(57)【要約】本発明は、一部において神経変性疾患及び障害を治療するための方法に基づく。具体的には、本発明は、神経幹細胞（NSC）及び／または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を使用して神経変性障害を治療するための方法を開示する。本発明はまた、対象においてドーパミンを放出させてドーパミンレベルを増加させるために、内因性ドーパミン作動性ニューロンを誘導する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患または障害を治療するための方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これにより該障害を治療する、方法。
【請求項２】
対象が、ヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
神経幹細胞またはPSCが、ヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
PSCが、投与の前に部分的にまたは完全に分化される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
PSCが、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）及び誘導された多能性幹細胞（iPSC）からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
PSCが、ヒト単為生殖幹細胞である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）及びハンチントン病からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
神経変性疾患または障害が、パーキンソン病である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
NSCまたはPSC由来ニューロン前駆細胞が、インビボにおいてドーパミン作動性ニューロンに分化する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
NSCまたはPSC由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞が、対象におけるドーパミンレベルを増加させる、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
NSCまたはPSC由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞が、ドーパミンを放出するために内因性ドーパミン作動性ニューロンを誘導する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
a）ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；並びに
b）チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤でhPSCを処理する工程
を含む方法によって、NSCが得られる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
PSC由来ニューロンまたはニューロン前駆細胞が、ドーパミン作動性である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるドーパミンレベルを増加する方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これによりドーパミンレベルを増加する、方法。
【請求項１５】
ドーパミンを放出するために内因性ドーパミン作動性（DA）ニューロンを誘導する方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これにより、ドーパミンを放出するために内因性DAニューロンを誘導する、方法。
【請求項１６】
神経変性疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、
a）ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；
b）チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤でhPSCを処理する工程；並びに
c）対象の脳に該細胞を投与する工程
を含み、これにより神経変性障害を治療する、方法。
【請求項１７】
hPSCが、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）及び誘導された多能性幹細胞（iPSC）からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
hPSCが、単為生殖または核移植によって得られる、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
hPSCが、
a）ヒト卵母細胞を単為生殖で活性化する工程であって、活性化が、
i）高O2圧力にてイオノフォアと卵母細胞とを接触させること、及び
ii）低O2圧力下でセリンスレオニンキナーゼ阻害剤と卵母細胞とを接触させること
を含む、工程；
b）胚盤胞形成まで低O2圧力にて工程（a）の活性卵母細胞を培養する工程；
c）胚盤胞を支持細胞の層へ移し、移された胚盤胞を高O2圧力下で培養する工程；
d）工程（c）の胚盤胞の栄養外胚葉から内細胞塊（ICM）を機械的に単離する工程；並びに
e）支持細胞の層上で工程（d）のICMの細胞を培養する工程であって、培養する工程（e）が、高O2圧力下で実施され、これによりヒト幹細胞を産生する、工程
を含む方法によって得られる、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
CK1阻害剤が、SB2180708である、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
BMP阻害剤が、ドルソモルフィン、LD-193189及びDMH-1からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
神経変性疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、
a）ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；
b）チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤で該細胞を処理する工程；
c）ググルステロンで該細胞を処理する工程；並びに
d）対象の脳に該細胞を投与する工程
を含み、
これにより神経変性障害を治療する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、該して、神経変性障害または疾患の診断、予後、進行及び治療に関する。より具体的には、本発明は、神経変性疾患の治療のための神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）に由来するニューロンもしくはニューロン前駆細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞（hPSC）は、数多くの細胞型に分化することができる細胞である。幹細胞は、2つの重要な特徴によってその他の細胞型から区別される。第1に、これらは、時には長期の無活動の後に、細胞分裂を介してそれ自体を再生することができる分化していない細胞である。第2に、一定の生理的または実験的条件下で、これらは、特殊な機能を持つ組織特異的または臓器特異的細胞になるように誘導することができる。腸及び骨髄などのいくつかの器官では、幹細胞は、定期的に分裂して、使い古された、またはダメージを受けた組織を修復し、及び置換する。しかし、膵臓及び心臓などのその他の器官では、幹細胞は、特殊な条件下でのみ分裂する。
【０００３】
胚発生の間、幹細胞は、3つの主要な細胞集団：外胚葉、中胚葉及び確定的内胚葉から、体組織を形成する。中胚葉は、血液細胞、内皮細胞、心臓及び骨格筋及び脂肪細胞を生じる。確定的内胚葉は、肝臓、膵臓及び肺を生成する。外胚葉は、神経系、皮膚及び副腎組織を生じる。
【０００４】
幹細胞は、健康及び医学的な研究の多くの異なる領域において潜在性を有する。癌及び先天性欠損などの最も重篤な医学的状態のいくつかは、細胞が形質転換を受けるときに生じる問題が原因である。正常細胞発生及び分化機構を理解することにより、これらの状態をより適切に理解することができるだろう。
【０００５】
幹細胞のもう一つの潜在性適用は、医学療法のために細胞及び組織を作製することである。今日、提供された臓器及び組織は、病気にかかるか、または破壊されたものを置換するために使用されることが多い。残念なことに、移植を必要とする人々の数は、移植に利用できる臓器の数をはるかに超える。幹細胞は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、火傷、心臓病、糖尿病及び関節炎を含む無数の疾患、状態及び障害を治療するための置換細胞及び組織の再生可能な供与源の可能性を提供する。
【０００６】
神経変性疾患は、ニューロンまたはニューロンの機能の進行性の喪失によって特徴づけられる。一般的な神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病である。たとえば、パーキンソン病（PD）は、黒質緻密部における中脳ドーパミンニューロンの進行性変性によって生じる神経変性障害である。現在のところ、PDの治療法はなく、深脳刺激及びレボドパなどの処置は、症候のいくらかを緩和することができるが、時間とともに有効性を失う。黒質において局在的にDAニューロンが喪失しているという性質は、ヒト多能性幹細胞（hPSC）から分化された神経幹細胞（NSC）またはニューロンのいずれかの神経細胞をPD患者の脳へ移植することによる細胞置換療法の可能性を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一部において、幹細胞療法が神経変性障害の治療のために有益であるという発見に基づく。具体的には、本発明は、神経幹細胞（NSC）及び／または多能性幹細胞（PSC）に由来するニューロンもしくはニューロン前駆細胞を使用して神経変性障害を治療するための方法を開示する。本発明はまた、対象においてドーパミンを放出しドーパミンレベルを増大するために、内因性ドーパミン作動性ニューロンを誘導する方法を開示する。
【０００８】
一つの実施形態において、本発明は、神経変性疾患または障害を治療するための方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これにより障害を治療する、方法を提供する。一つの態様において、対象は、ヒトである。もう一つの態様において、神経幹細胞またはPSCは、ヒトである。さらなる態様において、PSCは、投与の前に、部分的にまたは完全に分化される。さらなる実施形態において、PSCは、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）または誘導された多能性幹細胞（iPSC）である。好ましい態様において、PSCは、ヒト単為生殖幹細胞である。一つの態様において、神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）及びハンチントン病である。具体的態様において、神経変性疾患または障害は、パーキンソン病である。さらなる態様において、NSCまたはPSC由来ニューロン前駆細胞は、インビボにおいてドーパミン作動性ニューロンに分化する。一つの態様において、NSCまたはPSC由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞は、対象におけるドーパミンレベルを増加させる。もう一つの態様において、NSCまたはPSC由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞は、内因性ドーパミン作動性ニューロンを誘導してドーパミンを放出する。さらなる態様において、NSCは、以下を含む方法によって得られる：ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；並びにチェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤でhPSCを処理する工程。一つの態様において、多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞は、ドーパミン作動性である。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるドーパミンレベルを増加する方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これによりドーパミンレベルを増加する、方法を提供する。
【００１０】
もう一つの実施形態において、本発明は、ドーパミンを放出するために内因性ドーパミン作動性（DA）ニューロンを誘導する方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与することを含み、これにより、ドーパミンを放出するために内因性DAニューロンを誘導する、方法を提供する。
【００１１】
さらなる実施形態において、神経変性疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤でhPSCを処理する工程；並びに対象の脳に該細胞を投与する工程を含み、これにより神経変性障害を治療する方法を提供する。一つの態様において、hPSCは、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）または誘導された多分化能幹細胞（iPSC）である。好ましい態様において、hPSCは、単為生殖または核移植によって得られる。さらなる態様において、hPSCは、以下を含む方法によって得られる：ヒト卵母細胞を単為生殖で活性化する工程であって、活性化が、高O2圧力にてイオノフォアと卵母細胞とを接触させること、及び低O2圧力下でセリンスレオニンキナーゼ阻害剤と卵母細胞とを接触させることを含む、工程；胚盤胞形成まで低O2圧力にて活性卵母細胞を培養する工程；胚盤胞を支持細胞の層へ移し、移された胚盤胞を高O2圧力下で培養する工程；胚盤胞の栄養外胚葉から内細胞塊（ICM）を機械的に単離する工程；並びに高O2圧力下で支持細胞の層上でICMの細胞を培養し、これによりヒト幹細胞を産生する工程。一つの態様において、CK1阻害剤は、SB2180708である。もう一つの態様において、BMP阻害剤は、ドルソモルフィン、LD-193189またはDMH-1である。
【００１２】
一つの実施形態において、本発明は、神経変性疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤で該細胞を処理する工程；ググルステロンで該細胞を処理する工程；並びに対象の脳に該細胞を投与する工程を含み、これにより神経変性障害を治療する、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1A〜Cは、hPSCからのNSC及びDAニューロン前駆体の導出を示す。（A）：NSC及びDAニューロン前駆細胞へのhPSCの分化の流れ図。（B〜C）：NSCにおけるPAX6、ネスチン及びムサシ（B）、及びDAニューロン前駆細胞におけるNURR1、FOXA2及びTUJ1（C）の免疫蛍光タンパク質発現解析。スケールバー= 100μm。
【図２】図2A〜Bは、hPSC由来NSC及びDAニューロン前駆細胞の遺伝子発現解析を示す。（A）：RT-PCRによるNSC、DAニューロン前駆細胞及びhPSCの遺伝子発現解析。（B）：DAニューロン前駆細胞とNSCとの間の示差的に発現された遺伝子を示すヒートマップ。
【図３】図3A〜Eは、移植を受けた6-OHDA病変ラットの挙動、生化学及び移植解析を示す。（A）：NSC及びDAニューロン前駆細胞を移植した6-OHDA病変ラットにおけるアンフェタミンで誘導される回転解析。（B）：NSC、DAニューロン前駆細胞及び偽対照を移植したラット脳におけるドーパミンレベル。（C）：ヒト特異的マーカー（STEM121）で検出した、移植片の移植28週後のNSC及びDAニューロン前駆細胞の移植及び生存。（D）：NSC及びDAニューロン前駆細胞を移植したラット脳において検出されるヒト細胞の数。（E）：移植されたNSC（STEM121）は、増殖マーカーKi67と共染色されなかった。スケールバー= 100μm。
【図４】図4A〜Cは、6-OHDA病変ラットにおける移植片の遊走及び免疫応答を示す。（A）：黒質に移植されたNSCの遊走を示す略図。矢状面は、線条体（冠状切断における赤い点）における注射部位と黒質（SN）との間の相対距離を示す。（B）：ラットにおける神経膠の瘢痕（GFAP）及びDAニューロン前駆細胞移植片（STEM121）に対する小膠細胞数（IBA-1）の増大。（C）：ラットにおいて、移植されたNSCを囲む神経膠の瘢痕（GFAP）またはIBA-1+小膠細胞は見いだされなかった。スケールバー= 100μm。
【図５】図5A〜Dは、移植を受けたMPTP処理非ヒト霊長類における挙動を示す。NSC［Z722（A）及びZ721（B）］及びDAニューロン前駆細胞[Z724（C）及びZ743（D）］を移植したサルのパーキンソン及び健康スコア。「健康挙動」の、及び「パーキンソンスコア」の線形回帰からの予測値を細胞注射前及び後にプロットしてある（直線）。これらのそれぞれは、回帰線より上及び下にプロットされた（曲線）95%の信頼レベルを有する。
【図６】図6A〜Dは、移植を受けたMPTP処理非ヒト霊長類の生化学的及び組織学的解析を示す。（A〜B）：NSC及びDAニューロン前駆細胞を移植したサルのドーパミンレベル（A）及びHVA/DA比（B）の生化学的解析。（C〜D）チロシンヒドロキシラーゼ（TH）について染色されたNSC及びDAニューロン前駆細胞を移植したサルの線条体組織（C）及び黒質（D）の免疫組織学的解析。スケールバー= Cについて1cm及びDについて100μm。
【図７】図7A〜Eは、MPTP処理非ヒト霊長類における移植された細胞の免疫応答及び表現型を示す。（A）：星状細胞マーカー（GFAP）及び小膠細胞マーカー（IBA-1）について染色したNSCまたはDAニューロン前駆細胞（STEM121）を移植したサル脳組織。（B）：TUJ1、TH、NURR1及びFOXA2について染色したDAニューロン前駆細胞移植片（STEM121）。（C）：移植されたNSC（STEM121）は、未分化にみえ（ネスチン）、及び黒質線状体の経路に沿って見いだされた（下部パネル）。（D）：NSC移植したサルの黒質。白い矢印は、宿主DAニューロン前駆細胞（TH）に密着したヒトNSC（STEM121）を示す。（E）：DAニューロン前駆細胞に分化した少ない割合の移植されたNSC（〜1%）。ヒトNSC由来ニューロン（STEM121）に対する黄色の線及び白い矢印は、TH、GIRK2、VMAT2及びSYPと同時標識している。スケールバー= 100μm。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、幹細胞療法が神経変性障害の治療のために有益であるという発見に基づく。具体的には、本発明は、神経幹細胞（NSC）及び／または多能性幹細胞（PSC）に由来するニューロンもしくはニューロン前駆細胞を使用して神経変性障害を治療するための方法を開示する。本発明はまた、対象においてドーパミンを放出しドーパミンレベルを増大するために、内因性ドーパミン作動性（DA）ニューロンを誘導する方法を開示する。
【００１５】
本組成物及び方法が記述される前に、本発明は記述した特定の組成物、方法及び実験条件に限定されないことを理解すべきであり、そのような組成物、方法及び条件を変更してもよい。本明細書に使用される用語法は、具体的な実施形態を記述する目的のためのみにあり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、限定することを意図しないことも十分に理解される。
【００１６】
この明細書及び添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が別途はっきり指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、たとえば、「方法」に対する言及は、本明細書において記述したタイプの1つまたは複数の方法及び／または工程を含み、それはこの開示等を読むことにより当業者に明らかになるだろう。
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門的及び科学的用語は、本発明が属する技術における当業者によって理解されるものと同じ意味を一般に有する。本明細書において記述したものに対する任意の方法及び類似の材料または均等物を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで記述してある。
【００１８】
本発明は、神経幹細胞（NSC）多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与することによる神経変性障害の治療のための方法を提供する。
【００１９】
NSCは、神経性疾患及び障害の治療において重要な役割を果たし得る。神経変性は、ニューロンの死を含むニューロンの構造または機能の進行性の喪失のための包括的な用語である。パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病を含む多くの神経変性疾患は、神経変性プロセスの結果として生じ、及び進行性の神経系機能不全によって特徴づけられる。神経性の疾患及び障害は、アルツハイマー病及びその他の認知症、脳癌、神経変性疾患、脳炎、癲癇、遺伝的脳疾患、頭及び脳形成異常、水頭症、脳卒中、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ALSまたはルー・ゲーリック病）、ハンチントン病、プリオン病、脳卒中及びその他を含むが、限定されない。
【００２０】
NSCは、死滅ニューロンの遊走及び置換に関与することが示されている。加えて、マウスにおける脳卒中の間の海馬幹細胞の役割が解明されている。これらの結果は、NSCが傷害の結果として成体脳において関与し得ることを証明した。さらにまた、NSCが定方向の様式で脳腫瘍に遊走することが証明されている。さらに、傷害に対するNSCの応答のための分子機構が調査されている。SDF-1aなどの傷害の間に放出されるケモカインは、マウスにおける傷害の領域へのヒト及びマウスNSCの定方向の遊走を担う。傷害環境において機能するさらなる機構の調査及びこれらが急性及び慢性疾患の際にNSCの応答にどのように影響するかは、重大な研究事項である。
【００２１】
一つの実施形態において、本発明は、神経変性疾患または障害を治療するための方法であって、その必要のある対象に対して、対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これにより障害を治療する、方法を提供する。一つの態様において、対象は、ヒトである。もう一つの態様において、神経幹細胞またはPSCは、ヒトである。さらなる態様において、PSCは、投与の前に、部分的または完全に分化される。さらなる実施形態において、PSCは、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）または誘導された多能性幹細胞（iPSC）である。好ましい態様において、PSCは、ヒト単為生殖幹細胞である。一つの態様において、神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）及びハンチントン病である。具体的態様において、神経変性疾患または障害は、パーキンソン病である。さらなる態様において、NSCまたはPSC由来ニューロン前駆細胞は、インビボにおいてドーパミン作動性ニューロンに分化する。一つの態様において、NSCまたはPSC由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞は、対象におけるドーパミンレベルを増加させる。もう一つの態様において、NSCまたはPSC由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞は、内因性ドーパミン作動性ニューロンを誘導してドーパミンを放出する。さらなる態様において、NSCは、以下を含む方法によって得られる：ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；及びチェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤でhPSCを処理する工程。一つの態様において、多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンまたはニューロン前駆細胞は、ドーパミン作動性である。
【００２２】
本明細書に使用される、「神経変性疾患または障害」は、ニューロンまたはニューロンの機能の進行性の喪失によって特徴づけられる任意の疾患または障害をいう。神経変性疾患または障害の例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALSまたはルー・ゲーリック病）及びハンチントン病を含む。
【００２３】
アルツハイマー病は、大脳皮質及び一定の皮質下領域におけるニューロン及びシナプスの喪失によって特徴づけられる。この喪失は、影響を受けた領域の全体的な萎縮を生じ、それには側頭葉及び頭頂葉、並びに前頭皮質及び帯状回の一部における変性が含まれる。
【００２４】
アルツハイマー病は、脳における異常に折り畳まれたA-ベータの蓄積及びタウタンパク質によって引き起こされるタンパク質ミスフォールディング疾患（プロテオパチー）であると仮定されている。プラークは、ベータ-アミロイドと呼ばれる（またA-ベータまたはAβと書かれる）長さ39〜43アミノ酸の小さなペプチドで構成される。ベータ-アミロイドは、ニューロンの膜を貫通する膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）と呼ばれるより大きなタンパク質からの断片である。APPは、ニューロン成長、生存及び傷害後修復に重要である。アルツハイマー病では、未知のプロセスにより、APPを、酵素を介したタンパク質分解によってより小さな断片に分割させる。これらの断片の1つは、ベータ-アミロイドの原繊維を生じ、これが密度の高い構成で外側ニューロンに沈着する老人斑として公知の凝集塊を形成する。
【００２５】
パーキンソン病（PD）は、2番目に一般的な神経変性障害であり、運動緩徐、硬直、静止震動及び姿勢不安定性として顕在化する。PDの粗有病率は、100,000人あたり15人〜100,000人あたり12,500人の範囲と報告され、PDの発病率は100,000人あたり15人〜100,000人あたり328人であり、本疾患は、アジア諸国においてより一般的ではない。パーキンソン病は、中枢神経系の変性障害である。これは、黒質、中脳の領域においてドーパミンを生成する細胞の死によって生じ；細胞死の原因は、未知である。
【００２６】
パーキンソン病（PD）は、黒質緻密部における中脳ドーパミン（DA）ニューロンの進行性の変性によって生じる神経変性障害である。DAニューロンの変性は、運動系の緩やかな機能不全を生じさせ、とりわけ、ふるえ、硬直及び運動緩徐などの症候をまねく。現在のところ、PDの治療法はなく、深脳刺激及びレボドパなどの処置は、症候のいくらかを緩和することができるが、時間とともに有効性が弱まる傾向がある。しかし、黒質（SN）において局在的にDAニューロンが喪失しているという性質により、細胞置換療法がPD患者を治療するための魅力的なアプローチになる。
【００２７】
パーキンソン病において脳細胞が失われる機構は、ダメージを受けた細胞におけるユビキチンに結合したタンパク質アルファ-シヌクレインの異常な蓄積からなり得る。アルファ-シヌクレイン-ユビキチン複合体は、プロテオゾームに導くことができない。このタンパク質蓄積は、レビー小体と呼ばれるタンパク質の細胞質内封入体を形成する。疾患の病原性についての最新の研究は、アルファ-シヌクレインによるドーパミン作動性ニューロンの死が2つの主要な細胞の細胞小器官-小胞体（ER）及びゴルジ装置の間でタンパク質を輸送する機構の欠損のためであることが示されている。Rab1のようなあるタンパク質は、動物モデルにおいてアルファ-シヌクレインによって生じるこの欠損を逆転させ得る。
【００２８】
最近の研究は、アルファ-シヌクレインの軸索輸送の障害がレビー小体におけるその蓄積をまねくことを示唆する。実験は、培養されたニューロンの軸索を介した、野生型及び2つの家族性パーキンソン病関連突然変異体アルファ-シヌクレインの輸送割合の減少を示している。アルファ-シヌクレインによる膜損傷は、もう一つのパーキンソン病機構であり得る。
【００２９】
ハンチントン病（HD）は、アストログリオーシス及び中型有棘ニューロンの喪失を生じさせる。脳の領域は、これらの構造及びこれらが含むニューロンのタイプによって影響を受け、細胞を累積的に失うことでサイズが減少する。影響を受ける領域は、主に線条体であるが、前頭及び側頭皮質も影響を受ける。線条体の視床下核は、制御シグナルを淡蒼球に送り、これが運動を開始し、及び調節する。したがって、視床下核からのより弱いシグナルは、運動の開始及び調整の低下を引き起こし、結果としてこの障害の特徴的な動きを生じる。
【００３０】
変異ハンチントンは、凝集体を生じやすいタンパク質である。細胞の天然のクリアランスプロセスの間、これらのタンパク質は、リソソームによる破壊のために細胞体へ逆行性に輸送される。分子モーター並びに微小管に損傷を与えることにより、これらの突然変異体タンパク質凝集体がBDNFなどの重要な積荷の逆行性輸送に損傷を与える可能性がある。
【００３１】
筋萎縮性側索硬化症（ALS/ルー・ゲーリック病）は、運動ニューロンが変性のために選択的にターゲットされる疾患である。1993年に、酸化防止酵素Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）をコードする遺伝子におけるミスセンス突然変異が、家族性筋萎縮性側索硬化症である患者のサブセットにおいて発見された。この発見により、研究者は、SOD1によって媒介される疾患の機構を明らかにすることに注目した。しかし、SOD1変異体毒性の根底にある病原性機構は、いまだ解明されていない。より最近では、TDP-43及びFUSタンパク質凝集体が、この疾患のいくつかのケースに関与しており、染色体9（C9orf72）における突然変異は、散発性ALSで最も一般的な公知の原因であると考えられる。
【００３２】
本明細書において記述した神経幹細胞（NSC）、ドーパミン作動性（DA）ニューロン及びニューロン前駆細胞を得る方法、並びに生じる幹細胞及びニューロンは、胚性幹細胞などのヒト多能性幹細胞（hPSC）から生成される。本明細書に使用される、「胚性」は、単一接合体で開始し、発達した配偶子細胞以外の多能性または全能細胞をもはや含まない多細胞性構造で終了する生物の発生段階の範囲をいう。配偶子融合に由来する胚に加えて、「胚性」という用語は、体細胞の細胞核移植に由来する胚をいう。ヒト幹細胞は、当該技術分野において公知である方法を使用して、実質的な分化を伴わない多能性状態で培養物中に維持することができる。このような方法は、たとえば米国特許第5,453,357号、第5,670,372号、第5,690,926号、第5,843,780号、第6,200,806号及び第6,251,671号において記述されており、これらの開示は、これらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００３３】
本明細書に使用される、「多能性」または「多能性細胞（multipotent）」は、限られた数のその他の特定の細胞型を生じ得る細胞タイプをいう。多能性細胞の例は、限られた数のその他の細胞を生じることができる外胚葉細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞及び神経幹細胞を含む。
【００３４】
本明細書に使用される、「多能性細胞（pluripotent）」は、長期の、理論的に無期限の期間の間、インビトロにおいて未分化状態に維持することができ、異なる分化した組織型、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉を生じることができる細胞をいう。ヒト多能性幹細胞（hPSC）は、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）及び誘導された多能性幹細胞（iPSC）を含むが、限定されない。このようなhPSCを得る方法は、当該技術分野において周知である。
【００３５】
hPSCを得る1つの方法は、単為生殖による。「単為生殖」（「単為生殖で活性化される」及び「単為発生で活性化される」は、本明細書において交換可能に使用される）は、精子進入の非存在下で卵母細胞の活性化が生じるプロセスをいい、全ての雌性起源のDNAを含む卵母細胞または胚性細胞、たとえば割球の活性化によって得られる栄養外胚葉及び内細胞塊を含む早期段階胚の発生をいう。関連した態様において、「単為生殖生物」は、このような活性化によって得られる、結果として生じる細胞をいう。もう一つの関連した態様において、「胚盤胞」は、外栄養芽細胞及び内細胞塊（ICM）でできた細胞の中空球を含む、受精または活性化された卵母細胞の卵割段階をいう。さらに関連した態様において、「胚盤胞形成」は、卵母細胞受精または活性化の後のプロセスをいい、ここで、卵母細胞は、外栄養芽細胞及びICM（たとえば、5〜6日）でできた細胞の中空球へと発生できるように、培地においてその後一定時間培養される。
【００３６】
hPSCを得るもう一つの方法は、核移植を介する。本明細書に使用される「核移植」は、その内因性核DNAを除去する、または不活性化するための移植または融合の前、同時または後に、適切な受容細胞、典型的には処理されるのと同じまたは異なる種の卵母細胞内への、ドナー細胞またはドナー細胞からのDNAの融合または移植をいう。核移植のために使用するドナー細胞は、胚性及び分化細胞、たとえば体細胞及び胚細胞を含む。ドナー細胞は、増殖性細胞周期（G1、G2、SまたはM）または非増殖（G0または休止）にあってもよい。好ましくは、ドナー細胞またはドナー細胞からのDNAは、増殖している哺乳動物細胞培養、たとえば繊維芽細胞の細胞培養に由来する。ドナー細胞は、任意でトランスジェニックでもよく、すなわち、これは、1つまたは複数の遺伝的付加、置換または欠失修飾を含んでいてもよい。
【００３７】
hPSCを得るためのさらなる方法は、細胞の再プログラミングを介して誘導された多能性幹細胞を得ることである。Takahashi et al.（Cell 131、861-872（2007））は、任意の胚またはES（胚性幹）細胞を使用することなく、分化された細胞を再プログラムし、及びES細胞に類似の多能性及び発生能力を有する誘導性多能性幹細胞を確立するための方法を開示している。Takahashi et al.は、分化した繊維芽細胞について種々の異なる核を再プログラムする因子を記述し、これは、以下の4遺伝子の産物を含む：Octファミリー遺伝子；Soxファミリー遺伝子；Klfファミリー遺伝子；及びMycファミリー遺伝子。
【００３８】
細胞の多能性状態は、適切な条件下で細胞を培養することによって、たとえば繊維芽細胞支持細胞層またはもう一つの支持細胞層または白血病抑制因子（LIF）を含む培地で培養することによって、好ましくは維持される。このような培養した細胞の多能性状態は、種々の方法、たとえば（i）多能性細胞に特有のマーカーの発現の確認；（ii）多能性細胞の遺伝子型を発現する細胞を含むキメラ動物の産生；（iii）インビボにおいて様々な分化された細胞型の産生を伴う動物（たとえばSCIDマウス）への細胞の注射；及び（iv）インビトロにおける胚様体およその他の分化された細胞型への細胞の分化の観察（たとえば支持細胞層またはLIFの非存在下において培養したとき）によって確認することができる。
【００３９】
本発明において使用される細胞の多能性状態は、種々の方法によって確認することができる。たとえば、細胞を特徴的な胚性幹細胞マーカーの有無について試験することができる。ヒト胚性幹細胞の場合において、このようなマーカーの例は、上記で明らかにされており、SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81及びOCT 4を含み、及び当該技術分野において公知である。
【００４０】
生じる多能性細胞及び細胞株、好ましくはヒト多能性細胞及び細胞株は、多数の治療上及び診断上の用途を有する。このような多能性細胞は、多数の疾患状態の治療における細胞移植療法または遺伝子療法（遺伝子組み換えされた場合）のために使用してもよい。
【００４１】
ヒト多能性幹細胞（hPSC）は、このような細胞によって産生されるヒト胚性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、誘導された多能性幹細胞及び細胞株を含むが、限定されない。hPSCは、神経幹細胞を得ることが望まれるまで、ルーチンの継代によって多能性状態で培地において維持される。ヒト単為生殖幹細胞株の例は、LLC2P及びLLC12PHを含む。
【００４２】
「NSC」（また「多能性神経幹細胞」とも呼ばれる）は、以下の特性の1つまたは複数を示す：1）ネスチンの発現；2）Sox2の発現；3）ムサシ1の発現；4）自己複製を経る能力（単層として、または懸濁培養において神経球体として）；5）ニューロン、ニューロンの特異的サブタイプ、星状細胞及びオリゴデンドロサイトに分化する能力；及び6）NSCについて典型的な形態学的特徴。
【００４３】
NSCは、神経系の主な表現型を生じる、自己複製する多能性細胞である。NSCは、主にニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトに分化する。
【００４４】
NSCは、神経幹細胞マーカーの発現増加を検出することによって同定することができ、これは以下を含むが、限定されない：ABCG2、ASCL1/Mash1、β-III チューブリン、BMI-1、Brg1、BRN2、CDCP1、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP、FABP7/B- SLAIN1、FABP8/M-FABP、FGF R4、FOXA2、FOXO4、Frizzled-9、GFAP、Glut1、HOXB1、LMX1A、MAP2、ムサシ-1、ムサシ-2、ネスチン、ニューロD1、ノギン、ノッチ-1、ノッチ-2、ヌクレオステミン、オリゴデンドロサイトマーカーO4、OTX2、PAX6、PDGF Rアルファ、プロミニン 2、SOX1、SOX2、SOX3、SOX9、SOX11、SOX21、SSEA-1、ST6GALNAC5、TUBB3、TRAF-4及び／またはビメンチン。
【００４５】
本明細書に使用される、「神経幹細胞を誘導する化合物」は、NSCになるようにhPSCを誘導する化合物である。このような化合物は、チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BPM）阻害剤を含むが、限定されない。CK1阻害剤の例は、SB-218078、ヒメニアルジシン、デブロモヒメニアルジシン、PD0166285、13-ヒドロキシ-15-オキソゾアパタ、グラニュラチミド、イソグラニュラチミド及びS27888を含むが、限定されない。BMP阻害剤の例は、ドルソモルフィン、LD-193189及びDMH-1を含むが、限定されない。
【００４６】
一旦NSCが得られたら、長期の、理論的に無期限の期間の間、星状細胞、ニューロン及びオリゴデンドロサイトなどのその他の神経細胞型に分化する能力を保持しながら、その細胞をインビトロにおいて維持してもよい。実施例に記載したように、少なくとも7回の継代でNSC培地中においてMatrigel被覆したプレート上で、hPSC由来NSCを培養することができる。
【００４７】
PSC、NSC及びPSC由来ニューロン前駆細胞は、既定の化学的条件下でドーパミン作動性ニューロンに分化することができる。
【００４８】
本明細書に使用される、「分化」は、これらの細胞が一定の分化した機能を担い、及び一定のその他の分化した機能的ユニットに変化する能力を失わせるように、細胞において生じる変化をいう。分化できる細胞は、全能性、多能性（pluripotent）または多能性（multipotent）細胞のいずれかでもよい。分化は、成熟した成体細胞に対して部分的でも、または完全でもよい。
【００４９】
「分化した細胞」は、特定の分化した、すなわち非胚性の状態を有する非胚性細胞をいう。3つの最も早く分化される細胞型は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉である。
【００５０】
PSCに由来するNSCは、多能性であり、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトを含むいくつかの神経細胞型に分化することができる。
【００５１】
ニューロンは、電気的及び化学的シグナルを介して情報を処理し伝達する、電気的に興奮性の細胞である。化学的シグナルは、シナプス、その他の細胞との特定化された連絡を介して生じる。ニューロンは、互いにつながってニューラルネットワークを形成する。ニューロンは、神経系のコア成分であり、これは、脳、脊髄及び末梢の神経節を含む。ニューロンの多数の分化したタイプが存在する：感覚ニューロンは、接触、音、光及び多数のその他の刺激に応答して、次いでこれが脊髄及び脳にシグナルを送る感覚器官の細胞に影響を及ぼす。運動ニューロンは、脳及び脊髄からシグナルを受けて、筋収縮を生じさせて、腺に影響を及ぼす。介在ニューロンは、脳または脊髄の同じ領域内でニューロンをその他のニューロンに接続する。いくつかのタイプのニューロンがある：コリン作動性、GABA作動性、グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性及びセロトニン作動性。
【００５２】
コリン作動性。アセチルコリンは、シナプス前ニューロンからシナプス間隙に放出される。これは、リガンド依存性イオンチャネル及び代謝調節型（GPCR）ムスカリン受容体のためのリガンドとして作用する。ニコチン受容体は、ニコチンを結合するアルファ及びベータサブユニットで構成される五量体のリガンド依存性イオンチャネルである。リガンド結合は、チャネルを開いてNa+脱分極の流入を生じさせ、及びシナプス前神経伝達物質の放出の可能性を上昇させる。
【００５３】
GABA作動性ニューロン-ガンマアミノ酪酸。GABAは、CNSにおける2つの神経阻害物質の一方であり、他方はグリシンである。GABAは、アニオンチャネルに対して相同的機能を有し、Cl-イオンをシナプス後ニューロンに入れることができるアニオンチャネルを開閉する。Cl-は、ニューロン内で過分極を生じさせ、電圧がより陰性になるため、活動電位が生じる可能性を低下させる（活動電位が生じるには陽電圧閾値に達しなければならないことを思い起こされたい）。
【００５４】
グルタミン酸作動性ニューロン。グルタミン酸は、2つの一次興奮性アミノ酸の一方であり、他方は、アスパラギン酸である。グルタミン酸受容体は、4つのカテゴリーの1つのであり、そのうちの3つは、リガンド依存性イオンチャネルであり、及びその1つは、G-タンパク質結合受容体（GPCRと呼ばれることが多い）である。AMPA及びカイニン酸受容体は、Na+カチオンを透過するカチオンチャネルとして機能し、両方とも迅速な興奮性シナプス伝達を媒介する。NMDA受容体は、Ca2+がより透過するもう一つのカチオンチャネルである。NMDA受容体の機能は、チャネル孔内のコアゴニストとして結合するグリシン受容体に依存的である。NMDA受容体は、両方のリガンドが存在しないと機能しない。代謝調節型受容体、GPCRは、シナプス伝達及びシナプス後の興奮を調節する。血流が抑制されているとき、グルタミン酸はシナプス前ニューロンから放出され、ストレス状態以外の場合よりもNMDA及びAMPA受容体活性化を生じさせ、シナプス後ニューロンに入るCa2+及びNa+の上昇及び細胞障害をまねく。
【００５５】
ドーパミン作動性ニューロン。ドーパミンは、D1タイプ（D1及びD5）Gs結合受容体に対して作用する神経伝達物質であり、これは、cAMP及びPKA及びD2タイプ（D2、D3及びD4）受容体を増加させ、これは、cAMP及びPKAを減少させるGi結合受容体を活性化する。ドーパミンは、気分及び挙動に関係し、及びシナプス前及び後の神経伝達を調節する。黒質におけるドーパミンニューロンの喪失は、パーキンソン病に関連していた。
【００５６】
セロトニンニューロン。セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT）は、興奮性または阻害性に作用し得る。4つの5-HT受容体クラスのうち3つはGPCRであり、及び1つは、リガンド依存性カチオンチャネルである。セロトニンは、トリプトファンヒドロキシラーゼによって、及び次いでさらなる芳香族酸デカルボキシラーゼによって、トリプトファンから合成される。シナプス後のニューロンにおける5-HTの欠如は、うつ病に関連していた。シナプス前のセロトニン輸送体を遮断する薬物、プロザック及びゾロフトなどは、治療のために使用される。
【００５７】
ニューロンは、神経マーカーTuj1（ベータ-III-チューブリン）；MAP-2（微小管関連タンパク質2、MAP-1または-5などのその他のMAP遺伝子を使用してもよい）；抗軸索成長クローン；ChAT（コリンアセチルトランスフェラーゼ）；CgA（抗クロマグラフィンA）；DARRP（ドーパミン及びcAMP調節リンタンパク質）；DAT（ドーパミン輸送体）；GAD（グルタミン酸脱炭酸酵素）；GAP（成長関連タンパク質）；抗HuCタンパク質；抗HuDタンパク質；アルファ-インターネキシン；NeuN（ニューロン特異的核タンパク質）；NF（神経フィラメント）；NGF（神経発育因子）；ガンマ-SE（ニューロン特異的エノラーゼ）；ペリフェリン；PH8；PGP（タンパク質遺伝子産物）；SERT（セロトニン輸送体）；シナプシン；タウ（神経原繊維変化タンパク質）；抗-Thy-1；TRK（チロシンキナーゼ受容体）；TRH（トリプトファンヒドロキシラーゼ）；抗TUCタンパク質；TH（チロシンヒドロキシラーゼ）；VRL（バニロイド受容体様タンパク質）；VGAT（小胞GABA輸送体）、VGLUT（小胞グルタミン酸輸送体）の発現によって同定してもよい。
【００５８】
NSCまたはPSC由来ニューロン前駆細胞の分化を誘導することによって産生されるニューロンは、機能的基準に従って試験することができる。たとえば、カルシウム流量を、神経伝達物質またはインビボにおいてニューロンに影響を及ぼすことが公知であるその他の環境条件に応答して、任意の標準的な技術によって測定することができる。最初に、集団におけるニューロン様細胞を形態学的基準によって、またはNCAMなどのマーカーによって同定する。次いで、神経伝達物質または条件を細胞に適用し、及び応答をモニターする。また、細胞を標準的なパッチクランプ技術に供して、活動電位の徴候があるかどうか、及び適用された電位と応答の間の時間のずれがどれくらいあるかを決定することができる。NSCまたはPSC由来ニューロン前駆体細胞の分化は、ニューロンの形態学的特徴を有し、NCAMまたはMAP-2陽性であり、かつGABA、アセチルコリン、ATP及び高ナトリウム濃度、グルタミン酸、グリシン、アスコルビン酸、ドーパミンまたはノルエピネフリンの1つまたは複数に応答を示す部分母集団を含む培養物を生成することができる。いくつかの実施形態において、NCAMまたはMAP-2陽性の分化した対象はまた、パッチクランプシステムにおいて活動電位を示し得る。
【００５９】
ドーパミン作動性ニューロンのためのマーカーは、TUJ1、TH、Dat、Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1またはVMAT2またはこれらの任意の組み合わせを含むが、限定されない。
【００６０】
PSC、NSC及びPSC由来ニューロン前駆細胞は、ドーパミン作動性（DA）ニューロンを含むニューロンに分化することができる。PSC、NSC及びPSC由来ニューロン前駆細胞をDAニューロンに分化する1つの方法は、ドーパミン作動性ニューロンを誘導する化合物で細胞を処理することである。このような化合物は、ホモキノリン酸、L-システインスルフィン酸、キヌレン酸、（R）-（+）-HA-966、m-クロロフェニルビグアニドハイドロクロライド、カルペプチン、ジマプリットジヒドロクロリド、8-ヒドロキシ-DPATヒドロブロミド、トランス-4-ヒドロキシクロトン酸、ファスジルハイドロクロライド、チオペラミド、レチノイン酸、AM580、TTNPB、レモキシプリドハイドロクロライド、ICI 215,001ハイドロクロライド、イミロキサンハイドロクロライド、スピペロンハイドロクロライド、ケンパウロン、CL 218872、CV 1808、Ro 15-4513、リノピリジンジヒドロクロライド、ググルステロン、Ch 55、3-MATIDA、SEW 2871、イメスリジンジヒドロブロミド、LY 364947、トラニルシプロミンハイドロクロライド、（-）-シチシンまたはニルタミドまたはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００６１】
生じるDAニューロンは、TUJ1、TH、Dat、Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1またはVMAT2またはこれらの任意の組み合わせを含むドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーの発現によって特徴づけられるだろう。
【００６２】
NSC及びPSC由来ニューロン及びニューロン前駆細胞は、当該技術分野において公知の任意の経路によって対象に投与してもよい。例には、経口、静脈内、皮下及び筋肉内投与を含む。NSC及びPSC由来ニューロン及びニューロン前駆細胞はまた、脳の患部に直接または患部に隣接して、対象の脳に直接注射してもよい。
【００６３】
実施例に記載したように、開示した方法は、ドーパミンレベルを増加させ、並びにPDモデルにおいて行動改善を生じた。NSCが注射部位から遊走することも観察された。さらに、PD症候の進行の予防または緩徐化があった。シナプス前の活性における改善、並びにTH+ニューロンの数及び神経支配における増大もあった。加えて、NSC及びPSC由来ニューロン前駆体細胞が観察される場合、内因性DAニューロン活性の刺激及び自発的インビトロ分化の両方もあった。
【００６４】
さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるドーパミンレベルを増加する方法であって、その必要のある対象に対して神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を対象の脳に投与する工程を含み、これによりドーパミンレベルを増加する、方法を提供する。
【００６５】
もう一つの実施形態において、本発明は、ドーパミンを放出するために内因性ドーパミン作動性（DA）ニューロンを誘導する方法であって、その必要のある対象に対して、該対象の脳に神経幹細胞（NSC）または多能性幹細胞（PSC）由来ニューロンもしくはニューロン前駆細胞を投与する工程を含み、これにより、ドーパミンを放出するために内因性DAニューロンを誘導する、方法を提供する。
【００６６】
さらなる実施形態において、本発明は、神経変性疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤でhPSCを処理する工程；並びに対象の脳に該細胞を投与する工程を含み、これにより神経変性障害を治療する、方法を提供する。一つの態様において、hPSCは、ヒト胚性幹細胞（hESC）、ヒト単為生殖幹細胞（hpSC）または誘導された多能性幹細胞（iPSC）である。好ましい態様において、hPSCは、単為生殖または核移植によって得られる。さらなる態様において、hPSCは、ヒト卵母細胞を単為生殖で活性化する工程であって、活性化が、高O2圧力にてイオノフォアと卵母細胞とを接触させること、及び低O2圧力下でセリンスレオニンキナーゼ阻害剤と卵母細胞とを接触させることを含む、工程；胚盤胞形成まで低O2圧力にて活性卵母細胞を培養する工程；胚盤胞を支持細胞の層へ移し、移された胚盤胞を高O2圧力下で培養する工程；胚盤胞の栄養外胚葉から内細胞塊（ICM）を機械的に単離する工程；並びに高O2圧力下で支持細胞の層上でICMの細胞を培養する工程であって、これによりヒト幹細胞を産生する、工程を含む方法によって得られる。一つの態様において、CK1阻害剤は、SB2180708である。もう一つの態様において、BMP阻害剤は、ドルソモルフィン、LD-193189またはDMH-1である。
【００６７】
一つの実施形態において、本発明は、神経変性疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を得る工程；チェックポイントキナーゼ1（CK1）阻害剤及び骨形態形成タンパク質（BMP）阻害剤で該細胞を処理する工程；ググルステロンで該細胞を処理する工程；並びに対象の脳に該細胞を投与する工程を含み、これにより神経変性障害を治療する、方法を提供する。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、本発明を例証するが、限定しないことが意図される。
【００６９】
実施例1
hPSC-NSC
NSCを得るために、Matrigel上で増殖したhPSCをStemProから5μM SB218078及び1μM DMH-1を補ったN2B27培地に移すことによって未分化神経上皮を誘導した。これらの神経誘導因子の存在下で6日後に、Pax6、神経誘導の初期のマーカーは、有意にアップレギュレートした。7日目に、神経化されたhPSCをNSC培地に移し、及び次いで、分離して増殖性NSCを得た。4継代後、hPSC由来NSC（hPSC-NSC）集団は、ネスチンに対して98%、ムサシ-1に対して96%、PAX6に対して95%、OCT4に対して0%陽性であり、及び遺伝子発現マイクロアレイ解析は、FABP7、BRN2、SOX3、ST6GALNAC5、CXCR4、DCX、NES及びMSIを含む推定上のNSCマーカーのアップレギュレートが明らかになった。
【００７０】
具体的には、まずhPSC株［ヒト胚性幹細胞株WA-09及びヒト単為生殖幹細胞株LLC2P及びLLC12PH（International Stem Cell Corporation）］を胚性幹細胞培地：Knock Out DMEM/F12（Life Technologies）、2mM L-グルタミン（GlutaMax-I、Invitrogen）、0.1mM MEM可欠アミノ酸（Life Technology）、0.1mMβ-メルカプトエタノール（Life Technologies）、ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB（100U/100 μg/250ng）（MP Biomedicals）及び5ng/ml bFGF（Peprotech）中でマイトマイシン-C不活性化したマウス胚性繊維芽細胞（Millipore）支持細胞層上で維持した。細胞を1：4または1：6の分割比で5〜7日毎にディスパーゼ（Life Technologies）で継代した。次いで、hPSCをMatrigel（BD Biosciences）で被覆したプレートへ移し、及びStem Pro hESC SFM培地（Invitrogen）：GlutaMAX、1×STEMPRO hESC SFM増殖サプリメントを伴うDMEM/F12、1.8%ウシ血清アルブミン、8ng/mL bFGF及び0.1mM 2-メルカプトエタノールで増殖させた。
【００７１】
実施例2
hPSC由来ドーパミン作動性ニューロン
hPSC-NSCをまず、100ng/mL FGF8及び2μMパルモルファミンで7日間DAニューロン前駆細胞にプライムした。DAニューロン前駆細胞を96ウェルプレートの2000細胞/ウェルにてプレートにまき、及び2.5μMググルステロン（GS）で2週間処理した。分化の30日後に、GS処理したニューロンは、精巧な神経突起伸長を伴って成熟したようにみえた。この段階にて、得られた細胞は、主要な神経細胞のマーカー、β-III-チューブリン（TUJ1）だけでなく、また重要なDAニューロンマーカー、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン輸送体（Dat）、Foxa2、Nurr-1及びGirk2を発現した。さらにまた、FACS解析は、97%を超えるゲーティングされた細胞がTH陽性であることを明らかにした。
【００７２】
本方法は、7日間のNB培地［NeuroBasal培地、1X GlutaMAX、1X N2/B27 Supplement（Invitrogen）］中のパルモルファミン（2μM）及びFGF8（100ng/mL）でのhESC-H9- NSC（Invitrogen）及びhPSC-NSCの両方への処理を具体的に含んだ。パルモルファミン及びFGF8処理の7日後に、NSCをAccutase（Sigma）で分離し、及びMatrigelで被覆した96ウェルプレートに20,000細胞/mLをまき、最終濃度2.5μMのググルステロンで2週間処理した。小分子での処理の2週間後に、全てのウェルを視覚的に観察し、及び神経突起密度及びドーパミン放出に基づいて記録した。神経突起密度の測定については、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、及び相コントラスト画像をランダムに選択した視野からCellavista細胞イメージングシステム（Roche Applied Science）を使用して取得した。神経突起密度を、Cellavista密度ソフトウェア画像処理プログラムを使用して測定した。それぞれの実験の条件は、二つのウェルにおいて行い、及び少なくとも3つの独立した実験を行って最終結果を得た。hPSC由来NSC、DAニューロン前駆細胞及びhPSCの遺伝子発現解析により、DAニューロン前駆細胞において801のアップレギュレートした遺伝子、及びNSCにおいて566のアップレギュレートした遺伝子があったことが決定された（図2）。
【００７３】
実施例3
6-OHDA誘導されたパーキンソン病ラットモデルへのhPSC由来NSCの移植
黒質線状体経路の内側前脳束に片側性の6-OHDA病変を持つ成体雌Sprague-DawleyラットをCharles Riverから購入した。このパーキンソン病ラットモデルは、左脳半球における6-OHDA誘導された病変に基づいている。0.2mg/kgの塩酸アポモルフィンの皮下注射の外科的な成功を検証するために、術後5〜7日にCharles Riverによって回転負荷試験が施された。薬物を投与し、最初の回転と同時に回転カウントを開始した。カウントを5分間続け、最終的なカウントを5で割って1分あたりの回転数とした。1分あたり最低5回転することにより、外科手術が成功であったと決定した。全ての情報をパーキンソンテストシート上に記録した：動物数、体重量、注射時刻、開始時刻、終了時刻、総回転数、毎分回転数及び合格または不合格。
【００７４】
6-OHDA病変の3週後にラットを麻酔し、及び定位フレームに置いた。穿頭孔を標的領域上で穿孔し、及び5×105のhPSC-NSCを、2つの部位に分けたそれぞれのラットの線条体に注射した。5μlの細胞懸濁液を15分間にわたって0.5μl/分の速度にて部位あたりに（100,000細胞/μl）注射した。対照ラットにはPBSを与えた。
【００７５】
動物に移植の前及び移植12週後にアンフェタミンを注射して、回転挙動を試験した。研究の最後に動物を屠殺し、ドーパミン濃度のELISA解析のために血液を収集し、及び徹底的な検死を行った。免疫細胞化学のために、PBSでの経心腔的灌流後に全脳を収集した。PCRのために、試料を収集し、及びPCR緩衝液中に置いた。
【００７６】
6-OHDA病変ラットへのNSC及びDAニューロン前駆細胞の細胞移植の後、動物は、全28週間の研究期間、パーキンソン症候群以外の異常行動なしで健康なままであった。有意な行動改善は、アンフェタミン誘導された回転試験によって証明されたように、両方の細胞型について観察された（図3A）。DAニューロン前駆細胞を移植した脳組織、または偽対照脳組織よりも、NSCを移植した齧歯類のホモジナイズされた全脳組織において、より高いドーパミンレベルが観察された（図3B）。NSC及びDAニューロン前駆細胞の両方が、移植後28週間の長期生存及び移植の成功を証明した（図3C及び3D）。DAニューロン前駆細胞を注射した齧歯類において、移植された細胞は、注射部位にて小型の移植片を形成したが、一方NSCを移植した齧歯類において、細胞は注射部位周辺でより広範囲に分散した（図3C）。DAニューロン前駆細胞と比較して3倍の数のNSCが脳において検出され、これは、NSCの生存率がおよそ60%、DAニューロン前駆細胞の生存率が20%であることに対応する（図3D）。NSCのより高い生存率は、細胞接着、血管発生及び細胞運動の制御と関連する遺伝子がNSCにおいて豊富であることを示したRNA配列決定データによって説明することができ、それら全てが移植の成功を助ける（図2B）。もう一つの可能性のある理由は、NSCがインビボで増殖したということであり得るが、NSCは、増殖マーカーKi67と共染色しなかった（図3E）。
【００７７】
NSCの有意な遊走は、おそらく黒質線状体経路に沿って、線条体における注射部位から黒質まで観察された（図4A）。移植されたNSCは、注射部位の近くに、しかしより優勢に宿主DAニューロンが存在する黒質において見いだされた。移植されたNSCは、注射部位から8〜10mm移動し、及び注射側に対して反対側の黒質においてさえ見いだされた（図4A）。DAニューロン前駆細胞移植片の注射部位からの移動がないだけでなく、この細胞は、免疫抑制にもかかわらずIBA-1陽性宿主小膠細胞及び関連した移植領域における星状細胞数（GFAP+）における増大（図4B）によって証明されるとおり、予想される免疫応答を誘発するようにみえた。対照的に、移植されたNSCは、宿主グリア細胞または大量の小膠細胞によって囲まれず、有意により明白でない免疫原性応答を示した（図4C）。全体の検死結果は、異常な組織または腫瘍がないことを明らかにし、及び体内分布解析は、ヒト細胞が解析したその他の器官のいずれにも存在しなかったことを証明した。
【００７８】
実施例4
MPTP誘導されたパーキンソン病を持つ非ヒト霊長類脳におけるhPSC由来NSCの移植
この研究において使用した非ヒト霊長類は、St. Kitts, West Indiesからのアフリカミドリザル（Chlorocebus sabaeus）であった。St. Kitts/アフリカミドリザルは、研究されてきたあらゆる種のうちで、ヒトパーキンソン病の最も完全でよく似たモデルであることから選択された。外科手術は、St. Kitts, West IndiesのSt. Kitts Biomedical Research Foundationにおける承認されたAnimal Care and Use Committee（ACUC）プロトコル下で行った。5日間にわたる累積用量1.5mg/kgのMPTPを注射して黒質線状体経路の変性を誘導することで無症候性サルを作製した。これは、ドーパミン欠乏を生じるが、機能障害を伴わない。この研究における全てのサルは、移植の1日前に免疫抑制され、屠殺まで薬物を与えられ続けた。hPSC-NSCの細胞懸濁液を標的部位中への移植の直前に22gカニューレ中に吸い込んだ。試料を、標準的定位手順を使用して脳に移植し、及び定位座標を検証した。挿入を2分間にわたってゆっくり行い、カニューレの先端が注射の前に少なくとも2分間移植部位にとどまることを許した。1μm/分の速度でカニューレを除去する前に2分間の猶予を持って、制御された潅流ポンプ（Stoelting）を使用して細胞を1μl/分の最大速度で押し出した。定位標的は、片側のみであった。尾状核：イヤーバー ゼロからAP 21mm、側方3.5mm及び垂直18.6mm、被殻：同一のAP及び垂直、しかし側方10mm。黒質標的：AP 11.1、側方3.5及び垂直12.1であった。
【００７９】
hPSC-NSCの移植は無菌状態下で行った。2匹の宿主サルを研究のために使用し、対照及び有効性理由両方のために同時に手術した。特別なKopfドリルをダイヤモンドカバーされた球状ドリルを使用してそれぞれの入口点の部位にて小さな2mmの穴をあけるのに使用した。次いで、送達器具を、22ゲージ針を伴うHamilton注射器を保有するものに変えた。無菌技術を使用して、hPSC-NSCを無菌の22ゲージ針中に吸い込んだ。対照サルには、代わりにビヒクル対照PBSを与えた。針をStoeltingマイクロ注入ポンプの100μl Hamilton注射器に取り付け、及び標準的定位手順に従って宿主脳の適切な部位内に降ろした。細胞を、1μl/分の速度でStoelting注射器ポンプの制御下で注射した。2分待った後、針を5mmの間1mm/分の速度にて、及び次いで、脳から出るまで「ゆっくり」引き抜いた。全ての注射が完了した後、頭部を潅注し、及び筋肉、皮下層及び皮膚を、標準的外科的方法を使用して閉じた（クロム及びビクリル縫合で筋肉、皮下及び皮膚層を閉じ、続いてDermabondで創傷端部を塞ぐ）。次いで、動物を定位装置から移し、覚醒するまで連続的にモニターした。対象は、術後鎮痛薬を与えられ（48時間）、生命徴候が安定し動物が覚醒するまでモニターした。これらは、合併症を伴わずに外科手術から十分に回復した。
【００８０】
パーキンソンスコアは、公開されかつ検証済の定量的時間標本抽出法を使用して、サルを記録した盲検のオブザーバによって、1日あたり2回、1週間あたり5日間記録したが、これは、効率的に及び正確にパーキンソン病様挙動を標本抽出することが経験的に示されている。外科手術の時に、パーキンソンスコアは、10以下であり、これは、サルが無症候性であり、及びPDの機能障害または臨床的症候を有しなかったことを意味する。
【００８１】
より関連したパーキンソン病モデルにおける細胞の効果を評価するために、細胞をMPTP曝露されたサルに移植した。これらのサルは、有意なドーパミン欠乏を有するが、しかし一般に無症候性であり、及びそれら自体の面倒を見ることができることが前の研究から公知である。このモデルは、ドーパミン欠乏させた環境における細胞生存及び分化効果を評価するために有用である。移植された霊長類は、14週の研究期間の全体にわたってパーキンソン症候群の安定な評価及びスコア、並びに概略健康挙動スコアを維持した（図5）。これらのデータは、これらのサルが追跡調査期間の全体にわたってパーキンソン症候群の安定な非常に低いスコア、及び高レベルの健康挙動を示したことを確信させる。重要なことに、運動異常または筋緊張異常、変形、腫瘍または過成長などの有害事象は観察されず、これは、移植された細胞が安全であり、実験動物によって十分許容されたことを示した。最も重要なことに、未分化、多能性、OCT-4陽性細胞の存在を移植片のいずれにおいても検出しなかった。
【００８２】
ドーパミンレベルを測定するために、組織パンチを、注射部位のいくつかに近い線条体の8つの異なる部位にて採取した。NSCを移植した霊長類は、DAニューロン前駆細胞を移植した動物より高い移植後ドーパミンレベルを示した（図6A）。また、ホモバニリン酸/ドーパミン（HVA/DA）比によって反映されるドーパミン代謝回転をNSCを移植した霊長類において規準化し、既存のドーパミン作動性ニューロンのシナプス前の活性における改善が示された（図6B）。加えて、DAニューロン前駆細胞と比較して、NSCを移植した霊長類の線条体（図6C）及び黒質（図6D）において、TH+ニューロンのより多い数及び神経支配が観察された。加えて、生存するDAニューロン前駆細胞は、宿主グリア細胞（GFAP）及び宿主小膠細胞（IBA-1）によって囲まれた小型の移植片を形成したが（図7A）、NSCは、齧歯類において観察されたように（図4）、分散しており、移植片を囲んでいるグリア細胞の瘢痕または宿主小膠細胞を有しなかった（図7A）。これらの解析は、DAニューロン前駆細胞移植片の生存にもかかわらず、DAニューロン前駆細胞がDAレベルを増大する機能能力が、宿主免疫応答によって損なわれ得ることを示す。
【００８３】
サルにおけるDAニューロン前駆細胞移植のさらなる特性付けにより、これらのニューロンの同一性が確認され（TUJ1+）、及びDAニューロン前駆細胞のいくつかが、インビボでDAニューロンへとさらに成熟することが明らかになった（TH+、NURR1+及びFOXA2+）（図7B）。対照的に、かなりの比率の移植されたNSCは、未分化状態で残った（ネスチン+）（図7C）。NSCは、遊走活性を保持し、及び黒質線状体経路に沿って選択的に移動し（図7C）、及び宿主神経修復を促進する可能性のある黒質における宿主DAニューロンと密着しているようにみえた（図7D）。この見解を裏付けて、NSCがDAニューロン前駆細胞よりインビトロ及びインビボで高いレベルのGDNF及びBDNFを分泌することが見い出され、これはおそらく、NSC移植された動物における黒質線条体系において、より多くの再分化が観察されることを説明する。NSCのごく一部は、ドーパミン作動性マーカーGタンパク質調節された内向き整流性カリウムチャネル2（GIRK2）、小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）との共染色によって示されるように、TH+細胞に自発的に分化することが観察された（図7E）。NSCは、シナプトフィジン（SYP）、シナプス前小胞の必須膜タンパク質を発現するニューロンに分化し、これらの機能的移植を支援した（図7E）。細胞置換、免疫調節及び宿主DAニューロンとのNSCの神経保護クロストークの併用効果は、黒質において観察されるTH+ニューロンのより多い数及び線条体における全体的により高いDAレベルの原因となり得る（図6）。
【００８４】
本発明は、上の実施例に関して記述してきたが、改変及びバリエーションが本発明の精神及び範囲内に包含されることが理解されるだろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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