(57)【要約】本発明は、流体から生体分子を回収するための新規の吸着組成物を提供する。組成物は、粉砕粒子の形態で、正及び負荷電の微小粒子を含む。吸着剤は、細胞培養物からの生体分子の精製のために特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を含む組成物であって、該正荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陰イオン交換樹脂を含み、前記負荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含む、組成物。
【請求項２】
前記陽イオン交換樹脂は弱又は強酸性である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記陰イオン交換樹脂は弱又は強塩基性である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂は、ポリスチレンベース、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）ポリアクリルアミドベース、メタクリル酸（ＭＡＡ）ベースである、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂はジビニルベンゼンベースと架橋されたポリスチレンである、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記微小粒子は約５μm未満の平均粒子サイズを有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記陰イオン交換樹脂は、Amberlite IRA-485、Amberlite IRA-400、Dowex 1X2-100、Dowex 1-8-100、Marathon A2、又はDiaion SA20Aである、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
前記陽イオン交換樹脂は、Amberlite IRC-748、Dowex 50 WX2-100、Dowex 50WX8-100、Marathon MSC、又はDiaion SK110である、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
生体分子、好ましくはタンパク質又はプラスミドを吸着するための、請求項１〜８のいずれか１項記載の正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子の使用。
【請求項１０】
細胞ホモジネート又は発酵上清から生体分子、好ましくはタンパク質を吸着するための請求項８記載の使用。
【請求項１１】
細胞を破壊するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用。
【請求項１２】
細胞を破壊するための、並びに、分子、好ましくは生体分子、より好ましくはポリペプチド及びプラスミドを吸着するための、請求項１〜１６記載の正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用。
【請求項１３】
生体分子を含む生物学的流体から生体分子を得る方法であって、
ｅ）生物学的流体に、請求項１〜１６のいずれか１項記載の正荷電の微小粒子を加えること、及び負荷電の微小粒子を加えること、
ｆ）前記微小粒子が綿状物を形成することを可能にすること、
ｇ）前記生物学的流体から綿状物を除去すること、
ｈ）前記生体分子を回収すること
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に規定する正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子並びに、場合により、懸濁のための手段を含むキット。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に規定する生体分子並びに正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を含む、生物学的流体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、流体から、特に生物学的流体からの生体分子の分離の分野に関する。本発明は、生物学的流体からの生体分子の回収のために適用される組成物、使用、及び方法に関する。さらに、別の局面において、本発明は、細胞培養の分野及び細胞培養からの生体分子の精製に関する。
【０００２】
発明の背景
混合物からの生体分子の分離は、伝統的には、クロマトグラフィ技術、ろ過、又は沈殿を利用することにより実施されてきた。バイオテクノロジー産物及びプロセスの開発における継続する急増は、効率的で費用対効果の高い分離及び精製プロセス並びに装置についての必要性をもたらしてきた。発酵プロセスによる生体分子の調製は、一般的に、「上流」及び「下流」プロセスとして言及される２つの一般的なカテゴリーに分けることができる。上流プロセスでは、所望の生物医薬産物を産生するためのシステムの生化学的設計に取り組み、下流プロセスでは、最終産物を回収及び精製することに焦点を合わせる。
【０００３】
下流プロセシングは、典型的には、以下を含む：（１）発酵産物（例、タンパク質）又はポリヌクレオチド（例えばプラスミドなど）は、宿主細胞による分泌のため、培養上清中に既にありうるため、必要な場合、例えば細胞破壊による、発酵細胞の内容物の放出；（２）典型的には、所望の産物及び他の生物学的実体を含む母液から細胞残屑を分離することによる、内容物の清澄を提供するための遠心分離；（３）その後の工程のために母液を濃縮するための限外ろ過；及び（４）典型的には、マルチ方式の分離方法（例、イオン交換、疎水性相互作用、逆相）を使用した液体クロマトグラフィ方法による最終産物の精製。
【０００４】
タンパク質吸着のために使用されるクロマトグラフィ樹脂は、一般的に、マクロ多孔性の親水性材料を含む。伝統的なクロマトグラフィ技術において、定義された粒子及び細孔のサイズを有する、従来の粒状クロマトグラフィ材料が使用される。多孔度は、高容量のために十分な表面積を提供するために不可欠であり、親水性の表面によって可逆的吸着が可能になる。クロマトグラフィ樹脂の基材は、通常、架橋天然ポリマー（セルロース、デキストラン、又はアガロースなど）、並びにポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、及びポリスチレンジビニルベンゼンの誘導体で作製された合成ポリマーである。後者は、しばしば、親水性ポリマーでコーティングされる。イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、又は親和性樹脂は、化学的誘導体化により、又は表面グラフト化技術により機能的リガンドと共役される。
【０００５】
工業において、上流の製造能力は劇的に増加しており、多くの製造業者は、複数の１００００Lバイオリアクターを同時に操作することを選んでいる。しかし、標準的なクロマトグラフィ方法によって、迅速なスケールアップを可能にすることはできない。
【０００６】
クロマトグラフィ精製工程（また、捕捉工程と呼ばれる）の最初の段階では、プロセシングされなければならない大きなサンプル容積のため、大きな床容積が一般的に使用される。しかし、大きなカラムでは、スケールに関連する包装の問題（例えばヒステリシス、エッジ効果、及び樹脂圧縮など）に悩まされ、それらは、予測不可能な流体分布及び圧力降下をもたらす。
【０００７】
工業用及び調製適用における充填クロマトグラフィカラムの性能は、最大許容圧力降下により限定される。圧力降下の制限のため、より大きな（例えば４０μmより大きな）直径を伴う樹脂ビーズが使用される。
【０００８】
生体分子の捕捉は、細孔拡散に依存するが、しかし、大きな生体分子は、孔中に容易には拡散せず、拡散経路は、より大きな樹脂粒子の使用により増加される。これによって、物質移動抵抗が起こり、カラム効率が下がる。なぜなら、大きな分子は、樹脂ビーズの外表面にだけ結合することができるためである。従って、より長い滞留時間が、樹脂粒子内部に結合するリガンドを発見するために要求され、それは、次に、遅い吸着プロセスにつながる。ハイスループットが、大きなサンプル容積を処理するために非常に重要であるため、特に、大きなタンパク質の吸着のための大きな粒子の使用は、全体的な生産性に対する影響を有する。
【０００９】
要するに、現在のクロマトグラフィ技術は、工業における要求を満たすために簡単にスケールアップすることはできない。この方法では、時間がかかり、工業的規模において実行するのが高価であるという欠点に悩まされる。
【００１０】
したがって、カラムクロマトグラフィへの代替物を提供する必要性がある。クロマトグラフィに代わる方法（膜ろ過、水性二相抽出、沈殿、結晶化、モノリス、及び膜クロマトグラフィを含む）が提案されてきた（Przybycien et al "Alternative bioseparation operations: life beyond packed-bed chromatography" Curr Opin Biotechnol. 2004; 15(5）:469-78）。
【００１１】
Paril et al. J. Biotechnol. 2009; 141: 47-57には、微小粒子の荷電表面上にＤＮＡを吸着するための手段及び方法が提供されている。具体的には、Paril et al.は、ｐＤＮＡの吸着に、Rohm及びHaasにより提供されるポリスチレンベースの微小粒子を使用している。しかし、Paril et al.は、ｐＤＮＡを吸着することができるように、これらの微小粒子をどのように調製するのかを教示していない。一般的に、微小粒子は、ミクロンサイズを有する粒子を指す。
【００１２】
標準的なクロマトグラフィ技術への代わりである、流体から生体分子を得るための、代替の、好ましく改善された方法を提供する必要性が依然としてある。本発明の技術的課題は、上に言及する必要性の１つ又は複数に準拠することである。
【００１３】
本明細書において使用される通り、文脈が明らかに他を示さない場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の参照を含むことに注意しなければならない。このように、例えば、「ａ  ｒｅａｇｅｎｔ（試薬）」への参照は、そのような異なる試薬の１つ又は複数を含み、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ（方法）」への参照は、本明細書において記載する方法について改変又は置換されうる、当業者に公知の等価の工程及び方法への参照を含む。
【００１４】
特記のない場合、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連におけるすべての要素を指すものと理解すべきである。当業者は、日常的な実験だけを使用し、本明細書において記載する、本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識又は確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明により包含されることが意図される。
【００１５】
用語「及び／又は」は、本明細書において使用される場合はいつでも、「ａｎｄ」、「ｏｒ」、及び「前記用語により接続される要素の全て又は任意の組み合わせ」の意味を含む。
【００１６】
本明細書において使用する用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０%以内、好ましくは１０%以内、より好ましくは５%以内を意味する。それは、しかし、また、具体的な数を含み、例えば、約２０は２０を含む。
【００１７】
用語「未満」又は「より大きい」は、具体的な数字を含む。例えば、２０未満は、それより少ない、又は等しいことを意味する。同様に、上回る、又はより大きいは、上回る、又は等しい、あるいは、より大きい、又は等しいを意味する。
【００１８】
本明細書及び続く特許請求の範囲を通して、文脈が他に要求しない場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、及びバリエーション（例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」など）は、記載する整数又は工程あるいは整数又は工程の群の包含を意味するが、しかし、任意の他の整数又は工程あるいは整数又は工程の群の排除を意味しないことが理解されるであろう。本明細書において使用する場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」は、用語「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含んでいる）」又は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含んでいる）」、あるいは、時折、本明細書において使用される場合、用語「ｈａｖｉｎｇ（有している）」と置換されることができる。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「からなる」は、請求項の要素において特定されない任意の要素、工程、又は成分を排除する。本明細書において使用する場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的な、新規の特徴に、物質的に影響しない物質又は工程を排除しない。
【００２０】
本明細書における各々の例において、用語「を含んでいる」、「から本質的になる」、及び「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。
【００２１】
本発明は、本明細書において記載する、特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、及び物質などに限定されず、そのように変動することができることを理解すべきである。本明細書において使用する用語法は、特定の実施態様だけを記載する目的のためであり、特許請求の範囲だけにより定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００２２】
本明細書の本文を通して引用される全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、上記又は下記を問わず、その全体が参照により本明細書により組み入れられる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明により、そのような開示に先行する資格がないことの承認として解釈されるべきではない。参照により組み入れられる材料が、本明細書と矛盾する、又は一致しない範囲まで、本明細書は、任意の材料に優先する。
【００２３】
概要
本発明は、例えば、液体、流体（例えば培養上清など）から、細胞ホモジネート及び／又は他の生物学的流体から、分子、好ましくは生体分子の直接的な捕捉を可能にする、新規方法及び吸着剤材料を提供する。本発明は、伝統的なクロマトグラフィ技術と比較し、簡単で、迅速で、安価である。以前に記載した通り、生体分子の現在の捕捉は、多孔性粒子で充填した固定床上での吸着又は多孔性粒子でのバッチ吸着により作製される。しかし、これらのプロセスは、望ましくない欠点を有する。なぜなら、大きなカラム床容積が要求され、それは、次に、通常、大きな直径を有する粒子の孔中の長い拡散経路のため、遅い吸着に導く。さらに、これらのプロセスは、物質移動が限定される。
【００２４】
本発明に従い、生体分子の捕捉のための新規の吸着材料が提供される。吸着材料は、固体であり、荷電した微小粒子を含む。微小粒子は粉砕形態であり、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を粉砕することにより調製することができる。
【００２５】
本発明は、また、固体であり、疎水性である生体分子微小粒子の捕捉のための新規の吸着材料として提供する。微小粒子は、粉砕形態であり、疎水性吸着材料（例えばAmberlite XAD4、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD761など）を粉砕することにより調製することができる。
【００２６】
本発明により提供される粗い表面を伴う微小粒子は、充填床中のクロマトグラフィ媒質として使用されない。なぜなら、それらは、フリット及びフィルターを詰まらせ、従って、プロセシングの困難をもたらすからである。さらに、それらは、バッチプロセシング適用における設定時間を延長し、樹脂の摩耗に寄与する。しかし、共通の一般的知識に基づく、これらの悲観的な仮定にもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の粒子は、分子、好ましくは生体分子、特にポリペプチドを迅速かつ高度に効率的に吸着し、それらがバッチ吸着に適することができることを見出した。さらに、本発明は、迅速な吸着性を示すことが見出された。特に、本発明者らは、粒子（本発明の荷電粒子及び疎水性粒子の両方）が、分子、好ましくは、生体分子への結合時に凝結することを見出した。綿状物の形成によって、不要な細胞残屑を含む生物学的流体からの生体分子の簡単な分離が可能になる。従って、本発明における吸着剤は、スケーラブルな様式で、分子、好ましくは、生体分子を吸着するために利用することができる。さらに、驚くべきことに、回収のプロセスにおいて荷電粒子を使用し、高い吸着能を有することが見出されている。加えて、それは、また、そこから形成された綿状物の簡単な取り扱い、並びに流体からの形成された綿状物の簡単な分離を可能にする。
【００２７】
さらに、本発明者らは、微小粒子が、細胞構造を破壊するように作用することができることも発見している。従って、本発明は、一局面において、細胞破壊及び下流のプロセシング中の生体分子の回収の工程を組み合わせた、単純化された使用及び方法を提供する。
【００２８】
用語「細胞破壊」又は「細胞の破壊」は、互換的に使用され、一般的に、細胞の完全性を妨害するための方法又はプロセスを指す。本明細書において使用される細胞破壊は、生体分子が細胞から放出されるような程度まで、細胞を透過性にするための方法又はプロセスを含むが、これらに限定されない。細胞破壊は細胞死を含む場合もあれば、含まない場合もある。好ましくは、細胞破壊は、細胞構造の完全な断片化を含まない。特定の理論により拘束されることを望まないが、細胞の断片化の減少によって、（潜在的に）混入する細胞残屑のレベルが低下する。本発明の一部の実施態様において、細胞は、本明細書において記載する方法により破壊され、生体分子を放出するが、しかし、生存可能なままである。放出された生体分子は、細胞を破壊するために使用される微小粒子に吸着しうる、又はしないであろう。放出された生体分子は、その後、本明細書において記載する方法又は他の公知の技術を使用して生物学的流体から回収することができる。このように、本発明は、単純化されたツーステッププロセスにおける、細胞破壊、生体分子放出、及びその後の生体分子の回収のための新規方法を与える。本発明の微小粒子を使用し、生体分子の酸性度（即ち、生体分子は、酸性、塩基性、又は中性でありうる）にかかわらず、それらが細胞懸濁液中に回収することができるように、細胞を開き、生体分子を放出してもよい。
【００２９】
本発明の第１の局面に従い、前記組成物は、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を含み、該正荷電の微小粒子は、粉砕されたポリマー陰イオン交換樹脂を含み、前記負荷電の微小粒子は、粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含む。前記組成物は、互いに混合される、又は混合されない、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を指す。本明細書において出現する通り、前記吸着材料は、生物学的流体中に、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を別々に加えることにより使用することができる。あるいは、それらは、事前に混合され、生物学的流体に添加される場合がある。
【００３０】
本発明の第２の局面において、前記組成物は、疎水性微小粒子を含む。これらの疎水性微小粒子は、特定のペプチド又はポリペプチドを吸着することが可能である。吸着のための機構は、吸着リガンド（例えばペプチド又はポリペプチドなど）の疎水性部分と微小粒子のポリマー表面との間での疎水性（ファンデルワールス、ロンドン・タイプ）引力に主に基づいていると考えられる。
【００３１】
微小粒子は、本明細書において記載する通りに樹脂を粉砕し、例えば、イオン交換樹脂を粉砕することにより、及び、場合により、樹脂を条件付けすることにより、入手可能である（得ることができる）。そのような粒子は、好ましくは、本明細書において、「微小粒子」、「吸着粒子」、「吸着剤」、「粒子」、「粉砕粒子」、又は「粉砕樹脂」として言及される。これらの用語は互換的に使用される。好ましくは、微小粒子は、例えば、水の脱イオン化及び廃水処理のために通常意図されている従来の大きな直径の小孔粒子を粉砕することにより得られる。
【００３２】
正荷電の微小粒子は、好ましくは、粉砕されたポリマー陰イオン交換樹脂を含み、負荷電の微小粒子は、好ましくは、粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含む。好ましい実施態様における微小粒子は、粉末の形態である、又は粒子懸濁液を形成する液体媒質中に存在する。好ましくは、微小粒子は、水性ゲルの形態ではない。正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の両方を含む組成物が、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を混合することにより調製することができる。それらは、生物学的流体中に別々に添加されるように、正荷電微小粒子及び負荷電の微小粒子を別々に提供することにより調製することができる。
【００３３】
陽イオン交換樹脂を使用し、負荷電の微小粒子を調製することができる。陽イオン交換樹脂は、弱又は強酸性の場合がある。同様に、陰イオン交換樹脂を使用し、正荷電の微小粒子を調製することができる。陰イオン交換樹脂は、弱又は強塩基の場合がある。
【００３４】
本発明に従ったイオン交換樹脂は、任意の適切な材料に基づくことができる。好ましくは、樹脂は、ポリスチレンベース、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）ベース、ポリアクリルアミドベース、又はメタクリル酸（ＭＡＡ）ベースである。より好ましくは、樹脂は、ジビニルベンゼンベースを用いて架橋されたポリスチレンである。
【００３５】
好ましい一実施態様において、微小粒子は、約１０μm未満（例えば約５μm未満など）の平均粒子サイズを有する粉砕粒子の形態である。本発明の〜１μmの直径（ｄ５０）の微小粒子は、表面積計算値、タンパク質能力の測定値、及び球状タンパク質の六角形フットプリントを仮定した理論上計算値に基づき、〜１００ｎｍの直径（ｄ５０）の球状ナノ粒子と同様のタンパク質能力を有する。より好ましくは、本発明の微小粒子は、高い結合能を有するマクロ多孔性媒質、例えばBio-Rad Laboratories（ＵＳＡ）により開発されたNuvia媒質（Nuvia S Media−オンラインカタログ２０１３，Ｎｏ．１５６−０３１１、Nuvia Q Media−オンラインカタログ２０１３，Ｎｏ．１５６−０４１１、又はNuvia cPrime media−オンラインカタログ２０１３，Ｎｏ．１５６−３４０１）の粒子などと同程度、即ち等価である比面積（specific area）を有する。「比面積」とは、１ミリリットル（ml）のスラリー当たりの面積又は１グラム（g）の樹脂当たりの面積を意味する。
【００３６】
本発明に従った微小粒子は、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を粉砕することにより得ることができる。陰イオン交換樹脂は、例えば、Amberlite IRA-485、Amberlite IRA-400、Dowex 1X2-100、Dowex 1-8-100、DIAION SA20A、Marathon A2、又は当技術分野において公知の他の陽イオン交換樹脂でありうるが、陽イオン交換樹脂は、例えば、Amberlite IRC-748、Dowex 50 WX2-100、WX8-100Dowex 50、DIAION SK110、Marathon MSC、又は当技術分野において公知の他の陰イオン交換樹脂の場合がある。
【００３７】
正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の比率は、約０．１：９９．９（ｗ／ｗ）から９９．９：０．１（ｗ／ｗ）の範囲の場合がある。
【００３８】
別の局面において、本発明は、流体から、生体分子、好ましくはタンパク質又はポリヌクレオチド、例えばＤＮＡなど（例、プラスミド）を吸着するための、本明細書において開示する正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用を提供する。代替物において、疎水性微小粒子は、同じ目的のために使用される。本発明の微小粒子により吸着することができる、さらなる生体分子を、本明細書において以下に記載する。流体は、生物学的流体、例えば細胞ホモジネート、発酵上清、細胞懸濁液、発酵ブロスなどである。「生物学的流体」並びに生物学的流体の好ましい例のより詳細な、また、好ましい記載が、本明細書において以下に提供される。
【００３９】
本発明のさらに別の局面は、細胞を破壊し、細胞から放出された生体分子を吸着するための微小粒子の使用、特に荷電微小粒子の使用である。そのような細胞は、好ましくは、本明細書において記載する、細胞懸濁液、発酵ブロス、又は培養液中に含まれる。
【００４０】
本発明は、また、生物学的流体、例えば細胞ホモジネート又は発酵上清などから生体分子を得る方法に関し、本明細書において記載する吸着剤を加えること；微小粒子が綿状物を形成することを可能にすること；生物学的流体から綿状物を除去すること、及び、綿状物から生体分子を脱着すること、又は生物学的流体から生体分子を精製することにより、生体分子を回収することを含む。
【００４１】
好ましくは、前記方法は、発酵ブロス、発酵上清、細胞ホモジネート、又は細胞懸濁液から生体分子を得るために使用される。好ましい一実施態様において、生物学的流体は、微小粒子が加えられた後、撹拌される。
【００４２】
生物学的流体の例は、大腸菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及び培養ＣＨＯ細胞などからの細胞培養物及び細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞上清を含む。前記細胞培養物及び細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞上清を追加的にろ過し、濃縮し、透析し、条件付けし、又は任意の他の方法で処理することができる。本明細書において説明する細胞培養物及び細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞上清を、例えば、希釈、ｐＨ調整、塩分濃度の調整などにより条件付けその他の方法で処理することができる。
【００４３】
別の局面において、本発明は、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子を含むキットを提供する。キットは、さらに、微小粒子を懸濁するための手段（例えば水など）を含みうる。
【００４４】
また、本発明は、また、生体分子並びに本発明の正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子を含む生物学的流体を提供する。
【００４５】
本発明の正確な本質、並びにその利点が、以下の記載及び実施例から当業者に明らかになるであろう。本発明は、このように、開示された好ましい実施態様又は実施例に限定されない。当業者は、他の実施態様及び適用を作成するために、本発明の教示を容易に適合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ】Dowex 1X8-100から調製された微小粒子の光学顕微鏡写真（１０００×拡大）。
【図１ｂ】Dowex 1X8-100から調製された微小粒子の光学顕微鏡写真（１０００×拡大）（粒子サイズ分布。
【図２】種々の微小粒子の粒子サイズ分布。
【図３ａ】MARATHON A2の表面の原子間力顕微鏡像（粉砕前）；左から右に増加する詳細な識別。
【図３ｂ】MARATHON A2の表面の原子間力顕微鏡像（粉砕後）；左から右に増加する詳細な識別。
【図３ｃ】MARATHON MSCの表面の原子間力顕微鏡像（粉砕前）；左から右に増加する詳細な識別。
【図３ｄ】MARATHON MSCの表面の原子間力顕微鏡像（粉砕後）；左から右に増加する詳細な識別。
【図４】０．１mg/mLの濃度（左パネル）での微小粒子上でのトリプシン阻害剤（ＴＩ）及びＩｇＧの、並びに０．５mg/mLの濃度（右パネル）でのＴＩの吸着動態。
【図５ａ】Labstar LS1ミルを用いたMARATHON MSCの粉砕プロセスの間での微小粒子のサイズ分布。パーセンテージは（ｖ／ｖ）として与えられる。
【図５ｂ】Labstar LS1ミルを用いたMARATHON MSCの粉砕プロセスの間での微小粒子の平均径。パーセンテージは（ｖ／ｖ）として与えられる。
【図６ａ】種々の陰イオン交換微小粒子上でのトリプシン阻害剤の平衡能。緩衝条件は、２０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０であった。インキュベーション時間は１／２時間であった。
【図６ｂ】種々の陰イオン交換微小粒子上でのウシ血清アルブミンＢＳＡの平衡能。緩衝条件は、２０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０であった。インキュベーション時間は１／２時間であった。
【図７ａ】種々の陽イオン交換微小粒子及びポリマー粒子Nuvia S上でのリゾチームの平衡能。緩衝条件は、５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０であった。インキュベーション時間は、微小粒子については１／２半時間及びNuvia Sについては１２時間であった。
【図７ｂ】種々の陽イオン交換微小粒子及びポリマー粒子Nuvia S上でのポリクローナルＩｇＧの平衡能。緩衝条件は、５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０であった。インキュベーション時間は、微小粒子については１／２半時間及びNuvia Sについては１２時間であった。
【図８】陰イオン交換微小粒子上での大腸菌透析ろ過物からのＧＦＰの平衡能。緩衝条件は、２０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０であった。インキュベーション時間は１／２時間であった。
【図９ａ】NuviaS樹脂についての吸着緩衝液の導電率に対してプロットされたポリクローナルＩｇＧの平衡能。
【図９ｂ】MARATHON MSC微小粒子についての吸着緩衝液の導電率に対してプロットされたポリクローナルＩｇＧの平衡能。
【図１０】ｐＨ６．０での異なる粒子サイズを伴うMARATHON MSC上でのポリクローナルＩｇＧについての平衡能。吸着条件は、２０mM  ＭＥＳ  ｐＨ６．０での１mg*mL-1ポリクローナルＩｇＧであった。ＩｇＧ濃度は、マイクロタイタープレート中で、２８０ｎｍで測定した。
【図１１ａ】パス０１、０２、及び０３にわたる吸着、溶出、及び再生工程後の、粉砕されたＤＯＷＥＸ  ＭＡＴＡＴＨＯＮ  Ａ２（ＭＡ２）からのＧＦＰ、ＨＣＰ、及びｄｓＤＮＡの回収（%）。パス０１、０２、及び０３は、同じサンプルのその後のプロセシングについての同義語として使用される。ＧＦＰの回収についての結果を示す。
【図１１ｂ】パス０１、０２、及び０３にわたる吸着、溶出、及び再生工程後の、粉砕されたＤＯＷＥＸ  ＭＡＴＡＴＨＯＮ  Ａ２（ＭＡ２）からのＧＦＰ、ＨＣＰ、及びｄｓＤＮＡの回収（%）。パス０１、０２、及び０３は、同じサンプルのその後のプロセシングについての同義語として使用される。ＨＣＰの回収についての結果をそれぞれ示す。
【図１１ｃ】パス０１、０２、及び０３にわたる吸着、溶出、及び再生工程後の、粉砕されたＤＯＷＥＸ  ＭＡＴＡＴＨＯＮ  Ａ２（ＭＡ２）からのＧＦＰ、ＨＣＰ、及びｄｓＤＮＡの回収（%）。パス０１、０２、及び０３は、同じサンプルのその後のプロセシングについての同義語として使用される。ｄｓＤＮＡの回収についての結果をそれぞれ示す。
【図１２】吸着／溶出実験の間での上清についてのエンドトキシン濃度。
【図１３．１】約３０秒の設定時間後での１０%MARATHON A2微小粒子を用いた凝結MARATHON MSC。
【図１３．２】粉砕されたMarathon A2を使用したその後の凝結を伴う、粉砕されたMarathon MSC上でのｐｌｇＧの捕捉の間に形成された綿状物の算出された流体力学的直径のボックスプロット。流体力学的直径ｄ１０は、１０%パーセンタイル（綿状物の９０%が、所与の直径よりも大きい）として与えられる。データは、Marathon A2（ＡＩＥＸ）とMarathon MSC（ＣＩＥＸ）の容積比によりグループ化される。ひげは四分位範囲の１．５倍でプロットされる。赤色線は、分布の中央値を表す。青色のプラス記号は、ひげにより記載される範囲外のデータポイントである。
【図１４．１】凝結したMarathon MSC微小粒子についての速度分布。
【図１４．２】ＣＨＯ細胞上清からのＩｇＧの捕獲及び溶出を記載するフローチャート。
【図１４．３】ＩｇＧのその後の捕捉を伴う、ＡＩＥＸ微小粒子を使用した細胞捕捉。ＤＮＡの９９%超及び宿主細胞タンパク質の６０%が、細胞と一緒に捕捉される。
【図１４．４】異なる塩及び緩衝条件でのMarathon MSCからのＩｇＧの回収。１mg/mLの濃度でのポリクローナルＩｇＧは、粉砕されたMarathon MSCを使用して捕捉された。吸着条件は５０mM  ＭＥＳ  ｐＨ６．０であった。吸着は、ロータリーシェーカー上で、２０rpmで１５分間にわたり１５mLのFalcon試験管中で行った。結果としてもたらされるMarathon MSCの容量は、約４０mg/mLであった。微小粒子を、１０分間にわたる１６０００rcfでの遠心分離により分離した。アッセイの容積は２mLであった。溶出は、対応する緩衝液の１mLを使用して実施した。
【図１５】粉砕された微小粒子MARATHON A2及びMARATHON MSC並びに商業的に入手可能なミクロスフェアＡＬＥＸ及びＣＩＥＸの粒子サイズ分布。
【図１６】粉砕された微小粒子MARATHON A2及びMARATHON MSC並びに商業的に入手可能なミクロスフェアＡＬＥＸ及びＣＩＥＸのゼータ電位。
【図１７】粉砕された微小粒子MARATHON A2及びMARATHON MSC並びに商業的に入手可能なミクロスフェアＡＬＥＸ及びＣＩＥＸのタンパク質結合能。
【図１８】Marathon MSC（ＯＲＳ）及び事前に凝結されたMarathon MSC（ＴＲＳ）上でのＩｇＧについてのタンパク質の能力の比較。Marathon A2とMarathon MSCとの比率は０．４であった。吸着は、１５分間にわたり行った。
【００４７】
本発明の項目
本発明は、また、以下の項目により特徴付けることができる：
１．正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を含む組成物であって、該正荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陰イオン交換樹脂を含み、前記負荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含む、組成物。
２．疎水性微小粒子を含む組成物。
３．前記陽イオン交換樹脂は弱又は強酸性である、項目１の組成物。
４．前記陰イオン交換樹脂が弱又は強塩基性である、項目１の組成物。
５．前記陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂は、ポリスチレンベース、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）ポリアクリルアミドベース、メタクリル酸（ＭＡＡ）ベースである、先行する項目のいずれか１つの組成物。
６．前記陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂はジビニルベンゼンベースと架橋されたポリスチレンである、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
７．前記微小粒子は約５μm未満の平均粒子サイズを有する、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
８．前記負荷電の微小粒子は実施例４において記載する条件を使用し、少なくとも５mg  のＧＦＰを吸着することができる、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
９．前記正荷電の微小粒子が実施例４において記載する条件を使用し、少なくとも５mgのポリクローナルＩｇＧを吸着することができる、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
１０．前記微小粒子は、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を粉砕し、粉砕された前記陰イオン交換樹脂及び粉砕された前記陽イオン交換樹脂を混合することにより得られる、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
１１．前記陰イオン交換樹脂は、Amberlite IRA-485、Amberlite IRA-400、Dowex 1X2-100、Dowex 1-8-100、Marathon A2、又はDiaion SA20Aである、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
１２．前記陽イオン交換樹脂は、Amberlite IRC-748、Dowex 50 WX2-100、Dowex 50WX8-100、Marathon MSC、又はDiaion SK110である、先行する項目のいずれかの１つの組成物。
１３．前記樹脂は非多孔質である、先行する項目のいずれか１つの組成物。
１４．前記正荷電の微小粒子及び／又は負荷電の微小粒子あるいは疎水性微小粒子は、前記樹脂を粉砕し、該樹脂を条件付けすることにより入手可能である、先行する項目のいずれか１つの組成物。
１５．前記組成物は粉末の形態である、先行する項目のいずれか１つの組成物。
１６．前記組成物は、液体媒質中、例えばスラリー又は懸濁液などの中に存在する、先行する項目のいずれか１つの組成物。
１７．正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の比が約０．１：９９．９（ｗ／ｗ）から９９．９：０．１（ｗ／ｗ）である、先行する項目のいずれか１つの組成物。
１８．生体分子、好ましくはタンパク質又はプラスミドを吸着するための、先行する項目のいずれか１つの正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子の使用。
１９．細胞ホモジネート又は発酵上清から生体分子、好ましくはタンパク質を吸着するための項目１７における使用。
２０．細胞を破壊するための、先行する項目いずれか１つの正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用。
２１．細胞を破壊するための、並びに、分子、好ましくは生体分子、より好ましくはポリペプチド及びポリヌクレオチドを吸着するための、項目１−１６の正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用。
２２．生体分子を含む生物学的流体から生体分子を得る方法であって、  ａ）生物学的流体に、項目１〜１６のいずれか１つの正荷電の微小粒子を加えること、及び負荷電の微小粒子を加えること、
ｂ）前記微小粒子が綿状物を形成することを可能にすること、
ｃ）前記生物学的流体から綿状物を除去すること、
ｄ）ｃ）において綿状物から生体分子を脱着すること、又は、生物学的流体から生体分子を精製すること
を含む、方法。
２３．前記生物学的流体は細胞ホモジネート又は発酵上清である、項目２１に従った方法。
２４．前記流体は細胞懸濁液であり、前記方法は、さらに、工程ａ）及び／又はｄ）の後に細胞懸濁液を撹拌することを含む、項目２１に従った方法。
２５．工程ｃ）が、遠心分離又はろ過のような分離より行われる、項目２１、２２、又は２３に従った方法。
２６．工程ａ）において、前記正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子は別々に加えられる、項目２１〜２４のいずれか１つに従った方法。
２７．工程ａ）は、前記生物学的流体中に前記負荷電の微小粒子を加え、次に、該生物学的流体中に前記正荷電の微小粒子を加えることを含む、項目２１〜２４のいずれか１つに従った方法。
２８．項目１〜１６のいずれか１つの正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子並びに、場合により、懸濁のための手段を含むキット。
２９．項目１−１６のいずれか１つに規定する、生体分子並びに正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子を含む、生物学的流体。
３０．綿状物をさらに含む項目２９の流体。
３１．生体分子の回収のための正及び負荷電の微小粒子の使用であって、該正荷電の微小粒子は粉砕された陰イオン交換樹脂を含み、該負荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含み、前記生体分子は酸性又は塩基性である、使用。
３２．細胞溶解物又は細胞ホモジネートからの生体分子の回収のための項目３１の使用。
３３．細胞懸濁液からの生体分子の回収のための項目３１の使用。
３４．細胞破壊及び細胞からの生体分子の放出のための正及び負荷電の微小粒子の使用であって、該正荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負荷電の微小粒子は粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含み、前記生体分子は酸性又は塩基性である、細使用。
３５．生物学的流体から生体分子を得る方法であって、ａ）該生物学的流体に正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を加えること、並びに前記生物学的流体から前記生体分子を回収することを含み、前記生体分子は酸性又は塩基性である、方法。
３６．前記生物学的流体は、細胞懸濁液、細胞溶解物、又は細胞ホモジネートである、項目３５の方法。
３７．細胞から生体分子を得る方法であって、ａ）該細胞を破壊するために正荷電の微小粒子又は負荷電の微小粒子を加えること、ｂ）反対荷電の微小粒子を加えること、並びにｂ）前記生体分子を回収することを含む、方法。
３８．前記生体分子は酸性又は塩基性である、項目３７の方法。
３９．前記正荷電の微小粒子が最初に加えられる、項目３７の方法。
４０．前記負荷電の微小粒子が最初に加えられる、項目５５の方法。
【００４８】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書において記載する吸着剤を使用して生体分子を回収するための単純で迅速な方法を提供する。本発明は、部分的に、生物学的流体からの、分子、好ましくは、生体分子の簡単な分離を可能にする、荷電の微小粒子を含む吸着剤が、大きな直径（例えば少なくとも５μmなど）の綿状物を迅速に形成するとの驚くべき知見に基づく。さらに、本発明の吸着剤の精製効率及び不純物低下が非常に高いことが見出されている。当業者により理解される通り、本発明は、本明細書において記載するパイロット又は工業規模のような大規模な用途において、細胞ホモジネート及び発酵上清からタンパク質を分離するために特に有用である。吸着剤は、連続プロセス又はバッチプロセス（バッチ吸着として言及される）において有利に使用されることができる。
【００４９】
用語「生体分子」は、通常、生物において見出される、又はそれにより合成される分子を意味し、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。生体分子は、酸性又は塩基性の生体分子でありうる。生体分子の例は、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、オリゴペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、フラボノイド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ（ｄｓ又はｓｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ＹＡＣ  ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｄｓ又はｓｓＲＮＡ）、有機金属化合物、アミノ酸、脂質、ピリミジン、プリン、炭水化物、ペプチド模倣化合物、毒素、ステロイド、酵素を含むが、これらに限定されない。前記用語は、また、本明細書において以下に記載する「産物」又は「発現産物」を含む。生体分子は、好ましくは、荷電している。
【００５０】
本発明に従った吸着剤は、粉砕粒子の形態でイオン交換樹脂を含む。
【００５１】
代替物において、本発明に従った吸着剤は、粉砕粒子の形態で疎水性樹脂を含む。低塩濃度で、従来のクロマトグラフィ媒体よりも優れている、そのような疎水性微小粒子の顕著なタンパク質吸着能は、例えば、ポリヌクレオチド又は親水性タンパク質のネガティブ精製のために特に有用である。したがって、本発明は、疎水性微小粒子を適用することにより、ポリヌクレオチド又は親水性タンパク質のネガティブ精製のための使用及び方法を提供する。その目的のために、ホモジネート又は標準タンパク質溶液に、５０%（ｖ／ｖ）疎水性微小粒子懸濁液を、ホモジネート又はタンパク質溶液に加える。微小粒子懸濁液を、例えば３０分間にわたりインキュベートする。その後、微小粒子を遠心分離し、結合タンパク質の溶出を、溶出緩衝液の添加、混合、及びインキュベーション（例えば、３０分間）により実施する。場合により、溶出緩衝液を用いた第２洗浄工程を含めることができる。溶出後、微小粒子を、以前の通りに再び遠心分離する。上清中のタンパク質の濃度は、例えば測光分析により定量化することができ、標的タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックすることができる。
【００５２】
第１の局面において、本発明は、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を含む組成物を提供し、該正荷電の微小粒子は、粉砕されたポリマー陰イオン交換樹脂を含み、前記負荷電の微小粒子は、粉砕されたポリマー陽イオン交換樹脂を含む。
【００５３】
本発明のために有用な樹脂は、種々の要素と相互作用し、それに付着することが可能であり、混合物から要素の捕捉を可能にする、固体の不溶性ポリマー材料である。樹脂は、一般的に、不活性化合物（セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、又は中性多糖類を含むを含むが、これらに限定されない）で構成される。それらは、また、アガロース、セルロース、デキストランなどの架橋された天然ポリマーを含みうる。そのような樹脂は、本発明の粉砕粒子、即ち、微小粒子の教示に従うことになる。
【００５４】
本明細書において定義する通り、「正荷電の」微小粒子は、中性ｐＨで、プロトンの少なくとも１つの素荷電、より典型的には、１を上回る素荷電を有する。「負荷電の」微小粒子は、中性ｐＨで、電子の少なくとも１つの素荷電、より典型的には、１を上回る素荷電を有する。
【００５５】
好ましい実施態様に従った微小粒子は、イオン交換樹脂、より好ましくはポリマー陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂から調製される。イオン交換樹脂は、固定された官能基又は交換可能なイオンを伴う部位を担持する荷電ポリマーの不溶性担体を含む固体支持体を指す。適切なイオン交換樹脂の例示的な例は、また、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、及び混合モードクロマトグラフィー樹脂（また、時々、混合モードイオン交換樹脂として本明細書において呼ばれる）を含む。交換可能なイオン形態は、一般的に、イオン交換樹脂の種類に応じて、Ｎａ＋、Ｈ＋、ＯＨ−、又はＣｌ−イオンの１つ又は複数である。イオン交換樹脂は、弱及び強陽イオン交換樹脂並びに弱及び強塩基性陰イオン交換樹脂を含む。イオン交換樹脂は、種々の工業分野において広く使用されている。イオン交換樹脂は、一般に、水処理の分野（例えばボイラー用の水の脱塩又は発電所での復水処理など）において、食品分野（例えば糖液のための精製など）において、又は半導体の調製用の超純水の分野において使用される。
【００５６】
本発明における吸着粒子は、好ましくは、多孔質球状イオン交換樹脂から調製される。球状イオン交換樹脂は、懸濁重合により調製され、それにおいて、単官能付加重合性モノマー及びラジカル重合開始剤を含むモノマー混合物が、液体媒質に加えられ、モノマー混合物の懸濁液を調製するための撹拌が続いた。懸濁液は、次に、球状架橋共重合体を得るための時間にわたり重合温度で維持される。水処理用のイオン交換樹脂の直径は、典型的には、３００〜６００μmの間である。
【００５７】
イオン交換樹脂のポリマーマトリックスは、ポリスチレン、ポリスチレン及びスチレン共重合体、ポリアクリル酸、芳香族置換ビニル共重合体、ポリメタクリレート、フェノール−ホルムアルデヒド、ポリアルキルアミン、それらの組み合わせなどを含みうる。好ましい実施態様において、ポリマーマトリックスは、ポリスチレン、スチレンコポリマー、ポリアクリレート、又はメタクリレートであるが、別の実施態様において、ポリマーマトリックスは、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体である。好ましくは、吸着粒子の調製用のイオン交換樹脂では、ポリスチレンベース、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）ベース、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）ベースである樹脂が使用される。最も好ましくは、樹脂は、ジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンから作製される。
【００５８】
本明細書において使用する陽イオン交換樹脂は、弱又は強酸性の場合がある。本明細書で用いられる用語「弱酸性陽イオン交換樹脂」は、従来の方法（例えば、Fishery et al., J. Phys. Chem., 60, 1030 (1956)を参照のこと）により測定される通り、約４．５より大きな見掛け上の解離定数又はイオン化定数（ｐＫａ）を有する樹脂を指す。それは、交換基として、カルボン酸基、フェノール性水酸基、ホスホン酸基、及びａｒｓｏｎｏ基を有しうる。典型的には、そのような樹脂は、ポリアクリル酸型又はポリメタクリル酸型のものがある。好ましくは、樹脂は、メタクリル酸型を有する。
【００５９】
弱酸性陽イオン交換樹脂上の種々のイオンの吸着力は、強酸性樹脂上のものと一般的に類似している。選択性は、より高い原子価イオンについてより高い。
【００６０】
用語「強酸性陽イオン交換樹脂」は、約１．５未満のｐＫａを有する樹脂を指す。強酸性陽イオン交換樹脂は、スルホン酸基、例えばポリスチレンスルホン酸ナトリウム又はポリＡＭＰＳなどを有しうる。スルホン酸基（−ＨＳＯ３）は交換基であり、強酸のように挙動し、アルカリ性溶液中は言うまでもなく、酸性溶液中でさえ、（−ＳＯ３−）−及びＨ＋に解離する。
【００６１】
本明細書において使用する陰イオン交換樹脂は、弱又は強塩基の場合がある。本明細書において使用する用語「弱塩基性陽イオン交換樹脂」は、従来の方法（例えばFishery et al., J. Phys. Chem., 60, 1030 (1956)を参照のこと）により測定される、約８．５より大きい見掛け上の解離定数又はイオン化定数（ｐＫａ）を有する樹脂を指す。それは、交換基として、一級、二級、及び／又は三級アミノ基（例、ポリエチレンアミン）を有しうる。用語「強塩基性陰イオン交換樹脂」は、他方で、約１２未満のｐＫａを有する樹脂を指す。強塩基性アニオン交換樹脂は、交換基として、第四級アミノ基、例えば、トリメチルアンモニウム基（例、ポリＴＡＣ）を有しうる。
【００６２】
当業者は、生体分子の吸着のために使用される陰イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂を選択することができる。生体分子の吸着能及びイオン交換体を決定する、いくつかのパラメータがある。いずれの生体分子が、どのような条件下で、いずれのイオン交換の型により吸着されることができるかを決定することは、当業者の一般的な知識の範囲内である。吸着剤の選択は、特に、目的の生体分子の等電点（ＩＥＰ）及び／又はその全体的な親水性の性質に依存する。生体分子溶液のｐＨ及び生体分子（例えばタンパク質など）の等電点（ＩＥＰ）によって、陽イオン又は陰イオンイオン交換体に結合するか否かの大部分が決定される。タンパク質が、生体分子のＩＥＰを下回るｐＨで陽イオン交換体、又はＩＥＰを上回るｐＨで陰イオン交換体に結合することが公知である。
【００６３】
商業的に入手可能なイオン交換樹脂は、例えば、Rohm & Haas（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）により、Bayer（ドイツ、レーバークーゼン）からのAmberlite、Amberjet、Duolite、及びImac樹脂として、Dow Chemical（米国ミシガン州ミッドランド）からのLewatit樹脂として、Mitsubishi Chemical（日本、東京）からのDow樹脂として、Purolite（米国ペンシルバニア州Ｂａｌａ  Ｃｙｎｗｙｄ）からのDiaion及びRelite樹脂として、Sybron（米国ニュージャージー州バーミンガム）からのPurolite樹脂として、Resintech（米国ニュージャージー州ウエストベルリン）からのIonac樹脂として提供される。
【００６４】
正荷電の微小粒子は、ポリマー陰イオン交換樹脂から調製することができる。商業的に入手可能な陰イオン交換樹脂は、典型的には、ＯＨ−又はＣｌ−のいずれかの形態である。一実施態様において、陰イオン交換樹脂はＯＨ−形態である。樹脂は、例えば、「Diaion」陰イオン交換樹脂、例えばDiaion  ＳＡ樹脂（DIAION SA 20Aを含む）及びDiaion SK樹脂（DIAION SK 110を含む）（Mitsubishi Chemicalから）「Amberlite」樹脂、例えばAmberlite IRA-400、Amberlite IRA-734、及びAmberlite IRA-900（Rohm & Haas Co.から）又は「Dowex」樹脂、例えばDowex 1、Dowex 2、Dowex 11、Dowex 21K、Dowex 1x2、Dowex 1x4、Dowex 1x8、及びDowex Marathon樹脂（Dow Chemical Coから）でありうる。好ましくは、微細格子の球状イオン交換樹脂Dowex 1×2、Dowex1x4、1×8が使用される。陰イオン交換樹脂中の官能基は、第四級アンモニウム基、例えば、ベンジル基（１型樹脂）、ベンジル基（２型樹脂）、トリアルキルアンモニウム基（１型樹脂）、ジメチルエタノールアミン（２型）、又は第三級アミン官能基を含む場合がある。
【００６５】
負荷電の微小粒子は、ポリマー陽イオン交換樹脂から調製することができる。商業的に入手可能な陽イオン交換樹脂は、典型的には、Ｈ＋又はＮａ＋のいずれかの形態である。一実施態様において、陽イオン交換樹脂は、Ｈ＋の形態である。樹脂は、例えば、「Diaion」陽イオン交換樹脂、例えばDiaion  ＰＫ樹脂及びDiaion  ＳＫ樹脂（Mitsubishi Chemicalから）など又は「Dowex」樹脂、例えばDowex 50WX2、Dowex 50WX8、及びDowex Marathon樹脂、例えばMarathon C、Marathon MSC（Dow Chemical Coから）などでありうる。陽イオン交換樹脂の官能基は、スルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）、ホスホン酸基（−ＰＯ３Ｈ）、ホスホン酸基（−ＰＯ２Ｈ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ又は−Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯＯＨ）、それらの組み合わせを含みうる。一実施態様において、陽イオン交換樹脂中の官能基は、−ＰＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、又は−ＣＯＯＨであろうが、最も好ましい実施態様において、陽イオン交換樹脂中の官能基は−ＳＯ３Ｈである。
【００６６】
本明細書において使用する通り、ポリマー材料は、ポリマー、ポリマーの混合物、架橋ポリマー、それらの混合物、又はポリマーネットワークを指しうる。しばしば、ポリマー材料は、単純にポリマーとして言及される。
【００６７】
ポリマー性陽イオン交換樹脂は、本明細書において使用する通り、プロトンの１つ又は複数の素荷電を有するポリマー材料、又はそのような高分子自体を指す。ポリマー陰イオン交換樹脂は、１つ又は複数の素荷電を有する。
【００６８】
本発明の正荷電の微小粒子は、比較的中性のｐＨで、プロトンの少なくとも１つの素荷電、より典型的には複数の素荷電を有する粒子であるのに対し、負荷電の微小粒子は、これらの条件で、少なくとも１つの素荷電を有する。
【００６９】
正又は負荷電の微小粒子は、微小粒子の構成成分の少なくとも一部がイオン的に荷電している場合に得られる。
【００７０】
正荷電の微小粒子と負荷電の微小粒子の間の比率は、約０．１：９９．９（ｗ／ｗ）から９９．９：０．１（ｗ／ｗ）でありうる。例えば、それは、約５０：５０でありうるが、それは、また、異なりうる（例えば９０：１０、８０：２０、７５：２５、６０：４０、４０：６０、２０：８０、２５：７５、１０：９０など）。好ましい比率は、約９０：１０である。
【００７１】
本発明の疎水性微小粒子は、好ましくは、一晩粉砕される。粉砕された樹脂は、水中に懸濁される。上清を遠心分離する。樹脂は、塩溶液（例えば２Ｍ塩化ナトリウムなど）中を再懸濁し、遠心分離し、ペレットを捨てる。上清を移し、再び遠心分離する。上清を捨てる。粉砕された樹脂は、水中に再懸濁し、試験管に移す。樹脂は、遠心分離し、上清を捨て、樹脂を水性洗浄溶液中に再懸濁する。洗浄順序は以下の通りである：
−  １×５０%ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
−  ３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
【００７２】
好ましい一実施態様において、微小粒子は、平均粒子サイズ約１０μm未満、例えば約９μm、８μm、７μm、６μm、５μm、４μm、３μm、２μm、及び１μm未満などを有する粉砕粒子の形態である。好ましくは、粉砕粒子は、平均粒子サイズ約５μm未満、より好ましくは２．５μm未満を有する。好ましくは、粉砕粒子は、０．５μmよりも大きい平均粒子サイズを有する。したがって、粉砕粒子は、好ましくは、約１０μmから０．５μm、約９μmから約０．５μm、約８μmから約０．５μm、約７μmから約０．５μm、約６μmから約０．５μm、約５μmから約０．５μm、約４μmから約０．５μm、約３μmから約０．５μm、又は約２．５μmから約０．５μmの範囲の平均粒子サイズを有する場合がある。しかし、粉砕粒子は、粒子サイズ１０μm超並びに０．５μm未満を有する場合がある。
【００７３】
吸着粒子の調製
微小粒子は、陰イオン交換樹脂及び／又は陽イオン交換樹脂を粉砕することにより入手可能である。好ましくは、本発明の微小粒子は、樹脂を粉砕する、樹脂を条件付けすることにより入手可能である（又はそれにより得られる）。
【００７４】
樹脂の製造プロセスにおいて残留副産物を除去するために、粉砕粒子を条件付けすることが好ましい。イオン交換樹脂のための典型的な条件付け方法が、当技術分野において周知であり、また、供給業者により記載されている。
【００７５】
必要な場合、「条件付け」は、Ｈ＋又はＯＨ−からＮａ＋又はＣｌ−の形態へ樹脂を移すために実施することができる。一実施態様において、条件付けは、ＮａＣｌ及び水を使用した洗浄工程を繰り返すことにより実施される。このプロセスにおいて、樹脂を水中で粉砕することができ、沈降は、遠心分離により行うことができ、それは、非常に小さな微小粒子を除去するという利点を有する。非常に小さな粒子は、通常、沈降しないが、表面で浮遊する微小粒子である。そのようなものとして、それらは、デカントする、又は機械的に除去してもよい。あるいは、Ｎａ＋又はＣｌ−の形態の樹脂も既に商業的に入手可能であり、供給業者から得ることができる。
【００７６】
好ましい実施態様において、微小粒子は、（ａ）イオン交換樹脂を粉砕すること、（ｂ）前記粉砕樹脂を水中に再懸濁すること、（ｃ）前記粉砕樹脂の沈降を可能にすること、（ｄ）沈降した懸濁液の上清から粉砕樹脂を回収すること、（ｅ）回収した粉砕樹脂を約２Ｍ塩化ナトリウム中に再懸濁すること、（ｆ）前記粉砕樹脂の沈降を可能にすること、（ｇ）（ｆ）の沈降懸濁液の上清から粉砕樹脂を回収すること、（ｈ）前記粉砕樹脂の沈降を可能にすること、（ｉ）（ｈ）の粉砕樹脂の沈降物を回収すること、及び（ｊ）前記の回収した粉砕樹脂を洗浄することにより調製される。
【００７７】
粉砕
粉砕は、当技術分野において公知の任意の方法で、非限定的に、粉砕装置、例えば粉砕ミル（ジェットミル、ボールミル、ハンマーミルなどを含む）などにより、又は、例えば、乳鉢及び乳棒を用いて手により行うことができる。本明細書において使用する「粉砕」は、粒子サイズにおける低下に導く操作を指す。当業者は、樹脂を調製するための粉砕方法を容易に選択することができる。一実施態様において、樹脂は、乳鉢中で１つ又は複数の乳棒を動かすことにより、自動化された様式で湿式粉砕される。粉砕プロセスは、粒子の大部分が、約１０μm未満のサイズを有するまで、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１未満などが得られるまで継続してもよい。好ましくは、樹脂は、粒子の大部分が、以下に記載する通りの平均粒子サイズを有するように粉砕される。大部分により、それは、５０%超、例えば、６０%、７０%、８０%、９０%、又は９５%超を意味する。他の実施態様において、粒子の大部分は、少なくとも０．１μm、例えば０．２μm、０．３μm、０．４μm、０．５μm、０．６μm、０．７μm、０．８μm、０．９μm、１．０μm、１．１μm、１．２μm、１．３μm、１．４μm、１．５μm、１．６μm、１．７μm、１．８μm、１．９μm、２．０μm、３μm、４μm、及び５μmなどの平均粒子サイズを有する。
【００７８】
当業者は、当技術分野において公知の方法を用いて、粉砕粒子のサイズを容易に決定することができる。それから、平均粒子サイズは、当技術分野において公知の手段及び方法により決定することができる。例えば、サイズは、実施例において例証する通り、サイズのソフトウェアベースの決定を使用し、光学顕微鏡法により決定することができる。粉砕樹脂の粒子サイズは、等しい円直径の推定により１０００倍の倍率で決定することができる。分布は、好ましくは、１%ｖ／ｖでの約１００〜５００の粒子の直径サイズの比較により算出される。粉砕によって、狭い孔が破壊され、表面積を増加させる効果を有し、それは、生体分子、特にタンパク質又はポリペプチドについての結合能の有意な増加、並びに非常に迅速な結合動態に導く。直径の決定は、好ましくは、技術的手段、例えば、粒子を認識し、直径を測定するソフトウェアなどの補助で行われる。
【００７９】
「再懸濁」又は「懸濁する」あるいは、本明細書において使用する場合、それらの任意の文法的な形態は、微小粒子が懸濁液中に持ち込まれることを意味する。
【００８０】
「沈降を可能にする」は、本明細書において使用する場合、使用される微小粒子が、それらが同調され、バリヤに対して寄り掛かるようになる流体から外に定着することが可能になることを意味する。沈降は、それらに作用する力に応答した、流体を通じた粒子運動に起因する。これらの力は、重力又は遠心加速（例、遠心分離）の場合があるが、後者が好ましい。
【００８１】
「回収」は、微小粒子が懸濁液から回収されることを意味する。
【００８２】
「洗浄」は、本明細書において使用する場合、微小粒子の性能を妨害しうる、又はそれに干渉しうる液体の残量が低下することを意味する。好ましくは、洗浄工程は、以下の順序を有する：１×５０%エタノール、３×水（好ましくは脱イオン）、１×０．５M  ＮａＯＨ、４×水（好ましくは脱イオン水）、水（好ましくは脱イオン水）中に再懸濁させる。これらの流体の各々の容積は、微小粒子の容積の過剰、好ましくは１０又は２０倍過剰である。
【００８３】
粉砕プロセス後、好ましい範囲外の粒子は、場合により、例えば、遠心分離、沈殿、ろ過、又は当業者に公知の任意の他の方法により除去することができる。
【００８４】
負荷電の微小粒子は、実施例４において記載する条件を使用し、ＧＦＰの少なくとも５mg（例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００など）を吸着することができる。正荷電の微小粒子は、実施例４において記載する条件を使用し、ポリクローナルＩｇＧの少なくとも５mg（例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００など）を吸着することができる。
【００８５】
驚くべきことに、粉砕粒子中の粗面は、高い結合能を有するマクロ多孔質媒質（例えばBio-Rad Laboratories（ＵＳＡ）により開発されたＮｕｖｉａ媒質など）と比較し、吸着のための同程度の比面積を提供することが見出されている。Ｎｕｖｉａ媒質は、Bio-Rad Laboratories（ＵＳＡ）により開発されたNuvia S媒質−オンラインカタログ２０１３、Ｎｏ．１５６−０３１１、Nuvia Q媒質−オンラインカタログ２０１３、Ｎｏ．１５６−０４１１、又はNuvia cPrime媒質−オンラインカタログ２０１３、Ｎｏ．１５６−３４０１を含む。
【００８６】
組成物
本発明の特許請求の範囲に記載する組成物は、粉末の形態で、又は懸濁液中で、正荷電の微小粒子を負荷電の微小粒子と混合することにより調製することができる。正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を別々の懸濁液中で調製し、次に懸濁液を混合することも可能である。
【００８７】
生体分子を吸着する方法
本発明は、さらなる局面において、流体から生体分子を得るための、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用を含む。本明細書において使用する通り、「流体」は、流れる傾向がある非晶質物質を指す。
【００８８】
本発明の一局面に従い、生物学的流体から分子、好ましくは生体分子、特にポリペプチドを得る方法が提供される。この方法は、以下を含む：
ａ）生物学的流体中に正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を加えること、
ｂ）粒子が綿状物を形成することを可能にする、
ｃ）生物学的流体から綿状物を除去すること、
ｄ）ｃ）において綿状物から生体分子を脱着させ、生物学的流体から生体分子を精製すること。
【００８９】
別の実施態様において、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子が用いられ、それらが、生物学的流体に別々に加えられるようにする。本発明は、このように、以下の方法を包含する：
ａ）生物学的流体中に正荷電の微小粒子又は負荷電の微小粒子のいずれかを加えること、
ｂ）生物学的流体中に反対荷電の微小粒子を加えること、
ｃ）粒子が綿状物を形成することを可能にすること、
ｄ）生物学的流体から綿状物を除去すること、
ｅ）ｃ）において綿状物から生体分子を脱着させ、生物学的流体から生体分子を精製すること。
【００９０】
微小粒子の添加
第１工程において、微小粒子が、流体中に加えられる。本明細書で開示する吸着剤は、実験室規模、パイロット規模、又は工業規模で使用することができる。本明細書において使用する通り、「実験室規模」は、約１又は１０mlの流体から約１０００mlの流体（１リットルの大腸菌細胞ホモジネート又は発酵上清は、通常、約４５０〜５５０gの大腸菌細胞湿重量に対応する）からの生体分子のバッチ吸着を含む。本明細書において使用する通り、「パイロット規模」は、約１リットルの流体から約１０リットルの流体（１０リットルの大腸菌細胞ホモジネート又は発酵上清は、通常、約４．５〜５．５kgの大腸菌湿細胞重量に相当する）からの生体分子のバッチ吸着を含む。本明細書において使用する通り、「工業規模」又は大規模は、約１０リットルの流体から約１０００又は１００００リットルの流体（１００００リットルの大腸菌細胞ホモジネート又は発酵上清は、通常、約４．５〜５．５トンの大腸菌湿潤細胞重量又はさらにそれ以上に相当する）からの生体分子のバッチ吸着を含む。
【００９１】
微小粒子は、生体分子が分離されるべきから生物学的流体中に加えることができる。用語「生物学的流体」は、広く理解されるべきである。それは、生物に関連付けられる（例えば任意の生物から得られる、又は産生される、など）任意の流体を指す。生物学的流体の例は、細胞培養培地、発酵上清、発酵ブロス、細胞懸濁液、細胞溶解物を含む。生物学的流体のさらなる例が、本明細書において上に記載されている。他の実施態様において、生物学的流体は、また、唾液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、血液、血漿、血清、汗、粘液分泌、乳、乳清、腹水、器官抽出物、植物抽出物、動物抽出物でありうる。好ましい実施態様において、生物学的流体は、本明細書において記載する任意の生物学的流体、例えば種々のインビトロ又はインビボプロセスから由来するポリペプチド又はポリヌクレオチド（例、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡなど）を含む流体、特に、発酵培養液、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞ホモジネート、細胞溶解物、又は細胞懸濁液である。「細胞ホモジネート」は、一般的に、破壊された細胞の混合物として理解される。細胞ホモジネートは、機械的又は化学的方法により得てもよい。例えば、細胞は、従来の方法（例えば発酵ホモジネートを与えるホモジナイザー中での高圧など）により、又は溶解溶液（アルカリ溶解を含む）中での単なるボルテックスによりホモジナイズされうる。
【００９２】
従って、本発明は、また、生体分子並びに正荷電及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子を含む流体を含む。好ましい実施態様において、生物学的液体は、本発明の方法の工程のいずれかの間及び／又は後に撹拌されるが、しかし、好ましくは、粒子が綿状物を形成することを可能にする、及び／又は綿状物が生物学的流体から除去される工程の間にはされない。
【００９３】
微小粒子が生物学的流体中に加えられる間及び／又は後に、それらは、撹拌又は震盪することにより混合され、均質な混合物を得ることができる。理論に束縛されないが、粒子が生物学的流体と混合されながら、吸着が自然に起こることが想定される。
【００９４】
好ましい実施態様において、微小粒子は、細胞を破壊するために、生物学的流体中に最初に加えられる。実際に、驚くべきことに、本発明の微小粒子を使用し、細胞を破壊し、細胞内の生体分子を吸着することができ、このように、例えば、高圧均質化の使用を不要にすることができることが見出されている。正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の別の使用は、細胞の破壊並びに細胞の破壊及び分子、好ましくは生体分子、好ましくは本明細書において記載するタンパク質又はポリヌクレオチドの吸着のためのその（組み合わせた）使用のためである。
【００９５】
凝結
次の工程は、綿状物の形成を可能にすることである。驚くべきことに、吸着粒子は、生体分子を吸着し、生体分子と大きな直径の綿状物を迅速に形成することが見出されている。綿状物は、生体分子の吸着時（正荷電及び負荷電の微小粒子が最初に混合され、次に、生物学的流体に加えられる場合）並びに、微小粒子が別々に添加される場合、添加後での反対荷電の微小粒子の添加時に形成される。
【００９６】
一実施態様において、反対荷電の微小粒子は、異なる時間で加えられる。生体分子が酸性である場合、正荷電の微小粒子は、吸着のための細胞溶解物又は細胞ホモジネートのような生物学的流体に加えることができる。正荷電の微小粒子は、また、細胞を破壊し、生体分子を放出するための十分な量、又は細胞を破壊し、並びに、生体分子を吸着するより高い量のいずれかで、細胞懸濁液に加えてもよい。当業者は、部分的又は完全に細胞を破壊するために必要な量を決定することができる。負荷電の微小粒子は、その後に加えてもよく、それは、綿状物の粒子サイズ及び安定性を増加するための架橋剤として作用する。あるいは、キレート化陽イオン交換樹脂から調製した負荷電の微小粒子は、また、細胞を破壊し、生体分子を放出するために十分な量で細胞懸濁液に最初に加えてもよい。次に、正荷電の微小粒子を加えて、凝結を増加させてもよい。
【００９７】
回収される生体分子は、一部の例において塩基性でありうる。この場合において、正荷電の微小粒子は、最初に、細胞溶解物又は細胞ホモジネートのような生物学的流体に加えてもよく、細胞残屑又は他の不純物（例えばＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、及び細胞フラグメントなど）と綿状物を形成する。次に、負荷電の微小粒子を加え、凝結を増加させてもよく、そのため、綿状物は、簡単に分離し、捨てることができる。基本的な生体分子は、次に、上清から回収することができる。あるいは、正荷電又は負荷電の微小粒子の使用を、細胞破壊のために細胞懸濁液に加えてもよく、それは上清中の生体分子の放出をもたらす。上清は、精製のためにさらに処理することができる。
【００９８】
綿状物は、典型的には、視認可能な１００μm又はそれよりさらに大きいサイズを有する。この形成によって、重力又はろ過によりその上に吸着された生体分子を含む綿状物の分離が促される。これは、他の望ましくない材料（例えば細胞残屑など）を、遠心分離を不要にするろ過により簡単に除去できることを意味する。本発明は、従って、先行技術の方法よりもより速く、より単純である。さらに、カラムクロマトグラフィにより要求される、樹脂を再生する必要はない。微小粒子は、使用後に捨てることができる安価な材料である。
【００９９】
さらに、分子が脱着緩衝液により脱着された後、そのサイズにより、形成された綿状物を脱着緩衝液から分離することは簡単である。
【０１００】
好ましい実施態様において、綿状物は、少なくとも５μmの平均粒子サイズを有し、例えば少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μm又はそれ以上が形成される。
【０１０１】
本発明者らは、正荷電又は負荷電の微小粒子だけとの凝結が、生体分子の脱着後に問題となることを観察してきた。脱着後、微小粒子は、生体分子がそこから簡単に分離することができない均質な懸濁液を形成する。故に、遠心分離機又はマイクロフィルターが、粒子から生体分子を分離するために要求されるであろう。しかし、驚くべきことに、反対荷電の微小粒子が追加的に使用される場合、微小粒子は、脱着後でさえ綿状物として残り、より小さい粒子についての場合でさえ、単純な沈降により生体分子から簡単に分離することができることが発見されている。従って、本発明者らは、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の両方の組合せが、より小さな直径を伴う微小粒子の使用を可能にする予想外の利点を有することを見出している。これは有利である。なぜなら、より小さな直径（例えば１μmより小さい）を伴う微小粒子の使用によって、容積当たりの生体分子のより高い量を処理することが可能になるためである。さらに、本発明によって、単純な操作手順を与える、単純なミキサー−沈降装置の使用が可能になる。
【０１０２】
綿状物の除去
一般的に、液体（例えば生物学的流体又は緩衝液など）からの綿状物の除去は、ろ過、遠心分離、沈降、又は他の任意の適切な手段により実施することができる。当業者は、いずれの方法が、流体から綿状物を分離又は脱着するために使用することができるかを容易に決定することができる。綿状物の懸濁液は、例えば、パイロット及び工業規模の操作のいずれかのための、バケット遠心分離機（実験室規模）、管状遠心分離機、デカンター、又はディスクスタック遠心分離機のいずれかにおいて処理することができる。同様に、綿状物が保持されるろ過により、又は沈降もしくは抽出により綿状物を除去することが可能である。脱着は、抽出デカンター、ミキサー沈降機、又はカラム抽出機により達成することができる。除去のための他の有用な方法は、接線流ろ過、深層ろ過、デッドエンドろ過、又はフィルタープレスの使用を含む方法、ヌッチェろ過でありうる。
【０１０３】
生体分子の脱着
脱着は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して行うことができる。例えば、脱着は、タンパク質などの生体分子の脱着を可能にする緩衝液（脱着緩衝液）中で綿状物を再懸濁することにより行うことができる。これは、当技術分野において公知の任意の手段（管状（静的）ミキサー、又は他の混合デバイス、例えば撹拌タンクなどを含む）を使用することにより達成することができる。脱着は、また、抽出デカンター、ミキサー沈降機、又はカラム抽出機により達成することができる。
【０１０４】
懸濁液を、次に、脱着するために適した条件に供する。当業者は、綿状物に吸着した生体分子を脱着するための、そのような条件を決定することができる。一般的に、従来のイオン交換クロマトグラフィにおいて使用される脱着方法を用いることができる。例えば、脱着は、等電点を下回る、もしくは上回るｐＨでの溶出、又は増加する塩濃度により行うことができる。
【０１０５】
生体分子は、当該分野において公知の方法によりさらに精製又は濃縮することができる。これらには、例えば、沈殿、結晶化、並びに／あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィー、擬似アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ及び／又はサイズ排除クロマトグラフィからなる群より選択されるクロマトグラフィを含む。したがって、本明細書において記載する方法は、好ましい実施態様において、以前に記載された通りに沈殿及び／又はクロマトグラフィを使用することにより、（所望の）生体分子、特にタンパク質を精製及び／又は濃縮するさらなる工程を含む。
【０１０６】
最後に、本発明の吸着剤に吸着された生体分子を回収する。「Recovering the biomolecule（生体分子を回収する）」は、そのすべての文法的形態において、生体分子が、得られる、回収される、達成される、受けられる、又は獲得されることを含み、それらは、プラスミド、ポリヌクレオチド、又は発現産物、例えばペプチド、タンパク質（グリコシル化又は翻訳後修飾されたタンパク質を含む）などでありうる。生体分子は、単離及び／又はさらにプロセシングされうるが、例えば、それは、例えば、当技術分野において公知である、及び／又は本明細書において他で記載する手段並びに方法により精製されうる。さらに、分子を回収するという用語は、また、宿主細胞が、好ましくは、本発明の吸着剤による吸着が可能である、並びに、産物のさらなる精製及び／又は濃縮が可能となる程度まで、産物を放出するために破壊されることを含む。
【０１０７】
本発明の方法は、また、脱着緩衝液から綿状物を回収する工程を含みうる。
【０１０８】
一実施態様において、前記方法は、以下の手順で行うことができる：
−  例えば、濃度又はｐＨ、塩分濃度を調整すること、又は生物学的液体を希釈することにより、生物学的流体を得る、場合により、調製すること、
−  生物学的流体中に正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を同時に、又は別々に加えること、
−  震盪又は撹拌すること、
−  目的の生体分子が吸着／結合することを可能にすること、
−  粒子が綿状物を形成することを可能にすること、
−  例えば、沈降、遠心分離、又はろ過により生物学的流体から綿状物を除去すること、
−  除去された綿状物を洗浄し、液体の残留不純物を分離する、
−  適当な脱着緩衝液を加えること、
−  震盪又は撹拌すること、
−  目的の生体分子を微小粒子から脱着することを可能にすること、
−  例えば、沈降、遠心分離、又はろ過により脱着緩衝液から綿状物を除去すること、
−  綿状物を洗浄し、綿状物から残留生体分子を得ること、
−  綿状物から生体分子を脱着すること。
【０１０９】
生体分子（「産物」）を産生する細胞を培養する
本発明の吸着剤を適用する前に、本明細書において定義及び記載する生体分子を得る方法は、場合により、生体分子（「産物」）、好ましくは発現産物（例えばタンパク質又はポリヌクレオチドなど）を産生（例えば発現など）する（宿主）細胞を培養する工程を含む。本発明の宿主細胞の文脈における培地中での用語「細胞の培養」又は「細胞の培養」は、培養容器中に細胞を播種すること、細胞を培地中で、付着培養の場合において、単層が形成される、又は、浮遊培養の場合において、十分な細胞密度が確立されるまで成長させること、並びに／あるいは、単層が形成された直後の培地中での細胞の維持、又は浮遊液中での細胞の維持をそれぞれ指す。培地中での用語「細胞の培養」又は「細胞の培養」は、また、上に言及する工程の全てが、無血清培地を用いて実施されることを含み、動物血清産物が、細胞の全培養プロセスの間に存在しない、又は本質的に存在しないようにする。細胞を、指数関数的フィード、又は線状もしくは一定フィード、又は他の型のフィード、流加培養、又は高密度培養により培養してもよい。けれども、代替物において、上に言及する工程は、また、血清含有培地を用いて実施してもよい。
【０１１０】
ヌクレオチド配列及び／又はコードされるポリペプチドは、細胞に関して、非相同的（heterologous）であってもなくてもよい。「非相同的」により、これは、異なるゲノムバックグラウンドを伴う細胞又は生物から由来する、又は（宿主）細胞に関して同種であるが、しかし、前記ヌクレオチド配列の天然の対応物とは異なるゲノム環境中に位置付けられることを意味する。これは、ヌクレオチド配列が、宿主に関して相同である場合、それは、前記宿主のゲノム中のその天然の位置において位置付けられず、特に、それは、異なる遺伝子により囲まれることを意味する。
【０１１１】
「細胞」は、本明細書において使用する場合、生体分子を産生することが可能である細胞を指す。前記細胞は、本発明の方法及び使用において適用される。その目的のために、細胞がポリヌクレオチド又はポリペプチドを発現する場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを産生するためのヌクレオチド配列を細胞中に導入する。
【０１１２】
生体分子が回収される細胞は、原核細胞、真核細胞のいずれか、又はそれらの両方の場合がある。より好ましくは、本発明の方法において適用される細胞は、脊椎動物細胞（哺乳動物、鳥類、両生類、及び魚類の細胞を含む）及び昆虫細胞を含む。また、用語「細胞」により真核細胞が含まれる。典型的には、真核細胞は、ヒト細胞株、哺乳動物細胞、鳥類細胞、又は昆虫細胞である。細胞は、また、酵母細胞又は真菌細胞を含む。しかし、細胞は、グラム陰性細菌からの細菌細胞、例えば腸内細菌（例、大腸菌）又はシュードモナス、（例、Ｐ．プチダ、Ｐ．フルオレッセンス）からの細胞など、又はグラム陽性細菌、例えば乳酸菌やバチルスからの細胞などを含む原核細胞であることが好ましい。最も好ましくは、しかし、細胞は大腸菌である。
【０１１３】
本発明の好ましい実施態様において、発現産物は、タンパク質性産物である。「タンパク質性」は、本明細書において使用する場合、炭素、水素、酸素、窒素、及び、通常は、硫黄を含み、アミノ酸の１つ又は複数の鎖で構成される複雑な有機高分子の群のいずれかを指す。好ましいタンパク性の発現産物は、（目的の）ポリペプチドである。したがって、用語「タンパク質性」は、また、タンパク質に関する、それからなる、それと似ている、又はそれと関連することを意味する。本発明のより好ましい実施態様において、産物は、発現されて、このように産生される、目的のポリペプチドでありうる。産物は、生物学的に活性であることが好ましい。タンパク質性産物は、酸性又は塩基性でありうる。
【０１１４】
発現産物は、ヌクレオチド配列の、好ましくは、宿主細胞を遺伝的に操作することの文脈における、当技術分野において公知の手段及び方法により細胞に外因的に加えられるヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳の産物の場合がある。産物は、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、コスミド、ＢＡＣ、ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を含むヌクレオチド配列であることができ、それらの全てが、宿主細胞中で産生されることが可能である、又は、それは、細胞中の転写されたＲＮＡの翻訳により生成されるポリペプチドの場合がある。
【０１１５】
「ポリペプチド」は、タンパク質、ポリペプチド、及びそれらのフラグメントを含み、前記フラグメントは、好ましくは、生物学的に活性である。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に使用され、任意の長さ、一般的には、約１０、２０、又は３０アミノ酸を上回るアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、また、グリコシル化、アセチル化、及びリン酸化を含む反応を通じて翻訳後修飾されたタンパク質を含む。ポリペプチドは、半減期の延長のための融合パートナー、例えばＦｃ融合体、アルブミン融合体、又は親和性クロマトグラフィ用の親和性タグとしての融合パートナー、又は正確なＮ末端を提供するため、もしくは目的のタンパク質の産生収量を増加させるための融合パートナーに融合された融合ポリペプチドでありうる。用語「ペプチド」は、アミノ酸のより短いストレッチ、一般的に約３０未満のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、アゴニスト又はアンタゴニストとしての役割を果たし、及び／又は治療的もしくは診断的用途を有する場合がある。
【０１１６】
さらに、本発明の細胞中で発現されたポリペプチドは、哺乳動物起源でありうるが、微生物及び酵母の産物も産生することができる。
【０１１７】
哺乳動物のポリペプチド又はタンパク質の例は、ホルモン、サイトカイン及びリンホカイン、抗体、例えばＦａｂ、ナノボディ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、受容体、接着分子、及び酵素並びにそれらのフラグメントなどを含む。所望の産物の非網羅的なリストは、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン成長、黄体形成ホルモン；ホルモン放出因子；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；カルシトニン；グルカゴン；分子、例えばレニンなど；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォンウィルブランド因子など；抗凝固因子、例えばプロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタントなど；プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）など；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、通常、Ｔ細胞発現及び分泌される）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ又はＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は成長因子についての受容体；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、４、５、又は６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、成長因子（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む）、神経成長因子、例えばＮＧＦなど；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６など；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−ｐｌ、ＴＧＦ−ｐ２、ＴＧＦ−ｐ３、ＴＧＦ−ｐ４、又はＴＧＦ−ｐ５を含む）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−１１）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９など；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；エリスロポエチン；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質、例、ＨＥＲ２；デコイ促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシング；調節タンパク質；抗体；キメラタンパク質、例えばイムノアドヘシン及び上に列挙されたポリペプチドのいずれかのフラグメントなどを含む。
【０１１８】
本明細書における好ましいポリペプチド及びタンパク質は、治療用タンパク質（例えばＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＤＮアーゼなど）、プラスミノーゲン活性化因子（例えばｔ−ＰＡなど）、凝固因子（例えば組織因子及び第ＶＩＩＩ因子など）、ホルモン（例えばリラキシン及びインスリンなど）、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γなど）、キメラタンパク質（例えばＴＮＦ受容体ＩｇＧイムノアドヘシン（ＴＮＦｒ−ＩｇＧ）など）又は抗体（例えば二重特異性抗体、ラクダ抗体、及びそれらのフラグメントなど）、ＶＨＨドメイン抗体、ドメイン抗体、免疫グロブリン（例えば抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＤ、又は抗ＩｇＥなど）である。好ましい治療用タンパク質は、ヒト由来又は「ヒト化」タンパク質、例えば本明細書において記載するヒト化抗体などである。
【０１１９】
産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、タグを付けてもよく、即ち、好ましくは、前記ポリペプチドの単離及び／又は精製を可能にする非相同的ポリペプチドと融合してもよい。非相同的ポリペプチドは、例えば、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ストレプトアビジンタグ、ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグ、インテイン、マルトース結合タンパク質、ＩｇＡ又はＩｇＧ  Ｆｃ部分、プロテインＡ又はプロテインＧの場合がある。
【０１２０】
産物が、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである場合、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である前記発現産物の単離及び／又は精製を可能にする非相同的ヌクレオチド配列と融合させてもよい。例えば、非相同的ヌクレオチド配列は、相補的なヌクレオチド配列に結合することができ、それにより、前記ヌクレオチド配列の単離及び／又は精製を可能にする。「非相同的」は、非相同的ポリペプチド又はヌクレオチド配列の文脈において使用される場合、ポリペプチド又はヌクレオチド配列が、所望の産物であるポリペプチド又はヌクレオチド配列とは異なることを意味する。
【０１２１】
産物が、ポリヌクレオチドの例として、プラスミドである場合、前記プラスミドは、遺伝子治療もしくはＤＮＡワクチン接種のために有用である、又は治療用タンパク質（例えば本明細書において記載するものなど）をコードしうる。
【０１２２】
他方で、細胞はウイルスを発現しうる、即ち、細胞は、いわば、ウイルスが複製する、及び／又は伝播される適当な環境を提供する産生細胞株としての役割を果たす。したがって、産物はウイルスでありうる。実質的に、任意のウイルスが、本発明の方法により回収することができる（例えばｄｓＤＮＡウイルス（例、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ｓｓＤＮＡウイルス（例、パルボウイルス）、ｄｓＲＮＡウイルス（例、レオウイルス）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例、ピコルナウイルス、トガウイルス）、（−）ｓｓＲＮＡ（例、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（例、レトロウイルス）、及びｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（例、ヘパドナウイルス）など）。ウイルス複製は、標的細胞中での感染及び伝播プロセスの間でのウイルスの生成を記載するために使用される用語である。ウイルスの観点から、ウイルス複製の目的は、その種類の産生及び生存を可能にすることである。そのゲノムの豊富なコピーを生成し、ウイルス中にこれらのコピーをパッケージ化することにより、ウイルスは、新たな宿主への感染を継続することができる。本発明の文脈において、適当な宿主細胞により産生されたウイルスは、例えば、溶解又は出芽の方法により、宿主細胞から脱出することが可能ではない、又は本質的に可能ではないことが好ましい。
【０１２３】
前に言及した通り、産物はウイルスでありうる。「ウイルス」は、「天然」ウイルス及び「組換え」ウイルスを含み、「天然」は、自然から単離され、遺伝的に操作されていないウイルス（例えば臨床単離株など）又は自然において見出されることができる（即ち、自然に生じる）又は、例えば、免疫化の目的のために使用される、典型的な樹立ウイルス株（例えば弱毒化ウイルスなど）を意味する。
【０１２４】
本発明は、このように、工業的規模において簡単に適用することができる、高速で効率的かつ安価な方法を提供する。
【０１２５】
正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用
別の局面において、本発明は、また、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子の使用に関する。具体的には、本発明は、分子、好ましくは生体分子、好ましくはタンパク質を吸着するための、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子の使用を提供する。前記タンパク質は、好ましくは、細胞ホモジネート由来である、又は、目的のタンパク質を発現及び分泌する細胞の液体培養液由来である。同じ実施態様が、疎水性微小粒子に適用可能である。
【０１２６】
本発明の手段及び方法の文脈において記載する実施態様は、上に記載する使用に、変更すべきところは変更して、等しく適用可能である。
【０１２７】
キット
本発明は、また、本発明の正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子あるいはそれらの両方を含むキット、並びに、場合により、前記微小粒子を懸濁させるための手段を提供する。キットは、例えば、微小粒子を含む遠心バイアルを含む場合がある。
【０１２８】
微小粒子は、粉末の形態、又は、あるいは、液体媒質中（例えばスラリー又は懸濁液中など）でありうる。微小粒子は、好ましくは、ゲルの形態ではない。さらに、キットは、脱着緩衝液を含む別のバイアルを含んでもよい。
【０１２９】
本発明の正荷電及び負荷電の微小粒子又は疎水性微小粒子は、混合物として、又は別々に提供されてもよい。後者において、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子は、生物学的流体に、別々に加えられる。それらは、両方が流体中に加えられるまで、互いに接触していない。従って、本発明は、また、正荷電の微小粒子及び負荷電の微小粒子を含む生物学的流体を含む。
【０１３０】
実施例
実施例１．イオン交換樹脂からの微小粒子の調製
異なる型のイオン交換樹脂を、Sigma Aldrich及びDIAIONから購入した。
【０１３１】
以下の陰イオン交換樹脂を使用した：Amberlite IRA-400、Amberlite IRA-743、Dowex 1X2-100、Dowex 1X2-400、Dowex 1X8-100、Marathon A2、DIAION SA20A、DIAION SA10A、DIAION SA312。
【０１３２】
以下の陽イオン交換樹脂を使用した：Dowex 50 WX2-100、Dowex 50 WX8-100、Marathon V、Marathon MSC、DIAION PK216、DIAION SK110。
【０１３３】
樹脂は、コーティングされたセラミック乳鉢中で、手により、約３０分間にわたり湿式粉砕（１／２時間にわたり２０g）した。粉砕樹脂は、水（５０mlを加える）中で懸濁した。期間（約９６時間）後、樹脂沈降物の上清を試験管に移した。上清は、約２００μlの樹脂が１本の試験管当たりで回収されるまで、７０００rcf（相対遠心力）で１５分間にわたり区分的に（１ml）遠心分離した。樹脂を２M塩化ナトリウム（１，５ml）中に再懸濁し、１分間にわたり遠心分離（７０００rcf）した。１分目の遠心分離のペレットを捨てた（Amberlite IRA-743を除く）。上清を移し、１５分間にわたり再び遠心分離（７０００rcf）した。１５分目の遠心分離の上清を捨てた。微小粒子（約２００μl）も、２M塩化ナトリウム中で遠心分離した。ミクロ粒子（約１５０μl）及び他の粉砕樹脂（５０〜２００μl）を水中で再懸濁し（１：４）、一部（５０μl樹脂）を試験管に移した。
【０１３４】
樹脂の一定分量を７０００rcfで遠心分離し、上清を捨て、樹脂を水性洗浄溶液の２０倍容積（約１ml）中に再懸濁した。溶液中でのインキュベーションの時間は３０分間であった。
【０１３５】
洗浄順序：
−  １×５０%ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
−  ３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
−  中性近いｐＨについてチェック
−  脱イオン水中での微小粒子及び粉砕樹脂の再懸濁（約７０%ｖ／ｖ）
−  樹脂は、特定の実験のために使用される、対応する緩衝液中で平衡化した。
【０１３６】
光学顕微鏡を使用した粒子サイズの決定
調製された微小粒子の粒子サイズは、サイズのソフトウェアベースの決定を使用した光学顕微鏡法により決定した。粉砕材料及び微小粒子の粒子サイズは、相対的な直径の推定により１０００倍の倍率で測定した。分布を、１%ｖ／ｖでの１０００〜５０００粒子の直径サイズの比較により算出した。結果を表１に示す。
【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
陰イオン交換体Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ８−４００についての代表的な画像及び評価を図１ａ−Ｂに示す。図２に示す通り、同様の粒子サイズの範囲が、全ての材料について得られた。
【０１３９】
形態
ＡＦＭ測定を、MARATHON A2及びMARATHON MSCから調製された微小粒子の可視化のために実施した。サンプルは、エタノールで洗浄し、顕微鏡スライドガラス上で乾燥させた。ＡＦＭ測定から生成されたデータの可視化及び分析のために、オープンソースソフトウェアGwyddion（ｖ２．３０）を使用した。結果を図３−４に示す。粉砕した微小粒子は形状が不規則であり、メソ細孔は観察されなかった。
【０１４０】
実施例２．NETZSCH社により粉砕された、実験室ミルを使用した微小粒子の調製
Marathon MSC樹脂は、NETZSCH Labstar LS1ミルを使用して湿式粉砕した。２kgの樹脂を、３kgの水と混合した。約２００分の期間の後、１μmのｄ５０に達した。サイズ分布は、動的光散乱を用いて、粉砕の間に分析した。
【０１４１】
Marathon A2樹脂は、より高い機械的安定性のため、コーティングされたセラミック乳鉢により、１２時間にわたり事前に粉砕され、NETZSCH Labstar LS1ミルを使用した湿式粉砕が続いた。
【０１４２】
図５ａ−ｂにおいて、Marathon MSCのサイズ分布並びに平均直径（ｄ５０）が、粉砕プロセスの持続時間に対してプロットされている。最初の粉砕スプレッドの間でのサイズ分布は、２００分から狭くなり続け、約３００分で単峰性になる。この段階での平均直径は約３００nmである。Labstar LS1ミルを用いた１〜２μmの全体のｄ５０までのMarathon MSCの粉砕によって、常に少なくとも二峰性分布が産生される。２００分で、及び１μmの全体のｄ５０で、１〜２μmのｄ５０を伴う粒子画分は約３０%である。１μmよりも小さい粒子が約５５%を占めるのに対し、粒子の約１５%が２μmと５μmの間のｄ５０を有する。パーセンテージは、それぞれの容積分画の比率（ｖ／ｖ）として与えられる。Labstar LMZ（２mmビーズ）を用いた粉砕に先立つ、４μm（５mmビーズ）のｄ５０までのＬＭＥ３０ミルを用いたMarathon A2の粉砕は、１μmのｄ５０を伴う単峰性分布をもたらす。
【０１４３】
実施例３．微小粒子の吸着の動態
Dowから得られた粉砕形態の樹脂の一定分量を、７０００相対遠心力（rcf）で遠心分離し、上清を捨て、樹脂を水性洗浄溶液（約１ml）の１０倍容積中に再懸濁した。溶液中でのインキュベーションの時間は３０分であった。洗浄を以下の通りに行った：
−  １×５０%ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
−  ３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
−  １×０．５Ｍ  ＮａＯＨ（ＯＨ−への陰イオンの置換）
−  ４×脱イオン水（間質液からの陰イオンの希釈）
−  脱イオン水中での微小粒子の再懸濁（約２０%ｖ／ｖ）
【０１４４】
吸着の動態を、バッチ吸着及び異なる非常に短い時間間隔でのサンプル採取により決定した。トリプシン阻害剤（ＴＩ）及びＩｇＧのストック溶液は、２０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中で、約５mgタンパク質/mlに調整した。さらなるストック溶液を、０．１及び０．５mgタンパク質/mlの濃度まで、緩衝液を用いて各々のタンパク質について希釈した。微小粒子（２０%ｖ／ｖ）を、２０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中で、４%ｖ／ｖまで希釈した。微小粒子の容量を推定し、加えた微小粒子の量を、平衡状態でタンパク質量の半分を吸着するように調整した。アッセイの最終全容量は１０mlであった。この容積を５mlの２つの半分に分割した（タンパク質を含む第１の半分及び微小粒子を含む第２の半分）。２つの半分をＳｐｉｎＸ遠心管中の０．２５ml部分で混合し、異なる時間間隔にわたるインキュベーションが進行した。定められた時間間隔の後、混合物を、微小粒子上でのタンパク質の吸着を停止するために、ろ過した。吸着タンパク質の量は、マイクロウェルプレート中で、２８０nmで吸光度を測定することにより決定した。
【０１４５】
図４に示す通り、吸着の動態は極めて速かった。平衡能力のほぼ９０%に、１０秒以内に達した。従って、タンパク質種間の差は、実験的に観察することができなかった。適当な吸着モデルを使用することによる定量化も可能ではなかった。同様の実験条件を使用した従来のクロマトグラフィ材料によって、平衡が、３０分の期間前、６時間までに達しなかったことが示される。この観察は、微小粒子がメソ孔を有さないというＳＥＭ測定の知見を支持する。
【０１４６】
実施例４．平衡能
実施例４．１
実施例１において調製した微小粒子を使用し、トリプシン阻害剤（ＴＩ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧの）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を吸着する。平衡能及び吸着等温線を評価した。トリプシン阻害剤（ＴＩ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のストック溶液を、約１mgタンパク質/mlに調整した。吸着条件は、２０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０又は２０mM酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）（ｐＨ６．０）であった。粉砕樹脂（１０%ｖ／ｖ）を各々の１mlタンパク質溶液に加え、２０rpmの転倒で、約２３℃でインキュベートした。３０分後、１mlのサンプルを試験管から取り、０．２μmでろ過した。吸着タンパク質の量は、マイクロウェルプレート中で、２８０nmでの吸光度、又は、ＧＦＰの場合において、蛍光を測定することにより決定した。
【０１４７】
図６は、トリプシン阻害剤（図６ａ）及びＢＳＡ（図６ｂ）についての異なる陰イオン交換微小粒子の平衡能を示す。DIANION SA20及びDIANION PA312は、ほぼ同じ容量を示し、DIAION SA10についての能力はより低い。
【０１４８】
図７は、リゾチーム（図７ａ）及びポリクローナルＩｇＧ（図７ｂ）についての異なる陽イオン交換微小粒子間の平衡能を示す。NuviaSが、従来のビーズ材料を表す参照として含まれた。２つの陽イオン交換DIAION PK216及びDIAION SK110は、Dow樹脂（４０〜１００mg/mL）及び、また、Nuvia S（約１５０mg/mL）と比較し、有意に低い能力を有する。
【０１４９】
図８は、透析ろ過ＧＦＰホモジネートからのＧＦＰについての異なる陰イオン交換微小粒子の平衡能を示す。能力は、Marathon A2、DIAION SA20及びDIAION PA312（４０−５０mg  ＧＦＰ/ml）についてほぼ等しかったのに対し、DIAION SA10は〜２０−２５mg/mLの低下能を有した。
【０１５０】
実施例４．２
Marathon MSC及びNuviaS（Biorad）の平衡能を、（約３．５mS/cmと約１７mS/cmの間の導電率で）上昇する塩レベルで評価した。NuviaSとは対照的に、MARATHON MSCについてのポリクローナルＩｇＧの平衡能は、塩濃度の全範囲にわたり一定に近いままであった。これは、粉砕微小粒子が、従って、細胞培養上清からのＩｇＧの直接的な捕捉のために適していることを示す。図９は、NuviaS樹脂（図９ａ）及びMARATHON MSC微小粒子（図９ｂ）についての吸着緩衝液の導電率に対してプロットされた、ポリクローナルＩｇＧの平衡能を示す。
【０１５１】
実施例５．吸着及び粒子サイズ
平衡能に対する粒子サイズの効果を調べた。微小粒子は、向流（counter current flow）で調製し、遠心分離により分画し、異なるサイズの微小粒子を得た。
【０１５２】
図１０において、ポリクローナルＩｇＧについてのMarathon MSCの能力が、平均粒子サイズ（ｄ５０）に対してプロットされている。示す通り、能力は、２μmのｄ５０から劇的に減少し続けているが、１μmよりも小さい微小粒子は、より高い能力に導く可能性が高いであろう。しかし、この限定は、反対に荷電した微小粒子を含むことにより克服することができる（実施例７に示す通り）。
【０１５３】
実施例６．大腸菌ホモジネートからのＧＦＰの吸着／脱着
大腸菌ホモジネートからの組換えＧＦＰのバッチ吸着を、以下の工程を用いて、MARATHON A2を使用して実施した。
【０１５４】
細胞破壊：
大腸菌細胞懸濁液を一晩４℃まで冷却し、４０００rcf及び４℃で１５分間にわたり遠心分離した。上清を捨て、細胞のペレットを、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５０mM  ＮａＣｌ中で１６５g湿/kg（〜３０g d.m./kg）まで懸濁した。細胞は、２継代により、１０００バールでの高圧均質化により破壊した。ホモジネートを、１００００rcf及び４℃で３０分間にわたり遠心分離し、上清を０．２μmでろ過した。ホモジネートを、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５０mM  ＮａＣｌを用いて１：５に希釈し、４℃で保存した。
【０１５５】
吸着／脱着
バッチ吸着／脱着は、１．５μm  ｄ５０（ＭＡ２）を伴う、粉砕されたDowex Marathon A2（塩化物形態）上での〜１mg/mL  Ｃ  ＧＦＰで、１ml vの小さなスケールで、試験管中で実施した。ホモジネートの開始伝導率は、〜９ms/cmであった。１mlのホモジネートに、１００μlの５０%（ｖ／ｖ）ＭＡ２を加えた。サンプルは、ロータリーシェーカー上で少なくとも１５分間インキュベートした。その後、サンプルは、５分間（吸着）又は１５分間（脱着）にわたり７０００rcfで遠心分離し、上清を他の試験管に移した。１mlの緩衝液をペレットに加え、樹脂を、激しく混合することにより懸濁した。
【０１５６】
プロトコール：
吸着
−  １mlホモジネート
−  １ml  ５０mM  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．５
【０１５７】
溶出
−  １ml  ５０mM  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．５，  ０．５M  ＮａＣｌ
【０１５８】
再生
−  １ml  ５０mM  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．５，  １．０M  ＮａＣｌ
−  １ml  ５０mM  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．５，  ２．０M  ＮａＣｌ
【０１５９】
洗浄
−  ３ｘ  １ml  ｄｄＨ２Ｏ
全ての工程を、樹脂及び試験管を変えることなく、３回繰り返した（パス０１〜０３）。
【０１６０】
分析
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、及び２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、蛍光（マイクロウェルプレート）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀及びクマシー染色）のデンシトメトリー、及びＰｉｃｏグリーンアッセイ（マイクロウェルプレート）により定量化した。
【０１６１】
ＧＦＰの決定：
サンプルを、マイクロウェルプレート中で１：２、１：４、１：８、及び１：１６希釈した。蛍光は、４８５nm励起及び５３５nm発光で測定した。濃度は、１８０００ＦＬＵ（約８０μg  ＧＦＰ/ml）まで、ＧＦＰ標準キャリブレーションを用いて測定した。
【０１６２】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の決定：
サンプルを、マイクロウェルプレート中で１：２、１：４、１：８、及び１：１６希釈した。ｄｓＤＮＡは、４８５nm励起及び５３５nm発光での蛍光を測定することにより、Picogreen DNAを用いて測定した。濃度は、１００００ＦＬＵ（約１００μg  ｄｓＤＮＡ/ml）まで、ラムダｄｓＤＮＡ標準キャリブレーションを用いて測定した。
【０１６３】
エンドトキシンの決定：
エンドトキシンは、エンドポイント蛍光分析（PyroGene、rFCエンドトキシン検出システム、Lonza）により測定した。
【０１６４】
ＨＣＰの決定：
電気泳動サンプルは、ＳＤＳサンプル緩衝液４×（２５%）、２M  ＤＴＴ（１０%）中で希釈し（６５%）、１００℃で１０分間にわたり加熱することにより調製した。電気泳動は、ＭＥＳ−ＳＤＳ泳動緩衝液を伴うNuPage  １０〜２０%アクリルアミドゲル（２００Ｖ、４００ｍＡ、５０分）中で実施した。タンパク質は、酸メタノール溶液を伴うゲル上で１０分間にわたり固定し、クマシー−ビスマルクブラウンを用いて染色した（Choi J-K, Yoon S-H, Hong H-Y, Choi D-K, Yoo G-S (1996) Anal Biochem 236:82）。染色の光学密度は、デンシトメトリー分析により決定し、タンパク質の各々の可視帯域について算出した。ＧＦＰの純度及びＨＣＰの量は、全ての他のタンパク質を表し、この分析から推定した。
【０１６５】
MARATHON A2微粒子のための高塩濃度での非変性再生後のバッチ吸着／脱着の再現性（３回；パス０１〜０３）を試験した。結果を図１１ａ〜ｃに示す。ＧＦＰ及びＨＣＰの結合能はパス間で有意に変化しないが、ｄｓＤＮＡの結合能は、パス０１からパス０３に着実に減少する。図１１は、パス０１、０２、及び０３にわたる吸着、溶出、及び再生後の、粉砕されたDOWEX MATATHON A2（ＭＡ２）からのＧＦＰ、ＨＣＰ、及びｄｓＤＮＡからの回収（%）を示す。
【０１６６】
自作の微小粒子からの溶出画分は、１００%に近いＧＦＰ回収を示し、同時に、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の約６０〜７０%が除去された。２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、溶出液中で見出されなかった（ｄｓＤＮＡが、高塩条件ＮａＣｌ＞１Mで回収された）。微小粒子の結合能は、２M  ＮａＣｌを用いて再生することにより完全に回復することはできなかった。
【０１６７】
吸着／溶出実験の間での上清についてのエンドトキシン濃度を評価した。吸着条件は２０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５及び１００mM  ＮａＣｌであった。溶出は、２０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５で行った。ろ過した細胞ホモジネートを、２０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５  １００mM  ＮａＣｌを用いて１：２０希釈した。結果として得られたＧＦＰ濃度は０．５mg/mLであった。吸着及び溶出の間での１００μlのMARATHON A2微小粒子（ＭＡ２）からのエンドトキシンの回収が、図１２にプロットされている。５対数低下が、１０００mM  ＮａＣｌの塩レベルまで達成された。２Ｍ  ＮａＣｌを用いた再生は、試験されなかった。
【０１６８】
実施例７．１．ポリクローナＩｇＧの吸着
ポリクローナルＩｇＧを、異なるｐＨ値及び塩濃度（ｐＨ５．０及び６．０；５０mM〜１００mM  ＮａＣｌ）でMARATHON MSC上に吸着させた。タンパク質濃度を０．３と１．３mg/mLの間で変動させた。MARATHON MSCを使用し、ポリクローナルＩｇＧを吸着した（実施例４に記載する通り）。全固体濃度を０．５%と２%の間で変動させた。ＩｇＧ濃度を０．２mg/mLと１．３mg/mLの間で変動させた。吸着条件は、２０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）又は２０mM  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）のいずれかであった。塩化ナトリウム濃度は、５０mM又は１００mMのいずれかであった。溶出条件は、２０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１Ｍ  ＮａＣｌであった。沈降は、混合タンク（EasyMax、Mettler Toledo）内で行われた。沈降挙動は、光遠心分離機（photocentrifuge）（LumiSizer、L.U.M GmbH、ベルリン）を用いて測定した。
【０１６９】
凝結は、吸着工程後に形成される。サンプルを、５mLピペット（３mmの最小先端径）を用いて取った。２%固体濃度での凝結MARATHON MSCの典型的な例を図１３．１に示す。
【０１７０】
形成された綿状物の流体力学直径に対する、及び、このように、沈降速度（平均化された２９０の相対遠心力で）の正規分布に対する、MARATHON A2をMARATHON MSC（Ｔｗｏ  Ｒｅｓｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＴＲＳ）に加えることの効果をさらに評価する。図１３．２は、MARATHON A2とMARATHON MSCの異なる容積比についての流体力学直径の１０%パーセンタイル（綿状物の９０%はより大きい）のボックスプロットを示す。沈降速度（平均化された２９０の相対遠心力で）の正規分布及び３パラメトリックガウス曲線の適合パラメータに対する、１０%  MARATHON A2をMARATHON MSCに加えることの効果をさらに評価する。図１４．１は、適合ガウス曲線を伴う、凝結したMARATHON MSC微小粒子についての速度分布のプロットを示す。凝結は、吸着したポリクローナルＩｇＧ単独（丸印、赤色点線）及び追加の１０%MARATHON A2（三角印、緑色実線）を用いて行った。平均沈降速度は１５０μm/s  ＋／−  ３９．０から２８７４μm/s  ＋／−  ５８０まで増加した。
【０１７１】
MARATHON A2を吸着後に加えた。データは、光遠心分離機（LumiSizer、L.U.M GmbH、ベルリン）により記録し、ソフトウェアＳｅｐＶｉｅｗ（LumiSizer、L.U.M GmbH、ベルリン）を用いて分析した。ストークスの法則を、流体力学的直径を算出するために使用した。密度１．５g/mLを、算出のために仮定した。プロッティング及び適合は、それぞれソフトウェアmatplotlib及びscipyを用いて行った。ウィスカを四分位範囲の１．５倍でプロットする。本発明者らは、従って、驚くべきことに、１０%MARATHON A2を加えることにより、流体力学直径に関する１桁だけの増加が達成されたことを見出している。流体力学的直径の中央値は、０．７μmから４０μmまで増加した。流体力学的直径は、プロセス条件の変動に伴い変動するが、プロセス条件が一定のままである場合（０．２の比率である場合）、それは正確に一定範囲内に止まる。
【０１７２】
反対荷電の微小粒子を伴う凝結は、タンパク質の吸着の前後に、反対荷電の微小粒子を加えることにより行うことができる。静電相互作用に起因して、大きな綿状物が形成される。
【０１７３】
MARATHON A2とMARATHON MSCの間に形成された綿状物を、遠心管を反転させることにより、簡単に再懸濁することができる。
【０１７４】
綿状物が吸着工程後に形成した場合、MARATHON A2の量は、好ましくは、２０%〜３０%未満のMARATHON A2であることが見出される。他の点では、MARATHON A2粒子は非凝結のままでありうる。
【０１７５】
ｐＨ６．０及び１００mM  ＮａＣｌで２分間又はそれ以下にわたる凝結は、ポリクローナルＩｇＧ並びにMARATHON MSC及び１０%Marathon A2のための好ましい条件（沈降速度に関して）を表すように見える。微小粒子のサイズは、０．１μmと２μm（ｄ５０）の間でありうる。これらの条件下で、高い表面積と単純な沈降挙動の組み合わせを達成することができる。
【０１７６】
実施例７．２  粉砕されたMarathon MSC及び粉砕されたMarathon A2を使用することによるＣＨＯ細胞ブロスからのＩｇＧの回収及び精製
ＴＲＳ（ＩｇＧの吸着前後での、粉砕されたMarathon MSCへの粉砕されたMarathon A2の添加）を適用する際での選択性の喪失は回避することができる。例えば、正荷電のタンパク質（ＩｇＧなど）が、ＣＩＥＸ樹脂を用いて捕捉され、樹脂が、その後、ＡＩＥＸ樹脂を用いて凝結される場合、ＤＮＡ又はＨＣＰなどの不純物も結合し、最終的に、標的タンパク質と共溶出する。この効果は、ＣＨＯ細胞上清から捕捉されたＩｇＧ及びＤＮＡの場合において観察することができる。ＩｇＧは、イオン交換体について高い親和性を有し、従って、高塩濃度（ＮａＣｌなどの１M塩）でだけ溶出する。残念なことに、ＤＮＡは、１M塩濃度で共溶出する。図１４．２には、そのようなプロセスが記載されている。細胞上清のｐＨを、２M  ＨＣｌを使用して６．０に調整した。その後、約８０μlの約５０%（ｖ／ｖ充填床）Marathon MSC懸濁液を、２mLの細胞上清に加えた。ロータリーシェーカー上での２０rpmで２分後、８μlと４０μlの間のMarathon A2（ｖ／ｖ充填床）を加えた。換言すれば、Marathon A2とMarathon MSCの容積比は、１０%〜５０%の範囲であった。全ての微小粒子を超純水中に懸濁した。凝結した微小粒子を、５分間にわたる１０００rcfでの遠心分離により分離した。ペレットを、０．５mLの５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。微小粒子を、５分間にわたる１０００rcfでの遠心分離により分離した。溶出は、１M  ＮａＣｌを含む、０．５mLの５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して行った。全ての場合において、元のＣＨＯ細胞上清のＤＮＡの６０〜８０%が、ＩｇＧと共溶出した。
【０１７７】
粉砕されたMarathon MSC／粉砕されたMarathon A2へのＩｇＧの吸着前での選択性の喪失を回避するために、ＣＨＯ細胞を、ＡＩＥＸ微小粒子を用いて凝結する。その後細胞は簡単に分離することができる。数分間以内の５ｇと５０ｇの間での相対遠心力での沈降又は遠心分離により、凝結細胞を分離することが可能である。ＤＮＡ及び他の陰荷電のタンパク質などの不純物は、ＡＩＥＸ樹脂に結合する。１４．３中のフローチャートに、この方法が記載されている。３５０μlの５０%（ｖ／ｖ充填床）Marathon A2懸濁液を、１０mlのＣＨＯ上清に加えた。選ばれた量を下回る場合、ＣＨＯ細胞の凝結は不完全であり、分離効率は減少した。形成した綿状物を、次に、５と５０rcfの間の相対遠心力での遠心分離により分離した。ＩｇＧの捕捉及び溶出は、以前のパラグラフにおいて記載する通りに行った。
【０１７８】
粉砕されたMarathon A2を用いた細胞の凝結後の、得られた細胞上清は、ほぼＤＮＡを含まず、同時に、宿主細胞タンパク質の約６０%が細胞捕捉工程の間に分離された。全体的に、宿主細胞タンパク質の８７%超を分離することができた。結果を表２にまとめる。
【０１７９】
【表２】
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【０１８０】
表２。図３に従った捕捉及び溶出の間での、ＩｇＧ、ＤＮＡ、及び宿主細胞タンパク質の測定濃度。濃度は、以下の方法を用いて測定した：ＩｇＧ：  ２８０nmでのＵＶ検出を使用したＳＥＣクロマトグラフィ。DNA:Picogreenアッセイ（Invitrogen）、宿主細胞タンパク質：HCP-ELISA（Cygnus）。溶出は、１M  ＮａＣｌを含む２０mM  ＰＯ４緩衝液を使用して行った。
【０１８１】
ＩｇＧの溶出
ＩｇＧを溶出することは、Marathon MSCについてのその高い親和性のため困難でありうる。イオン交換体のための溶出イオンの親和性が高いほど、より少ない量が、完全な回収のために必要とされる。１Ｍ  ＫＣｌを使用することは、１．５M  ＮａＣｌを使用することと同様の効果を有する。ＩｇＧの９５%超が、１M  ＫＣｌを含む２０mM  ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して回収することができる。Marathon MSC及びモノクローナルのＩｇＧを使用した溶出試験の結果は、Ｆｅｈｌｅｒ！  Ｖｅｒｗｅｉｓｑｕｅｌｌｅ  ｋｏｎｎｔｅ  ｎｉｃｈｔ  ｇｅｆｕｎｄｅｎ  ｗｅｒｄｅｎ（エラー！参照元が見つかりません）にプロットされている。
【０１８２】
実施例８．商業的に入手可能なミクロスフェアとの比較
粉砕されたMarathon A2及びMarathon MSCの吸着能を、同様の官能基を有する陽イオン交換体ＣＩＥＸ（Polysciences Polybead（登録商標）硫酸ミクロスフェア１．００μm）及び陰イオン交換体ＡＩＥＸミクロスフェア（Estapor（登録商標）Microspheres White Functionalized Microspheres K6-100）と比較した。粒子サイズは、１０００×倍率の光学顕微鏡検査により、決定した。ゼータ電位は、Malvern Zeta Sizer Nanoシリーズ機器での動的光散乱により測定された電気泳動移動度（スモルコフスキー式に基づく）から、ｄｄＨ２Ｏ中で、＜０．１mS/cmで推定した。
【０１８３】
図が示す通り、これらのミクロスフェアは、サイズにおいて同様であり（図１５）、同様のゼータ電位を有する（図１６）。
【０１８４】
ＧＦＰ結合能は、ＡＩＥＸミクロスフェア及び粉砕されたMarathon A2について評価されたのに対し、ポリクローナルＩｇＧ結合能は、ＣＩＥＸミクロスフェア及び粉砕されたMarathon MSCについて評価された。吸着条件は、ＧＦＰ及びＩｇＧについて、それぞれ５０mM  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）及び５０mM  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）であった。平衡タンパク質濃度は、約０．１mg/mL樹脂であった。
【０１８５】
実施例４に記載する条件を使用し、ＡＩＥＸについてのＧＦＰの結合能（正荷電の微小粒子）及びポリクローナルＩｇＧの結合能を評価した。
【０１８６】
粉砕されたミクロスフェアは、サイズにおいて同様であり（図１５を参照のこと）、ミクロスフェアと同様のゼータ電位を有し、それらの結合能は、商業的に入手可能なミクロスフェアよりもずっと高いことが証明された。図１７は、粉砕された微小粒子のタンパク質結合能が、商業的に入手可能なミクロスフェアよりも優れていることを示す。
【０１８７】
実施例９．疎水性微小粒子
疎水性微小粒子の調製
DOWにより提供される吸着型樹脂：Amberlite XAD4、Amberlite XAD7HP、及びAmberlite XAD761は、Sigma Aldrich（オーストリア、ウィーン、２０１１）から購入した。
【０１８８】
樹脂は、駆動される電動モーター、セラミックコーティングされた乳鉢を用いて、一晩（〜１２時間にわたり２０ｇ）粉砕された。粉砕された樹脂を、水（約１０%ｖ／ｖ及び５０mlを加える）中に懸濁した。上清を、４０００×ｇ（相対遠心力と等価）で３０分間にわたり遠心分離した。樹脂を、２M塩化ナトリウム（５０ml）中に再懸濁し、１分間にわたり遠心分離（４０００×ｇ）した。１分間の遠心分離のペレットを捨てた。上清を移し、３０分間にわたり再び遠心分離（４０００×ｇ）した。上清を捨てた。粉砕樹脂を水中に再懸濁し（１：２）、試験管に移した。樹脂を４０００×ｇで遠心分離し、上清を捨て、樹脂を５０mlの水性洗浄溶液中に再懸濁した。
【０１８９】
洗浄順序は以下の通りであった：
１×５０%  ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
【０１９０】
疎水性微小粒子の粒子サイズ
微小粒子の粒子サイズ分布は、１%ｖ／ｖ及び６００×倍の倍率での、約５００粒子の明視野顕微鏡投影の測定による等価円直径から算出した。
【０１９１】
微小粒子及び従来のクロマトグラフィ媒質吸着／脱着のための一般的なプロトコール。
【０１９２】
吸着及び脱着の試験は、１mLのバッチ（ホモジネート又は標準タンパク質溶液）中で実施した。５０%（ｖ／ｖ）微小粒子懸濁液（μl中）の種々の量を、２mL試験管中のタンパク質溶液に加えた。タンパク質濃度及び導電率に関する希釈因子を考慮に入れた。
【０１９３】
微小粒子懸濁液を３０分間にわたり、従来のクロマトグラフィ媒質懸濁液を１２時間にわたりインキュベートした。後に、微小粒子又は従来のクロマトグラフィ媒質を１０分間にわたり７０００×ｇで遠心分離し、結合タンパク質の溶出を、１mLの溶出緩衝液の添加、激しい混合、及び３０分間にわたるインキュベーションにより実施した。一部の場合において、溶出緩衝液を用いた２回目の洗浄工程が含まれた。溶出後、微小粒子又は従来のクロマトグラフィ媒質を、以前の通りに再び遠心分離した。上清中のタンパク質の濃度を、測光分析により定量化し、標的タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０１９４】
実施例１０
大腸菌ホモジネートからの組換えＧＦＰのバッチ吸着は、正荷電の微小粒子（ＭＰ）（粉砕されたクロマトグラフィ樹脂Marathon A2（ＭＡ２））及び負荷電の微粒子（ＭＰ）（Marathon MSC（ＭＭＳＣ））を使用し、以下の工程を用いて実施した。この実施例では、酸性の細胞内可溶性タンパク質としてＧＦＰを使用する。
【０１９５】
大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ  ＧＦＰｍｕｔ３．１）を、５  Ｌスケールフェッドバッチプロセス中で発酵させた。細胞内の可溶性標的タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して誘導した。
【０１９６】
回収及び均質化：大腸菌懸濁液（バイオマス含量〜３０重量%）を４℃に冷却し、２０分間にわたり１５０００gで遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットをさらに処理した。細胞ペレットを、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に再懸濁させ、バイオマス含量２０重量%細胞／緩衝液に希釈した。細胞を、粗細胞溶解産物を産生する２継代について、１０００バールでの高圧均質化により破壊した。
【０１９７】
溶解物からのバッチ吸着のために、凍結したバイオマスを使用することも可能である。この場合において、バイオマス（２０%ｗ／ｖ）を、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に再懸濁し、新鮮な発酵大腸菌細胞の場合と同じ破壊手順を適用することもできる。
【０１９８】
バッチ吸着は、室温（ｒｔ）でのガラスビーカー中の１mL容積の小スケールにおいて、並びに１００mlまでのスケールにおいて、試験管中で実施した。粗細胞溶解物に、ＭＡ２を加え（１．２μlの５０%  ｖ／ｖ  ＭＡ２を１μg細胞ペレット当たりに加えた）、〜５秒間にわたり実験室ボルテックス中で、又はより大きなスケール中で、〜３０秒間にわたりオーバーヘッド撹拌機を用いて混合した。混合の間に、凝結が起こり、ＭＡ２が、標的タンパク質並びにＤＮＡ、ｈｃｐｓ（宿主細胞タンパク質）、及び細胞フラグメントなどの不純物に結合した。最初の凝結後、負荷電のＭＰを混合物に加えた（０．０６μlのMarathon MCS  ５０%  ｖ／ｖ）。それらの反対荷電のＭＰは、凝結物の粒子サイズ及び安定性を増加させるクロスリンカーとして働く。凝結物は、遠心分離又はろ過することができる。
【０１９９】
洗浄のために、凝結物のペレットを、７５mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を伴う５０mM  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液中に再懸濁した。短時間のインキュベーション後、凝結物を、遠心分離（３分間にわたり１３４００g）を使用して分離した。分離が、ろ過プロセスを使用して起こった場合、ろ過ケーキは再懸濁せず、ろ過ケーキを通じて洗浄緩衝液をろ過する（１．５バールでの０．２μmろ過プレート）ことにより洗浄した。上清を捨て、ペレット／ろ過ケーキを、溶出工程のためにさらに処理した。低塩濃度によって、低い結合力を伴う不純物を溶出することができる。
【０２００】
溶出工程のために、洗浄凝結物を、４００mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む５０mM  Ｔｒｉｓ緩衝液中に再懸濁した。凝結物を、５分間にわたりタンブラー中で混合した。４００mM  ＮａＣｌ濃度で、標的タンパク質がＭＰから溶出し、今回は上清中にある。上清を、遠心分離（３分間にわたる１３４００g）を使用し、又はデッドエンドろ過（１．５バールでの０．２μmろ過プレート）当たりで、凝結物から分離した。結合した不純物を伴うＭＰを含むペレット／ろ過ケーキを捨て、目的のタンパク質（ＧＦＰ）を含む上清をさらに処理した。
【０２０１】
実施例１１
大腸菌ホモジネートからの組換えＧＦＰのバッチ吸着は、正荷電の微粒子（ＭＰＳ）（粉砕されたクロマトグラフィ樹脂Marathon A2（ＭＡ２））及び負荷電の微粒子Marathon MSC（ＭＭＳＣ）を使用し、以下の工程を用いて実施する。この実施例では、酸性細胞内の可溶性タンパク質としてＧＦＰを使用する。
【０２０２】
大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ  ＧＦＰｍｕｔ３．１）を、５  Ｌスケールフェッドバッチプロセス中で発酵させる。細胞内の可溶性標的タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して誘導する。
【０２０３】
回収及び均質化：大腸菌懸濁液（バイオマス含量〜３０重量%）を４℃まで冷却し、２０分間にわたり１５０００gで遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットをさらに処理する。細胞ペレットを、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に再懸濁させ、バイオマス含量２０重量%細胞／緩衝液まで希釈する。細胞を、粗細胞溶解物を産生する２継代について、１０００バールでの高圧均質化により破壊する。
【０２０４】
溶解物からのバッチ吸着のために、凍結したバイオマスを使用することも可能である。この場合において、バイオマス（２０%ｗ／ｖ）を、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に再懸濁し、新鮮な発酵大腸菌細胞についての場合と同じ破壊手順を適用することもできる。
【０２０５】
バッチ吸着は、室温（ｒｔ）でのガラスビーカー中の１mL容積の小スケールにおいて、並びに１００mlまでのスケールにおいて、試験管中で実施した。粗細胞溶解物に、ＭＡ２を加え（１．２μlの５０%  ｖ／ｖ  ＭＡ２を１μg湿細胞ペレット当たりに加えた）、〜５秒間にわたり実験室ボルテックス中で、又はより大きなスケール中で、〜３０秒間にわたりオーバーヘッド撹拌機を用いて混合した。混合の間に、凝結が起こり、ＭＡ２が、標的タンパク質並びにＤＮＡ、ｈｃｐｓ（宿主細胞タンパク質）、及び細胞フラグメントなどの不純物に結合する。凝結後、サンプルを１３４００gで３分間にわたり遠心分離し、又は、オーバーヘッド圧力を伴うデッドエンドろ過において１．５バールで０．２μmろ過プレートを使用してろ過する。上清を捨て、ペレット／ろ過ケーキを、洗浄工程のためにさらに処理する。
【０２０６】
凝結物の細胞ペレットを、７５mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を伴う５０mM  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液中に再懸濁する。短時間のインキュベーション後、凝結物を、遠心分離（３分間にわたり１３４００g）を使用して分離する。分離が、ろ過プロセスを使用して起きる場合、ろ過ケーキは再懸濁せず、ろ過ケーキを通じて洗浄緩衝液をろ過する（１．５バールでの０．２μmろ過プレート）ことにより洗浄する。上清を捨て、ペレット／ろ過ケーキを、溶出工程のためにさらに処理した。低塩濃度によって、低い結合力を伴う不純物を溶出することができる。
【０２０７】
溶出工程のために、洗浄凝結物を、標的タンパク質を溶出することができる塩濃度を含む５０mM  Ｔｒｉｓ緩衝液中に再懸濁する。懸濁液を、今回は、負荷電の微小粒子と混合し、より大きく、より安定な綿状物を産生する（１μgの湿細胞ペレット当たり０．０６μlの５０%  ｖ／ｖ  Marathon MSC）。標的タンパク質がＭＰから溶出し、今回は上清中にある。上清を、遠心分離を使用し、又はデッドエンドろ過（１．５バールでの０．２μmろ過プレート）当たりで、凝結物から分離することができる。結合した不純物を伴うＭＰを含むペレット／ろ過ケーキを捨てることができ、目的のタンパク質を含む上清をさらに処理できる。
【０２０８】
実施例１２
この実施例は、細胞ホモジネートからの粉砕Marathon A2（ＭＡ２）樹脂からの、ＭＰを使用して組換え発現された塩基性タンパク質の回収を実証する。タンパク質、インターフェロンガンマ、ＩＦＮ−γは、細胞内の、可溶性の発現塩基性タンパク質についての一例として機能する。この実施例は、正荷電の交換樹脂が、望ましくない細胞構造及び細胞内物質に結合することにより、生体分子の回収のために使用することができることを示す（ネガティブ精製という）。
【０２０９】
ＩＦＮ−γは、流加発酵により、大腸菌中で、細胞内で可溶性発現された。
【０２１０】
回収及び均質化
インターフェロンガンマＩＦＮ−γを発現する細胞の凍結バイオマス（２０%  ｗ／ｖ）を使用し、溶解緩衝液（２０mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  ＥＤＴＡ、１M尿素、０．１%β−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。細胞は、粗細胞溶解液を産生する３継代について、９５０バールの高圧均質化により破壊した。細胞破壊は、また、新鮮なバイオマスを用いて働きうる。
【０２１１】
標的タンパク質のネガティブ精製
バッチ吸着は、室温（ｒｔ）での２mL容積の小スケールにおいて、試験管中で実施した。粗細胞溶解物を、ＭＡ２と混合し、〜５秒間にわたり実験室ボルテックス中で混合した（１μg湿細胞ペレット当たり０．８４μlの５０%  ｖ／ｖ  Marathon 2）。混合の間に、凝結が起こり、そこでは、ＭＡ２が、ＤＮＡ、ｈｃｐｓ（宿主細胞タンパク質）、及び細胞フラグメントなどの負荷電の不純物に結合する。
【０２１２】
第１の凝結後、反対荷電のＭＰを混合物に加え（１μg湿細胞ペレット当たり０．０４２μlの５０%ｖ／ｖ  Marathon MSC）、第２の混合工程が実施される。それらの反対荷電のＭＰは、凝結物の粒子サイズ及び安定性を増加させる架橋剤として働く。凝結物を遠心分離又はろ過することができる。結合した不純物を伴うＭＰを含むペレット／ろ過ケーキを捨て、目的のタンパク質を含む上清をさらに処理できる。
【０２１３】
実施例１３
この実施例は、正及び負荷電のＭＰ（ＭＡ２及びＭＭＳＣ）を使用し、インタクトな大腸菌からの酸性荷電の細胞内組換えタンパク質の抽出を示す。
【０２１４】
大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ  ＧＦＰｍｕｔ３．１）及びＢＬ２１（ｐＢＩ１ＫＴ７ｉｘ．１＿  ＧＦＰ．１）を、５Lスケールの流加プロセス中で発酵させる。細胞内の可溶性標的タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して誘導させる。
【０２１５】
細胞を回収し、Flexboy（登録商標）バッグ中で、４℃で一晩（〜１２時間）保存する。大腸菌懸濁液（バイオマス含量〜３０重量%）を４℃に冷却し、２０分間にわたり１５０００gで遠心分離し、後に、同じバイオマス含量を含みながら、５０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁する。
【０２１６】
細胞凝結及びタンパク質抽出
第１の凝結のために、正荷電のＭＰを細胞懸濁液に加え（３０%湿バイオマス含量での１mLの懸濁液当たり１０２μlのＭＡ２（５０%ｖ／ｖ））、大腸菌細胞を結合及び凝結させる。ＭＰが細胞と接触している間、抽出が起こり、標的タンパク質（ここではＧＦＰ）が上清中に蓄積する。２〜３時間のインキュベーション後、抽出が完了し、負荷電のＭＰ（負荷電のMarathon MSC：３０%湿バイオマス含量での１mLの細胞懸濁液当たり５．４μl）が、凝結細胞に加えられる。凝結物の粒子サイズが増加し、凝結物の安定性が増加する。第２凝結工程後、凝結物を、ろ過又は遠心分離を使用して分離することができる。細胞ペレット／ろ過ケーキを捨て、標的タンパク質を含む上清をさらに処理した。
【０２１７】
正荷電のＭＰの第１の添加後、上清は、未結合ＭＰ（この場合においてＭＡ２）から由来する乳白色の濁度を有する。一度、反対荷電のＭＰ（ＭＭＳＣ）が混合物に加えられた場合、濁度は消え、それは、第２の凝結工程を実証する。細胞は、反対荷電のＭＰ（ＭＭＳＣ）により安定化されているＭＡ２−ＭＰＳに結合した。
【０２１８】
実施例１４
ＧＦＰの抽出は、正荷電のＭＰ（DIAION SA20A）及び負荷電のＭＰ（ＤＯＷ  ５０ＷＸ２−１００）を使用して実施される。
【０２１９】
正荷電のＭＰは、DIAION SA20Aから調製し、負荷電のＭＰは、ＤＯＷ  ５０ＷＸ２−１００から調製する（実施例１に記載する通り）。
【０２２０】
大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ  ＧＦＰｍｕｔ３．１）及びＢＬ２１（ｐＢＩ１ＫＴ７ｉｘ．１＿  ＧＦＰ．１）を、５  Ｌスケールの流加プロセス中で発酵させる。細胞内の可溶性標的タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して誘導させる。
【０２２１】
細胞を回収し、Flexboy（登録商標）バッグ中で、４℃で一晩（〜１２時間）保存する。大腸菌懸濁液（バイオマス含量〜３０重量%）を４℃に冷却し、２０分間にわたり１５０００gで遠心分離し、後に、同じバイオマス含量を含みながら、５０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁する。
【０２２２】
第１の凝結のために、正荷電のＭＰを細胞懸濁液に加え、大腸菌細胞を結合及び凝結させる。ＭＰが細胞と接触している間、抽出が起こり、標的タンパク質（ここではＧＦＰ）が上清中に蓄積する。２〜３時間のインキュベーション後、抽出が完了し、負荷電のＭＰが、凝結細胞に加えられる。凝結物の粒子サイズが増加し、凝結物の安定性が増加する。第２凝結工程後、凝結物を、ろ過又は遠心分離を使用して分離することができる。細胞ペレット／ろ過ケーキを捨て、標的タンパク質を含む上清をさらに処理した。
【０２２３】
実施例１５
ＧＦＰの抽出は、正荷電のＭＰ（DIAION SA312）及び負荷電のＭＰ（ＤＯＷ  ５０ＷＸ８−１００）を使用して実施される。
【０２２４】
正荷電のＭＰは、DIAION SA312から調製し、負荷電のＭＰは、ＤＯＷ  ５０ＷＸ８−１００から調製する（実施例１に記載する通り）。
【０２２５】
大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａ  ＧＦＰｍｕｔ３．１）及びＢＬ２１（ｐＢＩ１ＫＴ７ｉｘ．１＿  ＧＦＰ．１）を、５  Ｌスケールの流加プロセス中で発酵させる。細胞内の可溶性標的タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して誘導させる。
【０２２６】
細胞を回収し、Flexboy（登録商標）バッグ中で、４℃で一晩（〜１２時間）保存する。大腸菌懸濁液（バイオマス含量〜３０重量%）を４℃に冷却し、２０分間にわたり１５０００gで遠心分離し、後に、同じバイオマス含量を含みながら、５０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁する。
【０２２７】
第１の凝結のために、正荷電のＭＰを細胞懸濁液に加え、大腸菌細胞を結合及び凝結させる。ＭＰが細胞と接触している間、抽出が起こり、標的タンパク質が上清中に蓄積する。２〜３時間のインキュベーション後、抽出が完了し、負荷電のＭＰが、凝結細胞に加えられる。凝結物の粒子サイズが増加し、凝結物の安定性が増加する。第２凝結工程後、凝結物を、ろ過又は遠心分離を使用して分離することができる。細胞ペレット／ろ過ケーキを捨て、標的タンパク質を含む上清をさらに処理した。
【０２２８】
実施例１６．粉砕されたMarathon MSCと粉砕されたMarathon MSC及び粉砕されたMarathon A2の混合物でのポリクローナルＩｇＧの結合能の比較
ポリクローナルＩｇＧは、それぞれ５０mM及び１００mM  ＮａＣｌを含む５０mM  ＭＥＳ  ｐＨ６．０で、粉砕したMarathon MSC（ｄ５０＝１μm）に吸着させた。１つの場合において、樹脂は、吸着工程の前に、粉砕されたMarathon A2を用いて凝結させた（２樹脂系；ＴＲＳ）。他の場合だけにおいて、Marathon MSCだけを、タンパク質吸着のために使用した（１樹脂系；ＯＲＳ）。Marathon A2とMarathon MSCの比率を０．４に調整した。０．０１〜０．９９の範囲の他の比率も可能である。吸着は、ロータリーシェーカー上で１５分間にわたり行った。その後、粒子を遠心分離により分離した。以下のろ過工程では、０．２μmの孔幅を伴うシリンジフィルターを使用して行い、いかなる粒子もタンパク質測定に干渉しないことを確実にした。タンパク質濃度は、マイクロタイタープレート中で、２８０nmでのＵＶ吸収を介して測定した。結果を図１８にプロットしている。
【０２２９】
ＯＲＳとＴＲＳの使用の間でのタンパク質容量は、同程度である。ポリクローナルＩｇＧの吸着前での凝結によって、ポリクローナルＩｇＧについての最大タンパク質容量は減少しない。
【０２３０】
使用したポリクローナルIgG:Octagam  ５%（Octapharma AG）。溶液は、対応する緩衝液を用いて５%溶液を希釈することにより調製した。
【図１ａ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図１３．１】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３．２】
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【図１４．１】
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【図１４．２】
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【図１４．３】
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【図１４．４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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