(57)【要約】本発明は、リンパ腫の処置のための、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の表面でＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子に関する。本発明は、また、リンパ腫を診断及び／又は監視するために有用なバイオマーカーとしての、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルのインビトロの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子。
【請求項２】
該リガンド分子が、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の死滅を特異的に誘導する能力があり、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の死滅が、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を含む群より選択される過程によって媒介される、請求項１記載のリガンド分子。
【請求項３】
該リガンド分子が、抗体、抗体のフラグメント及びオリゴデオキシヌクレオチドを含む群より選択される、請求項１又は２記載のリガンド分子。
【請求項４】
該抗体が、ＡＺ１５８及びＱ６６モノクローナル抗体を含む群より選択される、請求項３記載のリガンド分子。
【請求項５】
該オリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号５の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ａ、配列番号６の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｂ、配列番号７の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ及び配列番号８の配列のＧｐＣ ＯＤＮを含む群より選択される、請求項３記載のリガンド分子。
【請求項６】
皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、請求項１〜５のいずれか記載のリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、該方法が、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を該個体に投与することを含み、該リンパ腫が、形質転換皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される、方法。
【請求項８】
ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、該方法が、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を該個体に投与することを含み、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される、方法。
【請求項９】
皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのバイオマーカーとしての、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルのインビトロの使用。
【請求項１０】
ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量する少なくとも１つの段階を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのインビトロの方法であって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される、インビトロの方法。
【請求項１１】
発現レベルが、ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって定量される、請求項１０記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
発現レベルが、細胞性タンパク質の発現レベル、好ましくはタンパク質の表面発現レベルを測定することによって定量される、請求項１０記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
ａ）被験個体から生物学的試料を提供する段階、
ｂ）生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階、
ｃ）ｂ）で見出された値が、該発現レベルについて前もって決定された閾値と異なり、リンパ腫陽性個体を示すならば、該リンパ腫と診断する段階
を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１４】
リンパ腫に対する処置を必要とする個体における治療剤を用いた該処置の有効性を監視するための方法であって、該方法が：
（ｉ）治療剤の投与前に個体から投与前の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｉ）投与前の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階；
（ｉｉｉ）個体から１つ以上の投与後の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｖ）投与後の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階；
（ｖ）投与前の生物学的試料について測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを、１つ以上の投与後の生物学的試料について測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルと比較する段階；及び
（ｖｉ）それに応じて個体への治療剤の投与を変更する段階
を含み、
リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される、方法。
【請求項１５】
治療剤が、請求項１記載のリガンド分子及び請求項６記載の医薬組成物を含む群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
リンパ腫に対する処置を必要とする個体における該処置を適応させるための方法であって、該方法が、少なくとも：
ａ）個体から収集された少なくとも１つの生物学的試料に請求項１０〜１２のいずれか一項記載のインビトロの診断方法を行う段階；及び
ｂ）個体に適切な治療法を施すことによって個体のリンパ腫に対する処置を適応させる段階
を含み、
リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される、方法。
【請求項１７】
適切な治療法が、請求項１記載のリガンド分子又は請求項６記載の医薬組成物の投与を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ａ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現できる少なくとも１つのＴ細胞を提供する段階；
ｂ）段階ａ）で提供された少なくとも１つのＴ細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定することによって第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が得られる段階；
ｃ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現している少なくとも１つのＴ細胞を被験候補化合物と共にインキュベートする段階；
ｄ）段階ｃ）のＫＩＲ３ＤＬ２を発現している少なくとも１つのＴ細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定することによって第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が得られる段階；
ｅ）第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値を第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値と比較する段階；及び
ｆ）第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値よりも低い場合、該候補化合物を選択する段階
を含む、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルに影響する化合物候補をスクリーニングするための方法。
【請求項１９】
ａ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現できる少なくとも１つのＴ細胞を提供する段階；
ｂ）段階ａ）で提供された少なくとも１つのＴ細胞中からＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を測定することによって第１の活性値が得られる段階；
ｃ）ＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞を被験候補化合物と共にインキュベートする段階；
ｄ）段階ｂ）の終わりに得られたＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞中からＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を測定することによって第２の活性値が得られる段階；
ｅ）第１の活性値を第２の活性値と比較する段階
を含む、ＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性に影響する候補化合物のスクリーニングのための方法。
【請求項２０】
ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量するための手段を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのキットであって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される、キット。
【請求項２１】
発現レベルが、ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって定量される、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
発現レベルが、細胞性タンパク質の発現レベル、好ましくはタンパク質の表面発現レベルを測定することによって定量される、請求項２０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫の診断又は治療的処置の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、進行性の臨床経過及び現在の処置戦略で大部分は転帰不良によって特徴付けられる、不均質で珍しい非ホジキン腫瘍疾患である。
【０００３】
最も差し迫った困難の１つは、細胞標的化学療法、放射線療法及び／又は骨髄移植などの最も適応した処置を患者に提供するために、これらの疾患を適正に分類することである。
【０００４】
臨床症状及び遺伝子発現プロファイルを考慮して、ＰＴＣＬ疾患を分類するためのいくつかの試みが過去に行われている。
【０００５】
今日、世界保健機関は、（ｉ）播種性リンパ腫；（ｉｉ）皮膚リンパ腫；（ｉｉｉ）節性非皮膚リンパ腫；及び（ｉｖ）節外性非皮膚リンパ腫などの、国際疾病分類−腫瘍学（ＩＣＤＯ、第３版）に登録されているようなＰＴＣＬのいくつかのサブタイプを認知している。
【０００６】
皮膚ＰＴＣＬの中で、セザリー症候群及び形質転換菌状息肉症が最も高頻度に見られる皮膚Ｔ細胞リンパ腫である。セザリー症候群は、紅皮症、リンパ節腫大及びセザリー細胞と呼ばれるかなりの数の悪性リンパ球の存在を招く、広範な皮膚波及を伴う進行性の臨床挙動を提示する。逆に、菌状息肉症は、緩徐進行性の臨床挙動を提示するが、約１０％の患者で本疾患は、大Ｔ細胞リンパ腫（「形質転換菌状息肉症」）に進行し、時にリンパ節又は内臓波及を伴う大型の皮膚の、しばしば潰瘍化した皮膚腫瘍を招く。
【０００７】
目下、セザリー症候群及び形質転換菌状息肉症のための治癒法はないものの、患者の生活を改善するために、いくつかの一時緩和のアプローチを採ることができる。例えば、これらのアプローチは：
−  局所コルチコステロイド、イミキモド、レチノイドであるベキサロテン、インターフェロン−α、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ、例えばボリノスタット及びロミデプシン）、経口メトトレキサート、デニロイキンジフチトクス（インターロイキン−２とジフテリア毒素とが結合した抗悪性腫瘍薬）、プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬（レナリドミド）を含む薬物療法及び化学療法；
−  ＵＶＢ光線療法を含む光線療法；
−  ソラレン＋紫外線Ａ（ＰＵＶＡ）を含む光線力学的療法；
−  放射線療法；
−  全身電子線照射療法（ＴＳＥＢ）；
−  体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）；
−  自家幹細胞移植；
−  同種幹細胞移植
を含む。
【０００８】
主に、正常な非病原細胞によって耐え抜かれ、そのような処置の患者の利益に影響するおそれがある副作用のせいで、これらのアプローチの大部分は、限界を提示している。
【０００９】
したがって、ターゲット療法の必要性がある。この概念は、アレムツズマブ、すなわち、成熟リンパ球、単球及び樹状細胞の表面に見られるペプチドであるＣＤ５２に対するモノクローナル抗体を使用することによって最近実行されている（Lundin et al. Phase 2 study of alemtuzumab (anti-CD52 monoclonal antibody) in patients with advanced mycosis fungoides/Sezary syndrome. Blood. 2003 Jun 1; 101(11):4267-72）。
【００１０】
以前の研究から、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤チロホスチンＡＧ４９０、並びにククルビタシンＩ又はクルクミンを用いたセザリー細胞の処置が、ホスホ−ＳＴＡＴ３の脱リン酸化を効率的に促進し、セザリー細胞のアポトーシスを誘導することが実証された（Eriksen et al. Constitutive STAT3-activation in Sezary syndrome: tyrphostin AG490 inhibits STAT3-activation, interleukin-2 receptor expression and growth of leukemic Sezary cells. Leukemia. 2001; 15:787-793; van Kester et al. Cucurbitacin I inhibits Stat3 and induces apoptosis in Sezary cells. J Invest Dermatol. 2008; 128:1691-1695; Zhang et al. Curcumin selectively induces apoptosis in cutaneous T-cell lymphoma cell lines and patients' PBMCs: potential role for STAT-3 and NF-kappaB signaling. J Invest Dermatol. 2010;130:2110-2119）。
【００１１】
セザリー症候群の一部の生理学的態様に関して、特に、当技術分野においてセザリーの個体において関連し得るバイオマーカーのうち、４つのバイオマーカーの組み合わせが特に関心対象であることが示されている。それは、ＰＳＬ３、ＴＷＩＳＴ、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＮＫｐ４６がセザリーの個体及び形質転換菌状息肉症の個体からのＴ細胞中に過剰発現されることが示されたからである（Michel et al. Combination of PSL3, Twist, CD158/KIR3DL2 and NKp46 gene expression for the diagnosis of syndrome. J Invest Dermatol. 2012; 132(2), page S50）。
【００１２】
しかし、ＫＩＲ３ＤＬ２が、セザリー症候群及び形質転換菌状息肉症に関連するバイオマーカーと見なされるべきであるかどうか紛らわしいデータがある。
【００１３】
実際、Bagotら（CD4(+) cutaneous T-cell lymphoma cells express the p140-killer cell immunoglobulin-like receptor. Blood. 2001 Mar 1; 97(5):1388-91)、Poszepczynska-Guigneら（CD158k/KIR3DL2 is a new phenotypic marker of Sezary cells: relevance for the diagnosis and follow-up of Sezary syndrome. J Invest Dermatol. 2004 Mar; 122(3):820-3）及びOrtonneら（CD158k/KIR3DL2 and NKp46 are frequently expressed in transformed mycosis fungoides. Exp Dermatol. 2012 Jun; 21(6):461-3）は、セザリー症候群又は形質転換菌状息肉症を有する患者からのＴ細胞の表面にＫＩＲ３ＤＬ２が過剰発現していることを報告した。
【００１４】
上記研究と完全に矛盾して、定量ＲＴ−ＰＣＲによってＫＩＲ３ＤＬ２のｍＲＮＡレベルを測定することによって判定した場合、セザリー細胞においてＫＩＲ３ＤＬ２の発現がダウンレギュレーションされていることも当技術分野において見出された（国際公開公報第２００７／０７１８２９号参照）。
【００１５】
Bookenら（Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 2008 (22), 393-399）は、ＫＩＲ３ＤＬ２がセザリー症候群を有する患者の部分集団だけに発現されることを報告した。
【００１６】
加えて、Iqbalら（Molecular signature to improve diagnosis in peripheral T-cell lymphoma and prognostication in angioimmunoblastic T-cell lymphoma; Blood, 2010, 115(5):1026-36）は、ＰＴＣＬの「非特定型」サブセット（ＰＴＣＬ／ＮＯＳ）についての推定上のバイオマーカーとしてＫＩＲ３ＤＬ２を報告したが、セザリー症候群及び形質転換菌状息肉症などの皮膚リンパ腫については言及しないままであった。
【００１７】
最後に、Nebozhynら（Quantitative PCR on 5 genes reliably identifies CTCL patients with 5% to 99% circulating tumor cells with 90% accuracy. Blood. 2006 Apr 15;107(8):3189-96）は、５つの信頼できるバイオマーカー、すなわちＳＴＡＴ４、ＧＡＴＡ−３、ＰＬＳ３、ＣＤ１Ｄ、及びＴＲＡＩＬのセットを示唆し、したがって、ＫＩＲ３ＤＬ２をセザリー症候群の診断のための価値のあるバイオマーカーであることから排除した。
【００１８】
Obamaら（Killer cell immunoglobulin-like receptor/3DL2 expression in adult T-cell leukaemia. Br J Haematol. 2007 Sep; 138(5):666-7）に開示されたように、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＣＬ）と診断された患者からの一部のＴ細胞の表面にもＫＩＲ３ＤＬ２が過剰発現されていることが見出されたことに留意すべきである。しかし、この研究によると、ＫＩＲ３ＤＬ２は、ＡＴＣＬに対する高度に特異的なバイオマーカーではないと考えられる。
【００１９】
キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識するためにヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴリンパ球サブセットによって使用される受容体ファミリーに相当する。
【００２０】
ＫＩＲ３ＤＬ２は、３つの免疫グロブリン様ドメイン及び長い細胞質尾部を表しているＫＩＲ受容体ファミリーに属する。
【００２１】
ＫＩＲ３ＤＬ２に結合するモノクローナル抗体が、ＫＩＲ３ＤＬ２を発現している悪性Ｔ細胞に対する抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘発することができるので、ＫＩＲ３ＤＬ２は、標的療法の候補であると報告されている（国際公開公報第２０１０／０８１８９０号）。
【００２２】
さらに、Sivoriら（A novel KIR-associated function: evidence that CpG DNA uptake and shuttling to early endosomes is mediated by KIR3DL2; Blood, 2010, 116(10):1637-1647）は、ＮＫ細胞（ナチュラルキラー）を処置するため、及び多様なサイトカインを産生及び放出するようにＮＫ細胞を誘導するためのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオシドの使用を開示している。
【００２３】
当技術分野において、Ｔ細胞リンパ腫に対する新規な治療戦略及びこれらの疾患を診断するための信頼できるツールの必要性がある。
【００２４】
発明の概要
第一の態様では、本発明は、セザリー症候群、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を記載する。
【００２５】
一態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、セザリー症候群、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の予防及び／又は治療のための、本発明において同義のリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を記載する。
【００２７】
一態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２発現性悪性Ｔ細胞リンパ腫の予防及び／又は治療のための、本発明において同義のリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫を処置することを必要とする個体における該処置のための方法であって、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を個体に投与することを含む方法を記載し、その際、該リンパ腫は、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【００２９】
本発明の別の態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫を処置することを必要とする個体における該処置のための方法であって、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を個体に投与することを含む方法に関し、その際、該リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【００３０】
本発明の別の態様では、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫を処置することを必要とする個体における該処置のための方法であって、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を個体に投与することを含む方法に関し、その際、該リンパ腫は、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫、好ましくは皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのバイオマーカーとしての、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルのインビトロの使用に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量する少なくとも１つの段階を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのインビトロの方法であって、該リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される方法に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、また、リンパ腫に対する処置を必要とする個体における治療剤を用いた該処置の有効性を監視するための方法であって：
（ｉ）治療剤の投与前に個体から投与前の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｉ）投与前の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階；
（ｉｉｉ）個体から１つ以上の投与後の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｖ）投与後の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階；
（ｖ）投与前の生物学的試料について測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを、１つ以上の投与後の生物学的試料について測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルと比較する段階；及び
（ｖｉ）それに応じて個体への治療剤の投与を変更する段階
を含む方法に関し、その際、リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【００３４】
さらなる一態様では、本発明は、リンパ腫に対する処置を必要とする個体における治療剤を用いた該処置の有効性を監視するための方法であって：
（ｉ）治療剤の投与前に個体から投与前の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｉ）投与前の生物学的試料中のＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベル比を測定する段階；
（ｉｉｉ）個体から１つ以上の投与後の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｖ）投与後の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベル比を測定する段階；
（ｖ）投与前の生物学的試料中のＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベル比を、１つ以上の投与後の生物学的試料中のＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベル比と比較する段階；及び
（ｖｉ）それに応じて個体への治療剤の投与を変更する段階
を含む方法に関し、その際、該リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【００３５】
別の態様では、本発明は、また、リンパ腫に対する処置を、それを必要とする個体において適応させるための方法であって、少なくとも：
ａ）個体から収集された少なくとも１つの生物学的試料に、本発明によるインビトロの診断方法を行う段階；及び
ｂ）個体に適切な治療法を施すことによって個体のリンパ腫に対する処置を適応させる段階
を含む方法に関し、
その際、リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【００３６】
本発明の別の態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルに影響する化合物候補をスクリーニングするための方法であって：
ａ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現できる少なくとも１つのＴ細胞を提供する段階；
ｂ）段階ａ）で提供された少なくとも１つのＴ細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定することによって、第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が得られる段階；
ｃ）少なくとも１つのＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞を被験候補化合物と共にインキュベートする段階；
ｄ）段階ｃ）の少なくとも１つのＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定することによって、第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が得られる段階；
ｅ）第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値を第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値と比較する段階；及び
ｆ）第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値よりも低いとき、候補化合物を選択する段階
を含む方法に関する。
【００３７】
本発明のさらなる一態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性に影響する候補化合物のスクリーニングのための方法であって：
ａ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現できる少なくとも１つのＴ細胞を提供する段階；
ｂ）段階ａ）で提供された少なくとも１つのＴ細胞中からＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を測定することによって、第１の活性値が得られる段階；
ｃ）ＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞を被験候補化合物と共にインキュベートする段階；
ｄ）段階ｂ）の終わりに得られたＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞中からＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を測定することによって、第２の活性値が得られる段階；
ｅ）第１の活性値を第２の活性値と比較する段階
を含む方法に関する。
【００３８】
最終的に、本発明の別の態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル又はＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量するための手段を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのキットであって、該リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるキットに関する。
【００３９】
本発明は、皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットを診断及び／又は監視するために簡単で、対費用効果が高く、信頼できるアッセイ法を提供する利点を有する。
【００４０】
その利点のもう１つによると、本発明は、皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットを予防及び／若しくは治療するために有効であると推定される治療的処置を監視すること、又は皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットを予防及び／若しくは治療するために有効と推定される薬物候補をスクリーニングすることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】皮膚ＰＴＣＬのサブセットの組織試料中のＫＩＲ３ＤＬ２タンパク質の発現。ＲＴ−ＰＣＲ研究によってＫＩＲ３ＤＬ２に比べてＫＩＲ３ＤＬ１転写物の無発現又は非常に低い発現が示されたので、本発明者らは、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１の両方と特異的に反応する、５．１３３クローン（Miltenyi-Biotec）からの抗体を用いて得られた標識はＫＩＲ３ＤＬ２を実際に特定したと想定している。（Ａ）及び（Ｂ）。抗ＫＩＲ３ＤＬ２モノクローナル抗体で標識された、密な腫瘍性浸潤（Ａ）又は軽微な血管周囲の浸潤（Ｂ）を伴う、ＰＨＲＣ ＫＩＲからのセザリー症候群の試料は、両方共バックグラウンド標識なしで膜陽性を示す。Ａに表皮向性腫瘍細胞を特定することができる（矢尻印）。（Ｃ）及び（Ｄ）。形質転換菌状息肉症（ＭＦ）の１症例は、表皮内の表皮向性腫瘍細胞（Ｅｐ、矢尻印）を含む、ＫＩＲ３ＤＬ２の強い膜発現を示した。（Ｅ）及び（Ｆ）。原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、真皮及び表皮向性細胞（矢尻印）の両方において腫瘍細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２のびまん性発現を示した。（Ｇ）及び（Ｈ）。皮下「脂肪織炎様」Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）は、分散したＫＩＲ３ＤＬ２＋細胞を示した。染色された細胞の一部は、腫瘍細胞が通常局在する脂肪細胞の近傍にあるが、染色は不均一である。本来の倍率：Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ及びＨ：×２００；Ｃ及びＥ：×１００。
【図２】非皮膚ＰＴＣＬのサブセットの組織試料におけるＫＩＲ３ＤＬ２発現。この群ではＫＩＲ３ＤＬ１転写物に関するデータは利用できないが、トランスクリプトーム解析を用いたＫＩＲ３ＤＬ２転写物の検出と５．１３３モノクローナル抗体を用いた標識との間の相関関係は、ＫＩＲ３ＤＬ２だけが腫瘍性Ｔ細胞の表面で実際に標識されたことを示唆している。（Ａ）及び（Ｂ）。末梢Ｔ細胞リンパ腫−非特定型（ＰＴＣＬ／ＮＯＳ）は、ＫＩＲ３ＤＬ２の有意な発現を示さず、分散しているだけの陽性細胞は、反応性ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞（矢尻印）に対応し得る。（Ｃ）及び（Ｄ）。腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）は、びまん性で強いＫＩＲ３ＤＬ２陽性を示した。内皮（矢印）にも周皮細胞にも標識化を示さない腫瘍内血管が見られる（Ｖ）。（Ｅ）及び（Ｆ）。成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）は、ＫＩＲ３ＤＬ２の強いびまん性発現を示した。前述の場合と同様、陰性対照として採用された腫瘍内血管は染色されていない（陰性の内皮細胞、矢印）。（Ｇ）及び（Ｈ）。肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）はＫＩＲ３ＤＬ２のびまん性発現を示した。本来の倍率：Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ及びＨ：×２００；Ｄ及びＦ：×１００。
【図３】肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）におけるＫＩＲ３ＤＬ２転写物の発現。このグラフでは、免疫組織化学検査を使用してＫＩＲ３ＤＬ１／２について陽性であることが示された、ＰＨＲＣ ＴＥＮＯＭＩＣ群からの肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）の試料（灰色）並びに全てのＨＳＴＬ及び血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）の試料（白）中のＫＩＲ３ＤＬ２ ｍＲＮＡの相対レベルを示す。
【図４Ａ】ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ処置に対する腫瘍性セザリー細胞上のＫＩＲ３ＤＬ２発現のダウンモジュレーション。（Ａ）セザリー患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を未処置のままとするか、又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ（１０g/ml）若しくはＡＺ１５８ ｍＡｂ（２μg/ml）の存在下でインキュベートした。２４時間インキュベーション後に、細胞を抗ＫＩＲ３ＤＬ２ ｍＡｂ（Ｑ６６）＋ＦＩＴＣコンジュゲーション型ヤギ抗マウスＩｇＭ二次抗体、抗ＴＣＲＶ−ＰＥｍＡｂ、抗ＣＤ３−ＰＣ５ ｍＡｂ及びＣＤ４−ＰＣ７ ｍＡｂで標識した。ゲート通過したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団に対応するＴＣＲＶβ／ＫＩＲ３ＤＬ２の染色を示す。ＫＩＲ３ＤＬ２標識の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。（Ｂ）ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、対照（Ｃｔｒｌ）ＯＤＮ又はＡＺ１５８ ｍＡｂと共にインキュベーション後に、セザリー患者（ｎ＝１２）からのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞上に観察されたＫＩＲ３ＤＬ２のＭＦＩのグラフ表示。
【図４Ｂ】ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ処置に対する腫瘍性セザリー細胞上のＫＩＲ３ＤＬ２発現のダウンモジュレーション。（Ａ）セザリー患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を未処置のままとするか、又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ（１０g/ml）若しくはＡＺ１５８ ｍＡｂ（２μg/ml）の存在下でインキュベートした。２４時間インキュベーション後に、細胞を抗ＫＩＲ３ＤＬ２ ｍＡｂ（Ｑ６６）＋ＦＩＴＣコンジュゲーション型ヤギ抗マウスＩｇＭ二次抗体、抗ＴＣＲＶ−ＰＥｍＡｂ、抗ＣＤ３−ＰＣ５ ｍＡｂ及びＣＤ４−ＰＣ７ ｍＡｂで標識した。ゲート通過したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団に対応するＴＣＲＶβ／ＫＩＲ３ＤＬ２の染色を示す。ＫＩＲ３ＤＬ２標識の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。（Ｂ）ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、対照（Ｃｔｒｌ）ＯＤＮ又はＡＺ１５８ ｍＡｂと共にインキュベーション後に、セザリー患者（ｎ＝１２）からのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞上に観察されたＫＩＲ３ＤＬ２のＭＦＩのグラフ表示。
【図５Ａ】ＣｐＧ ＯＤＮ−ＣではなくＡＺ１５８ ｍＡｂとのＫＩＲ３ＤＬ２の結合が、ＣＤ３誘導型増殖をダウンモジュレートし、セザリー細胞の細胞死を誘導する。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を前もって負荷し、さらに無処置のままとするか、又は単独若しくは表示のように組み合わせた抗ＣＤ３ ｍＡｂ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共にインキュベートした。４日培養後、細胞を収集し、フローサイトメトリー分析に供した。ゲート通過したＴＣＲＶβ３＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞クローンのＣＦＳＥ染色を示す。（Ｂ）細胞の処置を（Ａ）と同様に行った。抗ＴＣＲＶ３−ＰＥ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ ｍＡｂ並びに７ＡＡＤを使用して免疫標識を行った。ＴＣＲＶ３＋ＣＤ４＋腫瘍細胞内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞を示す。（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果は、セザリー患者４人で行われた実験を代表するものである。（Ｃ）新鮮単離されたセザリー症候群細胞を、表示のように抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び／又はＡＺ１５８ ｍＡｂと共にインキュベーションした。アイソタイプが一致する対照ｍＡｂ（抗ＣＤ１６）を使用して、各条件に使用された抗体の量を等しくした。休止条件（ＮＴ）を除いて、ヤギ抗マウスＩｇの添加によって架橋形成が誘発された。溶解後、抗体標的分子を収集し、生じた免疫沈降物を電気泳動及びウエスタンブロッティング手順に供した。免疫ブロットを抗ホスホ−ＣＤ３ ｍＡｂで明らかにし（上欄）、脱ハイブリダイゼーション後に抗ＣＤ３ ｍＡｂを使用して再探索して効率的な免疫沈降であることを判定した（下欄）。（Ｄ）セザリー患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３単独で、又はＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと一緒に活性化し、溶解に供した。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥにより分離し、抗ホスホ−Ｅｒｋ ｍＡｂを使用するウエスタンブロットによって分析した。ストリッピングし、抗Ｅｒｋ１／２抗体を用いた再探査後に試料の負荷が等しいことを判定した。
【図５Ｂ】ＣｐＧ ＯＤＮ−ＣではなくＡＺ１５８ ｍＡｂとのＫＩＲ３ＤＬ２の結合が、ＣＤ３誘導型増殖をダウンモジュレートし、セザリー細胞の細胞死を誘導する。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を前もって負荷し、さらに無処置のままとするか、又は単独若しくは表示のように組み合わせた抗ＣＤ３ ｍＡｂ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共にインキュベートした。４日培養後、細胞を収集し、フローサイトメトリー分析に供した。ゲート通過したＴＣＲＶβ３＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞クローンのＣＦＳＥ染色を示す。（Ｂ）細胞の処置を（Ａ）と同様に行った。抗ＴＣＲＶ３−ＰＥ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ ｍＡｂ並びに７ＡＡＤを使用して免疫標識を行った。ＴＣＲＶ３＋ＣＤ４＋腫瘍細胞内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞を示す。（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果は、セザリー患者４人で行われた実験を代表するものである。（Ｃ）新鮮単離されたセザリー症候群細胞を、表示のように抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び／又はＡＺ１５８ ｍＡｂと共にインキュベーションした。アイソタイプが一致する対照ｍＡｂ（抗ＣＤ１６）を使用して、各条件に使用された抗体の量を等しくした。休止条件（ＮＴ）を除いて、ヤギ抗マウスＩｇの添加によって架橋形成が誘発された。溶解後、抗体標的分子を収集し、生じた免疫沈降物を電気泳動及びウエスタンブロッティング手順に供した。免疫ブロットを抗ホスホ−ＣＤ３ ｍＡｂで明らかにし（上欄）、脱ハイブリダイゼーション後に抗ＣＤ３ ｍＡｂを使用して再探索して効率的な免疫沈降であることを判定した（下欄）。（Ｄ）セザリー患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３単独で、又はＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと一緒に活性化し、溶解に供した。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥにより分離し、抗ホスホ−Ｅｒｋ ｍＡｂを使用するウエスタンブロットによって分析した。ストリッピングし、抗Ｅｒｋ１／２抗体を用いた再探査後に試料の負荷が等しいことを判定した。
【図５Ｃ】ＣｐＧ ＯＤＮ−ＣではなくＡＺ１５８ ｍＡｂとのＫＩＲ３ＤＬ２の結合が、ＣＤ３誘導型増殖をダウンモジュレートし、セザリー細胞の細胞死を誘導する。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を前もって負荷し、さらに無処置のままとするか、又は単独若しくは表示のように組み合わせた抗ＣＤ３ ｍＡｂ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共にインキュベートした。４日培養後、細胞を収集し、フローサイトメトリー分析に供した。ゲート通過したＴＣＲＶβ３＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞クローンのＣＦＳＥ染色を示す。（Ｂ）細胞の処置を（Ａ）と同様に行った。抗ＴＣＲＶ３−ＰＥ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ ｍＡｂ並びに７ＡＡＤを使用して免疫標識を行った。ＴＣＲＶ３＋ＣＤ４＋腫瘍細胞内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞を示す。（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果は、セザリー患者４人で行われた実験を代表するものである。（Ｃ）新鮮単離されたセザリー症候群細胞を、表示のように抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び／又はＡＺ１５８ ｍＡｂと共にインキュベーションした。アイソタイプが一致する対照ｍＡｂ（抗ＣＤ１６）を使用して、各条件に使用された抗体の量を等しくした。休止条件（ＮＴ）を除いて、ヤギ抗マウスＩｇの添加によって架橋形成が誘発された。溶解後、抗体標的分子を収集し、生じた免疫沈降物を電気泳動及びウエスタンブロッティング手順に供した。免疫ブロットを抗ホスホ−ＣＤ３ ｍＡｂで明らかにし（上欄）、脱ハイブリダイゼーション後に抗ＣＤ３ ｍＡｂを使用して再探索して効率的な免疫沈降であることを判定した（下欄）。（Ｄ）セザリー患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３単独で、又はＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと一緒に活性化し、溶解に供した。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥにより分離し、抗ホスホ−Ｅｒｋ ｍＡｂを使用するウエスタンブロットによって分析した。ストリッピングし、抗Ｅｒｋ１／２抗体を用いた再探査後に試料の負荷が等しいことを判定した。
【図５Ｄ】ＣｐＧ ＯＤＮ−ＣではなくＡＺ１５８ ｍＡｂとのＫＩＲ３ＤＬ２の結合が、ＣＤ３誘導型増殖をダウンモジュレートし、セザリー細胞の細胞死を誘導する。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を前もって負荷し、さらに無処置のままとするか、又は単独若しくは表示のように組み合わせた抗ＣＤ３ ｍＡｂ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共にインキュベートした。４日培養後、細胞を収集し、フローサイトメトリー分析に供した。ゲート通過したＴＣＲＶβ３＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞クローンのＣＦＳＥ染色を示す。（Ｂ）細胞の処置を（Ａ）と同様に行った。抗ＴＣＲＶ３−ＰＥ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ ｍＡｂ並びに７ＡＡＤを使用して免疫標識を行った。ＴＣＲＶ３＋ＣＤ４＋腫瘍細胞内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞を示す。（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果は、セザリー患者４人で行われた実験を代表するものである。（Ｃ）新鮮単離されたセザリー症候群細胞を、表示のように抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び／又はＡＺ１５８ ｍＡｂと共にインキュベーションした。アイソタイプが一致する対照ｍＡｂ（抗ＣＤ１６）を使用して、各条件に使用された抗体の量を等しくした。休止条件（ＮＴ）を除いて、ヤギ抗マウスＩｇの添加によって架橋形成が誘発された。溶解後、抗体標的分子を収集し、生じた免疫沈降物を電気泳動及びウエスタンブロッティング手順に供した。免疫ブロットを抗ホスホ−ＣＤ３ ｍＡｂで明らかにし（上欄）、脱ハイブリダイゼーション後に抗ＣＤ３ ｍＡｂを使用して再探索して効率的な免疫沈降であることを判定した（下欄）。（Ｄ）セザリー患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３単独で、又はＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと一緒に活性化し、溶解に供した。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥにより分離し、抗ホスホ−Ｅｒｋ ｍＡｂを使用するウエスタンブロットによって分析した。ストリッピングし、抗Ｅｒｋ１／２抗体を用いた再探査後に試料の負荷が等しいことを判定した。
【図６Ａ】ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃは悪性セザリー細胞のアポトーシスを誘導する。（Ａ）セザリー患者のＰＢＭＣをＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ又は対照ＯＤＮと共に３７℃で７日間インキュベートした。アポトーシス性ＴＣＲＶβ＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞の検出のための染色を、図５Ｂの脚注に記載のように行った。（Ｂ）ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ又は対照ＯＤＮ（Ｃｔｒｌ）と共にインキュベーション後のセザリー患者（ｎ＝８）のＴＣＲＶ＋ＣＤ４＋集団内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞の率（％）のグラフ表示。（Ｃ）セザリー細胞系をＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に表示時間インキュベートした。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングのために処理した。ブロットを抗切断済みカスパーゼ７抗体、抗切断済みカスパーゼ３抗体、抗切断済みＰＡＲＰ抗体及びＥｒｋ１／２抗体で連続的に探査した。
【図６Ｂ】ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃは悪性セザリー細胞のアポトーシスを誘導する。（Ａ）セザリー患者のＰＢＭＣをＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ又は対照ＯＤＮと共に３７℃で７日間インキュベートした。アポトーシス性ＴＣＲＶβ＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞の検出のための染色を、図５Ｂの脚注に記載のように行った。（Ｂ）ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ又は対照ＯＤＮ（Ｃｔｒｌ）と共にインキュベーション後のセザリー患者（ｎ＝８）のＴＣＲＶ＋ＣＤ４＋集団内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞の率（％）のグラフ表示。（Ｃ）セザリー細胞系をＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に表示時間インキュベートした。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングのために処理した。ブロットを抗切断済みカスパーゼ７抗体、抗切断済みカスパーゼ３抗体、抗切断済みＰＡＲＰ抗体及びＥｒｋ１／２抗体で連続的に探査した。
【図６Ｃ】ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃは悪性セザリー細胞のアポトーシスを誘導する。（Ａ）セザリー患者のＰＢＭＣをＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ又は対照ＯＤＮと共に３７℃で７日間インキュベートした。アポトーシス性ＴＣＲＶβ＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞の検出のための染色を、図５Ｂの脚注に記載のように行った。（Ｂ）ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ又は対照ＯＤＮ（Ｃｔｒｌ）と共にインキュベーション後のセザリー患者（ｎ＝８）のＴＣＲＶ＋ＣＤ４＋集団内の早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞の率（％）のグラフ表示。（Ｃ）セザリー細胞系をＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に表示時間インキュベートした。核除去後の溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングのために処理した。ブロットを抗切断済みカスパーゼ７抗体、抗切断済みカスパーゼ３抗体、抗切断済みＰＡＲＰ抗体及びＥｒｋ１／２抗体で連続的に探査した。
【図７Ａ】セザリー細胞のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ処置はＳＴＡＴ３の脱リン酸化を招く。（Ａ）セザリー細胞系をＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に表示時間インキュベートした。細胞溶解物をゲル電気泳動に供し、ニトロセルロースメンブランに移行させた。次に、抗ホスホ−ＳＴＡＴ３抗体を使用してブロットを明らかにし、脱ハイブリダイズし、ＳＴＡＴ３抗体を用いて再探査した。（Ｂ）セザリー患者からの分取後のＣＤ４＋Ｔ細胞（その９８％がＫＩＲ３ＤＬ２＋）を培地単独又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくは対照ＯＤＮを補充された培地中で３７℃で２４時間インキュベートした。次に、溶解物を（Ａ）と同様に分析した。
【図７Ｂ】セザリー細胞のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ処置はＳＴＡＴ３の脱リン酸化を招く。（Ａ）セザリー細胞系をＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に表示時間インキュベートした。細胞溶解物をゲル電気泳動に供し、ニトロセルロースメンブランに移行させた。次に、抗ホスホ−ＳＴＡＴ３抗体を使用してブロットを明らかにし、脱ハイブリダイズし、ＳＴＡＴ３抗体を用いて再探査した。（Ｂ）セザリー患者からの分取後のＣＤ４＋Ｔ細胞（その９８％がＫＩＲ３ＤＬ２＋）を培地単独又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくは対照ＯＤＮを補充された培地中で３７℃で２４時間インキュベートした。次に、溶解物を（Ａ）と同様に分析した。
【図８Ａ】セザリー細胞のＧｐＣ ＯＤＮ処置はアポトーシスを招く。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣを、オリゴヌクレオチドなし（曲線１）で、又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ（曲線２）、ＧｐＣ（曲線３）若しくは対照ＯＤＮ（曲線４）と共に３７℃で７日間インキュベートした。悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｖβ１＋細胞として同定）上のＫＩＲ３ＤＬ２の発現を各インキュベーション条件について判定した。（Ｂ）セザリー患者からのＰＢＭＣを、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＧｐＣ又は対照ＯＤＮと共に３７℃で７日間インキュベートした。アポトーシス性ＴＣＲＶβ１＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞、すなわち早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞の検出用の染色を、前記のように行った（図５Ｂ参照）。（Ｃ）（Ｂ）からの早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞のパーセンテージを各処置タイプ毎にプロットする。
【図８Ｂ】セザリー細胞のＧｐＣ ＯＤＮ処置はアポトーシスを招く。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣを、オリゴヌクレオチドなし（曲線１）で、又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ（曲線２）、ＧｐＣ（曲線３）若しくは対照ＯＤＮ（曲線４）と共に３７℃で７日間インキュベートした。悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｖβ１＋細胞として同定）上のＫＩＲ３ＤＬ２の発現を各インキュベーション条件について判定した。（Ｂ）セザリー患者からのＰＢＭＣを、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＧｐＣ又は対照ＯＤＮと共に３７℃で７日間インキュベートした。アポトーシス性ＴＣＲＶβ１＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞、すなわち早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞の検出用の染色を、前記のように行った（図５Ｂ参照）。（Ｃ）（Ｂ）からの早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞のパーセンテージを各処置タイプ毎にプロットする。
【図８Ｃ】セザリー細胞のＧｐＣ ＯＤＮ処置はアポトーシスを招く。（Ａ）セザリー患者からのＰＢＭＣを、オリゴヌクレオチドなし（曲線１）で、又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ（曲線２）、ＧｐＣ（曲線３）若しくは対照ＯＤＮ（曲線４）と共に３７℃で７日間インキュベートした。悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｖβ１＋細胞として同定）上のＫＩＲ３ＤＬ２の発現を各インキュベーション条件について判定した。（Ｂ）セザリー患者からのＰＢＭＣを、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＧｐＣ又は対照ＯＤＮと共に３７℃で７日間インキュベートした。アポトーシス性ＴＣＲＶβ１＋ＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞、すなわち早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞の検出用の染色を、前記のように行った（図５Ｂ参照）。（Ｃ）（Ｂ）からの早期（７ＡＡＤｌｏｗ）及び後期（７ＡＡＤｈｉｇｈ）アポトーシス細胞のパーセンテージを各処置タイプ毎にプロットする。
【００４２】
発明の詳細な説明
当技術分野において入手可能な様々な実験データの間の高度の矛盾を考慮して、本発明者らは、最初からＴ細胞リンパ腫のための診断及び／又は治療ツールを提供することの実現可能性を判定する目的で実験作業を開始した。
【００４３】
本発明は、セザリー症候群、形質転換菌状息肉症及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などの皮膚ＰＴＣＬ、並びに最も驚くことには、皮膚並びに非皮膚節性及び節外性リンパ腫の両方のサブセットを患う数人の個体からのＴ細胞表面にＫＩＲ３ＤＬ２が過剰発現されていることが分かったという結果に依拠している。本発明者の知るところでは、ＫＩＲ３ＤＬ２は、最初は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫などの２つの皮膚ＰＴＣＬ、並びに２つの非皮膚ＰＴＣＬ、すなわち腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫について関連する特異的バイオマーカーとして特定することができた。
【００４４】
しかし、ＫＩＲ３ＤＬ２を、原発性皮膚ＣＤ３０＋Ｔ細胞リンパ球増殖性障害などの一部の皮膚ＰＴＣＬ、並びに血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫−ＡＬＫ陰性及びＡＬＫ陽性の両方、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫−鼻型及び末梢Ｔ細胞リンパ腫−非特定型などの一部の非皮膚ＰＴＣＬに対する重要で関連する特異的バイオマーカーとして特定することができなかった。したがって、ＫＩＲ３ＤＬ２は、これらの特異的リンパ腫を診断及び／又は監視するための関連するバイオマーカー、並びに皮膚及び非皮膚ＰＴＣＬ疾患の両方の確定されたサブセットの最初の選別を提供するための有利なバイオマーカーからなることが明らかとなった。
【００４５】
バイオマーカーとしてのＫＩＲ３ＤＬ２
Bookenら（Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 2008 (22), 393-399）、Iqbalら（Molecular signature to improve diagnosis in peripheral T-cell lymphoma and prognostication in antioimmunoblastic T-cell lymphoma; Blood, 2010, 115(5):1026-36）からの結果及び国際公開公報第２００７／０７１８２９号の教示に矛盾するが、Michelら（Combination of PSL3、Twist, CD158/KIR3DL2 and NKp46 gene expression for the diagnosis of Sezary syndrome. J Invest Dermatol. 2012; 132(2), page S50）、Bagotら（CD4(+) cutaneous T-cell lymphoma cells express the p140-killer cell immunoglobulin-like receptor. Blood. 2001 Mar 1; 97(5):1388-91）、Poszepczynska-Guigneら（CD158k/KIR3DL2 is a new phenotypic marker of Sezary cells: relevance for the diagnosis and follow-up of Sezary syndrome. J Invest Dermatol. 2004 Mar;122(3):820-3）、Ortonneら（CD158k/KIR3DL2 and NKp46 are frequently expressed in transformed mycosis fungoides. Exp Dermatol. 2012 Jun; 21(6):461-3）からの結果及び国際公開公報第０２／５０１２２号及び国際公開公報第２０１０／０８１８９０号の教示を考慮して、本発明者らは、セザリー症候群及び形質転換菌状息肉症からのＴ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ２の過剰発現を判定した。
【００４６】
ＫＩＲ３ＤＬ２発現についての陰性対照として、本発明者らの最初のアプローチは、皮膚ＰＴＣＬの亜群から他のリンパ腫型を選択すると共に、非皮膚節性及び節外性ＰＴＣＬの亜群からリンパ腫型を選択することであった。本発明の時点で、いくつかの研究チームによって行われた系統的バイオマーカーアプローチは、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現変化と、セザリー症候群、形質転換菌状息肉症及び成人リンパ腫を除くこれらのＰＴＣＬのいずれかの発生率との間に全く特定の相関関係を提供しなかったので、他のリンパ腫型は、悪性Ｔ細胞の表面にＫＩＲ３ＤＬ２を発現しないと想定された。
【００４７】
すでに言及したように、全てのＰＴＣＬがＴ細胞の細胞型における変更によって特徴付けられるという事実を除き、それらの生理学的、組織学的、臨床的及び予後的特徴は、実に多様で様々であり、これは、これらの多様な疾患を分類する困難を説明している。
【００４８】
例えば、上述されたセザリー症候群又は形質転換菌状息肉症以外の皮膚ＰＴＣは、以下のように区別され得る：
−  原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫は、中心部の潰瘍形成及び壊死、又は表在性で過角化性の斑及びプラークを示す局所性又は散在性の発疹状丘疹、結節又は腫瘍によって特徴付けられる進行性Ｔ細胞型リンパ腫である；
−  皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫は、稀な形式の緩徐進行性Ｔ細胞リンパ腫に相当し；患者は、多くの場合に、通常は脚に波及する孤立性又は多発性の結節及びプラークを有するのが見られ；結節及びプラークの潰瘍形成は、どちらかといえばあまり見られない。
【００４９】
非皮膚ＰＴＣＬに関しては：
−  成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫は、無防備性行為、分娩、母乳哺育、輸血時に伝染し得るヒトＴ細胞白血病ウイルス−１に関連し、通常その予後は不良である；
−  未分化大細胞非皮膚リンパ腫は、主にリンパ節部位を冒す、希少なリンパ腫であり；それらは、「未分化リンパ腫キナーゼ」（ＡＬＫ）と呼ばれるタンパク質の不在又は存在に応じて、それぞれＡＬＫ陰性及びＡＬＫ陽性リンパ腫に細分される。ＡＬＫ陰性患者の方が、通常、積極的な処置を要する一方で、ＡＬＫ陽性患者は化学療法に大いに応答性である；
−  血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫はよく見られるＰＴＣＬであり、進行性の経過を見せ；それらは、主にリンパ節を冒し、皮膚、肝臓又は脾臓を冒す場合がある；
−  腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫は、グルテン過敏症によって起こるセリアック病に有意に関連し；それらは、胃痛、体重減少、消化管出血又は腸穿孔によって特徴付けられる；
−  節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫−鼻型は、鼻並びに鼻及び頬の奥の副鼻腔領域を冒し、皮膚、消化管及び精巣も冒す場合があり；これらリンパ腫は、エプスタイン−バーウイルスに関連する；
−  肝脾γδＴ細胞リンパ腫は、肝臓又は脾臓に生じる希少な進行性疾患である；
−  末梢Ｔ細胞リンパ腫−非特定型は、最もよく見られるＰＴＣＬであり、ＰＴＣＬの他の下位区分によって包含できない多様な進行性Ｔ細胞リンパ腫を含み；骨髄、肝臓、消化管又は皮膚などの節外部位も冒され得るものの、大部分の患者は、リンパ節部位が冒される
と区別され得る。
【００５０】
セザリー症候群；形質転換菌状息肉症；原発性皮膚ＣＤ３０＋Ｔ細胞リンパ球増殖性障害（皮膚未分化大細胞リンパ腫及びリンパ腫様丘疹症）；皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫；原発性皮膚鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫；及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫などの皮膚ＰＴＣＬの患者の凍結皮膚試料が、Ｔ細胞表面でのＫＩＲ３ＤＬ２の過剰発現について測定された。
【００５１】
血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）；未分化大細胞リンパ腫−ＡＬＫ陰性；未分化大細胞リンパ腫−ＡＬＫ陽性；腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）；成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）；節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫−鼻型；肝脾γδＴ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）；及び末梢Ｔ細胞リンパ腫−非特定型（ＰＴＣＬ／ＮＯＳ）などの節性又は節外性非皮膚ＰＴＣＬの患者から得られた組織試料も、Ｔ細胞表面でのＫＩＲ３ＤＬ２の過剰発現について測定された。
【００５２】
結果から、全部で７人のセザリー症候群患者から得られたＴ細胞がＴ細胞表面にＫＩＲ３ＤＬ２を発現していたことが明白に確認された（実施例１参照）。
【００５３】
しかし驚くことに、セザリー症候群及び形質転換菌状息肉症に加えて、皮膚並びに非皮膚節性及び節外性ＰＴＣＬの両方のサブセットがＴ細胞表面でＫＩＲ３ＤＬ２を過剰発現していることが示された。
【００５４】
皮膚悪性Ｔ細胞リンパ腫に関しては、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫が、ＫＩＲ３ＤＬ２を発現していることが示された。
【００５５】
そのうえ、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫の両方が、２つの非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫に相当することが示された。
【００５６】
バイオマーカーとしてのＫＩＲ３ＤＬ２発現の使用
それゆえに、本発明の第１の態様は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのバイオマーカーとしての、ＫＩＲ３ＤＬ２発現レベルのインビトロの使用に関する。
【００５７】
本発明のさらなる一態様は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのバイオマーカーとしてのＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１発現レベル比のインビトロの使用に関する。
【００５８】
好ましい一実施態様では、リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫である。
【００５９】
別の好ましい実施態様では、リンパ腫は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫である。
【００６０】
本明細書に使用されるＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１発現レベル比は、（ｉ）測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルと測定されたＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベルとの間の比の値及び（ｉｉ）測定されたＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベルと測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルとの間の比の値の両方を包含する。本明細書において好ましくは、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１発現レベル比は、測定されたＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルと測定されたＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベルとの間の比の値からなる。
【００６１】
ＫＩＲ３ＤＬ２は、ＣＤ１５８ｋ及びＮＫＡＴ４遺伝子、又はＣＤ１５８ｋ／ＫＩＲ３ＤＬ２としても公知である。
【００６２】
ＫＩＲ３ＤＬ１は、ＣＤ１５８ｅ、ＮＫＢ１、ＮＫＡＴ３及びＡＭＢ１１、又はＣＤ１５８ｅ／ＫＩＲ３ＤＬ１としても公知である。本発明のために、本発明者らは、これらの名前が等価であると見なしている。
【００６３】
ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の両方は、ＨＵＧＯ（Human Genome Organisation）Gene Nomenclature Committee（特にhttp://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/index.htmlから利用可能）からのデータベースを含む配列データベースにおける対応する遺伝子及びタンパク質の国際的に認められた名称を表す。
【００６４】
健康な個体及びＰＴＣＬを患う個体においてｍＲＮＡ分析を行ったとき、ＫＩＲ３ＤＬ１がＴ細胞であまり合成されなかったことが示された。したがって、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１のそれぞれの発現レベルの間の比は、１人の個体を別の個体と直接比較できる値を提供する。
【００６５】
本発明において、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルは、ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって有利に定量される。
【００６６】
ｍＲＮＡの発現を測定するための当業者に公知の任意の方法が本発明の実施のために適しており、それらは、各ターゲットマーカーに対する特異的プライマー対を使用する周知のＲＴ−ＰＣＲ法を含む。
【００６７】
別の好ましい実施態様では、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルは、細胞性タンパク質の発現レベル、好ましくはタンパク質の表面発現レベルを測定することによって定量される。
【００６８】
好ましい一実施態様では、本発明による使用は、さらに、バイオマーカーの組み合わせの、すなわちＫＩＲ３ＤＬ２と、本発明の範囲内である前記皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫に関連することが公知の１つ以上の追加的なバイオマーカーの組み合わせの、発現レベルを測定することを含む。例証的に、１つ以上の追加的なバイオマーカーは、非限定的に、表面膜複合体ＣＤ３、表面膜タンパク質ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ５６及びＰＤ１、ＣＸＣＬ１３ケモカイン並びに細胞傷害性タンパク質であるグランザイムＢ（ＧｒＢ）及びＴ細胞細胞内抗原（ＴｉＡ１）を、ＥＢＶ（エプスタイン−バーウイルス）特異的ＥＢＥＲ（ＥＢＶコードＲＮＡ）転写物と一緒に包含する。
【００６９】
本明細書記載の本発明の一般的な実施態様によると、細胞性タンパク質の発現レベルは、特に（ｉ）全細胞試料中に含有される該タンパク質の量を測定することによって、又は（ｉｉ）細胞表面、好ましくはＴ細胞表面に存在する該タンパク質の量を測定することによって、行われ得る。
【００７０】
全細胞試料中に含有される関心対象のタンパク質マーカーの量を測定することは、細胞溶解物の可溶性画分から開始して、関心対象のタンパク質マーカーに対する抗体を当業者に周知の方法に従って使用するウエスタンブロッティングによって行われ得る。
【００７１】
ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１のそれぞれの発現値を含む、関心対象の各バイオマーカーの発現値は、任意の単位として表現され得る。例証的に、関心対象のバイオマーカーの発現値は、（ｉ）該バイオマーカー（例えばＫＩＲ３ＤＬ２又はＫＩＲ３ＤＬ１）の測定された発現値と、（ｉｉ）ＣＤ３δの発現値のように、発現レベルが一定である遺伝子の測定された発現値との間の比として表現され得る。
【００７２】
細胞表面に存在する関心対象のタンパク質マーカーの量を測定することは、当業者に周知の方法に従って、固定細胞の免疫標識又はフローイムノサイトメトリーのいずれかの免疫化学法によって行われ得る。
【００７３】
したがって、特定の実施態様では、選択されたマーカーを本明細書記載のインビトロの診断方法に従って定量することは：
−  （ｉ）免疫検出法によって、例えば１つ以上のタンパク質マーカーのそれぞれに特異的な抗体を使用して周知の免疫検出法、例えばフローサイトメトリーに従って、関心対象のタンパク質マーカーを定量することを含む免疫化学法によって、選択されたマーカーが定量されること、
−  （ｉｉ）関心対象の１つ以上のマーカーｍＲＮＡの定量を含む遺伝子発現解析によって、例えばリアルタイムＰＣＲ Taqman ＰＣＲ解析を行うことによって、選択されたマーカーが定量されること
を包含する。
【００７４】
ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによるマーカーの定量
好ましい一実施態様では、マーカーは、ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって定量される。
【００７５】
本明細書記載の実施例に示されるように、ＫＩＲ３ＤＬ２マーカー及びＫＩＲ３ＤＬ１の発現は、遺伝子ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１のそれぞれに特異的なプライマーが使用される周知の定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅技法を行うことによって測定され得る。
【００７６】
好ましい一実施態様では、試験されたマーカーのそれぞれについてのｍＲＮＡの発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲの周知の技法を使用し、次に増幅の結果として生じた２本鎖核酸と蛍光ＳＹＢＲ（登録商標）分子との間に複合体を形成させ、次に増幅された核酸と複合体を形成したＳＹＢＲ（登録商標）分子によって生成した蛍光シグナルを測定することによって行われる。
【００７７】
各遺伝子のｍＲＮＡに特異的なプライマーは、当業者に日常的な作業からなる。例証的に、当業者は、本明細書の実施例に開示されるＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１のそれぞれに対して特異的なプライマーを使用してもよい。
【００７８】
一部の好ましい実施態様では、ＫＩＲ３ＤＬ２の定量は、配列番号１及び２のプライマー対を使用することによって行われ得る：
配列番号１：フォワード５’−ＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＡＴＧ−３’；及び
配列番号２：リバース５’−ＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧ−３’。
【００７９】
いくつかの好ましい実施態様では、ＫＩＲ３ＤＬ１の定量は、配列番号３及び４のプライマー対を使用することによって行われ得る：
配列番号３：フォワード５’−ＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＣ−３’；及び
配列番号４：リバース５’−ＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣ−３’。
【００８０】
タンパク質の発現レベルを測定することによるマーカーの定量
そのような技法は、タンパク質型のマーカーを、それに特異的に結合する核酸（例えば周知のＳＥＬＥＸ法により結合について選択された核酸）、抗体及び抗体フラグメントを含む任意の型のリガンド分子を用いて検出及び定量することを含む。
【００８１】
注目すべきことに、本明細書記載のように、ＫＩＲ３ＤＬ２からなるバイオマーカー及びＫＩＲ３ＤＬ１に対する抗体は、現在すでに入手可能である。
【００８２】
例証的に、当業者は、会社Aviva Systems Biologyによって参照番号ＯＡＡＢ０５０８０７で販売されているモノクローナル抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体を使用してもよい。
【００８３】
さらに例証的に、当業者は、会社Novus Biologicalsによって参照番号ＮＰＢ−１４７００６で販売されているモノクローナル抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体を使用してもよい。
【００８４】
なお例証的には、当業者は、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１の両方に結合するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体を使用してもよい。これらの実施態様では、「ＫＩＲ３ＤＬ２」の発現レベル値は、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１の両方の発現レベル値からなる。
【００８５】
本明細書記載の実施例に示されるように、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルに比べてＫＩＲ２３ＤＬ１の発現レベルは低い。こういうわけで、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルのみの測定は、本発明による当該バイオマーカーからなる。
【００８６】
さらに、所与のマーカーに対する抗体は、抗体産生ハイブリドーマの作製を含む従来技法を用いて容易に得られ得る。
【００８７】
次に、従来技法によって調製されたハイブリドーマは、標準法を用いてスクリーニングされ、生物学的マーカータンパク質又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマが特定される。本発明は、また、この方法によって製造されたハイブリドーマ及びそのようなハイブリドーマを使用して製造された抗体を包含する。同じくポリクローナル抗体も使用してもよい。
【００８８】
したがって、好ましい実施態様では、マーカーの発現は、例えば：
−  放射性標識抗体（特に、本発明に適する放射性部分は、例えば３Ｈ、１２１Ｉ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ又は３２Ｐを含む群内より選択され得る）；
−  クロモフォア標識抗体又はフルオロフォア標識抗体（本発明に適する発光マーカー、特に蛍光マーカーは、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、蛍光プローブ型ＡＬＥＸＡ、クマリン及びその誘導体、フィコエリトリン及びその誘導体、又はＧＦＰ若しくはＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質のような、当技術分野において通常使用される任意のマーカーであり得る）；
−  ポリマー骨格抗体、
−  酵素標識抗体（本発明に適する標識化酵素は、アルカリホスファターゼ、チロシナーゼ、ペルオキシダーゼ、又はグルコシダーゼであり得；例えば、適切なアビジン標識型酵素は、アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得、適切な基質は、ＡＥＣ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）であり得る）；
−  抗体誘導体（例えば基材と、又はタンパク質−リガンド対のタンパク質若しくはリガンド、特にビオチン、ストレプトアビジン若しくはポリヒスチジンタグ結合性の抗体とコンジュゲートした抗体）；
−  抗体フラグメント（例えば、その正常な翻訳後修飾の全て又は一部を受けたマーカータンパク質を含む、マーカータンパク質又はそのフラグメントに特異的に結合する１本鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）
を使用して判定される。
【００８９】
生物学的マーカータンパク質の検出のためのインビトロの技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法及び免疫蛍光法を含む。
【００９０】
別の好ましい実施態様では、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルは、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベル比として表現される。
【００９１】
インビトロで診断及び／又は監視するための方法
別の態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量する少なくとも１つの段階を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのインビトロの方法であって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるインビトロの方法に関する。
【００９２】
本発明の範囲内で、インビトロで診断及び／又は監視するための方法は、皮膚又は非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の診断及び／又は監視を包含する。
【００９３】
好ましい一実施態様では、リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫である。
【００９４】
別の好ましい実施態様では、リンパ腫は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫である。
【００９５】
本発明内で考慮されるべき「個体」は、リンパ腫を患う臨床リスクを示す任意の対象、又はリンパ腫とすでに診断された任意の対象であり得る。好ましくは、個体は、哺乳類、より好ましくは経済的に重要性のある動物、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽、マウス、ラットなどの家畜、実験動物又は食品産業用動物であり得る。また、本発明による個体は、ヒトであり得る。より好ましくは、個体はヒトである。
【００９６】
本発明は、また、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量する少なくとも１つの段階を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのインビトロの方法であって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるインビトロの方法に関する。
【００９７】
本発明によるインビトロの方法は：
ａ）被検個体から生物学的試料を提供する段階、
ｂ）生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階、
ｃ）段階ｂ）で見出された値が該発現レベルについて予め定められた閾値と異なり、リンパ腫陽性個体を示す場合、前記リンパ腫と診断する段階
を含む。
【００９８】
有利な一実施態様では、該方法は、さらに、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量することと組み合わせて、本発明の範囲内にある皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫と関連することが公知の１つ以上の追加的なバイオマーカーの発現レベルを定量することに依存する。
【００９９】
そのような１つ以上の追加的なバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３０、グランザイムＢ及びＴｉＡ１を含む群より選択され得る。
【０１００】
本発明による使用及び方法は、好ましくは単離された生物学的試料を用いて行われる。本明細書に使用される「生物学的試料」は、一般的に、個体から入手、到達、収集又は単離された、インビボ又はインサイツの生物学的試料を表す。そのような試料は、非限定的に、哺乳類から単離された器官、組織、画分及び細胞であり得る。例示的な生物学的試料は、非限定的に、細胞培養物、細胞系、皮膚生検などの組織生検、鼻腔組織生検、消化管組織生検又はリンパ節組織生検、器官、生体液、血液試料などを含む。好ましい生物学的試料は、非限定的に、血液試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、又は皮膚生検、鼻粘膜生検、腸生検若しくはリンパ節生検を含む組織生検を含む）。試料は、粗試料の可能性があり、又は保存、処理、若しくは測定の前に様々な程度精製される可能性もある。
【０１０１】
本発明の単離された生物学的試料は、Ｔ細胞を含む。
【０１０２】
好ましい一実施態様では、本発明の使用及び方法のために生物学的試料を収集する段階は、本発明による使用又は方法の第１段階に相当し得る。
【０１０３】
別の好ましい実施態様では、本発明の使用及び方法のために生物学的試料を収集する段階は、本発明を実施する前に行われ、本発明による使用又は方法の段階ではない。
【０１０４】
一態様では、本発明に適した、Ｔ細胞を含む単離された生物学的試料は、血液試料、組織生検、液状試料からなる群より選択され得る。
【０１０５】
本発明に適した試料を、試験前に精製することができる。一部の実施態様では、血液単核細胞、好ましくはＴ細胞を、試験前に残りの含有細胞から単離することができる。血液単核細胞又はＴ細胞を分離することは、当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば密度勾配遠心分離によって行われ得る。
【０１０６】
一実施態様によると、単離された全血液試料を使用する場合、リンパ細胞及び単球細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、血漿（非細胞性成分）、好中球細胞及び好酸球などの多核細胞、並びに赤血球から分離され得る。
【０１０７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をその他の血液細胞型及び非細胞性成分から分離するための当技術分野において公知の任意の方法が実行され得る。
【０１０８】
例えば、適切な方法として、遠心分離法などの物理的分離法を挙げてもよい。適切な遠心法の例として、例えばFicoll（登録商標）を使用する勾配密度も挙げてもよい。
【０１０９】
また、例えば磁気ビーズ及びフローサイトメトリーなどの免疫学的分離法を使用してもよい。
【０１１０】
特異的マーカーＫＩＲ３ＤＬ２又は比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１についての閾値は、各特定のリンパ腫について：
ａ）（ｉ）本発明の範囲内の皮膚リンパ腫又は節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットの少なくとも１つに陽性とすでに診断された個体からの生物学的試料の収集物並びに（ｉｉ）該リンパ腫に陰性と診断された個体からの生物学的試料の収集物を提供する段階、
ｂ）段階ａ）で提供された収集物（ｉ）からの各試料について、ＫＩＲ３ＤＬ２及び場合によりＫＩＲ３ＤＬ１（比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を得るため）の発現レベルを定量することによって、該マーカーについての定量値の第１の収集物が得られる段階、
ｃ）段階ａ）で提供された収集物（ｉｉ）からの各試料について、ＫＩＲ３ＤＬ２及び場合によりＫＩＲ３ＤＬ１（比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を得るため）の発現レベルを定量することによって、該マーカーについての定量値の第２の収集物が得られる段階、
ｄ）段階ｂ）の終わりに得られた定量値の第１の収集物から、リンパ腫陰性個体における該マーカーについての平均定量値を計算する段階、
ｅ）段階ｂ）の終わりに得られた定量値の第２の収集物から、リンパ腫陽性個体の１つにおける該マーカーについての平均定量値を計算する段階、
ｆ）それぞれ段階ｄ）及びｅ）で得られた平均定量値から、リンパ腫陽性個体とリンパ腫陰性個体とを最適に識別する閾値を計算する段階
を含む方法を実施することによって決定され得る。
【０１１１】
上記方法の段階ｆ）からのリンパ腫陽性個体が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されることが意図されることを了解しなければならない。
【０１１２】
さらに、明快にするために、上記方法の段階ｆ）を説明するために使用された表現《最適に識別する》は、閾値が計算され、該値が、（ｉ）段階ｄ）で得られた平均定量値と段階ｅ）で得られた平均定量値との間にあり、リンパ腫陽性個体とリンパ腫陰性個体との間を最もよく識別することを意味する。
【０１１３】
上記閾値は、個体におけるリンパ腫の候補のサブセットからリンパ腫の信頼できる診断を行うために、本発明のインビトロの診断方法において各リンパ腫について行われるものとする。
【０１１４】
本発明からの診断方法は、具体的に定義された皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットをＰＴＣＬ疾患の大部分と識別するための第１のアプローチを提供することが意図される。
【０１１５】
実際に、本明細書開示のインビトロの診断方法を行う場合に使用され得る閾値は、分析された生物学的試料中のＫＩＲ３ＤＬ２マーカーの発現レベルを反映する任意の単位として表現され得、該発現レベルは、タンパク質の発現レベル、例えば細胞表面発現レベル、又は遺伝子の発現レベル、例えばｍＲＮＡの発現レベルのいずれかからなる。
【０１１６】
一部の実施態様では、本発明によるインビトロの方法は：
ａ）被験個体から生物学的試料を提供する段階、
ｂ）生物学的試料中の発現レベル比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を測定する段階、
ｃ）段階ｂ）で見出された値が、該比について予め決定された閾値と異なり、リンパ腫陽性個体を示す場合、前記リンパ腫を診断する段階
を含む。
【０１１７】
好ましい一実施態様では、本方法は、さらに、本発明の範囲内にある皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫に関連することが既知の１つ以上の追加的なバイオマーカーの発現レベルを定量することを包含する。
【０１１８】
本発明の別の態様は：
（ｉ）治療剤の投与前に個体から投与前の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｉ）投与前の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階；
（ｉｉｉ）個体から１つ以上の投与後の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｖ）投与後の生物学的試料中からＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定する段階；
（ｖ）投与前の生物学的試料中のＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを、１つ以上の投与後の生物学的試料中のＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルと比較する段階；及び
（ｖｉ）それに応じて個体への治療剤の投与を変更する段階
を含む、リンパ腫に対する処置を必要とする個体における、治療剤を用いた該処置の有効性を監視するための方法であって、
リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される方法に関する。
【０１１９】
好ましい一実施態様では、本発明は：
（ｉ）治療剤の投与前に個体から投与前の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｉ）投与前の生物学的試料中から発現レベル比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を測定する段階；
（ｉｉｉ）個体から１つ以上の投与後の生物学的試料を提供する段階；
（ｉｖ）投与後の生物学的試料中から発現レベルの比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を測定する段階；
（ｖ）投与前の生物学的試料中の発現レベル比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を、１つ以上の投与後の生物学的試料中の発現レベル比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１と比較する段階；及び
（ｖｉ）それに応じて個体への治療剤の投与を変更する段階
を含む、リンパ腫に対する処置を必要とする個体における、治療剤を用いた該処置の有効性を監視するための方法であって、
リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される方法に関する。
【０１２０】
有利には、本発明の範囲内のリンパ腫に対する処置の有効性を監視するための方法は、各種リンパ腫に特異的であると当技術分野においてすでに特定された１つ以上の追加的なバイオマーカーのレベルを測定することを含み得る。
【０１２１】
例えば、処置の経過中にＫＩＲ３ＤＬ２バイオマーカーの発現レベル又はＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１比を判定することによって決定される、より悪い診断は、無効な投薬量及び投薬量増加の望ましさを示し得る。逆に、選択されたマーカーの発現レベル、すなわちＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル又は比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１を判定することによって決定される、より良い診断は、有効な処置であるゆえに、投薬量を変える必要がないことを示し得る。
【０１２２】
本発明は、また、少なくとも
ａ）個体から収集された少なくとも１つの生物学的試料に本発明によるインビトロの診断方法を行う段階；及び
ｂ）個体に適切な治療法を施すことによって、個体のリンパ腫に対する処置を適応させる段階
を含む、リンパ腫に対する処置を必要とする個体において該処置を適応させるための方法であって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される方法に関する。
【０１２３】
適切な治療法は、化学療法、放射線療法及び骨髄移植を含み得る。
【０１２４】
本発明の範囲内の皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫を処置するために適した化学療法の例として、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、エトポシド、イホスファミド、カルボプラチン、ゲムシタビン、ビノレルビン、デキサメタゾン、シタラビン、シスプラチンなどが挙げられ得る。
【０１２５】
治療的関心対象の化合物をスクリーニングするための方法
ＫＩＲＤ３ＤＬ２発現レベルの増加が、皮膚並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットと特異的に相関するので、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル及び／又は生物学的活性に影響する化合物を単離、スクリーニング及び投与することは、そのような過剰増殖性Ｔ細胞リンパ腫の発生を治療及び／又は予防することに有用であり得る。関心対象の化合物は、特に、Ｔ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ２の発現阻害を誘導する化合物である。
【０１２６】
それゆえに、本発明の別の態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルに影響する化合物候補をスクリーニングするための方法であって：
ａ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現可能な少なくとも１つのＴ細胞を提供する段階；
ｂ）段階ａ）で提供された少なくとも１つのＴ細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定することによって第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が得られる段階；
ｃ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現している少なくとも１つのＴ細胞を被験候補化合物と共にインキュベートする段階；
ｄ）段階ｃ）のＫＩＲ３ＤＬ２を発現している少なくとも１つのＴ細胞によるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを測定することによって、第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が得られる段階；
ｅ）第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値を第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値と比較する段階、及び
ｆ）第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値が第１のＫＩＲ３ＤＬ２発現値よりも低い場合に候補化合物を選択する段階
を含む方法に関する。
【０１２７】
又は、ＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベル及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルの両方は、上記のスクリーニング方法の段階ｂ）及びｄ）で測定され得、第１及び第２の値に対応する比ＫＩＲ３ＤＬ２／ＫＩＲ３ＤＬ１は、それぞれ段階ｂ）及びｄ）の終わりに計算され、段階ｅ）の終わりに比較される。
【０１２８】
好ましい一実施態様では、第２のＫＩＲ３ＤＬ２発現値は、定量的な第１の値の多くとも約２分の１、例えば約３分の１、例えば約４分の１、例えば約５分の１、例えば約１０分の１、例えば約２０分の１又は例えば約５０分の１に低下される。
【０１２９】
一部の実施態様では、候補化合物は、天然起源からの精製後又は半若しくは全化学合成後のいずれかで得られ得る小有機分子を包含する。ＫＩＲ３ＤＬ２の遺伝子発現を阻害することを目標とする上記化合物に加えて、小分子又は他の天然産物が、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子のインビボ転写を阻害するために特定及び採用され得ると構想されている。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、候補化合物は、ＫＩＲ３ＤＬ２核酸の適切なヌクレオチド配列に対するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー及び／又は２本鎖ＲＮＡを包含する。これらの化合物は、過度の負担も実験もなしに、当業者に公知の従来技術を用いて同定、単離又はデノボ合成され得る。例えば、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子発現の阻害は、ＫＩＲ３ＤＬ２タンパク質をコードする遺伝子の重要な領域に標的化された、ＤＮＡ又はＲＮＡ型のアンチセンス分子を設計することによって得ることができる。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性に影響する候補化合物のスクリーニング方法であって：
ａ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現できる少なくとも１つのＴ細胞を提供する段階；
ｂ）段階ａ）で提供された少なくとも１つのＴ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を測定することによって、第１の活性値が得られる段階；
ｃ）ＫＩＲ３ＤＬ２を発現しているＴ細胞を被験候補化合物と共にインキュベートする段階；
ｄ）段階ｂ）の終わりで得られたＫＩＲ３ＤＬ２を発現しているＴ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を測定することによって、第２の活性値が得られる段階；
ｅ）第１の活性値を第２の活性値と比較する段階
を含む方法に関する。
【０１３２】
好ましい実施態様では、第２の活性値が第１の活性値よりも低い場合、さらなる段階ｆ）で候補化合物が選択される。
【０１３３】
有利には、第２の値は、定量的な第１の値の多くとも約２分の１、例えば約３分の１、例えば約４分の１、例えば約５分の１、例えば約１０分の１、例えば約２０分の１又は例えば約５０分の１に低下される。
【０１３４】
上記方法では、生物学的活性は、非限定的に膜区画でのＫＩＲ３ＤＬ２の局在又はＫＩＲ３ＤＬ２がその細胞性及び／若しくは細胞外性パートナー分子と結合及び／若しくは相互作用する能力を表す。
【０１３５】
別の態様では、本発明は、本明細書記載の皮膚並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセット内から選択されるリンパ腫の１つを有する個体の状態を処置又は改善するための方法であって、それを必要とする個体に、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル及び／又は生物学的活性に影響する少なくとも１つの化合物の、最も好ましくはＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル又は生物学的活性を阻害する少なくとも１つの化合物の、有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１３６】
別の好ましい実施態様では、ＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性に影響する化合物は、ＫＩＲ３ＤＬ２のタンパク質活性に対するアンタゴニストを包含する。
【０１３７】
アンタゴニストの投与の結果として目標とされる生物学的活性の減少は、非限定的に細胞環境中のＫＩＲ３ＤＬ２量の減少、膜区画でのＫＩＲ３ＤＬ２局在の欠損、ＫＩＲ３ＤＬ２がその細胞性及び／又は細胞外性パートナー分子と結合及び／又は相互作用する能力の減少によって起こり得る。
【０１３８】
本明細書に使用される用語「アンタゴニスト」は、ＫＩＲ３ＤＬ２の生物学的活性を減少させる分子を表す。アンタゴニストは、非限定的に、ＫＩＲ３ＤＬ２タンパク質の量又は生物学的活性を減少させるペプチド、タンパク質、核酸（ＤＮＡ型アプタマー及びＲＮＡ型アプタマー）、炭水化物、抗体又は任意の分子を含む可能性がある。
【０１３９】
好ましい一実施態様では、アンタゴニストは、該生物学的活性に関与するエピトープ決定基と結合する能力がある、抗体、又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどのその活性フラグメントである。
【０１４０】
抗体又はその活性フラグメントは、当業者に利用可能な周知の方法に従って調製することができる。
【０１４１】
本発明によって包含される阻害化合物は、医薬組成物として投与することができる。本発明による使用のためのそのような医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容し得る担体又は賦形剤を使用して従来様式で製剤化され得る。
【０１４２】
したがって、化合物並びにその生理学的に許容し得る塩及び溶媒和物は、非限定的に局所、経口、口内、全身、非経口又は結腸投与を含む任意の可能な投与経路のために製剤化され得る。
【０１４３】
キット
本発明の別の態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル、又はＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量するための手段を含む、個体におけるリンパ腫を診断及び／又は監視するためのキットであって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるキットに関する。
【０１４４】
好ましい一実施態様では、キットは、さらに、本発明の範囲内の皮膚リンパ腫並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫とすでに相関関係にある１つ以上の追加的なバイオマーカーの発現レベルを定量するための手段を含む。
【０１４５】
それゆえに、好ましい一実施態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル、又はＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量するための手段を含む、個体における皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫を診断及び／又は監視するためのキットであって、リンパ腫が、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択されるキットに関する。
【０１４６】
別の好ましい実施態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル、又はＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを定量するための手段を含む、個体における非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫を診断及び／又は監視するためのキットであって、リンパ腫が、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるキットに関する。
【０１４７】
なお好ましい一実施態様では、本発明によって包含されるリンパ腫の１つ以上と相関関係にあることが示された追加的なバイオマーカーを利用してもよい。そのような追加的なバイオマーカーは、非限定的に、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ＰＤ１、ＣＸＣＬ１３、グランザイムＢ、ＴｉＡ１である。
【０１４８】
マーカー核酸（例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）との結合に適した試薬は、相補的核酸を含む。例えば、核酸試薬は、基材に固定されたオリゴヌクレオチド（標識又は非標識）、基材と結合していない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー対、分子ビーコンプローブなどを含み得る。
【０１４９】
有利には、本発明によるキットは、ｍＲＮＡの発現レベルを測定することによってＫＩＲ３ＤＬ２及び／又はＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベルを定量可能にする。
【０１５０】
好ましい一実施態様では、キットは、ＫＩＲ３ＤＬ２又はＫＩＲ３ＤＬ１のｍＲＮＡの部分と特異的にハイブリダイズする２つのプライマーの少なくとも１つのセットを含む。これらのプライマーは、当業者がＲＴ−ＰＣＲ技法を実行できるようにする。
【０１５１】
なお好ましい一実施態様では、本発明によるキットは、細胞性タンパク質の発現レベルを、好ましくはタンパク質の表面発現レベルを測定することによって、ＫＩＲ３ＤＬ２及び／又はＫＩＲ３ＤＬ１の発現レベルを定量可能にする。
【０１５２】
タンパク質の発現は、特異的抗体によって定量され得る。なお、本発明に適した抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル型のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥであり得る。本発明に適した抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラマ、ヒト又は他の霊長類由来の抗体より選択され得る。
【０１５３】
上に定義された結合特性を有する抗体フラグメントも、本発明に適し得る。「抗体フラグメント」によって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及び他の類似物などの抗体部分が意味される。これらの用語は、また、本発明の検出可能なタンパク質への結合によって上記と同義のタンパク質複合体の状態で抗体として作用できる、任意の合成又は遺伝子操作タンパク質を含む。
【０１５４】
本発明に適した抗体又は抗体フラグメントは、例えば、「Making and using antibodies: a practical handbook」（Howard & Kaser, Ed CRC, 2006）に記載の、当業者に公知の任意の方法によって調製され得る。
【０１５５】
キットは、それぞれが核酸マーカー又はタンパク質マーカーＫＩＲ３ＤＬ２、及び場合により核酸又はタンパク質ＫＩＲ３ＤＬ１と特異的に結合する能力がある複数の試薬を含み得る。
【０１５６】
マーカータンパク質との結合に適した試薬は、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントなどを含む。
【０１５７】
したがって、本発明のさらなる一目的は、皮膚並びに節性及び節外性非皮膚リンパ腫のサブセットの発生の診断のためのキットであって、少なくとも１つのマーカー、すなわちＫＩＲ３ＤＬ２、及び場合によりＫＩＲ３ＤＬ１を定量するための手段を含むキットからなる。
【０１５８】
本発明のキットは、場合により、本発明の方法を行うために有用な追加的な成分を含み得る。例として、キットは、相補的核酸をアニーリングするため、又は抗体をそれが特異的に結合するタンパク質と結合させるために適した液体（例えばＳＳＣ緩衝液）、１つ以上の試料区画、本発明のインビトロの診断方法の性能を説明する教材などを含み得る。
【０１５９】
又は、上記のキットは、上記のＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベル及び／又は生物学的活性に影響する化合物候補をスクリーニングするために有用であり得る。
【０１６０】
以下に示す実施例は、本発明の目的を例証するためのものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１６１】
治療ターゲットとしてのＫＩＲ３ＤＬ２
ＫＩＲ３ＤＬ２は、セザリー症候群の治療法の貴重な標的として見なされると報告されている。
【０１６２】
実際に、ＫＩＲ３ＤＬ２に対して特異的にターゲティングされたモノクローナル抗体は、細胞増殖を阻害し、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を伴うメカニズムによってＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の特異的細胞死をさらに促進することが示された（国際公開公報２０１０／０８１８９０）。
【０１６３】
さらに、Sivoriら（A novel KIR-associated function: evidence that CpG DNA uptake and shuttling to early endosomes is mediated by KIR3DL2; Blood, 2010, 116(10):1637-1647）に開示されたように、ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）に富むいくつかのオリゴデオキシヌクレオシドが、セザリー個体からのＴ細胞及びＮＫ細胞（ナチュラルキラーリンパ球）の両方由来のＫＩＲ３ＤＬ２に結合することが示され、ＫＩＲ３ＤＬ２発現ＮＫ細胞からのサイトカイン放出を誘発し得る。
【０１６４】
ＣｐＧ ＯＤＮは、自然免疫を活性化することによって腫瘍退縮を誘導し、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を高め、特異的防御免疫応答を誘発する貴重なワクチンアジュバントであり、様々な種類のがん性及び非がん性疾患の処置のための優れた候補であると報告されている（Bodera et al. Synthetic immunostimulatory oligonucleotides in experimental and clinical practice. Pharmacol Rep. 2012 Sep;64(5):1003-10）。
【０１６５】
さらに、多くの場合に対照ＯＤＮとして使用されるＧｐＣ ＯＤＮ（ＧｐＣジヌクレオチドに富むオリゴヌクレオチド）も試験された。
【０１６６】
ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の処置のための化合物又は医薬組成物
複数の特異的Ｔ細胞リンパ腫がＴ細胞表面にＫＩＲ３ＤＬ２を発現するという、本明細書に開示された本発明者らの知見は、本発明者らがこれらの特定のＴ細胞リンパ腫を処置するための新規な治療ツールを設計できるようにした。
【０１６７】
より正確には、本明細書に開示された本発明者らの知見は、ＫＩＲ３ＤＬ２に結合性のリガンドである治療ツールであって、ＫＩＲ３ＤＬ２へのリガンドの結合事象が悪性Ｔ細胞の死滅を引き起こす治療ツールを設計できるようにした。
【０１６８】
別の態様では、本発明は、セザリー症候群、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を記載する。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子に関する。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子に関する。
【０１７１】
なお別の一態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子に関する。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子に関する。
【０１７３】
本発明によるリガンド分子は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の死滅を特異的に誘導する能力がある。特に、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の死滅は、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を含む群より選択される過程によって媒介される。
【０１７４】
本発明によるリガンド分子は、抗体、抗体のフラグメント及びオリゴデオキシヌクレオチドを含む群より選択される。
【０１７５】
好ましい一実施態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合する抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体に関する。
【０１７６】
別の好ましい実施態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合する抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体に関する。
【０１７７】
なお別の好ましい一実施態様では、本発明は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合する抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体に関する。
【０１７８】
本発明の範囲内の抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、例えばハイブリドーマ法などの、当業者に公知の方法に従って得ることができる。抗体産生を高めるために、当技術分野において公知の様々なアジュバントを採用することができる。
【０１７９】
抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、モノクローナル抗体が好ましいものの、ポリクローナルであってもよい。
【０１８０】
当業者は、その表面にＫＩＲ３ＤＬ２を発現している悪性Ｔ細胞を枯渇させるために適した抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体、例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、細胞増殖の阻害又は細胞死の誘導（例えばアポトーシスを介する）を介して悪性ＫＩＲ３ＤＬ２発現Ｔ細胞を枯渇させる抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体を容易に選択することができる。
【０１８１】
抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）は、例えば、Nelsonら（51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Curr Protoc Immunol. 2001 May; Chapter 7: Unit 7.27）；Broussasら（Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods Mol Biol. 2013; 988:305-17によって開示されたプロトコールに従って判定してもよい。
【０１８２】
補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）は、例えば、Harmerら（A highly sensitive, rapid screening method for the detection of antibodies directed against HLA class I and class II antigens. Transpl Int 1993; 6:277-80）；Robsonら（A comparison of flow cytometry screening methods. Eur J Immunogenetics 1999; 26:43-80）；Broyerら（Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 2013; 988:319-29）によって開示されたプロトコールに従って判定してもよい。
【０１８３】
アポトーシスは、当業者に周知の多数のプロトコール又はキットによって判定され得る。
【０１８４】
例えば、アポトーシスは、例えばCaspase 3 Activity Assay（Roche Applied Science）、Apo-ONE（登録商標）Homogeneous Caspase-3/7 Assay（Promega）、EnzChek（登録商標）Caspase-3 Assay Kit #1（Invitrogen）などの市販されているキットの１つを製造業者の説明書に従って使用することによって、カスパーゼ誘導型活性をアッセイすることによって判定してもよい。
【０１８５】
アポトーシスは、また、例えばApoptotic DNA Ladder Kit（Roche Applied Science）、DeadEnd（商標）Fluorometric TUNEL System（Promega）、APO-BrdU（商標）TUNEL Assay Kit（Invitrogen）、Apoptotic DNA Ladder Kit（Genotech）などの市販されているキットの１つを製造業者の説明書に従って使用することによって、タネル及びＤＮＡのフラグメンテーションをアッセイすることによって判定してもよい。
【０１８６】
例えば細胞透過性を測定する、アネキシンＶによってホスファチジルセリンを染色する、ミトコンドリア膜電位を測定するなどの他の方法が、アポトーシスを判定するために利用可能である。
【０１８７】
有利には、本発明の範囲内でリガンド分子がＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の死滅を誘発する能力は、単離された細胞系でインビトロの判定をされ得る。
【０１８８】
そのようなアッセイ法のために利用可能なセザリー症候群細胞系の非限定的でもある例証的な一例として、ＨＵＴ−７８（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からATCC T1B-161として入手可能）；ＨＨ（ATCC CRL-2105）、ＳｅＡｘ（Kaltoft et al. A continuous T-cell line from a patient with Sezary syndrome. Arch Dermatol Res. 1987; 279(5):293-8.）；ＭｙＬａ ２０５９（Kaltoft, University of Aahrus, Denmark）；Ｐ１（Marie-Cardine et al. Killer cell Ig-like receptors CD158a and CD158b display a coactivatory function, involving the c-Jun NH2-terminal protein kinase signaling pathway, when expressed on malignant CD4+ T cells from a patient with Sezary syndrome. Blood 2007; 109: 5064-5）；ＰＮＯ（Poszepczynska et al. Functional characterization of an IL-7-dependent CD4(+)CD8alphaalpha(+) Th3-type malignant cell line derived from a patient with a cutaneous T-cell lymphoma. Blood 2000; 96:1056-1063）を挙げることができる。
【０１８９】
ヒト化抗体を含む抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体及びその抗体フラグメントは、公知の技法に従って調製され得る。特定の一実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体である。
【０１９０】
別の特定の実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、すなわち最小認識部分を担持するフラグメントの群より選択される抗体フラグメントである。
【０１９１】
なお好ましい一実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。
【０１９２】
好ましくは、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導する。特定の実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３ヒトアイソタイプ抗体である。他の実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ヒトアイソタイプ抗体である。
【０１９３】
別の好ましい実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、補体細胞傷害メカニズム（ＣＤＣ）を誘導する。
【０１９４】
別の好ましい実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、アポトーシスを誘導する。
【０１９５】
好ましい一実施態様では、リガンド分子は、以前にParoliniら（The AZ158 ｍＡｂ specifically reacts with p70 and p140 inhibitory NK receptors for HLA-B and HLA-A alleles. Leukocyte Typing VII. 2002. In: (Mason D, Andre P, Bensussan A, Buckley C, Civin C, Clark E et al., eds) Oxford: Oxford University Press, 415-417）に記載されたＡＺ１５８モノクローナル抗体ｍＡｂである。
【０１９６】
好ましい一実施態様では、リガンド分子は、Ｑ６６モノクローナル抗体（Pende et al. The natural killer cell receptor specific for HLA-A allotypes: a novel member of the p58/p70 family of inhibitory receptors that is characterized by three immunoglobulin-like domains and is expressed as a 140-kD disulphide-linked dimer. J Exp Med. 1996;184:505-18）である。
【０１９７】
好ましい一実施態様では、本発明によるリガンド分子は、ＡＺ１５８及びＱ６６モノクローナル抗体を含む群より選択される。
【０１９８】
別の態様では、本発明は、セザリー症候群、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するオリゴデオキシヌクレオチドを記載する。
【０１９９】
一態様では、本発明は、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【０２００】
一態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【０２０１】
別の態様では、本発明は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【０２０２】
別の態様では、本発明は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【０２０３】
本明細書の実施例において、セザリー個体由来のＴ細胞のＣｐＧ ＯＤＮ処置が、（ｉ）Ｔ細胞表面でのＫＩＲ３ＤＬ２へのＣｐＧ ＯＤＮの結合；（ｉｉ）ＫＩＲ３ＤＬ２のインターナリゼーションによるＴ細胞表面からのその枯渇；及び予想外に（ｉｉｉ）カスパーゼ依存性アポトーシス経路の誘導を招くことが示される。
【０２０４】
文書である国際公開公報第０１／２２９７２号及びEP2290078は、その免疫刺激機能のための、顕著には様々な種類のがんを処置するための、ＣｐＧ ＯＤＮの使用に関するものとして挙げられ得る。
【０２０５】
有利には、本発明によるリガンド分子は、配列番号５の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ａ；配列番号６の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｂ；配列番号７の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、それらの混合物及びそれらの類似体を含む群より選択されるオリゴデオキシヌクレオチドであり得る。
【０２０６】
配列番号５の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ａ；配列番号６の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｂ；配列番号７の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃを含む群より選択されるオリゴデオキシヌクレオチドの類似体は、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のいずれかと少なくとも５０％同一の、例えば少なくとも６０％同一の、少なくとも７０％同一の、少なくとも８０％同一の、少なくとも９０％同一の、少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０２０７】
好ましい一実施態様では、本発明によるリガンド分子は、配列番号７の配列のオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃであり得る。
【０２０８】
驚くことに、多くの場合にＣｐＧ ＯＤＮ陰性対照として使用されるＧｐＣ ＯＤＮが、アポトーシスを誘導するためのＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞処置について判定するために使用された場合、それは、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと同じくらい活性であることが見出された。
【０２０９】
それゆえに、本発明の別の実施態様では、ＧｐＣ ＯＤＮは、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するリガンド分子である。
【０２１０】
好ましい一実施態様では、配列番号８の配列のＧｐＣ ＯＤＮは、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞を処置するためにリガンド分子として使用され得る。
【０２１１】
別のさらなる実施態様では、配列番号８と少なくとも５０％同一の、例えば少なくとも６０％同一の、少なくとも７０％同一の、少なくとも８０％同一の、少なくとも９０％同一の、少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、配列番号８の配列のオリゴデオキシヌクレオチドＧｐＣ ＯＤＮの類似体は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞を処置するリガンド分子として使用され得る。
【０２１２】
したがって、より有利には、本発明によるリガンド分子は、配列番号５の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ａ；配列番号６の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｂ；配列番号７の配列のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ；配列番号８の配列のＧｐＣ ＯＤＮ、それらの混合物及び／又はそれらの類似体を含む群より選択されるオリゴデオキシヌクレオチドであり得る。
【０２１３】
なお好ましい一実施態様では、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体は、両方のリガンド分子の作用を増強するようなオリゴヌクレオチド又はその類似体との混合物の状態である。
【０２１４】
好ましい一実施態様では、本発明の範囲内のリガンド分子は、細胞傷害性アッセイ法で判定されるとき、細胞死の少なくとも約１０％、例えば約２０％、例えば約３０％、例えば約４０％、例えば約５０％、例えば約６０％、例えば約７０％、例えば約８０％、例えば約９０％を誘導する能力がある。
【０２１５】
皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫，及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択されるＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の予防及び／又は治療のための、本発明において同義のリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【０２１６】
さらに、本発明は、また、皮膚リンパ腫のサブセット並びに非皮膚節性及び節外性リンパ腫のサブセットの予防及び／又は治療のための、ＫＩＲ３ＤＬ２の細胞外ドメインに特異的に結合し、悪性Ｔ細胞の細胞死を誘導できるリガンド分子に関する。
【０２１７】
本発明は、さらに、ＫＩＲ３ＤＬ２受容体、特にＫＩＲ３ＤＬ２受容体の細胞外ドメインと結合するリガンド分子が、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞の増殖低下を、すなわち、ＫＩＲ３ＤＬ２介在性阻害シグナルを誘導することによって誘導する能力があるという発見に起因する。
【０２１８】
一部の実施態様では、治療組成物及び治療計画は、本明細書に開示され、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫などのＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫と以前に診断された個体を処置するために使用される。
【０２１９】
ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫を処置するための方法
本発明のさらなる一態様は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体にＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を投与することを含む方法に関する。
【０２２０】
特に、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫は、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【０２２１】
本発明のさらなる一態様は、皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体にＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を投与することを含む方法に関する。
【０２２２】
特に、皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫は、形質転換皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【０２２３】
本発明のさらなる一態様は、非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体にＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を投与することを含む方法に関する。
【０２２４】
特に、非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【０２２５】
別の態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体に、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０２２６】
好ましい一実施態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体に、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関し、その際、リンパ腫は、形質転換菌状息肉症、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【０２２７】
別の好ましい実施態様では、本発明は、皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体に、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関し、その際、リンパ腫は、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【０２２８】
なお別の好ましい一実施態様では、本発明は、非皮膚ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体に、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関し、その際、リンパ腫は、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫を含む群より選択される。
【０２２９】
好ましい一実施態様では、本発明は、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法であって、個体に、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子を、Ｔ細胞を枯渇させるのに十分な量で投与することを含む方法に関係する。
【０２３０】
好ましい一実施態様では、ＫＩＲ３ＤＬ２に特異的に結合するリガンド分子は、循環性及び／又は器官局在型の悪性Ｔ細胞を枯渇させる。
【０２３１】
好ましい一実施態様では、本明細書開示のリガンド分子又は医薬組成物の投与計画は、医師によって制定される。処置を必要とする特定の個体に特異的な、治療的に有効な投与計画及びＴ細胞を枯渇させるために十分な量は、処置されるＴ細胞リンパ腫及び障害の重症度；年齢；体重；全身の健康状態；性別；食事；投与の時間経過；投与経路；処置の持続期間；本発明の範囲内のリガンド分子又は医薬組成物と一緒に同時投与される薬物を非限定的に含む多様な要因に依存する。
【０２３２】
最も好ましい一実施態様では、本明細書開示のリガンド分子又は医薬組成物の投与計画は、成人１人あたり１日約０．０１〜約１，０００mgの範囲であり得る。好ましくは、処置を必要とする特定の個体に最も適した投与計画を調整するために、患者に約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの量のリガンド分子が投与される。本発明の範囲内の医薬組成物は、リガンド分子約０．０１mg〜約５００mg、好ましくはリガンド分子約１mg〜約１００mgを含有し得る。
【０２３３】
好ましい一実施態様では、リガンド分子の有効量は、１日約０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、特に１日約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の投与計画で日常的に投与される。
【０２３４】
本発明による薬学的投薬単位中に含まれるべきリガンド分子の最適量は、日常的な公知のプロトコール又は方法を使用して当業者によって容易に適応され得る。
【０２３５】
本明細書開示のリガンド分子及び医薬組成物は、任意の適切な経路、すなわち非限定的に経口、舌下、口内、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、くも膜下腔内及び鼻腔内並びに直腸投与を含む経路によって投与される。
【０２３６】
有利には、本発明に開示の、ＫＩＲ３ＤＬ２発現悪性Ｔ細胞リンパ腫の処置を必要とする個体における該処置のための方法は、細胞死の少なくとも約１０％、例えば約２０％、例えば約３０％、例えば約４０％、例えば約５０％、例えば約６０％、例えば約７０％、例えば約８０％、例えば約９０を誘導する能力がある。
【０２３７】
実施例
実施例１：皮膚、非皮膚末梢節外性及び節性Ｔ細胞リンパ腫におけるＫＩＲ３ＤＬ２の発現
１）材料及び方法
１．１）材料及び方法
組織試料は、様々な収集物から回収し、全ての症例で現行の分類に従って診断を行った（Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. In: press IARC, ed. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid tissues (ed 4th). Lyon; 2008）。以下のリストに開示される各リンパ腫群について、国際疾病分類−腫瘍学（ＩＣＤＯ）コードをカッコ内に示す。
【０２３８】
ａ）皮膚Ｔ細胞リンパ腫
セザリー症候群（９７０１／３）の患者の凍結皮膚試料ＫＩ０４０２８、ＫＩ１００２５及びＫＩ１８０２７を、Nicolas ORTONNE博士を主任研究者及びコーディネーターとする国家研究プロジェクトＰＨＲＣ（programme hospitalier de recherche clinique）ＫＩＲから収集した。それらは、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて血液及び皮膚の両方においてＫＩＲ３ＤＬ２ ｍＲＮＡ転写物の強い発現が実証されたが、ＫＩＲ３ＤＬ１の顕著な発現は見られなかったセザリー症候群患者より選択された。加えて、皮膚及び関連するリンパ節標本の両方を用いて、病理部門からの他のセザリー症候群の２症例（日常的な診療）を検討した。
【０２３９】
他の皮膚Ｔ細胞リンパ腫からの凍結皮膚試料を、Henri Mondor病院（AP-HP, groupe hospitalier Henri Mondor Albert Chenevier）の病理部門の保管ファイルから回収した。これらの試料は：
−  ３つの形質転換菌状息肉症（９７００／３ｔ）；
−  ４つの原発性皮膚ＣＤ３０＋Ｔ細胞リンパ球増殖性障害（２つの皮膚未分化大細胞リンパ腫（９７１８／３）及び２症例のリンパ腫様丘疹症（９７１８／１））；
−  ４つの皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫（９７０８／３）；
−  １つの原発性皮膚鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（９７１９／３）；
−  ２つの原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫（９７０９／３）
を含んだ。
【０２４０】
ｂ）節性及び非皮膚節外性リンパ腫
節性及び非皮膚節外性リンパ腫からの凍結皮膚試料を、Philippe GAULARDを主任研究者及びコーディネーターとする研究プロジェクトＰＨＲＣ ＴＥＮＯＭＩＣから収集した。本発明者らは、日常的な組織学的管理において７０％を超える腫瘍細胞を有する症例を選択した。これらの試料は：
−  ４つの血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ、９７０５／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ０６０、２６８、４２４、４１５；
−  ３つの未分化大細胞リンパ腫−ＡＬＫ陰性（９７０２／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ１０５、２１３、２３８；
−  ６つの腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ、９７１７／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ０４６、４１８、４４１、２１０、３１９、３５８、４１３；
−  ８つの成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ、９８２７／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ２８５、２５７、３４０、３６１、０６６、２５６、５４０、５６０；
−  ４つの節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型（９７１９／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ０５３、２４６、４１９、５７９；
−  ７つの肝脾γδＴ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ、９７１６／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ０１４、０３７、１８１、０１４、０３７、１８１、１８３；
−  ４つの末梢Ｔ細胞リンパ腫−非特定型（ＰＴＣＬ／ＮＯＳ、９７０２／３）：ＴＥＮＯＭＩＣ２１４、２２５、２３２、４６９
を含んだ。
【０２４１】
加えて、５つの未分化大細胞リンパ腫−ＡＬＫ陽性（９７０２／３）Ｐ９７１０７３０、Ｐ０５５４０１、Ｐ００１６６３２、Ｐ００１１３８７２、Ｐ１２６３７０の凍結切片を、Institut Universitaire du Cancer de Toulouse - Oncopoleの病理部門のLaurence LAMANT博士から得た。
【０２４２】
１．２）免疫組織化学
免疫染色手順について、厚さ３μmの切片をSuperfrost plusスライド（CML, Angers, France）上に適用した。各症例で切片をヘマトキシリン−エオシン及びサフラン（ＨＥＳ）で染色して、組織試料の品質（壊死）をチェックし、腫瘍性浸潤の存在を確認した。
【０２４３】
ＫＩＲ３ＤＬ２の免疫染色を、１：５０希釈したマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（クローン５．１３３, Miltenyi Biotec, Paris, France）を使用して加湿チャンバー内で１時間インキュベーションして手作業で行った。この抗体は、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＩＲ３ＤＬ１の両方と反応する。染色を、ペルオキシダーゼ（Dako SA, Glostrup, Denmark）にコンジュゲートしたEnVision（登録商標）増幅システムを使用して行った。ペルオキシダーゼ反応をアミノエチルカルバゾールによって明らかにし、ヘマトキシリンを用いて切片を青に対比染色した。
【０２４４】
各症例で、全試料についてＴ細胞マーカー（ＣＤ３）、未分化大細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ３０＋Ｔ細胞リンパ球増殖性障害についてＣＤ３０、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫についてＣＤ８及びグランザイムＢ、皮膚及び節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型についてＣＤ５６及びグランザイムＢ、ＡＩＴＬについてＣＸＣＬ１３及びＰＤ１、ＡＴＬＬについてＣＤ２５、ＨＳＴＬについてＣＤ５及びＴｉＡ１を含む古典的表現型マーカーの発現についてチェックするために他の免疫染色を行った。これらの追加的な染色を、ペルオキシダーゼ（Vectastain（登録商標）ＡＢＣ−Ｐキット、Vector, Burlingame, USA製）にコンジュゲートしたビオチン／アビジンシステムを使用して手作業で、又はBond-Max自動装置（Menarini, Leica）を使用してのいずれかで行った。ペルオキシダーゼ反応をジアミノベンジジン（Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France）によって明らかにし、ヘマトキシリンを用いて切片を青に対比染色した。
【０２４５】
Axioskop 2顕微鏡（Zeiss, Germany）を使用してスライドを分析し、デジタルカメラEOS 600D（Canon, France）を使用して画像を取得した。
【０２４６】
１．３）ＲＴ−ＰＣＲ研究
LightCycler 2.0システム（Roche Diagnostics, Meylan, France）でRoche Diagnostics（Meylan, France）製SYBR Green PCRキットを使用して、ＣＤ３（δ鎖）、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１についての定量ＰＣＲ反応を行った。融解曲線及びアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の純度を立証した。以前に記載されたようにリンパ球に安定的に発現することから対照ハウスキーピング遺伝子として選択されたスプライシング因子３ａの１２０kDaサブユニットをコードするＳＦ３Ａ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量によって規準化を達成した。ＰＣＲ試料は、４mM ＭｇＣＬ２、０．４μMの各プライマーを含有し、増幅サイクリング条件は以下のようであった：９４℃変性、ハイブリダイゼーション６０℃１０秒及び伸長７２℃２５秒を４０サイクル。転写物の発現を、以前に記載されたようにリアルタイムＰＣＲの相対定量によって測定した。異なるアッセイ法の間で等価の最適増幅効率を得るように、全てのＰＣＲ条件を調整した。得られた直線グラフを使用することによって、Light Cyclerソフトウェア4.0（Roche）を用いてＰＣＲ効率を調整後にΔΔＣｔ法により各試料についてＣｔ値の差を決定し、検量用試料中に存在するｍＲＮＡの相対パーセンテージとして表現した。非特異的産物の存在が対照アガロースゲル上で検出された場合は、定量を信頼できないと見なした。
【０２４７】
陽性染色された皮膚Ｔ細胞リンパ腫、すなわち１つの原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫及び２つの皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫で定量ＲＴ−ＰＣＲ研究を行った。
【０２４８】
凍結切片に対して総ＲＮＡの抽出を行い、Trizol中に移行させ、直ちに均質化し、その後クロロホルム／イソプロパノールで沈殿させた。次にHigh Capacity cDNA Reverse Transcription with RNase Inhibitor kit（Applied Biosystems）を製造業者の説明書に従って使用することによって総ｍＲＮＡを逆転写させた。
【０２４９】
ＫＩＲ３ＤＬ２を定量するために使用されたプライマーは、配列番号１及び配列番号２のプライマーであり得る：
配列番号１：フォワード５’−ＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＡＴＧ−３’
配列番号２：リバース５’−ＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧ−３’。
【０２５０】
ＫＩＲ３ＤＬ１を定量するために使用されたプライマーは、配列番号３及び４のプライマーであり得る：
配列番号３：フォワード５’−ＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＣ−３’
配列番号４：リバース５’−ＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣ−３’。
【０２５１】
以前の刊行物（Ortonne et al. CD158k/KIR3DL2 and NKp46 are frequently expressed in transformed mycosis fungoides. Exp Dermatol. 2012 Jun; 21(6):461-3）と同様にＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２転写物の特異的な検出を可能にする、新たに設計されたプライマー及びＳＹＢＲ（登録商標）グリーン並びにABI 7900HT装置（Applied Biosystems）を使用して増幅を行った。
【０２５２】
ＳＦ３Ａ１ハウスキーピング遺伝子を検量用試料として使用した。ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２受容体の発現レベルを、Ｔ細胞リンパ球の密度における差による潜在的バイアスを避けるために最終的にＣＤ３δに対する比として表現した。
【０２５３】
２つのＨＳＴＬ並びに１つのＥＡＴＬ及びＡＴＬＬ（ＰＨＲＣ ＴＥＮＯＭＩＣ）において、凍結標本から総ｍＲＮＡを抽出後のトランスクリプトーム解析（Affymetrix U133 Plus 2.0）によってＫＩＲ３ＤＬ２のｍＲＮＡレベルを検討し、全てのＨＳＴＬ及びＡＩＴＬと比較した。
【０２５４】
２）結果
２．１）免疫組織化学
図１及び２からの結果を下の表１に要約する。
【０２５５】
【表１】
2016529208.tif 000002
【０２５６】
１ＩＣＤＯは、国際疾病分類−腫瘍学を意味する；２ＩＨＣは、免疫組織化学を意味する；３ＧｒＢは、グランザイムＢを意味する；４腫瘍性及び／又は反応性であり得る、分散した陽性細胞のみが特定された；５１症例は原発性皮膚型であり、その他の３症例は鼻腔からであった；６ＥＢＥＲ転写物。
【０２５７】
全ての症例で、ＨＥＳを用いた標準染色は、組織壊死及びＴ細胞腫瘍浸潤物の存在を全く示さないか、又はわずかだけ示した。古典的表現型マーカーの発現が全試料で実証された（データは示さず）。
【０２５８】
全てのセザリー症候群の皮膚試料におけるＫＩＲ３ＤＬ１／２染色は、予想通り腫瘍浸潤物における膜染色を示し、バックグラウンドの染色は示さなかった（図１Ａ及び１Ｂ）。表皮、皮膚付属器（cutaneous adenexae）、正常な真皮細胞及び皮下組織を含む無関係の構造では染色は明らかでなかった。２症例からのリンパ節においても強くびまん性の染色が明らかであった。
【０２５９】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫群では、形質転換菌状息肉症（ｎ＝１／３、図１Ｃ及び１Ｄ）並びに原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫（図１Ｅ及び１Ｆ）において顕著なびまん性で強い染色が明示された。全ての皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫において、分散したＫＩＲ３ＤＬ１／２＋細胞が存在したが、主に脂肪細胞周囲に局在する大部分の腫瘍細胞で染色は陽性でなかった。
【０２６０】
末梢Ｔ細胞リンパ腫群では、図２ＢにおけるＰＴＣＬ／ＮＯＳ試料について示されるように、分散したＫＩＲ３ＤＬ１／２＋細胞があるだけで、大部分の症例が染色されなかった。ＥＡＴＬの１症例（ｎ＝１／３、図２Ｃ及び２Ｄ）並びにＡＴＬＬの１症例（ｎ＝１／４、図２Ｅ及び２Ｆ）は、強くびまん性のＫＩＲ３ＤＬ１／２の発現を示した一方で、検討されたＨＳＴＬの全試料は、びまん性で強いＫＩＲ３ＤＬ１／２の発現を示した（図２Ｇ及び２Ｈ）。
【０２６１】
【表２】
2016529208.tif 000003
【０２６２】
追加的な１６個体のコホートによって得られた結果から、ＫＩＲ３ＤＬ２が：
−  ２つの皮膚ＰＴＣＬ、すなわち皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、並びに
−  ２つの非皮膚ＰＴＣＬ、すなわち腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び肝脾γδＴ細胞リンパ腫
についての関連バイオマーカーであることが確認された。
【０２６３】
したがって、ＫＩＲ３ＤＬ２は、形質転換菌状息肉症、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などのリンパ腫を有する患者の亜集団を診断するためのバイオマーカーであり得る。ＫＩＲ３ＤＬ２は、これらの特定の皮膚並びに非皮膚節性及び節外性リンパ腫の予後を判定するための優れた候補であり得ることも示唆できる。
【０２６４】
２．２）ＲＴ−ＰＣＲ研究
定量ＲＴ−ＰＣＲ研究から、研究された全ての皮膚Ｔ細胞リンパ腫において顕著に少ないＫＩＲ３ＤＬ１を伴うＫＩＲ３ＤＬ２の有意な発現が示された（表３）。
【０２６５】
【表３】
2016529208.tif 000004
【０２６６】
以前に行われたように特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した（Ortonne et al. CD158K/KIR3DL2 Transcript detection in lesional skin of patients with erythroderma is a tool for the diagnosis of Sezary syndrome. J Invest Dermatol 2007; 128: 465-72）。ＳＦ３Ａ１ハウスキーピング遺伝子を用いて各受容体の発現を較正し、第３及び４列に示したデータは、各受容体とＣＤ３δ鎖との間のΔΔＣｔ値の比を表す。
【０２６７】
セザリー症候群試料についてのＫＩＲ３ＤＬ２のΔΔＣｔ値（×１０）は５．８３、３１．６及び６．４であり、一方でＫＩＲ３ＤＬ１についての値は、それぞれ０．０３、０及び０．４３であった。同様に、陽性染色された形質転換菌状息肉症において、ΔΔＣｔ値はＫＩＲ３ＤＬ２について１５．１６、ＫＩＲ３ＤＬ１について０．２３であった。原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫でも、ＫＩＲ３ＤＬ２転写物は、ＫＩＲ３ＤＬ１よりもずっと高い率で、ＫＩＲ３Ｄ２／ＫＩＲ３ＤＬ１比１３０．１４で発現されるように見えた。
【０２６８】
２つの皮下脂肪織炎様リンパ腫においても、ＫＩＲ３ＤＬ２転写物はＫＩＲ３ＤＬ１よりも多く発現されたが、ＫＩＲ３ＤＬ１との差はあまり顕著でなかった。したがって、これらの症例はむしろＫＩＲ３ＤＬ１よりもＫＩＲ３ＤＬ２を発現し、抗ＫＩＲ３ＤＬ１／２クローン５．１３３が腫瘍細胞表面でＫＩＲ３ＤＬ２を染色したと結論することができる。図３に示すように、２つのＨＳＴＬ試料において、並びに陽性染色を示しているＥＡＴＬ及びＡＴＬＬ試料において、トランスクリプトーム解析によっても、他の末梢Ｔ細胞リンパ腫よりもずっと高いレベルで有意なＫＩＲ３ＤＬ２のｍＲＮＡ発現が確認された。
【０２６９】
本結果が、ＰＴＣＬ「非特定型」（ＰＴＣＬ／ＮＯＳ）のサブセットについての推定上のバイオマーカーとしてとしてＫＩＲ３ＤＬ２を報告したIqbalら（Molecular signature to improve diagnosis in peripheral T-cell lymphoma and prognostication in angioimmunoblastic T-cell lymphoma; Blood, 2010, 115(5):1026-36）によって得られた結果と矛盾するように見えることに留意すべきである。しかし、ＰＴＣＬ／ＮＯＳは、１つの特定の定義済み下位区分に割り当てることができなかったので、それらが別個の性質の多様なリンパ腫を包含することに気づき得る。
【０２７０】
３）結論
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫及び原発性皮膚ＣＤ８＋進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫）並びに真皮外末梢Ｔ細胞リンパ腫（一部の肝脾Ｔ細胞リンパ腫及び腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫）のサブセットは、ＫＩＲ３ＤＬ２を発現し、したがって標的化療法の優れた候補であるように見える。
【０２７１】
皮下「脂肪織炎様」Ｔ細胞リンパ腫を除き、大多数の腫瘍細胞が抗ＫＩＲ３ＤＬ１／２モノクローナル抗体で染色された。ＲＴ−ＰＣＲの結果が入手可能であった全ての症例で、ＫＩＲ３ＤＬ１よりもずっと高いレベルでＫＩＲ３ＤＬ２転写物が検出された。抗ヒトＫＩＲ３ＤＬ１／２マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（クローン５．１３３、Miltenyi Biotec, Paris, France）を使用する組織試料におけるＫＩＲ３ＤＬ２発現の特定は、ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ腫の特定のために信頼できるものであった。
【０２７２】
実施例２：ＫＩＲ３ＤＬ２に結合性のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＡＺ１５８又はＣｐＧ ＯＤＮは、セザリー症候群悪性Ｔ細胞において別個の細胞死経路を誘導する
１）材料及び方法
１．１）患者及び細胞
セザリー症候群の診断は、承認された国際的な臨床的、組織学的及び生物学的基準で確定された。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＫＩＲ３ＤＬ２＋細胞が９０％を超えるセザリー症候群の患者１５人からの血液を本研究のために収集したが、これは、施設内倫理委員会によって承認されたものである（Saint Louis Hospital, Paris)。
【０２７３】
ヘパリン処理静脈血から、リンパ球分離培地（ＬＳＭ; PAA Laboratories, Les Mureaux, France）を用いる密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
【０２７４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを製造業者のプロトコール（Miltenyi Biotech）に従って使用するＭＡＣＳによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。本研究に使用されたセザリー細胞系を樹立し、以前に記載されたように増幅させ、安定な表現型を維持した。２mM Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）及び１０％ヒト血清（Jacques Boy Biotechnologies Institute）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で細胞を培養した。
【０２７５】
１．２）ＣｐＧ ＯＤＮ、ＧｐＣ ＯＤＮ又は抗体の細胞処置
ＣｐＧ ＯＤＮ及びＧｐＣ ＯＤＮ処置のために、細胞を２４ウェルプレート中で２×１０６個/mlの濃度で表示時間（１、４又は７日）培養した。以下のＣｐＧ ＯＤＮ及びＧｐＣ ＯＤＮを終濃度１０μg/mlで使用した：ＣｐＧクラス−Ａ（ＯＤＮ ２３３６）、ＣｐＧクラス−Ｂ（ＯＤＮ ２００６）、ＣｐＧクラス−Ｃ（ＯＤＮ ２３９５）、ＧｐＣ（ＯＤＮ ２３９５対照）及び対照ＯＤＮ（ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ）（全てInvivogen製）。
【０２７６】
【表４】
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【０２７７】
１大文字の塩基はホスホジエステルであり、小文字の塩基はホスホロチオアートである。
【０２７８】
インキュベーションは最大１２日間処理した。
【０２７９】
短時間刺激について、細胞を無処置のままとするか、又は抗ＣＤ３（ＣＤ３ｘ３、ＩｇＧ１；局所産生）、抗ＫＩＲ３ＤＬ２（ＡＺ１５８、ＩｇＧ２ａ;Innate Pharma, Marseille, Franceによって親切にも提供された）若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に単独で若しくは組み合わせて処置し、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｂ（Beckman Coulter）と３７℃で５分間架橋形成させた。
【０２８０】
増殖アッセイ法及びアポトーシスアッセイ法を、表示の抗体、ＣｐＧ ＯＤＮ及び／又はＧｐＣ ＯＤＮで前もってコーティングされた９６ウェルプレート中で３７℃で４日間（図５）又は７日間（図６及び８）培養された細胞で行った。インキュベーション後に、細胞を下記のようにフローサイトメトリー又は生化学分析用に処理した。
【０２８１】
１．３）フローサイトメトリー
抗ＫＩＲ３ＤＬ２ ｍＡｂ Ｑ６６（ＩｇＭ；Dr A. Moretta, Genova, Italyによって親切にも提供された）＋ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ３−ＰＣ７ ｍＡｂ、抗ＴＣＲＶ−ＰＥ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４−ＰＣ５ ｍＡｂ（Beckman Coulter, Marseille, France）を使用して標準的な手順に従ってセザリー細胞の染色を行った。増殖アッセイ法のために、活性化前に細胞に０．５μM ＣＦＳＥ（Invitrogen）を前もって負荷し、一方で、ＰＥコンジュゲーション型７ＡＡＤ（BD Biosciences）を供給業者のプロトコールに従って使用してアポトーシス細胞の検出を行った。FC500サイトメーター（Beckman Coulter）で細胞を分析した。
【０２８２】
１．４）免疫蛍光
細胞を未処置のままか、又はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ、ＦＩＴＣ標識ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ若しくは対照ＯＤＮの存在下にて３７℃で２４時間インキュベーションするかのいずれかとした。細胞を、Ｑ６６ ｍＡｂ及びＦＩＴＣ結合型ヤギ抗マウスＩｇＭ Ａｂを用いたＫＩＲ３ＤＬ２免疫標識に供し、洗浄し、ポリ−Ｌ−リシンコーティング済みカバーグラス上に固定化した。−２０℃でのメタノール固定段階後に、ＤＡＢＣＯ（Fluka）を有するポリビニルアルコールマウンティング媒質中で細胞をマウントした。ＫＩＲ３ＤＬ２の細胞内染色のために、細胞をポリ−Ｌリシンカバーグラスに接着させ、メタノール中で固定し、ＫＩＲ３ＤＬ２標識前にＰＢＳ／０．１％ Tween 20で透過処理をした。洗浄後、カバーガラスを載せ、Leica DMRB顕微鏡で分析した。
【０２８３】
１．５）免疫沈降及びウエスタンブロッティング
他の箇所に記載のように活性化細胞を溶解に供し、核除去後の上清を調製及び処理した。ウエスタンブロッティングのために、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上に移行させた。免疫沈降物を抗ホスホ−ＣＤ３ ｍＡｂ（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）及び抗ＣＤ３ ｍＡｂ（Cell Signaling）で探査した。以下の分子に特異的な抗体を使用して核除去後溶解物の分析を行った：切断されたカスパーゼ３、切断されたカスパーゼ７及び切断されたカスパーゼＰＡＲＰ、ホスホ−ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、Ｅｒｋ１／２（全てCell Signaling Technology製）及びホスホ−Ｅｒｋ１／２（Sigma-Aldrich）。順番に検出を行う場合、各顕色段階の間にストリッピング手順を行った。適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型二次抗体（Jackson Immunoresearch）と共にインキュベーション後、ＥＣＬシステム（Perbio Science, Brebieres, France）及びImageQuant LAS 400システム（GE Healthcare）を使用して検出を行った。
【０２８４】
２）結果
２．１）ＫＩＲ３ＤＬ２のインターナリゼーションはそれがＣｐＧ ＯＤＮと会合すると誘導されるが、抗ＫＩＲ３ＤＬ２ ｍＡｂ ＡＺ１５８では誘導されない
本発明者らは、以前に、セザリー症候群の患者の腫瘍性ＣＤ４＋Ｔリンパ球の信頼できる細胞表面マーカーとしてＫＩＲ３ＤＬ２を特定した。ＫＩＲ３ＤＬ２がセザリーＣＤ４＋Ｔ細胞において任意の機能を発揮するかどうかを立証するために、抗ＫＩＲ３ＤＬ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＡＺ１５８又はその新たに特定されたリガンドＣｐＧ ＯＤＮのいずれかを使用することによって受容体の会合を達成した。相互作用のＡＺ１５８及びＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ部位の両方が受容体のＤ０細胞外ドメイン内に位置づけられたことに留意されたい。
【０２８５】
ＣｐＧ ＯＤＮは、ＮＫ細胞上でＫＩＲ３ＤＬ２の細胞表面のダウンモジュレーションを促進することが示された（Sivori et al. A novel KIR-associated function: evidence that CpG DNA uptake and shuttling to early endosomes is mediated by KIR3DL2; Blood, 2010, 116(10):1637-1647）ので、本発明者らは、最初に、そのような観測が悪性セザリー細胞にも当てはまるかどうかを試験した。本発明者らは、対照ＯＤＮではなく、Ａ、Ｂ又はＣ型のＣｐＧ ＯＤＮと共にセザリー患者のＰＢＭＣをインキュベーションすることが、セザリー患者のＣＤ４＋Ｔ細胞表面での受容体平均蛍光強度の５０％低下に対応する、ＫＩＲ３ＤＬ２の実質的なダウンモジュレーションに至ったことを観測した（表５）。
【０２８６】
【表５】
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【０２８７】
１無処置；２対照。
【０２８８】
ＣｐＧ ＯＤＮ−ＣはＫＩＲ３ＤＬ２の効率的な細胞表面モジュレーションを誘導し、免疫細胞上のクラスＡ及びクラスＢ ＯＤＮ（ＣｐＧ ＯＤＮ−Ａ及びＣｐＧ ＯＤＮ−Ｂ）の免疫効果を組み合わせたので、それを以下の実験のために優先的に使用した。次に、ＯＤＮ−Ｃ処置細胞又はＡＺ１５８ ｍＡｂ処置細胞を用いてセザリー患者の腫瘍Ｔ細胞クローンによるＫＩＲ３ＤＬ２の発現レベルを平行して監視した。結果として生じたデータから、ＯＤＮ−ＣがＫＩＲ３ＤＬ２のダウンモジュレーションを促進した一方で、ＫＩＲ３ＤＬ２とＡＺ１５８ ｍＡｂとのライゲーションは、悪性Ｔ細胞上で検出された受容体レベルに影響しなかったことが明らかに実証された（それらのクローン性ＴＣＲＶβの再配列により特定）（図４Ａ）。分析された異なるセザリー患者１２人から同一の結果が得られた（図４Ｂ）。
【０２８９】
最終的に、樹立セザリー細胞系での蛍光顕微鏡分析から、休止細胞において、又は対照ＯＤＮと接触後に形質膜に均等に分布しているＫＩＲ３ＤＬ２が、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ細胞処置後に部分的にインターナリゼーションされることが示された。同様に、ＦＩＴＣ結合ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃを使用した場合、この後者は、細胞インキュベーション後に形質膜及び細胞内レベルの両方で検出された。まとめると、これらのデータは、ＫＩＲ３ＤＬ２へのＡＺ１５８ ｍＡｂではなくＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃの結合が、セザリー細胞における受容体のインターナリゼーションを促進することを立証した。
【０２９０】
２．２）ＣｐＧ ＯＤＮ−ＣではなくＡＺ１５８ ｍＡｂはＫＩＲ３ＤＬ２の共受容体阻害機能を促進する
セザリー細胞上でのＫＩＲ３ＤＬ２トリガーの結果をさらに検討するために、本発明者らは、ＣＤ３誘導型悪性Ｔ細胞の増殖及びアポトーシスの過程に及ぼすその潜在的機能を最初に評価した。このために、セザリー患者からのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３ ｍＡｂ単独で、又はＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくはＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に４日間活性化した。悪性Ｔ細胞クローンの増殖及びアポトーシス状態を免疫標識によってさらに判定した。患者１からのＰＢＭＣで得られた代表的な結果を図５Ａ及びＢに示す。本発明者らは、悪性Ｔ細胞クローン（ＴＣＲＶ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞として特定）のＣＤ３依存性増殖が、ＫＩＲ３ＤＬ２にＣｐＧ ＯＤＮ−ＣではなくＡＺ１５８ ｍＡｂが結合すると強く阻害されたことを観測した（図５Ａ）。その結果、ＣＤ３が誘導する腫瘍細胞死もＡＺ１５８ ｍＡｂの存在下で障害されることが見出された一方で、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃは無作用であった（図５Ｂ）。これらの観測に一致して、ＡＺ１５８ ｍＡｂがＫＩＲ３ＤＬ２に結合したときに、ＣＤ３標的化時に誘導されるＣＤ３鎖のリン酸化及びＥｒｋ１／２活性化のダウンモジュレーションが観測された（図５、Ｃ及びＤ）。対照的に、ＣＤ３介在性Ｅｒｋ１／２活性化の著しい改変はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃの存在下で観測されなかった。したがって、ＫＩＲ３ＤＬ２へのＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃの結合はＣＤ３依存性活性化過程を妨害しなかったように見え、一方でＫＩＲ３ＤＬ２のＡＺ１５８ ｍＡｂの結合はその共受容体阻害機能を明らかにした。
【０２９１】
２．３）長期ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ／ＫＩＲ３ＤＬ２相互作用はセザリー細胞のアポトーシスに至る
本発明者らは、最初に、４日間インキュベーションのアッセイ法を行ったとき、腫瘍細胞生存率に及ぼすＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃの影響を全く観測しなかった（図５Ｂ参照）。したがって、インキュベーション時間を最大１２日間まで延長した。７日目の患者１５からのＰＢＭＣで得られた代表的な結果を図６Ａに示す。
【０２９２】
著しいことに、７日目に腫瘍細胞生存率は処置の長さ（無処置／ＮＴパネル）又はＡＺ１５８ ｍＡｂ若しくは対照ＯＤＮの存在によって影響されなかったものの（全ての条件は５〜６％という自然アポトーシスの検出を生じる）、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃの添加は、悪性細胞死亡率の有意な増加に至り、腫瘍集団内の７ＡＡＤ陽性細胞は２９％と検出された。
【０２９３】
対照的に、健康なドナーから単離されたＰＢＭＣを用いて行われた類似の実験から、正常なＣＤ４＋Ｔ細胞が実験時間の長さに、より敏感であるように見えたものの、この集団の１５％が時間経過中にアポトーシスを受けて、細胞死はＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ又はＡＺ１５８ ｍＡｂの存在によって増幅されなかったことが明らかとなった。
【０２９４】
患者１５（図６Ａ）で得られた結果を、追加的な患者７人を用いて確認し（図６Ｂ）、最大ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ誘導型アポトーシスが、患者に応じて７〜１２日処置後に検出された。
【０２９５】
最終的に、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共にインキュベーション後のカスパーゼ依存性アポトーシス経路の誘導を免疫ブロッティングによって確認した。図６Ｃに示すように、セザリー細胞系をＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共にインキュベーションすると切断型のカスパーゼ７及びカスパーゼ３、並びにそれらの基質ＰＡＲＰのレベルが増加することが見出され、６時間処置後に最大レベルに達した。まとめると、これらの結果から、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃを用いた処置によりセザリー悪性細胞の特異的アポトーシスを誘導できたことが立証された。
【０２９６】
２．４）セザリー細胞のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ処置はホスホ−ＳＴＡＴ３の脱リン酸化を招く
以前の研究から、セザリー細胞においてＳＴＡＴ３は構成的にリン酸化されることができ、その脱リン酸化を促進する処置が悪性細胞死に至ることが立証された。したがって本発明者らは、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ処置細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化状態を検討した。セザリー細胞系に行われた動態実験から、ＣｐＧ ＯＤＮ処置で有意な時間依存性ＳＴＡＴ３脱リン酸化が起こり、それがタンパク質の分解と相関関係にないことが示された（図７Ａ）。この脱リン酸化過程は、さらに、全てのＣＤ４＋Ｔリンパ球がＫＩＲ３ＤＬ２であった患者のソーティング済みＣＤ４＋Ｔ細胞で確認された（図７Ｂ）。これらの細胞において、ＳＴＡＴ３の完全な脱リン酸化は、ＯＤＮ−Ｃインキュベーションの２４時間後に視覚化され、一方でホスホ−ＳＴＡＴ３レベルは、ＡＺ１５８ ｍＡｂ又は対照ＯＤＮの存在下で改変されなかった。したがって、セザリー細胞のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ誘導型アポトーシスは、ＳＴＡＴ３の脱リン酸化と相関関係にあり得るように見えた。
【０２９７】
２．５）ＧｐＣ ＯＤＮ処置
ＧｐＣ ＯＤＮは、ＣｐＧの代わりにＧｐＣジヌクレオチドが存在することがＣｐＧ ＯＤＮと異なり、通常はＣｐＧ ＯＤＮについての陰性対照として使用される。
【０２９８】
予想外に、ＧｐＣ ＯＤＮの存在下で７日間培養されたセザリー細胞の処置は、これによってＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃと共に培養されたセザリー細胞の処置と同程度にセザリー細胞のアポトーシスに対して活性であることが示された（図８Ａ〜８Ｃ参照）。
【０２９９】
セザリー細胞のＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃ（図８Ａ、曲線２）処置及びＧｐＣ（図８Ａ、曲線３）処置の両方が、未処置のまま（図８Ａ、曲線１）又は対照ＯＤＮ（図８Ａ、曲線４）で処置されたセザリー細胞に比べてＫＩＲ３ＤＬ２発現の減少を招く。
【０３００】
しかし、セザリー細胞に対するＧｐＣ ＯＤＮの作用は、ＣｐＧ ＯＤＮと異なるように見える。
【０３０１】
実際に、早期アポトーシスは、ＧｐＣ ＯＤＮで処置されたセザリー細胞におけるアポトーシス事象の２１％に相当し、後期アポトーシスは６％に相当するが、一方でＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃで処置されたセザリー細胞は、後期アポトーシス事象と同じ多さの早期アポトーシス事象（１６％）を示す（図８Ｂ及び８Ｃ）。
【０３０２】
３）結論
ＫＩＲ３ＤＬ２の同じ細胞外ドメイン、すなわちＤ０ドメインに結合するものの、セザリー細胞に対するＡＺ１５８ ｍＡｂ及びＣｐＧ ＯＤＮの作用は明らかに異なる。本発明者らは、ＣｐＧ ＯＤＮを介したＣＤ３及びＫＩＲ３ＤＬ２の共会合が、ＫＩＲ３ＤＬ２依存性陰性シグナルの送達に至らなかったことを示した。さらに、本発明者らは、ＡＺ１５８ ｍＡｂとは異なり、ＣｐＧ ＯＤＮが受容体のインターナリゼーションを促進することを観測した。全ての被験患者について、本発明者らは、ＣｐＧ ＯＤＮ処置後にＫＩＲ３ＤＬ２ ＭＦＩの平均５０％の低下を経験し、より高い濃度のＣｐＧ ＯＤＮ（最大２５μg/ml）又はより長い暴露時間（最大１２日）を使用した場合、この閾値を超えない（データは示さず）。ＮＫ細胞において、ＫＩＲ３ＤＬ２のインターナリゼーションはエンドソーム区画におけるＣｐＧ ＯＤＮ連結型受容体とＴＬＲ９との共局在に至る１４。したがって、これらの細胞においてＫＩＲ３ＤＬ２がＣｐＧ ＯＤＮをそれらの受容体ＴＬＲ９にもたらしてＮＫ細胞活性化を招く担体タンパク質として作用し得ることが示唆されている。セザリー細胞系及びセザリー患者腫瘍細胞におけるＴＬＲ９転写物の検出にかかわらず、本発明者らは、これらの細胞においてＴＬＲ９の発現を全く検出しなかった（データは示さず）。加えて、ＣｐＧ及び非ＣｐＧ ＯＤＮがＴＬＲ９及びＭｙＤ８８に依存しないメカニズムによってマウス及びヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を共刺激できることが最近報告された２８。本発明者らの観測と一緒に、これらのデータから、セザリー細胞においてＴＬＲ９の関与なしのＫＩＲ３ＤＬ２／ＯＤＮ ＣｐＧ介在性作用の可能性が示唆された。これは、また、ＴＬＲ９発現に依存するＮＫ細胞及びセザリー細胞（それぞれ活性化受容体に対するアポトーシス介在性受容体）におけるＣｐＧ ＯＤＮ受容体としてのＫＩＲ３ＤＬ２についての別個の役割も指している。
【０３０３】
予想外に、最大であるが単に部分的なＫＩＲ３ＤＬ２のインターナリゼーション（細胞表面受容体の５０％喪失に対応）及びＳＴＡＴ３の完全な脱リン酸化が、ＣｐＧ ＯＤＮ−Ｃへのセザリー患者腫瘍細胞の曝露の２４時間後に観測されるものの、腫瘍Ｔ細胞クローンのアポトーシスの検出は７〜１２日の処置を必要とする。対照的に、増殖中のセザリー細胞系に対して行われた実験から、ＣｐＧ ＯＤＮの添加の２〜４時間後に受容体の完全なインターナリゼーションが示され（データは示さず）、ＳＴＡＴ３の脱リン酸化及び細胞のアポトーシスが６〜８時間後に検出された（図４Ａ及びＳ１）。これらの時間経過の矛盾が、樹立された増殖中のセザリー細胞に比べて末梢血腫瘍細胞の低代謝回転及びホスホＳＴＡＴ３依存性抗アポトーシス経路をシャットダウンするために数日必要であることの結果かどうかはまだ決定されていない。それでもなお、結果は、セザリー細胞において、ＫＩＲ３ＤＬ２／ＣｐＧ ＯＤＮの結合及びインターナリゼーションがホスホＳＴＡＴ３の脱リン酸化及び腫瘍細胞死に至ったことを示している。以前の研究から、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤チロホスチンＡＧ４９０及びククルビタシンＩ又はクルクミンを用いたセザリー細胞の処置が、ホスホＳＴＡＴ３の脱リン酸化を効率的に促進し、セザリー細胞のアポトーシスを誘導することが実証された。セザリー細胞におけるＳＴＡＴ３の構成性活性化が、ＳＨＰ−１の喪失のせいではなく、ＪＡＫファミリーメンバーの構成性異所性活性化によって媒介されることが最近立証された。セザリー細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ２へのＣｐＧ ＯＤＮの結合がＪＡＫ活性にどのように影響し得るかを決定するための努力が現在行われている。
【図１】
2016529208.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2016529208.tif 000019
【図７Ｂ】
2016529208.tif 000020
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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