(57)【要約】【課題】本発明は、セリシンハイドロゲルの調製方法を開示する。【解決手段】該方法は、カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、ＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液によって抽出し、透析、純化によって、分解されていない質量百分率濃度０．１〜４％のセリシン水溶液を得た後、セリシン水溶液を濃縮して１．５〜１０．０％とし、濃縮後のセリシン水溶液に対して架橋剤を加え（セリシン水溶液１ｍＬに対し架橋剤２〜５００μＬ）、十分に混合した後、４〜４５℃で５秒〜３６時間置き、ハイドロゲルを得る。該ハイドロゲルは、生体活性と多用途性を備え、成長因子、薬物および細胞の担体として、皮膚損傷、筋肉損傷、血管損傷、神経損傷、心筋損傷等を含むがこれらに限定されない多種の軟組織損傷の修復及び疾病の治療に使用できる。【選択図】図１１【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリシンハイドロゲルの調製方法であって、以下のステップ、
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、ＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液によって抽出し、透析、純化によって、分解されていない質量百分率濃度０．１〜４％のセリシン水溶液を得る、
２）ステップ１）で得られたセリシン水溶液を濃縮して質量百分率濃度１．５〜１０％とし、濃縮後のセリシン水溶液に対して、セリシン水溶液１ｍＬに対し架橋剤２〜５００μＬの比率で架橋剤を加え、十分に混合した後、４〜４５℃で５秒〜３６時間置き、ハイドロゲルを得る、
を含むことを特徴とする、セリシンハイドロゲルの調製方法。
【請求項２】
前記架橋剤が、グルタルアルデヒド、マロンジアルデヒドおよびゲニピンからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のセリシンハイドロゲルの調製方法。
【請求項３】
前記架橋剤の質量百分率濃度が１〜２５％であることを特徴とする、請求項１または２に記載のセリシンハイドロゲルの調製方法。
【請求項４】
前記ステップ１）中のセリシン水溶液の調製方法が、以下のステップ、
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、蚕繭を剪断して砕片とし、水洗し、水分を除去する、
２）ステップ１）で得られた蚕繭砕片を、ＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液中に、蚕繭砕片１ｇに対し６〜８ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液２０〜１００ｍＬの比率で、２５〜５０℃で浸し、セリシンを溶解させる、
３）ステップ２）で得られた溶液を遠心分離して不溶性物質を分離し、清澄溶液を得る、
４）ステップ３）で遠心分離した溶液中に、４分の１の体積の１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０〜１１．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を加え、透析し、セリシン水溶液を得る、
５）ステップ４）で得られたセリシン水溶液を遠心分離して沈殿物を除去し、濃縮して質量百分率濃度１．５〜１０％のセリシン水溶液とし、使用まで冷蔵庫で保存する、
を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のセリシンハイドロゲルの調製方法。
【請求項５】
以下のステップ、
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、蚕繭を剪断して１ｃｍ２の砕片とし、３回洗浄し、水分を除去する、
２）ステップ１）で得られた蚕繭砕片を、蚕繭砕片１ｇに対し濃度６ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液４０ｍＬの比率で、６ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液中に、３５℃で浸し、２４時間、セリシンを溶解させる、
３）ステップ２）で得られた溶液を３５００ｒｐｍで遠心分離して不溶性物質を除去し、清澄溶液を得る、
４）ステップ３）で得られた清澄溶液中に、４分の１の体積の１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を加え、透析を行い、セリシン水溶液を得る、
５）ステップ４）で得られたセリシン水溶液を遠心分離して沈殿物を除去し、セリシン水溶液を透析して質量百分率濃度０．１〜４％のセリシン水溶液とし、更に濃縮して質量百分率濃度１．５〜１０．０％とし、使用まで４℃の冷蔵庫で保存する、
６）上記で得られたセリシン水溶液中に、セリシン水溶液１ｍLに対して質量百分率濃度２０〜２５％のグルタルアルデヒド２〜１００μLの比率で、グルタルアルデヒドを加え、両者を混合した後、３７℃で５分間置き、ハイドロゲルを得る、
を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のセリシンハイドロゲルの調製方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の調製方法によって得られるセリシンハイドロゲルの生体医用材料における使用。
【請求項７】
該セリシンハイドロゲルを以下の方面、
１）該セリシンハイドロゲルを、皮膚の損傷、筋肉の損傷、血管の損傷、神経の損傷、心筋の損傷等を含むがそれらに限定されない多種の損傷修復および疾病の治療に使用する、
２）該セリシンハイドロゲルを、工具細胞と結合して対応する治療因子を包むことによって、組織の修復に使用する、
３）該セリシンハイドロゲルを、成長因子、薬物および細胞の担体または足場として使用する、
において使用することを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
セリシン凍結乾燥足場の調製方法であって、以下のステップ、
１）上記で得られたセリシンハイドロゲルを零度以下で冷凍する、
２）冷凍したセリシンハイドロゲルを、真空低温乾燥させて、セリシン凍結乾燥足場を得る、
を含む、調製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の調製方法によって調製されるセリシン凍結乾燥足場の、生体医用材料における使用。
【請求項１０】
請求項１乃至５いずれかに記載の調製方法によって得られるセリシンハイドロゲルの、蛍光標識プローブ材料における使用。
【請求項１１】
請求項１乃至５いずれかに記載の調製方法によって得られるセリシンハイドロゲルの、任意の形態または形式による生体医用材料における存在と使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体医用複合材料の分野に関し、より詳しくは、セリシンハイドロゲルの調製方法と使用に関する。該ハイドロゲルは、生体活性と多用途性を備え、成長因子、薬物および細胞の担体として、皮膚損傷、筋肉損傷、血管損傷、神経損傷、心筋損傷等を含むがこれらに限定されない、多種の軟組織損傷の修復および疾病の治療に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは、水中で溶解膨張し多量の水分を保持することのできる三次元網状ポリマーである。ハイドロゲルは、膨張して多量の水分を保持することのできる特性を備えた重要な生体材料として、生体医薬および組織工学の分野で広く適用されている。ハイドロゲルの一種は、天然の生体材料（コラーゲン、アルギン酸塩、キトサン等）によって調製され、この種のハイドロゲルは有機体と非常に類似した物理化学的特性と卓越した生物学的特性を備えることで人気を得ている。近年、天然の生体材料を使用した新たなハイドロゲルの開発が、組織工学の分野において注目の重要課題となっている。
【０００３】
セリシン（シルクセリシン）は、シルクフィブロインの表面を取り囲む一種の天然高分子粘性タンパク質で、蚕繭の成分の約２０〜３０％を占める。セリシンは、分子量２４〜４００ｋＤａのポリペプチドによって構成され、ポリペプチド分子は、セリン、アスパラギン酸、グリシンなどの１８種類のアミノ酸によって構成されている。長い間、人々のセリシンに対する認識が不足し、研究も限定的であったため、セリシンは、絹糸製糸業において廃棄物として処理され、大量の貴重な天然資源が浪費されていた。近年、人々は、セリシンに保湿、抗菌、抗酸化、抗凝血、および、細胞の接着と増殖の促進等の生物特性があることを発見した。更に、セリシンは、親水性と生分解性を備え、理想的な生体医用材料である。セリシンが、しばしば他の材料（エラスチンおよびポバール等）と共重合または単純に架橋して生体足場を作ることで、高性能の生体材料が得られることが報告されている。しかし、単にセリシンのみから作られた生体材料は、脆弱な二次元のセリシンフィルムに限られている。真の意味での三次元純粋セリシンハイドロゲルは、未だに実現が難しい。その主な理由は、従来のセリシン分離方法（高温法、アルカリ法等）では、容易にセリシンの分解が起こり、分解したセリシンは分子量が小さく、物理的性質が脆弱で、水溶性が高く、ハイドロゲルの作成（架橋を含む）が困難なことである。セリシンの組織工学への適用は大いに制約されている。このため、高い生体適合性と優れた力学特性と安定性を備えた純粋セリシンハイドロゲルを開発し、セリシンを組織工学に十分適用することには、重要な社会的意義があり、広範な応用が見込まれている。このため、三次元構造の純粋セリシンハイドロゲルを調製し生体医学分野に適用することの成否は、研究に値する重要課題である。
【０００４】
本発明は、カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を使用し、臭化リチウム抽出法によって純粋セリシンを抽出し、化学共有結合架橋法を用いて、蛍光特性を備え注射可能な純粋セリシンハイドロゲルを調製することに成功した。該セリシンハイドロゲルは、良好な生体適合性と細胞接着性、優れた機械特性を備えている。該セリシンハイドロゲルの自己蛍光特性は、体内におけるリアルタイムの追跡と画像化のために利用できる。
【０００５】
該三次元純粋セリシンハイドロゲルは、生体活性と多用途性を備え、成長因子、薬物および細胞の担体として、皮膚の損傷、筋肉の損傷、血管の損傷、神経の損傷、心筋の損傷等を含むがこれらに限定されない、多種の軟組織損傷の修復および疾病の治療に用いることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題に鑑み、セリシンハイドロゲルの調製方法と使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭（中国農業科学院蚕業研究所より購入、該品種の資源は中国農業科学院蚕業研究所国家蚕資源保存センタにて保存）を原材料として使用し、抽出純化によりセリシン水溶液を作成し、化学架橋剤（アルデヒドおよびゲニピン）を使用して架橋することにより、細胞適合性と細胞接着性、高架橋率、高速ゲル化性を備え、機械的特性が良好で、性質が安定し、蛍光特性を備えたセリシンハイドロゲルを調製するものである。
【０００８】
該材料は、一種の新型の生体材料であり、成長因子、薬物および細胞の担体として、皮膚の損傷、筋肉の損傷、血管の損傷、神経の損傷、心筋の損傷を含むがこれらに限定されない、多種の軟組織損傷の修復および疾病の治療に用いることができる。
【０００９】
上述の技術課題を解決するため、本発明は、以下のステップを含むセリシンハイドロゲルの調製方法を提供する。
【００１０】
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、ＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液によって抽出し、透析、純化によって、分解されていない質量百分率濃度０．１〜４％のセリシン水溶液を得る。
【００１１】
２）ステップ１）で得られたセリシン水溶液を濃縮して質量百分率濃度１．５〜１０．０％とし、濃縮後のセリシン水溶液に対して架橋剤を加え（セリシン水溶液１ｍL毎に架橋剤２〜１００μLを加える）、十分に混合した後、４〜４５℃に保持して５秒〜３６時間反応させ、ハイドロゲルを得る。
【００１２】
好適には、前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、マロンジアルデヒドおよびゲニピンからなるグループから選択される。
【００１３】
好適には、前記架橋剤の質量百分率濃度は０．１〜２５％である。
【００１４】
好適には、前記ステップ１）におけるセリシン水溶液調製方法は、以下のステップを含む。
【００１５】
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、蚕繭を剪断して砕片とし、水洗し、水分を除去する。
【００１６】
２）ステップ１）で得られた蚕繭砕片を濃度６〜８ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液中に浸し（蚕繭砕片１ｇ毎に、６〜８ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒまたはＬｉＣｌ水溶液２０〜１００ｍＬ）、２５〜５０℃で５〜２４時間置く。
【００１７】
３）ステップ２）で得られた溶液を遠心分離して不溶性物質を分離除去し、清澄溶液を得る。
【００１８】
４）ステップ３）で得られた清澄溶液中に、４分の１の体積の１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０〜１１．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を加え、超純水中で透析し、セリシン水溶液を得る。
【００１９】
５）ステップ４）で得られたセリシン水溶液を遠心分離して沈殿物を除去し、濃縮して質量百分率濃度１．５〜１０％のセリシン水溶液とし、使用まで冷蔵庫で保存する。
【００２０】
好適には、セリシンハイドロゲルの調製方法は、以下のステップを含む。
【００２１】
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭を量り取り、蚕繭を剪断して１ｃｍ２の砕片とし、３回洗浄し、水分を除去する。
【００２２】
２）ステップ１）で得られた蚕繭砕片を濃度６ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液中に浸し（蚕繭砕片１ｇ毎に、ＬｉＢｒ水溶液４０ｍＬ）、３５℃の水槽に２４時間置き、セリシンを溶解させる。
【００２３】
３）ステップ２）で得られた溶液を３５００ｒｐｍで遠心分離して不溶性物質を分離除去し、清澄溶液を得る。
【００２４】
４）ステップ３）で得られた清澄溶液中に、４分の１の体積の１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を加え、透析を行い、セリシン水溶液を得る。
【００２５】
５）ステップ４）で得られたセリシン水溶液を遠心分離して沈殿物を除去し、濃縮して質量百分率濃度１．５〜１０％のセリシン水溶液とし、使用まで４℃で保存する。
【００２６】
６）上記で得られたセリシン水溶液中にグルタルアルデヒドを加え（セリシン水溶液１ｍL毎に質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒドを２〜１００μL）、十分に混合した後、３７℃で５分置き、ハイドロゲルを得る。
【００２７】
本発明は、更に、セリシンハイドロゲルの生体医用材料における使用方法を提供する。該セリシンハイドロゲルは、以下の方面で使用できる。
【００２８】
１）該セリシンハイドロゲルは、血管、表皮、筋肉、皮膚および神経組織の損傷の修復を含むがそれらに限定されない、多種の損傷の修復および疾病の治療に用いることができる。
【００２９】
２）該セリシンハイドロゲルは、工具細胞と結合して、対応する治療因子を包むことによって、組織の修復に使用できる。
【００３０】
３）該セリシンハイドロゲルは、成長因子、薬物および細胞の担体とすることができる。
【００３１】
本発明は、更に、以下のステップを含む、セリシン凍結乾燥足場の調製方法を提供する。
【００３２】
１）上記で得られたセリシンハイドロゲルを０℃以下に置き、冷凍させる。
【００３３】
２）冷凍したセリシンハイドロゲルを真空冷凍乾燥させ、セリシン凍結乾燥足場を得る。
【００３４】
本発明は、更に、セリシン凍結乾燥足場の生体医用材料における使用方法を提供する。
【００３５】
本発明は、更に、セリシンハイドロゲルの蛍光標識プローブ材料における使用方法を提供する。
【００３６】
本発明は、更に、セリシンハイドロゲルの、任意の形態または形式による生体医用材料における存在と使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の有利な効果は以下の通りである。
【００３８】
１）セリシンの良好な天然特性を保持しながら、従来の抽出方法で得られなかった分解されていない高い生体特性を備えたセリシンを得るという難題を克服した。（従来のセリシンは、野生型の蚕の蚕繭に由来し、高温高圧法やアルカリ法といった従来の抽出法を用いて処理されていたために、セリシンの分解が深刻でゲル化特性に乏しく、また、臭化リチウム溶液抽出法を用いてセリシンをフィブロインから分離するのが困難だった。）
【００３９】
２）本発明の方法によれば、セリシンの抽出効率は９０％以上である。
【００４０】
３）本発明は、初めて、分解されていないセリシン水溶液とアルデヒドまたはゲニピン等の架橋剤を用いてハイドロゲルを作成したので、調製方法が簡単で、実施し易い。
【００４１】
４）本発明は、初めて、三次元構造の良好な機械的特性を備えた純粋なセリシン足場を調製し、また、初めて、注射可能な純粋セリシンハイドロゲルを調製した。（本発明前には、注射可能な純粋セリシン三次元ハイドロゲルは世界になく、一般に、セリシンとその他の材料を単純に混合して、ゼラチン、ポリビニルアルコール、キトサン等の複合生物材料が調製されていた。）
【００４２】
５）本発明の方法によって調製したセリシンハイドロゲルは、独特の性質を備えている。本発明の方法によって抽出された完全なセリシンペプチドはセリシンの良好な天然特性を保持しており、該セリシン水溶液は、架橋剤（アルデヒド、ゲニピンなど）の作用下で容易に架橋しゲル化する。本発明の方法によって調製されたセリシンハイドロゲルは、従来のハイドロゲルの特徴（多孔性、分解可能性等）だけでなく、次のような多くの独自の優れた特性を備えている。（I）良好な生体適合性を備え、多種の細胞を担持し、細胞の接着と増殖を支持できる。（II）注射可能性とin situゲル化特性を備え、注射によって該材料を体内に移植できるため、該方法は、手術と比べて、有機体の傷が明らかに小さい。（III）自己蛍光特性を備え、体内におけるリアルタイム追跡が可能である。（IV）良好な機械的特性を備えている。（セリシンハイドロゲルは、組織工学に広く用いられているアルギン酸塩ハイドロゲルよりも機械的特性が優れている。）（V）分解生成物がｐＨ値を中性化する強い緩衝能力を備えているため、該材料を薬物または成長因子の担体として使用する場合、薬物または成長因子等がｐＨ環境の影響で変性失活するのを防ぐことができる。（VI）分解速度がｐＨ値と相関する。（VII）良好な薬物遅延放出能力を備え、良好な薬物担体である。
【００４３】
６）本発明の方法によって得られるセリシンハイドロゲルは、架橋率とゲル化時間がいずれも調節可能であり（必要に応じたin situゲル化を実現できる）、架橋材の用量や種類、または、セリシン水溶液の濃度等の条件を変えることにより、ハイドロゲルの架橋率とゲル化速度を調節することができる。
【００４４】
７）本発明の方法によって得られるセリシンハイドロゲルは、用途が広く、様々な形状のゲルとすることができ、また、凍結乾燥により、様々な形状および孔径の多孔生体足場とすることができる。
【００４５】
８）該セリシンハイドロゲルは、良好な生体適合性と細胞接着性を備え、多種の細胞の生存と増殖を支持できる。薬物に対し良好な制御放出作用を備えている。セリシンハイドロゲル、および、それを凍結乾燥して得られた三次元多孔セリシン生体足場は、細胞外基質として、細胞の成長と栄養物質交換の促進を支持できる。関連する実験の結果によれば、該セリシンハイドロゲルは、血管、表皮、筋肉、皮膚、神経等の組織の損傷および疾病の治療を含むがそれらに限定されない用途に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】セリシンハイドロゲルを異なる温度で冷凍および低温真空乾燥して得られた凍結乾燥足場と、セリシン神経導管である。
【図２】（室温における）セリシン濃度とゲル化時間の関係を示すグラフである。
【図３】３７℃におけるセリシンハイドロゲルの架橋率を示す折線グラフである。
【図４】セリシンハイドロゲルおよびアルギン酸塩ハイドロゲルの弾性係数を表す棒グラフで、Ａは圧縮強度、Ｂは圧縮係数を表す。
【図５】異なるｐＨ環境下でのセリシンハイドロゲルの吸水膨張率（３７℃）を示す折線グラフである。
【図６】ＰＢＳ中におけるセリシンハイドロゲルの分解（３７℃）を示す折線グラフである。
【図７】セリシンハイドロゲル分解生成物が分解液のｐＨ値に及ぼす影響を示す。
【図８】異なるｐＨ値（３．０、７．４、１１．０）条件下でのセリシンハイドロゲルの水飽和度を示す。
【図９】示差走査熱量測定法による分析スペクトルを示し、図中、（I）はセリシン、(II)はグルタルアルデヒドで架橋されたセリシンハイドロゲル、（III）はグルタルアルデヒドおよび濃塩酸で処理されたセリシン、（IV）はエタノールで処理されたセリシンである。
【図１０】セリシンハイドロゲルとセリシンの赤外線スペクトルを示し、図中、（ａ）はエタノール処理したセリシン、（ｂ）はグルタルアルデヒドおよび濃塩酸で処理されたセリシン、（ｃ）はグルタルアルデヒドで架橋されたセリシンハイドロゲル、（ｄ）はセリシンである。
【図１１】蛍光顕微鏡で観察したセリシン導管および凍結乾燥ハイドロゲルを示す写真である。（Ａ〜Ｈは導管、Ｉ〜Ｌはセリシンハイドロゲル凍結乾燥足場を示す。スケールバーは２００μｍ。）
【図１２】小動物画像システムによるマウスの体内に注射したセリシンハイドロゲルの追跡を示す。
【図１３】セリシンハイドロゲルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）放出を示す折線グラフである。
【図１４】ヒト臍帯静脈内皮細胞の、セリシンハイドロゲル組と対照組における、細胞接着性と細胞生存性を測定したものである。Ａは細胞のセリシンハイドロゲルに対する接着性を測定したグラフ（ＥＣＶ３０４細胞株を用いた）、Ｂは細胞生存性を測定したグラフである（ＥＡ．ｈｙ９２６細胞株を用いた）。
【図１５】ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＥＣＶ３０４）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。Ａは通常の電子顕微鏡写真、Ｂは共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。
【図１６】ヒト皮膚表皮細胞（ＨａＣａＴ）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図１７】マウス筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図１８】ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図１９】ヒト胎児皮膚繊維芽細胞（ＣＣＣ−ＥＳＦ−１）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２０】マウス小グリア細胞（ＢＶ２）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２１】マウス膵島内皮細胞（ＭＳ１）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２２】ラットシュワン細胞（ＲＳＣ９２６）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２３】ラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明をより良く理解するため、以下に、具体的実施例を参照して本発明の主要な内容を説明する。但し、本発明の内容は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
セリシンハイドロゲルの調製方法は、以下のステップを含む。
【００４９】
一．蚕繭の選択
カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭（中国農業科学院蚕業研究所より購入、該品種の資源は中国農業科学院蚕業研究所国家蚕資源保存センタにて保存）を原材料として選択し使用した。主要化学成分はセリシン。
【００５０】
二．セリシンの抽出と分離
【００５１】
１）カイコシルクフィブロイン欠失型突然変異品種の蚕繭（中国農業科学院蚕業研究所提供のもを購入）１ｇを量り取り、蚕繭を剪断して１ｃｍ２の砕片とし、清浄なビーカーに入れ、超純水を用いて３回洗浄し、３５００ｒｐｍの遠心分離で５分間水分を除去した。
【００５２】
２）ステップ１）で得られた蚕繭砕片に３０〜６０ｍＬの濃度６ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液を加え、該ビーカーを３５℃の恒温水槽に入れて２４時間置き、セリシンを溶解させた。
【００５３】
３）ステップ２）で得られた溶液を遠心分離管に移し、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離して不溶性物質を除去し、清澄溶液を得た。
【００５４】
４）ステップ３）で得られた清澄溶液中に、４分の１の体積のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．０）を加えた。
【００５５】
５）ステップ４）の溶液を、前処理した透析袋（ＭＷＣＯ３５００）中に移し、その後、透析袋の両端をクリップで挟み、超純水を入れたビーカーの中に置いた。該ビーカーを攪拌器上に置き、３時間に１回水を換えながら４８時間ゆっくり攪拌して透析した。
【００５６】
６）ステップ５）の透析後のセリシン水溶液を遠心分離管に移し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して沈殿物を除去した。
【００５７】
７）セリシン水溶液を再度透析袋に入れ、透析袋の両端をクリップで挟み、透析袋を質量百分率濃度２０％のＰＥＧ６０００溶液中に置き、セリシン水溶液が所望の濃度となるまで濃縮した（質量百分率濃度２．０％以上）。
【００５８】
８）タンパク質濃度測定にはＢＳＡ法とセリシン水溶液乾燥法を使用した。
【００５９】
９）タンパク質の分子量測定を行った（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ参照）。１０〜１５μＬのセリシン水溶液を採取して分子量測定に用い、残りは使用まで４℃で冷蔵庫に保存した。
【００６０】
三．ハイドロゲルの調製
【００６１】
１．濃縮後のセリシン水溶液を、超純水を用いて質量百分率濃度２．０％に調整した。
【００６２】
２．セリシン水溶液１ｍＬ毎に質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒトを２２μＬ加えた。
【００６３】
３．十分混合した後、３７℃で５分間置き、ハイドロゲルを得た。
【００６４】
四．実験分析
【００６５】
１．セリシンのゲル化時間と架橋率の分析
セリシン水溶液と質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒトとを、体積比１００：２．２で、室温下で、セリシンハイドロゲルに調製し、ゲル化時間と架橋率を観測、記録した。
【００６６】
図２は、セリシン濃度の低下に従って、架橋に必要な時間が長くなることを示している。ゲル化時間の調節にセリシン濃度を利用できることがわかる。
【００６７】
図３よれば、セリシン水溶液のグルタルアルデヒドによる架橋は、０．５時間後には基本的に架橋が完了し、その後、架橋率は比較的安定した状態に保たれることが示されている。
【００６８】
２．セリシンハイドロゲルの多孔構造
セリシンハイドロゲルを三種類の異なる温度下（それぞれ−２０℃、−８０℃、−１９６℃）で凍結乾燥させ、走査電子顕微鏡で観察した。図１に示すように、セリシンハイドロゲルを−１９６℃、−８０℃、−２０℃の冷凍温度で処理後、凍結乾燥させて得られたセリシン三次元多孔生体足場の孔径は、それぞれ、約２０μｍ、３００μｍ、７００μｍだった。冷凍温度が低いと、三次元多孔生体足場の孔径も小さくなった。また、三次元多孔生体足場には大量の微小孔が存在し、細胞外基質として、細胞の成長を支持し栄養物質の交換を促進することが可能である。
【００６９】
３．セリシンハイドロゲルとアルギン酸塩ハイドロゲルとの力学特性の比較分析
一定の規格の円柱型ハイドロゲル塊を作成し、小型万能試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ５８４８  ＭｉｃｒｏＴｅｓｔｅｒ，Ｉｎｓｔｒｏｎ，ＵＳＡ）を利用して常温におけるセリシンハイドロゲルの力学特性を測定した。
【００７０】
図４Ａ、図４Ｂに示すように、セリシンハイドロゲル（質量百分率濃度２％）は、組織工学の研究に広く用いられている材料であるアルギン酸塩ハイドロゲル（質量百分率濃度それぞれ２％および４％、ハイドロゲル中に等質量の高分子量および低分子量のアルギン酸塩を含有する）と比較して、更に優れた機械的特性を備えている。アルギン酸塩ハイドロゲルは、１ｍＬのアルギン酸塩水溶液に４０μＬのＣａ２ＳＯ４懸濁液（０．２１ｇ／ｍＬ）を加えて混合することによって作成された。
【００７１】
４．異なるｐＨ環境下でのセリシンハイドロゲルの分解速度
分解に対するｐＨ環境の影響を知るために、セリシンハイドロゲルを異なるｐＨ値（ｐＨ３．０、ｐＨ５．０、ｐＨ７．４、ｐＨ１１．０）のＰＢＳ溶液中に浸し、毎日１回ＰＢＳ溶液を交換し、異なる時間で取り出し、乾燥し、重量を量った。結果を図５に示す。
【００７２】
図５によれば、セリシンハイドロゲルは、初めの５日間は分解速度が比較的速く、５日経過後はセリシンハイドロゲルの分解速度は緩慢になった。ハイドロゲルの分解はｐＨ値との相関性があり、ｐＨ１１．０のアルカリ性条件下での分解速度が最も速く、１５日後には完全に分解した。ｐＨ３．０の酸性条件下での分解速度が最も緩やかであり、５３日時点での分解率が３０％前後に過ぎなかった。
【００７３】
セリシンハイドロゲル分解生成物の環境ｐＨに対する影響を試験するため、ゲルの外部の緩衝溶液を交換せず、対応する時点で該緩衝溶液のｐＨ値を測定した。結果を図６に示す。
【００７４】
図６によれば、セリシンハイドロゲル分解生成物は外部の緩衝溶液のｐＨ値を中性化できる特性があることがわかる。
【００７５】
５．セリシンハイドロゲルの膨張率に対するｐＨ値の影響
セリシンハイドロゲルを凍結乾燥し、重量を量り、三種類の異なるｐＨ値（ｐＨ３．０、ｐＨ７．４、ｐＨ１１．０）のＰＢＳ溶液中に浸し、異なる時点で取り出し、以下の公式に従って吸水膨張率を測定した（式中で、Ｗｓは膨張状態での重量、Ｗｄは乾燥重量である）。
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【００７６】
図７によれば、セリシンハイドロゲルは、初めの３時間で膨張率が大幅に上昇し、２週間後は基本的に安定している。ｐＨ７．４およびｐＨ１１．０の環境下で、膨張率が最大で２６倍に達した。ｐＨ３．０の条件下では、最大膨張率は２１倍だった。
【００７７】
６．異なるｐＨ値条件下でのセリシンハイドロゲルの水飽和度
セリシンハイドロゲルを−８０℃で１晩冷凍した後、低温真空乾燥機中で乾燥させ、凍結乾燥させたサンプルの重量を量り、異なるｐＨ値（ｐＨ３．０、ｐＨ７．４、ｐＨ１１．０）の脱イオン水中に４８時間浸した。その後、吸水膨張したサンプルを取り出し、表面の水分を除去後、直ちに重量を量り、サンプルの乾燥重量に対するサンプルの吸水膨張後の重量を計算することによって、サンプルの水飽和度を得た。
【００７８】
図８によれば、異なるｐＨ値（３．０、７．４、１１．０）条件下でのセリシンハイドロゲルの水飽和度は、ｐＨ１１．０のアルカリ性条件におけるセリシンの吸水量が１２．７５％、ｐＨ３．０の酸性条件におけるセリシンハイドロゲルの吸水量が８６０％であった。
【００７９】
７．セリシンの示差走査熱量測定法による分析
示差走査熱量測定法を利用して（測定装置にはＮＥＴＺＳＣＨ  ＳＴＡ  ４４９  Ｆ３，Ｇｅｒｍａｎｙを採用）、セリシンハイドロゲルの相変化時の溶融点の変化を測定した。測定流速は６０ｍＬ／ｍｉｎとし、昇温範囲は４０〜５５０℃にプログラムし、毎分１０℃昇温させた。
【００８０】
図９は、異なる処理を行ったセリシンサンプルの熱分解を示すグラフである。（I）は純セリシン凍結乾燥粉末、（II）はグルタルアルデヒドと濃塩酸で処理したセリシン、（III）はエタノールで処理したセリシン、（IV）はグルタルアルデヒドで架橋したセリシンハイドロゲルを示している。（I）の分解温度は３２１．７℃、（II）の分解温度は３９４．０℃、（IV）の分解温度は３１４．４℃、（III）の分解温度は２０８．３℃および３９８．３℃であった。
【００８１】
８．セリシンハイドロゲルおよびセリシンの赤外線スペクトル分析
フーリエ変換赤外分光光度計（Ｎｅｘｕｓ，Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｎｉｃｏｌｅｔ，  ＵＳＡ）を利用してセリシンハイドロゲルの４０００〜６５０ｃｍ−１にある特性ピークの測定を行った。
【００８２】
図１０によれば、グルタルアルデヒドを用いて架橋したセリシンハイドロゲル中のセリシンの二次構造に明確な変化がなく、セリシンハイドロゲルは天然セリシンの構造を非常に良好に保持できることが分かる。（ａ）はエタノールで処理したセリシン、（ｂ）はグルタルアルデヒドと濃塩酸で処理したセリシン、（ｃ）はグルタルアルデヒドで架橋したセリシンハイドロゲル、（ｄ）は純セリシン凍結乾燥粉末を示している。
【００８３】
特性ピークａｍｉｄｅ  Iとａｍｉｄｅ  IIから、曲線（ｃ）と曲線（ｄ）が基本的に同じであることが見て取れ、これは、セリシンハイドロゲル中のポリペプチドの二次構造が純セリシンのものと類似していることを意味し、また、セリシンハイドロゲルがセリシンの天然構造を非常に良く維持していることを意味している。
【００８４】
９．ヒト臍帯静脈内皮細胞の、セリシンハイドロゲル組と対照組における、細胞接着性（ＥＣＶ３０４細胞を使用）と細胞生存性（ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を使用）の測定
【００８５】
１）まず、セリシン水溶液を架橋剤と混合した後、プラスチックの細胞培養皿に敷いた。安定してゲル化されるのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【００８６】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない細胞培養皿を対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ高グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【００８７】
３）図１４Ａは、播種後４時間および８時間の二つの時点における未接着の細胞数の計数によって得たものであり、最初に播種した細胞総数と未接着の細胞数との差が播種した細胞総数に占める割合を細胞接着率とした。図１４Ｂは、ＭＴＴ法によって測定した、細胞播種後２．５日および４．５日後の細胞の生存性である。
【００８８】
図１４は、セリシンハイドロゲルが、ヒト臍帯静脈内皮細胞に対し良好な細胞接着性を有し、かつ、細胞の生存と増殖を支持できることを示している。セリシンハイドロゲルが良好な生体適合性と細胞接着性を備えていることが分かる。
【実施例２】
【００８９】
本実施例におけるセリシン水溶液の調製方法は、以下を除いて、実施例１の調製方法と同じである。
【００９０】
１．セリシン水溶液１ｍＬ毎に質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒトを１００μＬ加えた。
【００９１】
２．十分混合した後、３７℃で０．５時間置き、セリシンハイドロゲルを得た。
【実施例３】
【００９２】
本実施例におけるセリシン水溶液の調製方法は、以下を除いて、実施例１の調製方法と同じである。
【００９３】
１．セリシン水溶液１ｍＬ毎に質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒトを２μＬ加えた。
【００９４】
２．十分攪拌混合した後、３７℃で０．５時間置き、セリシンハイドロゲルを得た。
【実施例４】
【００９５】
本実施例におけるセリシン水溶液の調製方法は、以下を除いて、実施例１の調製方法と同じである。
【００９６】
１．セリシン水溶液１ｍＬ毎に質量百分率濃度２％のゲニピン水溶液を０．２５ｍＬ加えた。
【００９７】
２．十分攪拌混合した後、３７℃で２時間置き、セリシンハイドロゲルを得た。
【実施例５】
【００９８】
一．セリシン凍結乾燥足場の調製
実施例１によって得られたハイドロゲルをそれぞれ迅速に−２０℃、−８０℃、−１９６℃に置いて２４時間冷凍後に取り出し、サンプルを低温真空乾燥機中に置いて乾燥させ（乾燥時間はサンプルの大きさによって決められた）、三種類の孔径の異なるセリシン凍結乾燥足場を得た。孔径は、それぞれ、３１６ｎｍ、１６７ｎｍ、２０．５６ｎｍであった。
【００９９】
二．実験分析
【０１００】
１．異なる温度下でのセリシン三次元多孔生体足場の微細構造
セリシンハイドロゲルを３種類の異なる温度（−２０℃、−８０℃、−１９６℃）で冷凍し乾燥させた後、走査電子顕微鏡下で観察した。
【０１０１】
図１に示すように、セリシンハイドロゲルを−１９６℃、−８０℃、−２０℃の冷凍温度で処理後に凍結乾燥して得たセリシン三次元多孔生体足場の孔径は、それぞれ、約２０μｍ、３００μｍおよび７００μｍであった。冷凍温度が低くなると、三次元多孔生体足場の孔径はそれに応じて小さくなった。また、三次元多孔生体足場には大量の微小孔が存在し、細胞外基質として、細胞の成長を支持し栄養物質の交換を促進することが可能である。
【０１０２】
２．セリシン導管および凍結乾燥セリシンハイドロゲルの自己蛍光測定
蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１，Ｊａｐａｎ）を利用して、異なる波長条件におけるセリシンハイドロゲルの微視構造を観察した。
【０１０３】
図１１に示すように、セリシンハイドロゲル凍結乾燥足場は、励起波長の異なる光源の励起によって、それぞれ、赤色蛍光、緑色蛍光、青色蛍光等を発するのが見られた。
【実施例６】
【０１０４】
一．セリシンハイドロゲルおよびその凍結乾燥足場の蛍光標識プローブとしての使用
１．本実施例におけるセリシン溶液の調製方法は、実施例１の調製方法と同じであり、ハイドロゲルと凍結乾燥足場の調製方法は、実施例１、４、５の調製方法と同じである。
【０１０５】
２．調製したセリシンハイドロゲルと凍結乾燥足場は、異なる波長の励起光の下で、異なる蛍光を発した。波長５１０〜５５０ｎｍの励起下では材料は赤色の光を発し、波長３３０〜３８６ｎｍの励起下では材料は青色の光を発し、波長４２０ｎｍの励起光の励起下では材料は緑色の光を発した。
【０１０６】
３．セリシンハイドロゲルおよびその凍結乾燥足場を動物体内に移植し、小動物画像システムを用いてリアルタイム追跡できた（材料の蛍光信号によって測定）。セリシンハイドロゲルと凍結乾燥足場は、蛍光標識プローブとして使用可能であった。
【０１０７】
二．実験分析
【０１０８】
１．セリシン導管とセリシン凍結乾燥足場の自己蛍光測定
蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１，Ｊａｐａｎ）を利用して、異なる波長条件におけるセリシンハイドロゲルの微視構造を観察した。
図１１に示すように、セリシンハイドロゲル凍結乾燥足場は、励起波長の異なる光源の励起によって、材料が、それぞれ、赤色蛍光、緑色蛍光、青色蛍光等を発するのが見られた。
【０１０９】
２．小動物画像システムによるマウスの体内に注射したセリシンハイドロゲルの追跡分析
小動物画像システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  II,  Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＵＳＡ）を利用し、セリシンハイドロゲルのマウスの皮下、筋肉、腹腔への注射後の状態を観察した。
【０１１０】
図１２に示すように、セリシンハイドロゲルは良好な自己蛍光特性を備え、ハイドロゲルは動物体内でリアルタイム追跡可能である。
【実施例７】
【０１１１】
一．西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をモデル薬物とする、セリシンハイドロゲルの制御放出の測定
【０１１２】
１．西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液（２μｇ／μＬ）４μＬを取り、質量百分率濃度２％のセリシン水溶液５００μＬと混合した。
【０１１３】
２．１に対して質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド１１μＬを加え、室温に０．５時間放置し、４℃の冷蔵庫に入れて２４時間置いた。
【０１１４】
３．サンプル中にＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬを加え、３７℃に保持した。
【０１１５】
４．０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８および２０日時点で、上澄液を注意深く取り出し、新たに１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えた。
【０１１６】
５．酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いて上澄液中のＨＲＰ含有量を測定し、薬物装荷量に対する各時点の上澄液中の累計のＨＲＰ含有量の比率を計算して薬物の累計放出率を得た。
【０１１７】
二．実験分析
測定ステップについては、上記「一」のステップ「１、２、３、４、５」を参照されたい。
セリシンハイドロゲルのＨＲＰ放出分析を行った。
図１３に示すように、２４時間以内の薬物（ＨＲＰ）放出は２７．９７％であり、３日で約５０％に、１４日で８３．７７％に、２０日で８５．３７％に達した。この結果により、セリシンハイドロゲルが、薬物担体として良好な制御放出作用を備えていることが分かる。
【実施例８】
【０１１８】
一．セリシンハイドロゲル上でのヒト皮膚表皮細胞（ＨａＣａＴ）の培養
【０１１９】
１）質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１２０】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地は１６４０培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１２１】
３）０、１、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１２２】
二．実験分析
ヒト皮膚表皮細胞（ＨａＣａＴ）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析した。
１６４０培地を用いて細胞培養を行った。測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１２３】
図１６は、対照組（０日、１日、３日）、およびセリシンハイドロゲル組（０日、１日、３日）に対してそれぞれ播種されたヒト皮膚表皮細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ヒト皮膚表皮細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示し、更にセリシンハイドロゲルが表皮組織の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【実施例９】
【０１２４】
一．セリシンハイドロゲル上でのマウス筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）の培養
【０１２５】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１２６】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地は１６４０培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１２７】
３）０、１、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１２８】
二．実験分析
マウス筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析した。
測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１２９】
図１７は、対照組（０日、１日、３日）、およびセリシンハイドロゲル組（０日、１日、３日）に対してそれぞれ播種されたマウス筋細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、マウス筋細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示し、更にセリシンハイドロゲルが筋肉組織の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【実施例１０】
【０１３０】
一．セリシンハイドロゲル上でのヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）の培養
【０１３１】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１３２】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地は１６４０培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１３３】
３）０、１、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１３４】
二．実験分析
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析した。
測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１３５】
図１８は、対照組（上から下にそれぞれ、０日、１日、３日）、およびセリシンハイドロゲル組（上から下にそれぞれ、０日、１日、３日）に対してそれぞれ播種されたヒト胎児腎臓細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ヒト胎児腎臓細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、ＨＥＫ２９３は良好な工具細胞であり、該セリシンハイドロゲルが工具細胞と結合して対応する治療因子を包むことで、組織の修復に適用可能であることを証明している。
【実施例１１】
【０１３６】
一．セリシンハイドロゲル上でのヒト胎児皮膚繊維芽細胞（ＣＣＣ−ＥＳＦ−１）の培養
【０１３７】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１３８】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地は１６４０培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１３９】
３）０、１、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１４０】
二．実験分析
図１９は、ヒト胎児皮膚繊維芽細胞（ＣＣＣ−ＥＳＦ−１）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析したものである。
細胞は、１６４０培地を使用して培養した。測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１４１】
図１９は、対照組（０日、１日、３日）、およびセリシンハイドロゲル組（０日、１日、３日）に対してそれぞれ播種されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、該セリシンハイドロゲルが、ヒト胎児皮膚繊維芽細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、皮膚組織の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【実施例１２】
【０１４２】
一．セリシンハイドロゲル上でのマウス小グリア細胞（ＢＶ２）の培養
【０１４３】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１４４】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１４５】
３）０、１、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１４６】
二．実験分析
マウス小グリア細胞（ＢＶ２）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析した。
細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して培養した。測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１４７】
図２０は、対照組（上から下にそれぞれ、０日、１日、３日）、およびセリシンハイドロゲル組（上から下にそれぞれ、０日、１日、３日）に対してそれぞれ播種されたマウス小グリア細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、マウス小グリア細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、神経組織の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【実施例１３】
【０１４８】
一．セリシンハイドロゲル上でのマウス膵島内皮細胞（ＭＳ１）の培養
【０１４９】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１５０】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない細胞培養皿を陰性対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ低グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１５１】
３）０、１、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１５２】
二．実験分析
マウス膵島内皮細胞（ＭＳ１）をセリシンハイドロゲル組と照組で比較分析した。
【０１５３】
細胞は、ＤＭＥＭ低グルコース培地を使用して培養した。測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１５４】
図２１は、対照組（０日、１日、３日）、およびセリシンハイドロゲル組（０日、１日、３日）に対してそれぞれ播種されたマウス膵島内皮細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、マウス膵島内皮細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、血管の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【実施例１４】
【０１５５】
一．セリシンハイドロゲル上でのラットシュワン細胞（ＲＳＣ９２６）の培養
【０１５６】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２％のゲニピン水溶液６００μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、７５％エタノールに１時間浸し、エタノールを除去し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１５７】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を陰性対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ高グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１５８】
３）播種後、１、２日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１５９】
二．実験分析
ラットシュワン細胞（ＲＳＣ９２６）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析した。
細胞は、ＤＭＥＭ低グルコース培地を使用して培養した。測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１６０】
図２２は、対照組（１日、２日）、およびセリシンハイドロゲル組（１日、２日）に対してそれぞれ播種されたマウス膵島内皮細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ラットシュワン細胞（ＲＳＣ９２６）の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、末梢神経損傷の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは１００μｍである。
【実施例１５】
【０１６１】
一．セリシンハイドロゲル上でのラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２）の培養
【０１６２】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２％のゲニピン水溶液６００μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、７５％エタノールに１時間浸し、エタノールを除去し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１６３】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を陰性対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ高グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１６４】
３）播種後、１日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１６５】
二．実験分析
ラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２）をセリシンハイドロゲル組と対照組で比較分析した。
細胞は、ＤＭＥＭ低グルコース培地を使用して培養した。測定ステップは、上記測定ステップ「１、２、３」を参照されたい。
【０１６６】
図２３は、対照組（１日）、およびセリシンハイドロゲル組（１日）に対してそれぞれ播種されたマウス膵島内皮細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２）の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、心筋組織損傷の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは１００μｍである。
【実施例１６】
【０１６７】
一．セリシンハイドロゲル上でのヒト臍帯静脈内皮細胞の培養（細胞接着実験にはＥＣＶ３０４細胞を使用、細胞生存性実験にはＥＡ．ｈｙ９２６細胞を使用）
【０１６８】
１）まず質量百分率濃度２％のセリシン水溶液１．５ｍＬと質量百分率濃度２５％のグルタルアルデヒド３３μＬを細胞培養皿中に入れて混合し、培養皿に敷いた。安定にゲル化するのを待って、セリシンハイドロゲルの敷かれた細胞培養皿を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、更に７５％エタノールに１時間浸し、最後に滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、使用まで４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１６９】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ高グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【０１７０】
３）細胞播種後４時間および８時間の２つの時点で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて未接着の細胞をそっと洗い落とし、細胞計数盤を用いて計数した。最初に播種した細胞数と未接着の細胞数の差の、最初に播種した細胞総数に対する比率を、細胞の接着率とした。
【０１７１】
４）細胞播種後２．５日および４．５日で、ＭＴＴ法を用いて播種された細胞の生存性を測定した。
０日、１日、３日時点で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて、普通光下で、細胞を撮影した。
【０１７２】
５）播種後２日時点で、それぞれローダミンファロイジンと４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを用いて播種した細胞を染色し、その後、共焦点レーザー走査顕微鏡（ｉＮｉｋｏｎ  ＡｌＳｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて観察、撮影した。
【０１７３】
二．実験分析
図１５Ａおよび図１５Ｂは、ヒト臍帯静脈内皮細胞の接着と増殖の状態を、普通の電子顕微鏡および共焦点レーザー電子顕微鏡下で観察したものである。図１５Ａは、ヒト臍帯静脈内皮細胞をそれぞれ対照組（０日、１日、４．５日、７．５日）と、セリシンハイドロゲル組に播種したもの（０日、１日、４．５日、７．５日）の普通電子顕微鏡写真である。図１５Ｂは、ヒト臍帯静脈内皮細胞をそれぞれ対照組とセリシンハイドロゲル組に播種したものの１日後の共焦点顕微鏡写真である。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ヒト臍帯静脈内皮細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、血管等の組織損傷の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【０１７４】
その他、詳細に説明しなかった部分は、従来技術である。上述の実施例により本発明を詳細に説明したが、これらは本発明の実施例の一部であり、実施例の全てではない。当業者であれば、本実施例に基づき、創造性なしにその他の実施例を得ることができるが、それらの実施例も全て本発明の保護範囲に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月21日(2016.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【図１】セリシンハイドロゲルを異なる温度で冷凍および低温真空乾燥して得られた凍結乾燥足場と、セリシン神経導管である。
【図２】（室温における）セリシン濃度とゲル化時間の関係を示すグラフである。
【図３】３７℃におけるセリシンハイドロゲルの架橋率を示す折線グラフである。
【図４】セリシンハイドロゲルおよびアルギン酸塩ハイドロゲルの弾性係数を表す棒グラフで、Ａは圧縮強度、Ｂは圧縮係数を表す。
【図５】ＰＢＳ中におけるセリシンハイドロゲルの分解（３７℃）を示す折線グラフである。
【図６】セリシンハイドロゲル分解生成物が分解液のｐＨ値に及ぼす影響を示す。
【図７】異なるｐＨ環境下でのセリシンハイドロゲルの吸水膨張率（３７℃）を示す折線グラフである。
【図８】異なるｐＨ値（３．０、７．４、１１．０）条件下でのセリシンハイドロゲルの水飽和度を示す。
【図９】示差走査熱量測定法による分析スペクトルを示し、図中、（I）はセリシン、(II)はグルタルアルデヒドで架橋されたセリシンハイドロゲル、（III）はグルタルアルデヒドおよび濃塩酸で処理されたセリシン、（IV）はエタノールで処理されたセリシンである。
【図１０】セリシンハイドロゲルとセリシンの赤外線スペクトルを示し、図中、（ａ）はエタノール処理したセリシン、（ｂ）はグルタルアルデヒドおよび濃塩酸で処理されたセリシン、（ｃ）はグルタルアルデヒドで架橋されたセリシンハイドロゲル、（ｄ）はセリシンである。
【図１１】蛍光顕微鏡で観察したセリシン導管および凍結乾燥ハイドロゲルを示す写真である。（Ａ〜Ｈは導管、Ｉ〜Ｌはセリシンハイドロゲル凍結乾燥足場を示す。スケールバーは２００μｍ。）
【図１２】小動物画像システムによるマウスの体内に注射したセリシンハイドロゲルの追跡を示す。
【図１３】セリシンハイドロゲルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）放出を示す折線グラフである。
【図１４】ヒト臍帯静脈内皮細胞の、セリシンハイドロゲル組と対照組における、細胞接着性と細胞生存性を測定したものである。Ａは細胞のセリシンハイドロゲルに対する接着性を測定したグラフ（ＥＣＶ３０４細胞株を用いた）、Ｂは細胞生存性を測定したグラフである（ＥＡ．ｈｙ９２６細胞株を用いた）。
【図１５】ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＥＣＶ３０４）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。Ａは通常の電子顕微鏡写真、Ｂは共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。
【図１６】ヒト皮膚表皮細胞（ＨａＣａＴ）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図１７】マウス筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図１８】ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図１９】ヒト胎児皮膚繊維芽細胞（ＣＣＣ−ＥＳＦ−１）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２０】マウス小グリア細胞（ＢＶ２）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２１】マウス膵島内皮細胞（ＭＳ１）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２２】ラットシュワン細胞（ＲＳＣ９２６）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【図２３】ラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２）の、セリシンハイドロゲル組と対照組の写真。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
図８によれば、異なるｐＨ値（３．０、７．４、１１．０）条件下でのセリシンハイドロゲルの水飽和度は、ｐＨ１１．０のアルカリ性条件におけるセリシンの吸水量が１２７５％、ｐＨ３．０の酸性条件におけるセリシンハイドロゲルの吸水量が８６０％であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない細胞培養皿を対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ低グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本実施例におけるセリシンハイドロゲルの調製方法は、以下を除いて、実施例１の調製方法と同じである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
本実施例におけるセリシンハイドロゲルの調製方法は、以下を除いて、実施例１の調製方法と同じである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
本実施例におけるセリシンハイドロゲルの調製方法は、以下を除いて、実施例１の調製方法と同じである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を陰性対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ低グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
図２２は、対照組（１日、２日）、およびセリシンハイドロゲル組（１日、２日）に対してそれぞれ播種されたラットシュワン細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ラットシュワン細胞（ＲＳＣ９２６）の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、末梢神経損傷の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは１００μｍである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を陰性対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ低グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
図２３は、対照組（１日）、およびセリシンハイドロゲル組（１日）に対してそれぞれ播種されたラット心筋細胞の接着と増殖の状態を、電子顕微鏡下で観察したものである。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ラット心筋細胞（Ｈ９Ｃ２）の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、心筋組織損傷の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは１００μｍである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
２）細胞培養フラスコから集めた細胞を懸濁し、吹散し、１）で前処理した培養皿に播種した。セリシンハイドロゲルの敷かれていない培養皿を対照とした。細胞培養用の培地はＤＭＥＭ低グルコース培地とし、細胞培養器に入れて細胞を培養した（３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度１００％）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
二．実験分析
図１５Ａおよび図１５Ｂは、ヒト臍帯静脈内皮細胞の接着と増殖の状態を、普通の電子顕微鏡および共焦点レーザー走査顕微鏡下で観察したものである。図１５Ａは、ヒト臍帯静脈内皮細胞をそれぞれ対照組（０日、１日、４．５日、７．５日）と、セリシンハイドロゲル組に播種したもの（０日、１日、４．５日、７．５日）の普通電子顕微鏡写真である。図１５Ｂは、ヒト臍帯静脈内皮細胞をそれぞれ対照組とセリシンハイドロゲル組に播種したものの１日後の共焦点顕微鏡写真である。この実験結果は、セリシンハイドロゲルが、ヒト臍帯静脈内皮細胞の接着と生存および増殖を良好に支持できることを示している。さらに、該セリシンハイドロゲルが、血管等の組織損傷の修復に適用可能であることを証明している。スケールバーは５０μｍである。
【国際調査報告】
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