(57)【要約】  組換えタンパク質の産生を増加するための製剤及び方法、並びに他の態様が開示される。上記製剤及び方法は、組換えタンパク質を発現する細胞を培養するための細胞培養培地製剤中のマンノース若しくはカルシウムの濃度、又はそれらの両方を増加することに関する。或る実施形態では、約３．５ｇ／Ｌ以上の少なくとも１種のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムを有する哺乳動物細胞培養培地製剤が提供される。多数の他の態様及び／又は実施形態が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む哺乳動物の細胞培養培地製剤。
【請求項２】
前記培地が約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース、及び約１．５ｍＭ未満若しくは約９．５ｍＭ超のカルシウムを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記培地が約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記培地が約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノースを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記培地が約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノースを含む、請求項２に記載の製剤。
【請求項６】
前記培地が約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記培地が約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムを含む請求項３に記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤が１：１の比率でＤＭＥＭ／Ｆ１２を含み、約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノース及び約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
細胞培養物中に組換えタンパク質を産生する方法であって、
組換えタンパク質発現細胞を供給すること、並びに
約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む細胞培養培地において前記細胞を培養すること、
を含む前記方法。
【請求項１０】
前記培地が約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース、及び約１．５ｍＭ未満又は約９．５ｍＭ超のカルシウムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノースを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノースを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記培地が約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物細胞が、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＫＢ細胞、ＨＥＫ細胞、及びＮＳ０細胞から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞がＢＨＫ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が血液凝固経路の組換えタンパク質を発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（ｒｈＦＶＩＩＩ）又はその変異体を発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
変異体第ＶＩＩＩ因子が遺伝子変異体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子変異体がＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異体第ＶＩＩＩ因子がペグ化ＦＶＩＩＩである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が組換え第ＶＩＩＩ因子発現ＢＨＫ細胞であり、前記培地が１：１の比率でＤＭＥＭ／Ｆ１２を含み、約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノース及び約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＣＲＥＡＳＥＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ」と題される２０１３年２月２６日付で出願された米国仮特許出願番号第６１／７６９，４０２号（代理人事件番号ＢＨＣ１２５０２２ＵＳ（ＢＨ−０２３／Ｌ））に由来する優先権を主張し、その全体が全ての目的について参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養系は、細胞成長を促進する栄養素を含む細胞培養培地製剤において組換えタンパク質を産生するため使用され得る。細胞培養培地製剤の例として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、マウスＥＳ細胞基礎培地、Ｌ−１５、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地、及びＶｅｒｏＰｌｕｓ  ＳＦＭが挙げられる。
【０００３】
商業生産を含む組換えタンパク質の産生において、生成物の品質を維持しながら組換えタンパク質産生のレベルを増加することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、生成物の品質を低下せずに組換えタンパク質産生を増加する細胞培養培地製剤及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
或る実施形態では、哺乳動物の細胞培養培地製剤が提供される。上記製剤は、約３．５ｇ／Ｌ以上の少なくとも１種のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムを有する。
【０００６】
１又は複数の実施形態では、細胞培養物において組換えタンパク質を生産する方法が提供される、上記方法は、約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウム等の組換えタンパク質の安定化剤の少なくとも１つを有する細胞培養培地中で組換えタンパク質発現細胞を培養することを含む。特定の実施形態では、上記方法は組換えタンパク質の産生の増加をもたらす。特定の実施形態では、上記方法は、産生される組換えタンパク質の品質を損なうことなく組換えタンパク質の産生の増加をもたらす。
【０００７】
これらの及び他の実施形態による多数の他の態様が提供される。本教示のこれら及び他の特徴が本明細書において明記される。
【０００８】
当業者は、以下に記載される図面は解説目的にすぎないことを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を何ら制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】様々な実施形態による細胞培養系において組換えタンパク質産生を増加する方法を説明するフローチャートである。
【図２】様々な実施形態による１Ｌの灌流バイオリアクター細胞培養物において３グラム／リットル（「ｇ／Ｌ」）〜５ｇ／Ｌのマンノース濃度の増加が組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（「ｒｈＦＶＩＩＩ」）の力価を２５％まで増加したことをグラフで示す図である。
【図３】様々な実施形態による１５Ｌの灌流バイオリアクター細胞培養物において３ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌのマンノース濃度の増加がｒｈＦＶＩＩＩ力価を約３７％増加させたことをグラフで示す図である。
【図４】様々な実施形態によるローラーチューブ（リピートバッチ）中５ミリモル（「ｍＭ」）の塩化カルシウム実験の試験条件においてｒｈＦＶＩＩＩ力価に対して最も強い影響（約１９％増加）を実証する結果をグラフで表す図である。
【図５】様々な実施形態による１Ｌの灌流バイオリアクター細胞培養物において１ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム濃度の増加がｒｈＦＶＩＩＩ力価を約２７％まで増加したことをグラフで示す図である。
【図６】１ｍＭ〜５ｍＭのカルシウム濃度の増加が、様々な実施形態による１５Ｌの灌流バイオリアクター細胞培養物において約２９％までｒｈＦＶＩＩＩ力価を増加したことをグラフで示す図である。
【図７Ａ】様々な態様に従い、対照培地（１ｍＭ塩化カルシウム及びマンノース３ｇ／Ｌを含有する）から両方の成分について富化された、すなわち、５ｍＭ塩化カルシウム及び５ｇ／Ｌのマンノースを含有する、培地への移行が２９％までｒｈＦＶＩＩＩ力価を増加し、その効果が不可逆的であることの結果をグラフで示す図である。
【図７Ｂ】様々な態様による、対照培地（１ｍＭ塩化カルシウム及びマンノース３ｇ／Ｌを含有する）から両方の成分について富化された、すなわち、５ｍＭ塩化カルシウム及び５ｇ／Ｌのマンノースを含有する、培地への移行が２９％までｒｈＦＶＩＩＩ力価を増加し、その効果が不可逆的であることの結果をグラフで示す図である。
【図８Ａ】様々な実施形態による１５Ｌの灌流バイオリアクターキャンペーンの設計を示す図である。
【図８Ｂ】様々な実施形態による、得られる効力のデータを示す図である。
【図９】ｒｈＦＶＩＩＩの産生レベルに対する細胞培養製剤の糖含有量を操作することの結果をグラフで示し、様々な実施形態によるマンノース含有培地及びマンノース不含培地を使用する効力の平均値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上述のように、タンパク質生成物の品質に悪影響を与えずに細胞培養培地製剤中で培養したタンパク質発現細胞の産生レベルを増加することは挑戦である。本明細書に記載される１又は複数の実施形態によれば、マンノース等の追加の栄養素及び／又はカルシウム等の安定化剤を細胞培養培地に供給することにより、改良された細胞培養培地製剤を作製することができる。或る実施形態では、改良された細胞培養培地製剤は、上記細胞培養培地を使用して培養されたタンパク質発現細胞の産生レベルを、生成物の品質にほとんど影響せず又は検出可能な影響を与えることなく増加することができる。かかる細胞培養培地製剤を形成する方法及び／又は使用する方法も提供される。
【００１１】
細胞培養培地製剤の例
上述のように、様々な実施形態において、細胞培養培地製剤中の組換えタンパク質の産生の増加は、製剤中のマンノースの濃度及び／又はカルシウム等の組換えタンパク質の安定化剤の濃度、又はそれらの両方の増加によって達成され得る。
【００１２】
或る一つの態様では、３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース（又は特定の実施形態では、約４ｇ／Ｌ以上、５ｇ／Ｌ以上、６ｇ／Ｌ以上、又は７ｇ／Ｌ以上）、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭ以上（又は特定の実施形態では、約２ｍＭ以上、約３ｍＭ以上、約４ｍＭ以上、約５ｍＭ以上、約６ｍＭ以上、約７ｍＭ以上、約８ｍＭ以上、約９ｍＭ以上、又は約９．５ｍＭ以上）の範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む、細胞培養培地製剤（例えば、細胞培養培地組成物）が提供される。他の細胞培養培地製剤を採用することができる。
【００１３】
細胞培養培地製剤は、約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つの添加前に、任意の細胞培養培地製剤であってもよい。例えば、特定の実施形態では、細胞培養培地製剤は、１：１等の好適な比率でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含み、更に約５ｇ／Ｌの少なくとも１種のマンノース及び約５ｍＭのカルシウムを含んでもよい。
【００１４】
ＲＰＭＩ（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、マウスＥＳ細胞基礎培地、Ｌ−１５、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地、及びＶｅｒｏＰｌｕｓ  ＳＦＭ等の他の細胞培養培地製剤をＤＭＥＭ／Ｆ１２に代えて採用することができる。特定の実施形態では、細胞培養培地製剤は哺乳動物細胞の培養用である。
【００１５】
本明細書において提供される細胞培養培地製剤の例として、限定されないが、以下が挙げられる。
【００１６】
（ａ）約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約１．５ｍＭ未満又は約９．５ｍＭ以上のカルシウム；
（ｂ）約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウム；
（ｃ）約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲の少なくとも１種のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウム；
（ｄ）約５ｇ／Ｌの少なくとも１種のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウム；
（ｅ）約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノース、及び約１．５ｍＭ未満又は約９．５ｍＭ超のカルシウム；
（ｆ）約５ｇ／Ｌのマンノース、及び約１．５ｍＭ未満又は約９．５ｍＭ超のカルシウム；
（ｇ）約３．５ｇ／Ｌ以上の少なくとも１種のマンノース、及び約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウム；
（ｈ）約３．５ｇ／Ｌ以上の少なくとも１種のマンノース、及び約５ｍＭのカルシウム；
（ｉ）約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース、及び約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウム；
（ｊ）約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース、及び約５ｍＭのカルシウム；及び／又は
（ｋ）１：１の比率のＤＭＥＭ／Ｆ１２、及び約５ｇ／Ｌの少なくとも１種のマンノース及び約５ｍＭのカルシウム。
【００１７】
他の製剤を採用することができる。
【００１８】
細胞培養培地製剤の形成方法／使用方法
以下の図１〜図８を参照して細胞培養において組換えタンパク質を産生する方法をここに記載する。
【００１９】
図１は、本明細書で提供される特定の実施形態による細胞培養において組換えタンパク質を産生するための方法１００のフローチャートを解説する。図１を参照すると、方法１００は、組換えタンパク質発現細胞が供給されるブロック１０１により開始する。
【００２０】
組換えタンパク質発現細胞の例として、例えば、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞等の任意の真核生物細胞又は原核生物細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例として、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腎臓細胞とＢ細胞のハイブリッド（ＨＢＫ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、及びＮＳ０細胞が挙げられる。
【００２１】
組換えタンパク質発現細胞は、任意の生物学的タンパク質生成物を作製する任意の細胞であってもよい。例えば、上記細胞は、１又は複数の組換えタンパク質生成物を発現するように操作された組換え細胞、及び／又は抗体分子を発現する組換え細胞であってもよい。
【００２２】
組換えタンパク質発現細胞の生成物は、任意のタンパク質生成物であってもよく、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含む凝固因子（血液凝固経路におけるタンパク質）等の組換えタンパク質生成物が挙げられる。例えば、組換えタンパク質発現細胞は、第ＶＩＩＩ因子を発現する哺乳動物細胞であってもよい。
【００２３】
第ＶＩＩＩ因子は、ｒＦＶＩＩＩ遺伝子コンストラクトの遺伝子変異体を作製することによって作製されてもよく、例えば、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子及び第ＶＩＩＩ因子の突然変異体を生じる、遺伝子変異体等の第ＶＩＩＩ因子の変異体であってもよい。例えば、第ＶＩＩＩ因子変異体として、例えば、ペグ化ＦＶＩＩＩ及び共有結合的に付着したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有するＦＶＩＩＩ等の発現後修飾された第ＶＩＩＩ因子を含む。また、第ＶＩＩＩ因子変異体は、共発現される結合要素を有する融合タンパク質を含んでもよい。
【００２４】
特定の実施形態では、組換えタンパク質発現細胞の組換えタンパク質生成物は、糖タンパク質であってもよい。或る実施形態では、組換えタンパク質は分泌される。組換えタンパク質を発現する組換え細胞の任意の好適な起源及び／又はそれを形成する方法が採用され得る。
【００２５】
ブロック１０２において、組換えタンパク質発現細胞を、約３．５ｇ／Ｌ以上の少なくとも１種のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムを含む細胞培養培地製剤（すなわち、組成物）中で培養する。本明細書で使用される、細胞培養培地は、組織又は細胞の培養液、組織又は細胞の培養培地又は培地（複数）等を含むことができる。
【００２６】
細胞培養培地製剤は、約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つの添加の前に、任意の細胞培養培地製剤であってもよい。例えば、特定の実施形態では、上記細胞培養培地製剤は、１：１等の好適な比率のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭｅｄｉｕｍとＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）とを含み、更に約５ｇ／Ｌの少なくとも１種のマンノース及び約５ｍＭのカルシウムを含んでもよい。
【００２７】
ＲＰＭＩ（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、マウスＥＳ細胞基礎培地、Ｌ−１５、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地、及びＶｅｒｏＰｌｕｓ  ＳＦＭ等の他の細胞培養培地製剤をＤＭＥＭ／Ｆ１２に代えて採用することができる。特定の実施形態では、細胞培養培地製剤は哺乳動物細胞の培養用である。
【００２８】
様々な実施形態では、細胞培養培地製剤は、鉄、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、又はインスリン等の他の栄養補助剤によって補足された、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＳＡＦＣ、カンザス州レネクサ）又はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニューヨーク州グランドアイランド）によって製造される商業的に入手可能なＤＭＥＭ／Ｆ１２製剤に基づく培地組成物であってもよく、他のタンパク質を本質的に含まないものであってもよい。他の基礎培地組成を採用してもよい。
【００２９】
錯化剤であるヒスチジン（ｈｉｓ）及び／又はイミノ二酢酸（ＩＤＡ）を使用することができ、及び／又はＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、及び／又はＴＲＩＺＭＡ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノエタン）等の有機緩衝液を使用することができ、これらの全てを、例えば、ＳＡＦＣ（ミズーリ州セントルイス）から入手することができる。或る場合には、組織培養培地は、既知濃度のこれらの錯化剤及び／又は有機緩衝溶液により、個別に又は組み合わせて補足されてもよい。或る実施形態では、組織培養液は、ＥＤＴＡを、例えば５０μＭ含有してもよく、又は他の好適な金属（例えば、鉄）キレート剤を含有してもよい。他の組成物、製剤、栄養補助剤、錯化剤及び／又は緩衝溶液を使用することができる。
【００３０】
細胞培養培地製剤は、例えば、天然アミノ酸のいずれかを含み得るアミノ酸を含むことができる。
【００３１】
細胞培養培地は、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硝酸第二鉄、二酸化セレン、塩化カルシウムを含んでもよい塩、及び／又は細胞培養培地製剤における使用に適した他の塩を含んでもよい。
【００３２】
細胞培養培地製剤は、ビオチン、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ヒポキサンチン、イノシトール、ナイアシンアミド、ビタミンＣ、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、チミジン、ビタミンＢ−１２、ピリドキサール、プトレシンを含むビタミン、及び／又は細胞培養培地製剤における使用に適した他のビタミンを含むことができる。
【００３３】
細胞培養培地製剤は、上記に列挙される以外の１又は複数の成分（「他の成分」）を含むことができ、デキストロース、マンノース、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グルタチオン、リノール酸、リポ酸、エタノールアミン、メルカプトエタノール、オルトホスホリルエタノールアミン、及び／又は細胞培養培地製剤における使用に適した他の成分を含むことができる。
【００３４】
一般的な哺乳動物細胞培養培地製剤は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）とＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅの１：１の混合物である。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、多くの商業的な供給元から利用可能であり、ｒｈＦＶＩＩＩ等の組換えタンパク質の産生に使用されることが多い。ＤＭＥＭ／Ｆ１２の完全な成分組成は自由に利用可能である（例えば、ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００６）（表１）。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）は、典型的には１．０５ｍＭ（０．１１６６５ｇ／Ｌ）の溶けやすいＣａＣｌ２（無水）を含有する。Ｄ−マンノースは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）製剤の成分ではなく、Ｄ−グルコースが約３ｇ／Ｌで存在する（炭化水素源として）。
【００３５】
特定の実施形態では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び約３ｇ／Ｌ未満のマンノースを含む製剤が提供される。例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１ｇ／Ｌのグルコースを含む）及び３ｇ／Ｌのマンノースを含む（合計４ｇ／Ｌの糖を含む）製剤は、マンノースを全く含まないが４ｇ／Ｌのグルコース（合計４ｇ／Ｌの糖）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２による細胞培養と比較して、約２８％の細胞培養物におけるｒｈＦＩＩＩ力価の増加をもたらすことができる。特定の実施形態では、４ｇ／Ｌのマンノース（合計４ｇ／Ｌの糖）を含むが、グルコースを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む製剤は、３ｇ／Ｌマンノース及び１ｇ／Ｌグルコース（合計４ｇ／Ｌの糖）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いる細胞培養と比較して約１８％の細胞培養物におけるｒｈＦＶＩＩＩ力価の増加をもたらすことができる。例えば、ｒｈＦＶＩＩＩの産生レベルに対する細胞培養製剤の糖含有量の操作の結果をグラフで解説する図９を参照されたい。
【００３６】
マンノースは糖単量体であり、グルコースのエピマーである。マンノースは、細胞代謝に関与する。マンノースは、糖タンパク質の生合成の間、翻訳後タンパク質中へと組み込まれる。糖タンパク質に付着したオリゴ糖は、新生タンパク質の適切な折りたたみを補助することができ、タンパク質分解から成熟タンパク質を保護する（Ｈｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｍｏｌｉｎａｒｉ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８７：１３７７−１４０８（２００７））。典型的なＮ連結オリゴ糖は、マンノース、また同様にＮ−アセチルグルコサミンを含有し、通常、幾つかの分岐鎖を有し、時に、末端が負に帯電したシアル酸残基を有する。この構造修飾は、ＦＶＩＩＩを含む多くの糖タンパク質に重要な品質特性であり、分子の生合成、分泌並びに安定性及び薬物動態／薬理学（ＰＫ／ＰＤ）特性に影響し得る。
【００３７】
真核生物細胞が、マンノース−６ホスフェートイソメラーゼによってフルクトース−６−ホスフェートをマンノース−６−ホスフェートに転換するプロセスにおいてグルコースをマンノースへと転換できるのに対し、一部の細胞型では、糖タンパク質の生合成のための大半のマンノースは、グルコースではなくマンノースに由来する（Ａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８（３）２８５−２９５（１９９８））。
【００３８】
組換えタンパク質の安定化剤は、例えば、分解から組換えタンパク質を安定化するどんなものであってもよい。安定化剤の例としてカルシウム及びマグネシウムが挙げられる。
【００３９】
カルシウムイオンは、ＦＶＩＩＩ複合体の四次構造を安定化することによってＦＶＩＩＩ凝集活性を安定化する重要な役割を果たす（Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ６０：８１９−８２８（１９７７）；Ｍｉｋａｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ６２（５）：１００６−１０１５（１９８３））。カルシウム及びマグネシウムは、重鎖及び軽鎖の両方に結合することによってＦＶＩＩＩ活性を促進して、ヘテロ二量体の構造を調節することが示されている（Ｆａｙ，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．１８：１−１５（２００４）における総論）。カルシウム（及び／又はマグネシウム）は、ＦＶＩＩＩの活性な構造を促進するために必要であると示唆されている。
【００４０】
実施形態の製剤及び／又は実施形態の方法を使用して、細胞を培養するために任意の好適な細胞培養系を採用することができる。細胞培養系は哺乳動物の細胞培養系であってもよい。細胞培養系は、灌流バイオリアクター細胞培養系を含むバイオリアクター細胞培養系であってもよい。細胞培養系は、組織培養フラスコ若しくはローラーボトル等の小規模培養系、及び／又はバイオリアクター細胞培養系等の大規模細胞培養系を含むことができる。細胞培養培地の例は、ウシ血清、ウマ血清、仔ウシ血清、ウシ胎児血清、及び／又はウシ胎児血清を含む血清により更に補足されてもよい。細胞培養培地の例は、ヒト血清及び／又はヒト血漿タンパク質画分によって更に補足されてもよい。
【００４１】
バイオリアクター細胞培養系は、（１）組換えタンパク質発現細胞、並びに（２）（ａ）約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む製剤；（ｂ）約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約１．５ｍＭ未満又は９．５ｍＭ超の範囲のカルシウムを含む製剤；（ｃ）約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムを含む製剤；（ｄ）約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む製剤；（ｅ）約５ｇ／Ｌのマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む製剤；（ｆ）約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲のマンノース、及び約１．５ｍＭ未満又は約９．５ｍＭ以上のカルシウム；（ｇ）約５ｇ／Ｌのマンノース、及び約１．５ｍＭ未満又は約９．５ｍＭ以上のカルシウムを含む製剤；（ｈ）約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムの少なくとも１つを含む製剤；（ｉ）約３．５ｇ／Ｌ以上のマンノース及び約５ｍＭのカルシウムの少なくとも１つを含む製剤；（ｊ）約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース及び約２ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のカルシウムを含む製剤；（ｋ）約３．５ｇ／Ｌ未満のマンノース、及び約５ｍＭのカルシウムを含む製剤；並びに（ｌ）１：１の比率でＤＭＥＭ／Ｆ１２を含み、約５ｇ／Ｌのマンノース及び約５ｍＭのカルシウムの少なくとも１つを含む製剤から選択される細胞培養培地製剤を含むことができる。
【００４２】
或る実施形態では、約５ｇ／Ｌのマンノース、及び約５ｍＭのカルシウムの少なくとも１つを含む細胞培養培地製剤の使用により、組換えタンパク質の産生が増加される。特定の実施形態では、組換えタンパク質の産生は、産生された組換えタンパク質の品質を損なわずに増加される（例えば、約３．５ｇ／Ｌのマンノース、及び約１．５ｍＭ〜約９．５ｍＭの範囲、又は本明細書に記載されるこれらの（１又は複数の）範囲の任意の具体的な（１又は複数の）点のカルシウムの少なくとも１つを含まない同一又は実質的に同一の細胞培養培地と比較した場合）。或る特定の実施形態では、組換えタンパク質の産生の増加は、約１３０日以上まで維持される。
【００４３】
組換えタンパク質の産生のための細胞培養系及びバイオリアクター細胞培養システムの例は文献に記載される。組換え第ＶＩＩＩ因子の産生のための灌流細胞系の例は、例えば、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｕｎｄｅｒ  Ｌｏｗ  Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」，と題される米国特許第６，３３８，９６４号、及びＢｏｅｄｅｋｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｄ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２７（４），ｐａｇｅｓ  ３８５−３９４の文献に記載される。
【００４４】
上記の製剤及び方法は、著しく設備容量を増加し、生産費用を削減することができる。例えば、或る実施形態では、ｒｈＦＶＩＩＩに対して約４０％までの細胞培養生産性の増加が観察された（例えば、少なくとも３ヶ月に亘る継続的灌流培養に亘る生産性の増加を伴って）。更に、特定の実施形態による方法は、比較的複雑ではなく、ｃＧＭＰ監督機関に準拠するＡＰＩ産生設備における実施に対し低コストである。例えば、様々な実施形態において、確立された組換えタンパク質生成物に対して遺伝子操作若しくは細胞株の変更は必要ではなく、基本設備若しくは生産工程に対して大きな変更は必要ではなく、及び／又は生成物の品質に対して何らの影響もない。
【００４５】
以下の実施例を考慮して本教示の態様を更に理解することができ、それらは本教示の範囲を何ら限定するものと解釈されるべきではない。
【００４６】
［実施例］
［実施例１］：マンノースの増加は細胞培養系における組換えタンパク質の産生の増加をもたらした
ｒｈＦＶＩＩＩ発現ＢＨＫ−２１細胞を、既存のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地成分の濃度へと変化してローラーチューブ（Ｓｈｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２３（８）：２８−３７（２０１０））で培養した。マンノースレベルを増加した場合にｒｈＦＶＩＩＩ力価の増加（効力に関するアッセイにより特定された）が観察された。
【００４７】
１Ｌの灌流バイオリアクターシステムを使用して行われた実験の後、１５Ｌスケールの灌流バイオリアクター研究を行った。結果は、一般的に１Ｌスケールと１５Ｌスケールで一致する。
【００４８】
１Ｌスケールの灌流バイオリアクターで行われた範囲試験の実験は、続く３ｇ／Ｌのマンノースを含有する標準培地における播種及び定常状態までの成長（対照条件）の力価に対するマンノース増加の用量依存性効果を実証した。細胞を、３ｇ／Ｌのマンノースの後、４ｇ／Ｌ及び５ｇ／Ｌのマンノース（バイオリアクターに供給される培地を交換することにより）を含有する（標準）培地においてそれぞれ約１０日間に亘り更に継続して培養した。他の培地成分は本実験において交換されなかった。効力の判定のためほぼ毎日試料を採取した（加工し、凍結した）。マンノースを３ｇ／Ｌから４ｇ／Ｌに増加した場合に約１５％まで、マンノースを５ｇ／Ｌまで増加した場合に約２５％（すなわち、更に約１０％）力価が増加した（図２）。
【００４９】
図２によるデータの統計学的分析は、効力／力価の増加に対するマンノース濃度の増加の効果が有意（Ｐ値＜０．０００１）であることを実証した。
【００５０】
上記実験を１５Ｌスケールで行った場合、ほぼ毎日採取した試料（加工して凍結した）を用いる３ｇ／Ｌのマンノースを含有する培地から５ｇ／Ｌのマンノースを含有する培地への移行は、力価の約３７％の増加をもたらした（図３：３ｇ／ＬのマンノースはＸ軸に「対照」と表示される、及び５ｇ／ＬのマンノースはＸ軸に「マンノース」と表示される）。いずれの実験（１Ｌスケール及び１５Ｌスケールで行われた）においても統計学的分析は、マンノース増加の効果が統計学的に有意であることを示す。ＦＶＩＩＩ力価に対するマンノースの効果は、培地交換の日数以内で観察され、継続的な（１Ｌ及び１５Ｌ）灌流培養系において維持された。
【００５１】
図３によるデータの統計学的分析は、効力／力価の増加に対するマンノースの効果が有意である（Ｐ値＜０．００１２）ことを実証する。
【００５２】
［実施例２］：カルシウムの増加は、細胞培養系における組換えタンパク質の産生の増加をもたらした
ｒｈＦＶＩＩＩ発現ＢＨＫ−２１細胞をローラーチューブで培養した（Ｓｈｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２３（８）：２８−３７（２０１０））。ｒｈＦＶＩＩＩ力価の増加（効力に関するアッセイにより判定した）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地中のカルシウムレベルを増加した場合に観察された。
【００５３】
ローラーチューブにおいて範囲を見つける実験を行い、ＦＶＩＩＩ力価の増加に最適なカルシウム濃度を同定した。試験した濃度のうち、５ｍＭの塩化カルシウムがＦＶＩＩＩ力価に対して最も大きな影響（約１９％の増加）を有した（図４：４日間の実験に対して試料を２日目、３日目及び４日目に採取し（Ｘ軸）、Ｙ軸において力価（効力）を対照（１ｍＭの塩化カルシウム）の％として表す）。１ｍＭ（対照）、２ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭの範囲の塩化カルシウム濃度を試験した。１ｍＭ（対照）〜２ｍＭのカルシウムの増加は、約８％までＦＶＩＩＩ力価を増加したのに対し、５ｍＭでは力価は約１９％まで増加する。しかしながら、１０ｍＭではカルシウムは力価に対して悪影響を有する。
【００５４】
１Ｌの灌流バイオリアクターで細胞を成長させた細胞を１ｍＭ塩化カルシウム（対照培地）から５ｍＭ塩化カルシウム含有培地へと移行した場合、力価は約２７％まで増加した（図５）。１Ｌ灌流バイオリアクターで約５日間に亘って１ｍＭ塩化カルシウムを含有する培地において、定常状態で細胞を継続的培養した後、５ｍＭ塩化カルシウムを含有する培地中へ移行して更に５日間培養した。効力の判定のためほぼ毎日試料を採取した（加工し凍結した）。
【００５５】
類似の実験を１５Ｌスケールの灌流バイオリアクターで繰り返した場合、１ｍＭカルシウム中よりも、５ｍＭカルシウムを含有する培地中で力価は約２９％高かった（図６：５ｍＭカルシウムを含有する培地を「Ｘ軸」に「Ｃａ」と表す）。１５Ｌ灌流バイオリアクターにおいて、１ｍＭ塩化カルシウムを含有する培地（「対照」）中、約３日間定常状態で細胞を継続的に培養した後、５ｍＭ塩化カルシウムを含有する培地へ移行し、１週間に亘って培養した。効力の判定のためほぼ毎日試料を採取した（加工し、凍結した）。
【００５６】
そのようにして１Ｌスケール及び１５Ｌスケールで行われたいずれの実験も、互いに一致し、培地を１ｍＭから５ｍＭの塩化カルシウムに移行させた場合に２７％〜２９％の急速なＦＶＩＩＩ力価の増加を実証した。より高い力価は実験の継続を通して維持された。
【００５７】
５ｇ／Ｌマンノースを含有する培地を使用し（図２）、５ｍＭカルシウムを含有する培地を使用する（図５）、２回の上記１５Ｌの実験の終わりに材料を回収し、限外濾過によって濃縮した。
【００５８】
図６によるデータの統計学的解析は、効力／力価の増加に対するカルシウム濃度増加の効果は有意であることを実証する（Ｐ値＜０．０１７６）。
【００５９】
［実施例３］：マンノース又はカルシウム濃度の増加による組換えタンパク質の産生の増加はタンパク質の品質を損なわない
その後、実施例１〜２（１５Ｌバイオリアクター、各培地型：Ａ．５ｍＭカルシウム；Ｂ．５ｇ／Ｌマンノースを用いたおよそ２週間のキャンペーン）の凍結限外濾過した培養収集物を加工し、以前に記載された幾つかの工程においてＦＶＩＩＩを精製し（Ｂｏｅｄｅｋｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２７（４）：３８５−３９４（２００１））、最後に様々な生成物の品質特性について査定した。５ｇ／Ｌマンノース含有培地及び５ｍＭカルシウム含有培地の両方から精製したｒｈＦＶＩＩＩ材料は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットに基づく方法によって査定される純度及び完全性、効力、特異的活性、様々な宿主細胞の不純物（タンパク質及び核酸）及びグリコシル化パターンを含む様々な生成物の品質特性に合格し、培地中のマンノース及びカルシウム濃度の変化はＦＶＩＩＩ生成物に影響を及ぼさないことを示した。
【００６０】
［実施例４］：マンノース及びカルシウムの増加は細胞培養系における組換えタンパク質の産生の増加をもたらした
図７Ａ〜図７Ｂは、（５ｍＭ）カルシウムと（５ｇ／Ｌ）マンノースの両方を濃縮したＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地が、各成分単独よりもＦＶＩＩＩ力価に対してより高い有利な効果を有したことを示す。また、これらの図は、力価の変化は１日以内に生じ、標準培地（１ｍＭ塩化カカルシウム及び３ｇ／Ｌマンノースを含有する）に培養物を戻すと力価における約２９％の増加がベースラインまで逆転したことから可逆的であったことを示す。
【００６１】
図７Ａ〜図７Ｂは、対照培地（１ｍＭ塩化カルシウム及び３ｇ／Ｌマンノースを含有する）から両方の成分について濃縮した、すなわち、５ｍＭ塩化カルシウム及び５ｇ／Ｌマンノースを含有する培地への移行の結果である、ｒｈＦＶＩＩＩ力価の２９％の増加及びその効果が可逆的であることをグラフで示す。５ｍＭカルシウム及び５ｇ／Ｌマンノースを含有する培地に約９日間移行した後、標準培地（対照−２）に戻した、標準培地（１ｍＭカルシウム及び３ｇ／Ｌマンノース；対照−１）中で１５Ｌ灌流バイオリアクター細胞培養において継続的に培養した細胞は、急速（１日以内）で可逆的なｒｈＦＶＩＩＩ力価の変化を実証した。条件は、（それぞれ）５ｍＭ塩化カルシウム及び５ｇ／Ｌマンノース（「Ｃａ＋マンノース」）試験培地への／からの移行前で「対照−１」、移行後で「対照−２」であった。効力の判定のためほぼ毎日試料を採取した（加工し凍結した）。
【００６２】
パネルＡは「条件」による。
【００６３】
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）によるデータの統計学的分析は、効力／力価の増加に対するマンノース及びカルシウム（共に）の濃度の増加の効果は有意であることを実証する。図７（Ａ）によるデータの統計学的分析は、ｐ値＜０．０５を生じる。図７（Ｂ）によるデータの統計学的分析は、ｐ値＜０．０１０２を生じる。
【００６４】
［実施例５］：マンノース及びカルシウム濃度の増加による組換えタンパク質の産生の増加はタンパク質の品質を損なわなかった
上記効果が灌流培地中で１３０日に亘って継続するキャンペーンで維持されることを確認するため、２つのバイオリアクターを同時に実行し、すなわち、一方は５ｇ／Ｌマンノース及び５ｍＭカルシウムを含有する試験培地中で培養し、もう一方は３ｇ／Ｌマンノース及び１ｍＭカルシウム対照培地中で培養した（図８Ａ）。実際に３０％超の力価の利益は、対照に対して試験バイオリアクターにおいて１３０日に亘る灌流キャンペーンで維持された（図８Ｂ）。
【００６５】
実施例５から収集物を採取し、限外濾過により濃縮することによって試験培養物（図８Ａ、時間点３、５、７）及び対照（図８Ａ、時間点２、４、６）について３つの時間点で一緒に生成物の品質を試験した。対照培地から試験培地へと移行する前に初期の時間点１（図８Ａ、時間点１）を試験バイオリアクターから採取した。限外濾過した培養収集物を精製し、ＦＶＩＩＩ品質を査定した。試験培地を使用して作製したＦＶＩＩＩは、純度及び完全性、効力、特異的活性、様々な宿主細胞不純物及びグリコシル化パターンを含む全ての品質基準を満たし、更に、試験培地中の培養物から作製されたＦＶＩＩＩ材料は、対照培地中で成長させた培養物から作製されたものに匹敵し、力価における３０％超の持続する増加は生成物の品質に影響しないことを示した。細胞培養物の成長特性もまた、２つのバイオリアクター、すなわち試験及び対照において同等であった。工程管理設定点（ｐＨ、溶解酸素、ｐＣＯ２及び温度）、細胞特性（バイオリアクター細胞密度、バイオリアクター生存率）、代謝産物（グルコース及びラクトースの残存率及び消費率）、及び具体的な生産性は全て、試験バイオリアクターと対照バイオリアクターで同等であった。
【００６６】
［実施例６］：実施例１〜５の材料及び方法
ローラーチューブ実験
以前に記載されるように（Ｓｈｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２３（８）：２８−３７（２０１０））小さいスケールの培地試験の実験を通気式のねじ蓋を有する５０ｍＬ培養チューブ（Ｃｕｌｔｉｆｌａｓｋ  ５０、ニューヨーク州ボヘミアのＳａｒｔｏｒｉｕｓ）で行った。初期細胞密度３×１０５細胞／ｍＬを含む１４ｍＬの試験培地でチューブを充填した。加湿した温度及びＣＯ２制御インキュベータに置いた回転チューブプラットフォーム上で３０ｒｐｍの回転運動でチューブを混合した。チューブを４日間インキュベートし、試料の１．３ｍＬを代謝産物分析用に２日目、３日目及び４日目に採取した。凝集又は発色アッセイによる効力試験のため追加の試料を３日目及び４日目に採取した。
【００６７】
１Ｌ灌流バイオリアクター細胞培養
スケールアップのためｒｈＦＶＩＩＩ発現ＢＨＫ−２１細胞を、産生培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地）を使用して振蕩フラスコ中に播種した。フラスコを３５．５℃、３０ｒｐｍでインキュベートし、所望量の細胞が存在するまで連続的に分裂させた。
【００６８】
スケールアップに由来する細胞を、ＤＡＳＧＩＰ制御ステーション上、作業容量１Ｌにて１．５Ｌ  ＤＡＳＧＩＰ（ドイツのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ）容器に９×１０６ｖｃ／ｍＬで播種した。培地ポンプを制御するレベルセンサによって、作業容量を一定に保持した。
【００６９】
測定した細胞密度に依存する収集ポンプの調整により０．４５ｎＬ／細胞／日の標的細胞特異的灌流速度（「ＣＳＰＲ」）にて、定常状態で細胞保持装置（沈殿槽）を用い灌流を確立した。ステーションサーモスタットを使用して３５．５℃に温度を制御し、沈殿槽の温度を２０℃〜３０℃に制御した。エアレーションを浸漬したシリコーン管によって供給した。２５×１０６ｖｃ／ｍＬの標的細胞密度を維持するように溶解酸素の減少に応じてバイオリアクターから細胞を廃棄した。補足のエアレーションを５Ｌ／時間のヘッドスペースエアレーションにより供給した。必要に応じて炭酸ナトリウム溶液の添加により６．８５の標的で培養ｐＨを制御した。
【００７０】
１５Ｌの灌流バイオリアクター細胞培養
１２Ｌの作業体積で細胞培養を１５Ｌバイオリアクター（カナダ、フォスターシティのＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．）において細胞培養を行った。１×１０６細胞／ｍＬ以上の播種密度でバイオリアクターをインキュベートした。実行中、制御可能な加工パラメーターの標的設定点；ｐＨ＝６．８、温度＝３５．５℃、溶解酸素ＤＯ＝５０％空気飽和を維持した。溶解酸素のための混合気体及びｐＨ制御をシリコーン膜により上記培養物に供給し、陽圧を維持し、ストリッピングを補助するためヘッドスペースを手動ロタメーターにより制御した。収集ストリームから細胞を除去し、細胞の沈殿集団をバイオリアクターに戻すため、バイオリアクターを細胞保持装置（沈殿槽）に接続した。
【００７１】
ＣＳＰＲを０．４５ｎＬ／細胞／日の定常状態標的に調整し、実行の持続期間中維持した。酸素流制御アルゴリズムに基づいて上記システムから細胞を自動的に廃棄することによって定常状態の細胞濃度を２０×１０６ｖｃ／ｍＬに合わせた。
【００７２】
サンプリング及び試料加工
バイオリアクター及び収集ストリームから試料を毎日採取した。細胞濃度、生存率及び大きさをＣｅｄｅｘ細胞カウンタ（ドイツのＲｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）で測定した。残留グルコース及びラクトース濃度をＹＳＩ  ２７００生化学アナライザ（米国のＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。バイオリアクターの気体及びｐＨをＲａｐｉｄＬａｂ  ２４８血液ガスアナライザ（ドイツのＳｉｅｍｅｎｓ）で測定した。バイオリアクター及び収集物の試料を１ステージ凝固又は発色アッセイ（以下に記載される）のいずれかによってｒＦＶＩＩＩ定量のため分析した。
【００７３】
ＦＶＩＩＩ効力アッセイ（１ステージ凝固及び発色）
ＦＶＩＩＩ：Ｃ凝固試験法は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づく１ステージアッセイである。第ＶＩＩＩ因子は、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への酵素転換において、第ＩＸａ因子、カルシウム及びリン脂質の存在下で補因子として作用する。このアッセイでは、希釈した試験試料をＦＶＩＩＩ欠損血漿基質及びａＰＴＴ試薬の混合物と共に３７℃でインキュベートする。塩化カルシウムをインキュベートした混合物に添加し、凝固を開始する。凝固物を形成する所要時間（秒）とＦＶＩＩＩ：Ｃの濃度の対数の間に逆相関が存在する。未知の試料に対する活性レベルは、様々な試験材料の希釈物の凝固時間と既知の活性の標準物質の一連の希釈物から構成される曲線との比較により内挿され、１ｍＬ当たりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）で報告される。
【００７４】
発色効力アッセイ法は、色の強度が試料中の第ＶＩＩＩ因子の活性に比例する２つの連続する工程を含む。第１の工程では、第Ｘ因子は、最適量のカルシウムイオン及びリン脂質の存在下で、その補因子である第ＶＩＩＩａ因子と共に第ＩＸａ因子によって第Ｘａ因子へと活性化される。第Ｘ因子の活性化速度が第ＶＩＩＩ因子の量にのみ依存するように、過剰量の第Ｘ因子が存在する。第２の工程では、第Ｘａ因子は発色基質を加水分解して発色団を生じ、発色強度を４０５ｎｍにて測光法で読み取る。未知の効力を算出し、線形回帰統計法を用いて上記アッセイの確実性を確認した。１ｍＬ当たり国際単位（ＩＵ／Ｌ）で活性を報告する。第ＶＩＩＩ因子の発色及び凝集アッセイに関する更なる詳細は文献（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ  Ｔ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２８（３），２００２；Ｌｉｐｐｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ２００９，２０（１），２００９を参照されたい）に見られる。
【００７５】
ここに報告される上記実験結果は、相対単位で与えられる。
【００７６】
限外濾過培養収集物
１５Ｌの発酵物の収集液を濾過して細胞及びデブリを除去した後、１００キロダルトン（ｋＤａ）カットオフ膜を使用するクロスフロー濾過により４０倍に濃縮した。
【００７７】
ＵＦＤＦへの精製
固定化したモノクローナル抗体に対するｒＦＶＩＩＩの結合による免疫親和性クロマトグラフィーを含む一連のクロマトグラフィー工程、及びＢｏｅｄｅｋｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２７（４）：３８５−３９４（２００１）に記載されるイオン交換クロマトグラフィーにより限外濾過した材料からｒＦＶＩＩＩを精製した。
【００７８】
ＱＣアッセイ
産生されるｒｈＦＶＩＩＩタンパク質の品質を分析するため、一連の具体的な方法を適用した。ＦＶＩＩＩ生成物の品質を、完全性のあらゆる可能性のある変化、グリコシル化パターン、及び宿主細胞不純物について査定した。
【００７９】
第ＶＩＩＩ因子の完全性をＨＰＬＣによって分析した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色により、また抗ＦＶＩＩＩ抗体を使用するウェスタンブロットにより上記生成物を完全性及び不純物について分析した。
【００８０】
汚染物質及び不純物の特定のため、特異的免疫アッセイを使用して宿主タンパク質について、また同様にＢＨＫ細胞培養物に由来する核酸不純物について上記生成物を分析した。
【００８１】
単離したタンパク質のグリコシル化パターンを、異なる糖成分及びシアリル化の程度の特定により分析した。上記データを実験施設内の対照ｒＦＶＩＩＩタンパク質と比較した。
【００８２】
実施例１〜６に関する結論の所見
これらの結果は、培養培地にマンノース及び／又はカルシウムを導入、及び／又はマンノース及び／又はカルシウム濃度を増加することによって、３０％超の力価の増加を達成でき、その力価の増加は、継続的な灌流培養において１３０日超に亘り維持されることを実証する。重要なことには、生成物の品質特性（不純物を含む）も培養成績のいずれも培養培地への変化によって影響を受けない。力価の増加に対する観察された影響は、グルコースによって、例えば、マンノースを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中のグルコース濃度を単に増加するだけでは再現されない。
【００８３】
マンノース濃度の３ｇ／Ｌから５ｇ／Ｌの増加は、１５Ｌの灌流バイオリアクターを使用することによりｒｈＦＶＩＩＩの生産性を２５％超増加できる。独立して、約１ｍＭ〜５ｍＭのカルシウムの増加も生産性においてほぼ同じ増加をもたらす。マンノース及びカルシウムの両方を増加した場合、生産性の増加は４０％近くまで更に増加し、５ｇ／Ｌのマンノースと５ｍＭのカルシウムの組み合わせは、３ｇ／Ｌのマンノース及び１ｍＭのカルシウムを含有する標準産生培地に対して第ＶＩＩＩ因子特異的な生産性の３０％超の増加をもたらした。細胞培養成績及び生成物の品質の特性は、培地の処方に対するこの変化によって影響を受けなかった。生産性に対する影響は、培地交換後約１日以内に明らかであり、可逆的である。３０％超の生産性の増加は、継続的な灌流バイオリアクター細胞培養の間、細胞バンクの解凍から３ヶ月に亘って維持された。
【００８４】
力価の増加に対するマンノース及びカルシウムの効果は、各々単独よりも両方を採用した場合により高い。カルシウムは、第ＶＩＩＩ因子の分子を安定化することが知られている。標準ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養培地製剤中のカルシウム濃度がわずか約１ｍＭである。したがって、培養培地製剤中のより高いカルシウムレベルは、上記プロセスのより早期、すなわち、収集物を採取した後よりも第ＶＩＩＩ因子が細胞から分泌されるほど早期に第ＶＩＩＩ因子を安定化するのを補助することができる。
【表１】
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2016508376.tif 000004
【００８５】
本明細書で使用される段落の項目は、組織化する目的にすぎず、記載される主題を何らも限定するものと解釈されるものではない。
【００８６】
本教示は様々な実施形態と併せて記載されるが、本教示がかかる実施形態に限定されることを意図するものではない。対照的に、本教示は当業者によって理解される様々な代替物、修飾、及び等価物を包含する。
【００８７】
したがって、明細書及び実施例は、限定的意味ではなく実例とされるものである。更に、本明細書で参照される全ての論文、書籍、特許出願及び特許は、全ての目的についてそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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