術における過去の製剤と比較して高濃度の化合物(I)を含むことができ、凝集に抵抗性であり、それにより許容し得る長期の保存安定性を有する。適当には、該新規製剤は、従来技術における過去の化合物(I)の製剤と比較して、同等の又は向上したインビボにおける有効性を有する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、化合物(I)の新規医薬水性ナノ懸濁液を製造した。該医薬水性ナノ懸濁液は、HPBCD及びその潜在的腎毒性を免れるという利点、及び化合物(I)を従来技術における過去の製剤と比較してずっと高い濃度で製剤化させるという実際的な利点を有する。実施例に示されているように、そのようなナノ懸濁液は凝集に抵抗性であり、照射に対し安定であり、優れた長期保存安定性、投与に適した特性、及び細菌感染症の治療に使用する場合に適当な有効性を有する。
【００１５】
従って、一態様において、本発明はナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む医薬水性ナノ懸濁液（本明細書では以下、「本発明の医薬ナノ懸濁液」又は「本発明のナノ懸濁液」と呼ぶ）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、実施例1の手順を用いて製造された化合物(I)の試料のXRPDパターンを示す。
【００１７】
【図２】図2は、制御沈殿により製造された本発明のナノ懸濁液の試料の粒度分布（PSD）を示す（実施例8及び9）。
【００１８】
【図３】図3は、制御沈殿により製造された本発明のナノ懸濁液の試料の熱重量分析（TGA）を示す（実施例10）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド（化合物(I)）
化合物(I)を合成する一般的な方法は、WO 2007/135562に開示されており、その内容は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。化合物(I)を合成する具体的な方法は、WO 2011/026529の「実施例1（代替手順）」に記載されており、その内容も、その全体が引用により組み込まれている（また、本出願の実施例1も参照されたい）。
【００２０】
本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、活性成分として化合物(I)を治療有効量含む。治療有効量の化合物(I)は、所与の用量、又は複数の分離した用量について、治療プロトコルの中で対象に投与した際に、該対象において治療的意義のある効果を達成するに十分な量として定義される。
【００２１】
一実施態様において、本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、約1 mg/mL〜約1000 mg/mLの化合物(I)を、例えば約1 mg/mL〜約500 mg/mL、又は約10 mg/mL〜約100 mg/mL、例えば約90 mg/mLの化合物(I)を含む。別の実施態様において、本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、少なくとも20 mg/mLの化合物(I)を、例えば少なくとも30 mg/mL、少なくとも40 mg/mL、少なくとも50 mg/mL、少なくとも60 mg/mL、少なくとも70 mg/mL、又は少なくとも80 mg/mLの化合物(I)を含む。本発明の水性ナノ懸濁液は、有利には化合物(I)を従来技術における過去の製剤におけるものよりもずっと高い濃度で製剤化することを可能とする。
【００２２】
本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、結晶形態の化合物(I)、例えば、実質的に実施例1又は実施例2に従う手順によって製造された化合物(I)、及び/又は実質的に図1に示されるXRPDパターンを有する化合物(I)から製造することができる。
【００２３】
（本発明の医薬水性ナノ懸濁液）
本発明のナノ懸濁液は、化合物(I)のナノ粒子を含み、該ナノ粒子は、本明細書において1 μm未満の大きさを有する粒子と定義される。本発明のナノ懸濁液は適当には1 μm未満の第一粒度を有し、すなわち、粒度分析（適当には、体積分布）において最も大きなピークが1 μm未満の粒径に相当する。粒度分析のために適当な方法は、例えば、Malvern Instruments社製Mastersizer 2000装置を用いたレーザー回折法、又は例えば、Beckmann Coulter N4装置を用いた動的光散乱法である。また、レーザー回折法は、粒度分布（PSD）を決定するために使用することもでき、該粒度分布は通常体積径（Dv）の観点で定義される。Dv(0.50)、すなわちその中央値は、体積分布の半分がこの値より下に位置する径として定義される。同様に、体積分布の90%がDv(0.90)より下に位置し、該分布の10%がDv(0.10)の下に位置する。用語Dv(0.99)も同様に解釈できる。
【００２４】
該ナノ懸濁液は適当には約0.050 μm〜約0.800 μmの、例えば約0.050 μm〜約0.600 μm、約0.100 μm〜約0.500 μm、約0.100 μm〜約0.400 μm、約0.100〜約0.300 μm、約100 μm〜約200 μm、約0.100 μm〜約0.800 μm、約0.200 μm〜約0.600 μm、約0.300 μm〜約0.500 μmの体積中位径（Dv(0.50)）を有する。
【００２５】
該ナノ懸濁液は、適当には約0.010 μm〜約0.300 μmの、例えば約0.010 μm〜約0.100 μm、又は約0.100 μm〜0.300 μmのDv(0.10)を有する。
【００２６】
該ナノ懸濁液は、適当には約0.300 μm〜約0.900 μmの、例えば約0.300 μm〜約0.500 μm、又は約0.500 μm〜約0.900 μmのDv(0.90)を有する。
【００２７】
本発明者らは、ナノ粒子形態の化合物(I)の安定な水性ナノ懸濁液を、可溶化剤としてHPBCDを用いることなく製造できることを発見した。従って、一実施態様において、本発明の医薬水性組成物は実質的にシクロデキストリン、特にHPBCDを含まない。
【００２８】
薬物ナノ懸濁液について知られている欠点は、とりわけ沈殿及びオストワルド熟成効果が原因で、その長期安定性が限定されていることである。本発明の水性ナノ懸濁液は、優れた長期安定性を示すことが見出されている。
【００２９】
本発明の水性ナノ懸濁液は、該溶液中でのナノ粒子の集塊を防ぐことにより、かつ大きな粒子、すなわち1 μm超の大きさの粒子の形成を防ぎ、又は最小化することにより、ナノ懸濁液を安定化する安定剤を含む。そのような安定剤の例は当業者に周知である。適当には、該安定剤は界面活性剤又は界面活性剤ポリマーである。適当には該安定剤は水溶性である。本発明のナノ懸濁液中で使用するための適当な界面活性剤としては、限定はされないが、ポリソルベート界面活性剤、ポロキサマー界面活性剤、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム（DOSS）が挙げられる。典型的なポリソルベート界面活性剤は、Tween（登録商標）、例えばTween 20（登録商標）又はTween 80（登録商標）である。典型的なポロキサマー界面活性剤としては、ポロキサマー188及びポロキサマー228が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ポビドン又はPVPとしても知られる）はN-ビニルピロリドンのモノマーから作られる水溶性ポリマーである。適当な界面活性剤ポリマーはポリビニルピロリドン（PVP）である。PVPはしばしば平均分子量を特徴づけるK値の観点から、例えばポビドンK12、ポビドンK17、ポビドンK25、ポビドンK30、及びポビドンK90のように定義される。PVPはプラスドンC-15（登録商標）、コリドン12PF（登録商標）、コリドン17PF（登録商標）及びコリドン30（登録商標）などの様々な商用名で利用することができる。一実施態様において、該PVPは約2,000 Da〜1,500,000 Daの平均分子量、例えば約2,000 Da〜約5,000 Da;約6,000 Da〜約12,000 Da;約25,000 Da〜約40,000 Da;約41,000 Da〜約65,000 Da、又は約1,000,000 Da〜約1,500,000 Daの平均分子量を有する。適当には、該PVPは約2,000 Da〜約3000 Daの平均分子量（コリドン12に相当する）を有する。
【００３０】
好ましくは、該安定剤はPVPである。PVPは医薬製造に広く使用されており、よく許容される。
【００３１】
本発明のナノ懸濁液は、該ナノ懸濁液の許容し得る長期保存安定性を提供するに十分な量、すなわち集塊を防ぎ、かつ/又は保存による1 μm超の大きさの粒子の形成を防ぐ/最小化する量の安定剤を含む。例えば、典型的には該安定剤はナノ懸濁液を安定化し、5℃/周囲相対湿度の条件下、又は25℃/60%相対湿度の条件下で保存した場合に、粒度分布における第一ピークが1 μm未満の粒子径、例えば0.800 μm未満の、0.700 μm未満の、0.600 μm未満の、又は0.500 μm未満の粒子径に、少なくとも2ヶ月、例えば少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも12ヶ月、又は少なくとも24ヶ月維持されるようにする。ナノ懸濁液中の安定剤の正確な量は、化合物(I)の濃度及び使用される特定の安定剤に応じて決定される。
【００３２】
一実施態様において、該安定剤は該ナノ懸濁液中に約1 mg/mL〜約1000 mg/mLの濃度で、例えば約1 mg/mL〜約500 mg/mL、約1 mg/mL〜約250 mg/mL、約10 mg/mL〜約100 mg/mL、又は約20 mg/mL〜75 mg/mLの濃度で存在する。
【００３３】
別の実施態様において、該安定剤はPVPであり、該ナノ懸濁液中に約1 mg/mL〜約500 mg/mLの濃度で、例えば約1 mg/mL〜約250 mg/mL、約10 mg/mL〜約100 mg/mL、又は約20 mg/mL〜75 mg/mL、例えば約50 mg/mLの濃度で存在する。
【００３４】
溶媒蒸発、溶媒注入、及びスプレー乾燥した粉末の再構成により化合物(I)のナノ粒子を製造する試みは、化合物(I)の大きな、ナノ粒子でない粒子が形成されるために適当でないことが見出されている。油中油、油中水系のような代替の溶媒蒸発系が調査されたが、大きな粒度は依然として観察された。水中油系の連続相への溶媒の溶解を低減する試みにおいて、水相を異なる塩で飽和させ、溶媒の溶解性を低下させた。しかしながら、依然として大きな結晶が観察され、該飽和塩系の使用による利益はほとんど何も達成されなかった。濃縮された水性ポリマー溶液の使用により、結晶形成が中断され、又は防がれるであろうと考えられた。複数の分子量及び濃度のPVPが試験された。低分子量PVP（3,500 Da）は、化合物(I)の4.4 μmの粒子の懸濁液を作製するのに適していることが見出された。粒度がさらに（1 μm未満、すなわちナノ粒子形態へと）低下することを期待して、さらに界面活性剤を加えた。しかしながら、対照的に、該溶液へのさらなる界面活性剤の追加により、粒子の大きなサイズ成長がもたらされた。
【００３５】
本発明者らのさらなる実験により、化合物(I)のナノ粒子は、安定剤及び水の存在下での湿式ミル粉砕法又は制御沈殿法を用いて製造することができ、化合物(I)の安定な水性ナノ懸濁液をもたらすことが明らかとなった。安定剤としての界面活性剤の有無を問わず、溶媒蒸発及び他の方法の先の失敗を踏まえると、これは予期せぬことであった。さらに、湿式ミル粉砕及び制御沈殿により製造されるナノ懸濁液により、先に記載の通り、化合物(I)を従来技術における過去の製剤よりもずっと高い濃度で製剤化することが可能となった。
【００３６】
（本発明の医薬水性ナノ懸濁液の湿式ミル粉砕による製造）
一実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって、
(a) 粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む水性懸濁液を製造する工程；及び
(b) 工程(a) の水性懸濁液をミルで粉砕し、ナノ粒子の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含む、前記方法が提供される。
【００３７】
代表的な湿式ミル粉砕手順は、実施例3に記載されている。まず粒子性の化合物(I)を安定剤を含む水溶液中に懸濁することにより、ナノ懸濁液を製造する。粒度分布における第一ピークが1 μm未満の粒径に相当するように、又は目標とする粒度分布に到達するまで化合物(I)材料の粒度を低下させるために、該水性懸濁液に対し、続いてミル粉砕工程を実施する。
【００３８】
この実施態様において、典型的には該安定剤は、界面活性剤又は界面活性剤ポリマーである。適当には、該安定剤はPVPである。工程(a)において、該安定剤は通常化合物(I)を加える前に水に溶解させる。安定剤を溶解させた溶液に化合物(I)を加えると、化合物(I)の水中での不溶性/部分的不溶性のために懸濁液が形成される。続いて、該ミル粉砕工程(b)の準備において、該懸濁液をガラスバイアルに適切に移す。
【００３９】
ミル粉砕の工程（工程(b)）は、例えば、ミル粉砕媒体を該バイアルに加えることを含み、続いて該バイアルをローラーミル上に配置する。また、工程の順序を変更することも可能であり、例えば、最初に該ミル粉砕媒体を該バイアルに加え、続いて化合物(I)を加え、続いて該安定剤溶液を加えることも可能である。達成するべき化合物(I)の粒度、及び該バイアルの大きさに基づいて、適当なミル粉砕媒体を選択することができる。典型的なミル粉砕媒体は、セラミックビーズ（セリウム又はイットリウムで安定化させた酸化ジルコニウム）、ステンレス鋼、ガラス又は高度に架橋されたポリスチレン樹脂を含み、これらは全て様々な径、典型的には0.1〜1 mmで得ることができる。適当には、該ミル粉砕媒体は、0.5 mm径のイットリウムで安定化させた酸化ジルコニウムでできたミル粉砕ビーズである。代替の径は、1.0 mmである。該湿式ミル粉砕工程は、任意の適当な装置、例えばローラーミル又はローターステーター湿式ミルを用いて遂行することができる。
【００４０】
一実施態様において、工程(a)で使用される化合物(I)の出発物質は、実質的に実施例1又は実施例2の手順に従って製造される。この実施態様において、該化合物(I)の出発物質は実質的に図1に示されているXRPDパターンを有する。
【００４１】
一実施態様において、化合物(I)を、約1 mg/mL〜約500 mg/mLの濃度で、例えば約10 mg/mL〜約100 mg/mL、例えば約90 mg/mL、又は約10 mg/mL〜約400 mg/mL、例えば約100 mg/mL〜約300 mg/mLの濃度で加える。出発懸濁液（すなわち、湿式ミル粉砕の前の懸濁液）の組成はミル粉砕プロセスの間に変化しないため、ナノ懸濁液中の化合物(I)の濃度はミル粉砕プロセス全体を通じて、及び最終ナノ懸濁液において、同程度（実験的誤差の範囲内）のままであると期待することができる。
【００４２】
一実施態様において、該安定剤はPVPであり、約10 mg/mL〜約100 mg/mLの濃度で、例えば約20 mg/mL〜75 mg/mL、例えば約50 mg/mL、又は約50 mg/mL〜200 mg/mL、例えば約50 mg/mL〜150 mg/mLの濃度で加える。
【００４３】
出発懸濁液（すなわち、湿式ミル粉砕の前の懸濁液）の組成はミル粉砕プロセスの間に変化しないため、該ナノ懸濁液中のPVPの濃度（又はより一般的に、該安定剤の濃度）は全体を通じて概ね同等のままであると期待される。
【００４４】
適当には、両工程(a)及び(b)は室温で遂行される。
【００４５】
工程(b)、すなわち、ミル粉砕プロセスは、所望の粒度に到達するのに要求される限りの間遂行される。例えば、ミル粉砕工程(b)は、少なくとも90%の懸濁粒子が1.000 μm、0.900 μm、0.800 μm、0.700 μm、0.600 μm、若しくは0.500 μmより小さくなるまで、又は目標の粒度分布に到達するまで、遂行することができる。
【００４６】
一実施態様において、粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤の水中懸濁液を湿式ミル粉砕することにより得ることができる、医薬水性ナノ懸濁液が提供される。
【００４７】
実施例3に記載の湿式ミル粉砕手順により製造されたナノ懸濁液の3つの異なるバッチの粒度分布（PSD）を分析し、その結果を実施例4に示した。該PSDは、以下の通りであった：Dv(0.10)＝0.066〜0.067 μm；Dv(0.50)＝0.133〜0.134 μm；及びDv(0.90)＝0.314〜0.358 μm。この結果は、まず第一に、該手順が所望の大きさの粒子（すなわち、ナノ粒子）を形成したことを示し、かつ第二に、それぞれのバッチにおいて非常によく似た粒度分布が観察されたため、該手順の再現性を示している。
【００４８】
ナノ懸濁液の保存安定性を評価するために、実施例3の湿式ミル粉砕法によって製造されたナノ懸濁液を、異なる温度及び相対湿度で異なる長さの時間保存した。その結果を実施例5に示す。ここでは、該ナノ懸濁液は典型的な保存条件下で、及び相対的に高い温度と相対湿度である「加速」条件下で、優れた安定性を示した。
【００４９】
（本発明の医薬水性ナノ懸濁液の制御沈殿による製造）
この実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって、
(i) 有機溶媒に4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを溶解する工程；
(ii) 溶液を均一に維持しながら、工程(i)の溶液を水に溶解した安定剤の溶液に加える工程；
(iii) 工程(ii)の溶液を撹拌する工程；及び
(iv) 工程(iii)の溶液をゆっくりと冷水に加え、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含む、前記方法が提供される。
【００５０】
代表的な制御沈殿手順は、実施例8に記載されている。
【００５１】
工程(i)の有機溶媒は、化合物(I)が完全に溶解する有機溶媒、例えば酢酸エチルである。一実施態様において、工程(a)において化合物(I)を有機溶媒に溶解し、約10 mg/mL〜200 mg/mL、例えば約50 mg/mL〜約100 mg/mLの濃度にする。
【００５２】
適当には、該安定剤はPVPである。該工程(i)の溶液を水と合わせるとき（すなわち、工程(ii)）、化合物(I)は均一な溶液中で完全に溶解したままである。一実施態様において、該安定剤は、界面活性剤又は界面活性剤ポリマーである。適当には、該安定剤は、水に溶解したPVPであり、適当には約40% w/wの濃度である。
【００５３】
典型的には、工程(iii)は約30℃〜約50℃、適当には40℃の温度で実施される。例えば、該工程(ii)の溶液を4時間40℃で撹拌した後、室温で一晩撹拌する。
【００５４】
典型的には、工程(iv)は冷水中で実施される。この事例における「冷」水は、化合物(I)の沈澱を誘導するに十分な低温であり、典型的には約0℃〜約5℃、適当には約2℃の水である。工程(ii)において加えられる水は冷水ではなく、すなわち、該工程(i)の溶液と合わせた際、該水は化合物(I)の沈澱を生じず、化合物(I)は溶液中に溶けたままである。典型的には工程(ii)で加えられる水は周囲温度、例えば室温で、例えば約21℃以上である。該工程(iii)の溶液が冷水に加えられる間、該冷水は、適当には約600 rpmの速度で撹拌される。適当には、該工程(iii)の溶液は冷水へと10 ml/分の速度で送出される。適当には、該溶液は冷水の液面下へ送出される。
【００５５】
該工程(iii)の溶液を加えた後、合わせた化合物(I)/有機溶媒/水/安定剤溶液は化合物(I)のナノ粒子が形成されたために濁っている。適当には、この濁った溶液（ナノ懸濁液）を冷却して一晩撹拌した後、室温へと温める。
【００５６】
該工程(iv)のナノ懸濁液を水で洗い、例えばクロスフローシステム、例えばPureTec Autopurification systemを用いて濃縮することができる。過剰なPVPなどの安定剤をクロスフロー濾過により除去することができる。
【００５７】
一実施態様において、使用する該化合物(I)の出発物質は、実質的に実施例1又は実施例2の手順に従って製造される。この実施態様において、該化合物(I)の出発物質は実質的に図1に示されたXRPDパターンを有する。
【００５８】
一実施態様において、4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドのナノ粒子の制御沈殿により得ることができる、4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む医薬水性ナノ懸濁液が提供される。
【００５９】
実施例8に記載された制御沈殿手順により製造されたナノ懸濁液の粒度分布を、実施例9に記載された通りに測定し、該ナノ懸濁液が、動的光散乱を用いて測定された391.5 nm（強度％）の平均粒度（Dv(0.50)）を有し、一切のマイクロ粒子（すなわち、1 μm超の粒子）も含まないことを見出した。ゼータ電位分析により、このナノ懸濁液の優れた電位的安定性が示された（実施例11）。
【００６０】
（医薬用途及び投与法）
実施例に示されているように、本発明の水性ナノ懸濁液は、特に微生物病原体による感染症を治療するための潜在的な治療有用性を有する。
【００６１】
一実施態様において、本明細書に記載されるように、ヒト及び動物における微生物感染症の治療に使用する医薬水性ナノ懸濁液が提供される。
【００６２】
さらなる実施態様において、本発明は本明細書に記載されるように、微生物感染症の治療用薬剤の製造のための医薬水性ナノ懸濁液の使用を提供する。
【００６３】
なおさらなる実施態様において、本発明は微生物感染症を治療する方法であって、本明細書に記載されるように、対象に有効量の医薬水性ナノ懸濁液を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００６４】
本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、FabI阻害を受けやすい細菌株に対するインビトロ及びインビボでの選択的活性スペクトルを有する治療レジメンを形成するのに特に有用である。
【００６５】
そのような株は、多剤耐性株を含む黄色ブドウ球菌(例えば、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)、及びバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)株)、アシネトバクター株（アシネトバクター・バウマニなど）、炭疽菌(Bacillus anthracis)、クラミドフィラ・ニューモニエ(Chlamydophila pneumoniae)、大腸菌、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、 S．インターメディウス（S. intermedius）、 P．ムルトシダ（P. multocida）、気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）、M．ヘモリチカ（M. haemolytica）及びA．プルロニューモニエ（A. pleuropneumoniae）、並びにまた、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）などの相同なFabI酵素、例えばInhAを有する細菌又はマラリア原虫（Plasmodium falciparum）などの他の生物を包含する。
【００６６】
欧州薬局方（Eur. Ph.）によると、270〜330 mOsm/kgのオスモル濃度が非経口用等張溶液/懸濁液について推奨されているため、本発明の実施態様において、本発明のナノ懸濁液のオスモル濃度がこの推奨範囲より低い又は高い場合、該ナノ懸濁液を、医薬組成物中で即座の使用のためにさらに製剤化することができる。従って、一実施態様において、本発明のナノ懸濁液は、浸透圧調節剤をさらに含む。適当な浸透圧調節剤としては、限定はされないが、グルコース、マンニトール、及びNaClが挙げられ、これらは典型的には水に溶解してストック溶液を形成した後、ナノ懸濁液に加える。静脈内（IV）投与に適当な等張ナノ懸濁液は、典型的には250〜350 mOsm/kgのオスモル濃度、例えば280〜320 mOsm/kgのオスモル濃度を有する。浸透圧調節剤としてグルコースを使用すると、NaClを使用した場合よりより安定なナノ懸濁液を生じるようである（実施例7A、7B、14、及び14Aを参照されたい）。従って、非荷電浸透圧調節剤（例えば、グルコース又はマンニトール、好ましくはグルコース）を使用することが好ましいようである。
【００６７】
従って、一実施態様において、本発明の水性ナノ懸濁液は、浸透圧調節剤をさらに含み、約250 mOsm/kg〜約350 mOsm/kgのオスモル濃度、例えば約280 mOsm/kg〜約320 mOsm/kgのオスモル濃度を有する。
【００６８】
実施例6、6A、及び6Bは濃縮された本発明のナノ懸濁液から製造することができ、IV投与に適当である等張製剤の具体例を提供する。該等張製剤の短期安定性を評価した。実施例7、7A、及び7Bに示されているように、実施例6、6A、及び6Bに記載される製剤は、即座のIV投与に適当であるが、これは該オスモル濃度、pH及び粒度分布が48〜69時間にわたって、及び実により長期の保存に際し、最大6週間、相対的に安定しているからである。実施例14及び14Aに示されているように、実施例6A及び6Bに記載されている製剤は、ガンマ線による照射に対し安定である。
【００６９】
本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、例えば21℃で測定した場合、3〜9のpH、例えば4〜8のpHで製剤化することができる。非限定的な例として、酢酸緩衝液を有効に利用してpHを約3.75〜5.75（例えば、pH 4.2〜5.3）に緩衝することができる。
【００７０】
本発明のナノ懸濁液は、化合物(I)に加えて、1以上の薬剤を含むことができる。適当には、追加の薬剤は、抗菌剤である。従って一実施態様において、本発明のナノ懸濁液はカルバペネム、アミノグリコシド、ポリミキシン、グリシルサイクリン、リファンピシン、及びスルバクタムからなる群から選択される抗菌剤をさらに含む。
【００７１】
カルバペネムの例としては、限定はされないが：メロペネム、イミペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム、及びビアペネムが挙げられる。一実施態様において、該カルバペネムはメロペネム又はイミペネムであり、適当にはメロペネムである。
【００７２】
アミノグリコシドの例としては、限定はされないが、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アルベカシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン及びアプラマイシンが挙げられる。一実施態様において、該アミノグリコシド抗菌剤はアミカシン、ゲンタマイシン、又はトブラマイシンであり、適当にはアミカシンである。
【００７３】
一実施態様において、該ポリミキシン抗菌剤は、コリスチン、適当にはコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムである。
【００７４】
一実施態様において、該グリシルサイクリン抗菌剤は、チゲサイクリンである。
【００７５】
一実施態様において、該追加の薬剤は、メロペネム、イミペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、コリスチン、チゲサイクリン、リファンピシン、及びスルバクタムからなる群から選択される抗菌剤であり、かつメロペネム、アミカシン、及びコリスチンからなる群から適当に選択される。
【００７６】
本発明のナノ懸濁液は従来技術における過去の製剤と比較してインビボで同等の有効性を有する。実施例16に示されているように、実施例3にしたがって製造された本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、マウスの全身感染モデルにおいて、HPBCDを含む化合物(I)の従来技術における過去の製剤と同等の黄色ブドウ球菌に対する生存率を示した。また、実施例17に示されているように、実施例3に従って製造された本発明の医薬水性ナノ懸濁液も、好中球減少マウスの腿への感染モデルにおいて、化合物(I)の従来技術における過去の製剤と比較して、MSSA及びMRSAに対し同等の有効性を示した。
【００７７】
実施例18に記載されているように、本発明の医薬水性ナノ懸濁液のラット血漿、肝臓、心臓、肺、皮膚及び骨におけるPKプロファイルを従来技術における過去の製剤と比較するため、組織分布試験を実施した。従来技術における過去の製剤について、血漿及び組織において本発明の医薬水性ナノ懸濁液と比較してより高い曝露が観察された。これは、従来技術における過去の製剤の血漿クリアランス及び分布体積が本発明の医薬水性ナノ懸濁液と比較して半分であり、その結果、より高い血漿曝露をもたらしたためである。
【００７８】
しかしながら、本発明のナノ懸濁液は従来技術における過去の製剤よりも低い血漿濃度であるにもかかわらず、組織-血漿分配係数は従来技術における過去の製剤と比較した場合、全てのマトリックスにおいて本発明の医薬水性ナノ懸濁液についてより高いことが見出された。このことは、本発明の医薬水性ナノ懸濁液が従来技術における過去の製剤よりも優れた組織への浸透性を提供し、それにより投与されるべき製剤濃度を低くしていることを示唆している。
【００７９】
適当には、本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、非経口的に、例えば、静脈内又は皮下又は腹腔内に投与される。従って、適当には本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、医薬水性非経口的ナノ懸濁液である。
【００８０】
典型的には、該対象に投与されるべき医薬水性ナノ懸濁液としての化合物(I)の用量は、約1000 mg/kg〜約 0.1 mg/kg、例えば約800 mg/kg〜約1 mg/kg、約500 mg/kg〜約10 mg/kg 又は約300 mg/kg〜約100 mg/kg、例えば約200 mg/kgである。
【００８１】
本発明の医薬水性ナノ懸濁液は、本発明のナノ懸濁液がHPBCDを含まず、従ってシクロデキストリンに伴う潜在的毒性の問題を回避し、一方従来技術の製剤よりもずっと高い濃度で化合物(I)を製剤化することを可能とするため、化合物(I)の従来技術の製剤の有利な代替物を提供する。実施例5に示されているように、本発明のナノ懸濁液は優れた長期保存性を有し、最大9ヶ月保存される。さらに、即座の製剤（非経口的投与のために適当なオスモル濃度を有する）は、適当な短期安定性を有することが見出されている。インビボにおいて、本発明のナノ懸濁液は、従来技術における過去の製剤と比較してラットPKプロファイルについて同等の有効性を有することが見出され、このことは、本発明のナノ懸濁液がより優れた組織への浸透性を有することを示唆している。
【００８２】
本発明の一実施態様において、該医薬水性ナノ懸濁液はPVPを安定剤として含む。添加剤としてのPVPは、その非毒性特性のために現在公知の製剤において使用されるHPBCDに対する顕著な利点を提供する。具体的には、PVPは優れた許容性及びK12のような低い分子量グレードを有し、系から速やかに除去され、非経口用製剤においてすでに使用されている（http://www.pharma-ingredients.basf.com/Statements/Technical%20Informations/EN/Pharma%20Solutions/03_030730e_Soluble%20Kollidon%20grades.pdf）。
【００８３】
（本発明のさらなる実施態様）
一実施態様において、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む医薬水性ナノ懸濁液が提供され、ここで、該4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドは該ナノ懸濁液中に少なくとも80 mg/mLの濃度で存在し、かつ該安定剤はPVPである。
【００８４】
一実施態様において、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む医薬水性ナノ懸濁液が提供され、ここで、該ナノ懸濁液の体積中位径（Dv(0.50)）は約0.050 μm〜0.500 μmであり、かつ該安定剤は、PVPである。
【００８５】
一実施態様において、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ）-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む医薬水性ナノ懸濁液が提供され、ここで、該ナノ懸濁液の体積中位径（Dv(0.50)）は約0.050 μm〜0.500 μmであり、該4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドは該ナノ懸濁液中に少なくとも80 mg/mLの濃度で存在し、かつ該安定剤はPVPである。
【００８６】
一実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって：
(a) 粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む水性懸濁液を製造する工程；及び
(b) 工程(a)の水性懸濁液をミルで粉砕し、ナノ粒子の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含み、ここで、該安定剤がPVPであり、かつ得られるナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが約0.050 μm〜約0.600 μmの体積中位径（Dv0.5）を有する、前記方法が提供される。
【００８７】
一実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって：
(a) 粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む水性懸濁液を製造する工程；及び
(b) 工程(a)の水性懸濁液をミルで粉砕し、ナノ粒子の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含み、ここで、該安定剤がPVPであり、かつ工程(a)の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが実質的に実施例1又は実施例2の手順に従って製造される、前記方法が提供される。
【００８８】
一実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって：
(a) 粒子性4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド及び安定剤を含む水性懸濁液を製造する工程；及び
(b) 工程(a)の水性懸濁液をミルで粉砕し、ナノ粒子の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含み、ここで、該安定剤がPVPであり、かつ工程(a)の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが実質的に図1に示されるXRPDパターンを有する、前記方法が提供される。
【００８９】
一実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって：
(i) 有機溶媒に4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを溶解する工程；
(ii) 溶液を均一に維持しながら、工程(i)の溶液を水に溶解した安定剤の溶液に加える工程；
(iii) 工程(ii)の溶液を撹拌する工程；及び
(iv) 工程(iii)の溶液をゆっくりと冷水に加え、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程、
を含み、該安定剤がPVPであり、かつ得られるナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが約0.050 μm〜約0.600 μmの体積中位径（Dv(0.5)）を有する、前記方法が提供される。
【００９０】
一実施態様において、医薬水性ナノ懸濁液を製造する方法であって：
(i) 酢酸エチルに4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを溶解する工程；
(ii) 溶液を均一に維持しながら、工程(i)の溶液を水に溶解したPVPの溶液に加える工程；
(iii) 工程(ii)の溶液を約30℃〜約50℃の温度で撹拌する工程；及び
(iv) 工程(iii)の溶液を約0℃〜約5℃の温度で水にゆっくりと加え、ナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドを形成する工程
を含み、該安定剤がPVPであり、かつ得られるナノ粒子形態の4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミドが約0.050 μm〜約0.600 μmの体積中位径（Dv(0.5)）を有する、前記方法が提供される。
【００９１】
一実施態様において、25℃、及び相対湿度60％で最大6週間の保存に対し安定な本発明の医薬水性ナノ懸濁液が提供される。「保存に対し安定」とは、密封バイアル中25℃、及び相対湿度60％で最大6週間の保存の後、該ナノ懸濁液のDv(0.90)が1 μmを超えず、好ましくは0.9 μm、又はより好ましくは0.8 μmを超えず、例えば0.6 μmを超えないことを意味する（実施例7A及び7Bの方法を参照されたい）。
【００９２】
本発明の医薬水性ナノ懸濁液に、例えば保存前の無菌状態を確保するため、最大40 kGyのガンマ線を照射することは適当であり得る。
【００９３】
一実施態様において、最大40 kGyのガンマ線による照射に対し安定である本発明の医薬水性ナノ懸濁液が提供される。「最大40 kGyのガンマ線による照射に対し安定である」とは、最大40 kGyのガンマ線による照射後に該ナノ懸濁液のDv(0.50)及びさらに好ましくはDv(0.90)が1 μmを超えない、好ましくは0.9 μm、又はより好ましくは0.8 μmを超えない、例えば、0.6 μmを超えないことを意味する（実施例12、13、14、及び14Aの方法を参照されたい）。最大40 kGyのガンマ線の照射及びそれに続く密封バイアル中25℃、及び60％の相対湿度での最大6週間の保存の後に該ナノ懸濁液の好ましくはDv(0.50)及びさらに好ましくはDv(0.90)は1 μmを超えず、好ましくは0.9 μm、又はより好ましくは0.8 μmを超えず、例えば0.6 μmを超えない（実施例14及び14Aの方法を参照されたい）。
【００９４】
（略語）
【表１】
2016529273.tif 000003
【実施例】
【００９５】
（一般手順）
全ての出発物質及び溶媒は商業的供給源から入手したか、又は本明細書に記載された手順若しくは文献引用に記載された手順に従って製造した。別途言及されない限り、全ての反応で撹拌を行った。有機溶液は慣例的に無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。
【００９６】
（分析方法）
（X線粉末回折(XRPD)）
XRPD分析はBruker-AXS D8 Advance回折計上で、銅の対陰極、単結晶ケイ素試料ホルダー、及び位置高感度検出器を用いて実施した。粉末試料をケイ素試料ホルダー上に、選択配向（ランダムな配列をもった結晶ではない）を避けるようにして分散させ、被検物表面の平坦性を確保した。X線パターン取得のための装置操作条件は以下の通りである：温度：周囲；雰囲気：周囲；X線発生器：40 mAで40 kV；X線源：Cu標的；放出放射（emission radiation）Kλ1 (nm)＝0.15406；Kλ2 (nm)＝0.15444；比Kλ2/Kλ1＝0.5；Kβフィルター放射＝ニッケル；スリット（発散防止）＝0.6；ゴニオメーター：（分析された角度セクター）＝3.5〜40又は3.5〜70（°、2θ）；ステップサイズ＝0.069（°、2θ）；試料ホルダーの回転速度：30 rpm；検出：開始角＝8°；回折強度を測定するためのステップ時間＝6秒。
【００９７】
（HPLC分析（ナノ懸濁液中の化合物(I)の量））
以下のHPLC法を本発明のナノ懸濁液中の化合物(I)の量を決定するために使用した。
装置：UV検出器を備えたHPLCシステム；カラム：Waters X-Bridge Shield RP18 3.5 μm、150 mm×3.0 mm；移動相：A：超純水（milliQ又は同等物）＋0.05％ TFA；B：アセトニトリル＋0.05％ TFA；動作時間：28分；波長：282 nm；流速：0.70 mL/分；カラム温度：50℃；オートサンプラー温度：20±5℃；注入体積：25 μl。
【００９８】
表1：クロマトグラフィー条件
【表２】
2016529273.tif 000004
【００９９】
（レーザー回折分析（ナノ懸濁液の粒度分布―実施例4）
該懸濁粒子の粒度分布をレーザー回折、タイプMastersizer 2000（Malvern, Worcestershire, UK）を用いて決定した。Hydro 2000S試料分散モジュールを使用した。試料ホルダーを精製水で満たし、該ナノ懸濁液のアリコートを該試料ホルダー中で1500 rpmで分散させた。それぞれの分析は2連で実施した。粒度をMalvernソフトウェアを用いて体積径（Dv）を介して表す。中央値であるDv(0.50)を、該体積分布の半分がこの値より下に位置する径と定義する。同様に、該体積分布の90％がDv(0.90)の下に位置し、該分布の10％がDv(0.10)より下に位置する。
【０１００】
（動的光散乱法（ナノ懸濁液の粒度分析―実施例9））
該懸濁粒子の大きさを、動的光散乱の原理に基づいて粒度を測定する光子相関分光計である、Beckman Coulter N4 Plusを用いて分析した。この方法は、体積％よりもむしろ強度％を提供する。しかしながら、このデータを操作して、およそのDv(0.10)、Dv(0.50)、及びDv(0.90)値を与えることができる。
【０１０１】
（オスモル濃度測定）
オスモル濃度はAdvanced Micro Osmometer（Model 3320 Advanced Instruments Inc, Norwood, MA, US）を用いて凝固点法により測定した。Clinitrol（商標）290を、参照溶液（Advanced Instruments）として使用した。結果をmOsm/kgで表す。
【０１０２】
欧州薬局方によれば、270〜330 mOsm/kgが非経口的等張溶液/懸濁液に推奨されている。
【０１０３】
（ゼータ電位（静電気的安定性））
ゼータ電位はPALS Zeta Potential Analyzer Ver. 3.40（Brookhaven Instruments Corp.）で、以下のパラメータを用いて測定した。
【０１０４】
表2：ゼータ電位のパラメータ
【表３】
2016529273.tif 000005
【０１０５】
（実施例1―4-(4-エチル-5-フルオロ-2-ヒドロキシフェノキシ)-3-フルオロベンズアミド（化合物(I)）の製造)
化合物(I)はWO 2011/026529の「実施例1（代替手順）」（18ページ4行目〜19ページ6行目）を用いて製造することができる。この手順を用いて単離された物質は結晶性であることが見出された。実質的にこの手順に従って製造された化合物(I)の試料から得られたXRPDパターンを、図1に示す。
【０１０６】
（実施例2―化合物(I)の結晶化）
実質的に図1に示されているXRPDパターンを有する結晶形態の化合物(I)は、以下の結晶化手順を用いても製造できる。化合物(I)（600 mg）を磁石撹拌下90℃（還流）のトルエン/EtOH（95/5 v/v）24 mL中に溶解した。該反応混合物を90℃で1時間撹拌し、続いて10分毎に5℃ずつ（1時間当たり30℃）温度を低下させることにより冷却した。70℃で結晶化が観察され、反応混合物を25℃まで（10分ごとに5℃）冷却した。得られる固体を25℃で濾過し、減圧下80℃で1時間乾燥させ、実質的に図1に示されているXRPDパターンを有する化合物(I)を与えた（収率80％）。
【０１０７】
（実施例3―本発明のナノ懸濁液の湿式ミル粉砕による製造）
化合物(I)のナノ懸濁液を湿式ミル粉砕により以下のように製造した。ミル粉砕媒体を純水（50 mL）にポリマー、コリドン12PF（登録商標）（PVP；50.0 mg/mL）に溶解することにより、製造した。該溶液を250 mLの透明なガラスバイアル（タイプII）に加え、続いて化合物(I)（実施例1の手順を用いて得たもの）を100 mg/mLで加えた。凝集を回避するため、配合（すなわち、化合物(I)の該溶液への添加）の直後に前懸濁液を磁気撹拌子を用いて30分間撹拌することにより作製した。最後に、ミル粉砕ビーズを加えた。0.5 mm径のイットリウムで安定化させた酸化ジルコニウムのビーズを加えた。該バイアルを閉め、湿式ミル粉砕プロセスのためにローラーミル上に配置した。バイアルの速度は160 rpmに設定した。64時間の湿式ミル粉砕の後、試料をレーザー回折を用いた粒度分布分析のために取り、少なくとも90％の該懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認し、ミル粉砕プロセスを終了した。白色の均一なナノ懸濁液を続いて23G針つきのシリンジを用いてミル粉砕ビーズから回収した。製造後、該ナノ懸濁液を2〜8℃で保存した。
【０１０８】
（実施例3A―本発明のナノ懸濁液の湿式ミル粉砕による製造）
実施例3と同じであるが、コリドン12PF（登録商標）の濃度を75 mg/gに、化合物(I)の濃度を150 mg/gに上げた手順に従って湿式ミル粉砕により化合物(I)のナノ懸濁液を製造した。湿式ミル粉砕の時間を28時間に減らし、レーザー回折を用いた粒度分布分析のために取った試料から、少なくとも90％の該懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認した。μmでの粒度分布Dv(0.10/0.50/0.90/0.99)は、以下の通りであることが見出された：0.062/0.120/0.233/0.41。
【０１０９】
（実施例3B―本発明のナノ懸濁液の湿式ミル粉砕による製造）
実施例3と同じであるが、コリドン12PF（登録商標）の濃度を100 mg/gに、化合物(I)の濃度を200 mg/gに上げた手順に従って湿式ミル粉砕により化合物(I)のナノ懸濁液を製造した。イットリウムで安定化された酸化ジルコニウムのビーズの径の大きさを1 mmに上げ、バイアル速度を120 rpmに設定し、湿式ミル粉砕時間を40時間に減らした。レーザー回折を用いた粒度分布分析のために取った試料から、少なくとも90％の該懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認した。μmでの粒度分布Dv(0.10/0.50/0.90/0.99)は、以下の通りであることが見出された：0.068/0.140/0.310/0.72。
【０１１０】
（実施例3C―本発明のナノ懸濁液の湿式ミル粉砕による製造）
実施例3と同じであるが、コリドン12PF（登録商標）の濃度を150 mg/gに、化合物(I)の濃度を300 mg/gに上げた手順に従って湿式ミル粉砕により化合物(I)のナノ懸濁液を製造した。イットリウムで安定化された酸化ジルコニウムのビーズの径の大きさを1 mmに上げ、バイアル速度を120 rpmに設定し、湿式ミル粉砕時間を46時間に減らした。レーザー回折を用いた粒度分布分析のために取った試料から、少なくとも90％の該懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認した。μmでの粒度分布Dv(0.10/0.50/0.90/0.99)は、以下の通りであることが見出された：0.078/0.181/0.492/1.01。
【０１１１】
（実施例4―ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）の粒度分布分析）
実施例3の手順に従って製造された3つの異なるバッチのナノ懸濁液を、レーザー回折分析により分析し、一般手順に記載されている手順に従って粒度分布を決定した。また、該試料をHPLCによって分析し、一般手順に記載されている手順も用いて、該ナノ懸濁液中の化合物(I)の量を決定した。結果を表3に要約する。この結果は、それぞれの事例において非常によく似た粒度分布が観察されたことから、手順の再現性を示している。
【０１１２】
表3：湿式ミル粉砕により形成されたナノ懸濁液のT＝0での粒度分布
【表４】
2016529273.tif 000006
＊化合物(I)の理論濃度（出発物質としての化合物(I)の量に基づく）は、100 mg/mLであった。
【０１１３】
（実施例5―ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）の安定性分析）
該ナノ懸濁液の保存安定性を評価するために、実施例3に従って製造されたナノ懸濁液の試料を、異なる温度及び相対湿度で、異なる長さの時間保存した。保存安定性を、変化する粒度分布、オスモル濃度、及びpHの観点から評価した。結果を表4に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液が典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で優れた安定性を示したことを示している。
【０１１４】
表4：湿式ミル粉砕により形成されるナノ懸濁液の保存安定性
【表５】
2016529273.tif 000007
【０１１５】
（実施例5A―ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）の安定性分析
該ナノ懸濁液の保存安定性を評価するために、実施例3Bに従って製造された該ナノ懸濁液の試料を、異なる温度及び相対湿度で、異なる長さの時間保存した。保存安定性を、変化する粒度分布、オスモル濃度、及びpHの観点から評価した。結果を表5に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液が典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で優れた安定性を示したことを示している。
【０１１６】
表5：湿式ミル粉砕により形成されたナノ懸濁液の保存安定性
【表６】
2016529273.tif 000008
【０１１７】
（実施例5B―ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）の安定性分析
該ナノ懸濁液の保存安定性を評価するために、実施例3Cに従って製造された該ナノ懸濁液の試料を、異なる温度及び相対湿度で、異なる長さの時間保存した。保存安定性を、変化する粒度分布、オスモル濃度、及びpHの観点から評価した。結果を表6に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液が典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で優れた安定性を示したことを示している。
【０１１８】
表6：湿式ミル粉砕により形成されたナノ懸濁液の保存安定性
【表７】
2016529273.tif 000009
【０１１９】
（実施例6―IV投与のための等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）製剤の製造）
濃縮された本発明のナノ懸濁液を、医薬組成物中で即座の使用のためにさらに製剤化することができる。以下の方法は静脈内（IV）投与に適当な等張製剤の例を提供する。
【０１２０】
インビボ試験におけるIV投与のための即座の希釈の裏付けにおいて、浸透性の薬剤を含む水溶液中での湿式ミル粉砕（実施例3）により生産された該ナノ懸濁液の希釈を評価した。
【０１２１】
理論上の化合物(I)濃度100 mg/ml並びに46 mOsm/kgのオスモル濃度及び1.031 g/mLの密度を有するナノ懸濁液を、グルコース、マンニトール、又は塩化ナトリウムの水溶液を用いて1/3、1/1、又は3/1 v/vの比で希釈した。第二の一連において、理論上の化合物(I)濃度100 mg/mLのナノ懸濁液を塩化ナトリウムの水溶液を用いて1/1、3/1、6/1、10/1、及び25/1の比で希釈した。該溶液の濃度をオスモル濃度の関数として適応させた。該希釈されたナノ懸濁液のオスモル濃度は280〜320 mOsm/Lを目標とした。
【０１２２】
マンニトール、グルコース、及び塩化ナトリウムのストック溶液を精製水中で異なる濃度で調製した。マンニトール、グルコース、及び塩化ナトリウムの水溶液中の該ナノ懸濁液の希釈液は、指定された分量のナノ懸濁液をガラスビーカーに移すことにより調製した。指定された分量のストック溶液を続いて加え、該懸濁液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。最終体積25 mLをそれぞれの組合せについて調製し、白色の均一な懸濁液をもたらした。該希釈溶液中に使用したマンニトール、グルコース、及び塩化ナトリウムの濃度、希釈比、及びこれらの生じた新規ナノ懸濁液製剤の分析データを以下の表7に提供する。オスモル濃度の結果は全て欧州薬局方により非経口的等量溶液/懸濁液について推奨された270〜330 mOsm/kgの範囲内に収まった。
【０１２３】
表7：静脈内投与に適当なナノ懸濁液製剤
【表８】
2016529273.tif 000010
＊賦形剤ストック溶液の濃度
a（ナノ懸濁液体積/賦形剤体積）
b成分のオスモル濃度の加重平均
cオスモル濃度及び密度から算出した
d粒度分布
【０１２４】
（実施例6A―IV投与のための等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）製剤の製造
塩化ナトリウムの水溶液を実施例3Bに従って製造した化合物(I) 200 mg/gのナノ懸濁液に加えた。続いて、該希釈したナノ懸濁液を手で振り動かすことにより均一にした。この等張ナノ懸濁液の理論濃度は化合物(I)が100 mg/mL、コリドン12PF（登録商標）が50 mg/mL、及びNaClが6.9 mg/mLである。
【０１２５】
このナノ懸濁液は、化合物(I) 99.3 mg/mLという許容し得る検定結果及びIV投与に適当な309 mOsm/kgのオスモル濃度を示した。レーザー回折を用いた粒度分布分析のために取った試料から、少なくとも90％の懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認した。μmでの粒度分布Dv(0.10/0.50/0.90)は、以下の通りであることが見出された：0.068/0.137/0.293。
【０１２６】
（実施例6B―IV投与のための等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）製剤の製造）
グルコースの水溶液を実施例3Bに従って製造された化合物(I)の200 mg/gのナノ懸濁液に加えた。続いて、該希釈ナノ懸濁液を手で振り動かすことにより均一にした。この等張ナノ懸濁液の理論濃度は化合物(I)が100 mg/mL、コリドン12PF（登録商標）が50 mg/mL、及びグルコースが34.6 mg/mLである。このナノ懸濁液は99.3 mg/mLという化合物(I)の許容し得る検定結果及びIV投与に適当な294 mOsm/kgのオスモル濃度を示した。レーザー回折を用いた粒度分布分析のために取った試料から、少なくとも90％の懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認した。μmでの粒度分布Dv(0.10/0.50/0.90)は、以下の通りであることが見出された：0.065/0.129/0.268。
【０１２７】
（実施例7―IV投与のための等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）製剤の安定性）
実施例6の等張ナノ懸濁液の短期安定性を密封バイアル中で評価した。保存安定性を、変化する粒度分布、オスモル濃度、及びpHの観点から評価した。結果を表8に要約する。この結果は、オスモル濃度、活性成分濃度、pH及び粒度分布が48〜69時間相対的に安定であるため、これらの新規製剤が即座のIV投与に適していることを示している。
【０１２８】
表8：等張ナノ懸濁液の短期安定性
【表９】
2016529273.tif 000011
【０１２９】
（実施例7A―IV投与のための等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）製剤の安定性）
該ナノ懸濁液の保存安定性を評価するために、実施例6Aにしたがって製造されたナノ懸濁液試料を、密封バイアル中で異なる温度及び相対湿度で、異なる長さの時間保存した。保存安定性を、変化する粒度分布、オスモル濃度、及びpHの観点から評価した。結果を表9に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液が典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で優れた安定性を示し、加速保存条件下（40℃、相対湿度75％）で中程度の安定性を示したことを示している。
【０１３０】
表9：湿式ミル粉砕により形成されるナノ懸濁液の保存安定性
【表１０】
2016529273.tif 000012
【０１３１】
（実施例7B―IV投与のための等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）製剤の安定性）
該ナノ懸濁液の保存安定性を評価するために、実施例6Bにしたがって製造されたナノ懸濁液試料を、密封バイアル中で異なる温度及び相対湿度で、異なる長さの時間保存した。保存安定性を、変化する粒度分布、オスモル濃度、及びpHの観点から評価した。結果を表10に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液が典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で、しかしまた加速保存条件下（40℃、相対湿度75％）でも優れた安定性を示したことを示している。
【０１３２】
表10：湿式ミル粉砕により形成されるナノ懸濁液の保存安定性
【表１１】
2016529273.tif 000013
【０１３３】
実施例7、7A、及び7Bの結果は、本発明の方法が少なくとも6週間安定である、IV投与に適当な化合物(I)の等張ナノ懸濁液の製造に適当であることを示している。
【０１３４】
（実施例8―本発明のナノ懸濁液の制御沈殿による製造）
化合物(I)のナノ懸濁液を制御沈殿により以下のように製造する。化合物(I) 5.33 g（実施例2の手順を用いて得る）を酢酸エチル74 mLに溶解した。該溶液を続いて脱イオン水中の40％ w/wコリドン12 400 mLと合わせた。混合物を加熱し、磁気撹拌子で4時間、40℃で撹拌し、続いて、室温で一晩封を開けて撹拌させた。1 Lのジャケット付ビーカーを2℃で脱イオン水928 mLで満たした。600 rpmで撹拌している間、化合物(I)/PVP溶液32 mLを50 mLシリンジ及び水の液面下に浸した19ゲージ針を用いて10 mL/分の速度で該ビーカー中に送り込んだ。該溶液はすぐに濁り、これを2℃で一晩撹拌させ、16時間後に冷却を切り、ゆっくりと温めた。このプロセスを個別のバッチでさらに3回繰り返した。該溶液を洗浄し、クロスフローシステムPureTec Autopurification System、Sartocon Hydrostart 30 kDフィルター、及びサイズ15のチューブを用いて濃縮した。フィルターを準備した後、懸濁液460 mLをループで180 rpm、5時間濾過した。このプロセスを用いて、該懸濁液を脱イオン水1.5 Lで洗浄し、最終体積を40 mLまで低下させる。4つのバッチのそれぞれからの濃縮溶液を合わせ、さらに濃縮して40 mLとし、400 Gで20分遠心した。残存コリドン12を除くため、該最終懸濁液を全部で800 mlで20回洗浄し、最終の試料40 mLを生じた。
【０１３５】
（実施例9―ナノ懸濁液（制御沈殿）の粒度分布分析）
実施例8に従って製造されたナノ懸濁液の粒度分析を一般手順に記載のように遂行した。その結果を図2及び以下の表11に要約する。これらから、実施例8に記載のプロトコルにより平均粒度391.5 nm（強度％）であり、マイクロ粒子（すなわち、1 μm超の粒子）をほとんど含まないナノ懸濁液が生産されることを読み取ることができる。
【０１３６】
表11：粒度分布の概要
【表１２】
2016529273.tif 000014
＊粒子の平均サイズ ＞ 1 μm
【０１３７】
続いてデータを曲線フィッティングにより操作し、体積分布の概数値を以下のように提供した：
Dv(0.10): 200.11 nm (4次多項式フィットにより計算した)
Dv(0.50): 392.8 nm (4次多項式フィットにより計算した)
Dv(0.90): 534.168 nm (2つのデータ点間での線形フィットにより計算した)。
【０１３８】
（実施例10―ナノ懸濁液（制御沈殿）の熱分析）
熱重量分析（TA Instruments Q600）を用いて実施例8で製造したナノ懸濁液の最終固体含有量を測定した。該試料を75℃で20分、150℃で20分、150℃で60分、続いて500℃で30分加熱した。傾斜速度は20℃/分とした。水、化合物(I)、及びPVP 12のそれぞれについて同時に起こった3つの注目すべき重量減少が観察された。500℃の後の残渣塊の大部分は化合物(I)であり、従って最終濃度計算値の8.80％を含むと推測された。結果を図3（該ナノ懸濁液のDSC分析も示す）に示す。図3は、88 mg/mLの化合物(I)の含有量（推定密度1 g/mL）と、許容し得る許容範囲内である4.66％ w/wのコリドン12を示している。該ナノ懸濁液中のPVPの量は、実施例9に記載のように最終等張医薬製剤へと希釈することによりさらに減少させることができる。
【０１３９】
（実施例11―ナノ懸濁液（制御沈殿）のゼータ電位分析）
実施例8に従って製造された該ナノ懸濁液のゼータ電位を一般手順に記載した手順に従って測定した。平均ゼータ電位-43.41 mVを観察し、このナノ懸濁液の優れた電位安定性が示された。
【０１４０】
（実施例12―ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）のガンマ線照射に対する安定性）
実施例3Bに従って製造された開始ナノ懸濁液200 mg/gを水で希釈し、化合物(I)の最終濃度を100 mg/mLにすることにより製造された化合物(I) 100 mg/mLのナノ懸濁液の試料を、最大40 kGyの高線量のガンマ線の影響下においた。該試料を6 mLの透明なガラスバイアル中に満たし、ボール紙の箱に詰めた。適用されたガンマ線の線量を該箱に取り付けた線量計からの測定値に基づいて計算した。結果を表12に要約する。この結果は該ナノ懸濁液がこの滅菌処理に対し優れた安定性を示したことを示している。
【０１４１】
表12：湿式ミル粉砕により形成されたナノ懸濁液のガンマ線照射安定性
【表１３】
2016529273.tif 000015
【０１４２】
（実施例13―緩衝された等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）のガンマ線照射に対する安定性）
実施例3Bに従って製造された開始ナノ懸濁液200 mg/gを酢酸緩衝液（pH 4.3）及びNaClで希釈し、化合物(I)の最終濃度を100 mg/mLにすることにより製造された化合物(I) 100 mg/mLの緩衝等張ナノ懸濁液の試料を、最大40 kGyの高線量のガンマ線の影響下においた。該試料を6 mLの透明なガラスバイアル中に満たし、ボール紙の箱に詰めた。適用されたガンマ線の線量を該箱に取り付けた線量計からの測定値に基づいて計算した。結果を表13に要約する。この結果は該ナノ懸濁液がこの滅菌処理に対し優れた安定性を示したことを示している。
【０１４３】
表13：湿式ミル粉砕により形成された緩衝等張ナノ懸濁液のガンマ線照射安定性
【表１４】
2016529273.tif 000016
【０１４４】
（実施例14―ガンマ線を照射された等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）の時間安定性）
実施例6Aに従って製造した化合物(I)の等張NaClナノ懸濁液の試料に47.8〜53.8 kGyを照射した。該試料をボール紙の箱に詰められた6 mLの透明なガラスバイアル中に満たした。適用した最小及び最大のガンマ線線量を、該箱に取り付けた線量計からの測定値に基づいて計算した。その結果を表14に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液がこの滅菌処理に対し中程度の安定性を示し、典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で優れた安定性を示したが、また加速保存条件下（40℃、相対湿度75％）でも優れた安定性を示したことを示している。
【０１４５】
表14：湿式ミル粉砕により形成された化合物(I)のNaCl等張ナノ懸濁液のガンマ線照射安定性
【表１５】
2016529273.tif 000017
【０１４６】
（実施例14A―ガンマ線を照射された等張ナノ懸濁液（湿式ミル粉砕）の時間安定性）
実施例6Bに従って製造した化合物(I)の等張グルコースナノ懸濁液の試料に47.8〜53.8 kGyで照射を行った。該試料をボール紙の箱に詰められた6 mLの透明なガラスバイアル中に満たした。適用した最小及び最大のガンマ線線量を、該箱に取り付けた線量計からの測定値に基づいて計算した。その結果を表15に要約する。この結果は、該ナノ懸濁液がこの滅菌処理に対し優れた安定性を示し、典型的な保存条件下（5℃及び25℃）で優れた安定性を示したが、また加速保存条件下（40℃、相対湿度75％）でも優れた安定性を示したことを示している。
【０１４７】
表15：湿式ミル粉砕により形成された化合物(I)のグルコース等張ナノ懸濁液のガンマ線照射安定性
【表１６】
2016529273.tif 000018
【０１４８】
実施例12、13、14、及び14Aは本発明の方法が、最大で少なくとも40 kGyのガンマ線照射後に安定な、IV投与に適当な化合物(I)のナノ懸濁液の製造に適当であることを示している。
【０１４９】
（実施例15―スケールアップされた湿式ミル粉砕による本発明のナノ懸濁液の製造）
化合物(I)のナノ懸濁液を実施例3と同じ手順に従って湿式ミル粉砕により製造し、一方で化合物(I)の量を2 Lボトル中の650 gにスケールアップし、化合物(I) 200 mg/g及びコリドン12PF（登録商標）100 mg/gという最終濃度を達成した。湿式ミル粉砕時間は22時間であり、バイアルの速度設定は80 rpm、ビーズ径は0.5 mmである。レーザー回折を用いた粒度分布分析のために取った試料から、少なくとも90％の懸濁粒子が500 nm未満の径であることを確認した。μmでの粒度分布Dv(0.10/0.50/0.90/0.99)は、以下の通りであることが見出された：0.065/0.128/0.264/0.600。この結果は、そのような製造はスケールアップに適当であることを示している。
【０１５０】
（実施例16―黄色ブドウ球菌に対するマウスのインビボ全身感染モデル）
本試験の目的は、黄色ブドウ球菌の感受性（MSSA）株及びメチシリン耐性（MRSA）株に対するマウスの全身感染モデルを用いて、従来技術における過去の製剤と本発明の新規ナノ懸濁液とのインビボでの有効性を比較することである。
【０１５１】
（方法）
3つの個別の試験をそれぞれの単離株（一方はMSSA及び一方はMRSA）に対し実行し、3つの試験のデータを合わせて分析を実施した。細菌単離株は、液体培養中で対数期まで増殖させた。細菌を感染後48時間以内に少なくとも90％の死亡率を達成する濃度まで8％ムチンで希釈した。6頭の18〜20 gのCD-1メスマウスを化合物(I)の濃度ごとに割り当て、腹腔内注射により0.5 mlの細菌懸濁液で感染させた。感染後5分に、マウスに静脈内投与による処置を行った。本発明のナノ懸濁液（実施例3に従って製造されたもの）は、50、100、及び200 mg/kg（化合物(I)の投与量）での単回IV用量送達の直前に新たに製造した。また、化合物(I)の従来技術における過去の製剤（20％ HPBCD及び1％グルコース中10 mg/mLで製剤化されたもの）及びバンコマイシン（Sigma Aldrich）も1回用量でIV投与され、比較基準として用いた。感染対照のマウスには生理食塩水を投与した。生存を感染後48時間評価した。死亡日を記録し、プロビット分析を実施してPD50（50％保護用量）を決定した。
【０１５２】
（結果）
結果を以下の表16及び17に要約する。90 mg/mLで安定剤としての5％ PVP 12PFとともに投与した本発明のナノ懸濁液は、感受性単離株MSSAに対し50 mg/kg未満の推定合算（n＝3）PD50値を伴い、メチシリン耐性単離株MRSAに対して83.4 mg/kgの推定合算（n＝3）PD50値を伴う顕著な活性を示した。この黄色ブドウ球菌全身感染のマウスモデルにおいて、新規ナノ懸濁液のインビボでの有効性は、従来技術における過去の製剤と同程度の範囲の有効性であった。
【０１５３】
表16：MSSAに対するマウス全身感染モデルの合算した結果（n＝3）
【表１７】
2016529273.tif 000019
＊4頭の動物が試験とは無関係な理由で3つの試験の間に死亡した
【０１５４】
表17：MRSAに対するマウス全身感染モデルの合算した結果（n＝3）
【表１８】
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＊若干数の動物が試験とは無関係な理由で死亡した
【０１５５】
（結論）
本発明の新規ナノ懸濁液は、MSSA及びMRSAに対し、全身感染のマウスモデルにおいて、化合物(I)の従来技術における過去の製剤と同等の生存率で顕著な保護を提供した。
【０１５６】
（実施例17―黄色ブドウ球菌に対するインビボ好中球減少マウス腿感染モデル）
本試験の目的は、黄色ブドウ球菌の感受性（MSSA）株及びメチシリン耐性（MRSA）株の両方に対する好中球減少マウスの腿感染モデルを用いて、従来技術における過去の製剤と本発明の新規ナノ懸濁液とのインビボでの有効性を比較することである。
【０１５７】
（方法）
7つの独立した試験を実施した。黄色ブドウ球菌単離株は一晩のプレート培養から調製し、吸光度により確認した所定の濃度へと再懸濁した。最終接種原濃度は調製した接種原のCFU計数値を通じて決定した。それぞれの試験について、18〜20グラムの4頭のCD-1メスマウスを用量群ごとに割り当て、第-4日目及び第-1日目のシクロホスファミド（150及び100 mg/kg）の2連続投与により好中球減少症にした。マウスに0.1 mlの細菌懸濁液を筋肉内注射によって注射した。感染から90分後、マウスを静脈内投与で処置した。本発明のナノ懸濁液（実施例3に従って製造されたもの）は、50 mg/kg、100 mg/kg、及び200 mg/kgの化合物(I)を投与されるマウスへの用量送達の直前に新たに製造した。従来技術における過去の製剤及びバンコマイシンをIVにより単回投与で送達し、比較基準として用いた。感染対照マウスには、生理食塩水を投与した。
【０１５８】
（結果）
感受性単離株MSSAに対し、本発明のナノ懸濁液は、化合物(I)の従来技術における過去の製剤と同程度の活性を示し、バイオバーデンは100 mg/kg（n＝1）で0.61 log10 CFU/腿低下した。耐性単離株MRSAに対し、本発明のナノ懸濁液は化合物(I)の従来技術における過去の製剤と同程度の活性を示し、バイオバーデンは100 mg/kg（n＝1）で0.79 log10 CFU/腿低下した。
【０１５９】
（結論）
本発明の新規ナノ懸濁液は、好中球減少マウス腿感染モデルにおいて、化合物(I)の従来技術における過去の製剤と比較してMSSA及びMRSAに対し同等の有効性を提供した。
【０１６０】
（実施例18―インビボでの組織分布試験）
オスのスプラーグ・ドーリーラットにおいて組織分布試験を実施し、化合物(I)の血漿、肝臓、心臓、肺、皮膚、及び骨における薬物動態（PK）プロファイルを従来技術における過去の製剤と比較した。動物に従来技術における過去の製剤（F3）又は本発明のナノ懸濁液(F1及びF2)を、化合物(I)が200 mg/kgとなる量で、単回の10分の尾静脈内注入として投与した。
【０１６１】
投与された3つの製剤は以下の通りであり、結果を以下の表18に要約する。
製剤＃1（F1）：5％ PVP 12PF中に化合物(I)を96.9 mg/mL含む、実質的に実施例3に従って製造された本発明のナノ懸濁液。
製剤＃2（F2）：5％ PVP K12中に化合物(I)を88 mg/mL含む、実質的に実施例8に従って製造された本発明のナノ懸濁液。
従来技術における過去の製剤（F3）：20％ HPBCD及び1％グルコース中に化合物(I)を10.28 mg/mL含む濃縮物である、シクロデキストリンベースの複合体。
【０１６２】
表18：化合物(I)製剤（10 mg/mL）200 mg/kgでの、単回の10分の静脈内注入後の化合物(I)の平均ラット薬物動態パラメータ
【表１９】
2016529273.tif 000021
【０１６３】
従来技術における過去の製剤について、本発明の医薬水性ナノ懸濁液と比較して、血漿及び組織におけるより高い曝露が観察された。これは、該過去の製剤の血漿クリアランスが本発明の医薬水性ナノ懸濁液と比較して半分であり、より高い血漿曝露をもたらしたためである。製剤F1（湿式ミル粉砕―実施例3―により製造されたもの）及びF2（制御沈殿―実施例8―により製造されたもの）は、血漿及び組織曝露の観点では概ね同等であると観察された。
【０１６４】
しかしながら、本発明のナノ懸濁液は従来技術における過去の製剤よりも低い血漿濃度を有しているものの、以下の表19から見て取ることができるように、全体の組織-血漿分配係数は、本発明の医薬水性ナノ懸濁液について従来技術における過去の製剤と比較した場合に全てのマトリックスにおいてより高かった。製剤1及び2はこの点については概ね同等であることが見出された。
【０１６５】
表19：3つの製剤についてのラットの組織-血漿分配係数
【表２０】
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【０１６６】
この結果は、本発明の医薬水性ナノ懸濁液が、従来技術における過去の製剤よりも優れた組織への浸透性を提供し、それにより投与する製剤の濃度を低くすることができることを示唆している。
【０１６７】
本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通じて、文脈がそうでないことを要求しない限り、単語「含む（comprise）」並びに変形「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」などは言及された整数、工程、整数群、又は工程群を含むことを示唆するが、いかなる他の整数、工程、整数群、又は工程群を除外するものではないことが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2016529273.tif 000025
【国際調査報告】
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2016529273.tif 000027
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