(57)【要約】  本発明は、流加発酵によるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の生産方法であって、微細藻類による酸素消費の低下に応じて、特に発酵培地中の溶存酸素圧力（ｐＯ２）が既定の閾値を超えた場合に、逐次的、かつ、自動的に炭素源の供給を行うことを特徴とする生産方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
流加発酵によるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の生産プロセスであって、
前記微細藻類による酸素の消費の低下に応じて逐次的、かつ、自動的に炭素系供給源の供給を行うことを特徴とする生産プロセス。
【請求項２】
前記微細藻類による前記酸素の消費の低下を、発酵培地中の溶存酸素圧力（ｐＯ２）を計測することにより検出する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
炭素系供給源の供給を、前記発酵培地中の前記溶存酸素圧力（ｐＯ２）が既定の閾値を超えた場合に開始する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記閾値が、前記発酵培地中の前記炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立される前記ｐＯ２値よりも１〜１００％大きい、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記閾値が、前記発酵培地中の前記炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立される前記ｐＯ２値よりも１０〜８０％大きい、請求項３または請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記発酵培地中の前記炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立される前記ｐＯ２値が２０〜４０％、好ましくはおよそ３０％である、請求項４または請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の前記微細藻類が、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）及びクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）よりなる群から選択される、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記微細藻類が、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記炭素系供給源が、グルコース、アセテート及びエタノール、並びにこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記炭素系供給源がグルコースである、請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
炭素源が完全に消費された時点から炭素系供給源の供給までの時間が、５分間未満、好ましくは１分間未満である、請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
残存する炭素供給源を、０ｇ／Ｌよりも大きく２０ｇ／Ｌ未満の値で永久的に維持する、請求項１ないし請求項１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
炭素系供給源の供給を、１０〜２０ｇ／Ｌの炭素系供給源を前記発酵培地に１０分間未満の間に添加可能である最大流量でポンプにより行う、請求項１ないし請求項１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流加発酵によりクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類を生産する新規プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、増殖に「水および太陽光のみ」を必要とすることから、藻類は長い間、食料資源として検討されてきた。
【０００３】
数種の食用藻類が存在しており、これらは主に、ケルプ、アオサ（オオバアオサ（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ））などの「大型藻類」、および、アマノリ属（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）（日本では養殖されている）またはダルス（ダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ））種の紅藻類である。
【０００４】
しかしながら、これらの大型藻類に追加して、「微細藻類」に代表される他の藻類資源が存在し、すなわち、海洋性または非海洋性の光合成または非光合成単細胞微小藻類が、バイオ燃料または食品における用途のために培養されている。
【０００５】
例えば、スピルリナ（アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ））は、栄養補助食品としての使用、または、菓子もしくは飲料への少量の添加物（一般に０．５％重量／重量未満）としての使用のために、屋外の池（光合成条件下）で培養されている。
【０００６】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属に属する一定の種を含む他の脂質に富む微細藻類もまた、アジア諸国において栄養補助食品としてきわめて一般的である。
【０００７】
数種の微細藻類は、光化学合成独立栄養成長（ＣＯ２を炭素鎖に変換するためのエネルギーを光から得るもの）から、炭素およびエネルギーの代謝に用いられることが可能であるグルコースまたは他の炭素系基質を用いる従属栄養成長（光を伴わない）に変化することが可能である。
【０００８】
現在、以下の３種のプロセスが微細藻類の工業的な生産に用いられている。
−  従属栄養反応器（完全閉鎖型）
−  屋外の池
−  ガラス管
【０００９】
様々な特性および組成のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｅ）がこれらの培養方法で生産されている。組成は、明条件で生産されたか、および、屋外で生産されたかに応じて異なることとなる。
【００１０】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）種の微細藻類の粉の生産および使用は、例えば、国際公開第２０１０／１２０９２３号および国際公開第２０１０／０４５３６８号に記載されている。
【００１１】
実質的に一不飽和油から組成されていることが可能である微細藻類の粉の油画分は、従来の食材において頻繁に見出される飽和、水素化および多価不飽和油と比較して、栄養上および健康上の利点を有していることが可能である。
【００１２】
微細藻類の粉末をバイオマスから工業的に製造することが所望される場合、技術的な観点のみからではなく、生産される組成物の官能プロファイルの観点からも、大きな問題が残っている。
【００１３】
これは、例えば屋外の池で光合成培養したか、または、光バイオリアクタにより培養した藻類で製造した藻類の粉末が商業的に入手可能であるが、これらは濃い緑色（クロロフィルによる）を呈し、強い不快な味を有するためである。
【００１４】
そして、実際のところ、葉緑体の形成および成長が従属栄養培養条件下および暗中で抑制されることは一般的に認められている。
【００１５】
これらの従属栄養条件下では、微細藻類はそれ故、光合成反応を利用せず、培養培地の糖質を消費することにより成長する。
【００１６】
この生産システムの利点は以下のとおりである。
−  体積基準で生産性が大きく増加し、屋外システムに対して１００倍、および、バイオリアクタに対して１０倍である。
−  乾燥物における濃度が極めて高い（１リットル当たり数百グラム）。
−  生産コストが安い。
−  きわめて高品質の生産物が得られる。
−  密閉培地であるために汚染がない。
−  生産地に関する制約がない。
−  工業的な運用がきわめて容易である。
−  化学産業および食品加工産業などの異なる産業によって、酵母およびバクテリアに関する工業規模での技術は、数十年にわたって、完全に習熟している。
−  クロロフィルが存在せず、それ故、くせの少ない味となる。
【００１７】
従来においては、２形態の従属栄養培養が文献に記載されている（例えば、Ｈ．Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．（ｅｄ．），２００４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ，２５５−２６３）。
【００１８】
従属栄養培養ステージがバッチモード（すべてのグルコースを一度にすべて発酵の開始時に供給）で制御されている場合、指数関数的な増殖の初期フェーズの後には成熟ステージが続き、これにより、有利な化合物に富む細胞が得られることがＨ．Ｉｗａｍｏｔｏにより記載されている。
【００１９】
バイオマスは初期フェーズ中にグルコースを消費しながら増加し、次いで、グルコースがなくなると停止する。
【００２０】
２番目の「成熟」フェーズは、他の有利な分子（顔料、脂質等）の生産を促進するために、引き続き利用される。
【００２１】
流加モード（段階的なグルコースのフィード）での培養は、一般に、「グルコース制限」条件下で行われる。
【００２２】
この方法の核心に係る原理として、Ｈ．Ｉｗａｍｏｔｏにより記載されているとおり、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｅ）の増殖に伴うグルコースの消費に応じてグルコースが供給される。
【００２３】
培養培地中のグルコースの濃度は連続的に分析され、自動で１．５％に維持される。
【００２４】
グルコースのフィードは所望の細胞密度に達した場合に停止される。次いで、細胞成熟を促進するために、培養はこの状態でおよそ１０時間維持される。
【００２５】
グルコース制限条件下におけるこの流加培養モードの適用は、Ｈ．Ｉｗａｍｏｔｏによりクロレラ・レギュラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）の菌株を用いて例示されている。
【００２６】
培養は合計で４０時間かけて行われ、初めの３０時間は微細藻類の増殖および微細藻類へのグルコースのフィードに充てられている。
【００２７】
その後の１０時間が、グルコースの供給を伴わない成熟に充てられている。
【００２８】
次いで、遠心分離によりバイオマスが回収および濃縮され、洗浄され、１３０℃で３秒間熱失活（これにより、クロロフィラーゼの抑制が可能となる）され、きわめて微細な粉末を得るために噴霧化により乾燥される。
【００２９】
しかしながら、この進行方法は、特に、成熟ステージの最中におけるクロロフィルおよびカロチノイドの生産を再活性化するために利用される。
【００３０】
この進行方法は、官能特性に対する悪影響（不適当な風味）を確実に回避し、また、特にクロロフィルを生産することなく、脂質に富むクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）バイオマスを生産するには好適ではない。
【００３１】
さらに、残存グルコースを測定する自動デバイスの信頼性は十分ではなく、また、発酵を厳密に制御するには応答速度が十分ではない（１分超）。
【００３２】
それ故、残存グルコースの管理に制約されることがない、流加発酵による効率的な生産方法を達成するという要求が未解決のまま未だ存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２０９２３号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４５３６８号
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】Ｈ．Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４，ｐ．２５５−２６３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本出願会社は、炭素系供給源の添加が完全に特定の条件下で逐次的であり、かつ、自動化されており、換言すると、発酵培地中の溶存酸素圧力の値（ｐＯ２）を制御するために、逐次的添加によって炭素系供給源を供給することによる流加発酵によるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の生産プロセスを提供することにより上記の要求に応えることが可能であることを見いだした。
【００３６】
それ故、本発明は、微細藻類による酸素の消費の低下に応じて逐次的、かつ、自動的に
炭素系供給源を供給することを特徴とする、流加発酵によるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の生産プロセスに関する。
【００３７】
微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）からなる群から選択可能である。好ましくは、微細藻類はクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。
【００３８】
炭素系供給源は、微細藻類の発酵による培養に好適な任意の炭素源であることが可能である。特に、グルコース、アセテートおよびエタノール、ならびに、これらの混合物からなる群から選択可能である。好ましくは、炭素系供給源はグルコースである。
【００３９】
微細藻類の酸素消費の低下は、培地中の溶存酸素圧力を計測することにより検出可能である。この圧力の増加は消費の低下を反映するため、炭素系供給源の供給は、発酵培地中の溶存酸素圧力（ｐＯ２）が閾値を超えた場合に開始可能である。
【００４０】
この閾値は、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合における発酵培地中のｐＯ２よりも、１〜１００％、好ましくは１〜８０％、より好ましくは１〜２０％、さらにより好ましくは１０〜２０％大きいｐＯ２値であることが可能である。
【００４１】
好ましくは、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立されるｐＯ２値は２０〜４０％であり、より特定的には、好ましくはおよそ３０％である。
【００４２】
好ましくは、炭素系供給源が完全に消費された時点から炭素系供給源の供給までの時間は５分間未満であり、特に好ましくは１分間未満である。
【００４３】
残存する炭素供給源は、０ｇ／Ｌよりも大きく２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは１０ｇ／Ｌ未満の値で、好ましくは永久的に、または、実質上永久的に維持される。
【００４４】
好ましくは、炭素系供給源の供給は、１０〜２０ｇ／Ｌの炭素系供給源を発酵培地に１０分間未満の間に添加可能である最大流量でポンプにより行う。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】手動調節によるグルコースの連続フィードである。
【図２】逐次的自動添加によるグルコースのフィード−開始閾値：ｐＯ２＝３５％（すなわち、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に得られる値よりも１６．７％大きい）。
【図３】逐次的自動添加によるグルコースのフィード−開始閾値：ｐＯ２＝５０％（すなわち、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に得られる値よりも６７％大きい）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
流加発酵の場合には、培地中の残存グルコースの濃度の自動計測により制御されたグルコースの連続添加によって、残存グルコースの濃度は５〜１５ｇ／Ｌで維持しなければならないと主張する技術的な予想とは対照的に、本出願会社は、発酵培地中のグルコースがすべて消費された場合にｐＯ２が急速に増加するという知見を活用するものである。
【００４７】
それ故、本出願会社によって、ｐＯ２が上昇する度グルコースパルスが開始され、残存グルコースの濃度が５ｇ／Ｌ未満である場合にはグルコースパルスが開始されないよう、
グルコースフィードポンプをプログラミングすることにより、炭素系供給源の供給が自動化された。
【００４８】
換言すると、グルコースフィードポンプは、残存グルコースの濃度が制限されていない場合に計測されたｐＯ２に対して確立される閾値をｐＯ２の計測値が超えるとすぐに開始される。
【００４９】
これは、所定の閾値を超えるｐＯ２の上昇が検知されることにより、発酵槽の初期体積に対して補正値で１〜３０ｇ／Ｌ、好ましくはおよそ１０ｇ／Ｌの濃度に対応する一定量のグルコースを達成するために、グルコースフィードポンプの始動が、好ましくは最大速度で所定の時間（好ましくは１０分間未満）開始されるという事実に反映されている。
【００５０】
本プロセスによれば、グルコース要求量は、微細藻類によって直接的および自動的に「管理」される。
【００５１】
炭素系供給源が連続的にフィードされる流加発酵プロセスと比較すると、本発明に係るプロセスは以下の数々の利点を示す。
−  実験パートにおいて実証されているとおり、発酵の厳密な自動制御が可能とされていることから、人間が関与する必要性がまったくない
−  炭素系供給源の供給は、微生物による要求量に従って行われる。それ故、発酵培地では、いかなる場合においても、パルスにより定義される量よりも多くグルコースを蓄積させることが可能であり、または、他方で、長時間にわたって残存グルコースがゼロとされる可能性がある。これらの２つのパラメータは、最終的な生産物の質（具体的には不適当な風味が存在しない、すなわち、官能的特徴が悪影響を受けていない）を確保するために必須である
−  残存グルコースは制御性が高く、それ故、発酵プロトコルはしっかりとしており、再現性が高い
−  グルコースがフィード不足に陥ることがなく、かつ、微細藻類の代謝が阻害される濃度にグルコースが蓄積することなく、生産性は最大限である
【００５２】
本明細書において用いられるところ、「生産性」という用語は、流加発酵１リットルおよび１時間当たりで生産されるバイオマスの量に相当する。
【００５３】
従来から、変換収率Ｙｘ／ｓは、形成されたバイオマス対消費されたグルコースの比を表す。しかしながら、本発明において意味されるところでは、特に実験パートにおいて種々のテストしたプロトコルを比較するために、および、収率に対する変更の影響を評価するために、本出願会社は、生産された脂肪酸の生産量の４５％（バイオマスの乾燥ｗ／ｗとして）に係る収率の値を判定することによりこのパラメータを合理化することを選択した。
【００５４】
それ故、本発明は、微細藻類による酸素の消費の低下に応じて逐次的、かつ、自動的に炭素系供給源の供給を行うことを特徴とする、流加発酵によるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の生産プロセスに関する。
【００５５】
炭素系供給源は、微細藻類の発酵による培養に好適な任意の炭素源であることが可能である。特に、炭素系供給源は、グルコース、アセテートおよびエタノール、ならびに、これらの混合物よりなる群から選択されることが可能である。好ましくは、炭素系供給源はグルコースである。
【００５６】
流加発酵において、バッチ発酵（すなわち、供給を伴わない）を開始した後に、定義さ
れた量のバイオマスが得られるまで発酵プロセスを通じて炭素系供給源が添加される。
【００５７】
炭素系供給源の供給が連続フィードにより行われる従来技術に係る流加プロセスとは対照的に、本発明に係るプロセスにおいては、炭素系供給源の供給は、逐次的添加またはパルスにより行われる。
【００５８】
これらの逐次的添加またはパルスは、各々について、発酵マストにおいて所望される濃度を達成するために、多量の好ましくはグルコースシロップといった炭素系供給源の濃縮溶液の、比較的短時間、好ましくは１０分間未満、特に好ましくはおよそ６分間内での添加から構成される。好ましくは、発酵マストにおいて所望される濃度は、１〜３０ｇ／Ｌ、より具体的には１〜２０ｇ／Ｌ、特に好ましくは１０〜２０ｇ／Ｌである。特定の実施形態によれば、発酵マストにおける炭素系供給源の所望される濃度はおよそ１０ｇ／Ｌである。ここで用いられるところ、「およそ」という用語は、値の＋／−２０％、１０％、５％または２％を指す。
【００５９】
以下において例示するが、培地中のグルコースが完全に消費された直後に、および、結果としてｐＯ２が増加した直後に、１〜２０ｇ／Ｌの発酵培地中のグルコースの濃度を達成するために、例えば７００ｇ／Ｌのグルコース溶液といった濃縮グルコース溶液のフィードを、１０分間未満の時間をかけて行う。続いて、グルコースの供給は、残存グルコースが消費されている間停止する。グルコースが消費されると、ｐＯ２が上昇し、これにより、グルコース等のさらなる供給を開始する。
【００６０】
上記のとおり、グルコースフィード流量が実際に菌株の代謝要求量（図１を参照のこと）に相当することとなるよう確認する必要性が進行中に存在する連続添加とは対照的に、これらの添加は特定の人間による関与を必要としない。これは、一旦グルコースが消費されると、微細藻類による発酵培地の酸素の消費が急激に低減することとなることによる。それ故、攪拌または空気流量またはドーム背圧またはＯ２の供給のＰＩＤ（比例積分偏差）調節に従って、数％のｐＯ２の顕著な上昇が生じることとなる。本発明に係るプロセスにおいては、この上昇によってグルコースの供給が自動的に開始される。
【００６１】
炭素系供給源の供給は、好ましくは、１０〜２０ｇ／Ｌの炭素系供給源を発酵培地に１０分間未満の間に添加可能である最大流量でポンプにより行う。
【００６２】
特定の実施形態によれば、炭素系供給源の供給は、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立されるｐＯ２値よりも１〜１００％、１〜８０％、５〜８０％、１０〜８０％、または、好ましくは１５〜７０％大きい閾値をｐＯ２が超えた直後に行われる。特定の実施形態によれば、炭素系供給源の供給は、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立されるｐＯ２値よりも１〜２０％、さらにより好ましくは１０〜２０％、特に好ましくはおよそ１５％大きい閾値をｐＯ２が超えた直後に行われる。他の特定の実施形態によれば、炭素系供給源の供給は、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合に確立されるｐＯ２値よりも５０〜８０％、さらにより好ましくは６０〜７０％、特に好ましくはおよそ６５％大きい閾値をｐＯ２が超えた直後に行われる。
【００６３】
一例として、制限されていないグルコース濃度は、５〜１５ｇ／Ｌの濃度であることが可能である。発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合におけるｐＯ２の値は、攪拌または空気流量またはドーム背圧またはＯ２の供給のＰＩＤ（比例積分偏差）調節を含む数々のパラメータに応じる。これらのパラメータは、バイオマスの増加が意図される発酵フェーズを通して一定であることが好ましい。それ故、ｐＯ２の変化は、微細藻類の酸素消費量の変化を忠実に反映するものである。
【００６４】
発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合におけるｐＯ２の値は、通常は２０〜４０％、好ましくはおよそ３０％である。
【００６５】
特定の実施形態によれば、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合におけるｐＯ２値は、およそ３０％、好ましくは３０％であり、炭素系供給源の供給が開始される閾値はおよそ３５％〜およそ５５％、好ましくは３５％〜５５％である。他の特定の実施形態によれば、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合におけるｐＯ２値は、およそ３０％、好ましくは３０％であり、炭素源の供給が開始される閾値は、およそ３５％、好ましくは３５％である。
【００６６】
好ましくは、炭素源が完全に消費された時点から発酵培地における炭素系供給源の供給までの時間は５分間未満であり、特に好ましくは、１分間未満である。上記のとおり、炭素系供給源が完全に消費されると、酸素消費が急激に低下し、これが特定のプローブによる発酵培地中のｐＯ２の値の計測によって検知され、ｐＯ２の増加は酸素消費の低下を反映するものであり、それ故、培地中の炭素源の不足を反映する。
【００６７】
それ故、この反応時間により、グルコースによる代謝を限定もしくは阻害するリスクを伴うことなく、０ｇ／Ｌよりも大きく２０ｇ／Ｌ未満である値、好ましくは０ｇ／Ｌよりも大きく１０ｇ／Ｌ未満の値で残存する炭素供給源を実質上一定に維持することが可能となる。
【００６８】
微細藻類は、流加発酵に好適な任意のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）であることが可能である。一実施形態によれば、微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）よりなる群から選択される。好ましくは、微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。特定の実施形態によれば、微細藻類は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＵＴＥＸ  ２５０（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ａｌｇａｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）である。
【００６９】
例示を意味し、非制限的である以下の実施例により、本発明はさらに理解されることとなる。
【実施例】
【００７０】
実施例１．２通りのグルコース供給方法を用いた脂質に富むクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の生産
用いる菌株は、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＵＴＥＸ  ２５０（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）である。
【００７１】
前培養：
−  ２Ｌエルレンマイヤーフラスコ中の５００ｍＬの培地；
−  培地の組成（ｇ／Ｌ）。
【００７２】
【表１】
2016524923.tif 000002
【００７３】
インキュベーションは以下の条件下で行う：時間：７２時間；温度：２８℃；攪拌：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベータ）。
【００７４】
次いで、前培養物を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ型の３０Ｌ発酵槽に移す。
【００７５】
バイオマスの生産のための培養
基本培地は以下のとおりである。
【００７６】
【表２】
2016524923.tif 000003
【００７７】
接種後、発酵槽の初期体積（Ｖｉ）を７Ｌに調節する。最後に、これを１５〜２０Ｌとする。
【００７８】
発酵を行うためのパラメータは以下のとおりである。
【００７９】
【表３】
2016524923.tif 000004
【００８０】
グルコースの供給形態
従来においては、グルコースの残存濃度が１０ｇ／Ｌ未満となった場合に、発酵槽中のグルコース含有量が０〜２０ｇ／Ｌに維持されるようグルコースの供給が行われる。
【００８１】
この供給は、濃縮７００ｇ／Ｌグルコース溶液から開始して行われ、蠕動ポンプを用いて発酵槽に移される。
【００８２】
グルコースの供給は、２通りの異なる方法に従って管理される。
１）プロトコル１：手作業で調節した流量によるグルコースの連続供給（テスト１および
３）
この種のフィードにおいて、ポンプは連続的に操作される。
【００８３】
発酵の最中における菌株のグルコース要求量の変化はモデリングされているため、ポンプの流量のモデル変化プロファイルがプログラミングされる（図１、「モデルポンプ％」曲線を参照のこと）。
【００８４】
しかしながら、グルコースの流量（最大で２０ｇ／Ｌ／ｈ程度）および累積量（およそ１０００ｇ／Ｌ）はきわめて高いため、適用される流量と実際の菌株による消費速度との間に存在するわずかな不一致（モデルの精度未満）によって、残存グルコースにおける差異が急速に高まってしまう。
【００８５】
それ故、図１に示されているとおり、完全な安定性を達成することができず、残存グルコース（図１、「残存グルコース」曲線を参照のこと）を所望される範囲内に維持するために、培養の最中に手動調節が頻繁に必要となる（図１、「実際のポンプ％」曲線を参照のこと）。
【００８６】
それ故、この方法ではオペレータによる連続的な制御が必要とされ、時により、菌株の代謝はグルコースの利用可能性によって制限されてしまう。
【００８７】
２）プロトコル２：ｐＯ２に応じた逐次的自動添加によるグルコースの供給（テスト２および４）
本発明によるプロセスによれば、グルコースの添加は、専用のプローブを用いる発酵培地中の溶存酸素の含有量（ｐＯ２）を計測することによりポンプの操作を制御するアルゴリズムによって逐次的であり、また、自動化されている。
【００８８】
制御の原理が図２に示されている。
【００８９】
グルコースの濃度が発酵槽中において０ｇ／Ｌとなった場合、菌株による酸素消費が激しく低減し、従って、ｐＯ２を制御するためのアルゴリズムによって開始される攪拌の低減によってもｐＯ２が急速に上昇することとなる。
【００９０】
所定の閾値（３５％）を超えるｐＯ２の上昇が検知されることにより、選択された濃度（発酵槽の初期体積に対して補正値で１０ｇ／Ｌ）に対応する一定量のグルコースを達成するために、グルコースフィードポンプの始動が、最大速度で所定の時間（６分間）開始される。
【００９１】
本実施例において、グルコースの完全な消費からさらなる添加までの時間は、１分間未満である。
【００９２】
それ故、残存グルコースは、グルコースによる代謝が制限または阻害されるリスクを伴うことなく、０超および１０ｇ／Ｌ未満の値に永久的に維持される。
【００９３】
手動プロトコルとは対照的に、どの時点においても発酵速度がグルコースを原因として減速されることはない。
【００９４】
さらに、本方法は完全に自動化されており、人間による監視を必要とすることなく運用される。
【００９５】
脂質富化フェーズ
すべての事例において、１０００ｇのグルコースが消費された場合であって、かつ、バイオマスが７０ｇ／Ｌの濃度に達した場合には、ｐＨを調節するために、水溶性アンモニアは水酸化カリウムによって置き換えられる。これにより、バイオマスにおける脂質の蓄積が可能とされる。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
本発明に係るプロトコル２、すなわち、逐次的および自動添加によるグルコースの供給によって、生産性を高めることが可能である。これは、本発明に係るプロセスによれば、７０ｇ／Ｌのバイオマスを達成するために必要とされる発酵時間が短いからである。この差は、菌株自体によってグルコースの供給が管理されており、および、結果として菌株の代謝は制限されることがないという事実により説明可能である。
【００９８】
さらに、残存グルコースの濃度の差は、本発明に係るプロセスでは少ない。
【００９９】
実施例２：ｐＯ２が飽和率５０％に達した場合におけるグルコースのパルス式添加による脂質に富むクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の生産
培養培地および操作条件は実施例１のテスト１のものと同等である。
【０１００】
【表５】
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【０１０１】
実施例１に記載のとおり、グルコースの添加は、専用のプローブを用いる溶存酸素含有量（ｐＯ２）を計測することによりポンプの操作を制御するアルゴリズムによって、逐次的であり、また、自動化されている。
【０１０２】
しかしながら、この事例におけるグルコースの添加が開始されるｐＯ２閾値はより高く：飽和率３５％の代わりに飽和率５０％である。
【０１０３】
それ故、換言すると、開始閾値は、発酵培地中の炭素系供給源の濃度が制限されていない場合における発酵培地中の溶存酸素圧力よりも６７％大きい。
【０１０４】
図３に示されているグラフは、パルス技術を実施した場合の一例である。グルコース濃度が発酵槽中においておよそ０ｇ／Ｌの値となった場合、菌株の酸素消費量が激しく低減し、従って、ｐＯ２が急速に上昇する。この事例における攪拌は４００ｒｐｍで保持される。
【０１０５】
飽和率５０％を超えるｐＯ２の上昇（すなわち、グルコースが制限されることとなる前の値よりも６７％大きい）が検知されることにより、グルコースフィードポンプの始動が最大速度で開始される。
【０１０６】
本テストの最終結果：
・時間：９０時間
・バイオマス：１７６ｇ／Ｌ
・脂質含有量：４５．１％
それ故、添加に係る開始閾値の上昇にも関わらず（実施例１中の３５％と比して、飽和率５０％）、グルコースが枯渇した後にパルスが急速に行われ、バイオマスの所望される濃度を達成するための培養時間は、実施例１に対して延びていない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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