(57)【要約】  本発明は、高濃度にてＬ−トリプトファンを産生するために、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形された、Ｌ−トリプトファン産生能が向上したエシェリキア属微生物および前記微生物を培養するステップを含むＬ−トリプトファンの産生方法に関する。前記遺伝子組み換え大腸菌は、Ｌ−トリプトファンを高い歩留まりにて産生することができて医薬および薬学産業、飼料産業において、特に、動物飼料のために有効に使用可能である。
2016515400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形された、Ｌ−トリプトファン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項２】
酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のＬ−トリプトファン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項３】
前記変形は、アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターが形質導入されて行われるか、あるいは、前記ポリヌクレオチドが染色体内に挿入されて行われることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−トリプトファン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号９の塩基配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のＬ−トリプトファン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項５】
前記エシェリキア属微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−トリプトファン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物。
【請求項６】
請求項１から請求項５のうちのいずれか一項に記載のＬ−トリプトファン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物を培養するステップと、
前記培養液からＬ−トリプトファンを分離するステップと、
を含むＬ−トリプトファンの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−トリプトファンの産生能が向上した組み換え微生物およびこの微生物を用いてＬ−トリプトファンを産生する方法に関する。
【０００２】
Ｌ−トリプトファン（Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）は、必須アミノ酸の一種であり、飼料および食品添加剤として広く用いられている。Ｌ−トリプトファンは、主としてコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス型細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物を用いた発酵法により産生され、これらの菌株の野生型菌株から誘導された人工変異株がＬ−トリプトファンの産生のために用いられている。
【０００３】
Ｌ−トリプトファンは、芳香族アミノ酸の共通中間物質であるコリスミ酸（ｃｈｏｒｉｓｍｉｃａｃｉｄ）から生合成される。ホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）およびＤ−エリトロース−４−リン酸（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から始まる共同のシキミ酸（ｓｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄ）経路を経て生成されたコリスミ酸にトリプトファンオペロンであるｔｒｐＥＤＣＢＡが合成する５種類の酵素が作用してＬ−トリプトファンが生合成される。まず、アントラニル酸合成酵素（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＴｒｐＥ−ＴｒｐＤ重合体）がコリスミ酸に作用してアントラニル酸（ａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）を合成し、次いで、アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＴｒｐＤ）が作用してホスホリボシルアントラニル酸（Ｎ −（５’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ）を合成する。次いで、ホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＴｒｐＣ）およびインドール−３−グリセロールリン酸合成酵素（ｉｎｄｏｌｅ−３−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＴｒｐＣ）が作用してインドール−３−グリセロールリン酸（ｉｎｄｏｌｅ−３−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を合成し、ここにトリプトファン合成酵素（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓｙｎｔｈａｓｅ、ＴｒｐＢ−ＴｒｐＡ重合体）が作用してＬ−トリプトファン合成を完成する（図１；Ｂｏｎｇｇａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｅｔａｂＥｎｇ，  ３，  ２８９−３００，  ２００１  非特許文献１）。
【０００４】
大腸菌の場合、ｔｒｐＥおよびｔｒｐＤ遺伝子が生成するタンパク質が重合体をなしてアントラニル酸合成酵素を形成してアントラニル酸を合成する。このようにして合成されたアントラニル酸は、ｔｒｐＤ遺伝子が生成するアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素により５− ホスホリボシル１−ピロリン酸（５−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ１−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＲＰＰ）と反応してホスホリボシルアントラニル酸となる。このとき、ｔｒｐＤ遺伝子が生成するタンパク質は、ｔｒｐＥ遺伝子が生成するタンパク質と重合体をなしてアントラニル酸合成酵素として作用するか、あるいは、単独でアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素として作用するが、野生型大腸菌においてはこれらの二種類の作用がバランスをとっている。
【０００５】
野生型大腸菌の場合、細胞内のトリプトファンの生合成に際して補助因子として活用されるＰＲＰＰの濃度は、約１８０μＭである（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  ５，  ５９５−５９９，  ２００９  非特許文献２）。アントラニル酸の生合成が強化されたＬ−トリプトファン産生菌株において細胞の外部に排出されて蓄積されるアントラニル酸の濃度が最大数ｍＭであるのに対し、細胞内のＰＲＰＰの濃度は、アントラニル酸の濃度に比べて遥かに低い。低いＰＲＰＰ濃度は、ホスホリボシルアントラニル酸の生成に際して制限因子として作用して全体的なＬ−トリプトファンの合成速度を阻害し、細胞内／外へのアントラニル酸の蓄積を促す。このため、ＰＲＰＰへの馴染み度がさらに高いアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を用いるほど、細胞内／外のアントラニル酸蓄積を防ぎ、Ｌ−トリプトファンの生合成速度を高めることができる。
【０００６】
Ｌ−トリプトファン産生菌株を改良する以前の報告のうち、このようにアントラニル酸合成酵素およびアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素活性間のバランスをとりながら生合成経路を強化させる技術は未だにない。
【０００７】
研究資料によれば、大腸菌のＰＲＰＰに対するＫｍ値が５０であるのに対し、酵母のＰＲＰＰに対するＫｍ値は約２２．４±２．６である（Ｈｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １８０，３３−４０，  １９８９  非特許文献３）。このため、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、大腸菌のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素よりもＰＲＰＰへの馴染み度が高い。このため、大腸菌のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素よりも酵母のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を用いる場合、Ｌ−トリプトファン生合成経路が強化された微生物におけるアントラニル酸の細胞内／外の蓄積を防ぎ、Ｌ−トリプトファンの生合成を増加させる効果がさらに高いことが見込まれる。
【０００８】
本発明者らは、産業的に有用なＬ−トリプトファンを量産するために、大腸菌のコリスミ酸生合成経路およびｔｒｐオペロンを強化させていたところ、前記両経路を強化させるほどアントラニル酸が細胞内／外に蓄積され、これにより、非正常培養が現れるということを見出した。この理由から、Ｌ−トリプトファン生合成経路が強化された微生物に不足したアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の発現を強化させることは、アントラニル酸の細胞内／外への蓄積を防ぎ、Ｌ−トリプトファンの生合成を増加させることにつながる見込みであると思われて鋭意研究を行い続けた結果、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｎｇｇａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｅｔａｂＥｎｇ，  ３，  ２８９−３００，  ２００１
【非特許文献２】Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  ５，  ５９５−５９９，  ２００９
【非特許文献３】Ｈｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １８０，３３−４０，  １９８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素（ｔｒｐ４）を発現するように変形された、Ｌ−トリプトファン産生能が向上した微生物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記微生物を用いてＬ−トリプトファンを産生する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形された、Ｌ−トリプトファン産生能が向上したエシェリキア属微生物を提供する。
本発明の他の目的は、前記エシェリキア属微生物を培養するステップと、前記培養液からＬ−トリプトファンを分離するステップと、を含むＬ−トリプトファンを産生する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微生物は、高い歩留まりにてＬ−トリプトファンを産生することができて医薬産業、飼料産業、特に、動物飼料分野に有効に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、大腸菌におけるＬ−トリプトファン生合成経路およびここに与るタンパク質を図式化したものである。
【図２】図２は、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素のアミノ酸配列の相同性を図式化したものである。
【図３】図３は、ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤおよびｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４ベクターを図式化したものである。
【図４】図４は、発酵４０時間におけるＬ−トリプトファン産生母菌株とベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤまたはｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４が取り込まれた菌株のＬ−トリプトファンの産生性を比較したものである。
【図５】図５は、Ｌ−トリプトファン産生母菌株とベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤまたはｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４が取り込まれた菌株の発酵後のトリプトファン前駆体であるアントラニル酸の蓄積量を比較したものである。
【図６】図６は、発酵４０時間におけるＬ−トリプトファン産生母菌株と遺伝体にｔｒｐ４遺伝子発現カセットが挿入された菌株のＬ−トリプトファンの産生性を比較したものである。
【図７】図７は、Ｌ−トリプトファン産生母菌株と遺伝体にｔｒｐ４遺伝子発現カセットが挿入された菌株の発酵後のトリプトファン前駆体であるアントラニル酸の蓄積量を比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形された、Ｌ−トリプトファン産生能が向上したエシェリキア属微生物を提供する。
アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、アントラニル酸およびＰＲＰＰを用いてホスホリボシルアントラニル酸を合成する酵素である。Ｌ−トリプトファン産生能が強化された産生菌株の場合、強化されたシキミ酸経路を通じてコリスミ酸の合成が増加され、これは、アントラニル酸の増加につながる。増加されたアントラニル酸は、細胞内／外に蓄積されて細胞の正常生理活性を妨げてＬ−トリプトファンの産生を阻害する。
このため、アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の発現強化を通じて細胞内／外へのアントラニル酸の蓄積を防ぎ、Ｌ−トリプトファンの生合成を強化しようとする。
このとき、大腸菌のｔｒｐＤ遺伝子が暗号化させるアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素よりもＰＲＰＰへの馴染み性により優れている酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を用いることにより、ホスホリボシルアントラニル酸の合成速度をさらに増加させようとする。
【００１５】
本発明のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は酵母由来のものであり、様々な種の酵母由来の当該酵素のアミノ酸配列は８７％以上の相同性を示すことが分かる（図２）。好ましくは、本発明のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。しかしながら、微生物の種または菌株に応じて前記活性を示す酵素のアミノ酸の配列に相違点が存在する場合があるため、これに何ら限定されない。
【００１６】
すなわち、本発明のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の活性を維持または強化できる限り、配列番号１のアミノ酸配列の一つ以上の位置における一つまたは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、添加または類似アミノ酸への変異を引き起こす沈黙突然変異などを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを暗号化させる突然変異体または人為的な変形体であり得る。ここで、「数個」とは、タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類に応じて異なるが、具体的には、２個から２０個、好ましくは、２個から１０個、さらに好ましくは、２個から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、添加または逆位などには、前記酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の活性を含有する微生物の個体または種の相違に基づく場合などの天然的に生じる突然変異または人為的な変異により発生するものも含まれる。
【００１７】
本発明の活性強化は、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターが形質導入されるか、あるいは、前記ポリヌクレオチドが染色体内に挿入されて達成され得る。
【００１８】
前記酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させるポリヌクレオチドは、配列番号９に記載されている。前記ポリヌクレオチドは、前記宿主細胞に形質導入され得るが、前記導入されるべき宿主細胞において使用し易いコドンに置換されてもよく、Ｎ末端またはＣ末端が延長または削除されてもよく、発現量の調節のために開始コドンが変更されてもよい。このため、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の変異体の前記酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の活性を維持または強化できる限り、配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するタンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを有してもよく、最も好ましくは、配列番号９に記載のポリヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
本発明において、前記用語「相同性」は、二つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、点数、同一性、類似度などの媒介変数（パラメータ）を計算するＢＬＡＳＴ２．０を用いる、当業者にとって周知の方法により決定され得る。
また、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号９のポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチド配列から製造されたプローブと厳しい条件下で混成化されてもよく、正常的に機能する酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させる変異型であってもよい。
【００２０】
本発明において、前記用語「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド同士の特異的な混成化を可能にする条件のことをいう。これは、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ ａｌ．，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）または分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に具体的に記載されており、例えば、６５℃の混成化緩衝液（３．５ＸＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニールピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン、２．５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭＥＤＴＡ）における混成化を記載している。ＳＳＣは、ｐＨ７．０の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムである。混成化後に、ＤＮＡが伝達されているメンブレインを室温下で２ＸＳＳＣで洗浄した後、６８℃の温度で０．１〜０．５ＸＳＳＣ／０．１ＸＳＤＳで洗浄する。
【００２１】
本発明において用いられるベクターは、宿主中において複製可能なものであれば、特に制限がなく、当業界において周知の任意のベクターが使用可能である。通常的に用いられるベクターの例としては、天然状態あるいは組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルスおよびバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどが使用可能であり、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などが使用可能である。本発明において使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターが使用可能である。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどが使用可能である。最も好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＬ、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターが使用可能である。
【００２２】
また、細菌内染色体挿入用のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を介して染色体内の特定の遺伝子座に目的タンパク質を暗号化させる新規なポリヌクレオチドを挿入することができる。前記新規なポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界における周知の任意の方法、例えば、相同組み換えにより行われる。本発明の染色体挿入用ポリヌクレオチドは、相同組み換えを引き起こして、染色体内に挿入可能であるため、前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカーをさらに含むことができる。選別マーカーは、前記ポリヌクレオチドに形質転換された細胞を選別、すなわち、目的ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を与えるマーカーが使用可能である。選択剤が処理された環境下では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、あるいは、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【００２３】
本発明において、前記用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に取り込んで宿主細胞内において前記ポリヌクレオチドが暗号化させるタンパク質が発現できるようにすることをいう。取り込まれたポリヌクレオチドは、宿主細胞内において発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置してもよく、染色体外に位置してもよい。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現可能なものである限り、いかなる形で取り込まれても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形で宿主細胞に取り込まれ得る。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、以下、「ＯＲＦ」と略称する。）に作動可能なように連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含む。本発明において用いられるプロモーターは、宿主細胞内において目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドの転写を高い頻度にて開始するものであれば、特に限定されるものではなく、当業界における周知の任意のプロモーターが使用可能である。好ましくは、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＣＪ１プロモーター（大韓民国登録特許番号第０６２００９２号）などが使用可能である。最も好ましくは、ｔｒｃプロモーター、ＣＪ１プロモーターが使用可能である。
【００２４】
前記発現カセットは、自体的に複製可能な発現ベクターの形であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に取り込まれて、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能なように連結されているものであってもよい。
本発明の微生物には、Ｌ−トリプトファンが産生できる限り、原核微生物のいずれも含まれる。例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌株が含まれ得る。好ましくは、エシェリキア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【００２５】
本発明の微生物がＬ−トリプトファンを産生するためには、さらにアントラニル酸合成酵素（ｔｒｐＥ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸合成酵素（ａｒｏＧ）、３−デヒドロカイネート合成酵素（ａｒｏＢ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼ（ａｒｏＬ）、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ａｒｏＡ）、コリスミ酸合成酵素（ａｒｏＣ）、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼおよびトリプトファン合成酵素（ｔｒｐＡＢ）から選ばれる一種以上の酵素活性が強化される必要があるか、あるいは、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼの活性が弱化される必要がある。なお、アントラニル酸合成酵素およびホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼのうちの一種以上がＬ−トリプトファンおよびＬ−セリンによるフィードバック阻害が解除されるように変異を有する酵素を取り込むように変形され得る。
【００２６】
具体的な実施形態において、大腸菌に配列番号１に記載の酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させる遺伝子（ｔｒｐ４）を含むベクターに形質転換し、製作された菌株をＣＡ０４−２００６と命名し、２０１３年０４月０８日付けで大韓民国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１-２２１番地に所在する国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１４０８Ｐで寄託した。
また、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形されたＬ−トリプトファン産生能を有するエシェリキア属微生物を培養するステップおよび前記培養液からＬ−トリプトファンを分離するステップを含むＬ−トリプトファンを製造する方法を提供する。
【００２７】
本発明の前記培養過程は、当業界において周知の適当な培地および培養条件により行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて手軽に調整して用いることができる。前記培養方法の例には、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）および流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の微生物の培養に用いられる培地およびその他の培養条件は、通常のエシェリキア属微生物の培養に用いられる培地であればいなかるものも使用可能であり、本発明の微生物の要求条件を適切に満たさなければならない。
【００２８】
本発明の具体的な態様として、本発明の微生物を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地内において好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養する。
このとき、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸およびクエン酸などのアルコールおよび有機酸、グルタミン酸、メチオニンおよびリシンなどのアミノ酸などが挙げられ、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜糖蜜、米糠、カッサバ、甘蔗の搾りかすおよびトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源が使用可能であり、好ましくは、グルコースおよび殺菌済みの前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などの炭水化物であり、その他の適正量の炭素源が制限なしに種々に使用可能である。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸およびペプトン、ＮＺ−アミン、肉類エキス、酵母エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物など有機窒素源が使用可能である。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用可能である。前記培地には、リン源として、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウムおよび対応するナトリウム含有塩が含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが使用可能であり、これらに加えて、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが含まれ得る。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式により添加可能である。
【００２９】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を培養物に適切な方式を用いて添加して、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えることができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有ガスを注入してもよく、嫌気および未好気状態を維持するために、ガスを注入しなくてもよく、あるいは、窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。
【００３０】
培養物の温度は、普通、２７℃〜３７℃、好ましくは、３０℃〜３５℃である。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで続き、好ましくは、１０〜１００時間である。
【００３１】
本発明の前記培養ステップにおいて産生されたＬ−トリプトファンは、さらに精製または回収してもよく、前記精製または回収方法は、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などに応じて当該分野における公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするＬ−トリプトファンを精製または回収することができる。
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることはない。
【実施例１】
【００３２】
実施例１：ＣＪ１プロモーターおよび大腸菌由来のｔｒｐＤ遺伝子または酵母由来のｔｒｐ４遺伝子を含む組み換えベクターの製作
１−１．ＣＪ１プロモーター断片の準備
ＣＪ１プロモーターを含むＤＮＡ断片を得るために、ＣＪ１プロモーターを含んでいるｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ１プラスミド（米国登録特許番号第８０４８６４８号）を鋳型として用いて連鎖重合反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、「ＰＣＲ」と略称する。）を行った。ＰＣＲＨＬプレミックスキット（ＢＩＯＮＥＥＲ社製、以下、同じ。）を用い、このときに用いたプライマーは、配列番号２および３であり、ＰＣＲ反応条件は、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）は９４℃で３０秒間、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は５５℃で３０秒間、伸張（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）は７２℃で３０秒間であり、これを３０回繰り返し行った。
前記ＰＣＲ結果物（以下、「ＰＣＪ１断片」と命名する。）は、１％アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。
【００３３】
１−２．ｔｒｐＤおよびｔｒｐ４遺伝子断片の準備
ｔｒｐＤ遺伝子のＯＲＦを得るために、野生型大腸菌Ｋ−１２由来のＷ３１１０菌株を韓国微生物保存センサー（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）から購入し、ｔｒｐ４遺伝子のＯＲＦを得るために、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株を米国生物資源センター（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。
前記菌株から遺伝体ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて遺伝体ＤＮＡを準備した。前記大腸菌遺伝体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４および５のプライマーを用いて、ＰＣＲにより配列番号６のｔｒｐＤ遺伝子ＯＲＦに相当するＤＮＡ断片１，６０７ｂｐを増幅した。また、酵母遺伝体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７及び８のプライマーを用いて、ＰＣＲにより配列番号９のｔｒｐ４遺伝子ＯＲＦに相当するＤＮＡ断片１，１５４ｂｐを増幅した。前記ＰＣＲ結果物（以下、それぞれ「ｔｒｐＤ断片」、「ｔｒｐ４断片」と命名する。）は、０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。
【００３４】
１−３．組み換えベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤおよびｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４の製造
前記実施例１−１において準備したＰＣＪ１断片およびｐＣＬ１９２０ベクターを制限酵素ＥｃｏＲ1で処理した後、０．８％アガロースゲルで溶離した。それぞれのＤＮＡ断片をＲａｐｉｄＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＲＯＣＨＥ社製、以下、同じ。）を用いて３０分間結さつした後、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、これをスペクチノマイシンを含有するＬＢプレートに塗抹して形質転換済み菌体を選別した。
選別された菌体は、白金耳を用いてスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地２０ｍＬに接種して一晩中培養した後、プラスミド抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、以下、同じ。）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素ＥｃｏＲＩを処理して確認し（データは図示せず）、配列番号２および３のプライマーでＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターを「ｐＣＬ−ＰＣＪ１」と命名した。
前記実施例１−２において準備したｔｒｐＤ断片またはｔｒｐ４断片および前記ｐＣＬ−ＰＣＪ１ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで処理した後、０．８％アガロースゲルで溶離した。それぞれのＤＮＡ断片をＲａｐｉｄＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＲＯＣＨＥ社製、以下、同じ。）を用いて３０分間結さつした後、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換された菌体は、上記の方法と同様にして選別し、同方法を用いて形質転換菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを処理して確認し（データは図示せず）、配列番号２および５、または配列番号２および８のプライマーでＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをそれぞれ「ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤ」および「ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」と命名した（図３）。
【００３５】
実施例２：組み換えベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤ若しくはｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４が取り込まれたＬ−トリプトファン産生菌株の製作
実施例１において準備したｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤおよびｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４組み換えベクターは、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社が供給するＴＳＳ試薬（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いてＬ−トリプトファン産生母菌株に取り込んだ。
この実施形態においては、Ｌ−トリプトファン産生母菌株として大腸菌ＫＣＣＭ１１１６６Ｐを用いた。大腸菌ＫＣＣＭ１１１６６Ｐは、大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ（大韓民国登録特許番号第１０−０７９２０９５号）から製作されたＬ−トリプトファン産生菌株であり、染色体上のｔｅｈＢ遺伝子が不活性化され、ＮＡＤキナーゼの活性が増加されたことを特徴とするＬ−トリプトファン産生能を有する組み換え大腸菌である（大韓民国特許公開番号第１０−２０１２−００８３７９５号）。
Ｌ−トリプトファン産生母菌株を一白金耳に見合う分だけ４ｍＬのＬＢ培地に接種して３時間培養した後に遠心分離した。分離した細胞に５０ｎｇのｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤベクタープラスミドまたはｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４ベクタープラスミドおよびＴＳＳ試薬を１００μＬ添加して勢いよく混合した。その後、単一段階形質転換技法（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；  Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６，  ２１７２−２１７５，  １９８９）を用いてＬ−トリプトファン産生母菌株に取り込み、これをスペクチノマイシン含有ＬＢプレートに塗抹して形質転換済み菌株を選別した。形質転換済み菌株を確認するために、形質転換済み菌株からプラスミドＤＮＡを回収し、実施例１−３の方法と同様にして制限酵素処理およびＰＣＲを行って確認した。前記形質転換済み菌株をそれぞれ「Ｃｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤ」および「Ｃｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」と命名した。
【００３６】
実施例３：形質転換済み菌株のＬ−トリプトファン産生性および生理活性の比較
前記実施例２において準備した形質転換済み菌株を下記表１のトリプトファン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してＬ−トリプトファン産生性を比較した。
【００３７】
【表１】
2016515400.tif 000003
【００３８】
３７℃の培養器においてＬＢ固体培地中に一晩中培養したＬ−トリプトファン産生母菌株（Ｃｏｎ）、Ｃｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐＤおよびＣｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４菌株を前記表１の２５ｍＬ力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを３７℃、２００ｒｐｍの培養器において４０時間培養し、その結果を下記表２および３に示す。
【表２】
2016515400.tif 000004
【表３】
2016515400.tif 000005
【００３９】
前記表２に示すように、Ｌ−トリプトファン産生母菌株は、４０時間培養した場合に６．９ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを産生したが、Ｃｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４菌株およびＣｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４菌株は、それぞれ８．０ｇ／Ｌおよび１０．３ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを産生して母菌株に比べてそれぞれ１．１ｇ／Ｌおよび３．４ｇ／Ｌの向上したＬ−トリプトファン産生性を示した（それぞれ１６％、４９％増加）。
【００４０】
また、前記表３に示すように、形質転換済み菌株は、Ｌ−トリプトファン産生母菌株と比較したとき、糖を用いる速度や細胞成長の側面からみて類似の様相を示し、発酵副産物であるアセテートの蓄積も類似若しくは低いレベルを示した（データは図示せず）。したがって、前記形質転換済み菌株は、Ｌ−トリプトファン産生母菌株とほとんど同じ生理活性を示すということを確認することができた。
特に、Ｌ−トリプトファン産生母菌株の場合、発酵中のアントラニル酸の蓄積を伴う異常発酵現象により正常的な発酵を維持できない場合がしばしば現れる。このため、Ｌ−トリプトファン産生母菌株の発酵に際しては、アントラニル酸が過度に蓄積されないように発酵因子を調節することが重要であり、持続的にモニターリングし続けなければならないという難点がある。このため、アントラニル酸が少量蓄積されるＬ−トリプトファン産生菌株は、異常発酵の頻度を下げることができるという点で重要視される。前記表２および図３に示すように、ｔｒｐＤまたはｔｒｐ４遺伝子をｐＣＬベクターを用いて発現する形質転換済み菌株は、Ｌ−トリプトファン産生母菌株に比べてアントラニル酸が少量蓄積される現象を示した。
大腸菌由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素と、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現させる形質転換済み菌株を比較する場合、ＰＲＰＰへの馴染み性に優れたｔｒｐ４遺伝子を発現させる形質転換体の方が、Ｌ−トリプトファンの産生性の増加およびアントラニル酸の蓄積の減少の側面からみてなお一層優れていることを確認することができた。このため、この形質転換済み菌株を用いてＬ−トリプトファンを産生する場合、より高い産生性にてＬ−トリプトファンを産生することができるということを確認し、より高い発酵安定性を維持して全体的なＬ−トリプトファンの産生性を高く維持することができるものと結論付けることができる。
【００４１】
実施例４：Ｌ−トリプトファン産生菌株への組み換えベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４の取り込みおよび形質転換体のＬ−トリプトファン産生性の比較
他のＬ−トリプトファン産生菌株からも実施例３と同じ効果が得られるか否かを確認するために、ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４ベクターを取り込んで実施例３の方法と同様にしてＬ−トリプトファン産生性を比較した。
この実施例に用いられたＬ−トリプトファン産生大腸菌は、ＫＣＣＭ１０８０５Ｐ（大韓民国登録特許番号第０８５０８５３号）およびＫＣＣＭ１０８１４Ｐ（大韓民国登録特許番号第０８３８０３６号）である。ＫＣＣＭ１０８０５Ｐ大腸菌変異株は、トリプトファン類似体であるトリプトファンヒドロキサメート耐性を有するＬ−トリプトファン産生大腸菌ＣＪ２８５（大韓民国特許公告１０−２００５−００５９６８５）由来の菌株であり、亜硝酸塩還元作用に与るｎｒｆＥ遺伝子が相同組み換えにより不活性化されたことを特徴とするＬ−トリプトファン産生大腸菌である。ＫＣＣＭ１０８１４Ｐ大腸菌変異株は、ＣＪ２８５由来の菌株であり、内部生体膜を合成するのに必要なタンパク質をコーディングするｙｊｅＯ遺伝子が欠損されたことを特徴とするＬ−トリプトファン産生大腸菌である。
【００４２】
４−１．組み換えベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４が取り込まれた色々なＬ−トリプトファン産生菌株の製作
Ｌ−トリプトファン産生菌株菌であるＫＣＣＭ１０８０５ＰおよびＫＣＣＭ１０８１４Ｐに組み換えベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４を実施例２の方法と同様にして取り込んで形質転換済み菌株を製作し、前記形質転換済み菌株をそれぞれ「ＫＣＣＭ１０８０５Ｐ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」および「ＫＣＣＭ１０８１４Ｐ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」と命名した。
【００４３】
４−２．組み換えベクターｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４が取り込まれた色々なＬ−トリプトファン菌株におけるＬ−トリプトファン産生性の比較
前記実施例４−１において製作した形質転換済み菌株を実施例３の方法と同様にして三角フラスコにおいて培養してＬ−トリプトファン産生性を比較し、その結果を下記表４に示す。
【表４】
2016515400.tif 000006
【００４４】
前記表４に示すように、３種類のＬ−トリプトファン産生菌株において全てベクターで酵母由来ｔｒｐ４遺伝子を発現させた場合、Ｌ−トリプトファン産生性が０．９ｇ／Ｌから３．７ｇ／Ｌへと向上する結果を示した。また、３種類の菌株において全てベクターで酵母由来ｔｒｐ４遺伝子を発現させた場合にアントラニル酸が大幅に減少するということを確認した。このため、酵母由来ｔｒｐ４遺伝子をＬ−トリプトファン産生菌株において発現させる場合、Ｌ−トリプトファンの産生性を向上させながらアントラニル酸の蓄積を抑える効果があるということを確認した。
【００４５】
実施例５：Ｌ−トリプトファン産生母菌株の染色体の上へのＣＪ１プロモーターおよびｔｒｐ４遺伝子の取り込みによる組み換えＬ−トリプトファン産生菌株の製作
実施例３において製作したＣｏｎ／ｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４菌株の場合、形質転換済み菌株が細胞分列する過程でプラスミドを消失する可能性があり、これにより、ｔｒｐ４遺伝子の発現カセットを消失する虞がある。この場合、Ｌ−トリプトファン産生母菌株に戻ってしまい、安定したｔｒｐ４遺伝子の発現カセットが維持し難くなる。また、プラスミドにある抗生剤耐性選別マーカーがＬ−トリプトファン産生母菌株の遺伝体に取り込まれて当該抗生剤に対して耐性を有する突然変異菌株が生成されることが危惧される。
そこで、本発明においては、ｔｒｐ４遺伝子の発現カセットのみをＬ−トリプトファン産生母菌株の遺伝体にあるｙｂｉＸ遺伝子座に挿入してこのような問題を解決しようとする。
【００４６】
５−１．ＰＣＪ１−ｔｒｐ４断片およびクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子を含むベクターの準備
遺伝体の内部へのｔｒｐ４遺伝子発現カセットの挿入を確認するための選別マーカーとして、クロラムフェニコールに抵抗性を与えるクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子を用い、このために、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子を含むｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣベクター（大韓民国公開特許：第２００９−００７５５４９号）を用いた。
【００４７】
実施例１−３において製作したｐＣＬ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４を鋳型として配列番号１０および１１のプライマーでＰＣＲを行ってＰＣＪ１−ｔｒｐ４断片を準備した。準備した断片およびｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣベクターに制限酵素であるＫｐｎＩおよびＳｐｅＩを処理した後、０．８％アガロースゲルで溶離した。それぞれのＤＮＡ断片をＲａｐｉｄＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＲＯＣＨＥ社製、以下、同じ。）を用いて３０分間結さつした後、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換された菌体はクロラムフェニコールを含むＬＢ固体培地において選別した。選別したコロニーをＬＢ液体培地に培養してプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素処理およびシーケンシングを通じてＰＣＪ１−ｔｒｐ４遺伝子およびクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子が含まれているベクターが正常に製作されたことを確認した。確認されたベクターは、「ｐｍｌｏｘ−Ｃｍｔ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」と命名した。
【００４８】
５−２．ｙｂｉＸ遺伝子座にＰＣＪ１−ｔｒｐ４遺伝子およびクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入するための断片の準備
ｙｂｉＸ遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：１２９３０９６１）は、これまで機能が明確に究明されていない遺伝子であり、欠損時に細胞内のＡＴＰ水位が高まることが知られている（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，  ２９７，  ２１７−２２４，  ２００９）。大腸菌においてｙｂｉＸ遺伝子を欠損しても大腸菌の生理活性に大きく影響しないことが知られている。このため、本発明においては、ｔｒｐ４遺伝子発現カセットをＬ−トリプトファン産生母菌株の遺伝体にあるｙｂｉＸ遺伝子座に挿入した。
【００４９】
ｙｂｉＸ遺伝子座に挿入するためのｔｒｐ４発現カセット断片は、実施例５−１において製作したｐｍｌｏｘ−Ｃｍｔ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４プラスミドを鋳型として配列番号１２および１３のプライマーを用いてＰＣＲを行って準備した。準備したＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲルで溶離した。このようにして溶離したＤＮＡ断片を再び鋳型として配列番号１４および１５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。このようにして準備したＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲルで溶離した。
準備されたＤＮＡ断片は、５’および３’末端にそれぞれｙｂｉＸ遺伝子などの配列を１００ｂｐ含む断片であり、Ｌ−トリプトファン産生菌株のｙｂｉＸ遺伝子座から遺伝子組み換え酵素により遺伝体内に挿入され得る。準備したＤＮＡ断片は、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ、サーモサイエンティフィック社製）を用いて濃度を測定し、これを「ｙｂｉＸ：：Ｃｍ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」と命名し、その配列を配列番号１６に示す。
【００５０】
５−３．Ｌ−トリプトファン産生菌株のｙｂｉＸ遺伝子座へのＰＣＪ１−ｔｒｐ４の酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素発現カセットの挿入
ｙｂｉＸ遺伝子座にｔｒｐ４遺伝子発現カセットを遺伝子組み換え酵素を用いて挿入した。このために、ＤａｔｓｅｎｋｏＫＡらが開発したラムダレッド組み換え酵素を用いた単一段階遺伝子不活性化技法を応用した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９７，  ６６４０−６６４５，  ２０００）。
ラムダレッド組み換え酵素を発現させるベクターであるｐＫＤ４６プラスミドを実施例２の方法と同様にしてＬ−トリプトファン産生菌株（ＫＣＣＭ１０８１２Ｐ）に取り込んだ。ｐＫＤ４６ベクターが取り込まれたＬ−トリプトファン産生菌株をアンピシリンを含むＬＢ固体培地において選別した。選別したｐＫＤ４６ベクターが取り込まれたＬ−トリプトファン産生菌株は、ラムダレッド組み換え酵素の発現を誘導するために、５ｍＭのアラビノースを含む２０ｍＬの液体ＬＢ培地において培養した。菌体の量が５10１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに増えたときに遠心分離して菌体を回収し、これを冷たい１０％グリセロール溶液で３回洗浄した。
このようにして準備したＬ−トリプトファン産生菌株に電気穿孔法を用いて実施例５−２において準備した５００ｎｇのｙｂｉＸ：：Ｃｍ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４ＤＮＡ断片をと取り込んだ。前記ＤＮＡ断片が取り込まれたＬ−トリプトファン産生菌株は、ラムダレッド組み換え酵素によりｙｂｉＸ遺伝子座において遺伝子組み換えが起きてクロラムフェニコール抵抗性遺伝子およびｔｒｐ４遺伝子発現カセットがｙｂｉＸ遺伝子座に挿入される。この菌株はクロラムフェニコールに対して抵抗性を示すため、クロラムフェニコールを含むＬＢ固体培地において選別した。このようにして選別した菌株は、配列番号１７および１８のプライマーを用いて、コロニーＰＣＲによりｙｂｉＸ遺伝子座にＣｍ−ＰＣＪ１−ｔｒｐ４断片が挿入されたことを確認した。
次いで、ｐＫＤ４６ベクターは温度に敏感な複製起点を有しているため、選別した菌株を４０℃以上で培養して菌体内からｐＫＤ４６ベクターを除去し、これは、アンピシリンを含む固体ＬＢ培地において選別した菌株が生長しないことにより確認した。
次いで、Ｌ−トリプトファン産生菌株の遺伝体からクロラムフェニコールに対して抵抗性を示す遺伝子を除去するために、ｐＪＷ１６８プラスミド（Ｐａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，２４７，  ２５５−２６４，  ２０００）を菌株に実施例２の方法と同様にして取り込んだ。取り込んだｐＪＷ１６８プラスミドからＣｒｅ組み換え酵素を発現させるために、アンピシリンを含むＬＢ培地にイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を塗抹して菌株を選別した。選別された菌株は、Ｃｒｅ組み換え酵素によりｍｕｔａｎｔｌｏｘＰ位において遺伝子組み換えが起きてクロラムフェニコールに対して抵抗性を示す遺伝子が除去され、これを配列番号１７および１８のプライマーで確認した。このようにして確認した菌株は、ｔｒｐ４遺伝子発現カセットが挿入されたＬ−トリプトファン産生菌株であり、「Ｃｏｎ／ｙｂｉＸ：：ＰＣＪ１−ｔｒｐ４」と命名した。
【００５１】
実施例６：染色体の上にＰＣＪ１−ｔｒｐ４の発現カセットが挿入された形質転換体のＬ−トリプトファン産生性および生理活性の比較
前記実施例５において準備した形質転換体を前記表１のトリプトファン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してＬ−トリプトファン産生性を比較した。
３７℃の培養器においてＬＢ固体培地中において一晩中培養したＬ−トリプトファン産生母菌株（Ｃｏｎ）、Ｃｏｎ／ｙｂｉＸ：：ＰＣＪ１−ｔｒｐ４菌株を表１の２５ｍＬの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを３７℃、２００ｒｐｍの培養器において４０時間培養し、その結果を下記表５および６に示す。
【表５】
2016515400.tif 000007
【表６】
2016515400.tif 000008
【００５２】
前記表５に示すように、母菌株は、４０時間培養した場合に６．３ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを産生したが、Ｃｏｎ／ｙｂｉＸ：：ＰＣＪ１−ｔｒｐ４菌株は、９．２ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを産生して母菌株に比べて２．９ｇ／Ｌ（４６％増加）の向上したＬ−トリプトファン産生性を示しているということを確認した。
また、表６に示すように、Ｃｏｎ／ｙｂｉＸ：：ＰＣＪ１−ｔｒｐ４は、ベクターとしてｔｒｐ４遺伝子発現カセットを取り込んだときと同様に、糖を用いる速度や細胞の成長の側面からみて母菌株とほとんど同じ様相を示し、発酵副産物であるアセテートの蓄積度もほとんど同じであるか、あるいは、それよりも低いレベルを示した（データは図示せず）。
【００５３】
このため、前記Ｃｏｎ／ｙｂｉＸ：：ＰＣＪ１−ｔｒｐ４もまた、ベクターとしてｔｒｐ４遺伝子発現カセットを取り込んだ形質転換体と同様に、Ｌ−トリプトファン産生母菌株とほとんど同じ生理活性を示すということを確認することができた。発酵中のアントラニル酸の蓄積量も、ベクターとしてｔｒｐ４遺伝子発現カセットを取り込んだ形質転換体と同様に、Ｌ−トリプトファン産生母菌株に比べて大幅に減少するということを確認した。このため、この形質転換体を用いてＬ−トリプトファンを産生する場合よりも高い産生性にてＬ−トリプトファンを産生することができるということを確認し、より高い発酵安定性を維持して全体的なＬ−トリプトファンの産生性を高く維持することができるものと結論付けることができる。
寄託書コピー
【表７】
2016515400.tif 000009
【図１】
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【図２】
2016515400.tif 000011
【図３】
2016515400.tif 000012
【図４】
2016515400.tif 000013
【図５】
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【図６】
2016515400.tif 000015
【図７】
2016515400.tif 000016
【配列表】
2016515400000001.app
【国際調査報告】
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