(57)【要約】  本発明は、生存可能な微生物の急速な再活性化およびそれらの連続的増殖に有利に作用する無水栄養培地が予備充填された天然の小型発酵槽として機能する可変的体積を有する高吸収性アグロペレット中に担持された固体接種材料に関する。低い微生物細胞密度で担体中に取込まれる液体接種材料は、好ましくは、同じ菌株の液体接種材料について規格により推奨される密度の１／５００〜１／１０の間に含まれる。微生物個体群の生体増加は、およそ１０４〜１０６の追加微生物細胞である。本発明に係る固体接種材料は、有利な条件での微生物の保存およびその操作を可能にする。この固体接種材料は、土壌中で水による溶脱を受けない。前記接種材料は、その発育および／または寄生虫攻撃からのその保護を目的とした作物の生物学的処理に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自重の５００％に至る水または水溶液を吸収することのできる高吸収性の生分解性可塑的複合材料マトリクス製アグロペレットで構成され担持された固体接種材料において、前記アグロペレットには栄養培地が予備充填されており、前記アグロペレットが担体としての機能と同時に、前記接種材料を構成する微生物がその内部で増殖することができるようにする発酵槽としての機能も果たし、前記栄養培地が前記アグロペレット中で無水状態にあり、接種すべき菌株について規格に沿って適応された液体培地の濃度よりも２〜１０倍高い濃度を有すること、ならびに接種材料の密度が、同じ菌株の液体接種材料について推奨される量の１／５００〜１／１０であることを特徴とする、固体接種材料。
【請求項２】
前記アグロペレットが、２５重量％〜５００重量％の比率で濃縮された前記栄養培地を取込んでいることを特徴とする、請求項１に記載の固体接種材料。
【請求項３】
担体中に含まれる濃縮無水培地が、溶脱の危険性なく、雨水または散水用水により部分的かつ漸進的に溶解することを特徴とする、請求項１または２に記載の固体接種材料。
【請求項４】
前記アグロペレットが埋設される場合も含め、前記アグロペレットの再水和および前記栄養培地の部分的および漸進的溶解が、再活性化された微生物の成長とそれに続く連続的増殖に有利に作用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の固体接種材料。
【請求項５】
前記アグロペレットが、植物性タンパク質バイオポリマーと、でんぷん、ヘミセルロース、セルロースかつペクチンを富有する糖類バイオポリマーと、ヒアリンまたは水嚢細胞で構成された天然組織との混合物を用いて作製された生分解性可塑的複合材料マトリクスからなることを特徴とする、請求項１に記載の固体接種材料。
【請求項６】
高吸収性アグロペレットが９２重量％〜９５重量％の乾燥材料比率を有することを特徴とする、請求項１および５のいずれか一つに記載の固体接種材料。
【請求項７】
前記アグロペレットの体積が、水または水溶液の吸収による膨張およびこれら前記液体の放出による収縮で変動するものの、それが剥片状になることはないことを特徴とする、請求項１、５および６のいずれか一つに記載の固体接種材料。
【請求項８】
微生物が、菌根菌および根粒菌の中から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つ記載の固体接種材料。
【請求項９】
微生物が、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａ、Ｍｅｔｅｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ、さらにはＢｅａｕｖａｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａの中から選択されることを特徴とする、請求項１および８のいずれか一つに記載の固体接種材料。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の固体接種材料の獲得方法において、
ａ）２５重量％〜５００重量％の比率で、接種すべき菌株に適した濃縮液体栄養培地を高吸収性アグロペレット製担体中に取込むステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた担体を、９０重量％〜９５重量％の乾燥材料比率に至るまで４０℃〜５５℃で脱水するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得た乾燥担体を、気密容器内で殺菌するステップと；
ｄ）ステップｃ）で得た無菌担体中に、同じ菌株の液体接種材料について規格により推奨されている量の１／５００〜１／１０、好ましくは１／２００〜１／１００の間で変動する微生物密度で、予め培養された微生物菌株を取込むステップと；
ｅ）ステップｄ）で得た充填済み担体を、３５℃〜４０℃での恒温処理により脱水して、９０重量％〜９５重量％の乾燥材料比率で担持された固体接種材料を獲得するステップと；
ｆ）ステップｅ）で得た担持された固体接種材料を、湿気を受けないように包装するステップと、
で構成されていることを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記栄養培地の担体中への取込みが、散布、噴霧さらには高速浸漬によって行なわれることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
担体中に取込まれた栄養培地の濃度が、接種すべき微生物菌株について規格に沿って適応された液体培地のものよりも２〜１０倍高いものであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
液体接種材料の担体中への取込みが、散布または噴霧によって行なわれることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
担体の殺菌がオートクレーブ内で、照射によって、あるいはさらにチンダル間欠滅菌法によって行なわれることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥料および／または植物病虫害防除処理の部分的または全面的代用として農業および作物学において使用可能な刺激性生命維持加工助剤の生産の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
接種材料とは、
・  植物が使用する栄養因子の土壌中での放出、
・  大気中の窒素の固定および使用など、植物の生命維持に不可欠な機能の遂行を可能にするための、植物の根系との共生的関係の樹立、
・  植物の病原体に対するアンタゴニスト作用、
によって植物の発育を改善するべく土壌中にもたらされる極微の細菌または真菌であるということは公知である。
【０００３】
この目的で、マメ科の根の根粒形成を行なう根粒菌は、大部分の植物が水分を保持して栄養素をより良く吸収するのを助けるために根にコロニーを形成する菌根菌と全く同様に最も一般的に使用されるものである。非病原性の微生物を接種に利用することが可能であり、その中でも、網羅的にではなく一般名で例として、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、ならびに他の属を挙げることができる。植物の保護については、同様に、予防的効果をもつ微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａ、Ｍｅｔｅｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅあるいはさらにＢｅａｕｖａｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａを挙げることもできるが、これらに限定されるわけではない。
【０００４】
市販の接種材料は、粉末、顆粒および液体の形で入手可能である。一般的に、泥炭は、粉末の形をした好ましい担体を構成する。無機担体、カオリナイトおよびバーミキュライトも同様に使用されているが、比較的限定的である。接種材料は、穀粒を直接薄膜状に覆う場合もある。
【０００５】
国際公開第２００４／１１２４６２号（２００４年１２月２９日）は、土壌の病原体の生物学的制御のために、ならびに土壌の除染のために、そして土壌の活性化および肥沃化のために、天然のリンをもたらすのに利用可能な、０．００１ｍｍ〜１０ｍｍの顆粒剤を形成する動物の骨のカーボンブラックから作製した担体を開示している。しかしながら、この文書は、国際公開第９６／３７４３３号を引用しており、該特許は、物理化学的および生物学的視点から見て微生物接種材料の不動化および保存にとって望ましくないものである酸性およびアルカリ性溶液による処理を必要とするその獲得方法に起因するこのタイプの担体の欠点を対象にしている。このタイプの材料のもう１つの欠点は、その水溶性が高く、このため作物に対する生物学的貢献が大きく低下するという点にある。このタイプの担体は、微生物の発育を加速することができるが、そのために菌株の生殖期が延長されることはない。なおこれは、この目的で、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  Ｊａｐｏｎｉｃｕｍの発育を加速するために接種材料担体上にダイズレチシンを付加することを用いる米国特許第５１７３４２４号明細書の中で達成され記載されたものと同じ結果である。
【０００６】
ポリマーマトリクス製微小粒子内のその微生物カプセル封入が前記微生物の不動化を可能にし、かつ生産、保管および操作の容易さをもたらす複数のタイプの固体接種材料担体が泥炭の代替案として研究されてきた。（Ｃａｓｓｉｄｙ  Ｍ．Ｂ．、Ｌｅｅ  Ｈ．およびＴｒｅｖｏｒｓ  Ｊ．Ｔ．１９９６年−Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：７９〜１０１）。仏国特許第２５９０９０４号明細書（１９８５年１２月４日）は、例えばリン酸緩衝液などの緩衝液によるビーズの再水和の後に得られる、ゲル状で土壌中に分散したアルギン酸カルシウムビーズ中への糸状体微生物の取込みについて記載している。国際公開第００／５９９４９号（１９９９年４月６日）の方は、キトサンマトリクスに結びつけられた抗真菌薬について記載している。キチンも同様に、仏国特許出願公開第２９４１５８９号明細書（２００９年２月３日）によって細菌生物施肥担体として説明されている。効能は非常に高いものの、キチンは、コストが過度に高いことおよび、その入手可能性が不確実で地理的に制限されたゾーンに限定されていることという二重の問題を有している。
【０００７】
さらに、植物性担体がすでに言及されている（Ｓｍｉｔｈ  Ｒ．Ｓ  １９９２年−Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：７３９〜７４５）。この概念は、乾燥され粉砕されたブドウの果肉製の接種材料担体について記載する仏国特許第２５９３１９１号明細書（１９９６年）および欧州特許出願公開第０２３６１５６号明細書（１９８６年１月１７日）によって確認されている。アザミ属もまた、一部の考案者によって使用されている。
【０００８】
これらの担体は、その使用のため、以下のような一連の作業に付される：
・  恒温器内における７０℃で４８時間の乾燥、
・  ペレットまたは粉末の形への粉砕、
・  ＣａＣＯ3を添加することにより６．８〜７に調整された一定のｐＨでの中和。
【０００９】
ただし、これらの接種材料担体は、特に微生物細胞の輸送および保管に限定されており、土壌内で有利な条件がひとたび揃った時点で発育サイクルの再開を容易にするために微生物と共に発育促進要素が取込まれている場合でさえ、その連続的増殖を保証することはない。実際、これらの担体の水吸収能力は、泥炭については１７．５％、フランス泥炭については２３．５％、カオリナイトについては１７．８％、バーミキュライトについては１９．２５％、そしてアザミ属については２６．２５％という、それらの重量に対する水の重量比率に相対的に限定されている。Ｓａｉｎｔ−ＭａｃａｒｙおよびＮｅｙｒａ（１９９２年）によると、担体中に吸収され得る液体接種材料の最適な所要体積は、概して保水体積の６０％〜７０％であり、このために引用された担体の容量はさらに限定される。
【００１０】
ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＲａｓｋの研究（２０００年）によると、担体は、２つの根本的な特性、すなわち、微生物の所定の場所での成長を可能にすることおよび許容可能な保存期間にわたってそれらを維持することという特性を有していなければならない。微生物の増殖特性は求められていない。
【００１１】
欧州特許第０４４３０４０号明細書（１９９０年９月５日）は、植物の害虫に対して感染性を有する微生物を含む培地中で溶解状態にある栄養素で被覆または含浸された不織織物を含むもう１つのタイプの微生物培養装置について記載している。このように含浸された織物は、乾燥させられ、その後、処理すべき木の茎、枝または幹の周りに複数の層の形に巻き付けられる。専ら外部にあるこの装置は、微生物培養に対し直接的影響を及ぼすことになる天候不順に左右され続けている。培養対象の微生物は処理対象の植物との共生活性を全く必要としない。
【００１２】
同じ枠内で、米国特許第５７８６１８８号明細書（１９９８年７月２８日）は、極微真菌接種材料の調製について記載している。前記接種材料は、ヒドロゲル、アルギネートまたはアルギン酸中の極微真菌懸濁液でコーティングされたペレット状の植物性繊維質基質で構成されている。栄養素は、ペレット中にあるが、表面上にいる微生物の発育、専ら真菌類の発育用である。極微真菌に特異的なこのタイプの担体は、閉鎖型または半閉鎖型環境内で発育する細菌の培養に役立てることができない。
【００１３】
したがって、先行技術に照らして、同時に下記の担体であることによって、以下の根本的機能を少なくとも提供する担体を有する固体接種材料を提供する必要性が存在する：
・  再活性化可能な微生物の保管および保存用担体、
・  最も良い取扱い条件下での微生物の輸送用担体、
・  微生物を再活性化するための微生物成長用担体、および
・  再活性化された微生物の増殖用担体、
・  間質環境の元素に対する微生物の保護用担体、
・  溶脱効果に対する微生物およびその培地の保護用担体、
・  水ストレスに対する微生物の保護用担体。
【００１４】
前記機能は、有利にも、間質環境内での微生物の持続可能な大きな密度を獲得して、例えば根系と微生物の間の共生関係、または植物の発育および生産力を刺激するかまたは植物を保護する生命維持上の影響を最適化することを可能にする。
【００１５】
本発明をより良く理解するために、単数または複数の「可変的体積を有する高吸収性のアグロペレット」という用語は、剥片状になることなく体積を増大させその後脱水状態となることで原初の体積に戻る大きな水または水溶液吸収能力を有する植物性ポリマーをせん断下で混練りし加圧することにより材料を可塑加工する２本の同時回転ウォームの備わった押出し加工装置を用いた化学的および熱力学的処理によって得られる顆粒剤を意味する。
【００１６】
単数または複数の「天然小型発酵槽」という用語は、アグロペレット中に導入されてそこで成長しその後補水により水条件が満たされた時点でそこで増殖する再活性化可能な微生物細胞が活用することになる栄養培地または無水培地を内部に保管している可変的体積を有する高吸収性アグロペレットを意味する。生産された微生物は前記アグロペレットの多孔質網状組織を介した移動によって外に出ることができる。
【００１７】
単数または複数の「連続式天然小型発酵槽」という用語は、反復的補水により連続的に栄養培地または培養基を可溶化し、こうして微生物による利用能を更新し、このようにして微生物が増殖し続けることができるようにする、先に定義した小型発酵槽を意味する。ここで、前記微生物は生産されるにつれて間質環境内の前記小型発酵槽から根系に向かって移動し、こうして植物との共生関係にはこれが考慮に入れられることが理解される。
【００１８】
「間質環境」という用語は、固体接種材料と植物の根系との間の土壌中の空間を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】液体接種材料および１／１００担持接種材料という２つの接種材料の比較推移曲線を表わす。
【図２】液体接種材料および１／１担持接種材料という２つの接種材料の比較推移曲線を表わす。
【００２０】
本特許の出願人が出願した仏国特許出願公開第２９９０９４３号明細書（２０１２年５月２２日）は、剥片状となることなく、そして浸透もなく、５００重量％に至る大量の水または水溶液を吸収し備蓄することができるという特徴を有する可変的体積を有する高吸収性アグロペレットについて記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、溶脱による喪失なく水懸濁液中の極微物質または元素を吸収できる天然小型発酵槽として機能する可変的体積を有する高吸収性のアグロペレットによって、前述の先行技術の接種材料系の欠点を克服することを提案する。詳細には、担体の機能と同時に、前記接種材料を構成する微生物をその内部で増殖させることのできる発酵槽の機能を果たし、前記発酵槽内ではそのさまざまな栄養素および栄養培地の成長因子が溶脱されるリスク無くすでに乾燥状態にある、前記アグロペレット中に担持された固体微生物接種材料系を製造できることが所望されている。こうして前記接種材料系は、その効能およびその生物活性持続時間を増大させるように条件付けされる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明によると、担体が埋設された場合を含め、前記担体が再水和された場合に直ちに、微生物細胞が発酵槽内と同様に再活性化し次に成長し増殖することのできる、同様に乾燥した所要量の栄養培地と共に生物分解性担体中に相当な量で担持された新しいタイプの固体接種材料の製造が提案されている。接種材料を構成する定まった使用価値を有する微生物の選択にあたっては、これらの微生物が、閉鎖した環境内でさえ増殖できかつ植物の根系との間の親和性という生物学的特性のために小型発酵槽外へ移動することのできる能力を有するという事実が考慮されなければならない。
【００２３】
したがって本発明の目的は、雨水および散水用水による溶脱を回避しこうしてこの生物学的供給源を安定化させてその効能および生命維持活性持続時間を増大させることを通して、栄養培地の再水和および漸進的溶解により、再活性化された微生物細胞の成長とそれに続く連続的増殖に有利に作用する無水栄養培地が予備充填された、天然の小型発酵槽として機能する可変的体積を有する高吸収性のアグロペレット中に担持された固体接種材料にある。
【００２４】
したがって、本発明の第１の態様は、効能および生物活性持続時間を増大させるため、低密度で取込まれた微生物が再活性化されて連続的に増殖する上で有利に作用する無水濃縮栄養培地が予備充填された連続的な天然の小型発酵槽として機能する可変的体積を有する高吸収性のアグロペレット中に担持された固体接種材料において、
ａ．再活性化可能な微生物の保存および保管、
ｂ．取扱いおよび現場適用の最も優れた条件下での微生物の輸送、
ｃ．有利な条件が揃った時点で発育サイクルを再開するための、再活性化された微生物の成長、
ｄ．微生物の担体中増殖、
ｅ．間質培地の負の要素に直面した場合の微生物の保護、
ｆ．溶脱効果に対する微生物およびその培地の保護、
ｇ．水ストレスに対する微生物の保護、
を可能にする根本的特性を保証する前記接種材料に関する。
【００２５】
本発明に係る前記担体は、仏国特許出願公開第２９９０９４３号明細書に記載された方法にしたがって得た可変的体積を有する高吸収性のアグロペレットである。この担体は、先行技術において記載された既知の担体の条件づけのために説明された作業を必要としないという点で、技術的方法に利益をもたらす。実際、以下の点を指摘しておかなければならない：
・  その作製時に例えばｐＨはすでに調整されている、
・  農業で一般的に使用されている工具を用いて、現場で取扱いかつ適用する上で有利な規則的粒度を有する、
・  その可塑的構造のため、水または水溶液の吸収による膨張およびこれら前記液体の喪失または脱着による収縮において体積を変動させる特性が付与され、これらの条件下でのその剥片状化を回避することができる、
・  水または水溶液を吸収してその体積を変動させる能力は、微生物が窒息する剛性多孔質材料中で発生する状態とは異なり、多孔質網状組織内での微生物の高速再活性化および増殖にとって有利である、
・  水または水溶液を吸収するその高い能力は、その強い保水能力と結びつけられて、保持された液体の浸透つまり、懸濁状態または溶解状態にある元素の溶脱を回避すると同時に、前記担体中に常に充分にかつ決して過剰ではなく水が存在することによって水ストレスから微生物を保護することを可能にする、
・  その大きな細孔網状組織は、圧力差または生命維持作用物質の作用による内から外へ向かう微生物の移動に有利に作用する。
【００２６】
仏国特許出願公開第２９９０９４３号明細書に係る前記可変的体積を有する高吸収性のアグロペレットの獲得方法は、植物性タンパク質バイオポリマー（例えばヒマワリ、ダイズ、セイヨウアブラナ、ウマゴヤシ属または亜麻の搾りかす）、でんぷん、ヘミセルロースおよびペクチンを富有する糖質バイオポリマー、およびヒアリンまたは水嚢細胞（例えばミズゴケ）の天然組織の混合物で構成された生分解性可塑的複合材料マトリクスを作製することからなる。
【００２７】
より厳密に言うと、本発明を適応した固体接種材料担体は、９２％〜９５％の乾燥材料比率、ならびに５００重量％に至る吸収能力により水または水溶液を吸収し備蓄する大きい容量を有し、こうして並外れた内部生物活性が可能となり、このため小型発酵槽としての性質が得られることになる。前記担体は、その吸収限界に達した時点でもはや吸収せず、このため、吸収された水または水溶液は構造中に保たれることから、浸透つまり溶脱から保護される。
【００２８】
本発明に係る天然の小型発酵槽としての前記アグロペレットの作製は、接種すべき微生物の属に対応する液体濃縮栄養培地を通気性で高吸収性のアグロペレットに予備充填し、その後それを脱水してからそこに前記液相の微生物を取込み、次に改めてそれを脱水してから保管のために包装することによって、実施される。
【００２９】
本発明を適応したアグロペレットは、二軸押出し加工装置を用いて天然材料を樹脂加工することによって作製され、以下のものを含むマトリクスを有する：
ａ）ｉ．タンパク質作物（ヒマワリ、ダイズ、セイヨウアブラナ、ウマゴヤシ属、亜麻）の植物性材料の副産物の中から選択された、グロブリン、アルブミン、プロラミンだけでなく繊維も富有するタンパク質バイオポリマー５５重量％〜６０重量％、および
ｉｉ．穀物の穀粒またはサトウダイコンの食用部分の粉の中から選択された、でんぷん、ヘミセルロースおよびペクチンを富有する多糖類バイオポリマー４０重量％〜４５重量％、
で構成されたバイオポリマー混合物。
ｂ）ミズゴケまたはアザミ属Ｃａｒｄｕｕｓなどの生きた植物性材料の中から選択されるヒアリンまたは水嚢細胞の天然組織の固体混合物５重量％〜４０重量％。
【００３０】
本発明に係る最も優れた結果を導く好ましい組成によると、栄養培地は、接種すべき微生物の菌株に適応させられ、
ａ）ＹＭＢ（酵母−マンニトール−ブロス）（Ｖｉｎｃｅｎｔ、１９７０）
ｂ）ＹＭ（酵母−マンニトール）、
ｃ）ＢＨＩ（ブレイン  ハート  インフュージョン）
の中から任意に選択される組成にしたがって調合されるが、処理すべき微生物と調和した好適なあらゆる他の培地であってよい。
【００３１】
本発明の一実施形態によると、小型発酵槽担体中に取込まれる培地は、水相にあり、接種すべき微生物の菌株に特に有利なさまざまな栄養素および成長因子で構成されたその乾燥材料の比率は、同じ微生物菌株に推奨される規格に沿って適応された液体培地の比率よりも２〜１０倍高いものである。有利には、前記担体中に取込むべき濃縮液体栄養培地の体積は、２５重量％〜５００重量％の間で変動し得る。
【００３２】
濃縮栄養培地は、最終体積が等しい場合、栄養素および／または培養中の微生物の成長および増殖に有利に作用する元素を、通常の栄養培地に比べて２〜１０倍高い量で含むことを特徴とする。前記元素および／または栄養素は、培養中の微生物のタイプに応じて、当業者にとっては周知のものである。例えば、酵母エキス、マンニトール、グルコースまたはサッカロースなどの単糖、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの塩を挙げることができる。
【００３３】
本発明に係る微生物は、非限定的に、菌根菌、根粒菌ならびに植物の生命の改善、それらの保護およびそれらの生命維持処理に寄与することのできる他の微生物、例えばＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａ、Ｍｅｔｅｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ、さらにはＢｅａｕｖａｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａであり得る。
【００３４】
本発明の機能様式によると、小型発酵槽内に少量吸収された水または水溶液は、物理化学的溶解法則に従い、高濃度で存在する乾燥培地を部分的にしか溶解させず、こうして、保管された再活性化可能な微生物細胞が、それを利用して成長し増殖できるようにする。実際、本発明の一態様によると、栄養培地の存在によって微生物細胞の高速再活性化が可能になる。無水培地の部分的溶解により、小型発酵槽内の微生物細胞の生産サイクルの連続性のための備蓄の確保が可能になる。その上、小型発酵槽内に乾燥状態で培地が存在することは、保管される水体積の最適化に寄与し、これは微生物に好ましい水活性にとって有利である。実際、水活性が高すぎると微生物細胞の高い致死率を導く可能性がある。
【００３５】
本発明に係る小型発酵槽内で生産された微生物細胞は、微生物細胞と受容体根系という２つの実体の共生関係および生物学的配置によって、その生産につれて、前記小型発酵槽の多孔質網状組織を通って、間質環境と受容体植物の根系に向かって移動する。こうして、前記小型発酵槽内の微生物細胞の生産サイクルは、補給水ならびに適応された水活性を有する微生物にとってアクセス可能な溶解した栄養培地が存在するかぎり、続行することができ、小型発酵槽の内部で微生物細胞により生産された代謝産物は、間質環境に向かう生きた細胞の移動により運び去られる。しかしながら、担体により吸収され得る水または水溶液の量は、吸収能力の限界によってと同様前記アグロペレット中の無水栄養培地の存在によっても当然制限される。
【００３６】
本発明の有利な一実施形態によると、連続的機能条件下に置かれた小型発酵槽は、前記担体中に接種すべき生存可能な微生物細胞の密度を、液体接種材料について規格が推奨する量の１／５００〜１／１０の間の密度、ただし好ましくは液体接種材料について規格が推奨する前記量の１／２００〜１／１００の間の密度まで著しく減少させることができる。この密度は、たった数日で、規格が推奨する密度に急速に到達する。液体接種材料について、勧告では、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ密度として１ｍＬあたり１０6〜１０8個の細胞が勧められている（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ  ＳｏｍａｓｅｇａｒａｎおよびＪａｋｅ  Ｈａｌｌｉｄａｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．４４、１９８２年）。規格は、例えば、少なくとも５×１０8個の細胞という、担体１グラムあたりのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．数を指示している（Ｂｅｃｋら、１９９３年）。本発明に係る小型発酵槽内に１グラムあたり例えばｎ×１０4個の細胞（ｎは２〜９の間で変動する）を本発明にしたがって接種することによって、間質環境内において３〜５日で推奨された生存可能な細胞密度が得られ、これは、植物に対する発育因子の供給において期待される収量に比べて少ない運用コストで、担体および接種材料の体積、あるいは植物病原体に対するアンタゴニスト作用の規模の極めて大きな増大を表わしている。固体接種材料についての生存可能な細胞の推奨される最大密度は、担体１グラムにつき１０6個の細胞である（Ｆｉｃｈｉｅｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｄｅ  ｌａ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｓｙｍｂｉｏｔｉｑｕｅ  ｄｅ  ｌ’ａｚｏｔｅ−Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｕｎｉｅｓ  ｐｏｕｒ  ｌ’Ａｌｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｔ  ｌ’Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＦＡＯ）−１９９２年）。
【００３７】
実際、意外にも、本発明に係る小型発酵槽からの微生物細胞の生産レベルは、担体１グラムあたりｎ×１０4個の細胞から出発して、補水シーケンスおよび接種された微生物菌株に応じて、可変的持続時間で担体１グラムあたりｎ×１０9個〜ｎ×１０10個の細胞という値に達し、これは、担体１グラムあたりｎ×１０8個の細胞というＦＡＯの手引書の勧告にしたがって助言された規格を大きく上回るものである。微生物個体群の生体増加により表現される効能および生物活性持続時間の増大が指摘され、こうしてこの微生物個体群は、担体中で、ｎ×１０4個からｎ×１０6個の追加細胞数まで増殖して、３〜５日以内に、接種された担体が播種された土壌中およそｎ×１０10ＣＦＵ（コロニー形成単位）の密度に達し得る。
【００３８】
したがって本発明に係る担体は、微生物が内部で低密度から出発して急速に成長し増殖して、ＦＡＯの手引書の勧告にしたがった規格により勧められる微生物密度の値に迅速に達しさらにはこれを越える、真の発酵槽として機能する。
【００３９】
本発明によると、小型発酵槽担体の保水能力によって、雨水または散水用水による培地の溶脱も微生物細胞の溶脱も回避することが可能になる。担持された接種材料は、根系の近くに維持され、こうして、植物の根系とそれにコロニーを形成するはずの微生物細胞との間の共生関係の効率を増大させる。
【００４０】
本発明の第２の態様によると、本発明を適応した天然の小型発酵槽として機能する可変的体積を有する高吸収性のアグロペレット中に担持された固体接種材料は、
ａ）２５重量％〜５００重量％の比率、ただし好ましくは微生物に適応される一定の習慣的値の比率で、接種すべき菌株に適した濃縮液体栄養培地を高吸収性アグロペレット製担体中に接種するステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた担体を、９０重量％〜９５重量％の乾燥材料比率に至るまで４０℃〜５５℃で脱水するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得た乾燥担体を、気密容器内で殺菌するステップと；
ｄ）ステップｃ）で得た無菌担体中に、同じ菌株の液体接種材料について規格により推奨されている量の１／５００〜１／１０の間で変動する微生物密度で、ただし好ましくは同じ菌株の液体接種材料について規格により推奨されている量の１／２００〜１／１００に含まれる微生物密度で、予め培養された微生物菌株を取込むステップと；
ｅ）ステップｄ）で得た充填済み担体を、３５℃〜４０℃での恒温処理により脱水して、９０重量％〜９５重量％の乾燥材料比率で担持された固体接種材料を獲得するステップと；
ｆ）ステップｅ）で得た担持された固体接種材料を、湿気を受けないように包装するステップと、
で構成されている方法を実施することによって得られる。
【００４１】
本発明の方法の実施形態によると、濃縮液体栄養培地ならびに接種すべきバイオマスの担体中への取込みは、好ましくは散布によって行なわれるが、これは、噴霧あるいはさらに高速浸漬によっても行なうことができる。
【００４２】
本発明の方法の実施形態によると、アグロペレットの殺菌はオートクレーブ内で、照射によって、あるいはさらにチンダル間欠滅菌法によって行なわれる。
【００４３】
本発明に係る小型発酵槽として機能する可変的体積を有する高吸収性アグロペレット中に担持された固体接種材料には、多くの利点があり、第１のものとしては、実用的であること、密閉した包装材に入れて安全に保管し輸送でき、こうして一般的な農業材料を用いて農業従事者の利用状況に応じて容易に適用されるようになっていることがある。これは、風によって運び去られることはなく、生分解性を有するため土壌を飽和しない。それは、発生する根系にとって有用である微生物個体群の溶脱効果と同様、前記微生物個体群に必要な培地の溶脱効果を回避できるようにする。取込まれた栄養培地は、サイクルの開始のためのスタータとしての役目と同時に、接種された微生物菌株の連続的な担体中増殖のための培地としての役目も果たす。これは、内部で発育中の微生物バイオマスを水ストレスから守る。
【００４４】
本発明に係る小型発酵槽としての担持された固体接種材料の使用により、適用すべき接種材料の量を最小限に抑えることができ、これは、特異的菌株からの微生物バイオマスの生産の管理における重要な検約源である。同様にこうして、それは微生物菌株を土壌の元素による負の効果から、例えばそのｐＨおよびｐＨに大きな影響を与えるものであるその化学的元素組成から保護することができる。
【００４５】
以下の実施例は、本発明を例示し、そのさまざまな利点をより良く理解できるようにするものである。便宜上、以下では、次の略語を使用するものとする：
・ＣＦＵ：コロニー形成単位
・ＹＭ：液体栄養培地（酵母  マンニトール）
・ＹＭ２ｘ：液体培地ＹＭに比べ２倍の濃縮度を有する液体栄養培地。
【実施例】
【００４６】
実施例１−液体接種材料と小型発酵槽担体中に充填された接種材料との土壌中における推移の比較
液体の５００重量％の吸収能力を有する、出願人の実験室内で製造されたヒマワリおよびミズゴケの搾りかすでできた通気性で高吸収性のアグロペレットを使用する。
【００４７】
使用する菌株は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属の土壌菌、すなわちＤＳＭＺ収集機関（ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）のＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｐｈａｓｅｏｌｉ  ＤＳＭ  ３０１３７である。
【００４８】
表１および２に組成が記載されているこの菌株に特異的な培地を使用する。培地（ＹＭ）の濃度は、存在する菌株の培養のために通常使用されるものであり、一方担体中に取込むための培地（ＹＭ２ｘ）の濃度は、通常の培養濃度（ＹＭ）の２倍である。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２】
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【００５１】
濃縮栄養培地１ミリリットルを伴う１グラムのアグロペレットをその取込み、つまりＹＭ２ｘでできたアグロペレット１００重量％の取込みを目的として散布する。その後、アグロペレットを乾燥材料９２重量％まで乾燥させる。
【００５２】
次に、担体上の接種材料を得るため同様に乾燥アグロペレット上に散布することによって１０6個の細菌、つまり液体培地で規格により推奨されている量の１／１００を接種する。
【００５３】
粉砕し殺菌した１００グラムの土のロットを調製し、それを表面積１ｄｍ2の正方形のペトリ皿の中に置く。こうして構成されたロットを次の２つのグループに分配する：
・  担体上の１ｇの接種材料、およそ１０6個／ｄｍ2の細菌、つまり土１ｇにつき１０4個の細菌を接種した１００ｇの土のロットを含む、Ｎｏ．１試験と呼ばれるグループ１；
・  １０6個／ｄｍ2の細菌、つまり土１ｇにつき１０4個の細菌のための液体接種材料を接種した１００ｇの土のロットを含む、Ｎｏ．２試験と呼ばれるグループ２。
【００５４】
土の表面に対して５ｍｌの無菌流水を噴霧し、２８℃でインキュベートする。毎日散水を同じように反復する。
【００５５】
５日間の試験の後、各ロット内の細菌を計数し、Ｎｏ．１試験の平均とＮｏ．２試験の平均を比較する。
【００５６】
Ｎｏ．１試験においては、皿１枚あたり約３．４×１０10ＣＦＵのプラトーが得られ、Ｎｏ．２試験においては、皿１枚あたり約１．５×１０10ＣＦＵのプラトー、すなわちＮｏ．１試験の半分未満のプラトーしか得られず、こうして差は、皿１枚あたり、約１．９×１０10ＣＦＵという非常に大きいものとなる。
【００５７】
したがって、通気性で高吸収性のアグロペレットでできた担体は、発酵槽として機能した。
【００５８】
実施例２−液体接種材料、１／１００の液体接種材料を伴う担持された接種材料および１／１の液体接種材料を有する担持された接種材料という３つの接種材料間での長時間にわたる比較研究（図１および２）。
【００５９】
定期的に耕作された畑において採取した培養土を使用する。
【００６０】
接種材料担体として、ＡＢ７  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮの実験室内で製造された通気性高吸収性アグロペレットを使用する。
【００６１】
パスツール研究所のＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ菌株ＣＰＩ１０６９５９というＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属の土壌菌を使用する。
【００６２】
菌株の培養について、かつ液体接種材料を構成するものとして、組成が表３に記されている液体培地ＹＭを使用する。培地ＹＭ２ｘは、それに細菌を接種する前に担体を富化する目的で使用される一方で、表４に記されたその組成は、培地ＹＭよりも２倍濃縮度が高いことを示している。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【００６５】
ａ．土の調製
培養土を気密な容器内に入れて、恒温器内において１１０℃で４日間殺菌する。その後、この土を１００グラムのロット９０個に分配する。
【００６６】
ｂ．テストの設定
直径６．５センチメートル、高さ５．３センチメートルで、余剰の散水用水を外に排水できるようにするための穴が底にあいている１２５ミリリットル入りの９０個の無菌ポットを入手する。これらを、３０個のポットからなる３つのグループ、すなわち液体接種材料用のグループ１と、液体接種材料を１／１００で接種したアグロペレット用のグループ２と、さらに液体接種材料を１／１で接種したアグロペレット用のグループ３とに分配する。表５中に明記されたポット内の細菌の分布が得られる。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
その後、以下の通りに進行する：
・  各ポット内に、８０グラムの無菌土を均一に入れる；
・  そこに、土１００ｇのポット１個につき、２×１０8個の細胞を含む液体については１ｍＬの割合で、そして１／１００つまり２×１０6個の細胞および１／１つまり２×１０8個の細胞が接種された担体１ｇの割合で、接種材料を均一に分散させる；
・  残りの土つまり２０グラムの土で被覆し、次に軽く押し固める；
・  蒸留水１５ｃｍ3を散水し、試料を２８℃の恒温器内に入れる。
【００６９】
ｃ．テストの追跡調査
各グループについて、２日毎に一回１５ｃｍ3、そして週末には２５ｃｍ3の散水を企図する。４日毎に各グループから２つのポットを採取し、細菌細胞の数を計数する。そのために：
・  ミキサー内で良好な均質化のためポットの中身全体を混合し、試験管内にそれを５ｇ採取する。
・  管内に無菌水１０ｍｌを注ぎ、次にヴォルテックスで激しく撹拌する。
・  傾瀉させてから上清を採取してＣＦＵを計数し、顕微鏡で観察し計数する。ＣＦＵは、ペトリ皿内においてゲロース上で実施される。
【００７０】
ｄ．結果の分析
４５日間のテストの後に得られた結果は、液体接種材料、１／１００で担持された接種材料および１／１で担持された接種材料という３つの接種材料の推移曲線を表わす図１および２のグラフによって示されている。それらを分析することで、以下の結論が導かれる。
【００７１】
１．図２に示されている液体接種材料と１／１で担持された接種材料との間の推移の比較は、同じ土１グラムあたりの細菌密度、つまり２×１０6から出発して、担持された接種材料はより耐性が高いことを示しており、このことはすなわち、担体が、例えばｐＨなどの土の負の要素のみならず、ポットの底に設けられた穴をその余剰分が通過する散水用水による溶脱といった環境的要素に対して微生物個体群を保護する役目を果たしていることを証明している。
【００７２】
２．１／１００で担持された接種材料の推移を観察すると、担体中の細菌の急速な増殖効果がわかり、担体はこのように真の発酵槽として機能している。担体中に含まれた乾燥培地は、散水の時点で溶解して、大きなスタータ効果を果たし、その後微生物増殖を支援する。したがって、１／１００で担持された接種材料は、最終的にテスト５日以降液体接種材料のレベルを超え、研究の最終日に至るまでそれにとどまる（図１）。したがって、このように構成された小型発酵槽は、微生物個体群の保護だけでなく、細菌が増殖するために利用可能であり続ける培地の役目も果たすと考えることができる。
【００７３】
３．１／１および１／１００で担持された２つの接種材料間で比較された推移は、以下のような閉鎖型発酵槽内での発酵に固有の現象を明らかにする：
ａ．発酵槽内の微生物細胞密度が高すぎると、バイオマスにより生産された代謝産物に起因して細胞の一定の致死率が導かれる。この致死率は、培地の入替えによって減衰させられる。これには、各散水毎に培地が入れ替わる担持された接種材料の場合に該当する。
ｂ．微生物増殖は、同じ発酵槽容積に対してより小さい細胞密度で出発した場合により明確である。１／１００の接種材料では、使用すべき接種材料の量についての多大な倹約およびコスト上のかなりの利益を実現しながら、より優れた効果が得られる。
【００７４】
結論として、天然小型発酵槽担体を使用することによって、土壌の負の要素に対するならびに培地の溶脱に対する微生物の保護が可能になり、それがなければ接種材料の微生物細胞の生産サイクルの連続性がないであろうと考えられる。そして意外なことに、出発接種材料を構成する接種された微生物細胞の数は、１／１００に削減され、これは、微生物菌株の培養の時間およびコスト面のかなりの倹約を表わす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００７５】
【特許文献１】国際公開第２００４／１１２４６２号
【特許文献２】国際公開第９６／３７４３３号
【特許文献３】仏国特許第２５９０９０４号明細書
【特許文献４】国際公開第００／５９９４９号
【特許文献５】仏国特許出願公開第２９４１５８９号明細書
【特許文献６】仏国特許第２５９３１９１号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第０２３６１５６号明細書
【特許文献８】欧州特許第０４４３０４０号明細書
【特許文献９】米国特許第５７８６１８８号明細書
【特許文献１０】仏国特許出願公開第２９９０９４３号明細書
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2016529887.tif 000011
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