(57)【要約】  本明細書に、TLR3アゴニスト等のアジュバントと共にアデノウイルスベクター(Adベクター)ワクチンを非侵襲的に投与するための方法及び組成物を提供する。これらの方法は、例えばワクチンへの免疫応答の増加、Adベクターワクチンの免疫原性の増加、抗原節約効果、及びワクチンへの効果的な防御免疫応答を伴う安全性の向上をもたらす。
2016529316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物においてアデノウイルスベクター(Adベクター)ワクチンの免疫原性を増加させる方法であって、
非侵襲的な方式で前記動物に前記Adベクターを投与する工程であって、前記ワクチンが、目的の遺伝子を含み発現する、工程と、
前記Adベクターワクチンを投与して24時間以内に、非侵襲的な方式で前記動物にAdベクターワクチンアジュバントを投与する工程であって、前記Adベクターワクチンアジュバントが、ポリICLC又はTLR3アゴニストである、工程と
を含み、
前記ポリICLC又はTLR3アゴニストの投与は、前記ポリICLC又はTLR3アゴニストなしに投与される前記Adベクターワクチンと比較して、前記Adベクターワクチンの免疫原性を増加させる、
方法。
【請求項２】
前記Adベクターワクチンアジュバントが、ポリICLCである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
免疫原性の増加が、前記ポリICLC又はTLR3アゴニストなしに投与される前記Adベクターワクチンと比較したときの抗原に対する中和抗体の増加によって測定される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記Adベクターワクチンの免疫原性の増加が、抗原の感染による負荷に対し少なくとも90%の防御をもたらす、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記Adベクターワクチンの免疫原性の増加が、抗原の感染による負荷に対し100%までの防御をもたらし、少なくとも約106ifuの前記Adベクターが前記動物に投与されている、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記Adベクターワクチンの免疫原性の増加が、抗原節約効果をもたらす、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記非侵襲的な方式が、皮膚投与、粘膜投与又は鼻腔内投与を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記動物が家畜動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記家畜動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル又はブタである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記Adベクターが、インフルエンザヘマグルチニン、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザノイラミニダーゼ、インフルエンザM2、インフルエンザM1、破傷風毒素C断片、炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、HBV表面抗原、HIV gp 120、HW gp 160、マラリアCSP、マラリアSSP、マラリアMSP、マラリアpfg、結核菌HSP又はそれらの変異体からなる群から選択される抗原をコードする遺伝子を発現する、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
Adベクターが、E1/E3欠損アデノウイルス血清型5(Ad5)である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
約5μgから約5mgのポリICLCが前記動物に投与されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
約1mgから約2mgのポリICLCが前記動物に投与されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
約1mgから約2mgのポリICLCが前記動物に投与されている、請求項5に記載の方法。
【請求項１６】
前記TLR3アゴニストが、ポリIC(12)U、ポリIC(12)G又はポリAUである、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
防御免疫応答を、それを必要とする動物において誘導するための非侵襲的な方法であって、
非侵襲的な方式で前記動物にアデノウイルスベクター(Adベクター)を投与する工程であって、前記ワクチンが、目的の抗原を含み発現する、工程と、
前記Adベクターワクチンを投与して24時間以内に、非侵襲的な方式で前記動物にAdベクターワクチンアジュバントを投与する工程であって、前記Adベクターワクチンアジュバントが、ポリICLC又はTLR3アゴニストである、工程と
を含み、
免疫応答の誘導は、抗原の感染による負荷に対する防御をもたらす、
方法。
【請求項１８】
動物においてアデノウイルスベクター(Adベクター)ワクチンに対する免疫応答速度を増加させるための方法であって、
非侵襲的な方式で前記動物に前記Adベクターワクチンを投与する工程であって、前記ワクチンが、目的の抗原を含み発現する、工程と、
前記Adベクターワクチンを投与して24時間以内に、非侵襲的な方式で前記動物にAdベクターワクチンアジュバントを投与する工程であって、前記Adベクターワクチンアジュバントが、ポリICLC又はTLR3アゴニストである、工程と
を含み、
前記ポリICLC又はTLR3アゴニストの投与は、前記ポリICLC又はTLR3アゴニストなしに投与されるAdベクター化ワクチンと比較して、前記Adベクターワクチンに対する免疫応答速度を増加させる、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び参照による組み入れ
本願は、2013年9月6日出願の米国仮特許出願第61/874,505の利益及び優先権を請求するものである。
【０００２】
本願に引用された文書に引用又は参照された全ての文書、及び本明細書に引用又は参照された全ての文書(「本明細書に引用された文書」)、及び本明細書に引用された文書に引用又は参照された全ての文書は、本明細書で言及した任意の製品のための、又は本明細書に参照により組み込まれている任意の文書内の、任意の製造業者の取扱説明書、記載、製品仕様書及び製品シートと共に、ここに参照により本明細書に組み入れられており、本発明の実施に採用されうる。更に具体的には、参照された全ての文書は、個々の文書のそれぞれが、参照により組み入れられることを具体的且つ別個に示されたのと同程度に参照により組み入れられている。
【０００３】
本開示は、異種遺伝子を含有し発現するアデノウイルスベクターの非侵襲的な投与、及びアジュバントの投与のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
組換えAdベクターがワクチン担体として利用されるのには、いくつかの注目すべき理由がある。これらには、1)Adベクターが、有糸分裂期と有糸分裂後の両方の細胞を、in situで形質導入することが可能であること(Shi 1999)、2)高力価のウイルス[1mL当たり1012pfu(プラーク形成単位)超]を含有するストックを調製することができ、高い感染多重度(MOI)で細胞をin situで形質導入することが可能になること、3)該ベクターが、ワクチンとしての長期の使用に基づき安定であること、4)ウイルスが、高レベルの導入遺伝子の発現を誘導することが可能であること(少なくとも初期バーストとして)、及び5)該ベクターを多用的に大いに組換え改変することできることが挙げられる。組換えAdベクターは、鼻腔内、皮膚上、気管内、腹腔内、静脈内、皮下、及び筋肉内の経路によって、ワクチン担体として利用されてきた。
【０００５】
Adベクター化経鼻ワクチンは、免疫応答を惹起する際に、DNAの注射又はAdの局所適用よりも有効であるように思われる(Shiら(2001)、J. Virol. 75: 11474〜11482)。最近報告された結果では、E1/E3を欠損したAd5ベクターの経鼻ワクチン担体としての効力は、Adに対する既存の免疫によって抑制されないことが示されている(Xiangら(1996)、Virology、219(1)、220〜7;Shiら、2001)。
【０００６】
Adに基づくワクチンは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIによって制限されるT細胞応答を誘発する能力の面で、天然の感染の効果を模倣し、更に、病原性へと逆戻りする可能性を排除するが、なぜなら、病原体のゲノムの小断片のみがベクターから発現されるためである。この「選択的発現」は、ワクチン接種されているものの感染していない動物を、感染した同等物と区別するという課題を解決し得、なぜなら、ベクターによってコードされていない病原体の特異的マーカーを使用して、その2つの事象を見分けることができるためである。中でも、病原体の増殖は、ベクター化ワクチンを生成するために必要ではないが、なぜなら、関連する抗原遺伝子を野外試料から直接的に増幅しクローニングすることができるためである(Rajakumarら、1990)。このことは、H5N1等、高病原性のAI株を生産するために特に重要であるが、なぜなら、この株は、増殖させるにはあまりに危険であり難しいためである(Woodら、2002)。
【０００７】
米国特許第4,349,538号(Hilton B LEVY)及び第7,439,349号(Andres M. Salazar)は、ポリICLCの調製及び臨床使用に関する。ポリリジンとカルボキシメチルセルロースとを用いて安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(Poly-ICLC)は、数年前にがんの短期臨床試験でインターフェロン誘導剤として高用量(300mcg/kg IVまで)で使用されていた、ポリリジンとカルボキシメチルセルロースとを用いて安定化されたポリイノシン酸とポリシチジル酸との合成複合体[二本鎖RNA(dsRNA)]である。これは、中等度の毒性を伴う混成の結果を生じたため、組換えインターフェロンが利用可能になるにつれてポリICLCの使用は概ね断念されている。しかし、低用量のポリICLC(10から50mcg/kg)は、更に広範に宿主防御の刺激を生じ、毒性がほぼなく又はなく臨床上の活性を増強した。そのように、それは、特異的な生物又は腫瘍を標的とする従来の抗生剤、抗ウイルス剤又は抗新生物剤(Salazar, Levyら、1996)(Ewel, Urbaら、1992)(Levy及びSalazar、1992)(Talmadge及びHartman、1985)(Maluish, Reidら、1985)とは対照的に、広範なスペクトルを有する宿主標的治療薬を代表するものである。
【０００８】
ポリICLC[HILTONOL(登録商標)]の相互に関連する少なくとも5つの生物作用があり、そのいずれもが(単独で又は組み合わせで)抗ウイルス活性に関与している可能性がある。これらは、1)そのインターフェロンの誘導、2)その広範な免疫増強効果、3)その特異的な酵素、特にオリゴアデニル酸シンターゼ(OAS)及びp68タンパク質キナーゼ(PKR)の活性化、4)その広範な遺伝子調節作用、及び5)そのTLR3を含む1つ又は複数のToll様受容体(TLR)の活性化である[Proc Natl Acad Sci U S A.、2008年2月19日、105(7)、2574〜2579]。
【０００９】
ポリICLCはまた、ワクチン増大効果又はアジュバント効果も有し、抗原に対する抗体及び細胞免疫応答を増加させる。例えば、サルで、ブタインフルエンザワクチン接種と併せて低用量のポリICLCを投与することによって、抗体産生が劇的に促進し増加する。これに関連するdsRNAとインターフェロンとの複雑な相互作用は、依然として完全には解明されていないが、抗ウイルス剤及び免疫増強物質としてのポリICLCのこの一見逆説的な二重の役割は、ウイルスの攻撃に対し迅速な防護機構を確立しつつそれと同時に長期免疫の確立を刺激することにおける機能と一致する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第4,349,538号
【特許文献２】米国特許第7,439,349号
【特許文献３】米国特許第6,706,693号
【特許文献４】米国特許第6,716,823号
【特許文献５】米国特許第6,348,450号
【特許文献６】米国特許出願公開第2003/0045492号
【特許文献７】米国特許出願公開第2004/0009936号
【特許文献８】米国特許出願公開第2005/0271689号
【特許文献９】米国特許出願公開第2007/0178115号
【特許文献１０】米国特許出願公開第2012/0276138号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Shiら(2001)、J. Virol. 75: 11474〜11482
【非特許文献２】Xiangら(1996)、Virology、219(1)、220〜7
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci U S A.、2008年2月19日、105(7)、2574〜2579
【非特許文献４】Fieldsら、Virology 2、第67章(第3版、Lippincott-Raven Publishers)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、ワクチンの免疫原性を増加させ、感染性抗原の負荷(challenge)に対する防御をもたらす、アデノウイルスベクター化ワクチン及びアジュバントの非侵襲的な投与が、未だに求められている。アジュバントの追加の利点は、抗原節約活性であろう。即ち、ワクチンのみを使用して達成することができる用量よりも低いワクチン用量で、防御的なワクチン力価を達成する能力である。
【００１３】
本出願内の任意の文書の引用又は特定は、そのような文書が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ある実施形態では、動物においてアデノウイルスベクター(Adベクター)ワクチンの免疫原性を増加させるための方法であって、本方法は、非侵襲的な方式で動物にAdベクターを投与する工程であって、ワクチンが目的の遺伝子を含み発現しうる、工程と、Adベクターワクチンの投与と同時に(共投与)又は24時間以内に、非侵襲的な方式で動物にAdベクターアジュバントを投与する工程であって、AdベクターワクチンアジュバントはポリICLC又はTLR3アゴニストである、工程とを含んでいてもよく、ポリICLC又はTLR3アゴニストの投与は、ポリICLC又はTLR3アゴニストなしに投与されるAdベクターワクチンと比較して、Adベクターワクチンの免疫原性を増加させる、方法が提供される。
【００１５】
更に別の実施形態では、防御免疫応答を、それを必要とする動物において誘導するための方法であって、本方法は、非侵襲的な方式で動物にアデノウイルスベクター(Adベクター)を投与する工程であって、ワクチンが目的の抗原を含み発現しうる、工程と、Adベクターワクチンの投与と同時に(共投与)又は24時間以内に、非侵襲的な方式で動物にAdベクターワクチンアジュバントを投与する工程であって、Adベクターワクチンアジュバントが、ポリICLC又はTLR3アゴニストである、工程とを含んでいてもよく、免疫応答の誘導は、抗原の感染による負荷に対する防御をもたらす、方法が提供される。
【００１６】
他の実施形態では、動物においてアデノウイルスベクター(Adベクター)ワクチンに対する免疫応答速度を増加させるための方法であって、本方法は、非侵襲的な方式で動物にAdベクターワクチンを投与する工程であって、ワクチンが、目的の抗原を含み発現しうる、工程と、Adベクターワクチンの投与と同時に(共投与)又は24時間以内に、非侵襲的な方式で動物にAdベクターワクチンアジュバントを投与する工程であって、Adベクターワクチンアジュバントが、ポリICLC又はTLR3アゴニストである、工程とを含んでいてもよく、ポリICLC又はTLR3アゴニストの投与は、ポリICLC又はTLR3アゴニストなしに投与されるAdベクター化ワクチンと比較してAdベクターワクチンに対する免疫応答速度を増加させる、方法が提供される。
【００１７】
したがって本発明の目的は、出願人が権利を保持し、その結果これまでに公知の任意の生成物、プロセス又は方法の否認を開示することとなるように、これまでに公知の任意の生成物、生成物を作製するプロセス、又は生成物を使用する方法を本発明の範囲内に包含しないことである。更に、出願人が権利を保持し、その結果これまでに記載された任意の生成物、生成物を作製するプロセス、又は生成物を使用する方法の否認を開示することとなるように、米国特許商標庁(合衆国法典第35巻第112条第1段落)又は欧州特許庁(欧州特許条約第83条)の記載要件及び実施可能要件を満たさない任意の生成物、プロセス、又は生成物の作製、又は生成物を使用する方法を、本発明の範囲に包含することを本発明は意図しないことが留意される。
【００１８】
本開示並びに具体的には特許請求の範囲及び/又は文章では、「含む(comprises)」、「含まれる(comprised)」、「含む(comprising)」等の用語は、米国特許法にてそれらが帰する意味を有することができ、例えば、それらは、「含む(includes)」、「含まれる(included)」、「含む(including)」等を意味することができ、「〜から実質的になる(consisting essentially of)」や「〜から実質的になる(consists essentially of)」等の用語は、米国特許法にてそれらが帰する意味を有し、例えば、それらは、明示的には引用されない要素を許容するが、先行技術に見出されるか又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を及ぼす要素を除外することを留意されたい。
【００１９】
これらの及び他の実施形態は、開示されているか、又は以下の詳細な記載から明らかであり、以下の詳細な記載によって包含される。
【００２０】
添付されている図面は、本明細書内に組み込まれてその一部を構成しており、本願の開示の1つ又は複数の実施形態を例示すると共に、詳細な記載及び実施例の項と併せて、本開示の原理及び実現例を説明する助けとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】負荷感染の28日前に単回で投与したワクチン接種したマウスの群のカプラン-マイヤー生存曲線を示す図である。108個用量のAd-VN.H5ワクチンは、ポリICLCの濃度に関わらず(10μL容量中5、15又は50μg)、負荷感染に対し100%の防御をもたらした(図1A)。また、15μgのポリICLCと組み合わせた4通りの用量(1.2×106、1.2×107、1.2×108又は3.5×108ifu/50μL)のAd-VN.H5の全てが、負荷感染に対し100%の防御をもたらした(図1B)。AdEを受けていた群はまた、いくらか死亡が観察されたものの、著しい防御を示した(図1A及び図1B)。
【図２】負荷感染の28日前にワクチン接種したマウスの群の体重変化の平均を示す図である。108個のAd-VN.H5ワクチンを受けていた全てのマウスが、著しい体重低下から防御された。しかし、最低用量(10μL容量中5μg)のポリICLCを受けていた群が、最も優れた防御を示した(図2A)。106個用量のAd-VN.H5を15μg用量のポリICLCと組み合わせて用いてワクチン接種されたマウスもまた、体重低下に対し著しい防御を示した。また、107個から108個用量のワクチンを受けていた群は、プラセボと比較して体重変化の平均に著しい差を示した(図2B)。
【図３】ワクチン接種に続く14日目での血清への血球凝集阻害(HAI)アッセイの結果を示す図である。ワクチン接種の24時間後にアジュバントなしで108個用量のAd-VN.H5を受けていた群及びポリICLCと組み合わせた108個用量のAd-VN.H5を受けていた群は、ワクチン接種後14日目に、プラセボを超える著しい増加を示した(図3A)。ワクチン用量の力価測定の結果では、最高用量(108.5個)のAd-VN.H5を受けていた群のみが、プラセボと比較して著しい差を示したことが示されている(図3B)。
【図４】ワクチン接種に続く28日目での血清への血球凝集阻害(HAI)アッセイの結果を示す図である。ワクチン接種後28日目に、108個用量のAd-VN.H5を受けていた全ての群が、プラセボを超える著しい増加を示した(図4A)。しかし、用量の力価測定では、2通りの最高用量のAd-VN.H5を受けていた群のみが、著しいHAI力価の上昇を示した(図4B)。
【図５】ワクチン接種に続く14日目の肺洗浄物中のsIgAのレベルを示す図である。ワクチン接種後14日目に、50μgのポリICLCを含有するAd-VN.H5を受けていた群を除いて、108個のAd-VN.H5を受けていた全ての群が、プラセボを超える著しい増加を示した(図5A)。15μg用量のポリICLCと組み合わせて108個及び108.5個用量のワクチンを受けていた群のみが、著しいIgAの増加を示した(図5B)。また、108.5個のAd-VN.H5ワクチンによって誘導されたIgAのレベルは、15μgのポリICLCと組み合わせた際に、ワクチン接種後14日目に他の全てのワクチン組成よりも著しく高かった。
【図６】ワクチン接種に続く28日目の肺洗浄物中のsIgAのレベルを示す図である。ワクチン接種後28日目に、108個用量のAd-VN.H5を受けていた全ての群が、プラセボを超える著しい増加を示した(図6A)。しかし、15μg用量のポリICLCと組み合わせて108個及び108.5個のAd-VN.H5ワクチンを受けていた群のみが、著しい増加を示した(図6B)。また、108個のAd-VN.H5ワクチンを、ワクチン接種の24時間後に15μgのポリICLCを投与することと組み合わせることによって誘導されたIgAのレベルは、ワクチン接種後28日目に他の全てのワクチン組成よりも著しく高かった。
【図７】ワクチン接種に続く28日目に、肺洗浄物から単離されて培養されたIFN-γ産生細胞数を示す図である。ワクチン接種の24時間後でのポリICLCと組み合わせて108個用量のAd-VN.H5を受けていた全ての群のみが、ワクチン接種後14日目に、IFN-γ産生細胞数に著しい増加を示した(図7A)。各種の用量のAd-VN.H5を処理された群には、IFN-γ産生細胞の著しい差は観察されなかった(図7B)。
【図８】ワクチン接種に続く28日目に、肺洗浄物から単離されて培養されたIFN-γ産生細胞数を示す図である。ポリICLCと組み合わせて108個のAd-VN.H5を用いてワクチン接種された全ての群が、ワクチン接種後28日目に、IFN-γ産生細胞数に著しい増加を示した(図8A)。しかし、15μg用量のポリICLCと組み合わせて108個及び108.5個用量のワクチンを受けていた群のみが、著しい増加を示した(図8B)。
【図９】ワクチン接種に続く14日目に、肺洗浄物から単離されて培養されたIL-4産生細胞数を示す図である。ワクチン接種後14日目に、15μg用量のポリICLCと組み合わせて108個のAd-VN.H5を受けていた群のみが、IL-4産生細胞数に著しい増加を示した。
【図１０】ワクチン接種に続く28日目に、肺洗浄物から単離されて培養されたIL-4産生細胞数を示す図である。ワクチン接種後28日目に、IL-4産生細胞数の増加が、全ての群に観察された。そのため、ワクチン群間に著しい差は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、アデノウイルスベクター化(Adベクター化)ワクチンと、アジュバントとして二本鎖(ds)RNAポリヌクレオチド又はTLR3アゴニスト(本明細書では「Adベクターワクチンアジュバント」とよぶ)との非侵襲的な投与に続いて、病原体に対する防御免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための方法を提供する。驚くべきことに、ポリICLC[HILTONOL(登録商標)]等、抗ウイルス活性が既知である合成dsRNAポリヌクレオチドをアジュバントとして使用して、ワクチンと同じ経路で、且つワクチン接種と同時(共投与)又はワクチン接種から24時間以内に投与することによって、Adベクター化ワクチンの免疫原性が著しく増加した。このワクチンの免疫原性の改善によって、H5N1インフルエンザウイルス等の生きたウイルスによる負荷感染に続いて生存率の改善がもたらされた。
【００２３】
ある実施形態では、負荷感染に対する100%の防御が観察された。図1Bを参照されたい。本明細書で使用されるような106個用量でのAdベクター化ワクチンは、本願のアジュバントなしで使用される際に、典型的には、生きたウイルスを用いた負荷感染に続いて防御性がない。しかし、Adベクター化ワクチンのアジュバントを共投与(0〜24時間)することによって、少なくとも90%の防御がもたらされ、ある実施形態では、感染性の負荷に対し100%の防御がもたらされる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、Adベクター化ワクチンは、インフルエンザ若しくは炭疽菌抗原やその断片等の目的の遺伝子を含み発現してもよい。本開示は、必要とされる用量を低下させることを含めて、病原体に対する防御をもたらすためにAdベクター化ワクチンを使用することの有効性の著しい改善を提供し、ここでは、ワクチンは非侵襲的に投与される。
【００２５】
したがって、一実施形態では、本明細書に提供されるのは、非侵襲的に投与された際に、Adベクター化ワクチンの免疫原性を増加させるための方法であり、Adベクター化ワクチンのアジュバントは、同時に(共投与)又は24時間以内に投与され、ポリICLC又はTLR3アゴニスト(アジュバントとして)の投与によって、ポリICLC又はTLR3アゴニストなしに投与されるAdベクターワクチンと比較して、Adベクターワクチンの免疫原性が増加する。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書に提供されるのは、防御免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための方法であって、本方法では、Adベクター化ワクチンは、非侵襲的に投与され、Adベクター化ワクチンのアジュバントは、ワクチン投与と同時に(共投与)又はワクチン投与から24時間以内に投与され、免疫応答の誘導によって、抗原の感染性の負荷に対する防御をもたらす。
【００２７】
更に別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、動物においてアデノウイルスベクター(Adベクター)ワクチンに対する免疫応答速度を増加させるための方法であり、本方法では、Adベクター化ワクチンは、非侵襲的に投与され、Adベクター化ワクチンのアジュバントは、ワクチン投与と同時に(共投与)又はワクチン投与から24時間以内に投与され、ポリICLC又はTLR3アゴニスト(アジュバントとして)の投与によって、ポリICLC又はTLR3アゴニストなしのAdベクター化ワクチンの投与と比較して、Adベクターワクチンに対する免疫応答速度が増加する。本明細書で使用されるとき、速度とは、ワクチンの投与と免疫応答の惹起との間の時間を指し、時間が短いほど、速度は速い。
【００２８】
実施例1は、マウス内で、高病原性のA/ベトナム/1203/04(H5N1)トリインフルエンザウイルスを用いた負荷感染に対して、Ad5ベクター化インフルエンザウイルスHAワクチン(Ad5-VN1203/04.H5)の免疫原性を増加させるための、合成のdsRNAポリICLC[Hiltonol(登録商標)]のアジュバントとしての使用を提供している。各種の用量のポリICLCを投与する30分前又は24時間前でのAdVN.H5ワクチンの投与を比較すると、108個用量のAdVN.H5を受けていた全ての処理群が、負荷感染に対し、ポリICLCの濃度に関わらず100%の防御をもたらした。また、15μgのポリICLCを投与する30分前に4通りの用量(1.2×106、1.2×107、1.2×108又は3.5×108ifu/50μL)でAdVN.H5ワクチンを投与した全ての群が、負荷感染に対して100%の防御をもたらした。AdE(インフルエンザ抗原のない)はまた、いくらかの死亡率が観察されたものの、著しい防御を示した。空AdEベクターによって付与された防御は驚くべきことであり、この特異的なAd5ベクターに1つを超える作用のメカニズムがあることを示唆する。
【００２９】
108個用量のAdVN.H5を受けていた全ての処理群が、ポリICLCの濃度に関わらず、マウスを著しい体重低下から防いだ。しかし、5μg用量のポリICLCが、最も優れた防御を示した。4通りの用量のAdVN.H5ワクチンを比較すると、15μg用量のポリICLCと組み合わせた106個用量のAdVN.H5が、体重低下に対し最も優れた防御を示した。そのため、生存率及び体重低下のデータは、108個用量のAdVN.H5が、ポリICLCの濃度に関わらず防御に働くことを示す。しかし、アジュバントと組み合わせた場合には、低用量のワクチンでさえも防御的でありうる。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「1つの(a)」又は「1つの(an)」という用語は、特許文書によくあるように、「少なくとも1つ」又は「1つ又は複数の」の他の任意の実例又は使用とは独立して、1つ又は1つ超を含めるために使用される。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「又は」という用語は、別段に指示がない限り、非排他的なものを指すように使用されるか、又は「A又はB」は「AであるがBではない」、「BであるがAではない」及び「A且つB」を含むように使用される。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、述べられた量におよそ(approximately)、ほとんど(nearly)、ほぼ(almost)、若しくは同等(equal)に極めて近いか、又は同等である量を指すために使用され、例えば、述べられた量プラス/マイナス約5%、約4%、約3%、約2%又は約1%である。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「アジュバント」という用語は、ワクチンから供給された抗原に対する免疫応答を増強する等、別の作因の効果を改変する薬学的又は免疫学的な作因を指す。
【００３４】
本明細書で互換的に使用されるような「Adベクターワクチン」又は「Adベクター化ワクチン」という用語は、抗原をコードする目的遺伝子を含みうるアデノウイルスベクターを指す。アデノウイルスは、任意のアデノウイルスであってよく、ヒトアデノウイルス、ウシアデノウイルス、イヌアデノウイルス、非ヒト霊長類アデノウイルス、ニワトリアデノウイルスやブタ(porcine)若しくはブタ(swine)アデノウイルス等がありうるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「Adベクターワクチンアジュバント」という用語は、共投与、又はAdベクター化ワクチン接種から24時間以内に投与された際に、Adベクターワクチンの免疫応答を増強するためにアジュバントとして作用する、二本鎖(ds)RNAポリヌクレオチド又はTLR3アゴニストを指す。ある実施形態では、Adベクターワクチンアジュバントは、ポリ-IC(ポリイノシン酸-ポリシチジル酸)、ポリ-ICLC、ポリ-IC(12)U又はポリ-IC(12)Gである。他の実施形態では、Adベクターワクチンアジュバントは、核酸の一方若しくは両方の鎖に塩基改変、又は核酸骨格、糖部分若しくは他の部位の改変を有するか、又はリポソーム若しくはポリマー内に組み入れられるdsRNA分子であり、該分子は、二本鎖RNAパターン認識受容体(PRR)との相互作用を介して免疫細胞に結合する及び/又は免疫細胞を活性化し、PRRとしては、Toll様受容体3(TLR3)が挙げられるが、これに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「ヒトアデノウイルス」という用語は、マストアデノウイルス(Mastadenovirus)属を含む、アデノウイルス(Adenoviridae)科の全てのヒトアデノウイルスを包含することを意図する。これまでに、51を超えるアデノウイルスのヒト血清型が同定されている[例えばFieldsら、Virology 2、第67章(第3版、Lippincott-Raven Publishers)を参照]。アデノウイルスは、サブグループA、B、C、D、E又はFに属しうる。ヒトアデノウイルスは、血清型1(Ad 1)、血清型2(Ad2)、血清型3(Ad3)、血清型4(Ad4)、血清型5(Ad5)、血清型6(Ad6)、血清型7(Ad7)、血清型8(Ad8)、血清型9(Ad9)、血清型10(Ad10)、血清型11(Ad11)、血清型12(Ad12)、血清型13(Ad13)、血清型14(Ad14)、血清型15(Ad15)、血清型16(Ad16)、血清型17(Ad17)、血清型18(Ad18)、血清型19(Ad19)、血清型19a(Ad19a)、血清型19p(Ad19p)、血清型20(Ad20)、血清型21(Ad21)、血清型22(Ad22)、血清型23(Ad23)、血清型24(Ad24)、血清型25(Ad25)、血清型26(Ad26)、血清型27(Ad27)、血清型28(Ad28)、血清型29(Ad29)、血清型30(Ad30)、血清型31(Ad31)、血清型32(Ad32)、血清型33(Ad33)、血清型34(Ad34)、血清型35(Ad35)、血清型36(Ad36)、血清型37(Ad37)、血清型38(Ad38)、血清型39(Ad39)、血清型40(Ad40)、血清型41(Ad41)、血清型42(Ad42)、血清型43(Ad43)、血清型44(Ad44)、血清型45(Ad45)、血清型46(Ad46)、血清型47(Ad47)、血清型48(Ad48)、血清型49(Ad49)、血清型50(Ad50)、血清型51(Ad51)、又はそれらの組合せでありうるが、これらの例に限定されない。ある実施形態では、アデノウイルスは、血清型5(Ad5)である。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「非侵襲的な投与」という用語は、局所適用を介した、及び/又は粘膜を介した、及び/又は皮膚を介した、及び/又は鼻腔内投与を介した、Adベクターワクチンの投与を指す。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「TLR3アゴニスト」という用語は、樹状細胞及びB細胞でTRIF依存的シグナリング経路を活性化する、合成のToll様受容体3(TLR3)リガンドを指す。TLR3は、ウイルスの二本鎖RNA(dsRNA)及びその合成類縁体であるポリイノシン酸-ポリシチジル酸[ポリ(I:C)]を認識する。TLR3アゴニストとしては、ポリIC、ポリICLC、ポリIC(12)U及びポリAUが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本願の開示は、動物での非侵襲的な遺伝子免疫又は遺伝子治療を対象とし、該免疫又は治療は、動物を非侵襲的な方式(例えば、動物の皮膚/粘膜/鼻腔内域)でAdベクターワクチン及びAdベクターワクチンアジュバント(ポリICLC及び/又はTLR3アゴニスト)に接触させる工程を含んでいてもよく、この工程では、ワクチンとアジュバントとを合わせた量が、動物に防御免疫応答を誘導するのに有効な量である。
【００４０】
ある実施形態では、防御免疫応答を誘導するためのAdベクターワクチンの投与量は、本願のAdベクター化ワクチンのアジュバントなしに使用されるAdベクター化ワクチンと比較して、更に低い。ポリICLC又はTLR3アゴニストを使用する際のAdベクターワクチンの投与量は、約106から約1012ifu又はpfuの範囲であってもよい。一態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約106ifu又はpfuである。別の態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約107ifu又はpfuである。更に別の態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約108ifu又はpfuである。別の態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約109ifu又はpfuである。別の態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約1010ifu又はpfuである。更に別の態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約1011ifu又はpfuである。別の態様では、動物に投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約1012ifu又はpfuである。
【００４１】
当業者は、マウス(又は前臨床試験で使用される任意の動物)で有効な用量が、ヒト等の更に大きな動物に拡大しうることを理解している。このようにして、相対成長スケーリング(生物学的スケーリングともよぶ)を介して、ヒトでの用量を前臨床試験動物での用量から外挿して、その動物の体重又は体表面積に基づいて同等の用量を得てもよい。ヒトでのAdベクターワクチンの用量は、約109から約1012ifu又はpfuであってもよい。一態様では、ヒトに投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約109ifu又はpfuである。一態様では、ヒトに投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約1010ifu又はpfuである。別の態様では、ヒトに投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約1011ifu又はpfuである。更に別の態様では、ヒトに投与されるAdベクターワクチンの用量は、約、又は少なくとも約1012ifu又はpfuである。
【００４２】
ある実施形態では、Adベクターワクチンの免疫原性は、Adベクター化ワクチンアジュバントなしに使用されるAdベクターワクチンと比較して、増加する。防御的な免疫原性は、例えば、中和抗体の力価を比較することによって測定されてもよく、その測定では、中和抗体の力価の上昇は、ワクチンの免疫原性の増加を表す。免疫原性の増加はまた、抗原負荷に続いて、防御又は生存率によって測定されうる。一態様では、Adベクターワクチンとアジュバントとの組合せによって、負荷に対し少なくとも約90%の防御がもたらされる。別の態様では、Adベクターワクチンとアジュバントとの組合せによって、負荷に対し少なくとも約95%の防御がもたらされる。ある実施形態では、Adベクターワクチンとアジュバントとの組合せによって、負荷に対し約100%の防御がもたらされる。
【００４３】
他のある実施形態では、Adベクターワクチンの安全性は、Adベクター化ワクチンアジュバントなしに使用されるAdベクターワクチンと比較して改善される。ワクチンの安全性の改善は、例えば、体重低下によって測定されてもよく、その測定では、体重低下の改善(より少ない体重が、ワクチン及びアジュバントの投与に続いて失われる)は、ワクチンの安全性の改善を表す。
【００４４】
ある実施形態では、Adベクターワクチンの投与に対する応答時の粘膜免疫が、Adベクター化ワクチンのアジュバントなしに使用されたAdベクター化ワクチンと比較して上昇する。粘膜免疫は、例えば分泌IgAの力価を比較することによって測定され、この測定では、sIgAの増加は、粘膜免疫の上昇を表す。
【００４５】
他のある実施形態では、Adベクターワクチンの投与に続く免疫応答速度は、本願のAdベクター化ワクチンのアジュバントなしに使用されたAdベクター化ワクチンと比較して増加する。Adベクター化ワクチンの投与に続く免疫応答時間は、例えば、ワクチン接種後に何日間にもわたってIFNガンマ分泌細胞数を比較することによって、測定されうるが、その測定では、より早期の時点での免疫細胞の増加は、Adベクターワクチンの投与に対する免疫応答速度の増加を表す。
【００４６】
Adベクターワクチンアジュバント(ポリICLC又はTLR3アゴニスト)は、Adベクターワクチンと共投与(時間0)されてもよいし、実行可能であればそれ以降短時間でなされてもよいし、Adベクターワクチンの投与から24時間後以内のその時点を含めあらゆる時間であってもよい。ある実施形態では、Adベクターワクチンアジュバントは、Adベクターワクチンの投与に続いて5分後、10分後、15分後、20分後、25分後、30分後、45分後、1時間後、90分後、2時間後、2.5時間後、3時間後、3.5時間後、4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、12時間後、13時間後、14時間後、15時間後、16時間後、17時間後、18時間後、19時間後、20時間後、21時間後、22時間後、23時間後、24時間後、又はそれらの任意の組合せに投与される。アジュバントの用量は、Adベクターワクチンの投与に続く24時間の間に1回、又は複数回投与されうる。ある実施形態では、Adベクターワクチンは、Adベクターワクチンアジュバントと共投与される。一態様では、Adベクターワクチンは、ポリICLC、ポリIC(12)U又はTLR3アゴニストをAdベクターワクチンアジュバントとして共投与される。
【００４７】
アジュバント用量は、Adベクターワクチンと共に又はそれに続いて投与された際に、アジュバントなしのAdベクターワクチンの投与と比較して、防御免疫応答の増強を誘導する量である。ある実施形態では、アジュバントの用量としては、約5μgから約50μgが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、アジュバントの用量は、約5μgから約25μgである。別の態様では、アジュバントの用量は、約5μgから約15μgである。一態様では、アジュバントの用量は、約5μgという低用量である。別の態様では、アジュバントの用量は、約25μgから約50μgという高用量である。更に別の態様では、アジュバントの用量は、約15μgという中用量である。当該用量は、動物の体重によって、又は動物の表面積によって、動物へ投与される最終用量として表されうる。
【００４８】
当業者は、非臨床動物に使用される用量を、体重又は体表面積に基づく相対成長スケーリングによって、ヒト等の大型動物に拡大しうることを理解している。この場合、ヒトに用いるアジュバントの用量は、約1mgから約5mgでありうる。一態様では、ヒトに投与されるアジュバントの量は、約1mg、約1.5mg、約2mg、約2.5mg、約3mg、約3.5mg、約4mg、約4.5mg又は約5mgである。各患者に用いる適切な用量は、正確に計算され、Adベクターワクチンと共に投与されうる。
【００４９】
当業者に公知であり、非侵襲的な適用のために調製された任意のアデノウイルスベクター(Adベクター)が、免疫原性の抗原を含み発現することができ、本開示の方法を用いて使用されうる。そのようなAdベクターとしては、米国特許第6,706,693号、第6,716,823号、第6,348,450号、又は米国特許出願公開第2003/0045492号、第2004/0009936号、第2005/0271689号、第2007/0178115号、第2012/0276138号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられている)にある任意のAdベクターが挙げられる。
【００５０】
ある実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、複製しない。ある実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、E1欠損、E3欠損、及び/若しくはE4欠損のアデノウイルスベクター、又は全てのウイルス遺伝子が欠失している「腑抜けの」アデノウイルスベクターを含みうる。E1変異は、ベクターの安全性の幅を上げるが、なぜなら、E1欠損アデノウイルス変異体は、非許容細胞では、複製に不適であるためである。E3変異は、アデノウイルスがMHCクラスI分子を下方制御するための機構を破綻させることによって、抗原の免疫原性を増強する。E4変異は、後期の遺伝子発現を抑制することによって、アデノウルスベクターの免疫原性を低減させ、それゆえ、同じベクターを利用して再ワクチン接種を繰り返すことを可能にしうる。「腑抜けの」アデノウイルスベクターの複製は、ヘルパーウイルスと、E1a及びCreの両方を発現する特殊なヒト293細胞株という、天然の環境には存在しない状況を要する。該ベクターは、全てのウイルス遺伝子を奪われており、それゆえ、ワクチン担体としての該ベクターは、非免疫原性であり、再ワクチン接種のために複数回接種されうる。「腑抜けの」アデノウイルスベクターはまた、導入遺伝子を収めるために、36kbの空間を含有し、それゆえ、多数の抗原遺伝子を細胞内に共送達することを可能にしている。RGDモチーフ等、特異的な配列モチーフは、アデノウイルスベクターのH-Iループ内に挿入されて、感染性を増強しうる。アデノウイルス組換え体は、特異的な導入遺伝子又は導入遺伝子の断片を、下記に記載されるもの等、任意のアデノウイルスベクター内にクローニングすることによって、構築されうる。該アデノウイルス組換えベクターは、免疫作因として使用するために、非侵襲的な方式で脊椎動物の上皮細胞に形質導入するために使用される。
【００５１】
他の実施形態では、アデノウイルスベクターの組合せが提供される。例えば、空のAdベクター(E1/E3を欠失しインサートがない)が、それを必要とする患者に、別のベクターと共に連続的に又は同時に投与されてもよく、当該別のベクターは、例えば、E1/E3を欠失し、本明細書に記載したような外来性及び/又は異種の遺伝子等のインサートがありうるAdベクター等である。理論に縛られる訳ではないが、空のAdベクター(E1/E3を欠失しインサートがない)は、最初に迅速な免疫応答を惹起しうるが、その応答では、抗原若しくはエピトープ等、外来性及び/又は異種の遺伝子を発現するベクターが、追加の防御応答を惹起しうる。
【００５２】
ある実施形態では、Adベクターの非侵襲的な投与としては、皮膚への局所適用、並びに/又は鼻腔内及び/若しくは粘膜及び/若しくは舌下及び/若しくは頬側及び/若しくは経口及び/若しくは口腔の投与が挙げられるが、これらに限定されない。Adベクターワクチンを適用するための剤形としては、液体、軟膏、粉末及び噴霧が挙げられる。活性の構成成分は、滅菌条件下で、生理的に許容されうる担体と、必要に応じて任意の保存剤、緩衝剤、噴射剤、又は吸収増強剤と、混和させてもよい。
【００５３】
経鼻又は経呼吸器(粘膜)の投与が望ましい場合には、組成物を、加圧スプレーディスペンサー、ポンプディスペンサー、複数回用量ディスペンサー、点滴型ディスペンサー又はエアロゾルディスペンサーによる形態としてもよく、それによって小出しにしてもよい。そのようなディスペンサーはまた、組成物を口又は口腔(例えば頬側若しくは舌下)の粘膜に送達するために利用してもよい。エアロゾルは、通常は、炭化水素による圧力下にある。ポンプディスペンサーは、好ましくは、定用量、又は具体的な粒径を有する用量を小出しにしうる。
【００５４】
アジュバントを含む投与の全ての場合に、非侵襲的な送達が望ましい一方で、本方法は、侵襲的な送達と併用されてもよい。そして、そのような方法は、概して、プライム・ブーストレジメンの一部として使用されうる。一例として、本方法は、プライム・ブーストレジメンの一部として使用されうるが、そのレジメンでは、非侵襲的な本発明の方法は、同じ若しくは異なる免疫学的成分若しくは治療成分の別の非侵襲的若しくは侵襲的な投与等、別の投与の前に、又は後に、又は同時に投与されるが、例えば、非侵襲的な投与の前、その間、又は後に、同じ又は類似の病原体用の各種のワクチン又は免疫学的組成物を注射することによる投与があり、そのような病原体としては、例えば、その目的の抗原又はエピトープが非侵襲的な投与にてベクターによって発現される、同じ又は類似の病原体に用いる全体又はサブユニットのワクチン又は免疫学的組成物等がある。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、免疫学的に有効な量とは、対象に投与された際に目的の遺伝子産物に対する免疫応答を生成する、目的の遺伝子をコードするAdベクター(Adベクターワクチン)の量又は濃度を指す。本願の開示のAdベクターワクチンは、動物に単独で、又は免疫学的組成物の一部としてのどちらかで、投与されうる。
【００５６】
免疫原性組成物は、それらを更に魅力的にするために、特にそれらが経口で(又は頬側で又は舌下で)投与される場合に、薬学的に許容されうる風味及び/又は色を含有していてもよい。そして、そのような組成物は、頬側又は舌下で吸収されるために、口中で溶解するか又は噛まれて液体を放出する、錠剤又はカプセルの形態[ニトログリセリンやニフェジメン(nifedimen)等、狭心症に用いる経口、舌下又は頬側の医薬に似た]であってもよい。粘性の組成物は、ゲル、ローション、軟膏、クリーム等(例えば、局所及び/又は粘膜及び/又は経鼻及び/又は経口及び/又は口腔及び/又は舌下及び/又は頬側の投与)の形態であってもよく、10000cpsにまで更に粘度のある組成物が採用されうるものの、粘度が約2500から6500cpsになるように、典型的には充分量の増粘剤を含有することになる。
【００５７】
液体製剤は、通常はゲル、粘性のある他の組成物、及び固体組成物よりも、調製が容易である。更に、液体組成物は、動物、小児、具体的には幼い小児、及びピル、錠剤、カプセル等を嚥下するのが難しいことがあるか又は複数回用量の状況にあるその他に、特に経口又は頬側又は経舌で(perlinually)投与するのに、いくぶん更に便利である。粘性のある組成物は、一方で、胃又は鼻の粘膜の内壁等、粘膜との更に長期の接触期間を提供するために、又は経舌又は頬側又は経口で空洞吸収させるために、適切な粘度の範囲内で製剤化されてもよい。
【００５８】
Adベクターが、動物で、目的の異種又は外来性の遺伝子産物と目的の同種の遺伝子産物との両方を発現しうることから、該ベクターは、宿主に適合していてもよいし、宿主又は動物について採用することに興味のあるベクターであってもよい。この場合に、獣医学上の用途では、その動物に関連のあるベクターを使用することが有用となり得、例えば、イヌに、イヌアデノウイルスを使用してもよいし、又は、更に一般的には、ベクターは、本方法が実施される宿主又は動物の弱毒化又は不活化された天然の病原体であってもよい。当業者は、本開示にある情報及び当技術分野の知識を用いて、試行錯誤なく、宿主又は動物にベクターを適合させうる。
【００５９】
それゆえ、本明細書に記載されているヒトワクチンに加えて、本開示の方法を、動物資源を免疫するために使用してもよい。動物という用語は、ヒトを含むあらゆる動物を意味する。動物の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、トリ及びブタ等が挙げられる。全ての脊椎動物の免疫系は、類似して動作することから、記載されている適用は、あらゆる脊椎動物系で実行されうる。
【００６０】
ある実施形態では、動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類や魚類等の脊椎動物であり、ヒト、又はウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、若しくはブタ、若しくはウマ、若しくはシチメンチョウ、アヒルやニワトリ等の家禽等、伴侶動物、若しくは飼養動物、若しくは食料生産動物、若しくは食餌生産動物、若しくは家畜動物、若しくは遊戯動物、若しくは競走動物、若しくはスポーツ動物である。具体的な実施形態では、脊椎動物はヒトである。別の具体的な実施形態では、脊椎動物は鳥類である。
【００６１】
ある実施形態では、Adベクターは、インフルエンザ抗原、呼吸器多核体ウイルス(RSV)抗原、HIV抗原、SIV抗原、HPV抗原、HCV抗原、HBV抗原、CMV抗原又はスタフィロコッカス(Saphylococcus)抗原をコードする遺伝子を発現する。インフルエンザは、ブタインフルエンザ、季節性インフルエンザ、トリインフルエンザ、H1N1インフルエンザ又はH5N1インフルエンザでありうる。
【００６２】
他の実施形態では、Adベクターは、インフルエンザヘマグルチニン、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザM2、インフルエンザノイラミニダーゼ、破傷風毒素C断片、炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、HBV表面抗原、HIV gp120、HW gp160、マラリアCSP、マラリアSSP、マラリアMSP、マラリアpfg、結核菌(mycobacterium tuberculosis)HSP、又はそれらの変異体をコードする遺伝子を発現する。
【００６３】
ある実施形態では、目的の抗原をコードする遺伝子を動物細胞で発現させる遺伝子ベクターによって、動物での防御免疫応答が誘導される。他のある実施形態では、該動物細胞は上皮細胞である。別の実施形態では、Adベクターは、予防処置ワクチン又は治療ワクチンとして使用される。別の実施形態では、遺伝子ベクターは、目的の抗原を動物細胞で発現することが可能な遺伝子ベクターを含んでいてもよい。
【００６４】
ある実施形態では、Adベクターは、共刺激遺伝子及びサイトカイン遺伝子からなる群から選択される遺伝子を更に含んでいてもよい。この場合には、該遺伝子は、GM-CSF遺伝子、B7-1遺伝子、B7-2遺伝子、インターロイキン-2遺伝子、インターロイキン-12遺伝子及びインターフェロン遺伝子からなる群から選択される。
【００６５】
本発明の組換えAdベクター及び方法は、様々な呼吸器の病原体の治療又は予防で使用されてもよい。そのような病原体としては、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS-CoV)、ヒトライノウイルス(HRV)、及び呼吸器多核体ウイルス(RSV)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
また、本願の方法は、1つ又は複数のインフルエンザ株及び/又は雑種に対する免疫原性応答を刺激するか又は変調させる多価のワクチン又は免疫原性組成物を提供するように、別々の組換えベクターで又は1つの組換えベクターにまとめてのどちらかで送達される、1つを超える治療リガンド、免疫原又は抗原を、本発明のAdベクター及び方法で使用することを内包する。更に、本願の方法は、別々の組換えベクターで又は1つの組換えベクターにまとめてのどちらかで送達される、1つを超える病原体由来の治療リガンド、免疫原又は抗原を、本発明のベクター及び方法で使用することを包含する。
【００６７】
本発明の方法は、予防処置ワクチン接種として疾患を予防するために、又は治療ワクチン接種として疾患を治療するために、適切に適用されうる。
【００６８】
本開示は、防御免疫応答の増強を、それを必要とする動物において誘導するために、アジュバントとしてポリヌクレオチド又はTLR3アゴニスト(Adベクターワクチンアジュバント)をAdベクターワクチンと共に使用することに関する。この場合には、ポリヌクレオチドは、リボ核酸(RNA)のヌクレオチドの分子鎖である。それらは、細胞由来であってもウイルス由来であってもよいし、合成されてもよい。個体/対象/患者/動物へのAdベクターワクチンアジュバントの投与は、少なくとも4つの重要な機能を有しているものと思われる。第1に、免疫刺激効果を有していること(例えば、抗原に対する中和抗体の力価を高めること)、第2に、粘膜免疫を高める(例えば、分泌IgAを増加させる)こと、第3に、インターフェロンガンマ産生細胞(自然免疫)を増加させ、インターフェロンは、ウイルス感染への阻害効果を有することが知られていること、第4に、体重低下の低減によって測定されるようにAdベクターワクチンの安全性を高めることである。
【００６９】
インターフェロンは、サイトカインとして知られる糖タンパク質の大きなクラスに属する。それらは、ウイルス、寄生生物や腫瘍細胞等、外来の作因による負荷への応答の際に、免疫系の細胞によって産生される天然のタンパク質である。インターフェロンは、ウイルス感染の主たる指標である二本鎖RNAの存在に応答する際に、幅広い種々の細胞によって産生される。インターフェロンは、宿主細胞内でウイルスの複製を阻害し、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージを活性化し、リンパ球に対する抗原提示を増加させ、ウイルス感染に対する宿主細胞の抵抗性を誘導することによって、免疫応答を支援する。抗原が、適合するT細胞又はB細胞に提示されている際には、それらの細胞は増殖して、感染の作因を攻撃し分解する。抗原(Adベクターワクチンを介して)の24時間以内にAdベクターワクチンアジュバントを投与することによって、インターフェロンの産生の誘導に加えて、免疫応答が高まる。
【００７０】
ある実施形態では、任意の数の公知のウイルス又は細菌の作因から抽出された天然のdsRNAポリヌクレオチドが使用される。そのような作因としては、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、センダイウイルス、大腸菌(E.coli)等が挙げられる。抽出、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を使用した増幅、及び天然のポリヌクレオチドの精製の方法は、当技術分野の当業者に公知である。合成ポリヌクレオチドもまた使用されうる。合成ポリヌクレオチドは、ポリイノシン酸とポリシチジル酸(ポリIC)、ポリアデニル酸とポリウリジル酸(ポリAU)、ポリイノシン酸類縁体とポリシチジル酸、ポリイノシン酸とポリシチジル酸類縁体、ポリイノシン酸類縁体とポリシチジル酸類縁体、ポリアデニル酸類縁体とポリウリジル酸、ポリアデニル酸とポリウリジル酸類縁体、及びポリアデニル酸類縁体とポリウリジル酸類縁体からなる群から選択される二本鎖核酸である。
【００７１】
ポリヌクレオチド鎖は、指定された間隔で当該鎖の中に他の塩基を置換すること、例えばポリIC(12)U又はポリIC(12)G等によって、又はポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース等の追加の化合物を当該ヌクレオチド鎖に付加することによって、改変されうる。例えば、ポリICは、ポリ-L-リジンを添加して、ポリICLCとよばれる新しいポリヌクレオチドを形成することによって、安定化されうる。
【００７２】
本発明及びその利点が詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲に規定されているように、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書で、様々な変更、置換及び修正をなすことができることを理解されたい。
【００７３】
本発明は、以下の実施例に更に例示されることになるが、該実施例は、例示の目的のみに供され、どのようであれ本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００７４】
以下の実施例は、本発明の実施を例示するために供される。それらは、本発明の全体の範囲を限定又は規定することを意図しない。
【００７５】
(実施例1)
材料及び方法
動物:6週齢のBALB/c雌マウスをCharles River Laboratories社から入手した。マウスは、使用前に72時間隔離し、ユタ州立大学実験動物研究センターでTeklad Rodent Diet(Harlan Teklad社)及び水道水にて維持した。
【００７６】
ウイルス:インフルエンザA/ベトナム/1203/2004(H5N1)を、アメリカ疾病予防管理センター(アトランタ、ジョージア州)から入手した。ウイルスの増殖及びアッセイは、Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞[アメリカ培養細胞系統保存機関、マナサス、バージニア州]にて行った。親ウイルスを1回継代して負荷用プールを調製した。次いで該負荷用プールを、使用前にMDCK細胞にて力価測定した。細胞を、5%CO2インキュベーターにて、5%ウシ胎児血清(Hyclone社、ローガン、ユタ州)及び0.18%炭酸水素ナトリウムを含有し且つ抗生物質非存在のMEM中で成長させた。
【００７７】
ワクチン:Ad5-VN 1203/04.H5 (A/ベトナム/1203/04 H5ヘマグルチニン遺伝子をコード)及び空ベクターAdEを(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2012/0276138号)に記載されているように調製した。AdVN.H5のウイルス力価は、7×109感染形成単位(ifu)/mL(3.5×108ifu/0.05ml)であり、AdEは、2.4×109ifu/ml(1.2×108ifu/0.05ml)であった。ワクチンは、50μL容量で、鼻腔内経路によって単回で投与した。ワクチンアジュバントとして使用したポリICLC製剤であるHiltonol(登録商標)(合成dsRNAポリICLC、Oncovir, Inc.社)は、(参照によりその全体が組み入れられている米国特許第7,439,349号)に記載されている。アジュバントは、ワクチン投与に続く30分後又は24時間後に、10μL容量で、鼻腔内経路によって単回で投与した(実験設計を参照)。
【００７８】
実験設計:動物数及び試験群をTable 1(表1)及びTable 2(表2)に記載する。試験0日目にマウスの群を鼻腔内経路によってワクチン接種した。プラセボ群は、同じ経路で50μLの生理的滅菌食塩水(PSS)を受けた。追加の対照には、空ベクター(AdE)を用いてワクチン接種されたマウスを含めた。インフルエンザウイルスの負荷については、マウスをカタミン/キシラジン(50mg/kg//5mg/kg)のi.p.注射によって麻酔した後に、50μLのインフルエンザA/ベトナム/1203/2004(H5N1)を用いて鼻腔内負荷した。マウス1匹当たりおよそ5プラーク形成単位(1×LD90)のウイルスとなった。全マウスが、試験28日目にウイルス負荷を受けた。負荷に続いて、負荷後21日目を過ぎるまで、体重低下及び死亡率について全マウスを観察した。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
統計学的解析:Prism 5.0d(GraphPad Software Inc.社、ラホヤ、カリフォルニア州)で、カプラン-マイヤー生存曲線を生成して、ログランク(マンテル-コックス)検定によって比較し、続いてゲーハン-ブレスロウ-ウィルコクソン(Gehan-Breslow-Wilcoxon)検定を使用して対比較した。Prism 5.0dを使用して、平均体重を分散分析(ANOVA)によって解析し、続いてテューキーの多重比較検定を行った。また、血清学的アッセイ(HAI、IgA及びアデノウイルス中和)及びELISpotアッセイからの結果を、Prism 5.0dを使用して、分散分析(ANOVA)によって解析し、続いてテューキーの多重比較検定を行った。
【００８１】
血球凝集阻害(HAI)検査:96ウェル丸底マイクロタイタープレート(Fisher Scientific社、ピッツバーグ、ペンシルバニア州)で、血清試料をPBS中に希釈した。血清の希釈に続いて、8HAユニット/ウェルのインフルエンザA/ベトナム/1203/2004×アナーバー/6/60ハイブリッドウイルス(ベトナムH5及びN1表面タンパク質並びにアナーバーコア)とニワトリ赤血球(Lampire Biological Laboratories社、パイパーズビル、ペンシルバニア州)とを添加し(各ウェル50μL)、手早く混合して、室温で60分間インキュベートした。血清試料のHAI力価を、血球凝集が完全に阻害される血清の最高希釈率の逆数として報告する。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
IgA ELISA:製造業者の取扱説明書に従ってマウスIgA酵素免疫アッセイ(EIA)キット(Bethyl Laboratories社、モンゴメリー、テキサス州)を使用することによって、マウス由来の肺洗浄試料中の総IgAレベルを決定した。簡潔に述べれば、マイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp C、Fisher Scientific社、ピッツバーグ、ペンシルバニア州)に結合させたヤギ抗マウスIgAを使用して、洗浄試料から室温で1時間、抗体を捕捉し、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgAを使用して、結合された抗体を検出した。プールしたマウス血清をIgA抗体(Bethyl Laboratories社)について較正し、それを使用することによって生成した標準曲線から、抗体濃度を読み取った。
【００８４】
IFN-γ及びIL-4用のELISpotアッセイ:製造業者の取扱説明書に従って、マウスIFN-γ及びIL-4用ELISpotキット(R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州)を使用した。簡潔に述べれば、0.2mM Pefabloc SC Plus(Hyclone社、ローガン、ユタ州)を含有する1.0mLの滅菌PBSを使用して、肺洗浄試料を採取した。96ウェル細胞培養プレートに、肺洗浄試料由来の細胞を、1.0×105個/ウェルの密度で、2%FBSを含む100μLのRPMI-1640に懸濁して添加した。インフルエンザA/カリフォルニア/04/2009を、およそ1000CCID50/mLに希釈し、100μLを各プレートに添加して100CCID50/ウェルとなるようにして、サイトカインの産生を刺激した。プレートを37℃でおよそ24時間インキュベートした。洗浄に続いて、100μLの検出抗体を各ウェルに添加し、2〜8℃で一晩インキュベートした。洗浄後、100μLのストレプトアビジン-APを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、色素原である100μLのBCIP/NBTを各ウェルに添加して、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、色素原溶液を捨て、脱イオン水を用いてプレートを洗浄した。ペーパータオル上でプレートの底を風乾し、サイトカインを活発に産生している細胞を示すスポットを、解剖顕微鏡を用いて目視で計数した。
【００８５】
抗Ad5中和抗体アッセイ:使用する24時間前に、96ウェルプレートにて、10%FBS(Hyclone社、ローガン、ユタ州)を含有するRPMI中、1ウェル当たり1×104個でHEK-293細胞を播種した。翌日、各血清試料の2倍希釈系列を、無血清培地に1:10希釈に始まり1:1280に終わるよう調製した。各血清希釈物を、1×104CCID50/mLの野生型アデノウイルス5型[アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)、マナサス、バージニア州]を含む無血清培地と1:1(0.1mL)で混合した。室温で1時間インキュベーションした後、293細胞を入れたウェルに血清-Ad5混合物(0.2mL)を移し入れて、2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、血清-Ad5混合物を除去し、0.5%FBS及びゲンタマイシンを含有する0.1mLのRPMIに置き換えて、3日間インキュベートした。抗Ad中和抗体を、細胞変性効果(CPE)の阻害として測定した。感染後3日目に光学顕微鏡下で単層の293細胞を調べることによって、CPEを2連の試料から点数化した。
【００８６】
ワクチン接種に続く免疫応答の評価には、血球凝集阻害アッセイによる血清抗体レベルの測定と、肺洗浄物中の分泌IgA(sIgA)レベルの測定とを含めた。図3〜図6を参照されたい。細胞免疫は、IFN-γ及びIL-4を遊離している肺洗浄物中の細胞を、ELISpotアッセイによって定量することにより評価した。図7〜図10を参照されたい。
【００８７】
本研究は、合成dsRNAポリICLC[Hiltonol(登録商標)]をアジュバントとして使用して、マウス内で、高病原性A/ベトナム/1203/04(H5N1)トリインフルエンザウイルスを用いた負荷感染に対し、Ad5ベクター化インフルエンザウイルスHAワクチン(Ad5-VN 1203/04.H5)の免疫原性を増加させたことを記載している。ポリICLCを各種の用量で投与する30分前又は24時間前でのAdVN.H5ワクチンの投与を比較すると、108個用量のAdVN.H5を受けていた全ての処理群が、負荷感染に対して、ポリICLCの濃度に関わらず100%の防御をもたらした。更に、15μgのポリICLCを投与する30分前に4通りの用量(1.2×106、1.2×107、1.2×108又は3.5×108ifu/50μL)でAdVN.H5ワクチンを投与した全ての群が、負荷感染に対して100%の防御をもたらした。AdEはまた、いくらかの死亡率が観察されたものの、著しい防御を示した。空AdEベクターによって付与された防御は驚くべきことであり、この特異的なAd5ベクターに1つを超える作用のメカニズムがあることを示唆する。108個用量のAdVN.H5を受けていた全ての処理群が、ポリICLCの濃度に関わらず、マウスを著しい体重低下から防いだ。しかし、5μg用量のポリICLCが、最も優れた防御を示した。4通りの用量のAdVN.H5ワクチンを比較すると、15μg用量のポリICLCと組み合わせた106個用量のAdVN.H5が、体重低下に対し最も優れた保護を示した。このように、生存率及び体重低下のデータは、108個用量のAdVN.H5が、ポリICLCの濃度に関わらず防御に働くことを示す。しかし、アジュバントと組み合わせた場合には、低用量のワクチンでさえも、更に安全に投与され得、同等に防御的でありうる。
【００８８】
ワクチン接種に続く免疫応答の評価には、血球凝集阻害アッセイによる血清抗体レベルの測定と、肺洗浄物中の分泌IgA(sIgA)レベルの測定とを含めた。細胞免疫は、IFN-γ及びIL-4を遊離している肺洗浄物中の細胞を、ELISpotアッセイによって定量することにより評価した。アデノウイルス特異的な免疫は、ワクチン接種されたマウス由来の血清を使用して、アデノウイルス中和によって評価した。
【００８９】
ワクチン接種後14日目及び28日目の免疫学的な応答をまとめたものが以下である。
【００９０】
108個用量のAdVN.H5を受けていた全ての群が、ワクチン接種後14日目に、肺洗浄試料中に著しいレベルのsIgAを誘導した。しかし、15μg用量のポリICLCの結果、108個用量のAdVN.H5のみよりも高いsIgA力価がもたらされた。ワクチン接種後28日目には、ベクターの30分後又は24時間後のどちらかに108個用量のAdVN.H5を15μg用量のポリICLCと共に投与した結果、108個用量のAdVN.H5のみと比較して更に高いsIgA力価がもたらされた。
【００９１】
ワクチン接種後14日目には、108個用量のAdVN.H5を15μg用量のポリICLCと組み合わせて受けていた群のみが、肺洗浄物から単離及び培養されたIFN-γ産生細胞数の有意な増加を誘導した。しかし、28日目までには、108個用量のAdVN.H5を受けていた全ての群が、著しいレベルのIFN-γ産生細胞を示した。このように、ポリICLCを含めることによって、免疫応答の速度が増加した。
【００９２】
14日目には、108個用量のAdVN.H5を15μg用量のポリICLCと組み合わせて受けていた処理群のみが、IL-4産生細胞数の有意な増加を示した。ワクチン接種後28日目には、全ての処理群が、IL-4産生細胞数に増加を示した。このように、ポリICLCを含めることによって、免疫応答の速度が増加した。
【００９３】
このように、本発明の好適な実施形態を詳細に記載してきたが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく多数のそれらの明らかな変形が可能であることから、上述の文章によって規定された本発明は、上記記載に述べられた具体的な詳細に限定されないことが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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