(57)【要約】  標的核酸を増幅してアンプリコンを作製するためにオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを使用する、等温核酸増幅のための方法及びキットが本明細書において提供される。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いる等温ＤＮＡ増幅方法及びポリアミン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーもまた提供される。【選択図】図１
2016529915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡに基づく１以上のアンプリコンを作製する方法であって、当該方法が、
（ａ）標的ＤＮＡを用意するステップと、
（ｂ）オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ混合物を含むＤＮＡ増幅反応混合物を用意するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のＤＮＡ増幅反応混合物を使用して標的ＤＮＡの少なくとも一部を増幅して、１以上のアンプリコンを作製するステップと
を含んでおり、
オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーがオリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含んでおり、増幅が等温条件下で実施される、方法。
【請求項２】
オリゴカチオン部分がカチオン性ポリアミンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴカチオン部分が１以上のスペルミン部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド配列がランダムオリゴヌクレオチド配列又は部分的拘束性オリゴヌクレオチド配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド配列がヌクレオチド類似体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチド配列が、３’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの間にホスホロチオエート連結を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチド配列がＮＮＮＮＮ*Ｎである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーが次の構造Ｉの一般構造（式中、ｎの整数値は１〜５である）有する、請求項１に記載の方法。
【化１】
2016529915.tif 000009
【請求項９】
オリゴカチオン部分が１以上のリジン部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
標的ＤＮＡに基づく１以上のアンプリコンを作製する方法であって、当該方法が、
（ａ）標的ＤＮＡを用意するステップと、
（ｂ）１以上のオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを標的ＤＮＡとアニーリングして、標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッドを作製するステップと、
（ｃ）標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッド中のオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを等温核酸増幅反応により伸長して、標的ＤＮＡの少なくとも一部に相補的な１以上のアンプリコンを作製するステップと
を含んでおり、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーがオリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む方法。
【請求項１１】
等温核酸増幅が、多鎖置換核酸増幅又はローリングサークル増幅である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーが、ランダムペンタマー配列又はランダムヘキサマー配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーが１以上のスペルミン単位を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーが、ｎの整数値が２である構造ＩＶの一般構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【化２】
2016529915.tif 000010
【請求項１５】
等温ＤＮＡ増幅のためのキットであって、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含み、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーがオリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般に、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを用いる等温増幅を実施するための方法及びキットに関する。このオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの増幅は、標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を複製して複数のコピーを作製する過程である。ｄｓＤＮＡの個別の鎖は逆平行及び相補的であるため、各鎖はその相補鎖を作製するための鋳型鎖として機能し得る。鋳型鎖は全体又は切断部分として保存され、相補鎖はＤＮＡポリメラーゼによりデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から組み立てられる。相補鎖の合成は、鋳型鎖にハイブリダイズされるプライマー配列の３’末端から開始され、５’→３’方向に進行する。さまざまな効率の良い核酸増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などが、現在利用可能である。これらの技術の多くは、短期間で多数の増幅産物を作製する。
【０００３】
全ゲノム増幅（ＷＧＡ）は、標的ＤＮＡの非特異的増幅を伴う。ＷＧＡは多くの場合、標的ＤＮＡの複数位置においてＤＮＡ合成をプライミングするためのランダムなオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、ＮＮＮＮＮ*Ｎ）を、鎖置換活性（strand displacing activity）を有するハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｈｉ２９ポリメラーゼ）と共に用いるＭＤＡにより達成される。現在利用可能な市販のＷＧＡ系、例えばＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国））及びＲｅｐｌｉＧ（Ｑｉａｇｅｎ社）キットは１ナノグラム以上のＤＮＡのインプットにより最適な結果を提供するが、これらの系の性能は、利用可能な標的ＤＮＡが少量しかない場合、又はＤＮＡ増幅が数個もしくは単一の細胞から実施される場合にはあまりよくない。
【０００４】
従来の方法を使用する微量の標的ＤＮＡの増幅は、多くの場合、配列包括度に「ドロップアウト」を残したままのＤＮＡ配列の不完全な増幅及びＤＮＡ配列が不均等に増幅された増幅バイアスをもたらす。さらに、増幅反応の産物（アンプリコン）は、多くの場合それ自体の中でアニーリングして、望ましくないキメラ産物の作製をもたらし得る。したがって、微量の標的ＤＮＡの非特異的増幅の効率的な方法が強く望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１５１５６０号
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの実施形態では、標的核酸を増幅してアンプリコンを作製するための、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを使用する核酸増幅が提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに基づく１以上のアンプリコンを作製する等温増幅法が提供される。この方法は、標的ＤＮＡを用意するステップと、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ混合物を含むＤＮＡ増幅反応混合物を用意するステップと、ＤＮＡ増幅混合物を使用して標的ＤＮＡの少なくとも一部を増幅して、１以上のアンプリコンを作製するステップとを含む。増幅反応に使用されるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに基づく１以上のアンプリコンを作製する方法であって、標的ＤＮＡを用意するステップと、１以上のオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを標的ＤＮＡとアニーリングして、標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッドを作製するステップと、標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッド中のオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを等温核酸増幅反応により伸長して、標的ＤＮＡの少なくとも一部に相補的な１以上のアンプリコンを作製するステップとを含む方法が提供される。この方法に使用されるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、等温ＤＮＡ増幅のためのキットが提供される。このキットは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含み、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーはオリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。
【００１０】
本発明のこれら及び他の特色、態様及び有利性は、下記の詳細な説明を、添付の図面を参照しながら読むことでさらによく理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＭＤＡ反応の反応速度及び感度を上げるための、スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーの有効性を例示する図である。
【図２】ＤＮＡ増幅反応の配列包括度及び増幅バランスを上げるための、スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーの有効性を例示する図である。
【図３】スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーを使用する、単一細菌細胞からのＤＮＡ増幅を例示する図である
【発明を実施するための形態】
【００１２】
特許請求する発明の主題をより明確及び簡潔に記述及び指摘するために、特定の用語に下記の定義を提供し、この定義は下記の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。
【００１３】
本明細書において、「標的ＤＮＡ」という用語は、ＤＮＡ増幅反応で増幅されることが望まれる天然起源又は合成起源いずれかのＤＮＡ配列を指す。標的ＤＮＡはＤＮＡ増幅反応の鋳型として機能する。標的ＤＮＡの一部分又は標的ＤＮＡの全領域のいずれかは、ＤＮＡ増幅反応においてＤＮＡポリメラーゼにより増幅され、増幅産物又はアンプリコンを作製することができる。アンプリコンは、標的ＤＮＡの複数のコピー又は標的ＤＮＡに相補的な配列の複数のコピーを含み得る。標的ＤＮＡは、インビボ又はインビトロで生体試料から得ることができる。例えば、標的ＤＮＡは、体液（例えば、血液、血漿、血清又は尿）、臓器、組織、細胞、臓器もしくは組織の薄片部、生体から単離された細胞（例えば、罹患細胞を含有する領域又は循環腫瘍細胞）、法医学試料又は古代試料から得ることができる。標的ＤＮＡを含有する、又は含有すると疑われる生体試料は、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源又はバクテリオファージ起源であってもよい。例えば標的ＤＮＡは、昆虫、原虫、トリ、サカナ、爬虫類、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット又はウサギ）又は霊長類（チンパンジー又はヒト）から得ることができる。標的ＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ）から逆転写酵素を使用して作製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい。別の反応、例えば連結反応、ＰＣＲ反応により作製されたＤＮＡ産物又は合成ＤＮＡもまた、適切な標的ＤＮＡとして機能し得る。標的ＤＮＡは溶液中に分散されても、又は固体支持体、例えばブロット、アレイ、スライドグラス、マイクロタイタ―プレート、ビーズもしくはＥＬＩＳＡプレートに固定されてもよい。
【００１４】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語はヌクレオチドのオリゴマーを指す。ヌクレオチドは、そのヌクレオシドに対応するアルファベット文字を使用した文字名称により表すことができる。例えば、Ａはアデノシンを表し、Ｃはシチジンを表し、Ｇはグアノシンを表し、Ｕはウリジンを表し、及びＴはチミジン（５−メチルウリジン）を表す。ＷはＡ又はＴ／Ｕを表し、ＳはＧ又はＣのいずれかを表す。Ｎはランダムヌクレオシドを表し、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕのどれであってもよい。文字名称の前の星印（*）記号は、その文字により指定されるヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを表す。例えば、*Ｎはホスホロチオエート修飾ランダムヌクレオチドを表す。文字名称の前のプラス（＋）記号は、その文字により指定されるヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであることを表す。例えば、＋ＡはアデノシンＬＮＡヌクレオチドを表し、＋Ｎはロックドランダムヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラ配列であってもよい。オリゴヌクレオチドが文字の配列で表される場合は常に、ヌクレオチドは左から右に５’→３’である。例えば、文字配列（Ｗ）x（Ｎ）y（Ｓ）z（式中ｘ＝２、ｙ＝３及びｚ＝１）により表されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列ＷＷＮＮＮＳを表し、Ｗは５’末端ヌクレオチドであり、Ｓは３’末端ヌクレオチドである（「末端ヌクレオチド」はオリゴヌクレオチド配列の末端位置に位置づけられるヌクレオチドを指す。３’末端位置に位置づけられる末端ヌクレオチドは３’末端ヌクレオチドと称され、５’末端位置に位置づけられる末端ヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドと称される）。
【００１５】
本明細書において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、天然に存在するヌクレオチドの構造類似体である化合物を指す。ヌクレオチド類似体は、改変されたホスフェート骨格、糖部分、核酸塩基又はこれらの組合せを有し得る。ヌクレオチド類似体は、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は代替置換部分例えばイノシン）を有し得る。概して、改変核酸塩基を含むヌクレオチド類似体は、とりわけ異なる塩基対合及び塩基スタッキング特性をもたらす。
【００１６】
本明細書において、「プライマー」又は「プライマー配列」という用語は、標的ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズして、標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッドを作製し、ＤＮＡ合成反応をプライミングする線形オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの長さの上限及び下限は両方とも経験的に決定される。プライマーの長さの下限は、核酸増幅反応条件下で標的核酸とのハイブリダイゼーションで安定な二重鎖を形成するために必要とされる最小の長さである。非常に短いプライマー（通常３ヌクレオチド長未満）は、このようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と熱力学的に安定な二重鎖を形成しない。上限は、多くの場合標的核酸中の所定の核酸配列以外の領域において二重鎖形成を有する可能性により決定される。概して、適切なプライマー長は、約３〜約４０ヌクレオチド長の範囲内である。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド又はキメラ配列であってもよい。
【００１７】
本明細書において、「ランダムオリゴヌクレオチド」という用語は、所与の位置がいずれのヌクレオチド候補又はそれら類似体からなっていてもよいような方法で、オリゴヌクレオチド配列中のすべての所与の位置においてヌクレオチドがランダム化されることによって作製される（完全なランダム化）、オリゴヌクレオチド配列の混合物を指す。ランダムプライマーとして使用する場合、ランダムオリゴヌクレオチドは、配列内のヌクレオチドのすべての組合せ候補からなる、オリゴヌクレオチドのランダムな混合物を表す。例えば、ヘキサマーランダムプライマーは、配列ＮＮＮＮＮＮ又は（Ｎ）6で表すことができる。ヘキサマーランダムＤＮＡプライマーは、４つのＤＮＡヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ及びＴのすべてのヘキサマーの組合せ候補からなり、４6（４０９６）の固有なヘキサマーＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含むランダム混合物をもたらす。ランダムプライマーは、標的核酸の配列が未知である場合核酸合成反応のプライミングのために、又は全ゲノム増幅反応のために有効に使用され得る。
【００１８】
本明細書に記載のように、「部分的拘束性オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチドのいくつか（例えば、ヌクレオチドはＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ又はこれらの類似体のいずれかであってよい）は完全にランダム化されるが、いくつかの他のヌクレオチドの完全なランダム化が制限される（例えば、特定の位置においてヌクレオチドのランダム化はＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ又はこれらの類似体の組合せ候補より少ない）ことによって作製されるオリゴヌクレオチド配列の混合物を指す。部分的拘束性オリゴヌクレオチドはプライマー配列として使用することができる。例えば、ＷＮＮＮＮＮで表される部分的拘束性ＤＮＡヘキサマープライマーは、混合物中のすべての５’末端ヌクレオチドがＡ又はＴのいずれかであるプライマー配列の混合物を表す。ここで、５’末端ヌクレオチドは、完全なランダムＤＮＡプライマー（ＮＮＮＮＮＮ）の最大４つの組合せ候補（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）とは異なり２つの組合せ候補（Ａ又はＴ）に拘束される。部分的拘束性プライマーの適切なプライマー長は、約３〜約１５ヌクレオチド長の範囲内である。
【００１９】
本明細書において、「オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー」という用語は、線形オリゴヌクレオチドがオリゴカチオンと共有結合したプライマー配列を指す。オリゴカチオンは１以上のカチオン性部分を含む。多くの場合、オリゴカチオンはカチオン性部分のオリゴマーである。オリゴカチオン複合ランダムプライマーは、ランダムな配列を有する、正電荷により修飾されたプライマーである。
【００２０】
本明細書において、ｄＮＴＰ混合物は、ＮがＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕのいずれかを含むランダムヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を指す。
【００２１】
本明細書において、「鎖置換核酸ポリメラーゼ」又は「鎖置換活性を有するポリメラーゼ」は、鎖置換活性をその核酸合成活性とは別に有する核酸ポリメラーゼを指す。鎖置換核酸ポリメラーゼは、鋳型鎖にアニーリングされている相補鎖を置換しながら、鋳型鎖を読み取ることによって核酸の鋳型鎖の配列に基づき核酸合成を続けることができる。
【００２２】
本明細書において、多置換増幅（ＭＤＡ）は、増幅が、プライマーを変性核酸二アニーリングして、その後連続合成を遮断する下流二本鎖ＤＮＡ領域を、これらの領域の間を鎖置換核酸合成により解離させるＤＮＡ合成ステップを伴う核酸増幅方法を指す。核酸が鎖置換により合成される場合、一本鎖ＤＮＡが鎖置換により作製され、結果として、プライミング事象の数が徐々に増え、超分枝型核酸構造のネットワークが形成される。ＭＤＡは、少量のゲノムＤＮＡ試料から限られた配列バイアスで高分子量ＤＮＡを作製する、全ゲノム増幅に高度に有用である。鎖置換活性をその核酸合成活性とは別に有する任意の鎖置換核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大型断片）がＭＤＡに使用可能である。ＭＤＡは多くの場合、等温反応条件下で、配列バイアスが限られた増幅を達成するためにランダムプライマーを使用して実施される。
【００２３】
本明細書において、「ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）」は、環状核酸鋳型（例えば、一本鎖環状ＤＮＡ）をローリングサークル機序により増幅する核酸増幅反応を指す。ＲＣＡは、プライマーと、環状の多くの場合一本鎖の核酸鋳型とのハイブリダイゼーションにより開始される。核酸ポリメラーゼは次いで、環状核酸鋳型にハイブリダイズされたプライマーを環状核酸鋳型の周りに連続して進めることによって伸長し、核酸鋳型の配列を何度も繰り返して複製する（ローリングサークル機序）。ＲＣＡは通常、環状核酸鋳型配列の相補体の直列反復単位を含むコンカテマーを作製する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、標的核酸を増幅してアンプリコンを作製するための、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを用いる方法が提供される。オリゴカチオン−オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマー配列の５’末端に共有結合されたオリゴカチオン部分を含む。例えば、１以上のカチオン性スペルミン単位（例えば、スペルミンのモノマー単位又はダイマー単位）を含む化学部分は、オリゴヌクレオチドプライマー配列（例えばランダムヘキサマー配列）の５’末端に共有結合され得る。正に帯電した、カチオン性スペルミン誘導体のランダムプライマー配列の５’末端への共有結合は、オリゴヌクレオチドプライマー配列の標的核酸（例えば標的ＤＮＡ）へのハイブリダイゼーションにおいて負に帯電したリン酸ジエステル結合からの静電反発力を軽減することができる。
【００２５】
核酸増幅反応におけるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの使用は、プライマーの標的認識を強化し、さらにプライマーと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率を上げる。さらに、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチドプライマーを核酸増幅反応に用いた場合、標的核酸−プライマーハイブリッドの融解温度は上昇する。したがって、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を核酸増幅反応に用いて、望ましくない増幅産物及び人工物減らすことができる。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、核酸増幅反応に一般に使用される条件により提供されるストリンジェンシーより高いストリンジェンシーをオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション事象にもたらす反応条件を指す。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、反応温度の上昇又は塩濃度の低下により核酸増幅反応において達成され得る。核酸増幅反応は多くの場合、約７５ｍＭの塩濃度において実施される。対照的に、核酸増幅反応が塩濃度約１５ｍＭにおいて実施される場合、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が提供され得る。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、温度を、多くの場合使用される約３０℃から上昇させることによってｉｎ−ｖｉｔｒｏの等温核酸増幅反応に提供され得る。例えば、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを使用する等温核酸増幅反応は、約３５℃〜約４５℃において実施され、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が提供され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに基づく１以上のアンプリコンを作製する等温増幅法が提供される。この方法は、標的ＤＮＡを用意するステップと、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ混合物を含むＤＮＡ増幅反応混合物を用意するステップと、ＤＮＡ増幅混合物を使用して標的ＤＮＡの少なくとも一部を増幅して、１以上のアンプリコンを作製するステップとを含む。
【００２７】
増幅反応に使用されるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。オリゴカチオン部分は、複合体化に使用される合成方法のいずれか（例えば、ホスホラミダイト合成）を使用して、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合し得る。オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーが標的核酸に高効率でハイブリダイズしたとしても、このようなプライマーは鎖置換増幅を阻害はしない。さらに、オリゴヌクレオチド（プライマー）配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオンは、ＤＮＡポリメラーゼの結合及びプライマー伸長反応に干渉はしない。
【００２８】
オリゴカチオン部分の結合により、オリゴヌクレオチド配列全体の負の電荷が減少する。この電荷の減少は、電荷の静電反発力を低下させ、オリゴヌクレオチド配列の溶融温度を上昇させ、このことがハイブリダイゼーション特性をさらに改善する。オリゴヌクレオチド配列の５’末端におけるオリゴカチオン部分の結合は、オリゴヌクレオチド構造及びＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡプロセシング酵素に対する基質として作用するその能力を維持する。
【００２９】
オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のオリゴヌクレオチド配列は、特異的なプライマー配列、ランダムプライマー配列又は部分的拘束性ランダムプライマー配列であってよい。特異的プライマー配列は、ワトソン−クッリク的な意味で、標的ＤＮＡ鋳型中に存在する特定の配列に相補的である。特異的オリゴヌクレオチド配列は、例えば、混合物中のミトコンドリアＤＮＡ、混合物中の特定のプラスミド又は特定のゲノム領域を特異的に増幅するために、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーに用いることが可能である。いくつかの実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のオリゴヌクレオチド配列は、ランダムプライマー配列である。例えば、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のオリゴヌクレオチド配列は、ＮＮ（Ｎ）mＮＮ（式中、ｍの整数値は０〜３６である）である。いくつかの実施形態では、ｍの整数値は０〜２０である。いくつかの他の実施形態では、ｍの整数値は０〜１０である。いくつかの例示的実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ランダムテトラマー、ランダムペンタマー、ランダムヘキサマー、ランダムヘプタマー又はランダムオクタマ―である。オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、天然、合成もしくは修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、安定性及び／又は他の有利性（例えば、二次構造の形成）をプライマー（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸）にもたらす合成骨格もしくはヌクレオチド類似体を含むか、又は修飾糖部分（例えば、キシロース核酸又はこの類似体）を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のオリゴヌクレオチド配列は１以上のＬＮＡヌクレオチドを含む。ＬＮＡヌクレオチドは、リボ核酸模倣糖立体構造中にロックされた二環式フラノース糖単位を含有する。デオキシリボヌクレオチド（又はリボヌクレオチド）からＬＮＡヌクレオチドへの構造変化は、化学的観点、例えば、２’位及び４’位の炭素原子間のさらなる連結（例えば、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン連結）の導入により限定され得る。ＬＮＡヌクレオチド中のフラノース単位の２’及び４’位は、Ｏ−メチレン（例えば、オキシ−ＬＮＡ：２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルフラノヌクレオチド）、Ｓ−メチレン（チオ−ＬＮＡ）又はＮＨ−メチレン部分（アミノ−ＬＮＡ）などにより連結され得る。このような連結は、フラノース環の立体構造の自由を制限する。１以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含むオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、相補性一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性の強化を表す。さらに、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡ包含は、Ａ型（ＲＮＡ様）二重立体構造を誘導し得る。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ増幅反応のために用いられるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼに対して耐性である。例えば、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のオリゴヌクレオチド配列は、１以上のホスフェート修飾連結（例えば、ホスホロチオエート連結）を含み、該複合体プライマーにエキソヌクレアーゼ耐性をもたらす。いくつかの実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーはエキソヌクレアーゼ耐性ランダムオリゴヌクレオチド配列を含む。例えば、該複合体プライマーのオリゴヌクレオチドは、ＮＮＮＮＮ*Ｎ又はＮＮＮＮ*Ｎ*Ｎのようなランダム配列を有し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のオリゴカチオン部分は、限定するものではないが、カチオン性ポリアミン（例えば、スペルミジン、スペルミン又はプトレシン、１以上のＮＨ単位又はＮＣ（ＮＨ2）2単位を含む化学部分）又はカチオン性側鎖を含有するペプチド（例えば、リジン残基を含むペプチド）を含む。例えば、１以上のスペルミン部分を含むオリゴカチオン部分は、オリゴヌクレオチドプライマー配列の５’末端に共有結合し、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを作製し得る。いくつかの他の実施形態では、カチオン性ポリアミンは、カチオン性スペルミン部分に由来する化学部分である。いくつかの実施形態では、オリゴカチオン部分は、１以上のアニオン性基と併せてカチオン性ポリアミンを含み得る。しかし、オリゴカチオン部分の正味の電荷は、ＤＮＡ増幅反応のために用いられる条件下で少なくとも＋１であるとする。例えば、スペルミン中の窒素原子は、位置に依存して、約８．５〜１１．５の範囲のｐＫａを有する。したがって、スペルミン含有プライマーを使用するＤＮＡ増幅反応は、１以上の窒素が反応条件下でプロトン化されるようなｐＨ値を有する緩衝液中で実施することができる。例えば、室温において約８．０未満のｐＨ及び３０℃において７．８のｐＨを有する緩衝液がＤＮＡ増幅反応に使用され得る。得られたオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの溶解度係数に悪影響を与えずにオリゴヌクレオチドプライマー配列の５’末端に結合できるカチオン性基の数は、限定するものではないが、各カチオン性基の正味電荷、オリゴヌクレオチドプライマー配列の長さ及び／又はオリゴカチオン部分の長さを含むさまざまな因子に依存すると思われる。
【００３３】
いくつかの例示的実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、構造Ｉに表す一般化学構造を有する。構造Ｉ中のｎの整数値は、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー中のスペルミン単位の数を表す。ｎの整数値は１〜５である。構造Ｉ中のオリゴヌクレオチド配列の長さは、６〜２０ｍｅｒ配列である。いくつかの実施形態では、単一のスペルミン単位（ｎ＝１）は、得られたオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの溶解度を損なうことなく、ヘキサマー（６ｍｅｒ）配列の５’末端ヌクレオチドに共有結合し得る。いくつかの他の実施形態では、２又は３つのスペルミン部分を含むオリゴカチオンは、８〜１５ｍｅｒの範囲のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに共有結合し得る。４又は５つのスペルミン部分を含むオリゴカチオンの共有結合は、得られたオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの溶解度係数に悪影響を与えずに、それぞれ１６又は２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドにおいて実施され得る。オリゴヌクレオチドプライマー配列にオリゴカチオン部分を共有結合させることによって、オリゴヌクレオチドプライマー配列の全電荷が変わる。構造Ｉ中の各スペルミン単位は、式３ｎ−（ｍ−１）（式中、ｎはスペルミン単位の数に等しく、ｍはオリゴヌクレオチド中の塩基の数に等しい）により計算されるオリゴヌクレオチド配列の全電荷を＋３増加する。例えば、構造Ｉにおいてｎ＝３の場合、オリゴヌクレオチド配列の全電荷は＋９（＋３ｎ）に変わる。
【００３４】
【化１】
2016529915.tif 000003
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ増幅反応に用いられるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、スペルミン単位含有カチオン性ポリアミンに共有結合されたランダムオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは構造ＩＩに表される式を有する。構造ＩＩにおいて、ｎの整数値は１〜５であり、ｍの整数値は０〜３６である。
【００３５】
【化２】
2016529915.tif 000004
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ増幅反応に用いられるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、ヌクレアーゼ耐性プライマーである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ耐性オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、構造ＩＩＩの一般構造を有する。ｎの整数値は１〜５であり、ｍの整数値は０〜３６である。
【００３６】
【化３】
2016529915.tif 000005
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ増幅反応に用いられるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、構造ＩＶを有するヌクレアーゼ耐性ヘキサマープライマーである。ｎの整数値は構造ＩＶにおいて１又は２である。
【００３７】
【化４】
2016529915.tif 000006
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ増幅反応に用いられるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、構造Ｖにより表されるヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーである。このランダムプライマーは、２つのスペルミン単位を含むポリアミンを含み、該ポリアミンは、ランダムヘキサマーの５’末端ヌクレオチドに共有結合している。ランダムヘキサマープライマーは、その３’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの間にホスホロチオエート連結をさらに含む。
【００３８】
【化５】
2016529915.tif 000007
いくつかの実施形態では、１以上のリジン部分を含むポリアミンは、オリゴヌクレオチドプライマー配列の５’末端に共有結合し、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを作製し得る。いくつかの実施形態では、分子量６４０Ｄａを有する、５つのリジンモノマー単位からなるポリリジン部分（ペンタマー）を含むポリアミンは、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合されている。リジン含有オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、当該技術分野において承認されているプロトコルのいずれか（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８、２６、３１３６−３１４５）により合成され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに基づく１以上のアンプリコンを作製する方法は、標的ＤＮＡを用意するステップと、１以上のオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを標的ＤＮＡとアニーリングして、標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッドを作製するステップと、該オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを等温核酸増幅反応により伸長して、標的ＤＮＡの少なくとも一部に相補的な１以上のアンプリコンを作製するステップとを含む。この方法に使用されるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。
【００４０】
標的ＤＮＡは、線形鋳型、ニックが入った鋳型又は環状鋳型であってよい。標的ＤＮＡは、天然ＤＮＡであっても、又は合成ＤＮＡであってもよい。標的ＤＮＡは、ｃＤＮＡであっても、又はゲノムＤＮＡであってもよい。ＤＮＡ鋳型は合成鋳型（例えば、酵素的／化学的反応によって環状化された線形又はニックの入ったＤＮＡ）であってもよく、又はプラスミドＤＮＡであってもよい。
【００４１】
構造Ｉで表されるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーは、本方法に使用可能である。複合体プライマー中のオリゴヌクレオチド部分は、特異的配列、ランダム配列又は部分的拘束性ランダム配列であってよい。例えば、オリゴヌクレオチドはランダムペンタマー配列又はランダムヘキサマー配列であってよい。さらに、このランダム配列は、１以上の修飾ヌクレオチドを含んでも、１以上のホスホロチオエート連結を含んでもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、構造Ｉのオリゴヌクレオチド配列は、部分的拘束性プライマー配列である。末端ヌクレオチドにおいてのみランダム化が制限されている部分的拘束性プライマー配列の限定されない例としては、Ｗ（Ｎ）yＳ、Ｓ（Ｎ）yＷ、Ｄ（Ｎ）yＧ、Ｇ（Ｎ）yＤ、Ｃ（Ｎ）yＡ又はＡ（Ｎ）yＣが挙げられるが、これらに限定されない。ｙの整数値は２〜１３である。いくつかの実施形態では、ｙの値は２、３、４又は５である。いくつかの例示的実施形態では、部分的拘束性プライマー配列、（Ｗ）x（Ｎ）y（Ｓ）z（式中、ｘ、ｙ及びｚは互いに独立した整数値であり、ｘの値は２又は３であり、ｙの値は２、３、４又は５であり、並びにｚの値は１又は２である）は、構造Ｉ中のオリゴヌクレオチド配列として用いることができる。この部分的拘束性プライマー配列は、１以上のヌクレオチド類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、部分的拘束性プライマー配列は、末端がミスマッチであるプライマー−ダイマー構造を有し得る。例えば、ＷはＳと塩基対合できないので、陥凹末端が全くないプライマー−ダイマー構造が分子間ハイブリダイゼーションにより形成される場合、両方の３’末端ヌクレオチドには末端ミスマッチが存在すると思われる。いくつかの実施形態では、構造Ｉのオリゴヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼ耐性の、修飾ヌクレオチドを含む部分的拘束性プライマー配列であり、末端ミスマッチプライマーダイマー構造を有する。構造Ｉの一部となり得る適切なオリゴヌクレオチド配列としては、限定するものではないが、＋Ｗ＋ＷＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＳ、＋Ｗ＋ＷＮＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮ*Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮＮ*Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＮ*Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮＮＮ*Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋Ｎ*Ｎ*Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮ*Ｎ*Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮ*Ｎ*Ｓ又は＋Ｗ＋ＷＮＮ*Ｎ*Ｓが挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、構造ＩＩ〜Ｖのいずれかで表されるオリゴヌクレオチド−オリゴカチオンプライマーは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用する等温ＤＮＡ増幅反応のために用いることができる。いくつかの例示的実施形態では、このＤＮＡ増幅方法は、構造ＩＶの一般構造であるがｎの整数値が２である構造Ｖの構造を有するオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを用いる。
【００４４】
【化６】
2016529915.tif 000008
等温増幅方法に使用される核酸ポリメラーゼは、校正型核酸ポリメラーゼであっても、又は非校正型核酸ポリメラーゼであってもよい。核酸ポリメラーゼは、高熱性又は中温性の核酸ポリメラーゼであってよい。この方法に使用される適切なＤＮＡポリメラーゼの例としては、限定するものではないが、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ハイフィデリティ・フュージョンＤＮＡポリメラーゼ（例えば、処理能力強化ドメインを有するパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）様酵素、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国マサチューセッツ州））、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社（米国カリフォルニア州ラホヤ））、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国マサチューセッツ州））、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの変異体であるＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、ｅｘｏ（−）ＶｅｎｔR（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国マサチューセッツ州））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩ由来のＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）ＧＢ−Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国マサチューセッツ州））又はサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国マサチューセッツ州））が挙げられる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、等温増幅に使用される核酸ポリメラーゼは、鎖置換核酸ポリメラーゼである。この方法は、処理能力の高い、鎖置換ポリメラーゼを用い、ハイフィデリティな塩基組み込みのための条件下で標的ＤＮＡを増幅することができる。ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼは、適切な条件下で、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ又はＴ７  ＤＮＡポリメラーゼなどの一般的に使用される熱安定性ＰＣＲポリメラーゼに伴うエラー組み込み率と同等又はそれより低いエラー組み込み率（約１．５×１０-5〜約５．７×１０-5）を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。いくつかの実施形態では、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ又はＰｈｉ２９様ポリメラーゼがＤＮＡ鋳型の増幅に使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの組合せが、環状ＤＮＡ増幅に使用され得る。
【００４６】
さらなる酵素を等温増幅反応混合物に含めることにより、誤組み込み事象を最小にすることができる。例えば、タンパク質媒介性エラー訂正酵素、例えばＭｕｔＳを加えて、ＤＮＡポリメラーゼ反応の間又はその後のいずれかにおけるＤＮＡポリメラーゼのフィデリティの改善が可能である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、１以上のアンプリコンが、環状の標的ＤＮＡの鋳型からローリングサークル増幅により作製される。ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー及びｄＮＴＰを含む増幅試薬を標的ＤＮＡに加えて、ＲＣＡ反応を開始するための増幅反応混合物を調製することができる。増幅反応混合物は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質及び／又は適切な増幅反応緩衝液などの試薬をさらに含み得る。増幅反応後又は反応の間に、ＤＮＡ検出に関する現在公知の方法のいずれかによりアンプリコンを検出可能である。ＲＣＡは線形増幅反応速度を示す線形ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）（例えば、単一の特異的プライマーを使用するＲＣＡ）であってもよく、又は指数関数的増幅反応速度を示す指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）であってもよい。ＲＣＡはまた、超分枝型コンカテマーをもたらす複数のオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを使用して実施してもよい（多重プライミングローリングサークル増幅（ＭＰＲＣＡ））。例えば、二重プライミングＲＣＡにおいて、線形ＲＣＡの場合、１つのプライマーが環状核酸鋳型に対して相補的であり、他方のプライマーがＲＣＡ産物の直列反復単位の核酸配列に相補的である。結論として、二重プライミングＲＣＡは、多重ハイブリダイゼーションの分岐型カスケード、プライマー伸長及び両方のプライマーが関与する鎖置換事象を特徴とする指数関数的（幾何学的）増幅反応速度を有する連鎖反応として進行し得る。これは多くの場合、鎖状体の二本鎖核酸増幅産物の不連続なセットを作製する。いくつかの例示的実施形態では、ＲＣＡは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの適切な核酸ポリメラーゼを使用する等温条件下でインビトロで実施される。
【００４８】
いくつかの他の実施形態では、線形ＤＮＡ鋳型はＭＤＡを使用して増幅され得る。ＭＤＡの従来の方法は多くの場合、増幅速度の低下、配列のバイアスが高い増幅をもたらす。対照的に、ＭＤＡ反応におけるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの使用は、より速いＤＮＡ増幅反応速度を促進し、ＤＮＡ配列の包括度及びバランスを改善した。さらに、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを使用した場合、標的ＤＮＡ：プライマーハイブリッドのＴｍの増加が、よりストリンジェントな条件下、例えばより高温において、もしくはより低い塩濃度（例えば、他の標準的条件下では７５ｍＭであるのに相対して１５ｍＭのＫＣｌ）により実施されるＭＤＡ反応を可能にするか、又は高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件のためのよりストリンジェントな緩衝液の使用を可能にする。このようなストリンジェントな反応は、望ましくない反応中間体及び産物、例えば、自己ハイブリダイゼーションによるキメラ産物をさらに減少させる。
【００４９】
さらに、増幅反応におけるオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの使用は、さまざまな条件下において、限定するものではないが、循環血漿ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から単離されたＤＮＡ、環境条件に曝露された法医学的ＤＮＡ試料又は古代ＤＮＡ試料を含む、微量のＤＮＡ試料の着実な増幅を可能にする。アンプリコンを含む増幅ライブラリは、ｑＰＣＲ又はシーケンシンによる増幅配列のを標的とする検出にも使用可能である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、等温ＤＮＡ増幅のためのキットが提供される。このキットは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含み、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーはオリゴヌクレオチド配列の５’末端に共有結合したオリゴカチオン部分を含む。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチド配列はランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、キットはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含む。キットは、構造Ｉ〜Ｖで表される化学構造を有するオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含み得る。構造Ｉ〜ＩＩＩにおけるｎの整数値は１〜５であり、オリゴヌクレオチド配列は６ｍｅｒ〜２０ｍｅｒの配列である。いくつかの実施形態では、キットは単一のスペルミン単位（ｎ＝１）がヘキサマー（６ｍｅｒ）配列の５’末端ヌクレオチドに共有結合したオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含む。いくつかの他の実施形態では、キットは、２又は３つのスペルミン部分を含むオリゴカチオンが、８〜１５ｍｅｒの範囲のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに共有結合したオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含む。いくつかの他の実施形態では、キットは、４又は５つのスペルミン部分を含むオリゴカチオンが、それぞれ１６ｍｅｒのオリゴヌクレオチド又は２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにカップリングされたオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ｎの整数値は１又は２である構造ＩＶの一般構造を有するオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、構造Ｖを有するオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを含む。
【００５２】
本明細書に記載の方法及びキットは、ＤＮＡ試料の増幅及び分析、例えば法医学的分析、生物学的脅威の同定又は医学的分析に使用可能である。この方法の感度は、下流の試験及び分析のための全ゲノム増幅のための、単一の細菌細胞及び真核細胞の全ゲノム増幅を可能にする。さらに、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの使用は、より速いＤＮＡ増幅反応速度、インプット量の少ないＤＮＡに対する高感度及びバイアスがより少なく、よりバランスのとれた増幅を促進する。さらに、より強力に結合するこれらの修飾プライマーは、増幅反応条件の改変を可能にし、ＤＮＡ合成の自己ハイブリダイゼーション事象の安定性を低減させる。
【００５３】
下記の実施例は単なる例示として本明細書に開示され、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。実施例の項で使用されるいくつかの略語は下記のように広がる：「ｍｇ」：ミリグラム；「ｎｇ」：ナノグラム；「ｐｇ」：ピコグラム；「ｆｇ」：フェムトグラム；「ｍＬ」：ミリリットル；「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル；「ｍＭ」：ミリモル濃度；「ｍｍｏｌ」：ミリモル；「ｐＭ」：ピコモル濃度；「ｐｍｏｌ」：ピコモル；「μＬ」：マイクロリットル；「ｍｉｎ．」：分及び「ｈ．」：時間。
【実施例】
【００５４】
実施例１：スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーを利用するＭＤＡ反応の反応速度及び感度
増幅反応を、１０μＭのランダムプライマー又はオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーを使用して実施し、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーのＭＤＡ反応に対する効果を決定した。配列ＮＮＮＮ*Ｎ*Ｎを有する、エキソヌクレアーゼ耐性の標準ランダムヘキサマープライマーを、ランダムプライマーとして使用した。ダイマースペルミン部分を含むオリゴカチオン部分が、エキソヌクレアーゼ耐性のランダムヘキサマー配列、ＮＮＮＮＮ*Ｎの５’末端に共有結合した２−ＳＰ−修飾ヘキサマープライマー配列である５’ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎ（ｍｅｔａｂｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（「ＳＰ２」はｎ＝２の構造ＩＶ；ＤＮＡ配列の５’末端に結合された２単位のスペルミン修飾を表す）、を、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーとして使用した。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体ＤＮＡ（標的ＤＮＡの鋳型）のリアルタイム増幅を、１ｎｇ〜１ｆｇの範囲の段階希釈液を使用して実施した。ＤＮＡを、等量の溶解緩衝液（０．４Ｍ  ＫＯＨ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加することによって変性させ、５分間インキュベートし、一体積の中和緩衝液（０．４Ｍ  ＨＣｌ、０．６Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で中和した。反応液（１２μＬ）は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、２．５％  ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０μＭランダムヘキサマー又は１０μＭ  ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎ、２０μｇ／ｍｌ  Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、１：２００００希釈のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び表示濃度の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡ含有液１μＬを含有した。３０℃において５時間インキュベートした。Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＳＮｉＰｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で蛍光の増加を継時的にモニターすることによって増幅反応をリアルタイムにモニターした
図１は、標準ランダムヘキサマープライマー（ＮＮＮＮ*Ｎ*Ｎ）及びスペルミン修飾ランダムヘキサマープライマー（ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎ）の増幅速度を例示する。各段階希釈液の増幅速度を、各段階希釈液において検出可能なレベルのアンプリコン産物の作製にかかる時間をモニターすることによって評価した。ＮＴＣは、増幅反応が標的ＤＮＡ鋳型の添加なしに実施された「鋳型非含有対照」を表す。図１は、スペルミン修飾ランダムプライマーを増幅反応に使用した場合のＭＤＡ反応の反応速度及び感度の上昇を示す。標準ランダムヘキサマーを５’−ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎヘキサマー（２ＳＰ修飾ヘキサマー）に置き換えると、増幅速度の上昇（およそ３倍）がもたらされ、フェトグラム量のＤＮＡが効率的に増幅された。想定外に、短鎖プライマーの５’末端における荷電種の存在が、ＤＮＡポリメラーゼによる結合及び伸長を阻害しなかった。さらに、荷電種は、等温鎖置換増幅の間にＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの鎖置換を阻害しなかった。上流アンプリコン作製は、ＭＤＡ反応において下流のプライミング及び伸長セクションにより進行するので、修飾プライマーの鎖置換が必要とされる。プライマー修飾がＤＮＡポリメラーゼによる伸長の開始又はＤＮＡポリメラーゼによる鎖置換を阻害された場合、反応速度は低くなり収率も下がるものと思われる。
【００５５】
実施例２：スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーを利用する増幅反応の配列包括度及び増幅バランス
１００ｆｇの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ耐性標準ランダムヘキサマープライマー配列ＮＮＮＮ*Ｎ*Ｎを使用するか、又はダイマースペルミン部分を含むオリゴカチオン部分（ＳＰ２）が配列ＮＮＮＮＮ*Ｎの５’末端に共有結合したエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマー配列、ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎ（構造ＩＶ）を使用するかのいずれかで増幅させ、４種の異なる細菌遺伝子座の相対増幅レベルを決定した。全増幅レベルは約２５００万倍であった。次いで、それぞれの増幅反応由来のこの増幅ライブラリ１０ｎｇを、４つの異なるゲノム遺伝子座（ＬｙｔＤ、ＹｄｃＱ、ＤｎａＫ及びＭｅｎＦ）を標的とする特異的プライマーセットを使用する標準ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−１に基づく定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して分析し、感度が高くバランスのとれたＤＮＡ増幅を促進するためのオリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマーの有効性をサンプリングした。反応を三連に実施し、それぞれのアンプリコンライブラリ中のこれらの４種のゲノム遺伝子座の絶対Ｃｔ値を、非増幅細菌ＤＮＡ由来の値と比較して、相対発現レベルを求めた。図２は、ｌｏｇ２比としてプロットしたデータを例示しており、０値は非増幅細菌ＤＮＡ対照と比較して同等の遺伝子座の発現が同等であることを示す。図２に表すように、オリゴカチオン−オリゴヌクレオチド複合体プライマー、ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎはランダムプライマー、ＮＮＮＮ*Ｎ*Ｎと比較してより優れた配列包括度及び増幅バランスを表した。スペルミン修飾ヘキサマーを使用して増幅された産物は、比較的均等な４種の遺伝子座の包括度を保持し、一方、標準ヘキサマーから増幅された産物は、いくつかの配列の増幅不足及び喪失を示した。
【００５６】
実施例３：スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーを使用した単一細菌細胞からのＤＮＡの増幅
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を希釈により単離し、ＦＭ  １−４３  ＦＸ膜色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で染色し、倒立型蛍光顕微鏡を使用して計数した。細胞を、等量の溶解緩衝液（０．４Ｍ  ＫＯＨ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加することによって溶解し、５分間インキュベートし、一体積の中和緩衝液（０．４Ｍ  ＨＣｌ、０．６Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で中和した。
【００５７】
スペルミン修飾ヘキサマーを利用するＭＤＡ反応を、１〜５個の単離大腸菌細胞を用いて実施した。反応液（２０μＬ）は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、２．５％  ＰＥＧ−８０００、１５μＭ  ＳＰ２−ＮＮＮＮＮ*Ｎ、２０μｇ／ｍｌ  Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、１：２００００希釈のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び３μＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解液を含有した。３０℃において５時間インキュベートした。単一細胞反応における合計増幅はおよそ、４００００００００倍である。増幅ＤＮＡをライブラリに処理し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ））全ゲノムシーケンシングに１００ヌクレオチドリード長で供した。各試料に関して八（８）百万のリードを大腸菌参照ゲノムに対してマッピングし、マッピングされたリードのパーセント及び１以上のオーバーマッピングリードを含むゲノム包括度のパーセントを決定した。スペルミン修飾ランダムヘキサマーを利用するＭＤＡ反応は、数個及びたとえ単一の細菌細胞からであってもＤＮＡの増幅を可能にするほど強固であり、十分な感度を有した。図３に表すように、約７５％（７５−９０％）を超えるリードが、細菌の単一細胞からのＤＮＡ増幅において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）参照ゲノムにマッピングされた。さらに、リードは、スペルミン修飾ランダムヘキサマープライマーを使用する単一細胞ＤＮＡ増幅において、約５３％（５３−８０％）を超えるゲノムを発現した。
【００５８】
上記の詳細な説明は例示であり、本出願の発明及び本発明の使用を限定する意図のものではない。本明細書を通して、特定の用語の例示は限定されない例と考えるべきである。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の支持対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通じてこの中で使用される近似の言い回し（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ）は、関連する基本的な機能に変化を生じさせることなく変えることができると考えられる任意の量的表現を修飾するために適用することができる。したがって、「約」のような用語により修飾される値は、指定された正確な値に限定されるものではない。特に他のことが示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される、原料の量、分子量などの特性、反応条件を表すすべての数字は、「約」という用語によりすべての事例において修飾されていると理解すべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において記された数値パラメーターは、本発明により得ることが探求される所望の特性に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲の範囲と等価の原理の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数値を考慮して、通常の四捨五入技術を適用することによって解釈されるべきである。必要に応じて範囲が与えられるが、それらの範囲はその間のすべての部分範囲を含んでいる。
【００５９】
本発明は、本発明の精神又は基本的特徴を逸脱することなく他のいろいろな形態で具現化することができる。前述の実施形態は、多種多様な実施形態又は実施例のすべての候補から選択された実施形態又は実施例である。したがって前述の実施形態は、あらゆる点において本発明を限定するものではなく例示として考えるべきである。本発明のわずかな特定の特色を本明細書に例示及び記載しているが、この開示から利益を受ける当業者が、本発明の原理に従って本方法を使用するための適切な条件／パラメーターを、これら及び他のタイプの応用に適切に、特定、選択、最適化又は改変できることを理解すべきである。試薬の正確な使用及び選択、濃度、体積、インキュベーション時間などの変数の選択は、意図される具体的適用に大いに依存すると思われる。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の精神の範囲内ですべての変形及び変更を包括する意図のものであると理解すべきである。さらに、特許請求の範囲と同等の意味及び範囲に属するすべての変更は本発明の範囲内であることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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