(57)【要約】  本発明は、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合する新規な抗体に関するものである。より詳細には、本発明はｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ（Ｃ−タイプレクチン様ドメイン）に特異的に結合する抗体、前記抗体を製造する方法、前記抗体を含む血管新生抑制用組成物、前記抗体または前記組成物を投与して、血管新生を抑制する方法、前記抗体を含む癌予防または治療用組成物、前記抗体または前記組成物を投与して癌を治療する方法、前記抗体を含む癌診断用組成物、前記組成物を含む癌診断用キット、前記組成物を用いて癌を診断する方法、ｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質を含む血管新生抑制用組成物、前記組成物を含む血管新生用キット、前記組成物を用いて血管新生を抑制するか癌を治療する方法、及び血管新生を抑制する抗体のためのエピトープとしてのｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤの用途に関するものである。前記抗体はｃｌｅ１４ａ−媒介性癌進行を効果的に抑制することができる。
2016503286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ（Ｃ−タイプレクチン様ドメイン）に特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤのＮ−末端またはＣ−末端に特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ内の１番目のアミノ酸から４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片またはｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ内の４２番目のアミノ酸から１２２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片を含む部位に特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、ヒト、チンパンジー及びネズミのｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに特異的に結合する、交差反応性を持つことを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
新生血管生成を抑制することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＣＴＬＤは、ｃｌｅｃ１４ａのアミノ酸配列上で３１−１７２番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１４のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号４２のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２１のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号４９のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号２８のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号５６のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号３５のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号６３のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、配列番号１２５のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１２９のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含む抗体；配列番号１２６のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３０のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含む抗体；配列番号１２７のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３１のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含む抗体；及び配列番号１２８のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３２のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含む抗体；で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
細胞移動を抑制する機能を行うことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
チューブ形成を抑制する機能を行うことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
細胞間接触を抑制する機能を行うことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ複合体の形成を抑制する機能を行うことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
動脈血管内皮細胞の表面上でｃｌｅｃ１４ａの下向き調節を誘導する機能を行うことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１９】
前記核酸は、配列番号７０の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号７２の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号７４の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号７９の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
前記核酸は、配列番号８４の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号８６の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号８８の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸は、配列番号９８の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１００の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１０２の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載の核酸。
【請求項２２】
前記核酸は、配列番号１１２の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１１４の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１１６の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載の核酸。
【請求項２３】
前記核酸は、重鎖可変部位に対する配列番号１３３の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１３４の核酸配列を含む核酸；重鎖可変部位に対する配列番号１３５の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１３６の核酸配列を含む核酸；重鎖可変部位に対する配列番号１３７の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１３８の核酸配列を含む核酸；及び重鎖可変部位に対する配列番号１３９の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１４０の核酸配列を含む核酸；で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の核酸。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２０に記載のベクターまたは請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２６】
前記抗体を産生するために核酸が発現するように請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法。
【請求項２７】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体と薬物が結合した抗体−薬物結合体。
【請求項２８】
前記薬物は、毒素、化学治療剤、抗癌剤、抗生剤、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ、放射性同位元素及び核酸分解酵素で構成された群から１種選択されたことを特徴とする請求項２７に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項２９】
前記抗体−薬物結合体は、細胞内に内在化できることを特徴とする請求項２７に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項３０】
前記細胞は、癌細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項３１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項３２】
前記血管新生関連疾患は、癌、転移、糖尿網膜病症、未熟児網膜病症、角膜移植拒否、黄斑変成、血管新生成緑内障、全身紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性股関節炎、動脈硬化性プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管癒着、リューマチ関節炎、退行性関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、粥状動脈硬化症、腸狭窄、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変症、腎臓炎、糖尿病性腎臓疾患、真性糖尿病、炎症疾患及び神経変成疾患で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３３】
前記癌は、食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、すい臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、甲状腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫瘍、リンパ腫及び多発性骨髄血液癌で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の抗体または請求項３１に記載の薬剤学的組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体を含む血管新生抑制用組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の抗体または請求項３１に記載の薬剤学的組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生を抑制する方法。
【請求項３７】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体を含む血管新生関連疾患診断用組成物。
【請求項３８】
前記血管新生関連疾患は、癌、転移、糖尿網膜病症、未熟児網膜病症、角膜移植拒否、黄斑変成、血管新生成緑内障、全身紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性股関節炎、動脈硬化性プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管癒着、リューマチ関節炎、退行性関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、粥状動脈硬化症、腸狭窄、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変症、腎臓炎、糖尿病性腎臓疾患、真性糖尿病、炎症疾患及び神経変成疾患で構成された群から選択されたことを特徴とする請求項３７に記載の血管新生関連疾患診断用組成物。
【請求項３９】
前記癌は、ｃｌｅｃ１４ａを発現することを特徴とする請求項３８に記載の診断用組成物。
【請求項４０】
請求項３７に記載の診断用組成物を含む血管新生関連疾患診断用キット。
【請求項４１】
血管新生関連疾患が疑われる個体から分離した生物学的試料内の抗原−抗体反応を介してｃｌｅｃ１４ａを検出する工程を含む、血管新生関連疾患の診断方法。
【請求項４２】
血管新生を抑制する抗体の生成を誘導できるエピトープとして作用する、ｃｌｅｃ１４ａの単離ＣＴＬＤを含むポリペプチド。
【請求項４３】
血管新生を抑制する抗体の生成を誘導できるエピトープとして作用する、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤのＮ−末端またはＣ−末端を含むポリペプチド。
【請求項４４】
血管新生を抑制する抗体の生成を誘導できるエピトープとして作用して、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ内の１番目のアミノ酸から４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片またはｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ内の１２２番目のアミノ酸から１４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片を含むポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドをエピトープとして用いてバイオパンニングする工程を含む、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合する抗体を製造する方法。
【請求項４６】
ｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質を含む血管新生抑制用組成物。
【請求項４７】
前記物質は、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤの発現を抑制する物質であることを特徴とする請求項４６に記載の血管新生抑制用組成物。
【請求項４８】
前記物質は、ｃｌｅｃ１４ａに特異的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡｓ、アプタマー及び抗体で構成された群から選択されたことを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
血管新生を抑制することによって血管新生関連疾患を治療することを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の組成物を含む血管新生抑制用キット。
【請求項５１】
請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生を抑制する方法。
【請求項５２】
請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法。
【請求項５３】
ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ及びＦｃの融合タンパク質を含む、血管新生関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項５４】
前記血管新生関連疾患は、癌、転移、糖尿網膜病症、未熟児網膜病症、角膜移植拒否、黄斑変成、血管新生成緑内障、全身紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性股関節炎、動脈硬化性プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管癒着、リューマチ関節炎、退行性関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、粥状動脈硬化症、腸狭窄、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変症、腎臓炎、糖尿病性腎臓疾患、真性糖尿病、炎症疾患及び神経変成疾患で構成された群から選択されたことを特徴とする請求項５３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５５】
ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ及びＦｃの融合タンパク質または請求項５３に記載の薬剤学的組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ（ｃｌｅｃ１４ａ）に特異的に結合する新規な抗体及びその用途に関する。より詳細には、本発明はｃｌｅｃ１４ａのＣ−タイプレクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）に特異的に結合する抗体、前記抗体を製造する方法、前記抗体を含む血管新生抑制用組成物、前記抗体または前記組成物を投与して血管新生を抑制する方法、前記抗体を含む癌予防または治療用組成物、前記抗体または前記組成物を投与して癌を治療する方法、前記抗体を含む癌診断用組成物、前記組成物を含む癌診断用キット、前記組成物を用いて癌を診断する方法、ｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質を含む血管新生抑制用組成物、前記組成物を含む血管新生用キット、前記組成物を用いて血管新生を抑制するか癌を治療する方法、及び血管新生を抑制する抗体作製のためのエピトープとしてのｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え抗体技術は、急激に発展して最近まで約３０個の抗体が承認されて、ヒト治療に用いられて、広範囲な病気治療のために世界的に２７０個を越える抗体に対する臨床研究が進行中である。しかし、従来の抗体スクリーニングは、時間及び手間がかかり、高費用の短所がある。一般にターゲットタンパク質の細胞外の部分が、抗体をスクリーニングするのに用いられる。結果的に多くのスクリーニングされた抗体は、細胞には結合するが、治療潜在力を持つ機能性抗体ではない場合が多い。最近では、分子生物学及びタンパク質生化学技術の発展により細胞機能と繋がるタンパク質ドメイン及びモチーフ上の多量の情報の活用が可能になっている。機能性ドメイン（functional domain）を組換え抗体スクリーニングに使用する用途は、機能性抗体を確認して根本的な作用機序（mode of action）を調べる効果的な手段でありうる。
【０００３】
腫瘍血管新生は、腫瘍進行に重要な役割を果たす。血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）及び上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）は、血管新生で重要な因子であり、血管新生は癌治療において非常に有望なターゲットである。抗−ＶＥＧＦ抗体（anti-VEGF antibody）のベバシズマブ（bevacizumab）は、転移性大腸癌（metastatic colorectal cancer）、腎臓癌（renal cell carcinoma）、非小細胞性肺癌（non-small cell lung cancer）、及び悪性脳神経膠腫（malignant brain glioma）疾患を持つ患者の治療に用いられている。抗−ＥＧＦＲ抗体（anti-EGFR antibody）であるセツキシマブ（cetuximab）は、内皮細胞間接触を阻害して、ＶＥＧＦ、インターロイキン−８（interleukin-8）及び基本繊維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）のような血管新生因子の発現を抑制することができる。
【０００４】
しかし、胎盤成長因子（placental growth factor）、アンジオポエチン（angiopoietin）、基本繊維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor）、及び肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor）を含む腫瘍−分泌血管新生因子の多様かつ過多な存在によって、これらの薬剤に対する腫瘍の抵抗性（resistant phenotype）が現れる（Kopetz S, et al., Phase II trial of infusional fluorouracil, irinotecan, and bevacizumab for metastatic colorectal cancer: efficacy and circulating angiogenic biomarkers associated with therapeutic resistance. Journal of Clinical Oncology. 28(3): 453-9; Lucio-Eterovic AK, et al., Mediators of glioblastoma resistance and invasion during antivascular endothelial growth factor therapy. Clinical Cancer Research. 2009; 15(14): 4589-99）。
【０００５】
現在ヒトＶＥＧＦ特異的抗体であるベバシズマブは、多様な癌患者の治療に用いられている。しかし、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は、正常細胞でも発現するため、これの使用は高血圧、蛋白尿、及び胃腸管穿孔（gastrointestinal perforation）を含む副作用と関連があると見られる。また、副作用によってＶＥＧＦＲ−２及びアンジオポエチン−２（angiopoietin-2）のような血管新生前駆因子（pro-angiogenic factors）に対する多くの治療用途に制限が生じる。結果的に、新生血管生成（angiogenesis）を抑制することによって、癌患者を治療する新しい癌−特異的ターゲットの確認は、より副作用が少ない治療用抗体の開発において決定的である。
【０００６】
また、ベバシズマブ及びセツキシマブは、溶解性新生血管成長因子（angiogenic growth factors）及びその受容体の相互作用を阻害することによって、新生血管生成を抑制する治療用抗体である。しかし、これらの薬剤を長期間服用する場合、腫瘍細胞が分泌する様々な血管新生前駆成長因子（pro-angiogenic growth factors）によって腫瘍の薬剤に対する抵抗性が現れる。これにより、長期間の治療を必要とする患者において溶解性成長因子に対する抗体を用いることは、大きな問題を引き起こすことになりうる。
【０００７】
Ｃｌｅｃ１４ａは、上皮成長因子様ドメインであるＣ−タイプレクチン−様ドメイン（ＣＴＬＤ）及びスシ−様ドメイン（sushi-like domain）を構成する細胞外ドメインであるタイプＩ膜貫通タンパク質である。いくつかの報告で、腫瘍新生血管生成にあたり、ｃｌｅｃ１４ａが役割を果たすことが示された。ロー等は、ｃｌｅｃ１４ａが血管内皮細胞特異的であり、新生血管生成において細胞間接触で重要な役割を果たすことができると報告した（Rho SS, et al., Clec14a is specifically expressed in endothelial cells and mediates cell to cell adhesion. Biochemical & Biophysical Research Communications. 404(1): 103-8）。ミュラー等は、ｃｌｅｃ１４ａが糸状仮足（filopodium）形成、細胞移動（cell migration）、及び血管内皮細胞チューブ形成（endothelial tube formation）と関連した血管新生前駆表現型（pro-angiogenic phenotypes）を調節するのに決定的であると報告し、このグループもｃｌｅｃ１４ａが正常組織の内皮では発現しなかった腫瘍内皮細胞特異的マーカーである点を確認した（Mura M, et al., Identification and angiogenic role of the novel tumor endothelial marker CLEC14A. Oncogene. 31(3): 293-305）。
【０００８】
この数年の間ｃｌｅｃ１４ａに対して関心が高まるにもかかわらず、その分子メカニズムは明確に確認されていない。臨床的に活用可能な抗体を発掘して開発するためには、新生血管生成に関連したｃｌｅｃ１４ａの機能性の部分またはドメインに対する研究は必ず実行されなければならない。これと関連して、前臨床及び臨床研究のためにマウス及びヒトｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合してヒト化された、抗体またはヒト抗体に変換されることができるモノクローナル抗体が強く求められている。好ましくは、腫瘍新生血管生成の阻害に臨床的に適用可能で、究極的に癌を治療できる抗体が必要である。また、新生血管生成を抑制することを確認して、癌を治療するためには腫瘍新生血管生成を抑制する新しい薬剤が必要である。
【０００９】
前記内容は、本発明の背景に対する理解を助けるためのものであって、本発明が属する技術分野において当業者にはすでに知らされた公示技術に該当しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者等は、まず新生血管生成において重要な細胞移動及び糸状仮足形成でＣＴＬＤ機能を確認した。ファージディスプレイ法を利用して、本発明者等は、ヒト及びマウスｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤｓに特異的な組換えヒト抗体を開発した。機能アッセイ結果は、抗体が生存力または活性化に影響を及ぼさず、内皮細胞移動及びチューブ形成を特異的に阻害することを見せた。
【００１１】
そこで、本発明者等は、ＣＴＬＤ−媒介細胞間相互結合を調節して、内皮細胞表面上のｅｌｅｃ１４ａ発現を下向き調節（down-regulating）することで、新生血管生成を抑制できる作用機序を提案する。この結果は、新生血管生成でのＣＴＬＤの機能的重要性及びｃｌｅｃ１４ａ媒介腫瘍新生血管生成を防止するためのＣＴＬＤ−特異的ヒト抗体の潜在力を立証する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を解決するために、本発明はｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合する抗体を提供する。
本発明はまた、前記抗体をエンコードする核酸を提供する。
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。
本発明はまた、前記ベクターまたは前記核酸を含む宿主細胞を提供する。
本発明はまた、前記抗体を産生するために前記核酸が発現するように前記宿主細胞を培養することを含む、前記抗体を製造する方法を提供する。
本発明はまた、前記抗体が前記薬物に結合した抗体−薬物結合体を提供する。
本発明はまた、前記抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明はまた、血管新生関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物の製造のための前記抗体の用途を提供する。
本発明はまた、血管新生関連疾患の予防または治療用抗体を提供する。
本発明はまた、前記薬剤学的組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法を提供する。
本発明はまた、前記抗体を含む血管新生抑制用組成物を提供する。
本発明はまた、血管新生抑制用組成物の製造のための抗体の用途を提供する。
本発明はまた、血管新生抑制用抗体を提供する。
本発明はまた、前記抗体または前記薬剤学的組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、血管新生を抑制する方法を提供する。
本発明はまた、前記抗体を含む血管新生関連疾患診断用組成物を提供する。
本発明はまた、前記血管新生関連疾患の生体外診断のための抗体の用途を提供する。
本発明は、前記診断用組成物を含む血管新生関連疾患診断用キットを提供する。
本発明はまた、血管新生関連疾患が疑われる患者から分離した生物学的試料内の抗原−抗体複合体を介してｃｌｅｃ１４ａを検出する工程を含む、血管新生関連疾患の診断方法を提供する。
本発明はまた、血管新生を抑制する抗体の生成を誘導できるエピトープとして作用する、ｃｌｅｃ１４ａの単離ＣＴＬＤを含むポリペプチドを提供する。
本発明はまた、血管新生を抑制する抗体の生成を誘導できるエピトープとして作用する、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤのＮ−末端またはＣ−末端を含むポリペプチドを提供する。
本発明はまた、血管新生を抑制する抗体の生成を誘導できるエピトープとして作用して、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ内の１番目のアミノ酸から４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片またはｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ内の１２２番目のアミノ酸から１４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片を含むポリペプチドを提供する。
本発明はまた、前記ポリペプチドをエピトープとして用いてバイオパンニング（biopanning）する工程を含む、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合する抗体を製造する方法を提供する。
本発明はまた、ｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質を含む血管新生抑制用組成物を提供する。
本発明はまた、前記組成物を含む血管新生抑制用キットを提供する。
本発明はまた、前記組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、血管新生を抑制する方法を提供する。
本発明はまた、前記組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法を提供する。
本発明はまた、血管新生抑制用組成物の製造のためにｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質の用途を提供する。
本発明はまた、血管新生抑制用ｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質を提供する。
本発明はまた、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ及びＦｃの融合タンパク質を含む、血管新生関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明はまた、前記血管新生関連疾患の予防または治療用ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ及びＦｃの融合タンパク質を提供する。
本発明はまた、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ及びＦｃの融合タンパク質または前記薬剤学的組成物を必要とする患者に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞移動でのｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの効果を示した図面である。Ａ．創傷治癒アッセイ（wound healing assay）でＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ、またはｃｌｅｃ１４ａ△ＣＴＬＤ−ＧＦＰでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の移動を光学顕微鏡を利用して調べた。イメージは、０時間（上）及び２０時間（下）にキャプチャーした。Ｂ．移動距離は、コントロール移動のパーセントで示した。三つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。
【図２】糸状仮足形成でのｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの効果を示した図面である。ＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ及びｃｌｅｃ１４ａ△ＣＴＬＤ−ＧＦＰでトランスフェクションされた（Ａ）ＣＯＳ−７細胞及び（Ｂ）ＨＵＶＥＣｓを固定させた後、ローダミンパロイジン（rhodamine-phalloidin）及びヘキスト（Hoechst）で染色して蛍光顕微鏡（fluorescence microscopy 1000X）で調べた。矢印は、糸状仮足が形成された部位を示す。結果は三つの独立的な実験を代表するもので示す。
【図３】ヒト及びマウスＣＴＬＤｓに特異的なｓｃＦｖクローンの単離を示した図面である。Ａ．ヒト合成ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、Ｆｃバインダーを事前に除去し、組換えｈＣＴＬＤ−ＦｃまたはｍＣＴＬＤ−Ｆｃで選択的なバイオパンニングを行って、スクリーニングした。Ｂ−Ｄ．ｓｃＦｖを表示する９６個のファージクローン（１−９６）を無作為で選択して、上澄液をファージＥＬＩＳＡで分析した。選択されたｓｃＦｖクローンのヒト及びマウスＣＴＬＤｓに対する反応性は４５０ｎｍでの吸光度を測定して調べた。矢印は、ｈＣＴＬＤ−Ｆｃ（■、黒色）及びｍＣＴＬＤ−Ｆｃ（■、灰色）に反応するｓｃＦｖクローンを示し、Ｆｃ（□）、ＢＳＡ（□、斜線）に反応しないのは、バックグラウンド調整に用いた。
【図４】ヒト及びマウスＣＴＬＤｓに対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓの交差−種反応性を示した図面である。ｈＣＴＬＤ−Ｆｃ（■、黒色）及びｍＣＴＬＤ−Ｆｃ（■、灰色）でコートされた９６−ウェルマイクロタイタープレート上での精製、選択されたｓｃＦｖクローン（クローン１−４）でＥＬＩＳＡを実施して、Ｆｃ（□）及びＢＳＡ（□、斜線）でバックグラウンド調整した。三つの独立的な実験中の一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。
【図５】血管内皮細胞移動及びチューブ形成でのｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓの効果を示した図面である。Ａ．傷を負った後、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（クローン１−４）またはセツキシマブの不在（ＭＯＣＫ）または存在下にインキュベーションされたＨＵＶＥＣｓの移動を光顕微鏡を利用して調べた。イメージは、０時間（上）及び９時間（下）にキャプチャーした。Ｂ．移動距離は、コントロール（ＭＯＣＫ）移動のパーセントで示した。三つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。Ｃ．ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（クローン１−４）またはセツキシマブの不在（ＭＯＣＫ）または存在下でチューブ形成を調べた。Ｄ．チューブ形成の程度は、コントロール（ＭＯＣＫ）チューブ形成のパーセントで示した。三つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。
【図６】血管内皮細胞増殖及び活性に対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓの効果を示した図面である。Ａ．ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓ、セツキシマブ、または、５−ＦＵ（ポジティブコントロール）の不在（ＭＯＣＫ）または存在下でＨＵＶＥＣｓを２日間インキュベーションした。４５０ｎｍで吸光度を測定することによって細胞の生存力を調べた。二つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。Ｂ．ｈＴＮＦα、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓまたはセツキシマブの部材（鎖線）または存在（実線）下にＨＵＶＥＣｓを培養して；抗−ＶＣＡＭ−１（anti-VCAM-1、上）またはＩＣＡＭ−１（下）ポリクローナル抗体で染色して；フローサイトメトリーで分析した。ｈＴＮＦαは内皮細胞活性に対するポジティブコントロールとして用いた。結果は、三つの独立的な実験を代表するものとして示す。
【図７】ｃｌｅｃ１４ａ−媒介性細胞間接触上のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓの効果を示した図面である。Ａ．ＧＦＰ及びｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞をｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓまたはセツキシマブの不在（ＭＯＣＫ）または存在下で８時間インキュベーションした。細胞凝集体（ｍａｓｓ＞４ｃｅｌｌｓ、矢印頭）を光学顕微鏡を利用してカウントした。フィールド当たり凝集体の数はＢに示した。Ｂ．三つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。
【図８】ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互結合でのｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの効果を示した図面である。Ａ．抗−ＧＦＰまたは抗−β−アクチン抗体で免疫ブロッティングすることで、ＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａ△ＣＴＬＤ−ＧＦＰでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の溶解物を分析した。Ｂ．ＧＦＰ（白色）、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ（黒色）またはｃｌｅｃ１４ａ△ＣＴＬＤ−ＧＦＰ（明るい灰色）を発現するＣＯＳ−７細胞を０．１５μｇのｈＣＴＬＤ−ＦｃまたはＦｃと共にインキュベーションとＥＬＩＳＡを利用してＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互結合を測定した。ｃ．ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の溶解液をｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（クローン１）の濃度を増加させながら予備インキュベーションさせたｈＣＴＬＤ−Ｆｃでインキュベーションさせた。三つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。
【図９】血管内皮細胞の表面でｃｌｅｃ１４ａの下向き調節に対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの効果を示した図面である。Ａ．ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（クローン１）の存在（点線）または不在（実線）下に固定及び固定しなかったＨＵＶＥＣｓをインキュベーションして、フローサイトメトリーで分析した。Ｂ．指定時間ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（白色）またはＦｃ（黒色）と共にインキュベーションされたＨＵＶＥＣｓの表面のｃｌｅｃ１４ａを細胞ＥＬＩＳＡ方法で調べた。三つの独立的な実験中一つから測定した平均値±ＳＤの３重測定値である。
【図１０】ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの部分切片に対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓの特異性を示した図面である。Ａ．Ｆｃ及びｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの部分切片の融合タンパク質。Ｂ．Ｆｃ及びｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの部分切片の融合タンパク質、ｗｔＣＴＬＤ−Ｆｃ及びＦｃに対するクローン１（上側グラフ）及びクローン２（下側グラフ）に対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓの特異性を各々示したグラフである。
【図１１】チューブ形成に対するｈＣＴＬＤ−Ｆｃの抑制効果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）に特異的に結合する抗体に関する。
好ましくは、本発明の抗体は、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）のＣＴＬＤ（Ｃ−タイプレクチン様ドメイン）に特異的に結合する抗体であってもよい。
【００１５】
本発明で用いられた用語「抗体」とは、抗原を特異的に認識して特定抗原に免疫学的に反応する免疫グロブリンと分子を含むタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全抗体及び抗体切片を含む。また、キメラ抗体（例えば、ヒト化されたネズミ抗体）、２価または２重特異性分子（bispecific molecules）（例えば、２重特異性抗体）、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）及びテトラボディ（tetrabodies）は、本発明に用いられる抗体の範囲に属する。
【００１６】
全抗体は、軽鎖と重鎖との間に二硫化結合（disulfide bond）に結合した二つの全体の長さの重鎖から構成されている。哺乳類では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＧで知らされた五つの抗体亜型があって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の四つの亜型にさらに分類される。
【００１７】
用語「抗体切片」とは、少なくとも抗原−結合性能を維持する切片を示して、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖを含んでもよい。Ｆａｂは、抗原結合部位を持つ、重鎖及び軽鎖の各々の可変部位、軽鎖の不変ドメイン、及び重鎖の第１不変ドメイン（ＣＨ１）で構成されている。Ｆａｂ'は、重鎖のＣＨ１ドメインのＣ−末端に少なくとも一つのシステイン残基を追加で含む点で、Ｆａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ'）２は、ヒンジ部位（hinge region）のシステイン残基の間の二硫化結合を持つ二つのＦａｂ'分子で構成される。重鎖及び軽鎖各々の可変部位で構成されたＦｖ（可変切片）は、親免疫グロブリンの本来の特異性を含む最も小さい抗体切片である。二硫化−安定化されたＦｖ（Disulfide-stabilized Fv、ｄｓＦｖ）は、二硫化結合を介して軽鎖の可変部位に重鎖の可変部位を結合させることによって形成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）は、重鎖と軽鎖の各々の可変部位でペプチドリンカーによって共有結合的に連結されたＦｖである。プロテアーゼ（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２を提供するパパインまたはペブシンで全抗体をプロテアーゼ処理して、これらの抗体切片を得ることができ、好ましくは遺伝子組換え技術によって構築することができる。
【００１８】
一般に、抗体スクリーニングは、ターゲットタンパク質の全体細胞外部位を利用して実施するので、抗体の分離に問題が生じる。本発明では、抗体スクリーニングのターゲットタンパク質の機能性ドメインを用いてより迅速に抗体を生成するようにする。本発明の一実施例で、ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤが血管新生に重要な役割を果たすことを確認して、抗体スクリーニングに用いた。抗体スクリーニングの工程を図３Ａに図式的に示した。
【００１９】
ここに用いられた用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」とは、実質的に同じ集団の抗体から収得して、単一エピトープに対する結合特異性及び親和性を示す、均一な分子組成を持つ抗体分子を意味する。
【００２０】
一般に、免疫グロブリンは、一つの重鎖及び二つの軽鎖で構成された基本構造単位を持つ。各重鎖は、一つの可変部位（「部位（region）」として知らされる）及び三つの不変ドメインで構成されているのに対して、各軽鎖は、一つの可変部位及び一つの不変ドメインで構成されている。重鎖及び軽鎖における各々の可変部位は、三つの相補性−決定部位（complementarity-determining regions、以後、「ＣＤＲｓ」と称する）及び四つのフレームワーク部位を含む。ＣＤＲｓは、抗体のエピトープに結合するために機能する。各鎖上のＣＤＲｓはＮ末端から始めてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の順に配列される。これらは位置した鎖によって区別される。
【００２１】
ここに用いられた用語「ヒト抗体（human antibody）」とは、ＣＤＲｓ、フレームワーク部位などを含み、全体的にヒト免疫グロブリンのすべての成分のアミノ酸配列で構成された分子である。ヒト疾患の治療法で、ヒト抗体は少なくとも三つの潜在的な長所を有している。第一に、ヒト抗体は、ヒト免疫体系とより好ましく相互作用してより効果的にターゲット細胞を破壊するが、例えば、補体依存性細胞毒性反応（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）または抗体依存性細胞−媒介細胞毒性反応（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）がある。また他のメリットは、ヒト免疫体系がヒト抗体を外部分子として認識しないことである。さらにヒト抗体の半減期は、より少量または少ない回数で投与される時でさえ、ヒト循環系で自然に発生する抗体と似ている。従って、本発明に係る抗体は、好ましくはヒトモノクローナル抗体であって、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−媒介血管新生を効果的に抑制するヒト内皮細胞上に発現したｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに対する強力な親和力を持つと共に、全重鎖及び軽鎖はヒトから由来するので、低い免疫原性を持つため、血管新生関連疾患または癌の治療に有用に用いられる。
【００２２】
ここに用いられた用語「ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）」とは、Ｃ−タイプレクチン／Ｃ−タイプレクチン−様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）上科（superfamily）のメンバーを意味する。Ｃｌｅｃ１４ａは、一連の上皮細胞成長因子様ドメインであるＣ−タイプレクチン−様ドメイン（ＣＴＬＤ）及びスシ−様ドメインを構成する細胞外ドメインであるタイプＩ膜貫通タンパク質である。ｃｌｅｃ１４ａに対する情報は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋのような公認データベースから得られる。例えば、ヒトｃｌｅｃ１４ａは、Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ  １６１１９８を持つことができるが、これに限定されるのではない。Ｃｌｅｃ１４ａは、細胞間融合及び血管新生に関連すると知られているが、その具体的なメカニズム及び血管新生の実質的なドメインはまだ確認されていない。本発明者等は、ｃｌｅｃ４ａのアミノ酸配列上で３１番目のアミノ酸から１７２番目のアミノ酸を含むドメインが血管新生に重要な役割を行うことを初めて発見した。
【００２３】
ここに用いられた用語「ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）のＣ−タイプレクチン様ドメイン（C-type lectin-like domain、ＣＴＬＤ）」とは、「ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ」または「ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ」とも記されて、いずれも同じ意味である。
【００２４】
他の観点において、本発明は、血管新生の抑制に有用なエピトープとしてのｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）−ＣＴＬＤ（Ｃ−タイプレクチン様ドメイン）の単離ポリペプチドに関するものである。好ましくは、ｃｌｅｃ１４ａはヒト、チンパンジーまたはマウスから由来してもよい。
【００２５】
ここに用いられた用語「エピトープ」とは、抗原特異性を決める部位で、抗原決定基または抗原決定部位も同じ意味で用いられる。本発明の目的の達成のために、エピトープは、ｃｌｅｃ１４ａのアミノ酸配列上で３１番目のアミノ酸から１７２番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列を持つＣＴＬＤを示すが、これは血管新生の抑制に有用であるかＣＴＬＤを持つ同じ機能を有したポリペプチドを示す。従って、ＣＴＬＤの追加部位を含んでもよい。ＣＴＬＤと同じ役割を果たしさえすれば、すべてのポリペプチド、例えばアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上の相同性を持つ場合エピトープとして用いることができる。ヒト、マウス及びチンパンジーＣＴＬＤｓの３１番目のアミノ酸から１７２番目のアミノ酸のアミノ酸配列を表１に示して、各々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：９、１０及び１３３で表した。本発明者等は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：９、１０及び１３３のアミノ酸配列が血管新生を抑制する抗体を産生するに当たり用いられることができるエピトープとして作用できることを初めて確認した。
【００２６】
また、本発明の一実施例で、ＣＴＬＤのＮ−末端またはＣ−末端部位は、血管新生を抑制する抗体を生成するに当たり用いられることができるエピトープとして作用できることを示唆している（図１０Ｂ）。好ましくは、ＣＬＴＤのＮ−末端部位はＣＴＬＤ内の１番目のアミノ酸から４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片またはＣＴＬＤ内の１番目のアミノ酸から６２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片を含む部位でありうる。好ましくは、ＣＬＴＤのＣ−末端部位は、ＣＴＬＤ内の８２番目のアミノ酸から１４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片、ＣＴＬＤ内の６２番目のアミノ酸から１４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片またはＣＴＬＤ内の１２２番目のアミノ酸から１４２番目のアミノ酸までのアミノ酸切片を含む部位でありうる。
【００２７】
抗体は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤまたは血管新生を抑制するために有効切片に特異的に結合することができ、本発明者等は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤが、ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互結合依存的な方式で血管新生を調節する唯一のドメインであることを示唆する。第一に、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ、特に３１−１７２のアミノ酸は、アクチン細胞骨格再配列を調節することによって、ｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞移動で重要な役割を果たす。第二に、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが、ｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞間接触を特異的に抑制するとの結果と一致する。第三に、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧによるｃｌｅｃ１４ａ媒介は、ＨＵＶＥＣ移動及びチューブ形成を特異的に抑制する。最後に、ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ複合体の形成は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧによって特異的に抑制された。
【００２８】
高親和性ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓは、血管内皮細胞生存能力及び活性に影響を及ぼさず、血管内皮細胞の移動及びチューブ形成を特異的に抑制した。ｃｌｅｃ１４ａは、血管内皮細胞上に排他的に発現して、腫瘍血管内皮細胞特異的なマーカーでありうる。ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ抗体は、腫瘍血管内皮上に排他的に発現するｃｌｅｃ１４ａを標的にして正常血管内皮では少ない副作用を招いて、ｃｌｅｃ１４ａ−媒介腫瘍進行時血管新生を抑制すると考えられる。
【００２９】
また、ベバシズマブ及びセツキシマブは、溶解性血管新生誘発成長因子（soluble angiogenic growth factors）及びその受容体の相互作用を抑制することによって、血管新生を抑制する治療用抗体である。しかし、前記薬剤の長期利用は、腫瘍細胞−分泌血管新生誘発前駆成長因子の過剰によって腫瘍に対する耐性を示す。これにより長期治療を要する患者に溶解性成長因子に対する抗体を使用することは、最大の課題として残っている。Ｃｌｅｃ１４ａは、内皮細胞間接触のために決定的なタイプＩ膜貫通タンパク質である。ここで開発されたｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、濃度依存的な方式でＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用を特異的に抑制して、ＩｇＧによって架橋結合されたｃｌｅｃ１４ａは、内皮細胞膜上にｃｌｅｃ１４ａ下向き調節を誘導した。架橋結合２時間、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、ＨＵＶＥＣｓ内部の点類似パターンを見せるが、これは抗体−誘導内包作用（antibody-induced endocytosis）を示す。それで、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、血管新生を抑制するに当たり２段階に亘る作用機序を持つ。
【００３０】
従って、前記抗体は、好ましくは細胞移動、チューブ形成または細胞間接触を抑制することによって、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞移動、チューブ形成または血管内皮細胞の表面上でｃｌｅｃ１４ａの下向き調節を誘導することによって、血管新生を抑制することができる。
【００３１】
血管内皮細胞の生存能力及び活性に対する影響がなく（図６Ａ及び６Ｂ）、本発明の抗体は、治療用抗体として用いられる。
【００３２】
本発明の一実施例で、本発明のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、血管内皮細胞移動（図５Ａ及び５Ｂ）及びチューブ形成（図５Ｃ及び５Ｄ）を抑制して、ｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞間接触（図７Ａ及び７Ｂ）を特異的に抑制するを確認されて、これは前記抗体が腫瘍血管新生時血管内皮細胞間接触を抑制できることを示す。また、ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧによって抑制された（図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ）。さらに本発明の抗体は、ＨＵＶＥＣの表面上でｃｌｅｃ１４ａの下向き調節を誘導することが明らかになった（図９Ａ及び９Ｂ）。これらの結果は、本発明の抗体がｃｌｅｃ１４ａ−媒介血管新生を効果的に抑制して、血管新生関連疾患または癌を治療するに当たり適用されることができることを示唆している。
【００３３】
好ましくは、本願発明の抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号４２のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４６のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含み、より好ましくは配列番号１２５のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１２９のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含むが、これに限定されるのではない。
【００３４】
前記抗体をコードする核酸は、前記核酸は配列番号７０の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号７２の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号７４の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号７９の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。
【００３５】
一実施例で、本発明のヒトモノクローナル抗体は、配列番号１２５のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１２９のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位で構成され、これをクローン１と定める。前記抗体をコードする核酸は、重鎖可変部位に対する配列番号１３３の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１３４の核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。
【００３６】
好ましい一実施例で、本発明の抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号４９のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含み、より好ましくは配列番号１２６のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３０のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含むが、これに限定されるのではない。
【００３７】
前記抗体をコードする核酸は、配列番号８４の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号８６の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号８８の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。本発明の一実施例で、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号１２６のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３０のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含む抗体；配列番号１２７のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３１のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含む抗体；及び配列番号１２８のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３２のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位で構成されて、これをクローン２と定める。前記抗体をコードする核酸は、重鎖可変部位に対する配列番号１３５の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１３６の核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。
【００３８】
他の好ましい実施例で、本発明の抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３２のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号５６のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含み、より好ましくは配列番号１２７のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３１のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含むが、これに限定されるのではない。前記抗体をコードする核酸は、配列番号９８の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１００の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１０２の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１０７の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。本発明の一実施例で、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号１２７のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３１のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位で構成されて、これをクローン３と定める。前記抗体をコードする核酸は、重鎖可変部位に対する配列番号１３７の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１３８の核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。
【００３９】
さらに他の一実施例で、本発明の抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位、及び配列番号６３のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含み、より好ましくは配列番号１２８のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３２のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位を含むが、これに限定されるのではない。前記抗体をコードする核酸は、配列番号１１２の重鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１１４の重鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１１６の重鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む重鎖核酸配列、及び配列番号１１９の軽鎖ＣＤＲ１核酸配列、配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ２核酸配列及び配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲ３核酸配列を含む軽鎖核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。本発明の一実施例で、ヒトモノクローナル抗体は、配列番号１２８のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部位及び配列番号１３２のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部位で構成されて、これをクローン４と定める。前記抗体をコードする核酸は、重鎖可変部位に対する配列番号１３９の核酸配列及び軽鎖可変部位に対する配列番号１４０の核酸配列を含むが、これに限定されるのではない。
【００４０】
前記の通り、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤを特異的に認識する限り、異種配列で構成された抗体が、血管新生を抑制することが明らかになった。従って、血管新生関連疾患または癌の予防または治療に効果的に作用することを確認した。本発明の抗体が一定のドメインを含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはこれらの組み合わせまたはハイブリッドから由来してもよい。
【００４１】
ここに用いられた「組み合わせ」とは、同じ起源の単鎖免疫グロブリンとＦｃ切片をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合してダイマーまたはマルチマーを生成することを意味する。これはダイマーまたはマルチマーは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変ドメインで構成された群から選択された二つまたはそれ以上の不変ドメインから形成されることができることを示す。
【００４２】
ここに用いられた用語「ハイブリッド」とは、異なる起源の二つまたはそれ以上の重鎖不変ドメインをコードする配列が単鎖免疫グロブリンと重鎖不変ドメイン内に存在することを意味する。例えば、ドメインハイブリッドは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３  ａｎｄ  ＣＨ４  ｏｆ  ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭで構成された群から選択された一つ〜四つのドメインで構成されてもよい。また、ハイブリッドの組み合わせは、ＩｇＧ亜型であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖不変ドメインから生成されてもよい。ハイブリッドの組み合わせは、前記定義したとおりである。
【００４３】
また、本発明の抗体は、軽鎖不変部位をさらに含んでもよく、ラムダ（λ）またはカッパ（κ）軽鎖から由来してもよい。
【００４４】
好ましくは、前記抗体は、ヒトｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤだけでなくネズミ科のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに特異的に結合して、血管新生を抑制できるヒトモノクローナル抗体であってもよい。ヒト及びマウスのいずれにおいても機能するヒト抗体の能力、言い換えると、交差反応性（cross-reactivity）は、ヒト抗体がマウス内で臨床前研究を可能にするメリットを提供する。
【００４５】
また他の観点において、本発明は、前記核酸を含むベクター、及び前記ベクターまたは前記核酸を含む宿主細胞に関する。
【００４６】
また他の観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａ（Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）、好ましくは、ヒトｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ（Ｃ−タイプレクチン様ドメイン）またはヒト及びネズミ科ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ）に特異的に結合する抗体を製造する方法に関する。好ましくは、前記抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。前記抗体を製造する方法は、機能性ドメインを用いてバイオパンニングという工程を含んでもよい。また、本発明は、前記抗体を産生するために核酸が発現するように宿主細胞を培養することを含む、前記抗体を製造する方法に関する。
【００４７】
本発明によるモノクローナル抗体は、公示の技術を利用して容易に製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、免疫化された動物のＢリンパ球（Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495）で作製したハイブリドーマ、または、ファージディスプレイ技術によって製造することができるが、これに限定されるのではない。
【００４８】
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて製造することができる。本発明による方法は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119, 1991 and J. Virol. 2001 Jul; 75(14): 6692-9）、及びＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994）を参考にして、工程別に実施されることができる。抗体ライブラリーを作製するに当たり有用なファージは、繊維状ファージであってもよく、例えば、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３があるが、これに限定されるのではない。繊維状ファージの表面上に外来遺伝子（exogenous genes）を発現するために使用できるベクターの例としては、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄＣＡＴ１及びｆｄｔｅｔＤＯＧのようなファージベクター、またはｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８及びｐＳＥＸのようなファージミドベクターを含むが、これに限定されるのではない。増幅用組換えファージの成功的な再感染のために必要なコートタンパク質の野生型バージョンを供給するのにヘルパーファージを用いて、Ｍ１３Ｋ０７及びＶＳＣＭ１３が挙げられるが、これに限定されるのではない。
【００４９】
本発明に係るハイブリドーマ−由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイクローンをコードするポリヌクレオチドは、一般的な工程によって容易に単離及びシーケンスすることができる。例えば、ハイブリドーマまたはファージテンプレートＤＮＡの重鎖及び軽鎖コード部位を特異的に増幅させるために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。一旦単離されると、ポリヌクレオチドは発現ベクター内に挿入できて、以後宿主細胞内に導入されることができる。その結果、製造された宿主細胞（即ち、形質転換体）は、目的とするモノクローナル抗体を生成することができる。従って、本発明の抗体の製造方法は、前記抗体のために、ポリヌクレオチドコードを行う発現ベクターを増幅させる工程を含んでもよい。好ましくは組換え抗体は、ヒトｓｃＦｖライブラリーからＦｃバインダーを先除去（pre-clearing）して、機能性ドメインでバイオパンニング技術を行うことによって、特定クローンを選択して製造することができる。
【００５０】
本発明は、前記エピトープまたは前記抗体用ポリヌクレオチドコード、前記ポリヌクレオチドを伝達する発現ベクター、及び前記ベクター内に固定させる形質転換体に関する。
【００５１】
抗体は、前記で記述したとおりである。
本発明によって前記エピトープまたは前記抗体を伝達する発現ベクターは、哺乳細胞（例えば、ヒト、猿、ウサギ、ネズミ、ハムスター、マウスなど）、植物細胞、イースト、昆虫細胞及びバクテリア細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）のような真核または原核細胞内にポリヌクレオチドの複製及び／または発現するようにするベクターを含むが、これに限定されるのではない。好ましくは、ベクターは、関心遺伝子の発現を誘導するようにするために、ポリヌクレオチドで使用可能に連結された適切なプロモーター、及び少なくとも一つ以上の選択マーカーを有してもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ−染色体（mini-chromosome）、ウイルスまたはレトロウイルスベクター内に導入されることができる。
【００５２】
抗体に対するポリヌクレオチドコードを行う発現ベクターは、前記抗体の重鎖及び前記抗体の軽鎖の各々に対するポリヌクレオチドコードを行う発現ベクター、または前記抗体の重鎖及び前記抗体の軽鎖に対するポリヌクレオチドコードを伝達する発現ベクターの組み合わせであってもよい。
【００５３】
本発明に係る発現ベクターの導入で生成された形質転換体の例としては、大腸菌、ストレプトマイセス（streptomyces）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のようなバクテリア細胞；イースト；ピキア酵母（Pichia pastoris）のような菌類；ショウジョウバエ（drosophila）、スポドプテラＳｆ９（spodoptera Sf9）のような昆虫細胞；ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞株、Chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫、mouse myeloma）、ヒトリンパ芽球性（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、悪性黒色腫細胞（melanoma cells）、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（子ハムスター腎臓細胞、baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胚芽腎臓細胞、human embryonic kidney cells）、及びＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞、human retina cell）のような動物細胞；及び植物細胞を含むが、これに限定されるのではない。
【００５４】
ここに用いられた用語「導入」とは、細胞内に前記エピトープまたは前記抗体をコードするポリヌクレオチドを伝達することを意味する。カルシウムホスフェート−ＤＮＡ共沈法（calcium phosphate-DNA co-precipitation）、ＤＥＡＥ−デキストリン−媒介トランスフェクション（DEAE-dextran-mediated transfection）、ポリブレン−媒介トランスフェクション（polybrene-mediated transfection）、電気穿孔法（electroporation）、微細注入法（microinjection）、リポソーム融合法（liposome fusion）、リポフェクタミントランスフェクション（Lipofectamine transfection）及び原形質融合法（protoplast fusion）を含む本分野での様々な公示技術を用いて導入を実施することができる。形質導入（transduction）は、外来ＤＮＡが感染を根拠にウイルスベクターを介して他の細胞に伝達される工程を示す。また、宿主細胞内へのベクターの伝達は、遺伝子衝撃（gene bombardment）によって達成されることができる。本発明で、導入は形質転換（transformation）に代わって使用できる。
【００５５】
他の観点において、本発明は、前記抗体を含む血管新生抑制用組成物に関する。
【００５６】
本発明による抗体が、血管新生を効果的に抑制できるので、前記抗体を有効成分として含む組成物も血管新生を抑制するのに有用で、追加で血管新生関連疾患を予防または治療するのに有用である。
【００５７】
ここに用いられた用語「血管新生の抑制（suppression of angiogenesis）」とは、以前に存在した血管から新しい血管の形成または成長を抑制することを意味する。本発明の目的のために、血管新生の抑制は、細胞移動、細胞間接触を抑制、より好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞移動、ｃｌｅｃ１４ａ−媒介細胞間接触、ＨＵＶＥＣ移動、または、チューブ形成、ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＬＴＤ−ＣＬＴＤ複合体形成を抑制することによって達成される。
【００５８】
ここに用いられた用語「血管新生関連疾患（angiogenesis-related disease）」とは、血管新生の発生または進行に関連した疾患を意味する。前記抗体で治療できるならば、その疾患は限定されることなく血管新生関連疾患の範囲に含まれる。血管新生関連疾患の例としては、癌、転移（metastasis）、糖尿網膜病症（diabetic retinopathy）、未熟児網膜病症（retinopathy of prematurity）、角膜移植拒否（corneal graft rejection）、黄斑変成（macular degeneration）、血管新生成緑内障（neovascular glaucoma）、全身紅色症（erythrosis）、増殖性網膜症（proliferative retinopathy）、乾癬（psoriasis）、血友病性股関節炎（hemophilic arthritis）、動脈硬化性プラーク（atherosclerotic plaques）の毛細血管形成、ケロイド（keloid）、創傷肉芽（wound granulation）、血管癒着（vascular adhesion）、リューマチ関節炎（rheumatoid arthritis）、退行性関節炎（osteoarthritis）、自己免疫疾患（autoimmune diseases）、クローン病（Crohn's disease）、再狭窄（restenosis）、粥状動脈硬化症（atherosclerosis）、腸狭窄（intestinal adhesions）、猫引っかき病（cat scratch disease）、潰瘍（ulcer）、肝硬変症（liver cirrhosis）、腎臓炎（nephritis）、糖尿病性腎臓疾患（diabetic nephropathy）、真性糖尿病（diabetes mellitus）、炎症疾患（inflammatory diseases）及び神経変成疾患（neurodegenerative diseases）を含むが、これに限定されるのではない。また、前記癌は、食道癌（esophageal cancer）、胃癌（stomach cancer）、大腸癌（large intestine cancer）、直膓癌（rectal cancer）、口腔癌（oral cancer）、咽頭癌（pharynx cancer）、喉頭癌（larynx cancer）、肺癌（lung cancer）、結腸癌（colon cancer）、乳癌（breast cancer）、子宮頸部癌（uterine cervical cancer）、子宮内膜癌（endometrial cancer）、卵巣癌（ovarian cancer）、前立腺癌（prostate cancer）、睾丸癌（testis cancer）、膀胱癌（bladder cancer）、腎臓癌（renal cancer）、肝臓癌（liver cancer）、すい臓癌（pancreatic cancer）、骨癌（bone cancer）、結合組織癌（connective tissue cancer）、皮膚癌（skin cancer）、脳腫瘍（brain cancer）、甲状腺癌（thyroid cancer）、白血病（leukemia）、ホジキンリンパ腫瘍（Hodgkin's lymphoma）、リンパ腫（lymphoma）及び多発性骨髄血液癌（multiple myeloid blood cancer）で構成された群から選択されるが、これに限定されるのではない。
【００５９】
ここに用いられた用語「予防（prevention or prophylaxis）」とは、本発明の抗体または組成物を投与して、関心疾患の開始を抑制または遅延するようにするいずれの措置を示す。用語「治療（treatment or therapy）」とは、本発明の抗体または組成物を投与して、関心疾患の症状が改善されたり好転するようにするいずれの措置を示す。
【００６０】
本発明の抗体を含む組成物は、好ましくは薬剤学的組成物で、本分野で典型的に用いられる適切なビークル、賦形剤または、希釈剤をさらに含んでもよい。
【００６１】
薬剤学的に許容可能なビークルを含む薬剤学的組成物は、錠剤、丸剤、粉末、顆粒剤、カプセル剤、懸濁液、内服液、エマルジョン、シロップ、滅菌水溶液、非水溶液、凍結乾燥物及び座薬のような多様な経口または非経口服用形態であってもよい。本発明の薬剤学的組成物は、フィラー、増粘剤、バインダー、湿潤剤、精製分解物質（disintegrant）、界面活性剤などのような希釈剤または賦形剤で組み合わせて製剤化されることができる。経口投与のための個相調剤は、錠剤、丸剤、粉末、顆粒剤、カプセル剤などのような形態であってもよい。これらの個相製剤と関連して、本発明の化合物は、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、またはゼラチンのような一つ以上の賦形剤を組み合わせて製剤化されることができる。簡単な賦形剤、マグネシウムステアレート、タルクなどのような潤滑剤を追加で用いても良い。経口投与のための液体助剤は、懸濁液、内服液、エマルジョン、シロップなどであってもよい。水または液体パラフィンのような簡単な希釈剤、湿潤剤、甘味剤、芳香族、防腐剤などのような多様な賦形剤を液体助剤内に含ませることができる。また、本発明の薬剤学的組成物は、滅菌水溶液、非水溶性溶媒、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥物、座薬などのような非経口服用形態であってもよい。注入可能なプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油及びエチルオレエートのようなエステルが、非水溶性溶媒及び懸濁液に適合することができる。座薬の基本物質は、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイン６１、カカオバター、ラウリンバター及びグリセロゼラチンを含む。
【００６２】
本発明の組成物は薬剤学的に有効な量で投与される。
ここに用いられた用語「薬剤学的に有効な量（pharmaceutically effective amount）」とは、すべての医学的治療に適用可能な妥当な危険度と受益度との割合（benefit/risk ratio）で、十分な疾患治療用薬剤学的組成物の量を示す。有効量は、治療しなければならない疾患の重症度、患者の年齢及び性別、疾患の種類、薬剤の活性度、薬剤に対する敏感度、投与時間、投与経路、分泌速度、治療期間、薬剤の共投与及び本分野で知らされた他のパラメーターを含んだ多様な要因によって変わる。本発明の組成物は、単独でまたは他の治療法と組み合わせて投与されてもよい。このような場合に、従来の治療法と共に順にまたは同時に投与されてもよい。また、前記組成物は、１回量または、多数回容量で分けて投与されてもよい。これらの要因を完全に考慮すると、副作用なしに最大効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要で、この服用量は、分野の専門家によって容易に決定される。本発明の薬剤学的組成物の服用量は、特に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含んだ多様な要因により変わる。組成物は一日に１回量または、多数回容量でラット、ネズミ、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許された経路、例えば、経口に、直腸に、静脈に（intravenously）、皮下に（subcutaneously）、子宮内に（intrauterinely）または脳血管内に（intracerebrovascularly）投与されてもよい。
【００６３】
他の観点において、本発明は、前記抗体または前記薬剤学的組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生を抑制する方法に関する。
【００６４】
前記抗体、前記組成物及び血管新生抑制は、前記に記述した通りである。
詳細に説明すると、本発明の抑制方法は、血管新生の抑制を必要とする個体に薬剤学的に有効な量の薬剤学的組成物を投与する工程を含む。
【００６５】
前記個体は、犬、牛、馬、ウサギ、マウス、ラット、鶏及びヒトのような哺乳類であってもよいが、これに限定されるのではない。薬剤学的組成物は、非経口的に（parenterally）、皮下に、腹腔内に（intraperitoneally）、肺内に（intrapulmonarily）または、鼻内に（intranasally）、必要ならば、局所治療のために病変内（intralesional）投与を含む適切な方法によって投与されてもよい。本発明の薬剤学的組成物の好ましい服用量は、個体の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含んだ多様な要因により変わり、本分野の当業者によって容易に決定される。
【００６６】
他の観点において、本発明は、前記抗体を含む、癌予防または治療用薬剤学的組成物に関する。
用語「抗体」、「予防」及び「治療」は、前記に言及した通りである。
本発明のペプチドで治療可能ならば、癌は制限されない。ｃｌｅｃ１４ａ−媒介腫瘍進行が発生する癌が好ましい。詳細には、本発明の抗体は、血管新生を抑制することによって、癌の発生または進行を予防することができる。前記癌の例では、食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、すい臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、甲状腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫瘍、リンパ腫及び多発性骨髄血液癌を含むが、これに限定されるのではない。
【００６７】
また、本発明の抗体は、他の抗体または生物学的活性剤または多様な目的のための物質と組み合わせて用いることができる。
【００６８】
本発明の一実施例で、本発明の抗体は、血管新生を抑制して癌の発生または進行を遅延させたり予防することが明らかになった。そのために、本発明の抗体は、癌の予防または治療に効果的に適用可能である。
【００６９】
他の観点において、本発明は、抗体または薬剤学的組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法に関する。
【００７０】
抗体、組成物及び癌は、前記に言及した通りである。
治療法で、前記薬剤学的組成物は、癌の疑いのある個体に薬剤学的に有効な量で投与されてもよい。前記個体は、犬、牛、馬、ウサギ、マウス、ラット、鶏及びヒトのような哺乳類であってもよいが、これに限定されるのではない。薬剤学的組成物は、非経口的に、皮下に、腹腔内に、肺内にまたは、鼻内に、必要ならば、局所治療のために病変内投与を含む適切な方法によって投与されてもよい。本発明の薬剤学的組成物の好ましい服用量は、個体の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含んだ多様な要因により変わり、本分野の当業者によって容易に決定される。
【００７１】
他の観点において、本発明は、前記抗体を含む癌診断用組成物に関する。
前記抗体及び癌は、前記に記述した通りである。
ｃｌｅｃ１４ａが特異的に発現した癌が好ましい。
【００７２】
ここに用いられた用語「診断（diagnosis）」とは、病理的状態の存在または性質の評価を示す。本発明の目的と関連して診断は、癌の発生を決めるものである。
【００７３】
他の観点において、本発明は、前記診断用組成物を含む癌診断用キットに関する。
【００７４】
本発明のキットは、癌、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤのマーカーを検出することができる。本発明の検出キットは、分析法に適合した一つまたはそれ以上の組成物、溶液、または、機器だけでなく、前記マーカーを選択的に認識する抗体を含んでもよい。
【００７５】
好ましくは、診断キットは、マトリックス、適切なバッファー溶液、発色酵素（coloring enzyme）または蛍光物質でラベリングされた２次抗体、抗体の免疫学的検出のための発色基質などを含んでもよい。前記マトリックスに対しては、ニトロセルロースメンブレン、ポリビニル樹脂で製造された９６ウェルプレート、ポリステレン樹脂で製造された９６ウェルプレート、及びスライドグラスが用いられてもよい。発色酵素に対しては、ペルオキシダーゼ及び塩基性ホスファターゼが用いられてもよい。蛍光物質に対しては、ＦＩＴＣ及びＲＩＴＣが用いられてもよく、発色基質溶液に対しては、ＡＢＴＳ（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)）、ＯＰＤ（o-phenylenediamine）、またはＴＭＢ（tetramethyl benzidine）が用いられてもよい。
【００７６】
他の観点において、本発明は、癌が疑われる個体から分離した生物学的試料内の抗原−抗体複合体を介してｃｌｅｃ１４ａ、好ましくは、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＬＴＤを検出する工程を含む、癌を診断する方法に関する。
抗体、癌、及び診断は、前記に記述した通りである。
より詳細には、生物学的試料からタンパク質を単離することは、公示の方法を用いて達成することができる。
【００７７】
ここに用いられた用語「生物学的試料」とは、癌マーカーｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤの発現程度での差を表示する試料を含み、例えば組織、細胞、血栓、血清、プラズマ、唾、痰、脳脊髄液（cerebrospinal fluid）または小便であってもよいが、これに限定されるのではない。
【００７８】
検出法に対しては正常対照群と癌の疑いのある患者のｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ発現程度を比較することによって、癌の発生を診断することができる。これは、正常細胞と癌の疑いのある細胞で本発明に係るマーカーの発現程度を比較するものである。もし癌の疑いのある細胞でマーカー発現程度が非常に増加すると確認されたとすれば、推測された癌は、癌として診断することができる。
【００７９】
タンパク質レベルを測定する分析法としては、ウェスタンブロッティング（Western blotting）、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫測定法（radioimmunoassay）、放射性免疫拡散法（radialimmunodiffusion）、オクタロニ免疫拡散法（Ouchterlony immunodiffusion）、ロケット免疫電気泳動法（rocket immunoelectrophoresis）、免疫組織染色（immunohistostaining）、免疫沈降反応分析法（immunoprecipitation assay）、補体固定分析法（complement fixation assay）、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップ分析法（protein chip assay）を含むが、これに限定されるのではない。分析法に対しては、形成された抗原−抗体複合体の量に対して正常コントロールと癌の疑いのある患者を比較して、癌マーカー遺伝子のタンパク質の発現程度において相当増加したものを評価することによって癌の疑いのある患者を診断する。
【００８０】
ここに用いられた「抗原−抗体複合体（antigen-antibody complexes）」とは、そこに特異的な抗体に癌マーカータンパク質の生成物が結合するものを示す。検出ラベルの信号強度を測定することによって、形成された抗原−抗体複合体の量を定量的に決めることができる。
【００８１】
前記検出ラベルは、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、マイクロ粒子、レドクス分子及び放射線同位元素で構成された群から選択されるが、本発明は前記実例に限定されるのではない。検出ラベルとして使用可能な酵素の例では、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼまたは塩基性ホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ及びＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、及びルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸脱炭酸酵素及びβ−ラクタマーゼを含むが、これに限定されるのではない。蛍光物質の例では、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタアルデヒド及びフルオレサミンを含むが、これに限定されるのではない。リガンドの例では、ビオチン誘導体を含むが、これに限定されるのではない。発光物質は、アクリジウムエステル（acridinium esters）、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含むが、これに限定されるのではない。マイクロ粒子の例では、金コロイド及び有色ラテックスを含むが、これに限定されるのではない。レドクス分子の例では、フェロセン、光電荷発生体、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジアミド、１，４−ペンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、[Ｏｓ（ｂｐｙ）３]２＋、[ＲＵ（ｂｐｙ）３]２＋、及び[ＭＯ（ＣＮ）８]４−を含むが、これに限定されるのではない。放射性同位元素は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ及び１８６Ｒｅを含むが、これに限定されるのではない。
【００８２】
好ましくは、タンパク質発現程度は、ＥＬＩＳＡによって測定される。ＥＬＩＳＡの例では、固相支持体上に固定化された抗原を認識するラベリングされた抗体を利用する直接ＥＬＩＳＡ、固相支持体上に固定化された抗原と複合体を形成するキャプチャー抗体を認識するラベリングされた抗体を利用する間接ＥＬＩＳＡ、固相支持体上に固定化された抗原−抗体複合体の抗原を認識する他のラベリングされた抗体を利用する直接サンドイッチＥＬＩＳＡ、及び固相支持体上に固定化された抗原−抗体複合体の抗原を認識する他のラベリングされた抗体を反応させて、他のラベリングされた抗体を認識する２次ラベリングされた抗体を使う間接サンドイッチＥＬＩＳＡを含む。より好ましくは、タンパク質発現程度は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出されるが、試料が固相支持体上に固定化された抗体と反応して、製造された抗原−抗体複合体は、抗原に特異的なラベリングされた抗体を添加した後、酵素発色（enzymatic color development）するか、抗原−抗体複合体の抗原を認識する抗体に特異的な２次ラベリングされた抗体を添加した後、酵素発色して検出される。癌マーカータンパク質及びこれに対する抗体の複合体形成程度を測定することによって、癌の発生を診断することができる。
【００８３】
また、タンパク質の発現程度は、好ましくは一つまたはそれ以上の抗体を前記癌マーカーに用いるウェスタンブロッティングによって測定される。総タンパク質は、試料から単離されて、電気泳動下でサイズ別で分離して、ニトロセルロースメンブレン上に移動させた後、抗体と反応させる。遺伝子発現によって生成されるタンパク質の量は、ラベリングされた抗体を用いて生成された抗原−抗体複合体の量を測定することによって決めて、癌の発生を診断する。検出法は、コントロールのマーカー遺伝子と癌が発生する細胞の発現程度を評価する方法で構成されている。ｍＲＮＡまたはタンパク質程度は、マーカータンパク質の量において絶対的な（例えば、μｇ／ｍＬ）または相対的な（例えば、信号の相対的な強度）差で示すことができる。
【００８４】
また、タンパク質発現程度は、癌マーカーに対する一つまたはそれ以上の抗体を用いる免疫組織染色によって好ましく測定される。正常内皮組織及び癌疑い組織を収集して固定させて、パラフィン包埋ブロックを公示の方法によって準備した。ブロックを小さいセクション（数ｕｍの厚さ）で切って、公示の方法により選択された一つまたはそれ以上の抗体と反応するグラススライドに付着させた。
【００８５】
続いて、未反応の抗体を洗浄して、反応した抗体を前記言及されたラベルで選択された検出ラベルでラベリングして顕微鏡で観察した。
【００８６】
癌マーカーに対する一つまたはそれ以上の抗体が配列されて、基質上に予定された位置で高密度に固定されるタンパク質チップを利用して、タンパク質レベルを分析することも好ましい。これと関連して、タンパク質を試料から分離して、タンパク質チップでハイブリダイゼーションして抗原−抗体複合体を形成して、関心タンパク質の存在または発現程度を検査するために解読して癌の発生を診断する。
【００８７】
他の観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａの発現を抑制する物質を含む血管新生抑制用組成物に関する。
好ましくは前記物質は、ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの発現を抑制する物質であってもよい。
【００８８】
本発明の一実施例で、細胞移動及びチューブ形成（例えば、糸状仮足形成）を抑制するに当たり重要な役割を果たすことが確認された（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂ）。このような結果は、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの発現を抑制する物質が血管新生を抑制することを示唆する。
【００８９】
ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの発現を抑制する物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマー、単鎖可変部位切片（single chain variable region fragments）、ペプチド、低分子量化合物及び自然抽出物を含むが、これに限定されるのではない。
【００９０】
好ましくはｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤの発現を抑制する物質は、ｃｌｅｃ１４ａ遺伝子、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ遺伝子の発現を抑制する物質に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００９１】
ここに用いられた用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定ｍＲＮＡ配列に対し相補的な核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれの誘導体を意味して、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡでタンパク質への翻訳を抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってもよく、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ｍＲＮＡに結合することができ、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ｍＲＮＡの翻訳、細胞質電位（cytoplasmic translocation）または成熟または全体生物学的機能に対して必須の他の全ての活性を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、６〜１００塩基、好ましくは８〜６０塩基、さらに好ましくは１０〜４０塩基の長さを持つ。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率を向上させるために一つまたはそれ以上の塩基、糖または、バックボーン位置で変形されうる（De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3): 343-55 (1995)）。オリゴヌクレオチドバックボーンは、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル、シクロアルキルまたは、単鎖ヘテロ原子またはヘテロシクロ糖内結合に変形されることができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つまたはそれ以上の置き換えられた糖官能基を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、変形された塩基を含んでもよい。変形塩基の例では、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−メチル−ピリミジン（特に、５−メチルシトシン）、５−ヒドロキシメチルシトシン（5-hydroxymethylcytosine、ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、ゲンチオビオシルＨＭＣ、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンを含む。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つまたはそれ以上の官能基またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性及び細胞取り込みを増強させるコンジュゲートに化学的に結合することができる。例えば、親油性官能基（liphophilic moieties）は、コレステロール官能基（cholesterol moiety）、コレステリル官能基（cholesteryl moiety）、コール酸）、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪鎖、リン脂質、ポリアミン鎖、ポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル官能基（palmityl moiety）、オクタデシルアミン官能基（octadecylamine moiety）及びヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール官能基（hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety）を含むが、これらに限定されるのではない。官能基を含むオリゴヌクレオチドを製造する方法は、本分野で公示されている（米国特許第５１３８０４５号明細書、第５２１８１０５号明細書及び第５４５９２５５号明細書）。変形されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼの存在下に増強された安定性及びターゲットｍＲＮＡに対する増強された結合親和度を持つことができる。
【００９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的な方法で生体外で合成されて、身体に投与され、生体内で合成されることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを生体外で合成する方法は、ＲＮＡポリメラーゼＩを利用する。アンチセンスＲＮＡを生体内で合成する方法は、反対方向にマルチクローニング部位（multicloning site、ＭＣＳ）を含むベクターを利用して、アンチセンスＲＮＡの転写を実施することを含む。前記アンチセンスＲＮＡは、好ましくはペプチド配列内への翻訳を遮断するために、その配列内に翻訳停止コドンを含む。
【００９４】
本発明で有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインは、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤのヌクレオチド配列を参考にして、本分野の公示の方法によって容易に実行できる（Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55: 334-358 (1999)）。
【００９５】
ここに用いられた用語「ｓｉＲＮＡ」はＲＮＡ干渉または、遺伝子サイレンシング（gene silencing）を媒介できる核酸分子を示す（参考文献：国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号、国際公開第０１／２９０５８号、国際公開第９９／０７４０９号 及び 国際公開第００／４４９１４号）。ｓｉＲＮＡは、ターゲット遺伝子の発現を抑制できるので、遺伝子ノックダウンまたは遺伝子治療法の効果的な方法を提供する。植物、虫、ショウジョウバエ及び寄生虫で初めて発見されたｓｉＲＮＡは、最近開発されて哺乳類細胞の研究に用いられている。
【００９６】
本発明のｓｉＲＮＡ分子が用いられる場合に、センスストランド（ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ｍＲＮＡ配列に対応する配列）及びそのアンチセンス鎖（ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ｍＲＮＡ配列に相補的な配列）が、二重鎖を形成する構造を持つ。そうでなければ、自己−相補的なセンス及びアンチセンス鎖を持つ一本鎖構造を持つことができる。
【００９７】
ｓｉＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ官能基が完全な対を構成することに限定されず、ミスマッチ（mismatch、相補的でない塩基に対応する）、バルジ（bulge、一つの鎖内の塩基に対応しない）のような対を形成しない官能基を含む。ｓｉＲＮＡの総長は、１０〜１００塩基、好ましくは１５〜８０塩基、さらに好ましくは２０〜７０塩基である。
【００９８】
ｓｉＲＮＡの末端は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ遺伝子の発現を抑制できるならば、末端が鈍かったり凝集性であってもよい。凝集性末端は、３'−または５'−凝集性末端の中一つであってもよい。
【００９９】
本発明で、ｓｉＲＮＡ分子は、自己−相補的なセンス及びアンチセンス鎖の間に挿入された短いヌクレオチド配列（例えば、約５−１５個のヌクレオチド）を持つことができる。この場合、ヌクレオチド配列の発現から形成されたｓｉＲＮＡ分子は、分子間ハイブリダイゼーションを介して、ヘアピン構造を形成して、結果的に全体的にステム−ループ構造を形成する。ステム−ループ構造は、生体外または生体内で加工されてＲＮＡｉを調節できる活性化したｓｉＲＮＡ分子を生成する。
【０１００】
ここに用いられた用語「アプタマー」とは、特定ターゲット分子に対して結合親和度を持つ核酸分子を示す。また、アプタマーは、特定ターゲット分子に結合することによって特定ターゲット分子の活性を抑制することができる。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、変形核酸またはその混合物であってもよい。本発明のアプタマーはさらに、線形または環状型であってもよい。本発明のアプタマーは、特にその長さに限定されない。典型的に、約１５〜２００個、例えば、約１００個以下のヌクレオチド、好ましくは約８０個以下のヌクレオチド、さらに好ましくは約６０個以下のヌクレオチド、最も好ましくは約４５個以下のヌクレオチドの長さを持つ。本発明のアプタマーはさらに、約１８、２０または２５個以上のヌクレオチドの長さを持つ。ヌクレオチドの合計数が少ないほど、化学合成及び大量産生がより容易で、費用面でも主要な長所がある。化学変形も容易で、体内の安定性が高くて毒性は低い。
【０１０１】
本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法またはその改訂版を利用して製造することができる（例えば、Ellington et al., Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510）。ＳＥＬＥＸ法は、１０〜１４個の異なるヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドプールからターゲット分子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを選択する方法である。用いられたオリゴヌクレオチドは、約４０残基の無作為配列を持って、プライマー配列の側面に位置している（flanked by）。このオリゴヌクレオチドプールは、ターゲット分子と混合されるようになって、ターゲット分子に結合したＲＮＡだけがフィルターなどを利用して収集される。収集されたオリゴヌクレオチドは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されて、これは次回のためにテンプレートとして用いられる。前記操作を約１０回繰り返すことによって、ターゲット分子に特異的に結合したアプタマーを得ることができる。ラウンド数を増加させたり競争物質を用いることによってターゲット分子に対して強力な結合ポテンシャルを見せるアプタマーは、濃縮及び選択される。そうして、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節する及び／又は、競争条件を調節させることによって、異なる結合力または結合モードを持つアプタマー、及び同じ結合力または結合モードを持つが、異なる塩基配列を持つアプタマーをいくつかの場合で得ることができる。ＳＥＬＥＸ法は、ＰＣＲによる増幅工程を含む；工程のうちにマンガンイオンなどを利用して突然変異を起こすことによってより高い多様性を持つＳＥＬＥＸを行うことが可能である。
【０１０２】
公示のＳＥＬＥＸ法に加えて、複合体ターゲット、生細胞または組織に対するアプタマー細胞−セレックス方法（Cell-SELEX method）を利用して、アプタマーもまた得ることができて（Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9(4): 668, 2008）、細胞−セレックス方法は、表面上のターゲット分子の過去の知識がなくても疾患に対しアプタマーを直接選択する長所がある。さらに単離される際に、固有の性質を示さないことがあるので、選択過程中に生理学的状態でのターゲットタンパク質に対する機能的なアプローチが可能であるとの側面から細胞−セレックス方法は従来のセレックス方法に比べて有利である。
【０１０３】
一方、アプタマーは、ホスフェート基の負電荷を基にしたイオン結合、リボースを基にした水素結合及び核酸塩基を基にした水素結合及び積層結合（stacking interaction）のような多様な結合モードで、ターゲット分子と結合する。特に、ホスフェート基の負電荷を基にしたイオン結合は、構成ヌクレオチドの数と同じ数で存在して、強くて、タンパク質の正電荷表面に存在するリジン及びアルギニンと結合する。このような理由から、核酸は置き換えられるターゲット分子に直接結合することには関与しない。特に、幹構造の部位は、塩基対を既に形成して、二重らせん構造の内面に直面して、核酸塩基は、ターゲット分子に直接結合しないものと見られる。従って、塩基対が異なる塩基対と交替させられる時でさえも時々アプタマーの活性は減少しない。ループ構造のように塩基対が形成されない構造では、核酸塩基がターゲット分子に直接結合するのに関与せず、塩基置換は可能である。例えば、リボースの２'−位置でヒドロキシ基はすべての元素または官能基で置き換えられる。元素または官能基の例では、水素原子、フッ素原子または−Ｏ−アルキル基（例えば、−Ｏ−ＣＨ３）、−Ｏ−アシル基（例えば、−Ｏ−ＣＨＯ）、及びアミノ基（例えば、−ＮＨ２）を含むことができる。ターゲット分子に直接結合するのに関与する官能基が置き換えられたり除去されないならば、アプタマーは通常その活性を維持する。
【０１０４】
また、アプタマーは、化学合成を許容するので、容易に変形可能である。アプタマーに対してＭＦＯＬＤプログラムを利用して２次構造を予測したり、Ｘ線分析またはＮＭＲ分析で立体構造を予測することによって、ヌクレオチドが置き換えられたり除去できる程度で予測することが可能である。新しい配列を持つ予測されたアプタマーは、容易に化学的に合成でき、現存するアッセイシステムを利用して、アプタマーが活性を維持するか否かを決めることができる。
【０１０５】
本発明のアプタマーは、各ヌクレオチドの糖残基（例えば、リボース）が変形されて結合活性、安定性、薬剤伝達性などを増加させるものであってもよい。糖の残基での変形の例としては、糖の残基の２'−位置、３'−位置及び／または４'−位置で酸素を他の原子に置換させることなどが挙げられる。変形の一種として、フッ素化、Ｏ−アルキル化（例えば、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリール化、Ｓ−アルキル化（例えば、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリール化、及びアミノ化（例えば、−ＮＨ）が挙げられる。前記糖の残基での変更（alterations）は、公示方法それ自体によって実行されることができる（例えば、 Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 1991 19, 733-738; Cotton et al., Nucl. Acid. Res. 1991 19, 2629-2635; Hobbs et al., Biochemistry 1973 12, 5138-5145）。
【０１０６】
本発明のアプタマーはさらに、核酸塩基（例えば、プリンまたは、ピリミジン）を持っても良く、結合活性を増加させるために変形されてもよい（例えば、化学置換によって）。前記変形の例としては、５'−位置でのピリミジン変更、６−及び／または８−位置でのプリンの変更、エキストラサイクリックアミンに変更、４−チオウリジンに置換、及び５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルに置換が挙げられる。
【０１０７】
本発明のアプタマーに含まれたホスフェート基は、核酸加水分解酵素及び加水分解に耐性を与えるために変形される。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ官能基は、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ'、ＣＯ  ｏｒ  ＣＨ２（ホルムアセタール）または３'−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）[ここでＲまたはＲ'の各々のユニットは、独立してＨまたは置換若しくは非置換のアルキル基である（例えば、メチル、エチル）]で置き換えられてもよい。連結基（joining group）は、例えば−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−及びこれらの連結基を介して隣接するヌクレオチドに結合できるヌクレオチドである。
【０１０８】
また、変形は、３'及び５'でのキャップのような変形を含んでもよい。変形は、末端にポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、逆ｄＴ（inverted dT）、核酸、ヌクレオシド、ミリストイル（Myristoyl）、リトコール酸−オレイル（Lithocholic-oleyl）、トコサニル（Docosanyl）、ラウロイル（Lauroyl）、ステアロイル（Stearoyl）、パルミトイル（Palmitoyl）、オレオイル（Oleoyl）、リノレオイル（Linoleoyl）、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、顔料、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを添加することによって追加で実施できる。
【０１０９】
前記変形に対しては、例えば、米国特許第５６６０９８５号明細書及び第５７５６７０３号明細書を参考にする。
またアプタマーは、リポソームまたはナノ粒子の表面に結合して、抗癌剤、毒素、腫瘍抑制遺伝子、及び前記リポソームまたはナノ粒子内にカプセル化されたｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）をターゲット細胞に伝達する。
【０１１０】
本発明で、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤの発現、特にその活性を抑制する物質は、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに特異的に結合する抗体、ペプチド、低分子量化合物、または、自然抽出物である。
【０１１１】
ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに特異的に結合できる抗体は、前記に記述した通りである。
【０１１２】
ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤに特異的に結合して、その活性を抑制するペプチドは、本分野で公示された典型的な方法、例えば、ファージディスプレイ（phage display）によって得ることができる（Smith GP, “Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface”. Science 228 (4705): 1315-1317 (1985); Smith GP, Petrenko VA, “Phage display”. Chem. Rev. 97(2): 391-410 (1997)）。
好ましくは血管新生抑制用組成物は、血管新生を抑制することによって癌を治療することができる。
【０１１３】
好ましくは血管新生抑制用組成物は、血管新生を抑制することによって血管新生関連疾患を治療することができる。
【０１１４】
他の観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくは、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＬＴＤの発現を阻害する物質を含む組成物を含む血管新生抑制用キットに関する。
【０１１５】
他の観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくは、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＬＴＤの発現を阻害する物質を含む組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法に関する。
【０１１６】
他の観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａ、好ましくは、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＬＴＤの発現を阻害する物質を含む組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、癌を治療する方法に関する。
【０１１７】
他の観点において、本発明は、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体と薬物が結合した抗体−薬物結合体に関する。前記薬物は、毒素、化学治療剤（chemotherapeutic agent）、抗癌剤、抗生剤、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（ADP-ribosyl transferase）、放射性同位元素及び核酸分解酵素（nucleolytic enzyme）で構成された群から選択された一つであってもよいが、これに限定されるのではない。
【０１１８】
好ましくは、前記抗体−薬物結合体は、細胞内に内在化できる（internalized）。本発明の一実施例で、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが、癌細胞のようなｃｌｅｃ１４ａを発現する細胞内に内在化できる（図９Ａ、９Ｂ）。
【０１１９】
他の観点において、本発明は、ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤ及びＦｃの融合タンパク質を含む、血管新生関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物に関する。
【０１２０】
本発明の一実施例で、ｈＣＴＬＤ−Ｆｃは、濃度依存的にチューブ形成を抑制した（図１１）。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
【０１２２】
≪実施例１：細胞培養及びトランスフェクション≫
ＨＵＶＥＣ（Human umbilical vein endothelial cells、Lonza, Baltimore, MD, USA）をＥＧＭ−２（endothelial growth medium-2）に置いた。ＭＡＥＣ（Mouse aortic endothelial cells）及びＣＯＳ−７細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（fetal bovine serum）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium）中で培養した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で湿度及びＣＯ２が調節されたインキュベーター（（Sanyo, Panasonic Healthcare Company, Secaucus, NJ, USA）に維持した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、湿度調節されたＭｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーション振とう機（Infors HT, Bottmingen (Switzerland)）中に１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Invitrogen）で３７℃及び８％ＣＯ２で維持した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて製造者の指示に従って、ＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ（野生型ｃｌｅｃ１４ａ）またはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰ（ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ欠失変異体）をコードするベクターでＨＵＶＥＣｓ及びＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションした。
【０１２３】
≪実施例２：ヒト及びマウスＣＴＬＤ  Ｆｃ融合タンパク質の構築及び作製≫
プライマー５’−ＴＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＧＧ−３’（配列番号２）を用いてｈＣＴＬＤの３１−１７２番アミノ酸残基をコードするＤＮＡを増幅した。ｍＣＴＬＤの同じ残基をコードするＤＮＡは、プライマー５’−ＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＡＧＧＴＡＧＣＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号４）を用いて増幅した。ＳｆｉＩ（NEB, Ipswich, MA, USA）を処理してＰＣＲ断片を作製して、ヒンジ及びヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインをコードする変形哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Invitrogen）の３'部位のクローニングサイトにクローニングした（gift of Dr. Chung, Seoul National University, Seoul, South Korea）。ライゲーションされた産物を反応性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞に形質転換し、プラスミドＤＮＡを作製した。１．５ｍｇポリエチレンイミン（polyethylenimine: Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA）を用いて、各ＤＮＡ０．７５ｍｇでＨＥＫ２９３Ｆ細胞（６×１０８ｃｅｌｌｓ）をトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地に維持した。７日間培養した後、培養培地を回収して、タンパク質Ａセパロード（RepliGen, Waltham, MA, USA）の親和度クロマトグラフィーを介して融合タンパク質を精製した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Wilmington, DE, USA）を用いてタンパク質濃度を定量した。サンプルをＰＢＳで透析してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブリリアントブルー染色（Coomassie brilliant blue staining）を介して分析した。最終収集された分画の分液（aliquot）を−８０℃に保管した。
【０１２４】
≪実施例３：ヒト合成ｓｃＦｖライブラリーの事前除去≫
ヒト合成ｓｃＦｖライブラリー（Barbas CF. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001）を再増幅した。Ｆｃバインダーを事前除去するために、タンパク質Ａセパロード上にヒトイムノグロブリン−Ｇ（Green Cross Pharma Derivatives Corp, Yong-in, Korea）を固定させて、３７℃で抗体−タンパク質Ａ複合体を２時間インキュベーションした。簡単な遠心分離後、上澄液を収集して、ペレットは除去した。このような過程を２回繰り返した。最終上澄液をファージＥＬＩＳＡで分析して除去の程度を評価した。
【０１２５】
≪実施例４：ファージディスプレイを用いたＣＴＬＤ特異的ｓｃＦｖの選別≫
４μｇ組換えヒト（ｈＣＴＬＤ−Ｆｃ）またはマウス（ｍＣＴＬＤ−Ｆｃ）融合タンパク質でコートされたイムノチューブ（ImmunoTM tube maxisorp, Nunc, Rochester, NY, USA）または、マグネチックビーズ（Dynabeads M-270 epoxy, Invitrogen）で３回のバイオパンニングを行って、Barbas CF. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001; Vestweber D. Lymphocyte trafficking through blood and lymphatic vessels: more than just selectins, chemokines and integrins. European Journal of Immunology. 2003; 33(5): 1361-4に記述された通り、種交差反応性を持つクローンを選別した。アウトプットプレートで育ったコロニーから無作為で９６個のファージクローンを選別して、ファージ酵素免疫アッセイを介してヒトとマウスＣＴＬＤに対する反応性をテストした。最終ｓｃＦｖクローンのＤＮＡをシーケンスして、異なる相補性決定領域配列を持つと確認された四つのｓｃＦｖクローンに分類した。
【０１２６】
≪実施例５：ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの作製≫
プライマー５’−ＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧ−３’（配列番号５）及び５’−ＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣ−３’（配列番号６）を用いて選別されたｓｃＦｖクローン（クローン１−４）の重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子を増幅した。クローンの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、プライマー５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＧＧＣＣＧＴＡＣＧＴＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡＡＧＡＣＡＴＡＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号８）を用いて増幅した。５'及び３'両末端にＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限酵素サイトを追加して、ＶＨプライマーを設計した。両末端にＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩサイトを追加して、ＶＬプライマーを設計した。ＰＣＲ断片を適切な制限酵素（NEB, Ipswitch, MA, USA）で処理して、ヒンジ及びヒトｌｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインをコードするｐＣＤＮＡ３．１（bicistronic mammalian expression vector, Invitrogen）（gift of Dr. Hong, Kangwon National University, Chuncheon, Kangwon, South Korea）の３'ＶＨクローニングサイトにクローニングした（Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001）。Ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧを産生して、Kim HY, Tsai S, Lo SC, Wear DJ, Izadjoo MJ. Production and characterization of chimeric monoclonal antibodies against Burkholderia pseudomallei and B. mallei using the DHFR expression system. PLoS ONE [Electronic Resource]. 6(5): e19867に記述された通り精製した。
【０１２７】
≪実施例６：創傷治癒及び細胞移動性アッセイ≫
製造者の指示に従って、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔＴＭ２４−ｗｅｌｌ創傷治癒アッセイキット（wound healing assay kit: Cell Biolabs Inc, San Diego, CA, USA）を用いた。簡単に、創傷治癒挿入口の一番上に開放された末端を介してピペットチップを注意深く挿入して、ＧＦＰでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰを各ウェルに入れた。細胞が育って合流すれば、挿入口をウェルから除去して、細胞をＰＢＳ（phosphate-buffered saline）で２回洗浄した。損傷２０時間が過ぎた後、イメージをキャプチャーした。
内皮細胞移動性を分析するために、単一層が形成されるまでＨＵＶＥＣを挿入口で培養して、２０μｇ／ｍＬのｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧまたはセツキシマブの存在あるいは不在下で９時間の間３７℃でインキュベーションした。細胞を２回ＰＢＳで洗浄して、クリスタルバイオレット（Sigma, St. Louis, MO, USA）で染色した。定量分析のために、光学顕微鏡（Nikon TS 100, Melville, NY, USA）下でプレート当たり５個のフィールドを撮影して、移動距離をマニュアルに従って測定した。
【０１２８】
≪実施例７：免疫細胞化学≫
Lee S, et al., Hydrogen peroxide increases human leukocyte adhesion to porcine aortic endothelial cells via NFkappaB-dependent up-regulation of VCAM-1. Int Immunol. 2007 Dec; 19(12): 1349-5926に記述された通り、免疫細胞化学を行った。簡単に、ＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ、またはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰでトランスフェクションされて、１日間コラーゲンでコートされたカバースリップで成長したＣＯＳ−７細胞及びＨＵＶＥＣを３０分間３７℃で４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄して、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（bovine serum albumin）及び０．１％ＴＸ−１００を含んだＰＢＳで１時間３７℃でインキュベーションして遮断した。０．１ｕｎｉｔ／ｗｅｌｌローダミンパロイジン及び２μｇ／ｍＬヘキストと共に１時間細胞をインキュベーションして、蛍光顕微鏡（Leica DM2500, Wetzlar, Germany）下で観察した。
【０１２９】
≪実施例８：ＥＬＩＳＡ≫
ＰＢＳに含まれた２５ｎＭの組換えｈＣＴＬＤ−Ｆｃ、ｍＣＴＬＤ−ＦｃまたはＩｇＧ１のＦｃ断片をマイクロタイタープレートの９６ウェルに入れた。３７℃で一夜インキュベーションした後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含んだＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳＴに３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含んで１時間３７℃でインキュベーションした。以後、プレートを３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含んだＰＢＳＴに６７ｎＭ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧを含み、３時間３７℃でインキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄して、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中でＨＲＰ（horseradish peroxide）が接合された抗−ヒトラムダ軽鎖抗体（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA）（１：１０００に希釈）と１時間３７℃でインキュベーションした。
【０１３０】
ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用を測定するために、ＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の溶解物（２０μｇ）を９６−ｗｅｌｌプレートのウェルに入れて、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含んだＰＢＳＴで１時間３７℃でインキュベーションした後、同じバッファーに０．１５μｇのｈＣＴＬＤ−ＦｃまたはＦｃを添加して、２時間３７℃でインキュベーションした。ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧとの競争の有無をアッセイするために、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの濃度を増加させて、ｈＣＴＬＤ−Ｆｃと２時間３７℃で予めインキュベーションした。以後、タンパク質複合体をウェルに入れて２時間３７℃でインキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄して、ＨＲＰが接合されたロバ抗−ヒトＦｃ  ＩｇＧ（１：５０００；Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA）を入れて、１時間３７℃でインキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄して、１００μＬ  ＴＭＢ基質溶液（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を各ウェルに入れた。マイクロタイタープレートリーダー（microtiter plate reader: VICTORTM X4, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）を用いて４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１３１】
≪実施例９：フローサイトメトリー≫
６−ｗｅｌｌマイクロタイタープレートで育ったＨＵＶＥＣ（３×１０５）を２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＴＮＦα（Millipore, Billerica, MA, USA）、または、２０μｇ／ｍＬ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧまたはセツキシマブの存在または不在下で２４時間インキュベーションした。細胞を収穫して、フローサイトメトリーバッファー中で１時間３７℃で２０μｇ／ｍＬ抗−ＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１ポリクローナル抗体と共に染色した。細胞をフローサイトメトリーバッファーで３回洗浄して、１０００Ｘｇで１０分間遠心分離して、フローサイトメトリーバッファー中でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８でラベリングされた抗−ウサギ抗体（１：１０００；Jackson ImmunoResearch）と１時間３７℃でインキュベーションした。
【０１３２】
６ウェルマイクロタイタープレートで育ったＨＵＶＥＣ（３×１０５）を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞と固定されなかった細胞をＰＢＳで２回洗浄して、２０μｇ／ｍＬ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ存在または不在下で２時間３７℃でインキュベーションした。７．５μｇ／ｍＬヒツジ抗−ｃｌｅｃ１４ａポリクローナル抗体で２時間３７℃で細胞を染色した。細胞をフローサイトメトリーバッファーで３回洗浄して、フローサイトメトリーバッファー中でＮＬ４９３（Northern LightsTM 493 Fluorochrome）でラベリングされた抗−ヒツジ抗体（１：２００；R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）と共にインキュベーションした後、フローサイトメトリー（BD FACSCalibur, BD Bioscience, Miami, FL, USA）で分析した。
【０１３３】
≪実施例１０：チューブ形成≫
Rho SS, et al., Clec14a is specifically expressed in endothelial cells and mediates cell to cell adhesion. Biochemical & Biophysical Research Communications. 404(1): 103-8に記述された通り、チューブ形成アッセイを行った。簡単に、２５０μＬ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences, Bedford, MA）を２４−ｗｅｌｌプレートのウェルに入れて、３７℃で２０分間重合されるようにした。ＥＧＭ−２で培養されたＨＵＶＥＣを収穫して、ＥＧＭ−２に再懸濁した後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に接種した。培養物をｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧまたはセツキシマブの存在または不在下で３７℃でインキュベーションして、２１時間後撮影した。チューブはマニュアルに従ってカウントした。
【０１３４】
≪実施例１１：ＨＵＶＥＣ細胞生存能アッセイ≫
ＨＵＶＥＣ（１０４）を９６−ｗｅｌｌマイクロタイタープレートに接種して、２０μｇ／ｍＬ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ、セツキシマブまたは５−ＦＵ（Sigma）と２日間３７℃でインキュベーションした。細胞生存能は、セルカウンティングキット−８（Cell Counting Kit-8：Dojindo, Kumamoto, Japan）を用いて製造者の指示に従って測定した。ＶＩＣＴＯＲＴＭＸ４分光光度計（Perkin Elmer）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１３５】
≪実施例１２：細胞−細胞接触測定≫
細胞−細胞接触法をRho SS, et al., Clec14a is specifically expressed in endothelial cells and mediates cell to cell adhesion. Biochemical & Biophysical Research Communications. 404(1): 103-8に記述された通り行った。簡単に、懸濁液のうち１．５×１０７ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＧＦＰ、Ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ及びＣｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰを発現するプラスミドでトランスフェクションして、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ２９３発現培養液で一夜の間培養した後、６ウェルプレートに接種した（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。２０μｇ／ｍＬ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧまたはセツキシマブの存在または不在下で８時間細胞を維持した。細胞凝集体（ｍａｓｓ＞４ｃｅｌｌｓ）を１０個以上のフィールドでカウントして、平均±標準偏差（ＳＤ）を計算した。
【０１３６】
≪実施例１３：免疫ブロット分析≫
Van Meter KE, et al., A monoclonal antibody that inhibits translation in Sf21 cell lysates is specific for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 2008; 69(3): 107-17に記述された通り免疫ブロット分析を行った。簡単に、１２％ポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動してＧＦＰ−、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ−、またはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰを分離した。ウェットトランスファーシステム（wet transfer system: GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移動した。５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含み、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＴＢＳ）で１時間室温でインキュベーションした後、同じ溶液で抗−ＧＦＰ単クローン抗体（１：５０００；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）または、抗−β−アクチン単クローン抗体（１：５０００；Applied Biological Materials, Richmond, BC, Canada）と共に４℃で一夜でインキュベーションした。ＴＴＢＳで膜を洗浄して、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含むＴＴＢＳでＨＲＰ−接合されたアフィニピュアヤギ抗−マウスＩｇＧ（HRP-conjugated Affinipure goat anti-mouse IgG）（１：５０００；Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA）と共に１時間室温でインキュベーションした。ＴＴＢＳで数回洗浄した後、製造者の指示に従って、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Pierce, Rockford, IL, USA）を用いてタンパク質バンドを視覚化した。
【０１３７】
≪実施例１４：細胞ＥＬＩＳＡ≫
９６ウェルプレートに置かれたＨＵＶＥＣｓ（１０４）を２０μｇ／ｍＬ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧまたはＦｃと共に０、１０、３０、６０、１２０、または、１８０分間３７℃でインキュベーションした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄して、１時間４℃で３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含むＰＢＳで遮断した後、遮断溶液中でヒツジ抗−ｃｌｅｃ１４ａポリクローナル抗体（１：１０００）と２時間４℃でインキュベーションした。氷冷ＰＢＳで細胞を３回洗浄して、ＨＲＰと接合された抗−ヒツジＩｇＧ（１：５０００；Santa Cruz Biotechnology）と１時間４℃でインキュベーションした。ＰＢＳで数回洗浄後、１００μＬ  ＴＭＢ基質溶液を各ウェルに追加した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１３８】
≪実施例１５：エピトープマッピングに対するＥＬＩＳＡ≫
ＰＢＳにある１０μｇ／ｍＬ  ｈＣＴＬＤ−Ｆｃ、ＦｃまたはｈＣＴＬＤ−ＦｃのＮ−末端またはＣ−末端断片の各々を９６ウェルプレートに入れた。プレートを３７℃で一夜でインキュベーションして、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗浄した後、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含んだＰＢＳＴと１時間３７℃でインキュベーションした。３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中１０μｇ／ｍＬ  ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧと共に２時間３７℃でプレートをインキュベーションした。ＰＢＳＴで２回洗浄した後、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中ＨＲＰで接合された抗−ヒトラムダ軽鎖抗体（１：１０００；Bethyl Laboratories, TX, USA）を１時間３７℃でインキュベーションした。
【０１３９】
≪実施例１６：ｈＣＴＬＤ−Ｆｃの存在または不在下でのチューブ形成アッセイ≫
２５０μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）を２４ウェルプレートに入れて、２０分間３７℃で重合されるようにした。ＥＧＭ−２で培養されたＨＵＶＥＣを収穫して、ＥＧＭ−２に再懸濁した後、Ｍａｔｒｉｇｅｌに接種した（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。１０μｇ／ｍＬ及び２５μｇ／ｍＬ  ｈＣＴＬＤ  ＦｃまたはＦｃの存在または不在下で培養物を３７℃インキュベーションして、８時間後撮影した。
【０１４０】
≪試験例１：Ｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤは細胞移動及びフィロポジウム形成に重要な役割を果たすことができる≫
ｃｌｅｃ１４ａ媒介細胞移動でのＣＴＬＤの役割を説明するために、ＣＯＳ−７細胞をＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ（wild-type clec14a fused to GFP）またはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰ（clec14a CTLD deletion mutant fused to GFP）でトランスフェクションして、０時間及び２０時間となった時創傷治癒アッセイでの移動を分析した。野生型ｃｌｅｃ１４ａを発現する細胞の移動程度は、ＧＦＰ単独発現細胞に比べて約１．６倍高い反面、ｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ欠失変異体の発現は、移動にほとんど影響を与えなかった（図１Ａ及び１Ｂ）。
細胞移動は、アクチン細胞骨再配列によって精巧に調節されるので、免疫細胞化学を用いてＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰを発現するＣＯＳ−７細胞及びＨＵＶＥＣでのアクチンネットワーク組織を調べた。二つの細胞類型で共に、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ発現は、顕著にフィロポジウム形成を増加させた反面、ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰは最小の影響を示した（図２Ａ及び２Ｂ）。
まとめると、このような結果は、アクチン細胞骨格再配列を介してＣＴＬＤが内皮細胞移動に重要な役割を果たすことができることを示す。
【０１４１】
≪試験例２：ＣＴＬＤ特異的ｓｃＦｖ（single-chain variable fragments）の分離≫
ヒト、マウスまたはチンパンジーｃｌｅｃ１４ａ（表１）のＣＴＬＤは、Ｆｃ融合タンパク質であるため、ヒト合成ｓｃＦｖライブラリーからＦｃバインダーを除去するために、２工程の連続的事前除去過程を行った；ファージ酵素結合免疫吸着法によって約９０％が除去されたことを確認した。
【０１４２】
【表１】
2016503286.tif 000003
【０１４３】
本発明で用いられたアミノ酸配列に対するに対するアミノ酸残基はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って略字で表される：
Alanine: A Arginine: R
Asparagine: N Aspartic acid: D
Cysteine: C Glutamic acid: E
Glutamine: Q Glycine: G
Histidine: H Isoleucine: I
Leucine: L Lysine: K
Methionine: M Phenylalanine: F
Proline: P Serine: S
Threonine: T Tryptophane: W
Tyrosine: Y Valine: V
【０１４４】
以後、ＣＴＬＤ−Ｆｃコードされた免疫チューブ及びマグネチックピーズを用いて、ヒト（ｈＣＴＬＤ−Ｆｃ）またはマウス（ｍＣＴＬＤ−Ｆｃ）ＣＴＬＤ融合タンパク質とライブラリーを選択的にバイオパンニングすることで、種交差ＣＴＬＤ反応性を持つクローンを分離した（図３Ａ）；このようないくつかのクローンをビーズだけで区別した（図３Ｂ−３Ｄ）。９６個のファージクローンを無作為的に選別して、ファージ酵素免疫アッセイで選別した。クローンＤＮＡをシーケンスして、ヒト及びマウスＣＴＬＤ二つ共に認識しながら他の相補性決定領域配列を持つ四つのクローン（クローン１−４）を選別した（表２−９）。一方、四つのクローンは、チンパンジーＣＴＬＤを特異的に認知して、チンパンジーｃｌｅｃ１４ａ−レクチンのアミノ酸配列は、ヒトｃｌｅｃ１４ａ−レクチンのアミノ酸配列と同じであるため、交差反応性を持つ。
【０１４５】
【表２】
2016503286.tif 000004
【０１４６】
【表３】
2016503286.tif 000005
【０１４７】
【表４】
2016503286.tif 000006
【０１４８】
【表５】
2016503286.tif 000007
【０１４９】
【表６】
2016503286.tif 000008
【０１５０】
【表７】
2016503286.tif 000009
【０１５１】
【表８】
2016503286.tif 000010
【０１５２】
【表９】
2016503286.tif 000011
【０１５３】
また、クローン１−４の核酸配列は、表１０−１７の通りである。
【表１０】
2016503286.tif 000012
【０１５４】
【表１１】
2016503286.tif 000013
【０１５５】
【表１２】
2016503286.tif 000014
【０１５６】
【表１３】
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【０１５７】
【表１４】
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【０１５８】
【表１５】
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【０１５９】
【表１６】
2016503286.tif 000018
【０１６０】
【表１７】
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【０１６１】
≪試験例３：ヒト及びマウスｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤを特異的に認知するＣｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ≫
ｓｃＦｖクローンをＩｇＧに変換して、ＨＥＫ２９３Ｆ（human embryonic kidney 293F）細胞で発現した後、精製した。四つのＩｇＧクローンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色によって９０％超の純度であることを示した。ＥＬＩＳＡは、精製されたＣＴＬＤ特異的ＩｇＧ（ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓ）がヒト及びマウスＣＴＬＤ−Ｆｃ二つに共に特異的に結合するが、Ｆｃ単独はそうでないことを示した。クローン１及び２は、クローン３及び４よりはるかに大きい親和度を示した（図４）。
【０１６２】
≪試験例４：Ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは内皮細胞移動及びチューブ形成を特異的に抑制する≫
ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが内皮細胞移動に阻害作用をするか否か調べるために、ＨＵＶＥＣと共にｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの存在または不在下で創傷治癒アッセイを行った。セツキシマブ、抗−ＥＧＦＲ抗体を対照ＩｇＧとして用いた。選別されたｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ中、クローン１及び２は、各々約４４％及び５４％でＨＵＶＥＣ細胞移動を顕著に抑制した反面、クローン３及び４とセツキシマブ単独は、ほとんど効果がなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。
ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧがチューブ形成に及ぼす影響を確認するために、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ及びセツキシマブの存在または不在下でチューブ形成をアッセイした。クローン１及び２とセツキシマブは、前述の通りＨＵＶＥＣチューブ形成を顕著に遮断する反面、残りのクローンは大きな影響がなかった（図５Ｃ及び５Ｄ）。
このような結果は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが腫瘍血管新生を顕著に抑制することを強く示す。
【０１６３】
≪試験例５：Ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの内皮細胞生存能及び活性への影響≫
ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが、内皮細胞生存能に及ぼす影響を調べるために、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ、セツキシマブまたは５−ＦＵ（5-fluorouracil）、アポトーシス誘導剤存在または不在下で２日間ＨＵＶＥＣを培養して、細胞カウンティングキットを用いて細胞生存の可能性を確認した。抗体は、ＨＵＶＥＣ生存能に影響をほとんど及ぼさない反面、５−ＦＵは特異的に生存能を減少させた（図６Ａ）。
内皮細胞活性にｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが及ぼす影響を確認するために、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧｓ、セツキシマブまたはｈＴＮＦα（human tumor necrosis factor alpha）の存在または不在下でＨＵＶＥＣを培養した。活性は、フローサイトメトリーによって測定されたＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule-1）及びＩＣＡＭ−１（intercellular cell adhesion molecule-1）の発現に基づいて決定された。細胞をｈＴＮＦαで処理して陽性対照群でＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の上向き調節を誘導した。抗体及びセツキシマブは、ＨＵＶＥＣ活性に影響が殆どなかった（図６Ｂ）。
まとめると、このような結果は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが内皮細胞生存能または活性に影響をほとんど及ぼさないことを示す。
【０１６４】
≪試験例６：Ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは特異的にｃｌｅｃ１４ａによって媒介された細胞−細胞接触を抑制する≫
内皮細胞−細胞接触でｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの役割を確認するために、ＧＦＰまたはｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞によって形成されて、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧまたはセツキシマブの存在または不在下で培養されて、ｃｌｅｃ１４ａ媒介細胞−細胞接触のマーカーである細胞凝集体の数を測定した。細胞凝集体の数は、ＧＦＰ単独発現細胞よりｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ発現細胞で約４倍以上多かった（図７Ａ及び７Ｂ）。さらに、クローン１及び２は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰでトランスフェクションされた細胞の凝集を大きく抑制した反面、他のクローン及びセツキシマブはほとんど影響がなかった。
まとめると、このような結果は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、腫瘍血管新生の間ｃｌｅｃ１４ａ媒介内皮細胞−細胞接触で阻害作用を行うことができることを示す。
【０１６５】
≪試験例７：Ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧはｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用を特異的に遮断する≫
免疫分析を用いて、トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の溶解物中でＧＦＰ、ｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ及びｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰの発現を確認した（図８Ａ）。以後、溶解物をｈＣＴＬＤ−ＦｃまたはＦｃと共にインキュベーションして、ＣＴＬＤの間の相互作用を観察した。ｈＣＴＬＤ−Ｆｃが、ＣＯＳ−７細胞溶解物中でいくつかの他のタンパク質と相互作用できても、ｃｌｅｃ１４ａΔＣＴＬＤ−ＧＦＰでないｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰに強く結合しており、これは内皮細胞で特異的ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用を示す（図８Ｂ）。
ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが、ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用を遮断するのか否かを決めるために、ｈＣＴＬＤ−Ｆｃは増加する濃度のｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（クローン１）とインキュベーションして、タンパク質複合体は、ＧＦＰ−またはｃｌｅｃ１４ａ−ＧＦＰ−トランスフェクションされた細胞の溶解物とインキュベーションした。競争的ＥＬＩＳＡを介して、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが、濃度依存的方式でＣＴＬＤ−ＣＴＬＤ相互作用を特異的に阻害することを示し（図８Ｃ）、これはｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが内皮細胞でｃｌｅｃ１４ａ  ＣＴＬＤ−ＣＴＬＤを特異的に遮断できることを示す。
【０１６６】
≪試験例８：ＨＵＶＥＣ表面でｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧで下向き調節されたｃｌｅｃ１４ａに交差結合する≫
新生血管形成表現型（pro-angiogenenic phenotype）を抑制するのに、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの可能な役割を調べるために、フローサイトメトリー法を用いてｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧ（クローン１）で処理前後にＨＵＶＥＣ膜でｃｌｅｃ１４ａ発現レベルを比較した。ＩｇＧ処理時生細胞でｃｌｅｃ１４ａは顕著に減少したが、パラホルムアルデヒドに固定された細胞はそうではなかった（図９Ａ）。
ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧによってＨＵＶＥＣ膜でのｃｌｅｃ１４ａ下向き調節を確認するために、細胞をＩｇＧ（クローン１）またはＦｃで処理して、ｃｌｅｃ１４ａ膜を細胞ＥＬＩＳＡで測定した。Ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、ＨＵＶＥＣ膜でｃｌｅｃ１４ａを時間依存的方式で下向き調節した（図９Ｂ）。
このような結果は、ｃｌｅｃ１４ａに対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの交差反応が内皮細胞膜でのｃｌｅｃ１４ａを特異的に下向き調節することを強く示す。また、このような結果は、ｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧが癌細胞のようなｃｌｅｃ１４ａ発現細胞に内在化できることを示す。
【０１６７】
≪試験例９：エピトープの細部マッピング≫
エピトープの細部マッピングのために、ＥＬＩＳＡでＣｌｅｃ１４ａｗｔＣＴＬＤ及びｈＣＴＬＤ−Ｆｃ断片に対するｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧの特異度（図１０Ａ）を試験した。
その結果、図１０Ｂに示した通り、クローン１及び２二つ共にｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧは、ｗｔｈＣＴＬＤだけでなく、ｈＣＴＬＤのＮ−末端及びＣ−末端に結合した。
このような結果は、ＣＴＬＤのＮ−末端またはＣ−末端に、例えばクローン１及び２における全てのｃｌｅｃ１４ａ−ＣＴＬＤ  ＩｇＧのように、ｈＣＴＬＤで１番アミノ酸〜４２番アミノ酸のアミノ酸断片を含む融合タンパク質、ｈＣＴＬＤで１番アミノ酸〜６２番アミノ酸のアミノ酸断片を含む融合タンパク質、ｈＣＴＬＤで８２番アミノ酸〜１４２番アミノ酸のアミノ酸断片を含む融合タンパク質、ｈＣＴＬＤで６２番アミノ酸〜１４２番アミノ酸のアミノ酸断片を含む融合タンパク質、ｈＣＴＬＤで１２２番アミノ酸〜１４２番アミノ酸のアミノ酸断片を含む融合タンパク質に特異的に結合して、エピトープとして用いられる可能性があることを強く示す。
【０１６８】
≪試験例１０：ＣＴＬＤ−Ｆｃがチューブ形成を抑制するか否かを観察するための試験≫
血管新生にｈＣＴＬＤ−Ｆｃの抑制効果を確認するために、実施例１６によりｈＣＴＬＤ−ＦｃまたはＦｃの存在下でチューブ形成をアッセイした。
その結果、図１１に示した通り、ｈＣＴＬＤ−Ｆｃが濃度依存的方式でチューブ形成を抑制した。
このような結果は確かにｈＣＴＬＤ−Ｆｃが腫瘍血管新生を特異的に抑制することを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
ｃｌｅｃ１４ａのＣＴＬＤが細胞移動及びフィロポジウム形成に重要な役割を果たす新規発見に基づいて、本発明では血管新生を抑制する、ＣＴＬＤに対する新規抗体機能を確認した。従って、本発明は血管新生を抑制するのに利用可能な新規ターゲットドメインを提供する。さらに、本発明の抗体は、血管新生関連疾患またはｃｌｅｃ１４ａ媒介癌を予防または治療するのに効果的でありうる。
具体的な構成を参照して本発明を詳細に記載したが、このような記載は、好ましい具現例に関しており、発明の範囲を制限しないことは、当業者にとっては自明である。よって、本発明の実質的範囲は、出願された請求項及びその等価物によって定義される。
【図１Ａ】
2016503286.tif 000020
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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