(57)【要約】  本発明は、発癌性融合タンパク質を開示する。本発明は、遺伝子融合による癌の治療方法を提供する。
2016515508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される、該ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製された融合タンパク質。
【請求項２】
セプチンタンパク質のコイルドコイルドメインを含むポリペプチドに５’末端を融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質。
【請求項３】
ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）タンパク質を含むポリペプチドに５’末端を融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質。
【請求項４】
カリン関連ＮＥＤＤ化解離（ＣＡＮＤ）タンパク質を含むポリペプチドに３’末端を融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質。
【請求項５】
前記セプチンタンパク質が、セプチン−１、セプチン−２、セプチン−３、セプチン−４、セプチン−５、セプチン−６、セプチン−７、セプチン−８、セプチン−９、セプチン−１０、セプチン−１１、セプチン−１２、セプチン−１３、またはセプチン−１４である、請求項２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項６】
前記セプチンタンパク質が、セプチン−１４（ＳＥＰＴ１４）である、請求項２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＣＡＮＤタンパク質が、ＣＡＮＤ１、ＣＡＮＤ２、またはＣＡＮＤ３である、請求項４に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項８】
ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４が、ヒト７番染色体に配置されるＳＥＰＴ１４のエクソン７〜１０の組み合わせに対して５’をスプライスされるヒト７番染色体ｐ１１．２に配置されるＥＧＦＲのエクソン１〜２５の組み合わせを含み、遺伝的切断点が、ＥＧＦＲのエクソン１〜２５のいずれか１つ及びＳＥＰＴ１４のエクソン７〜１０のいずれか１つで生じる、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４核酸によりコードされる精製融合タンパク質。
【請求項９】
ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨが、ヒト７番染色体ｐ１１．２に配置されるＰＳＰＨのエクソン１〜１０の組み合わせに対して、５’をスプライスされるヒト７番染色体ｐ１２に配置されるＥＧＦＲのエクソン１〜２５の組み合わせを含み、遺伝的切断点が、ＥＧＦＲのエクソン１〜２５のいずれか１つ及びＰＳＰＨのエクソン１〜１０のいずれか１つで生じる、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ核酸によりコードされる精製融合タンパク質。
【請求項１０】
ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１が、ヒト１２番染色体ｑ１４に配置されるＣＡＮＤ１のエクソン１〜１６の組み合わせに対して、３’をスプライスされるヒト７番染色体ｐ１２に配置されるＥＧＦＲのエクソン１〜２５の組み合わせを含み、遺伝的切断点が、ＥＧＦＲのエクソン１〜２５のいずれか１つ及びＣＡＮＤ１のエクソン１〜１６のいずれか１つで生じる、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１核酸によりコードされる精製融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、８、９、または１０に記載の融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項１２】
配列番号１または５を含む、精製されたＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号４を含む遺伝的切断点を有する、精製されたＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号７または１１を含む、精製されたＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号９を含む遺伝的切断点を有する、精製されたＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号１３または１７を含む、精製されたＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１５を含む遺伝的切断点を有する、精製されたＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号２を含む、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項１９】
配列番号４を含む遺伝的切断点を有する、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項２０】
配列番号８を含む、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項２１】
配列番号１０を含む遺伝的切断点を有する、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項２２】
配列番号１４を含む、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項２３】
配列番号１６を含む遺伝的切断点を有する、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質をコードする合成核酸。
【請求項２４】
ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される前記ＥＧＦＲタンパク質の前記チロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
セプチンタンパク質のコイルドコイルドメインを含むポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）タンパク質を含むポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
カリン関連ＮＥＤＤ化解離（ＣＡＮＤ）タンパク質を含むポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
前記融合タンパク質が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質である、請求項２４に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２９】
前記ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質がＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４である、請求項２８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３０】
前記ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質がＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１である、請求項２８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３１】
前記ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質が、配列番号１、３、または５のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３２】
前記ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質が、配列番号１３、１５、または１７のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３３】
前記ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質が、配列番号７、９、または１１のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３４】
ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、対象における融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させる組成物であって、前記融合タンパク質の阻害剤を含む薬学的に許容可能な担体と混合されている組成物。
【請求項３５】
前記阻害剤が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質、若しくはその断片に特異的に結合する抗体；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、若しくはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＣＡＮＤタンパク質はＣＡＮＤ１である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＳＥＰＴタンパク質はＳＥＰＴ１４である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子が、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
有効量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象における遺伝子融合に関連する癌の治療方法。
【請求項４０】
有効量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象における固形腫瘍の増殖の減少方法であって、前記阻害剤が前記固形腫瘍のサイズを減少させる方法。
【請求項４１】
遺伝子融合に関連する癌を有する対象における細胞増殖を減少させる方法であって、有効量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記阻害剤が細胞増殖を減少させる前記方法。
【請求項４２】
前記遺伝子融合に関連する癌が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む、請求項３９及び４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記固形腫瘍が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＥＧＦＲ融合が、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質を含む、請求項３９、４０、または４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である、請求項３９、４０、または４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記阻害剤が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質、若しくはその断片に特異的に結合する抗体；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、若しくはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；またはその組み合わせを含む、請求項３９、４０、または４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子が、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、またはその組み合わせを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対象からのサンプルがＥＧＦＲ融合の存在を示すかどうかを測定するための診断キットであって、ＥＧＦＲ融合、またはその一部と特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドが、１セットの核酸プライマーまたはインサイチュウハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、またはその組み合わせを含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
ＥＧＦＲ融合が存在する場合にのみ、前記プライマーがポリメラーゼ反応を刺激する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記測定が、遺伝子配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅、遺伝子発現分析、またはその組み合わせを含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５４】
対象からのサンプルがＥＧＦＲ融合タンパク質の存在を示すかどうかを測定する診断キットであって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７を含むＥＧＦＲ融合タンパク質に特異的に結合する抗体を含み、ＥＧＦＲ融合タンパク質が存在する場合にのみ、前記抗体が前記タンパク質を認識する、キット。
【請求項５５】
前記融合タンパク質はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
ヒト対象におけるＥＧＦＲ融合の存在の検出方法であって、
（ａ）前記ヒト対象からの生体サンプルを得ること、および
（ｂ）ＥＧＦＲ融合が前記対象に存在するかどうかを検出すること、
を含む、方法。
【請求項５７】
前記検出が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１７に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１７に対する抗体を用いるウエスタンブロット、質量分析、等電点分離法、またはその組み合わせによりＥＧＦＲ融合タンパク質レベルを測定することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ヒト対象におけるＥＧＦＲ融合の存在の検出方法であって、
（ａ）前記ヒト対象からの生体サンプルを得ること、および
（ｂ）前記対象におけるＥＧＦＲ融合タンパク質をコードする核酸配列が存在するかどうかを検出すること、
を含む、方法。
【請求項５９】
前記核酸配列が、配列番号２、４、８、１０、１４、１６のいずれか１つを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記検出が、ＥＧＦＲ融合を検出するためのハイブリダイゼーション、増幅、または配列決定法を用いることを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記増幅が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９を含むプライマーを用いる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記融合タンパク質が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記融合タンパク質が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質を含む、請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９３，０８６号の利益及び優先権を主張し、その内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に挙げられるすべての特許、特許出願及び刊行物は、それらの全体において参照によりここに組み込まれる。それらの全体におけるそれらの刊行物の開示は、本願の中に参照によりここに組み込まれる。
【０００３】
本特許出願の開示は、著作権保護に供されるものを含む。著作権の保有者は、米国特許商標庁に掲載されるまたは記録される特許文献または特許の開示の何者かによる複製に対する異議を有しないが、一方、あらゆる及びすべての著作権を確保する。
【０００４】
政府援助
本発明は、米国国立がん研究所から認可番号Ｒ０１ＣＡ１０１６４４のもとに、政府援助によりなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
多形膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も一般的な脳癌の形態であり、全てのヒト癌のなかで最も不治で致命的である。現在の治療のスタンダードは、外科手術、化学療法、及び放射線治療を含む。しかしながら、ＧＢＭの予後は一様に乏しいままである。可能な標的療法はわずかであり、特異的にＧＢＭを標的とするものはない。
【０００６】
ＥＧＦＲ遺伝子融合を伴い、ＥＧＦＲキナーゼ活性の標的化抑制から恩恵を受けるＧＢＭ患者の標的母集団は、世界的に１年あたり６，０００人の患者に相当すると予想される。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的に、ＧＢＭにおいて高く発現されたクラスの遺伝子融合の発見によるものであり、セプチン−１４のようなセプチンタンパク質のコイルドコイルドメインに、ＥＧＦＲ遺伝子のレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ドメインを結合し、またはホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）タンパク質を含むポリペプチド若しくはカリン関連ＮＥＤＤ化解離（Cullin−associated and neddylation−dissociated）（ＣＡＮＤ）タンパク質を含むポリペプチドに融合される。本発明は、少なくとも部分的に、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合、及びＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合が、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の標的化抑制から恩恵を受けるＧＢＭ患者のサブセットを識別することの発見によるものである。神経膠芽腫患者におけるＥＧＦＲ遺伝子の融合の識別は、有用な治療標的である。
【０００８】
本発明の一態様は、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される、前記ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【０００９】
本発明の一態様は、セプチンタンパク質のコイルドコイルドメインを含むポリペプチドに５’を融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記セプチンタンパク質は、セプチン−１、セプチン−２、セプチン−３、セプチン−４、セプチン−５、セプチン−６、セプチン−７、セプチン−８、セプチン−９、セプチン−１０、セプチン−１１、セプチン−１２、セプチン−１３、またはセプチン−１４である。別の実施形態では、前記セプチンタンパク質はセプチン−１４（ＳＥＰＴ１４）である。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１０】
本発明の一態様は、ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）タンパク質を含むポリペプチドに５’を融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に関する。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１１】
本発明の一態様は、カリン関連ＮＥＤＤ化解離（ＣＡＮＤ）タンパク質を含むポリペプチドに３’を融合される、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記ＣＡＮＤタンパク質はＣＡＮＤ１、ＣＡＮＤ２、またはＣＡＮＤ３である。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１２】
本発明の一態様は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４が、ヒト７番染色体に配置されるＳＥＰＴ１４のエクソン７〜１０の組み合わせに対して５’をスプライスされるヒト７番染色体ｐ１１．２に配置されるＥＧＦＲのエクソン１〜２５の組み合わせを含み、遺伝的切断点が、ＥＧＦＲのエクソン１〜２５のいずれか１つ及びＳＥＰＴ１４のエクソン７〜１０のいずれか１つで生じる、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４核酸によりコードされる精製融合タンパク質に関する。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１３】
本発明の一態様は、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨが、ヒト７番染色体ｐ１１．２に配置されるＰＳＰＨのエクソン１〜１０の組み合わせに対して、５’をスプライスされるヒト７番染色体ｐ１２に配置されるＥＧＦＲのエクソン１〜２５の組み合わせを含み、遺伝的切断点が、ＥＧＦＲのエクソン１〜２５のいずれか１つ及びＰＳＰＨのエクソン１〜１０のいずれか１つで生じる、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ核酸によりコードされる精製融合タンパク質に関する。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１４】
本発明の一態様は、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１が、ヒト１２番染色体ｑ１４に配置されるＣＡＮＤ１のエクソン１〜１６の組み合わせに対して、３’をスプライスされるヒト７番染色体ｐ１２に配置されるＥＧＦＲのエクソン１〜２５の組み合わせを含み、遺伝的切断点が、ＥＧＦＲのエクソン１〜２５のいずれか１つ及びＣＡＮＤ１のエクソン１〜１６のいずれか１つで生じる、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１核酸によりコードされる精製融合タンパク質に関する。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１５】
本発明の一態様は、上記の前記ＥＧＦＲ融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００１６】
本発明の一態様は、配列番号１または５を含む、精製されたＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１７】
本発明の一態様は、配列番号４を含む遺伝的切断点を有する、精製されたＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質に関する。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１８】
本発明の一態様は、配列番号７または１１を含む、精製されたＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質に関する。別の実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号９を含む遺伝的切断点を有する、精製されたＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００２０】
本発明の一態様は、配列番号１３または１７を含む、精製されたＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００２１】
本発明の一態様は、配列番号１５を含む遺伝的切断点を有する、精製されたＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質に関する。一実施形態では、前記精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を実質的に含まない。
【００２２】
本発明の一態様は、配列番号２を含む、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００２３】
本発明の一態様は、配列番号４を含む遺伝的切断点を有する、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００２４】
本発明の一態様は、配列番号８を含む、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００２５】
本発明の一態様は、配列番号１０を含む遺伝的切断点を有する、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００２６】
本発明の一態様は、配列番号１４を含む、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００２７】
本発明の一態様は、配列番号１６を含む遺伝的切断点を有する、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質をコードする合成核酸に関する。
【００２８】
本発明の一態様は、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される前記ＥＧＦＲタンパク質の前記チロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。一実施形態では、前記融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質である。別の実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４である。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質は、配列番号１、３、または５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１である。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質は、配列番号１３、１５、または１７のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
本発明の一態様は、セプチンタンパク質のコイルドコイルドメインを含むポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。別の実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４である。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質は、配列番号１、３、または５のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明の一態様は、ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）タンパク質を含むポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質は、配列番号７、９、または１１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明の一態様は、カリン関連ＮＥＤＤ化解離（ＣＡＮＤ）タンパク質を含むポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１である。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質は、配列番号１３、１５、または１７のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の一態様は、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される、前記ＥＧＦＲタンパク質の前記チロシンキナーゼドメインを含む、対象における融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させる組成物であって、前記融合タンパク質の阻害剤を含む薬学的に許容可能なキャリアの混合剤における前記組成物に関する。一実施形態では、前記阻害剤が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質、若しくはその断片に特異的に結合する抗体；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、若しくはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；またはその組み合わせを含む。別の実施形態では、前記ＣＡＮＤタンパク質はＣＡＮＤ１である。さらなる実施形態では、前記ＳＥＰＴタンパク質はＳＥＰＴ１４である。いくつかの実施形態では、前記ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する前記小分子が、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、またはその組み合わせを含む。
【００３３】
本発明の一態様は、有効な量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象における遺伝子融合に関連する癌を治療する方法に関する。一実施形態では、前記遺伝子融合に関連する癌が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ融合が、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される前記ＥＧＦＲタンパク質を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である。一実施形態では、前記阻害剤が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質、若しくはその断片に特異的に結合する抗体；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、若しくはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；またはその組み合わせを含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する前記小分子が、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、またはその組み合わせを含む。
【００３４】
本発明の一態様は、有効な量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象における固形腫瘍の増殖を減少させる方法であって、前記阻害剤が前記固形腫瘍のサイズを減少させる前記方法に関する。一実施形態では、前記対象が遺伝子融合に関連する癌を患う。一実施形態では、前記遺伝子融合に関連する癌が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。一実施形態では、前記固形腫瘍が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ融合が、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される前記ＥＧＦＲタンパク質を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である。一実施形態では、前記阻害剤が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質、若しくはその断片に特異的に結合する抗体；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、若しくはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；またはその組み合わせを含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する前記小分子が、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、またはその組み合わせを含む。
【００３５】
本発明の一態様は、遺伝子融合に関連する癌を患う対象における細胞増殖を減少させる方法であって、有効な量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記阻害剤が細胞増殖を減少させる前記方法に関する。一実施形態では、前記遺伝子融合に関連する癌が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ融合が、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合される前記ＥＧＦＲタンパク質を含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である。一実施形態では、前記阻害剤が、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質、若しくはその断片に特異的に結合する抗体；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、若しくはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤを特異的に標的とするｓｉＲＮＡ；またはその組み合わせを含む。一実施形態では、前記ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する前記小分子が、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、またはその組み合わせを含む。
【００３６】
本発明の一態様は、対象からのサンプルがＥＧＦＲ融合の存在を示すかどうかを測定するための診断キットであって、ＥＧＦＲ融合、またはその一部と特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む前記キットに関する。一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドが、１セットの核酸プライマーまたはインサイチュウハイブリダイゼーションプローブを含む。別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、またはその組み合わせを含む。さらなる実施形態（ｅｍｎｂｏｄｉｍｅｎｔ）では、ＥＧＦＲ融合が存在する場合にのみ、前記プライマーがポリメラーゼ反応を刺激する。いくつかの実施形態（ｅｍｄｏｉｍｅｎｔ）では、前記融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である。他の実施形態では、前記測定が、遺伝子配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅、遺伝子発現分析、またはその組み合わせを含む。
【００３７】
本発明の一態様は、対象からのサンプルがＥＧＦＲ融合タンパク質の存在を示すかどうかを測定する診断キットであって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７を含むＥＧＦＲ融合タンパク質に特異的に結合する抗体を含み、ＥＧＦＲ融合タンパク質が存在する場合にのみ、前記抗体が前記タンパク質を認識する前記キットに関する。一実施形態では、前記融合タンパク質はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である。一実施形態では、前記対象は、遺伝子融合に関連する癌を患う。一実施形態では、前記遺伝子融合に関連する癌が、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。
【００３８】
本発明の一態様は、ヒト対象におけるＥＧＦＲ融合の存在を検出する方法に関する。前記方法は、前記ヒト対象からの生体サンプルを得ることと、ＥＧＦＲ融合が前記対象に存在するかどうかを検出することとを含む。一実施形態では、前記検出が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に対する抗体を用いるウエスタンブロット、質量分析、等電点分離法、またはその組み合わせによりＥＧＦＲ融合タンパク質レベルを測定することを含む。
【００３９】
本発明の一態様は、ヒト対象におけるＥＧＦＲ融合の存在を検出する方法に関する。前記方法は、ヒト対象からの生体サンプルを得ることと、前記対象におけるＥＧＦＲ融合タンパク質をコードする核酸配列が存在するかどうかを検出することとを含む。一実施形態では、前記核酸配列が、配列番号２、４、８、１０、１４、及び１６のいずれか１つを含む。別の実施形態では、前記検出が、ＥＧＦＲ融合を検出するためのハイブリダイゼーション、増幅、または配列決定法を用いることを含む。さらなる実施形態では、前記増幅が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９を含むプライマーを用いる。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合タンパク質である。
【００４０】
ＰＣＴ特許出願の要件に従うために、本明細書に示される多くの図面は、もとはカラーで作成された画像の白黒表示である。以下の説明及び実施例では、カラーのプロット及び画像が、その白黒で示されるものに関して記載される。もとのカラーのバージョンは、（ネイチャージェネティックス誌のウェブサイトで利用できるマニュスクリプトのオンラインバージョンで利用できる付随的な追加情報を含む）Frattini et al.,(2013)Nature Genetics,45(10):1141−49でみることができる。ＰＣＴの目的のために、付随的な「追加情報」を含むFrattini et al.,(2013)Nature Genetics, 45(10):1141−49の内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌによる３つのカテゴリのそれぞれの最上位にスコア付けされる確認されたＧＢＭ遺伝子のクロモソームビューである。プロットは、有意なコピー数の変更なしに変異した遺伝子を示す（Ｍｕｔ、変異％、変異の頻度）。これまでに知られるＧＢＭ遺伝子は緑（白黒画像ではライトグレー）で示され、新たに単独で確認されたＧＢＭ遺伝子は赤（白黒画像ではダークグレー）で示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌによる３つのカテゴリのそれぞれの最上位にスコア付けされる確認されたＧＢＭ遺伝子のクロモソームビューである。プロットは、局所性的及び再発的増幅の領域における変異した遺伝子を示す（Ａｍｐ−Ｍｕｔ、増幅／変異スコア）。これまでに知られるＧＢＭ遺伝子は緑（白黒画像ではライトグレー）で示され、新たに単独で確認されたＧＢＭ遺伝子は赤（白黒画像ではダークグレー）で示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌによる３つのカテゴリのそれぞれの最上位にスコア付けされる確認されたＧＢＭ遺伝子のクロモソームビューである。プロットは、局所性的及び再発的欠失の領域における変異した遺伝子を示す（Ｄｅｌ−Ｍｕｔ、欠失／変異スコア）。これまでに知られるＧＢＭ遺伝子は緑（白黒画像ではライトグレー）で示され、新たに単独で確認されたＧＢＭ遺伝子は赤（白黒画像ではダークグレー）で示される。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜Ｂは、ＬＺＴＲ−１における変更された残余の局所化（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。図２Ａは、ＬＺＴＲ−１及びＦｌａｇ−Ｃｕｌ３野生型（ＷＴ）を発現するベクターにより遺伝子導入された２９３Ｔ細胞由来のライセートを示し、Ｆｌａｇ−Ｃｕｌ３−ドミナントネガティブ（ＤＮ）または空のベクターは、Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降され、示される抗体でウエスタンブロットによりアッセイされた。＊、非特異的バンド；左のブラケットはＣｕｌ３ポリペプチドを示す。分子量は、右に示される。図２Ｂは、推定結合部位に結合されたＣｕｌ３のＮ末端ドメイン（白）を有するＬＺＴＲ−１のＫｅｌｃｈ（緑；リボンダイヤグラムの左側の白黒画像におけるグレー）、ＢＴＢ（シアン；（リボンダイヤグラムの中央及び右側の白黒画像におけるライトグレー）及びＢＡＣＫ（紫；リボンダイヤグラムの中央及び右側の白黒画像におけるダークグレー）ドメインの相同性モデルを示す。ＧＢＭ変異は、赤で示される（白黒画像におけるダークグレー；リボンダイヤグラムの左側）。
【図２Ｃ】Ｋｅｌｃｈのβ−プロペラドメイン由来の６つのブレードの配列アラインメント。各ブレードは、ａ、ｂ、ｃ、ｄで標識された４つのコアβストランドを含む。保存残余はグレーでハイライトされ、ＧＢＭで変異された残余は赤で示される。ブレード５及び６の端部の挿入は、ブラケットで示される。
【００４２】
【図３Ａ−Ｂ】Ｃ・・・Ｄ・の欠損は、ＧＢＭの間充織を形質転換させる。３ａ、δ−カテニン抗体を用いるヒト大脳皮質の蛍光免疫染色（赤、左のパネル）；核はＤａｐｉにより対比染色される（青、右のパネル）。３ｂ、δ−カテニン抗体（赤）を用いる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）におけるヒトプライマリＧＢＭの蛍光免疫染色；核はＤａｐｉにより対比染色される（青）。代表的なδ−カテニン−陽性及び陰性腫瘍はそれぞれ、左及び右パネルに示される。
【図３Ｃ−Ｄ】Ｃ・・・Ｄ・の欠損は、ＧＢＭの間充織を形質転換させる。３ｃ、神経膠腫（青線）の残りと比較した、低ＣＴＮＮＤ２のｍＲＮＡ発現（≦２倍、赤線）を有する神経膠腫患者のカプラン・マイヤー生存分析。３ｄ、神経膠腫（青線）の残りと比較した、低ＣＴＮＮＤ２ｍＲＮＡ発現（≦２倍）及び減少したＣＴＮＮＤ２遺伝子コピー数（≦１）（赤線）を有する神経膠腫患者のカプラン・マイヤー生存分析。
【図３Ｅ−Ｆ】Ｃ・・・Ｄ・の欠損は、ＧＢＭの間充織を形質転換させる。３ｅ、δ−カテニン（四角）を発現するレンチウイルスまたは空のベクターにより形質導入されたＵ８７神経膠腫細胞の増殖率（丸、３回の培養の平均）。３ｆ、δ−カテニンまたは空のベクターを発現する神経膠腫細胞における間充織遺伝子の発現（３回の定量ＲＴ−ＰＣＲの平均）。すべてのエラーバーはＳＤである。＊、ｐ≦０．００５；＊＊、ｐ≦０．００１。
【図３Ｇ−Ｈ】Ｃ・・・Ｄ・の欠損は、ＧＢＭの間充織を形質転換させる。３ｇ、δ−カテニンまたは空のベクターを発現する神経膠腫細胞におけるβＩＩＩ−チューブリン（上のパネル）及びＰＳＤ９５（下のパネル）についての蛍光免疫染色。３ｈ、δ−カテニンまたは空のベクターを発現する神経膠腫細胞における示された抗体を用いるウエスタンブロット。ビンクリンは、ローディングのための対照を示す。
【図４Ａ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４遺伝子融合。分裂の読み取りは、限界点での整列を示す。限界点での予測されるリーディングフレームは、上に、ＥＧＦＲ配列を青で、ＳＥＰＴ１４を赤で示される。アミノ酸配列（上）は配列番号１である；ヌクレオチド配列（下）は配列番号２である。
【図４Ｂ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４遺伝子融合。（左のパネル）、ＧＢＭ由来のｃＤＮＡからのＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４−特異的ＰＣＲ。マーカー、１ｋｂラダー。（右のパネル）、限界点でのリーディングフレームを示すサンガーシーケンシングクロマトグラム（配列番号４）及び陽性サンプルにおける融合タンパク質（配列番号３）の推定上の翻訳。
【図４Ｃ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４遺伝子融合。ＥＧＦＲ−セプチン１４融合タンパク質配列（配列番号５）及び概略図。ＥＧＦＲ及びセプチン１４に対応する領域が、それぞれ、青（図の左側；（白黒画像におけるグレー；配列番号５の「ＭＲＰ…ＶＩＱ」アミノ酸を含む配列）及び赤（図の右側；白黒画像におけるライトグレー；配列番号５の「ＬＱＤ…ＲＫＫ」アミノ酸を含む配列）で示される。融合は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインとセプチン１４のコイルドコイルドメインとを結合する。
【図４Ｄ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４遺伝子融合。ＥＧＦＲエクソン２５のＳＥＰＴ１４のイントロン９とのゲノムの融合。融合ｍＲＮＡにおいて、ＥＧＦＲのエクソン２４は、ＳＥＰＴ１４のエクソン１０に対して５’をスプライスされる。実線の矢印は、ＧＢＭサンプルＴＣＧＡ−２７−１８３７における、融合特異的なＰＣＲ産物を生成する融合ゲノムプライマーの位置を示す。
【００４３】
【図５Ａ】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の発現は悪性表現型を促進し、ＥＧＦＲキナーゼの阻害が生体内でＧＢＭ増殖を遅らせる。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ  Ｖｉｉｉ、ＥＧＦＲ  ＷＴを発現するレンチウイルスまたは空のベクター（３回の培養の平均）により形質導入されたＳＮＢ１９神経膠腫細胞の増殖率。
【図５Ｂ】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の発現は悪性表現型を促進し、ＥＧＦＲキナーゼの阻害が生体内でＧＢＭ増殖を遅らせる。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ  Ｖｉｉｉ、ＥＧＦＲ  ＷＴを発現するレンチウイルスまたは空のベクターにより形質導入されたＳＮＢ１９神経膠腫細胞のミグレーションアッセイ。
【図５Ｃ】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の発現は悪性表現型を促進し、ＥＧＦＲキナーゼの阻害が生体内でＧＢＭ増殖を遅らせる。ｂ（３回の培養の平均）により示される実験についての細胞被覆エリアの定量化。すべてのエラーバーは、ＳＤである。
【図５Ｄ】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の発現は悪性表現型を促進し、ＥＧＦＲキナーゼの阻害が生体内でＧＢＭ増殖を遅らせる。野生型ＥＧＦＲではなく、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４の融合をもたらす神経膠腫患者由来の異種移植における、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による腫瘍増殖の生体内での阻害。Ｔ−Ｃは、薬物処理された及びビヒクル（対照）処理されたマウス間の生存における中央値の差を示す。
【図５Ｅ】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の発現は悪性表現型を促進し、ＥＧＦＲキナーゼの阻害が生体内でＧＢＭ増殖を遅らせる。ラパチニブまたはビヒクル（対照）で処理された同じ異種移植についての腫瘍増殖の動態。すべてのエラーバーは、ＳＤである。
【００４４】
【図６】図６は、全てのエキソームデータからの置換の分布を示す。
【図７】図７は、変異部位におけるジヌクレオチド分布を示す。
【図８】選択されたＬＺＴＲ−１オルソログの配列アラインメント。ＧＢＭで検出された変異は、整列された配列の上に赤で示される。ＬＺＴＲ−１遺伝子は、最も古代に生存する後生動物系統１７として遺伝子的に認識される、海綿Ａｍｐｈｉｍｅｄｏｎ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃａを含む、最も後生の動物に存在する。ＬＺＴＲ−１は、また、Ｃａｐｓａｓｐｏｒａ  ｏｗｃｚａｒｚａｋｉ（図面に含まれる）を含むいくつかの近後生動物単細胞の原生生物、及び襟鞭毛虫のＳａｌｐｉｎｇｏｅｃａ  ｒｏｓｅｔｔａ及びＭｏｎｏｓｉｇａ  ｂｒｅｖｉｃｏｌｌｉｓに存在する。これらのオピストコンタは、動物における多細胞性、分化、及び細胞間の連絡の研究の発展のために重要な生物であり、癌１８における分子経路の役割の理解を補助する。ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−Ｋｅｌｃｈタンパク質８とは異なり、ＬＺＴＲ−１は、特徴的なＫｅｌｃｈ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン構造を有し、その外観から、もしあっても、ＬＺＴＲ−１遺伝子の重複がほとんどない。その名前に関わらず、ＬＺＴＲ−１はロイシンジッパー領域を含まない。
【図９】ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインの配列アラインメント。ＬＺＴＲ−１の２つのＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインは、ＨＨｐｒｅｄ６からの予測される二次構造とともに含まれる。３−ｂｏｘは、ＢＡＣＫドメイン内のＣｕｌ３結合エレメントである。ＫＬＨＬ３（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＨＸＩ）、ＫＬＨＬ１１（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＡＰ２）及びＧｉｇａｘｏｎｉｎ（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＨＶＥ）の二次構造は、結晶構造に基づく。ＳＰＯＰの二次構造は、ＢＴＢ並びにＢＡＣＫドメインの残りからの３−ｂｏｘ領域（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＨＴＭ）及びＨＨｐｒｅｄ予測についての結晶構造に基づく。ＳＰＯＰ及びＬＺＴＲ−１がＢＡＣＫドメインの切断されたバージョンを含むため、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ１１、及びＧｉｇａｘｏｎｉｎからのＢＡＣＫドメインの半分のＮ末端のみが含まれる。
【００４５】
【図１０Ａ】ＧＢＭにおける、体細胞の（ｓｏｍａｔｉｃ）変異、ＣＮＶ、及びＣＴＮＮＤ２の発現のパターン。タンパク質の既知のドメイン構造に関して示されるＣＴＮＮＤ２において同定された体細胞の変異概略図の表示。数字は、δ−カテニンタンパク質のアミノ酸残基を指す。
【図１０Ｂ】ＧＢＭにおける、体細胞の変異、ＣＮＶ、及びＣＴＮＮＤ２の発現のパターン。ＣＴＮＮＤ２の体細胞の欠失。サンプルは、ＣＴＮＮＤ２欠失の局所性によりソートされる。赤−青のスケールでは、白は通常の（二倍体）コピー数に対応し、青は欠失、赤は増加である。
【図１０Ｃ】ＧＢＭにおける、体細胞の変異、ＣＮＶ、及びＣＴＮＮＤ２の発現のパターン。免疫染色により測定される、発現マウスの脳のδ−カテニンの発現のパターン（胎生期の日数１４．５）。δ−カテニンの最も高いレベルは、分化しているニューロンを含む皮質板（ＣＰ）で検出される。ＩＺ、中間ゾーン；ＶＺ／ＳＶＺ脳室ゾーン／脳室下ゾーン；ＬＶ，側脳室。
【図１０Ｄ】ＧＢＭにおける、体細胞の変異、ＣＮＶ、及びＣＴＮＮＤ２の発現のパターン。Ａｔｌａｓ−ＴＣＧＡサンプル由来のＣＴＮＮＤ２のｍＲＮＡ発現分析は、ＣＴＮＮＤ２が間充織サブグループにおいて有意に下方制御されることを示す。緑−赤のスケールでは、黒が中間、緑が下方制御、赤が上方制御である。
【図１１Ａ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ遺伝子融合。分裂の読み取りは、限界点での整列で示される。限界点での予測されるリーディングフレームは、青でＥＧＦＲ配列（白黒画像におけるグレー；「ＳＲＲ．．ＶＩＱ」アミノ酸及び「ＡＧＴ…ＣＡＧ」ヌクレオチドを包含する）及び赤でＰＳＰＨ（白黒画像におけるライトグレー；「ＤＡＦ…ＱＱＶ」アミノ酸及び「ＧＡＴ…ＣＡＡ」ヌクレオチドを包含する）により上に示される。アミノ酸配列（上）は配列番号７であり；ヌクレオチド配列（下）は配列番号８である。
【図１１Ｂ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ遺伝子融合。（左のパネル）、ＧＢＭ由来のｃＤＮＡによるＥＧＦＲ−ＰＳＨＰ特異的ＰＣＲ。マーカー、１ｋｂラダー（右のパネル）、限界点でのリーディングフレーム（配列番号１０）を示すサンガーシーケンシングクロマトグラム及び陽性サンプルにおける融合タンパク質（配列番号９）の推定上の翻訳。
【図１１Ｃ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ遺伝子融合。ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質配列（配列番号１１）及び概略図。ＥＧＦＲ及びＰＳＰＨに対応する領域が青（白黒画像におけるグレー；概略図の左側；配列番号１１の「ＭＲＰ…ＶＩＱ」アミノ酸を含む配列）及び赤（白黒画像におけるライトグレー；概略図の右側；配列番号１１の「ＤＡＦ…ＬＥＥ」アミノ酸を包含する）でそれぞれ示される。融合はＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメイン及びＰＳＰＨの最後の３５のアミノ酸を含む。
【００４６】
【図１２Ａ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１遺伝子融合。分裂の読み取りは限界点での整列で示される。限界点での予測されるリーディングフレームは、青でＮＦＡＳＣ配列（白黒画像におけるグレー；「ＲＶＱ…ＧＥＤ」アミノ酸及び「ＡＧＡ…ＡＴＴ」ヌクレオチドを包含する）及び赤でＮＴＲＫ１（白黒画像におけるライトグレー；「ＹＴＮ…ＶＧＬ」アミノ酸及び「ＡＧＡ…ＡＡＧ」ヌクレオチドを包含する）により上に示される。
【図１２Ｂ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１遺伝子融合。（左のパネル）、ＧＢＭ由来のｃＤＮＡによるＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１特異的ＰＣＲ。マーカー、１ｋｂラダー（右のパネル）、限界点でのリーディングフレームを示すサンガーシーケンシングクロマトグラム及び陽性サンプルにおける融合タンパク質の推定上の翻訳。
【図１２Ｃ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１遺伝子融合。ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１融合タンパク質配列及び概略図。ＮＦＡＳＣ及びＮＴＲＫ１に対応する領域が青で（白黒画像におけるグレー；「ＭＡＲ…ＧＥＤ」アミノ酸を含む配列）及び赤で（白黒画像におけるライトグレー；「ＹＴＮ…ＶＬＧ」アミノ酸を含む配列）それぞれ示される。融合は、ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎの５つのフィブロネクチン−タイプＩＩＩドメインのうち２つ及びＮＴＲＫ１のプロテインキナーゼドメインを含む。
【図１２Ｄ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１遺伝子融合。ＮＦＡＳＣイントロン９とＮＴＲＫ１のイントロン２１とのゲノムの融合。融合ｍＲＮＡにおいて、ＮＦＡＳＣのエクソン２１は、ＮＴＲＫ１のエクソン１０に対して５’をスプライスされる。実線の矢印は、ＧＢＭサンプルＴＣＧＡ−０６−５４１１において融合特異的なＰＣＲ産物を生成する融合ゲノムプライマーの位置を示す。
【図１３】ＲＮＡ配列データから読み取られた深さにより測定される発現を示す。融合事象に関係される遺伝子の領域における非常に高いレベルの発現に留意する。
【００４７】
【図１４Ａ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ遺伝子融合。分裂の読み取りは限界点での整列で示される。限界点での予測されるリーディングフレームは、青でＣＡＮＤ１配列（白黒画像におけるグレー；配列番号１３の「ＴＳＡ…ＬＳＲ」アミノ酸及び配列番号１４の「ＴＴＡ…ＣＡＧ」ヌクレオチドを含む配列）及び赤でＥＧＦＲ（白黒画像におけるライトグレー；配列番号１３の「ＣＴＧ…ＶＧＸ」アミノ酸及び配列番号１４の「ＡＴＣ…ＧＧＣ」ヌクレオチドを含む配列）により上に示される。アミノ酸配列（上）は配列番号１３；ヌクレオチド配列（下）は配列番号１４である。
【図１４Ｂ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ遺伝子融合。（左のパネル）、ＧＢＭ由来のｃＤＮＡによるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ特異的ＰＣＲ。マーカー、１ｋｂラダー（右のパネル）、限界点でのリーディングフレーム（配列番号１５）を示すサンガーシーケンシングクロマトグラム及び陽性サンプルにおける融合タンパク質（配列番号１６）の推定上の翻訳。
【図１４Ｃ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ遺伝子融合。ＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ融合タンパク質配列（配列番号１２）。ＣＡＮＤ１及びＥＧＦＲに対応する領域は、青（白黒画像におけるグレー；配列番号１２の「ＭＡＳ…ＬＳＲ」アミノ酸を含む配列）及び赤（白黒画像におけるグレー；配列番号１２の「ＣＴＧ…ＩＧＡ＊」アミノ酸を含む配列）でそれぞれ示される。
【図１４Ｄ】トランスクリプトームシーケンシング全体により識別されるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ遺伝子融合。ＣＡＮＤ１イントロン４とＥＧＦＲのイントロン１５とのゲノムの融合。融合ｍＲＮＡにおいて、ＣＡＮＤ１のエクソン４は、ＥＧＦＲのエクソン１６に対して５’をスプライスされる。
【図１５】野生型及び変異体ＬＺＴＲ−１のタンパク質安定性とＣｕｌ３との相互作用を示すブロットの写真画像である。Ｍｙｃ−ＬＺＴＲ−１及びＦｌａｇ−Ｃｕｌ３を発現するベクターまたは空のベクターにより遺伝子導入されたＳＦ１８８神経膠腫細胞由来のライセートが、Ｆｌａｇ抗体により免疫沈降され、示される抗体を用いるウエスタンブロットによりアッセイされた。＊、非特異的バンド；矢印の先端はＮＥＤＤ化されたＣｕｌ３を示す。
【００４８】
【図１６Ａ】野生型及び変異体ＬＺＴＲ−１のタンパク質安定性とＣｕｌ３との相互作用を示すブロットの写真画像である。ＧＢＭ関連変異体とＣｕｌ３とＬＺＴＲ−１野生型間の相互作用の試験管内分析。左のパネル、試験管内で翻訳されたＭｙｃ−ＬＺＴＲ−１インプット。右のパネル、試験管内で翻訳されたＭｙｃ−ＬＺＴＲ−１が遺伝子導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から免疫沈降されたＦｌａｇ−Ｃｕｌ３と混合された。結合タンパク質は示される抗体を用いてウエスタンブロットにより分析された。
【図１６Ｂ】野生型及び変異体ＬＺＴＲ−１のタンパク質安定性とＣｕｌ３との相互作用を示すブロットの写真画像である。野生型ＬＺＴＲ−１及びＧＢＭ関連変異体の定常のタンパク質レベル。
【図１６Ｃ】ブロットの写真画像（上）及びグラフ（下）である。上のパネル、ＬＺＴＲ−１野生型またはＲ８１０Ｗ変異体により遺伝子導入された細胞は、示される時間の間シクロヘキサミド（ｃｙｃｌｏｅｘａｍｉｄｅ）で処理された。下のパネル、左パネルにおける実験由来のＬＺＴＲ−１野生型及びＬＺＴＲ−１−Ｒ８１０Ｗタンパク質の定量化。
【図１６Ｄ】野生型及び変異体ＬＺＴＲ−１のタンパク質安定性とＣｕｌ３との相互作用を示すブロットの写真画像である。図１６Ｃに示されるように遺伝子導入された細胞におけるＬＺＴＲ−１野生型及びＬＺＴＲ−１−Ｒ８１０ＷのＲＮＡ発現のセミ定量ＲＴ−ＰＣＲ評価。
【図１７Ａ】ＧＢＭ由来の細胞における、ＬＺＴＲ−１野生型及びＧＢＭ関連変異体の機能的分析を示すグラフである。ＧＳＥＡは、ＬＺＴＲ−１遺伝子における変異をもたらすプライマリヒトＧＢＭにおける神経膠腫細胞の「球状の培養」の表現型と関連される遺伝子の上方制御を示す。［エンリッチメントスコア（ＥＳ）＝０．７５４；Ｐ（ファミリーワイズエラー率，ＦＷＥＲ）＝０．０００ｑ（偽陽性率，ＦＤＲ）＝０．０００］。
【図１７Ｂ】ＧＢＭ由来細胞におけるＬＺＴＲ−１野生型及びＧＢＭ関連変異体の機能的な分析を示すグラフである。スフィア形成アッセイ（左のパネル）及びベクターまたはＬＺＴＲ−１を発現するＧＢＭ由来の神経膠腫球（＃４８）のウエスタンブロット分析（右のパネル）。データは３重サンプルの平均±ＳＤである（ｐ＝０．００３６）。エラーバーは、ＳＤである。
【図１７Ｃ】ベクターまたはＬＺＴＲ−１を発現するＧＢＭ由来の神経膠腫球＃４６を用いる試験管内の限界希釈アッセイの直線回帰プロットである。スフィア形成細胞の頻度は、ベクター及びＬＺＴＲ−１発現細胞において、それぞれ８．４９±１．０４及び１．４４±０．０５％であった（ｐ＝０．００７９５）。各データポイントは、３回の平均を示す。エラーバーは、ＳＤである。
【図１７Ｄ】ＧＢＭ由来細胞におけるＬＺＴＲ−１野生型及びＧＢＭ関連変異体の機能的な分析を示すグラフ及び写真の顕微鏡画像である。左上のパネル、ベクターまたはＬＺＴＲ−１を発現するレンチウイルスによる形質導入後６日目のＧＢＭ由来株４６細胞の明視野顕微鏡写真である。左下のパネル、図１７Ｃにおける実験由来のベクターまたはＬＺＴＲ−１を発現するレンチウイルスを発現するＧＢＭ由来神経膠腫細胞＃４６のスフィアの明視野顕微鏡写真。右のパネル、ｃにおける培養由来の腫瘍スフィアのサイズが培養１４日後に顕微鏡検査レビューにより測定された。各条件について３重にｎ＝６０スフィア。データは平均±ＳＤである（ｐ＜０．０００１）。エラーバーは、ＳＤである。
【図１７Ｅ】ベクターまたはＬＺＴＲ−１を発現するＧＢＭ由来細胞＃８４を用いるウエスタンブロット分析の写真画像である。
【図１７Ｆ】ベクター、ＬＺＴＲ−１、ＬＺＴＲ−１−Ｒ８１０Ｗ、またはＬＺＴＲ−１−Ｗ４３７ＳＴＯＰを発現するＧＢＭ由来株８４を用いる試験管内限界希釈アッセイの直線回帰プロットである。スフィア形成細胞の頻度は、ベクターについて７．２±０．９２、ＬＺＴＲ−１野生型について１．４８±０．０９（ｐ＝０．００９６）；ＬＺＴＲ−１−Ｒ８１０Ｗについて７．８２±０．９９（ｐ＝０．２４８９）；及びＬＺＴＲ−１−Ｗ４３７ＳＴＯＰについて６．７４±１．０７（ｐ＝０．２２６９）であった。エラーバーは、ＳＤである。
【００４９】
【図１８Ａ−Ｂ】ニューロンにおけるδ−カテニンの発現及びＧＢＭにおける間充織マーカーを欠損したδ−カテニンを示す写真の顕微鏡検査画像である。図１８Ａは、免疫染色により測定された発育過程の脳におけるδ−カテニンの発現のパターンを示す。δ−カテニン抗体（赤；白黒画像におけるダークグレー（中央））及びβＩＩＩ−チューブリン（緑；白黒画像におけるライトグレー（右））を用いる大脳皮質の二重蛍光免疫染色；核はＤａｐｉ（青；白黒画像におけるグレー（左））により対比染色される。図１８Ｂは、免疫染色により測定された成人の脳におけるδ−カテニンの発現のパターンを示す。上のパネル、δ−カテニン抗体（赤；白黒画像におけるダークグレー（中央））及びＭＡＰ２（緑；白黒画像におけるライトグレー（右））を用いる大脳皮質の二重蛍光免疫染色；核はＤａｐｉ（青；白黒画像におけるグレー（左））により対比染色される。下のパネル、δ−カテニン抗体（赤；白黒画像におけるダークグレー）及びＧＦＡＰ（緑；白黒画像におけるライトグレー）を用いる大脳皮質の二重蛍光免疫染色；核はＤａｐｉ（青；白黒画像におけるグレー）により対比染色される。
【図１８Ｃ】空のベクターまたはδ−カテニン野生型、神経膠腫関連δ−カテニン変異体を発現するＵ８７細胞について示された抗体を用いるウエスタンブロットの写真画像である。ＦＢＮ、フィブロネクチン。ビンクリンはローディングのための対照として示される。
【図１９Ａ−Ｂ】間充織ＧＢＭにおけるδ−カテニンの機能的な分析を示す。図１９Ａは、空のベクターまたはδ−カテニンを発現するレンチウイルスによる感染後４日目の神経膠腫球＃４８におけるフィブロネクチン、コラーゲン−５α１（ＣＯＬ５Ａ１）及び平滑筋アクチン（ＳＭＡ）についての免疫蛍光法の写真の顕微鏡検査画像である。核はＤａｐｉにより対比染色される。図１９Ｂは、ａで処理された培養についてのＳＭＡ、ＣＯＬ５Ａ１及びＦＢＮの蛍光強度の定量化を示す棒グラフである。ｎ＝３は独立した実験、データは平均±ＳＤを示す。
【図１９Ｃ】空のベクターまたはＣＴＮＮＤ２を発現するレンチウイルスにより感染した細胞＃４８におけるβＩＩＩ−チューブリンについての蛍光強度の定量化を示す棒グラフである。
【図１９Ｄ】空のベクターまたはＣＴＮＮＤ２を発現するレンチウイルスにより形質導入された神経膠腫球＃４８におけるβＩＩＩ−チューブリン発現の経時変化の分析を示す写真の顕微鏡検査画像である。βＩＩＩ−チューブリン発現細胞の高度な培養からの欠失に留意する。
【図１９Ｅ−Ｆ】グラフである。図１９Ｅは、ベクターまたはδ−カテニンを発現するＧＢＭ由来の細胞＃４８を用いる試験管内限界希釈アッセイの直線回帰プロットを示す。スフィア形成細胞の頻度は、ベクター及びδ−カテニンについてそれぞれ７．４２±１．１６及び０．８８±０．０２であった（ｐ＝０．００９８）。エラーバーは、ＳＤである。図１９Ｆは、ベクターまたはδ−カテニンを発現するＧＢＭ由来の株４８により脳内に注入されたマウスにおける生物発光画像の縦モード解析を示す。ベクターについてはｎ＝３のマウス、δ−カテニンについいては５。データはフォトンカウントの平均±ＳＥＭである。
【００５０】
【図２０Ａ−Ｅ】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の機能的分析及び神経膠腫増殖でのＥＧＦＲキナーゼの阻害の影響を示す。図２０Ａは、ベクター、ＥＧＦＲ野生型、ＥＧＦＲ  ＶｉｉｉまたはＥＧＦＲ−ＳＥＰ１４融合を発現するＧＢＭ由来初代細胞（＃４８）のＥＧＦの欠如におけるスフィア形成アッセイのグラフである。データは、３重サンプルの平均±ＳＤである（ベクターと比較してＥＧＦＲ−ＳＥＰ１４融合及びＥＧＦＲ  Ｖｉｉｉについてそれぞれｐ＝０．００５１及び０．０２７である。）。図２０Ｂは、ＥＧＦの存在下で培養されたベクター、ＥＧＦＲ  ＶｉｉｉまたはＥＧＦＲ−ＳＥＰ１４融合を発現するＧＢＭ由来初代細胞（＃４８）のウエスタンブロット分析である。図２０Ｃは、４８時間ＥＧＦの非存在下で培養され、その後、示される時間の間、ＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌにより刺激されたベクター、ＥＧＦＲ  ＶｉｉｉまたはＥＧＦＲ−ＳＥＰ１４融合を発現するＧＢＭ由来細胞（＃４８）を示すブロットの写真画像である。細胞は、示される抗体を用いてウエスタンブロットによりアッセイされた。図２０Ｄは、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合遺伝子をもたらすプライマリヒトＧＢＭにおけるＳＴＡＴ３標的遺伝子の上方制御を示すＧＳＥＡのグラフである［エンリッチメントスコア（ＥＳ）＝０．７３８；Ｐ（ファミリーワイズエラー率、ＦＷＥＲ）＝０．０００ｑ（偽陽性率，ＦＤＲ）＝０．０００］。図２０Ｅは、示される濃度で、４８時間ラパチニブにより処理された後のベクター、ＥＧＦＲ野生型、ＥＧＦＲ  ＶｉｉｉまたはＥＧＦＲ−ＳＥＰ１４融合を発現するＧＢＭ由来細胞（＃４８）の生存を示す棒グラフである。データは３重のサンプルの平均±ＳＤである。
【図２１】ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子候補を内部に持つＴＣＧＡサンプルにおける変異の数を示すプロットである。所与の遺伝子Ｇについて、変異Ｍ８の数は、塗りつぶされた丸としてＧを内部に有するサンプルにプロットされた。Ｍ８の平均は、また、アスタリスクとしてプロットされる。全てのＴＣＧＡサンプルにおける変異の数の平均、μ及び標準偏差σを付与するとき、過度に変異された（１１±１．９６＊ａ）サンプルの９５％確信間隔がプロットされ、全てのＧについて、Ｍ８の平均が９５％確信間隔内にうまく収まることを示し、過度に変異されたサンプルにおいてＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子が生じる傾向はないことを論証した。
【図２２Ａ−Ｂ】ＧＢＭにおける、体細胞の変異のパターン、ＣＮＶ及びＣＴＮＮＤ２の発現を示す。図２２Ａは、δ−カテニン抗体を用いる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（赤；白黒画像におけるダークグレー）；核はＤａｐｉにより対比染色される（青；白黒画像におけるグレー）に含まれるヒトプライマリＧＢＭの蛍光免疫染色の写真の顕微鏡検査画像である。２つの代表的なδ−カテニン−陽性及び２つのδ−カテニン−陰性腫瘍は、それぞれ上及び下パネルにおいて示される。図２２Ｂは、ＧＢＭ由来神経膠腫球培養のパネルにおけるδ−カテニンの発現のウエスタンブロット分析である。脳、正常なヒトの脳。矢印の先端はδ−カテニン；アスタリスク、非特異的バンドを示した。ビンクリンはローディングのための対照として示される。
【図２３Ａ−Ｂ】神経膠腫細胞におけるδ−カテニンの発現の影響を示す。図２３Ａは、空のベクターまたはδ−カテニンを発現する神経膠腫細胞における示された抗体を用いるウエスタンブロットである。ビンクリンはローディングのための対照として示される。図２３Ｂは、野生型δ−カテニン、δ−カテニンＧＢＭ由来変異体または空のベクターを発現するレンチウイルスにより形質導入されたＵ８７神経膠腫細胞が蛍光顕微鏡により分析されたことを示す写真の顕微鏡検査画像である。
【図２３Ｃ】神経膠腫細胞におけるδ−カテニンの発現の影響を示す棒グラフである。神経伝達を示す細胞の数がスコア付けされた。少なくとも２００細胞／サンプルが分析された。
【図２３Ｄ】空のベクター（上のパネル）またはＣＴＮＮＤ２（下のパネル）を発現するレンチウイルスにより形質導入された神経膠腫球細胞＃４８により脳内に注入される１つの代表的なマウスについての縦モード生物発光イメージングの写真である。
【００５１】
【図２４】ＥＧＦＲ融合を内部に有するサンプル間でＥＧＦＲ、ＳＥＰＴ１４、及びＰＳＰＨの付近のゲノムの周りの増幅を示すヒートマップである。コピー数は、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ（上の３列）及びＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４（下の６列）を有するサンプルについてｃｈｒ７：５５００００００〜５６５０００００のゲノムの領域にわたるｌｏｇ２率がプロットされた。また、ゲノムの座標がＥＧＦＲ（青；白黒画像におけるダークグレー）、ＳＥＰＴ１４（黄；白黒画像におけるライトグレー）、及びＰＳＰＨ（シアン；白黒画像におけるグレー）についてプロットされる。
【図２５】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合の発現が悪性表現型を促進し、ＥＧＦＲキナーゼの阻害が生体内でＧＢＭ増殖を遅らせることを示すプロットである。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ  Ｖｉｉｉ、ＥＧＦＲ  ＷＴまたは空のベクター（３回の培養の平均）を発現するレンチウイルスにより形質導入されたＵ８７神経膠腫細胞の増殖率。
【図２６】ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合及びＥＧＦＲｖｌｌｌ再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を内部に有するＧＢＭ腫瘍サンプルの異なる発現を示すマップである。発現差異についての統計学的な有意性についてフィルタリングした後に、ＥＧＦＲｖｌｌｌ表現型由来のＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４表現型を特徴づける１０の遺伝子が残った。Ｌｏｇ２発現がヒートマップとしてプロットされた。サンプルは、平均連結法を用いてユークリッド距離により階層的にクラスター化された。このクラスター化は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４サンプル（赤；白黒画像におけるダークグレー；左側の強度のバーの上半分に対応する）及びＥＧＦＲｖｌｌｌサンプル（緑；白黒画像におけるライトグレー；左側の強度のバーの下半分に対応する）間で明らかな分離を示し、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４遺伝子融合の独特な分子サインを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
ＥＧＦＲのＲＴＫコーディングドメインを保持する遺伝子融合はＧＢＭにおける最も頻繁な遺伝子融合事象である。ＥＧＦＲの遺伝子融合は、ＧＢＭ患者の７．６％で生じ、ＲＮＡレベルでの一貫した切断点を伴って融合における３’側の相手としてＳｅｐｔ１４遺伝子が関与することが多い。これによって診断上及び治療上の双方でＥＧＦＲの融合が高度に扱いやすい遺伝子変化になる。一実施形態では、ＥＧＦＲの融合は神経膠腫細胞の増殖能及び移動能を高める。別の実施形態では、ＥＧＦＲの融合はマウス異種移植片として増殖するヒトＧＢＭに対するＥＧＦＲの阻害に感受性も付与する。従って、ＲＴＫコーディング遺伝子を包含する遺伝子融合はＧＢＭの病態形成に関与し、ＥＧＦＲ阻害剤に基づく臨床試験においてＥＧＦＲの融合を抱えるＧＢＭ患者を含めることに強い論理的根拠を提供する。ＥＧＦＲの遺伝子融合を運び得るＧＢＭ患者の標的集団はＥＧＦＲキナーゼ活性の標的とされた阻害から利益を得ることができ、世界中で年間２０，０００人の患者に相当すると推定される（米国では年間約１，０００人）。
【００５３】
多形膠芽腫（ＧＢＭ）は頭蓋内腫瘍の１２〜１５％及び原発性脳腫瘍の５０〜６０％を占める成人の脳腫瘍の最も一般的な形態である。ＧＢＭはヒトの癌で最も致死的な形態の中に入る。癌の標的療法の成功の歴史は、悪性血液腫瘍及び最近では上皮癌の一部における再発性の及び腫瘍形成性の遺伝子融合の不活化に大部分一致する。ＧＢＭはヒトの癌の最も致死的で治癒不能な形態の中にある。ＧＢＭにおける一般的な遺伝子変化に対する標的療法は、それがＧＢＭの本当に依存するようになる癌タンパク質の活性を全身性には撲滅できない可能性が高いので、その疾患の悲惨な臨床転帰を変えることはなかった。結果的に腫瘍形成性の遺伝子融合を創る再発性の染色体再配置はＧＢＭでは見いだされていない。
【００５４】
ＧＢＭはヒトで治療するのに最も困難な癌の形態の中にある（１）。今までのところ、ＧＢＭにて潜在的に重要な腫瘍形成性の標的に対して調べられた治療アプローチは限定された成功を収めているにすぎない（２−４）。腫瘍形成性の融合タンパク質の生成をもたらす再発性の染色体転座はヒトの癌の病態形成における開始する及び依存するようになる事象と見なされるので、癌治療法のための最も望ましい分子標的を提供する（５,６）。再発性の及び腫瘍形成性の遺伝子融合はＧＢＭでは見いだされていない。染色体再配置は悪性血液腫瘍の顕著な特徴であるが、最近それらは固形腫瘍（乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌）のサブセットでも明らかにされている（７,８）。腫瘍がこれらの再配置を持つ患者にとっての重要で上手く行く標的治療介入は、特に転座にキナーゼをコードする遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ）が関与する場合、機能的な遺伝子融合の発見に端を発している（９,１０）。最も一般的な悪性脳腫瘍であるＧＢＭは、治療するのに最も困難な癌の形態の１つのままである。大量のパッセンジャー変異及び大きな領域のコピー数の変化は、神経膠芽腫のドライバー突然変異のランドスケープの限界を暗示している。
【００５５】
ＧＢＭの顕著な特徴は蔓延した染色体不安定性（ＣＩＮ）であり、それは異数性をもたらす（１１）。ＣＩＮ及び異数性は癌の病態形成の初期の事象である（１２）。理論によって束縛されないで、有糸分裂忠実性を標的とする遺伝子変化は有糸分裂の間で染色体の分離ミスに関与し、異数性を生じ得る（１３,１４）。
【００５６】
表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は膜貫通糖タンパク質であり、タンパク質キナーゼスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は表皮増殖因子ファミリーのメンバーのための受容体である。ＥＧＦＲは表皮増殖因子に結合する細胞表面のタンパク質である。タンパク質のリガンドへの結合は受容体の二量体化及びチロシンの自己リン酸化を誘導し、細胞増殖をもたらす。ＥＧＦＲの過剰発現または過剰活性をもたらす突然変異は肺癌、肛門癌及び多形膠芽腫を含む多数の癌に関連している。
【００５７】
ホスホセリンホスファターゼ（ＰＳＰＨ）はＬ−セリン形成における第３の且つ最後の工程に関与する酵素である。それは、Ｌ−ホスホセリンのマグネシウム依存性の加水分解を触媒し、Ｌ−セリンとＬ−ホスホセリンの交換反応にも関与する。このタンパク質の欠乏はＷｉｌｌｉａｍｓ症候群に関連すると考えられる。
【００５８】
単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の参照を含む。
【００５９】
用語「約」は大まかなまたはおおよその領域においておよそを意味するように本明細書で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、それは言及される数値の上下に境界を拡大することによってその範囲を改変する。一般に、用語「約」は２０％の分散によって述べた値の上下に数値を修正するように本明細書で使用される。
【００６０】
ＤＮＡ及びアミノ酸の操作方法及びそれらの精製
本発明の態様の実践は、特に指示されない限り、当該技術の技量の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を採用することができる。そのような技法は文献にて完全に説明されている。たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版．Ｓａｍｂｒｏｏｋ編（２００１），Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．），ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４及び１５５巻（Ｗｕら．編．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃａｎｅｒ及びＷａｌｋｅｒ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。本明細書で引用される特許、特許出願及び参考文献はすべてその全体が参照によって組み入れられる。
【００６１】
当業者は、生化学的手段を介してタンパク質を単離することまたは遺伝子操作法によって当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させることを含むが、これらに限定されない幾つかの方法にてタンパク質を得ることができる。
【００６２】
タンパク質は核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、と同様に相当するＲＮＡの任意の形態を含む）によってコードされる。たとえば、それは遺伝子の組換え核酸によってコードされることができる。本発明のタンパク質は種々の供給源から入手することができ、当該技術で既知の種々の技法に従って作出することができる。たとえば、タンパク質をコードする核酸はＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってまたは天然の供給源からの増幅によって得ることができる。タンパク質はその断片または一部であることができる。タンパク質をコードする核酸は組換えＤＮＡ技術を介して作出することができ、そのような組換え核酸は化学合成、遺伝子操作、酵素法またはそれらの組み合わせを含む従来の技法によって調製することができる。たとえば、本発明の融合タンパク質は、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む。たとえば、融合タンパク質はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質であることができる。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質の例はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４である。一実施形態では、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合ポリペプチドは配列番号１、３または５で示されるアミノ酸配列を有することができる。ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質の例は配列番号７、９または１１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質の例はＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１である。一実施形態では、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合ポリペプチドは配列番号１３、１５または１７で示されるアミノ酸配列を有することができる。
【００６３】
ＥＧＦＲ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋＩＤは１９５６である。たとえば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５２１９（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿００５２２８）；ＮＰ＿９５８４３９（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０１２８２）；ＮＰ＿９５８４４０（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０１２８３）；ＮＰ＿９５８４４１（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０１２８４）を有する４つのアイソフォームがＥＧＦＲについて載せられている。載せられた受入番号を用いて当業者はヌクレオチド及びアミノ酸の配列を容易に入手することができる。
【００６４】
ＳＥＰＴ１４遺伝子のＧｅｎｂａｎｋＩＤは３４６２８８である。ＳＥＰＴ１４のＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号はＮＰ＿９９７２４９（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０７３６６）である。載せられた受入番号を用いて当業者はヌクレオチド及びアミノ酸の配列を容易に入手することができる。
【００６５】
ＰＳＰＨ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋＩＤは５７２３である。ＰＳＰＨのＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号はＮＰ＿００４５６８（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿００４５７７）である。載せられた受入番号を用いて当業者はヌクレオチド及びアミノ酸の配列を容易に入手することができる。
【００６６】
ＣＡＮＤ１遺伝子のＧｅｎｂａｎｋＩＤは５５８３２である。ＣＡＮＤ１のＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号はＮＰ＿０６０９１８（相当するヌクレオチド配列ＮＭ＿０１８４４８）である。載せられた受入番号を用いて当業者はヌクレオチド及びアミノ酸の配列を容易に入手することができる。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「ＥＧＦＲ融合分子」はＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質に相当するポリペプチドをコードする核酸であることができる。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子には、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、配列番号１、３、または５で示されるアミノ酸配列を含むまたは配列番号２または４で示される核酸配列を含むＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合ポリペプチド）；ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合（たとえば、配列番号７、９、または１１で示されるアミノ酸配列を含むまたは配列番号８または１０で示される核酸配列を含む）、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、配列番号１３、１５、または１７で示されるアミノ酸配列を含むまたは配列番号１４または１６で示される核酸配列を含むＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合ポリペプチド）を挙げることができる。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子にはＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５２１９、ＮＰ＿９５８４３９、ＮＰ＿９５８４４０またはＮＰ＿９５８４４１に相当するアミノ酸配列を含むＥＧＦＲ含有の融合を挙げることができる。ＥＧＦＲ融合分子には、表１０に載せた遺伝子のいずれか１つによってコードされるタンパク質に融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを挙げることもできる。ＥＧＦＲ融合分子には、その断片のような上述の例の変異体を挙げることができる。
【００６８】
【表１】
2016515508.tif 000003
【表２】
2016515508.tif 000004
【００６９】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、合成または半合成のＤＮＡ、と同様に相当するＲＮＡの形態を含む任意の型の核酸であることができる。ｃＤＮＡはメッセンジャーＲＮＡ鋳型から人工的に合成されたＤＮＡの形態であり、遺伝子クローンを作出するのに使用される。合成ＤＮＡは、細胞性核酸にて見いだすことができ、ヒストン及びメチル化を含むが、これらに限定されない修飾を含まない。たとえば、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸はそのようなタンパク質をコードする組換え核酸を含むことができる。核酸は人工的に創られた（たとえば、配列を組み立てる、切断する、連結するまたは増幅することによって）天然に存在しない核酸であることができる。それは二本鎖または一本鎖であることができる。
【００７０】
本発明はさらにＥＧＦＲ融合分子に対して相補性である核酸を提供する。相補性の核酸はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上述の核酸配列とハイブリダイゼーションすることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定例には、３０℃を上回る、３５℃を上回る、４２℃を超える温度及び／または約５００ｍＭ未満または２００ｍＭ未満の塩濃度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩濃度及び／または他の試薬、たとえば、ＳＤＳまたはＳＳＣの濃度を改変することを介して技量のある熟練者によって調整することができる。
【００７１】
本発明によれば、タンパク質変異体はアミノ酸配列の修飾を含むことができる。たとえば、アミノ酸配列の修飾は、３つの部類：置換変異体、挿入変異体または欠失変異体の１以上に入る。挿入には、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合と同様に単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を挙げることができる。挿入は普通、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合のものよりは小さい、たとえば、１〜４の残基の幅の挿入であろう。欠失はタンパク質配列からの１以上のアミノ酸残基の取り外しを特徴とする。これらの変異体は普通、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異によって調製され、それによって変異体をコードするＤＮＡを作出し、その後、組換え細胞の培養にてＤＮＡを発現させる。
【００７２】
一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子は、たとえば、配列番号２、４、８、１０、１４または１６で示される配列のような、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸配列は配列番号２、４、８、１０、１４または１６に対して約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。別の実施形態では、ポリペプチドは、たとえば、グリコシル化及び／またはアセチル化及び／または化学反応またはカップリングによって修飾することができ、１または数個の非天然のまたは合成のアミノ酸を含有することができる。ＥＧＦＲ融合分子の例は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドであるＥＧＦＲ融合分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に対して約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。別の実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子はＥＧＦＲ融合タンパク質の断片であることができる。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の少なくとも約８の連続するアミノ酸の部分を包含することができる。断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の少なくとも約１０のアミノ酸、少なくとも約２０のアミノ酸、少なくとも約３０のアミノ酸、少なくとも約４０のアミノ酸、少なくとも約５０のアミノ酸、少なくとも約６０のアミノ酸、または少なくとも約７５のアミノ酸を含むことができる。断片には、約８〜約１００のアミノ酸の間の考えられるアミノ酸の長さすべて、たとえば、約１０〜約１００のアミノ酸の間、約１５〜約１００のアミノ酸の間、約２０〜約１００のアミノ酸の間、約３５〜約１００のアミノ酸の間、約４０〜約１００のアミノ酸の間、約５０〜約１００のアミノ酸の間、約７０〜約１００のアミノ酸の間、約７５〜約１００のアミノ酸の間、または約８０〜約１００のアミノ酸の間の長さが含まれる。断片には、約１００〜８００のアミノ酸の間の考えられるアミノ酸の長さすべて、たとえば、約１２５〜８００のアミノ酸の間、約１５０〜８００のアミノ酸の間、約１７５〜８００のアミノ酸の間、約２００〜８００のアミノ酸の間、約２２５〜８００のアミノ酸の間、約２５０〜８００のアミノ酸の間、約２７５〜８００のアミノ酸の間、約３００〜８００のアミノ酸の間、約３２５〜８００のアミノ酸の間、約３５０〜８００のアミノ酸の間、約３７５〜８００のアミノ酸の間、約４００〜８００のアミノ酸の間、約４２５〜８００のアミノ酸の間、約４５０〜８００のアミノ酸の間、約４７５〜８００のアミノ酸の間、約５００〜８００のアミノ酸の間、約５２５〜８００のアミノ酸の間、約５５０〜８００のアミノ酸の間、約５７５〜８００のアミノ酸の間、約６００〜８００のアミノ酸の間、約６２５〜８００のアミノ酸の間、約６５０〜８００のアミノ酸の間、約６７５〜８００のアミノ酸の間、約７００〜８００のアミノ酸の間、約７２５〜８００のアミノ酸の間、約７５０〜８００のアミノ酸の間、または約７７５〜８００のアミノ酸の間の長さが含まれる。
【００７３】
化学合成：
当該技術で既知の化学法を用いてＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸配列を全体でまたは部分的に合成することができる。或いは、そのアミノ酸配列を合成するための化学法を用いて、たとえば、固相法を用いた直接ペプチド合成によって、ポリペプチドを作出することができる。手動の技法を用いて、または自動化によってタンパク質合成を行うことができる。たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて自動化された合成を達成することができる。
【００７４】
任意でポリペプチド断片を別々に合成し、化学法を用いて組み合わせて完全長の分子を作出することができる。たとえば、これらの方法を利用して本発明の融合タンパク質を合成することができる。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む。たとえば、融合タンパク質はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、またはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質であることができる。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質の例はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４である。一実施形態では、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合ポリペプチドは配列番号１、３または５で示されるアミノ酸配列を有することができる。ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質の例は配列番号７、９または１１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質の例はＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１である。一実施形態では、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合ポリペプチドは配列番号１３、１５または１７で示されるアミノ酸配列を有することができる。
【００７５】
ＥＧＦＲ融合分子を得ること、精製すること及び検出すること：
ＥＧＦＲ融合分子またはその変異体をコードする核酸のような核酸によってコードされるポリペプチドは、そのような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを発現するヒト細胞からの精製によって得ることができる。非限定の精製法には、サイズ排除クロマトグラフィ、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ及び分取用ゲル電気泳動が挙げられる。
【００７６】
合成ポリペプチドは、たとえば、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）のような高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を介して実質的に精製することができる。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子のような合成ポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定によって確認することができる。
【００７７】
他の構築物を使用して、可溶性タンパク質の精製を円滑にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に請求される本発明のポリペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を連結することもできる。そのような精製を円滑にするドメインには、不動化された金属上での精製を可能にするヒスチジン／トリプトファン分子のような金属キレートペプチド、不動化された免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸張／親和性精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）で利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインと本発明の核酸によってコードされるポリペプチドとの間で切断可能なリンカー配列（すなわち、因子Ｘａまたはエンテロキナーゼに特異的なもの（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を含めることも精製を円滑にするのに使用することができる。たとえば、技量のある熟練者は、当該核酸と併せて、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼの切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする発現ベクターを使用することができる。ヒスチジン残基は不動化された金属イオンのアフィニティクロマトグラフィによる精製を円滑にする一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨまたはＥＧＦＲを含有する核酸によってコードされるポリペプチドを精製するための手段を提供する。
【００７８】
ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸を含有し、その後それを発現する宿主細胞は、当業者に既知の種々の手順によって特定することができる。これらの手順には、核酸またはタンパク質の検出及び／または定量のための膜、溶液またはチップに基づいた技法を含むＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイまたは免疫アッセイの技法が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸の存在は、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションまたはプローブ若しくはそれをコードする核酸の断片を用いた増幅によって検出することができる。一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子の核酸断片は配列番号２、８または１４の少なくとも約８の連続するヌクレオチドの部分を包含することができる。別の実施形態では、断片は、配列番号２、８または１４の少なくとも約１０の連続するヌクレオチド、少なくとも約１５の連続するヌクレオチド、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド、または少なくとも約３０の連続するヌクレオチドを含むことができる。断片は、約８〜約１００のヌクレオチドの間の考えられるヌクレオチドの長さすべて、たとえば、約１５〜約１００のヌクレオチドの間、または約２０〜約１００のヌクレオチドの間の長さを含むことができる。核酸の増幅に基づくアッセイには、ＥＧＦＲ融合分子核酸をコードする配列またはＥＧＦＲ融合分子核酸から選択されるオリゴヌクレオチドを使用してそのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体を検出することが関与する。
【００７９】
ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸のような核酸によってコードされるポリペプチドの発現を検出する及び測定するためのプロトコールは当該技術で既知である。非限定例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸のような核酸によってコードされるポリペプチド上での２つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を用いた２部位モノクローナルに基づいた免疫アッセイを使用することができ、または競合結合アッセイを採用することができる。
【００８０】
標識法及び抱合法は当業者によって知られており、種々の核酸及びアミノ酸のアッセイで使用することができる。ＥＧＦＲ融合分子のようなタンパク質をコードする核酸配列に関連する配列を検出するために標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲのプローブを作製する方法には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸のような核酸配列を、ｍＲＮＡプローブを作製するためのベクターにクローニングすることができる。そのようなベクターは当該技術で既知であり、市販されており、標識されたヌクレオチド及びたとえば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼの添加によって試験管内でＲＮＡプローブを合成するのに使用することができる。これらの手順は種々の市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ａｎｄ  ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて実施することができる。検出を容易にするのに使用することができる好適なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素及び蛍光剤、化学発光剤または発色剤、と同様に基質、補因子、阻害剤及び／または磁気粒子が挙げられる。
【００８１】
断片は、たとえば、ＥＧＦＲ融合タンパク質のようなタンパク質の断片であることができる。たとえば、ＥＧＦＲ融合の断片は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の少なくとも８の連続するアミノ酸の部分を包含することができる。断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７の少なくとも約１０の連続するアミノ酸、少なくとも約２０の連続するアミノ酸、少なくとも約３０の連続するアミノ酸、少なくとも約４０の連続するアミノ酸、少なくとも約５０の連続するアミノ酸、少なくとも約６０の連続するアミノ酸、少なくとも約７０の連続するアミノ酸、少なくとも約７５の連続するアミノ酸、少なくとも約８０の連続するアミノ酸、少なくとも約８５の連続するアミノ酸、少なくとも約９０の連続するアミノ酸、少なくとも約９５の連続するアミノ酸、少なくとも約１００の連続するアミノ酸、少なくとも約２００の連続するアミノ酸、少なくとも約３００の連続するアミノ酸、少なくとも約４００の連続するアミノ酸、少なくとも約５００の連続するアミノ酸、少なくとも約６００の連続するアミノ酸、少なくとも約７００の連続するアミノ酸、または少なくとも約８００の連続するアミノ酸を含むことができる。断片は、約８〜約１００のアミノ酸の間の考えられるアミノ酸の長さすべて、たとえば、約１０〜約１００のアミノ酸の間、約１５〜約１００のアミノ酸の間、約２０〜約１００のアミノ酸の間、約３５〜約１００のアミノ酸の間、約４０〜約１００のアミノ酸の間、約５０〜約１００のアミノ酸の間、約７０〜約１００のアミノ酸の間、約７５〜約１００のアミノ酸の間、または約８０〜約１００のアミノ酸の間の長さを含む。
【００８２】
細胞の形質移入
当該核酸配列によって形質転換される宿主細胞は、タンパク質の発現及び細胞培養物からのタンパク質の回収に好適な条件下で培養することができる。形質転換された細胞によって産生されるポリペプチドは、使用される配列及び／またはベクターに応じて分泌され得るまたは細胞内に含有され得る。ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸のような核酸配列を含有する発現ベクターは、核酸によってコードされる可溶性ポリペプチド分子の分泌を指示するシグナル配列を含有するように設計することができる。細胞の形質移入及び培養の方法を以下でさらに詳細に記載する。
【００８３】
ベクターのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、たとえば、ＥＧＦＲ融合分子をコードするものを産生させるために、真核発現ベクターを用いて細胞を形質移入することができる。当該技術で既知の方法によって適当な宿主細胞に発現ベクターを導入することを介して、哺乳類細胞は発現ベクター（たとえば、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有するもの）を含有することができる。
【００８４】
所望の方式で、挿入された配列の発現を調節する能力、または核酸によってコードされ、発現されたポリペプチドを処理する能力について宿主細胞株を選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて正しい挿入、折り畳み及び／または機能を促進することもできる。翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的なメカニズムを有する様々な宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３及びＷ１３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確保するために選択することができる。
【００８５】
たとえば、リポフェクチン、微量注入、リン酸カルシウム沈澱または塩化カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ／デキストラン介在性の形質移入、またはエレクトロポレーションのような当該技術で既知の種々の技法を介して細胞に外来性の核酸を導入することができる。近似の電圧及びキャパシタンスにてエレクトロポレーションを実施して当該細胞（たとえば、神経膠腫細胞（細胞系ＳＦ１８８）、神経膠芽腫細胞（細胞系ＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−Ｆ及びＳＨ−Ｎ）、星状細胞等）へのＤＮＡ構築物の侵入を生じる。他の形質移入法には、改変リン酸カルシウム沈殿、ポリブベン沈殿、リポソーム融合、及び受容体介在性の遺伝子送達も挙げられる。
【００８６】
遺伝子操作される細胞は、種々の組織から得られる初代細胞及び二次細胞であることができ、それには培養にて維持し、増殖させることができる細胞型が含まれる。初代細胞及び二次細胞の非限定例には、上皮細胞、神経細胞、内皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、筋肉細胞（たとえば、筋芽細胞）、角化細胞、血液の形成要素（たとえば、リンパ球、骨髄細胞）及びこれらの体細胞型の前駆細胞が挙げられる。
【００８７】
たとえば、パンチ生検または当該初代細胞型の組織供給源を得る他の外科的方法のような当業者に既知の方法によって脊椎動物の組織を得ることができる。一実施形態では、パンチ生検または除去（たとえば、吸引による）を用いて癌細胞（たとえば、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞等）の供給源を得ることができる。たとえば、外植または酵素消化（たとえば、プロナーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ジスパーゼ及びキモトリプシンのような酵素を用いた）のような当該技術で容易に実践される方法を用いて組織から初代細胞の混合物を得ることができる。生検法は、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，４１９，６６１号及びＷＯ２００１／３２８４０にも記載されている。
【００８８】
遺伝子操作された初代細胞または二次細胞が投与される個体から初代細胞を取得することができる。しかしながら、初代細胞は、同種のレシピエントではなくドナーから得ることもできる。細胞は別の種（たとえば、ウサギ、ネコ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウマ、ウシ、トリまたはブタ）から得ることもできる。初代細胞には、組織培養基材（たとえば、フラスコまたはディッシュ）に付着させて増殖するまたは浮遊して増殖する単離されたまたは精製された脊椎動物組織供給源に由来する細胞；組織に由来する外植片に存在する細胞；最初にプレートに入れた前述の細胞型の双方；及びこれらのプレートに入れた細胞に由来する細胞培養浮遊液も挙げることができる。二次細胞は、その後の継代に由来する細胞に加えて、培養基材から取り出される及び再びプレートに入れられるまたは継代される、プレートに入れられた初代細胞であることができる。二次細胞は１回以上継代することができる。これらの初代細胞または二次細胞はＥＧＦＲ融合分子をコードする遺伝子を有する発現ベクターを含有することができる。
【００８９】
細胞培養
培養される宿主細胞に関して種々の培養パラメータを使用することができる。哺乳類細胞に適した培養条件は当該技術で周知であり（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＷＬら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３，５６（２）：２２１−２３４）、または技量のある熟練者が決定することができる（たとえば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．及びＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）を参照のこと）。細胞培養条件は選択される宿主細胞の種類によって異なり得る。市販の培地を利用することができる。培養培地の非限定例には、たとえば、最少必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）；ＨａｍのＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）；ハイクローン細胞培養培地（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）；ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）；及び化学的に定義される（ＣＤ）培地が挙げられ、それらは、たとえば、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）のように種々の細胞型について処方される。
【００９０】
細胞培養培地は、必要に応じてまたは所望に応じて適当な濃度または量で任意の構成成分を含む補完的な構成成分または成分で必要に応じて補完され得る。細胞培養培地溶液は、以下のカテゴリ：（１）普通、グルコースのような炭水化物の形態であるエネルギー源；（２）必須アミノ酸すべて、普通、２０のアミノ酸足すシステインの基本セット；（３）低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の有機化合物；（４）遊離の脂肪酸または脂質、たとえば、リノール酸；及び（５）微量要素の１以上に由来する少なくとも１つの構成成分を提供し、その際、微量要素は、非常に低い濃度、普通、マイクロモルの範囲で必要とされ得る無機化合物または天然に存在する要素として定義される。
【００９１】
培地はまた、以下のカテゴリ：（１）塩、たとえば、マグネシウム塩、カルシウム塩及びリン酸塩；（２）ホルモン及びたとえば、血清、インスリン、トランスフェリン及び表皮増殖因子のような他の増殖因子；（３）タンパク質及び組織加水分解物、たとえば、精製ゼラチン、植物物質または動物副生成物から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物；（４）アデノシン、チミジン及びヒポキサンチンのようなヌクレオシド及び塩基；（５）ＨＥＰＥＳのような緩衝液；（６）ゲンタマイシン及びアンピシリンのような抗生剤；（７）細胞保護剤、たとえば、プルロニックポリオール及び（８）ガラクトースのいずれかに由来する１以上の構成成分によって選択的に補完することもできる。一実施形態では、可溶性因子を培養培地に加えることができる。
【００９２】
本発明で使用することができる哺乳類細胞の培養物は培養される細胞の種類に好適な培地にて調製される。一実施形態では、細胞培養培地は、哺乳類供給源に由来する血清（たとえば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））で補完される以前議論されたものの１つ（たとえば、ＭＥＭ）であることができる。別の実施形態では、培地は宿主細胞の増殖を持続させるように調整された培地であることができる。
【００９３】
三次元培養は、寒天（たとえば、Ｇｅｙの寒天）、ヒドロゲル（たとえば、マトリゲル、アガロース等；Ｌｅｅら、（２００４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２５：２４６１−２４６６）または架橋されるポリマーから形成することができる。これらのポリマーは天然のポリマー及びその誘導体、合成ポリマー及びその誘導体、またはそれらの組み合わせを含むことができる。天然のポリマーはアニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、両親媒性ポリマーまたは中性ポリマーであることができる。アニオン性ポリマーの非限定例には、ヒアルロン酸、アルギン酸（アルギン酸塩）、カラーギーナン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸及びペクチンを挙げることができる。カチオン性ポリマーの一部の例には、キトサンまたはポリリジンが挙げられるが、これらに限定されない（Ｐｅｐｐａｓら，（２００６）、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１８：１３４５−６０；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００２）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４３：３−１２；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００１）、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４４：６２−７３）。両親媒性ポリマーの例には、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン及びカルボキシメチルキチンを挙げることができるが、これらに限定されない。中性ポリマーの非限定例には、デキストラン、アガロースまたはプルランを挙げることができる（Ｐｅｐｐａｓら，（２００６）、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１８：１３４５−６０；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００２）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４３：３−１２；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００１）、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４４：６２−７３）。
【００９４】
培養される細胞は、たとえば、プラスミドのような導入された発現ベクターを有することができる。発現ベクター構築物は形質転換、微量注入、形質移入、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたは感染を介して導入することができる。発現ベクターは、発現及び産生のためのタンパク質をコードするコーディング配列またはその一部を含有することができる。当業者に周知で当業者によって実践される方法を用いて、産生されるタンパク質及びポリペプチド、と同様に適当な転写及び翻訳の制御要素をコードする配列を含有する発現ベクターを生成することができる。これらの方法には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙにて記載されている合成法、試験管内組換えＤＮＡ法、及び生体内遺伝子組換えが挙げられる。
【００９５】
ＥＧＦＲ融合分子阻害剤
本発明は、対象にてＥＦＧＲ／ＥＧＦＲ融合分子の発現レベルまたは活性を低下させる化合物の使用方法を提供する。加えて、本発明は遺伝子融合に関連する癌の治療のための化合物の使用方法を提供する。一実施形態では、遺伝子融合に関連する癌は多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌または結腸直腸癌を含む。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「ＥＧＦＲ融合分子阻害剤」は本発明のＥＧＦＲ融合分子と相互作用し、その活性及び／またはその発現を調節する化合物を指す。たとえば、化合物はＥＧＦＲ融合分子の活性または発現を低下させることができる。化合物はＥＧＦＲ融合分子の拮抗剤（たとえばＥＧＦＲ融合分子阻害剤）であることができる。ＥＧＦＲ融合分子阻害剤の一部の非限定例には、ペプチド（たとえば、ＥＧＦＲ融合分子、またはその抗体または断片を含むペプチド断片）、小分子及び核酸（たとえば、ＥＧＦＲ融合分子を含む核酸に特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。ＥＧＦＲ融合分子の拮抗剤はＥＧＦＲ融合分子の活性の量または持続時間を低下させる。一実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲタンパク質（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ（たとえば、ＥＦＧＲ−ＳＥＰＴ１４）、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨまたはＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１））のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む。拮抗剤には、ＥＧＦＲ融合分子の活性を低下させるタンパク質、核酸、抗体、小分子、または他の分子が挙げられる。
【００９７】
用語「調節する」は本明細書で現れるとき、ＥＧＦＲ融合分子の活性または発現における変化を指す。たとえば、調節は、ＥＧＦＲ融合タンパク質のようなＥＧＦＲ融合分子のタンパク質活性、結合特性または他の生物学的な機能または免疫的な特性にて低下を引き起こすことができる。
【００９８】
一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子阻害剤はタンパク質自体に結合するＥＧＦＲ融合タンパク質のペプチド断片であることができる。
【００９９】
たとえば、ＥＧＦＲ融合ポリペプチドは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の少なくとも約８の連続するアミノ酸の部分を包含することができる。断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７の少なくとも約１０の連続するアミノ酸、少なくとも約２０の連続するアミノ酸、少なくとも約３０の連続するアミノ酸、少なくとも約４０の連続するアミノ酸、少なくとも約５０の連続するアミノ酸、少なくとも約６０の連続するアミノ酸、少なくとも約７０の連続するアミノ酸、少なくとも約７５の連続するアミノ酸、少なくとも約８０の連続するアミノ酸、少なくとも約８５の連続するアミノ酸、少なくとも約９０の連続するアミノ酸、少なくとも約９５の連続するアミノ酸、少なくとも約１００の連続するアミノ酸、少なくとも約２００の連続するアミノ酸、少なくとも約３００の連続するアミノ酸、少なくとも約４００の連続するアミノ酸、少なくとも約５００の連続するアミノ酸、少なくとも約６００の連続するアミノ酸、少なくとも約７００の連続するアミノ酸、または少なくとも約８００の連続するアミノ酸を含むことができる。断片は、約８〜約１００のアミノ酸の間の考えられるアミノ酸の長さすべて、たとえば、約１０〜約１００のアミノ酸の間、約１５〜約１００のアミノ酸の間、約２０〜約１００のアミノ酸の間、約３５〜約１００のアミノ酸の間、約４０〜約１００のアミノ酸の間、約５０〜約１００のアミノ酸の間、約７０〜約１００のアミノ酸の間、約７５〜約１００のアミノ酸の間、または約８０〜約１００のアミノ酸の間の長さを含む。これらのペプチド断片は商業的に得ることができ、または液相合成法若しくは固相合成法を介して合成することができる（Ａｔｈｅｒｔｏｎら，（１９８９）、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ＥＧＦＲ融合ペプチド断片は、天然の供給源から単離することができ、遺伝子操作することができ、または化学的に調製することができる。これらの方法は当該技術で周知である。
【０１００】
ＥＧＦＲ融合分子阻害剤は、ＥＧＦＲ融合分子に対して向けられた抗体（モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラまたは完全にヒトの）またはその結合断片のようなタンパク質であることができる。抗体断片は、完全長形態以外の抗体の形態であることができ、それには、操作されている抗体断片に加えて、完全長の抗体の範囲内に存在する部分及び成分が挙げられる。抗体断片には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、Ｆｖ、及び（Ｆａｂ’）２、三重特異性抗体、Ｆｃ、Ｆａｂ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、四重特異性抗体、二官能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域等を挙げることができるが、これらに限定されない（Ｍａｙｎａｒｄら，（２０００）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９−７６；Ｈｕｄｓｏｎ（１９９８）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３９５−４０２を参照のこと）。抗体は、商業的に得ることができ、特別注文で生成することができ、または当該技術で確立された方法に従って当該抗原に対して合成することができる（それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，９１４，１２８号、米国特許第５，７８０，５９７号、及び米国特許第５，８１１，５２３号；Ｒｏｌａｎｄ、Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＳｔｅｆａｎ  Ｄｕｅｂｅｌ（編者），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第Ｉ及びＩＩ巻，（２０１０）第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ａｎｔｏｎｙ  Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編者），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（２００９），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｅｎｎｙ  Ｌｏ（編者）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（２００４）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子に向けた抗体は、Ａｂｃａｍ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｂｇｅｎｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ等から商業的に入手することができる。ＥＧＦＲ融合分子に向けたヒト抗体（たとえば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全にヒト抗体またはキメラ抗体）はヒトにおいて使用するための有用な抗体療法であることができる。一実施形態では、抗体またはその結合断片は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に対して向けられる。
【０１０１】
ＥＧＦＲ融合分子をコードするＲＮＡの阻害はＥＧＦＲ融合分子の発現を効果的に調節することができる。阻害剤は、ｓｉＲＮＡ；干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ；ｄｓＲＮＡ；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが転写したＤＮＡ；リボザイム及びＲＮＡ、ＤＮＡまたは人工核酸であり得るアンチセンス核酸を含む群から選択される。
【０１０２】
アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡの分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的とされるｍＲＮＡに結合し、タンパク質の翻訳を妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。たとえば、少なくとも約１５塩基の、ＥＧＦＲ融合分子をコードするＤＮＡ配列の独特の領域に相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、たとえば、従来のホスホジエステル法によって合成することができる（Ｄａｌｌａｓら，（２００６）、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１２（４）：ＲＡ６７−７４；Ｋａｌｏｔａら，（２００６）、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：１７３−９６；Ｌｕｔｚｅｌｂｕｒｇｅｒら，（２００６）、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：２４３−５９）。アンチセンスヌクレオチド配列には、モルフォリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
ｓｉＲＮＡは、約１５〜約５０塩基対、たとえば、約２１〜約２５塩基対を含有し、細胞内で発現される標的の遺伝子またはＲＮＡと同一のまたはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは、標準のワトソン／クリックの塩基対相互作用によって一緒にアニーリングされるセンスＲＮＡ鎖と相補性のアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的のｍｉＲＮＡ分子内に含有される核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。標的のｍＲＮＡ内に含有される標的配列と「実質的に同一である」は、約３％以下標的配列と異なる核酸配列を指す。ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２本の相補性の一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または２つの相補性の部分が塩基対合し、一本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合する単一の分子を含むことができる。その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＭｃＭｎａｕｓ及びＳｈａｒｐ、（２００２）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３：７３７−４７、並びにＳｅｎ及びＢｌａｕ、（２００６）、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２０：１２９３−９９も参照のこと。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡは、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡであることができる。そのような変化には、たとえば、ｓｉＲＮＡの末端若しくはｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、またはｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に耐性にする修飾、またはデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡにおける１以上のヌクレオチドの置換を挙げることができる。ｓｉＲＮＡの一方または双方の鎖は３’オーバーハングも含むことができる。本明細書で使用されるとき、３’オーバーハングは二本鎖ＲＮＡの３’末端から伸張する少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを指す。たとえば、ｓｉＲＮＡは長さ１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）、または長さ１〜約５ヌクレオチド、または長さ１〜約４ヌクレオチド、または長さ約２〜約４ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを含むことができる。たとえば、ｓｉＲＮＡの各鎖はジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含むことができる。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡは化学的に若しくは生物学的に作製することができ、または組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることができる（たとえば、その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，２９４，５０４号及び米国特許第７，４２２，８９６号を参照のこと）。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの分子を作製し、調べるための例となる方法は、その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＧｅｗｉｒｔｚへの米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号、Ｈａｎｎｏｎらへの米国特許第８，０７１，５５９号及びＴｏｌｅｎｔｉｎｏらへの米国特許第７，１４８，３４２号にて記載されている。
【０１０６】
一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子を含むヒト核酸配列に向けられるｓｉＲＮＡは配列番号２、４、８、１０、１４または１６のいずれか１つに対して生成することができる。別の実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子の切断点を含むヒト核酸配列に向けられるｓｉＲＮＡは配列番号４、１０または１６のいずれか１つに対して生成することができる。
【０１０７】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが転写するＤＮＡは、たとえば、Ｕ６プロモータのようなプロモータを含有する。これらのＤＮＡが転写されて細胞にて、アンチセンスＲＮＡとして機能することができるｓｉＲＮＡまたは線状ＲＮＡとして機能することができる小分子ヘアピンＲＮＡを作出することができる。ＥＧＦＲ融合分子阻害剤は、標的ＲＮＡ及び／または遺伝子が阻害されるようにリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または好適な組み合わせを含むことができる。加えて、核酸のこれらの形態は一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖であることができる（たとえば、Ｂａｓｓ（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８；米国特許第６，５０９，１５４号；米国特許出願公開第２００３／００２７７８３号；及びＰＣＴ公報ＷＯ００／０４４８９５、ＷＯ９９／０３２６１９、ＷＯ００／０１８４６、ＷＯ０１／０２９０５８、ＷＯ００／０４４９１４を参照のこと）。
【０１０８】
ＥＧＦＲ融合分子阻害剤は、本明細書で記載されるＥＧＦＲ融合タンパク質に結合し、その機能を崩壊させる小分子であることができる。小分子は一般に低分子量を有する合成の及び天然の物質の多様な群である。それらは、天然の供給源（たとえば、植物、真菌、微生物等）から単離することができ、商業的に得ることができ、及び／またはライブラリー若しくは収集物として利用可能であり、または合成することができる。ＥＧＦＲ融合タンパク質を阻害する候補小分子は、コンピュータによるスクリーニングまたは当該技術で確立された方法に従ったコンビナトリアルライブラリーの高速大量処理（ＨＴＰ）スクリーニングによって特定することができる（たとえば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰｏｔｙｒａｉｌｏら，（２０１１）、ＡＣＳ．Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．１３（６）：５７９−６３３；Ｍｅｎｓｃｈら，（２００９）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９８（１２）：４４２９−６８；Ｓｃｈｎｕｒ（２００８）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．１１（３）：３７５−８０；及びＪｈｏｔｉ（２００７）、Ｅｒｎｓｔ．Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．（３）：１６９−８５を参照のこと）。たとえば、アスピリン、ペニシリン及び多数の化学療法剤のような最も好都合な医薬品は小分子であり、商業的に入手することができ、化学的に合成することができ、または以下で記載されるような無作為ライブラリー若しくはコンビナトリアルライブラリーから入手することができる（たとえば、Ｗｅｒｎｅｒら，（２００６）、Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ、５（１）：３２−６を参照のこと）。
【０１０９】
ＥＧＦＲ融合分子阻害剤の非限定例には、ＥＧＦＲ阻害剤ＡＺＤ４５４７（それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＧａｖｉｎｅら，（２０１２）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７２（８）；２０４５−５６を参照；ＰＣＴ特許出願公報ＷＯ２００８／０７５０６８も参照のこと）；ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＧｕａｇｎａｎｏら，（２０１１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５４：７０６６−７０８３を参照；米国特許出願公開第２００８−０３１２２４８Ａ１号も参照のこと）；ＰＤ１７３０７４（それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＧｕａｇｎａｎｏら，（２０１１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５４：７０６６−７０８３を参照；Ｍｏｈａｍｍａｄｉら，（１９９８）、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：５８９６−５９０４も参照のこと）；ＮＦ４４９（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）カタログ番号４８０４２０；その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＫｒｅｊｃｉ，（２０１０）、ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５（２７）：２０６４４−２０６５３を参照のこと）；ＬＹ２８７４４５５（それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ；Ｚｈａｏら．（２０１１）、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．（１１）：２２００−１０を参照；ＰＣＴ出願公報ＷＯ２０１０１２９５０９も参照のこと）；ＴＫＩ２５８（ドビチニブ）；ＢＩＢＦ−１１２０（インテダニブ−バルガテフ）；ＢＭＳ−５８２６６４（ブリバニブアラニナート）；ＡＺＤ−２１７１（セジラニブ）；ＴＳＵ−６８（オランチニブ）；ＡＢ−１０１０（マシチニブ）；ＡＰ−２４５３４（ポナチニブ）；及びＥ−７０８０（Ｅｉｓａｉによる）が挙げられる。ＥＧＦＲ融合分子阻害剤の非限定例には、阻害剤ＫＨＳ１０１（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｕｒｄａｋら，（２０１０）、ＰＮＡＳ，１０７（３８）：１６５４２−４７）が挙げられる。
【０１１０】
本発明に有用なＥＧＦＲ融合分子阻害剤の構造にはＥＧＦＲ阻害剤ＡＺＤ４５４７、
【化１】
2016515508.tif 000005
ＥＧＦＲ阻害剤ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、
【化２】
2016515508.tif 000006
ＥＧＦＲ阻害剤ＰＤ１７３０７４、
【化３】
2016515508.tif 000007
ＥＧＦＲ阻害剤ＬＹ２８７４４５５、
【化４】
2016515508.tif 000008
及び、ＥＧＦＲ阻害剤ＮＦ４４９（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）カタログ番号４８０４２０）、
【化５】
2016515508.tif 000009
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
他のＥＧＦＲ阻害剤には、
【化６】
2016515508.tif 000010
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明に有用なＥＧＦＲ融合分子阻害剤の構造には、阻害剤ＫＨＳ１０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【化７】
2016515508.tif 000011
【０１１３】
評価及び治療処置
本発明は対象にて固形腫瘍の増殖を低下させる方法を提供する。腫瘍は、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌に関連するが、これらに限定されない。一実施形態では、方法は対象から得られる試料にてＥＧＦＲ融合分子の存在を検出することを含む。一部の実施形態では、試料は、たとえば、抗体、プローブ、核酸プライマー等のようなＥＧＦＲ融合分子に結合する剤と共にインキュベートされる。さらなる実施形態では、方法は、有効量のＥＧＦＲ融合分子阻害剤を対象に投与することを含み、該阻害剤は固形腫瘍のサイズを減らす。
【０１１４】
本発明は、対象にて、たとえば、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌のような、しかし、これらに限定されない遺伝子融合に関連する癌を治療するまたは予防する方法も提供する。一実施形態では、方法は、対象から得られる試料にてＥＧＦＲ融合分子の存在を検出することを含み、融合の存在は遺伝子融合に関連する癌を示し、遺伝子融合に関連する癌に対して必要とする対象に治療処置を投与することを含む。一部の実施形態では、試料は、たとえば、抗体、プローブ、核酸プライマー等のようなＥＧＦＲ融合分子に結合する剤と共にインキュベートされる。
【０１１５】
本発明はまた、それを必要とする対象にて、ＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドに融合されるＥＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質の発現レベルまたは活性を低下させる方法も提供する。一部の実施形態では、方法は対象からの生体サンプルを得ることを含む。一部の実施形態では、試料は、たとえば、抗体、プローブ、核酸プライマー等のようなＥＧＦＲ融合分子に結合する剤と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、方法は、薬学的に許容可能なキャリアと本発明の融合タンパク質の阻害剤の混加物を含む、治療用の量の組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、融合タンパク質の発現レベルまたは活性を測定することを含む。別の実施形態では、方法はさらに、組成物の投与前の融合タンパク質の発現レベルまたは活性と比べて融合タンパク質の発現レベルまたは活性が低下しているかどうかを検出し、それによって融合タンパク質の発現レベルまたは活性を低下させることを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質はＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質またはＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質である。
【０１１６】
請求される方法のそれぞれにおける投与工程は、たとえば、ＥＧＦＲ融合分子阻害剤（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質またはそれらの断片に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物；ＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合タンパク質、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合タンパク質の発現を低下させるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ；ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合遺伝子、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合遺伝子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡ）のような薬剤の投与を含むことができる。一実施形態では、投与される治療分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のアミノ酸配列の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を含み、そのようなタンパク質の発現を低下させる機能を呈するので、遺伝子融合に関連する癌を治療するＥＧＦＲ融合分子のポリペプチドを含む。別の実施形態では、治療分子の投与は、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌に関連する固形腫瘍のサイズを低下させる。さらなる実施形態では、治療分子の投与は、遺伝子融合に関連する癌を患う対象にて細胞増殖を低下させる。
【０１１７】
別の実施形態では、投与される治療分子はＥＧＦＲ融合分子を含むヒトの核酸配列に向けられたｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列番号２、４、８、１０、１４または１６のいずれか１つに向けられる。さらなる実施形態では、投与される治療分子は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に対して向けられる抗体またはその結合断片を含む。一部の実施形態では、投与される治療分子は、たとえば、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、またはＬＹ２８７４４５５のようなＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子を含む。
【０１１８】
ＥＧＦＲ融合分子、たとえば、ＥＧＦＲとＳＥＰＴ、ＰＳＰＨまたはＣＡＮＤとの間の融合はＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで測定することができる。任意で、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、確認に基づくアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、対立遺伝子特異的な増幅アッセイ、微量配列決定アッセイ、融解曲線解析、変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）アッセイ（たとえば、Ｊｏｎｅｓら，（２０００）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０６（６）：６６３−８を参照）、またはそれらの組み合わせを行うことによって検出を判定することもできる。一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ）のすべて若しくは一部の配列決定によって、またはＥＧＦＲ融合分子（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ）のすべて若しくは一部の選択的ハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出を実施する。融合を特定する工程の前に、ＥＧＦＲ融合分子に特異的な増幅（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１）、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨの核酸に特異的な増幅）を実施することができる。
【０１１９】
本発明は遺伝子融合に関連する癌を患う対象にて染色体変化を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、遺伝子融合に関連する癌は、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。一実施形態では、染色体変化は本明細書で記載されるインフレームで融合される転写物、たとえば、ＥＧＦＲ融合分子である。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨをコードする核酸のようなＥＧＦＲ融合分子によって占有される染色体の領域における変化は、単独でまたは種々の組み合わせで、遺伝子座のコーディング領域及び／または非コーディング領域における突然変異、欠失、再構成及び／または挿入の形態であることができる。突然変異は点突然変異を含むことができる。挿入は、遺伝子の遺伝子座のコーディング部分及び／または非コーディング部分における１個または数個の残基の付加を包含することができる。挿入は遺伝子の遺伝子座における１〜５０の塩基対の間の付加を含むことができる。欠失は、たとえば、２残基から遺伝子または遺伝子座全体までのような、遺伝子の遺伝子座のコーディング部分及び／または非コーディング部分における１、２以上の残基の領域を包含することができる。欠失は、さらに大きな欠失も同様に生じ得るが、たとえば、ドメイン（イントロン）または約５０未満の連続する塩基対の反復配列若しくは断片のような小さな領域に影響を及ぼすことができる。再配置は、配列の反転を含む。たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨをコードする核酸のようなＥＧＦＲ融合分子によって占有される染色体の領域における変化は、アミノ酸の置換、ＲＮＡのスプライシング若しくはプロセッシング、産物の不安定性、停止コドンの創製、腫瘍形成性の融合タンパク質の作出、フレームシフト突然変異、及び／または切り詰めたポリペプチドの作出を生じることができる。変化は、変化した機能、安定性、標的化または構造を持つＥＧＦＲ融合分子、たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合をコードする核酸の作出を生じることができる。変化はまたタンパク質の発現で低下、または上昇さえも引き起こすことができる。一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子によって占有される染色体の領域における変化は、たとえば、ＥＧＦＲ融合分子、たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合のようなＥＧＦＲ融合分子の作出を生じる染色体の再配置を含むことができる。この変化はＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで測定することができる。別の実施形態では、検出または測定は、核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅、遺伝子発現の解析またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または測定は、たとえば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出法によるタンパク質発現の解析を含む。
【０１２０】
本発明は、それを必要とする対象にて遺伝子融合に関連する癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、方法は対象から試料を得て、対象におけるＥＧＦＲ融合分子の発現のレベルを測定することを含む。一部の実施形態では、試料は、たとえば、抗体、プローブ、核酸プライマー等のような、ＥＧＦＲ融合分子に結合する剤とともにインキュベートされる。別の実施形態では、検出または測定は、核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅、遺伝子発現の解析またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または測定は、たとえば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出法によるタンパク質発現の解析を含む。一部の実施形態では、方法はさらに対象の発現パターンに基づいてＥＧＦＲ融合分子阻害剤を投与するかどうかを評価することを含む。さらなる実施形態では、方法は対象にＥＧＦＲ融合分子阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、遺伝子融合に関連する癌は、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。
【０１２１】
一実施形態では、本発明は、対象、たとえば、遺伝子融合に関連する癌を患う者にてＥＧＦＲ融合分子の変化したＲＮＡ発現の存在を検出する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は対象におけるＥＧＦＲ融合分子の存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は対象から試料を得て、対象がＥＧＦＲ融合分子を発現するかどうかを判定することを含む。一部の実施形態では、試料は、たとえば、抗体、プローブ、核酸プライマー等のような、ＥＧＦＲ融合分子に結合する剤とともにインキュベートされる。他の実施形態では、検出または測定は、核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、選択的増幅、遺伝子発現の解析またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または測定は、たとえば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出法によるタンパク質発現の解析を含む。一部の実施形態では、方法はさらに対象の発現パターンに基づいてＥＧＦＲ融合分子阻害剤を投与するかどうかを評価することを含む。さらなる実施形態では、方法は対象にＥＧＦＲ融合分子阻害剤を投与することを含む。変化したＲＮＡ発現には、変化したＲＮＡ配列の存在、変化したＲＮＡのスプライシング若しくはプロセッシングの存在、または変化した量のＲＮＡの存在が挙げられる。これらは、ＲＮＡの全部または一部の配列決定を含む当該技術で既知の種々の技法によって、またはＲＮＡの全部または一部の選択的なハイブリダイゼーション若しくは選択的な増幅によって検出することができる。
【０１２２】
さらなる実施形態では、方法は、たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合のようなＥＧＦＲ融合分子の存在または発現を検出することを含むことができる。変化したポリペプチドの発現には、変化したポリペプチド配列の存在、変化した量のポリペプチドの存在、または変化した組織分布の存在が挙げられる。これらは、配列決定及び／または特定のリガンド（たとえば、抗体）への結合を含む当該技術で既知の種々の技法によって検出することができる。一実施形態では、検出することは、ノーザンブロット；リアルタイムＰＣＲ及び配列番号２、４、８、１０、１４若しくは１６に向けられたプライマー；リボヌクレアーゼ保護アッセイ；ハイブリダイゼーション、増幅、または配列番号２、４、８、１０、１４若しくは１６を含むもののようなＥＧＦＲ融合分子を検出するための配列決定法；またはそれらの組み合わせを使用することを含む。別の実施形態では、ＰＣＲプライマーは配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９を含む。さらなる実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子のスクリーニングに使用されるプライマーは配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ融合のゲノム検出に使用されるプライマーは配列番号２６、２７、２８または２９を含む。
【０１２３】
ハイブリダイゼーション、配列決定、増幅及び／または特定のリガンド（たとえば、抗体）への結合を含むが、これらに限定されない、当該技術で既知の種々の技法を用いて変化した遺伝子若しくはＲＮＡの発現、または核酸の配列を検出するまたは定量することができる。他の好適な方法には、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、オリゴヌクレオチドのライゲーション、対立遺伝子特異的な増幅、サザンブロット（ＤＮＡ用）、ノーザンブロット（ＲＮＡ用）、一本鎖高次構造解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、固定変性ゲル電気泳動、変性ＨＬＰＣ、融解曲線解析、ヘテロ二本鎖解析、ＲＮＡ分解酵素保護、化学的または酵素的なミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が挙げられる。
【０１２４】
これらのアプローチの一部（たとえば、ＳＳＣＡ及び一定勾配ゲル電気泳動（ＣＧＧＥ））は変化した配列の存在の結果としての核酸の電気泳動移動度における変化に基づく。これらの技法によれば、変化した配列はゲル上での移動度のシフトによって視覚化される。そのとき、断片を配列決定して変化を確認することができる。一部の他のアプローチは、対象に由来する核酸と野生型または変化した遺伝子若しくはＲＮＡに特異的なプローブとの間での特異的なハイブリダイゼーションに基づく。プローブは懸濁液中にあることができ、または基材上に不動化することができる。プローブを標識してハイブリッドの検出を円滑にすることができる。これらのアプローチの一部、たとえば、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡはポリペプチドの配列または発現レベルを評価するのに向いている。これら後者は、ポリペプチドに特異的なリガンドの使用、たとえば、特異抗体の使用を必要とする。
【０１２５】
ハイブリダイゼーション：
ハイブリダイゼーションの検出方法は、核酸配列の変化を検出するのに役立つ相補性の核酸配列間の特異的なハイブリッドの形成に基づく。検出法には、野生型または変化した遺伝子若しくはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、その後のハイブリッドの存在の検出が関与する。プローブは懸濁液中にあることができ、または基材若しくは支持体（たとえば、核酸のアレイまたはチップの技法）の上に不動化することができる。プローブを標識してハイブリッドの検出を円滑にすることができる。一実施形態では、本発明に係るプローブは配列番号２、４、８、１０、１４または１６に向けられた核酸を含むことができる。たとえば、対象に由来する試料を、ＥＧＦＲ融合分子をコードする遺伝子に特異的な核酸プローブに接触させ、その後、ハイブリッドの形成を評価することができる。一実施形態では、方法は試料をＥＧＦＲ融合分子に特異的であるプローブのセットに同時に接触させることを含む。また、種々の対象に由来する種々の試料を並行して調べることもできる。
【０１２６】
本発明によれば、プローブは、ＥＧＦＲ融合分子に相当する遺伝子またはＲＮＡの標的部分に対して相補性であり、それと特異的にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド配列であることができる。有用なプローブは遺伝子、ＲＮＡまたはその標的部分に相補性であるものである。プローブは長さ８〜１０００のヌクレオチドの間、たとえば、１０〜８００の間、１５〜７００の間、または２０〜５００の間の一本鎖核酸を含むことができる。さらに長いプローブも同様に使用することができる。本発明の有用なプローブは、長さ８〜５００のヌクレオチドの間の一本鎖核酸分子であり、ＥＧＦＲ融合分子に相当する遺伝子またはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。
【０１２７】
プローブの配列は本明細書で提供されるＥＧＦＲ融合遺伝子の配列に由来することができる。プローブの化学的な修飾と同様にヌクレオチドの置換を行うことができる。そのような化学的な修飾を達成してハイブリッド（たとえば挿入基）の安定性を高める、またはプローブを標識することができる。標識の一部の例には限定しないで放射性活性の標識、蛍光標識、発光標識及び酵素標識が挙げられる。
【０１２８】
核酸のハイブリダイゼーションの指針は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），第１−３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，編．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，編．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９３にて見いだされる。
【０１２９】
配列決定：
当該技術で周知の技法を用い、自動シーケンサーを用いて配列決定を行うことができる。完全なＥＧＦＲ融合分子またはその特定のドメインについて配列決定を行うことができる。
【０１３０】
増幅：
増幅は、核酸の複製を開始するのに役立つ相補性の核酸配列間で特定のハイブリッドを形成することに基づく。たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）のような当該技術で既知の種々の技法に従って増幅を行うことができる。市販の試薬及びプロトコールを用いてこれらの技法を実施することができる。当該技術で有用な技法は、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的なＰＣＲ、またはＰＣＲに基づく一本鎖立体構造多形（ＳＳＣＰ）を包含する。増幅は普通、反応を開始するのに特定の核酸プライマーの使用を必要とする。たとえば、ＥＧＦＲ融合分子に相当する配列を増幅するのに有用な核酸プライマーは遺伝子座の標的領域に隣接する遺伝子の遺伝子座の部分と特異的にハイブリダイゼーションすることができる。一実施形態では、増幅は配列番号２、４、８、１０、１４若しくは１６に向けられた順行及び逆行のＰＣＲプライマーを使用することを含む。ＥＧＦＲ融合分子に由来する配列を増幅するのに有用な核酸プライマー；プライマーはＥＧＦＲ融合分子の一部と特異的にハイブリダイゼーションする。特定の対象では、ＥＧＦＲ融合分子の存在は遺伝子融合に関連する癌の対象に対応する。一実施形態では、増幅は配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のヌクレオチド配列を含む順行及び逆行のＰＣＲプライマーを使用することを含むことができる。
【０１３１】
非限定の増幅方法には、たとえば、ポリメラーゼ鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０及びＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，１９９５，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）、Ｇｅｎｅ、８９：１１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈ（１９８９）、ＰＮＡＳ、８６：１１７３）；及び自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）、ＰＮＡＳ、８７：１８７４）；Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｓｍｉｔｈ（１９９７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７−１４９１）、ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｑ−βレプリカーゼ増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ（１９９６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、１０：２５７−２７１）及び他のＲＮＡポリメラーゼが介在する技法（たとえば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ；Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６も参照のこと；米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；及びＳｏｏｋｎａｎａｎ、（１９９５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５６３−５６４）が挙げられる。上記で述べられた参考文献はすべてその全体が参照によって組み入れられる。
【０１３２】
本発明は核酸プライマーを提供し、その際、プライマーは遺伝子融合に関連する癌を有する特定の対象にて、たとえば、核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）のようなＥＧＦＲ融合分子の一部に対して相補性であり、それと特異的にハイブリダイゼーションすることができる。一実施形態では、遺伝子融合に関連する癌は、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌を含む。本発明のプライマーは、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）における融合配列に特異的であることができる。そのようなプライマーを使用することによって、増幅産物の検出はＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合をコードする核酸の融合の存在を示す。本発明のプライマーの例は長さ約５〜６０ヌクレオチド、または長さ約８〜約２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子であることができる。配列は、ＥＧＦＲ融合分子、たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合をコードする核酸の配列に直接由来することができる。完全な相補性は高い特異性を確保するのに有用ではあるが、特定のミスマッチは認容することができる。たとえば、上記で記載されるような核酸プライマーまたは核酸プライマーの対は、対象にて遺伝子融合に関連する癌の存在を検出する方法で使用することができる。一実施形態では、たとえば、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９またはそれらの組み合わせを含むプライマーのようなプライマーを用いてＥＧＦＲ融合分子を検出することができる。
【０１３３】
特異的なリガンド結合：
本明細書で議論されるように、ＥＧＦＲ融合分子をコードする核酸またはＥＧＦＲ融合分子の発現は、それによってコードされるポリペプチドの配列または発現レベルにおける変化をスクリーニングすることによっても検出することができる。たとえば、特異抗体のような異なった型のリガンドを使用することができる。一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体に試料を接触させ、その後、免疫複合体の形成を測定する。たとえば、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）のような、免疫複合体を検出するための種々の方法を使用することができる。
【０１３４】
たとえば、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、と同様に実質的に同一の抗原特異性を有するその断片または誘導体であることができる。断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’２またはＣＤＲの領域が挙げられる。誘導体には、単鎖抗体、ヒト化抗体、または多機能抗体が挙げられる。ＥＧＦＲ融合分子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体は、そのようなポリペプチドを選択的に結合する抗体であることができる。一実施形態では、抗体はＥＧＦＲ融合分子またはエピトープを含有するその断片によってコードされるポリペプチドに対して作られる。他の抗原に向けた非特異的な結合が生じ得るが、標的ポリペプチドへの結合は高い親和性で生じ、非特異的な結合とは確実に識別することができる。一実施形態では、方法は、対象に由来する試料をＥＧＦＲ融合分子に特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の存在を測定することを含むことができる。任意で、ＥＧＦＲ融合分子に特異的な抗体で被覆した支持体に試料を接触させることができる。一実施形態では、試料は、様々な形態のＥＧＦＲ融合分子、たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合）、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ融合（たとえば、ＥＧＦＲ−ＣＡＮＤ１融合）、またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合に特異的な種々の抗体と同時に、並行してまたは順次、接触させることができる。
【０１３５】
本発明はまた、対象に由来する試料にてＥＧＦＲ融合分子の存在を検出するための製品及び試薬を含む診断用キットも提供する。キットは、対象に由来する試料がＥＧＦＲ融合分子の低下した発現を呈するかどうかを測定するのに有用であることができる。たとえば、本発明に係る診断用キットは、プライマー、プライマーの対、核酸プローブ及び／またはリガンド、またはＥＧＦＲ融合分子に特異的に向けられた抗体を含む。本発明にを係る診断用キットはさらに、ハイブリダイゼーション、増幅、または抗原／抗体免疫反応を行うための試薬及び／またはプロトコールを含むことができる。一実施形態では、キットは、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９またはそれらの組み合わせを含むＥＧＦＲ融合分子と特異的にハイブリダイゼーションし、それに由来するポリメラーゼ反応を刺激することができる核酸プライマーを含むことができる。一実施形態では、たとえば、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９またはそれらの組み合わせを含むプライマーのようなプライマーを用いてＥＧＦＲ融合分子を検出することができる。さらなる実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子をスクリーニングするのに使用されるプライマー。
【０１３６】
診断方法は、試験管内で、生体外でまたは生体内で行うことができる。これらの方法はＥＧＦＲ融合分子の状態を評価するために対象に由来する試料を利用する。試料は、対象に由来する任意の生物試料であることができ、それは核酸またはポリペプチドを含有する。そのような試料の例には流体、組織、細胞試料、臓器及び組織の生検が挙げられるが、これらに限定されない。試料の非限定例には血液、肝臓、血漿、血清、唾液、尿または精液が挙げられる。試料は従来の技法に従って、採取され、直接診断に使用され、または保存されることができる。試験のための核酸またはポリペプチドの生体利用効率を提供するまたは改善するために、方法を実施するのに先立って試料を処理することができる。処理には、たとえば、溶解（たとえば、機械的な、物理的なまたは化学的な）、遠心分離が挙げられる。核酸及び／またはポリペプチドは従来の技法によって予備精製しまたは濃縮し、及び／または複雑さを減らすことができる。核酸及びポリペプチドを酵素によってまたは他の化学的な若しくは物理的な処理によって処理し、その断片を生じることもできる。一実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子の存在を評価するために、試料は試薬、たとえばプローブ、プライマー、またはリガンドと接触される。好適な用具、たとえば、プレート、試験管、ウェルまたはガラスにて接触することを実施することができる。一部の実施形態では、接触することは、たとえば、核酸アレイまたは特異的なリガンドアレイのような試薬を被覆した基材上で実施される。基材は、たとえば、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属またはポリマーを含む支持体のような固体基材または半固体基材であることができる。基材は種々の形態及びサイズ、たとえば、スライド、膜、ビーズ、カラムまたはゲルであることができる。接触することは、試薬と試料の核酸またはポリペプチドとの間で形成される複合体に好適な条件下で行うことができる。
【０１３７】
核酸送達法
核酸の生細胞への送達は、ウイルスベクター（たとえば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロウイルス）のようなベクターの使用によって生体外で、原位置で、または生体内で達成することができ、または物理的なＤＮＡ導入法（たとえば、リポソームまたは化学処理）の使用によって生体外で達成することができる。試験管内での核酸の哺乳類細胞への導入に好適な非限定の技法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、微量注入、細胞融合、ＤＥＡＥ／デキストラン及びリン酸カルシウム沈澱法が挙げられる（たとえば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ３９２（６６７９）：２５を参照）。本発明のポリペプチドをコードする核酸または遺伝子の導入も、染色体外基質（一時的な発現）または人工染色体（安定な発現）によっても達成することができる。細胞にて増殖させる、または所望の効果または活性を生じるために、本発明の治療用組成物の存在下でそのような細胞を生体外で培養することもできる。次いで処理した細胞を治療目的で生体内に導入することができる。
【０１３８】
核酸をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。パポバウイルス、たとえば、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら，（１９９２）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ６）：１５３３−６）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６；Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６（７）：６１６−２９；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ及びＫａｐｉｋｉａｎ（１９９２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（７）：４４０７−１２；Ｑｕａｎｔｉｎら，（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９（７）：２５８１−４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，（１９９２）、Ｃｅｌｌ．６８（１）：１４３−５５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら，（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（９）：２２３３−９；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，（１９９０）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１（３）：２４１−５６）ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓ（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（５）：５１８−２２）、アデノ関連ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｏｈｉら，（１９９０）、Ｇｅｎｅ．８９（２）：２７９−８２）、ＨＳＶ及びＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：６７−９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら，（１９９２）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２（１−３）：９５−１０２；Ｆｉｎｋら，（１９９２）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（１）：１１−９；Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ及びＧｅｌｌｅｒ（１９８７）、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１（４）：３３９−７１；Ｆｒｅｅｓｅら，（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０（１０）：２１８９−９９）、及び鳥類のレトロウイルス（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ及びＴｅｍｉｎ（１９８４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（４）：７４９−５４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら，（１９９２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（６）：３３９１−７）、マウスのレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒら．（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（７）：３２６２−７２；Ｍｉｌｌｅｒら，（１９８５）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５（３）：５２１−６；Ｓｏｒｇｅら，（１９８４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（９）：１７３０−７；Ｍａｎｎ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８５）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４（２）：４０１−７；Ｍｉｌｌｅｒら，（１９８８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（１１）：４３３７−４５）及びヒト起源のレトロウイルス（Ｓｈｉｍａｄａら，（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８（３）：１０４３−７；Ｈｅｌｓｅｔｈら，（１９９０）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（１２）：６３１４−８；Ｐａｇｅら，（１９９０）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（１１）：５２７０−６；Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ及びＰａｎｇａｎｉｂａｎ（１９９２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：２７３１−９）を含む多数のウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されている。
【０１３９】
生体内の遺伝子導入法の非限定例には、ウイルス（たとえば、レトロウイルス）ベクターによる形質移入（その全体が参照によって組み入れられる米国特許第５，２５２，４７９号を参照）及びウイルスコートタンパク質／リポソームが介在する形質移入（参照によって全体的に組み入れられるＤｚａｕら，（１９９３）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：２０５−２１０）が挙げられる。たとえば、ネイキッドＤＮＡワクチンは当該技術で一般に既知であり；たとえば、その全体が参照によって組み入れられるＢｒｏｗｅｒ，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：１３０４−１３０５を参照のこと。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与（たとえば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照）によって、または定位注射（たとえば、Ｃｈｅｎら，（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３０５４−３０５７を参照）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤には許容可能な希釈剤における遺伝子治療ベクターが含まれることができ、またはそれは遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリクスを含むことができる。或いは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞、たとえば、レトロウイルスベクターからインタクトで作出することができる場合、医薬製剤は遺伝子送達系を作出する１以上の細胞を含むことができる。
【０１４０】
核酸送達のプロトコール及び方法の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら．（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：８０８−８１３；米国特許第５，２５２，４７９号、同第５，７４７，４６９号、同第６，０１７，５２４号、同第６，１４３，２９０号、同第６，４１０，０１０号、同第６，５１１，８４７号；及び米国出願公開第２００２／００７７３１３号を参照のこと。それらはすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。追加の概説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０；Ｋｉｋｕｃｈｉら．（２００８）、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．５０（２）：８７−９８；Ｉｓａｋａら．（２００７）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．４（５）：５６１−７１；Ｊａｇｅｒら．（２００７）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７（４）：２７２−８３；Ｗａｅｈｌｅｒら．（２００７）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．８（８）：５７３−８７；Ｊｅｎｓｅｎら．（２００７）、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３９（２）：１０８−１５；Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら．（２００７）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４（２）：９９−１０７；Ｅｌｉｙａｈｕら．（２００５）、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１０（１）：３４−６４；及びＡｌｔａｒａｓら．（２００５）、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１９３−２６０を参照のこと。それらはすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１４１】
ＥＧＦＲ融合核酸も制御放出系で送達されることができる。たとえば、静脈内点滴、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮貼付剤、リポソーム、または他の投与の方式を用いてＥＧＦＲ融合分子を投与することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら．（１９８０）、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら．（１９８９）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ，（１９８３）、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照；Ｌｅｖｙら．（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら．（１９８９）、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら．（１９８９）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照）。さらに別の実施形態では、制御放出系は治療標的の近傍に配置することができるので、全身性用量のほんの一部のみを必要とする（たとえば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照）。他の制御放出系はＬａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２７−１５３３）による概説にて議論されている。
【０１４２】
医薬組成物及び治療のための投与
本発明の阻害剤、たとえば、該阻害剤と薬学的に許容可能なキャリアを投与に好適な医薬組成物に組み入れることができる。
【０１４３】
本発明のＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を対象に１回（たとえば、単回の注射または沈着物として）投与することができる。或いは、約２〜約２８日または約７〜約１０日の期間、それを必要とする対象に１日１回または２回、ＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を投与することができる。年当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回の期間、またはそれらの組み合わせ、対象に１日１回または２回、ＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を投与することもできる。さらに、本発明のＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を別の治療剤と同時投与することができる。投与計画が複数の投与を含む場合、対象に投与される有効量のＥＧＦＲ融合分子または阻害剤は投与計画全体にわたって投与される総量の遺伝子産物を含むことができる。
【０１４４】
たとえば、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌のような癌の細胞のような対象の細胞にＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を送達するのに好適な手段によってＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を対象に投与することができる。たとえば、細胞に形質移入するのに好適な方法によってＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を投与することができる。真核細胞の形質移入法は当該技術で周知であり、それには、細胞の核または前核への核酸の直接注入、エレクトロポレーション、リポソーム導入または親油性物質が介在する導入、受容体が介在する核酸の送達、生物弾道または粒子の加速、リン酸カルシウム沈殿、及びウイルスベクターが介在する形質移入が挙げられる。
【０１４５】
本発明の組成物を製剤化し、投与して、たとえば、ヒトまたは動物（たとえば、イヌ、ネコまたはウマ）のような対象の生体にて剤の作用部位との有効成分の接触を生じる手段によって、遺伝子融合に関連する癌、たとえば、多形膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または結腸直腸癌に関連する症状を軽減することができる。それらは、個々の治療有効成分としてまたは治療有効成分の併用にて医薬と併せて使用するのに利用可能な従来の手段によって投与することができる。それらは単独で投与することができるが、一般に、選択される投与の経路及び標準の薬務に基づいて選択される医薬キャリアと共に投与される。
【０１４６】
ＥＧＦＲ融合分子または阻害剤の治療上有効な量は当業者に既知の多数の因子に左右され得る。ＥＧＦＲ融合分子または阻害剤の用量は、たとえば、治療される対象または試料の固有性、サイズ及び状態に応じて、さらに適用可能であるならば、組成物が投与されるべきである経路、及びＥＧＦＲ融合分子または阻害剤が有するように実行者が所望する本発明の核酸またはポリペプチドに対する効果に応じて変化することができる。技量のある熟練者はこれらの量を容易に決定することができる。たとえば、哺乳類、たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはヒトを含むそのような治療法を必要とする対象に本明細書で記載される治療適用のいずれかを適用することができる。
【０１４７】
本発明に従って使用するための医薬組成物は１以上の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を用いて従来の方法で製剤化することができる。本発明の治療用組成物は全身性の及び局所のまたは限局された投与を含む、投与の種々の経路のために製剤化することができる。技法及び製剤化は一般に、その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（第２０版，２０００年）にて見いだすことができる。全身性投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下の注射を含む注射が有用である。注射については、本発明の治療用組成物は液体溶液、たとえば、ハンクス溶液またはリンガー溶液のような生理的に適合性の緩衝液にて製剤化することができる。加えて、治療用組成物は固体形態で製剤化することができ、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥された形態も含まれる。本発明の医薬組成物は少なくとも無菌であり、発熱物質を含まないことを特徴とする。これらの医薬製剤にはヒト及び動物で使用するための製剤が含まれる。
【０１４８】
本発明によれば、薬学的に許容可能なキャリアは、医薬投与に適合する、任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことができる。薬学上活性のある物質のためのそのような媒体及び剤の使用は当該技術で周知である。活性化合物と相溶性である従来の媒体または剤を使用することができる。補完的な活性のある化合物も組成物に組み入れることができる。
【０１４９】
ＥＧＦＲ融合分子または阻害剤を含有する医薬組成物を本明細書で議論される治療効果のいずれかのために薬学的に許容可能なキャリアと併せて投与することができる。そのような医薬組成物は、たとえば、ＥＧＦＲ融合分子に向けられた抗体またはその変異体、またはＥＧＦＲ融合分子の拮抗剤を含むことができる。組成物は単独で投与することができ、または少なくとも１つの他の剤、たとえば、無菌で投与することができる安定化化合物、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース及び水を含むが、これらに限定されない生体適合性の医薬キャリアとの併用で投与することができる。組成物は単独でまたは他の剤、薬剤若しくはホルモンとの併用で患者に投与することができる。
【０１５０】
必要に応じて、本明細書で列挙される１または組み合わせの成分とともに必要な量で適当な溶媒にＥＧＦＲ融合分子阻害剤（たとえば、ポリペプチドまたは抗体）を組み入れ、その後、フィルター滅菌することによって無菌の注射用溶液を調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒と本明細書で列挙されるものに由来する必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉末の場合、有用な調製方法の例は、有効成分の粉末に加えて以前無菌濾過したその溶液に由来する追加の所望の成分を得る真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１５１】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲ融合分子阻害剤は、経皮送達系を介して適用することができ、それは経皮吸収のために活性化合物を緩慢に放出する。透過増強剤を用いて調整された媒体にて活性因子の経皮浸透を促進することができる。経皮貼付剤は、たとえば、米国特許第５，４０７，７１３号；米国特許第５，３５２，４５６号；米国特許第５，３３２，２１３号；米国特許第５，３３６，１６８号；米国特許第５，２９０，５６１号；米国特許第５，２５４，３４６号；米国特許第５，１６４，１８９号；米国特許第５，１６３，８９９号；米国特許第５，０８８，９７７号；米国特許第５，０８７，２４０号；米国特許第５，００８，１１０号；及び米国特許第４，９２１，４７５号にて記載されている。
【０１５２】
「皮下」投与は皮膚の直下（すなわち、真皮の下位）への投与を指すことができる。一般に、皮下組織はさらに大きな血管や神経を収納する脂肪及び結合組織の層である。この層のサイズは体全体にわたって及びヒトからヒトで異なる。皮下層と筋肉層の間の界面は皮下投与によって包含され得る。投与のこの方式は、組成物に存在する因子が投与の場所から移動し、拡散することができるように皮下層が十分に薄い場合、実行可能であり得る。従って、皮内投与が利用される場合、投与される組成物のボーラス投与は皮下層に近接して局在する。
【０１５３】
細胞凝集体（たとえば、ＤＰまたはＤＳの凝集体）の投与は単一経路に制約されないが、複数の経路による投与を包含することができる。たとえば、複数経路による例となる投与には、とりわけ、皮内と筋肉内の投与の組み合わせ、または皮内と皮下の投与の組み合わせが挙げられる。複数投与は順次であっても、同時であってもよい。複数経路による適用の他の方式は技量のある熟練者には明らかであろう。
【０１５４】
他の実施形態では、この移植法は一部の対象にとって１回限りの治療であろう。本発明のさらなる実施形態では、複数の細胞療法の移植が必要とされるであろう。一部の実施形態では、移植に使用される細胞は一般に対象特異的に遺伝子操作された細胞である。別の実施形態では、異なる種または同じ種の別の個体から得られる細胞を使用することができる。従って、そのような細胞を使用することは移植される細胞の拒絶を防ぐために免疫抑制剤を投与することを必要とし得る。そのような方法は米国特許第７，４１９，６６１号及びＰＣＴ出願公報ＷＯ２００１／３２８４０にも記載されており、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は投与の意図する経路に適合性であるように製剤化される。投与の経路の例には、非経口、たとえば、静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入または摂取）、経皮（局所）、経筋肉及び直腸の投与が挙げられる。非経口、経皮または皮下の適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧の調整用の剤を含むことができる。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調整することができる。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器またはガラス若しくはプラスチック製の複数用量バイアルに内包することができる。
【０１５６】
注射使用に好適な医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液及び無菌の注射用の溶液若しくは分散液の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与については、好適なキャリアには生理的な生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。あらゆる場合で、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、たとえば、細菌及び真菌のような微生物の混入活動に対して保護されなければならない。キャリアは、たとえば、水、エタノール、薬学的に許容可能なポリオール等、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって適正な流動性を維持することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、組成物にて等張剤、たとえば、糖類、たとえば、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことは有用であることができる。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１５７】
必要に応じて、本明細書で列挙される１または組み合わせの成分と共に適当な溶媒にて必要な量での本発明の阻害剤（たとえば、ポリペプチドまたは抗体または小分子）を組み入れ、その後フィルター滅菌することによって無菌の注射用溶液を調製することができる。一般に、基本の分散媒と本明細書で列挙されるものに由来する必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を組み入れることによって分散液が調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉末の場合、有用な調製方法の例は、有効成分の粉末に加えて以前無菌濾過したその溶液に由来する追加の所望の成分を得る真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１５８】
経口組成物には一般に不活性の希釈剤または食用キャリアが含まれる。それらはゼラチンカプセルに内包されまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物を賦形剤と共に組み入れ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、流体キャリアを用いて調製され、その後、飲み込むことができる。
【０１５９】
薬学上適合性の結合剤及び／または補助物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似の性質の化合物：微小結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ風味剤のような風味剤のいずれかを含有することができる。
【０１６０】
全身性投与は経粘膜または経皮の手段によることもできる。経粘膜または経皮の投与については、透過されるべきバリアに適した浸透剤を製剤にて使用する。そのような浸透剤は当該技術で一般に既知であり、たとえば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻内スプレーまたは坐薬の使用を介して達成することができる。経皮投与については、活性化合物は当該技術で一般に既知であるように軟膏、軟膏、ゲルまたはクリームに製剤化される。
【０１６１】
一部の実施形態では、投与されるＥＧＦＲ融合分子阻害剤の有効量は、少なくとも約０．０００１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０００２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０００５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０００７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９５００μｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約１０，０００μｇ／ｋｇ体重である。
【０１６２】
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似するまたはそれと同等である方法及び材料を本発明の実践または試験で使用することもできるが、例となる方法及び材料を以下に記載する。
【０１６３】
本明細書で言及される出版物及び他の参考文献はすべて、各個々の出版物または参考文献が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのように、その全体が参照によって組み入れられる。本明細書で引用される出版物及び参考文献は従来技術であるとは認められない。
【実施例】
【０１６４】
実施例
実施例は、本発明のより完全な理解を容易にするために以下に提供される。以下の実施例は、本発明を製造及び実施する例示的な態様を示す。しかし、同様の結果を得るために他の方法を利用することができるので、実施例は説明のみの目的のためであり、本発明の範囲は、これらの実施例に開示される特定の実施態様に限定されるものではない。
【０１６５】
実施例１：膠芽腫におけるドライバーゲノム変化の全体像（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ）
膠芽腫（ＧＢＭ）でドライバー変異の課題に対処し、ヒトのＧＢＭで新しいドライバー遺伝子を発見するために、全体のエキソームのデータセットからコピー数の変化及び体細胞変異の解析を統合する計算プラットフォームを開発した。インフレーム遺伝子融合の完全なスペクトルは、膠芽腫の大トランスクリプトームデータセットから発表された。分析により、以前より膠芽腫の病因に関与する全ての遺伝子における焦点コピー数の変化及び変異が明らかになった。回帰性コピー数の変化及び体細胞変異は、まだ膠芽腫に関与していない１８種の遺伝子内に検出された。新しい遺伝子のそれぞれについて、体細胞変異に加えて、焦点と再発コピー数変化の発生は、膠芽腫の病因についての関連性を強調している。理論に拘束されないが、ＬＺＴＲ−１内の変異、Ｃｕｌ３含有Ｅ３リガーゼ錯体のＫｅｌｔｃｈ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫアダプターは、ＬＺＴＲ−１基質のユビキチンに影響を与えた。ＣＴＮＮＤ２（δ−カテニンをコードする）の機能欠失型変異は、神経特異的遺伝子を標的とし、間葉系細胞系列、侵襲性膠芽腫の特徴とともに、神経膠腫細胞の形質転換に関連していた。間葉系神経膠腫細胞におけるδ−カテニンの再構成により、神経細胞の最後に向かって、それらは再プログラムされた。ヒト膠芽腫で最も頻度の高い機能的な遺伝子融合物としてのＥＧＦＲセプチン−１４スコアリングで、腫瘍の７．６％において、いくつかのパートナーに対するＥＧＦＲのコード配列をインフレームで融合する再発転座が同定された。ＥＧＦＲ融合物は、神経膠腫細胞の増殖及び運動性を高め、神経膠芽腫異種移植片におけるＥＧＦＲ阻害に対する感受性を付与する。これらの結果は、膠芽腫の病因についての重要な洞察を提供し、治療的介入のための新しい標的として強調される。
【０１６６】
膠芽腫（ＧＢＭ）は、毎年約１０，０００名の新たな患者が発症する、最も一般的な原発性の内因性の悪性脳腫瘍であり、生存率の中間値はたったの１２〜１５ヶ月である１，２。ＧＢＭの発症及び進行を操作する遺伝子変化の機能的重要性の同定及び理解は、より効果的な治療法を開発するのに重要である。ＧＭＢゲノムの特徴付けにおける以前の努力としては、コピー数の変化のアレイに基づくプロファイリング、候補遺伝子のメチル化、遺伝子発現、及び標的とする配列決定が挙げられる３〜６。これらの研究は、周知のＧＭＢ遺伝子中の体細胞変化（ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ＩＤＨ１、ＴＰ５３、ＮＦ１等）を同定し、体細胞変異を有する推定上の癌遺伝子を推定したが、ほとんどの変化の機能的重要性は不明である。ＧＢＭでの体細胞変異と機能との間に厳密な相関関係がないことは、関連する遺伝子が多くの他の遺伝子を含むゲノムドメイン中にマスクされている、大規模なコピー数変異（ＣＮＶ）の領域によって明らかにされている。更に、全体のコーディングエキソームの次世代配列決定の可能性が、新たな癌遺伝子の候補として広く認められているが、ＧＢＭの体細胞変異率の上昇は、パッセンジャー変異を有するものからドライバー変異を有する遺伝子を区別することを目的とする統計的アプローチのための重要な課題である。統計的アプローチは、局所性（ｆｏｃａｌｉｔｙ）及び遺伝子変異の規模を優先する、ＣＮＶ解析を伴う体細胞変異についての全体のエキソーム配列データの呼び出しの統合からＧＢＭ中のドライバー遺伝子を指定するために使用された。
【０１６７】
再発性及び発癌性遺伝子融合をもたらす染色体再配置は、悪性血液腫瘍の特徴であり、近年それらは、固形腫瘍（乳癌、前立腺癌、肺癌及び結腸直腸癌）でも明らかになってきた７，８。近年、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合物を有するＧＢＭの小サブセットが、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ陽性腫瘍の患者が標的ＥＧＦＲキナーゼ阻害から利益を得るであろうことが示された９。ＧＢＭにおいて、他のＲＴＫをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物が存在し、異なる癌遺伝子依存状態を形成するかどうかは不明のままである。原発性ＧＢＭ及び神経膠腫幹細胞（ＧＳＣ）の大きなＲＮＡ配列データセットを分析し、ヒトのＧＢＭにおけるインフレーム遺伝子融合の世界的ランドスケープが報告された。
【０１６８】
候補となるＧＢＭ遺伝子の指定
局所的なＣＮＶ及び点突然変異は、その正確な位置を特定することにより、候補ドライバー遺伝子の精巧な情報を提供する。理論に束縛されないが、体細胞点突然変異及び単一のフレームワークにおける局所的なＣＮＶ情報の統合により、ＧＢＭに関与する候補遺伝子が指定される。ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌは、この目的のために設計されたアルゴリズムであり、ドライバー遺伝子は、再発性、局所性及び変位スコアの統合によってランク付けされる（方法を参照のこと）。全体として、この戦略を１３９種のＧＢＭの集団に適用し、全体のエキソーム配列決定によって分析した正常ＤＮＡに適合させ、体細胞変異を同定し、４６９種のＧＢＭをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０プラットフォームにより分析し、ＣＮＶを同定した。
【０１６９】
全体のエキソームの分析により、４３種のタンパク質を変化させる体細胞の変異の腫瘍試料あたりの平均値が同定された（表１、２）。置換の分布は、より高い塩基転換に対する塩基転移率（６７％）を示し、非常に好ましくはＣ→Ｔ及びＧ→Ａ（５５％）である（図６）。他の腫瘍型で見られるように１０、ＣｐＧジヌクレオチドの構成において、１９．２％の変異が起こる（図７）。体細胞小ヌクレオチド変異体の中で、最も頻繁に変異する遺伝子は、ＧＢＭ（ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、及びＩＤＨ１、表３）等の癌において役割が十分に確立している。公知の癌遺伝子に加え、全体のエキソーム配列決定により、腫瘍試料の約５％で変異する、いくつかの潜在的な新たな候補ドライバー遺伝子を同定した。ＧＢＭの開始及び／または進行の最も可能性の高いドライバー遺伝子を明らかにするために、変異の結果がＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌスコアを生成するために、高密度ＳＮＰアレイに適用されるアルゴリズムを使用して検出し、共通の焦点ゲノム変化と統合した（表４）。この分析は、体細胞変異遺伝子を３つの群：コピー数を著しく変化させない再発的変異遺伝子（Ｍｕｔ）、限局的及び再発的増幅領域内の変異遺伝子（Ａｍｐ−Ｍｕｔ）、及び限局的及び再発的欠失領域内の変異遺伝子（Ｄｅｌ−Ｍｕｔ）に層別化する。このフレームワークを使用し、３つのカテゴリのそれぞれの上部に点数化し、以前にＧＢＭに関与するほぼ全ての遺伝子を含んでいる、６７種の遺伝子のリストを作成した（表４）。図１において緑色に標識されている遺伝子としては、ＩＤＨ１（Ｍｕｔ、図１ａ）、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＭＤＭ４、ＭＹＣＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＤＧＦＲＡ、ＫＩＴ、ＥＧＦＲ、及びＢＲＡＦ（Ａｍｐ−Ｍｕｔ、図１ｂ）、並びにＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＮＦ１及びＡＴＲＸが挙げられる（Ｄｅｌ−Ｍｕｔ、図１ｃ）。興味深いことに、この分析は、以前にＧＢＭに報告されていない、５２種の新規な候補ドライバー遺伝子をも選択した。ＣＮＳの発生及び恒常性における役割、並びに腫瘍形成及び腫瘍増殖におけるそれらの潜在的な機能に基づき、２４種の遺伝子を、３５種のＧＢＭの独立的なデータベース内の再配列決定のために選択し、正常コントロールと適合させた。Ｓａｎｇｅｒ配列決定により独立したパネル内の１８種の遺伝子が体細胞変異していることがわかり、これを図１（表５）において赤色で標識する。ＧＢＭの２．９％〜４５．７％の間に含まれる累積的画分において、確認された新しいＧＢＭ遺伝子のそれぞれが体細胞変異及びＣＮＶにより標的となる（図９）。
【０１７０】
トップＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌスコアを示し、独立したＧＢＭデータセットで検証された、通常に変異し、限局的に欠失した遺伝子の中で、ＢＣＯＲ、ＬＲＰファミリーメンバー、ＨＥＲＣ２、ＬＺＴＲ−１、及びＣＴＮＮＤ２．ＢＣＯＲ、染色体Ｘ連鎖型遺伝子は、神経外胚葉の正常な発生及び幹細胞の機能に必須の核コリプレッサー複合体の成分をコードする１１−１３。網膜芽腫及び髄芽腫内のＢＣＯＲ変異が最近記載され、これは、ＢＣＯＲ内の機能欠失変異体が、神経外胚葉性腫瘍において共通の遺伝的事象であることを示している１４，１５。ＬＲＰ１ＢはＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーであり、人の癌において最も頻繁に変異した遺伝子の１つである（図１ｃ）１６。興味深いことに、他の２種のＬＤＬ受容体ファミリーメンバー（ＬＲＰ２及びＬＲＰ１）が、それぞれ腫瘍の４．４％及び２．９％で変異している（図１ａ、表１）。ＬＲＰタンパク質は、神経上皮において高度に発現し、マウス及びヒトにおける前脳の形態形成に不可欠である１７，１８。ＧＢＭにおけるＬＲＰタンパク質の腫瘍抑制機能は、ＧＢＭ中の癌始原細胞を維持する原因であるソニックヘッジホッグ経路を介した化学受容性及び制御シグナル伝達を促進する能力と連結している可能性がある１９−２１。ＨｅｃｔユビキチンリガーゼＨｅｒｃ２をコードする遺伝子は染色体１５ｑ１３に局在しており、ＧＢＭのケースにおいて、それぞれ１５．１％及び２．２％が欠失及び変異している（表４）。この遺伝子は、重度の神経発達症候群に関与している。更に、Ｈｅｒｃ２のタンパク質基質はゲノム安定性及びＤＮＡ損傷の修復に重要な要因であり、２つの細胞機能は、癌においてしばしば破壊される２２，２３。
【０１７１】
機能欠失遺伝子変異は、ＧＢＭにおいてＬＺＴＲ−１及びＣＴＮＮＤ２遺伝子を標的とする。
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌによる最も高いＤｅｌ−Ｍｕｔスコアの１つを受ける遺伝子はＬＺＴＲ−１である（図１ｃ、表４）。ＬＺＴＲ−１コード領域は４．４％で非同義変異を有しており、ＬＺＴＲ−１遺伝子座（ヒト染色体２２ｑ１１）はＧＢＭの２２．４％で欠失していた。通常はヒトの脳で発現するＬＺＴＲ−１（表６）は、特徴的なＫｅｌｃｈ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫのドメイン構造を有するタンパク質をコードする（図８、９）。ＬＺＴＲ−１遺伝子は後生動物において高度に保存されており、当初は転写調節因子として機能することが提案されたが、追跡研究は、このタンパク質の転写における役割を排除した２４。ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインを有するほとんどのタンパク質は、ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域がＣｕｌ３のＮ−末端ドメインに結合する、Ｃｕｌｌｉｎ３（Ｃｕｌ３）型ユビキチンリガーゼ複合体における基質アダプターであるが、リガンド結合ドメイン、しばしばＫｅｌｃｈの６枚羽根のβ−プロペラモチーフはユビキチン化を標的とする基質と結合する２５。ＬＺＴＲ−１がＣｕｌ３に直接結合するかどうかを確認するため、共免疫沈降実験を実施した。図２ａは、Ｃｕｌ３免疫沈降物がＬＺＴＲ−１を含むことを示しており、これは、ＬＺＴＲ−１がＣｕ１３ユビキチンリガーゼ複合体のアダプターであることを示す。
【０１７２】
ＬＺＴＲ−１変異の潜在的機能に対処するため、ＭＡＴＨ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫタンパク質、ＳＰＯＰ２６、ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−Ｋｅｌｃｈタンパク質、ＫＬＨＬ３及びＫＬＨＬ１I２７、並びにＫｅａｐ１のＫｅｌｃｈドメイン２８の結晶構造に一部基づいてＬＺＴＲ−１の相同性モデルを構築した（図２ｂ）。理論に拘束されないが、ＬＺＴＲ−１の第２のＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域は、このＢＴＢドメインにおいて、Φ−Ｘ−Ｅモチーフが存在するため、Ｃｕｌ３と結合し、その後、３−Ｂｏｘ／ＢＡＣＫ領域と結合する（図９）２６。しかし、前記ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域もＣｕｌ３結合に関与している。ＧＢＭにおいて同定された６つのうちの４つのＬＺＴＲ−１変異はＫｅｌｃｈドメインに位置しており、高度に保存されたアミノ酸を標的とする（図２ｂ、ｃ、図８）。興味深いことに、Ｋｅｌｃｈドメイン内のＬＺＴＲ−１変異の集中状態は、ＫＬＨＬ３遺伝子のＫｅｌｃｈコード領域内の変異の類似パターンを反映しており、近年、高血圧及び電解質異常を有する家族で同定された２９，３０。Ｒ１９８Ｇ及びＧ２４８Ｒ変異は、ドメインの基質結合表面を提供すると予測される領域内で、Ｋｅｌｃｈドメインのｂ−ｃループに局在する２８。Ｗ１０５Ｒ変異は、Ｋｅｌｃｈリピートにおいて高度に保存されたアンカー残基を標的としており、Ｔ２８８Ｉ変異は、ＬＺＴＲ−１内に保存されている隠蔽残基を破壊する（図２ｂ、図８）。これらの変異は、いずれもＫｅｌｃｈドメインの折りたたみを撹乱すると予想される。ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン内に位置する残りの２つの変異は、全体のＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域（Ｗ４３７ＳＴＯＰ）を除去することにより、またはＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン内の最後のらせん状ヘアピンの折りたたみを破壊することにより（Ｒ８１０Ｗ、図２ｂ）、Ｃｕｌ３との相互作用に影響すると予測される。ＧＢＭにおけるＬＺＴＲ−１の変異パターンは、それらが特定の基質またはＣｕｌ３のいずれかへの結合を害することを示している。
【０１７３】
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌの最高位の遺伝子のうち、ＣＴＮＮＤ２は、正常の脳において最も高いレベルで発現する遺伝子である（表６）。ＣＴＮＮＤ２は、神経突起の伸張、樹状細胞の形態形成及びシナプス可塑性に重要な、神経系でほぼ独占的に発現するカテニンのｐ１２０のサブファミリーのメンバーであるカテニンをコードする３１−３３。ＣＴＮＮＤ２の生殖細胞系列ホモ接合損失は深刻な認知機能を損ない、精神遅滞のいくつかの形態の基礎となる３４，３５。ＣＴＮＮＤ２は、ＧＢＭにおける変異の顕著なクラスタリングを示している。変異の観察スペクトルは、アルマジロコードドメイン内に位置する４つの変異を含み、Ｎ末端のコイルドコイルドメインのコード領域内に１つの変異が位置する（図１０ａ）。これらの領域は、δ−カテニンの２つの最も関連性のある機能的ドメインであり、変異のそれぞれは、おそらく（Ｋ６２９Ｑ、Ａ７７６Ｔ、Ｓ８８１Ｌ、Ｄ９９９Ｅ）、たぶん（Ａ７１Ｔ）結果に打撃を与える、高度に保存された残基を標的とする３６。ＣＴＮＮＤ２の焦点ゲノム損失と共に（図１０ｂ）、変異パターンは、ＣＴＮＮＤ２がＧＢＭの癌抑制遺伝子であることを示す。
【０１７４】
ＣＴＮＮＤ２の発現が、ＣＮＳの発癌性形質転換の際に下方制御されるかどうかが問われた。免疫染色実験は、δ−カテニンが、神経細胞における最も高い発現をもって、正常なヒト及びマウスの脳内で強く発現していることを示した（図３ａ、図１０ｃ）。逆に、６９種のＧＢＭの免疫染色分析は、２１例でδ−カテニンの発現がごくわずかであるかないことを示した（図３ｂ）。ＣＮＳにおける発癌性形質転換は、頻繁に非常に積極的な臨床転帰と関連している異常な間葉表現型を支持して初期状態の前神経細胞の運命の損失をもたらす３７。ＡＴＬＡＳ−ＴＣＧＡコレクションからの４９８種のＧＢＭの遺伝子発現プロファイルの分析により、ＣＴＮＮＤ２の低発現が間葉系遺伝子発現特性により確認される腫瘍において非常に富化されていることを示した（Ｔ−試験ｐ−値＝２．４  １０−１２、図１０ｄ）。ＣＴＮＮＤ２発現の低い腫瘍も、不十分な臨床成績により特徴づけられ、それらの腫瘍の中で、ＣＴＮＮＤ２遺伝子のコピー数の損失は、最悪の予後を示した（図３ｃ、ｄ）。大多数の確立された神経膠芽腫細胞系内で検出されるＧＢＭの間葉系形質転換は、前神経細胞の運命及び神経細胞マーカーの明らかに不可逆的な損失と関連している３７。Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞系におけるδ−カテニンの発現は細胞増殖を減少させ（図３ｅ）、間葉系マーカーの発現を減少させ（図３ｆ）、後シナプスマーカーＰＳＤ９５について陽性に染色するβ３−チューブリン陽性神経突起の伸張及び分岐状樹状突起の発生により示されるように神経細胞の分化を誘発した（図３ｇ）。したがって、δ−カテニンは、サイクリンＡ、Ｓ期サイクリンの発現を減少させ、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐ１及び神経細胞特異的遺伝子Ｎ−カドヘリンを上方制御した（図３ｈ）。したがって、δ−カテニンの発現を正常に戻すことにより、間葉系神経膠芽腫が前神経血統に再プログラム化される。
【０１７５】
ＧＢＭにおける再発性ＥＧＦＲの融合
ＧＢＭにおける遺伝子融合物を同定するために、ＲＮＡ配列データは、１８５種全てのＧＢＭ試料（原発性ＧＢＭを保因している患者から新たに分離した１６１個の原発性ＧＢＭ及び２４個の短期間培養の神経膠芽腫幹細胞様細胞（ＧＳＣ））から分析した。ＲＮＡ配列のデータセットの分析は、インフレーム融合転写物を生じる９２の候補となる再配列の発見をもたらした（表７）。以前に報告されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合事象に加え、最も頻繁に再発するインフレーム融合は、試料の７．６％においてＥＧＦＲに関与していた（１４／１８５、３．８％〜１１．３％ＣＩ）。１４個のＥＧＦＲ融合物のうちの９個は、融合物の３’遺伝子断片として再発性パートナーＳＥＰＴ１４（６／１８５、３．２％）及びＰＳＰＨ（３／１８５、１．６％）を含んでいた。２つの高度に発現したインフレーム融合物も、２つの異なる５’パートナー（ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１及びＢＣＡＮ−ＮＴＲＫ１）を有する３’遺伝子として、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１遺伝子（ＮＴＲＫ１）に関与することがわかった。ＮＴＲＫ１に関与する同様の構造を有する融合物は、通常、甲状腺乳頭癌で見つかっている３８。全体のエキソームデータからのゲノム融合物の再構成のためのアルゴリズムであるＥＸｏｍｅＦｕｓｅを使用し、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＮＲＴＫ１融合物は再発性染色体転座の結果であり、対応する遺伝的切断点を再構築した（表８）。
【０１７６】
融合切断点にまたがるＰＣＲ産物を配列決定することにより、３種類の再発性インフレーム融合物のそれぞれの予測物（ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ及びＮＲＴＫ１融合物、図４、図１１、及び図１２）を検証した。図４ａ、ｂにおいて、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物（ＴＣＧＡ−２７−１８３７）を有する腫瘍の１つについて、予測物及びｃＤＮＡ配列の検証をそれぞれ示す。増幅されたｃＤＮＡは、残基１〜９８２のＥＧＦＲアミノ末端部分と残基３７３〜４３２のＳＥＰＴ１４のカルボキシ末端部分との融合物から得られた１，０４１個のアミノ酸のタンパク質のためのオープンリーディングフレームを含んでいた（図４ｃ）。したがって、ＥＧＦＲ−Ｓｅｐｔｉｎ１４融合タンパク質の構造は、Ｎ末端にＥＧＦＲを含んでおり、Ｓｅｐｔｉｎ１４からのコイルドコイルドメインと融合する受容体チロシンキナーゼドメインを提供している。ＴＣＧＡ−２７−１８３７におけるＲＮＡ配列決定の範囲からのエクソン特異的遺伝子発現解析は、融合に関与するＥＧＦＲ及びＳＥＰＴ１４エクソンが、融合事象に含まれないｍＲＮＡ配列と比較して高度に過剰発現していることを示した（図１３）。ＰＣＲを使用することにより、協調的に発現する遺伝的切断点は、５’ＥＧＦＲエクソン２４が３’ＳＥＰＴ１４エクソン１０にスプライシングする転写が起こるＥＧＦＲエクソン２５及びＳＥＰＴ１４イントロン９内に含まれる第７染色体にマッピングされる（ＥＧＦＲについて５５，２６８，９３７、ＳＥＰＴ１４について５５，８７０，９０９、ゲノムビルドＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）（図４ｄ）。興味深いことに、ＧＢＭ試料ＴＣＧＡ−０６−５４０８内の融合ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ  ｃＤＮＡ及び予測融合タンパク質は、ＰＳＰＨを有するＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４が３５アミノ酸のカルボキシ末端部分を提供するのに関与する同じＥＧＦＲ  Ｎ末端領域を含んでいる（図１１）。ＥＧＦＲ−ＴＫ領域が３’パートナーである融合物の例はＧＳＣ−３３１６におけるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ融合物である（図１４）。したがって、ＥＧＦＲが５’パートナーである、より頻繁な融合において、または、ＥＧＦＲが３’遺伝子としての融合において、ＴＫドメインのためのＥＧＦＲ  ｍＲＮＡコーディングの領域は、常に融合転写物各々で保持される（表７）。ＧＢＭ  ＴＣＧＡ−０６−５４１１由来のＲＴ−ＰＣＲ及びゲノムＰＣＲに続くサンガーの配列決定を、予測融合タンパク質が、細胞接着の免疫グロブリン様領域及びニューロファシンのアンキリン結合領域下流に融合した高親和性ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）のＴＫドメインを含むＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１融合物をうまく検証するのにも使用した（図１２）。
【０１７７】
ＧＢＢが再発性ＥＧＦＲ融合物を有することを確認し、独立したデータセット内の頻度を決定するために、２４８種のＧＢＭのパネルからｃＤＮＡをスクリーニングし、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物を有する１０種の追加ケース（４％）を発見した。逆に、このデータセットにおいては、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１融合物は検出されなかった。ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合物の頻度は２．２％（３／１３５）であった。
【０１７８】
ＧＢＭにおける再発性ＥＧＦＲ融合物の発見は特に重要である。エクソン２−７のインフレーム欠失（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）によって、原発性ＧＢＭのかなりの割合で（約２５％）、ＥＧＦＲは活性化される３９。ＥＧＦＲ融合物の機能的関連性を確立するために、ＧＢＭにおける最も頻度の高いＥＧＦＲ融合物（ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４）が、ＥＧＦＲ活性化の他のメカニズムを提供し、ＥＧＦＲ阻害に対する感受性を付与するか否かを決定した。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４  ｃＤＮＡをクローニングし、調製されたレンチウイルスは、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、または野生型のＥＧＦＲを発現していた。ＳＮＢ１９神経膠芽腫細胞系（ＥＧＦＲのゲノム変化を欠失している）に組換えレンチウイルスを形質導入すると、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している細胞が、対照の細胞または野生型ＥＧＦＲを発現している細胞よりも２倍速い速度で増殖していることが示された（図５ａ）。更に、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＥＧＦＲｖＩＩＩは、創傷アッセイにおいて、ＳＮＢ１９細胞の移動能力を著しく増強させた（図５ｂ、ｃ）。最終的に、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物が、生体内においてＥＧＦＲ−ＴＫ活性に対する感受性を付与するか否かを調べた。マウスにおいて、ヒトのＧＢＭから直接確立された３０個のＧＢＭ異種移植片の収集の分析は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物を有している１つの異種移植片モデル（Ｄ０８−０５３７ＭＧ）を同定した。Ｄ０８−０５３７  ＭＧは、厳しく前処理したＧＢＭから確立された。Ｄ０８−０５３７  ＭＧ腫瘍を２種のＥＧＦＲ阻害剤で処置すると、２種の薬剤のそれぞれが、腫瘍増殖の速度を著しく遅延させたことが示された（図５ｄ）。興味深いことに、不可逆的なＥＧＦＲ阻害剤であるラパチニブが、近年ＧＢＭにおけるＥＧＦＲの変化を標的とすることが提案され４０、最も強い抗腫瘍効果を示した（図５ｄ、ｅ）。逆に、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ遺伝子のゲノム変化を欠くＧＢＭ異種移植片Ｄ０８−０７１４  ＭＧに対して無効であった（図５ｄ、ｅ）。まとめると、これらのデータにより、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物は、神経膠芽腫細胞への増殖及び遊走表現型を付与し、融合遺伝子を有するヒト神経膠芽腫へのＥＧＦＲ阻害に対する感受性を付与することが確定する。
【０１７９】
考察
計算パイプラインは、体細胞の癌遺伝子の指定のために記載されている。このアプローチは、そのゲノムの位置に存在する遺伝子についての体細胞変異率でのヒトゲノム中の任意の遺伝子座でのＣＮＶの頻度、大きさ及び局所性を算出する。したがって、ドライバー癌遺伝子の遺伝的特徴の２つ（コピー数の異常及び点突然変異の局所性）は１つのスコアに統合される。このアプローチは、ほとんどのヒト腫瘍を特徴づけるパッセンジャー変異の大きな負荷を効率的に除去することにより、大規模な先入観のない癌ゲノム研究におけるポジティブな体細胞を選択するための標識を識別し、他の種類の癌の遺伝的ランドスケープの精査に適用できるであろう。
【０１８０】
ＧＢＭにおける機能的関連性を有することが報告されているほぼ全ての既知の遺伝子を認識する以外にも、本出願人らの研究により、ＧＢＭのかなりの割合で限局的及び再発的ＣＮＶをも有する、１８種の新たな遺伝子内の体細胞変異が発見され、確認された。交差腫瘍関連性（たとえば、ＢＣＯＲ）、及びタンパク質ファミリーの再発（たとえば、ＬＲＰファミリーメンバー）により強調されるように、これらの遺伝子のいくつかについては、その重要性はＧＢＭを超えて拡大している。たとえば、ＬＺＴＲ−１の変異は他の腫瘍で報告されている。特に、本明細書で報告される、ケルチドメイン（Ｗ１０５、Ｇ２４８、Ｔ２８８）及び第２のＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン（Ｒ８１０）内の高度に保存された残基の変異は、他の種類の腫瘍における再発事象である４１。したがって、ＬＺＴＲ−１−Ｃｕｌ３ユビキチンリガーゼ活性の基質の性質を理解することは、複数のタイプの癌の病因に重要な病識を提供する。
【０１８１】
間葉系ＧＢＭにおいてクラスター化するＣＴＮＮＤ２遺伝子の遺伝的及びエピジェネティックな機能欠失型変異の同定は、この侵襲性のＧＢＭのサブタイプを駆動する遺伝的事象への手がかりを提供する。軸索及び樹状突起樹枝状の協調制御のような重要な神経形態形成の活動のためのδ−カテニンの重要な機能は、脳内の本格的な間葉転換を初期状態の神経系統に沿ってＣＮＳ中の細胞の運命決定を制約する主要なレギュレータの損失を必要とすることを示している。ニューロンの運命に関して間葉系遺伝子を発現する神経膠芽腫を再プログラムするδ−カテニンの能力は、治療的に悪用される可能性がある間葉系ＧＢＭの意外な柔軟性を解明する。
【０１８２】
本研究においては、遺伝子融合物のランドスケープが、ＲＮＡの配列決定によって分析されたＧＢＭの大きなデータセットから報告される。インフレームＥＧＦＲのＲＴＫ−コーディングドメインを保持する遺伝子融合物は、ＧＢＭの中で最も頻度の高い遺伝子融合事象として浮上してきた。この腫瘍においては、ＥＧＦＲは局所的増幅により頻繁に標的となり、本出願人らの発見は、髄芽腫中のｍｙｃ遺伝子座について最近報告されたように、局所的に増幅された遺伝子の強い組換え確立を強調している４２。ＥＧＦＲｖＩＩＩ対立遺伝子を生成する遺伝子内再配列と類似し、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物は、神経膠芽腫の増殖及び遊走能力を増強する。それらはまた、マウス異種移植片として増殖させたヒトＧＢＭに対し、ＥＧＦＲ阻害に対する感受性を付与する。これらの発見は、ＧＢＭの病因におけるＲＴＫをコードする遺伝子を示す遺伝子融合物の関連性を強調している９。それらは、ＥＧＦＲ阻害剤をベースとする臨床試験において、ＥＧＦＲ融合物を保有するＧＢＭ患者を含めるための強力な理論的根拠をも提供する。
【０１８３】
方法
ＴＣＧＡからの１３９対の腫瘍−正常試料をＳＡＶＩパイプラインを用いて分析した４３。ＳＡＶＩアルゴリズムは、試料中の変異型対立遺伝子の頻度だけでなく、対を形成している試料間の対立遺伝子頻度の差を推定する。アルゴリズムは、一方では、試料の遺伝子型を同定し、他方では試料の腫瘍／正常対の場合の体細胞変異を検出し得る、これらの頻度と周波数の違いについて高い事後信頼性区間を確立する。このアルゴリズムは、ランダムな配列決定の誤りを考慮に入れ、その信頼性の推定として、配列決定された対立遺伝子のＰｈｒｅｄスコアを使用する。点突然変異と、４６９個のＧＢＭ  ＣＮＶデータ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＳＮＰ６．０）とを統合するために、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ（下記参照）を使用した。ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌアルゴリズムは、潜在的な腫瘍形成性ドライバーに関する少ない不確実性が存在する、障害、試料及び遺伝子に優先順位を与える、３つの異なる戦略を介して各遺伝子にドライバースコアを割り当てる。第１に、スコアの局所性要素は、遺伝子が属するゲノム障害の大きさに反比例するので、より多くの局所性のゲノム障害を優先する。第２に、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌスコアの再発性要素は、試料中の変化する遺伝子の総数に反比例し、変化した遺伝子がより少ない試料を優先させる。最後に、スコアの変異要素は、一方では変異遺伝子の優先順位付けの２倍の目標を達成する、他方では変異のより少ない試料中で変異した遺伝子の総数に反比例する。
【０１８４】
１６１個のＲＮＡ配列決定したＧＢＭ腫瘍試料は、本出願人のＧＳＣのデータセットから生成したＴＣＧＡプラス２４からも分析した。以前に他の研究で報告されたこれらの試料のうちの９種は、再発を評価するためのリストに保持された９。遺伝子融合物候補のリストを検出するために、ＣｈｉｍｅｒａＳｃａｎアルゴリズムを用いて試料を分析した４４。Ｐｅｇａｓｕｓアノテーションパイプライン（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｐｅｇａｓｕｓ−ｆｕｓ／）を使用して融合転写物を再構成し、リーディングフレームをアノテーションし、新規キメラ事象で保存されるかまたは欠失するタンパク質ドメインを検出した。再発性遺伝子融合物のＲＮＡ転写物の遺伝的切断点も、全体のエキソーム配列決定データ（ＥＸｏｍｅ−Ｆｕｓｅアルゴリズム）９を使用してプローブした。ＣＴＮＮＤ２  ＣＮＶ及びＣＴＮＮＤ２発現についてのカプラン・マイヤー生存率分析は、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ神経膠腫データセットを用いて得た。
【０１８５】
ＳＡＶＩ（変異頻度同定のための統計的アルゴリズム）
試料中の対立遺伝子の頻度は、全ての試料由来のデータを用い、対立遺伝子の頻度についての事前の経験的ベイジアンを構築するＳＡＶＩパイプラインによって推定し、各対立遺伝子の事後分布及び高信頼性区間を得るＳ１。事前及び事後確率は、１％の精度を有する頻度の離散集合にわたって分布し、多少の誤差率を考慮する修飾二項尤度と連結される。更に正確には、区間［０，Ｅ］における頻度ｆの事前分布ｐ（ｆ）及び誤差ｅユニフォームの事前分布は、０≦Ｅ≦１に固定されていると仮定された。特定の対立遺伝子における配列決定データは、ｎ個の１を有するｍビットのストリング（対立遺伝子における全深度）を生成する確率的実験である（対立遺伝子における種々の深度）。データの二項尤度を仮定し、ランダムな誤差によるビッドの誤読を考慮し、頻度ｆの事後可能性Ｐ（ｆ）は、
【数１】
2016515508.tif 000012
（式中、Ｃは規格化定数である）である。特定の対立遺伝子については、Ｅの値は、Ｐｈｒｅｄスコアによって指定されるように、その位置において配列決定されたヌクレオチドの質によって決定される。ＳＡＶＩパイプラインは、配列決定技術により生成された読み取りを入力としてとらえ、低品質の読み取りを除去し、残りの部分をヒトの参照ゲノム上にマッピングする。マッピング後、均一な事前情報から開始し、反復性の事後更新手段によって各試料の対立遺伝子頻度のベイジアン事前分布を構成する。試料の遺伝子型を決定するために、各ゲノム位置での対立遺伝子の頻度についての事後の高い信頼性区間を使用した。また、種々の試料からのベイジアン事前確率を組み合わせ、各対立遺伝子の頻度の試料間の差についての事後の高い信頼性区間を得た。最後に、腫瘍と正常試料との間の統計的に有意な差を、体細胞変異として報告する。結果を表１に示す。ＴＣＧＡ  ＧＢＭ試料中のＳＡＶＩの正の予測値を推定するために、Ｓａｎｇｅｒの配列決定による非依存的検証のために４１個の変異を選択した。４１個の変異のうち３９個をＳａｎｇｅｒの配列決定により確認し、０．９５（９５％信頼性区間  ０．８３〜０．９９）の検証率を得た（表２）。
【０１８６】
表３は、体細胞性の非同義的変異の数によりランクづけされる候補遺伝子を示す。バイスクェア加重関数を用いて、同義比に対する非同義の比率のロバスト近似を生成した。過剰の非同義的変異は、ロバスト近似からの比と、同義的変異の数との積に等しい平均のポアゾン分布を用いて推定した。高度な多形的遺伝領域内の遺伝子は、正常試料の独立的コホートに基づいて排除した。これらの領域のリストとしては、体細胞予測において擬陽性を生成することが知られている遺伝子のファミリー（たとえば、ＨＬＡ、ＫＲＴ及びＯＲ）が挙げられる。
【０１８７】
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ．Ｋｅｙ癌遺伝子は、他の多くの遺伝子を含む染色体領域で増幅または欠失していることがしばしば発見される。一方、点突然変異及び遺伝子融合は、発癌過程でどの遺伝子が関与し得るのかについての更に具体的な情報を提供する。ＣＮＶ及び点突然変異データを統合することにより、ドライバー遺伝子を同定するためのＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ，ベイジアンアプローチが開発された。
【０１８８】
特定の試料については、
【数２】
2016515508.tif 000013
は、Ｎｉがｉ番目の障害における遺伝子の数であり、ｃｉが正常細胞からのコピー数変化となるように、その試料中の増幅障害を表す。ｉ番目の障害に属する遺伝子について、増幅再発性試料スコアは、
【数３】
2016515508.tif 000014
として定義され、その増幅局所性試料スコアは、
【数４】
2016515508.tif 000015
として定義される。特定の遺伝子についての増幅再発及び局所性スコアを得るために、対応する試料スコアを、全試料にわたって合計し、各スコアの合計が１になるように結果を正規化した。欠失と再発スコアは、同様の方法で定義される。変異スコアは、変異した遺伝子が１つの遺伝子のみで障害に属していることが想定された再発スコアに類似している。
【０１８９】
増幅／変異スコアは２つの増幅スコアと変異スコアの積として定義されるが、欠失／変異スコアは、２つの欠失スコアと変異スコアの積として定義される。増幅／変異、及び欠失／変異スコアは１に正規化され、各スコアについて、上位２Ｈに残る遺伝子が次の層に含まれるように、遺伝子を反復的に層に分ける（ここで、Ｈは１に正規化された残りの遺伝子のスコアのエントロピーである）。スコアの異なるタイプ間の層に基づいて、遺伝子が欠失／変異または増幅／変異のいずれかに割り当てられ、上部層の遺伝子が、近接する領域にグループ分けされている。各領域のトップ遺伝子は手動に考慮され、更なる機能的検証のために選択される。
【０１９０】
再発性及び局所性スコアは、このために２つの異なる事前分析、実際に１つは全体的、１つは局所的な事前分析の下で、遺伝子が疾患の選択を駆動している事後確率として解釈することができる。遺伝子が非常に多くの変異遺伝子を有していない多くの試料に関与している場合は再発性スコアはより高くなるが、遺伝子が多くの局所性病変に関与している場合は局所性スコアがより高くなる。潜在的ドライバーとして遺伝子の結論に強い支持を与える他に、それぞれ、コピー数変更（増幅または欠失）の指向性は、癌遺伝子または腫瘍抑制器として我々に候補遺伝子のありそうな性質を知らせる。
【０１９１】
図１に示す遺伝子は、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌの順位付け（上位２５０個の遺伝子）、最小領域のサイズ（１０遺伝子未満）、及び変異の頻度（欠失／変異について２％以上、増幅／変異において少なくとも１％）に基づいて選択される。
【０１９２】
ＲＮＡ−Ｓｅｑバイオインフォマティクス分析
１６１個のＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＧＢＭ腫瘍試料を、種々の癌の大規模のゲノム配列と、２４名の患者由来のＧＳＣを含む公共のリポジトリであるＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から分析した。以前の研究で報告されたＧＳＣ試料のうちの９個は、再発性を評価するためにリストに維持されたＳ２。遺伝子融合物候補のリストを検出するために、試料はＣｈｉｍｅｒａＳｃａｎＳ３アルゴリズムを用いて分析した。手短に言えば、ＣｈｉｍｅｒａＳｃａｎは、同じ基準（スプリットインサート）の異なる転写物と不調和的に整列する読み取りを検出する。これらの読み取りにより、推定上の融合物候補の初期セットが提供される。最後に、このアルゴリズムは、推定上の融合物候補に対する初期にマッピングされていない読み取りを再調整し、接合境界を超えて整列する読み取りを検出する（分裂の読み取り）。これらの読み取りは、切断点のゲノム座標を提供する。
【０１９３】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析は、合計３９，３２９個の推定上の遺伝子融合事象を検出した。生物学的に関連する融合転写物における実験的分析に焦点を当てるため、Ｐｅｇａｓｕｓアノテーションパイプライン（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｐｅｇａｓｕｓ−ｆｕｓ／）を適用した。各推定上の融合物について、Ｐｅｇａｓｕｓは、ゲノム融合切断点座標及び遺伝子アノテーションに基づいて全体の融合配列を再構成する。Ｐｅｇａｓｕｓは、インフレームまたはフレームシフトのいずれかとして生じた融合配列のリーディングフレームをもアノテーションする。更に、Ｐｅｇａｓｕｓは、アミノ酸配列を予測し、ＵｎｉＰｒｏｔウェブサービスを自動的に照会することにより、新たなキメラ事象において保存または欠失しているタンパク質ドメインを検出する。Ｐｅｇａｓｕｓアノテーション報告に基づき、リーディングフレームと、保存／欠失ドメインとにより、更なる実験的検証のために、関連する遺伝子融合物が選択された。選択されたリスト（表７）は、１０以上の読み取り、及び切断点の全体にわたる少なくとも１個の読み取りによって表わされるインフレーム事象に基づいていた。候補のトランススプライシング事象を排除するため、少なくとも２５ｋｂの距離で推定上の切断点を有する事象に焦点を合わせた。
【０１９４】
エキソーム−融合物：全体のエキソームデータを使用した、遺伝的再配列の同定
全体のエキソーム配列決定データは融合物発見の感度を低減させる低イントロンカバー率を含むが、ＴＣＧＡデータベースを介して容易に入手可能である。染色体再配列の遺伝的切断点を特徴づけるため、エキソーム−融合物を設計した。遺伝子融合物発見パイプラインは、特に全体のエキソームデータを解析するように設計した。ＲＮＡ中にＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１、及びＢＣＡＮ−ＮＴＲＫ１融合物を有する試料については、エキソーム−融合物は、ＴＣＧＡに堆積した対応する全体のエキソーム配列決定データに適用された。このアルゴリズムは、３つの段階、スプリットインサート同定、分裂の読み取り同定、及び実質的な基準整列に分けることができる。ＢＷＡを用いてヒトゲノム基準ｈｇ１８に対してマッピングすることにより、全てのスプリットインサートは、融合物候補の予備リストを収集するために最初に同定された。このリストは、重複遺伝子データベース及びＥｎｓｅｍｂｌＣｏｍｐａｒａ  ＧｅｎｅＴｒｅｅｓを使用し、パラロガス遺伝子対から生成される任意の偽陽性を排除した４。候補リスト中の疑似遺伝子は、ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ）のデータベースＳ５からリストを使用してアノテーションされ、低い優先度が与えられた。相同遺伝子間の候補、並びに切断点の周辺に相同的または低複雑度領域を有する候補も排除された。残りの融合物候補については、任意の支持分裂の読み取り及びその類似物が、ワードサイズ１６、同一性カットオフ９０％、及び期待カットオフ１０−４によりＢＬＡＳＴを用いてプローブされた。最後に、仮想基準は、各融合転写物のために作成され、位置合わせリードペアがＦ−Ｒ指向性を維持するように、全ての分割挿入及び分割読み込みの最終集計を計算するために全ての読み取りが再調整された。
【０１９５】
標的エクソンの配列決定
興味のある２４種の遺伝子についての全てのタンパク質をコードするエクソンを、凍結した腫瘍及び一致した血液から抽出したゲノムＤＮＡを用いて配列決定した。各試料からの５００ｎｇのＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ装置内で３６０秒かけ、平均１５０塩基対に切断した（負荷サイクル−１０％；強度−５；サイクル／バースト−２００）。標準型のＫａｐａ高処理ライブラリー調製キット（Ｋａｐａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、バーコード標識したライブラリーを調製した。ＫＡＰＡハイファイライブラリー増幅キット（ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ライブラリーを増幅した（８サイクル）。ライブラリーは、量子ビット蛍光定量法（Ｑｕｂｉｔ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、質及び大きさを評価した。４種のバーコード標識したライブラリーの等モルプール（各３００ｎｇ）を作成し、３８種の遺伝子のコードエクソンを標的とするカスタムプローブを用いてカスタムＮｉｍｂｌｅｇｅｎ  ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ（Ｒｏｃｈｅ）の１つの反応管を使用して、１，２００ｎｇをエクソンキャプチャに入力した。ハイブリダイゼーションによる捕獲は、以下の修飾を加え、製造業者のプロトコールに従って実施した。ブロッカーオリゴヌクレオチド（バーコード標識されたアダプターと相補的）のプール１ｎｍｏｌを用い、（Ｂ）Ｋａｐａハイファイキットは、ＧＣリッチな領域に対するバイアスを大幅に減少または消去するので、６０μｌ容量中、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＨＦ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔの代わりにＫＡＰＡハイファイライブラリー増幅キットを使用して捕獲後ＰＣＲ増幅を実施した。プールした捕獲ライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により定量し、２×１５０のペアエンドサイクルプロトコールを用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシークエンサーで配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒにより実行されたｓａｍｔｏｏｌｓを用い、重複したものを除去し、ＢＷＡを使用し、ヒトゲノムのｈｇ１９ビルドに読み取り位置を合わせた。ＧＡＴＫ  ＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒを使用して、変異体の検出を実施した。ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒを使用して対になった試料について体細胞変異を同定し、頻度について３％未満を正常、３％以上を腫瘍試料と選別した。変異は、Ｃｈａｒｉｔｙアノテーターを用いてアノテーションしてタンパク質コードの変化を同定し、既知のｄｂＳＮＰ、１０００個のゲノム及びＣＯＳＭＩＣ変異と相互参照した。正常及び腫瘍ＤＮＡ由来の各変異を確認するために、Ｓａｎｇｅｒの配列決定を使用した。Ｓａｎｇｅｒにより検証した体細胞変異の完全なリストを補足表５に報告する。
【０１９６】
ＬＺＴＲ−１のモデル化
ヒトＬＺＴＲ−１のＫｅｌｃｈ及びＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域の構造テンプレートは、ＨＨｐｒｅｄＳ６を用いて同定された。初期３次元モデルは、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲサーバーを用いて生成したＳ７。ＫＬＨＬ３ＢＴＢ−ＢＡＣＫ／Ｃｕｌ３ＮＴＤ結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＨＸＩ、Ｘｉ及びＰｒｉｖｅ  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１３）を第２のＬＺＴＲ−１  ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインに重ねることにより、Ｃｕｌ３  Ｎ−末端ドメインをモデルと結合させた。このモデルは高度の四次構造を有していないが、多くのＢＴＢドメイン、及び多くのＫｅｌｃｈドメインは、自己会合性であることが知られているＳ８。第１のＢＡＣＫドメインの端部と第２のＢＴＢドメインの開始部との短い結合は、鎖内ＢＴＢ−ＢＴＢ疑似ホモ二量体を排除するように思われ、理論に拘束されないが、ＬＺＴＲ−１は自己会合し、高次の会合体を形成する。双方のＢＡＣＫドメインは短く、ＳＰＯＰＳ９，Ｓ１０のように、不規則な形状のドメインであり、２つのらせん状のヘアピンモチーフからなり、ほとんどのＢＴＢ−ＢＡＣＫ−Ｋｅｌｃｈタンパク質Ｓ１０，Ｓ１１に見られる４つのヘアピンモチーフではない。Ｋｅｌｃｈドメインからのモデルは、ブレード１のｄ鎖に寄与するＮ−末端領域及び同じブレードのａ、ｂ、ｃ鎖に寄与するＣ−末端領域を有するまれな１＋３ベルクロ配列Ｓ１２を予測するが、他の２＋２ベルクロモデルを排除することはできない。
【０１９７】
細胞培養
１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ内でＳＮＢ１９及びＵ８７細胞を培養した。図面の説明において示したレンチウイルスによる感染３日後に６ウェルプレート内に細胞を蒔くことにより、増殖速度を測定した。生存細胞数は、３組の独立した感染から得られた３組の培養物におけるトリパンブルー排除により測定した。コンフルエント細胞をピペットチップでこすり、０．２５％ＦＢＳ中で培養することにより、遊走を評価した。１６時間後、デジタルカメラに接続したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０を用いて画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを用いて画像を処理した。無細胞損傷の面積は３つの試料で評価した。実験は２回繰り返した。
【０１９８】
免疫蛍光及びウエスタンブロット
脳腫瘍組織マイクロアレイにおける免疫蛍光染色は、以前Ｓ１７に記載したように実施した。免疫蛍光顕微鏡は、リン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した細胞で実施した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて細胞を透過処理した。免疫蛍光染色で使用した抗体及び濃度は以下の通りである。
【表３】
2016515508.tif 000016
【０１９９】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と結合した二次抗体を使用した。ＤＮＡはＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）により染色した。蛍光顕微鏡は、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  ＭＰ顕微鏡で実施した。
【０２００】
ｐＬＯＣ−ＧＦＰまたはｐＬＯＣ  ＣＴＮＮＤ２で形質導入したＵ８７細胞のウエスタンブロット解析は、以下の抗体を用いて実施した。
【表４】
2016515508.tif 000017
【０２０１】
クローニング及びレンチウイルスの産生
レンチウイルス発現ベクター、ｐＬＯＣ−ＧＦＰ及びｐＬＯＣ−ＬＺＴＲ１は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。全長のＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４  ｃＤＮＡは、腫瘍試料ＴＣＧＡ−２７−１８３７から増幅した。使用したプライマーは、ＥＧＦＲ  ＦＷ：５’−ａｇｃｇＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡ−３’（配列番号：３０）及びＳＥＰＴ１４  ＲＥＶ：５’−ＴＣＴＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴ（配列番号：３１）であり、ＥＧＦＲ野生型、ＥＧＦＲ  Ｖｉｉｉ及びＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４  ｃＤＮＡを、ｐＬｏｃ内でクローニングし、レンチウイルス粒子は、公開されたプロトコールＳ１３−Ｓ１５を用いて産生させた。
【０２０２】
ゲノム及びｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の説明書に従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造業者の説明書に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。逆転写後に得られたｃＤＮＡを、記載されたようなｑＰＣＲＳ１３，Ｓ１５の鋳型として使用した。反応は、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘを用い、Ｒｏｃｈｅ４８０サーマルサイクラーで実施した。特定のｍＲＮＡの相対量をＧＡＰＤＨに基準化した。結果は、３組の増幅の平均±ＳＤとして表わす。融合転写物の検証は、ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出したペアエンドリード配列の末端内に設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせを用いたゲノム及びＲＴ−ＰＣＲの両方を用いて実施した。発現した融合転写物変異体を、配列及び翻訳フレームを確認するために直接配列決定に供した。遺伝子融合物のスクリーニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【０２０３】
ｈＥＧＦＲ−ＲＴ−ＦＷ１：５’−ＧＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：３２）；
ｈＳＥＰ１４−ＲＴ−ＲＥＶ１：５’−ＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴＡＴＣＧＧＴＧＣ−３’（配列番号：３３）；
ｈＥＧＦＲ−ＲＴ−ＦＷ１：５’−ＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＧ−３’（配列番号：３４）；
ｈＰＳＰＨ−ＲＴ−ＲＥＶ１：５’−ＴＧＣＣＴＧＡＴＣＡＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号：３５）；
ｈＮＦＡＳＣ−ＲＴ−ＦＷ１：５’−ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号：３６）；
ｈＮＴＲＫ１−ＲＴ−ＲＥＶ１：５’−ＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＧ−３’（配列番号：３７）；
ｈＣＡＮＤ１−ＲＴ−ＦＷ１：５’−ＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＧＡＣ−３’（配列番号：３８）；
ｈＥＧＦＲ−ＲＴ−ＲＥＶ１：５’−ＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＡＧＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：３９）
遺伝子融合物のゲノム検出に使用したプライマーは以下の通りである。
【０２０４】
ゲノムＥＧＦＲ−ＦＷ１：５’−ＧＧＡＴＧＡＴＡＧＡＣＧＣＡＧＡＴＡＧＴＣＧＣＣ−３’（配列番号：４０）；
ゲノムＳＥＰＴ１４−ＲＥＶ１：５’−ＴＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧ−３’（配列番号：４１）；
ゲノムＮＦＡＳＣ−ＦＷ１：５’−ＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：４２）；
ゲノムＮＴＲＫ１−ＲＥＶ１：５’−ＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＡＣ−３’（配列番号：４３）；
ゲノムＣＡＮＤ１−ＦＷ１：５’−ＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣ−３’（配列番号：４４）；
ゲノムＥＧＦＲ−ＲＥＶ１：５’−ＧＡＡＣＡＣＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＧ−３’（配列番号：４５）
【０２０５】
皮下移植片及び薬剤による治療
メスの無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ遺伝子型、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃバックグラウンド）を、全ての抗腫瘍研究のために使用した。患者由来の成人ヒト神経膠芽腫異種移植片を維持した。無菌条件下、宿主マウスから移植片を取り出し、ティッシュプレス／修飾された組織サイトシーブ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔｅｒ  Ｉｎｃ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して均質化し、腫瘍のホモジネートを、リピーティングハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃｏ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）ディスペンサーに入れた。１９ゲージの針を用い、５０μＬの接種容量で、無胸腺マウスの右脇腹に細胞を皮下注射したＳ１６。皮下腫瘍は、携帯型ノギス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭｃＧｒａｗ，ＩＬ）を用いて週に２回測定した。腫瘍の容量Ｖは、以下の式：［（幅）２×（長さ）］／２＝Ｖ（ｍｍ３）を用いて計算した。皮下腫瘍の試験については、腫瘍容量によってランダムに選択されたマウスの群は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤で処置され、腫瘍容量の中間値は平均１５０ｍｍ３であり、媒体（生理食塩水）を投与した対照動物と比較した。エルロチニブを、１日１回、１００ｍｇ／Ｋｇ、１０日間経口投与した。ラパチニブを、１日２回、７５ｍｇ／Ｋｇ、２０日間経口投与した。処置に対する応答は、腫瘍成長及び腫瘍縮小の遅延により評価した。Ｔ−Ｃで表わされる成長遅延は、処置及び対照動物における腫瘍処置開始時に測定したものよりも５倍大きい容量に到達するのに必要な時間の中央値と日数との差として定義される。腫瘍縮小は、２つの連続した測定値を超える腫瘍容積の減少として定義される。統計解析は、既に記載されている、ＳＡＳ統計解析プログラム、成長遅延についてのウィルコクソン順位検定、腫瘍縮小についてのフィッシャの直接確率検定を使用して実施した。
【０２０６】
参考文献
【表５】
2016515508.tif 000018
【表６】
2016515508.tif 000019
【表７】
2016515508.tif 000020
【表８】
2016515508.tif 000021
【表９】
2016515508.tif 000022
【表１０】
2016515508.tif 000023
【表１１】
2016515508.tif 000024
【０２０７】
実施例２−膠芽腫におけるゲノム変化
膠芽腫は、処置するのが最も困難な形態の癌の１つである。本実施例は、コピー数の変化及び体細胞変異の分析を統合し、膠芽腫におけるインフレーム遺伝子融合物のランドスケープを解明する計算プラットフォームについて議論する。変異は、Ｃｕｌ３含有Ｅ３リガーゼ複合体のアダプターのヘテロ接合性ＬＺＴＲ−１の消失により発見された。変異及び欠失は、自己再生及び幹細胞の特徴を保持する神経膠腫球の増殖を抑制するＬＺＴＲ−１の機能を破壊する。ＣＴＮＮＤ２の機能欠失型変異は、神経特異的遺伝子を標的とし、非常に攻撃的な間葉系表現型とともに、神経膠芽腫細胞の形質転換に関連している。ヒト膠芽腫で最も頻度の高い機能的な遺伝子融合物としてのＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４を有するいくつかのパートナーに対するＥＧＦＲのコード配列を融合する再発転座が報告されている。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物はＳｔａｔ３のシグナル伝達を活性化し、マイトジェンの独立性、及びＥＧＦＲ阻害に対する感受性が付与される。これらの結果は、膠芽腫の病因についての重要な洞察を提供し、治療的介入のための新しい標的として強調される。
【０２０８】
膠芽腫（ＧＢＭ）は、毎年約１０，０００名の新たな患者が発症する、最も一般的な原発性の内因性の悪性脳腫瘍であり、生存率の中間値は１２〜１５ヶ月である１，２。ＧＢＭの発症及び進行を操作する遺伝子変化の機能的重要性の同定及び理解は、効果的な治療法を開発するのに重要である。ＧＢＭゲノムの特徴付けにおける以前の努力は、周知のＧＢＭ遺伝子中の体細胞変化（ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ＩＤＨ１、ＴＰ５３、ＮＦ１等）を同定し、体細胞変異を有する推定状の癌遺伝子を推定したが、ほとんどの変化の機能的重要性は不明である３〜６。更に、パッセンジャー変異及びコピー数変動（ＣＮＶ）の大きな領域の存在は、膠芽腫におけるドライバー変異のランドスケープの定義を複雑にしている。この挑戦に対処するため、統計的アプローチは、局所性及び遺伝子変異の規模を優先する、ＣＮＶ解析を伴う全体のエキソーム配列決定により同定される体細胞変異を統合することにより、ＧＢＭ中のドライバー遺伝子を指定するために使用された。
【０２０９】
再発性及び発癌性遺伝子融合は、悪性血液腫瘍の特徴であり、それらは、固形腫瘍でも明らかになってきた７，８。近年、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合物を有するＧＢＭの小サブセットが、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ陽性腫瘍の患者が標的ＦＧＦＲキナーゼ阻害から利益を得るであろうことが示された９。ＧＢＭにおいて、他のＲＴＫをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物が存在し、癌遺伝子依存状態を形成するかどうかは不明のままである。ここで、原発性ＧＢＭ及び神経膠腫球細胞培養物（ＧＳＣ）の大きなＲＮＡ配列データセットを試験し、ヒトのＧＢＭにおけるインフレーム遺伝子融合の世界的ランドスケープが報告される。
【０２１０】
候補となるＧＢＭ遺伝子の指定
理論に束縛されないが、体細胞点突然変異及び局所的なＣＮＶの統合により、候補ドライバーＧＢＭ遺伝子が明らかになるであろう。ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌは、再発性、局所性及び変位スコアの統合によって遺伝子をランク付けするために設計されたアルゴリズムである。この戦略を１３９種のＧＢＭに適用し、全体のエキソーム配列決定によって分析した正常ＤＮＡに適合させ、体細胞変異を同定し、４６９種のＧＢＭをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０プラットフォームにより分析し、ＣＮＶを同定した。
【０２１１】
全体のエキソームの分析により、４３種の非同義的体細胞の変異の腫瘍試料あたりの平均値が示された（表１及び９）。置換の分布は、より高い塩基転換に対する塩基転移率（６７％）を示し、非常に好ましくはＣ→Ｔ及びＧ→Ａ（５５％）である（図６）。他の腫瘍型で見られるように１０、ＣｐＧジヌクレオチドの構成において、１９．２％の変異が起こる（図７）。体細胞小ヌクレオチド変異体の中で、最も頻繁に変異する遺伝子は、ＧＢＭ（ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、及びＩＤＨ１、表３）等の癌において役割を有している。公知の癌遺伝子に加え、新たな候補ドライバー遺伝子が、腫瘍試料の約５％で変異された。変異及び共通の局所的遺伝的障害を統合することにより、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ（表４）は、体細胞変異遺伝子を３つの群：コピー数を著しく変化させない再発的変異遺伝子（Ｍｕｔ）、限局的及び再発的増幅領域内の変異遺伝子（Ａｍｐ−Ｍｕｔ）、及び限局的及び再発的欠失領域内の変異遺伝子（Ｄｅｌ−Ｍｕｔ）に層別化する。
【０２１２】
３つのカテゴリのそれぞれの上部に点数化し、以前にＧＢＭに関与するほぼ全ての遺伝子を含んでいる、６７種の遺伝子のリストを作成した（表４）。これらの遺伝子の中で（図１において灰色に標識されている）は、ＩＤＨ１（Ｍｕｔ、図１ａ）、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＭＤＭ４、ＭＹＣＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＤＧＦＲＡ、ＫＩＴ、ＥＧＦＲ、及びＢＲＡＦ（Ａｍｐ−Ｍｕｔ、図１ｂ）、並びにＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＮＦ１及びＡＴＲＸである（Ｄｅｌ−Ｍｕｔ、図１ｃ）。この分析は、ＧＢＭに報告されていない、５２種の新規な候補ドライバー遺伝子をも選択した。ＣＮＳの発生及び恒常性における役割、及び神経膠芽腫生成におけるそれらの潜在的な機能に基づき、２４種の遺伝子を、８３種のＧＢＭの独立的なデータセット内の再配列決定のために選択し、正常コントロールと適合させた。Ｓａｎｇｅｒ配列決定により独立したパネル内の１８種の遺伝子が体細胞変異していることがわかった（図１において濃い灰色で標識、表２０）。検証した、それぞれの新たなＧＢＭ遺伝子は、ＧＢＭを２．９％〜４５．７％含む累積画分で、体細胞変異及びＣＮＶに標的とされる（表４）。更に、１８種の新しいＧＢＭ遺伝子の突然変異は腫瘍につき４３の突然変異の平均に類似したグローバル突然変異率で、９５％の信頼区間の中で大部分は腫瘍に起こり、１８種の新しい遺伝子の突然変異が高頻度に変異した腫瘍に集まっていないことを示す（図２Ｃ及び図９）。
【０２１３】
トップＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌスコアを示し、独立したＧＢＭデータセットで検証された、通常に変異し、限局的に欠失した遺伝子の中で、ＢＣＯＲ、ＬＲＰファミリーメンバー、ＨＥＲＣ２、ＬＺＴＲ−１、及びＣＴＮＮＤ２．ＢＣＯＲ、Ｘ連鎖型遺伝子は、神経外胚葉の正常な発生及び幹細胞の機能に必須の核コリプレッサー複合体の成分をコードする１１−１３。網膜芽腫及び髄芽腫内のＢＣＯＲ変異が最近開示された１４，１５。ＬＲＰ１ＢはＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーであり、人の癌において最も頻繁に変異した遺伝子の１つである（図１ｃ）１６。興味深いことに、他の２種のＬＤＬ受容体ファミリーメンバー（ＬＲＰ２及びＬＲＰ１）が、それぞれ腫瘍の４．４％及び２．９％で変異している（図１ａ、表１）。ＬＲＰタンパク質は、神経上皮において高度に発現し、マウス及びヒトにおける前脳の形態形成に不可欠である１７，１８。ＧＢＭにおけるＬＲＰタンパク質の腫瘍抑制機能は、ＧＢＭ中の癌始原細胞と関連する化学受容性及びソニックヘッジホッグ経路制御シグナル伝達を促進する能力と連結している可能性がある１９−２１。染色体１５ｑ１３に局在するＨｅｃｔユビキチンリガーゼＨｅｒｃ２遺伝子は、ＧＢＭのケースにおいて、それぞれ１５．１％及び２．２％が欠失及び変異している（表４）。Ｈｅｒｃ２は重度の神経発達症候群に関与しており、Ｈｅｒｃ２の基質はゲノム安定性及びＤＮＡ損傷の修復を調整している２２，２３。
【０２１４】
ＬＺＴＲ−１の変異は、神経膠腫球の自己再生及び増殖を促進するＣｕｌｌｉｎ−３アダプターを不活性化する。
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌによる最も高いＤｅｌ−Ｍｕｔスコアの１つを受ける遺伝子はＬＺＴＲ−１である（図１ｃ、表４）。ＬＺＴＲ−１コード領域は４．４％で非同義変異を有しており、ＬＺＴＲ−１遺伝子座（ヒト染色体２２ｑ１１）はＧＢＭの２２．４％で欠失していた。１８種の新たなＧＢＭ遺伝子の中で、ＬＺＴＲ−１は、変異及び欠失の最も高い共起スコアを有していた（フィッシャの直接確率検定、ｐ＝０．０００７、表２１）。また、遺伝子のリストの一番上に得点を得、そのＣＮＶは統計的に発現と相関している（ＬＺＴＲ−１  ＣＮＶと発現とのピアソン相関は０．３６であり、スチューデントｔ−分布によるｐ−値＜１０−６、表２２）。最後に、ＬＺＴＲ−１は、ＬＺＴＲ−１の欠失を保有する腫瘍における変異対立遺伝子の単一対立遺伝子発現させるための最も相関の高い遺伝子であることが明らかになった（ｐ−値＝０．０００７、表２３）。まとめると、これらの知見は、癌における腫瘍抑制因子の不活性化のための２つのヒットモデルを満たす、ＬＺＴＲ−１が同時に突然変異及びコピー数の損失によりＧＢＭに標的化されることを示す。
【０２１５】
ＬＺＴＲ−１は、特徴的なＫｅｌｃｈ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫのドメイン構造を有するタンパク質をコードし（図２Ｃ、８、９）正常な脳内で発現している（表６）。ＬＺＴＲ−１遺伝子は後生動物において高度に保存されている。ＬＺＴＲ−１は、当初は転写調節因子として機能することが提案されたが、追跡研究において、この役割は排除された２４。ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインを有するほとんどのタンパク質は、ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域がＣｕｌ３のＮ−末端ドメインに結合する、Ｃｕｌｌｉｎ−３（Ｃｕｌ３）型ユビキチンリガーゼ複合体における基質アダプターであるが、リガンド結合ドメイン、しばしばＫｅｌｃｈの６枚羽根のβ−プロペラモチーフはユビキチン化を標的とする基質と結合する２５。ＬＺＴＲ−１がＣｕｌ３に直接結合するかどうかを確認するため、ヒトの神経膠芽腫細胞内で共免疫沈降実験を実施した。図１５は、Ｃｕ１３免疫沈降物がＬＺＴＲ−１を含むことを示しており、これは、ＬＺＴＲ−１がＣｕ１３ユビキチンリガーゼ複合体のアダプターであることを示す。
【０２１６】
ＬＺＴＲ−１変異の機能に対処するため、ＭＡＴＨ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫタンパク質、ＳＰＯＰ２６、ＢＴＢ−ＢＡＣＫ−Ｋｅｌｃｈタンパク質、ＫＬＨＬ３２７及びＫＬＨＬ１１２８、並びにＫｅａｐ１のＫｅｌｃｈドメイン２９の結晶構造に一部基づいてＬＺＴＲ−１の相同性モデルを構築した（図２ｂ）。理論に拘束されないが、ＬＺＴＲ−１の第２のＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域は、このＢＴＢドメイン中のΦ−Ｘ−Ｅモチーフのため、Ｃｕ１３と結合し、その後、３−Ｂｏｘ／ＢＡＣＫ領域と結合する（図９）２６。しかし、前記ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域もＣｕ１３結合に関与し得る。ＧＢＭにおいて同定された７つのうちの５つのＬＺＴＲ−１変異はＫｅｌｃｈドメインに位置しており、高度に保存されたアミノ酸を標的とする（図２ｂ、図２Ｃ、図８）。興味深いことに、Ｋｅｌｃｈドメイン内のＬＺＴＲ−１変異の集中状態は、ＫＬＨＬ３のＫｅｌｃｈコード領域内の変異の類似パターンを反映しており、近年、高血圧及び電解質異常を有する家族で同定された３０，３１。
【０２１７】
Ｒ１９８Ｇ及びＧ２４８Ｒ変異は、基質結合表面を提供すると予測される領域内で、Ｋｅｌｃｈドメインのｂ−ｃループに局在する２９。Ｗ１０５Ｒ変異は、Ｋｅｌｃｈリピートにおいて高度に保存されたアンカー残基を標的としており、Ｔ２８８Ｉ変異は、ＬＺＴＲ−１内に保存されている隠蔽残基を破壊する（図２ｂ、図２Ｃ、図８）。これらの変異は、いずれもＫｅｌｃｈドメインの折りたたみを撹乱すると予想される。Ｅ３５３ＳＴＯＰ変異は、Ｃ末端ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域を除去する以外にミスフォールドＫｅｌｃｈドメインを生成することが期待される。ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン内に位置する残りの２つの変異は、全体のＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域（Ｗ４３７ＳＴＯＰ）を切断するか、またはＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン内の最後のらせん状ヘアピンの折りたたみを破壊することが予測される（Ｒ８１０Ｗ、図２ｂ）。
【０２１８】
変異がＣｕｌ３との相互作用を撹乱するＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインに影響すると予測されるかどうかを確認するため、試験管内で翻訳された、野生型、Ｅ３５３ＳＴＯＰ、Ｗ４３７ＳＴＯＰ及びＲ８１０Ｗ  ＬＺＴＲ−１  Ｍｙｃ−標的タンパク質を調製し、哺乳細胞から精製したＦｌａｇ−Ｃｕｌ３との結合能力を試験した。野生型のＬＺＴＲ−１はＦｌａｇ−Ｃｕｌ３と結合したが、Ｅ３５３ＳＴＯＰ及びＷ４３７ＳＴＯＰ変異は、この性質を失っていた。しかし、このアッセイにおいて、Ｒ８１０Ｗ変異は、Ｃｕｌ３との結合能力を保持していた（図１６Ａ）。基質を促進するユビキチンで介在される分解以外に、Ｃｕｌｌｉｎアダプターは、基板のユビキチン化を導くのと同じＣｕｌｌｉｎ複合体によって自己ユビキチン化及び破壊を受ける短命なタンパク質である３２−３４。したがって、ＬＺＴＲ−１  Ｃｕｌ３複合体の減少したユビキチンリガーゼ活性は、変異ＬＺＴＲ−１タンパク質の蓄積をもたらす。一過性形質移入アッセイにおいて、３種のＬＺＴＲ−１変異体のそれぞれは、野生型のＬＺＴＲ−１よりも高いレベルで蓄積されたＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインの完全性を損なうことが予測される（図１６Ｂ）。ＬＺＴＲ−１  Ｒ８１０Ｗ変異タンパク質の定常状態及び半減期は、変異ｍＲＮＡの変化がないと、顕著に増大した（図１６Ｃ〜Ｄ）。したがって、２つの短縮変異体に関しては、Ｒ８１０Ｗ変異は、タンパク質分解を損なっていた。
【０２１９】
次に、ヒトＧＢＭにおけるＬＺＴＲ−１不活性化の生物学的重要性。変異を有するＧＢＭの差次的遺伝子発現パターンを調べ、ＬＺＴＲ−１の欠失または正常のＬＺＴＲ−１により、ＬＺＴＲ−１の遺伝子不活性を有する腫瘍が、神経膠腫球の成長及び増殖に関連する遺伝子について富化されていることが明らかになった３５（図１７Ａ）。ＧＢＭから派生する３種それぞれの神経膠腫球の培養物にＬＺＴＲ−１を導入することにより、神経膠腫球の形成及びグリオーマ幹細胞マーカーの発現が強く阻害された（図１７Ｂ〜Ｅ）。また、ＬＺＴＲ−１は腫瘍球の大きさを小さくし、扁平かつ付着性の表現型を誘発し、細胞周期進行に関するタンパク質（サイクリンＡ、ＰＬＫ１、ｐ１０７、図１７Ｄ〜Ｅ）を減少する。興味深いことに、Ｒ８１０Ｗ及びＷ４３７ＳＴＯＰ  ＬＺＴＲ−１変異は、いずれも神経膠腫球形成を害するＬＺＴＲ−１の能力を無効にする（図１７Ｆ）。上記実験は、ヒトＧＢＭにおけるＬＺＴＲ−１の不活性化が神経膠腫球を自己再生及び増殖させることを示す。
【０２２０】
ＣＴＮＮＤ２の不活性化は、膠芽腫における間葉系の形質転換を誘発する。
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌの最高位の遺伝子のうち、ＣＴＮＮＤ２は、正常の脳において最も高いレベルで発現する（表６）。ＣＴＮＮＤ２は、神経突起の伸張、樹状細胞の形態形成及びシナプス可塑性に重要な、神経系でほぼ独占的に発現するｐ１２０のサブファミリーのメンバーであるカテニン、δ−カテニンをコードする３６−３８。ＣＴＮＮＤ２の生殖細胞系列ヘミ接合損失は認知機能を損ない、精神遅滞のいくつかの形態の基礎となる３９，４０。ＣＴＮＮＤ２は、ＧＢＭにおける変異の顕著なクラスタリングを示している。変異の観察スペクトルは、アルマジロコード領域内に４つの変異を含み、Ｎ末端のコイルドコイルドメインのコード領域内に１つの変異が位置し（図１０Ａ）、δ−カテニンの２つの最も関連性のある機能的ドメインである。変異のそれぞれは、おそらく（Ｋ６２９Ｑ、Ａ７７６Ｔ、Ｓ８８１Ｌ、Ｄ９９９Ｅ）、たぶん（Ａ７１Ｔ）結果に打撃を与える、高度に保存された残基を標的とする４１。ＧＢＭは、ＣＴＮＮＤ２の局所的遺伝的損失、及びＣＴＮＮＤ２発現の損失と関連する欠失を有する（図１０Ｂ、表２２）。
【０２２１】
免疫染色実験は、神経マーカーβ３−チューブリン及びＭＡＰ２で共染色するが、星状膠細胞マーカーＧＦＡＰでは染色しないことにより証明されるように、δ−カテニンが、正常な脳、特に神経細胞で強く発現していることを示した（図１８Ａ〜Ｂ）。逆に、６９種のＧＢＭの免疫染色分析及び９種の神経膠腫球培養物のウエスタンブロットは、２１の腫瘍、及びほとんどの神経膠腫球培養物で、δ−カテニンの発現がごくわずかであるかないことを示した（図２２）。ＣＮＳにおける発癌性形質転換は、頻繁に非常に積極的な臨床転帰と関連している異常な間葉表現型を支持して初期状態の前神経細胞の運命を混乱させる４２。ＡＴＬＡＳ−ＴＣＧＡからの４９８種のＧＢＭの遺伝子発現の分析により、ＣＴＮＮＤ２の低発現が間葉系遺伝子発現特性を示す腫瘍に非常に富化されていることを示した（ｔ−試験ｐ−値＝２．４  １０−１２、図１０Ｄ）。ＣＴＮＮＤ２が低減した腫瘍は不十分な臨床成績により特徴づけられ、それらの腫瘍の中で、ＣＴＮＮＤ２のコピー数の損失を伴う腫瘍は、最悪の予後を示した（図３Ｃ〜Ｄ）。ＣＴＮＮＤ２の発現が低い患者は、間葉系ＧＢＭにおいて最悪の臨床成績を示したが、非間葉系腫瘍も、強度低下はあるものの、予後不良を示した（図３Ｄ）。
【０２２２】
ＧＢＭの間葉系形質転換は、前神経細胞の運命及び神経細胞マーカーの不可逆的な損失と関連しており４２、最も多く確立している神経膠芽腫細胞系において検出される。Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞系におけるδ−カテニンの発現は細胞増殖を減少させ（図３Ｅ）、神経タンパク質、βＩＩＩ−チューブリン、ＰＳＤ９５（後シナプスマーカー）、及びＮ−カドヘリンの発現を増大し（図３Ｇ、図２３Ａ）、間葉系マーカーのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを減少させた（図３Ｆ、図１８Ｃ、図２３Ａ）。この効果は、分岐した樹上突起の軸索伸張及び成長により特徴づけられる形態変化と関連していた（図３Ｆ、図２３Ｂ〜２３Ｃ）。逆に、ＣＴＮＮＤ２のＡ７７６Ｔ、Ｋ６２９Ｑ及びＤ９９９Ｅ変異の発現は神経細胞の特徴を誘発せず、間葉系マーカー、フィブロネクチン（ＦＢＮ）を下方制御する（図１８Ｃ、図２３Ｂ〜２３Ｃ）。神経膠腫細胞における細胞増殖のδ―カテニンによる阻害と一致して、唯一の野生型δカテニンはサイクリンＡ、Ｓ期サイクリンを減少させる（図１８Ｃ）。
【０２２３】
次に、内因性δ−カテニンタンパク質を欠き（図２２Ｂ）、高レベルの間葉系マーカーを発現するＧＢＭから派生する球細胞＃４８内のδ−カテニンの発現の影響を分析した４３。定量的免疫蛍光法により測定されるように、球細胞＃４８へのδ−カテニンの導入は、間葉系タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、コラーゲン−５Ａ１（Ｃｏｌ５Ａ１）及びＦＢＮを強く減少させる（図１９Ａ〜Ｂ）。また、βＩＩＩ−チューブリンよりも８倍誘導される（図１９Ｃ〜Ｄ）。経時的解析は、形質導入の４〜６日後に最高度のβＩＩＩ−チューブリン陽性軸索伸張、次いで培養物からニューロン様細胞の進行性の消耗を示した（図１９Ｄ）。最後に、δ−カテニンが、試験管内における神経膠腫球の自己再生及び増殖、生体内における腫瘍塊として増殖する能力に影響を与えるかどうかを調べた。限界希釈アッセイにおいて、δ−カテニンは、神経膠腫球の形成を８倍以上阻害した（図１９Ｅ）。生体内における脳腫瘍形成に関するδ−カテニンの影響を特定するため、ルシフェラーゼを発現する４８種の神経膠腫球培養物を生成し、生物発光画像法を、マウス脳における対照及びδ−カテニン発現細胞の定位的形質導入後の異なる時点で実施した。対照と比較した場合、分析した各時点におけるδ−カテニンによる腫瘍増殖の５倍の阻害が示された（図１９Ｆ、図２３Ｄ）。これらの結果は、ＧＢＭの侵襲性の間葉表現型を駆動する重要な遺伝的変化としてＣＴＮＮＤ２の不活性化を識別する。
【０２２４】
ＧＢＭにおける再発性のＥＧＦＲ融合物
ＧＢＭにおける遺伝子融合物を同定するために、ＲＮＡ配列データは、１８５種全てのＧＢＭ試料（原発性ＧＢＭを保因している患者から新たに分離した１６１個の原発性ＧＢＭ及び２４個の短期間培養の神経膠腫球培養物）から分析した。ＲＮＡ配列の分析は、インフレーム融合転写物を生じる９２の候補となる再配列の発見をもたらした（表７）。以前に報告されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合事象に加え、最も頻繁に再発するインフレーム融合は、試料の７．６％においてＥＧＦＲに関与している（１４／１８５、３．８％〜１１．３％ＣＩ）。１４個のＥＧＦＲ融合物のうちの９個は、融合物の３’遺伝子断片として再発性パートナーＳＥＰＴ１４（６／１８５、３．２％）及びＰＳＰＨ（３／１８５、１．６％）を含んでいた。全てのＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及び３種のＥＧＦＲ−ＰＳＰＨのうちの２種の遺伝子融合物は、融合遺伝子の増幅領域内に発生した（図２４）。
【０２２５】
融合転写物と関連しないＥＧＦＲエクソンにまたがりリードに対する融合切断点にまたがる発現したリードの定量分析により、ＥＧＦＲ融合遺伝子が９個の腫瘍のうち５個で高レベルで発現したことが示された（表１１）。２つの高度に発現したインフレーム融合物は、２つの異なる５’パートナー（ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１及びＢＣＡＮ−ＮＴＲＫ１）を有する３’遺伝子として、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１遺伝子（ＮＴＲＫ１）に関与する。ＮＴＲＫ１に関与する融合物は、甲状腺乳頭癌において通常である４４。全体のエキソームデータからのゲノム融合物の再構成のためのアルゴリズムであるＥＸｏｍｅＦｕｓｅを使用し、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＮＲＴＫ１融合物は再発性染色体転座の結果であり、対応する遺伝的切断点は再構築された（表１２）。
【０２２６】
融合切断点にまたがるＰＣＲ産物の配列は、３種類の再発性インフレーム融合物のそれぞれの予測物（ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ及びＮＲＴＫ１融合物、図４、１１、１２）を検証した。図４Ａ〜Ｂにおいて、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物（ＴＣＧＡ−２７−１８３７）を有する腫瘍の１つについて、予測物及びｃＤＮＡ配列の検証をそれぞれ示す。増幅されたｃＤＮＡは、ＥＧＦＲの残基１〜９８２及びＳＥＰＴ１４の残基３７３〜４３２の融合物から得られた１，０４１個のアミノ酸のタンパク質のためのオープンリーディングフレームを含んでいた（図４Ｃ）。したがって、ＥＧＦＲ−Ｓｅｐｔｉｎ１４融合物の構造は、Ｎ末端にＥＧＦＲを含んでおり、Ｓｅｐｔｉｎ１４からのコイルドコイルドメインと融合する受容体チロシンキナーゼドメインを提供している。ＴＣＧＡ−２７−１８３７におけるエクソン特異的ＲＮＡ配列決定の発現は、融合に関与するＥＧＦＲ及びＳＥＰＴ１４エクソンが、融合事象に含まれないｍＲＮＡ配列と比較して高度に発現していることを示した（図１３）。
【０２２７】
ＰＣＲを使用することにより、遺伝的切断点は、５’ＥＧＦＲエクソン２４が３’ＳＥＰＴ１４エクソン１０にスプライシングする転写物が作成されるＥＧＦＲエクソン２５及びＳＥＰＴ１４イントロン９内に含まれる第７染色体にマッピングされた（ＥＧＦＲについて５５，２６８，９３７、ＳＥＰＴ１４について５５，８７０，９０９、ゲノムビルドＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）（図４Ｄ）。興味深いことに、試料ＴＣＧＡ−０６−５４０８内の融合ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ  ｃＤＮＡ及び予測融合タンパク質は、ＰＳＰＨを有するＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４が３５アミノ酸のカルボキシ末端部分を提供するのに関与する同じＥＧＦＲ  Ｎ末端領域を含んでいる（図１１）。ＥＧＦＲ−ＴＫ領域が３’パートナーである融合物の例は神経膠腫球培養物Ｎｏ．１６におけるＣＡＮＤ１−ＥＧＦＲ融合物である（図１４）。各融合転写物は、ＴＫドメインをコードするＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの領域を含んでいる（表７）。ＧＢＭ  ＴＣＧＡ−０６−５４１１のＲＴ−ＰＣＲ及びゲノムＰＣＲに続くサンガーの配列決定により、予測融合タンパク質が、細胞接着の免疫グロブリン様領域及びニューロファシンのアンキリン結合領域下流に融合した高親和性ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）のＴＫドメインを含むＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１融合物が検証された（図１２）。
【０２２８】
ＧＢＭが再発性ＥＧＦＲ融合物を有することを確認し、独立したデータセット内の頻度を決定するために、２４８種のＧＢＭのパネルからｃＤＮＡをスクリーニングし、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物を有する１０種の追加ケース（４％）を発見した。逆に、このデータセットにおいては、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１融合物は検出されなかった。ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合物２．２％（３／１３５）の頻度が検出された。
【０２２９】
ＧＢＭにおける再発性ＥＧＦＲ融合物の発見は特に重要である。エクソン２−７のインフレーム欠失（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）によって、原発性ＧＢＭのかなりの割合で（約２５％）、ＥＧＦＲは活性化される４５。しかし、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ遺伝子融合物を有する９種の腫瘍のうちの７種はＥＧＦＲｖＩＩＩの再配列を欠いていた（表１３）。ＧＢＭにおける最も頻繁なＥＧＦＲ融合物（ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４）がＥＧＦＲ活性化の代替機構を提供し、ＥＧＦＲ阻害に対する感受性を付与するか否かを決定した。最初に、ＥＧＦＲ遺伝子融合が、ＧＢＭ（前神経、神経、古典、間葉系）のいずれかの遺伝子発現サブタイプにクラスター化するかどうかを調べた。個々のサブタイプは、ＥＧＦＲ融合物の統計的に有意な富化を示さなかったが、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨを有する９種のＧＢＭのうち８種は、古典的または間葉系サブタイプに属していた（古典／間葉系富化に対するフィッシャのＰ値＝０．０５、表１４）。
【０２３０】
次に、神経膠芽腫細胞における異所性ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲ野生型の影響を調べた。４８種のヒト神経膠腫球培養物（ＥＧＦＲの遺伝子変化を欠いている）のレンチウイルス形質導入により、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞がＥＧＦ及びｂＦＧＦの非存在下で増殖及び自己再生を保持していたが、野生型ＥＧＦＲを発現し、またはベクターを発現する細胞は保持していなかったことが示された（図２０Ａ）。したがって、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する、確立している神経膠芽腫細胞系は、対照の細胞または野生型のＥＧＦＲを発現する細胞よりも早い速度で増殖した（図５Ａ、図２５）。更に、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＥＧＦＲｖＩＩＩは、創傷アッセイにおいて神経膠芽腫細胞移動を著しく増強させた（図５Ｂ〜Ｃ）。上記発見は、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４が構成的にＥＧＦＲの下流のシグナル伝達事象を活性化する可能性があることを示している。分裂促進因子の存在下及び非存在下で分析した場合、神経膠腫球培養物４８種中のＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４（またはＥＧＦＲｖＩＩＩ）の発現は、ホスホ−ＳＴＡＴ３の構成的活性化の引き金となったが、ホスホ−ＥＲＫ及びホスホ−ＡＫＴには影響しなかった（図２０Ｂ〜Ｃ）。これは、野生型ＥＧＦＲを有する腫瘍と比較してＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合を有する原発性ヒトＧＢＭにおけるＳＴＡＴ３標的遺伝子の富化と一致している（図２０Ｄ）。差次的遺伝子発現解析は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性のＧＢＭと比較し、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４腫瘍において上方制御された９種の遺伝子のセットを同定した（図２６）。これらの遺伝子は、炎症／免疫応答、並びに侵襲性神経膠芽腫の表現型と関連するケモカイン（ＣＸＣＬ９、１０、１１）のいくつかのコードと広く関連している４６。
【０２３１】
最後に、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物が、ＥＧＦＲ−ＴＫの阻害に対する感受性を付与するか否かを調べた。ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、野生型ＥＧＦＲまたはベクターコントロールを発現する４８種を、ＧＢＭにおけるＥＧＦＲの変化を標的とすることが最近提案された４７、不可逆的なＥＧＦＲ阻害剤であるラパチニブで処理することにより、ＥＧＦＲ−Ｓｅｐｔ１４及びＥＧＦＲｖＩＩＩが、医薬品のＥＧＦＲ阻害に対して神経膠芽腫細胞を感作するが、野生型のＥＧＦＲは感作しないことが示された（図２０Ｅ）。４８種の誘導体を、エルロチニブ、ＥＧＦＲ−ＴＫの他の阻害剤で処理した後に、同様の効果が得られた（図５Ｄ）。
【０２３２】
ＥＧＦＲ−ＴＫ阻害の感受性が、生体内で自然にＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４を有しているヒト神経膠芽腫細胞において保持されているか否かを確認するため、重度の前処理した患者から確立した、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４陽性ＧＢＭ移植片（Ｄ０８−０５３７  ＭＧ）を使用した。Ｄ０８−０５３７  ＭＧ腫瘍をラパチニブまたはエルロチニブで処置すると、両方の薬剤が腫瘍増殖の速度を著しく遅延させ、ラパチニブが最も強い抗腫瘍効果を示すことが示された。逆に、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ遺伝子変化を欠くＧＢＭ移植片Ｄ０８−０７１４  ＭＧに対して無効であった（図５Ｅ）。まとめると、これらのデータにより、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物は、分裂促進因子非依存的増殖を付与し、構成的にＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化し、融合遺伝子を有する神経膠芽腫細胞へのＥＧＦＲキナーゼ阻害に対する感受性を付与することが確定した。
【０２３３】
考察
計算パイプラインは、そのゲノムの位置に存在する遺伝子の体細胞突然変異率とともに、ヒトゲノム中の任意の遺伝子座におけるＣＮＶの頻度、大きさ及び局所性を計算し、その結果、ドライバー癌遺伝子の２個の遺伝的特徴（ＣＮＶの局所性及び点突然変異）を１つのスコアに統合することを記載していた。ＧＢＭにおける機能的関連性を有することが知られているほぼ全ての遺伝子を認識する以外にも、本研究により、ＧＢＭのかなりの割合で限局的及び再発的ＣＮＶをも有する、１８種の新たな遺伝子内の体細胞変異が発見され、確認された。交差腫瘍関連性（たとえば、ＢＣＯＲ）、及びタンパク質ファミリーの再発（たとえば、ＬＲＰファミリーメンバー）により強調されるように、これらの遺伝子のいくつかの重要性はＧＢＭを超えて拡大している。
【０２３４】
また、ケルチドメイン（Ｗ１０５、Ｇ２４８、Ｔ２８８）及び第２のＢＴＢ−ＢＡＣＫドメイン（Ｒ８１０）内の高度に保存された残基を標的とするＬＺＴＲ−１変異は、他の種類の腫瘍における再発事象である４８。したがって、ＬＺＴＲ−１−Ｃｕｌ３ユビキチンリガーゼ活性の基質の性質を理解することは、複数のタイプの癌の病因に重要な病識を提供する。腫瘍抑制遺伝子不活性化のツーヒットメカニズムを支持する変異及び欠失によるＬＺＴＲ−１の同時標的、並びにＣｕｌ３結合及び／またはタンパク質安定性におけるＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインを標的とする変異の影響、自己再生における野生型タンパク質の抑制活性から神経膠芽腫細胞を遊離する能力により、ＧＢＭにおけるＬＺＴＲ−１の遺伝子変化の重要性が強調される。
【０２３５】
この侵襲的なＧＢＭサブタイプを活発にする遺伝的事象に、ＣＴＮＮＤ２クラスターの機能欠失を間葉系ＧＢＭで見いだすことは手がかりを提供する。重要な神経形態形成のためのδ−カテニンの機能は、脳内の本格的な間葉系形質転換が神経系統に沿って細胞の運命決定を制約するマスターレギュレータの損失を必要とすることを示している。ヒト神経膠腫球にδ−カテニンを導入することにより、間葉系表現型及び阻害された球体の形成及び腫瘍増殖が崩壊した。したがって、ニューロンの運命に向かって、間葉系遺伝子を発現する神経膠腫細胞を再プログラムするδ−カテニンの能力は、治療的に悪用される可能性がある間葉系ＧＢＭの予想外の柔軟性を明らかにする。
【０２３６】
本研究においては、ＲＮＡの配列決定によって分析されたＧＢＭの大きなデータセットからの遺伝子融合物のランドスケープも報告される。インフレームＥＧＦＲのＲＴＫ−コーディングドメインを保持する遺伝子融合物は、ＧＢＭの中で最も頻度の高い遺伝子融合事象として浮上してきた。この腫瘍においては、ＥＧＦＲは局所的増幅により頻繁に標的となり、本出願人らの発見は、髄芽腫中のｍｙｃ遺伝子座について最近報告されたように、局所的に増幅された遺伝子の強い組換え確立を強調している４９。ＥＧＦＲｖＩＩＩ対立遺伝子を生成する遺伝子内再配列と類似し、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４融合物は、分裂促進因子の非存在下に自己再生及び増殖能力を神経膠芽腫細胞に与え、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を構成的に活性化し、ＥＧＦＲ阻害に対する感受性を付与する。これらの発見は、ＧＢＭの病因におけるＲＴＫをコードする遺伝子の関連を示す遺伝子融合物の関連性を強調している９。それらは、ＥＧＦＲ阻害剤をベースとする臨床試験において、ＥＧＦＲ融合物を保有するＧＢＭ患者を含めるための強力な理論的根拠をも提供する。
【０２３７】
方法
ＳＡＶＩ（変異頻度同定のための統計的アルゴリズム）
変異型対立遺伝子の頻度を、ＳＡＶＩパイプライン５０を用いてＴＣＧＡからの１３９対の腫瘍及び正常な全てのエキソーム試料において推定した。全ての試料由来のデータを用い、その頻度についての事前の経験的ベイジアンを構築することにより、アルゴリズムは変異型対立遺伝子の頻度を推定し、各対立遺伝子の事後分布及び高信頼性区間を得る５０。事前及び事後確率は、１％の精度を有する頻度の離散集合にわたって分布し、多少の誤差率を考慮する修飾二項尤度と連結される。更に正確には、区間［０，Ｅ］における頻度ｆの事前分布Ｐ（ｆ）及び誤差ｅユニフォームの事前分布は、０≦Ｅ≦１に固定されていると仮定された。特定の対立遺伝子における配列決定データは、ｎ個の１を有するｍビットのストリング（対立遺伝子における全深度）を生成する確率的実験である（対立遺伝子における種々の深度）。データの二項尤度を仮定し、ランダムな誤差によるビッドの誤読を考慮し、頻度ｆの事後可能性Ｐ（ｆ）は
【数５】
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（式中、Ｃは規格化定数である）である。特定の対立遺伝子については、Ｅの値は、Ｐｈｒｅｄスコアによって指定されるように、その位置において配列決定されたヌクレオチドの質によって決定される。ＳＡＶＩパイプラインは、配列決定技術により生成された読み取りを入力としてとらえ、低品質の読み取りを除去し、残りの部分をヒトの参照ゲノム上にマッピングする。マッピング後、均一な事前情報から開始し、反復性の事後更新手段によって各試料の対立遺伝子頻度のベイジアン事前分布を構成する。試料の遺伝子型を決定するために、各ゲノム位置での対立遺伝子の頻度についての事後の高い信頼性区間を使用した。また、種々の試料からのベイジアン事前確率を組み合わせ、各対立遺伝子の頻度の試料間の差についての事後の高い信頼性区間を得た。最後に、腫瘍と正常試料との間の統計的に有意な差を、体細胞変異として報告する。結果を表１に示す。ＴＣＧＡ  ＧＢＭ試料中のＳＡＶＩの正の予測値を推定するために、Ｓａｎｇｅｒの配列決定による非依存的検証のために４１個の変異を選択した。４１個の変異のうち３９個をＳａｎｇｅｒの配列決定により確認し、０．９５（９５％信頼性区間  ０．８３〜０．９９）の検証率を得た（表９）。
【０２３８】
表３は、体細胞性の非同義的変異の数によりランクづけされる候補遺伝子を示す。バイスクェア加重関数を用いて、同義的変異に対する非同義の比率のロバスト近似を生成した。過剰の非同義的変異は、ロバスト近似からの比と、同義的変異の数との積に等しい平均のポアゾン分布を用いて推定した。高度な多形的遺伝領域内の遺伝子は、正常試料の独立的コホートに基づいて排除した。これらの領域のリストとしては、体細胞予測において擬陽性を生成することが知られている遺伝子のファミリー（たとえば、ＨＬＡ、ＫＲＴ及びＯＲ遺伝子ファミリー）が挙げられる。
【０２３９】
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ．Ｋｅｙ癌遺伝子は、他の多くの遺伝子を含む染色体領域でしばしば増幅または欠失している。一方、点突然変異及び遺伝子融合は、発癌過程でどの遺伝子が関与し得るのかについての更に具体的な情報を提供する。４６９種のＧＢＭ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０）からの点突然変異及びＣＮＶデータを統合することにより、各遺伝子にドライバースコアを割り当てる、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ、ベイジアンアプローチが開発された。一般に、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌは３つの異なる戦略を使用する。第１に、スコアの局所性要素は、遺伝子が属するゲノム障害の大きさに反比例するので、より多くの局所性のゲノム障害を優先する。第２に、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌスコアの再発性要素は、試料中の変化する遺伝子の総数に反比例し、変化した遺伝子がより少ない試料を優先させる。第３に、スコアの変異要素は、一方では変異遺伝子の優先順位付けの２倍の目標を達成する、他方では変異のより少ない試料中で変異した遺伝子の総数に反比例する。
【０２４０】
更に具体的には、特定の試料については、ｌｅｔ（ｃ１，Ｎ１），．．．（ｃκ，Ｎκ）は、Ｎｉがｉ番目の障害における遺伝子の数であり、ｃｉが正常細胞からのコピー数変化となるように、その試料中の増幅障害を表す。ｉ番目の障害に属する遺伝子について、増幅再発性試料スコアは、（ｃ１，Ｎ１），．．．，（ｃκ，Ｎκ）として定義され、その増幅局所性試料スコアは、（ｃｉ／Σｊｃｊ）×（１／Ｎｊ）として定義される。特定の遺伝子についての増幅再発及び局所性スコアを得るために、対応する試料スコアを、全試料にわたって合計し、各スコアの合計が１になるように結果を正規化した。欠失と再発スコアは、同様の方法で定義される。変異スコアは、変異した遺伝子が１つの遺伝子のみで障害に属していることが想定された再発スコアに類似している。
【０２４１】
増幅／変異スコアは２つの増幅スコアと変異スコアの積として定義されるが、欠失／変異スコアは、２つの欠失スコアと変異スコアの積として定義される。増幅／変異、及び欠失／変異スコアは１に正規化され、各スコアについて、上位２Ｘに残る遺伝子が次の層に含まれるように、遺伝子を反復的に層に分ける（ここで、Ｈは１に正規化された残りの遺伝子のスコアのエントロピーである）。スコアの異なるタイプ間の層に基づいて、遺伝子が欠失／変異または増幅／変異のいずれかに割り当てられ、上部層の遺伝子が、近接する領域にグループ分けされている。各領域のトップ遺伝子は手動に考慮され、更なる機能的検証のために選択される。
【０２４２】
再発性及び局所性スコアは、２つの異なる事前分析、実際に１つは全体的、１つは局所的な事前分析の下で、遺伝子が疾患の選択を駆動している事後確率として解釈することができる。遺伝子が非常に多くの変異遺伝子を有していない多くの試料に関与している場合は再発性スコアはより高くなるが、遺伝子が多くの局所性病変に関与している場合は局所性スコアがより高くなる。潜在的ドライバーとして遺伝子の結論に強い支持を与える他に、それぞれ、コピー数変更（増幅または欠失）の指向性は、癌遺伝子または腫瘍抑制器として我々に候補遺伝子のありそうな性質を知らせる。
【０２４３】
図１に示す遺伝子は、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌの順位付け（上位２５０個の遺伝子）、最小領域のサイズ（１０遺伝子未満）、及び変異の頻度（欠失／変異について２％以上、増幅／変異において少なくとも１％）に基づいて選択される。
【０２４４】
ＲＮＡ−ｓｅｑバイオインフォマティクス分析
１６１個のＲＮＡ−ｓｅｑ  ＧＢＭ腫瘍試料を、種々の癌の大規模のゲノム配列と、２４名の患者由来のＧＳＣを含む公共のリポジトリであるＴＣＧＡから分析した。以前の研究で報告されたＧＳＣ試料のうちの９個は、再発性を評価するために本出願人の分析に維持された９。遺伝子融合物候補のリストを検出するために、試料はＣｈｉｍｅｒａＳｃａｎ５１アルゴリズムを用いて分析した。手短に言えば、ＣｈｉｍｅｒａＳｃａｎは、同じ基準（スプリットインサート）の異なる転写物と不調和的に整列する読み取りを検出する。これらの読み取りにより、推定上の融合物候補の初期セットが提供される。その結果このアルゴリズムは、推定上の融合物候補に対する初期にマッピングされていない読み取りを再調整し、接合境界を超えて整列する読み取りを検出する（分裂の読み取り）。これらの読み取りは、切断点のゲノム座標を提供する。
【０２４５】
ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、合計３９，３２９個の推定上の遺伝子融合事象を検出した。生物学的に関連する融合転写物における実験的分析に焦点を当てるため、Ｐｅｇａｓｕｓアノテーションパイプライン（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｐｅｇａｓｕｓ−ｆｕｓ／）を適用した。各推定上の融合物について、Ｐｅｇａｓｕｓは、ゲノム融合切断点座標及び遺伝子アノテーションに基づいて全体の融合配列を再構成する。Ｐｅｇａｓｕｓは、インフレームまたはフレームシフトのいずれかとして生じた融合配列のリーディングフレームをもアノテーションする。更に、Ｐｅｇａｓｕｓは、アミノ酸配列を予測し、ＵｎｉＰｒｏｔウェブサービスを自動的に照会することにより、新たなキメラ事象において保存または欠失しているタンパク質ドメインを検出する。Ｐｅｇａｓｕｓアノテーション報告に基づき、リーディングフレームと、保存及び欠失ドメインとにより、更なる実験的検証のために、関連する遺伝子融合物が選択された。選択されたリスト（表２２）は、１０以上の読み取り、及び切断点の全体にわたる少なくとも１個の読み取りによって表わされるインフレーム事象に基づいていた。候補のトランススプライシング事象を排除するため、少なくとも２５ｋｂの距離で推定上の切断点を有する事象を探求した。
【０２４６】
全体のエキソームデータを使用した、遺伝的再配列の同定
全体のエキソーム配列決定データは融合物発見の感度を低減させる低イントロンカバー率を含むが、ＴＣＧＡデータベースを介して容易に入手可能である。染色体再配列の遺伝的切断点を特徴づけるため、特に全体のエキソームデータを解析するように設計される新たな遺伝子融合物発見パイプラインである、エキソーム融合物を設計した。ＲＮＡ中にＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４、ＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１、及びＢＣＡＮ−ＮＴＲＫ１融合物を有する試料については、エキソーム−融合物は、ＴＣＧＡに堆積した対応する全体のエキソーム配列決定データに適用された。このアルゴリズムは、３つの段階、スプリットインサート同定、分裂の読み取り同定、及び実質的な基準整列に分けることができる。ＢＷＡを用いてヒトゲノム基準ｈｇ１８に対してマッピングすることにより、全てのスプリットインサートは、融合物候補の予備リストを収集するために最初に同定される。このリストは、重複遺伝子データベース及びＥｎｓｅｍｂｌＣｏｍｐａｒａ  ＧｅｎｅＴｒｅｅｓを使用し、パラロガス遺伝子対から生成される任意の偽陽性を排除した５２。候補リスト中の疑似遺伝子は、ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ）のデータベース５３からリストを使用してアノテーションされ、低い優先度が与えられた。相同遺伝子間の候補、並びに切断点の周辺に相同的または低複雑度領域を有する候補も排除された。残りの融合物候補については、任意の支持分裂の読み取りが、ワードサイズ１６、同一性カットオフ９０％、及び期待カットオフ１０−４によりＢＬＡＳＴを用いてプローブされた。仮想基準は、各融合転写物のために作成され、全ての位置合わせリードペアがフォワード−リバース指向性を維持するように、分割挿入及び分割読み込みの最終集計を計算するために全ての読み取りが再調整された。
【０２４７】
標的エクソンの配列決定
興味のある２４種の遺伝子についての全てのタンパク質をコードするエクソンを、凍結した腫瘍及び一致した血液から抽出したゲノムＤＮＡを用いて配列決定した。各試料からの５００ナノグラムのＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ装置内で３６０秒かけ、平均サイズ１５０塩基対に切断した（負荷サイクル−１０％；強度−５；サイクル／バースト−２００）。標準型のＫａｐａ高処理ライブラリー調製キット（Ｋａｐａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、バーコード標識したライブラリーを調製した。ＫＡＰＡハイファイライブラリー増幅キット（ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ライブラリーを増幅した（８サイクル）。ライブラリーは、量子ビット蛍光定量法（Ｑｕｂｉｔ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、質及び大きさを評価した。４種のバーコード標識したライブラリーの等モルプール（各３００ｎｇ）を作成し、３８種の遺伝子のコードエクソンを標的とするカスタムプローブを用いてカスタムＮｉｍｂｌｅｇｅｎ  ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ（Ｒｏｃｈｅ）の１つの反応管を使用して、１，２００ｎｇをエクソンキャプチャに入力した。ハイブリダイゼーションによる捕獲は、以下の修飾を加え、製造業者のプロトコールに従って実施した。ブロッカーオリゴヌクレオチド（バーコード標識されたアダプターと相補的）のプール１ｎｍｏｌを用い、Ｋａｐａハイファイキットは、ＧＣリッチな領域に対するバイアスを大幅に減少または消去するので、６０μＬ容量中、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＨＦ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔの代わりにＫＡＰＡハイファイライブラリー増幅キットを使用して捕獲後ＰＣＲ増幅を実施した。
【０２４８】
プールした捕獲ライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により定量し、２×１５０のペアエンドサイクルプロトコールを用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシークエンサーで配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒにより実行されたＳＡＭｔｏｏｌｓを用い、重複したものを除去し、ＢＷＡを使用し、ヒトゲノムのｈｇ１９ビルドに読み取り位置を合わせた。ＧＡＴＫ  ＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒを使用して、変異体の検出を実施した。ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒを使用して対になった試料について体細胞変異を同定し、頻度について３％未満を正常試料、３％以上を腫瘍試料と選別した。変異は、Ｃｈａｒｉｔｙアノテーターを用いてアノテーションしてタンパク質コードの変化を同定し、既知のｄｂＳＮＰ、１０００個のゲノム及びＣＯＳＭＩＣ変異体と相互参照した。正常及び腫瘍ＤＮＡ由来の各変異を確認するために、Ｓａｎｇｅｒの配列決定を使用した。Ｓａｎｇｅｒにより検証した体細胞変異の完全なリストを表２０に報告する。
【０２４９】
一塩基変異体（ＳＮＶ）についての増幅及び欠失遺伝子の富化
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌが発癌を駆動する遺伝子を同定するために、ＳＮＶ及びＣＮＶデータを結合するが、それは明示的に増幅または欠失遺伝子が同じ試料内のＳＮＶについて富化されているかどうかを決定するものではない。同じ試料内の欠失及び遺伝子のＳＮＶは、腫瘍抑制のツーヒットモデルを示している可能性がある。試料内の癌遺伝子の増幅及び機能獲得型変異は、更に腫瘍形成を促進する可能性がある。それぞれのＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ候補遺伝子について、ＴＣＧＡ試料の数を、増幅及びＳＮＶ、増幅のみ、ＳＮＶのみ、またはいずれもなしで測定した。対応するフィッシャのＰ値を計算した。欠失について同様の分析を実施した。
【０２５０】
コピー数及び発現の相関
増幅または欠失遺伝子の機能的関連性を評価する１つの方法は、遺伝子量の影響を評価することである。ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌにより指定された各遺伝子について、コピー数と発現間のピアソンの相関係数を計算した。対応するＰ値を、対応スチューデントｔ検定を用いて計算した。
【０２５１】
ＳＮＶの対立遺伝子特異的発現
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌにより指定された、示された遺伝子について、ＲＮＡの配列決定により、変異型または野生型の対立遺伝子のいずれが発現されたかを判定することができる。この目的に向けて、ＶＣＦｔｏｏｌｓ５４が、基準（Ｒ）及び変異体（Ｖ）対立遺伝子を呼び出す読み取りの深さを生成するトップハットによって生成されるＴＣＧＡ  ＢＡＭ−ＲＮＡ配列ファイルに適用された。その結果、変異型対立遺伝子の相対的発現の測定は、Ｖ／（Ｖ＋Ｒ）である。各変異について、Ｖ＋Ｒ読み取りのうちＶ以上を観測する二項のＰ値は、読み取りが変異または参照を読み出すことも同様に可能性があると仮定して計算された。その結果、各変異の二項のＰ値は、Ｓｔｏｕｆｆｅｒ’ｓ  Ｚ−スコア法を用いてプールされ、遺伝子あたりの結合Ｐ値を計算した。
【０２５２】
超変異試料内のパッセンジャー変異の除外
ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌの候補が、超変異試料内でパッセンジャー変異である傾向がある可能性を除外するため、変異の数を、各ＴＣＧＡ試料における変異の数の分布Ｎと、ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ変異を有する試料と比較した。ＴＣＧＡ試料の数が３０を十分に超えるので、Ｎは、正規分布により十分に近似されると推測され、平均値、μ、及びｓ．ｄ．、σを計算した。それぞれのＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌの変異については、Ｚ−検定を実施し、全ての変異には、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの方法により補正された後の統計的有意性がなかった。
【０２５３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ転写物の存在の判定
ＥＧＦＲｖＩＩＩ転写物の存在を判定するため、ＥＧＦＲエクソン１及び８の間の接合を支持するスプリットインサート及び分裂の読み取りの数を計算するためのインハウススクリプトを作成した。ＥＧＦＲｖＩＩＩのアイソフォームは、試料中に５個以上の分裂の読み取りまたは５個のスプリットインサートがあると発現すると考えられた。
【０２５４】
野生型ＥＧＦＲと比較した、ＥＧＦＲ融合物の相対的発現の計算
ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ融合物の機能的関連性を決定するために、トップハットによってマッピングされ、ＴＣＧＡによって提供されたＢＡＭファイルに基づいて、各試料内の融合物及び野生型転写物との間で相対的な発現を決定した。転写物の発現の代用として、変異体または野生型のいずれかの接合部をおおっている読み取りの深さを計算した。特に、ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨの融合切断点をおおう読み取りの深さは、融合転写物の発現を推定すると考えられた。全てのＥＧＦＲ融合物は、ＳＥＰＴ１４またはＰＳＰＨのいずれかと結合したエクソン２４と型どおりに関与しているので、野生型ＥＧＦＲ発現の特異的な基準である、ＥＧＦＲエクソン２５−２６、２６−２７及び２７−２８間の接合部をおおう読み取りの深さを評価した。
【０２５５】
ＥＧＦＲ融合した試料の古典的及び間葉系サブタイプの富化
ＥＧＦＲ融合した試料が、特定のＧＢＭサブタイプで発生する傾向があるかどうかを評価するために、各ＴＣＧＡ  ＧＢＭ試料を、最初にＶｅｒｈａａｋら６の方法によって、発現により分類した。次いで、古典的、間葉系、前神経及び神経の試料の数を、ＥＧＦＲ遺伝子融合ありと、融合なしとで集計した。フィッシャの正確確率検定に従い、古典的表現型及び間葉系表現型を組み合わせたクラスはＥＧＦＲ融合物が富化していた。
【０２５６】
ＥＧＦＲ融合におけるコピー数の変動
遺伝子融合は、ゲノムの不安定性からしばしば生じる。この観察に刺激され、セグメント化されたＳＮＰアレイデータをＴＣＧＡからダウンロードし、腫瘍のコピー数及び正常細胞のコピー数のｌｏｇ２比を計算した。これを、ＥＧＦＲ、ＳＥＰＴ１４及びＰＳＰＨ（ｃｈｒ７：５５，０００，０００−５６，５００，０００）の染色体周辺に沿ってプロットした。
【０２５７】
ＧＳＥＡ
ＬＺＴＲ１変異の生物学的影響を判断するため、特定の表現型が富化した遺伝子セットを指定するために発現データを利用する分析手段であるＧＳＥＡ５５を使用した。ＴＣＧＡ試料をＬＺＴＲ１  ＳＮＶと同一視して、ＧＳＥＡをＴＣＧＡ発現データに適用した。試料は、最初に、野生型ＬＺＴＲ１を有するものに対し、ＬＺＴＲ１  ＳＮＶと比較した（ＬＺＴＲ１欠失を除く）。統計的有意性を評価するため、データセットを遺伝子セットの順序を５００回変えることによってランダム化し、ＦＤＲ  ｑ＜０．０５の遺伝子セットのみであると考えられた。
【０２５８】
ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４を有する試料及びＥＧＦＲｖＩＩＩを有する試料の差次的発現
ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４表現型及びＥＧＦＲｖＩＩＩ表現型を区別するための独特な分子署名を決定するために、インハウス差次的発現分析も実施した。このような目的で、各遺伝子の試料の２つの群の発現を比較してｔ検定を実施した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの方法を用いて補正し、ＦＤＲ＜０．０５の遺伝子のみを考えた。更に、１０パーセンタイル未満、または全ての試料のうちの２未満の絶対値を有する相違の遺伝子は除外した。これらのフィルターにより１０種の一連の予測的遺伝子が残された。次いで、ユークリッド距離及び平均連結法を用い、１０種の遺伝子の発現について階層的なクラスター化を実施した。
【０２５９】
ＬＺＴＲ１のモデル化
ヒトＬＺＴＲ１のｋｅｌｃｈ及びＢＴＢ−ＢＡＣＫ領域の構造テンプレートは、ＨＨｐｒｅｄ５６を用いて同定された。初期３次元モデルは、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲサーバーを用いて生成した５７。ＫＬＨＬ３ＢＴＢ−ＢＡＣＫ／ＣＵＬ３ＮＴＤ結晶構造２７を第２のＬＺＴＲ１  ＢＴＢ−ＢＡＣＫドメインに重ねることにより、ＣＵＬ３  Ｎ−末端ドメインをモデルと結合させた。このモデルは高度の四次構造を有していないが、多くのＢＴＢドメイン、及び多くのｋｅｌｃｈドメインは、自己会合性であることが知られている２５。第１のＢＡＣＫドメインの端部と第２のＢＴＢドメインの開始部との短い結合は、鎖内ＢＴＢ−ＢＴＢ疑似ホモ二量体を排除するように思われ、理論に拘束されないが、ＬＺＴＲ１は自己会合し、高次の会合体を形成する。双方のＢＡＣＫドメインは短く、ＳＰＯＰ２６，５８のように、不規則な形状のドメインであり、２つのらせん状のヘアピンモチーフからなり、ほとんどのＢＴＢ−ＢＡＣＫ−ｋｅｌｃｈタンパク質２８，５８に見られる４つのヘアピンモチーフではない。ｋｅｌｃｈドメインからのモデルは、ブレード１のｄ鎖に寄与するＮ−末端領域及び同じブレードのａ、ｂ及びｃ鎖に寄与するＣ−末端領域を有するまれな１＋３ベルクロ配列５９を予測するが、他の２＋２ベルクロモデルを排除することはできない。
【０２６０】
細胞培養
Ｕ８７細胞は、ＡＴＣＣから得た。ＳＮＢ１９、Ｕ８７及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ内で培養した。図面の説明において示したレンチウイルスによる感染３日後に６ウェルプレート内に細胞を蒔くことにより、増殖速度を測定した。生存細胞数は、３組の独立した感染から得られた３組の培養物におけるトリパンブルー排除により測定した。損傷アッセイ遊走試験のために、コンフルエント細胞をピペットチップでこすり、０．２５％ＦＢＳ中で培養した。１６時間後、デジタルカメラに接続したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０を用いて画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ６４ソフトウェアを用いて画像を処理した。無細胞損傷の面積は３つの試料で評価した。実験は２回繰り返した。
【０２６１】
ＧＢＭ由来の初代培養物を、Ｎ２及びＢ２７サプリメント、並びにヒト組換え型ＦＧＦ−２及びＥＧＦ（各５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で増殖させた。球体の形成のために、細胞をレンチウイルス粒子で感染させた。４日後、１個の細胞を、低付着性９６ウェルプレートにウェルあたり１細胞の密度に３組蒔いた。１０〜１４日後に、球体の数及び大きさを採点した。既に記載されたように６０、限界希釈アッセイを実施した。ＥＧＦの非存在下に培養したＥＧＦＲ形質導入した細胞を除き、球体を１個の細胞に分離し、成長因子（ＥＧＦ及びＦＧＦ−２）を含む０．２ｍｌの培地中、低付着性９６ウェルプレート内に蒔いた。培養物を１０日間静置した後、各細胞希釈物について球体を含まないウェルの割合を計算し、ウェルあたりの細胞数に対してプロットした。線形回帰直線をプロットし、各ウェルにおいて少なくとも１個の球体を生成するのに必要な細胞数（幹細胞頻度）を算出した。実験は２回繰り返した。ｐＬＯＣベクター、野生型ｐＬＯＣ−ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４で形質導入した細胞内で、ＧＢＭ初代培養物のエルロニチブまたはラパチニブによる処理を行い、５日間、ブラストサイジンを用いて選択した。ＥＧＦの非存在下に細胞を６ｃｍのシャーレに蒔き、表示した薬剤で、表示した濃度で４８時間処理した。各処理群は、３組ずつ蒔いた。絶対的生細胞数は、トリパンブルー色素排除法により検出し、血球計数器で数えた。ＥＧＦＲで形質導入した初代培養神経膠芽腫細胞のＥＧＦ刺激は、成長因子を取り除いた細胞内で４８時間実施した。表示した時間に細胞を収集し、タンパク質ブロッティング分析を行った。
【０２６２】
免疫蛍光法
正常マウス及びヒトの脳及び脳腫瘍組織マイクロアレイにおける免疫蛍光染色は、以前４３，６１，６２に記載したように実施した。免疫蛍光顕微鏡は、リン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで固定した細胞で実施した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて細胞を透過処理した。免疫蛍光染色で使用した抗体及び濃度を表１５に詳述する。
【０２６３】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（１：３００，Ａ１１０３７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはＡｌｅｘａ  ４８８（１：５００，Ａ１１００８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と結合した二次抗体を使用した。ＤＮＡはＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）により染色した。蛍光顕微鏡は、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  ＭＰ顕微鏡で実施した。初代培養または確立された神経膠芽腫細胞の蛍光強度染色の定量は、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＵＲＬを参照されたい）を使用して実施した。各条件についての代表的な区域の各ポイントの蛍光強度のヒストグラムを作成した。３つのそれぞれの実験からの１０個の区域の蛍光強度を採点し、その区域内の細胞数に対して標準化し、ベクターの強度で割った。
【０２６４】
タンパク質ブロッティング、免疫沈降法及び試験管内結合
タンパク質ブロッティング分析及び免疫沈降法は、表１６に詳述した抗体を使用して実施した。ＣＵＬ３  ａｎｄ  ＬＺＴＲ１の試験管内結合については、ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、野生型及び変異型ＬＺＴＲ１を試験管内で翻訳した。ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ），０．１％  ＳＤＳ，１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ），１０ｍＭ  ＮａＦ，０．５Ｍ  Ｎａ３ＯＶ４（オルトバナジウム酸ナトリウム）及びコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル，Ｒｏｃｈｅ）を使用し、Ｆｌａｇ−Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）により形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からＦｌａｇ−ＣＵＬ３を免疫沈降させた。結合は、２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５％  ＮＰ−４０内で、４℃で２時間で行った。免疫複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングにより分析した。
【０２６５】
クローニング及びレンチウイルスの産生
レンチウイルス発現ベクター、ｐＬＯＣ−ＧＦＰ及びｐＬＯＣ−ＣＴＮＮＤ２は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。全長のＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４  ｃＤＮＡは、腫瘍試料ＴＣＧＡ−２７−１８３７から増幅した。野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４  ｃＤＮＡを、ｐＬＯＣベクター内でクローニングした。ｐＣＤＮＡ−ＭＹＣ−Ｈｉｓｔ−ＬＺＴＲ１は親切な贈り物であった２４。ｐＣＤＮＡ−Ｆｌａｇ−ＣＵＬ３は贈り物であった。野生型と、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ，Ａｇｉｌｅｎｔ）により得られたＬＺＴＲ１及びＣＴＮＮＤ２の変異ｃＤＮＡを、ｐＬＯＣベクターにクローニングした。レンチウイルス粒子は、公開されたプロトコール４３，６１，６２，６３，６４を用いて産生させた。
【０２６６】
ゲノムＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の説明書に従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造業者の説明書に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。逆転写後に得られたｃＤＮＡを、記載されたような定量ＰＣＲ４３，６４の鋳型として使用した。反応は、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘを用い、Ｒｏｃｈｅ４８０サーマルサイクラーで実施した。特定のｍＲＮＡの相対量をＧＡＰＤＨに基準化した。結果は、３組の増幅の平均±ｓ．ｄ．として表わす。融合転写物の検証は、ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出したペアエンドリード配列の末端内に設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせを用いたゲノムＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲの両方を用いて実施した。発現した融合転写物変異体を、配列及び翻訳フレームを確認するために直接配列決定に供した。遺伝子融合物のスクリーニングに使用したプライマーを表１７に詳述する。遺伝子融合物のゲノム検出に使用したプライマーを表１８に記載する。外因性の野生型ＭＹＣ−ＬＺＴＲ１及び変異ｐ．Ａｒｇ８０１Ｔｒｐ  ＬＺＴＲ１を検出するための半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、表１９に記載したプライマーを使用して実施した。
【０２６７】
皮下移植片及び薬剤による治療
メスの無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ遺伝子型、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）を、全ての抗腫瘍研究のために使用した。患者由来の成人ヒト神経膠芽腫異種移植片を維持した。無菌条件下、宿主マウスから移植片を取り出し、ティッシュプレス／修飾された組織サイトシーブ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して均質化し、腫瘍のホモジネートを、リピーティングハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃｏ．）ディスペンサーに入れた。１９ゲージの針を用い、５０ｍＬの接種容量で、無胸腺マウスの右脇腹に細胞を皮下注射した６５。
【０２６８】
皮下腫瘍は、携帯型ノギス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて週に２回測定した。腫瘍の容量（Ｖ）は、以下の式：［（幅）２×（長さ）］／２＝Ｖ（ｍｍ３）を用いて計算した。皮下腫瘍の試験については、腫瘍容量によってランダムに選択されたマウスの群は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤で処置され、腫瘍容量の中間値は平均１５０ｍｍ３であり、媒体（生理食塩水）を投与した対照動物と比較した。
【０２６９】
エルロチニブを、１日１回、１００ｍｇ／ｋｇ体重、１０日間経口投与した。ラパチニブを、１日２回、７５ｍｇ／ｋｇ体重、２０日間経口投与した。処置に対する応答は、腫瘍成長及び腫瘍縮小の遅延により評価した。
【０２７０】
Ｔ−Ｃ値で表わされる成長遅延は、処置及び対照動物における腫瘍処置開始時に測定したものよりも５倍大きい容量に到達するのに必要な時間の中央値と日数との差として定義される。腫瘍縮小は、２つの連続した測定値を超える腫瘍容積の減少として定義される。統計解析は、ＳＡＳ統計解析プログラム、成長遅延についてのウィルコクソン順位検定、腫瘍縮小についてのフィッシャの直接確率検定を使用して実施した。
【０２７１】
頭蓋内注射
ＧＢＭ由来初代細胞は、最初にルシフェラーゼを発現するレンチウイルスで感染させ、次いで、ｐＬＯＣベクターまたはｐＬＯＣ−ＣＴＮＮＤ２レンチウイルス粒子を形質導入した。頭蓋内注射は、９週齢のオスのｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で実施した。手短に言えば、５≦１０５細胞を２．５μＬのＰＢＳに再懸濁し、定位固定フレームを用い、尾状核被殻に注射した（ブレグマからの相対座標：前方０．６ｍｍ；側方１．６５ｍｍ；深さ３ｍｍ）。ＩＶＩＳ画像化システムを用いて腫瘍の成長を監視した。手短に言えば、体重１ｋｇあたり１００ｍｇのｎ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）の腹腔内注射前に、３％イソフルランでマウスに麻酔をかけた。ｎ−ルシフェリンの投与１０分後、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ収録及び分析ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）により１分間画像を収録した。生物発光シグナルは毎秒の光子で発現し、光子カウントの空間分布を表す疑似カラー画像として表示された。
【０２７２】
ＵＲＬ
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）のＤＮＡ及びＲＮＡの配列及びコピー数変異体のデータ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｄａｔａ（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）からの神経膠芽腫患者の生存データ、ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｍｂｒａｎｄｔ／；遺伝子型及び表現型のデータベースにおける配列データ蓄積（ｄｂＧａＰ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇａｐ；遺伝子融合アノテーションソフトウェアパッケージＰｅｇａｓｕｓ，ｈｔｔｐ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｐｅｇａｓｕｓ−ｆｕｓ／。
【０２７３】
データアクセス
本研究における２４種のヒトＧＢＭ球体培養物のＲＮＡ配列は、ｐｈｓ０００５０５．ｖ２．ｐ１でｄｂＧａｐ研究目録に寄託された。ＴＣＧＡ  ＧＢＭ試料のＲＮＡ及びＤＮＡ配列も、ｄｂＧａｐ研究目録ｐｈｓ０００１７８．ｖ１．ｐ１から分析した。
【０２７４】
実施例２についての参考文献
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０２７５】
表及び実施例の説明
表１．ＳＡＶＩによって予測されるような、ＴＣＧＡからの１３９全エクソームデータからの体細胞点変異。Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．６１／７９３，０８６の表１及びＦｒａｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４５（１０）：１１４１−４９で利用可能なオンライン材料の補足の表１は、それぞれその全体が参照として組み込まれる。
【０２７６】
【表１７】
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【表１８】
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【０２７７】
【表１９】
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【表２０】
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【０２７８】
【表２１】
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【表２２】
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【０２７９】
【表２３】
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【表２４】
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【０２８０】
【表２５】
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【表２６】
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【０２８１】
【表２７】
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【表２８】
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【０２８２】
【表２９】
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【表３０】
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【０２８３】
【表３１】
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【表３２】
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【０２８４】
【表３３】
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【表３４】
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【０２８５】
【表３５】
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【表３６】
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【０２８６】
【表３７】
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【表３８】
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【０２８７】
【表３９】
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【表４０】
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【０２８８】
【表４１】
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【表４２】
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【０２８９】
【表４３】
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【表４４】
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【０２９０】
【表４５】
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【表４６】
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【０２９１】
【表４７】
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【表４８】
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【０２９２】
【表４９】
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【表５０】
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【０２９３】
【表５１】
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【表５２】
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【０２９４】
【表５３】
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【表５４】
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【０２９５】
【表５５】
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【表５６】
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【０２９６】
【表５７】
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【表５８】
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【０２９７】
【表５９】
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【表６０】
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【０２９８】
【表６１】
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【表６２】
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【０２９９】
【表６３】
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【表６４】
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【０３００】
【表６５】
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【表６６】
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【０３０１】
【表６７】
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【表６８】
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【０３０２】
【表６９】
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【表７０】
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【０３０３】
【表７１】
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【表７２】
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【０３０４】
【表７３】
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【表７４】
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【０３０５】
【表７５】
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【表７６】
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【０３０６】
【表７７】
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【表７８】
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【０３０７】
【表７９】
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【表８０】
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【０３０８】
【表８１】
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【表８２】
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【０３０９】
【表８３】
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【表８４】
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【０３１０】
【表８５】
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【表８６】
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【０３１１】
【表８７】
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【表８８】
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【０３１２】
【表８９】
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【表９０】
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【０３１３】
【表９１】
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【表９２】
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【０３１４】
【表９３】
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【表９４】
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【０３１５】
【表９５】
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【表９６】
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【０３１６】
【表９７】
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【表９８】
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【０３１７】
【表９９】
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【表１００】
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【０３１８】
【表１０１】
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【表１０２】
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【０３１９】
【表１０３】
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【表１０４】
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【０３２０】
【表１０５】
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【表１０６】
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【０３２１】
【表１０７】
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【表１０８】
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【０３２２】
【表１０９】
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【表１１０】
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【０３２３】
【表１１１】
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【表１１２】
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【０３２４】
【表１１３】
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【表１１４】
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【０３２５】
【表１１５】
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【表１１６】
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【０６８６】
【表８３７】
2016515508.tif 000851
【表８３８】
2016515508.tif 000852
【０６８７】
【表８３９】
2016515508.tif 000853
【表８４０】
2016515508.tif 000854
【０６８８】
【表８４１】
2016515508.tif 000855
【表８４２】
2016515508.tif 000856
【０６８９】
【表８４３】
2016515508.tif 000857
【表８４４】
2016515508.tif 000858
【０６９０】
【表８４５】
2016515508.tif 000859
【表８４６】
2016515508.tif 000860
【０６９１】
【表８４７】
2016515508.tif 000861
【表８４８】
2016515508.tif 000862
【０６９２】
【表８４９】
2016515508.tif 000863
【表８５０】
2016515508.tif 000864
【０６９３】
【表８５１】
2016515508.tif 000865
【表８５２】
2016515508.tif 000866
【０６９４】
【表８５３】
2016515508.tif 000867
【表８５４】
2016515508.tif 000868
【０６９５】
【表８５５】
2016515508.tif 000869
【表８５６】
2016515508.tif 000870
【０６９６】
【表８５７】
2016515508.tif 000871
【表８５８】
2016515508.tif 000872
【０６９７】
【表８５９】
2016515508.tif 000873
【表８６０】
2016515508.tif 000874
【０６９８】
【表８６１】
2016515508.tif 000875
【表８６２】
2016515508.tif 000876
【０６９９】
【表８６３】
2016515508.tif 000877
【表８６４】
2016515508.tif 000878
【０７００】
【表８６５】
2016515508.tif 000879
【表８６６】
2016515508.tif 000880
【０７０１】
【表８６７】
2016515508.tif 000881
【表８６８】
2016515508.tif 000882
【０７０２】
【表８６９】
2016515508.tif 000883
【表８７０】
2016515508.tif 000884
【０７０３】
【表８７１】
2016515508.tif 000885
【表８７２】
2016515508.tif 000886
【０７０４】
【表８７３】
2016515508.tif 000887
【表８７４】
2016515508.tif 000888
【０７０５】
【表８７５】
2016515508.tif 000889
【表８７６】
2016515508.tif 000890
【０７０６】
【表８７７】
2016515508.tif 000891
【表８７８】
2016515508.tif 000892
【０７０７】
【表８７９】
2016515508.tif 000893
【表８８０】
2016515508.tif 000894
【０７０８】
【表８８１】
2016515508.tif 000895
【表８８２】
2016515508.tif 000896
【０７０９】
【表８８３】
2016515508.tif 000897
【表８８４】
2016515508.tif 000898
【０７１０】
【表８８５】
2016515508.tif 000899
【表８８６】
2016515508.tif 000900
【０７１１】
【表８８７】
2016515508.tif 000901
【表８８８】
2016515508.tif 000902
【０７１２】
【表８８９】
2016515508.tif 000903
【表８９０】
2016515508.tif 000904
【０７１３】
【表８９１】
2016515508.tif 000905
【表８９２】
2016515508.tif 000906
【０７１４】
【表８９３】
2016515508.tif 000907
【表８９４】
2016515508.tif 000908
【０７１５】
【表８９５】
2016515508.tif 000909
【表８９６】
2016515508.tif 000910
【０７１６】
【表８９７】
2016515508.tif 000911
【表８９８】
2016515508.tif 000912
【０７１７】
【表８９９】
2016515508.tif 000913
【表９００】
2016515508.tif 000914
【０７１８】
【表９０１】
2016515508.tif 000915
【表９０２】
2016515508.tif 000916
【０７１９】
【表９０３】
2016515508.tif 000917
【表９０４】
2016515508.tif 000918
【０７２０】
【表９０５】
2016515508.tif 000919
【表９０６】
2016515508.tif 000920
【０７２１】
【表９０７】
2016515508.tif 000921
【表９０８】
2016515508.tif 000922
【０７２２】
【表９０９】
2016515508.tif 000923
【表９１０】
2016515508.tif 000924
【０７２３】
【表９１１】
2016515508.tif 000925
【表９１２】
2016515508.tif 000926
【表９１３】
2016515508.tif 000927
【０７２４】
表１用の各列における注釈情報を以下に記載する：
【表９１４】
2016515508.tif 000928
【０７２５】
表２．ＴＣＧＡデータセットにおいてＳＡＶＩにより予測され、サンガー配列決定により体細胞の事象（腫瘍ＤＮＡに存在し、一致した正常なＤＮＡに存在しない）であることが確認された変異のリスト。第２の表のサブセットにおいて、サンガー配列決定によって首尾よく確認された変異は、灰色で強調し、一方でサンガー配列決定によって確認されなかった変異は太字で示す。
【０７２６】
【表９１５】
2016515508.tif 000929
【表９１６】
2016515508.tif 000930
【０７２７】
【表９１７】
2016515508.tif 000931
【表９１８】
2016515508.tif 000932
【０７２８】
【表９１９】
2016515508.tif 000933
【０７２９】
表３．同義を超え非同義の変異の富化によりランク付けされたＧＢＭにおいて変異した遺伝子のリスト。米国仮特許出願第６１／７９３，０８６号の表３及びＦｒａｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４５（１０）：１１４１−４９で利用可能なオンライン素材からの補足の表３は、それぞれその全体が引用により組み込まれる。
【表９２０】
2016515508.tif 000934
【０７３０】
【表９２１】
2016515508.tif 000935
【表９２２】
2016515508.tif 000936
【０７３１】
【表９２３】
2016515508.tif 000937
【表９２４】
2016515508.tif 000938
【０７３２】
【表９２５】
2016515508.tif 000939
【表９２６】
2016515508.tif 000940
【０７３３】
【表９２７】
2016515508.tif 000941
【表９２８】
2016515508.tif 000942
【０７３４】
【表９２９】
2016515508.tif 000943
【表９３０】
2016515508.tif 000944
【０７３５】
【表９３１】
2016515508.tif 000945
【表９３２】
2016515508.tif 000946
【０７３６】
【表９３３】
2016515508.tif 000947
【表９３４】
2016515508.tif 000948
【０７３７】
【表９３５】
2016515508.tif 000949
【表９３６】
2016515508.tif 000950
【０７３８】
【表９３７】
2016515508.tif 000951
【表９３８】
2016515508.tif 000952
【０７３９】
【表９３９】
2016515508.tif 000953
【表９４０】
2016515508.tif 000954
【０７４０】
【表９４１】
2016515508.tif 000955
【表９４２】
2016515508.tif 000956
【０７４１】
【表９４３】
2016515508.tif 000957
【表９４４】
2016515508.tif 000958
【０７４２】
【表９４５】
2016515508.tif 000959
【表９４６】
2016515508.tif 000960
【０７４３】
【表９４７】
2016515508.tif 000961
【表９４８】
2016515508.tif 000962
【０７４４】
【表９４９】
2016515508.tif 000963
【表９５０】
2016515508.tif 000964
【０７４５】
【表９５１】
2016515508.tif 000965
【表９５２】
2016515508.tif 000966
【０７４６】
【表９５３】
2016515508.tif 000967
【表９５４】
2016515508.tif 000968
【０７４７】
【表９５５】
2016515508.tif 000969
【表９５６】
2016515508.tif 000970
【０７４８】
【表９５７】
2016515508.tif 000971
【表９５８】
2016515508.tif 000972
【０７４９】
【表９５９】
2016515508.tif 000973
【表９６０】
2016515508.tif 000974
【０７５０】
【表９６１】
2016515508.tif 000975
【表９６２】
2016515508.tif 000976
【０７５１】
【表９６３】
2016515508.tif 000977
【表９６４】
2016515508.tif 000978
【０７５２】
【表９６５】
2016515508.tif 000979
【表９６６】
2016515508.tif 000980
【０７５３】
【表９６７】
2016515508.tif 000981
【表９６８】
2016515508.tif 000982
【０７５４】
【表９６９】
2016515508.tif 000983
【表９７０】
2016515508.tif 000984
【０７５５】
【表９７１】
2016515508.tif 000985
【表９７２】
2016515508.tif 000986
【０７５６】
【表９７３】
2016515508.tif 000987
【表９７４】
2016515508.tif 000988
【０７５７】
【表９７５】
2016515508.tif 000989
【表９７６】
2016515508.tif 000990
【０７５８】
【表９７７】
2016515508.tif 000991
【表９７８】
2016515508.tif 000992
【０７５９】
【表９７９】
2016515508.tif 000993
【表９８０】
2016515508.tif 000994
【０７６０】
【表９８１】
2016515508.tif 000995
【表９８２】
2016515508.tif 000996
【０７６１】
【表９８３】
2016515508.tif 000997
【表９８４】
2016515508.tif 000998
【０７６２】
【表９８５】
2016515508.tif 000999
【表９８６】
2016515508.tif 001000
【０７６３】
【表９８７】
2016515508.tif 001001
【表９８８】
2016515508.tif 001002
【０７６４】
【表９８９】
2016515508.tif 001003
【表９９０】
2016515508.tif 001004
【０７６５】
【表９９１】
2016515508.tif 001005
【表９９２】
2016515508.tif 001006
【０７６６】
【表９９３】
2016515508.tif 001007
【表９９４】
2016515508.tif 001008
【０７６７】
【表９９５】
2016515508.tif 001009
【表９９６】
2016515508.tif 001010
【０７６８】
【表９９７】
2016515508.tif 001011
【表９９８】
2016515508.tif 001012
【０７６９】
【表９９９】
2016515508.tif 001013
【表１０００】
2016515508.tif 001014
【０７７０】
【表１００１】
2016515508.tif 001015
【表１００２】
2016515508.tif 001016
【０７７１】
【表１００３】
2016515508.tif 001017
【表１００４】
2016515508.tif 001018
【０７７２】
【表１００５】
2016515508.tif 001019
【表１００６】
2016515508.tif 001020
【０７７３】
【表１００７】
2016515508.tif 001021
【表１００８】
2016515508.tif 001022
【０７７４】
【表１００９】
2016515508.tif 001023
【表１０１０】
2016515508.tif 001024
【０７７５】
【表１０１１】
2016515508.tif 001025
【表１０１２】
2016515508.tif 001026
【０７７６】
【表１０１３】
2016515508.tif 001027
【表１０１４】
2016515508.tif 001028
【０７７７】
【表１０１５】
2016515508.tif 001029
【表１０１６】
2016515508.tif 001030
【０７７８】
【表１０１７】
2016515508.tif 001031
【表１０１８】
2016515508.tif 001032
【０７７９】
【表１０１９】
2016515508.tif 001033
【表１０２０】
2016515508.tif 001034
【０７８０】
【表１０２１】
2016515508.tif 001035
【表１０２２】
2016515508.tif 001036
【０７８１】
【表１０２３】
2016515508.tif 001037
【表１０２４】
2016515508.tif 001038
【０７８２】
【表１０２５】
2016515508.tif 001039
【表１０２６】
2016515508.tif 001040
【０７８３】
【表１０２７】
2016515508.tif 001041
【表１０２８】
2016515508.tif 001042
【０７８４】
【表１０２９】
2016515508.tif 001043
【表１０３０】
2016515508.tif 001044
【０７８５】
【表１０３１】
2016515508.tif 001045
【表１０３２】
2016515508.tif 001046
【０７８６】
【表１０３３】
2016515508.tif 001047
【表１０３４】
2016515508.tif 001048
【０７８７】
【表１０３５】
2016515508.tif 001049
【表１０３６】
2016515508.tif 001050
【０７８８】
【表１０３７】
2016515508.tif 001051
【表１０３８】
2016515508.tif 001052
【０７８９】
【表１０３９】
2016515508.tif 001053
【０７９０】
表４．ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌにより優先度を付けられた６７の遺伝子のリスト。最初の表のサブセットの第３列では、遺伝子名に斜体（既知のＧＢＭ遺伝子）、太字（新規のＧＢＭ遺伝子、独立したＧＢＭデータセットにおいて確認される体細胞変異）、または下線（新規のＧＢＭ遺伝子、独立したＧＢＭデータセットにおいて確認されていない体細胞変異）を施している。
【表１０４０】
2016515508.tif 001054
【０７９１】
【表１０４１】
2016515508.tif 001055
【表１０４２】
2016515508.tif 001056
【０７９２】
【表１０４３】
2016515508.tif 001057
【表１０４４】
2016515508.tif 001058
【０７９３】
【表１０４５】
2016515508.tif 001059
【０７９４】
表４用の各列における注釈情報を以下に記載する
2016515508.tif 001060
【０７９５】
表５．３５のＧＢＭ試料及び一致した正常なＤＮＡの独立したデータセットからの１８のＧＢＭ遺伝子において同定された体細胞点変異。このリストに報告される各変異は、サンガー配列決定により、対応する腫瘍ＤＮＡに存在し、一致した正常なＤＮＡには存在しないと確認された。
【表１０４６】
2016515508.tif 001061
【０７９６】
【表１０４７】
2016515508.tif 001062
【表１０４８】
2016515508.tif 001063
【０７９７】
【表１０４９】
2016515508.tif 001064
【表１０５０】
2016515508.tif 001065
【０７９８】
【表１０５１】
2016515508.tif 001066
【０７９９】
表６．ＧＢＭ遺伝子のＮＣＢＩからのＥＳＴ発現報告。
【表１０５２】
2016515508.tif 001067
【０８００】
表７．ＲＮＡ配列決定を通し同定される遺伝子融合
【表１０５３】
2016515508.tif 001068
【表１０５４】
2016515508.tif 001069
【０８０１】
【表１０５５】
2016515508.tif 001070
【表１０５６】
2016515508.tif 001071
【０８０２】
【表１０５７】
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【表１０５８】
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【０９２０】
【表１２９１】
2016515508.tif 001306
【表１２９２】
2016515508.tif 001307
【０９２１】
【表１２９３】
2016515508.tif 001308
【表１２９４】
2016515508.tif 001309
【０９２２】
【表１２９５】
2016515508.tif 001310
【表１２９６】
2016515508.tif 001311
【０９２３】
【表１２９７】
2016515508.tif 001312
【表１２９８】
2016515508.tif 001313
【０９２４】
【表１２９９】
2016515508.tif 001314
【表１３００】
2016515508.tif 001315
【０９２５】
【表１３０１】
2016515508.tif 001316
【表１３０２】
2016515508.tif 001317
【０９２６】
【表１３０３】
2016515508.tif 001318
【表１３０４】
2016515508.tif 001319
【０９２７】
【表１３０５】
2016515508.tif 001320
【表１３０６】
2016515508.tif 001321
【０９２８】
【表１３０７】
2016515508.tif 001322
【表１３０８】
2016515508.tif 001323
【０９２９】
【表１３０９】
2016515508.tif 001324
【表１３１０】
2016515508.tif 001325
【０９３０】
【表１３１１】
2016515508.tif 001326
【表１３１２】
2016515508.tif 001327
【０９３１】
【表１３１３】
2016515508.tif 001328
【表１３１４】
2016515508.tif 001329
【０９３２】
【表１３１５】
2016515508.tif 001330
【表１３１６】
2016515508.tif 001331
【０９３３】
【表１３１７】
2016515508.tif 001332
【表１３１８】
2016515508.tif 001333
【０９３４】
【表１３１９】
2016515508.tif 001334
【表１３２０】
2016515508.tif 001335
【０９３５】
【表１３２１】
2016515508.tif 001336
【表１３２２】
2016515508.tif 001337
【０９３６】
表７用の各列における注釈情報を以下に記載する:
ｓａｍｐｌｅ：ＴＣＧＡまたは非公式の試料の名称。
＃ｃｈｒｏｍ５ｐ：５’染色体
＃ｓｔａｒｔ５ｐ：５’ゲノム始点座標
＃ｅｎｄ５ｐ：５’ゲノム先端座標
＃ｃｈｒｏｍ３ｐ：３’染色体
＃ｓｔａｒｔ３ｐ：３’ゲノム始点座標
＃ｅｎｄ３ｐ：３’ゲノム先端座標
ｓｔｒａｎｄ５ｐ：５’鎖
ｓｔｒａｎｄ３ｐ：３’鎖
ｇｅｎｅｓ５ｐ：５’遺伝子
ｇｅｎｅｓ３ｐ：３’遺伝子
ｔｏｔａｌ＿ｆｒａｇｓ（ｓｐｌｉｔ  ｉｎｓｅｒｔｓ＋ｓｐｌｉｔ  ｒｅａｄｓ）：スプリットインサート及び分裂の読み取りの総数
ｓｐａｎｎｉｎｇ＿ｆｒａｇｓ（ｓｐｌｉｔ  ｒｅａｄｓ）：分裂の読み取りの数
ＧｅｎｅＢｒｅａｋｐｏｉｎｔ５ｐ：５’遺伝子における切断点のゲノム座標
ＧｅｎｅＢｒｅａｋｐｏｉｎｔ３ｐ：３’遺伝子における切断点のゲノム座標
ＦｒａｍｅＴｙｐｅ：遺伝子融合の読み取り枠。値は、インフレーム、フレームシフト、またはｎｕｌｌ（Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３７．６０．ｇｔｆ  ファイルにおいて何のトランスクリプト情報も発見されなかった）を含む。
Ｆｕｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：融合ＲＮＡトランスクリプトの再構築された配列
ＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｒｔ５ｐ：５’タンパク質断片の始点座標
ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｏｐ５ｐ：５’タンパク質断片の停止座標  （切断点）
ＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｒｔ３ｐ：３’タンパク質断片の始点座標  （切断点）
ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｏｐ３ｐ：３’タンパク質断片の停止座標
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：融合タンパク質の再構築された配列
ＥｘｏｎＢｒｅａｋ５ｐ：切断点前の５’遺伝子の最後のエクソン
ＥｘｏｎＢｒｅａｋ３ｐ：切断点後の３’遺伝子の最初のエクソン。
【０９３７】
表８．全エキソームＤＮＡ配列決定により検出される遺伝子融合のゲノム切断点。各列における注釈情報を以下に記載する：
【表１３２３】
2016515508.tif 001338
【表１３２４】
2016515508.tif 001339
【０９３８】
【表１３２５】
2016515508.tif 001340
【０９３９】
表８用の各列における注釈情報を以下に記載する：
ｓａｍｐｌｅ：ＴＣＧＡ試料の名称
ｓｐｌｉｔ  ｒｅａｄｓ：分裂の読み取りの総数
ｇｅｎｅ５ｐ：５’遺伝子
ｃｈｒ５ｐ：５’染色体
ｓｅｎｓｅ５ｐ：５’センス
ｓｔａｒｔ５ｐ：５’ゲノム始点座標
ｅｎｄ５ｐ：５’ゲノム先端座標
ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ５ｐ：切断点の５’ゲノム座標
ｅｘｏｎＢｅｆｏｒｅＢｒｅａｋｐｏｉｎｔ５ｐ：切断点前の５’遺伝子のエクソン数
ｇｅｎｅ３ｐ：３’遺伝子
ｃｈｒ３ｐ：３’染色体
ｓｅｎｓｅ３ｐ：３’センス
ｓｔａｒｔ３ｐ：３’ゲノム始点座標
ｅｎｄ３ｐ：３’ゲノム先端座標
ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ３ｐ：切断点の３’ゲノム座標
ｅｘｏｎＡｆｔｅｒＢｒｅａｋｐｏｉｎｔ３ｐ：切断点後の３’遺伝子のエクソン数
ｓｐｌｉｔ  ｉｎｓｅｒｔｓ：スプリットインサートの総数
ｐｏｓＡ５ｐ：５’遺伝子における５’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｐｏｓＢ５ｐ：５’遺伝子における３’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｒｅａｄＤｉｒ５ｐ：５’遺伝子におけるスプリットインサート読み取りの読み取り方向
ｐｏｓＡ３ｐ：３’遺伝子における５’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｐｏｓＢ３ｐ：３’遺伝子における３’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｒｅａｄＤｉｒ３ｐ：３’遺伝子におけるスプリットインサート読み取りの読み取り方向。
【０９４０】
表９．ＴＣＧＡデータセットにおいてＳＡＶＩにより予測され、サンガー配列決定により体細胞の事象（腫瘍ＤＮＡに存在し、一致した正常なＤＮＡに存在しない）であることが確認された変異のリスト。サンガー配列決定によって首尾よく確認された変異は、緑色で強調し、一方でサンガー配列決定によって確認されなかった変異は赤色で強調する。
【表１３２６】
2016515508.tif 001341
【０９４１】
【表１３２７】
2016515508.tif 001342
【０９４２】
表１１．ＥＧＦＲ融合及び野生型トランスクリプトの相対的発現。発現は、融合切断点または融合トランスクリプトから除外される野生型エクソンジャンクションをカバーする読み取りの深さを使用して推定される。これらの野生型エクソンは、エクソン２５〜２６、２６〜２７、及び２７〜２８を含む。
【表１３２８】
2016515508.tif 001343
【０９４３】
表１２．全体のエキソームＤＮＡ配列決定を通し検出される遺伝子融合のゲノムの切断点。
【表１３２９】
2016515508.tif 001344
【表１３３０】
2016515508.tif 001345
【０９４４】
表１２用の各列における注釈情報を以下に記載する：
ｓａｍｐｌｅ：ＴＣＧＡ試料の名称
ｓｐｌｉｔ  ｒｅａｄｓ：分裂の読み取りの総数
ｇｅｎｅ５ｐ：５’遺伝子
ｃｈｒ５ｐ：５’染色体
ｓｅｎｓｅ５ｐ：５’センス
ｓｔａｒｔ５ｐ：５’ゲノム始点座標
ｅｎｄ５ｐ：５’ゲノム先端座標
ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ５ｐ：切断点の５’ゲノム座標
ｅｘｏｎＢｅｆｏｒｅＢｒｅａｋｐｏｉｎｔ５ｐ：切断点前の５’遺伝子のエクソン数
ｇｅｎｅ３ｐ：３’遺伝子
ｃｈｒ３ｐ：３’染色体
ｓｅｎｓｅ３ｐ：３’センス
ｓｔａｒｔ３ｐ：３’ゲノム始点座標
ｅｎｄ３ｐ：３’ゲノム先端座標
ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ３ｐ：切断点の３’ゲノム座標
ｅｘｏｎＡｆｔｅｒＢｒｅａｋｐｏｉｎｔ３ｐ：切断点後の３’遺伝子のエクソン数
ｓｐｌｉｔ  ｉｎｓｅｒｔｓ：スプリットインサートの総数
ｐｏｓＡ５ｐ：５’遺伝子における５’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｐｏｓＢ５ｐ：５’遺伝子における３’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｒｅａｄＤｉｒ５ｐ：５’遺伝子におけるスプリットインサート読み取りの読み取り方向
ｐｏｓＡ３ｐ：３’遺伝子における５’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｐｏｓＢ３ｐ：３’遺伝子における３’末端に最も近いスプリットインサート読み取りの座標
ｒｅａｄＤｉｒ３ｐ：３’遺伝子におけるスプリットインサート読み取りの読み取り方向。
【０９４５】
表１３．ＧＢＭ含有またはＥＧＦＲｖＩＩＩ再配置でないＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４及びＥＧＦＲ−ＰＳＰＨ遺伝子融合の発生の分析。
【表１３３１】
2016515508.tif 001346
表１４．ＥＧＦＲ−ＳＥＰＴ１４またはＥＧＦＲ−ＰＳＰＨを有する試料中の古典的／間葉系サブタイプの富化。
【表１３３２】
2016515508.tif 001347
フィッシャのｐ値=古典的/間葉系サブタイプの富化において０．０５００
【０９４６】
表１５．蛍光免疫染色において使用した抗体及び濃度。
【表１３３３】
2016515508.tif 001348
【０９４７】
表１６．ウエスタンブロット及び免疫沈降アッセイに使用した抗体及び濃度。
【表１３３４】
2016515508.tif 001349
【０９４８】
表１７．ｃＤＮＡから遺伝子融合をスクリーニングするために使用されるプライマー。
【表１３３５】
2016515508.tif 001350
【０９４９】
表１８．遺伝子融合のゲノムを検出するために使用されるプライマー。
【表１３３６】
2016515508.tif 001351
【０９５０】
表１９．外因性Ｍｙｃ−ＬＺＴＲ１  ＷＴ及び変異ＬＺＴＲ１−Ｒ８０１Ｗを検出する半定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマー。
【表１３３７】
2016515508.tif 001352
【０９５１】
表２０．８３のＧＢＭ試料及び一致した正常なＤＮＡの独立したデータセットからの１８のＧＢＭ遺伝子において同定された体細胞点変異。このリストに報告される各変異は、サンガー配列決定により、対応する腫瘍ＤＮＡに存在し、一致した正常なＤＮＡには存在しないと確認された。
【表１３３８】
2016515508.tif 001353
【０９５２】
【表１３３９】
2016515508.tif 001354
【表１３４０】
2016515508.tif 001355
【０９５３】
【表１３４１】
2016515508.tif 001356
【表１３４２】
2016515508.tif 001357
【０９５４】
【表１３４３】
2016515508.tif 001358
【０９５５】
表２１．ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子におけるコピー数多型及び単一ヌクレオチド多型の富化。各遺伝子について、ＳＮＶの欠失した遺伝子だけでなくＳＮＶの増幅させた遺伝子の富化の統計的有意性をフィッシャの正確確率検定を用い評価した。
【表１３４４】
2016515508.tif 001359
【０９５６】
表２１用の各列における注釈情報を以下に記載する:
ｇｅｎｅ：ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子
ｍｕｔ：変異（ＳＮＶ）を伴う試料の数
ａｍｐ＋ｍｕｔ：増幅及び変異を伴う試料の数
ａｍｐ：増幅を伴う試料の数
ｐ値（ａｍｐ＋ｍｕｔ）：増幅及び変異の富化のためのフィッシャの正確なｐ値
ｄｅｌ＋ｍｕｔ：欠失及び変異を伴う試料の数
ｄｅｌ：欠失を伴う試料の数
ｐ値（ｄｅｌ＋ｍｕｔ）：欠失及び変異の富化のためのフィッシャの正確なｐ値
【０９５７】
表２２．ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子候補におけるコピー数及び発現の相関関係。ピアソンの相関関係は対応のあるスチューデントｔ検定により計算される対応するｐ値と共に計算される。
【表１３４５】
2016515508.tif 001360
【０９５８】
表２３．ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子候補の対立遺伝子特異的発現。各変異について、読み取り数を参照（Ｒ）及び多型（Ｖ）対立遺伝子を呼び出し計算した。対応する遺伝子あたりのプールされたＰ値と同様に、多型Ｖ／（Ｖ＋Ｒ）の対立遺伝子特異的発現のスコアを計算した。最後に、コピー数及び発現の対数比を腫瘍及び通常遺伝子の間に含んだ。
【表１３４６】
2016515508.tif 001361
【０９５９】
【表１３４７】
2016515508.tif 001362
【表１３４８】
2016515508.tif 001363
【０９６０】
【表１３４９】
2016515508.tif 001364
【表１３５０】
2016515508.tif 001365
【表１３５１】
2016515508.tif 001366
【０９６１】
表２３用の各列における注釈情報を以下に記載する:
Ｇｅｎｅ：ＭｕｔＣｏｍＦｏｃａｌ遺伝子
ｓａｍｐｌｅ：ＴＣＧＡ試料
ｒｅｆ：参照対立遺伝子
ｖａｒ：多型対立遺伝子
ＣＮＶ：コピー数ｌｏｇ２比
Ｅｘｐ：発現ｌｏｇ２比
ｔｏｔａｌ＿ｄｅｐｔｈ：読み取りの総深さ
ｒｅｆ＿ｄｅｐｔｈ  Ｒ：参照対立遺伝子を呼び出す読み取りの深さ
ｖａｒ＿ｄｅｐｔｈ  Ｖ：多型対立遺伝子を呼び出す読み取りの深さ
Ｖ／（Ｖ＋Ｒ）：多型対立遺伝子の単一対立遺伝子性発現
ｐｖａｌ＿ｐｅｒ＿ｇｅｎｅ：遺伝子の単一対立遺伝子性発現のプールされたＰ値。
【図１Ａ】
2016515508.tif 001367
【図１Ｂ】
2016515508.tif 001368
【図１Ｃ】
2016515508.tif 001369
【図２Ａ】
2016515508.tif 001370
【図２Ｂ】
2016515508.tif 001371
【図２Ｃ】
2016515508.tif 001372
【図３Ａ】
2016515508.tif 001373
【図３Ｂ】
2016515508.tif 001374
【図３Ｃ】
2016515508.tif 001375
【図３Ｄ】
2016515508.tif 001376
【図３Ｅ】
2016515508.tif 001377
【図３Ｆ】
2016515508.tif 001378
【図３Ｇ】
2016515508.tif 001379
【図３Ｈ】
2016515508.tif 001380
【図４Ａ】
2016515508.tif 001381
【図４Ｂ】
2016515508.tif 001382
【図４Ｃ】
2016515508.tif 001383
【図４Ｄ】
2016515508.tif 001384
【図５Ａ】
2016515508.tif 001385
【図５Ｂ】
2016515508.tif 001386
【図５Ｃ】
2016515508.tif 001387
【図５Ｄ】
2016515508.tif 001388
【図５Ｅ】
2016515508.tif 001389
【図６】
2016515508.tif 001390
【図７】
2016515508.tif 001391
【図８Ａ】
2016515508.tif 001392
【図８Ｂ】
2016515508.tif 001393
【図９】
2016515508.tif 001394
【図１０Ａ】
2016515508.tif 001395
【図１０Ｂ】
2016515508.tif 001396
【図１０Ｃ】
2016515508.tif 001397
【図１０Ｄ】
2016515508.tif 001398
【図１１Ａ】
2016515508.tif 001399
【図１１Ｂ】
2016515508.tif 001400
【図１１Ｃ】
2016515508.tif 001401
【図１２Ａ】
2016515508.tif 001402
【図１２Ｂ】
2016515508.tif 001403
【図１２Ｃ】
2016515508.tif 001404
【図１２Ｄ】
2016515508.tif 001405
【図１３】
2016515508.tif 001406
【図１４Ａ】
2016515508.tif 001407
【図１４Ｂ】
2016515508.tif 001408
【図１４Ｃ】
2016515508.tif 001409
【図１４Ｄ】
2016515508.tif 001410
【図１５】
2016515508.tif 001411
【図１６Ａ】
2016515508.tif 001412
【図１６Ｂ】
2016515508.tif 001413
【図１６Ｃ】
2016515508.tif 001414
【図１６Ｄ】
2016515508.tif 001415
【図１７Ａ】
2016515508.tif 001416
【図１７Ｂ】
2016515508.tif 001417
【図１７Ｃ】
2016515508.tif 001418
【図１７Ｄ】
2016515508.tif 001419
【図１７Ｅ】
2016515508.tif 001420
【図１７Ｆ】
2016515508.tif 001421
【図１８Ａ】
2016515508.tif 001422
【図１８Ｂ】
2016515508.tif 001423
【図１８Ｃ】
2016515508.tif 001424
【図１９Ａ】
2016515508.tif 001425
【図１９Ｂ】
2016515508.tif 001426
【図１９Ｃ】
2016515508.tif 001427
【図１９Ｄ】
2016515508.tif 001428
【図１９Ｅ】
2016515508.tif 001429
【図１９Ｆ】
2016515508.tif 001430
【図２０Ａ】
2016515508.tif 001431
【図２０Ｂ】
2016515508.tif 001432
【図２０Ｃ】
2016515508.tif 001433
【図２０Ｄ】
2016515508.tif 001434
【図２０Ｅ】
2016515508.tif 001435
【図２１】
2016515508.tif 001436
【図２２Ａ】
2016515508.tif 001437
【図２２Ｂ】
2016515508.tif 001438
【図２３Ａ】
2016515508.tif 001439
【図２３Ｂ】
2016515508.tif 001440
【図２３Ｃ】
2016515508.tif 001441
【図２３Ｄ】
2016515508.tif 001442
【図２４】
2016515508.tif 001443
【図２５】
2016515508.tif 001444
【図２６】
2016515508.tif 001445
【配列表】
2016515508000001.app
【国際調査報告】
2016515508.tif 001446
2016515508.tif 001447
2016515508.tif 001448
2016515508.tif 001449