(57)【要約】  いくつかの実施態様において、本発明の開示は、対象に炭素材料を投与することによる、対象における炎症性疾患を処置する方法に関する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、対象におけるＴ細胞を選択的に標的化する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、ポリ（エチレングリコール）で官能化された親水性カーボンクラスターを包含する。いくつかの実施態様において、対象への炭素材料の投与は、対象におけるＴ細胞媒介反応を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、Ｔ細胞への優先的な取り込みにより、他のタイプの免疫細胞に対して選択的にＴ細胞を標的化する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害し、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害し、標的化されたＴ細胞における細胞内の酸化剤含量を低減する。いくつかの実施態様において、本発明の開示は、エクスビボでＴ細胞を炭素材料と共にインキュベートすることによってＴ細胞を調節する方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に炭素材料を投与することを含む、対象における炎症性疾患を処置する方法であって、
炭素材料が、対象におけるＴ細胞を選択的に標的化する、上記方法。
【請求項２】
炭素材料が、グラフェン量子ドット、グラフェン、酸化グラフェン、カーボンブラック、活性炭、カーボンナノチューブ、極短単層カーボンナノチューブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炭素材料が、約１５時間から約４０時間の間の血清中半減期を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
炭素材料が、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炭素材料が、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
炭素材料が、複数の官能基で官能化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
官能基が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（アクリル酸）、多糖、ポリ（アルコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、ケトン、エステル、アミド、カルボキシル基、オキシド、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
官能基が、ポリエチレングリコールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
炭素材料が、１つまたはそれより多くの輸送成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
輸送成分が、アダマンタン成分（ＡＤＭ）、ジメチルアダマンタン成分、親油性成分、小分子、カンナビノイド、エピカンナビノイド、ペプチド、糖、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
炭素材料が、酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
炭素材料が、カーボンナノチューブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブ、極短単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、２層カーボンナノチューブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炭素材料が、極短単層カーボンナノチューブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
極短単層カーボンナノチューブが、複数の官能基で官能化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
極短単層カーボンナノチューブが、ポリ（エチレングリコール）で官能化された極短単層カーボンナノチューブを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
極短単層カーボンナノチューブが、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
極短単層カーボンナノチューブが、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
投与が、経口投与、吸入法、皮下投与、局所投与、経皮投与、関節内投与、静脈内投与、腹膜内投与、筋肉内投与、髄腔内注射、舌下投与、鼻腔内投与、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、炎症性疾患に罹っている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、哺乳動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
炎症性疾患が、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、Ｔ細胞媒介性疾患、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、乾癬、強皮症、円形脱毛症、１型糖尿病、セリアックスプルー病、大腸炎、悪性貧血、脳脊髄炎、血管炎、甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、自己免疫性心筋症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性障害、自己免疫性末梢神経疾患、膵臓炎、多内分泌腺症候群、血小板減少性紫斑病、ブドウ膜炎、ベーチェット病、ナルコレプシー、筋炎、多発性軟骨炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、移植片対宿主疾患、慢性移植片拒絶反応、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
炭素材料の投与が、毎日の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
毎日の投与が、約３日〜約３ヶ月継続される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
毎日の投与が、１日当たり約１回の炭素材料の投与から、１日当たり約５回の炭素材料の投与を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
投与が、対象の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇから対象の体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの範囲の投与量での炭素材料の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
炭素材料の投与が、対象におけるＴ細胞媒介反応を低減または阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
炭素材料が、他のタイプの免疫細胞に対して選択的にＴ細胞を標的化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
炭素材料が、Ｔ細胞への優先的な取り込みにより、選択的にＴ細胞を標的化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞によるＴ細胞のシグナル伝達を低減または阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞における細胞内の酸化剤含量を低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞を炭素材料と共にインキュベートすることを含む、Ｔ細胞を調節する方法。
【請求項３７】
炭素材料が、グラフェン量子ドット、グラフェン、酸化グラフェン、カーボンブラック、活性炭、カーボンナノチューブ、極短単層カーボンナノチューブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
炭素材料が、複数の官能基で官能化されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
官能基が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（アクリル酸）、多糖、ポリ（アルコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、ケトン、エステル、アミド、カルボキシル基、オキシド、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
官能基が、ポリエチレングリコールを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
炭素材料が、１つまたはそれより多くの輸送成分を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
輸送成分が、アダマンタン成分（ＡＤＭ）、ジメチルアダマンタン成分、親油性成分、小分子、カンナビノイド、エピカンナビノイド、ペプチド、糖、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
炭素材料が、極短単層カーボンナノチューブを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
極短単層カーボンナノチューブが、複数の官能基で官能化されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
極短単層カーボンナノチューブが、ポリ（エチレングリコール）で官能化された極短単層カーボンナノチューブを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
極短単層カーボンナノチューブが、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
炭素材料が、Ｔ細胞媒介反応を低減または阻害する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
エクスビボで行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
エクスビボで、他のタイプの免疫細胞の存在下で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
炭素材料が、他のタイプの免疫細胞に対して選択的にＴ細胞を標的化する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
炭素材料が、Ｔ細胞への優先的な取り込みにより、選択的にＴ細胞を標的化する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞によるＴ細胞のシグナル伝達を低減または阻害する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞における細胞内の酸化剤含量を低減する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５６】
炭素材料が、標的化されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導しない、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１３年９月３日付けで出願された米国仮特許出願第６１／８７３，０４６号の優先権を主張する。上述の出願の全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
[0002]本発明は、アメリカ国防総省によって付与された認可番号Ｗ８１ＸＷＨ−１２−１−０６１２、および国立衛生研究所によって付与された認可番号ＤＫ０９３８０２に基づく政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]炎症性疾患を処置するための現在の方法および治療用組成物は、順に悪性腫瘍（例えば、がん）や感染を引き起こす可能性がある全身性の免疫抑制などの極めて多くの問題がある。したがって、炎症性疾患を処置するための改善された方法および組成物の必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]いくつかの実施態様において、本発明の開示は、対象における炎症性疾患を処置する方法に関する。いくつかの実施態様において、本方法は、対象に炭素材料を投与することを包含する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、対象におけるＴ細胞を選択的に標的化する。
【０００５】
[0005]いくつかの実施態様において、炭素材料としては、これらに限定されないが、グラフェン量子ドット、グラフェン、酸化グラフェン、カーボンブラック、活性炭、カーボンナノチューブ、極短単層カーボンナノチューブ（親水性カーボンクラスターまたはＨＣＣとも称される）およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、炭素材料は、約１５時間から約４０時間の間の血清半減期を有する。
【０００６】
[0006]いくつかの実施態様において、炭素材料は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する。
【０００７】
[0007]いくつかの実施態様において、炭素材料は、酸化されている。いくつかの実施態様において、炭素材料は、複数の官能基で官能化されている。いくつかの実施態様において、官能基としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（アクリル酸）、多糖、ポリ（アルコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、ケトン、エステル、アミド、カルボキシル基、オキシド、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、炭素材料はまた、１つまたはそれより多くの輸送成分も包含する。
【０００８】
[0008]いくつかの実施態様において、炭素材料は、極短単層カーボンナノチューブ（すなわち、ＨＣＣ）を包含する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、複数の官能基で官能化されている。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、ポリ（エチレングリコール）で官能化された極短単層カーボンナノチューブ（ＰＥＧ−ＨＣＣとも称される）を包含する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する。
【０００９】
[0009]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、炎症性疾患に罹った対象に投与される。いくつかの実施態様において、処置しようとする炎症性疾患としては、これらに限定されないが、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、Ｔ細胞媒介性疾患、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、乾癬、強皮症、円形脱毛症、１型糖尿病、セリアックスプルー病、大腸炎、悪性貧血、脳脊髄炎、血管炎、甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、自己免疫性心筋症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性障害、自己免疫性末梢神経疾患、膵臓炎、多内分泌腺症候群、血小板減少性紫斑病、ブドウ膜炎、ベーチェット病、ナルコレプシー、筋炎、多発性軟骨炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、移植片対宿主疾患、慢性移植片拒絶反応、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１０】
[0010]いくつかの実施態様において、対象への炭素材料の投与は、対象におけるＴ細胞媒介反応（例えば、Ｔ細胞媒介性炎症反応）を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、他のタイプの免疫細胞に対して選択的にＴ細胞を標的化する。
【００１１】
[0011]いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞への優先的な取り込みにより、選択的にＴ細胞を標的化する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞によるＴ細胞のシグナル伝達を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞における細胞内の酸化剤含量を低減する。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導しない。
【００１２】
[0012]いくつかの実施態様において、本発明の開示は、Ｔ細胞を炭素材料とインキュベートすることによってＴ細胞を調節する方法に関する。いくつかの実施態様において、本方法は、エクスビボで行われる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、炎症性疾患を処置する方法のスキームを提供する、
【図１Ｂ】図１Ｂは、ポリ（エチレングリコール）で官能化された親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）の化学構造を提供する。
【図２Ａ】図２は、Ｔ細胞がＰＥＧ−ＨＣＣを選択的に吸収することを示す。図２Ａは、ＰＥＧ−ＨＣＣがＴ細胞によって内在化されたことを実証する結果を示す。ラット脾細胞を０．１μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートした。次いで脾細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって分析したところ、細胞の透過化後に（特にＣＤ３＋Ｔ細胞において）抗ＰＥＧ抗体からのシグナルの増加が実証された。図２Ａの結果は、３つの実験の代表的なものであり、ＰＥＧ−ＨＣＣ内在化を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＦＣＭ分析によって決定した場合、インビトロにおいて、他の免疫細胞（すなわち、脾臓免疫細胞）に対して優先的にＴ細胞によってＰＥＧ−ＨＣＣが取り込まれることを実証する結果を示す（ｎ＝３）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＨＣＣの単回皮下注射によって決定した場合のラット血清におけるＰＥＧ−ＨＣＣの薬物動態学を示す（左のパネル）。血液を提示された時間で収集し、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によってナノ粒子濃度を測定した（ｎ＝ラット５〜６匹／タイムポイント）。データを単一の指数関数的減衰にフィッティングして、約２５時間の循環半減期を計算する（右のパネル）。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＦＣＭを使用して分析した場合、インビボにおいて、マクロファージおよびＴ細胞に対して優先的にＴ細胞によってＰＥＧ−ＨＣＣが取り込まれることを実証する結果を示す。ラットに２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＨＣＣを注射した。次いで２４時間後に脾細胞を単離した。結果は、図２Ｂに記載のインビトロでの結果（ｎ＝３匹のラット）と一致する。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±標準偏差として表示される。
【図２Ｅ】図２Ｅは、フローサイトメトリーによって免疫細胞によるＰＥＧ−ＨＣＣの細胞内取り込みを決定し、ＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みを同定するのに使用されるゲーティング戦略を概説する。
【図３Ａ】図３は、ＰＥＧ−ＨＣＣが、エンドサイトーシスを介して主としてＴ細胞に入り、次第に失われることを示す。図３Ａは、Ｔ細胞のＰＥＧ−ＨＣＣ取り込み（ＦＣＭによって分析した場合）は、エンドサイトーシスによる阻害条件下（４℃）で、生理学的条件（３７℃）と比較して低減することを示すデータを提供する（ｎ＝３）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＦＣＭ分析の前に０．１μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＨＣＣと共に提示された時間インキュベートした脾臓Ｔ細胞におけるナノ粒子内在化の速度論に関するデータを示す（ｎ＝３）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、脾臓Ｔ細胞におけるナノ粒子損失の速度論に関するデータを示す。０．１μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＨＣＣと共に細胞を３０分インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、提示された時間後にＦＣＭによって分析した（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±標準偏差として表示される。
【図４Ａ】図４は、ＰＥＧ−ＨＣＣが内在化時にＴ細胞の活性を抑制することを実証する。図４Ａは、［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定した場合の、オボアルブミンで刺激された初代ＧＦＰ変換オボアルブミン特異的ラットＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＣ−Ｋｖ１．３ｈｉｇｈ）の増殖は、提示された濃度のＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートされた後、減少することを示す（ｎ＝３）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、インキュベート後に過量のＰＥＧ−ＨＣＣを細胞から洗い落としたとしても、刺激されたＴ細胞の増殖は不変であることを示し、これは、増殖の低減は、ナノ粒子内在化を必要とすることを示す。Ｔ細胞をＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートし、洗浄し、次いで６時間後に刺激したところ増殖は回復したが、これは、ナノ粒子損失の速度論との優れた一致を示し、Ｔ増殖に対するＰＥＧ−ＨＣＣの作用は可逆的であることを示唆する（ｎ＝３）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、刺激されていない、刺激された、および刺激前にＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートした、またはスタウロスポリンで刺激され処置されたＴ細胞における細胞死の定量化に関するデータを提供する。細胞を７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）染色およびＦＣＭによって分析した（ｎ＝４）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ、ＦＣＭによって分析した場合）の産生は、提示された濃度のＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートされ刺激されたＴ細胞において低減することを示す（ｎ＝６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±標準偏差として表示される。
【図５】図５は、ＰＥＧ単独が、Ｔ細胞の増殖を減少させるには不十分であることを示す。［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定した場合の、刺激されたオボアルブミン特異的ラットＴ細胞の増殖は、ＰＥＧ−ＨＣＣと比較して、提示された濃度のＰＥＧ−５０００に影響されない（ｎ＝３）。
【図６Ａ】図６は、マクロファージがＰＥＧ−ＨＣＣ内在化できないことが、主要なマクロファージ機能を不変のままにしたことを示す。図６Ａは、トランスウェルフィルターを通過して、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した初代ラット腹膜内マクロファージから収集された上清に向かうＴ細胞の移動を示す。Ｔ細胞の移動は、刺激の前にマクロファージがＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートされても不変のままであり（緑色）、これは、ＰＥＧ−ＨＣＣはマクロファージによる化学誘引物質産生に影響を与えないことを示す。またＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートされたＴ細胞の移動（青色）も不変のままであり、これは、ナノ粒子は、刺激されていないＴ細胞に影響を与えないことを示唆する（ｎ＝３）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、提示された濃度のＰＥＧ−ＨＣＣまたはＦｅ３Ｏ４ナノ粒子と共にインキュベート後にマクロファージの食細胞活動に関するデータ（共焦点顕微鏡法を使用してザイモサンＡ生体粒子の取り込みにより定量化した場合）を示す（ｎ＝３）。下のパネルに、それに対応するアレクサフルオロ（Alexa Fluor）４８８にコンジュゲートした生体粒子（緑色）およびＤＡＰＩで染色されたマクロファージの核（青色）の画像を示す。スケールバーは、５μｍである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、オボアルブミンと共にプレインキュベートされたマクロファージで刺激されたオボアルブミン特異的Ｔ細胞（刺激された）の増殖によって測られた、マクロファージによる抗原のプロセシングおよび提示を示す。Ｔ細胞を添加する前にマクロファージをＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートすることは、Ｔ細胞の増殖に影響を与えないが（緑色）、それに対してＴ細胞をＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートすること（青色）は、それらの増殖を減少させる（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±標準偏差として表示される。
【図７】図７は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、刺激されなかったＴ細胞の増殖を減少させないことを示す。休止期のオボアルブミン特異的ラットＴ細胞の増殖は、［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定した場合、提示された濃度のＰＥＧ−ＨＣＣによって影響されないが、これは、Ｔ細胞活性化中の細胞内ＳＯの増加は、ＰＥＧ−ＨＣＣにとって細胞機能を変更するのに必要であることを示唆する（ｎ＝３）。
【図８Ａ】図８は、ＰＥＧ−ＨＣＣの投与が、Ｔ細胞媒介性炎症を抑制し、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を緩和することを示す。図８Ａは、２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＨＣＣの単回皮下注射は、ＰＢＳ（ビヒクル）処置と比較して、免疫化時または攻撃時のいずれかにラットの耳においてオボアルブミンに対して惹起された進行中の遅延型過敏症応答を低減することを示す。攻撃の２４時間後に耳の腫れが測定された（ｎ＝ラット５匹／グループ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、疾患徴候の発生時に、ＰＢＳ（ビヒクル）またはＰＥＧ−ＨＣＣ（２ｍｇ／ｋｇ）で３日毎に皮下処置したＥＡＥを有するラットの臨床スコアを示す（ｎ＝ラット６匹／グループ）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色され、８つの無作為の視野からの免疫浸潤の程度に関して盲検で定量化された、疾患のピーク時にＥＡＥを有するラットから収集された脊髄の組織学的分析を示す（ｎ＝ラット３匹／グループ）。スケールバー、１００μｍ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±標準偏差として表示される。
【図９Ａ】図９は、ＰＥＧ−ＨＣＣがヒトＴ細胞の原形質膜を横切って、内在化されるとＴ細胞の活性を抑制することを示す。図９Ａは、ＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートされたヒト単核血液細胞の相対的細胞数のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。単核細胞を０．０１μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＨＣＣと共に１０分インキュベートし、抗ＣＤ３抗体で染色して、Ｔ細胞を検出した。抗ＰＥＧ抗体を使用して、無傷細胞（赤色）上で、または細胞の透過化後に（青色）ＰＥＧ−ＨＣＣを検出した。未処置細胞は、黒色の点線として示される。
【図９Ｂ】図９Ｂは、フィトヘムアグルチニンによって刺激され、［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定された初代ヒトＴ細胞の増殖は、提示された濃度のＰＥＧ−ＨＣＣとインキュベートした後に減少することを示す（ｎ＝３ドナー）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±標準偏差として表示される。
【図１０Ａ】図１０は、ラットの多発性硬化症の進行中の急性モデルにおいて、ＰＥＧ−ＨＣＣは、血液脳関門への病変の数を低減することを示す。進行中の急性ＥＡＥのラットモデルにおいて、血液脳関門（ＢＢＢ、黄色の矢印）へのＧｄ３＋で増強された病変の数は、ビヒクルでの処置と比較して（図１０Ａ）、ＰＥＧ−ＨＣＣでの処置中に低減する（図１０Ｂ）。ＰＥＧ−ＨＣＣ処置ラット（図１０Ｂ）では、小さい病変が２つのみ観察された。ビヒクル処置動物（図１０Ａ）において、病変は極めて多数であった。
【図１０Ｂ】図１０は、ラットの多発性硬化症の進行中の急性モデルにおいて、ＰＥＧ−ＨＣＣは、血液脳関門への病変の数を低減することを示す。進行中の急性ＥＡＥのラットモデルにおいて、血液脳関門（ＢＢＢ、黄色の矢印）へのＧｄ３＋で増強された病変の数は、ビヒクルでの処置と比較して（図１０Ａ）、ＰＥＧ−ＨＣＣでの処置中に低減する（図１０Ｂ）。ＰＥＧ−ＨＣＣ処置ラット（図１０Ｂ）では、小さい病変が２つのみ観察された。ビヒクル処置動物（図１０Ａ）において、病変は極めて多数であった。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＢＢＢ病変の数の定量化を示す。ｐ＝０．０８であり、ｎ＝ラット３匹／グループである。
【図１１】図１１は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、炎症性関節炎のラットモデルであるプリスタン誘導関節炎における疾患の重症度を低減することを示す。グラフは、疾患の発生時に開始して４日毎にＰＢＳ（ビヒクル）で処置されたラット（ｎ＝１５匹のラット）と比較した、ＰＥＧ−ＨＣＣ処置ラット（ｎ＝８匹のラット）の平均臨床スコアを示す。臨床スコアリングは、大きい赤く腫れた関節（手首、足首）１つ当たり５ポイント、および小さい赤く腫れた関節（足中央部、指、指関節）１つ当たり１ポイントを包含していた。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２は、ＰＥＧ−ＨＣＣが、小規模なパイロット試験において再発性の実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｒ−ＥＡＥ）の再発期中に臨床スコアを低減させる傾向に従うことを示す。ＤＡラットを、完全フロインドアジュバントとのエマルジョンでラット脊髄に免疫化することによって、Ｒ−ＥＡＥを誘導した。免疫化時に、ＰＥＧ−ＨＣＣまたはＰＢＳ（ビヒクル）での処置を始めた。臨床スコアリングのスケールは、以下：０、疾患なし；１、尾の引きずり；２、中程度の対不全麻痺、運動失調；３、中程度の対不全麻痺；４、完全な後肢麻痺；５、４に加えて失禁；および６、瀕死、安楽死の必要性を包含していた。再発は、少なくとも２回の連続した観察で、少なくとも全てのスコアのポイントが変化することと定義される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[0025]前述の一般的な説明と以下の詳細な説明はいずれも例示的および説明的なものであり、特許請求された主題を限定しないことが理解されると予想される。本出願において、単数形の使用は、複数形を包含し、特に他の規定がない限り、「１つの（a）」または「１つの（an）」という言葉は、「少なくとも１つの」を意味し、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、用語「〜を包含する」、加えて他の形態、例えば「は、〜を包含する」および「包含される」の使用は、限定的ではない。また、「要素（element）」または「構成要素（component）」などの用語は、特に他の規定がない限り、１つの単位を含む要素または構成要素と、１つより多くの単位を含む要素または構成要素との両方を包括する。
【００１５】
[0026]本明細書において使用される章の見出しは、系統化する目的のためであり、説明される主題を限定すると解釈されないものとする。本出願で引用された全ての文書または文書の一部、例えば、これらに限定されないが、特許、特許出願、論文、書籍、および専門書などは、あらゆる目的で、これにより明示的にそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。組み入れられた文献および類似の資料の１つまたはそれより多くが、本出願における用語の定義と矛盾する方式でその用語を定義している場合には、本出願が優先する。
【００１６】
[0027]炎症性疾患（例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、１型糖尿病、喘息、および血管炎）は、世界的に数百万の人々に影響を及ぼし、生活の質を著しく悪化させて、死さえも引き起こす。Ｔ細胞は、炎症を起こしている組織に入り、大量のケモカインおよびサイトカインを産生することにより、そのような疾患において主要な役割を果たす。
【００１７】
[0028]さらに、過剰な量の酸化剤が、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患の病因に関与していた。具体的に言えば、低いレベルの酸化剤、例えば細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）は、Ｔ細胞受容体の刺激に応答して産生される。このような酸化剤は順に、Ｔ細胞の活性化中に第２メッセンジャーとして作用することができる。
【００１８】
[0029]例えば、多発性硬化症（ＭＳ）の期間中、ＣＮＳにおいて、小グリア細胞、星状細胞、および浸潤性の免疫細胞により過量のスーパーオキシド（ＳＯ）およびヒドロキシルラジカルが産生される。ＳＯは、Ｔ細胞受容体を介したＴ細胞の活性化において重要な役割を果たす。加えて、ヒドロキシルラジカルは、ＭＳの期間中、ミエリンに直接ダメージを与える。
【００１９】
[0030]ほとんどの炎症性疾患（例えば、自己免疫疾患）のための現行の療法は、全身性の免疫抑制剤の投与を含む。また酸化剤を標的化する抗酸化剤も、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患のための療法の代替経路として利用されてきた。しかしながら、このような処置は、極めて多くの欠点を有する。
【００２０】
[0031]例えば、全身性の免疫抑制剤は、有害な副作用、例えば感染および悪性腫瘍と関連する。さらに、内因性および食物抗酸化剤は、ごくわずかな臨床効果しか有さないことが示されている。このような限られた臨床効果の原因は、ラジカルを全滅させるには低い選択性、迅速な不活性化、限られた化学量論的能力、および他の解毒分子への依存性である可能性がある。加えて、食物抗酸化剤は、高い投与量の投与を必要とすることから、死亡率を増加させる。例えば、広範な抗酸化剤、例えばビタミンＥの高用量の投与または長期使用は、有毒である。
【００２１】
[0032]したがって、有力な抗酸化剤として作用する毒性のない物質が、ＭＳなどの様々な炎症性疾患を処置するための治療選択肢として評価されている。例えば、核因子赤血球２−関連因子２（Ｎｒｆ−２）活性化剤であるフマル酸ジメチルは、抗酸化剤反応要素を介して複数の抗酸化剤経路を活性化する、２〜３回／日で摂取される経口薬である。フマル酸ジメチルで処置したＭＳ患者において、胃腸障害または刺痛などの最小の副作用で造影ＭＲＩにおける改善が報告されている。
【００２２】
[0033]フマル酸ジメチルが極めて多数のＲＯＳに影響を与えるという事実は、励みになる一方で、長期にわたる相乗作用および血管緊張などの多くの正常な生理学的プロセスにおいてＲＯＳの正常レベルが必要であることから、相当長期にわたり健康状態への作用を有する可能性がある。加えて、加齢に伴ってＮｒｆ−２の発現レベルは減少し、これは、高齢患者ではＮｒｆ−２活性化剤の効能が低減することを示唆する。さらに、フマル酸ジメチルは、活性化ヒトＴ細胞のアポトーシスを誘導する。さらに、フマル酸ジメチルの投与は、循環系のＴ細胞数の低減をもたらす。
【００２３】
[0034]それゆえに、全身性の免疫抑制または細胞死を引き起こさない、炎症性疾患（例えば、Ｔ細胞媒介性の自己免疫または炎症性疾患）を処置するためのより有効な方法および組成物の必要性がある。本発明の開示は、この必要性に取り組むものである。
【００２４】
[0035]図１Ａで例示されるいくつかの実施態様において、本発明の開示は、対象に炭素材料を投与すること（工程１０）による、炎症性疾患を処置する方法に関する。いくつかの実施態様において、投与される炭素材料は、対象におけるＴ細胞を選択的に標的化する（工程１２）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害すること（工程１４）、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害すること（工程１６）、または標的化されたＴ細胞の細胞内酸化剤含量を低減すること（工程１８）によって、標的化されたＴ細胞に作用する。このような作用は順に、対象におけるＴ細胞媒介反応を低減または阻害することができる（工程２０）。
【００２５】
[0036]本明細書でより詳細に説明されるように、本発明の開示の方法は、様々な実施態様を有し得る。例えば、様々な炭素材料は、様々な炎症性疾患を処置するために、様々な対象に異なる様式で投与されてもよい。さらに、本発明の開示の炭素材料は、様々な方式で多種多様なタイプのＴ細胞を選択的に標的化してそれらに作用する可能性がある。
【００２６】
[0037]炭素材料
[0038]本発明の開示の方法は、炎症性疾患を処置するために様々な種類の炭素材料を利用することができる。いくつかの実施態様において、好適な炭素材料は、選択的にＴ細胞を標的化することができる炭素材料を包含する。いくつかの実施態様において、好適な炭素材料は、Ｔ細胞媒介反応（例えば、Ｔ細胞媒介性炎症反応）を低減または阻害することができる炭素材料を包含する。
【００２７】
[0039]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、それらを生物学的に利用可能にする特性を有していてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、親水性（すなわち、水溶性）であってもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、親水性部分と疎水性部分の両方を有していてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、親水性ドメイン（例えば、親水性の表面）と疎水性ドメイン（例えば、疎水性のキャビティ）を有していてもよい。いくつかの実施態様において、炭素材料は、水溶液または食塩水の形態であってもよい。
【００２８】
[0040]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１５時間から約４０時間の間の血清半減期を有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約２５時間の血清中半減期を有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、対象の皮下に投与される場合、約１５時間から約４０時間の間の血清中半減期を有する。
【００２９】
[0041]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、ナノ材料の形態である。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、ナノ粒子の形態である。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲の直径を有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約５ｎｍの直径を有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１ｎｍ〜約２ｎｍの直径を有する。
【００３０】
[0042]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１０ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約４０ｎｍの長さを有する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍの長さとおよそ１〜２ｎｍの幅を有するカーボンナノ粒子を包含する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約３５ｎｍの長さとおよそ３ｎｍの幅を有するカーボンナノ粒子を包含する。
【００３１】
[0043]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、追加の材料に連結されていなくてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、医薬品有効成分（例えば、活性物質または薬物）に連結されていない。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、金属に連結されていない。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、検出不可能な、または微量の金属にのみ連結されていてもよい。
【００３２】
[0044]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、様々な方法で改変されてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、酸化されている。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、複数の官能基で官能化されている。いくつかの実施態様において、官能基は、Ｔ細胞による炭素材料の取り込みを促進し、他の細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、および好中球による炭素材料の取り込みを阻害する。いくつかの実施態様において、官能基としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（アクリル酸）、多糖、ポリ（アルコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、ケトン、エステル、アミド、カルボキシル基、オキシド、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３３】
[0045]いくつかの実施態様において、官能基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。いくつかの実施態様において、ポリエチレングリコールは、約５，０００原子質量単位（ＰＥＧ−５０００）から、約５０原子質量単位（ＰＥＧ−５０）の範囲の分子量を有する。いくつかの実施態様において、ポリエチレングリコールは、約５００原子質量単位（ＰＥＧ−５００）から、約５０原子質量単位（ＰＥＧ−５０）の範囲の分子量を有する。いくつかの実施態様において、ポリエチレングリコールとしては、これらに限定されないが、ＰＥＧ−５０００、ＰＥＧ−５００、ＰＥＧ−１００、ＰＥＧ−５０、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
[0046]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、１つまたはそれより多くの輸送成分を包含する。いくつかの実施態様において、輸送成分は、様々な生物学的な関門、例えば血液脳関門または血液脊髄関門を通る炭素材料の輸送を補助する。いくつかの実施態様において、輸送成分はまた、Ｔ細胞などのある特定の細胞型の認識を補助する可能性もある。いくつかの実施態様において、輸送成分としては、これらに限定されないが、アダマンタン成分（ＡＤＭ）、ジメチルアダマンタン成分、親油性成分、小分子、カンナビノイド、エピカンナビノイド（epi-cannabinoid）、ペプチド、糖、およびそれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施態様において、輸送成分としては、カンナビノイドのエナンチオマーまたはジアステレオマーも挙げることができる。
【００３５】
[0047]いくつかの実施態様において、輸送成分は、炭素材料に直接連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、輸送成分は、炭素材料に直接連結されている官能基に連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、輸送成分は、官能基の末端に付着していてもよい（例えば、ＰＥＧ成分の末端に付着したＡＤＭ成分）。
【００３６】
[0048]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、１つまたはそれより多くの界面活性剤に連結されていてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、炭素材料は、界面活性剤で包まれている。いくつかの実施態様において、炭素材料は、プルロニック（pluronic）で包まれている。
【００３７】
[0049]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料の血清中半減期は、炭素材料に連結された官能基の改変によってさらに延長することができる。例えば、いくつかの実施態様において、炭素材料に連結された官能基（例えば、ＰＥＧ官能基）の長さ、密度、または分岐を延長することによって、炭素材料の血清中半減期を延長することができる。いくつかの実施態様において、炭素材料に連結された輸送成分（例えば、ＰＥＧ成分の末端に付着したＡＤＭ成分）の数を増加させることによって、炭素材料の血清中半減期を延長することができる。
【００３８】
[0050]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料としては、これらに限定されないが、グラフェン量子ドット、グラフェン、酸化グラフェン、カーボンブラック、活性炭、カーボンナノチューブ、極短単層カーボンナノチューブ（親水性カーボンクラスターまたはＨＣＣとも称される）、およびそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００３９】
[0051]いくつかの実施態様において、上述の炭素材料は、これまでに述べられた通り、複数の官能基で官能化されていてもよい。いくつかの実施態様において、上述の炭素材料は、これまでに述べられた通り、１つまたはそれより多くの輸送成分に連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、上述の炭素材料は、ポリ（エチレングリコール）で官能化されていてもよく（ＰＥＧ官能化）、またはさらにアダマンチル（ＡＤＭ）で官能化されていてもよい。
【００４０】
[0052]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、カーボンナノチューブを包含する。いくつかの実施態様において、カーボンナノチューブとしては、これらに限定されないが、単層カーボンナノチューブ、極短単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、２層カーボンナノチューブ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、カーボンナノチューブは、複数の官能基で官能化されていてもよい（前述した通り）。いくつかの実施態様において、カーボンナノチューブは、酸化されていてもよい。
【００４１】
[0053]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、極短単層カーボンナノチューブ（ＵＳ−ＳＷＮＴ）を包含する。ＵＳ−ＳＷＮＴは、親水性カーボンクラスター（ＨＣＣ）とも称される。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、複数の官能基で官能化されている（前述した通り）。図１Ｂに示されるいくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、ポリ（エチレングリコール）で官能化された極短単層カーボンナノチューブ（ＰＥＧ−ＨＣＣとも称される）を包含する。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ−ＨＣＣはまた、１つまたはそれより多くの輸送成分、例えばＡＤＭに連結されていてもよい（ＡＤＭ−ＰＥＧ−ＨＣＣとも称される）。
【００４２】
[0054]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する極短単層カーボンナノチューブを包含する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約１０ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約４０ｎｍの長さを有する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、約３５ｎｍの長さを有する。
【００４３】
[0055]いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、金属に連結されていない。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、分散された形態である。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、水溶性および親水性である。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブを、超酸、例えば発煙硫酸および硝酸に晒すことによって調製される。このような極短単層カーボンナノチューブの調製方法の例は、米国特許第８，３１３，７２４号；米国特許出願公開第２０１２／０３０２８１６号および２００９／０１７０７６８号；ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３５２６７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３５２４４、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２５０２に開示されている。
【００４４】
[0056]極短単層カーボンナノチューブおよびそれらの作製方法のさらなる例は、以下の論文および出願に開示されている：Berlinら、ACS Nano 2010、4、4621〜4636；Lucente-Schultzら、J. Am. Chem. Soc. 2009、131、3934〜3941；Chenら、J. Am. Chem. Soc. 2006、128、10568〜10571；Stephensonら、Chem. Mater. 2007、19、3491〜3498；Priceら、Chem. Mater. 2009、21、3917〜3923；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７７６；およびＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４３２１。
【００４５】
[0057]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、グラフェン量子ドットを包含する。いくつかの実施態様において、グラフェン量子ドットとしては、これらに限定されないが、酸化グラフェン量子ドット、石炭から誘導されたグラフェン量子ドット、コークスから誘導されたグラフェン量子ドット、アスファルトから誘導されたグラフェン量子ドット、酸化石炭から誘導されたグラフェン量子ドット、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、グラフェン量子ドットは、複数の官能基で官能化されている（前述した通り）。いくつかの実施態様において、グラフェン量子ドットは、ポリエチレングリコールで官能化されたグラフェン量子ドットを包含する。いくつかの実施態様において、グラフェン量子ドットは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３６６０４で開示された方法によって調製される。
【００４６】
[0058]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、活性炭を包含する。いくつかの実施態様において、活性炭は、酸化された活性炭を包含する。いくつかの実施態様において、活性炭は、複数の官能基で官能化されている（前述した通り）。いくつかの実施態様において、活性炭は、ポリエチレングリコールで官能化された活性炭を包含する。
【００４７】
[0059]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、カーボンブラックを包含する。いくつかの実施態様において、カーボンブラックは、酸化カーボンブラックを包含する。いくつかの実施態様において、カーボンブラックは、複数の官能基で官能化されている（前述した通り）。いくつかの実施態様において、カーボンブラックは、ポリエチレングリコールで官能化されたカーボンブラックを包含する。
【００４８】
[0060]対象への炭素材料の投与
[0061]本発明の開示の炭素材料は、様々な方法で対象に投与することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、経口投与（胃管栄養を包含する）、吸入法、皮下投与（ｓｕｂ−ｑ）、局所投与、経皮投与、関節内投与、静脈内投与（Ｉ．Ｖ．）、腹膜内投与（Ｉ．Ｐ．）、筋肉内投与（Ｉ．Ｍ．）、髄腔内注射、舌下投与、鼻腔内投与、およびこのような様式の組み合わせによって投与されてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、局所塗布（例えば、経皮吸収剤（transderm）、軟膏、クリーム、軟膏、点眼剤、および同種のもの）によって投与されてもよい。
【００４９】
[0062]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、静脈内投与によって投与されてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、経皮投与によって投与されてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、炭素材料を含有するパッチの使用による経皮投与によって投与されてもよい。
【００５０】
[0063]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、関節炎を処置するために、関節内投与によって投与されてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、鼻腔内投与によって投与されてもよい。いくつかの実施態様において、鼻腔内投与は、対象の気道（例えば、肺および気管）への炭素材料の送達をもたらす。いくつかの実施態様において、鼻腔内投与は、対象の中枢神経系（例えば、脳）への炭素材料の送達をもたらす。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、多発性硬化症を処置するために、対象の中枢神経系に送達するために鼻腔内投与によって投与されてもよい。
【００５１】
[0064]いくつかの実施態様において、炭素材料の投与は、望ましい部位で選択的に行うことができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、対象の肺または中枢神経系に投与されてもよい。追加の投与様式も想定することができる。
【００５２】
[0065]本発明の開示の炭素材料の投与は、様々な期間にわたり行うことができる。例えば、いくつかの実施態様において、炭素材料の投与としては、これらに限定されないが、毎時間の投与、毎日の投与、毎週の投与、毎月の投与、およびそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５３】
[0066]いくつかの実施態様において、炭素材料の投与は、毎日の投与を包含する。いくつかの実施態様において、毎日の投与は、約３日〜約３ヶ月継続される。いくつかの実施態様において、毎日の投与は、１日当たり１回またはそれより多くの炭素材料の投与を包含し得る。例えば、いくつかの実施態様において、毎日の投与は、１日当たり約１回の炭素材料の投与から、１日当たり約５回の炭素材料の投与を包含し得る。
【００５４】
[0067]本発明の開示の炭素材料はまた、様々な投与量で投与され得る。例えば、いくつかの実施態様において、炭素材料の投与は、対象の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇから対象の体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの範囲の投与量でなされる。いくつかの実施態様において、炭素材料の投与は、対象の体重１ｋｇ当たり約２ｍｇでなされる。
【００５５】
[0068]対象
[0069]本発明の開示の炭素材料は、様々な対象に投与することができる。例えば、いくつかの実施態様において、対象は、ヒトである。いくつかの実施態様において、対象は、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、他のげっ歯類、またはそれより大きい哺乳動物、例えばイヌ、サル、ブタ、ウシおよびウマであってもよい。いくつかの実施態様において、対象は、哺乳動物、例えばイヌであってもよい。
【００５６】
[0070]いくつかの実施態様において、対象は、炎症性疾患に罹っていてもよい。いくつかの実施態様において、炎症性疾患に罹った対象は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、炎症性疾患に罹った対象は、ヒトである。いくつかの実施態様において、炎症性疾患に罹った対象は、イヌまたは別の動物である。
【００５７】
[0071]炎症性疾患の処置
[0072]本発明の開示の炭素材料は、対象における様々な炎症性疾患を処置するのに利用することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料によって処置することができる炎症性疾患としては、これらに限定されないが、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、Ｔ細胞媒介性疾患、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、乾癬、強皮症、円形脱毛症、１型糖尿病、セリアックスプルー病、大腸炎、悪性貧血、脳脊髄炎、血管炎、甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、自己免疫性心筋症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性障害、自己免疫性末梢神経疾患、膵臓炎、多内分泌腺症候群、血小板減少性紫斑病、ブドウ膜炎、ベーチェット病、ナルコレプシー、筋炎、多発性軟骨炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、移植片対宿主疾患、慢性移植片拒絶反応、およびそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５８】
[0073]本発明の開示の炭素材料は、炎症性疾患の様々な症状を処置するのに利用することができる。例えば、いくつかの実施態様において、対象への炭素材料の投与は、対象における炎症性疾患に関連する炎症（例えば、炎症性疾患、例えば関節炎などに関連する腫脹関節）を減少させることができる。いくつかの実施態様において、対象への炭素材料の投与は、対象における炎症性疾患に関連する病変の数を低減することができる。いくつかの実施態様において、病変の数は、対象において約１０％〜約１００％低減する。いくつかの実施態様において、病変の数は、対象において約１０％〜約５０％低減する。いくつかの実施態様において、病変の数は、対象において約３３％低減する。いくつかの実施態様において、病変は、対象において除去される。いくつかの実施態様において、病変は、多発性硬化症と関連している。いくつかの実施態様において、病変は、血液脳関門の近辺である。
【００５９】
[0074]理論に縛られることはないが、本発明の開示の炭素材料は、様々なメカニズムによって炎症性疾患を処置することができることが考えられる。例えば、いくつかの実施態様において、対象への炭素材料の投与は、対象におけるＴ細胞が媒介する反応（例えば、Ｔ細胞媒介性炎症反応）を低減または阻害することができる。いくつかの実施態様において、対象への炭素材料の投与は、対象における炎症性疾患に関連する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を、予防、遅延、低減または阻害することができる。
【００６０】
[0075]標的化されたＴ細胞への炭素材料の作用
[0076]さらなる理論に縛られることはないが、本発明の開示の炭素材料は、様々な細胞メカニズムによって炎症性疾患を処置することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、他のタイプの免疫細胞に対して選択的にＴ細胞を標的化することができる。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料によって標的化されない他のタイプの免疫細胞としては、これらに限定されないが、マクロファージ、Ｂ細胞、顆粒球、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞およびそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００６１】
[0077]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、および好中球に対して選択的にＴ細胞を標的化する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、マクロファージにいかなる作用も与えずに、選択的にＴ細胞を標的化する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、マクロファージの活性（例えば、マクロファージによる食細胞活動、抗原のプロセシングおよび提示、または化学誘引）に影響を及ぼさずに、Ｔ細胞の活性に作用する。
【００６２】
[0078]本発明の開示の炭素材料は、様々な種類のＴ細胞を選択的に標的化することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、エフェクター−メモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）を選択的に標的化する。
【００６３】
[0079]本発明の開示の炭素材料は、様々なメカニズムによって、選択的にＴ細胞を標的化することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞への炭素材料の優先的な取り込みによって、選択的にＴ細胞を標的化する。いくつかの実施態様において、標的化されたＴ細胞は、他の免疫細胞より高い炭素材料取り込み能力を示す可能性がある。いくつかの実施態様において、標的化されたＴ細胞は、他の免疫細胞の炭素材料取り込み能力より約１０％〜約１００％高い炭素材料取り込み能力を有する。いくつかの実施態様において、標的化されたＴ細胞は、他の免疫細胞の炭素材料取り込み能力より約１０％〜約２０％高い炭素材料取り込み能力を有する。いくつかの実施態様において、標的化されたＴ細胞は、他の免疫細胞の炭素材料取り込み能力より約１０％〜約５０％高い炭素材料取り込み能力を有する。
【００６４】
[0080]本発明の開示の炭素材料はまた、様々なメカニズムによって標的化されたＴ細胞に入る可能性もある。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、Ｔ細胞の原形質膜を横切ることによって、標的化されたＴ細胞に入る。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、エンドサイトーシスによって、標的化されたＴ細胞に入る。
【００６５】
[0081]さらなる理論に縛られることはないが、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞に様々な作用を有し得ることが考えられる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を約１０％〜約１００％低減する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を約４０％〜約１００％低減する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を約５０％低減する。
【００６６】
[0082]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞におけるサイトカイン産生を約１０％〜約８０％低減または阻害する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞におけるサイトカイン産生を約２０％〜約４０％低減または阻害する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を約３０％低減または阻害する。
【００６７】
[0083]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞における炎症促進性サイトカインの産生を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、炎症促進性サイトカインとしては、これらに限定されないが、インターロイキン、インターフェロン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、炎症促進性サイトカインとしては、これらに限定されないが、インターロイキン（ＩＬ）−２およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γが挙げられる。
【００６８】
[0084]いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞によるＴ細胞のシグナル伝達を低減または阻害する。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞のシグナル伝達は、サイトカイン産生の低減または阻害の結果として低減または阻害される。
【００６９】
[0085]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞の細胞内の酸化剤含量を低減する。いくつかの実施態様において、低減される酸化剤としては、これらに限定されないが、スーパーオキシド（ＳＯ）、ヒドロキシルラジカル、活性酸素種（ＲＯＳ）、およびそれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、酸化剤を捕捉することによって、細胞内の酸化剤含量を低減する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、酸化剤を触媒的に変換することによって、細胞内の酸化剤含量を低減する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、他の免疫細胞の酸化剤含量に実質的な作用を有さない。
【００７０】
[0086]いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、可逆的な方式で、標的化されたＴ細胞の活性に作用する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、用量依存性の方式で、標的化されたＴ細胞の活性に作用する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞の生存率に影響を及ぼさずに、標的化されたＴ細胞の活性に作用する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料は、標的化されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導せずに、標的化されたＴ細胞の活性に作用する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の炭素材料が引き起こす標的化されたＴ細胞の死は、１０％未満である。
【００７１】
[0087]Ｔ細胞の調節
[0088]いくつかの実施態様において、本発明の開示は、Ｔ細胞を炭素材料と共にインキュベートすることによってＴ細胞を調節する方法に関する。いくつかの実施態様において、本方法は、エクスビボで行われる。いくつかの実施態様において、本方法は、エクスビボで、他のタイプの免疫細胞（前述した通り）の存在下で行われる。いくつかの実施態様において、本方法は、インビトロで行われる。いくつかの実施態様において、炭素材料は、他のタイプの免疫細胞に対して選択的にＴ細胞を標的化する（前述した通り）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、Ｔ細胞への優先的な取り込みにより、選択的にＴ細胞を標的化する（前述した通り）。
【００７２】
[0089]いくつかの実施態様において、炭素材料は、Ｔ細胞媒介反応を低減または阻害する（前述した通り）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞の増殖を低減または阻害する（前述した通り）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞によるサイトカイン産生を低減または阻害する（前述した通り）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞によるＴ細胞のシグナル伝達を低減または阻害する（前述した通り）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞における細胞内の酸化剤含量を低減する（前述した通り）。いくつかの実施態様において、炭素材料は、標的化されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導しない（前述した通り）。
【００７３】
[0090]様々な炭素材料を、Ｔ細胞を調節するのに利用することができる。好適な炭素材料は、これまでに説明されてきた。いくつかの実施態様において、炭素材料は、極短単層カーボンナノチューブを包含する。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、複数の官能基で官能化されている。いくつかの実施態様において、極短単層カーボンナノチューブは、ポリ（エチレングリコール）で官能化された極短単層カーボンナノチューブを包含する。
【００７４】
[0091]利点
[0092]本発明の開示は、全身性の免疫抑制を引き起こさずに様々な種類の炎症状態を処置するための改善された方法および炭素材料を提供する。さらに、本発明の開示の炭素材料は、可逆的で非毒性の方式で、Ｔ細胞を特異的に標的化することができる。そのようなものとして、本発明の開示の方法および炭素材料は、炎症性疾患を処置する現存の方法および組成物に対して有意な利点をもたらす。例えば、本発明の開示の方法および炭素材料は、悪性腫瘍（例えば、がん）の発達および感染などの従来の処置方法に伴う副作用を起こすことなく、様々な種類の炎症性疾患を処置することができる。
【００７５】
[0093]追加の実施態様
[0094]以下、このような実施態様への支持を提供するより具体的な本発明の開示の実施態様および実験結果について述べる。しかしながら、以下の開示は単に例示の目的のためであり、特許請求された主題の範囲をいかなるようにも限定することは意図されないことを出願人は指摘する。
【実施例】
【００７６】
[0095]実施例１．Ｔ細胞によるＰＥＧ−ＨＣＣの優先的な取り込み
[0096]この実施例において、出願人は、ポリ（エチレン）−グリコールで官能化された親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）が、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞および好中球に対して優先的にＴ細胞に入ることを示す。また出願人は、この特性を適用して、疾患関連のＴ細胞の活性を弱め、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）およびプリスタン誘導関節炎（多発性硬化症およびリウマチ様関節炎の動物モデル）をそれぞれ緩和する。また出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣを吸収できないことが、マクロファージの主要な機能を無傷のままにすることも示す。このような結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣの選択的な活性は、全身性の免疫抑制を誘導せずに、Ｔ細胞媒介性の自己免疫および炎症性疾患を処置するのに利用できることを示唆する。
【００７７】
[0097]ＰＥＧ−ＨＣＣは、ＳＯおよびヒドロキシルラジカルを優先的に捕捉する点、効果的であるが選択的な抗酸化活性を示す点、酸化窒素と反応しない点、ラジカルを他の分子上に移動させない点、生物的に利用可能である点、げっ歯類において低い毒性しか示さない点、および迅速に不活性化しない点において、ＰＥＧ−ＨＣＣは既存の抗酸化剤に対して有利である。例えば、電子常磁性共鳴分光によるスーパーオキシド（ＳＯ）消光の研究において、７０μｇのＰＥＧ−ＨＣＣは、１０Ｕ／ｍｇスーパーオキシドジスムターゼの消光作用に類似した消光作用を有していた。この値は、１３Ｕ／ｍｇタンパク質であるラット全脳で測定された総スーパーオキシドジスムターゼ活性に類似している。この値はまた、４〜６Ｕ／ｍｇタンパク質の範囲である死後のヒト脊髄から報告されたスーパーオキシドジスムターゼ活性に関する値よりも高い。またＰＥＧ−ＨＣＣは、目的の生物学的な位置に小分子薬物を送達するのに使用できるナノベクターとして利用できることからも有利である。
【００７８】
[0098]出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣが細胞内のスーパーオキシドラジカル（ＳＯ）と接触しているかどうかを決定するために、ＰＥＧ−ＨＣＣが脾臓中の主要な免疫細胞集団に入るかどうかを調査した。フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を使用して、出願人は、ナノ粒子と共にインキュベートされた初代ラット脾細胞が、細胞が透過化されたときにＰＥＧ−ＨＣＣシグナルの増加を示すことを見出し、これは、ナノ粒子は、単に細胞表面に結合しているのではなく、内在化されていることを示す（図２Ａ）。さらに、このような作用はＣＤ３＋細胞においてより明らかであったことから、ＰＥＧ−ＨＣＣは、優先的にＴ細胞によって内在化されることが示唆される（図２Ａ）。
【００７９】
[0099]以前の研究から、ＰＥＧ−ＨＣＣは他の細胞型に入ることができることが示されている。それゆえに、出願人は、様々な細胞、例えばＣＤ３脾細胞によるＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みを評価した。特定には、出願人は、脾臓Ｂ細胞（ＣＤ３−Ｂ２２０＋）、好中球（ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｌｙ−６Ｇ＋）、マクロファージ（ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｌｙ−６Ｇ−ＣＤ１０３−ＣＤ１１ｂ＋）、樹状細胞（ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｌｙ−６Ｇ−ＣＤ１０３＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６１ａ＋）およびＮＫＴ（ＣＤ３＋ＣＤ１６１ａ＋）細胞へのＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みを評価した。出願人は、意外なことに、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞および好中球の透過化は、ＰＥＧ−ＨＣＣシグナルを増加させなかったことを観察した（図２Ｂ）。このような観察は、Ｔ細胞が選択的にＰＥＧ−ＨＣＣを取り込むことを示す。
【００８０】
[00100]インビボでもＰＥＧ−ＨＣＣが優先的にＴ細胞によって内在化されるかどうかを確認する前に、出願人は、ラット血清におけるＰＥＧ−ＨＣＣの生物学的利用率を、首筋への２ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射後に酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した（図２Ｃ）。出願人は、皮下送達は半減期を２５時間に著しく強化することを示した（図２Ｃ）。またＰＥＧ−ＨＣＣは注射後の２４時間に血清中で最大レベルに達したが、これは、皮膚の真下で徐放性の貯留槽が形成されたことに起因する可能性がある。
【００８１】
[00101]薬物動態学的な研究からの結果を利用して、出願人は、ラットの皮下に２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＨＣＣを注射し、２４時間後に脾細胞を単離し、様々な細胞によるＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みを評価した。２４時間後に脾細胞を収集し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ／ｃ、およびＢ２２０に対して向けられた抗体で染色した。次いで、細胞内および細胞外のＰＥＧ−ＨＣＣの両方の検出のために脾細胞を透過化するか、または細胞外のＰＥＧ−ＨＣＣを検出するために無傷のままにした。出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣが、マクロファージ（ＣＤ３−ＣＤ１１ｂ／ｃ＋ＣＤ４＋）およびＢ細胞（ＣＤ３−Ｂ２２０＋）に対して、Ｔ細胞（ＣＤ３＋Ｂ２２０−）に入る申し分のない能力を有し続けていたことを見出した（図２Ｄ）。このような結果は、インビトロでの発見と一致する。
【００８２】
[00102]Ｔ細胞による取り込みにおいてエンドサイトーシスを阻害する条件の作用を評価するために、ＰＥＧ−ＨＣＣを４℃でインキュベートし、ＦＣＭによって分析した。出願人は、このような条件が内在化を弱めるが妨害しないことを見出した（図３Ａ）。理論に縛られることはないが、このような結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みは、主としてエンドサイトーシスを介して起こることを示唆する。
【００８３】
[00103]次に、出願人は、Ｔ細胞へのＰＥＧ−ＨＣＣ流入の速度論を試験したところ、２５分のインキュベート後に、ＰＥＧ−ＨＣＣが最大細胞内レベルに到達することを見出した（図３Ｂ）。加えて、出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣが次第にＴ細胞を離れ、６時間後にほぼ検出不可能になることを見出した（図３Ｃ）。理論に縛られることはないが、このような結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣは細胞内部に蓄積しないことを示唆する。
【００８４】
[00104]加えて、出願人は、自己免疫疾患に関与する優勢な細胞型であるＴ細胞の細胞活性に対するＰＥＧ−ＨＣＣ内在化の結果を評価した。出願人が初代ＧＦＰ変換オボアルブミン特異的ラットＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＣ−Ｋｖ１．３ｈｉｇｈ）をＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートし、細胞をオボアルブミンで刺激したところ、出願人は、細胞内ＳＯレベルと増殖の両方において用量依存性の低減を見出した（図４Ａ）。しかしながら、Ｔ細胞の増殖の減少はＰＥＧの存在に起因するものではなく、単独では阻害応答を誘導するには不十分であった（図５）。加えて、過量のＰＥＧ−ＨＣＣを洗い落として細胞を即座に刺激することは、増殖に対する作用を変更しなかったことから、Ｔ細胞の活性を変更するには、ＰＥＧ−ＨＣＣを内在化させる必要があることが確認された（図４Ｂ）。
【００８５】
[00105]対照的に、６時間後に細胞を刺激したところ、増殖に対する阻害作用が回復した（図４Ｂ）。この結果は、ナノ粒子損失の速度論に合致しており、ＰＥＧ−ＨＣＣは、Ｔ細胞の活性に可逆的な作用を有することを示唆する。
【００８６】
[00106]観察されたＴ細胞の増殖に対する作用がナノ粒子による細胞傷害作用に起因するのかどうかを調査するために、出願人はＦＣＭを利用して、刺激の前にＰＥＧ−ＨＣＣで処置したＴ細胞における細胞死を分析したところ、それらが細胞生存率においていかなる変化も促さなかったことを見出した（図４Ｃ）。また出願人はＦＣＭ分析を利用して、オボアルブミンで刺激されたＴ細胞における炎症促進性サイトカインの産生に対するＰＥＧ−ＨＣＣの作用も試験したところ、インターロイキン（ＩＬ）−２およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γのレベルが約３０％低減したことを見出した（図４Ｄ）。
【００８７】
[00107]出願人はマクロファージがＰＥＧ−ＨＣＣを内在化しないことを実証したが、出願人は、観察されたＰＥＧ−ＨＣＣによるＴ細胞の活性に対する作用が、マクロファージを包含する抗原提示細胞の機能の変更に由来するのかどうかを調査した。出願人は、トランスウェルフィルターを通過して、リポ多糖（ＬＰＳ）での刺激の前にＰＥＧ−ＨＣＣで処置した初代ラット腹腔内マクロファージの培養物から収集された上清に向かうＴ細胞の移動に対して作用がないことを見出した（図６Ａ）。この結果から、ＰＥＧ−ＨＣＣはマクロファージによる化学誘引物質産生に影響を与えないことが示される。
【００８８】
[00108]加えて、Ｔ細胞をＰＥＧ−ＨＣＣで処置することは、それらの移動には作用しなかった（図６Ａ）。このような結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、刺激されていないＴ細胞の増殖に対して作用がないことを示す（図７）。
【００８９】
[00109]次に、出願人は、マクロファージをＰＥＧ−ＨＣＣと共にインキュベートした場合、他のナノ粒子とは異なり、ザイモサン生体粒子の食細胞活動は不変であったことを見出した（図６Ｂ）。最終的に、オボアルブミンをローディングしてオボアルブミン特異的Ｔ細胞を提供する前に、マクロファージをＰＥＧ−ＨＣＣで処置した場合、出願人は、Ｔ細胞の増殖に作用がなかったことを見出した（図６Ｃ）。しかしながら、Ｔ細胞と同時にマクロファージにＰＥＧ−ＨＣＣを添加することは、図４Ａに記載の発見と同様に、Ｔ細胞の増殖の低減をもたらした（図６Ｃ）。このような結果から、ＰＥＧ−ＨＣＣは、マクロファージによる抗原のプロセシングおよび提示を改変しないことが示される。
【００９０】
[00110]次に出願人は、Ｔ細胞によって媒介される動物疾患モデルに対するＰＥＧ−ＨＣＣの作用を試験した。出願人は、ラットの耳でオボアルブミンに対する進行中の遅延型過敏症応答（ＤＴＨ）を惹起し、免疫化時または攻撃時のいずれかにおける２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＨＣＣの単回皮下注射が、炎症を減少させるのに十分であったことを見出した（図８Ａ）。この発見に促されて、出願人は、ミエリン塩基性タンパク質によって誘導されたＥＡＥを有するラットに対するＰＥＧ−ＨＣＣの作用を試験したところ、出願人は、疾患の徴候が出現したときから開始して３日毎の２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＨＣＣによるラットの皮下処置が、臨床スコアを有意に低減したことを見出した（図８Ｂ）。疾患のピーク時にＥＡＥラットから単離した脊髄の組織学的分析から、炎症性の病巣の減少が明らかになり、これは、免疫細胞の脊髄への浸潤が減少したことを示す（図８Ｃ）。
【００９１】
[00111]この実施例において、出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣが、炎症性疾患を処置するために利用することができる選択的な免疫調節物質であることを実証した。出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、他の免疫細胞に対して優先的にＴ細胞によって内在化されることを確立した。
【００９２】
[00112]出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣのＴ細胞取り込みに関与する単一のメカニズムを同定することができなかったが、出願人のデータは、ＰＥＧ−ＨＣＣは、主にエンドサイトーシスを介して入ることを示す。また出願人は、Ｔ細胞によるＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みは、Ｔ細胞に永続的な作用または細胞傷害作用を与えることなく炎症促進性サイトカインの産生およびＴ細胞の増殖を阻害することもできることも実証する。このような発見は、分裂促進物質または抗原により誘導されたＴ細胞の活性化を弱めるための抗酸化剤の使用を実証する研究と一致する。
【００９３】
[00113]さらに、ＰＥＧ−ＨＣＣによるＴ細胞の活性で観察された結果は、Ｔ細胞の生理学的な活性化に必須の工程であるマクロファージによる化学誘引、食細胞活動、ならびに抗原のプロセシングおよび提示に対する外部の作用に起因していなかった。これらのデータが意味する主要なことは、ＰＥＧ−ＨＣＣを内在化できないことによって、マクロファージの主要な機能は不変のままであることである。これは、ＰＥＧ−ＨＣＣは、確立された自己免疫疾患処置にはない戦略的な選択性を含むことを実証する。これもまた、ＰＥＧ−ＨＣＣでの処置は、全身性の免疫抑制を誘導しないと予想されることを示唆する。
【００９４】
[00114]加えて、出願人のＰＥＧ−ＨＣＣによるＴ細胞の活性に関するインビトロでの結果の重要性は、これらのナノ粒子をラットモデルに投与することにより、ＤＴＨ炎症、ＥＡＥスコアおよび脊髄への免疫浸潤の低減がもたらされるという発見によって明らかに実証された。まとめると、これらのデータは、ＰＥＧ−ＨＣＣが、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患（例えば、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患）を処置するための極めて貴重なツールであることを示唆する。
【００９５】
[00115]実施例２．ＰＥＧ−ＨＣＣはヒトＴ細胞に入る
[00116]この実施例において、出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣが優先的にヒトＴ細胞に入ることを実証する追加のデータを提供する。このような結果は、実施例１で提供された結果をさらに支持し補っている。
【００９６】
[00117]出願人はフローサイトメトリーを使用して、透過化されていないＴ細胞の表面と透過化したＴ細胞の内部にＰＥＧ−ＨＣＣを検出した。図９Ａで示されたように、出願人は、３７℃で１０分インキュベートした後のＴ細胞に連結されたＰＥＧ−ＨＣＣの大部分が細胞内であったことを見出した。これらの結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、細胞内スーパーオキシドと接触していることを実証する。さらに、図９Ｂで示されたように、ヒトＴ細胞にＰＥＧ−ＨＣＣが内在化されたときに、刺激されたヒトＴ細胞の増殖の低減が観察された。
【００９７】
[00118]実施例３．Ｔリンパ球媒介性自己免疫疾患の動物モデルにおけるＰＥＧ−ＨＣＣの作用
[00119]この実施例において、出願人は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の動物モデルにおけるＰＥＧ−ＨＣＣの作用に関する追加のデータを提供する。このような結果は、実施例１および２で提供された結果をさらに支持し補っている。
【００９８】
[00120]実施例３．１．ＰＥＧ−ＨＣＣは、ラットの進行中の急性多発性硬化症モデルにおいて血液脳関門の病変の数を低減する
[00121]中枢神経系の病変を前臨床的および臨床的に検出する方法の１つは、ダイナミック造影（ＤＣＥ）ＭＲＩイメージングの使用である。この方法において、キレート化したＧｄ３＋造影剤が静脈に導入されると、結果として病変部位で陽性造影増強が起こる。この場合、出願人は、完全フロインドアジュバント中のミエリン塩基性タンパク質に対するルイスラットの免疫化により誘導された進行中の急性ＥＡＥモデルにＤＣＥ  ＭＲＩイメージングを行った。免疫化のときと７日後に、ラットをビヒクルまたはＰＥＧ−ＨＣＣで処置した（図１０）。第１のパネル（図１０Ａ）は、ビヒクルで処置した多発性硬化症モデルを有するラットから得られた画像を表する。黄色の矢印は、病変が増強された領域を指し示す。第２のパネル（図１０Ｂ）は、ＰＥＧ−ＨＣＣで処置した多発性硬化症モデルを有するラットから得られた画像を表する。病変が増強された領域が著しく低減したことに注目されたい。図１０Ｃに記載のチャートは、病変を定量化する。これらの結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、ラットの多発性硬化症モデルにおいて血液脳関門への病変の数を低減できることを示す。
【００９９】
[00122]実施例３．２．ＰＥＧ−ＨＣＣは、ラットにおいて遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を予防し、リウマチ様関節炎のラットモデルにおいて疾患の重症度を低減する
[00123]進行中のＤＴＨ反応を説明されているようにしてオボアルブミンに対して惹起した（Mol Pharmacol 2005；67：1369〜1381；J Vis Exp 2007；6：e237；J Vis Exp 2007；8：e325；J Biol Chem 2008；283：988〜997；およびJ Pharmacol Exp Ther 2012；342：642〜653）。免疫化時または攻撃時におけるＰＥＧ−ＨＣＣの単回皮下投与は、Ｔ細胞媒介性炎症の尺度である耳の腫れを有意に低減した（例えば、実施例１における図８Ａを参照）。リウマチ様関節炎の動物モデルであるプリスタン誘導関節炎を、説明されているようにしてラットで誘導し、モニターした。出願人は、臨床徴候が出現したときから開始して４日毎のＰＥＧ−ＨＣＣの投与が、疾患の重症度を有意に低減させたことを見出した（図１１）。これらの結果は、ＰＥＧ−ＨＣＣは、インビボでＴ細胞媒介性免疫反応を阻害できることを実証する。
【０１００】
[00124]実施例３．３．ＰＥＧ−ＨＣＣは、疾患の再発期中にＲ−ＥＡＥ臨床スコアを低減させる傾向を示した
[00125]小規模な試験において、出願人は、ＤＡラットの小さい同齢集団（ｎ＝９匹のラットを２つの処置群に分割）においてＲ−ＥＡＥを誘導し、ＰＥＧ−ＨＣＣを用いて予防試験を行った。ＰＥＧ−ＨＣＣは、疾患の初期の発現期間に軽度の作用を示した（図１２）。このような結果は予想外であった。
【０１０１】
[00126]さらなる詳細がなくとも、当業者は、本明細書に記載の説明を使用して本発明の開示を最大限利用できると考えられる。本明細書で説明された実施態様は、例示的であって、開示されていない事柄をいかなるようにも決して束縛しないと解釈されるものとする。実施態様を示し説明したが、本発明の本質および教示から逸脱することなくそれらの多くのバリエーションおよび改変が当業者によりなされ得る。したがって、保護の範囲は上に記載された説明によって限定されないが、特許請求の範囲の主題の全ての等価体を含めた特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書において引用された全ての特許、特許出願および公報の開示は、本明細書に記載のものに一致しそれを補充する手順上または他の詳細を提供する程度に、ここでの参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図６Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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