(57)【要約】  アロ反応性Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出を利用した、ドナーとレシピエントとの間の適合性を決定する方法であって、以下の工程：ａ）分析すべきドナー／レシピエントペアから得られた一方の血液サンプルに標識を添加する工程であって、以下では前記サンプルを標識サンプルと呼び、この標識は、レシピエントに由来するサンプルと区別するために適しており、分析すべきドナー／レシピエントペアから得られた他方の血液サンプルを、以下では非標識サンプルと呼ぶ工程、ｂ）両方のサンプルを、第１の培地で少なくとも１回希釈し、サンプルの細胞成分を液相から分離する工程、ｃ）細胞成分、特に同一体積の、標識サンプルの血液サンプル残渣、非標識サンプルの血液サンプル残渣を第２の培地にそれぞれ別々に再取込みする工程、ｄ）非標識サンプルからの一部と標識サンプルの一部とを、特におよそ１：１の比率で混合して、混合物を得る工程、ｅ）請求項１の工程ｄ）に記載される、標識サンプルと非標識サンプルとからなる混合物中で、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ４９ｄ抗体の添加により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を刺激する工程、続いて、ｆ）３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度にて、１．５時間〜２．５時間、好ましくは２時間の期間、保護ガス雰囲気、ＣＯ2雰囲気下でもよく、混合物の１回目のインキュベーションを行う工程、ｇ）分泌阻害剤を添加する工程、ｈ）請求項１の工程ｄ）に由来するサンプルを混合する工程、ｉ）続いて、３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度にて、少なくとも２．５時間の期間、保護ガス雰囲気、ＣＯ2雰囲気下でもよく、２回目のインキュベーションを行う工程、ｊ）場合によっては赤血球を溶解する工程、ｋ）例えば、標識された抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ８抗体による、ＣＤ４リンパ球またはＣＤ８リンパ球の標識、およびフローサイトメトリー検知を利用して、リンパ球をフローサイトメトリーにより検知する工程、ｌ）細胞内サイトカインで活性化されたリンパ球および活性化マーカーを発現するリンパ球をフローサイトメトリーにより検知する工程、ｍ）フローサイトメトリー検知において以下の結果：ａ．標識陽性／ＣＤ４陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性、ｂ．標識陰性／ＣＤ４陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性、ｃ．標識陽性／ＣＤ８陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性、ｄ．標識陰性／ＣＤ８陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性が現れる場合、標識サンプルが得られた個体と非標識サンプルが得られた個体との間にアロ反応性が存在すると同定する工程を含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロ反応性Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出を利用した、ドナーとレシピエントとの間の適合性を決定する方法であって、以下の工程：
ａ）分析すべきドナー／レシピエントペアから得られた一方の血液サンプルに標識を添加する工程であって、以下では前記サンプルを標識サンプルと呼び、前記標識はレシピエントに由来するサンプルを弁別するために適した標識であり、分析すべきドナー／レシピエントペアから得られた他方の血液サンプルを、以下では非標識サンプルと呼ぶ工程、
ｂ）両方のサンプルを、第１の培地で少なくとも１回希釈し、サンプルの細胞成分を液相から分離する工程、
ｃ）細胞成分、特に同一体積の、標識サンプルの血液サンプル残渣、非標識サンプルの血液サンプル残渣を第２の培地にそれぞれ別々に、再取込みする工程、
ｄ）非標識サンプルからの一部と標識サンプルの一部とを、特におよそ１：１の比率で混合して維持して、混合物を得る工程、
ｅ）請求項１の工程ｄ）に記載される、標識サンプルと非標識サンプルとの混合物において、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ４９ｄ抗体の添加により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を刺激する工程、続いて、
ｆ）３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度にて、１．５時間〜２．５時間、好ましくは２時間の期間、保護ガス雰囲気、ＣＯ2雰囲気下でもよく、混合物の１回目のインキュベーションを行う工程、
ｇ）分泌阻害剤を添加する工程、
ｈ）請求項１の工程ｄ）に由来するサンプルを混合する工程、
ｉ）続いて、３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度にて、少なくとも２．５時間の期間、保護ガス雰囲気、ＣＯ2雰囲気下で、２回目のインキュベーションを行う工程、
ｊ）場合によっては赤血球を溶解する工程、
ｋ）例えば、標識された抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ８抗体による、ＣＤ４リンパ球またはＣＤ８リンパ球の標識、およびフローサイトメトリー検知を利用して、リンパ球をフローサイトメトリーにより検知する工程、
ｌ）細胞内サイトカインで活性化されたリンパ球および活性化マーカーを発現するリンパ球をフローサイトメトリーにより検知する工程、
ｍ）フローサイトメトリー検知において以下の結果：
ａ．標識陽性／ＣＤ４陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性、
ｂ．標識陰性／ＣＤ４陽性／ＣＤ６９陽性／ＩＮＦ−γ陽性、
ｃ．標識陽性／ＣＤ８陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性、
ｄ．標識陰性／ＣＤ８陽性／ＣＤ６９陽性／INF−γ陽性
が現れる場合、標識サンプルが得られた個体と非標識サンプルが得られた個体との間に存在するアロ反応性の存在が同定されたとする工程
を含む方法。
【請求項２】
標識が、標識されたＣＤ４５抗体、ＣＦＤ−ＳＥ、またはＣＦＳＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の工程ｂ）で挙げた第１の培地が請求項１の工程ｃ）で挙げた第２の培地と独立であり、第１の培地および第２の培地が、リン酸緩衝生理食塩水、ＲＰＭＩからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルの細胞成分の液相からの分離が遠心分離を利用して行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分泌阻害剤が、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）またはモネシンである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フローサイトメトリー検知に先立って添加される細胞膜透過処理剤（Ｚｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｐｅｒｍｅａｔｏｒ）がサポニンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サイトカインがγ−ＩＦＮである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
活性化マーカーがＣＤ６９である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１のａの場合に、ドナー／レシピエントペアに由来する非標識パートナーに対するドナー／レシピエントペアの標識パートナーのアロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞が示される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１のｂの場合に、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーに対するドナー／レシピエントペアの非標識パートナーのアロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞が示される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１のｃの場合に、ドナー／レシピエントペアの非標識パートナーに対する、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーのアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が示される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１のｄの場合に、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーに対する、ドナー／レシピエントペアの非標識パートナーのアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を示される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ドナー血液サンプルおよびレシピエント血液サンプルが全血に由来する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、アロ反応性Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出を利用した、ドナーとレシピエントとの間の適合性の決定法である。
【背景技術】
【０００２】
組織または臓器の提供に対する細胞性免疫反応は、急性および慢性双方の移植片拒絶反応においても重要な役割を演じる。レシピエントにおいて提供への拒絶反応が起こるかどうかのリスクを判断することがきわめて重要である。
Urban Sester et al.は、Transplantation, Vol. 78 (4), 607 614, (2004)の中で、臨床実地で使用することを目的とした、アロ反応性Ｔ細胞の同定法を記載している。その際の欠点は、末梢血単核球を利用して行う比較的手間のかかる手法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
それゆえ、特に全血からの迅速かつ確かな適合性リスク評価を可能にするより簡単なテストを使用できることが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
それは、本発明によると、アロ反応性Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出を利用した、ドナーとレシピエントとの間の適合性の決定法により可能になる。本発明による方法は、以下の工程：
ａ）分析すべきドナー／レシピエントペアから得られた一方の血液サンプルに標識を添加する工程であって、以下では前記サンプルを標識サンプルと呼び、前記標識はレシピエントに由来するサンプルを弁別するために適した標識であり、分析すべきドナー／レシピエントペアから得られた他方の血液サンプルを、以下では非標識サンプルと呼ぶ工程、
ｂ）両方のサンプルを、第１の培地で少なくとも１回希釈し、サンプルの細胞成分を液相から分離する工程、
ｃ）細胞成分、特に同一体積の、標識サンプルの血液サンプル残渣、非標識サンプルの血液サンプル残渣を第２の培地にそれぞれ別々に、再取込みする工程、
ｄ）非標識サンプルからの一部と標識サンプルの一部とを、特におよそ１：１の比率で混合して維持して、混合物を得る工程、
ｅ）請求項１の工程ｄ）に記載される、標識サンプルと非標識サンプルとの混合物において、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ４９ｄ抗体の添加により抗原提示細胞（ＡＰＣ）を刺激する工程、続いて、
ｆ）３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度にて、１．５時間〜２．５時間、好ましくは２時間の期間、保護ガス雰囲気、ＣＯ2雰囲気下でもよく、混合物の１回目のインキュベーションを行う工程、
ｇ）分泌阻害剤を添加する工程、
ｈ）請求項１の工程ｄ）に由来するサンプルを混合する工程、
ｉ）続いて、３５〜３９℃、好ましくは３７℃の温度にて、少なくとも２．５時間の期間、保護ガス雰囲気、ＣＯ2雰囲気下で、２回目のインキュベーションを行う工程、
ｊ）場合によっては赤血球を溶解する工程、
ｋ）例えば、標識された抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ８抗体による、ＣＤ４リンパ球またはＣＤ８リンパ球の標識、およびフローサイトメトリー検知を利用して、リンパ球をフローサイトメトリーにより検知する工程、
ｌ）細胞内サイトカインで活性化されたリンパ球および活性化マーカーを発現するリンパ球をフローサイトメトリーにより検知する工程、
ｍ）フローサイトメトリー検知において以下の結果：
ａ．標識陽性／ＣＤ４陽性／ＣＤ６９陽性／ＩＮＦ−γ陽性、
ｂ．標識陰性／ＣＤ４陽性／ＣＤ６９陽性／ＩＮＦ−γ陽性、
ｃ．標識陽性／ＣＤ８陽性／ＣＤ６９陽性／ＩＮＦ−γ陽性、
ｄ．標識陰性／ＣＤ８陽性／ＣＤ６９陽性／ＩＮＦ−γ陽性
が現れる場合、標識サンプルが得られた個体と非標識サンプルが得られた個体との間に存在するアロ反応性が同定INFされたとする工程
を含む。
【０００５】
本発明による方法の一実施形態では、サンプルまたは両方とものサンプルが全血に由来してもよい。
本発明による方法のさらなる一実施形態では、標識は、標識されたＣＤ４５抗体、ＣＦＤＡ−ＳＥ、またはＣＦＳＥである。
特に、本発明による方法の工程ｂ）で使用される第１の培地が、請求項１の工程ｃ）で挙げた第２の培地と独立であってもよい。第１の培地と第２の培地は、任意の細胞培養培地であってよく、特に、リン酸緩衝生理食塩水、ＲＰＭＩからなる群から選択されるような培地であってもよい。
【０００６】
本発明による方法では、サンプルの細胞成分の、液相からの分離が、遠心分離を利用して行われてもよい。
典型的には、分泌阻害剤はブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）またはモネシンである。
本発明による方法のさらに別の一実施形態では、フローサイトメトリー検知に先立って添加される細胞膜透過処理剤（Ｚｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｐｅｒｍｅａｔｏｒ）はサポニン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）である。
典型的には、本発明による方法でのサイトカインはγ−ＩＦＮである。
活性化マーカーとしては、ＣＤ６９を使用することができる。
【０００７】
工程ｍ）ケースａの結果が存在する場合、ドナー／レシピエントペアに由来する非標識パートナーに対する、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーのアロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞が示される。
工程ｍ）ケースｂの結果が存在する場合、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーに対する、ドナー／レシピエントペアの非標識パートナーのアロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞が示される。
工程ｍ）ケースｃの結果が存在する場合、ドナー／レシピエントペアの非標識パートナーに対する、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーのアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が示される。
工程ｍ）ケースｂの結果が存在する場合、ドナー／レシピエントペアの標識パートナーに対する、ドナー／レシピエントペアの非標識パートナーのアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が示される。
これらの場合、それぞれ、拒絶反応リスクの高まりが存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】全血アッセイにおける前染色および刺激の概略図である。ドナーの全血（ＶＢ）５００μｌおよびレシピエントの全血７００μｌを基にファルコンチューブの初期重量を測定する。続いて、ドナー血液にＣＤ４５−ＡＰＣ抗体５μｌを添加し、暗所（室温）で３０分間インキュベートする。次の工程では、レシピエント血液サンプルもドナー血液サンプルも、ＰＢＳ１５ｍｌで洗浄する（３５３ｇで１０分間遠心分離）。上清を取り除いた後、培地（ＲＰＭＩ；１％Ｇｌｎ；１％Ｐ／Ｓ；０．５％ＨＳＡ）１５ｍｌで洗浄する。遠心分離（３５３ｇ；１０分間）後、上清を取り除き、ファルコンチューブに培地を加えて初期重量にする。次いで、レシピエント血液（未染色血液サンプル）５００μｌをドナー血液にピペットで移す（およそ１ｍｌ）。刺激するために、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄからなる混合物をピペット添加し、インキュベーター中で２時間インキュベートする。続いて、サンプルにＢＦＡを加え、インキュベーター中で４時間インキュベートする（曲線矢印は添加）。
【図２】それぞれ、各Ab（抗体）Ａ）ＳｉｇｍａのＣＤ４５−ＦＩＴＣ（青色）、Ｂ）ＢＤのＣＤ４５−ＡＰＣ（褐色）、およびＣ）ＢＤのＣＤ４５−ＦＩＴＣ（緑色）による、ＣＤ４５染色細胞集団（円形シンボル）およびＣＤ４５未染色細胞集団（四角形シンボル）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、製造元濃度および対応する希釈（各濃度の１／２、１／４および１／８）に基づいてプロットした図である。染色細胞集団のＭＦＩは、濃度の上昇と共に高まり、未染色細胞集団のＭＦＩはゼロレベルのままである（Ａ）、またはわずかに増加する（ＢおよびＣ）。図Ｄ）には、ＣＤ４５陽性細胞集団のＭＦＩの、ＣＤ４５陰性細胞集団のＭＦＩに対する比率をプロットしている。Ｓｉｇｍａの抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（青色）が、最高のＭＦＩ比を示す。ＢＤの抗ＣＤ４５−ＡＰＣ（褐色）は、ＢＤのＣＤ４５−ＦＩＴＣ（緑色）と同様に、なおもより良好なＭＦＩ比を示す。赤色円形は、さらなる実験経過において選択された濃度を示す。
【図３】ＦＡＣＳ測定の評価第１部を示す図である。評価戦略は、全血サンプルおよびＰＢＭＣ（末梢血単核球）サンプルにおいて、本質的には同一アルゴリズムに従って適用される。まず、２つの非占有チャンネル（Ｖ−４５０およびＶ−５００）を相互に表示することにより（右上方のドットブロット）、ゲートＰ５中に表示されている非特異的イベントを除去する。その下方のドットブロットには、ＣＤ８がＣＤ４に対してプロットされている。その場合、ゲートＰ３中に位置する細胞を除去する。ゲートＰ１中に位置する細胞が、「バックゲート」される、つまり、左側のドットブロット表示（ＦＳＣ対ＳＳＣ）中では、ゲートＰ１（中央のドットブロット、右側）中で視認可能な細胞のみが表示されている。リンパ球への第２の「バックゲート」が、ゲートＰ２（密度ブロット、左下側）により行われ、その場合、ＣＤ４５陽性細胞とＣＤ４５陰性細胞との間で一集団へとゲートされた（青色ゲート）。これらの細胞は、その密度ブロット（左上側、青色で表示）中での局在により、リンパ球ではないため、ゲーティングの際にはこれらの細胞を評価に含まないように努めた。両方のバックゲーティング戦略が適用された密度ブロット（左上側）では、前方散乱（ＦＳＣ）が側方散乱（ＳＳＣ）に対して表示される。それにより、リンパ球集団（枠）にゲートすることができる。リンパ球はまた、密度ブロット表示（右下側）を利用して、さらにＣＤ４５陽性細胞（枠、上側）とＣＤ４５陰性細胞（枠、下側）とに細分される。
【図４】ＦＡＣＳ測定の評価第２部を示す図である。次の工程では、第１部からのＣＤ４５陽性リンパ球とＣＤ４５陰性リンパ球とを、ＣＤ４陽性細胞（左側の２つの正方形）とＣＤ８陽性細胞（右側の２つの正方形）とにさらに細分し、それらをＩＦＮγに対してプロットする（上方の４つの密度ブロット）。その下方の４つのドットブロット中では、上方の密度ブロットのうちの陽性Ｔ細胞のみ、つまり黄色枠内に存在する細胞のみを表示する。その際、左側の両方のドットブロットが、再びＣＤ４陽性Ｔ細胞を表し、右側の両方のドットブロットがＣＤ８陽性Ｔ細胞を表す。これらの細胞を、次に、さらにそれらの、活性化マーカーＣＤ６９およびサイトカインＩＦＮγの発現を手がかりに、４つの分集団に細分すると、それぞれ右上側の象限（枠）内に、アロ反応性と定義されるＴ細胞が位置することになる。  ＣＤ４５＋ＣＤ４＋：ドナーのＣＤ４Ｔ細胞。右上側の象限中のイベントは、レシピエントの細胞に対して反応する、ドナーのアロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞に対応する。  ＣＤ４５−ＣＤ４＋：レシピエントのＣＤ４Ｔ細胞。右上側の象限中のイベントは、ドナーの細胞に対して反応する、レシピエントのアロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞に対応する。  ＣＤ４５＋ＣＤ８＋：ドナーのＣＤ８Ｔ細胞。右上側の象限中のイベントは、レシピエントの細胞に対して反応する、ドナーのアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞に対応する。  ＣＤ４５−ＣＤ８＋：レシピエントのＣＤ８Ｔ細胞。右上側の象限中のイベントは、ドナーの細胞に対して反応する、レシピエントのアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞に対応する。
【図５】それぞれ、４つの異なる、並行して作製された調製物（それぞれ２つのアロ反応性サンプルおよび対応する自己対照）に由来する未染色ＣＤ４Ｔ細胞のＩＦＮｇ／ＣＤ６９ドットブロットを表す図である。アロ反応性サンプルを右段に表示し、対応する自己対照を左段に表示している。その際、被験者ＡのＣＤ４Ｔ細胞の０．０１５％が、被験者Ｂに対してアロ反応性を示す（自己対照を差し引いた）。対照的に、被験者ＢのＣＤ４Ｔ細胞の０．３６２％が、被験者Ａに対してアロ反応性を示す（自己対照を差し引いた）。
【図６】それぞれ、４つの異なる、並行して作製された調製物（それぞれ２つのアロ反応性サンプルおよび対応する自己対照）に由来する未染色ＣＤ８Ｔ細胞のγＩＦＮ／ＣＤ６９ドットブロットを表す図である。アロ反応性サンプルを右段に表示し、対応する自己対照を左段に表示している。その際、被験者ＣのＣＤ８Ｔ細胞の０．２７７％が、被験者Ｄに対してアロ反応性を示す（自己対照を差し引いた）。対照的に、被験者ＤのＣＤ８Ｔ細胞の０．０１８％が、被験者Ｃに対してアロ反応性を示す（自己対照を差し引いた）。
【図７】サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）血清反応陰性被験者ａおよびＣＭＶ血清反応陽性被験者ｂのＣＤ４Ｔ細胞を示す図である。このドットブロットは、（左から右に向かって）被験者ａおよびｂに由来する、図（Ａ）では対照抗原による刺激後の、そして図（Ｂ）ではＣＭＶ−Ａｇでの刺激後の、部分的にＣＤ４５染色された（*）またはＣＤ４５未染色のＣＤ４Ｔ細胞の自己刺激およびアロ測定によるγＩＦＮ発現を示す。（Ａ）非特異的な刺激後にはγＩＦＮの発現は起こらない。（Ｂ）ＣＭＶ−Ａｇによる刺激後には、ＣＭＶ血清反応陽性被験者ｂにおいてのみγＩＦＮ発現が検出される。非特異的な細胞破片（灰色のゲート）は、評価において考慮されなかった。細胞頻度は、個々の象限内において％表示されている。  予備実験に基づくと、異なる血液型の血液サンプルの組み合わせも、アロ反応性の損失または歪曲されたＴ細胞頻度をもたらさないようであるが、なぜならＡＢＯ式血液型の同一血液型の組み合わせにおいても異なる血液型の被験者においてもアロ反応性Ｔ細胞を検出できたからである。このことは、全血アッセイにおいては同種凝集素が重要でないこと、または洗浄工程により除去されることも示唆する。
【図８】４７名の被験者に由来する５９０のペア組み合わせを示す図であり、ただし、ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８Ｔ細胞（Ｂ）について、被験者は「レシピエント」として未染色の状態で、かつ、同一被験者は以前はそれと同じペアの組み合わせにおいて前染色された「ドナー」として存在する。両方の図において、一被験者の未染色としての出現と他方の前染色された出現との間で有意な相関関係を認めることができる（ＣＤ４：スピアマン検定、ｒ＝０．２５７６、ｐ＜０．０００１；ＣＤ８：スピアマン検定；ｒ＝０．４５４１、ｐ＜０．０００１）。
【図９】４７名の被験者に由来する５９０の独立したペア組み合わせについて、アロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ）およびアロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞（Ｂ）の存在を全血アッセイで検査した図である。その際、算出された検出限界（ＮＧ、破線）は、アロ反応性ＣＤ４Ｔ細胞では０．００８１％であり、アロ反応性ＣＤ８Ｔ細胞では０．０１４５％である。（Ｃ）アロ測定に関して、検出限界を上回る、または検出限界を下回る、様々なペア組み合わせの比率（フィッシャーの正確検定、ｐ＝０．４１４９）。データは、中央値±ＩＲとして示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
全血中でのアロ反応性Ｔ細胞の検出には、それぞれ２名の被験者（「レシピエントとドナー」）からヘパリン化全血が必要とされる。単離ＰＢＭＣを使用する場合と同様に、ドナー血液とレシピエント血液とを合わせた後でフローサイトメーターにおいて両個体の細胞を区別できるように、ドナー血液サンプルをＣＤ４５抗体で前染色した。
レシピエントおよびドナーからの細胞の前処理は、それぞれ、１５ｍｌのファルコンチューブ中で行った。ＰＢＭＣを使用する場合と同様に、レシピエントサンプルは未染色のままであって、抗ＣＤ４５を用いて前染色されたドナーサンプルに添加された（図１）。前処理の洗浄処置の際にピペット操作損失が起きたため、レシピエントサンプルでは全血７００μｌを使用し、そのうちの５００μｌをドナーの全血５００μｌに添加した。
【００１０】
全血を含むファルコンチューブを初めに計量し、それぞれの初期重量（レシピエントサンプルは６．９ｇでドナーサンプルは６．７ｇ）を書き留めた。ドナーサンプルを染色するために、各チューブに直接、ＣＤ４５抗体５μｌをピペット添加し、混合し、暗所で３０分間インキュベートした。続いて、レシピエントサンプルもドナーサンプルもそれぞれ１４ｍｌのＰＢＳで洗浄した（遠心分離：３５３ｇ；１０分間）。上清を除去し、サンプルに培地（ＲＰＭＩ＋０．５％ＨＳＡ＋１％Ｐ／Ｓ）１４ｍｌを加えて洗浄した（遠心分離：３５３ｇ；１０分間）。
測定の際にアロ反応性を妨害する可能性がある同種凝集素（血液型抗体）を除去するために個々の洗浄工程は不可欠だった。上清を慎重に除去した後、１５ｍｌのファルコンチューブをもう一度計量し、培地を加えてその初期重量にした。その後にはじめて、一調製物のレシピエントサンプル５００μｌを同一調製物の対応するドナーサンプルへと移し入れた。一調製物中の細胞懸濁液または全血の総量は、その結果１ｍｌである（図１）。それぞれの刺激用調製物に、共刺激性抗体（１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ）の混合物を添加した。刺激用調製物を混合してからインキュベーター（３７℃、６％ＣＯ2、ファルコンチューブの蓋はゆるく締めた）中で２時間インキュベートした。
【００１１】
次いで１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡを添加し、混合し、インキュベーター（３７℃、６％ＣＯ2、ファルコンチューブの蓋はゆるく締めた）中でさらに４時間インキュベートした。続いて、全血調製物の固定を行った。
方法の特徴づけおよび確立に貢献した、選択された複数実験では、アロ反応に加えて、対照（Ｋｏ）抗原、ＣＭＶ抗原（それぞれ３２μｇ／ｍｌ）による刺激、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、２．５μｇ／ｍｌ）による刺激を行った。これらは、共刺激性抗体の添加後に加えられ、その後、上述したように、インキュベーター中での２時間のインキュベーション、それに続くＢＦＡの添加、インキュベーター中でのさらなる４時間のインキュベーションを行った。ＣＭＶでの刺激においては、以前にＣＭＶと接触したことがある結果、特異的Ｔ細胞免疫応答を生じさせていた場合、その被験者は、対応する免疫応答を示す。対照抗原による刺激は陰性対照として利用され、ＳＥＢによる刺激は陽性対照として利用された。ＳＥＢは、わずかな濃度ですでに強力な刺激をもたらすスーパー抗原である。その際、Ｔ細胞は、その抗原特異性にはかかわりなく刺激される。陽性対照により、刺激条件が正しいかどうか、または被験者のＴ細胞が基本的に刺激可能であったかどうかが点検された。
【００１２】
全血調製物を固定するために、まず、細胞間接着を緩める２ｍＭのＥＤＴＡを添加し、チューブをそれぞれ１０秒間、撹拌ミキサ上で混合した。ＲＴ、暗所で１５分間インキュベーションした後、赤血球を溶解し白血球を固定するために、全血１ｍｌごとに溶解溶液９ｍｌを添加し、さらなる１０分間のインキュベーション（暗所、ＲＴで）とそれに続く遠心分離（３５３ｇで１０分間）後に、上清を吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー２ｍｌに再懸濁した。第２の遠心分離工程（３５３ｇで１０分間）に続き上清を除去した。次いで、ペレットを４００μｌ／サンプルのＦＡＣＳバッファーに取り込んだ。続いて、細胞を直接に染色するか、または一晩、４℃の冷蔵庫中で保管した。
【００１３】
フローサイトメトリー用に染色（ＦＡＣＳ染色）するために、分析すべき細胞懸濁液それぞれ２００μｌをＦＡＣＳチューブに移し、サポニンバッファー２ｍｌに１０分間インキュベートした。インキュベーションは、ＲＴ、暗所で行ったが、なぜならサンプルはすでに、光に当たると退色するであろう蛍光色素結合表面抗体で前染色されていたためである。サポニンにより細胞が透過処理されたため、続いて添加するAbが細胞内に到達することができた。インキュベーション後に、チューブを３５３ｇで１０分間遠心分離し、続いて上清を除去した。サンプルごとにAb混合物５０μｌをピペット添加し（表１を参照）、混合し、３０〜４５分間インキュベートした。続いて、結合していない遊離の蛍光色素結合Abを除去するために、細胞をＦＡＣＳバッファー３ｍｌで洗浄した。サンプルを３５３ｇで７分間遠心分離した後、上清を吸引し、最終的には細胞を４００μｌの１％ＰＦＡに取り込み、混合し、フローサイトメーターで分析した。
【００１４】
表１：様々な染色用の抗体混合物の組成
2016506494.tif 000003
【００１５】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）は、適切な抗体で前もって標識された細胞の特異的な光散乱特性および蛍光特性を測定するためのレーザー支援方法である。
毛細管を介して、正圧により細胞懸濁液が測定用キュベットに導入される。流体力学的収束により、細胞を取り囲む支持液により細胞が強く加速され、個々の細胞が分析点において順次、レーザー光線を通過し、そこではそれら個々の単一細胞が検知され、分析され、分類される。細胞が、レーザー光と相互作用すると、ある細胞集団に典型的な光回折または光散乱が起こり、それが光検出器によって検知される。その際、いわゆる前方散乱光（ＦＳＣ＝ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞のサイズに関する情報を提供し、光の回折によって引き起こされる。側方散乱光（ＳＳＣ＝ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞の顆粒度に関する情報を仲介し、光の屈折によって引き起こされる。そのように算定された各細胞のサイズ特性および顆粒度特性は、二次元ダイアグラムで描写可能であり、細胞分集団の同定に利用される。
【００１６】
さらに蛍光色素が結合された抗体により、集団または分集団の個々の単一細胞を、より詳細に同定し特徴づけることが可能である。これは細胞型特異的な表面分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８のような膜受容体）を染色することにより、または細胞膜の透過処理後に細胞内局在抗原を検出ことによっても可能である。蛍光色素はレーザーによって励起され、光学系で測定可能な、より長波長の光子の形状で光を放出する。様々な蛍光色素は励起波長が同じであるにもかかわらず、特徴的な異なる放出波長を有するため、１つのレーザーを用いて、様々に結合された複数のAbを識別し、それにより同時に異なる細胞特性を調査することが可能である。
中でも、波長領域４８８ｎｍのアルゴンレーザー（青色）で励起され５２０ｎｍの最大蛍光を発する蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を使用した。同様に、５７６ｎｍの最大放射を有するフィコエリスリン（ＰＥ）を使用した。ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体）は、６７８ｎｍで可視化され、ＰＥ−Ｃｙ７（フィコエリスリンシアニン７）は７８５ｎｍで可視化される。それに対して、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）は、ヘリウムネオンレーザー（赤色）によって６３５ｎｍの波長で励起される。この色素の放射の最大値は６６０ｎｍにある。
【００１７】
測定および分析、ならびにコンピュータ支援データ処理のためには、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＴＩ）およびソフトウェアプログラムＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１．３を使用した。個々の細胞の分類は、前方散乱光（ＦＳＣ）および側方散乱光（ＳＳＣ）中での散乱光信号による「ドットプロット」表示および「密度プロット」表示を利用して行った。その際、全血中でも、ＰＢＭＣにおいても、サンプルごとにＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞がフローサイトメトリーにより検知され、定められたゲーティング戦略を利用して評価された。十分な細胞数を確保するために、できる限り、測定ごとに１００，０００個のＣＤ８Ｔ細胞を検知するよう努めた。
【００１８】
その結果として、まず全細胞をその顆粒度（ＳＳＣ）およびそのサイズ（ＦＳＣ）に基づいて図解し、リンパ球領域を特定した（「ゲートした」）。１つの点は、「ドットプロット」表示中では個々の細胞に対応し、「密度プロット」表示中の密度勾配は、ある特定の特性の細胞の頻度に対応する。続いて、リンパ球を、ＣＤ４５前染色（「ドナー」またはＣＤ４５＋）細胞および未染色（「レシピエント」またはＣＤ４５−）細胞に区分した（図３）。それらの細胞をそれぞれ、さらにＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞に細分した（図４）。機能特性をさらに把握するために、４つの細胞集団（ＣＤ４＋ＣＤ４５＋；ＣＤ４＋ＣＤ４５−；ＣＤ８＋ＣＤ４５＋；ＣＤ８＋ＣＤ４５−）を、さらに、活性化マーカーＣＤ６９およびサイトカインＩＦＮγの発現を手がかりにそれぞれ４つの分集団に細分した。象限へのこの細分により、それぞれの蛍光信号の、個々の象限中での百分率での割合を算出することができた。アロ反応性Ｔ細胞は、ＣＤ６９とＩＦＮγとの共発現によって定義され、従って右上方の象限内に現れた（図５および図６）。
【００１９】
本研究の統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを利用して行った。２つの群の連続変数を互いに比較する場合には、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｈｎｅｙ）検定を使用した。２つを超える群の対応する分析には、クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用し、有意性が認められた場合、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定を利用して個々の集団を互いに比較した。２つ以上のカテゴリカル変数の依存性は、フィッシャーの正確検定またはカイ二乗検定を利用して算定した。相関関係分析には、スピアマン検定を使用した。０．０５を下回るすべてのｐ値は有意と見なされる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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