(57)【要約】  その野生型と比較して、alaD遺伝子によりコードされる酵素の活性の増大を有する改変微生物を提供する。アラニンの生産方法及び改変微生物の使用もまた提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニンデヒドロゲナーゼEC 1.4.1.1をコードするalaD遺伝子によりコードされる酵素の発現の増大及び/又は活性の増大を有する、パスツレラ科（Pasteurellaceae）由来の改変微生物であって、
野生型と比較して、alaD遺伝子の発現及び/又は活性の増大が、
a）  alaD遺伝子を発現する発現構築物を改変微生物のゲノムに挿入することによって、
b）  alaD遺伝子のコピー数を増大させることによって、
c）  alaD遺伝子の野生型と比較してより強力なプロモーターによって、
d）  alaD遺伝子の活性をアップレギュレートする遺伝子の活性を増大させることによって、又はalaD遺伝子の活性をダウンレギュレートする遺伝子の活性を低下させることによって
達成される、改変微生物。
【請求項２】
配列番号1の16S rDNA若しくは配列番号1と少なくとも96％の配列同一性を示す配列を有する、及び/又は配列番号2の23S rDNA若しくは配列番号2と少なくとも96％の配列同一性を示す配列を有する、請求項1に記載の改変微生物。
【請求項３】
バスフィア属（Basfia）に属する、請求項1又は請求項2に記載の改変微生物。
【請求項４】
バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succinicproducens）種に属する、請求項3に記載の改変微生物。
【請求項５】
改変微生物が由来した野生型が、DSMZ、GermanyにDSM 18541で寄託されたバスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1株である、請求項4に記載の改変微生物。
【請求項６】
alaD遺伝子が、
a）  配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、及び
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）
からなる群から選択される核酸を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項７】
a）  ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の低減、
b）  乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低減、
c）  ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の低減、又は
d）  それらのいずれかの組み合わせ
をさらに有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項８】
a）  ldhA遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入、
b）  pflD遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入、
c）  pflA遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入、
d）  pckA遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、pckA遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はpckA遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入、あるいは
e）  それらのいずれかの組み合わせ
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項９】
ldhA遺伝子が、
a）  配列番号5のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、及び
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）
からなる群から選択される核酸を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項１０】
pflD遺伝子が、
a）  配列番号7のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号8のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、及び
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）
からなる群から選択される核酸を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項１１】
pflA遺伝子が、
a）  配列番号9のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号10のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、及び
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）
からなる群から選択される核酸を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項１２】
pckA遺伝子が、
a）  配列番号11のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、及び
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）。
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項１４】
I）  培養培地中で適切な培養条件下において請求項1〜12のいずれか一項に記載の改変微生物を培養して、改変微生物がアラニンを生産するのを可能にし、それによって、アラニンを含む発酵ブロスを得るステップと、
II）  方法ステップI）で得られた発酵ブロスからアラニンを回収するステップと
を含む、アラニンを生産する方法。
【請求項１５】
培養培地が、同化可能な炭素源として、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース及び/又はグリセロールを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
改変微生物の培養が、嫌気的又は微好気的条件下で実施される、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1つの化学反応によって、方法ステップI）で得られた発酵ブロスに含まれるアラニン又は方法ステップII）で得られた回収したアラニンを、アラニンと異なる第二の有機生成物へ変換する方法ステップ
をさらに含む、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
アラニンの発酵生産のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の改変微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2013年8月30日に出願された欧州特許出願第13182425.2号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、alaD遺伝子によりコードされるアラニンデヒドロゲナーゼ酵素の発現の増大及び/又は活性の増大を有する、パスツレラ（Pasteurellaceae）科由来の改変微生物、アラニンを生産する方法、及び改変微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アミノ酸は、カルボキシ基及びアミノ基を有する有機化合物である。最も重要なアミノ酸は、アミノ基がカルボキシ基の隣に位置しているα-アミノ酸である。タンパク質は、α-アミノ酸に基づいている。α-アミノ酸のうちの9つは、哺乳動物が生産できず、飼料及び食料で供給する必要がある必須アミノ酸である。L-アラニンは、コリネ型細菌（Hermann、2003: Industrial production of amino acids by Coryneform bacteria、J. of Biotechnol、104、155〜172.）又は大腸菌（E.coli.）（Zhangら、Production of L-alanine by metabolically engineered Escheria coli. (2007) Appl. Microbiol Biotechnol.、77:355〜366）を用いる発酵によって生産することができる。L-アラニンは、医薬品産業、獣医学及び甘味料で使用されている。
【０００４】
アラニンは、食料、飼料及び医薬品産業において添加物として使用されているので、かなりの関心を集めてきた。
【０００５】
大腸菌株によるアラニンの工業生産は、化学製品に適用可能である。大腸菌は、強い免疫応答を惹起し得るリポ多糖を含んでいる。したがって、ヒトの消費及び/又は輸液などの医薬用途のための材料を調製するための大腸菌の使用は、やや不評である。したがって、先のヒト病原生物に由来しない、飼料及び食料製品の生産のための細菌株を使用することが好ましい。そのような生物は、非病原性のバスフィア（Basfia）属である。
【０００６】
コリネバクテリウム（Corynebacterium）は嫌気的条件下で増殖することができず、バイオマス1gあたりのアラニンの生産性が非常に低いので、コリネ型細菌によるアラニンの工業生産は、あまり効率的ではない。Yamamotoら、Applied and environmental microbiology;78(12);4447〜4457は、高密度まで増殖し、続いて8.3倍濃度を上げ、次いでこれをグルコースを用いて嫌気的にインキュベートする、好気的に増殖する細胞を示す。しかし、コリネバクテリウム・グルタミクム（C. glutamicum）では、増殖及びアラニン生産のために2つの異なるフェーズが必要とされるので、この方法は複雑であり、技術的に困難である。
【０００７】
Uhlenbuschら（Applied and Environmental Microbiology第57巻1360〜1366、1991）は、生物のザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）が、アラニンデヒドロゲナーゼの形質転換及びその過剰発現の後に、アラニンを生産することができるが、わずか2つの量に対しても効率が低い（25時間で7.5g/l）ことを示す。アラニン合成とびエタノール生産の間に競合作用が起こることが分かった。アラニンの生産は、組換えラクトコッカスラクティス（Lactococcus lactis）でも示されたが、収量生産性及び有用性が制限されることが分かった（Nature Biotechnology、第17巻、588〜592、1999）。
【０００８】
ラクトコッカス・ラクティスのようないくつかの生物の欠点の1つは、アラニンが、収量を低下させるジアセチル及びアセトインなどの望まれない副生成物に分解され得ることである（Journal of Applied Microbiology、第104巻、171〜177、2008）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、好ましくは上記の不都合のない、アラニンの発酵生産に使用することができる微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
野生型と比較して、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性が増大したパスツレラ科の改変微生物が、上述の目的を達成するために寄与する。アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、以後alaD遺伝子とも称される。
【００１１】
驚いたことに、alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性の増大によって、この酵素の発現及び/又は活性が増大していない対応する微生物と比較して、アラニンの収量増大を特徴とする組換えパスツレラ株がもたらされることが発見された。これに対して、WO2009/024294のバスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succinici producens）は、コハク酸の生産が記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プラスミドpSacBの概略図を示す。
【図２】プラスミドpSacB alaDの概略図を示す。
【図３】プラスミドpSacB ΔldhAの概略図を示す。
【図４】プラスミドpSacB ΔpflDの概略図を示す。
【図５】プラスミドpSacB ΔpflAの概略図を示す。.
【図６】プラスミドpSacB ΔpckAの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
微生物の「野生型」は、ある種の遺伝子、例えば、alaD遺伝子、ldhA遺伝子、pflD遺伝子、pflA遺伝子及び/又はpckA遺伝子の遺伝的改変を導入する前の場合と同様の状況でゲノムが存在する微生物を指す。遺伝的改変は、例えば、例えばalaD遺伝子に関する、例えばゲノムへの前記遺伝子の挿入でもよい。遺伝的改変は、例えば、ldhA遺伝子、pflD遺伝子、pflA遺伝子及び/又はpckA遺伝子の、例えば、遺伝子若しくはその一部の欠失又は点変異でもよい。
【００１４】
したがって用語「改変微生物」は、（例えば遺伝的改変が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合）それが由来した野生型微生物と比較して変化した又は異なる遺伝子型及び/又は表現型を示すように遺伝的に改変された微生物を含む。本発明に係る特定の好ましい実施形態において、改変微生物は組換え微生物であり、これは、その微生物が少なくとも1つの組換えDNA分子を含むことを意味する。本発明に係る特定の好ましい実施形態において、改変微生物は、点変異を導入することによって得てもよい。
【００１５】
DNAに関する用語「組換え体」は、組換えDNA技法を使用して人為的に作製されたDNA分子を指す。この用語は、それ自体は天然には存在しないが、人為的に改変、変化、変異又は操作されたDNA分子を含む。好ましくは、「組換えDNA分子」は、少なくとも1つの核酸によって天然に存在する核酸分子と配列が異なる、天然に存在しない核酸分子である。「組換えDNA分子」は、好ましくは機能的に連結させた、その順序で天然に存在しない核酸分子の配列を含む「組換え構築物」を含むこともできる。前記組換えDNA分子を作製する好ましい方法は、クローニング技法、定方向若しくは非定方向変異誘発、遺伝子合成又は組換え技法を含むことができる。そうした組換えDNAの例は、異種のDNA配列が挿入されたプラスミドである。
【００１６】
用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特定の遺伝子（複数可）又は特定の遺伝子ベクター構築物の転写を意味する。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特に、遺伝子（複数可）又は遺伝子ベクター構築物のmRNAへの転写を意味する。このプロセスは、DNAの転写及び生じたRNA産物のプロセシングを含む。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、mRNAの翻訳及びそれとともにコードされるタンパク質の合成、すなわちタンパク質発現を含むこともできる。
【００１７】
本発明に係る微生物が由来する野生型はパスツレラ科に属する。パスツレラ科は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）などの細菌から動物及びヒトの粘膜の共生生物に及ぶメンバーを有するグラム陰性プロテオバクテリア（Proteobacteria）の多くを含む。大部分のメンバーは、鳥及び哺乳動物の粘膜表面に、特に上気道中に共生生物として生息する。パスツレラは、一般的には桿状であり、通性嫌気性菌の有名な群である。これは、オキシダーゼの存在によって関連する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）と区別することができ、鞭毛がないことによって大部分の他の類似した細菌と区別することができる。パスツレラ科の細菌は、代謝特性並びに16S RNA及び23S RNAの配列に基づいて、いくつかの属に分類されている。パスツレラの多くはピルビン酸-ギ酸-リアーゼ遺伝子を含み、炭素源を嫌気的に発酵して有機酸にすることができる。パスツレラ科の属はバスフィア属であり、非病原性生物群は、Kuhnertら、International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology、第60巻、44〜50 (2010)に記載されている。
【００１８】
本発明に係る改変微生物の特定の好ましい実施形態において、改変微生物が由来した野生型はバスフィア属に属し、特に、改変微生物が由来した野生型がバスフィア・サクシニシ・プロデュセンス種に属することが好ましい。
【００１９】
最も好ましくは、本発明に係る改変微生物が由来した野生型は、ブダペスト条約のもとでDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen、GmbH、Inhoffenstraβe 7B、38124 Braunschweig、Germany）に寄託された、受託番号DSM 18541を有するバスフィア・サクシニシプロデュセンス-DD1株である。この株は、ドイツ起源のウシのルーメンから最初に単離された。パスツレラ（Pasteurella）菌は、動物及び好ましくは哺乳動物の消化管から単離することができる。細菌DD1株は、特に、ウシのルーメンから単離することができ、炭素源としてグリセロール（粗グリセロールを含める）を利用することができる。本発明に係る改変微生物を調製するために使用することができるバスフィア属のさらなる株は、DSMZに受託番号DSM 22022で寄託されたバスフィア株である。本発明に係る改変微生物を調製するために使用することができるバスフィア属のさらなる株は、Culture Collection、University of Goteborg (CCUG)、Sweden (CCUG、Department of Clinical Bacteriology; Guldhedsgatan 10、SE-413 46 Goteborg、Box 7193、SE-402 34 Goteborg、Sweden)に受託番号CCUG 57335、CCUG 57762、CCUG 57763、CCUG 57764、CCUG 57765及びCCUG 57766で寄託されたバスフィア株である。前記株は、ドイツ又はスイス起源のウシのルーメンから最初に単離された。
【００２０】
本発明に係る好ましい実施形態において、改変微生物はグリセロールのスクロース媒介性異化抑制を特徴としない。グリセロールのスクロース媒介性異化抑制を示す微生物は、例えばWO-A-2012/030130に開示されている。
【００２１】
この文脈において、本発明に係る改変微生物が由来した野生型が、配列番号1の16S rDNA、又は配列番号1と好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％若しくは少なくとも99.9％の配列同一性を示す配列を有することが、特に好ましい（同一性は、核酸の長さ全体にわたる配列番号1との同一性である）。
【００２２】
この文脈において、本発明に係る改変微生物が由来した野生型が、配列番号2の23S rDNA、又は配列番号2と好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％若しくは最も好ましくは少なくとも99.9％の配列同一性を示す配列を有することが、特に好ましい（同一性は、核酸の長さ全体にわたる配列番号2との同一性である）。
【００２３】
本発明に係る改変微生物に使用される様々なポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して言及されるパーセンテージ値での同一性は、好ましくは、アライメントした配列の全長にわたる残基の同一性として計算され、例えば、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージEMBOSS（バージョン5.0.0、http://emboss.source-forge.net/what/）のニードル（needle）プログラムを使用して、デフォルトパラメーター、すなわちギャップ開始（ギャップの開始に対するペナルティー）:10.0、ギャップ伸長（ギャップの伸長に対するペナルティー）:0.5、及びデータファイル（パッケージに含まれるスコア行列ファイル）:EDNAFULを用いて、（かなり類似した配列について）計算される同一性などである。
【００２４】
本発明に係る改変微生物は、上述の野生型微生物、特にバスフィア・サクシニシプロデュセンス-DD1株に由来するだけでなく、これらの株の変異体にも由来し得ることに留意されたい。この文脈において、表現「株の変異体」は、野生型株と同じ又は本質的に同じ特徴を有するあらゆる株を含む。この文脈において、変異体の16S rDNAが、変異体が由来した野生型と少なくとも99％、好ましくは少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、少なくとも99.9％又は最も好ましくは少なくとも99.9％の同一性を有することが、特に好ましい。さらに、変異体の23S rDNAが、変異体が由来した野生型と少なくとも99％、好ましくは少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99,7％、少なくとも99.8％、少なくとも99.9％又は最も好ましくは少なくとも99.9％の同一性を有することが特に好ましい。この定義の意味での株の変異体は、例えば、変異誘発性化学薬剤、X線又はUV光で野生型株を処理することによって、得ることができる。
【００２５】
本発明に係る改変微生物は、野生型と比較して、alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性が増大していることを特徴とする。用語「alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性の増大」は、alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性が検出されない野生型微生物も包含する。alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性を検出及び測定する方法は、例えば、Jojima T, Fujii M, Mori E, Inui M, Yukawa H.、Engineering of sugar metabolism of Corynebacterium glutamicum for production of amino acid L-alanine under oxygen deprivation (2010) Appl Microbiol Biotechnol. 87、159〜165; WO 2008119009 A2 (Materials and methods for efficient alanine production); A. Freese, E. Biochim. Biophys. Acta 96、248〜262 (1965)又はSakamotoら、J. Ferment. Bioeng. 69、154〜158 (1990);Honoratら、Enzyme Microb. Technol. 12、515〜520 (1990);又はLaue, H.; Cook, A.M.、Arch. Microbiol. 174、162〜167 (2000)に見出すことができる。Jojimaら(2010)に記載されている方法が好ましい。
【００２６】
一実施形態では、アラニンデヒドロゲナーゼ（alaD）の発現及び/又は活性の増大は、野生型の微生物における前記酵素の発現及び/若しくは活性と比較して少なくとも110％の発現及び/若しくは酵素活性の増大、又は少なくとも120％の発現及び/若しくは酵素活性の増大、又はより好ましくは少なくとも130％の発現及び/若しくは酵素活性の増大、又はより好ましくは少なくとも140％の発現及び/若しくは酵素活性の増大、又はさらにより好ましくは少なくとも150％の発現及び/若しくは酵素活性の増大、又はさらにより好ましくは少なくとも160％の発現及び/若しくは酵素活性の増大である。野生型のアラニンデヒドロゲナーゼの発現及び/又は酵素活性は、発現及び/又は酵素活性の増大と比較して、100％である。用語「alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性の増大」は、この酵素の発現及び/又は活性が検出されない改変微生物も包含し得る。
【００２７】
一実施形態では、アラニンデヒドロゲナーゼの発現及び/又は活性の増大は、アラニンデヒドロゲナーゼ、EC1.4.1.1をコードするalaD遺伝子の活性化によって達成される。
【００２８】
alaD遺伝子は、以下：
a）  配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、並びに
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）、
からなる群から選択される核酸を含み、
好ましくは、b）からd）で定義された核酸によりコードされるタンパク質は、a）で定義された核酸によりコードされるタンパク質として、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、少なくとも30％、より好ましくは少なくとも40％、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００２９】
用語「酵素の遺伝子発現の増大」は、例えば、前記微生物の野生型が発現するよりも高いレベルでの、前記遺伝子操作された（例えば、遺伝子組換えされた）微生物による酵素の発現、又はデノボ発現を含む。酵素をコードする遺伝子の発現を増大させるための遺伝子操作としては、1コピー若しくはさらなるコピーの対応する遺伝子を導入すること、（例えば、それぞれの野生型と比較して強力なプロモーターを導入する若しくは抑制性プロモーターを除去することによって）酵素をコードする遺伝子の発現と関係がある調節配列若しくは部位を変化させる若しくは改変すること、酵素をコードする遺伝子の転写及び/若しくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を改変すること、又は当技術分野で慣例的な特定の遺伝子の発現を増大させる任意の他の慣用的手段を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３０】
さらに、酵素活性の増大は、活性を増大すべき酵素を活性化するために必要な活性化酵素の活性化（又は発現の増大）を含むこともできる。
【００３１】
本発明に係る改変微生物の好ましい実施形態において、alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性の増大は、alaD遺伝子の改変によって達成され、この改変は、好ましくは、微生物ゲノムへのalaD遺伝子の挿入、例えば、好ましくはバスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succinic producens）のpflD遺伝子座におけるalaD遺伝子の相同組換えによって実現される。以下に、配列を挿入するための適切な技法を記載する。
【００３２】
本発明に係る改変微生物のさらなる好ましい実施形態において、この微生物は、alaD遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性の増大だけでなく、野生型と比較して、以下：
i）  ldhAの発現及び/若しくは活性の低減
ii）  pflDの発現及び/若しくは活性の低減
iii）  pflAの発現及び/若しくは活性の低減、並びに/又は
iv）  pckAの発現及び/若しくは活性の低減
も特徴とする。
【００３３】
本明細書に開示される酵素の発現及び/又は活性の低減、特に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（pflD）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化因子（アクチベーター）（pflA）及び/又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（pckA）によりコードされる酵素の発現の低減及び/又は活性の低減は、野生型の微生物における前記酵素の発現及び/若しくは活性と比較して、少なくとも50％の発現及び/若しくは酵素活性の低減、又は少なくとも90％の発現及び/若しくは酵素活性の低減、又はより好ましくは少なくとも95％の発現及び/若しくは酵素活性の低減、又はより好ましくは少なくとも98％の発現及び/若しくは酵素活性の低減、又はさらにより好ましくは少なくとも99％の発現及び/若しくは酵素活性の低減、又はさらにより好ましくは少なくとも99.9％の発現及び/若しくは酵素活性の低減でもよい。用語「ldhA遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/若しくは活性の低減」、「pflD遺伝子によりコードされる酵素の活性の低減」、「pflA遺伝子によりコードされる酵素の活性の低減」又は「pckA遺伝子によりコードされる酵素の活性の低減」は、これらの酵素の発現及び/又は活性が検出されない改変微生物も包含する。前記遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性を検出及び測定のための方法は、例えば、以下に見出すことができる。
【００３４】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現又は活性を測定する方法は、例えば、G.P. Bridger, T.K. Sundaram (1976) Occurrence of phosphenolpyruvate carboxylase in the extremely thermophilic bacterium Thermus aquaticus、J Bacteriol. 125、1211〜1213; P. Maeba, B. D. Sanwal (1969) Phosphoenolpyruvate carboxylase from Salmonella typhimurium strain LT2、Methods in Enzymology 13、283〜288;又はJ. L. Canovas, H. L. Kornberg (1969) Phosphoenolpyruvate carboxylase from Escherichia coli、Methods in Enzymology 13、288〜292に開示されている。G.P. Bridger, T.K. Sundaram (1976)に記載され、開示されている方法が好ましい。
【００３５】
乳酸デヒドロゲナーゼの発現又は活性を測定する方法は、例えば、Bunchら、「The ldhA gene encoding the fermentative lactate de hydrogenase of Escherichia Coli」、Microbiology (1997)、第143巻、187〜155頁;又はBergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M. (1983〜1986)、「Methods of Enzymatic Analysis」、第3版、第III巻、126〜133頁、Verlag Chemie, Weinheim;又はEnzymes in Industry: Production and Applications、第2版(2004)、Wolfgang Aehle、23頁によって開示されている。最後の方法が好ましい。
【００３６】
ピルビン酸ギ酸リアーゼの発現又は活性を測定する方法は、例えば、Knappe and Blaschkowski、「Pyruvate formate-lyase from Escherichia coli and its activation system」、Methods Enzymol. (1975)、第41巻、508〜518頁;又はAsanuma N. and Hino T.、「Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis」、Appl. Environ. Microbiol. (2000)、第66巻、3773〜3777頁に開示されている。最後の方法が好ましい。
【００３７】
ピルビン酸ギ酸-リアーゼ活性化酵素の発現又は活性、ピルビン酸ギ酸リアーゼの活性を測定する方法は、Takahashi-Abbe S., Abe K., Takahashi N.、Biochemical and functional properties of a pyruvate formate-lyase (PFL)-activating system in Streptococcus mutans (2003) Oral Microbiology Immunology 18、293〜297に開示されている。
【００３８】
用語「酵素の発現の低減」としては、例えば、前記微生物の野生型が発現するものより低いレベルでの、前記遺伝子操作された（例えば、遺伝子組換えされた）微生物による酵素の発現が含まれる。酵素の発現を低減させるための遺伝子操作としては、酵素をコードする遺伝子若しくはその一部を欠失させること、（例えば、強力なプロモーター若しくは抑制性プロモーターを除去することによって）酵素をコードする遺伝子の発現と関係がある調節配列若しくは部位を変化させる若しくは改変すること、酵素をコードする遺伝子の転写及び/若しくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を改変すること、又は当技術分野で慣例的な特定の遺伝子の発現を低下させる任意の他の慣用的手段（これらに限定されないが、アンチセンス核酸分子の使用若しくは標的タンパク質の発現をノックアウト若しくはブロックする他の方法が挙げられる）を挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、mRNAに不安定化エレメントを導入してもよいし、RNAのリボゾーム結合部位（RBS）の変質をもたらす遺伝子改変を導入してもよい。さらに、RNAの変質をもたらすアンチセンス又はRNAi構築物をゲノム中に導入してもよい。翻訳効率及び速度を低下させるように遺伝子のコドン使用頻度を変化させることも可能である。
【００３９】
本発明に係る改変微生物の好ましい実施形態において、ldhA遺伝子、pflD遺伝子、pflA遺伝子及び/又はpckA遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性の低減は、ldhA遺伝子、pflD遺伝子、pflA遺伝子及び/又はpckA遺伝子の改変によって達成され、この/これらの遺伝子改変（複数可）は、前記遺伝子又は少なくともその一部の1つ以上の欠失、前記遺伝子の1つ以上の調節エレメント（例えばプロモーター配列）又はその一部の欠失によって、フレームシフトによって、終止コドンの導入によって、前記遺伝子の1つ以上への少なくとも1つの有害変異の導入によって、好ましくは実現される。さらに、前記遺伝子の1つ以上から発現される対応のRNAの変質をもたらす、アンチセンス又はRNAi構築物をゲノム中に導入してもよい。
【００４０】
酵素の活性の低減は、酵素の活性の低減をもたらす1つ以上の有害な遺伝子変異を導入することによって得ることもできる。さらに、酵素の活性の低減は、活性を低減すべき酵素を活性化するために必要な活性化酵素の不活性化（又は発現の低減）を含むこともできる。後者の手法によって、活性を低減すべき酵素は、好ましくは、不活性化された状況で維持される。
【００４１】
有害変異は、遺伝子のコード領域によりコードされるタンパク質のタンパク質活性の低下又は除去をもたらす、プロモーター及びコード領域を含む遺伝子内の任意の変異でもよい。そうした有害変異は、例えば、フレームシフト、コード領域中への終止コドンの導入、転写などを妨げる、TATAボックスなどのプロモーターエレメントの変異を含む。
【００４２】
ldhA遺伝子、pflD遺伝子、pflA遺伝子及び/又はpckA遺伝子によりコードされる酵素の発現及び/又は活性が低減した微生物は、天然に、すなわち自発的な有害変異が原因で生じ得る。微生物は、化学処理又は放射線照射などの様々な技法によって、前記遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の活性を欠く又は有意に低減するように改変することができる。この目的のために、微生物は、例えば、変異誘発性化学薬剤、X線又はUV光で処理される。次のステップで、前記遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の発現及び/又は活性が低減した微生物が選択される。改変微生物は、微生物のゲノム中の前記遺伝子の1つ以上を変異させる、破壊する若しくは削除すること又は野生型遺伝子によりコードされる酵素と比較して、発現及び/若しくは活性が低減している酵素をコードする対応する遺伝子で前記遺伝子の1つ以上を置換することを目的とする相同組換え技法によっても獲得可能である。
【００４３】
上記遺伝子への変異は、例えば、部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発、続いて、組換えによる微生物のゲノムへの改変遺伝子の導入によって、導入することができる。遺伝子の変異体は、PCRで遺伝子配列を変異させることにより作製することができる。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」（Stratagene）を、定方向変異誘発を行うのに使用することができる。コード配列全体、さもなければその一部のみにわたるランダム変異誘発を、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」（Stratagene）を用いて実施することができる。変異誘発率は、使用する鋳型DNA量を介して所望の変異量に設定される。多重変異は、標的とされる個々の変異の組み合わせ又はいくつかの変異誘発サイクルの連続的な実施によって作製される。
【００４４】
以下では、組換え、特に変異導入又は配列欠失のための好適な技術を記載する。
【００４５】
この技術はまた、本明細書で「キャンベル組換え（Campbell recombination）」と称されることもある（Leenhouts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 55, p.394-400）。本明細書で用いる「キャンベルイン（Campbell in）」とは、環状二本鎖DNA分子（例えばプラスミド）の全体が、単一の相同組換え事象（クロスイン事象）によって染色体に組み込まれ、それにより、該環状DNA分子の線状型が、該環状DNA分子の第一DNA配列に相同な染色体の第一DNA配列に効率的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体を意味する。「キャンベルドイン（Campbelled in）」とは、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれている線状化DNA配列を意味する。「キャンベルイン」は、第一相同DNA配列の重複を含有し、その各コピーは、相同組換え交差点のコピーを含み、それを取り囲む。
【００４６】
本明細書で用いる「キャンベルアウト（Campbell out）」とは、第二相同組換え事象（クロスアウト事象）が、「キャンベルドイン」DNAの線状化挿入DNA上に含まれる第二DNA配列と、該線状化挿入体の第二DNA配列に相同な染色体由来の第二DNA配列との間で起きている、「キャンベルイン」形質転換体の子孫である細胞を意味する。第二組換え事象は、組み込まれたDNA配列の一部の欠失（放出）をもたらすが、重要なことに、組み込まれた「キャンベルドイン」DNAの一部（これはわずか単一塩基であってもよい）の染色体中への残存ももたらし、元の宿主細胞と比べて「キャンベルアウト」細胞は、染色体における1つ以上の意図的な変化を含有する（例えば、一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子若しくはDNA配列の挿入、相同遺伝子若しくは改変相同遺伝子のさらなる1つ又は複数コピーの挿入、あるいは上に挙げたこれらの例の2つ以上を含むDNA配列の挿入）。「キャンベルアウト」細胞は、好ましくは、「キャンベルドイン」DNA配列の一部（放出されることが望ましい一部）に含まれる遺伝子（例えば、約5％〜10％スクロースの存在下で増殖する細胞中で発現されると致死である、枯草菌（Bacillus subtilis）sacB遺伝子）に対する対抗選択によって得られる。対抗選択を行っても、又は行わなくても、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型、例えば以下に限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在又は不在、ポリメラーゼ連鎖反応による所定のDNA配列の存在又は不在、栄養要求性の存在又は不在、酵素の存在又は不在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなどを用いて、所望の細胞をスクリーニングすることによって得る又は同定することができる。「キャンベルイン」及び「キャンベルアウト」という用語はまた、上記方法又はプロセスを参照するために、様々な時制の動詞として使用することができる。
【００４７】
「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」をもたらす相同組換え事象が、相同なDNA配列内のDNA塩基の範囲にわたって起こり得ることが理解されており、相同な配列は少なくともこの範囲の部分では互いに同一であるため、交差事象が起きた正確な場所を特定することは通常可能ではない。言い換えると、どの配列が挿入されたDNAに由来するか、そしてどの配列が染色体DNAに由来するかを正確に特定することはできない。さらに、第一相同DNA配列及び第二相同DNA配列は、通常、部分的に非相同な領域によって分離され、「キャンベルアウト」細胞の染色体に残ったままであるのはこの非相同領域である。
【００４８】
好ましくは、第一及び第二相同DNA配列は、少なくとも約200塩基対長であり、最大数千塩基対長であり得る。しかし、本方法は、より短い又はより長い配列で機能するようにすることができる。例えば、第一及び第二相同配列の長さは約500〜2000塩基であることができ、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」を得ることは、第一及び第二相同配列をおよそ同じ長さにすることによって、好ましくは200塩基対未満で異なるように、最も好ましくは2つのうち短い方を塩基対が長い方の長さの少なくとも70％であるようにすることによって、促進される。
【００４９】
一実施形態において、アラニンデヒドロゲナーゼの活性の増大は、好ましくは上述したような「キャンベル組換え」を使用した、alaD遺伝子の発現及び／又は活性化の増大により達成される。
【００５０】
一実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼの発現及び/又は活性の低減は、乳酸デヒドロゲナーゼEC1.1.1.27又はEC1.1.1.28をコードするldhA遺伝子の不活性化により達成され、ピルビン酸ギ酸リアーゼの発現及び/又は活性の低減は、ピルビン酸ギ酸リアーゼEC1.97.1.4の活性化因子（アクチベーター）をコードするpflA遺伝子の不活性化により達成され、あるいは、ピルビン酸ギ酸リアーゼの発現及び/又は活性の低減は、ピルビン酸ギ酸リアーゼEC2.3.1.54をコードするpflD遺伝子の不活性化により達成され、並びに／あるいはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現及び/又は活性の低減は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼEC4.1.1.49をコードするpckA遺伝子の不活性化により達成される。
【００５１】
一実施形態において、上記遺伝子（すなわち、ldhA、pflA、pflD及び／又はpckA）の不活性化は、好ましくは、上記遺伝子若しくはその一部の欠失により、上記遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失により、又は上記遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入により行われ、これらの改変は、好ましくは上述したような「キャンベル組換え」を使用して行われる。
【００５２】
ldhA遺伝子は、好ましくは以下：
a）  配列番号5のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、並びに
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）、
からなる群から選択される核酸を含む。
【００５３】
pflD遺伝子は、好ましくは以下：
a）  配列番号7のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号8のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、並びに
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）、
からなる群から選択される核酸を含む。
【００５４】
乳酸デヒドロゲナーゼを欠損する及び／又はピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を欠損する改変微生物は、WO-A-2010/092155、US2010/0159543及びWO-A-2005/052135に開示されており、微生物、好ましくはパスツレラ属（Pasteurella）の細菌細胞、特に好ましくはバスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）DD1株において乳酸デヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸ギ酸リアーゼの活性を低減する種々の方法に関するその開示内容を参照により本明細書に組み入れる。
【００５５】
pflA遺伝子は、好ましくは以下：
a）  配列番号9のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号10のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、並びに
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）、
からなる群から選択される核酸を含む。
【００５６】
pckA遺伝子は、好ましくは以下：
a）  配列番号11のヌクレオチド配列を有する核酸、
b）  配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸、
c）  a）又はb）の核酸に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸（同一性は、a）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である）、並びに
d）  a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、最も好ましくは少なくとも97％、最も好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸（同一性は、a）又はb）の核酸によりコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である）、
からなる群から選択される核酸を含む。
【００５７】
この文脈において、本発明に係る改変微生物は、以下：
a）  alaD遺伝子の挿入、
b）  pflD遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入、あるいはpflA遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入、
c）  pckA遺伝子若しくは少なくともその一部の欠失、pckA遺伝子の調節エレメント若しくは少なくともその一部の欠失、又はpckA遺伝子への少なくとも1つの有害変異の導入
を含むことが好ましい。
【００５８】
最初に言及した課題の解決に対する貢献は、以下を含む有機化合物の生産方法によってもたらされる：
I）  同化可能な炭素源を含む培養培地中で適切な培養条件下において本発明に係る改変微生物を培養して、改変微生物がアラニンを生産するのを可能にし、それによって、アラニンを含む発酵ブロスを得るステップと、
II）  方法ステップI）で得られた発酵ブロスからアラニンを回収するステップ。
【００５９】
本発明において使用する用語「アラニン」は、その最も広い意味で理解されるべきであり、その塩、例えば、Na+及びK+塩などのアルカリ金属塩、又はMg2+及びCa2+塩などのアルカリ土類金属塩、又はアンモニウム塩；又はアラニンの無水物も包含する。
【００６０】
本発明に係る改変微生物は、好ましくは、培地中で、約10〜60℃若しくは20〜50℃若しくは30〜45℃の範囲の温度で、pH 5.0〜9.0若しくは5.5〜8.0若しくは6.0〜7.0でインキュベートする。
【００６１】
好ましくは、アラニンを嫌気的条件下で生産する。好気的条件又は微好気的条件を使用してもよい。嫌気的条件を、慣用技術により、例えば、反応媒体の構成要素を脱気し、二酸化炭素若しくは窒素又はその混合物、必要に応じて、水素を、例えば流速0.1〜1又は0.2〜0.5 vvmで導入することにより嫌気的条件を維持することにより確立することができる。好気的条件は、慣用技術により、例として、例えば流速0.1〜1又は0.2〜0.5 vvmで空気又は酸素を導入することにより確立することができる。適当であれば、方法中に0.1〜1.5バールのわずかな過圧を印加することができる。
【００６２】
一実施形態において、微好気的とは、酸素濃度が空気中の濃度未満であることを意味する。一実施形態において、微好気的とは、酸素圧5〜27mmHg、好ましくは10〜20Hgを意味する（Megan Falsetta et al. (2011), The composition and metabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms, Frontiers in Microbiology, Vol 2, p.1-11）。
【００６３】
本発明の方法の一実施形態において、同化可能な炭素源は、グルコース、グリセリン、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、スクロース、アラビノース、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの混合物とすることができる。
【００６４】
好ましい実施形態において、同化可能な炭素源は、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、グリセロール又はその組み合わせである。好ましい炭素源は：
グルコース、
スクロース、
グルコース及びスクロース、
グルコース及びキシロース、並びに／又は
グルコース、アラビノース及びキシロース
である。
【００６５】
本発明に係る方法の一実施形態において、同化可能な炭素源は、グルコース、グリセリン及び／又はグルコースでありうる。
【００６６】
同化可能な炭素源の初期濃度、好ましくは初期濃度は、好ましくは、5〜100g/l、好ましくは5〜75g/l、より好ましくは5〜50g/lの範囲の値に調整し、培養の間に該範囲に維持することができる。反応培地のpHは、例えば、気体アンモニア、NH4OH、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N、及び／又はそれらの混合物などの好適な塩基の添加により制御することができる。
【００６７】
本発明における発酵ステップI）は、例えば、撹拌発酵槽、気泡塔及びループ反応器中で行うことができる。撹拌機の種類及び幾何学的設計を含む可能な方法の種類の包括的概観は、Chmiel:「Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik」第1巻に見出すことができる。本発明の方法において、利用できる典型的な変形は、当業者に公知の、又は例えばChmiel, Hammes and Bailey:「Biochemical Engineering」中に説明されている以下の変形、例えば、バイオマスの再循環を伴う又は伴わない、バッチ発酵、フェドバッチ（fed-batch）発酵、反復フェドバッチ発酵、又は他の連続的発酵である。生産株に応じて、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素又は適切な気体混合物の注入（スパージ）を、優れた収率（YP/S）を達成するために行ってよい。
【００６８】
方法ステップI）においてアラニンを生産するための特に好ましい条件は：
同化可能な炭素源：グルコース
温度：30〜45℃
pH：5.5〜7.0
供給ガス：気体アンモニア
である。
【００６９】
方法ステップII）では、方法ステップI）において得られた発酵ブロスからアラニンを回収する。
【００７０】
通常、回収方法は、いわゆる「バイオマス」としての発酵ブロスから組換え微生物を分離するステップを含む。バイオマスを除去する方法は、当業者に公知であり、ろ過、沈降、浮選又はその組み合わせを含む。その結果、バイオマスを例えば遠心機、分離機、デキャンター、フィルターを用いて、又は浮選装置中で除去することができる。価値ある生成物を最大限回収するために、例えば透析ろ過の形式での、バイオマスの洗浄が望ましい場合が多い。方法の選択は、発酵ブロス中のバイオマス含量、及びバイオマスの特性に依存し、そしてまたバイオマスと有機化合物（例えば価値ある生成物）との相互作用にも依存する。一実施形態において、発酵ブロスを滅菌又は殺菌することができる。さらなる実施形態において、発酵ブロスは濃縮される。必要に応じて、この濃縮はバッチ方式で又は連続的に行うことができる。圧力及び温度範囲は、第一に生成物の損傷が起こらないように、第二に必要な装置及びエネルギーの使用が最小限になるように、選択するべきである。多段蒸発法についての圧力及び温度レベルをうまく選択すると、特に、エネルギーの節約が可能となる。
【００７１】
回収方法はさらに、アラニンをさらに精製する追加の精製ステップを含んでもよい。しかしながら、アラニンが以下に記載するように化学反応により第二の有機生成物に変換される場合には、アラニンのさらなる精製は、反応の種類及び反応条件に応じて異なるが、必ずしも必要なわけではない。方法ステップII）において得られるアラニンをさらに精製するため、当業者に公知の方法、例えば結晶化、ろ過、電気透析、及びクロマトグラフィーを用いることができる。得られる溶液を、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製して、望ましくない残留イオンを除去することができる。 
【００７２】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、該方法は、さらに方法ステップ： 
III）  少なくとも1つの化学反応によって、方法ステップI）で得られた発酵ブロスに含まれるアラニン又は方法ステップII）で得られた回収した有機化合物を、該有機化合物と異なる第二の有機生成物へ変換する方法ステップ
を含む。
【００７３】
本発明を、図面及び非限定的な実施例を用いて以下でより詳細に説明する。
【実施例】
【００７４】
実施例１：バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）の形質転換のための一般的方法
【表１】
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【００７５】
バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1（野生型）に、以下のプロトコールを用いたエレクトロポレーションによってDNAを形質転換した。
【００７６】
前培養物を調製するために、DD1を、凍結ストックから、100ml振とうフラスコ中の40mlのBHI（ブレインハートインフュージョン、Becton, Dickinson and Company）に接種した。インキュベーションを37℃、200rpmで一晩行った。主培養物を調製するために、100mlのBHIを250ml振とうフラスコ中に入れ、最終OD（600nm）0.2となるよう前培養物を接種した。インキュベーションを37℃、200rpmで行った。細胞をOD約0.5、0.6及び0.7で回収し、ペレットを4℃で10％冷グリセロールで一度洗浄し、2mlの10％グリセロール（4℃）中に再懸濁した。
【００７７】
100μlのコンピテント細胞を2〜8μgのDNAと混合し、0.2cmの幅を持つエレクトロポレーションキュベット中で2分間氷上に保持した。エレクトロポレーションは以下の条件であった：400Ω；25μF；2.5kV（Gene Pulser, Bio-Rad）。1mlの冷却BHIをエレクトロポレーション直後に添加し、インキュベーションを37℃で約2時間行った。
【００７８】
細胞を5mg/Lのクロラムフェニコールを含むBHI上にプレーティングし、形質転換体のコロニーが見えるまで37℃で2〜5日間インキュベートした。クローンを単離し、純粋なクローンが得られるまで5mg/lのクロラムフェニコールを含むBHI上に再度画線を引いた。
【００７９】
実施例２：欠失コンストラクトの作製
突然変異／欠失プラスミドを、ベクターpSacB（配列番号13）を基に構築した。図１は、プラスミドpSacBの略図を示す。欠失されるべき染色体断片の5'-及び3'-隣接領域（それぞれ約1500bp）を、バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）の染色体DNAからPCRによって増幅し、標準的技術を用いて該ベクターに導入した。通常、ORFの少なくとも80％を欠失のために標的化した。この方法で、乳酸デヒドロゲナーゼldhAのための欠失プラスミドpSacB_delta_ldhA（配列番号15）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflDのための欠失プラスミドpSacB_delta_pflD（配列番号16）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflAのための欠失プラスミドpSacB_delta_pflA（配列番号17）、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（craboxylase）のための欠失プラスミドpSacB_delta_pckA（配列番号18）を構築した。図３、４、５及び６は、それぞれプラスミドpSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflD、pSacB_delta_pflA、及びpSacB_delta_pckAの概略図を示す。プラスミドpSacB_alaD（配列番号14）は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）XL65-6のalaD遺伝子を境界としてバスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）のpflD 遺伝子の5’及び3’隣接領域を含有して構築した。alaD遺伝子はDNA2.0からオーダーした。プラスミドpSacB_alaDは、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのpflD遺伝子座にalaD遺伝子を導入するために使用することができる。図２は、プラスミドpSacB_alaD（配列番号14）の概略図を示す。
【００８０】
pSacB（配列番号13）のプラスミド配列において、sacB遺伝子は塩基2380〜3801に含まれる。sacBプロモーターは塩基3802〜4264に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基526〜984に含まれる。大腸菌の複製起点（ori EC）は塩基1477〜2337に含まれる（図１参照）。
【００８１】
pSacB_alaD（配列番号14）のプラスミド配列において、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpflD遺伝子の5'隣接領域は塩基4〜1574に含まれ、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpflD遺伝子の3'隣接領域は塩基2694〜4194に含まれる。alaD遺伝子は塩基1575〜2693に含まれる。sacB遺伝子は塩基6466〜7887に含まれる。sacBプロモーターは塩基7888〜8350に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基4612〜5070に含まれる。大腸菌の複製起点（ori EC）は塩基5563〜6423に含まれる（図２参照）。
【００８２】
pSacB_delta_ldhAのプラスミド配列（配列番号15）において、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なldhA遺伝子の5'隣接領域は塩基1519〜2850に含まれ、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なldhA遺伝子の3'隣接領域は塩基62〜1518に含まれる。sacB遺伝子は塩基5169〜6590に含まれる。sacBプロモーターは塩基6591〜7053に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3315〜3773に含まれる。大腸菌の複製起点（ori EC）は塩基4266〜5126に含まれる（図３参照）。
【００８３】
pSacB_delta_pflDのプラスミド配列（配列番号16）において、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpflD遺伝子の5'隣接領域は塩基1533〜2955に含まれ、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpflD遺伝子の3'隣接領域は塩基62〜1532に含まれる。sacB遺伝子は塩基5256〜6677に含まれる。sacBプロモーターは塩基6678〜7140に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3402〜3860に含まれる。大腸菌の複製起点（ori EC）は塩基4353〜5213に含まれる（図４参照）。
【００８４】
pSacB_delta_pflAのプラスミド配列（配列番号17）において、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpflA遺伝子の5'隣接領域は塩基1506〜3005に含まれ、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpflA遺伝子の3'隣接領域は塩基6〜1505に含まれる。sacB遺伝子は塩基5278〜6699に含まれる。sacBプロモーターは塩基6700〜7162に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3424〜3882に含まれる。大腸菌の複製起点（ori EC）は塩基4375〜5235に含まれる（図５参照）。
【００８５】
pSacB_delta_pckAのプラスミド配列（配列番号18）において、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpckA遺伝子の5'隣接領域は塩基5281〜6780に含まれ、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノムに相同なpckA遺伝子の3'隣接領域は塩基3766〜5265に含まれる。sacB遺伝子は塩基1855〜3276に含まれる。sacBプロモーターは塩基3277〜3739に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基1〜459に含まれる。大腸菌の複製起点（ori EC）は塩基952〜1812に含まれる（図６参照）。
【００８６】
実施例３：改善されたコハク酸アラニン株の作製
a）バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）DD1に、上記のようにpSacB_delta_ldhAを形質転換し、「キャンベルドイン」を行って「キャンベルイン」株を得た。形質転換及びバスフィア・サクシニシプロデュセンスゲノム内への組み込みを、バスフィア・サクシニシプロデュセンスのゲノム内へのプラスミドの組み込み事象についてのバンドをもたらすPCRによって確認した。
【００８７】
その後「キャンベルイン」株を、sacB遺伝子の（機能の）喪失を選択するための、対抗選択培地としてスクロースを含有する寒天プレートを用いて「キャンベルドアウト」を行った。すなわち、「キャンベルイン」株を25〜35mlの非選択培地（抗生物質を含有しないBHI）中で37℃、220rpmで一晩インキュベートした。その後、一晩培養物を、新たに調製したスクロース含有BHIプレート（10％、抗生物質なし）上に画線を引き、37℃で一晩インキュベートした（「1回目のスクロース移動」）。1回目の移動から得た単一コロニーを新たに調製したスクロース含有BHIプレート（10％）上に再度画線を引き、37℃で一晩インキュベートした（「2回目のスクロース移動」）。この手順を、最低5回のスクロース中の移動（「3、4、5回目のスクロース移動」）を終えるまで反復した。「1回目〜5回目のスクロース移動」という用語は、sacBレバン-スクラーゼ遺伝子を含有するベクターの染色体組み込み後の株を、sacB遺伝子及び周囲のプラスミド配列が喪失した株を選択するために、スクロース及び増殖培地を含有する寒天プレート上に移すことを意味する。5回目の移動プレートからの単一コロニーを、25〜35mlの非選択培地（抗生物質を含有しないBHI）に接種し、37℃、220rpmで一晩培養した。一晩培養物を連続希釈し、BHIプレート上にプレーティングし、単離した単一コロニーを得た。
【００８８】
ldhA遺伝子座の野生型状況又はldhA遺伝子の変異／欠失を含有する「キャンベルドアウト」株を、クロラムフェニコール感受性によって確認した。これらの株のうち変異／欠失変異体を、PCR解析によって同定及び確認した。これにより、ldhA欠失変異体バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhAを得た。
【００８９】
b）バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhAに、上記のようにpSacB_delta_pflDを形質転換し、「キャンベルドイン」を行って「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組み込みをPCRによって確認した。その後「キャンベルイン」株を、既に記載したように「キャンベルドアウト」を行った。これらの株のうち欠失変異体を、PCR解析によって同定及び確認した。これにより、ldhA pflD二重欠失変異体バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhA ΔpflDを得た。
【００９０】
c）バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhA ΔpflD（DD3）に、上記のようにpSacB_alaDを形質転換し、「キャンベルドイン」を行って「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組み込みをPCRによって確認した。その後「キャンベルイン」株を、既に記載したように「キャンベルドアウト」を行った。これらの株のうち変異体を、PCR解析によって同定及び確認した。これにより、ldhA pflD alaD変異体バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhA ΔpflD alaD（DD3 alaD）を得た。
【００９１】
d）バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhA ΔpflD alaD（DD3 alaD）に、上記のようにpSacB_delta_pckAを形質転換し、「キャンベルドイン」を行って「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組み込みをPCRによって確認した。その後「キャンベルイン」株を、既に記載したように「キャンベルドアウト」を行った。これらの株のうち欠失変異体を、PCR解析によって同定及び確認した。これにより、変異体バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD1 ΔldhA ΔpflD ΔpckA alaD（DD3 ΔpckA alaD）を得た。
【００９２】
実施例４：グルコース上での種々のDD1株の培養
1. 培地調製
培養培地の組成及び調製は以下の表2及び3に記載のようにした。
【００９３】
【表２】
2016529901.tif 000003
【００９４】
【表３】
2016529901.tif 000004
【００９５】
2. 培養及び分析
前培養物を増殖させるために、新たに増殖させたBHI-寒天プレートからの細菌を、表2a）に記載の50mlの液体培地B4_AEを含有する250ml振とうフラスコ又は表2b）に記載の50mlの液体培地B4_ANを含有する100ml振とうフラスコに接種するために用いた。フラスコを37℃にて170rpmでインキュベートした（振とう直径：2.5cm）。炭素源の消費及びカルボン酸の生成を、表中に特定した時間後にHPLC（HPLC法は表10及び11に記載）によって定量した。
【００９６】
分光光度計（Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Sweden）を用いて、600nmでの吸光度（OD600）を測定することによって細胞増殖を追跡した。
【００９７】
主培養物を増殖させるために、前培養物を表3a）に記載の50mlの液体培地B5_AEを含有する250ml振とうフラスコ又は表3b）に記載の50mlの液体培地B5_ANを含有する100ml振とうフラスコに接種するために用いた。フラスコを37℃にて170rpmでインキュベートした（振とう直径：2.5cm）。
【００９８】
炭素源の消費及びカルボン酸の生成を、表中に特定した時間後にHPLC（HPLC法は表10及び11に記載）によって定量した。好気的条件下で増殖する主培養物に、同様に好気的条件下で増殖する前培養物を接種した。嫌気的条件下で増殖する主培養物には、同様に嫌気的条件下で増殖する前培養物を接種した。
【００９９】
分光光度計（Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Sweden）を用いて、600nmでの吸光度（OD600）を測定することによって細胞増殖を測定した。
【０１００】
3. 結果
予想外にも、バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）野生型株DD3は、使用した培地B4_AEにおける好気的培養条件下で増殖又はアラニン生産のいずれも示さなかった（表9）。したがって、バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD3のために主培養物は培養しなかった。
【０１０１】
バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD3 alaD株は、バスフィア・サクシニシプロデュセンスDD3野生型株とは対照的に、好気的（培地B4_AE及びB5_AE；表4及び表5）及びまた嫌気的（培地B4_AN及びB5_AN；表6、表7、表8及び表9）培養条件下でアラニンの生産の増大を示した。
【０１０２】
【表４】
2016529901.tif 000005
【０１０３】
【表５】
2016529901.tif 000006
【０１０４】
【表６】
2016529901.tif 000007
【０１０５】
【表７】
2016529901.tif 000008
【０１０６】
【表８】
2016529901.tif 000009
【０１０７】
【表９】
2016529901.tif 000010
【０１０８】
【表１０】
2016529901.tif 000011
【０１０９】
【表１１】
2016529901.tif 000012
【０１１０】
実施例５：アラニンデヒドロゲナーゼ（alaD）の活性の測定
酵素活性アッセイ：酵素活性を33℃において分光光度法により測定した。アラニン生産開始前の細胞を遠心（5,000×g, 4℃; 10分）により回収した。細胞ペレットを抽出バッファー（100mM Tris-HCl, pH7.5, 20mM KCl, 20mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 2mM DTT）で1回洗浄した。得られた細胞懸濁液を、氷水浴中で15分かけて超音波ホモジナイザーを用いて音波処理した。細胞破片を遠心（10,000×g, 4℃; 30分）により除去した。このように生成された細胞溶解物を、続いて酵素アッセイのための粗抽出物として使用した。タンパク質アッセイキット（Bio-Rad, USA）を用いてタンパク質濃度を測定した。AlaDHは、NADHを消費しながらピルビン酸及びアンモニウムイオンからのアラニンの形成を触媒する。AlaDH活性は、分光光度計を用いた340nmにおけるNADHの吸収の低下により測定した。アッセイ混合物は、100mM Tris-HCl, pH8.5中に0.5mM NADH、2mMピルビン酸塩、100mM NH4Clを含有した。反応は、粗抽出物をアッセイ混合物に添加することにより開始した（Jojima et al. (2010): Engineering of sugar metabolism of Corynebacterium glutamicum for production of amino acid L-alanine under oxygen deprivation, Appl. Microbiol. 87, 159-165）。
【０１１１】
配列
配列番号1 (DD1株の16 S rDNAのヌクレオチド配列)
(Basfia succiniciproducens)
tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaa
agcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggaggggga
taacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccaccc
gccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctag
ctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtg
gggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgt
aaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaa
gcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggc
gtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttc
agactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgt
ggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagc
aaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctg
gtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaatt
gacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactct
tgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctg
tcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccag
catgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtc
atcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgag
gtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaa
tcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca
ccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattc
atgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcgg
【０１１２】
配列番号2 (DD1株の23 S rDNAのヌクレオチド配列)
(Basfia succiniciproducens)
agtaataacg aacgacacag gtataagaat acttgaggtt gtatggttaa gtgactaagc      
gtacaaggtg gatgccttgg caatcagagg cgaagaagga cgtgctaatc tgcgaaaagc     
ttgggtgagt tgataagaag cgtctaaccc aagatatccg aatggggcaa cccagtagat     
gaagaatcta ctatcaataa ccgaatccat aggttattga ggcaaaccgg gagaactgaa     
acatctaagt accccgagga aaagaaatca accgagatta cgtcagtagc ggcgagcgaa     
agcgtaagag ccggcaagtg atagcatgag gattagagga atcggctggg aagccgggcg     
gcacagggtg atagccccgt acttgaaaat cattgtgtgg tactgagctt gcgagaagta     
gggcgggaca cgagaaatcc tgtttgaaga aggggggacc atcctccaag gctaaatact     
cctgattgac cgatagtgaa ccagtactgt gaaggaaagg cgaaaagaac cccggtgagg     
ggagtgaaat agaacctgaa accttgtacg tacaagcagt gggagcccgc gagggtgact     
gcgtaccttt tgtataatgg gtcagcgact tatattatgt agcgaggtta accgaatagg     
ggagccgaag ggaaaccgag tcttaactgg gcgtcgagtt gcatgatata gacccgaaac     
ccggtgatct agccatgggc aggttgaagg ttgggtaaca ctaactggag gaccgaaccg     
actaatgttg aaaaattagc ggatgacctg tggctggggg tgaaaggcca atcaaaccgg     
gagatagctg gttctccccg aaatctattt aggtagagcc ttatgtgaat accttcgggg     
gtagagcact gtttcggcta gggggccatc ccggcttacc aacccgatgc aaactgcgaa     
taccgaagag taatgcatag gagacacacg gcgggtgcta acgttcgtcg tggagaggga    
aacaacccag accgccagct aaggtcccaa agtttatatt aagtgggaaa cgaagtggga    
aggcttagac agctaggatg ttggcttaga agcagccatc atttaaagaa agcgtaatag    
ctcactagtc gagtcggcct gcgcggaaga tgtaacgggg ctcaaatata gcaccgaagc    
tgcggcatca ggcgtaagcc tgttgggtag gggagcgtcg tgtaagcgga agaaggtggt    
tcgagagggc tgctggacgt atcacgagtg cgaatgctga cataagtaac gataaaacgg    
gtgaaaaacc cgttcgccgg aagaccaagg gttcctgtcc aacgttaatc ggggcagggt    
gagtcggccc ctaaggcgag gctgaagagc gtagtcgatg ggaaacgggt taatattccc    
gtacttgtta taattgcgat gtggggacgg agtaggttag gttatcgacc tgttggaaaa    
ggtcgtttaa gttggtaggt ggagcgttta ggcaaatccg gacgcttatc aacaccgaga    
gatgatgacg aggcgctaag gtgccgaagt aaccgatacc acacttccag gaaaagccac    
taagcgtcag attataataa accgtactat aaaccgacac aggtggtcag gtagagaata    
ctcaggcgct tgagagaact cgggtgaagg aactaggcaa aatagcaccg taacttcggg    
agaaggtgcg ccggcgtaga ttgtagaggt atacccttga aggttgaacc ggtcgaagtg    
acccgctggc tgcaactgtt tattaaaaac acagcactct gcaaacacga aagtggacgt    
atagggtgtg atgcctgccc ggtgctggaa ggttaattga tggcgttatc gcaagagaag    
cgcctgatcg aagccccagt aaacggcggc cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaaa    
ttccttgtcg ggtaagttcc gacctgcacg aatggcataa tgatggccag gctgtctcca    
cccgagactc agtgaaattg aaatcgccgt gaagatgcgg tgtacccgcg gctagacgga    
aagaccccgt gaacctttac tatagcttga cactgaacct tgaattttga tgtgtaggat    
aggtgggagg ctttgaagcg gtaacgccag ttatcgtgga gccatccttg aaataccacc    
ctttaacgtt tgatgttcta acgaagtgcc cggaacgggt actcggacag tgtctggtgg    
gtagtttgac tggggcggtc tcctcccaaa gagtaacgga ggagcacgaa ggtttgctaa    
tgacggtcgg acatcgtcag gttagtgcaa tggtataagc aagcttaact gcgagacgga    
caagtcgagc aggtgcgaaa gcaggtcata gtgatccggt ggttctgaat ggaagggcca    
tcgctcaacg gataaaaggt actccgggga taacaggctg ataccgccca agagttcata    
tcgacggcgg tgtttggcac ctcgatgtcg gctcatcaca tcctggggct gaagtaggtc    
ccaagggtat ggctgttcgc catttaaagt ggtacgcgag ctgggtttaa aacgtcgtga    
gacagtttgg tccctatctg ccgtgggcgt tggagaattg agaggggctg ctcctagtac    
gagaggaccg gagtggacgc atcactggtg ttccggttgt gtcgccagac gcattgccgg    
gtagctacat gcggaagaga taagtgctga aagcatctaa gcacgaaact tgcctcgaga    
tgagttctcc cagtatttaa tactgtaagg gttgttggag acgacgacgt agataggccg    
ggtgtgtaag cgttgcgaga cgttgagcta accggtacta attgcccgag aggcttagcc    
atacaacgct caagtgtttt tggtagtgaa agttattacg gaataagtaa gtagtcaggg    
aatcggct                                                             
【０１１３】
配列番号3 (alaD遺伝子のヌクレオチド配列)
(Geobacillus stearothermophilus、E.Coliに最適化)
atgaaaattggcatccctaaagagattaagaacaatgaaaaccgtgtagcaatcaccccggcaggtgtta
tgactctggttaaagcgggccacgatgtgtacgtcgaaaccgaagcgggtgccggcagcggcttcagcga
cagcgagtatgagaaggcgggtgcggttattgtgactaaggcggaggacgcttgggcagccgaaatggtt
ctgaaggtgaaagaaccgctggcggaggagtttcgctattttcgtccgggtctgattttgttcacctacc
tgcacctggctgcggccgaggcgctgaccaaggcactggtggagcagaaggttgttggcatcgcgtacga
aacggttcaactggcgaatggttccctgccgctgctgacccctatgtctgaagttgcgggtcgcatgagc
gttcaagtcggcgctcagtttctggagaaaccgcacggtggcaagggcattttgctgggtggtgttccgg
gtgtccgccgtggtaaagtgacgatcattggcggtggtacggccggtacgaacgcggccaagattgccgt
aggtctgggtgcagatgtgaccattctggacatcaacgcggaacgtttgcgtgagctggacgatctgttt
ggcgaccaagtcaccaccctgatgagcaacagctaccacatcgcggagtgcgtccgtgaaagcgatttgg
tcgttggtgcggtgctgatcccgggtgcaaaagccccgaaactggtgaccgaggagatggtccgtagcat
gaccccgggttcggttctggtcgacgtggcaattgaccagggcggtatcttcgaaaccaccgaccgcgtc
acgacccatgatgacccgacctatgtgaaacatggcgtggttcactatgcggtcgcgaatatgccgggtg
cagtgccgcgcacgtccacgttcgcgctgacgaacgtgacgattccatacgctctgcagatcgccaataa
gggctatcgtgcggcgtgtctggataatccggcattgctgaaaggcatcaataccctggatggtcatatc
gtttacgaggctgtggctgcagcacacaacatgccgtacactgatgtccatagcttgctgcaaggctaa
【０１１４】
配列番号4 (上記AlaD遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸配列) 
(Geobacillus stearothermophilus)
mkigipkeiknnenrvaitpagvmtlvkaghdvyveteagagsgfsdseyekagavivtkaedawaaemv
lkvkeplaeefryfrpglilftylhlaaaealtkalveqkvvgiayetvqlangslplltpmsevagrms
vqvgaqflekphggkgillggvpgvrrgkvtiigggtagtnaakiavglgadvtildinaerlrelddlf
gdqvttlmsnsyhiaecvresdlvvgavlipgakapklvteemvrsmtpgsvlvdvaidqggifettdrv
tthddptyvkhgvvhyavanmpgavprtstfaltnvtipyalqiankgyraacldnpallkgintldghi
vyeavaaahnmpytdvhsllqg
【０１１５】
配列番号5 (ldhA遺伝子のヌクレオチド配列)
(Basfia succiniciproducens)
ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttggcgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgtattttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaataatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcgatcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggttttaatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgttctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgttatcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaataccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggatgtttatgaaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataatgtgctttttaccggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaacgtgcgaaaatagcgttgaaggctaa
【０１１６】
配列番号6 (上記ldhA遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸配列)
(Basfia succiniciproducens)
MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFVNDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKVVRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLNRRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAEALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEALKRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVTLSNIQAVSKNATCENSVEG
【０１１７】
配列番号7 (pflD遺伝子のヌクレオチド配列)
(Basfia succiniciproducens)
atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgactttatccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtgatggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctggttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaatgatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaaggcgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatcggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaagcgggcgaagacattcaggcaactatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatggcggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagcggttaaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatcactgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattattctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgtattacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgtgcgaaagtatctattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcatgctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaacggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcgaacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatgaagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatccgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatcgacttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaaaaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaaaccggtaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggtgcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattaggtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaacacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcaggttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa
【０１１８】
配列番号8 (上記pflD遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸配列)
(Basfia succiniciproducens)
MAELTEAQKKAWEGFVPGEWQNGVNLRDFIQKNYTPYEGDESFLADATPATSELWNSVMEGIKIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINKDLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGRKLDPQVEFIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYLMKDKKAQFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQEAIQWTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMDHLVMKLRMVRFLRTPEYDQLFSGDPMWATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLHTLYTMGTSPEPNLTILWSEQLPEAFKRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMVVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGIDEKNGMQVGPKTAPITDEVLNFDTVIERMDSFMDWLATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAALMAFHDRDVFRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNVVASNVAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDGYFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM
【０１１９】
配列番号9 (pflA遺伝子のヌクレオチド配列)
(Basfia succiniciproducens)
atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactggttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgcacatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaagtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctacgggcttaatgtgacatattag
【０１２０】
配列番号10 (上記pflA遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸配列) 
(Basfia succiniciproducens)
MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTWDLHGGKEISVEELMKEVVTYRHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDWFRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLVLLDLKEMNERVHESLIGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHVVVPGYTDSDEDLHMLGNFIKDMKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY
【０１２１】
配列番号11 (pckA遺伝子のヌクレオチド配列)
(Basfia succiniciproducens)
atgacagatcttaatcaattaactcaagaacttggtgctttaggtattcatgatgtacaagaagttgtgt
ataacccgagctatgaacttctttttgcggaagaaaccaaaccaggtttagacggttatgaaaaaggtac
tgtaactaatcaaggagcggttgctgtaaataccggtatttttaccggtcgttctccgaaagataaatat
atcgttttagacgacaaaactaaagataccgtatggtggaccagcgaaaaagttaaaaacgataacaaac
caatgagtcaagatacctggaacagtttgaaaggtttagttgccgatcaactttccggtaaacgtttatt
tgttgttgacgcattctgtggcgcgaataaagatacgcgtttagctgttcgtgtggttactgaagttgca
tggcaggcgcattttgtaacaaatatgtttatccgcccttcagcggaagaattaaaaggtttcaaacctg
atttcgtggtaatgaacggtgcaaaatgtacaaatcctaactggaaagagcaaggattaaattccgaaaa
cttcgttgcgttcaacattacagaaggcgttcaattaatcggcggtacttggtacggcggtgaaatgaaa
aaaggtatgttctcaatgatgaactacttcttaccacttcgcggtattgcatcaatgcactgttccgcaa
acgttggtaaagacggcgataccgcaattttcttcggtttgtcaggtacaggtaaaactacattatcaac
agatcctaaacgtcaactaatcggtgatgacgaacacggttgggacgatgaaggcgtatttaacttcgaa
ggtggttgctacgcgaaaaccattaacttatccgctgaaaacgagccggatatctatggcgctatcaaac
gtgacgcattattggaaaacgtggtcgttttagataacggtgacgttgactatgcagacggttccaaaac
agaaaatacacgtgtttcttatccgatttatcacattcaaaatatcgttaaacctgtttctaaagctggc
ccggcaactaaagttatcttcttgtctgccgatgcattcggtgtattaccgccggtgtctaaattaactc
cggaacaaaccaaatactatttcttatccggttttactgcgaaattagcgggcacagagcgtggtattac
agagcctacaccaacattttctgcatgttttggtgcggctttcttaagcttgcatccgacgcaatatgcc
gaagtgttagtaaaacgtatgcaagaatcaggtgcggaagcgtatcttgttaatacaggttggaacggta
ccggcaaacgtatctcaattaaagatacccgtggtattattgatgcaattttagacggctcaattgataa
agcggaaatgggctcattaccaatcttcgatttctcaattcctaaagcattacctggtgttaaccctgca
atcttagatccgcgcgatacttatgcggataaagcgcaatgggaagaaaaagctcaagatcttgcaggtc
gctttgtgaaaaactttgaaaaatataccggtacggcggaaggtcaggcattagttgctgccggtcctaa
agcataa
【０１２２】
配列番号12 (上記pckA遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸配列)
(Basfia succiniciproducens)
MTDLNQLTQELGALGIHDVQEVVYNPSYELLFAEETKPGLDGYEKGTVTNQGAVAVNTGIFTGRSPKDKY
IVLDDKTKDTVWWTSEKVKNDNKPMSQDTWNSLKGLVADQLSGKRLFVVDAFCGANKDTRLAVRVVTEVA
WQAHFVTNMFIRPSAEELKGFKPDFVVMNGAKCTNPNWKEQGLNSENFVAFNITEGVQLIGGTWYGGEMK
KGMFSMMNYFLPLRGIASMHCSANVGKDGDTAIFFGLSGTGKTTLSTDPKRQLIGDDEHGWDDEGVFNFE
GGCYAKTINLSAENEPDIYGAIKRDALLENVVVLDNGDVDYADGSKTENTRVSYPIYHIQNIVKPVSKAG
PATKVIFLSADAFGVLPPVSKLTPEQTKYYFLSGFTAKLAGTERGITEPTPTFSACFGAAFLSLHPTQYA
EVLVKRMQESGAEAYLVNTGWNGTGKRISIKDTRGIIDAILDGSIDKAEMGSLPIFDFSIPKALPGVNPA
ILDPRDTYADKAQWEEKAQDLAGRFVKNFEKYTGTAEGQALVAAGPKA
【０１２３】
配列番号13 (プラスミドpSacBの完全ヌクレオチド配列)
(人工：artificial)
tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatatcgtcgac
atcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagactccataggccgctttcctggctttgc
ttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatgga
taaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcag
atggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatg
tgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattat
tactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgatta
ttaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaa
tcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgat
attaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatct
cccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggacca
gtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttatttt
ccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgt
ttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggat
ttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcagga
aggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagca
cggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaag
ccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagac
tggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatt
tgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggc
cggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctc
gctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaata
cggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagga
accgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcg
acgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctcc
ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcg
tggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctg
tgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccg
gtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcg
gtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgc
tctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggt
agcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttga
tcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatc
aaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttt
tatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttga
tgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagct
tgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgtta
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aaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccgcgggagtc
agtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgtta
gatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgc
cgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatga
tgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtg
tttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgt
cgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaa
gattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgca
gttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcag
atgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaattt
gtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatag
aacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgt
gatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcaga
agagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcaggg
atttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgttt
ctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttt
tgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttcca
gccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgac
gccaaagtatacactttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcga
tttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggattgcaactggtctattttcctcttttgtttg
atagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttcttttcat
tctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatat
cataatatctcatttcactaaataatagtgaacggcaggtatatgtgatgggttaaaaaggatcggcggc
cgctcgatttaaatc 
【０１２４】
配列番号14 
(プラスミドpSacB_alaDの完全ヌクレオチド配列)
(人工：artificial)
tcgagtaagtgcatatgaatatgaaatacttcttgcccgccgtgtttgttacaattgacaattaaacggt
agccgtcttccgcaataccttccagtttggcaattttagcggcagtaataaataagcgccctaatacggc
ttcatcttctgcggttacgtcgtttactgtcggaatcaatttattcggaataattaaaatatgagttttt
gcctgcggcgcaatatcgcgaaatgcggtgacaagatcgtcttgatatataatgtcggcgggaatttctt
tacgaataattttactgaaaattgtttcttctgccattttgtgtttccttatttttgggaaaaatctacc
gcactttttatcagaaatcagcttaaatagcaatttatctcgtaaaccaaaggaataaatccacaccctt
tataatggtattattactctatttgggtaattttgatttaggtcaaaaaatctgtaaaaggtgatatgga
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ttggattttttaatctatcatttatgctttaaggcagttctactcatttccgagtagttttattactaag
gaaagctcaatgaaatcggaagattttaaattggcttggatggcttcgccaaccgagatggctcaaaccg
ggttagacgtcggcgtttataaagctacgaaaaaacaagcctattcatttttatcggcgatctctgccgg
tatgtttattgctcttgcattcgttttttatacaacaactcaaacagcctctgcgggagcgccttgggga
ttaactaaactggtcggcggtttggtgttctctctcggggtaattatggtggtggtttgcggctgtgaac
tatttacttcatcaactttatcgactattgcccgctttgagagtaaaattacaacaattcagatgttacg
taactggattgtggtttatttcggtaattttgtcggcggtttatttattgttgcattaatttggttttcc
ggtcagatcatggcggcaaacggtcagtggggattaaccattttaaatacggcacaacataaaatagaac
atacctggattgaagccttctgtttaggtattctttgcaacattatggtatgtattgccgtttggatggc
ctatgccggcaaaactctaacggataaagcttttattatgatcctgccgatcgggttatttgtcgcttca
ggctttgaacactgcgtagcaaatatgtttatgatccctatgggcatggtaattgcaaatttcgcatcgc
cggaattctggcaggcaacgggtttaaatgccgagcagtttgcaaatttagatatgtaccatttagtaat
taaaaatttaattcctgttactttaggtaacatcgtcggtggtggtgtttgcattggtctaatgcaatgg
tttaccagtcgtccacattagttgggtgagagtgacggcaaatccgccgtcatccttgcaaggtttcaat
cttatcaatactagaaaagaaggaagtattaaaaatgaaaattggcatccctaaagagattaagaacaat
gaaaaccgtgtagcaatcaccccggcaggtgttatgactctggttaaagcgggccacgatgtgtacgtcg
aaaccgaagcgggtgccggcagcggcttcagcgacagcgagtatgagaaggcgggtgcggttattgtgac
taaggcggaggacgcttgggcagccgaaatggttctgaaggtgaaagaaccgctggcggaggagtttcgc
tattttcgtccgggtctgattttgttcacctacctgcacctggctgcggccgaggcgctgaccaaggcac
tggtggagcagaaggttgttggcatcgcgtacgaaacggttcaactggcgaatggttccctgccgctgct
gacccctatgtctgaagttgcgggtcgcatgagcgttcaagtcggcgctcagtttctggagaaaccgcac
ggtggcaagggcattttgctgggtggtgttccgggtgtccgccgtggtaaagtgacgatcattggcggtg
gtacggccggtacgaacgcggccaagattgccgtaggtctgggtgcagatgtgaccattctggacatcaa
cgcggaacgtttgcgtgagctggacgatctgtttggcgaccaagtcaccaccctgatgagcaacagctac
cacatcgcggagtgcgtccgtgaaagcgatttggtcgttggtgcggtgctgatcccgggtgcaaaagccc
cgaaactggtgaccgaggagatggtccgtagcatgaccccgggttcggttctggtcgacgtggcaattga
ccagggcggtatcttcgaaaccaccgaccgcgtcacgacccatgatgacccgacctatgtgaaacatggc
gtggttcactatgcggtcgcgaatatgccgggtgcagtgccgcgcacgtccacgttcgcgctgacgaacg
tgacgattccatacgctctgcagatcgccaataagggctatcgtgcggcgtgtctggataatccggcatt
gctgaaaggcatcaataccctggatggtcatatcgtttacgaggctgtggctgcagcacacaacatgccg
tacactgatgtccatagcttgctgcaaggctaattgagagtttgtcttattgcttaataaattccgcctc
aataggcggaatttttttgttttaattcccctgattaaagcggataaaagtgcggtagttttttgcgaag
atttgactattctctgaaaaaaacgaaattctttgctataatcttcttgctatattttgttgattattta
agggcatattatgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccggga
atccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctggg
atttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttat
gaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggac
tggttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatg
atcatattattgatgaattgattgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacg
ggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcga
aatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgcacatgc
tggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgc
ccataaatgggaagtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatg
gagcatgttaaggggttgcttgcaggctacgggcttaatgtgacatattagaagaaataaaaaaaccgtc
gtaaacattatgacggtttttttgtcactatttttcagaggagttaagccgggggtgttgtaaaagtgcg
gtagctttttgttgttttttctgttccctgcgcttttggaaaaagcggcttaacttctgactgcattgat
cctgtaagacaccgcttgtgatctcaaccccatgattcattttataatcctcaaaaaaatgaaatctgga
acccaccgcaccggttttgtaatcggacgccccgaataccaagcgtttgattcggctgtgtaaaatcgcg
ccggcgcacatggtgcagggttctaaagtcacgtataaagtggtattgagcaggcggtaattttggattt
tctgcgcggcgttacgcaacgcaataatttcggcatgggcggtgggatccgagttcacaatagagaggtt
ccagccttcaccaatgatattgccccgttcatccaccaatacggcacctacgggaatttcccctaaagct
tccgccttgtcggcaaggaaaagagctcgattcatcattttttcgtcaaagctaatttgttgatctagac
tccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattt
tcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccgg
cggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccg
tgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaata
cagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccatt
gagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaatttt
acccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcg
gattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagtt
ttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaa
gacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacat
tctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggc
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【０１２５】
配列番号15
(プラスミドpSacB_delta_ldhAの完全ヌクレオチド配列)
(人工：artificial)
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【０１２６】
配列番号16 (プラスミドpSacB_delta_pflDの完全ヌクレオチド配列)
(人工：artificial)
tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatgggatcgag
ctcttttccttgccgacaaggcggaagctttaggggaaattcccgtaggtgccgtattggtggatgaacg
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gggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtcc
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ctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccacc
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tgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttc
cgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatc
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ggcggccgctcgatttaaatc 
【０１２７】
配列番号17 (プラスミドpSacB_delta_pflAの完全ヌクレオチド配列)
(人工：artificial)
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【０１２８】
配列番号18 (プラスミドpSacB_delta_pckAの完全ヌクレオチド配列)
(人工：artificial)
atgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccgcgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgtgatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcagaagagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgccaaagtatacactttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggattgcaactggtctattttcctcttttgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttcttttcattctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaataatagtgaacggcaggtatatgtgatgggttaaaaaggatcggcggccgctcgatttaaatctcgagggtcggtaaaaatccgatacatccatgttttagagaacagagagtaggagaaattttcgattttattatgctcaatccctaaaaagattgttctccctttcgggttgttggaaaacgccaacattcaaaaagtagcacttttgtaaccgcacttttgaggtatttaaatgaaaaaacatttcacccgctccatccaaacattgcttgtaacggcaaccgcattcttctcaacctccctgcttgcagcgaccaaacagctgtacatctataactggaccgattacattccttcggatttaatttctaaattcaccaaagaaaccggtattaaagtgaattattccaccttcgaaagcaacgaagaaatgttttccaaattgaaattaacaatcaacaagccggggtacgatcttgtttttccctcaagttattacatcggtaaaatggtgaaagaaaatatgctggcacccatcgaacacagaaaactgacgaatttcaaacaaatcccggtcaatttattaaacaaagatttcgatccgacaaataaattttctttgccttatgtttacggtctgacaggaatcggtattaatacctctttcgtaaatcctgacgaagtcaccggttggggcgacttatggaaagaaaaattcaaaggcaaagtgttattaaccgccgattcccgggaagtattccatattgcactgttattagacggaaaatcgccaaacactcaaaatgaagaagaaatccgtaacgcctaccaacgtttaacaaaaatactgccaaatgtagcggcatttaactcagatacaccggaactaccatacattcagggtgaagtagaactcggtatgatttggaatggttcggcttatatggcggaaaaagaaaatccggctattaaatttatttatccgaaagaaggcgccattttctggatggataattatgcgattcctaaaaatgcccgtaacatcgagggagcccataaatttatcgactttatgcttcgtccggaacacgccaaaatcattatcgaacgcatgggattttccatgcctaatgaaggcgtgaaagtattgctaaaacctgaagaccgcgtaaacccattactgttcccgccggaagaggaagtgaaaaaaggcgtatttcaggcagatgtaggcgatgcaaccgacatttatgaaaaatattggaataaactgaaaaccaactaaacgcttactcacttt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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2016529901000001.app
【国際調査報告】
2016529901.tif 000019
2016529901.tif 000020
2016529901.tif 000021
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